Brevet FR2461719A2 — publié le 19810206

FR 2461719 A2 19810206 FR 7918873 A 19790720 L'invention est relative à une fraction mucopolysaccharidique douée de propriétés biologiques, lui permettant notamment de jouer un rôle régulateur vis-à-vis de la coagulation sanguine. Une telle fraction peut notamment être obtenue à partir de préparations d'héparine, telles qu'extraites de tissus de mammifères. L'invention représente un développement de celle qui fait l'objet de la demande de brevet nO 78 31357 déposée le 6 novembre 1978. On rappellera que l'invention de la demande de brevet principal concerne, dans l'un de ses aspects, une fraction mucopolysaccharidique susceptible d'être obtenue à partir de l'héparine ou de fractions comportant des constituants hépariniques de poids moléculaires s'étageant notamment d'environ 2.000 à 50.000, tels qu'obtenus par extraction à partir de tissus de mammifères.La fraction de la demande de brevet principal est caractérisée en ce qu'elle est soluble dans un milieu hydro-alcoolique (eau-éthanol) ayant un titre de 55-61 GL, en ce qu'elle tend à l'insolubilité dans un milieu eau-éthanol ayant une teneur en alcool plus élevée, en ce qu'elle est insoluble dans l'alcool pur, et en ce qu'elle présente un titre Yin-Wessler et un titre USP qui sont respectivement dans un rapport au moins égal à 2, notamment d'au moins 3, de préférence supérieur à 6. Ces fractions mucopolysaccharidiques donnent lieu à des fractionnements supplémentaires, permettant l'obtention de fractions mucopolysaccharidiques de haute activité spécifique, au niveau du titre Yin-Wessler et présentant des rapports du titre Yin-Wessler au titre USP dépassant 10, voire 16. Le titre de Yin-Wessler est mesuré selon la techni- que de ces auteurs qui est décrite dans 1J. Lab. Clin. Med.", 1976, 81, 298-300. De meme, le titre USP, qui mesure, de façon en soi connue, une intensite de coagulation globale dans des conditions bien déterminées, est bien connu. Pour mémoire, il a été mis en oeuvre de la façon décrite dans la Pharmacopée des Etats-Unis XIX, pp. 229-230 (voir aussi le Second Supplément USP-NF, p. 62, et le Quatrième Supplément USP-NF, page 90, respectivement intitulés "Drug Substances and Dosage Forms" (substances médicamenteuses et modes de dosage)). L'invention de la demande de brevet principal four-nit donc un principe actif particulièrement intéressant par la capacité qu'il a d'inhiber le facteur Xa de façon qui peut être très sélective, capacité qui contraste avec son activité sur la coagulation globale, laquelle peut être maintenue à un niveau très faible. Cette fraction mucopolysaccharidique constitue un principe actif de médicament anticoagulant particulièrement avantageux, dans la mesure où l'on peut à ce JOur admettre que l'inhibition préférentielle d'un facteur activé, intervenant à un stade plus proche de la thrombinoformation, pratiquement en aval et à l'intersection des voies intrinsèque et extrinsèque, est susceptible d'assurer une protection contre les risques d'hypercoagulabilité, équivalente à celle procurée par l'héparine couramment utilisée en thérapeutique, sans cependant, en raison de cette sélectivité d'action, entraîner les mêmes risques hémorragiques que ceux de l'héparine classique.Celle-ci est en effet apte à inhiber non seulement le facteur Xa, mais également d'autres facteurs intervenant tant en amont qu'en aval de celui-ci, à d'autres stades des voies de coagulation, par exemple le facteur IIa. On conçoit que le rééquilibrage in vivo du système de coagulation et de fibrinolyse, lorsque celui-ci tend à se déséquilibrer sous l'effet d'une cause pathologique ou d'une intervention extérieure, par exemple chirurgicale, soit plus facile à réaliser avec un médicament agissant sélectivement sur un facteur spécifique, le facteur X, plus particulièrement au niveau de l'inhibition du facteur Xa, qu'avec un médicament susceptible d'agir de façon non différenciée sur plusieurs facteurs de coagulation à la fois. La demande de brevet principal définit également un procédé pour obtenir une telle fraction mucopolysaccharidique, ce procédé étant caractérisé par - la mise en suspension dans un milieu hydro-alcoolique du type eau-éthanol, ayant un titre compris entre environ 55 et environ 610 GL, de préférence de l'ordre de 580 GL, d'une matière à base d'héparine ou de constituants hépari niques dont les poids moléculaires s'étagent notamment de 2.000 à 50.000, cette matière ayant une teneur réduite en sels minéraux, de préférence inférieure à 1 % en poids, - la séparation de la fraction insoluble et la récupération de la solution contenant la fraction mucopolysaccharidique dissoute, dont elle peut à son tour etre séparée, notam ment par précipitation alcoolique, à partir du susdit mi lieu hydro-alcoolique. La matière première, à partir de laquelle le mucopolysaccharide selon l'invention peut être extrait, peut être constituée par une héparine de qualité pharmaceutique classique, injectable, ou par une héparine brute telle qu'elle est obtenue à l'issue des opérations d'extraction de ce principe actif à partir de tissus ou d'organes de mammifères, notamment de mucus d'intestins ou de poumons, par exemple de porc ou de boeuf. Elle peut encore être constituée par les fractions qui sont normalement écartées (produits de rejet) lors de la purification d'une telle héparine brute, en vue de l'obtention d'une héparine de qualité injectable et d'activité spécifique plus élevée, à condition bien entendu que les produits de rejet de moindre activité spécifique contiennent encore des constituants hépariniques. Il est alors possible, à partir de matières premières de ce type, sensiblement exemptes de protéines, d'acides nucléiques et de sels minéraux, de préférence lorsque des teneurs pondérales de ces derniers sont