Brevet FR2461500A1 — publié le 19810206

La présente invention concerne un médicament contre la granulocytopénie humaine et plus particulière- ment un procédé de préparation d'une substance qui agit directement sur les cellules souches granulopoiétiques (désignées simplement ci-après sous le nom de cellules souches), stimulant ainsi la prolifération et la diffé- renciation de ces cellules [dans ce qui suit, une telle substance est désignée sous le nom de CSF (facteur de stimulation des colonies)]. Il est bien connu que le CSF joue un rôle essentiel dans la granulopoiêse et dans la formation des monocytes (cellules qui doivent encore grandir pour donner des macrophages), et/ou des macrophages, car le CSF du corps humain vivant agit sur les cellules souches -qui sont les cellules mères de ces granulocytes, mono- cytes et macrophages, en induisant leur prolifération et leur differentiation ietcalfg Do., Experimental Haemotology, Vol. 1, 185-201 (1973)]. On se serait attendu à ce que le CSF, présentant cette activité, soit utilisé comnme médicament pour le traitement de la granulocytopénie [Fumimaro Takakn, Igakn no A^umi (Progress in Medical Science), Volo 95, N 2t 4-50 (1975)]. L'utilisation effective du CSF comme médicament n'a cependant pas été encore réalisée en raison du fait que le mécanisme de formation des granulocytes, monocytes et macrophages in vivo est compliqué, queil existe toujours une partie inconnue dans le comportement du CSF dans ce mécanisme, et quoit était difficile de produire de grandes quantités de CSF d'une qualité phar- macologiquement acceptable. En ce qui concerne l'utilisation du CSF comme réactif de diagnostic, on savait que la mesure du nombre de cellules r5agissant au CSF dans les cellules de la moelle des os est d'une grande importance pour le pro- nostic concernant un malade souffrant de leucémie mvélo- gêne (Nakao and Takakn, Ed.: "'Proliferation and Diffe- rentiation of Blood Cells - Fundumental and Clinical aspects -, p. 29, Published by Kagakn Hyoronsha Co., Japan, 1975) et-que le CSF est utile comme stimulateur du réactif de référence à cet effet. Cependant, de même que dans le cas de l'utilisation pharmaceutique indiquée ci-dessus, l'utilisation du CSF dans le diagnostic n'a pas encore été mis en pratique en raison de la difficul- té de produire de grandes quantités de CSF ayant une qualité suffisante pour l'utilisation diagnostic. Pour la préparation du CSF qui agit directe- ment sur les cellules souches, on connait des procédés qui consistent à cultiver des leucocytes du sang péri- phérique [Price, G.B. et al., Biochemical Journal, Vol. 148, 209-217 (1975)], des cellules placentaires humaines [Burges, A.W. et al., Blood, Vol. 49, N04, 513-583 (1977)] ou un certain type de cellules cancéreuses dites tumeurs produisant du CSF [Nakaaki Osawa et al., Acta Hematologica Japonica, Vol. 42, N02, 237 (1979)]. Parmi ces procédés, ceux qui sont susceptibles de produire du CSF convenant pour l'utilisation pharmaceutique sont les deux premiers. Cependant, les procédés classiques utilisant ces cellules sont des procédés expérimentaux destinés à la préparation de faibles quantités de CSF et cui ne conviennent pas pour la production à grande échelle. De plus, pour préparer lt CSF par les procédés classiques, le sérum est un constituant indispensable du milieu de culture des cellules (en l'absence de sérum dans le milieu, il ne se forme pas de CSF) et le sérum de boeuf ou le sérum de foetus de veau ont été classiquement utilisés. Pour éviter des effets secon- daires provoqués par les protéines étrangères contenues dans ces milieux, il est nécessaire d'éliminer ces protéines après culture des cellules ou d'utiliser du sérum humain. L'élimination de ces protéines du CSF produit dans le milieu exige une procédure laborieuse et est difficile, tandis que le sérum humain présente l'inconvénient de son coût élevé qui conduit à une augmentation du coût de production. Comme il a été décrit ci-dessus, en dépit du fait que les utilisations du CSF comme médicament et comme réactif de diagnostic étaient connues, aucun procé- dé n'avait été mis au point jusqu'à présent pour la production à grande échelle et à faible coût d'un CSF ne présentant pas d'effets secondaires. Un des buts de l'invention est de fournir un procédé permettant une production à grande échelle d'un CSF ne présentant pas d'effets secondaires et utilisable comme médicament contre la granulqcytopénie humaine, et comme réactif de diagnostic pour la leucémie myélogène. Conformément à l'invention, il est fourni un procédé de production d'une substance capable de stimuler la prolifération et la différenciation des cellules souches granulopoiétiques humaines, qui consiste à culti- ver des monocytes et des macrophages, isolés du sang périphérique humain, dans un milieu synthétique pour culture de tissu, contenant une glycoprotéine isolée de l'urine humaine et capable de stimuler la formation de granulocytes humains ou de macrophages et de granulocytes de souris, produisant ainsi une substance active dans le milieu, et à récupérer la substance active du milieu. 25.La glycoprotéine capable de stimuler la forma- tion de granulocytes humains [désignés ci-après sous le nom de glycoprotéine (H)],qui est isolée de l'urine humaine et utilisée dans l'invention, est décrite en détail dans la demande de brevet japonaise en cours d'examen no 140.707/79, dans la demande de brevet alle- mande no 2.910.745 et dans la demande de brevet britan- nique no 2.016.477. Une glycoprotéine capable de stimuler la formation de macrophages et de granulocytes de souris a été isolée de l'urine humaine, elle a été décrite comme une glycoprotéine connue contenant de l'acide sialique par Stanley and Metcalf, Australian Journal of Experi- mental Biological Medical Science, 47, 467-483 (1969); stanley et al., Federation Proceedings, 34, N 13, 2272- 2278 (1975); Laukel et al., Journal of Cellular Physio- logy, 94, 21-30 (1978) etc.. Le milieu synthétique pour culture de tissus utilisés dans l'invention peut être un milieu synthétique du commerce destiné à l'utilisation dans la culture des tissus ou une culture cellulaire telle que par exemple le milieu 5A de McCoy, T.A., Maxwell, M., et Kruse, P.F.: Proc. Soc, Exper. Biol. and Med., 100: 115-118 (1959), vendu par Gibco Co., Mélange de Nutrients HAMF-10 [Ham, R. G., Exp. Cell Res., 29: 515-526, sold by. Gibco Co.], RPMI-1640 [Iwakata, S., Grace J. T. J., N. Y. I. of Med., 64/18: 2279-2282 (September 15, 1964) vendu par Nissui Seiyakn Co.], ou du milieu MEM de Eagle supplémenté en amino-acides [Eagle, H. Science 130: 432 (1959), vendu- par Nissui Seiyakn Co.]. Le procédé de l'invention est décrit ci-dessous en détaiI. (1) Isolement des monocytes et des macrophages. Du sang recueilli de la veine d'individus en bonne santé au moyen d'une seringue héparinisée est placé dans un tube à essai stérile et laissé au repos à la température ambiante pendant une a deux heures. Les opérations ultérieures sont toutes effectuées dans des conditions aseptiques. Apres repos, la couche supérieure de leukocyte est recueillie, lavée une fois avec un milieu synthétique pour culture de tissus, et soumise à la précipitation centrifuge à gradient de densité [Mahmood, T. et W.A. Robinson, Blood, 51, N 5, 879-887 (1978)] pour la fractionner en une couche contenant des monocytes, macrophages et des lymphocytes et une autre couche contenant des granylocytes. La première couche est recueillie pour obtenir une fraction cellulaire. La fraction cellulaire est mise en suspension dans un milieu synthétique du commerce pour culture de tissus (désigné ci-après en abrégé sous le nom de milieu) et elle est centrifugée pour éliminer et rejeter les liquides sur- nageant. Les cellules ainsi recueillies sont lavées par addition du même milieu que ci-dessus. Le lavage est répété au moins deux fois. Les cellules lavées sont mises en suspension dans un faible volume du même milieu. Une partie de la suspension obtenue est soutirée et le nombre de cellules est mesuré avec un compteur automatique des cellules du sang. Le rapport en nombre des monocytes et des macrophages au lymphocytes est déterminé par examen microscopique d'un frottis traité par le colorant de Wright - Giemsa. La suspension cellulaire est répandue sur une boite de Pétri en verre ou en matière plastique de sorte que le nombre d'inocula (monocytes et macropha- ges) puisse prendre la valeur prescrite, de préférence de 10 5à 107 par boite, puis additionné d'un milieu synthétique du commerce pour culture de tissus supplé- mentée avec 5 à 20 % (en volume par rapport au milieu; ceci vaut également pour ce qui suit) de sérum, et laissé reposer en atmosphère humidifié dans de l'air à 5 % de C 2 à 370C pendant 1 à 2 