Brevet FR2466503A1 — publié le 19810410

L'invention concerne un procédé de culture de cellules animales sous forme de cultures en suspension et monocouches dans des récipients de fermentation. La multiplication de certaines cellules animales dans des récipients d'un volume supérieur à 3 litres était gênée jusqu'ici par le problème de l'alimentation en oxygène. Qu'il s'agisse de cellules en suspension dans la solution de culture du récipient de fermentation ou se développant sur les surfaces de celui-ci, la croissance stagne à partir d'un certain rapport A/V (A étant la surface de diffusion d'oxygène de la phase gazeuse à la phase dissoute et V le volume de fermentation). La multiplication en assez grande quantité de cellules d'insectes par exemple est l'une des conditions de la fabrica- tion en masse de virus des insectes, qui sont étudiés de plus en plus près depuis quelque temps. Précisément sur le groupe des baculovirus, qui appartiennent aux virus des insectes, divers groupes de travail ont, depuis quelques années, mis en route des projets de recherche, parce que ces virus peuvent être utilisés éventuellement comme insecticides biologiques ayant une action spécifique sur des espèces. La production des baculovirus dans des cultures de cellules offrirait la possibilité de fabriquer à tout moment, dans des conditions contrôlées et reproductibles, des préparations normalisées de virus destinées à la lutte contre les. parasites. La multi- plication de cellules d'insectes dans des cultures en suspen- sion, en tant que substrats pour la multiplication des virus sur une grande échelle est donc une condition importante de cette production. La multiplication de cellules d'insectes dans des cultures en suspension peut - comme dans le cas des cellules de vertébrés - s'effectuer dans des flacons dits "roulants" (roller), ou des flacons "tournants" (spinner) ou dans des récipients similaires. Le plus souvent, toutefois, la "production en masse " est limitée 1) par la grandeur des récipients qui doivent rester pratiquement maniables à la main et 2) par la pression partielle d'oxygène dans-le milieu nutritif, qui devient de plus en plus faible à mesure que le volume du milieu augmente. En général, l'air qui se trouve dans un récipient fermé, au-dessus du milieu nutritif, ne suffit que pendant un temps limité à renouveler dans le milieu nutritif l'oxygène consommé par les cellules qui se multiplient. Il se produit alors un appauvrissement du milieu naturel en oxygène et par conséquence une diminution de la multiplica- tion et un dépérissement ou mort croissant des cellules. C'est pourquoi pour de grands volumes de milieu nutritif, non seulement le brassage mécanique du milieu nutritif,mais encore l'injection d'air filtré et stérile sous forme de bulles finement divisées sont devenus une méthode nécessaire e-t favorable. On enrichit ainsi en oxygène le milieu nutritif. Ce procédé, courant dans la technique de fermentation, qui consiste à augmenter le taux ou la vitesse de diffusion d'oxygène en insufflant de l'air stérilisé dans la solution ou bouillon de culture, ne convient pas pour plusieurs raisons dans le cas considéré ici. Dans ce procédé, grâce à une ou plusieurs ouvertures ménagées dans le tube d'amenée d'air en dessous du niveau de liquide, on arrive à ce que l'air monte à la surface sous forme de bulles. Plus il se forme alors de bulles par litre d'air, plus l'interface entre les phases air/liquide est grande. La dimension des bulles et leur nombre ne peut être modifié qu'entre certaines limites. Si les ouvertures et par suite les bulles, sont trop grosses, ces dernières peuvent se réunir avant même d'atteindre la surface du liquide. Si les ouvertures ou orifices sont très petits, de manière à engendrer de nombreuses petites bulles, il y a risque de bouchage des ouvertures. En outre, l'obten- tion d'un grand nombre d'ouvertures très petites pose un problème technique. Il faut donc partir d'un nombre moyen et d'une grosseur moyenne des bulles et par