Brevet FR2470773A1 — publié le 19810612

1. La présente invention concerne un nouveau composé polypeptidique thiolé provenant d'un fragment de la toxine tétanique, son procédé d'obtention et ses applications, no- tamment à titre d'agent de transport neuropharmacologique et de marquage spécifique des cellules neuronales. On sait que la toxine tétanique est transportée de façon rétrograde vers le système nerveux central et le systè- me nerveux périphérique. A cet effet, on peut se référer à l'article de BIZZINI et al. intitulé: "An antigenic poly- peptide fragment isolated from tetanus toxin: chemical cha- racterization, binding to gangliosides and retrograde axonal transport in various neuron systems", paru dans le "Journal of Neurochemistry", 1977, vol. 28, pp 529-542", ainsi qu'à toutes les références bibliographiques citées dans cet arti- cle. Différentes études ont montré que la toxine téta- nique pouvait être dégradée ou scindée en plusieurs fractions ou sousunités. Par exemple, COHEN et al. /-The Journal of Immunology vol. 104, n 6 Juin 1970_7 ont montré que la con- gélation-décongélation de filtrat brut de culture de Clostri- dium tetani entraine la dégradation de la molécule de la to- xine tétanique; la toxine tétanique dégradée résultante est pratiquement dépourvue de toxicité et présente un pouvoir flocculant plus faible que la toxine tétanique. BIZZINI et RAYNAUD ont également étudié les sous- unités A-I, A-II, A-III, et B-I, B-II et B-III de la toxine tétanique /-C. R. Acade Sc. Paris, t. 279, 1974 série D, pp. 1809-1811 et Annales de l'Institut Pasteur Paris 126, 159-176 (1975) 7. Le brevet FR 74 36 622 (publication 2.249.679) dé- crit un produit atoxique immunogène obtenu à partir de la to- xine tétanique. Ce produit atoxique est obtenu par traitement de la toxine tétanique avec une protéinase. BIZZINI et al. ont également isolé, à partir de la toxine brute congelée, un fragment polypeptidique de la toxine, qui est identique, du point de vue immunologique, aux fragments A-II et B-II cités ci-dessus, mais en diffère par sa taille et sa toxicité (voir à cet effet Journal of Neurochemistry, 1977, vol. 28, pp. 529=542). Ce fragment, dénommé B-IIb, qui sera défini plus en détail ci-après, est capable de se fixer sur les gangliosides et sur les membra- nes synaptiques avec une affinité qui est même supérieure à celle de la toxine tétanique. Compte-tenu de cette propriété, il est suggéré dans cet article que ce fragment pourrait être utilisé pour véhiculer spécifiquement dans le système nerveux central des agents chimiothérapeutiques, ou des agents pharmacologi- ques, pour déterminer des effets spécifiques dans le système nerveux central. Cependant, on n'a pas jusqu'à présent trouvé le moyen de fixer ces agents chimiothérapeutiques ou pharmaco- logiques sur ledit fragment B-II de manière, d'une part, à maintenir toute l'activité de l'agent à véhiculer vers le système nerveux central et, d'autre part, à conserver la propriété de fixation du fragment B-IIb sur les récepteurs pour la toxine tétanique dans le système nerveux central. On a maintenant trouvé un moyen de fixer des agents chimiothérapeutiques ou pharmacologiques sur le fragment B-IIb tout en lui conservant sa propriété de fixa- tion sur les récepteurs pour la toxine tétanique dans le système nerveux central. Par ailleurs, il est très difficile, à la connais- sance de la demanderesse, de séparer les cellules neuronales des cellules gliales. On a trouvé que le nouveau composé po- lypeptidique thiolé selon la présente invention pourrait ê- tre utilisé comme marqueur spécifique des cellules neurona- les; la séparation des cellules neuronales marquées devient alors plus aisée par des techniques bien connues de l'homme de l'art, telles que la filtration sur gel, la chromatogra- phie d'affinité, etc. Le composé polypeptidique thiolé selon la présente invention est constitué par le fragment B-IIb de la toxine tétanique sur lequel est fixé au moins un groupe -SH et pré- sente sensiblement les mêmes propriétés de transport axonal et de fixation sur les récepteurs de la toxine tétanique que le fragment B-IIb lui-même. Dans le composé de l'invention, le ou les groupes- SH sont fixes, directement ou indirectement, sur le fragment B-IIb. En général, compte-tenu du procédé pour son