Brevet FR2467195A1 — publié le 19810417

La présente invention concerne certains nouveaux polypeptides et elle concerne également des agents carcinostatiques et des agents servant à la détection et à la détermination de virus, ces agents contenant les polypeptides nouveaux à titre de constituants actifs. Plus particulierement, l'invention concerne des agents carcinostatiques ainsi que des agents de détection et/ou de détermination de virus, agents qui contiennent les deux types suivants de polypeptides nouveaux répondant à la formule générale ci-apres (formule structurale primaire) dans laquelle les symboles "Ala", "Arg", "Asn", "Cys", "Gln", "Gly", "Leu", "Lys", "Phe", "Pro", "Ser", "Thr", "Tyr" et "Val" indiquent respectivement les restes de formes lévogyres de l'alanine, arginine, asparagine, 1/2 cystine, glutamine, glycine, leucine, lysine, phénylalanine, proline, sérine, thréonine, tyrosine et valine et dans laquelle les radicaux R1 à R5 désignent (1) les restes des L-aminoacides respectifs suivants R1 : lysine R2 : asparagine R3 : leucine R4 : thréonine R5 : acide aspartique ou (2) R1 représente l'arginine, R2 et R5 représentent la glycine, R3 représente l'isoleucine et R4 représente la sérine. Les symboles ~~~~~~ representent les liaisons -S-S- et, en outre, les chiffres arabes apparais sant dans la formule structurale à côté de certains restes d'aminoacides désignent la séquence de ces aminoacides en partant du N terminal. Le premier analogue des nouveaux polypeptides selon l'invention (qu'on désignera ci-après ''SPI'') est constitué de quarante cinq restes d'aminoacides et répond à la formule structurale primaire ci-après dans laquelle tous les symboles désignant les restes d'aminoacides respectifs sont les mêmes que ci-dessus. Cet analogue présente une structure tétracy- clique particulière en ce qu'il est prévu quatre liaisons disulfure de pontage entre chaque paire de molécules de cystéine, lesdites paies étant présentes entre les 3ème et 39ème, 4ème et 3sème, 12ème et 29me, et 16ème et 25ème positions, respectivement. Le second analogue des polypeptides nouveaux selon l'invention (quton désignera ci-après "SP2") comprend également 45 fragments d'aminoacides et répond à la formule structurale primaire ci-après dans laquelle tous les symboles désignant les restes d'aminoacides respectifs sont les mêmes que ci-dessus. Cet analogue présente également une structure tétracyclique particulière en ce qu'il comporte des pontages constitués par des liaisons disulfure de la même façon que l'analogue SPI. Ces deux analogues peuvent être caractérisés par les paramètres physiques et chimiques suivants (SPI) Aspect : cristaux aciculaires incolores Point isoélectrique : pH de 10 environ Poids moléculaire (PM) 4 913 calculé à partir des sequences d'aminoacides, mais le PM est en outre estimé comme ayant une valeur d'environ 5 500 selon un procédé d'équilibre de sédimentation.Pour obtenir cette derniè re détermination, on dissout l'échantillon dans un tampon 0,05 M de tris-HCl contenant de la guanidine. HC1(64 de manière à at teindre une concentration de 1 à 5 mg/ml et la mesure étant effectuée à 17 600 tours/minute à l'aide d'une ultracentrifugeuse Spinco Modèle E (Beckman Co) Nombre de fragments d'aminoacides : 45 Les abrevlatlons et les cl rires ont la me me signitication que precedemment. Analyse élémentaire C H N S Calculé (%) 49,56 6,84 19,07 5,21 Trouvé (%) 49,32 6,94 18,92 5,34 Spectre d'absorption U.V. (Figure 3) On observe une absorption caractéristique due aux peptides à proximité de 278 nm. On mesure des échantillons de 2 mg/ml à l'aide du spectrophotomètre à deux ondes et à double faisceau fabriqué par Hitachi (Type 356). Spectre d'absorption I.R. (Figure 4) On observe une absorption caractéristique due aux peptides à proxi mité de 1 600 cm -1 (mesurée par un spectrophotomètre à réseau I.R. fabriqué par Hitachi). Composition en Aminoacides Les résultats sont indiqués dans le tableau 1. On hydrolyse les échantillons avec du HCl 6N à 1100C dans un tube hermétique dans lequel a été établi le vide et on effectue la mesure à l'aide d'un analyseur d'aminoacides (type JLC 5 AH de Nippon Denshi Co., Ltd.) TABLEAU 1 Nombres entiers les Aminoacides Proportion molaire plus proches (nom (trouvée) bre de fragments d'aminoacides pré sumés) ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ sumés) AsX(Asp+Asn) 4,02 4 Thr 1,94 2 Se GlX(Glu+Gln) 1,01 1 Pro 2,11 2 Gly 3;11 3 Ala 3,12 3 1/2 Cys 8::: Val 0,88 1 Met 0,00 0 Ile 0,00 0 Leu 4,76 5 Tyr - 1 * Phe 1,01 1 Lys 6,08 6 His 0,00 0 Arg 4,11 4 Trp ** 0,00 0 * à partir des séquences d'aminoacides n mesuré par spectrophotométrie Electrophorèse sur Gel On observe une bande unique à la suite de l'électrophorèse a dis que de polyacrylamide. On effectue cette mesure dans un gel à 7,5 % de polyacrylamide à pH 9,4 et 4,0. On connecte l'électrode supé rieure à l'anode et on effectue l'électrophorèse à 25 mA/cm2 pendant 50 minutes à température ambiante. On teinte le gel avec du colorant bleu (Coomassie Brilliant Blue R) (0,02 ,et on supprime la coloration avec 10% d'acide trichloracétique. (SP2) Poids moléculaire 4 812 ( à partir du résultat des séquences d'aminoacides). Cepen dant on trouve un PM aux alentours de 5 500 par le procédé d'équi libre de sédimentation mettant en oeuvre une ultracentrifugeuse, comme expliqué à propos de SP1. Nombre de fragments