suite, d'une interface non satis- faisante entre les phases. L'interface entre phases est amenée ensuite à la dimension voulue par le fait que l'on divise les bulles au moyen d'un agitateur et on les distribue sur le volume de la solution ou bouillon de culture dans le récipient de fermentation. Les forces de compression et de traction liées à ce travail (tension de glissement et efforts de cisaillement) endommagent souvent les cellules animales à un point tel qu' elles peuvent en mourir. En outre, les liquides de culture contiennent des quantités minimales de sérum de veau ou d'autres milieux nutritifs alumineux de sorte que l'injection d'air conduit à une formation inadmissible de mousse et qui peut perturber et entraver très fortement le déroulement des essais. En outre, il apparaît des forces de cisaillement sup- plémentaires lorsque les bulles de gaz crèvent à l'interface (entre bouillon de culture et poche de gaz). Ces forces aussi détériorent les cellules de sorte que le rapport entre cellules intactes, endommagées et mortes devient de plus en plus défa- vorable, même si leur nombre total peut encore augmenter. Dans le cas o il faut un plus grand apport d'air (oxygène), c'est-à-dire quand la quantité de bulles d'air augmente, le nombre de cellules endommagées et dépérissantes augmente également, ce qui,non seulement contrarie la multi- plication désirée des cellules/mais conduit en outre de plus en plus à l'accumulation de produits toxiques de décomposition des cellules. Ceuxci peuvent encore nuire davantage à la multiplication des cellules. En outre, des mesures dans des récipients tournants (spinner) de plusieurs litres ont montré qu'à partir d'une quantité de milieu nutritif d'environ 3 litres, la teneur en oxygène 02 du milieu ne peut plus, même par une plus grande injection d'air, être maintenue au niveau qui serait nécessaire à la prolifération normale des cellules. Si l'on agrandit artificiellement la surface sur laquelle les cellules animales de souches déterminées se développent préférentiellement, en remplissant par exemple le récipient de fermentation de billes de matière synthétique qui flottent ou se déposent alors, dans la solution ou bopillon de culture, ce il se produit lors de l'injection d'air et/l'agitation des difficultés encore plus grandes car les billes se heurtent aux pales de l'agitateur et/ou les unes entre les autres de sorte qu'il se produit des forces de cisaillement et une formation de mousse nuisibles. S'il est important de maintenir constants le Ph, la température de culture et la qualité du milieu nutritif (par addition du milieu frais) le facteur qui limite le volume des récipients de fermentation est cependant l'oxygène dissous dans le milieu. Il faut encore souligner que l'on doit certes effectuer aussi le brassage mécanique de façon normalisée au moyen d'un agitateur (environ 70 tours/mn) mais que l'appauvrissement en O des compartiments à milieu nutritif n'est pas supprimé par le brassage mécanique. L'invention a donc pour but d'assurer l'alimentation des cellules en oxygène sans devoir accepter les inconvénients graves de l'injection d'air, énumérés plus haut. Dans la solution de -ce problème de l'invention, il faut en outre être certain que le microbrassage et le macrobrassage nécessaires du contenu du récipient de fermentation (bouillon de culture) reste maintenu. Autrement dit, il faut qu'il- reste assuré que, pour un volume - du litre au microlitre, il y aura toujours la même quantité de cellules, de milieu nutritif et d'oxygène. On entend par microbrassage le brassage dans l'entourage des cellules à une distance de 1 à 10 diamètres de cellule et par macrobrassage, le brassage de tout le récipient. Or, on a constaté le fait surprenant qu'il est possible d'amener uniquement par des membranes perméables l'oxygène nécessaire au métabolisme, pour la culture de cellules animales sous forme de cultures en suspension et monocouches dans des récipients de fermentation, sans utiliser l'introduction de bulles d'air