Brevet FR2460961A1 — publié le 19810130

La présente invention concerne une nouvelle série de dérivés semibiosynthétiques de tallysomycine, qui sont doués de propriétés antimicrobiennes et antitumorales avantageuses. Bien qu'on ait découvert un certain nombre d'antibiotiques glycopeptidiques, certains d'entre eux ont également la propriété d'inhiber efficacement le développe- ment de tumeurs chez des mammifères. Il subsiste le besoin de trouver d'autres agents antimicrobiens et antitumoraux. Il est nécessaire en particulier de trouver des agents anti- tumoraux qui exercent une activité accrue et/ou présentent un spectre élargi par rapport aux agents actuellement disponi- bles ou qui exercent moins d'effets secondaires indésirables. On donne ci-après un bref aperçu des antibiotiques glyco- peptidiques les plus importants. Les bléomycines sont des glycopeptides basiques solubles dans l'eau élaborés par fermentation de Streptomyces verticillus. Elles ont été mentionnées pour la première fois par Umezawa et collaborateurs dans J. Antibiotics 19A:200 (1966) (voir également le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 681 491). Le complexe de bléomycine a été divisé en plusieurs composants comprenant les bléomycines A1, A2, A5 et B2. Le complexe de bléomycine est vendu à l'heure actuelle en vue du traitement de divers néoplasmes chez l'homme, comprenant le carcinome à cellules squameuses, le lympho- sarcome, le sarcome à cellules réticulaires, le cancer du testicule et la maladie d'Hodgkin. Une révision de la structure des bléomycines a été récemment publiée par H. Umezawa et collaborateurs dans J. Antibiotics 31:801-804 (1978). Les antibiotiques du groupe de la phléomycine obtenus par fermentation d'une autre souche de Streptomyces verticillus ont été rapportés par Maeda et collaborateurs dans J. Antibiotics: Volume A9, pages 82-85 (1956) ; volume A12, page 111 (1959); volume A12, pages 285-289 (1959) et volume A17, pages 194-199 (1964). Comme dans le cas du complexe de bléomycine, la phléomycine a été divisée en plusieurs composants qui peuvent exister aussi bien sous la forme dépourvue de cuivre que sous la forme chélatée avec le cuivre. La zorbamycine et les antibiotiques apparentés, à savoir la zorbonomycine B et la zorbonomycine C, sont décrits dans J. Antibiotics 2_4(8): 543-557 (1971) et dans le brevet britannique N 1 277 150. Ces antibiotiques, isolés de milieux de fermentation de Streptomyces bikiniensis var. zorbonensis, sont étroitement apparentés aux familles de la bléomycine et de la phléomycine. Une autre famille d'antibiotiques du groupe phléomycine-bléomycine a été isolée du bouillon de culture d'un variant de Stréptomyces humidus et on lui a attribué la référence YA-56. Une description du complexe YA-56 et des composants actifs YA-56X et YA-56Y a été donnée dans J. Antibiotics 24(10) : 727-731 (1971) et dans J. Antibiotics 26: 77-83 (1973). Le complexe antibiotique XK 49 et son composant principal, à savoir la victomycine (également appelé XK 49-1- B-2), ont été décrits dans J. Antibiotics 28: 358-371 (1975). La victomycine a été isolée d'un actinomycète producteur de sporanges, à savoir Streptosporangium violaceochromogenes MK 49, et parait être semblable aux bléomycines et à la zorbonomycine B. Le complexe antibiotique glycopeptidique Bu-2231 et ses composants Bu-2231 A et B Lappelé ci-après tallysomycine et tallysomycines A et respectivement B) ont été décrits dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 051 237 (voir également J. Antibiotics: Volume 30, pages 779-805 (1977) et volume 31, pages 667-674 (1978)J. Les tallysomycines sont isolées du bouillon de fermentation de certaines souches de Streptoalloteichus hindustanus et exercent de puissantes activités antimicrobiennes et anti- tumorales. La préparation de divers dérivés semibio- synthétiques de phléomycine et de bléomycine par la technique de la fermentation alimentée par un précurseur a été décrite dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique N 3 984 390 et N 3 846 400. Dans cette technique, des souches de micro- organismes capables de produire les antibiotiques phléomycine et bléomycine sont cultivées dans un milieu de fermentation en présence d'un précurseur aminé pour produire des dérivés nouveaux de phélomycine et de bléomycine présen- tant une structure en chaîne latérale qui correspond à l'amine ajoutée. Le brevet britannique N 2 001 962 A décrit la préparation de la 3- (S)-l'-phényléthylaminojpropylamino- bléomycine (pépléomycine) en tant que dérivé semibio- synthétique de bléomycine particulièrement apprécié du fait qu'il allie une puissante activité antitumorale à une faible toxicité pulmonaire. La présente invention offre de nouveaux dérivés semibiosynthétiques de tallysomycines A et B et leur procédé de production. Plus particulièrement, l'invention offre des dérivés de tallysomycine A de formule: 0 0 CONH NH2. il ' N NH N C-NH-(CH2)3-CH-CH2-C- OX N,"N. s NH2 H3C HN NScH 3 ô OHO H 1, -HC".., u OH H3C7'H" 0 " / 1H.t CC 0 Z OH HO ZOHH Ia dans laquelle R représente: _NH-(CH2)3-NH2 -NH-(CH2)3-S (CH3)2 -NH- (CH2)3-NH-CH2-CH20H -NH-(CH2)3-N(CH2CH2OH)2 -NH- (CH2)4-NH2 -NS-(Z2)3-NH-CH3 ou -NH-(CH2)3 -NH 4IC CH3 et des dérivés de tallysomycine B de formule: aOH NH2 N, ' il #';"N o-R HaN> i II - -- 5t H2"C I tH 01 H3C HMN OH W OH 0oH OH OH Ib