d'aminoacides : 45 Séquence d'aminoacides Bs abréviations et les chiffres ont les mêmes significations que précédemment. Analyse élémentaire : C H N S Calculé (%) 49,34 6,94 19,77 5,32 Trouvé (%) 49,21 6,52 19,92 4,92 Spectre d'absorption U.V. (Figure 3) : On observe une absorption caractéristique due aux peptides à proximité de 278 nm. Spectre d'absorption I.R. (Figure 4) On observe une absorption caractéristique due aux peptides à pro -1 ximité de 1 600 cm Composition en Aminoacides Les résultats sont indiqués dans le tableau 2. On effectue l'ana lise de la même manière que celle qui a été décrite pour le tableau 1. TABLEAU 2 Nombres entiers les Aminoacides Proportion molaire plus proches (nombre (trouvée) de radicaux restants ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ présumés) AsX(Asp+Asn) 2,16 2 Thr 1,10 1 Ser 4,92 5 GlX(Glu+Gla) 1,04 Pro 2,13 2 Gly 4,88 5 Ala 3,05 3 1/2 Cys Val 0,84 1 Met 0,00 O Ile 0,95 1 Leu 3,89 4 Tyr Phe 1,00 1 Lys 4,81 5 His 0,00 0 Arg 4,95 5 Trp n 0,00 0 à partir des séquences d'aminoacides n mesuré par spectrophotométrie. Electrophorèse sur Gel On observe une bande unique à la suite de l'électrophorèse à disque de polyacrylamide. Il est évident à l'examen de ces résultats que SP1 et SP2 sont très similaires l'un à l'autre, aussi bien sur le plan physique que sur le plan chimique et il en résulte que la séparation de ces deux composés à partir d'un mélange est difficile sans chromatographie à l'aide d'un absorbant à cations échangeables, comme par exemple la carboxyméthyl (CM) cellulose. SP1 et SP2 ainsi que leurs analogues sont présents en des quantités importantes dans l'orge et le blé. On va décrire ci-après un exemple de procédé pour obtenir SP. On met en suspension 4 kg de farine de blé dans 20 litres d'acide sulfurique 0,05N et on maintient à 300 C pendant 3 heures. Après enlèvement du précipité par centrifugation (3000 tours/minute, 10 minutes,température ambiante) on neutralise le liquide qui surnage avec NaOH 10N et on laisse au repos pendant 12 heures à 500 C. On enlève le précipité résultant par centrifugation et on chromatographie le surnageant sur une colonne de CM cellulose (2,5x 80cm) équilibrée avec un tampon phosphate 0,05 M, à pH 7,2 et avec élution à l'aide d'un gradient linéaire de NaCl de 0,1 à 0,8 M dans le même tampon (700 ml dans chaque réservoir) à température ambiante. On contrôle le débit par absorption à 280 nm.On chromatographie une nouvelle fois l'éluat sur une colonne similaire (1,5 x 75 cm) et, si on désire, on lyophilise. Rendement : 120 mg. On charge 120 mg de la matière ci-dessus séchée sur une colonne de CM cellulose (3,1 x 33 cm) tamponnée avec une solution 0,2 M de bicarbonate d'ammonium et on élue avec un gradient d'une solution de bicarbonate d'ammonium de 0,2 à 0,8 M à une vitesse de 66 ml/hr. On fractionne ltéluat en fragments de 13 ml, chacun étant contrôlé par absorption à 280 nm. On recueille ainsi deux types de fractions d'absorption, les fractions N" 63 à 75 et N" 80 à 89, respectivement. Les exemples suivants, presentés en références aux dessins annexés, servent à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée, dessins dont - la figure 1 est un graphique montrant le nombre de cellules en fonction de la durée de culture (en heures) pour les cellules à l'état d'inhibition de contact - la figure 2 A représente un graphique des poids corporels des souris en fonction du nombre de jours après l'inoculation - la figure 2 B est un graphique montrant le nombre de souris ayant survécu en fonction du nombre de jours apres l'inoculation ; - la figure 3 représente les spectres U.V. de SP1 et Si, ; et - la figure 4 représente les spectres I.R. de SP et SP2. L'un des objectifs principaux de l'invention est d'utiliser les nouveaux polypeptides décrits ci-dessus comme agents carcinostatiques et comme agents de détection et de détermination de virus. On a déjà découvert que certains peptides acides provenant de certains microorganismes possèdent des propriétés antitumorales. Par exemple, Beerman et al (1977) ont indiqué récemment que la néocarzinostatine, dont la séquence d'aminoacides a été déterminée par Meinhofer et- al (1972), agit comme inhibiteur contre la division des cellules par liaison aux doubles chaines DNA des cellules suivie d'un sectionnement de la chaîne. D'autre part, on a constaté que les cellules de tumeurs sont dif férentes des cellules normales en ce qui concerne certaines caractéristiques. Comme facteur le plus caractéristique des cellules de tumeurs, on peut faire remarquer la diminution de l'aptitude d'inhibition de contact et la variation des membranes des cellules , en même temps que d'autres symptômes. Par exemple, la différence entre les cellules de tumeurs et les cellules normales peut être constatée par une culture in vitro. Dans le cas des cellules normales, la croissance des cellules s'arrête une fois qu'elles se sont développées et ont pris une disposition monolamellaire sur une surface intérieure inferieure du plateau ; au contraire, dans le cas des cellules de tumeurs, la croissance des cellules ne s'arrête pas mais se poursuit sans aucune limitation au-delà du stade monolamellaire sans s'arrêter à ce dernier stade. Plus précisément, l'une des particularités caractéristiques des cellules de tumeurs est leur croissance illimitée. On peut donc présumer que dans les cellules de