inférieures à 1 %, d'obtenir par extraction à l'alcool 55-610 GL une fraction mucopolysaccharidique contenant des constituants de faibles poids moléculaires, dont les titres Yin-Wessler et USP sont dans un rapport d'environ 2 à environ 5, notamment de 3 à 5. La demande de brevet principal a également déjà défini des variantes de procédé supplémentaires permettant un enrichissement supplémentaire des fractions traitées en un "produit de fractionnement", dont les titres Yin-Wessler et USP sont dans un rapport encore plus élevé. Selon l'une de ces variantes, on procède à des fractionnements supplémentaires de la fraction mucopolysaccharidique obtenue à l'issue du procédé sus-décrit, par diverses techniques, telles que gel-filtration ou encore précipitation sélective dans un milieu hydro-alcoolique de titre déterminé, en présence de proportions également déterminées d'un sel minéral, tel que le chlorure de sodium. Un fractionnement supplémentaire peut être obtenu par une étape supplémentaire appliquée à ladite fraction mucopolysaccharidique, préalablement remise en solution dans l'eau, étape qui consiste à ajouter à cette solution aqueuse de 1 à 2 volumes d'éthanol et de 10 à 100 g/l de chlorure de sodium et à recueillir, d'une part, le précipité formé également actif et, d'autre part, le contenu restant dissous dans le surnageant, notamment par une nouvelle précipitation alcoolique, et qui constitue un produit de fractionnement dont les titres Yin-Wessler et UMP respectivement sont dans un rapport encore plus élevé que celui relatif à la fraction. initiale, notamment passent d'une valeur de l'ordre de 3 à une valeur de l'ordre de 6 à 8. Selon une autre de ces variantes du procédé selon l'invention, on a obtenu des fractions mucopolysaccharidiques ayant un rapport de titres Yin-Wessler/USP plus élevé par gel-filtration à partir des fractions de première extraction par le milieu hydro-alcoolique 55-61 GL, après remise en solution préalable dans un solvant aqueux, telle qu'une solution NaCl 0,5 M ; tris-HCl 0,1 M ; pH 7,5. Une telle solution peut être passée sur un gel de polyacrylamide et d'agarose, sous forme de perles, sous la désignation commerciale ULTROGEL AcA 44, dont la zone de fractionnement effectif se situe entre des'poids moléculaires effectifs de 4.000 à 60.000 (pour les molécules linéaires). Des fractions mucopolysaccharidiques selon l'invention de la demande de brevet principal , qui ont un rapport de titres Yin-Wessler/USP plus élevé, sont donc encore celles qui passent après élution d'un volume de 2,5 litres, volume mort non compris (le volume mort étant le volume de liquide que peut contenir la colonne de gel, notamment dans les espaces interstitiels entre grains de gel), lorsque la gelfiltration est conduite, sous un débit de 200 ml/heure, dans une colonne ayant un diamètre de 100 mm et une hauteur de 1 m et lorsque la concentration en mucopolysaccharide et le volume de la solution placée sur la colonne ont été respectivement de 50 mg/ml et 37,5 ml. Les fractions les plus actives sont alors contenues dans les 1,5 litres qui passent ensuite. Le contenu des premiers 2,5 litres est en grande partie formé d'héparane-sulfates ou héparitine-sulfates, produits de poids moléculaires élevés et de forte viscosité, qui n'ont pas d'activité anticoagulante. Le passage d'une colonne à une autre colonne de meme longueurmais de section différente suppose la modification du volume de solution (de même concentration) à placer sur l'autre colonne, vis-à-vis du volume placé sur la précédente colonne, dans un rapport égal au carré de celui des sections (ou diamètres) de ces cplonnes, pour que les mêmes fractions soient obtenues dans un volume d'élution de l'autre colonne se trouvant lui aussi dans un rapport avec le volume d'élution correspondant de la précédente colonne sensiblement égal au carré du rapport desdites sections. Enfin, comme on l'a également encore décrit dans la demande de brevet principal, il est possible d'obtenir à partir des fractions ayant des rapports de titres Yin/Wessler/ USP de l'ordre de 6 à 8, par des fractionnements supplementaires, notamment par gel-filtration ou analogue, des fractions mucopolysaccharidiques caractérisées par des rapports de titres Yin-Wessler/USP excédant 10, notamment de l'ordre de 13-16, et ayant des titres Yin-Wessler supérieurs à 130, notamment de 135-160 unités/mg. Il est entendu que les indications de poids moléculaires qui. précèdent (et qui suivent, notamment dans les exemples) découlent des mesures de temps de rétention de solutions ayant une teneur déterminée de matière étudiée, dans des expériences de gel-perméation à travers une colonne de gel, dans des conditions d'élution également déterminées, les logarithmes de ces indications de poids moléculaire étant dans la même relation de proportionnalité vis-à-vis des temps de rétention mesurés susdits, que le sont ceux des poids moléculaires de 4.000, 6.500, 16.000 et 31.000 respectivement, de polystyrène-sulfonates de sodium étalons, notamment ceux commercialisés par la société dite CHROMPACK (Orsay-les-Ulis, France), vis-à-vis de leurs temps de rétention respectifs, mesurés dans un système et sous des conditions de gelperméation identiques. L'invention se propose donc de fournir des fractions répondant davantage encore aux buts que la demanderesse s'était assignée dans la demande de brevet principal, à savoir fournir des principes actifs de médicaments (et les médicaments eux-mêmes) qui permettent de remédier au moins en partie à ces difficultés, notamment qui soient capables de permettre un rééquilibrage éventuel et/ou un contrôle plus aisé, au prix d'une moindre surveillance clinique du système coagulation-fibrinolyse chez des patients affectés d'une pathologie de la coagulation ou ayant subi un