Brevet FR2471408A1 — publié le 19810619

Procéda pour produire de l'acide L-glutamique par fermentation. La présente invention concerne un procédé pour produire de l'acide L-glutamique par fermentation. On produit l'acide L-glutamique, dont on utilise les sels monosodiques comme agents d'assaisonnement, selon des procédés de fermentation qui utilisent des micro-organismes appartenant aux genres Brevibacterium ou Corynebacterium. La demanderesse a réussi à obtenir, à partir de microorganismes connus producteurs d'acide L-glutamique appartenant aux genres Brevibacterium et Corynebactérium, des mutants qui résistent à l'acide glutamique ou aux analogues de l'acide glutamique et ont un pouvoir de production de l'acide L-glutamique supérieur à celui des micro-organismes connus producteurs d'acide L-glutamique. L'invention concerne un procédé pour produire de l'acide L-glutamique par fermentation, qui consiste à cultiver en adrobiose, dans un milieu aqueux, un mutant provenant d'un microorganisme producteur d'acide L-glutamique appartenant aux genres Brevibacterium ou Corynebacterium, ce mutant résistant à l'acide glutamique ou aux analogues de l'acide glutamique et à recueillir l'acide L-glutamique accumulé dans le milieu aqueux. On peut citer comme mutants utiles dans le procéda de l'invention : Brevibacterium lactofermentum AJ 11292 (FERM-P 4585, NRRLB-12035) (résistant au glutamate d'ammonium), Brevibacterium lactofermentum AJ 11293 (FERM-P 4586, NRRLfl-12036) (résistant à l'acide glutamique-&gamma;-monohydroxamate), Brevibacterium flavum AJ 11294 (FERM-P 4587, NRItLB-12037) (résistant au glutamate d'ammonium), Brevibacterium flavum AJ 11295 (FERM-P 4588, NRRL-B 12038) (résistant à l'acide &alpha;;-méthylglutamique) Corynebacterium acetoacidophilum AJ 11296 (FERM-P 4581, NRItL-B 12039) (résistant au glutamate d'amnonium), Corynebacterium acetoacidophilum AJ 11297 (FERM-P 4582, NRRL-B 12040) (résistant à l'acide glutamique-y-monohydroxamate), Corynebacterium glutamicum AJ 11298 (FERM-P 4583, NRItL-B 12041) (résistant au glutamate d'ammonium), Corynebacterium glutamicum AJ 11299 (FEEM-P 4584 RL-B 12042) (résistant à l'acide a-mSthylglutamique). Les numéros FERM-P sont les numéros d'enregistrement è l'institut de Recherches sur les Fermentations, Service des Sciences et Technologies Industrielles, Ministère du Commerce International et de l'Industrie, 3-go, l-ban, l-chome, Yatabecho-higashi, Tsukuba-gun, Ibaragi-ken, Japon. Les numéros NRRL -sont les numéros d'admission à l'Agricultural Research, North Central Region, Northern Regional Research Centrer, 1815 North University Street, Peoria Illinois 61604, Etats-Unis d'Amérique. Ces mutants dérivent respectivement de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Brevibacterium flavum ATCC 14067 et Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. On peut également utiliser comme souches parentes pour produire les mutants utiles dans l'invention : Brevibacterium divaricatum NRRLB-2311, Brevibacterium saccharoliticum ATCC 14066, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354 et d'autres bactéries productrices d'acide L-glutamique de type Coryne. Lorsque le mutant présente d'autres caractéristiques biologiques que l'on sait être utiles pour la production d'acide L-glutamique, telles que la sensibilité à l'acide N-palmitoylglutamique, le rendement en acide L-glutamique peut être encore accru. Les procédés d'obtention de la mutation sont classiques et sont, par exemple, l'exposition