Brevet FR2466020A1 — publié le 19810327

La présente invention concerne des réactifs ainsi qu'une méthode pour la détermination de l'aldolase du type contenu dans les mucles de l'homme. Le terme "aldolase" désigne, d'une manière générale, les enzymes qui catalysent la condensation aldolique et la scission en dihydroxyacétone phosphate et en une série d'aldéhydes. L'aldolase selon l'invention est une fructo- se diphosphate aldolase (notamment la 4. 1. 2. 13. fruc- tose-1, 6-phosphate D-glycéraldéhyde-3-phosphate lyase) qui décompose réversiblement le fructose-1,6-diphosphate en dihydroxyacétone phosphate et en D-glycéraldéhyde-3- phosphate. Ces enzymes jouent un rôle fondamental dans la glycolyse et, en particulier, existent principalement dans le muscle, en contribuant ainsi fortement au métabo- lisme énergétique. L'aldolase des mammifères comprend trois ty- pes d'isoenzymes, à savoir le type musculaire (type A), le type hépatique (type B) et le type cervical (type C). Il est connu que les proportions respectives de ces iso- enzymes varient en fonction des métamorphoses de l'orga- nisme vivant, comme la différentiation du foie fétal chez le rat, l'apparition du cancer dans l'organisme hu- main ou chez le rat, et analogues. On connaît deux méthodes usuelles de déter- mination de l'aldolase du type contenu dans le muscle de l'homme, l'une de celles-ci étant la méthode électro- phorétique et l'autre une méthode qui comprend la mesure des activités de décomposition de deux substrats, en l'occurrence le fructose-1,6diphosphate (FDP) et le fructose-1-phoshate (FIP) pour l'aldolase /activité FDP-ALD et activité FIP-ALD7, ce qui donne le rapport d'activité (FDP/FIP). Ces méthodes soulèvent cependant de nombreux problèmes. 2 2466020 Dans la méthode électrophorétique, le problè- me consiste en ce que les taches résultant de la migration des isoenzymes de l'aldolase humaine sont si proches les uns des autres que la discrimination est difficile et qu'il n'est pas possible d'effectuer une détermination quantitative précise. Dans la méthode de mesure du rapport d'acti- vité FDP/FIP, il faut noter que l'opération de mesure de l'activité FIPALD est particulièrement compliquée et que la détermination n'est pas quantitative. On a récemment décrit une méthode d'essai radio-immunologique. Par comparaison avec les méthodes précitées, cette méthode présente une bien meilleure sensibilité et donne aussi des résultats quantitatifs. Cependant, cette méthode présente cependant quelques inconvénients car le réactif ne peut pas être stocké en raison de la diminution rapide d'activité du radioisotope à utiliser pour le marquage; de plus,des machines et appareils spéciaux ainsi que des locaux spéciaux sont né- cessaires pour mesurer le radioisotope; en outre, la manipulation du radioisotope lors de la mesure et l'éli- mination des substances usées ou résiduaires provenant de celui-ci sont difficiles, en raison du fait que l'u- tilisation du radioisotope s'accompagne d'un danger pour la santé. La Demanderesse a mis au point un réactif des- tiné à être utilisé pour un essai immunologique avec en- zyme, concernant l'aldolase du type contenu dans le mus- cle humain, et une méthode pour la détermination de l'aldolase du type du muscle humain en utilisant ce réac- tif. Conformément à cette méthode, les divers inconvé- nients des méthodes de l'art antérieur peuvent être éli- minés ou amoindris. La méthode selon l'invention est une méthode d'essai immunologique avec enzyme, dite "méthode sandwich". Selon cette méthode, la mesure est effectuée en mettant 3 2466020 en oeuvre les étapes suivantes (a) mise en contact d'un échantillon avec un anticorps del'aldolase du type conte- nu dans le muscle, à l'état insolubilisé, puis séparation de la phase solide; (b) mise en contact de la phase solide avec un anticorps de l'aldolase du type con- tenu dans le muscle, marqué par un enzyme, puis séparation de la phase solide; (c) mise en contact de la phase solide avec un substrat dudit enzyme; et (d) mesure de l'absorbance du produit de