Brevet FR2472576A1 — publié le 19810703

La présente invention concerne un procédé de séparation d'agrégats de - globuline en vue de préparer un médicament à base de e-globuline mais ne contenant pas d'agrégat de e-globuline. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé de séparation d'un agrégat de Y-globuline par l'utilisa- tion d'une membrane d'ultrafiltration pour obtenir un médicament de e-globuline qui n'est pas chimiquement modifié, ce qui permet son emploi pourl'adminis- tration par voie intraveineuse. Parmi les immunoglobulines, à titre d'un des composants des protéines de plasma, on a utilisé un médicament de t-globuline dont IgG constitue le composant principal pour le traitement préventif et curatif de diverses maladies infectieuses, mais malheureusement un tel médicament provoque une réaction anaphylactique sévère par suite de la présence d'agrégats de r-globuline et on a donc été forcé d'en limiter l'emploi aux injections intra- musculaires. En raison de l'importance d'un tel médicament sur le plan médical général, on a également proposé de l'administrer par voie intraveineuse, c'est-à-dire pour assurer une administration efficace à une dose importante et avec un effet immédiat. Pour pouvoir ftre administré par voie intraveineuse, un médicament de rglobuline doit subir une réduction d'activité anti-complémentaire due à son effet secondaire. Il a été confirmé que l'activité anticomplémentaire résulte de l'agrégation de la --globuline lors de la séparation du monomère de )-globuline. Certains procédés de séparation de l'agrégat de Y-globuline ou de réduction de l'activité anticomplémentaire sont comme suit: (1) Traitement enzymatique [Vox Sang. 13 71 (1967)] (2) Modification chimique [Vox. Sang. 28 422 (1965)] [Demande non examinée de brevet japonais 103723/1973] (3) Procédé de désagrégation des agrégats présents dans les médicaments de r-globuline [Acta Chemica Scandinavia 22 490 (1968)] Le procédé (1) pour le traitement de l'immunoglobuline avec la pepsine afin de faire disparaître le site de fixation des compléments présente certains inconvénients, savoir que la demi-vie de l'activité anticorps de la r-globuline dans le sang devient extrêmement brève et qu'on ne peut prévoir l'activité Fc. Le procédé (2) présente l'inconvénient de la différence par rapport à l'état naturel du monomère intact de -globuline. Le procédé (3) est le procédé optimal pour obtenir le monomère intact de e-globuline. Cependant, il en résulte la présence d'agrégats pendant le stockage, ce qui augmente l'activité anti-complémentaire. La présente invention a pour but principal de surmonter les inconvénients indiqués et d'obtenir un monomère intact de ï-globuline en qualité d'un médicament idéal. On réalise les objectifs indiqués ainsi que d'autres par un procédé de séparation du monomère de -globuline d'une façon relativement simple et rapide, procédé qui consiste à séparer sélectivement ce monomère dans un état lui permettant de traverser une membrane sans permettre le passage à travers cette membrane d'ultrafiltration des agrégats de r-globuline. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre en regard des dessins annexés sur lesquels: - la figure 1 montre le rapport entre le pH des solutions utilisées dans les exemples et le pourcentage de perméation du monomère de e-globuline - les figures 2, 3 et R représentent des chromatogrammes liquides obtenus dans les exemples selon l'invention; et - la figure 4 représente un chromatogramme liquide d'un produit de référence dans- différentes conditions. Les diamètres des pores des membranes ne peuvent pas être observés au microscope électronique. Dans le cas d'une membrane d'ultrafiltration, il est usuel de définir les propriétés de la membrane par le seuil de coupure. On définit en général un tel seuil en mesurant les pourcentages de ré- tention de la membrane avec une protéine sphérique présentant un poids Molé- culaire connu [(1-concentration du perméat/concentration de la solution initiale) x 100], en portant les poids moléculaires du soluté et les pourcen- tages de rétention sur un graphique et enfin en calculant le poids moléculaire pour un pourcentage de rétention de 100 %. Par exemple, la membrane PM-10 fabriquée par Amicon Co est considérée comme ayant un seuil de coupure de 10 000 mais la myoglobine ayant un poids