Brevet FR2473060A1 — publié le 19810710

La présente invention concerne un procédé pour stabi- liser une peroxydase dans un milieu à base de protéine sérique et un réactif contenant une peroxydase stabilisée. De façon générale l'invention concerne la préparation et la conservation des réactifs utilisés dans les déterminations immunoenzymatiques et elle est particulièrement utile pour stabiliser les enzymes et les conjugués enzymatiques utilisés pour détecter et déterminer des composés immunoréagissants tels que des antigènes, des anticorps, des protéines fixantes et des haptènes. Les brevets des Etats-Unis d'Amérique n0 3 911 096 et n0 3 928 553 décrivent l'utilité de l'acide anilino-8 naphtalène- sulfonique-l (ANS) comme "agent bloquant" pour inhiber la fixation de la triiodothyronine et/ou de la thyroxine à la globuline fixant la thyroxine (TBG). Ces brevets indiquent que l'on peut, par l'emploi d'un agent bloquant tel que l'ANS, analyser la T3 et/ou la T4 d'un sérum non extrait sans être gêné par la globuline fixant la T4 et la préalbumine fixant la thyroxine. L'explication théorique en est que les sites fixant la T3 et la T4 de la globuline dt de la préal- bumine fixantes sont occupés ou bloqués par l'ANS si bien que la T3 et/ou la T ne sont pas fixées et peuvent être détectées selon une technique de détermination. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique n0 4 169 102 décrit un procédé pour stabiliser des compositions de peroxydases, par addition d'ions polyvalents des groupes 3 et 4 de la classifi- cation périodique à des réactifs contenant des compositions de peroxydase. Les titulaires de ce brevet déclarent que les réactifs stabilisés selon ce procédé se prêtent particulièrement bien à la lyophilisation. L'invention concerne un procédé pour stabiliser des réactifs contenant une'peroxydase ou un conjugué de peroxydase qui sont particulièrement utiles pour la détection et la détermination immunoenzymatiques de composés réagissants immunologiques. Essentiel- lement ce procédé consiste a ajouter au réactif contenant une peroxy- dase une quantité stabilisante d'acide anilino-8 naphtalènesulfo- nique-l (ANS). Le mode de réalisation préféré de l'invention va maintenant être décrit. 247306 O On sait que les peroxydases, qu'elles soient ou non couplées (conjuguées) à un autre composant, ne sont pas très stables en particulier aux faibles concentrations. Par conséquent leu.r sta- bilité au stockage est assez médiocre ce qui réduit leur intérêt commercial. Les peroxydases sont des enzymes qui catalysent l'oxy- dation de certains composés pendant laquelle un peroxyde, en parti- culier du peroxyde d'hydrogène, se comporte comme un "accepteur" vis-àvis d'une molécule donneuse de protons. On peut obtenir les peroxydases à partir de végétaux, par exemple la peroxydase de raifort; de vertébrés, par exemple la lactoperoxydase; et de micro-organismes,par exemple la cytochrome-peroxydase de Pseudomonas. On utilise les peroxydases à diverses fins, y compris comme marqueurs détectables dans des méthodes immunologiques de détection et de détermination de composés réagissants tels que des haptènes, des antigènes ou des. anticorps. L'emploi de composés réagissants immunologiques marqués par une peroxydase est particuliè- rement intéressant car on peut détecter visuellement l'activité ou la présence de l'enzyme et évaluer les degrés d'activités par colorimétrie. Les ensembles de détermination qui sont commercialisés pour effectuer les déterminations immunoenzymatiques comportent comme constituant essentiel une certaine quantité d'un composé réagissant immunologique couplé à une peroxydase. Ces ensembles sont expédiés et conservés pendant des durées variables avant l'emploi, il est essen-iel que l'activité de l'enzyme soit maintenue aussi longtemps que possible. Généralement on conserve les conjugués enzymatiques dans un milieu de réaction immunologique constitué d'environ 10 % de sérum de veau foetal. On a noté que la présence de sérum de veau améliore la stabilité du conjugué. On estime que la matrice de sérum contri- bue à maintenir la structure spatiale de l'enzyme. Paradoxalement on a également observé que le sérum de veau contribue à l'inactivation de l'enzyme par extraction des fragments hémines détachables de la structure de l'enzyme. Cette dénaturation de la peroxydase semble due à des interactions entre l'hémine de la peroxydase et les protéines fixant l'hémine du sérum de veau. La demanderesse a découvert que, lorsque pour diminuer l'attraction et conséquent l'interaction entre l'hémine et les pro- téines du sérum on ajoute de 'ANS au milieu du réactif, la stabi- lité de la peroxydase est augmentée de 10 à 20 fois. Il semble que 'ANS améliore la stabilité de la peroxydase en réagissant avec les protéines sériques du sérum de veau et en occupant les sites fixant l'hème. L'invention est illustrée par l'exemple non limitatif suivant. EXEMPLE On réunit des sérums de veaux foetaux du commerce et on traite l'ensemble a chaud à 55 C pendant une heure pour éli- miner toute activité peroxydasique endogène. On filtre le sérum à travers un tampon "ertel" pour éliminer les précipités et on dilue le filtrat avec du tampon Tris 0,1 M (pH 7,5) et du NaCl 0,15 M pour obtenir une concentration finale de 10 % de sérum. On répartit la composition a base de sérum dans deux flacons. On ajoute a un des flacons de l'acide anilino8 naphtalènesulfonique-l pour obtenir une concentration de 0,01 %. On ajoute a chaque solution de sérum tamponné de la peroxydase de raifort conjuguée par oxydation au periodate avec de l'IgG. On filtre les solutions à travers un filtre stérile de 0,45,um et on répartit en fractions de 5 ml dans des flacons stériles. On conserve les flacons a 4 C ou a 45 C. On titre l'activité enzymatique du contenu de chaque flacon pour déterminer la stabilité a O, 8, 20 et 43 jours. On détermine l'activité enzymatique par spectrophotométrie avec un analyseur bichromatique à 415 nm. On effectue l'analyse en 5 minutes par mélange de 10ul de la solution enzymatique avec 250jul d'une solution substrat contenant du tampon Trisphosphate à pH 6, du peroxyde d'hydrogène et 3 mg/ml d'o-phénylènediamine. Pour détermi- ner la stabilité on calcule le pourcentage d'activité enzymatique après conservation a 45 C par rapport à l'activité de l'enzyme conservée a 4 C. Les résultats de cette étude figurent ci-après: Activité enzymatique relative Stabilisant Néant 0,01 % d'ANS O jour % % 7,5 jours 7,5 % 77 % 19,5 jours 43 jours 2,4 % 0 % 66 % 43 % Bien entendu diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limi- tatifs sans sortir du cadre de l'invention. R E V E N D I C A T I O N S REVENDICATIONS 1. Procédé pour stabiliser une peroxydase dans un milieu à base de protéine sérique, caractérisé en ce qu'il consiste a ajouter à ce milieu une quantité efficace d'acide anilino-8 naphta- lènesulfonique-l. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise l'acide anilino-8 naphtalènesulfonique-l à une concen- tration d'environ 0,001 % à environ 0,5 %. 3. Procédé pour stabiliser la peroxydase de raifort dans du sérum de veau foetal, caractérisé en ce qu'il consiste à ajouter à ce milieu une quantité efficace d'acide anilino-8 naphta- lènesulfonique-l. 4. Réactif utile dans des déterminations immunochimiques caractérisé en ce qu'il est constitué d'une peroxydase dans un milieu à base de protéine sérique stabilisé avec de l'acide anilino-8 naphtalènesulfonique-l.