HA dans laquelle R représente: -NH-(CH2)3-NH2 -NH-(CH2)3- Se(CH3)2 -NH-(CH2)2-NH2 -NH-CH2- CH-CH2-NH2 OH -NH- (CH2) 2-NH-CH2-CH-CH3 u OH -NH- ( CH2)3-NH-CH2-CH20H -NH-(CH2)3-N(CH3)2 -NH-(CH2)3-N(CH2CH20H)2 -NH-(CH2)2-NH-CH2-CH20H -NH-(CH2)4-NH2 -NH-(CH2)3-NH-CH3 -NH-(CH2)3-N_. -NH-(CH2)3-N CH. ou -NH- (CH2)3-NH-CH- Q & 3 ainsi que les sels d'addition d'acides acceptables du point de vue pharmaceutique de ces dérivés. Les composés mentionnés ci-dessus peuvent exister sous la forme d'un chélate de cuivre ou sous la forme dépourvue de cuivre. Une forme de réalisation particulièrement appré- ciée de la présente invention réside dans le dérivé de tallysomycine B de formule: (CH2)4-NH2 H3CXO Tall Ysomycine.S10b H2N OH Des études initiales portant sur des animaux expérimentaux ont démontré que la tallysomycine Sl0b (compre- nant tant les formes dépourvues de cuivre que les formes chélatées avec le cuivre et leurs sels acceptables du point de vue pharmaceutique) déploient une excellente activité antitumorale contre un large spectre de tumeurs malignes tout en présentant des effets secondaires moins indésirables (par exemple néphrotoxicité) que les tallysomycines A et B naturelles. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 051 237 révèle la production et l'isolement de deux nouveaux antibio- tiques glycopeptidiques appelés Bu-2231 A et B. Des travaux subséquents ont montré que les composés Bu-2231 A et B (appelés maintenant tallysomycines A et B) ont les structures ci-après: H21 Tal lysomycine.A o il :-NH-(CH2)3 -CH-CH-C-NH NH2 (CH2)3 NH (CH2) (?2)4 NH2 -NH(CH2)3-NH-(CH2)4-NH2 Tal lysomycineB Les tallysomycines mentionnées ci-dessus sont les composants principaux de la fermentation de souches productrices de tallysomycine de Streptoalloteichus hindustanus isolées conformément aux méthodes chromato- graphiques classiques. On vient de découvrir conformément à la présente invention que la méthode de fermentation révélée dans le CO-NH2 NH2 N"HN NH2 Ne N o brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 4 051 237 précité peut être conduite en présence de certains précurseurs aminés pour produire des dérivés nouveaux de tallysomycines A et B douées de propriétés antimicrobiennes et antitumorales intéres- santes. La technique générale de fermentation alimentée par un précurseur aminé décrite dans les brevets des Etats- Unis d'Amérique NI 3 984 390 et NI 3 846 400 est exploitée dans le procédé de la présente invention. Dans le procédé de l'invention, un précurseur aminé est ajouté au milieu de fermentation produisant la tallysomycine conformément au brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 4 051 237 précité et il est incorporé au cours de la fermentation au groupe amine terminal de la tallysomycine A et/ou de la tallysomycine B pour former de nouveaux dérivés semibiosynthétiques compor- tant une chaîne latérale aminée terminale correspondant au précurseur aminé que l'on ajoute. L'isolement et la purifi- cation des dérivés ainsi obtenus peuvent être effectués par des opérations chromatographiques classiques comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 4 051 237 précité. Une description plus détaillée de ce procédé est donnée ci-dessous et dans les exemples qui suivent. Préparation des antibiotiques. Dans la mise en oeuvre du procédé de l'invention, une souche de Streptoalloteichus hindustanus productrice de tallysomycine (comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique NI 4 051 237 précité), notamment la souche E 465- 94 ATTC 31 158 de Streptoalloteichus hindustanus ou un mutant de cette souche, est cultivée dans un milieu nutritif aqueux. Le milieu nutritif renferme une source assimilable de carbone (par exemple glucose, ribose, galactose, fructose, mannose, saccharose, lactose, amidon soluble ou glycérol) et une source assimilable d'azote (par exemple farine de poisson, farine de soja, farine de graine, de cotonnier, extrait soluble de mais, peptones, extrait de malt, farine d'arachide, extrait de levure ou sels d'ammonium). Des sels inorganiques tels que le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le sulfate de magnésium, le carbonate de calcium, des phosphates, etc., sont ajoutés le cas échéant. Des oligo- éléments tels que cuivre, manganèse, fer, zinc, etc. sont ajoutés éventuellement au milieu ou peuvent être introduits sous la forme d'impuretés avec d'autres constituants du milieu. En plus des constituants nutritifs classiques définis ci-dessus, on ajoute au milieu un précurseur aminé comme défini ci-après sous la forme de la base libre ou sous la forme d'un sel d'addition d'acide de cette base. Généra- lement, le précurseur aminé est utilisé sous la forme d'une solution aqueuse neutralisée. Les précurseurs aminés que l'on peut utiliser avantageusement dans la présente invention sont indiqués ci-après en même temps que le nom de code de la tallysomycine correspondante obtenue comme produit: Amine Nom chimique J ],2-diaminoethane 1,3-diaminopropane 1,4diaminobutane 1,3-diamino-2-hydroxy- propane N-(C-hydroxyethyl)-l1,2- diaminoethane N-({-hydroxypropyl)-1,2- diaminoethane N-methyl-1,3-diaminopropane N-(S-hydroxyéthyl)- 1,3- diaminopropane N-(l'-phényléthyl)-1,3- diaminopropane N,N-dimethyl-l1,3-diamino- propane N,N-di(3-hydroxyéthyl)- 1,3-diaminopropane Formule NH2- (CH2)2-NH2 NH2-(CH2)3-NH2 NH2-(CH2 4-NH2 NH2-CH2-CH-CH2-NH2 OH NH2- (CH2) 2-NH-CH2-CH20H NH2-(CH2)2-NH-CH2-CH-CH3 OH NH2- (CH2)3-NH-CH3 NH2-(CH2) 3-NH-CH2-CH20H NH2- (CH2)3-NH-CHQ CH3 NH2-(CH2)3-N(CH3)2 NH2-(CH2)3-N(CH2-CH20H)2 Tallysomycine obtenue comme produit final 3 S3b Sla, Slb SlOa, S10b S4b S9b S5b Slla, Sllb S6a, S6b 514a' S14b S7b S8a, S8b N-(3-aminopropyl)morpholine NH2-(CH2)3-N \O S12b Amine Tallysomycine obtenue comme Nom chimique - Formule produit final x N-(3-aminopropyl)-2- NH2(CH2)3N S13b pipecoline CH2-' S13b CH3/ Chlorure de 3-amino- NH- CH2)3-S(CH3)2 S S NH.(CH)3.-SDCH3)2 S 2a, 2 propyl-diméthylsulfonium 2 a 0 2b * On nomme les dérivés de tallysomycine en attribuant un numéro à chaque précurseur aminé puis en désignant la tallysomycine obtenue comme produit final par le numéro de son amine terminale et par la lettre a ou b selon qu'il s'agit d'un dérivé de tallysomycine A ou B. Par exemple, la tallysomycine S10b est le dérivé de tallysomycine B dont l'amine terminale est le 1,4- diaminobutane. Les amines utilisées sous la forme de bases libres ou de sels d'addition d'acides avec des acides minéraux tels que HBr ou HCl sont ajoutées de préférence au milieu à une concentration d'environ 0,05 à 0,4 % en poids/volume, notamment d'environ 0,1 à 0,2 % en poids/volume au début de la fermentation, bien que de bons résultats puissent aussi être obtenus par addition par portions de solution d'amine pendant les premiers stades de la fermenta- tion. On conduit la fermentation en suivant le mode opératoire décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 051 237 précité. Conformément à ce brevet, la température d'incubation peut être toute température à laquelle une souche produisant de la tallysomycine est capable de se développer, par exemple 20-540C, mais il est préférable de conduire la fermentation à 25-350C, notamment à 27-320C. On utilise de préférence un pH initial du milieu neutre ou presque neutre, par exemple un pH d'environ 6 à 7, et on conduit généralement la production de l'antibiotique pendant une période d'environ deux à dix jours. Ordinairement, la production optimale est obtenue en trois à sept jours. Pour la préparation de quantités relativement faibles, on peut utiliser des fioles agitées par secousses et une culture en surface, mais pour la production à grande échelle, on préfère utiliser une culture aérobie en immersion dans des cuves stériles. Lorsqu'on doit effectuer une fermentation en cuves, il est désirable de produire un inoculum végétatif dans un bouillon nutritif par inoculation du bouillon de culture avec des spores provenant de l'organisme producteur. Lorsqu'on a obtenu un inoculum végétatif actif jeune, on transfère cet inoculum dans des conditions aseptiques dans le milieu renfermé dans la cuve de fermentation. Une aération dans des cuves et des bouteilles peut être effectuée par injection d'air dans le milieu en cours de fermentation ou à sa surface. L'agitation dans les cuves peut être effectuée mécaniquement à l'aide d'un rotor, et on peut ajouter le cas échéant un agent anti-mousse tel que l'huile de saindoux. La production du dérivé désiré de tallysomycine dans le milieu de culture peut être suivie au cours de la fermentation par la méthode de diffusion en gélose avec disques de papier, en utilisant comme organisme d'essai la souche M6-3 de Mycobacterium smegmatis. Isolement et purification Après que la puissance optimale du bouillon a été atteinte (comme déterminé par exemple par la méthode d'essai mentionnée ci-dessus), le mycélium et les résidus non dissous sont séparés du bouillon de fermentation par des moyens classiques, par exemple par filtration ou par centrifugation. L'activité antibiotique se trouve dans le filtrat et peut en être isolée par des techniques classiques d'adsorption (voir par exemple J. Antibiotics 30(10):779-788 (1977). 13 2460961 Dans une forme de réalisation appréciée, le filtrat est tout d'abord adsorbé sur une résine d'échange cationique, par exemple une résine du type vendu par la firme Rohm & Haas Company sous la désignation commerciale "AMBERLITE IRC-50" (forme NH4+). On lave la résine avec de l'eau et on élue les fractions de tallysomycine avec un acide minéral aqueux, par exemple l'acide chlorhydrique décinormal. L'éluat contenant les fractions actives est neutralisé avec une solution aqueuse d'ammoniac et il est de préférence agité avec du carbone activé. Le charbon est recueilli par filtration, lavé à l'eau puis élué avec du butanol aqueux (butanol:HCl dilué, 1:1 volume/volume) à un pH acide (par exemple pH 2). La phase aqueuse de l'éluant est neutralisée avec une résine basique d'échange anionique et concentrée sous vide. L'éluat concentré venant de la résine IRC-50 (si l'étape d'adsorption sur du carbone a été omise) ou de carbone activé est ensuite dissous dans l'eau, adsorbé sur une résine du type "DIAION HP-20" (désignation commerciale d'une résine adsorbante non ionique macroporeuse composée d'un copolymère styrène-divinylbenzène produit par la firme Mitsubishi Chemical Co.) et élué avec de l'eau en donnant un mélange de tallysomycines brutes sous la forme du chélate de cuivre. La séparation et la purification des dérivés de tallysomycine désirés formés au cours de la fermentation amorcée par un précurseur peuvent être effectuées par adsorption du complexe de tallysomycine brute obtenu