Brevet FR2465785A1 — publié le 19810327

La présente invention concerne un procédé pour détermi- ner l'activité de l'enzyme transformant l'angiotensine en utili- sant une X-hippuryl-L-histidyl-L-leucine à titre de substrat de synthèse et de l'hippuricase. L'enzyme transformant l'angiotensine (dénommé ci-après par souci de brièveté ACE) catalyse la transformation de l'angiotensine I en angiotensine II par élimination du dipeptide à terminaison carboxy, c'està-dire de la L-histidyl-L-leucine, cet angiotensine II étant une substance active vasomotrice. L'ACE joue un rôle important dans le corps humain et on peut diagnostiquer la sarcoldose en mesurant le taux de l'ACE dans le sang. La détermination précise de la teneur en ACE du sang humain est significative du point de vue physiologique et du point de vue clinique. Comme procédés classiques pour cette détermination, on connaît (1) un essai radioimmunologique (2) un essai par fluorométrie et (3) un essai par chromatrographie en phase liquide. Mais ces procédés classiques n'ont pas été utilisés, en général, parce qu'ils exigent des instruments spé- ciaux. L'essai par spectrophotométrie pour l'ACE (l'un des pro- cédés classiques) proposé par D.W. Cushman et collaborateurs est connu et consiste à effectuer les opérations suivantes. On ajoute l'hippuryl-L-histidyl-L-leucine, qui est utilisé comme substrat synthétique, à l'échantillon contenant l'ACE, tel que le sérum humain ou une humeur corporelle, et on le fait réagir pendant une durée déterminée. On arrête ensuite la réaction en ajoutant HCl au système réactionnel. On extrait du mélange réactionnel, à l'aide d'acétate d'éthyle, l'acide hippurique produit par la réaction. On dissout le résidu>obtenu par évaporation de l'acétate d'éthyledans de l'eau distillée. On détermine la concentration de l'acide hippurique en mesurant l'absorption dans l'ultraviolet. On peut évaluer l'activité en ACE à partir de la concentration de l'acide hippurique ainsi trouvé. L'invention procure un procédé plus simple de détermina- tion de l'activité de l'ACE. Ce procédé repose sur ce qui suit. On utilise, comme substrat synthétique, de l'X-hippuryl- L-histidyl-L-leucine ayant la formule suivante et on utilise de l'hippuricase comme enzyme décomposant l'acide hippurique en 2 2465785 acide benzoique et en glycine: x 0 O X5 C-NH- CH2- C--NH-H-- C -NH-CH -COOH I I CH2 CH2CH(CH3)2 NH N dans laquelle X représente OH, NH2 ou N(CH3)2. On ajoute de l'X-hippuryl-L-histidyl-L-leucine à un liquide contenant de l'ACE tel que du sang humain, ou une humeur corporelle, pour obtenir de l'acide X-hippurique et de la L- histidyl-L-leucine en décomposant la X-hippuryl-L-histidyl-L- leucine par l'ACE. On ajoute l'hippuricase au liquide pour obte- nir de l'acide X-hippurique et de la glycine en décomposant l'acide Xhippurique. La réaction de l'acide X-benzoique sur la 4-aminoantipyrine et sur H202 en la présence de peroxydase donne un colorant quinoniminique. On mesure, par colorimétrie, la con- centration de ce colorant quinoniminique pour évaluer l'activité de l'ACE. On peut donc déterminer l'activité de 'ACE par les stades suivants: (1) On mélange un liquide contenant 'ACE à un réactif consistant essentiellement en X-hippuryl-L-histidyl-L-leucine, en hippuricase, en peroxydase, en 4-aminoantipyrine et en H202, et (2) on mesure, par colorimétrie, la concentration du colorant quinoniminique préparé au stade (1). Ce procédé est représenté par les formules suivantes. (1) X-hippuryl-L-histidyl-L-leucine ACE. acide X-hippurique + L-histidyl-L-leucine (2) acide-X-hippurique hippuricase - acide X-benzoique + glycine (3) acide X-benzoique + 4aminoantipyrine + H202 peroxydase 2 2 colorant quinoniminique. 