Brevet FR2464268A1 — publié le 19810306

Procédé pour la préparation de bis-indole-alcaloides et leurs sels acides d'addition, nouveaux bis-indole-alcaloîdes ainsi obtenus et compositions pharmaceutiques renfermantces produits. La présente invention concerne un procédé pour la prépa- rataon de bls-indole-alcaloïdes et de leurs sels acides d'addition ainsi que les nouveaux bis-indole-alcaloïdes.Plus particufière- mentla prIser ienvention concerne l'oxydation du groupe N-méthyl de la vinblastine, de la leurosine, ou de leurs sels acides d'addition par l'acide chromique (CrO3) ou un sel de celui- ci. L'oxydation de la vinblastine ou d'un sel acide d'addition de celle-ci, donne la N-desméthyl-vinblastine et la vincris- tine (appelée également N-desméthyl-N-formyl-vinblastine) connues et également un nouveau composé désigné par la suite par "RGiI-14451". Quand la leurosine ou un sel acide d'addition de celle-ci est oxydé, en plus de la N-desméthyl-leurosine et de la N-desméthyl-N-formyl-leurosine connues, un autre nouveau composé désigné par "RG1H-1I478 est obtenu. Les nou- veaux composés "RGH" contiennent un groupe N-CH2-0-C2H5 à la place du groupe N-méthyle de la vinblastine et de la leuro- sine, respectivement. Les composés de départ, utilisés dans le procédé selon la présente invention, sont connus du spécialiste. La vinblastine et ses sels acides d'addition sont par exemple décrits dans la description du brevet US n 3 097 137, tandis que la leurosine est le sujet de la description du brevet US n 3 570 057. La vinblastine est utilisée comme agent anti- tumeur également dans la pratique clinique. La marque déposée des compositions contenant la vinblastine est "Velbe". Egale- ment l'activité antitumeur de la leurosine a été révélée sur les animaux, mais elle ne peut pas être uti]lisée avec plein succès dans la thérapie humaine à cause de sa toxicité par- ticulièrement élevée sur les organes hématopoiètiques (Rohn, R. et al.: Cancer Chemother. Reports 38, 53/1963/). La préparation de la vincristine est donnée par exemple dans la description du brevet US n 5 205 220, dans la description du brevet belge n 819 663, dans les descrip- tions des brevets hongrois n 168 433 et 165. 599 (corres- pondant à la description du brevet UIS n' 3 899 493)et- dans la description du brevet allemand n 2 614 863; et la N-desméthyl- vinblastine peut être préparée selon la description du brevet US n 3 354 163, la description du brevet belge n 819 078 et la description du brevet hongrois n 165 599. La N-desméthyl-N- formyl-leurosine et la N-desméthyl-leurosine sont révélées dans la description du brevet hongrois n 165 986 (correspondant à la description du brevet britannique n 1 412 932). Les dérivés N-desméthyle n'ont pas d'activité antitumeur notable. Les déri- vés N-formyle sont avant tout capables de maîtriser la leucémie et diverses maladies lymphomiques; tandis que la vincristine est utilisée pour le traitement du psoriasis (voir description du brevet US n 3 74119 784. Puisque l'utilisation de di-indole-alcaloldes est accompagnée par des effet secondaires toxiques, par exemple l'administration de la vincristine entraîne des symptômes para- lytiques dus à la neurotoxicité, un effortconsidérable a été fait pour préparer de nouveaux dérivés ayant la même activité ou une action similaire sans ou avec moins d'effets toxiques indésirables. D'un autre câté, les di-indole-alcaloides qui ne peuvent pas être directement utilisés dans des applications médicales, sont souvent convertis en alcaloïdes utilisables en pharmacologie. Par exemple, selon le procédé révélé dans la descrip- tion du brevet hongrois n0 165 986, la leurosine est convertie en la Ndesméthyl-N-formyl-leurosine efficace, nion toxique, ou bien selon la description du brevet hongrois n 165 599, la vinblastine est transformée en le dérivé N-formyle plus effi- cace, c'est-à-dire en la vincristine. Selon ces procédés; le composé de départ est oxydé avec le trioxyde de chrome dans un mélange d'acide acétique glacial, d'acétone et d'anhydride acé- tique à une température compriseentre -90 C et-30 C, après quoi le mélange réactionnel est neutralisé et à partir du mé- lange obtenu contenant la N-desméthyl-leurosine et la N-formyl- leurosine, les composants sont séparés ou, si on le désire, le dérivé N-desméthyle est converti en le dérivé N-formyle corres- pondant par un agent de formylation approprié. L'obJet de la présente invention est de fournir un nouveau procédé d'oxydation et les nouveaux dérivés obtenus par oxydation. D'une façon tout à l'ait surprenante, les auteurs de la présente invention ont découvert que, si dans le procédé ci- dessus l'acétone est remplacé par un solvant organique non miscible avec l'eau, dans lequel les alcaloïdes sont facile- ment solubles, de préférence par un hydrocarbure- chloré, et par une petite quantité d'éthanol, l'oxydation donne égale- ment de nouveaux composés. Plus spécialement, l'oxydation de la vinblastine entratne en plus des composés connus, la forma- tion d'un nouveau dérivé dénommé "RGH-451"; et d'une façon analogue, par oxydation de la leurosine, un autre nouveau composé désigné par "RGIHl478" est également obtenu. Ces nouveaux composés contiennent un groupe NCHl 2-0-C2H5 à la place du groupe N-méthyle des composés de départ dans le fragment vindoline. En plus des nouveaux composés, par l'oxydation ci- dessus, les dérivés N-desméthyle et N-desméthyl-N-formyle correspondant sont également obtenus. Il faut noter que la présence de l'éthanol n'est pas essentielle en ce qui con- cerne la formation des composés connus. Les composés connus sont toujours obtenus si l'oxydation est effectuée à une tem- pérature comprise entre -30 C et -90 C. Par ailleurs, les nouveaux composés ne sont obtenus que si l'éthanol est présent et si la température de l'oxyda- tion dépasse -45 C, l'isolation des nouveaux composés est plutôt compliquée. Les auteurs de la présente invention ont encore découvert que les nouveaux composés "RGH" peuvent être conver- tis en les dérivés N-desméthyle connus correspondant par un traitement acide et ces derniers composés peuvent être ensuite convertis en les dérivés N-desméthyl-N-formyle correspondants par des procédés connus en soi. L'utilisation d'un système solvant différent présente également un avantage technologique; à cause du système réac- tionnel à deux phases, l'oxydation, et la neutralisation ultérieure, sont moins exothermiques, facilitent le contrôle, et le risque de décomposition des composés di-indoles instables à la chaleur est considérablement diminué. Les nouveaux composés préparés selon la présente in- vention ont été soumis à des essais pharmacologiques-compara- tifs nombreux, et il en a été conclu que du point de vue phar- macologique, le RGH-4451 est le plus avantageux des composés obtenus. La toxicité aiguë du RGH-4451 est essayée sur des souris. La valeur LD50 de ce nouveau composé atteint 70 mg/kg (administration intrapéritonéale), ce qui représente 17 fois la dose léthale de la vincristine, environ 10 fois celle de la vinblastine et 2,5 celle de la N-desméthyl-N-formyl-leurosine. La dose léthale tue les animaux entre le deuxième et le cinquième jour. La mort n'est pas accompagnée de symptômes paralytiques et, contrairement aux résultats obtenus avec la vincristine, les animaux survivants ne sont pas impotants, même temporairement. L'inhibition sur la croissance des tumeurs a été étudiée au départ dans une culture de tissus. Une solution de 20 mg/ml de RGH-4451 dans le milieu de Fischer est préparée puis diluée à la concentration désirée. Le nombre de cellules dans les cultures P 388 est déterminé 24 heures et 48 heures après le traitement. A une concentration de 10-1 g/ml, le RGH-4451 inhibe considérablement la croissance des cellules de la tumeur P 388. L'inhibition est de 43% après 24 heures et de 89% après 48 heures. Dans les essais in vitro, le composé est fois moins toxique que la vincristine, et 4 fois moins toxique que la N-desméthyl-N-formyl-leurosine. L'inhibition sur la croissance des tumeurs est examinée également sur des tumeurs transplantées sur des ron- geurs. - Effet sur les tumeurs leucémiques P 388 des souris 106 cellules leucémiques P 388 sont transplantées dans des souris hybrides BDF1 par voie intrapéritonéale(i.p.). L'administration de RGH-41451 est commencée le jour qui suit la transplantation. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau ci-dessous. Dose Nombre Plan des Durée de vie moyenne mg/kg de traite- exprimée en i. p. traite ments exprimée en Jours % de traités/ ments traités témoins témoins 3,2 9 chaque Jour 22,3 12,3 181 ,0 9 chaque jour 21,5 13,2 163 6, 4 9 chaque Jour 20,5 19,3 166 5 tous les 2 Jours 21,8 10,5 208 lO 6 chaque Jour 8,5 13,2 64 1 - 19,4 10,5 185 D'après le tableau, on peut voir que la durée de vie des animaux cancéreux a considérablement été prolongée par l'administration de doses quotidiennes de 3,2 à 6,4 mg/kg. A 10 mg/kg, la dose administrée tous les deux Jours donne même un effet plus favorable. On peut voir également qu'une simple dose de 20 mg/kg est également efficace, mais cette forte dose ne peut pas être administrée quotidiennement à cause de sa toxicité. Un effet similaire est obtenu avec des doses quotidiennes de 0,1 à 0,3 mg/kg de vincristine, des doses quotidiennes de 1 à 4 mg/kg de N-desméthyl-N-formyl- leurosine et des doses quotidiennes de 0,1 à 0,4 mg/kg-de vinblastine. Effet sur le carcinome ascitique de Ehrlich La transplantation est effectuée sur des souris suisses sélectionnées,à raison de 5 x 106 cellules tumorales 0 ascitiques. L'administration de RGH-4451 est commencée 24 heures après la transplantation. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau ci-après. Dose Nombre Plan des Durée de vie moyenne mg/kg de traite- expriméeen i.p. traite- ments exprimée en jours % de traités/ ments traités témoins témoins 1,0 9 chaque Jour 54,2 15,4 341 2,0 9 chaque jour 413,0 16,4 261 4,0 9 chaque Jour 36,4 16,4 222 6,0 9 chaque Jour 148,2 15,9 303 D'après les résultats ci-dessus, on peut voir nette- ment que l'effet de dosesalant del à 6 mg/kg est significatif. Effet sur.le lymphome ascitique NK/Ly Les essais sont effectués d'une façon analogue à l'essaisur les ascites de Ehrlich. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau ci-après. Dose Nombre Plan des Durée de vie moyenne au mg/kg de traite- exprimée exprimée| 65e jour i.p. traite- ments en Jours en % de ments trai- tétraités/ tée moins* témoins vivants guéris 2,0 9 chaque Jour 64,1 16,4 392 9/10 6/10 4,0 9 chaque Jour 62,9 16,4 384 8/10 7/lb0 6,0 9 chaque Jour 65,8 16,7 394 8/10 4/10 1 - 65,5 16,7 392 8/10 3/10 Maintenues en vie pendant 4 fois la durée de vie moyenne du groupe témoin. Le maximum est par conséquent de 400%. D'après les résultats, on peut voir que des doses de 2 à 6 mg/kg administrées une fois par Jour ont un effet antitumoral remarquable, une grande partie des animaux traités est guérie le 65ème Jour. Un résultat similaire est obtenu quand on administre une seule dose importante. Des doses quotidiennes de 0,05 à 0,25 mg/kg de vincristine et des doses quotidiennes de N-desméthyl-N-formyl- leurosine de 1 à 4 mg/kg ont un effet similaire. Dans ce cas cependant, l'adminsltration d'une seule des grandes doses n'augmente pas la durée de vie. Effet sur-le carcinome S 180 sc. Des tissus de tumeur S 180 sc. sont transplantés dans des souris suisses par voie sous-cutanée. Le traitement est commencé 24 heures après la transplantation. Le RGH-4451 est administré en doses quotidiennes de 2, 4, 8 et 16 mg/kg pendant 8 Jours, respectivement, par voie intrapéritonéale. L'inhibition sur la croissance de la tumeur est évaluée le llème Jour en se basant sur le poids des tumeurs. Le change- ment du poids de la rate est également contrôlé. I'inhibition sur la croissance des tumeurs observée après administration du RGH-14451 est sensiblement la même que dans le cas des di-indolealcaloïdes connus (54 à 56% selon la dose) mais les doses quotidiennes des nouveaux composés pourraient 8tre plus élevées et on n'observe aucune diminu- tion importante du poids de la rate meme avec des doses aussi élevées que 16 mg/kg. Effet sur le carcinome sc. de Guérin La tumeur est transplantée sur des rats Wistar par voie sous-cutanée. L'administration du RGH-44.51 est commencée le jour qui suit la transplantation et le composé est adminis- tré 6 Jours de suite par voie intrapéritonéale. L'inhibition sur la croissance de la tumeur est évaluée le 22ème jour. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau ci-dessous. Dose Poids de la tumeur Mortalité jusqu'au mg/kg Inhibition 22èie jour/nombre i.p. traités témoins d'animaux 2,0 10,7 18,9 43 0/6 6,0 8,69 i44,9 81 0/6 ,0 14,64 414,9 68 0/6 14,0.. 5/6 Des doses de RGH-4451 de 2 à 10 mg/kg administrées par voie intrapéritonéale inhibent fortement la croissance du carcinome de Guérin. D'après les essais décrits précédemment, on peut conclure que des doses quotidiennes de 1 à 10 mg/kg ou des doses uniques de 20 mg/kg de RGH-14451 ont un effet d'inhibi- tion significatif sur la croissance des tumeurs, sur les tumeurs des rongeurs et prolongent la durée de vie. Contrairement à la vincristine, il n'y a pas de symptômes paralytiques même quand des doses inférieures à la dose léthale sont.adminlstrées. L'étendue thérapeutique du nouveau composé essayé est supérieure à celle de la vincris- tine et de la Nl-desméthyl-N-formyl-leurosine comme le montre le tableau ci-dessous. Etendue thérapeutique (MTD/min off. D) -nr% RGH-4451 10 Vincristine 6 N-desmdthyl-N-formyl- leurosine 4 u " Dans le tableau MTD signifie dose maximale admissi- ble. Dans la thérapeutliquehumaine, pour l'administration par voie intraveineuse lente ou normale, des doses quotidien- nes de 0,5 à 1 mg/kg sont avantageusement utilisées. La présente invention concerne un procédé pour l'oxydation de la vinblastine et de la leurosine et de leurs sels acides d'addition par l'acide chromique ou par un bichro- mate de métal alcalin en présence d'un solvant organique, d'anhydride acétique et éventuellement d'acide acétique gla- cial, à basse température, et concerne éventuellement la for- myation'du mélange obtenu. Ce procédé est caractérisé par Le fait qu'on effectue l'oxydation à une température de -30 C à -90 C dans un milieu contenant comme solvant organique, un solvant organique non miscible avec l'eau, de préférence un hydrocarbure chloré,et éventuellement de l'éthanol à une con- centration inférieure à 10% par rapport au volume du solvant en présence d'anhydride acétique et éventuellement d'acide acétique glacial, et qu'on règle le pHi du mélange réactionnel à 8 à 10, et a) qu'on isole de la phase organique les composants du mélange de produits obtenu, c'est-àdire, si c'est la vinblastine, ou un sel acide d'addition de celle-ci, qui est cxydé(e) en N-desméthyl-vinblastine, on obtient la vinéristine et éventuellement le composé "RGH-4451" qui a les propriétés suivantes: point de fusion 235 C à 238 C, - pouvoir rotatoire spécifique 25 =_ +30, 50 (c -= 1, chloroforme), - spectre infrarouge; comme celui illustré sur la figure 1, 1- spectre RMN-H: illustr sur la figure 2, - spectre RMN- H3C illustré sur la figure 3, - spectre ERMNC illustré sur la figure 3, ce qui rend fortement probable que la structure de la molécule diffère de la vinblastine en renfermant un groupe N-CH -0-C2H5 à la place d'un groupe N-méthyle, dans le fragment vindoline de la molécule, et - poids moléculaire égal à 854 449 correspondant à la formule C2.H6pN4010; ou bien si c'est la leurosine ou un sel acide -d'addition de eelle-ci, qui est oxyd)en N-desméthyl-leurosine, on obtient la N-desméthyl-N-lformylleurosine et éventuellement un nouveau composé "'RGH-44178" qui a les propriétés suivantes: - point de fusion 180Cà 182 C, - pouvoir rotatoire spécifique a a75 = +59,25 (c = 1, chloroforme), - spectre infrarouge: illustré sur la figure 4, - spectre RMN-1H: illustré sur la figure 5, et spectre RMN-13: illustré sur la