Brevet FR2467401A1 — publié le 19810417

I1 est connu depuis fort longtemps que les basophiles sanguins et mastocytes tissulaires jouent un rôle primordial dans bon nombre d'allergies humaines et animales, telles que l'asthme allergique, le rhume des foins, la rhinite allergique, l'urticaire et les allergies médicamenteuses. Les basophiles sanguins et les mastocytes tissulaires contiennent dans les granules qui les caractérisent un certain nombre de médiateurs de l'inflammation allergique tels que l'histamine, la sérotonine ou l'héparine. Ces cellules sont également capables, lorsqu'elles sont stimulées, de synthétiser certains médiateurs additionnels tels que la "slow-reacting substance of anaphylaxis" (SRS-A) et divers facteurs chimiotactiques pour les éosinophiles (ECF-A) ou pour les neutrophiles (NCF-A). Le rôle primordial des basophiles sanguins et des mastocytes tissulaires en allergie provient du fait que s'accumulent à leur surface deux catégories d'anticorps formés en prédilection par les malades allergiques : les immuno-globulines de classe IgE et IgG4.Chez un individu allergique a un antigène donné tel que pollens de graminées ou médicament, l'interaction de l'antigene avec des IgE et/ou IgG4 présents sur la surface des basophiles ou mastocytes entraîne une expulsion rapide des granules intracellulaires et la libération correspondante des médiateurs inflammatoires dans le tissu ambiant. Alors que les mastocytes tissulaires se prêtent par définition mal a une investigation in vitro (puisqu'ils ne sont accessibles qu'a la suite d'une excision du tissu) il aten va pas de meme pour les basophiles sanguines circulants, qui forment en regle générale 0,5-0,8 % des leucocytes sanguins circulants.L'étude de la réactivité des basophiles sanguins de malades allergiques avec l'un ou l'autre aatigene in vitro représente potentiellement une méthode de diagnostic efficace et sans danger pour le patient, alors que les tests cutanés couramment pratiqués a l'heure actuelle pour le diagnostic des allergies (et qui se basent sur la stimulation des basophiles et mastocybe- in vró) ne sort pas sans danger5 particulièrement chez les patients fortement sensibilisés. L'étude de la réaction des basophiles sanguins avec un antigène peut se baser en principe, soit sur U- l'observation microscopique du phénomène d'expulsion des granules ("dégranulation"), soit sur l'analyse biochimique des médiateurs inflammatoires (en pariculier histamine) libérés dans le milieu ambiant. La mesure de la libération dShi tanine qui a été perfectionnée et semiautomatisée ces dernières années (EvansS D.P. et al.Life sciences 12 327, 1973) a trouvé de nombreuses applications an recherche allergologique car elle permet d'étudier, non seulement la nature des antigènes auxquels le patient peut être sensibilisé, mais également divers paramètres jouant un rôle dans la réaction allergique, tels que la quantité d'IgE et de IgG4 présents sur la surface des basophiles et la réactivité propre de ces cellules en présence d'antigènes ou d'autres agents pharmacologiques capables d'entrainer une dégranulation. Cette technique a trouvé également son utilisation en recherche pharmacologique pour l'étude de médicaments permettant d'inhiber la libération des médiateurs inflammatoires.Toutefois, la complexité des manipulations requises pour déterminer la libération d'histamine a partir de basophiles sanguins isolés, le prix de l'instrumentation nécessaire pour cette détermination semi-automatique, le coût élevé des réactifs nécessaires et le fait que le nombre d'analyses possibles par unité de temps est relativement limité, a empêché jusqu'a présent l'application généralisée de cette méthode au diagnostic de routine des allergies chez l'homme. En ce qui concerne la dégranulation des basophiles, le phénomène fut observé au microscope en présence d'antigènes ou d'autres agents stimulants les basophiles il y a déjà de nombreuses années (Shelley, W.B., Juhlin, L. NATURE, 191, 1056, 