Brevet FR2464258A1 — publié le 19810306

-2464258 L'invention fournit de nouveaux PPL (préparation de pénicilloyl-polylysine) et MDM (mélange de déterminants mi- neurs) et des compositions contenant des matériaux, ainsi que des tests plus sensibles pour prédire et diagnostiquer une allergie ou une hypersensibilité à la pénicilline chez les humains ou d'autres espèces animales au moyen d'essais cutanés avec les compositions de PP1 et de MDM, améliorées, selon l'invention. Depuis l'introduction des pénicillines pour le traite- ment thérapeutique des infections chez les humains et les ani- maux, on a observé diverses réactions allergiques; la plus sérieuse de ces réactions est le choc anaphylactique dont on estime qu'il est la cause de plusieurs centaines de décès aux Etats Unis, chaque année. La possibilité d'une anaphyla- xie non-fatale et de réactions d'urticaire, qui sont beaucoup plus communes qu'une anaphylaxie fatale, revêt également une importance nonnégligeable pour le médecin responsable du traitement d'un patient par les pénicillines. On a donc consacré beaucoup d'efforts en vue de déve- lopper des tests fiables pour prédire la réponse allergique humaine ou l'hypersensibilité à la pénicilline. Ceci s'est traduit par la description dans la littérature de quelques tests cutanés qui font actuellement l'objet d'une étude cli- nique. Un test de ce genre implique généralement la scarifi- cation de la peau sur une surface sur laquelle on a placé une solution d'essai, ou une injection intradermique de la solution d'essai, et l'observation ultérieure d'une réaction positive - c'est-à-dire l'apparition d'une papule érythéma- teuse autour de la scarification ou des sites d'injection, en 15 minutes, Des tests cutanés plus sensibles consistent en une injection intradermique de solutions contenant (1) des compositions de PPL et (2) des compositions de MDM. La chimie responsable du mécanisme par lequel une pé- nicilline peut engendrer des réactions allergiques chez les humains, et les détails relatifs à l'état de la technique dans les tests cutanés par "scarification" et "injection in- tradermique" sont décrits en détail dans la littérature. Les références non-limitatives suivantes ne sont que quelques-unes des études représentatives qui fournissent la base technique dans le domaine de l'invention -: "Mécanismes immunologiques de l'allergie à la pénicil- line"', B.B. Lévine, J. New England Medicine, 275, 1115 (1966) "La nature des complexes antigène-anticorps initiant l'apparition d'une papule érythémateuse spécifique chez l'homme sensibilisé", B.B. Levine, A. P. Redmond, J. Clinical Investigation, 47, 556 (1968) "Prédictions de l'allergie à la pénicilline par des tests immunologiques", B.B. Levine, DoM. Zolov, J.of Allergy 43, 4, 231 (1969) "Allergie aux médicaments", B. B. Levine, Tiré à part de Remarques présentées au séminaire organisé sous l'égide de Johns Hopkins Univ., Am. Acad. of Allergy et NIH (1971) "Exanthèmes cutanés lors d'une thérapie à la pénicil- line, conduite usuelle", B.B. Levine, New England Journal of Medicine (1971) "Un guide des essais cutanés concernant l'allergie à la pénicilline", N.F. Adkinson Jr., Médecin résident, John Hopkins Univ. (1977). Voir également les brevets US 3 867 365 et 3 979 508, de Stahmann et Wagleo Le brevet US 3 867 365, mentionné ci-dessus, décrit un matériau de PPL de la technique antérieure, utilisé dans les tests cutanés pour déterminer l'allergie à la pénicilline, et on pense que ces composés peuvent avoir été commercialisés. Les compositions brevetées dont l'amélioration constitue l'ob- jet de la présente demande, comprennent des conjugats de BPO (benzylpénicilloyle) d'un mélange hétérogène de polymères de polylysine statistiques qui contiendraient de 12 à 102, ou plus, unités de lysine fixées dans la chaîne polymère. Dans les études antérieures, telles que celles citées plus haut, on a également montré que certains patients à qui on a administré de la pénicilline, dans un but thérapeutique, développent des anticorps de classe IgE contre certains hap- tènes qui sont formés par la réaction de la pénicilline avec les protéines des tissus. Ceux-ci comprennent l'haptène de benzylpénicilloyle (BPO) dont la structure est bien connue et certains haptènes dedéterminants mineurs" dont les structu- res ne sont pas encore connues. Les anticorps de classe IgE sont connus pour être des médiateurs de réactions anaphylactiques et d'autres réactions allergiques-immédiates vis-à-vis de la pénicilline, chez 1' homme. Ces réactions sont souvent sévères, provoquant un exan- !.5 cheme diffus, des difficultés respiratoires, des crampes abdo- minales et des évanouissements, de l'hypertension et une aryth- mie. Elles sont capables d'entra ner la mort par collapsus cardiovasculaire, arythmie ventriculaire et/ou obstruction respiratoire. Des -tests cutanés avec divers matériaux dérivés de la pénicilline se sont montrés positifs en présence de ces anti- corps de classe IgE, et servent donc de test pour prédire une allergie sévère vis-à=vis de la pénicilline. Les compositions pour les tests cutanés, couramment utilisées, comprennent la benzyl-pénicilloylpopylysine (BPL), qui détecte les anticorps de classe IgE spécifiques pour le groupe des haptènes BPO, et le MDM qui détecte les anticorps de classe IgE spécifiques pour déterminants mineurs. Jusqu'à maintenant, le MDM généralement utilisé com- prenait des combinaisons de deux ou plusieurs substances choi- sies parmi la benzylpénicilline (PG), l'acide benzylpénicil- loique (NaBPO), l'acide benzylpénilloique (POIC) et la benzyl- pénicilloyl-amine (BPO amine). Bien que les tests