Brevet FR2470603A1 — publié le 19810612

La présente invention a pour objet les extraits antimitotiques obtenus 5 partir de nouvelles souches de tissus de Catharanthus roseus G. Don cultivées in vitro. Ces extraits sont caractérisés par une forte activité antimitotique associée à une faible toxicité. Les nouvelles souches ont été obtenues par création d'une large population diversifiVe de souches de tissus de Catharanthus roseus G. Don et sélection des souches actives dans cette population par un criblage approprié. I1 est connu que les cultures de tissus de végétaux supérieurs peuvent biosynthétiser des métabolites secondaires identiques ou non à ceux de la plante entière, et en particulier des alcaloïdes. Les cultures de tissus de Catharanthus roseus G. Don s'inscrivent typiquement dans ce cadre. Certaines souches biosynthétisent par exemple l'ajmalicine et la serpentine (ZENK M.H.and al., in BARZ W, REINHARD E. et ZENK M.H. : "Plant tissue culture and its biotechnological application n Springer-Verlag 1976, p. 27 et BOEHRINGER .XANNHEIM Gmbh, DOS 2,639,876) ; d'autres ont permis de mettre en évidence des composés inconnus jusqu'alors et sans intérêt thérapeutique (PATTERSON B. et CAREW D. P. ; Lloydia 1969, 32 , p. 131) d'autres encore ont abouti à des extraits ayant des activités thérapeutiques différentes de celle de la plante (KYOWS HAKKA KOGYO, Japon, KOKAI 75 101510 : "Prevention and therapy of Coccidiosis"). Aucune souche de tissus de Catharanthus roseus G. Don biosyntheti- sant des extraits à activité antimitotique n'a été signalée jusqu'ici. La culture in vitro de tissus de Catharanthus roseus G. Don peut être effectuée selon tout procédé approprié et bien con- nu pour l'homme de lar-6. Selon l'invention, on a créé une large population diversifiée de souches de Catharnnthus roseus G. Don. La variabilité a été introduite dans cette population à différents niveaux : - le génotype de la plante, origine des tissus, - le type d'organe utilisé pour initier les cultures de tissus "in vitro", - les conditions de culture : milieu nutritif, température, photopériode, périodicité de repiquages, -la conservation des divergencés morphologiques spontanées apparaissant au cours de repiquages successifs. Selon l'invention, une souche est définie de façon très stricte comme un ensemble de cals homogène et constant en ce qui concerne - l'origine génotypique 3 (clone de cal primaire) - l'origine culturale - les conditions de culture - l'aspect morphologique et la pigmentation - la vitesse de croissance et la friabilité - l'absence totale de capacité morohogénétique. Selon l'invention, on cultive les souches de Catharanthus roseus G. Don selon tout procédé approprié de culture "in vitro", par exemple sur milieu gélosé en suspension dans un milieu liquide, en fiole d'Erlenmeyer agitée, en réacteur, en fermenteur, sous forme immobilisée sur des supports convenables, etc.... D'après les criteres définis ci-dessus, on a obtenu 80 souches différentes dont les extraits ont été soumis à un criblage pour révéler une activité antimitotique éventuelle ; deux se sont alors montrées très actives et ont fait l'objet d'études plus approfondies . Ce sont les souches référencées CR-1 et CR-2 déposées au laboratoire du Phytotron - C.N.R.S. GI sur 't'V=TTL - 91190 - FRANCS. L'invention a donc pour objet principal les extraits de cul- tures de tissus obtenus & partir des souches CR-1 et CR-2. Les exemples suivants illustrent l'invention. EXEMPLE 1 Obtention et définition des souches les plus actives. Toutes les souches ont été obtenues et entretenues selon les méthodes classiques (GAUTHERET R.J. "La culture des tissus végétaux" MASSON, 1959). Chacune d'entre elles a été cultivée sur milieu gélosé et les extraits de cultures ont fait l'objet d'un test de criblage. Celui-ci est décrit par la suite (Exemple 4). Les deux souches qui sont apparues les plus actives se definissent comme suit Souche CR-1 Génotype : Variété ornementale hétérogène Origine culturale : 1 plantule stérile (tige) Milieu de culture : Milieu semi-solide Concentration par litre de milieu Composition :Macro-éléments minéraux 100 ml/l (Solution de Murashige et