moléculaire de 18 000 traverse cette membrane. Le seuil de coupure de la membrane d'ultrafiltration selon l'invention est en général compris entre 2 x 105 et 3,5 x 10 et, de préférence, entre 5 2,5 x 10 et 3 x 10. Le seuil de coupure varie selon le procédé de mesure. Par exemple, le seuil de coupure varie selon les changements du pH de la solution bien que l'échantillon et la membrane soient les mêmes. On considère que cette variation dépend des charges des protéines et de la répartition des protéines dans la solution. Dans ce cas, le seuil de coupure est déterminé par utilisation de protéines ayant des poids moléculaires connus dans une solution de tampon phosphate (pH = 6,8) à titre d'éluat pour une chromatographie par perméation à travers un gel aqueux (qu'on abrège ci-après GPC), en mesurant les rapports des pouvoirs absorbants de l'échantillon à 280 mm à l'aide d'une colonne G 3000SW fabriquée par Toyo Soda Mfg. Co.et en portant sur un graphique les pourcentages de rétention de la membrane. Les protéines utilisées pour les mesures sont notamment la myoglobine, la6-lactoglobuline, l'albumine, la r-globuline et la glutamatedéshydrogénase. Dans la présente invention, on indique le seuil de coupure à pH 6,8. Le procédé de mesure du pourcentage de rétention n'est pas limité à celui qui est décrit dans la présente invention. Parmi les membranes d'ultrafiltration ayant des seuils de coupure iden- tiques, les membranes en polyamide, polytéréphtalate d'éthylène, polycarbonate, cellulose ou acétate de cellulose laissent parfois passer les agrégats en même temps que les monomères et on considère donc que leur capacité de séparation est moins bonne. Par exemple, quand on utilise une membrane en cellulose, la i-globuline adsorbée sur la membrane présente un taux d'ultrafiltration beaucoup plus faible. Au contraire, quand on utilise une membrane en résine de polysulfone, on peut obtenir une membrane d'ultrafiltration présentant une répartition remarquablement étroite de diamètres de pores, ce qui assure une vitesse constante d'ultrafiltration en l'absence d'une adsorption quelconque de la Y-globuline sur la membrane. Ceci est une membrane optimale pour la séparation du monomère de r-globuline. On a donc réussi à séparer les comp- posants en se basant sur les différences de dimensions, ce qui constitue une caractéristique intéressante de la membrane d'ultrafiltration. Ainsi la séparation par membrane du monomère de r-globuline à partir d'une solution aqueuse contenant des agrégats de r-globuline a été réalisée par un procédé simple et rapide basé sur les différences de dimensions des monomères de r-globuline et des agrégats de r-globuline. Les résines de polysulfones présentent les motifs de structure ci-après: cF-o-oj SO2t- ou {O-1 4j-o 4j-c4 t CH3 (n = 50 à 250) On peut préparer la membrane en dissolvant la polysulfone dans un solvant et ensuite on étale la solution sous forme d'une pellicule et on la plonge dans un non-solvant. Lors de la séparation avec la membrane, le pH de la solution aqueuse est avantageusement de 6 à 8 et, de préférence, de 6,5 à 7,5. Le pourcentage de perméation du monomère de f-globuline (concentration du perméat/concentra- tion de la solution initiale x 100) varie très fortement selon le pH. La durée de la séparation par membrane est d'autant plus courte que le pourcen- tage de de perméation du monomère de Y-globuline par cette membrane est plus élevé. En raison des problèmes économiques, le pH optimal lors de la séparation avec la membrane est compris, de préférence, entre 6 et 8 et, mieux encore, entre 6,5 et 7,5. La concentration de la solution est en général inférieure à 5 % et, de préférence, inférieure à 2 % (pds/vol.). Quand cette concentration est plus élevée, la vitesse d'ultrafiltration est plus faible et le pourcen- tage de perméation du monomère de C-globuline est également plus bas, en raison de la plus forte polarisation par concentration du soluté sur la surface de la membrane. Selon le procédé qui fait l'objet de l'invention, on règle le pH de la solution aqueuse contenant les agrégats de r-globuline entre 6 et 8. On effectue l'ultrafiltration de la solution à travers la membrane de manière à laisserl'agrégat de r-globuline sur la membrane et à permettre le passage à travers cette dernière du monomère de moutons. Les exemples suivants et les