Brevet FR2463809A1 — publié le 19810227

La présente invention concerne un procédé microbien pour produire des dérivés d'acide cholanique de formule: 0 1 0 (I) X OH H o X représente ----OH ou =0; et R représente un atome d'hydrogène II H ou un métal alcalin ou alcalino-terreux et des microbes utilisés -dans ce procédé. Plus particulièrement selon l'invention, on peut produire rapidement avec un rendement élevé les dérivés d'acide cholanique de formule (1) par culture de microbes particuliers dans un milieu de culture contenant de l'acide cholanique ou un de ses sels commne substrat. Le dérivé d'acide cholanique de formule (I) o X re- présente -H, c'est-a-dire l'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 p-cholanique ainsi que ses sels sont utiles comr4e intermédiaires de la production d'un agent de solubilisation des calculs biliaires, l'acide chénodésoxycholique (CDCA). Le dérivé d'acide cholanique de formule (I) o X représente =0, c'est-a-dire l'acide hydroxy-7a dicéto-3,12 5p- cholanique et ses sels sont des intermédiaires utiles pour produire l'acide désoxycholique qui est une matière de départ utile pour produire la progestérone et des dérives adrénocorticos- térotdes. On sait que l'on peut obtenir les dérivés d'acide cholanique de formule (I) selon un procédé microbien qui utilise l'acide cholique ou un de ses sels comme substrat. Par exemple Hayakava et coll. ont décrit un procédé pour produire l'acide dihy- droxy-3a,7a céto-12 5p-cholanique par emploi de la souche Streptomyces gelaticus 1164 [The Journal of Biochemistry (Japon), vol. 44, n 2, pages 109 à 113 (1975); et Proceedings of Japan Academy, vol. 32, pages 519 à 522 (1956)]. Hasegawa et coll. ont décrit un procédé pour produire l'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 55-cholanique par emploi de la souche Aspergillus cinnamomeus HUT 2026 [Hiroshima Journal of Medical Science, Vol. 8, n 3, pages 277 à 283 (1959)]. Kikuchi et coll. ont également décrit un procédé pour produire l'acide dihydroxy-3",7a céto-12 5P-cholanique par emploi de la souche Staphylococcus epidermidis H-1 [Journal of Biochemistry, vol. 72 n 1, pages 165 à 172 (1972)]. De plus, Hayakawa et coll. ont décrit un procédé pour produire l'acide hydroxy-7a, dicéto-3,12 cholanique par emploi de la souche Streptomyces Relaticus 1164 [Proceedings of Japan Academy, vol. 32, pages 519 à 522 (1956)]. Cependant dans ces procédés, la concentration de l'acide cholique utilisé comme substrat dans un milieu de culture est faible, c'est-à-dire ne dépasse pas 10 g/l. Par conséquent, selon les expériences de la demanderesse, il est nécessaire d'uti- liser une faible concentration d'acide cholique pour produire les dérivés d'acide cholanique selon les procédés microbiens connus car les microbes utilisés se développent peu ou mal lorsque la concen- tration d'acide cholique dans le milieu de culture est égale ou supérieure à 20 g/l. De plus, ces procédés connus nécessitent un temps de culture trop important. On cherche donc à mettre au point un procédé pour produire les dérivés d'acide cholanique rapidement et avec un rendement élevé. La demanderesse a découvert que certains microbes appartenant aux genres Arthrobacter, Brevibacterium et Corynebacterium peuvent se développer dans un milieu contenant de l'acide cholique ou un de ses sels comme substrat à une concentra- tion comprise dans une gamme étendue et qu'on peut produire les dérivés d'acide cholanique rapidement avec un rendement élevé. L'invention a pour objet: un procédé microbien pour produire les dérivés d'acide cholanique de formule (I) rapidement et avec un rendement élevé; et de nouveaux microbes qui peuvent se développer dans un milieu contenant de l'acide cholanique ou un de ses sels comme substrat. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre de plusieurs exemples de réalisation en se référant aux dessins annexés sur lesquels: - la figure 1 est un chromatogramme obtenu par chromatographie liquide à grande vitesse, o l'indice de réfraction relatif (úln) est en ordonnées et le temps (min) est en abscisses, du produit obtenu dans l'exemple 1; - les figures 2, 3 et 4 illustrent respectivement les spectres infrarouges. des esters méthyliques des composés correspon- dant aux pics A, B et C (et de standards de référence A', B' et C'), les nombres d'onde (cm) étant en abscisses; et - les figures 5 à 15 sont des chromatogrammes semblables à celui de la figure 1 des produits obtenus respectivement dans les exemples 6 et 9 à 18. L'invention concerne donc un procédé microbien pour produire un dérivé d'acide cholanique de formule (I) qui consiste à cultiver un microbe capable de se développer dans un milieu con- tenant de l'acide cholique ou un de ses sels comme substrat pour produire le dérivé d'acide cholanique, choisi parmi les genres Arthrobacter, Brevibacterium et Corynebacterium, dans un milieu de culture contenant le substrat et à recueillir le dérivé produit. Les microbes que Von utilise dans l'invention sont ceux isolés du sol et leurs mutants obtenus par mutation naturelle ou produits, par exemple par irradiation par les rayons X, irradia- tion par les ultraviolets, action I'un agent mutagène tel que la N-méthyl N'-nitro N-nitroso guanidine, le N-oxyde de nitro-4 quino- léine, l'acriflavine ou le méthanesuifonate d'éthyle ou une de leurs combinaisons et similaires. La demanderesse a déposé à l'Institut de Recherches sur les Fermentations, Ministère des Sciences et Technologies Indus- trielles du Japon (FERM) et à l'American Type Culture Collection des Etats-Unis d'Amérique (ATCC), les souches caractéristiques des microbes capables de produire des dérivés d'acide cholanique de formule (I) dans un milieu de culture contenant de l'acide cholique ou un de ses sels, qu'elle a obtenues. Ce sont les souches: Arthrobacter CA-35 (FERM-P N 5145; ATCC N 31651), Arthrobacter CA-35-A589-29-32 (FERM-P N 5522; ATCC N 31652), Arthrobacter CA-35-A589-47 (FERM-P N 5523; ATCC N 31653), Arthrobacter CA-35-A849 (FERM-P N 5524; ATCC N 31654), Arthrobacter CA- 35-A-1071-15 (FERM-P N 5525; ATCC N 31655), Arthrobacter CA-35-A-1448 (FERM-P N 5526; ATCC N 31656), Arthrobacter CA-35-A-1475 (FERM-P N 5527; ATCC N 31657), Arthrobacter CA-35-A-1766-15 (FERM-P N . 5528; ATCC N 31658), Arthrobacter CA-35-M-965-3 (FERM-P N 5529; ATCC N 31659), Arthrobacter CA-35-Y-37-12 (FERM-P N 5530; ATCC N 31660), Brevibacterium CA-6 (FERM-P N 5144; ATCC N 31661) et Corynebacterium CA- 53 (FERM-P N 5532; ATCC N 31662) Les souches Arthrobacter CA-35, Brevibacterium CA-6 et Corynebacterium CA-53 sont des souches sauvages et les neuf autres souches d'Arthrobacter sont des mutants de la souche Arthrobacter CA-35. La souche Arthrobacter CA-35-Y-37-12 a été produite par irradiation par les ultraviolets. Les huit autres mutants de la souche Arthrobacter CA-35 ont été obtenus par 'traitement de la souche parente par la N-méthyl N'-nitro N-nitroso guanidine. Les caractéristiques morphologiques, culturales et physiologiques de ces souches figurent dans le tableau I ci-après. A titre comparatif, les caractéristiques de la souche Arthrobacter simplex IAM 1660 qui présente des rapports avec la souche Arthrobacter CA-35 figurent également dans le tableau I ci-après. A partir de ces caractéristiques morphologiques, cul- turales et physiologiques, on a déterminé la ciassification des souches selon le Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 7e et 8e édition. On a déterminé que la souche Arthrobacter CA-35 était en relation avec Arthrobacter simplex en raison de ses caractéris- tiques microscopiques, telles"que la forme, la coloration de Gram et similaires ainsi que ses caractères physiologiques. Cependant, la souche Arthrobacter CA-35 diffère de la souche Arthrobacter simplex IAM 1660 par la production de pigment, l'assimilation des hydrates de carbone et la culture dans un milieu contenant de l'acide cholique. La souche Arthrobacter CA-35 peut se développer dans un milieu contenant du cholate de sodium comme seule source de carbone a une concentration élevée,.dlle qu'environ 20 & 500 g/1 pour former comme produit métaboliques principaux, l'acide hydroxy-7a,dicéto-3,12 53-cholanique, l'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 5p-cholanique, l'acide dihydroxy-7a,12a cdto-3 5D-cholanique et/ou leurs sels de sodium tandis que la souche Arthrobacter simplex IAM 1660 peut difficilement se développer dans un milieu contenant du cholate de sodium comme seule source de carbone à la concentration de 10 g/l. La souche Arthrobacter CA-35 produit des pigments de couleur jaune à crème. D'autre part, comme microbes appartenant au genre Arthrobacter et produisant un pigment, il existe Arthrobacter oxydans, Arthrobacter aurescens et Arthrobacter ureafaciens. Cependant, la souche Arthrobacter CA-35 diffère de ces microbes car Arthrobacter oxydans et Arthrobacter aurescens sont généralement gram négatif et hydrolysent l'amidon et Arthrobacter ureafaciens est généralement gram négatif et ne réduit pas un nitrate. Il