Skoog) Micro-éléments minéraux 1 ml/l (Solution de Heller) Complexe vitaminique B1 2 ml/i Chlorure ferrique hexahydraté 1 mc/l Acide naphtyl-1-acétique 1 mg/l (Furfurylamino)-6 purine i mg/l Glucose 30 g/l Gélose 7 g/l Macro-éléments minéraux (Solution de Murashige et Skoog) Concentration en mg/l de milieu Nitrate d'ammonium 1650 Nitrate de potassium 1900 Chlorure de calcium hydraté 440 Sulfate de magnésium heptahydraté 370 Phosphate de potassium 170 Micro-éléments minéraux (Solution de Heller) Concentration en mg/l de milieu Sulfate de zinc heptahydraté 1 Acide borique 1 Sulfate de manganèse rtétrahydraté 0,1 Sulfate de cuivre pentahydraté 0,03 Chlorure d'aluminium hexahydraté 0,05 Iodure de potassium 0,01 Chlorure de nickel hexahydraté Q,03 Complexe vitaminique (B1) Concentration en mg/l de milieu Panthoténate de calcium 1 Pyridoxine 1 Acide nicotinique 1 Thiamine 1 Méso-inositol 10 Biotine 0,01 Conditions de culture : Température 220C Eclairement par tube fluorescent Sylvania Grolux (2500 lux) Photopériode 16 H/24 H Périodicité de repiquage : 5 semaines Caractéristiques : Aspect morphologique : granuleux Pigmentation : vert clair Taux de croissance : de tordre de 6 fois la taille de l'implant initial par cycle de culture Friabilité : très friable Aucun phénomène d'organogénèse SOUCHE CR-2 Génotype :Variété ornementale hétérogène Origine culturale : 1 plantule stérile (tige) Milieu de culture : Milieu semi-solide Composition identique & celle du milieu utilisé pour la Souche CR-1. Conditions de culture : Température 220C Eclairement par tube fluorescent Sylvania Grolux (2500 lux) Photopériode 16 H/ 24 H Périodicité de repiquage : 5 semaines Caractéristiques : Aspect morphologique : granuleux Pigmentation : vert Taux de croissance : de l'ordre de 12 fois la taille de l'implant initial par cycle de culture Friabilité : très friable Aucun phénomène d'organogenèse. EXEMPLE 2 Développement des souches actives. Afin d'obtenir des quantités plus importantes d'extraits de souches actives on a développé les cultures sous forme de cultures en suspension dans un milieu liquide. Dans ces conditions, les souches sont cultivées soit dans des fioles d'Erlenmeyer agitées, soit dans des réacteurs de culture, soit dans des fermenteurs de capacité croissante selon les besoins, soit sous forme immobilisée sur des supports convenables. Conditions de culture en fiole d'Erlenmeyer Flacon de 250, 500 ou 1000 ml Milieu nutritif identique à celui de l'exemple 1, mais dépourvu de gélose Température : 220C à 260C Photopériode 16 H/ 24 H Agitation : mouvement giratoire : 100 à 150 rotations/minute. Conditions de culture en réacteur ou en fermenteur Agitation à pales : 100 à 250 R.P.M. Aération : 0,1 à 0,25 V.V.M. Température : 250C à 300C Obscurité totale et permanente Milieu nutritif identique à celui de l'exemple 1, mais dépour- vu de gélose. EXEMPLE 3 Préparation des extraits de cultures de souches. La méthode mise au point po.ur l'extraction des souches répond à 3 impératifs principaux - d'une part, l'importante variabilité inhérente aux cultures de tissus obtenues, laisse supposer des possibilités de biosynthèse de composés actifs différents de ceux présents dans la plante in situ. En conséquence, les méthodes d'ex traction ne doivent pas être spécifiques d'une classe pré cise de composes. - d'autre part, le procédé d'extraction doit éviter que soit retenu tout composant initial, y compris les sels minéraux, du milieu nutritif des cellules végétales pouvant interfe- rer sur la réponse des tests biologiques mis en oeuvre (voir exemples 4 et 5). - enfin, les moyens chimiques et physiques utilisés ne doivent provoquer en eux-memes aucune perturbation de ces tests biologiques. Ils doivent également tenter de conserver les compose-s biosynthétisés par les cellules sous leur forme native originale (eviter la formation d'artéfacts). La possibilité d'excrétion de métabolites par des tissus végétaux dans le milieu nutritif su lequel ils ont proliféré, est bien connuetANDREEvA T.I. et BEREZEEGQVSKAYA L.N. Nauch. Dokl. Vyss. Skol. Biol Nauk 1978, nc 7, pp. 107-109). Aussi l'extraction en vue du criblage des souches a été appli- que en