Brevet FR2468644A1 — publié le 19810508

La présente invention concerne un procédé pour réduire la stabilité thermique de présure microbienne de Mucor par contact d'une solution aqueuse de cette présure avec une source d'oxydation de méthionine dans des conditions favorables à la réduction sensible de la stabilité thermique de la présure microbienne. Des sources d'oxydation de la méthionine sont bien connues et comprennent l'utilisation d'une photo- oxydation sensibilisée par un colorant et d'autres processus qui sont capables d'oxyder au moins une portion des résidus de méthionine en sulfoxyde de méthionine dans la présure microbienne. L'utilisation de ces sources d'oxydation de la méthionine s'est montrée favorable à une réduction appréciable de la stabilité thermique de la présure microbienne. La photo-oxydation sensibilisée par un colorant est un processus bien connu (voir Industrial and Engineering Chemistry, 55, 40 (1963)> qui est décrit dans Biochemical and Biophysica Acta, 154, 1 (1968) en tant que moyen sélectif d'oxydation de résidus de méthionine dans des substrats tels que la ribonucléase A et divers peptides de même que l'aminoacide libre. Toutefois, cette photo-oxydation de la ribonucléase A entraîne une perte notable (52-82 %) d'activité. On vient de découvrir le fait surprenant que la photo-oxydation de présure microbienne n'entraîne pas de baisse notable d'activité enzymatique avant le traitement thermique, mais réduit dans une mesure appréciable la stabilité thermique de la présure microbienne. Cette photo- oxydation est réalisée par contact d'une solution aqueuse de la présure microbienne avec de l'oxygène en présence de lumière et d'un photosensibilisateur. La lumière utilisée peut être la lumière solaire ou la lumière produite par une lampe à incandescence, une lampe fluorescente, une lampe à rayons ultraviolets, etc. On peut utiliser l'oxygène seul ou en mélange avec d'autres gaz, par exemple l'air. Les agents photosensibilisateurs comprennent le bleu de méthylène, le rose bengale, des indicateurs d'oxydo-réduction, des mélanges de ces substances, etc. Dans la pratique de la présente invention, une solution aqueuse de la présure microbienne thermiquement stable mentionnée ci-dessus est mise en contact avec la source d'oxydation de la méthionine dans des conditions favorables à une réduction sensible de sa stabilité thermique (c'est-àdire à l'accroissement de sa thermolabilité), de préférence pour obtenir une activité résiduelle de coagulation du lait, après traitement thermique, d'au moins environ 20 % de son activité initiale de coagulation du lait avant le traitement thermique, et pour atteindre notamment une stabilité thermique au moins du même ordre que celle de la présure de veau. La solution de présure microbienne ainsi traitée peut être utilisée telle quelle, concentrée ou purifiée davantage, comme peut l'exiger le procédé particulier de production du fromage. L'homme de l'art concevra que le procédé ci- dessus peut être mis en oeuvre en discontinu ou en continu et que les conditions de contact avec la source d'oxydation de la méthionine, c'està-dire la concentration des matières, le pH, la température et la durée de contact, varient largement en fonction de la stabilité thermique de la présure microbienne naturelle, du type de traitement et de l'appareillage choisi. Toutefois, ces conditions doivent être choisies de manière à ne pas affecter sérieusement l'activité initiale de coagulation du lait de la présure microbienne avant le traitement thermique. Lorsque la photo-oxydation utilisée par un colorant est le processus choisi pour oxyder la méthionine, les photo-sensibilisateurs se comportent un peu comme des catalyseurs sans subir aucune modification permanente. Ainsi, la concentration du photo-sensibilisateur peut varier entre de larges limites. La limite supérieure de concentra- tion est fonction de la solubilité du photo-sensibilisateur dans le milieu aqueux. La limite inférieure de concentration doit être suffisante pour déclencher simplement la photo- oxydation; par exemple, on a utilisé avec succès une concentration en photo-sensibilisateur d'environ 0,0025 mm à environ 1,0 mM. La concentration se situe de préférence entre environ 0,025 mM et environ 0,1 mM. Le pH du traitement se situe de préférence dans une plage d'environ 3,0 à 8,0. A des valeurs de pH très supérieures à environ 8,0, l'enzyme est indésirablement