Brevet FR2466990A1 — publié le 19810417

La présente invention concerne des procédés et des compositions synergiques pourstimuler l'activité phagocytaire. Une somme considérable de travail a été réa- lisée dans le domaine du phénomène naturel connu sous le nom de phagocytose, pour tenter d'en comprendre le mé- canisme et d'accrottre ou de stimuler ce processus. On sait, par exemple, que l'acide hyaluronique (HA) et en particulier son sel de sodium (Na-HA) inhibent ou stimu- lent la phagocytose selon les conditions. Ainsi Forrester et Balazs (1979) dans "Inhibition of phagocytosis by high molecular weight hyaluronate" (présenté mais non publié), et Sebag, Balazs, Eakins, Bhattacherjee et KulkaTni, (1979) dans "The effect of hyaluronic acid on prostaglandin synthesis and phagocytosis by mononuclear phagocytes in vitro" (présenté pour la publication à "The Journal of Cell Biology") ont montré que de l'hya- luronate de sodium de diverses tailles moléculaires (480-2300 x 10 3) inhibent l'activité phagocytaire des ma- crophages péritonéaux. Cette inhibition dépend de la vis- cosité de la solution avec laquelle les cellules sont en contact. On a constaté une inhibition complète de la pha- gocytose de perles de matière plastique lorsque le mi- lieu a une viscosité spécifique de 8 à 9. [Balazs, The effects of viscosity on phagocytosis (résultats non pu- bliés)J. Cette inhibition n'est pas spécifique du Na-HA car des solutions de gélatine et d'ADN ayant approxima- tivement la même viscosité provoquent également une in- hibition complète. Cependant des glycosaminoglycanes sulfatés à des concentrations semblables et même quel- que peu supérieures, ainsi que les oligosaccharides de l'HA ne provoquent pas d'inhibition ni n'interfèrent avec l'inhibition duNa-HA de poids moléculaire plus élevé. Brandt dans "The effect of synovial hyaluro- nate on the ingestion of monosodium urate crystals by leucocytes" Clinica Chimica Acta 55, 307-315 (1974) a montré que des préparations de Na-HA de divers poids moléculaires (2,94-0,86 x 106) inhibent la fixation des cristaux d'urate par les leucocytes du sang. D'autres auteurs ont montré que la phagocytose des staphyloco- ques est réduite en présence de liquide synovial [Bodel et Hollingworth, Comparative morphology, respiration, and phagocytic function of leukocytes from blood and joint fluid in rheumatoid arthritis. J. of Clin. Invest. (4), 580-589 (1966)]7. La phagocytose de streptocoques encapsulés du groupe A par les leucocytes sanguins hu- mains a également été étudiée in vitro par Hirsch et Church ZStudies of phagocytosis of Group A Streptococci by polymorphonuclear leucocytes in vitro. J. Exp. Med. 111, 309-322 (1960)7. Ces auteurs ont montré que le Na-HA de la capsule a une activité antiphagocytaire. Ils ont également montré que le sérum humain mais non le sé- rum de lapin contient un facteur qui contrecarre l'effet antiphagocytaire du Na-HA capsulaire. Ces auteurs n'ont pas élucidé la nature de ce facteur mais ont exclu qu'il s'agisse d'un anticorps dirigé contre le Na- HA ou d'une enzyme dépolarisant le Na-HA. Un effet stimulant du Na-HA sur l'activité phagocytaire des phagocytes mononucléaires et polynuclé- aires a été récemment démontré. Hakansson, Halgren et Venge Zhyaluronic Acid -- A New Opsonin. (communication personnelle; 1978)7 ont montré que du Na-HA ayant un poids moléculaire supérieur à 0,7-2 x 106 à une faible concentration (1-10,ug/ml) stimule la vitesse initiale de phagocytose des perles de plastique par les leucocytes du sang humain. Cet effet stimulant