Brevet FR2472608A1 — publié le 19810703

La présente invention concerne une nouvelle glucose-6-phosphate-déshydrogénase utile et son procédé de prépara- tion. Plus particulièrement l'invention concerne une glucose-6- phosphate-déshydrogénase que l'on peut utiliser pour la détermination de glucose, du glucose-6-phosphate, de l'hexokinase et de l'hexose- 6phosphate-isomérase dans des analyses cliniques médicales et dans la détermination du fructose et du glucose dans l'industrie alimen- taire ainsi qu'un procédé pour préparer une telle déshydrogénase. Depuis peu en analyses médicales et en analyses alimentaires, on utilise beaucoup d'enzymes comme catalyseurs en raison de leur grande spécificité en ce qui concerne la nature de la réaction, le substrat (c'est-à-dire la substance sur laquelle on agit) et les caractéristiques optiques. Comme il est bien connu, la détermination des teneurs en glucose et en hexokinase des liquides de l'organisme est un paramètre important en analyses cliniques. La détermination des teneurs en glucose et en fructose des aliments est également un paramètre important dans la fabrication du sucre interverti. Actuellement on utilise beaucoup la glucose-6-phosphate- déshydrogénase pour déterminer ces paramètres en raison de sa très grande spécificité en ce qui concerne la réaction et lê substrat et ses caractéristiques optiques et c'est donc actuellement une des enzymes les plus importantes. Bien que les micro-analyses utilisant des enzymes présentent les avantages précités, les enzymes sont très labiles et elles perdent leur activité catalytique après des durées relativement brèves de quelques jours à plusieurs semaines même lorsqu'on les maintient en dessous de la température ordinaire. Donc la labilité des enzymes limite beaucoup les micro-analyses utilisant des enzymes. Les préparations de glucose-6-phosphate-déshydrogénase connues à ce jour sont également labiles et la glucose-6-phosphate-déshydrogénase provenant de levures décrites dans the Journal of Biological Chemis- try, vol. 236, p. 1225 (1961) perd généralement la plupart de son activité en une à trois semaines en solution aqueuse à la température ordinaire. Le prix élevé est également une autre raison qui empêche la généralisation de l'emploi de la glucose-6-phosphate- déshydrogénase dans les micro-analyses médicales et alimentaires. La réaction de glucose-6-phosphate-déshydrogénase nécessite toujours un coenzyme et la plupart des analyses classiques utilisant la glu- cose-6-phosphate-déshydrogénase nécessitent l'emploi de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (appelé ci-après NADP). Comme il est bien connu, le NADP est très coûteux. On connaît de nombreuses pré- parations de glucose-6-phosphate-déshydrogénase, comme décrit par exemple dans Advances in Enzymology, publié par Alton Meister, vol. 48 pp 97-191, et la plupart de ces préparations nécessitent du NADP comme coenzyme dans une réaction enzymatique, à l'exception de celles qui dérivent le Leuconostoc mesenteroides et de Pseudomo- nas W 6 qui peuvent être utilisés avec du nicotinamide adénine dinu- cléotide (appelé ci-après NAD) qui coûte au moins dix fois moins que le NADP. Cependant les glucose-6-phosphate-déshydrogénàses produites à partir de Leuconostoc mesenteroides et de Pseudomonas W 6 ne sont pas thermostables et il est difficile de les conserver longtemps, et par exemple on observe une inactivation de l'enzyme lorsqu'on la laisse séjourner pendant une à deux semaines à la température ordi- naire. On recherche donc pour maximaliser les avantages des analyses utilisant une glucose-6-phosphate-déshydrogénase, une glucose-6- phosphate-déshydrogénase qui soit stable et compatible avec des - coenzymes peu coûteux (c'est-a-dire autres que le NADP coûteux). Un des objets de l'invention est une glucose-6- phosphate-déshydrogénase qui est thermostable, ne perd pas son acti- vité pendant des durées prolongées et qui est compatible avec un coenzyme peu coûteux (c'est-à-dire autre que le NADP coûteux). La demanderesse a découvert qu'un micro-organisme du genre Bacillus produit une glucose-6-phosphate-déshydrogénase possédant les propriétés précédemment décrites. L'invention concerne donc une glucose-6-phos- phate-déshydrogénase, qui, lorsqu'on l'incube pendant environ 15 mi- nutes dans une solution tampon à environ 50 C,conserve au moins % de son activité initiale, ainsi qu'un procédé pour produire une telle glucose-6-phosphate-déshydrogénase par culture d'un micro- organisme du genre Bacillus et récupération dans la culture d'une glucose6-phosphate-déshydrogénase qui,lorsqu'on l'incube pendant environ 15 minutes dans une solution tampon à environ 500C, conserve au moins 80 % de son activité initiale. La glucose-6-phosphate-déshydrogénase de l'inven- tion est très stable vis-à-vis de la chaleur si bien qu'après isole- ment on peut