Brevet FR2467214A1 — publié le 19810417

La présente invention concerne un procédé de production d'érythropolètine et, plus particulièrement, un procédé de préparation d'érythropolètine partiellement purifiée par séparation de l'urine humaine par adsorption. L'érythropolètine est une hormone stimulant de façon spécifique l'érythropolèse. C'est un facteur essentiel pour la différenciation des cellules hémato- poIétiques souches en érytbrocytes développés dont la déficience entraîne l'anémie. Ainsi, l'érythropo!ètine est un médicament prometteur pour guérir l'anémie ou, en particulier, l'anémie rénale mais, malheureusement on ne l'utilise pas en pratique à cause de sa faible dispono- bilité. L'érythropolètine est une sorte de protéine de telle sorte que quand on désire l'utiliser comme médicament, elle doit être préparée à partir d'une matière première d'origine humaine à cause de l'action antigène possible. Comme matière première d'origine humaine pour la prépara- tion de l'érythropolètine, on peut proposer par exemple du sang humain ou de l'urine de malades souffrant d'anémie aplastique ou d'une maladie semblable, malades dont l'urine contient de grandes quantités d'érythropolètine. Ces matières premières cependant sont disponibles en quantité limitées.En conséquence, il serait très avantageux de développer un procédé pratique pour sa préparation à partir d'urine d'homme en bonne santé disponible en grandes quantités. Grâce à ce procédé on pourrait obtenir de grandes quantités d'érythropolètine malgré sa concentration bien plus faible que dans les matières premières citées ci-dessus. On a réalisé plusieurs tentatives pour obtenir de l'érythropolètine purifiée à partir de matières pre- mières d'origine humaine. Ces essais cependant sont orientés vers la préparation d'érythropol&tineàpetldematères premières en faibles quantités, telles que le sang humain ou l'urine de patients anémiés. Ces procédés de l'art antérieur ne peuvent convenir au traitement de grandes quantités d'urine d'homme en bonne santé contenant de l'érythropolètine seulement à faible concentration, du point de vue du degré de concentration, du pourcentage de récupération, de la mise en oeuvre du procédé et des coûts de production. Un moyen prometteur et pratique de sépara- tion d'érythropolètine de grandes quantités d'urine humaine consiste en une méthode d'adsorption avec un adsorbant qui est mis en contact direct avec l'urine. Aucun procédé, de cette sorte,d'adsorption directe n'a été proposé jusqu'à maintenant pour traiter non seulement l'urine d'homme en bonne santé mais aussi l'urine de malades anémiés. Tous les procédés par adsorption proposés jus- qu'ici sont précédés pat une concentration préliminaire ou une purification partielle de l'érythropolètine par précipitation avec un précipitant convenable ou un solvant organique, relargage, dialyse ou procédés semblables, puis l'érythropo!ètine ainsi partiellement purifiée est adsorbée sur un-adsorbant tel que, par exemple des matériaux échangeurs d'ions anioniques.Les inventeurs ont essayé de réaliser l'adsorption directe de l'érythropolè- tine sur un adsorbant tel que la diéthylaminoéthylcellulose, les résines d'échange d'ionsanioniquesfortement ou faible- ment basiques ou analogues en mettant en contact directe- ment ces adsorbants avec de l'urine humaine mais sans succès, car l'érythropolètine est peuadsorbée par ces adsorbants. En conséquence, c' est un objet de la présente invention de procurer un procédé nouveau et amélioré pour préparer efficacement de l'érythropolètine à partir de l'urine humaine. C'est un autre objet de la présente invention de procurer un procédé efficace et économique pour la production d'une préparation d'érythropoIètine partielle- ment purifiée en utilisant un adsorbant spécifique qui peut adsorber sélectivement l'érythropolètine même direc- tement de l'urine humaine. Ainsi, le procédé selon la présente invention pour la préparation d'érythropolètine à partir d'urine humaine comprend les étapes de(a) ajuster le pH de l'urine humaine dans un domaine compris entre 6 et 8, si le pH de l'urine est hors de ce domaine, (b) mettre en contact l'urine humaine ayant un pH ainsi contrôlé avec un adsorbant sélectionné dans le groupe comprenant une résine adsorbante poreuse à base de polystyrène, le chitosane et la terre àdiatoméoE pour ainsi adsorber l'érythropolètine sur ledit adsorbant, (c) séparer l'adsorbant ayant adsorbé l'érythropo!