Brevet FR2464074A1 — publié le 19810306

La présente invention concerne un procédé de pré- paration de vaccins comportant des quantités élevées d'im- munoglobulines G et M, mais pratiquement dépourvus d'immu- noglobuline E, anticorps responsables d'allergies et de chocs anaphylactiques. En général, les vaccins sont préparés par sup- pression de la toxicité ou inactivation de substances bio- logiquement toxiques hautement purifiées, à l'aide d'un réactif, comme formaldéhyde ou f-propiolactone, qui ne di- 0lo minue pas leur activité immunologique; ces vaccins sont utilisés pour la prévention, le traitement et l'essai cli- nique, de différentes maladies. La production d'anticorps comme les immunoglobulines G et M, qui empêchent l'infec- tion de se développer, est, lorsqu'on prépare les vaccins selon des procédés classiques, beaucoup plus diminuée en comparaison de celle de substances intactes, biologiquement toxiques; l'administration de ces vaccins entraîne en ou- tre la production d'immunoglobuline E responsable d'aller- gies et/ou de chocs anaphylactiques. La présente invention permet d'éviter ces incon- vénients de l'art antérieur et d'éliminer complètement ou presque la tendance à produire de l'immunoglobuline E, sans qu'il y ait diminution de production d'immunoglobulines-G et M, qui empêchent l'infection. Le nouveau procédé selon l'invention consiste à préparer, par la fixation covalente d'une substance biolo- giquement toxique à un saccharide, un produit de conjugai- son substance biologiquement toxique-saccharide qui permet l'inactivation de ladite substance. La substance biologiquement toxique, utilisée conformément à l'invention, qui contient généralement une protéine toxique, anatoxine protéinique et/ou enzymes toxi- ques, comme collagénase ou protéase, comprend des toxines bactériennes comme celles de la diphtérie, du tétanos, de la gangrène gazeuse, du choléra, ainsi que la toxine botu- lique, qui provoquent des maladies chez l'homme et/ou les animaux, des zootoxines, y compris des venins comme ceux d'Agkistrodon halys, Trimeresurus flavoviridis et scor- pion, et des phytotoxines comme le ricin. Les saccharides, utilisés selon l'invention, com- prennent des mono-, di-, oligo- et poly-saccharides, comme amidon, amylose, dextrane, polysucrose (par exemple "Ficoll" fabriqué par Pharmacia Fine Chemicals AB, en Suède), pullu- lane, elsinane, curdlane, gomme arabique, gomme adragante, gomme guar, gomme de xanthane, carraghénane, pectine, cellu- lose, glucomannane, chitosane, ainsi que leurs dérivés et produits d'hydrolyse partielle, ayant un poids moléculaire moyen compris dans l'intervalle de 100 à 10 000 000, et de préférence 500 à 1 000 000. Plus particulièrement, la liai- son de covalence de la substance biologiquement toxique avec pullulane, elsinane ou leurs produits d'hydrolyse partielle, rend non toxique avantageusement ladite substance, et aug- mente de façon remarquable la production originale des an- ticorps tels qu'immunoglobulines G et M, mais par contre, élimine nettement la production d'immunoglobuline E. Conformément à l'invention, on peut utiliser, pour réaliser la liaison de covalence entre ladite substance et le saccharide, tout mode opératoire tel que de préférence: copulation diazorque, procédé peptidique, procédé par alky- lation, réticulation, et copulation par disulfure. La copulation diazolique implique une réaction de copulation de la substance avec un saccharide diazoté, por- tant un ou plusieurs types de groupements aminoaromatiques choisis parmi les suivants: p-aminobenzyle, m-aminobenzyle, p-aminobenzoyle, maminobenzoyle, m-aminoanisoyle, p-amino benzyloxy méthyle, (paminophénoxy)-3 hydroxy-2 propionyle, (p-amino m-methyl anilino)-3 chloro5 triazinyle,- que l'on peut introduire par des procédés classiques. Le procédé peptidique met en jeu une réaction de la substance avec un saccharide activé comme les saccharides activés par BrCN, carbonates de sucre, et les dérivés, azide d'acide, halogénure d'acide, carbodiimide et isocyanate de saccharides portant un groupement carboxylique. Le procédé par alkylation implique une réaction entre