Brevet FR2467215A1 — publié le 19810417

La présente invention concerne un nouvel antibiotique, la Botryticidine A, ainsi qu'un procédé pour sa préparation et une composition fongicide pour l'agriculture et l'horticulture contenant la Botryti- cidine A en tant qu'ingrédient actif. La Botryticidine A de l'invention est pro- duite par culture d'une bactérie productrice de Botryticidine A appartenant au genre Bacillus et par fractionnement du bouillon de culture. Parmi les antibiotiques connus, on peut citer ceux qui sont produits à partir du microorga- nisme appartenant au genre Bacillus.A titre d'exemple, les Bacileucines A et B qui sont produites à partir d'un microorganisme appartenant à l'espèce Bacillus servent toutes deux d'ingrédients actifs dans une composition fongicide pour l'agriculture et l'horti- culture et sont de nouveaux antibiotiques que la demanderesse est la première à avoir développés (voir le brevet des Etats-Unis d'Amérique no 4 181 714). Il a été découvert que les Bacileucines A et B pro- duisent un effet très puissant contre les principales maladies du riz, à savoir la brûlure et l'anthracnose du rizet contre des maladies affectant diverses autres plantes telles que la pourriture grise et l'anthrac- nose du concombre, la tache noire de la poire et la pourriture maculée de la vigne. Il a en outre été découvert que les nouveaux antibiotiques Bacileucines A et B ne présentent aucune phytotoxicité vis-à-vis de tous les types de plantes et qu'elles ne produisent aucun effet défavorable sur l'organisme humain. La présente invention concerne un nouvel antibiotique basique, la Botryticidine A, produit à partir d'un microorganisme appartenant au genre Bacilluset exerçant un puissant effet d'inhibition sur la croissance de diverses bactéries pathogènes des plantes, ainsi qu'un procédé pour sa préparation et qu'une composition fongicide pour l'agriculture et l'horticulture contenant de la Botryticidine A en tant qu'ingrédient actif. Le nouvel antibiotique de l'invention, la Botryticidine A, produit un puissant effet contre les maladies de- certains végétaux, telles que les princi- pales maladies du riz, à savoir la brûlure du riz, l'Helminthosporiose et l'anthracnose du riz, plusieurs maladies affectant les légumes, à savoir la pourriture grise, l'anthracnose, le blanc et les taches anguleuses du concombre, la sclérotiniose de la tomate, le black- rot de la patate douce, la pourriture molle du chou de Chine et plusieurs maladies des fruits telles que la maladie des taches noires de la poire et les taches anguleuses de la vigne. Cet antibiotique ne présente aucune phytotoxicité vis-à-vis des autres plantes et n'exerce aucun effet défavorable sur l'organisme humain lors de son application. La figure 1 représente le spectre d'absorption ultraviolet-de la Botryticidine A de l'invention et la figure 2 représente le spectre d'absorption infrarouge de la Botryticidine A. - Le nouvel antibiotique de l'invention, la Botryticidine A et son procédé de préparation sont décrits plus en détail ci-après. Le microorganisme utilisé dans la présente invention est capable de produire de la Botryticidine A et appartient au genre Bacillus. On peut en citer comme exemple le Bacillussubtilis AJ1316 qui présente la propriété mentionnée ci-dessus de produire de la Botryticidine A. Cette souche peut avantageusement être utilisée dans le procédé de l'invention. D'après le "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (8ème édition)", le Bacillus subtilis AJ1316 (NRRL B-12231) (désigné ci-après "sp. AJ1316") décrit ci-dessus est une souche appartenant au genre Bacillus subtilis. Le sp. AJ1316 a été déposé à l'Institut de Recherche sur la Fermentation, à l'agence pour la Science et la Technologie Industrielle, Ministère du Commerce International et de l'Industrie sous la rubrique FERM et avec pour numéro d'accès, FERM-P n0 5154 et à la collection de cultures de-la Recherche en Agriculture (désignée ci-après par "NR1L") (1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604) sous la rubrique NRRL avec le numéro d'accès B-12231 et est déposé au NRRL avec libre accès au public. La souche sp. AJ1316 (NRRL B-12231) est un exemple de microorganisme pouvant être utilisé dans l'invention. On peut non seulement utiliser dans l'invention des mutants naturels et artificiels du sp. AJ1316 (NRRL B-12231) mais également toutes les espèces appartenant au genre Bacilluset capables de produire de la Botryticidine A. Le procédé de l'invention permet de cultiver une bactérie productrice de Botryticidine A appartenant au genre Bacillusselon un procédé classique de produc- tion d'antibiotiques. La méthode de culture n'est pas déterminante et on peut adopter une méthode de culture liquide ou solide. Pour réaliser de façon avantageuse la culture à l'échelle industrielle, il est recommandé d'utiliser un procédé consistant à inoculer dans un bouillon de culture une suspension de spores ou un bouillon de culture d'une bactérie productrice de Botryticidine et d'effectuer la culture sous aération et avec agitation. La source nutritive utilisée dans l'invention n'est pas particulièrement déterminante et on peut utiliser n'importe quelle source nutritive couramment utilisée pour la culture des microorganismes. A titre d'exemple, on peut utiliser comme source