Brevet FR2462442A1 — publié le 19810213

Les antibiotiques aminoglycosidiques constituent une classe bien connue d'antibiotiques utiles. On remarque parmi ces antibiotiques la gentamicine, la néomycine, la sisomicine, la kanamycine, etc. La production de gentamicine par fermentation et sa séparation sont décrites dans le bre- vet des Etats-Unis d'Amérique NO 3 091 572. L'utilisation de la chromatographie dans un procédé de séparation de la genta- micine a été décrite pour la première fois en 1967 par Maehr et Schaffner dans "The Separation And Differentiation Of The Gentamicine Complex", J. Chromatog., 30, 572-578. Plus récem- ment, le brevet des Etats-Unis d'Amérique N0 3 915 955 a décrit l'utilisation d'un procédé chromatographique essen- tiellement identique à celui qui a été décrit par Maehr et Schaffner, ci-dessus. Conformément à l'invention, une solution contenant de la gentamicine et des impuretés est concentrée jusqu'à une concentration en matières solides d'environ 0,5 g/ml, puis soumise à la chromatographie au moyen d'une résine d'échange ionique fortement basique, cependant que le pH et la température du processus chromatographique sont main- tenus entre certaines limites définies. Cette limitation com- binée de pH et de température offre une amélioration surpre- nante de la production de gentamicine de plus de 100 % par rapport au procédé de l'art antérieur qui ne tient pas compte du caractère déterminant de la limitation du pH et de la tem- pérature. La présente invention, considérée au sens le plus large, est un procédé chromatographique par lequel un anti- biotique aminoglycosidique est séparé des impuretés. L'invention est décrite plus spécialement pour la gentamicine, mais elle peut aussi être appliquée à d'autres antibiotiques aminoglycosidiques. La solution de gentamicine que l'on peut utiliser dans le procédé de l'invention peut être obtenue par une fermentation produisant de la gentamicine dans les conditions décrites dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N0 3 091 572 précité. Différents procédés peuvent être utilisés pour trai- ter le bouillon de fermentation au moment de la récolte pour obtenir une solution aqueuse concentrée renfermant de la gentamicine et des impuretés. Dans l'un de ces procédés dé- crits dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique NI 3 903 072 et N 3 915 955 précité, le bouillon est filtré à un faible pH, le pH du filtrat est ajusté à la neutralité par addition d'hydroxyde d'ammonium, et le filtrat est chargé sur un lit de résine d'échange cationique faiblement acide, la résine est lavée à l'eau, et la colonne est éluée avec de l'hydro- xyde d'ammonium aqueux. L'éluat est ensuite concentré. Un autre procédé consiste à filtrer le bouillon, à faire passer le bouillon filtré à un pH neutre sur une résine di' échange cationique mixte faiblement acide (en suivant le mode opéra- toire décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique NI 2 786 831), à laver la résine avec de l'eau, puis à effectuer l'élution et la concentration comme indiqué dans le premier procédé décrit ci-dessus. Au début de chaque chromatographie, le lit de résine est porté à la température désirée par réglage de la température de l'eau circulant dans la chemise de la colonne. L'éluat concentré utilisé comme charge, préparé comme décrit ci-dessus, est introduit à la partie supérieure de la colonne et s'abaisse lentement dans le lit de résine jusqu'à ce que le niveau de liquide se trouve juste au-dessous du sommet de ce lit. Ensuite, de l'eau à la température de travail est intro- duite par pompage en courant descendant dans la colonne à un débit choisi de manière que- la durée de contact soit de 34 minutes. Une fraction de vides de 0,35 est admise dans le calcul du débit à partir de la durée de contact. Dans chaque chromatographie, on utilise comme éluant une quantité d'eau correspondant au moins à 1,5 volume de lit. Un collecteur automatique de fractions peut être utilisé pourrecueillirles fractions d'éluat. Normalement, on prélève une fraction préalable de 0,25 volume de lit, suivie de fractions de 0,035 volume de lit jusqu'à la fin de l'élution. Une chromatographie en couche mince est conduite sur les fractions chromatographiques d'après la méthode sui- vante: 1. On dépose à la touche 20 11 d'éluat sur une plaque de gel de silice (plaque de gel de si- lice 60 F-254 de E. Merck). On dépose également à la touche 20 pl d'un témoin contenant 10 mg/ml de sulfate de gentamicine. 2. On installe la plaque dans une chambre chroma- tographique contenant la couche inférieure d'un mélange de méthanol, de chloroforme et d'hydro- xyde d'ammonium concentré (1:1:1). 