la substance en question et un dérivé halogénure d'al- kyle de saccharides portant un groupement fonctionnel, tels que chloroacétyle, bromoacétyle, iodoacétyle, halogénure de triazinyle, etc. Le procédé de réticulation est réalisé en présen- ce de la substance et de réactif polyfonctionnel comme glu- taraldéhyde, glyoxal, succindialdéhyde, diisocyanate d'hexa- méthylène, diisocyanate de toluène-2,4, bis-azobenzidine ou NN'N-éthylène bis-maléimide. Le rapport pondéral entre la substance biologique- ment toxique et le saccharide, pour la réaction de conjugai- O10 son, est en général compris dans l'intervalle de 1/1000 à 1000, de préférence de 1/100 à 100, conformément à l'inven- tion. Dans ce cas, la substance biologiquement toxique et le saccharide, respectivement, ne sont pas limités à une seule variété: la conjugaison utilisant une variété de subs- tance biologiquement active, peut impliquer 2 ou plusieurs variétés de saccharides, et celle qui utilise une variété de saccharide peut impliquer 2 ou plusieurs variétés de substan- ces biologiquement toxiques pour produire un vaccin mixte; de même, conformément à l'invention, on peut utiliser 2 ou plusieurs variétés aussi bien de saccharides que de subs- tances biologiquement toxiques. Les conditions de réaction ne sont pas critiques, pourvu que le produit, résultant de la conjugaison de la substance biologiquement toxique avec le saccharide, ne soit pas toxique, et que ces conditions fassent décroître consi- dérablement la production d'immunoglobuline E, sans entraP- ner une baisse notable de la production des immunoglobulines G et M. On réalise, par exemple, cette conjugaison à une tem- pérature de 0O à 1000C, un pH de l'ordre de 3 à 12, pendant une durée de 6 minutes à 50 heures. Les produits de conjugaison, substance biologique- ment toxique-saccharide, ainsi obtenus, sont généralement soumis à des procédés de purification et de séparation, tels que filtration, lavage, centrifugation, relargage, dialyse, adsorption et désorption par échangeur d'ions, filtration sur gel, chromatographie par échange d'ions, chromatographie par affinité et électrophorèse; ils sont ultérieurement concen- trés sous forme de sirops ou de liquides, ou bien séchés pour 2464074 - donner des poudres, qui constituent le vaccin. Pour la désensibilisation de l'induction d'inter- feron chez l'homme ou l'animal, le vaccin est utilisé avan- tageusement seul, ou en combinaison avec d'autres substan- ces comme agents-antiseptiques ou adjuvants. De plus, la production de vaccin selon le procédé classique, utilisant le formaldéhyde, nécessite généralement une période de 20 à 90 jours pour l'inactivation, ce qui constitue -un danger de possibilité de régénération de toxicité potentielle. Par contre, bien que le procédé selon l'invention ne demand- de que 1 à 2 jours pour l'inactivation, le produit est très stable sur une longue durée d'entreposage, sans danger. Ainsi, les dispositions à prendre, concernant la prédomi- nance des maladies, sont considérablement facilitées. De plus, comme la production du vaccin élimine les choc ana- phylactique et allergie léthale dues à la souillure par des protéines, il n'est plus nécessaire d'avoir comme matière première hautement purifiée, ccmmie une substance biologique- ment toxique. Par conséquent, le procédé selon l'invention permet une inactivation directe de la substance, sans sta- des préalables de purification, d'o réduction du coût et obtention de quantités suffisantes de vaccin. On constate également que le vaccin, produit à partir d'une substance brute, possède une activité immunogénique égale ou même bien supérieure à celle des vaccins préparés à partir de substances hautement purifiées. Les exemples non limitatifs suivants, constituent des formes de réalisation préférées de l'invention et per- mettent de la mieux comprendre. EXEMPLE 1 VACCIN ANTITETANIQUE ) Préparation de la toxine tétanique On prépare la toxine tétanique selon le mode opératoire dé- crit dans "Japan J. Med. Sci. Biol.", vol. 14, page 121 (1961); on ensemence 100 litres de milieu P II avec une souche Harbard A 47, puis on cultive le mélange