Brevet FR2461716A1 — publié le 19810206

La présente invention concerne de nouveaux antibiotiques appartenant au groupe phléomycine- bléomycine, appelés cléomycines, qui présentent des activités antitumorale et anti-microbienne et qui sont utiles comme agents chimiothérapeutiques pour le traitement du cancer et des infections bactériennes. Dans le groupe phléomycine-bléomycine, on connaît déjà les antibiotiques suivants: les bléomyci- nes extraites, d'une manière connue, d'un milieu de culture liquide de Streptomyces verticillus Zuimezawa, et al., Journal of Antibiotics, 19 210 (1966)7; les bleomycines produites en utilisant un milieu de culture mélangé à un composé amino jouant le rôle de précur- seur (brevets des Etats-Unis d'Amérique n 3 846 400 et n 4 195 018); les bléomycines décrites dans la demande de brevet allemand publiée avant examen n 2 828 933; les bléomycines N-substituées dans le groupe amine terminal (brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 922 262); les phléomycines produites par Streptomyces verticillus 843-1 ATCC 21890 /mezawa, et al., Journal of Antibiotics, 9, 82 (1956)7; la zorbamy- cine produite par Streptomyces bikiniensis variété zorbonesis Z rgoudelis, et al., Journal of Antibiotics, 24, 543 (1971)_7; la substance dénommée YA-56, produite par Streptoryces humidus variété antitumoris F urumai et al., Journal of Antibiotics, 24, 727 (1971)]; la tallysomycine produite par un actinomycète, Streptoalloteichus /kawaguchi et al., Journal of Antibiotics, 30, 779 (1977)]; la platomycine produite par un actynomycète; Streptosporangium violaceochromoqenes sous-espèce globophilum / akazawa et al., Journal of Antibiotics 28, 366 (1975)_; la zorbonomycine produite par Streptomyces bikiniensis, variété zorbonensis ZKrgoudelis et al., Journal of Antibiotics, 24, 543 (1971)7; et la victomycine produite par Streptosporangium violaceochromogenes /Kawamoto et al., Journal of Antibiotics, 28, 358 (1975)7. A la suite d'études approfondies concernant de nouveaux antibiotiques du groupe phléomycine- bléomycine, les inventeurs de la présente demande ont découvert certains composés, appelés cléomycines, qui présentent la structure partielle: o0 H H Il N C C I HO È CH C 2 H2 à la place du groupe thréonine dans la structure par- tielle: H 1o Nc C C.....R NC C NH IN C -R HO CH3 CH 3 2 qui est présente dans le squelette de la bléomycine, et ils ont en outre trouvé que ces composés présentent des activités anti-tumorale et anti-microbienne. Dans les dessins ci-joints, la figure 1 repré- sente la courbe d'absorption U.V du chlorhydrate ( forme contenant du cuivre) de la 3-/(S)-l'-phényléthylamino/ propyla-inocléomycine (composé n 33) dans l'eau distillée, la figure 2 la courbe d'absorption ultra- violette du chlorhydrate (forme exempte de cuivre) de la 3-/N-iréthvl-N-(3-aminopropyl)/aminopropylaminocléomy- cine (composé n 20) dans de l'acide chlorhydrique 0,1 N, la figure 3 la courbe d'absorption ultraviolette du chlorhydrate (forme exempte de cuivre) de la 3-/TS)- l'-phényléthylamino7propylaminocléomycine (composé n 33) dans l'acide chlorhydrique 0,1 N, la figure 4 la courbe d'absorption infrarouge, déterminée par la méthode du comprimé de bromure de potassium, du chlorhy- drate (forme contenant du cuivre) de la 3-/N-méthyl-N- (3-aminopropyl)_/aminopropylaminocléomycine (composé n ), la figure 5 la courbe d'absorption infrarouge, déterminée par la méthode du comprimé de bromure de potassium, du chlorhydrate (forme contenant du cuivre) de la 3L(S)-l'-phényléthylamino7propylaminocléomycine (composé n 33), la figure 6 la courbe d'absorption infrarouge, déterminée par la méthode du comprimé de bromure de potassium, du chlorhydrate (forme exempte de cuivre) de la 3-/N-méthyl-N-(3-aminopropyl)/amino- propylaminocléomycine (composé n 20), et les figures 7 et 8 la courbe d'absorption infrarouge, déterminée par la méthode du comprimé de bromure de potassium, et la courbe de résonance magnétique nucléaire proto- nique (dans D20), respectivement, du sulfate (forme exempte de cuivre) de la 3-/(S)-l'-phényléthylamino7 propylaminoclëomycine (composé n 33). On va maintenant donner une description détaillée de l'invention. L'un des buts de l'invention est de fournir de nouvelles cléomycines répondant à la formule: à - CH3 H O 0 HO Il Il il ) 3 CH\ N C C-R 0 CH CH \CMCHNH I I I l I N C\ CH O C CH N CH 'o N \ C N I CH3 HOICH2 C2 \CH- S.H i CH3 i CH CH2 H' N - H H. ( H C I) NH a. C N2 CH3 I H OH OH H H I O OH I C O C-CH20H \" OH H NH2 dans laquelle R représente un résidu amino terminal de la cléomycine, tandis qu'un autre but de l'invention consiste en la production desdites cléomycines. D'autres buts, objets et avantages de l'invention apparaîtront au cours de la description ci-après. Les cléomycines selon l'invention peuvent être obtenues en inoculant une souche productrice de cléo- mycine, appartenant à un actinomycète, Streptomyces verticillus, dans un milieu auquel on ajoute, si nécessaire, une amine primaire aliphatique ayant deux groupes basiques ou davantage, en cultivant ladite souche pour obtenir une cléomycine représentée par la formule (1) précitée, et en extrayant ensuite la cléo- mycine du milieu. Le microorganisme utilisé dans cette invention est un actinomycète, Streptomyces verticillus, qui est connu comme étant une souche capable de produire les antibiotiques que sont les bléomycines. /Umezawa et al., Journal of Antibiotics, 19, 200 (1966)7; toute souche appartenant à ce genre peut être utilisée. Une souche typique est Streptomyces verticillus no NK 68-144 (Collection japonaise) à laquelle correspond le dépôt ATCC No 31307. Il est aussi bien connu que l'aptitude des actinomycètes à produire des antibiotiques est susceptible d'être modifiée naturellement ou artifi- ciellement; une souche de Streptomyces verticillus ayant subi une mutation et ayant une plus grande apti- tude à produire la cléomycine peut être utilisée, une telle souche étant obtenue, de manière en soi connue, par exemple par soumission aux rayons X, aux radiations ultraviolettes ou à l'action d'un agent inducteur de mutation. Les souches productrices de cléomycine utilisables dans l'invention comprennent, bien entendu, de telles souches ayant subi une mutation naturelle ou artificielle. En ce qui concerne maintenant le procédé de cul- ture selon l'invention, on utilise comme agents nutri- tifs, pour le milieu de culture, des combinaisons ou associations de substances en les choisissant parmi les sources de carbone comme l'amidon, le sirop d'amidon, le glucose, le mannose, le lactose, le maltose, le saccha- rose, l'inositol, le mannitol, le glycérol, les mélasses et les acides organiques, les sources d'azote minéral ou organique comme le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le nitrate de sodium, l'urée, les peptones, l'extrait de viande, l'extrait de levure, la levure sèche, la liqueur de mais macéré, la farine de soja, la farine de soja dégraissée, la farine de poisson, l'acide '"Casamino" (fourni par Difco Co.) et les acides aminés; et les sels minéraux comme le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, les phosphates, le carbonate de calcium, le