Brevet FR2467240A1 — publié le 19810417

i La présente invention concerne le nouvel antibiotique antitumoral NCS-C et un procédé pour le préparer. On sait déjà que la néocazzinostatine, antibiotique anti- tumoral à haut poids moléculaire (voir la publication de bre- vet japonais N 21752/1967 publiée le 26 octobre 1967), fraction N-1, fraction N-2 (voir la publication de brevet japonais N 680/1972 publiée le 10 Janvier 1972) et frac- tion Ma (voir la publication de brevet japonais N 13516/1979 publiée le 31 Mai 1979) sont obtenus en cultivant le variant F41 Kuroya de streptomyces carzinostaticus. Les auteurs de la présente invention ont poursuivi les recherches sur la substan- ce cultivée et ont découvert qu'elle contenait également un nouvel antibiotique antitumoral NCS-C qui diffère par ses propriétés physiques et chimiques de la néocarzinostatine, de sa fraction N-1, de sa fraction N-2 et de sa fraction Ma. En conséquence, un objectif premier de la présente invention est de procurer le nouvel antibiotique antitumoral NCS-C (ci-après appelé substance NCS-C) ainsi que ses sels d'acide libres. Un autre objectif de la présente invention est de procurer un nouveau procédé de préparation du nouvel antibiotique antitumoral NCS-C et de ses sels d'acide libres. Selon un des aspects de l'invention, il est procuré l'anti- biotique antitumoral NCS-C. Son sel d'acide chlorhydrique a les propriétés physiques et chimiques suivantes: (a) apparence: poudre jaunâtre claire brunâtre (b) point de décomposition: 125 C (c) rotation spécifique: [a]D = _171 (c = 1,4 x 103, dans le méthanol) (d) analyse élémentaire: C 51,72, H 4,94, N 2,03, O 31,00 Cz 10,31 (e) poids moléculaire: 686,5 à 688,5 (f) formule brute: C30H33-35C2NO 13 (g) spectre d'absortion ultraviolet: épaulements à 240, 274 290, 305 et 330 nm (h) spectre d'abscpUtion infrarouge: absOptions à 3400, 1780, 1610, 1400, 1190, 1080 et 1010 cm 1 (i) réactions colorées: réaction au permanganate et réaction de copulation diazoique positives; réaction xanthoprotéique, réaction d'Ehrlich, réaction à la Ninhydrine, réaction à l'orcinol, réaction de Molisch négatives. (j) solubilité: très soluble dans le méthanol, l'éthanol, le propanol et le butanol; soluble dans l'acétone; et peu soluble dans l'acétate d'éthyle; difficilement soluble dans l'eau, l'éther et le benzène. La présente invention a également pour objet les sels d'acide libres de l'antibiotique antitumoral NCS-C. Selon un autre aspect de la présente invention,il est procuré un procédé de préparation de la substance NCS-C ou de son sel d'acide libre. Le procédé consiste à cultiver un microorganisme générateur de NCS-C appartenant à la famille des streptomyces dans un milieu de culture, à séparer le milieu de culture en corps bactériens et filtrat de culture; et à extraire le filtrat de culture à l'aide d'un solvant organique polaire non miscible à l'eau, dans des conditions acides. Selon encore un autre aspect de la présente invention, il est également procuré un procédé de préparation de la substance NCS-C ou de son sel d'acide libre. Le procédé consiste à dé- composer la néocarzinostatine dans des conditions acides de façon à former un sel d'acide libre de la substance NCS-C, et à extraire ledit sel à l'aide d'un solvant organique polaire. Sur les planches de dessins annexées la figure 1 est le spectre d'absorption ultraviolet de l'antibiotique antitumoral NCS-C selon l'invention; et la figure 2 est le spectre d'absorption infrarouge de la même substance. On peut préparer la substance NCS-C selon cette invention, par exemple, de la manière suivante: on emploi un micro-organisme générateur de néocarzinosta- tine, qui appartient à la famille des streptomyces, pour pré- parer la substance NCS-C selon