Brevet FR2472387A1 — publié le 19810703

La présente invention concerne une composition thérapeutique nouvelle, surtout efficace contre les oedèmes pulmonaires aigus, les chocs provoqués par les endotoxines bactériennes, le choc anaphylactique et l'hyperfibrino- lyse. Plus particulièrement, l'invention concerne des esters de Larginine. On connaît de nombreux esters de L-arginine comme, par exemple, les esters d'alcools aliphatiques répondant à la formule générale COOR H2N H NH c H Ca dans laquelle représente un anion organique ou minéral pharmaceutiquement compatible et R représente un radical alkyle. On obtient ces esters avec les alcools aliphatiques par une estérifi- cation de la L-arginine en utilisant l'un des procédés décrits dans la litté- rature spécialisée, comme par exemple la réaction de la L-arginine avec un alcool aliphatique ayant subi une saturation préalable avec du gaz chlorhy- drique sec ou une estérification par élimination d'eau par distillation a2otropique ou encore la-réaction avec un alcool en présence de chlorure de thionyle ou des procédés analogues. Ces esters, par exemple sous forme de chlorhydrates, sont stables à l'état solide et on peut préparer des solutions à partir de ces esters à un pH neutre ou légèrement acide. Les solutions restent stables pendant une très longue période. On a maintenant trouvé de façon surprenante que les esters d'argini- ne avec des alcools aliphatiques et leurs sels font preuve de propriétés thérapeutiques intéressantes pour le soulagement de certains états patholo- giques. Le produit qu'on administre par voie parentérale est une solution aqueuse ayant un pH de 5,5 à 8,5 et contenant le cation de l'ester de l'ar- ginine et un anion minéral ou organique dans un rapport molaire qui peut être de 1: 1 ou un rapport molaire différent. Plus précisément, les esters et leurs sels correspondants ont une action inhibitrice sur l'oedème pulmo- naire aigu et permettent de prolonger l'espérance de vie dans les cas d'un syndrome de choc provenant de causes très variées telles que les endotoxines bactériennes ou les endotoxines du type immunitaire. On a également constaté que les esters de L-arginine ont une activité très utile in vivo contre le syndrome hyperfibronolytique provoqué par administration d'urokinase. Il convient de remarquer qu'on obtient tous ces effets thérapeutiques à des doses telles et par des voies d'administra- tion telles qu'aucun effet toxique notable ne soit provoqué. En outre, en général, la toxicité de toutes ces substances est très faible; Comptetenu de la dose, de la voie d'administration et, d'une façon plus générale, de la façon dont les effets sur les animaux sont obtenus, ces substances sont aussi utiles en thérapeutique humaine lors du traitement des états patholo- giques du type mentionné plus haut. L'activité des compositions pharmaceutiques selon l'invention sera mise en évidence par les résultats expérimentaux résumés ci-après Protection contre l'oedème pulmonaire On a utilisé le procédé de A.M. Rothschild et A. Castania [Arch. Pharmacol., 295, 177 (1976)], pour développer l'oedème aigi dans les poumons et on a utilisé des substances ayant une activité thérapeutique connue aux fins de comparaison. Pour ce test,- on a utilisé des rats albinos mâles Wistar pesant en moyenne 250 à 350 g. On a stabilisé les rats pendant une période de dix jours à une température de 21- 1C avec une alimentation contrôlée et avec de l'eau "ad libitum". Avant le test on a divisé les animaux en groupes de dix pour obtenir de bons résultats statistiques. On a essayé chaque dose sur trois groupes d'animaux. On a anesthésié les animaux avec du pentobar- bital à une dose de 30 mg/kg au début du