Brevet FR2463151A1 — publié le 19810220

La présente invention concerne de nouvelles planothiocines antibiotiques choisies dans le groupe cons- titué par les planothiocines A, B, C, D, E, F et Go Les propriétés physico-chimiques des plano- thiocines sont indiquées dans le tableau 1 suivant. Les propriétés biologiques des planothiocines sont indiquées dans le tableau 2. Comme illustré, les planothiocines sont des antibiotiques contenant du soufre. Parmi les antibioti- ques contenant du soufre, on connait le thiostrepton, les thiopeptines, les sulfomycines, les siomycines, A-59, les pepthiomycines, la thermothiocine, les sporangiomy- cines, l'althiomycine, A-7413, le nosiheptide, L-13365, l'actinothiocine, A-10947 et 35665RP. Le nosiheptide a une composition en amino- acides identique à celle de la planothiocine-A. On ne connaît pas d'autres antibiotiques ayant les mêmes compo- sitions en amino-acides que la planothiocine-B. Le nosi- heptide a un pic d'absorption maximale à 416 m u (E1%m = 1cm 124) et 440 mP (E1%cm = 104,8), toutefois la planothio- cine-A n'a pas de tels pics d'absorption. Le nosiheptide est en cristaux jaunâtres pâles, tandis que la planothio- cine-A est en cristaux incolores ou blancs. Les quantités Rf en chromatographie sur gel de silice sont différentes entre elles, c'est-à-dire que Rf = 0,87 avec CHCl3: mé- thanol (3: 1) et Rf = 0,71 avec acétate d'éthyle: mé- thanol: eau (10: 2: 1) pour le nosiheptide. Comme expliqué, les planothiocines A et B sont nouvelles et ne sont identiques à aucun autre anti- biotique connu contenant du soufre. Des substances ayant les mêmes compositions en amino-acides que les planothiocines C, D et E sont le no- siheptide et la planothiocine-A. De même, une substance ayant les mêmes compositions en amino-acides que les pla- nothiocines F et G est la planothiocine B. Tableau 1 Planothiocine-A Planothiocine-B Planothiocine-B (1) point de fusion 266269 C (décomp.) 259-262 C (décomp.) (2) analyse élémentai- C = 49,47%, H = 3,53% C = 49,37%, H = 3,45% re N = 13,25%, S = 13,73% N 13,10%, S = 14, 19% (3) masse moléculaire 1438 (masse moléculaire minimale 1350 (masse moléculaire minimale par par analyse des amino-acides; analyse des amino-acides; une molécu- une molécule de thréonine dans le de thréonine dans une molécule du une molécule du composé) composé) (4) rotation optique (o)23 = +1,96 (C = 0,7, pyridine) ( (5) spectre d'absorp- Fig. I dans le méthanol,pic d'ab- Fig. 5, dans le méthanol, pic d'ab- tion dans l'ultra- sorption maximale à 217 m u sorption maximale à 218 mp (540,4), violet (629,5), 239 m p (sh) (487,7), 239 m u (sh) (423,8), 260 mp (sh) 260 miu (sh) (347,4), 330 m (294,5), 330 m/a (276,6) (317,9 (sh): épaulement Fig. 2,dans du méthanol acide (une Fig. 6,dans du méthanol acide (une 1% goutte de 0,1N-HCl),pic d'absorp- goutte de 0,1 N-HC1), pic d'absorp- (): E% tion maximale à 219 m (sh) tion maximale à 239 m (sh) (514,0), I cm (644,9), 240 mp (sh) (508,8), 297 m/a (263,8), 329 mp (262,1). 259 mu (sh) (371,9), 330 mp (323,5) Fig. 3,dans du méthanol alcalin Fig. 7, dans du méthanol alcalin (une goutte de 0,1 N-NaoH),pic (une goutte de 0,1 N - NaoH), pic d'absorption maximale à 234 m d'absorption maximale à 239 mV (sh) (589,5), 299 m F (sh) (sh), (514,0), 297 m p (263,8, lu (284,2), 328 mu (sh) 231,6) 329 mp (262,1). U Lq Tableau 1 (suite) (6) spectre d'absorption Fig. 4; Fig. 8; dans l'infrarouge 3380, 3110, 2980, 1730, 1650, 3380, 3110, 2980, 1720, 1650, (comprimé de KBr) 1520, 1480, 1410, 1380, 1330, 1520, 1480, 1410, 1370, 1330, 1300, 1230, 1160, 1150, 1100, 1300, 1230, 1160, 1145, 1060, 1060, 1020, 990, 930, 910, 1020, 990, 930, 910, 830, 830, 780, 750, 700 cm' 780, 740, 700 cm' (7) réaction de couleur positive: décoloration du per- positive: décoloration du perman-g manganate de potassium, de ganate de potassium, de l'iode. l'iode négative: chlorure ferrique, négative: chlorure ferrique, ni- ninhydrine, Molisch nhydrine Molisch. (8) solubilité soluble: CHCl -méthanol,pyri- soluble: CHC1 3-méthanol, pyridine, dine, DMSO, ac2de acétique DMS0, acide acétique glacial. glacial. insoluble: benzène, acétone, insoluble; benzène, acétone, é- éther de pétrole, hexane. ther de pétrole, hexane. (9) nature faiblement acide faiblement acide (10) cristaux cristaux blancs (cristaux cristaux blancs (cristaux acicu- aciculaires) laires) (11) analyse des amino- thréonine et 2 composants thréonine et I composant positif acides (déterminé par auto-positifs à la ninhydrine à la ninhydrine. analyseur pour amino-aci- des, fractions positives à la ninhydrine de 6 N- HC1, à 105 C, pour un hy- drolysat de 20 heures) Tableau 1 (suite) (11) valeur de Rf (gel de silice f, produit de Tokyo Kasei Co.) CHCl méthanol:acide acétique (10:1:0,1) CHC13: méthanol (3:1) acétate d'éthyle:métha- nol:eau (10:2:1) Rf = 0,26 Rf = 0,42 Rf = 0,2 Rf = 0,15 acétonitrile:eau (10:2) Rf = 0,43 butanol:acide acétique: eau (3:1:1) Rf = 0,80 Rf = 0,27 Rf = 0,15 Rf = 0,55 Rf = 0,83 (12) stabilité stable dans des conditions stable dans des conditions aci- acides et neutres. des et neutres. instable dans des condi- instable dans des conditions tions alcalines. alcalines. ul Tableau 1 (suite) Planothio- Planothio- Planothio- Planothio- Planothio- cine-C cine-D cine-E cine-F cine-G (1) point de fusion 247 - 251iC 254'258 C 245d%-247 C 258^_260 C 262^,264 C (décomp) (décomp.) (décomp.) (décomp.) (décomp.) i (2) analyse élémen- taire C: 47,81% 48,18% 48,31% 49,83% 49,26% H: 3,42% 3,58% 3,36% 3,54% 3,42% N: 13,62% 13,26%- 13,41% 14,70% 13,70% S: 13,85% 15,61% 13,92% 15,29% 15,96% (3) masse moléculai- re (analyse des 1200 r1500 1200 è-1500 1200,J_1500 1200r-1500 1200-,1500 amino-acides) (4) rotation optique /.