Brevet FR2468365A1 — publié le 19810508

Cette invention a essentiellement pour objet des préparations de N - acylcytosine arabinoside présentant une activité accrue comme agent antitumoral La N4-acylcytosine arabinoside est un dérivé de la.cytosine arabinoside, connu comme agent contre la leucémie aigue et elle est particulièrement utilisée comme agent anti-tumoral présentant une durée d'activité améliorée et une résistance à la cytidine desaminase tout en maintenant une activité anti-tumorale élevée de la cytosine arabinoside. (Cancer Research, Vol.36, page 2726 et Vol. 37, page 2481). Les inventeurs ont trouvé que l'activité anti-tumorale de la cytosine arabinoside était hautement augmentée lorsque celle-ci était encapsulée dans des gouttelettes de graisse intra-cellulaire contenant des lipides tels que par exemple la sphingo-myéline, la lécithine. En outre, ces inventeurs ont aussi trouvé que l'addition de cytosine arabinoside dans lesdites gouttelettes de graisse demandait la présence d'additifs tels que la stéarylamine et la dicétyl phosphate, même pour une quantité de cytosine arabinoside encapsulée dans les gouttelettes de graisse intracellulaires très inférieure à celle mise en oeuvre au départ (la demande de brevet japonaise (OPI) 114015/1977). Les additifs décrits ci-dessus sont cependant nocifs à la santé du corps. Donc, il était important d'accroitre l'efficacité d'encapsulation de la cytosine arabinoside dans les gouttelettes de graisse intra-cellulaire sans l'emploi d'aucun additif nocif. Un objet de cette invention est de procurer des préparations de N4-acylcytosine arabinoside montrant une activité anti-tumorale accrue. Un autre objet de l'invention est de procurer une préparation de N4- acylcytosine arabinoside encapsulée sans l'emploi d'aucun additif nocif. 2 2468365 Ces préparations de N4-acylcytosine arabinoside comprennent essentiellement de la N4-acylcytosine arabinoside ayant un radical acyle aliphatique contenant de 6 à 18 atomes de carbone et étant encapsulée dans des gouttelettes de lécithine intra-cellulaire. Selon une autre caractéristique de l'invention, les gouttelettes de lécithine intracellulaire contiennent du cholestérol. Selon une nouvelle caractéristique de l'invention le radical acyle aliphatique comprenant de 6 à 18 atomes de carbone est choisi parmi les radicaux suivants: caproyle, caprylyle, capryle, lauroyle, myristoyle, palmitoyle et stearoyle. L'invention sera mieux comprise, et d'autres caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement au cours de la description explicative qui va suivre, et au travers des exemples illustrant avec plus de détail la présente invention et son mode de mise en pratique. Ces exemples ne doivent pas être considérés comme limitant le cadre de l'invention parce que de nombreuses variations et modification en sont possibles. Les gouttelettes de graisse intra-zellulaire utlisées dans la présente invention sont constituées par de la lécithine, et de préférence par la lécithine du jaune d'oeuf. Les constituants élémentaires de la lécithine peuvent être soit la distéaroyl- phosphatide choline, la dipalmitoyl-phosphatide choline, la dimyristoyl-phosphatide choline ou la dioléyl- phosphatide choline; la lécithine peut également être composée d'un mélange de ces différents produits. Pour augmenter la fluidité desdites gouttelettes de graisse intracellulaire, on leur additionne du cholestérol par une méthode conventionnelle et connue. La N4-acylcytosine arabinoside employée pour les préparations conformes à l'invention est choisie parmi les N4-acylcytosine arabinosidescontenantun radiral acyle aliphatique ayant de 6 à 18 atomes de carbone tel que par exemple la N4-caproylcytosine arabinoside, la N4-caprilcytosine arabinoside, la N4.lauroylcytosine arabinoside, la N -myristoylcytosine arabinoside, la N4-palmitoylcytosine arabinoside ou la N4-stéaroyl- cytosine arabinoside. Si la N4-acylcytosine arabinoside utilisée a un radical acyle aliphatique comprenant moins de 6 atomes de' carbone ou plus