Brevet FR2461000A1 — publié le 19810130

1. La présente invention concerne un dispositif pour l'identification des microorganismes et, plus spécifi- quement, des moyens pour résoudre le problème des réactions donnant une réponse positive erronée dans les logements des témoins négatifs des récipients d'essai pour identification des microorganismes. Le grand nombre de souches de bactéries hautement pathogènes et leur susceptibilité variable aux antibiotiques ont entraîné le développement de techniques pour l'identifi- cation des microorganismes et l'évaluation de leur suscepti- bilité aux antibiotiques et notamment la détermination de la concentration inhibitrice minimale de l'antibiotique, c'est- à-dire la plus faible concentration d'antibiotique qui inhibe complètement la croissance du microorganisme. Ces techniques comprennent, de manière caractéristique, l'utilisation de plateaux d'essai qui comportent, par exemple, une coquille ou carcasse monobloc en matière plastique, pourvue d'une plura- lité de logements, en forme de puits, pour l'incubation, désignés ciaprès par le terme "logements". Ces logements peuvent être disposés en rangées parallèles, comme décrit dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique n0 3 826 717 et n0 3 356 462 ou en motifs circulaires comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n0 4 010 078. Jusqu'à présent, il n'était pas possible de dis- poser d'un plateau d'essai microbiologique peu coûteux, donnant rapidement des résultats et qui non seulement fournisse des informations concernant la sensibilité des antibiotiques, mais aussi constitue un moyen précis et repro- ductible pour l'identification des microorganismes à l'aide de comparaisons entre les logements des témoins négatifs et les logements pour essais biochimiques. Un problème addition- nel soulevé par l'identification des microorganismes consiste en ce que de nombreux essais biochimiques connus impliquent seulement de faibles changements de coloration des milieux d'essai en réponse à la croissance des micro- organismes. Les déterminations liées à ces faibles change- ments de coloration sont difficiles à faire d'une manière fiable. Il est donc souhaitable d'améliorer la fiabilité des 2. identifications de microorganismes basées sur de faibles changements de coloration dans les milieux d'essai bio- chimiques. La présente invention concerne un dispositif et un procédé qui améliorent d'une manière importante la possi- bilité de détecter les résultats des essais d'identification des microorganismes impliquant la détection de changements de coloration dans les milieux d'essai. L'invention réduit nota- blement la possibilité d'obtention d'un résultat erroné dans l'identification d'un microorganisme en raison des incapa- cités à détecter de faibles changements de coloration dans les milieux d'essai. L'invention permet d'obtenir une fiabilité accrue de l'identification des microorganismes en utilisant des logements de témoins négatifs qui ont un aspect identique aux logements d'essai lorsque les milieux, dans les deux types de logements, sont reconstitués avec de l'eau, avant l'inoculation des microorganismes dans les logements d'essai. Les témoins négatifs conservent la coloration ini- tiale des milieux d'essai et fournissent une norme ou réfé- rence à laquelle on peut comparer les milieux d'essai après inoculation des microorganismes et incubation. Pour une bonne efficacité d'un plateau d'essai compact, en particulier un plateau permettant d'effectuer plusieurs essais d'identification de microorganismes, les logements des témoins négatifs doivent être situés très près des logements d'essai correspondants. L'adjonction d'une série de logements pour témoins négatifs à proximité immé- diate des logements d'essai s'est révélée entraîner un problème de contamination de voisinage jusqu'ici non rencon- tré. Les produits volatils engendrés dans les logements d'essai dans lesquels les microorganismes ont été inoculés peuvent contaminer les logements des témoins négatifs par suite du cheminement de la vapeur et donner un changement visible de coloration, constituant une réponse erronée, dans les logements des témoins négatifs. Il est difficile de déterminer si un changement de coloration vrai s'est produit ou non dans les logements d'essai en réponse à l'activité des 3. microorganismes sans se référer à un témoin négatif conser- vant la coloration initiale de référence des milieux des logements d'essai. L'invention n'élimine pas le problème de la contamination de voisinage des témoins négatifs, mais inter- dit cependant les changements de coloration desdits témoins négatifs par incorporation d'un inhibiteur qui empêche les composés volatils générateurs de coloration produits dans les logements d'essai inoculés de changer la coloration des milieux formant témoins négatifs. L'inhibiteur le plus appré- cié est un tampon inclus dans les milieux constituant les témoins négatifs au moment du remplissage et de l'emballage du plateau d'essai. L'invention fournit des témoins négatifs, à correction automatique, qui n'exigent pas une manipulation ultérieure de l'opérateur et qui permettent la conservation de la coloration de référence des milieux d'essai. L'invention fournit des compositions pour témoins négatifs qui conservent leur coloration initiale et ne sont pas altérées par la contamination de voisinage résul- tant des produits volatils engendrés, après inoculation, dans les logements d'essai d'identification des microorganismes. Ainsi, les résultats d'essai obtenus par mise en oeuvre de Il'inventionsont pueuctles et précis, c'est-à-dire exem)pts d reins -cvnnant une reponse positive erronée oins nfat ifs. dans les io=m,_nî de s L iofd de d -ónlisnt-ion préf'ré de l'invention úot',rn!t deso ur effectuer, dans un seul récipient, d'u'ance r*2n)M eff.. de multiples essais utili- :,ant h C-niatic5 ei cro- 2r, a s; et de s once ntrations en de ncmbeux tiiticu Le m e ' tion pr-, ré correspond z: un j j. 