Brevet FR2473549A1 — publié le 19810717

La présente invention concerne un procédé d'obten- tion de l'isomérase du glucose, ou glucose-isomérase, à partir d'une souche de Streptomyces. On sait que l'enzyme appelée glucose-isomérase permet de transformer le D-glucose en D-fructose, qui trouve des applications de plus en plus larges dans l'industrie de traitement des aliments et l'alimentation diététique dans un certain nombre de pays développés. La glucose-isomérase, en combinaison avec un complexe d'enzymes amylolytiques(a -amylase et gluco-amylase) permet d'obtenir des sirops de glucose-fructose et de fructose directement à partir de l'amidon, à l'aide d'enzymes. Certains procédés d'obtention de la glucose- isomérase sont connus depuis 1957, lorsque la possibili- té de transformation directe du D-glucose en D-fructose par l'intermédiaire des cellules de la souche bactérien- ne Pseudomonas hydrophila n 491 et n 492 fut démontrée pour la première fois. Pour obtenir la glucose-isomérase, on utilise de la manière la plus large des micro-organis- mes du genre Streptomyces. On a découvert que la présen- ce de différents sels minéraux dans le milieu de culture est une condition nécessaire à la bio-synthèse de l'enzyme appelée glucose- isomérase. Dans les milieux de culture, décrits dans la littérature et dans des brevets, les sels de magnésium sont présents sous la forme de MgSO4, 7H20 et le cobalt sous la forme de Coc12, 6H20 (18). Les concentrations dans lesquelles ces sels sont introduits dans le milieu de culture dépend du type du micro-organisme producteur et varient le plus souvent de 0,02 à 0,5% pour MgSO4, 7H20 et de 0,005 à 0,024% pour CoC12, 6H20 (14). Avec certaines espèces de Streptomyces, le cobalt est absolument nécessaire à la formation de la glucose-isomérase, bien que l'activation résulte de la présence des ions magnésium (18, 16, i7). Il est nécessaire de découvrir des souches et des mutants producteurs de la glucose-isomérase, qui soient capables de produire une quantité suffisante de l'enzyme en l'absence d'ions cobalt dans le milieu de culture. On connait les mutants de CPC International Inc (2), ainsi que certaines espèces d'Artrobacter, étudiées par R.J. Reynolds Tobacco (9), qui ne nécessitent pas'de cobalt pour la bio- -synthèse de la glucose-isomérase. L'addition d'ions cobalt et magnésium à la solution de glucose pendant l'isomérisation influence également fortement l'activité de l'enzyme. Il a été prouvé que ces métaux sont des co-facteurs de l'enzyme, et que la glucose- -isomérase peut être considérée comme une enzyme "métallique" (3). Il a été constaté qu'une molécule de glucose-isomérase appartenant à l'espèce de Streptomyces YT n05 contient 4,1 atomes de cobalt et 33 atomes de magnésium. On suppose (3) que la combinaison de Mg++ et de Co avec la glucose-iso- mérase est nécessaire à sa transformation en une forme active. On considère également que pendant ce processus une modification de la conformation de l'enzyme a lieu. Certains auteurs supposent que l'introduction d'ions cobalt, surtout en compagnie d'ions magnésium, augmente considéra- blement la thermostabilité de la glucose-isomérase (3,10). La présence de plus grandes quantités de Co++ dans les sirops de fructose est indésirable (5), mais-des traces de Co++ sont nécessaires pour la nutrition de l'homme (12). La teneur en ions Co du sirop de fructose est d'environ lmM (1), mais il a été démontré que cette concentration a certains effets toxiques sur les rats. Pour la séparation des ions cobalt d'avec les sirops de glucoseisomérase une fois que le procédé d'isomérisation est terminé, il faut nécessairement