la conserver plus longtemps que la glucose-6-phosphate- déshydrogénase classique. L'enzyme est très utile en recherche bio- chimique, dans l'industrie alimentaire et pour les analyses cliniques. De plus l'enzyme est compatible avec le NAD qui est beaucoup moins coûteux que le NADP si bien qu'on peut l'utiliser de façon avanta- geuse comme réactif peu coûteux. D'autres caractéristiques et avantages de l'in- vention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre de plusieurs exemples de réalisation en se référant aux dessins annexés sur lesquels: - la figure 1 est un graphique montrant les activités résiduelles (%) de la glucose-6-phosphate-déshydrogénase de l'invention (courbe A) et d'une glucose-6-phosphate-déshydrogé- nase provenant de levures (courbe B) après chauffage à diverses températures ( C) pendant 15 minutes; et - la figure 2 est un graphique semblable à celui de la figure 1 montrant les activités résiduelles (%) de la glu- cose-6-phosphate-déshydrogénase de l'invention (courbe C) et d'une glucose-6-phosphate-déshydrogénase provenant de levures (courbe D) après conservation à 30 C pendant la durée (j) indiquée. La glucose-6-phosphate-déshydrogénase de l'inven- tion, lorsqu'on l'incube pendant environ 15 minutes dans une solution tampon & environ 50'C,conserve au moins environ 80 %, de préférence au moins environ 90 % et mieux environ 100 % de son activité initiale. En particulier la déshydrogénase de l'invention conserve au moins environ 80 % de son activité initiale lorsqu'on la traite pendant environ 15 minutes avec une solution tampon à environ 57 C. La con- centration et le pH de la solution tampon ne sont pas limités à des valeurs particulières mais généralement la concentration est comprise entre 5 et 500 mmol/l (ci-après "mM") et le pH est compris entre 7 et 10, 5. Selon l'invention on utilise de façon avantageuse une solution de tampon Tris-HCl 100 mM (pH environ 9,0) contenant environ mM de chlorure de potassium. Les propriétés physico-chimiques de la glucose-6- phosphate-déshydrogénase de l'invention figurent ci-après. 1. Fonction de l'enzyme. La glucose-6-phosphate-déshydrogénase de l'inven- tion catalyse les réactions suivantes: hexose-6-phosphate + coenzyme (forme oxydée) = acide hexose-aldonique-6-phosphate + coenzyme (forme réduite). L'expression "hexose-6-phosphate" désigne de façon générale le glu- cose-6-phosphate, le mannose-6-phosphate et le galactose-6-phosphate et l'expression "acide hexose-aldonique-6-phosphate" désigne de façon générale l'acide gluconique-6-phosphate, l'acide mannonique-6-phos- phate et l'acide galactonique-6-phosphate. Le coenzyme peut être le NADP ou le NAD. 2. Spécificité du substrat. La constante de Michaelis (Km) de l'enzyme pour le glucose-6-phosphate est d'environ 0,16 mM. Les vitesses de réaction pour le mannose-6- phosphate et le galactose-6-phosphate pour une concentration donnée du substrat sont d'environ 40 % et 20 % de la vitesse pour le glucose-6- phosphate. Les valeurs de Km pour le NADP et le NAD sont respectivement d'environ 0,016 et 1,64 mM. 3. pH optimal. Environ 9,0 (à 30 C). 4. Gamme de stabilité au pH. On observe une faible désactivation de l'enzyme lorsqu'on l'incube entre pH 7,0 et 10,5 et à 4 C pendant 24 heures. 5. Gamme des températures optimales d'activité. Les températures optimales d'activité sont com- prises entre 25 C et 75 C. L'activité s'accroit à pH 8,9 lorsque la température s'élève de 25 C à 75 C. 6. Résistance à la chaleur. L'enzyme résiste au chauffage à 57 C pendant au moins 15 minutes. 7. Poids moléculaire. La chromatographie par filtration sur gel de Sephacryl S-200 (produit de Pharmacia Fine Chemical) montre que l'enzyme a un poids moléculaire d'environ 230 000. Les glucose-6- phosphate-déshydrogénases provenant de levures et de Leuconostoc mesenteroides ont un poids moléculaire d'environ 100 000 selon la chromatographie par filtration sur gel de Sephacryl S-200. 8. Détermination et définition de l'activité. On prépare un mélange 2mM en glucose-6-phosphate, 0,5 mM en NADP et 5 mM en chlorure de magnésium dans du tampon Tris- HC1 50 mn ayant un pH de 8,9. On ajoute au mélange une quantité appropriée de glucose-6-phosphate-déshydrogénase et on mesure l'ac- croissement de l'absorption de la forme réduite du NADP (NADPH) à 340 nm pour une période de temps donnée. Si, par définition, une unité d'activité enzymatique provoque un accroissement de l'absorp- tion correspondant à une micromole de NADPH à 340 nr par minute, l'enzyme purifiée a une activité d'environ 100 unités/mg à 30 Co 9. Pureté. Par électrophorèse en disques sur acrylamide à 7,5 % a pu 9,4, un échantillon purifié de l'enzyme migre vers l'élec- trode positive en formant une bande unique. Lors de l'électrophorèse avec du dodécylsulfate de sodium, l'échantillon migre également vers l'électrode positive et forme une bande unique. 