Brevet FR2470377A1 — publié le 19810529

J La présente invention se rapporte généralement à un appareil d'analyse de particules et elle concerne plus particulièrement desappareils o des études peuvent être faites de systèmes particulaires Enutilisant le principe de détection d'impédance. Depuis sa conception il y a plus de 25 ans, le principe du comptage et du dimensionnement des particules inventé par Wallace H. Coulter a donné de nombreux procédés et appareils pour le comptage, le dimensionne- ment et l'analyse électroniques de particules microscopi- ques, qui sont explorées dans une suspension fluide, comme cela est indiqué par le brevet U.S. No. 2 656 508 au nom de Coulter. Dans cet agencement selon l'art antérieur, un écoulementd'un courant électrique continu est établi entre deux récipients par des électrodes en suspension dans les corps respectifs du fluide en suspen- sion. La seule connexion de fluide entre les deux corps passe par un orifice; par conséquent, un écoulement de courant et un champ électrique sont établis dans l'orifice. L'orifice et le champ électrique résultant dans et autour de lui constituent une zone de détection. Tandis que chaque particule passe par la zone de détection, pendant la durée du passage, l'impédance du contenu de la zone de détection change, modulant ainsi l'écoulement de courant et le champ électrique dans la zone de détection, et provoquant par conséquent la production d'un signal à appliquer à un détecteur avantageusement prévu pour répondre à ce change- ment (la marque "Coulter" est une marque déposée sous le No. 995 825 par Coulter Electronics, Inc. à Hialeah, Floride, U.S.A). On a prouvé que le changement d'impédance du contenu de la zone de détection lors du passage d'une particule était à peu près proportionnel au volume de la particule, lorsque l'aire en coupe transversale de la particule est sensiblement plus petite que celle de l'orifice, et que le diamètre de la particule est plus petit que la longueur axiale de l'orifice. En conséquence, de nombreux 2470377 1 modes de réalisation d'analyseurs commercialisés de particules ont été développés, qui mesurent l'amplitude du signal à la sortie d'un agencement de détection d'impédance, dans le but de mesurer le volume de la particule ou la dimension des particules. Un tel agencement mesure la dimension électrique de la particule qui sera appelée ci-après "dimension de la particuleiSou "dimension mesurée". Il a également été prouvé que la forme de la particule affectait la dimension mesurée et qu'elle n'était donc pas exactement en corrélation avec le volume réel de la particule. En général, du fait de la focalisation hydro- dynamique dans la plupart des appareils, les particules allongées seront alignées avec leur axe majeur sensiblement parallèle à l'axe central de l'orifice. Avec deux particules de volume égal, l'une étant sphérique et l'autre étant allongée, la particule sphérique, en passant par l'orifice, aura une plus grande coupe transversale perpendiculaire à l'écoulement de courant que la particule allongée. Par conséquent, la particule sphérique déformera le champ de façon à donner un plus grand signal de dimension mesurée que la particule allongée, malgré les volumes égaux. Pour compenser cela, les particules ont été classées selon leur forme par un terme appelé "facteur de forme". Par exemple, si l'on assigne, à une particule extrêmement allongée, un facteur de forme de 1,0, alors la particule sphérique du même volume aura un facteur de forme de 1,5. Un appareil utilisant deux orifices de détection pouvant déterminer- le facteur de forme est révélé dans le brevet U.S. No. 3 793 587 au nom de Thom et autres. Dans ce dispositif, la longueur de l'un des orifices a le mxme ordre de grandeur que les longueurs des particules ou est plus petite que les longueurs des particules. En conséquence, avec cet orifice, une particule allongée provoque une impulsion qui, après sa montée, reste à un maximum pendant un certain temps puis retombe. Une particule sphérique produit, au contraire, une impulsion quil retombe immédiatement après avoir atteint un maximum. Dans ce brevet, il est suggéré que la dimension mesurée peut être corrigée en divisant le changement d'impédance pour une particule par son facteur de forme. Du fait des complications des champs électriques, ces corrections peuvent ttreecOetispaMctiormées, La déformabilité de la particule, provoquée par les pressions hydrodynamiques lors du passage de la particule à travers un orifice de détection, ou la forme d'une particule peut être très importante, aussi bien en tant que facteur affectant la dimension mesurée qu'en tant que paramètre séparé pour examiner les particules. D'abord, la déformation ou la forme des particules affecte leur facteur de frme, qui à son tour affecte la dimension mesurée. Deuxièmement, l'état déformé d'une cellule biologique dépend non seulement du type de la cellule, mais également de son age. Par exemple, les érythrocytes des mammifères n'ont pas de noyau. Contrairement aux leucocytes, les érythrocytes se déforment facilement du fait de leur faible viscosité interne. De même, dans un type donné de cellule, la membrane de la cellule devient plus rigide avec l'age, par conséquent moins déformable. Il est envisagé que l'état pathologique d'une cellule affecte sa déformabilité ou sa forme naturelle. Dans l'appareil commercialisé construit selon le brevet U.S. No. 2 656 508 ci-dessus mentionné, l'excitation du champ était produite par une source de courant continu ou de faible fréquence. Comme on l'a précédemment décrit, le changement électrique provoqué par le passage d'une particule dans le champ électrique de faible dimension, excité par un courant continu ou à basse fréquence5est à peu près proportionnel à la dimension de la particule. Un