de carbone des composés du carbone pouvant être assimilés tels que le glucose, le saccharose, le lactose, le maltose, l'amidon, la dextrine, la mélasse, le glycérol et la cellulose,et comme source d'azote, on peut utiliser des substances azotées telles que la liqueur -de mais, la poudre de soja, la poudre de graine de coton, le gluten de blé, la peptone, les extraits de viande, les extraits de levure, la levure, un hydrolysat de protéine du soja, un hydrolysat de la caséine, des sels d'ammonium et des nitrates. On peut si on le souhaite, ajouter un agent anti-mousse tel que l'huile de silicone, l'huile de soja, un agent tensio-actif, etc. On peut choisir la température de culture -15 dans une gamme qui n'empêche pas la production de Botryticidine A. Celle-ci se situe entre 20 et 350C et de préférence, entre 25 et 300C. Le temps de culture varie en-fonction des autres conditions de cultures, mais est d'ordinaire compris entre 24 et 96 heures et'de préférence, entre 24 et 48 heures. Le pH initial du bouillon de culture est ajusté à environ 6,0-6,8. Il est souhaitable d'achever la culture lorsque le pouvoir de la Botryticine A atteint son niveau le plus élevé. La Botryticidine A s'accumule dans le bouillon dans lequel la bactérie productrice de Botryticidine A a été ainsi cultivée. En conséquence, on retire les cellules du bouillon de culture pour séparer et recueillir la Botryticidine A. Un exemple du procédé de séparation et de purification de la Botryticidine A est décrit ci-après: On-cultive la souche sp. AJ1316 (NRRL B-12231) à 270C pendant 24 heures dans un milieu de culture sur plan incliné ( milieu de culture YMG) contenant 0,3 % d'extrait de levure, 0,3 % d'extrait de malt, 0,5 % de polypeptone, 1,0 % de glucose et 1,5 % d'agar- agar. On inocule la souche cultivée dans le milieu incliné mentionné cidessus dans 100 ml d'un bouillon de culture (stérilisé à 120 C pendant 20 mn), pH initial = 6,2) contenant 2 % d'amidon, 2 % de glucose, 2 % de poudre de soja.et 0,05 % d'agent anti-mousse (ingrédient principal: polypropylene glycol) placée dans un flacon Sakaguchi, puis on la cultive à 27 C pendant 24 heures (pré-ensemencement). On procède ensuite à la culture de la semence puis on effectue la culture principale, ce qui donne le bouillon de culture contenant de la Botryticidine A. Culture inclinée sp. AJ1316 (NRRL B-12231) milieu de culture YMG, 27 C, 24 h Pré-ensemencement Dans un flacon Sakaguchi, contenance: 100 ml, 27 C, 24h (volume de semence: 2 %) lie Ensemencement Quantité: 20 l, 27 C, 24 h. Iagitation: 350 t/mn aération: 1/2 v/v /min. pression interne: 0,5 kg/cm2, Ir t (volume de semence 2 %) Culture principale Quantité: 300 ú, 27 C, 24-48 h agitation: 300 t/mn aération: 1/2 v/v /min. pression interne: 0,5 kg/cm2 Bouillon de culture contenant de la Botryticidine A Le-bouillon de culture contenant la Botrytici- dine A ainsi obtenu est soumis à une centrifugation pour éliminer les cellules. On fait passer le liquide sur- nageant résultant dans une colonne garnie d'une résine d'adsorption telle qu'une résine échangeuse de cations Dowex-50 W (de type H) (marque commerciale). On fait passer de l'eau distillée dans la colonne jusqu'à ce qu'il ne reste plus de composés organiques dans l'éluat. On élue les substances adsorbées avec une solution aqueuse IN de NH4OH puis avec de l'eau distillée jusqu'à ce que la valeur du pH atteigne 8. On recueille la totalité de l'éluat dont le pH est supérieur à 8 et on le concentre en-dessous de 400C pour en éliminer l'ammoniaque. On fait passer le concentré obtenu dans une colonne garnie d'une substance telle qu'une résine échangeuse d'ions CM-Sephadex C-25 (marque commerciale> puis on fait passer de l'eau distillée dans cette colonne pour éliminer totalement les substances non adsorbées. On élue ensuite les substances adsorbées en utilisant un gradient linéaire 0,1 M-1,0 M de NaCi et l'on soumet chaque fraction éluée à des essais in vitro selon la méthode du disque de papier. On trouve une substance active dans la fraction finale qui est éluée par environ 0,68 M de NaCl.. On lyophilise la fraction active, puis on la désale par voie dialytique. On lyophilise de nouveau la solution ainsi dialysée, ce qui donne de la Botryticidine A sous forme d'une poudre blanche. Les diverses opérations décrites ci-dessus peuvent être représentées par l'organigramme suivant Bouillon de culture Les cellules sont éliminées par centrifugation Adsorption sur Dowex 50 W (H | élué avec du NH4OH iN Eluat (pH: inférieur à 8) Concentré à moins de 40 C sous 4ffi vide pour éliminer NH3 Concentré Adsorption sur du CM-Sephadex C-25 Elué avec un gradient linéaire de Q,1 à 1,0 M de NaCl Eluat Fraction active (éluée avec environ 0,68 M de NaCl) Lyophilisation (concentré jusqu'à un volume 41 -de 1/10) Dialyse Lyophilisation 1, Poudre blanche (Botryticidine A) La Botryticidine A ainsi obtenue est un nouvel antibiotique présentant les propriétés physico- chimiques et biologiques suivantes. Propriétés physicochimiques de la Botryticidine A (1) Composition élémentaire: C = 53,34 % H = 7,55 % N = 24,32 % 0 = 14,77 % (2) Masse moléculaire (estimée à partir de l'analyse des valeurs des acides aminés): 6 400 (3) Point de fusion: Comme la Botryticidine A est une peptide de masse moléculaire élevée, son point de fusion ne peut être déterminé. (4) Pouvoir rotatoire spécifique: {a}25: + 1,10 (C = 0,02, dans une solution de D NaCl 0,8M) 2467215. (5) Spectre d'absorption ultraviolet: Le spectre d'absorption ultraviolet de la Botryticidine A, déterminé dans une solution de NaCl 0,9 M est représenté figure 1. L'absorption maximale est observée à 207 nm (E0'005 %: 0,3). 