Brevet FR2467841A1 — publié le 19810430

La présente invention concerne un fragment de glucagon de la formule H-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp- Leu-Met-Asn-Thr-OH (I) une forme conjuguée de ce fragment de glucagon et d'u- ne protéine et un procédé pour la préparation d'un an- ticorps spécifique en utilisant cette forme conjuguée. Le glucagon est une hormone qui agit sur le métabolisme des hydrates de carbone et on sait que c'est un peptide 1-29 du pancréas de la formule 1 2 3 4 5 6 H - His - Ser - Gln - Gly - Thr - P he 7 8 9 10 11 12 13 T hr - S er - A sp - T yr - S er - L ys - T yr- 14 15 16 17 18 19 20 L eu - A sp - S er - A rg - A rg - A la - G ln- 21 22 23 24 25 26 27 A sp - P he - V al - G In - T rp - L eu - M et - 28 29 Asn - T hr - O H (II) Zque l'on appelle ci-après glucagon (1-29)7 et la déter- mination de son taux sanguin a été très importante comme détermination clinique. La détermination radio-immunologique, la déter- mination par immunofluorescence, la détermination immuno- logique enzymatique et des procédés de détermination du même genre basés sur la réaction immunitaire ont été uti- lisés comme principaux procédés de détermination des quan- tités de glucagon de l'ordre de traces et donc son anti- corps spécifique a été essentiellement nécessaire. Toutefois, l'anticorps spécifique pour le glu- cagon ne peut être obtenu qu'accessoirement en utilisant une combinaison de glucagon(1-29) comme haptène et d'al- bumine de sérum bovin (BAS); de plus, on ne peut pas s'attendre à sa reproductibilité. En outre, on a rapporté peu d'exemples de la production de l'anticorps en utilisant une combinaison d'un haptène tel qu'un fragment du glucagon (129), par exemple un fragment de glucagon constitué du peptide (18-29) présent dans la glucagon, un fragment de gluca- gon constitué du peptide (19-29) présent dans- le gluca- gon Lappelé ci-après glucagon(19-29), Publication non- examinée de brevet japonais NO 53-993207ou un fragment de glucagon constitué du peptide(15-29) présent dans le glucagon (Publication nonexaminée de brevet japonais NO 54-24868) et de BSA. La demanderesse a étudié un procédé pour ob- tenir un anticorps efficace dans une détermination ba- sée sur la réaction immunitaire du glucagon(1-29) et a trouvé que la combinaison d'une protéine et du nouveau fragment de glucagon constitué du peptide(16-29) pré- sent dans le glucagon produit son anticorps d'une ma- nière efficace et que cet anticorps réagit avantageu- sement avec le glucagon(1-29) marqué et divers fragments de glucagon marqués dans la réaction immunitaire. Un but de la présente invention est de fournir des fragments de glucagon constitués du peptide de la formule H-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp- Leu-Met-Asn-T9r-OH (I) /-que l'on appellera ci-après fragment(16-29) de glucagon7. Un autre but de la présente invention est de fournir une combinaison de glucagon(16-29) et de protéine. Un autre but encore de la présente invention est de fournir un procédé pour produire un anticorps spécifique en utilisant la combinaison de glucagon(16- 29) et d'une protéine. La synthèse du glucagon(16-29) selon la présen- te invention peut être effectuée comme suit: on fait réagir un aminoacide et/ou un peptide inférieur par condensation dans l'ordre de succession des amino-aci- des de la formule (I) et le groupe protecteur du grou- pe réactif est libéré au stade final de la réaction. La réaction de