sulfate de zinc et le sulfate de cuivre. Les cléomycines peuvent être produites d'une manière satisfaisante en cultivant la souche précitée dans le milieu susmentionné. Cependant, on obtient incidemment, d'une manière habituelle,-plusieurs types de cléomycines présentant différents résidus amino terminaux, comme par exemple la 3-S,S-diméthylmercapto- propylaminocléomycine, la 4-guanidinobutylamino- cléomycine et la 3-(4-aminobutylamino)propylamino- cléomycine. Par conséquent, afin de favoriser la pro- duction d'une cléomycine souhaitée, en fonction des nécessités, on peut ajouter encore aux sources nutri- tives précitées, une amine primaire aliphatique dont la molécule comporte deux groupes basiques ou davan- tage. On donne ci-après des précisions à ce sujet: une amine aliphatique dont la molécule comporte deux groupes basiques ou davantage (désignée simplement dans le présent mémoire par l'expression "composé amino") est ajoutée au milieu de culture en une quantité conve- hable, par exemple de 0,01 à 1 % en poids. Des études ont révélé que, pendant la biosynthèse des cléomycines par une souche productrice de cléomycine, le composé amino ci-dessus est fixé par les cléomycines sous forme de résidu amino terminal. Conformément à ce procédé, on peut obtenir divers types de cléomycines en modi- fiant la nature du composé amino à ajouter. De plus, la production sélective d'un type donné de cléomycine est possible par addition d'une quantité appropriée d'un composé amino, ce qui présente un grand avantage sur le plan industriel. Il n'y a pas de condition restrictive particulière quant au composé amino à ajouter, pourvu qu'il s'agisse d'une amine primaire aliphatique dont la molécule comporte deux groupes basiques ou davan- tage. Comme exemples de tels composés amino, on peut citer ceux représentés par la formule: X - Rll NH2 (II) dans'laquelle Rll est un groupe alcoylène ou un radical représenté par la formule R12-Y 1-R 13- ou -R12-Y1-R13-Y2-R 14- /dans laquelle R12, R13 et R14 sont chacun un groupe alcoylène tandis que Y1 et Y2 sont chacun un radical de formule - N - R1 (o R1 est l'hydrogène ou un groupe alkyle inférieur, ou un radical représenté par la formule -N N- ou _ 7, et X est un radical basique quelconque, représenté par exemple par les formules suivantes: R RZ,,R6 NH R2,R4 -S, -N, -N- R3, -NH-C-NH2, -N -ND, R R R2 -N O, -N _N-R1, - ' ou H H Lo R1 a la signification précitée, R2, R3 et R6 repré- sentent chacun un groupe alkyle inférieur tandis que R4 et R5 sont chacun l'hydrogène ou un groupe alkyle/7. Comme exemples de groupes alcoylène dans les composés amino, on peut citer -CH2-, -(CH2)2-, CH CH CH CH 3253,3 3,3 -CH-, -(CH2)3-, -CH2CH-, -(CH2)4-, -CH2CH2CH-, -CH2CHCH2-, CH CH5 C2H5 -(CH2)5-, -(CH23 CH2, -(CH2)6- CH 3 7 -(CH2)8- et -(CH2)2-CH-(CH2)2-. Comme exemples de groupes alkyle inférieur, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, propyle, butyle, pentyle et hexyle. Comme exemples de groupes alkyle autres que les groupes alkyle inférieur préciteés, on peut citer les groupes heptyle, octyle, etc. Ces groupes alkyle inférieur et groupes alkyle peuvent aussi contenir des substituants comme le groupe hydroxy; un groupe alcoxy la tel qu'un groupe méthoxy, éthoxy, propoxy, butoxy ou octoxy; et un groupe phényle (qui peut contenir un groupe alkyle inférieur). Le tableau I ci-après donne des exemples du composé amino et de la cléomycine obte- nue par cultute en présence dudit composé amino. En ce qui concerne le procédé de culture, le procédé de culture en milieu liquide et,en particulier, le procédé de culture submergée conviennent à la mise en oeuvre industrielle. Pour la culture, une tempéra- ture de 20 à 40 C et une valeur de pH presque neutre sont souhaitables. Les cléomycines-sont produites et s'accumulent dans le milieu liquide par culture en 2 à 10 jours. La culture est arrêtée lorsque la concentra- tion en cléomycine du milieu liquide atteint une valeur maximale, à la suite de quoi le mycélium est séparé par filtration et le produit recherché est isolé du filtrat et purifié. Les cléomycines ont la propriété de former des complexes avec l'ion cuprique (complexes désignés dans le présent mémoire par l'expression "forme contenant du cuivre"). En premier lieu, les cléomycines de cette forme contenant du cuivre sont isolées du filtrat du milieu de culture et elles sont facilement converties en cléomycines ne contenant pas de cuivre (désignées dans le présent mémoire par l'expression "forme exempte de cuivre"). TABLEAU I No Nom du composé amino à ajouter Nom de la cléomycine et formule du résidu amino terminal 1 bromhydrate du bromure de 3-amino- 3-S,Sdimethylmercaptopropylamino-cléomycine propyl-diméthyl-sulfonium G Cl, (CH3)2-S-(CH2) 3-NH- 2 sulfate d'agmatine 4-guanidinobutylaminocléomycine NH il NH2-C-NH-(CH2)4-NH- 3 1,2-diaminoéthane 2-aminoéthylaminocléomycine NH2 (CH2) -NH- 4 1,3-diaminopropane 3-aminopropylaminocléomycine NH2- (CH2)3-NH- 1,4-diaminobutane 4-aminobutylaminocléomycine NH2- (CH2) 4-NH-, à suivre w oa o4 Ot. TABLEAU I (Suite) 6 Spermidine 3- (4-aminobutylamino) propylamino- clêomycine NHE2- (CH2) 4-NH- (CH2) 3-NH- 7 N, N-diméthyl-1,2-diamino6thane 2-N, Ndiméthylaminoéthylaminocléomycine CH3 N- (CH 2) 2 -NH- -8--.. N',N-'dithy1-1, 2-diarninoéthane 2-N, N-dithy1amninoéthy1arninocléoniycine C 2H52 C25.N- (CH2) 2-NH-- C2H 9 N, N-diméthyl-1,3-diaminopropane 3-N,Ndiméthylaminopropylaminocléomycine CH3. CH N-(CH2)3-NH- 2 5 CH3- s 1!N, N-diéthyl-1,3-diaminopropane 3-N, Ndiéthylaminopropylaminocléomycine C25N- (CH2) 3-NH- à suivre O- O ra % 1-4 TABLEAU I (Suite) 11 N-n-butyl-N' - (3-aminopropyl) - 3-(3-n-butylaminopropylamino) 1,3-diaminopropane propylaminocléomycine C4H9 N- (CH2) 3-NH- (CH2)3-NH- 12 N-(2-hydroxypropyl)-1,2-diaino- 2-(2-hydroxypropyaino)éthylamino- éthane cléomycine CH3CH(OH) -CH2% C H/N-(CH2)2-NH- 13 N-(3-aminopropyl)pipérazine 3-(1-pipérazinyl)propylaminocléomycine ___N/N-(CH2) 3-N.H- 14 N-(1-phényléthyl)-N'-(3-amino- 3-/3-(1-phényléthylamino)propylamino/- propyl)-1,3-diaminopropane propylaminocléomycine O -CH (CH3) /N-(CH2) 3-NH-(CH2) 3-NHI- 1,2-diaminopropane 2-aminopropylaminoclOomycine NH2-CH(CH3) -CH2-NH- à suivre - k- tu os of TABLEAU I (suite) 16 N-méthyl-1,3-diaminopropane 3méthylaminopropylaminocléomycine CH3 H N-(CH2)3-NH- H/ _,..., .. .. 