Brevet FR2465001A1 — publié le 19810320

-1- La présente invention concerne une hétéro- polysaccharide, dénommé hétéropolysaccharide S-88. Le produit S-88 peut être préparé par fer- mentation d'un milieu nutritif approprié avec un orga- nisme n'ayant pas été décrit jusqu'à présent, d'après des études taxonomiques poussées, qui est une espèce de Pseudomouas non-dénommée. Un dépôt permanent sans restriction de cet organisme utilisé dans la production du présent hétéropolysaccharide a été effectué avec l'American Type Culture Collection le 21 août 1979 sous le numéro d'inscription ATCC 31554. Divers critères de classification pour le genre Pseudomonas et les descriptions de cultures d'espèces de Pseudomonas se trouvent dans la 7ème édi- tion de Bergey's Manual (Breed et autres (1957)) et dans la 8àme édition de Bergey's Manual (Doudouroff et autres, (1974)), ainsi que par d'autres écoles dans diverses publications; Hugh et Gilardi, 1974, Pseudo- monas, Manual of Clinical Microbiology, 2ème édition, Lennette et autres, éditeurs, pages 250-269; Iizuka et autres, 1963, Attempt at Grouping the Genus Pseudo- monas, J. Gen. Appl. Microbiolopy 9:73-825 et Hendric et autres, 1966, Identification of Certain Pseudomonas Species, Identification Methods for Licrobiologists, Part A, Gibbs et autres, éditeurs, pages 1-7, Academic Press, New York. On a recherché ces critères et descriptions pour une espèce de Pseudomonas ayant des caractéris- tiques morphologiques et culturales similaires à celles de ATCC 51554. Les considérations suivantes rendent la définition d'une nouvelle espèce de Pseudomonas justi- fiée et nécessaire. -2- Description de la souche A. Caractéristiques de morphologie des colonies Deux types de colonies (typiques et atypi- ques) apparaissent tant sur gélose nutritive que sur gélose YM. Sur gélose nutritive, de petites colonies jaunes translucides se développent en deux jours à la température ambiante; le diamètre atteint environ 1 mm en 5 jours. Les colonies sont rondes, à bord lisse, et convexes. Les colonies typiques sont plus luisantes et la texture de surface est extrêmement dure; des colonies entières sont enlevées si elles sont poussées par une boucle; toutefois, les colonies atypiques ne possèdent pas de telles caractéristiques. Sur gélose YM, les diamètres des colonies tant typiques qu'atypiqẻs sont d'environ 7-9 mm en jours. Celles des deux types sont rondes, lisses, convexes, opaques et pigmentées en jaune. Les colonies typiques deviennent davantage en forme de protubérances et les colonies atypiques sont plus aplaties. Les cer- cles concentriques sont plus importants dans le cas de colonies atypiques. La surface des colonies typiques est plus gluante et une membrane élastique est formée avec incubation-prolongée. B. Caractéristiques de morphologie des cellules La souche S-88 est une bactérie Gram-négative en forme de bâtonnet. Il n'y a pas de différence dans la forme des cellules entre des souches typiques et atypiques, sauf en ce qui concerne la disposition des cellules. Les cellules d'une souche typique sont ob- servées en agrégation, comme en une masse ressemblant à des Zoogloea. Sur gélose nutritive, la plupart des cellules ont des grosseurs de 0,5-0,6 sur 2,G-2,51 iT; amincies à une extrémité. Peu de cellules sont motiles. Des granules de poly-3-hydroxybutyrate peuvent être observés dans les cellules en cas d'incubation prolon- -3- gée. Parfois, des cellules anormales très longues ont été observées. Le pléomorphisme est courant. La plupart des cellules sont détruites dans les 5 jours à la température ambiante. Sur milieu