figure 6, ce qui O30 rend fortement probable que la structure de cette molécule diffère de la leurosine en renfermant un groupe N-CH2-0-C2H5 à la place du groupe N-méthyle dans le fragment vindoline de la molécule, et - poids moléculaire égal à 852 correspainnt d la formule C48H60N4010 et que, si on désire, on transforme les produits obtenus en leurs sels acide d'addition; ou b) qu'éventuellement on hydrolyse le mélange de produits présents dans la phase organique, si nécessaire, qu'on soumet à la formylation le mélange de dérivés N-desmé- thyle et N-desméthyl-N-formyle obtenus, de façon connue en soi, et qu'on isole, d'une façon connue,ledévé 1desrthyl-N- formyeoltenu,c'est-à-dire la vincristine si c'est la vinblastine, ou un sel acide d'addition de celle-ci, qui est oxyde-),ou bien ou la N-desméthyl-N-formyl-leurosine si c'est la leurosine/un sel acide d'addition de celle-ci,qui est oxyd"e),et que, si néces- saire, on transforme le produit obtenu en un sel acide d'addition de celui-ci. Dans le procédé conforme à la présente invention, la vinblastine industrielle ou de pharmacopéeou un sel de celle- ci, et la leurosine ou un sel de celle-ci peuvent être utili- sés, respectivement, comme matière de départ. Si un alcaloïde de qualité industrielle est utilisé, le produit obtenu peut être purifié par exemple par des procédés chromatographiques. Si la matière de départ est de la qualité pharmacopée, le produit est directement approprié pour des applications thérapeutiques. Comme agent oxydant, on peut utiliser l'acide chromique CrO3 ou un bichromate de métal alcalin. L'oxydation est effectuée en présence d'un solvant organique non miscible avec l'eau dans lequel les alcaloïdes sont facilement solubles, d'anhydride acétique et éventuel- lement d'acide acétique. Des représentants types de ces sol- vants sont le benzène, les hydrocarbures chlorés, de préfé- rence le chloroforme ou le chlorure de.méthylène. Eventuellement, c'est-à-dire si les composés "RGH" doivent être également préparés, l'oxydation est effectuée en présence d'éthanol. L'éthanol est utilisé à raison de moins de 10% par rapport au volume du solvant organique, de préférence à raison de 0,1 à 3%. Ia température d'oxydation est comprise entre -30 C et -90 C. Les dérivés N-desméthyleet N-desméthyl-N-formyle sont toujours obtenus dans ces conditions. Si la réaction est effectuée à une température ne dépassant pas -45 C, également des composés "RGH" peuvent être facilement isolés. Si la réaction est effectuée au-dessus de -45 C, les dérivés N-des- méthyle et N-formyle sont faciles à isoler, mais rl'isolement du composé "RGIO" est difficile. Quand l'oxydation est terminée, la valeur du pH et du mélange réactionnel est réglée à 8-10 en prenant soin que la température ne dépasse pas 50 C et en maintenant le pH de la phase aqueuse égal ou supérieur à 8. Ensuite, on laisse les phases se séparer et les alca- loïdes sont isolés de la phase organique. Si on suit la variante a) du procédé le cqmposé "RGH" peut aussi être isolé. Dans ce cas, le mélange d'alcaloïdes obtenus par évaporation de la phase organique comprenant le dérivé M-desméthyle, le dérivé N-desméthylN-formyle et le composé "RGH" est séparé en ces constituants par chromatogra- phie. La chromatographie est effectuée sur une colonne garnie d'alumine partiellement désactivée en effectuant l'élution avec divers mélanges de benzène et d'un hydrocarbure chloré. L'identification des alcaloïdes présents dans les diverses fractions effectuées par chromatographie en couche mince, les fractions contenant les mêmes alcaloïdes sont combinées et les alcaloïdes sont isolés, par exemple,. par évaporation. Les alcaloïdes obtenus, si on le désire sont purifiés et éventuel- lement, sont transformés en sels acides d'addition acceptables en parmacie-, de préférence en leur sulfate. Si on le désire, le dérivé N-desméthyle est soumis à la formylation. Comme agent de formylation,cn utlised préfémencele mélange d'acide formique et d'anhydride acétique. Si la variante b) du procédé est suivie, le composé "RGHi" n'est pas isolé mais, si nécessaire, il peut être trans- formé en dérivé N-desméthyl correspondant avec l'acide étendu d'eau, par exemple avec une solution aqueuse d'acide sulfuri- que à 0,5-5%, une solution d'acide chlorhydrique ou 'de l'acide acétique. Les nouveaux composés et/ou leurs sels d'acides d'ad- dition peuvent être transformés en compositions pharmaceutiques qui sont de préférence administrées par voie parentérale, L'ingrédient actif est lyophilisé, introduit dans des ampoules sèches, à partir desquelles il sera mélangé avec le contenu des ampoules de s.;olvants renfermant les produits additifs classiques, de préférence immédiatement avant l'administration. Dans les ampoules de solvants, on utilise comme véhicule de préférence de l'eau distillée ou une solution physiologique de chlorure de sodium, éventuellement en même temps qu'un agent de conservation (par exemple alcool benzy- lique), un antioxydant, du lactose ou des tampons. L'adminsitration est effectuée sQus la forme d'injec- tions intraveineuse lente, de préférence dans une solution de saline physiologique. La composition peut contenir également d'autres composés actifs du point de vue pharmaceutique, par exemple des adJuvants (analgésiques, remontants cardiaques ou d'autres produits