17 N-n-butyl-1,3-diaminopropane 3-n-butylaminopropylaminocléomycine C H NH - (CH2) 3-NH- H23 18 chlorure de 3-aminopropyl-triméthyl- 3-(N,N,N-triméthylamino) propylamino- ammonium cléomycine O O C1, (CH3)3N-(CH2)3-NH- 19 'N-f/3-(N,N-dimxthylamino)propyl7/- 3-/3- (N,N-diméthylamino)propyl/7- 1,3-diaminopropane prpylaminocléomycine (CH3) 2N-(CH2) 3-NH (CH2) 3-N- N,N-bis(3-aminopropyl)méthyl- 3- -méthyl-N-(3-aminopropylamino- amine CH3 CH3 NH 2-(CH2) 3-N-(CH2)3-NH- à suivre -4 0. TABLEAU I (suite) 21 N-(3-amino-1-méthylpropyl)-1,3- 3-(3-amino-1-méthylpropylamino)- diaminopropane propylaminocléomycine NH2-(CH2) 2-CH(CH3)-NH- (CH2) 3-NH- 22 N-(3-aminopropyl)pyrrolidine 3-(1-pyrrolidinyl)propylaminocléomycine D N- (CH2) -NH- 23 N-(3-aminopropyl)pipéridine 3-pipéridinopropylaminocléomycine C N- (CH2) 3-NH- 24 N-(3-aminopropyl)morpholine - 3-morpholinopropylaminocléomycine Oj N-(CH2) 3-NH- N- (2-aminoéthyl)pipérazine 2-(1-pipérazinyl)éthylaminocléomycine N N-(CH2) 2-NH- 26 N-/3-(1-pyrrolidinyl)propyl/7- 3-/3- (1-pyrrolidinyl)propylamino7- 1, 3-diaminopropane propylaminocléomycine _ _ __ __ __ __ __ __ __ __ _ L N-(CH2) 3-NH-(CH2) NH- à suivre w -p.b 1-.1 0o' TABLEAU I (suite) 27 N-(3-pipérizinopropyl)-1,3- 3-(3-pipérizinopropylamino)propyl- diaminopropane aminocléomycine C N- (CH2)3-NH-(CH2) 3-NH- 28 N-(3-morpholinopropyl)-1,3- 3-(3-morpholinopropylamino)propyl- diaminopropane aminoclomycine O N-(CH2) 3-NH-(CH2) 3-NH- 29 N,N-bis(3-aminopropyl)pipérazine 3-/4- (3-aminopropyl)pipérazine-1-yl/- propylaminocléomycine N2- (CH2) 3-N N- (CH2) 3-NH- N- (3-hydroxypropyl)-1,3-diamino 3-(3-hydroxypropylamino)propylamino- propane cléomycine HO-(CH2) 3 H ' N- (CH2) 3-NH- H 31 N-(3-méthoxypropyi) -1,3-diamino- 3-(3-méthoxypropylamino)propylamino- propane clomycine CH 0- (CE2) ". C30- 2 3- _ (CH2) -NH- ____...............,_____ _ H /2 3 suivre 1-_ "u 0% -4 TABLEAU I (suite) 32 N-benzyl-1,3-diaminopropane 3benzylaminopropylaminocléomycine GNCH 2.- H2 N-(CH2) 3-NH- 33 N-/(S)-l'-phényléthyl7-1,3- 3-/(S)-t'-phényléthylamino7propyl- diaminopropane aminocléomycine -" -CH (CH3) \_CJH( 3 N-(CH2)3-NH- 34 m-xylylènediamine m-aminométhylbenzylaminocleomycine CH2-NH- NH2-CH2- p-xylylènediamine p-aminométhylbenzylaminocléomycine H 2- H-n-CH 2-NH- 36 N-cyclohexyl-1,3-diaminopropane 3-cyclohexylaminopropylaminoclomnycine ---NH-(CH2) 3-NH à suivre èn r o os TABLEAU I (suite) 37 N-(3-cyclohexylaminopropyl)-1,3- 3-(3-cyclohexylaminopropylamino)- diaminopropane propylaminocléomycine 1.NH- (CH2)3-NH-(CH2) 3-NH- 38 N-(2-furfuryl)-1,3-diaminopropane 3-(2-furfurylamino) propylaminocléomycine _ O -CH2-NH-(CH2)3-NH- 39 4-pipéridylméthylamine 4-pipéridylméthylaminocléomycine HND -CH2-NH- 2-(4-imidazolyl) éthylamine 2-(4-imidazolyl) éthylaminocléomycine H N . f) (CH)NH- 2 2 * 41 N-/2-(2-pyridyl)éthyl7- 3-/2-(2-pyridyl)é thylamino7propylamino- 1,3-diaminopropane 1clomycine CH2CH2NH-(CH2)3-NH- à suivre 6', 01% -a CN 4m, os,, i i i j i i TABLEAU I (suite et fin) 42 N-(6-hydroxyhexyl)-1,3-diamino- 3-(6-hydroxyhexylamino)propylamino- propane cléomycine HO- (CH2) 6 H N-(CH2) 3-NH 43 N-(3-aminopropyl)-1,3-diamino- 3-(3-aminopropylamino)propylamino- propane cleomycine NH2- (CH2) 3-NH-(CH2)3-NH- 44 N-(3-aminopropyl)-1,6-diamino- 3-(6-aminohexylamino)propylamino- hexane cléomycine NH2- (CH2) 6-NH-(CH2) 3-NH- N-(3-benzylaminopropyl)-1,3- 3-(3-benzylaminopropylamino)propyl- diaminopropane aminocléomycine F'._CH2 HN- (CH2)3-NH-(CH2) 3-NH- H-H 46 N-3-aminopropyl)-N-(3-benzyl- 3-/N-méthyl-N-(3-benzylaminopropyl)7- aminopropyl)-méthylamine aminopropylcléomycine _. CH 2 ( CH Q c 2 cH3 H / N- (CH2) 3-N- (CH2) 3-NH- N -à4 -h 0N Pour l'extraction et la purification des cléomycines, on peut appliquer toutes les méthodes connues utilisées pour les bléomycines dont les pro- priétés physiques et chimiques sont analogues à celles des cléomycines. Comme le montre la description ci- après, on utilise une combinaison convenable des techniques connues de chromatographie en phase liquide. Par exemple, on fait passer le filtrat du milieu de culture à travers une colonne garnie d'une résine échangeuse de cations faiblement acide, par exemple Amberlite IRC-50 (forme H+, fournie par Rohm & Haas Co.), pour adsorber la substance recherchée. Après lavage de la colonne à l'eau, le produit adsorbé est élué par l'acide chlorhydrique dilué. Les fractions qui présen- tent une activité vis-à-vis du microorganisme d'essai Mycobacterium smegmatis ATCC 607 sont recueillies et neutralisées par l'hydroxyde de sodium. On fait ensuite passer I'éluat, pour son dessalage, à travers une colonne garnie-d'une résine d'adsorption de type macro- réticulé, par exemple l'Amberlite XAD-2 (Rohm & Haas,-Co.), pour adsorber la substance recherchée. Après lavage de la colonne avec de l'eau, on élue le produit adsorbé avec du méthanol aqueux acidifié par l'acide chlorhydrique. Les fractions actives sont recueillies, neutralisées avec une résine échangeuse d'anion faiblement basique, par exemple Dowex 44 (forme OH, Dow Chem. Corp.),et ensuite. évaporées jusqu'à siccité sous pression réduite. On obtient ainsi une poudre brune dessalée. On la dis- sout dans le méthanol ou dans le méthanol aqueux et on fait passer la solution à travers une colonne garnie d'alumine neutre en utilisant le même solvant. En éluant avec le même solvant que ci-dessus, on obtient des frac- tions bleu-verdâtre qui sont ensuite concentrées et séchées pour donner une poudre. On dissout cette poudre dans l'eau distillée et on la fait passer à travers une colonne de Séphadex G-25 (Pharmacia Fine Chemicals Inc.). Par élution avec de l'eau distillée, on élimine les substances colorées jaunes et on obtient des fractions de couleur bleue. On dissout à nouveau celles-ci dans l'eau distillée et on fait passer la solution obtenue à travers une colonne garnie de résine CM-Séphadex C-25 (forme Na,Pharmacia Fine Chemicals Inc.) en utili- sant de l'eau distillée. Les fractions bleues contenant les cléomycines sont extraites par élution avec une solution aqueuse contenant du chlorurede sodium de telle sorte que la concentration en chlorure de sodium dans l'éluant soit progressivement élevée jusqu'à 1 mole/ litre. Lorsqu'on produit deux ou plusieurs sortes de - cléomycines, celles-ci sont séparées au cours du procédé précité et récupérées séparément. Ces fractions sont dessalées de la manière précitée, en utilisant de l'Amberlite XAD-2, et lyophilisées. On obtient ainsi une poudre bleue brute contenant la cléomycine. Les souches usuelles productrices de cléomycine donnent aussi des bléomycines en tant que sous-produits. En conséquence, la poudre de cléomycine obtenue par les étapes de purification décrites ci-dessus est contaminée par la bléomycine comportant le même résidu amino terminal que celui de la cléomycine. Par conséquent, la demande- resse a fait des études approfondies pour mettre au point un procédé d'obtention de cléomycine purifiée exempte de bléomycine. Elle a ainsi défini un procédé de chroma- tographie en phase liquide qui utilise une colonne garnie d'une résine adsorbante de type macroréticulé comme par exemple l'Amberlite XAD-2 ou le Diaion HP-40 (Mitsubishi Chemical Co.) ou une colonne garnie de silice chimique- ment liée, vendue dans le commerce pour la chromatogra- phie en phase inversée, comme par exemple le LiChroprep (E. Merck Inc.), le Type RP 8 ou le Type RP 18 ou le PrepPak 500/C 18 Cartridge (Waters Assoc. Inc.). La cléomycine présente, vis-à-vis des substan-_ ces de garnissage cidessus, une affinité plus élevée que la bléomycine comportant le même résidu amino terminal. En conséquence, le développement par un système solvant approprié permet l'élimination de la bléomycine qui est éluée préalablement à la cléomycine. D'une manière plus spécifique, une solution aqueuse de la poudre brute précitée est versée dans une colonne garnie d'une résine, par exemple l'Amberlite XAD-2. On élue plus tôt et on élimine la bléomycine en développant par l'eau distillée ou le méthanol aqueux. Le dernier éluat contenant la cléomycine est récupéré, concentré