Brevet FR2473523A1 — publié le 19810717

L'invention concerne un procédé de séparation de l'al- bumine et d'une guin. Plus précisément, elle concerne un procédé de sépara- tion de l'albumine et d'une I ques, par filtration de la solution sur une membrane semi- perméable. Les protéines du sérum sanguin d'un humain ou d'autres mammifères sont principalement constituées d'albumine ayant une masse moléculaire d'environ 7 x 104 et d'une line ayant une masse moléculaire d'environ 1,6 x 10. Ces deux protéines représentent au moins environ 70 % des protéi- nes totales de sérum sanguin. Ces protéines sont fractionnées, et par exemple des fractions de protéinesdu sérum sanguin hu- main sont utilisées pour des applications médicales. Comme procédés de fractionnement des protéines de sérum sanguin, on a jusqu'à présent adopté un procédé de relargage, un procé- dé de précipitation au moyen de l'éthanol ou du polyéthylène glycol froid, et on a récemment développé un procédé de chro- matographie par filtration sur gel et un procédé de chromato- graphie par échange d'ions. Les deux premiers procédés peu- vent entraîner une modification indésirable des protéines de sérum sanguin et l'opération de séparation est très compli- quée. Les deux derniers procédés ne conviennent pas pour un fractionnement à grande échelle. Une membrane semi-perméable peut être avantageusement utilisée pour la séparation de molécules dont les masses mo- léculaires sont très différentes l'une de l'autre, c'est-à- dire pour la séparation de substances macromoléculaires d'a- vec des substances à faible masse moléculaire. C'est ainsi qu'une membrane semi-perméable a été utilisée jusqu'à mainte- nant pour la dialyse. Une membrane asymétrique ayant une capacité relative- ment bonne a été récemment développée, et des membranes semi- perméables de ce type ont été beaucoup utilisées en appliquant une pression comme force d'entraînement de même que dans une filtration ordinaire. Cependant, conformément à ce procé- dé, la séparation de macromolécules ltune de l'autre est sou- vent considérée comme difficile, bien que les masses molécu- laires diffèrent notablement. On pense que cette difficulté est due à une large distribution des dimensions des pores de la membrane. Cependant, la perméabilité des molécules à tra- vers la membrane dépend énormément non seulement de la masse moléculaire, mais également d'autres facteurs ambiants, par exemple la co-existence d'autres protéines et la concentra- tion en ion hydrogène ou la concentration en sel dans la so- lution tamponnée. On a rapporté par exemple la séparation de X -globuline et d'albumine humaines l'une de l'autre au moyen d'une membrane d'acétate de cellulose /voir Oss et al., "Membrane Science and Technology", page 146, (1970), édité par J.E. Flinn/. Conformément à ce procédé, on a réussi à sé- parer l'albumine et les i -globulines dans une solution mix- te artificielle contenant de l'albumine pure et des ( -glo- bulines avec un de leurs dimères, mais il a été impossible de séparer ces protéines dans une solution ne contenant pas de dimère de Y. -globuline ou dans une solution contenant la to- talité du sérum sanguin. L'invention a pour but principal de fournir un procédé de séparation de l'albumine sérique et d'une t'-globuline l'une de l'autre en utilisant une membrane semi-perméable, grâce à quoi l'albumine et une Y -globuline peuvent être sé- parées avec une meilleure efficacité. L'invention a également pour but de fournir un procédé de séparation de l'albumine sérique et d'une '-globuline sérique l'une de l'autre dans un système en solution ne con- tenant pas de dimère de la Y-globuline, en utilisant une membrane semi-perméable. L'invention a encore pour but de fournir un procédé de séparation de l'albumine sérique et d'une 1 -globuline sé- rique l'une de l'autre dans une solution contenant la totalité du sérum sanguin, en utilisant une membrane semi-perméable. Enfin, l'invention a pour but de fournir un procédé de séparation de l'albumine sérique et d'une i -globuline sé- rique l'une de l'autre dans une solution contenant ces protéi- nes sériques à une concentration élevée en utilisant une mem- brane semi-perméable. D'autres buts et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description ci-après. Conformément à l'invention, on fournit un procédé de séparation