Brevet FR2463931A1 — publié le 19810227

La présente invention est relative à une méthode de réalisation d'essais immunologiques à l'aide d'enzymes, et en particulier à un perfectionnement à la méthode d'es- sais immunologiques par voie enzymatique en phase solide, connue sous le nom d"'ELISA". Dans cette méthode, l'un des composants qui parti- cipent à la réaction est fixé sur une phase solide, et le perfectionnement qui fait l'objet de la présente invention est réalisé en utilisant un tampon contenant un polymère qui accélère la réaction immunologique antigène-anticorps. L'utilisation d'un polymère dans les techniques d'essais immunologiques, telles que les techniques néphélo- métriques et les techniques d'immuno-précipitation, est déjà connue, mais elle n'a pas été utilisée jusqu'à présent dans les essais immunologiques par voie enzymatique en phase solide. Les essais immunologiques par voie enzymatique en phase solide sont actuellement largement utilisés dans les laboratoires des hôpitaux et des cliniques pour réaliser le dosage quantitatif de différentes sortes de protéines du sérum, d'hormones, d'anticorps viraux et bactériens dans la classe des IgG et IgM, ainsi que de médicaments; dans les instituts de recherche vétérinaire pour effectuer le diagnos- tic d'infections virales ou bactériennes chez les animaux domestiques et le bétail; et dans le domaine de l'agricul- ture, en particulier pour faire le diagnostic de maladies virales chez les plantes. La sensibilité et la spécificité des techniques radioimmunologiques et immunologiques par voie enzymatique sont du même ordre de grandeur, mais les réactifs utilisés dans les essais immunologiques par voie enzymatique, contrairement à ceux qui sont employés dans les radioimmuno-essais peuvent être conservés pendant de longues durées et ne sont pas nocifs pour la santé (pas de risques d'irradiation). Comme, de plus, des techniques im- munologiques impliquant des enzymes ne nécessitent pas un équipement coûteux ni un personnel spécialement entraîné ou des mesures spéciales prescrites par la loi pour l'élimina- tion des déchets, elles offrent de très nombreuses possibi- lités d'application, en plus des domaines d'utilisation in- diqués plus haut, dans la jurisprudence médicale, l'indus- trie alimentaire, la recherche des allergies et la sérologie auto-immune. L'utilisation d'essais immunologiques à l'aide d'enzymes est déjà décrite, par exemple dans les brevets suivants d'ORGANON: Brevets américains 3 879 262, 3 791 932, 3 850 752 et 3 839 153. Ces essais immunologiques sont caractérisés par l'utilisation d'antigènes ou d'anti- corps fixés à une phase solide et le dosage de leurs anti- corps ou antigènes, à l'aide d'anti-immunoglobuline marquée par une enzyme. Toutefois, dans ces méthodes, la lenteur des réactions antigèneanticorps constitue un inconvénient, en particulier dans les cas o un diagnostic rapide est néces- saire pour permettre de prendre des mesures thérapeutiques rapides. Jusqu'à présent, la vitesse de réaction a été ac- célérée en réalisant la réaction à 370C, dans une enceinte chauffante. Or, la Demanderesse a constaté que la sensibilité de ces essais immunologiques par voie enzymatique peut être améliorée, et la vitesse de réaction accélérée, par l'utili- sation d'un tampon contenant un polymère, à titre de réac- tif. Un avantage supplémentaire de l'objet de la présente invention est représenté par le fait que les réactions antigène-anticorps peuvent être réalisées rapidement à la température ambiante sans qu'il y ait une réduction quelcon- que de la sensibilité par rapport à ce que permettent les méthodes utilisées jusqu'à maintenant. La présente inven- tion étend les possibilités d'application des essais im- munologiques par voie enzymatique