10. Analyse de composition. Les proportions des amino-acides dans l'enzyme sont exprimées ci-après en pourcentages molaires: acide aspartique 11,04 %, thréonine 5,42 %, sérine 4,56 %, acide glutamique 11,86 %, proline 3,66 %, glycine 6,67 %, alanine 7,92 %, cystine (cystéine) 0,62 %, valine 6,09 %, méthionine 1,97 %, isoleucine 5,59 %, leu- cine 8,04 %, tyrosine 3,72 %, phénylalanine 4,88 7.%, lysine 5,28 %, histidine 3,40 %, arginine 6,56 % et tryptophane 2,72 %. 11. Structure cristalline. La structure cristalline de l'enzyme n'a pas encore été déterminée car on ne l'a pas encore cristallisée. On peut pour produire la glucose-6-phosphate- déshydrogénase de l'invention la récupérer dans une culture d'un microorganisme du genre Bacillus. Le micro-organisme utilisé pour produire la glucose-6-phosphate-déshydrogénase de l'invention est l'un quelconque de ceux qui appartiennent au genre Bacillus et qui sont capables de produire cette déshydrogénase. On préfère les Bacil- lus stearothermophilus tels que par exemple les souches ATCC 7953, 7954, 8005, 10149, 12980 et NCA 1503. On peut utiliser diverses substances nutritives pour cultiver un micro-organisme du genre Bacillus dans l'invention. Parmi les sources de carbone, figurent des saccharides tels que le glucose, le saccharose, le fructose, l'hydrolysat d'amidon, la mélasse et la liqueur résiduaire de fabrication de la pâte à papier au sulfite, des acides organiques tels que l'acide acétique et l'acide lactique, des alcools utilisables par le micro-organisme tels que l'alcool éthylique et l'alcool butylique, des graisses et des huiles, des acides aliphatiques et la glycérine; parmi les sources d'azote figurent des composés minéraux et organiques tels que le sulfate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, le phosphate d'ammonium, l'ammoniac, les amino-acides, la peptone, l'extrait de viande et l'extrait de levure; parmi les sels minéraux figurent les sels de potassium, de sodium, d'acide phosphorique, de zinc, de fer, de magnésium, de manganèse, de cuivre, de calcium et de cobalt; parmi les substances nutritives facultatives figurent des traces de sels métalliques, l'infusion de mais, les vitamines et les acides nucléi- ques. On peut utiliser les milieux nutritifs connus généralement utilisés pour cultiver les micro-organismes. On cultive un micro-organisme du genre Bacillus en aérobiose dans les milieux précédemment décrits pendant environ 2 à 6 heures à une température d'environ 20 à 800C, de préférence d'environ 40 à 70C et mieux d'environ 60C. Pour la préparation industrielle, on préfère effectuer une culture continue avec un taux de dilution du micro-organisme étudié ajusté pour qu'il soit supé- rieur à 90 % du taux maximal de croissance spécifique (pmax) d'un microorganisme cultivé dans des conditions de culture continue, exprimé par le taux de dilution en 1/h du micro-organisme étudié. La culture continue avec ajustement du taux de dilution pour qu'il soit supérieur à 90 % du umax du micro-organisme, produit plus de cellules que n'en produit un procédé discontinu et la teneur en glucose-6-phosphatedéshydrogénase par cellule est supérieure à la valeur maximale obtenue dans un procédé discontinu. En particulier une culture continue à un taux de dilution maintenu proche de pmax, produit environ 1,3 fois plus de glucose-6-phosphate-déshydrogénase qu'un procédé discontinu. Si on effectue une culture continue avec un taux de dilution inférieur à 0,9 pmax, la concentration en glu- cose-6-phosphate-déshydrogénase dans les cellules tend à être infé- rieure à celle observée dans un procédé discontinu. Le taux de dilution (appelé ci-après D) qu'on utilise dans l'invention est représenté par la formule suivante D = F o D taux de dilution (1/h) F débit (1/h) auquel on introduit la liqueur de fermentation dans le fermenteur et on l'en prélève, et V volume (1) de liqueur de fermentation dans le fermenteur. Le symbole "lmax" qu'on utilise dans l'invention est le taux maximal de croissance spécifique (1/h) d'un micro-orga- nisme cultivé dans des conditions de culture continue et c'est le taux de croissance spécifique que l'on observe au moment de l"'en- trainement", c'est-à-dire le moment o le micro-organisme que l'on cultive dans un chimiostat (voir Herbert, Elsworth et Telling, Jour- nal of General Microbiology, vol. 14, n08, pp 601-622, 1956) ne maintient plus une concentration stationnaire en cellules par suite d'un accroissement de D. On peut déterminer de la façon suivante le pmax d'un micro-organisme thermophile utilisé dans l'invention: on ensemence 1,5 à 20 1 d'un milieu nutritif dans un fermenteur de 2 è litres avec le micro-organisme pour effectuer une culture dis- continue entre 40 et 750C, de préférence entre 48 et 61C,à un pH compris entre 4,5 et 9,0 et de préférence entre 6,0 et 8,0; lorsque la croissance du