courant continu est considéré comme ayant une fréquence nulle dans cette demande. Cependant, le principe de détection de l'impédance a été matériellement étendu pour donner une information concernant des particules qui sont étudiées, non pas limitée seulement aux caractéristiques dues à la dimension des particules, mais comprenant des 2470377 i caractéristiques dues à la composition et à la nature du matériau constituant les particules, comme cela est révélé dans le brevet U.S. No. 3 502 974 au nom de Coulter et autres et le brevet U.S. No. 3 502 973 au nom de Coulter et autres. Ces appareils selon l'art antérieur ont généralement au moins deux sources de courant, toutes deux étant appliquées simultanément à la zone de détection, l'une étant à une haute fréquence et l'autre étant un courant continu à une "fréquence nulle" ou alternativement, ayant une fréquence suffisamment faible pour que la partie réactive de l'impédance de la particule ait un effet négligeable sur la réponse de l'appareil. L'un des moyens de description utiles de la particule que l'on peut obtenir avec cet agencement à deux sources est connu comme "l'opa- cité" des particules. Dans un sens général, l'opacité mesure la différence de dimension mesurée à haute fréquence en comparaison à la dimension mesurée à une fréquence basse ou nulle. Comme cela est remarqué dans la technique de la cytologie, tout nouveau moyen de description d'une particule qui peut être mesurée est utile pour identifier, analyser et trier les particules. Par exemple, les cellules ont une membrane de très forte résistivité qui est dans la gamme diélectrique. Cependant, la partie ixterne de la cellule est assez conductrice, des types différents de particules ayant des résistivités internes variables. De mIme, il est envisagé que l'état pathologique de la cellule affecte sa résistivité interne. En conséquence il est souhaitable de mesurer cette résistivité interne sur une base cellule par cellule. Le brevet U.S. No. 3 890 568 au nom de Coulter et autres est intéressant parce qu'il révèle la configuration du champ électrique pour un exemple d'un orifice de détection. Par ailleurs, ce brevet enseigne la mesure de la longueur d'une particule dans le but de corriger des mesures imprécises de dimension provoquées par des particules allongées dépassant la longueur de la zone de 2470377. détection. Cependant, le processus qui y est révélé ne permet de déterminer avec précisbn la longueur de la particule que quand cette longueur dépasse l'étendue efficace d'exploration, ou en d'autres termes, la gamme dans laquelle la particule peut être effectivement détectée. Cette situation se produit généralement uniquement dans des cas o des particules telles que des fibres sont triées. Avec la plupart des particules, comme les cellules bilogi- ques, la longueur de l'orifice sera plusieurs fois la longueur des particules, même si les particules sont étirées par les forces hydrodynamiques mises en cause. Le dispositif révélé dans un article intitulé "Fast Imaging in Flow: A Means of Combining Flow-Cytometry and Image Analysis" de V. Kacirl et autres, THE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY, volume 27, No. 1 (1979), pages 335-341, est intéressant pour révéler un schéma selon l'art antérieur capable d'un examen subséquent de la forme de la particule, après passage de la particule à travers un orifice de détection. Dans ce dispositif, une unité électronique associée à l'orifice de détection, pour une sous-population limitée et pré- sélectionnée de cellule, déclenche une lampe flash ou éclair pour projeter les images des cellules choisies sur une pellicule, afin d'un stockage et d'un examen subséquents. Cependant, cet agencement ne présente pas la capacité de mettre en corrélation la forme de la parti- cule avec le volume mesuré sur une base particule par particule. L'information de la forme ne peut être facile- ment qualifiée d'une façon rapide pour un traitement par calculateur, car la forme finale n'est rien de plus qu'une image sur une pellicule. Par ailleurs, les vitesses d'écoulement sont limitées à 5 m par seconde avec un maximum qui n'est que de 150 images par seconde, et alors seule- ment pour les particules qui sont pré-sélectionnées. Les vitesses typiques d'écoulement sont de 5 à 10 m -par seconde avec un taux de compte de particules de 1000 à 5000 particules par seconde. 2470377! Un orifice de détection d'impédance a été utilisé avec.en aval. une détection d'absorbance de lumière, une détection de lumière dispersée et une détection de lumière fluorescente, comme cela est révélé dans le brevet U.S. No. 3 710 933 au nom de Fulwyler et autres. Cependant, les types de mesures optiques effectuées en aval de l'orifice ne donnent pas l'information requise pour l'invention décrite ci-après. Dans d'autres agencements selon l'art antérieur, on a mesuré simultanément l'impé- dance et les signaux optiques ci-dessus mentionnés dans des cellules d'écoulement optiquement claires. Bien que les motifs de lumière dispersée soient affectés par la forme de la particule, cet effet ne peut ttre détecté et discerné que par un appareil extrêmement complexe avec une précision marginale, car il est masqué par la lumière dispersée créée par la lumière réfléchie, qui dépend principalement de la dimension de la particule, et la lumière réfractée qui dépend principalement des caractéristiques de transmission de lumière de la particule, c'est-à-dire l'absorption et l'indice de réfraction et la dimension. Diverses techniques d'exploration à fente pour analyser les particules au moyen d'un faisceau étroit de lumière sont connues, comme cela est illustré par un article intitulé "Imaging in Flow", de D.B. Kay et autres, publié par THE JOURNAL OF HISTOCHEMIETRY AND CYTOCHEMISTRY, Vol. 27, No. 1, (1979), pages 