Brevet FR2467843A1 — publié le 19810430

Procédé pour préparer les dérivés carbamyle d'd'-hydroxy- acides et les o--hydroxy-acides correspondants. La présente invention concerne un procédé de préparation d'o-hydroxyacides par l'hydrolyse de composés de formule générale (I): - R I HC 1i O = C 2 C=O. H o R peut être un résidu aromatique ou aliphatique substitué ou non substitué. Selon la présente invention, les composés de formule générale (I), c'est-à-dire les 2,4-oxazolidinediones substi- tuées sur la position 5, peuvent subir une réaction d'hydrolyse qui ouvre le noyau selon le schéma réactionnel suivant: R R O0 HGC - O HC - OC- NH ) I + 1o1 22 O=C C=0 2 ô N 0=1 N H (I) (II) Le composé de formule générale (II) obtenu par hydrolyse est le dérivé carbamyle d'un oL-hydroxy-acide, à partir duquel 1' oc-hydroxy-acide peut être obtenu en soumettant le composé (II) à une hydrolyse ultérieure selon le schéma: R R - CH - COOH + Go + NH HOOC CH -OCONH2 + i20 2 3 2 11 (III) Le produit final (III) est 1' o(-hydroxy-acide. Un autre objet important de la présente invention est un procédé de préparation directe des D-carbamyl- cC -hydroxy- acides par hydrolyse enzymatique stéréosélective des mélanges racémiques de composés ayant la formule générale (I). Sous ce rapport, les auteurs de la présente invention ont découvert d'une façon tout à fait surprenante qu'il était pos- sible d'hydrolyser par les enzymes les DL-2,4-oxazolidinediones substituées sur la position 5 de façon à obtenir seulement le D-carbamylol -hydroxy-acide, c'est-à-dire un seul des deux isomères optiques possibles. L'dc-hydroxy-acide libre ayant la configuration D peut être obtenu à partir du dérivé carbamyle optiquement actif par une simple hydrolyse. Des composés tels que ceux décrits dans la formule (I) peuvent être facilement préparés à partir des-C-hydroxy-acides correspondants en les faisant réagir avec de l'urée comme le décrit Helge Aspelund in Acta Acad. Aboensins Math. and Phys. 22 (7) 12 (1961). La résolution du mélange racémique est effectuée par hydrolyse stéréosélective du noyau oxazolidine réalisée par des enzymes que l'on peut obtenir facilement à partir des cultures de divers micro-organismes ou à partir d'extraits d'organes d'animaux tels que le foie de veau. Un cas particulier qui est extrêmement intéressant mais ne limite pas la valeur générale du procédé mentionné ci-dessus est la préparation de l'acide D(-)mandélique correspondant à la formule: CH- COOH (IV) I. OH qui est un produit intermédiaire important dans la préparation des antibiotiques semi-synthétiques. Ce produit intermédiaire est généralement préparé par résolution du mélange racémique au moyen de la formation de sels diastéréo-isomères avec des bases naturelles optiquement actives telles que la brucine. Ce procédé donne dans certains cas un rendement théorique maximum de 50% du fait que l'énantiomorphe L doit être racémisé avant d'être recyclé. Selon la présente invention, le dérivé carbamyle de l'acide D(-) mandélique peut être préparé avantageusement par hydrolyse enzymatique stéréosélective de la 5-phényl-2,4- oxazolidinedione correspondante. L'autre avantage considérable du procédé selon la présente invention est dû au fait que le substrat de la réaction enzymatique se racémise spontanément dans les conditions d'hydrolyse de sorte qu'à la fin de la réaction, on obtient le carbamate de l'acide D(-) mandélique en quantité stoechiométrique par rapport au substrat de départ.. Le schéma réactionnel est le suivant: >a 1 C__ C -O- _ NS2 c c c CC-OH) c% Il N/ %0 o 0 N 0 0 N o 0 H H H L D D L'acide D(-) mandélique est ensuite obtenu à partir du carbamate de l'acide D(-) mandélique par hydrolyse dans un milieu acide. L'activité enzymatique nécessaire pour préparer le carba- mate d'acide D(-)mandélique a été découverte à lafois dans le foie de veau homogénéisé et dans les micro-organismes suivants: Pseudomonns, Achromobacter, Corynebactérium, Brevibacterium, Microbacterium, Arthrobacter, Agrobacteriuzm, Aérobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Bacillus, licrococcus, Sarcina, Protaminobacter, Streptomyces, Actinonmyces, Candida, Rhodo- torula, Pichia et Paecilomyces. Les micro-organismes des types suivants se sont révélés particulièrement appropriés: Agrobacterium radiobacter NRRL B 11291 Bacillus Brevis NRRL B 11080 Bacillus stearothermophilus NRRL B 11079 