est spécifiquedes particules opsonifiées du sérum. La fixation des parti- cules revêtues d'IgG n'est pas stimulée. Forrester et Balazs, supra, ont découvert que la phagocytose des macrophages péritonéaux est également stimulée par le Na-HA à de faibles concentrations. Le mé- canisme de la stimulation et de l'inhibition des phago- cytes mononucléaires et polynucléaires est décrit en dé- tail par Paul et Balazs dans "The mechanism of the régulation of phagocytosis of human polymorphonuclear phagocytes by Na-Hyaluronate". Science (en cours de pu- blication, 1979). Stossel, dans Phagocytosis: Recognition and Ingestion. Seminars in Hematology, Volume 12, 83-116 (1973) a établi que la phagocytose se produit en deux phases: tout d'abord la reconnaissance et l'adhésion et ensuite l'ingestion ou inclusion. L'effet stimulant du Na-HA à de faibles concentrations est dé à l'accrois- sement de l'adhésion qui augmente la vitesse d'inges- tion. Cependant sous l'effet de cette stimulation, les cellules n'ingèrent pas plus de particules qu'elles ne le feraient en l'absence de Na-HA. La stimulation accroit le nombre total des particules qui adhèrent à la surface cellulaire à un moment donné quelconque. Cela permet d' accroître la vitesse d'ingestion. Donc les cellules réa- lisent la phagocytose maximale plus rapidement. D'autre part, l'inhibition pour des concentrations plus élevées en Na-HA ( >100 pg/ml) n'a pas d'effet sur le processus d'adhésion mais inhibe la phase d'ingestion de la phago- cytose. Cet effet est totalement dépendant de la visco- sité de la solution. La viscosité dépend de la concen- tration et de la taille moléculaire. Donc l'inhibition totale de la phagocytose peut être obtenue avec une so- lution à 10 mg/ml de Na-HA ayant un poids moléculaire de 48 000, une solution à 5 mg/ml de Na-HA ayant un poids moléculaire de 260 000 ou une solution à 0,4 mg/ml de Na-HA ayant un poids moléculaire de 3,2 millions. Klockars et Roberts, dans "Stimulation of phagocytosis by human lysozyme"; Acta Haemat. 55, 289- 295 (1976) ont découvert que la muramidase (MUas) sti- mule la phagocytose par les phagocytes polynucléaires humains. Cependant seule la MUas homologue, c'est-à-dire humaine, a cet effet et non la MNas de blanc d'oeuf. La stimulation a été observée à des concentrations en MUas de 10 à 100 pg/ml avec des cellules de levure comme par- ticules phagocytées. Cette concentration en MUas corres- pond à la gamme observée dans les exsudats inflammatoi- res par Senn, Chu, O'Malley et Holland, "Experimental and Clinical Studies on Muramidase (Lysozyme)"; Acta Haemet. 44, 65-77 (1970) et dans les liquides synoviaux de l'arthrite par Pruzanski, Ogryzlo et Katz, "Lysozyme production and abnormalities in rheumatic diseases" dans Lysozyme, Academic Press, New York, chapitre 38, 419-425 (1974). Klockars et Roberts, supra, ont suggéré que la MUas libérée par les phagocytes lors de la phase d'inges- tion (voir Wright et Malawista, "The mobilization and extracellular release of granular enzymes from human leukocytes during phagocytosis", J. of Cell Biology, 53, 788-798 (1972)] a un effet "auto-stimulant" sur les cel- lules. Cependant la MUas n'est pas une opsonine, car elle agit sur la membrane cellulaire et non sur les particules. L'invention concerne,selon un de ces aspects, de nouvelles compositions synergiques, capables de stimu- ler les deux types de cellules phagocytaires et pinocytai- res, c'est-à-dire les phagocytes mononucléaires (PMN) et les phagocytes polynucléaires (PPN). Cet aspect de l'in- vention repose sur la