IY, les cellules sont plus grosses et plus longues (0,6-0,8 sur 2,5-35,07m), en bâtonnets de formes régulières. La plupart des cellules sont dans un arrangement en palissades. Des granules de poly-p-hydroxybutyrate s'accumulent. Les cellules de- viennent très longues (plus de 5/am) lors d'une incu- bation prolongée. La coloration des flagelles est extrêmement difficile parce que relativement peu de cellules sont flagellées et la formation de gomme gene l'observation du mode de flagellation. Selon les méthodes d'Iniss et Mayfield, la majorité des cellules flagellées le sont de manière monotriche; l'insertion est polaire et/ou sub-polaire. C. Caractéristiues physiologiques et biochimiques Résultat faible ou négatif avec la cyto- chrome-oxydase; positif avec la catalase. L'organisme est capable de développement à 37 C, mais pas à 4 0 ni à 410 C. Pas de tolérance à 3 % de NaCl et à des pH de 4 et de 12. Pas de survie à 60 C pendant 50 minutes. Aérobie; de l'acide est produit à partir de divers hydrates de carbone, mais pas de gaz. Le nitrate peut être réduit. Le lait tournesols a été réduit, mais pas peptonisé.Il n'y a pas eu de H2S produit (méthode à l'acétate de plomb). De la phosphatase et de la lipase ont été produites. Il y a eu hydrolyse de l'esculine et de la gélatine (très faiblement), mais pas de l'a- midon ni de la caséine. Les résultats avec ADH, LDC et ODC ont été négatifs. Tolérance à 0,1 %o de chlorure de triphényltétrazolium. Pas de développement sur les milieux gélosés SS, Pseudosel ou.'acConkey. De l'acide -4- a été produit en culture inclinée; pas de développe- ment dans du milieu TSI. D. Essai de sensibilité aux antibiotiques La souche S-88 est sensible aux antibio- tiques suivants: Carbénicilline (100/ug) Gentamicine (10/ug) Chlorotétracycline (51ug) Pénicilline (10 unités) Polymyxine B (300 unités) Erythromycine (15 /g) Novobiocine (30 Zg) Kanamycine (30/ug) Tétracyc line (3 pg) Néomycine (30/ug et n'est pas sensible à: Streptomycine (10g) Colistine (I10 pg) E. Caractéristiques de nutrition Des vitamines ne sont pas nécessaires pour le développement. Des sels d'ammonium servent de seule source d'azote. Au moins 26 sur 123 composés organiques sont utilisés comme seule source de carbone et d'éner- gie; la plupart sont des hydrates de carbone. F. Teneur en G+C de l'ADN La teneur molaire en G+C de la souche S-88 est de 69,8 5. G. Identification par les systèmes de tubes API et OXI/FERM La souche S-88 n'a pas été identifiée par les méthodes des tubes API ou OXI/FERMI. Cela suggère que l'organisme n'a pas pu être isolé à partir d'une source clinique. H. Identification j5 Comme la souche S-88 est flagellée de ma- -5- nière monotriche polaire ou sub-polaire, l'organisme appartient à l'un des membres du genre Pseudomonas, à en juger d'après les caractéristiques phénotypiques. La teneur en G+C de l'ADN (69,8 moles %) est comprise dans l'intervalle des teneurs molaires en G+C du genre Pseudomonas. TABLEAU I: Essais biochimiques et autres essais divers utilisés pour la souche S-88 Oxydase: de Kovac Pathotech Catalase Milieu OF: oxydant fermentatif Gaz à partir du glucose Produ6tion de H2S: TSI à partir de cystine Ammonium à partir de peptone P-galactosidase (ONPG) Arginine dihydrolase Lysine décarboxylase Ornithine décarboxylase Tryptophane désaminase Phénylalanine désaminase Uréase Indole Essai MR Essai VP Réduction de nitrate Réduction de nitrite Dénitrification Fixation de N2: Développement dans milieu de Burk Activité de nitrogénase Malonate (oxydation) Phosphatase + (faible) + (faible + + + + Hydrolyse de Gélatine Caséine Amidon Tween 80 Pectine Alginate Cellulose Chitine ADN Esculine + (faible) + NT NT + Développement sur divers milieux Gélose EMB + Gélose MacConkey - Gélose SS - Gélose au sel de mannitol - Gélose TCBS - Gélose au sang et au tellurite de Tinsdale - Gélose Pseudosel - Production de pigment: Milieu King A Milieu King B + NT + Réaction de colorants: Rouge Congo Bleu Nil NT ru J". 