Brevet FR2466015A1 — publié le 19810327

1.- 2466015 i'inventiorn concerne un dispositif pour l'éva- luation de la fluorescence d'échantil1lons au moyen d'une source de radiations d'un rayonnement primaire provoquant le rayon- nement fluorescent, des éléments optiques pour centrer ce rayonnemenr primaire sur l'échantillon, un vase pour l'éprouvet- te et des éléments récepteurs et dévaluation du rayonnement fluorescent7 les éléments optiques étant des filtres9 des lentilles et des miroirs9 disposés de façon fixe. Dans un fluoromètre,9 l'éprouvette est traversée par la lumière dtexcitation et émet ainsi une lumière fluores- centeo Les deux lumières sont soumises à l'intérieur de l'éprou- vette à une absorption suivant la loi de Lambert=Beer, ce qui entraîne une détection irrégulière des volumes de mesure. Jusqu'à présent, cette détection irrégulière a été affaiblie Jusqu'à des valeurs insignifiantes au moyen d'une forte dilution9 ce qui abaissait la limite de détection. ine exploitation presque complète des lumières d'excitation et de fluorescence a été impossible jusqu'à présente, car9 afin de maintenir un arrière-plan obscur, les trajets des rayons d'excitation et de mesure étaient disposés à angle droit l'un par rapport à l'autre. Les trajets des rayons de l'éclairage par transmission présentent cet incon- vénient que les restes de la lumière d'excitation, qui traversent également le filtre d'interception, occasionnent un éclairage perturbateur considérable du récepteur. Les fluoromètres sont utilisés en particulier pour l'évaluation reproductible de la teneur en chorophylle des plantes (par exemple des algues). Par l'évaluation des signaux de fluorescence, on peut obtenir en outre une informa- tion sur l'activité photosynthétique et l'acticn de substances (par exemple des herbicides) sur l'évaluation en fonction du temps de la réaction de photosynthèse, lorsqu'il est possible d'effectuer l'excitation du processus de fluorescence avec une intensité suffisante, et d'évaluer séparément les impul- sions individuelles. La chlorophylle a été extraite à l'aide d'agents chimiques, et mesurée par méthode photométrique. Ceci nécessite de nombreuses étapes de travail, qui ne peuvent être entreprises qu'en laboratoire. Les mesures extérieures sur place sont impossibles. 2.- 2466015 D'autre manière on détermine la teneur en chlorophylle des plantes vivant de la fluorescence, mais avec cet inconvénient que le rendement quantitatif de la fluorescence dépend d'une manière imprévisible de l'état physiologique. Cette dépendance se fonde sur la concurrence entre photosynthèse et fluorescence. On déterminait jusqu'à présent l'activité photo- synthétique par une évaluation chimique de la production d'oxy- gène ou de la consommation de dioxyde de carbone (par marquage avec du C14 radioactif). Ces procédés exigent des durées d'exposition élevées (quelques heures) et de nombreuses manipu- lations, qui ne peuvent être effectuées à l'extérieur. Il est connu de déterminer l'activité photo- synthétique à partir de la différence de fluorescence avant et après empoissonnement avec DCMU. Mais on ne prend toujours pas en considération que la mesure avant l'empoisonnement est encore dépendante de l'éclairage initial et d'autres facteurs physiologiques, ce qui rend cette mesure incertaine. Les analyses d'herbicides sont effectuées au moyen de procédés chimiques nombreux et totalement différents-, dont principalement l'extraction, suivie de séparation chromato- graphique en phase gazeuse ou liquide. Un autre procédé est décrit dans le brevet PS 26 26 915. L'invention a pour objet de créer un dispositif, qui permette une transmission uniforme de la lumière d'excitation et une évaluation simultanée de tous les volumes partiels lors de la réception de la lumière fluorescente (indépendance de la sédimentation et de l'homogénéité), les lumières d'excitation et fluorescente étant exploitées pratiquement sans perte, et o l'on peut opérer avec une faible énergie d'excitation, de sorte qu'aucune action de décoloration ne puisse se produire, et que l'on puisse déterminer la teneur en chlorophylle, l'activité photosynthétique et/ou le déroulement de la réaction de phbo- synthèse, même sur des sujets naturels, non préparés. Pour atteindre cet