condensation peut être conduite selon la synthèse classique des peptides en répétant la fixation et l'élimination du groupe protecteur et la condensation. Les groupes protecteurs pour la synthèse des matières de départ ou des produits inter- médiaires sont des groupes protecteurs classiques pour la synthèse des peptides et sont facilement éliminables par hydrolyse, décomposition par un acide, réduction, aminolyse ou hydrazinolyse. Par exemple, le groupe alpha-amino peut ê- tre protégé de manière classique par un groupe benzy- loxycarbonyle tel que les groupes benzyloxycarbonyle, p-nitrobenzyloxycarbonyle ou p-méthoxybenzyloxycarbo- nyle ou un groupe oxycarbonyle aliphatique tel que les groupes t-amyloxycarbonyle ou t-butylxycarbonyle. Le groupe carboxyle peut être protégé par estérification. Le groupe ester est substitué par un alcanol tel que le méthanol ou l'éthanol ou un aral- canol tel que l'alcool benzylique, l'alcool p-nitro- benzylique, l'alcool p-méthoxybenzylique ou l'alcool dichlorobenzylique. Le groupe hydroxy dans la sérine et la thréo- nine peut éventuellement être protégé par estérifica- tion ou éthérification. Un groupe protégé par estéri- fication est le groupe benzyloxycarbonyle. Un groupe protégé par éthérification est le groupe benzyle. Le groupe amino dans le groupe guanidino de l'arginine est protégé par un groupe tosyle ou benzylo- xycarbonyle. Toutefois, il n'est pas toujours nécessai- re de protéger le groupe guanidino. Après la fin de l'étape finale des condensa- tions, ces groupes protecteurs sont de préférence éli- minés par décomposition par un acide comme par l'acide fluorhydrique dans une seule étape d'élimination. En conséquence, le groupe réactif dans la chaîne latérale de la sérine, l'arginine, l'acide aspartique ou la thréonine est protégé par un groupe protecteur facile- ment éliminé par l'acide fluorhydrique. Par exemple, le groupe hydroxyle dans la sérine et la thréonine est protégé par un groupe benzyle; le groupe amino dans le groupe guanidino de l'arginine est protégé par un groupe tosyle; et le groupe carboxyle en chaîne la- térale dans l'acide aspartique est protégé par un groupe ester de benzyle. D'autres groupes alpha-amino et carboxyle sont protégés par un groupe protecteur qui peut être éliminé dans des conditions n'éliminant pas le grou- pe protecteur en chaîne latérale. Par exemple, le groupe alpha-amino est de préférence protégé par un groupe t-butoxycarbonyle ou tamyloxycarbonyle qui peut être éliminé par l'acide trifluoro-acétique, ou protégé par un groupe benzyloxycarbonyle qui peut être éliminé par réduction catalytique. Le groupe carboxy- le est protégé par un groupe ester de méthyle ou d'é- thyle qui peut être éliminé par une solution aqueuse diluée d'hydroxyde de sodium, et le groupe carboxyle à l'extrémité C-terminale est protégé par un groupe ester de benzyle qui peut être éliminé par l'acide fluorhydrique anhydre. La condensation d'amino-acides et/ou de pep- tides est effectuée comme suit. Par exemple, un amino- acide ou peptide ayant un groupe alpha-amino protégé et un groupe carboxyle terminal activé est mis à réagir avec un amino-acide ou peptide ayant un groupe alpha- amino libre et un groupe carboxyle terminal protégé. Au contraire, un amino-acide ou peptide ayant un groupe alpha-amino activé et un groupe carboxyle terminal pro- tégé est mis à réagir avec un amino-acide ou peptide a- yant un groupe carboxyle terminal libre et un groupe alpha-amino