Brevet FR2466505A1 — publié le 19810410

i La présente invention concerne la préparation de l'acide 2,5- dicétogluconique, qui est utile comme composé intermédiaire pour la production de l'acide ascorbique. Une solution d'acide 2,5dicétogluconique peut être réduite sélectivement en acide 2-cétogulonique que l'on peut convertir en acide ascorbique. La réduction de l'acide 2,5- dicétogluconique peut être effectuée par réduction avec un borohydrure de métal alcalin, comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 159 990, ou par réduction par fermentation comme décrit, par exemple, dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique N0_3 922 194, N 3 959 076 et N 3 963 574. L'acide 2,5-dicétogluconique est également utile comme composé intermédiaire pour la préparation de l'acide coménique par chauffage en présence d'un acide, comme décrit, par exemple, dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 654 316. Jusqu'à présent, l'acide 2,5-dicétogluconique a été produit par plusieurs espèces différentes de bactéries telles qu'Acetobacter melanogenum, Acetobacter aurantium, Gluconoacetobacter rubiginosus, Gluconoacetobacter liquifaciens et Pseudomonas sesami. Toutefois, l'utilisation de ces microorganismes n'est pas satisfaisante du point de vue industriel à cause des rendements relativement faibles en acide 2,5-dicétogluconique, de la longueur relative des durées de fermentation et de la production de grandes quantités de pigments bruns ou brun-jaune comme sous-produits de la culture, ce qui réduit la pureté de l'acide 2,5- dicétogluconique désiré. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 790 444 concerne la production d'acide 2,5-dicétogluconique, sans la formation simultanée de pigment brun, par une espèce nouvelle appelée Acetobacter fragum ATCC N 21 409. La demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique N 79 668 déposée le 28 Septembre 1979 concerne un procédé de production d'acide 2,5dicétogluconique donnant de bons rendements sans la formation de matière pigmentée, par propagation aérobie d'Acetobacter cerinus dans un milieu contenant du glucose. Bien qu'on puisse utiliser des quantités totales de glucose allant d'environ 2,5 à environ % (poids/volume), on a trouvé que des concentrations initiales en glucose de plus d'environ 15 % dans le milieu ne pouvaient pas être tolérées par les micro-organismes. Par conséquent, des quantités totales de glucose supérieures à environ 15 % (en poids/volume) peuvent seules être utilisées par conduite de la fermentation à une concentration initiale en glucose d'environ 10 à 15 % (en poids/volume) et par des additions subséquentes de glucose au milieu fermentescible au cours de la fermentation, la concentration en glucose dans le milieu ne dépassant jamais environ 15 % (en poids/volume). C'est pourquoi, jusqu'à présent, les concentrations totales ou les capacités de production d'acide 2,5-dicétogluconique ont été limitées par la concentration initiale relativement faible en glucose que l'on peut utiliser dans le milieu de fermentation. La productivité-de procédés utilisant d'autres micro-organismes pour la préparation de l'acide 2,5- dicétogluconique, comme décrit ci-dessus, est également limitée par la nécessité d'utiliser une concentration initiale relativement faible en glucose dans le milieu de fermentation. Il est évident qu'un procédé dans lequel des concentrations initiales en glucose de plus d'environ 15 % (en poids/volume), notamment des concentrations dépassant 207o pourraient être tolérées et utilisées par les micro- organismes pour la préparation de l'acide 2,5-dicéto- gluconique, offrirait une amélioration notable de la capacité de production et permettrait de réaliser des économies substantielles de mise en oeuvre. Un tel procédé éviterait également l'éventualité d'une contamination du milieu de fermentation, qui peut exister lorsque les capacités de production sont élevées par l'introduction de quantités additionnelles de glucose au cours de la fermentation. Conformément à la présente invention, on vient de découvrir que des concentrations initiales en glucose supérieures à 20 % et pouvant aller jusqu'à environ 30 % (en poids/volume) dans un milieu de fermentation peuvent être utilisées par le micro-organisme Acetobacter cerinus