de la souche parente à la lumière ultraviolette, à des rayons X ou à des agents chimiques mutagènes. Par exemple, on expose les souches parentes Bl'action de la N-nitro N'-méthyl N-nitrosoguanidine à 30CC pendant 20 min. On peut, pour séparer les souches mutantes utiles dans l'invention, des souches parentes exposées, isoler les souches qui peuvent se développer dans un milieu contenant des quantités d'acide glutamique ou d'analogues de l'acide glutamique inhibant le développement des souches parentes. Les analogues de l'acide glutamique inhibent le développement des souches parentes des mutants utilisés dans l'inven tion, mais cette inhibition est supprimée par l'acide L-glutamique et ces analogues sont, par exemple, l'acide a-méthylglutsmique, l'acide -hydroxyglutamique, l'acide glutamique-Y-monohydroxamate, l'acide a-aminophosphono-4 butyrique, l'ester y-méthylique de l'acide glutamique, l'ester diméthylique de l'acide glutamique, l'ester y-éthylique de l'acide glutamique, l'ester di-tert-butylique de l'acide glutamique et l'ester diéthylique de l'acide glutamique. Les mutants qui résistent à l'acide glutamique ou aux analogues de l'acide glutamique peuvent se développer dans un milieu gélosé contenant une quantité d'analogues de l'acide glutamique inhibant le développement des souches parentes. Le degré de résistance des mutants précités à l'acide glutamique et aux analogues de l'acide glutamique figure dans les tableaux I et il ci-aprEs. TABLEAU Glutamate d'ammonium ATCC AJ ATCC AJ ATCC AJ ATCC AJ g/dl en acide glu- 13869 11292 14067 11294 13870 11296 13032 11298 tamique O 100 100 100 100 100 100 100 100 1 105 105 95 101 98 99 101 102 5 102 110 98 97 96 97 98 99 10 85 102 65 95 68 96 95 96 15 1 50 95 40 68 52 96 77 95 20 10 60 20 30 20 58 52 85 TABLEAU II Acide L-glu tamique -r- ATCC AJ ATCC ÂJ ATCC AJ ATCC AJ monohydroxa mate pg/Xl 13869 11293 14067 11295 13870 11297 13032 11299 0 100 100 100 100 100 100 100 100 10 99- 99 72 98 95 99 96 98 20 85 97 52 95 90 98 92 97 50 70 96 45 93 72 95 72 95 100 55 60 30 65 54 88 55 88 1000 20 50 15 55 36 60 43 55 On détermine la résistance des mutants de la. façon suivante. On cultive préalablement-les micro-organismes sur une gélose inclinée contenant 1 g/dl de peptone, 1 g/dl d'extrait de levure, 0,5 g/dl de chlorure de sodium et 2 g/dl de gélose à pH 7,0, à 300C pendant 24 h, puis on en ensemence des milieux aqueux contentant, par décilitre, 0,5 g de glucose, 0,15 g d'urée, 0,15 g de sulfate d'ammonium, 0,3 g de phosphate monopotassique, 0,1 g de phosphate dipotassique, 0,01 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,1 mg de chlorure de calcium dihydraté, 1011g de chlorhydrate de thiamine, 3pg de biotine, 0,44 mg de borate de sodium décahydraté, 4,85 mg de chlorure ferrique hexahydrate, 1,95 mg de sulfate cuivrique pentahydraté, 0,185 mg d'heptamolybdate d'ammonium tétrahydraté, 44 mg de sulfate de zinc heptahydraté, 0,36 mg de chlorure manganeux tétrahydraté et la quantité de L-glutamate d'ammonium ou d'acide L-glutamique-7-monohydroxamate indiquée dans les tableaux I et li ci-dessus. Après 24 h de culture à 300C, on détermine la croissance par mesure de la densité optique du milieu aqueux. Les milieux de fermentation utilisés dans l'invention sont des milieux classiques contenant des sources de carbone, des sources d'azote, des sels minéraux et, lorsqu'il est nécessaire, d'autres substances nutritives organiques secondaires telles que des vitamines et des aminoacides. Les sources