traitement, tel qu'une intervention chirurgicale, qui les expose à des risques dthypercoagulabilité. L'invention concerne des fractions mucopolysaccharidiques (cj-après désignées par la référence MPS) exerçant un effet régulateur à l'égard de la coagulation, notamment dans le sens d'un retard à la coagulation, par-la mise en jeu d'actions inhibitrices plus sélectives encore que celles des MPS définies dans la demande de brevet principal, s'exerçant tout particulièrement à l'égard du facteur X activé. L'invention est relative à une fraction mucopolysaccharidique purifiée susceptible d'être obtenue à partir de la fraction mucopolysaccharidique du brevet principal, celleci étant elle-même susceptible d'être obtenue à partir de l'héparine ou de fractions comportant des constituants hépariniques de poids moléculaires de 2.000 à 50.000, tels qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par extraction à partir de tissus de mamifères, cette fraction étant caractérisée en ce qu'elle est soluble dans un milieu hydroalcoolique (eau-éthanol) ayant un titre de 55-610GL, en ce qu'elle tend à l'insolubilité dans un milieu eau-éthanol ayant une teneur en alcool plus élevée, en ce qu'elle est insoluble dans l'alcool pur, et en ce qu'elle présente un titre Yin-Wessler et un titre USP qui sont respectivement dans un rapport au moins égal à 2, notamment d'au moins 3, de préférence supérieur à 6. La fraction de MPS de la présente invention peut plus particulièrement encore être obtenue à partir de l'une ou l'autre des fractions également décrites dans la demande de brevet principal et respectivement caractérisées - en eg aue~;dans une opération de gel-filtration sur colonne de gel de polyacrylamide et d'agarose, sous forme de perles, du type commercialisé sous la désignation ULTROGEL AcA 44, cette fraction passe après élution d'un volume de 2,5 litres, volume mort non compris, lorsque la gel-filtration est conduite, sous un débit de 200 ml/ heure, dans une colonne ayant un diamètre de 100 mm et une hauteur de 1 m et lorsque la concentration en muco polysaccharides et le volume de la solution placée sur la colonne ont été respectivement de 50 mg/ml et 37,5 ml, l'essentiel de cette fraction étant notamment contenu dans les 1,5 litres d'éluat qui passent ensuite ; - par un temps de rétention de l'ordre de 5,7 à 7,5, notam ment de 6,6 à 7,0 minutes dans une colonne, dans un sys tème de gel-perméation sur colonne garnie de silice à gra nulométrie de 10-100 microns, de 250 mm de hauteur et de 9 mm de diamètre, lorsque 50 ul d'une solution de 1,3 mg/ ml de cette fraction dans un tampon Na2S04 0,02 M, ayant été placés sur cette colonne, l'on procède ensuite à l'élution de ladite fraction sous un débit de 3 ml/minute. Il résulte de ce qui précède que la fraction et les produits selon la présente invention se trouvent être contenus dans les différentes fractions qui ont été définies dans la demande de brevet principal et que, à ce titre, ils en possèdent (conjointement avec les autres constituants contenus dans ces fractions) toutes les propriétés. Les fractions selon la présente invention sont caractérisées plus particulièrement encore, d'une part, par une affinité particulière à l'égard de l'antithrombine III se manifestant par leur capacité de se fixer sur cette dernière, notamment dans un système comprenant la mise en contact de ces fractions avec une antithrombine III fixée sur un support, tel que l'agarose, au sein d'un tampon NaCl 0,2 M, tris-HCl 0,05 M pH 7,5 et, d'autre part, par des titres Yin Wessler et USP qui sont dans un rapport (rapport YW/USP) au moins égal à 6, le titre Yin-Wessler lui-même étant au moins égal à 300 UI/mg. Des fractions et composés préférés selon l'invention sont caractérisés par des rapports YW/USP supérieurs à 18, avec une activité Yin-Wessler supérieure à 900. De préférence encore les fractions et composés selon l'invention sont caractérisés par des rapports YW/USP supérieurs à 50. Les composés préférés de l'invention sont caractérisés par des rapports YW/USP supérieurs à 65 avec une activité Yin-Wessler supérieure à 1.300 UI/mg. L'affinité particulière des fractions selon l'invention est à la base du procédé selon la présente invention pour l'obtention de telles fractions, notamment à partir de celles qui ont été définies dans le brevet principal, procédé qui consiste à réaliser une fixation sélective des fractions ou produits de la présente invention sur l'antithrombine III, notamment par la mise en contact des fractions initiales avec l'antithrombine III fixée sur un support, notamment de l'agarose, au sein d'un tampon tel que NaCl 0,2 M, tris-HCl 0,05 M pH 7,5,. puis à éluer la fraction fixée avec un tampon de force ionique plus forte, suffisante pour produire la désorption, notamment un tampon NaCl 2 M, tris HCl 0,05 M. Bien entendu,les matièrespremièresà partir-desquelles les fractions ou les composés de l'invention sont susceptibles d'être obtenus ne sont pas limitées aux fractions qui ont -été définies dans la demande de brevet principal. Ils peuvent être obtenus de toutes autres manières appropriées, notamment à partir des matières premières brutes dont on -a plus haut rappelé la nature et à partir desquelles peuvent être obtenues les fractions définies dans la demande de brevet principal.: L'invention concerne plus particulièrement encore des composés sensiblement homogènes qui paraissent constituer le principe actif essentiel des fractions ayant fait l'objet de la demande de brevet principal et que le procédé selon l'invention qui vient d'être défini permet d'obtenir à un état pratiquement pur. Ces composés sont caractérisés par les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN) réalisés dans les conditions indiquées ci-après et qui font l'objet des figures 4, 5, 7 et 8. Se