1961, Hirsch, S. R. and Zastrow, J.E., J. Allergy, 50, 338, 1972). Toutefois, l'examen microscopique des basophiles se heurte, en tant qu'examen de routine, a un certain nombre de difficultés pratiques qui ont empêché jusqu'à présent l'adoption généralisée de cette méthode de diagnostic. Ces difficultés sont en particulier a) - la rareté relative des basophiles dans le sang circulant obligeant l'observateur a compter un minimum de 5.000 a 10.000 leucocytes, afin de détecter un nombre statistiquement acceptable de basophiles témoins. b) - La fragilité relative des basophiles sanguins et la difficulté-de les concentrer sans causer accidentellement leur dégranulation. Un certain progres dans la technique d'examen microscopique a été réalisé par le développement de méthodes de coloration spécifiques (en particulier au bleu de toluidine) permettant de colorer spécifiquement les granules des basophiles dans le sang complet, sans séparation préalable des cellules. Sur la base d'une telle méthode microscopique, un test de diagnostic en allergie a été récemment proposé (Benveniste, J. in "Allergy and Clinical Immunology" (E. Mathov ed.) Excerpta Medica, 418, 1977). c) - Chaque examen et comptage microscopique requiert cependant l'attention soutenue d'un observateur compétent et le nombre d'analyses possibles par unité de temps reste par conséquent très limité. A cela vient s'ajouter le fait que dans les méthodes précitées, le nombre total de basophiles comptés par test (et capables de disparaître partiellement lors d'une dégranulation) est généralement de l'ordre de 30 à 50 avec des variations considerables d'un échantillon à l'autre, si bien que la reproductibilité du test ne peut être considérée comme satisfaisante. L'avenement des techniques de flow-cytométrie depuis quelques années, a conduit deux groupes de chercheurs à développer des techniques permettant de détecter et compter les mastocytes ou basophiles sanguins par une méthode automatique, c'est- -dire par flow-cytométrie. Les techniques de flow-cytométrie ont été décrites par ADAMS L.R. (J. Histochem. Cytochem. 1977, 25, 965) et par HORAN P.K. et col. (Science 1977, 198, 149). Le principe en est le suivant : les cellules en suspension dans un liquide sont véhiculées une à une dans un tube de verre où elles réagissent avec un rayon laser. Les informations provenant de ces interactions (dispersion de la lumière et perte de lumière axiale) sont alors affichées électroniquement sous forme d'un diagramme de dispersion, sur un tube de rayons cathodiques. L'un des groupes de chercheurs qui ont mis en oeuvre ces techniques utilise un colorant fluorescent (berbérine) se fixant sur l'héparine et nécessitant l'emploi d'un cytofluorographe (Enerback, L. et al. J. Histochem. Cytochem. 24, 1231, 1976). Ce groupe n'a jusqu'à présent utilisé la technique à la berbérine que sur les mastocytes péritonéaux de rats et il n'est donc pas certain qu'elle soit également applicable aux basophiles humains sanguins. De plus, la technique utilise semble entraîner une perte cellulaire de 20 % à 50 % selon les échantillons, ce qui ne permettrait pas par calcul différentiel d'établir la présence d'une dégranulation. L'autre groupe (Technicon, Saunders, A.M., J. Histochem. Cytochem. 25, 1001, 1977) qui a développé la méthode de flow-cytométrie en vue d'une technique semi-automatique de comptage des basophiles (sur un nombre fixe de 1.000 à 10.000 leucocytes) a utilisé comme colorant le bleu d'alcian en présence de chlorure de lanthanun et de chlorure de cethylpyridinium à pH 2.2, en coloration directe sur le sang complet. I1 ne semble pas avoir appliqué ou utilisé avec succès jusqu a présent cette technique de comptage pour l'étude des phénomènes de dégranulation. En fait, en essayant d'appliquer cette méthode de comptage des basophiles en sang complet à l'étude de la dégranulation des basophiles par des allergènes, on s'est rapidement aperçu que cette méthode ne permet pas d'arriver au résultat désiré, c'est-à-dire au