Brevet FR2472014A1 — publié le 19810626

-1 - La présente invention concerne un procédé pour la production d'ascorbate oxydase. L'ascorbate oxydase catalyse une réaction qui produit une mole d'acide déhydro-ascorbique et une mole d'eau à partir d'une mole d'acide ascorbique et de 1/2 mole d'oxygène, et est connue sous la classifica- tion d'enzyme EC 1. 10. 3. 3. L-Ascorbate: oxygène oxydoréductase, nom vulgaire: ascorbate oxydase. L'en- zyme a été préparée à partir de péricarpes du genre Cucurbita et du genre Cucumis ou son existence a été indiquée dans divers jeunes plants. (Voir Enzyme Handbook, pages 158 - 159, 1966, Asakura Publ. Co.). L'ascorbate oxydase du genre Cucurbita et du genre Cucumis a un poids moléculaire de 140 000 environ et existe principalement dans les péricarpes de ces plantes. Leur sarcocarpe a une activité qui est vrai- ment de l'ordre de traces et la préparation d'ascor- bate oxydase a été effectuée à partir des péricarpes séparés et le rendement était donc très faible. L'ascorbate oxydase dans les jeunes plants a été rapportée par une action oxydante de l'extrait de jeunes plants sur l'acide ascorbique, toutefois un iso- lement important et concret d'enzyme et une préparation d'ascorbate oxydase n'ont pas été confirmés. On a effectué un large examen des sources d'ascorbate oxydase de diverses origines comme les poi- vrons (Capsicum grossum), les oranges (Citrus sinensis), les patates (Solanum tuberosum) et les chénopodes (Chenopodium ambrosioides var. anthelminticum) et on n'a trouvé aucune activité d'ascorbate oxydase. On a trouvé que non seulement les péricarpes, mais aussi la -2- totalité de la plante de Sechium edule Sw., comme les carcocarpes, les tiges et les feuilles présentaient une forte activité d'ascorbate oxydase et on a extrait et purifié l'ascorbate oxydase à partir de tissus de Sechium edule Sw.. On a trouvé aussi que l'on effec- tuait efficacement l'extraction en utilisant un milieu alcalin aqueux. Un but de la présente invention est de four- nir un procédé pour la production d'ascorbate oxydase caractérisé en ce que cette enzyme est extraite de tis- sus de plantes appartenant au genre Sechium Un exemple de plante appartenant au genre Sechium dans la présente invention est Sechium edule Sw. (= Chayota edulis Jacq.) (ouvrage illustré de Malino sur la flore japonaise, 1961, page 612, Hokuryukan Publ. Co.). L'ascorbate oxydase est contenue dans la totalité des tissus de la plante Sechium edule Sw., comme les péricarpes, les sarcocarpes, les tiges et les feuilles à raison d'au moins 10 U (unités)/g, habituellement de 10 à 50 U/g dans les tissus des sarcocarpes et des feuilles et de 20 à 30 U/g dans les tissusdes tiges. Ces tissus sont utilisés isolément ou en combinaison. Des modes d'exécution de l'extraction d'as- corbate oxydase à partir de Sechium edule Sw. sont les suivants. Des tissus de Sechium edule Sw. lavés à l'eau sont déchiquetés (à des grosseurs de 1 cm3 environ). Les tissus déchiquetés sont plongés dans de l'acétone aqueuse comme une solution aqueuse à 30-50 % d'acétone pendant toute une nuit pour élimination des constituants inutiles, et homogénéisés pour extraction au moyen d'un solvant d'extraction. Ou en variante, les tissus déchi- quetés sont homogénéisés sans immersion dans l'acétone aqueuse et soumis à l'extraction par un solvant d'ex- 247201 4 -3- traction. Un exeL:ple de solvant d'extraction est un milieu aqueux tel qu'une solution tampon. Un milieu al- calin aqueux, de préférence un milieu alcalin de pH 11 est utilisé avantageusement pour l'extraction de ma- nière à éviter la précipitation d'ascorbate oxydase causée par des constituants inutiles. L'extraction par ce milieu alcalin fournit l'effet avantageux d'extrac- tion de l'enzyme. L'extrait est soumis à une centrifugation, à 