Brevet FR2471409A1 — publié le 19810619

Cette invention concerne des procédes de préparation du glucoside de l'acide mycophénolique qui est utilisable dans le traitement du psoriasis et de la goutte. Il inhibe également la croissance des cellules tumorales transplantées chez les souris et les rats. L'acide mycophénolique et le glucoside de l'acide mycophénolique ont les formules 1 et 2 respectivement: R 1 0 3 J tiKH-tcl-il-Ii\g/ Yt 1 I;-CO " 1 IH3 1 R = HIl (acide mycophénolique); 2 R = I-D-glucopyranosyle (glucoside de l'acide mycophénolique). Le nom chimique du glucoside de l'acide mycophénolique est acide 6-[4-(!%-D-cglucopyranosyl.)-6- méthoxy-7-méthy].-3-oxo-5-phtalanyll-4-méthly]-4-hlexénoique. le procédé de préparation du glucoside de l'acide phénolique qui est décrit dans le brevet des E.U.A. N 3.903.07] est assez complexe et nécessite plusieurs étapes et n'est donc pas pratique à l'échelle de la fabrication. Selon la présente invention, il est fourni un procédé de préparation du glucoside de l'acide mycoph6nolique, qui consiste à mettre l'acide mycophénolique en contact avec du glucose en présence d'une enzyme de glucosylation dans un milieu aqueux jusqu'à production d'une quantité substantielle du glucoside de l'acide mycophénolique. Comme exemple d'une enzyme de glucosylation appropriée utilisable dans le procédé de l'invention, on peut mentionner l'enzyme produite par Streptomyces candidus NRRL 5449 et celle produite par Streptomyces aureofaciens NRRL 2209. IDans la mise en oeuvre du procédé dc le l'invention, on peut utiliser comme substance de départ dle l'acide mycophénolique purifié ou de l'acide mycoph6nolique partiellement purifié. Comme indiqué précédemment, l'enzyme préférée qui effectue la glucosylation de l'acide mycophénolique est obtenue par une souche de S. aureofaciens NRRL 2209 ou S. candidus NRRL 5449. Les cultures portant un numéro NRRL sont disponibles à la collection de culturoe permanentesdu Northern Regional. Research Center, United States Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, sous les numéros d'accès NRRL indiqués. Le milieu de culture utilisé pour cultiver S. aureofaciens NRRL 2209 ou S. candidus NRR], 5449 peut être l'un quelconque d'un certain nombre de milieux. I' une source préférée d'azote est la farine de soja. Quand la transformation doit avoir lieu dans le milieu de fermentation au moment o l'on cultive S. aureofaciens NRRL 2209 ou S. candidus NRRL 5449, le milieu doit contenir une source de glucose pour permettre une transformation effective. Quand on cultive le micro-organisme en vue de la production de son enzyme pour une utilisation ultérieure pour transformer l'acide mycophénolique en glucoside de l'acide mycophénolique, la présence de glucose pendant la fermentation est facultative. Des oligo-éléments essentiels nécessaires à la croissance et au développement de l'organisme peuvent se trouver en tant qu'impuretés dans les autres constituants du milieu, en quantités suffisantes pour satisfaire la croissance et les besoins biosynthétiques de l'organisme. Il peut cependant être intéressant d'incorporer dans les milieux de culture d'autres sels minéraux nutritifs solubles pouvant fournir des ions fer, sodium, potassium, magnésium, ammonium, calcium, phosphate, chlorure, carbonate, sulfate, nitrate, etc. Le pli initial du milieu de culture peut varier. Avant l'inoculation avec l'organisme, il est cependant indiqué d'ajuster le pH du milieu de culture entre 5,7 et 7,5 selon le milieu particulier utilisé. Comme c'est le cas avec d'autres Actinomycetes, le milieu devient progressivement plus alcalin au cours de la fermentation et peut monter à partir d'un pli initial de 5,9 à 6,9 ou plus pendant la période de croissance de l'organisme. Le pH final est influencé par le pli initial du milieu, le substrat et les tampons présents dans le milieu, et la durée pendant laquelle