protégé. L_ groupe carboxyle peut être activé, par exemple, par transformation en azide d'acide, en anhy- dride d'acide, en imidazolide d'acide, en izoxazolide ou en ester actif ou par réaction avec le carbodiimide ou le N,N'-carbonyl-diimidazole. Des réactions de condensation préférées sont celles utilisant le carbodiimide, l'azide ou l'ester actif. Dans la réaction de condensation, la racémisa- tion doit être soigneusement évitée et des procédés préférables sont ceux utilisant un azide ou un ester actif comme l'ester de succinimide ou l'ester de p-ni- trophényle, méthode Winsch /Z. Naturforsch., 216, 426 (1966)_7 ou méthode Geiger modifiée utilisant le N-é- thyl, N'-3-diméthylaminopropyl-carbodiimide comme a- gent de condensation. On obtient ainsi le peptide (I) protégé. Ces groupes protecteurs sont éliminés de préférence par dé- composition par un acide comme l'élimination en une seule étape par l'acide fluorhydrique et finalement on peut obtenir le produit (I). La purification du peptide (I) peut être effectuée par chromatographie sur colonne connue en utilisant un support. Le glucagon(16-29) selon la présente inven- tion est lié à une protéine afin de produire une forme conjuguée pour la production d'anticorps. Des exemples de la protéine qu'on utilise de manière classique sont BSA ou sa modification obtenue en coupant le groupe di- sulfure à l'intérieur de la molécule par traitement al- calin ou au moyen de laurylsulfate de sodium et de mercaptoéthanol. Des exemples de réactifs de conjugaison pour le glucagon et la protéine sont des réactifs de conju- gaison polyfonctionnels comme le glutaraldéhyde ou l'ester de succinimide de 3-(2'-benzothiazolyl-dithio)- propionate (se reporter à la demande de brevet japonais NO 53-85900). Ces réactifs de conjugaison polyfonc- tionnels sont choisis de manière à donner des groupes fonctionnels qui participent à la fixation de la pro- téine. Le rapport du glucagon(16-29) à la protéine telle que BSA est de une mole ou plus de glucagon(16- 29) par mole de BSA, de préférence dix moles de gluca- gon(16-29) par mole de BSA. Dans la réaction d'en- chaînement, par exemple la quantité nécessaire de glu- cagon(16-29) est ajoutée dans un milieu aqueux de pH 7-8 et on y ajoute un réactif de conjugaison polyfonc- tionnel. La réaction se produit tandis qu'on refroi- dit ou à la température ambiante pendant 1 à 4 heures. Après purification par filtration à travers un gel, on ajoute BSA et on fait réagir à la température am- biante pendant 1 à 4 heures. Le produt conjugué de glucagon(16-29) et de BSA est obtenu après purifica- tion comme par filtration à travers un gel et dialyse et si nécessaire conservé après lyophilisation. La forme conjuguée ainsi obtenue de glucagon- (16-29) et de protéine est administrée à des mammifères tels que dés lapins, des rats, des cobayes ou des sou- ris pour les sensibiliser. Par exemple, la substance conjuguée est mise en suspension dans l'adjuvant com- plet de Freund et la suspension est injectée par voie sous-cutanée à des cobayes à rauson de 50 - 70 Y de glucagon(16-29) 4 à 7 fois à des intervalles de 2 se- maines. On obtient de l'antisérum à partir du sang des animaux sensibilisés par une technique classique telle que par recueil du sang et centrifugation. Cet antisérum contient une plus forte proportion de l'anti- corps spécifique et peut être conservé dans un congé- lateur et peut être utilisé et peut être conservé dans un congélateur et