parallèle aux tissus et au milieu de culture correspondant. Le procédé d'extraction préféré en fonction des 3 critères mentionnés ciodessus est décrit dans le schéma suivant TISSUS OU MILIEUX 15 mn de fixation dans 2,3 volume de C2H5OH 960 baumé bouillant FILTE ATION BROYAGERES RESIDU FILTRAT ID AGITATION dans C2HSOH a 7 Oc baumé 25 FILTRATION PSIDU FILTRAT ( Elimine ) CONCENTRATION sous vide à 30% du du volume initial FILTRATION sur membrane de porosité 0,22y - FILTRAT I | RESfDU i AT I | (Eliminé) StTCC SSIVENENTX A) EXTRA TION par CHCl3 usqu a Reprise par~~~ btention d'un E11 au py : initial résidu sec CHC13 B) EXTRACTION par-CHC13 Concentration a pH 1 obtention d'un o 3usqu'à reprise KTRBI par iS04) résidu sec CHCl3 3 I sec 2 C) EXTRACTION par CHCl3 Concentration à pH 10 (alcalinisa- ~ jusqu'à Reprise par obtention d un d'un T E tion par N114OH) résidu sec CHOC13 D'autres procédures d'extraction ont été également utilisées dans le cas précis de ces souches.Elles aboutissent aussi à des extraits actifs. I1 s'agit par exemple d'une procédure sensiblement identique à celle décrite ci-dessus, si ce n'est que la oremière extraction est réalisée par le CHC13 à pH alcalin (9,5-10). On a également utilisé des procédés d'extraction plus spécifiques des alcaloldes, par exemple, extraction du tissu ou milieu parl'éthanol à 700 Baumé à la température d'ébullition mise à siccité reprise par 112504 à 1% alcalinisation par NH40H jusqu'à pH 9,5 extraction par CHC13 llca- bides (obtenus par acidification) Si l'on utilise un procédé d'extraction du même type que ceux décrits ci-dessus, à partir des souches CR-1 et CR-2, on obtient des extraits possédant une activité antimitotique élevée alliée à une faible toxicité. EXEMPLE 4 Mise en évidence de l'activité antimitotique des extraits obtenus war culture des souches CR-1 et CR-2. Préalablement, il a été vérifié que 1/ les extraits E1, E2 et E3 du volume de milieu nutritif neufe égal à celui nécessaire à la croissance de la quantité active de tissus des souches CR-l et CR-2, ne présentaient aucune activité antimitotique dans le test décrit ci-dessous 2/ l'rapport des extraits à tester ne perturbait en aucun cas ce test, ni par la dilution du milieu nutritif des cellules animales ou humaines, ni par les solvants utilisés pour Les introduire dans ce milieu. Le test utilisé est hasé sur 2'étude de la cinétique de prolifération de leucocytes de souris leucémiques (Souche L 1210) en présence des extraits à essayer. Son protocole est bien connu (Tissue culture methods and applications KRUSE P.F. and PATTERSON M.K. 1971 - Academic Press New York) Les extraits E1, E2 et E3 des tissus et des milieux gélosés obtenus par extraction à partir de cultures de souches CR-1 et CR-2 ont été étudiés selon ce test. Les résultats sont les suivants Seuls les extraits E1 de tissus et de milieux nutritifs obtenus à partir des deux souches CR-1 et CR-2 sont actifs. Ces résultats sont illustrés par les figures 1 et 2, qui représentent la cinétique de croissance des cellules L 1210 en présence, respectivement de différentes quantités de tissus et de milieu de culture de la souche CR-l. On peut remarquer qu'un ralentissement notable de la croissance des cellules L 1210 est observé dès l'introduction d'une dose d'extrait correspondant à 25 g de tissus frais, et que l'effet augmente avec la dos?. EXEMPLE 5 Confirmation de l'activité antimitotique des extraits obtenus par extraction de cultures des souches CR-i et CR-2. I1 a évidemment été vérifié que l'effet décelé par le test décrit à l'exemple 4 était une activité antimitotique et non une simple toxicité : le taux de cellules mortes reste constant durant toute la culture. De plus, on a confirmé cette activité sur des cellules d'une autre espèce animale, et sur un autre type cellulaire que les leucocytes. On a recherché également l'effet sur des cellules normales. On a utilisé pour ces essais une souchedelymphoblastes humains (C C L leucémiques 19, ATCC), une souche de fibroblastes humains normaux ( M R C 5, ICIG) et sa lignée homologue transformée par un virus oncogène (VA 13, ICIG). Un exemple des résultats obtenus est présenté dans les figures 3, 4 