heures. Pendant la période de repos, les monocytes et les macrophages se collent sur le fond de la boite, tandis que les lymphocytes restent en suspension dans le milieu. Le milieu est ensuite jeté et la boite lavée plusieurs fois par addition d'un milieu ne contenant pas de sérum ou un sérum physiologique. Après le traitement, la plus grande partie des lymphocy- tes est éliminée, tandis que les monocytes et les macro- phages restent fixés sur le fond de la boîte. Par examen microscopique, on trouve que 95 % ou davantage des cellules fixées sur le fond sont des monocytes et des macrophages, et que leur nombre est de 105 à 107 par boite. (2) Culture des monocytes et macrophages. A la boite de culture ci-dessus, on ajoute un milieu synthétique avec ou sans supplément de sérum et contenant au moins 0,1 pg/ml de milieu de glycoprotéine (H) ou de fraction contenant de la glycoprotéine (H) ou au moins 500 unités/ml de milieu de glycoprotéine (M) ou de fraction contenant de la glycoprotéine (M)(l'unité de glycoprotéine sera décrite plus loin), de telle sorte que la densité de population des monocytes ét*des macro- phages puisse être d'au moins 105/ml de milieu. Le milieu inoculé est mis à incuber à 370C dans une atmosphère humidifiée d'air à 5 % de CO2 pendant 1 à 7 jours pour produire du CSF dans le milieu. Le milieu synthétique utilisé ci-dessus est le milieu du commerce précédemment mentionné pour la culture des tissus. Les conditions optimales pour la production de CSF conformément à l'invention en ce qui concerne la durée de culture, la quantité de glycoprotéines à ajouter, la auantité de cellules à inoculer, la quantité de sérum à incorporer et le type de milieu sont décrits ci-après dans les exemples plus expérimentaux. Dans la préparation du CSF pour l'utilisation pharmaceutique conformément à l'invention, on utilise un milieu contenant du sérum humain ou un milieu exempt de sérum pour éviter des effets secondaires provoqués par des protéines étrangères. Pour préparer le CSF en vue d'utilisation comme réactif de diagnostic, d'autre part, on peut utiliser un milieu additionné de sérum de boeuf ou de sérum de foetus de veau. Il est également possible d'utiliser un flacon de culture à la place de la boîte de Pétri. En outre, on peut utiliser plusieurs fois les monocytes et macrophages qui ont subi la culture. (3) Glycoprotéine devant être ajoutée au milieu. La glycoprotéine utilisée dans lé procédé de l'invention est celle isolée de l'urine humaine et capable de stimuler la formation de granulocytes humains ou de macrophages et de granulocytes de souris ou une fraction contenant cette glycoprotéine. La glycoprotéine capable de stimuler la forma- tion de granulocytes humains peut être obtenue conformé- ment à la description de la demande de brevet japonaise en cours d'examen No 140.707/79 et des autres brevets, tels que décrits ci-dessous. L'urine fraîche recueillie d'un individu en bonne santé est ajustée à pH 6-9, de préférence 7-8, avec des solutions acides ou alcalines diluées et centri- fugées pour éliminer les impuretés contenues dans l'urine. Le liquide surnageant ainsi obtenu est mis en contact avec un adsorbant contenant du silicium, tel que par exemple du gel de silice, un gel de silice- silicate de magnésium, de la terre de diatomée, un verre de silice ou de la bentonite, et les constituants adsor- bés sont élevés avec une solution alcaline, de préférence à pH 9, ou supérieure. La solution alèaline utilisée pour l'élution n'est pas déterminante, mais elle est de préférence une solution aqueuse d'hydroxyde d'ammonium, d'hydroxyde de sodium etc. a une concentration de 0,3 à 1,5 M. L'éluat ainsi obtenu est ajusté à pH 7-8 et additionné d'un sel neutre tel que par exemple du sulfate d'ammonium à 70 % de la saturation pour relarguer la substance active, ce qui fournit une fraction-brute contenant la glycoprotéine. La fraction brute ci-dessus est redissoute dans une faible partie d'une solution alcaline débarrasser des substances de faible masse moléculaire, ayant une masse moléculaire de 10.000 ou moins, par ultrafiltration et mise en contact avec un échangeur de cations (par exemple du carboxyméthyldex- trane, de la carboxyméthylcellulose ou de la phospho- cellulose) pour éliminer les impuretés contenues dans la solution. Avant ce contact, la fraction brute conte- nant la glycoprotéine et l'échangeur d'ions sont mis en équilibre à pH 68 avec une solution tampon de préférence 0,01 - 0,15 M, de façon que le contact puisse être effectué dans des conditions de pH pratiquement neutre. La plus grande partie de la glycoprotéine traverse l'é- changeur d'ions sans être adsorbée. Après concentration, l'effluent concentré est mis en équilibre avec une solution tampon diluée à pH 6-8, et versé sur une colonne d'échangeur d'anions (par exemple, de la DEAEcellulose mise en équilibre avec le même tampon que ci-dessus), pour adsorber la glycoprotéine sur la colonne. La glyco- protéine adsorbée est éluée par élution à gradient de concentration linéaire en utilisant une solution saline 0,1 à 0,3 M, par exemple une solution de chlorure de sodium. L'élution s'effectue à une concentration en sel de 0,1 M ou davantage, mais il est difficile d'obtenir une séparation parfaite. Les fractions d'effluents aux concentrations en sel de 0,1-0,3. M sont rassemblées, et si nécessaire, les fractions rassemblées sont désali- nisées et concentrées (la fraction obtenue est désignée sous le nom de fraction A). La fraction A peut être utilisée telle quelle dans le procédé de l'invention. Il est également possible, avant de la soumettre à-l'élution par gradient de concentration linéaire, de purifier la fraction de glycoprotéine par adsorption sur un échangeur d'anions et élution progres- sive avec une solution saline 0,1-0,3 M. En vue d'une purification ultérieure, la fraction A obtenue ci-dessus est soumise à une chromato- graphie de filtration sur gel sur un gel de polymère fortement réticulé ayant une reprise d'eau de 10 à 20 ml/g, telle que par exemple le"Sephadex G-15U'ou le Biogel P-100"; les substances actives sont développées avec un tampon salin 0,05-0,1 M et des fractions ayant des valeurs d'effluents relatives de 1,11 à 1,60, de préférence de 1,11 à 1, 45, sont recueillies, désalinisées et concentrées ou lyophilisées (cette fraction est dési- gnée sous le nom de fraction B). La fraction B contenant la glycoprotéine ainsi obtenue peut aussi être utilisée dans le procédé de l'invention. Le volume d'effluents relatif dont il est question ici est le volume exprimé par le rapport Ve/V0 (ou Ve représente le volume de solvant nécessaire pour élever la substance dans la colonne et V0 représente le volume de vide de la colonne de gel). En vue d'une purification ultérieure, la subs- tance semi-purifiée obtenue ci-dessus est dissoute dans une solution tampon dilué contenant un sel 1,0 à 2,0 M par exemple une solution de tampon phosphate à pH 6,0 à 8,0, de préférence 6,0 à 7,0, contenant du chlorure de sodium 1,0 à 2,0 M, et soumise à une chromatographie d'affinité avec comme adsorbant un sucre tel que par exemple la concanavaline A - Sépharose 4B (fournie par Pharmasia Fine Chemical) qui a été mise en équilibre avec la même solution tampon. La glycoprotéine adsorbée sur la colonne d'affinité est élevée avec une solution saline 1, 0-2,0 M dans du tampon dilué à pH 6,0-8,0, de préférence 6,0-7 0, contenant la saccharide (par exemple a-méthyl-D-glucoside) 20-100 mM. Les fractions contenant la glucoprotéine sont combinées, et si nécessaire désa- linisées et concentrées ou lyophilisées. La fraction obtenue peut également être utilisée dans le présent procédé. En vue d'une purification supplémentaire, la fraction ci-dessus est soumise à une électrophorèse de zones préparatives en utilisant comme milieu de support, par exemple un gel de polyacrylamide ou un gel d'agar, à pH 7,0-9,0, et on recueille une fraction de glycopro- téine hautement purifiée du milieu de support avec une solution saline diluée en refroidissant. Cette fraction est désalinisée et concentrée ou lyophilisée. La glyco- protéine purifiée peut aussi être utilisée dans le procédé de l'invention. La glycoprotéine utilisée dans le présent procédé, qui stimule la formation des granulocytes et des macrophages de souris, a été décrite dans la lite- SR 1354 JA/GL rature précitée. La méthode de préparation de Stanley et Metcalf, celle de Stanley et al. et celle de Laukel et al. sont décrites en détail dans les exemples 6, 5 et 7, respectivement, dans la présente description. L'activité biologique des préparations de glycoprotéine pour les cellules de moelle osseuse de souris, est déterminée de la façon décrite ci-après et exprimée en terme d"'unité". A 1 ml de milieu de McCoy SA supplémenté avec 20 % de sérum