Brevet FR2472385A1 — publié le 19810703

Les liquides biologiques naturels, tels que sérums d'animaux, liquides amniotiques, laits, extraits tissulaires et embryonnaires sont utilisés depuis longtemps en Cosmétologie. Leurs propriétés, favorisant la résorption des cicatrices, l'amélioration de l'état général de la peau, et un effet retardant la sénescence de celle-ci ont été constates. Les travaux scientifiques sur les cultures de cellules in-vitro ont servi de justification à postériori à cette utilisation. En effet, ces liquides biologiques naturels (sérums, laits, liquides amniotiques, extraits tissulaires, extraits embryonnaires) sont largement utilisés pour les cultures cellulaires in-vitro. La fixation des cellules sur les substrats, première étape indispensable pour la réussite de ces cultures, ainsi que la multiplication cellulaire proprement dite, ne peuvent se faire en l'absence de liquides biologiques naturels. Depuis cette constatation, de nombreux travaux scientifiques ont eu pour but d'isoler à partir de ces liquides biologiques, produits éminemment complexes, les véritables facteurs de croissance. Bien qu'à ce jour on n'ait pas réussi à trouver un produit identifié qui remplace totalement les liquides biologiques complexes, on peut constater, que pour l'essentiel, les travaux réalisés depuis 1960 convergent vers la définition de facteurs de croissance représentés par des peptides dialysables, résistant à la chaleur et aux variations du pH. Le plus grand nombre de publications scientifiques se refèrent à des extraits de sérum, et sans vouloir être exhaustif, on peut citer EAGLE H., Biochemistry 46, 427 (196Q); METZGAR D.P., MOSKOWITZ M., Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 104, 363 (1960) ; GWATKIN R.B., Nature, 186, 984 (1960); PUMPER R. W. YAWASHIROYA H.M., MOLANDER L.T., Nature, 207, 662 (1965); C. DE LUCA, A.F.S.A. HABEEB, G.L. TRITSH Exptl. Cell Res., 43, 98 (1966) ; PIERSON R.W., J. Cell. Physiol., 79, 319 (1971); PICKART L., THALER M.M., Nature, 243, 85 (1973); YOUNG D.N., NAKAND E.T., J. Cell. Physiol. 96, 147 (1978). Pour l'essentiel, ces travaux aboutissent à la définition de facteurs de croissance pour les cellules cultivées in-vitro, facteurs qui présentent de nombreuses similitudes : il s'agit de peptides ou de glycopeptides de faible poids moléculaire compris entre 500 et 50 000 daltons, relativement thermorésistants et souvent acido-résistants. Pour de nombreux auteurs, ces peptides sont naturellement accrochés à des macromolécules porteuses telles qu'albumine ou globulines. Il est alors possible de les extraire de leur support soit par un traitement protéolytique judicieusement choisi, soit par un simple chauffage. D'autre part, certains auteurs dont : SELTZER J.L. et al.Biochem. Biophys. Res. Comm. 80, 637 (1978)] ont démontré que certains peptides sériques de faible poids moléculaire (20 000), relativement thermorésistants, pouvaient activer la collagénase animale. Or, il est connu que lors du vieillissement. le collagène devient de plus en plus résistant à l'action de la collagénase, et que cette activité enzymatique a tendance à baisser. Des travaux moins nombreux, et en particulier récemment KLAGSBRUN M. [ Proc. Natl. Acad. Sci. US, 75, 5057 (1978)], décrivent des facteurs de croissance cellulaire extraits du lait, et ayant des caractéristiques générales semblables à celles des extraits de sérums animaux cités précédemment. On peut également relever des grandes similitudes avec des facteurs de croissance extraits de tissus, et spécialement de peau animale pKARASEK M.A., J. Invest. Dermat., 59, 99 (1972)] , ou extraits de milieux de culture préalablement conditionnés par la croissance cellulaire. Il s'agit là aussi de peptides de faible poids moléculaire, donc dialysables, relativement thermorésistants, et résistants aux principaux enzymes protéolytiques. Si les macromolécules du sérum ou d'autres liquides biologiques ne peuvent pénétrer, ou ne pénètrent que difficilement lorsqu'elles sont utilisées dans des préparations cosmétologiques, elles ont la propriété de retenir l'eau et évitent ainsi une évaporation trop rapide à partir de l'épiderme. Les inventeurs ont trouvé que les peptides à propriétés de facteur de croissance, ou à propriétés d'activateur de collagénase, présentaient un intérêt comme principe utilisable en Cosmétologie, et pourraient remplacer avantageusement les liquides biologiques naturels. Il est évident que ces peptides seront mieux tolérés par la peau, tout en pénétrant plus facilement à travers l'épiderme. Il est connu que les constituants macromoléculaires peuvent par contre entrainer des réactions locales ou générales d'intolérance. De même, la thermorésistance relative de ces peptides les rend propre à une large exploitation cosmétologique. Les inventeurs ont mis au point un procédé de