Brevet FR2472610A1 — publié le 19810703

La présente invention concerne des mutants et un procédé pour produire de l'acide L-glutamique par fermentation. On a produit l'acide L-glutamique par fermentation avec des microorganismes appartenant aux genres Brevibacterium ou Corynebacterium. On s'est efforcé d'améliorer la productivité des souches connues productrices d'acide glutamique selon des techniques de mutation artificielle. On peut citer comme exemples de tels mutants artificiels des mutants de Brevibacterium résistant à la S-(amino-2 éthyl)-cystéine (demande de brevet japonais publiée n 126877/1975), des mutants de Brevibacterium ou Corynebacterium résistant a l'acide fluorocitrique, à l'acide cétomalonique, à l'acide a-amino -hydroxyvalérique, au DLthréonine-hydroxamate, à l'acide amino-2 phospho-3 propionique ou à l'acide amino-5 lévu- linique (demande de brevet japonais publiée n 89045/1979), des mutants de Brevibacterium et de Corynebacterium sensibles au lysozyme (demande de brevet japonais publiée n 122794/1979), des mutants de Brevibacterium et de Corynebacterium ayant une activité réduite d'acide pyruviquedéshydrogénase (demande de brevet japonais publiée n 21762/1980), des mutants de Brevibac- terium ou de Corynebacterium résistant à l'acide glutamique ou à un analogue de l'acide glutamique (demande de brevet japonais publiée n 21763/I980) et des mutants de Brevibacterium résistant à l'acide pyridinedicarboxylique-2,6 (demande de brevet japonais publiée n 21764/1980). La demanderesse a découvert que des mutants du genre Brevibacterium ou Corynebacterium dont la croissance nécessite de l'acide acétique produisent de l'acide L-glutamique avec un rende- ment amélioré, en particulier lorsqu'on les cultive dans un milieu de culture aqueux contenant à la fois un saccharide et un alcool ou acide aliphatique comme source de carbone. L'invention concerne en particulier un procédé pour produire de l'acide Lglutamique qui consiste à cultiver dans un milieu de culture aqueux un mutant du genre Brevibacterium ou Corynebacterium dont la croissance nécessite de l'acide acétique et à récupérer l'acide L-glutamique accumulé dans le liquide de culture. Les mutants utilisés dans l'invention appartiennent au genre Brevibacterium ou Corynebacterium et leur croissance nécessite de l'acide acétique. On peut citer comme exemples de tels mutants: Brevibacterium lactofermentum AJ 11515 (FERM-P 5335, NRRLB-12308), Brevibacterium lactofermentum AJ 11516 (FERM-P 5336, NRRLB-12309), Brevibacterium flavum AJ 11517 (FERM-P 5337, NRRLB- 12310), Corynebacterium acetoacidophilumAJ 11601 (FERM-P 5626, NRRLB-12311), Corynebacterium acetoacidophilum AJ 11602 (FERM-P 5627, NRRLB-12312), et Corynebacterium glutamicum AJ 11603 (FERM-P 5628, NRRLB-12313). Les mutants AJ 11516 et AJ 11602 sont de plus déficients en isocitrate-lyase. Les mutants ci-dessus dérivent respectivement des souches parentes: Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, brevibacterium flavum ATCC 14067, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 et Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. On peut obtenir les mutants de l'invention de façon classique par exemple par irradiation des cellules avec des rayons ultraviolets ou des rayons X, et exposition des cellules à un agent mutagène (tel que la N-méthyl N'nitro N-nitroso guanidine) à partir des souches parentes précitées et d'autres bactéries produc- trices d'acide glutamique appartenant au genre Brevibacterium ou Corynebacterium. On peut citer comme autres exemples de bactéries produisant de l'acide glutamique pouvant être utilisées comme souches parentes: Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066, Brevibacterium divaricatum ATCC 14020, Corynebacterium callunae ATCC 15991 et Corynebacterium lilium ATCC 15990. La culture des mutants de l'invention et de leurs