Brevet FR2472607A1 — publié le 19810703

La présente invention concerne les systèmes de régén- ration des cofacteurs pyridiniquesf et plus particulièrement des systèmes de régénération des cofacteurs pyridiniques faisant intervenir des réactions enzymatiques et des fonctions biologiques immobilisées I1 est connu d'élaborer et de faire fonctionner des systèmes de régénération enzymatiques de cofacteurs,de cosubstrats, de co-enzymes etc .., dans le but soit de procéder à des analyses fines dans des gammes infinitésimales, soit de fabriquer des produits en particulier avec une haute valeur ajoutée. On peut citer à propos des enzymes nécessitant des co-substrats, par exemple, l'ouvrage intitulé "Methods of Enzymatic Analysis", de H.U. Bergmeyer, 2ème édition anglaise, 1974, Ed.Academic Press, Inc., ainsi que, à propos des méthodes de régénération enzymatiques, les travaux de K.Mosbach relatés dans "Methods in Enzymology", vol. 44,(1976), Ed. Academic Press, Inc, Les systèmes sans régénération préconisés actuellement mettent en oeuvre des cofacteurs, dans des proportions stoe- chiométriques. I1 en résulte un coût important, rédhibitoire pour beaucoup d'applications, en particulier dans les cas d'enzymes à cofacteurs pyridiniques, qui représentent environ un tiers des enzymes connues. En effet, dans un système enzymatique tel que ceux décrits dans l'ouvrage de Bergmeyer susdit, une molécule de cofacteur est consommée pour chaque molécule de substrat soumise à la réaction enzymatique. Cela peut s'écrire cofacteur + substrat Enzyme oefacteur modifié+produit La régénération a pour but de ramener chaque molécule de cofacteur modifié dans son état initial. On a déjà proposé pour ce faire trois types de méthodes. Les méthodes du premier type consistent en des régénérations chimiques, qui font intervenir des substances acceptrices d'électrons, commetpar exemple le phénazineméthosulfate (PMS) et le p-hénazine-éthosulfate (PES), Mais ces substances acceptrices d'électrons sont particulièrement instables et il faut en assurer fréquemment le renouvelement Les méthodes du deuxième type consistent en des régérations électrochimiques qui font intervenir une réaction d'oxydo-réduction à l'tnterface d'une électrode. Toutefois, les rendements obtenus dans cette régénération sont insuffisants et le système converge. Or, il faut rappeler qu'un rendement de régénération, pour être. opérationnel, doit être d'au moins 99 t-. Les méthodes du troisième type reposent sur des régérations biochimiques avec des enzymes et impliquent donc un deuxième système enzymatique,un deuxième substrat et un deuxième produit qui contamine'le milieu, comme il est décrit dans l'article de Mosbach mentionné plus haut. On a maintenant trouvé qu'on peut réaliser des systèmes de régénération biochimique exceptionnellement avantageux, tant du point de vue efficacité que du point de vue coût, en associant à un système enzymatique impliquant un substrat et un cofacteur au moins un système biologique immobilisé et conçu pour assurer la régénaration du cofacteur de façon fonctionnelle, en utilisant uniquement de l'oxygène, notamment l'oxygène de l'air. La présente invention a donc fondamentalement pour objet un système de régénération biochimique comprenant,en association avec un système enzymatique impliquant des proportions stoechiométriquement équivalentes d'un cofacteur et d'un substrat, au moins un système biologique immobilisé et conçu pour assurer la régénration du cofacteur de façon fonctionnelle en utilisant uniquement de l'oxygène. Dans la présente invention, on entend par "système biologique immobilisé associé au système enzymatique", tous systèmes ou fonctions biologiques aptes à réaliser la régé- nération des cofacteurs sans nécessiter de second substrat, c'est-â-dire en particulier des préparations membranaires plus ou moins purifiées de cellules animales, de cellules végétales et/ou de protistes, ou les cellules entières correspondantes,-et par exemple des bactéries,des mitochondries et des organites photosynthétiques, ou les préparations membranaires correspondantes.Un tel système biologique utilise essentiellement la chaîne respiratoire de la phos phorylation oxydative en présence d'oxygène, notamment de 11 oxygène de l'air, et ne nécessite donc ni transporteurs d'électrons artificiels exogènes ni substrats supplémentaires. Le système conforme à la présente invention est remarquable en ce qu'il comprend un système biologique tel que défini plus haut, dans lequel il n'est même pas toujours nécessaire de purifier les membranes; il p ut être constitué de bactéries entières, de mitochondries entières ou d' organiies photo synthétiques entiers. Ainsiton a pu établir expérimentalement que l'efficacité d'un tel système dans le cas des bactéries entières, après immobilisation, est en