-7 20 (pyri- - -D dine) +28,4 (C=0,9) +31,4 (C=0,7) +45,5 (C=0,7) +107,8 (C=0,8) +122, 4 (c=o,4) (5) spectre d'absor- Fig.9, pic Fig.13, pic Fig. 17, pic Fig. 21, dans Fig. 25, dans tion dans l'ultra- d'absorption d'absorption d'absorption méthanol, pic méthanol, pic violet maximale à maximale à maximale dans d'absorption d'absorption 218 m u (721), 217 m/u (764), méthanol à maximale à maximale à E1% 240 m;a (sh) 240 m;a (sh) 217m p (756), 217mu (744), 217m 770), 1 cm (499) 260 mu (502), 260m u 240 mp (sh) 240mu (sh) 240m sh)(522); (sh):épaulem,*nt (sh) (322) 330 (sh) (276) (534), 260m, (515>, 260 330m.p (350 m (327) (dans 330,mu (343) 308, 329 m mp (sh)(333)3 m thanol 309. 330m P (333). hN Ot' w9 J' Tableau 1 (suite) méthanol alcalin: une goutte de 0,1 N-NaoH dans méthanol méthanol acide: une goutte de 0,1 N-HCl dans méthanol Fig. 11, dans méthanol al- calin,pic d'absorption maximale à 233 m/u (sh) 611,299 mu 271,329 m 241). Fig. 15, dans méthanol,alca- lin,pic d'ab- sorption maxi- male à 232 m u (sh) 676),300 m/u 282),329 mp (248) Fig. 19, dans méthanol al- calin,pic d'absorption maximale à 233 m P (sh) (662), 299 mM 272), 329 m u 207) Fig. 23, dans méthanol alca- lin,pic d'ab- sorption maxi- male à 240 m p(515) 330 m P( 291) Fig. 27, dans méthanol alca- lin, pic d'ab- sorption maxi- male à 240 m p (519), 299 m (247), 329 mu P (284) Fig.10,dans méthanol aci- de,comme dans méthanol. Fig.14, dans méthanol aci- de,comme dans méthanol. Fig. 18,dans méthanol aci- de,comme dans méthanol. Fig. 22,dans méthanol aci- de,comme dans méthanol. Fig. 26, dans méthanol acide, comme dans méthanol. ru 4> o. ul Tableau 1 (suite) (6) spectre d'absorp- Fig. 12 Fig. 16 Fig. 20 Fig. 24 Fig. 28 tion dans l'infra- 3360,3100,1730, 3380,3100,1730, 3380,3100,1730,3380,3100,1720, 3380,3100,1710, rouge \ 1650,1520,1470, 1650,1570,1530, 1650,1520,1470,1650,1520,1470, 1650,1570,1520 (comprimé de KBr) 1410,1375,1330, 1480,1420,1380, 1410,1360,1330,1410,1370,1330, 1470,1410,1360, 1300,1230,1160, 1340,1300,1240, 1300,1230,1160,1300,1230,1160, 1330,1230, 1150, 1140,1100,1050, 1160,1140,1100, 1140,1090,1010,1140,1060,1020, 1140,1060, 1010, 1010, 980, 930, 1060,1020, 990, 980, 960, 940, 980, 960, 930, 980, 940, 910, 740cm-1 780, 750 cm-1 750 cm-1 750 cm-1 cm-1 (7) réaction de couleur positive: dé- coloration du permanganate de ditto ditto ditto ditto potassium négative:chlo- rure ferrique, ditto ditto ditto ditto ninhydrine,Mo- lisch (8) solubilité soluble:CHCl3, pyridine, DMF, DMS0. insoluble:benzè- ditto ditto ditto ditto ne,acétone,éther de pétrole, eau. (9) nature faiblement acide ditto ditto ditto ditto (10) couleur blanche ditto ditto ditto ditto * (t Tableau 1 (suite) (11) analyse des aminothréonine et thréonine et thréonine et thréonine et thréonine et acides (déterminée par deux composants deux compo- deux compo- un composant un composant auto-analyseur des ami- positifs à la sants posi- sants posipositif à positif à la no-acides,fractions po- ninhydrine tifs à la tifs à la la thréonine thréonine sitives à la ninhydrine thréonine thréonine de 6N-HCl, à 105 C, pour un hydrolysat de heures) 12) valeur de Rf (gel de silice f, produit de Tokyo Kasei Co.) CHC1:méthanol:aci- Rf = 0,43 Rf = 0,57 Rf = 0,57 Rf = 0,67 Rf = 0,79 de 3 acétique (20:1:0,1) acétate d'éthyle: méthanol:acide acé- Rf = 0,49 Rf = 0,41 Rf = 0,55 Rf = 0,65 Rf = 0,49 tique (10:1:0,2) acétonitrile:eau (10:1) Rf = 0,42 Rf = 0, 37 Rf = 0,49 Rf = 0,49 Rf = 0,41 chloroforme:métha- nol (10:1) Rf = 0,85 Rf = 0,87 Rf = 0,92 Rf = 0,94 Tableau 2 planothio- planothio- planothio- planothio- planothio- planothioplanothio- cine-A cine-B cine-C cine-D cine-E cine-F cine-G toxicité aiguë 500 ( (souris,voie in50-pa (souristvoie in- de morta ditto ditto ditto ditto ditto ditto mgfkg) li' concentration in- hibitrice minimale MI C (V /ml) Staphylococcus 0,008 0,016 0,008 0,004 0, 016 0,031 0,016 aureus ATCC 6538p Staphylococcus aureus MS 353 0,016 0, 031 0,008 0,004 0,016 0,031 0,016 Staphylococcus aureus MS 353 C36 0,016 0,031 0,008 0,004 0,016 0,031 0,016 Staphylococcus aureus MS 353 AO 0,008 0,031 0,008 0,004 0,016 0,031 0,016 Staphylooccus aureus 0116 0,008 0,031 0,008 0,008 0,016 0,031 0,016 Staphylococcus aureus 0119 0,008 0,016 0, 008 0,004 0,016 0,031 0,016 Staphylococcus aureus 0126 0,016 0,031 0,008 0,007 0,016 0,031 0,016 Staphylococcus aureus 0127 0,016 0,031 0,008 0, 008 0,016 0,031 0,016 Staphylococcus epidermis sp-al-1 0,031 0,063 0,016 0,016 0,063 0,125 0,016 14o % Lm Tableau 2 (suite) Streptococcus pyogenes N.Y.5 4 0,002 0,004 C 0,0020,002 0,004 4 02 0,002 Streptococcus pyogenes 1022 0,004 0,008 0,004 0,004 0,008 0,004 0,004 Streptococcus aecalis 1501 0,25 1 0,5 1 >1 1 Streptococcus agalactiae 1020 0,063 1 0,25 I I >1 0,5 Sarcina lutea ATCC 9341 0,004 0,008 g 0,002 A 0,002 0,008 0,008 0,002 Micrococcus flavus ATCC 10240 0,004 0,008 Corynebacterium diphtheriae P.W.8 0,004 4 0,002 acillus subti- is ATCC 6633 0,031 0,063 0,031 0,016 0,031 7 1 0,063 Escherichia coli NIJH - JC2 I t I 71 1 1 71 z1 Escherichia coli B 1 " I).1,1 11 1. 