découverte du fait que l'on peut accroître de plusieurs fois l'effet connu de stimulation de la phagocytose de l'acide hialuronique lorsqu'on le mé- lange avec une petite quantité de muramidase. L'effet sy- nergique est évident, car l'élévation de la concentration en HA ou en MUas n'accroit pas l'effet stimulant. Donc lorsqu'on utilise ces deux substances ensemble, la stimu- lation de la phagocytose atteint une valeur qu'on ne peut atteindre avec l'une ou l'autre de ces substances emplo- yées séparément. L'invention permet d'obtenir l'effet désiré, lorsque les concentrations sanguines en MUas et en Na-HA sont toutes deux d'environ 10 à 50 ug/ml. Pour attein- dre de telles teneurs dans la circulation sanguine, on utilise une solution salée physiologique contenant en- viron 5 à 40 mg/ml de Na-HA et environ 2 à 20 mg/ml de MUas. De façon typique on injecte 1 à 2 ml de cette so- lution par voie sous-cutanée ou intramusculaire. La li- bération lente des deux substances conduit à la concen- tration sanguine désirée de 10 à 50,pg/ml. Les compositions de l'invention sont donc des solutions salées physiologiques, aqueuses, contenant de la MUas pure (2 à 20 mg/ml) et un sel soluble (de pré- férence le sel de sodium) de l'acide hialuronique (Na-HA) ayant un poids moléculaire d'au moins environ 430 000 (il n'y a pas de limite supérieure) à raison de 5 à 40 mg/ml. La concentration sanguine, que l'on préfère tout particulièrement pour stimuler les phagocytes polynu- cléaires, est d'environ 10 à 30,ug/ml. Selon un autre de ses aspects, l'invention con- cerne des procédés pour stimuler l'activité phagocytaire par administration à un animal, dont il est nécessaire d'accroître la phagocytose, par exemple un sujet grave- ment brûlé, risquant une infection généralisée, d'une quantité thérapeutique efficace des compositions selon l'invention. Les matériels et les méthodes, utilisés pour la mise en pratique de l'invention, sont décrits en détail ci-après. Phagocytes mononucléaires (MIN) Ces cellules proviennent du péritoine de sou- ris. On utilise uniquement des cellules stimulées. On effectue la stimulation par injection intrapéritonéalé 2466990 - de thioglycollate. On recueille les cellules 2 à 3 jours après l'injection. Phagocytes polynucléaires (PPN) Ces cellules sont fournies par des donneurs en bonne santé du sexe masculin. On les utilise dans les deux à trois heures qui suivent le prélèvement. Le sérum, utilisé pour enrober les perles de matière plastique, provient dans tous les cas du même sang que celui dont proviennent les cellules. Ce mode de séparation des PPN à partir du sang est décrit par Ehlenverger et Nussenz- weig dans "The role of membrane receptors for C-3b and C3d in phagocytosis", j. Exp. Med. 145, 357-371 (1977). Tests de phagocytose Les particules, utilisées dans ces tests, sont des perles de latex (1,101hm de diamètre) fournies par Dow Diagnostics, Indianapolis, Ind. On opsonifie les par- ticules avec du sérum frais, avant de les utiliser dans les tests de fixation et d'ingestion avec les PPN. Le test de phagocytose avec les PMN est décrit en détail par Forrester et Balazs- Cependant, pour être complet, ce test est décrit ci-après en détail. EVALUATION DE LA PHAGOCYTOSE On effectue une évaluation quantitative de la oe phagocytose par des couches monocellulaires/macrophages avec des sphères de latex de polystyrène (SLP) (diamètre 1,099 micron) selon la méthode de Vassali et coll. [Cell 8 1976]. On lave les SLP une fois avec dix volumes d'é- thanol à 70% et deux fois avec le même volume de tampon salé