0% Ln H3+ I Il Il Il Fd Fd ti: P) O (D ca ou as P. Pa -J. m Fb Ft (D cc CD,, I O I TABLEAU I (Suite) Hémolyse (sang de mouton) - Lait tournesols: acide, réduction seulement Production de 5-cétolactose - Survie à 600C pend.0 min. + TSI: Culture inclinée "ButteuD Gaz Réaction au jaune d'oeuf Acide Pas de développement -'J ! os c:, -8- Conditions de fermentation L'hétéropolysaccharide S-88 est produit durant la fermentation aérobie de milieux nutritifs aqueux appropriés dans des conditions contrôlées par inoculation de l'organisme de l'espèce nondénommée de Pseudomonas. Les milieux sont frd milieux usuels, contenant une source de carbone, d'azote et des sels inorganiques. En général, des hydrates de carbone (par exemple le glucose, le fructose, le maltose, le su- crose, le xylose, le mannitol, etc) peuvent être uti- lisés isolément ou en combinaison comme sources de carbone assimilable dans le milieu nutritif. La quan- tité exacte de la source ou des sources hydrate de carbone qu'on utilise dans le milieu dépend en partie des autres ingrédients dans le milieu, mais en général la quantité d'hydrate de carbone varie habituellement entre 2 % et 4 % environ du poids du milieu. Ces sour- ces de carbone peuvent 8tre-utilisées individuellement ou plusieurs de ces sources de carbone peuvent etre combinées dans le milieu.-En général, de nombreuses matières protéiques peuvent être utilisées comme sour- ces d'azote dans la fermentation. Des sources d'azote utilisables sont, par exemple, des hydrolysats de le- vures, de la levure primaire, de la farine de soja, de la farine de graines de coton, des hydrolysats de caséine, de la liqueur de macération de mais, des résidus solubles de distillation, de la pâte de to- mates, etc. Les sources d'azote, isolément ou en com- binaison, sont utilisées à raison de 0,5 à 0,2 % envi- ron du poids du milieu aqueux. Parmi les sels inorganiques nutritifs qui peuvent être incorporés dans les milieux de culture, se trouvent les sels usuels capables de donner des ions de sodium, de potassium, d'ammonium, de calcium -9- et des ions phosphate, sulfate, chlorure, carbonate, etc. Sont inclus aussi les métaux présents en quanti- tés de l'ordre de traces comme le cobalt, le manganèse, le fer et le magnésium. Il y a lieu de noter que les milieux décrits dans les exemples sont seulement illustratifs de la grande variété de milieux pouvant être utilisés, et ne doivent pas 6tre considérés comme limitatifs. Une caractéristique importante des milieux est que quand la souche S-88 est cultivée dans des conditions de basse teneur en Ca++, c'est-à-dire dans de l'eau désionisée ou dans un système aqueux ayant moins de 200 ppm d'ions Ga++, la gomme résultante est facilement soluble dans les solutions sans géli- fication. La fermentation est effectuée à des tempéra- tures comprises entre 25 et 355C environ; toutefois, pour les meilleurs résultats, il est préférable de con- duire la fermentation à des températures comprises entre 28 et 32 0 environ. Le pH des milieux nutritifs pour le développement de la culture de Pseudomonas et pour la production du polysaccharide S-88 peut varier entre 6 et 8 environ. Bien que le polysaccharide S-88 soit produit par culture tant en surface