329-334. Selon un premier aspect de l'invention, on prévoit un appareil d'exploration de particules comportant un orifice pour les mesures d'impédance de particules individuelles en suspension dans un courant liquide, un moyen de focalisation pour focaliser de façon hydro- dynamique le courant de particules afin que les particules se déplacent le long d'une trajectoire prédéterminée à travers l'orifice, un premier moyen de courant électrique pour produire un courant électrique à basse fréquence à travers l'orifice afin de produire un premier signal 2470377. d'impédance électrique, l'appareil d'exploration de particules comprenant un moyen générateur de signaux, de préférence un moyen générateur de signaux optiques, pour produire un signal de longueur représentatif de la longueur de chaque particule et un moyen pour mettre ce signal de longueur en corrélation avec le premioe signal d'impédance correspondant pour chaque particule, cette production et cette mise en corrélation des signaux offrant tous les paramètres requis pour les calcuL pour obtenir l'information concernant la forme de la particule. Selon un second aspect de l'invention, on prévoit: un procédé d'exploration de particules o des particules individuelles ensaspension dans un courant liquide, sont hydrodynamiquement focalisées pour passer à travers un orifice pour mesurer l'impédance électrique, un courant électrique à basse fréquence passe par l'orifice afin de produire une première mesure d'impédance électrique, le procédé consistant à mesurer, de préférence par voie optique, la longueur de chaque particule tandis que la particule est hydrodynamiquement focalisée et à mettre en corrélation la première mesure d'impédance et la mesure de longueur pour chaque particule afin d'obtenir une information de la forme de chaque particule. - La présente invention est dirigée vers un appareil et un procédé d'exploration de particules o des particules en suspension dans uncourant liquide sont hydrodynamiquement focalisées pour passer à travers un orifice de détection d'impédance. Une source de courant à basse fréquence produit un courant à travers l'orifice pour produire un premier signal d'impédance, qui est à peu près représentatif de la dimension de la particule. Une source de courant à haute fréquence produit un courant dans l'orifice afin de produire un second signal d'impédance, qui est principa- lement représentatif de la résistanceinterne de la particule, qui, à son tour, dépend de la dimension, de la forme, de l'orientation et de la résistivité interne de la particule. Un moyen de détection produit un signal électrique de temps 2470377! de portée représentatif de la longueur de chaque particule, qui est utilisé pour corriger la mesure de dimension inhérente dans le premier signal d'impédance afin de donner des mesures précises de forme et de volume, essentiellement indépendantes de la forme de la particule. Avec les mesures précises de forme et de volume, une détermination précise de la résistivité d'une particule peut ttre extraite des mesures de résistance interne inhérentes au second signal d'impédance. La détermination de la résistivité d'une particule sur une base particule par particule a une grande valeur comme nouveau moyen de description-pour analyser et identifier des cellules biologiques. Dans les dispositifs selon l'art antérieur, il était possible d'utiliser le second signal d'impédance pour mesurer la résistance interne de la particule, mais cette mesure n'a pas de signification en elle-même. Cela est dû au fait que la mesure cblarésistance interne varie non seulement avec la résistivité interne de la particule mais également avec sa dimension, sa forme et son orientation. De même, dans les dispositifs selon l'art antérieur, il était possible d'utiliser les premier et second signaux d'impé- dance pour mesurer l'opacité de la particule, mais cette mesure n'a pas d'interprétation directe en elle-même. Cela est dû au fait que la mesure d'opacité varie sensible- ment avec la forme, l'orientation et la résistivité interne de la particule. L'appareil et le procédé selon l'invention donnent, aux particules allongées, la même orientation le long d'une trajectoire prédéterminée pendant toute la production des signaux. Alors, la nouvelle combinaison des trois signaux produits permet l'extraction précise de la résistivité interne des particules, ce qui jusqu'à maintenant était impossible à obtenir par un système d'écoulement selon l'art antérieur. Par conséquent, on dispose d'un nouveau'moyen valable de description de particules pour la technique de la cytologieselon l'invention. Une nouvelle sous-combinaison de l'appareil et du procédé selon l'invention utilise un moyen détecteur optique pour déterminer le temps de trajectoire de la particule et par conséquent sa longueur. Cette nouvelle sous-combinaison trouve son utilité pour mesurer son facteur de forme, le volume réel et la forme naturelle ou déformer des pa&icules sur une base particule par particule, en utilisant que le premier signal d'impédance et le signal de temps de trajectoire ou de portée. L'invention sera mieux comprise et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaitront plus clairement au cours de la description explicative qui va suivre faite en référence aux dessins schématiques annexés donnés uniquement à titre d'exemple illustrant un mode de réalisation de l'invention et dans lesquels: - la figure 1 est une vue latérale en coupe trans- versale partielle et partiellement sous forme schématique de l'appareil selon l'invention; et - la figure 2 est un schéma des caractéristiques électriques d'une cellule biologique et du liquide o la cellule est en suspension. La figure 1 illustre un appareil d'exploration de particules 10 ayant un tube 12 d'introduction de l'échantil- lon, une gaine 