décomposition dudit substrat. La description ci-après est donnée pour illus- trer cette méthode. Dans l'étape (a), un anticorps insolubilisé par combinaison avec un support est incubé avec un échan- tillon, comme du sérum, etc., de telle sorte que l'anti- gène (aldolase du type du muscle humain) de l'échantillon puisse réagir avec ledit anticorps insolubilisé. Lorsque la réaction est terminée, la solution réactionnelle est retirée et la phase solide est lavée avec une solution tampon, de l'eau distillée ou analogue. Dans l'étape (b), la phase solide obtenue dans l'étape (a) est incubée avec un anticorps marqué par un enzyme, avec pour résultat la combinaison dudit anticorps marqué par un enzyme avec l'antigène lui-même préalable- ment combiné à l'anticorps insolubilisé. Lorsque la réac- tion est terminée, la solution réactionnelle est retirée et la phase solide est lavée avec une solution tampon, de l'eau distillée ou analogue. Dans l'étape (c), la phase solide obtenue dans l'étape (b) est incubée avec un substrat d'enzyme pour effectuer la réaction enzymatique. Au bout d'une durée prédéterminée, la réaction est stoppée par addition d'une 4 2466020 solution appropriée au milieu réactionnel. Dans l'étape (d), l'absorbance du produit de décomposition du substrat dans la solution réactionnelle de l'étape (c) est mesurée. La mesure du pouvoir absorbant est effectuée avec un photomètre d'ab- sorption en utilisant une longueur d'onde appropriée à la détermination quantitative du produit de décomposition du substrat. L'absorbance d e 1 a quantité connue de l'échantillon de référence, comme témoin, est préala- blement mesura avec ce système de mesure de façon à éta- blir une courbe opératoire ou courbe caractéristique re- présentant la quantité d'antigène en fonction du pouvoir absorbant. La quantité d'antigène dans l'échantillon peut être déterminée à partir de cette courbe caractéris- tique par mesure de l'absorbance d'une quantité inconnue dans l'échantillon au moyen du même système de mesure. Les figures 1 à 4 des dessins ci-joints mon- trent des courbes caractéristiques, pour l'aldolase du type contenu dans le muscle humain, obtenues par l'essai immunologique avec enzyme selon l'exemple 5 ci-après. La figure 5 montre une courbe caractéristique, concernant l'aldolase du type contenu dans le muscle hu- main, obtenue par l'essai immunologique avec enzyme selon l'exemple 6 ci-après. La figure 6 montre les résultats de détermina- tion de l'aldolase du type du muscle humain qui sont ob- tenus par l'essai immunologique avec enzyme de l'exemple 7 ci-après. La description suivante illustre le réactif d'analyse à utiliser avec la présente méthode. A) Anticorps de l'aldolase du type contenu dans les muscles- L'antisérum est obtenu par immunisation d'un animal (animal immvn)vis-à-vis de l'aldolase de type muscu- 2466020 laire d'un mammifère tel qu'un homme, un lapin,un chien, un singe, etc. L'animal immun est de préférence choisi par- mi les différentes espèces d'oiseaux, étant donné que les aldolases de type musculaire ne présentent pas des différences immunologiques importantes avec celles des mammifères. Les oiseaux préférés comprennent, par exem- ple, les poules, les dindons, les canards et analogues. i0 Il est préférable d'ajouter le sérum inacti- vé de l'animal,qui constitue la source d'aldolase de type musculaire,à l'antisérum résultant, de manière à enlever, par absorption, l'autre anticorps impur. La purification de ces antisérums peut être effectuée par chromatographie d'affinité en utilisant un support combiné à l'aldolase du type contenu dans les muscles des mammifères, le mammifère étant choisi parmi l'homme, le lapin, le singe, les bovins, etc, par exemple. Les matériaux de support à utiliser à cet effet sont l'a- garose, le dextrane ponté, etc. Le support combiné peut être préparé en activant un support par du bromare de cyanogène ou analogue, en ajoutant le support activé à la solution d'aldolase de type musculaire et en agitant la solution résultante à basse température. L'anticorps de l'aldolase de type musculaire, à l'état purifié, est obtenu par ad- dition de l'antisérum à une colonne garnie du support com- biné précité et en effectuant la chromatographie d'affi- nité. L'anticorps de l'aldolase de type musculaire peut être élué de la colonne au moyen d'une solution faiblement alcaline. Dans cette chromatographie d'affinité, la sen- sibilité varie,dans le cas de la méthode de mesure de la présente invention, en fonction de la combinaison du genre d'aldolase de type musculaire combinée avec le support et du genre d'aldolase de type musculaire utilisée pour la préparation de l'antisérum. 