moyenne 10 fois supérieur à celle de la fraction membranaire correspondante de ces bactéries. Le système enzymatique lui-même peut être choisi par l'homme de l'art parmi les systèmes enzymatiques connus comme aptes à réaliser l'objectif qu'on s'est assigné (notamment la production d'un produit à haute valeur ajoutée, des analyses ou une opération de purification, entre autres) et comprenant le cofacteur, le substrat et l'enzy- me appropriés à cet objectif. Par exemple, on peut choisir - des substrats tels que des antibiotiques, des hormones, des stéroides, des dérivés d'acides aminés, des peptides des principes actifs cardiaques, des pigments, des additifs alimentaires, des arômes; - des cofacteurs tels que le NAD (nicotinamide-adénine dinucléotide ), le NADP (nicotinamide-adénine-phos-hate etc.; - et toutes les enzymes utilisant ces cofacteurs. Les bactéries peuvent être choisies parmi toutes les bactéries aérobies; on préfère cependant tout particulièrement celles qui sont issues de souches thermostables, dans la mesure ot on peut alors faire fonctionner le système selon llinventiontsi possible à des températures plus élevées et, augmentant de toute manière la cinétique de réaction, diminuer le temps de fonctionnement du système pour un résultat équivalent, et donc réduire d'autant les durées d'immobilisation de l'installation ou accroitre la productivité, On a constaté de façon inattendue que, dans un système en fonctionnement conforme à la présente invention, dans lequel on réalise une immobilisation du système enzymatique de base et du système biologiques intégré, les éléments du système biologique entier immobilisé (notamment les bactéries et les organites photosynthétiques) font intervenir les enzymes appropriées, situées sur leur face membranaires interne, qui sont devenues accessibles aux cofacteurs après immobilisation. Il est donc fondamental que le système enzymatique et7le système biologique soient immobilisés. Les moyens de réaliser cette immobilisation sont connus et décrits én particulier dans le brevet FR 1.604.982 et dans ses premier, deuxième et troisième certificats d'addition portant respectivement les numéros 69 01.451, 69 07.897 et 70 33.059, ainsi que dans la demande de brevet français 77 15.616. La technique d'immobilisation doit de préférence être choisie parmi celles qui procurent des produits ayant la structure de membranes ou films ou de mousses, telles que -l'homme de l'art est à même de les déduire des publications ci-dessus auxquelles il peut se référer utilement. En pratique, il convient d'effectuer cette immobilisation au moyen de glutaraldéhyde en présence de gélatine, ou d'autres protéines, les conditions opératoires étant choisies parmi celles qui sont exposées dans les publications susdites, et en particulier conformes à celles qui ont été mises en oeuvre pour les expériences concrètes relatées dans les exemples ci-dessous. Le système mixte immobilisé obtenu peut être utilisé tel quel, dès qu'il est préparé ou après une conservation convenable; ce système peut aussi, avant utilisation ou avant mise en conservation, être réduit en fragments. L'addition d'un solvant non aqueux, par exemple un alcool, permet une meilleure conservation en fonctionnement (effet bactéricide, notamment) et dans certains cas la solub lisation de substrats insolubles en phase aqueuse (ce qui est le cas, par exemple, des stéroides). L'invention est décrite plus concrètement dans les exemples ci-après, qui ne la limitent aucunement. EXEMPLE 1 Cet exemple concerne un système de réaénération selon l'invention dans lequel le système enzymatique comprend du NAD, de l'alcool-déshydrogénase et un substrat éthanol, ainsi que de la gélatine et du glutaraldéhyde pour son immobilisation, tandis que le système biologique, également immobilisé avec la gélatine au moyen de glutaraldéhyde, est essentiellement composé de bactéries entières d'Escherichia coli. Croissance des bactéries. On a fait croître des E.coli K 12, souche 3300 de la Collection Jacob et Monod de l'institut Pasteur, dans une culture aérée à 37"C, dans un milieu minéral ayant la composition suivante, par litre : 6,0 g de H2KPO4, 18g de HK2PO4, 4g de (NH4)2 S04, 0,2g de MgS04 et 0,005mg de FeSO4. On a ajusté le pH à 7,0 avec KOH 1M et on a complété le milieu avec 8g de glycérol et Img de thiamine, pour 1 litre. Immobilisation des bactéries A îml de gélatine fraîchement dissoute -à 10 %, à 400C, on a ajouté rapidement 0,75ml de cette suspension bactérienne (absorbance de 200 à 600 nm) remise en suspension dans du tampon H2NaPO4 0,02 M à pH 6,8; on a ensuite ajouté 0,25 ml de glutaraldéhyde à 1 %. Après agitation rapide, on-a aussitôt placé le tout pendant au moins 2 heures à -200C. Préparation d'un système de régénération On a ajouté au système décrit ci-dessus lmg