objectif, l'invention propose un dispositif caractérisé en ce que devant la cuvette à échan- tillon, dans le sens de propagation du rayonnement primaire, est disposé un premier miroir, transparent au rayonnement primaire, réfléchissant le rayonnement fluorescent, et derrière la cuvette à échantillon, est disposé un deuxième miroir, trans- 3o 2466015 parent au rayonnement fluorescent et réfléchissant le rayonnement primaire, la l1-mzère fluorescente traversant le second miroir étant dirigée sur les éléments de réception et d'évaluation. D'autres développements de l'invention se caractérisent en ce que devant la source de rayonnement, tourné dans le sens de propagation du rayonnement primaire, est disposé un miroir supplémentaire, qui réfléchit aussi bien le rayon= nement primaire de la source de rayonnement que le rayonnement primaire réfléchi par le second miroir, dans le sens de propragation du rayonnement primaire, les miroirs ont une structure plane ou sphérique, entre la source de rayonnement et le premier miroir, se trouve disposé un filtre d'excitation destiné à la présélection du rayonnement primaire, et que, entre le second miroir et l'élément de réception, se trouve disposé un autre filtre de fluorescence. Les avantages de l'invention consistent en ce que la lumière d'excitation traverse le volume de mesure, et grâce à un étamage sélectif des miroirs, est réfléchie vers l'échantillon. De ce fait, l'échantillon, après que la lumière l'ait traversé d'un côté, va être encore éclairé de l'autre c8té, même si c'est avec une intensité un peu plus faible. La même chose est valable pour la lumière fluorescente. La lumière se propageant dans la direction des rayons d'excitation, est amenée directement au récepteur et le reste, grâce à l'étamage reflétant séleotivement, est conduit aussi au récepteur. En conséquence s les inégalités, dues à l'absorption, dans la détection des volumes de mesure, sont largement aplanies. D'autre part les lumières d'excitation et fluorescente sont mieux exploitées. Enfin, lors de l'augmentation simultanée de la sensibilité, la proportion de rayons d'excitation dans le signal d'émission est fortement réduite. Ainsi, l'efficacité globale de la fluorescence s'accroit. D'autres filtres disposés sur le trajet des rayons d'excitation et fluorescents, abaissent à un niveau non mesurable le reste de la lumière, qui perturbe les dispositifs courants. Ces filtres peuvent être également remplacés par des miroirs sélectifs. L'obtention de la lumière d'excitation se fait au moyen d'un éclair, comme dans les flash électroniques pour la photographie. Cependant, la technique de l'échir n'a pas été 4,- 2466015 exploitée jusqu'à présent pour économiser de l'énergie, ou pour maintenir une durée d'éclairage déterminée après une période d'obscurité précédente. L'économie d'énergie est importante dans les machines opérant sur le terrain (poids de la batterie). Le maintien d'une période d'obscurité définie et l'obtention d'éclairs de lumière définis sont importants pour de nombreux colorants fluorescents, qui peuvent se décomposer sous l'influ- ence de la lumière d'excitation, en particulier pour la fluores- cence de la chlorophylle, décrite ci-après. Un faible poids et une faible consommation d'é- nergie (machines de terrain) sont favorables également lors de l'emploi de photG-éléments semi-conducteurs comme récepteurs de la lumière. Ceci permet une alimentation stable-de haute tension pour les multiplicateurs électroniques secondaires souvent nécessaires dans ces cas, à cause de la production défectueuse de lumière fluorescente. Le choix spécifique d'un élément avec une constante de temps faible permet ainsi une liaison avec ltexcitation par éclairs. On obtient donc selon l'invention une linéarité plus élevée pour une dépense égale c'est-à-dire une exploitation de volume d'échantillon plus grande, et ainsi une sensibilité plus élevée pour une même linéarité. La bonne exploitation des lumières d'excitation et fluorescente permet de mettre en oeuvre de plus petites sources lumineuses, une plus faible consomma- tion d'énergie, et un moindre endommagement de l'échantillon. Le régime à impulsions diminue la consommation d'énergie de la source lumineuse et donc aussi le poids de la batterie. Il permet