ètine de l'urine traitée, et (d) éluer l'érythropolètine adsorbée de l'adsorbant. La matière première du procédé selon l'invention est l'urine humaine. L'urine humaine peut être utilisée telle quelle, ou après récupération de certains autres ingrédients utilisables, en petites quantités, tels que l'urokinase ou analogue. Des précipités peuvent être formés dans l'urine humaine quand le pH de l'urine est supérieur à 7, de telle façon qu'il est préférable mais non essentiel que l'urine humaine soit rendue en premier lieu faiblement alcaline et les précipités ainsi formés sont éliminés avant l'adsorption. Par ce traitement préliminaire, un peu d'érythropolètine est perdu. L'efficacité du procédé selon l'invention n'est pas affectée de façon essentielle même sans traitement préliminaire à l'exception de quelques inconvénients dans la procédure subséquente. Puis, le pH de l'urine est ajusté entre 6 et 8 par addition d'un acide organique ou inorganique convenable tel que l'acide chlorhydrique ou d'une base telle que la soude ou l'ammoniaque. Quand le pH de l'urine est en dehors de ce domaine, l'adsorption de l'érythropolètine décroît remarquablement. L'étape suivante consiste à mettre en contact l'urine ayant un pH ainsi contrôlé avec un adsorbant de telle façon que l'érythropolètine qui y est contenue soit de façon efficace et sélective adsorbée sur ledit adsorbant Comme adsorbantsapproprié on peut citer les résines adsor- bantes poreuses à base de polystyrène, le chitosane et la toreà diatomée. L'urine passe à travers une colonne remplie avec ledit adsorbant ou l'urine est mélangée avec une quantité appropriée dudit adsorbant et agitée pour former une suspension dudit adsorbant dans l'urine. La quantité d'adsorbant que l'ondoit utiliser dépend des types d'adsorbant utilisé et de la quantité d'érythropolètine contenue dans l'urine. En général, une quantité de 1 g ou moins d'adsorbant par 100 ml d'urine est suffisante. Ainsi, le procédé selon l'invention est très avantageux sur le plan économique, les adsorbants précités étant bon marché et le degré de concentration de l'ingrédient désiré étant élevé. De plus, ces adsorbants se dispersent facilement et précipitent rapidement quand ils sont en suspension dans l'urine de telle sorte que le procédé d'adsorption est grandement facilité. En utilisant le procédé selon l'invention, une production pratique d'érythropo!ètine à partir dyurine d'homme en bonne santé peut être menée avec succès. L'adsorption de l'érythro- polètine sur l'adsorbant est en général menée à la température ambiante ou à une température inférieure à la température ambiante. L'adsorbant ayant adsorbé l'érythropolètine est alors séparé de l'urine traitée et soumis à une élution. Ce procédé d'élution dépend du type d'adsorbant. Par exemple, l'élution de la résine adsorbante poreuse à base de polystyrène est menée en utilisant une solution d'éluant qui peut être un solvant alcoolique tel que l'alcool méthylique, l'alcool éthylique ou analogue, une solution alcaline aqueuse ou leur mélange. L'élution du chitosane ou de la temà diatoméesest d'autre part menée en utilisant une solution alcaline aqueuse contenant de la soude, de l'ammoniaque, du carbonateé de sodium ou analogue. L'activité de l'érythropoiètine est déterminée grâce au test sur une souris exhypoxique polycythémique proposé par P.M. Cotes (voir P.M. Cotes et D.R. Bangham, Nature, volume 191 (1961), page 1065) si nécessaire, après concentration et dialyse, et les résultats sont comparés avec la courbe de calibrage (voir L. Annable, P.M. Cotes et M.V. Mussett, "Bulletin of World Health Organization", volume 47 (1972), page 99) préparée en utilisant la préparation de référence internationale d'érythropolètine (WHO Second International Reference Preparation of Erythropoietin, 67/343) et exprimée en unités interna- tionnales (UI). De plus, l'activité spécifique, c'est-à- dire la valeur déterminée ci-dessus en unités internation- nales par milligramme du conenuenprotéine dans l'échantil- lon, est déterminée avec le contenu en protéine déterminé par le procédé biuret avec de l'albumine de sérum bovin purifié comme référence (voir A.G. Gornall, C.S. Bardawill et M.M. David, "Journal of Biological Chemistry", volume 177 (1949), page 751). Les exemples qui suivent illustrent la présente invention en plus de détail afin de mieux éclaircir son mode de réalisation pratique mais ils ne doivent en aucun cas être considérés comme limitant le cadre de la présente invention, parce que de nombreuses variations et modifica- tions sont possibles. Exemple 1 Le pH de 10 litres d'urine d'être humainmMe en bonne santé est ajusté à 8, 5 par addition de petites quantités d'une solution de soude 2N, après quoi des précipités se forment dans l'urine. La quantité totale d'érythropoIètine dans l'urine est de 14,9 UI. Après élimination des précipi- tés par décantation, le pH de l'urine est ramené à 7,1 par addition d'acide chlorhydrique 2N et 100 grammes d'une résine adsorbante poreuse à base de polystyrène (Amberlite XAD-7, un produit de Rohm et Haas Co.) y sont ajoutés. Après une heure et demie d'agitation