cette invention. Parmi ces microorganismes, générateurs de néocarzinostatine, il y a le variant F41 Kuroya de streptomyces carzinostaticus et ses mutants, ainsi que toutes les bactéries qui produisent la substance NCS-C et appartiennent à la famille des streptomy- ces.Le variant F41 Kuroya de streptomyces carzinostàticus a déjà été déposé sous le numéro 2257 à l'institut de recherche sur les fermentations de l'Agence pour la Science et la Techno- logie Industrielles du Japon, et aussi sous le numéro ATCC 15945 dans la American Type Culture Collection. Les procédés de culture qui sont décrits dans les publi- cations de brevets japonais susmentionnées No 21752 /1967 et 13516 /1979 peuvent être suivis pour cultiver le variant F41Kuroya de streptomyces carzinostaticus pour préparer la substance NCS-C selon cette invention. On peut recueillir la substance NCS-C de la solution de culture conformément à un procédé qui va être décrit ci-dessous. Avant tout, après séparation de la solution de culture en corps bactériens et solution de culture conformément à un procédé connu tel que la séparation par filtration ou par cen- trifugation, la substance NCS-C se trouve principalement dans le filtrat de la solution de culture. On ajuste ensuite entre 1 et 4 le pH du filtrat ainsi obtenu, à l'aide d'un acide minéral tel que l'acide chlorhydrique ou l'acide sulfurique, ou bien à l'aide d'un acide organique tel que l'acide acétique ou l'acide formique. En extrayant le fîltrat dont le pH est ainsi ajusté, à l'aide d'un solvant non miscilble à l'eau tel que le butanol ou le chloroforme, on fait passer la plus grande partie de la substance NCS-C dans la couche organique. On concentre ensuite la couche organique et on lui fait subir une purification qui comprend soit une chromatographie par adsorpion, par exemple sur gel de silice, alumine, ou "Amber- lite XAD", soit à une chromatographie en phase inversée, par exemple sur "y - bondapack C18" ou "Lichrosorb RP-8", soit à une chromatographie de perméation (diffusion) de gel, par exemple sur"Sephadex LH--20"ou gel de"TSK.' On obtient ainsi la substance NCS-C. On peut également obtenir la substance NCS-C en décompo- sant, dans des conditions douces, de la néocarzinostatine purifiée. En d'autres termes, quand on met en suspension de la poudre de néocarzinostatine et qu'on l'agite dans des conditions acides dans un solvant organique polaire tel que le méthanol, l'éthanol, le propanol, le butanol, l'acétone ou le choloroforme, elle se décompose en la substance NCS-C, qui se dissout dans le solvant organique, et en prénéocarzinosta- tineinsoluble (décrite dans "Journal of Antibiotics", Vol 27, page 766). On purifie ensuite la substance NCS-C contenue dans le solvant organique, conformément au procédé décrit ci-dessus. On obtient ainsi la substance NCS-C sous la forme d'un sel d'acide, que l'on peut transformer en la substance NCS-C elle- même conformément à n'importe quel procédé approprié connu en soi dans la technique, par exemple en faisant subir audit sel d'acide une réaction d'hydrolyse. Le sel d'acide chlorhydrique de la substance NCS-C a les caractéristiques suivantes: (1) Propriétés physiques et chimiques: (a) apparence: poudre jaunâtre clair - brunâtre (b) point de décomposition: 125 C -17o (c) rotation spécifique:[ 20 _ 171 1D ( c = 1,4 x 10 dans le méthanol) (d) analyse élémentaire: C 51,72, H 4,94, N 2,03, 0 31,00, C, 10,31. (e) poids moléculaire: 686,5 - 688,5 (f) formule brute: C30H33-35 C,2NO13 (g) spectre d'absorption ultraviolet (Fig.l): épaulements à 240, 265, 274, 290, 305 et 330 nm (h) spectre d'absorption infrarouge (Fig.2): absorptions à 3400, 1780, 1610, 1400, 1190, 1080 -1 et 1010 cm (i) réactions colorées: réaction au permanganate, et réaction