et les rend possibles même dans des conditions sommaires. Par exemple, une réaction effectuée entre une anti- immunoglobuline marquée par une enzyme et une immunoglobuli- ne G dans un tampon contenant un polymère, se déroule au moins cinq fois plus vite que la même réaction réalisée dans les mêmes conditions dans un tampon dépourvu de polymère. Les polymères exercent un effet favorable sur l'interaction entre les anticorps et les antigènes solubles, apparemment par exclusion stérique des complexes immuns du domaine du polymère. c Conformément à la présente invention, il est es- sentiel d'utiliser un tampon contenant un polymère qui accélère la réaction immunologique antigène-anticorps. Comme polymère, on peut utiliser par exemple le polyéthylène- glycol, qui s'est révélé extrêmement avantageux, mais d'au- tres polymères comme le dextrane, la polyvinylpyrrolidone (PVP), l'alcool polyvinylique (PVA),et certains autres polymères capables d'influencer des réactions immunologiques peuvent également être utilisés. Conformément à la présente invention, on utilise, en fonction de la dimension et de la nature de la protéine à déterminer - une expérience pratique dont on ne connaît pas la raison - 0,01 à 20 % (poids/volume) de polymère dans un tampon phosphate 0,01 M, à pH 7,2, contenant 0,9 % (p/v) de NaCl et 0,1 % (p/v) de NaN3. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complé- ment de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples. Il doit être bien entendu toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 Dosage d'anticorps viraux à l'aide d'un tampon contenant du polyéthylèneglycol (PEG 6000) 1. Le virus ou son composant est fixé sur du polystyrène (par exemple sous forme de tubes, de cuvettes ou de plaques de microtitrage) en le diluant avec du tampon phosphate 0,01 M, pH 7,2, contenant 0,9 % (p/v) de NaCl, de telle sorte que le virus ou son composant, présent à raison d'un volume de 200 pl, est absorbé passivement par le poly- styrène. Apres une période de 16 à 20 heures, l'antigène ou son composant en excès est éliminé par rinçage des tubes à deux reprises avec de l'eau distillée. 2. Les spécimens de sérum sont dilués dans un rapport de 1:200 dans du tampon phosphate 0,01 M, pH 7,2, contenant 4 % (p/v) de polyéthylèneglycol (PEG 6000), 0,9 % (p/v) de NaCl, 0,1-% (v/v) de Tween 20 et 0,1 % (p/v) de NaN3. 3. On fait réagir les spécimens de sérum dilués (200 pl) avec l'antigène pendant 30 minutes à la températu- re ambiante, après quoi les tubes sont lavés par rinçage à deux reprises avec de l'eau distillée. 4. Le produit de conjugaison (anti-IgG humaine marquée par de la phosphatase alcaline) est dilué suivant un rap- port de 1:200 dans du tampon phosphate 0,01 M, pH 7,2, con- tenant 4 % (p/v) de polyéthylèneglycol (PEG 6000), 0,9 % (p/v) de NaCl, 0, 1 % (v/v) de Tween 20 et 0,1 % (p/v) de NaN3. 3' 5. On fait réagir le produit de conjugaison (200 pl) pendant une heure à la température ambiante avec les anti- corps spécifiques de l'antigène dans l'échantillon, après quoi les tubes sont rincés à l'eau distillée. 6. Du sel disodique de phosphate alcalin est dissous dans du tampon diéthanolamine MgCl2 (200 mg/100 ml de tam- pon) et 200 pl de cette solution sont ajoutés dans les tubes et incubés 30 minutes à la température ambiante. 7. La réaction de l'enzyme est stoppée à l'aide de NaOH 1M (200 pl) et l'intensité de la couleur formée est mesurée par spectrophotométrie ou évaluée à l'oeil (dans une série d'échantillons, on inclut toujours un échantillon de référence positif et négatif connu, traité de la façon dé- crite plus haut). EXEMPLE 2 Dosage d'anticorps viraux à l'aide d'un tampon contenant du dextrane (Dx 150) 1. Le virus ou son composant est fixé sur du poly- styrène comme décrit dans l'Exemple 1, paragraphe 1. 