Brevet FR2462164A1 — publié le 19810213

"Médicament contre les maladies infectieuses des voies urinaires et digestives à base d'un lysat bactérien provenant d'au omins une souche d'Escherichia coli". La présente invention concerne un médicament contre des maladies in- fectieuses des voies urinaires et digestives contenant conne principe actif un lysat bactérien provenant d'au nmoins une des souches suivantes de Escherichia coli: - NCTC: 8603, 8621, 8622, 8623, 9026, 9111, 9119, 9707, 9708; - I-081, I-082, I-083, I-084, I-085, I-086, I-087, I-088, I-089. De préférence, les lysats proviennent de toutes les souches mentionnées ci-dessus. Les souches NTC sont cataloguées par la "National Collection of Ty- pe Cultures, London" et accessibles au public, tandis que les souches I ont été déposées par le titulaire du présent brevet le 7 mars 1979 au- près de la "Collection nationale de cultures de microorganismes, Ins- titut Pasteur, Paris". Les cultures bactériennes sont faites selon les techniques bacté- riologiques courantes, dans les conditions les mieux adaptées à la multiplication des germes. Le traitement des cultures pour 1 'obtention des lysats se fait de préférence dans un milieu contenant par litre d'eau: extrait de viande 22, 5 g, extrait de levure 7,5 g, chlorure de sodium 2,5 g, acétate de sodium 0,5 g, monohydrogènephosphate de sodium 2,0 g, lactate de sodium % p/p 2;0 ml, lactate d'ammonium 50% p/p 2,0 ml, aneurine 3,0 mg, aci- de nicotinique 3,0 mg, glucose 3,0 g, ces chiffres pouvant varier de + 5%, en fermenteur, par exemple à 3q-37 C nendant P-14 heures, ou en flacons de Roux, oar exemple, à 33-37 C pendant 24-48 heures. De préférence, ce milieu contient en plus par litre d'eau 2,0 g de gélatine et 24,0 g de gélose afin de le rendre solide. Dans un milieu solide, on peut utiliser le milieu défini ci-dessus renfermant de la gélatine et de la gélose. Les cultures sont récoltées selon les méthodes usuelles.Les suspen- sions bactériennes ainsi obtenues sont dénombrées souche par souche et soumises à la lyse alcaline (pH 9 à 10) progressive à une température pouvant varier entre 20 et 40 C, avec entre autre: soude caustique, potasse caustique, amines primaires, secondaires et tertiaires. La lyse est poursuivie pendant un à cinq jours sous contrôle microscopique. Le volume des lysats de chaque souche bactérienne entrant dans le concentré final est calculé en fonction des résultats des dénombrements. Le traitement des cultures pour l'obtention des lysats par autolyse se fait, de préférence, dans un milieu contenant par litre d'eau: extrait de viande 25,0 g, chlorure de sodium 5,0 g, nonohydrogénophosphate de sodium 1,0 g, ces chiffres pouvant varier de + 5 %. Les cultures ensemencées sont incubées pendant 3 mois à 370C. Le surnageant filtré de ces cultures constitue le lysat. Préparation du concentré de lysats bactériens Les lysats de chaque souche bactérienne obtenus en milieu solide et/ou milieu liquide sont mélangés dans des proportions appropriées pour obtenir les médicaments définis ci-dessus. Les quantités de germes des sou- ches utilisées en association peuvent varier entre cer- taines limites pour une prise journalière humaine (adulte): 1 à 50 milliards de germes. Le mélange des lysats constitue un concentré natif qui est clarifié par centrifugation et filtration en profondeur. Le concentré clarifié est stérilisé par filtration sur membrane et constitue le concentré de ly- sats bactériens servant de base à la préparation des dif- férentes formes galéniques. Formes galéniques L'administration se fait de préférence par voie orale, sous forme de comprimés, capsules, gélules, granu- lés, contenant le lysat sous forme lyophilisée ou de solu- té buvable sous forme d'ampoules monodose, de sirop ou de gouttes contenant le lysat. L'administration peut égale- ment se faire par voie parentérale, ou encore par voie rectale sous forme de suppositoires. La dose journalière pour un adulte prise de préférence en une fois, peut con- tenir au total un lysat variant entre 1 et 50 milliards d'équivalentsgermes. La dose enfant est la moitié de la dose adulte. Travaux pharmacologiques Une étude expérimentale de l'état immunitaire a été effectuée chez la souris Balb/c après