cytostatiques connus. La présente invention est illustrée par les exemples descriptifs et non limitatifs cl-après. Exemple 1 On dissout 5 g (5,5 mmoles) de sulfate de vinblastine dans un mélange de 1,2 litre d'une solution à 1% d'éthanol dans le chloroforme et de 250 ml d'acide acétique. La solu- tion obtenue est refroidie à -55 C et on ajoute une solution de 2,48 g (214,48 mmoles) de trioxyde de chrome dans 93-50 ml d'anhydride acétique à-55 C. Le mélange réactionnel est agité pendant 40 minutes, après quoi le PH est réglé à 9-10 avec de l'ammoniaque concentrée ayant une température de -45 C à-50 C' Ensuite, on ajoute 5 litres d'eau au mélange- réactionnel à deux phases et après une agitation de 5 minutes, on laisse les phases se séparer. La phase chloroformique est mise de c8té et la phase aqueuse est extraite avec 0,5 1 de chloroforme. Les phases chloroformiques sont rassemblées et traitées avec des portions de 2,5 1 d'ammoniaque à 1%. Les phases sont sépa- rées de nouveau et la phase chloroformique est séchée sur du sulfate de sodium,filtrée et le filtrat est évaporé à siccité sous pression réduite. On obtient 4 g d'un mélange de dérivés de la vinblas- tine qui peuvent être séparés en les constituants correspon- dants, en suivant le mode opératoire ci-dessous: On dissout le produit obtenu (4g) dans 24 ml d'un mélange 2:1 de benzène et de chloroforme. La solution est ensuite passée à travers une colonne chromatographique garnie avec 200 g d'alumine, ayant un degré d'activité de III, qui a été humidifiée au préalable avec un mélange de 2:1 de benzène et de chloroforme. Les alcaloïdes sont élués en utili- sant les éluats ci-après dans l'ordre indiqué. - 1,2 litre d'un mélange 2:1 de benzène et de chloro- rorme, 1,5 litre d'un mélange 1:1 de benzène et de chloro- forme, 0,9 litre d'un mélange 1:2 de benzène et de chloro- forme. Les diverses fractions obtenues sont examinées par chromatographie en couche mince. * a) Traitement de la fraction obtenue par élution avec un mélange 2:1 benzène:chloroforme La première fraction de 400 ml de l'éluat est exempte d'alcaloïdes; les éluats ultérieurs obtenus avec un mélange 2:1 de benzène et de chloroforme contiennent un nouveau compo- sé. En combinant et évaporant les fractions contenant les alcaloïdes, on obtient 1,88 g du nouveau composé brut. Ce com- posé. est désigné par "RGH-4451". En effectuant une ou plusieurs recristallisations du produit brut, obtenues à partir d'une quantité double.d'étha-_ nol, on obtient 1,30 g d'un produit RGH-4451 cristallin, homo- gène du point de vue chromatographique, ayant un point de fu- sion de 235 C à 238 C (se décompose après avoir été recristal- lisé deux fois dans l'éthanol). /-_7 25 = +30,5 (c = 1, chloroforme) RF = 0,62 (adsorbant: gel de silice; mélange d'élution: :5:5:5 éther diéthylique:éthanol: benzène:diéthylamine). Spectre de masse: selon le spectre de masse, le poids molécu- laire du oomposé s'élève à 854,449, correspondant à la formule C48H6 N4010 Le nombre de masse de cette molécule est supérieur à celui de la vinblastlne égal à 44, ce qui correspohd à l'unité C2H40. En se basant sur des études par fragmentation, on peut conclure d'une façon certaine que ladite unité est reliée à la partie vindoline de la molécule. Le spectre NRMN-1H est indiqué sur la figure 2. Dans ce spectre, le singulet N-méthyle présent à 2,73 ppm dans le spectre de la vinblastine, est absent. Par ailleurs, le pic multiplet à 4,48 ppm du reste méthylène du groupe N-CH2-O peut être vu, tandis que le triplet méthyle et le quartet mé- thylène du groupe O-C2H5 a4lraisentà 1,05 et 3,35 ppm, respec- tivement. Le spectre RMN-13C est indiqué sur la figure 3. La présence du groupe NCH2-O est vérifiée par le pic à 64,42 ppm (qui a un grand nombre de triplets dans le spectre de résonance décalé). En se basant sur l'analyse ci-dessus, on peut être certain qu'ungroupe N-CH2-0-C2H5 remplace le groupe N-méthyle de la partie vindoline. Le spectre IR du composé peut être vu sur la figure 1 o les fréquences des groupes caractéristiques sont les sui- vantes: -1 3470 cm valence OH 2970-2830 cm vibrations de la valence OH 1737 et 1230 cm1 groupes acétyle 1612 cm 1 liaison C=C -1 1595 cm squelette aromatique 742 cm- 4 AR-H voisins l'un de l'autre. Les nouvelles bandes caractéristiques du RGH-4451 ayant une faible intensité apparaissent à 995, 1170 et 1360cm-1 On peut voir aussi que les bandes des basses fréquences L 1 -1 à 1090 cm et 700 cm caractéristiques de la vinblastine ont disparu. b) Traitement de la fraction obtenue par élution avec un mélange 1:1 benzène:chloroforme La première fraction 1000 à 1200 ml de l'éluat obtenuequand on élue avec 1,5 litre du mélange 1:1 benzène:chlOroforme est une fraction dite "mixte" consistant en le nouveau composé appelé RGII-4451 et la N-desmthyl-vinblastine tandise que la fraction restante 300 à 500 ml contient la N-desméthyl-vinblas-' tine. La fraction mixte est évaporée pour obtenir 0,57 g d'un produit solide mixte qui est transformé en N-desméthyl- vinblastine par le mode opératoire suivant: le résidu d'évaporation est dissous dans 10 ml de benzène, la solution benzénique est extraite avec trois portions de 15 ml d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique à 2, óo, les phases sont séparées, après quoi le PH de la phase aqueuse est réglé à 9 avec