Brevet FR2472609A1 — publié le 19810703

La présente invention concerne un procédé pour séparer et récupérer la myéloperoxydase à partir de leucocytes myélogEnes humains, et un médicament germi- 5 cide contenant de la myéloperoxydase comme principal constituant. La myéloperoxydase est une enzyme qu'Agner fut le premier à découvrir en 1941 dans les leucocytes animaux (Agner, Acta Physiol. Scand., 2, Suppl., 8 10 (1941)). Elle est présente en grande quantité en même temps que le lysozyme dans les globules blancs myélo- gènes, en particulier dans les leucocytes polynucléaires neutrophiles et dans les monocytes, sa proportion étant de 5 % par rapport au poids des neutrophiles.- 15 Cette enzyme est de caractère basique et pré- sente une masse moléculaire de l'ordre de 120 000 à 150 000 .Dalton. Sa molécule est constituée de deux sous- ensembles analogues et contient deux atomes de fer dont l'un se trouve sous forme heme et l'autre sous forme non 20 hàme. Elle appartient à un groupe d'oxydoréductases. Il semble que la fonction physiologique de la myéloperoxydase soit de produire, en présence de peroxyde d'hydrogène et d'ions halogènes, un ion hypo-halo- génure qui possède un puissant pouvoir oxydant et un 25 fort caractère halogénant, ce qui a pour effet de pro- duire des modifications irréversibles dans la partie de protéine ou d'acide nucléique des bactéries, des champi- gnons, des virus, etc. Ce mécanisme est vraisemblablement à l'origine de l'effet pharmacologique de la myéloper- 30 oxydase, qui se traduit par exemple par la destruction de bactéries et de virus ou par leur inactivation. Comme décrit ci-dessus, les propriétés de la myéloperoxydase montrent qu'il s'agit d'une substance pharmaceutiquement intéressante. Cependant, lorsque la 35 myéloperoxydase est isolée à partir d'espèces animales éloignées, elle présente des dangers biologiques car 2472609 2 elle provoque des effets secondaires dus à la réaction antigène-anticorps, ce qui rend difficile sont adminis- tration de façon régulière. En outre, la myéloperoxy- dase d'origine humaine est très difficile à obtenir en 5 grandes quantités en raison du nombre limité de sour- ces. Pour les raisons indiquées ci-dessus, on considère généralement que la myéloperoxydase ne peut pas avoir d'applications cliniques, de sorte qu'elle n'a jamais été utilisée dans la pratique. 10 Dans ces circonstances, la demanderesse a entrepris des études approfondies pour isoler et puri- fier la myéloperoxydase d'origine humaine à l'échelle industrielle. A la suite de ces recherches, il a été découvert qu'en mélangeant une suspension aqueuse d'un 15 produit désintégré de leucocytes myélogènes humains à au moins une substance choisie parmi les sels de manganèse et le sulfate de protamine, la suspension se séparait en un liquide surnageant contenant la myélo- peroxydase et en un précipité d'impuretés. On a en outre 20 découvert que l'on pouvait séparer et récupérer une mygloperoxydase humaine de haute pureté à l'échelle industrielle de ce liquide surnageant en récupérant tout d'abord une fraction contenant de la myéloperoxy- dase par centrifugation et en mettant en contact cette 25 fraction avec un échangeur de cations pour adsorber la -myéloperoxydase que l'on peut ensuite éluer et récupérer. La demanderesse a en outre entrepris des études sur la myéloperoxydase et elle a découvert qu'une compo- sition comprenant de la myéloperoxydase et un halogénure 30 de métal alcalin dans des proportions bien définies, pouvait produire, en l'absence de peroxyde d'hydrogène, l'effet pharmacologique mentionné ci-dessus sur les micro-organismes, dont le système synthétiseur de catalase est déficient ou affaibli. On a découvert de plus 35 que cette composition pouvait être administrée en quan- tités importantes par injection, de sorte que l'on peut 2472609 3 s'attendre à un effet thérapeutique spectaculaire de la myéloperoxydase sur les maladies