procéder àune culture avec des résines d'échange d'ions jusqu'à leur séparation maximale. Il est nécessaire que les dispositifs automatiques industriels d'échange d'ions soient construits pour ce procédé supplé- mentaire. La société Mi-Car International fait appel à certains systèmes d'échange d'ions complètement automatisés se composant de deux parties cations-anions, à savoir une résine d'échange de cations fortement acide, la "Duolite C25-D", et une résine anionique faiblement basique, la "Duolite S-56". Ce dispositif d'échange d'ions nécessite une régénération périodique avec des acides ou des bases, et de grandes quantités supplémentaires d'eau propre. La teneuren anionscobalt des sirops de glucose- -fructose, qui ont été traités dans le dispositif d'échange d'ions, est vérifié à l'aide d'un spectrophotomètre d'absortion automatique, et au moyen d'essais sur des échantillons constamment prélevés du courant. Cela permet de réguler le fonctionnement du dispositif d'échange de cations. Dans ce traitement, des ions Co++ peuvent être éliminés efficacement de manière à ce que leur teneur n'excède pas 5 parties par milliard (ppb) avec 25% de soufre (8). Ce procédé complique la production et influence le rendement et le facteur principal de prix de revient du produit. L'objectif de la présente invention est de fournir un procédé permettant d'obtenir la glucose-isomérase à partir d'une souche productrice d'importance industrielle, dans lequel les ions cobalt ne soient pas nécessaires à la bio-synthèse de l'enzyme et à l'isomérisation du Dglucose en D-fructose. La souche productrice de glucose-isomérase Streptomyces sp. n 765 a été isolée de terre de Bulgarie. 874 souches de Streptomyces ont été triées pour sa découver- te. Le triage a été réalisé sur le milieu de culture synthé- tique modifié nol de Krassilnikov, la sélection étant réalisée sur deux niveaux de substrat à l'aide de xylose et de xylane. Dans ces conditions, on a découvert 18 souches de Streptomyces qui peuvent développer et produire l'enzyme appelée glucose-isomérase. Parmi celles-ci se trouve la souche Streptomyces sp. no 765 qui est capable de produire la glucoseisomérase en l'absence de Co++ dans le milieu de culture. Cette souche a été déposée au State Institute for Drugs Control - bul. Vladimir Zaimov n0 26 le 29 septem- bre 1979 sous le no 143, et possède les caractéristiques morphologiques et bio-chimiques suivantes: Sur milieu de culture n l avec une source minéral d'azote (d'après G.F. Gause et ses collaborateurs), les colonies ont habituellement une forme ovale avec des bords infOrmes, convexes dans le centre, gonflées avec une cavité en forme de cratère et des plis radiaux fortement marqués. La croissance est bonne. Les sporanges dans les cultures jeunes sont allongés, à situation monopode avec 3 à 5 spires, et dans les cultures plus vieilles elles sont condensées dans du sorgho. Les spores sont allongés avec des extrémités arrondies: lorsqu'on les grossit plus de 16.000 fois, on peut observer des formations criniformes à leur surface. Avec un grossissement moins important, les spores semblent lisses. Leur taille varie de 0,9 à 1,2 microns de longueur de 0,4 à 0,6 microns de largeur. On détermine la coloration du mycelium aérien et du mycelium substratique selon l'échelle de couleur de A.C. Bondartsev et l'échelle de Tresner et Backus. Avec les différent milieux de cultures, la coloration du mycelium aérien passe du blanc (d)au gris pale et au violet (a5 - a3) suivant les sources de carbone et d'azote. Sur le milieu de culture n l avec une source minérale d'azote(d'après G.F. Gause et ses collaborateurs) la couleur est gris