peut être utilisé par dilution aliquo- te. Cet anticorps spécifique se lie immunologiquement non seulement au glucagon(1-29) marqué, mais aussi à divers fragments marqués de glucagon tels que le frag- ment(16-29) de glucagon, le fragment (17-29) de gluca- gon et le fragment (19-29) de glucagon. Comme expliqué ci-dessus, le fragment(16-29) de glucagon selon la présente invention est utile pour la production d'anticorps sous la forme d'un produit de conjugaison de glucagon (16-29) et de protéine. L'anticorps ainsi obtenu présente un excellent enchaî- nement spécifique dans la réaction immunitaire et cet- te réaction immunitaire est utilisée avantageusement pour détermination radio-immunologique, détermination par immunofluorescence et détermination immunologique enzymatique du glucagon(1-29) in vivo. Il a été rapporté (Publication non-examinée de brevet japonais No 5539702) que le fragment(15-29) de glucagon a une activité pour conjugaison avec les protéines. Toutefois, aucun exemple de glucagon(16-29) n'est mentionné dans le brevet ci-dessus. De plus, le glucagon(16-29) de la présente invention est plus réac- tif et spécifique que le fragment(15-29) en raison de l'amino-acide sérine à l'extrémité N-terminale du glu- cagon(16-29). Les abréviations utilisées sont les suivan- tes: Ser; L-sérine Val; L-valine Arg; L-arginine Trp; L-trytophane Ala; Lalanine Leu; L-leucine Gln; L-glutamine Met; L-méthionine Asp; acide Laspartique Asn; L-asparagine Phe; L-phénylalanine Thr; L-thréonine BOC; tbutoxycarbonyle OBzl; ester de benzyle AOC; t-amyloxycarbonyle OSU: ester de N-hydroxy- succinimide 2467841' Z; benzyloxycarbonyle ONP; ester de p-nitrophényle Bzl; benzyle TFA; acide trifluoroacétique Tos; tosylo NMM; N-méthylmorphorine OMe; ester de méthyle Et20; oxyde diéthyle THF; tétrahydrofuranne DMF; diméthylformamide HOBT; 1-hydroxybenzotriazole WSC; N-éthyl, N'-3diméthylaminopropylcarbodiimide Les exemples suivants illustrent la présente invention. Dans les exemples, on utilise le support et le solvant de développement suivants pour la chro- matographie en couche mince. Support: cellulose de Merck Art 5716 Solvant de développement: 1: butanolpyridine-acide acétique-eau (15:10:3:11) 2:couche supérieure de butanol-pyridine-acide acétique-eau (10:3: 0,1:11) 3: couche supérieure de butanol-pyridine-acide acétique-eau (5:3: 0,1:11) Support: gel de silice de Merck Art 5721 Solvant de développement: 4: chloroforme-méthanol-acide acétique (95:5:3) : chloroforme-méthanol-acide acétique (80:25:2) 6: chloroforme-éthanol-acétate d'éthyle (5:2:5) 7: chloroforme-méthanol-acide acétique (85:15:5) Exemple 1 Production H-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn- Thr-OH -glucagon(16-29)_7: On ajoute de l'anisol (6 cm3), de l'éthanediol (0,94 cm3, 10 mM) et du skatol (131 mg, lmM) à 2,5 g (1 mM) de BOC-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Gln-Asp(OBzl)- Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(Bzl)-OBzl). On ajoute le mélange dans de l'acide fluorhy- drique anhydre (HF, 20 cm3), on agite à 0 C pendant une heure et on élimine HF rapidement par distillation sous vide. On ajoute Et20 (100 cm3) au résidu pour sé- parer le précipité. On dissout le précipité dans de l'acide acétique à 50-80% (100 cm3) et on centrifuge. On sèche par congélation le liquide surnageant pour obtenir une poudre (1, 22 g). On dissout la poudre dans une solution aqueuse 8 M d'urée (150 cm3) et on règle le pH à 9 par addition