tumeurs, on remarque.un cycle récurrent de croissance des cellules qui est différent de celui des cellules normales et, par conséquent, au cours de la croissance des cellules de tumeurs on observe le cycle suivant G1 : phase préparatoire pour synthèse de DNA (phase de pré-synthèse de DNA) S : phase de synthèse de DNA G2 : stade préparatoire pour la segmentation (phase de post synthèse de DNA) M : phase de segmentation Go : phase stagnante de segmentation; Ce cycle passe incontestablement par la phase de synthèse de DNA. Ensuite, comme expliqué par Ben-Or et al (Nature, 188, 1200, 1961) et par d'autres chercheurs, dans la surface d'une membrane de cellule (couche superficielle), la surface change du point de vue de la densité de la charge et devient fortement chargée négativement à mesure de la croissance des cellules hépatiques. Contrairement à ce qu'il vient d'être dit, la cause de l'augmentation de la densité de la charge à la surface des cellules de tumeurs peut être considérée comme une accélération de la fonction multiplicatrice (surtout de la fonction de synthèse de DNA). La transformation des cellules normales en cellules de tumeurs peut être provoquée par un virus plutôt que par des facteurs physxDwehimiques tels que les substances chimiques, les rayons U.V., les radiations etc.. De même, dans les cellules qui sont devenues des cellules de tumeurs à la suite d'une infection par un virus de tumeur, on constate en général que sa charge a la surface devient plus négative et que la structure superficielle change jusqu'à un état dans lequel les cellules subissent une forte multiplication, en d'autres termes, un état analogue à celui de la phase 5 dans le cycle cellulaire. En fait, on a détecté la présence de certaines substances carcinostatiques qui apparaissent basées sur ces caractéristiques des cellules de tumeurs. Pour citer une substance typique parmi les substances indiquées, la poly-DL-lysine (degré moyen de polymérisation de 240) possède une action carcinostatique reconnue. A la suite des recherches effectuées par les demandeurs et axées sur l'action physiologique des polypeptides nouveaux SPI et SP2 (qu'on désigne d'une façon générale par "SP"), comme précédemment expliqué, lesdits composés étant isolés des grains de blé et leur structure chimique étant déterminée de la façon décrite plus haut, on a trouvé que ce SP agit d'une façon spéciale et sélective sur les cellules animales à la phase S (phase de synthèse de DNA) et tue lesdites cellules, tout en faisant preuve d'une faible action contre d'autres cellules à un stade quelconque autre que la phase S. En particulier, ce SP n'agit pas contre les cellules normales à l'état d'inhibition de contact. De nombreuses cellules comprenant des tissus d'origine animale peuvent être considérées comme étant dans la phase G . Ainsi alors que le SP O selon l'invention est fatal pour les cellules dans la phase de segmentation (cellules de tumeurs) dans les corps vivants, on remarquera que cette substance n'affecte pas les cellules normales à 11 état d'inhibition de contact. En conséquence, une nouvelle découverte des demandeurs concerne des protéines basiques possèdant la propriété d'agir très sélectivement et d'une façon très spéciale sur les cellules qui sont dans un état spécial et de les tuer afin d'arrêter ou d'inhiber toute nouvelle croissance des tumeurs. Plus précisément, SP montre son fort pouvoir destructeur de cellules uniquement contre les cellules dans la phase de multiplication. En général, étant donné qu'on savait parfaitement qu'il existe une similitude entre la multiplication des cellules de tumeurs et celles des cellules animales, le fait que SP soit fatal pour les cellules dans la phase S fournit but d'abord la perspective d'une utilisation de cette substance en qualité d'agent entitumoral ayant une fonction et un mécanisme nouveaux. Comme on le verra plus loin, cette affirmation a été corroborée par des tests in RritTo. sur des animaux atteints de cancer. La seconde possibilité fondée sur ce qui précède est l'utilisation de cette substance comme agent de détection et de détermination de virus. A l'heure actuelle on utilise la cultur des virus avec des ceilules animales et végétales pour'de nombreuses recbercbes et buts partiques, comme par exemple l'isolement d'un virus, des études concernant ses propriétés, la fabrication des vaccins, le traitement prophylactique et curatif des maladies à virus etc.. Cependant, pour effectuer une telle re-cherche et un tel développement, une exigence préalable et impérative consiste à pouvoir détecter et/ou déterminer avec exactitude et commodément la nature du virus. Les moyens utilisés dans ce but sont les suivants 1) Procédé dans lequel on mesure la dégénération cellulaire visible des cellules infectées par un virus, à titre de paramètre (dégénération cellulaire). 2) Procédé par phénomène d'hémoagglutinatîon, provoqué par mélange des érythrocytes avec des cellules infectées par le virus (pro cédé dthémoagglutination). 3) Procédé par phénomène d'interférence entre une cellule infectée par un virus et d'autresvirus ; les infections provoquées par ces derniers virus sont inhibées (procédé d'interférence). 4) Procédé avec un antisérum particulier qui est spécifiquement actif sur un virus particulier (procédé d'antisérum). 5) Procédé d'un changement métabolique des cellules provoqué par les infections par virus, (mesure du changement métabolique). 