6 2466020 Dans le cas de l'antisérum de l'aldolase de type musculaire, on obtient une courbe caractéristique préférée, comme montrée sur la figure 1, en utilisant l'anticorps de l'aldolase du type contenu dans le muscle de l'homme, cet anticorps étant préparé par purification avec le support combiné à l'aldolase du type contenu dans le sérum humain. Dans le cas de l'antisérum de l'aldolase du type contenu dans le muscle du lapin, des courbes caractéristiques d'utilisation préférée sont obtenues par purification en utilisant le support combiné à l'aldolase du type contenu dans le muscle de l'homme et le support combiné avec l'al- dolase du type contenu dans les muscles des bovins, plutôt que le support combiné à l'aldolase du type contenu dans le muscle du lapin, comme montré sur les figures 2, 3 et 4. B) Anticorps de l'aldolase du type contenu dans le muscle, marqué par un enzyme En tant qu'enzymes à utiliser pour le marqua- ge, on peut mentionner les enzymes qui sont généralement utilisés pour les essais immunologiques avec enzymes, par exemple les alcaliphosphatases, les peroxydases, la 8-D- galactosidase, la glucoamylase, la glucose oxydase, et ana- logues. Le marquage peut être obtenu par toutes métho- des usuelles, comme par exemple la méthode glutalaldéhyde, la méthode de Nakane, la méthode au maléimide, la méthode aux anhydrides d'acides mixtes, la méthode au carbodiimide, etc. Dans la méthode au glutalaldéhyde, le marquage est effectué en ajoutant l'enzyme à l'anticorps et en ajoutant le glutaraldéhyde de telle sorte que la concentration puisse atteindre 0,2 - 0,8%, à la suite de quoi la réac- tion est effectuée à la température ambiante. Le rapport réactionnel de l'enzyme à l'anticorps est de préférence de 1: 1 (concentration/concentration), quoiqu'il puisse aller de 1: 2 à 2: 1. L'anticorps marqué à l'enzyme est généralement utilisé comme réactif par dilution avec une solution tampon ou analogue. Il est aussi souhaitable d'ajouter un sérum de lapin inactivé en une quantité d'environ 20% par rap- port à ladite solution diluée. Comme le montre la figure 4, l'addition de sérum inactivé de lapin donne une cour- be caractéristique dont l'utilisation est de beaucoup pré- férée à celles obtenues en utilisant une solution tampon seule ou une solution tampon contenant la sérum-albumine bovine. C) Anticorps de l'aldolase de type musculaire, à l'état insolubilisé On peut utiliser, en tant que support, un solide insoluble qui est susceptible de se combiner avec un anticorps. Comme exemples de tels solides, on peut citer le polystyrène, la cellulose, l'agarose, le verre, le dextrane ponté, le caoutchouc de silicone, les métaux, etc. Ce solide peut notamment être utilisé sous la forme d'un tube, d'une plaque de microtitration, d'une poudre, d'une sphère, d'un disque, d'une plaque, d'une feuille mince, etc. Dans le cas d'une plaque de microtitration en polystyrène, l'anticorps peut se combiner avec la surface de paroi de la plaque, lorsque ledit anticorps est adéquatement dilué avec une solution tampon ou ana- logue, la solution diluée étant ensuite ajoutée à la plaque et l'ensemble étant finalement laissé au repos. D) Les autres substances On utilise, en tant que substrat, les subs- trats d'enzymes qui ont été utilisés pour l'anticorps marqué par un enzyme. Lorsque l'enzyme utilisé est une alcaliphosphatase, les substrats utilisés sont le phos- phate de p-nitrophényle, le phosphate de ê-glycérol, le phosphate de phényle, le phosphate de 6-naphtyle, le phosphate de phénolphtaléine ou analogue. Pour la-solution d'arrêt des réactions enzy- matiques, on peut utiliser des solutions connues corres- pondant aux enzymes respectifs. Dans le cas d'une alca- liphosphatase, la solution convenable d'arrêt de réaction est une solution 1N d'hydroxyde de sodium.