1 Klebsiella pneumo- niae ATCC 10031 I I,1 1 >1> 1 > 1 Salmonella typho-- sa H901 1 > 1 1 1 1 1;1 En comparant la nosiheptide aux planothiocines C, D et E, le nosiheptide a les caractéristiques mention- nées ci-dessus, tandis que les planothiocines C, D et E n'ont pas de pics d'absorption dans la région visi- ble et sont des cristaux blancso La substance 35665RP est un dérivé du nosiheptide et a un pic d'absorption à 405 m p (E1%m = 107). Les valeurs de Rf en chromatographie sur couche mince pour les planothiocines C, D, E, F et G sont différentes de celles concernant le nosiheptide et les planothiocines A et B comme suit: nosiheptide: (1)* Rf = 0,35, (2) Rf = 0,27, (3) Rf = 0,29, (4) Rf = 0,62. planothiocine-A: (1) Rf = 0,2, (2)** Rf = 0,13, (3)*** Rf = 0,19, (4)**** Rf = 0,05. planothiocine-B: (1) Rf = 0,43, (2)** Rf = 0,22, (3)*** Rf = 0,18, (4)****Rf = 0,05. systèmes de solvants: * CHCl3: méthanol: acide acétique = 20: 1: 0,1 ** acétate d'éthyle: méthanol: acide acétique = : 1: 0,2 *** acétonitrile: eau = 10: 1 **** CHC13: méthanol = 10: 1 D'autres propriétés physico-chimiques telles que la rotation optique sont différentes de celles d'anti- biotiques connus contenant du soufre. Comme résultat, les planothiocines C, D, E, F et G ne sont pas identi- ques à des antibiotiques connus contenant du soufre. En conséquence, les planothiocines selon la présente invention sont des antibiotiques nouveaux. Le microorganisme produisant les planothioci- nes est un Actinomycétale isolé à partir d'un échan- tillon de terre d'un champ de paprika de Mihama-cho,- Mikita-gun, Fukui-ken, Japon, et appartient au genre Actinoplanes, et est appelé Actinoplanes sp. A12526. Cette souche a été déposée à l'Institute for Microbiolo- gical Industry and Technology, M.I.T.I., Japon, comme dépôt permanent N FERM-P 5063 le 29 juin 1979. Les propriétés taxonomiques de cette souche sont les suivantes. (I) Propriétés morphologiques: Les observations sur un milieu gélosé à l'amidon et aux sels inorganiques cultivé à 30 C pendant 10 à 14 jours sont les suivantes: Le mycélium de support est ondulé ou flexueux, ramifié, de 0,8 à 1,0 y de diamètre, sans formation d'hyphes aériennes. Des sporanges sont formés sur le sporangiphore court émergeant du mycélium du support. Les sporanges I 5 ont des formes sphériques ou elliptiques, ayant des dimensions de 5 -10 x 5 - 15pu, et contenant de nom- breux sporangiospores. Les sporangiospores sont le plus souvent sphériques ou presque sphériques, de 1 1,5 p de diamètre, et motiles par des flagelles poly- triches. (II) Composition de l'acide diaminopimélique: L'acide diaminopimélique détecté par analyse de toutes les cellules est du type méso comme constituant majeur et du type hydroxy comme constituant mineur. (III) Caractéristiques de culture sur divers milieux: Les résultats d'observation de caractéristiques de culture dans divers milieux à 30 C pour une cultu- re de 14 jours sont présentés dans le Tableau 3 sui- vant. On a observé une faible formation de mycélium aérien à développement prématuré sur de nombreux mi- lieux. L'indication de la couleur est basée sur les in- dications données dans "Color Harmony Manual", 4ème é- dition, 1958, publié par Container Corporation of Ame- rica. Tableau 3 Caractéristiques de culture sur divers milieux Milieu Développe- Sporange Couleur du mycélium Pigment solubl ment de support Gélose sucrosée nitratée bon médiocre.aune melon clair néant Miga) Gélose glucosée à l'asparagine médiocre petit nombre blé clair (2ea) néant Gélose glycérolée à l'aspara- peu abondant petit nombre incolore néant gine Gélose aux sels inorganiques ambre (31c) - ambre et à l'amidon bon moyen clair (3ic) néant Gélose à la tyrosine médiocre à petit nombre incolore - ivoire clair peu abondant (2ca) néant Gélose à la farine d'avoine bon médiocre ambre (3nc 3 lc) néant Gélose aux levures et au malt bon médiocre topaze (3ne) cannelle néant (31e) Gélose de Bennett bon petit nombre topaze (3ne) néant Gélosé d'Emerson bon médiocre ambre (3pc - 3nc) néant Gélose nutritive médiocre néant incolore néant Gélose de Hickey et Tresner moyen moyen à tan-liège (4ie) tan-liège médiocre (4ie) Gélose peptonée de Szapeck bon moyen orangé roussâtre néant (IV) Propriétés physiologiques: Les propriétés physiologiques sont illustrées comme suit: 1) Utilité des sources de carbone: Source de carbone L-arabinose D-xylose D-glucose D-fructose D-mannose D-mannitol inositol L-rhamnose sucrose A- lactose raffinose cellulose amidon Utilisation + + + + + + + + + + Source de carbone salicine D-galactose glycérol L-sorbose tréhalose d-melibiose D-ribose maltose mélézitose D-cellobiose D-sorbitol dulcitol + (+ = positive; + = faiblement - = négative) positive 2) Température de développement: > - 40 C 3) Peptonisation et coagulation du lait écrémé: positif 4) Production de mélanine: milieu gélosé à la tyrosine: négatif milieu de gélose peptonée au fer et aux levures: positif ) Hydrolyse de