pour la -2466505 production de l'acide 2,5-dicétogluconique lorsqu'on ajoute au moins environ 0,04 % en poids de choline au milieu de fermentation, sur la base de la quantité de D-glucose contenue dans ce milieu. Plus particulièrement, la présente invention propose un procédé de production d'acide 2,5- dicétogluconique en fortes concentrations dans le milieu de fermentation par propagation aérobie d'Acetobacter cerinus dans un milieu de fermentation contenant du D-glucose à une concentration initiale supérieure-à environ 20 % et pouvant aller jusqu'à environ 30 % (en poids/volume) et de la choline en une quantité d'au moins environ 0,04 % en poids sur la base de quantité de D-glucose contenue dans le milieu. La concentration initiale en glucose dans le milieu de fermenta- tion est de préférence égale à environ 25-30 % (en poids/volume). La propagation est de préférence conduite à une température de 25 à 300C et à un pH d'environ 5 à 6. Les souches préférées d'Acetobacter cerinus sont Acetobacter cerinus IFO 3263 et IFO 3266. L'acide 2,5-dicétogluconique est obtenu en de bons rendements dans le procédé de la présente invention sans formation de quantités notables de matières pigmentées et en des périodes de fermentation relativement courtes. Plusieurs souches d'Acetobacter cerinus telles que IFO 3262 (ATCC 12 303), IFO 3263, IFO 3264, IFO 3265, IFO 3266, IFO 3267, IFO 3268 et IFO 3269 sont accessibles au public et peuvent être utilisées dans le procédé de l'invention pour la préparation de l'acide 2,5- dicétogluconique. Des souches particulièrement appréciées sont les souches IFO 3263 et IFO 3266. Il y a lieu de remarquer que des mutants de ces micro-organismes produits par des méthodes classiques, par exemple par irradiation aux rayons X ou à la lumière ultraviolette, traitement avec des moutardes azotées, etc., sont également utiles dans le procédé de l'invention et sont compris dans son cadre. L'espèce Acetobacter cerinus est cultivé dans un milieu dont la source principale de carbone est le D-glucose. Il y a lieu de remarquer que, conformément à la pratique classique de fermentation, le milieu fermentescible contient également des sources d'azote, de potassium, de phosphore et de magnésium. L'expression "milieu fermentescible" utilisée dans le présent mémoire désigne un milieu contenant ces composés. Lorsqu'on utilise les micro-organismes de l'espèce Acetobacter cerinus dans le procédé de l'invention, il n'est pas nécessaire de recourir à des sources coûteuses d'azote organique telles que la peptone ou l'extrait de viande. L'azote peut être produit de façon économique par l'utilisation d'urée ou de sources inorganiques d'azote, par exemple le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le phosphate d'ammonium ou des sels similaires, généralement en quantités allant d'environ 0,1 à 2 g/l de milieu fermentescible, lorsque de l'acide nicotinique est aussi ajouté comme facteur de croissance, généralement en une quantité d'environ 0,2 à 10 mg/l de milieu fermentescible. Le potassium, le magnésium et le phosphore sont 'aisément introduits par l'addition de sels tels que le phosphate de potassium, le phosphate d 'ammonium, le sulfate de magnésium ou des sels similaires, généralement en quantités d'environ 0,1 à environ 1 g/l de milieu fermentescible. Une variation considérable de la composition du milieu fermentescible est toutefois possible. D'autres milieux convenables sont évidents pour l'homme de l'art et le procédé de l'invention ne doit nullement être limité à l'utilisation des milieux particuliers, définis ci-dessus et dans les exemples qui suivent. Conformément au procédé de l'invention, le milieu fermentescible contient du D-glucose à des concentrations initiales plus fortes que cela n'a été possible jusqu à présent sans effet nuisible sur le micro-organisme utilisé dans la fermentation. Plus particulièrement, la concentration initiale en D-glucose dans le milieu fermentescible utilisé dans le procédé de l'invention se situe dans une plage de plus d'environ 20 % à un maximum d'environ 30 % (poids/volume), notamment d'environ 25 à 30 % (poids/volume). Le cas échéant, du D-glucose peut être ajouté sous la forme de cérélose (monohydrate de D-glcose). Pour que les micro-organismes de l'espèce Acetobacter cerinus