Brevet FR2471411A1 — publié le 19810619

Les nouveaux substrats sont utiles comme réac- tifs dans la détection et la détermination d'enzymes protéolytiques qui coupent les liaisons amide des chaînes peptidiques du côté du carboxyledes restes arginine et lysine. Des substrats chromogènes et fluorométriques de structure voisine ont été décrits dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique n 3 886 136, 4 028 318, 4 061 625 et 4 070 245; cepen- dant, aucun de ces substrats ne bénéficie du remplacement d'un groupe a-amino par un groupe e-hydroxy dans la portion terminale. Plus particulièrement, la demanderesse a trouvé que, lorsque l'on substitue un substrat tripeptidique par un e- 3' hydroxyacide analogue dans la position N-terminale ou P3 d'un subs- trat tripeptidique, on obtient au moins trois avantages. Le plus notable est que la solubilité dans les tampons aqueux est plus grande avec les chydroxyacides qu'avec les substrats aminoacides bloqués par un groupe benzoyle. En outre, les substrats a-hydroxy ne sont pas sensibles a l'activité d'aminopeptidase, ce qui élimine la nécessité de groupements bloquants sur la position N-terminale et év i te l'utilisation de la forme D par rapport à la forme L (naturelle) de l'aminoacide N-terminal. Les analogues a-hydroxy simplifient également la synthèse en éliminant la nécessité de bloquer et débloquer le substituant hydroxy pendant la synthèse. Les substrats a-hydroxy présentent également des réactivités enzy- matiques semblables avec une cinétique très voisine de celle des ac-aminoacides correspondants. En particulier, l'invention concerne de nouveaux substrats décelables par spectrophotométrie qui peuvent être caracté- risés comme des a-hydroxytripeptides de formule suivante HO-CH-CO-A1-A2-R R1 dans laquelle R1 est choisi parmi l'hydrogène, les groupes alkyle inférieur à chaîne droite ou ramifiée en C1-C4 et les groupes benzyle; R2 est choisi parmi les restes paranitroanilide, nitrophényle, méthyl- nitrophényle, dinitrophényle, naphtyle, nitronaphtyle 4-méthyl-7- coumarylamide, 1-méthoxy-3-naphtylamide et thiobenzylester; A1 est choisi parmi les restes de L-aminoacides consistant en glycine, ala- nine, valine, leucine, proline, isoleucine, sérine, thrêonine, acide aspartique, asparagine, acide glutamique, glutamine, lysine, hydro- glycine, histidine, arginine, phénylalanine, tyrosine, tryptophane, cystéine, méthionine, acide pipécolique; et A2 est un reste L-argi- nine ou L-lysine. Un groupe particulièrement préféré de substrats comprend ceux de formule HO-CH-CO-A -A -R2 R dans laquelle R1 est choisi parmi l'hydrogène, les groupes alkyle inférieur à chatne droite ou ramifiée en C1-C4 et les groupes benzyle; R2 est choisi parmi les restes paranitroanilide, nitrophényle, thio- benzylester; A1 est choisi parmi les L-aminoacides consistant en glycine, alanine, valine, proline, isoleucine, acide aspartique, acide glutamique et phénylalanine; et A2 est le reste L-arginine ou L- lysine. Les a-hydroxyacides utilisés dans la préparation des substrats de l'invention peuvent tous être préparés selon la technique décrite par M. Winitz et col., J. Am. Chem. Soc., 78, page 2423 (1956). A partir de l'ahydroxy P-phénylpropionique et de l'acide a-hydroxy isocaproique, on peut synthétiser les substrats de l'invention selon le mode opératoire de base suivant de condensa- tion par étapes: R On condense le carbobenzoxy (CBZ)-Arg-OH avec R l'isocyanate de pnitrophényle pour donner CBZ-Arg-pNA que l'on R traite à son tour avec HBr/acide acétique pour donner HBr-Arg-pNA. On condense l'ester de succinimidyle de CBZ-Pro R R g! avec HBr-Arg-pNA pour donner le CBZ-Pro-Arg-pNA protégé. On traite le dipeptide protégé par HiBr/acide acé- R tique pour donner HBr-Pro-Arg-pNA que l'on condense à nouveau avec 47141 1 un a-hydroxyacide en utilisant le l-hydroxybenzotriazole et le di- cyclohexylcarbodiimide. On