l'amidon: positif 6) Décomposition de la cellulose: négatif 7) Hydrolyse de la caséine: positif 8) Décomposition de la tyrosine: positif 9) Liquéfaction de la gélatine: positif ) Décomposition de la xanthine: négatif 11) Décomposition de l'hypoxanthine: négatif 12) Formation d'hydrogène sulfuré: positif 13) Réduction des nitrates: positif. Utili- sation + + + + + + + + D'après les résultats taxonomiques ci-dessus, selon lesquels la souche A12526 a des sporangiophores portant des sporanges développés sur un mycélium de support ramifié, des sporanges de forme sphérique ou elliptique, des sporangiospores de forme sphérique ou presque sphérique avec des polaires motiles et de l'a- cide méso diaminopimélique, cette souche appartient au genre Actinoplanes. Les planothiocines peuvent être obtenues de préférence à partir d'un bouillon cultivé de la souche Actinoplanes sp. A12526 ci-dessus. La souche ci-dessus est seulement illustrative et on peut utili- ser des microorganismes producteurs de planothiocines comprenant les planothiocines A, B, C, D, E, F et G ci-dessus. Par exemple, on peut utiliser des micro- organismes appartenant au genre Actinoplanes ou à ses mutants. Les planothiocines peuvent être produites en cultivant dans des conditions aérobies une souche productrice de planothiocines appartenant au genre Actinoplanes dans un milieu classique de production d'antibiotiques. Des milieux solides ou liquides peu- vent être utilisés et pour une production à l'échelle industrielle une culture immergée avec aération est préférable. On peut utiliser un milieu nutritif clas- sique pour microorganismes, comprenant des sources de carbone assimilables comme du glucose, du sucrose, du lactose, du maltose, de l'amidon, de la mélasse ou du glycérol ou des sources d'azote assimilables comme de la liqueur de macération de mals, de la poudre de so- ja, de la poudre de graines de coton, du gluten de blé, de la peptone, de l'extrait de viande, de l'ex- trait de levures, de la levure sèche, de l'hydrolysat de caséine, un sel d'ammonium ou un nitrate. Des phos- phates, carbonates, sulfates et des sels de magnésium, de calcium, de potassium, de sodium, de cobalt, fer- -reux ou de manganèse peuvent être ajoutés au milieu suivant le besoin. La température de culture dépend du déve- loppement des microorganismes et de la production de planothiocines. De préférence, la température est comprise entre 25 et 300C. La durée de culture dépend des conditions et est habituellement de 2 à 4 jours. On arrête la culture quand la concentration maximale de planothio- cines dans le milieu est atteinte. Les planothiocines sont produites princi- palement dans le mycélium et partiellement dans le filtrat de culture. Une technique pour isoler et purifier à partir des planothiocines les composants planothioci- nes A, B, C, D, E et F est la suivante: On obtient à partir d'une culture du my- célium humide et du filtrat en centrifugeant le bouil- lon de culture de la souche productrice de planothio- cines ci-dessus. Le filtrat de culture contient une petite quantité de planothiocines et de préférence les anti- biotiques peuvent être isolés à partir du mycélium de culture. On peut extraire les planothiocines du my- célium humide en ajoutant de l'acétone. On concentre l'extrait acétoniquel sous vide et on le soumet de nou- veau à une extraction en ajoutant de l'acétate d'éthyle. On concentre sous vide l'extrait à l'acétate d'éthyle pour obtenir un sirop huileux brunâtre. On obtient un précipité brunâtre en y ajoutant de l'hexane. On dissout le précipité dans un mélange de chloroforme et de méthanol et on concentre la solution sous vide pour obtenir un précipité brunâtre pâle après élimination du chloroforme. On répète cette opération pour obten- * nir un précipité blanc grisâtre qui est une planothia- cine brute contenant les planothiacines A, B, C, D, E, F et G. On dissout le produit brut dans un mélange de chloroforme et de méthanol (3: 1) et on le sèche par addition de poudre de gel de silice. On applique ce mélange pour chromatographie sur une colonne de gel de silice en développant au moyen de chloroforme: méthanol: acide acétique (20: 1: 0,1). On peut obtenir un groupe de fractions ac- tives contenant principalement: planothiocines F et G; planothiocines D et E; planothiocines B et C; et planothiocines A. Une fraction active contenant les planothio- cines F et G est concentrée sous vide pour donner une poudre blanche que l'on purifie en la soumettant à une chromatographie sur une colonne de gel de silice, en éluant avec un mélange de chloroforme et de méthanol (25: 1). Une fraction active contenant les planothio- cines E et D peut être purifiée par concentration et chromatographie sur une colonne de gel de silice, en dé- veloppant avec un mélange d'acétate d'éthyle: métha- nol: acide acétique (20: 1: 0,2). Une fraction active contenant les planothio- cines B et C peut aussi être purifiée par le même pro- cédé que ci-dessus. On peut obtenir des cristaux blancs de planothiocine A en dissolvant le concentré de fraction active contenant la planothiocine A dans un mélange de chloroforme: méthanol (2: 1) et en éliminant le chlo- roforme pour recristallisationo Les planothiocineS ainsi obtenues peuvent