clair à gris souris (a5-a3), et sur un milieu de culture avec une source organique d'azote (d'après G.F. Gause et collabora- teurs) la couleur est gris foncé à violet gris (a2-a3). Sur des milieux de culture avec des sources diffé- rentes de carbone et d'azote, le mycelium aérien est vert grisatre. Sur le milieu de culture n l avec une source minérale d'azote (d'après G.F. Gause et ses collaborateurs), le mycelium substratique est gorge de pigeon à outremer (16-vl). Sur le milieu de culture n 2 avec une source organique d'azote (d'après G. F. Gause et ses collaborateurs), il est outremer (vl), et après culture prolongée il devient noir (a1). Sur des milieux de culture avec des sources différentes de carbone et d'azote, le mycelium substratique est de rouge foncé à noir. Sur un milieu de culture viande-peptone-gélose: faible croissance, mycelium aérien rose et rouge brique le long du bord, sub-mycelium substratique rouge brique. Sur milieu de culture pomme de terre-glucose- gélose: croissance très bonne, mycelium aérien bleu gris, mycelium substratique bleu à bleu foncé. Sur milieu de culture Tchapek avec du saccharose: faible croissance, mycelium aérien rose, mycelium substrati- que rouge brique clair. Sur milieu de culture Tchapek avec du glucose: croissance moyenne, mycelium aérien bleu clair, mycelium substratique incolore avec une nuance du mycelium aérien. Sur milieu de culture avec du saccharose: bonne croissance, mycelium aérien bleu ciel, mycelium substratique bleu foncé à noir. Sur milieu de culture amidOn-gélose:bonne crois- sance, mycelium aérien gris, mycelium substratique bleu. Sur milieu de culture amidon-amoniac, d'après Mishustin: très bonne croissance, mycelium aérien gris, mycelium substratique bordeau à bordeau foncé. Sur milieu synthétique selon N.A. Krassilnikov: croissance moyenne, mycelium aérien de légère couleur cendrée, mycelium substratique rose à violet. Sur CPI d'après N.A. Krassilnikov: bonne crois- sance, mycelium aérien gris bleu, mycelium substratique rouge brun. Sur CPIId'après N.A. Krassilnikov: croissance faible à moyenne, mycelium aérien bleu, mycelium substratique de couleur crème foncée. Sur CP Id'après N.A.Krassilnikov: bonne croissance, mycelium aérien gris à outremer, mycelium substratique bordeau. Sur CPIVselon N.A. Krassilnikov: bonne croissance, mycelium aérien gris clair, mycelium substratique incolore, avec une nuance de la couleur du mycelium aérien. Sur CPV selon N.A. Krassilnikov:bonne croissance, mycelium aérien gris, mycelium substratique violet foncé. Sur milieu de culture synthétique selon Vaxman: croissance moyenne, mycelium aérien gris à gris souris, mycelium substratique de couleur crème foncée à rouge-brun. Sur milieu de culture viande-amidon -gélose: faible croissance, mycelium aérien blanc, mycelium substra- tique de couleur crème. Sur peptone-gélose: bonne croissance, mycelium aérien gris, mycelium substratique incolore avec une nuance grise de la couleur du mycelium aérien. Sur glucose-asparagine-gélose: très bonne croissance, mycelium aérien gris à outre mer, mycelium substratique bleu violet à bleu foncé. Sur glycérine-asparagine-gélose: bonne croissance, mycelium aérien outremer, mycelium substratique violet foncé à noir. Sur milieu de culture tyrosine: bonne croissance, mycelium aérien gris bleu, outremer, mycelium substratique rouge-brun. Sur tyrosine-caséine-nitrate-gélose: faible croissance, mycelium aérien blanc, mycelium substratique de couleur crème. Sur glucose-tyrosine-gélose: croissance moyenne, mycelium aérien gris crème, mycelium substratique violet. Sur saccharose-nitrate-gélose: bonne croissance, mycelium aérien