1 cm (6) Spectre d'absorption infrarouge: Le spectre d'absorption infrarouge de la Botryticidine A est représenté figure 2. Certaines bandes d'absorption particulières sont observées pour des nombres d'onde de 1630, 1210, 1160, 1110, 1090, 1040, 980, 730 cm. (7) Solubilité dans les solvants: Soluble dans l'eau mais difficilement so- luble dans des solvants organiques classiques tels que le méthanol, l'éthanol, le butanol, l'acétate -d'éthyle, l'éther, le chloroforme, le benzène etc. (8) Réactions de coloration: Réaction positive au biuret et à la ninhydrine mais négative à la Foline et à la réaction de Molisch. (9) Basicité, acidité ou neutralité: substance basique. (10) Couleur: - Blanc, poudre amorphe. (11) Stabilité thermique: - La Botryticidine A brute (concentrée avant adsorption sur du CM-Sephadex C-25 ou en solution dans du NaCl (concentration: 200 ppm) au-dessus de 0,6M, est stable à une température allant de la température ambiante à 100 C, mais l'activité antibiotique de la substance brute diminue lorsqu'elle est désalée. (12) Composition en acides aminés: La composition en acides aminés de la Botryticidine A, déterminée au moyen d'un analyseur d'acides aminés automatiques (Modèle NIPPON-DENSHI JLC-6AH) est donnée ci-dessous. Acide aminé Nombre de molécules Sérine 11 Leucine 10 Glycine 9 Acide glutamique 7 (y compris la glutamine) Phénylalanine 5 Alanine 4 Acide aspartique 3 (y compris l'Asparagine) Ornithine 3 Lysine 2 Histidine 2 Valine 2 Thréonine 2 Arginine 1 Isoleucine 1 Propriétés biologiques de la Botryticidine A (1) Spectre antimicrobien: Le spectre antimicrobien de la Botryticidine A vis-à-vis de diverses bactéries pathogènes des plantes déterminé selon la méthode du disque de papier (la concentration en Botryticidine (fraction active 6luée avec environ 0,68M de NaCl) est de 10 ppm) comme le montre le tableau suivant Bactéries pathogènes Taille du cercle d'inhi- bition de la croissance (mm) Botrytis cinerea (provoquant la pourriture grise du concombre) Colletotrichum lagenarium (provoquant l'anthracnose du concombre) 2467215; Alternaria kikuchiana 25 (provoquant la maladie des taches noires de la poire) Ceratocystis finbriata 40 (provoquant la maladie des taches noires de la patate douce) Glomerella cingulata 42 (provoquant la pourriture maculée de la vigne) Rhizoctonia solani 25 (provoquant le chancre de la gaine de riz) Pyricularia oryzae 35 (provoquant la brûlure du riz) En outre, la Botryticidine A exerce un léger effet anti-microbien vis-à-vis d'autres bactéries telles que les staphylocoques dorés, le Streptococcus epidermis, le Micrococcus fulvus et le Sarcina lutea. (2) Toxicité: La toxixité aiguë de la Botryticidine A vis- à-vis des souris est telle que celles-ci ne sont pas tuées par administration abdominale ou orale de mg/kg et-par conséquent, il a été confirmé que la Botryticidine A présente une très faible toxicité. Comme la Botryticidine A est un peptide de masse moléculaire élevée, on peut la comparer à un-enzyme. Les substances qui appartiennent aux groupes des enzymes ont une activité enzymatique, c'est-à-dire qu'elles présentent une activité spécifique n'agissant que vis-à-vis de la structure particulière du substrat à traiter, alors que la Botryticidine ne présente pas d'effet de ce type. Les substances qui appartiennent au groupe des antibiotiques sont des produits métabo- liques d'un microorganisme et présentent une activité d'inhibition de la croissance d'autres microorganismes, et leur masse moléculaire ou leur degré d'activité n'est pas limité. Bien que la Botryticidine A soit une substance de masse moléculaire élevée, elle présente une activité antibiotique telle que décrite ci-dessus. En conséquence, compte tenu des propriétés physico-chimiques et biologiques de la Botryticidine A, il est raisonnable de la classer parmi les antibiotiques. Les propriétés physico-chimiques et biolo- giques décrites ci-desus sont ci-après comparées à celles d'antibiotiques connus décrits dans la litté- rature et en particulier, d'antibiotiques produits à partir de microorganismes appartenant au genre Bacillus. Tout d'abord, la Bacillomycine se différencie de façon notable de la Botryticidine A en ce qui concerne sa masse moléculaire (la Bacillomycine a une masse molé- culaire inférieure à 1 000). La Mycobacilline se diffé- rencie de la Botryticidine en ce que cette dernière est un polypeptide circulaire ayant une masse molé- culaire de 1 800 et est soluble dans les alcools (voir Nature, 181, 134 (1958) et Biochemical, J. 121, 839 (1971)). En outre, la substance Fraction A (voir Mira Sen & P. Nandi; "Isolation of the Active Principles from a Strain of Bacillus subtillis", Indian J. Chem., vol. 1, p 135-136) se différencie nettement de la Botryticidine A en ce qui concerne son spectre d'absorp- tion ultraviolet et la bande d'absorption maximale (substance Fraction A: 226 nm) et en ce qui concerne sa solubilité dans divers solvants organiques). Enfin, les Bacileucines A