Brevet FR2464998A1 — publié le 19810320

La glucose-isomérase est un enzyme de valeur pour la production de fructose. Initialement, on a tenté d'isomériser le glucose par voie alcaline, mais on a constaté que cette opération n'était pas réalisable à l'échelle industrielle en raison du manque de sélectivité. Ce manque de sélectivité permettait la production de matières non métabolisables telles que le psicose, et de matières colorées gênantes qui sont coûteuses à éliminer. Par la suite, la production microbiologique de glucose-isomérasea été développée et a acquis une impor- tance commerciale. Les microorganismes qui ont été utilisés appartiennent aux genres Lactobacillus, Pseudomonas, Pasteurella, Leuconostoc, Streptomyces, Aerobacter et Arthrobacter (voir brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 645 848). Ces procédés microbiologiques de préparation de glucose-isomérase atteignent leur but par l'utilisation de microorganismes portant un gène chromosomique de produc- tion de glucose-isomérase. La méthodologie de recombinaison de l'ADN, décrite ci-dessous, a été utilisée pour édifier un élément génétique déterminant spécifiquement la production d'un enzyme appelé glucose-isomérase. Cet élément génétique a ensuite été inséré dans un microorganisme-hMte qui, dans des conditions de culture, a produit de bien plus grandes quantités de glucose-isomérase que la souche don- neuse ne l'avait permis jusqu'à présent. Pour autant que l'on sache, c'est la première fois qu'un résultat aussi peu évident a été obtenu. Des plasmides recombinants portant le gène relatif à l'enzyme appelé xylose (glucose)-isomérase ont été édifiés par liaison de fragments linéaires d'ADN préparés par digestionlimitéepar l'endonucléase HindIII de l'ADN(réplicon)du plasmide pMB9 et de l'ADN total d'Escherichia coli K12 (source du gène de l'isomérase). La bactérie hôte a été également une souche de E.coli K12 (souche JC1553) qui manquait de xylose (glucoseisomérase et qui a été transform&e,par les plasmides recombinants, du phénotype de Xyl Tc en XylTr. Le choix de clones. porteurs du plasmide recombinant désiré a été basé sur les faits suivants: (1) le plasmide pMB9 détermine spécifiquement la résistance à la tétracycline (Tc) et (2) la souche receveuse JC1553 de E.coli présente une mutation dans son gène de xylose-isomérase et ne peut donc pas se développer sur ce substrat. Cette souche ne peut également pas isomériser le glucose, attendu que le même enzyme effectue les deux réactions. Toutefois, la souche JC1553 se développe normalement sur le glucose puisque, contraire- ment au xylose, les principales voies métaboliques pour l'utilisation du glucose n'impliquent pas cet enzyme. Les cellules dont l'induction est liée au xylose, portant le plasmide recombinant pUC1002, affichent une amplifica- tion de l'activité de glucose-isomérase de plus de 500 % par rapport au niveau présenté par la souche donneuse. Il y a lieu de remarquer que le gène de glucose- isomérase qui existe dans la nature est un gène chromoso- mique, dont il existe une réplique par chromosome. En revanche, le gène de glucose-isimérase de la présente invention est inséré dans un plasmide qui existe chez un hôte en répliques multiples. Cette insertion du gène dans un plasmide ou dans un autre véhicule convenablejcomm.e défini dans le présent mémoire, entraîne une amplification du gène et l'obtention du produit désiré de ce gène, en l'occurrence laglucose-isomérase. Le schéma suivant illustre les étapes du procédé de production du plasmide recombinant portant le ou les gènes de E. coli déterminant spécifiquement la production de l'enzyme appelé glucose-isomérase. Bien que les abréviations utilisées sur ce schéma soient classiques et bien connues de l'homme de l'art, on en reproduit la définition ci-après pour faciliter la compréhension de la présente invention I pMB9 Hpa 1/Sa1i TcBamH + EcoR1d | AGCT EcoR1 