Brevet FR2464992A1 — publié le 19810320

246499Z Culture thermophile anaérobie productrice d'éthanol. La présente invention concerne une culture mixte de micro-organismes thermophiles anaérobies et plus particulièrement une culture mixte d'un organisme anaérobie glycolytique thermophile nouvellement découvert, Thermoanaerobactçr ethanolicus, et de Clos- tridium thermocellum. En outre, l'invention concerne le nouveau procédé pour produire de l'éthanol à partir de cellulose par fermen- tation.dans un milieu nutritif avec une culture mixte préparée à partir de cultures biologiquement pures de Thermoanaerobacter ethanolicus et de Clostridium thermocellum. On a isolé et caractérisé relativement peu de micro- organismes anaérobies qui poussent sur des hydrates de carbone (microorganismes glycolytiques) et donnent de l'éthanol dans des conditions thermophiles et thermophiles extrêmes. Des exemples représentatifs de bactéries anaérobies glycolytiques bien caractéri- sées,qui poussent dans un milieu de culture dans la gamme thermo- phile a thermophile extrême,appartiennent au genre Clostridium et comprennent: C. thermoaceticum, C. tartarivorum, C. thermosaccharo- lyticum, C. thermocellum, C. thermocellulaseum et C. thermohydrosul- furicum. Des souches de ces derniers organismes ont été isolées et caractérisées par J. Wiegel et L.G. Ljungdahl (voir Abstract I 75 de l'Abstract of the Annual Meeting of the American Society of Micro- biology, Las Vegas, Nevada, Etats-Unis d'Amérique, 1978 et J. Bac- teriology, septembre 1979, sous presse). Une souche néotype de C. thermohydrosulfuricum E 100-69 a été isolée des liqueurs d'une usine autrichienne de betteraves à sucre par F. Hollaus et U. Sleytr (voir Arch. Mikrobiol. 86, pages 129-146, 1972). Outre ces espèces bien connues, on a isolé et caracté- risé deux souches ne formant pas de spores, représentant de nouvelles espèces d'un nouveau genre. Les anaérobies thermophiles nouvellement découverts ont été isolés dans des cultures biologiquement pures et dénommés Thermoanaerobacter ethanolicus. Une souche représenta- tive de ce nouveau micro-organisme dans une sous-culture biologique- ment pure, dénommée JW 200, a été déposée dans la collection de souchesde l'American Type Culture Collection, à Rockville, Maryland, Etats-Unis d'Amérique, sous le n ATCC 31550. Dans l'isolement, la purification et la caractérisation de cette nouvelle espèce qui n'est pas un Clostridium, la demanderesse a trouvé que la nouvelle espèce est un producteur efficace d'éthanol à partir de divers hydrates de carbone, en particulier des mono- et disaccharides les plus courants. Thermoanaerobacter ethanolicus a été décrit par la demanderesse dans une demande de brevet déposée ce jour intitulée "Culture thermophile anaérobie et son application à la production d'éthanol" sous le n 80. Comme décrit dans cette demande, T. ethanolicus est cultivé dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions thermophiles anaérobies et utilisé dans un nouveau procédé pour produire de l'éthanol,qui consiste à soumettre des hydrates de carbone, en particulier les saccharides, à l'action de fermentation du nouveau micro-organisme T. ethanolicus dans une culture biologiquement pure pour former de l'éthanol et à récupérer ledit éthanol. Bien que T. ethanolicus fasse fermenter efficacement divers sucres pour donner de l'éthanol, l'une des caractéristiques de l'anaérobie est qu'il ne fait pas fermenter la cellulose. On sait qu'un micro-organisme anaérobie isolé en 1950, Clostridium thermocellum, fait fermenter la cellulose en donnant de l'hydrogène, du dioxyde de carbone, de l'éthanol, du formiate, de l'acétate, du lactate et, à un moindre degré, des acides dicarboxyliques, à des températures therraophiles (voir McBee, R. H., 1950, The anaerobic thermophilic cellulolytic bacteria. Bacteriol. Rev. 14, pages 51-63). Cependant, la demanderesse a découvert que, dans le système de cellulase clostridienne produit dans cette fermentation, certains des produits formés par l'action de la cellulase, tels que cellobiose et glucose, tendent à inhiber la croissance de C. thermocellum en réduisant le système de cellulase. D'autres sucres qui peuvent être présents dans un milieu de fermen- tation, comme le lactose, peuvent également inhiber la cellulase. Bien que C. thermocellum utilise