Brevet FR2461753A1 — publié le 19810206

La présente invention concerne la production d'une céphalosporine par fermentation. Les fermentations relatives à la céphalosporine C constituent la source principale d'accès au noyau céphalosporinique que l'on utilise en grandes quantités en vue de la préparation d'un important nombre de cépha- losporines antibiotiques par voie semi-synthétique. De telles fermentations se déroulent généralement pendant une période de plusieurs jours et on a observé que comme la céphalosporine C elle-même en solution aqueuse est sujette à une décomposition non enzymatique par hydrolyse Plactamique, une fermentation industrielle typique entraînait une perte d'environ 25 % du titre observé en céphalosporine C par décomposition non enzymatique. On a également généralement observé qu'environ % des noyaux céphalosporiniques produits au cours de la fermentation étalent présents sous forme de désacétyl céphalosporine C. Bien que ce composé soit également intéressant à titre de source du noyau céphalosporinique, il est généralement incommode et peu économique de tenter d'isoler la quantité de désacétyl céphalosporine C formée, en raison des différences des techniques qui sont néces- saires et de l'échelle de l'opération. Par conséquent, les 15 % des noyaux céphalosporiniques qui se présentent sous forme de désacétyl céphalosporine C représentent également une perte, si bien que, dans l'ensemble, un total d'environ 40 % des noyaux céphalosporiniques qui sont produits ne sont pas disponibles pour l'extraction sous forme de céphalosporine C. La demanderesse a à présent étonnamment découvert que, contrairement à ce qui était précédemment supposé par des chercheurs antérieurs (Konecny et coll., J. Antib., Vol. XXVI, No 3, p. 140), la désacétylcéphalosporine C était bien plus stable vis-à-vis de la dégradation P-lactamique non enzymatique que la céphalosporine C en bouillon de culture. Non sans surprise, il a été impossi- ble à la demanderesse de déceler une quelconque décompo- sition de la désacétylcéphalosporine C dans des solutions aqueuses et des bouillons de culture dans des conditions de fermentation, même en ayant recours à des procédés de titrage extrêmement sensibles. La demanderesse s'est servi de cette découverte pour mettre au point un procédé de conversion de la cépha- losporine C en désacétylcéphalosporine C-au cours de la fermentation, au fur et à mesure de sa formation. Un tel - 10 procédé est doublement avantageux. En-premier lieu, il n' y a pratiquement pas de perte en céphalosporine produite, qui serait due à une décomposition, en raison de l'éton- nante stabilité de la désacétylcéphalosporine C et, en second lieu, la désacétylcéphalosporine C qui est produite au cours de fermentations normales peut également être récupérée. La demanderesse a par conséquent trouvé que d'importants accroissements de la récupération en céphalosporine produite pouvaient être réalisés. L'ac- croissement est typiquement d'environ 40 % mais ce pour- centage peut varier en fonction de la teneur en désacétyl- céphalosporine C de la fermentation normale relative à la céphalosporine C et en fonction des caractéristiques cinétiques relatives à l'accumulation de céphalosporine C. Au surplus, la demanderesse a également découvert que la désacétylcéphalosporine C continuait à s'accumuler si l'on poursuivait la fermentation pendant des périodes plus longues que celles normalement mises en oeuvre pour la production de céphalosporine C. De manière générale, l'accumulation de céphalosporine C commence à diminuer après environ 6 jours de fermentation qui représentent la période standard, mais la demanderesse a découvert que l'on pouvait obtenir jusqu'à 50 % de noyaux céphalo- sporiniques utilisables supplémentaires si la durée de fermentation en présence de l'acétylestérase était prolon- gée de, par