désactivé et a des valeurs de pH bien inférieures à 3,0, la solubilité et l'activité de l'enzyme baissent et la durée de réaction augmente. Lorsque la photo-oxydation sensibilisée par un colorant constitue le moyen choisi d'oxydation de la méthionine, il est préférable d'éliminer toutes quantités résiduelles ou excessives du photo-sensibilisateur par toute opération commode qui ne désactive pas la présure microbienne. Par exemple, des photo-sensibilisateurs tels que le bleu de méthylène et le rose bengale peuvent être aisément éliminés de la solution traitée de présure par extraction par un solvant, dialyse, etc. On connaît des photosensibilisateurs liés à des supports solides tels que des résines d'échange ionique. Si l'on utilise un photo- sensibilisateur lié de ce genre, on peut l'éliminer de la présure microbienne par simple séparation physique du support de la solution. La stabilité thermique de la présure microbienne ainsi traitée est déterminée dans des conditions qui sont normalement utilisées pour la pasteurisation de solutions de lactosérum pour la production du fromage. Dans les conditions appréciées de la présente invention, les enzymes traités se révèlent aussi thermolabiles que la présure de veau lorsqu'ils sont soumis aux mêmes conditions thermiques. Le concept de la présente invention est illustré par les exemples suivants, donnés à titre non limitatif. EXEPJ=H 1 Cet exemple illustre le traitement de présure microbienne de Mucor par un processus d'oxydation de la méthionine consistant en une photo-oxydation sensibilisée par un colorant. On se procure dans le commerce deux bouillons aqueux de fermentation de présure microbienne élaborée par Mucor miehei (pH 4,85), le bouillon portant le numéro de code MR-160 contenant 79 680 US/ml et le bouillon portant le numéro de code MR-40 contenant 19 920 US/ml. On prépare une solution de bleu de méthylène 0,2 mM en dissolvant 74,8 mg du colorant dans 1000 ml d'eau. On prépare séparément des échan- tillons d'essai contenant 3 ml du bouillon aqueux et 1 ml du colorant. L'échantillon d'essai ainsi préparé (MR-160 ou MR- ) contient respectivement 59 760 US/ml ou 14 940 US/ml de l'enzyme et 0,05-mM du colorant. On introduit les échantil- lons d'essai dans des tubes à essai de 1,1 x 10 cm que l'on dispose ensuite dans une chambre d'irradiation à égale distance (38 cm) entre deux ampoules à incandescence de 150 W refroidies par des ventilateurs à air. On ne maintient pas la température constante mais on la laisse croître graduelle- ment, sous l'effet de la chaleur de l'incandescence, depuis une température initiale d'environ 24WC jusqu'à un maximum d'environ 37WC pendant l'irradiation. Pour photo-oxyder les échantillons d'essai, on allume les lampes et on fait passer lentement un courant d'oxygène dans l'échantillon d'essai pendant une période de 5 heures. Pour préparer les échantillons destinés à éprouver l'activité de coagulation du lait à la fin de la période d'irradiation, on dilue les échantillons d'essai à 100 ml avec-un tampon au phosphate de sodium 0,2 M (pH 5,5). L'échantillon d'essai portant le numéro de code MR-160 est encore dilué avec un tampon au phosphate de sodium 0,2 M (pH 5,5). On prépare des échantillons témoins en diluant 3 ml des bouillons enzymatiques initiaux à un volume de ml avec le tampon au phosphate de sodium 0,2 M (pH 5,5). Le témoin portant le numéro de code MR-160 est encore dilué (1:8 volume à volume) avec le tampon au phosphate de sodium 0,2 M (pH 5,5). On détermine ensuite les activités de coagula- tion du lait (CL) des échantillons d'essai dilués et des témoins. On détermine la stabilité thermique des échantillons d'essai et des témoins dans des conditions de pasteurisation impliquant une température de 660C et une durée de 10 minutes. Après ce traitement thermique, on refroidit les échantillons en les plongeant dans un bain de glace et d'eau et on éprouve leurs activités résiduelles de coagulation du lait que l'on exprime par un pourcentage de l'activité initiale avant la pasteurisation. Les résultats sont reproduits sur le tableau A suivant TABLEAU A % de l'activité Activité résiduelle CL initiale avant %, après la pasteu- Echantillon la pasteurisation risation MR-160, Témoin 100 81 MR-160, Essai 90,5 65 MR-40, Témoin 100 80,7 MR-40, Essai 98,9 8,7 Les résultats reproduits sur le tableau A démontrent que la photo-oxydation sensibilisée par un colorant est capable de