être utilisées pour des compositions antibactériennes 2463 15 I de glucose, 2% d'amidon soluble, 1% d'hydrolysat de caséine, 1% d'extrait de levures et 0,2% de carbonate de calcium dans un erlenmeyer de 500 cm3 est stérili- sé à 1201C pendant 20 minutes. Dans ce milieu sté- rilisé, on inocule le contenu d'une boucle de fil de platine d'Actinoplanes sp. A12526 cultivé sur gélose inclinée et on conduit la culture sur une se- coueuse à 250 tpm à 300C pendant 4 jours. Le même milieu de culture est préparé et cuktivé dans les mê- mes conditions. Cette culture de production de ger- mes (200 cm3 au total) est inoculée dans un milieu stérilisé de la même composition (20 litres) dans un fermenteur cylindrique de 30 litres et on conduit la culture à 300C pendant 2 jours à 300 tpm, aération 20 litres par minute. On inocule ce milieu de cultu- re (10 litres) dans un milieu stérilisé contenant 3% de sucrose, 2% de poudre de soja, 0,3% de CaCO3, 0,001% de CoCl2.6H20 et 0,001% de MgS04. 7H20 (pH 6,5, litres) dans une cuve de 250 litres et on conduit la culture à 30QC pendant 3 jours à 200 tpm, débit d'aération 200 litres par minute. Le milieu de culture ainsi obtenu est fil- tré après l'addition de l'adjuvant de filtration "Per- lite" (5 kg) pour séparer le mycélium humide du fil- trat. Des antibiotiques sont contenus tant dans le mycé- lium que dans le filtrat, principalement dans le mycé- lium. On ajoute de l'acétone (80 cm 3) au mycé- lium humide, on agite énergiquement pendant 3 heures a et on filtre. L'extrait acétonique est concentré sous vide à 20 litres. On y ajoute de l'acétate d'éthyle (20 litres), on règle le pH de la couche aqueuse à 3,0. Après agitation énergique, on sépare la couche d'acétate d'éthyle. On ajoute encore de l'acétate d'éthyle (10 litres) à la couche aqueuse résiduelle, thérapeutiques ou prophylactiques ou comme additifs à la nourriture pour du bétail, de la volaille ou des poissons. Des additifs à la nourriture pour favori- ser la croissance, comme pour causer un accroissement de l'effet de la nourriture et de l'effet de croissance sur les porcs contiennent de préférence 1 à 20 ppm de planothiocines. Un effet d'activation de croissance sur les poulets peut être obtenu en ajoutant 1 à 10 ppm des additifs à la nourriture. Pour les poissons, on ajoute dans la nourriture de 0,1 à 100 ppm. Des aliments disponibles dans le commerce peuvent être utilisés pour addition des planothiocines. Pour des applications antibactériennes thérapeutiques, ou prophylactiques, on peut utiliser des proportions de 1 à 500 ppm. La nourriture contenant des planothioci- nes peut être traitée pour être mise sous la forme de types préférables, tels qu'un mélange, une pâte, des comprimés, des granules, des pastilles ou un sirop. On obtient un effet antibactérien théra- peutique et prophylactique et un effet d'activation de croissance en faisant manger les compositions par du bétail, de la volaille ou des poissons. De plus, on a observé un accroissement de l'effet de reproduction. Les planothiocines ne restent pas dans les organes et tissus du bétail, de la volaille et des pois- sons quand on les administre. On n'a pas observé de symptômes toxiques aigus ni d'actions tératogéniques. - Les exemples suivants illustrent la présente invention, mais ne doivent pas être considérés comme la limitant. Dans toute la description et dans les re- vendications, les pourcentages sont en poids. Exemple 1 Un milieu (pH 6,5, 100 cm3-) contenant 2% on agite énergiquement et on sépare la couche d'acé- tate d'éthyle. On combine les couches d'acétate d'é- thyle. La couche organique combinée (30 litres) est concentrée sous vide pour donner un sirop huileux brunâtre. On ajoute de l'hexane (2 litres) à ce si- rop afin de précipiter la substance brunâtre qui est recueillie par centrifugation. On dissout le préci- pité dans un mélange (1500 cm3) de chloroforme et de méthanol (5: 2) et on concentre la solution pour précipiter une substance brunâtre pale qui est re- cueillie par centrifugation. On dissout de nouveau le précipité dans le mélange de chloroforme et de mé- thanol (5: 2) et on concentre la solution sous vide pour précipiter une substance grisâtre. Après filtration, on sèche cette substance sous vide pour obtenir une poudre brute (15,2 g) con- tenant les planothiocines A, B, C, D, E, F et G. Exemple 2 La poudre brute (15 g) obtenue dans l'exem- ple 1 est dissoute dans un mélange (2 litres) de chloro- forme et de méthanol (3: 1). On ajoute de la poudre de gel de silice (300 g) à cette solution et on sèche sous vide pour obtenir le mélange de gel de silice. On ajoute ce mélange de gel de silice sur le dessus d'une colonne de gel de silice sur le dessus d'une colonne de gel de silice (1500 cm3) mise en place avec une so- lution mixte de chloroforme: méthanol: acide acétique (20: 1: 0,1). L'élution est effectuée avec le même mélange de solvants. Les fractions actives contenant les compo- sants planothiocine sont éluées comme suit. Fractions N 11-13: planothiocines F et G. Fractions NO 14-16: planothiocines D et E. Fractions N 17-24: planothiocines B et C. Fractions N0 46-60: planothiocine A. Les fractions actives NI 46-60 sont re- cueillies et concentrées sous vide pour précipiter