provoquées par une infection par les micro-organismes décrits ci-dessus. La présente invention a été réalisée sur la base de ces 5 découvertes. L'invention a pour but de fournir-un procédé pour récupérer la myéloperoxydase à partir de leuco- cytes myélogènes humains à l'échelle industrielle. L'invention a également pour but de fournir 10 une composition pharmaceutique contenant de la myélo- peroxydase, agissant contre des micro-organismes dont le système synthétiseur de catalase est déficient ou affaibli. D'autres buts et avantages de l'invention 15 apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après. L'invention concerne un procédé pour la sépa- ration et la récupération de myéloperoxydasequi con-.- siste à mélanger une dispersion aqueuse d'un produit 20 de désintégration de leucocytes myélogènes hfmains, à au moins une substance choisie parmi les sels de manganèse et le sulfate de protamine, et à séparer et récupérer la myéloperoxydase de la liqueur surnageante elle concerne en outre un procédé pour la séparation 25 et la récupération de myéloperoxydase par séparation par centrifugation d'une fraction de myéloperoxydase de cette liqueur surnageante, puis mise en contact de la fraction obtenue avec un échangeur de cation$ afin d'adsorber la myéloperoxydase sur celui-ci. Selon un 30 autre mode de réalisation de l'invention, un traitement thermique peut être effectué au cours de l'une des étapes du procédé ci-dessus, à une température de 50 C ou davantage, et de préférence, de 500C à 80C, pendant 8 à 36 heures. 2472609 4 De plus, l'invention concerne une composition pharmaceutique efficace contre les micro-organismes dont le système de synthèse de la catalase est déficient ou affaibli, qui comprend de 5 à 0,05 mmoles d'un 5 halogénure de métal alcalin pour 100 à 0,05 unités de myéloperoxydase. Le produit de départ servant à la récupération de la myéloperoxydase est -un produit de désintégration de leucocytes myélogènes humains contenant la my6lo'peroxydase à séparer et à récupérer. Chez l'homme,-les leucocytes représentent généralement de 60 à 70 % des globules blancs consi- dérés au sens large, ne contenant pas de pigment res- piratoire présent dans le sang (ces globules blancs 15 seront désignés ci-après sous le nom de "globules blancs-au sens large"). -Bien que l'on puisse utiliser le produit de désintégration de ces leucocytes comme produit de départ pour le présent procédé, on préfère néanmoins éliminer préalablement les constituants 20 solides du sang tels que les érythrocytes et les plaquettes ainsi que le plasma sanguin. Actuellement, les globules blancs au sens large sont utilisés dans le but de se servir des lymphocytes qu'ils contiennent pour la production induite de l'interféron qui paraît intéres25 sent comme agent antimicrobien à large spectres Les leucocytes résiduels restant après séparation de l'in- terf6ron peuvent bien sûr être utilisés comme produit de départ. On obtient le produit de désintégration de 30 leucocytes myélogènes humains utilisé dans le présent procédé en désintégrant les substances brutes indiquées ci-dessus. La désintégration s'effectue ordinairement par traitement d'une suspension aqueuse de leucocytes dans un homogénéiseur à 0 C pendant 5 minutes. 2472609 5 Avant de la soumettre à l'étape suivante qui consiste à la mélanger à au moins une substance choisie parmi les sels de manganèse et le sulfate de protamine, la suspension aqueuse ci-dessus est de pré- 5 férence séparée par centrifugation (10 000 tours/mn) en un précipité et une couche surnageante. On recueille le liquide surnageant d'un vert jaunâtre, qui constitue la fraction contenant la myéloperoxydase et on le met en suspension dans cinquante à cent fois (en volume) 10 sa quantité d'une solution tampon (pH 6,0-8,0) contenant du sulfate de potassium ou du TRIS et 5 à 15 % (pds/vol) de sulfate d'ammonium. On homogénéise ensuite la sus- pension obtenue. Dans