- Les descriptions ci-dessus ont été effectuées en référence à la méthode sandwich, mais l'aldolase, con- forme à la présente invention, du type contenu dans les muscles de l'homme, peut aussi être déterminée par un essai immunoenzymométrique. Cette méthode comprend la réaction de l'anticorps, marqué à l'enzyme, avec un é- chantillon (antigène), puis la séparation de la substance réactionnelle antigène-anticorps marqué à l'enzyme (B) par rapport à l'anticorps marqué à l'enzyme n'ayant pas réagi (F), et la détermination de l'activité enzymatique du constituant (B) ou du constituant (F) avec le substrat. En ce qui concerne la méthode de séparation de (B) et (F), on peut mentionner la méthode de filtration sur gel, la méthode d'absorption au moyen d'un antigène insolubilisé, etc. En outre, dans la détermination de l'aldolase du type contenu dans les muscles de l'homme par l'essai immu- noenzymométrique, on utilise, en tant que réactif, l'an- ticorps de l'aldolase du type des muscles humains,, marqué par enzyme, tel que décrit ci-dessus. Les expériences et les exemples suivants illustrent encore la présente invention. Expérience 1 Antisérum de l'aldolase du type du muscle humain L'aldolase du type contenu dans le muscle de l'homme (1 mg) est dissoute dans 0,5 ml de sérum physiolo- gique et un volume égal d'adjuvant complet de Freund est mélangé à la solution. Le produit est injecté dans le muscle d'une poule (Leghorn blanche). L'aldolase du type du muscle humain est administrée, selon le même processus que ci-dessus, deux semaines et aussi trois semaines après. Une semaine après la dernière administration, le sang de la poule est recueilli pour obtenir l'antisérum de l'al- dolase du type du muscle humain. 9 2466020 On ajoute, à cet antisérum, le sérum normal humain (NHS) inactivé à 56 C pendant 2 heures, de sorte que ledit antisérum puisse en contenir 10%. Le mélan- ge est incubé à 37 C pendant une heure et laissé au repos pendant environ 16 heures à 4 C. Le produit est centrifugé à raison de 3000 tours/min, pendant 20 minu- tes. Le produit surnageant qui est recueilli constitue l'antisérum de l'aldolase du type du muscle humain, contenant du NHS absorbé. Expérience 2 Antisérum de l'aldolase du type du muscle du lapin L'aldolase du type contenu dans le muscle du lapin (2 mg) est dissoute dans 1 ml de sérum physio- logique. On répète ensuite le processus décrit dans l'expérience 1 pour obtenir l'antisérum de l'aldolase du type du muscle du lapin. On ajoute à cet antisérum, jusqu'à une teneur de 10%o, du sérum normal de lapin (NRS) inactivé à 56 C pendant 3 heures. On répète ensuite le processus décrit dans l'exemple 1, pour obtenir l'anti- sérum de l'aldolase du type du muscle du lapin, contenant du NRS.absorbé. Expérience 3 Anticorps de l'aldolase du type du muscle humain 10 g de l'agarose de dénomination commercia- le "Sepharose 4B " (Pharmacie Fine Chemicals AB) et 10 mg d'aldolase du type du muscle humain sont laissés au repos, à 4 C, pendant environ 16 heures dans 15 ml d'une solution tampon à 0,1M de carbonate de sodium (pH de 9,0). Le gel de "Sepharose 4B" résultant, combiné à l'aldolase du type contenu dans le muscle de l'homme, est chargé dans une colonne et lavé avec une solution tampon à 0,05 M de tris-acide chlorhydrique contenant 0,5 N de chlorure de sodium. On ajoute à cette colonne 3 ml d'antisérum de l'aldolase du type du muscle humain, con- tenant du NHS absorbé (antisérum obtenu dans l'expé- 2466020 rience 1) et on élue l'antisérum avec la solution tampon à 0,05 M de trisacide chlorhydrique (pH 8,0) contenant 0,5 N de chlorure de sodium. On ajoute ensuite à la colonne une solution aqueuse à 0,1 N de carbonate de sodium pour éluer l'anticorps