de l'albumine sérique et d'une -globuline séri- que l'une de l'autre dans une solution d'un mélange de ces substances, en utilisant une membrane semi-perméable, carac- térisé en ce qu'on effectue une ultrafiltration en utilisant comme membrane semi-perméable une membrane pour ultrafiltra- tion ayant une limite supérieure de séparation des masses mo- léculaires d'environ 100 000, en ajustant la concentration totale en protéines et la concentration saline de la solution à une valeur au plus égale à 4 g/dl et 0,6 mole/i respective- ment, et en ajustant également le pH de la solution à une va- leur comprise entre environ 3,8 et 4,7. La figure 1 des dessins annexés représente JLes chroma- togrammes obtenus par chromatographie en phase liquide d'une solution de protéines de sérum sanguin (A) utilisée dans un mode de mise en oeuvre de l'invention et des solutions de pro- téines (B) et (C) fractionnées à partir de la solution de pro- téines de sérum sanguin conformément à l'invention; Les figures 2 et 3 des dessins annexés représentent des diagrammes illustrant l'influence de la concentration en ion hydrogène et de la concentration en sel dans une solution de protéines de sérum sanguin, respectivement, sur le fraction- nement de la solution de protéines de sérum sanguin; et La figure 4 des dessins annexés représente les chroma- togrammes obtenus par chromatographie en phase liquide d'une solution de protéines de sérum sanguin (A) utilisée dans un autre mode de mise en oeuvre de l'invention et d'une solution de protéines (B) fractionnée à partir d'une solution de pro- téines de sérum sanguin conformément à l'invention. Une membrane composée d'un polyéther sulfone aromati- que ayant des unités récurrentes représentées par la formule suivante {Y0s-à "o4 or dans laquelle R1 et R2 représentent chacun un atome d'hydro- gène ou un groupe alkyle ayant de 1 à 2 atomes de carbone, est particulièrement préférée comme membrane semi-perméable utilisée dans l'invention, et cette membrane a une limite su- périeure de passage des masses moléculaires d'environ 100 000. La limite supérieure de passage des masses moléculai- res des membranes semi-perméables varie en fonction de la forme et de la configuration de la molécule à fractionner et de l'atmosphère dans laquelle la molécule est placée, et par conséquent la limite supérieure de passage des masses mo- léculaires des membranes semi-perméablesne peut pas toujours être déterminée avec précision. Par "membrane semi-perméable ayant une limite supérieure de passage des masses moléculai- res d'environ 100 000", on entend une membrane semi-perméable capable de fractionner des molécules sphériques, telles que des protéines, ayant une masse moléculaire comprise entre en- viron 50 000 ou 60 000 et 140 000 ou 150 000, comme dans le cas de membranes commercialisées ayant une limite supérieure de passage des masses moléculaires d'environ 100 000. L'épaisseur de la membrane semi-perméable utilisée dans l'invention n'est pas critique, mais peut normalement être comprise entre environ 40 et 400 microns, comme dans un cas classique. Le degré de polymérisation de la polyéther sulfone aromatique utilisée pour la préparation de la membrane semi- perméable selon l'invention n'est pas critique, mais peut nor- malement être compris entre environ 500 et 10 000 comme dans le cas de membranes semi-perméables de polyéther sulfone aro- matique classiques. Dans le procédé selon l'invention, on peut utiliser des membranes composées d'un matériau autre que la polyéther sulfone aromatique mentionnée ci-dessus, mais ces membranes présentent des défauts par rapport à la membrane de polyéther sulfone aromatique eu égard à l'efficacité de séparation, et sont en outre malencontreusement sujettes à un colmatage. Il est donc préférable d'utiliser une membrane semiperméable composée de la polyéther sulfone aromatique mentionnée ci- dessus. Dans le procédé selon l'invention, la filtration peut être conduite comme dans le cas d'une filtration sur membrane semi-perméable classique, par exemple à une vitesse d'environ 0,1 à 20 l/m h, valeur en aucune façon limitative. La pres- sion de filtration peut être de préférence de l'ordre de 9,8 x 103 à 490 x 103 Pascal. Dans le procédé selon l'invention, la concentration totale en protéines dans la solution contenant l'albumine sé- rique et une