de copula- tion diazoique positives; réaction xapthoprotéique, réaction d'Ehrlich, réaction à la Ninhydrine, réaction à l'orcinol, réaction de Molisch négatives (j) solubilité: très soluble dans le méthanol, l'éthanol, le propanol et le butanol; peu soluble dans l'acétate d'éthyle; difficilement soluble dans l'eau, l'éther et le benzène. (k) stabilité: stabilité thermique à 60 OC 0 mn 10 mn 30 mn 60 mn Reliquat (%) 100 84,4 72,4 56,9 stabilité aux rayons ultraviolets: irridiation avec une lampe de stérilisation Toshiba placée à 20 cm n 10 mn 30 mn 60 mn Reliquat (%) 100 56,9 22,7 7,2 pH: après écoulement de quatre heures pH 2 pH 4 pH 6 pH 8 pH 10 Reliquat (%) 100 100 55,1 18,9 0,0 (2) Toxicité aigue: Souris: injection intraveineuse DL50 = 1,8 mg/kg Souris: injection intrapéritonéale DL50 = 10 mg/kg et plus. (3) Propriétés biologiques: (i) effets antitumoraux: Sarcome de Yoshida (ip - ip) Dose maximale Dose minimale ______ tolérée (mg/kg) efficace (mg/kg) Substance NCS-C > 10 0,1 Mélange 1/10 de substance NCS-C et de 0, 5 0,005 prénéocarZinostatine Prénéocarzinostatine > 10 > 10 Cellules Hela S3 La substance NCS-C n'a pas manifesté ses propriétés anti- tumorales à une concentration de 1,0 mg/mQ mais un mélange 10/1 de prénéocarzinostatine et de substance NCS-C a présen- té des effets antitumoraux à une concentration de 0,1 mg/mQ. (ii) effets antimicrobiens: Concentration minimale inhibitrice(mc /mZ) Micro-organismes Substance Substance Prénéo- NCS-C carzino- d'essais NCS-C contenant statine y/mQ de prénéo- carzino- _._ statine Proteus vulgaris > 100 > 100 > 100 OX-19 Proteus morganii 100 100 > 100 IFO 3848 Proteus rettgeri > 100 > 100 > 100 Salmonella typhi > 100 > 100 > 100 V 1901 Shigella flexneri 100 100 > 100 2a Shigella sonnei > 100 > 100 > 100 Escherichia coli > 100 > 100 > 100 NIHJ Pseudaxnas aeruginosa > 100 > 100 > 100 GN 83 Serratia marcescens > 100 > 100 > 100 IFO 1022 Staphylococcus aureus 50 1,56 > 100 FDA 209p Staphylococcus epidermidis 25,0 0,4 > 100 IFO 3726 Streptococcus haemolyticus 25,0 100 Sarcina lutea ATCC 9341 12,5 100 Bacillus subtilis PCI 219 25,0 0,8 > 100 Bacillus cereus IFO 3001 100 0,8 > 100 Xanthomonas oryzae IAM 1657 > 100 > 100 > 100 Candida albicans YU 1200 > 100 > 100 > 100 _ _ Comme le montrent les tableaux cidessus, bien que la substance NCS-C selon cette invention ait par ellemême des effets antitumoraux et antimicrobiens, on augmente considé- rablement son efficacité en l'utilisant en association avec la prénéocarZinostatine. Comme décrit ci-dessus, les propriétés physiques, chimiques et biologiques de la substance NCS-C selon la présente inven- tion sont entièrement différentes de celles de la néocarZino- statine produite par le variant F41 Kuroya de streptomyces carzinostaticus, de la fraction N-1, de la fraction N-2, de la fraction Ma et du complexe de carzinostatine produit par une espèce bactérienne analogue, streptomyces carzinostaticus (voir la publication de brevets japonais N 5400 /1960), ainsi que de tout autre antibiotique antitumoral. Par consé- quent, la substance NCS-C selon cette invention a été iden- tifiée comme étant une substance nouvelle. On va maintenant décrire la présente invention au moyen des exemples suivants: Exemple 1 Dans un réservoir de culture de 400 Q, on a préparé 200 Z d'un milieu de culture (ajusté à pH 6,6) cco_ sé de 2,0 % d'amidon, 2,0% de farine de soja, 0,5% de levure sèche, 0,25% de chloru- re de sodium, 0,35% de carbonate de calcium, 0,005% de chloru- re de manganèse, 0,005% de sulfate de cuivre et 0,005% de sulfate de zinc. On a stérilisé thermiquement le milieu de culture à 120 C pendant 30 minutes. Puis on a chargé dans le réservoir de culture 3 ú d'une solution d'ensemencement de variant F41 Kuroya de