et lyophilisé, ce qui donne une cléomycine pure (forme contenant du cuivre) à l'état de poudre amorphe bleue. Lorsque l'éluat intermédiaire contenant à la fois la cléomycine et la bléomycine est envoyé dans la colonne précitée pour être soumis à nouveau à une adsorption et à une élution (ce processus étant dénommé "recyclage" dans le présent mémoire), une quantité additionelle de cléomycine pure peut être récupérée. Ce recyclage peut être répété si nécessaire. La concentration en méthanol de l'éluant précité est accrue, d'une manière souhaitable, en fonction du caractère hydrophobe de la cléomycine à produire, une concentration convenable étant généralement inférieure à % (en volume/volume). On augmente l'efficacité de la séparation en ajoutant'à l'éluant un sel tel que le chlorure de sodium, le chlorure d'ammonium, le sulfate de sodium, le sulfate d'ammonium, l'acétate de sodium, l'acétate de potassium, l'acétate d'ammonium, le formiate d'ammonium, le citrate de sodium, le phosphate monosodiquei le phosphate disodique, le phosphate monopotassique ou le phosphate dipotassique ou en ajoutant un acide comme l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, l'acide acétique ou l'acide citrique dans le but de régler le pH. Le procédé décrit ci-dessus est applicable lorsque d'autres types de substances de garnissage, par exemple la silice chimiquement liée mentionnée plus haut, sont utilisés. Par exemple, le tableau II donne les résultats des mesures des temps de rétention dont la chromatographie en phase liquide inversée des cléomycines (forme contenant du cuivre) produites selon le présent procédé. TABLEAU II Composé n0 Durée de rétention (min) /le même que.. dans lea Solvant 1 Solvant 2 tableau I/_ il 8,52 14,95 7,90 ,54 21,22 11,40 12,13 9,30 ,24 13,50 9,44 14,61 6,47 6, .64 8,23 7,39 14,78 7,91 11,65 >30 8,47 9,90 7,38 8,30 9,97 11,55 11,23 14,67 >30 >30 18,65 ,93 22,41 ,00 6,41 7,45 21,61 >30 Remarque 1. Colonne chromatographique: silice liée chimiquement Microbondapack C 18 (4 mm x 300 mm, Waters Assoc. Inc.) Remarque 2. Solvant 1: solution aqueuse (contenant 1 % d'acétate de potassium et 0,5 % d'acide acétique): méthanol = 65: 35 en volume/volume Solvant 2: la même solution aqueuse que ci- dessus: méthanol = 70: 30 en volume/volume. La cléomycine (forme contenant du cuivre) ainsi i0 obtenue est débarrassée de son cuivre par un procédé connu, par exemple par le procédé utilisant l'acide éthylènediaminetétracétique (EDTA) (brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 929 993) pour obtenir la forme correspon- dante exempte de cuivre. Ce procédé est illustré par l'exemple donné ci- après: la forme de cléomycine contenant du cuivre est dissoute dans l'eau distillée et la solution est versée dans une colonne garnie d'Amiberlite XAD-2 pour adsorber les produits dissous. La colonne est lavée successivement avec une solution aqueuse contenant 2 % de chlorure de sodium et 5 % du sel disodique de l'acide éthylènediamine- tétracétique (désigné dans le présent mémoire par "EDTA, Na2"), avec une solution aqueuse contenant 2 % de chlorure de sodium pour éliminer le "EDTA,Na2" en excès, et avec de l'eau distillée. On recueille ensuite, par élu- tion avec du méthanol aqueux acide, par exemple un mélange acide chlorhydrique 0,02 N - méthanol (1: 4 en volume/ volume), les fractions présentant un maximum d'absorption ultraviolette proche de la longueur d'onde 290 mpm. On règle à 6 le pH de l'éluat recueilli en utilisant la résine Dowex 44 (type OH-), on le concentre sous pression réduite et on le lyophilise, ce qui donne la forme exempte de cuivre du chlorhydrate de cléomycine à l'état de poudre amorphe blanc-jaunâtre pàle.Quand on utilise par exemple l'acide sulfurique dilué au lieu de l'acide chlorhydrique dilué ci-dessus, le produit recherché est obtenu sous la forme de sulfate. On peut obtenir éventuellement un sel non toxique de cléomycine avec un acide pharmaceutique- ment acceptable en choisissant convenablement l'acide à utiliser dans l'étape d'élution comme décrit ci-dessus. Les longueurs d'onde des maxima du spectre d'absorption ultraviolette des cléomycines (forme conte- nant du cuivre) produites conformément au procédé de l'invention sont voisins de 292 mpm et 243 mpm, c'est-à- dire très proches de ceux des bléomycines. Les spectres précités (dénommésci-après dans le présent mémoire par l'expression "spectres d'absorption-ultraviolette du type bléomycine"), par comparaison avec ceux-des antibiotiques appartenant au groupe phléomycine-bléomycine, sont nette- ment différents de ceux des phléomycines, des zorbamycines et de la substance YA-56. Les produits de décomposition mentionnés sur le tableau III sont obtenus lorsque les cléomycines sont hydrolysées avec de l'acide chlorhydrique 6 N à 105 C, pendant 24 heures. Comme on peut le voir sur le tableau III, les cléomycines se caractérisent par le fait que, à l'inverse des bléomycines, elles ne donnent pas de L- thréonine. A ce sujet, par comparaison avec d'autres antibiotiques donnant les spectres d'absorption ultra- violette du type bléomycine, la tallysomycine et la platomycine donnent de la L-thréonine mais ne produisent pas d'acide 2'-(2-aminoéthyl)-2,4'-dithiazole-4-carboxy- lique et, par conséquent,ellessont nettement différentes des cléomycines. Les zorbonomycines sont aussi nettement différentes étant donné qu'elles donnent de la P-hydroxy-L- valine, bien qu'elles ne produisent pas de L-thréonine. En ce qui concerne les victomycines, leur teneur en soufre est seulement de 1,98 %, alors que les cléomycines contiennent un acide aminé à base de soufre, l'acide 2'- (2-aminoéthyl)-2,4'-bithiazole-4-carboxylique, et présen- tent une teneur en soufre, même pour la cléomycine ayant la teneur minimale en soufre, aussi élevée qu'environ 4 %. Les victomycines ne contiennent pas du tout l'acide aminé précité à base de soufre et se distinguent des cléomycines. TABLEAU III _ _ Produit d'hydrolyse catalysée Cléomycine Bléomycine par un acide 1. Lthréonine + 2. Acide P-amino-8-(4-amino-6- carboxy-5-méthylpyrimidine- 2-yl)-propionique + + 3. Acide 4-amino-3-hydroxy-2- méthyl-n-pentanolque + + 4. P-Hydroxy-L-histidine + + 5. p-Amino-Lalanine + + 6. Acide 2'-(2-aminoéthyl)-2,4'- bithiazole-4-carboxylique + + 7. Amine terminale + + On a en outre établi les spectres de résonance magnétique nucléaire au C et protonique de cléomycines typiques produites selon le procédé de l'invention. Sur la base des résultats obtenus et des propriétés chimiques, on a recherché quelle était la structure chimique de la cléomycine et on a prouvé qu'elle était représentée par la formule précitée (I). On a déterminé les spectres de résonance magnéti- que protonique d'échantillons de cléomycine dans l'eau lourde, à une fréquence de 100 ffz, en utilisant le tétraméthylsilane comme étalon de référence externe, et on a observé un signal large, qui est commun aux cléomycines et qui correspond à 4 protons, à un déplacement chimique c d'environ 1,2(ppm). Ce signal a été attribué au groupe méthylène (atomes de carbone repérés 4 et 5) dans la structure partielle représentée par la. nouvelle formule (III): H O H2 H2 On a trouvé que