micro-organisme a réduit la teneur en source de carbone dans le bouillon en dessous de 0,01 %. en poids, on alimente le fermenteur avec un milieu nutritif ayant la même composition que le milieu introduit au départ, pour commencer une culture en continu dans laquelle le seul facteur inhibant la croissance est une source de carbone. On établit ainsi un chimiostat. Lorsque la cul- ture continue atteint une phase stationnaire, on accroît progres- sivement D en mesurant la concentration en cellules dans la liqueur de fermentation et la concentration résiduelle en source de carbone à des intervalles de temps donnés et lorsque D dépasse le taux de croissance spécifique du micro-organisme, la concentration en cellules qui était stable commence à diminuer tandis que la teneur de la source de carbone commence à s'accroître. Le phénomène selon lequel un accroissement de D fait sortir la culture continue de la phase stationnaire est appelé "entraînement" et le taux de croissance spécifique au moment de l'entraînement est pmax. La valeur de pmax varie pour un organisme donné selon la nature du milieu nutritif et les conditions de culture mais pour une combinaison donnée de micro- organisme, de milieu nutritif et de conditions de culture, pmax est constant et par conséquent, lorsqu'on l'a mesuré, il fournit une valeur fiable pour une opération prolongée. Selon l'invention on limite D à une valeur pré- déterminée dans une culture continue qu'on effectue après avoir atteint une concentration cellulaire désirée dans une préculture et une culture discontinue classiques. On peut passer à la culture con- tinue à un moment quelconque de la culture discontinue mais de pré- férence on passe en culture continue dans le dernier stade de la phase de croissance logarithmique de la culture discontinue et on doit fixer D à une valeur prédéterminée aussi rapidement que possible. Un mode de réalisation du procédé de l'invention est'décrit ci-après après relativement à la culture de Bacillus stearothermophilus NGA 1503 dans un milieu de culture contenant du glucose comme source de carbone. Lorsqu'on effectue une culture chimiostatique continue dans un fermenteur de 30 litres (contenant litres de milieu), à une température optimale d'environ 570C et un pH optimal d'environ 6,8, lepmax du micro-organisme est de 1,1 (11h). Donc pour effectuer une culture continue avec D égal à ymax, on doit introduire en continu dans le fermenteur du milieu nutritif frais ayant la même composition que le milieu utilisé pour la culture discontinue à raison de 1,1 fois le volume initial intro- duit dans le fermenteur par heure, soit à un débit de 22 1/h selon la formule précédente et prélever en continu la même quantité. On peut effectuer cette introduction et ce prélèvement avec une pompe doseuse. On récupère ensuite dans le milieu de culture la glucose-6-phosphate-déshydrogénase de l'invention. On peut récu- pérer l'enzyme sous forme de cellules vivantes séparées, de cellules vivantes traitées, d'une enzyme brute ou d'une enzyme purifiée. Pour la purification, on peut utiliser une technique classique de puri- fication des enzymes; après centrifugation ou séparation d'autre façon appropriée, on homogénéise les cellules avec un homogénéiseur Manton Gaulin ou Dyno-mill, une presse French ou des ultrasons puis on centrifuge pour éliminer les membranes cellulaires et obtenir un extrait cellulaire que l'on traite avec du sulfate de strepto- mycine ou du sulfate de protamina puis qu'éventuellement on précipite par le sulfate d'ammonium, l'acétone ou la chaleur. Si une purifi- cation complémentaire est nécessaire, on peut combiner les techniques précédentes à une chromatographie par échange d'ions sur une colonne de DEAE-cellulose, une chromatographie d'absorption sur hydroxy- apatite ou une chromatographie de perméation de gel sur Sephadex. (Sephadex = dextrane réticulé commercialisé par la Société Pharmacia A.B.). On sépare ainsi de la culture et on purifie la glucose-6- phosphate-déshydrogénase de l'invention. La glucose-6-phosphate-déshydrogénase de l'in- vention est très stable à la chaleur si bien qu'après isolement on peut la conserver pendant une durée plus importante que les prépa- rations de glucose-6-phosphate-déshydrogénase existantes. Donc la déshydrogénase de l'invention peut être utilisée de façon particu- lièrement avantageuse pour la recherche biochimique, l'industrie alimentaire et les analyses cliniques. Par exemple on peut mesurer de façon très précise la teneur en glucose d'aliments ou de liquides de l'organisme avec un liquide réactionnel constitué de glucose-6- phosphate-déshydrogénase de l'invantion, d'hexokinase, de NAD, de ATP et de chlorure de magnésium. La teneur en glucose des aliments est un paramètre important de l'analyse opératoire dans la fabri- cation du sucre interverti et la teneur en glucose des liquides de