intradermiques utilisant la PPL et le MDM se soient avérés utilisables pour prédire une aller- gie à la pénicilline, le déposant a observé qu'avec certains patients, les anticorps de classe IgE induits par la pénicil- line ne sont pas détectés ou seulement faiblement détectés par les compositions d'essai au MDM couramment utilisées. Conformément à l'invention, le déposant a observé que l'addition d'une Npénicilloyl-amine d'une amine aliphatique ou d'un os -amino-acide, en particulier la BPO-propyl amine ou la BPO-éthyl amine, au MDM, augmente considérablement l'in- tensité du test. En ce qui concerne les nouveaux matériaux de PPL, le déposant a observé de nombreuses améliorations par rapport à la technique antérieure. Tout d'abord, les matériaux de PPL sont des matériaux homogènes, très purs, qui présentent une plus grande reproductibilité d'un lot à un autre que les con- jugats de polylysine hétérogènes de la technique antérieure. Les nouveaux matériaux de PPL selon l'invention sont également substantiellement exempts d'impuretés à bas poids moléculaire (polylysine2 et/ou polylysine3) et, en conséquence, ils mini- misent la possibilité de diffusion d'un composé du site d'es- sai dans le courant sanguin, avec pour conséquence des réztc- tions constitutionnelles. De plus, les matériaux à poids mo- léculaire relativement faible, B4_13-L612Y devraient avoir un plus faible degré d'immunogénicité que les conjugats de PPL à haut poids moléculaire de la technique antérieure, et ils sont donc moins aptes à induire une allergie chez un sujet examiné. En outre, les matériaux de PPL selon l'invention sont dtun poids moléculaire qui permet une diffusion suffisante dans la peau à partir d'un site d'essai intradermique ou par piqûre, pour donner une réaction érythémato-papuleuse intense. Au contraire, les conjugats à haut poids moléculaire peuvent diffuser moins bien chez un quart à un tiers des patients et dans ce cas ne peuvent pas fournir un test cutané positif ai- sément reconnaissable chez certains patients allergiques (Le- vine et Fellner, Journal of Allergy, 36, 242-52 (1965)) Eu égard aux conséquences, peut-être catastrophiques, de l'observation d'une réponse négative chez un patient qui est réellement allergique à la pénicilline, il est nécessaire que des tests d'allergie plus sensibles et très fiables soient cliniquement disponibles. En outre, l'emploi d'un test très sensible revêt une grande importance dans des tests par piqnre ou scarification. Ils sont beaucoup plus commodes, mais moins sensibles que les tests intradermiques. C'est ainsi que des matériaux d'essai plus sensibles permettent l'application d'un test par piqûre. En conséquence, le principal but de l'invention est de fournir un test cutané plus sensible et reproductible pour détecter une allergie à la pénicilline, en utilisant des pré- parations de PPL améliorées et un MDM amélioré. L'invention a encore pour but de fournir de nouveaux composés et composi- tions de PP1 et de MDM, utilisables dans des essais cutanés pour prédire ou diagnostiquer une réaction allergique ou une hypersensibilité à la pénicilline. L'invention consiste en: (1) de nouvelles préparations de PPL. Les groupes pé- nicilloyle sont les M -diastéréoisomères. Les supports de polylysine sont des polymères linéaires homogènes ayant un de- gré de polymérisation de 6 à 12. Les polymères de polylysine peuvent être préparés à partir des L-, D-, ou D,L-lysines. Les polymères sont couplés au maximum avec des groupes péni- cilloyle. Par exemple, dans un matériau, le support de poly-L- lysine8 a une pureté de 97 %, le reste étant de la polylysi- ne6_7o Ce matériau est couplé au maximum avec 8 unités péni- cilloyle. Dans d'autres préparations de ce PPL, de 6 à 9 uni- tés pénicilloyle peuvent être couplées à la chaîne de polymè- re de polylysine8. (2) de nouveaux matériaux de MDM Les matériaux sont des N-pénicilloyl-amines d'une amine aliphatique ou d'un O - aminoacide et des mélanges de MDM contenant ces matériaux. Les N-pénicilloyl-amines ou -aminoacides peuvent être des - diastéréoisomères, ou d'autres diastéréoisomères ou des mélanges diastéréoisomères. (3) des procédés pour des essais cutanés en vue de dé- tecter une allergie ou une hypersensibilité à la pénicilline en utilisant des solutions contenant les nouveaux matériaux de (1) et de (2) indépendamment ou dans un test combiné à deux solutions. Les nouveaux matériaux de MDM peuvent être u- tilisés seuls ou comme une partie d'un MDM à constituants mul- tiples. Les tests cutanés peuvent être effectués par piqûre, par scarification ou par injection intradermique. Certaines des compositions peuvent également être utilisables pour un essai in vitro de l'allergie à la pénicilline. La présente invention a principalement pour objets: Une composition stable au stockage, capable d'être reconsti- tuée par mélange avec un solvant approprié pour former une composition utilisable dans un essai cutané en vue de déter- miner une allergie à la pénicilline ou une hypersensibilité aux pénicillines comprenant la benzyl pénicilline, et des phé- nicillines semi-synthétiques, caractérisée en ce qu'elle con- tient un mélange lyophilisé de: (1) un composé représenté par la formule S CH3 2R1 N-CH NH CH (I) & NlH C_ L COOH 04" H HNR2 dans laquelle: R1 est une chaSne latérale contenue dans les pénicil- lines à partir desquelles le composé de pénicilloyl amine ou aminoacide est préparé; les pénicillines étant choisies par- mi la benzylpénicilline et des pénicillines semi-synthétiques, et R2 est un substituant choisi parmi un groupe alkyle ayant une chaîne en C2-C6, un groupe carboxy alkyle ayant une chaîne