de foetus.de veau, on ajoute de l'agar-agar à 0,3 % et 1 x 105 cellules de moelle osseuse de souris C 57Bl/6J, avec 0,1 ml de la glycoprotéine essayée ou une fraction la contenant. On place le milieu contenant la glycoprotéine ainsi prépa- rée dans une boite de Pétri en matière plastique de 35 mm de diamètre, et on la fait incuber à 370C en atmosphère humidifiée d'air à 5 % de CO2 pendant 7 jours. Lorsque l'incubation est terminée, on compte le nombre de colonies séparées contenant chacune 50 cellules ou davantage avec un microscope inversé. L'activité biolo- gique d'un échantillon formant une colonie est supposée être d'une unité. Pour évaluer le degré de purification d'un échantillon de glycoprotéine, on calcule l'activité spécifique par l'équation suivante unité de l'échantillon activité spécifique = quantité de glycoprotéine ou defraction contenant de la glycoprotéine (mg) L'activité spécifique augmente avec l'avance- ment de la purification. La glycoprotéine ou la fraction contenant la glycoprotéifie ajoutée au milieu dans le procédé de l'invention peut être une fraction purifiée ayant une activité spécifique élevée, mais elle est de préférence une glycoprotéine d'une activité assez faible obtenue au cours de la purification. Les quantités des glycoprotéines (H) et (M) devant être ajoutées au milieu sont d'au moins 0,1 pg, de préférence de 10 à 100 pg pour 1 ml de milieu, et d'au moins 500 unités, de préfé- rence de 1000 unités ou davantage pour 1 ml du milieu respectivement. (4) Récupération de la substance active dans le milieu conditionné. Le milieu conditionné contenant du CSF préparé conme il a été décrit cidessus est recueilli dans la boite de Pétri et centrifugé à 1.000-2.000 x g pendant à 10 minutes pour obtenir un liquide surnageant contenant du CSF d'activité élevée. Le liquide surnageant ci-dessus est utilisable pour la préparation d'un réactif de diagnostic clinique ou d'un réactif de référence pour tester la formation de colonies par des cellules souches granulopoiétiques humaines. A cet effet, l'activité du liquide surnageant est ajustée de telle sorte que 0,1 ml du liquide surna- geant puisse contenir une activité de CSF suffisante pour former au moins 100 colonies de granulocytes humains, il est filtré à travers un filtre à membrane, et placé aseptiquement dans un récipient, puis herméti- quement scellé de façon à obtenir un réactif liquide. Un réactif sous forme de poudre préparé par lyophilisa- tion aseptique du substrat stérile ci-dessus. Pour l'usage pharmaceutique, on dialyse un milieu conditionné obtenu en utilisant un milieu exempt de sérum ou un milieu supplémenté en sérum humain contre de l'eau pour éliminer les constituants du milieu, et on le stérilise par filtration sur.membrane. Si néces- saire, on concentre le fil-trat, on le verse aseptiquement dans un récipient et on le scelle hermétiquement de façon à obtenir un médicament sous forme liquide. Il est également possible d'obtenir un médicament sous forme de poudre en stérilisant la solution dialysée par filtration sur membrane et en la lyophilisant aseptiquement. Pour purifier encore le CSF destiné à l'usage pharmaceutique, on sépare le liquide surnageant ci-dessus en une fraction de masse moléculaire élevée (masse molé- 2461s00 culaire supérieure à 5.000 ou 10.000) et une fraction de faible masse moléculaire (masse moléculaire inférieure à 5.000 ou 10.000) au moyen d'une membrane d'ultrafiltra- tion (limite de séparation des masses moléculaires 5.000 ou 10.000). Bien que les deux fractions contiennent du CSF, 90 % ou davantage du CSF se trouve dans la fraction de masse moléculaire élevée. On peut obtenir un médicament en concentrant sous vide la fraction de faible masse moléculaire. Le concentrat de masse moléculaire élevée est dissout dans une solution tampon 0,01-0,1 M (pH 6,0-8,0) et mis en contact avec une résine échangeuse d'anion telle que par exemple de la DEAE-cellulose, du DEAE-Séphadex ou du QAE-Séphadex qui a été mis en équilibre avec cette solution tampon, pour faire adsorber le CSF sur la résine. Le CSF adsorbé sur la'résine est élevé par une solution tampon 0, 1-0,3 M (pH 6,0-8,0) pour obtenir un produit purifié. L'éluat ci-dessus peut encore être purifié par concentration et chromatographie ultérieure sur tamis moléculaire par filtration sur gel. Le gel destiné à la filtration sur gel peut être par exemple du'Séphadex G-150'' du'Biogel P-100"et de l"'Ultrogel AcA-44". Lorsque l'activité de CSF est obtenue en utilisant un milieu exempte de sérum, de traitement par une résine échangeuse d'anions peut être omis et la purification est effectuée directement par chromatogra- phie à filtration sur gel. Une solution tampon de développement approprié dans la chromatographie de fil- tration sur gel est une solution tampon 0,01-0,3 M (pH 6,0-8,0). Les fractions d'activité de CSF obtenues par filtration sur gel sont rassemblées et la fraction globale est concentrée, désalinisée et lyophilisée pour obtenir un CSF purifié. Sur les CSF purifiés obtenus ci-dessus, on effectue une analyse des protéines contaminantes par immunoëlectrophorèse en utilisant de l'antisérum humain et de l'antisérum de boeuf. Des traces de protéines analogues à la globuline humaine et de protéines analogues à la sérum-albumine et à la globuline provenant vraisem- blablement toutes deux du sérum de foetus de veau sont détectées dans les CSF obtenus à partir d'un milieu supplémenté en sérum de foetus de veau. Par ailleurs, comme absolument aucune de ces substances protéiniques n'est détectable dans le CSF produit dans le milieu exempt de sérum, celui-ci peut être utilisé-comme médi- cament exempt d'effets secondaires. Pour l'injection, les médicaments liquides sont utilisés tels quels et les poudres sont avantageuse- ment dissoutes dans de l'eau stérile, du sodium physio- logique stérile, etc. avant l'emploi. Le médicament préparé par le présent procédé est administré A un malade souffrant de granulocytopénie à une dose effective supérieure à 77,8 mg/kg de poids corporel/jour. Exemple expérimental 1. Experience sur la période d'incubation. (1) Isolement de monocytes et de macrophages et préparation de la glycoprotéine. On isole des monocytes et des macrophages comme il sera décrit ultérieurement dans l'exemple 1-(1). Les glycoprotéines utilisées dans l'expérience ont été prépa- rées comme il sera décrit ci-après dans l'exemple 1-(2) et dans l'exemple 5-(2). La glycoprotéine (H) préparée comme dans l'exemple 1-(2) est un produit hautement purifié au stade de purification finale et la glycopro- téine (14M) préparée comme dans l'exemple 5-(2) est un produit de pureté ordinaire (activité spécifique: 180.000). (2) Incubation des monocytes et des macrophages. On prépare deux milieux contenant chacun 100 pg/ml de glycoprotéine (H) et deux milieux exempts de glycoprotéine. Comme milieux, on utilise un milieu de McCoy 5A exempt de sérum et un milieu de McCoy 5A com- plété contenant 20 % de-sérum de foetus de veau. A chaque boîte de Pétri contenant des monocytes et des macrophages fixés sur le fond, on ajoute l'un des quatre milieux à raison de 106 des monocytes et macro- phages pat ml de milieu. Chaque milieu est mis à incuber de la mnme manière que dansl'exemple 1-(3). Un volume pré- déterminé du milieu est retiré de chaque boite avant l'incubation et après des périodes d'incubation de 1, 3, 5 et 7 jours. Par ailleurs, on répète le mode opératoire ci-dessus, excepté qu'on utilise, la glycoprotéine (M) à raison de 1.000 unités/ml de milieu à la place de cette même quantité de la glycoprotéine (H). (3) Essai du CSF dans le milieu conditionné. -L'activité du CSF de chaque milieu conditionné a été déterminée par la formation de colonies de cellules de moelle osseuse humaine. La moelle osseuse est prélevée dans le sternum d'un individu en bonne santé au moyen d'une seringue héparinisée après une ponction sternale. La moelle osseuse prélevée est centrifugée à 1.000 x g pendant 10 minutes pour recueillir la couche lococytaire. La couche lococytaire est lavée avec un milieu SA de McCoy, mise en suspension dans un milieu 5A de McCoy contenant 20 % de sérum, étalée dans une boîte de Pétri, additionnée de quelques mg/ml de milieu d'un fer car- bonyle en poudre qui a été soumis à une stérilisation par l'air sec, et laissé reposer dans un incubateur à 370C pendant 1 à 2 heures. Après repos, les cellules phagocytaires aui ont phagocytée les particules de fer carbonyle sont fixées au fond de la boîte de Pétri au moyen d'un aimant et la suspension de cellules surna- geantes est recueillie. Les cellules en suspension sont des cellules de moelle osseuse non adhérentes, non phagocytaires et elles sont utilisées pour la détermi- nation de l'acticité du CSF. Ces cellules de moelle osseuse sont lavées par centrifugation et mises en suspension dans un faible volume du milieu.Le nombre de cellules nuclées dans la suspension est déterminé après traitement par un colorant acide acétique-gentiane. Les cellules nuclées.non adhérentes, non phagocytaires sont ajoutées à un milieu 5A de Mc Coy contenant 0,3 % d'agar-agar et -20 % de sérum de foetus de veau, de telle sorte que le milieu puisse contenir 2 x 105 de ces cellules par ml. Après addition du milieu conditionné à raison de 0,1 ml/ml de milieu, le milieu inoculé à 370C dans une atmosphère humidifiée d'air à % de Co2 est mis à incuber pendant 10 jours. Après incubation, on compte sous un microscope le nombre de colonies formé parmi les agrégats cellulaires (le terme "colonie" désigne ici.