peut faire à nouveau réagir l'a-hydroxy- R acide-Pro-Arg-pNA avec HF ou l'acide méthanesulfonique pour éliminer le groupement protecteur R du reste guanidine de l'arginine. Des groupes R convenables comprennent les groupes méthoxybenzènesulfonyle, nitro et tosyle. Le groupe CBZ pour la protection du groupe a-amino des a-aminoacides peut être remplacé par d'autres restes tels que t-butoxycarbonyle ou o-nitrophénylsulfonyle. On peut remplacer avec succès les aminoacides mentionnés dans le schéma précédent de préparation par d'autres amino- acides. Par exemple, l'aminoacide fixé directement au groupe êlimi- nable décelable peut être soit l'arginine, soit la lysine. L'amino- acide au centre du tripeptide peut être l'un quelconque des amino- acides précédemment identifiés par A1. Le substituant a-hydroxy N-terminal, bien qu'il soit ordinairement préparé par remplacement du reste amino par un reste a-hydroxy dans la glycine, l'alanine et la phénylalanine, peut également dériver de la valine, de la leucine, de l'isoleucine, de la sérine, de la thréonine, de l'acide aspartique, de l'aspara- gine, de l'acide glutamique, de la glutamine, de la lysine, de l'hydroxylysine, de l'histidine, de l'arginine, de la tyrosine, du tryptophane, de la cystéine et de la méthionine. Un chromophore préféré est le reste paranitro- anilide, mais on peut également utiliser d'autres restes chromo- gènes admis dans la technique, tels que méthylnitrophényle, nitro- phényle, dinitrophényle, naphtyle et nitronaphtyle. Voir Plapinger et col., J. Organic Chem., 30, page 1781 (1965). On peut également utiliser des groupes éli- minables fluorométriques bien connus dans la technique, tels que 4-méthyl7-coumarylamide (Morika, et col., J. Biochem., 82, page 1495 (1977)); 1méthoxy-3-naphtylamide (Elarin et col., Anal. Biochem., 80, page 355 (1977)); et thiobenzylester. 247141'11 Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 Préparation du N"-méthoxybenzènesulfonyl-L-arginyl-p-nitroanilide,HBr On dissout 23 g de Nc-carbobenzoxy-IN-(4-méthoxy- benzènesulfonyl)-Larginine, préparée selon la méthode décrite par Nishimura et col., Chem. Pharm. Bull., 24, page 1568 (1976) dans ml d'hexaméthylphosphoramide. On ajoute à la solution résultante 6,7 ml de triéthylamine et 15,8 g d'isocyanate de p-nitrophényle. On agite la solution à la température ambiante pendant une nuit et ensuite on la verse dans 1300 ml de bicarbonate de sodium à 5 %. On recueille par filtration le précipité résultant et on le lave sur filtre séparé- ment avec deux fois 400 ml de bicarbonate de sodium à 5 %X, une fois 300 ml d'eau, trois fois 300 ml d'acide chlorhydrique lN et ensuite deux fois 200 ml d'eau. On sèche le précipité sur filtre par esso- rage a la trompe et ensuite on l'extrait par trois fois 300 ml de méthanol bouillant. On réunit les extraits méthanoliques et on évapore le méthanol sous vide à 35 C. On purifie encore le résidu semi-solide sur une colonne de gel de silice en utilisant le méthanol à 1-5 7. dans le chloroforme comme éluant. Ceci donne le Nc-carbobenzoxy-Ne-(4- méthoxybenzènesulfonyl)-L-arginyl-p-nitroanilide. On dissout 6,0 g de ce produit dans l'acide bromhydrique à 30 % dans l'acide acétique. On maintient le mélange de réaction résultant à la température ambiante pendant 45 min et ensuite on le verse dans 400 ml d'éther anhydre. On filtre le sel précipité et on le lave avec deux fois 100 ml d'éther anhydre pour donner le bromhydrate de NU-méthoxybenzènesulfonyl-L- arginyl-p-nitroanilide. EXEMPLE 2 Préparation du Na-CBZ-Pro-N-MBS-Arg-pNA On dissout 0,7 g (2 mmol) d'ester de succini- midyle de carbobenzoxy-L-proline et 1,1 g (2 mmol) de N&-MBS-L-Arg- pNA,HBr dans 10 ml de tétrahydrofuranne et 2 ml de diméthylformamide. On ajoute au mélange de réaction 0,24 ml (2 mmol) de N-méthylmorpholine et on agite à la température ambiante pendant une nuit. On évapore le