et B (voir brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 181 714) diffèrent également de la Botryticidine A en ce qui concerne leur masse molé- culaire (ces deux Bacileucines ont une masse moléculaire de 13 000), le spectre d'absorption ultraviolet et la bande d'absorption maximale dans l'ultraviolet (les Bacileucines A et B ont respectivement des maxima à 273 et 260 nm), la stabilité thermique (les Bacileucines A et B perdent 50 % de leur activité antimicrobienne lorsqu'on les maintient à 60'C pendant environ 10 mn à pH 7,2), la composition.en acides.aminés et par le fait que les Bacileucines A et B sont toutes deux des substances acides. Par conséquent, il est impossible de trouver une substance connue qui puisse être considérée comme - identique à la Botryticidine A de l'invention. Il en a été conclu que la Botryticidine.A est un nouvel antibiotique. Comme mentionné ci-dessus, l'antibiotique de l'invention, la Botryticidine A, se différencie de tous les antibiotiques connus du point de vue de - ses propriétés physicochimiques et n'a jamais été décrite dans la littérature. L'invention concerne également une compo- sition fongicide pour l'agriculture et l'horticulture contenant le nouvel antibiotique décrit ci-dessus en tant qu'ingrédient actif. Comme fongicides à usage-agricole et horti- cole, on utilisait largement jusqu'-à présent des produits contenant un composé métallique lourd tel que des préparations de cuivre, de mercure et d'ar- senic, des substances chimiques organiques à base de chlore et de phosphate. Cependant, tous ces fongi- cides à usage agricole et horticole classiques sont -toxiques vis-à-vis des animaux et de l'organisme humain. En outre, ils contaminent le sol et restent dans l'environnement pendant des périodes prolongées tout en exerçant une influence néfaste vis-à-vis des animaux et des plantes. En conséquence, la pollution de l'environnement par ces produits chimiques pose 2467215. actuellement un grave problème social et l'utilisation de ces produits est interdite ou restreinte. Cependant, diverses maladies des plantes telles que des maladies du riz augmentent en virulence au fur et à mesure que le nombre de substances chi- miques utilisables diminue, de sorte qu'il était devenu indispensable dans la technique de mettre au point un nouveau produit agricole ayant un puissant effet contre les maladies des plantes et présentant un degré de sécurité élevé. En conséquence, la deman- deresse a entrepris des recherches dans le but de mettre au point un produit chimique agricole de ce type. Il en a résulté la découverte que le nouvel anti- biotique mentionné ci-dessus, la Botryticidine A, permettait d'agir très efficacement contre les princi- pales maladies du riz, à savoir la brûlure du riz et le chancre de la gaine de riz,et contre les maladies de diverses autres plantes telles que la pourriture grise, le blanc, les taches anguleuses et l'anthracnose du concombre, la maladie des taches noires de la poire, l'an-thracnose de la vigne, la maladie des taches de la tige de tomate, le black-rot de la patate douce et la pourriture molle du chou de chine, ces effets étant confirmés par des essais de pulvérisation. Il a en outre été découvert que le nouvel antibiotique ne présentait aucune phytotoxicité vis-à-vis de n'importe quel type de plantes et qu'il ne produisait - aucun effet défavorable sur l'organisme humain. Sur la base de ces découvertes, la demanderesse a mis au point le fongicide agricole et horticole de l'invention. Lorsqu'on utilise la Botryticidine A de l'invention comme fongicide agricole et horticole, conformément à des techniques couramment utilisées pour fabriquer les produits chimiques agricoles ordinaires, on peut la mettre sous forme d'une préparation optique telle que des granulés, une poussière, un liquide émulsionnable, une poudre mouillable, des comprimés, une huile, un liquide pour pulvérisation ou un fumigant en utilisant un support solide, un support liquide ou un dispersant émulsionnant approprié couramment utilisé dans la technique. Comme supports solides, on peut citer à titre d'exemples l'argile, le kaolin, la bentonite, l'argile acide, la terre de diatomée, le carbonate de calcium, la nitrocellulose, l'amidon, la gomme arabique et des mélanges de ceux-ci et comme supports liquides, on peut par exemple citer l'eau, le méthanol, l'éthanol, l'acétone, le diméthylformamide, l'éthylène glycol et des mélanges de ceux-ci. En outre, il peut être commode d'incorporer des additifs couramment utilisés dans la fabrication des produits chimiques agricoles, -tels que des esters de l'acide sulfurique d'alcools supérieurs, des éthers alkyliques aryliques de poly- --oxyéthylène, des éthers alkyliques aryliques de poly- éthylèneglycol, des alkyl aryl sorbitane monolaurates, des alkyl aryl sulfonates, des sels d'acide alkyl sulfo- nique, des sels d'acide alkyl aryl sulfonique, des sels d'ammonium quaternaire, des oxydes de polyalkylène et des mélanges de ceux-ci. Il convient d'utiliser un rap- port de mélange de l'ingrédient actif d'environ 10 à environ 90 % dans le cas d'un liquide émulsionnable ou d'une poudre mouillable et d'environ 0, 1 à environ 10 % dans le cas d'une poudre ou d'une huile. Il est clair que le rapport de mélange de l'ingrédient actif peut être modifié selon le but de l'application envisagée. Le fongicide de l'invention peut en outre contenir d'autres fongicides, herbicides, insecticides, engrais ou agents de modification du sol selon les besoins. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention. Sauf indication contraire, les termes "%" et "parties" désignent respectivement des pourcentages pondéraux et des parties en poids dans le reste du présent mémoire et dans les revendications. *Exemple 1 (Botryticidine A) On inocule le sp. AJ1316 (NRRL B-12231) décrit cidessus dans un milieu de culture incliné contenant 0,3 % d'extrait de levure, 0,3 % d'extrait de malt, 0,5 % de polypeptone, 1 % de glucose et 1,5 % d'agar-agar et on le cultive à 27 C pendant 24 heures. On inocule ensuite la souche cultivée sur milieu incliné dans 100 ml d'un milieu de culture placé dans un flacon Sakaguchi (stérilisation: 120 C, 20 mn, pH initial: 6,2) contenant 2 % d'amidon, 2 % de glucose, 2 % de poudre de soja et 0,05 % d'agent anti- mousse (ingrédient principal: polypropylène glycol) et on le soumet à une culture de pré-ensemencement à 27 C pendant 24 heures (volume de semence: 2 %). On effectue la culture de la semence à 27 C pendant 24 heures dans les conditions suivantes: quantité; 20 1, agitation: 350 t/mn, aéra- tion: 1/2 v/v/ /min et pression interne: 0,5 kg/cm2. On entreprend ensuite la culture principale à 27 C pendant 48 heures dans les conditions suivantes: quantité: 300 1, agitation: 300 t/mn, aération: 1/2 v/v/ min et pression interne 0,5 kg/cm2, ce qui donne 300 1 d'un milieu de culture contenant de la Botryticidine A. On soumet à une centrifugation un litre du milieu de culture ainsi obtenu à 10 000 t/mn pendant 30 mn pour éliminer les cellules On fait passer le liquide surnageant dans une colonne garnie de 500 g de Dowex-50W (du type H +) et on fait passer trois fois ce volume d'eau distillée dans la colonne pour éliminer par lavage les substances organiques non adsorbées. On élue les substances adsorbées avec un litre d'une solution aqueuse de NH40 OH IN puis on les élue avec de l'eau distillée jusqu'à ce que le pH de l'éluat devienne inférieur à 8. On recueille la totalité de l'éluat dont le pH est au-dessus de 8 et on le concentre à 40 C sous vide pour en éliminer l'ammoniaque. On obtient un litre du concentré. On fait passer ce concentré dans une colonne garnie de CM-Sephadex C-25 (marque commerciale) puis on fait passer de l'eau distillée dans la colonne pour éliminer totalement les substances non adsorbées. On élue les substances adsorbées avec un gradient linéaire de 0,1 à 1 M de NaCl à un débit de 3 ml/mn. En déter- minant les spectres anti-microbiens de chacune des fractions selon la méthode du disque de papier (concen- tration: 10 ppm, organisme pathogène: Botrytis cinerea), il a été constaté que la substance active était contenue dans la fraction finale éluée par environ 0,68'M de NaCl. On lyophilise la fraction active jusqu'à une concentration de 1/10 en volume et on la dialyse à travers un tube Visking pour la désaler. On lyophilise la solution dialysée et désalée, ce qui donne 10 mg de Botrytici- dine A sous forme d'une poudre blanche. Exemple 2 (poudre mouillable) On prépare un mélange de 10 parties de Botryticidine A (concentré avant adsorption sur du CM-Sephadex C-25), 5 parties de lauryl sulfate de sodium, 2 parties d'un condensat de sodium dinaphtyl- méthane-disulfonate-formol et 83 parties d'argile et on le pulvérise, ce qui donne 100 parties d'une poudre mouillable. Exemple 3 - (liquide émulsionnable) On prépare un mélange de 8 parties de Botryticidine A (concentré avant adsorption sur du CM-Sephadex C-25), 10 parties d'éthylène glycol, 20 prties de diméthylformamide, 10 parties de chlorure d'alkyl-diméthylbenzyl ammonium et 52 parties de méthanol et on le dissout, ce qui donne 100 parties d'un liquide émulsionnable. Exemple 4 (Poudre) On prépare un mélange de 0,2 partie de Botryticidine A (concentré avant adsorption sur du CM-Sephadex C-25), 0,5 partie de stéarate de calcium, parties de talc et 9,3 parties d'argile et on le pulvérise, ce qui donne 100 parties d'une poudre. Exemple 5 (Granulés) On prépare un mélange de 10 parties de Botryticidine A (concentré avant adsorption sur du CM-Sephadex C-25), 15 parties d'amidon, 72 parties de bentonite et 3 parties de lauryl sulfate de sodium et on le pulvérise, ce qui donne 100 parties de granu- lés. Les effets du fongicide agricole et horti- cole de l'invention contre diverses maladies des plantes sont décrits en détail ci-après en se référant aux essais suivants: Exemple d'essai n l Essai de l'effet contre la pourriture grise du concombre On dilue une poudre mouillable préparée con- formément au procédé décrit dans l'exemple 2 avec de l'eau jusqu'à une concentration prédéterminée et on pulvérise la dilution sur des jeunes plants de coicombre. (va- riété Sagami Hanjiro) obtenus 15 jours après ensemen- cement et on sèche la substance chimique pulvérisée à l'air. On cultive un parasite pathogène provoquant 2467215; la pourriture grise du concombre (Botrytis cinerea) dans un milieu de culture sur plaque pomme de terre- glucose-agar-agar et on l'irradie au moyen d'un rayon- nement de lumière noire "Black Light Blue" pour induire la formation de spores. On met ensuite les spores en suspension dans une solution aqueuse