ces sucres, la croissance est lente et le rendement en produits, tels que l'éthanol, est faible. Ainsi donc, C. thermocellum sous forme biologiquement pure, bien qu'il soit utile pour dégrader la cellulose, ne fait pas fermenter effi- cacement le substrat de sucre produit et, en effet, la fermentation est inhibée par l'accumulation du substrat. Une souche représentative de.C. thermocellum nouvellement isolée, dénommée JW 200 a été déposée à la collection de souches de l'American Type Culture Collection, à Rockville, Maryland, Etats-Unis d'Amérique sous le n0 ATCC 31549. Ces micro-organismes sont, bien entendu, utilisables pour la fermentation anaérobie possible de divers hydrates de carbone, tels que les saccharides, et dans des cultures mixtes pour dégrader efficacement la cellulose pour la production d'éthanol et d'autres produits de fermentation dans des conditions thermophiles. La fer- mentation du sucre par la levure (espèce Saccharomyces), comme il est bien connu, doit être effectuée à moins d'environ 370C dans des conditions semi-aérobies pour donner de l'éthanol. En outre, les conditions doivent être soigneusement contrôlées pour éviter la contamination par des bactéries,champignons et moisissures nuisibles. L'invention a donc pour objet un nouveau système nutritif de culture mixte de micro-organismes produisant de l'éthanol dans des conditions thermophiles anaérobies. L'invention a également pour objet un procédé pour produire de l'éthanol par la combinaison de cultures biologiquement pures de certaines anaérobies thermophiles. L'invention a également pour objet la combinaison de cultures biolo- giquement pures du micro-organisme nouveau T. ethanolicus et du microorganisme connu C. thermocellum pour la fermentation efficace de la cellulose pour produire de l'éthanol. Selon l'invention, on propose une culture mixte pour le nouveau micro-organisme T. ethanolicus et C. thermo- cellum. Dans un milieu nutritif de culture mixte qui contient de la cellulose, on a combiné ces micro-organismes et on les a cultivés pour la fermentation efficace de ladite cellulose pour produire des quantités récupérables d'éthanol. Cette nouvelle fermentation est effectuée en conditions thermophiles anaérobies. Outre ce nouveau procédé, l'invention concerne un procédé pour la production directe d'éthanol à partir de cellulose,qui consiste à soumettre ladite cellulose à l'action de fermentation du nouveau micro-organisme T. ethanolicus combiné avec C. thermocellum dans un milieu nutritif de culture mixte pour former de l'éthanol et à récupérer ledit éthanol. Ce procédé est mis en oeuvre dans des conditions thermo- philes et dans des conditions thermophiles extrêmes anaérobies. Pour les buts de l'invention, le terme "thermophile"' désigne une température de culture comprise entre environ 45 et 70 C et le terme "thermophile extrême" désigne les températures de culture supérieures à environ 70 C. Sans vouloir limiter par une théorie particulière quel- conque le procédé de l'invention, il semble, d'après ce qui suit, que la combinaison de T. ethanolicus et C. thermocellum facilite fortement la dégradation de la cellulose, évite l'inhibition de la fermentation comme décrit ci-dessus et déplace la fermentation vers la production d'éthanol. Comme décrit dans la demande de brevet francais n 80 citée ci-dessus, le micro-organisme T. ethanolicus a été découvert et isolé dans des échantillons de boue de sources chaudes du Yellowstone National Park, Wyoming, Etats-Unis d'Amérique. Une souche JW-201 a été isolée dans une source acide, la Dragon Mouth, ayant un pH d'environ 5,5 et la seconde souche JW-200 dans une source alcaline, la White Creek, d'un pH d'environ 8,8. Les souches sont très semblables et ont été découvertes en association avec les souches de Clostridium thermophiles anaérobies mentionnées ci-dessus. Bien que les nouvelles souches de micro-organismes partagent l'aptitude à faire fermenter les hydrates de carbone à des températures thermophiles avec les Clostridium mentionnés ci-dessus, elles ne forment pas de spores et sont donc exclues du genre Clos- tridium. Au vu de la morphologie et des caractéristiques de fermentation, on pense que ces souches sont un nouveau genre, l'espèce désignée ciaprès Thermoanaerobacter ethanolicus, la souche ATCC 31550, étant représentative