résultant à 350C pendant 7 jours. A la partie surnageante du bouillon de culture, obtenue par centrifugation, on ajoute une solution aqueuse de chlorure de zinc à 50 % en poids/volume, et l'on extrait la toxine à partir du précipité formé, à l'aide d'une solution aqueu- se de phosphate disodique, puis on additionne l'extrait avec du sulfate d'ammonium pour obtenir une saturation de à 60 %, et on recueille ultérieurement le précipité for- mé. Par dissolution de ce précipité dans de l'eau distillée, on obtient une solution brute de toxine tétanique. Cette anatoxine brute est alors purifiée à l'aide d'un sys- tème de colonne de gel de dextrane et de colonne échangeuse d'ions, avec respectivement du Sephadex G-100 (fabriqué par Pharmacia Fine Chemicals AB, en Suède) et de la cellulose DEAE, ce qui permet d'obtenir une toxine tétanique haute- ment purifiée, ayant une Lf de 3 000 par mg d'azote protéi- nique. Une unité Lf est définie comme la quantité de toxine ou d'anatoxine qui, mélangée avec 1 unité d'anti-toxine, produit le plus rapidement la réaction de floculation. 2 ) Préparation du produit de conjugaison toxine-pullulane. On ajuste à pH 10,7 avec de la soude iN, une solution de pullulane préparée avec 400 ml d'eau et 5 g de pullulane de poids moléculaire moyen de l'ordre de 140 000. Tout en main- tenant le pH à ce niveau, on ajoute peu-à-peu au mélange 3g de BrCN, et l'on poursuit la réaction pendant 1 heure pour activer le pullulane, puis on ajuste la valeur du pH à 5 au moyen de HCl iN et on dialyse ensuite le mélange réaction- nel contre de l'eau glacée, à pH 5. On ajoute à la solution de pullulane, ainsi activée, 200 ml de solution de toxine tétanique hautement purifiée, prépa- rée comme plus haut, et on laisse la réaction de conjugai- son se faire à temnpérature ambiante pendant 24 heures. Lorsque cette réaction est terminée, on ajoute au mélange réactionnel 3 volumes d'acétone, et on recueille le préci- pité résultant. Puis on dissout ce dernier dans un tampon de phosphate 0, 01 M (pH 7) et on centrifuge pour éliminer les substances insolubles. La partie surnageante est sou- mise à une filtration sur gel, pour recueillir la fraction contenant le produit de conjugaison toxine-pullulane, et cette fraction est filtrée sur filtre Millipore (fabriqué par Millipore Inc. aux U.S.A.) pour donner un vaccin d'ana- toxine tétanique avec un rendement de 70 % environ par rap- port à la protéine de la toxine de départ. Conformément au procédé classique, on prépare un vaccin té- moin par addition d'une solution de formaldéhyde du codex à ml de solution de toxine tétanique hautement purifiée, jusqu'à une concentration finale de 0,4 % en volume/volume, et on laisse reposer 3 semaines à 370C. Le rendement, par rapport à la protéine de la toxine de départ, est de l'or- dre de 60 %. ) Essai d'administration chez l'animal. L'essai d'administration chez la souris montre que la toxi- cité de la toxine est abaissée à environ 1/50 000 par la conjugaison selon l'invention, et que la dose léthale mini- male (DLM) est de l'ordre de une à plusieurs fois supérieure par Lf. De plus, on effectue chez la souris des injections intraveineuses de vaccin témoin et de vaccin selon l'inven- tion, à raison de 10 Lf, et on répète l'injection à la mê- me dose 7 jours plus tard. 10 jours après la dernière admi- nistration, les souris sont saignées et les titres des anti- corps sont déterminés, ceux des immunoglobulines G et M par la réaction d'hémoagglutination passive (HAP) décrite dans Japan J. Med. Sci. Biol. vol. 28, page 127 (1975), et ceux de l'immunoglobuline E par la réaction d'anaphylaxie cuta- née passive (ACP) décrite dans Life Science, vol. 8, page 813 (1969). Ces essais révèlent que l'administration du vac- cin, préparé conformément à l'invention, conduit à une pro- duction environ 12 fois supérieure d'immunoglobulines G et M, comparée à la production obtenue avec le vaccin témoin, et que l'on ne peut détecter d'immunoglobuline E dans le cas du vaccin selon l'invention. Il ressort de ce qui précède que la conjugaison donne de bons résultats dans le cas du vaccin antitétanique. EXEMPLE 2 