obtention, qui implique une thiolation, la fixation des groupes-SH se fera par l'intermédiaire du résidu de l'agent de thiolation. Celui-ci est par ailleurs fixé sur le fragment B-IIb par l'in- termédiaire des-groupes-NH2 dont celui-ci est porteur. Le fragment B-IIb, dont dérive le nouveau composé polypeptidique thiolé selon la présente invention, est un polypeptide de la toxine tétanique dont le poids moléculaire est d'environ 46000. Le procédé d'obtention de ce fragment B-IIb ainsi que ses propriétés physico-chimiques et immunologiques sont décrits en détail dans l'article de BIZZINI et al., cité précédemment (Journal of Neurochemistry, 1977, vol. 28, pp. 529-542). On rappellera brièvement que ce fragment a été ob- tenu par le procédé qui consiste à soumettre un filtrat congelé de culture de Clostridium tetani (souche Harvard n 6037 de la Collection Nationale de Cultures de Microorga- nismes de l'Institut Pasteur) aux étapes ci-après: 1 - ultrafiltration pour éliminer les substances ayant un poids moléculaire inférieur à,10000; 2 - fractionnement à l'aide de sulfate d'ammonium; 3 - filtration sur gel. Le fragment B-IIb présente les propriétés physico- chimiques ci-après: - poids moléculaire d'environ 46000; - il possède un pont disulfure et deux groupes sulfhydryle libres non réactifs; - les groupes N-terminaux sont la tyrosine et la lysine; - sa composition en acides aminés est donnée dans le - tableau I ci-après. Le fragment B-IIb de la toxine tétanique possède la même structure antigénique que le fragment B-II mais en diffère par sa toxicité spécifique. Les propriétés immunolo- giques du fragment B-IIb comparées à celle de la toxine téta- nique et du fragment B-II sont rassemblées dans le tableau II ci-après. TABLEAU I Composition en acides aminés du fragment B-IIb. : Acide aminé: Azote: Nombre de: Poids Acides aminés (g/100 g (g/100 g résidus moléculaire protéine) protéine) supposés calculé ::: : Tryptophane Lysine Histidine Amide Arginine Acide aspartique Thréonine Sérine Acide glutamique Proline Glycine Alanine Semi-cystine Valine Méthionine Isoleucine Leucine Tyrosine Phénylalanine Total : 0,41 : 1,41 :. 0,44 : 2,21 : 1,48 : 2,30 0,61 : 1,01 0,74 0,43 : 0,77 0,55 : 0,11 0,76 0,16 1,10 1,22 : 0,79 : 0,49 : 77 : 23 : 5 : 12 : 20 : 33 : 14 : 25 : 4 : 24 : 36 16,99: 409 : 48293 : 45678 : 48185 : 45444 : 46208 : 46080 : 45606 : 45528 : 45325 : 45432 : 50656 : 45756 : 46120 : 45942 : 45568 : Acides aminés extracellulaires : & la toxine :(g/100Z protéine) 1,63 , 42 : 1,34 :* 3,94 17,72 :* 5,32 : 6,59 ,49 : 4,22 : 3,30 : 3,21 :* 1,12 : 4,78 : 2,29 11,02 : 10,05 :* 9,79 :* 6,39 : 46145: 113,62 2,96 7,36 1,61 m : 4,60 : 21,87 :. 5,17 : 7,60 : 7,83 : 3,54 : 4,14 : 3,53 : 0,95 : 6,22 : 1,75 : 10,32 : 11,38 : 10,25 ,80 : 116,88 TABLEAU IlI Comparaison des principales caractéristiques immunologiques et toxiques du fragment B-IIb avec celles du fragment B-II et de la toxine tétanique. :Test: Activité:: Toxicité composé Ouchterlony flocculante. LF/O.D: LF/Lf spécifique Comps.(structure ' spécifique L/g :antigénique):(LF/mgN):: : toxine: l(a,b): 3150: 423:2,5.103: 7,8o107 fragment:: : : B-IIb: l(b) 11000 1000 0,05 555 fragment. B-IIa l(b) 8200 825 8 6,6l104 Le composé polypeptidique thiolé selon la présente invention est obtenu par thiolation du fragment B-IIb traité au préalable pour éliminer sa toxicité résiduelle. La thiolation du fragment B-IIb peut être effectuée par des moyens classiques permettant l'introduction de-grou- pes-SH sur une molécule comportant des groupes amino, mais, pour les besoins de l'invention, les moyens en cause ne doi- vent pas dénaturer les propriétés de transport axonal et de fixation sur les récepteurs spécifiques de la toxine tétani- que dans le système nerveux central du fragment B-IIbo A titre d'exemple, on indiquera que la-thiolation du fragment B-IIb peut être réalisée avec les agents de thio- lation ci-après: - 4 - méthyl-mercaptobutyrimidate: HS-(CH2)3-CO-CH3 / Biochemistry vol. 17 n 8, 19787 NH2+Cl 2 - iminothiolane /Schramm H.J. et Dulffer T. (1977) Z. Physiol. Chem. 358, 137-139_ - N acétylhomocystéine thiolactone (ART) _/voir J. Amo Chem. Soc., 1960, 82, 565-571/7 S H2C C = 0 H2C CH NHCOCH3 6. - l'anhydride S-acétyl-mercaptosuccinique (AMS) /J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, 