qu'immergée, il est préfé- ré de conduire la fermentation à l'état immergé. On effectue commodément une fermentation à petite échelle en inoculant un milieu nutritif appro- prié avec la culture et, après transfert à un milieu de production, en permettant à la fermentation de s'ef- fectuer à une température constante de 300C environ sur une secoueuse pendant plusieurs jours. La fermentation est commencée dans un flacon stérilisé de milieu par une ou plusieurs étapes de développement de germes. Le milieu nutritif pour l'é- -10- tape de développement de germes peut être une combinai- son appropriée quelconque de sources de carbone et d'a- zote. Le flacon de développement de germes est secoué dans une chambre à une température constante de 300C environ pendant 1 à 2 jours, ou jusqu'à ce que le dé- veloppement soit satisfaisant, et on utilise un peu du développement végétatif résultant pour inoculer un deu- xième étage de développement de germes ou le milieu de production. Les flacons des étages intermédiaires de développement de germes, quand on les utilise, sont développés essentiellement de la m8me manière; c'est- à-dire qu'une partie du contenu du flacon du dernier étage de développement de germes est utilisée pour inoculer le milieu de production. Les flacons inoculés sont secoués à une température constante pendant plu- sieurs jours et à la fin de la période d'incubation les contenus des flacons sont recueillis par précipita- tion par un alcool approprié comme l'isopropanol. Pour un travail à grande échelle, il est préférable de conduire la fermentation dans des réser- voirs appropriés équipés d'un agitateur et d'un moyen pour aérer le milieu de fermentation. Seloxce procédé, le milieu nutritif est préparé dans le réservoir et stérilisé par chauffage à des températures allant jus- qu'à 1210C environ. Après refroidissement, le milieu stérilisé est inoculé avec des germes obtenus précé- demment de la culture productrice et on laisse s'ef- fectuer la fermentation pendant un laps de temps de, par exemple, 2 à 4 jours tout en agitant et/ou en aérant le milieu nutritif et en maintenant la tempé- rature à 3OC environ. Ce procédé de production du S-88 convient particulièrement bien pour la prépara- tion de grandes quantités. Le produit est recueilli à partir du milieu de fermentation par précipitation par un alcool appro- -il- prié, comme l'isopropanol. Hétéropolysaccharide S-88 L'hétéropolysaccharide produit par une es- pèce non dénommée de Pseudomonas est composé princi- palement d'hydrates de carbone avec 3-7 % de groupes acétyle comme l'ester à liaison 0-glycosidique. La portion hydrate de carbone du polysaccha- ride S-88 contient 10-20 % d'acide glucuronique, -30 % de mannose, 30-40 % de glucose et 35-45 % de rhamnose. Le Tableau II indique des résultats d'ana- lyses spécifiques sur six échantillons de fermenta- tion, y compris l'analyse en triple de deux échantil- lons. TABLEAU II: Composition de la gomme S-88 ORGANISMES PARTICULIERS Echan- Acide tillon glucuronique Pyruvate no a (%) p (%) Acétyle (%)s Constituants sucres neutres (%) Glu Man Fuc Rha Ara Protéines (%o) -- 45 -- 59 -- 57 -- 36 3 37 -- 41 1 37 I 40 I 44 0 41 I 11,8 11,9 11,5 11,7 12,7 12,7 12,7 14,0 14,0 14,0 a par décarboxylation y par analyse colorimétrique 4.b 0% uo o> CO A B C 6A 6B 6C 11,8 18,7 18,0 , 8 ,1 ,1 ,1 13,7 13,7 13,7 0,1 0,1 0,1 0,1 0,I 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 ,2 ,2 7, 0o 6,6 6,1 6,1 6,1 4,9 4,9 4,9 k- !u -13- La teneur en groupes acétyle de 5-10 % a été déterminée en traitant une solution aqueuse & 0,2 % de gomme S-88 par un