soient capables de tolérer et d'utiliser d'aussi fortes concentrations en glucose dans le milieu fermentescible, il est nécessaire d'ajouter de la choline à ce milieu en une quantité d'au moins environ 0,04 % en poids sur la base de la quantité initiale de D-glucose dans le milieu fermentescible. Le cas échéant, on peut utiliser des proportions relativement grandes de choline, par exemple environ 0,5 % en poids sur la base de la concentration initiale en D-glucose dans le milieu fermentescible, bien qu'il y ait peu d'avantage à utiliser plus d'environ 0,1 % en poids de choline, et on préfère généralement une proportion de choline d'environ 0,04 à environ 0,06 % en poids. La choline peut être ajoutée soit sous la forme de la base libre, soit sous la forme d'un sel, par exemple le chlorure de choline, le bicarbonate de choline, le citrate de choline, le gluconate de choline ou des sels similaires. Le chlorure de choline constitue un sel apprécié. La concentration en choline, telle qu'elle est définie dans le présent mémoire, est exprimée en choline base. Une petite partie de la choline nécessaire peut être introduite, le cas échéant, par l'addition d'un extrait soluble de mais au milieu fermentescible. L'extrait soluble de mais, qui a été utilisé dans des milieux fermentescibles comme source de vitamines et de sels minéraux, ne renferme généralement qu'environ 0,5 à 3 mg de choline par gramme d'extrait. Toutefois, on n'utilise ordinairement pas plus d'environ 5 g d'extrait soluble de mais par litre de milieu fermentescible, attendu que l'extrait soluble de-mais contient des corps colorés et que l'addition de plus d'environ 5 g de cet extrait par litre de milieu fermentescible rend plus difficiles l'isolement et la purification de l'acide 2,5- dicétogluconique. Par conséquent, l'extrait soluble de mais ne peut être utilisé, le cas échéant, que comme source d'une petite proportion de la choline nécessaire à la fermentation et le reste de la quantité désirée de choline est ajouté au milieu fermentescible sous la forme de choline base ou d'un sel de ce composé, comme décrit ci-dessus. La fermentation est généralement conduite à une température d'environ 20 à 35WC, de préférence de 25 à 301C, notamment à environ 280C. Le pH initial d'un milieu de culture se situe dans la plage d'environ 3,5 à 7,5, de préférence d'environ 5 à 6. Au cours de la fermentation, le pH est avantageusement maintenu dans cette plage, de préférence à environ 5,5, par exemple par l'addition d'un hydroxyde de métal alcalin, de préférence une solution d'hydroxyde de sodium. A titre de. variante, un carbonate de métal alcalin ou de métal alcalino-terreux, de préférence le carbonate de calcium, peut être utilisé pour ajuster le pH et on l'ajoute à cette fin lorsqu'on effectue l'appoint après l'autoclavage, en une quantité suffisante pour ajuster le pH désiré, généralement en quantité d'environ 20 à 30 g/100 g de glucose. Il y a lieu de remarquer que l'acide 2,5-dicéto- gluconique est produit dans de tels milieux fermentescibles sous la forme des sels correspondants de métaux alcalins ou alcalino-terreux tels que les sels de sodium ou de calcium et que ces sels sont couverts par le terme "acide 2,5-diceto- gluconique" utilisé dans le présent mémoire. Après l'inoculation, le milieu fermentescible est agité par exemple à l'aide d'un agitateur mécanique et aéré, de préférence à un débit d'environ 0,5 à 1 volume d'air par volume de bouillon fermentescible par minute. Le cas échéant, on peut ajouter encore du glucose au cours de la fermentation pour en remplacer une partie de celui qui a été utilisé dans la fermentation, de manière à accroître ainsi la concentration totale en acide 2,5-dicétogluconique obtenu dans le bouillon. La fermentation est poursuivie jusqu'à ce que le rendement désiré ait été obtenu. Par exemple, lorsqu'on utilise Acetobacter cerinus IFO 3263 ou 3266, un temps de fermentation d'environ 40 à 50 heures donne un rendement d'environ 90 à 95 % d'acide 2,5-dicétogluconique sur la base du D-glucose. Toutefois, on doit s'attendre à une certaine variation des durées de réaction et des rendements selon la souche particulière du micro-organisme, la concentration en glucose dans le milieu fermentescible et la température de la culture. Bien qu'on ne