ni un autre type d'oxygène par d'autres procédés connus. Dans le procédé selon l'invention, non seulement on évite les forces de cisaillement qui apparaissent lors de l'injection d'air mais en outre, il ne se forme pas de mousse et les problèmes de dimension des ouvertures destinées aux bulles d'air sont éliminés. D'autre part, un avantage tout à fait essentiel de l'invention réside dans le fait que le procédé de l'invention permet pour la première fois de cultiver des cellules animales et en particulier des cellules d'insectes sous forme de cultures en suspension et monocouches dans des récipients de fermentation dont le volume est largement supérieur au volume usuel antérieurement dans les flacons ou autres réci- pients. C'est ainsi qu'il est par exemple possible d'opérer dans des volumes de culture en suspension de 10 litres et davantage, les cellules se multipliant de façon optimale. Même des volumes de 15, 20 litres ou davantage sont réalisables sans difficulté par le procédé de l'invention, ce qui était impossible jusqu'à présent. Même des volumes de 50 et même 100 litres ne sont même pas exclus. L'oxygène diffuse à travers les membranes perméables en matière synthétique, à l'occasion de quoi il est important que les cellules ne se développent pas sur la matière synthé- tique, car l'amenée d'oxygène serait alors diminuée et finalement interrompue. C'est pourquoi il est important que la matière à utiliser soit d'une part perméable aux gaz, c'est-à- dire à l'oxygène et d'autre part soit de nature telle qu'il ne se produise aucun développement ni aucune fixation de cellules sur elle. Il faut au moins qu'il soit assuré que le développe- ment de cellule sur la matière qui constitue les membranes perméables, soit si faible que l'alimentation nécessaire du système en oxygène n'en soit pas perturbée. Des matières synthétiques appropriées pour les membranes perméables sont par exemple les matières synthétiques à base de silicone ou revêtues de silicone. En outre, on peut envisa- ger d'autres matières synthétiques disponibles mais il faut veiller que des cellules animales ne puissent pas adhérer aux matières synthétiques perméables à l'oxygène ni se développer sur celles-ci. Les feuilles et gaines de silicone ont une sur- face sur laquelle des cellules ne peuvent se fixer, que très difficilement ou pas du tout. C'est pourquoi la matière synthétique à base de silicone est tout à fait recommandée. Il est évident pour le praticien que la matière et la structure géométrique des membranes de matière synthétique ainsi que leur incorporation dans les récipients de fermen- tation doivent répondre aux exigences biotechnologiques usuelles. Comme source d'oxygène, on envisage habituellement l'air. Toutefois, on peut aussi utiliser un mélange d'air et d'oxygène. Il est possible aussi d'utiliser un mélange d'oxygène et d'azote. Un autre avantage d'utiliser exclusivement des membranes perméables pour amener l'oxygène dans le bouillon de culture est que la membrane assure un effet de filtration, de sorte que les germes contenus dans l'air sont retenus. Il est évident que dans la mise en oeuvre du procédé de fermentation selon l'invention, tout l'appareil et les liquides de culture utilisés sont stérilisés. La forme de la membrane perméable peut être quelconque; il faut cependant la choisir de manière telle qu'elle permette une diffusion suffisante de l'oxygène pour alimenter le métabolisme celklaire et que le montage ne perturbe pas la multiplication des cellules. Les membranes perméables, par exemple en caoutchouc de silicone, sont apparues comme appropriées. Par exemple, on peut enrouler une gaine de caout- chouc de silicone autour d'un support qui se trouve dans le récipient de fermentation. Comme supports, sont par exemple normalement proposés des échangeurs thermiques. Dans la description ci-après de divers exemples de réalisation, on trouvera en détail les caractéristiques et avantages de l'invention en se référant aux dessins annexés dans lesquels: fig. 1 