parents dans un milieu contenant de l'acide acétique comme seule source de carbone est illustrée par le tableau I ci-après. On effectue l'expérience de la façon suivante: On prépare un milieu aqueux contenant 0,5 g/dl de glucose, 0,15 g/dl d'urée, 0,15 g/dl de sulfate d'ammonium, 0,3 g/dl de phosphate monopotassique, 0,1 g/dl de phosphate dipotassique, 0,01 g/dl de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,1 mg/dl de chlorure de calcium dihydraté, 10/ug/dl de chlorhy- drate de thiamine, 3/ug/dl de biotine, 0,44 mg/dl de tétraborate disodique décahydraté, 4,85 mg/dl de chlorure ferreux hexahydraté, 1,95 mg/dl de sulfate cuivrique pentahydraté, 0,185 mg/dl de Mo7024(NH4)6,4H20, 44 mg/dl de sulfate de zinc heptahydraté, 0,36 mg/dl de chlorure de manganèse heptahydraté et la quantité d'acide acétique indiquée dans le tableau I ci-après et on ajuste le pH à 7,0. On cultive au préalable les micro-organismes étudiés à 31,5 C pendant 24 h da s un milieu à pH 7,0 contenant 1 g/dl de peptone, 1 g/dl d'extrait de levure et 0,5 g/dl de chlorure de sodium et,après avoir mis les microorganismes en suspension dans de l'eau stérilisée, on ensemence des portions de 3 ml du milieu aqueux. On détermine la croissance après 24 h de culture en aérobiose à 31,5 C par mesure de la densité optique à 562 nm des bouillons de culture. On détermine l'activité isocitrate-lyasique des mutants déficients en isocitrate-lyase et de leurs parents; les résultats figurent dans le tableau II ci-après. On détermine l'activité isocitrate-lyasique de la façon suivante: On utilise un milieu à pH 7,0 contenant 2,5 g/dl de glucose, 0,8 g/dl d'acétate d'ammonium, 0,1 g/dl de phosphate monopotassique, 0,1 g/dl de sulfate de magnésium heptahydraté, 1 mg/dl de sulfate de manganèse tétrahydraté, 0,4 g/dl d'urée, 0,3/ug/dl de biotine, 20/ug/dl de chlorhydrate de thiamine et 48 mg/dl (en azote total) d'hydrolysat acide de protéine de soja, On introduit des portions de 20 ml de ce milieu dans des flacons à agitation de 500 ml et on stérilise par chauffage. On ensemence le milieu avec les souches à étudier et on cultive à 31,5 C en agitant jusqu'au début de la phase de croissance exponentielle (durée de culture: 10 à 16 h). On sépare les cellules, on lave et on traite par des ultrasons. On sépare la fraction protéique (préparation enzymatique) avec du Sephadex G-10. On détermine l'activité isocitrate-lyasique des préparations enzymatiques selon la technique décrite dans "Journal of Biochemistry", 49, 262 (1961). Les milieux utilisés pour la culture-précitée sont classiques en soi, si ce n'est qu'ils contiennent une substance nutritive satisfaisant au besoin d'acide acétique, une source de carbone, une source d'azote, des ions minéraux etlorsqu'il est nécessaire, des substances organiques nutritives secondaires. Les substances nutritives satisfaisant au besoin d'acide acétique sont un acide aliphatique tel que l'acide acétique, l'acide propio- nique, l'acide palmitique et l'acide stéarique ou un alcool alî- phatique tel que l'éthanol et le propanol. La substance nutritive satisfaisant au besoin d'acide acétique peut également être utilisée comme source de carbone. On peut obtenir le meilleur résultat lorsque la substance nutritive satisfaisant au besoin d'acide acétique est utilisée comme source de carbone avec un saccharide tel que le glucose, le fructose et le saccharose, et des matières brutes contenant un tel saccharide (tel qu'un hydrolysat d'amidon, un hydrolysat de cellulose, un jus de fruit, la mélasse de canne à sucre, la mélasse de betterave et le petit-lait de soja). Lorsqu'on utilise ensemble un saccharide et un alcool ou acide aliphatique comme sources de carbone, on les ajoute au milieu à raison de 2 à 3 parties en poids du saccharide pour 2 à 1 partiesen poids de l'alcool ou de l'acide aliphatique. - Comme sources d'azote, on