l'instauration de phases définies d'éclairage et d'obs- curité avec une faible dépense technique. Ceci est particuliè- rement important pour des colorants fluorescents décomposables. Le détecteur semi-conducteur économise en cot et en poids. L'excitation de l'échantillon par le haut et par le bas, ainsi que la détection séparée du rayonnement fluores- cent, ont pour effet une meilleure prise en compte des parti- -35 cules sédimentées par rapport au trajet vertical normal des rayons. Les éléments optiques sont montés sous une forme compacte résistant aux trépidations, et facilement remplaçable. Toutes les parties qui transmettent et reflètent (filtres et miroirs) ainsi que le support d'échantillon sont incorporés dans un bloc commun, qui peut être échangé en entier si c'est néces- - 2466015 saire en cas de changement de longueur d'onde. A la place des surfaces galbées à métallisation sélectiî'e, 9n peut aussi employer des surfaces plates. L'invention sera mieux comprise en regard des exemples de réalisation décrits et des dessins annexes dans lesquels - la figure 1 est une représentation schémati= que de la constitution d'un parcours de rayons compact, - la figure 2 montre un autre exemple de réalisation,9 - la figure 3 représente l'évolution dans le temps de la fluorescence après une période prolongée d'obscurité. La figure 1 représente schématiquement la constitution d'un trajet de rayons compact. Le faisceau d'esci- tation 3 émis par une source d'impulsion 8 se reflète dans le miroir 9 métallisé sélectivement pour la fréquence d'excitation (miroir en verre avec métallisation par oxyde de thorium, de telle façon que pour > = 682 nm ou A = 435 nm, il se produise un maximum de tyansmission ou de réflexion)-et arrive sur un miroir 14 en passant par un filtre d'excitation 10 (filtre d'interférence Schott, Type A1 435). Ce miroir 14, en verre revêtu d'oxyde de thorium, reflète sélectivement les rayons d'excitation incidernts sous 450 ( > = 435 rm). Le filtre 6, disposé devant le vaseà échantillon 1 dans le trajet de faisceau 2, est revêtu d'oxyde de thorium, de telle façon qu'il soit transparent au faisceau 3 primaire ou d'excitation, et reflète cependant le faisceau fluorescent 5 créé dans l'échan- tillon (, = 682 nm). Le vase à échantillon 1 contient la substance, homogène ou non, qu'il y ait sédimentation ou non. Son diamètre est de 25 mm, sa hauteur de 30 mm. Dans le trajet de rayons 2, derrière la cuvet- te à échantillon 1, se trouve un autre élément optique, le filtre 7, qui a la propriété de réfléchir désormais le faisceau d'excitation 3, qui a traversé la cuvette à échantillon 1, et de transmettre cependant le faisceau fluorescent 5. La métallisa- tion au thorium est établie de façon appropriée. Grâce à un autre miroir déflecteur 15 (il correspond au miroir déflecteur 14), et afin de compacter le disposit f, la lumière fluorescente 5 est réfléchie sous un angle de 45o. La lentille concave 12, avec f = 25 cm, donne 6.- 2466015 l'image du fond de la cuvette 1 sur la photodiode 4. Pour dimi- nuer encore les rayons que l'onxe souhaite pas enregistrer, on dispose devant la photodiode 4 un autre filtre 11 (filtre à interférence Schott, type Al 682), qui est transparent au faisceau fluorescent. Le trajet des rayons 2, deux fois coudé, permet une structure mécanique compacte. La figure 2 représente un autre exemple de réalisation. Le trajet de faisceau 2 n'est pas coudé. Les références restent les mêmes pour les parties correspondantes de la figure 1. Avec un trajet de faisceau 2 rectiligne, on peut renoncer aux miroirs déflecteurs 14 et 15. Bien entendu, le trajet peut contenir des filtres sélectifs 14' et 15' correspondant aux miroirs déflecteurs 14 et 15, avec transpa- rence verticale pour la lumière d'excitation 3 ou la lumière fluorescente 5. Contrairement à la disposition de la figure 1, le miroir 9 a la structure d'un miroir condenseur, ce qui permet d'augmenter le rendement de la source 8 pour le faisceau d'excitation 3. Une lentille condenseuse 13 forme exclusivement un trajet lumineux 2 parallèle, qui passe par le filtre d'exci- tation 10 et le filtre 6 pour tombbr sur la cuvette 1. Pour renforcer l'action réfléchissante des filtres 7 et 6 pour les faisceaux d'excitation 3 et fluorescent 5, ces filtres