mélange de réaction sous vide et on met le résidu huileux en suspen- s i o n dans 300 ml de chlorure de méthylène. On lave la solution par une fois 60 ml d'acide chlorhydrique 1N, une fois 60 ml de solution de saumure, une fois 60 ml de solution saturée de bicarbo- nate de sodium et une fois 60 ml de solution de saumure, respective- ment. On sèche la solution sur MgSO4 anhydre et on concentre à 2-3 ml. On ajoute de l'éther anhydre à cette solution et on recueille le produit précipité par filtration. Rendement: 0,64 g. EXEMPLE 3 Préparation du L-Pro-N-MBS-Arg-pNAHBr On dissout 0,64 g de N -CBZ-L-Pro-Nw-EBS-Arg- pNA dans 10 ml de HBr à 30 % dans l'acide acétique. On maintient la solution à la température ambiante pendant 1 h,puis on la verse dans -60 ml d'éther anhydre. On recueille par filtration le produit pré- cipité et on le sèche dans un dessiccateur à vide. Rendement: 0,45 go EXEMPLE 4 Préparation d'un a-hydroxyacyl-L-Pro-N -MBS-Ar-pNA On dissout 437 mg (0,68 mmol) de Pro-N"-MBS- Arg-pNA,HBr, 0,68 nmol d'un a-hydroxyacide et 92 mg (0,68 mmol) de 1hydroxybenzotriazole dans 10 ml de tétrahydrofuranne et 2 ml de diméthylformamide. On refroidit la solution à 0 C et on agite au moyen d'un agitateur magnétique en ajoutant 0,1 ml (0,68 mmol) de N-méthylmorpholine et 140 mg (0,68 mmol) de dicyclohexylcarbodiimide. On réchauffe le mélange de réaction à la température ambiante et on agite pendant une nuit. On filtre la dicyclohexylurde et on évapore le filtrat sous vide. On met le résidu en suspension ou on le dissout dans le chloroforme ou le méthanol et on le précipite par l'éther. On recueille le solide par filtration. On prépare par ce mode opératoire les composés bloqués énumérés cidessous: (1) L-a-hydroxy-f-phénylpropionyl-L-Pro-Nb- MBS-L-Arg-pNA, (2) D-a-hydroxy-O-phénylpropionyl-L-Pro-N'- MBS-L-Arg-pNA, (3) L-a-hydroxyisocaproyl-L-Pro-N'-MBS-L- ArgppNA, (4) D-'-hydroxyisocaproyl-L-Pro-N4-MBS-L- Arg-pNA, (5) Glycoloyl-L-Pro-'>-MBS-L-Arg-pNA. EXEMPLE 5 a-hydroxyacyl-L-Pro-L-Arg-pNA On dissout 0,5 mmol d'a-hydroxyacyl-L-Pro-L- N-MBS-Arg-pNA dans l'acide méthanesulfonique (35 sq). Apres 30 min à la température ambiante, on verse le mélange de réaction dans l'éther anhydre. On recueille par filtration le produit précipité. On précipite à nouveau le produit dans le mélange éthanol-éther et le mélange tétrahydrofuranne-éther. Dans la chromatographie sur couche mince, le chromatogramme développé par le mélange n-butanol-acide acétique-eau 4:1:1 présente une seule tache. En suivant ce mode opératoire, on prépare les composés suivants et on les utilise comme substrats d'enzymes: (1) L-a-hydroxy-P-phénylpropionyl-L-Pro-L-Arg- pNA, (2) D-a-hydroxy-P-phénylpropionyl-L-Pro-L- Arg-pNA, (3) L-a-hydroxyisocaproyl-L-Pro-L-Arg-pNA, (4) D-ahydroxyisocaproyl-L-Pro-L-Arg-pNA, (5) glycoloyl-L-Pro-L-Arg-pNA. Dans l'application clinique, les substrats selon l'invention peuvent être utilisés pour mesurer l'antithrombine III (AT III). L'antithrombine III est le composant princi- pal du système anticoagulant humain. Elle inhibe diverses sérine- protéases en formant un complexe 1:1 avec la sérine, centre actif de ces enzymes. La présence d'héparine augmente la vitesse de réaction de 1 'AT III avec ces protéases dans un rapport d'environ 100 fois. La chimie de l'AT III est décrite dans les équations suivantes: Héparine, Thrombine + AT III) (Thrombine: AT III) + thrombine en excès Substrat thrombine en excès) peptide + chromophore Comme la présence d'héparine potentialise l'activité de l'AT III, il est possible de délimiter l'inhibition due à l'AT III par rapport à celle d'autres protéines du plasma qui peuvent également inhiber la thrombine. Ainsi, donc, on mesure 247 1 41 1 l'activité totale de 1'AT III comme une entité distincte de l'acti- vité antithrombine progressive, qui est mesurée en l'absence d'hépa- rine. Il en résulte que l'on peut