streptomyces carzinostaticus que l'on avait au préalable cultivé pendant 24 heures sur un milieu de culture ayant une composition identique à celle du milieu de culture ci- dessus. On a ensuite fait subir au milieu de culture une culture de 50 heures à 27 C dans des conditions d'aération et d'agitation (Alimentation d'air: 300 Z/mn, vitesse d'agitation: 180 tours/mn). On a obtenu cent quatre vingt litres (180 Z) d'une solution de culture. On a ensuite filtré cette solution de culture au moyen d'un filtre presse. Après avoir ajusté le pH du filtrat à pH 2,0 à l'aide d'acide chlorhydrique, on a ajouté 100 z de n-butanol, et on a agité la solution résultante pendant 2 heures à une vitesse d'agitation de 180 tours/minute, puis on l'a laissé reposer pendant 24 heures. On a ensuite enlevé la couche butanolique, qui s'était suffisamnent séparée de la couche aqueuse et on l'a condensée dans un évaporateur "éclair" à 50 'C. On a obtenu une solution concentrée de la substance NCS-C (rendement: 1200 mt). Exemple 2 On a adsorbé la solution concentrée à l'exemple 1 dans une colonne garnie de 5 litres de gel de silice que l'on avait au préalable équilibré avec du chloroforme. On a ensuite élué la colonne avec un mélange 1/1 de méthanol et de chloro- forme, ce qui a donné 400 mZ d'une fraction active.On a ensuite fait subir à cette fraction une concentration et un séchage sous pression réduite. On a obtenu la substance NCS-C sous la forme d'une poudre brute (rendement 2,1 g). Exemple 3 Dans 50 m2 de méthanol on a dissout 2,1 g de la poudre brute obtenue à l'exemple 2. On a ensuite fait passer la solution résultante dans une colonne garnie de 19Q de "Sephadex LH-20" que l'on avait équilibré au préalable avec un mélange 1/9 d'acide chlorhydrique 1,0 N et de méthanol. On lui a ensuite fait subir une chromatographie en utilisant comme éluant un mélange 1/9 d'acide chlorhydrique 1,0 N et de méthanol. On a recueilli quatre vingt dix millilitres (90 m9) d'une fraction active. On l'a ensuite concentrée et séchée pour obtenir 126 mg de la poudre de substance NCS-C. Exemple 4 Dans 1,5 litre d'une solution de méthanol à 95% on a mis en suspension 16 g de poudre de néocarzinostatine. Après avoir ajusté à 2,0 le pH de la suspension à l'aide d'acide chlorhy- drique 1 N, on a agité la suspension pendant deux heures, puis on lui a fait Subir une séparation centrifuge. On a ensuite concentré le liquide surnageant et on l'a séché pour obtenir 920 mg de poudre brute de la substance NCS-C. On a fait subir à cette poudre brute une chromatographie sur "Sephadex LH-20" de la même manière que dans l'exemple 3. On a obtenu la substance NCS-C sous la forme d'une poudre (rendement 105 mg). REVENDICATIONS 1. Antibiotique antitumoral NCS-C et ses sels d'acides libre, le sel d'acide chlorhydrique ayant les propriétés physiques et chimiques suivantes: (a) apparence: poudre jaunâtre clair - brunâtre (b) point de décomposition: 125 C (c) rotation spécifique: [a 1D = - 171 O (c) = 1,4 x 103, dans le méthanol) (d)analyse élémentaire: C 51,72, H 4,94, N 2,03, O 31,00, CA 10,31. (e) poids moléculaire: 686,5 - 688,5 (f) formule brute: C30N33-35 C O2N 13 (g) spectre d'absorption ultraviolet: épaulements à 240, 265, 274, 290, 305 et 330nm (h) spectre d'absorption infrarouge: absorptions à 3400, 1780, 1610, 1400, 1190, 1080 et -1 1010 cm 1 (i) réactions colorées: réaction au permanganate et réaction de copulation diazolque positives; réaction xanthoprotéique, réaction d'Ehrlich, réaction à la Ninhydrine, réaction à l'orcinol, et réaction de Molisch négatives (j) solubilité: très soluble dans le méthanol, 1 'éthanol,le propanol et le butanol; soluble dans l'acétone, peu soluble dans l1acétate d'éthyle; difficilement soluble dans l'eau, l'éther et le benzène. 