3. On développe la plaque à une hauteur de 15 cm (l'opération dure environ 2 heures). 4. On sèche la plaque à l'air chaud, on applique par pulvérisation de la ninhydrine (0,1 % de réactif pulvérisable à la ninhydrine de E. Merck), et on chauffe à la plaque chauffante jusqu'à ce que des taches foncées apparaissent. Les conditions appréciées pour le procédé chroma- tographique de l'invention débutent par la concentration en matières solides du concentré chargé de gentamicine. Une con- centration en matières solides d'environ 0,5 g/ml est préfé- rable. Une concentration plus faible donne une plus large bande de charge dans la colonne chromatographique, et il s'ensuit une moins bonne séparation. Le pH de la charge peut varier d'environ 3,0 à environ 11,0. On apprécie un pH d'environ 7,0 de la charge. La colonne chromatographique est préparée avec une résine d'échange ionique fortement basique, par exemple la résine "Dowex 1-X2" (Dow Chem.), la résine "Amberlite IRA- 401S" (Rohm and Haas), et la résine "Duolite A-143"- (Diamond Shamrock). On donne la préférence à la résine "Dowex l-X2". Le rapport du volume de résine à l'activité biolo- gique de la gentamicine dans la charge n'est pas déterminant. Un volume de résine d'environ 140 ml de résine par gramme d'activité biologique en gentamicine dans le concentré de charge est préférable. A mesure que ce rapport est réduit, la séparation de la gentamicine des impuretés qui l'accompa- gnent est moins favorable. Il est préférable que la résine soit sous la forme hydroxyde pour l'obtention de bons résultats. Par exemples la forme sulfate donne une bonne productions mais la gentamicine est relativement mal séparée des impuretés. La température du lit de résine et de l'eau uti- lisée comme éluant est déterminantes de même que le pH de la charge. Une élévation de la température au-dessus de la tempé- rature ambiante, c'est-à-dire d'environ 25 à environ 100C, fait croître la quantité de gentamicine qui est recueillie dans l'éluat chromatographique. A mesure que le pHde la charge- croit, la température doit être élevée pour permettre une pro- duction équivalente de gentamicine. Les températures et les pH que l'on apprécie sont les suivants. Environ 60C pour un pH d'environ 5,0, environ 70WC pour un pH d'environ 7,0, et environ 751C pour un pH d'environ 9,0. La durée de séjour de la charge dans la colonne n'est pas déterminante. Ainsi, la durée de séjour peut varier d'environ 10 minutes à environ 300 minutes. Une durée de séjour d'environ 34 minutes est-appréciée. On. donne ci-après une illustration des formes de réalisation préférées du procédé de l'invention. Cette illus- tration représente le meilleur mode de mise en oeuvre du pro- cédé. Comme indiqué ci-dessus, les paramètres admissibles s'étendent au-delà de ces conditions préférées et, en consé- quence, les exemples suivants ne doivent pas être considérés comme limitant le cadre et la portée du procédé de l'invention. Tous les pourcentages sont exprimés en poids et toutes les proportions des mélanges de solvants sont exprimées en volume, sauf spécification contraire. A. Concentrer une solution contenant de la genta- micine et des impuretés à une concentration en matières solides de 0,2 g/ml. Ajuster le pH à. 7,0 avec de l'acide sulfurique 18 N. Concentrer ensuite à une concentration en matières solides de 0,5 g/ml. B. Garnir une colonne de 140 ml de résine d'échange ionique fortement basique "Dowex 1-X2" (forme hydroxyde; particules de 0,149 à 1,19 mm) par gramme d'activité biologique en gentamicine contenue dans le concentré constituant la charge dans l'étape A. C. Chauffer le lit de résine à 70C. D. Introduire la charge concentrée à la partie supérieure du lit de résine et laisser descen- dre la charge lentement dans le lit de résine jusqu'à ce que le niveau de liquide se trouve juste au-dessous de la partie supérieure du lit. E. Faire passer par pompage à 70C en courant des- cendant dans la colonne une quantité d'eau égale à 1,5 volume de lit (de l'eau désionisée-.est pré- férable) à une vitesse choisie de manière que la durée de séjour dans la colonne soit de 34 minutes. F. Recueillir initialement une fraction d'effluent de la colonne correspondant à 0,25 volume de lit et recueillir ensuite des fractions de 0,035 volume de lit. G. Analyser les fractions pour déceler la gentami- cine et les impuretés par chromatographie sur couche mince. Réunir les fractions riches en gentamicine. On donne ci-après une récapitulation des résultats obtenus dans quatre essais utilisant les conditions opératoires définies ci-dessus: Chromatographies sur "Dowex l-X2" Charge de DH 7,0, température de 700C No de Diamètre x N1d ihauteur de essai la colonne, en cm 1 10,16x121,92 2 35,56x320,04 3 35,56x233,68 4 35,56x233,68 Moyenne Activité biologique recueillie Eluat total Eluat riche % _ % 98 78 88 81 97 109 100 89 Pureté Charge Eluat riche % _ % 61 72 57 88 93 47 88. 58 85 Résultats obtenus dans la chromatoqraphie en phase liquide sous haute pression dans des essais chromato- graphiques en installation pilote pH de la charge 7,0, Température 70 C Ne de Charge l'essai C % C2 % 1 29 37 2 36 46 3 28 41 4 29 43 Cla % Eluat riche C1% C2 % Cla % 29 36 35 37 47 16 28 42 30 29 44 27 REMARQUE: Les symboles C1, C2 et Cla correspondent aux composants principaux du complexe de gentamicine dont il est question. La chromatographie en phase liquide sous haute pression est un essai normalisé (voir J. Anhalt, F.D. Sancilio et T. McCorkle, "Gentamicin-CComponent Ratio Determination by High Pressure Liquid Chromatography", J. Chromatoq. 153, 489-493 (1978). La bioactivité en gentamicine dans des solutions est déterminée au moyen d'une méthode turbidimétrique nor- male utilisant S. aureus. REVENDICATIONS 1. Procédé chromatographique pour séparer un anti- biotique aminoglycosidique d'impuretés, caractérisé en ce qu'il consiste à limiter le pH de la solution chargée d'anti- biotique et à limiter la température de la colonne chromato- graphique. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le pH de la charge contenant l'antibiotique amino- glycosidique en solution est limité à une valeur d'environ 3 à environ 11, et la température de la colonne chromatogra- phique- est limitée à une valeur d'environ 25 à 100 C. 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le pH de la charge contenant l'antibiotique amino- glycosidique en solution est limité à environ 5,0 et la température de la colonne chromatographique est limitée à environ 60 C. 4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le pH de la charge contenant l'antibiotique amino- glycosidique en solution est limité à environ 7,0 et la tem- pérature de la colonne chromatographique est limitée à environ 700C. 5. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le pH de la charge contenant l'antibiotique amino- glycosidique en solution est limité à environ 9,0 et la tem- pérature de la colonne chromatographique est limitée à envi- ron 750C. 6. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'antibiotique aminoglycosidique est le complexe de gentamicine et la solution d'antibiotique chargée est une solution de gentamicine. 7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que le pH de la solution de gentamicine utilisée comme charge est limité à une valeur d'environ 3 à environ 11, et la température de la colonne chromatographique est limitée à une valeur d'environ 25 à environ 1000 C. 8. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que le pH de la charge contenant la gentamicine en so- lution est limité à une valeur d'environ 7,0 et la tempéra- ture de la colonne chromatographique est limitée à environ C 9. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que le pH de la charge contenant la gentamicine en solution est limité à environ 9,0 et la température de la colonne chromatographique est limitée à environ 75 C. 10. Procédé chromatographique pour séparer un an- tibiotique aminoglycosidique d'impuretés, caractérisé en ce qu'il consiste: (a) à ajuster le pH d'une solution d'antibiotique aminoglycosidique à une valeur d'environ 3,0 à environ 11,0O,; (b) à faire passer la solution dont le pH est ajus- té sur une résine d'échange ionique fortement basique qui a été chauffée à une température comprise dans la plage de 25 à 1000C; (c) à faire passer de l'eau à une température com- prise dans la plage de 25 à 100 C sur la colonne chromatographique; et (d) à recueillir des fractions riches en antibio- tique aminoglycosidique. 11. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce que l'antibiotique aminoglycosidique est le complexe de gentamicine, la solution d'antibiotique aminoglycosidique utilisée dans l'étape (a) est un concentré de gentamicine, et les fractions riches en antibiotique aminoglycosidique sont des fractions riches en gentamicine. 12. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce que le pH de la solution d'antibiotique aminoglycosidi- que est ajusté à environ 7,0 et la température de la colonne chromatographique est limitée à environ 70 C. 13. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce que la résine d'échange ionique fortement basique est sous la forme hydroxyde. 14. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce que la résine d'échange ionique fortement basique est la résine "Dowex l-X2" sous la forme hydroxyde.