on laisse l'organisme se développer., Bien que le pll puisse être ajusté par addition d'un acide ou d'une base, on a obtenu de bons résultats sans ajustement du plI. Ainsi que les autres espèces Strepton]yces, les micro-organismes nécessitent des conditions de croissance aérobie. Une propagation sur un. petit volume est commodément effectuée sur des cultures inclinées ou des plaques de gélose, dans des flacons agités ou dans des bouteilles. Po'ur une production à plus grande échelle, on préfère une culture aérobie en immersion dans de grands réservoirs. Le milieu de fermentation contenu dans un réservoir stérile peut être inoculé avec une suspension sporulée pour amorcer la fermentation. Comme l'inoculation avec une suspension sporulée implique un temps de latence avant le développement, il est préférable d'utiliser cependant un inoculum végétatif. L'inoculum végétatif peut être préparé en inoculant un petit volume du milieu de culture avec la forme spore ou des fragments mycé1iens de l'organisme pour obtenir une culture fraîche en Croissance active de l'organisme. L'inoculum végétatif est alors transféré dans un réservoir plus grand. Le milieu utilisé pour la culture de l'inoculum végétafif peut être le même que celui utilisé pour la production à grande échelle, mais on peut également utiliser d'autres milieux. L'organisme S. aureofaciens NRRL 2209 se développera sur un intervalle de température dle 20OC à 37 C. La croi.ssancte maxim ale et lIa sploruilation s;e p l-odilisetnt cependant entre 28 C et 32 C. L'organisme S. candidus NRRL 5449 se développera sur un intervalle de température de 26 C à 40 C, la croissance maximale et la sporulation se produisant entre 32 C et 37 C. Comme il est habituel dans les procédés de culture en immersion aérobie, de l'air stérile est insuff]lé dans le milieu de culture pendant la fermentation. Pour une croissance effective de l'organisme et une production effective du glucoside de l'acide mycophéno]lique, le volume d'air utilisé dans la production en réservoir de la substance doit être supérieur à 0,1 volume d'air par volume de milieu de culture par minute (V/V/M). On obtient des rendements optimaux quand le volume d'air utilisé est au moins 0,33 à 0,5 volume d'air par volume de milieu de culture par minute. La durée de la fermentation nécessaire pour effectuer la transformation varie. La présence d'une quantité suffisante de glucose est essentielle. En général, quand le glucose est présent en quantité suffisante et que l'acide mycophénolique est présent à raison de 0,1 à]1,0 g par litre de milieu, la transformation de l'acide mycophéno]ique en son glucoside est essentiellement terminée en 72 à 120 heures. Une transformation optimale se produit quand l'acide mycophénolique est présent entre 0,2 et 0,75 g par litre de milieu. Une quantité suffisante de glucose est supérieure à 1 % en poids du milieu. Une quantité préférée de glucose est de 2 à 5 % en poids par rapport au milieu. Un papier d'essai sensible au glucose peut être utilisé pour vérifier les niveaux de concentration. Quand la teneur en glucose descend en-dessous d'environ 2 %, il faut ajouter du glucose pour maintenir la concentration aux niveaux optimaux. Encore un autre procédé de mise en oeuvre de la transformation consiste à immobiliser l'enzyme par des procédés connus dans le domaine. Voir par exemple "Biomedical Applications of Immobilized Enzymes and Proteins", Thomas Ming Swi Chang, Ed., Plenum Press, New York,]977; Vol. 1. L'enzyme immolbil is6e peut être tLii lisée dans tune colonne (ou tout auil-re typre dte r(acteu-ilt alpprnrié) pouil e Itlt-lUer a 2471 409 réaction de glucosylation. En outre, le micro-organisme peut lui-même être immobilisé et utilisé pour catalyser la réaction de glucosylation. Le cours de la transformation peut être suivi par chromatographie sur couche mince (CCM) en utilisant une lumière UV pour