Brevet FR2473341A1 — publié le 19810717

La présente invention se rapporte d'une façon générale à un médicament à base d'albumine de plasma et elle concerne, plus particulière- ment, un procédé pour séparer une albumine de plasma sensiblement pure à partir du plasma sanguin. Récemment on a utilisé le sang non seulement pour les transfusions sanguines pour sauver une vie en cas d'urgence, mais aussi pour le stocka- ge (banques de sang) et pour la préparation de médicaments à base de sang. En raison des développements techniques du type indiqué, seul le composant important du sang est séparé et introduit par transfusion pour en permettre l'administration au dosage désiré et pour empêcher les effets secondaires provoqués par les composants inutiles et l'on utilise ainsi efficacement le sang humain qui représente une source mineure mais capitale. On sait qu'il est possible de séparer le sang en érythrocytes, leucocytes, plaquettes du sang et plasma sanguin liquide. Le plasma sanguin renferme diverses protéines ayant des fonctions différentes. Il est souhai- table de séparer et de purifier les protéines du plasma sanguin et d'utili- ser seulement le composant désiré selon le but recherché. Parmi les protéines du plasma sanguin, l'albumine de plasma remplit la fonction du maintient de la pression osmotique du sang et du transfert des substances biologiquement indispensables, comme par exemple la nutrition, à divers organes. Les applications médicales de l'albumine de plasma comprennent notamment le traitement de l'hypoalbuminanémie et d'oedèmes provoqués par l'hypoalbuminanémie; le traitement d'urgence pour un choc hémorragi- que ou pour des brûlures et aussi l'élimination de la bilirubine du plasma lors d'une transfusion d'échange chez les nouveaux nés. On a obtenu d'excellents résultats dans toutes ces applications. En ce qui concerne les procédés de séparation de l'albumine de plasma à partir du plasma sanguin, on connaît l'utilisation de la différence de solubilité des molécules, de la différence de charges et de grosseurs de molécules, comme suit: (1) une précipitation fractionnée par addition d'un sel neutre tel que le sulfate d'anmonium ou d'un solvant organique tel que l'éthanol froid ou une macromolécule hydrosoluble telle que le polyéthylène-glycol (2) une chromatographie en utilisant un échangeur d'ions, un adsor- bant ou un tamis moléculaire etc. (3) un procédé d'électrophorèse basé sur la différence de charge; et (4) une immunoadsorption. Chacun des procédés mentionnés ci-dessus a été utilisé ainsi d'ailleurs qu'une combinaison de tels procédés. Tous ces procédés présentent certains inconvénients, notamment l'endommagement de la structure des molécules des protéines du plasma par l'opération à la température ambiante; la formation d'agrégats; et la nécessité d'une durée prolongée pour assurer la séparation ou une opération précise. La présente invention a pour objet un procédé de séparation de l'albumine de plasma par une opération simple et de brève durée, sans aucune rupture de la structure des protéines du plasma et sans formation d'agrégats. Pour aboutir à l'objectif indiqué ainsi qu'à certains autres, l'invention prévoit la séparation d'une faction d'albumine brute à partir du plasma sanguin par un procédé de séparation fractionnée grossière, puis une séparation de l'albumine de plasma par passage à travers une membrane d'ultrafiltration fabriquée en une résine de polysulfone. Sur les dessins annexés - la figure 1 montre le rapport entre le pourcentage de passage par perméabilité de l'albumine et le pH des solutions dans les cas o l'on utilise la même membrane et le meme échantillon que dans l'exemple 1; et - les figures 2 et 3 sont des chromatogrammes en phase liquide obtenis selon les exemples de l'invention. La Demanderesse a étudié les perfectionnements à la technologie connue suivant des aspects différents et elle a élaboré un nouveau procédé de séparation de l'albumine de plasma à partir du plasma sanguin. Selon le procédé qui fait l'objet de l'invention, on sépare une fraction d'albumine brute par un fractionnement du plasma sanguin à l'aide d'un agent de précipitation tel qu'un composé macromoléculaire soluble dans l'eau, un sel neutre ou l'éthanol froid et ensuite on traite la frac- tion brute d'albumine par ultrafiltration à l'aide d'une membrane d'ultra- filtration dans des conditions ne permettant le passage que de l'albumine de plasma pure, l'albumine de plasma étant séparée en peu de temps et par une opération simple. La fraction d'albumine brute désigne, dans