référant plus particulièrement au spectre de RMN des composés selon l'invention pour le proton CH2 H) réalisé sur des solutions de ces composés dissous dans l'veau deutériée à 35 C avec un rayonnement de 270 mégaherz (MHz), on observe à titre d'élément caractéristique du spectre, des signaux de résonance qui, pour des déplacements chimiques de l'ordre de 4,8 et 5,2 ppm, sont sensiblement plus faibles que le signal de résonance qui est également observé pour un déplacement chimique de l'ordre de 5,4 ppm (référence pour la mesure des déplacements : TSP (sodium 3-triméthylsilyl propionate 2,2, 3,3-d4)). Les signaux observés au niveau des déplacements chimiques de 5,4; 5,2 et 4,8 ppm correspondent aux signaux qui, dans le cas d'une héparine classique étudiée en RMN dans les mêmes conditions, sont respectivement caractéristiques - du proton anomère, en position 1, des motifs glucosamine N-sulfatée de l'héparine (signal G1) ; - du proton anomère en position 1, des motifs acide iduro nique 2-0-sulfaté (signal I1) et - du proton en position 5 des motifs acide iduronique 2-0-sulfaté (signal 15). Dans les héparines classiques, les signaux (G1), (11) et (15) présentent tous trois des intensités du même ordre de grandeur. Pour la commodité du langage, il sera également fait référence ci-après, même en ce qui concerne les fractions ou composés selon l'invention, aux signaux (G1), (I1) et pour désigner les signaux observés en rapport avec les déplacements c mimiques correspondants (que ce soit pour le proton ou pour 1 C) Cette èquivalence au niveau du langage s'éteindra éga- lement aux spectres RMN réalisés dans des conditions et avec des références différentes. Se référant plus particulièrement au spectre de RMN des composés selon l'invention pour le carbone 13 (13C), réalisé sur des solutions de ces composés dissousdans liteau deutériée avec un rayonnement de 20 MHz, on observe à titre d'éléments caractéristiques du spectre (référence pour la mesure des déplacements TM5 (tétraméthylsilane)) - pratiquement l'absence de signal de résonance caractéris tique de la présence de groupes OH sur le carbone primaire (en position 6)des motifs glucosamine contenus dans les fractions mucopolysaccharidiques de l'invention, - des signaux supplémentaires, dans la région des signaux (I1) et (G1), dans des régions correspondant à des déplace ments chimiques de l'ordre de 100 ppm, - un signal (G2) supplémentaire près du signal G2N-sulfaté dans la région 60 ppm - la présence d'un signal de résonance dans la région 75 ppm (auquel normalement ne correspond sensiblement aucun si gnal de résonance dans des spectres de RMN réalisés dans des conditions semblables avec une héparine classique), (les indications de déplacements chimiques sus-indiqués sont appréciéesvis-à-vis du CH3 des groupes N-acétyl glucosamine contenus dans les MPS selon l'invention (région de 25 ppm dans les spectres joints)). Les composés homogènes selon l'invention, à l'état pratiquement purifié, qui présentent toutes les caractéristiques qui ont déjà été définies plus haut, pour ce qui est de leurs activités USP et Yin-Wessler et leurs affinités spécifiques vis-à-vis de l'antithrombine III, sont encore caractérisés en ce qu'ils sont formés par un oligosaccharide homogène présentant encore les caractéristiques supplémentaires suivantes - il comprend de 8 à 12, notamment dix motifs mono-saccharidiques; - toutes les positions primaires des motifs glucosamine de cet oligosaccharide sont sulfatées ; - cet oligosaccharide comporte une unité N-acétyl-glucosamine pour deux unités acide iduronique 2-0-sulfate et pour deux unités N-sulfate-glucosamine, les autres saccharides étant de nature différente et comportant des substituants distincts. Les poids moléculaires de certains au moins des oligosaccharides selon l'invention se situent dans un intervalle d'environ 2.000 à environ 3.000, notamment d'environ 2.500 dans la mesure où il s'agit de décasaccharides. L'invention concerne également des polysaccharides ayant les propriétés générales indiquées ci-dessus, en ce qui concerne plus particulièrement les activités USP et Yin Wessler, d'une part, et l'affinité pour l'antithrombine III, d'autre part, ces fractions ayant un poids moléculaire plus élevé, mais contenant également dans leur structure une partie oligosaccharide répondant aux conditions évoquées cidessus. D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront encore au cours de la description d'exemples de mise en oeuvre de l'invention, notamment avec référence aux dessins dans lesquels - la fig. 1 est un diagramme d'élution schématique d'une fraction conforme à l'invention, à l'occasion de la mise en oeuvre du procédé, également selon l'invention, de sé paration sélective de ladite fraction à partir d'une frac tion contenant également d'autres constituants ; - la fig. 2 est représentative d'un diagramme d'élution caractéristique d'une autre fraction mucopolysaccharide préférée, conforme à l'invention ; - la fig. 3 est le spectre RMN d'une héparine classique pour le proton H ; - les fig. 4 et 5 sont des spectres de RMN pour le proton 1H de différentes fractions conformes à l'invention ;; - la fig. 6 est un spectre de RMN pour le carbone 13 d'une héparine classique utilisée à titre de comparaison ; - la fig. 7 est un spectre RMN pour le carbone 13 d'une fraction conforme à l'invention et - la fig. 8 est un agrandissement d'une partie du spectre de RMN de la fig. 7. EXEMPLE I Matière première Elle est constituée par des sous-produits issus de la fabrication dthéparinate de calcium injectable à partir dthéparinesbrutes, telles qu'elles sont extraites de tissus d'animaux (notamment mucus d'intestins ou poumons de boeuf ou deporc) ou d 'hépa- rines purifiées ou semi-purifiées commerciales. Ces sous-produits contiennent