stimulation orale par le lysat ci-dessus. Cette étude couvre l'immunité à médiation humorale et l'immunité à médiation cellulaire, tant spécifique que non-spécifique. Test de protection- Les souris ont été traitées par voie orale avec mg/kg pendant 5 jours. Il a été montré que le lysat a un pouvoir protecteur statistiquement significatif vis-à- vis d'une infection par Escherichia coli injecté par voie intrapéritonéale 10 et 30 jours après le début du traite- ment ou par Salmonella typhimurium inoculé par voie entérale 30 jours après le début du traitement. Test "Plaque forming Cells" Cette technique a permis de montrer une augmen- tation en fonction du temps, du nombre de cellules splé- niques produisant des plaques de lyse chez les souris traitées avec 150 mg/kg de lysat, pendant 5 jours par voie orale. Le test a été effectué 14 jours après le début du traitement. Test de phagocytose in vivo au Carbone colloïdal Le Carbone colloïdal injecté à une souris est éliminé du système vasculaire par les cellules deK{pffer. La cinétique d'élimination du colloide est donc le re- flet de l'activité du système réticuloendothélial. On a traité des souris par voie orale pendant 5 jours avec mg/kg de lysat. 10 et 30 jours après le début du traitement le test est réalisé. L'indice phagocytaire est augmenté de façon statistiquement significative. Etude de l'activité des macrophages Des souris ont été traitées avec 150 mg/kg de lysat par voie orale pendant 5 jours. Les macrophages intrapéritonéaux ont été prélevés 10 et 30 jours après le début du traitement. L'étude des capacités d'adhérence et de phago- cytose in vitro (Candida albicans) des macrophages a mon- tré que le lysat utilisé a une action immunostimulante au niveau cellulaire. Il a également été montré une chute caractéris- tique des activités enzymatiques de ces macrophages, due probablement à un épuisement de ces cellules trop solli- citées. Des contrôles effectués en microscopie électro- nique de transmission ont pu confirmer cette hypothèse; les macrophages activés présentent de fottes vacuolisa- tions. Etude de la toxicité chronique Le lysat a été administré à des doses de 100 et 1000 fois la dose thérapeutique humaine à des rats et à des doses de 20 et 200 fois à des chiens par voie orale pendant 13 semaines. Aucune altération fonctionnelle ou organique n'a été décelée au cours du traitement. Essais cliniques 17 malades souffrant d'infection urinaire chro- nique ont été traités à raison de 1 dose par jour de lysat pendant 8-12 mois à raison de 10 à 15 jours de traitement par mois. Les récidives ont été totalement éliminées dans 14 cas et espacées dans 3 cas. 24 64 REVENDICATIONS 1. Médicament immunobiothérapique contre des maladies infectieuses des voies urinaires et digestives, contenant comme principe actif un lysat bactérien prove- nant d'au moins une des souches suivantes de Escherichia coli: - NCTC: 8603, 8621, 8622, 8623, 9026, 9111, 9119,. 9707, 9708. - 1-081, I-082, 1-083, 1-084, I-085, I-086, 1-087, I-088, 1-089. 2. Médicament selon la revendication 1, carac- térisé par le fait que le dit principe actif est constitué par un mélange de lysats de toutes les souches mention- nées. 3. Procédé de fabrication d'un médicament selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que les- dites souches sont incubées dans un milieu de culture solide ou liquide, qu'elles subissent une lyse et/ou une autolyse, et qu'on récolte les lysats ainsi obtenus. 4. Milieu de culture pour exécuter le procédé selon la revendication 3, contenant par litre d'eau: extrait de viande 22,5 g, extrait de levure 7, 5 g, chlorure de sodium 2,5 g, acétate de sodium 0,5 g, monohydrogènephosphate de sodium 2,0 g, lactate de sodium 70 % p/p 2,0 ml, lactate d'ammonium 50 % p/p 2,0 ml, aneurine 3,0 mg, acide nicotinique 3, 0 mg, glucose 3,0 g, ces chiffres pouvant varier de + 5 %. 5. Milieu selon la revendication 4, contenant en plus par litre d'eau: gélatine 2,0 g et gelose 24,0 g afin de le rendre solide. 6. Milieu liquide culture pour exécuter le pro- cédé selon la revendication 3, par autolyse, contenant par litre d'eau: extiait de viande 25,0 g, chlorure de so- dium 5,0 g, monohydrogènophosphate de sodium 1,0 g, ces chiffres pouvant varier de t 5 %.