d'alcooldéshydrogénase et 4mg de NAD. Mise en oeuvre du système de régénération On a ajouté 100 mg de ce gel fractionné à 1,5 ml de Tris-HCl 0,5 M, pH 7,5,dans une cellule thermostatée à 250C. On a fait barboter de l'air dans le système jusqu'à l'obtention pratiquement d'un équilibre entre l'oxygène dissous et l'oxygène de l'air, et on a ensuite mesuré la consommation avec une électrode de Clark, en utilisant un oxygraphe Gilson. L'activité de NADH oxydase a été mesurée égalemeht au moyen d'un spectrophotomètre Gilford, à 300C; on a noté une diminution de l'absorbance à 340 nm. Dans la pratique, on a utilisé un système à circulation pour éviter que les morceaux de gel pénètrent dans la cuvette de mesure. Résultats Les bactéries intactes ne pouvaient pas utiliser le NADH qui n'atteignait pas son site d'action situé sur la face interne de la membrane interne, Après leur immobilisation, on a observé de la respiration après addition de NADH exogène. La NADH deshydrogénase située surla face interne de la membrane interne était alors accessible; des micrographies électroniques ont montré que, après immobilisation au sein du système selon l'invention, la membrane interne des bactéries n'était plus continue, comme elle l'était par contre dans des suspensions bactériennes non immobilisées. La régénération de NAD s'effectuait et pouvait être mesurée par la respiration du NADH formé par l'action de l'alcool-déshydrogénase sur l'alcool et le NAD. Le NAD pouvait être ainsi régénéré (recyclé) au moins 1000 fois. EXEMPLE 2 On a immobilisé des bactéries d'Escherichi & coli,comne indiqué ci-dessus dans l'exemple 1, en présence d'hydroxy stérolde-déshydrogénase et de NAD. L'audition d'androstérone, solubilisée dans 10 % de méthanol (concentration finale) a permis de mesurer une consommation d'oxygène révélatrice de la régénération du NAD nécessaire à l'hydroxystéroidedéshydrogénase. La diminution d'androstérone confirmait que la réaction se poursuivait. EXEMPLE 3 On a procédé comme indiqué dans l'exemple 1, mais en utilisant lmg environ de glucose-6-phosphate-déshydrogenase au lieu de l'alcool-déshydrogénase, et une proportion 10 3 molaire de NADP en plus du NAD. Les bactéries immobilisées pouvaient déshydrogéner le NADPH par le biais de la transhydrogénase membranaire en présence de NAD. NADPH + FNADP + NADH Le NAD était régénéré par la chaîne respiratoire en présence d'oxygène et la régénération du NADP a pu être mesurée par la consommation d'oxygène comme indiqué dans l'exemple 1. Il en résulte qu'on peut utiliser selon l'invention des déshydrogénases à NADP avec régénération du NAD?, EXEMPLE 4 On a suivi les techniques d'immobilisation indiquées dans l'exemple 1, mais en utilisant une bactérie thermophile, à savoir la souche SP3 (qu'on peut obtenir auprès du Mitsubishi Life Science Institute, Machida City, Tokyo, Japon) Après chauffage à 650C dans du tampon Tris 0,5 M, pH 7,5 on a mesuré les activités restantes vis-à-vis du NADH après divers temps de chauffage, sur plusieurs échantillons du même système, en comparant les valeurs obtenues avec celles que donnait un système semblable, mis en oeuvre chaque fois avec un même temps de chauffage à la même température de 650C, mais comportant des bactéries E. coli K 12, souche 3300. Les résultats (stabilités comparées de la chaîne respiratoire) ont montré que la souche susdite permet un fonctionnement nettement meilleur du système selon l'invention. Ce système peut en effet fonctionner plus longtemps à une telle tempéra turent et la vitesse de réaction peut, dans le cas considéré, être ainsi multiplié par un facteur 4. REVENDICATIONS 1. Système de régdnération biochimiquer comprenant un système enzymatique impliquant des proportions stoechiométriquement équivalentes d'un cofacteur et d'un substrat, caractérisé en ce qu'il comprend, en association avec lui, au moins un système biologique immobilisé et conçu pour as surer la régédsation du cofacteur de façon fonctionnelle en utilisant uniquement de l'oxygène. 2.Système selon la revendication 1, caractérisé en ce que le système biologique immobilisé associé au système enzymatique est essentiellement composé de systèmes ou fonctions biologiques aptes à réaliser la régénération des cofacteurs sans nécessiter de second substrat. 3. Système selon la revendication 1, caractérisé en ce que le système biologique comprend des bactéries entières, des mitochondries entières ou des organites photo synthétiques entiers. 4. Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est agencé pour la régénération des cofacteurs pyridiniques et met en oeuvre, en tant que cofacteurs, du NAD et/ou du NADP. 5. Système selon l'une quelconque des revendictations 1 à 4, caractérisé en ce que ses éléments actifs sont immobilisés au moyen de glutaraldéhyde en présence de gélatine ou de sérum albumine