d'une solution aqueuse d'ammo- niac. On charge la solution sur une colonne de carboxy- méthylcellulose (4 x 20 cm) mise en équilibre avec une solution aqueuse 8 M d'urée. Après 30 minutes, on lave complètement la colonne avec de l'eau de manière à éli- g0 miner l'urée et on l'élue par la technique du gradient continu de concentration en utilisant de l'eau (1 itre) réglée au pH 4,5 au moyen d'acide acétique et jusqu'à une solution aqueuse 0,2 M d'acétate d'ammonium (pH 4,5, 1 litre). Ensuite, on élue la colonne avec une solution aqueuse 0,5 M d'acétate d'ammonium (pH 4,5, 500 cm3) et on l'élue finalement avec une solution a- queuse 0,5 M d'acétate d'ammonium (pH 4,5) contenant de l'urée (8 M) de manière à fractionner les fractions actives II (tubes N 80 à 110), III (tubes N 120 à 170), IV (tubes N 171 à 230) et V (tubes N 231 à 290) en fractions de 7 cm3 chacune et on sèche par congéla- tion ces fractions actives. La poudre séchée préparée à partir de la frac- tion active V est dissoute dans de l'acide acétique à % (50 cm3). On ajoute de l'acide thioglycolique (2,5 cm3) à la solution qui est abandonnée à 45 C pen- dant 21 heures. On dissout de l'urée (24 g) dans cette solution. La matière insoluble est éliminée par fil- tration. On charge le filtrat sur une colonne (4,2 x 104 cm) de Sephadex LH-20 (nom commercial) et on l'élue avec de l'acide acétique à 50%. Les fractions des tu- bes N 62 à 79, chaque fraction 7 cm3, sont recueillies et séchées par congélation pour donner la poudre (150 mg). Chromatographie sur couche mince: Rf1 = 0,50, Rf2 = 0,34). La poudre lyophilisée obtenue à partir de la fraction active IV est dissoute dans de l'acide acéti- que à 50% (20 cm3), on ajoute de l'acide thioglycolique (1 cm3) et on abandonne le mélange à 45 C pendant 21 heures. On dissout de l'urée (9,6 g) dans cette solu- tion et la matière insoluble est éliminée par filtra- tion. On charge le filtrat sur une colonne (3,3 x 120 cm) de Sephadex LH20 (nom commercial) et on l'élue avec de l'acide acétique à 50%. Les fractions des tubes N 32 à 37, chaque fraction 7 cm3, sont recueillies et séchées par congélation pour donner la poudre (110 mg). Chromatographie sur couche mince: Rf1 = 0,50 Analyse des amino-acides: Asp 2.03 (2), Thr 0.96 (1), Ser 0.87 (1), Glu 2.07 (2), Ala 1.02 (1), Val 0.91 (1), Met 0.95 (1), Leu 1, Phe 0.95 (1), Arg 2.19 (2), Trp 1.04 (1). Les lyophilisats obtenus dans les fractions actives III et II sont traités et soumis à une chroma- tographie sur colonne en opérant comme sur les fractions actives IV cidessus pour l'obtention de la poudre (130 mg) (chromatographie sur couche mince: Rf1 = 0,50) pro- venant des fractions des tubes 31 à 36 dans la fraction active III et de la poudre (50 mg) (chromatographie sur couche mince RfI1 = 0,50) à partir des fractions des tu- bes N 39 à 44 dans la fraction active II. Exemple 2 Forme conjuguée de glucagon(16-29) et de BSA ou BSA modifié: 1) Forme conjuguée de glucagon(16-29) et de BSA On dissout du glucagon(16-29) (15 mg) dans une solution 0,0001 N d'hydroxyde de sodium et on règle la solution au pH 8,0 pour préparer une solution (20 cm3). On ajoute à cette solution une solution aqueuse à 25% de glutaraldéhyde (25 cm3) et on fait réagir la solution à la température ambiante pendant 2 heures. On fait passer le mélange de réaction à travers une colonne (5 x 50 cm) de Sephadex G-15 et on recueille la frac- * tion passée (une solution contenant environ 11 mg de