cette structure partielle est décomposée, par l'hydrolyse précitée, en 1-amino-2- butanone, par scission du noyau cyclopropane et décarbo- xylation. Les spectres de résonance magnétique nucléaire à 13C des cléomycines ont été établis, à une fréquence de 25,2 MHz, dans l'eau lourde, en utilisant le dioxanne comme étalon de référence interne. A titre d'exemple typique, celui de la 3-/(S)-l'-phényléthylamino/propyl- aminocléomycine présente les caractéristiques suivantes. On a observé les 51 signaux suivants, provenant des atomes de carbone, en tant que signaux communs aux cléomycines et attribuables à la structure fondamentale de celles-ci: (8) 178,0; 176,9; 172,1; 172,0; 171,0; 169,8; 168,5; 166,1; 165,4; 163,8; 163,1; 158,7; 153,0; 149,3; 147,6; 137,6; 135,4; 125,7; 119,9; 118,6; 113,1; 99,0; 98,3; 75,4; 75,2; 74,4; 73,8; 71,2; 70,0; 69,2; 68,8; 67,9; 65,6; 61,8; 61,2; 60,4 (x2); 57,8; 56,3; 53,3; 48,3; 47,7; 43,6; 40,9; 39,9; 32,9; 15,6; 12,7 (x3) et 11,7. En outre, on a observé les signaux suivants (8) attribuables au résidu amino terminal: 136,2; 130,3; 130,1 (x2); 128,3 (x2); 59,0; 45,3; 37,0; 26,3 et 19,3. En d'autres termes, on a observé un total de 62 signaux provenant des atomes de carbone. Ces données ont été confrontées aux signaux des bléomycines mentionnés dans la littérature /Naganawa, et al., Journal of Antibiotics, 30, 388 (1977)/. Les résul- tats obtenus étayent la formule (I). En ce qui concerne la formule structurale partielle (III), on attribue à celle-ci les résultats suivants: 172,1 (1); 56,3 (3); ,4 (2); 12,7 x 2 (4 et 5) o les nombres entre paren- thèses sont respectivement les nombres repérant la position des atomes de carbone correspondants. Les propriétés physiques et chimiques de cléomy- cines typiques sont résumées sur le tableau IV. On illustre ci-après des exemples typiques de mesures d'activité biologique des cléomycines (formes exemptes de cuivre). (1) Activité anti-microbienne La comparaison est effectuée par rapport aux bléomycines antibiotiques correspondantes. L'activité anti- microbienne relative (U.I./mg) vis-à-vis de Mycobacterium smegmatis ATCC 607 est mesurée par la métho- de cylindre-plaque d'agar en utilisant la bléomycine A2 comme référence (1000 U.I./mg). Les résultats sont donnés sur le tableau V. TABLEAU IV-1 Propriétés physiques et chimiques Composé (forme contenant du cuivre) (se reporter au tableau I) Chlorhydrate de Chlorhydrate de cléomycine n0 1 cléomycine n 2 (1) Aspect poudre amorphe bleue idem (2) Solubilité soluble dans l'eau, le diméthyl.formamide, le idem diméthylsulfoxyde et le méthanol (3) Réaction colorée Positive aux réactifs de La même que pour le Dragendorff, Ehrlich, Pauly composé de la colonne et Rydon-Smith centrale; en outre positive au réactif de Sakaguchi (4) Formule moléculaire et C56H83N17S3021Cl2Cu C56H 84N20O21S2C u poids moléculaire 1561,01 1571,97 1561,01 1571,97 _ _...... - _ '19- 20 (5) Point de fusion ou 205 - 208 197 - 201 décomposition ( C) 4 4 (6) Longueur d'onde, en mpm, des 292 (1,81 x 10) 292 (1,89 x 10) maxima d'absorption ultravio-. lette (dans l'eau distillée) 4 4 (coefficient d'extinction 243 (2,25 x 10) 243 (2,34 x 10) moléculaire) à suivre N -4 TABLEAU IV-1 (suite) do Remarque 1: (a) gel de silice 60F 254 (Merck Inc.), méthanol - acétate d'ammonium aqueux à 10 % - ammoniaque à 10 % (10:9:1 en volume/volume) (b) Avicel SF (FMC Corp.), n-propanol-pyridine-acide acétique-eau (15:10:3:12 en volume/volume) Remarque 2: Avicel SF, acide formique-acide acétique-eau (25:75:900 en volume/volume), 800 V, 15 minutes. is o' (7) Dichroisme circulaire O (230) 0 (230 (dans l'eau distillée) +27 000 (253) +25 000 (253) -14 000 (312) -13 000 (312) / 8 _27 (o), longueur d'onde + 4 100 (m565)m) + 4 100 (565) - 1 700 (678) - 1 700 (678) (8) Chromatographie en couche mince (1) 0,43 (1) 0,79 Valeur Rf (voir remarque 1) (2) 0,53 (2) 0,64 (9) Mobilité électrophorétique relative, Valeur R m (R de la L-alanine = 1) 0,88 0,82 (voir remarque 2) TABLEAU IV - 1 (suite) Chlorhydrate de Chlorhydrate de Chlorhydrate de cléomycine No 11 cléomycine No 20 cléomycine No 33 idem idem idem idem idem idem La même que pour la La même que pour la La même que pour la éclomycine n 1n en cléomycine n 2 cléomycine n0 1 outre, positive au réactif ninhydrine C61 il96N19021S2C13Cu C58H90N19021S2Ci3Cu C62H88N18021S2C12Cu 1665,57 1623,49 1620,06 189-192 193-195 203-205 4 4 x04 292 (1,83 x 104) 292 (1,91 x 104) 292 (1,90 x 10) 243 (2,25 x 104) 243 (2,35 x 104) 243 (2,32 x 104) à suivre w o N ru o4 - TABLEAU IV-1 (suite et fin) 0 (230) 0 (230) 0 (230) +26 000 (253) +26 000 (253) +26 000 (253) -10 000 (314) -14 000 (312) -14 000 (312) + 3 500 (565) + 4 500 (562) + 4 600 (565) - 1 400 (678) - 1 800 (674) - 1 900 (678) (1) 0,35 (1) 0,24 (1) 0,78 (2) 0,71 (2) 0,46 (2) 0,78 1,09 1,06 0,85 w j-. TABLEAU IV-2 Composé (forme exempte de cuivre) (se reporter au tableau I) Propriétés physiques et chimiques Chlorhydrate de Chlorhydrate de cléomycine n 1 cléomycine n 2 (1) Aspect Poudre amorphe blanc- idem jaunâtre pâle (2) Solubilité Soluble dans l'eau, le diméthylformamide, le idem diméthylsulfoxyde et le méthanol (3) Réaction colorée Positive aux réactifs de La même que pour le Dragendorff, Ehrlich, composé de la colonne Pauly, Rydon-Smith et à centrale; en outre la ninhydrine positive au réactif de Sakaguchi (4) Formule moléculaire et C56H85N17S30 21C2 l C56H86N20021S2Ci2 poids moléculaire 1499,47 1510,44 (5) Point de fusion (ou 182 - 185 185-188 décomposition) (OC) 5 (6) Longueur d'onde, en mpm, 290 (1,67 x 104) 290 (1,63 x 104) des maxima d'absorption ultraviolette (dans l'eau distillée) 4 4 Coefficient d'extinction 240 (2,17 x 10) 240 (2,19 x 10) moléculaire (palier) (palier) suivreo à suivre TABLEAU IV-2 (suite) (7) Dichroïsme circulaire -16 000 (230) -15 000 (230) (dans HC1 0, 1 N) + 2 600 (290 + 2 500 (290) / IU10 1O0,98 R de la L-alanine = 1) (voir Remarque 2) (voir Remarque 2) Remarque 1: Remarque 2: (a) gel de silice 60F 254 (Merck Inc.), méthanol - acétate d'ammonium aqueux à 10 % - ammoniaque à 10 % (10:9:1 en volume/volume) (b) Avicel SF (FMC Corp.), n-propanol-pyridine-acide acétique-eau (15:10:3:12 en volume/volume) Avicel SF, acide formique-acide acétique- eau (25:75:900 en volume/volume), 800 V, 15 minutes. w w tu o4 1-4 7%> TABLEAU IV-2 (suite) Chlorhydrate de Chlorhydrate de Sulfate cléomycine n 11 cléomycine N 20 cléomycine n 33 idem idem idem idem idem Soluble dans l'eau, le diméthylformamide et le diméthylsulfoxyde La même que pour la La même que pour la La même que pour la cléomycine n 1 cléomycine n 1 cléomycine n 1 C61H98N19021 2C3 c58H92N19021S 2c3 C62H90N18025S 3 1604,04 1561,96 1583,68 172-175 193-195 189-191 4 4 4 290 (1,64 x 10) 289 (1,69 x 104) 290 (1,62 x 10) 240 (2,10 x 104) 240 (2, 19 x 104) 240 (2,09 x 104) (palier) (.palier) (palier) suivre w N TABLEAU IV-2 (suite et fin) -15 000 (230) -15 000 (230) -19 000 (230) + 2 500 (290) + 2 600 (290) + 2 300 (290) - 700 (320) - 500 (320) - 600 (320) (1) 0,26 (1) 0,20 (1) 0,70 (2) 0,65 (2) 0,37 (2) 0,70 1,16 1,17 0,97 wn Ln, rua CN IN 0% 0% TABLEAU V Composé n Activité (voit Tableau I) anti-microbienne U.I./mg _...,,,.: 1 1 320 2 3 262 3 2 760 4 2 