représente un récipient de fermentation pour l'application duprocédé selon l'invention à la culture de cellules d'insectes sous forme de cultures en suspension; fig. 2 représente un récipient de fermentation pour l'application du procédé selon l'invention à la culture de cellules de vertébrés sous forme de cultures en suspension et monocouches. Dans l'exemple de figure 1, le récipient de fermenta- tion est un tronçon de tube 1 en verre de borosilicate, fermé par un fond 7 et un couvercle 2 en acier inoxydable. Sur le couvercle 2 est disposé un échangeur thermique 3, ici sous la forme d'un tube d'acier à méandres. Sur ce tube d'acier, un tuyau 4 de caoutchouc de silicone est enroulé de manière que les spires n'en sont pas tout à fait jointives. L'épaisseur de paroi du tuyau 4 est en général de 0,6 à 1,2 mm, de préférence de 1 mm, les tolérances par rapport à une épaisseur de paroi prescrite étant de + 0,05 mm. Par les olives 5, on fait passer,l'air comprimé dans le tuyau de silicone. Par les olives 6, on amène au tube d'échangeur thermique l'agent régulateur de température. Le fond 7 du récipient de fermentation, de même que le couvercle, est assemblé au tronçon de tube de verre avec interposition d'un anneau de joint 8. Le moteur 9 entraîne l'hélice 11 par un arbre 10. L'hélice 11 tourne à environ 60 tours/mn et assure, par sa construction et sa faible vitesse de rotation, un macrobrassage en douceur du contenu 12 du récipient de fermentation. Le microbrassage est assuré par les turbulences le long du tuyau de matière synthétique enroulé en spirale. L'oxygène qui diffuse dans le liquide est préalabilement divisé grâce à ce microbrassage et distribué dans tout le récipient par le courant engendré par l'hélice. Les turbulences engendrées dans l'ensemble de l'écoulement par le tuyau enroulé, et l'ensemble de l'écoulement lui-même, assurent en outre que les substances nutritives et les cellules se distribuent uniformé- ment dans le volume de fermentation. Dans l'exemple de la figure 2, le récipient de fermenta- tion est un tronçon de tube 1 en verre de borosilicate, fermé par un fond 7 et un couvercle 2 en acier inoxydable. Sur le couvercle 2 est disposé un échangeur thermique 3 qui est ici sous la forme d'un double cylindre formé de deux tubes concentriques reliés entre eux par un anneau dans le haut et un autre dans le bas. Sur la surface extérieure de ce tube d'acier, un tuyau 4 en caoutchouc de silicone est enroulé de manière que ses spires ne sont pas tout à fait jointives. Par les olives 5, on fait passer l'air comprimé dans le tuyau de sili- cone. Par les olives 6, on amène au tube d'échangeur thermique l'agent régulateur de température. Le fond 7 du récipient de fermentation, de même que le couvercle,sont assemblésau tronçon de tube de verre avec interposition d'un anneau de joint 8. Le moteur 9 entraîne l'hélice 11 par un arbre 10. Grâce à une vitesse de rotation appropriée (50 à 200 tours/mn), l'hélice 11 doit assurer le macrobrassage en douceur du contenu 12 du récipient de fermentation, ce contenu étant ici principalement le bouillon de culture comportant le milieu nutritif qui s'écoule de haut en bas dans l'interstice annulaire 13 et a pu s'enrichir en oxygène. Le bouillon de culture 12 traverse le tamis 14 et baigne les billes 15 sur lesquelles se dévelop- pent les cellules. La constitution appropriée du tamis, le choix de la grosseur des billes (résistance à l'écoulement de l'entassement de billes) , le choix de.la densité des billes et de la vitesse de rotation de l'hélice, permettent d'obtenir que la charge de billes ne se dépose pas mais soit maintenue en suspension. On évite ainsi la formation, dans les surfaces de contact bille/bille, billes/tamis et billes/paroi du cylindre, de zones appauvries en milieu nutritif-et en oxygène, dans lesquelles les cellules dépériraient. Le microbrassage est obtenu par le tuyau enroulé en spirale,avec ses interstices, et par le champ d'écoulement inhomogène dans la charge de billes. On peut régler le temps