de l'aldolase du type contenu dans les muscles de l'homme. La fraction d'é- luat constitué par l'anticorps est soumise à une dialyse avec une solution tampon à 0,05 M de tris-acide chlorhy- drique (pH 8,0) pour obtenir 3 mg d'anticorps de l'aldo- lase du type des muscles humains. Expérience 4 Anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin On répète le processus décrit dans l'expé- rience 3, sauf qu'on ajoute 3 ml de l'antisérum de l'al- dolase du type du muscle du lapin ( ayant absorbé du NRS), décrit dans l'expérience 2, au gel de Sepharose 4B com- biné à l'aldolase du type du muscle du lapin. On obtient 3 mg d'antisérum de l'aldolase du type du muscle du lapin. Expérience 5 Anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin On répète le processus de l'expérience 3, sauf qu'on ajoute 3 ml de l'antisérum de l'aldolase du type du muscle du lapin ( ayant absorbé du NRS), décrit dans l'expérience 2, au gel de Sepharose 4B combiné avec l'aldolase du type du muscle de l'homme. On obtient 3 mg d'anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin. Expérience 6 Anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin On répète le processus de l'expérience 3, sauf qu'on ajoute 3 ml de l'antisérum de l'aldolase du type du muscle du lapin (ayant absorbé du NRS), décrit dans l'expérience 2, au gel de Sepharose 4B combiné avec l'aldolase du type du muscle des bovins. On obtient ainsi 1 2466020 3 mg d'anticorps de l'aldolase du type du muscle du la- pin. Expérience 7 Anticorps de l'aldolase du type du muscle humain, à l'état insolubilisé Dans chacun des trous d'une plaque de micro- titration en polystyrène, on introduit 200 microlitres d'une solution tampon à 0,05 M de tris-acide chlorhydri- que (pH 8,0) contenant 25 microgrammes/ml de l'anticorps de l'aldolase du type du muscle humain décrit dans l'ex- périence 3 et on laisse ensuite reposer pendant environ 16 heures à 4 C. La solution est alors retirée de la plaque.qui est lavée avec de l'eau distillée, de façon à obtenir la plaque de microtitration combinée à l'anti- corps de l'aldolase du type du muscle humain. Expérience 8 Anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin, à l'état insolubilisé Dans chacun des trous d'une plaque de micro- titration en polystyrène, on introduit 200 microlitres de solution tampon à 0,05 M de tris-acide chlorhydrique (pH 8,0) contenant 25 microgrammes/ml de l'anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin décrit dans l'e- xemple 4 et on maintient ensuite au repos pendant en- viron 16 heures à 4 C. La solution est alors retirée de la plaque. Cette plaque est lavée à l'eau distillée, de façon à obtenir la plaque de microtitration combi- née à l'anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin. Expérience 9 Anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin, à l'état insolubilisé Dans chacun des trous d'une plaque de micro- titration en polystyrène, on introduit 200 microlitres d'une solution tampon à 0,05 M de tris-acide chlorhydrique 12 2466020 (pH 8,0) contenant 25 microgrammes/ml de l'anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin décrit dans l'ex- périence 5 et on laisse ensuite au repos, pendant envi- ron 16 heures, à 4 C. La solution est ensuite retirée de la plaque. Cette plaque est lavée à l'eau distillée, de façon à obtenir ladite plaque de microtitration com- binée à l'anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin. Expérience 10 Anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin, à l'état insolubilisé. * En utilisant l'anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin qui est obtenu dans l'expérience 6, on obtient, d'une manière similaire à la précédente expérience 9, la plaque de microtitration combinée à l'anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin. Exemple 1 Anticorps de l'aldolase du type du muscle de l'homme, marqué par une alcaliphosphatase Dans 0,3 ml d'eau contenant I mg d'alcaliphos- phatase (activité relative: 1000 unités/mg), on ajoute 0,2 ml de solution tampon à 0,05 M d'acide phosphorique (pH de 7,0) contenant I mg de l'anticorps de l'aldolase du type du muscle humain décrit dans l'expérience 3 et 50 microlitres d'une solution à 2,5% de glutaraldéhyde. Le mélange est laissé au repos pendant 30 minutes, à la température ambiante, puis soumis à une dialyse avec une solution tampon à 0,05 M de tris-acide chlorhydrique (pH 8,0), pendant environ 16 heures. On obtient ainsi l'anticorps de l'aldolase du type du muscle humain, marqué par 1' alcaliphosphatase. Exemple 2 Anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin, marqué par une alcaliphosphatase On répète le processus de l'exemple 1, sauf qu'on utilise I mg de l'anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin décrit dans l'expérience 4 avec I mg d'alcaliphosphatase. On obtient ainsi l'anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin, marqué par l'alcaliphosphatase. Exemple 3 Anticorps du type de l'aldolase du muscle du lapin, marqué par une alcaliphosphatase On répète le processus de l'exemple 1, sauf qu'on utilise l'anticorps de l'aldolase du type du mus- cle du lapin décrit dans l'expérience 5 avec 1 mg d'al- caliphosphatase. On obtient l'anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin, marqué par l'alcaliphospha- tase. Exemple 4 Anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin, marqué par une alcaliphosphatase On répète le processus de l'exemple 1, sauf qu'on utilise l'anticorps de l'aldolase du type du mus- cle du lapin décrit dans l'expérience 6, avec 1 mg d'al- caliphosphatase. On obtient ainsi l'anticorps de l'al- dolase du type du muscle du lapin, marqué par l'alcali- phosphatase. Exemple 5 Essai immunologique avec un enzyme Une solution d'antigène de référence (à 500 ng/ml - 7,6 mg/ml) est préparée en diluant successive- ment deux fois l'aldolase du type du muscle humain avec le sérum de lapin normal inactivé à 56 C pendant 2 heu- res. On ajoute 0,1 ml de cette solution de référence à la plaque de microtitration combinée avec l'anticorps de l'aldolase de type musculaire et on maintient l'ensemble 14 2466020 à 37 C pendant 60 minutes. On enlève ensuite la solution réactionnelle. On lave quatre fois la plaque avec de l'eau distillée. Par ailleurs, l'tanticorps de l'aldola- se de type musculaire marqué par l'alcaliphosphatase est dilué 150 fois avec la solution tampon à 0,05 M de tris- acide chlorhydrique contenant 30% de sérum normal de la- pin inactivé à 56 C pendant 2 heures. On ajoute 0,1 ml de cette solution diluée à la plaque précitée et on laisse l'ensemble au repos pendant 60 minutes à 37 C. On enlève ensuite la solution réactionnelle. On lave quatre fois la plaque avec de l'eau distillée. On pré- pare séparément une solution à 5 mg/ml de phosphate de p-nitrophényle dans une solution tampon à 0,1 M de car- bonate de sodium (pH de 9,0) contenant 0,001 M de chloru- re de magnésium. On ajoute 0,1 ml de cette solution à la plaque précitée et on laisse réagir.à 37 C pendant minutes, à la suite de quoi on ajoute 0,1 ml d'hydro- xyde de sodium 1 N pour terminer la réaction. La solu- tion réactionnelle est diluée 10 fois avec de l'eau dis- tillée. Lt' absorbance à 405 micromètres est mesu- réeavec un spectrophotomètre pour établir la courbe carac- téristique illustrant la relation entre l'absorban- ce et la concentration en aldolase du type du muscle de l'homme. La figure 1 montre la courbe caractéristique dans le cas du système d'essai mentionné plus haut;dans ce cas, la plaque de microtitration combinée à l'anti- corps de l'aldolase du type du muscle humain de l'expé- rience 7 a été utilisée comme plaque de microtitration combinée à l'anticorps de l'aldolase de type musculaire et l'antigène de l'aldolase du type du muscle humain, marqué par l'alcaliphosphatase, de l'exemple 1, a été utilisé comme antigène de l'aldolase de type musculaire marqué par l'alcaliphosphatase. La figure 2 montre la courbe caractéristique dans le cas o la plaque de microtitration combinée à l'anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin selon l'expérience 8 a été utilisée comme plaque