phosphaté (PBS). On remet les perles en suspension dans du milieu essentiel minimum de Hanks avec 20% de sérum foetal de veau à la concentration de 1,36 x 109 SLP/ml et on maintient à 4 C jusqu'à l'emploi. A cha- que couche monocellulaire de macrophages on ajoute 1 ml de SLP préchaufféeset on laisse la phagocytose des perles s'effectuer pendant une heure à 370C dans une atmosphère humidifiée constituée de 95% d'air et 5% de dioxyde de carbone. On lave ensuite à fond les couches monocellulai- res avec du PBS (6 à 10 fois) et on les examine en mi- croscopie de contraste de phase. On constate que toutes les SLP sont associées aux cellules et que 85% apparais- sent être intracellulaires. Dans toutes les expériences, on effectue des cultures témoins incubées à 4eC pour te- nir compte de l'adhésion des particules à la surface des cellules par opposition à l'ingestion vraie des SLP. On lyse ensuite les cellules avec 0,5 ml de Triton-X 100 (Fisher Scientific, New Jersey) à la concen- tration de 0,05% en volume dans l'eau distillée, puis on dilue la suspension de SLP avec 1,0 ml de Triton-X à 0,05%. On mesure ensuite l'absorbance de la lumière par la suspension de SLP à 540 nm. On corrige les valeurs pour tenir compte du trouble de fond, dé à la présence des membranes des cellules lysées, qui est minime et constant. On compare les valeurs obtenues à des courbes standards et on compare le nombre des particules de SLP ingérées par une couche monocellulaire dans les condi- tions témoins et dans les conditions d'essai. Dans la plupart des cas, on calcule à partir de ce rapport 1' indice de phagocytose (CE/Co) qui est le rapport de la concentration des SLP ingérées dans les conditions d'es- sai (Ca) et dans les conditions témoins (CO). Dans la plupart des expériences on utilise 0,5 x 106 cellules par essai et environ 100 à 1 000 perles de matière plastique par cellule. La durée d'incubation varie entre 1 et 5 heures. Les tests d'adhésion et d'ingestion sont dé- crits par Mickl, Ohlbaum et Silverstein dans "2-Deoxy- glucose selectively inhibits Fc and complement receptor- mediated phagocytosis in mouse peritoneal macrophages". II, Dissociation of the inhibitory effect of 2-Deoxy- glucose on phagocytosis and ATP-génération; J. Exp. Med. 144, 1484-1493 (1976). Muramidase On utilise dans l'invention de la muramidase (lysozyme) de blanc d'oeuf. Hyaluronate On peut utiliser le sel de sodium ou tout autre sel soluble dans l'eau de l'acide hyaluronique. Dans l' invention la pureté du Na-HA n'a pas de limitation par- ticulière. Donc, bien que l'on préfère la fraction spé- ciale, très purifiée, de Na-HA, appelée Healon (brevet U.S. nc 4 141 973), on peut utiliser d'autres prépara- tions du commerce, moins pures. On détermine le poids moléculaire du Na-HA à partir de la viscosité intrinsèque selon l'équation: _ 1,25 rP =( o [n] est la viscosité intrinsèque exprimée en cm3/g. Stimulation de l'activité phaqocytaire par la muramidase On a précédemment montré (Klockars et Roberts, supra) que la muramidase de blanc d'oeuf ne stimule pas la phagocytose des granulocytes humains par suite de la spécificité d'espèce de cette molécule. Lors des tra- vaux ayant conduit à l'invention, la demanderesse a con- firmé ce fait comme indiqué ci-après. De plus la deman- deresse a également découvert que cette règle n'est pas valable dans le cas des macrophages péritonéaux du rat et de l'homme. La stimulation de la phagocytose par la MUas semble n'avoir lieu que dans une gamme relativement étroite des concentrations comprise entre environ 10 