la détection. Par chromatographice sur couche mince de gel de silice dans le mélange 9:1 d'acétonitrile et d'eau, le Rf de l'acide mycophénolique est d'environ 0,62 tandis que le Rf du glucoside de l'acide mycophénolique est d'environ 0,45. Le (jlucoside de l'acide mycophénolique est présent tant dans le bouillon de culture que dans le mycd].ium. En conséquence, les techniques utilisées pour la séparation du glucoside de l'acide mycophénolique doivent être conçues pour permettre une récupération maximale du produit à partir de l'une ou l'autre source ou des deux. Ainsi, par exemple, on filtre le milieu de fermentation, on abaisse le pl1 du filtrat à une valeur acide et on extrait le filtrat acidifié avec un solvant approprié, comme le chloroforme, pour enlever tout l'acide mycophénolique n'ayant pas réagi. En outre, le gâteau mycé6lien est extrait avec un solvant approprié comme le méthanol; le solvant organique est chassé et la solution aqueuse restante est ajoutée au bouillon filtré pour les étapes de séparation. Le produit est recueilli à partir de la solution par des procédés connus dans le domaine. Un procédé de récupération préféré comprend l'adsorption sur une résine polymère et l'élution avec un système solvant approprié, comme un système méthanol-eau. EXEMPLE 1 Préparation du glucoside de l'acide mycophénolicue en utilisant l'enzyme de S. aureofaciens A. Fermentation de S. aureofaciens On met une pastille lyophilisée de Streptomyces aureofaciens NRRL 2209 en suspension dans de l'eau et on l'utilise pour inoculer une culture ur -lô q()l; il c]'in, e ayant I,.1namps; i Lion suivante: Ingrédient Quantité Dextrine 10 ( llydrolysat enzymatique de caséine:: 2 q Extrait de boeuf I g Extrait de levure 1 g Solution minérale de Czapek:::: 2 ml Gélose 20 g l'au q.s. 1 litre pli ajusté à 7,3 avec NaOIl 5N :: N-Z-Amine A, Ilumko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J., U.S.A. ::: Solution minérale de Czapek KiC] 100 q MqSO4.71120 100 g 4 Eau désionisée 900 ml On dissout 2 g de FeSO4.7H20 dans 100 ml d'eau désionisée contenant 2 ml d'HlCl concentré. On ajoute cette solution à la solution KC1/MgSO4.71T20 précédente pour terminer la préparation de la solution minérale de Czapek. On fait incuber les cultures inoculées à 30 C pendant 10 jours puis on les conserve à 4 C pendant pas plus de 30 jours. On transfère à l'aide d'une anse un inoculum à partir d'une culture inclinée, dans 50 ml de milieu végétatif dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml. Le milieu végétatif a la composition suivante: Ingrédient Quantité Glucose 15 g Farine de soja]5 g Liqueur de macération de mais 10 g Dextrine de tapioca:: 20 g CaCO 4 g CC3 Solution minérale de Czapek 2 ml Eau désionisée q.s. 1 litre pll ajusté à 7,0 avec NaOII 5N :: Stadex 11, AoE. Staley Co., Decatur, Illinois, U.S.A. On fait incuber le flacon inoculé à 3(0 C sur un agitateur rotatif fonctionnant à 250 tours par minute. Après 48 heures d'incubation, on transfère 5 ml de la culture dans 100 ml d'un milieu végétatif de second stade (ayant la même composition que le milieu végétatif) dans un flacon Irletnmeyer de 500 ml. On fait incuber cette culture pendant 418 heures à 30 C sur un agitateur roLatif fonctionnant à 250 tours par minute. B. Préparation du glucoside de l'acide mycophénolique On dissout 50 mg d'acide mycophénolique dans 8 ml d'eau. On atjuste le plH à 7,0 et on ajoute de l'eau jusqu'à un volume de 10 ml. On ajoute la solution au flacon obtenu dans la partie A ci-dessus, flacon qui contient l'enzyme de S. aureofaciens, ainsi que 4 ml d'une solution aqueuse contenant 250 mg/ml de glucose. Puis on fait incuber le flacon pendant 72 heures supplémentaires. Pour suivre le cours de la transformation, on extrait périodiquement avec de l'acétate d'éthyle des parties aliquotes du bouillon de fermentation. On examine les extraits par CCM sur gel de silice, en