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L'invention sera décrite plus en détail en regard des dessins annexés à titre d'exemple nullement limitatif et sur lesquels: - la figure 1 est une vue de dessus schématique représentant un mode de réalisation du récipient selon l'invention pour l'évaluation combinée de microorganismes et d'antibiotiques; et - la figure 2 est une vue de profil du récipient d'évaluation de microorganismes et d'antibiotiques selon l'invention, avec coupe partielle des logements d'identifi- cation des microorganismes selon la ligne 2-2 de la figure 1. En se référant plus spécifiquement à ces figures, on va décrire-ci-après plus en détail le mode de réalisation préféré de l'invention. Comme le montre la figure 1, le plateau 2 présente dans ce mode de réalisation un contour de forme générale rectangulaire. Ce plateau constitue de préfé- rence un ensemble monobloc obtenu par exemple par moulage. Il est muni d'une pluralité de logements formés dans la masse du plateau et ouverts à leur partie supérieure. Dans l'exemple illustré, le plateau ou plaque 2 présente seize colonnes de logements et onze rangées de logements, ces dernières étant représentées par les lettres "A" à "K". Les logements sont constitués par des creux cylindriques à fonds arrondis. Le plateau 2 comportant lesdits logements peut être en un matériau choisi parmi une grande diversité de substances comme le verre, les matières plastiques ou même les métaux légers tels que l'aluminium. On préfère généra- lement mouler ce plateau à partir d'une matière plastique résistante, transparente et imperméable aux liquides. Parmi les substances-convenant particulièrement à cet usage, on 5. peut citer le polyéthylène, le polypropylène, le polystyrène ou analogues. Ces substances non seulement possèdent les propriétés souhaitées, mais peuvent aussi être fabriquées économiquement sous la forme géométrique désirée par les techniques modernes usuelles de fabrication des matières plastiques. En outre, l'utilisation de telles substances fait qu'il est économiquement possible de jeter le plateau après utilisation. Selon le mode de réalisation préféré, le plateau 2 est de forme générale rectangulaire et présente une longueur de 17,5 cm et une largeur de 11,0 cm. Les logements d'une rangée donnée sont espacés de 10 mm, tandis que les rangées adjacentes sont espacées de neuf millimètres. Chaque logement est de forme cylindrique et à fond rond et présente une profondeur de 10 mm, un diamètre de 7 mm au niveau de l'extrémité ouverte du logement et un rayon de courbure de 3 mm à l'extrémité fermée formant fond du logement. Bien que la structure spécifique décrite en détail dans le présent mémoire présente un contour de forme générale rectangulaire, en vue de dessus, et qu'une telle géométrie soit préférée, l'invention n'est pas limitée à cette forme et d'autres configurations ou contours peuvent être utilisés tout en conservant les avantages de l'inven- tion. En outre, bien que l'on ait seulement représenté ici des logements cylindriques à fond rond, qui correspondent au mode de réalisation préféré, on peut éventuellement mettre en oeuvre d'autres configurations comme des logements cylin- driques à fond plat ou des logements à section transversale rectangulaire. Chacun des logements des figures 1 et 2 est rempli de la substance convenable (de préférence par des moyens de remplissage automatique en atmosphère stérile) de telle façon que la surface supérieure 24 du contenu du loge- ment 26 soit généralement disposée en dessous de l'ouverture de ce logement. Dans le mode de réalisation préféré, les contenus des logements ont été séchés à l'air et doivent être reconstitués avant utilisation. Il est bien entendu qu'on peut utiliser des nombres différents de rangées contenant des 6. nombres différents de logements, en fonction du nombre d'antibiotiques et de milieux d'identification utilisés, bien que l'on ait représenté ici, dans un simple but d'illus- tration, un plateau 2 comportant seize colonnes contenant chacune onze logements. En outre, pour un essai particulier donné, on peut seulement remplir les rangées ou colonnes de logements qui sont à utiliser dans l'essai. Les rangées de logements "C" à "nI de la figure 1, correspondant au mode de réalisation préféré de l'invention, sont formées de logements pour essais d'antibio- tiques (par exemple le logement 22), chaque colonne 1-16 con- tenant un antibiotique différent et chaque rangée C-I correspondant à une concentration différente de l'antibio- tique particulier de chaque colonne. On préfère que les loge- ments de la rangée "I" présentent la concentration la plus élevée en antibiotique et que cette concentration diminue progressivement en direction de la rangée "C" qui correspond à la plus faible concentration. Il existe aussi des logements de témoins d'antibiotiques qui ne contiennent pas d'antibio- tique. La croissance des microorganismes dans les logements des témoins d'antibiotiques confirme le fait que le micro- organisme croît dans le système d'essai et fournit une base pour la comparaison avec les logements d'essais d'antibio- tiques contenant différentes concentrations en antibiotique. L'effet des différents types et des différentes concentrations d'antibiotiques sur la croissance des micro- organismes n'est normalement pas évalué par un changement de coloration, mais apparaît plutôt comme un changement de turbidité par comparaison aux logements à contenu limpide (absence de croissance) présentant des concentrations en antibiotique qui inhibent la croissance des microorganismes. Sur les figures 1 et 2 du mode de réalisation préféré de l'invention, les rangées de logements "A", "B", nJ" et "K" sont utilisées pour les essais d'identification des microorganismes. Les logements des rangées "A" et "K" sont réservés aux témoins des essais d'identification des microorganismes (par exemple le logement 18), appelés aussi logements des témoins négatifs, qui contiennent des milieux 7. formant témoins négatifs. Les logements des rangées "B" et "J" sont des logements d'essai pour identification des microorganismes (par exemple le logement 20) contenant des milieux d'identification des microorganismes. La figure 2 illustre le fait que, dans le mode de réalisation préféré, les logements des témoins négatifs (par exemple 18) sont placés au voisinage immédiat et à côté des logements pour essais d'identification (par exemple 20) qui sont euxmêmes contigus aux logements pour essais d'antibiotiques (par exemple 22). Le tableau I donne une liste de milieux utilisés dans chaque logement pour essai d'identification des micro- organismes (c'est-à-dire de milieux d'essai) selon le mode de réalisation préféré, quoique l'invention s'étende aussi à différents arrangements de milieux et à l'utilisation de milieux additionnels ou à d'autres milieux. Les concentra- tions optimales peuvent être déterminées pour chaque ingré- dient, dans les divers milieux donnés sur le tableau I, selon des manières bien connues de l'homme de l'art. Chacun des logements d'essai des rangées "J" et "B" et, par conséquent, chacun des logements correspondants pour témoins négatifs des rangées "A" et "K", contiennent un milieu différent en fonc- tîon du microorganisme à identifier, chaque milieu étant apte à maintenir l'activité métabolique spécifique d'un micro- organisme particulier. Les indicateurs sont, soit ajoutés aux milieux pour essais d'identification des microorganismes après inoculation desdits microorganismes, comme il est connu, soit engendrés dans les milieux d'essai par les trans- formations métaboliques se produisant sous l'action des microorganismes. L'indicateur entraîne un changement de coloration du milieu dans le logement d'essai en réponse à l'activité métabolique du microorganisme. L'activité du microorganisme soumis aux investigations est déterminée par un changement de coloration des milieux d'essai, par compa- raison avec le témoin négatif correspondant. 8. TABLEAU I Colonne Rangée Milieu J Bouillon de Mueller-Hinton J Lysine-décarboxylase J Arginine-dihydrolase J Ornithine-décarboxylase J Détection de sulfure J Uréase J Tryptophane-désaminase J Indole J Voges-Proskauer J t tilisation de citrate J Détection de DNAse J o-nitrophényl-e-d- galactopyranoside J Fermentation de glucose J Arabinose J Inositol J Sorbitol B Bouillon de Mueller-Hinton B Saccharose B Mannitol B Rhamnose B Raffinose B Mélibiose B Dulcitol B Adonitol B Utilisation du malonate B Hydrolyse d'esculine B Détection de phospho- diestérase B MacConkey B Oxydation-fermentation de glucose B Oxydationfermentation de maltose B Oxydation-fermentation de xylose B Pyocyanine 1 1 1 1 Abrévia- tion (MB) (Lys) (Arg) (Orn) (Ur) (TDA) (I) mmP) (Cit) (DNA) (ONGS) (Glu) (Ara) (Ino) (Sor) (MH) (Suc) (Man) (lha) (Raf) (Mel) (Dul) {Ado) (Mal) coloration, même s'ils sont faibles. Si les couleurs ini- tiales dans les logements pour témoins négatifs sont altérées par contamination de voisinage, les interprétations des essais d'identification des microorganismes peuvent être erronées. Des problèmes particulièrement difficiles ont été rencontrés en ce qui concerne les logements suivants pour témoins négatifs: rangée "A", colonne 11 (milieu phospho- diestérase); rangée "K", colonne 7 (milieu tryptophane- désaminase); rangée "K", colonne 8 (milieu indole); rangée "K", colonne 9 (milieu de Voges-Proskauer) et rangée "K", colonne 12 (milieu onitrophényl-S-d-galactopyranoside). Les milieux, formant témoins négatifs, contenus dans ces loge- ments sont limpides et incolores et, par conséquent, des plus susceptibles d'une contamination de voisinage quelconque par des composés volatils formant une coloration et résultant des réactions d'identification des microorganismes qui se produisent dans les logements d'essai adjacents. Le tableau II donne la liste des composés volatils produits dans les logements d'essai et engendrant une coloration par conta- mination de voisinage. 10. TABLEAU II Logement Logement du Composé d'essai témoin négatif volatil Colon- Rangée Colon- Rangée Milieu d'essai engendrant ne ne la coloration il B il A Phosphodiesté- p-nitro- rase -phénol 7 J 7 K Tryptophane- indole désaminase 8 J 8 K Indole Indole 9 J 9 K Voges- Acétoine Proskauer 12 J 12 K o-nitrophényl- o-nitro- 0-d-galactopyra- phénol noside (ONPG) Conformément à l'invention, on a trouvé que non seulement les changements de coloration dans les logements des témoins négatifs résultaient de la contamination par les composés volatils, responsables de la formation d'une colora- tion, engendrés dans les logements d'essai contigus par suite de l'inoculation, mais aussi que de tels changements indési- rables de coloration pouvaient être empêchés en incorporant dans les milieux contenus dans les logements des témoins négatifs un inhibiteur qui, en solution aqueuse, empêche la formation d'une coloration dans ceuxci sous l'action du composé volatil responsable de la coloration. L'inhibiteur préféré est un système tampon, c'est-à-dire un ou plusieurs composés tampons, capable de réguler le pH dans les logements des témoins négatifs. Le p-nitrophénol et le o-nitrophénol sont des indicateurs de pH qui, dans les solutions acides, sont inco- lores, mais qui virent au jaune en présence de solutions alcalines. Ainsi, les milieux formant témoins négatifs qui changent de coloration lorsqu'ils sont contaminés par le o- nitrophénol ou le p-nitrophénol subissent ce changement en raison de la modification de coloration de ces indicateurs de pH lorsqu'ils sont soumis à un pH basique. Par ailleurs, les milieux formant témoins négatifs qui présentent un changement 11. de coloration lorsqu'ils sont contaminés par l'indole ou l'acétoine subissent un tel changement en raison d'une réaction chimique de formation de coloration entre les milieux formant témoins négatifs et ces contaminants de voisinage. Le p- nitrophénol et le o-nitrophénol produits dans les milieux d'essai phosphodiestérase et ONPG, après inoculation des microorganismes, peuvent conférer une colo- ration jaune à tout milieu de pH basique. Par conséquent, ces contaminants volatils peuvent même modifier la coloration de milieux formant témoins négatifs qui présentent un pH basique et qui sont sans relation