test. Une fois que les animaux étaient sous narcose complète, on a administré les substances suivantes par voie parentérale: 1 - aux animaux témoins, une solution saline physiologique à raison de 1 ml/kg. 2 - aux animaux du test, une solution de la substance testée dans = une solution saline physiologique à raison de 1 ml/kg et aux doses indiquées dans le tableau ci-après. - Au bout de quinze minutes, pour déterminer l'activité protectrice des substances, on a administré de l'adrénaline en une quaneité de 16 W /kg par voie endoveineuse et dans une solution physiologique saline afin de provoquer un oedème aigi. Au bout de cinq minutes on a sacrifié les animaux en les décapitant, on a extrait les poumons et on a déterminé le poids des poumons. Les résul- tats de ce test apparaissent dans le tableau I ci-après en même temps que la concentration de la substance et le pourcentage d'inhibition relatif de l'oedème. Les résultats sont discutés après les tableaux. - 3 TABLEAU I Composé Dose % inhibition de Composé Dose lodm 1 oedème Solution physiologique o 1 ml/kg + adrénaline 32,2 2,5 Aprotinine *I I. l L-A.M. * VI IV I! Il D-A. M. **** !l fI si il g' D-A.M.* t g 36,9 48,2 54,3 19,6 I 000 2,5 l 2,5 17,3 36,5 54,5 42,7 21,2 27,4 29, 0 ,7 ,7 16,8 11,7 ,4 4,4 6,4 3,4 32,2 33,3 ,7 47,9 41,0 38,9 39,7 1 1 Il 4,2 ,3 2,5 0,1 0,25 0,5 2,5 0,1 0,25 0,5 1,0 2,5 ,0 Aspirine IV # I. I! L-A. E. " t I il I1 I! VI D-A. E. *** IV Il of I! It g' I I I TABLEAU I (suite) t en mg/kg sauf dans le cas de l'aprotinine, les chiffres indiquent la valeur U.I.K./kg, c'est-à-dire l'unité inhibitrice de Kunitz. m produit pharmaceutique disponible dans le commerce sous la marque déposée "Trasylol" fabriqué par Farbenfabriken Bayer. 3 as L-A.M. = chlorhydrate d'ester méthylique de L-arginine t D-A.M. chlorhydrate d'ester méthylique de D-arginine 11 LD-A.M. = chlorhydrate d'ester éthylique de L-arginine tesât D-A.E. = chlorhydrate d'ester éthylique de L-arginine * D-A.E. = chlorhydrate d'ester éthylique de Darginine Composé Dose % inhibition de 1 'oedéme L-Arginine. 2HC1 1 7 " 2,5 9 " 5 11 " 10 10,1 " 20 13,1 Ethanol 0,08 7 " 0,8 12 " 2 15 " 4 14,7 " 8 16 " 16 15,9 Méthanol 0,08 2,3 " 0,8 5 " 2 12 " - 4 6 " 8 15 " 16 15 L-Arglnine.2HCl + Ethanol 1+0,08 10 " 2,5+0,8 9 " 5+2 _ 5,3 " 10+4 7,2 " 20+8 4,6 L-Arginine.2HCl + Méthanol 1+0,08 11,4 " 2,5+0,8 7,2 " 5+2 9,5 " 10+4 8,1 " 20+8 6 Protection contre le choc provoqué par les endotoxines On a provoqué un choc sous l'effet des endotoxines en utilisant le procédé décrit par A. Bertelli et L. Donati, dans "The influence of Some Enzymes and Enzymes Inhibitors in Shock", publié dans "Shock Biochemical, Pharmaceutical and Clinical Aspects"; A. Bertelli et N. Back Editors, Advances in Experimental Medicine and Biology; Volume 9, Plenum Press New York Londres 1970, page 215. A titre de comparaison, on a utilisé une substance ayant une activité thérapeutique bien connue, à savoir l'aprotini- ne, produit vendu par Farbenfabriken Bayer sous le nom "Trasylol". On a utilisé des rats mâles Wistar pesant 120 + 10 g. On a au préalable stabilisé les rats pendant dix jours à une température de 21 - 1 C avec une alimentation contrôlée et de l'eau "ad libitum". 24 heures avant le test, on a divisé les animaux en groupes de dix pour obtenir de bons résultats statistiques. On a testé chaque dose unitaire sur six groupes d'animaux. En qualité d'endotoxine on a utilisé le lipopolysaccharide B de S. Enteritidis (Difco Labs.). On a administré cette substance à une dose de 10 mg/kg par voie endopéritonéale, une heure après l'administration de la substance par voie parentérale ou sous forme d'une solution physiologique dans un volume égal (par kg) aux animaux servant de témoins. On a déterminé le pourcentage de mortalité chez les animaux testés par comparaison avec les témoins après 24 heures. Les résultats sont consignés dans le tableau II ci-après. TABLEAU II Composé Dose % mortalité Solution physiologique - 70,9 Aprotine 1000 50,0 " 3000 65,0 " 10000 65,0 " 100000 93,3 L-A.M. 5 55,0 " 10 50,0 " 20 40,0 "_ 5028,0 TABLEAU II (suite) Composé Dose % mortalité L-Arginine.2HCl T, L-Arginine. 