l'organisme est utile pour le diagnostic du diabète. Dans une autre application, on peut déterminer l'activité de la phosphoglucose- isomérase par mesure de la teneur en glucose-6-phosphate d'un liquide de l'organisme avec un liquide réactionnel constitué de la glucose-6- phosphate-déshydrogénase de l'invention, de NAD et de chlorure de magnésium. On utilise cette activité comme paramètre pour l'examen de cancers tels que les métastases du cancer du sein. La glucose-6-phosphate-déshydrogénase de l'in- vention agit comme un coenzyme avec le NAD qui est un coenzyme beau- coup moins cofiteux que le NADP si bien que l'on peut utiliser de façon avantageuse un réactif peu coûteux à base de coenzyme. L'invention est illustrée par les exemples, exemples comparatifs et exemples de référence suivants. Exemple 1 et exemple comparatif 1 On ajuste a pH 7,0 et on stérilise par chauffage à 115 C,pendant 10 minutes, 250 litres d'un milieu contenant 0, 5 g/dl de polypeptone, 0,5 g/dl d'extrait de levure, 1,0 g/dl de saccharose, 0,13 g/dl de sulfate de potassium, 0,644 g/dl de phosphate trisodique, 0,027 g/dl de sulfate de magnésium, 0,032 g/dl d'acide citrique, 0,0007 g/dl de sulfate ferreux et 0,015 g/dl de sulfate de manganèse. On ensemence ensuite le milieu avec une souche de Bacillus stearo- thermophilus NCA 1 503 et on cultive en aérant à 60 C pendant 3 heures sous une pression manométrique de 0,5 bar. Immédiatement après la culture, on recueille 700 g de cellules avec un centrifugeur de Laval refroidipar l'eau. On congèle les cellules et on met 300 g de l'échantillon congelé en suspension dans 600 g de tampon phosphate 0,1 M (pH 7,5) puis après homogénéisation complète avec une presse French, on élimine les membranes cellulaires par centrifugation pour obtenir un extrait brut contenant la glucose-6-phosphatedéshydrogénase. A 600 ml de l'extrait brut, on ajoute 300 ml de sulfate de-protamine aqueux à 1 7% et on agite soigneusement le mélange. On élimine le précipité par centrifugation et on obtient un surnageant contenant de la pro- tamine. On ajoute progressivement du sulfate d'ammonium solide au surnageant jusqu'à 50 % de la saturation à 4 C. On recueille le précipité par centrifugation et on le dissout dans du tampon phos- phate 0,1 M (pH 7,5). On dessale la solution par dialyse contre une quantité vingt fois supérieure de tampon phosphate 0,1 M (pH 7,5). On fait passer l'enzyme brute liquide ainsi obtenue à travers une colonne de DEAE-cellulose équilibrée avec du tampon phosphate 20 mM (pH 7,5), 2 mM en mercaptoéthanol et 2mM en éthylènediaminetétraacétate de sodium. Après élution avec une solu- tion constituée de chldorure de potassium dans du tampon phosphate ayant la même composition que ci-dessus, on obtient la glucose-6- phosphate-déshydrogénase désirée pour une concentration en KC1 voi- sine de 0,15 M. On combine les fractions actives, on concentre, on dessale et on fait passer a travers une colonne d'hydroxy-apatite équilibrée avec du tampon phosphate 5 mM (pH 7,5) et on élue avec un gradient linéaire allant du tampon phosphate 5 mM jusqu'au tam- pon phosphate 250 mM. On obtient la glucose-6-phosphate-déshydro- génase désirée pour une concentration du tampon voisine de 75 mM. On combine les fractions actives, on les concentre, on les dessale et on les soumet à une chromatographie avec de l'Ultrogel ACA 34 (produit de LKB-Produkter A.B., Suède) avec un agent d'élution constitué de tampon Tris-HCl 50 mM ayant une concentration en chlo- rure de potassium de 0,1 M. On fait passer les fractions actives obtenues à travers une colonne de DEAE-Sephadex A-50 équilibrée avec du tampon phosphate 30 mM (pH 7,7) ayant une concentration de 2 mM en mercaptoéthanol et de 2 mM en éthylènediaminetêtraacé- tate de sodium et on élue avec un gradient linéaire de chlorure de potassium compris entre 0,1 et 0,4 M dans un tampon ayant la même composition que ci-dessus. On obtient ainsi la glucose-6-phosphate- déshydrogénase purifiée pour une concentration en chlorure de potas- sium voisine de 0,2 M. La glucose-6-phosphate-déshydrogénase ainsi obtenue migre vers l'électrode positive lors d'une électrophorèse en disques à pH 9,4 avec de l'acrylamide a 7,5 % en formant une bande unique. On obtient un pic unique pour un poids moléculaire d'environ 230 000 par chromatographie sur Sephadex G-200. Le rendement de l'enzyme est d'environ 10 mg et son activité est d'environ 100 unités/mg. Le degré de purification de l'enzyme est d'environ 1 500 par rapport à l'extrait brut auquel on attribue la valeur 1. On compare la stabilité de la glucose-6-phosphate- déshydrogénase de l'invention à celle d'une glucose-6-phosphate- déshydrogénase provenant d'une levure préparée dans l'exemple com- paratif 1. Les résultats sont illustrés par les figures 1 et 2. La figure 1 montre les activités résiduelles des deux enzymes après