Pseudomonas sp CBS 145.75 Pseudomonas sp CBS 146.75 Pseudomones sp ATCC 11299 Pseudomonas desmolytica ICIB8859 Pseudomonas fluorescens ATCC 11250. Pseudomones putida ATCC 12633 Dans la réalisation du procédé selon laprésente invention, lesmicro-organismes des types mentionnés ci-dessus sont culti- vés dans des conditions aérobies dans un milieu de culture contenant des sources d'azote, de carbone, de phosphore et des sels minéraux, à une température comprise entre 20 C et 80 C pendant une durée comprise entre 10 et 72 heures et à un pH allant de 6 à 8. Le glucose, le lactate, l'acétate, la liqueur de macéra- tion du mais et le lactose peuvent être utilisés comme sources de carbone. La viande hydrolysée, la caséine ou le soja, les sels d'ammonium, l'urée, l'hydrantolne, etc. peuvent être utilisées comme sources d'azote. Un milieu de culture approprié a par exemple la compo- sition suivante: Peptone de viande 5 g Extrait de viande 3 g Glucose 5g Eau distillée 1000 ml pH 7,0 t 7,2 Le D(-) carbamate d'acide mandélique peut être préparé directement dans le milieu de fermentation contenant la DL- 2,4-oxazolidinedione correspondante, ou bien il peut être préparé en utilisant directement la pfte microbienne comme cellules dites inactivescuen utilisant des extraits de celle-ci. Les complexes enzymatiques de la présente invention sont extraits de la pate bactérienne par des procédés normaux utilisés dans 1'enzymologie. Dans ce but, les cellules sont désintégrées en utilisant un appareil approprié tel que la "French Pressure-Cell Press", l'homégénéiseur "Manton Gaulin", les désintégrateurs rotatifs, etc., ou en utilisant les ultra-sons. L'hydrolyse des D,L-2,4-oxazolidinediones substituées sur la position 5 peut être effectuée en ajoutant au mélange réactionnel l'enzyme sous les formes suivantes: cellules fraîches, cellules lyophilisées, cellules traitées au toluène, poudre acétonique ou extraits bruts ou extraits purifiés. Un autre perfectionnement technique et économique peut être réalisé en immobilisant les enzymes par combinaison avec des composés macromoléculaires par formation de liaisons chimiques avec la matrice, ou de liaisons de type ionique ou par immobilisation physique. La présente invention est illustrée par les exemples descriptifs et non limitatifs ci-après donnant d'autres procédés pour réaliser la présente invention. EXEMPLE 1 On prépare un bouillon de culture ayant la composition suivante: Peptone de viande 5 g Extrait de viande 3 g Glucose 5 g Eau distillée 1 000 ml Le pH est réglé à 7,2 avec du carbonate de sodium et le milieu est réparti dans des fioles de 500 ml en fractiorsde ml. Après avoir stérilisé pendant 30 minutes à 1100C, les fioles sont inoculées avec une culture de la souche ensemencée sur plan incliné de Pseudomonas CBS 145,75 contenant le même milieu avec 2% d'agar (DIFCO)et mise en incubation pendant 24 heures à 30çC sous agitation orbitale de 220 tours par minute. 1 ml de cette culture préliminaire (densité optique à 550 nm = 0,250, dilué au dixième) est placé dans cinq fioles de 500 ml contenant 100 ml du même milieu et la culture est mise en incubation à 30 C sous agitation orbitale (220 tours/ minute) pendant 24 heures (densité optique 550 nm = 0,450, dilué au-dixième). Les cellules sont ensuite recueillies, lavées dans une solution physiologique puis mises en suspension dans 100 ml d'un tampon pyrophosphate 0,1 M de pH 8,7 contenant 2 g de DL-5-phényl-2,4-oxazolidinedione à une température de 50 C. Apres 70 heures d'incubation dans ces conditions, l'hydrolyse en carbamate d'acide D(-) mandélique est terminée comme le montre l'analyse polarimétrique du mélange réactionnel. Le carbamate est isolé du mélange réactionnel après avoir éliminé la pâte cellulaire par centrifugation, puis il est refroidi et le pH est réglé à 2,5 avec HCl concentré. Le précipité ainsi obtenu est filtré, lavé avec de l'eau froide et séché sous vide. On obtient 1,8 g de carbamate, son identité étant prouvée par les spectres IR et RMN et par l'analyse élémentaire. Le pouvoir rotatoire optique spécifique (c)25 de la solution alcoolique du carbamate obtenu comme décrit ci-dessus est de -141. Son point de fusion (avec décomposition) est de 169 C. 1,4 gramme de carbamate est mis en suspension dans 100 ml d'eau puis chauffé au reflux pendant 4 heures. La solution aqueuse ainsi obtenue est acidifiée puis extraite avec l'éther éthylique et la phase organique est concentrée sous vide à siccité. 