Brevet FR2466454A1 — publié le 19810410

L'invention est relative à de nouveaux peptides ayant des propriétés biologiques, notamment immunostimu- lantes. Elle concerne plus particulièrement des peptides de petite taille comportant une séquence peptidique en commun avec la bradykinine. L'invention est aussi relative à des peptides dérivés de la bradykinine. Celle-ci est quelquefois visée ci-après par l'abréviation "Bk". Sa formule peut être re- présentée comme suit: Arginine -- proline --> praline --> glycine > henylalanine - sérine - proline - phenylalanine - àrginine - (le sens des flèches indique la direction de la liaison peptidique: de l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale). Cette nomenclature sera également adoptée dans ce qui suit en ce qui concerne la représentation des formules des peptides selon l'invention. Dans l'une de ces premières variantes, l'inven- tion concerne un peptide comportant au plus sept amino- acides, caractérisé en ce qu'il contient une séquence prolyl - prolyl. glycyle, le groupe carboxylique du résidu glycyle étant le cas échéant engagé dans une liaison peptidique avec un autre résidu aminoacyle. Avantageusement ce peptide contient une séquence prolyl prolyl > glycyl - phénylalanyle. L'invention concerne plus particulièrement ceux de ces peptides dans lesquels le susdit résidu phényl- alanyle porte l'extrémité C-terminale du peptide. L'invention concerne plus particulièrement encore un peptide tel que cidessus défini dans lequel le groupe aminé du premier résidu prolyle de la susdite séquence prolyl - prolyl -p' glycyle est engagée dans une liai- son peptidique avec un résidu arginyle, lysyle ou histidyle. Les composés préférés de la série qui précède sont constitués par des pentapeptides dont les représentants préférés peuvent être caractérisés par les formules sui- vantes: Arginyl. prolyl -> prolyl--. glycyle phenylalanyle Lysyl - prolyl -. prolyl -4 glycyl - phenylalanyle Histidyl - prolyl - prolyl. glycyl \ phénylalanyle. Une classe préférée des peptides selon l'inven- tion est aussi constituée par celle dans laquelle le résidu aminoacyle Nterminal est constitué par un résidu lysyle ou h-istidyle. Le premier de ces pentapeptides est donc consti- tué des mêmes résidus aminoacyle que ceux de la séquence des cinq premiers aminoacides de la bradykinine, d'o la désignation "1-5" utilisée quelquefois dans ce qui suit pour le désigner. Les deux autres pentapeptides diffèrent du pre- mier par la nature du premier résidu aminoacyle (C-terminal), la lysine pour le second, la histidine pour le troisième, d'o les abréviations "L5" et "H5" qui seront utilisées pour les désigner quelquefois dans ce qui suit. Le cas échéant,-les peptides selon l'invention tels qu'ils ont été définis ci-dessus, comportent un ou deux résidus aminoacyle supplémentaires, notamment tels que lysyle et/ou méthionyle, reliés notamment aux résidus amino- acyle N-terminaux des susdits peptides par l'intermédiaire de liaisons peptidiques. L'invention concerne également, selon une seconde de ses variantes, des dérivés-de la bradykinine constitués par des peptides plus longs, comportant notamment la tota- lité de la séquence peptidique de la bradykinine et un ou deux résidus aminoacyle supplémentaires, tels que lysyle et ou méthionyle, respectivement reliés par l'intermédiaire 2466454' de liaisons peptidiques au résidu N-terminal de la brady- kinine, en l'occurrence le résidu arginyle N-terminal. A titre d'exemples préférés de ces peptides déri- vés dela bradykinine, on citera: 1 ) la lysine bradykinine (LBk) Lysine >, arginine - proline y proline - glycine - phénylalanine -, serine ' proline phenylalanine -- arginine 2 ) la méthionine lysine bradykinine (MLBk) Méthionine -> lysine -, arginine - proline - glycine --> phenylalanine y serine > proline -- phenylalanine - arginine, Le résidu arginyle N-terminal peut le cas échéant être remplacé par un autre résidu aminoacyle, tel que lysyle ou histidyle. Il en est le cas échéant de même du cinquième résidu aminoacyle de la bradykinine et des sui- vants, en l'occurrence du premier résidu phénylalanyle à partir de l'extrémité N-terminale de la bradykinine et des suivants. Les résidus aminoacyle successifs des peptides selon l'invention sont de préférence tous constitués par leurs isomères