150 1 935 6 3 575 11 7 942 12 2 280 13 980 14 11 420 18 878 19 2 004 2 273 21 2 620 24 800 26 3 590 28 1-715 31 1 869 32 6 977 33 10 949 à suivre TABLEAU V (suite) (2) Activité sur des cellules HeLa S3 cultivées On détermine la concentration d'inhibition de 50 % (LD50) en utilisant la cléomycine à évaluer, qui est le compo- sé n 33,et un composé de référence, qui est la bléomycine A2, en mesurant le pourcentage d'inhibition de croissance de cellules HeLa S3 après avoir cultivé ces cellules en présence de chacun desdits composés. Les résultats sont donnés sur le tableau VI. TABLEAU VI Comme on peut le voir d'après les résultats men- tionnés ci-dessus, les cléomycines présentent une activité antimicrobienne qui n'est pas du tout inférieure au composé de référence qu'est la bléomycine A2. En ce qui concerne l'action anti-HeLa, la cléomycine n 33, qui est une cléomy- cine typique, présente une activité presque égale à celle de la bléomycine A2 qui est maintenant utilisée pour le trai- 37 14 784 1 147 41 6 068 42 4 806 43 2 790 44 3 520 - 8 400 46 7 660 Composé LD50 (chlorhydrate exempt de cuivre) (pg/ml) Bléomycine A2 (composé de référence) 0,73 Cléomycine No. 33 0,77 tement clinique du carcinome cellulaire squameux. Ces résultats suggèrent l'utilité des cléomycines en tant qu'agents chimiothérapeutiques pour le traitement des infections bactériennes ou du cancer. La présente invention est illustrée d'une manière plus détaillée par les exemples non limitatifs ci-après. Exemple 1. Production de la 3-/(S)-1'-phényléthylamino/- propylaminocléomycine Etape A: On inocule Streptomyces verticillus NK 68144 (ATCC 31307), qui a été cultivé dans un milieu d'agar en culture inclinée, dans un milieu d'ensemencement (pH de 7,0) contenant 2 % de glucose, 0,3 % de chlorure de sodium, 0,75 % de peptone et 0,75 % d'extrait de viande et on soumet l'ensemble à une culture sous agitation, à 27 C, pendant 24 heures pour obtenir une culture d'ensemencement. * Un milieu de culture de production (120 1; pH de 7,0), contenant 10 % de sirop d'amidon, 1 % de glucose, 5 % de farine de soja, 1 % de liqueur de mais macéré, 0,3 % de chlorure de sodium, 0,1 % de phosphate dipotassique, 0,05 % de sulfate de zinc (heptahydrate), 0,05 % de sulfate de cuivre (pentahydrate) et 0,2 % de nitrate de sodium est stérilisé dans un réservoir en acier inoxydable d'une capacité de 200 litres; ce milieu de production est inoculé avec 2,5 % en volume de la culture d'ensemencement précitée. On ajoute successivement au milieu, 0,1 % de N-/(S)-1'- phényléthyl/-1,3-diaminopropane, ce pourcentage étant exprimé par rapport au milieu. Après culture à 27 C pendant 187 heures, en aérant le milieu et en agitant, on arrête la culture et on filtre le milieu en utilisant un adjuvant de filtration, de façon à obtenir un filtrat de culture de 1. Apres réglage du pHi à 7,0 par addition d'acide chlorhydrique, on fait passer ce filtrat à travers une colon- ne de 7 litres garnie d'Amberlite IRC-50 (forme H+) pour adsorber la substance recherchée. Après lavage à l'eau, le produit adsorbé est élué avec de l'acide chlorhydrique 0,5 N. 2 4 6 1 7 1 6 On recueille des fractions actives vis-à-vis de Mycobacterium segmatis ATCC 607 et on neutralise avec de l'hydroxyde de sodium 1N. On fait ensuite passer ces fractions à travers une colonne de 2 litres garnie d'Amberlite XAD-2 pour adsorber la substance recherchée. Après lavage à l'eau, le produit adsorbé est élué avec un mélange d'acide chlo- rhydrique 0,01 N et de méthanol (1:4 en volume/volume) pour recueillir des fractions actives. Les fractions ainsi recueillies sont neutralisées avec la résine Dowex 44 (forme OH), soumises à une évaporation et séchées sous pression réduite, à la suite de quoi le résidu est soumis à une extraction par le méthanol. On fait passer la portion soluble dans le méthanol à travers une colonne de 400 ml garnie d'une alumine neutre, en utilisant du méthanol contenant 20 % (en volume/volume) d'eau. Par élution avec le solvant ci-dessus, on recueille des fractions bleu- verdâtre et on les soumet à une évaporation sous pression réduite jusqu'à siccité. On dissout le résidu dans 100 ml d'eau distillée et on fait passer la solution à travers une colonne de 2 litres garnie de Sephadex G25. Le produit adsorbé est élué avec de l'eau distillée et on recueille des fractions de couleur bleue que l'on fait passer à travers une colonne de 2 litres garnie de CM-Sephadex C-25 (forme Na) pour adsorber la substance recherchée. Le produit adsorbé est élué avec une solution aqueuse de chlorure de sodium de telle façon que la concentration en chlorure de sodium dans l'éluant soit progressivement augmentée jusqu'à 1 mole/litre, et on recueille les fractions bleues qui s'écoulent et dont les concentrations en chlorure de sodium sont voisines de 0,45 mole/litre. Les fractions recueillies sont déssalees de la manière précitée, en utili- sant de l'Amberlite XAD-2, à la suite de quoi on évapore jusqu'à siccité. On obtient ainsi 11,7 g d'une poudre brute de couleur bleue. On dissout 10 g de la poudre bleue précitée dans de l'eau distillée et on verse la solution résultante dans une colonne d'Amberlite XAD-2 (volume de 1,4 litre) préa- lablement équilibrée avec un solvant de développement constitué par un mélange acide acétique aqueux (0,02 mole/ litre)-méthanol (75:25 en volume/volume). La colonne est développée avec le solvant précité. Les fractions contenant de la bléomycine, qui ont été dCtectées plus précocement au moyen d'un détecteur ultraviolet, sont éliminées et les dernières fractions d'éluat contenant la substance recher- chée sont recueillies tandis que les fractions intermé- diaires sont "recyclées". Ce proce.ssus de développement est répété 7 fois et les fractions contenant la substance recherchée sont recueillies dans chaque cycle. On réunit ensuite toutes les fractions récupérées et on les neutralise avec de l'hydroxyde de sodium iN. La masse ainsi obtenue est dessalée de la manière précitée, en utilisant de l'Amberlite XAD-2,concentrée sous pression réduite et ensuite lyophilisée. On obtient ainsi 3,2 g de chlorhydrate du pro- duit recherché (forme contenant du cuivre) sous la forme d'une poudre amorphe bleue. Les maxima d'absorption ultraviolette et l'activité anti-microbienne de ce produit sont donnés ci-après: Maxima d'absorption ultraviolette: 1% Longueur d'once (m-in) (E dans l'eau 1 cm distillée) 292 (117) 243 (143) Activité anti-1ioeobienD e: 11 300 U.I./mg (Remarque: l'activité anti.microbienne est déterminée en considérant que la bléomycir n A, a une activité de 1000 U.I/mg et en utilisant Myúobacter o segrtatis ATCC 607 comme bacté- rie d'essai. On procède de la Ireme manière dans la suite de la description). Etape B: On dissout, dans 5- mil d'eau distillée, 3 g du produit, sous forme contenant du cuivre, obtenu dans l'étape précédente A et, afin d'éliminer le cuivre, on verse la solution dans une colonne (500 ml) d'Amberlite XAD-2. La colonne est lavée successivement avec 1 litre de solu- tion aqueuse contenant 2 % de chlorure de sodium et 5 % de EDTA,Na2, avec 1 litre de chlorure de sodium aqueux (2 %) et avec 1 litre d'eau distillée. On élue ensuite