ci- dessus, sur un échangeur cationique d'ions consistant en un dérivé de dextrane modifié, par exemple un dextrane poly- saccharidique modifié du type vendu dans le commerce sous la marque déposée "CM-SEPHADEX C-25" par la firme Pharmacia Fine Chemicals Inc. Le ou les dérivés de tallysomycine sont élués par étapes avec une solution aqueuse de formiàte d'ammonium dont les concentrations varient d'environ 1 à 7 %. Des fractions contenant le même dérivé sont rassemblées, relarguées par adsorption sur du carbone activé (élution avec du butanol aqueux acide) et lyophilisées en donnant le dérivé de tallysomycine purifié sous la forme d'un chélate de cuivre. On peut parfaire la purification, le cas échéant, par des opérations classiques de chromatographie et/ou de filtration sur gel. Les dérivés de tallysomycine de la présente invention ont la propriété de se chélater avec le cuivre comme le font les tallysomycines A et B et, en conséquence, les nouveaux dérivés et leurs sels d'addition d'acidqs peuvent exister sous la forme d'un complexe de cuivre ou sous la forme dépourvue de cuivre. Les formes dépourvues de cuivre des dérivés de tallysomycine peuvent être préparées à partir des formes correspondantes complexées avec le cuivre, par les procédés connus tels que ceux qui sont décrits dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 4 051 237 et dans la demande de brevet britannique mise à l'Inspection Publique sous le NO 2 001 962 A. Les dérivés de tallysomycine sous la forme des bases libres de la présente invention peuvent être convertis par des opérations classiques en sels d'addition d'acides acceptables du point de vue pharmaceutique. Des exemples de ces sels comprennent les sels non toxiques d'acides organiques ou inorganiques tels que les acides chlorhydrique, sulfurique, phosphorique, acétique, formique, stéarique, maléique, benzoique, succinique et bromhydrique. Activité antimicrobienne Les concentrations inhibitrices minimales (CIM) des dérivés semibiosynthétiques de tallysomycine de la présente invention ont été déterminées contre des champignons et des bactéries Gram-positives, Gram-négatives et acido- résistantes par la méthode de dilution double sur gélose. De la gélose nutritive a été utilisée pour les bactéries et de la gélose de Sabouraud a été utilisée pour les champignons. Les résultats sont reproduits sur le tableau suivant, compa- rativement aux tallysomycines A et B. Activité antimicrobienne de dérivés de tallysomycine Staphyl o- coccus Sarcina Bacillus Myco- Tallyso- aureus 1 utea subtil i s bacterium mycine Smith PCIlO1 PCI 219 607 A 0,1 0,05 B o, o o, o,oo6 0o2 Sla 0,4 0o1 05 1 0oo006 0 003 S5sb 6,3 12 5 0 025 0, 2 S6a /08 1,6 0,03 '0/ S6b 6,3 12 5 0 02 0/2 S7b 6r3 12,5 0/1 3e1 S8a 0,2 o0 4 0oo006 0,1 S8b o04 0,8 0,013 0;1 S9b o/4 0,8 0013 or,1 SiOa 1,6 0,4 0014 0>2 Sl0b 613 311 012 0/2 Slla oz8 0,2 0to025 01 Sllb 3/1 0,8 0,1 0O1 S52b 12 5 1215 O 4 0O2 513b 6t3 613 0>8 0,2 S14a 0,8 0,8 01 01 S14b 3/1 311 o,4 o02 Activité antimicrobienne de dérivés de Lallysomycine Escherichia coli NIHJ O 05 0, 2 0,1 > 12,5 > > Candida albicans IAM 4888 12, 5 6, 3 3,1 12,5 12,5 6,3 >50 12,5 >50 3,1 12,5 1,6 12,5 >100 >100 Aspergillus fumigatus IAM 2593 1,6o o08 0,8 1,6 0,o8 o,8 0,8 o, 4 0,2 o,8 o 4 O,8 1,6 1,6 1,6 6,3 o,8 6, 3 12r5 ' Tal lyso- myci n e A B Sla Slb S2a sb 53b S5b S6a S6b. S7b S8a S8b S9b Sloa S10b Slla Sllb S1l2b S13b S14a S14b Les pouvoirs antibactériens relatifs (étalon de tallysomycine A = 1000 pg/mg) des dérivés de tallysomycine ont été déterminés par la méthode de diffusion en gélose avec disques de papier, en utilisant comme organisme d'essai la souche M6-3 de Mycobacterium smegmatis. Les résultats sont reproduits sur le tableau suivant. Pouvoir antibactérien de dérivés de tallysomYcine Pouvoir antibactérien Tal lysomycine (.g/mg) A 1 000 B 900 Sla Slb S2a S2b S3b 54b S5b S6a S6b S7b S8a S8b S9b SlOa Slob Slla Sllb S12b S13b S14a S14b J 075 1 000 1 450 1 iCO 1 090 ! 300 1 y90 i 19 2460961 Activité antitumorale L'activité d'induction de prophages de la bactérie lysogénique E. coli W1709 (X) a été déterminée conformément à la méthode décrite par Lein et collaborateurs dans Nature 196: 783-784 (1962). Le comptage des plaques a été effectué sur la plaque de gélose renfermant le composé d'essai (t) et une plaque témoin (c). Un rapport t/c des nombres de plaques supérieur à 3,0 est défini comme étant un niveau important et l'activité d'induction lysogénique (activité ILB) est exprimée par la concentration minimale pouvant être induite du composé d'essai. Les résultats sont reproduits sur le tableau suivant. Activité ILB de dérivés de Tallysomycine Activité ILB Tallysomycine (Av/ml) (i./ml),, A 0,00125 B 0O01 Sla 0,16 Slb 0,31 S2a 0,31 S2b 0,63 S3b 0o31 s -4b S5b S6a S6b S7b S8a S8b ss S9b Sloa Sl ob 0,08 0,02 0JO8 o008 0,005 0,02 0,16 Activité ILB Tallysomycine (Ag/mé) SIla 0,08 Sllb 0,63 S12b 0,31 Sl3b 0,08 S14a 0, 01 Sl4b,o4 L'activité antitumorale des dérivés de tally- somycine a été étudiée sur quatre types de tumeurs expérimen- tales chez la souris. La leucémie à lymphocytes P388 et le carcinome pulmonaire de Lewis ont été implantés par voie intrapéritonéale à des souris BDF des deux sexes, à des taux respectifs d'inoculum de 3 x 10 et 5 x 105 cellules par souris. On inocule la tumeur d'ascite (sarcome 180) par voie intrapéritonéale