avec les milieux d'essai consi- dérés. Les milieux formant témoins négatifs qui sont contigus aux logements d'essai à milieu phosphodiestérase ou ONPG dans lesquels on a inoculé les microorganismes doivent soit pré- senter un pH de 6,0 ou moins, soit être tamponnés à un tel pH de façon à éviter les changements de coloration dans lesdits milieux formant témoins négatifs au cours des essais d'iden- tification des microorganismes. L'indole qui est produit à la fois dans le milieu d'essai triptophanedésaminase et dans le milieu d'essai indole réagira avec les milieux indole formant témoins néga- tifs auxquels on ajoute la substance co-réactionnelle forma- trice de coloration qu'est le p-diméthylaminobenzaldéhyde. Dans le mode de réalisation préféré de l'inven- tion, les logements des témoins négatifs dont les milieux correspondent au milieu de détection de phosphodiestérase, au milieu Voges-Proskauer et au milieu o-nitrophényl-e-d- galactopyranoside, doivent être maintenus à un pH de 6, ou moins, lorsque les réactions d'identification des micro- organismes se produisent dans les logements d'essai contigus contenant les milieux phosphodiestérase et ONPG afin d'empê- cher l'apparition de changements de coloration qui fausse- raient les réactions positives. L'inhibiteur préféré à uti- liser avec ces milieux est le phosphate monopotassique (KH2PO4). Le pH des milieux indole formant témoins négatifs doit être au moins égal à 9,8 afin d'empêcher l'apparition de 12. changements de coloration dans ces témoins négatifs par suite de la contamination par le milieu d'essai indole contigu cor- respondant dans lequel ont été inoculés les microorganismes. L'inhibiteur préféré du témoin négatif à milieu indole est NaOH additionné de glycine. Après détermination de l'identité du contaminant volatil responsable de la coloration, on peut choisir, par des processus de laboratoire connus, avant que les divers milieux ne soient introduits dans les logements du plateau, un inhibiteur convenable permettant d'empêcher les change- ments de coloration provoqués, dans un témoin négatif donné, par ce contaminant volatil. Par exemple, on peut effectuer une série d'expériences, dans des conditions variables de pH, pour choisir un système tampon convenable de telle sorte qu'il ne se produise pas de changement de coloration dans les témoins négatifs. Conformément à un mode de réalisation préféré de l'invention, on introduit les solutions d'antibiotiques dans les logements pour essais d'antibiotiques et les logements d'identification des microorganismes, par exemple les milieux du tableau I, dans les logements prévus à cet effet. Les contenus de tous les logements sont ensuite séchés à l'air et le dispositif est emballé dans une substance d'emballage étanche à l'humidité et scellée pour expédition au personnel des laboratoires. Le contenu des logements à antibiotiques est reconstitué, avant utilisation, au moyen d'un bouillon nutritif. Le contenu des logements pour les essais de détermination des microorganismes est reconstitué avec de l'eau distillée. Afin d'illustrer plus spécifiquement l'utili- sation du système d'essais d'identification de micro- organismes selon l'invention, on considèrera ci-après quatre exemples. Ces exemples illustrent les compositions spéci- fiques de cinq logements particuliers pour essais d'identi- fication de microorganismes et les compositions des logements correspondants pour témoins négatifs. Les compositions des logements formant témoins négatifs permettent d'effectuer des comparaisons significatives entre les logements d'essai 13. et les logements des témoins négatifs en raison de la conser- vation, dans ces derniers logements, de la coloration de référence des milieux d'essai correspondants pour l'identi- fication des microorganismes. Puisque le but du témoin négatif est de fournir une référence à laquelle on peut comparer les changements de coloration du milieu d'essai, le milieu formant témoin négatif doit contenir seulement l'agent tampon et ceux des ingrédients du milieu d'essai qui augmen- tent la coloration de ce milieu d'essai. Les compositions indiquées illustrent les contenus des logements avant séchage à l'air. EXEMPLE 1 On considérera tout d'abord la préparation du milieu d'essai phosphodiestérase et du milieu correspondant formant témoin négatif. Le milieu d'essai phosphodiestérase (PDE) est préparé en mélangeant, dans un ballon - Peptone (*) 3,0 g - Thymidine-3'-monophospho-p-nitrophényl-ester 0,2 g - Na2HPO4 0,1 M 100 cm3 (*) Cette peptone est disponible sous la dénomination commer- ciale "Bacto-peptone" auprès de Difco Laboratories, Inc., Detroit, Michigan. La solution est dissoute sous agitation et, si nécessaire, en chauffant doucement (à température au plus égale à 50WC). Lorsque les constituants sont dissous, la solution est stérilisée par passage à travers un filtre à membrane de 0,20 micromètre. Le filtrat est décanté asepti- quement dans un récipient stérile en vue de son stockage. Le milieu est stocké, réfrigéré et protégé de la lumière. Le pH du milieu d'essai est d'environ 8,0 0,2. Le milieu phosphodiestérase formant le témoin négatif correspondant est préparé en mélangeant, dans un ballon: - Peptone 3,0 g - KH2 PO4 10,0 g Eau distillée 100 cm3 14. La solution est dissoute, stérilisée sur filtre et stockée selon le processus utilisé pour le milieu d'essai phosphodiestérase. Le pH du milieu constituant le témoin négatif est de l'ordre d'environ 4,8 à 5,3 et, dans cet exemple, d'environ 5,0. On introduit 25 mm3 du milieu d'essai et 25 mm3 du milieu témoin dans des logements distincts contigus d'un plateau d'essai. Les milieux des logements sont séchés à l'air. Après réhydratation avec 100 mm3 d'eau distillée stérile, aussi bien le milieu d'essai dans lequel les micro- organismes n'ont pas été inoculés que le milieu formant témoin négatif sont presque incolores à jaune paille pâle. Le pH du milieu d'essai réhydraté est d'environ 8,0 0,2 et le pH du milieu réhydraté formant témoin négatif est de l'ordre de 4,8 à 5,3 et, dans cet exemple, d'environ 5,0. Après