et 50) ug/ml (tableau I ci-dessous). A la concentration de pg/ml, non seulement il n'y a pas de stimulation, mais on observe au contraire une inhibition. Effet du Na-HA sur la phagocytose Des études antérieures non publiées, effectuées au laboratoire de la demanderesse ont montré que l'on ne peut pas accroître l'importance de la phagocytose, c'est- à-dire le nombre total de particules ingérées par unfMN par addition de Na-HA au milieu (Paul et Balazs, supra). Cependant on peut accroître le nombre de perles adhérant à la paroi cellulaire et stimuler la vitesse d'ingestion par addition d'une quantité de Na-HA, de poids moléculai- re supérieur à 300 000, suffisante pour qu'on obtienne une teneur sanguine de 10 à lOOpug/ml. Cependant, la MUas semble se comporter différem- ment. Elle accroit faiblement la quantité totale de perles fixées par les PMN. Ce léger accroissement de la phago- cytose est considérablement accru lorsque, selon l'inven- tion, on ajoute simultanément du Na-HA à une faible con- centration (10-30>ug/ml) au milieu. Pour cela un ajoute suffisamment de Na-HA pour obtenir une concentration san- guine d'environ 10 à 30)Jg/ml. Cet effet stimulant du Na-HA est une propriété exclusive du Na-HA de poids moléculaire élevé (PM = 430 000 ou plus). On sait (Hakanson et coll., supra) que le Na-HA seul, sans MUas, stimule la vitesse de phagocytose des PPN. Cette stimulation est due à l'accroissement de l'a- dhésion des particules à la surface cellulaire en pré- sence de Na-HA (Paul et Balazs, supra). La MUas de blanc d'oeuf ne stimule pas- cette phagocytose des PPN humains. Selon l'invention, le Na-HA en présence de MUas accroit fortement l'importance de la phagocytose (tableau IV ci- dessous). EXPERIENCES ET RESULTATS Stimulation des phagocytes mononucléaires par la muramidase La MUas s'est révélée stimuler la phagocytose des macrophages péritonéaux de la souris ou du rat. Cette stimulation n'est pas très forte (environ 30%) mais elle est très significative et, de plus, on l'observe pour des concentrations en MUas de 1 à 100pg/ml. On observe cette stimulation par la MUas uniquement lorsque les cellules elles-mêmes n'ont pas une activité phagocytaire extrêmement élevée. Les résultats de ces expériences fi- gurent dans le tableau I. Ces résultats montrent que 1' effet de stimulation apparait à des concentrations d'en- viron 10 à 50àug/ml. Tableau I. Stimulation de la phagocytose des phagocytes mononucléaires par la MUas. Concentration MUas Indice de (uq/ml) Phagocytose 1 0,96 + 0,10 1,28 + 0,04 1,32 - 0,03* 1,42 + 0,04* 0.74 + 0.03 * Moyenne de 5 à 11 expériences indépendantes compor- tant chacune 5 témoins et 5 échantillons d'essai; écart- type: 0,12k Absence de stimulation par le Na-HA Le Na-HA ne s'est pas révélé provoquer un ac- croissement de la phagocytose des PMN. L'indice de phago- cytose après 2 à 5 heures d'incubation est le même, lors- que du Na-HA est présent à une faible concentration dans les milieux d'incubation (10-30Og/ml) ou est absent. La variation du poids moléculaire du Na-HA entre 48 000 et 2 300 000 n'entratne aucune différence. Cela ressort des valeurs figurant dans le tableau II. Tableau II. Indice de phagocytose des phagocytes mononu- cléaires en présence de 10 ka/ml de Na-HA de divers poids moléculaires Indice de P.M. Phaqocytose 48 000 0,98 + 0,03 000 1,04 0,02 260000 1,01 0,03 430 000 0,92 0,03 1 300 000 1,02 + 0,06 2 300 000 1,01 0,02 ,,1 00 1 1 On calcule la moyenne de l'indice de phagocytose à par- tir de 3 à 5 expériences indépendantes comportant chacune un nombre égal (5) de témoins et d'échantillons d'essai. Stimulation de la phagocytose des PMN par le Na-HA et la MUas. Lorsqu'on ajoute du Na-HA à de faibles concen- trations (10-50 pg/ml) à un milieu dans lequel de la MUas est présente à une concentration de 10 à 5OPug/ml, l'in- dice de phagocytose s'accroit de façon considérable et significative comme le montre le tableau III. Cette stimulation inattendue de l'indice de phagocytose n'apparait que si le poids moléculaire du Na-HA ajouté est d'environ 430 000 ou plus. Tableau III. Effet d'un mélange de Na-HA et de MUas sur la phagocytose des PNN. P.M. de Na-HA MUas MUas + Na-HA P 1,23 + 0,01 1,57 + 0,01 1,25 + 0,05 1,75 - 0,01 2 300 000 1,50 - 0,01 2,03 - 0,01 1,33 - 0,03 1,52 -+ 0,01 1,28 + 0,01 1,40 + 0,01 1 300 000 1,14 0,02 1,26 + 0,01 1,12 + 0,02 1,50 + 0,03 430 000 1,38 1,25 _+ _+ 0,02 0,03 1,13 1,21 + i 0,01 0,02 non signi- ficatif Il 260 000 1,31 0,03 1,33 0,02 1,35 0,01 1,38 0,02 1,35 0,03 1,25 0,03 *000 1,11 0,02 1,19 0,05 1,38 0,04 1,26 - 0,04 1,25 0,04 1,38 0,02 Stimulation des phagocytes polynucléaires La MUas (de blanc d'oeuf) seule ne stimule ni la fixation ni la phagocytose des PPN humains. Cependant en présence d'une faible concentration de Na-HA (10-30 pg/ml) la fixation et la phagocytose sont accrues de fa- çon significative comme le montre le tableau IV. Tableau IV. Effet de la MUas et du Na-HA sur les phago- cytes polynucléaires Na-HA MUas Indice de fixation Indice de (Ugml) (uaml) phagocytose - 3,02 - 0,03 1,31 + 0,02 - 10 0,97 + 0,03 1,01 0,02 10 3,20 0,02 3,02 + 0,05 Une HYPOTHESE DE TRAVAIL Il ressort de façon évidente de ce qui vient d' 4tre exposé, que l'emploi combiné de Na-HA et de MUas a un effet stimulant accroissant de façon significative la phagocytose. La demanderesse estime que ce résultat peut être expliqué et propose donc l'hypothèse suivante, tout en précisant qu'il ne s'agit que d'une hypothèse à la- quelle l'invention n'est liée en aucune façon. Le premier stade de la phagocytose nécessite la reconnaissance, puis la fixation des particules à la surface des cellules. Cela est obtenu partine interaction spécifique antigène-anticorps ou par l'intermédiaire des opsonines sériques ou tissulaires. Ce processus s' effectue indépendamment de l'activité métabolique de la cellule; on l'observe donc à 40C et dans les cel- lules empoisonnées. Dans les expériences de la demande- resse, qui utilisent des particules de latex, les opsoni- - nes sériques sont indispensables à la reconnaissance et à la fixation à la surface des cellules phagocytaires. Le Na-HA de poids moléculaire élevé a une chat- ne dont la conformation présente un site moléculaire spé- cifique permettant une interaction avec un récepteur cel- lulaire de surface spécifique. Dans l'interaction avec la surface cellulaire, le Na-HA se comporte comme un co- facteur de la fixation des particules opsonifiées. Donc un nombre plus important de particulessont fixées à la surface des cellules en présence de Na-HA de poids molé- culaire élevé qu'en son absence. La MUas n'a pas d'effet sur cette première phase de la phagocytose. La seconde phase, qui consiste en l'ingestion (englobement ou inclusion) peut être déclenchée par la MUas qui est libérée par la cellule phagocytaire. Cette autostimulation de la cellule progresse et la MUas ajou- tée stimule légèrement l'ingestion. Cet effet stimulant de la MUas est apparemment très sensible à la conformation de la molécule et, bien que les PPN humains nécessitent des enzymes spécifiques de l'espèce, on peut stimuler les PMN de souris avec de