6) Procédé par microscopie directement ou après coloration (pro cédé microscopique). Parmi ces procédés, le procédé (1) est le plus répandu mais il existe de nombreux virus qui ne sont pas détectables par cette méthode, comme par exemple, le virus de leucémie murine (Mo-Mu LV). En outre, même si certains virus sont détectables d'une façon ou d'une autre selon les procédés 1 à 6, ces procédés sont, dans la pratique, difficiles à appliquer car, ou bien le jugement fourni n'est pas clair et n'est pas concluant ou bien les techniques utilisées sont trop fastidieuses. Ainsi, de nombreux perfectionnements ont déjà été proposés.Par exemple, Rowe et al tVirology, 42, 1136 - 9 (197O)jont cultivé des cellules infectées avec Mo-LuLV ci-dessus avec des cellules d'embryon de souris (ME), puis ils ont arreté la croissance par irradiation par des rayons U.V. et ils ont fait suivre cette opération d'une culture avec des cellules XC (cellules de tumeurs de rats cancérisés par des souches en plaquettes du virus de sarcome de Raus), le dernier stade consistant à mesurer le nombre de plaquettes ainsi formées après coloration. Cette mesure est une utilisation de la propriété spéciale des cellules XC, ces cellules formant aisément un syncytium avec le virus développé par les cellules infectées avec le virus et, par conséquent, il s'agit en quelque sorte d'une détection et détermination indirectes (titrage) du virus.De ce fait, il est inévitable que l'objet d'une telle mesure soit limité de façon naturelle à un virus spécial qui forme un syncytium par comparaison avec un procédé de mesure directe tel que le procédé de dégénération cellulaire. En variante, on utilise partiellement le procédé d'anti-sérum pour une telle mesure mais la préparation de l'anti-serum est très fastidieuse et prend beaucoup de temps. De plus, ces procédés ne sont applicables qu'à des virus spécifiques. Pour toutes ces raisons, il existe un besoin sérieux de mettre au point un procédé de détection et de titrage de virus, procédé qui serait plus commode, plus exact et plus universel pour constituer un guide fiable dans l'étude des virus. Ce problème a été résolu par la présente invention qui consiste à appliquer la caractéristique remarquable indiquée plus haut de SP qui est fatal aux cellules infectées par les virus, à la réalisation de l'objectif recherché. On remarquera que le virus de leucémie des souris dont il a été question plus haut ne produit pas un effet de cysto-dégénération sur les cellules réceptrices. Plus précisément, il s'agit d'un exemple dans lequel la détection directe classique ou le titrage des virus par l'effet de cysto-dégénération n'est pas applicable, étant donné que rien ne différencie les cellules infectées par les virus des cellules non infectées lorsqu'on utilise un examen microscopique, la synthèse de DNA etc..Cependant, à la suite des essais effectués par les demandeurs, il est maintenant clair que lorsqu'on applique le SP aux cellules à l'état d'inhibition de contact, par exemple aux cellules A (un clone dérivé de BLAB/C de souris), seules les cellules infectées par le virus sont tuées alors que les cellules saines (non infectées) ne sont nullement affectées et aussi que cette action fatale sélective est presque quantitative.Ce résultat est en conformité avec celui trouvé par la mesure des cellules XC selon Rowe (procédé des plaquettes XC). En outre, étant donné que le nombre des virus initiaux est calculé à partir du nombrede syncytiums formés par diffusion des cellules XC dans ce procédé des plaquettes XC, il est naturellement impossible d'isoler des cellules insensibles au virus ou les cellules non infectées car ce sont des cellules vivantes (les cellules initiales sont devenues statiques par suite de l'irradiation par des rayons U.V. et en outre, des cellules XC ont été ajoutées à la culture). Cependant, selon les moyens préconisés consistant à ajouter directement SP à la culture, le procédé devient beaucoup plus simple en premier lieu et, en outre, il présente un avantage certain en ce que les cellules survivantes (surviè due à l'insuffisance de la quantité de virus, la mutation des cellules, etc..) peuvent être utilisées pour de nombreuses études étant donné que les cellules débarrassées de l'infection fatale sont toujours vivantes. En conséquence, si la quantité de virus (cJest- -direle nombre de virus individuels) est suffisante on-peut l'appliquer avantageusement à l'isolement des cellules ayant subi une mutation , lesdites cellules subissant une mutation en raison de leur sensibilité au virus ou bien le virus subissant une mutation au cours de la multiplication des cellules.Dans ces conditions, en utilisant l'agent SP selon l'invention, on peut fournir des moyens nouveaux et efficaces pour étudier les virus, comme suit : (I) On peut détecter et titrer un virus qui est négatif à la dégéné ration cellulaire simplement à partir dtun mélange de ce virus et de cellules réceptrices. Ce procédé est simple, car il est le même que l'isolement d'un virus qui est positif à la dégénération cellulaire à partir d'un mélange de ce virus et de cellules réceptrices. (II) I1 devient possible de détecter et d'isoler des cellules qui ont perdu leur sensibilité au virus. Comme il a déjà été décrit en détails, le fait que SP possède une action particulière contre