Brevet FR2462165A2 — publié le 19810213

FR 2462165 A2 19810213 FR 7919432 A 19790727 La présente invention concerne un perfectionnement au procédé décrit dans la demande de brevet principal 73 42 981 déposée le 3 Décembre 1973. La présente invention réalisée au Centre d'immunologie et de Biologie Pierre FABRE concerne essentiellement un perfectionnement au procédé d'obtention d'un activateur tissulaire du plasminogène décrit dans la demande de brevet principal. I1 faut rappeler que la demande principale concerne un nouvel activateur du plasminogène extrait d'organes animaux et un procédé pour la préparation dudit activateur ainsi que l'application de cet activateur en tant que médicament. La demanderesse a mis au point un nouveau procédé pour la préparation de cet activateur du plasminogène faisant appel à une adsorption sélective sur fibrine. La demanderesse a en effet découvert que la fibrine possède la propriété de fixer sélectivement cet activateur du plasminogène au milieu d'autres protéines inactives et d'en réaliser ainsi très rapidement la séparation. Ce procédé présente l'avantage de pouvoir être réalisé à grande échelle et ainsi d'obtenir un activateur du plasminogènf possédant une activité spécifique sensiblement supérieure au produit faisant l'objet de la demande principale. Ledit activateur peut d'ailleurs être associé à un polysaccharide sulfaté comme cela est décrit dans le certificat d'addition NO 75 13 932 déposé le 5 Mai 1975 et bénéficier de la potentialisation qui résulte de cette association. La présente invention concerne donc un procédé de séparation d'un activateur du plasminogène selon le brevet principal caractérisé en ce qu'il comporte au moins les étapes: - d'adsorption sélective dudit activateur par de la fibrine ; - de séparation de la fibrine portant l'activateur adsorbé et d'solution de l'activateur à partir de la fibrine portant l'ac tivateur adsorbé. Dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon la présente invention l'adsorption sélective est effectuée à partir d'une phase aqueuse contenant l'activateur du plasminogène à un pH compris entre 7 et 9. De même, dans un mode de mise en oeuvre préféré l'élution de l'activateur du plasminogène à partir de la fibrine est effectuée par une solution aqueuse à un pH compris entre 3 et 5 ; de préférence à l'aide d'un tampon acétate de potassium - acide acétique à un pH voisin de 4,2. Cette élution est effectuée de préférence à froid. Bien que l'on puisse envisager d'autres modes de mise en oeuvre de ce procédé on préfère traiter une solution clarifiée d'activateur du plasminogène en y ajoutant de la fibrine, le pH de cette solution aqueuse étant tamponné à pH 7,4 à l'aide d'un tampon phosphate. Dans ces conditions, la fibrine portant l'activateur du plas minogène adsorbé pourra être séparée par précipitation et de préférence par centrifugation. Bien entendu, la fibrine portant l'activateur du plasminogène adsorbé pourra si cela est nécessaire être lavée plusieurs fois à l'aide d'une solution aqueuse, en particulier d'un tampon phosphate pH 7,4 par exemple à froid afin d'éliminer toutes les protéines inactives. La phase aqueuse à traiter est de préférence obtenue à partir d'une bouillie d'organes broyés et congelés dans un tampon acétate de potassium - acide acétique à pH 4,2. Dans ces conditions, on obtient l'extrait brut contenant l'activateur du plasminogène dans la phase aqueuse, les différents résidus pouvant être éliminés par passage sur un séparateur et/ou par centrifugation. Afin de parfaire ce début de traitement la solution aqueuse peut être traitée par du sulfate d'ammonium cristallisé par exemple àune concentration de l'ordre de 250 g/l afin de recueillir un précipité concentré en activateur du plasminogène lequel après reprise dans le tampon phosphate à pH 7,4 constituera la phase à traiter par les étapes décrites précédemment. Enfin, l'éluat obtenu après séparation de la fibrine pourra