semble donc que la souche Arthrobacter CA-35 constitue une nouvelle espèce appartenant au genre Arthrobacter car elle diffère des souches des espèces standards appartenant au genre Arthrobacter. Bien que certains des mutants de la souche Arthrobacter CA-35 diffèrent totalement de la souche parente en ce qui concerne les flagelles, on a déterminé que ces mutants appartiennent àA Arthrobacter car de façon générale on classe un mutant dans la même espèce que sa souche parente. On a déterminé que la souche Brevibacterium CA-6 appartient au genre Brevibacterium par l'examen microscopique ainsi que la coloration de Gram et similaires et ses caractères physiolo- giques. Cependant, la souche Brevibacterium CA-6 diffère quelque peu des autres microbes appartenant au genre Breyibacterium car les autres microbes ont des flagelles péritriches tandis que la souche Brevibacterium CA-6 a un flagelle polaire, etc. De plus, on a déterminé que la souche Corynebacterium CA-53 est en relation étroite avec Corynebacteriym equi. Pour mettre en pratique le procédé de l'invention, on cultive un microbe capable de se développer dans un milieu contenant de l'acide cholique ou un de ses sels comme substrat, choisi parmi les genres Arthrobacter, Brevibacterium et Corynqbacterium, tels que ceux ci-dessus dans un milieu de culture contenant de l'acide cholique ou un de ses sels chLume substrat. Dans l'invention, on peut utiliser l'acide cholique lui-même comme substrat. On peut également utiliser un sel de métal alcalin de l'acide cholique, tel que le cholate de sodium, le cholate de potassium ou similaires ou un sel de métal alcalino-terreux de l'acide cholique, tel que le cholate de calcium, le cholate de ma- gnésium ou similaires et on préfère un sel de métal alcalin. Lorsqu'on utilise un cholate, on le dissout dans l'eau pour préparer une solution aqueuse contenant le cholate à une con- centration prédéterminée. Sinon, on peut préalablement dissoudre dans l'eau une certaine quantité d'un composé de métal alcalin ou d'un composé de métal alcalino-terreux qui forme un sel avec l'acide cholique et ajouter de l'acide cholique pour obtenir une solution aqueuse contenant un cholate à une concentration prédéterminée. La concentration de l'acide cholique ou de son sel peut varier de façon importante dans la gamme d'environ 1 à 500 g/l (en acide cholique). Pour des questions de rendement en les dérivés d'acide cholanique désirés de formule (I), de conditions de culture et de rentabilité telles que l'aptitude et la facilité de mise en oeuvre et similaires, il est recommandé d'utiliser l'acide cholique ou son sel à une con- centration d'environ 5 à 300 g/l et mieux d'environ 10 à 200 g/l en acide cholique. On peut effectuer la culture selon un procédé connu et on effectue généralement une culture avec agitation ou une cul- ture submergée avec un milieu liquide. On peut utiliser un milieu contenant des substances nutritives pouvant être assimilées par le microbe employé. Le milieu peut contenir de l'acide cholique ou son sel comea seule source de carbone ou contenir une source de carbone additionnelle, telle qu'un pentose (par exemple l'arabinose, etc.), un hexose (par exemple le glucose, le mannose, le fructose, le galactose, etc.), un disaccha- ride (par exemple le-maltose), un produit de décomposition de l'amidon (par exemple une dextrine, etc.), un polyalcool à caractère gluci- dique (par exemple le sorbitol, etc.), un polyalcool (par exemple le glycérol, etc.), un de leurs mélanges ou similaires et/ou une autre substance nutritive, telle qu'une polypeptone, une peptone, un extrait de viande, un extrait de malt, une infusion de mats, un extrait de levure, un amino-acide, un de leurs mélanges ou similaires. Généralement, on peut ajouter une source de carbone additionnelle et/ou une autre substance nutritive à un milieu à la concentration d'environ 0, 1 à 10 g/l. Comme source d'azote, on peut utiliser, par exemple, le sulfate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, le phosphate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le nitrate de sodium, le nitrate de potassium, un de leurs mélanges et similaires. Généralement, on peut ajouter une source d'azote à un milieu à une concentration d'environ 0,5 à 5 g/l. De plus, comme sels minéraux, on peut ajouter à un milieu, du phosphate dipotassique, du phosphate monopotassique, du sulfate de magnésium, et similaúres, généralement à une concen- tration d'environ 0,1 à 10 g/l. On peut effectuer une culture avec agitation ou une culture submergée, entre 25 et 35 C pendant 6 h jours. Selon le procédé de l'invention, l'acide cholique ou son sel qu'on utilise comme substrat est transformé en les dérivés d'acide cholanique de formule (I) et en une petite quantité d'acide dihydroxy-7a,12a céto-3 5P-cholanique ou d'un de ses sels lorsqu'on utilise la souche Arthrobacter CA-35. La demanderesse a découvert que lorsqu'on utilise les mutants ci-dessus d'Arthrobacter CA-35, on obtient de façon prédominante le dérivé d'acide cholanique de formule (I) o X représente ---OH, c'est-à-dire l'acide dihydroxy- \ H 3ac,7a céto-12 53-cholanique ou un de ses sels. Donc lorsqu'on désire l'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 5P-cholanique ou un de ses sels, il est préférable d'utiliser ces mutants en particulier la souche Arthrobacter CA-35-A589-29-32 (FERM-P N 5522; ATCC N 31652), la souche Arthrobacter CA-35-A589-47 (FERM-P N 5523; ATCC N 31653), et la souche Arthrobacter CA-35-A-1766-15 (FERM-P N 5528; ATCC N 31658). En particulier, onpréfère surtout la souche Arthrobacter CA-35-A589-29-32 et la souche Arthrobacter CA-35-A589-47. Lorsqu'on utilise la souche Brevibacterium CA6, l'acide cholique ou son sel est transformé en les dérivés d'acide cholanique de formule (I) et en une petite quantité d'acide hydroxy-7a dicéto-3,12-.à-4-cholénique ou un de ses sels. Lorsqu'on utilise la souche Corvnebaeterium CA-53, l'acide cholique ou son sel est transformé en les dérivés d'acide cholanique de formule (I) et en acide hydroxy-7a dicéto-3,12-A-4- cholénique ou un de ses sels. Apres achèvement de la culture, on sépare du milieu les produits qui s'y sont accumulés et on les purifie. Tout d'abord, on élimine du milieu selon des procédés connus tels que la filtra- tion, la centrifugation et similaires, les matières insolubles du milieu, telles que les cellules microbiennes et similaires. Ensuite, on acidifie le filtrat ou le surnageant par addition d'un acide, tel que l'acide chlorhydrique, pour y précipiter les produits. En même temps, l'acide cholique ou son sel, utilisé comme substrat, qui demeure sans avoir été transformé, est également précipité sous forme d'acide cholique. Après séparation du précipité obtenu, on extrait a nouveau le filtrat ou le surnageant avec un solvant orga- nique inerte, tel que l'acétate d'éthyle ou similaires et on chasse le solvant de l'extrait par distillation, pour obtenir un résidu. On récupère ainsi presque totalement les produits restants et le substrat. On combine ce résidu au précipité précédemment obtenu. On soumet le mélange de produits et d'acide cholique ainsi obtenu à une chromatographie pour isoler le produit désiré. Par exemple, on peut isoler de la façon suivante les produits ob- tenus par emploi de la souche Arthrobacter CA-35 ou d'un de ses mutants: on transforme les produits et l'acide cholique en leurs esters méthyliques et on soumet les esters méthyliques obtenus à une chromatographie sur une colonne de gel de silice avec élutions successives par le chloroforme, un mélange chloroforme-éthanol (99/1, v/v) puis un mélange chloroforme-éthanoi (97/3, v/v). L'ester méthylique de l'acide hydroxy-7a dicéto-3,12 5P-cholanique désiré est élué avec le chloroforme. Par élution avec le mélange chloro- forme-éthanol (99/1, v/v) d'abord un des sous-produits, l'ester méthylique de l'acide dihydroxy-7a,12a céto-3 5p-cholanique puis l'ester méthylique de l'acide"dihydroxy-3a,7a céto-12 5p-cholanique désiré sont élués. L cholate de méthyle est élué avec le mélange chloroforme-éthanol (97/3, v/v). On peut transformer ces esters méthyliques en les acides correspondants par hydrolyse selon un procédé classique. Sinon, lorsqu'on utilise la souche Brevibacterium CA-6 ou la souche Corvnebacterium CA-53, on peut isoler les produits par exemple de la façon suivante: on soumet directement un mélange des produits et d'acide cholique & une chromatographie sur gel de silice avec élutions successives avec un mélange chloroforme-éthanol (98/2, v/v) puis un mélange chloroformeéthanol (97/3, v/v). L'acide hydroxy-7T dicéto-3,12 5p-cholanique désiré est élué avec le mélange chloroforme-éthanol (98/2, v/v). Par élution avec le mélange chloro- forme-éthanol (97/3, v/v), on élue d'abord un sous-produit l'acide hydroxy-7a dicéto-3,12- C-4-cholénique puis l'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 5p-cholanique désiré. On peut facilement réduire l'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 5p-cholanique ou son sel obtenu selon