Brevet FR2463184A1 — publié le 19810220

La présente invention concerne un procédé pour la production d'acide L-glutamique par fermentation. On a produit l'acide L-glutamique par fermentation en utilisant un micro-organisme du genre Brevibacterium ou Coryne- bacterium. Diverses tentatives ont été faites pour améliorer par des techniques artificielles de mutation la productivité des souches productrices d'acide glutamique connues. Des exemples de ces mutants artificiels sont les mutants de Brevibacterium résistant à la S-2aminoéthylcystéine (demande de brevet japonais publiée sans examen n 126 877/1975), les mutants de Brevibacterium et de Corynebacterium résistant & l'acide fluorocitrique, à l'acide céto- malonique, à l'acide c-amino-p-hydroxyvalérique, au DL-thréonine- hydroxamate, à l'acide 2-amino-3-phosphopropionique ou à l'acide aminolévulinique (demande de brevet japonais publiée sans examen n 89 045/1979), les mutants de Brevibacterium et de Corynebacterium sensibles au lysozyme (demande de brevet japonais publiée sans examen n 122 794/1979), les mutants de Brevibacterium et de Corynebacterium ayant une activité réduite d'acide pyruvique-déshydrogénase (demande de brevet japonais publiée sans examen n 21 762/1980), les mutants de Brevibacterium ou de Corynebacterium résistant à l'acide glutamique ou aux analogues- de l'acide glutamique (demande de brevet japonais publiée sans examen n 21 763/1980), et les mutants de Brevibacterium résistant à l'acide 2,6-pyridine-dicarboxylique (demande de brevet japonais publiée sans examen n 21 764/1980), La demanderesse a maintenant trouvé que les mutants du genre Brevibacterium ou Corynebacterium résistant à un inhibiteur respiratoire ou à un inhibiteur de phosphorylation de l'ADP produisent l'acide L-glutamique avec un rendement amélioré. L'invention concerne un procédé pour la production d'acide L-glutamique qui consiste à cultiver dans un milieu de culture aqueux un mutant du genre Brevibacterium ou Corynebacterium, qui est résistant à un inhibiteur respiratoire ou à un inhibiteur de phosphorylation de V'ADP, et à récupérer l'acide L-glutamique accumulé dans le bouillon de culture résultant. Les inhibiteurs respiratoires selon l'invention inhibent, comme il est bien connu, la respiration des micro-organismes et, par conséquent, leur croissance. Les exemples des inhibiteurs respiratoires sont l'acide malonique, le cyanure de potassium, l'azide de sodium, l'arsénite de sodium. Les inhibiteurs de phosphorylation de 1'ADP inhibent la phosphorylation de 1'ADP (adénosine-diphosphate) des micro-orga- nismes et la production d'ATP (adénosine-triphosphate), et donc leur croissance. Les inhibiteurs de phosphorylation de 1'ADP compren- nent les découpleurs qui inhibent la réaction de couplage dans la chaine respiratoire, tels que 2,4-dinitrophénol, hydroxylamine et arsenic, et les inhibiteurs de transfert d'énergie qui inhibent les réactions de transfert d'énergie, tels que la guanidine. Des échantillons des mutants de l'invention sont: Brevibacterium lactofermentum AJ 11426 (PERM-P 5123, NRRL-B 12211) (acide malonique) Brevibacterium flavum AJ 11427 (FERM-P 5124, NRRL-B 12203) (acide malonique) Corynebacterium glutamicum AJ 11441 (FERM-P 5138> NRRL-B 12210) (acide malonique) Brevibacterium lactofermentum AJ 11428 (FERM-P 5125, NRRL-B 12212) (azide de sodium) Brevibacterium lactofermentum AJ 11429 (FERM-P 5126, NRRL-B 12213) (cyanure de potassium) Brevibacterium flavum AJ 11430 (FERM-P 5127, N1RRL-B 12204) (cyanure de potassium) Corynebacterium flutamicum AJ 11431 (FERM-P 5128, NRRL-B 12207) (cyanure de potassium) Brevibacterium lactofermentum AJ i11432 (FERM-P 5129, NRRLB 122 (arsénite de sodium) Brevibacterium lactofermentum AJ 11433 (FERM-P 5130, NRRL-B 122 (2,4-dinitrophénol) 14) ) Brevibacterium flavum AJ 11434 (FERM-P 5131, NRRL-B 12205) (2,4-dinitrophénol) Brevibacterium lactofermentum AJ 11435 (FERM-P 5132, NRRL-B 12216) (chlorhydrate d'hydroxylamine) Corynebacterium glutamicum AJ 11436 (FERM-P 5133, NRRL-B 12208) (chlorhydrate d'hydroxylamine) Brevibacterium lactofermentum AJ 11437 (FERM-P 5134, NRRL-B 12217) (arsenic) Brevibacterium lactofermentum AJ 11438 (FERM-P 5135, NRRL-B 12218) (guanidine) Brevibacterium flavumAJ 11439 (FERM-P 5136, NRRL-B 12206) (guanidine) Corynebacterium glutamicum AJ 11440 (FERM-P 5137, NRRL-B 12209) (guanidine) Les mutants de Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum et Corynebacterium glutamicum sont dérivés des souches mères Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 et Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, respectivement. Brevibacterium divaricatum ATCC 14020, Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 et d'autres bactéries productrices d'acide glutamique des genres Corynebacterium et Brevibacterium peuvent être utilisés comme souches mères. Les souches mères peuvent être traitées pour obtenir les mutants de l'invention de manière classique,par exemple par les rayons ultraviolets et les rayons X ou l'exposition à un agent muta- gène. Par exemple, la souche mère peut être traitée par exposition a 250 y/ml de N-nitro-N'-méthyl-N-nitrosoguanidine à 30 C pendant min. L'action inhibitrice de la croissance des mutants de l'invention et de leurs souches mères en présence des inhibiteurs respectifs auxquels les mutants sont résistants a été déterminée et les résultats sont montrés dans les tableaux I, Il et III ci-après. Comme on peut le voir dans ces tableaux, la croissance des mutants de l'invention est moins inhibée par les inhibiteurs que celle de leurs souches mères. La détermination de la croissance est effectuée de la manière suivante: on stérilise à 120 C pendant 15 min le milieu contenant 1 g/dl d'extrait de levure, 1 g/dl de peptone, 0,5 g/dl de chlorure de sodium et 2 g/dl de gélose à pH 7,0 et on le verse sur des plaques. Les plaques sont inoculées avec les micro-organismes qui ont été cultivés sur tranches de gélose à l'extrait de viande pendant 24 h et mis en suspension dans l'eau stérilisée. La quantité d'inoculum est de 105-10 cellules par plaque. On place sur chaque plaque un disque de papier contenant la quantité d'inhibiteur indiquée dans le tableau. On observe la croissance autour du disque de papier après 16 à 48 h d'incubation des plaques à 30 C.- Dans les tableaux, les symboles "+1", "+" et I"-" signifient que l'on observe autour du disque une bonne croissance, une croissance faible et une croissance rare, respectivement. On détermine l'effet de l'inhibiteur respiratoire sur l'oxydation du NADH chez les mutants et leurs souches mères. Les résultats sont indiqués dans le tableau IV ci-après. On détermine l'activité d'oxydation du NADH de la manière suivante: on maintient à l'abri de l'air des lots de 10 ml du mélange de réaction contenant 500/umoles de tampon au phosphate (pH 7,5), 6/umoles de NADH, un certain volume d'extrait de cellules de la souche essayée et la quantité d'inhibiteur respiratoire indiquée dans le tableau IV ci-après dans des récipients munis d'un détecteur d'oxygène "Beckman model 777", on agite et on maintient à 32 C. On détermine l'activité d'oxydation du NADH d'après la vitesse de diminution de la pression partielle de l'oxygène. On observe que l'activité d'oxydation de l'oxygène chez AJ 11429, AJ 11430 et AJ 11431 est moins réduite par les inhibiteurs indiqués dans le tableau IV ci-après que chez leurs souches mères. L'activité respiratoire et l'activité de phosphorylation de V'ADP du mutant résistant à l'inhibiteur de phosphorylation de l'ADP et celles de leurs souches mères sont déterminées en présence d'un découpleur (tableau V ci-après) ou d'un inhibiteur de transfert d'énergie (tableau VI ci-après). La détermination de l'activité respiratoire et de l'activité de phosphorylation de V'ADP s'effectue de la manière suivante: - Activité respiratoire: On cultive les souches essayées pendant 20 h dans un milieu contenant, par ml, 36 mg de glucose, 2 mg d'urée, 1 mg de KH2P04e 0,4 mg de MgSO4,7H20, 