des protéines, des mucopolysaccharides (MPS), notamment héparines, héparanes,héparitines, etc. et, le cas échéant, des acides nucléiques. Ils ont auparavant été dessalés par deux précipitations alcooliques. La matière première type utilisée dans l'exemple qui suit avait les caractéristiques suivantes Poids : 252 kg Titre USP : 82 UI/mg Titre Yin-Wessler :100 UI/mg. On a alors eu recours aux étapes de traitement décrites ci-après. Extraction à l'alcool 580 GL Les 252 kg de matière première sont dispersés dans 6.000 litres d'alcool 580GL, sous agitation violente. On sépare la phase insoluble par décantation et centrifugation. On récupère la fraction soluble par addition de NaCl et d'alcool îO00GL. On obtient Fraction insoluble : 230 kg recyclés en fabrication, Fraction soluble : 20,6 kg (titre USP = 21 UI/mg titre Yin-Wessler = 90 UI/mg). Extraction des bas poids moléculaires de la fraction soluble La fraction soluble dans l'alcool 580GL est dissoute dans 512 litres d'eau (20 volumes). On ajoute 20g/l de NaCl, soit 10,24 kg, puis 1,5 volumes d'alcool 1000GL, soit 768 litres. La fraction précipitée est recueillie, déshydratée à l'alcool et séchée. Poids : 19 kg Titre USP = 22 UI/mg Titre Yin-Wessler = 89 UI/mg. Cette fraction est conservée et sera ultérieurment purifiée et transformée en sel de calcium injectable. Le surnageant de la précipitation à 1,5 volumes est additionné de 1,5 volumes d'alcool, soit 768 litres. La fraction précipitée est recueillie, déshydratée à l'alcool et séchée. Poids : 700 grammes Titre USP = 6 UI/mg, Titre Yin-Wessler = 40 UI/mg. Cette fraction de 700 grammes est un mélange de MPS de bas poids moléculaire, de MPS de haut poids moléculaire peu sulfatés et d'acides nucléiques plus ou moins dégradés. Elimination des acides nucléiques de la fraction de bas poids moléculaire La majeure partie des acides nucléiques est éliminée par précipitation au chlorure de manganèse, de la manière suivante La fraction de 700 grammes est dissoute dans 7 litres d'eau. 1 litre de MnCl2 à 10 % est ajouté sous agitation. Le précipité important formé (constitué des sels de manganèse insolubles des ARN et ADN) est éliminé par centrifugation. Les MPS sont récupérés du surnageant limpide par précipitation à l'alcool. Poids : 480 grammes Titre USP = 8 UI/mg, Titre Yin-Wessler = 54 UI/mg. Isolement des très bas poids moléculaires par gelfiltration Les très bas poids moléculaires sont séparés par gelfiltration sur ultrogel ACA 44. Une colonne de 200 mm de diamètre et 1 m de hauteur permet de traiter 25 grammes. Le diagramme d'élution est du type de celui représenté à la fig. 1. Trois fractions (numérotées de (1) à (3)) sont recueillies. Elles ont les caractéristiques suivantes (pour 25 grammes mis en oeuvre au départ) (1) poids : 16 grammes Titre USP : 12 UI/mg Titre Y.W : 30 UI/mg, (2) poids : 7 grammes Titre USP : 6,5 UI/mg Titre Y.W : 70 UI/m* (3) poids : 2 grammes Titre USP : 2,1 UI/mg Titre Y.W : 60 UI/mg. Chromatographie sur antithrombine III insolubilisée La fraction (3) précédente est soumise à une chromatographie sur antithrombine III fixée sur agarose. Une colonne de 100 ml utilisée actuellement permet de traiter 700 mg de la fraction -(3). L'adsorption se fait en tampon NaCl 0,2 M, tris HCl 0,05 M pH 7,5. L'élution est effectuée par du tampon NaCl 2 M, tris-HCl 0,05 M. La partie non fixée (600 à 650 mg) a un titre USP voisin de 1 à 2 UI/mg et un titre Yin/Wessler de 10 à 20 UI/mg. La partie fixée (10 à 30 mg) a un titre USP de 10 à 20 UI/mg et un titre Yin-Wessler de 1.000 à 1.400 UI/mg. EXEMPLE Il La matière première utilisée provient de sousfractions telles qu'elles sont obtenues à 1occasion de la purification d'une héparine du commerce, en vue de la production d'une héparine injectable. Elle provient notamment en partie du surnageant obtenu par addition de 0,6 à 0,7 volume d'alcool 1000 GL à une-solution aqueuse de l'héparine contenant 10 à 20 g par litre de chlorure de sodium, l'héparine purifiée précipitée étant alors récupérée en vue de purifications. La matière première ici retenue contient également divers résidus de purification de l'héparine, notamment ceux obtenus à l'occasion des précipitations alcooliques, en vue de débarrasser l'héparine injectable des traces de sels minéraux. On ajoute à 10 kg de cette matière première 30 volumes d'alcool 580GL (300 litres). On soumet la suspension à une dispersion et agitation violentes pendant 15 minutes, l'agitation étant encore maintenue de façon énergique pendant 12 heures. On laisse ensuite reposer pendant 48 heures, afin d'obtenir une décantation de la matière première non solubilisée. Le surnageant légèrement trouble est alors repris et clarifié par centrifugation. On ajoute au surnageant (volume de 280 litres) 10 litres d'une solution saturée de chlorure de sodium, puis 1 volume (280 litres d'alcool) 1000 GL. Le précipité obtenu, qui contient la fraction mucopolysaccharidique, est lavé à l'alcool 100 GL, puis séché. On obtient 660 g d'une fraction dont les titres Yin Wessler et USP, respectivement, sont déjà dans un rapport supérieur à 2 (fraction P194HH(A)). On procède encore à un fractionnement supplémentaire de cette fraction, en dissolvant les 660 g dans 13.200 ml d'eau. On ajoute à la solution formée 264 g de chlorure de sodium, puis 1,5 volumes d'alcool 1000GL (19,8 litres). Le produit précipité est recueilli, lavé à l'alcool, puis seché. On obtient 640 g de la fraction P194HH(C) ayant les caractéristiques suivantes - titre USP : 31 UI/mg, - titre Yin-Wessler : 100 UI/mg. Le surnageant contient également des fractions mucopolysaccharidiques actives. Il est alors lui-même additionné de 19,8 litres d'alcool 1000 GL et la suspension formée laissée au repos pendant 24 heures. Le précipité formé est recueilli, lavé à l'alcool 1000 GL et