nettement identifier un défaut dans le système anticoagulant comme associé à MAT III plutôt qu'à un autre mécanisme d'inhibition de protéines. Cet essai repose sur le fait que lAT III humaine contenue dans un échantillon inhibe l'a-thrombine humaine dans un rapport molaire de 1:1. La thrombine en excès est disponible pour l'hydrolyse d'un substrat incolore. Lorsque ce substrat est coup, il libère un groupe éliminable décelable par spectrophotométrie, ce qui provoque un déplacement très important dans le spectre d'absorption indiqué par l'apparition d'une.couleur ou fluorescence décelable. Cette coupure du substrat est analogue à la coupure de la liaison arginylglycine dans le fibrinogène qui conduit à là formation de fibrines. Par contrôle de l'apparition d'une fluorescence colhrée du mélange réactionnel, on peut suivre le remplacement du substrat par la thrombine. Comme la quantité d'AT III et la quan- tité de fluorescence ou de couleur produite sont inversement propor- tionnelles, on peut facilement déterminer la teneur en AT III. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits à titre d'illustra- tion et que l'homme de l'art pourra y apporter des modifications sans sortir du cadre de l'invention. R E V E N D I CA T I 0 N S 1. Substrat chromogène ou fluorescent pour la détermination quantitative d'enzymes protéolytiques qui coupent les liaisons peptidiques du côté du carboxylede l'arginine et de la lysine, caractérisé en ce qu'il répondià la formule générale HO-CH-CO-A -A 2-R2 R1 dans laquelle R1 est choisi parmi l'hydrogène, les groupes alkyle inférieur à chaîne droite ou ramifiée en C1-C4 et les groupes benzyle; 1 R2 est choisi parmi les restes paranitroanilide, nitrophényle, méthyl- nitrophényle, dinitrophényle, naphtyle, nitronaphtyle, 4-méthyl-7- coumarylamide, l-méthoxy-3-naphtylamide et thiobenzylester; A1 est choisi parmi les restes de L-aminoacides consistant en glycine, ala- nine, valine, leucine, proline, isoleucine, sérine, thréonine, acide aspartique, asparagine, acide glutamique, glutamine, lysine, hydro- glycine, histidine, arginine, phénylalanine, tyrosine, tryptophane, cystéine, méthionine, acide pipécolique; et A2 est un reste L-argi- nine ou L-lysine. 2. Substrat chromogène ou fluorescent pour la détermination quantitative d'enzymes protéolytiques qui coupent les liaisons peptidiques du côté du carboxyle de l'arginine et de la lysine, caractérisé en ce qu'il répond a la formule générale suivante HO-CH-C0-A1-A -R R1 dans laquelleR2 est un reste choisi parmi paranitroanilide, nitro- phényle, méthylnitrophényle, dinitrophényle, naphtyle, nitronaphtyle et thiobenzylester; et R1 et A2 sont tels que définis ci-dessus. 3. Substrat chromogène ou fluorescent pour la dé- termination quantitative d'enzymes protéolytiques qui coupent les liaisons peptidiques du côté du carboxyle, d l'arginine et de la lysine, caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale suivante HO-CH-CO-A1- -R2 R1 dans laquelle R2 est choisi parmi les restes paranitroanilide, nitro- phényle et thiobenzylester et R1 et A2 sont tels que définis ci-dessus. 4. Substrat chromogène selon la revendica- tion 3, caractérisé en ce qu'il consiste en glycoloyl-L-prolyl-L- arginyl-p-nitroanilide. 5. Substrat chromogène selon la revendicae tion 3, caractérisé en ce qu'il consiste en L-a-hydroxyisocaproyl-L- prolyl-Larginyl-p-nitroanilide. 6. Substrat chromogène selon la revendica- tion 3, caractérisé en ce qu'il consiste en D-e-hydroxyisocaproyl-L- prolyl-L-arginyl-p-nitroanilide. 7. Substrat chromogène selon la revendica- tion 3, caractérisé en ce qu'il consiste en L-a-hydroxy--phényl- propionyl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitroanilide. 8. Substrat chromogène selon la revendica- tion 3, caractérisé en ce qu'il consiste en D-a-hydroxy-P-phényl- propionyl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitroanilide.