Brevet FR2463618A1 — publié le 19810227

La présente invention concerne un nouvel antibiotique aminoglycoside constitué par G-367-2 et ses sels non toxiques ou un procédé pour sa production. Le nouvel antibiotique aminoglycoside G-367-2 (appelé ci-dessous G-367-2) a les propriétés physico- chimiques suivantes: (1) G-367-2: Pf: 151 - 155 C. (()24: +159,8 (c = 1,0, H20). Analyse élémentaire: Trouvé: C% = 50,41, H% = 7,92, N% = 15,16 Calculé: C% = 50,99, H% = 8,33, N% = 15,64. Poids moléculaire: 447 (par spectre de masse) Formule moléculaire: C19H37N507. Spectre d'absorption ultraviolet: pas de pic d'absorp- tion maximum caractéristique dans l'eau à 220- 360 nm, ne montrant qu'une absorption d'extré- mité. Spectre d'absorption infra-rouge (KBr): cf figure 1. bande d'absorption à 3350, 2920, 1650, 1540, 1470, 1350, 1140, 1100, 1050, 1020, 950 cm-1. Spectre RMN (noyau d'hydrogène): cf Figure 2. (D20, 100 MHz, standard interne DSS). Spectre RMN (noyau de carbone): (D20, 25 MHz, standard interne: dioxanne). No. p p m No. p p m 1 149,5 11 67,4 (dioxanne) 2 101,4 12 64,2 3 98,7 13 51,6 4 97,5 14 50,1 No p p m No p p m 87,9 15 47,2 6 85,1 16 43,0 7 75,2 17 37,7 8 73,1 18 36,2 9 70,0 19 23,9 68,6 20 22,5 Solubilité: soluble: eau, méthanol. insoluble: acétone, benzène, acétate d'éthyle, chloroforme. Réaction colorée: positive: ninhydrine, décoloration du permanganate de potas- sium négative: Elson-Morgan, Biuret Couleur: poudre blanche Nature: basique. Chromatographie en couche mince (gel de silice): couche inférieure de chloroforme: méthanol: ammo- niaque à 28% (1:1:1), Rf = 0,28. acétate d'ammonium à 10%: méthanol (1:1), Rf = 0,10. Les propriétés physico-chimiques ci-dessus du G-367-2 telles que l'analyse élémentaire, le poids molé- culaire et la formule moléculaire ressemblent à celles d'un antibiotique connu, la sisomycine. Cependant le Rf de la sisomycine sur chromatographie en couche mince au chloroforme:méthanol:ammoniaque à 28% (1:1:1) est de 0,38, ce qui diffère de celui du G-367-2. Les autres propriétés physico-chimiques du G-367-2 révèlent un nouvel antibiotique aminoglycoside ayant la structure plane suivante, et que l'on pense être un stéréoisomère de la sisomycine: CH2NH2 NHCH 0 OH o H2N G-367-2 15... Staphylococcus aureus ATCC 12,5 6538P " " " " MS27 12,5 " " " 0119 12,5 Staphylococcus epidermidis sp- 1,6 al-l Streptococcus pyogènes N.Y.5 6,3 Bacillus subtilis ATCC 6633 1,6 Escherichia coli NIHJ-JC2 3,1 " " W3630 1,6 "n " W3630 RGN14 1,6 Citrobacter freundii GN346 3,1 Klebsiella pneumonia ATCC 10031 1,6 Salmonella enteritidis G'rtner 3,1 Shigella sonnei E33 3,1 Proteus morganii 0239 6,3 Proteus rettgeri ACR 3,1 Enterobacter aerogenes 0655 1,6 Enterobacter cloacae GN336 1,6 Serratia marcescens 50 Pseudomonas aeruginosa IAMA095 25 " "12 "I ML4561 Rms166 > 100 " " " ML4561 Rms164-1 50 " " " ML4561 RP4 6,3 " "l " 1946 >100 " " " 2512 >100 Pseudomonas putida 1842 >100 Pseudomonas maltophilia 1850 > 100 L'antibiotique G-367-2 de l'invention a une forte action anti-bactérienne contre les bactéries gram- négatives et peut être utilisé sous forme de sels d'addi- tion acides non toxiques d'acides organiques ou inorgani- ques, par exemple de chlorhydrate, bromhydrate, sulfate, phosphate, carbonate, acétate, fumarate, malate, citrate, mandérate, succinate, ascorbate, aspartate ou glutamate. L'antibiotique selon la présente invention est utile notamment à titre de médicament pour le traitement des maladies à germes sensibles en particulier les bacté- ries gram négatives et peut également être utilisé pour la stérilisation et la désinfection d'objets divers chi- rurgicaux par exemple. L'antibiotique G-367-2 ou ses sels d'addition acides non toxiques peut être utilisé sous forme de pré- parations injectables, par exemple sous la forme de fla- cons ou d'ampoules de 20-40 mg. La souche de actinomycetes G-367 productrice de G-367-2 a été isolée à partir d'un échantillon de sol 2463618 - prélevé dans un champ à Fuji-shi, Shizuokaken, au Japon, et a été attribuée à Dactylosporangium thailandense G-367. Cette