Brevet FR2461749A1 — publié le 19810206

La présente invention se rapporte à un procédé pour pré- parer la L-lysine par fermentation et concerne plus particulièrement un procédé de préparation de la L-lysine au moyen d'un micro-organisme formé par une technique de recombinaison génétique. Jusqu'à maintenant, pour utiliser une souche naturelle dans la préparation de la L-lysine à partir d'hydrates de carbone, il fallait au préalable induire des mutants artificiels de cette souche naturelle. Il existe de nombreux mutants artificiels connus pour produire de la lysine. La plupart de ces mutants résistent aux analogues de la lysine, comme la S-(2-aminoéthyl)-cystéine ("AEC"), et/ou exigent pour leur croissance de l'homosérine, et ils appartiennent au genre Brevibacterium ou Corynebacterium. Ces micro-organismes produisent la L-lysine avec un rendement de 40 à 50%. Parmi les publications récentes traitant de la production de la L-lysine par fermentation, on peut citer les demandes de brevets japonais publiées sous le n' 9784/1980, 9783/1980, 9559/1980, 9785/1980, 86091/1978, 86090/1978, 86089/1978, 2639/1978, 20490/1978, 9394/1978 et 6486/1978. Toutefois, il s'est avéré difficile d'augmenter les rendements en L-lysine au moyen des techniques de mutation artifi- cielle. Il existe donc toujours un besoin en nouveaux micro-organismes capables de produire la L-lysine avec des rendements élevés. La présente invention concerne en premier lieu un nouveau micro-organisme capable de produire la L-lysine avec des rendements élevés. L'invention comprend également un procédé de préparation de la L-lysine avec des rendements élevés. D'autres buts et avantages de l'invention appraîtront plus clairement à la lecture de la description ci-après. Ces buts et avantages ont été atteints en premier lieu dans un microorganisme producteur de L-lysine qu'on obtient en incorporant dans une souche hôte du genre Escherichia, un plasmide hybride dans lequel on a inséré un fragment de DNA possédant une information génétique contrôlant la production de L-lysine et qui dérive d'une souche donneuse résistant aux analogues de la L-lysine. L'invention comprend également un plasmide hybride obtenu par insertion dans un plasmide choisi dans le groupe forgé par les plasmides Col El, pSC 101, pBR 322, pACYC 177, pCR 1, RIK et X phage, d'un fragment de DNA contenant une information contrôlant la production de L-lysine, fragment de DNA qui dérive du IBA d'une souche donneuse résistant aux analogues de la L-lysine. Un autre objet de l'invention consiste en un procédé de préparation de la L-lysine qui se caractérise en ce que l'on cultive dans un milieu de culture un micro-organisme producteur de L-lysine qu'on a obtenu par incorporation dans une souche hôte du genre Escherichia, un plasmide hybride dans lequel on a inséré un fragment de DNA possédant une information génétique contrôlant la production de la L-lysine qui dérive d'unie souche donneuse résistant aux analogues de la L-lysine et on recueille la L-lysine qui s'est accumulée dans le milieu de culture. La demanderesse a réussi à obtenir un mîcro-orga-ise du genre Escherichia qui produit la L-lysine avec des rendemeuts supérieurs à ceux obtenus avec les mutants artificiels d'Escberiîcla. Ce micro-organisme a donc permis d'élaborer un procédé de préparation de la L-lysine-par fermentation, dans lequel on cultive dans un milieu de culture un micro-organisme producteur de la L-lysine obtenu par incorporation d'un plasmide hybride dans un récepteur du genre Escherichia et on récolte la L-lysine qui s'est accumulée dans le milieu de culture, ce procédé se caractérisant en ce que le plasmide hybride contient un fragment d'acide déscxyrxbo- nucléique possédant une information génétique en relation avec la production de la L-lysine et lui-même obtenu à partir d'un micro- organisme du genre Escherichia résistant aux analogues de la l!sine. La souche donneuse de DNA utilisée pour former le pro- ducteur de L-lysine selon l'invention est un micro-organism du genre Escherichia possédant une information génétique en relation avec la production de L-lysine. On utilise de préférence comre donneuses de DNA des souches à haute productivité en L-lysine. Le mutant résistant aux analogues de la lysine, qu'on utilise comme donneur de DNA peut lui-même être obtenu par des techniques de mutation classiques. 