3802-3803_7 C3 - CO - S - CH- C I \ ce- C Par contre, on indiquera que les procédés connus de thiolation consistant en une étape de dithiopyridylation et en une étape de réduction ne conviennent pas aux fins de l'invention. En effet, les propriétés de transport axonal et les propriétés de fixation du fragment B-IIb ainsi thiolé sont modifiées au cours de l'étape de réduction. Par exemple, la thiolation effectuée par réaction avec le N-succinimidyl3-(2-pyridyl-dithio)-propionate et par réduction du composé dithiopyridylé obtenu, par exemple,selon le mode opératoire décrit par CARLSSON et al. / Bioch. J. (1978) 173 723-724 7 n'est pas appropriée aux fins de l'in- vention. Pour plus de précision, on indiquera que le composé polypeptidique thiolé selon l'invention comporte un ou plu- sieurs groupes Z-SH, Z étant le résidu de l'agent de thiola- tion. Ainsi, si l'on met en oeuvre l'un des agents de thiolation cidessus, Z représente alors: +,Cl -C -(CH2)3-; - CO - CH- c2 - - C - H - CO - NH - CO -CH3 HN2- COOH - c -(CH2) - NH La thiolation du fragment B-IIb est réalisée sur les groupes NH2 de celui-ci. La toxicité résiduelle du fragment B-IIb peut être éliminée au préalable, par exemple par une étape d'immuno-ad- sorption sur une colonne de gel de Sépharose 4B activé avec du CNBr sur lequel est fixée de façon covalente la fraction IgG du sérum anti-Ibc. Le fragment B-IIb ainsi obtenu n'est 7. pas toxique chez la souris à la dose de 1,9 mg. Oa a trouvé que le composé polypeptidique thiolé selon l'invention convient comme agent de transport neuro- pharmacologique pour véhiculer vers le système nerveux cen- tral des agents pharmacologiques ou chimiothérapeutiques. Pour permettre le transport d'un médicament vers le système nerveux central par l'intermédiaire de l'agent selon l'invention, il est nécessaire de fixer ou de coupler ce médicament sur le composé polypeptidique thiolé, utilisé comme agent de transport, sans évidemment modifier la pro- priété pharmacologique du médicament ni la propriété de fixa- tion du fragment B-IIb sur les récepteurs spécifiques de la toxine tétanique dans le système nerveux central. Par "médi- caments" on désigne, selon l'invention, toutes substances a- yant des propriétés pharmacologiques, telles que les agents pharmacologiques, les agents chimiothérapeutiques, etc. Les médicaments qui peuvent être fixés selon l'invention sur le composé polypeptidique utilisé comme agent de transport neuro- pharmacologique doivent posséder des groupes Ni2. A titre d'exemples de médicaments qui peuvent être véhiculés vers le système nerveux central au moyen du composé polypeptidique thiolé selon l'invention, on citera: la phos- phatase alcaline, le fragment A de la toxine cholérique, le fragment A de la toxine diphtérique, les dipyrido-indoles se- lon le brevet FR 77.11.148 etde façon généraletout médica- ment porteur de groupes NH2. Il est connu que la toxine cholérique se fixe sur les gangliosides GM1 de la paroi intestinale et que le frag- ment A est responsable de l'augmentation du taux d'AMP cycli- que /-acide adénosine-monophosphorique cyclique _7. Par contre, dans le tétanos, on constate une diminution du taux d'AMP cy- clique dans le système nerveux central. Le conjugué selon 1'- invention, constitué du composé polypeptidique thiolé couplé avec le fragment A, peut être utilisé pour lutter contre le tétanos. Les dipyrido-indoles selon le brevet FR 77.11.148 sont des chimiothérapeutiques utiles dans le traitement des cancers. Dans ce domaine, on sait que les métastases sont dues au fait que des cellules cancéreuses viennent se nicher 8. dans le système nerveux central, d'o elles migrent vers d'- autres régions du corps, o elles développent des tumeurs. Le développement des métastases pourrait être évité ou ré- duit dès lors que les moyens pour détruire ces cellules dans le système nerveux central parviendront jusqu'au système nerveux central. De la même manière, l'invention peut être appli- quée au traitement des tumeurs cérébrales. La présente invention concerne donc également les moyens de couplage du composé polypeptidique thiolé selon l'invention avec des médicaments. Les moyens de couplage du composé selon l'inven- tion et du médicament à transporter mettent en oeuvre au moins un pont disulfure ou au moins une liaison