2. Les spécimens de sérum sont dilués suivant un rap- port 1:200 dans du tampon phosphate 0,01 M, pH 7,2, conte- nant 9 % (p/v) de dextrane (Dx 150), 0,9 % (p/v) de NaCl, 0,1 % (v/v) de Tween 20 et 0,1 % (p/v) de NaN3. 3. On fait réagir les spécimens de sérum dilués comme décrit dans l'Exemple 1, paragraphe 3. 4. Le produit de conjugaison (anti-IgH humaine marquée par une phosphatase alcaline) est dilué suivant un rapport de 1:200 dans du tampon phosphate 0,01 M, pH 7,2, contenant 9 % (p/v) de dextrane (Dx 150), 0,9 % (p/v) de NaCl, 0,1 % (v/v) de Tween 20 et 0,1 % (p/v) de NaN3. 5. La détermination est poursuivie de la façon décrite dans l'Exemple 1, paragraphes 5 à 7. EXEMPLE 3 Détermination de la protéine C-réactive (CRP) à l'aide d'un tampon contenant du polyéthylèneglycol (PEG 6000) 1. De l'anti-CRP humaine de lapin est fixée à la surfa- ce d'un tube de plastique par dilution suivant un rapport de 1:8000 (200 pl) dans du tampon phosphate 0,01 M, pH 7,2, contenant 0,9 % (p/v) de NaCl. La dilution d'antisérum est incubée à la température ambiante, à laquelle l'anticorps est absorbé passivement par le polystyrène. La durée d'incu- bation est de 16 à 20 heures à la température ambiante. L'anticorps en excès est éliminé par rinçage des tubes à deux reprises avec de l'eau distillée. 2. Les échantillons de sérum sont dilués suivant un rapport de 1:1000 dans du tampon phosphate 0,01 M, pH 7,2, contenant 3 % (p/v) de polyêthylèneglycol (PEG 6000), 0,9 % (p/v) de NaCl, 0,1 % (v/v) de Tween 20 et 0,1 % (p/v) de NaN3. 3. Les échantillons de sérum dilués (200 pil) sont incu- bés avec l'anticorps pendant 30 minutes à la température ambiante, après quoi les tubes sont lavés par un double rinçage à l'eau distillée. 4. De l'anti-CRP humaine de porc est diluée suivant un rapport de 1:1500 f200 pl) dans du tampon phosphate 0,01 M, pH 7,2, contenant 4 % (p/v) de polyéthylèneglycol (PEG 6000), 0,9 % (p/v) de NaCl, 0,1 % (v/v) de Tween 20 et 0,1 % (p/v) de NaN3. Après une heure d'incubation, l'interaction entre la CRP et l'anti-CRP a lieu à la température ambiante. Les tubes sont lavés deux fois à l'eau distillée, comme ci- dessus. 5. Le produit de conjugaison (anti-IgG porcine de mouton marquée par une phosphatase alcaline) est dilué suivant un rapport de 1:200 dans du tampon phosphate 0,01 M, pH 7,2, contenant 4 % (p/v) de polyéthylèneglycol (PEG 6000), 0,9 % (p/v) de NaCl, 0,1 % (v/v) de Tween 20 et 0,1 % (p/v) de NaN3. 6. On fait réagir le produit de conjugaison (200 pl) avec l'anti-CRP humaine de porc pendant une heure à la température ambiante, après quoi les tubes sont lavés comme ci-dessus. 7. Du sel disodique d'un phosphate alcalin est dissous dans du tampon de diéthanolamine MgCl2 (200 mg/100 ml de tampon) et 200 pil de cette solution sont ajoutés dans les tubes et incubés pendant 30 minutes à la température am- biante. 8. La réaction de l'enzyme est stoppée avec du NaOH 1 M (200 p1) et l'intensité de la couleur est mesurée par spectrophotométrie ou évaluée à l'oeil. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'in- vention ne se limite nullement à ceux de ses modes de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse, au contraire, tou- tes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du techni- cien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 - Méthode de réalisation de titrages immunolo- giques par voie enzymatique dans lesquels l'un des compo- sants qui participent à la réaction est fixé à une phase solide, caractérisée en ce qu'on utilise un tampon conte- nant un polymère qui accélère la réaction immunologique antigène-anticorps. 2 - Méthode selon la Revendication 1, caractérisée en ce que le polymère est du polyéthylèneglycol ou du dextrane.