souche a été déposée à l'Institute for Microbial Industry and Technology, au Japon, sous le n FERM-P n 4840, le 28 Février 1979. Les propriétés taxonomiques de la souche sont les suivantes: (1) Propriétés morphologiques: Observations sur gélose calcium-malate (Bact. Rev. 21, 1 (1957) à 30 C, pendant 3 à 7 jours de culture: Le mycelium substrat est courbé ou entrelacé, la crois- sance se fait par ramification, il n'y a pas de fragmen- tation, le diamètre est de 0,5 à 0,8 micron et il n'y a pas de formation d'hyphae aériens. Corps globuleux ou elliptique de 1,5-2,0 x 2,0 - 2,5 microns formé sur le mycellium substrat noyé dans le milieu gélosé. Un court sporangiophore émerge du mycelium substrat et des sporanges en forme de doigt se forment isolément ou en touffes à la surface du milieu gélosé. La taille des sporanges est de 1,0 - 1,5 x 4,0 - 6,5 microns. Chaque sporange contient une seule rangée ver- ticale de trois à quatre spores. Les spores sont mobiles dans l'eau, ont une forme globuleuse, elliptique ou pyriforme, ont une taille de 1,0 - 1,5 x 1,5 - 2,5 mi- crons, avec des flagelles polaires (bactérie polytriche) (II) Composition de l'acide diaminopimélique: On détecte un Rm de type méso et de valeur infé- rieure au type méso (acide diaminopimélique à déplacement lent) par analyse mycélienne complète. (III) Croissance sur divers milieux: Les observations sur divers milieux à 30 C pen- dant 14 jours sont illustrées dans le tableau suivanto Le mycelium aérien ne se forme pas sauf sur la gélose de farine d'avoine sous une forme rudimentaire. La formation des sporanges est bonne sur gélose au malate de calcium, moyenne sur gélose au sol (J. gen. Microbiol., Q0, 295 (1968)) , et légère ou nulle sur les autres mi- lieux. Les indications de couleur se fondent sur le "Color Harmony Manual, 4è éd., 1958" (Container Corporation of America). Croissance sur divers milieux Milieu Croissance Couleur du mycelium substrat pigment soluble Gélose saccharose Modérée à Abricot (4 ia) à non nitrate (milieu de Waksmann 1) m faible orange Dusty (4 lc) (milieu de Waksmann 1) Gélose glucose-asparagine fb Jaune melon Brite faible (milieu de Waksmann N02) X (3 ia) à Abricot (4 ia) ,, Gélose Glycérine-asparaassez faible incolore à jaune Melon gine à faible (3 ea) clair (milieu ISP NO 5) Gélose d'amidon inorganique modérée à Orange feuille morte (milieu ISP N 4) A bonne (4 nc) à Orange Dusty (4l1c) Gélose à la tyrosine assez faible à Abricot (4 ga) à Orange (milieu ISP NO 7) x faible Pastel pâle (4 ic) Gélose de farine d'avoine modérée à bonne Rouille Orange (4 pe) à, (milieu ISP N 3) h Orange feuille morte (4 pc). Gélose extrait levure Erable (4 le) à Brun Erable (4 le) extrait de malt " bagages (4 ne) brun clair (milieu ISP NO 2) ex. . ....... (4 ng) -,3 r'> a. Co Gélose au malate de faible incolore calcium Gélose nutritive (milieu assez faible incolore de Waksmann N 14) m Gélose de Benett (milieu modérée à bonne Erable (4 le) à brun bagages Erable (4 le) à de Waksmann NO 30) m (4 ne) brun clair (4 ng Gélose d'Emerson (milieu modérée Orange Pastel (4 ic) à éra- Erable (4 le) de Waksmann N 28) m ble (4 le) Gélose d'Hickey et Tresner modérée à bonne Cannelle (3 le) à érable Erable (4 le) à (milieu de Waksmann N 32)2 (4 le) brun épice clair _ _ _ _ _ _ _ __ _(4 1lg) Gélose au glucose - ex- modérée Jaune melon (3 ga) trait de levure (Milieu 0 de Waksmann NO 29) Gélose peptone - extrait assez faible incolore de levure ferreuse (Mi- lieu IPS NO 6) __.._À__ Gélose du sol assez faible à * faible Repiquage de pomme de Rouge tuile (5 ne) à terre (Milieu de modérée Cuivre (5 lc) Waksmann N 40) w lu COl Waksmann S.A. The Actinomycetes Vo/2 1961 P. 327334 Williams & Wilkins Co. Inter. J. Syst. Bact. 16: 313.340 (1966) Antimicrob. Agents and Chemother 1963 P.116 v 124 o' -à Repiquage de pomme de Rouge tuile (5 ne) à terre + carbonate de Modérée Cuivre (5 lc) calcium Repiquage de carotte assez faible incolore I li iiii 1) Utilisation des sources de carbone: Source de carbone P & Gt Lm1 D- arabinose + + L-arabinose + + D-fructose + + D-galactose + + D-glucose + + glycérol i-inositol - - D-mannose + + D-mannitol + + "-mélibiose + + e-lactose + + dulcitol - - D-toréharose + + D-cellobiose + + mélézitose + + raffinose + L-rhamnose + + D-ribose - L-sorbose D-sorbitol - - saccharose + + D-xylose + + adonitol - - salicine + + ++ amidon + + maltose + + dextrine + + inuline +: positive + : Faiblement positive -: négative Milieu inorganique de Pridham-Gotlieb î Inter. J. Syst. Bact., 21, 240-247 (1971) 1 1 2) Température de croissance: 20-40 C 3) Peptonisation et coagulation du lait écrémé: positives. 