Brevet FR2464073A1 — publié le 19810306

La présente invention concerne un procédé pour con- server la semence utilisée pour l'insémination artificielle d'ani- maux domestiques, en particulier pour l'insémination artificielle des porcins. On a précédemment conservé la semence des animaux domestiques à des températures inférieures au point de congélation. Par exemple, le procédé de conservation par congélation a été couramment utilisé pour conserver le semence des bovins. Cependant, on n'est pas parvenu a conserver ls semence des porcs pour les raisons suivantes. L'insémination des porcs nécessite une quantité de semence bien supérieure à celle que nécessite l'insémination des autres animaux domestiques et on ne connaissait pas à ce jour de substance appropriée pour protéger la semence contre les temp4- ratures de congélation. On a proposé à ce jour un procédé pour conserver la semence à l'état liquide par addition d'une solution diluante. Ce procédé est efficace lorsqu'on doit conserver la semence pendant des durées brèves. Cependant lorsqu'on doit conserver la semence pendant 7 à 10 jours, ce procédé ne permet pas de maintenir l'ac- tivité spermatique nécessaire à la réalisation de l'insémination artificielle. De plus avec le procédé précité de conservation à l'état liquide, un nombre important de spermatozoïdes présentent, des anomalies de l'acrosome (pointe). On a donc tenté de conserver la semence à des tempé- ratures aussi faibles que plusieurs degrés Celsius pour prolonger la durée de conservation efficace de la semence. Cependant selon ce procédé, on doit refroidir la semence recueillie d'une tempé- rature voisine de la température corporelle (environ 37WC) de l'animal à la température de refroidissement à une vitesse aussi faible que 1 à 2WC/h. Donc pluas la température de conservation est basse, plus la durée de refroidissement est importante, ce qui nécessite un appareil de refroidissement spécialement conçu. L'invention a pour objet un procédé pour conserver la semence, qui ne présente pas les inconvénients propres au pro- cédé classique précité, qui contribue à maintenir l'activité sper- matique nécessaire à l'insémination artificielle même lorsqu'on conserve la semence pendant une durée prolongée, qui évite que les spermatozotdes ne présentent des anomaLies pendant la conservation et qui ne nécessite pas une opération compliquée de refroidissement. La caractéristique du procédé de conservation de l'invention est que l'on conserve la semence d'un animal domestique et une solution de Ringer contenant de l'albumine ou du charbon activé sous une forme o elles sont mises en contact mutuel par l'intermédiaire d'une membrane de dialyse. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui suit de plusieurs exemples de réalisation et en se référant aux dessins annexés sur lesquels: - la figure 1 est une coupe d'un récipient de conser- vation utilisé dans la mise en pratique du procédé de l'invention; et - la figure 2 est une vue en plan d'un autre disposi- tif utilisé dans l'invention. Pour mettre en pratique le procédé de l'invention, on utilise un récipient, tel que celui représenté schématiquement par la figure 1. Le récipient 1 contient un tube de dialyse 2 muni d'un passage d'injection 3. Un passage d'injection 4 est également réuni à l'espace formé entre le tube de dialyse 2 et le récipient 1. Les passages d'injection 3 et 4 sont assujettis par un anneau 7 et bouchés hermétiquement respectivement par les bou- chons 5 et 6. On injecte dans le tube de dialyse 2, la semence recueillie ou la semence que l'on a diluée avec une solution diluante, puis on ferme hermétiquement le passage d'injection avec le bou- chon 5. On injecte dans l'espace entre le tube de dialyse 2 et le récipient 1, une solution de-Ringer 9 contenant de l'albumine ou du charbon activé. On conserve le récipient 1 contenant la semence 8 et la solution de Ringer 9 dans un réfrigérateur maintenu à tempé- rature constante (qui de façon appropriée est réglée à environ C). Le procédé de l'invention