lévogyres, à l'exception des résidus glycyle qui ne sont pas susceptibles de former des isomères respec- tivement dextrogyres et lévogyres. Les peptides selon l'invention sont de préférence obtenus par synthèse peptidique, notamment selon la méthode décrite par R.B. MERRIFIELD, dans l'article intitulé "Solid Phase Peptide Synthesis. I The Synthesis of a Tetrapeptide" (Synthèse Peptique en Phase Solide. I La Synthèse d'un Tétrapeptide), (J.Am. Chem. Soc. 45 (1963),2149-2154). L'invention concerne également les dérivés fonction- nels physiologiquement acceptables de ces peptides, notam- ment les sels d'acides ou d'amine qu'ils peuvent former avec des acides ou bases physiologiquement acceptables, ou des dérivés de substitutions du type amide ou ester, pour ce qui est de l'acide aminé C-terminal, ou dérivés du type sel d'ammonium ou amine secondaire ou tertiaire, pour ce qui est de l'acide aminé N-terminal. Elle concerne également plus particulièrement les compositions pharmaceutiques administrables à l'homme ou à l'animal, contenant à titre de principe actif l'un au moins des susdits peptides en association avec un véhicule pharma- ceutiquement acceptable. D'autres caractéristiques de l'invention ressorti- ront encore de la description qui suit des propriétés biolo- giques de quelques uns des peptides selon l'invention consi- dérés à titre d'exemple. I - Augmentation de la survie des souris à une infection par Listeria monocytogenes après traitement par Bk, LBk et MLBk. Les souris de quatre groupes de Il animaux ont reçu, par voie intraveineuse, soit uniquement 0,5 ml d'une solution apyrogène de ClNa 0,15 M, soit 0,5 ml de la même solution con- tenant 10-4 M de Bk, de LBk ou de MLBk. Douze heures plus tard, chaque groupe est divisé en deux lots de cinq et six souris. Les souris du premier lot ont reçu, par voie intraveineuse, 1,2 x 105 Listeria monocytogenes et celles du second 0,6 x 105 Listeria monocytogenes. Le tableau suivant résume les résultats obtenus. Il apparaît clairement que, contrairement aux animaux témoins qui sont tous morts à la 72ème heure, la résistance des souris trai- tées par Bk et, plus particulièrement, celle des animaux trai- tés par LBk et MLBk est très augmentée. _Traitement _ _Nombre d'animaux survivants aux heures des mt Listeoria indiquées après l'infection par des. s LListeria monocytogenes 48 58 72 96 120 144 ClNa 0,15 M 1,2 x 105 5 0 0 0 0 0 I.V. 0,6 x 105 6 2 0 0 0 0 -145 Bk 104 M 1,2 x 105 5 3 0 0 0 0 I.V. 0,6 x 105 6 5 4 2 2 2 Lys Bk 10-4 M 1,2 x 105 5 5 4 3 3 3 I.V. 0,6 x 105 6 6 6 5 5 5 Met Lys Bk 1-4 M 1,2 x 105 5 5 5 4 4 4 I.V. 0,6 x 105 6 6 6 5 5 5 II - Diminution de la multiplication de Listeria monocytogenes dans le foie et la rate des souris traitées par Bk, LBk et MLBK. Les souris de quatre groupes de 4 animaux ont été trai- tées dans les mêmes conditions que précédemment. Douze heures plus tard, les souris sont toutes inoculées, par voie intravei- neuse avec 1,3 x 105 Listeria monocytogenes. Le tableau suivant résume les résultats obtenus. A nou- veau, les souris traitées par les kinines et, plus particulière- ment, par LBk et MLBk présentent, dans leur rate et surtout dans leur foie un nombre de Listeria jusqu'à 500 fois moins im- portant que dans le foie des animaux témoins. 2466454 1 III - Accélération de l'épuration sanguine de Salmonella typhimurium chez les souris traitées par Bk, LBk et MLBk. L'augmentation du pouvoir bactéricide des macropha- ges s'accompagnant toujours d'une augmentation de leurs capa- cités d'ingestion, on a cherché à mesurer celle-ci avec Salmonella typhimurium qui nécessite pour sa phagocytose, au contraire de Listeria monocytogenes, des anticorps opsonisants ou une stimulation importante des macrophages hépatiques-. Pour cela, les souris ont été traitées dans les mêmes conditions que dans l'expérience précédente mais ont été inoculées avec 2 x 107 Salmonella typhimurium par voie intraveineuse. Les résultats rapportés dans le tableau suivant montrent que la bactériémie est de 5 à 10 fois moins élevée que chez les animaux témoins. Nombre de Listeria trouvées dans Traitement le foie et la rate des souris des souris souris Rate Foie ClNa 0,15 M 7 x 107 +2,41 3,9 x 107 - 2,36 Bk 10-4 M 3,1 x 107 - 1,06 p souris: Listeria monocytogenes et Salmonella typhimurium. IV - Diminution