exemple, 2 jours, soit environ 1/3 de la période de fermentation. Par conséquent, si l'on prolonge la fermentation, le gain total en noyaux céphalospori- niques utilisables>obtenu par la production délibérée de désacétylcéphalosporine C peut être de jusqu'à 90 % supérieur à la quantité de noyaux céphalosporiniques utilisables produits au cours d'une fermentation de céphalosporine C normale. Par conséquent, on réalisera parfaitement que ceci constitue un accroissement considérable du rendement en noyaux céphalosporiniques utilisables, ce qui repré- sente un intérêt économique très important. Au surplus, les limitations qui étaient imposées par l'instabilité de la céphalosporine C sur le développement et les rende- ments en noyaux céphalosporiniques par fermentation peu- vent être fortement réduites. La désacétylcéphalosporine C peut aisément être convertie en dérivés pharmaceutiquement intéressants, comme la céphalothine et la céphaloridine. La présente invention a donc plus particulière- ment pour objet un procédé de préparation de la désacétyl- céphalosporine C, caractérisé en ce que l'on fait fermen- ter un micro-organisme producteur de céphalosporine C, en présence d'une quantité d'acétylestérase suffisant à convertir sensiblement la totalité de la céphalosporine C produite en désacétylcéphalosporine C, avant que la dégradation non enzymatique de la céphalosporine C ne se produise. On peut ajouter l'acétylestérase directement à l'amorce de la fermentation, ou bien à l'amorce de la phase d'accroissement de la céphalosporine et, facultati- vement, par intervalles au cours de la fermentation. On peut aussi développer l'acétylestérase in situ au cours de la totalité du processus de fermentation. L'enzyme qu'est l'acétylestérase peut provenir de sources extrêmement diverses. Ainsi, l'estérase peut provenir, entre autres, de champignons, de levures, de bactéries et de plantes supérieures. Comme sources appropriées issues de plantes supérieures, on peut citer la pelure des fruits citrus, comme décrit dans le brevet britannique no 966.222 et les germes de blé, comme décrit dans le brevet britannique n 1.121.308. Ce dernier bre- vet décrit également une activité d'acétylestérase appro- priée dans le genre bactérien Rhizobium. Comme sources d'acétylestérase appropriées issues de levures, on peut citer les levures du genre Rhodotorula comme décrit, par exemple, dans le brevet britannique n 1.474.519. Des microorganismes de la classe des Basidiomycetes, tels que décrits dans le brevet britannique n 1.531.212 et des bactéries de l'espèce B. subtilis telles que décrites dans App. Microbiol. Vol. 30, No 3, p. 413 constituent également des sources convenables d'acétylestérase. Une source de l'enzyme que la demanderesse a trouvé être tout particulièrement appropriée est le genre microbien Rhodosporidium, en particulier l'espèce Rhodosporidium toruloides, par exemple la souche CBS 349, telle que décrite dans le brevet britannique no 1.531.212 précité. Un procédé de triage approprié permettant de déterminer les sources intéressantes d'acétylestérase est décrit dans le brevet britannique n 1. 531.121. Bien que la description du procédé dans ce document se réfère généralement à la détermination des taux en estérase produits par des micro-organismes de la classe des - -Basidiomycetes, le procédé peut être aisément adapté au triage d'estérases produites par d'autres sources par.un choix approprié des conditions opératoires. Le procédé conforme à la présente invention se met avantageusement en oeuvre en procédant à la culture d'une souche productrice de céphalosporine C connue en présence de l'acétylestérase dans des conditions aérobies, de préférence en culture submergée, sous agitation ou remuage à l'aide d'air ou d'oxygène. Le milieu de fermentation utilisé doit contenir une source assimilable de carbone, une source