irréversible soufrée. La présente invention concerne donc également les conjugués fragment BIIb / Médicament comportant au moins un pont disulfure ou au moins une liaison irréversible soufrée. Il est connu de préparer des conjugués protéiniques par formation de liaison disulfure intermoléculaire. La for- mation d'une telle liaison disulfure intermoléculaire est réalisée par exemple par réaction d'une protéine ayant des groupes thiol avec une protéine ayant des groupes dithiopy- ridyle. Par exemple, selon le procédé décrit par TE PIAO KING et al. (Biochemistry vol. 17 n0 8, 1978) on peut coupler deux protéines différentes en fixant d'abord sur une des pro- téines des groupes thiol et sur l'autre protéine des groupes 4-dithiopyridyle et en faisant réagir les deux protéines mo- difiées résultantes dans des conditions appropriées permet- tant la formation d'un pont disulfure et l'élimination de 4- thiopyridone. Les groupes thiol peuvent être fixés sur l'une des protéines à l'aide de 4-méthyl-mercapto-butyrimidate et les groupes 4-dithiopyridyle sur l'autre protéine par l'in- * termédiaire de, par exemple, le 3-méthyl-(4'-dithiopyridyl)- propionimidate. Ce procédé de couplage permet l'obtention d'un conjugué protéine-protéine dans lequel la fraction en- tre les deux protéines est symétrique par rapport au pont disulfure. 9. Selon CARLSSON et al. (Bioch. J., 1978, 173, 723- 724) on peut introduire le groupe thiol sur l'une des protéi- nes par réaction de ladite protéine avec le N-succinimidyl-3- (2-pyridyl-dithio) propionate et réduction ultérieure; selon ce procédé, on utilise le même réactif, à savoir le N-succi- nimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate, pour introduire des groupes thio et dithiopyridyle sur les protéines. Les conju- gués résultants possèdent également une fraction de liaison symétrique par rapport au pont disulfure. On a également utilisé le 4-méthyl-mercapto-butyri- midate pour la formation de dimères et d'oligomères supéri- eurs de protéines du ribosome 30 S d'Escherichia Coli (Bio- chemistry, 12, 3266-3273, 1973). Les conjugués ainsi obtenus ont de nombreuses ap- plications, par exemple comme réactifs de dosages immunologi- ques. Le procédé de couplage, selon l'invention, du com- posé polypeptidique thiolé utilisé comme agent de transfert neuropharmacologique avec un médicament par l'intermédiaire de ponts disulfure consiste: 1 - à introduire sur le médicament à fixer des groupes dithio- pyridyle; 2 - à faire réagir le médicament porteur de groupes dithiopy- ridyle avec le composé polypeptidique thiolé selon loin- vention. - Le schéma réactionnel de ce procédé de couplage peut être représenté de la façon suivante lorsque l'agent de dithiopyridylation mis en oeuvre dans l'étape 1 est le N-suc- cinimidyl-3-(2-pyridyl-dithio)propionate: 1) - - ±s - S-CH2- C- - o Hoo M a NH - C -CH2-CH2- S - S + HO-O 10. NH+, C1i 0 2) [B-II b7-Ni-l C(CH2)3 r-SH + M-NH-C-CH2-Cl2-S-S t o}l v C1 - M -NH -C-CI-l2-CI2-S - S (CH2)3-C-NI-/-B-IIb 7 + S H Dans ce procédé on peut utiliser un autre agent de dithiopyridylation, tel que la dithiopyridine ou tout autre agent approprié pour une telle réaction. Un autre moyen de couplage du composé polypeptidi- que utilisé comme agent de transport neuropharmacologique se- lon l'invention consiste à créer une liaison irréversible en- tre ledit agent et le médicament à véhiculer. Ce procédé peut être représenté par le schéma réactionnel ci-après: 1) M- NH2 + - O - N 0 0 + -0i o M- NI- C - - + N - OR 2) M- NH- C - + /-B-IIb_7/-NH--- C(CH2) 3? SHi S-(C))3-C-NH /-B-IIb M-NilJiL. Nf W20 -- - Il consiste: 1) à faire réagir le médicament à fixer avec l'ester de métamaléimidobenzoyl-N-hydroxy-succinimide 2) à faire réagir le composé résultant avec le composé polypeptidique selon l'invention. Les schémas réactionnels ci-dessus et ceux qui se- ront donnés ci-après sont simplifiés et ne tiennent pas comp- 11. te du nombre de groupes SH qui peuvent être fixés sur le fragment B-IIb. On a déjà proposé d'utiliser l'ester de métamaléi- midobenzoyl-N-hydrosuccinimide pour former des conjugués en- zyme-anticorps (FEBS Letters, vol. 95, n 2, Nov. 1978).o Tou- tefois, les enseignements de l'art antérieur ne permettaient pas de prévoir que l'utilisation de l'ester de métamaléimido- benzoyl-N-hydroxysuccinimide