de microtitration combinée à l'anticorps de l'aldolase de type musculaire et o l'anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin, marqué par l'alcaliphosphatase, de l'exemple 2, a été utilisée comme anticorps de l'al- dolase de type musculaire marqué par l'alcaliphosphatase. La figure 3 montre la courbe caractéristique dans le cas o la plaque de microtitration combinée avec l'anticorps de 1'aldolase du type du muscle du lapin de l'expérience 9 a été utilisée comme plaque de microti- tration combinée avec l'anticorps de l'aldolase de type musculaire et o l'anticorps du type du muscle du lapin marqué par l'alcaliphosphatase de l'exemple 3 a été uti- lisé comme anticorps de l'aldolase de type musculaire marqué par l'alcaliphosphatase. La figure 4 montre la courbe caractéristique dans le cas o la plaque de microtitration combinée à l'anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin de l'expérience 10 a été utilisée comme plaque de microti- tration combinée avec l'anticorps de l'aldolase de type musculaire et o l'anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin marqué par l'alcaliphosphatase, de l'exem- ple 4, a été utilisé comme anticorps de l'aldolase de type musculaire marqué par l'alcaliphosphatase. Sur les figures 1 à 4, la concentration (ng/ml) en aldolase du type du muscle humain est repor- tée sur les axes des abscisses et i ' absorbance pour une longueur d'onde de 405 millimicrons(DO405im) a été reportéesur les axes des ordonnées. Comme le montrent les figures 1 à 4, la cour- be caractéristique dont l'utilisation est préférée est obtenue avec l'anticorps insolubilisé et avec l'anticorps marqué par un enzyme pour lesquels on utilise l'anti- corps de l'aldolase du type contenu dans les muscles de l'homme (figure 1), puis, par ordre de préférence dé- croissant, avec l'anticorps insolubilisé et l'anticorps marqué par un enzyme pour lesquels on utilise l'anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin (figures 4, 3 et 2). On remarque que, par comparaison aux cas o l'an- ticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin est utilisé, les courbes caractéristiques dont l'utilisa- tion est préférée sont respectivement obtenues dans le cas (figure 4) o le support combiné à l'aldolase du type des muscles des bovins est utilisé, de même que dans le cas (figure 3) o le support combiné à l'aldo- lase du type du muscle humain est utilisé, pour la pu- rification de l'anticorps par chromatographie d'affini- té, plutôt que la courbe obtenue dans le cas (figure 2) o le support combiné à l'aldolase du type du muscle du lapin est utilisé. Exemple 6 Essai immunologique avec un enzyme - Les effets de la nature du diluant sur les anticorps marqués par des enzymes sont étudiés au moyen du système d'essai immunologique selon l'exemple 5. On utilise l'anticorps de l'aldolase du ty- pe du muscle humain, marqué par l'alcaliphosphatase, décrit dans l'exemple 1, comme anticorps marqué par enzyme, et la plaque de microtitration combinée à l'al- dolase du type du muscle humain décrit dans l'expérien- ce 7, en tant qu'antigène insolubilisé. Les diluants suivants sont utilisés dans cet exemple: (A) Solution tampon à 0,05 M de tris-acide chlorhydrique (pH de 8,0) contenant 30% de sérum de lapin normal, inactivé à 560C pendant 2 heures. (B) Solution tampon-à 0,05 M de tris-acide chlorhydrique (pH 8,0), contenant 1% de sérum-albumine de bovins, inactivée 17 2466020 à 56WC pendant 30 minutes. (C) Solution tampon à 0,05 M de tris-acide chlorhydrique (pH 8,0), en tant que té- moin. On utilise respectivement les anticorps mar- qués aux enzymes après les avoir dilués 150 fois avec chacun des diluants précités. La courbe caractéristi- que est établie par le processus décrit dans l'exemple en utilisant la solution d'antigène de référence. Chaque courbe caractéristique obtenue est donnée sur la figure 4. La concentration en aldolase du type du mus- cle humain (ng/ml) est reportée sur l'axe des abscisses de la figure 4 et l ' absorbance, pour la longueur d'onde de 405millimicrons (DO4051I), est