gris à outremer, mycelium substratique bleu à bleu foncé. Sur glycérol-calcium-malate-gélose: bonne croissance, mycelium aérien bleu à outremer. Sur peptone-boeuf-gélose: croissance-moyenne à bonne, mycelium aérien gris, mycelium substratique incolore avec une nuance grise du mycelium aérien. Sur avoine-gélose: croissance moyenne, mycelium aérien gris, mycelium substratique bordeau. Sur tomate-gélose: bonne croissance, mycelium aérien gris, mycelium substratique beige foncé à terre cuite. Sur acétate de plomb-gélose: faible croissance, mycelium aérien brun, mycelium substratique incolore avec une nuance de la couleur du mycelium aérien. Sur fer-peptone-gélose: bonne croissance,mycelium aérien incolore à gris, mycelium substratique incolore avec une nuance grise du mycelium aérien. Sur levure-malt-gélose: croissance moyenne, mycelium aérien gris à gris souris, mycelium substratique de couleur crème foncé. Tolérance de la souche vis à vis de NaCl. La souche présente une faible tolérance vis à vis de la concentration du Chlorure de sodium dans le milieu. La concentration maximale est de 4%. A cette concentration, la croissance de la souche est faible. Le mycelium aérien est bleu clair. Le mycelium substratique est bleu foncé. Une concentration de plus de 2% de chlorure de sodium a un effet négatif sur le degré de sporulation. La souche coagule le lait écrémé. Elle ne conden- se pas la gélatine. Elle se développe bien sur un milieu de saccharose, mais elle n'intervertit pas le saccharose. Elle se développe très bien sur une gélose d'amidon et hydrolyse bien l'amidon. Elle ne décompose pas la cellulose et réduit les nitrates en nitrites. Elle libère de l'acide sulfhydri- que. Elle se développe sur des pommes de terre. Le test d'hémolyse est négatif et le test de la tyrosinase positif. Elle forme des mélanoides. On a constaté que sur le milieu de culture basique de Pridham et Gottlieb la croissance est bonne en présence des sources de carbone suivantes: glucose, fructose, lactose, levulose, xylose, mannose, cellulose, galactose, mannite, inosite, arabinose, dextrine, ribose et glycérol. La souche absorbe le salicine dans une faible mesure. Elle ne se développe pas sur milieu de culture avec de la sorbite, du saccharose et du raffinose. Certaines différences de pigmentation du mycelium aérien et du mycelium substratique sont observées, suivant la source de carbone. La croissance de la souche est bonne sur le milieu de culture basique modifié de Prudham et Gottlieb avec les sources d'azote suivantes: NH4C1, (NH4)2S04; (NH4)2HPO4; NH4H2PO4 et carbamide. La croissance est modérée sur un milieu de culture contenant du nitrate d'ammonium et du biphosphate de sodium. La souche ne se développe pas du tout sur un milieu de culture contenant du nitrate de sodium et du nitrite de sodium. On observe une très bonne croissance de la souche sur des milieux de culture contenant les amino- acides suivants: acide glutamique, acide asparaginique, alanine, valine, asparagine. La croissance est modérée sur un milieu de culture contenant de la leucine, de la cystine, de la proline,de 1' hydroxyproline, de la phénylalanine et de la tyrosine. Suivant la source d'azote, on observe certaines différences de pigmentation du mycelium aérien et du mycelium substratique. Selon certaines caractéristiques, la souche de Streptomyces n 765 ressemble à Streptomyces coelicolor, appartenant à la série Gray d'après Bergey-1974 (Actinomyces coelicolor du groupe coelicolor d'après N.A. Krassilnikov- 1970). Cette dernière se distingue par certaines propriétés morphologiques, culturelles, physiologique et biochimique, qui sont décrites