à des souris mâles de souche dd à raison de 2,5 x 1016 cellules par souris. Le mélanomemélanotique B16 est implanté par voie sous-cutanée à des souris BDF1 à raison de x 105 cellules par souris. Vingt-quatre heures après l'implantation de cellules tumorales, on administre des doses graduelles des composés d'essai à des souris par voie intrapéritonéale, le volume d'injection étant de 0,2 ml par g de poids corporel. Les composés d'essai sont administrés une fois par jour pendant 9 jours (programme qd 1- _9) excepté aux souris auxquelles on inocule le carcinome du poumon de Lewis, qui sont traitées pendant 11 jours (qd 1-11). On note quotidiennement les cas mortels et les survivants parmi les animaux traités et non traités (témoins) pendant la période d'observation de 45 jours après l'implantation de cellules tumorales, et on calcule le temps moyen de survie pour chacun des groupes d'essais (T) et des groupes témoins (C). Une valeur T/C égale ou supérieure à % indique qu'un essai antitumoral important a été obtenu contre la leucémie P388 et le carcinome pulmonaire de Lewis. La dose réelle donnant un rapport T/C de 125 % a été estimée par analyse par régression linéaire et définie comme étant la dose efficace 125 ou DE125. La dose efficace 150 (DE150) a été utilisée pour évaluer l'effet antitumoral contre le sarcome 180. Dans l'essai portant sur le mélanome B16, les dimensions de la tumeur ont été déterminées 16 jours après l'inoculation des cellules tumorales et la dose donnant une inhibition de 50 % de la croissance de la tumeur (DI50) a été calculée d'après les courbes de régression. L'activité antitumorale des dérivés est indiquée sur le tableau suivant. Activité antiturmota ( egkg/jour, voie intraPeri oneae Tal lysomyci n e A (sans Cu) B (sans Cu) Sla Slb S2a S2b S3b S4b S5b S6a S6b S7b S8a S8b S9b S1 Oa S1 Ob S10b (sans Cu) Slla Sllb S12b S13b S1 4a S1 4b P388 (ED1is) 0, 26 0,89 1 2 2/0 >3,0 0, 91 >310 o,66 0o,/70 2,2 2;1 0,78 1,5 >31o 0,28 O0P47 0t 60 0t28 1,30 0/70 3.0 * forme chélatée cation contraire S1 80 (ED5 lso) 0,07 0,o06 0,07 0, 11 0,07 0,12 0,06 - 0,13 0,10 O/ 09 O, 08 o, 1h 0 25 O/ 08 0,08 0/33 0/02 0,20 0,o06 0t,33 0, 08 B16 Cancer du poumon de Lewis (ID50) (ED125) 0,27 0,13 O,82 0, 11 o,84 0,15 0t 12 0,17 o,14 0,33 0,65 0,20 0,26 0,31 0,38 0,12 O/47 0,22 0,17 0,16 0,26 0,12 0,29 0,41 0,39 0/59 0,75 0> 21 0,70 0,32 1,30 0t23 0O,3 avec le cuivre, 0,29 sauf spécifi- 24 2460961 Des doses graduelles des composés d'essai sont administrées par voie intrapéritonéale à des groupes de souris dd. L'injection est effectuée une seule fois ou une fois par jour pendant 9 jours consécutifs. On note les cas mortels ou des cas de survie des animaux pendant 30 jours après la dernière dose de composé d'essai pour calculer la dose léthale moyenne simple ou multiple (DL50). Les résultats *sont reproduits ci-dessous. Toxicité aiauë et Tal 1 ysomyci nez A (sans Cu) B (sans Cu) Sla Slb S2a S2b S3b S4b S5b S6a S6b S7b S8a S8b Sgb SlOa S10b S1 Ob SI Ob (sans Cu) subaiquë de dérivés de Tallysomycine DL50 (mg/kg/jour, voie intrapéritonéale) Dose unique Dose multiple (qd 1 -9) 19 4,4 46 6,8 2/0 4, 0 DL50 (mg/kg/jour, voie intrapéritonéale) Tallysomycine Dose uniaue Dose multiple (qd 1_--9) Slla Sllb S12b S13b 23. >50 S14a S14b * forme- chélatée au cuivre, sauf spécification contraire. 15.L'indice thérapeutique antitumoral a été calculé pour chaque dérivé d'après le rapport de la toxicité et de l'activité antitumorale. Comme l'indique le tableau suivant, plusieurs des nouveaux dérivés semibiosynthétiques de tallysomycine présentent de meilleurs indices thérapeu- tiques que les tallysomycines A et B d'origine naturelle dans certaines des tumeurs expérimentales qui ont été examinées. Ta Indices théraDeutiques antitumoraux de dérivés de Tallysomycine Indices thérapeutiques antitumoraux xx Cander pulmonaire Ilysomycine x P388 S180 B16 de Lewis A (sans Cu) 73 271 70 146 B (sans Cu) Sla Slb S2a S2b S3b 54b 38 Si 80 >833 B16 >38 antitumoraux X Cancer pulmonaire de Lewis forme chélatée au cuivre sauf spécification contraire rapport de la toxicité (DL50) pour une dose unique à la dose antitumorale efficace (DE125, DE150 ou DI50). On a évalué la néphrotoxicité de la tallysomycine Sl0b sur le modèle de la souris en utilisant un dosage de l'azote d'urée sanguine comme critère d'appréciation et l'hydroxyproline pulmonaire comme modèle de toxicité pulmonaire (voir Cancer Res. 35:787 (1978)). La toxicité de la tallysomycine Sî0b envers le rein n'est pas supérieure à celle de la bléomycine, à des doses équitoxiques. La tally- somycine Sl0b produit un accroissement du taux d'hydroxy- proline pulmonaire, qui est l'indice d'une toxicité pulmonaire. Toutefois, la pente de réponse à la dose a été plus plate que celle que l'on observe avec la bléomycine, et la teneur en hydroxyproline aux doses fortes a été réduite comparativement à celle d'animaux traités avec la bléomycine, à des doses équitoxiques. Comme l'indiquent les résultats donnés- ci- dessus, les dérivés de tallysomycine de la présente invention sont utiles comme agents antimicrobiens pour inhiber le développement d'organismes microbiens, tant bactériens que fongiques, qui sont pathogènes envers les animaux et les plantes. Ils sont également utiles pour inhiber le développe- ment de tumeurs chez les mammifères. Les composés