Brevet FR2471410A2 — publié le 19810619

FR 2471410 A2 19810619 FR 7930820 A 19791217 la présente Addition est relative a des perfectionnements apportés au nouveau procédé de dosage des protéases et des antiprotéases et plus particulièrement des protéases et antiprotéases des systèmes de la coagulation et du complément, qui fait l'objet du Brevet principal. Le Brevet principal a notamment pour objet un procédé de dosage des protéases et des antiprotéases, caractérisé en ce que l'on fait réagir l'enzyme a doser sur un substrat électrochimîquement neutre mais qui fournit après l'hydrolyse par l'enzyme, un produit d'hydrolyse susceptible d'étire soit oxydé, soit réduit électrochimiquement, lequel produit est ensuite dosé par ampérométrie. En poursuivant l'étude des conditions opératoires du procédé de dosage conforme au Brevet principal, les Demandeurs ont réussi a perfectionner et a améliorer encore le dosage, notamment - en mettant au point de nouvelles conditions de mise en oeuvre de ce procédé, plus favorables aux mesures d'activité, notamment des tampons plus appropriés, une gamme de pn plus étendue, de nouveaux substrats donnant de meilleurs résul- tats, etc..., - en préparant et en mettant en oeuvre une électrode particulièrement adaptée aux dosages qui font l'objet du Brevet principal et de la présente Addition. La présente Addition a pour objet un procédé de dosage des protéases et des antiprotéases selon le Brevet principal, caractérisé en ce que l'électrode indicatrice est une électrode dont les courants de fond sont faibles et qui possède un domaine de potentiel explorable anodiquement très étendu. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, l'électrode indicatrice est une électrode à pate de carbone préparée en mélangeant intimement de la poudre de carbone de qualite spectroscopiquement pure avec de l'huile de paraffine, dans des proportions d'environ 2:1, en introduisant cette pate dans la cavité ménagée a l'extrémité d'un cylindre en matière inerte (telle que le "Teflon" notamment) qui constitue le corps de l'élec- trode et en reliant le circuit électrique à la pâte de carbone par l'intermédiaire d'un fin cylindre de carbone, l'épaisseur de ladite pate de carbone étant au moins égale à 2 mm. Cette électrode, meme s'il faut renouveler sa surface avant chaque tracé de la courbe de dosage (ce qui peut méme parfois constituer un avantage dans le cas où des amines sont détectées car elles ont tendance a s'adsorber sur le matériau qui constitue l'électrode), présente des avantages très importants par rapport aux autres électrodes,représentés notamment par le fait que leurs courants de fond (capacitifs et autres) sont faibles a très faibles et par le fait que le domaine de potentiel explorable anodicruement est bien nlus étendu. Suivant un autre perfectionnement conforme à la présente Addition,du procédé selon le Brevet principal, le milieu de dosage peut entre aussi bien aqueux que non-aqueux et le dosage peut etre effectué dans toute la gamme de pH. Les Demandeurs ont pu isoler le produit de la réaction enzymatique avant de le doser dans un solvant et à un pH ap proprie. Si les pH des réactions enzymatiques elles-memes sont bien les pH physiologiques, il n'en est pas de meme pour l'analyse et le dosage du produit de la réaction. Suivant un autre perfectionnement conforme à la présente Addition, du procédé selon le Brevet principal, les substrats mis en oeuvre sont avantageusement constitués par - le chlorure de tosyl-L-glycyl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitra nilide, ou - le chlorure de fl-D-phénylalanyl-L-pipecolyl-L-arginyl-p- nitranilide, ou - le chlorure de N-benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginyl p-nitranilide, ou - le chlorure de H-D-phenylalanyl-L-pipecolyl-L-arginyl-p aminodiphenylamide, ou encore - le chlorure de H-D-phenylalanyl-L-pipecolyl-L-arginyl-4 methoxy-2-naphtylamide. Dans ce dernier cas, par exemple, la réaction pourra etre représentée par le schéma I suivant (cas de la thrombine produit électroactif 4-méthoxy-ss-naphtylamine La présente invention pourra etre mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mesure des constantes cinétiques de quelques enzymes, à un exemple de dosage dans un milieu nonaqueux et à un exemple de préparation dune électrode à pate de carbone, ainsi qu'au dessin annexe dans lequel les figures I et 2 représentent l'électrode indicatrice conforme à la présente Addition, respectivement vue de face et vue de dessous. Il doit etre bien entendu, toutefois, que ces exemples et dessin sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, mais n'en constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE I Préparation de l'électrode à pâte de carbone On mélange intimement 15 g de poudre de carbone pur et 9 ml d'huile de paraffine (telle que, par exemple, celle vendue dans le commerce sous la Marque NUJOL) La pate obtenue, bien mélangée, peut constituer une électrode de