l'invention selon le procédé de réduction de Huang Minlon pour obtenir un agent utile comme solubilisant des calculs biliaires, l'acide chénodésoxy- cholique (CDCA). On peut facilement transformer l'acide hydroxy-7a dicéto-3,12 5pcholanique ou son sel en acide désoxycholique qui est une matière de départ utile pour produire la progestérone et des adrénocorticostéroldes, par déshydratation puis hydrogénation selon un procédé classique. L'invention est illustrée par les exemples et exemples de référence non limitatifs suivants. Préparation de mutants On prélève une anse de la souche Axthrobacter CA35 (FERM-P N 5145; ATCC N 31651) cultivée sur un milieu incliné (milieu A; NaOH: 0,5 %; acide cholique: 5,0 %; peptone: 0,5 %; extrait de levure: 0,5 %; NaCl: 0,5 % et gélose 1,5 %) et on en ensemence 10 ml d'un milieu (milieu B; NaOH: 1%; acide cholique: %; NH4NO3: 0,2 %; KH2PO4: 0,2 %, K2HPO4: 0,5 %; MgSO4,7H20: 0,02 % et extrait de levure: 0,01 %) dans un tube à essai (200 mm x 21 mm de diamètre) et on incube en agitant à 30 C pendant 24 h. On ajoute 0,3 ml de la culture obtenue à 10 ml d'un milieu (milieu C; NaOH: 0,05 %; acide cholique: 0,5 Z; glucose: 0,5 %; N4N3: 0,2 %; KH2PO4: 0,2; K K2HPO4: 0,5 %; MgSO4,7H20: 0,02 % et extrait de levure: 0,01 %) dans un tube à essai (200 mm x 21 mm de diamètre) et on incube en agitant à 30 C pendant à 16 h. On recueille les cellules microbiennes dans la phase logarithmique avec une membrane filtrante (taille des pores: 0,45/um) en conditions aseptiques, on lave avec 20 ml de tempon phosphate O,lM (pH: 7,0) et on met en suspension dans 25 ml du m4me tampon. Pour effectuer un traitement mutagène, on ajoute de la N-méthyl N'-nitro N-nitroso guanidine à la concentration finale de 50/ug/ml à 4 ml de la suspension cellulaire ci-dessus dans un tube à essai (200 mm x 21 mm de diamètre) et on incube le mélange en agitant à 30 C pendant 45 min. Dans ces conditions, le taux de létalité de la souche Arthrobacter CA-35 est d'environ 80 %. On recueille les cellules ainsi traitées avec une membrane filtrante (taille des pores: 0,45/um) en conditions aseptiques, on lave avec 20 ml de tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) et on met en suspension dans 25 ml du même tampon. On dilue la suspension cellulaire obtenue avec une solution salée normale sté- rilisée et on étale sur des boites de gélose (milieu D; NaOH: 0,1% acide cholique: 1,0 %7; NH4N03: 0,2 %; KH2PO4 0,2 %; K2HPO4: 0,5 %; MgSO4,7H20: 0,02 %; extrait de levure:0,01% et gélose 1,5 %) de façon à obtenir 300 a 500 colonies par botte. On incube les bottes à 30 C pendant 4 h. On isole chaque colonie ponctiforme formée et on incube sur une boite de gélose (milieu E; peptone: 0,5 %; extrait de levure: 0,5 %; NaCl: 0,5 % et gélose 1,5 %) à 30 C pendant 24 h. On repique chaque colonie formée sur la boite de milieu E sur une botte de milieu D et on incubq à 30 C pendant h. On incube sur un milieu incliné (milieu F; NaOH: 0,1%; acide cholique: 1,0 %; peptone: 0,5 %; extrait de levure: 0,5 %; NaCl: 0,5 % et gélose 1,5 %) à 30 C pendant 24 h chaque colonie de la boite ci-dessus de milieu E dont la colonie repiquée ne se ' développe pas sur la botte de milieu D. On ensemence avec une anse de la culture inclinée 6 ml d'un milieu (milieu G; NaOH: 0,5; acide cholique: 5,0 %; glucose: 0,5 %; NH4N03:0,2 %; KH2PO4: 0,2 %; K2HPO4: 0,5 %; MgS04,7H20: 0,02 %; et extrait de levure 0,1 %) dans un tube'-à essai (200 mm x 21 mm de diamètre) et on incube en agitant à 30 C pendant 3 jours. L'examen par chromatographie en couche mince des pro- duits accumulés dans chaque milieu G a permis à la dem4nderesse de découvrir un microbe qui produit sélectivement l'acide dihy- droxy-3a,7a céto-12 55-cholanique ou un de ses sels et qui a été nommé souche Arthrobacter CA-35-M-965-3. Le mode opératoire ci-dessus est appelé ci-après "mode opératoire M". Selon le mode opératoire M, on a effectué un trai- tement mutagène avec la souche Arthrobacter CA-35-M-965-3 comme souche parente. La demanderesse a ainsi découvert trois souches qui produisent sélectivement l'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 5p-cholanique ou un de ses sels qui ont été nommées respectivement, souche Arthrobacter CA-35-A589, souche Arthrobacter CA-35-A849 et souche Arthrobacter CA-35-A-1071. A partir d'une colonie de souche Arthrobacter CA-35-A589 deux souches supérieures ont été isolées et nommées respectivement souche Arthrobacter CA-35-A589-29-32 et souche Arthrobacter CA-35- A589-47. Une souche supérieure a également été isolée d'une colonie de la souche Arthrobacter CA-35-A-1071 et nommée souche Arthrobacter CA-35-A-1071-15. De plus, une souche supérieure a été produite par emploi de la souche Arthrobacter CA-35-A849 comme souche parente selon le mode opératoire M et nommée souche Arthrobacter CA-35-A-1448. La souche Arthrobacter CA-35-A-1475 a été produite par emploi de la souche Arthrobacter CA-35-A-1448 comme souche parente selon le mode opératoire M. La souche Arthrobacter CA-35-A-1766 a été produite par emploi de la souche Arthrobacter CA-35-A-1071 comme souche parente selon le mode opératoire M et la souche Arthrobacter CA-35-A-1766-15 a été isolée d'une colonie de cette souche Arthrobacter CA-35-A-1766. La souche Arthrobacter CA-35-Y-37-12 a été produite selon le mode opératoire suivant. On prélève une anse de la souche Arthrobacter CA-35 (FERM-P N 5145; ATCC N 31651) cultivée sur un milieu A incliné et on en ensemence 10 ml de milieu B dans un tube à essai (200 mm x 21 mm de diamètre) et on incube en agitant à 30 C pendant 20 h. On recueille les cellules microbiennes par centrifugation (10.000 tr/min) à 5 C pendant 5 min en conditions aseptiques. On met les cellules en suspension dans 10 ml d'eau stérilisée. On in- troduit la suspension dans une boite de Pétri (diamètre 7,5 cm) o placée à environ 27 cm sous une lampe à ultraviolets de 15 W (2537 A) dans une enceinte stérile et on irradie par les ultraviolets pendant min. Dans ces conditions le taux de létalité de la souche Arthrobacter CA-35 est d'environ 99,9 %. ! Apres irradiation, on recueille les cellules micro- biennes avec une membrane filtrante, on lave avec du tamponm phosphate 0,1 M et on met en suspension dans le meme tampon. On dilue la sus- pension obtenue avec une solution salée physiologique et on répète la culture ci-dessus avec les milieux D à G pour obtenir une souche supérieure qui produit sélectivement l'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 pcholanique ou un de ses sels. EXEMPLE 1 On cultive la souche Arthrobacter CA-35 (FERM-P N 5145; ATCC N 31651) dans les conditions suivantes: Composition du milieu de culture: Acide cholique 100 g Nitrate d'ammonium 2,0 g Phosphate monopotassique 2,0 g Phosphate dipotassique 5,0 g Sulfate de magnésium heptahydraté 0,2 g Extrait de levure 0,1 g Hydroxyde de sodium 10 g Eau distillée q.s.p. 1 litre On mélange les ingrédients ci-dessus pour obtenir un litre de milieu de culture. On répartit des portions de 100 ml du milieu de culture dans 10 flacons de Sakaguchi de 500 ml et on autoclave à 120 C pendant 15 min. On ajoute à chaque fraction, 10 ml de culture d'ensemencement obtenue par culture préalable de la souche dans le même milieu avec agitation a 30 C pendant 2 jours. On incube chaque flacon sur un agitateur à 30 C pendant 2 jours. Lorsque la culture est achevée, on combine les bouillons de culture, et on centrifuge pour éliminer les cellules microbiennes. On acidifie le surnageant obtenu par addition de 600 ml d'acide chlo- rhydrique aqueux 1 N'pour former un précipité. On sépare le précipité et on extrait la solution restante avec 1 litre d'acétate d'éthyle. On chasse l'acétate d'éthyle de l'extrait par distillation avec un évaporateur rotatif et on combine le résidu au précipité ci-dessus pour obtenir un mélange de dérivés d'acide cholanique et d'acide cholique (85 g). On dissout une petite portion du mélange dans le méthanol à la concentration de 1 %. On injecte 10/ul de solution dans un appareil de chromatographie liquide à grande vitesse muni d'une colonne /uBondapak C18 (type HLC-GPC-244 produit par Waters aux Etats-Unis d'Amérique). On élue la colonne avec un mélange eau-méthanol (30/70, v/v pH 2,5) à un débit de 1 ml/min et on mesure l'indice de réfraction de l'éluat. Le chromatogramme obtenu est illustré par la figure 1. Les pics A, B, C et D de la figure 1 correspondent à ceux des stan- dards de référence constitués respectivement d'acide hydroxy-7a dicéto-3,12 5P-cholanique, d'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 5P-chola- nique, d'acide dihydroxy-7a,12a céto-3 53-cholanique et d'acide cholique. De plus, lorsqu'on isole les composés des fractions 15.Correspondant aux pics A, B et C et qu'on détermine leur constitu- tion chimique à partir du spectre de masse, du spectre infrarouge et du spectre de résonance magnétique nucléaire, ces spectres montrent que ces composés sont respectivement l'acide hydroxy-7a dicéto-3,12 g-cholanique,l'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 