peuvent être administrés de la même manière que la bléomycine du commerce, et les doses optimales pour un ensemble donné de conditions peuvent être déterminées par l'homme de l'art par des tests classiques de détermination de la dose et d'après les résultats donnés ci-dessus. La présente invention couvre également des compositions pharmaceutiques qui renferment une quantité antimicrobienne ou antitumorale efficace d'un dérivé de tallysomycine de la présente invention, ou d'un sel d'addition d'acide acceptable du point de vue pharmaceutique de ce dérivé, en association avec un véhicule ou diluant inerte acceptable du point de vue pharmaceutique. Conformément à un autre de ses aspects, l'inven- tion a trait au traitement thérapeutique d'un animal (de préférence un mammifère) atteint d'une infection microbienne ou d'une tumeur maligne, par administration à l'animal en question d'une dose antimicrobienne ou antitumorale efficace d'un dérivé de tallysomycine de la présente invention ou d'un sel d'addition d'acide acceptable du point de vue pharmaceu- tique de ce dérivé. L'invention est illustrée par les exemples suivants, donnés à titre non limitatif. EXEMPLE 1 - S2a et S2b Un milieu gélosé incliné, à l'extrait de malt est inoculé avec Streptoalloteichus hindustanus ATCC 31 158 et soumis à l'incubation pendant une semaine à 28 C. Le milieu incliné est utilisé pour inoculer 100 ml de milieu de germi- nation ayant la composition suivante, dans une fiole d'Erlenmeyer de 500 ml: glucose 1,5 % extrait de levure 0,2 polypeptone 0,5 K2HPO4 0,05 MgSO4.7H20 0,05 CaCO3 0,5 On ajuste le pH à 7,2 avant la stérilisation en autoclave. On fait incuber les fioles ensemencées à 33 C pendant 48 heures sur une secoueuse rotative fonctionnant à 230 tr/min. La culture d'ensemencement obtenue ci-dessus est transférée dans 100 ml de milieu fermentescible contenu dans une fiole d'Erlenmeyer de 500 ml, à un taux d'inoculum de % (volume/volume). Le milieu fermentescible contient les ingrédients suivants: saccharose 2,5 % glucose 0,5 "PHARMAMEDIA" (farine de graine de cotonnier) 3,0 Extraits solubles de distillerie 3,0 (NH4)2SO4 0,3 ZnSO4.7H20 0,003 CuSO4.5H20 0,01 CaCO3 0,4 Une solution aqueuse neutralisée de chlorure de 3-aminopropyldiméthylsulfonium est ajoutée au milieu fermen- tescible avant la stérilisation, à une concentration de 0,1 % (poids/volume) exprimée en chlorhydrate. Le pH du milieu est ajusté à 7,0 avant la stérilisation. On fait incuber à 28 C les fioles renfermant le milieu fermentescible inoculé pendant 5 jours sur une secoueuse rotative fonctionnant à 250 tr/min. On surveille la progression de la fermentation par l'épreuve de diffusion en gélose utilisant des disques de papier, l'organisme d'essai étant la souche M6-3 de M. smegmatis. Le bouillon de fermentation contenant les tally- somycines S2a et S2b est agité en présence d'un auxiliaire de filtration et le filtrat (20 litres) est agité en présence de "AMBERLITE IRC-50" (60 % de forme NH4+, 3,5 1). On lave la résine avec de l'eau puis on élue la fraction active avec trois fois 4 litres de HCl 0,2 N. On ajuste le pH de l'éluat actif à 6,0 et on agite avec 400 g de charbon activé. Les composants doués d'activité biologique adsorbés sur le carbone activé sont élués par agitation trois fois avec un mélange de n-butanol et d'eau, le pH étant maintenu à 2,0 au cours de l'élution. Les éluats aqueux rassemblés sont neutra- lisés et concentrés sous vide à un volume d'environ 100 ml et le concentré est chromatographié sur une colonne de 1,2 1 de "DIAION HP-20". On développe la colonne avec de l'eau et on recueille des fractions de tallysomycine de couleur bleue. Par évaporation des fractions correspondantes, on obtient un mélange brut de tallysomycines (4,85 g) que l'on chromato- graphie sur une colonne de 330 ml de "CM-SEPHADEX C-25" développée avec une solution de formiate d'ammonium à concen- tration croissante. Les tallysomycines S2b, S2a et B sont éluées successivement avec du formiate d'ammonium à 2 % et la tallysomycine A est éluée avec du formiate d'ammonium à 4 %. Chaque fraction antibiotique est relarguée par adsorption sur du charbon activé suivie d'une élution avec une solution aqueuse acide de n-butanol. Par lyophilisation de l'éluat aqueux, on obtient 156 mg de tallysomycine S2a et 570 mg de tallysomycine S2b en même temps que 210 mg de tallysomycine A et 540 mg de tallysomycine B, chacune étant sous la forme chélatée avec le cuivre. EXEMPLE 2 - S6a et S6b On répète le processus de fermentation de l'exemple 1 à la différence qu'on utilise le chlorhydrate de N-(bêtahydroxyéthyl)-1,3-diaminopropane comme précurseur aminé. Le bouillon récolté (11 1) est filtré avec un auxiliaire de filtration. L'activité antibiotique contenue dans le filtrat est adsorbée sur de la résine "AMBERLITE IRC- " (60 % de forme NH4+, 2,4 1) et éluée de la résine avec de l'acide chlorhydrique décinormal. On ajuste le pH de l'éluat à 6,5 puis on fait passer l'éluat sur une colonne de 2 litres de "DIAION HP-20". On élue la colonne avec de l'eau. On concentre sous vide toutes les fractions contenant des tally- somycines et on les lyophilise pour obtenir 824 mg d'une substance solide bleue. On sépare les tallysomycines par chromatographie sur "CM-SEPHADEX C-25" (200 ml) en utilisant comme éluant une solution aqueuse de formiate d'ammonium. On