utilisant un système solvant 9:1 d'acétonitrile et d'eau et une lumière UV pour la détection. Quand la CCM indique que pratiquement tout l'acide mycophénolicque a été transformé en glucoside, on récolte le produit de fermentation. Des expériences ultérieures ont montré que de l'acide mycophénolique supplémentaire et du glucose pouvaient être ajoutés et que l'on pouvait poursuivre l'incubation pendant 24-48 heures supplémentaires pour obtenir de plus grandes quantités du produit. C. Isolement et purification du produit On réunit un groupe de 59 flacons contenant le glucoside de l'acide mycophénolique, obtenu comme décrit dans le paragraphe B. On ajuste le pH du bouillon d'environ 7,6 à 4,0 avec IlCl. On ajoute au bouillon combiné un adjuvant de fil]tration (l{yflo Super-cel, terr:e de Àdia Ltomée',,{olhn:;-Munviil( Pr-oducts; Cor-p.),.t on l:pare par- filtration le mélange résultant. On extrait avec du méthanol la masse mycélienne (contenant l'adjuvant de filtration). On concentre sous vide pour chasser le méthanol l'extrait méthanolique obtenu par filtration. On ajoute la solution aqueuse résultante au filtrat du bouillon. On ajuste le pHli de cette solution à 4,0 avec HCl. Puis on extrait la solution avec un volume égal de chloroforme (pour enlever tout acide mycophénolique restant). On concentre sous vide la solution aqueuse restante jusqu'à un litre puis on la chromatographie sur une colonne de 75 cm x 40 mm de diamètre extérieur garnie de 700 ml de résine adsorbante polymère (XAD-2, Rohmin and Hlaas Co., Philadelphie, Pennsylvanie, U.S.A.). On lave la colonne avec 4 1 d'eau désionisée puis on l'élue avec un gradient méthanol/eau. On contrôle la progression sur la colonne par CCM comme décrit dans le paragraphe B. Le gradient consiste en 4 litres d'un mélange 1:7 de méthanol et d'eau, puis 8 1 d'un mélange 1:3 de méthanol et d'eau et enfin 8 1 d'un mélange l:1 de méthanol et d'eau. Le glucoside est élué avec ce dernier mélange. On réunit les fractions contenant le glucoside de l'acide mycophénolique et on les concentre sous vide pour obtenir 2,0 g de produit partiellement purifié. On effectue la purification finale du glucoside de l'acide mycophénolique par chromatographie liquide sous pression élevée en utilisant du gel de silice C18 à phase inversée (préparé comme décrit dans l'Exemple 5). On chromatographie une partie du produit obtenu à partir de la colonne XAD-2 (200 mg) sur une colonne de gel de silice - C18 de 28 cm et 20 mm de diamètre extérieur, garnie comme décrit dans l'Exemple 6. On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,9 bars et un débit de 7 ml/mn. On élue la colonne avec un mélange 65:35 d'eau et de méthanol et on contrôle l'effluent de la colonne par absorption UV à 250 nm. On recueille des fractions ayant un volume de 20 ml; le glucoside de] 'acide mycophénolique est présent clans les fractions 22-33. On réunit les fractions contenant le glucoside et on les concentre sous vide, et] 'on obtient 11] mq (du dI1i cn:);i ld ci'acihde mycolplhnoliiqu Iui ri. i. Lcs analyses physico-chimiques du produit montrent qu'il est identique à l'acide 6-[4-(l?-D-glucopyranosyl)-6-méthoxy-7- méthyl-3-oxo-5-phtalanyl]-4-méthlyl-4-hexédnoîque préparé de façon chimique comme décrit dans le brevet des E.U.A. N 3.903.071. EXEMPLE 2 On prépare le glucoside de l'acide mycophénolique en utilisant le procédé décrit dans l'Exemple 1, mais on cultive S. aureofaciens dans un milieu de fermentation différent selon le paragraphe A suivant: A. Fermentation de S. aureofaciens On cultive S. aureofaciens NRRL 2209 sur une culture inclinée de gélose préparée à partir (Idu milieu de Bennett. On enlève la culture et on la met sous forme de suspension avec 10 ml d'eau désionisée stérile. On répartit cette suspension dans quatre flacons agités de 500 ml, contenant chacun 100 ml du milieu végétatif défini par la composition suivante: Ingcrédient Quantité (g/1) (NIl4) 2IPO4 10,0 K2111PO4 5,0 Na2SO4 0,5 MgSO4. 