Brevet FR2463806A1 — publié le 19810227

-1- L'invention concerne une culture sur plaques multiples empilées; elle concerne plus particulièrement un procédé de croissance de cellules animales et la pro- duction de métabolites à partir de celles-ci, ainsi qu'un appareil utilisé dans ce procédé. On effectue généralement la culture de cellu- les animales à une grande échelle dans un appareil com- prenant un récipient pour le milieu de culture et une pluralité de surfaces disposées dans le récipient et sur lesquelles croissent les cellules, ces surfaces étant constituées de disques ou de plaques espacés l'un de l'autre. Le brevet britannique nO 1 097 669 décrit un propagateur de culture de tissus comprenant un récipient pour le milieu de culture et une série de plaques, espa- cées disposées en un empilement sur un support dans le récipient. L'empilement de plaques demeure stationnaire dans le récipient et la circulation nécessaire du milieu de culture à l'intérieur du récipient s'effectue au mo- yen d'une pompe à air aspirante. Pour son fonctionnement, on remplit le récipient du milieu de culture dans la me- sure voulue, on l'inocule avec les cellules que l'on dé- sire cultiver, que l'on laisse se déposer sur la surface des plaques et on produit la circulation requise à l'aide d'une pompe aspirante à air ou par agitation magnétique ou vibratoire. Une modification d'un appareil de ce type est constituée par l'appareil vendu par la Société Suédoise dite Biotec AB, qui comprend un empilement de disques monté sur un arbre rotatif axial, à l'intérieur du ré- cipient cylindrique. Dans la pratique, on place d'abord l'appareil verticalement, c'est-à-dire avec son arbre axial à angle droit avec la surface de travail, on rem- plit le récipient du milieu nutritif, on plaque des -2- cellules sur les surfaces des disques, puis on place l'appareil dans une position horizontale, on retire du récipient environ la moitié du milieu nutritif et on fait tourner le support et l'empilement de disques de façon que seule la portion inférieure des disques passe à tout moment à travers le milieu de culture reposant dans le récipient. Le brevet britannique n0 1 393 654 décrit une modification de l'appareil Biotec, dans laquelle le rap- port du diamètre d'un disque au diamètre interne du ré- cipient est compris entre 0,80:1 et 0,90:1 et, en outre, la distance entre le bord des disques et la paroi in- terne du récipient est de préférence de 1,27 à 1,905 cm. Il est également préféré que le rapport de la surface totale des disques au volume du récipient soit de 5,5:1 à 6,0:1. Compte tenu de la nature du fonctionnement de cet appareil, ainsi que de l'appareil Biotec, il est nécessaire que la rotation de l'arbre soit lente, afin de minimiser les forces de cisaillement produites sur les cellules pendant que les disques tournent en péné- trant et en sortant du milieu de culture. On a proposé des vitesses de rotation de l'ordre de 0,5 tours/mn comme vitesse maximale pratique pour cet appareil et on utilise fréquemment des vitesses plus faibles. Les types d'appareils décrits ci-dessus, bien qu'efficaces pour la croissance des cellules, présentent divers inconvénients qui résultent des caractéristiques de construction et de fonctionnement, et qui rendent impossible un règlage convenable d'un procédé cellulaire synthétique pour la production de métabolites de cellu- les utilisables.'C'est ainsi que l'emploi d'un empilement- fixe de plaques maintenu dans un support à encoches ré- sulte en un assemblage dont le nettoyage et la récolte des cellules sont compliqués. -3- On ne peut obtenir une circulation efficace du milieu de culture en utilisant une pompe à air aspi- rante sans provoquer un moussage indésirable du milieu, qui peut nécessiter l'addition d'agents anti-moussants pouvant nuire à la croissance et au métabolisme des cellules de tissus de culture. Dans les appareils du type rotatif décrit, la nécessité de faire passer l'appareil de la verticale à l'horizontale constitue un inconvénient réel dans le cas d'appareils de grandes dimensions. Les vitesses néces- sairement basses de rotation rendent inéfficace le mé- lange des constituants du milieu de culture et autres réactifs ultérieurement ajoutés, et, de plus, la mesure en continu des conditions à l'intérieur du récipient, n'est pas fiable, car son mélange médiocre fait que le contenu du récipient ne constitue