-unagrégat cellulaire contenant cellules ou davantage). L'activité du CSF est exprimée par le nombre de colonies et utilisée comme mesure de la production de CSF. Les résultats sont donnés dans le tableau 1. TABLEAU 1 \ Conditions Activité du CSF (nombre de colonies) pour 0,1 ml de milieu de culture conditionné Durée Milieu contenant 20 % de sérum Milieu exempt de sru d'incu- de foetus de veau bation (jours) Avec addition Sans addition Avec addition Sans addition de glycoprotéine de glycoprotéine de glycoprotéine de glycoprotéine Glycoprotéine (H) avant incubation 0 0 0 O 1 '13 + 3 3+1 2+1 0 3 116 + 4 24 + 3 25 + 2 1 + 1 117+ 3 23 + 1 20 + 1 0 7 98 + 1 16 + 4 18 + 1 0 Glycoprotéine (M) avant incubation 0 O 0 O 1 20 + 8 6+ 4 0 0 3 89 + 6 29 + 8 35 + 4 3 + 1 86 + 3 30 + 4 30 + 6 4 + 1 7 69 + 4 16 + 2 23 + 4 2 + 1 j-. Un o> Comme le montre la tableau 1, on trouve que par addition de l'une ou l'autre glycoprotéine, la production de CSF est presque maxima au troisième jour de l'incubation dans chacun des milieux. Dans le milieu contenant 20 % de sérum de foetus de veau, la production de CSF est nettement plus importante en présence de glycoprotéine qu'en l'absence de glycoprotéine (procédé classique). Dans le milieu exempt de sérum, le CSF est formé lorsque la glycoprotéine est ajoutée, tandis qu'il ne se forme presque pas de CSF en l'absence de glyco- protéine. Des résultats ci-dessus, il ressort clairement que dans la production de CSF par culture de monocytes et de macrophages in vitro, ces glycoprotéines stimulent la production de CSF, que le milieu contienne ou non du sérum. On a trouvé aussi qu'une période d'incubation appropriée est de 3 à 7 jours, de préférence de 3 jours. Il est à noté que lorsque l'on n'ensemence pas de mono- cytes et de macrophages, aucune activité du CSF n'est détectée dans le milieu conditionné, que la glycoprotéine soit présente ou non. Exemple expérimental 2. Expérience sur la quantité de glycoprotéine ajoutée au milieu. On prépare des milieux en ajoutant les mêmes glycoprotéines (H) et (M) que dans l'exemple expérimental 1 à un milieu de Mc Coy 5A supplémenté avec 20 % de sérum de foetus de veau et un milieu de Mc Coy 5A exempt de sérum. Dans le cas de la glycoprotéine (H), la quantité ajoutée au milieu est de 0,1, 1,0, 10,0 ou 100pg/ml de milieu. Dans le cas de la glycoprotéine (M), la quantité ajoutée est de 100, 500, 1.000 ou 2.000 unités/ml de milieu. Chaque milieu préparé est versé dans la boîte de Pétri contenant des monocytes et macrophages fixes en son fond, et mis à incuber pendant 3 jours de la même manière qu'à l'exemple expérimental 1. L'activité du CSF de chaque milieu conditionné est déterminée comme dans l'exemple expérimental 1 pour évaluer la production de CSF. Les échantillons obtenus en faisant incuber cha- que milieu sans addition de glycoprotéine ont été utilisés comme témoin. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 2. TABLEAU 2 Comme le montre le tableau 2, par addition de l'une ou l'autre glycoprotéine, la production de CSF augmente avec la quantité de glycoprotéine ajoutée. Compte tenue des résultats ci-dessus, ainsi que des Activité du CSF (nombre de colonies) Quantit6 de gly- pour 0,1 ml de mil.ieu conditionné ajoutée Milieu contenant Milieu exempt coprotine 20 % de sérum de de sérum foetus de veau Glycoprotéine (H) ( 0,1 51 + 2 9 + 1 1,0 116 + 4 25 + 2 ,0 166 + 10 53 + 3 ,0 170 + 8 80 + 4 Glycoprotéine (M) (unités/ml) 0 (témoin) 21 + 6 2 + 1 28 + 3 6 + 3 500 96 + 10 13 + 6 1000 129 + 8 49 + 6 2000 170 + 6 85 + 8 résultats précédemment indiqués dans le tableau 1 (résul- tats obtenus par 3 jours d'incubation), on peut admettre que la production de CSF est augmentée de façon marquee par la présence de 0,1 pg de glycoprotéine (H) ou de 500 unités de glycoprotéine (M) dans 1 ml du milieu. Dans le présent procédé, par conséquent, la quantité de glycoprotéine devant être ajoutée à 1 ml du milieu est d'au moins 0,1 pg, de préference de 10 à 100 pg pour la * glycoprotéine (H) et d'au moins 500 unités, de préfé- rence de 1.000 unites ou davantage pour la glycoprotéine (M). Exemple expérimental 3. Expérience sur la quantité de monocytes et de macrophages à inoculer dans le milieu. Une série de milieux conditionnés ont été obtenus en répétant le mode opératoire de l'exemple expérimental 1, excepté que le nombre de monocytes et de macrophages inoculés dans 1 ml du milieu est de 0, 103, 104, 105 ou 106; 1 pg de la glycoprotéine (H) ou 500 unités de la glycoprotéine (M) sont ajoutées à 1 ml du milieu de Mc Coy 5A supplémenté par 20 % de sérum de foetus de veau ou de milieu Mc Coy 5A exempt de sérum; la durée d'incubation est de 3 jours. Dans les milieux conditionnés obtenus, on détermine l'activité du CSF pour évaluer la production de CSF de la même manière qu'à l'exemple expérimental 1. Les résultats expéri- mentaux sont donnés dans le tableau 3. TABLEAU 3 Nombre de cellules inoculées (nombre/ml) Milieu contenant de la glycopro- téine (H) - 0 Milieu contenant de la glycopro- téine (M) O Activité du CSF (nombre de colonies) pour 0,1 ml de milieu conditionné Milieu contenant % de sérum de foetus de veau 13+ 1 + 2 116 + 4 + 7 o0 19 + 6 29 + 10 98 + 6 169 + 9 Milieu exempt de sérum o0 o 6+1 + 2 69 + 5 o 8+4 31 + 3 74 + 2 Comme il ressort clairement du tableau 3, dans l'un quelconque des milieux utilisés dans l'expérience, une forte quantité de CSF a été formée lorsqu'au moins 105 cellules étaient présentes dans 1 ml du milieu. Dans le procédé de l'invention, par conséquent, il est souhai- table d'inoculer au moins 105 de monocytes et de macrophages dans 1 ml du milieu. Exemple expérimental 4. g Expérience comparative concernant la production de CSF sur divers milieux. On compare les uns aux autres quatre milieux du commerce pour culture de tissus ou culture de cellules en ce qui concerne la production du CSF. Les milieux utilisés dans l'expérience comprennent le milieu de Mc Coy 5A (Gibco Co.), le mélange de nutrients HAMF-10 (Gibco Co.), le RPMI-1640 (Nissui Seiyaku Co.), et le milieu MEM d'Eagle complémenté par des amino acides (Nissui Seiyaku Co.). A chacun des milieux ne contenant pas de sérum supplémenté on ajoute 1,0 pg/ml de milieu de la glycoprotéine (H) ou 500 unités/ml de milieu de la glycoprotéine (M). On met à incuber les milieux préparés pendant 3 jours de la même manière que dans l'exemple expérimental 1. Dans les milieux conditionnés, on détermine l'activité du CSF de la même manière que dans l'exemple expérimental 1, pour évaluer la production de CSF. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 4. TABLEAU 4 Comme il ressort clairement du tableau 4, l'un quelconque des quatre milieux ci-dessus peut être utilisé pour effectuer le procédé de l'invention, bien que la production de CSF soit un peu plus faible dans le milieu EM. Activité du CSF (noEbre de colonies) pour 0,1 ml de milieu conditionné Milieu Avec addition de Avec addition de glycoprotéine (H) glycoprotéine (M) McCoy 5A 69 + 5 83 + 6 HAMF - 10 71 + 3 76 + 8 RPMI - 1640 75 + 3 81 + 1 MEM 48 + 1 46 + 5 Exemple expérimental 5. Expérience sur la quantité de sérum ajoutée au milieu. Des milieux conditionnés sont obtenus de la même manière que dans l'exemple expérimental 1, excepté que l'on utilise des milieux qui ont été préparés en ajoutant à du milieu de Mc Coy 5A 0, 5, 10, 20 ou 30 % de sérum humain (Green Cross Co.) ou de sérum de foetus de veau (Flow Laboratory Co.), tous deux ayant été chauffés à 58 C pendant 30 minutes, puis 1.g/ml'de milieu de la glycoprotéine (H) ou 500 unités/ml de milieu de la glycoprotéine (M); le nombre des monocytes et des macrophages inoculés dans chaque milieu est de 105/ml; et la durée d'incubation est de 3 jours. Dans les milieux conditionnés obtenus, on détermine l'activité du CSF de la même manière que dans l'exemple expérimental 1 pour évaluer la production de CSF. Les résultats sont donnés dans le tableau 5. TABLEAU 5 Quantité de sérum Activité du CSF (nombre de colonies) pour 0,1 ml de milieu conditionné