3 2465785 L'un des substrats synthétiques qui est utilisé suivant l'invention, la phydroxyhippuryl-L-histidyl-L-leucine, peut être préparé de la manière suivante. Synthèse de la p-hydroxyhippuryl-L-histidyl-L-leucine. Dans 300 ml de chloroforme, on dissout 30 grammes de carbobenzoxy-glycine et 24 grammes d'ester méthylique de L- histidine et, à cette solution, on ajoute 30 grammes d'éthylamino- propylcarbodiimide destiné subir la réaction. Après avoir laissé le mélange réactionnel à température ambiante pendant 2 heures, on le lave par de l'eau et par une solution aqueuse à 2,5 % de NaHC03, puis on élimine le solvant (chloroforme) par distilla- tion sous pression réduite. On dissout 25 grammes du produit de la réaction, l'ester méthylique de la carbobenzoxyglycyl-L-histidine, dans 50 ml d'éthanol et à cette solution on ajoute 15 ml d'hydrazine hydratée, puis on laisse reposer la solution pendant une nuit. L'hydrazide de carbobenzoxyglycyl-histidine ainsi préparée est lavée à l'eau et recristallisée dans l'eau chaude. On dissout 21 grammes d'hydrazide de carbobenzoxyglycyl- L-histidine dans 185 ml d'HCl 1N et à cette solution on ajoute 245 ml d'acétate d'éthyle et 4,3 grammes de NaNO2 à 0 C tout en agitant et, 5 minutes après, 73 ml d'une solution aqueuse à % de K2C03, puis on extrait cette solution par l'acétate d'éthyle. Après avoir déshydraté l'extrait sur du sulfate de sodium anhydre, on ajoute à l'extrait une solution (refroidie à 0 C) d'ester méthylique de L-leucine dans l'éther éthylique (9 grammes/208 ml) et on abandonne ce mélange pendant une nuit à -5 C. On filtre les cristaux ainsi obtenus et on les lave à l'éther éthylique pour obtenir l'ester méthylique de la carbo- benzoxyglycyl-L-histidyl-L-leucine. A 100 ml d'une solution d'HBr à 25 % dans l'acide acétique, on ajoute 20 grammes de l'ester méthylique de la carbobenzoxy- glycyl-L-histidyi-L-leucine et on agite le mélange pendant une heure pour éliminer le groupe carbobenzoxy, puis on ajoute 2000 ml d'éther absolu. On sépare le précipité ainsi préparé par filtration et on le lave à l'éther éthylique, puis on le sèche dans un dessiccateur. On dissout dans 80 ml de dichlorométhane, 20 grammes du précipité, l'éther méthylique de glycyl-L-histidyl-L-leucine, 2HBr, et 10,1 ml de triéthylamine et à cette solution on ajoute 246S785 6,5 grammes d'acide p-acétoxybenzolque, puis on ajoute 7,5 grammes d'6thylaminopropylcarbodiimide, HC1, et on agite ce mé- lange à température ambiante pendant 2 heures. On lave le mélan- ge réactionnel à l'eau et par une solution aqueuse à 2,5 % de NarCO3, puis on le sèche sur sulfate de-sodium anhydre et on le rend exempt de solvant sous pression réduite, puis on l'aban- donne à une température de -20 C, pour précipiter l'ester méthy- lique de p-acétoxyhippuryl-L-histidyl-L-leucine. On dissout 5,1 grammes d'ester méthylique de p-acétoxy- ) hippuryl-L-histidyl-L-leucine dans 20 ml de méthanol, et à cette solution on ajoute 20Oml d'une solution aqueuse IN de NaOH à'. une température de 4 C et, après avoir agité pendant une heure, on abaisse le pH de la solution à 5 par addition d'HCl et on enlève l'eau et le méthanol par distillation. On dissout le résidu dans le méthanol et on le filtre et à la solution on ajoute de l'éther éthylique. On filtre des-cristaux qui préci- pitent après repos à -20 C pour obtenir la p-hydroxyhippuryl- L-histidyl-L-leucine. Les exemples suivants illustrent l'invention. EXEMPLE 1 On détermine l'activité de 'ACE en utilisant la p- hydroxyhippuryl-L-histidyl-L-leucine préparée comme ci-dessus à titre de substrat synthétique. A 0,25 ml d'une solution-tampon dont le pH est de 8,3 contenant 5 mM de phydroxyhippuryl-L-histidyl-L-leucine, 1 U d'hippuricase, 0,5 U de peroxydase, 2 mM de 4-aminoantipyrine, 2 mM de H202, 0,5 M de NaCl et 0,1 d'acide borique, on ajoute 0,05 ml de sérum et 0,049 ml d'eau pure. On mesure la variation de l'absorbance par la solution pour une lumière ayant une longueur d'onde de 505 nm à une tem- pérature de 37 C pendant le déroulement de la réaction. Pour cette mesure, on utilise un analyseur centrifuge dont l'inter- valle de temps est