pas un système homo- gène. On peut, selon l'invention, surmonter tous ces inconvénients, en effectuant la culture dans un appareil comprenant un récipient disposé verticalement, pratique- ment rempli d'un mélange du milieu de culture et des cellules, contenant un empilement de plaques métalliques parallèles, esnacées, montées de façon fixe par rapport à un arbre axial susceptible de vitesses de rotation relativement élevées, et en utilisant un moyen pour la circulation du milieu, depuis le fond jusqu'en haut du récipient. L'invention a donc pour objet un procédé pour la croissance de cellules animales par incubation avec un milieu de culture, dans un appareil de culture à pla- ques multiples, selon lequel on remplit pratiquement un récipient cylindrique, disposé verticalement, d'un mélan- ge de cellules et du milieu de culture, ledit récipient étant fermé par des plaques sur le sommet et le fond, b -4- plaque du sommet étant pourvue de plusieurs conduits d'admission et la plaque du fond étant pourvue d'un conduit d'évacuation; le récipient contient une série de disques, parallèles et espacés, montés de façon fixe par rapport à un arbre axial rotatif dans le récipient; on laisse les cellules se déposer sur les surfaces des disques, tout en maintenant le contenu du récipient à une température de croissance optimale et tout en infu- sant au contenu du récipient un mélange d'oxygène et de bioxyde de carbone; on fait ensuite tourner l'arbre axial à une vitesse telle qu'on produit une vitesse pé- riphérique minimale de plaque de 200 cm/mn, pendant un temps donné, pour laisser la croissance optimale se produire, en faisant circuler le milieu de culture depuis le fond jusque dans le haut du récipient à l'aide d'un moyen de pompage externe. Dans un récipient typique de 5 1, pour produi- re une vitesse périphérique de plaque de 200 cm/mn, la vitesse de rotation de l'arbre axial est de l'ordre de 5 tours/mn. Dans les procédés antérieurs, on a proposé divers matériaux pour les substrats de croissance des cellules. Selon l'invention, l'acier inoxydable lisse constitue le matériau idéal pour les plaques de l'appa- reil de l'invention, comme fournissant des taux plus élevés de croissance et des densités maximales plus élevées de population que les autres matériaux usuels. Sur les dessins annexés, la Figure 1 représente des courbes de croissance de cellules conjonctives humaines 3C: de fibroblastes diploides 17/1, croissant dans un milieu de culture usuel RPMI 1640 + 10 % de sérum. On a anté- rieurement proposé (voir brevet des EUA n0 3 976 547) d'utiliser divers métaux, y compris l'acier inoxydable, comme substrat pour la croissance des cellules, mais en -5- modifiant la surface du matériau de façon telle qu'elle comporte des irrégularités plus grandes que le diamètre des cellules à cultiver. N'ayant toutefois constaté au- cun avantage à un tel changement de la topographie de surface, selon l'invention, on utilise des plaques lis- ses. Le fait de pouvoir faire tourner les disques dans l'appareil de l'invention à des vitesses beaucoup plus élevées qu'il n'est possible d'utiliser dans des récipients disposés horizontalement, nermet de réaliser un mélange plus efficace du contenu du récipient. On constate, cependant, qu'on peut encore améliorer le mé- lange en montant les plaques sous un angle d'au moins avec l'horizontale, en produisant un effet de vissage à l'intérieur du récipient. En conséquence, et selon un mode de réalisation préféré, l'appareil utilisé dans le procédé de l'inven- tion, comprend: - un récipient cylindrique disposé verticale- ment, fermé par des plaques de recouvrement supérieure et inférieure, avec plusieurs conduits d'admission dans la plaque supérieure communiquant avec l'intérieur du récipient et au moins un conduit d'évacuation dans la plaque inférieure; - un empilement de disques parallèles espacés dans le récipient, ces disques étant fixes par rapport à un arbre rotatif disposé selon l'axe, et étant inclinés sous un angle d'au moins 5 avec l'horizontale; - des moyens pour faire tourner l'arbre dans le récipient; et - des moyens externes au récipient pour en pomper le contenu depuis le fond jusqu'en haut. On peut encore améliorer le taux de mélange dans le récipient, en utilisant un moyen d'agitation -6- additionnel, seul ou en combinaison. On peut aussi incor- porer dans l'empilement des disques, une ou