désire pas se limiter au mécanisme suivant, on suppose que la transformation du glucose en acide 2,5-dicétogluconique s'effectue d'après le mécanisme suivant: glucose --> acide 2-cétogluconique---- acide 2,5-dicéto- gluconique glucose ---> acide 5-cétogluconique --- acide 2,5-dicétogluconique. Les acides 2-cétogluconique et 5-cétogluconique intermé- diaires et l'acide 2,5-dicétogluconique peuvent être séparés par chromatographie sur papier "Whatman" N 1 et N 4 en utilisant comme mélange de solvants un mélange de méthyl- éthylcétone, d'acétone, d'acide formique et d'eau dans la proportion de 80:6:2:12. Les taches des acides sont mises en évidence par pulvérisation d'une solution éthanolique à 0,2 % de o-phénylènediamine contenant 1 % d'acide nitrique et chauffage à environ 70 C (acide 5-cétogluconique-bleu; acide 2-cétogluconique-jaune; acide 2,5-dicétogluconique- vert). On peut aussi utiliser la chromatographie en phase liquide sous haute pression. En utilisant les méthodes ci- dessus, on peut suivre la progression de la fermentation. L'acide 2,5-dicétogluconique peut être séparé et recueilli dans le bouillon final de fermentation par toute opération classique connue de l'homme de l'art. Par exemple, le bouillon de fermentation peut être filtré, le pH du filtrat- aqueux peut être ajusté à environ 2-2,5 par addition d'un acide minéral tel que l'acide chlorhydrique, puis la solution peut être concentrée et additionnée d'un alcool alkylique inférieur, de préférence l'éthanol ou le méthanol. Au repos, l'acide 2,5-dicétogluconique, sous la forme de son sel de calcium ou de sodium, se sépare de la solution sous la forme d'une matière solide. L'acide 2,5-dicétogluconique peut être obtenu à partir du sel par traitement avec un acide minéral dilué, suivi par exemple d'un traitement avec une résine d'échange cationique telle qu'une résine acide sulfonique, par exemple la résine "Dowex 50" (Dow Chemical Company). Le cas échéant, le bouillon de fermentation peut être traité en vue de transformer l'acide 2,5-dicéto- gluconique formé en d'autres produits désirés, par exemple par réduction par fermentation en acide 2-cétogluconique comme décrit dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique N 3 922 194, N 3 959 076 ou N 3 963 574. A titre de variante, le bouillon de fermentation filtré peut être utilisé comme solution réactionnelle convenable pour réduire l'acide 2,5dicétogluconique en une solution contenant de l'acide 2-cétogulonique par réaction avec un borohydrure de métal alcalin comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 159 990. L'acide 2-cétogulonique produit dans ces réactions est facilement transformé en acide ascorbique par des moyens connus dans l'art antérieur, par exemple par chauffage de son ester méthylique en présence d'une base. La présente invention est illustrée par les exemples suivants. Toutefois, il a lieu de remarquer que l'invention n'est pas limitée aux détails particuliers donnés dans ces exemples. Exemple 1 On prépare le milieu aqueux d'inoculation suivant: Ingrédient g/litre Glucose monohydraté 25 Extrait soluble de mais 5 - KH2PO4 0,5 K2HPO4 0,5 MgSO4 7H20 0,2 CaCO3 7,0 pH 6,2 Un ballon d'agitation par secousses contenant 1 litre de milieu est autoclavé pendant 30 minutes à 121 C. Des cellules d'Acetobacter cerinus IFO 3263 provenant d'une culture inclinée sur gélose nutritive (5 ml de suspension aqueuse stérile d'un volume de 20 ml) sont ajoutées au ballon qui est ensuite agité par secousses sur une secoueuse rotative à environ 28 C pendant environ 24 heures. Le pH du milieu refroidi est égal à 5,0. Une portion aliquote de la culture, suffisante pour former un inoculum à 10 % en volume/volume, est ajoutée à un fermentateur de 4 litres sous agitation, 2 litres du milieu de production suivant: Ingrédient Glucose monohydraté Extrait soluble de mais (NH4)2HP04 KH2PO4 MgSO4. 7H20 Urée Chlorure de choline Acide nicotinique CuSO4. 