de carbone utilisées dans la pratique de l'invention sont des sources classiques, telles que les hydrates de carbone (saccharose, glucose, mélasse ou hydrolysat d'amidon), l'acide acétique ou l'éthanol. On effectue la culture dans les milieux de fermentation de façon classique. Le bouillon de fermentation obtenu contient des quantités d'acide L-glutamique supérieures à celles accumulées lorsqu'on utilise diverses bactéries connues productrices d'acide L-glutamique. On peut récupérer l'acide L-glutamique contenu dans le bouillon de fermentation selon divers procédés tels que la préci pitation au point isoélectrique. L'invention est utilisée par les exemples non limi- tatifs suivants. EXEMPLE 1 On place, dans des flacons à agitation de 500 ml, des portions de 30 ml d'un milieu de fermentation contenant, par millilitre, 100 mg de sucre de mélasse de canne à sucre, 1 mg de phosphate monopotassique, 1 mg de sulfate de magnésium heptahydraté et du chlorhydrate de thiamine, à pH 7,0 et on chauffe. On ensemence les milieux de fermentation avec les micro-organismes indiqués dans le tableau iii ci-après et on cultive à 31,50C en agitant. Pendant la culture, on introduit,dans les milieux de fermentation, une petite quantité de solution d'urée (contenant 400 mg/ml d'urée) pour maintenir le pH du milieu de fermentation entre 6,5 et 8,0. Lorsque la densité optique à 562 nm d'une dilution au 1/26 des milieux de fermentation atteint 0,3, on ajoute aux milieux 3 mg/ml de polyoxyéthyldnesorbitannemonopalmitate (PESP). Après 36 h de culture, les quantités d'acide L-glutamique indiquées dans le tableau III ci-après sont accumulées. TABLEAU III Micro- AJ ATCC AJ ATCC AJ ATCC ATCC AJ organismes 13869 11292 14067 11294 13870 11296 13032 11298 étudiés Rendement en acide L-glu- 55 58 49 52 5o 52 51 53 tamique en en poids) EXEMPLE 2 On prépare un milieu aqueux contentant, par millilitre, 50 mg de sucre de mélasse de betterave, 1,0 mg de phosphate monopotassique, 1,0 mg de sulfate de magnésium heptahydraté, 10 g de sulfate ferreux heptahydraté, 8g de sulfate manganeux tétrahydraté et l/ug de chlorhydrate de thiamine, on ajuste le pH à 7 > 0 et on introduit des portions de 300 ml de ce milieu dans des fermenteurs de 1 litre et on chauffe pour stériliser. On ensemence les milieux avec les micro-organismes indiqués dans le tableau IV ci-après et on cultive à 31,5 C en agitant et en aérant. Pendant la culture, on introduit de l'ammoniac gazeux dans les milieux pour maintenir leur pH à 7,8. Lorsque la densité optique à 562 nm d'une dilution au 1/26 des milieux de culture atteint 0,3, on ajoute aux milieux 0,5 mg/ml de PESP. Après 24 h de culture, on détermine l'acide L-glutamique accumulé dans le liquide de culture. Les résultats figurent dans le tableau IV. TABLEAU iv Nicro-organismes étudiés Rendement en acide L-glutamique AJ 11293 65% ATCC 13869 60% AJ 11297 54% ATCC 13870 507. EXEMPLE 3 On introduit des portions de 30 mî d'un milieu de culture aqueux contenant, par millilitre, 36 mg de glucose, 2 mg d'urée, 1 ng de phosphate monopotassique, 0,4 mg de sulfate de magnésium heptahydraté, 10,ug de sulfate ferreux heptahydraté, 8,ug de sulfate manganeux tétrahydraté, 5P1 d'hydrolysa t de protéine de soja, O,1/Cig de chlorhydrate de thiamine et 0,005 g de biotine, dans des flacons à agitation de 500 mî et on chauffe à 115 C pendant 10 min. On ensemence le milieu de culture avec Brevibacterium îactofermentum AJ 11292 ou la forme parente ATCC 13869 et on cultive à 31,50C