59-cholanique et l'acide dihydroxy-7a, 12ac céto-3 5P-cholanique. Les figures 2, 3 et 4 illustrent les spectres infrarouges (A, B et C) des esters méthyliques des composés correspondant aux pics A, B et C par comparaison avec ceux des standards de référence (A', B' et C'). Les points de fusion des composés correspondant aux pics A, B et C et de leurs esters méthyliques figurent dans le ta- bleau II ci-après. On calcule le rendement des produits et la quantité d'acide cholique qui demeure sans être transformé à partir des rapports des surfaces du chromatogramme de la figure 1. Les résultats figurent dans le tableau III ci-après. EXEMPLE 2 On reprend le mode opératoire décrit dans l'exemple 1, si ce n'est qu'on ajoute de plus au milieu 5,0 g/l de glucose pour obtenir un mélange de produits et d'acide choliqiu demeurant sans être transformé (91,0 g). On dissout le mélange (01,0 g) dans-270 ml r de méthanol et on ajoute 9 ml d'acide chlorhydrique concentré. On chauffe à reflux la solution obtenue pendant 20 min pour transformer les produits et l'acide cholique en leurs esters méthyliques. On garnit une colonne (1.200 mm x 70 mm de diamètre) de 1.500 g de gel de silice C-200 et on y adsorbe les esters méthy- liques ci-dessus. On élue la colonne par le chloroforme pour obtenir ,1 g d'ester méthylique de-l'acide hydroxy-7a dicéto-3,12 5p-cho- lanique. On élue ensuite la colonne avec un mélange chloroforme-étha- nol (99/1, v/v) pour obtenir d'abord 1,40 g de l'ester méthylique de l'acide dihydroxy-7a,12a céto-3 5p-cholanique puis 56,4 g de l'ester méthylique de l'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 5p-cholanique. On hydrolyse ces esters méthyliques pour obtenir 24,8 g d'acide hydroxy-7ca dicéto-3,12 5p-cholanique, 1,38 g d'acide dihy- droxy-7a,12a céto-3 5p-cholanique et 56,0 g d'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 5p-cholanique. EXEMPLE 3 On reprend le mode opératoire décrit dans l'exemple 1, si ce n'est qu'on modifie la concentration de l'acide cholique et qu'on ajoute de l'hydroxyde de sodium au milieu à raison de 10 % en poids par rapport à l'acide cholique utilisé. Le rendement en produits et la quantité d'acide cholique qui demeure sans être trans- formé pour chaque concentration du substrat (acide cholique) figurent dans le tableau IV ci-après. EXEMPLE 4 On reprend le mode opératoire décrit dans l'exemple 2, si ce n'est qu'on incube chaque flacon sur un agitateur à 30'C pendant 24 h pour obtenir un mélange de produits et d'acide cholique qui demeure sans être transformé (98,0 g). On soumet ce mélange à une chromatographie liquide à grande vitesse dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1 pour déterminer sa composition. Les résultats figurent dans le tableau V ci-après. EXEMPLE 5 On reprend le mode opératoire décrit dans l'exemple 2, si ce n'est qu'on ajoute à chaque flacon 20 ml de culture d'ense- mencement obtenue par culture à 30 C pendant 24 h pour obtenir un mélange de produits et d'acide cholique qui demeure sans être trans- formé (117,0 g). On soumet le mélange a une chromatographie à grande vitesse dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1 pour déter- miner sa composition. Les résultats figurent dans le tableau VI ci- après. EXEMPLE 6 On cultive la souche Arthrobacter CA-35-A589-29-32 (FERM-P N 5521; ATCC N 31652) de la façon suivante: Composition du milieu de culture: Acide cholique 100 a Nitrate d'ammonium 2,0 g Phosphate monopotassique 2,0 g Phosphate dipotassique 5,0 g Sulfate de magnésium heptahydraté 0,2 g Extrait de levure 0,1 g Hydroxyde de sodium 10 g Glucose 5,0 g Eau du robinet q.s.p. 1 litre On mélange les ingrédients ci-dessus à l'exception du glucose avec de l'eau du robinet pour obtenir un volume de 800 ml et on autoclave à 120 C pendant 15 min. On dissout le glucose dans ml d'eau du robinet et on autoclave à 110 C pendant 30 min. Après refroidissement, on combine les deux solutions pour obtenir un litre de milieu de culture. On répartit des portions de 100 ml du milieu de culture dans 10 flacons de Sakaguchi de 500 ml en conditions aseptiques. On ajoute à chaque flacon 200 ml de culture d'ensemen- cement obtenue par culture préalable de la souche dans le même milieu avec agitation à 30 C pendant 14 h. On incube chaque flacon sur un agitateur à 30 C pendant 3 jours. Lorsque la culture est achevée, on combine les bouillons de culture et on centrifuge pour éliminer les cellules microbiennes. On acidifie le surnageant par addition de 600 ml d'acide chlorhydrique aqueux iN pour former un précipité. On sépare le précipité et on extrait la solution résiduelle avec 1 litre d'acétate d'éthyle. On chasse l'acétate d'éthyle de l'extrait par distillation avec un évaporateur rotafif et on combine le résidu avec le précipité ci-dessus pour obtenir un mélange de dérivés d'acide cholanique et d'acide cholique (99,3 g). On dissout une petite portion du mélange dans du méthanol à la concentration de 2 %. On injecte 10 ul de la solution dans un appareil de chromatographie liquide à grande vitesse muni d'une colonne /uBondapak C-18 (type HLC-GPC-244). On élue la colonne avec un mélange eau-méthanol (30/70, v/v, pH: 4,0) à un débit de 1 ml/min et on mesure l'indice de réfraction de l'éluat. Le chromatogramme obtenu est illstré par la figure 5. Les pics B et D de la figure 5 correspondent à ceux des standards de référence constitués respectivement d'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 5j3-cholanique et d'acide cholique. Lorsqu'on isole le composé de la fraction correspondant au pic B, et qu'on détermine sa constitution chimique à partir du spectre de masse, du spectre infrarouge et du spectre de résonance magnétique nucléaire, ces spectres montrent que ce composé est l'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 5p-cholanique. On calcule le rendement des produits et la quantité d'acide cholique qui demeure sans être transformé à partir du rapport des surfaces du chromatogramme de la figure 5. Les résultats figurent dans le tableau VII ci-après. EXEMPLE 7 On reprend le mode opératoire décrit dans l'exemple 6, si ce n'est qu'on prépare une suspension de cellules microbiennes par séparation par centrifugation des cellules microbiennes des 10 ml de culture d'ensemencement, qu'on les met en suspension dans 10 ml d'eau stérilisée et qu'on les introduit dans chaque flacon au lieu des 2 ml de culture d'ensemencement pour obtenir un mélange de pro- duits et d'acide cholique restant (99,5 g). On dissout ce mélange (99,5 g) dans 270 ml de méthanol et on ajoute 9 ml d'acide chlorhy- drique concentré. On chauffe la solution obtenue à reflux pendant min pour transformer les produits et l'acide cholique en leurs esters méthyliques. On garnit une colonne (1.200 mm x 70 mm de diamètre) de 1.500 g de gel de silice C-200 et on y adsorbe les esters méthy- liques ci-dessus. On élue la colonne avec un mélange chloroforme- éthanol (99/1, v/v) pour obtenir 102,0 g d'ester méthylique de l'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 5P-cholanique que l'on hydrolyse pour obtenir 98,5 g d'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 5p-cholanique. EXEMPLE 8 On reprend le mode opératoire décrit dans l'exemple 6, si ce n'est qu'on modifie la concentration de l'acide cholique, qu'on ajoute zu milieu de l'hydroxyde de sodium à raison de 10 % en poids par rapport à l'acide cholique utilisé et qu'on ajoute de l'acide chlorhydrique aqueux 1N a raison de 60 ml par gramme d'hydroxyde de sodium utilisé, pour former un précipité. Le taux de conversion ou le rendement du produit et la quantité d'acide cholique restant pour chaque concentration du substrat (acide cholique) figurent dans le tableau VIII ci-après. *EXEMPLE 9 On reprend le mode opératoire décrit dans l'exemple 6, si ce n'est qu'on utilise la souche Arthrobacter CA-35-A589-47 (FERM-P N 5523; ATCC N 31659) au lieu de la souche Arthrobacter CA-35-A589-29-32, la concentration de l'acide cholique dans le milieu est de 50 g/l, la concentration de l'hydroxyde de sodium dans le milieu est de 5 g/l et on incube chaque flacon à 30 C pendant 35 h pour obtenir un mélange de produits et d'acide cholique restant (49,31 g). On soumet le mélange à une chromatographie liquide à grande vitesse dans les mêmes conditions que dans l'exemple 6. Le chromatogramme obtenu est illustré par la figure 6. Les pics A, B, C et D de la figure 6 correspondent respectivement à ceux des stan- dards de référence constitués d'acide hydroxy-7a dicéto-3,12 P-cholanique, d'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 5$-cholanique, d'acide dihydroxy-7a,12a céto-3 5P-cholanique et d'acide cholique. Lorsqu'on sépare les fractions correspondant aux pics A, B, C et D et qu'on les soumet à une chromatographie en couche mince, chaque fraction correspondant aux pics B, C et D contient un seul composant. La fraction correspondant au pic A est constituée d'un mélange d'acide hydroxy-7a dicéto-3,12 5P-cholanique et d'une autre matière non identifiée. On calcule