Y -globuline à séparer est ajustée à environ 4 g/dl au plus. Si la concentration totale en protéines dépas- se ce taux critique, il en résulte souvent un colmatage de la membrane et la séparation devient difficile. Le pH de la solution du mélange de protéines de sérum sanguin est ajusté à une valeur de pH de 3,8 à 4,7 environ, de préférence de 3,9 à 4,3. Si la valeur du pH dépasse envi- ron 4,7 la perméation de l'albumine est drastiquement réduite et la séparation ne peut pas avoir lieu avec une efficacité élevée. Lorsque la valeur du pH de la solution est inférieure à 3,8 environ, il y a un risque de modification de l'albumine. En outre, la concentration en sel dans la solution est ajus- tée à une valeur au plus égale à environ 0,6 mole/l. Si la concentration en sel dépasse ce taux critique, la séparation ne peut pas avoir lieu. Plus la concentration en sel est fai- ble, meilleurs sont les résultats obtenus, dans la mesure o les protéines sont présentes à l'état dissous dans la so- lution. Normalement, la concentration en sel peut être d'au moins 0,001 mole/l. Quant aux sels contenus dans la solution, ce peut ê- tre des sels physiologiquement acceptables tels que le chlo- rure de sodium ou des sels contenus de façon inhérente dans le sérum. Dans le procédé selon l'invention, on peut utiliser diverses solutions de protéines de sérum sanguin contenant de l'albumine et une - -globuline, et l'état des solutions nt est pas spécialement critique. Par exemple, une solution pré- parée en diluant le sérum sanguin total avec de l'eau pure ou une solution tampon et d'autres solutions contenant de l'albumine et une 'C - globuline peuvent être utilisées dans l'invention. De plus, on peut utiliser non seulement le sé- rum sanguin humain, mais également des sérums de bovins, d'é- quins et de porcins pour une séparation selon le procédé de l'invention. Conformément à l'invention, la séparation de l'albumi- ne et d'une Y -globuline dans le sérum sanguin total, l'une de l'autre ou d'avec d'autres fractions, qui était impossible selon les techniques classiques, peut se faire très facilement. De plus, dans le procédé de l'invention, la présence d'un di- mère de la paration de l'albumine et de la procédé de l'invention est avantageux par rapport aux procé- dés classiques de fractionnement des-protéines de sérum san- guin, car l'opération est très simple et la précision de la séparation est très élevée; le procédé selon l'invention est donc approprié à des séparations à grande échelle. Si les conditions de perméation sont convenablement ajustées, une albumine sérique et une IC -globuline, ayant chacune une pure- té désirée, peuvent être obtenues sous la forme de solutions de concentration désirée et éventuellement en continu. L'invention sera maintenant décrite en détail à l'ai- de des exemples non-limitatifs suivants. Dans les exemples, les chromatogrammes en phase liqui- de des solutions de protéines de sérum sanguin sont obtenus au moyen d'un chromatographe en phase liquide fabriqué et commercialisé sous la marque "HLC-802UR" par Toyo Soda Manu- facturing Co. Ltd. Une colonne G-3000 SW (fabriquée par Toyo Soda Manufacturing Co. Ltd) est utilisée comme colonne et une solution de tampon au phosphate 1,15 M, ayant un pH de 6,8, est utilisée comme éluant. Pour détecter les protéines, on a recours à l'absorption ultraviolette à une longueur d'on- de de 254 nm. Le pourcentage de rejet (R) dont il est ques- tion dans les exemples; est défini par la formule suivante: R() = concentration dans le filtrat)x R(%) = (1 -...._______________________) xlOO concentration dans la solution chargée EXEMPLE 1 Dans 100 ml de N-méthyl-2-pyrrolidone, on dissout 15 g d'une polyéther sulfone (marque déposée: "P-1700", fabriquée par Union Carbide Corporation) ayant des unités récurrentes représentées par la formule suivante: O (H3 0 ! ! 