exemples de référence servent à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. EXEMPLE 1 On dissout une résine de polysulfone P-1700 (fabriquée par UCC) dans la Nméthyl-2-pyrrolidone pour préparer une solution à 15 %. On étale cette solution sur une étoffe non tissée en polyéthylène dont la dimension est de x 30 cm pour une épaisseur de 100 microns, l'étalement se faisant à l'aide d'une raclette et-ensuite on plonge le tout dans l'eau pour former une membrane. On mesure le seuil de coupure de la membrane en découpant cette membrane à une dimension qui correspond à un diamètre de 43 mm et en équipant avec cette membrane, un appareil d'ultrafiltration permettant de mesurer les pourcentages de rétention des protéines de myoglobine (18 000), d'albumine (68 000), de r-globuline (160 000) et de glutamatedéshydrogénase (360 000). Le seuil de coupure est d'environ 3 x 10. On dissout une solution aqueuse de e-globuline contenant des agrégats de rglohuline d'origine humaine dans une solution de tampon phosphate ayant un pH de 6,8 pour préparer une solution à 1 %. On traite la solution dans un appareil d'ultrafiltration équipé de cette membrane. Les résultats apparaissent sur la figure 2. Il est évident que le monomère de e-globuline traverse la membrane par chromatographie. Le pourcentage de permeation du monomère de C-globuline est d'environ 40 %. On mesure le chromatogramme à l'aide de l'appareil utilisé pour la mesure du seuil de coupure. Sur la figure 2, la référence (1) désigne le polymère; la référence (2) désigne le dimère et la référence (3) désigne le monomère. Sur le c8té gauche, on a représenté le chromatogramme de la solu- tion initiale alors que du côté droit on voit le chromatogramme du perméat. EXEMPLE 2 Par le même procédé que dans l'exemple 1, on effectue une séparation par membrane d'une solution aqueuse de e-globuline de sérum bovin à un pH de 7,5. Les résultats apparaissent sur la figure 3. Seul le monomère de Yglobu- line traverse la membrane. Le pourcentage de permeation du monomère de C-globuline est d'environ 30 %. EXEMPLE DE REFERENCE 1 Conformément au procédé de l'exemple 1, on dissout une résine de polysulfone P-1700 (UCC) dans la N-méthyl-2-pyrrolidone pour préparer une solution à 10 %, on prépare une membrane et on mesure le seuil de coupure. Ce seuil de la membrane est d'environ 5 x 105. On dissout des agrégats de Y-globuline humaine dans une solution de tampon phosphate ayant un pH de 6,8 afin de préparer une solution à 1 %. Comme dans le procédé de l'exemple 1, on effectuetme séparation de la solution avec la membrane. Les résultats apparaissent sur le figure 4. A l'examen du chromatogramme, on constate qu'une proportion relativement importante d'agrégats de rglobuline a traversé la membrane. EXEMPLE DE REFERENCE 2 Selon le même procédé que dans l'exemple 1, on effectue une séparation par membrane d'une solution à pH 4. On constate que le pourcentage de permea- tion du monomère de -globuline est extrêmement faible, à savoir de l'ordre d'environ 5 %. EXEMPLE 3 On dissout une résine de polysulfone de formule - -(j>--- S0- 0 (n=200) dans la N-méthyl-2-pyrrolidone pour préparer une solution à 15 %. En procé- dant comme dans l'exemple 1, on prépare une membrane et on mesure son seuil de coupure qui est d'environ 2,5 x 10. Par le procédé décrit dans l'exemple 2, on effectue une séparation par membrane d'une solution aqueuse de -globuline de sérum de bovin à pH 7,0. Les résultats apparaissent dans la figure 5. Il est évident que seul le monomère de Yglobuline traverse la membrane. Le pourcentage de permeation du monomère de i-globuline est d'environ 30 %. 24725 75 REVENDICATIONS 1. Procédé de séparation d'agrégats de (-globuline à l'aide d'une mem- brane, caractérisé en ce qu'il consiste à séparer les agrégats de '-globu- line contenus dans une solution aqueuse de Y-globuline, par passage de cette solution à travers une membrane d'ultrafiltration en résine de polysulfone. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la résine de polysulfone répond à la formule: Q - o-Q 0 SO0 ou lO CH3 (n=50 à 250) 3. Procédé selon la revendication 1 ou ?, caractérisé en ce que le pH de la solution aqueuse est de 6 à 8. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, ca- ractérisé en ce que la membrane d'ultrafiltration à un seuil de coupure de 2,5.105 à 3.105.