VACCIN D'ANATOXINE DIPHTERIQUE ) Préparation de la toxine diphtérique. La toxine diphtérique est préparée selon le mode opératoire décrit dans Journal of Immunology, vol. 40, pp. 21-32 (1941). On ensemence dans 20 litres de milieu de Mueller & Miller, de la souche NO 8 de Park Williams, puis on cultive pen- dant 48 heures le mélange résultant à 35OC, sous agitation et dans des conditions aérobiques. Après centrifugation du bouillon de culture, la partie sur- nageante (pH 8,4) est refroidie à 40C, et additionnée peu- à-peu avec une solution aqueuse à 50 % en poids/volume de chlorure de zinc, pour obtenir un pH de 6; après centri- fugation du mélange, on recueille le précipité que l'on dissout dans 1/10 de son volume d'une solution à 25 % en poids/volume de Na2HPO4.12H20, et on laisse reposer la so- lution résultante une heure durant à 350C, avant de centri- fuger. On additionne la partie surnageante de 0,3 % en poids/vo- lume de charbon activé et à 40 % de saturation de sulfate d'ammonium, puis le mélange est abandonné pendant 3 heures; il est ensuite soumis à la filtration. Le filtrat obtenu est à nouveau additionné de sulfate d'ammonium, à 60 % de saturation, abandonné une nuit durant, puis le mélange est centrifugé et le précipité recueilli. On dissout ce préci- pité dans 700 ml de tampon phosphate M/15 (pH 8) et l'on soumet à une chromatographie par échange d'ions et à une filtration sur gel. On obtient ainsi une toxine diphtérique (environ 3 000 Lf/ml). 20) Préparation du produit de conjugaison toxine diphtéri- que-pullulane. Une solution activée de pullulane, préparée par le procédé décrit dans l'exemple 1, est ajustée à pH 8 avec du tampon carbonate 0,05 M et on y ajoute 200 ml de solution de toxi- ne diphtérique. La solution résultante est soumise, à tem- pérature ambiante pendant 24 heures, à la réaction de con- jugaison, et le produit de conjugaison formé est purifié et séparé comme décrit dans l'exemple 1, ce qui donne, avec un rendement de 70 % par rapport à la toxine de départ, un vac- cin antidiphtérique. Un vaccin témoin est préparé par addition d'une solution de forme aldéhyde codex à 50 ml de solution de toxine préparée au (1) de cet exemple, à une concentration finale de l'ordre de 0,4 % en volume/volume; on laisse reposer 5 semaines à 370C, dialyse pendant 2 jours, et soumet à filtration par Millipore. Le rendement par rapport à la protéine de la toxine de départ, est voisin de 60 %. -30) Essai d'administration du vaccin chez l'animal. L'administration de 0,02 Lf de vaccin témoin, dilué avec de la solution saline physiologique, à des cobayes pesant 300 g environ, aboutit à leur mort. Par contre, l'adminis- tration du vaccin préparé conformément à l'invention (envi- ron 500 Lf) ne provoque aucun décès. La détermination des titres en immunoglobulines G et M, selon le procédé décrit dans l'exemple 1, indique que la conjugaison les multiplie par 10, par rapport au témoin, et qu'il n'y a pas de pro- duction détectable d'immunoglobuline E. On constate égale- ment, après immunisation avec 1 ml de vaccin témoin addi- tionné de 1 mg d'adjuvant hydroxyde d'aluminium, une quan- tité considérable d'immunoglobuline E aussi bien que d'im- munoglobulines G et M. Il résulte de ces résultats que le produit selon l'inven- tion convient comme vaccin antidiphtérique, puisqu'il n'y a aucun danger d'allergie ou de choc anaphylactique. EXEMPLE 3 VACCIN D'ANATOXINE DIPHTERIQUE Une solution d'elsinane, préparée avec 200 ml d'eau chaude et 8 g d'elsinane, de masse moléculaire moyenne aux envi- rons de 800 000, est refroidie à la température ambiante, puis est additionnée de 40 ml de chlorure cyanurique à 10% en poids/volume dans de la diméthyl formamide, puis soumi- se à cette température pendant 2 heures à une réaction d'ac- tivation, le pH étant maintenu à 7. Lorsque la réaction est terminée, le mélange réactionnel est dialysé contre de l'eau à 40C, le pH étant toujours maintenu à la même valeur. On obtient ainsi une solution d'elsinane activée. A cette solution sont ajoutés 45 ml de solution de toxine diphtérique, afin que s'effectue la réaction de conjugaison, et l'on poursuit