2HCl+Méthanol Tt si L-Arginine.2HCl+Ethanol T I Les abréviations sont les mêmes que dans le tableau les doses d'aprotinine sont exprimées en U.I.K./kg. Protection contre le choc anaphylactique I. Dans ce cas, On a provoqué le choc anaphylactique par le procédé de S.M. Feimberg, J. Pharmacol. Exp. Terap., 99, 195 (1950). On a utilisé des cobayes mâles albinos pesant en moyenne 350 - 20 g et ayant subi une stabilisation préala- ble pendant dix jours à une température de 21-1 C, avec une alimentation contrôlée et de l'eau "ad libitum". Trois jours avant le début de l'essai, D-A.M. I. il y. L-A. E. I. I i. 71,2 68,5 51,3 48,2 37,5 ,0 D-A. E. sI T. i Méthanol i 69,3 T Ethanol i i 4+0,61 8+1,23 16+2,46 4+1,06 8+2,12 16+4,24 i -À on a divisé les animaux en groupes de dix pour obtenir de bons résultats statistiques. On a testé chaque dose unitaire sur trois groupes d'animaux. Pour provoquer la sensibilisation, on a administré par voie endoveineuse un sérum de cheval (à raison de 1 ml/cobaye), en l'occurence un sérum entier non traité par des agents de conservation, en dilution 1: 10 dans une solution physiologique saline. Après 14 jours, on a administré par voie parentérale les solutions des substances testées et les échantillons physiologiques pour les témoins. En même temps, on a administré par voie en- doveineuse 1 ml par cobaye de sérum de cheval non dilué, cette substance servant également d'agent provoquant l'anaphylaxie. On a déterminé après douze heures le pourcentage de mortalité.Les résultats sont consignés dans le tableau III. TABLEAU III Composé Dose % mortalité Solution physiologique - 80 Aprotinine 3000 40 " 10000 55 " 100000 80 L-A.M. 10.40,5 il 20 27 si 50 12,5 D-A.M. 10 78,8 " L-A;E20 81,0 76,3 L-A.E. 10 35 23 9,5 D-A.E. 10 76,7 79,4 81,0 L-Arginine.2HCl 10 78,5 si Mt:l 20 76,3 80 Ir'1-, 1 Il. 10,0 "sL 4 Uz t s' 4 79,4 if 8 81 TABLEAU III (suite) Composé Dose % mortalité Ethanol 2 76,4 "I 4 74 " 8 76,5 L-Arginine.2HCl+Méthanol 4+0,61 77,3 " 8+1,23 76,3 " 16+2,46 81,0 L-Arginine.2HCl+Ethanol 4+1,06 75,8 " 8+2,12 73,2 " 16+4,24 77,0 Pour les dosages et abréviations, voir notes au bas du tableau I. Inhibition de l'hyperfibrinolyse On a provoqué l'état d'hyperfibrinolyse par administration d'urokinase. On a déterminé l'inhibition par une estimation de l'indice P.D.F. (Produits de dégradation des fibrines) selon la technique de J.Hawiger et al. J. Lab. Clin. Med. 75, 93 (1970), au moyen d'un test de regroupement des staphylocoques (Test de Boehringer Mannheim GmbH). + On a utilisé des rats Wistar pesant 300 - 10 g et ayant subi une stabilisation préalable pendant 10 jours à une température de 21 1I C avec une alimentation contr8lée et de l'eau "ad libitum". 24 heures avant le début de l'essai, on a divisé les animaux en groupes de dix pour obtenir de bons résultats statistiques. On a testé chaque dose sur trois groupes d'animaux. Au début du test (temps zéro) on a administré les composés testés par voie parentérale. Dans le cas des animaux témoins, on a administré au même moment un volume égal d'une solution physiologique saline, un peu de sang par ponction cardiaque ayant été prélevé afin de déterminer l'ac- tivité fibrinolytique basale. Apres 30 minutes on a administré l'urokinase humaine (composition vendue par Ukidan-Serono) par voie intraveineuse à raison de 2 500 U.I./rat. Apres une période supplémentaire de dix minutes on prélève du sang par ponction cardiaque pour la détermination finale de P.D.F., détermination qui est exprimée en millilitres. Les résultats sont consignés dans le tableau IV. sont consignés dans le tableau IV. TABLEAU IV Composé Dose P.D.F. Solution physiologique Aprotinine "! I Acide tranexamique if Il L-A.M. i I. D-A.M. Il I. L-A.E. I i D-A.E. Il I! L-Arginine. 