calcul du pourcentage de basophiles ayant perdu leurs granules par comptage différentiel entre un témoin de contrôle et les échantillons de basophiles soumis à l'action de l'un ou l'autre agent dégranulant. Un grand nombre d'essais ont révélé que l'interaction des basophiles sanguins avec des agents dégranulants tels qu'antigènes, anticorps-anti IgE ou agents pharmacologiques tels que ionophore A 23187, entraîne en présence de sang complet des réactions secondaires faussant de façon marquée le comptage cytométrique des basophiles. Par la suite, à l'aide d'un cytographe modèle 6301 Biophysics (USA) on a mis au point selon l'invention un procédé-permettant pour la première fois d'arriver au but désiré, c'est-à-dire d'obtenir de manière reproductible des comptes exacts de basophiles aussi bien en la présence qu'en l'absence d'agents dégranulants de natures diverses. L'invention a pour objet un procédé de comptage différentiel des basophiles entre un échantillon témoin et un échantillon ayant subi l'action d'un agent de dégranulation, à l'aide d'un cytographe mettant en oeuvre les techniques de flow-cytométrie après coloration au bleu d'alcian, procédé caractérisé en ce qu'on effectue la réaction de dégranulation et la coloration après séparation des cellules sanguines du plasma et hémolyse des érythrocytes. Gilbert et Ornstein (Blood 1975, 46, n02, 279-286) ont rapporté qu'une méthode de coloration au bleu d'alcian convient pour le comptage des basophiles en utilisant un échantillonnage en courant continu et une détection électro-optique. L'observation microscopique des cellules après coloration a montré que seuls les basophiles sont colorés en bleu-verdâtre, ce qui permet de les différencier des autres cellules non-colorées, et en particulier des autres leucocytes, et des basophiles ayant subi une dégranulation. La solution de coloration utilisée dans le procédé selon l'invention est nouvelle par rapport à celles antérieurement utilisées ; c'est une solution de bleu d'alcian, pH 3,5, caractérisée en ce qu'elle contint, pour 100 ml, 120 à 200 mg, et de préférence 150 mg de bleu d'alcian ; 35 à 45 ml et de préférence 39 ml de solution physiologique (solution aqueuse à 0,9 Z de NaCl) ; 1,5 à 0,5 ml et de préférence 1 ml d'acide acétique glacial ; 20 à 5 ml et de préférence 10 ml de formaldéhyde ; 60 à 40 ml et de préférence 50 ml d'éthanol. Le procédé selon l'invention est caractérisé par les étapes suivantes a) - L'échantillon de sang hépariné est sédimenté par addition de dextrane en solution physiologique, et les cellules sont séparées du plasma par centrifugation. b) - Le culot cellulaire est remis en suspension dans une solution tampon contenant du chlorure d'ammonium pour hémolyser les érythrocytes ; c) - Les cellules sont ensuite lavées avec un tampon additionné d'albumine comme agent stabilisant, puis remises en suspension dans le même tampon que précédemment additionné de sels de calcium et de magnésium pour faciliter la réaction de dégranulation ; d) - Dans les tubes expérimentaux on ajoute à la suspension de cellules l'agent dégranulant à etudier, et dans les tubes témoins on ajoute le même volume de solution tampon, et on laisse incuber à 37 C pendant au minimum 15 minutes, jusqu'à la fin de la réaction de dégranulation ; e) - On lave les cellules avec une solution tampon additionnée d'un agent chélateur tel qu'EDTA pour bloquer la réaction de dégranulation et on les remet en suspension dans la même solution, à la concentration de 3 à 4 x 106 cellules/ml ; f) - On ajoute le réactif de coloration au bleu d'alcian à la suspension cellulaire, et après 10 minutes on effectue le comptage de la solution colorée au cytographe et détermine le nombre de basophiles pour 100.000 leucocytes. Le pourcentage de degranulation est calculé selon la formule % basophiles dans témoin - % basophiles dans essai % dégranulation = x 100 % basophiles dans témoin Les tampons utilisés au cours des différentes étapes du procédé selon l'invention sont