la MUas de poule. Le Na-HA joue un rôle capital dans ce processus. De très faibles con- centrations (10-50jug/ml) de cette molécule peuvent ac- crottre fortement l'effet de la MUas sur les PMN et pro- voquer un accroissement pratiquement triple dans le cas des PPN. Le mécanisme de cet effet repose sur l'activa- tion par le Na-HA de l'adhésion; puisque la surface de la cellule porte un nombre plus grand de particules, il peut s'en incorporer davantage dans la cellule. Egale- ment une fixation par coopération entre la MUas et le Na-HA sur la surface cellulaire assure une meilleure fixation de l'enzyme au substrat. La demanderesse pense que l'effet enzymatique de la MUas-sur le revêtement po- lysaccharidique des cellules est un élément essentiel de l'ingestion des particules. L'addition d'un mélange de MUas et de Na-HA permet d'assurer une fixation plus grande de particules à la surface cellulaire et d'ac- crottre l'activité enzymatique essentielle à l'ingestion. EMPLOIS PRATIQUES L'intérêt médical de l'invention est qu'au cours de maladies infectieuses, ou lorsque/l'activité phagocytaire est altérée (par exemple chez les brûlés), l'injection sous-cutanée ou intramusculaire, ou l'ap- plication locale de mélange de Na-HA et de MUas, provo- quent une libération lente des deux substances dans la circulation sanguine, ce qui permet de stimuler l'activi- té phagocytaire des globules blancs du sang. La circula- tion sanguine normale entraine les deux composants aux emplacements spécifiques des tissus o une lésion bacté- rienne ou stérile soumet le système phagocytaire à un stress. L'accroissement de la concentration en Na-HA et en MUas en ces emplacements régânère et même accrott l'activité phagocytaire des cellules. On peut utiliser le Na-HA mélangé ou couplé à de la MUas d'origine humaine ou animale. Lorsqu'on mé- lange du Na-HA à une concentration élevée,par exemple -100 mg/ml, sous forme d'une gelée à de la MUas, la diffusion à partir du site d'injection est lente, et on obtient un traitement à effet retardé. Si on mélange de l'acide hyaluronique à la concentration ci-dessus avec de la MUas, il se produit un précipité qui, lorsqu'on le met en suspension dans du chlorure de sodium 0,02 à 0,1 N, à pH 6,5-7,5, forme une suspension injectable par voie sous-cutanée ou intramusculaire. L'acide hyaluronique forme ainsi un complexe qui se dissout lentement sous l'effet de la solution salée dans l'espace intercellu- laire. Cette solubilisation lente du mélange et sa libé- ration lente dans le système circulatoire permettent un traitement retardé. Bien entendu l'invention est susceptible de di- verses variantes sans sortir de son cadre. 15. R E V E N D I C A T I O N S 1. Composition pour stimuler la phagocytose, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une solution salée physiologique, contenant de la muramidase et un sel soluble de l'acide hyalu- ronique de poids moléculaire d'au moins environ 430 000, ces deux composés étant présents en des quantités suffisantes pour qu'une injection, par voie sous-cutanée ou intramusculaire à un mammifère, d'environ 1 à 2 ml de la composition, conduise à la concentration de chacun d'eux, dans le système sanguin du mammifère, d'environ 10 à 50yg/ml. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la concentration de chacun des composes est comprise entre environ 10 et 30_ug/ml. 3. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la solution contient environ 5 à 40 mg du sel de l'acide hyaluronique et environ 2 à 20 mg de muramidase pour 1 à 2 ml de solution salée.