le rendement des produits et la quantité d'acide cholique qui demeure sans être transformé à partir du rapport des surfaces du chromatogramme de la figure 6. Les résultats figurent dans le tableau IX ci-après. EXEMPLE 10 On reprend le mode opératoire décrit dans l'exemple 9, si ce n'est qu'on utilise la souche Arthrobacter CA-35-A849 (FERM-P N 5524; ATCC 31654) au lieu de la souche Arthrobacter CA-35-A589-47 pour obtenir un mélange de produits et d'acide cholique restant (49,34 g). On soumet le mélange à une chromatographie liquide à grande vitesse-dans les mêmes conditions que dans l'exemple 6. Le chromatogramme obtenu est illustré par la figure 7. Les pics A, B, C et D de la figure 7 correspondent a ceux des stan- dards de référence qui sont respectivement l'acide hydroxy-7a dicéto-3,12 5P-cholanique, l'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 5P-cholanique, l'acide dihydroxy-7a,12a céto-3 5P-cholanique et l'acide cholique. Lorsqu'on sépare les fractions correspondant aux pics A, B, C et D et qu'on les soumet à une chromatographie en couche mince, chaque fraction contient un seul composé. On calcule le rendement des produits et la quantité d'acide cholique qui demeure sans être transformé à partir du rapport des surfaces du chromatogramme de la figure 7. Les résultats figurent dans le tableau X ci-après. EXEMPLE 11 On reprend le mode opératoire décrit dans l'exemple 9, si ce n'est qu'on utilise la souche Arthrobacter CA-35-A-1071-15 (FERM-P N 5525; ATCC N 31655) au lieu de la souche Arthrobacter CA-35-A589-47 pour obtenir un mélange de produits et d'acide cholique restant (49,31 g). On soumet le mélange à une chromatographie liquide à grande vitesse dans les mimes conditions que dans l'exemple 6. Le chromatogramme obtenu est illustré par la figure 8. Les pics A, B, C et D de la figure 8 correspondent à ceux des stan- dards de référence constitués respectivement d'acide hydroxy-7a dicéto-3,12 5p-eholanique, d'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 5P-chola- nique, d'acide dihydroxy-7a,12a céto-3 5p-cholanique et d'acide cholique. Lorsqu'on sépare les fractions correspondant aux pics A, B, C et D et qu'on les soumet A une chromatographie en couche mince, chaque fraction correspondant aux pics B, C ou D contient un seul composé. La fraction correspondant au pic A eat un mélange d'acide hydroxy-7a dicéto-3,12 5pcholanique et d'une autre matière non identifiée. On calcule le rendement des produits et la quantité d'acide cholique restant à partir du rapport des surfaces du chroma- togramme de la figure 8. Les résultats figurent dans le tableau XI ciaprès. EXEMPLE 12 On reprend le mode opératoire décrit dans l'exemple 9, si ce n'est qu'on utilise la souche Arthrobacter CA-35-A-1448 (FERM-P N 5526; ATCC N 31656) au lieu de la souche Arthrobacter CA-35-A589-47 pour obtenir unmélange de produits et d'acide cholique restant (49,30 g). On soumet le mélange à une chromatographie liquide à grande vitesse dans les mêmes conditions que dans l'exemple 6. Le chromatogramme obtenu est illustré par la figure 9. Les pics A, B, C et D de la figure 9 correspondent à ceux de stan- dards de référence constitués respectivement d'acide hydroxy-7a dicéto-3,12 5p-cholanique, d'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 5p-chola- nique, d'acide dihydroxy-7a,12a cdto-3 5P-cholanique et d'acLde cholique. Lorsqu'on sépare les fractions correspondant aux pics A, B, C et D et qu'on les soumet à une chromatographie en couche mince, chaque fraction correspondant aux pics B, C ou D contient un seul composé. La fraction correspondant au pic A est un mélange d'acide hydroxy-7a dicéto-3,12 5p-cholanique et d'une autre matière non iden- tifiée. On calcule les rendements des produits et la quantité d'acide cholique qui demeure sans être transformé à partir du rapport des surfaces du chromatogramme de la figure 9. Les résultats figurent dans le tableau XII ci-après. EXEMPLE 13 On reprend le mode opératoire décrit dans l'exemple 9, si ce n'est qu'on utilise la souche Arthrobacter CA-35-A1475 (FERM-P N 5529; ATCC N 31657) au lieu de la souche Arthrobacter CA-35- A589-47 pour obtenir un mélange de produits et d'acide cholique qui demeure sans Otre transformé (49,35 g). On soumet le mélange à une chromatographie liquide à grande vitesse dans les mêmes conditions que dans l'exemple 6. Le chromatogramme obtenu est illustré par la figure 10. Les pics A, B, C et D de la figure 10 correspondent à ceux de stan- dards de référence constitués respectivement d'acide hydroxy-7a dicéto-3,12 5p-cholanique, d'acide dihydroxy-3a, 7a céto-12 53-chols- nique, d'acide dihydroxy-7a,12a céto-3 5P-cholanique et d'acide cholique. Lorsqu'on sépare les fractions correspondant aux pics A, B, C et D et qu'on les soumet à une-chromatographie en couche mince, chaque fraction contient un seul composé. On calcule le rendement des produits et la quantité d'acide cholique à partir du rapport des surfaces du chrontogramme de la figure 10. Les résultats figurent dans le tableau XIII ci- après. EXEMPLE 14 On reprend le mode opératoire décrit dans l'exemple 9, si ce n'est qu'on utilise la souche Arthrobacter CA-35-A-1766-15 (FERM-P N 5528; ATCC N 31658) au lieu de la souche Arthrobacter CA-35-A589-47 pour obtenir un mélange de produits et d'acide cholique (49,27 g). On soumet le mélange à utne chromatographie liquide à grande vitesse dans les mêmes conditions que dans l'exemple 6. Le chromatogramme obtenu est illustré par la figure 11. Les pics A, B, C et D de la figure 11 correspondent à ceux des stan- dards de référence constitués respectivement d'acide hydroxy-7a dicéto-3,12 5p-cholanique, d'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 5$-chola- nique et d'acide cholique. Lorsqu'on sépare les fractions correspondant au pics A, B et D, et qu'on les soumet à une chromatographie en couche mince, chaque fraction contient un seul composé. On calcule le rendement des produits et la quantité d'acide cholique restant à partir du rapport des surfaces du chroma- togramme de la figure 1. Les résultats figurent dans le tableau XIV ci-après. EXEMPLE 15 On reprend le mode opératoire décrit dans l'exemple 9, si ce n'est qu'on utilise la souche Arthrobacter CA-35-M-965-3 (FERM-P N 5529; ATCC Ne 31659) au lieu de la souche Arthrobacter CA-35-A589-47 pour obtenir un mélange de produits et d'acide cholique (49,36 g). On soumet le mélange à une chromatographie liquide à grande vitesse dans les mêmes conditions que dans l'exemple 6. Le chromatogrammae obtenu est illustré par la figure 12. Les pics A, B et D de la figure 12 correspondent a ceux de standards de référence constitués respectivement d'acide hydroxy-7a dicéto-3,12 pcholanique, d'acide dihydroxy-3act,7a céto-12 5p-cholanique et d'acide cholique. Lorsqu'on sépare les fractions correspondant aux pics A, B et D et qu'on les soumet h une chromatographie en couche mince, chaque fraction correspondant aux pics B ou D contient un seul composé. La fraction correspondant au pic A est un mélange d'acide hydroxy-7a dicéto-3,12 5p-cholanique et d'une autre matière non identifiée. On calcule le rendement des produits et la quantité d'acide cholique restant à partir du rapport des surfaces du chroma- togramme de la figure 12. Les résultats figurent dans le tableaux XV ciaprès. EXEMPLE 16 On reprend le mode opératoire décrit dans l'exemple 9, si ce n'est qu'on utilise la souche Arthrobacter CA-35-Y-37-12 (FERM-P N 5530; ATCC N 31660) au lieu de la souche Arthrobacter CA-35-A589-47 pour obtenir un mélange de produits et d'acide cholique (49,33 g). On soumet le mélange à une chromatographie liquide à grande vitesse dans les memes conditions que dans l'exemple 6. Le chromatogramme obtenu est illustré par la figure 13. Les pics A, B, C et D de la figure 13 correspondent à ceux de standards de référence constitués respectivement d'acide hydroxy-7a dicéto-3,12 5pcholanique, d'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 59-cholanique, d'acide dihydroxy-7a,12a céto-3 5p-cholaniiue et d'acide cholique. Lorsqu'on sépare les fractions correspondant aux pics A, B, C et D, et qu'on les soumet à une chromatographie en couche mince, chaque fraction contient un seul composé. On calcule le rendement des produits et la quantité d'acide cholique restant à partir du rapport des surfaces du chroma- togramme de la figure 13. Les résultats figurent dans le tableaux XVI ciaprès. EXEMPLE 17 On reprend le mode opératoire décrit dans l'exemple 1, si ce n'est qu'on utilise la souche Brevibacterium CA-6 (FERM-P N 5144; ATCC N0 31661) au lieu de la souche Arthrobacter CA-35. On soumet le mélange de produits et d'acide cholique restant obtenu à une chromatographie liquide A grande vitesse coma dans l'exemple 1. Le chromatogramme obtenu est illustri par la figure 14. Lorsqu'on isole les composés des fractions correspon- dant aux pics E, A, B et D et qu'on détermine leur constitution chimique à partir du spectre de masse, du spectre infrarouge et du spectre de résonance magnétique nucléaire, ces