réactif alcalin, l'hydroxylamine, cela étant suivi d'un traitement par un réactif chlo- rure ferrique acide [S. Hestrin (1949) J. Biol. Chem. pages 249-261]. Les sucres neutres du polysaccharide S-88 ont été déterminés en dissolvant 10 mg du produit dans 2 cm3 de solution 2E de H2SO04 et en chauffant le mé- lance à 100 C pendant 4 heures. La solution résultante a été refroidie, neutralisée par l'hydroxyde de baryum et on a porté le pH à 5-6 au moyen d'anhydride carbo- nique solide. Le précipité résultant de sulfure de baryum a été éliminé par centrifugation et le liquide surnageant a été concentré à l'état d'un sirop sous pression réduite. On a tenté d'identifier les sucres dans l'hydrolysat par chromatographie gaz-liquide de leurs dérivés aldononitrile acétate sur un chromato- graphe modèle 5750 de Hewlett-Packard en utilisant 3 % en poids d'0V-225 sur Gas Chrom Q en particules de 0,149 à 0,177 mm à 210 C. On a identifié et déter- miné quantitativement les sucres par comparaison avec des étalons authentiques [J.K. Baird, M.J. Holroyde, et D.C. Ellwood (1973) Carbohydr. Res. 27 pages 464- 467j. Les divers sucres neutres des polysaccharides ont été caractérisés aussi par utilisation de chroma- tographie descendante sur papier sur du papier pour chromatographie Uhatman n 1 en utilisant comme sol- vant la couche supérieure d'un mélange pyridine: acé- tate d'éthyle: eau (2:5:5). On a coloré les chroma- togrammes en utilisant une immersion dans le nitrate d'argent et un réactif pour pulvérisation phtalate d'alanine acide. Les sucres constituants ont été identifiés par co-chromatographie avec des étalons de -14- sucres et par la réaction de couleur spécifique avec le réactif phtalate d'alanine. La teneur en acide glucuronique du polysaccha- ride a été déterminée par deux méthodes séparées. Dans une méthode, l'échantillon a été décarboxylé par de l'acide chlorhydrique à 19 % et l'anhydride carbonique libéré a été recueilli dans de l'hydroxyde de sodium normal et on a effectué des déterminations par titrage en retour [B.L. Browning (1967) Methods of Wood Chemistry II, pages 632-633] et par la méthode colori- métrique au carbazole [T. Bitter et H.M. Muir (1962) Anal. Biochem. 4 pages 330-334J. On a utilisé une électrophorèse sur papier pour la séparation et la tentative d'identification de l'acide glucuronique présent dans l'hydrolysat acide neutralisé décrit ci-dessus. Des portions ali- quotes de ce dernier et des étalons connus d'acide glucuronique ont été appliqués sur du papier pour électrophorèse Camag NI 68-011 et on a effectué une électrophorèse pendant 2,0 heures dans un tampon au pH 2,7 en utilisant un appareil d'électrophorèse Camag modèle HVE. Les chromatogrammes ont été colorés avec le réactif pour immersion au nitrate d'argent afin de localiser les acides glucuroniques séparés. Le polysaccharide S-88 donne de la viscosité à un milieu aqueux quand il est dissous dans l'eau à de faibles concentrations. Pour cette raison et aussi pour sa sensibilité au cisaillement et sa rhéologie d'ensemble, il est utile comme épaississant, agent de suspension, émulsionnant, stabilisant, lubrifiant, agent filmogène ou liant, spécialement dans des sys- tèmes aqueux. En particulier, il a des utilisations dans les applications suivantes ou les produits sui- vants: adhésifs, ciments pour joints de murs, mor- tiers liquides et mortiers retenant l'eau, enduits Z f65Oû1 -15- pour bouchage de fissures, étanchéité des boîtes de conserve, produits pour chaudières, crémage du latex, fondants pour baguettes de soudure, pâtes à braser, vernis céramiques et extrusions, produits