de circulation de l'écoulement à travers l'interstice annulai- re 13 et l'entassement de billes de telle manière que la concentration d'oxygène à l'intérieur de la charge de billes ne diminue pas notablement de bas en haut. Dans les essais selon l'invention, on a évité complète- ment l'introduction de bulles d'air. L'unique apport d'oxygène était assuré par le système formé du tuyau de silicone enroulé autour de l'échangeur thermique. La teneur en oxygène 2' mesurée en continu avec l'électrode d'oxygène, a pu ainsi être maintenue au même niveau pendant plusieurs jours. Ceci signifie que l'oxygène venant de l'air circulant dans le tuyau en silicone passe dans le milieu nutritif et reste même quand le nombre de cellules augmente, toujours disponible en quantité suffisante dans la culture qui se multiplie. En augmentant la vitesse de circulation de l'air dans le tuyau ou en augmentant la pression, on pourrait encore, pour des cultures consommant beaucoup d'oxygène, augmenter encore le passage de l'oxygène 02 dans le milieu de nutrition. Dans des essais avec des suspensions de culture de cellules de 4 et litres, on a pu obtenir par ce procédé, une multiplication. constante de cellules de Mamestra brassicae. En comparaison de tous les procédés de culture en suspension utilisés antérieurement, il est ainsi devenu possible pour la première fois, non seulement de multiplier des cellules dans un volume de milieu nutritif de 10 litres mais encore de les multiplier fois. La multiplication que l'on atteignait jusqu'à présent, dans des volumes ne dépassant pas 3 litres était de 4 à 5 fois. Il faut remarquer en outre que l'aspect mor- phologique des cellules était optimal et que le pourcentage de cellules mortes était seulement de 10 % au maximum. Dans des cultures en suspension de plus petit volume (1 à 3 litres), ce pourcentage est souvent notablement plus élevé. Par conséquent, le procédé d'enrichissement en oxygène 2 de milieux nutritifs en passant par des matières perméables à l'oxygène sous forme de feuilles ou de tuyaux de polytétra- fluoréthylène, de silicone, etc...permet donc de multiplier de façon optimale des cellules d'insectes dans des cultures en suspension d'un volume de 10 litres et davantage. Ici, les cellules ne peuvent pas se fixer sur le tuyau de silicone (et bloquer ainsi peu à peu le passage de l'oxygène 2) parce que le silicone a une surface qui ne se prête pas à l'adhérence des cellules. De plus, il ne se fixe donc pas entre les spires du tuyau, de cellules qui pourraient y mourir, se décomposer et enrichir le milieu nutritif en produits de décomposition toxiques. on a donné ci-après 2 exemples de cultures. Exemple 1 On utilise la lignée cellulaire d'insecte IZD-MB 0503 u IZD désigne Institut de Zoologie de Darmstadt; Mb le Mamestra brassicae = ou noctuelle du chou, espèce de lépidop- tère; 0503 = no de code de la lignée cellulaire; lignée cellulaire de lépidoptère ATCC no CRL 8003). Avec cette lignée cellulaire, on a préparé une culture en suspension, c'est-à-dire que dans un récipient dit tournant (Spinner) - sousagitation continue par un agitateur magnétique - on a provoqué la multiplication des cellules à l'état de suspension libre dans le milieu nutritif (pH 6,6). Le milieu nutritif correspondait aux indications de T.D. Grace dans '"Nature" 195, 788 à 789 (1962). Avec un nombre initial d'environ 2 x 10 cellules/ml de milieu nutritif, nécessaire à la multiplication, on a obtenu généralement au bout de 3 jours une concentration d'environ 6 à 10 x 10 cellules, soit une multiplication de 3 à 5 fois. A cause de l'épuisement du milieu nutritif et du "vieillissement" de cette culture, on n'a pas pu obtenir un plus grand nombre de cellules, même avec une incubation plus longue. De cette "culture-mère", on a prélevé le dépôt pour amorcer la culture de cellules dans le récipient de fermentation. On a étalonné les électrodes de mesure d'oxygène 02 et du pH, on les a passées à l'autoclave et on a refait l'étalonnage. Ensuite, on les a introduites