2HC1 !. Méthanol !l i. 0,26 Basale 3,30 0,34 0,29 0,30 0,58 0,39 0,33 0,48 0,30 0,25 3,10 3,03 3,16 0,50 0,33 0,27 3,20 3,16 3, 19 3,28 2,96 3,15 i 3,02 3,12 3,27 TABLEAU IV (suite) Composé Dose P.D.F Ethanol 2 3,06 " - 4 2,95 " 8 3,11 L-Arginine.2HCl+Méthanol 4+0,61 3,00 " 8+1,23 3,12 " 16+2,46 3,20 L-Arginine.2HCl+Ethanol 4+1,06 2,98 " 8+2,12 2,99 " 16+4,24 3,20 Pour les dosages et les abréviations, voir les notes au bas du Tableau I. L'acide tranexamique est l'acide trans-4-(aminomgthyl) cyclohexanecarboxyli- que. Les données répertoriées dans les tableaux I à IV mettent en évidence les effets thérapeutiques importants des esters éthyliques et méthyliques de l'arginine aux doses du test et aussi la spécificité de l'activité par rapport à la structure du composé et son stér$oisomgrisme. En fait, on a obtenu des effets insignifiants et des effets comparables à ceux sur les animaux traités comme témoins par une solution physiologique saline quand on administrait aux animaux l'arginine seule ou les alcools seuls ou encore les mélanges d'arginine et des alcoolsou les esters de D-arginine. On a testé la toxicité des esters de L-arginine, dont l'action thérapeu- tique a été démontrée dans les exemples ci-dessus, sur deux espèces d'ani- maux à savoir les souris par voie intraveineuse et les rats aussi bien par voie intraveineuse que par voie endopéritonéle. Les résultats en DL50(mg/kg) sont comme suit: Espèce: souris albinos mâles Swiss pesant en moyenne 22 - 1 g voie d'administration: endoveineuse. DL 50: 315,6 mg/kg (L.F. 276,5 - 360,2) Espèce: rats albinos mâles Wistar pesant en moyenne 180 - 10 g voie d'administration: endoveineuse. DL 50: 431,73 mg/kg (L.F. 374,2 - 498,0) voie d'administration: endop9ritcnie, DL 50-: 1111,1 mg/kg (L.F. = 1002,9 - 1230,8) Il convient de remarquer que les toxicités sont de loin plus élevées que les doses utilisées aux fins thérapeutiques. Avec les doses indiquées ci-dessus et avec la voie d'administration spécifiée, l'administration des substances à des animaux sains n'a provoqué aucune mortalité et aucun symptôme apparent de toxicité. Les données apparaissant dans les tableaux I à IV mettent en évidence la valeur thérapeu- tique des compositions pharmaceutiques selon l'invention. REVENDICATIONS 1. Composition pharmaceutique pour protection contre les oedèmes pulmonaires aigus, divers types de chocs, notamment les chocs anaphylactiques et l'hyperfibrinolyse provoquée par des agents qui activent le plasminogène, caractérisée en ce qu'elle comprend une solution d'un ester de L-arginine et d'un alcool aliphatique ou d'un sel de cet ester avec un acide organique ou minéral pharmaceutiquement acceptable, dans de l'eau à un pH de 5,5 à 8,5. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est sous forme de doses unitaires contenant de 0,25 à 100 mg par kg du poids du corps du sujet devant être traité par voie parentérale. 3. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le choc est provoqué par des endotoxines bactériennes. 4. Composition selon la revendication 1,2 ou 3, caractérisée en ce que l'ester de L-arginine est sous forme chlorhydrate. 5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'alcool est le méthanol ou l'éthanol.