AGCT 4- AGCT o EcoRi,) K37 ADN d111 Ill d111l I d111l pMB9 A K37 ADN T4 ADN JC1553 XyITcs Xyi+Tcr - BamH1 pMB9d111 pMB9 HindIII, EcoRi, BamHI, SalI, HpaI - sites de clivage par l'endonucléase de restriction. Tc - gène déterminant spécifiquement la résistance à. l'antibiotique appelé tétracycline. AGCT - fragment d'ADN à un seul brin renfermant les bases adénine, guanine, cytosine et thymine. ADN-ligase de T4 - enzyme codé par le bactériophage T4 qui catalyse la liaison covalente de polydéoxynucléotides. Xyl - xylose. prB9 - plasmide non transmissible de E. coli. réplication autonome. o Sa1i BamHi + T TCGA _T(Ir, Les souches de E. coli décrites. ci-dessus, y compris celles qui contiennent des plasmides., ont été déposées dans la collection permanente du "Northern Regional Research Laboratory", Ministère de l'Agriculture des Etats-Unis d'Amérique, Peoria, Illinois, U.S.A. Les numéros d'enregistrement qui leur ont été attribués par cet organisme sont les suivants: JC1553 - NRRL B-11391 K37 - NRRL B-11392 HB129 (pMB9) - NRRL B-11390 JC1553 (pUC*1002) - NRRL B-11393 pUC est la désignation officielle d'un plasmide, propriété de la firme The Upjohn Company. Ces souches. sont disponibles auprès de cet organisme depuis la délivrance d'un brevet les concernant. Il y a lieu de remarquer que le fait de pouvoir se procurer une souche déposée n'autorise pas pour autant à mettre en pratique le procédé de l'invention, en dérogation aux lois de la propriété industrielle. L'invention est illustrée par les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, dans lesquels tous les pourcentages sont exprimés en poids et toutes les proportions des mélanges de solvants sont exprimées en volume, sauf spécification contraire. EXEMPLE i Préparation de l'ADN On isole l'ADN chromosomique de E. Coli K37 - de la manière décrite par Marmur dans "J. Mol. Biol." 3: 208-218 (1961). On effectue la culture dans du bouillon L /E. S. Lennox (1955), "Virology" 1: 190-2067 en agitant énergiquement à. 37 C jusqu'à.ce que la densité optique à 590 nm atteigne 0,8.. On récolte les cellules par centrifuga- tion à 10 000 x g pendant 10 minutes, on les lave une fois avec une solution froide. de chlorhydrate de tris 50 i M (piH 8,0) et d'EDTA 20 mM puis on les remet en suspension dansle cinquièmedu volumedu même tampon. La lyse est effectuée par addition de dodécylsulfate de sodium a une concentration finale de 1,5 %, suivie d'un chauffage à 60 C pendant 10 minutes. La solution visqueuse résultante est refroidie à la température ambiante puis additionnée de perchlorate de sodium jusqu'à une concentration finale de 1M. Le mélange entier est ensuite agité par secousses avec un volume égal de mélange de chloroforme et d'alcool isoamylique dans un mélange en volume de 24:1 pendant 20 minutes. L'émulsion résultante est séparée en trois couches par une centrifuga- tion d'une durée de 5 minutes à 10 000 x g. La couche supérieure contenant l'ADN est transférée dans un récipient étroit et surmontée d'une couche de deux volumes d'éthanol à 95 % froid. L'ADN est ensuite "dévidé" sur une tige de verre, par agitation modérée. L'ADN précipité est dissous dans une solution de NaCl 15 mM et de citrate trisodique 1,5 mM, et l'opération d'élimination de la protéine est répétée comme indiqué ci-dessus jusqu'à ce qu'il apparaisse peu ou pas de protéine à l'interface après. centrifugation. Enfin, l'ADN purifié est dissous dans une solution de NaCl mM, de citrate trisodique 1,5 mM et d'EDTA 0,5 mM. L'ADN du plasmide pMB9 est isolé de E. coli HB129 cultivé de la manière indiquée ci-dessus dans le bouillon L additionné de tétracycline à une concentration de 25 /ug/ml. Des lysats bruts sont préparés par remise en suspension des cellules dans le dixième du volume de solution de chlorhydrate de tris 50 mM (pH 8,0), d'EDTA 20 mM plus 500,ug/ml de "Pronase" (Calbiochem, La Jolla, Calif.) prédigérée (90 minutes à 37 