4) Formation de pigment type mélanine: négative sur tyrosine et gélose peptone-extrait de levure-ferreuse. ) Hydrolyse de l'amidon: positive. 6) Décomposition de la cellulose: négative. 7) Décomposition de la caséine: positive. 8) Décomposition de la tyrosine: négative. 9) Liquéfaction de la gélatine: positive ) Formation d'H2S: faiblement positive 11) Réduction des nitrates: positive 12) pH de croissance: pH 5, 5-9,0 Telles qu'elles sont illustrées ci-dessus les caractéristiques de la souche G-367 sont: sporanges en forme de doigt croissant syr mycelium substrat, ran- gée verticale isolée de spores dans le sporange, et des flagelles polaires polytriches sur la spore. Ainsi les sporanges formés et contenant des flagelles polytriches appartiennent au genre Actinoplanaceae, et parmi eux les sporanges en forme de doigt et la simple rangée verticale de spores qu'ils contiennent appartiennent au genre Dactylosporangium. En outre, comme la souche G-367 présente un mycelium substrat de couleur brun orange à brun et un pigment soluble brun, la souche est attribuée à Dactylosporangium thailandense (Arch. Microbiol., 58, 42-52 (1967)), La souche est donc désignée comme Dactylosporangium thailandense G-367o La production d'un nouvel antibiotique G-367-2 peut se faire en cultivant de manière aérobie une souche productrice de G-367-2 appartenant au genre Dactylosporangium dans un milieu classique. On peut utiliser un milieu solide ou liquide, et pour une pro- duction à grande échelle, un milieu liquide est préfé- rable. On peut utiliser un milieu nutritif classique pour microorganisme. On peut utiliser des sources de carbone assimilables comme le glucose, le saccharose, le maltose, l'amidon, la dextrine et la mélasse. On peut utiliser des sources d'azote assimilables comme la li- queur de mals macérée, la poudre de soja, la poudre de graine de coton, le gluten de blé, la peptone, l'extrait animal, l'extrait de levure, l'hydrolysant de caséine, un sel ou un nitrate d'ammonium. On peut utiliser si nécessaire un phosphate et un sel de magnésium, de calcium, de potassium, de sodium, de cobalt, un sel ferreux ou un sel de manganèse. La température de culture dépend de la crois- sance des micro-organismes et de la production d'n anti- biotique et est de préférence de 25-350C. Le temps de culture dépend-des conditions et est généralement de à 200 heures, et la culture se termine à l'activité maximum de l'antibiotique dans le milieu. L'antibiotique est produit dans le filtrat de culture. On peut procéder à l'isolement de G-367-2 par un procédé d'isolement classique pour l'antibiotique aminosucré basique soluble dans l'eau. On peut doser G-367-2 sur plaques de gélose en utilisant Bacillus subtilis comme organisme expérimental. On trouvera ci-dessous des modes de réalisa- tion des procédés d'isolement et de purification de G-367-2. On obtient le filtrat de culture en ajustant le milieu de culture à un pH acide puis en le neutrali- sant et en filtrant. On introduit le filtrat de culture sur une colonne de résine échangeuse de cations telle que l'Amberlite IRC-50 (type NH+) pour adsorber la subs- tance active, on élue la substance active par de l'ammo- niaque 2 N et on concentre et on ajuste le pH de l'éluat. On introduit le concentré dans une colonne de résine échangeuse de cation telle que CM-Sephadex G-25 (type NH+), on élue avec de l'ammoniaque de gradient de con- centration 0-0,35 N pour obtenir la fraction active que l'on concentre