ajouté (%) Avec addition de Avec addition de sérum humain sérum de foetus de veau Milieu contenant la glycoprotéine (H) aucun 25+ 2 25+ 2 55+ 1 43+ 1 120 + 5 98 + 3 150 + 3 116 + 4 141+ 2 108+ 2 TABLEAU 5 (suite) Milieu contenant la glycoprotéine (M) aucun 21+ 8 21 + 8 5 49+ 6 51 + 4 109 + 5 89 + 2 124 + 7 102 + 6 123+ 8 92 + 5 Comme il ressort du tableau 5, lorsque la quantité de l'un ou l'autre sérum ajoutée au milieu augmente, la production de CSF augmente. Bien que conformément à l'invention le CSF soit produit dans un milieu exempt de sérum, on peut ajouter du sérum de boeuf ou du sérum de foetus de veau au milieu lorsque la production d'une grande quantité de CSF est nécessaire pour l'utilisation comme réactif. La quantité effective de sérum à ajouter à cet effet est d'au moins 5 %, de preférence de 10 % ou davantage. Exemple expérimental 6. L'expérience sur l'addition d'une fraction contenant de la glycoprotéine et d'une fraction hautement purifiée. Dans les exemples expérimentaux 1 à 5, on a utilisé de la glycoprotéine purifiée comme substance active ayant un effet stimulant sur la formation de granulocytes humains (Cas I) et d'autre part, on a utilisé une glycoprotéine de pureté ordinaire ( activité spécifique: 180.000) comme substance active ayant un effet stimulant sur la formation de macrophages et de granulocytes de souris (Cas II). La présente expérience a été effectuée, comme il est décrit ciaprès, pour démontrer que dans le procédé de l'invention, on peut utiliser une matière semi-purifiée à la place de la glycoprotéine purifiée dans le Cas I, et qu'une fraction moins purifiée ainsi qu'une matière hautement'purifiée peuvent être utilisées à la place de la glycoprotéine de pureté ordinaire dans le Cas II. Les fractions contenant de la glycoprotéine utilisée dans l'expérience correspondant au Cas I sont les fractions A et B préparées comme il est décrit ci- après dans l'exemple 1. Ces fractions sont ajoutées chacune à un milieu McCoy 5A exempt de sérum en quantité variable de 0, 0,5, 1,0, 5, 0 et 10 mg/ml correspondant respectivement à 0, 8,3, 16,6, 83,3 et 166,6 pg/ml de milieu en terme de glycoprôtéine active dans la fraction A et de 0, 41,7, 83,4, 417 et 834 gg/ml de milieu en terme de glyçoprotéine active dans la fraction B. Le nombre de monocytes et de macrophages inoculés dans chaque milieu est de10 5/ml et la durée d'incubation est de 3 jours. Des milieux conditionnés sont obtenus par incubation dans des conditions par ailleurs identiques à celles de l'exemple expérimental 1. Comme les fractions A et B contenaient de la sérum albumine humaine excrétée dans l'urine, les échantillons témoins ont été préparés en ajoutant de la sérum albumine humaine (Sigma Co.) au milieu McCoy 5A dans une quantité correspondant à celle contenue dans les milieux préparés ci-dessus; les conditions d'incu- bation étaient les mêmes que ci-dessus. Dans chaque milieu conditionné, on a déterminé l'activité du CSF de la même manière que dans l'exemple expérimental 1 pour évaluer la production de CSF. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 6. Comme dans le Cas II, les matières glycopro- téiniques utilisées dans la présente expérience étaient la fraction C (activité spécifique: 21.000), la fraction D (activité spécifique: 54.000) et la matière - hautement purifiée (activité spécifique: 1.240.000) décrites dans l'exemple 5 et préparées comme à l'exemple 5. Les milieux conditionnés ont été obtenus en répétant le mode opératoire expérimental décrit ci-dessus à propos du Cas I, excepté que les fractions C et D et la matière hautement purifiée (voir exemple 5) ont été ajoutés chacun aux milieux en quantité variable, de 0, 100, 500, 1.000 et 2.000 unités/ml de milieu à la place des quan- tités indiquées des fractions A et B (voir exemple 1) et les essais de contrôle en utilisant la sérum albumine humaine ont été omis. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 6. TABLEAU 6 Effet du degré de purification de la glyco- protéine ayant un effet stimulant sur la formation de granulocytes humains. - - La production de CSF dans un milieu additionné de la fraction A ou B est supérieure à celle dans le milieu témoin, ce qui indique que la glycoprotéine Quantité Activité du CSF (nombre de colonies) ajoutée' pour 0,1 ml de milieu conditionné Glycoprotéine. de l'exemple 1Fraction A Fraction B Témoin (mg/ml) ... .. ....DTD: Aucun 0 0 0 0,5 60 + 1 59 + 1 4 + 1 1,0 121 + 1 114 + 1 _ 6 + 2 ,0 170 + 3 103 + 3 14 + 2 ,0 148 + 2 98 + 4 26 + 1 Glycoprotéine Matière de l'exemple 5Fraction C Fraction D hautement (unités/ml) purifiée Aucun 2 + 1 2+ 1 2 + 1 8 + 2 10 + 4 5 + 2 500 36 + 6 37 + 4 10 + 3 1000 74 + 5 66 + 5 21 + 4 2000 122 + 8 113 + 6 44 + 9 stimule la production de CSF. Par comparaison avec l'exemple figurant dans le tableau 2, dans lequel pg/ml de glycoprotéine ont été ajoutés au milieu exempt de sérum, la production de CSF était plus élevée dans l'exemple présenté dans le tableau 6, dans lequel 0,5 mg/ml de la fraction A (8,3 pg/ml en t'erme de gly- coprotéine),ont été ajoutés, bien qu'une faible quantité de glycoprotéine ait été ajoutée dans ce dernier exemple. Ceci semble dû à l'influence de la sérum albu- mine et d'autres ingrédients inconnus de l'urine humaine contenue dans la fraction A. Si l'on compare le milieu ajouté avec la fraction A avec celui ajouté avec la fraction B en ce qui concerne la production de CSF, on voit que lorsque la quantité ajoutée est de 0,5 ou de 1,0 mg/ml, les deux fractions sont comparables l'une à l'autre, mais à des taux plus élevés, la fraction B donne lieu à une production de CSF plus faible. Ceci résulte probablement du fait aue la teneur en sérum albumine urinaire humaine de-A est plus élevée que celle de B et que l'addition de la fraction B dans une quantité plus importante que 5 mg/ml conduit à une addition excessive de glycoprotéine. En tenant compte collectivement de ces résultats, il est à présumer que la sérum albumine etc. contenue dans l'urine humaine et la glycoprotéine ont un effet synergique d'augmentation de la production de CSF et qu'une production de CSF maxima est obtenue en ajoutant au milieu environ 100 pg/ml de glycoprotéine. En ce qui concerne la glycoprotéine ayant un effet stimulant sur la formation de macrophages et de granulocytes de souris (Cas II), il ressort du tableau 6 que dans tous les cas la production de CSF augmente de façon approximativement proportionnelle à la quantité de glycoprotéine ajoutée au milieu. Par comparaison avec les résultats du tableau 2 obtenus en utilisant un milieu exempt de sérum, la production de CSF est plus élevée dans le cas de la présente expérience dans laquelle on utilise la fraction C ou la fraction D, bien que la quantité de glycoprotéine ajoutée au milieu soit la même que dans le premier cas. Ceci semble pro- venir de l'influence de la sérum albumine etc. contenue dans les fractions C et D qui provient d'urine humaine Les résultats obtenus en ajoutant une glycoprotéine hautement purifiée montZe clairement que bien que la production de CSF augmente avec la quantité de cette glycoprotéine, l'augmentation est inférieure à celle obtenue dans les cas des fractions C et D et de la matière de pureté ordinaire (tableau. 2). Ces résultats laissent présumer que dans les milieux exempt de sérum, la sérum albumine et les autrçssubstances provenant de l'urine humaine joue le même rôle que le sérum en ce qui concerne la production de CSF. Dans tous les cas, par conséquent, pour appliquer avantageusement le procédé de l'invention, il est préférable d'ajouter au milieu une glycoprotéine brute qu'une glycoprotéine purifiée. Lorsqu'on ajoute une glycoprotéine brute, celle-ci est ajoutée à raison d'au moins 0,1 pg/ml de milieu dans le Cas I ou d'au moins 500 unités/ml de milieu dans le Cas Il. Exemple expérimental 7. Expérience sur la dose efficace, etc. La dose efficace et la dose toxique aigue (DL50) du CSF produit par le procédé de l'invention ont été déterminées par l'essai sur l'animal ei-après. Un milieu conditionné préparé de la même manière au'à l'exemple 3 a été stérilisé par filtration sur membrane, puis filtré à travers une membrane d'ul- trafiltration (limite de séparation des masses molécu- laires: 10.000), concentré, désalinisé et lyophilisé pour obtenir du CSF sous forme de poudre. Déterminé par le même procédé que dans l'exemple expérimental 1, le nombre de colonies formées avec les cellules de moelle osseuse est de 4.500/mg. A titre de comparaison, l'essai a été répété en utilisant des cellules de moelle osseuse de souris C3H/He et on a trouvé que le nombre de colonies formées avec les cellules de moelle osseuse de souris était de 7.000/mg. Quatre vingt souris males C3H/He (agées de six semaines et d'un poids corporel