une solution d'ammoniaque concentrée. La solution alcaline obtenue est extraite avec trois portions de 10 ml de chloroforme et l'extrait chloroformique est évaporé. On obtient 0,56 g de N-desméthyl-vinblastine. En évaporant les fractions de N-desméthyl-vinblastine, on obtient 0,08 g de N-desméthyl-vinblastine, qui est combinée avec la N-desméthyl-vinblastine obtenue à partir de la frac- tion mixte. La N-desméthyl-vinblastine est convertie en vin- cristine comme décrit dans la spécification du brevet longrois no 165599. On obtient 0,63 g de vincristine. Point de fusion: 218 C à 220 C. c) Traitement de la fraction obtenue par élution avec un mélange de 1:2 benzene; chloroforme A partir de la fraction obtenue par élution avec 0,9 litre du mélange 1:2 benzène:chloroforme, on peut isoler la vincristine par évaporation. On obtient 1,22 g de vincris- tine. Point de fusion: 220 C. Exemple 2 On dissout 5 g (5,.5 mmoles) de- sulfate de vinblastine dans un mélange de 1,2 litre d'une solution à 1% d'éthanol dans le chloroforme et de 250 ml d'acide acétique. La solution 350 obtenue est refroidie à -55 C et on aJoute une solution de 2,48 g (24,118 mmoles) de trioxyde de chrome dans 930 ml d'anhy- dride acétique à -55 C. Le mélange réactionnel est agité pen- dant 410 minutes après quoi le pli est réglé à 9-10 avec de l'ammoniaque concentréerefroidJ entre -45 C et -50oC. Ensuite, on aJoute 5 litres dJeau au mélange réactionnel à deux phases et après une agitation de 5 minutes, on laisse les phases se séparer. La phase chloroforimique est mise de ci.té et la phase aqueuse est extraite avec.0,5 litre de chloroforme. Les phases 16.- chloroformiques sont combinées et traitées avec deux portions de 2,5 litres d'ammoniaque à 1%. Les phases sont séparées de nouveau et la phase chloroformique est extraite avec trois portions de 0,3 1 d'une solution aqueuse d'acide sulfurique, après quoi le pHi de l'extrait est réglé à 9 avec de l'ammonia- que concentrée. L'extrait alcalin est extrait avec trois por- tions de 0,2 litre de chloroforme. L'évaporation-des extraits donne un résidu constitué par de la N-desméthyl-vinblastine et de la vincristine, la première étant transformée en vincris- tine par formylation effectuée comme décrit dans la spécifica- tion du brevet hongrois n 165 599. En traitant avec une solu- tion d'acide sulfurique dans l'éthanol, le produit obtenu peut être converti en sulfate devincristine. Obtenu: 3,6 g de sulfate de vincristine. Exemple 3 - -On dissout 5 g (5,5 mmoles) de sulfate de vinblastine dans un mélange de 1,2 litre d'une solution à 1% d'éthanol dans le chloroforme et de 250 ml d'acide acétique. La solution obtenue est refroidie à -55 C et on ajoute une-solution de 2,48 g (24,148 mmoles) de trioxyde de chrome dans 930 ml d'anhy- dride acétique à-55 C. Le mélange réactionnel est agité pendant minutes puis il est versé dans un mélange de 6 litres d'eau et de 4 litres d'ammoniaque concentrée refroidie entre +2 C et +5 C. Le mélange réactionnel est agité pendant 5 minutes à une température inférieure à 20 C en s'assurant que le pH de la phase aqueuse reste au moins à 8.-Les phases-sont ensuite sépa- rées, la phase aqueuse est extraite avec 0,5 litre de ch]loro- forme et l'extrait est combiné avec la phase chloroformique. La solution chloroformique est extraite avec deux portions de 2,5 litres d'ammoniaqUe à 1%, les phases sont séparées et la phase chloroformique est séchée. Ensuite, elle est a) soit évaporée selon l'exemple 1 suivi par la sépa- ration du mélange de di-indole-alcaloîdes obtenuspesant 4g, en ses composants, b) soit convertie en vincristine par un traitement acide et une formylation ultérieure comme décrit dans l'exem- ple 2. Si le mode opératoire a) est effectué, le rendement est identique à celui obtenu dans l'exemple 1, tandis que le mode opératoire b) donne le même rendement que dans l'exemple 2. Exemple 4 On dissout 5 g (5,5 mmoles) de sulfate de vinblastine dans un mélange de 1,2 litre d'une solution à 0,5% d'éthanol dans le chlorure de méthylène et de 250 ml d'acide acétique. La solution obtenue est refroidie à -55 C et on ajoute une solution de 2, 48 g (21,4,8 mmoles) de trioxyde de chrome dans 930 ml d'anhydride acétique à -55 C. Le mélange réactionnel est agité pendant 4110 minutes, après quoi le pH est réglé à 9-10 avec de l'ammoniaque concentrée entre 45 C et -50 C. Ensuite, on ajoute 5 litres d'eau au mélange réactionnel à deux phases et après une agitation de 5 minutes, on laisse les phases se séparer. La phase contenant le chlorure de méthylène est mise de coté et la phase aqueuse est extraite avec 0,5 litre de chlorure de méthylène. Les phases de chlorure de méthylène sont combinées et traitées avecdeux portions de 2,5 litres d'ammonia- que à 1%. Les phases sont séparées de nouveau, la phase de chlo- rure de méthylène est séchée avec du sulfate de sodium, filtrée, puis le filtrat est évaporé à siccité sous pression réduite. Rendement: 3,5 g d'un mélange de di -indole-alcaloides qui est séparé en ses composants suivant le procédé décrit dans l'exemple 1. Les caractéristiques physiques du RGH-4451 et de la vincristine sont identiques respectivement aux propriétés cor- respondantes des produits de l'exemple 1. Exemple 5 On dissout 5 g de sulfate de leurosine dans un mélange de 1,2 litre d'une solution à 1% d'éthanol dans