Brevet FR2464961A1 — publié le 19810320

I La présente invention concerne un procédé de préparation de la L-çi - glycérylphosphoryl choline (I) dans un état de haute pureté. Quand on administre par voie intra-musculaire ou orale la L- HO-C-H O (I) CH -O-P/ O O-CH2-CH2-N (CH3)3 on constate qu'elle protège les tissus du foie contre la pénétra- tion des matières grasses sous l'effet d'une alimentation hyper- lipoprotéinée ou sous l'effet d'un empoisement par le tétrachlo- rure de carbone. On a également constaté que l'administration de L-& glycérylphosphoryl choline procure une protection contre la cholostase. Un fait important qui a été constaté est que la glycéryl- phosphoryl choline entre dans la structure des lipoprotéines. Des recherches pharmacocinétiques ont démontré que la glycérylphos- phoryl choline était rapidement absorbée par les intestins ou à l'emplacement même de l'injection intramusculaire. Le produit circule dans le courant sanguin et est distribué aux divers organes, surtout au foie, aux reins et au cerveau. En particulier au niveau du foie, le produit est remis en circulation, incorporé dans les lipoprotéines. C'est en raison de ce comportement que la glycéryl- phosphoryl choline peut être considérée comme possédant une action antidyslipémique. On peut obtenir la L-4-glycérylphosphoryl choline (I) par hydrolyse de la lécithine, en particulier de la lécithine de l'oeuf. Le problème principal cue l'on doit résoudre lors de la production de la L-,-glycérylphosphoryl choline est celui de sa purification; les produits secondaires qui accompagnent la L-& -glycérylphosphoryl choline (I) obtenue par hydrolyse, ont à la fois pour effet d'en réduire la valeur thérapeuthiaue et aussi fréquemment de provoquer des effets secondaires indésirables. Tou- tefois, certaines tentatives pour obtenir le composé (I) sous une forme particulièrement pure ont été couronnées d'un succèstrès relatif. Ainsi dans le brevet américain 2 864 848, on a décrit un procédé par lequel on effectue l'hydrolyse de la lécithine en présence de chlorure mercurique qu'on utilise pour précipiter les produits secondaires sous forme de sels mercuriques; une telle technique oblige ensuite à débarasser la glycérylphosphoryl cho- line du surplus d'ions mercuriques qui sont évidemment toxiques et on effectue cette opération par un traitement compliqué avec H2S et BaCO3. Ce même brevet mentionne cependant qu'un tel traitement n'assure pas une élimination adéquate de la totalité des ions mercuriques et qu'en conséquence, d'autres opérations de purifica- tion sont nécessaires. En particulier, on doit purifier le produit final par formation d'un complexe avec le chlorure de cadmium. L'opération globale est ainsi très compliquée et le produit final n'est pas exempt de métaux lourds. Une technique analogue à celle qui vient d'être décri- te est exposée dans "Biochemical Preparation" (Vol. 6, pages 16 à 19); l'élimination finale du cadmium est effectuée dans ce cas par passage du produit de réaction sur un mélange de résines échangeuses. Le procédé devient ainsi complexe, lui aussi, et on observe en outre, une réduction du rendement de production. Au lieu de l'hydrolyse, Brockerhoff (Journal Lipid Research 4, 96 (1963)) décrit la méthanolyse d'une solution très diluée de lécithine (environ 21 g/litre) avec du méthylate de so- dium utilisé en une proportion de 3 moles de méthylate par mole de phosphatide. La méthanolyse effectuée dans ces conditions pro- voque une scission partielle de la liaison P-O, avec formation de sousproduits nocifs, ainsi que la scission désirée de la liaison acyle - oxygène. Okui et ses collaborateurs(Yakugaku Zasshi 84 (12), 1206-9 (1964)) décrivent la préparation du composé (I) à partir de la lécithine de l'oeuf par une hydrolyse effectuée avec utilisa- tion d'hydroxides de métaux alcalino-terreux. Cependant le produit obtenu est très impur en raison de la présence de composants secon- daires. Brockerhoff et