inoculation de Serratia marcescens dans les logements d'essai et incubation pendant toute une nuit (16 à 18 heures) à 351C, le milieu d'essai est de coloration jaune par comparaison avec le milieu formant témoin négatif non inoculé qui est resté presque incolore pendant tout l'essai. Un témoin négatif préparé conformément à la formulation précitée, mais sans le KH2PO4, présente une cou- leur jaune lorsqu'il est évalué dans les mêmes conditions. Le pH du témoin négatif non tamponné est identique à celui du milieu d'essai, c'est-à-dire 8,0 - 0,2. On croit que ce changement de coloration du témoin négatif non tamponné est dû au fait que le p-nitrophénol, qui est un contaminant vola- til produit dans le logement d'essai contigu après inocu- lation des microorganismes, est un indicateur qui fait virer au jaune lessolutions non tamponnées jusqu'à un pH d'environ 6,0 ou moins (comme c'est le cas pour le témoin négatif non tamponné). EXEMPLE 2 Le milieu d'essai o-nitrophényl-6-d-galacto- pyranoside (ONPG) est préparé en mélangeant, dans un ballon - onitrophényl-e-d-galactopyranoside (ONPG) 1,0 g 15. - Isopropyl-e-dthiogalactopyranoside (ITPG) 0,08 g - Peptone (*) 3,0 g - Na2HPO4 0,1 M 100 cm3 (*) Peptone disponible sous la dénomination commerciale "Bactopeptone" auprès de Difco Laboratories, Inc., Detroit, Michigan. Le ONPG est ajouté par incréments au Na2HPO4 0,1 M chauffé (au plus à 500C) sous agitation continue. Lorsque le ONPG est complètement dissous, le ITPG est ajouté en poursuivant le chauffage et l'agitation. Lorsque le ITPG est dissous, la peptone est ajoutée à la solution en continuant l'agitation. La solution est stérilisée par passage à travers un filtre à membrane de 0,20 micromètre. Le filtrat est décanté aseptiquement dans un récipient stérile. Le milieu est stocké sous réfrigération et protégé de la lumière. Le pH du milieu d'essai est d'environ 8,0 - 0,2. Le milieu ONPG formant le témoin négatif corres- pondant est préparé en mélangeant, dans un ballon - ONPG 1,0 g - Peptone 3,0 g - KH2PO4 10,0 g - Eau distillée 100 cm3 Les ingrédients sont dissous et la solution obtenue est stérilisée par passage à travers un filtre et stockée selon le processus utilisé pour le milieu d'essai ONPG. Le pH du milieu témoin négatif est de l'ordre de 4,8 à ,3 et, dans cet exemple, d'environ 5,0. On introduit 25 mm3 du milieu d'essai et 25 mm3 du milieu formant témoin négatif dans des logements distincts contigus d'un plateau d'essai, comme dans l'exemple 1. On sèche à l'air les milieux des logements. Après réhydratation avec 100 mm3 d'eau distillée stérile, le milieu d'essai dans lequel les microorganismes n'ont pas été inoculés et le milieu formant témoin négatif sont presque incolores à jaune paille. Le pH du milieu d'essai réhydraté est d'environ 8,0 + 0,2 et le pH du milieu formant témoin négatif est de l'ordre de 4,8 à 5,3 et, dans cet exemple, d'environ 5,0. 16. Après inoculation de Klebsiella pneumoniae dans les logements d'essai et incubation pendant toute une nuit (16 à 18 heures) à 351C, le milieu d'essai est de couleur jaune par comparaison au témoin négatif dans lequel les microorganismes n'ont pas été inoculés et qui est resté presque incolore pendant toute la durée de l'essai. Un témoin négatif préparé selon la formulation précitée, mais sans l'agent tampon (KH2PO4), présente une coloration jaune lorsqu'il est soumis aux essais dans les mêmes conditions. Le pH du témoin négatif non tamponné est identique à celui du milieu d'essai, c'est-à-dire 8,0 0,2. On croit que la couleur initiale du milieu formant témoin négatif non tamponné est modifiée parce que le o-nitrophénol engendré, après inoculation, dans les logements d'essai contigus (voir tableau II) fait virer au jaune les solutions qu'il contamine si le pH de la solution est supérieur à environ 6,0. EXEMPLE 3 On prépare le milieu d'essai Voges-Proskauer (VP) en mélangeant, dans un ballon: - Milieu rouge de méthyle Voges-Proskauer(*) 6,8 g - Monohydrate de créatine 3,0 g - Glucose 3,0 g - Eau distillée 100 cm3 (*) Disponible sous la dénomination commerciale "MR-VP" auprès de Difco Laboratories, Inc., Detroit, Michigan. La solution est chauffée sur une plaque chauffante et agitée jusqu'à dissolution complète. Lorsque les constituants sont dissous, la solution est couverte et autoclavée à 1210C pendant dix minutes. Le milieu est stocké sous réfrigération. Le pH du milieu d'essai est d'environ 6,7 0,2. On prépare le milieu correspondant (VP), formant témoin négatif, en mélangeant, dans un ballon - Milieu rouge de méthyle Voges-Proskauer 6,8 g - Monohydrate de créatine 3,0 g - KH2PO4 12,0 g - Eau distillée 100 cm3 17. Ces ingrédients sont dissous et la solution obtenue est autoclavée et stockée suivant le processus utilisé pour le milieu d'essai VP. Le pH du milieu formant * témoin négatif est d'environ 5,8 + 0,2. Le milieu d'essai VP nécessite l'addition de réactifs, après inoculation du microorganisme, afin de présenter un changement de coloration en réponse à l'activité du microorganisme. Puisque les réactifs peuvent provoquer une légère décoloration du milieu d'essai, ils doivent être ajoutés à la fois au milieu d'essai et au milieu formant témoin négatif si une comparaison précise de coloration doit être faite. On introduit 25 mm 3 du milieu d'essai et 25 mm 3 du milieu formant témoin négatif dans des logements distincts contigus d'un plateau d'essai. Les milieux des logements sont séchés à l'air. Après réhydration avec 100 mm3 d'eau distillée stérile, le milieu d'essai non inoculé et le milieu formant témoin négatif sont presque incolores à jaune paille. Le pH du milieu d'essai réhydraté est d'environ 6,7 0,2. Le pH du témoin négatif réhydraté est de 5,8 0,2. On inocule Klebsiella pneumoniae dans le milieu d'essai et on incube pendant toute une nuit (16 à 18 heures), à 351C. On ajoute une goutte de 2-naphtol à 6 % et une goutte de KOH à 40 % (réactifs) à la fois au milieu d'essai et au témoin négatif correspondant et on laisse reposer les milieux pendant 10-15 minutes. L'addition de ces réactifs peut conférer une coloration