dans la caractérisation de l'espace par Bergey (1974) et par N.A. Krassilnikov (1970). Streptomyces coelicolor, par exemple, a de 1 à 3 enroulements des spirales, elle condense lentement la gélatine et peptonise le lait écrémé. Son test de la tyrosinase est négatif. Par conséquent, la souche de Streptomyces n 765 n'est pas identique à la souche de Streptomyces coelicolor similaire (Actinomyces coelicolor), et c'est pourquoi on la désigne par l'espèce n 765 de Streptomyces appartenant à la série Gray d'aprèsBergey(1974) et au groupe Coelicolor d'après N.A. Krassilnikov (1970). On cultive la souche productrice dans des flacons Erlenmeyer de 500 ml contenant 50 ml de milieu de culture de fermentation, pendant 36 -à 96 heures à une température de 24 à 36 C, un pH initial de culture de 6,5 à 9,0, sur un dispositif de secouage à 180320 tours par minute. L'isomérisation du glucose en fructose au moyen de la glucose-isomérase produite par la souche Streptomyces sp. n0765 peut se faire par traitement directe avec le mycelium frais (séparé par centrifugation à 12. 000 tours par minute et lavé trois fois avec un tampon de phosphate 0,05 M à pH 7,0) ou bien avec un mycelium séché (cellules séchées à air ou séchées à l'acétone) avec une solution d'enzyme(obtenue après désintégration ultrasonique ou autolyse du matériau cellulaire et séparation du liquide surnageant par centrifugation à 15.000 tours par minute avec centrifugation de la culture) contenant de l'isomérase extracellulaire ou des cellules immobilisées sur un support dur. On détermine la quantité de fructose formée dans le mélange réactionnel à l'aide de la méthode cystéine- -carbazole (4), et on exprime l'activité de la souche en milligrammes de fructose par millilitre de liquide de culture ou bien en unités internationales de glucose-isomérase (GIU). Une GIU est égale à la quantité d'enzyme qui, dans une solution de glucose 1M à7O0C et à pH 7,0 dans un tampon de phosphate 0,05 M et contenant 2.10 2M de MgSO4 7H20, transforme en une minute 1 mol de glucose en 1/ mol de fructose. Les avantages du procédé selon l'invention sont les suivants: La souche de Streptomyces sp. n0765 produit la glucose-isomérase en l'absence d'ions cobalt dans le milieu de fermentation. L'enzyme obtenue transforme le D-glucose en D-fructose en l'absence d'ions cobalt dans le milieu d'isomérisation, ce qui facilite considérablement le procédé technologique, et il n'est pas nécessaire de faire appel à des dispositifs d'échange d'ions pour la séparation du cobalt d'avec les sirops contenant le fructose. Par comparaison avec les souches, les micro-organismes et les mutants producteurs de glucose-isomérase, décrits dans les brevets antérieurs, qui ne nécessitent pas d'ions cobalt dans le milieu de culture et dans les milieux d'isomérisation (2a,b,c; 9a,b), Streptomyces sp. n 765 les surpasse par son activité de glucose-isomérase, son optimum de pH favorable (7,0), son optimum de température plus élevé (80 ) de l'enzyme et sa thermostabilité considé- rable entre 40 et 70 C. 1. Milieu de culture xylose: Xylose 20 g Gélose 20 g KNO3 1,0 g K2HPO4 0, 5 g 2 4 0,5 g MgSO4. 7H20 0,5 g NaCl 0,5 g CaCO3 1,0 g -FeSO4 0,001 g quantité d'eau suffisante pour faire I litre. 2. Pomme de terre-glucose-gélose extrait de pomme de terre obtenu à partir de 300 g de pommes de terre bouillies. glucose 10 g gélose 20 g eau en quantité suffisante pour faire 1 litre. Il est recommandé, pour l'entretien de la souche, de faire alterner les deux milieux de culture ci-dessus. A une matière bien ensemencée obtenue pendant culture de 10 à 15 jours sur un milieu de culture 1 ou 2 (le milieu de culture 1 est recommandé), on ajoute 6 ml de milieu de culture d'innoculation ayant la composition suivante: xylose 1 % extrait de boeuf 2 % MgSO4. 