Brevet FR2462163A1 — publié le 19810213

Procédé de dilution de la semence reproductrice pure, notamment de la semence animale. La présente invention concerne les procédés permettant d'obtenir une dilution de la semence reproductrice pure telle qu'elle est prélevée ou collectée chez les béliers, les taureaux, les chevaux, les porcs, les dindes, etc..., mais également telle qu'elle peut l'être chez l'homme. Cette dilution est prévue pour donner à la préparation obtenue la meilleur aptitude possible à la congelabilite, puisqu'une congélation est nécessaire à sa conservation jusqu'à insémi- nation, le taux de dilution étant calculé en fonction, d'une part, de la qualité de la semence (densité, motilité, pourcentage de spermatozoïdes vivants) et d'autre part, du pouvoir fécondant de l'animal, cette dilution permettant d'obtenir, par exemple, 50 à 100 millions de sper matozoldes par millilitre de préparation dans le cas d'un taureau. Le dilueur, dont la préparation doit être terminée une heure avant la récolte de la semence pour laisser se stabiliser le milieu peut, par exemple, être constitué par un produit à base de poudre de lait écrémé, de sucres riches et d'antibiotiques complètement dissous, par exemple, à raison de 50 g dans 400 ml d'eau distillée portée à 400C, du jaune d'oeuf frais lui-même dissous dans de l'eau distillée étant en outre ajouté a cette solution pour obtenir un meilleur mélange.Cette fraction est en général divisée en deux fractions égales, dont la première est additionnée d'un produit cryo-protecteur tel que le glycérol à raison de 3 % et placée au bain-niarie à 320 C, tandis que la seconde est également addition(::ée de glycérol, mais à raison de 11 %, et placée en milieu réfflgére à 40 C Dans les procèdes de dol union pratiques jusqu'à ce jour, en matière d'insémination des animaux, chaque éjacu- lat, ou le premier des deux ejaculats dans le cas, par exemple, diun taureau, est tamponné en ajoutant, manuellement et instantanement, au sperme pur un volume égal de la première fraction de dilueur à 3 % de glycérol, ce qui donne donc une dilution à moitié.Dans le cas d'un double éjaculat, le premier ejaculat ainsi dilué est conservé au bain-marie à 32 C pendant la récolte du second éjaculat, auquel il est alors mélangé, ce mélange étant ensuite dilué à moitié du volume final à l'aide de la même fraction de dilueur. La semence ainsi diluée et conservée en récipients de verre, est disposée dans une cuve d'eau à 300 C qui est alors placée dans une enceinte réfrigérée à 40 C, ce qui permet de refroidir régulièrement cette semence jusqu'à cette température en environ 1 heure. La fraction de dilueur à 11 % de glycérol est alors ajoutée à cette préparation à 40 C, de manière à assurer aux cellules la protection indispensable pendant la cristallisation qui se produit lors de la congélation. En effet, dès. la fin de cette glycerolisation, la semence est conditionnée en paillettes, puis placée en containers de congélation à azote liquide dont la température des vapeurs d'azote est réglée à une températurede l'ordre de -100 à - 1600 C en fonc- tion de la dimension des paillettes et de la quantité de paillettes à congeler. On ne conserve en principe que les semences présentant à l'examen, 48 heures après la congélation, une motilité de 3 sur 5 et un pourcentage de spermatozoldes vivants égal ou supérieur à 35 %. Ainsi, dans l'état connu de la technique, on procède à une dilution effectuée par mélange, soit de manière extrêmement rapide, si ce n'est instantanée. Or, les spermatozoldes présents dans la semence pure sont particulièrement sensibles, c'est-à-dire sujets à destruction, lors de changements rapides survenant dans l'environnement naturel du liquide séminal, notamment lors d'une variation de la composition chimique de celui-ci, ce qui est en particulier le cas lorsqu'on le met en présence d'un produit cryo-protecteur tel que, par exemple, le glycérol, le diméthylsulfoxyde ou l'éthylène glycol. Par ailleurs, le plasma séminal contient des sels qui, conservés dans la préparation diluée et conditionnee, limitent la congélabilité de celleci et par conséquent sa fertilité. C'est pourquoi la présente invention a pour but de fournir un procédé de dilution de la semence reproductrice pure qui simultanément évite tout choc environnemental sur les sper matozoldes et réduise l'action néfaste des sels du plasma, qui en somme accroisse la conoelabilité, et par conséquent la fertilité, de cette semence. A cet effet, l'invention a pour objet un procédé de dilution de la semence reproductrice pure, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre cette semence à une opération de dialyse en présence du milieu dilueur prévu, avec interposition entre les deux d'un organe sêlectivement perméable à la semence. De manière particulièrement avantageuse, on peut procéder à l'opération de dialyse en soumettant simultanément la semence à un déplacement relatif par rapport au milieu dilueur. On utilise de préférence, comme organe sélectivement perméable à la semence, une enveloppe que l'on soumet alors-audit déplacement relatif avec la semence, par rapport au milieu dilueur qui est immobile et dans lequel est placée cette enveloppe. Avantageusement, on utilise une enveloppe constItuée d'un tube dont la paroi latérale est réalisée en un matériau sélectivement perméable à la semence, par exemple en une ma tière telle que l'hydrate de cellulose pure régénérée de la viscose, façonnée en pellicule et connue sous la marque de Cellophane, cette pellicule étant poreuse, Dans un tel cas, ou l'enveloppe présente deux surfaces opposées en contact avec le milieu dilueur, on soumet cette enveloppe audit déplacement relatif par rapport à ce milieu, de manière alterne et suivant deux directions opposées. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, ou l'enveloppe est constituée par un tube, on utilise un support de tube anime d'un mouvement de rotation alterné à l'inte- rieur d'une enceinte contenant le milieu dilueur. De manière particulièrement avantageuse, on procède à l'opération de dialyse sur une période de 10 minutes à 3 heures, cette durée étant fonction de l'espèce animale considérée et du volume de semence traité. La description qui va suivre, à titre d'exemple non limitatif, a uniquement pour but de bien faire comprendre comment l'invention peut être mIse en pratique. Sur les dessins, la Figure unique représente schématiquement un appareil permettant de mettre en oeuvre le procédé conforme à l'invention. Cet appareil est constitue par une enceinte 1 fermée par un couvercle 2 que traverse en son centre l'arbre de sortie 3 d'un moteur électrique réversible 4 monté sur ce couvercle. Cet arbre de sortie 3 porte, à son extrémité, un support horizontal 5 constitue de deux bras dont chacun porte lui-même à son extrémité, à travers un orifice 6, un tube#en cellophane poreuse 7. L'extrémité su prieure de chaque tube présente une collerette 8 qui repose sur le bras du support 8, tandis que son extrémité inférieure est obturée par un bouchon en matériau plein 9. Chacun des deux tubes 7 est rempli, sur environ la moitié de sa hauteur, de la semence à diluer 10 (dont le volume est fonction de l'importance de l'éjaculat à traiter), tandis que l'enceinte 1 est elle-même remplie de dilueur 11, jusqu'à un niveau 12 supérieur à celui 13 de la semence dans les tubes. On remplit tout d'abord jusqu'au niveau 12 l'enceinte 1 à l'aide d'une préparation de dilution telle que celle décrite au début de cette description, cette préparation présentant le pourcentage voulu d'un agent cryo-protecteur tel que le glycérol. La semence récoltée est alors versée pure dans les tubes 7 et on place ceux-ci sur leur support 5 dans l'enceinte 1. On alimente alors le moteur 4 de manière que celui-ci entraîne en rotation les tubes 7 alternativement dans un sens, puis dans l'autre, et l'on poursuit cette opération par exemple durant 30 minutes, période au bout de laquelle toute la semence a diffuse à travers les tubes pour se diluer dans le milieu 11. On porte ensuite, à la façon habituelle, cette semence diluée à la température de réfrigération voulue, à la suite de quoi on peut la diluer à nouveau à l'aide d'une seconde fraction de préparation diluante en mettant à nouveau en oeuvre, ou non, le procédé de dilution précedent. On procède enfin, également à la façon habituelle, à son conditionnement en paillettes et on la congèle dans les vapeurs d'azote liquide d'une enceinte cryogénique convenable. Les résultats de l'examen effectué après congélation montrent que la congélabilité de la semence est considéra- blement accrue par rapport à une semence ayant subi le traitement classique de dilution par mélange. On constate en effet que le pourcentage des spermatozoldes vivants et la mobilité de ceux-ci sont très fortement accrus, ce qui entraîne une augmentation notable de la ferutilité. On note également, après décongélation, une faculté de survie extrêmement importante puisqu'elle peut atteindre jusqu'à 24 heures après la décongélation, ce qui présente un grand intérêt sur le plan pratique puisque ce résultat évite d'avoir à procéder à cette opération de décongêlation juste avant I'insemination,c'est-à-dire en général dans les conditions relativement précaires d'un champ. REVENDICATIONS 10) - Procédé de dilution de la semence reproductrice pure, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre cette semence à une opération de dialyse en présence du milieu dilueur prévu, avec interposition entre les deux d'un organe sélectivement perméable à la semence. 20) - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on procède à l'apération de dialyse en soumettant simultanément la semence à un déplacemént relatif par rapport au milieu dilueur. 30) - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on utilise comme organe sélectivement perméable à la semence, une enveloppe que l'on soumet alors audit déplacement relatif avec la semence, par rapport au milieu dilueur qui est immobile et dans lequel est placée cette enveloppe. 40) - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on utilise une enveloppe constituée d'un tube dont la paroi latérale est réalisée en un matériau sélectivement perméable à la semence. 50) - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on utilise comme enveloppe un tube en hydrate de cellulose pure régénérée de la viscose, poreux. 6 ) - Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que, dans le cas où l'enveloppe présente deux surfaces opposées en contact avec le milieu dilueur, on sou met cette enveloppe audit déplacement relatif par rapport à ce milieu, de manière alternée et suivant deux directions opposées. 70) - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que, dans le cas où l'enveloppe est constituée par un tube, on utilise un support de tube anime d'un mouvement dé rotation alterné à l'intérieur d'une enceinte contenant le milieu dilueur. 8 ) - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on utilise deux tubes que l'on déplace suivant des directions relatives opposées par rapport au milieu dilueur. 9 ) - Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, caractérisé en ce que le tube est muni à son extrémité inférieure d'un bouchon plein. 100) - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'on procède à l'opération de dialyse sur une période de 10 minutes à 3 heures.