dérivé dans lequel le glutaraldéhyde a réagi avec l'ex- trémité N-terminale du glucagon(16-29). On y ajoute du BSA (42 mg, produit de Sigma Co.) et on fait réagir à la température ambiante pendant 2 heures. On dialyse le mélange de réaction dans de l'eau distillée et on lyophilise le dialysat pour obtenir une forme conjuguée de glucagon(16-29) et de BSA (rapport molaire d'enchaînement de BSA:glucagon(16-29) = environ 1:10). Production: 48 mg. 2) Forme conjuguée de glucagon(16-29) et de BSA modifié. On dissout du glucagon(16-29) (15 mg) dans une solution 0,0001 N d'hydroxyde de sodium et on règle le pH à 8,0 pour préparer la solution (20 cm 3). On ajoute à cette solution une solution à 0,1% dans le diméthyl- formamide d'ester de succinimide de 3-(2'-benzothiazo- lyl-dithio)propionate (1,575 cm3) et on fait réagir le mélange à 5 C pendant une heure. On fait passer le mé- lange de réaction à travers une colonne (5 x 50 cm) de Sephadex G-15 remplie de tampon acétate (pH 5) contenant du diméthylformamide pour recueillir la fraction passée (une solution contenant un dérivé (11,5 mg) dans lequel un groupe 3-(2'-benzothiazolyl-dithio)propionyle a été introduit dans l'extrémité N-terminale du glucagon (16-29). On règle la solution au pH 7,0, on y ajoute du BSA modifié (45 mg), préalablement traité au moyen de laurylsulfate de sodium et de mercaptoéthanol à la température ambiante pendant toute une nuit, et on fait réagir le mélange à la température ambiante pen- dant une heure. On dialyse le mélange de réaction dans de l'eau distillée et on le lyophilise pour obtenir une forme conjuguée de glucagon-16-29) et de BSA modi- fié (rapport d'enchaînement BSA modifié: glucagon (16-29) = environ 1: 10). Production: 52 mg. On remplace le glucagon(16-29) ci-dessus par du glucagon (17-29), du glucagon(19-29) et du glucagon (1-29) (produit de Sigma Co.) et on effectue le traite- ment de la même manière pour obtenir une forme conjuguée de BSA ou de BSA modifié et de glucagon(17-29), glucagon (19-29) ou glucagon(1-29). Exemple 3 I. Production d'anticorps en utilisant une for- me conjuguée de glucagon(16-29) et de BSA: 1) Une forme conjuguée de glucagon(16-29) et de BSA (1 mg) V-248 f de glucagon(15-2917 est dissoute dans 1,0 cm de tampon phosphate 10 mM (pH 7,2) (conte- nant 0,15 M NaCl). On y ajoute de l'adjuvant complet de Freund (1 0 cm3) et on mélange soigneusement de ma- nière à obtenir une émulsion. On injecte l'émulsion (0,5 cm3) dans la peau d'un doigt de pied et diverses parties sous-cutanées du dos d'un cobaye. La même quantité d'émulsion est injec- tée par voie sous-cutanée six fois à des intervalles de 2 semaines. Dix jours après l'injection finale, on re- cueille le sang entier et on l'abandonne pendant 60 minutes pour coagulation. On obtient du sérum anti-glu- cagon(16-29) par centrifugation à 3 000 tpm pendant 10 minutes. 2) La forme conjuguée de glucagon(17-29) et de BSA (1 mg), la forme conjuguée de glucagon(19-29) et de BSA (1 mg) et la forme conjuguée de glucagon (1-29) et de BSA (2,5 mg) obtenues dans l'exemple 2 sont utilisées et traitées selon les mêmes modes opé- ratoires que dans l'exemple 3 (1). On obtient du sé- rum anti-glucagon (17-29), du sérum anti-glucagon (19-29) et du sérum anti-glucagon(1-29). II. Réactivité immunitaire de l'antisérum 1) Méthode de détermination de la réactivité immunitaire: On dilue les antisérums ci-dessus à 200, 400, 800,3200, 6 400, 12800, 25600 et 51200 fois avec du tampon