le produit adsorbé au moyen d'un mélange d'acide sulfurique 0,02 N et de méthanol (1:4 en volume/volume) et on recueille des fractions ayant un maximum. d'absorption dont la longueur d'onde est voisine de 290 mpm. Le pH de 1-a solution recueil- lie est réglé à 6,0 au moyen d'une résine échangeuse d'a- nions (Dowex 44 sous forme OH-) et cette solution est ensuite concentrée sous pression réduite, puis lyophilisée. On obtient ainsi 2,6 g du produit recherché (sulfate sous forme exempte de cuivre), à l'état de poudre amorphe blanc-jaunâtre pâle, avec un rendement de 90 %. Les maxima d'absorption ultraviolette et l'acti- vité anti-microbienne de ce produit sont les suivants: Maxima d'absorption ultraviolette: mpm (E 1% dans 0,1 N HCl 1 cm' 290 (102) 240 (palier) (132) Activité anti-microbienne: 10 949 U.I./mg Exemple 2. Production de 3-/N-méthyl-N-(3-aminopropyl)7 aminopropylaminocléomycine Etape A: On effectue une culture au milieu liquide, comme décrit dans l'étape A de l'exemple 1, en ajoutant 0,1 %, par rapport au milieu, de N,N-bis-(3-aminopropyM-méthyl- amine en tant que composé amino. A partir du filtrat du milieu cultivé, on obtient 13,2 g d'une poudre brute bleue, de la même manière que dans l'étape A de l'exemple 1. On dissout 5 g de cette poudre brute dans de l'eau distillée et on verse la solu- tion dans une colonne (volume de 1 1) d'Amberlite XAD-2. En développant avec de l'eau distillée, on élue la plus grande partie de la bléomycine, tandis qu'une petite por- tion de la bléomycine reste sur la résine avec la substance recherchée. On utilise ensuite, pour éluer la substance recherchée, un solvant de développement constitué par un mélange d'acide chlorhydrique 0,01 N et de méthanol (1:4 en volume/volume). L'éluat est neutralisé avec de l'hydroxyde de sodium 0,1 N et le méthanol est séparé par distillation. Le résidu est à nouveau soumis à une chro- matographie, comme mentionné plus haut, pour éliminer la bléomycine. Les fractions obtenues contenant la substance recherchée, sont concentrées sous pression réduite et ensuite lyophilisées. On obtient ainsi 1,2 g du produit recherché (chlorhydrate sous forme contenant du cuivre), à l'état de poudre amorphe bleue. Les maxima d'absorption ultraviolette et l'activité anti-microbienne de ce produit sont les suivants: Maxima d'absorption ultraviolette: murm (E 1% dans l'eau distillée) 1 cm 292 (118) 243 (145) Activité anti-microbienne: 2300 U.I./mg Etape B: On dissout, dans 20 ml d'eau distillée, 1 g du produit, sous la forme contenant du cuivre, obtenu dans l'étape précédente A et on en élimine le cuivre de la manière décrite dans l'étape B de l'exemple 1. On obtient ainsi 702 mg du produit recherché (chlorhydrate sous forme exempte de cuiyre) à l'état de poudre amorphe blanc-jau- nâtre pale, avec un rendement de 73 %. Les maxima d'absorption ultraviolette et l'activité anti-microbienne de ce produit sont les suivants: Maxima d'absorption ultraviolette: mpm (E % dans HC1 0,1 N) i cm 289 (108) 240 (palier) (140) Activité anti-microbienne: 2 273 U.I./mg Exemple 3. Production de 3-/N-méthyl-N-(3-aminopropyl)/ aminopropylaminocléomycine On dissout, dans 5 ml d'eau distillée, 100 mg de la poudre brute obtenue dans l'étape A de l'exemple 2 et on verse la solution dans une colonne de LiChroprep RP-8 (25 mm x 310 mm) préalablement équilibrée avec un solvant de développement constitué par un mélange d'une solution aqueuse à 1 % d'acétate d'ammonium et de méthanol (87,5: 12,5 en volume/volume). La colonne est développée avec le même solvant de développement, avec un débit d'écoulement de 4,25 ml/min, pendant 7 heures, à la tempé- rature ambiante. Les premieres fractions d'éluat contenant la bléomycine sont éliminées et les fractions d'éluat suivantes contenant la substance recherchée sont récupérées. Ces dernières sont dessalées de la même manière que précé- demment, en utilisant l'Amberlite XAD-2, comme décrit dans l'étape A de l'exemple 1, concentrées et lyophilisées. On obtient ainsi 38 mg du produit recherché (chlorhydrate sous forme contenant du cuivre), à l'état de poudre amorphe bleue. Exemple 4. Production de 4-guanidinobutylaminocléomycine Etape A: On place un milieu de culture de production, tel que décrit dans l'étape A de l'exemple 1, dans des Erlen- meyers de 500 ml, à raison de 110 ml dans chaque récipient; on le stérilise, et on y inocule 5 % en volume de la cul- ture d'ensemencement mentionnée dans ledit exemple 1. On ajoute ensuite à la masse, en tant que composé amino, 0,5 % de sulfate d'agmatine. On prépare une-centaine de ces échantillons et on les cultive à 27 C, pendant 8 heures, en utilisant un agita- teur rotatif. On réunit ensuite les échantillons ainsi cultivés et on les filtre pour obtenir 8,5 1 de filtrat du bouillon de culture. On traite le filtrat de la même manière que dans l'étape A de l'exemple 1, ce qui donne 1,2 g d'une poudre brute de couleur bleue. On dissout 200 mg de cette poudre brute dans 5 ml d'eau distillée et on verse la solution dans une cartouche PrepPak 500/C 18 (5,7 cm x 30 cm) préalablement équilibrée avec un mélange d'une part, d'une solution aqueuse contenant 1 % d'acétate de potassium et 0,5 % d'acide acétique et d'autre part, de méthanol (7:3 en volume/volume).Ensuite,en utilisant un appareil de chromatographie en phase liquide à vitesse élevée pour la préparation, on effectue le développement en faisant passer le même solvant mixte que mentionné plus haut à un débit de 100 ml/min, pendant 80 minutes, à la température ambiante. Au cours de ce développement, on effectue 3 fois un "recyclage" et on récupère les fractions de la subs- tance recherchée. La solution récupérée est dessalée de la même manière que dans l'étape A de l'exemple 1, en utilisant de l'Amberlite XAD-2, concentrée et lyophilisée. On obtient ainsi 80 mg du produit recherché (chlorhydrate sous la forme contenant du cuivre), à l'état de poudre amorphe de couleur bleue. Les maxima d'absorption ultraviolette et l'activité anti-microbienne de ce produit sont les suivants Maxima d'absorption ultraviolette mum (E 1 % dans l'eau distillée) 1 cm -0 292 (120) 243 (152) Activité anti-microbienne: 3 350 U.I./mg Etape B: On dissout, dans 2 ml d'eau distillée, 70 mg du produit, sous forme contenant du cuivre, obtenu dans l'étape précédente A et on en élimine le cuivre de la même manière que mentionné dans l'étape B de l'exemple 1.. On obtient ainsi 60 mg du produit recherché (chlorhydrate sous la forme exempte de cuivre), à l'état de poudre amorphe blanc- jaunâtre pâle, avec un rendement de 89 %. Les maxima d'absorption ultraviolette et l'activité anti-microbienne de ce produit sont les suivants: Maxima d'absorption anti-microbienne: 1% nmFmin (E HCl 0,1 N) i cm 290 (109) 240 (palier) - (146) Activité anti-microbienne: 3 262 U.I./mg. Exemple 5. Production de 3-S,S-diméthylmercaptopropylamino- cléomycine Etape A: On effectue, comme décrit dans l'étape A de l'exemple 4, une culture en milieu liquide, avec addition de 0,1 %, par rapport au milieu, de bromhydrate du bromure de 3-aminopropyl-diméthylsulfonium, en tant que composé amino. A partir du filtrat du bouillon cultivé, on obtient 1,6 g d'une poudre