14 placée coaxiale etÈi façon à entourer le tube 12, et un orifice microscopique 16 placé à l'extrémité de la gaine 14. Un courant liquide de particule individuelles ensuspension, provenant d'un réservoir sous pression (non représenté), passe par le tube 12. Une gaine laminaire de liquide, provenant d'un autre réservoir sous pression (non représenté), passe par la gàne 14 afin d'entourer le courant de particules. Tandis que le courant liquide de particules sort du tube 12, les pressions hydro- dynamiques réduisent le diamètre du courant de particules tandis que le courant prend la vitesse de la gaine liquide. La gaine liquide sert également à centrer le courant de particules afin que les particules traversent l'orifice 16 2470377' le long d'un axe central 18, avec les particules allongées, s'il y en a, ayant leur axe majeur aligné avec l'axe central 18. Après avoir quitté l'orifice 16, les particules entrent dans une chambre d'écoulement 20 remplie de liquide qui est définie partiellement par une cuvette optiquement claire ou transparente 22. La cuvette 22 est entourée d'un bottier en métal 24. De préférence, la chambre d'écoulement 20 contient un second liquide formant gaine formé par un tube d'entrée en métal 26. Du fait de la chibe de pression associée à l'orifice 16, il est souhaitable d'avoir une seconde gaine de liquide pour pduire des pressions hydrodynamiques suffisantes pour maintenir l'axe long ou majeur des particules, s'il y en a un, en alignement avec l'axe central 18 et pour faire passer les particules par la chambre d'écoulement 20 et une tubulure de sortie Z7. Si les particules sont déformées tandis qu'elles passent par l'orifice 16, la seconde gaine de liquide aide à produire les forces hydrodynamiques nécessaires pour maintenir le même degré de déformation pendant la mesure optique subséquente que l'on décrira ci- après. Cet agencement d'exploration des particules décrit ci-dessus est de conception traditionnelle et est indiqué en détail dans le brevet U.S. No. 3 710 933 au nom de Fulwyler et autres. Cet agencement est légèrement modifié par l'inclusion d'une séparation 28 retardant le fluide, qui sépare la chambre 20 remplie de liquide d'une chambre 29 remplie d'air. Bien que les particules soient illustrées comme passant le long de l'axe central 18, d'autres trajectoires sont possibles. Par exemple, le courant de particules peut 'tre introduit le long d'une trajectoire prédéterminée qui passe par l'orifice 16 et forme un angle avec l'axe central 18. La caractéristique importante et commune de toutes les trajectoires possibles est que la pression hydrodynamique maintienne l'axe long ou majeur des partbules aligné avec la trajectoire prédéterminée, que cette trajectoire soit ou non l'axe central 18. 247037Z Une source de lumière 30, de préférence un laser -rouge, produit un faisceau de lumière collimaté 32 sur une première lentille cylindrique 34. La lentille cylin- drique 34 re-dirige la lumière en un faisceau 36 "en:6rme de fente" qui vient sur un foyer en ligne 38 horizontale- ment aligné sur l'axe central 18. La lumièreaprès passage par le foyer 38, est arrêtée par une pièce 39. La lumière dispersée, représentée par les rayons de lumière 41, est interceptée par un détecteur 42, de préférence un dispositif photoélectrique. En vertu de cet agencement, le temps de trajectoire ou de portée de chaque particule individuelle peut ttre déterminé. Plus particulièrement, l'extrémité menante de la particule dispersera initialement la lumière, et la particule continuera à disperser la lumière jusqu'au passage de son extrémité arrière par le faisceau de lumière. Le foyer 38 est placé juste en dessous de l'orifice 16 pour que, si les particules svnt déformées ou sont naturellement allongées, les forces hydrodynamiques soient suffisamment fortes pour maintenir l'alignement et la déformation s'il y en a, de la cellule lors de son passage par le foyer 38. La distance entre l'orifice 16 et la tubulure de sortie 27 est quelque peu exagérée sur la figure 1 afin de mieux illustrer les mesures optiques. Bien que la détection d'impédance et la détection optique soient entreprises en des positions différentes sur l'axe central 18, elles peuvent être mesurées simultanément en utilisant des cellules d'écoulement connuestransparentes à la lumière. Le signal électrique à la sortie du détecteur 42 est traité par un circuit 43 de durée des impulsions, d'une construction traditionnelle, qui permet d'obtenir un signal souhaité représentatif de la durée, dans le temps, pendant laquelle une partie de la particule s'est trouvée dans le faisceau 36, ou, en d'autres termes, son temps de trajectoire. Un tel circuit est représenté dans le brevet U.S. No. 3 890 568 au nom de Coulter et autres. Comme les vitesses des particules lors de leur passage par le foyer 38 peuvent etre prédéterminées, on peut utiliser un 2470377 J calculateur numérique 44 pour mettre chaque temps de trajectoire d'une particule en corrélation avec sa longueur le long de son axe majeur. Le tube 12 d'introduction de l'échantillon, composé d'un matériau conducteur de façon appropriée, sert, dans le mode de réalisation préféré, d'électrode en amont pour l'orifice 16 de détection de l'impédance. Le tube 26 d'entrée est de même formé en un matériau conducteur de façon appropriée et sert d'électrode en aval pour l'orifice 16. Le tube formant gine 14 est composé d'un matériau non conducteur approprié. L'orifice 16 est formé dans une pastille en saphir 45 placée à l'extrémité du tube 14. Comme l'orifice 16 forme la seule connexion de fluide entre le tube 12 et le tube 26, un champ électrique est établi dans l'orifice 16. Dans un agencement connu, une source 46 de courant à basse fréquence et une source 48 de courant à haute fréquence sont électriquement reliées au tube 