2. Procédé de préparation de l'antibiotique antitumoral NCS-C et de ses sels d'acides libre, le sel d'acide chlorhy- drique ayant les caractériques physiques et chimiques suivan- tes: (a) apparence: poudre jaunâtre clair - brunâtre (b) point de décomposition: 125 C (c) rotation spécifique:[a] = - 1710 D -3 (c = 1,4 x 10 3, dans le méthanol) (d) analyse élémentaire: C 51,72, H 4, 94, N 2,03, O 31,00, Ci' 10,31 (e) poids moléculaire: 686,5 - 688,5 (f) formule brute: C30I33-35Ck2N013 (g) spectre d'absorption ultraviolet: épaulements à 240, 265 274, 290, 305 et 330 nm (h) spectre d'absorption infrarouge: absorptior à 3400, 1780, 1610, 1400, 1190, 1080 et -1 1010 cm 1 (i)réactions colorées: réaction au permanganate et réaction de copulation diazoique positives: réaction xanthoprotéique, réaction d'Ehrlich, réaction à la Ninhydrine, réaction à l'orcinol, et réaction de Molisch négatives (j) solubilité: très soluble dans le méthanol,l'éthanol, le propanol et le butanol; soluble dans l'acétone; peu soluble dans l'acétate d'éthyle; difficilement soluble dans l'eau, l'éther et le benzene, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver un micro- organisme générateur de NCS-C appartenant à la famille des streptomyces, dans un milieu de culture; à séparer ce milieu de cultureen corps bactériens et filtrat de culture; et à extraire le filtrat de culture à l'aide d'un solvant organi- que polaire non miscibles à l'eau, dans des conditions acides. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit microorganisme générateur de NCS-C est choisi dans le groupe comprenant le variant F41 Kuroya de streptomyces carzinostaticus et ses mutants. 4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que l'on ajuste le pH dudit filtrat de culture entre 1 et 4 avant de l'extraire. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que ledit solvant organique polaire, non miscible à l'eau est le butanol ou le chloroforme. 6. Procédé de préparation de l'antibiotique antitumoral NCS-C et de ses sels d'acides libre, le sel d'acide chlorhy- drique ayant les caractéristiques physiques et chimiques suivantes: (a) apparence: poudre jaunatre clair - brunâtre (b) point de décomposition: 125 C (c) rotation spécifique: [a] = - 171 D -3 (c = 1,4 x 10, dans le méthanol) (d) analyse élémentaire: C 51,72, H 4,94, N 2,03, O 31,00; CZ 10,31 (e) poids moléculaire: 686,5 - 688,5 (f) formule brute: C30H33_35C 13 (g) spectre d'absorption ultraviolet: épaulements à 240, 265, 274, 290, 305 et 330 nm (h) spectre d'absorption infrarouge: absorptior à 3400, 1780, 1610, 1400, 1190, 1080 et -1 1010 cm (i) réactions colorées: réaction au permanganate et réaction de copulation diazoique positives; réaction xanthoprotéique, réaction d'Ehrlich, réaction à la Ninhydrine, réaction à l'orcinol et réaction de Molish négatives (j) solubilité: très soluble dans le méthanol, l'éthanol, le propa- nol et le butanol; soluble dans l'acétone; peu soluble dans l'acétate d'éthy, difficilement soluble dans l'eau, l'éther et le benzène, caractérisé en ce qu'il consiste à décomposer la néocarzinostatine dans des conditions acides de façon à former un sel d'acide libre de l'antibiotique de l'antitumoral NCS-C, et à extraire ledit sel à l'aide d'un solvant organique polaire. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on procède simultanément à ladite décomposition et à ladite extraction en mettant la néocarzinostatine en suspen- sion, dans les conditions acides, dans le solvant organique polaire, et en laissant le sel d'acide libremigrer dans le solvant organique. 8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que ledit solvant organique polaire est le méthanol, l'éthanol, le propanol, le butanol, l'acétone ou le chloroforme.