7H20 0,4 FeSO4. 7H20 0,02 MnSO4. 1H20 0,015 NaCl 0,02 il 03 0,0005 CuSO4 51{20 0,0004 Na2MoO4. 2H20 0,0002 ZnSO4.71120 0,008 CaCl 0,05 COC12.6H20 0,0002 Extrait de levure 1,0 Glucose: 10,0 Eau désionisée q.s. pour 1,0 litre :: Le glucose est stérilisé séparément et ajouté juste avant l'i.noti:li t ion avec S. aureofaciens 247-1409 On fait incuber les quatre flacons inoculés à 30 C sur un agitateur rotatif à 250 tours par minute pendant 48 heures. On utilise ce milieu végétatif (par portions de ml) pour inoculer des flacons agités (500 ml) contenant 100 ml d'un milieu de fermentation défini ayant la même composition que le milieu végétatif défini. On fait incuber le milieu inoculé pendant 48 heures. EXEMPLE 3 On prépare le glucoside de l'acide mnycophénolique par le procédé décrit dans l'Exemple 1 mais l'enzyme est celle produite par Streptomyces candidus NRRL 5449 par l'étape A suivante: A. Fermentation de S. candidus On cultive S. candidus NRRL 5449 sur une culture inclinée de gélose préparée à partir du milieu de Bennett pour obtenir une colonie bien définie. On enlève la colonie et on la met sous forme de suspension dans 10 ml d'eau désionisée stérile. On répartit cette suspension dans quatre flacons agités de 500 ml, contenant chacun 100 ml d'un milieu végétatif ayant la composition suivante: Ingrédient Quantité Matières solubles de distillation du mais:: 25,0 g Lactose 10,0 g Maltose 10,0 g FeSO4.7H120 0,01 g MgSO4.7H20 2,0 g KH2PO4 2,0 g CaCO3 2,0 g Eau désionisée q.s. pour 1,1 litre :: Nadrisol, National Distiller's Products Company On fait incuber les quatre flacons inoculés à 30 C sur un agitateur rotatif à 250 tours par minute pendant 24 heures. On utilise ce milieu végétatif (par portions de ml) pour inoculer des flacons agités de 500 ml contenant ml de milieu de fermentation stérilisé ayant la composition suivante:- 1]. Inqrédient Quantité Extrait de boeuf 5 ( Peptone, hydrolysat pancréatique de la caséine 5 g NaCl 5 g Glycérol 15 g CaCO3 2g Eau désionisée q.s. pour] litre pli 7,2, non ajusté On fait incuber le milieu inoculé pendant 72 heures comme décrit précédemment. EXEMPLE 4 Production du glucoside de l'acide mycophénolique par une enzyme de S. candidus en particules On cultive S. candidus NRRL 5449 comme décrit dans l'Exemple 3. On sépare les cellules du milieu de fermentation par filtration sous vide et on les répartit en parties aliquotes de 200 g que l'on conserve par congélation. On décongèle deux de ces parties à la température ambiante et on les met en suspension dans du tampon phosphate 0,05 M (pH 5,8) pour un volume final de 600 ml. On traite par ultra- sons cette suspension des cellules pendant 30 minutes, et on centrifuge le produit traité à 10.000 tours par minute pendant 30 minutes. Les débris de cellules résultants sont mis en suspension dans 100 ml de tampon phosphate; on dialyse cette suspension pendant 18 heures avec 5 1 du tampon phosphate refroidi. A 50 ml de l'enzyme dialysée en particules on ajoute du D-glucose et de l'acide mycophénolique dissous dans de l'éthanol. On agite le mélange résultant pendant 72 heures à 30 C puis on le filtre; on extrait le filtrat avec du chloroforme. On concentre cet extrait chloroformique sous vide puis on le purifie par chromatographie pour obtenir le glucoside de l'acide mycophénolique. EXEMPLE 5 Prépari.tionll ie la resine phasel i nver:e;(e 2471 409 1.2 On ajoute 1000 g de gel de silice LP-1 (de Quantum Corp., maintenant Whatman) à un.mlange de 1650 ml d'acide sulfurique concentré et de 1650 ml d'acide nitrique concentré dans un ballon à fond rond de 5 1 et on agite pour obtenir une suspension appropriée. On chauffe le mélange sur un bain de vapeur pendant une nuit (16 heures) avec un réfrigérant à refroidissement d'eau fixé sur le ballon. On refroidit le mélange dans un bain