élue la tallysomycine S6b avec du formiate d'ammonium à 2 %, les tallysomycines S6a et B avec du formiate d'ammonium à 3 % et finalement la tallysomycine A avec une solution de formiate d'ammonium à 5 %. On traite chaque fraction avec du charbon activé en vue du relargage. Les rendements en tally- somycines chélatées au cuivre sont les suivants: A 61 mg, B 31 mg, S6a 201 mg et S6b 288 mg. EXEMPLE 3 - S8 et S8b On répète le processus de fermentation de l'exemple 1 à la différence qu'on utilise du chlorhydrate de N,N-di(bêta-hydroxyéthyl)-1,3-diaminopropane comme précur- seur aminé à une concentration de 0,2 % en poids/volume. Le bouillon récolté (10 litres) est filtré. Les composants de la tallysomycine dans le filtrat de culture sont adsorbés sur de la résine "AMBERLITE IRC-50" (60 % de forme NH4, 2,2 1) et élués avec une solution diluée d'acide chlorhydrique. L'éluat actif est neutralisé et chargé sur une colonne de 2 litres de "DIAION HP-20" que l'on développe avec de l'eau. Les fractions renfermant l'activité biologique sont concentrées sous vide en donnant 1,16 g de tallysomycines brutes. La substance solide est chromatographiée sur une colonne de 300 ml de "CM-SEPHADEX C-25". La tallysomycine S8b est la première à être éluée de la colonne avec du formiate d'ammonium à 2 %, les tallysomycines S8a et B sont éluées avec du formiate d'ammonium à 3 % puis la tallysomycine A est éluée avec une solution à 5 % de formiate d'ammonium. Les fractions correspondantes sont relarguées par adsorption sur du carbone. Les rendements en tallysomycines chélatées au cuivre sont les suivants: A 184 mg, B 171 mg, S8a 63 mg et Ssb 248 mg. EXEMPLE 4 - Sl0a et SlOb Le processus de fermentation de l'exemple 1 est répété à la différence que du dichlorhydrate de 1,4-diamino- butane est utilisé comme précurseur aminé. Le bouillon de fermentation (35 litres, pH 7,5) est centrifugé en vue de séparer le gâteau mycélien. La liqueur surnageante claire ainsi obtenue est agitée avec la résine "AMBERLITE IRC-50" (60 % de forme NH4+, 6 litres) pendant 30 minutes. On lave la résine avec deux portions de 30 litres d'eau puis on l'élue avec 3 portions de 10 litres d'eau acide, en maintenant le pH au-dessous de 2, 0 au cours de l'élution. On rassemble les éluats, on ajuste leur pH à 7,8 et on les agite avec 800 g de charbon activé. On élue la fraction active avec un mélange à 1:1 de n-butanol et d'eau acide (5 litres de chaque, pH 2,0) et on répète trois fois l'élution. On réunit les phases aqueuses, on les neutralise avec de la résine "AMBERLITE IR- 45" (forme OH) (résine basique d'échange anionique de la firme Rohm & Haas Co., Etats-Unis d'Amérique) et on les concentre sous vide à un volume de 300 ml. On charge le concentré sur une colonne de 3 litres de "DIAION HP-20" que l'on développe avec de l'eau. On surveille l'élution par un titrage biologique et on concentre les fractions renfermant l'activité biologique pour obtenir un mélange de tally- somycines sous la forme d'une substance solide bleue (6 g). On chromatographie la substance solide sur une colonne. de 300 ml de "CMSEPHADEX C-25" qu'on lave préalablement avec une solution à 1 % de formiate d'ammonium. La colonne est développée avec des concentrations croissantes (1 % ' 3 %) de solution aqueuse de formiate d'ammonium. Les premières fractions douées d'activité biologique éluées avec du formiate d'ammonium à 3 % sont réunies (250 ml) et agitées avec 30 g de charbon activé. Le carbone est séparé, lavé à l'eau et élué deux fois avec un mélange à 1:1 de n-butanol et d'eau acide (120 ml de chaque). Les éluats aqueux sont neutralisés avec la résine "AMBERLITE IR-45" (forme OH) puis évaporés en donnant une préparation semi-pure de tally- somycine S10b (1,60 g). L'échantillon est chromatographié de nouveau sur une colonne de 240 ml de "AMBERLITE XT-2" (résine adsorbante macroporeuse formée d'un copolymère non ionique styrène-divinylbenzène, en fines particules, de la firme Rohm & Haas Co. des Etats-Unis d'Amérique) qu'on développe avec de l'eau. Les éluats renfermant l'activité biologique sont rassemblés, concentrés et lyophilisés en donnant 1,25 g de tallysomycine S10b pure chélatée avec le cuivre. Les tally- somycines S10a et B sont éluées avec succès de la colonne de "CMSEPHADEX" avec une solution à 3 % de formiate d'ammonium, ce qui donne 360 mg de tallysomycine S10a chélatée au cuivre et 370 mg de tallysomycine B. On obtient également des traces de tallysomycine A à partir de l'éluat de formiate d'ammonium à 5 %. EXEMPLE 5 En suivant essentiellement le même mode opéra- toire que dans les exemples 1 à 4, on prépare les dérivés semibiosynthétiques de tallysomycine suivants, par fermenta- tion alimentés par une amine. Dérivé de Tallysomycine Précurseur de chlorhydrate Volume de obtenu comme d'amine bouillon produit ferc!t scble Sa1,3-diainopropane 67 res Sl 1,3diaminopropane 6)7 I. Rendement (mg) traces 1,2-diaminoethane 1,3-diamino2-hydroxypropane N,-(-hydroxypropyl)-1,2-diamino- ethane N,N-dimethyl-1,3-diaminopropane N-(e-hydroxyethyl)-1,2-diamino- éthane N-methyl-1,3-diaminopropane II N.