les cellules animales lors de la phase de synthèse de DNA et contre les cellules infectées par le virus ou des cellules transformées, constitue la base d'utilisation de cette substance comme agent carcinostatique. Cette présomption a été démontrée par des expériences in vivo contre EAC (Carcinomes d'ascite d'Ehrlich), les sarcomes 180A et la leucémie lymphocytique L 1210 de la souris. Plus précisément on constate une inhibition marquée contre la multiplication des cellules de tumeurs d'EAC par un dosage de 1 à 2,5 mg/kg de SP. En outre, un effet visible de survie contre le sarcome 180A et la leucémie lymphocytique L 1210 a été constaté avec un dosage de 0,5 à 3 mg/kg de SP. Ci-après, on va décrire des faits expérimentaux typiques à partir desquels les découvertes ci-dessus ont été principalement déduites, ainsi que les études de toxicité aigüe de SP. En outre, étant donné que les effets et les comportements de SPI et SP2 sont pratiquement identiques,les les données et les faits concernant SPI sont également applicables à SP2 dans la description suivante. (1) Action particulière de SP sur le cycle cellulaire animal. (I-a) (Matières expérimentales) Cellules : Cellule A31 (clone dérivé de BALB/C (souche) de souris) Milieu de culture : NEM d'aigle avec addition de 10 % de sérum de foetus bovin. Agent : SP qui a été utilisé sous forme d'une solution de sel de tamponnement au phosphate (PBS). (I-b) Procédé expérimental. Pour synchroniser le cycle des cellules, on-soumet les cellules A31 à une incubation preliminaire de manière à provoquer l'inhibition de contact. On traite ensuite, une partie des cellules avec de la trypsine et on étale un nombre fixe de cellules sur des plaquettes en matière plastique. On ajoute ensuite l'agent dans un rapport de 4 ou 6 Sg pour 1 ml du milieu toutes les 4 heures et on mesure respectivement de temps en temps les nombres de cellules vivantes (différenciéespar coloration), la synthèse de DNA et le nombre de cellules de métaphases. En outre, au cours de cet essai, on effectue la mesure de la quantité de DNA à chaque stade du cycle cellulaire à l'aide d'un compteur à scintillations (Beckman Type LS 350). On effectue cette mesure de DNA en ajoutant 0,3 ,uci de (3H)-thymidine par plaquette, en titrant l'absorption de thymidine dans les 4 heures à l'aide d'un compteur à scintillations et en comparant avec la quantité de thymidine synthétisée. On calcule le nombre de cellules vivantes après coloration avec 0,05 ml de rouge neutre à 8 % par plaquette, en dispersant avec de la trypsine, en mettant en suspension dans PBS et en calculant le nombre de cellules colorées (en considérant les cellules colorées comme des cellules vivantes) à l'aide d'une table de calcul Türk-Bürker. (1-c) (Résultat) Le résultat de cette expérience apparalt sur la figure l. Comme on peut le voir sur la figure, l'addition de 6 ou 12 pg/ml de SP aux cellules pendant la phase de synthèse de DNA après 12 heures depuis la suppression de 11 inhibition de contact provoque la mort des cellules testées mais sans influer sur les cellules dans la phase G1 n'ayant pas atteint le laps de 12 heures à partir du moment de la suppression de l'inhibition de contact. L'action de SP devient faible contre les cellules à la phase G2 ou M, cellules qui ont passé par la phase S. Au contraire, on doit remarquer que la mort des cellules qui sont en inhibition de contact ne se produit pas du tout.De ce résultat, il devient évident que SP présente un comportement spécial contre les cellules à la phase S et tue ces cellules. Ordinairement, lors de la multiplication cellulaire, quatre phases telles que sont répétées, mais les cellules viennent en contact les unes avec les autres à la suite de cette multiplication et peuvent ainsi prendre l'état d'inhibition de contact. Ainsi, on peut présumer que SP n'influe pas sur les cellules normales mais attaque sélectivement les cellules de tumeurs pendant la phase S. Ce fait suggère en outre que SP est utilisable comme un inhibiteur particulier contre le cycle cellulaire et, de même, comme un agent biologique, c'est-à-dire un agent de synchronisation pour la culture des cellules. (2) Action de SP contre les cellules transformées. (2-a) Matières expérimentales. Cellules A31 (déjà citées), Lu14, PV4 (résuLtat de la tranformation de A3-1 par le virus de polyome). Milieu de culture : le même que dans (1-a) ci-dessus. Agent : le même que dans (1-a) ci-dessus. (2-b) procédé expérimental. On disperse 8,3 x 104 cellules individuelles par plaquette dans le milieu et en même temps on ajoute SP à raison de 2ywg par ml du culture. On noursuit l'incubation pendant 3 jours à 37 C et on remplace ensuite le milieu de culture par un/ On ajoute la même quantité de SP dans le milieu et on incube ntftttirtr- pendant 4 jours. On disperse la culture finale avec de la trypsine et on met en suspension dans PBS, puis on calcule le nombre de cellules comme décrit plus haut dans (I-a). (2-c) (Résultat) Le résultat apparaît dans le tableau 3 ci-après TABLEAU 3 Quantité de SP ajoutée (t g/ml de milieu) Cellules ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 0 2 4 Cellule normale (A31) 285(1) 290 220 (100,0) (101,8) (77,2) Cellule transformée (LP14) 310 238 63 (LP14) (100,0) (76,8) (20,3) Notes : (1) Nombre de cellules par plaquette (x 104/ plaquette). (2) les nombres qui apparaissent entre parenthèses