de 18 atomes de carbone, l'activité des agents anti-tumoraux n'est pas augmentée appréciablement, d'un point de vue statistique. Les préparations> conformes à l'invention peuvent être obtenues selon la méthode suivante: La lécithine, la N -acylcytosine arabinoside et si nécessaire, le cholestérol, sont dissous respective- ment dans des solvants organiques appropriés, ensuite les différentes solutions sont mélangées ensemble. Le mélange ainsi obtenu est évaporé,dans un ballon, sous pression réduite pour former un film très fin sur les parois intérieures dudit ballon. Ensuite, de l'eau est additionnée dans le ballon, qui est remué mécaniquement jusqu'à ce que le film se détache de la paroi intérieure. La suspension de la préparation de l'invention peut être obtenue par la méthode décrite ci-dessus. La préparation est ensuite isolée par centrifugation de la suspension. Les préparations de l'invention peuvent être administrées aux patients de différentesmanièressous forme modifiée ou non modifiée. Par exemple, les préparations de l'invention peuvent être administrées par voie orale, par injection intra-péritoziale, intraveineuse ou subcutanée, ou en suspension dans de l'eau ou dans une solution physiologique de chlorure de sodium. Exemple 1. Dans 1 ml, 2 ml et 0,4 ml d'un solvant mixte de chloroforme et méthanol (2 volumes de chloroforme pour 1 volume de méthanol), on dissous respectivement micromoles de lécithine de jaune d'oeuf, 30 micromoles de cholestérol et 8 micromoles de N -acylcytosine arabinoside (désignéeciaprès par "ACA"). Ces différentes solutions sont versées dans un ballon en forme de coeur et mélangées ensemble. Le ballon est alors monté en rotation dans un bain marie porté à une température de 40 C pour évaporer le solvant sous pression réduite. A la fin de l'évaporation, il s'est formé un film fin sur les parois internes du ballon, ce film est alors séché dans un dessiccateur sous vide pendant trois heures. Ensuite deux spatules pleines de perles de verre de diamètre de 0,18 mm1et 4 ml de solution physiologique de chlorure de sodium sont additionnées dans le ballon. On agite le ballon avec un vibrateur de tube-test jusqu'à ce que le film soit décollé de la paroi intérieure du ballon Les perles de verre sont alors retirées et on obtient une suspension dont l'activité antitumorale est testée selon l'expérimentation suivante: on a inoculé par injection intra-péritonéale 105 cellules leucémiques L-1210 à des souris, divisées en groupe de 8 animaux. A un certain groupe,on a inoculé par injection intra-péritonéale 10 à 20 micromoles par kilo de la suspension d'ACA décrite ci-dessuslau premier et au cinquième jour suivant le jour d'inoculation du greffon. L'activité est mesurée par la valeur T X 100 dans laquelle T est le nombre de joursmoyeU de survivance des souris dans les groupes ayant subi l'injection de la suspension et, C est le nombre de joursmoyen de survivance des souris dans les groupes d'animaux non soumis à l'injectioncèlasuspension. Une expérimentation comparative a été conduite par répétition de l'expérimentation décrite ci-dessus en employant une suspension de ACA comprenant de l'ACA et une solution physiologique de chlorure de sodium contenant 0,5% de TWEEN 80 (nom commercial du monooléate polyoxyéthylène sorbitan commercialisé par Kao Atlas Co, Ltd, Japon). Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 1. quantité injectée (Vmole/kg) TABLEAU 1. T/C(%) (a) (b) signification statis- tique de la différence entre (a) et (b) N4-butyryl N4-caproyl N4-caprylyl N4-capryl 4 - - N4-lauroyl N4-myristoyl N4-palmitoyl N4-stéaroyl N4-arachidoyl - (a): préparation d'ACA encapsulée dans X o0 o0 X des gouttelettes de graisse intra-cellulaire. - (b): suspension d'ACA. NOTE: O indique que la différence entre (a) et (b) a une signification statistique, X indique que la différence entre (a) et (b) n'a pas de signification statistique. Exemple 2. L'activité anti-tumorale mesurée par une méthode analogue à celle de l'exemple 1 et utilisant les préparations