chauffage pendant 15 minutes à diverses températures dans du tampon Tris 100 mM (pH 9,0) ayant une concentration en chlorure de potassium de 100 mM. Sur cette figure la courbe A correspond à la glucose-6-phosphate- déshydrogénase de l'invention et la courbe B à la glucose-6-phosphate- déshydrogénase provenant d'une levure. La figure 2 illustre la variation en fonction du temps des activités résiduelles des deux enzymes lorsqu'on les conserve à 30 C dans du tampon Tris 100 Nl (pH 9,O). Sur la figure la courbe C correspond à la glucose-6-phosphate déshydrogénase de l'invention et la courbe D à la glucose-6-phosphate-déshydrogénase provenant d'une levure. Comme lemonrent nettement les deux figures, la glucose-6-phosphate-déshy- drogénase provenant d'une levure perd de façon irréversible la quasi- totalité de son activité lorsqu'on la traite à 50 C pendant 15 mi- nutes tandis que la glucose-6-phosphate-déshydrogénase de l'invention ne perd pas du tout son activité lorsqu'on la traite à 50 C. Lorsqu'on la traite à 30 C, la glucose-6-phosphate-déshydrogénase provenant d'une levure perd de façon très importante son activité en 10 à jours tandis que la glucose-6-phosphate-déshydrogénase de l'in- vention ne présente pas de diminution de l'activité même après jours de conservation. Donc la glucose-6-phosphate-déshydrogénase de l'invention présente une stabilité étonnante à la chaleur ce qui indique une bonne aptitude à la conservation. Les préparations de glucose-6-phosphate-déshydrogénase précédemment connues sont totale- ment dépourvues de cette qualité. Exemples 2 à 5 Micro-organisme utilisé: Bacillus stearothermophilus NCA 1503. Composition du milieu nutritif: pour préparer un milieu dans lequel la source de carbone est le glucose,-on dissout les constituants suivants dans 1 litre d'eau du robinet: glucose 1,3 g, extrait de levure (produit d'Oriental Yeast Co., Ltd.) 1,0 g, peptone (produit de Difco) 0,5 g, phosphate monopotassique 0,5 g, phosphate disodique dodécahydraté 0,5 g, sulfate de magnésium heptahydraté 0,1 g, sul- fate de zinc heptahydraté 0,01 g, sulfate de manganèse heptahydraté 0,01 g, sulfate de cuivre pentahydraté 0,01 g, chlorure de cobalt *hexahydraté 0,01 g. Stade de croissance: on place 20 ml du milieu nutritif ci-dessus dans un flacon conique de 100 ml et on place 100 ml du même milieu nutritif dans un ballon conique de 500 ml et après avoir bouché chaque flacon au coton on stérilise les milieux à la vapeur d'eau pendant 10 minutes à 121 C sous 1 bar. Après refroidissement, on ensemence en conditions aseptiques le milieu du flacon de 100 ml avec environ 5 mg d'un échantillon lyophilisé de Bacillus stearo- thermophilus NCA 1503 fourni par l'American Type culture Collection. On soumet le milieu à une culture avec agitation rotative (160 tr/min) pendant 24 heures à 55 C avec un agitateur rotatif (produit de Taka- saki Seisakusho Co., Ltd.), le micro-organisme se développe et le degré de trouble s'élève au point que l'absorption à 660 nm (mesurée avec un spectrophotomètre modèle 101 de Hitachi Ltd., et appeléeci- après DO660 nm) est de 0,8- à 10. On transplante environ 5 ml de la culture de micro-organismes (inoculum) dans le milieu du flacon de 500 ml et on effectue une culture avec agitation rotative pendant quelques heures dans les mêmes conditions que ci-dessus. Lorsque la D0660 nm atteint environ 1,0, on arrête la culture. Stade de fermentaton: Dans un fermenteur de 30 litres, on introduit litres d'un milieu nutritif ayant la même composition que celui utilisé dans le stade de croissance précédent et on stérilise à 121 C sous 1 bar pendant 15 minutes. On introduit environ 1 litre d'inoculum dans le milieu puis on effectue une culture discontinue à 55 + 1 C et à pH 6,5-7, 0 (ajusté avec de l'hydroxydede sodium 4 N) en introduisant 20 litres d'air/min et en agitant à 900 tr/min. Comme la culture s'accompagne d'un moussage, on ajoute une petite quantité d'un agent antimousse (KM-70 de Shinetsu Chemical Industry co., Ltd.). Environ 2,5 heures avec le début de la culture, la D0660 atteint 1,2 (0, 56 g de cellules sèches par litre) et la teneur en glucose dans la liqueur de fermentation devient inférieure à 0,01 % en poids si bien qu'on commence immédiatement la fermentation continue. Comme on a constaté que le,umax de Bacillus stearothermophilus NCA 1503 est de 1,4 (l/h) on introduit dans le fermenteur un milieu nutritif stérilisé ayant la même composition que celui utilisé dans le stade de croissance à un débit de 28,0 1/h et on-évacue la liqueur de fer- mentation du fermenteur au même débit. On maintient ainsi pmax à 1,00 (dans l'exemple 2) en effectuant une culture continue avec une quantité de milieu nutritif égale à 5 fois le volume de la liqueur de fermentation contenu dans le fermenteur. On effectue une culture continue dans les mêmes conditions que ci-dessus, si ce