contenant 10 % de glucose et 1 % d'extrait de levure. Après avoir séché la substance chimique pulvérisée, on introduit lesjeunes plants dans une boîte d'inoculation. On pulvérise la suspension sur les jeunes plants au moyen d'un pistolet pulvérisateur à raison de 10 ml par 10 plants. On maintient les plants ainsi inoculés à une température de 20'C et à une humidité relative de 100 % pendant 4 jours, puis on observe les maladies apparaissant chez les plantes. Le degré d'efficacité a été calculé selon le mode opératoire suivant: Indice de maladie Etendue de la maladie observée o Degré d'effi sur les feuilles non observée faiblement discernée inférieure à 10 % à 20 % à 30 % à 40 % supérieure à 40 % ( somme de l'indice de maladie cacité (%) dans la zone traitée X 100 -sai=e de l'indice de maladie k dans la zone non traitée Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 1. TABLEAU 1 Note (1) Méthyl-l-(butylcarbamoyl)-2-benzimidazole carbamate Exemple d'essai n 2 Essai de l'efficacité contre l'anthracnose du concombre On dilue à l'eau un liquide émulsionnable préparé suivant le procédé décrit dans l'exemple 3 jusqu'à obtention d'une concentration prédéterminée et on pulvérise la dilution sur des jeunes plants de concombre (variété Sagami Hanjiro) obtenus 15 jours après ensemencement et on sèche la substance chimique pulvérisée à l'air. On cultive un parasite pathogène provoquant l'anthracnose du concombre (Colletotrichum lagenarium) dans un milieu de culture sur plaque de pomme de terre- agar-agar et on met en suspension les spores ainsi cultivées dans de l'eau. On ajuste la concentration en spores dans la suspension de façon à observer environ spores dans le champ d'un microscope fonctionnant avec un grandissement de 150. Après avoir séché le produit pulvérisé, on introduit les jeunes plants dans une boîte d'ino- culation. On pulvérise la suspension sur les jeunes Concentration dans la dilution pulvé- Degré d'effi- Phytoto- Substance essayéerisée (ppm) cacité xicité Botryticidine A 100 100 non observée Botryticidine A 100 100 non observée Botryticidine A 50 10099 non observée Botryticidine A 1025 99 non observée Botryticidine A 10 90 non observée Botryticidine A 10 90 'non observe Benlate (1) 250 95 non observée Témoin 0 non observée plants au moyen d'un pistolet pulvérisateur à raison de 10 ml par 10 plants. On maintient les jeunes plants ainsi inoculés dans la boite d'inoculation à une tem- pérature de 20 C et une humidité relative de 100 % pendant 24 heures, puis on les introduit dans une serre utilisant la lumière naturelle et on les y maintient pendant-4 jours. On-observe ensuite les maladies développées chez ces plants. Le degré d'efficacité est calculé d'après la formule suivante somme des taches de maladie Degré d'efficacité (%) = (_ dans la zone traitée 100 some des taches de maladie dans la zone non traitée - Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 2. TABLEAU 2 Note (2) Tétrachloroisophthalonitrile Exemple d'essai n 3 - Essai de l'efficacité contre la brûlure du riz On cultive 10 plants de riz (variété Jukkoku) dans un pot et au stade à quatre feuilles, on dilue à l'eau une poudre mouill-able préparée suivant le procédé décrit dans l'exemple 2 jusqu'à obtention d'une concen- tration prédéterminée et on pulvérise la dilution sur Concentration dans Substance essayée la dilution pul- Degré d'effi- Phytotoxicité vérisée (ppm) cacité (%) Botryticidine A 100 99 non observée Botryticidine A 50 95 non observée Botryticidine A 25 88 non observée Botryticidine A 10 79 non observée Daconil (2) 1250 95 non observée les plants au moyen d'un pistolet pulvérisateur à raison de 50 ml par pot. Une fois la substance chimique pulvérisée et séchée, on pulvérise uniformément une suspension préparée par mise en suspension dans de l'eau des spores d'une bactérie pathogène provoquant la brûlure du riz (Pyricularia oryzae) cultivé dans un milieu de culture à base d'écorce de riz (contenant 3 g d'écorces de riz, 0,0 1 g d'extrait de levure en poudre, 0,2 g de saccharose, 0,05 g d'amidon et 5 ml d'eau) et on l'inocule sur les plants de riz dans une boîte d'inoculation. Après avoir conservé les pots dans la boite d'inoculation maintenue à une température de 25 C et à une humidité relative de 100 %, on retire les plants de la boite d'inoculation et on les maintient à la température ambiante. Lorsqu'on observe l'appari- tion de la maladie au bout de 5 à 7 jours après l'ino- culation, on compte le nombre de taches de maladie par pot. Le degré d'efficacité est calculé en utilisant le procédé décrit dans l'exemple d'essai n 2. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 3. TABLEAU 3 Produit essayé Concentration du pro- Degré d'eff Phytotoxicité Produit essayé duit dans le liquide Degrt defiPhytotoxicité pulvérisé (ppm) Botryticidine A 100 100 non observée Botryticidine A 50 100 non observée Botryticidine A 25 97 non observée Botryticidine A 10 95 non observée BlàtidïiCe S (3) 10 96 non observée Note (3) Benzylaminobenzène-sulfonate de Blasticidine S. Exemple d'essai n' 4 Essai de l'efficacité contre la pourriture de la tige de tomate On dilue une poudre mouillable préparée selon l'exemple n' 2 jusqu'à une concentration pré- déterminée et on pulvérise 50 ml de la dilution sur des jeunes plants de tomates (variété Fukuju) au stade à sept ou huit feuilles après l'ensemencement. Après avoir laissé sécher à l'air le produit chimique pul- vérisé, on applique et on inocule un échantillon d'une colonie obtenu en découpant une zone périphé- rique de colonie de Sclerstinia sclerotiorum au moyen d'un perçoir à liège (d'environ 5 mm de diamètre) sur une partie prédéterminée d'une feuille de la plante. La colonie inoculée a été cultivée dans un milieu * de culture sur plaque à base de pomme de terre-glucose- agar-agar classique. On maintient les jeunes plants de tomates inoculés à une température de 250C et à une humidité relative supérieure à 95 % pendant 3 jours, puis on mesure la taille des taches de maladie. Le degré d'efficacité est calculé conformément à la formule suivante - somne des tailles des taches de Degré d'efficacité (%) - maladie dans la zone traitée d 100 sarrne des tailles des taches de ma- ladie dans la zone non traitée Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 4. 2467215; TABLEAU 4 Note (4) Ester diéthylique de l'acide {i,2-Phénylène bis (iminocarbonothioyl)}biscarmique Exemple d'essai n 5 Essai de l'efficacité contre la pourriture molle du chou de Chine On dilue une poudre mouillable préparée selon le procédé de l'Exemple 2 jusqu'à une concentration prédéterminée et on pulvérise 50 ml de cette dilution sur des jeunes plants de choux de Chine (variété Nozaki N 2) cultivés pendant 13 jours après l'ensemencement. On.utilise trois jeunes plants par zone d'essai. Après séchage à l'air de la substance pulvérisée, on inocule et on pulvérise sur les jeunes plants de choux de Chine au moyen d'un' pistolet pulvérisateur une suspension préparée par mise en suspension de cellules d'une bactérie pathogène provoquant la pourriture molle de certains légumes (Erwinia carotovora) cultivées dans un milieu de culture Suwa à 280C pendant 20 heures tout en agitant. Après inoculation, on maintient les jeunes plants dans une boite d'inoculation à une température de 28 C et une humidité relative supérieure à 95 % pendant 3 jours, puis on observe l'étendue de la maladie. J Concentration du pro- Produit essayé duit dans le liquide Degré d'effi- Phytotoxicité pulvérisé (ppm) cacité (%) Botryticidine A 100 99 non observé Botryticidine A 50 90 non observé Botryticidine A 25 87 non observé Topsine M (4) 1000 85 non observé Toin - -0 -- 2467215: Le degré manière suivante: Indice de maladie d'efficacité est calculé de la Etendue de la maladie sur Degré d'efficacité (%) = les feuilles non observée très légèrement décelable légèrement décelable environ 1/4 de la surface environ 1/3 de la surface environ 1/2 de la surface entièrement attaquées somer des indices de maladie dans la zone traitée somme des indices de maladie dans la zone non traitée Les résultats obtenus sont donnés dans le Tableau 5. TABLEAU 5 Concentration du pro- Produit essayé duit dans le liquide Degré d'effi- Phytotoxicité pfulvérisé (ppm) cacité (%) Botryticidine A 100 81 non observé Botryticidine A 50 75 non observé Botryticidine A 25 69 non observé Agret (5) 100 68 non observé Tamoin 0 non observé Note (5) Streptmycine Exemple d'essai n 6 Essai de l'effet sur le blanc du concombre On dilue une poudre mouillable préparée X 100 conformément à l'exemple 2 jusqu'à une concentration prédéterminée et on pulvérise 50 ml de cette dilution sur des jeunes plants de concombre (variété Sagami Hanjiro) cultivés pendant 14 jours après l'ensemencement. On utilise trois jeunes plants par zone d'essai. On laisse sécher le produit pulvérisé. On inocule une bactérie pathogène provoquant le blanc du concombre (Sphaerotheca fuliginea) sur une feuille développée du concombre. Au bout de il jours après l'inoculation, une colonie de cette bactérie s'est formée. On pulvé- rise et on inocule sur les jeunes plants de concombre une suspension de spores prélevés dans cette colonie (la concentration de spores étant de 1 x 105 spores/ml). On introduit les plants ainsi inoculés dans une serre constituée d'une pellicule de vinyle à une température de 25 à 30 C et on les y maintient pendant 11 jours. On compte ensuite le nombre de taches de maladie sur les feuilles. Le degré d'efficacité est calculé confor- mément à l'exemple d'essai n 2. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 6. TABLEAU 6 Note (6) Quinométhionate Concentration du pro- Produit essayé duit dans le liquide Degré d'effi- Phytotoxicité pulvérise (ppm) cacité (%) Botryticidine A 100 90 non observé Botryticidine A 50 82 non observé Botryticidine A 25 79 non observé Morestan (6) 60 85 non observé Témoin- 0- Exemple d'essai n 7 Essai d'efficacité contre les taches anguleuses du concombre On dilue une poudre mouillable préparée selon l'exemple 2 jusqu'à obtention d'une concentration prédéterminée et on pulvérise 50 ml de cette dilution sur les deux faces des feuilles de concombre (variété Suyo) au stade à deux feuilles. Apres avoir laissé sécher à l'air le produit pulvérisé, on pulvérise et on inocule sur les feuilles des jeunes plants de concombre une suspension de spores d'une bactérie pathogène provoquant les taches anguleuses du concombre (Pseudomonas lachrymans) obtenus par pré- culture pendant 24 heures. On maintient les jeunes plants ainsi inoculés dans une serre à une tezperature de 25 C pendant 2 jours, puis on les introduit dans une autre serre utilisant de la lumière naturelle. On observe ensuite l'étendue de la maladie. Le -degré d'efficacité est calculé selon l'exemple d'essai n 5. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 7. TABLEAU 7 Concentration du pro- l Produit essayé duit dans le liquide egré d' egiP:r--o-wace pulvérisé (ppm) cacité%) Botryticidine A 200 99.nobse-r Botryticidine A 100 85 r -ô abser- Botryticidine A 50 80 norn obser-vé Agret 50 70 non obsev t Témoin O 0 __________________. Commentaires Sur la base des résultats des essais dscrits ci-dessus, il ressort que le fongicide contenant la Botryticidine A de l'invention en tant qu'ingrédient 2467215. actif, présente un très haut degré d'efficacité vis-à- vis de diverses maladies de plants et qu'il n'exerce aucune phytotoxicité, c'est-à-dire que l'on peut l'utiliser à grande échelle en toute sécurité pour lutter contre de nombreuses maladies. REVENDICATIONS 1. Nouvel antibiotique désigné sous le nom de Botryticidine A, caractérisé en ce qu'il présente les propriétés physicochimiques et biologiques suivantes: 1) Composition élémentaire: C = 53,34% H = 7,55% N = 24,32% 0 = 14,77% 2) Masse moléculaire: 6 400 3) Pouvoir rotatoire spécifique: [a 25: +1,10 (C = 0,02, dans une solution D de NaCl 0,8 M) 4) Spectre d'absorption ultraviolet: Le spectre d'absorption ultraviolet de la Botryticidine A, déterminé dans une solution de NaCl 0,9 M, est représenté sur la figure 1. Le maximum d'absorption est observé à 207 nm (E 0,005%: 0,3); 1 cm ) Spectre d'absorption infrarouge: Le spectre d'absorption infrarouge de la Botryticidine A est représenté sur la figure 2. Des bandes d'absorption particulières sont observées aux nombres d'ondes 1630, 1210, 1160, 1110, 1090, 1040, 980, 730 cm-1; 6) Solubilité dans les solvants: Soluble dans l'eau mais difficilement soluble dans les solvants organiques classiques tels que le méthanol, l'éthanol, le butanol, l'acétate d'éthyle, * l'éther, le chloroforme, le benzène, etc...; 7) Réactions de coloration: Réaction positive au biuret et à la ninhydrine mais réaction négative à la Foline et à la réaction de Molish; 8) Basicité, acidité ou neutralité: Substance basique; 9) Couleur Poudre amorphe blanche; ) Stabilité thermique: La Botryticidine A brute (concentrée,avant adsorption sur du CM-Sephadex C-25) ou la Botryticidine A (concentration: 200 ppm) dans une solution de NaCl au-dessus de 0,6 M, est stable à une température allant de la température ambiante à.100 C, mais son activité antibiotique diminue lorsqu'on dessale la Botryticidine A brute'; 11) Composition en acides aminés: La composition en acides aminés de la Botryticidine A est indiquée ci-dessous: Acide aminé Nombre de molécules Sérine 11 Leucine 10 Glycine 9 Acide glutamique (y compris la glutamine) 7 Phénylalanine 5 Alanine 4 Acide aspartique (y compris l'asparagine) 3 Ornithine 3 Lysine 2 Histidine 2 Valine 2 Threonine 2 Arginine 1 Isoleucine 1 12) Spectre antimicrobien: La Botryticidine A présente une activité antimicrobienne spécifique vis-à-vis de diverses bactéries pathogènes des plantes, telles que Pyricularia oryzae, Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea, Colletotrichum lagenarium, Alternaria kikuchiana, Glomerella cingulata, Ceratocytis finbriata, etc... 2. Procédé pour la préparation d'un nouvel antibiotique, à savoir la Botryticidine A, caractérisé en ce qu'on cultive une bactérie productrice de Botryticidine A appartenant au genre Bacillus et en ce qu'on sépare et extrait ce nouvel antibiotique du bouillon de culture. 3. Procédé selon la revendication 2, caracté- risé en ce que la bactérie productrice de Botryticidine A appartenant au genre Bacillus est le Bacillus subtilis AJ1316 (NRRL B-12231). 4. Procédé selon la revendication 3, caracté- risé en ce que la bactérie productrice de Botryticidine A appartenant au genre Bacillus est cultivée dans un milieu de culture incliné, dans un bouillon de culture de pré-ensemencement, dans un bouillon de culture d'ensemencement et enfin, dans un bouillon de culture principal. 5. Procédé selon la revendication 4, caracté- risé en ce que la séparation de la Botryticidine A s'effectue par les opérations suivantes: a) centrifugation du bouillon de culture contenant la Botryticidine A pour ainsi éliminer les cellules, b)sépAration de la Botryticidine A du liquide surnageant par chromatographie sur colonne, et c) purification de la Botryticidine A par lyophilisation et dialyse. 6. Composition fongicide à usage agricole et horticole contenant de la Botryticidine A en tant qu'ingrédient actif. 7. Composition fongicide à usage agricole et horticole selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est sous forme d'une poudre mouillable conte- nant 10 à 90% en poids du constituant actif. 8. Composition fongicide a usage agricole et horticole selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est sous forme d'une émulsion contenant 10 à % en poids du constituant actif. 9. Composition fongicide à usage agricole et horticole selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est sous forme d'une poudre contenant 0,1 à 10% en poids du constituant actif. 10. Composition fongicide à usage agricole et horticole selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est sous forme de ganulés contenant 0,1 à 10% en poids du constituant actif.