la réaction pendant 2 heures à pH 9 à tem- pérature ambiante, sous agitation. Le mélange réactionnel est purifié et séparé comme décrit dans l'exemple 1, et l'on 2464074- obtient, avec un rendement de 60 % par rapport à la toxine de départ, un vaccin antidiphtériquae. L'étude de l'administration de ce vaccin à des souris, con- formément au procédé de l'exemple 1, démontre que la toxine est suffisamment inactivée par la conjugaison. La détermina- tion des titres d'immunoglobulines G et M indique également que la conjugaison multiplie par 10 environ la valeur des titres du témoin préparé dans l'exemple 2, et qu'on ne peut détecter de production d>immunoglobuline E. Les résultats ci-dessus conduisent à la conclusion que le produit de conjugaison convient comme vaccin antidiphtAri- que. EXEMPLE 4 VACCIN rD P.iTRIQUE Un vaccin d'anatoxine diphtérique est préparé commne dans l'exemple 2, le pullulane de masse moléculaire moyenne de l'ordre de 140 000 étant remplacé par du dextrane de mas- se moléculaire moyenne voisine de 70 000. Le rendement est de l'ordre de 40 % par rapport à la protéine de la toxine de départ. L'étude de l'administration de ce vaccin aux souris, con- formément au procédé décrit dans l'exemple 1, indique que la toxine est suffisamment inactivée par la conjugaison La détermination des titres des immunoglobulines G et M démontre également que la conjugaison multiplie par 5 la valeur des titres obtenus avec le vaccin témoin, préparé dans l'exemple 2, et quail n'y a pas de production déce- lable d'immunogiobuline E. 11 découle de ces résultats que ce produit de conjugaison convient commte vaccin antidiphtérique. EXEMPLE 5 VACCIN D'ANATOXINE DE Trimeresurus flavoviridis 1.) Préparation de la toxine de Tximeresurus flavoviridis. De la toxine solide de Trimeúesurus flavoviridis est dis- soute dans du tampon Tris-HCl 0,02 M (pH 8,5) de façon à aboutir à une concentration finale de l'ordre de 5 %' en poids/volume, puis le mélange est centrifugé pour élimi- ner les substances insolubles. La partie surnageante est Io utilisée dans ce qui suit, corme toxine brute deTrimeresurus flavoviridis. ) Préparation du produit de conjugaison toxine de Trimere- surus flavoviridis-hydrolysat partiel de pullulane. Une solution de pullulane, préparée par chauffage de 110 ml de diméthylformnamide et 5,2 g d'hydrolysat partiel de pul- lulane de masse moléculaire moyenne de l'ordre de 10 000, est refroidie à température ambiante, puis additionnée de ml de pyridine et 1 g de chlorure de p-nitrobenzoyle, O10 sous agitation, et on laisse ensuite reposer la solution résultante à température ambiante pendant 17 heures. A ce mélange réactionnel, on ajoute 2 volumes de n-propanol, et le précipité formé est recueilli et dissous dans de la di- mAthyl form-amide. On répète à 3 reprises ce mode de préci- * pitation, et le précipité final est dissous dans 100 ml de solution à 5 % en poids/volume de dithionite de sodium et on laisse incuber 30 minutes à 80 C. Le produit résultant est décoloré avec du charbon activé, filtré, et le filtrat est additionné de 2 volumes de n- propanol. Le précipité est dissous dans de l'eau, et la solution résultante est dialysée une nuit durant contre de l'eau, puis le dialysat est refroidi au-dessous de 20C et additionné de HCl jusqu'à une concentration finale de 0,1 N. -A cette solution on ajoute du nitrite de sodium à la concentration de 1 % en poids/volume environ, pour dia- zoter l'hydrolysat partiel de pullulane. Lorsque cette ré- action de diazotation est terminée, le produit résultant est dialysé contre de l'eau en dessous de 4 C, pendant 2 heures. On obtient ainsi un hydrolysat partiel de pullu- lane diazoté. A cette solution d'hydrolysat partiel de pullulane diazoté on ajoute 20 ml de la solution de toxine préparée au (1) de cet exemple, puis on ajuste à pH 8,5 avec du carbonate de sodium. Ce mélange est soumis à une réaction de copula- tion diazo'que à 4oc, pendant 2 heures, sous agitation, puis le mélange réactionnel est purifié et séparé comme au (2) de l'exemple 1, pour obtenir le produit de conjugaison toxine de Trimeresurus flavoviridishydrolysat partiel de il pullulane avec un rendement voisin de 60 % rapporté à la protéine toxique de départ. O -prépare un vaccin témoin par addition d'une solution de formaldéhyde du codex à 0,05 % en volume/volume, à la so- lution de toxine préparée au (1) du présent exemple, on laisse reposer 60 jours à 40C pour inactiver la toxine, on centrifuge, puis on filtre sur Millipore. Dans ce cas, le rendement rapporté à la toxine de départ est de l'or- dre de 50 %. 