246 1 7 4 9 Les analogues de la lysine sont les composés qui inhibent la croissance des souches Escherichia, mais l'inhibition est supprimée en totalité ou en partie lorsqu'il y a coexistence de L-lysine dans le milieu. Comme exemples d'analogues de la lysine, on citera l'oxo-lysine, l'hydroxamate de lysine, 1'AEC, la y-méthyl- lysine et le P-chloro-caprolactame. Le DNA chromosomique est extrait du donneur de DNA par des techniques bien connues et traité par une endonucléase de res- triction selon des techniques également bien connues (Biochem. Biophys. Acta 383: 457 (1975)). Le plasmide ou DNAphage utilisé comme vecteur dans le mode opératoire de synthèse est également traité, de manière analogue, au moyen d'une endonucléase de restriction. On peut utiliser divers types d'endonucléase de restriction si la digestion du DNA chromo- somique est faite en partie. Ensuite, le DNA chromosomique digéré et le DNA vecteur sont soumis à une réaction de ligation. La recombinaison du DNA conduisant au plasmide recombiné peut être effectuée par incorporation d'acide désoxyadénylique et d'acide thymidylique de transférase terminale, ou d'acide désoxy- guanylique et d'acide désoxycytidylique dans le fragment de DNA chromosomique et le DNA vecteur lysé, en soumettant ensuite le fragment de DNA chromosomique modifié et le DNA lysé à une réaction de recuit. Parmi les DNA vecteurs qui conviennent, on peut utiliser des vecteurs classiques tels que Col El, pSC 101, pBR 322, pACYC 177, pCR 1, R6K ou 1-phage, ou leurs dérivés. Le DNA hybride ainsi obtenu peut Etre incorporé dans un micro-organisme du genre Escherichia par des techniques classiques de transformation (cf. J. Bacteriol., 119, 1072 (1974>). Le transfor- mant recherché est sélectionné à l'aide d'un milieu sur lequel seul un clone possédant les caractéristiques de productivité de la L-lysine possédée par le fragment de DNA chromosomique et/ou possédée par le DNA vecteur, peut croître. Comme micro-organisme récepteur du DNA hybride, on utilise habituellement un auxotrophe de la L-lysine, car il est classique de distinguer le transformant producteur de lysine du 246174 9 récepteur. De préférence, pour parvenir aux meilleurs résultats, on utilise comme récepteur un mutant présentant déjà une haute productivité à l'égard de la L-lysine. Les modes opératoires utilisés pour la culture des souches productrices de L-lysine obtenues dans ces conditions sont classiques et analogues aux modes opératoires observés pour la culture de micro-organismes connus et producteurs de L-lysine. Ainsi, le milieu de culture utilisé est un milieu classique conte- nant des sources de carbone, des sources d'azonte, des ions miné- raux et, lorsque c'est nécessaire, des substances nutritives orga- niques mineures telles que les vitamines ou les aminoacides. Parmi les sources de carbone qui conviennent, on citera le glucose, le saccharose, le lactose, l'hydrolysat d'amidon et les mélasses. On peut utiliser comme source d'azote de l'ammoniac gazeux, de l'ammo- niaque aqueuse et des sels d'ammonium et d'autres substances contenant de l'azote. La culture des micro-organismes recombinés est effectuée dans des conditions aérobies avec un pH et une température du milieu réglés aux niveaux appropriés, ceci jusqu'à ce que la formation de la L-lysine s'arrête. On peut alors recueillir la L-lysine qui s'est accumulée dans le milieu de culture, selon des techniques classiques. Le procédé selon l'invention permet d'obtenir la L-lysine avec des rendements supérieurs à ceux obtenus antérieurement avec des mutants artificiels d'Escherichia.- Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée; dans ces exemples, les indications de parties et de pourcentages s'entendent en poids sauf mention contraire. EXEMPLE 1 (1) Préparation du DNA chromosomique possédant une information génétique en relation avec la piuduction deL-lysine. - On cultive, à370C pendant3 h, sous secousses, Escherichia coli EL-1, NRRL B-12199, un mutant résistant à V'AEC, et dérivant de la souche K-12 (ATCC 10798) par exposition de cellules de cette souche à 2501ag/ml de Nméthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine dans un tampon acide citrique, pH 6,0, à 30 C pendant 1 h, et séparation de la colonie apparaissant sur le milieu gélosé, dans 1 litre de milieu L contenant 1 g/dl de peptone, 0,5 g/dl d'extrait de levure, 0,1 g/dl de glucose et 0,5 g/dl de NaCl (pH réglé à 7,2) et on récolte les cellules bactériennes dans la phase de croissance exponentielle. On extrait le DNA chromosomique par une technique classique au phénol; on obtient 3,6 mg de DNA purifié. (2) Préparation du DNA vecteur. On prépare le vecteur, DNA de Col El, de la manière suivante: On soumet une souche d'Escherichia coli K-12 recélant le plasmide Col El à incubation à 37 C dans 1 litre de milieu glucose- "casamino acid", sels minéraux contenant 2 g de glucose, 1 g de NH4C1, 6 g de Na2HP04, 3 g de KH2P04, 5 g de NaCl, 0,1 g de MgSO4,7H20, 0,015 g de CaC12, 2H20, 20 g de "casamino acid", 0,05 g de thymine, 2V 2 0,05 g de Lméthionine et 0l0rg de chlorhydrate de thiamine par litre (pH réglé à 7,2) . On soumet à incubation jusqu'à la dernière phase logarithmique et on ajoute au milieu de culture 170/gkl de chloramphénicol. Ce mode opératoire provoque une propagation et une accumulation abondantes du DNA de plasmide dans les cellules bacté- riennes. Apres 16 h d'incubation, on récolte les cellules et on les soumet à lyse par traitement avec la lysozyme et le SDS. On centrifuge le lysat à 30 000 g pendant 1 h et on prélève le liquide surnageant. Après concentration de ce liquide, on obtient par fractionnement, au moyen d'une centrifugation à gradient de densité d'équilibre chlorure de caesium-bromure d'éthidium, 450Pg du DNA de plasmide. (3) Insertion du fragment de DNA chromosomique dans le vecteur. On traite lOpg du DNA chromosomique par l'endonucléase de restriction EcoRI à 37 C pendant respectivement 5, 10, 20, 30 et 60 min afin de couper les chaînes de DNA, puis on chauffe 5 min à 65 C. On traite également lOpg du DNA vecteur par l'endonucléase de restriction EcoRI à 37 C pendant 1 h afin de scinder complètement le DNA, puis on chauffe à 65 C pendant 5 min. On mélange la solution de DNA chromosomique digéré et la solution de DNA vecteur scindé et on soumet à l'action de ligation des fragments de DNA par la ligase DNAphage T4 en présence de ATP et de dithiothréitol à 10 C pendant 24 h. On chauffe ensuite le mélange de réaction à 65 C pendant 5 min et on ajoute deux fois son volume d'éthanol. On recueille le DNA recombiné qui précipite. (4) Transformation génétique avec le plasmide hybride recélant l'infor- mation génétique en relation avec la production de L-lysine On cultive, dans 10 ml de milieu L à 37cC sous secousses, une souche exigeant la biotine et la thymine, Escherichia coli BT-14, NRRL B-12200, obtenue à partir d'Escherichia coli K-12 par mutagénese à la N-méthyl-N'-nitro-Nnitrosoguanidine (250 pglml dans un tampon acide citrique, pH 6,0, à 30 C pendant 1 h, et séparation du mutant exigeant la biotine et la thiamine). On récolte les cellules dans la phase de croissance exponentielle et on les remet en suspension dans une solution O,lM de MgC12, puis dans une solution O,1M de CaC12 au bain de glace; on prépare ainsi des cellules'4ampétentes' capables d'absorber le DNA. A la suspension de cellules compétentes, on ajoute le DNA obtenu en (3) ci-dessus, contenant le DNA de plasmide hybride. On maintient la suspension au bain de glace pendant 30 min puis cn chauffe à 42 C pendant 2 min et on laisse à nouveau reposerz au imm de glace pendant 30 min; les cellules, auxquelles on a ainsi incor- poré le DNA de plasmide hybride, sont inoculées dans le milieu L; on secoue ce milieu à 37 C pendant 3 h, ce qui complète la reéaction de transformation. On récolte les cellules, on les lave et on les remet en suspension. On étale une petite portion de la suspension de cellules sur une plaque de gélose contenant 2 g de glucose, lg de (NH4)2S04, 7 g de K2HP04, 2 g de KH2P04, 0,1 g de