le chloroforme et de 250 ml d'acide acétique. La solution obtenue est refroidie à -55 C et on ajoute une solution de 2, 48 g (24,18 mmoles) de trioxyde de chrome dans 930 ml d'anhydride acétique à-55 C. Le mélange réactionnel est agité pendant 40 minutes, puis le pH est réglé à 9-10 avec de l'ammoniaque concentrée ayant une température de -45 à 50 C. Ensuite, on ajoute 5 litres-d'eau au mélange réactionnel à deux phases et après 5 minutes d'agi- tation, on laisse les phases se séparer. La phase chloroformi- que est mise de côté et la phase aqueuse est extraite avec 0,5 1 de chloroforme. Les phases chloroformiques sont combinées et extraites avec deux portions de 2,5 litres d'ammoniaque à 1%. Les phases sont séparées de nouveau, la phase chloroformique est séchée sur du sulfate de sodium, filtrée puis le filtrat est évaporé à siccité sous pression réduite. Rendement: 4,5 g d'un mélange de dérivés de la leu- rosine qui est séparé en les composants correspondants en suivant le procédé décrit ci-dessous: On dissout le produit obtenu (4,5 g) dans 27 ml d'un mélange 3:1 benzène:chloroforme, et la solution est passée en chromatographie sur une colonne garnie d'alumine ayant un degré d'activité de III et traitée avec un mélange de 3:1 benzène: chloroforme. Les alcaloïdes sont élués avec les éluants sui- vants dans l'ordre indiqué: 3,5 litres d'un mélange 3:1 de benzène et de chloroforme, 1 litre d'un mélange 2:1 de benzène et de chloro- forme, 2,5 litres d'un mélange 1:2 de benzène et de. chloro- forme. Des fractions de 250 ml sont recueillies et les alcaloïdes qui y sont contenues sont examinées par chromatographie en couche mince (t.l.c.). Les fractions n 1 à 6 (1,5 litre) sont exemptes d'alcaloïdes, les fractions n 7 à 14 (mélange 3:1 benzène: chloroforme) et les fractions n 15 à 17- (mélange 2:1 benzène: chloroforme) contiennent le nouveau composé identifié par RGH-4478. La fraction n 18, obtenue avec un mélange 2:1 ben- zène: chloroforme, et les fractions n 19 à 23 obtenues avec le mélange 1:2 benzène: chloroforme, contiennent la N-desmé- thyl-leurosine, tandis que les fractions n 2/4 à 28, obtenues par élution avec un mélange 1:2 benzène:chloroforme, contien- nent la N-desméthyl-N-formyl-leurosine. Les fractions d'éluat sont traitées de la manière suivante: a) les fractions n 7 à 17 sont combinées et évaporées. 2,13gdu R6I-4478 brut sont obtenus qui sont purifiées par par cristallisation dans 5 ml d'éthanol à 5 C. Si on le désire, le produit est dissous dans le chloroforme, la solution obte- nue est évaporée puis on recristallise dans l'éthanol. Rendement: 1,6 g de RGi-441178 Point de fusion: (après recristallisation dansl'éthanol deux lois): 180 C à 182 C. _/- 7D5 = t25 (c = 1, chloroforme). Rf = 0,37 (adsorbant: gel de silice; mélange-d'élution: un mélange 100:5:5:5 éther diéthylique:éthanol: benzène: diéthyamine). Poids moléculaire: 852. - ILe spectre FM-.H est indiqué sur la figure 4. D'après ce spectr'e, le singulet N-méthylecaractérlstique de la matière de départ est absent. Par ailleurs, à 4,2348 ppm, le pic multiplet du radical méthylène du groupe N-CH2-0 peut être vu, tandis que le triplet méthyle et le quartet mnthylène du groupe 0-C2li5 apparaissent à 1,10 et 3,38 ppm, respective- ment. Le spectre RMN-13C est indiqué sur la figure 5 tandis que le spectre est donné sur la figure 6. La fréquence des groupes caractéristiques du spectre IR du produit sont les suivantes - 32470 cml1 valence. OH -1 2970-2830 cm vibrations de la valence OH - 1737 et 12-50 cm- 1 groupes acétyle 1612 cm- liaison C=C c-1 1595 cm 1 squelette aromatique' 71742 cm1 4AR-H voisins l'un de l'autre -1 823 cm noyau époxyde b) les fractions n 18 à 23 sont combinées. Les traces de RGH-4478 sont éliminées par extraction avec une solution d'acide sulfurique à 2% et le réglage du pli de la phase aqueuse acide à 9 est fait avec le l'ammoniaque concentrée. La solu- tion est ensuite extraite avec trois portions de 0,2 1 de chloroforme et l'extrait chloroformique est évaporé. Rendement: 0,25 g de N-desuéthyl-leurosine. Le produit obtenu, si on le désire, est converti en N-desméthyl-N-t'ormylleuroslne par formylation effectuée comme s_' a_ décrit dans la spécification du brevet hongrois n 165 986, Rendement: 0,24 g de N-desméthyl-N-formyl-leurosine. c) Les fractions n 24 à 28 sont combinées et évapo- rées. Rendement: 4,42 g de N-desméthyl-N-formyl-leurosine. Exemple 6 En suivant le procédé décrit dans l'exemple 2, mais en partant de 5 g de sulfate de leurosine au lieu de sulfate de vinblastine, on obtient 3,7 g du sulfate de N-desméthyl-N- formryl-leurosine. Exemple 7 On dissout 5g (5,5 mmoles) de sulfate de vinblastine, séché Jusqu'à ce qu'il n'y ait plus d'alcool, dans 1000 ml de chlorure de méthylène sans éthanol et à la solution, on ajoute 120 ml d'acide acétique et 3,2 ml (10 équivalents) d'éthanol. La solution est refroidie à -55 C et on aJoute une solution de 2,5 g de trioxyde de chrome dans 470 ml d'anhydride acéti- que refroidi à -55 C. Le mélange réactionnel est agité à -55 C pendant 40 à 45 minutes, puis le pH èst réglé et les phases de chlorure de méthylène sont évaporées comme décrit dans l'exemple 4. Obtenu: 4 g du mélange de di-indole-alcaloides. On dissout les 4 g du mélange de produits obtenus dans un mélange 8:2 benzène: chloroforme et la solution est - passée à travers une colonne chromatographique garnie de 200g d'alumine, ayant un degré d'activité de III.. L'élution est effectuée de la façon suivante: - Commeéluarits de départ on utilise 5 à 6 litres d'un mélange 8:2 benzène:chloroforme, les éluats sont combinés et évaporés. On obtient 2,4 g de RGH-4451 brut. La recristallisa- tion du produit brut dans l'éthanol donne le RGH 4451 cristal- lisé qui a les mêmes. caractéristiques que celles décrites dans l'exemple 1. On répète l'élution avec 5 à 4 litres d'un mélange 1:1 benzène:chloroforme. Les fractions combinées contenant la N-desméthylvinblastine ainsi que les fractions contenant la vincristine sont rassemblée:; et évaporées séparément. Obtenu: 0,4 g de N-desméthl].