de nettoyage et de brillantage, jouets, émulsions (latex, asphalte, silicone), récupération de l'argent, enrobages de semences, réglage de la pulvérisation pour pesticides ou herbicides, pesticides et herbicides fluides et con- centrés émulsionnables, liants pour tabac, encres à base d'eau, solutions pour distributeurs lithogra- phiques, produits de finition pour cuir, hydro-paillage et hydro-semis, impression et finition de tissus, addi- tifs pour papier à ajouter dans la partie humide, ad- juvant de rétention et de formation pour papier à ajou- ter dans la partie humide, produits anti-adhésifs, agents de démoulage, résines liquides, explosifs en bouillie et emballés, boues de forage pour puits de pétrole et puits d'eau, fluides de stimulation pour pétrole produits de beauté, suspensions et émulsions pharmaceutiques. De plus, cette gomme est utile dans des pro- duits alimentaires tels que des gelées et d'autres pro- duits d'une haute teneur en sucre, des boissons compre- nant des boissons à base d'acide citrique, des produits laitiers comprenant la crème glacée et le yaourt, des assaisonnements pour salade, des mélanges secs, des glaçages, des sirops, les gâteaux dits puddings, des aliments farineux, des aliments en boîtes de conserve et passés à l'autoclave et des produits de remplissage pour boulangerie. Une utilité particulièrement intéressante se trouve dans leomaine des boues de forage pour puits de pétrole et puits d'eau. On trouvera ciaprès des exemples plus détaillés illustrant cette utilisation préférée. -16- Bien que la gomme S-88 possède une propriété générale consistant à donner de la viscosité, son pro- fil particulier de propriétés en solution est une ca- ractéristique distinctive qui permet de la distinguer des autres hétéropolysaccharides. A l'état sec, la gomme a une teneur en ma- tières solides de 85-90 %; dans sa granulométrie la plus utile, elle passe à 100 % à travers un tamis de 0,42 mm d'ouverture de maille, et à pas plus de 30 % à travers un tamis de 0,044 mm. Elle a à 1 % une visco- sité de 1200 à 2500 cPo dans un viscosimètre Brook- field à 60 tpm et donne les résultats suivants à une concentration de 0,4 % dans de l'eau du robinet conte- nant 2 % de KC1l, Famm 35 (F = 0,2): 600 tpm >120; 300 tpm >92; 200 tpm > 76; 100 tpm > 70; 6 tpm >32; et 3 tpm > 28. La gomme a aussi une excellente stabilité à la chaleur et pas de perte de viscosité par passage à l'autoclave à 1210 C et à 1,05 kg/cm2 pendant 15-20 mi- nutes. Elle produit un gel ferme avec NaOH à 15 % et * incubation à 800 C pendant deux heures. Elle est incom- patible avec CaCl2 saturé, le polyphosphate d'ammonium et NH4N03 à 60 %. De plus, la gomme a le profil suivant de pro- priétés: 1. Viscosité et cisaillement A. Brookfield 1. 1,0 % 60 tpm I 520 cPo 6 tpm 11 600 cPo Rotor N j 2. 0,1 % (adaptateur UL)a 295 cPo 3. 0,5 % Wells-Brookfield à 9,6 s- 474 cPo -17 - B. Cisaillementb 1. n à 1,92 s- 1 8512 cPo 2. n à 9,6 s-1 2342 cPo 3. n à 76,8 s-1 320 cPo 4. n à 384 s-1 64 cPo 5. n à 3842 s-1 64cPo 6. n à 9,6 s-1 1558 cPo C. Stockage à 4,4oC 1450 cPo, rotor N 3 à 60 tpm, pas de gélifica- tion, écoulement saccadé. 2. Stabilité aux acides, aux bases et à la chaleur A. Stabilité 1. Acide acétique plus chaleur -- a. valeur initiale de n: 1620 cPo b. valeur finale de n: 2450 cPo c. % de changement: +51 % (gélification) 2. HC01 à 10 % plus chaleur -- a. valeur initiale de n: t cPo b. valeur finale de n: Pt cPo c. % de changement: Ppt % 3. NaOH à 15 % plus chaleur -- a. valeur initiale de n: 1 869 cPo b. valeur finale de n: Gel cPo 4. Chaleur seulement -- a. valeur initiale de n: 2061 cPo b. valeur finale de n: 2266 cPo c. % de changement: +1_0 % B. Effet du pH 1. Acide acétique à 5 % pH 2,69 1741 cPoc 2. NH40H à 5 % pH 10,99 1741 cPo 3. La solution de S-88 est stable dans l'inter- valle de pH de 1,25 à 12,3 -18- Compatibilité avec les sels et A. Sels 1. CaC12 (saturé) 2. Polyphosphate d'ammonium 3. INH403 à 60 % 4. 