Yurkowski décrivent dans une brève note parue dans Canadian Journal Of Biochemistry, 43, 1777 (1965), qu'on peut préparer le composé (I) par hydrolyse de la lécithine avec un composé basique d'ammonium quaternaire (hydroxyde de tétrabutyl- ammonium): l'hydrolyse se déroule dans des conditions satisfaisantes 2A64961 comme il a été expliqué par Chadha (Chem. Phys. Lipids, 4, 104- 108 (1970)). Cependant l'hydrolyse globale avec le produit basi- que indiqué est onéreuse du point de vue industriel et ne permet pas d'obtenir la glycérylphosphoryl choline sous une forme exempte d'hydroxyde de tétrabutyl-ammonium qu'on est obligé de séparer du composé (1) par une opération de cristallisation. En outre, ce procédé peu satisfaisant ne se prête pas bien à des opérations à grande échelle car il n'est pas reproductible. Enfin, Cubero Robles et Roels (Chem. Phys. Lipids 6, 31-38 (1971)) décrivent un procédé dans lequel on obtient la L-od-glycérylphosphoryl choline par une méthanolyse d'un extrait gras obtenu par broyage du jaune d'oeuf. Le procédé décrit par ces auteurs comprend l'extraction de la poudre avec un mélange de chloroforme et de méthanol, l'évaporation de ce mélange de solvants, la dissolution du résidu dans de l'éther et le traite- ment de la solution éthérée avec du méthylate de lithium. On utilise ce dernier réactif à raison de 1 mole par mole de phosphatide. Le traitement avec ce réactif donne un mélan- ge de glycérylphosphoryl choline (GPC) et de glycérylphosphoryl éthanolamine (GPE). Après neutralisation de ce mélange avec HC1, on sépare GPC et GPE par chromatographie sur silice. Dans la pratique, on a constaté que cette chromatographie donne une GPC contaminée par de l'acide silicique colloïdal (comme on pouvait le prévoir, en considéraritque l'éluant est l'eau). On peut élimi- ner l'acide silicique de contamination seulement par des cristal- lisations répétées du produit final. Ces cristallisations sont très difficiles à effectuer. En résumé, les procédés décrits ci-dessus pour obte- nir GPC avec une pureté satisfaisante sont d'une façon générale peu commodes et d'une mise en oeuvre non économique à l'échelle industrielle. On a maintenant constaté de façon surprenante qu'on peut obtenir la GPC sous une forme pure et avec un rendement éle- vé par un procédé relativement simple dont la mise en oeuvre à l'échelle industrielle peut se faire sans difficulté, si on effectue la méthanolyse de la lécithine purifiée en présence d'une proportion catalytique de méthylate de sodium en rapport avec la quantité de lécithine utilisée. Ainsi, l'invention a pour objet un procédé de préparation de L-à glycérylphosphoryl choline (I) CH OH j2 HO--C O (II) / CH2-O-P CH2-CH2-k(CH 3)3 dans un état pur, procédé qui consiste à soumettre la lécithine purifiée à une alcoolyse avec catalyse par un alcoolate de métal alcalin qui provient du même alcool que celui qu'on utilise dans l'alcoolyse. Le produit obtenu est suffisamment pur pour qu'il ne soit plus nécessaire de le soumettre à une recristallisation qui, comme précédemment indiqué, est d'une mise en oeuvre parti- culièrement difficile ou le soumettre à une complexation avec CdCl2, ces deux opérations de purification ne convenant pas pour une mise en oeuvre à l'échelle industrielle. De préférence, on effectue l'alcoolyse qui fait partie du procédé selon l'invention en utilisant du méthanol. En outre, l'alcoolate catalyseur utilisé est de préférence l'alcoolate de sodium. On préfère donc l'utilisation d'une combinaison de mé- thanol et de méthylate de sodium. Suivant une technique préférée, on met en oeuvre le procédé selon l'invention en laissant au repos pendant 60 minutes environ à température ambiante, une solution méthanolique de lécithine purifiée contenant, de préfé- rence, environ 39 % en poids de lécithine et contenant également des quantités catalytiques d'un alcoolate. De préférence, on uti- lise l'alcoolate à raison dé 0,01 à 0,1 et, mieux encore, de 0,05 