-vinblastine et 0,i g de vincris- tine. Exemple 8 En suivant le procédé décrit dans l'exemple 7, mais en effectuant la réaction en présence de 9,5 ml (50 équivalents) d'éthanol, les produits de l'exemple 7 sont obtenus avec les mêimes quantités. Les caractéristiques physiques des produits sont également identiques à celles décrites dans l'exemple 7. -2464268 IREVENDI CATI ONS 1. Procédé pour l'oxydation de la vinblastine, de la leurosine ou d'un sel acide d'addition de ces composés, carac- térisé par le fait qu'il comprend la réaction de la vinblastine, de la leurosine ou d'un sel acide d'addition de ces composés avec l'acide chromique ou un bichromate de métal alcalin, à une température allant de 30 C à -90 C en présence d'un solvant organique non-miscible avec l'eau dans lequel les alcaloïdes sont facilement solubles, d'anhydride acétique et éventuelle- ment d'acide acétique glacial et/ou d'un volume d'éthanol allant Jusqu'à 10% par rapport au volume du solvant organique non- miscible avec l'eau; puis le réglage du pl! du mélange réaction- nel à 8 - 10 et l'isolation des produits obtenus et/ou la sou- mission desdits produits à un traitement ultérieur. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le solvant organique non-miscible avec l'eau est le chloroforme ou le chlorure de méthylène. 3. Procédé selon les revendications 1 ou 2, caractéri- sé par le fait que l'oxydation est effectuée dans un milieu contenant de l'éthanol en une quantité allant jusqu'à 10% en volume par rapport au volume du solvant organique non-misci- ble avec l'eau. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'oxydation est effectuée dans un milieu contenant -de l'éthanol à raison de 0,1 à 5% en volume par rapport au vo- lume du solvant organique non-miscible avec l'eau. 5. Procédé selon les revendications 3 ou.l, caractérisé par le fait que l'oxydation est effectuée à une température allant de ->l5 C à-90 C. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à.5, caractérisé par le fait que la vinhlastine, ou un sel acide d'addition de celle-ci, est util;is{.)comme matière de départ et qu'on isole du mélange réactionnel, après réglage du pH, la N-desméthylvinblastine, la vincristlne et un composé désigné par "'GII->451", ledit composé Rn]}!-l151 ayant un point de fusion de 235 C oà ?-38C, un pouvoir rotatoire de / 725= +30,50 (c = 1, chloroforme), un spectre infrarouge -D 2J3 montré sur la figure 1, un spectre RMN- 1H montré sur la figure 2, un spectre RI-1- C montré sur la figure 3 et un poids mol6culai- re de 854,1149, ces produits étant, si on le désire, éventuel- lement transformnés en leurs sels acides d'addition. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé par le fait que la leurosine, ou un sel acide d'addition de celle-ci, est utilqa(e))comme matière de départ et qu'on isole du mélange réactionnel, après réglage du pH, la N-desméthyl-leurosine, la Ndesméthyl-N-formnyl-leurosine et un composé désigné par "IGH-4478", ledit composé RGHI-4478 ayant un point de fusion de 380 C à 182 C, un pouvoir rotatoire de _/C_725 = +59,25 (c= 1, chloroforme), un spectre infrarouge montré sur la figure 4I, un spectre tfMN- H montré sur la figure ,- un spectre iMNi- 13C montré sur la figure 6 et un poids mo- - 15 léculaire de 852, ces produits étant, si on le désire, éventuel- lement transformes en leurs sels acides d'addition. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé par le fait que le mélange réactionnel est hydrolyseé après réglage du piH. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'hydrolyse est effectuée au moyen d'acide sulfuri- que en solution aqueuse à 0,5 à 5%,d'acide chlorhydrique ou d'acide acétique. 1.0. Procédé selon les revendications 1 ou 2, caracté- risé par le fait que l'oxydation est effectuée en l'absence d'é thanol-. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé par le fait que le mélange des dérivés N-desméthyle etN-desméthlyl-N-formyle obtenus est séparé. 12. Procédé selon l'.une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé par le fait que le mélange des dérivés N-desméthyle et N-desm(thlyl-N-formrnyle obtenus est soumis à la formylation ce qui fait que le dérivé N-desméthyle est trans- formé en dérivé N-desméthyl-N-formyle. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que la formylation est effectuée au moyen d'un mélange d'acide formique et d'anhydride acétique. 14. N-desméthyl-vinblastine, vincristine, N-desméthyl- leurosine, N-desmiéthyl-N-Forinyl-leurosine et leurs sels acides d'addition à chaque fois, préparés par un procédé selon-l'une quelconque des revendications 1 à 13.