l'étape suivante, on mélange la suspension homogénéisée à au moins un composé choisi parmi les sels de manganèse et le suffate de protamine. L'ad- dition d'un sel de ce type a pour effet de retenir la myéloperoxydase dans la couche surnageante et de rendre très aisée sa séparation et sa récupération. Comme sels 20 de manganèse appropriés, on citera les composés du manganèse qui sont capables de produire des ions manga- nèse, tels que le sulfate de manganèse, le nitrate de manganèse ou le chlorure de manganèse. Parmi ceux-ci, on préfère le sulfate de manganèse. La quantité de sel 25 de ce type à ajouter est telle que la concentration finale atteigne généralement 5 à 20 mM, et de préférence, 8 à 10 mM pour les sels de manganèse et 0,1 à 0,02 % (pds/vol), et de préférence 0,2 à 0,01 (pds/vol) pour le sulfate de protamine. Après addition du sel, la suspen- 30 sion est soumise à une centrifugation (à 10 000 tours/ mn) pour récupérer la fraction de myéloperoxydase, c'est-à-dire le liquide surnageant, que l'on soumet ensuite à une chromatographie sur colonne échangeuse de cations pour séparer la my6loperoxydase. Avant de le 35 soumettre à la chromatographie sur colonne, il est pré- férable de dialyser et de centrifuger le liquide sur- nageant pour éliminer le précipité. 2472609 6 La myéloperoxydase, de préférence adsorbée sur l'échangeur de cations, est ensuite éluée et récupérée. On peut utiliser sans restrictions particulières des échangeurs de cations d'acidités diverses allant de pH 5 fortement acides à des pH faiblement acides. L'adsorp- tion est sensiblement plus efficace à un pH de 5,5 à 8,0, en particulier de 7,0 à 7,5. Dans la pratique, il est préférable d'effectuer l'adsorption dans un tampon de faible concentration (par exemple dans un tampon de 10 10-80 mM de phosphate ou dans une solution de 50-80 mM de phosphate acide dipotassique) dont le pH est ajusté. L'élution est effectuée tout d'abord par lavage avec une solution tampon équilibrée, puis par traitement par des solutions tampons de concentrations salines crois- 15 santes (dans un mode de réalisation préféré, la concen- tration en phosphate passe progressivement de 80 mM à 400 mM), ce qui permet de récupérer la fraction contenant de la myéloperoxydase. L'effluent aqueux recueilli est de couleur 20 verte et le rendement en myéloperoxydase récupérée est d'environ 40 %. A titre d'exemple, on obtient au total 8 815 unités de myéloperoxydase (valeur déterminée selon le procédé de B. Chance et al, décrit dans "Methods in Enzymology", II, p. 764 (1955)) à partir de 1,47.1011 25 leucocytes. La solution aqueuse de myéloperoxydase ainsi obtenue est soumise à une série de traitements courants dans la production des substances pharmaceutiques, comme la dialyse, la filtration aseptique, l'introduction dans des flacons et la lyophilisation, de façon à la 30 présenter sous forme d'un produit pharmaceutique. Si nécessaire, on peut compléter le procédé de l'invention par une étape de traitement thermique à 50'C-700C pendant B à 36 heures. Ce traitement est effectué dans une solution aqueuse ou dans une suspen- 35 sion aqueuse de pH 5 à 8 dans le but d'inactiver les 2472609 7 divers virus et bactéries susceptibles de contaminer la préparation de sang. Cecui-ci peut être réalisé à n'importe quel stade du procédé. Lorsque l'on chauffe les leucocytes myélogènes, c'est-à-dire le produit 5 brut, on obtient simultanément l'élimination de subs- tances thermolabiles par précipitation, ce qui conduit à une augmentation du degré de purification. Il est clair que l'on peut également traiter thermiquement le produit final. 