de la multiplication de Listeria monocytogenes dans la rate et accélération de l'épuration sanguine de Salmonella typhimurium chez les souris traitées par les peptides "(1-5)", "L5", "H5". Ces peptides ont été injectés à la souris à la dose de 0,5 ml d'une solution de 10-4 M. Les souris ainsi traitées ont été, dans les mêmes conditions que précédemment (II et III), infectées avec L. monocytogenes et S. typhimurium. Les résultats ont été les suivants: V - Augmentation de la résistance des souris traitées par les peptides selon l'invention envers une des tumeurs les plus malignes de la souris: le carcinome de Lewis (3LL). Cette tumeur est entretenue au laboratoire ainsi qu'il l'a été décrit (Fauve, R.M. et Hevin, B., Ann. Immunol. (Inst. Pasteur), 1977, 128C, 923-928). Brièvement, les cel- lules 3LL sont cultivées dans du milieu de Eagle supplémenté par 15 % de sérum foetal de veau et, après lavage et remise en suspension dans du milieu de Eagle sans sérum, injectées à raison de 105 cellules sous un volume de 50 pl dans le coussinet plantaire de souris C57B1/6. La différence entre les épaisseurs de la patte o se développe la tumeur et de la Traitement Nombre de L.monocytogenes Nombre de S.typhimurium des dans la rate des souris par ml de sang, 2 h après animaux 48 h après infection infection ClNa 0,15 M 7 x 107 + 2,4 1,20 x 106 + 0,28 1 - 5 3, 1x 107 + 1 p Dans tous les cas, les produits testés ont été in- jectés 24 heures après l'inoculation des cellules malignes et, 9 jours plus tard, après avoir mesuré l'épaisseur des pattes, la patte portant la tumeur est amputée et, 11il jours plus tard, soit 20 jours après l'inoculation des tumeurs, les animaux sont autopsiés et le nombre de noduloemétastasiques pulmonaires comptés. Le tableau suivant résume les résultats obtenus.- Les résultats obtenus sont considérés comme signi- ficatifs pour un p catif). Dans ces conditions, on constate que les animaux ainsi traités présentent une résistance augmentée envers le carci- nome de Lewis. Traitement des animaux Développement de la Nombre de métastases (10 souris par lot) tumeur pulmonaires ClNa 0,15 M 326 + 34 5,3 + 2,7 Bk 10- l4 M 243 47 p L5 295 25 p H5 272 -41 P 2466454' Les expérimentations dont les résultats ont été expo- sés ci-dessus font donc apparaître que les peptides selon l'invention possèdent des propriétés immunostimulantes non spécifiques, puisqu'ils sont, après injection à la souris, capables d'augmenter leur résistance envers des organismes aussi différents que les bactéries très virulentes pour la souris: L. monocytogenes, S. typhimurium et les tumeurs murines les plus malignes, dont le carcinome de Lewis est représentatif. L'effet immunostimulant est obtenu douze heures avant l'injection des bactéries et vingt-quatre heures après l'injection des cellules malignes. Les propriétés immunostimulantes de la bradykinine n'étaient pas connues à ce jour. Il en va a fortiori de même des peptides selon l'invention. On remarque l'activité particulièrement importante des pentapeptides testés, plus particulièrement de ceux dans les- quels le résidu aminoacyle N-terminal est constitué par la lysine ou l'histidine. Si les bradykinines modifiées (L Bk et ML Bk) exercent à des doses très supérieures à la dose active un certain effet hypotenseur, on a remarqué aucun effet semblable avec les pentapeptides, et ce même à des doses cent fois supé- rieures à celles mises en oeuvre dans les essais sus-décrits. Ces différents composés peuvent donc non seulement être utilisés comme réactifs de laboratoire, notamment à titre de référencesou d'étalonspour étudier la présence ou non de pro- priétés immunostimulantes non spécifiques dans des substances étudiées sous cet angle, mais encore comme principesactifs de médicaments. Cette dernière application est particulière- ment indiquée en ce qui concerne les peptides selon l'inven- tion comportant un nombre d'acides aminés inférieur à celui de la bradykinine. Il est intéressant,en ce qui concerne plus particuliè- rement le pentapeptide 1-5, de noter que celui-ci ne doit normalement pas entraîner d'accident de sensibilisation chez l'homme, puisqu'il pourrait, à la limite, être considé- ré comme un produit de dégradation de la bradykinine chez le mammifère. Les peptides selon l'invention peuvent constituer le principe