indiquent les pourcentages numériques des cellules testées par comparaison avec le témoin sans addition de SP. (3) Effet fatal sur les cellules infectées par virus (3-a) Matières expérimentales Cellules : les mêmes que dans (l-a) Virus : Virus de leucémie murine (Mo-LuLV), souche Molony de souris Milieu de culture : MEM d'aigle avec 5 % de sérum de foetus bovin. Agent : le meme que (I-a) décrit plus haut. (3-b) Procédé expérimental. On disperse 3 x 105 cellules individuelles A31 dans le milieu, on infecte simultanément avec MuLV et on incube pendant 5 jours à 37"C. Après que l'inhibition de contact qui a liera été confirmée par voie microscopique, on ajoute à la culture IOpglml de SP et on incube pendant 4 heures de plus. On colore les cellules avec un rouge neutre (la concentration finale est de 0,4 %) et on calcule le nombre de cellules vivantes (en utilisant les cellules colorees comme paramètre des cellules vivantes)à l'aide d'une table de calcul Türk-Bürker avec comparaison avec les cellules A31 infectées par virus. (3-c) (Résultat) Le résultat apparaît dans le tableau 4 ci-après TABLEAU 4 (3) Cellules Nombre de cellules vivantes/plateau Cellules normales (A31 - MuLV) 4 x Cellules infectées par virus (A31+ MuLV) 1,8 x Note : (3) Le nombre de cellules vivantes après 4 jours depuis le traitement avec SP. Il ressort à l'évidence de ce tableau que SP-attaque les cellules infectées par virus et les tue. Ce phénomène, en ce qui concerne la sensibi lité accrue des cellules infectées par virus à l'action de SP, laisse penser que SP pourrait être utilisé pour plusieurs usages scientifiques tels que la discrimina tion des cellules infectées par virus et le titrage de la teneur en virus ou la sélection des mutants de virus ou des applications similaires. (4)-Action carcinostatique sur les animaux (4-a) : (Matières expérimentales) Animaux : souris (albinos suisses) Cellules : Cellules de carcinome d'ascite d'Ehrlich (EAC) (4-b) Procédé expérimental. On partage un certain nombre de souris albinos suisses (mâles, pesant en moyenne 21,6 g et agées de 5 à 6 semaines) en 6 groupes, dont chacun comprend 6 souris, et on inocule chaque souris par voie i.p. avec 0,1 ml de la suspension de cellules de tumeur. La suspension contient 3,5 x 10 cellules individuelles de tumeur par ml, et on la prépare en diluant une ascite avec PBS recueilli d'une souris cancérisée par EAC après 7 jours à compter de l'ino- culation. A partir du jour qui suit celui de l'inoculation, on administre par voiei.p. pendant 7 jours, jour après jour, respectivement 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 et 3,0 mg/kg/0,2 ml de SP. Les ascites dév-loppéesaprès 8 jours depuis l'inoculation sont recueillies et on calcule le rapport cellulaire (T/C %). (4-c) Résultat Le résultat de cette expérience est résumé dans le tableau 5. TABLEAU 5 Dose d'administation T/C % (nombre de cellules/ Décision de SP (mg/kg) souris) O 100,0 (265 x 106) Témoin 1,0 42,9 (113 x 106) + 1,5 30,3 (79,7 x 106) ++ 2,0 22,3 (58,7 x 106) ++ 2,5 12,6 (33,2 x 106) ++ 3,0 9,1 (24,0 x 106) Note : (4) La décision est basée sur la norme suivante T/C % 100 - 66 : 65 - 41 : + 40 - 1 1 : ++ 10 - O : Comme il est indiqué dans ce tableau 5, il est évident que SP est hautement actif contre la croissance des cellules de tumeurs avec une dose supérieure à 2,0 mg/kg contre EAC de la souris. (4'-a) : (Matières expérimentales) Animaux : souris (souche ICR, femelle, poids moyen 23,0g, age 5 semaines ). Cellules : Cellules de sarcome 180 A (4'-b) : (Procédé expérimental) On groupe six souris en un groupe organisé et on inocule chaque souris par voie i.p. avec 0,1 ml de la suspension des cellules de tumeur. La suspension contient 1 x 108 cellules expérimentales individuelles par ml. A partir du jour d'inoculation, on administre 5 fois par jour par voie i.p. 0,5 mg / kg de SP. (4'-c) : Résultat Le résultat apparaît sur la figure 2 annexée.Comme on peut le voir, la perte de poids corporel des souris expérimentales est faible ou même elle diminue pendant qu'on poursuit l'administration de SP mais, une fois que cette administration est interrompue, on peut constater une augmentation brutale du poids corporel et ensuite, la mort du groupe tout entier après 31 jours à dater de la cancérisation. Au contraire, dans le groupe témoin n'ayant pas subi d'administration de SP, on constate une augmentation brutale du poids corporel et tous les animaux meurent 17 jours après la cancérisation. Il est donc évident que SP exerce un effet carcinostatique marqué contre les cellules de tumeurs de sarcome 180 A. (5) Toxicité aigüe pour les souris (5-a) (Matières expérimentales) Animaux : souris (CF nO 1, Albinos suisse et BDFI) (5-b) (Procédé expérimental) On divise les souris CF n01 (mâles, poids moyen 26,2 g, âge 5 semaines), les souris albinos suisses (mâles, poids moyen 21,5 g, âge 5 à 6 semaines) et les souris BDFI (femelles, poids moyen 20,5 g, âge 5 à 6 semaines) en 4 groupes. Chaque groupe est composé de 6 souris et on injecte dans l'inté- rieur du péritoine de chaque souris des quantités prévues de SP en dissolution dans 0,2 ml de PBS. (5-c) CRésultat) Le résultat apparait dans le tableau 6. La valeur DL50 de SP semble être d'environ 3,5 mg/kg. Cette valeur semble faible (c'est-à-dire que la toxicité de SP est importante) mais elle est pratiquement la ?me que celle de la néocarzinostatine (constituée par 109 aminoacides), qui a cea été utilisée dans la pratique médicale en qualité agent carcinostatique. En outre, étant donné que la toxicité résiduelle de SP est faible, une fois que l'administration est arrêtée, l'état ultérieur des souris survivantes est tout à fait similaire à celui des souris normales, c'est-à-dire qu'on ne constate aucune toxicité chronique. En outre, en prenant en considération les découvertes indiquées, la dose appropriée de SP n'a pas besoin de dépasser 2,5 mg/kg et on préfère une valeur de 0,3 à 1,0 mg/kg par jour. Une telle dose peut être divisée en plusieurs prises pour une administration à long terme. TABLEAU 6 CF N01 (5) Albinos-Suisse (6) BDF (7) Quantité mg/kg Nombre Quantité mg/kg Nombre Quantité mg/kg Nombre réelle de poids de j réelle de poids de celle de poids de (mg) corporel souris (mg) corporel souris (mg) corporel souris mortes mortes mortes 0,065 2,48 0/6 0,044 2,05 0/6 0,040 1,95 0/6 0,85 3,24 2/6 0,066 3,07 3/6 0,060 2,93 1/6 0,105 4,01 4/6 0,088 4,09 5/6 0,080 3,90 3/6 0,125 4,7i 6/6 0,110 5,12 6/6 0,100 4,88 6/6 Notes : (5) DL50 : 3,63 mg/kg (6) DL50 : 3,15 mg/kg (7) DL50 : 3,74 mg/kg (6) Action de SP contre des cellules infectees par virus et des cellules non infectées. (6-a) ( Matières expérimentales) Cellules : Cellules A31 (clone dérivé de BALB/C de souris) Virus : Mo-MuLV (Virus de leucémie de souris, de la souche Molony) Milieu de culture : MEM d'aigle avec 5 % de sérum de foetus bovin. Agent : le même que dans (l-a) (mélange de SP1 et SP2) (6-b) (Procédé expérimental) On disperse 3 x 105 cellules individuelles A31 par litre, on infecte par addition d'une quantité suffisante de MuLV et on incube ensuite pendant 5 jours à 370 C. Après confirmation microscopique de l'apparition de l'inhibition de contact, on ajoute 10 og/ml de SP au milieu. Après 4 heures, on colore les cellules avec un rouge neutre (concentration finale 0,4 %), on disperse dans la trypsine et on calcule sur une table de calcul Türk-Bürker en considérant les cellules colorées comme vivantes par comparaison avec les cellules A31 non infectées. (6-c) Résultat Le résultat apparaît dans le tableau 7. TABLEAU 7 Nombre de cellules vivantes/plaquette* Cellules normales (-MuLV) 4,0 x 105 (témoin) Cellules 41 infectées par virus (+MuLV) 1,8 x 103 Note : X Le nombre de cellules vivantes après 4 heures avec traitement par SP. I1 ressort de ce tableau que SP attaque d'une façon très particulière les cellules infectées par virus et les tue. (7) Mesures de la quantité de virus. (7-a) (Matières expérimentales) Cellules : A31 (les mêmes que dans l-a) Cellules XC (cellules de tumeur de rat cancérisées par une souche en plaquettes de virus de sarcome de Raus. Virus : MuLV (le même que dans l-a) Milieu de culture : MEM d'aigle (le même que dans l-a) Agent : Le même que dans l-a. (7-b) (Procédé expérimental) On dilue le virus progressivement de 101 à 109 fois et on ajoute ensuite chaque produit de dilution sur les plaquettes respectives comportant 5 x 104 cellules individuelles A31. On effectue l'incubation pendant 5 heures. Après confirmation de l'inhibition de contact, on disperse les cellules avec de la trypsine et on divise ensuite en trois parties égales, puis on incube à 370 C pour provoquer une inhibition de contact. On répète les stades ci-dessus à deux reprises afin de provoquer l'infection totale de toutes les cellules. Aux plaquettes des cellules qui sont à l'état d'inhibition de contact qu'on obtient de cette façon, on ajoute lOJug/ml (concentration finale) de SP et on colore les cellules avec du rouge neutre après 24 heures afin de calculer le nombre de cellules vivantes comme dans l'essai 1. On effectue également un essai parallèle selon le procédé des plaquettes de XC. Pour effectuer cet essai, on immobilise les cellules qui sont en état d'inhibition de contact, soit par irradiation avec deslayons U.V. soit par addition de mitomycine C dans un rapport de 5 à lO,ug/ml à la plaquette. On ajoute ensuite 2 à 4 x 106 cellules individuelles de XC à chaque plaquette. Après 20 heures, on fixe les cellules avec du méthanol et on colore par le procédé de Gimsa, de manière à calculer le nombre de plaquettes formées. (7-c) (Résultat) Le résultat est indiqué dans le tableau 8. TABLEAU 8 Pas Degré de dilution 1 2 3 4 5 6 7 8 9 d'addition du virus (lu ) (n=) (Témoin) Nombre de cellules dans échantillon 7,2 5,5 0,75 24,3 43,0 42,5 49,0 43,8 46,0 31,5 traité par SP (xlO /plaquette) (A) Nombre de cellules dans échantillon 34,3 33,8 24,5 28,3 56,3 41,5 45,5 34,8 44,8 33,3 non raité au SP (x10 /plaquette) (B) A: B (A/B) 0,21 0,16 0,03 0,86 0,76 1,27 1,08 1,26 1,03 0,95 Procédé des plaquettes XC +++ +++ ++ + - - - - - - I1 ressort de ce tableau que dans les régions où le degré de dilution du virus est inférieur à lO 4, on constate une baisse soudaine du nombre des cellules vivantes. Ce fait indique la présence de cellules infectées par les virus qui sont hautement sensibles au SP.Plus précisément, dans ce cas, la quantité de virus avant dilution peut être présumée comme étant d'environ -4 1 x 10 /ml et cette présomption est en accord avec le résultat obtenu par le procédé des plaquettes XC. En outre, selon cette utilisation de SP, les techniques sont très simples car il suffit de 4 heures pour les mesures et, en outre, le résultat apparaît quantitativement. Ce procédé est donc beaucoup