connus en eux-mêmes. On utilise de préférence les tampons Tris recommandés pour l'étude de la libération d'histamine par Lichsteinstein et Osler (J. Exp. Med. 120, 507, 1964) mais on peut également utiliser des tampons à base de phosphate ou autres, à condition d'utiliser dans l'étape b) un tampon contenant du chlorure d'ammonium, dans l'étape c) un tampon additionné d'albumine comme stabilisant pour le lavage des cellules, auquel on ajoute ensuite des ions Ca++ et Mg++ pour effectuer la réaction de dégranulation, enfin dans l'étape 4 un tampon contenant un agent chélateur tel qu'EDTA pour stopper cette reaction. Les tampons Tris qui peuvent être utilisés dans le procédé selon l'invention sont les suivants 1 - dans l'étape b, un tampon Tris-NH4Cl : 0,010 à 0,030 M Tris (de préférence 0,015 M) ; 0,5 à 1,0 Z de NH4C1 (de préférence 0,75 %). 2 - Dans l'étape c, un tampon Tris-A : 0,01 à 0,03 M Tris (de préférence 0,025 M) ; 0,1 à 0,15 M NaCl (de préférence 0,12 M) ; 0,001 à 0,01 M KCl (de préférence 0,005 M) ; 0,1 - 0,01 % de sérum-albumine humaine (de préférence 0,03 %). 3 - Pour la réaction de dégranulation, un tampon Tris-ACM avec les mêmes composants que Tris-A plus 0,005 à 0,0002 M CaCl2 (de préférence 0,0006 M) ; 0,005 à 0,0005 M MgC12 (de préférence 0,001 M). 4 - Dans l'étape e, un tampon Tris EDTA : avec les mêmes composants que Tris-A plus 0,05-0,005 M EDTA (de préférence 0,01 M). Le dextrane utilisé dans l'étape a) de sédimentation a un poids moléculaire de 150.000 à 250.000 (de préférence 200.000 à 250.000) et a une concentration de 3 à 10 Z dans le sérum physiologique (de préférence 6 %). On donne ci-dessous, à titre d'exemple, un mode opératoire détaillé du procédé selon l'invention 10 cm3 de sang veineux sont prélevés dans un tube de polystyrène spécialement prétraité par EDTA et héparine. Le sang hépariné est sédimenté à la température ambiante par addition d'un demi-volume de dextrane à 6 Z en solution physiologique. Après sédimentation pendant 60 minutes, le plasma est prélevé, centrifugé à 1000 rpm pendant 10 minutes à 40C. Les cellules centrifugées sont remises en suspens ion dans une solution tampon de Tris-NH4Cl (0,015 M Tris, 0,747 747 Z de chlorure d'ammonium) afin d'hémolyser les érythrocytes. Les cellules sont lavées une à deux fois avec un tampon Tris-A (0,025 M Tris, 0,12 M NaC1, 0,005 M KC1, 0,03 Z sérum albumine humaine et remises en suspension en tampon Tris-ACM (tampon Tris-A plus ou 0006 M chlorure de calcium et 0,001 M de chlorure de magnésium à la concentration de 5 x 106 cellules/ml. Aux tubes expérimentaux sont ajoutés les agents dégranulants à étudier tels qu'antigènes à des concentrations diverses, antiséra anti-IgE ou dirigés contre d'autres classes d'immunoglobulines allergisantes telles qu'IgG4, agents pharmacologiques dégranulants tels qu'ionophore A 23187 etc. Aux tubes témoins sont ajoutés le même volume de solution tampon. Les tubes témoins et expérimentaux sont incubés pendant au minimum 15 minutes à 370C. Un à deux lavages avec solution tampon Tris-EDTA (tampon Tris-A plus 0,01 M EDTA) sont suivis d'une remise en suspension finale en tampon Tris-EDTA à la concentration de 3 - 4 x 106 cellules/ml. Coloration avec une solution de bleu d'alcian (0,15 Z alcian bleu pH 3,5 , composée de 39 ml solution physiologique, 1 ml acide acétique glacial, 10 ml formaldéhyde et 50 ml éthanol) : 0,9 ml de la solution de colorant sont ajoutés à 0,1 ml de la suspension de leucocytes lavés, pendant 10 minutes. Le comptage de la solution colorée au cytographe permet de déterminer automatiquement le nombre de basophiles non dégranulés pour 100.000 leucocytes. Le comptage des basophiles au cytographe sur la base de 100.000 leucocytes (valeur normale 400-800 basophiles) permet d'obtenir une bien meilleure statistique que par comptage microscopique et en particulier de réduira considérablement la variation de comptage d'un échantillon à l'autre. La corrélation entre les valeurs observées au microscope et les valeurs