Brevet FR2468582A1 — publié le 19810508

La présente invention est relative à certains nou- veaux antibiotiques de type macrolide qui sont des dérivés de Mycoplanecine. Les antibiotiques de type macrolide suivant l'inven- tion sont des composés répondant à la formule (I): R-N C-N-CH-CO-H-CH--N C-HH-C H-CH3 -CHH fi C /i CH3 CH2CH3 OC:CHú-NH-aC-CH-N-aC -i--- O CH CH H3C CH3 dans laquelle R représente un groupe N-(z-hydroxybutyryl)- N-méthylvalyle, c'est-à-dire un groupe de formule H3C / CH3 3 u,> 3 CH i CH -CH -CH-CO-N-CH-CO- 3 2; - OH CH3 ou un atome d'hydrogène. La Mycoplanecine est décrite dans la demande de bre- vet britannique n 7918201 et répond à la formule (I) ci- dessus à cela près que, dans la Mycoplanecine, R représen- te un groupe N-(k-cétobutyryl)-N-méthylvalyle, c'est-à- dire H3C CH3 CH CH3-CH2-CO-CO-N-CH-CO- 3 2 CH3 Comme décrit dans la demande de brevet précitée, la Mycoplanecine a de précieuses propriétés antibiotiques vis-à-vis de divers microorganismes, mais tout particuli- érement vis-à-vis de microorganismes du genre Mycobacterium. La Mycoplanecine est également peu toxique et, de ce fait, devrait présenter un intérêt considérable en chimiothéra- pie. Toutefois, la Demanderesse a maintenant découvert que la disponibilité biologique de la Mycoplanecine, lorsqu'on l'administre aux animaux par les voies usuelles, est assez faible et que cela peut, dans une certaine mesu- re, limiter la valeur thérapeutique de la Mycoplanecine. Il s'ensuit que la Demanderesse a considéré souhaitable de rechercher des dérivés de Mycoplanecine qui conserve- raient la totalité - ou une proportion substantielle - de l'activité de la Mycoplanecine mais qui seraient mieux absorbés lors de l'administration aux animaux. La Demanderesse a maintenant découvert, de façon sur- prenante, que la modification ou le remplacement du groupe N-((cétobutyryl)-N-méthylvalyle de la Mycoplanecine donne des composés ayant tune disponibilité et une valeur biologique améliorées comme intermédiaires dans la préparation d'au- tres dérivés de Mycoplanecine. Pour plus de commodité, les deux composés représentés par la formule (I) sont ci-après désignés composé (II): CH3 H3C CH3 H3C CH3 CH2 CH CH :HH2 I CH3! dJ,CH3 CH2 1 (CH212 R-C I-HNCH-C-H-CH-C- C-H -CHC JCH-CH3 1 CH3CH3 OC-CH2-NH-flC-CH-N- U O CH2 CH - H3C CH3 dans lequel R' représente un groupe.N--%-hYdrOxybut-ril.)-N- méthylvalyle, et composé (III).d : -: 0 . _. CH3 I3CX CH3 H3CN C3 CflCH -_c6 g" CH CH CH2 I CH3 I 2 CH3 CH2 (CH212 H- -CO-N-CH-CO-NH-CH-CO-N- -CO-H-CH-CO I I CH-CH3 N-CH3C I I /CH3 a CH-CH\ I CH 3 CH3 CH2 CH H3C CH3 (IIII Le composé (II) peut être caractérisé par les propri- étés physico-chimiques suivantes: 1. Couleur et forme: aiguilles incolores 2. Point de fusion: 175-182 C 3.2 3. Pouvoir rotatoire: /_-7D - 69,1 (c = 1,02,chloroforme) 4. Analyse élémentaire: C, 60,74%; H, 8,84%; N, 11,46% 5. Formule brute: C61H104N10013 6. Masse moléculaire: 1184 7. Spectre d'absorption ultraviolet: dans le méthanol: absorption terminale seulement 8. Spectre d'absorption infrarouge (KBr): : 1760, 1670 - 1640 cm 1 max 9. Solubilité: soluble dans le méthanol, l'acétone, l'acétate d'éthyle, le chloroforme et le benzene. Insoluble dans l'eau et l'hexane. 10. Chromatographie en couche mince sur plaque de gel de silice n 5715 (produit de Merck & Co., Inc.) de 0,25 mm d'épaisseur. Développement à l'acétate d'éthyle: Rf = 0,10. Développement à l'aide d'un mélange 10/1 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol: Rf = 0,27. Le composé (III) peut être caractérisé par les pro- priétés physico-chimiques suivantes: - 1. Couleur et forme: poudre amorphe blanche 2. Point de fusion: 140-150 C - -25 3. Pouvoir rotatoire:.//D -57,7 (c=0,78, chloroforme) 4. Analyse élémentaire: C,61,54%; H, 8,93%; N, 12,51%. 