mole par mole de lécithine. A la fin de la réaction, on élimine les esters des acides gras qui ont été séparés pendant la réaction et on traite la solution alcoolique résiduelle avec environ 8 équivalents d'une résine cationique faible IR-C 50 (H+) par équivalent d'alcoolate afin d'éliminer les ions de métal alcalin. On concentre l'éluat et les eaux de lavage de la rési- ne à un faible volume par évaporation sous pression réduite (par exemple 12 mm de mercure) et, après dilution avec de l'eau, on extrait avec du chloroforme pour faire disparaître les dernières traces d'esters d'acides gras, les traces finales de lécithine non désacylée ou partiellement désacylée et les traces de sphin- gomyéline qu'on trouve généralement dans la lécithine provenant des oeufs. On évapore la phase aqueuse à siccité sous pression réduite et ensuite, si on le désire, on décolore le produit avec du carbone SL50. Le produit obtenu est exempt d'impuretés d'hydrolyse, de sels minéraux et d'esters d'acides gras et on ne constate au- cune différence notable entre ses propriétés et celles de GPC obtenue par formation d'un complexe avec CdC12, cristallisations successives, décomposition du produit par passage sur des résines échangeuses et cristallisations finales de la L-& glycérylphos- phoryl choline ainsi obtenue. La L-v;-glycéryltDhosphoryl choline obtenue par le pro- cédé selon l'invention contient en général environ 15 % d'humidi- té en poids. On peut éventuellement éliminer cette humidité en séchant sur P2O5 sous un vide poussé, puis en effectuant des cristallisations répétées dans un mélange d'éthanol et d'éther diéthylique ou un mélange d'éthanol et d'acétate d'éthyle; on obtient ainsi une matière solide hygroscopique incolore, dont le point de fusion est de 130 à 1310C et qui répond à la formule empirique C8H20NO6P. Une telle opération est évidemment inutile si l'on désire utiliser la L-;glycérylphosphoryl choline en solution aqueuse ou encore en association avec d'autres ingrédients actifs principaux dans des spécialités pharmaceutiques lyophylisées injec- tables comme c'est en général le cas. On peut maintenant utiliser le produit amorphe tel quel sans avoir recours à des purifications successives étant donné que la pureté du phosphatide désacétylé est plus que satisfaisante à tous points de vue. Les exemples suivants, servent à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Exemple 1 a) Purification de la lécithine On utilise comme matière première la lécithine prove- nant d'oeufs crus (P labile alcalin: 2,7 à 2,85 %; P de glycérylphosphoryl choline: 2,24 à 2,52 %). On verse une solution de 0,5 kg de lécithine brute dans 1 litre de chlorure de méthylène, dans 6 litres d'acétone sous agitation à 5 C. Après 60 minutes, on décante les liquides et on effectue la purification qui con- siste à dissoudre le résidu dans le chlorure de méthylène (1 litre) et à verser la solution dans l'acétone (6 litres) comme précé- demment. On filtre le précipité formé et on le sèche sous vide (12 mm Hg) à température ambiante (320 g). On chromatographie une solution de 320 g de lécithine dans 650 ml d'un mélange de chloroforme et de méthanol (1:1 en volume) sur 1,4 kg de A1203 en éluant avec 3,5 litres d'un mélan- ge de chloroforme et de méthanol (1:1 en volume). On concentre l'éluat à siccité sous un vide de 12 mm de mercure à une tempé- rature de 40 C et ensuite on dissout de nouveau dans 350 ml de chlorure de méthylène, on soumet à une centrifugation et on verse dans 2,4 litres d'acétone sous agitation à 5 C. Après 60 minutes à cette température de 5 C, on filtre le précipité formé et on le sèche sous vide (12 mm Hg) à température ambiante, pour obteni 210 g de lécithine pure (P labile alcalin: 3,70 - 3,80 %; P de glycérylphosphoryl choline 3,70 - 3,80 %). b) Préparation de L-Qi-glycérylphosphryl choline On laisse au repos à température ambiante pendant minutes une solution de lécithine purifiée comme expliqué dans le paragraphe (a)(environ 500 g; 0,7 mole) dans un litre de méthanol anhydre contenant 0,039 mole de méthylate de sodium. On sépare la couche huileuse ainsi formée et on filtre la solu- tion sur un lit comprenant 80 g de résine IR C 50 H,ce lit ayant une hauteur de 50 cm et la matière adsorbée étant ulté- rieurement éluée avec du méthanol en utilisant un litre à chaque fois. On concentre l'éluat sous vide (12 mm de Hy) à 40 C jusqu'à un volume d'environ 1 litre, on dilue ensuite avec 550 ml d'eau et enfin on extrait au chloroforme (4 x 400 ml). On concentre la phase aqueuse à siccité sous vide (12 mmn de mercure) à 40 C, on dissout le résidu dans 410 ml d'eau, on ajoute 12 g de carbone décolorant et on agite la phase aqueuse à température ambiante pendant 15 minutes. On filtre à travers un filtre millipore et on élimine le solvant sous pression réduite (12 mm de Hg) à 40 C pour obtenir ainsi 165 g de L-" - glycérylphosphoryl choline sous une forme pure amorphe. H20 = 15,5 % 2z64961 P total = 84,1 % Phosphore après séparation chromatographique: 83,94 %. Glycol vicinal: 84,59 % Choline: 85 % On n'observe pas de produits de scission de la liaison P-O, comme on peut le vérifier en effectuant une analyse de l'échan- tillon selon Brockerhoff (J. Lipids Research 4,96 (1963)) ou selon Dawson (J. Biochem. 75,45 (1960)). On cristallise un échantillon séché sur P205 sous 0,05 mm de Hg dans un mélange de 99 % d'étha- nol-éther éthylique et on obtient une matière solide cristalline blanche et hygroscopique dont le point de fusion est de 130 à 131 C; D = -2,84 (10 % dans H20). Valeurs trouvées: C = 37,50; H = 7,70; N = 5,38; P = 12,06; Ester de choline: 46,92; Glycol vicinal = 99,8 % Valeurs calculées: C = 37,35; H = 7,84; N = 5,45; P = 12,04; Ester de choline = 47,12. Exemple 2 On utilise comme matière première la lécithine de soja (phosphore labile alcalin: 2 %; P minimal de GPC: 0,5 %). On agite une suspension de 600 g de cette lécithine dans 600 ml de méthanol à température ambiante pendant 60 minutes. On laisse à 5 C pendant 60 minutes et ensuite on décante le solvant, on lave le résidu avec 300 ml de méthanol, on laisse l'extrait méthanolique au repos à 5 C pendant 18 heures puis on filtre et on concentre à siccité sous pression réduite de 12 mm de Hg à 400C (70 g) (P labile alcalin: 3,0 - 3,1 %; P de glycérylphos- phoryl choline: 2,0 - 2,1 %). Les purifications répétées du résidu donnent 20 g de lécithine pure. On traite la lécithine de la même façon que la lécithine d'oeuf dans l'exemple 1. On obtient une GPC de même pureté et sensiblement avec le même rendement. REVENDICATIONS 1 - Procédé de préparation de la L- o -glycérylphos- phoryl choline de formule: CH2OE I HO-C-H O / (I) CH -O-P O O-CH2-CH2 -N+(CH3)3 2 23 3 dans un état pur, caractérisé en ce qu'on soumet une lécithine purifiée à une alcoolyse catalysée par un alcoolate de métal alcalin provenant du même alcool que celui utilisé dans l'alcoolyse. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise 0,01 à 0,1 mole d'alcoolate par mole de lécithine. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on utilise 0,05 mole d'alcoolate par mole de lécithine. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'alcool est le méthanol. - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on catalyse avec un alcoolate de sodium. 6 Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce qu'on effectue une méthanolyse catalysée par le méthylate de sodium. 7 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on opère à température ambiante. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que sa durée est d'environ 60 minutes. 9 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'on utilise la lécithine d'oeufs puri- fiée. - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on utilise une lécithine de soja purifiée. 11 - A titre de produit industriel nouveau, la L-4 - glycérylphosphoryl choline obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.