en agitant. Pendant la culture, on introduit dans le milieu une petite portion de solution d'urée (d 450 mg/ml) pour maintenir le pH du milieu entre 6,5 et 8,0. Lorsque la densité optique à 562 nm d'une dilution au 1/26 du milieu de culture atteint 0,3, on ajoute 3 mg/ml de PESP au milieu de culture. La souche M 11292 produit 19,8 mg/dl d'acide L-glutamique dans le liquide de culture et la souche ATCC 13869 en produit 18,7 mg/dl. EXEMPLE 4 On introduit dans des flacons h agitation de 500 ml des portions de 30 ml d'un milieu de culture contenant, par millilitre, 100 mg de sucre brut, 1 mg de phosphate monopotassique, 0,4 mg de sulfate de magnésium heptahydraté, lOpg de sulfate ferreux heptahydraté, 8,ug de sulfate manganeux tétrahydraté, 5 mg d'urée et 5/ul d'hydrolysat acide de protéine de soja et on chauffe pour stériliser. On ensemence le milieu de culture avec la souche AJ 11299 ou la souche ATCC 13032 et on cultive à 31,5 C en agitant. Pendant la culture, on introduit une petite portion d'une solution à 400 mg/ml d'urée pour maintenir le pH du milieu entre 6,5 et 8,0. Lorsque la densité optique à 562 nm d'une dilution au 1/26 du milieu atteint 0,30, on ajoute au milieu 3 mg/ml de PESP. Après 30 h de culture, la souche AJ 11299 a produit 50 mg/ml d'acide L-glutamique dans le milieu de culture et la souche ATCC 13032 en a produit 48 mg/ml. EXEMPLE 5 On cultive BrevibacteriumlactofermentumM 11292 dans 300 ml d'un milieu de culture d'ensemencement suivant contenu dans un fermenteur de 1 litre. Milieu de culture d'ensemencement glucose 5,0 g/dl KH2PO4 0,1 g/dl MgSO4,7R2O 40 mg/dl FeSO4,7H2O 1,0 mg/dl MnSO4,4H2O 1,0 mg/dl hydrolysat de protéine de soja 24 mg/dl (en azote total) urée 0,2 g/dl biotine 30/1/dl thiamine,HCl 20 g/dl On introduit 300 ml du milieu de culture suivant dans un fermenteur de 1 litre et on chauffe pour stériliser : mélasse de canne à sucre 6,0 g/dl (en sucre) RH2P04 0,2 g/dl MgSO4,7H2O 80 mg/dl FeSO4,7H2O 2,0 mg/dl Hydrolysat de protéine de soja 6,8 mg/dl (en azote total) thiamine,HCl 20rg/dl On transfère 15 ml du bouillon de culture d'ensemencement ci-dessus dans 300 ml de milieu de culture et on cultive à 31,50C en ajustant le pH du milieu à 7,8.Lorsque la densité optique à 562 nm d'une dilution au 1/26 du milieu de culture atteint 0,45, on introduit dans le milieu 0,4 g/dl de PESP. Pour maintenir la concentration en sucre entre 2 et 4 g/dl, on introduit de la mélasse de canne à sucre contenant 45 g/dl de sucre. Lorsqu'on poursuit la culture pendant 33 h, on introduit 170 ml de mélasse de canne à sucre et on utilise 20,1 g/dl de sucre. On cultive Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 selon le procédé ci-dessus. Les résultats figurent dans le tableau V ci-après. TABLEAU V Acide L-glutamique Rendement accumulé (en poids) Brevibacterium lactofermentum AJ 11292 9,84 g/dl 48,0% ATCC 13869 9,21 g/dl 45,8% Bien entendu, diverses modifications peuvent autre apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent entre décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATION Procédé pour produire de l'acide L-glutamique par fermentation, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver en aérobiose dans un milieu aqueux, un mutant provenant d'un micro-organisme producteur d'acide L-gîutamique appartenant aux genres Brevibacterium ou Corynebacterium, ce mutant résistant à l'acide glutamique ou aux analogues de l'acide glutamique} et a recueillir l'acide L-glutamique accumulé dans le milieu aqueux.