pour le couplage de l'agent de transport neuropharmacologique selon l'invention avec des mé- dicaments ne modifierait ou n'inhiberait pas les propriétés pharmacologiques dudit médicament et la propriété de fixation du fragment B-IIb sur les récepteurs spécifiques de la toxine tétanique dans le système nerveux central. On remarquera que le couplage selon l'invention du médicament avec le composé polypeptidique thiolé utilisé com- me agent de transport neuropharmacologique est réalisé selon des techniques connues classiques de couplage protéine-pro- téine. Toutefois, il faut noter que toutes les techniques de couplage protéine-protéine à la portée de l'homme de l'art ne conviennent pas aux fins de l'invention. En effet, seules les techniques de couplage permettant de réaliser une liaison di- sulfure ou une liaison irréversible soufrée sont appropriées. En particulier, on indiquera que la technique de couplage la plus classique, qui met en oeuvre le glutaraldéhyde, ne con- vient pas aux fins de l'invention car le fragment B-IIb trai- té par le glutaraldéhyde perd ses propriétés de transport a- xonal et de fixation sur les récepteurs de la toxine tétani- que dans le système nerveux central. Ainsi, le fragment B-IIb, sur lequel on aurait fixé des groupes carbonyle, avec le glu- taraldéhyde par exemple, ne convient pas aux fins de l'inven- tion. Une autre application du composé polypeptidique thiolé selon l'invention est le marquage des cellules neuro- nales. Ainsi, le composé de l'invention peut être utilisé comme marqueur spécifique des cellules neuronales et aussi pour préparer des réactifs immunologiques. On peut préparer par exemple un réactif enzymatique à partir du composé poly- peptidique thiolé selon l'invention et de la phosphatase al- caline. On a constaté que le conjugué résultant possédait à 12. la fois le pouvoir de fixation du fragment B-IIb et l'activi- té enzymatique de la phosphatase. L'invention va être maintenant décrite plus en dé- tail par les exemples illustratifs de préparation du composé polypeptidique thiolé de l'invention et de couplage de celui- ci, avec des médicaments. Dans tous ces exemples on a utilisé le fragment B-IIb tel que défini ci-dessus, dépourvu de sa toxicité résiduelle. EXEMPLE 1. Thiolation du fragment B-IIb à l'aide du 2-iminothiolanne. La thiolation du fragment B-IIb a été réalisée se- lon le mode opératoire décrit par Schramm et al. /-Z. Physiol. Chem. 1977, 358, 137-139_7. Le fragment B-IIb (1 mg) en solution dans du glycé- rol à 50 % (0,2 ml) a été thiolé par l'iminothiolane (0,5 mg) en solution dans 750/ul de tampon triéthanolamine HCOl 0,2 M, pH 8,5-9,0. Le mélange réactionnel a été maintenu à la tempé- rature ambiante pendant deux heures. L'excès de réactif a été éliminé par filtration sur une colonne "SEPHADEX G-25". EXEMPLE 2. Thiolation du fragment B-IIb à l'aide de la N-acétylhomocys- téine thiolactone. On a réalisé la thiolation du fragment B-IIb selon le mode opératoire décrit par SINGER et al. _/J. Am. Chem. Soc., 1960, 82, 567-571_7. A 3 mg du fragment B-IIb en solution dans 2 ml d'eau on a ajouté le tampon K2C03/NaHCO3 pH 10,7 (1,6 ml). On a fait passer un courant d'azote pour chasser l'air. On a ajouté 0,4 ml d'une solution de Nacétylhomocystéine-thiolactone à 80 mg/1. On a maintenu le mélange réactionnel pendant 2 heures à 4 C sous azote. La réaction a été ensuite arrêtée par filtra- tion sur SEPHADEX G 25. EXEMPLE 3. Thiolation du fragment B-IIb à l'aide de l'anhydride S-acétyl- mercaptosuccinimique. On a réalisé la thiolation du fragment B-IIb selon le mode opératoire décrit par Klotz et al. / J. Am. Chem. soc. 1959, 81, 3802-3803/7. On a introduit le fragment B-IIb (3 mg) dans 1 ml 13. de tampon phosphaté 0,1 M, pH 7,4 dans un ballon à trois tu- bulures et on a purgé le ballon avec de l'azote. Sous agitation, et en maintenant une atmosphère d'- azote, on a introduit 140/ug de l'anhydride S-acétyl-mercap- tosuccinimique en deux fois à 5 minutes d'intervalle. On a laissé la réaction s'accomplir pendant 20 mi- nutes au total. On a ensuite filtré le mélange réactionnel sur SEPHADEX G 25. On a recueilli une solution du fragment B-IIb modifié à laquelle on a ajouté du NH2OH 1 M jusqu'à 1'- obtention d'une concentration finale de 0,1 M. On a laissé la désacétylation s'effectuer