10 Un mode de réalisation préféré de l'invention consiste en outre à affectuer une étape de filtration sur gel. Lors de cette étape, on utilise un support adapté à la séparation d'une substance ayant une masse moléculaire d'environ 3 000 à 150 000 Dalton (comme -15 des gels de polyacrylamide tels que le Sephadex G-200 et le Biogel P-300 ou des gels d'agarose tels que la Sepharose 6B).Il est préférable de soumettre le produit à une filtration sur gel après l'avoir traité par l'échangeur de cations. Le traitement de filtration sur 20 gel permet d'éliminer les impuretés de faibles masses moléculaires et d'obtenir un produit présentant une uniformité satisfaisante par analyse électrophorétique (avec un gel de pH 4,0 ; 1,5 heure d'électrophorèse à la température ambiante). 25 Le procédé de l'invention décrit ci-dessus permet de produire une myéloperoxydase humaine de haute pureté avec un rendement élevé et à l'échelle indus-trielle. Comme ce produit ne contient pratiquement pas d'impuretés et qu'il est d'origine humaine, il peut 30 être utilisé en tant que produit pharmaceutique sans danger et sans risques d'effets secondaires dus à la présence d'antigènes protéiniques hétérogènes. Dans la composition pharmaceutique de l'inven- tion, la myéloperoxydase purifiée par le présent procédé 35 est utilisée de façon préférentielle mais non exclusive, 2472609 8 et l'on peut utiliser toutes celles qui ont eté produites par des procédés fournissant un degré de puri- fication aussi élevé que celui obtenu par le présent procédé. 5 L'halogénure'de métal alcalin utilisé dans l'invention peut être n'importe lequel des halogénures pharmacologiquement acceptables tels que des chlorures et des iodures de métaux alcalins (comme le potassium et le sodium). 10 La proportion d'halogénure de métal alcalin dans la composition est généralement de 5 à 0,05 mmoles, et de préférence de 1 à 0,1 mmole pour 100 à 0,5 unités de myéloperoxydase. La composition pharmaceutique de l'invention 1.5 est préparée par l'un quelconque des proc9désclassiques, après addition d'un halogénure de métal alcalin à la myéloperoxydase purifiée. Si nécessaire, on peut incor- porer à cette composition n'importe lequel des supports diluants, stabilisants, activateurs et conservateurs 20 pharmaceutiques connus. La composition pharmaceutique ainsi préparée présente in vivo une activité germicide prononcée contre des micro-organismes pathogènes dont l'activité de synthèse de la catalase est déficiente ou affaiblie. La 25 composition présente également un effet thérapeutique sur les maladies provoquées par l'infection par ces micro-organismes. Le terme de "micro-organismes patho- gènes dont l'activité de synthèse de la catalase est déficiente ou affaiblie" tel qu'il est utilisé ici 30 désigne les micro-organismes pathogènes dont l'activité productrice de catalase est déficiente ou amoindrie chez un organisme vivant infecté par ces micro-organismes. Comme exemple typique-de ces micro-organismes, on citera un myobacterium tuberculosis résistant à l'isoniazide 35 (INH). La composition pharmaceutique de l'invention est 2472609 9 donc utile pour traiter une maladie telle que la tuber- culose réfractaire qui est résistante à la chimiothé- rapie et aux agents antibiotiques. A titre d'exemple, dans le cas d'une injection, 5 la présente composition est dissoute avant utilisation dans du sérum pour injection pour obtenir environ 100 à 1 000 unités/ml de solution de myéloperoxydase et administrée, de préférence localement, à un organisme vivant. 10 L'administration peut être effectuée par voie parentérale. Bien que l'administration locale soit préférable, la présente composition peut etre appliquée de façon externe. Dans la pratique, on peut par exemple l'administrer par voie intraveineuse (dans le cas d'une 15 maladie intéressant l'organisme entier telle qu'une septicémie ou une tuberculose miliaire), intramuscu- laire, ou par pulvérisation dans les conduits arériens. La dose de la présente composition à adminis- trer à un organisme vivant dépend du mode d'adminis- 20 tration, de la maladie à traiter et des symptômes. Dans le cas d'une injection intraveineuse ou d'une adminis- tration locale, la dose quotidienne pour un adulte est comprise entre 100 et 1 unités/kg de poids corporel. L'effet germicide déterminé à partir d'essais 25 sur des animaux et la toxicité aigôe de la présente composition sont décrits ci-après. L'unité d'activité de la myéloperoxydase a été déterminée selon le pro- cédé décrit par B. Chance et ai. dans "Methods in Enzy- mology", II, 764 (1955). 