C) et 1 % de dodécylsulfate de sodium, puis incubation de la suspension à 37 C jusqu'à ce qu'elle se clarifie. L'ADN chromosomique est ensuite cisaillé par aspiration des lysats dans une aiguille n 13, et l'ADN du plasmide est isolé par centrifugation à. l'équilibre (centrifugeuse "Spinco 50 Ti", 15 , 40 000 tours par minute, 48-60 heures) des lysats cisaillés.en gradients de densité dans un mélange de chlorure de césium et de bromure d'éthidium. On sépare l'ADN de plasmide en recueil- lant des fractions par aspiration à l'aide d'une aiguille à la partie inférieure du gradient. Les fractions contenant l'ADN de plasmide sont rassemblées et extraites trois fois avec des volumes égaux d'alcool isoamylique, de manière à extraire le bromure d'éthidium. La solution d'ADN est ensuite dialysée vis-à-vis d'une solution de NaCl 15 mM, citrate trisodique 1,5 mM et EDTA 0,5 mM, l'ADN est précipité à l'éthanol et il est finalement dissous dans un petit vo- lumLe du tampon ci-dessus. EXEMPLE 2 Uigestion par l'endonucléase de restriction Le clivage par HindIII d'un mélange d'ADN de E.coli K37 et de pbM9 (3:1), préparé comme décrit dans l'exemple 1, est effectué dans un mélange réactionnel contenant du chlorhydrate de tris 7 mM (pH 7,9), MgC12 7mM, NaCl 60 mM, 100j/g/ml de gélatine autoclavée et une unité d'endonucléase HindIII par ug d'ADN. Après incubation à 37 C pendant 60 minutes, on arrête la réaction par chauf- fage à 65 C pendant 5 minutes. EXEMPLE 3 Réaction de l'ADN-li.gase de.T4 Le mélange dont la réaction a été arrêtée comme indiqué dans l'exemple 2 ci-dessus est additionné de manière qu'il renferme une concentration finale de 5 ml de MgC12, 10 m de dithiothréitol, 50,uM d'ATP et une unité a'ADN-ligasedeT4/ig d'ADN. On fait incuber ce mélange réactionnel à 0 pendant environ 16 heures. EXEMPLE 4 Transformation de E. Coli La transformation de E. coli JC1553 par l'ADN d'un plasmide esteffectuée d'après la méthode décrite par Cohen et collaborateurs dans "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 69: 2110-2114 (1972)). On inocule 100 ml de bouillon L avec la souche JC1553 NRRL B-11391 et on poursuit la culture jusqu'à une densité optique à 590 nm de 0,85. On refroidit ensuite les cellules, on les laisse se sédimenter et on les lave avec un demi-volume de NaCl 10 mM froid. Après centri- fugation, on remet les cellules en suspension dans un demi-volume de solution froide de CaCl2de 0,03 M, on maintient la suspension à 0 pendant 20 minutes, on laisse les cellules se sédimenter puis on les remet en suspension dans le dixième du volume initial de solution de CaC12 0,03 M. On mélange ensuite 0,2 ml de ces cellules avec 0,1 ml du mélange de réaction de l'ADN avec la ligase, préalable- ment additionné de CaCl2 jusqu'à une concentration de 0,03 M. La suspension résultante est maintenue à 0 pendant 60minutes puissa température est élevée à 42 . Enfin, les cel- lules sontdiluées au dixièmedans du bouillon L, soumises à l'incubation à 37 C sous agitation énergique pendant 2 à 4 heures de manière à permettre l'expression de la résis- tance au médicament, puis inoculées à un milieu minimal renfermant des sels, contenant du xylose comme unique sour- ce de carbone et d'énergie plus de la tétracycline à la concentration de 5/ug/ml. Le développement sur ce milieu permet de faire la distinction entre les transformants portant l'élément génétique désiré de recombinaison pro- venant de la souche JC 1553 (qui ne peut pas se développer en présence de tétracycline ou utiliser le xylose comme unique source de carbone et d'énergie) et de la souche JC1553 portant le plasmide pMB9 intact (qui se développe en présence de tétracycline mais qui, là encore, ne peut pas utiliser le xylose comme unique source de carbone et d'énergie). EXEMPLE 5 Activité en glucose-isomérase d'extraits bruts de JC1553 (pUC1002) On inocule des portions de 100 ml de milieu de Fraser (D. Fraser