être concentré par tout moyen approprié en particulier on pourra en séparer les ions acétate par dialyse contre un tampon phosphate. D'autres caractéristiques du procédé selon la présente invention pourront être déterminés à partir de l'exemple de mise en oeuvre qui sera décrit ci-après. Comme cela a été décrit dans le brevet principal les organes animaux utilisés sont de préférence choisis parmi les poumons, coeurs eut reins de porcs veaus boeufS chevaux, agneaux,moutons, ou les ovaires ou matrices de porcins, bovins et ovins. On préfère tout particulièrement utiliser les ovaires de porcins. Pour ce qui concerne la fibrine utilisée, elle peut être préparée par exemple à partir du sang d'animaux tels que le porc, le boeuf, le cheval ou le mouton et être soumise à plusieurs lavages préalables par de l'eau et-par le tampon phosphate puis séchée . Cette fibrine est de préférence conservée à basse température sous emballage hermétique. EXEMPLE On prélève à l'abattoir des ovaires de truie qui sont immédiatement congelés à - 400C et qui sont broyés à cette température. Ce broyat d'organes congelés constitue la matière première servant à la préparation de l'activateur -tis- sulaire selon la présente invention. A 100 kg d'organes broyés et congelés on ajoute 300 1 d'un tampon acétate de potassium - acide acétique à pH 4,2 que l'on extrait pendant 4 heures à + 40C. On élimine le résidu d'organes par passage dans un séparateur solide-liquide en continu, puis on clarifie la phase surnageante par centrifugation continue à 15 000 tours/ minute à + 40C. L'extrait aqueux ainsi clarifié est recueilli puis on lui ajoute du sulfate d'ammonium cristallisé à raison de 250 g/l. Après dissolution complète du sulfate d'ammonium on abandonne le mélange pendant environ 12 heures à froid afin de laisser se développer un précipité. Le précipité brut est recueilli par centrifugation continue à 15 000 tours/ minute à + 40C. Le surnageant est éliminé. Le précipité brut qui contient l'activité est repris par 200 1. de tampon phosphate à pH 7,4 à froid pendant 4 heures, puis le mélange obtenu est clarifié par centrifugation à 15 000 tours/minute. La solution clarifiée est alors additionnée de 2,5 kg de fibrine de porc lavée et séchée, la suspension est maintenue sous agitation pendant une nuit à + 40C pour permettre à l'activateur tissulaire du plasminogène de se fixer spécifiquement sur la fibrine, à l'exclusion des protéines inactives. Le mélange ainsi obtenu est centrifugé en continu à 15 000 tours/minute afin de séparer la fibrine portant l'activateur du plasminogene adsorbé, le surnageant de fixation ne contenant que des protéines inactives est éliminé. On lave ensuite la fibrine par 25 1. de tampon phosphate à pH 7,4 à froid puis centrifugation. Le précipité étant de nouveau soumis à un lavage par 50 1. de tampon phosphate à pH 7,4 à froid, puis à un troisième lavage par 50 1. de tampon phosphate à pH 7,4 à froid effectué pendant une nuit à + 40C sous agitation lente. La fibrine recueillie par centrifugation continue est alors rincée par 25 1. d'eau distillée et à nouveau centrifugée. Pour éluer l'activité fixée on met la fibrine en suspension dans 20 1. de tampon acétate de potassium - acide acétique pH 4,2 à froid sous agitation pendant 3 heures. L'éluat est séparé de la fibrine par centrifugation continue puis clarifiée par filtration sur membrane. On obtient ainsi une solution contenant l'activateur du plasminogène. Cette solution peut être concentre au 1/5ème du volume initial par une ultrafiltration sur inembrane de type AMICON UM-10 à basse température. On obtient ainsi environ 4 1. de concentrat qui est neutralisé à pH 7,4 par addition de soude, puis soumis à une dialyse 18 heures contre un tampon phosphate pH 7,4, pour éliminer les ions acétate, à froid. La solution dialysée est alors stérilisée par filtration sur membrane de 02ji. Un échantillon de filtrat stérile est prélevé pour contrôler la teneur