1 une concentration sous vide, à un relargage par le sul- fate d'ammonium et à un fractionnement au solvant par l'acétone pour préparer l'ascorbate oxydase brute. Une purification supplémentaire peut tre ef- fectuée par dialyse, chromatographie par échange d'ions, chromatographie d'adsorption et filtration à travers un gel. Les propriétés biochimiques de l'ascorbate oxydase selon la présente invention ainsi obtenue sont les suivantes. (1) Action enzymatique: L'enzyme catalyse une réaction qui produit une mole d'acide déhydro-ascorbique et une mole d'eau à partir d'une mole d'acide ascorbique et de 1/2 mole d'oxygène. Acide L-ascorbique + Acide déhydro-ascorbique + 1/2 02 H20 (2) Spécificité du substrat: L'enzyme a une activité spécifique pour l'a- cide ascorbique comme suit: Substrat: Activité relative (%): Acide Lascorbique 100 Glycérol 0 Glucose O Galactose 0 Maltose 0 Ethylène-glycol 0 -4- () r-H optil.'al: Comme repr'senté sur la firure 1, le p- opti- mal est voisin du. pl 7. bur la fiL-ure I: O-0: tarmon dinéthjllglutarateIlaOH à: tampon phczphate C: tampon tris-MC1 (4) Valeur de Em:,3 M. (5) Point iso-électrique: voisin du pC 6,3. (6) Poids moléculaire: environ 10% C"C (fé- termin' au moyen de Sephacryl S-200). (7) Stabilité au pH: Corne représenté sur la igure 2, stable e ur pH de 5, 7 à 7,5. Sur la figure 2: o-O: tampon diméthylglutarate-TaOH e-e: tampon phosphate El]-U: tampon glycine-'..a0H A&-A: tampon acétate -: tampon Tris-HCl, à 37 C pendant 60 minutes.- 2C (8) Température optimale: de l'ordre de 4C C. (9) Dénaturation par le pH et la température: Rapidement dénaturée audessous du pl 4,5 et au-dessus de 500C. (1C) Effet d'ions métalliques et de EDÀA: -5- Additifs Concentration (m) Activité relative (%) Né ant - 100 NaCl 10 88,4 KCl 10 91,9 LiCi 10 84,9 I'NH4C1 10 91,9 1.nCl2 10 87,2 CaCl2 10 86,0 BaC12 10 77,9 u12 CoC12 10 - CuC12 1 X 10-2 - ZnCl2 10 17,4 MglC12 10 36,0 NaITN3 10 12,8 EDTA 0,1 96,5 I 98,8 107 (11) Détermination de l'activité: De l'acide ascorbique 2 mM dans du tampon diméthylglutarate-I!TaOH (pH 6,5, 1,0 cm3) est introduit dans une cellule de 2 cm3. On ajoute l'enzyme (20 cm3) à 37 C et la quantité d'oxygène consommée est mesurée par un instrument Galvanic de mesure de l'oxygène dissous (Ishikawa LVfg. Co.). Une unité (1 unité, I U) est définie comme la quantité d'enzyme qui fixe 0,5/ mole d'oxygène par minute à 37 C. L'enzyme ascorbate oxydase selon la présente invention peut àtre utilisée avantageusement pour éliminer l'erreur causée par l'acide ascorbique dans un échantillon pour détermination clinique utilisant l'oxydase ou pour détermination quantitative de l'acide ascorbique. 2472014. -6- Les exemples suivants illustrent la présente invention, mais ne doivent pas 6tre considérés comme la limitant. Exemple 1 Des fruits lavés de Sechium edule Sw (1]kg) sont déchiquetés en fragments de 1 cm3 et plongés usn de l'acétone aqueuse à 50 % pendant toute une nuit. Après filtration, on ajoute les blocs dans du tampon tris-H1Ol 20 mE (pH 8,5, 10 litres) et on les hompge- néise au moyen d'un mélangeur Maring (15 000 tpm pen- dant 20 minutes), puis on effectue une filtration à travers de la gaze. On centrifuge le filtrat à 5000 tpm pendant 10 minutes pour obtenir le liquide surnageant (ascorbate oxydase: 256 CG000 U). On con- centre le liquide surnageant à 1/10 de son volume C sous pression réduite de 20 mm Hg et on le cen- trifuge pour séparer les matières insolubles. On fac- tionne le liquide surnageant avec du sulfate d'ammlniu pour obtenir une fraction saturée à 0,23 - 0,52. On dissout le précipité dans du tampon Tris-HC1 20 mM (500 cm3, pH 8,5) et on centrifuge pour séparer les matières insolubles. On ajoute un volume égal d'acetnme dans le liquide surnageant. On dissout le précipite dans du tampon tris-HCl 20 