spectres montrent que ces composés sont respectivement l'acide hydroxy-7a dicéto-3,12 ú4-cholénique, l'acide hydroxy-7a dicéto-3,12 5g-cholanique, l'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 5P-cholanique et l'acide cholique. Les com- posés des fractions correspondant aux pics X et Y sont non identifiés. Dans le chromatogramme de la figure 14, le rapport des o10 surfaces des pics autres que les pics X et Y (c'est-a-dire le rapport des surfaces E/A/B/D) est de 12,2/22,2/44,9/20,7. EXEMPLE 18 On reprend le mode opératoire décrit dans l'exemple 1, si ce n'est qu'on utilise la souche Corynebacterium CA-53 (FERM-P N 5532; ATCC N 31662) au lieu de la souche Arthrobacter CA-35 pour obtenir un mélange de produits et d'acide cholique (82 g). On soumet le mélange obtenu à une chromatographie liquide à grande vitesse dans les mêmes conditions que dans l'exem- ple 1, si ce n'est qu'on utilise pour l'élution un mélange eau-métha- nol (30/70, v/v, pH: 4,0) au lieu d'un mélange eau-méthanol (30/70, v/v, pH: 2,5). Le chromatogramme obtenu est illustré par la figure 15. Les pics A, B, C et D de la figure 15 correspondent à ceux de stan- dards de référence qui sont respectivement l'acide hydroxy-7c dicéto-3,12 5P-cholanique, l'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 5e-chola- nique, l'acide hydroxy-7a dicéto-3,12 A4-cholénique et l'acide cholique. Lorsqu'on isole les composés des fractions correspon- dant aux pics A, B et C et quyon détermine leur constitution chi- mique à partir du spectre de masse, du spectre infrarouge et du spectre de résonance magnétique nucléaire, ces spectres montrent que ces composés sont respectivement l'acide hydroxy-7a dicêto-3,12 P-cholanique, l'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 5-cholanique et l'acide hydroxy-7a dicéto-3,12 à 4-cholénique. EXEMPLE DE REFERENCE 1 On introduit 10 g de l'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 p-cholanique ainsi obtenu dans un ballon à fond rond à trois cols et on ajoute lentement 100 ml d'éthylèneglycol et une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium (10 g d'hydroxyde de potassium + 20 ml d'eau). On ajoute de plus 10 ml d'hydrate d'hydrazine à 85 % puis on porte le mélange à reflux à 100 C pendant 2 h. On élève progressivement la température et on poursuit le reflux entre 185 et 190 C pendant 4 h pour chasser par distillation l'hydrate d'hydra- zine. Après refroidissement, on dilue le mélange réactionnel avec un excès d'eau et on ajuste le pH à 3 pour former un précipité. On recueille le précipité par filtration, on le lave avec de l'eau et on le sèche a l'air pour obtenir l'acide dihydroxy-3a,7a 5p-chola- nique (CDCA); rendement 8,5 g. EXEMPLE DE REFERENCE 2 Dans un ballon à fond rond à trois cols, on dissout 3 g d'acide hydroxy7a dic'to-3,12 5P-cholanique obtenu dans les exemples ci-dessus, dans 70 ml de pyridine et on ajoute une mole de chlorure de tosyle. On laisse le mélange obtenu réagir a 0 C pendant 1 h puis on le porte à reflux pendant 5 h. Après reflux, on ajoute de l'acide chlorhydrique aqueux 3 N et on extrait le mélange réaction- nel avec 100 ml d'éther. On distille l'extrait sous pression réduite pour chasser l'éther et obtenir 2,5 g d'acide dicdto-3,12 &6- et/ou 47cholénique. On dissout les 2 g obtenus dans 10 ml d'hydroxyde de sodium aqueux 1 N et on ajoute 0,1 g de nickel de Raney. Après addition de 0,01 mole d'hydrogène, on fait réagir le mélange pendant une nuit pour obtenir' l'acide dihydroxy-3a,12a 5p-cholanique (acide désoxycholique) et l'acide dihydroxy-3a,1203 5p-cholanique (rende- ment 90 %). Bien entendu diverses modifications-peuvent etre ap- portées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. TABLEAU I Caractéristiques Arthrobacter simplex Arthrobacter CA-35 IAM 1660 Observation microscopique Forme Division Taille (/um) Flagelle Spores Coloration de Gram Acido-rés istance Observations culturales Bouillon gélosé en botte Gélatine (en piqûre) Lait tournesols Lait au pourpre de bromocrésol Caractères physiologiques 1) Réduction des nitrates bâtonnets (parfois gonflés ou courbés) 0,4 - 0,5 x 1 - 3 néant néant positivevariable néant circulaires, légèrement en relief, incolores, lisses, brillantes, transparentes liquéfaction en sac tournesol réduit, lait clarifié clarification, alcalinisation + bâtonnets (parfois cassés ou courbés) rupture 0,8 - 0,9 x 1,7 - 2,2 néant néant positive néant circulaires, légèrement en relief, couleur jaune à crème, lisses, brillantes, opaques pas de liquéfaction tournesol réduit, lait inchangé alcalin, ni coagulé ni peptonisé + en N tg os o T A B L E A U I (suite 1) Caractéristiques Arthrobacter simplex. Arthrobacter CA-35 IAM 1660 Dénitrification - - Test au rouge de méthyle - - Test de Voges-Proskauer - - Production d'indole - - Production de H2S + + Hydrolyse de l'amidon - - Utilisation des citrates + + O Assimilation de sources + + d'azote minéral Uréase Oxydase -- Catalase + + Besoin d'oxygène aérobie aérobie Test d'oxydation/fermentation - oxydation oa Co %0 TA BLEAU Caractéristiques Arthrobacter simplex Arthorbacter CA-35 IAN 1660 Production d'acides et de gaz à partir d'hydrates de carbone 2) 1. Larabinose 2. D-xylose 3. D-glucose 4. D-mannose 5. D-fructose 6. Dgalactose 7. Maltose 8. Saccharose 9. Lactose 10. Tréhalose 11. Dsorbitol 12. D-mannitol 13. Inositol 14. Glycérol 15. Amidon culture acides gaz +_ _ +_ _ +_ _ +_ _ +_ _ +_ _ j- _ _ +_ _ +_ _ +_ _ +_ _ +_ _ + _ _ +_ _ +_ _ z assimilation culture + + + + + + + + + + + + + + + + + + + acides gaz assimilation + - - -it + _ +4-F + -..+ - +.+ - - I II + tN -J ré> W to c CD 1 %0 I (suite 2) TABLEAU Caractéristiques Arthrobacter CA-35-A589-29-32 Arthrobacter CA-35-A589-47 Observation microscopique Forme Division Taille (/unm) Flagelle Spores Coloration de Grim Acido-résistance Observations culturales Bouillon gélosé en botte Bouillon gélosé en botte contenant 10 g/l d'acide cholique Gélatine (en piqûre) Lait tournesols Lait au pourpre de bromocrésol batonnets courts 0,8 - 1,0 x 1,3 - 2,0 flagelle polaire néant positive néant circulaires, plates, jaunes, lisses, brillantes, opaques circulaires, plates, jaunes, lisses, brillantes, opaques liquéfaction tournesol réduit, lait ni coagulé ni peptonisé alcalin, ni coagulé ni peptonisé bâtonnets courts 0,8 - 1,0 x 1,3 - 2,3 flagelle néant positive néant circulaires, plates, jaunes, lisses, brillantes, opaques circulaires, plates, couleur blanc à crème pale, lisses, brillantes, opaques liquéfaction tournesol réduit, lait ni coagulé ni peptonisé alcalin, ni coagulé ni peptonisé oo ro 0% os W CD - o- o I (suite 3) TABLEAU I (suite 4) Caractéristiques Arthrobacter CA-35-A589-29-32 Arthrobacter C&-35-A589-47 Caractères physiologiques 1) Réduction des nitrates + + Dénitrification - Test au rouge de méthyle - Test de Voges-Proskauer - Production d'indole - Production de H2S + + Hydrolyse de l'amidon - Utilisation des citrates + + Assimilation des sources d'azote minéral ammonium + + nitrate + + Uréase - Oxydase Catalase + + Besoin d'oxygène aérobie aérobie Test d'oxydation/fermentation oxydation t> CD os o TAB L E A U I (suite 5) Caractéristiques Arthrobacter CA-35-A589-29-32 Arthrobacter CA-35-A589-47 Production d'acides et de gaz à partir d'hydrates de carbone 2) acides gaz acides gaz 1. L-arabinose' + - + 2. D-xylose 3. D-glucose + 4. D- mannose 5. D-fructose + - + - 6. D-galactose. 7. Maltose + - + - 8. Saccharose. 9. Lactose. 10. Tréhalose. u1. D-sorbitol. 12. D-.annitol -. 13. Inositol - 14. Glycérol -. 15. Aidon - oe D TABLEAU I (suite 6) Caractéristiques Arthrobacter CA-35-A849 Arthrobacter CA-35-A-1071-15 Observation microscopique Forme Division Taille (/um) Flagelle Spores Coloration de Gram Acido-résistance Observations culturales Bouillon gélosé en botte Bouillon gélosé en botte contenant 10 g/l d'acide cholique Gélatine (en piqûre) Lait tournesolé Lait au pourpre de bromocrésol bâtonnets courts 0,7 - 1,0 x 1,3 - 2,3 néant néant positive néant circulaires, plates, jaunes, lisses, brillantes, opaques circulaires, plates, couleur blanche à crème pale, lisses brillantes, opaques liquéfaction tournesol réduit, lait ni coagulé ni peptonisé alcalin, ni coagulation ni peptonisation bâtonnets courts 0, 8 x 1,0 x 1,3 - 2,5 néant néant positive néant circulaires, piates, jaunes, lisses, brillantes, opaques circulaires, plates, couleur blanche à crème pale, lisses brillantes, opaques liquéfaction tournesol réduit, lait ni coagulé ni peptonisé alcalin, ni coagulation ni peptonisation fr" N 0%os W oe - oC o T A B L E A U I (suite 7) Caractéristiques Arthrobacter CA-35-A849 Arthrobacter CA-35-A-1071-15 Caractères physiologiques 1) Réduction des nitrates Dénitrification Test au rouge de méthyle Test de Voges-Proskauer Production d'indole Production de H2S Hydrolyse de l'amidon Utilisation des citrates Assimilation des sources d'azote minéral ammonium nitrate Uréase Oxydase Catalase Besoin d'oxygène Test d'oxydation/fermentation + + + + + + + + + +* + aérobie oxydation + aérobie oxydation N o TABLEAU I (suite 8) Caractéristiques Arthrobacter CA-35-A849 Arthrobacter CA-35-A-1071-15 Production d'acides à partir d'hydrates 1. L-arabinose 2. D-xylose 3. D-glucose 4. D-mannose 5. Dfructose 6. D-galactose 7. MlJtose 8. Saccharose 9. Lactose 10. Tréhalo"e 11. D-sorbitol 12. D-mannitol 13. Inositol 14. Glycérol 15. Amidon et de gaz 2) de carbone acides gaz gaz + + + + acides + + + + + + N o %0 ou TAB L E A U I (suite 9) Caractéristiques Arthrobacter CA-35-A1448 Arthrobacter CA-35-A-1475 Observation microscopique Forme Division Taille (/um) Flagelle Spores Coloration de Gram Acido-résistance Observations culturales Bouillon gélosé en botte Bouillon gélosé en botte contenant 10 g/1 d'acide cholique Gélatine (en piqûre) Lait tournesolé Lait au pourpre de bromocrésol bâtonnets courts 0,7 - 1,0 x 1,2 - 2,0 flagelle néant positive néant circulaires, plates, jaunes, lisses, brillantes, opaques circulaires, plates, couleur blanche à crème pâle, lisses, brillantes, opaques liquéfaction tournesol réduit, lait ni coagulé ni peptonisé alcalin, ni coagulé ni peptonisé bâtonnets courts à cocci 1,0 - 1,3 x 1,2 - 1,8 flagelle néant positive néant circulaires, plates, jaunes, lisses, brillantes, opaques circulaires, plates, couleur blanche à crème pâle, lisses, brillantes, opaques liquéfaction tournesol réduit, lait ni coagulé ni peptonisé alcalin, ni coagulé ni peptonisé w> N on co oC Q T A B L E A U I (suite 10) Caractéristiques Arthrobacter CA-35-A-1448 Arthrobacter CA-35-A-1475 Caractères physiologiques 1) Réduction des nitrates + + Dénitrification - Test au rouge de méthyle - Test de Voges-Proskauer Production d'indole Production de H2S + + Hydrolyse de l'amidon - Utilisation des citrates + + Assimilation des sources d'azote minéral ammonium + + nitrate + + Uréase - Oxydase Catalase + Besoin d'oxygène aérobie aérobie Test d'oxydation/fermentation oxydation - N Co o. to TAB L EAU I (suite 11) Caractéristiques Arthrobacter CA-35-A-1448 Arthrobacter CA-35-A-1475 Production d'acides et de gaz 2 partir d'hydrates de carbone 2 acides gaz acides gaz 1. L-arabinose + - - - 2. D-xylose - - - 3. D-glucose + - - - 4. D-mannose. 5. D-fructose + - + - 6. D-galactose. 7. Maltose + - - - 8. Saccharose 9. Lactose. 10. Tréhalose 11. D-sorbitol. 12. D-mannitol. 13, Inositol. 14. Glycérol + 15. Amidon. 0% o O TABLEAU I (suite 12) Caractéristiques Arthrobacter CA-35-A-1766-15 Arthrobacter CA-35-M-965-3 Observation microscopique Forme Division Taille (/um) Flagelle Spores Coloration de Gram Acido-résistance Observations culturales Bouillon gélosé en botte Bouillon gélosé en botte contenant 10 g/l d'acide cholique Gélatine (en piqûre) Lait tournesolé Lait au pourpre de bromocrésol bâtonnets courts 0,6 - 1,2 x 1,0 - 2,3 flagelle néant positive néant circulaires, plates, jaunes, lisses, brillantes, opaques circulaires, plates, jaunes, lisses, brillantes, opaques liquéfaction tournesol réduit, lait ni coagulé ni peptonisé alcalin, ni coagulé ni peptonisé bâtonnets courts à cocci 1,O - 1,2 x 0,8 - 1,6 flagelle néant positive néant circulaires, plates, jaunes, lisses, brillantes, opaques circulaires, plates, couleur blanc à crème, lisses, brillantes, opaques pas de liquéfaction tournesol réduit, lait ni coagulé ni peptonisé alcalin, ni coagulé ni peptonisé w os cn T A B L E A U I (suite 13) Caractéristiques Arthrobacter CA-35-A-1766-15 Arthrobacter CA- 35-M-965-3 Caractères physiologiques 1) Réduction des nitrates + + Dénitrification - - Test au rouge de méthyle - - Test de Voges-Proskauer - - Production d'indole - Production de H2S + + Co Hydrolyse de l'amidon - - Utilisation des citrates + + Assimilation des sources d'azote minéral ammonium + + nitrate - + Uréase Oxydase Catalase + + *Besoin d'oxygène aérobie aérobie Test d'oxydation/fermentation oxydation oxydation Ch o% o TAB L E A U I (suite 14) Caractéristiques Arthrobacter CA-35-A-1766-15 Arthrobacter CA-35-M-965-3 Production d'acides et de gaz à partir d'hydrates de carbone 2) acides gaz acides gaz 1. L-arabinose + 2. Dxylose _ 3. D-glucose + + 4. D-mannose _ 5. D-fructose + + 6. D-galactose _ 7. Maltose + + 8. Saccharose. 9. Lactose 10. Tréhalose 11. D-sorbitol _ 12. D-mannitol. 13. Inositol. 14. Glycérol + _ 15. Amidon co o o T A B LEAU I (suite 15) Caractéristiques Arthrobacter CA-35-Y-37-12 Brevibacterium CA-6 Observations microscopiques Forme Division Taille (/um) Flagelle Spores Coloration de Gram Acido-résistance Observations culturales Bouillon gélosé en botte Bouillon gélosé en botte contenant 10 g/l d'acide cholique Gélatine (en piqûre) Lait tournesolé Lait au pourpre de bromocrésol bâtonnets courts 0,8 - 1,O x 1,5 - 2,5 flagelle néant positive néant / circulaires, plates, jaunes, lisses, brillantes, opaques circulaires, plates, -couleur crème, lisses, brillantes, opaques liquéfaction tournesol réduit, lait ni coagulé ni peptonisé alcalin, ni coagulé ni peptonisé batonnets 1,0 x 2,5 - 4,0 flagelle polaire néant positive) néant ondulées, légèrement en relief, incolores, lisses, brillantes, translucides liquéfaction peptonisé et devenant alcalin peptonisé et devenant alcalin o ria 0% o %o T A B L E A U I (suite 16) Caractéristiques Arthrobacter CA-35-Y-37-12 Brevibacterium CA-6 Caractères physiologiques Réduction des nitrates + Dénitrification + Test au rouge de méthyle Test de Voges-Proskauer Production d'indole Production de H2S + + Hydrolyse de l'amidon + Utilisation des citrates + + Assimilation des sources d'azote minéral ammonium + nitrate + Uréase Oxydase + Catalase + + Besoin d'oxygène aérobie aérobie Test d'oxydation/fermentation oxydation - o I (suite 17) Caractéristiques Arthrobacter Brevibacterium CA-6 CA-35-Y-37-12 * Production d'acides et de gaz à partir d'hydrates de carbone 2) 1. Larabinose 2. D-xylose 3. D-glucose 4. D-mannose 5. D-fructose 6. Dgalactose 7. Maltose 8. Saccharose 9. Lactose 10. Tréhalose 11. Dsorbitol 12. D-mannitol 13. Inositol 14. Glycérol 15. Amidon acides gaz + + + + + + culture + + + + + + + + + + + + + + + acides + + + + + + gaz assimilation -I1 + +4+ + +44 +44 + |I; +1+ 4: N3 IN tu o o %0 TABLEAU T A B L E A U I (suite 18) Caractéristiques Observation microscopique Forme Division Taille (/um) Flagelle Spores Coloration de Gram Acidorésistance Observations culturales Gélose nutritive en botte Gélatine (en piqûre) Lait tournesolé Lait au pourpre de btomocrésol Cactères physiologiques 1) Réduction des nitrates Dénitrification Test au rouge de méthyle Test de Voges-Proskauer Corynebacterium CA-53 bâtonnets, en massues rupture 1,3 - 2,4 x 1,0 - 1,2 néant néant positive néant 4w tw circulaires, plates, jaunes, lisses, brillantes, opaques pas de liquéfaction tournesol réduit avec un sédiment brun alcalin + o O0 0% T A B L E A U I (suite 19) Caractéristiques Corynebacterium CA-53 Production d' indole Production de H2S + 2 + Hydrolyse de l'amidon Utilisation des citrates + Assimilation des sources d'azote minéral + Uréase Oxydase + Catalase + Besoin d'oxygène aérobie Test d'oxydation/fermentation Production d'acides et de gaz à partir d'hydrates de carbone 2) acides gaz 1. L-arabinose 2. D-xylose - - 3. D-glucose - - 4. D-mannose - - 5. D-fructose - - 6. D-galactose - - 7. Maltose co o M) T A B L E A U I (suite 20) Caractéristiques Corynebacterium CA-53 acides gaz 8. Saccharose - - 9. Lactose -. 10. Tréhalose - 11. D-sorbitol - - 12. D-mannitol - _ 13. Inositol - - 14. Glycérol - 15. Amidon - Remarques: 1) Les symboles concernant le caractère physiologique ont la signification suivante: +: La souche présente le caractère correspondant ou forme le produit correspondant. + -: Il est difficile de déterminer si la souche présente le caractère correspondant ou forme ou non le produit correspondant. -: La souche ne présente pas le caractère correspondant ou ne forme pas le produit correspondant. 