12 d'introduction de l' échantillon par un conducteur 50 et au tube d'entrée 26 par un conducteur 52, maintenu au potentiel de la masse. La source 46 de courant à basse fréquence produit un courant continu à "fréquence nulle" ou un courant à une fréquence suffisamment basse pour que la partie réactive de l'impédance de la particule ait un effet négligeable sur la réponse de l'appareil 10, étant donné les temps typiques pris par la particule pour passer par l'orifice 16. Dans le cadre de la présente description, une source de courant à basse fréquence sera définie comme comprenant une source de courant continu. Le seul critère est que les signaux résultanit pouvant être attribués à la source à basse fréquence, quand les particules passent par l'orifice 16, soifrt principalement proportionnels à la dimension de la particule. La source 48 de courant à haute fréquence produit un courant dans l'orifice 16 en même temps que le courant de la source 46, dont la fréquence est dans le spectre des hautes fréquences ou même plus. Les deux sources 46 et 48 produisent chacune des signaux identifiables capables d'une détection séparée quand la particule pasoe parl'orifice 16. un signal étant un signal à basse fréquence (LF) dû presque totalement à la dimension des particules, l'autre étant un signal à haute fréquence (RF) (défini comme étant au-dessus de 1 MHz) qui est dé non seulement à la dimension, mais également aux effets combinés de la dimension, de la forme, de la résistivité et de la réactance de la particule. Ces signaux de sortie sont appliqués par les conducteurs 50 et 52 à un moen détecteur traditionnel 54. Le moyen détecteur 54 comprend un détecteur 56 des signaux à haute fréquence et un détecteur 58 des signaux à basse fréquence, chacun des détecteurs 56 et 58 recevant les signaux par les conducteurs 50 et 52. Un premier signal d'impédance S (LF) produit par le détecteur 58, est d'une nature se rapportant principalement à la dimension des particules. Le détecteur 58 comporte typiquement des amplificateurs, des-filtres et autres circuits bien connus que l'on trouve couramment dans un compteur Coulter commercialisé, avec en plus un moyen tel qu'un filtre passe-bas, pour empecher les signaux à haute fréquence de saturer le circuit. Si la basse fréquence n'est pas nulle, un circuit de démodulation est alors incorporé. Le détecteur 56contient un moyen de détection de modulation d'amplitude pour démoduler le signal à haute fréquence afin de produire un second signal d'impédance S(RF) du type pulsé. Le détecteur 56 peut comporter des filtres, des amplificateurs, des démodulateurs et autres circuits connus. Les structures des sources de courant 46 et 48 et du moyen de détection 54 sont bien connues et leur construction détaillée est révélée dans les brevets U.S. No. 3 502 974 et No. 3 502 973 au nom de Coulter et autres. La chambre 29 remplie d'air forme un espace d'air entre la solution de l'électrolyte en amont de l'orifice 16 et la solution del'électrolyte en aval de cet orifice, réduisant ainsi les pertes de courant à haute fréquence. Pour le premier signal d'impédance S (LF)>le second 2470377 1 signal d'impédance S (RF), et le signal du temps de trajectoire ou de portée t à la sortie du circuit 43 de durée de l'impulsion, le calculateur 44 met les signaux sous forme numérique, les met en corrélation sur une base particule par particule et les mémorise dans sa mémoire. Dans le mode de réalisation préférX les signaux optiques a nt produits en un emplacement en dessous de l'emplacement o sont produits les signaux d'impédance. Par conséquent, il y a un retard entre le moment o les premier et second signaux d'impédance produits d'abord sont produits et lemoment o est produit le signal de longueur. La capacité de mémorisation de données du calculateur numérique 44 tient facilement compte de ce retard et permet aux trois signaux d'être mis en corrélation pour chacune des parti- cules. Alternativement, un circuit en matériel peut être utilisé pour produire un moyen retardateur pour les signaux d'impédance afin de permettre aux trois signaux d'être mis en corrélation, comme cela est indiqué par le brevet U.S. no. 3 976 862 au nom de Curbelo. Pour une meilleure *visualisation des calculs faits par le calculateur 44, ce dernier est divisé en un premier moyen 60 formant mémoire, mioeen corrélation et de calcul et un second moyen 62 formant mémoire, miseen corrélation et de calcul. Une version de circuit électrique en matériel du calcula- teur 44 est possible, et aura ces unités séparées. Cependant, il est préférable d'utiliser le calculateur numérique 44 avec commande de programme mémorisée. Le moyen de calcul 60 reçoit le signal d'impédance S (LF) et le signal t de temps ou durée de trajectoire ou de Axée, et, à partirde ces signaux, il tient compte de la forme de chaque particule et modifie le signal d'impédance S (LF) pour obtenir une mesure réelle du volume vp et une mesure du rapport de chaque longueur à chaque largeur d'une particule (a/b). Le moyen de calcul 60, qui ne nécessite pas le signal d'impédance S (RF), produit lui même un signal utile de sortie, car les signaux d'impédance S (LF) peuvent être corrigés pour réfléchir le volume réel vpet le rapport de la longueur à la largeur a/b est en corrélation avec la déformation de la particule. Par ailleurs, la présente invention concerne un nouveau moyen détecteur optique, utilisant le faisceau 36 en forme de fente, pour déterminer le signal de temps de trajectoire t. Le moyen 60 calcule également un facteur de forme f à partir du signal de temps de trajectoire t et du signal d'impédance S (LF) et le fait passer au moyen de calcul 62. Le moyen 62 reçoit une nouvelle combinaison de signaux pour chaque particule, se composant du signal d'impédance S(RF), du signal d'impédance S (LF) et d'un facteur de forme f qui, à son tour, à été calculé à partir du signal d'impédance S (LF) et du signal t de temps de trajectoire dans le moyen 60. Le moyen 62 met les signaux sous forme numérique, les met en corrélation sur une base particule par particule, et les mémorise. A partir de la combinaison uniquede tous ces signaux d'entrée, le moyen 62 peut calculer la résistivité internefPi sur une base particule par particule. Un moyen de corrélation 64 met en corréla- tion la mesure du volume réel vp, la mesure du rapport a/b et la résistivité interne i pour chaque particule individuelle et un moyen de lecture 66 imprime et/ou affiche les données accumulées. Le processus mathématique pour effectuer les calculs ci-dessus sera donné ci-après. Tandis que la présente invention est destinée à couvrir les particules en général, plus particulièrement, le terme particule comprend des particules entourées d'une membrane que nous appelerons cellules. Les cellules peuvent par exemple être des cellules biologiques ou des cellules artificielles entourées d'une membrane. La figure 2 représente un schéma de circuit connu des caractéristiques électriques d'une cellule et de son liquide de suspension l'entourant, et elle n'est présentée ici que pour aider à la compréhension. La cellule est représentée par un contour en pointillés 68. Les diverses valeurs desrésistancesélectriquesR en ohms, que l'on décrira ci-après, sont en rapport avec les valeurs de résistivité électrique e des matériaux ou solutions 24703'77 spécifiés par des équations bien connues. La résistivité r qui est l'inverse de la conductivité 5 est généralement mesurée en ohmscentimètres. Les valeurs de résistivité de ?el fm et ri désignent la résistivité de l'électrolyte liquide en suspension entourant la cellule, de) amembrane de la cellule et des constituants internes de celle-ci,, respectivement. Par conséquent, un circuit 70 comprend un circuit en série d'une résistance R1(ée), d'une résistance R2(?e) et d'une résistance R3(?e), chacune représentant une partie du liquide de suspension. En parallèle avec la résistance R2(ee) se trouve un circuit 72 représentant la cellule. Le circuit 72 comprend deux fois en série l'impédance de la membrane de la cellule, représentée par l'agencement en parallèle d'une résistance R4(em) et dune capacité Cl, etd'ure une résistance R5 (om) etd'une capacité C2, les deux impédances étant supposées être égales. En série entre ces deux impédances est inter- posée une résistance interne R6(pi). Cette résistance interne R6(?i) s'est révélée être importante pour examiner les cellules. La trajectoire prédéterminée 74 est illustrée comme étant alignée avec l'axe long de la cellule. Dans le mode de réalisation illustré sur la figure 1, la trajectoire prédéterminée sera le long de l'axe central 18. L'écoulement de courant est supposé être parallèle avec la trajectoire prédéterminée 74. Pour l'illustration, on imagine maintenant que la cellule tourne. Si la cellule possède un axe long et si cet axe forme progressivement un angle par rapport à la trajectoire prédéterminée 74, la résistance interne R6(e,) diminue progressivement. Par conséquent, on a trouvé que pour comparer la valeur de résistance R6(pi) de différentes cellules, l'orientation devait ttre la même pour chaque cellule au moment de la mesure. A partir des concepts ci-dessus pris sur un modèle qui ne sera pas plus amplement développé ici, la mesure de la résistivité Pi de la cellule dépend de sa forme et de son orientation. Par conséquent, la forme réelle de la cellule doit être 2470377.] déterminée et l'orientation maintenue afin de calculer la résistivité interne de la cellule à partir des para- mètres mesurés. Cela est rendu plus difficile par le fait que la résistivité de la membrane 9m est bien supérieure en grandeur que la résistivité interne,i' bien que cette résistivité interne fi soit typiquement supérieure, en grandeur, à la résistivité du liquide ee. Du fait de la combinaison unique des signaux dans l'appareil 10, la résistivité interne ei peut être déterminée sur une base cellule par cellule. On décrira ci-après le processus mathématique pour déterminer la résistivité interne ei ou son inverse, la conductivité interneS. Comme cela deviendra évidenttsi le facteur de forme f peut ttre déterminé, la résistivité interne ei ou son inverse, la conductivité6,i' peut être déterminée. De plus, le signal d'impédance S (LF) peut ttre corrigé pour réfléchir le volume réel vp. Le signal d'impédance S (LF) est en rapport avec le volume réel vp par le facteur de forme f selon l'équation qui suit: S(LF) = pr E(LF) (1) Le signal d'impédance S(RF) est en rapport avec le volume réel vp par le facteur de forme f selon l'équation qui suit: (30 I-t/8) 'iF- (IF) S (RF) = P- vp I.(/pv). (2) 2470377 J L'opacité Op est obtenue comme suit S(RF) ( e/À) (F Op = = a (3) P S (L F) [t (pe/gI) (t) E (L F) La présentation qui suit décrit un procédé pour dériver les équations 1 et 2. La particule est supposée avoir une configuration en ellipsoïde allongé. Ensuite, l'équation de Laplace- est résolue en coordonnées ellipsoïdes pour la particule, l'axe long de la particule ellipsoïdale simulée étant défini comme axe de coordonnée z, l'axe z étant parallèle au champ électrique et à l'écoulement de courant dans l'orifice. D'abord, le théorème de Green qui donne une intégrale du volume en termes d'une intégrale de surface peut ftre écrit comme suit, quand aucune charge n'est présente db\ 0 (4 i ( dIdh d n) d 0 4 o 0 est la distribution de potentiel lié à l'extérieur de la particule et n est un vecteur externe perpendiculaire à la surface s. Ensuite, la surface de l'orifice 6 est intégrée pour donner l'intégrale de surface qui suit i = R Evo = SO vo (5) o AR est le changement de la résistance R de l'orifice