7H20 0,1 % K2HPO4 0,3 % On procède à un lavage de la masse cellulaire et on place le tube à essai sur un dispositif de secouage pendant 24 heures à 30 C et à 240 tours par minute. A partir de la culture ainsi adaptée, on ensemence un milieu d'inoculation ayant la la composition suivante: xylose 1 % Extrait de mais 3 % (noids à sec) acetate de sodium 0,5 % On procède à la culture dans des flacons Erlenmeyer de 500 ml de milieu de culture de fermentation. On réalise la culture pendant 60 heures à 30 C sur un dispositif de secouage à 240 tours par minute. Le pH de culture initial est de 8,5. Après 60 heures de culture de Streptomyces sp. n 765, on obtient 160 à 240 g de biomasse humide par litre de liquide de culture. Exemple 2. On procède à l'isomérisation du glucose en fructose au moyen de glucose-isomérase de la souche Streptomyces sp. n 765, à une température de 70 C, à pH 7,0 en présence de MgSO4,7H2O à une concentration de 2.10 -2M et une concentration de substrat de 1M. L'activité de la souche Streptomyces sp. n 765 est de 75 à 130 mg de fructose par millilitre de liquide de culture, ou de 7.000 à 12 000 GIU par litre de liquide de culture. REFERENCES 1. Cotter W.P.,Lloyd N.E., Hinman C.W. 1971. Brevet USA 3623953. 2. a/ CPC International Inc. 1975. Brevet britannique 1411763. b/ CPC International Inc. 1975; Brevet britannique c/ CPC International Inc. 1975. Brevet britannique 3. Danno G., ibid., 1971, 35, 7, 997. 4. Dishe Z., Borenfreud E. 1951. J. Biol. Chem., 192,583 5. Jacbbziner H., Raybin H.W. 1961. Arch. Pediat. 78,200 6. Levy H., Levinson V., Shade A. 1950 Arch. Biochem., 27,34 7. Marschall R.O., Rooi E.R. 1957. Science, 125, N.3249, 648. 8. Mi-Car International Inc. "Isomerized Syrup process". 1975 MFG Information. 9. a/ R.J. Reynolds Tobacco Co. 1973 brevet britannique b/ R.J. Reynolds Tobacco Co. 1974 brevet britannique 10. Sergio S., Kare L. 1975. Appl. Microbiol., 29,6,745 11. Somers E. 1974. J. Food Sci., 39,215 12. Schraeder H.A., Nason A.P., Tipton I.H. 1967. J.Chronic. Dis. 20,869 13. Stradberg G.W., Smiley K.L. 1971.Appl.Microb.,21,588 14. Takasaki Y. Ibid. 1966, 30,12,1247 15. Takasaki Y., Kosegu Y., Kanbayashi A. 1969. Agr. Biol. Chem.,3, 11, 1527 16. Takasaki Y., Kosogu Y. 1969. Academic Press Inc. N.Y. p. 561 17. Tsumura N., Hagi N., Sato T. 1967. Agr. Biol. Chem., 31,902 18. Yamanaka K. 1961. Agr. Biol. Chem., 25,4,272 REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention de glucose-isomérase, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver la souche productrice d'enzyme Streptomyces sp. n 765 déposée sous le n 143 au State Institute for Drugs Control, pendant 36 à 72 heures dans un milieu de culture adéquat, la température étant maintenue entre 24 et 36 C et le pH initial de culture étant de 6,5 à 9,0. 2. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de culture contient du xylose. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le milieu de culture a la composition suivante: xylose 1,0 - 2,0 % extrait de mais 1,5 - 4,0 % (poids à sec) acétate de sodium 0,25 - 1,0 % 4. Isomérisation du glucose en fructose qui consiste à traiter le glucose par la glucoseisomérase, caractérisé en ce que cette dernière est celle obtenue conformément au procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, en ce que la température d'isomérisation est de 50 à 90 C et le pH est de 6,0 à 9,0 et en ce qu'on opère en présence de MgSO4, 7H20 à une concentration de 1. 10-4 à 1.10-2M et une concentration de substrat de 0,1 à 3M.