de glace et on le filtre soigneusement en utilisant un entonnoir en verre fritté. On lave]e gel de silice avec de l'eau désionisée jusqu'à pill neutre. Puis, on lave le gel de silice avec 4 1 d'acétone et on le sèche sous vide à 100 C pendant 2 jours. Etape 2: Première silylation Le gel de silice sec de l'Etape 1 est transféré dans un ballon à fond rond et mis en suspension dans 3,5 1 de toluene. On chauffe le ballon au bain de vapeur pendant 2 heures pour chasser toute l'eau résiduelle par distillation azéotrope. On ajoute 321 ml d'octadécyltrichlorosilane (Aldrich Chemical Company), et on chauffe le mélange réactionnel à reflux pendant une nuit (16 heures) avec une lente agitation mécanique à 60 C. On prend soin d'éviter que l'agitateur ne soit trop près de la partie' inférieure du ballon, pour éviter un broyage des particules de gel de silice. On laisse le mélange refroidir. On recueille le gel de silice silanisé, on le lave avec 3 1 de toluène et 3 1 d'acétone, puis on le sèche à l'air pendant une nuit (16-20 heures). On met le gel de silice séché en suspension dans 3,5 1 d'un mélange 1:1 d'acétonitrile et d'eau dans un ballon de 5 1, on agite soigneusement à la température ambiante pendant deux heures, on filtre, on lave avec 3 l d'acétone et on sèche à l'air pendant -une nuit. Etape 3: Deuxième silylation On répète le mode opératoire de la première -silyla- tion en utilisant 200 ml d'octadécyltri.chllorosi lane. On chauffe la suspension à reflux à 60 C pendant deux heures, tout en agitant soigneusement. On recueil]le le produit final par fi ltral ion, on lave avec 3 1 de tolunL f' (, I, de méthanol, puis on le sèche sous vide à 50 C pendant une nuit (16-20 heures) EXEMPLE 6 Mode opératoire de garnissage en suspension pour les colonnes MichelMiller Renseignements généraux A. On peut garnir par ce mode opératoire des colonnes analytiques ou préparatives. B. On recommande les garnissages par gel de silice et à phase inversée de gel de silice (par exemple, Quantum LP-1, granulométrie 10-20 microns, LiChoprep RP-8 et RP-18, granulométrie 25-40 microns). Cependant, d'autres gels de silice (par exemple, Shandons ODS llypersil, granulométrie microns) ainsi que d'autres types de résines ont été utilisés comme garnissage avec succès à l'aide de ce mode opératoire. C. En général, une pression inférieure à]4 bars et des débits compris entre 5 et 40 ml/minute sont nécessaires pour cette technique de garnissage en suspension; ceci dépend du volume et des dimensions de la colonne. Il est important de noter que: la pression de garnissage doit être supérieure à la pression utilisée pendant la séparation réelle de 2 à 3,5 bars; ceci assure qu'il ne se produit pas de tassement ultérieur de l'adsorbant pendant les séparations. Les colonnes garnies selon ce mode opératoire avec du gel de silice à phase inversée peuvent fonctionner pendant plusieurs années, sans perte'd'efficacité. D. Une diminution soudaine de la pression peut provoquer des craquelures ou des canaux dans le matériau de garnissage, ce qui réduirait de façon importante l'efficacité de la colonne. I] est donc important de laisser la pression descendre lentement jusqu'à zéro chaque fois que l'on arrête la pompe. E. Volume approximatif des colonnes (Colonnes en verre de Ace, Catéqorie No., non garnies): 5795-04, 12 ml; 5795-10, ml; 5795-16, 300 ml; 5795-24, 635 mil.; et 5796-34, 34 ml. F. Loe Lemls pIou(r nssarire pou r q(n.1i.rune cl(.oloiCi( (n verr pelut varier de quelques minutes à quelques heures, selon la dimension de la colonne et l'expérience de l'opérateur. Exemple: 1. Relier la colonne de verre à une colonne réservoir par un accouplement (le volume de la colonne réservoir doit être deux fois celui de la colonne). Placer les deux colonnes verticalement avec la colonne réservoir au-dessus. 2. Peser le matériau de garnissage (100 g pour 200 ml de colonne). 