en C2-C6 ou un reste d'un composé d'aminoacide ou d'a- mine du type présent dans le sang, dans le plasma sanguin ou dans les fluides des tissus, le composé étant choisi parmi la cystamine, la spermine, la spermidine, la phosphoëthanolamine, l'arginine, la cystine, la glutamine, l'histidine, la lysine, la proline, la sérine, la thréonine et l'asparagine: les composés étant des (3) le benzylpénicilloate de sodium. Dans la formule I ci-dessus, le groupe R2 est notam- ment un groupe éthyle ou propyle. Des conjugués de PPL substantiellement homogène, ca- ractérisés en ce qu'ils répondent à la formule R R R M NH H (") 2(CH2)4(H) (CH-2)4 H4() RHN, C_ _ N _ C C. c ___ COOH I P I J È B H O 0 HH n dans laquelle: R est choisi parmi H et des groupes pénicilloyle ou similaires dérivés des pénicillines, des céphalosporines ou d'autres antibiotiques p-lactamiques, et au moins de 66 à % environ des groupes R sont différents de l'hydrogène; n est un nombre entier compris entre 4 et 10; et les polylysines linéaires peuvent être choisies parmi les poly-L-lysines, les poly-D-lysines et les poly-D,L,-lysi- neso Les composés de formule II ci-dessus sont notamment la benzylpénicilloy!8 -polylysine8 et la benzylpénicilloyl8 poly-L-lysine. Une solution pour l'essai cutané de J'allergie ou de l'hypersensibilité a la pénicilline qui contient une solution d'un conjugué tel que défini cidessus, et le produit stable au stockage obtenu par lyophilisation de cette solution. Des composés caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule: O S il CH3 R NH. _H CH___ C CH p: hH,SC COOHS 0 H NR2 dans laquelle: R1 est une chaîne latérale contenue dans la pénicilli- ne à partir de laquelle le composé de pénicilloyl amine ou aminoacide est préparé; et R2 est un substituant choisi parmi un groupe alkyle ayant une chaîne en C2-C6, l'acide 2-aminopropanoique, l'aci- de 2-amilobutanoique, l'acide 2-aminopentanolque, l'acide 2- aminohexanoique ou un reste d'un aminoacide ou d'une amine du type présent dans le sang, dans le plasma sanguin ou dans les fluides des tissus, les composés étant des o' -diastéréoiso- mères, d'autres diastéréoisomères ou des mélanges diastéréoiso- mères. Une composition pour l'essai cutané de l'allergie ou de l'hypersensibilité aux pénicillines comprenant la benzyl- pénicilline et des pénicillines semi-synthétiques, par la dé- tection d'anticorps spécifiques contre les déterminants mi- neurs dans des tests de sensibilisation cutanée, par un essai par piqûre par scarification ou intradermique de la peau d'un patient, caractérisée en ce qu'elle contient: 1) un composé représenté par la formule: 5. S CH Ru1 11. NH CHH @t CH3 (II) 1 L- - COO C H HNR2 dans laquelle: R1 est une chaXne latérale contenue dans les pénicil- lines à partir desquelles le composé de pénicilloyl amine ou aminoacide est formé; les pénicillines étant choisies parmi la benzylpénicilline et des pénicillines semi-synthétiques, et R2 est un substituant choisi parmi un groupe alkyle ayant une chaîne en C2 - C6, un groupe carboxy alkyle ayant une chaîne en C2-C6 ou un reste d'un composé d'aminoacide ou d'amine contenu dans le sang, dans le plasma sanguin ou dans les fluides des tissus, le composé d'amine et le composé d' aminoacide étant choisis parmi la cystamine, la spermine, la spermidine, la phosphoéthanolamine, l'arginine, la cystine, la glutamine, l'histidine, la lysine, la proline, la sérine, la thréonine et l'asparagine. Les composés représentés par la formule ci-dessus é- tant des a -diastéréôOisomères ou des mélanges diastéréoiso- mères; et 2) un solvant approprié pour le composé 1), le solvant étant compatible avec l'utilisation de la composition dans un essai cutané de détermination d'une al- lergie à la pénicilline ou de l'hypersensibilité aux pénicil- lines comprenant la benzyl pénicilline et des pénicillines semisynthétiques, la concentration du composé 1) dans le solvant 2) é- tant suffisante pour obtenir une réponse érythémato-papuleuse chez des patients allergiques ou pouvant 9tre allergiques aux pénicillines lorsque la composition est administrée au patient dans un essai cutané, mais la concentration étant optimale afin d'éviter une réaction constitutionnelle. Dans les composés de formule II ci-dessus, R1 est no- tamment un groupe benzyle et R2 un groupe éthyle ou N-propyle. Des compositions qui comprennent outre le composé de formule I et un solvant, la benzyl pénicilline ou du benzyl- pénicilloate de sodium. Un procédé pour déterminer par un test cutané une al- lergie ou une hypersensibilité aux pénicillines, comprenant la benzyl pénicilline et des pénicillines semi-synthétiques, par la détection des anticorps spécifiques contre les déter- minants mineurs, dans des tests de sensibilisation cutanée, caractérisée en ce qu'on examine la peau d'un patient après un essai par piqure, par scarification ou intradermique, avec des solutions contenant des compositions, comprenant un com- posé de formule I ou un conjugué tels que définis ci-dessus. Ce procédé peut comprendre un premier traitement sur une première surface de peau avec une solution contenant des compositions comprenant un composé de formule I et un deuxiè- me traitement d'une deuxième surface de peau avec une solu- tion contenant des compositions comprenant un conjugué tel que défini ci-dessus. D'autres buts et avantages de l'invention apparaltront à la lecture de la description de certains modes de mise en oeuvre préférés, ci-après. A. Benzylpénicilloyl8-poly-L-lysine8(B8L8) 1. Préparation Les matériaux de PPL selon l'invention comprennent un support homogène de polylysine, ayant un degré de polymérisa- tion de 6 à 12, dans