5. Formule brute: C51H87N9010 6. Masse moléculaire: 985 7. Spectre d'absorption ultraviolet: Dans le méthanol: absorption terminale seulement 8. Spectre d'absorption infrarouge (KBr): -1 : 1760, 1670 - 1640 cm 1 max 9. Solubilité: Soluble dans le méthanol, l'acétone, l'acétate d'éthyle et -le chloroforme. Insoluble dans l'eau, le benzène et l'hexane. 10. Chromatographie en couche mince: on utilise comme adsorbant une plaque de gel de silice n 5715 (Merck & Co., Inc.) ayant une épaisseur de 0,25 mm. Développement à l'aide d'un mélange 90/10/1 en volume de chloroforme, de méthanol et d'hydroxyde d'ammonium Rf = 0,2. Les composés (II) et (III) présentent une puissante activité antibactérienne vis-à-vis d'un certain nombre de microorganismes infectieux, notamment de microorganismes du genre Mycobacterium, et tout particulièrement de Myco- bacterium tuberculosis, variété H37Rv. Il s'ensuit que ces composés devraient être précieux dans le traitement de la tuberculose. Les concentrations inhibitrices minimales (CIM) des composés (II) et (III) vis-à-vis de divers microorganismes du genre Mycobacterium sont indiquées dans le tableau sui- vant et ont été déterminées en faisant incuber le microor- ganisme pendant 7 jours (dans le cas de Mycobacterium - smegmatis) ou 42 jours (dans le cas des autres microorga- nismes) à 37 C sur milieu liquide de Dubos. : TABLEAU Organisme testé Composé Composé i___________, (II) (III) ij I,'ug/ml i g/mig Mycobacterium smegmatis ATCC 607 0,05 313-,25 1Mycobacterium tuberculosis H37 Rv 0,625 6,25-12,5 Mycobacterium intracellulare !FM2073 2,5 12,5-25 IFM 2073 S25 È 252 On peut préparer le composé (II) par réduction de la Mycoplanecine. L'agent réducteur utilisé peut être n'im- porte quel agent capable de réduire le groupe carbonyle de la chaîne latérale N-(d-cétobutyryl)-N-méthylvalyle en un groupe hydroxy, sous réserve que l'agent réducteur et/ou les conditions dans lesquelles on effectue la réduction soient tels que d'autres parties de la molécule de Myco- planecine ne soient pas affectées. Comme exemples d'agents réducteurs appropriés, on citera: le borohydrure de sodium, l'hydrure de lithium et d'aluminium, ou NaBH3CN. On peut également traiter la Mycoplanecine à l'aide d'hydrogène gazeux en présence d'un catalyseur (comme l'oxyde de pla- tine) dans un solvant organique ou hydro-organique. On peut également obtenir le composé (II) à partir de la Mycoplanecine en traitant cette dernière par des enzymes réductrices produites par des microorganismes ou des ani- maux. On peut obtenir le composé (III) par hydrolyse du composé (II) ou de la Mycoplanecine. L'hydrolyse peut être effectuée en utilisant des acides organiques ou miné- raux dans un solvant organique ou hydro-organique. On obtient des résultats particulièrement bons en effectuant l'hydrolyse de ces composés à l'aide d'acide chlorhydrique (ayant de préférence une concentration de 3 à 5N) à tempé- rature ambiante, de préférence pendant un laps de temps i 3 à 5 heures. Toutefois, on peut faire appel à tout mode d'hydrolyse classique permettant d'éliminer un groupe acyle d'un atome d'azote. Le composé de formule (II) ou (III) cherché, obtenu comme décrit ci-dessus, peut être isolé du mélange réac- tionnel par des moyens classiques, particulièrement par chromatographie ou recristallisation. La chromatographie peut être effectuée en utilisant divers véhicules, sépa- rément ou en association et, si nécessaire, peut être effectuée plusieurs fois. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention. L'exemple 1 illustre la préparation de la Mycoplanecine. EXEMPLE 1 Préparation de la Mycoplanecine Dans un ballon Sakaguchi de 500 ml on introduit 100 ml d'un milieu de culture d'ensemencement ayant un pH de 7 avant stérilisation et la composition suivante (les pourcentages sont exprimés en pds/vol): Glucose 1% Glycérine 1% Farine d'avoine 0,5% Saccharose 1% Farine de soja 2% Casaminoacide 0,5% Levure pressée 1% Carbonate de calcium 0,1% Dans ce milieu on inocule une culture d'Actinoplanes souche 41042 (déposéesous le n d'accession FERM-4504 auprès de "The Technical Research Institute of the Micro- bial Industry, Agency of Industrial Science and Technolo- gy, Ministry of International Trade and Industry', au Japon; cette souche est décrite de façon détaillée dans la demande de brevet britannique n 7918201 précitée). Puis on cultive en secouant par un mouvement de va-et- vient à 28 C pendant 96 heures. On divise le bouillon de culture résultant en portions aliquotes de 5 ml qu'on ino- cule dans un ballon Sakagushi, chaque ballon contenant ml d'un milieu de production ayant un pH de 7,0 avant stérilisation et ayant la composition suivante (les pour- centages sont exprimés en pds/vol): Glycérine 0,5% Saccharose 2% Farine de soja 1% Levure pressée 1% Ligueur de macération de mals 0,5% CoC12. 6H2O 0,001% Puis on cultive en secouant à l'aide d'un mouvement de va-et- vient à 280C pendant 96 heures. On réunit les bouillons de culture résultants. A 4 litres des bouillons de culture réunis (pH 7,2) on ajoute 5% pds/vol de Celite 545 ( Nom Commercial d'un adjuvant de filtration fourni par Johns Manville Product Corporation, E.U.A.)et on filtre les bouillons afin de séparer la liqueur du gâteau de filtre contenant le mycélium. On extrait le filtrat à l'aide de 2 litres d'acétate d'éthyle, afin de recueillir la Mycoplanecine qu'il contient, et on extrait le gâteau mycélien à l'aide de 2 litres d'acétone contenant 20% vol/vol d'eau; puis on élimine l'acétone de ce dernier extrait par distilla- tion sous pression réduite et on extrait le résidu par 2 litres d'acétate d'éthyle. On réunit les extraitsdu fil- trat et du gâteau mycénien dans l'acétate d'éthyle, obte- nant ainsi 4 litres d'extraits totaux. On lave deux fois ces extraits réunis, chaque fois à l'aide d'un litre d'une solution aqueuse saturée de chlo- rure de sodium. On déhydrate les extraits lavés, sur sul- fate de sodium anhydre, puis on concentre par évaporation sous pression réduite, obtenant ainsi 1,07 g d'une substan- ce huileuse. On dissout la substance huileuse dans un petit voleme de chloroforme et on adsorbe sur une colonne contenant 20 g de gel de silice, préalablement préparé avec du chloro- forme. On lave ensuite la colonne au chloroforme et on éli- mine les impuretés par-élution à l'aide d'un mélange 1/1 en volume de chloroforme et d'acétate d'éthyle, puis à l'aide d'acétate d'éthyle seulement. On élue ensuite la Mycoplanecine cherchée à l'aide d'un solvant mixte conte- nant, en volume, 95% d'acétate d'éthyle et 5% de méthanol. On sépare un litre d'une fraction active des fractions éluées, et on concentre par évaporation sous pression ré- duite, obtenant ainsi 130 mg d'une poudre blanche. On dissout 110 mg de cette poudre blanche dans un petit volume de chloroforme et on fait passer la solution résultante sur une colonne de 220 ml contenant du Sephadex LH-20 (fourni par Pharmacia Co. Limited, Suède) et remplie de chloroforme, et qu'on élue ensuite au chloroforme. On concentre les fractions actives ainsi recueillies, par évaporation sous pression réduite, ce qui fournit 90 mg de Mycoplanecine sous la forme d'une poudre blanche. Ce produit purifié présente une tache unique à l'iode, à l'acide sulfurique et au permanganate de potassium à la CCM (chromatographie en couche mince) sur gel de silice. EXEMPLE 2 Préparation du composé (II) A une solution de 20 g de Mycoplanecine dans 200 ml de méthanol on ajoute, tout en refroidissant sur de la glace, 1,5 g de borohydrure de sodium, après quoi on agite le mélange pendant une heure. Au bout de ce laps de temps, on concentre le mélange réactionnel et on additionne le résidu de 500 ml d'acétate d'éthyle. On lave le mélange deux fois, chaque