pendant 5 minutes. On a ensuite filtré immédiatement le mélange réactionnel sur du SEPHADEX G 25 équilibré en tampon phosphate 0,1 M pH 7,4. Le schéma réactionnel peut être représenté comme suit: O CH3-CO-S-CHN-C/ \O + B-IIb OH2C O /-CcH3-CO-S-C.z-CO- B-Ib N -COOH / CH3-_COSCH-CO- 7- B-IIb + /- b-I+ NH20H CH2-COOH / HS-cH-CO- 7- B-IIb !H2-COOH 3O EXEMPLE 4. Thiolation du fragment B-IIb à l'aide du 4-méthyl-mercaptobu- tyrimidate. On a effectué la thiolation selon le mode opératoi re décrit par TE PIAO KING et al. /Biochemistry vol. 17 n 8 1978 7 à l'aide de 4-méthyl-mercaptobutyrimidate et on a ob- tenu un composé polypeptidique thiolé comportant des groupes - C (CH2)3-SH NH2 C1- 14. EXEMPLE 5. Préparation d'un conjugué composé polypeptidique thiolé- fragment A de la toxine diphtérique. On a utilisé 2,2 mg du fragment A de la toxine di- phtérique dans 1 ml de tampon borate 0,025 M pH 9,0. On a a- jouté 7 mg de 2-iminothiolane et 77/ug de 4,4'-dithiopyridine sous forme d'une solution méthanolique (100/ul d'une solution de 3,85 mg dans 5 ml de méthanol). On a effectué l'addition de cette solution en deux fois 50/ul, à trois minutes d'inter- valle, en refroidissant dans la glace et sous agitation. On a laissé la réaction s'accomplir pendant deux heures. On a ap- pliqué aussitôt le mélange réactionnel sur du SEPHADEX G 25 (0,9 x 20 cm) équilibré avec un tampon phosphate 0,1 M pH 6,9 contenant 1 mM Na2 EDrA. On a mélangé 3 moles du composé polypeptidique obte- nu selon l'exemple 4 avec 2,8 moles du fragment A-dithiopyri- dylé selon le mode opératoire ci-dessus. On a suivi la réac- tion d'échange à 324 nm. On a filtré sur SEPHAROSE 6 B équili- bré avec un tampon tris 0,05 M, NaCl 0,5 M, pH 8,0. Le conjugué obtenu conserve le pouvoir de fixation du fragment B-IIb et l'activité immunologique du fragment A de la toxine diphtérique. On peut ainsi préparer une chimère. La, dithiopyridylation du fragment A peut également efecetuee être/à l'aide du N-succinimidyl-3-(2-pyridyl-dithio)propiona- te. EXEMPLE 6. Utilisation du composé polypeptidique thiolé selon l'invention comme agent de transport neuropharmacologique. Pour montrer que le composé polypeptidique thiolé selon l'invention peut être utilisé comme agent neuropharma- cologique spécifique, on a utilisé comme modèle expérimental le système oculomoteur périphérique chez le rat. On a utilisé le composé polypeptidique thiolé obte- nu selon l'exemple 4 ci-dessus. Ce composé polypeptidique thiolé a été couplé avec le fragment Ibc de la toxine tétani- que. Le fragment Ibc a été obtenu par digestion papaúni- que de la toxine selon le mode opératoire ci-après: l'injection à des souris de ce fragment Ibc provo- 15. que des symptomes d'empoisonnement semblables à ceux du frag- ment B / Helting et al. J. Biol. Chem., 253 (1978) 125-129 7. On a utilisé le fragment!bc couplé avec le compo- sé polypeptidique selon l'invention pour bien mettre en évi- dence que c'est le fragment B-IIb qui se fixe sur les récep- teurs spécifiques de la toxine tétanique dans le système ner- veux central et non pas un autre fragment de la toxine téta- nique, tel que le fragment Ibc. En effet, le conjugué B-IIb/ Ibc comportant des ponts disulfure obtenu selon le procédé de couplage défini ci-dessus ressemble, du point de vue de la structure, à la toxine tétanique entière, et les résultats relatés ci-après indiquent que c'est seulement le fragment B-IIb qui se fixe sur les récepteurs spécifiques de la toxine tétanique. Les fragments B-IIb et Ibc ont été marqués à l'iode b bc radioactif I125 ainsi que le conjugué B-IIb/Ibc. Ce marquage a été réalisé selon la méthode de Greenwood et al. / Biochem. J. 89, (1963) 114-127_7. Pour chaque substance à marquer on a utilisé 400/ug de ladite substance et 2 mCi de Na I125 (fourni par le Centre de Radiochimie de Amersham). La radioactivité spécifique de chaque substance ainsi marquée est indiquée ci-après; Substance Radioactivité - fragment B-IIb 3,4/uCi//ug - fragment Ibc 2,6/uCi//ug - conjugué B-IIb/Ibc 3/uCi//ug Protocole d'essai: Pour tous les essais, on a utilisé des rats Spra- gue-Dawley femelles d'un poids de 250-270 g. Les rats ont été maintenus à la température constante de 23 C et nourris avec le régime habituel -Nafag, Gossau_7 et de l'eau. Cinq rats albinos ont reçu une injection