de ces souches. L'isolement de T. ethanolicus sous une forme biologi- quement pure a été effectué en utilisant la technique anaérobie selon Hungate, Bacteriol. Rev. 14, pages 1-49, modifiée par Bryant et Robinson, J. Dairy Science 44, pages 1446-1456, cette technique étant familière à l'homme de l'art. Le milieu utilisé pour les cultures d'isolement et d'enrichissement et pour entretenir des souches isolées présente la composition préférée suivante: KH2PO4: 1,5 g/l; Na2HP04,12H20: 4,2 g/l; NH4C1: 0,5 g/l; MgC12: 0,18 g/l; extrait de levure (Difco): 2,0 g/l; glucose: 8,0 g/l; et solution minérale de Wolfe: 5 ml. Le milieu est préparé en conditions anaérobies et doit être conservé en atmosphère de gaz inerte tel qu'azote ou argon. Le pH du milieu est de l'ordre d'environ 6,8 à 7,8, de préférence 7,3, et on l'ajuste selon le besoin avec une solution anaérobie,stérile de NaOH ou HC1. Les cultures de réserve sont entretenues sur le même milieu solidifié avec 2% de gélose et stockées à 4 C. Les cultures sur milieu liquide peuvent être conser- vées à -18 C après addition d'un égal volume de glycérol. Bien que le glucose soit le substrat hydrocarboné préféré dans le milieu nutritif cité à titre d'exemple, on peut utiliser d'autres monosaccharides, tels que xylose, ribose, mannose, fructose et galactose, et des disaccharides, tels que saccharose, lactose, maltose et cellobiose. La croissance a également lieu sur pyruvate, pectine et amidon. On notera que T. ethanolicus nécessite pour pousser de l'extrait de levure. Sans extrait de levure, on n'obtient pas de croissance dans les sous- cultures ultérieures. Bien que la croissance soit beaucoup plus faible qu'en présence de glucose, des concentrations d'extrait de levure de plus de 0,5% peuvent servir de seule source de carbone, d'azote et d'énergie. Cependant, comme on le verra dans l'exemple ci-après, les cultures pures de T. ethanolicus ne font pas fermenter la cellulose. On peut préparer convenablement des cultures biologi- quement pures de Thermoanaerobacter ethanolicus ATCC 31550 (JW 200) à utiliser selon l'invention en utilisant le même milieu nutritif que pour l'isolement en conditions anaérobies à des températures d'environ 36 à 78 C, la température optimale de croissance étant d'environ 68 C. La période de doublement à 68 C est d'environ 90 min. Cette croissance ne dépend pas du pH, en ce qu'elle a lieu dans la gamme de pH très large de 4,5 à 9,8. Pour la croissance optimale, le pH du milieu doit être compris entre environ 5,7 et 8,6, le pH préféré étant d'environ 7,3. Un certain nombre de chercheurs ont isolé, cultivé et caractérisé Clostridium thermocellum. Outre le travail de McBee mentionné ci-dessus, on citera: Alexander, J. L. 1969. Purification and specificity of cellobiose phosphorylase from Clostridium thermocellum. J. Biol. Chem. 243, pages 2899-2904. Patni, N. J. et J. K. Alexander. 1971a. Utilization of glucose by Clostridium thermocellum; Presence of glucokinase and other glycolytic enzymes in cell extracts. J. Bacteriol. 105, pages 220-225. Patni, N. J. et J. K. Alexander. 1971b. Catabolism of fructose and mannitol in Clostridium thermocellum. Presence of phosphoenol- pyruvate: fructose phosphotransferase, fructose 1-phosphate kinase, phosphoenolpyruvate; mannitol phosphotransferase and mannitol 1-phosphate dehydrogenase in cell extracts. J. Bacte- riol. 105, pages 226-231. Lee, B. H. and T. H. Blackburn. 1975. Cellulose production by a thermophilic Clostridium species. Appl. Microbiol. 30, pages 346-353. Ng, T. K., P. J. Weimer and J. G. Zeikus. 1977. Cellulolytic and physiological properties of Clostridium thermocellum. Arch. Microbiol. 114, pages 1-7. La demanderesse a isolé une souche de C. thermocellum ATCC 31549 (JW 20) dans une balle de coton en Louisiane, Etats-Unis d'Amérique. Comme avec T. ethanolicus, cette souche de C. thermo- cellum a été isolée sous forme biologiquement pure en utilisant la technique de Hungate,modifiée par Bryant et Robinson. Le milieu nutritif décrit ci-dessus utilisé pour T. ethanolicus a été utilisé pour l'isolement et l'enrichissement de C. thermocellum, sauf que l'on utilise 10,8 g/l de cellulose au lieu de glucose pour le substrat et on augmente la quantité d'extrait de levure à 5,0 g/l. Le milieu est préparé en conditions anaérobies et doit être stocké