à température ambiante, on laisse décanter pour récupérer la résine. La quantité d'érythropoiètine contenue dans le liquide au-dessus de la résine décantée est inférieure à 1 U.I de telle sorte que plus de 93% de l'érythropoîètine de 2467214 l l'urine de départ est adsorbéesur la résine. La résine obtenue ayant adsorbé l'érythropolètine est dispersée dans 400 ml d'une solution tampon de 0,01M à pH 9,24 contenant 80% en volume d'alcool éthylique et agitée pendant 3 heures à 7 C. La filtration de la suspen- sion donne une solution d'éluat qui contient 13,6 UI d'érythropolètine, soit un taux de récupération de 91%. L'activité spécifique (UI/mg de protéine) de cette solution d'éluat a une valeur égale à 6,1 fois la valeur de l'urine de départ. On a calculé que 90,3% de l'érythropolètine reste dans l'urine après élimination des précipités formés dans la phase de prétraitement à pH de 8,5. Dans un but de comparaison, la même procédure que celle indiquée cidessus est répétée à l'exception près que le pH de l'urine mise en contact avec l'adsorbant est de 5,72 au lieu de 7,1. Seulement 23% de l'érythro- polètine a été alors adsorbé sur l'adsorbant. Exemple 2 Le pH de 10 litres d'urine d'être humain mâle en bonne santé contenant 7, 5 UI d'érythropolètine est ajusté à 8,5 par addition d'une solution de soude 2N et les précipités formés sont éliminés par décantation. Après avoir ramené le pH de l'urine à 7 par addition d'acide chlorhydrique 2N, l'urine est mélangée avec 87 g de chitosane (FLONAC-N produit par Kyowa Yushi Kogyo Co.) et agitée pendant une heure et demie à la température ambiante. Le liquide est éliminé par décantation pour récupérer le chitosane. Le chitosane ayant adsorbé l'érythropolètine est dispersé dans 800 ml d'une solution tampon au carbonate de sodium 0,1M à pH 11 contenant du chlorure de sodium 0,5M et agité pendant 3 heures à 7 C puis filtré pour donner un éluat. La quantité d'érythropolètine dans cet éluat est de 5,93 UI, ce qui correspond à un taux de récupération de 79%. L'activité spécifique (UI/mg de protéine) dans l'éluat ci-dessus possède une valeur égale à 14,6 lois la valeur correspondante dans l'urine de départ. Dans un but de comparaison, la même procédure est répétée à l'exception près que le pH de l'urine mise en contact avec le chitosane est de 5,98 au lieu de 7, le taux de récupération de l'érythropoiètine dans ce cas est seulement de 48%. Exemple 3 Le pH de 10 litres d'urine d'être humain mâle en bonne santé contenant 11, 2 UId'érythropolètine est ajusté à 8,5 par addition d'une solution de soude 2N et les précipités formés sont éliminés par décantation. Après avoir ramené le pH à 7 par addition d'acide chlorhydrique 2N, l'urine est mélangée avec 100 g de terre à diatomées (Hyflo Super-Cel, produit par Johns-Manville Corp.) et agitée pendant 35 minutes à la température ambiante. Le liquide est éliminé par décantation et l'on récupère la terre à diatomées. La 'lle à diatom6es ayant adsorbé l'érythropoiètine est dispersée dans 400 ml d'une solution ammoniacale à 4% à pH 12,3 et agitée pendant 35 minutes à 7 C puis filtrée pour donner un éluat. La quantité dérythropoiètine dans cet éluat est de 5,69 UI, ce qui correspond à un taux de récupération de 50,8%. L'activité spécifique (UI/mg de protéine) dans cet éluat a une valeur correspondant à 12,7 fois la valeur correspondante dans l'urine de départ. Dans un but de comparaison, la même procédure que celle indiquée cidessus est répétée à l'exception près que le pH de l-urine mise en contact avec la terre à diatoméesest de 4,3 au lieu de 7. Dans ce cas, le taux de récupération d'érythropoiètine est seulement de 9,7%. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre de la protection comme revendiquée. R E V E N D I C A T I 0 N S 1.- Procédé de production d'érythropolètine purifiée à partir de l'urine humaine caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: (a) ajuster le pH de l'urine dans un domaine compris entre 6 et 8, si le pH de l'urine est en dehors de ce domaine, (b) mettre en contact l'urine ayant un pH ainsi contrôlé avec un adsorbant sélectionné dans le groupe comprenant une résine adsorbante poreuse à base de poly- styrène, le chitosanè et la tereà diatomées,pour ainsi adsorber l'érythropolètine sur ledit adsorbant, (c) séparer ledit adsorbant ayant adsorbé l'érythropolètine de l'urine traitée, et (d) éluer l'érythropolètine dudit adsorbant. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape (a) est précédée des étapes préliminaires consistant à élever le pH de l'urine à 7 ou plus, pour qu'ainsi se forment des précipités dans l'urine et à éliminer les précipités de l'urine. 3.- Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'étape (d) est menée en utilisant une solution aqueuse alcaline comme éluant.