plusieurs roues mobiles, qui peuvent avoir la forme de disques à ailettes. Le mélange efficace, selon l'invention, du contenu du récipient, assure qu'un système homogène se forme et se maintient dans le récipient. Il résulte de ce mélange efficace une distribution rapide et complète des constituants ajoutés au contenu du récipient, qui assure que des mesures continues et fiables de la compo- sition et des autres conditions du milieu de culture puissent être facilement prises, et qu'un réglage précis, entièrement instrumental, du procédé soit rendu possible. La vitesse d'un taux donné de mélange dans le récipient dépend de la combinaison de la vitesse de rotation de l'empilement de disques et de la mise en oeuvre de moyens auxiliaires de pompage. On peut améliorer davantage le mélange par l'inclinaison des disques par rapport à l'horizontale. On peut mettre en évidence l'influence et la relation entre la vitesse de rotation de l'empilement de disques et le taux de pompage auxiliaire du contenu du récipient, en injectant dans le centre supérieur d'un récipient de 5 1, une certaine quantité de colorant, en faisant tourner l'empilement de disques, en effectuant un pompage auxiliaire et en mesurant la durée nécessaire pour disperser 95 96 du colorant dans le contenu du réci- pient. On obtient les résultats suivants en utilisant un récipient de 5 1, muni d'un empilement de plaques dis- posées horizontalement. -7- L'inclinaison des plaques dans l'empilement contribue encore à l'efficacité du mélange, et présente l'avantage important supplémentaire de faciliter l'écou- lement du contenu du récipient au moment de sa vidange. Le milieu de culture tend en général à être retenu entre les plaques, sous l'effet de la capillarité, mais on constate que si les plaques sont inclinées vis-à-vis de. l'horizontal et qu'on fait tourner l'empilement, on amé- liore l'efficacité de l'écoulement. Les résultats suivari illustrent ce principe; La possibilité d'utiliser de grandes vitesses de rotation avec l'appareil de l'invention, simplifie beaucoup le processus de la récolte des cellules de croissance dans le récipient; dans ce processus, on retire le milieu de culture du récipient, on le remolace par un milieu contenant un enzyme capable de détacher les cellules des plaques et on fait tourner l'empilement Durée de dispersion de 95 % du colorant (mn) Tours/mn 0 3 6 11 17 30 40 50 60 i. _ _ _ _ - Débit de pompage ml/mn 0 - - - - 38 23 13 13 9 300 30'+ 30 23 9 11 9 7 8 7 760 30+23 16 5 4 5 - - - 1060 - 20 10 7 3 3 - - - Angle avec la verticale Liquide retenu (% de l'original) 0o 50 6 2 0,6 j,j(bOC -8- des Plaiues à grande vitesse de façon que les cellules soient Drojetées par tournoiement dans le milieu, qui est alors retiré du récipient par le conduit de sortie. Outre, la simple croissance de cellules ani- males, le procédé et l'appareil de l'invention convier- nent particulièrement à la production de métabolites produites par les cellules adultes, et résultant de l'introduction dans le récipient d'un inducteur de la métabolite cherchée. Le procédé et l'appareil convien- nent particulièrement à ce but en raison de leur capa- cité de créer et de maintenir un système homogène dans le récipient et de permettre le mélange rapide et complet des constituants ajoutés. Un exemple en est donné par la Droduction d'interféron selon un procédé utilisant l'appareil de l'invention, comme décrit ci-après. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit de plusieurs exemples et à l'examen des dessins annexés, qui représentent à titre non limitatif, divers modes de réalisation suivant l'in- vention. Exemple 1 Dans un récipient stérile de 5 l contenant plaques d'acier inoxydable, on introduit 5 1 du mi- lieu de culture RPMI 1640 contenant 10 %o en volume de sérum de veau et un ensemencement de 105 cellules/ml. On utilise une souche de cellules conjonctives humaines de fibroblastes diploIdes 17/1. Après incubation station- naire pendant la nuit à 37WC, on fait tourner les plaques à 40 tours/mn pendant 136 h. A ce moment, 50 9o du glucose du milieu de culture sont consommés et des cultures éle- vées en parallèle dans des bottes de Roux sont devenues confluentes et ont aussi utilisé 50 du glucose du milieu de culture. Après 136 h, on évacue le milieu de culture et on le remplace par 5 1 de RPMI 1640 contenant une dose -9- d'ensemencement d'interféron fibroblaste. Après