orange ou brun rouille aux témoins négatifs. Le milieu d'essai est de coloration rouge cerise par comparaison au témoin négatif dans lequel les microorga- nismes n'ont pas été inoculés et qui conserve sa couleur initiale. Un témoin négatif préparé conformément à la formulation précitée, mais sans agent tampon (KH2PO4), présente une coloration rouge cerise lorsqu'il est soumis à l'essai dans les mêmes conditions. Le pH du témoin négatif non tamponné est identique à celui du milieu d'essai, 18. c'est-à-dire 6,7 0,2. On croit que le changement de coloration du témoin négatif non tamponné est dû à une réaction entre le contaminant volatil qu'est l'acétoine, engendré dans le logement d'essai contigu dans lequel les microorganismes ont été inoculés (voir tableau II), et le milieu formant témoin négatif, qui n'est pas tamponné jusqu'à un pH de 6 ou moins, le produit de réaction étant de colora- tion rouge cerise. EXEMPLE 4 On prépare le bouillon de tryptophane en mélangeant, dans un ballon: Tryptone (*) 0,8 g - 1-tryptophane 1,0 g - NaCl 2,0 g Polyvinylpyrrolidone (poids moléculaire moyen 000) 1,6 g - Na2HPO4 0,1 M 2,0 cm3 - Eau distillée 98 cm (*) Vendue sous la dénomination commerciale "Bacto-tryptone" par Difco Laboratories Inc., Detroit, Michigan. Le mélange est chauffé sur une plaque chauffante et agité jusqu'à dissolution complète. Lorsque les consti- tuants sont dissous, la solution est recouverte et autoclavée à 121 C pendant 15 minutes. Le milieu est stocké sous réfri- gération. Le bouillon de tryptophane est utilisé avec des réactifs convenables de même que pour les milieux d'essai indole et tryptophanedésaminase. Le pH du bouillon de tryptophane est 6,4 0,2. Le système d'essai d'identification des micro- organismes par le milieu tryptophane-désaminase nécessite un témoin négatif, tamponné, seulement lorsque le témoin négatif se trouve contigu aux logements d'essai engendrant les contaminants volatils que sont le p-nitrophénol ou le o- nitrophénol, c'est-à-dire le milieu de détection de phospho- diestérase et le milieu ONPG. Puisque ces contaminants forment des solutions jaunes en présence de milieux basiques, le témoin négatif doit être tamponné à un pH de 6,0 ou moins. Dans le mode de réalisation préféré de l'invention, le 19. logement d'essai contenant le milieu ONPG se trouve contigu au système d'essai contenant le milieu tryptophane- désaminase et le témoin négatif de ce système doit être tamponné à un pH de 6,0 ou moins. Quoique le milieu tryptophane-désaminase inoculé engendre l'indole volatil formateur de coloration, l'indole ne donne pas de coloration en présence du milieu tryptophane-désaminase, conforme à l'invention, formant le témoin négatif. L'indole produira seulement un changement de coloration dans les milieux formant témoins négatifs qui contiennent du p-diméthyl- aminobenzaldéhyde comme c'est le cas pour le milieu formant témoin négatif qui contient de l'indole (voir exemple 5). Le milieu tryptophane-désaminase correspondant, qui constitue le témoin négatif, est préparé en mélangeant, dans un ballon: - Tryptone 0,8 g - 1tryptophane 1,0 g - NaCl 2,0 g - KH2PO4 10,0 g - Eau distillée 100 cm3 Ces constituants sont dissous et la solution obtenue est autoclavée et stockée selon le processus utilisé pour le bouillon de tryptophane. Le pH du milieu tryptophane- désaminase constituant le témoin négatif est de l'ordre de 4,3 à 5,2 et, dans cet exemple, d'environ 4,5. Pour l'essai d'identification des microorga- nismes pour le milieu tryptophane-désaminase, on introduit mm3 du bouillon de tryptophane et 25 mm3 du milieu tryptophane-désaminase du témoin négatif dans des logements distincts contigus du plateau d'essai du mode de réalisation préféré. On introduit 25 mm3 du milieu d'essai ONPG de l'exemple 2 dans un autre logement contigu du plateau. Les milieux des logements sont séchés à l'air. Après réhydrata- tion avec 100 mm3 d'eau distillée stérile, le bouillon non inoculé, le milieu formant témoin négatif et le milieu ONPG non inoculé sont presque incolores à jaune paille. Le pH du bouillon réhydraté est de 6,7 0,2. Le pH du témoin négatif réhydraté est de l'ordre de 4,3 à 5,2 et, dans cet exemple, d'environ 4,8. 20. On inocule Proteus rettgeri dans le milieu d'essai tryptophanedésaminase et Klebsiella pneumoniae dans le milieu d'essai ONPG contigu. Le plateau inoculé est mis à incuber à 35 C pendant toute une nuit (16 à 18 heures). Le milieu d'essai tryptophane-désaminase nécessite l'addition d'une goutte de chlorure ferrique à 10 % après inoculation du microorganisme afin de présenter un changement de coloration en réponse à l'activité du microorganisme. On ajoute aussi une goutte de chlorure ferrique à 10 % au témoin négatif formé par le milieu tryptophanedésaminase. Le milieu d'essai tryptophane-désaminase est de couleur brun sombre par compa- raison au témoin négatif correspondant qui est orange. Le milieu d'essai ONPG dans lequel le microorganisme a été inoculé a alors viré au jaune. On prépare un témoin négatif formé par le milieu tryptophane-désaminase conforme à la formulation ci-dessus, mais sans l'agent tampon (KH2PO4). Le pH de ce témoin négatif non tamponné est identique à celui des milieux d'essai tryptophane-désaminase, c'est-à-dire de 6,7 + 0,2. Le témoin négatif présente une coloration jaune-orange lorsqu'il est évalué dans les mêmes conditions que le témoin négatif tamponné, c'est-à-dire lorsqu'il est placé contigu au milieu d'essai ONPG dans lequel le microorganisme a été inoculé. On croit que le témoin négatif non tamponné change de coloration en raison du fait que le o-nitrophénol qui est engendré dans le logement d'essai contigu contenant le milieu ONPG confère une coloration jaune aux solutions non tamponnées à un pH d'environ 6,0 ou moins. EXEMPLE 5 Le bouillon de tryptophane préparé conformément à l'exemple 4 est aussi utilisé comme milieu d'essai indole. Le pH de ce milieu est de 6,4 0,2. Le milieu indole correspondant, constituant le témoin négatif, est préparé en mélangeant, dans un ballon: - Tryptone (*) 0,8 g - Glycine 9,0 g - NaCl 2,0 