la planothiocine A. Les précipités sont recueillis par centrifugation, dissous dans le mélange de chlorofor- me: méthanol (2: 1) et abandonnés à la température ambiante pour élimination du chloroforme et obtention de planothiocine A purifiée sous la forme de cristaux blancs (6,9 g). Exemple 3 Les fractions actives NI 11-13 contenant les planothiocines F et G sont recueillies et concen- trées sous vide pour obtention d'une poudre blanche (80 mg). On dissout cette poudre dans le solvant mixte chloroforme: méthanol (2: 1) et on charge la solution sur une colonne de gel de silice (150 cm3) mise en place avec le même mélange de solvants, et on élue avec le même solvant. On fractionne l'éluat en fractions de 7 g chacune. On trouve la planothiocine G dans les fractions actives NO 23-27. On trouve la planothiocine F dans les fractions actives NO 30-37. Chaque fraction active est recueillie et concentrée sous vide pour don- ner des cristaux aciculaires fins blancs. Les cristaux séparés par filtration sont dissous dans du chloroforme et la solution est abandonnée à la température ambiante pour cristallisation de fins cristaux blancs de plano- thiocines G et F. Ces cristaux sont séparés par filtra- tion et séchés pour donner, à l'état purifié, la plano- thiocine G (6 mg) et la planothiocine F (22 mg). Exemple 4 Les fractions actives NO 14-16 contenant les planothiocines D et E sont recueillies, concentrées sous vide et chargées sur une colonne de gel de silice (150 cm3) mise en place au préalable avec un mélange acétate d'éthyle: méthanol: acide acétique (20: 1 0,2). L'élution est effectuée avec le même mélange de solvants (11 g/une fraction). On recueille les 2 4 6 3 1 5 1 fractions N 23-29 comme fraction active contenant la planothiocine E. On trouve la planothiocine D dans les fractions N 35-49. Chacune des fractions acti- ves est concentrée sous vide et on y ajoute de l'hexane pour précipiter les planothiocines E et.D. On dissout chaque précipité dans un mélange chloroforme: méthanol (5: 3) et on élimine le chloroforme par concentration pour précipiter les planothiocines E et D sous la forme de cristaux aciculaires fins blancs. Les cristaux sont séparés par filtration et séchés pour donner, à l'état purifié, la planothiocine E (83 mg) et la planothioci- ne D (74 mg). Exemple 5 Les fractions actives NI 17-24 contenant les planothiocines B et C sont recueillies, concentrées sous vide et chargées sur une colonne de gel de silice (200 cm3) garnie au préalable d'acétate d'éthyle: mé- thanol: acide acétique (20: 1: 0,2). On effectue l'élution avec le même mélange de solvants (15 g/une fraction). On trouve la planothiocine C dans les frac- tions N 30-47 et on trouve la planothiocine B dans les fractions N 70-88. Chaque fraction active est concen- trée sous vide et on y ajoute de l'hexane pour précipi- ter les planothiocines C et B. On dissout chaque pré- cipité dans un mélange chloroforme: méthanol (5: 3) et on concentre la solution pour éliminer le chlorofor- me et pour précipiter des cristaux blancs des plano- thiocines C et B. Les cristaux sont séparés par fil- tration et séchés pour donner, à l'état purifié, la planothiocine C (137 mg) et la planothiocine B (160 mg) sous la forme de fins cristaux aciculaires blancs. Exemple 6 Un milieu (pH 7,0, 100 cm3) contenant 1% de dextrine, 2% de glucose, 2% d'amidon soluble, 1% d'hydrolysat de caséine (nom commercial: NZ-Amine Type A), 1% d'extrait de levures et 0,2% de CaC03 dans un erlenmeyer de 500 cm3 est stérilisé à 120 C pendant 20 minutes. Dans ce milieu stérilisé, on inocule le contenu d'une boucle de fil de platine d'Actinoplanes sp. A12526 cultivé sur gélose inclinée et on conduit la culture sur une secoueuse à 250 tpm à 30 C pendant 4 jours. Cette culture de production de germes (200 cm3) est inoculée dans un milieu stérilisé contenant 3% de sucrose, 2% de poudre de soja, 0,3% de CaC03, 0,001% de CoCl2.6H20 et 0,001% de MfSO4.7H20 (20 litres) dans un fermenteur cylindrique de 30 litres et on conduit la culture à 30 C pendant 4 jours à 200 tpm, aération litres par minute. On centrifuge le bouillon de culture ainsi obtenu pour séparer le mycélium et le liquide surna- geant. On ajoute de l'acétone (10 litres) au mycélium humide, on agite pendant 3 heures et on filtre. L'ex- trait acétonique est concentré à 2 litres, ajusté au pH 6,5, on ajoute de l'acétate d'éthyle (2 litres) et on agite énergiquement. On concentre la couche d'acétate d'éthyle pour obtenir un sirop huileux brunâtre. On ajoute de l'hexane (200 cm3) au sirop. La substance brunâtre précipitée est séparée par cen- trifugation et dissoute dans un mélange chloroforme: méthanol (5: 1) (200 cm3). On concentre la solution pour chasser le chloroforme par distillation. Un pré- cipité blanc grisâtre est recueilli par centrifugation et séché pour donner un mélange (240 mg, pureté 60%) contenant les planothiocines A et B. On dissout le mélange (170 mg) dans un mé- lange chloroforme: méthanol: acide acétique (13: I: 0,1) et on charge la solution sur une colonne de gel de silice (120 cm3) garnie au préalable du même mélange de solvants. On effectue l'élution avec le même mé- lange de solvants pour recueillir des fractions de 18 g chacune. On trouve des fractions