MgSO4,714, 0,5 de citrate de sodium,2H20, 1 g d'AEC,HCI, 0,1 mg de biotine, 0,1 mg de chlorhydrate de thiamine et 2 g de gélose par litre (pH réglé à 7,2). La plaque est soumise à incubation à 37 C pendant 3 jours. On recueille les colonies apparaissant sur la plaque et on sélectionne les transformants producteurs de L-lysine par forma- tion d'un halo sur un milieu à la gélose minimale sur lequel on a étalé au préalable le mutant L-l, exigeant de la lysine, induit d'Escherichia coli K-12. On obtient ainsi le transformant producteur de lysine, le micro-organisme AJ 11442, FERM-P 5084, NRRL B-12185. (5) Production de L-lysine au moyen de la nouvelle souche. On trouvera dans le tableau ci-après les résultats d'essais expérimentaux de production de L-lysine par fermentation à l'aide de la souche NRRL B12185 et de la souche EL-1, un mutant artificiel, donneur de DNA. Le milieu de fermentation contenait 5 g/dl de glucose, 2,5 g/dl de sulfate d'ammonium, 0,2 g de KH2PO4, 0,1 g/dl de MgSO4,7H20, 0,05 g/dl d'extrait de levure, 100pg/dl de chlorhydrate de thiamine, 30 p/dl de biotine, 1 mg/dl de FeSO4,7H20, 1 mg/dl de MnSO 4,4H20 et 2,5 g/dl de CaCO3 (stérilisé séparément), pH réglé à 7,0. On a placé des portions de 20 ml du milieu de fermenta- tion dans des fioles de 50 ml, inoculé par une boucle de fil de platine du micro-organisme soumis à l'essai et cultivé à 31 C pen- dant 72 h. La quantité de L-lysine contenue dans le liquide surnageant du bouillon de fermentation a été déterminée par test microbiologique. Microorganisme L-lysine produite ___ _ (mg/dl) EL-1 16 NRRL B-12185 28 Les souches EL-1, BT-14 et NRRL B-12185 ont les mêmes caractéristiques que la souche K-12, lesquelles figurent dans l'ouvrage "Bergeys Manual of Determinative Bacteriolygy", 8e édition. La souche NRPL B-12185 a été déposde au Northern Regional Research Center, Peoria, Ll!inois, Etats-Unis d'Amérique, le 10 juin 1980. Il est clair que l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'exemples et que l'homme de l'art peut y apporter des modifications sans pour autant sortir de son cadre. REVENDICATIONS R E V E N D I C A T I 0 N S 1 - Micro-organisme producteur de L-lysine, obtenu par incorporation dans une souche hôte du genre Escherichia, d'un plasmide hybride dans lequel on a inséré un fragment de DNA possédant une information génétique contrôlant la production de L-lysine, dérivant lui-même d'une souche donneuse résistante aux analogues de la L-lysine. 2 - Micro-organisme selon la revendication 1, caracté- risé en ce que la souche hôte est Escherichia coli BT-14, NRRL B 12200. 3 - Micro-organisme selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche donneuse est Escherichia coli EL-l, NRRL B-12199. 4 - Micro-organisme selon la revendication 1, caracté- risé en ce que la souche donneuse résiste aux analogues choisis dans le groupe formé par l'oxolysine, l'hydroxamate de lysine, la S-(2- aminoéthyl)-cystéine, la k-méthyl-lysine et le P-chloro-caprolactame. 5 - Micro-organisme selon la revendication 1: Escherichia coli NRRL B-12185. 6 - Micro-organisme selon la revendication 1, caracté- risé en ce que- le plasmide hybride dérive d'un membre du groupe formé par Col El, PsC 101, pBR 322, pACYC 177, pCR 1, R6K et X phage. 7 - Micro-organisme selon la revendication 1, caractérisé en ce que le plasmide dérive de Col El. 8 - Plasmide hybride obtenu par insertion dans un plasmide choisi dans le groupe formé par Col El, pSC 101, pBR 322, pACYC 177, pCR 1, R6K et x phage, d'un fragment de DNA contenant une information contrôlant la production de L-lysine, lequel fragment de DNA dérive du DNA d'une souche donneuse résistante aux analogues de la L-lysine. 9 - Plasmide selon la revendication 8, caractéris é-en ce qu'il dérive de Col El. - Plasmide selon la revendication 8, caractérisé en ce que la souche donneuse est Escherichia coli EL-1, NRRL B-12199. - 11 - Procédé de préparation de la L-lysine, caractérisé en ce que l'on cultive dans un milieu de culture le micro-organisme selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, et on recueille la L-lysine qui s'est accumulée dans le milieu de culture.