lequel au moins environ 66 % des sites de couplage sont occupés par des groupes pénicilloyle conju- gués, dérivés de pénicilline, de céphalosporines ou d'autres fractions antibiotiques de p-lactame. La nouvelle B8L8 entrant dans le cadre de l'invention est préparée de la façon suivante: On prépare l'octa-L-lysine par le procédé de L.E. Bars- tow et al (Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 74, 4248 (1977)), avec les modifications suivantes. Le matériau de départ est un es- ter de résine de Merryfield de 1' p -t-BOC- E -CBZ-L-lysine. Il y a sept couplages consécutifs avec 1'o -t-BOC- 5 -CBZ-L- lvs2ne avec suppression intermédiaire de la protection du grou- pe X -I2 au moyen de l'acide trifluoracétique (TFA). On sup- prime la protection de l'octa-L-lysine résultante et on la scinde de la résine en mélangeant la résine à 25 C pendant 25 minutes avec du TFA saturé de gaz HBr (1 g de résine par ml de TFA)o On chasse HBr par une purge de N2 et on chasse le TFA par évaporation sous vide. On dissout le produit dans H20 et on lyophilise. On dissout le résidu dans de l'acide a- cétique a. 50 %O et on purifie par chromatographie sur colonne de Sephadex G.15. On dilue à l'eau la solution contenant le pic principal de façon qu'elle ne soit plus qu'à 10 %o d'acide acétique et on lyophilise afin d'obtenir une poudre amorphe légèrement jaune. On analyse le matériau par chromatographie sur papier en utilisant un système Waley-Watson modifié (BOB. Levine et A.P. Redmond, J. Clinical Investigation 47, 556, 1968). On observe une tache principale correspondant à l'octa- L-lysine avec des traces de lysine6 et de lysine7 (correspon- dant en intensité de couleur à environ 1 % chacune). On dissout 100 mg de poly-L-lysine8.HBr (en supposant 90 9 de peptide, 10 % d'eau) dans 25 ml d'eau désionisée et + on ajuste le pH à 10 - 0,3 avec NaOH 0,5 Mo On ajoute une so- lution de 755 mg de PG de potassium dans 10 ml d'eau et on ajuste le pH à 11,5 - 0,05 avec NaOH 0,5 M. On conduit la réaction à la températureambiante (T = 22 C) en agitant au moyen d'un agitateur magnétique et on ajuste le pH à 11,5 - 0,05 par des additions de NaOH 0,05 M. La réaction est termi- née en deux heures, comme le montre la stabilisation du pH à 11,5, puis on refroidit la solution à 5 - 10 C dans un bain de glace. On ajuste le pH à 3,6 par addition de HC1 1 N à la solution agitée. On centrifuge le précipité blanc ainsi formé en utilisant une centrifugeuse refroidie. On lave deux fois le précipité avec de faibles quantités d'eau désionisée re- froidie dans de la glace. On met le précipité en suspension dans 20 ml d'eau désionisée et on dissout en ajustant le pH à 9,5 - 10,5 avec NaOH 0,5 M. On clarifie la solution par cen- trifugation à froid. On refroidit la solution à 5-10 C et on ajuste le pH à 3,6 avec HC1 iN. On centrifuge le précipité blanc et on lave trois fois avec de faibles quantités d'eau désionisée refroidie dans de la glace. On sèche le précipité humide sous un vide très poussé dans un lyophiliseur. On ob- tient ainsi 104 mg d'une poudre blanche, soit environ 55 % du rendement théorique. En plus du dérivé de polylysine8 de PG décrit ci-dessus, on peut également préparer des dérivés de polylysine8 à partir de toutes les pénicillines semi-synthétiques. C'est ainsi qu' on peut utiliser l'ampicilline, la carbénicilline, la naphta- cilline, l'oxacilline, la cloxacilline, la staphcilline, la phénoxyéthylpénicilline, la phénoxyméthylpénici]line, la pipa- ricilline, la mezlocilline, etco...pour préparer les dérivés de PPL8 correspondants. On pense qu'il est également possible de préparer des dérivés utiles de polylysine8 à partir de cépha- losporines et d'autres antibiotiques p-lactamiques. Des procé- dés autres qu'une précipitation à pH 3,7 peuvent être utilisés pour isoler ce produit final ou d'autres, par exemple, des procédés chromatographiques pour préparation ou des sépara- tions sur membrane. * 2. Préparation de la solution d'essai On prépare comme suit une solution utilisable dans les essais cutanés pour détecter une allergie ou une hyper- sensibilité à la pénicilline, en utilisant la BsLS décrite ci-dessus: On dissout 1,00 mg/ml de B8L8 dans Na2HPO4 0,05 M. Un dosage au pénamaldate indique que la concentration en BPO est alors égale à 1,90 x 10-3 M. On détermine la teneur en a- zote totale par la méthode micro-Kjeldahl et on obtient une valeur de 106 jg/ml. La contribution du BPO quant à l'azote est évaluée à 1,90 x 28 ug/ml soit 53 pg/ml. La contribution de la polylysine8 quant à l'azoté est égale à 106 - 53, soit 53 pg/ml. La polylysine8 est égale à 53 x 4,65 soit 246pg/ml, soit divisé par 1042, 2,37 x 10-4 M. Le nombre de groupes BPO par mole de polylysine8 est évalué par calcul à 8,02. C'est ainsi qu'on détermine que le conjugat est la B8L8 et que la concentration de B8L8 dans la solution mère de 1,00 mg/ml de B8L8 est de 2,37 x 10-4 M. 3. Tests cutanés au moyen de la solution de B8L8 L'essai cutané au moyen de la nouvelle solution de B8L8 est conduit comme suit: On dilue la solution mère de B8L8 à 1 x 10-6 molaire dans une solution saline tamponnée au tris à un pH de 8,2, contenant également de l'acide éthylène diamine tétraacétique (2 x 10-4 M) pour la stabilité. On utilise alors la composi- tion pour l'essai sur la peau. Les tests sont conduits selon les procédés par piqûre et intradermique, et les résultats sont les suivants: Patient n l - test par piqûre - B L8 = 2+. L'aspect 8 8 de l'érythème et la dimension de la papule (4 à 5 mm de dia- mètre) indiquent une réaction positive à la B8L8. Patient n 2 - test intradermique - la B8 L8 donne une papule de 10 mm et son