reportée sur l'axe des ordonnées. Les symboles A, B et C désignent les courbes caractéristiques respectives obtenues avec, respectivement, les diluants (A), (B) et (C). Comme le montre le dessin, la courbe caractéristique d'utilisation préférée est la courbe caractéristique A qui est obtenue dans le cas o l'on utilise le diluant contenant le sé- rum de lapin inactivé. Exemple 7 Essai immunologique avec un enzyme On a effectué, en utilisant le système d'essai immunologique décrit dans l'exemple 5, des dé- terminations de la concentration en aldolase du type du muscle humain dans les sérums de divers patients atteints de cancer, de patients souffrant de maladies bénignes et de personnes en bonne santé. L'anticorps, marqué par un enzyme, qui est utilisé dans cet exemple est l'anticorps de l'aldolase du type du muscle humain, marqué par l'alcaliphosphata- se, décrit dans l'exemple 1, et l'anticorps insolubili- sé utilisé est la plaque de microtitration combinée à l'aldolase du type du muscle humain décrite dans l'expérience 7. Le sérum de l'échantillon est utilisé directement, sans dilution. Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 6. Comme le montrent les dessins, l'aldolase du type contenu dans les muscles de l'homme tend à être présente dans le sérum des patients atteints de cancer à une concentration plus élevée que chez les patients souffrant de maladies bénignes et que chez les per- sonnes en bonne santé. REVENDICATIONS 1) Réactif pour la détermination de l'aldo- lase du type contenu dans les muscles de l'homme, ca- ractérisé en ce qu'il comprend un anticorps de l'aldo- lase de type musculaire, marqué par un enzyme. 2) Réactif selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme précité est une alcaliphosphatase. 3) Réactif selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'anticorps de l'aldolase de type musculaire précité est un anticorps de 1'aldolase du type contenu dans les muscles de l'homme. 4) Réactif selon la revendication 1, caracté- risé en ce que l'anticorps de l'aldolase de type muscu- laire précité est un anticorps de l'aldolase du type contenu dans le muscle du lapin. ) Réactif selon la revendication 4, caracté- risé en ce que ledit anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin précité est un anticorps purifié par chromatographie d'affinité en utilisant un support combiné avec l'aldolase du type contenu dans les muscles de l'homme. 6) Réactif selon la revendication 4, caracté- risé en ce que l'anticorps de l'aldolase du type du muscle du lapin précité est un anticorps qui est purifié par chromatographie d'affinité en utilisant un support combiné avec l'aldolase du type contenu dans les muscles des bovins. 7) Réactif selon la revendication 1, caracté- risé en ce que l'anticorps de l'aldolase du type mus- culaire précité, marqué par un enzyme, est dilué avec une solution tampon contenant du sérum de lapin inac- tivé. 8) Méthode pour la détermination de l'aldolase du type contenu dans les muscles de l'homme, caractéri- 20. 2466020 sée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes (a) mise en contact d'un échantillon avec un an- ticorps de l'aldolase de type musculaire à l'état insolubilisé, puis séparation de la phase solide; (b) mise en contact de ladite phase solide avec un anticorps de l'aldolase de type musculai- re, marqué par un enzyme, puis séparation de la phase solide; (c) mise en contact de la phase solide avec un substrat d'enzyme; et (d) détermination de l'absorbance des produits de décomposition du substrat. 9) Méthode selon la revendication 8, caractéri- sée en ce qu'elle comprend l'utilisation de l'anticorps de l'aldolase du type contenu dans le muscle du lapin, cet anticorps ayant été purifié par chromatographie d'affinité en utilisant un support combiné avec l'aldo- lase du type contenu dans les muscles des bovins, en tant qu'anticorps de l'aldolase de type musculaire, dans un anticorps de l'aldolase de type musculaire, à l'état insolubilisé, et un anticorps de l'aldolase de type mus- culaire marqué par un enzyme.