digestible d'azote et, si on le souhaite, des substances promotrices de croissance comme aussi des sels inorganiques. Comme sources de carbone convenables, on peut citer, par exemple, le glucose, le saccharose, l'amidon, l'amidon soluble, les n-paraffines, les huiles végétales et animales, l'acide acétique, le méthanol, le glycérol, le sorbitol et l'éthanol. Comme sources d'azote appropriées, on peut citer, par exemple, des substances azotées naturelles ou des matières produites à partir de telles substances, comme des extraits de viande, la peptone, la caséine, la liqueur de macération de mals, les extraits de levure, la farine de soya, la tryptone, la farine de graines de coton et le son de blé. On peut également utiliser des composés inorganiques ou organiques azotés, par exemple l'urée, les nitrates et les sels d'ammonium, tels que l'acétate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium et le phosphate d'ammonium. Des sels inorgani- ques que l'on peut utiliser dans le milieu de fermentation peuvent être, par exemple, des sulfates, des nitrates, des chlorures, des carbonates et des phosphates de potassium, de magnésium et de calcium. Comme substances promotrices de croissance que l'on peut utiliser, on peut citer, par exemple, la cystéine, la cystine, les thiosulfates, 1' oléate de méthyle et, plus particulièrement, la méthionine et également des oligo-éléments, tels que le fer, le zinc, le cuivre et le manganèse. Des conditions de culture, comme la température, le pH et la durée de la fermentation, se choisissent de telle façon que la souche utilisée puisse accumuler une quantité maximale de la céphalosporine voulue. Par exemple, on réalise avantageusement la fermentation à une tempéra- ture qui fluctue de 15 à 450C, de préférence à environ 250C, à un pH qui varie de 4 à 9, par exemple de 5 à 8 et qui est, de préférence, d'environ 6, la fermentation s' opérant en une période de 1 à 20 jours, de préférence 4 à 10 jours. La source productrice de céphalosporine C la plus avantageuse est une source d'Acremonium chrysogenum (antérieurement connue sous l'appellation: Cephalosporium acremonium). On a constaté que certains mutants de 1' Acremonium chrysogenum étaient également capables d'en- gendrer d'importantes quantités d'acétylestérase in situ au cours de la fermentation. D'autres micro-organismes du genre Cephalosporium, par exemple des souches de Cephalosporium polyaleurum et certains microorganismes des genres Emericellopsis et Streptomyces, par exemple des souches d'Emericellopsis glabra, d'Emericellopsis microspora et de Streptomyces lactamdurans sont également capables d'engendrer de la céphalosporine C. La quantité d'estérase ou de matière contenant de l'estérase nécessaire pour convertir la céphalosporine C formée au cours de la fermentation en désacétylcéphalo- sporine C peut être déterminée simplement par des titrages préliminaires de l'activité enzymatique ou par des essais à échelle réduite et dépend de l'estérase et des conditions réactionnelles mises en oeuvre. Le déroulement de la réac- tion peut commodément être suivi par chromatographie en phase liquide à haute performance ou par séparation par chromatographie en couche mince ou sur papier en utili- sant une combinaison support/système solvant convenable et en procédant à un titrage densitométrique. Des procédés appropriés sont décrits dans le brevet britannique n 1.531.212 susmentionné. De manière générale, il sera commode de recourir à un substantiel excès d'estérase. La méthode utilisée pour isoler la désacétyl- céphalosporine C produite suit dans l'ensemble des techniques classiques, par exemple celle décrite dans le brevet britannique n 1.433.528. Après la centrifugation ou la filtration du bouillon de fermentation, par exemple à travers un lit de kieselguhr, on peut réaliser l'isole- -t ment, par exemple en dessalant