3 O -- On verse la solution résultante en une épaisseur d'environ microns sur une étoffe non-tissée de polyéthylène, puis on plonge le non-tissé dans l'eau maintenue à 15 C pour coa- guler le polymère afin d'obtenir une membrane de polyéther sulfone asymétrique. La limite supérieure de passage des mas- ses moléculaires de cette membrane est d'environ 100 000. Le pourcentage de rejet de la membrane pour une solution d'al- bumine de sérum sanguin de bovins dans une solution de tampon au phosphate 1/15 M, ayant une valeur de pH de 6,8 et une concentration en albumine de 0,1 %, est d'environ 80 %. On dilue un-sérum de sang de bovin dont les substances macromoléculairesinsolubles ont été éliminées par séparation centrifuge, avec de l'eau pure de façon que le volume repré- sente environ 5 fois le volume original, afin de former une solution ayant une concentration en protéinesd'environ 1,5 % en poids et une concentration en sel d'environ 0,04 mole/l. On ajoute de l'acide acétique à la solution pour ajuster la valeur du pH à 4,1. Puis, on introduit 50 ml de la solution dans une cellule pour ultrafiltration de type à agitation, équipée d'une membrane de polyéther sulfone mentionnée ci- dessus, d'une forme circulaire, ayant un diamètre effectif de 43 mm et on effectue la filtration sous une pression de 49 x 103 Pa jusqu'à ce que le volume de la solution dans la cellule soit réduit à 10 ml. On analyse la solution chargée et le filtrat obtenu par chromatographie en phase liquide et on obtient les chromatogrammes représentés sur la figure 1, o (A) représente le chromatogramme de la solution chargée et (B) le chromatogramme du filtrat. Sur ces chromatogrammes, a indique le pic de la i -globuline et b indique le pic de l'albumine. On voit que la - globuline n'est pratiquement pas présente dans le filtrat. Puis a la solution restée dans la cellule dont le volume est de 10 ml, on ajoute 4,0 ml d'u- ne solution tampon d'acétate ayant une valeur de pH de 4,1 et une concentration en sel de 0,2 mole/l et on applique de nouveau une pression, puis on condense la solution jusqu'à ce que le volume soit réduit à 10 ml. On répète 5 fois cette opération au total. On analyse finalement la solution rete- nue sur la membrane par chromatographie en phase liquide et on obtient le chromatogramme de la figure 1 (C). On voit que l'albumine est pratiquement éliminée. EXEMPLE 2 On utilise une membrane d'un matériau semblable à ce- lui de la membrane utilisée dans l'exemple 1, qui a pratique- ment la même capacité que la membrane de l'exemple 1 et on traite le même sérum sanguin de bovin que dans l'exemple 1. On fait varier la valeur du pH et la concentration en sel pour déterminer l'influence de ces facteurs sur la perméa- bilité. L'influence de la valeur du pH (la concentration en sel étant fixée à 0,2 mole/1) est montrée sur la figure 2, et l'influence de la concentration en sel (la valeur du pH étant ajustée à 4,1) est montrée sur la figure 3. Comme sel à ajouter, on utilise NaCl. D'après les résultats illustrés sur les figures 2 et 3, il est évident qu'on obtient des sé- parations satisfaisantes lorsque la valeur du pH est ajus- tée entre 3,8 et 4,7, en particulier entre 3,8 et 4,3, et que la concentration en sel ne dépasse pas 0,6 mole/l. EXEMPLE 3 Dans 100 ml de diméthylacétamide, on dissout 16 g d'u- ne polyéther sulfone aromatique ayant des unités récurrentes représentées par la formule suivante o On verse la solution en une épaisseur de 200 microns sur une étoffe non-tissée en polyéthylène et on plonge le nontissé dans l'eau pour coaguler la solution coulée et obtenir une membrane pour ultrafiltration ayant une limite supérieure de passage des poids moléculaires d'environ 100 000. Le pourcen- tage de rejet de la membrane vis à vis de l'albumine dans une solution à 0,2 % en poids tamponnée avec un phosphate 0,15 M ayant une valeur de pH de 6,8 est de 55 %. On dilue un sérum sanguin humain avec de l'eau pure de façon que le volume atteigne 30 fois le volume original pour former une solution ayant une concentration en sel de 0,01 mole/l. On ajoute à la solution de l'acide acétique pour ajuster la valeur du pH à 4,2. Puis, on soumet la solution à l'opération de séparation selon le procédé décrit dans l'e- xemple 1, en utilisant la membrane pour ultrafiltration de polyéther sulfone aromatique mentionnée ci-dessus, toutes les autres conditions restant pratiquement les mêmes. La concentration en albumine dans le filtrat est de % par rapport à la concentration dans la solution chargée, et on n'observe pas de perméation de i -globuline. EXEMPLE 4 On effectue l'opération de séparation et l'analyse tel que décrit dans l'exemple 1, si ce n'est qu'on utilise comme membrane semiperméable une membrane commerciale ayant une li- mite supérieure de passage des masses moléculaires de 100 000 et composée