plus pratique que le procédé connu des plaquettes XC. La présente invention est fondée sur les découvertes indiquées et son essence est l'utilisation de SP comme agent carcinostatique et comme agent de détection et de détermination de virus. Quand on utilise ce SP comme agent carcinostatique, on peut l'employer sous forme unitaire de SP1 ou SP2 pur ou brut ou encore sous forme d'un mélange de ceux-ci. On peut réaliser l'administration de SP par injection, par exemple intraveineus-e, intramusculaire ou sous-cutanée ou par voie orale, par exemple sous forme d'une solution, de comprimés, de granules, de dragées, de pastilles, etc... ou bien encore par une administration percutanée, comme par exemple des suppositoires d'introduction dans le vagin ou dans l'anus, ou enfin sous forme d'un onguent dermique. Pour injection, il est évidemment préférable de purifier le Su autant qu'il est possible. Pour les compositions pharmaceutiques, on peut commodément utiliser des véhicules quelconques, des diluants, des liants, des épaississeurs et d'autres véhicules pharmaceutiquement acceptables, qu'on peut commodément utiliser pour préparer des produits pharmaceutiques, lorsqu'on effectue des préparations de SP. Des véhicules non toxiques tels que des graisses liquides conviennent pour préparer des suspensions de SP aux fins d'injection. On peut convertir SP en un sel d'addition d'acide en utilisant un acide physiologiquement acceptable tel que l'acide chlorhydrique, bromhydrique, maléfique, fumarique, lactique, citrique, malique, tartrique, succinique, glutarique, etc... D'une façon générale, le dosage approprié de SP est de 0,5 à 2,0 mg/kg de poids corporel par jour mas il est évident que la détermination de la dose n'est pas définitive et qu'on peut varier les dosages selon le procédé et/ou la forme d'administration. Autre part, si l'on utilise le SP comme agent de détection ou de détermination de virus, la concentration appropriée est d'environ 5 à 20,ug/ml du milieu de culture. Cependant, dans ce cas encore, la concentration optimale doît-tre- finalement fixée selon la nature du virus. Si la concentration est trop faible, il devient impossible de tuer entièrement les cellules infectées par le virus. Si la concentration est trop élevée, les cellules saines restantes (les cellules non infectées) vont être affectées de façon fatale. Outre les usages mentionnes, le-polypeptide selon l'invention est utilisable comme un éliminateur contre ce qu'on appelle les porteurs de virus qui sont présents à l'état latent, comme par exemple le virus de papillome de lapin, le virus de la grippe, le virus de la fièvre jaune, le virus de la rougeole, le virus de la grippe porcine provenant de Paragonlmus westermani et similaires. SP, qui est le constituant principal de l'agent selon l'invention forme une solution aqueuse stable. il est donc commode de l'utiliser sous forme d'une préparation aqueuse avec ou sans autres constituants comprenant un milieu synthétique pour la culture ou l'incubation du virus. Les figures 1 et2 décrites plus haut au sujet des essais 1 et 4' représentent respectivement (1) le comportement de SP contre chaque stade des cellules A31 et (2) l'effet de survie ainsi que l'effet contre une augmentation du poids corporel des souris cancérisées par multiplication des cellules de tumeur avec le sarcome 180 A (A étant la montée et la descente du poids moyen du corps et B étant le pourcentage de survie). Les figures 3 et 4 ont déjà été décrites. il va de soi qu'on peut apporter diverses modifications aux modes de mise en oeuvre qui ont été décrits, sans sortir pour cela du cadre de l'invention REVENDICATIONS 1. Polypeptide, caractérisé en ce qu'il répond à la formule dans laquelle les symboles "Ala", "Arg", "Asn", "Cys", "Gln", "Gly", "Leu", "Lys", "Phe", "Pro", "Ser", "Thr","Tyr" et "Val" désignent respectivement les restes des formes lévogyres d'alanine, d'arginine, d'asparagine, de 1/2 cystine, de glutamine, de glycine, de leucine, de lysine, de phénylalanine, de proline, de serine, de thréonine, de tyrosine et de valine ; dans laquelle les radicaux R1 à R5 désignent (1) respectivement les restes des L-aminoacides suivants : lysine, asparagine, leucine, thréonine et acide aspartique, ou (2) R1 représente l'arginine, R2 et R5 représentent la glycine, R3 représente l'isoleucine et R4 représente la sérine ; les symboles ~~~~~~~~ désignent les liaisons -S-S- ; et les chiffres arabes apparaissant dans la formule structurale à côté dé certains restes d'aminoacides indiquent la séquence de ces aminoacides à partir du N terminal. 2. Polypeptide, caractérisé en ce qu il répond à la formule dans laquelle tous les symboles et tous les chiffres ont la même signification que dans la revendication 1. 3. Polypeptide, caractérisé en ce qu' répondàla formule : dans laquelle tous les symboles et tous les chiffres ont la même signification que dans la revendication 1. 4. Agent carcinostatique, caractérisé en ce qu'il comprend à titre d'ingrédient actif, un polypeptide tel que défini dans la revendication 1, 2 ou 3 et un véhicule ou diluant pharmaceutiquement acceptable. 5. Procédé de détection et/ou de-détermination de virus, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser une composition comprenant un polypeptide tel que défini dans la revendication I, 2 ou 3 et un véhicule ou diluant pharmaceutiquement acceptable.