la terminologie du présent mémoire, une fraction d'albumine de plasma qui ne contient prati- quement pas de e -globuline (poids moléculaire: 16 x 10 4) comme par exemple une fraction d'albumine brute obtenue par fractionnement avec du polyéthylène-glycol et une fraction S résultant du fractionnement de Cohn avec de l'éthanol froid. Si la fraction contient de la -globuline, cette dernière traverse ensemble avec l'albumine de plasma la membrane d'ultrafiltration et on ne peut pas obtenir dans ces conditions une albumine de plasma pure. Le procédé de fractionnement de la fraction d'albumine brute n'est pas critique et n'est nullement limité à l'exemple présenté ci-dessus. Quand on traite directement le plasma sanguin par ultrafiltration, le composant fibrinogène du plasma sanguin est adsorbé sur la membrane d'ultrafiltration, de sorte que l'ultrafiltration de l'albumine de plasma est trop lente pour que le procédé soit avantageux. Pour surmonter ces inconvé- nients, on sépare au préalable le composant fibrinogène par un fractionnement 1o avec du polyéthylène glycol, un sel neutre etc. et ensuite on traite la fraction d'albumine brute résultante à l'aide de la membrane d'ultrafil- tration pour obtenir une albumine de plasma pure. Le procédé selon l'inven- tion a été élaboré à partir de la découverte indiquée. Pour ce qui est de la membrane d'ultrafiltration qu'on utilise dans le procédé de l'invention, on préfère diliser une membrane confectionnée avec une résine de polysulfone dont la structure unitaire est de préférence choisie par les suivantes ou t | e 2 tCH (n - 50 à 250) On peut préparer la membrane en dissolvant la polysulfone dans un solvant et ensuite en étalant la solution sous forme d'une pellicule et en plongeant le tout dans un non solvant. Les diamètres des pores de la membrane ne peuvent pas être observés à l'aide d'un microscope électronique. Dans le cas de la membrane d'ultrafiltration, il est usuel de définir les propriétés de la membrane par son seuil de coupure. On définit habituellement ce seuil de coupure en mesurant les pourcentages de rétention de la membrane avec une protéine sphérique ayant un poids moléculaire connu (1-concentration de la solution ayant traversé / concentration de la solution initiale) x 100, puis en portant les poids moléculaires du soluté et les pourcentages de rétention sur un graphique et en calculant le poids moléculaire pour un pourcentage de rétention de 100 %. Le seuil de coupure peut varier selon le procédé de mesure. Par exemple la membrane "PM-10" fabriquée par Amicon Co. présen- te, selon les indications, un seuil de coupure de 10 000-; cependant, une myoglobine ayant un poids moléculaire de 18 000 traverse cette membrane. Le seuil de coupure varie selon le procédé de mesure. Par exemple, ce seuil varie selon les chagements du pH de la solution même si l'échantillon et la membrane sont les mêmes. On considère que la variation dépend des charges de protéines et de la distribution des protéines dans la solution. Dans un tel cas, on détermine le seuil de coupure en utilisant des protéines ayant des poids moléculaires connus (myoglobine, /3 lactoglobuline, albumine, -globuline etc.) dans une solution de tampon phosphatée (pH 6,8) à titre d'éluat d'une chromatographie aqueuse par permeation de gel (qu'on abrège ci-après CPG), en mesurant les rapports d'absorbance de l'échantillon à 280 nm par une colonne "G3000S'W" fabriquée par Toyo Soda Mfg. Co et en portant sur un graphique les pourcentages de rétention de la membrane. Dans la présente invention, on donne les seuils-de coupure à pH 6,8. Le seuil de coupure de la membrane d'ultrafiltration qu'on utilise selon l'invention est normalement compris entre 2 x 105 et 3 x 105 et, 5 de préférence, entre 2,5 x 10 et 3 x 105. Le procédé de mesure du pourcen- tage de rétention n'est pas limité à l'exemple indiqué précédemment. Parmi les membranes d'ultrafiltration ayant le même seuil de coupure, les membranes en polyamides, en téréphtalate de polyéthylène, en polycarbonates, en cellulose ou en acetate de cellulose, laissent parfois passer des protéines macromoléculaires en meme temps que l'albumine ou bien encore le pourcentage de passage par perméabilité de l'albumine de plasma est très faible ce qui diminue l'aptitude à la séparation. Par exemple, quand on utilise une membrane en cellulose, les protéines adsorbées sur la membrane font preuve d'un taux d'ultrafiltration très inférieur. Au contraire, quand on utilise une membrane en résine de polysulfone, on peut obtenir une membrane