récupération de ces peptides à partir de divers liquides biologiques naturels ou à partir d'extraits aqueux de peau, spécialement de peau d'embryons. Le procédé comporte la sélection èt la séparation des peptides utilisables en Cosmétologie, par des procédés de tamisage moléculaire et la récupération de la fraction macromoléculaire restante pour une utilisation classique en film de rétention de l'eau de perspiration. Le procédé de sélection et de séparation des peptides utilisables en Cosmétologie comporte une thermo-dégradation, et un tamisage moléculaire avant et après digestion enzymatique. Cette double étape permet de séparer les produits sensibles et résistants aux traitements enzymatiques. Chaque étape comporte un traitement thermique compris entre 37 et 80"C afin de ne retenir que les produits thermorésistants, et éviter la présence de peptides à activité hormonale, telle l'hormone thymique par exemple, activités qui ne doivent pas se trouver dans des préparations cosmétiques. Le procédé revendiqué comprend donc une ou plusieurs dégradations thermiques à des températures allant de 37 à 800C, une première séparation sur tamis moléculaire (diafiltration, ultrafiltration ou chromatographie), à point de coupure moyen de 20 000 (compris entre 10 000 et 50 000), une dégradation enzymatique par un ensemble d'enzymes à activité protéolytique, mais respectant la structure peptidique : cette dégradation enzymatique, qui a pour but de dénaturer les macromolécules et de libérer les peptides fixés, est suivie d'un nouveau chauffage qui doit inhiber les enzymes, et d'une séparation par tamisage moléculaire des peptides libéres. Le produit tamisé contenant les molécules de faible poids moléculaire, peut-être appelé "Ultralysat", du fait de son mode de préparation. Exemple NO 1 10 litres de sérum de veau sont dilués à 20 litres avec de l'au distillée, puis chauffés à 600C pendant 30 mn sous agitation. Dans ces conditions, il ne se produit pas de coagulation. Après clarification, l'ensemble est soumis à une opération d'ultrafiltration, et le premier filtrat est récolté. Le rétentat est additionné d'une solution de trypsine et de pepsine et porté à la température de 370C pendant 30 mn après que le pH ait été ajusté à la valeur optimale. Après ces 30 mn, la préparation est soumise à un chauffage à 800C pendant 15 mn, puis soumise à une ultrafiltration. Le filtrat récolté est mélangé avec le premier diafiltrat. Cette préparation comporte l'activité facteur de croissance cellulaire et activateur des collagénases. Le rétentat est récolté séparement pour servir de base à des préparations pour la réhydratation de la peau. Exemple NO 2 1 kg de peau de foetus bovin est broyée dans 10 litres d'eau distillée et mis à macérer pendant 30 mn à 370C. Après clarification le liquide d'extraction est soumis à une première ultrafiltration. Les résidus tissulaires et le rétentat sont additionnés d'un mélange d'enzymes à base de trypsine, pepsine, collagénase, aux conditions optimales de ces divers enzymes. Après action, le liquide clarifié est chauffé à 600C pendant 30 inn, puis soumis à une nouvelle opération de diafiltration. Les 2 diafiltrats sont réunis, et conservés comme préparation à usage cosmetologique. Exemple NO 3 oui 10 litres de lactosérum de lait de bovins sont chauffés à 600C pendant 30 mn, sous agitation. Après ce chauffage, le lactosérum est soumis à une opération de diafiltration, et le diafiltrat est récupéré. Le rétenlysat est soumis à une digestion enzymatique analogue à celle adoptée pour les sérums d'animaux, et le produit de digestion est ultrafiltré. Ici aussi, les ultrafiltrats sont recueillis pour l'usage cosmétologique. Les extraits peptidiques obtenus selon le procédé se presentent comme des liquides, avec une teneur en matière sèche de 1 à 3 %, et une teneur en matières protéiques de 5 à 10 mg/ml (dosée par la méthode du biuret). Toutefois, ils peuvent être concentrés à volonté, ou ramenés à sec par atomisation ou lyophilisation. Dans le cas des extraits de sérums, le spectre dans l'ultraviolet donne un pic à 257 nm. Une chromatographie sur gel de Séphadex G-75 montre 2 pics bien séparés. Ces 2 fractions sont également révélées par électrophorèse sur acétate de cellulose,. sous une tension de 220 V. Ces caractéristiques physico-chimiques sont citées à titre d'exemple, elles peuvent varier avec les sources biologiques de départ et avec les modalités opératoires. Elles sont données pour illustrer le haut dégré de purification apporté par la méthode. L' activité biologique des préparations peut être mise en évidence par la technique des cultures cellulaires. Ici encore, les exemples sont donnés à titre de démonstration car l'activité peut varier en fonction de l'origine des produits biologiques de départ, et avec les souches cellulaires utilisées. Essais sur cellules