sont conçus sous forme de miroirs sphériques, focalisés sur la cuvette à échantillon. La lumière fluorescente 5 arrive sur le photoélement ou indicateur 4 et elle est évaluée. La figure 3 représente l'évolution dn fonction du temps du phénomène de fluorescence après une période prolon- gée d'obscurité, ainsi qu'après empoisonnement avec CMU ou DCMU. Les différentes productions de fluorescence, avec et sans ces poisons, représentent une mesure de l'activité photosynthé- tique avant l'empoisonnement. Par addition de CMU (blocage de la chaine de transport des électrons du photosystème II) on obtient cet effet d'empoisonnement. La valeur de la fluorescence avant l'empoison- nement, après une période d'obscurité, se trouve dans un rapport bien reproductible au maximum de la courbe sur la figure 3 (A). La différence entre les valeurs de fluorescence avant et après l'empoisornnement présente une bonne corrélation à la valeur (B). Par mesure de l'évolution en fonction du temps et prélèvement des données A et B, on peut en principe obtenir les mêmes chiffres que par mesure de la fluorescence avant et après l'empoisonnement. L'évaluation de l'activité photosynthétique s'effectue, comme déjà décrit, à partir de la différente entre les valeurs de la fluorescence avant et après l'empoisonnement, ou à partir de l'évaluation des valeurs de fluorescence A et B. L'emploi de la période d'obscurité, l'emploi de CMU à la place de DCMU ou le prélèvement des valeurs de fluorescence sur la courbe, sont essentiels. De nombreux herbicides contiennent du CMUP du DCMU ou d'autres substances, qui bloquent la chaine de trans- port des électrons du photosystème II et présentent l'effet mentionné sur la fluorescence. Si l'on ajoute à une suspension d'algues intacte de l'eau suspecte, l'action de fluorescence en fonction du temps peut indiquer alors la présence éventuelle d'un herbicide, qui-a le même mécanisme d'action. Une détermination de chlorophylle est ainsi possible sans recours à l'extraction et sans les défauts d'une simple mesure de fluorescence, dans des conditions définies (période d'obscurité), une mesure de l'activité photosynthétique réussit avec les mêmes avantages, et une série d'herbicides peuvent être démontrés presque instantanément, sans recours à l'extraction, à la détermination chromatographique et à des manipulations chimiques semblables. 8.- 2466015 REVENDICATIONS 1.- Dispositif pour l'évaluation fluorométrique d'échantillons, avec une source de rayonnement primaire excitant le rayonnement de fluorescence, des éléments optiques pour cen- trer le rayonnement primaire sur l'échantillon, un vase pour l'échantillon et des éléments de réception et d'évaluation pour le rayonnement fluorescent, les éléments optiques étant des filtres, lentilles et miroirs disposés de manière fixe, disposi- tif caractérisé en ce que, devant la cuvette à échantillon (1), dans le sens de propagation (2) du rayonnement primaire (3), est disposé un premier miroir (6), transparent au rayonnement primaire (3), réfléchissant le rayonnement fluorescent (5), et derrière la cuvette à échantillon (1), est disposé un deuxième miroir (7), transparent au rayonnement fluorescent (5) et réfléchissant le rayonnement primaire (3), la lumière fluores- cente (5) traversant le second miroir (7) étant dirigée sur les éléments de réception et d'évaluation (4). 2.- Dispositif suivant la revendication 1, caractérisé en ce que, devant la source de rayonnement (8), tourné dans le sens de propagation (2) du rayonnement primaire (3),est disposé un miroir supplémentaire (9), qui réfléchit aussi bien le rayonnement primaire (3) de la source de rayon- nement (8) que le rayonnement primaire (3) réfléchi par le second miroir (7), dans le sens de propagation (2) du rayonnement primaire. 3.- Dispositif suivant les revendicatinns 1 et 2, caractérisé en ce que les miroirs (6, 7, 9) ont une structure plane ou sphérique. 4.- Dispositif suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que, entre la source de rayonnement (8) et le premier piroir (6), se trouve disposé un filtre d'excitation (10) destiné à la présélection du rayon- nement primaire, et que, entre le second miroir (7) et l'élément de réception (4), se trouve disposé un autre filtre de fluores- cence (11).