1 / Al12(SC4)3.18H20 5. I % CaCl2.2H20 6. 1 % KCl 7. 0,1% KCl 8. 2,5 % KCl B. Colorants 1. Vert "Milling" 2. Bleu de méthylène 4. Propriétés texture/écoulement Ecoulement saccadé, discontinu, gélatineux, gommeux au toucher 5. Synergie et Enzymesc les colorants Pré cipité Précipité Précipité Compatible Compatible Compatible 2214 cPoc 922 cPoc Compatible Précipité forte viscosité, A. Guar B. H.P. Guar C. CMC D. HEC E. LAS 1-1 A. Guar B. H.P. Guar C. CmC D. HEC n à n 1 0 O] du D 1600 cPo 170; 1715 cPo 174' - 852 cPo 108e 602 cPo 122 A65001 -19 - 7. Formation de film La gomme s'étend de manière irrégulière, un film se forme, consistance irrégulière, faiblement plas- tique, cassant. aViscosité mesurée sur un viscosimètre Brookfield modèle LVF à 6 tpm avec le rotor n' I et un adapta- teur UL. bToutes mesures effectuées sur un micro-viscosimètre Wells-Brookfield modèle RVT-c/p. CViscosité mesurée sur un micro-viscosimètre Wells- -1 Brookfield modèle RVT-c/p à 9,6 s-1. Exemple I Technique de fermentation pour production d'hétéro- polysaccharide S-88 A. Entretien de la culture L'organisme Pseudomonas non dénommé, ATCC 31554, pousse sur gélose NA à une température d'incuba- tion de 30 C. Cet organisme produit un pigment caro- ténoide jaune. Les colonies sur NA sont petites (seu- lement 1-3 mm) après 48 heures, sont convexes et ont une texture gélatineuse. La colonie typique a tendance se coller de manière tenace à la surface de la gé- lose. Parfois, une variante morphologique peut se dé- velopper, qui est facile à repérer sur NA. La variante a une colonie plate et n'adhère pas de manière tenace à la surface de la gélose. On a trouvé que cette va- riante a une activité réduite de production de gomme S-88. B. Préparation de germes Des germes en ballons sont préparés dans du bouillon YI mis à incuber à 30 C. Dans ce milieu, la culture donnera typique- ment un développement du type floculant suivi d'ac- croissements de viscosité avec un aspect de type gra- nulaire. Les germes dans Y. sont alors utilisés à -20- 24-30 heures pour inoculer un milieu de production de germes qui est le même que dans le fermenteur final, à ceci près que la teneur en phosphate est portée à 0,5 %. Des fermenteurs de 3,785 litres sont utilisés comme récipients de production de germes pour les fermenteurs de 20 litres et de 70 litres. C. Milieu dans le fermenteur final Le milieu suivant donne des résultats ac- ceptables dans des fermenteurs tant de 20 litres que de 70 litres. Glucose............................3,0 % K2HP04. .................... 0,05 % AM.......................... 0,05 % NH4N03............................... 0, 09 % MgS0 4.7H20......... 0,01% Fe++............i........1......i.i 1 PPMi F e. .1 ppm Sels HoLe...................... I ml/L Une vitesse d'agitation réglée à 500 tpm dans les fermenteurs tant de 20 litres que de 70 li- tres est avantageuse. Les durées de fermentation peuvent aller de 45 à 70 heures, avec la viscosité de la bière comprise entre 3000 cPo et 5000 cPo. Les efficacités de conversion varient de 31 à 52 % avec 3 %c de glucose. On peut utiliser de petites quantités d'un agent antimousse disponible dans le commerce. Des colorations de Gram effectuées sur la bière de fermentation de S-88 