réduire de façon spectaculaire la stabilité thermique de la présure microbienne ainsi traitée, comparativement au témoin non traité. EXEMPLE 2 Cet exemple illustre l'efficacité de la photo- oxydation sensibilisée par un colorant utilisée dans la présente invention comme moyen d'oxydation de la méthionine. Un échantillon d'une présure microbienne naturelle (non traitée) de Mucor miehei est soumis à une purification poussée par la méthode suivante de purification décrite dans J. of Dairy Science, 54, 159-167 (1971). L'échantillon est précipité au sulfate d'ammonium, dissous dans l'eau, dialysé vis-à-vis d'eau de ville et lyophilisé. L'échantillon lyophilisé est ensuite séparé sur une colonne de résine d'échange ionique "Amberlite CG50" au moyen d'un éluant consistant en un tampon d'acétate de sodium 0,1 N (pH 4,75) et les fractions d'élution désirées contenant la majeure partie de l'activité enzymatique sont rassemblées et concentrées par ultrafiltration. L'échantillon concentré est ensuite séparé par chromatographie sur une colonne de carboxyméthylcellulose, l'élution étant effectuée au moyen de solutions tampons d'acétate de sodium 0,1 M (pH 3,6 puis pH 4,5) et les fractions d'élution intéressantes sont recueillies et concentrées par ultrafiltration. On soumet ensuite l'échantillon résultant à un gradient d'élution sur une colonne de carboxyméthylcellulose en utilisant des gradients linéaires préparés à partir d'acétate de sodium 0,1 M (pH 3,6) et d'acétate de sodium 0,1 M (pH 4,8). Les fractions d'élution intéressantes sont rassemblées, dialysées vis-à-vis d'eau et lyophilisées. On prépare une solution-mère aqueuse de présure microbienne en dissolvant 20 mg de présure microbienne purifiée de Mucor miehei dans 20 ml d'eau distillée pour obtenir une solution dont le pH non ajusté est égal à 4,85. On ajoute ensuite à la solution-mère 20 ml de solution de bleu de méthylène 0,2 mM. La solution ainsi préparée contient 5000 US/ml de présure et 0,1 mM de colorant. On photo-oxyde des portions aliquotes de 10 ml de cette solution pendant 30 minutes de la manière décrite dans l'exemple 1. On détermine les activités de coagulation du lait des échantillons photo- oxydés et d'un témoin non traité. On détermine la stabilité thermique des échantillons traités et d'un témoin non traité en utilisant la méthode de pasteurisation décrite dans l'exemple 1. Les activités de coagulation du lait sont mesurées après pasteurisation et exprimées par un pourcentage de l'activité initiale avant la pasteurisation. Les résultats obtenus sont reproduits sur le tableau B ci-dessous. TABLEAU B % de l'activité Activité CL résiduelle CL initiale avant %, après la pasteu- Echantillon la pasteurisation risation Témoin 100 93 Echantillon -d'essai 84,6 37 Les résultats donnés sur le tableau B ci-dessus démontrent que la photo-oxydation est capable de réduire de façon spectaculaire la stabilité thermique de l'enzyme, exprimée par ses activités de coagulation du lait et compa- rativement au témoin non traité. On dialyse encore une portion de l'échantillon photo-oxydé (cellulose en tube) vis-à-vis d'eau pour enlever le colorant. L'échantillon dialysé est ensuite lyophilisé. L'échantillon lyophilisé et laàprésure microbienne purifiée naturelle sont soumis à une hydrolyse alcaline. On dissout il mg de chaque enzyme dans 1 ml de solution d'hydroxyde de sodium 4 N contenant 25 ml d'amidon soluble comme anti- oxydant, on place la solution dans des tubes scellés dans lesquels on fait un vide et on les chauffe à 1101C pendant 16 heures pour hydrolyser l'enzyme. Après l'hydrolyse, on refroidit les échantillons, on les dilue à 10 ml et on soumet des portions de 20 pl à une analyse automatique des amino- acides. Les profils partiels des aminoacides sont indiqués sur le tableau C suivant. TABLEAU C Quantité (ng) Etat Etat photo- Aminoacide naturel oxydé Sulfoxyde de méthionine 0 151 Acide aspartique 2370,4 2029,9 Thréonine 45,6 37,5 Sérine 406,1 406,2 Acide glutamique 1455,7 1573,9 Proline 22,7 22,3 Glycine 1621,9 1674,5 Alanine 1567,5 1663, 8 Valine 608,2 642,3 Méthionine 334,8 213,8 Les résultats reproduits sur le tableau C ci- dessus démontrent que la photo-oxydation sensibilisée par un colorant a pour effet d'oxyder une portion des résidus de méthionine de l'enzyme en sulfoxyde de méthionine. EXEMPLE 3 Cet exemple illustre le traitement de présure microbienne de Mucor par photo-oxydation sensibilisée