suivantes préparées comme dans l'exemple 1 aux différences suivantes: (A) utilise de la 4myristoylcytoeine arabinoside comme ACA, la solution (B) utilise la N4myristoylcytosine arabinoside comme ACA sans utilisation de chlolestérol, et la solution (C) utilise la préparation comparative suivante préparée par dispersion de N4-myristoylcytosine arabinoside et de gouttelettes de graisse intra- cellulaires consistant en lécithine et du cholestérol dans une solution physiologique de chlorure de sodium contenant 0,5% de TWEEN 80. La quantité d'injection est de 20 micromoles par kilo. Les résultats sont indiqués dans le tableau 2. radical acyle dans ACA 1; TABLEAU 2. Préparations T/C (%) (A) 165 (B) 200 (c) 122 Ce tableau 2 montre clairement que la différence entre les solutions(A)et(C)ou (B) et (C) est statistiquement significative. Exemple 3. L'exemple 1 est répété à la différence que l'on emploie la N myristoylcytosine arabinoside comme ACA, sans utilisation de cholestérol etl'on emploie différentes phosphatides cholines en remplacement de la lécithine. La quantité d'injection est de 20 micromoles par kilo. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau 3. TABLEAU 3. Radical diacylede la phosphatide choline T/C(%) Distéaroyle 156 Dipalmitoyle 162 Dimyristoyle 165 Dioléoyle 148 Exemple 4. Le taux d'indorporation de l'ACA dans les gouttelettes de graisse intracellulaire est mesuré par la méthode suivante: Dans 0,25 ml, 0,5 ml, 0,1 ml et 0,25 ml d'un solvant mixte de chloroforme et méthanol (2 volumes de chloroforme pour I volume de méthanol, on dissous respectivement 10 micromoles de lécithine de jaune d'oeuf, 7,5 micromoles de cholestérol, 2 micromoles de N -myristoylcytosine arabinoside et, si nécessaire, 1 micromole de stéarylamine. Ces solutions sont placées dans un ballon en forme de coeur et sont mélangées ensemble. Le ballon est placé en rotation dans un bain marie maintenu à une température de 400C pour évaporer le solvant sou+ression réduite. Après évaporation un film mince s'est formé sur les parois intérieures du ballon. Ce film est ensuite séché dans un dessiccateur sous vide pendant 3 heures. On ajoute ensuite dans le ballon, deux spatules pleines de perles de verre ayant un diamètre de 0,18mm et 2 ml de solution physiologique de chlorure de sodium. Le ballon est agité mécaniquement par un vibrateur jusqu'à ce que le film se décolle des parois intérieures dudit-flaçon. Tout le contenu du flaçon est versé dans un tube test en.polyéthylène de 40 ml d'une centrifugeuse. Le résidu contenu dans le ballon est rincé trois fois, chaque fois avec 10 ml d'une solution physiologi- que de chlorure de sodium et le liquide de rinçage est collecté et additionné dans le tube-test décrit ci-dessus. Les perles de verre sont retirées et la solution est centifugée avec uneviesse de 13 000 g pendant 15 minutes à 40C. La couphe de liquide supérieure est retirée et 30 ml de solution physiologique de chlorure de sodium fraiche est additionnée dans le tube-test et mélangée; la solution est à nouveau centrifugée. Cette opération est répétée encore deux fois et la couche liquide supérieure est retirée pour recueillir les gouttelettes de graisse intra- cellulaire. Lesdites gouttelettes ainsi obtenues sont séchées et le taux d'incorporation de l'ACA dans ces gouttelettes est mesuré. La quantité de gouttelettes de graisse intra-cellu- laire récupérée est calculée par mesure de la quantité de phosphore organique contenu dans ces gouttelettes. La quantité de N -myristoylcytosirie arabinoside récupérée est calculée par mesure de l'absorbance des gouttelettes de graisse intra-cellulaire. dissoutes dans le chloroforme à 300 nm. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau 4. TABLEAU 4. gouttelettes de taux de récupé- taux de récupé- taux d'in- graisse intra- ration des ration d'ACA corporation cellulaire gouttelettes de (%) d'ACA (%) graisse(% lécithine/choles- térol/stéarylamine 56 43 77 lécithine/choles- térol 81 70 86 Pour la comparaison, une préparation contenant de la cytosine arabinoside est préparée par le procédé suivant et le taux d'incorporation de la cytosine arabinoside dans les gouttelettes de graisse intra- cellulaire. est mesuré. Dans 0,25 ml, 0,5 ml et 0,25 ml d'un solvant mixte de chloroforme et méthanol (2 volumes de chloro- forme pour 1 volume de méthanol} on dissous respective- ment 10 micromoles de lécithine de jaune d'oeuf, 7,5 micromoles de cholestérol et, si nécessaire 1 micromole de stéarylamine. Ces différentes solutions sont mélangées ensemble dans un ballon en forme de coeur de 100 ml. Ce ballon est placé en rotation dans un bain marie maintenu à une température de 400C pour évaporer le solvant sous pression réduite. A la fin de l'évaporation un film mince s'est formé sur les parois intérieures du ballon, ce film est séché dans un dessiccateurjsous vide pendant 3 heures. On ajoute ensuite dans le ballon, deux spatules de perle de verre ayant un diamètre de 0,18 mm et 1 ml d'une solution de cytosine arabinoside (de concentration 300 micromoles par ml). Le ballonest agité mécaniquement par un vibrateur de tube jusqu'à ce que le film se décolle des parois intérieures du ballon.- Tout le contenu de ce ballon est versé dans un tube-test en polyéthylène de 40 ml pour centrifugeuse. Le résidu contenu dans le ballon est rincé trois fois par chaque fois 10 ml d'une solution physiologique de chlorure de sodium, le liquide de rinçage est collecté et additionné dans le tube-test décrit ci-dessus. Les perles de verre sont retirées et le tube-test est centrifugé sous une vitessede centrifugation de 13 000 g pendant 15 minutes à 40C. La couche liquide supérieure est ensuite retirée, et on ajoute 30 ml d'une solution physiologique de chlorure de sodium dans le tube-test qui est à nouveau centrifugé. Cette opération est répétée deux autres fois, et on récupère les gouttelettes de graisse intra-cellulaires sur les parois du tube. Ces gouttelettes de graisse ainsi obtenues sont séchées et le taux d'incorporation de la cytosine arabinoside dans les gouttelettes de graisse intra-cellulaires est mesuré. La quantité de gouttelettes de graisse intra-cellulaire récupérées est calculée comme dans les exemples décrits ci-dessus. La quantité de cytosine arabinoside récupérée est calculée par mesure de l'absorbance des gouttelettes de graisse dissoutes dans le chloroforme à 280 nm. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau 5. TABLEAU 5. gouttelettes taux de récu- taux de récu- taux d'incorpo- de graisse pération de pération de ration de la intra- gouttelettes de cytosine cytosine cellulaire graisse (%) arabinoside(%) arabinoside(%) lécithine/cho- lestérol/stéa- rylamine 70 4,8 6,9 Lécithine/cho- lestérol 87 2,0. 2,3 Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée auwmodoede réalisation décrits qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemple. En particulier elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre de. la protection comme revendiquée. R E V E N D I C A T I ONS 1. Une préparation de N -acylcytosine arabinoside est caractérisée en ce qu'elle comprend essentiellement des gouttelettes de lécithine intracellulaire et de la N4-acylcytosine arabinoside possédant un radical acyle- aliphatique comprenant de 6 à 18 atomes de carbone et étant encapsulé dans lesdites gouttelettes de lécithine. 2. La préparation de N -acylcytosine arabinoside selon la revendication 1, caractérisée en ce que les gouttelettes de lécithine intra-cellulaire contiennent du cholestérol. 3. La préparation de N4-acylcytosine arabinoside selon la revendication 1, caractérisée en ce que le radical acyle aliphatique est choisi parmi les radicaux caproyle, caprylyle, capryle, lauroyle, myristoyle, palmi- toyle, et stéaroyle. 4. Composition pharmaceutique notamment utilisée comme agent anti-tumoral, caractérisée en ce qu'Ele comprend une dose thérapeutique efficace d'une prépara- tion de N -acylcytosine arabinoside selon la revendica- tion ' dans un véhicule pharmaceutique acceptable pour l'organisme et compatible avec lui.