n'est que, dans l'exemple 3, la valeur de D est de 0,9)max (on introduit le milieu et on prélève la liqueur de fermentation à un débit de 25,2 1/h) etque,dans l'exemple 4, la valeur de D est de 0,75 pmax (débit d'introduction et de prélèvement: 21,0 1/h). On mesure la teneur en glucose-6-phosphate- déshydrogénase des cellules obtenues dans les exemples 2, 3 et 4, les résultats figurent dans le tableau I ci-desous. Le tableau I indique également la teneur en glucose-6-phosphate-déshydrogénase dans les cellules obtenues dans l'opération discontinue (dans l'exemple 5) qu'on effectue avant le passage a la culture continue. TABLEAU I Teneur en glucose- Rendement en Rendement en glucose- 6-phosphate-déshy- cellules (g de 6-phosphate-déshydro- drogénase (U/g de cellules sèches/ génase (U/l.h) Essai n cellules sèches) l.h) Exemple 2 98 0,65 63,7 Exemple 3 71 0,59 41,9 Exemple 4 65 0, 54 35,1 Exemple 5 69 0,23 15,9 Comme le montre nettement le tableau, les cel- lules produites par culture continueavec maintien de D à une valeur supérieure à 0,9 pmax, ont une teneur en glucose-6-phosphate-déshy- drogénase supérieure à celle obtenue par opération discontinue. Exemple 6 Dans un fermenteur de 30 litres, on introduit litres d'un milieu préparé par dissolution dans 1 litre d'eau du robinet d'un mélange de 1,3 g de glucose, 1,0 g de sulfate d'ammonium, 0,5 g d'extrait de levure, 0,5 g de phosphate monopotassique, 0,5 g de phosphate disodique et 0,1 g de sulfate de magnésium et on stéri- lise le milieu avec de la vapeur d'eau à 121 C sous 1 bar pendant minutes. On introduit dans le milieu stérilisé 1 litre d'un ino- culum liquide de Bacillus stearothermophilus ATCC 12980 cultivé dans un milieu nutritif ayant la même composition que ci-dessus et dont la D0660 nm a atteint environ 1,0 et on cultive à 57 C et à un pH de 6,5-7,0 (ajusté avec de l'hydroxyde de sodium 4 N) avec introduction d'air à un débit de 20 1/min et agitation à 900 tr/min. Lorsque la D0660 nm a atteint 1,0, par culture discontinue pendant environ 2,5 heures, on introduit en continu avec une pompe doseuse, à un débit de 24,0 l/hun milieu nutritif stérilisé ayant la même com- position que ci-dessus et on prélève la liqueur de fermentation du fermenteur au même débit avec la même pompe. On utilise au total litres de milieu nutritif pour la culture continue. Immédiate- ment après la fermentation, on utilise un centrifugeur de Laval pour récupérer 400 g de cellules. On met les cellules en suspension dans une quan- tité 1,5 fois supérieure de tampon phosphate 0,1 M et on homogé- néise avec un homogénéiseur Dyno-mill. On élimine la matière inso- luble avec un centrifugeur pour obtenir un extrait brut contenant la glucose-6-phosphate-déshydrogénase. A 400 ml de l'extrait, on ajoute 200 ml de sulfate de streptomycine aqueux A 10 % et on éli- mine le précipité obtenu avec un centrifugeur pour obtenir un surna- geant contenant de la streptomycine. On traite le surnageant avec du sulfate d'ammonium et on obtient des fractions entre 25 % de la saturation (4 C) et 50 % de la saturation (4 C). On dissout les fractions dans du tampon Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) et on fait passer la solution a travers une colonne de DEAE-Sephadex équilibrée avec un tampon ayant la même composition que ci-dessus et on élue un tampon de même composition si ce n'est qu'il contient du chlorure de sodium. On obtient la glucose-6phosphate-déshydrogénase désirée à une concentration en chlorure de sodium voisine de 0,2 M. On soumet la fraction active à une chromatographie sur une colonne d'hydroxy- apatite dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1. On fait pas- ser la fraction active obtenue à travers une colonne de Sephacryl S-200 et on élue avec du tampon Tris-HCl 30 mM (pH 8,0) ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,1 M. On obtient un échantil- lon de glucose-6-phosphate-déshydrogénase sous forme d'une bande unique par électrophorèse en disques avec de l'acrylamide comme dans l'exemple 1. L'enzyme forme un seul pic indiquant un poids molécu- laire moyen d'environ 230 000 par chromatographie sur Sephadex G-200 conmme dans l'exemple 1. Le rendement de l'enzyme est d'environ 20 g et son activité est d'environ 100 unités/mg. Le degré de purification de l'enzyme est d'environ 1100 par rapport à l'extrait brut auquel on attribue la valeur 1. Exemples de référence 1. 