30 1 - Effet germicide : Pour évaluer l'effet germicide de la présente composition pharmaceutique, diverses compositions comprenant de la myéloperoxydase et un halogénure ont été préparées. L'effet de la présence de peroxyde d'hydrogène 35 a été étudié à titre de comparaison. L'essai a été réa- lisé en dissolvant chaque constituant dans un tampon de 2472609 10 phosphate de sodium 0,1 M (pH 7,0) pour préparer un mélange d'essai comprenant 1 ml d'une solution aqueuse de mygloperoxydase, 1 ml d'une solution d'iodure de potassium (la teneur en KI est indiquée dans le 5 Tableau 1), 1 ml d'une solution de peroxyde d'hydro- gne (la teneur en H202 est indiquée dans le Tableau 1) et 1 ml d!une suspension bactérienne, puis en faisant incuber chaque mélange à 37 C pendant 60 mn, et en comptant le nombre de bactéries ayant survécu. Les 10 résultats obtenus sont rassemblés dans le Tableau I. 90gxo'90x 91 90 xg ú Loixó 'I 901 x z ' zI 0 o O 0 O O 04 QI 001 '... .. . ... . .. ,. 9EOI xI El-[9OI x TO 9OT x 'e1OLx . ' O1 x9'g. ,, iO ' 01:.x...1, 01xPl 0Tx1' e x1, 01x ,? lA A 10, O 01 x t'O x' 01 x x ú'Z 01 x 6'E OT x "f ,, I: 1'0 Il Il 1L IL lJ IL IL I ,,... ,,.... , O 0~~~O I. IlAIIL LA I. 00 O O o O O 0' O'S 001 90 ; 90I1'1 gOT xó'1zOT xOo'z gOI x8'ú ,~ ., 0 HNI n xe úOI x ú'1gOI x~ g'EO-c x I'úgOI x 1'úú l xg( .", I 10' U~~gT~~d STGO1E 01 O xy O1 0 x1'úO x 8 01 x6'z O1 x -'[O ,, s, 10u 11 ul lJ 11 . a li 11 Oz 0 0 0 0 0 0 'Z 0'5 OO1 HNI n-e S!soI -nozoqn~ sno~ne alw s aa!un -nxoaqnquwn!aeaoqsu-o!qe TsouflnaeasnDoOO soww 'asepTxo uimnTiaqoq -ooKN wpTpugoseuouIopnesJ-olflqduq' DIj -jadoladW -seuoATA=s. s.t=;owq apwo u-enqTsuo i avaTava C) 0 r- NeJ 100 0,1' 2,0 TABLEAU 1 .(suitej o o o o o 20 ., . _ Tt " " 1 i " *, .. . t 0,1 " " 3,8x 102 4,4 x 102, 1,8x103 1,9 x 102 1,8 x 103 0,01 4,1x 103 4,6x102 4,8x103 2,1x103 2,9x 103 0 " " 3,4x 106 1,1 x7 1,3X].07 1, x 107 10x 107 3~~~~~~~~~~~1,4x 107 1 3 x107 i 100 0,01 2, 0 0 0 0 0 0 20 " " 3,1x 10 2,8 x 10 2,11 X1 10 1,9x 10 1,3x 10 .1 " " 1,3x 102 1,9x 102 2,5x 102 2,1x 102 5,1 x 10 0,1 " ,5 x 103 2,3 x 104 1,8 x 1i03 2,3x 103 1)3x 102 0,01 5,4 x 105 4',8x 105 2,1 x 105 1,8 x 104 9 x 13 0 "" 3,3x 106 1,9 x1x107 1 x106 x107 20 __ " 1,8x 105 5 j3x 14 2,3x 107 lj9 x 105 2,5 x 104 i ét 14 x 106 1,1x 105 03,1x 1 1053,1 x 1053,1 x 105 0_1 , 1, 8 x lo6 1,3 x 106 3,19 x 105 2>8 x 106 3,9 x 105 _. . ......_ ..I... I '4 PO t-. -j %0 ......... ) T ' ------w-- À Oîx C3 '0 CO ir ('J c.. (el-,Fns) nv^q-iErvi 2472609 14 2 - Expérience sur les animaux : l) L'effet de la présente composition phar- maceutique (50 unités de myéloperoxydase et 2 mmoles d'iodure de sodium par ml) sur la maladie infectieuse 5 expérimentale provoquée par le myobacterium tuberculosis a été évalué en utilisant trois groupes de rats de souche Wistar d'un poids corporel de 200 à 250 g, chaque groupe comprenant cinq rats. Des myobacteria tuberculosi au nombre de 10 3,7 x 108 résistantes à i'INH ont été mises en suspension dans 1 ml d'une solution aqueuse et 0,05 ml de la sus- pension ainsi obtenue a été injecté dans la cavité nasale de chaque rat. Le premier groupe de rats a été utilisé comme 15 groupe témoin et n'a pas reçu de composition pharmaceu- tique. Le second groupe a été soumis à une pulvérisation de la présente composition quatre fois en 8 heures, deux semaines après l'inoculation du bacille, en utilisant chaque fois 2 ml de la composition et en pulvérisant 20 pendant 15 minutes. Le troisième groupe a été soumis à une pulvérisation de la composition pendant 15 minutes avant l'inoculation de l'injection de bacilles et a été soumis à quatre pulvérisations après l'injection des bacilles. La pulvérisation a été effectuée en plaçant 25 le rat dans un dessicateur de 35 cm de diamètre muni d'un double fond et un brouillard de la composition pharmaceutique produit au moyen d'un vaporisateur a été introduit sous le double fond et libéré depuis la partie supérieure du dessicateur. 