utilise des sources clas- siques telles que des sels d'ammonium, l'ammoniaque, l'ammoniac gazeux et l'urée. Lorsqu'il est nécessaire, on peut ajouter des ions minéraux tels que des ions phosphates et des ions magnésium. On peut ajouter au milieu, s'il en manque, des substances orga- niques secondaires telles que la thiamine et la biotine. Lorsque le milieu contient des quantités excessives de biotine, on utilise de façon classique un agent antibiotine tel que le polyoxyéthylène- sorbitanne-monopalmitate eL la pénicilline. On effectue la culture en conditions aérobies. Les valeurs appropriées de la température et du pHli de culture sont respectivement de 27 à 37 C et de 6 à 9. On peut récupérer selon des procédés connus l'acide L-glutamique ainsi accumulé dans le milieu de culture. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. EXEMPLE 1 On prépare un milieu aqueux contenant 2,3 g/dl de glucose, 1 g/dl d'acétate d'ammonium, 1 g/dl d'acétate de sodium, 0,1 g/dl de phosphate monopotassique, 0,1 g/dl de sulfate de magnésium heptahydraté, 20/ug/dl de chlorhydrate de thiamine, 0,6 g/dl d'urée, 1 mg/dl de sulfate ferreux heptahydraté, lmg/dl de sulfate de manganèse tétrahydraté, 36 mg (en azote total)/dl d'hydrolysat acide de protéine de soja et 2/ug/1 de biotine et on ajuste le pH à 7,0. On répartit des portions de 20 ml du milieu aqueux dans des flacons à agitation de 500 ml et on stérilise à C pendant 10 min. On ensemence les milieux avec les micro- organismes indiqués dans le tableau III ci-après et on cultive en agitant à 31,5 C. Pendant la culture, on ajuste le pH entre 6,5 et 8,0 avec de l'urée à 45 g/dl et de l'acide sulfurique 2 N. On arrête la culture après 36 h et on calcule le rendement en acide L-glutamique accumulé dans le milieu. Les résultats figurent dans le tableau III ci-après. Le rendement en acide L-glutamique est le rapport de la quantité d'acide L-glutamique produit dans le milieu de culture a la quantité de la source ou des sources de carbone utilisée. EXEMPLE 2 On prépare un milieu aqueux contenant 5,6 g (en sucre)/dl de mélasse de canne à sucre, 1,4 g/dl d'acide acétique, 0,2 g/dl de phosphate monopotassique, 0,1 g/dl de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,05 g/dl de sulfate d'ammonium, 1 mg/dl de sulfate de manganèse tétrahydraté, 1 mg/dl de sulfate ferreux heptahydraté, 3/ug/1 de biotine, 36 mg (en azote total) d'hydrolysat acide de protéine de soja et 200/ug/1 de chlorhydrate de thiamine. On introduit des portions de 300 ml du milieu aqueux dans des fermen- teurs de 1,5 litre et on chauffe à 120 C pendant 15 min pour stériliser. On ensemence les milieux avec les micro-organismes indiqués dans le tableau IV ci-après préalablement cultivés et on cultive à 31,5 C en maintenant le:pH à 7,8, en conditions aérobies. Lorsque la densité optique à 562 nm d'une dilution au 1/26 du milieu atteint 0,3, on ajoute du polyoxyéthylène-sorbitanne- monopalmitate pour obtenir une concentration de 0,2 g/dl dans le - milieu. On maintient la concentration en acide acétique du milieu entre 0, 1 et 0,5 g/dl par introduction d'une solution contenant 17 g (en sucre) /dl de mélasse de canne à sucre, 15 g (en acide acétique)/dl d'acétate d'ammonium, 15 g/dl d'acide acétique et 13 g (en acide acétique)/dl d'acétate de sodium. Lorsqu'on poursuit la culture pendant 48 h, on obtient de l'acide Lglutamique avec le rendement indiqué dans le tableau IV ci-après. EXEMPLE 3 On prépare un milieu aqueux contenant 1 g/dl de glucose, 0,5 g/dl d'éthanol, 0,1 g/dl de phosphate monopotassique, 0,1 g/dl de sulfate de magnésium heptahydraté, 1 mg/dl de sulfate de manganèse tétrahydraté, 1 mg/dl de sulfate ferreux heptahydraté, 3/ug/1 de biotine, 1,0 g/dl de sulfate d'ammonium, 96 mg (en azote total)/dl d'hydrolysat acide de protéine de soja et 200/ug/1 de chlorhydrate de thiamine. On introduit des portions de 30 ml de ce milieu aqueux dans des flacons à agitation de 500 ml et on chauffe à 115 C pendant 10 min pour stériliser. On cultive les micro-organismes indiqués dans le tableau V ci-après dans le milieu à 31,5 C en agitant. Pendant la culture, on ajoute au milieu 4, 2 g d'une solution contenant 30 g/dl de glucose, 15 g/dl d'éthanol et 15 g/dl de sulfate d'ammonium lorsque la concentration en éthanol du milieu devient inférieure à 0,5 g/dl. On effectue deux fois cette addition. 