2 et 3 On utilise la glucose-6-phosphatedéshydrogénase préparée dans l'exemple 1 pour déterminer la teneur en glucose de sérums standards que l'on sait au préalable contenir 76 mg/dl (exemple de référence 1), 155 mg/dl (exemple de référence 2) et 43 mg/dl (exemple de référence 3) de glucose. Mode opératoire On prépare un liquide réactionnel par dissolu- tion d'une unité/ml de glucose-6-phosphate-déshydrogénase, 2 unités/ml d'hexokinase, 2 mM de NAD, 2 mM d'ATP et 2 mM de MgCl2 dans 1 ml de tampon phosphate 100 mM (pH: 8,5). Après séjour à 30'C pendant minutes, on mélange le liquide réactionnel avec 20,ul de chaque sérum standard. Après 5 minutes de réaction à 30C on détermine l'absorption à 340 nm avec un spectrophotomètre. Comme témoin, oh ajoute 20 >11 d'eau pure à un liquide réactionnel ayant la même composition que ci-dessus et après 5 minutes de réaction à 30'C on détermine l'absorption à 340 nm. On soustrait l'absorption du témoin de l'absorption de chaque sérum standard pour déterminer l'accrois- sement de l'absorption. On calcule la teneur en glucose (mg) dans 1 dl de chaque sérum standard à partir de l'équation suivante: 145,8 x (accroissement de l'absorption) = teneur en glucose (mg) dans 1 dl d'échantillon. Les résultats obtenus figurent dans le tableau II ci-dessus. TABLEAU II Essai n- Mesures Exemple référence 1 79 mg/dl Exemple référence 2 151 mg/dl Exemple référence 3 43 mg/dl Les résultats du tableau II montrent que grâce à la grande concordance entre les concentrations connues en glucose et les concentrations mesurées on peut selon le mode-opératoire précédemment décrit mesurer la concentration en glucose. Bien entendu diverses modifications peuvent etre apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non li- mitatifs sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1 - Enzyme glucose-6-phosphate-déshydrogénase, caractérisée en ce qu'on l'a obtenue à partir d'un micro-organisme du genre Bacillus et en ce que, lorsqu'on l'incube pendant environ 15 min dans une solution tampon ayant une température d'environ 50 C, elle conserve une activité égale à au mbins environ 807% de son acti- vité initiale. 2 - Enzyme selon la revendication 1, caractérisée en ce que la conservation de l'activité est d'au moins environ 90%. 3 - Enzyme selon la revendication 2, caractérisée en ce que la conservation de l'activité est d'environ 100%. 4 - Enzyme selon la revendication 1, caractérisée en ce que la solution tampon a une température d'environ 57 C. - Enzyme selon l'une des revendications 1 ou 4, caractérisée en ce que la glucose-6-phosphate-déshydrogénase agit sur le nicotinamide adénine dinucléotide utilisé comme coenzyme. 6 - Procédé pour préparer une glucose-6-phosphate- déshydrogénase, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver un micro- organisme du genre Bacillus et à récupérer de la culture une glucose- 6-phosphate-déshydrogénase qui, lorsqu'on l'incube pendant environ min dans une solution tampon ayant une température d'environ 50 C, conserve au moins environ 80%. de son activité initiale. 7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on effectue la culture continue dans des conditions telles que le taux de dilution D soit d'au moins 0,9 max, /max étant le taux maximal de croissance spécifique d'un micro-organisme cultivé dans des conditions de culture continues. 8 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le micro-organisme du genre Bacillus est Bacillus stearo- thermophilus. 9 - Composition coenzymatique, caractérisée en ce qu'elle est constituée essentiellement d'une glucose-6-phosphate- déshydrogénase qui, lorsqu'on l'incube pendant environ 15 min dans une solution tampon ayant une température d'environ 50 C, conserve une activité égale à au moins environ 80% de son activité initiale et de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate. - Composition coenzymatique selon la revendi- cation 9, caractérisée en ce que la conservation de l'activité est d'au moins environ 90%. 11 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on choisit Bacillus stearothermophilus parmi les souches ATCC 7953, 7954, 8005, 10149, 12980 et NCA 1503. 12 - Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le microorganisme est Bacillus stearothermophilus NCA 1503 et ence que la solution tampon a une température d'environ 57 C et un pH d'environ 6,8. 13 - Enzyme selon la revendication 1, caractérisée en ce que le micro-organisme du genre Bacillus est Bacillus stearo- thermophilus. 14 - Enzyme selon la revendication 13, caractérisée en ce que le micro-organisme est choisi parmi les souches ATCC 7953, 7954, 8005, 10149, 12980 et NCA 1503. - Enzyme glucose-6-phosphate-déshydrogénase, caractérisée en ce que, lorsqu'on l'incube pendant environ 15 min dans une solution tampon ayant une température d'environ 50 C, elle conserve une activité égale à au moins environ 80% de son activité initiale. 16 - Composition coenzymatique, caractérisée en ce qu'elle est constituée essentiellement d'une glucose-6-phosphate- déshydrogénase obtenue a partir d'un micro-organisme du genre Bacillus qui, lorsqu'on l'incube pendant environ 15 min dans une solution tampon ayant une température d'environ 50 C, conserve une activité égale à au moins environ 80% de son activité initiale et de nicotinamide adénine dinucléotide.