en protéines par la méthode de LOWRY Les protéines sont dosées selon la méthode de LOWRY (O.H.), ROSEBROUGH (N.J.), FARR (A.L.) and RANDALL (R.J.), J. Biol. Chem. (1951) et l'activité de la solution est ensuite répartie en flacons stériles, et lyophilisée stérilement L'activité est déterminée par la méthode de mesure du temps de lyse d'un caillot standard dont le principe est le suivant: - Un caillot est formé avec du fibrinogène riche en plasminogène et en présence de l'activateur tissulaire qui se trouve ainsi réparti dans la masse de la fibrine. L'action de l'activateur sur le plasminogène provoque la libération de plasmine qui a son tour détruit la fibrine et provoque la lyse du caillot. Le temps de lyse est proportionnel à la quantité d'activateur présent et cette méthode est étalonnée avec une préparation standard d'Urokinase. Une relation linéaire entre le temps de lyse et l'activité existe entre 10 minutes et 16 minutes dans les conditions opératoires utilisées. La solution obtenue est ensuite conditionnée stérilement et soumise à divers contrôles de stérilité d'activité d'innocuité. Après lyophylisation le produit est stocké à + 40C où il conserve son activité pendant plusieurs mois. Dans ces conditions on obtient un produit titrant entre 20.106 et 50.106 unités pour 100 kg d'organes frais d'un produit titrant entre 15 000 et 20 000 unités par mg de protéines. Les propriétés pharmacologiques de l'activateur tissulaire obtenu par ce procédé sont identiques à celles décrites dans la demande principale. Toutefois le degré de purification est supérieur et permet d'obtenir une activité spécifique comprise entre 15 000 et 20 000 unités par mg de protéines comme cela a été dit précédemment. De plus, la grande affinité pour la fibrine de l'activateur du plasminogène ainsi isolé lui confère un très grand intérêt sur le plan thérapeutique pour le traitement des thromboses. C'est pourquoi la présente invention concerne oralement un activateur du plasminogène obtenu par le procédé de la pré- sente invention. et son application à titre de médicament. REVENDICATIONS 1) Procédé de séparation d'un acLivateur du plasmi nogane selon le brevet principal caractérisé en ce que elle comporte au moins les étapes - d'adsorption sélective dudit activateur par de la fibrine - de separation de la fibrine portant l'activateur adsorbé et d'élution de l'activateur à partir de la fibrine portant l'activateur adsorbé. 2) Procédé de séparation d'un activateur du plasminogène selon la revendication 1, caractérise en ce que l'adsorption sélective de l'activateur est conduite en solution aqueuse à un pH compris entre 7 et 9. 3) Procédé de séparation d'un activateur du plasminogène selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'adsorption sélective est conduite en phase aqueuse en présence d'un tampon phosphate pi 7,4. 4) Procédé de séparation d'un activateur du plasminogène selon 1'une des revendications 1 à 3, earactérisé en ce que la séparation de la fibrine est effectuée par précipitation. 5) Procédé de séparation d'un activateur du plasminogene selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que solution de l'activateur est effectuée par mise en suspension de la fibrine portant l'activateur adsorbé avec une phase aqueuse à pH compris entre 3 et 5. 6) Procédé de séparation d'un activateur du plasminogène selon la revendication 5 e caractérisé en ce que l'élution de l'activateur à partir de la fibrine est effectuée par mise en suspension de la fibrine portant l'activateur adsorbé dans un tampon acétate de potassium - acide acétique a pH-4,2. 7) Procédé de séparation d'un activateur du plasminogène selon l'une des revendications 9 à 6, caractérisé en ceque la separation est effectuée à froid. 8) Activateur du plasminogène obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'unes des revendications 1 à 7, 9) A titre de médicament nouveau un activateur du plasminogene selon la revendication 8.