3. Ajouter 5 volumes de solvant au matériau de garnissage utiliser un mélange de 70-80 t de méthanol et de 20-30 % d'eau. 4. Bien agiter jusqu'à ce que toutes les particules soient mouillées, laisser reposer pendant une nuit ou plus longtemps pour assurer une imprégnation complète des particules par le solvant. Décanter la liqueur surnageante. 5. Délayer la résine avec suffisamment de solvant-pour remplir la colonne réservoir. Verser rapidement dans le réservoir. NB: la colonne doit être pré-remplie avec le même solvant et la colonne réservoir doit être partiellement remplie du solvant avant de verser la suspension. L'utilisation de volumes de suspension plus grands peut également donner de bons résultats; cependant, ceci nécessite (a) un réservoir plus grand ou (b) plusieurs remplissages du réservoir pendant l'opération de garnissage. 6. Fermer le réservoir avec le bouchon de Teflon en-dessous de la colonne (voir la Figure 1 du brevet des E.U.A. N0 4.131.547, bouchon N' 3); relier à la pompe; et commencer immédiatement le pompage du solvant dans les dispositifs au débit maximum si l'on utilise une pompe Ace Cat. No. 13625-25, ou un système de distribution de solvant similaire (20 ml/minute). 7. Continuer jusqu'à ce que la colonne soit complètement remplie de l'adsorbant. La pression ne doit pas dépasser la tolérance maximale de la colonne pendant cette opération (14 bars pour les colonnes importantes et 21 bars pour les colonnes ana lI y iquos). I)anis la plupyart, des ca;, de" prvssions 2471 409 inférieures à 14 bars seront suffisantes. 8. Si la pression dépassait les valeurs maximales, réduire le débit et la pression diminuera. 9. Après remplissage de la colonne par l'adsorbant, arrêter la pompe; laisser la pression tomber à zéro; débrancher le réservoir; remplacer le réservoir par une pré-colonne; remplir la pré-colonne de solvant et d'une petite quantité d'adsorbant, et pomper à la pression maximale jusqu'à ce que la colonne soit complètement garnie. Pour une information supplémentaire, voir le mode opératoire général.. N.B.: Toujours laisser la pression descendre lentement après arrêt de la pompe; ceci empêchera la formation de toutes craquelures ou canaux préférentiels dans le matériau de garnissage. 10. Supprimer la pression et débrancher soigneusement la pré-colonne. Avec une petite spatule, enlever quelques millimètres (2-4) de garnissage au sommet de la colonne placer I ou 2 filtres au sommet de la colonne; appuyer doucement jusqu'au sommet du matériau de garnissage, et placer un bouchon de Teflon au sommet de la colonne jusqu'à confirmation de l'étanchéité. Relier la colonne à la pompe, introduire la pression (généralement moins de 14 bars) et observer par la paroi de verre au sommet de la colonne si la résine se tasse davantage. Si le matériau de qarnissage doit continuer à se déposer (ceci peut être le cas avec les colonnes de dimensions importantes), un certain espace mort apparaîtra ou bien, il se formera des canaux préférentiels et l'étape 9 doit être répétée. 2471 409 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation du q1ucoside de l'acide mycophénolique, caractérisé en ce qu'on mnet 'acide mycophénolique en contact avec du glucose en présence d'une enzyme de glucosylation dans un milieu aqueux jusqu'à production d'une quantité substantielle du glucoside de l'acide mycophénolique. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme de glucosylation est produite par Streptomyces aureofaciens NRRL 2209. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme de glucosylation est produite par Streptomyces candidus NRRL 5449. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2 et 3, caractérisé en ce que l'enzyme de glucosylation est utilisée dans le milieu de culture dans lequel elle est produite. 5. Glucoside de l'acide mycophénolique quand il est préparé par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.