séché. On obtient 6 g d'une fraction dite P194HH(p) ayant les caractéristiques suivantes - titre USP : 7 UI/mg, - titre Yin-Wessler : 46 UI/mg. La fraction P194HH(p) est à nouveau dissoute dans un tampon de tris-HCl 0,05 M, pH 7,5, NaCl 30 g/l, à raison de 50 mg/ml. La solution est soumise à une gel-filtration sur une colonne d'ULTROGEL AcA 44 (Pharmacia K 100/100, volume 7 litres ; hauteur 100 cm ; diamètre 10 cm) sous un débit de 200 ml/heure. Le diagramme d'élution obtenu est schématiquement indiqué à la fig. 1, représentative des variations de la teneur en matière (densité optique DO mesurée à 660 nanomètres) en fonction du volume élué, en litres (1). On recueille, après passage d'un volume de liquide correspondant au volume mort de la colonne, les fractions successives K, J, I, G, F, E, D, C, B et A, dont les volumes sont indiqués par les longueurs des segments d'abscisse correspondants de la fig. 1. Chacune de ces fractions possède les caractéristi ques analytiques qui figurent dans le tableau ci-après. TABLEAU I Caractéristiques des fractions obtenues Rapp@@@ Poids Titre USP Titre anti-Xa N fraction anti-Xa (mg) (UI) (UI) USP A 120 3,7 44,4 12 B 120 4,5 72 16 C 250 6 54 9 D 150 9 135 15 E , 300 9 144 16 F 400 11 143 13 G ' 300 : 11,5 161 14 H 200 13 143 11 I 50 13 91 7 J 200 7 14 2 K 3500 0 0 / On constate que les fractions peuvent être groupées en quatre types a) Les fractions A, B, C, dont les volumes d'élution correspondent, dans le protocole opératoire sus-décrit, essentiellement au quatrième litre élué, dont les titres USP sont -inférieurs à 10 et les titres Yin-Wessler infe- rieurs à 80 ; leurs poids moléculaires sont au plus de l'ordre de 4.000 ; b) Les fractions D, E, F, G, H, dont les titres USP sont inférieurs à 10 et les titres Yin-Wessler très élevés 135 à 161 unités ; ces fractions présentent aussi les rapports de titres Yin-Wessler/USP les plus favorables, de 13 à 16 ; elles sont essentiellement contenues dans le troisième litre d'éluat ; leurs poids moléculaires sont de l'ordre de 4.000 à 10.000, notamment de 4.000 à 8.000 Les fractions A, B et C ci-dessus sont réunies en une fraction unique qui fait alors l'objet d'un fractionnement supplémentaire par fixation sélective sur colonne d'Agarose Antithrombine III, dans les conditions définies dans l'exemple I. On élue la fraction fixée. On obtient la fraction dénommée ci-après P 194HHPA. Elle possède un titre Yin-Wessler de 310 UI/mg et un titre USP de 40 UI/mg. On réunit de même les fractions E et F susdites. On procède de même à la séparation des fractions les plus actives par la technique de fixation-élution sus-définie, au moyen de la colonne d'Agarose-Antithrombine III. On obtient finalement une fractionPî9L'HH ayant un titre Yin et Wessler de 900 UI/mg et un titre USP de 82 UI/mg. On soumet lesdites fractions P 194HHPA et P 194HHPF à l'analyse RMN, pour le proton 1H. On fait de même avec une héparine classique (7021HH). L'analyse est effectuée sur chacun desdits produits, préalablement dissous dans de l'eau deutériée à raison de 14 à 62 mg/0,35 ml, avec un appareil BRUKER, 270 MHz, équipé d'un système de transformée de FOURIER et permettant l'accumulation de spectres. Les déplacements chimiques ont été mesurés par référence au TSF, comme indiqué plus haut. La fig. 3 est représentative du spectre de RMN obtenu avec l'héparine classique. Les fig. 4 et 5 sont de même représentatives des spectres de RMN des fractions P 194HHPF et P 194HHPA. On remarque,par la comparaison des spectres de RMN, que les signaux (I1)et(I5) des fractions selon l'invention sont nettement moins intenses que le signal (G1), alors que ces signaux sont sensiblement de même inensité dans le spectre de l'héparine de référence. EXEMPLE III En appliquant les techniques décrites dans les exemples I et II à autres matières premières, on a obtenu de façon semblable des fractions P.219 HH : titre USP................= 14 UI/mg Titre Yin-Wessler...,....=1350 UI/mg P.225 HH : Titre USP................= 17 UI/mg Titre Yin-Wessler........= = 1320 UIlmg P.231 HH : Titre USP................= 16,2 UI/mg Titre Yin-Wessler........=1400 UI/mg P 194 HH A : Titre USP................ = 82 ui/mg Titre Yin-Wessler = 900 u/mg P 242 HH A : Titre USP................ = 16 ui/mg Titre Yin-Wessler =1800 u/mg P 255 HH A : Titre USP = = 36 ui/mg Titre Yin-Wessler =2145 u/mg On a soumis la fraction P 242HHA à l'analyse RMN, pour le carbone 13 (13C) (fig. 7 et 8). On a fait de même avec l'hé- parine classique de référence 7071HH (fig. 6). L'analyse est effectuée sur chacune des fractions (en solution dans l'eau dentériée à raison de 100 mg dans 1 ml de D20 avec un appareil VARIAN CFT-20, 20 MHz, équipé d'un système de transformée de FOURIER (référence pour la mesure des déplacements chimiques TMS). On remarque - pratiquement l'absence de signal de résonance caractéristi que de la présence de groupes OH sur le carbone primaire (en position 6 des motifs glucosamine contenus dans les fractions mucopolysaccharides de l'invention), - des signaux supplémentaires (non contenus dans le spectre RMN de l'héparine de référence dans la région des signaux (I1) et (G1), dans des régions correspondant à des déplacements chi miques de l'ordre de 100 ppm, - un signal supplémentaire dans la région 60 ppm près du signal (G2), - la présence d'un signal de résonance dans la région 75 ppm (auquel normalement ne correspond sensiblement aucun signal de résonance dans des spectres de RMN réalisés dans des con ditions semblables avec une héparine classique), (les indications de déplacements chimiques sus-indiqués sont appréciées vis-à-vis du CH3 des groupes N-acétyl glucosamine contenus dans les MPS selon l'invention (région de 25 ppm dans les spectres joints N-Ac dans les figures 7 et 8). Les signaux particuliers aux