phosphate 10 mM (pH 7,4) (contenant 25% de BSA, 1 mM MgC12, 0,1% de NaN3, 3 mM de EDTA et 0,15 M NaCl). Une portion d- 100 p1 de chacune de ces dilutions est mise à réagir avec 100 pl de solution au tampon phos- Dhate (la même composition que ci-dessus) de glucagon (1-29) marqué ou de fragment de glucagon marqué JEra-. Peur: bta-ga1actosidase, fragment de glucagon: glu- cagon(16-29), glucagon(17-29), glucagon(19-29)7à 5 C pendant 16 heures. On y ajoute de l'IgG de cobaye (4 t) et du sérum de lapin anti-IgG de cobaye et on fait incuber pendant une heure à la température am- biante. Le précipité est recueilli par centrifugation à 3 000 tpm pendant 10 minutes et ajouté à 200 pl de tampon phosphate pH 6,7 10 mM (contenant 0,1% BSA, I mM MgCl2, 0,1% NaN3 et 0,15 M NaCl) contenant 5 mg/ cm3 d'Onitrophényl-bêta-D-galactopyranoside et on fait incuber à 37 C pendant 45 minutes pour détermi- ner l'activité de bêta-galactosidase à 420 nm par colorimétrie. On détermine le rapport combiné au glu- cagon marqué et au fragment de glucagon marqué dans chaque concentration de dilution des antisérums par réaction immunitaire. (a) Glucagon(1-29) marqué On utilise du glucagon(1-29) marqué à la bêta- galactosidase -40 pg de glucagon(1-2917 obtenu par le procédé tel que mentionné ci-dessus. (b) Fragments de glucagon marqués Du glucagon(16-29) marqué à la bêtagalactosi- dase, du glucagon(17-29) marqué à la bêta-galactosidase et du glucagon(19-29) marqué à la bêta-galactosidase préparés par la méthode ciaprès sont utilisés à raison d'environ 20 pg de chaque fragment de glucagon. (2) Résultats et discussion concernant la réactivité immunitaire. Les rapports de combinaison en réactivité immunitaire, comme calculé par les quantités de précipi- tés pour chaque antisérum sont indiqués dans le ta- bleau pour le cas des dilutions aux coefficients 800, 6400 et 51200. Les rapports de combinaison dans les autres cas de dilution sont comparables à ces résultats. Dans le tableau: +++: rapport de combinaison % ++: rapport de combinaison -75% +: rapport de combinaison -50% -: rapport de combinaison 0-25% Comme montré dans le tableau, le glucagon (16-29) de la présente invention ressemble au glucagon (17-29) et au glucagon(19-29) dans sa structure, toute- fois on trouve de grandes différences de réactivité immunitaire des anticorps dans les antisérums obtenus par injection de chaque fragment. L'anticorps produit par le glucagon(16-29) de la présente invention fait montre d'une réactivité immunitaire sensible et avantageuse non seulement con- tre le glucagon(16-29), mais aussi contre le glucagon (17-29) et le glucagon(1-29). Ces résultats montrent que l'anticorps spé- cifique C-terminal (titre de l'anticorps) peut être déterminé quantitativement en utilisant le fragment de glucagon de la présente invention. Tableau composés mar- Glucagon(16-29) Glucagon(17-29) Glucagon Glucagon qués utilisés marqué à la bêta- marqué à la (19-29) (1-29) pour déterminagalactosidase bêta-galac- marqué à la marqué à la Glucagon tion tosidase bêta-galac- bêta-galac- et frag- tosidase tosidase et frag- ments de Dilution glucagon des pour im- antisérumns minuté m glucagon x800 ++ ++ +++ +++ (16-29)x60 a1 -29) x6400 ++ ++ ++ Àr x51200 + + + + lucagon x800 + + 17-29) x6400 - + + + x51200.. x800 _._._. lucagon 800 (19-29) x6400 o x51200.. E-. gluca on x800 + + ++ ++ (1-29) x6400 + + + ++ x51200 + co ms P4 III. Préparation de glucagon(1-29) marqué et de frag- ments de