de 5 secondes et la durée de la réaction est de 10 minutes. L'unité d'activité (mU) d'ACE est imprimée auto- matiquement dans l'autoanalyseur. Le calcul est effectué suivant la formule suivante: m Variation d'absorbance à 505 nm 1 U =Absorptivité moléculaire (>) x Duree de réaction (10 mn) 2465785 1 0,30 o6 X longueur du trajet de lumière (cm) x 0,05 x 10 = 12.000 (absorptivité moléculaire du colorant quinoniminique). Les résultats des mesures, répétés 20 fois, sont les suivants. Unité d'activité (mU) = 15,0 + 0,5 (nmoles/ml/minute). Coefficient de variation (CV) = 3,3 %. EXEMPLE 2 On obtient l'unité d'activité (mU) et le coefficient de variation (CV) en répétant le même processus et les mêmes calculs que ceux de l'exemple 1, si ce n'est que l'on utilise 10 mM de p-aminohippuryl-L-histidyl-L-leucine au lieu de 5 mM de p-hydroxy- hippuryl-L-histidyl-L-leucine et que l'on mesure la variation de l'absorbance à 480 nm et que dans le calcul on remplace E par 8000. Unité d'activité (mU) = 16,0 + 0,28 (nmoles/ml/minute). Coefficient de variation (CV) = 1,8 %. EXEMPLE 3 On obtient l'unité d'activité (mU) et le coefficient de variation (CV) en reprenant le même processus et le même calcul que ceux de l'exemple 1, si ce n'est que l'on utilise 8 mM de p-diméthylaminohippuryl-L-histidyl-Lleucine au lieu de 5 mM de P-hydroxyhippuryl-L-histidyl-L-leucine, et que l'on mesure la variation de l'absorbance à 555 nm et que dans le calcul on rem- place e par 32.000. Unité d'activité (mU) = 15,0 + 0,32 (nmoles/ml/minute). Coefficient de variation (CV) = 2,1 %. A des fins de comparaison avec le procédé suivant l'in- vention, on effectue une mesure par le procédé Cushman en utili- sant le même sérum que celui utilisé dans le procédé suivant l'invention et en procédant de la manière suivante. A 0,25 ml d'une solution-tampon boratée (pH = 8,3) contenant 5 mM d'hippuryl-L-histidyl-L-leucine, on ajoute 0,1 ml de sérum et on fait réagir à 37 C pendant 60 minutes, puis on arrête la réaction par addition d'HCl à la solution. On extrait l'acide hippurique produit par 1,5 ml d'acétate d'éthyle, et on sépare le liquide surnageant puis on dissout le résidu par dis- tillation du solvant dans 2 ml d'eau pure. On mesure l'absorbance de ce liquide à 228 nm pour déterminer la quantité d'acide hippurique et on calcule l'unité d'activité d'ACE (mU). Les 6 2465785 résultats de la mesure répétée 20 fois sont les suivants. Unité d'activité (mU) = 15,8 + 0,93. Coefficient de variation (CV) = 5,89 %. Comme le montrent les résultats ci-dessus, le procédé suivant l'invention est plus simple, en comparaison de celui de Cushman, et a une meilleure reproductibilité, comme le montrent les coefficients de variation respectifs. (Les coefficients de variation du procédé suivant l'invention sont 3,3 %, 1,8 % et 2,1 %. Le coefficient de variation du procédé de Cushman est de 5,89 %). 7 2465785 REVENDICATIONS 1. Procédé pour déterminer l'activité de l'enzyme trans- formant l'angiotensine, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer les stades suivants: (1) mélanger un liquide contenant l'enzyme transfor- mant l'angiotensine à un réactif consistant essentiellement en X-hippurylL-histidyl-L-leucine ayant la formule suivante, en hippuricase, en peroxydase, en 4-aminoantipyrine et en H202, et (2) mesurer colorimétriquement la concentration du colorant quinoniminique préparé au stade (1): x 0 0 0 > --NH- CH2- C- NH- CH- C-NH-CH -COOH l l CH2 CH2CH(CH3)2 NH dans laquelle X représente OH, NH2 ou N(CH3)2. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la X-hippuryl-L-histidyl-L-leucine est la p-hydroxyhippuryl- L-histidyl-L-leucine. 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la X-hippuryl-L-histidyl-L-leucine est la p-aminohippuryl- L-histidyl-L-leucine. 4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la X-hippuryl-L-histidyl-L-leucine est la p-diméthylamino- hippuryl-L-histidyl-L-leucine.