actives contenant la planothiocine B dans les fractions N 9-15. On trouve la planothiocine A dans les fractions actives N 16-46. Chacune des fractions est recueillie et concentrée pour précipitation de cristaux blancs qui sont recueillis par centrifugation. On dissout les cristaux dans un mélange (20 cm3) chloroforme: méthanol (2: 1), on abandonne la solution à la température am- biante pour élimination du chloroforme et ainsi les planothiocines A et B cristallisent sous la forme de cristaux aciculaires blancs. Les cristaux ainsi formés sont recueillis par filtration et séchés pour donner de la planothio- cine A (59 mg) et de la planothiocine B (23 mg). Les cristaux aciculaires blancs de plano- thiocine A (50 mg) obtenus par le procédé ci-dessus sont dissous dans la solution mixte (10 cm3) d'acide acéti- que: chloroforme: méthanol (3: I: 1). Les cristaux prismatiques incolores ainsi précipités sont recueillis par filtration et séchés pour donner de la planothiocine A sous la forme de cristaux prismatiques incolores (29 mg). Exemple de référence 1 Un mélange de planothiocine A et de planothio- cine B (planothiocine A:planothiocine B = 93:7)est mélangé avec la nourriture (lait artificiel pour porcelets)compre- nant 22,44% de protéine brute, 5,14%. de graisse brute, 0,74% de cellulose brute, 6,16% de cendre brute, 1,25% de calcium et 0,95% de phosphore;DCP(Digestible Crude Protein) 21,38%, TDN(Total Digestible Nutrient)87,41%(tous les pour- centages, sauf pour DCP et TDN, sont indiqués en poids/poids). Deux groupes de porcelets, à raison de 10 porcelets par groupe, âgés de 25 jours, sont nourris pendant 4 semaines de la manière suivante: pour un groupe, avec la nourriture témoin (sans addition d'an- tibiotiques), avec 0,5'ppm (nourriture contenant 0,5 ppm d'antibiotiques) et avec 5 ppm; pour l'autre grou- 2 463151 pe, avec la nourriture témoin (sans antibiotiques), avec 10 ppm et avec 20 ppm. Les résultats de poids moyen du corps, d'accroissement de poids moyen du corps et de rapport d'accroissement de poids du corps sont présentés dans le tableau 4. Comme montré dans le tableau, on ob- serve de bons effets d'activation de croissance. Tableau 4 poids du témoins corps avec 0,5 ppm avec 5 ppm initial1) 5,5 1,08 5,6 1,26 5,4 + 1,39 final1) 15,1 2,76 16,2 + 2,32 16,6 + 2,15 accrois- sement 2) 9,5 1,97 10,6 1,32 11,2 + 1,21 rapport d'accrois- sement poids du témoins corps avec 10ppm avec 20 ppm initial1) 5,8 + 1,07 5,8 + 0,87 5,7 + 1,15 final1) 15,4 + 2,14 17,2 + 1,95 16,8 + 2,33 accrois2) ** sement 9,7 + 1,33 11,5 + 1,27 11,1 + 1,27 rapport d'accrois- sement 1) poids moyen du corps écart-type (kg) 2) accroissement de poids moyen du corps + écart-type (kg) ** différence significative avec 1% de risque * différence significative avec 5% de risque Exemple de référence 2 Le mélange de planothiocines A et B (rapport 93: 7) est mélangé avec une nourriture pour poulets comprenant 20,0% de protéine brute, 3,4% de graisse bru- a> oj ci) à te, 3,4% de cellulose brute, 5,5% de cendre brute, 1,03% de calcium, 0,83% de phosphore et 0,43% de phosphate inorganique;- TDN 70,3% et énergie brute 34 Cal/1000 g. Deux groupes de poulets, un groupe de mâles et un groupe de femelles, 25 poulets par grou- pe, sont nourris pendant 4 semaines avec la nourri- ture témoin (sans addition d'antibiotiques), avec 0,5 ppm (nourriture contenant 0,5 ppm d'antibioti- ques), avec 5 ppm, avec 10 ppm et avec 20 ppm. Comme montré dans le tableau 5, on ob- serve un bon effet d'activation de croissance. Dans le tableau, pour le groupe de pou- lets mâles, on note une différence importante, toute- fois une faible dispersion caractéristique est obser- vée pour le groupe de poulets femelles. Tableau 5 poids du corps témoins avec 0,5 ppm avec 5 ppm avec 10 ppm avec 20 ppm initial 1) 44,32 + 2,94 44,12 + 2,65 44,32 + 2,48 44,0 + 2,47 44,16 + 2, 67 final 1) 720,5 + 60,3 769,6 + 55,0 759,0 + 63,2 787,8 + 69,2 806,0 + 53,1 o S accroissement ** * ** ** moyen2 676,2 + 60,0 725,4 + 54,5 714,7 + 62,4 743,7 + 68,5 761,8 + 52,9 poids du corps initial1) témoins 44,20 2,96 avec 0,5 ppm avec 5 ppm avec 10 ppm avec 20 ppm 44,20 3,21 44,48 2,52 44,32 + 3,16 44,48 2,97 final1) 784,4 70,9 823;1 45,6 839,2 + 62,7 868,7 61,6 863,2 + 47,7 accroissement moyen2) 742,2 + 71,1 * 778,9 + 45,0 **794,7 + 63,3 824,4 **+ 61,9 818,8 + 48,6 794,7 + 63,3 824,4 + 61,9 818,8 + 48,6 1) poids moyen du corps + écart-type (g) 2) accroissement de poids moyen du corps écart-type (g) * différence significative avec 1% de risque ** différence significative avec 5% de risque N w a) Id or OH h REVENDICATIONS 1) Des planothiocines antibiotiques choisies dans le groupe constitué par la planothiocine A, la plano- thiocine B, la planothiocine C, la planothiocine D, la planothiocine E, la planothiocine F et la planothiocine G. 2) La planothiocine A ayant les propriétés sui- vantes: 1) Point de fusion: 266 - 269 C (décomp.) 2) Analyse élémentaire: C = 49,47%, H = 3,53%, N = 13,25%, S = 13,73% 3)Masse moléculaire: 1438 (masse moléculaire minimale calculée par analyse des amino-acides, une mo- lécule de thréonine dans une molécule du composé 4) Rotation optique: 23 = +19,6 (c = 0,7, pyridine) ) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet: Fig. 1 (dans méthanol), Fig. 2 (dans méthanol acide), Fig. 3 (dans méthanol alcalin). 