et EoA. Jerrel, 1953, "J. Biol. Chem." 205: 291-295) additionnées de xylose à la concentration de 0,2 % en poids/volume avec des portions. de 5 ml de JC1553 (pUC1002), NRRL B-11393 cultivées pendant environ 18 heures dans le milieu de Fraser additionné de tétracycline à la concentration de 5 ug/ml. On fait incuber les fioles à 37 C sous agitation énergique pendant 6 heures puis on procède à la sédimentation des cultures et on les lave avec un tampon froid au phosphate de potassium 30 mM (pH 7,2). Les cellules sont remises en suspension dans 1/20e en volume du même tampon et des extraits bruts sont préparés par désinté- gration -ultrasonore. Les débris cellulaires sont retirés par centrifugation à 10 000 x g pendant 10 minutes et les liqueurs surnageantes sont titrées pour déterminer l'activité en glucose-isomérase. La solution à titrer contient 20jIM de tampon au phosphate de potassium (pH 7,2), 2,5 Mi de CoCl2, 5uiM de MgC12, 1iM de D-glucose et l'extrait brut, dans un volume total de 1 ml. La température optimale pour la biotransformation dans ces conditions est d'environ 600C. Le degré de transformation du glucose en fructose est déterminé en prélevant des échantillons de 0,02 ml à divers moments et en introdui- sant ces échantillons dans des tubes contenant 0,98 ml d'eau plus 3,0 ml d'acide chlorhydrique concentré. On ajoute 1 ml d'une solution à 0,05 % de résorcinol dans l'éthanol aux tubes que l'on chauffe ensuite à 770C pendant 8 minutes. On refroidit ensuite les tubes au bain d'eau et de glace et on mesure la densité optique à 420 nm. Bien que la méthode indiquée ci-dessus utilise l'enzyme sous une forme débarrassée des cellules (extrait brut) pour convertir le glucose en fructose, la conversion peut aussi être effectuée en utilisant l'enzyme sous une forme immobilisée, par des procédés bien connus dans la pratique. Il est possible pour l'homme de l'art de faire varier les concentrations des réactifs, des substrats et des enzymes ainsi que les conditions réactionnelles dans les exemples ci-dessus, et d'obtenir encore le résultat désiré. EXEMPLE 6 Autres-véhicules, hôtes et sources de gènes Des exemples d'autres véhicules que l'on peut utiliser conformément à l'invention comprennent des plasmides tels que pBR322 et pBR313 qui déterminent spécifiquement la résistance à l'ampicilline et à la tétracycline, pSC101 qui détermine spécifiquement la résistance à la tétracycli- ne, pCRIl qui détermine spécifiquement la résistance à la kanamycine et l'ADN de plasmide de levure 2 p, et des vecteurs du type de bactériophages, par exemple des phages du type Charon. Des exemples d'autres hôtes pour le véhicule comprennent tout dérivé de E. coli K-12 /WBacteriological Reviews", Décembre 1972, pages 525-557/ (ces hôtes ont été approuvés par les "NIH Guidelines") et des levures, d'autres champignons ou d'autres bactéries. Il est admis que ces derniers hôtes devraient aussi être approuvés par les "NIH Guidelines". Tous les enzymes utilisés dans le présent mémoire peuvent être fournis par la firme New England Biolabs, Beverly, Mass. Des exemples d'autres sources de gènes qui entrent dans le cadre de l'invention comprennent tout gène lié à la glucose-isomérase, de nature microbienne ou autre. En se conformant aux modes opératoires décrits ci-dessus, on peut édifier des éléments. génétiques déter- minant spécifiquement la production d'autres enzymes, par exemple protéase alcaline, amylase, cholestérol-oxydase, etc. Le plasmide pUC1002 peut être isolé de son hôte bactérien, comme décrit à propos du plasmide pMB9 dans l'exemple 1 ci-dessus. L'étude décrite dans le présent mémoire a été entièrement effectuée en conformité avec les conditions physiques et biologiques définies dans les "NIH Guidelines". REVENDICATIONS 1. Le plasmide pUC1002. 2. La souche E. coli JC1553 (pUC 1002) enregistrée sous le n NRRL B11393 et comprenant le plasmide selon la revendication 1.