la solution par adsorption sur du carbone, suivie d'une élution à l'aide d'acétone et d'eau. On peut davantage purifier l'éluat par absorption sur une résine échangeuse d'anions (par exem- ple l'Amberlite IRA-68 sous la forme acétate), en éluant la désacétylcéphalosporine de la résine à l'aide d'une solution d'acétate de potassium et en précipitant le pro- duit avec de l'acétone. En général, l'estérase se présente sous une forme qui peut être aisément répartie dans le bouillon de fermentation en vue d'hydrolyser la céphalosporine C. Ainsi, lorsque l'estérase provient d'un autre micro- organisme, on peut utiliser un échantillon de la culture entière ou des cellules séparées, de préférence après un traitement destiné à rendre les cellules non viables et, si on le souhaite, après rupture des cellules, par exem- ple par mise en oeuvre de procédés classiques, comme un traitement aux ultrasons, un traitement par des enzymes lyriques ou un traitement,par des détergents. On peut également utiliser d'autres préparations de cellules qui permettent leur conservation avec rétention de l'activité d'estérase, par exemple des cellules traitées à l'acétone ou des poudres séchées à l'acétone. On peut également utiliser l'estérase micro- bienne sous forme exempte de cellules. Ainsi, on peut utiliser un filtrat ou supernatant obtenu de la culture. Si on le souhaite, les cellules peuvent être rompues, par exemple comme décrit plus haut, avant la filtration ou la centrifugation. On peut davantage purifier l'estérase 3 exempte de cellules par des moyens classiques. Les techni- ques que l'on peut mettre en oeuvre à cette fin compren- nent la précipitation de l'enzyme, par exemple avec des sels ou des solvants organiques, tels. que l'acétone, la chromatographie, par exemple sur des résines échangeuses d'ions ou sur des supports doués d'une affinité spéciale pour l'enzyme et dessalage, par exemple filtration à tra- vers gel ou dialyse. L'estérase exempte de cellules peut s'utiliser sous la forme d'une solution, sous la forme d' un précipité ou sous la forme d'une préparation immobi- lisée de façon convenable. Lorsque l'estérase provient d'une plante supé- rieure, il est souhaitable d'utiliser un extrait de la plante contenant l'enzyme. Un tel extrait peut se préparer par mise en oeuvre de procédés classiques qui, dans 1' ensemble, impliquent la libération initiale de l'enzyme de la plante par mise en oeuvre de techniques physiques, comme une mouture ou un pressage,comme décrit dans le brevet britannique n0 966.222, ou par mise en oeuvre de techniques chimiques, par exemple par traitement de la plante par un solvant hydrocarboné, tel que l'éther de pétrole, comme décrit dans le brevet britannique n0 1.121.308. La préparation ainsi obtenue, avec ou sans élimination des débris cellulaires, peut être ajoutée directement à la solution d'hydrolyse. Si on le souhaite, on peut aussi davantage traiter la préparation, par exemple en utilisant les techniques décrites plus haut pour les enzymes microbiennes, de façon à obtenir une estérase exempte de cellules que l'on peut utiliser de la manière décrite à propos de l'enzyme microbienne. Il est clair qu'au cours de l'utilisation des formes susmentionnées de l'acétylestérase, cette enzyme sera réellement ajoutée.au bouillon de fermentation. Cependant, selon un autre procédé, il est également possible d'engendrer l'enzyme in situ par l'emploi d'une culture mixte de l'organisme producteur de céphalosporine et des organismes producteurs d'estérase mentionnés plus haut. On peut également utiliser des micro-organismes, par exemple des mutants d'Acremonium chrysogenum, qui produisent des taux élevés d'estérase en plus de la céphalosporine C au cours de la totalité de la fermenta- tion. De tels micro-organismes n'ont pas encore été anté- rieurement décrits et constituent une caractéristique