6) Spectre d'absorption dans l'infrarouge: Fig. 4 7) Réaction de couleur: positive; décoloration du permanganate de potassium, de l'iode négative: chlorure ferrique, ninhydrine, Molisch 8) Solubilité: soluble: mélange CHCl3-métha- nol, pyridine, DMSO, acide acétique glacial insoluble: benzène, acétone, éther de pétrole, hexane 9) Nature: faiblement acide 10) Couleur: cristaux blancs. 3) La planothiocine B ayant les propriétés sui- vantes: 1) Point de fusion: 259 - 262 C (décomp.) 2) Analyse élémentaire: C = 49,37%, H = 3,45%, N = 13,30%, S = 14,19% 3) Masse moléculaire: 1350 (masse moléculaire minimale calculée par analyse des amino-acides, une molécule de thréonine dans une molécule du composé) 4) Rotation optique: [-_;723 = +95,4 (c = 0,5, pyridine) ) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet: Fig. 5 (dans méthanol), Fig. 6 (dans méthanol acide), Fig. 7 (dans méthanol alcalin) 6) Spectre d'absorption dans l'infrarouge: Fig. 8 7) Réaction de couleur: positive: décoloration du permanganate de potassium de l'iode négative: chlorure ferrique, ninhydrine, Molisch 8) Solubilité: soluble: mélange CHC13-métha- nol, pyridine, DMSO, acide acétique glacial insoluble: benzène, acétone, éther de pétrole, hexane 9) Nature: faiblement acide ) Couleur: cristaux blancs 4) La planothiocine C ayant les propriétés sui- vantes: 1) Point de fusion: 247-251oC (décomp.) 2) Analyse élémentaire: C = 47,81%, H = 3,42%, N = 13,62%o, S = 13,85% 3) Masse moléculaire: 1200 1500 (déterminée par analyse des amino-acides) 4) Rotation optique: 27 = + 28,4 (c = 0,9, pyridine) ) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet: Fig. 9 (dans méthanol, Fig. 11 (dans méthanol alcalin) 6) Spectre d'absorption dans l'infrarouge: Fig. 12 7) Réaction de couleur: positive: décolora- tion du permanganate de potassium, de l'iode négative: chlorure ferrique, ninhydrine, Molisch 8) Solubilité: soluble: CHCl3, pyridine, DMF, DMS0 insoluble; benzène, acétone, éther de pétrole, hexane, eau 9) Nature: faiblement acide ) Couleur: cristal blanc ) La planothiocine D ayant les propriétés suivantes: 1) Point de fusion 254-258 C décomp.) 2) Analyse élémentaire: C = 48,18%, H = 3,58%, N- 13,26%, S = 15,61% 3) Masse moléculaire: 1200 - 1500 (déterminée par analyse des aminoacides) 4) Rotation optique: 2$._720= +31,4 (c = 0,7, pyridine) ) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet: Fig. 13 (dans méthanol), Fig. 15 (dans méthanol alcalin) 6) Spectre d'absorption dans l'infrarouge: Fig. 16 7) Réaction de couleur: positive: décolora- tion du permanganate de potassium, de l'iode négative: chlorure ferrique, ninhydrine, Molisch 8) Solubilité: soluble: CHCl3, pyridine, DMF, SMD0 insoluble: benzène, acétone, éther de pétrole, eau 9) Nature: faiblement acide 10) Couleur: cristaux blancs 6) La planothiocine E ayant les propriétés suivantes: 1) Point de fusion: 245-247 C (décomp.) 2) Analyse élémentaire:C = 48,31%, H - 3,36%, N = 13,41%, S =13,92% 3) Masse moléculaire: 1200 - 1500 (déterminée par analyse des aminoacides) 4) Rotation optique: o7 20= +45,5 (c = 0,7, pyridine) 5) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet: Fig. 17 (dans méthanol), Fig. 19 (dans méthanol alca- lin) 6) Spectre d'absorption dans l'infrarouge: Fig. 20 7) Réaction de couleur: positive: décolora- tion du permanganate de potassium, de l'iode - négative: chlorure ferrique, ninhydrine, Molisch 8) Solubilité: soluble: CHC13, pyridine, DMF, DMS0 insoluble: benzène, acétone, éther de pétrole, eau. 9) Nature: faiblement acide ) Couleur: cristaux blancs 7) La planothiocine F ayant les propriétés suivantes: 1) Point de fusion: 258 - 260 C (décomp.) 2) Analyse élémentaire: C = 49,83%, H = 3,54% N = 14,70%, S = 15,29% 3) Masse moléculaire: 1200 - 1500(déterminée par analyse des amino-acides) 4) Rotation optique: o7 0 = +107,8 (c = 0,8, pyridine) ) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet: Fig 21 (dans méthanol), Fig. 23 (dans méthanol alcalin) 6) Spectre d'absorption dans l'infrarouge: Fig. 24 7) Réaction de couleur: positive: décolora- tion du permanganate de potassium, de l'iode négative: chlorure ferrique, ninhydrine, Molisih 8) Solubilité: soluble: CHCl3, pyridine, DMF, DMS0 insoluble: benzène, acétone, éther de pétrole, eau 9) Nature: faiblement acide ) Couleur: cristaux blancs. 8) La planothiocine G ayant les propriétés suivantes: 1) Point de fusion: 262-264 C (décomp.) 2) Analyse élémentaire: C = 49,26%, H = 3,42%, N = 13,70%, S = 15,96% 3) Masse moléculaire: 1200 - 1500 (déterminée par analyse des aminoacides) 4) Rotation optique: oc7 D0 = 122,4 (c = 0,4, pyridine) ) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet: Fig. 25 (dans méthanol), Fig. 27 (dans méthanol alca- lin) 6) Spectre d'absorption dans l'infrarouge: Fig. 28 7) Réaction de couleur: positive: décolora- tion du permanganate de potassium, de l'iode négative: chlorure ferrique, ninhydrine, Molisch 8) Solubilité: soluble: CHC13, pyridine, DMF, DMSO insoluble: benzène, acétone, éther de pétrole, eau 9) Nature: faiblement acide ) Couleur: cristaux blancs. 9. A titre de médicament une planothiocine selon l'une des revendications 1 à 8.