est efficace pour la con- servation de la semence vraisemblablement pour les raisons exposées ciaprès. A une température de conservation d'environ 15'C, l'activité de la semence est freinée mais le métabolisme se poursuit. Par conséquent, des substances nutritives telles que les hydrates de carbone sont consommées et des substances telles que des déchets organiques qui sont nuisibles A la survie des spermatozoïdes sont formées. Des protéines telles que les albumines ou le charbon activé absorbent les substances nuisibles telles que les déchets organiques et par conséquent éliminent vraisemblablement les sub- stances nuisibles formées dans la semence A travers la membrane de dialyse. On peut choisir l'albumine parmi l'albumine de blanc d'oeuf, la sérum-albumine et similaires. On doit laver le charbon activé avec de l'eau chaude et on doit en éliminer les substances nuisibles telles que le chlore et similaires. En dépit de variations liées à la forme du récipient de conservation, l'albumine ou le charbon activé présentent des effets suffisants lorsqu'on les utilise dans la solution de dialyse à la concentration de 0,5 à lO % pour l'albumine et a la concentra- tion de 0,25 à 0,5 % pour le charbon activé. La solution de Ringer est de l'eau salée contenant environ 0,9 %-de chlorure de sodium et elle a pour effet de dissoudre ou de disperser l'albumine ou le char- bon activé et d'ajuster la concentration ionique et le pH à l'inté- rieur et à l'extérieur de la membrane de dialyse. Cependant, dans la présente description, des solutions salines auxquelles on a ajouté un reflux de rein artificiel telles qu'une solution KRB (solution bicarbonatée de Krebo-Ringer) ou une solution KRP (solution phos- phatée de Krebo-Ringer) en plus du chlorure de sodium sont également appelées solutions de Ringer. On peut ajouter à la semence A con- server, une substance antibiotique telle que la streptomycine ou la sulpénicilline pour empocher que les spermatozoïdes ne soient tués par la propagation des bactéries. La membrane de dialyse est une pellicule ayant des pores fins dont la taille permet le passage des déchets organiques formés dans la semence, mais qui empêche le passage des sperma- tozoldes ou de l'albumine ou du charbon activé. On peut pour pré- parer la membrane de dialyse, utiliser une membrane de dialyse du commerce pour rein artificiel faite d'une pellicule de cellulose ou d'une pellicule de matière plastique ou utiliser une pellicule poreuse. Dans le mode de réalisation illustré par la figure 1, la semence 8 est contenue à l'intérieur du tube de dialyse 2 et la solution de Ringer 9 est contenue à l'extérieur du tube de dialyse 2. On peut bien entendu placer l'agent d'adsorption dans le tube de dialyse 2 et la semence 8 à l'extérieur du tube de dialyse 2. De plus, comme illustré par la figure 2, le tube de dialyse 2 peut être scellé hermétiquement et placé dans la solution de dialyse sans être muni d'un bouchon. En d'autres termes, le récipient peut avoir une forme quelconque à condition que la semence et la solution de Ringer puissent venir en contact mutuel par l'intermédiaire de la membrane de dialyse. Pour conserver la semence, on peut obtenir de bons résultats lorsqu'on maintient le tube de dialyse 2 horizontal au lieu de le maintenir vertical. Ceci est vraisemblablement de au fait que les déchets organiques peuvent être facilement éliminés lorsque les spermatozo!des précipités sous l'effet de la pesanteur sont dis- persés sur une surface étendue de la membrane de dialyse. EXEMPLE 1 On conserve pendant 7 jours dans un réfrigérateur o on maintient la température à 15'C, la semence d'un porc contenue dans un récipient 1 illustré par la figure 2, pour mesurer l'activité des spermatozotdes et le pourcentage de spermatozoïdes ayant un acro- some normal. Les résultat obtenus figurent dans le tableau Il ci- dessous. La semence conservée a également été introduite dans le tube de dialyse 2 telle quelle et dialysée avec des solutions de Ringer ayant les compositions indiquées