1Q 30) Essai d'administration du vaccin à l'animal. L'étude de l'administration à des souris, conformément au procédé décrit au (3) de l'exemple 1, du vaccin témoin et du vaccin selon l'invention, démontre que la conjugaison inactive suffisamment la toxine. En outre, la détermina- tion des titres d'immunoglobulines G et M, indique qu'ils sont 5 fois plus élevés que ceux qui sont obtenus avec le témoin, et que, dans le cas du vaccin selon l'invention, on ne peut déceler de production d&immunoglobuline E. Par contre, lorsqu'on utilise le vaccin témoin on détecte, outre la production des immlnoglobulines G et M, une net- te formaeion d'immunoglobuline E. Il ressort des résultats ci-dessus, et du fait que l'ad- ministration du produit de conjugaison n'entraîne ni al- lergie, ni choc anaphylactique, que ce produit de conju- gaison peut être avantageusement utilisé comme vaccin con- tre Trimeresurus flavoviridis. EXEFMPLE 6 VACCIN D'ANATOXINE DE Trimeresurus-flavoviridis Une solution d'elsinane, préparée par chauffage de 200 ml d'eau distillée-et 10 g d'elsinane de poids moléculaire moyen de l'ordre de 200 000, est refroidie à température ambiante, puis additionnée de 5 g d"'hexaméthylène diamine, et ensuite son pHli est ajusté à 11 avec de la soude 1 N. On ajoute alors peu à peu à cette solution, sous agitation, maintenue au-dessous de 200C par addition de glace, 5 g de BrCN. La réaction est poursuivie pendant 30 minutes sous agitation, puis le mélange réactionnel est dialysé contre de l'eau distillée à 40C pendant 1 heure, et l'on obtient une solution d'elsinane activée-. A cette solution d'elsinane activé, on ajoute 2 ml de solution aqueuse de glutaraldéhyde à 25 % en poids/volume, 60 ml de solution de toxine brute de Trimeresurus flavoviridis préparée comme au (1) de l'exemple 5, et 10 ml de tampon acétate 1M (pH 5); on laisse se dérou- ler la réaction de conjugaison à 4 C, pendant 24 heures, sous agitation, puis on ajoute de la glycine jusqu'à une concentration voisine de 1M et on laisse reposer à tempé- rature ambiante pendant 24 heures, afin de bloquer les grou- pements actifs n'ayant pas réagi. Le mélange réactionnel est ensuite centrifugé et la partie surnageante est soumise à une filtration sur gel, afin de recueillir la fraction con- tenant le produit de conjugaison toxine-elsinane; cette fraction est concentrée puis filtrée sur Millipore, et on obtient ainsi, avec un rendement voisin de 50 %' rapporté à la toxine de départ, un vaccin d'anatoxine de TrimeresUruS flavoviridis. L'étude de l'administration à des souris de ce vaccin, con- formément au procédé décrit au (3) de l'exemple 1, démontre que la toxine est suffisamment désactivée' par la conjugaison. De plus, après détermination des titres d'imnmunoglobulines G et M,on constate que ces titres sont multipliés par 8 par la conjugaison, par rapport à ceux que l'on obtient avec le vac- cin témoin préparé au (2) de l'exemple 5; en outre, on ne peut déceler de production d'immunoglobuline E. En conséquence, ce produit de conjugaison convient comme vaccin d' anatoxine de Trimeresurus flavoviridis. EXPMPLE 7 VACCIN D'ANATOXINE de TTimeresurus flavoviridis Une solution de carboxyméthyl cellulose activée, préparée par addition de 2 g de méthiodure d'éthyl-1 (diméthylamino- 3'propyl)-3 carbodiimide à 200 ml d'une solution à 1 % en poids/volume de carboxyméthyl cellulose de poids moléculaire moyen de l'ordre de 20 000, ajustement du pH à 4, réaction d'activation à température ambiante sous agitation, et dia- lyse du mélange réactionnel contre de l'eau distillée une nuit durant, est additionnée avec 50 ml de la solution de toxine préparée au produit (1) de l'exemple 5. Le