fibroblastiques humaines : cellules diploides MRC5. Les cellules de cultures de la 10e à la 30e génération in-vitro sont lavées avant séparation par la trypsine ou tout autre agent de dis sociation. Une dispersion de 150 à 200 000 cellules par ml est réalisée dans un milieu de culture synthétique enrichi de 5 à 10 % de sérum de veau, ou de 5 à 10 % d'ultralysat de sérum de veau. La suspension est répartie dans des boites en plastique. Les cellules placées dans un milieu sans sérum ni ultralysat ne se fixent pas et meurent rapidement. Après 8 jours, les cellules mises en milieu avec sérum se sont multipliées abondamment, en formant un tapis cellulaire confluent, alors que les cellules mises en milieu avec ultralysat se multiplient peu, mais restent vivantes. Essais sur cellules hétéroploides épithéliales : cellules de rein de bovidés, lignée MDBK. Les suspensions cellulaires sont réalisées dans les mêmes conditions que précédemment. Ici encore, les cellules mises en milieu sans sérum ou sans ultralysat, ne se fixent pas et meurent rapidement. Après 4 jours, les cellules mises en milieu enrichi de sérum se sont multipliées abondamment, et le tapis cellulaire est confluent. Les cellules mises en milieu enrichi d'ultralysat de sérum se fixent parfaitement, et connais sent une bonne multiplication, proportionnelle à la concentration en ultralysat. Avec un milieu enrichi de 10 % d'ultralysat, le tapis cel-- lulaire couvre la moitié de la surface de la boîte, et le milieu s'acidifie, ce qui est autre signe de la multiplication cellulaire. Utilisation des extraits obtenus On sait que les substances biologiques de départ, surtout les sérums, les liquides amniotiques et les macérations de tissus, provoquent souvent de phénomènes d'intolérance quand elles sont appliquées, même diluées sur la peau. De plus, ces substances s'incorporent difficilement dans les préparations cosmétiques : l'incorporation se faisant toujours quand la préparation est encore tiède (35 - 400 C), la présence de protéines de haut poids moléculaire provoque souvent des précipitations, flocula tions et formation de grumeaux. Les extraits préparés selon les procédés décrits ci-dessus ont été incorporés dans des préparations cosmétiques dans le but de les soumettre à un test d'utilisation. A titre d'exemple non limitatif, une des compositions utilisées avait comme formule : Palmitate de cetyle 1 Stéarine 3 Alcool cétylique 2 Huile minerale 10 Myristate d'isopropyle 7 Triéthanolamine 0,85 Conservateur 0,3 Parfum 0,3 Extrait de sérum de veau 5 Eau q.s.p. 100 g D'une façon générale, les extraits, préparés selon les procédés décrits ci-dessus, s incorporent sans difficulté dans les émulsions, ce qui n'est très souvent pas le cas des substances d'origine (serums animaux, liquides amniotiques, laits, macération de tissus animaux). Ces extraits sont rigoureusement non irritants, et non toxiques, ainsi qu'il a été montré par des tests d'irritation cutané et de toxicite orale, executés de façon conforme à la législation sur les produits de beauté. REVENDICATIONS 1. Utilisation en Cosmétologie d'extraits de substances biologiques naturelles, caractérisés en ce qu'ils contiennent des constituants peptidiques, de poids moléculaires compris entre 500 et SC OOC daltons, thermorésistants jusqu'à 800C. 2. Procédés d'extraction des constituants selon la revendication 1, comportant au moins une thermo-dégradation de la substance de départ à des températures comprises entre 370C et 80 C, et au moins une séparation par tamisage moléculaire. 3. Procedé selon la revendication 2, comportant en outre une concentration partielle, ou un séchage du produit obtenu après tamisage moléculaire. 4. Procédé selon les revendications 2 et 3, comportant en outre une digestion enzymatique par des enzymes al.lotés à la substance naturelle de départ. 5. Procédées selon les revendications 1 à 4 utilisant des sérums animaux comme substance de départ. 6. Procédés selon les revendications 1 à 4, utilisant une macération de tissus animaux, spécialement de peau foetale animale, comme substance de départ. 7. Procédés selon les revendications 1 à 4, utilisant du lait ou du lactosérum d'animaux comme substance de départ. 8. Procédés selon les revendications 1 à 4, utilisant du liquide amnio tique d'animaux comme substance de départ. 9. Produits pour usage cosmétologique, obtenus par un ou plusieurs des procédés selon les revendications 2 à 8, et possédant une activité au moins partielle de facteur de croissance pour les cellules cultivées in-vitro. 10. Produits pour usage cosmétologique, obtenus par un ou plusieurs des procédés selon les revendications 2 à 8, et possédant des propriétés d'activation des collagénases. il. Composition cosmétique, caractérisée en ce qu'elle contient des extraits de substances biologiques naturelles selon les revendications i à 10.