Brevet FR2469454A2 — publié le 19810522

FR 2469454 A2 19810522 FR 8006624 A 19800325 La présente addition concerne de nouveaux plasmides hybrides selon le brevet principal utiles pour modifier les propriétés des souches de microorganismes et notamment de levures ainsi que les microorganismes comportant ces plasmides hybrides. La présente addition concerne un plasmide hybride composé d'au moins tout ou partie de 1'ADN du plasmide 2 de levure, un segment d'ADN renfermant le gène URA3 de levure et un ADN du plasmide bactérien pBR 322. I1 peut être utile de rappeler que le plasmide 2 de levure est connu et une étude très complète peut en être trouvée dans "Viruses and Plasmid in Fungi" éditeur Paul A. Lemke, cet ouvrage pourra également être utilisé comme référence pour la définition de certains termes dont la définition complète ne serait pas donnée dans la présente description. Le gène URA3+ est le gène codant pour 1 'orotidine-5 '-phosphate-décarboxylase, en son absence la levure ne peut se développer que sur un milieu contenant de l'uracile.La présence ou l'absence de ce gène permet de "cribler" les levures en utilisant un milieu avec et sans uracile. Le plasmide pBR 322 est disponible à Bethesda Research Laboratory Inc., Rockville, Maryland. Dans un mode de réalisation des plasmides selon la présente invention, le segment d'ADN renfermant le gène URA3+ de levure est inséré dans 1'ADN du plasmide bactérien pBR 322, de préférence au niveau du site Hind III. Les sites de restriction Hind III correspondent aux endroits de la molécule ADN qui sont coupés par une enzyme particulière, l'endonucl se Hind III (qui sera appelée ci-après par abréviation Hind III). Il n'y a qu'un site de restriction Hind III sur le plasmide pBR 322. Les plasmides selon la présente invention peuvent comporter l'intégralité de 1'ADN du plasmide 2 mais, de préférence, ne comportent qu'une partie de 1'ADN du plasmide 2 , la partie dénommée 2 D (l'autre partie étant dénommée 2 A), par rapport aux sites de restriction Eco R1. Les sites de restriction Eco R1 correspondent aux endroits de la molécule ADN qui sont coupés par une enzyme particulière, l'endonucléase Eco R1. Dans un mode de réalisation particulièrement intéressant des plasmides de la présente invention, 1'ADN total ou la partie d'ADN du plasmide 2 est inséré au niveau du site Eco RI de 1'ADN du plasmide pBR 322. Dans un autre mode de réalisation particulièrement intéressant de la présente invention, le plasmide hybride, en particulier au niveau de 1'ADN du plasmide bactérien, comporte l'insertion d'un ADN exogène provenant d'un organisme procaryote ou surtout d'un organisme eucaryote tel qu'une levure. On peut également prévoir dans le cadre de la présente addition des plasmides hybrides dans lesquels le plasmide 2p comporte une insertion d'un ADN exogène provenant d'un organisme procaryote ou surtout eucaryote. Les plasmides vecteurs selon la presente invention peuvent être préparés par des techniques connues qui sont déjà décrites dans le brevet principal. Les plasmides hybrides peuvent être conservés tel quel ou dans une levure ou une bactérie od ils se multiplieront et pourront en être extraits à la demande. Ces plasmides peuvent être intégrés dans une levure par le procédé décrit dans le brevet principal. L'exemple suivant est destiné à illustrer un procédé de préparation de plasmides hybrides et de microorganismes selon la présente invention sans pour autant qu'il puisse être considéré comme limitant la porte de ladite invention. EXEMPLE De façon analogue aux exemples 1 et 2 du brevet principal - on prépare un plasmide pBR 322 avec le fragment portant le gène URA3+ inséré au niveau du site Hind III - on effectue la digestion partielle du plasmide obtenu par l'enzyme Eco R1 - on effectue la digestion partielle du plasmide 2 de la souche Sacharomyces cerevisiae FL 100 ATCC 28383 par l'enzyme Eco R1 - on mélange les deux produits de digestion après inhibition de l'enzyme Eco