obtenues au cytographe est excellente, comme le montre la figure 1 où l'on a porté en abscisses les pourcentages de basophiles déterminés au microscope et en ordonnées les pourcentages de basophiles déterminés au cytographe pour un même échantillon (r = 0,94). I1 convient d'ajouter également que la détermination au cytographe est environ 5-10 fois plus rapide qu'au microscope pour compter 10-20 fois plus de basophiles. L'etude chez un grand nombre d'individus normaux et allergiques de l'effet de divers agents dégranulants confirme que la méthode utilisée permet d'etablir de manière rapide et reproductible le pourcentage de cellules dégranulées à différentes concentrations d'agent dégranulant. La figure 2 représente les courbes du pourcentage de dégranulation des basophiles an fonction de la dilution d'un agent de dégranulation qui est un anti-sérum anti-IgE (courbe 1), anti-IgG4 (courbe 2), anti-IgG2 (courbe 3), ou d'un sérum normal (courbe 0). Cette figure montre que 1) les anticorps anti-IgE, bien connus pour entraîner la dégranulation des basophiles et des mastocytes tissulaires in vitro (Ishizaka, K. in M.Sela The Antigens, vol. 1, page 479 académie Press, New York, 1973) et in vivo (Ishizaka, K., Ishizaka, T.J. Immunol. 100, 554, 1968) causent également une dégranulation des basophiles mesurable au cytographe (courbe 1) ; 2) il en va de même pour les anticorps dirigés contre les IgG4 qui représentent la deuxième classe d'immunoglobuline humaine fixée aux mastocytes et partiellement responsables de manifestations allergiques (courbe 2) 3) Les anticorps dirigés contre d'autres immunoglobulines non fixées aux mastocytes (par exemple IgG2) n'entraînent par contre pas de dégranulation mesurable au cytographe (courbe 3). La figure 3 est un graphique sur lequel on a porté en abscisses la pourcentage de dégranulation obtenu avec un sérum anti-lgG4 et en ordonnées le pourcentage de dégranulation obtenu pour un même échantillon sanguin, avec un sérum anti-IgE, les déterminations ayant été faites d'une part avec du sang de malades allergiques (points noirs) et d'autre part avec du sang de personnes non-allergiques (points blancs). Cette figure montre qu'il existe une corrélation certaine (r = 0,78) entre la dégranulation maximale obtenue par les anticorps anti-IgE et les anticorps anti-IgG4, le taux de dégranulation étant plus élevé chez les malades allergiques que chez les individus témoins non atteins d'allergie. D'autres agents pharmacologiques dégranulants obligatoires tels que ionophore A 23187 ont un effet dégranulant décelable au cytographe mais sans corrélation marquée avec l'état allergique du patient. La figure 4, qui est un graphique sur lequel on a porté le pourcentage de dégranulation en fonction de la concentration d'un allergène, montre enfin que -chez les -malades allergiques (courbe 1), l'utilisation de l'antigène correspondant (par exemple pollen de graminées) entraîne également une dégranulation marquée, ce qui n'est pas le cas chez le malade non allergique (courbe 2). Le fait que le compte différentiel au cytographe correspond effectivement à une expulsion extracellulaire des granules et à une libération des médiateurs contenus dans les basophiles est confirmé par l'excellente corrélation (r = 0,92) observée entre le taux de dégranulation mesuré par la méthode cytographique d'une part et le pourcentage d'histamine liberé dans le surnageant des cellules comptées d'autre part, comme le montre la figure 5 où l'on a porté sur un graphique le pourcentage de dégranulation en fonction du pourcentage d'histamine libéré. Par conséquent, la méthode de comptage au cytographe peut remplacer avantageusement, car beaucoup plus rapide et moins coûteuse, les méthodes de détection de médiateurs libérés tels que l'histamine. En résumé, le procédé selon l'invention de comptage différentiel des basophiles humains au cytographe constitue une nouvelle technique de diagnostic des allergies in vitro, qui se caractérise par sa simplicité, sa