30 L'effet pharmaceutique a été évalué sur la base de la mortalité des rats au bout de six mois. Les résul- tats obtenus sont donnés dans le Tableau 2. 5 2472609 15 TABLEAU 2 - Nombre de rats survivants 1er groupe 0/5 2ème groupe 5/5 3ème groupe 5/5 Comme il ressort du Tableau 2, tous les rats du groupe n'ayant pas reçu de composition pharmaceu- tique meurent, alors que tous les rats des groupes traités sont vivants. 10 2) Un essai de toxicité aigae a été effectué par administration de 2 130 unités/kg de myéloperoxy- dase et de 210 mg/kg d'iodure de sodium à un groupe de quatre souris mâles de souche dd pesant 16,5-20,0 g. La composition pharmaceutique a été adminis- 15 trée dans la veine coccygienne. Soixante douze heures et sept jours après l'administration, toutes les souris étaient vivantes et en bonne condition physique. Lors de l'autopsie pratiquée au bout de sept jours, aucune anomalie n'a été observée dans les organes internes 20 de toutes les souris. Sur la base des résultats obtenus ci-dessus, on peut estimer que l'effet thérapeutique se manifestera chez l'homme par administration de 100 à 0,05 unités totales de myéloperoxydase et de 5 à 0,05 mmoles d'un 25 halogénure. La présente invention permet pour la première fois d'utiliser de la myéloperoxydase sous forme d'un produit pharmaceutique et de disposer d'une excellente composition pharmaceutique ayant un effet thérapeutique 30 prometteur et sans précédent. 2472609 16 Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention. Exemple 1 On traite environ 1 litre d'une suspension de 5 1,47 x 1011 globules blancs (globules blancs au sens large) à ODC pendant 5 mn dans un homogénéiseur fonc- tionnant à 30 000 tours/mn pour les désintégrer. On soumet la suspension ainsi obtenue à une centrifuga- tion à 0 -100C pendant 20 mn, ce qui donne un liquide 10 surnageant d'un vert jaunâtre (activité totale de 22 493 unités). On ajoute du sulfate de manganèse au liquide surnageant jusqu'à une concentration finale de 5 à 10 mM. On élimine le précipité par centrifugation. On dessale le liquide surnageant par dialyse contre une 15 solution aqueuse de 80 mM de phosphate acide dipotas- sique en utilisant un tube de cellophane comme membrane semiperméable. On introduit la solution dessalée dans une colonne garnie d'environ 60 ml de CM-Sephadex C-50 (Pharmacia Co., Suède) préalablement équilibrée par un 20 solution aqueuse de 80 mM de phosphate acide disodique. On lave la colonne avec la même solution aqueuse que celle utilisée pour l'équilibrage, puis on l'élue par la méthode du gradient de concentration linéaire en utilisant des solutions aqueuses de phosphate acide 25 dipotassique 80 mM et 400 mM. On récupère la fraction souhaitée de l'éluat en mesurant les absorbances à 280 nm et à 430 nm, cette dernière longueur d'onde étant caractéristique de la mygloperoxydase. Exemple 2 30 On répète le mode opératoire de l'exemple 1, excepté que l'on utilise du sulfate de protamine (con- centration finale : 0,1 à 0,02 %) au lieu de sulfate de manganèse ; que l'on utilise du SP-Sephadex C-50 (Pharmacia Co.) équilibré par une solution tampon de 35 phosphate 50 mM (pH 7,5) au lieu du CM-Sephadex C-SO ; 2472609 17 et qu'après lavage de la colonne par du phosphate acide dipotassique 50 mM, on élue la colonne par la méthode du gradient de concentration linéaire en uti- lisant des solutions de phosphate acide dipotassique 5 50 mM et 200 mM. Les résultats obtenus sont semblables à ceux de l'exemple 1. Exemple 3 Des résultats semblables à ceux de l'exemple 1 sont obtenus en répétant le mode