brute bleue de la même manière que décrit dans l'étape A de l'exemple 1. En traitant 200 mg de cette poudre brute de.la manière décrite dans l'exemple 4, on obtient 76 mg du produit recherché (chlorhydrate sous la forme contenant du cuivre) à l'état de poudre amorphe de couleur bleue. Les maxima d'absorption ultraviolette et l'activité anti-microbienne de ce produit sont les suivants: Maxima d'absorption ultraviolette: mpm (E1% dans l'eau distillée) 1 cm 292 (117) 243 (145) Activité anti -microbienne: 1 360 U.I./mg Etape B: On dissoutdans 2 ml d'eau distillée, 70 mg du produit, sous la forme contenant du cuivre, obtenu dans l'étape A et on en élimine le cuivre de la manière décrite dans l'étape B de l'exemple 1. On obtient ainsi 61 mg du produit recherché (chlorhydrate sous la forme exempte de cuivre), à l'état de poudre amorphe blanc-jaunâtre pâle, avec un rendement de 91 %. Les maxima d'absorption ultraviolette et l'acti- vité anti-microbienne de ce produit sont les suivants: Maxima d'absorption ultraviolette: mpu1m (E dans HCl 0,1 N) 1 cm 290 (112) 240 (palier) (146) Activité anti-microbienne: 1 320 U.I./mg Exemple 6. Production de 3-S, S-diméthylmercaptopropylamino- cléomycine On effectue la culture en milieu liquide, comme décrit dans l'étape A de l'exemple 1, sans addition d'un composé amino quelconque. A partir du filtrat du milieu cultivé, on obtient, par le traitement décrit dans l'étape A de l'exemple 1, trois poudres brutes de couleur bleue constituées respecti- vement par 6,7 g du produit recherché, 3,7 g de 4-guanidino- butylaminocléomycine et 320 mg de 3-(4-amininobutylamino)propylaminocléomycine. En traitant 200 mg de poudre brute du produit recherché de la même manière que dans l'exemple 1, on obtient 4,68 mg du produit désiré (chlorhydrate sous la forme contenant du cuivre) à l'état de poudre amorphe bleue. Exemple 7. Production de 4guanidinobutylaminocléomycine Le produit désiré (chlorhydrate sous la forme contenant du cuivre) est obtenu en traitant, de la manière décrite dans l'exemple 4, 200 mg de la poudre brute du produit recherché obtenue dans l'exemple 6. Exemple 8. Production de 3-(4-aminobutylamino)propylamino- cléomycine Etame A: On obtient 70 mg du produit recherché (chlorhydrate sous la forme contenant du cuivre) en traitant, de la manière décrite dans l'exemple 3, 200 mg de la poudre brute du produit recherché obtenue dans l'exemple 6. Les maxima d'absorption ultraviolette et l'activité anti-microbienne de ce produit sont les suivants: Maxima d'absorption ultraviolette: - mpm (E 1% dans l'eau distillée) 1 cm 292 (119) 243 (146) - Activité anti-microbienne: 3 520 U.I./mg Etape B: En éliminant, comme décrit dans l'étape B de l'exemple 1, le cuivre des 50 mg du produit à base de cuivre obtenu dans l'étape A précédente, on obtient 38 mg du produit recherché (chlorhydrate sous la forme exempte de cuivre), à l'état de poudre amorphe blanc-jaunâtre pâle, avec un rendement de 79 %. Les maxima d'absorption ultraviolette et l'activité anti-microbienne de ce produit sont les suivants: Maxima d'absorption ultraviolette: 1% mpm (E dans HCl 0,1 N) 1 cm 290 (98) 240 (palier) (128) Activité anti-microbienne: 3 575 U.I./mg Exemple 9. Production de 3-(3-n-butylaminopropylamino)propyl- aminocléomycine Etape A: On cultive un milieu liquide, comme décrit dans l'étape A de l'exemple 1, en ajoutant 0,1 %, par rapport au milieu, de Nn-butyl-N'-(3-aminopropyl)-1,3-diaminopropane en tant que composé amino. A partir du filtrat du milieu cultivé, on obtient, de la même façon que dans l'étape A de l'exemple 1, 8,3 mg d'une poudre brute de couleur bleue. En traitant 5 g de cette poudre brute de la manière décrite dans l'étape A de l'exem- ple 2, on obtient 740 mg du produit recherché (chlorhy- drate sous la forme contenant du cuivre), à l'état de poudre amorphe bleue. Les maxima d'absorption ultraviolette et l'acti- vité anti-microbienne de ce produit sont les suivants: Maxima d'absorption ultraviolette: mpm (E 1% dans l'eau distillée) 1l cm 292 (111) 243 (136) Activité anti-microbienne: 8 130 U.I./mg Etape B: Dans 20 ml d'eau distillée,- on dissout 700 mg du produit, contenant du cuivre, obtenu dans l'étape précédente A et on en élimine le cuivre de la manière décrite dans l'étape B de l'exemple 1, ce qui donne 525 mg du produit recherché (chlorhydrate sous la forme exempte de cuivre) à l'état de poudreamorphe blanc-jaunâtre pâle, avec un rendement de 78 %. Les maxima d'absorption ultraviolette et-l'activité anti-microbienne de ce produit sont les suivants: Maxima d'absorption ultraviolette: 1% jumu (E 1 dans HCL 0,1 N) 1 cm 290 (103) 240 (palier) (132) Activité anti-microbienne: 7 942 U.I./mg REVENDICATIONS 1 - Nouveaux composés antibiotiques appelés cléo- mycines, de formule: NH2 O=C H 7H 1 i H2 H2C' CH,N\ CH CH\c/NH2 2 Il NH2 CH 0 CH2 [iI NN i\ /C/H N/CH O 1 I j H CH H f'0. N"H H 2OH CC 0 HOCH IH I OH H OH H H CH3 H O I - I 1 Il CH N \C C CH Il I i' C-R NH N CH2 N SH \CH S H CH2 HC\ / C-CH20H H O H i /OH 1 NH2 01H1 H C O NH 2 dans laquelle R est un résidu amino terminal de la cléo- mycine, et leurs sels non toxiques, 2 -Composés selon la revendication 1, caractérisés en ce que R est un résidu amino terminal de formule: X - R -NH - dans laquelle Rll est un groupe alcoylène ou un radical représenté par la formule -R12-Y -R13- ou -R 12-Y-R 13-Y2-R 14- /dans laquelle R12, R13, et R14 sont chacun un groupe alcoylène tandis que Y1 et Y2 sont chacun un radical de formule - N - R1 (o R1 est l'hydrogène ou un groupe alkyle inférieur) ou un radical représenté par la formule -NN - ou /, et X est un radical de formule: R6 NH /R2 /R4 " N Nl -S 2 N -N--R,3 -NH-C-NH2, -NJ,-N R3 R5 R2 R52 -N O, -N ' N-R ou H H /o R1 a la signification précitée, R2, R3 et R6 repré- sentent chacun un groupe alkyle inférieur tandis que R4 et R5 sont chacun l'hydrogène ou un groupe alkyle/ 3 - Composés selon la revendication 1, caractérisés en ce que R est choisi parmi les groupes sui- vants (CH3)2-S-(CH2)3-NH-, NH i NH2-C-NH (CH2)4-NH-, C4H9-NH-(CH2) 3-NH-(CHII2) 3-NH-, CH NH2- (CH2) 3_N-(CH2) 3-NH- et C\>CH(CH3)-NH-(CH2)3-NH-. 2 3 23323 4 - La 3-S,S-diméthylmercaptopropylaminocléomycine. - La 4-guanidinobutylaminocléomycine. 6 - La 3-(3-n-butylaminopropylamino)-propylamino- cléomycine. 7 - La 3-/N-méthyl-N-(3-aminopropyl)Jaminopropylaminocléomycine. 8 - La 3-f(S)-l'-phényléthylamino7 propylaminocléo- mycine. 9 - Procédé de production des composés selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à inocu- ler une souche productrice de cléomyciney appartenant à l'espèce Streptomyces verticillus, dans un milieu de culture, à cultiver ladite souche et à extraire les cléo- mycines définies à la revendication 1. 10 - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le milieu de culture précité contient une amine primaire aliphatique dont la molécule comporte deux groupes basiques ou davantage. 11il - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que là souche précitée productrice de cléomycine est Streptomyces verticillus NK 68-144 (ATCC 31307). 12 - Médicament caractérisé en ce qu'il contient à titre de principe actif un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.