fractions ou composés selon l'invention sont marqués d'un astérique dans les fig. 7 et 8. La fig. 8 comporte également la courbe d'intégration CI,laquelle permet de constater que - le composé étudié est homogène, donc pratiquement pur, - il présente les caractéristiques d'un décasaccharide, - il comporte une unité N-acétyl-glucosamine, pour deux unités acide iduronique 2-O-sulfate et pour deux unites N-sulfate glucosamine. Les fractions selon l'invention sont particulièrement actives in vivo. Des lapins ont reçu 500 UI/kg par voie sous-cutanée. Il s'agit d'une dose importante donnée intentionnellement,les lapins ayant beaucoup plus d'antithrombine que les humainsDn constate que 500 UI Yin et Wessler provoquent dans la deuxième heure chez le lapin une héparinémie de 0,85 UI/ml exprimée en unités anti-Xa, alors qu'il n'y a que 0,15 ml exprimée en TCK (temps de céphaline-kaolin). Comparativement : 500 UI/USP de l'héparinate de calcium normal donnent 0 > 55 Ut/ml exprimée enanti-Xa contre 0,30 UI/ml en TCK. On constate donc que l'action de 500 UI anti-Xa est plus forte que celle de 500 UI USP d'une héparine normale par le dosage de Yin-Wessler. Le résultat est inversé quand on s'exprime en TCK. Les fractions ou composés selon l'invention peuvent être utilisés sous toutes les formes de sels thérapeutiquement utiles, notamment de métaux physiologiquement acceptables (sels de sodium, calcium, magnésium ou sels mixtes).Onpasse éventuellement de l'un à l'autre par le procédé décrit dans la demande de brevet nO 73 13580 déposée le 13 avril 1973, au nom de la demanderesse. Les essais in vitro et in Vivo sont donc tous deux dans le sens- d'une action de la fraction mucopolysaccharidique de l'invention -nettement plus sélective, notamment au niveau de l'inhibition du facteur Xa, que celle de l'héparine de référence. Les fractions mucopolysaccharidiques selon l'invention sont atoxiques. L'administration de 100 mg/kg ntentraîne chez le'lapin aucune réaction toxique et aucun effet pyrogène dans le test de pyrogénicité sur le lapin conforme à la Pharmacopée française. L'invention concerne donc plus particulièrement des fractions mucopolysaccharidiques du type qui vient d'être décrit, ayant notamment une activité d'au moins 700, de préférence au moins 900, et même de façon plus avantageuse encore d'au moins I.WO UI/mg (titre Yin-Wessler). Elle concerne également les préparations pharmaceutiques, ayant des activités semblables, -exemptes de substances pyrogènes, et en association avec des excipients pharmaceutiques.Elle concerne en particulier des solutions concentrées de ces fractions, injectables, stériles, utilisables en thérapeutique pour le contrôle de la coagulation sanguine, de façon particulièrement avantageuse pour la prévention des thromboses ou embolies post-opératoires, ces solutions contenant de 1.000 à 100.000 UI (Yin-Wessler)/ml de la fraction muco polysaccharidique, de préférence de 5.000 à 50.000, par exemple de 25.000 UI/ml, lorsque ces solutions sont destinées à l'injection sous-cutanée ou contenant encore par exemple de 500 à 10.000, par exemple 5.000 unités UI/ml de la fraction mucopolysaccharidique, lorsqu'elles sont destinées à l'injection intraveineuse ou à la perfusion. La fraction mucopolysaecharidique selon l'invention est avantageusement sous forme de sel d'au moins un métal physiologiquement acceptable, tel que le sodium et/ou le calcium. Avantageusement, ces proportions pharmaceutiques sont présentées sous forme de seringues à n'utiliser qu'une fois, prêtes à l'emploi au moment approprié. Les compositions selon l'invention sont particulièrement adaptées au contrôle (préventif ou curatif) de la coagulation sanguine chez l'homme ou l'animal, notamment dans ceux des cas où l'hôte est soumis à des risques d'hypercoagulabilité, plus particulièrement ceux résultant d'une perturbation de la phase extrinsèque susdite, par exemple comme conséquence d'une libération par l'organisme de thromboplastine, par exemple de thromboplastine tissulaire (interventions chirurgicales, processus athéromateux, développement de tumeurs, perturbations des mécanismes de la coagulation par des activateurs bactériens ou enzymatiques, etc.).Dans le seul but d'illustrer l'invention, et sans que l'on puisse y trouver de cause à limiter la protection de l'invention, on indiquera ci-après, à titre d'exemple, une posologie susceptible d'être utilisée chez l'homme : elle comprend par exemple l'administration au patient de 1.000 à 25.000 UI par voie sous-cutanée, deux à trois fois par jour, selon le niveau des risquesdthypercoagulation ou l'état thrombotique du patient, ou de 1.000 à 25.000 UI par 24 heures par voie intraveineuse, en administration discontinue à intervalles réguliers ou de façon continue par perfusion, ou encore de 1.000 à 25.000 UI (trois fois par semaine) par voie intramusculaire (titres exprimés en UI Yin-Wessler). Les doses devront naturellement, chez chaque patient, être ajustées selon les résultats des analyses sanguines préalablement effectuées, de la nature de l'affection dont le patient souffre et, d'une façon générale, de son état de santé, comme cela est bien connu. L'invention concerne également encore l'application des mucopolysaccharides selon l'invention à la constitution de réactifs biologiques utilisables au laboratoire, notamment à titre de référence de comparaison pour l'étude d'autres produits dont est testée l'activité anticoagulante, notamment au niveau de l'inhibition du facteur Xa. Les mesures qui ont été faites par gel-perméation et auxquelles référence a été faite à la page 7 de la présente description ont été faites, à l'aide d'un chromatographe SPECTRAPHYSICS 3500, sur des colonnes 250 x 9 mm garnies de silice de granulométrie 10-100 microns, notamment celles commercialisées sous la désignation LICHROPHOSPHER, de solutions de ces fractions dans un tampon Na2S04 0,02 M, à raison de 1,3 mg de matière mucopolysaccharidique/ml (volume initialement déposé sur la colonne : 50 pl) et sous un débit d'élution de 3 ml/minute. La détection des matières a été faite par spectrophotométrie UV (200 mu). REVENDICATIONS 1.