5H20 Agent antimousse "P-2000" contenant 225 g/l 0,5 g/l 0,5 g/l 1,5 g/l 0,5 g/l 1,0 g/l mg/l mg/l 2,0 mg/l 1,0 mg/l pH 6,0 On conduit la fermentation à 28 C sous agitation à1700 tr/min et avec aération à une vitesse de 1,0 volume/volume de bouillon/minute. On maintient le pH à ,5 par addition éventuelle d'une solution à 20 % d'hydroxyde de sodium. L'acide 2,5dicétogluconique est obtenu sous la forme du sel de sodium en un rendement de 95 % après une durée de fermentation de 48 heures. Exemple 2 On prépare l'inoculum aqueux suivant: Ingrédient g/litre Glucose monohydraté 25 Extrait soluble de mais 5 KH2PO4 0,5 K2HPO4 0,5 MgSO4.7H20 0,2 CaCO3 7,0 Un ballon d'agitation par secousses contenant 1 litre de milieu est autoclavé pendant 30 minutes à 121 C. Des cellules d'Acetobacter cerinus IFO 3263 venant d'une culture inclinée sur gélose nutritive (5 ml d'une suspension aqueuse stérile de 20 ml) sont ajoutées au ballon qui est ensuite agité par secousses sur une secoueuse rotative à environ 28 C pendant environ 24 heures. Le pH du milieu refroidi est égal à 5,0. Une portion aliquote de la culture suffisante pour former un inoculum à 10 % en volume/volume est ajoutée à un fermentateur de 4 litres équipé d'un agitateur et contenant 2 litres du milieu suivant: Inoculum de second stade g/litre Glucose monohydraté 100 Extrait soluble de mais 0,5 (NH4)2HPO4 0,5 KH2PO4 1,5 MgSO4.7H20 0,5 Urée 1,0 Acide nicotinique 10 mg CuSO4.5H20 2,0 mg Chlorure de choline 500 mg "P-2000" 0,5 ml Le second stade est conduit à 28 C sous agitation à 1700 tr/min et avec ' aération à une vitesse de 1,0 volume/volume de bouillon par heure. Le pH est maintenu à ,5 par addition éventuelle d'une solution à 20 % d'hydroxyde :0 de sodium. Au bout de 20 heures, on ajoute une portion aliquote de culture suffisante pour former un inoculum à 10 % en volume/volume à un fermentateur sous agitation, de 14 litres de capacité, contenant 6 litres du milieu de production suivant: Ingrédient q/litre Glucose monohydraté 334 Extrait soluble de mais 0,5 (NH4)2HPO4 0,58 0 KH2PO4 1,5 MgSO4.7H20 0,5 Urée 1,0 Acide nicotinique 10,0 mg CuSO4.5H20 2,0 mg Chlorure de choline 150 mg "P-2000" 0,5 ml On conduit la fermentation à 28 C en agitant à 750 tr/min et en introduisant de l'air à une vitesse de 1 1 1,0 volume/volume de bouillon par minute. On maintient le pH à 5,5 par l'addition éventuelle d'une solution à 20 % d'hydroxyde de sodium. L'acide 2,5-dicétogluconique sous la forme du sel de sodium est obtenu en un rendement de 95 % après une durée de fermentation de 6570 heures. Exemple 3 En suivant le mode opératoire de l'exemple 1, on teste des souches IFO 3262, 3264, 3265, 3266, 3267, 3268 et 3269 d'Acetobacter cerinus. Dans chaque cas, le produit de fermentation contient de l'acide 2,5dicétogluconique en un rendement supérieur à 50 %, en même temps qu'un peu d'acide 2-cétogluconique et d'acide 5-cétogluconique intermédiaires non transformés. On peut obtenir de plus forts rendements en l'acide 2,5dicétogluconique désiré en utilisant de plus longues durées de fermentation lorsqu'on choisit d'utiliser ces souches d'Acetobacter cerinus. REVENDICATIONS 1. Procédé de production d'acide 2,5-dicéto- gluconique, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer la propagation aérobie d'Acetobacter cerinus dans un milieu de fermentation contenant du D-glucose à une concentration initiale supérieure à environ 20 % et allant jusqu'à environ % (poids/volume) et de la choline en une quantité d'au moins environ 0,04 % en poids sur la base de la quantité initiale de D-glucose contenue dans ledit milieu. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration initiale en D-glucose va d'environ 25 à 30 % (en poids/volume). 3. Procédé. suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu contient de la choline en une quantité d'environ 0,04 à 0,1 % en poids. 4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la propagation est conduite à une température d'environ 25 à 300C. 5. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la propagation est conduite à un pH d'environ 5 à 6. 6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que -le pH est maintenu par addition d'hydroxyde de sodium. - 7. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu contient de la choline en une quantité d'environ 0,04 à 0,1 % en poids et la propagation est conduite à une température d'environ 25 à 30WC et à un pH d'environ 5 à 6. 8. Procédé suivant l'une des revendications 1 et 7, caractérisé en ce que Acetobacter cerinus est la souche IFO 3263. 9. Procédé suivant l'une des revendications 1 et 7, caractérisé en ce que Acetobacter cerinus est la souche IFO 3266.