moyen de 20 g) ont été réparties au hasard en 16 sous groupes de chacun 5 mem- bres. Les sous groupes ont été assemblés au hasard pour former 4 groupes de chacun 4 sous groupes. Le CSF obtenu ci-dessus est dissout dans une solution de sérum physiologique stérile pour obtenir 3 solutions de 1 mg/0,1 ml (pour le groupe I), 2 mg/0,1 ml (pour le groupe II) et 4 mg/0,1 ml (pour le groupe III). On a administré la solution à chaque souris par voie sous cutanée à la dose de 0,1 ml/souris/jour, pendant 5 jours consécutifs. Au bout de 1, 3, 7 et il jours à partir du début d'administration, des échantillons de sang ont été recueillis sur cinq souris d'un sous groupe de chaque groupe (le sous groupe sur lequel les échantil- lons de sang avaient été recueillis, ont été exemptés de l'essai ultérieur). Le nombre de leucocytes dans le sang périphérique a été déterminé au moyen d'un compteur de cellules sanguines automatique et le nombre de granu- locytes a été déterminé au microscope sur des frottis colorés au WrightGimsa, pour déterminer l'augmentation du nombre de leucocytes et de granulocytes résultant de l'administration du CSF. Un groupe (groupe I) ayant reçu 0,1 ml de sérum physiologique stérile ne contenant pas de CSF a été traité de la même manière que ci-dessus et a été utilisé comme groupe témoin. Les résultats expérimentaux sont donnés dans le tableau 7. TABLEAU 7 - Groupe1 (Témoin) I II III IV Durée de l'essai Leucocyte Granulocyte Leucocyte Granulocyte Leucocyte Granulocyte Leucocyte Granulocyte (jours) _.. , 1 55 + 20 14 + 7 53 + 4 13 + 8 51 + 5 16 + 4 59 + 8 20 + 5 3 59 + 7 12 + 8 63 + 9 18 + 4 98 +10 40 +10 123 + 6 60 + 8 7 41 + 8 12 + 4 74 + 8 28 + 6 140 + 8 60 + 9 201 + 5 102 +14 11 58 + 8 15 + 6 102 + 9 45 +10 185 +14 75 +13 260 +19 121 +21 Note: 1 - les valeurs numériques correspondent ici au nombre de cellules du sang par mm3 de sang x 10-2. 2 - chaque résultat expérimental correspond à la moyenne de cinq souris. %0 MJ % os VI on CD Par comparaison avec le groupe I (témoin), parmi les groupes ayant reçu du CSF, le groupe II pré- sente une augmentation double du nombre de leukocytes et une augmentation de presque trois fois du nombre de granulocytes au bout de onze jours à partir du début de l'essai (six jours après la fin de l'administration). Par comparaison avec le groupe I, le groupe IV présente une augmentation remarquable d'environ 4,5 fois du nombre des leukocytes et d'environ 8 fois du nombre des granulocytes. Compte tenu des résultats ci-dessus, on peut supposer que la dose efficace chez la souris est de 50 mg/kg de poids corporel/jour. Comme l'activité de formation de colonie du CSF utilisé dans l'expérience ci-dessus est plus élevée pour les cellules de moelle osseuse de souris que pour les cellules de moelle osseuse humaine, d'un facteur de 1,556, la dose efficace pour un malade souffrant de granulocytopénie qui exerce sur les cellules de moelle osseuse humaine un effet équivalent à l'effet chez les souris est d'environ 77,8 mg/kg de poids corporel/jour. La toxicité aiguë du CSF préparée conformément à l'invention a été déterminée en utilisant le même CSF que dans l'essai ci-dessus pour la dose d'administration et des souris C3H/He (agées de 6 à 8 semaines et d'un poids corporel moyen de 20,4 g). Aucun cas de mort n'a été observé sur le groupe (5 males-et 5 femelles) ayant reçus 4,0 g de CSF/kg de poids corporel. En conséquence, la toxicité aiguë était trop faible pour être déterminée par l'essai ci-dessus. EXEMPLE 1 (1) Isolement des monocytes et des macrophages. Deux cents millilitres de sang périphérique provenant d'êtres humains normaux sont recueillis dans n flacon de collecte du sang contenant 1. 000 unités d'héparine et mélangés sous agitation modérée. On fait passer le sang héparinisé dans une éprouvette de verre stérile d'un diamètre de 20 mm et d'un volume de 200 ml, et on le laisse reposer pendant 2 heures à la température ambiante. Après repos, on recueille avec précaution la couche de leucocyte supérieure au moyen d'une pipette, on la dilue avec du milieu McCoy 5A exempt de sérum à deux fois le volume initial, on la centrifuge à 1.500 g pendant 15 minutes. On jette le liquide surnageant et on met en suspension le sédiment dans 20 ml de milieu McCoy A, déposé sur une solution de métrizoate de sodium (masse spécifique d = 1,077) dans un tube de centrifu- geuse, et on le centrifuge à 400 a pendant 30 minutes. La couche blanche contenant les monocytes, les macro- phages et les lymphocytes au bas de la douche supérieure et recueillie avec une pipette, lavée par addition de milieu McCoy 5A, centrifugée à 1. 500 a pendan.t 10 minutes et le liquide surnageant est jeté. Ce traitement est répété deux fois supplémentaires. Les cellules ainsi obtenues sont mises en suspension dans 20 ml du milieu Mc Coy 5A et une partie d'entre elles est utilisée pour compter le nombre de cellules au moyen d'un compteur automatique de cellule du sang, fabriquée par la (Toa Manufacturing Co.). On prépare un frottis de la suspen- sion, on le colore avec le colorant de Wright-Giemsa, et on détermine morphologiquement le nombre de lympho- cytes ainsi que le nombre de monocytes et de macrophages pour calculer le rapport des cellules. La proportion des monocytes et des macrophages est de 25,5 %. On place une partie aliquote de 5 ml de la suspension dans chacune des quatre boîtes de Pétri, de 15 cm de diamètre, on y ajoute 30 ml de milieu McCoy 5A supplémenté avec 10 %. de sérum de foetus de veau, et on la laisse reposer à 370C pendant 2 heures dans une atmosphère humidifiée d'air à 5 % de gaz carbonique. Après repos, on jette le milieu et on ajoute 30 ml de milieu Mc Coy 5A, et, après avoir agité énergiquement, on jette le milieu pour éliminer les lymphocytes. La 246 500 proportion de monocytes et de macrophages restant est déterminée par la même méthode d'essai que ci-dessus, elle est de 95 % dans chacune des boîtes. (2) Préparation de la glycoprotéine. - La glycoprotéine est préparée de la manière suivante par le procédé décrit dans la demande de brevet japonais en cours d'examen n0 14.707/79 et lés autres demandes de brevets précitées. On ajuste à pH 8 400 litres d'urine fraîche recueillie sur des êtres humains normaux avec une solu- tion d'hydroxyde de sodium à 10 % et on les centrifuges à 15.000 g dans une centrifugeuse continue à 00C, ce qỉ éliminent les matières insolubles, et on recueille le liquide surnageant. On ajuste le liquide surnageant à pH 7 avec de l'acide chlorhydrique à 10 % et on le fait passer à travers une colonne (10 x 80 cm) garnie de gel de silice. On élue les constituants les consti- tuants adsorbés sur le gel de silice avec 40 litres d' ammoniac à 5 %. On ajuste l'éluat ainsi obtenu à ph 7,5 avec de l'acide sulfurique 1 N, on l'additionne de sulfate d'ammonium en pôudre à une concentration de 70 %, on le laisse reposer à 00C pendant une nuit, et on recueille le précipité formé par filtration. On dissout le précipité dans deux litres d'ammoniac à 5 %, on le place dans un tube à dialyse (Visking Co.) et on le dialyse à fond contre une solution tampon phosphate 0,05 M (pH 6,5). On ajuste la solution dialysée à 10 litres avec cette solution tampon et on la fait passer à travers une colonne d'échange d'ion CM Séphadex C-50 (40 x 40 cm) équilibrée avec une solution de tampon phosphate 0,05 M. On élimine les contaminants par adsorption sur la colonne échangeuse d'ions et on recueille l'effluent. On concentre 10 litres de l'effluent ci-dessus en utilisant un concentrateur à fibre creuse Diaflow (type DC-30, Amicon Co.) et on dialyse le concentrat contre une solution tampon tris-HCl 0,1 M (pH 7,0) pendant une nuit à 5 C. On ajuste la solution dialysée à 1 litre avec la même solution tampon et on la fait passer à travers la colonne de DEAEcellulose (4,0 x 40 cm) qui a été équilibrée avec la même solution tampon. Apres lavage avec une solution tampon tris-HCl 0,1 M, on élue les constituants adsorbés avec une solution tampon tris- HCl 0,144 (pH 7,0) contenant du chlorure de sodium 0,3 M. On recueille l'éluat et on le dialyse contre une solution tampon tris-HCl 0,1 M (pH 7,0). On fait à nouveau passer la solution dialysée à travers la colonne de DEAE-cellulose (4,0 x 40 cm) qui a été activée par mise en équilibre avec la même solution tampon et éluée par élution à gradient de concentration linéaire de NaCl gradient de concentration de l'ion chlorure, 0,1 - 0,3 M) pour recueillir les fractions éluées à des concentrations d'ion chlorure de 0,15 à 0,25 M. La fraction misei en pool est additionnée de sulfate d'ammonium en poudre à 70 % de la saturation et le précipité formé est recueilli, dissout dans une faible portion de la solution de tampon trisHCl 0,1 M (pH 7,0) et dialysé contre le même tampon pour recueillir