(3-aminopropyl)morpholine N-(3aminopropyl)-2-pipeécoline N-(1'-pnenylethyl)-1,3-diamino propane I! 1,9 8/5 3t2 Il 2,2 EXEMPLE 6 Les tallysomycines dépourvues de cuivre correspondant aux dérivés chélatés au cuivre préparés dans les exemples 1 à 5 peuvent être obtenues par traitement à l'hydrogène sulfuré dans le méthanol conformément au mode opératoire décrit dans l'exemple 1 du brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 646 197. Slb S3b S4b S5b S7b S9b Slla Sllb S12b S13b S14a S14b il Les propriétés physico-chimiques des dérivés de tallysomycine préparés dans les exemples 1 à 5 sont indiquées sur le tableau suivant. Propriétés physico-chimiques des nouveaux dérivés de Tallvsomycine Tal lysomycine Sla Slb S2a S2b S3b S4b S5b S6a S6b S7b S8a S8b S9b SlOa S10b Slla Sllb Sl2b S13b S14a S14b CCM (Rf) S-102 S-123 0, 50 Or 23 0, 65 0, 37 o 24 0,15 0,38 0,34 0 59 0o 51 o0, 66 0o. 40 0 50 0, 58 0/ 42 0122 0o, 40 0i,44 0,25 0, 56 o, 4o0 0,70 0, 54 o0,56 os 48 0,143 0o24 0 61 0o 39 0,27 0,16 0o 49 0,35 0,o49 o,60 0,o 46 o.0 36 0; 52 0o 37 0o/ 62 0, 50 CLHPxx (Temos de rétention) 6 min 24 s 4 min 48 s 6 min 30 s min 18 s 4 min 49 s 4 min 47 s 4 min 54 s 6 min 18 s 4 min 42 s 4 min 54 s 6 min 24 s 4 min 48 s 4 min 52 s 6 min 20 s 4 min 47 s 4 min 4 min min 47 s 47 s 37 s 7 min C5 s ProDriétés physico-chimiques de nouveaux dérivés de Tallysomycine Tal lysomycine Sla Slb S2a S2b S3b S4b sS hb S6a S6b S7b S8a S8b S9b SQa slob Slla sli a S12b S13b S14a S14b H20 1% Xmaxnm (E lcm) 242(126), 292(102) 242(108), 290(94) 39,54 240(120), 290(108) 244.5(129),292(104) 38,51 240(123), 291(112) 242(120), 290(103) 244(124), 290(102) 40,17 243(105), 291(83) 39,73 243(128), 291(103) 39/81 245(120), 290(96) 40,89 243(107), 291(85) 243(114), 290(92) 40,73 243(104), 290(87) 39,80 244(142), 292(112) 39,76 24L(1141), 292(116) 38/81 244(62), 292(53) 244(112), 292(91) 40,16 245(74), 292(59) 34,98 243(142), 292(114) 39,14 243(102), 292(72) 243(143), 292(109) Analyse, trouvé C % H% N% ,45 15,01 /51 14,30 6,05 6,39 6,00 6,0o4 6,18 ,97 51,94 ,/85 ,148 ,09 ,85 ,02 ,35 ,21 14; 51 14,79 ,142 ,58 14;74 , 04 13,04 13,63 Le système S-102 de chromatographie sur couche mince (TLC) utilise une plaque de gel de silice "60F254" (Merck) et un système de solvants comprenant du méthanol et de l'acétate d'ammonium en solution aqueuse à 10 % (1:1 volume/volume); le système S123 de chromatographie sur couche mince utilise une plaque de gel de silice "60F254" (Merck) et un système de solvants formé de méthanol, d'acétate d'ammonium à % et d'hydroxyde d'ammonium à 10 % (10:9:1 volume/volume). La détection est effectuée au moyen d'un analyseur de chromatographie sur couche mince à double longueur d'onde (Shimadzu GS-910) à 290 nm. ++ Appareil: Waters Associates Model ALC 204 à injecteur type U6K Colonne: "pBondapak C18"' Waters Associates (4 x 300 mm), préalablement lavé avec une solution de EDTA à 0,5 % Phase mobile: CH3CN:H20 (3:7 volume/volume) conte- nant le réactif "PIC B-7" de Waters Associates Détecteur: Détecteur UV modèle 440 à 254 nm Débits: 1,0 ml/min (pression 80 MPa) Volume de l'échantillon injecté: 1 pl de solution à 2 mg/ml. L'invention est susceptible d'une application industrielle. REVENDICATIONS 1. Un dérivé de tallysomycine A de formule: o (CH2)3-CH-CH2-C-R NH2 dans laquelle R représente: -NH-(CH2)3-NH2 -NH-(CH2)3-S (CH3)2 -NH-(CH2)3-NH-CH2-CH20H -NH-(CH2)3-N(CH2CH20H)2 -NH-(CH2)4-NH2 -NH-(CH2)3-NH-CH3 O H-(CH)2)3-NI CH3 ou un sel d'addition d'acide acceptable du point de vue phar- maceutique de ce dérivé. 2. Un dérivé de tallysomycine B de formule: CM-NH2 H2N CO-NH2 NH2 0 1 5 " N.,-.., N1 N H2N y HO C CH-CH JS -R OH | eH2N OH H HO O;NH2 dans laquelle R représente: -NH- (CH2)3-NH2 -NH-(CH2)3S'e(CH3)2 -NH-(CH2)2-NH2 -NH-CH2-CH-CH2-NH2 OH -NH-(CH2)2-NH-CH2-CH-CH3 OH -NH- (CH2)3-NH-CH2-CH20H -NH-(CH2)3-N(CH3)2 -NH-(CH2)3-N(CH2CH2OH)2 -H- (CH2)2-NH-CH2-CH20H -NH- (CH2)4-NH2 -NH-(CH2)3-NH-CH3 -NH-(CH2)3-N 0O -NH- CH) 3-N CH3 ou -NH- (CH2)3-NH-CH. & 3 ou un sel d'addition d'acide acceptable du point de vue phar- maceutique de ce dérivé. 3. Procédé de production d'un dérivé de tally- somycine suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver une souche productrice de tallysomycine de Streptoalloteichus hindustanus dans un milieu nutritif aqueux en présence d'un précurseur aminé de formule: NH2- (CH2)2-NH2, NH2-(CH2)3-NH2' NH2-(CH2)4-NH2, NH2-CH2-CH-CH2-NH2, OH NH2-(CH2)2-NH-CH2-CH20H, NH2-(CH2)2-NH-CH2-CH-CH3, OH NH2-(CH2)3-NH-CH3, NH2-(cH2)3-NH-CH2- CH20H' NH2-(CH2)3-NH-CH, CH3 NH2-(CH2)3-N(CH3)2, NH2-(CH2)3-N(CH2CH20H)2, NH2-(CH2)3-N, HZ' (C Z)3'NS CH3 ou NH2-(CH2)3-Se(CH3)2, Cie ou un sel d'addition d'acide inorganique de ce composé, jusqu'à ce qu'une quantité notable du dérivé désiré de tally- somycine ait été produit par ledit organisme dans ledit milieu de culture et à recueillir le dérivé désiré de tally- somycine du milieu de culture sous une forme sensiblement dépourvue de substances produites simultanément. 4. Procédé suivant la revendication 3, caracté- risé en ce que la souche productrice de tallysomycine est la souche ATCC 31 158 de Streptoalloteichus hindustanus ou un mutant de cette souche. 5. Procédé suivant l'une des revendications 3 et 4, caractérisé en ce que le précurseur aminé est le 1,4- diaminobutane ou un sel d'addition d'acide inorganique de ce composé et le dérivé recueilli de tallysomycine est la tally- somycine Sl0b de formule: C-NH-(CH2)4-NH2 HO 6. Médicament, caractérisé en ce qu'il est constitué par ou en ce qu'il contient un dérivé de tally- somycine suivant les revendications 1 et 2. / !1 ! !