d'un copolymère d'acrylonitrile/chlorure de viny- le ("'Diaflo XM-l00", fabriquée par Amicone Co. Ltd.). Toutes les autres conditions sont pratiquement les mêmes que dans l'exemple 1. Le filtrat contient environ 5 % de l'albumine présente dans la solution chargée. Mais, le débit du filtrat diminue progressivement dans le temps. EXEMPLE 5 On dilue un sérum de sang humain avec une solution de tampon d'acétate ayant une valeur de pH de 4,2 et une concen- tration en sel de 0,2 mole/h de sorte que le volume atteigne fois le volume original afin d'obtenir une solution ayant une concentration en sel de 0,2 mole/l. On filtre alors la solution sur un papier filtre et un micro-filtre ayant un diamètre de pores de 0,45 microns. On sépare la solution de sérum sanguin obtenue en utilisant une membrane commerciale composée du même matériau que la membrane semiperméable utili- sée dans l'exemple 1. La limite supérieure nominale de pas- saae des masses moléculaires de la membrane utilisée est de 100 000. Plus précisément, on condense 50 ml de la solution de sérum sanguin sous une pression de 49 x 10 Pa pour réduire le volume au l/5ème et au concentrat résiduel on ajoute 40 ml de la solution de tampon ci-dessus. On répète cette opération 6 fois au total. Les quantités d'albumine et de i globuline dans la solution résiduelle sur la membrane sont respective- il ment de 8 et 98 % des quantités originales. EXEMPLE 6 On dissout 5 g d'une seconde fraction de sérum de sang humain obtenue par le procédé au polyéthylène glycol IA. Pol- son et al, Biochem. Biophys. Acta 82, 463 (1964) 7 dans un li- tre d'une solution aqueuse de tampon d'acétate ayant une con- centration en sel de 0,2 mole/i et une valeur de pH de 4,0. On analyse la solution obtenue par chromatographie en phase liquide et on obtient le chromatogramme représenté sur la fi- gure 4(A). Le principal constituant de la solution est la Y -globuline (fraction a), mais de grandes quantités de macro- molécules et d'albumine (fraction b)sont présentes. Sur une cellule de type à écoulement en couche mince ("TC-10" fabriquée par Amicone Co. Ltd.), on fixe une mem- brane semiperméable semblable à celle utilisée dans l'exemple 3, ayant un diamètre de 9 cm, et on effectue une filtration, à rétention de volume constante, de 500 ml de la solution ci- dessus en utilisant cette cellule. Plus précisément, on rem- place la quantité de filtrat par une quantité correspondante d'une solution de tampon d'acide acétique à 0,5 % ayant une concentration en sel de 0,2 mole/i et une valeur de pH de 4,0 de façon à avoir toujours 500 ml de la solution dans la cel- lule. Après avoir conduit cette opération en continu pendant environ 5 heures, on obtient 1,5 1 de filtrat environ. On ana- * lyse la solution restant dans la cellule par chromatographie en phase liquide afin d'obtenir le chromatogramme représenté sur la figure 4 (B). On voit que la majeure partie de l'albu- mine est éliminée. REVEND ICATI ONS 1 - Procédé de séparation d'albumine sérique et d'une -globuline sérique l'une de l'autre dans une solution d'un mélange de ces substances en utilisant une membrane semiper- méable, lequel procédé consiste à forcer la solution au me- lange de protéines de sérum sanguin à travers une membrane pour ultrafiltration ayant une limite supérieure de passage des masses moléculaires d'environ 100 000, -en ajustant la concentration totale en protéines et la concentration en sel dans la solution du mélange à 4 g/dl au plus et 0,6 mole/1 au plus respectivement, -et en ajustant également le pH de la solution à une valeur comprise entre environ 3,8 et 4,7. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la-membrane pour ultrafiltration est composée d'un polyéther sulfone aromatique ayant des unités récurrentes représentées par la formule suivante &-(OD-S-(D1 ou 0 0R dans laquelle R1 et R2 représentent chacun un atome dthydro- gène ou un groupe alkyle ayant de 1 à 2 atomes de carbone. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le pH de la solution du mélange de protéines de sérum sanguin est ajusté à une valeur comprise entre 3,9 et 4,3. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le sel contenu dans la solution du mélange de protéi- nes de sérum sanguin est au moins un sel choisi parmi le chlorure de sodium et d'autres sels physiologiquement accep- tables.