la solution dialysée (fraction A). On développe 20 ml de la solution dialysée ci-dessus sur une colonne de Séphadex G-150 (4,0 x 60 cm) qui a été mise en équilibre avec du tampontris-HCl 0,1 M (pH 7,0) et on recueille les fractions correspondant à une valeur relative d'effluent de 1,11-1,45. On dialyse à fond la fraction combinée contre l'eau distillée et on lyophilise la solution dialysée pour obtenir environ * 500 mg d'une poudre (fraction B). On dissout 200 mg de la poudre ci-dessus dans une solution de tampon phosphate 0,02 M (pH 7,0) conte- nant du chlorure de sodium 1,0 M et on la fait passer sur une colonne d'affinité concanavaline 1 - Sépharose 4B (100 ml) qui a été mise en équilibre avec la même solu- tion tampon. On lave soigneusement la colonne avec un tampon phosphate 0, 02 M (pH 7,0) contenant du chlorure de sodium 1,0.M puis on l'élue avec un tampon phosphate 0,02 M (pH 7,0) contenant 50 mM d'a-méthyl-D- glucoside et du chlorure de sodium 1,0 M. On dialyse l'éluat contre l'eau distillée et on lyophilise la solution dialysée. En outre, on dissout environ 50 mg de la poudre lyophilisée obtenue ci-dessus dans 1 ml d'un tampon tris-glycine 0,125 M (pH 6,8) contenant 10 % de glycérol et'on le soumet à une électrophorèse sous 10 mA en refroidissant au moyen d'un appareil d'électrophorèse préparative (Fuji Kabara - II de la Fuji Riken Co.) en utilisant un gel d'acrylamide à 8 % (pH 8,9; 20 x 25 mm). On recueille la fraction ayant une mobilité relative de 0,46 avec une solution tampon tris-glycine 0,025 M (pH 8,3), puis on la dialyse contre de l'eau distillée et on lyophilise la solution dialysée pour obtenir environ 10 mg de glycoprotéine. En répétant les opérations ci-dessus, on obtient environ 30 mg de glycoprotéine. (3) Culture de monocytes et de macrophages. On ajoute la glycoprotéine obtenue ci-dessus à 30 ml d'un milieu McCoy 5A supplémenté contenant 20 % de sérum de foetus de veau à raison de 100 pg/ml de milieu et on verse 30 ml du milieu préparé dans chaque boite de Pétri qui contient des macrophages et monocytes adhérents comme il a été décrit en (1) de cet exemple. Le nombre de monocvtes et de macrophages dans le milieu est de 106/ml de milieu. On met à incuber le milieu préparé à 37 C pendant 3 jours dans une atmosphère humidifiée d'air à 5 % de gaz carbonique, pour obtenir un milieu conditionné contenant du CSF. (4) Purification du CSF dans le milieu conditionné. On centrifuge le milieu recueilli (2,000 g) à 2 C pendant 10 minutes pour recueillir environ 120 ml du liquide surnageant limpide que l'on concentre au moyen d'une membrane d'ultrafiltration (Amicon Co.; limite de séparation des masses molaires 10.000). On additionne le concentré de 100 ml d'une solution tampon tris-HCl 0,05 M (pH 7,2) et on le concentre à nouveau à 5 ml. On fait passer la solution obtenue ci-dessus dans une colonne de DEAE-cellulose (2,0 x 60 cm) qui a été mise'en équilibre avec du tampon tris-HCl 0,05 M (pH 7,0) et on élue le CSF avec un gradient de concen- tration linéaire de NaCl (0 à 3 M). On réunit les frac- tions actives élevées et on les concentre au moyen de l'appareil à membrane d'ultrafiltration ci-dessus. On fait passer la solution concentrée dans une colonne de Séphadex G-150 (2,0 x 90 cm) qui a été mise en équilibre avec une solution tampon tris-HCl 0,05 M (pH 7;0) et on la développe avec la même solution tampon pour recueillir les fractions correspondant à une masse moléculaire de 65.000 - 90.000 et les fractions correspondant à une masse moléculaire de 30.000 - 60.000. On combine ces fractions et on les concentre au moyen de l'appareil à membrane d'ultrafiltration. On additionne la solution àoncentrée d'eau distillée, on la désalinise et on la concentre pour obtenir environ 5 ml d'une solution contenant du CSF purifié. On trouve que cette solution a une activité de formation de 41.000 colonies de granulocytes humains par ml, cette activité étant déter- minée de la même manière que dans l'exemple expérimental 1. EXEMPLE 2 D'une manière analogue à celle de l'exemple 1, on isole des monocytes et des macrophages du sang péri- phérique humain et on les traite pour préparer la gluco- protéine purifiée. En utilisant un milieu préparé en ajoutant la glycoprotéine purifiée au milieu McCoy 5A exempt de sérum à raison de 100 pg/ml de milieu, on obtient environ 5 ml d'une solution contenant du CSF purifié d'une manière analogue à l'exemple 1. Cette 246 1500 solution présente une activité de formation de 16.000 colonies de granulocyte humain par ml de solution, ces activités étant déterminées de la même manière que dans l'exemple exéprimental 1. EXEMPLE 3 D'une manière analogue à celle de l'exemple 1, on sépare des monocytes et des macrophages du sang périphérique humain.et on les traite pour préparer la fraction contenant les glycoprotéines (fraction A). En utilisant un milieu préparé en ajoutant cette fraction à un milieu de McCoy 5A exempt de sérum à raison de 5 mg (83,3 mg en terme de glycoprotéine)/ml de milieu, on obtient environ 120 ml d'un milieu conditionné. On dia- lyse le milieu conditionné contre de l'eau distillée et on concentre la solution dialysée par évaporation à basse température pour obtenir environ 5 ml d'une solu- tion contenant du CSF. Cette solution présente une activité de formation de 3.6.700 colonies de granulocyte humain par ml de la solution, cette activité étant déterminée de la même manière que dans l'exemple expé- rimental 1. EXEMPLE 4 D'une manière analogue à celle de l'exemple 1, on sépare des monocytes et des macrophages du sang périphérique humain et on les traite pour préparer la fraction contenant la glycoprotéine (fraction B). En utilisant un milieu préparé en ajoutant cette fraction à un milieu de McCoy 5A contenant 10 % de sérum humain à raison de 1 mg (83,3 pg en terme de glycoprotéine)/ml de milieu, on obtient environ 5 ml d'une solution contenant du CSF d'une manière analogue à celle de l'exemple 1. Cette solution présente une activité de formation de 43.200 colonies de granulocyte humain par ml de la solution, cette activité étant déterminée de la même manière que dans l'exemple expérimental 1. EXEMPLE 5 (1) Préparation de la glycoprotéine. Conformément au procédé de Stanley et al. décrit précédemment, on prépare la glycoprotéine et les fractions contenant la glycoprotéine de la minière suivante. On dialyse contre de l'eau à travers une membrane d'ultrafiltration 400 litres d'urine fraîche recueillie d'êtres humains normaux. On ajuste la solution dialysée à pH 7,4 et on la fait passer à travers une colonne de DEAE-cellulose (20 x 15 cm) qui a été mise en équilibre avec une solution tampon tris-HCl 0,003 M (pH 7,4), pour permettre aux substances actives de s'adsorber sur la colonne. Les substances actives adsor- bées sont lavées avec 20 litres d'une solution tampon tris-HCl 0,1 M contenant du chlorure de sodium 0,04 M, puis éluées avec 20 litres d'une solution tampon tris- CH1 0,1 M (pH 7,0) contenant du chlorure de sodium 0,15 M et on dialyse l'éluat contre de l'eau distillée (frac- tion C). On ajoute un gel de phosphate de calcium à la solution dialysée ci-dessus dans la proportion de 58 ml de gel/g de protéine pour permettre aux substances actives de s'adsorber sur le gel. On recueille le gel de phosphate de calcium par filtration, on le lave deux fois avec 20 litres d'un tampon phosphate 0,005 M (pH 6,5) et on l'élue avec 5 litres d'un tampon phosphate de 0,025 M. On centrifuge l'éluat à 12.000 g pendant 10 minutes pour recueillir le liquide surnageant. On dialyse le liquide surnageant contre de l'eau distillée et on concentre la solution dialysée à environ 50 ml par évaporation sous vide. On met en équilibre le concentré avec du tampon tris-HCl 0,1 M, on le fait passer dans une colonne de DEAE-cellulose (2,5 x 90 cm) qui a été mise en équilibre avec le même tampon, et on l'élue avec une solution tampon tris-HCl 0,1 M contenant du chlorure de sodium par la technique d'élution à gradient de concentration linéaire de chlorure (gradient de concen- tration du chlorure de sodium 0 à 0,15 M). On recueille les fractions contenant la glycoprotéine, et on les concentre au moyen d'une membrane d'ultrafiltration (fraction D). On soumet le concentré obtenu ci-dessus à une filtration sur gel en utilisant une colonne de Biogel P-100 (2,5 x 110 cm), qui a été mise en équilibre avec une solution tampon tris-HCl 0,03 M, pour obtenir 230 mg de glycoprotéine (produit de pureté ordinaire). On dissout 100 mg du produit de pureté ordinaire dans une solution tampon acétate 0,1 M (pH 6,0) contenant du NaCl 1,0 M, MgC12 0,001 M, MnC12 0, 001 M et CaC12 0,001 M, on la fait passer sur une colonne de concanavaline A-Sépharose 4B (36 x 1,0 cm) qui a été mise en équilibre avec la même solution tampon, et