dans le couvercle du récipient de fermentation. On a utilisé comme membrane un tuyau de caoutchouc de silicone, d'une épaisseur de paroi de 1,0 mm, que l'on a enroulé sur l'échangeur thermique. Le couvercle (avec les'électrodes) et toutes les parties du récipient de fermentation entrant en contact avec le milieu nutritif entrant et sortant, ont été stérilisées ainsi que les systèmes d'amenée et d'évacuation d'air. Ceci a été fait à l'autoclave. * En respectant les conditbns de stérilité, on a assemblé le récipient de fermentation et on a introduit la quantité désirée de milieu nutritif par des ouvertures prévues dans le couvercle du récipient. Dans le cas d'un récipient d'une contenance totale de 12 litres, on a introduit tout d'abord 2 litres. Dans cette quantité de milieu nutritif, les cellules avaient déjà été ajoutées avant le remplissage. La concentra- tion était de 10 cellules/ml. La concentration d'oxygène dans le milieu nutritif était d'environ 7,5 mg/l au début de l'expérience, à 280C. On a mis alors en action le récipient de fermentation et on a maintenu les conditions suivantes - agitation entre 60 et 70 tours/mn, - régulation de la température de la suspension à 28WC, - la régulation de l'oxygène et du pH s'effectuant par le moyen des électrodes de mesure. Pendant les 16 à 24 premières heures de culture, il n'a pas été absolument nécessaire d'enrichir en oxygène le il le milieu nutritif. Toutefois, cela est devenu nécessaire quand la culture est entrée dans sa phase de développement logarithmique et quand, par augmentation du nombre de cellules et de la puissance métabolique, l'oxygène contenu dans le milieu se consommait. L'apport d'oxygène a été effectué alors par le tuyau de silicone servant de "membrane" et à travers lequel, de l'oxygène atmosphérique 02 ou de l'oxygène 2 provenant d'un mélange d'oxygène et d'air diffusait dans le milieu de nutri- tion. Pour enrichir le milieu au bout des 16 à 24 heures initiales, on a introduit de l'air comprimé à une pression de 1,5 à 2,0 bar. Au besoin, on peut porter cette pression jusqu'à 3,0 bar. Par le procédé de diffusion d'oxygène 2 selon l'.inven- tion, le nombre des cellules par millilitre de milieu nutritif a été porté en 4 jours, de 10 cellules à 2 à 3 x 106 cellules. Après 2 à 3 jours, l'optimum de la multiplication des cellules a été dépassé, c'est-à-dire que la culture de cellules est passée à la phase stationnaire o les cellules cessaient peu à peu leur activité de scissiparité. Chaque millilitre contenait alors 2 à 3 x 106 cellules. On a ajouté ensuite dans des conditions stériles 6 à 7 litres de milieu nutritif frais. La concentration de cellules a ainsi diminuée en conséquence. De la phase stationnaire, les cellules sont passées à nouveau à une phase de multiplication. En l'espace de 2 à 3 jours, il en est résulté à nouveau des concentra- tions de cellules de 2 à 3 x 10 /ml. Ainsi, dans un volume total de 10 litres, en partant initialement de 3 x 108 cellules/3 litres, on a obtenu environ 10il cellules. Par le procédé à bulles d'air de la technique connue, il n'aurait même pas été possible d'augmenter le volume au dessus de 4 litres. La culture dans des volumes de 4 x 2,5 litres aurait cependant donné en tout, et au maximum, envi- ron 4 x 10 cellules seulement. Ainsi, le procédé à membrane selon l'invention donne un nombre de cellules environ 20 fois plus grand. On a retiré environ 5 litres de la suspension de cellules de 10 litres lorsque la phase stationnaire a été à nouveau atteinte (2ème à 3ème jour). On a introduit alors de façon stérile, dans le récipient de fermentation, 5 litres de milieu nutritif frais. Ainsi, -la suspension restante a été diluée et les cellules ont commencé à se diviser en entrant à nouveau dans une phase de multiplication. - En maintenant des conditions stériles dans le récipient de fermentation - ces phases de dilution/multiplication peuvent être répétées aussi longtemps que le permet l'état général des cellules. Dans le cas de lignées cellulaires