intensité est évaluée entre 2+ et 3+. D'autres concentrations du nouveau matériau de PPL peuvent également être utilisées pour l'essai. On examine de la m9me façon des patients non-aller- giques et on obtient des réactions négatives, indiquant que les solutions ne sont pas des irritants primaires. B. Matériaux de MDM L'examen cutané amélioré pour détecter une allergie ou une hypersensibilité à la pénicilline peut être réalisé en utilisant un MDM constitué d'une N-pénicilloyl amine d'une amine aliphatique, telle que la N-propyl amine ou l'éthyl a- mine, ou d'un oe -amino acide, tel que l'acide o -aminobu- tyrique, la norvaline, la glutamine, la proline, etc. comme nouvel ingrédient du MDM en plus de l'acide pénicilloique et de la pénicilline. Ces nouveaux matériaux (les N-pénicilloyl amines d'amines aliphatiques ou d' o-aminoacides) détectent les anticorps de classe IgE induits par la pénicilline, qui ne sont pas détectés ou seulement faiblement détectés par les matériaux couramment utilisés dans les tests cutanés. Par e- xemple, le Tableau II montre les résultats d'essais cutanés sur des patients allergiques à la pénicilline. Les patients MB et CM donnent des tests cutanés plus intenses A la BPO- éthyl amine et à la BPO-propyl amine qu'ils ne le font avec les autres matériaux d'essais de déterminants mineurs. Ces BPO-alkyl amines ne montrent pas de réactivité vis-à-vis de la BPL ou des autres déterminants mineurs, car il n'y a au- cune relation entre eux. Par exemple, le patient CM est to- talement négatif à la BPL alors qu'il donne une réaction po- sitive à la BPO-éthyl amine et à la BPO-propyl amine. Il faut également noter des réactions positives à la BPO-propyl ami- ne et à la BPO-éthyl amine, associées à des réactions négati- ves à la PG. On peut constater que les patients CM et MB donnent des réactions plus intenses à la BPO-propyl amine et la BPO-éthyl amine qu'au P/P (NaBPO plus POIC), alors que l'inverse est vrai pour les patients LG et NT. Enfin, on ob- serve un manque de relation entre les intensités des tests à la BPO-éthyl amine et à la BPO-propyl amine L'utilisation d'une BPO-alkyl amine ou d'un BPO-ami- noacide est basée sur le fait que chez certains patients un haptène ou un allergène de pénicilline important peut se for- mer à partir de la réaction de la pénicilline avec une amine ou un aminoacide présent dans le plasma sanguin et dans les fluides des tissus. On suppose que le NaBPO peut devenir al- lergisant par un premier réarrangement en acide benzylpénamal- dique, capable de se fixer chimiquement sur les protéines des tissus par l"intermédiaire de liaisons disulfure mixtes avec des résidus cystéine de la protéine. L'acide benzylpénamaldique peut, de son côté, se dé- grader en acide benzylpénaldique (un aldéhyde) capable de réa- gir avec les groupes amino de la protéine, en se fixant par une base de Schiffo La même séquence réactionnelle peut être valable pour une pénicilloyl-amineo Dans les deux cas, la chai- ne latérale alkyl amine ou aminoacide serait une partie inté- grale du groupe hapténique. In vivo, une partie de la pénicilline en circulation s'hydrolyse en acide pénicilloïque, et une partie peut réagir avec les amines ou lesaminoacides circulant dans le plasma en formant des BPO-alkyl amines ou des BPO-aminoacides. Un au- tre réarrangement et/ou une autre dégradation des BFO-amines et la réaction de ces produits avec les protéines tel que dé- crit ci-dessus, se traduirait par la formation de conjugats haptène-protéine allergisants. Certains individus peuvent mon- trer une réponse immune à un ou plusieurs de ces haptènes. Des examens cutanés avec le NaBPO, le POIC ou une BPO-amine (qui ne possèdent pas de chaîne latérale alkyl amine ou aminoacide dans leurs structures) peuvent ne pas détecter des anticorps de classe IaE dirigés contre l'haptène de BPO-alkyl amine ou de BPO aminoacide chez certains patients. Il existe probable- ment chez quelques patients une certaine réactivité croisée entre le NaBPO et la BPO-alkyl amine (ou aminoacide), mais ceci devrait se traduire par une considérable diminution de l'intensité de la réaction du test cutané. C'est ainsi qu'un essai avec de faibles concentrations en NaBPO (ou un essai par piqûre, ce qui revient au même), ne permettrait pas de détecter une sensibilité, alors qu'un essai avec une BPO-al- kyl amine ou un BPO aminoacide en faible concentration ou par piqûre serait plus apte à détecter cette sensibilité. Dans le nouveau test selon l'invention, il est prévu d'utiliser le test par piqure pour examiner des patients sans allergies an- térieures à la pénicilline, et qui doivent être traités avec la pénicilline ou des pénicillines semi-synthétiques ou des céphalosporines ou d'autres antibiotiques,-lactamique. Le nouveau MDM préféré consiste en NaBPO, PG ou BPO- propyl amine (ou BPO-éthyl amine ou d'autres BPO-alkyl amines ou BPOaminoacides conformément a l'invention). On suppose que l'élimination de la BPO-amine et du POIC desnMlanges de MDM préalablement décrits n'entraînerait pas une diminution de la sensibilité, car une combinaison de NaBPO et de BPO- propylamine détecterait toute allergie chez ces patients. On a choisi la BPO-propyl amine et la BPO-éthyl amine comme nou- veaux matériaux de MDM préférés, car leurs chaînes latérales sont très semblables à la majorité des aminoacides et des a- mines possibles, eu égard aux composés trouvés dans le sang et dans le plasma. (Voir les Tableaux IA, IB et IC pour une liste d'amines et d'aminoacides dont la présence a été identi- fiée dans le sang humain et le plasma). D'autres peuvent y i- tre ajoutés ou substitués ultérieurement. Conformément