et 5. Ils confirment clairement l'activité des extraits E1 de ces souches sur d'autres tests "in vitro" que celui basé sur la croissance des cellules L 1210. Par ailleurs la toxicité aiguë des extraits obtenus par cultures des souches CR-l et CR-2 à été déterminée par voie I,V. (veine caudale) sur la souris CD1 (Charles River) pesant en moyenne 20 g. La toxicité des extraits de tissus est indiquée sous forme de DLo a 300 mg/kg. On a également observé des nécroses de la guerre typiques des composés présentant une activité antimitotique. I1 apparaît donc que la toxicité des extraits obtenus par cultures des souches CR-1 et CR-2 est très faible LEGENDE DES FIGURES Figure 1 : Activité sur L 1210 dlun extrait E1 de cals de la souche CR-1 abscisse : temps en jours ordonnée : nombre de cellules par ml ±---+ témoin (T) : dose 0 o-----o dose 0,1 (I) ± + dose 0,5 (II) x-----x dose 1 = extrait E1 de 50 g de tissus frais (III) dose 1,5 (IV) Figure 2 : Activité sur L 1210 d'un extrait E1 du milieu de culture de la souche CR-1 abscisse : temps en jours ordonnée : nombre de cellules par ml +..+ témoin (T) : dose O o o dose 0,1 (I) x-----x dose 0,2 (II) dose 1 dose 1 = extrait E1 du milieu de 50 g de tissus frais (III) Figure 3 : Activité sur lymphoblastes humains leucémiques d'un extrait de cals de Catharanthus roseus G. Don (Souche CR-1) abscisse : temps en jours ordonnée : nombre de cellules par ml +. .+ témoin (T) : dose O x----x dose 0,2 7 (I) o---- o dose 0,1 Extrait E1 de tissus frais (II) . ~ , dose 1 (III) Figure 4 : Fibroblastes humains normaux (MRC5) Figure 5 : Fibroblastes humains transformés (VA 13) Activité comparée sur fibroblastes humains nor maux et transformés de la vinblastine et d'un extrait de cals de Catharanthus roseus G.Don (souche CR-1) abscisse : temps en jours 2 ordonnée : nombre de cellules par cm +. .+ témoin (T) : dose O (T) x x méthanol 1% (vol/vol) (I) o o vinblastine 10 7 ou 0,1 mg/l (II) extrait extrait E1 de tissus frais (dose : 1) (III) Revendications 1. Extraits caractérisés par une forte activité antimitotique et une faible toxicité, obtenus à partir de tissus ou de mi lieux obtenus par cultures de nouvelles souches de Cathmnthus roseus G. Don cultivées in vitro, ces souches ayant été obtenues par création d'une large population diversifiée de telles souches et sélection des souches actives dans cette population, les deux souches retenues pos sédant les caractéristiques générales suivantes chaque souche est constituée par un ensemble de cals for mant un clone de cal primaire issu d'un fragment de tige d'une plantule stérile d'une variété ornementale hétéro gène, chaque souche provenant de semences différentes, - chaque souche est cultivée dans un milieu renfermant des macro-éléments minéraux (solution de Murashige et Skoog, 100 ml/l), des micro-éléments minéraux (solution de Heller, 1 ml/l), le complexe vitaminique B1 (2 ml/l), du chlorure ferrique hexahydrate (1 mg/l), de l'acide naphtyl-l acéti que (1 mg/l), de la (furfuryl-amino)-6 purine (1 mg/l), du glucose (30 mg/l)et de la gélose (7 g/l), chaque souche est cultivée à 220C, sous éclairement de 2500 lux pendant 16 H/jour et la périodicité de repiqua ge est de 5 semaines, les souches ont un aspect morphologique granuleux, sont très friables et montrent une absence totale d'organogé nèse les deux souches retenues présentant de plus les caractéristiques suivantes pour la souche CR-1, une pigmentation vert clair et un taux de croissance de l'ordre de 6 fois la taille de l'implant initial par cycle de culture; pour la souche CR-2, une pigmentation verte et un taux de croissance de l'ordre de 12 fois la taille de l'im plant de croissance par cycle de culture. 2. Extraits selon la revendication 1, caractérisés en ce qu' ils sont obtenus par extraction de tissus ou de milieux de culture des souches retenues, cultivées en milieu liquide de composition semblable à celui décrit dans la revendica tion 1, à l'exception de la gélose. 3. Méthode de production des extraits actifs selon l'une quel conque des revendications 1 ou 2, par culture en suspen- sion dans des fermenteurs ou sous forme immobilisée, des souches selon la revendication 1.