d'ultrafiltration présentant une répartition remarqua- blement étroite de diamètres de pores ce qui assure une vitesse constante d'ultrafiltration sans aucune adsorption des protéines sur la membrane. Cette membrane constitue le dispositif optimal pour séparer l'albumine de plasma. Jusqu'à présent on pouvait séparer les composants selon les différ rences de grosseurs, résultat propre à une membrane d'ultrafiltration. - - Ainsi on réalisait l'ultrafiltration par un procédé simple et rapide en se basant sur les différences des grosseurs de l'albumine de plasma et des autres protéines. Lors de la séparation à l'aide de la membrane, le pH de la solution aqueuse est avantageusementde 5 à 8 et, mieux encore, de 6 à 7,5. Le pourcentage de passage par perméabilité de l'albumine de plasma (concentration de la solution ayant traversé / concentration de la solution initiale x 100, change très fortement selon le pH. La figure 1 montre le rapport qui existe entre le pourcentage de passage par perméabilité de l'albuminede plasma et le pH de la solution. Pour des raisons économiques, le pH optimal lors de la séparation sur la membrane est avantageusement compris entre 5 et 8 et, mieux encore, entre 6 et 7,5. De préférence la concentration de la solution est inférieure à 2 Z (pds/vol.). Si cette concentration est plus élevée, l'ultrafiltration devient plus lente et le pourcentage de passage par perméabilité de l'albumine de plasma baisse également, du fait de la plus forte polarisation de concentra- tion du soluté sur la surface de la membrane. Selon le procédé qui fait l'objet de l'invention, on règle le pH de la solution aqueuse de la fraction d'albumine brute entre 5 et 8. On effectue l'ultrafiltration de la solution sur la membrane de manière à retenir les autres protéines sur la membrane et à laisser passer l'albumi- ne de plasma à travers cette membrane d'ultrafiltration. On peut ensuite traiter la solution d'albumine de plasma ayant traversé la membrane par des étapes de concentration sur membrane et de relargage. Le procédé selon l'invention n'est pas seulement applicable au plasma sanguin provenant du sang humain mais aussi au plasma du sang de certains animaux tels que les bovins, les chevaux et les moutons. Les exemples suivants servent à illustrer l'invention sans aucune- ment en limiter la portée EXEMPLE I On dissout un polycondensat de diphénylsulfone et de bisphénol-A (n-170) dans du diméthylacétamide pour préparer une solution à 12 % (pds/ vol.). On étale cette solutionsur une étoffe non tissée en polyéthylène ayant une dimension de 30 x 30 cm de manière à établir une épaisseur de 200 microns, cet étalement étant réalisé à l'aide d'une raclette et ensuite on plonge l'ensemble dans l'eau pour obtenir une membrane. On mesure le seuil de coupure de la membrane en découpant cette membrane à une dimension qui correspond à un diamètre de 90 mm et en montant cette membrane sur un appareil d'ultrafiltration afin de mesurer les pourcentages de rétention des protéines de la myoglobine (18 000), d'al- bumine (68 000), de Y-globuline (160 000) et de glutamate-déshydrogénase (350 000). Le seuil de coupure est d'environ 3 x 105. On traite du sang humain par une séparation centrifuge à basse température pour éliminer les corpuscules et obtenir le plasma sanguin. On règle le pH du plasma sanguin à 8,0 avec une solution aqueuse normale de NaOH et on ajoute à ce plasma avec refroidissement et agitation une solution à 50 % de polyethylene-glycol (4 000) de manière à obtenir une concentration de 12 % de polyéthylène-glycol. On traite la solution par séparation centrifuge à basse température et on sépare le liquide qui sur- nage. On règle le pH du liquide qui surnage à 4,6 avec une solution normale de HC1 et on ajoute des paillettes de polyethylene-glycol (4 000) à la solution avec refrddissement et agitation de manière à obtenir une concen- tration de polyethylene-glycol de 25 %. On traite le mélange par séparation centrifuge à basse température pour séparer le précipité. On dissout le précipité dans une solution de tampon phosphate ayant un pH de 6,8 pour préparer une solution à I %. On traite la solution par ultrafiltration sous une différence de pression d'environ 9,8.104 Pa en utilisant un appa- reil d'ultrafiltration équipé de la membrane. Le chromatogramme de la solution qu'on obtient dans les conditions de mesure ci-après est représenté sur la figure 2. Condition de mesures Chromatographie par permeation de gel: "HLC-802UR G 3000SW" (une colonne) fabriqué par Toyo Soda Mfg. Co. Eluant: solution