incuba- tion pendant la nuit, on ajoute des réactifs inducteurs d'interféron. On ajoute les poly-IC et cycloheximide jusqu'à des concentrations finales respectives de 30 yug/ml et de 5 pg/ml. Cinq heures après l'addition de ces réactifs, on ajoute de l'actinomycine D (1 "g/ml). Après encore 2 h, on évacue le milieu de culture du ré- cipient et on ajoute 5 1 de solution saline tamponnée au phosphate. On évacue ce tampon, puis on lave 2 fois avec le tampon. On transfère 5 1 de RPMI 1640 dans le réci- pient. Après encore 16 h d'incubation, on recueille le liquide surnageant du milieu de culture, contenant l'in- terféron. On fait tourner les plaques à 40 tours/mn pen- dant la croissance, et l'induction et la production d'in- terféron. L'analyse du liquide surnageant indique qu'il contient 6000 unités d'interféron/ml. La Figure 2 représente un mode de réalisation de l'appareil selon l'invention. Sur cette Figure, un récipient cylindrique en verre l est pourvu d'une plaque de recouvrement supérieure 2 et d'une plaque de recouvre- ment inférieure 3, serrées entre elles, de façon étanche aux liquides, par des tiges 4 et des écrous à oreilles , et scellées par des garnitures en caoutchouc de sili- cone 6. La plaque supérieure 2 comporte 5 conduits d'ad- mission: 7 et 7' pour l'admission des gaz, 8 et 8' pour l'addition des réactifs et 9 pour l'addition du milieu de culture. La plaque inférieure 3 comporte un conduit de sortie 10. Un arbre axial 11 est placé dans l'appareil, suivant son axe, et un grand nombre de disques 12 en acier inoxydable lui sont attachés. Des roues mobiles, supé- rieure et inférieure 13 et 13' sont également fixées à l'arbre. Un moyen de commiande 14 de l'arbre est pourvu à l'extérieur du récipient. Un circuit de pompage (non représenté) fait -10- circuler le contenu du récipient depuis le fond jus- qu'en haut. La Figure 3 représente un appareil préparé suivant l'invention. L'appareil est identique à celui de la Figure 2, si ce n'est que les plaques 12 sont inclinées sous un angle de 150 avec l'horizontale. Pour son fonctionnement, l'appareil est d'a- bord stérilisé à l'autoclave, puis pratiquement rempli, à travers le conduit d'entrée 9, d'une suspension des cellules désirées dans un milieu de culture approprié. On commence la gazéification du contenu du-récipient en insufflant un mélange de 5 % de C02 et de 95 % d'air, à travers les conduits 7 et 7'. On poursuit la gazéifi- cation pendant tout le processus. Après remplissage, on laisse reposer l'appareil pendant la nuit, pour que les cellules s'attachent aux disques stationnaires. On fait ensuite tourner l'empilement de disques à une vitesse comprise entre 30 et 40 tours/mn, pendant 5 à 7 jours, le milieu de culture pouvant, ou non, être changé pen- dant cette durée, en fonction de la vitesse de croissan ce des cellules. Pendant le processus, on maintient l'appareil et son contenu à une température réglée, en général à 371C. A la fin de cette durée de rotation, il s'est établie une colonie optimale de cellules de croissance et le traitement qui suit, dépend du but poursuivi. Si les cellules sont recherchées par elles-mêmes, on retire le milieu de culture du récipient et on le remplace par une solution saline tamponnée contenant de la trypsine, pour détacher les cellules des plaques, on fait tourner les plaques à grande vitesse pour en détacher les cellu- les par tournoiement et on retire du récipient par le- conduit de sortie, la suspension des cellules dans la so- lution saline. Si on doit soumettre les cellules à un -11- traitement ultérieur dans le récipient, on remDlace le milieu de culture par l'agent voulu et on roursuit la rotation des disques et un chauffage réglé, jusqu'à la fin du traitement ultérieur. L'exemple suivant, décrit la croissance de cellules humaines diploides normales de poumon d'em- bryon. Exemple 2 On utilise un appareil tel que précédemment décrit, ayant une capacité de 6 1 et contenant un empi- lement de 50 à 100 disques en acier inoxydable; on le stérilise à l'autoclave, puis on le refroidit et on le maintient à 371C. On remplit le récipient par le conduit 9 avec 5 à 5,5 1 d'une suspension de 5 x 104 à 5 x 105/ ml de cellules humaines diploïdes normales de poumon d'embryon, dans un milieu de culture RPMI 1640 contenant % en volume de sérum de veau. On commence la gazéifi- cation du contenu du récipient avec 30 ml/mn d'un