Brevet FR2461952A1 — publié le 19810206

246-1952 L'invention concerne un procédé de détermi- nation des transaminases destiné au domaine du diagnostic clinique. La transamination est le processus de trans- fert d'un groupe amine d'un aminoacide à un cétoacide. Les enzymes qui catalysent ce type de réaction sont appelés transaminases et leur détermination est devenue essentielle en chimie clinique depuis qu'en 1954, LaDue, Wroblewski et Karmen ont signalé que la TGO (transaminase glutamique oxaloacétique ou aspartate aminotransférase ou EC 2.6.1.1. selon la classification I.U.B.) augmente après un infarctus du myocarde. On a noté des variations notables aussi bien de la TGO que de la TGP (transaminase glutamique pyruvique ou alanine aminotransférase ou EC 2.6. 1.2 selon la classification I.U.B.) dans d'autres formes pathologiques, spéciale- ment dans des hépatopathies. La TGO catalyse la réaction suivante: 0COH COOH COOH COOH I I! I CH2 + H CH2 CH2 CHNH8 H-2,0=0 CH2 kOOH CO CCOH CHNH2 !! COOH COOH acide acide acide acide aspartique d -céto- oxalo- glutamique glutarique acétique tandis que la TGP catalyse la réaction suivante: CH COOH CH 0COH !3, v3 CNH2 + CH2 -> C00 OH2 CHOC-0 CH t 2 2 COOH CH2 COOH CH2 CO CHNH2 ! 2 COOH COOH alanine acide acide acide O(-céto pyruvique glutamique glutarique Dans le cas de la TGO, il n'est pas facile de déterminer les acides aspartique et i-cétoglutari- que; c'est pourquoi tous les procédés actuellement en usage sont basés sur la détermination, directe ou indirecte, de l'acide oxaloacétique. On emploie dans le monde deux procédés: 1) le procédé colorimétrique basé sur la réaction de l'acide oxaloacétique et de la 2,4-dinitro- phénylhydrazine; cette réaction n'est pas cinétique mais au bout d'un temps d'incubation préétabli, on dose la quantité de cétoacide formé en mesurant à 536 nm l'extinction de la phénylhydrazone formée. Bien que ce procédé ait été modifié au cours des années, il pré- sente encore des inconvénients dans le cas de sujets souffrant d'ictère. 2) le procédé cinétique à l'ultraviolet qui est généralement considéré comme le procédé de référen- ce étant donné sa grande précision et sa grande spé- cificité. On détermine l'acide oxaloacétique formé dans la réaction de transamination par une réaction enzymatique couplée avec la déshydrogénase malique (DEHM) en mesurant à 340 nm l'oxydation du NADH (nicoti- namide adénine dinucléotide sous forme réduite). COOH COOH +H2DIDH ?H2 + N AD C = 0 + NADH + H+ H-C-OH COOH COOH acide oxaloacétique acide malique. Les modifications apportées à ce procédé, introduit initialement par Karmen, ont permis d'optimi- ser la réaction en fonction de la concentration de substrat et des températures de détermination et de surmonter les difficultés dues aux phases cinétiques non linéaires. Pour la TGP aussi, on peut faire des consi- dérations similaires dans le cas de l'essai colorimé- trique tandis que le procédé cinétique à l'ultraviolet introduit par Henley et Pollard est basé sur la déter- mination de l'acide pyruvique formé dans la réaction de transamination de l'alanine par une réaction enzyma- 246 1952 tique couplée avec la déshydrogénase lactique (DEL), la réoxydation du NADH se mesurant & 340 nm. CH CH 13 + LDH 1 + C = O + NADH-H H-C-OH + NAD * I COOH -- COOH acide pyruvique acide lactique Egalement pour le procédé cinétique à l'ul- traviolet, les modifications introduites et décrites dans la littérature ont permis d'optimiser la réaction en fonction des concentrations de substrat et des températures de détermination. -La détermination des activités îGO et TGP dans le sérum ou dans d'autres échantillons biologiques s'effectue par les procédés calorimétrique ou cinétique à l'ultraviolet mentionnés ci-dessus. Cela oblige toujours l'analyste à effectuer deux analyses diffé- rentes pour les deux transaminases. Cela est dû à l'impossibilité technique de coupler en une seule dé- termination les deux enzymes cinétiques à l'ultraviolet mentionnés plus haut, étant donné les phénomènes d'inhi- bition croisée. L'invention a pour objet un nouveau procédé permettant de déterminer par spectrophotométrie, en un processus cinétique à l'ultraviolet et en un seul dosage, la somme des deux activités transaminases et constitue donc le premier dosage de discrimination entre les niveaux normaux et pathologiques de ces acti- vités enzymatiques. En outre, selon les besoins de l'analyste, le nouveau procédé permet, en modifiant simplement l'ordre d'introduction des réactifs et des substrats dans le mélange réactionnel, de déterminer exactement les activités des deux transaminases, en unités par litre, dans le même échantillon de plasma ou de sérum, de sorte que l'on gagne du temps relati- vement aux méthodes traditionnellement appliquées en laboratoire. Il est connu que la TGO est capable de cata- lyser la transamination non seulement de ses substrats naturels (acide glutamique et acide aspartique) mais encore d'autres aminoacides. Parmi ceux-ci, l'acide cystéinesulfinique est transaminé activement, en présence d'acide 0(-cétoglutarique, avec formation d'acide 6sulfinylpyruvique qui, étant instable en solution aqueuse, s'hydrolyse rapidement en acide pyruvique et sulfite selon le schéma suivant: CH -S0 H COOH CH -S02H COOH 02 o 2 O2) COOH 2 o2o HNH +CH GO O - 0 + C COCH000H CH CH- 2 C00OH COOH acide cysté- inesulfini- que acide i - cétogluta- rique acide -sul- finylpyru- vique acide glutamique la TGO est sulfinic dc-l/sel CH2-S02H CHNH2 000CH lue + i20\ CH C = 0 + H2SO3 C00H acide pyruvique MNme en l'absence d'acide -cétoglutarique, capable de réagir avec l'acide cystéine- et de catalyser une réaction d'élimination Lon le schéma suivant: CH l 2 GOT C-N2 + H2S03 COOH + H20 acide cysté- inesulfinique acideV - amino- acrylique CH C= O + NH3 COOH acide pyruvique Dans ce cas aussi, le produit final de la réaction est l'acide pyruvique et on peut déterminer l'activité de TGO en cinétique spectrophotométrique à 540 nm en mesurant la réoxydation du NADH en présence de déshydrogénase lactique, le m9me enzyme qui sert à déterminer l'activité de TGP. L'usage de l'acide cystéinesulfinique comme substrat de la TGO permet donc d'utiliser un seul enzyme révélateur, la déshydrogénase lactique (DHL) dans la détermination couplée des deux transaminases selon le schéma suivant: CH3 ?3 CHNH2 +, -KG COOH P alanine CH- CH- C = O +NADH LDH CH2SO2H GOT COOH CH-NH2 COOH + i-KG acide cysté- acide pyruvique inesulfinique H - C-OH + NAD COOH acide lactique La diminution de l'extinction à 340 nm est une mesure de la quantité d'acide pyruvique formé et par conséquent, de l'activité des deux transaminaseso Il est important de noter que la détermination simul- tanée des transaminases est possible dans ces condi- tions grâce à l'absence d'inhibition croisée entre les substrats utilisés. Les propriétés cinétiques particulières de la réaction entre la TGO et l'acide cystéinesulfinique permettent deux applications différen- tes du système, comme l'illustrent les exemples suivants: EXEMPLE 1 Procédé de détermination des activités absoluesde TGO et TGP A un mélange de 2,5 ml contenant 200 mmoles de L-alanine, 2 mmolesd'acide Ckcétoglutarique, 0,24 mmole de tLNADH et 3,6 unités de déshydrogénase lactique dans 80 mmolesde tampon formé de chlorhydrate de "Tris" (2-amino2-hydroxyméthyl-1,3-propanediol) à pH 8,5, on ajoute 0,5 ml de plasma ou de sérum, puis 246 1952 on mesure la diminution de l'extinction à 340 nm (ou à d'autres longueurs d'onde, par exemple 334 ou 365 nm selon l'instrument utilisé). La diminution est direc- tement liée au degré de transformation d'alanine en acide pyruvique, causée par la TGP. Au bout de quelques minutes de réaction, on ajoute 0,1 ml d'une solution d'acide cystéinesulfinique de sorte que la concentration finale dans le mélange soit de 66 mmoles. L'accroissement de A E/mn est dû dans le cas présent à la transformation de l'acide cystéine- sulfinique en acide pyruvique, causée par la TGO. Par des coefficients de transformation, il est possible de calculer, d'après le, E/mn observé avant et après l'addition d'acide cystéinesulfinique, les quantités exactes en unités enzymatiques de TGO et TGP présentes dans le sérum, par un seul processus de détermination. EXEMPLE 2 Procédé de discrimination pour la détermination des niveaux normaux et pathologiques d'activités TGO et TGP dans le plasma ou le sérum A un mélange de 2,5 ml contenant 200 mmolesde L-alanine, 2 mmolesd'acide dcétoglutarique, 0,24 mmole de P-NADH, 7 mmoles d'acide cystéinesulfinique et 3,6 unités de déshydrogénase lactique dans 50 mmolesde tam- pon "Tris"-HC1, pH 8,5, on ajoute 0,5 ml de sérum ou de plasma et on mesure la diminution d'extinction à 340 nm (ou à d'autres longueurs d'onde, par exemple 334 ou 365 nm selon l'instrument utilisé). Dans ce cas, la diminution de l'extinction est en relation directe avec le degré de transformation de l'alanine aussi bien que de l'acide cystéinesulfinique en acide pyruvique, causée respectivement par la TGP et la TGO et c'est une mesure de la somme des deux activités enzymatiques. Les caractéristiques cinétiques du dosage permettent d'établir une valeur limite de à E/mn entre les niveaux normal et pathologique. Grace & des coefficients de transformation appropriés, il est possible, dans le cas d'échantillons normaux, de calculer exactement les unités enzymatiques effectives de TGO comme de TGP tandis que dans le cas d'échantillons pathologiques, ce procédé comporte une erreur d'environ 10 à 15%. REVENDICATIONS 1. Procédé cinétique à l'ultraviolet pour la détermination simultanée de la transaminase gluta- mique oxaloacétique (TGO) et de la transaminase glu- tamique pyruvique (TGP) dans un seul échantillon de sérum ou de plasma, caractérisé en ce que comme amino- acides spécifiques servant de substrats aux transaminases susdites, on utilise respectivement l'acide L-cystéine- sulfinique et la L-alanine, et que, comme enzyme révélateur des deux activités de transaminase, on utilise la déshydrogénase lactique. 2. Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que pour mesurer les activités totales de TGO et TGP, on mesure le AE/mn total, les deux amino- acides utilisés comme substrats étant présents dans le milieu de réaction dès le début. 3. Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que l'on mesure d'abord le E/mn en présence de L-alanine comme substrat et ensuite on mesure l'accroissement du A E/mn après l'addition d'acide cystéinesulfinique, ce dernier accroissement étant une mesure de l'activité de TGO. 4. Nécessaire à diagnostic pour la détection de taux normaux ou pathologiques de TGO et TGP par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend, comme substrats, de l'acide cystéinesulfinique et de la L-alanine.