montrent des cellules gram-négatives ayant des grosseurs de 1,25 Px 2,5x avec des corps polaires prenant une couleur foncée. Les sels HoLe sont une solution d'oligo- éléments contenant du tartrate, du molybdate de magné- sium, CoC13, ZnC12, CuC12, de l'acide borique, du chlorure de manganèse et du sulfate ferreux. Quand on désire un produit d'une basse te- -21- neur en calcium, un milieu pour fermenteur de 50 li- tres est le suivant: MIilieu dans un fermenteur de 30 litres pour un produit d'une basse teneur en calcium Eau désionisée Glucose.............. ............. 3,0 a..DTD: K2HP04......... 0,05 % ALIP.................. 0,05 % MgS04.7H20......................... 0,02 % 1TE4N03............................ 0,09 % Extrait de levures......... 0,01 % Sels HoLe.......................... 40 ml Mélange de vitamines................ 25 ml Fe++....................... 1 ppm Ca++... ................. 2 ppm Le mélange de vitamines est un mélange de 1 /cm3 de chacun des composés suivants: thiamine, cyanocobalamine, patothénate, riboflavine, acide nico- tinique, choline et pyridoxamine; 0,05/u/cm3 d'acide folique et d'acide paminobenzoique; et 0,005/u/cm3 de biotine. D. Recueil La bière de fermentation est pasteurisée à C pendant 10 à 15 minutes. En raison de l'excellente stabilité à la chaleur présentée par ce produit, des températures de pasteurisation plus élevées avec des durées plus courtes seraient acceptables. De bonnes fibres sont typiquement produites dans des conditions de précipitation donnant 58-60 % d'IPA usé. E. Séchage Tout le produit ainsi recueilli a été séché à 50-55 C pendant jusqu'à une heure dans un séchoir à plateaux à air forcé. Les propriétés de la gomme S-88 produite dans ces conditions de fermentation ont été indiquées ci-dessus. Z465001 -22- Quand on prépare la gomme S-88 d'une basse teneur en calcium, elle présente une analyse chimique et un profil de propriétés semblables à ceux de la gomme S-88, mais elle a une réponse inhabituelle dans une solution de NaCl. Bien que la viscosité initiale avec 0 % de sel soit légèrement faible, une viscosité stable se maintient jusqu'à 6 %, voir le Tableau III. TABLEAU III Réponse au sel: NaCl Concentration de NaCl, % en poids 0 2 4 6 8 10 15 20 600" 13,4 14,2 14,8 15,8 11,4 10,2 9,5 9,0 pn 300 20,1 21,4 122,0 20,6 20,2 19,7 19,4 19,0 _-4 - -i-.- 26,0 26,1 27,1 25,4 24,3 524,3 1,8 23,6 41,7 '42,0 42,5 41,2 40,6 39,6 39,1 38,5 6 33552 339 342 526 289 276 254 252 3 578 577 586 563 510 482 441 410 viscosité, co, Fann, 35 tpm Compositions utilisant S-88 Comme indiqué cidessus, la gomme S-88, tant de la forme normale que de la forme calcique, peut être utilisée dans des boues de forage à base d'eau douce ou d'eau salée. Une formule typique pour une boue à base d'eau douce est la suivante: S88 1,0 kg Bentonite 10,0 kg Eau douce 350 litres Résultats de viscosité Fann: Vitesse (tpm) 3 6 100 200 300 600 Lecture sur le cadran 7,6 7,9 16, 8 21,5 25,6 35,3 pH = 8,5; Filtrat API = 12,0 cm3 -23- Une autre formule, pour une boue à l'eau sa- lee, est la suivante: S-88 1,0 kg Eau de mer 350 litres Résultats de viscosité Fann: Vitesse (tpm) 3 6 100 200 300 600 Lecture sur le cadran 2, 8 3,2 9,0 12,8 15,6 23,6 pH = 7,2. -24- -REVEEIDICATIONS - I - H6étéropolysaccharide S-88, contenant -20 % d'acide glucuronique; 1030 % de mannose, -40 % de glucose; 35-45 % de rhamnose; et 3-7 % de groupes acétyle, prépar6 par fermentation dans des conditions contrôlées d'une culture de ATCC 31554, une espèce de Pseudomonas. 2 - Produit selon la revendication 1, carac- téris6 en ce qu'il contient moins de 200 ppm d'ions Ca++