de tampon phosphate (pH=6,8) Détecteur: vérificateur UV à 280 nm Le chromatogramme du côté gauche de la figure est celui de la fraction d'albumine brute qu'on obtient par fractionnement avec le polyé- thylene-glycol avant l'ultrafiltration. Le chromatogramme de droite est celui de la solution obtenue par ultrafiltration (albumine de plasma). Il est évident que seule l'albumine de plasma traverse la membrane selon le chromatogramme. Le pourcentage de passage par perméabilité est d'environ 50 %. Pics (1) et (2): protéine macromoléculaire Pic (3): albumine de plasma EXEMPLE 2 On dissout la même résine de polysulfone que dans l'exemple 1 dans un solvant mixte (7:3) de N-méthylpyrrolidone et de diméthylsuifoxyde pour préparer une solution à 15 % (pds/vol). Par le même procédé que dans l'exemple 1, on prépare une membrane d'ultrafiltration et on mesure son seuil de coupure. Ce seuil est d'environ 2,5 x 105. On traite, le plasma de sang humain de manière à obtenir un pH de 7,2, une force ionique de 0, 14 et une concentration d'éthanol de 8 % ainsi qu'une concentration de protéines de 5,1 % à une température de -3 C, puis on réalise une sépara- tion centrifuge pour séparer le liquide qui surnage. On traite ce surnageant de manière à obtenir une concentration d'éthanol de 25 %, un pH de 6,9, une force ionique de 0,09 et une concentration de protéines de 3,0 % à -5 C, puis on réalise une nouvelle séparation centrifuge pour séparer le surnageant (fraction SII + III). On dilue le liquide qui sur- nage pour obtenir une concentration deprotéines de 1 Z%, puis on traite la solution par ultrafiltration comme expliqué dans l'exemple 1. Le chromatogram-e de la solution obtenue dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1 est indiqué sur la figure 3. Il est évident que seule l'albumine de plasma traverse la membrane selon le chromatogramme. Le pourcentage de passage est d'environ 30 %. EXEMPLE 3 On dissout une résine de polysulfone dont le motif principal répond à la structure (n = 150) dans le diméthylsulfoxyde à une concentration de 15 Z (pds/vol.). Par le même procédé que dans l'exemple 1, on prépare une membrane d'ultrafiltration et on mesure le seuil de coupure de cette membrane. On trouve que ce seuil est de 3 x 105. On traite du sang de boeuf par le même procédé que dans l'exemple 1 avec du poly-thylèneglycol pour obtenir une fraction d'albuminede plasma brute et on traite cette fraction par ultrafiltration à l'aide d'un appareil d'ultrafiltration du type à agitation muni de la même membrane que dans l'exemple 1. Le chromatogramme de la solution est sensiblement le même que sur la figure 3. Il est évident que seule l'albumine est filtrée à travers la membrane. Le pourcentage de passage est d'environ 30 Z. EXEMPLE DE REFERENCE I On effectue une ultrafiltration du plasma de sang humain ayant un pH de 7 en utilisant la même membrane que dans l'exemple I. Une petite quantité seulement de l'albumine de plasma passe dans ces conditions à travers la membrane d'ultrafiltration. EXEMPLE DE REFERENCE 2 On utilise le même procédé que dans l'exemple 1 sauf que la membrane d'ultrafiltration est d'un modèle disponible dans le commerce en acetate de cellulose (seuil de coupure: 3 x 105); on effectue le frac- tionnement et l'ltrafiltration. Dans ces conditions, une petite quantité seulement d'albumine de plasma traverse la membrane au stade initial de la filtration et par la suite aucune nouvelle quantité d'albumine de plasma ne passe à travers la membrane. Le taux d'ultrafiltration est très fortement réduit. REVENDICATIONS I. Procédé de séparation d'une albumine de plasma, caractérisé en ce qu'il consiste à séparer une fraction d'albumine brute du plasma sanguin par une technique de fractionnement grossier, puis à séparer l'albumine de plasma par passage à travers une membrane d'ultrafiltration faite en une résine de polysulfone. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la résine de polysulfone est une résine de structure: OU ou C teH3S 2 u C{j -9 SO 2_O CH3 (n = 50 à 250) 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la fraction d'albumine brute utilisée est séparée du plasma sanguin par la technique de fractionnement grossier à l'aide de polyethylene-glycol. 4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser une fraction de Sii+III séparée du plasma sanguin par la technique de séparation de Cohn avec de l'éthanol froid. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, carac- térisé en ce que le pH de la solution aqueuse de l'albumine brute est compris entre 5 et 8.