10 y de FeSO4,7H20, 8 y de MnSO4,4H20, 5/ul d'hydrolysat acide de soja, 0,1 y de chlorhydrate de thiamine et 0,0025 y de biotine. On récolte les cellules dans le bouillon de culture résultant, on lave deux fois par NaCl à 0,5% et on met en suspension dans un tampon au phosphate 1/15M à pH 7,5. On agite la sus- pension de cellules à 280C pendant 3 h,et on place 0,5 ml de la suspen- sion de cellules restante dans 2 ml d'un mélange de réaction contenant /umoles de tampon au phosphate à pH 7,5, 100/umoles de glucose et la quantité d'inhibiteur indiquée dans le tableau V ou VI ci-après. On.maintient le mélange de réaction à 320C pendant 3 h et on mesure l'absorption d'oxygène au moyen d'un manomètre Warburg. Activité de phosphorylation de 'ADP On sèche à la température ambiante le reste des cellules mentionnées ci-dessus et on les sèche encore dans un exsiccateur au pentoxyde de phosphore sous vide pendant une nuit. On place 50 mg des cellules sèches dans 2 ml d'un mélange de réaction contenant 10/umoles d'ADP, 200/umoles de glucose, 250/umoles de tampon au phosphate, 5/umoles de MgC12,6H20 et la quantité d'inhibiteur indiquée dans le tableau V ou VI ci-après. On maintient le mélange de réaction à 30 C pendant 3 h, puis on le chauffe dans l'eau bouillante pendant 3 min. On détermine colorimétriquement V'ATP formé dans le mélange de réaction. A partir de ces expériences, on observe que l'activité de phosphorylation de I'ADP chez les mutants résistant au découpleur et chez les mutants résistant à l'inhibiteur de transfert d'énergie est moins diminuée par le découpleur ou par l'inhibiteur de transfert d'énergie que chez les souches mères. Les mutants de l'invention sont cultivés pour produire l'acide Lglutamique de manière classique. On effectue la culture en conditions aérobies à une température de 30 à 40 C. Le milieu de culture utilisé dans l'invention contient des sources de carbone, des sources d'azote et des ions inorganiques comme un milieu classi- que. Les sources de carbone préférées sont les hydrates de carbone (saccharose, glucose, fructose et produits bruts contenant des hydrates de carbone, tels que mélasses de canne à sucre, mélasses de betterave et hydrolysat d'amidon), l'acide acétique et l'éthanol. Les sources d'azote préférées sont l'urée, le gaz ammoniac et l'ammoniaque aqueuse. - L'acide L-glutamique ainsi accumulé dans le bouillon de culture résultant peut être récupéré également de manière classique. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 On place dans des flacons de 500 ml sur une secoueuse des lots de 20 ml d'un milieu de culture contenant, par ml, 36 mg de glucose, 2 mg d'urée, 1 mg de KH2P04, 0,4 mg de MgS04, 7HO20 10 y de FeSO4 7H20, 8 y de MnSO 44H20, 0,1 y de chlorhydrate de thiamine, 0,0025 y de biotine et 5/ul d'hydrolysat de protéines de soja et on stérilise à 1150C pendant 10 min. On inocule dans les milieux de culture les micro- organismes énumérés dans le tableau VII ci-après et on les cultive à 31, 50C en culture agitée. Pendant la culture, on introduit dans le milieu de fermentation une faible quantité de solution d'urée (contenant 450 mg d'urée/ml) pour maintenir le pH des milieux de fermentation a 6,5-8,0. Après 30 h de culture, les quantités d'acide L-gluta- mique indiquées dans le tableau VII ci-après sont accumulées dans le milieu. EXEMPLE 2 On prépare un milieu aqueux contenant, par ml, 100 mg de mélasses de canne à sucre (exprimé en sucre), 1,0 mg de KH2P04, 1,0 mg de MESO4,7H20 et 0,1 y de chlorhydrate de thiamine, on ajuste à pH 7,0, on place des lots de 30 ml du milieu dans des fioles de 500 ml et on chauffe pour stériliser. On inocule dans les milieux les micro-organismes énumérés dans le tableau VIII ci-après et on cultive à 31,5 C en culture agitée. Pendant la culture, on ajoute dans le milieu une solution d'urée contenant 400 mg d'urée par ml pour maintenir le pH du milieu à 6,5-8,0. Lorsque la densité optique & 562 m/u d'un échantillon du milieu de culture dilué 26 fois atteint 0,3, on ajoute au milieu 0,5 mg/ml de monopalmitate de polyoxyéthylène- sorbitanne. Après culture pendant 36 h, lesquantités d'acide L-glutamique indiquées dans le tableau VIII ci-après se sont accumulées dans le milieu. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustration et que l'homme de l'art pourra y apporter des modifications sans sortir du cadre de l'invention. TABLEAU I Inhibiteur.dans le disque _______ ______ ______ __Croissance (mg/ml) Acide malonique ATCC AJ ATCC AJ ATCC AJ 13869 11426 14067 11427 13032 11441 i -4i- + + 3 *. I - + - + - + KCN ATCC AJ ATCC AJ ATCC AJ 13869 1429 14067 11430 13032 11431 0.1 + + + + 0,3 h 0,5 0.8 l - NaN3 ATCC AJ 13869 11428 0,01 i 8 + i 0, 1 - - 0.5 - - - Na3 AsO3 i ATCC AJ 13869 11432,: 0,5 - 1 ,0 - l - 0 Ln w w C a o + + -4 4 F w -J C o o i, +* * o W Do I,* b Ici _ IoJ W w _ _w _ I + $ w- w a__ P t-4 C %o H H ro a'. Co I-J r tis 1 + I! 4 4 Fi > w Co _> oo o% O iJ w %.O H H n fi o Il O> O> m 3 I I I +f oO f- > I. C'J I I + + 4a, _ oà C) - I I i i I. I - O z tn Di :j - p- F-à ni p :j ! P;l --t- 4 T A B L E A U IV T A B L E A U V Découpleur Concen- Activité Activité relative ajouté tration déterminée. ATCC Ai ATCC AJ ATCC AJi (mg/ml) 13869 11433 14067 11434 13032 11436 2,4dini- respiration 125 160 145 145 135 140 0,5 L15. 3 4 trophenol tphosphond yla- 0 65 0 70 O 50 t ion ae 1 r-ADP hydroxyla- 1 0 respiration 130 175 120 150 135 160 mine phosphoryla- 0 50 0 65 0 45 tion de 1 ADP. ,. , respiration 130 160 145 160 140 160 arsenic 5,0 phosghovlla- 0 50 0 70 0 45 tion el 1 ADP respiration 100 100 100 100 100 100 néant -phosphoryla-'' niSéant_ _ phosphorla 100 100 100 100 100 i00 I to d iADP T A B L E A U VI concen-l Activité Activitd relative Inhibiteur tration| déterminée AA'3.! AI ATCC A.J (mg/ml) _ 113869 11438 14067 11439 13032 11440 3 respiration 100 110 100 110 100 100 guanidine I. .... .. _ phosphoryla- O 85 15 80 10 75 _tion de 'AD 85 15 80 10 75 respiration 100 100 00 100 100 néant -- phosphoryla- 100 100 100 100 100 tion de I'AD-. '_ _ Inhibiteur ConcenActivité relative d'oxydation du NADH tration ATCC AJ ATCC AJ ATCC AJ ajouté (mg/ml) 13869 11429 14067 11430 13032 11431 Acide I malonique 5 40 70 35 75 20 75 KCN 0,5'1 0 85 0 75 0 65 NaN3 0,05{ 0 50 0 60 0 75 Na3AsO3 1,0 |15 90 25 95 10 80 néant - 1100 1010 0 100 100 100 00 2 4 6 3184 TABLEAU VII Micro-organisme essayé ATCC 13869 ATCC 14067 ATCC 13032 AJ 11426 AJ 11427 AJ 11428 AJ 11429 AJ 11430 AJ 11431 AJ 11432 AJ 11433 AJ 11434 AJ 11435 AJ 11436 AJ 11437 AJ 11438 AJ 11439 AJ 11440 AJ 11441 Acide L-glutamique accumulé (g/l) 16,2 ,0 15.5 17,5 17 0 17,8 17 8 18 2 17,5 18,0 17.5 17.0 18.0 17,2 16,9 18 0 18,0 17.5 17,8 -i 8' os S'tS 6'OS O5'I S ú'OS 6'0S O'-US s O.zs O7t'IT 6úVTT 8úITT 9útTI SEVII Er tri E i7't -1 OEkII út,1 6EII 9Z P 1 L Z f7 Il QV úV _r, úV rv rv eV rV úV úV úV úV Prv rV n(1/m) 9nT-mD mgTuexo-opTss enbrueInIS-q eppay esUQS1U0I-Q1ixIg I I I A fi v a -1 9 y J. RE V E N D I CA TI 0 N S 1. Procédé pour la production d'acide L-glutamique par fermentation, caractérisé en ce que l'on cultive en conditions aérobies dans un milieu de culture aqueux un mutant du genre Brevi- bacterium ou Corynebacterium résistant à un inhibiteur respiratoire ou à un inhibiteur de phosphorylation de V'ADP et on récupère l'acide L-glutamique accumulé dans le bouillon de culture résultant. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit mutant appartient à l'espèce Brevibacterium lactofermentum ou Brevibacterium flavum. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit mutant appartient à l'espèce Corynebacterium glutamicum. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit mutant est résistant à l'acide malonique, à l'azide de sodium, au cyanure de potassium, à l'arsénite de sodium, au 2,4- dinitrophénol, au chlorhydrate d'hydroxylamine, à l'arsenic ou à la guanidine. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit mutant est résistant à un inhibiteur respiratoire ou à un inhibiteur de phosphorylation de V'ADP.