R1 et on ligature les fragments du mélange avec la ligase une nuit à 100C ;; - on extrait les plasmides obtenus et on transforme une souche de levure S. cerevisiae réceptrice ura3, c'est-à-dire ne pouvant croître sans uracile, et on sélectionne les transformants capables de croître sur milieu sans uracile. De ces transformants URA3 on extrait les plasmides qui peuvent, comme cela a été décrit, être utilisés pour transformer une souche Escherichia coli URA3 , laquelle par sélection des + souches URA3 obtenues constitue un réservoir de plasmides dont la structure est donnée dans les figures 1 et 2 ci-annexées. La figure 1 représente le plasmide pFL 1 qui comporte 1'ADN du plasmide pBR 322 (représenté en traits pointillés) avec insertion de 1'ADN du gène + URA3 (représenté en double trait) au niveau du site Hind III de 1'ADN de pBR 322 et insertion au niveau du site Eco R1 de pBR 322 d'un fragment de 1'ADN du plasmide 2 , le fragment 2 D (fragment défini par rapport aux sites Eco R1). I1 a été isolé 3 autres plasmides, pFL 2, + pFL 3et pFL 4. Pour pFL 2, 1'ADN du gene URA3 a l'orientation inverse, c'est-à-dire que le site Pst 1 se trouve à 0,8 kb du site Eco R1 pris comme origine. Les plasmides pFL 3 et pFL 4 ont le fragment 2 D dans l'orientation inverse de celle observée respectivement pour pFL 1 et pFL 2. La longueur totale de ce plasmide est de 7,652 kb. Le plasmide pBR 322 porte un gène de (Amp résistance à l'ampicilline (Ampr), gène qui code pour une pénicillinase. Dans une levure transformée par un plasmide de ce type (comme pFL 1 ou pFL 2) ce gêne bactérien est exprimé et on identifie une excrétion de pénicillinase par les levures transformées, ce qui montre l'intérêt des plasmides décrits dans la présente addition pour l'excrétion de protéines (enzymes en particulier), (CHEVALLIER M.R. et AIGLE M., Qualitative detection of penicillinase produced by yeast strains carrying chimeric yeast-coli plasmids. FEBS Letters, november 1979). Un autre avantage de ces plasmides est qu'ils démontrent que l'intégralité du plasmide 2 n'est pas indispensable à sa réplication et à son maintien dans la levure. L'avantage de cette construction est qu'elle permet d'envisager de cloner des fragments d'ADN étrangers de grande taille puisque le plasmide récepteur est plus petit. En effet, des plasmides de trop grande taille sont plus fragiles, plus difficiles à manipuler et à extraire des bactéries ou des levures. De façon identique, on obtient le plasmide pMA 1 représenté à la figure 2. Ce plasmide a la même structure que les précédents mais présente l'intégralité de 1'ADN du plasmide 2 (2 A + 2 D) au lieu du fragment 2 D. REVENDICATIONS 1) Plasmide hybride selon la revendication 1 du brevet principal comportant au moins tout ou partie de 1'ADN du plasmide 2p de levure, un segment d'ADN renfermant le gène URA3 et tout ou partie de 1'ADN du plasmide bactérien pBR 322. 2) Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce que le segment d'ADN renfermant le gène URA3+ de levure est inséré dans 1'ADN du plasmide bactérien pBR 322. 3) Plasmide selon la revendication 2, caractérisé en ce que le segment d'ADN renfermant le gène URA3 de levure est inséré dans 1'ADN du plasmide bactérien pBR 322 au niveau du site Hind III. 4) Plasmide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comporte le fragment d'ADN 2 D du plasmide 2p. 5) Plasmide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comporte tout 1'ADN du plasmide 2p. 6) Plasmide selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que 1'ADN total ou.la partie d'ADN du plasmide 2 est inséré au niveau du site Eco R1 de 1'ADN du plasmide pBR 322. 7) Plasmide selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comporte l'insertion d'un ADN d'un organisme procaryote ou eucaryote en plus du segment d 'ADN renfermant le gène URA3 de levure. 8) Un microorganisme comportant un plasmide hybride selon l'une des revendications 1 à 7. 9) Une levure selon la revendication 8.