de l'une des substances marquées ci-dessus dans le muscle terminal mé- dial de l'oeil gauche selon le mode opératoire ci-après. Après mise à nu du muscle, les substances ont été injectées par un système d'injection réglé thermiquement à l'aide d'une pipette en verre (50-100/um de diamètre extérieur). Le temps d'injec- tion a été de 35 à 50 minutes. Un rat a reçu le conjugué ci- dessus et quatre autres rats ont reçu l'un des fragments Ibc 16. ou B-IIb. De la peroxydase de raifort (HRP type Sigma VI) a été utilisée à titre de témoin. Les rats ont été sacrifiés 24 heures après l'injection. Une perfusion intracardiale a été effectuée sous anesthésie générale avec tout d'abord un agent dilatant du plasma ("Macrodex"), puis avec du glutaraldéhyde à 1,25 % et du paraformaldéhyde à 1 % dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4) pendant 30 minutes, et finalement avec une solution de saccharose à 10 % dans un tampon phos- phate 0,1 M (pH 7,4) pendant 30 minutes. Pour plus de détail sur ce mode opératoire, on pourra se reporter à l'article de MESULAM / J. Histochem. Cytochem., 26, (1978) 106-117 7. Le cerveau a été prélevé immédiatement après cette perfusion et maintenu pendant 44 heures dans une solution de saccharose à 30 % avant découpage. Des sections congelées (é- paisseurs 30/um) ont été prélevées à partir du noyau abduc- teur et jusqu'au noyau oculomoteur entier. Chaque section traitée avec la peroxydase de raifort a été colorée selon la méthode TMB selon MESULAM et recolorée avec du rouge neutre, alors que les autres sections ont été autoradiographiées. Ces dernières sections ont été trempées dans une émulsion liquide NTB2 à 45 C dilué au 1/2 avec de l'eau distillée. Les sections ont été exposées pendant 4 semaines à 4 C dans le noir et dé- veloppées avec le révélateur "Kodak Dektol" à 180C pendant 90 secondes, lavées, puis fixées avec du thiosulfate de sodium à 30 %, lavées pendant 2 heures, puis colorées avec du violet de crésyle et couvertes. Toutes les sections ont été exami- nées au microscope (grossissement 250) et la localisation des cellules marquées a été déterminée par microphotographie. Dans une première série d'essais, on a injecté si- multanément la conjugué B-IIb/Ibc avec la peroxydase de rai- fort dans le muscle médial terminal, et on a constaté un mar- quage radioactif dans le noyau oculomoteur pour le conjugué et la peroxydase de raifort. La principale différence entre la peroxydase de raifort (HRP) et le conjugué B-IIb/Ibc consiste en le fait que la localisation des granules de HRP est limitée aux péri- caryon et dendrites du noyau oculomoteur, tandis que les grains d'argent qui représentent le conjugué marqué avec 1 125 ont été trouvés dans les espaces péricellulaires. 17. Dans une autre série d'essais, on a injecté à deux rats, selon le mode opératoire ci-dessus, le fragment B-IIb marqué par I125 et on a observé des cellules marquées dans les neurones du noyau oculomoteur ipsilatéral chez les deux animaux ainsi traités. Dans une troisième série d'essais, on a injecté si- multanément le fragment Ibc marqué avec I125 et HRP dans le muscle de l'oeil d'un rat. Cette fois-ci,on a observé unique- ment un marquage des cellules du noyau oculomoteur da à la peroxydase de raifort. Chez un autre animalon a injecté seu- lement le fragment Ibc marqué par I125 et on n'a observé au- cun marquage des cellules du noyau oculomoteur. Le fait que le test réalisé avec le premier animal (traité simultanément avec HRP et Ibc marqué par 1125) ait donné des résultats po- sitifs dus à IRP est important, car il montre que le fait que le fragment Ibc ne soit pas transporté de façon axonale ré- trograde ne résulte pas d'une rupture du flux axonal rétro- grade mais plutôt des propriétés spécifiques du fragment Ibc qui semblent être incompatibles avec les fonctions de trans- port intraaxonal. Par ailleurs, on a trouvé que le fragment!bc ne se lie pas aux gangliosides et membranes synaptiques isolées. Par contrele fragment B-IIb se lie de façon spécifique sur les gangliosides et les membranes synaptiques Z voir Journal of Neurochemistry (1977), vol. 28, p. 529-542 7. Les essais ci-dessus montrent que, pour qu'il y ait transport axonal d'une substance, il faut que la substance puisse se lier spécifiquement aux gangliosides et membranes synaptiques. On a alors vérifié, en utilisant les tests décrits dans Journal of Neurochemistry (1977) volo 28, p. 529-542,que les conjugués B-IIb / Médicament obtenus selon l'invention à partir du composé polypeptidique thiolé se fixaient de façon spécifique sur les gangliosides et les membranes synaptiques; ces résultats prouvent que ces substances peuvent donc être transportées axonalement. :::.:: : -: q z9' : O': z: qI-; uam2.J: 6Lú-6L : +: -: -: 96'O: 00: dH: - oq1 ue::: :::i + OOP IS0'15 iI-E-I;9 uamâ?