surface égale à 0,16 cm2, dont l'épaisseur est de 3 mm. Les Figures 1 et 2 du dessin annexé représentent schématiquement une telle électrode respectivement vue de face (Figure 1) et vue de dessous (Figure 2). La pate bien homogénéisée est introduite dans la cavité 1 d'un cylindre 2 réalisé par exemple, mais non limitativement, en Teflon. Ce cylindre 2 est creux en son milieu afin de pouvoir y introduire une baguette cylindrique fine-3 de carbone, ladite baguette reliant la surface d'électrode 4 au circuit électrique (non représenté au dessin), la surface 4 doit entre impérativement renouvelée avant chaque dosage. EXEMPLE 2 EXEMPLE cinetigues 2 Constantes cinétiques de la trypsine et de la thrombine Ces constantes (résumées ci-après dans le Tableau I) ont été obtenues à l'aide de 11 électrode préparée selon l'Exemple 1. Les tampons utilisés sont les suivants a : Tris i(0,025 M), NaCl (0,12 M), Gly (0,05 M), DMSO 4,76 % Température : 200C, pH = 8,3 b :Veronal (0,025 M), NaCl (0,12 M), DMSO 6,35 % Température : 300C, pH = 8,4 TABLEAU I ENZYME SUBSTRATDOSAGE ELECTROCHIMIQUE V N TRYPSINE Chlorure de benzoyl d,) 0,00096 8.10-4 (b) arginine-pADA THROMBINE H-D -Phe-Pip-Arg- pADA 0,10- 1.10 (a) H-D-Phe-Pip-Arg H-D-Phe-Pip-Arg-5 4 MBNA 0,020 3,7.10-5 (a) pADA : para-aminodiphenylamide MBNA : méthoxy-ss-naphtylamide vitesse maximum exprimée en pmole/min.U.I la constante de Michaelis en mole/ EXEMPLE 3 Dosage du produit d'hydrolyse enzymatique dans un milieu nonaqueux On procède comme indiqué par exemple dans l'Exemple VIII du Brevet principal, mais après avoir bloqué la cinétique de la réaction d'hydrolyse par acidification (par addition d'un volume égal d'acide acétique à 50 % ou d'acide chlorhydrique 0,15 M), on ajoute 2 ml de chloroforme. Après agitation vigoureuse, la phase aqueuse surnageante est éliminée par aspiration.Dans le cas où il subsisterait une émulsion,on peut retrouver une phase homogène en disposant au sein de la solution,des billes de tamis moléculaire pendant une dizaine de minutes La phase organique ainsi isolée est additionnée de 2 ml de diméthylsulfoxyde, puis on introduit comme sel de fond du perchlorate d'ammonium quaternaire pour rendre le milieu conducteur. On évalue alors par voltamétrie la quantité de produit d'hydrolyse présente . La corrélation courant d'oxy- dation/concentration du produit d'hydrolyse se déduit par comparaison avec une courbe-étalon établie dans une solution de composition identique à celle de l'échantillon. Ainsi que cela ressort de ce qui précéder l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'entre décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse, au contrai- re, toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS l. Procédé de dosage des protéases et des antiprotéases selon l'une quelconque des Revendications 1 à 3 du Brevet principal, caractérisé en ce que l'électrode indicatrice est une électrode dont les courants de fond sont faibles et qui possède un domaine de potentiel explorable anodiquement très étendu. 2. Procédé selon la Revendication 1 ci-dessus, caractérisé en ce que l'électrode indicatrice est une électrode à ptte de carbone préparée en mélangeant intimement de la poudre de carbone de qualité spectroscopiquement pure avec de l'huile- de paraffine dans des proportions d'environ 2:1, en introduisant cette pate dans la cavité 1 ménagée a l'ex trémité d'un cylindre 2 en matière inerte (telle que le "Teflon" notamment) qui constitue le corps de l'électrode et en reliant le circuit électrique à la pate de carbone par l'intermédiaire d'un fin cylindre 3 de carbone, l'épaisseur de ladite p & e de carbone étant au moins égale à 2 mm. 3. Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 a 9 du Brevet principal, et selon la Revendication 1 ou la Revendication 2 ci-dessus, caractérisé en ce que le dosage est effectué dans un milieu aqueux. 4. Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 9 du Brevet principal et selon la Revendication 1 ou la Revendication 2 ci-dessus, caractérisé en ce que le dosage est effectué dans un milieu non-aqueux. 5. Procédé selon la Revendication 1 du Brevet principal et l'une quelconque des Revendications 3 ou 4 ci-dessus, caractérisé en ce que le produit de la réaction enzymatique est isolé préalablement au dosage. 6. Procédé selon l'une quelconque des Revendications 3 à 5 ci-dessus, caractérisé en ce que le dosage est réalisé dans un milieu à un pH quelconque approprié. 7. Composé nouveau nécessaire pour le dosage des protéases et des antiprotéases selon l'une quelconque des Revendications 1 à 6 ci-dessus, caractérisé en ce qu'il est constitué par le chlorure de H-D-phenylalanyl-L-pipecolyl-Larginyl-p-aminodiphenylamid e. -8. Composé nouveau nécessaire pour le dosage des protéases et des antiprotéases selon l'une quelconque des Revendications 1 à 6 ci-dessus, caractérisé en ce qu'il est constitue par le chlorure de H-D-phenylalanyl-L-pipecolyl- L-arginyl-4 mEthoxy--2-naphtylamide