opératoire de l'exemple 10 1, excepté que l'on ajuste le pH de la fraction de myéloperoxydase recueillie à 5-7, et qu'on la traite thermiquement à 60"C pendant une heure. Exemple 4 Après l'étape finale de l'exemple 1, on soumet 15 le produit à une filtration sur gel en utilisant du Sephadex G-200 (colonne de 2,5 x 16 cm ; après avoir été équilibrée par une solution tampon de phosphate 0,1 M de pH 7,0, la colonne a été développée avec le même tampon que celui utilisé lors de l'équilibrage). On 20 obtient ainsi un produit de haute pureté. Les augmen- tations de la pureté et du rendement sont indiquées dans le Tableau 3. TABLEAU 3 Moyen de Volume Absorbance Activité Rendement purifica- total ___ _ totale tion (m) (280 nm) (430nm) (430nm/ (unités)() 280nm) Solution de l'extrait 1.059 15,18 - - 22.493 100 Solution dyalisée 1.170 5,53 0,281 0,05 12.747 56,7 Après trai- tement par 282 0,305 0,204 0,67 8.815 39,2 du CM-Sephadex Après fil- tration sur 47 1,170 0,974 0,83 5.182 23,0 gel om 4--' c. 0Q 2472609 19 Exemple de préDaration pharmaceutique 1 (injection et pulvérisation) On introduit de façon aseptique des solu- tions pharmaceutiques dans des flacons bruns de telle 5 façon que chaque flacon contienne 100 unités de myélo- peroxydase et 3 mmoles d'iodure de sodium, puis on les lyophilise et on les scellé. Immédiatement avant l'uti- lisation, on ajoute à chaque flacon 5 ml de sérum phy- siologique pour injection pour dissoudre le contenu 10 et obtenir une préparation pour injection. 2472609 20 REVENDICATIONS 1. Procédé pour séparer la myéloperoxydase, caractérise en ce qu'il consiste à mélanger une sus- pension aqueuse d'un produit de désintégration de leucocytes myélogènes humains à au moins une substance 5 choisie parmi les sels de manganèse et le sulfate de protamine, puis à séparer et récupérer la myéloperoxy- dase de la liqueur surnageante. 2. Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que la séparation et la récupération de 10 la myéloperoxydase sont effectuées par récupération par centrifugation d'une fraction contenant la myéloperoxydase à partir de la liqueur surnageante et par mise en contact de la fraction récupérée avec un échangeur de cations pour adsorber la myéloperoxydase 15 sur celui-ci. 3. Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce qu'on effectue un traitement thermique à 50'-70'C pendant huit à trente-six heures à n'importe quel stade de la séparation de la myéloperoxydase. 20 4. Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que le sel de manganèse est le sulfate de manganèse, le nitrate de manganèse ou le chlorure de manganèse. 5. Procédé selon la revendication 1, carac- 25 térisé en ce- que la quantité de sel de manganèse à ajouter correspond à une concentration finale de 5 à 20 mM et en ce que la quantité de sulfate de protamine à ajouter correspond à une concentration finale de 0,1 à 0,02 % (pds/vol.). ~30 ~ 6. Procédé selon la revendication 2, carac- térisé en ce que la mi'se en contact avec l'échangeur de cations est effectuée à pH 5,5 - 8,0. 2472609 21 7. Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que le produit récupéré est en outre soumis à une filtration sur-gel. B. Composition pharmaceutique agissant contre 5 des micro-organismes dont l'activité de synthèse de la catalase est déficiente ou affaiblie, caractérisée en ce qu'elle comprend de 5 à 0,05 mmoles d'un halogénure de métal alcalin pour 100 à 0,05 unités de myéloperoxydase obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 10 9. Composition pharmaceutique selon la reven- dication 8, caractérisée en ce que les micro-organismes dont l'activité de synthèse de la catalase est défi- ciente ou affaiblie sont des myobacteria tuberculosi résistantes à l'isoniazide. 15 10. Composition pharmaceutique selon la reven- dication 8, caractérisé en ce que l'halogénure de 'métal alcalin est un chlorure ou un iodure de potassium ou de sodium. SR 1373 JA.MDT