par un colorant dans une large plage de pH et pendant une brève durée de contact. On prépare une solution-mère aqueuse de présure microbienne en dissolvant 30 mg de présure microbienne purifiée de Mucor miehei dans 15 ml d'eau distillée pour obtenir une solution à 20 000 US/ml. On prépare une solution de bleu de méthylène 0,2 mM en dissolvant 74,8 mg du colorant dans 1000 ml d'eau. On prépare une solution 0,2 mM de rose bengale en dissolvant 203,5 mg du colorant dans 1000 ml d'eau. On prépare divers tampons au phosphate de sodium 0,2 M pour obtenir des valeurs de pH allant de 3,0 à 8,0. On prépare des échantillons d'essai contenant 1 ml de la solution-mère de l'enzyme, 2 ml de l'une des solutions de colorant et 1 ml d'eau (les échantillons ayant donc un pH initial non ajusté de 4, 85) ou 1 ml d'une solution tampon pour ajuster le pH de l'échantillon d'essai entre 3,0 et 8,0. Les échantillons d'essai ainsi préparés contiennent 5000 US/ml d'enzyme et 0,1 mM du colorant respectif. On prépare des échantillons témoins de l'enzyme d'une manière similaire sans tampon ni colorant en utilisant un volume comparable d'eau de remplacement. Les échantillons sont ensuite photo-oxydés comme décrit dans l'exemple 1 pendant une courte période de minutes. Après l'irradiation, chacun des échantillons est dialysé (cellophane en tube) vis-à-vis d'eau pour éliminer le colorant et le tampon. La matière restante est ensuite diluée à 50 ml avec un tampon au phosphate de sodium 0,2 M (pH 5,5). On détermine ensuite les activités de coagulation du lait. Les résultats obtenus sont reproduits sur le tableau D ci- dessous. TABLEAU D % de l'activité CL initiale Bleu de Rose pH de traitement méthylène bengale 3,0 85,1 73,0 4,85(H20) 79,2 ND 5,0 87 63,8 ,5 88,4 57,7 6,0 80,9 74,5 6,5 72,2 75 7,0 70,4 57,1 7,5 49,6 37,3 8,0 11,2 ND* Non déterminé Un témoin traité de la même façon, sans colorant ni tampon, préparé avec 1 ml de la solution-mère d'enzyme et 3 ml d'eau, garde 74 % de l'activité initiale de coagulation du lait. Une comparaison des résultats reproduits sur le tableau D ci-dessus montre que la présure microbienne peut être traitée par oxydation sensibilisée par un colorant dans une large plage de pH de 3,0 à 8,0. Le pH se situe de préférence entre 3,0 et 7,5. La stabilité thermique de chacune des portions traitées de présure microbienne a été déterminée par la méthode de pasteurisation décrite dans l'exemple 1. Les activités de coagulation du lait ont été mesurées après pasteurisation et ont été exprimées par un pourcentage de l'activité initiale avant la pasteurisation. Les résultats sont reproduits sur le tableau E ci-après. TABLEAU E pH de traitement Durée de pas- teurisation % d'activité CL résiduelle (Minutes) à 66 C 3,0 4,85 (H20) ,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 Témoin (sans colorant) Non déterminé. o0 o o o Bleu de méthylène Rose bengale ND ND 1 1 Les résultats reproduits sur le tableau E ci- dessus démontrent clairement que le traitement de photo- oxydation sensibilisée par un colorant, même lorsqu'on utilise une brève durée de contact, a pour effet de réduire la sensibilité thermique de l'enzyme même dans une large plage de pH, de préférence à un pH compris entre 3,0 et 7,5. REVENDICATIONS 1. Procédé pour réduire la stabilité thermique de présure microbienne de Mucor, caractérisé en ce qu'il consiste à faire entrer une solution aqueuse de cette présure en contact avec une source d'oxydation de la méthionine dans des conditions propres à réduire sensiblement la stabilité thermique de la présure microbienne. 2. Procédé suivant la revendication 1, caracté- risé en ce que le mode d'oxydation de la méthionine est une photooxydation sensibilisée par un colorant qui consiste à faire entrer la solution aqueuse de- présure en contact avec de l'oxygène en présence de lumière et d'un photo- sensibilisateur. 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que le photo-sensibilisateur est le bleu de méthylène ou le rose bengale. 4. Une présure microbienne de Mucor de stabilité thermique sensiblement réduite, obtenue conformément au procédé suivant la revendication 1. 5. Procédé de production de fromage, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre du lait à l'action coagulante de la présure microbienne suivant la revendication 4. 6. A titre de produit industriel nouveau, un fromage-obtenu conformément au p'r'océdé suivant la revendica- tion 5.