en atmosphère de gaz inerte tel qu'azote ou argon. Le pH du milieu est dans la gamme d'environ 6,8 à 7,8, de préférence 7,3. On peut avantageusement faire pousser C. thermocellum dans le même milieu de substrat que pour l'isolement en conditions anaérobies à des températures entre 45 et 65 C, la température optimale de croissance étant d'environ 60 C. Le pH préféré pour la croissance est d'environ 7,5. Le même milieu contenant de la cellulose utilisé pour l'isolement et la culture de C. thermocellum est utilisé pour la fermentation combinée de la cellulose utilisant T. ethanolicus et C. thermocellum en conditions thermophiles anaérobies. Comme on le verra dans l'exemple ci-après, cette fermentation directe de la cellulose donne un rendement notable en éthanol. On produit jusqu'à 1,46 mole d'éthanol par motif glucose de la cellulose à une température de 60 C et à un pH de 7,5 en conditions anaérobies. L'éthanol produit dans cette fermentation peut etre récupéré par des techniques classiques de distillation. L'exemple suivant illustre l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE Fermentation de la cellulose On effectue la fermentation de la cellulose en utilisant T. ethanolicus et C. thermocellum en cultures pures et en cultures mixtes. Toutes les fermentations sont effectuées en atmosphère d'argon à 60 C pendant 168 h. Les incubations sont effectuées dans 50 ml du milieu décrit ci-dessus avec 540 mg de cellulose (au lieu de glucose) et 0,5% d'extrait de levure. pH initial 7,5. Les résultats de ces fermentations sont indiqués dans le tableau ci-dessous. Dans l'essai A, le pH est contrôlé pendant la fermentation et maintenu à 7:5, tandis que, dans l'essai B, on laisse le pH diminuer par suite de la formation d'acideso TABLEAU C. thermocellum T. ethanolicus C. thermocellum + T. ethanolicus _ _ _ _ _ _ _ _ _ A B Cellulose mg 351 4 500 372 fermentée mM 2,13 0,024 3,05 2,27 Ethanol produit mM, 179 0,05 4,45 2,33 Ethanol(mole) 0,84 - 1,46 1,05 par motif glucose de la cellulose Cet exemple montre que la combinaison de C. thermocellum avec T. ethanolicus augmente fortement le taux de dégradation de la cellulose et que cette combinaison déplace la fermentation vers une production nettement plus grande d'éthanol. Cet exemple indique également que l'on obtient les meilleurs résultats lorsque l'on contrôle le pH au cours de la fermentation. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustra- tion et que l'homme de l'art pourra y apporter des modifications sans sortir du cadre de l'invention. R E V E N D I CA T I 0 N S 1. Culture microbiologique mixte, caractérisée en ce qu'elle contient une souche dénommée Thermoanaerobacter ethanolicus et une souche dénommée Clostridium thermocellum. 2. Culture mixte selon la revendication 1, caractérisée en ce que la souche Thermoanaerobacter ethanolicus est T. ethanolicus -ATCC 31550. 3. Culture mixte selon la revendication 1, caractérisée en ce que la souche Clostridium thermocellum est C. thermocellum ATCC 31549. 4. Utilisation de la culture mixte selon la revendication 1 pour la production d'éthanol en quantités récupérables par fermen- tation dans un milieu nutritif aqueux contenant de la cellulose. 5. Culture mixte, caractérisée en ce qu'elle comprend une souche biologiquement pure de Thermoanaerobacter ethanolicus et une souche de Clostridium thermocellum dans un milieu nutritif aqueux. 6. Culture thermophile anaérobie mixte, caractérisée en ce qu'elle contient Thermoanaerobacter ethanolicus et Clostridium thermocellum. 7. Procédé microbiologique, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver Thermoanaerobacter ethanolicus et Clostridium thermocellum dans un milieu nutritif mixte contenant de la cellulose en conditions thermophiles anaérobies jusqu'à production d'une quantité récupérable d'éthanol. 8. Procédé pour la production d'éthanol à partir de cellulose, caractérisé en ce que l'on soumet ladite cellulose à l'action de fermentation de Thermoanaerobacter ethanolicus et de Clostridium thermocellum dans un milieu nutritif mixte pour former de l'éthanol et on récupère ledit éthanol. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on met en oeuvre ledit procédé en conditions thermophiles anaérobies. 10. Ethanol, caractérisé en ce qu'il est produit par un procédé selon la revendication 7, 8 ou 9.