mélange de 5 % de C02 et 95 % d'air. On laisse reposer le réci- pient rempli pendant 12 h, pour permettre aux cellules de se plaquer sur la surface des disques. Ensuite, et tout en poursuivant la gazéification et en maintenant la température à 370C, on fait tourner l'empilement de disques à une vitesse de 30 à 40 tours/mn pendant 5 à 7 jours. On mesure la vitesse de croissance des cellules par les moyens usuels, par intervalles, pendant ce temps, et on renouvelle le milieu de culture si, et quand né- cessaire. Tout milieu de culture ajouté est préchauffé à 370C. Après ce temps, le cycle de croissance des cel- lules est complet. On peut alors récolter les cellules en remplaçant le milieu de culture par une solution sa- line tamponnée contenant de la trynosine, en augmentant la vitesse de rotation pour détacher les cellules par tournoiement, et en recueillant les cellules avec la so- -12- lution saline, par le conduit de sortie 10. Outre, la production de métabolites secondai- res en utilisant le récipient rempli du milieu de cultu- re, on peut aussi les produire en vidant le récipient du milieu et en maintenant les plaques dans une eau sa- turée de gaz de façon réglée. Après leur détachement des plaques, on peut récolter les métabolites en remplissant à nouveau le récipient d'un milieu convenablement choisi. Ce procédé présente les avantages suivants (a) Si on utilise plusieurs récipients conte- nant des empilements, dont on recueille les métabolites en les faisant traverser par le milieu en continu, il est possible d'obtenir une récolte plus concentrée. (b) Le milieu utilisé pour la récolte n'est pas nécessairement un milieu qui convient à la croissan- ce et au métabolisme des cellules, mais un milieu que l'on peut adapter exactement aux opérations ultérieures de séparation. (c) Le fait d'éviter l'emploi d'un milieu de culture coCteux en (a) et en (b) résulte en une économie notable. Ce mode de mise en oeuvre de l'invention est illustré dans l'exemple suivant. Exemple 3 On stérilise à l'autoclave six récipients tels que précédemment décrits, d'une capacité de 1 litre et contenant un empilement de 30 plaques, puis on les re- froidit et on maintient leur température à 371C. On remplit chaque récipient avec 800 ml d'une suspension de 5 x 10 cellules humaines diploïdes normales de pou- mon d'embryon par ml du milieu de culture RPMI 1640, contenant 10 % en volume de sérum de veau. On commence la gazéification des contenus des récipients par l'emploi -13- d'un mélange de 5 % de C02 et de 95 % d'air, à raison de 30 ml/mn. On laisse reposer les récipients remplis pendant 12 h pour permettre aux cellules d'adhérer aux surfaces des disques. On fait ensuite tourner les dis- ques à environ 40 tours/mn pendant 5 jours, tout en maintenant la gazéification et la température à 371C. On mesure la vitesse de croissance de façon usuelle, à certains intervalles, pendant ce temps. On évacue le milieu, qu'on remplace par 800 ml de RPMI 1640, conte- nant une dose d'ensemencement d'interféron fibrocyte. Après incubation pendant la nuit, on ajoute des réactifs inducteurs d'interféron. On ajoute le poly-IC et le cycloheximide jusqu'à des concentrations finales res- pectives de 30 pg/l et de 5 pug/l. Cinq heures après l'addition de ces réactifs, on ajoute de l'actynomicine D (1 Fg/l). Après encore 2 h, on évacue le milieu de culture par écoulement et on ajoute 800 ml d'une solu- tion saline tamponnée au phosphate. On évacue ce tampon, qu'on remplace par un autre, semblable. On ajoute ensui- te 800 ml de RPMI 1640, en série, d'un récipient à un autre, en l'évacuant par écoulement du premier. Après encore 16 h d'incubation à 37oC, sans gazéification ni rotation, on ajoute 800 ml de RPMI 1640 à chaque réci- pient, pour mesurer l'interféron produit dans chaque récipient. (Il est généralement préférable d'ajouter le RPMI 1640 en série dans les récipients pour récolter l'interféron). Le titre moyen en interféron pour les 6 récipients est de 2512 U/ml (déviation standard = 0,3). Le procédé selon lequel on fait fonctionner les empilements de plaques dans des conditions d'évacua- tion par écoulement, est également avantageux quand il est nécessaire de traiter les cellules transitoirement avec des réactifs coûteux. Comme déjà mentionné, la tech- nique qui consiste à faire passer de tels réactifs en 24638o6 -14- série à travers les empilements de plaques résulte en économies de réactifs et donc de coûts. Il faut remarquer que l'emploi d'un milieu convenant pour la récolte du produit formé, bien que courant, n'est pas essentiel. Si on le désire, on peut laisser le produit s'accumuler sur les plaques jusqu'à ce qu'on le recueille ultérieurement. Bien entendu, l'invention n'est nullement li- mitée aux exemples décrits. Elle est susceptible de nombreuses variantes, suivant les applications envisa- gées, sans qu'on s'écarte pour cela du cadre de l'in- vention. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la croissance de cellules animales par incubation avec un milieu de culture dans un appareil à plaques multiples, caractérisé en ce qu'on remplit pra- tiquement un récipient cylindrique (1) disposé vertica- lement, d'un mélange de cellules et d'un milieu de culture, ledit récipient étant fermé par des plaques supé- rieure et inférieure (2,3), la plaque supérieure (2) étant pourvue de plusieurs conduits d'entrée (7,7', 8,8', 9) et la plaque inférieure (3) d'un conduit de sortie (10), et le récipient (1) étant pourvu d'uoesérie de disques (12) parallèles et espacés, montés de façon fixe par rapport à un arbre rotatif, axial (11), à l'intérieur du récipient, on laisse les cellules se déposer sur les-surfaces de disques (12) tout en maintenant le contenu du récipient (1) à une température optimale de croissance et en infusant le contenu d'un mélange d'oxygène et de bioxyde de carbone, puis on fait tourner l'arbre axial (11) à une vitesse d'au moins 5 tours/mn pendant une certaine durée pour permettre une croissance optimale et on faire circuler continuelle- ment le contenu du récipient depuis le fond jusqu'en haut. 2. Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que les disques parallèles et espacés sont inclinés sous un angle d'au moins 5 avec l'horizontale. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'à la fin du cycle de crois- sance, on évacue le milieu de culture résiduel et on récolte les cellules. 4. Procédé selon l'une-des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'à la fin du cycle de crois- sance, on remplace le milieu de culture par un milieu conçu pour induire les cellules à former un produit voulu et on incube à nouveau les cellules. -16- 5. Procédé selon la revendication 4, caracté- risé en ce que le milieu de remplacement est présent de façon transitoire. 6. Procédé selon l'une des revendications 4 et 5, caractérisé en ce que le produit de remplacement contient des réactifs inducteurs d'interféron. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que, après l'induction, on ajoute un milieu dans lequel le produit formé est libéré pour être recueilli. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que, après l'induction, on n'ajoute pas de milieu pour la récolte du produit formé, celui-ci s'accumulant sur les plaquesjusqu'à sa récupération ulté- rieure. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les disques métalliques, paral- lèles et espacés, sont inclinés sous un angle de 100 avec l'horizontale. 10. Cellules et produits de cellules obtenus par un procédé selon l'une des revendications 1 à 9. 11. Interféron obtenu par un procédé selon l'une des revendications 1 à 9. 12. Appareil propagateur de cellules à plaques multiples, caractérisé en ce qu'il comprend: un récipient cylindrique (1) disposé verticalement, fermé par des plaques supérieure et inférieure (2,3), plusieurs conduits d'entrée (7,7',8, 8', 9,) dans la plaque supérieure (2) communiquant avec l'intérieur du récipient, la plaque infé- rieure (3) étant pourvue d'au moins un conduit de sortie (10), un empilement de disques (12) parallèles et espacés, montés de façon fixe par rapport à un arbrerotatif (11) disposé axialement, et inclinés sous un angle d'au moins avec l'horizontale; des moyens (14) pour faire tourner l'arbre (11) à l'intérieur du récipient; et des moyens pour faire circuler le contenu du récipient depuis le fond jusqu'en haut du récipient. 15. Appareil selon la revendication 12, carac- térisé en ce qu'il comporte des disques en acier inoxy- dable. 14. Appareil selon l'une des revendications 12 et 13, caractérisé en ce qu'une ou plusieurs roues mobiles sont fixées à l'arbre axial. 15. Appareil selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que les moyens pour faire circuler le contenu du récipient comprennent un circuit externe de pompage.