1,10 g d'acide mandélique brut est obtenu ayant un (0 25 de -120 (rendement optique 76%). D Une fois cristallisé dans l'eau, le produit brut a un point de fusion de 130 C et un (oC-)25 de -154,5 dans l'eau au D 25 lieu d'un point de fusion de 133 C et un (L) D de -158 comme décrit la littérature pour l'acide D(-) mandélique. EXEMPLE 2 1 g de poudre acétonique de foie de veau homogénéisé est ajouté à une solution contenant 500 mg de DL-5-phényl-2,4- oxazolidinedione, dans 50 ml d'un tampon pyrophosphate 0,1 M ayant un pH de 8,5. Le mange réactionnel ainsi obtenu est mis en incubation à 30 C pendant 40 heures. Le carbamate d'acide D mandélique est ensuite récupéré comme décrit dans l'exemple 1. 380 mg du carbamate brut sont obtenus avec un pouvoir rotatoire optique spécifique (o() 25de -136 dans 1'éthanol. D L'hydrolyse acide du carbamate brut est ensuite effec- tuée et l'acide mandélique est extrait comme décrit dans l'exem- ple 1, pour obtenir 300 mg d'acide D mandélique ayant un de -116 (rendement optique 73,5%). D REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de dérivés carbamyle d't- hydroxy-ecidesconsistant à hydrolyser les 2,4-oxazolidine- diones substituées en position 5 ayant la formule générale (I): R H - C -.0 (I) I J 0=C / = O dans laquelle R est un résidu aromatique ou aliphatique,subs- titué ou non substitué. 2. Procédé de préparation des D-carbamyl-WC-hydroxy- acides caractérisé par le fait qu'il consiste à soumettre les DL-2,4oxazolidinediones substituées en position 5 ayant la formule générale (I) à une hydrolyse enzymatique stéréo- sélective. 3. Procédé de préparation des D-carbamoyl-co -hydroxy- acides selon la revendication 2, caractérisé par le fait que les agents ayant une activité enzymatique dans l'hydrolyse stéréo-sélective des 2,4oxazolidinediones substituées sur la position 5, sont obtenues à partir du foie de veau homogénéisé. 4. Procédé de préparation des D-carbamyl- acides selon les revendications 2 et 3, caractérisé par le fait que les agents possédant l'activité enzymatique dans l'hydrolyse stéréosélective des 2,4-oxazolidinediones substituées sur la position 5 sont produits à partir des micro-organismes choisis parmi les suivants Pseudomonas, Achronobacter, Corynebacter- ium, Brevibacterium, Microbacterium,_ Arthrobecter, Agrobacter- ium, Aerobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Bacillus, Micrococcus, Sarcina, Protaminobacter, Streptomyces, Actinomyces, Candida, Rhodotorula, Pichia et Taecilomyces. 5. Procédé de préparation des D-carbamyl-s acides selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, carac- térisé par le fait que les agents ayant l'activité enzymatique dans l'hydrolyse stéréosélective des DL-2,4-oxazolidinediones substituées sur la position 5 sont de préférence produits à partir des micro-organismes des types suivants: Agrobacterium radiobacter NRRL B 11291, Bacillus Brevis NRRL B 11080, Bacillus stearo thermophilus NRRL B 11079, Pseudomonas sp CBS 145.75, Pseudomonas sp CBS 146.75, Pseudomonas sp ATCC 11299, Pseudomonas desmoiytica NCI B 8859, Pseudomonas fluorescens ATCC 11250 et Pseudomonas putida ATCC 12633. 6. Procédé de préparation des D-carbamyl- c-hydroxy- acides selon l'une quelconque des revendications 2, 3 et 5, caractérisé par le fait que les micro-organismes sont cultivés dans des conditions aérobies à une température allant de 20 C à 80 C. 7. Procédé de préparation des D-carbamyl- c, -hydroxy- acides selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, carac- térisé par le fait que la durée de la culture du micro-orga- nisme est comprise entre 10 et 72 heures. 8. Procédé de préparation des D-carbamyl".c-hydroxy- acides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le pH du milieu de culture du micro-organisme est compris entre 6 et 8. 9. Procédé de préparation des D-carbamyl- C-hydroxy- acides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le D-oL-hydroxy-acide est l'acide D(-) mandélique et que le substrat ayant la formule générale (I) est la DL-5-phényl-2,4-oxazolidinedione. 10. Procédé de préparation de l'acide D(-) mandélique, caractérisé par le fait qu'il consiste à soumettre le carbamate correspondant à l'hydrolyse acide dans un milieu aqueux à une température comprise entre 40 et 100 C et à un pH compris entre 1 et 3,5.