- Fraction mucopolysacoharidique selon la revendication 1 de la demande de brevet principal, caractérisée, d'une part, par une affinité particulière à l'égard de l'antithrombine III se manifestant par sa capacité de se fixer sur cette dernière, notamment dans un système comprenant la mise en contact de cette fraction avec une antithrombine III fixée sur un support1 tel que l'agarose, au sein d'un tampon-NaCl 0,2 M, tris-HCl 0,05 M pH 7,5 et, d'autre part, par des titres Yin-Wessler et USP qui sont dans un rapport (rapport YW/USP) au moins égal à 6, le titre Yin-Wess ler lui-même étant au moins égal à 300 UI/mg. 2.- Fraction selon la revendication 1, caractérisée par un rapport YW/USP supérieur à 18 et une activité Yin-Wessler supé rieure à 900 UI/mg. 3.- Fraction selon la revendication 1 ou 2, caractérisée par un rapport YW/USP supérieur à 50. 4.- Fraction selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée par un rapport YW/USP supérieur à 65 avec une acti tivité Yin-Wessler supérieure à 1.300 UI/mg. 5.- Fraction ou composé selon l'une quelconque des reven dications 1 à 4, caractérisé par un spectre de RMN pour le proton (1H), réalisé sur une solution de ce composé dissous dans l'eau deutériée à 350C avec un rayonnement de 270 mégaherz (MHz), qui comprend, à titre d'éléments caractéristiques du spectre, des signaux de résonance qui, pour des déplacements chimiques de l'or dre de 4,8 et 5,2 ppm, sont sensiblement plus faibles que le signal de résonance qui est également observé pour un déplacement chi mique de l'ordre de 5,4 ppm (référence pour la mesure des dépla cements : TSP (sodium 3-triméthylsilyl propionate 2,2, 3,3-d4)). 6.- Fraction ou composé selon l'une quelconque des revendi cations 1 à 5, caractérisé par un spectre de RMN pour le carbone 13 (13C), réalisé sur une solution de ce composé dissous dans l'eau deutériée avec un rayonnement de 20 MHz, qui comprend, à titre d'éléments caractéristiques du spectre (référence pour la mesure des déplacements :TMS (tétraméthylsilane)) - pratiquement l'absence de signal de résonance caractéristique de la présence de groupes OH sur le carbone primaire (en posi tion 6) des motifs glucosamine contenus dans les fractions mucopolysaccharidiques de l'invention, - des signaux supplémentaires, dans la région des signaux (I1) et (G1), dans des régions correspondant à des déplacements chimiques de l'ordre de 100 ppm, - un signal (G2) supplémentaire près du signal G2 N-sulfaté dans la région 60 ppm, - la présence d'un signal de résonance dans la région 75 ppm. 7.- Fraction ou composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par un spectre de RMN con forme à celui de l'une au moins des figures 4, 5, 7 et 8. 8.- Fraction ou composé selon la revendication -7, carac térisé en ce qu'il est formé par un oligosaccharide homogène présentant encore les caractéristiques supplémentaires sui vantes : --il comprend de 8 à 12, notamment dix motifs mono-saccharidi ques , - toutes les positions primaires des motifs glucosamine de cet oligosaccharide sont sulfatées - cet oligosaccharide comporte une unité N-acétyl-glucosamine pour deux unités acide iduronique 2-O-sulfate et pour deux unités N-sulfate-glucosamine, les autres saccharides étant de nature différente et comportant des substituants distincts. 9,- Fraction ou composé selon la revendication 8, carac térisé par un poids moléculaire d'environ 2.000 à environ 3.000, notamment d'environ 2.500. 10.- Procédé pour l'obtention d'une fraction ou d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, appliqué a une matière première étant formée d'une fraction, elle-me'me caracterisée . - en ce que, dans une opération de gel-filtration sur colonne da gel de polyacrylamide et d'agarose, sous forme de perles, du type commercialisé sous la désignation ULTROGEL AcA 44, cette fraction passe après élution d'un volume de 2,5 litres, volume mort non compris, lorsque la gel-filtration est con duite, sous un débit de 200 ml/beure, dans une colonne ayant un diamètre de 100 mm et une hauteur de 1 m et lorsque la concentration en mucopolysaccharides et le volume de la solution placée sur la colonne ont été respectivement de 50 mg/ml et 37,5 ml, l'essentiel de cette fraction étant notamment contenu dans les 1,5 litres d'éluat qui passent ensuite ;; - par un temps de rétention de l'ordre de 5,7 à 7,5, notamment de 6,6 à 7,0 minutes dans une colonne, dans un système de gel perméation sur colonne garnie de silice à granulométrie de 10-100 microns, de 250 mm de hauteur et de 9 mm de diamètre, lorsque 50 pl d'une solution de 1,3 mg/ml de cette fraction dans un tampon Na2S04 0,02 M, ayant été placés sur cette colon ne, l'on procède ensuite à l'élution de ladite fraction sous un débit de 3 ml/minute, ce procédé consistant à réaliser une fixation sélective de la fraction ou composé de la présente invention sur l'antithrombine III, notamment par la mise en contact des fractions initiales avec l'antithrombine III fixée sur un support, notamment de l'agarose, au sein d'un tampon tel que NaCl 0,2 M, tris-HCl 0,05 M pH 7,5, puis à éluer la fraction ou composé fixé avec un tampon de force ionique plus forte, suffisante pour produire sa désorption, notamment un tampon NaCl 2 M, tris-HCl 0,05 M. 11.- Médicament contenant le composé ou fraction selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou celui obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 10 en association avec un véhicule physiologiquement acceptable.