à 1' invention, on pense que le résidu aminoacide des nouveaux matériaux de MDM peut être choisi parmi l'un -quelconque des aminoacides trouvés dans le plasma sanguin et dans les fluides des tissus, dont les plus typiques sont mentionnés dans les Tableaux IA, IB et IC, ainsi que parmi l'acide 2-aminopropa- noique, l'acide 2-aminobutanoique, l'acide 2-aminopentanoique et l'acide 2-aminohexanoique. Ces quatre derniers composés ont une structure similaire a certains aminoacides et amines trouvés dans le sang. Ces Npenicilloyl amines et aminoacides peuvent être des et -diastéréoisomères, d'autres diastéréo- isomères ou des mélanges de diastéréoisomères. TABLEAU I A. Amines aliphatiques présentes dans le sang ou dans le plasma1 Amines Concentration (i M4oyenne Amines aliphatiques totales 2/ (en azote) ' 0,3 (0, Cystamine2/ HSCH2CH2NH2 2,9 222, Spermine2/ H2N(CHCH 1,34 (î,: H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2 1,4 (1, Spermidine 2/ H2N(CH2)3NH(CH2)4NH2 0,96 (0,t Phosphoëthanolamine3/ 0,5 (O, mg/litre) amme 08-0,52) 14-1,54) 86-1,06) 0-1,1) HOPOCH2CH2NH2 OH 1. Extrait de "Scientific Tables", Diem & Lentner édit.7ème éd. 1970, Ciba-Geigy 2. Sang complet 3. Plasma sanguin TABLEAU I B. Aminoacides dans le plasma sanguin Aminoacide Concentration Aminoacide libre en tant qu'azote de NH2 en d 42 Alanine ' 31 Arginine 14 Cystine 18 Glutamine 83 Glycine 17 Histidine 12 Lèucine 13 Lysine 25 Proline 27 Sérine 12 Thréonine 19 Valine 20 (ma/litre) 1. Extrait de CRC Handbook of Bio Chemistry. ici est incopte. ici est incomplète.- La liste présentée TABLEAU I Co Structures des aminoacides COOH C1- R HaC - R LH2 Alanine Valine Leucine Asparagjine Glut an,i.ne Lysine i-I stidine o R = - CH3 - CH(CH3)2 - CH 2CH(CH)2 - CH2CONH2 - CH2CH2CONH2 - (CH2)4NH2 HC----.C CH2 l i HW N \ // C H Proline ICHH2 CH CHCOOH \ / N H L'invention eu égard aux nouveaux matériaux de MDM et aux nouvelles compositions, ainsi qu'aux méthodes d'essai cu- tané, sera encore illustrée par la description détaillée ci- dessous. C. Préparation des BPO-amines, par exemple: la N-Dt (benzylpénicilloyl)-amine 1. Dérivé de la n-propyl amine On dissout 26 g (0,07 mole de PG de potassium dans ml d'eau. A la solution de pénicilline, on ajoute goutte à goutte, en agitant, 6,2 g (ou 0,105 mole) de n-propyl amine, à la température ambiante (25 C) en surveillant le pH. On maintient le pH entre 11,2 et 11,5 pendant environ 5 minutes, pendant lequel temps on ajoute environ 0,07 mole de n-propyl amine. Après quoi, le pH s'élève à 11,8 - 12,0, car l'excès de n-propyl amine est ajouté en 5 autres minutes. On agite alors le mélange à la température ambiante pendant encore 60 minutes. On refroidit la solution résultante à 5 - 10 C dans un bain de glace et on ajuste le pH à 3,8 - 4,0 par addition de HC1 3N au mélange réactionnel agité. On sépare le précipi- té blanc résultant par filtration et- on lave soigneusement à l'eau froide. On sèche le résidu humide sous un vide poussé. y = 20 g de poudre blanche (70 %) Analyse: Calculée pour C19H27N3O4S.H20: C 55,46 H 7,10 N 10,21 Trouvée: C 55,34 H 6,79 N 10,26 [ -26= +111,20 (C: 1,006 %, tampon au phosphate 0,2M, pH 8,0). 2. D'rivé de la n-éthyl amine On traite 37,3 g (0,10 mole) de PG de potassium dans 150 ml d'eau par 6,9 g (0,15 mole) d'éthyl amine dans 20 ml d'eau qu'on ajoute goutte à goutte en 10 minutes à la soiution de pénicilline agitée, tel qu'indiqué ci-dessus pour le dérivé de propyl amine. On agite le mélange réactionnel pendant 45 minutes à la température ambiante, puis on lyophilise et on recueille 41 g de matériau brut. On dissout le matériau dans ml deacétone-eau à 10 % et on refroidit la solution à 8 C avant d'ajuster le pH à 3,9 avec HCI 3N. On sépare le préci- pité formé par filtration et on lave 3 fois avec de l'eau gla- cée. On sèche le solide humide sous un vide poussé. y = 23 g de poudre blanche (60 %) Analyse: Calculée pour C18H25N304S.l,5 H20: C 53,19 H 6,94 N 10,34 Trouvée: C 53,74 H 6,53 N 10,55 ]26 = +125,Oo (C:0,9712 %, tampon au phosphate 0,2 M, pH 8,o0) 3. Dérivés de la n-butyl amine et de la namyl amine On les prépare de la même façon en utilisant 1,5 g de l'amine par équivalent de PG avec précipitation du produit à partir du mélange réactionnel aqueux a 10 C par réglage du pi à 3,9 0,1. Do Préparation de dérivés de N-D d-benzyl-pénicilloyle d'laminoacides. On peut préparer des dérivés de N-D b -benzylpénicil- loyle d' o -aminoacides et d'autres amines et aminoacides. Ceux-ci comprennent les aminoacides naturels trouvés dans le plasma sanguin humain, tels qu'indiqués dans le Tableau I ainsi que: i. l'acide >'--aminopropanoúque (acide 2-amino- propanoïque) ii. l'acide e -aminobutyrique (acide-2-amino- butanoique) iii. l'acide d -aminovalérique (-acide 2-amino- pentanoique) iv. l'acide d -aminocaprorque (acide 2-amino- hexanoique) (norleucine) Ces aminoacides peuvent être des isomères Do L ou DL. Des dérivés de pénicilloyle tels qu'indiqués ci-des- sus peuvent être préparés à partir de toutes les pénicillines semisynthétiques ainsi qu'à partir de la PG. C'est ainsi qu' on peut utiliser l'ampicilline, l'amoxacilline, l'aczlocilli- ne, la carbénicilline, la naphtacilline, l'oxacilline, la clo- xacilline, la staphcilline, la phénoxyéthylpécinilline, la phénoxyméthylpénicilline, la piparicilline, la mezlocilline, etc. pour préparer ces dérivés de pénicilloyle. On peut éga- lement utiliser des céphalosporines et d'autres antibiotiques B13 -lactamiques. - Les dérivés de N-pénicilloyle d'amines et d'aminoaci- des tels qu'indiqués ci-dessus peuvent être préparés sous for- me de mélanges diastéréoisomères, d'autres diastéréoisomères ainsi que d'à -diastéréoisomères. Les dérivés ci-dessus peu- vent également être préparés par d'autres procédés synthéti- ques, et l'isolement et la purification des produits finals peuvent également être effectués selon d'autres modes opéra- toires. E. Essais cutanés Les tests dont il est question ci-dessus et dans le tableau ultérieur sont conduits tels que décrits ci-dessous. 