stabilisées, on peut opérer de façon continue en permanence. Exemple 2 Dans le procédé décrit à l'exemple 1, on peut aussi utiliser, pour une production en masse, les autres lignées cellulaires suivantes - IZD-Mb 2006 = Mamestra brassicae - IZD-Mb 1203 = - IZD-Mb 0504 = - IZD-Ld 1307 = Lymantria dispar - IZD-Ld 1407 = Après sélection appropriée, on peut aussi multiplier par le procédé à membrane toutes les autres lignées cellulaires d'insectes qui se développent sous forme de cultures en sus- pension. Pour toutes ces lignées citées, on peut prévoir une aussi bonne vitesse de multiplication, analogue à celle de IZD-Mb 0503. Etant donné que le procédé à membrane est un perfection- nement fondamental des conditions de milieu dans les cultures de cellules, on peut y prévoir l'obtention de meilleures vitesses de multiplication dans toutes les autres cultures en suspension de cellules d'invertébrés et de vertébrés. Parmi les lignées cellulaires de vertébrés, on citera surtout à titre d'exemple celles servant à la production de produits biologiques tels que des facteurs d'immunisation, des hormones, des enzymes, des agents antiviraux, des prépa- rations de virus/vaccins antiviraux, etc..., à l'échelle industrielle. Ce sont par exemple les lignées cellulaires de mammifères BHK21 NAMALWA et 1301 (tirée de la lignée leucémique CCRF-CEMT). Depuis quelque temps, on peut aussi utiliser dans des récipients de fermentation des cellules qui ne peuvent pas se multiplier sous forme de culture en suspension. En utilisant ce qui s'appelle des microsupports, c'est-à-dire par exemple des billes de résine de polystyrène d'un diamètre généralement inférieur à 1 mm, on peut multiplier, à la surface de celles- ci, des cellules qui se développent seulement sous la forme d'un tapis sur un support solide. Lorsqu'on introduit dans un récipient de fermentation environ 5 g de ces billes par litre de milieu nutritif, on obtient une surface atteignant 30.000 cm2. Des essais sur des cellules non diploïdes de mammifères ont donné, dans une culture en suspension avec microsupport, des nombres de cellules de 4 x 10 6/ml de milieu. Du fait qu'en mettant en oeuvre des microsupports on peut obtenir de grands nombres de cellules, la consommation d'oxy- gène 2 devient d'autant plus grande. Avec le procédé à bulles d'air de la technique connue, ce besoin accru d'oxygène 2 est notablement plus difficile à satisfaire que par le procédé à membrane selon l'inventioe Par suite, par le procédé à membrane, on peut porter/l'ensemble à une plus grande puissance métabolique les cellules qui se développent sur lesbilles microsupports, ce qui entraîne une division ou scission plus grande et plus rapide. Le nombre de cellules augmente alors plus rapidement par unité de temps, c'est-à-dire que des fermentations avec microsupports donnent aussi davantage de cellules. REVENDICATIONS 1) Procédé de culture de cellules animales sous forme de cultures en suspension et monocouches dans des récipients de fermentation, dans des milieux nutritifs usuels, avec apport d'oxygène caractérisé par le fait que l'apport d'oxygène s'effectue uniquement par des membranes perméables. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les membranes perméables sont formées de matière synthétique perméable aux gaz sur laquelle il ne se produit presque aucun développement de cellules. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que la membrane perméable est formée de caoutchouc de silicone. 4) Procédé selon l'une des revendications l à 3, caractérisé par le fait que la membrane est formée par la surface d'un tuyau enroulé en spirale. ) Procédé selon l'une des revendications l à 4, caractérisé par le fait que l'on cultive des cellules d'insectes. 6) Utilisation de membranes perméables en matière synthé- tique sur lesquelles il ne se produit presque aucun dévelop- pement de cellules, à l'amenée d'oxygène à des récipients de fermentation pour la culture de cellules animales sous forme de cultures en suspension et monocouches.