rapidité d'exécution, sa reproductibilité et le grand nombre d'échantillons pouvant être analysés par unité de temps. Cette méthode fait appel à un phénomène patho-physiologique directement assimilable à celui se déroulant chez le malade allergique in vivo. Elle offre par conséquent une meilleure. corrélation clinique que d'autres méthodes déterminant, par exemple par des méthodes radioimmunologiques (RAST, PRIST), les anticorps de type IgE et IgG4 circulant librement dans le sérum. R E V E N D I C A T I O N S 1. Procédé de comptage différentiel des basophiles sanguins entre un échantillon témoin et un échantillon ayant subi l'action d'un agent de dégranulation, à l'aide d'un cytographe mettant en oeuvre la méthode de flow-cytom8trie après coloration au bleu d'alcian, procédé caractérisé en ce qu'on effectue la réaction de dégranulation et la coloration sur les leucocytes, ctest- -dire après séparation des cellules sanguines du plasma et hémolyse des érythrocytes. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes a) L'échantillon de sang hépariné est sédimenté par addition de dextrane en solution physiologique, et les cellules sont séparées du plasma par centrifugation b) le culot cellulaire est remis en suspens ion dans une solution tampon contenant du chlorure d'ammonium pour hémolysar les érythroeytes c) les cellules sont ensuite lavées avec un tampon additionné d'albumine comme agent stabilisant, puis remises en suspension dans le même tampon que précédemment additionné de sels de calcium et de magnésium pour faciliter la réaction de dégranulation d) dans les tubes expérimentaux on ajoute à la suspension de cellules l'agent degranulant à étudier, et dans les tubes témoins on ajoute le même volume de solution tampon, et on laisse incuber à 370C pendant au minimum 15 minutes, jusqu'à la fin de la réaction de degranulation ; e) on lave les cellules avec une solution tampon additionnée d'un agent chélataur tel qu'EDTA pour bloquer la réaction de dégranulation.et on les remet en suspens ion dans la même solution, à la concentration de 3 à 4 x 106 cellules/ml f) on ajoute le réactif de coloration au bleu d'alcian à la suspension cellulaire, et après 10 minutes on effectue le comptage de la solution colorée au cytographe et détermine le nombre de basophiles pour 100.000 leucocytes. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le tampon utilisé dans l'étape b) est un tampon Tris 0,010 à 0,030 M contenant 0,5 à ],0 X de NH4C1. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la tampon de l'étape b) est un tampon Tris 0,015 M contenant 0,75 Z de NH4Cl. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le tampon de lavage des cellules dans l'étape c est un tampon Tris-A constitué par Tris 0,01 à 0,03 M, NaCI 0,1 à 0,15 M, KC1 0,001 à 0,01 M contenant 0,1 à 0,01 Z de sérum albumine humaine. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le tampon est constitué par Tris 0,025 M, NaCl 0,12 M, KCl 0,005 M et 0,03 Z de serum albumine humaine. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que, avant la réaction de dégranulation, les cellules sont remises en suspension dans un tampon Tris-A auquel on ajoute CaCl2 0,005 à 0,0002 M et MgC12 0,005 à 0,0005 M et de préférence CaCl2 0,0006 M et MgC12 0,001 M. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'on utilise, dans l'étape e), un tampon Tris-A auquel on ajoute EDTA 0,05 à 0,005 M et de préférence 0,01 M. 9. Réactif de coloration nécessaire pour le procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu il est constitué par une solution de bleu d'alcian, pH 3,5 contenant, pour 100 ml, 120 à 200 mg de bleu d'alcian, 35 à 45 ml de solution physiologique, 1,5 à 0,5 ml d'acide acétique glacial, 20 à 5 ml de formaldéhyde et 60 à 40 ml d'éthanol. 10. Réactif selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est constitué par 150 mg de bleu d'alcian, 39 ml de solution physiologique, 1 ml d'acide acétique glacial, 10 ml de formaldéhyde et 50 ml d'éthanol.