supplémentaire de la présente invention. On peut produire des mutants d'Acremonium chrysogenum par mise en oeuvre de divers procédés comprenant ceux décrits dans: Techniques for the Development of Micro-Organisms par H.I. Adler dans "Radiation and Radioisotopes for Industrial Micro- organisms", Proceedings of the Symposium, Vienne, 1973, p. 241, International Atomic Energy Authority. Ces pro- cédés comprennent: i) le traitement par un rayonnement ionisant, par exemple des rayons X et des rayons y, la lumière ultraviolette, la lumière ultraviolette en présence d'un agent photo- sensibilisant, par exemple le 8-méthoxysporalène; l'oxyde nitreux; l'hydroxylamine; des analogues de bases pyrimi- diniques, par exemple le 5-bromuracile; des acridines; des agents alkylants, par exemple le méthane-sulfonate d'éthyle ou le gaz moutarde; le peroxyde d'hydrogène; des phénols; le formaldéhyde; la chaleur et ii) des techniques génétiques, comme la recombinaison, la transduction, la transformation, la lysogénisation, la conversion lysogène et des techniques sélectives pour des mutants spontanés. La demanderesse a constaté que l'utilisation de lumière ultraviolette convenait parfaitement. L'existence d'un mutant conforme à cette carac- téristique de la présente invention peut être vérifiée par des procédés de triage convenables. Ainsi, au cours d'un premier procédé, on identifie les mutants qui pro- duisent des proportions importantes de DAC et très peu de céphalosporine C au cours de la totalité du déroule- ment de la fermentation par mise en oeuvre de procédés de titrage classiques. Conformément à un second procédé, on identifie également les mutants qui réalisent la désacétylation de la céphalosporine C ajoutée par des procédés de titrage classiques. Les mutants conformes à cette caractéristique de la présente invention sont ceux qui répondent de manière satisfaisante aux deux procédés de triage. On décrira à présent l'invention de manière plus particulière à l'aide des exemples non limitatifs qui suivent. Dans ces exemples, toutes les températures apparaissent en degrés Celsius. La souche IMI 237183 a été déposée au Commonwealth Mycological Institute, Kew, Angleterre, le 9 avril 1979. Des souches de ce type sont décrites, entre autres, dans l'ouvrage "Cephalosporium-artige Schimmel- pilze (Hyphomycetes)" par Walter Gams (Verlag, W. Germany) 1971, p. 109-111. EXEMPLE 1 (a) Préparation d'acétylestérase On a fait croître Rhodosporidium toruloides CBS 349 dans des flacons d'une contenance de 2 litres sur un milieu liquide comprenant du glucose (2 %), de l'extrait de levure (1 %), de la peptone (1 %), du phosphate dihydro- géné de potassium (0,5 %) et du polypropylène-glycol (0,1 %) pendant 72 heures. On a transféré une suspension de 100 ml de la levure dans un flacon stérile et on les a refroidis jusqu'à 4 . On y a ensuite ajouté de l'acétone (30 ml) que l'on avait préalablement refroidie jusqu'à -10 . Après une courte période d'agitation, on a ajouté des volumes supplémentaires d'acétone froide par frac- tions successives pour augmenter graduellement la concen- tration en acétone jusqu'à 75 % v/v. On a laissé les cel- lules de levure se déposer, on a décanté la couche surna- geante et on a ajouté de l'acétone pure fraîche. Après un mélange intime, on a décanté l'excès d'acétone et on a lavé les cellules traitées à deux reprises par centri- fugation dans de l'eau stérile. On a remis les cellules lavées en suspension dans de l'eau stérile de façon à obtenir une suspension avec une activité d'estérase de 3,5 UI/ml. il (b) Fermentation de la désacétylcéphalosDorine C (DAC) On a procédé à la fermentation dans des flacons secoueurs contenant le milieu (9,5 ml) de la composition indiquée ci-dessus auquel on avait ajouté 0,4 ml de la suspension d'estérase préparée de la manière décrite en (a) après passage à l'autoclave: Liqueur de macération de mais 0,5 % sous forme d'azote Lactose 46 g/l Glucose 2 g/l Méthionine 2,3 g/l Phénylacétyléthanolamine 1,5 g/1 Carbonate de calcium 16 g/l Urée 0,8 g/l Sulfate d'ammonium 3,4 g/l Huile de maIs 6 gouttes par flacon pH (ajusté à l'aide de NaOH avant passage à l'autoclave) 6,6 On a inoculé les flacons d'une souche d' A. chrysogenum IMI 237183 (0,5 ml) que l'on avait préala- blement fait croître pendant 48 heures dans un milieu con- tenant de la liqueur de macération de mais (0,1 % sous forme d'azote), de l'acétate d'ammonium (5,5 g/l), du saccharose (25 g/l) et du carbonate de calcium (10 g/l). On a incubé le flacon à 25 sur un secoueur pendant jours et on a déterminé le titre en DAC par chromato- graphie en phase liquide à haute performance (HPLC). Le tableau 1 qui apparaît en fin de texte présente le titre en DAC après 3, 4 et 5 jours, chaque donnée repré- sente la moyenne des titrages de trois flacons individuels. On a simultanément titré des flacons témoins contenant le milieu et le micro-organisme mais pas d'estérase. EXEMPLE 2 Développement de l'inoculum On a reconstitué le produit d'une ampoule lyophilisée d'A. chrysogenum IMI 237183 par l'addition de milieu de Sabouraud liquide (2 ml). On a utilisé la suspension de cellules ainsi obtenue pour inoculer une bouteille à côté plat de 250 ml (bouteille de Blake) contenant du milieu de Sabouraud solidifié. On a incubé la culture pendant 14 jours à 250. Milieu de Sabouraud Maltose 4,0 % p/v Extrait de malt 2,4 % Peptone 1,0 % Gélose 2,5 % Eau jusqu'à 100-%, pH ajusté à 7,5 avant la stérilisation. On a ajouté approximativement 50 ml d'eau stéri- le et des perles de verre après l'achèvement de l'incuba- tion afin d'enlever la culture surfacique par lavage. On a ensuite utilisé les cellules en suspension pour inoculer une bouteille à côté plat de 500 ml (bouteille de Roux) contenant du milieu de Sabouraud solidifié. On a utilisé environ 4 ml de suspension pour chaque bouteille de Roux que l'on a ensuite incubée pendant 12 jours à 25 . On a préparé une suspension de cellules en éliminant la culture surfacique par lavage avec 40 ml d'eau stérile et des perles de verre. On a utilisé cette suspension pour inoculer des ballons à fond plat à chicane d'une contenance de 2 litres contenant 600 ml d'un milieu à base de peptone et d'extrait de malt des milieux de repiquage liquides. Milieu à base de Deptone et d'extrait de malt Peptone 1,0 % p/v Extrait de malt 2,4 % Granules de Yeatex 2,68 % Craie 0,5 % Huile de soya 1,96 % Eau jusqu'à 100 %, pH ajusté à 7,5 3.5 avant la stérilisation. On a inoculé chacun des milieux de repiquage liquides de 6 ml d'une suspension de cellules provenant de la bouteille de Roux et on les a ensuite incubés à 250 sur un secoueur tournant à 110 tours/mn avec un excentrique de 4,9 cm, pendant 72 heures. On a rassemblé deux cultures de milieux de repiquage liquides pour obtenir un inoculum destiné à l'étape de fermentation principale. On a réalisé deux fermentations, chacune dans un fermenteur de 7 litres, sous agitation à 25 , en uti- lisant le milieu de fermentation de l'exemple 1(b) à 1' exception que de l'huile de mais était présente à raison de 3,0 % v/v. On a réglé le pH à 6,0 + 0,1 en utilisant de l'acide sulfurique i M et de l'hydroxyde d'ammonium 8 M. On a maintenu une tension en oxygène dissous supérieure à 30 % de saturation au cours de la totalité de la fermen- tation. On a appliqué une charge auxiliaire d'une solution de sulfate d'ammonium à 24 % pendant une partie de la fermentation afin de maintenir la proportion d'ammoniac libre à une valeur supérieure à 500 ppm. Lorsque les charges en carbone furent épuisées au bout d'environ 72 heures, on a appliqué une charge de glucose pendant le restant de la fermentation afin de maintenir le taux de respiration. Cette charge s'éleva à approximativement 