1. Matériaux pour les tests cutanés La benzylpénicilloyl-polylysine (BPL) est une prépa- ration de PPL hétérogène contenant en moyenne la benzylpénicil- loyl7- polylysine9 (B a9) à une concentration de 1 x 10-6 M du conjugat dans une solution saline tamponnée au tris à un pH de 8,2. La benzylpénicilline (PG) est à une concentration de -2 1,0 x 10- M dans une solution saline 0,11 M. Le benzylpénicilloate de sodium plus le benzylpénil- loate de sodium (P/P) sont chacun a une concentration de 1,0 x 102 M, dissous dans une solution saline tamponnée au phos- phate a un pH de 7,5. La benzylpénicilloyl-amine (BPO-amine) est à une con- centration de 1,0 x 10-2 M dans une solution saline tamponnée au phosphate à un pH de 7,5. La benzylpénicilloyl-l-propyl amine et la benzylpni- cillovl-n-ethvl amine (en tant qu'' -diastéréoisomêres) sont chacune dissoutes à une concentration de 1,0 x 10-2 M dans une solution saline tamponnée au phosphate à un pH de 7,5. Alors que des solutions aqueuses sont décrites ci- dessus, d'autres solvants appropriés peuvent etre utilisés pour le PPL et le MDM, par exemple des mélanges 50/50 de gly- cérol et d'eau. 2. Patients On a sélectionné neuf patients connus pour donner des tests cutanés positifs aux dérivés de pénicilline. Ce sont des hommes et des femmes en bonne santé, âgés de 23 à 56 ans; dix patients donnant des tests cutanés négatifs sont utilisés coeme témoins0 3. Exécution des tests cutanés Au moyen de seringues a tuberculine de 150 ml avec des aiguilles n 26 et des biseaux intradermiques, on injecte par voie intradermique des volumes de 0,01 ml des matériaux du test dans la région antérolatérale des bras. On lit les tests cutanés 15 minutes après. Une réaction négative est ca- ractérisée par un vésicule de fluide à peine formé de 1 à 3 mm de diamètre sans érythème environnant. Les tests positifs sont caractérisés par des papules bien formées de 4 à 20 mm cde dia- mètre avec érythème environnant. Les tests positifs sont notés 2±, 3+ et 4+ selon le diamètre de la papuleo 1+ = 4 à 6 mm; 2+ = 7 à 9 mm; 3+ = 10 à 12 mm; et 4+ = plus de 13 mm avec des pseudopodes. Les plus fortes réactions montrent de plus larges cercles d'érythème d'un rouge très intense autour de la papule. Les tests cutanés sont exécutés en double. Les doubles donnent des lectures identiques ou presqu'identiques. 4. Résultats des tests Les résultats des tests d'allergie à la pénicilline effectués selon les modes opératoires décrits ci-dessus, sont rapportés dans le Tableau II. TABLEAU II Réactionsdesitsts cutanés aux BPO-amines et autres matériaux d'essai cutané pour déterminer l'allergie à la pénicilline Intensité des réactions chez les Matériau de l'essai LI DL NT LG RM HD CM MB HM cutané (conc.) -6 B3PL 1 x 10- M 1+ 4+ 0 O 4+ 4+ 0 3+ 0 PG 1 x 10- M 2+ trace 1+ trace O O 0 2+ 0 P/P 1 x 10-2 M (de chaque ingrédient) 1+ 1-2+ 3+ 2+ 0 1+ 1-2+ 2+ 2-3+ BPO-amine 1 x 10-2 M 1-2+ trace 2-3+ 2+ 0 1+ 1+ 1-2+ 2-3+ BPO-éthyl amine 1 x 10-2 M 1-2+ trace 1.-2+ 1+ 0 1-2+ 2+ 3+ 2-3+ BPO- propyl amine 1 x 10M 1-2+ trace 2+ 1+ 0 1-2+ 2-3+ 3-4+ 2-3+ Diluant témoin 0 0 0 0 0 0 0 0 0 * Dix patients témoins donnent des tests cutanés négatifs aux matériaux dtessai cutané. o% ru oo E Préparation de matériaux de PPL et de MDM stables au stockage Les constituants du MDM sont instables en solution a- queuse. Afin d'obtenir une préparation pharmaceutique avec une durée utile acceptable, les constituants du MDM du test d'allergie à la pénicilline sont lyophilisés dans des fio- les de dose unitaire. Les doses unitaires de MDM lyophilisé sont fournies avec un tampon aqueux multidose ou tout autre diluant approprié, pour une reconstitution juste avant 1' emploi. Ce diluant est également utilisé comme matériau pour le test témoin avec le diluant. Par exemple, pour préparer un lot de 10 000 fioles du MDM, en procède comme suit: Dans un bêcher en verre de 4 litres, propre et stérile, on introduit 15,32 g de benzylpénicilloate monosodique et 16,08 g de benzylpénicilloyl-n-propylamine. On ajoute 3 lï- tres d'eau froide pour injection. Puis on agite le mélange en ajoutant NaOH 0,3 M pour maintenir le pH entre 7 et 9,5. Lorsque les solides sont dissous, on ajuste finalement le pH à 7,2. On dissout alors dans cette solution 14,88 g de benzylpénicilline de sodium, on ajuste le volume final à 4,00 litres avec de l'eau pour injection et on ajuste le pH final à 7,2 0,1. On stérilise la solution de MDM froide par filtration sur un filtre à membrane tel qu'un filtre à membrane de 0, 2 ou 0,22 micron. On distribue la solution de MDM froide et stérile, dans des conditions stériles en volumes de 0,30 ml dans des fioles stériles de 2 ml et on place les fioles dans un lyophiliseur. On peut utiliser plusieurs systèmes de lyophilisation. Par exemple, on peut utiliser le système Virtis 250 ou 500 SRC. On refroidit immédiatement à -40 'C des plateaux rem- plis des fioles de 2 ml contenant 0,30 ml de MDM. On peut conduire la lyophilisation à une pression de 5 microns de mercure pendant 48 heures au total. On maintient la tempéra- ture à -40 'C pendant 10 heures, puis on élève de 2 "C par heure jusqu'à obtention de la température ambiante (environ 0C). On ferme les fioles stériles, sèches, avec des bou- chons de caoutchouc et on scelle avec une bande d'aluminium. Le MDM lyophilisé ainsi préparé doit être stable pendant 4 années environ à 5-10 OC. On peut préparer de la même façon les dérivés de PPL selon l'invention dans des conditions lyophilisées, stables au stockage, qui sont fournis à l'utilisateur sous forme de fioles de dose unitaire pour une reconstitution avec un sol- vant approprié avant l'emploi. 