mélange résult=-nt est ajusté à pH 4,5, puis soumis à la réaction de conjugaison à température ambiante, sous agitation, toute la nuit. La partie surnageante, obtenue par centri- fugation du produit résultant, est soumise à une filtra- tion sur gel pour obtenir la fraction contenant le produit de conjugaison toxine-carboxyméthyl cellulose, puis cette fraction est concentrée et filtrée sur Millipore. On ob- tient ainsi, avec un rendement voisin de 60 % par rapport à la toxine de départ, un vaccin. L'étude de l'administration à des souris, conformément au procédé décrit au (3) de l'exemple 1, de ce vaccin, indi- que que la toxine est suffisamment désactivée par la con- jugaison. En outre, on constate, après détermination des titres d'immunoglobulines G et M, que ces titres sont mul- tipliés environ par 3 par rapport à ceux que l'on obtient avec le témoin, préparé au (2) de l'exemple 5, et qu'il n'y a pas de production d'inmunoglobuline E. En conséquence, ce produit de conjugaison convientcomme vaccin d' anatoxine de Trimeresurus flavoviridis. EXEMPLE 8 SUPPRESSION DE LA TOXICITE DU RICIN 1 ) Préparation du ricin. Une solution brute de ricin est préparée par extraction de poudre de grains de ricin dégraissés, dans une solution saline à 0,85 % en poids/volume, centrifugation de cet extrait, relargage de la partie surnageante avec du sulfa- te d'ammonium à 33-50 % de saturation à pH 8, et dissolu- tion finale du précipité dans de l'eau. 2 ) Préparation du produit de conjugaison ricin-pullulane. A une solution de pullulane activée, préparée par le pro- cédé décrit au (2) de l'exemple 1, on ajoute 200 ml d'une solution brute de ricin préparée comme au (1) de cet exem- ple, et l'on soumet la solution résultante à une réaction de conjugaison à température ambiante pendant 24 heures, pour obtenir un produit de conjugaison ricin-pullulane; on purifie et sépare ce produit conformément au procédé décrit au (2) de l'exemple 1, et on obtient ainsi du ricin désactivé avec un rendement de l'ordre de 40 % par rapport au ricin de départ. ) Essai d'administration du ricin désactivé chez l'ani- mal. L'étude de l'administration à des souris de ce ricin inac- tivé, selon le procédé décrit au (3) de l'exemple 1, démon- tre que la conjugaison inactive suffisamment le ricin. De plus, lors d'injections intraveineuses répétées de ce ri- cin inactivé chez la souris, on ne constate pas de choc anaphylactique. l0 Les résultats ci-dessus suggèrent une utilisation possible de ce produit de conjugaison comme désensibilisateur ou inducteur d'interferon. EXEMPLE 9. RICIN INACTIVE On prépare une gomme arabique activée de manière similaire à celle qui est décrite au (2) de l'exemple 3, à ceci près que' l'elsinane de poids moléculaire moyen de l'ordre de 800 000 est remplacé par de la gomme arabique de poids mo- léculaire moyen voisin de 300 000. On ajoute à la solution de gomme arabique activée, 100 ml de ricin brut, préparé au (1) de l'exemple 8, on ajuste le pH à 9, et laisse se dérouler la réaction de conjugaison à température ambian- te, sous agitation, pendant 2 heures. Le produit de conjur.e gaison résultant ricin-gomme arabique, est purifié et sé- paré comme au (2) de l'exemple 1. On obtient ainsi, avec un rendement de 50 % environ par rapport à la protéine de ricin de départ, un ricin inactivé. L'étude de l'administration de ce produit à la souris, se- lon le procédé décrit au 3 de l'exemple 1, démontre que le ricin est suffisamment inactivé par la conjugaison. Comme au (3) de l'exemple 8, l'administration intraveineuse répé- tée de cette substance chez la souris, n'entratne pas de choc anaphylactique. EXEMPLE 10 VACCIN ANTITETANIQUE Une solution de maltotriose, préparée avec 3 g de maltotrio- se et 300 ml d'eau distillée, est additionnée de 15 ml d'une solution de chlorure cyanurique à 10 % poids/poids dans de la diméthyl formamide, son pH est ajusté à 7, et on la sou- met à une réaction d'activation à température ambiante pen- dant 2 heures, sous agitation. A cette solution activée, on ajoute 150 ml de solution de toxine tétanique hautement pu- rifiée, préparée au (1) de l'exemple 1, puis on ajuste