quand une particule est présente, E est la force du champ électrique en tout point à l'intérieur de l'orifice, v0 est le volume effectif de l'orifice et S(E) est le signal d'impédance mesurée. Le potentiel sur la surface de la particule peut être donné par la solution de l'équation de Laplace avec les conditions limites qu'il y eat un potentiel à travers la membrane et une continuité de courant à travers celle-ci. Alors, il existe la relation qui suit: (6) o1, 2 et f 3 sont les coordonnées ellipsoïdes. Les autres termes de l'équation ci-dessus sont définis comme suit: F(C) =(a a2) (7) (8) A =[b_) (a a) 8 O R (9) [ 9(U) = É((u+a2) (U+ b 2 ( o a, b et c sont l'axe semi-long, semi-court et semi- court de l'ellipsoïde allongé respectivement. Le terme u est une coordonnée généralisée. Le terme i 1 est égal à l'intégral de surface de la particule divisée par 4, 2470377 - ce qui donne = 4-Tr x1 (11) a1 son tour est défini en appliquant des conditions limites appropriées sur la description du potentiel à l'intérieur et à l'extérieur de la cellule. MtI -f V - s=+ =O ( vO) 1-**** (14) (15) -00 a, b.C dul Jo Fu) * R(u) (13) S(E) =f - I + (P, /PO - (f - 1) ffl - R (U 1 - -i ). Et(q), (\/, /O - (1 - Pe /Pl e/pi (12) I.- 'e/pr). (r - 1) 24703?Z7 o Piet De sont les résistivités interne et externe de la cellule respectivement, V est le potentiel de la membrane (désignée par l'indice "mi") aiupôles(désign par la lettre "o") de l'ellipsoïde aligné avec la direction du courant. Il faut maintenant examiner les conditions limites pour l'équation (14). La première condition limit-est l'application de la source de courant à basse fréquence 46 qui produit dans l'orifice 16, un champs électrique E(LF). Cela conduit aux résultats qui suivent: /m=#"-a ' E (L F) (16) o S(E) = S(LF) et E = E(LF). En conséquence: S(LF). ((Pvo) E (LF) (17) En se référant aux figures 1 et 2, cette première condition limite signifie que, pour l'application de la source de courant à basse fréquence 46, les capacités C1 et C2 produisent des impédances si élevées qu'elles agissent sensiblement comme des circuits ouverts. Par conséquent, la résistance interne d'une cellule n'est pas détectable du fait de la forte résistivité de sa membrane. La seconde condition limite pour l'équation (14) est l'application de la source de courant à haute fréquence 48, qui produt dans l'orifice, un champ électrique E(RF). Si la fréquence est suffisamment élevée, par exemple 30 MHz, cela conduit aux résultats qui suivent: Vrn (18) o S(E) = S(RF) et E = E(RF). 2470377. En conséquence S(R) /V *)k/E(A)(19) En se réfèrant aux figures 1 et 2, cette seconde condition limite signifie que pour l'application de la source de courant à haute fréquence 48, les capacités Cl et C2 forment sensiblement un court-circuit pour servir de shunts autour des résistances très élevées de la membrane. En conséquence, la résistivité interne de la cellule est facilement mesurée. Maintenant, l'opacité est calculée, ce qui conduit à la relation qui suit op= s (20) O>SCL F) I(tPX) ? '}(F en se réfèrant à l'équation (20), on connait toutes les variables à l'exception du facteur de forme f et de la résistivité interne P.. Par conséquent, si l'on peut déterminer le facteur de forme f, la résistivité interne i peut ttre calculée. Cela peut btre accompli par le développement des relations qui suivent. Le volume réel vp de la cellule et la longueur a sont en rapport avec le facteur de forme f, si les axes semi-courts b et c sont égaux, par les équations qui suivent b = ' "(21) a (22) 24703.7 c _osh- r pou D > (23) m2-l( (rn-l En conséquence, les équations (17) et (23) donnent deux équations simultanées non linéaires pour trouver le facteur de forme f et le volume réel vp. Les calculs pour obtenir ces deux termes peuvent ttre accomplis avec juste le signal d'impédance S(LF) et la durée de trajectoire t, qui donne la longueur de particule a. Dans l'équation (21) on suppose que la particule est de forme ellipsoïde. Comme le montre la figure 1,le facteur de forme f et le volume réel vp sont calculés dans le moyen de calcul 60. Ayant résolu en fonction du facteur de forme fl'équation (20) peut être résolue par le moyen de calcul 62 pour trouver la résistivité interne Pi sur une base cellule par cellule. Ce calcul nécessite la réception du signal d'impédance S(RF), du signal d'impédance S(LF) et du facteur de forme f. Une autre façon pour obtenir electroniquement la longueur d'un axe long d'une particule est révélée dans le brevet U.S. No. 3 793 587 au nom de Thom et autres. Bien que la présente invention comprenne un nouveau moyen détecteur optique pour obtenir la longueur des particules, la même détermination de longueur peut ttre faite, bien qu'avec moins de précision, par l'agencement à deux orifices du brevet de Thom. Ayant obtenu la longueur de la particule par un moyen de détection électronique connu ou par le nouveau moyen de détection électronique optique, une nouvelle combinaison de signaux reçus, consistant en signal d'impédance S(LF), signal d'impédance S(RF) et longueur de particule, permet la détermination de la résistivité interne de la cellule Pi. L'un des deux orifices du brevet de Thom a une longueur axiale du même ordre de grandeur que les longueurs des particules ou plus petite que les longueurs des particules. La durée de l'impulsion 2470377i créée par la particule est en corrélation avec la longueur de la particule. Par conséquent, le terme "moyen de détec- tion" pour déterminer la longueur de la particule est des- tiné à couvrir un moyen de détection optique, comme l'utilis&ion du flaisceau en forme de fente 36, ainsi qu'un moyen de détection électronique, comme l'orifice du brevet de Thom qui a une courte longueur axiale. Les changements électriques provoqués par les particules se produiront dans les confins