mM (pH 8,5, 400 cm3) et les matières insolubles sont éliminées par centrifugation. La solution surnageante est dialysée contre du tampoei Tris-HCl 20 mI (pH 8,5) pendant 12 heures et on chmre le dialysat sur une colonne de DEAEcellulose (4 x cm), mise en équilibre avec du tampon Tris-fECl 20 m (pH 8, 5), lavée avec du tampon Tris-HClI 20 mM (pE S,5, 1,5 litre). La colonne est soumise à une élution à gra- dient linéaire par une solution O - 0,5 M de K1O. Las- corbate oxydase est éluée avec une concentration 1oe8 - 0,12 M de KCl. On recueille les fractions actives et on les concentre par filtration à travers une membrane -7- (Amicon Co.). On soumet le concentré à une chromatogia- phie sur une colonne de Sephacryl S-200 (5 x 100 cm) et on recueille les fractions actives éluées qu'on lyo- philise pour obtenir une poudre d'ascorbate ox:ydase (activité spcifique 920 U/mg, 56,2 mg, rendement: 13 %5). Exemple 2 De-- sarcocarpes, péricarpes, tioes et feuilles (avec pétiole) déchiquetés de Sechium edule Sw. (200 g chacun) sont ajoutés dans du tampon Tris-HC1 20 mMI (20C cm3, pn ú,5) et homogénéisés au moyen d'un mélan- geur W;iaring (15 GOC tpm pendant 10 minutes). On filtre l'hom.ogénat - travers de la gaze et on détermine l'ac- tivité d'ascorDate oxydase du filtrat. Les activités d'ascorbate oxydase qu'on trouve sont les suivantes: Sarcocarpe: 1,7 U/cm3 Péricarpe: 19,2 U/cm3 2ige: 14,6 U/,cm Feuille (avec pétiole) 13,3 U/cm3. Exemple comparatif On détermine l'activité d'ascorbate oxydase en opérant de la mg::e manière que dans l'exemple 2. Courge: sarcocarpe: - péricarpe avec sarcocarpe: 14,8 U/cm3. Poivron: - sarcocarpe, péricarpe: - Patate: sarcocarpe, péricarpe: - Carotte: péricarpe: 0,43 U/cm3 sarcocarpe: 0,21 U/cm3 Plaquemine: péricarpe: - -8- sarcocarpe: 0,65 U/cm3 (-: non détectable) Exemple 3 Un mélange (10 kg) de sarcocarpes, de péri- carpes, de feuilles et de tiges de Sechium edule Sw. est déchiqueté et plongé dans de l'acétone aqueuse à % toute une nuit. Après élimination de l'acétone aqueuse, le mélange est lavé à l'eau. Le mélange lavé est ajouté dans une solution 20 m de carbonate de sodium (pHi 11, 10 litres) et homogénéisé au moyen d'un mélangeur V aring. Le mélange homogénéisé est filtré à travers de la gaze et on centrifuge le filtrat à 5000 tpm pendant 10 minutes. On traite le liquide sur- nageant de la même manière que dans l'exemple I pour obtenir de la poudre d'ascorbate oxydase (activité spé- cifique: 940 //mg). Brève explication des dessins: Fig. 1: pH optimal de l'ascorbate oxydase. Fig. 2: stabilité au pH de l'ascorbate oxy- dase. 247201- _c,_ - REEVSiDICÀTI0llS - I - Un procédé pour la production d'ascorbate oxydase, caractérisé en ce qu'on extrait l'ascorbate oxydase du tissu de plantes appartenant au genre Sechium edule Sw. au moyen d'un solvant d'extraction et on purifie l'enzyme ainsi extraite. 2 - Un procédé selon la revendication 1, ca- ractérisé en ce que le solvant d'extraction est un mi- lieu alcalin aquoux. 3 - Un procédé selon l'une des revendications I ou 2, caractérisé en ce que l'ascorbate oxydase a les propriétés biochimiques suivantes: Action enzymatique: catalyse une réaction qui produit une mole d'acide déhydro-ascorbique et une mole d'eau à partir d'une mole d'acide ascorbique et de 1/2 mole d'oxygène. Spécificité du substrat: action spécifique pour l'acide L-ascorbique; pas d'action pour le glycé- rol, le glucose, le galactose, le maltose et l'éthylène- glycol. pH optimal: pH 7 environ. Valeur de Km: 0,3 mM. Point iso-électrique: pH 6,5 environ. Poids moléculaire: 100 0C0 environ. Stabilité du pH: pH 5,7 - 7,5. Dénaturation par pH et température: rapide- ment dénaturée au-dessous du pH 4,5 et au-dessus de C. 4 - Ascorbate oxydase obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications I à 3.