0% oe o Remarques: 2) Les symboles correspondant à la production d'acides et de gaz à partir des hydrates de carbone ont la signification suivante: a) Culture, acides et gaz: On cultive la souche dans un milieu de Hugh et Leifson dont la source de carbone est constituée d'un des hydrates de carbone 1 à 15 et on observe la culture et la production d'acides et de gaz. +: La souche se développe ou produit un acide ou un gaz. + -: Il est difficile de déterminer si la souche se développe ou si un acide ou un gaz est o' produit ou non. -: La souche ne se développe pas ou il n'y a pas production d'acide ou de gaz. b) Assimilation: On place dans un tube (diamètre 21 mm) un milieu de culture constitué de Nt4N03 (2 g/l), KH2P04 (2 g/l), K2HPO4 (5 g/l), MgSO4, 7H20 (0,2 g/l), extrait de levure (0,1 g/l) et un des hydrates de carbone 1 à 15 (5 g/l), on cultive la.souche en agitant et on observe l'assimilation (culture). -: La souche ne pousse pas. +: La souche pousse faiblement. +: La souche pousse. ++: La souche pousse bien. I+I: La souche pousse très bien. o" tg co Co TABLEAU Point de fusion des Point de fusion des esters méthyliques acides libres Composés (OC) ( C) Trouvé Littérature Trouvé Littérature Pic A 150-152 152-154 - - Pic B 154-156 156-157 219-220 221-222 Pic C 168-169 169-172 185-186 186188 el -J N a% os o - O0 II T A B L E A U III Composés Rapport des surfaces Taux de conversion Rendement ou quantité (%) (g) cide hydroxy-7a dicéto-3,12 P-cholanique 28,54 28,54 24,3 (pic A) cide dihydroxy-3a,7a céto-12 P-cholanique 63,06 63,06 53,6 (pic B) Acide dihydroxy-7a,12a cétP-3 P-cholanique 1,54 1,54 1,30 (pic C) cide cholique 6,86 6,86 5,80 (pic D) o0 of N o TA B LEAU IV Rendement Composés Concentration du substrat (g/l) 200 300 Acide dihydroxy-3a,7a céto-12 27,1 g 108,3 g 47,4 g P-cholanique Acide hydroxy-7a dicéto-3,12 12,3 g 49,0 g 21,4 g g-cholanique Acide dihydroxy7a,12a céto-3 0,7 g 2,65 g 1,20 g g-cholanique Acide cholique petite 20,1 g 230 g quantité N os Oc oe o TABLEAU V Composés Rapport Acide dihydroxy-3a,7a céto-12 5p-cholanique 67,7 Acide hydroxy-7a dicéto-3,12 5P-cholanique 8,3 Acide dihydroxy-7a,12a céto-3 5Pcholanique 4,0 Acide cholique 20,0 T A B L E A U VI Composés Rapport Acide dihydroxy-3a,7a céto-12 5A-cholanique 63,3 Acide hydroxy-7a dicéto-3,12 5A-cholanique 23,5 Acide dihydroxy-7a,12ax céto-3 5A-cholanique 2,0 cide cholique 11,2 N ru 0% o no TABLEAU VII Composés Taux de conversion * Rendement ou quantité Cop6s() (g) Acide dihydroxy-3a,7a céto-12 98,85 98,16 P-cholanique (pic B) Autres dérivés produits à partir 0,59 0,59 de l'acide cholique Acide cholique (pic D) 0, 56 0,55 * On détermine le taux de conversion à partir du rapport des surfaces. TABLEAU VIII Taux de conversion ou rendement Composés Concentration du substrat (g/l) 1 5 10 20 50 100 200 Acide dihydroxy-3a,7a céto-12 P-cholanique 96,7%* 98,0%7 9,3 g 19,5 g 49, 6 g 98,2 g 129,2 g Acide cholique 0,4% 0,7%* 0,1 g 0,2 g 0,1 g 0,6 g 70,0 g * Taux de conversion u W o o c" C TABLEAU IX Composés. Taux de conversion Rendement ou quantité Composés (%)(g) C.) (g) Acide hydroxy-7a dicéto-3,12 5p- 0,80 0,39 cholanique et matière non identifiée (pic A) Acide dihydroxy-3a,7a céto-12 5p- 98,01 48,33 cholanique (pic B) Acide dihydroxy-7a,12a céto-3 5p- 0,25 0,13 cholanique (pic C) Autres dérivés 0,24 0,12 Acide cholique (pic D) 0,70 0,35 Vn tO w ce o n0 TABLEAU X Composées Taux de conversion Rendement ou quantité M% (g) Acide hydroxy7a dicéto-3, 12 3,2 1,58 P-cholanique (pic A) Acide dihydroxy-3a,7a cé.to12 83,5 41,20 P-cholanique (pic B) Acide dihydroxy-7a,12a céto-3 7,9 3,90 e-cholanique (pic C) Autres dérives 28 1,38 Acide cholique (pic D) 2,6 1, 28 v, w oe o oD TABLEAU N w on o CD %o ComîposésTaux de conversion Rendement ouquantité ComposésM) Acide hydroxy-7a dicéto-3,12 5s2 2,56 f-cholanique et matière non identifiée (pic A) Acide dihydroxy-3a,7a céto-12 93,9 46,30 P-cholanique (pic B) Acide dihydroxy-7a,12a céto-3 0,2 0,10 b-cholanique (pic C) Autres dérivés 0,2 0,10 Acide cholique (pic D) 0, 0,25 XI TABLEAU XII composés Taux de conversion Rendement ou quantité Composéds (%) (g) Acide hydroxy-7a dicéto-3,12 6,5 3,20 P-cholanique et matière non identifiée (pic A) Acide dihydroxy-3a,7a céto-12 88,0 43,39 P-cholanique (pic B) ' Acide dihydroxy-7a,12a céto-3 0,3 0,15 P-cholanique (pic C) Autres dérivés O,1 0,05 Acide cholique (pic D) 5,1 2,51 un Ln &N 0% o % C T A B L E A U XIII Composés Taux de conversion Rendement ou quantité (%) (g) Acide hydroxy7a dicéto-3,12 3,26 1,61 59-cholanique (pic A) Acide dihydroxy-3a,7a céto12 92,0 45,40 P-cholanique (pic B) Acide dihydroxy-7a,12a céto-3 0,20 0, 10 e-cholanique (pic C) Autres dérivés petite quantité - Acide cholique (pic D) 4,54 2,24 n 0% Ms o% o ho c0 TA B LEAU XIV Taux de conversion Rendement ou quantité Composés (%) (g) Acide hydroxy7a dicéto-3,12 0,23 0,11 P-cholanique (pic A) Acide dihydroxy-3a,7a céto12 97,02 47,80 59-cholanique (pic B) Autres dérivés O,75 0,37 Acide cholique (pic D) 2,0 0,99 tn j M tu on o do TABLEAU XV Composés Taux de conversion Rendement ou quantité omos.s. M%) (g) Acide hydroxy-7a dicéto-3,12 8,6 4,24 P-cholanique et matière non identifiée (pic A) Acide di8ydroxy-3a,7a céto-12 85,3 42,11 P-cholanique (pic B) Autres dérivés 2,0 0,99 Acide cholique (pic D) 4,1 2,02 o0 w on Co CD "O TABLEAU XVI C omposés Taux de conversion Rendement ou quantité (%) (g) Acide hydroxy7a dicéto-3,12 7,7 3,80 P-cholanique (pic A) Acide dihydroxy-3a,7a céto12 90,0 44,40 P-cholanique (pic B) Acide dihydroxy-7a,12a céto-3 0,3 0,15 P-cholanique (pic C) Acide cholique (pic D) 2,0 0,98 En O o0 ho Co R E V E N D I C A T ATIONS 1. Procédé microbien pour produire un dérivé d'acide cholanique de formule: COOR H X OH o X représente ---OH ou =O et R représente un atome d'hydrogène, \H un métal alcalin ou un métal alcalino-terreux, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver un microbe capable de se développer dans un milieu contenant de l'acide cholique ou un de ses sels comme substrat pour produire le dérivé d'acide cholanique, choisi parmi les genres Arthrobacter, Brevibacterium et Corvnebacterium, dans un milieu de culture contenant le substrat et A recueillir le dérivé produit. 2. Procédé microbien selon la revendication 1, carac- térisé en ce qu'on choisit le microbe parmi le groupe constitué par les souches: Arthrobacter CA-35 (FERM-P n 5145; ATCC n 31651), Arthrobacter CA-35-A589-29-32 (FERM-P n 5522; ATCC n0 31652), Arthrobacter CA-35-A589-47 (FERM-P n 5523; ATCC n 31653), Arthro- bacter CA-35-A849 (FERM-P nQ 5524; ATCC n 31654), Arthrobacter CA-35-A-1071-15 (FERM-P n 5525; ATCC n 31655), Arthrobacter CA-35- A-1448 (FERM-P n 5526; ATCC n 31656), Arthrobacter CA-35-A-1475 (FERM-P n 5527; ATCC n 31657), Arthrobacter CA-35-A-1766-15 (FERM-P n 5288; ATCC n 31658), Arthrobacter CA-35 M-965-3 (FERM-P n 5529; ATCC n 31659. ), Arthrobacter CA-35-Y-37-12 (FERM-P n 5530; ATCC n 31660), Brevibacterium CA-6 (FERM-P n 5144; ATCC n 31661), et Corvnebacterium CA-53 (FERM-P n 5532; ATCC n 31662). 3. Procédé microbien selon la revendication 1, carac- térisé en ce que le dérivé d'acide cholanique produit est l'acide dihydroxy-3a,7a céto-12 5p-cholanique. 4. Procédé microbien selon la revendication 3, carac- térisé en ce qu'on choisit le microbe parmi le groupe constitué par les souches: Arthrobacter CA-35-A589-29-32 (FERM-P n 5522; ATCC n 31652), Arthrobacter CA-35-A589-47 (FERM-P n 5523; ATCC n 31653), Arthrobacter CA-35-A849 (FERM-P n 5524; ATCC n 31654), Atthrobac- ter CA-35-A-107115 (FERM-P n 5525; ATCC n 31655), Arthrobacter CA-35-A-1448 (FERM-P n 5526; ATCC n0 31656), Arthrobacter CA-35- A-1475 (FERM-P n 5527; ATCC n 31657), Arthrobacter CA-35-A-1766-15 (FERM-P n 5528; ATCC n 31658), Arthrobacter CA-35-M-965-3 (FERM-P n 5529; ATCC n 31659), et Arthrobacter CA-35-Y-37-12 (FERM-P n 5530; ATCC n 31660). 5. Procédé microbien selon la revendication 1, carac- térisé en ce qu'on utilise le substrat à une concentration de 1 à 500 g/l en acide cholique. 6. Procédé microbien selon la revendication 5, carac- térisé en ce qu'on utilise le substrat à une concentration de 5 à 300 g/l en acide cholique. 7. Procédé microbien selon la revendication 6, carac- térisé en ce qu'on utilise le substrat à une concentration de 10 à 200 g/l en acide cholique. 8. Arthrobacter sp. caractérisé en ce qu'il est capable de se développer dans un milieu contenant de l'acide cholique ou un de ses sels comme substrat pour produire des dérivés d'acide cholanique de formule: 0 COOR x OH H o X représente ---OH ou 30 et R représente un atome d'hydrogène, H un métal alcalin ou un métal alcalino-terreux. 9. Arthrobacter sp. selon la revendication 8, caracté- - risé en ce qu'il consiste en la souche Arthrobacter CA-35 (FERM-P n 5145; ATCC n 31651, Arthrobacter CA-35-A589-29-32 (FERM-P n 5522; ATCC n 31652), Arthrobacter CA-35-A 589-47 (FERM-P n 5523; ATCC n 31653), Arthrobacter CA-35-A 849 (PERM-P n 5524; ATCC n 31654), Arthrobacter CA35-A-1071-15 (FERM-P n 5525; ATCC n 31655), Arthrobacter CA-35-A-1448 (FERM-P n 5526; ATCC n 31656), Arthrobacter CA-35-A-1475 (FERM-P n 5527; ATCC n 31657), Arthro- bacter CA-35A-1766-15 (FERM-P n 5528; ATCC n 31658), Arthrobacter CA-35-M-965-3 (FERM-P n 5529; ATCC n 31659), ou Arthrobacter CA-35- Y-37-12 (FERM-P n 5530; ATCC n 31660). 10. Brevibacterium sp. caractérisé en ce qu'il est capable de se développer dans un milieu contenant de l'acide cho- lique ou un de ses sels comme substrat pour produire des dérivés d'acide cholanique de formule: COOR o X représente --OH ou = O et R représente un atome d'hydrog&ne, H un métal alcalin ou un métal alcalino-terreux. 11. Brevibacterium sp. selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il consiste en la souche Brevibacterium CA-6 (FERM-P n 5144; ATCC n 31661). 12. Corynebacterium sp. caractérisé en ce qu'il est - capable de se développer dans un milieu contenant de l'acide cho- lique ou un de ses sels comme substrats pour produire des dérivés d'acide cholanique de formule: o o X représente ---OH ou = O et R représente un atome d'hyrogène, H un métal alcalin ou un métal alcalino-terreux. 13. Corynebacterium sp. selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il consiste en la souche Corynebacterium CA-53 (FERM-P n 5332; ATCC n 31662).