-J:: L61-6L -_: q: 9'Z: VAI: ú: qI- Igi uo;: 08-6ú * III : :::::: : + q PZ: 0' 001: q II-E-I[ uemuamx: 96T-6L +,: q Pg: 'g: O 0'1: ú qIIl-5z %Uuome t;: 96I-6úII :-::::: : +: -: -: 96 'O 00: OOSH: : + ' q z: I: ú: qI/qII-G gnânnuoo: LLP-6L I ebJod: (W:):E r:Tss :::p :: (2/T n: /: / /:: : : D:T o:: 4p;o%: sd anbTdsulIU -OT(Pn) p o (!u//o)A: UDuolnenBJ9: eoeJ ST:s %odsu: lwuV: -opM: ep emnIOA: -ueouoo: nenb:eoueJ@pfip:s!ssM ::: ::. aptOz%94 %jaodsuuj4 ep sTusse sep 9mns'9 iiI avraéVL rl- r'- c- C'J O -I 19. REITENDICATIONS. 1. A titre de produit nouveau, le composé polypep- tidique thiolé constitué par le fragment B-1Ib de la toxine tétanique, sur lequel est fixé, directement ou indirectement, au moins un groupe -SH. 2. Composé polypeptidique thiolé selon la revendi- cation 1, caractérisé en ce qu'il est obtenu par thiolation et en ce qu'il comporte un ou plusieurs groupes Z-SH, Z étant le résidu de l'agent de thiolationo 3. Composé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que Z est choisi parmi les groupes ci-a- * près: IlH2+, Cl -C - (CN2)3-; Co - CH - CH2 - C-2 -;- c- CO i I I NH - CO- Ci3 C% - COaH - C - (CH2)3- Nil NH 4. Procédé pour l'obtention du composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on effectue la thiolation du fragment B-IIb à l'aide d'un agent de thiolation dans des conditions telles que les propriétés de transport axonal et de fixation sur les récepteurs spéci- fiques de la toxine tétanique dans le système nerveux central du fragment B-I1b ne soient pas dénaturées. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'agent de thiolation est choisi parmi: le 4-méthyl-mercaptobutyrimidate, le 2iminothiolane, la N-acétylhomocystéine thiolactone, l'anhydride S-acétyl-mercaptosuccinimique. 6. Application du composé polypeptidique thiolé se- lon l'une quelconque des revendications 1 à 3 à titre d'a- gent de transport neuropharmacologique spécifique pour véhicu- ler un médicament vers le système nerveux central. 7. Application du composé polypeptidique thiolé se- lon l'une quelconque des revendications 1 à 3 à titre de marqueur spécifique des cellules neuronales. 20. 8. Procédé de couplage d'un médicament avec le composé polypeptidique thiolé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, c ractorisé en ce qu'il consiste: 1- à introduire sur/médicament à fixer des groupes di- thiopyridyle; 2- à faire réagir le médicament porteur de groupes di- thiopyridyle avec le composé polypeptidique thiolé selon 1'- une quelconque des revendications 1 à 3. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce queIdans l'étape 1, on utilise un agent de dithiopyri- dylation, tel que le N-succinimidyl-3-(2-pyridyl-dithio)pro- pionate ou la dithiopyridine. 10. Procédé de couplage du médicament avec le com- posé polypeptidique thiolé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il consiste à: 1) faire réagir le médicament à fixer avec l'ester de méta-maléimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide; 2) à faire réagir le composé résultant avec le composé polypeptidique thiolé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 3. 11. Conjugué fragment B-IIb / médicament comportant au moins un pont disulfure. 12. Conjugué fragment B-IIb / médicament comportant au moins une liaison irréversible -S-. 13. Conjugué fragment B-IIb / médicament obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10. 14. Conjugué fragment B-IIb / médicament selon l'u- ne quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que le médicament est une substance pcrtant des groupes -NH2. 15. Conjugué fragment B-IIb / médicament selon l'u- ne des revendications 11 ou 14, caractérisé en ce que le mé- dicament est le fragment A de la toxine cholérique, le frag- ment A de la toxine diphtérique, un dipyrido-indole.