glucagon marqués 1) Glucagon(1-29) marqué Une solution aqueuse 100 mM de EDTA (10 ul) et 0,1% de 3-(2'-benzothiazolyl-dithio)propionate suc- cinimide dans du diméthylformamide (264,4 ul) sont ajoutés dans du glucagon(1-29) dissous dans un tampon phosphate 50 mM (pH 8,0) (0,4 cm3) et on fait réagir le mélange à 5 C pendant une heure. On fait passer le mélange de réaction à travers une colonne (1,5 x 40 cm) de Sephadex G-15 (1,5 x 40 cm) pour filtration à tra- vers le gel et on recueille la fraction passée pour obtenir la solution contenant un dérivé dans lequel un groupe 3-(2'-benzothiazolyl-dithio) propionyle a été introduit dans le groupe amino du glucagon(1-29). On ajoute de la bêta-galactosidase (produit de Boehringer Mannheim GmbH) (2,78 mg) dans du tampon phosphate 50 mM (pH 8,0) (2 cm3) contenant le dérivé (25 pg) de 3-(2'-benzothiazolyl-dithio)propionyl glu- cagon(1-29) et on fait réagir à la température ambian- te pendant une heure. On fait passer le mélange de réaction à tra- vers une colonne (1,5 x 90 cm) de Sephadex G-150 pour filtration à travers le gel et on recueille la frac- tion passée pour obtenir du glucagon(1-29) marqué à la bêta-galactosidase dans lequel il y a combinaison de l'extrémité N-terminale du glucagon(129) et du groupe thiol de la bêta-galactosidase. 2) Fragments de glucagon marqués Une solution aqueuse 100 mM de EDTA (10il) et 0,1% de 3-(2'-benzithiazolyl-dithio)propionate suc- cinimide dans du diméthylformamide (625 ul) sont ajou- tés dans du glucagon(16-29) (0,5 mg) dissous dans du tampon phosphate 50 mM (pH 8,0) (0,4 cm3) et on fait réagir à 5 C pendant une heure. On fait passer le mé- lange de réaction à travers une colonne (1,5 x 40 cm) de Sephadex G-15 pour filtration à travers le gel et on recueille la fraction passée pour obtenir la solu- tion contenant un dérivé dans lequel un groupe 3-(2'- benzothiazolyl-dithio)propionyle a été introduit dans l'extrémité N-terminale du glucagon(16-29). On ajoute de la bêta-galactosidase (6,19 mg) dans du tampon phosphate 50 mM (pH 8,0) (2 cm3) con- tenant le dérivé (25 lg) de 3-(2'-benzothiazolyl-dithio) propionyl glucagon(16-29) et on fait réagir à la tempé- rature ambiante pendant une heure. On fait passer le mélange de réaction à travers une colonne (1.5 x 90 cm) de Sephadex G-150 pour filtration à travers le gel et on recueille la fraction passée pour obtenir du gluca- gon(16-29) marqué à la bêta-galactosidase dans lequel il y a combinaison de l'extrémité N-terminale du gluca- gon(16-29) et du groupe thiol de la bêta-galactosidase. On remplace le glucagon(16-29) ci-dessus par du glucagon(17-29) et on le traite selon le même mode opé- ratoire que ci-dessus pour obtenir du glucagon(17-29) marqué à la bêtagalactosidase et du glucagon(19-29) marqué à la bêta-galactosidase. REVENDICATIONS 1) Le peptide de la formule H-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu- Met-Asn-Thr-OH 2) Une forme conjuguée du peptide de la formule H-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu- Let-Asn-Thr-OH et d'une protéine. 3) Une forme conjuguée selon la revendication 2, caractérisée en ce que la protéine est de l'albumine ou sa forme modifiée. 4) Un procédé pour la préparation d'un anticorps spécifique, caractérisé en ce qu'il comprend une sen- sibilisation par administration à des mammifères d'une forme conjuguée du peptide de la formule H-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu- Met-Asn-Thr-OH et d'une protéine.