dans le tableau I ci-dessous. Tableau5I Tableau I N Semence Composition de la solution de Ringer 1 5 ml de semence telle quelle 2 comme ci-dessus 3 comme ci-dessus 4 comme ci-dessus comme cidessus ml de solution KRB contenant 0 % d'agent adsorbant et 20 % de solution de glucose à ,05 %. ml de solution KRB contenant 0,125 % de charbon activé, 25 % de solution de glucose à 5,05 %. ml de solution charbon activé et à 5,05 %. ml de solution charbon activé et a 5,05 %. ml de solution charbon activé et à 5,05 %. KRB contenant 0,25 % de % de solution de glucose KRB contenant 0,5 % de % de solution de glucose KRB contenant 1,O % de % de solution de glucose 6 comme ci-dessus ml de solution KRB contenant 2,0 % de charbon activé et 25 % de solution de glucose à 5,05 %. Tableau II sp*tiu Taux de spermatozoïdes Activit spermatique nra Activité spermatique ayant un acrosome Echan- () normal Cillon Avant Apres 7 j Avant Après 7 j no conser- de conser- conser- de conser- vation vation vation vation 1 95 I++ 58,4 - 11,9 89 -++ 47,0 13,1 KG31 + charbon activé (0%) 2 " 63,7 + 18 " 55,6 + 12,4 " (0,125%) 3 " 69,6 + 6,9 " 625 + 10,3 " (0,25%) 4 " 67,5 + 8,7 " 57,6 - 10,2 (0>5%) " 61,8 t 15,6 " 56,0 - 12,4 "(1,0%) 6" 50,3 +18,5 " 49,8 + 12,9 "(2,0%) 24640?3 On indroduit la semence recueillie telle quelle dans le tube de dialyse 2, on place dans le récipient 1 rempli de solu- tion de Ringer etaprès fermeture du récipient, on refroidit la semence à environ 15 C en 3 à 4 h pour la conserver au réfrigérateur. On précipite par centrifugation la semence ainsi conservée et on laisse les spermatozoïdes flotter dans la solution de KRP à laquelle on a ajouté du glucose et de la catalase pour les cultiver à 37 C pendant 1 h. On examine l'activité spermatique. L'activité sperma- tique est exprimée par un pourcentage (4±L.) indiquant le nombre de spermatozoïdes mobiles dans un champ microscopique o on observe un nombre total de spermatozoldes de 100. On détermine le taux de spermatozoïdes ayant une pointe normale par emploi des échantillons de Dott et Foster colorés à l'éosine et à la nigrosine par observa- tion avec un microscope ayant un grossissement de 600. On considère que les spermatozoïdes ne présentant pas de déformation de la crête apicale sont normaux et que les autres sont anormaux. On exprime le taux de spermatozoïdes normaux par un pourcentage. La solution de Ringer à laquelle on a ajouté comme substances antibiotiques 1 mg/ml de streptomycine et 1 mg/ml de sulpénicilline que l'on ajoute à la semence et à la solution dialytique est généralement appelée solution KRB et a la composition suivante: Parties en volume Chlorure de sodium solution à 0,9 % 100 Chlorure de potassium solution à 1,15 t 4 Chlorure de calcium solution à 1,22 % 3 Phosphate monopotassique solution à 2,11% 1 Sulfate de magnésium heptahydraté solution à 3,22 % 1 Bicarbonate de sodium saturé en dioxyde de carbone solution à 1,30 % 21 Le procédé de l'invention qui vient d'être décrit permet de maintenir l'activité spermatique nécessaire à l'insémi- nation artificielle même lorsqu'on conserve la semence pendant 7 à 10 jours et rend les spermatozoïdes moins sensibles aux altéra- tions lors de la conservation. De plus, comme on conserve de façon appropriée la semence à une température de 15'C qui est voisine de la température ordinaire, on peut refroidir la semence recueillie -à la température de conservation en la laissant simplement revenir à la température ordinaire pendant 3 à 4 h. Par conséquent, le pro- cédé de l'invention ne nécessite pas l'opération malaisée de refroidissement indispensable dans le procédé de conservation à basse température. Bien entendu diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATION Procédé pour conserver la semence des animaux domes- tiques, caractérisé en ce qu'on conserve la semence d'un animal domestique et une solution dé Ringer contenant de l'albumine ou du charbon activé sous une forme telle qu'elles soient mises en contact mutuel par l'intermédiaire d'une membrane de dialyse (2).