actif de médicaments indiqués, notamment pour le traitement ou la prévention chez l'homme et l'animal des maladies infectieuses causées par des germes bactériens et même viraux, par exemple des infections du type tuberculose, pasteurelloses, brucelloses, listerioses ou infections à bactéries gram négatif. Ils peuvent également être utilisés pour le traitement de maladies dues à certains parasites présentant au cours de leur cycle une phase de passage dans la circulation sanguine ou lymphatique, par exemple le paludisme, la bilharziose et la filariose. Ils peuvent en- core être utilisés pour le traitement des toxi-infections et pour la prévention d'infections post-chirurgicales de toutes natures. Ils sont appropriés au traitement de celles des tumeurs dont le développement peut être inhibé par les produits actifs à l'égard du carcinome de Lewis. Les compositions contenant de tels peptides peuvent être administrées par voie intraveineuse, intra- musculaire ou sous-cutanée, en solution dans des véhicules pharmaceutiquement acceptables et stériles, telles que des solutions de sérum physiologique (solution saline ou sérum glucosé), à dès doses unitaires ini vivo de 0,3 à30 mg/kg, notamment de 1 à 10 mg/kg. Les agents actifs selon l'invention peuvent éga- lement être administrés par voie orale, lorsqu'ils sont as- sociés à des excipients solides ou liquides pharmaceutique- ment acceptables. Leur administration peut également être envisagée par voie rectale, lorsqu'ils sont associés à des excipients appropriés à ce mode d'administration. Ils peuvent également être administrés par voie externe, par exemple sous forme d'aérosol avec un véhicule approprié à ce mode d'administration, par exemple pour le traitement d'infections nasales. Les agents selon l'invention peuvent également être utilisés comme principes actifs de pommades, notamment lorsqu'ils sont appliqués à des traitements de cicatrisation externe. Ces pommades peuvent être réalisées de toutes façons en soi connues en ayant recours à des excipients pharmaceutiques de pommades, par exemple de la lanoline. La concentration en principe actif dans ces pommades est il normalement comprise entre 0,5 et 2 % en poids. Il va de soi que les indications de doses qui précèdent n'ont d'autre but que d'illustrer les possibi- lités d'utilisation de l'invention et qu'en fait la déter- mination de ces doses relèvera toujours de l'appréciation du clinicien. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés; elle en embrasse au con- traire toutes les variantes. REVENDICATIONS i - Peptide comportant au plus sept aminoacides, caractérisé en ce qu'il contient une séquence prolyl, prolyl > glycyle, le groupe carboxylique du résidu glycyle étant le cas échéant engagé dans une liaison peptidique avec un autre résidu aminoacyle. 2 - Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient une séquence prolyl - prolyl glycyl - phénylalanyle. 3 - Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce que le susdit résidu phénylalanyle porte l'extré- mité C-terminale dudit peptide. 4 - Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le groupe aminé du premier résidu prolyle de la susdite séquence prolyl -> prolyl--- glycyle est engagé dans une liaison peptidique avec un résidu arginyle, lysyle ou histidyle. - Peptide selon l'une quelconque des revendications i à 4, caractérisé en ce qu'il est formé d'un pentapeptide. 6 - Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le résidu aminoacyle N-terminal est constitué par un résidu lysyle ou histidyle. 7 - Peptide selon la revendication 1 de formule Arginyl - prolyl - prolyl > glycyl phényl- alanyle. 8 - Peptide selon la revendication 1 de formule: Lysyl > prolyl - prolyl -y glycyl, phénylalanyle. 9 - Peptide selon la revendication 1 de formule: Histidyl y prolyl > prolyl - glycyl -> phényl- alanyle. 10- Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que, à l'exception de la glycine, tous les résidus aminoacyle dont il est formé sont lévogyres. 11 - Les dérivés fonctionnels d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 12 - Composition ayant des propriétés biologiques, notamment immunostimulantes, contenant l'un quelconque des peptides selon l'une quelconque des revendications i à 11, en association avec un véhicule pharmaceutiquement accep- table.