246425U R=SNDICATIONS 1. Composés caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule 0 S CH3 (1) R - l NH _CH CH Ci \ CH3 vNH - COOH o H s 2 H dans laquelle = R1 est une chaine latérale contenue dans la pénicilline à partir de laquelle le composé de pénicilloyl- amine ou aminoacide est préparé; et R2. est un substituant choisi parmi un groupe alkyle ayant une chalne en C2-C6, un groupe carboxyalkyle ayant une chaîne en C2 à C6 ou un reste d'un composé d'aminoacide ou d'amine du type présent dans le sang, dans le plasma sanguin ou dans les fluides des tissus. 2. Composés suivant la revendication 1, caracté- risés en ce que la pénicilline est choisie parmi la benzyl- pénicilline et des pénicillines semi-synthétiques. 3. Composés suivant la revendication 1, caractéri- sés en ce que le groupe R2 est un reste dérivé de l'acide 2aminopropanoïque, 2-aminobutanoîque, 2-aminopentanotque ou 2-aminohexano".que. 4. Composés selon la revendication 1, caractérisés en ce que le composé d'amino-acide ou d'amine est choisi parmi la cystamine, la spermine, la spermidine, la phospho- éthanolamine, l'arginine, la cystine, la glutamine, l'his- tidine, la lysine, la proline, la sérine, la thréonine et l'asparagine. 5. Composés selon la revendication l. caractérisés en ce que les composés sont des " -diastéréoisomères, d'autres diastéréoisomères ou des mélanges diastéréoisomères. 6. Composition stable au stockage, capable d'être reconstituée par mélange avec un solvant approprié pour former une composition utilisable dans un essai cutané en vue de déterminer une allergie à la pénicilline ou une hypersensibilité aux pénicillines comprenant la benzyl pénicilline et les pénicillines semi-synthétiques, carac- térisée en ce qu'elle contient un mélange lyophilisé de: 1) un composé représenté par la formule 0 S CH -o H Ri 1 NH -_CH- CH i \C / C I 'INïR H dans laquelle R1 est une chaîne latérale contenue dans les pénicillines à partir desquelles le composé de pénicilloyl amine ou aminoacide est préparé; les pénicillines étant choisies parmi la benzylpénicilline et des pénicillines semi-synthétiques, et R2 est un substituant choisi parmi un groupe alkyle ayant une chaîne en C2-C6, un groupe carboxy alkyle ayant une chatne en C2-C6 ou un reste d'un compose d'a- mino acide ou d'amine du type présent dans le sang, dans le plasma sanguin ou dans les fluides des tissus, le composé étant choisi parmi la cystamine, la spermine, la spermidine, la phospthoéthanolamine, l'arginine, la cystins, la glutamine, l'histidine, la lysine, la proline, la sé- rine, la thrèonine et i'asparagine; les composés étant desodiastéréoisomères ou des mélanges diastéréoisom.res; 2) la benzylpénicil!ine; et 3) le benzylpénicilloate de sodium. 7. Composition selon la revendication 6, carac- térisée en ce que R2 est le groupe éthyle. 8. Composition selon la revendication 6, caracté- risée en ce que R2 est le groupe propyle. 9. Composition pour l'essai cutané de l'allergie ou de l'hypersensibilité aux pénicillines comprenant la benzylpénicilline et les pénicillines semisynthétiques, par la détection d'anticorps spécifiques contre les déter- minants mineurs dans des tests de sensibilisation cutanée, par un essai intradermique, par piqdres ou par scarification de la peau d'un patient, caractérisée en ce qu'elle contient: l) un composé représenté par la formule * * CH3 R est une chane latérale contenue dans lesCH 0 1,R1, dans laquelle R1 est une chaîne latérale contenue dans les pénicillines à partir desquelles le composé de pénicil- loyl amine ou aminoacide est formé; les pénicillines étant choisies parmi la benzylpénicilline et les pénicil- lines semi-synthétiques, et R2 est un substituant choisi parmi un groupe alkyle ayant une chalne en C2-C6, un groupe carboxy al- kyle ayant une chaTne en C2-C6 ou un reste d'un composé d'aminoacide ou d'amine contenu dans le sang, dans le plasma sanguin ou dans les fluides des tissus, le compo- sé d'amine et le composé d'aminoacide étant choisis par- mi la cystamine, la spermine, la spermidine, la phospho- éthanolamine, l'arginine, la cystine, la glutamine, l'his- tidine, la lysine, la proline, la sérine, la thréonine et l'asparagine, les composés représentés par la fomule ci- dessus étant des "-diastéréoisombres ou des mélanges di- astéréoisomères; et 2) un solvant approprié pour le composé (1), le solvant étant compatible avec l'utilisation de la composition dans un essai cutané de détermination d'une allergie à la pénicilline ou de l'hypersensibilité aux pénicillines comprenant la benzyl pénicilline et les pénicillines semi-synthétiques, la concentration du composé (1) dans le sol- vant (2) étant suffisante pour obtenir une réponse éry- thémato-papuleuse chez des patients allergiques oupou- vant être allergiques aux pénicillines lorsque la compo- sition est administrée au patient dans un essai cutané, mais la concentration étant optimale afin d'éviter une réaction constitutionnelle. 10. Composition selon la revendication 9, carac- térisée en ce que R1 est un groupe benzyle et R2 est un groupe choisi parmi les radicaux éthyle et n-propyle. 11. Compositionsselon la revendication 9 ou 10, caractérisées en ce qu'elles contiennent en outre de la benzyl pénicilline et du benzylpénicilloate de sodium.