g 21. - NaOH 10 N 10 cm3 - Eau distillée 90 cm3 (*) vendue sous la dénomination commerciale "Bacto-tryptonen par Difco Laboratories, Inc. Detroit, Michigan. Les constituants sont dissous et la solution obtenue est autoclavée et stockée selon le processus utilisé pour le bouillon de tryptophane (voir exemple 4). Le pH du milieu indole formant le témoin négatif est de 10,0 0,2. On introduit 25 mm3 du bouillon de tryptophane et 25 mm3 du milieu formant témoin négatif dans des logements distincts contigus d'un plateau d'essai. Les milieux des logements sont séchés à l'air. Après réhydratation avec mm3 d'eau distillée stérile, le milieu d'essai dans lequel le microorganisme n'a pas été inoculé et le milieu formant témoin négatif sont presque incolores à jaune paille. Le pH du milieu d'essai réhydraté est de 6,7 + 0,2 et le pH du milieu réhydraté formant le témoin négatif est de 10,0 + 0,2. Après inoculation de Escherichia coli dans le milieu d'essai et incubation pendant toute une nuit (16 à 18 heures) à 351C, on ajoute 1 à 2 gouttes du réactif de Kovacs (p-diméthylaminobenzaldéhyde alcoolique acidifié par l'acide chlorhydrique) à la fois au milieu d'essai et au témoin négatif correspondant. Le milieu d'essai à indole nécessite l'addition du réactif de Kovacs, après inoculation du microorganisme, afin que ce milieu puisse présenter un changement de coloration en réponse à l'activité du micro- organisme. Le réactif de Kovacs doit être ajouté à la fois au milieu d'essai et au témoin négatif puisqu'il peut éventuel- lement faire virer au brun rouille le plateau en matière plastique et gêner ainsi l'identification du microorganisme. Après addition du réactif de Kovacs, le milieu d'essai vire au rouge, ce qui est à comparer au témoin négatif qui devient jaune par suite de cette addition. Un témoin négatif préparé conformément à la formulation ci-dessus, mais sans NaOH 10 N, la glycine et les agents tampons, présente un pH d'environ 6,7 et une colora- tion rouge lorsqu'il est évalué dans les mêmes conditions. On 22. croit que le milieu non tamponné formant le témoin négatif change de coloration en raison d'une réaction entre ledit milieu à un pH inférieur à 9,8 et l'indole, contaminant volatil engendré dans le milieu d'essai correspondant à l'indole (voir tableau II) pour donner un produit coloré en rouge. Comme illustré par les exemples, les formula- tions des milieux d'essai et de leurs témoins négatifs ont des concentrations quatre fois plus élevées que celles des milieux effectivement utilisés dans les essais d'identifi- cation des microorganismes. Si le milieu doit être utilisé immédiatement, il doit être dilué avec de l'eau distillée dans le rapport de 1 à 4. Les formulations concentrées des exemples donnent toute satisfaction si les milieux ont été séchés et stockés. En général, comme illustré par les exemples, on introduit environ 25 mm3 des milieux concentrés pour l'identification des microorganismes dans les logements d'un plateau d'essai selon l'invention. On laisse les milieux sécher à l'air. Le contenu de chaque logement est ensuite reconstitué par addition de 100 mm 3 d'eau distillée stérile avant inoculation. Après inoculation des microorganismes, on laisse l'incubation se poursuivre pendant environ 16 à 18 heures. Les milieux sont ensuite observés visuellement. Si la couleur initiale n'est pas modifiée, on peut en déduire que le microorganisme inoculé dans le milieu est d'un type ne donnant pas le produit métabolique prévu, correspondant à ce milieu particulier. Cependant, si le milieu change de colora- tion pour prendre une coloration caractéristique, on peut en conclure que le microorganisme inoculé est présent, a subi une croissance et a métabolisé le substrat recherché dans ce milieu particulier. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre purement explicatif et nullement limitatif et que toutes modifications utiles pourront y être apportées sans sortir de son cadre tel que défini par les revendica- tions ci-après. 23. REVENDICATIONS 1. - Dispositif destiné à l'identification des microorganismes, caractérisé en ce qu'il comprend un plateau monobloc présentant une pluralité de logements formés dans la masse dudit plateau, au moins certains de ces logements servant de logements pour les essais d'identification des microorganismes et contenant des milieux d'essai biochimiques qui, sous forme hydratée, permettent la croissance desdits microorganismes avec formation d'un composé volatil engendrant une coloration, et au moins certains autres logements servant de logements correspon- dants pour témoins négatifs et étant situés à proximité immédiate de chacun desdits logements d'essai, ces logements des témoins négatifs contenant des milieux formant témoins négatifs qui comprennent un inhibiteur qui, en solution aqueuse, empêche l'apparition d'une coloration qui, autrement, surviendrait dans lesdits milieux sous l'action dudit composé volatil formateur de coloration, les milieux d'essai biochimiques avant inoculation desdits microorga- nismes et lesdits milieux formant témoins négatifs présentant tous la même coloration sous forme hydratée, ledit inhibiteur étant de préférence un agent tampon et lesdits logements d'essai pour identification des microorganismes contenant plus avantageusement des milieux d'essai biochimiques choisis parmi le milieu phosphodiestérase, le milieu Voges- Proskauer, le milieu o-nitrophényl-e-d-galactopyranoside, le milieu tryptophane-désaminase et le milieu indole. 2. - Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent tampon précité est choisi parmi KH2PO4 et NaOH additionné de glycine, au moins l'un des logements précités des témoins négatifs contenant soit un milieu phosphodiestérase qui comprend une peptone, tamponné à un pH d'environ 4,8 à 5,3, soit un milieu o-nitrophényl-5-d- galactopyranoside qui comprend du o-nitrophényl-S-D-galac- topyranoside et une peptone, tamponné à un pH d'environ 4,8 à ,3, soit un milieu de Voges-Proskauer qui comprend du rouge de méthyle VogesProskauer et du monohydrate de créatine, tamponné à un pH d'environ 5,6 à 6,0, soit un milieu tryp- 24. tophane-désaminase qui comprend de la tryptone, du L-tryp- tophane et NaCl, tamponné à un pH d'environ 4,3 à 5,2, soit un milieu indole qui comprend de la tryptone et NaCl, tamponné à un pH d'environ 9,8 à 10,2. 3. - Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que chacun des logements d'essai précités pour identification des microorganismes contient un milieu d'essai biochimique différent dont la coloration, après inoculation desdits microorganismes, peut être comparée à la coloration dudit milieu, dans le logement correspondant pour témoin négatif, afin de fournir des indices pour l'identifi- cation précise desdits microorganismes. 4. - Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits milieux d'essai biochimiques et lesdits milieux pour témoins négatifs sont présents sous forme sèche dans les logements précités. 5. - Dispositif selon la revendication 1, carac- térisé en ce qu'au moins certains des logements précités servent de logements pour essais d'antibiotiques et contien- nent une concentration prédéterminée d'un antibiotique, et en ce qu'au moins certains autres des logements précités servent de logements témoins d'antibiotiques et ne contiennent pas d'antibiotiques, lesdits milieux d'essai biochimiques, lesdits milieux formant témoins négatifs et lesdits antibio- tiques étant présents sous forme séchée. 6. - Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce que les logements précités sont disposés selon un certain nombre de rangées sensiblement parallèles et en ce que, de préférence: (a) les logements d'essai précités d'antibiotiques sont disposés suivant plusieurs colonnes, chacune desdites colonnes contenant un antibiotique différent tandis que chacun des logements d'essai de cette colonne présente une concentration différente en ledit antibiotique; et (b) les logements d'essai pour identification des micro- organismes et les logements précités des témoins négatifs sont disposés par paires de rangées de logements s'étendant perpendiculairement auxdites 25. colonnes de logements d'essai d'antibiotiques, chaque rangée de logements de témoins négatifs étant contiguë à une rangée desdits logements d'identification des microorganismes. 7. - Dispositif selon la revendication 6, carac- térisé en ce que: (a) les colonnes précitées de logements d'essai d'antibio- tiques sont au nombre de seize contenant sept logements d'essai d'antibiotiques, ce qui forme sept rangées de logements; et (b) les paires précitées de rangées de logements d'essai et de logements de témoins négatifs sont au nombre de deux, l'une au moins desdites paires de rangées s'étendant perpendiculairement à et à l'une des extrémités desdites colonnes pour antibiotiques tandis que l'autre desdites paires s'étend perpendiculairement et à l'autre extrémité desdites colonnes d'essai pour antibiotiques, tandis que ces rangées de logements d'essai pour identi- fication des microorganismes et de logements de témoins négatifs forment seize logements dans chacune desdites rangées. 8. - Procédé d'identification de microorga- nismes, caractérisé en ce qu'il consiste: (a) à utiliser un plateau monobloc comportant une pluralité de logements d'essai formés dans la masse dudit plateau, au moins certains de ces logements servant de logements pour les essais d'identification des microorganismes et contenant des milieux d'essai biochimiques qui, sous forme hydratée, permettent la croissance desdits micro- organismes avec formation d'un composé volatil engendrant une coloration, et au moins certains autres de ces logements servant de logements correspondants pour témoins négatifs et étant situés à proximité immédiate de chacun desdits logements d'essai, ces logements des témoins négatifs contenant, sous forme séchée, des milieux formant témoins négatifs qui comprennent un tampon qui, en solution aqueuse, empêche l'apparition d'une coloration qui, autrement, 26. surviendrait dans lesdits milieux sous l'action dudit composé volatil formateur de coloration, les milieux d'essai biochimiques avant inoculation desdits microorganismes et lesdits milieux formant témoins négatifs présentant tous la même coloration sous forme hydratée; (b) à reconstituer le contenu de ces logements d'essai pour identification et de ces logements des témoins négatifs avec de l'eau; (c) à inoculer le microorganisme dans lesdits logements d'essai pour identification; (d) à mettre ledit plateau à incuber; et (e) à comparer lesdits logements d'essai pour identifica- tion avec lesdits logements des témoins négatifs pour déterminer s'il y a eu un changement détectable, indicateur de l'activité dudit microorganisme, dans les milieux d'essai biochimiques contenant dans lesdits logements d'essai pour identification. 9. - Procédé selon la revendication 8, caracté- risé en ce qu'un indicateur capable de produire un changement de coloration dans lesdits milieux d'essai biochimiques, en réponse à la croissance du microorganisme, est ajouté auxdits milieux d'essai biochimiques après inoculation dudit micro- organisme. 10. - Procédé selon la revendication 8, caracté- r -; é en ce qu'il comprend: (a) l'utilisation d'au moins certains des logements précités en tant que logements d'essai d'antibiotiques contenant, sous forme séchée, une concentration prédé- terminée d'un antibiotique, et en tant que logements de témoins d'antibiotique ne contenant pas d'antibio- tique; (b) la reconstitution du contenu desdits logements d'essai d'antibiotiques et desdits logements témoins d'antibio- tiques avec un bouillon nutritif; (c) l'inoculation dudit microorganisme dans lesdits logements d'essai d'antibiotiques et dans lesdits logements de témoins d'antibiotiques; 27. (d) l'incubation desdits logements d'essai d'antibiotiques et desdits logements de témoins d'antibiotiques; (e) la comparaison visuelle desdits logements d'essai d'antibiotiques avec lesdits logements de témoins d'antibiotiques; et (f) la détermination de la concentration minimale en antibiotique qui est nécessaire pour inhiber la croissance dudit microorganisme.