15 ml/h de cérélose à 55 % (glucose monohydraté). Afin de démontrer l'avantage d'une fermentation produisant de la désacétylcéphalosporine C (DAC), on a ajouté de l'acétylestérase de Rhodosporidium toruloides CBS 349 (préparée de la manière décrite à l'exemple 1 a) à l'une des fermentations au début de la phase d'accrois- sement de la céphalosporine (48 h). On a ajouté une quan- tité équivalant à 400 ml de bouillon de levure. On a laissé les fermentations se dérouler pen- dant 8 jours et on a quotidiennement titré des échantil- ions quant à leur teneur en céphalosporine C et en DAC par titrage à la chromatographie en phase liquide à haute performance. Une comparaison entre la fermentation témoin productrice de céphalosporine C et la fermentation traitée à l'estérase productrice de DAC est présentée dans le tableau 2. Le tableau 3 présente les titres en DAC au bout de 141 et 189 heures, exprimés sous forme d'équiva- lents en céphalosporine C. TABLEAU 1 Durée DAC (1lg/ml) DAC (p.g/ml) (jours) Estérase présente Pas d'estérase 3 352 89 4 1732 137 2615 478 TABLEAU 2 Durée Témoin Traitée à l'estérase h Céph C leg/g DAC p.g/g Céph C lg/g DAC ILg/g 400 50 500 0 69 1.800 120 200 1.500 93 1.800 160 0 2.200 117 2.700 320 O 3.000 141 2.500 430 0 3.300 2.600 610 O 3.500 189 2.300 720 0 3.900 TABLEAU 3 Traitée à % Durée Témoin l'esterase d'élévation DAC (en du rendement équiv. en en DAC Cèph C) 141 2.500 3.663 47, 189 2.300 4.329 88 % REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de la désacétyl- céphalosporine C, caractérisé en ce que l'on procède à la fermentation d'un micro-organisme producteur de céphalosporine C en présence d'une quantité d'acétylestérase qui convient à la conversion de sensiblement la totalité de la céphalosporine C produite en désacétylcéphalosporine C avant que la dégradation non enzymatique de la céphalosporine C ne se produise. 2. Procédé suivant la revendication 1, carac- térisé en ce que l'on réalise la fermentation à une tem- pérature de 15 à 45 C à un pH de 4 à 9 pendant une période de 1 à 20 jours. 3. Procédé suivant la revendication 1 ou la reven- dication 2, caractérisé en ce que le micro-organisme producteur de céphalosporine C est une souche de l'espèce Acremonium chrysogenum. 4. Procédé suivant l'une quelconque des reven- dications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on ajoute un excès d'acétylestérase avant l'accroissement de la teneur en céphalosporine C. 5. Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions 1 à 4, caractérisé en ce que l'acétylestérase pro- vient du genre bactérien Rhizobium, du genre de levure Rhodotorule ou de la classe des basidiomycètes ou de l'espèce B:subtilis. 6. Procédé suivant l'une quelconque des revendi- cations 1 à 5, caractérisé en ce que l'acétylestérase provient de l'espèce Rhodosporidium toruloides souche CBS 349. 7. Procédé suivant l'une quelconque des reven- dications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on utilise l'estérase sous la forme d'une préparation exempte de cellules. 8. Procédé suivant l'une quelconque des reven- dications 1 à4, caractérisé en ce que l'on engendre 1' acétylestérase in situ par fermentation du micro-organisme producteur de l'estérase. 9. Procédé suivant l'une quelconque des reven- dications 1 à 4 et 8, caractérisé en ce que l'acétyl- estérase est engendrée in situ par le micro-organisme producteur de céphalosporine C au cours de la fermenta- tion. 10. Micro-organisme producteur de céphalospQ- rine C qui produit par fermentation une quantité d'acétyl- estérase qui convient pour convertir sensiblement toute la céphalosporine C produite en désacétylcéphalosporine C avant que la dégradation non enzymatique de la céphalospo- rine C ne se produise. 11. Micro-organisme suivant la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est un mutant de l'Acremonium chrysogenum.