la solution résultante à pH 9 avec du carbonate de sodium iN, on laisse s'effectuer la réaction de conjugaison à 40C sous agitation, on ajoute de la glycine et laisse reposer 6 heu- res à cette température. Après centrifugation du mélange réactionnel, la partie surnageante est soumise à une chro- matographie par échange d'ions et à une filtration sur gel, pour obtenir la fraction contenant un produit de conjugai- son toxine tétanique-maltotriose, qui est ensuite soumise à une filtration sur Millipore; on obtient ainsi, avec un rendement de l'ordre de 80 % par rapport à la toxine de dé- part, un vaccin antitétanique. L'étude de l'administration de ce vaccin chez la souris, selon le procédé décrit au (3) de l'exemple 1, indique que la toxine est suffisamment inactivée par la conjugaison. En outre, la détermination des titres des immunoglobulines G et M révèle que ces titres sont multipliés par 16, par rapport aux titres que l'on obtient avec le vaccin témoin préparé au (2) de l'exemple À, et qu'il n'y a pas, après immunisation, de production d'immunoglobuline E. Il ressort de ces résultats que ce produit de conjugaison convient parfaitement conume vaccin antitétanique. -2464074 REVENDICATIONS I. Procédé de préparation d'un vaccin, à partir d'une substance biologiquement toxique, caractérisé en ce qu'on prépare par fixation de covalence, un produit de conjugai- son entre cette substance biologiquement toxique et un saccharide, pour inactiver ladite substance. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la substance biologiquement toxique est constituée par une ou plusieurs des substances suivantes: toxines bactériennes, en particulier celles de la diphtérie, du tétanos, du botulisme, de la gangrène gazeuse ou du cho- léra; zootoxines, notamment venin de Agkistrodon de Trime- resurus flavoviridis ou de scorpion; et phytotoxines com- me celle du ricin. 3. Procédé selon une des revendications 1 ou 2, ca- ractérisé en ce que le saccharide est constitué par une ou plusieurs des substances suivantes: amidon, amylose, dextrane, polysucrose, curdlan, gomme arabique, gomme adragante, gomme "guar", gomme de xanthane, carraghenane, pectine, cellulose, glucomannane, chitosane, ainsi que leurs dérivés et produits d'hydrolyse partielle, et plus particulièrement pullulane et elsinane, ainsi que leurs dérivés et produits d'hydrolyse partielle. 4. Procédé selon une des revendications 1 à 3, ca- ractérisé en ce que la réaction de conjugaison se fait par: copulation diazoique, procédé peptidique, alkyla- tion, réticulation ou copulation par disulfure. 5. Procédé selon une des revendications 1 à 4, ca- ractérisé en ce que, le rapport pondérai substance bio- logiquement toxique/saccharide est compris entre 1/1 000 et 1 000, de préférence entre 1/100 et 100, le pH entre 3 et 12, la t.empérature entre 0 et 100C, la durée de la réaction poulvant aller de 6 minites à 50 heures. 6. Procédé selon une des revendications 1 à 5, ca- ractérisé en ce que le poids moléculaire moyen du saccha- ride est compris entre 100 et 10 000 000, de préference entre 500 et 1 000 000. 7. Procédé selon une des revendications 1 à 6, ca- ractérisé en ce que pour que s'effectue la fixation par covalence, le saccharide comporte un des groupements fonc- tionnels suivants: p-aminobenzyle, m-aminobenzyle, p-ami- nobenzoyle, m-aminobenzoyle, m-aminoanisoyle, p-aminoben- zyloxy méthyle, hydroxy-2 (p-aminophénoxy)-3 propionyle, (p-amino m-méthyl anilino)-3 chloro-5 triazinyle, imido- carbonate, azide d'acide, halogénure d'acide, carbodiimi- de, isocyanate, chloroacétyle, bromoacétyle, iodoacétyle, halogénure de triazinyle et disulfure. lo 8. Procédé selon une des revendications 1 à 6, carac- térisé en ce que la liaison de covalence est réalisée en présence d'un réactif polyfonctionnel tel que glutaraldA- hyde, gvlyoxal, succindialdéhyde, diisocyanate d'hexmnéthy- lène, diisocyanate de toluene-2,4, bis-azobenzidine ou N,N'-éthylene bis-maléimide. 9. Application du procédé suivant une des revendica- tions i à 8 à la préparation de vaccins utilisant ladite substance biologiquement toxique, conjuguée avec un sac- charide.