2 4 726 10 On arrête la culture après 36 h. Les résultats figurent dans le tableau V ci-aprés. Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limi- tatifs sans sortir du cadre de l'invention. 801c ú6'0 zS'O 8Z'0 0 ú0911 rV '! 80! L0'1 S0'1 90'T zú0O1 DDLV LO 1 06c0 8Ec0 OZ'0 0 Z09TI rV 'C Z6'0 OV'0 SZ'00 0 091T rV Lú0'c1 80oC O0'c1 0'OC 08OL DO.V C1 88C0 09'0 SZc0 0'0c LIITI rV 'I 90 80 ' 80'T 80'I L90T DDZV Z0 c1T 60 oVCo 6ZC0 0 91SIT rV 00'1 06'0 úV TABLEAU II Souche étudiée Activité spécifique Activité relative (%) à E/mg de protéines ATCC 13869 18,4 100 AJ 11516 0 0 ATCC 13870 23,0 100 AJ 11602 O 0 a r1j J- 01% as O LiSçi rl "S7'8 /-.L9091 DD.V 19 915ll rV LS SI II rv 9'1',698ú1 DD'V L ú0911 L'V ú9 ZúOúl DD:V 19 Z09TI rv 9 10911 rV Là+/ OLT8ú1 DD.V (X) anbmeinlg-'I epTop ue luuemopua- ppniq aUmsTuESio-oaotIw III fin v a Il V cJ (CI o TABLEAU IV Micro-organisme étudié Rendement en acide L-glutamique (%) ATCC 13870 48 AJ 11602 62 ATCC 13869 47 AJ 11516 62 F- 4. pls TABLEAU V Micro-organisme étudié Rendement en acide L-glutamique (%) ATCC 13869 53 AJ 11516 63 ATCC 13870 52 AJ 11602 63 b-' N- -NS o0% ( 24726 10 R E V E N D I C A T I 0 N S 1. Procédé pour produire de l'acide L-glutamique par fermentation, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver en aérobiose un mutant producteur d'acide L-glutamique du genre Brevibacterium ou Corynebacterium dont la croissance nécessite de l'acide acétique et à récupérer l'acide L-glutamique accumulé dans le liquide de culture. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de culture aqueux contient comme sourcesde carbone à la fois un saccharide et un alcool ou acide aliphatique. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit saccharide est le glucose, le fructose ou le saccharose ou une matière brute contenant un tel saccharide. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la matière brute est un hydrolysat d'amidon, une mélasse de canne à sucre ou une mélasse de betterave. 5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'alcool aliphatique est l'éthanol ou le propanol. 6. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'acide aliphatique est l'acide acétique, l'acide propionique, l'acide palmitique ou l'acide stéarique. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le milieu de culture aqueux contient comme sources de carbone de l'acide acétique et de l'hydrolysat d'amidon. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le milieu de culture aqueux contient de l'acide acétique et de la mélasse de betterave. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le milieu de culture aqueux contient de l'acide acétique et de la mélasse de canne à sucre. 10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mutant est de plus déficient en isocitrate-lyase. 2472610O 11. Mutant producteur d'acide L-glutamique du genre Brevibacterium ou Corynebacterium, caractérisé en ce que sa croissance nécessite de l'acide acétique. 12. Mutant producteur d'acide L-glutamique selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il est de plus déficient en isocitrate-lyase. 13. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise le saccharide et l'alcool ou acide aliphatique servant de sources de carbone dans un rapport de 3 à 2 parties en poids du saccharide pour 2 à 1 partiesen poids d'alcool aliphatique ou d'acide aliphatique.