on l'élue avec une solution d'a-méthyl-D- glucosicb 0,1 M pour obtenir 8 mg de glycoprotéine (produit hautement purifié). On détermine les activités biologiques sur des cellules de moelle osseuse de souris de glycoprotéines de pureté diverse par la méthode indiquée cidessus. Les résultats sont donnés dans le tableau 8. TABLEAU 8 (2) Culture des monocytes et des macrophages et purification du CSF dans le milieu conditionné. On répète les modes opératoires des exemples l3) SR 1354 JA/GL Echantillon Activité spécifique Produit semi-purifié Fraction A 21.000 Fraction B 54.000 Produit de pureté ordinaire 180.000 Produit hautement purifié 1.240.000 et 1-(4) excepté qu'on utilise 1.000 unités/ml de milieu de glycoprotéine de pureté ordinaire à la place de la glycoprotéine hautement purifiée. On obtient environ ml d'une solution contenant du CSF purifié qui présente unedctivité de formation de 35.000 colonies de granu- locyte humain par ml de la solution. EXEMPLE 6 On prépare environ 5 ml d'une solution conte- nant du CSF purifié en répétant le mode opératoire de l'exemple 5, excepté qu'on utilise une glycoprotéine préparée de la manière ci-après par la méthode de Stanley and Metcalf à la place de la glycoprotéine préparée par la méthode de Stanley et al. La solution contenant du CSF purifié obtenue dans le présent exemple a une activité de formation de 9. 800 colonies de granulocyte humain par ml de la solution. On dialyse 20 litres d'urine humaine contre de l'eau du robinet à la température ambiante pendant 8 a 12 heures. A la solution dialysée, on ajoute 75 g de DEAE-cellulose mise en équilibre et 100 ml d'un tampon tris-HCl 1,0 M (pH 7,0). On mélange intimement le mélange obtenu pour permettre à la glycoprotéine de s'adsorber sur la DEAE-cellulose. Après avoir éliminé le liquide surnageant, on lave la DEAE-cellulose trois fois avec du tampon tris-HCl 0,1 M (pH 7,0) contenant du chlorure de sodium 0, 05 M. Puis on élue la glycoprotéine adsorbée avec 300 ml de tampon trisHC1 0,1 M (pH 7,0) contenant du chlorure de sodium 0,5 M (on répète six fois cette série d'opérations). On concentre l'éluat par évaporation sous vide à 40 C et on le dialyse contre du tampon tris- HC1 0,1 M (pH 7,0). On fait passer la solution dialysée dans une colonne de DEAE-cellulose (2,3 x 44 cm) qui a été mise en équilibre avec du tampon tris-HCl 0,1 M (pH 7,0) pour permettre à la glycoprotéine de s'adsorber sur la DEAE-cellulose. Après avoir lavé la colonne avec le même tampon contenant du chlorure de sodium 0,05 M, on élue la glycoprotéine adsorbée par la technique d'élution à gradient de concentration de chlorure de sodium en utilisant un chlorure de sodium 0, 1 à 0,5 M dans le même tampon. On dialyse l'éluat contre de l'eau et on concen- * tre la solution dialysée par évaporation sous vide, puis on la lyophilise. On dissout la matière lyophilisée dans du tampon tris-HCl 0,1 M (pH 7,0) et on la fait passer dans une colonne de Séphadex G-150 (2,3 x 150 cm), qui a été mise en équilibre avec le même tampon, pour recueillir la fraction de glycoprotéine. On dialyse cette fraction et on la lyophilise pour obtenir environ 12 mg d'une poudre ayant une activité spécifique sur les cellules de la moelle osseuse de souris d'environ 36.000. EXEMPLE 7 On sépare des.monocytes et des macrophages du sang périphérique humain de la même manière que dans l'exemple 1. On prépare une fraction contenant de la glycoprotéiné de la même manière que ci-dessous confor- mément au procédé précité de Laukel et al., et on ajoute à un milieu de McCoy 5A exempte de sérum à raison de 2.000 unités/ml de milieu. En utilisant ce milieu, on effectue une culture d'une manière analogue à celle de l'exemple 5, pour obtenir 120 ml de milieu conditionné. On dialyse le milieu conditionné contre de l'eau distillée et on concentre la solution dialysée par évaporation sous vide -à basse température, ce qui donne environ 5 ml d'une solution contenant du CSF, présentant une activité de formation de 29.000 colonies de granulocyte humain par ml de la solution, cette activité étant déterminée de la même manière qu'à l'exemple expérimental 1. On dialyse contre de l'eau du robinet courante litres d'urine humaine au moyen d'un appareil d'ultra- filtration sur membrane (CL 100 de la Asahi Kasei Co.). On fait passer la solution dialysée à travers une colonne DEAE-cellulose (10 x 30 cm) qui a été mise en équilibre avec du tampon tris-HCl 0,05 M (pH 7,3), pour permettre à la glycoprotéine de s'adsorber sur la DEAE-cellulose. Après lavage de la colonne avec du tampon tris-EC1l 0,05 M (pH 7,3) supplémenté avec du chlorure de sodium 0,05 M, on élue la glycoprotéine avec le même tampon supplémenté avec du chlorure de sodium 0,3 M. On dialyse l'éluat contre du tampon tris-HCl 0,05 y (pH 8,0) supplémenté avec NaCl 0,5 M, CaC12 2 nmI et MgC1l2 2 mM. On fait passer la solution dialysée sur une colonne de concana- valine A - Sepharose 4B (2,6 x 40 cm) qui a été mise en équilibre avec le même tampon pour permettre à la glycoprotéine de s'tadsorber sur la colonne. Après avoir lavé la colonne avec le même tampon, on élue la glyco- protéine avec le même tampon supplémenté par de l'a- méthyl-D-mannoside 0,15 M. On concentre l'éluat par ultrafiltration pour obtenir environ 7 ml d'une fraction contenant 6 mg en terme de protéine de glycoprotéine dans 1 ml. L'activité spécifique de cette fraction est d'environ 20.000 sur les cellules de moelle osseuse de souris. EXEMPLE 8 On sépare des monocytes et des macrophages du sang périphérique humain de la même manière qu'à l'exemple 1. Une fraction contenant de la glycoprotéine (fraction D) préparée de la même manière qu'à l'exemple 5 est ajoutée a un milieu de McCoy 5A supplémenté avec % de sérum humain à raison de 2.000 unités/ml de milieu. En utilisant ce milieu, on obtient environ 5 ml d'une solution contenant du CSF purifié d'une manière analogue à celle de l'exemple 5. Cette solution présente une activité de formation de 24.000 colonies de-granu- locyte humain par ml de la solution, cette activité étant déterminée de la même manière que dans l'exemple expéri- mental 1. 246.1500 REVENDICATIONS 1. Procédé de production d'une substance capable de stimuler la prolifération et la différencia- tion des cellules souches granulopoiétiques humaines, caractérisé en ce au'on cultive des monocytes et des macrophages, qui sont séparés du sang périphérique humain, dans un milieu synthétique pour culture de tissu contenant une glycoprotéine séparée de l'urine humaine et capable de stimuler la formation des granulocytes humains et des macrophages et granulocytes de souris, produisant ainsi une substance active dans le milieu, et en ce qu'on recueille la substance active du milieu. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la glycoprotéine est une glycopro- téine capable de stimuler la formation de granulocytes humains. 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la glycoprotéine est une glycopro- téine Capable de stimuler la formation de macrophages et de granulocytes de 4. Procédé caractérisé en ce que présence de sérum. 5. Procédé caractérisé en ce que est du sérum humain. 6. Procédé caractérisé en ce que moins 5 % par rapport 7. Procédé caractérisé en ce que milieu est d'au moins 8. Procédé caractérisé en ce que milieu est d'au moins souris. suivant la.revendication 1, la culture est effectuée en suivant la revendication 4, le sérum présent dans le milieu suivant la revendication 1, la quantité de sérum est d'au au volume du milieu. suivant la revendication 2, la teneur en glycoprotéine du 0,1 pg par ml du milieu. suivant la revendication 3, la teneur en glycoprotéine du 500 unités par ml du milieu. 9. Procédé de production d'une substance capable de stimuler la prolifération et la différencia- tion des cellules souches granulopoiétiques humaines suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la glycoprotéine est une matière partiellement purifiée accompagnée de protéines urinaires. 10. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le nombre de cellules de monocytes et de macrophages inoculées dans le milieu est d'au moins 105 par ml du milieu. 11. Substance capable de stimuler la prolifé- ration et la différenciation des cellules souches granulopoiétiques humaines, caractérisée en ce qu'elle est produite par le procédé suivant la revendication 1. 12. Substance capable de stimuler la prolifé- ration et la différenciation des cellules souches granulopoiétiques humaines, caractérisée en ce qu'elle est produite par le procédé suivant la revendication 2. 13. Substance capable de stimuler la prolifé- ration et la différenciation des cellules souches granulopoiétiques humaines, caractérisée en ce qu'elle est produite par le procédé suivant la revendication 3.