fois à l'aide de 500 ml d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium. Après lavage, on déshydrate le mélange sur sulfate de sodium anhydre, puis on concentre par évaporation sous pression réduite, obte- nant ainsi 22 g d'une substance huileuse. On dissout la substance huileuse dans 30 ml d'acétonitrile et on aban- donne à la température ambiante. On obtient un précipité de 7,2 g (rendement: 36%) du composé (II) cherché, sous la forme d'aiguilles incolores. EXEMPLE 3 Préparation du composé (III) On dissout 5 g de composé (II) dans 15 ml d'une solu- tion méthanolque 4,5N de chlorure d'hydrogène, et on agite la solution résultante pendant 4 heures à températu- re ambiante (250C), après quoi on concentre le mélange réactionnel afin d'éliminer le chlorure d'hydrogène. On dissout le résidu résultant dans 10 ml de chloroforme, puis on adsorbe sur ure colonne contenant 90 g de gel de silice qui a été préalablement préparé à l'aide de chlo- roforme. On lave ensuite la colonne à l'aide de 200 ml de chloroforme et on procède à une élution fractionnée à l'aide d'une solution mixte contenant, en volume, 95% de chloroforme et 5% de méthanol. On recueille le produit d'élution par portions aliquotes de 15 ml. Le composé (III) cherché est contenu dans les fractions 17 à 24. On réunit ces fractions, on concentre par évaporation, obte- nant ainsi 3,85 g (rendement: 92,6%) du composé (III) cherché. EXEMPLE 4 Préparation du composé (III) On dissout 200 mg de Mycoplanecine dans 3 ml d'une solution méthanolique 4,5N de chlorure d'hydrogène, et on agite la solution résultante à température ambiante (250C) pendant 4 heures. Une fois la réaction terminée, on con- centre le mélange réactionnel par évaporation sous pres- sion réduite, afin d'éliminer le chlorure d'hydrogène. On purifie ensuite le résidu comme décrit à l'exemple 3, ob- tenant ainsi 12 mg du composé (III) cherché. REVENDICATIONS 1. Antibiotiques de type macrolide, caraetérisés en ce qu'ils sont des composés répondant à-la formule (I): CH H3C C H3 H3 CH3 3 3CH CH3 CH2 CH22 R-H C--k-CH-CO-HH -CH-C0----_I CD-NH-CH-CO I I CH-CH3 -CH L-11-LH3 I - I I /CH3 C3 - CH-CH UC-CH2-HH-OC-CH-H-OC j Q CH2 CH H3C CH3 dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un groupe N-(d-hydroxybutyryl)-N-méthylvalyle. 2. Procédé de préparation d'un antibiotique de type macrolide, caractérisé en ce qu'on réduit de la Mycoplane- cine, obtenant ainsi un composé répondant à la formule (II): CH3 3C CH3 H3C CH3 CH CH CH C2 I CH3 CH3 CH 2 (CH22 [[ 1 3 CHI R -N--CO-YH-CH-CO-,HH-CH-Cu-- CO-NHHH-CO CH-CH3 I-CH ICH H NCH3( f /CH3 O CH-CH( OC-CH2-7H-OC-CH-u-OC qH OC CH2 CH H3C CH3 dans laquelle R' représente un groupe N-("-hydroxybutyryl) -N-méthylvalyle. - 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce qu'on effectue la réduction à l'aide de borohydrure de sodium, d'hydrure de lithium et d'aluminium, de NaBH3CN ou d'hydrogène gazeux en présence d'un cataly- seur. 4. Procédé de préparation d'un antibiotique de type macrolide, caractérisé en ce qu'on hydrolyse de la Myco- planecine ou un composé de formule (II) tel que défini à la revendication 2, afin de préparer un composé répondant à la formule (III): H3C CH3 H3C 7CH3 CH3 N3s.1 3 3 \ 3 HN C0-N-CH-C0-HH-CH-CDN C -CH CH2 I CH3 J."CH, CH2 (,J.{CH2?2 HN CO-N-C-CO-;H-CH-CO-{---l CO-nH-H-CO C I (III) C-3CH-, N-CH jH3IC"-CN CH3 aOC-CH2-NH--CH- CH2 f CH H3C CH3 5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce qu'on effectue l'hydrolyse à l'aide d'un acide dans un solvant organique ou hydro-organique. 6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que l'acide est de l'acide chlorhydrique ayant une concentration de 3 à 5N. 7. Composition thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle contient à titre de principe actif un antibiotique de type macrolide selon la revendication 1.