et qu'on lyophilise pour obtenir G-367-2 sous la forme d'une poudre blanche purifiée en base libre. Le G-367-2 ainsi obtenu présente une seule tache en chromatographie en couche mince. Les exemples suivants présentent des modes de réalisation de l'invention, mais ne doivent pas être compris comme limitatifs. Exemple 1 On stérilise à 120 C pendant 20 min un milieu (pH 7,0, 100 ml) contenant de la dextrine à 1%, du glu- cose à 1%, de l'hydrolysant de caséine à 0,5%, de l'ex- trait de levure à 0,5% et du carbonate de calcium à 0,1% dans un erlenmeyer de 500 ml. On inocule une goutte de Dactylosporangium thailandense G-367 de milieu gélosé en biseau et on cultive en agitant à 30 C pendant 120 H. On inocule cette culture d'ensemencement au milieu stérilisé de la même composition (20 l) dans un fermentateur de 30 1 et on cultive à 30 C pendant 72 H à 300 tpm et en aérant à raison de 20 1/min. On inocule ledit milieu de culture (10 l) dans le milieu stérilisé contenant de la dextrine à 5%, du glucose à 0,5%, de la poudre de soja dégraissée à 3%, du carbonate de calcium à 0,7% et du chlorure de cobalt à 1,3 ppm (pH 7,2, 200 l) dans une cuve de 250 1 et on cultive à 30 C pendant 120 H, à 250 tpm, en aérant à raison de 100 1/min, pour obtenir 190 1 de milieu de culture. Exemple 2 On ajuste le milieu de culture obtenu dans l'exemple 1 à pH 2 en ajoutant de l'acide sulfurique 12 N, on agite pendant 30 min, on ajuste encore à pH 7,0 en ajoutant de l'ammoniaque concentré et on filtre après addition de "Perlite" (marque déposée) pour filtra- ge (4 kg). On introduit le filtrat sur une colonne d'Am- berlite IRC-50 (Rohm & Haas Co.) (type NH+, 10 1) et on élue avec de l'ammoniaque 2N (20 l) après avoir lavé avec de l'eau. On concentre l'éluat sous vide jusqu'à un volume de 100 ml On ajuste le concentré à pH 7,0 en ajoutant de l'acide sulfurique 6 N et on l'introduit sur une colonne de CM-Sephadex G-25 (Pharmacia Fine Chem. Co.) (type NHI, 500 ml, diamètre 4 cm). Après lavage à l'eau, on élue la substance active par élution au gradient avec de l'ammoniaque (5 l) de gradient de concentration 0-0,35 N. On vérifie chaque fraction par chromatographie en couche mince en utilisant une couche inférieure de chloroforme:méthanol:ammoniaque à 28% (1:1:1:) et on confirme la substance active par coloration à la ninhy- drine. On trouve la substance G-367-2 dans les frac- tions n 190-205o On combine les fractions actives, on les concentre sous vide, on lyophilise pour obtenir la poudre blanche. On sèche la poudre à 40 C pendant 48 H sous une pression réduite pour donner le G-367-2 puri- fié sous la forme d'une poudre blanche (base libre, 880 mg). Les figures ci-annexées sont les suivantes: Fig. 1: G-367-2, spectre IR. Fig. 2: G-367-2, spectre RMN (noyau d'hydrogène); et elles font explicitement partie de la présente descrip- tion pour être utilisées notamment aux éléments de caractéristiques techniques dans les revendications. REVENDICATIONS 1) Antibiotique aminoglycoside G-367-2 o Pf: 151 - 155 C. 4: + 159,80 (c = 1,0, H20) Analyse élémentaire: Trouvé: C% = 50,41, H% = 7,92 N% = 15,16 Calculé: C% = 50,99, H% = 8,335, N% = 15,64 Poids moléculaire 447 (mesuré par spectre de masse). Formule moléculaire: C19H37N507 Spectre d'absorption ultraviolet: pas de pic d'absorp- tion maximum caractéristique à 220-360 nm, ne montrant qu'une absorption d'extrémité. Spectre d'absorption infra-rouge: tel que représenté à la figure ô. Spectre RMN: tel que représenté à la figure. Solubilité: soluble: eau, méthanol. - insoluble: acétone, benzène, acétate d'é- thyle, chloroforme. - Réaction colorée: positive: ninydrine, décoloration de permanganate de potassium. négative: Elson-Morgan, Biuret. Couleur: blanc. Nature: basique. 2) Procédé de production de l'antibiotique aminoglycoside G-367-2 qui implique de cultiver un micro- organisme appartenant à Dactylosporangium thailandense G-367 FERM-P n 4840 dans un milieu nutritif et d'en isoler les antibiotiques produits. 3) A titre de médicament nouveau un antibioti- que selon la revendication 1.