effectifs de l'orifice 16, définis comme zone de détection ou étendue d'exploration. Comme cela est décrit en détail dans le brevet U.S. No. 3 890 568 au nom de Coulter et autres, la zone de détection s'étend sensiblement au-delà de la longueur axiale de l'orifice 16. Pour la présente demande, la zone de détection sera définie comme comprenant la région autour de l'orifice 16 o l'intensité du champ électrique est d'au moins 1% ou plus de celle dans la région centrale à l'intérieur de l'orifice 16. On comprendra que l'agencement d'écoulement avec la chambre 20 comme cela est représenté dans le brevet U.S. No. 3 710 933 au nom de.Fulwyler et autres, ne représente que l'un des nombreux agencements possibles d'écoulement que l'on peututiliser pour la mise en pratique de l'invention,et que cette invention n'est pas limitée à cette structure. Il est envisagé que l'invention puisse être utilisée avec tout agencement d'écoulementtraversant, o les particules sont hydrodynamiquement focalisées pour passer à travers un orifice de détection d'impédance. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée au mode de réalisation décrit et représenté qui n'a été donné qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits, ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre de la protection comme revendiquée. 24703'7 i R E V E N D I C A T I 0 N S 1. Appareil d'exploration de particules du type comprenant un orifice pour des mesures de l'impédance de particules individuelles en suspension dans un courant liquide, un moyen de focalisation pour focaliser hydro- dynamiquement le courant de particules afin que lesdites particules passent le long d'uoetrajectoire prédéterminée à travers ledit orifice, un premier moyen de courant électrique pour produire un courant électrique à basse fréquence dans ledit orifice afin de produire un premier signal d'impédance électrique, caractérisé par un moyen générateur de signaux, de préférence un moyen générateur optique de signaux (30, 34, 39, 40, 42, 43) pour produire un signal de longueur (t) représentatif de la longueur de chaque particule et un moyen (44) pour mettre ledit signal de longueur et le premier signal d'impédance de chaque particule en corrélation, la production et la mise en corrélation desdits signaux donnant tous les paramètres requis pour les calculs pour obtenir l'information concer- nant la forme d'une particule. 2. Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que le moyen générateur de signaux précité comprend un moyen générateur optique de signaux (30, 34, 39, 40, 42, 43) pour produire un faisceau étroit (36) de rayonnement afin d'intercepter chaque particule tandis que ladite particule est hydrodynamiquement focalisée et pour produire le signal de longueur (t) précité représentatif de la durée du passage de la particule à travers ledit faisceau étroit. 3. Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que le moyen générateur de signaux précité comprend un moyen générateur optique (30, 34, 39, 40, 42, 43) ou un moyen générateur de signaux de détection d'impédance et en ce qu'il comprend de plus un second moyen de courant électrique (48, 56) pour produire un courant électrique à 2470377} haute fréquence à travers l'orifice (16) précité afin de produire un second signal d'impédance électrique (SRF) et un moyen (44) pour mettre en corrélation le premier signal d'impédance (SLF) précité, ledit second signal d'impédance (SRF) et le signal de longueur (t) précité pour chaque particule pour la détermination de la résis- tivité interne "Pi) de chaque particule. 4. Appareil selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par un moyen de calcul (60) pour calculer un facteur de forme (f) à partir du premier signal d'impédance (SLF) précité et du signal de longueur (t) précité pour chaque particule.,% 5. Appareil selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par un moyen de calcul (60) utilisant le premier signal d'impédance (SLF) précité et le signal de longueur (t) précité, pour corriger une mesure de dimension basée sur ledit premfr signal d'impédance afin de tenir compte de la forme de la particule, pour donner une mesure du volume réel (vp) pour chaque particule. 6. Appareil selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par un moyen de calcul (.60) pour calculer le rapport(a/b) de la longueur et de la largeur de la particule, ledit rapport donnant une indication de la forme de ladite particule. 7. Appareil selon l'une qurlconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les particules précitées se composent de cellules. 8. Procédé d'exploration de particule o des parti- cules individuelles, en suspension dans un courant liquide, sont hydrodynamiquement focalisées pour passer à travers un orifice pour mesurer l'impédance électrique, un courant électrique à basse fréquence traverse ledit orifice pour produire une première mesure d'impédance électrique, caractérisé en ce qu'on mesure, de préférence par voie optique, la longueur de chaque particule tandis que ladite particule est hydrodynamiquement focalisée et on met 2470377 a en corrélation la première mesure d'impédance et la mesure de longueur pour chaque particule afin d'obtenir une information de la forme de chaque particule. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'étape précitée de mesurer la longueur de chaque particule consiste à mesurer optiquement ou électronique- ment la longueur de chaque particule, et en ce qu'on fait passer un courant électrique à haute fréquence à travers l'orificeprécité pour produire une seconde mesure d'impé- dance électrique, on met en corrélation la première mesure d 'impédance précitée,ladite seconde mesure d' impédance et la mesure de longueur précitée pour chaque particule et on calcule la résistivité interne de chaque particule.