Brevet FR2466455A2 — publié le 19810410

FR 2466455 A2 19810410 FR 7924923 A 19791005 La présente addition concerne une invention rattachée à l'objet du brevet principal(brevet FR 78;29 838). Le brevet principal est relatif à des composés hydrosolubles obtenus par couplage d'un extrait hydrosoluble de Streptomyces stimulosus 25556 (NRRL 5776) avec des acides aliphatiques à longues chaines,lesdits composés se présentant sous la forme d'un mélange dont les constituants sont présents dans un rapport molaire voisin de 4/1 et sont représentés respectivement par les formules générales suivantes: dans lesquelles X représente un radical R-CO- et Y représente un atome d'hydrogène ou un radical RCO,ou bien dans lesquelles Y représente un radical RCO et X représente un atome d'hy drogène ou un radical RCO,étant entendu que,dans ces définitions, R représente un radical alcoyle ou alcényle contenant 11 à 19 atomes de carbone en chaîne droite ou ramifiée et dans lesquelles les acides aminés ont les configurations suivantes: Ala: L,Glu :D et DAP : L, L. Ces composés sont des adjuvants immunologiques particulièrement intéressants. Lesdits composés hydrosolubles proviennent du couplage avec des acides aliphatiques à longue chaîne d'un mélange de deux constituants de formules (I) et (II) dans un rapport molaire de 4/1 environ: Le mélange des deux constituants de formules (I) et (II) dans le rapport molaire d'environ 4/l,désigné au brevet principal par le numéro 39592 RP peut être obtenu par purifications successives d'extrait,désigné sous le numéro 34129 RP,de Streptomyces stimulosus DS 25556 (NRRL 5776) par chromatographie sur divers supports appropriés,tels que les "Biogels". I1 a maintenant été trouvé,et c'est ce qui fait l'un des objets de la présente addition,que le mélange des produits de formule (I) et (II) peut être séparé en ses constituants La présente addition concerne donc le tétrapeptide de formule: et le tétrapeptide de formule: leur séparation à partir d'un extrait de Streptomyces stimulosus ainsi que leur utilisation pour la préparation d'adjuvants immunologiques. Selon la présente additionXles tétrapeptides de formules (I) et (II) peuvent être obtenus en soumettant le mélange 39592 RP à une chromatographie sur une colonne Dowex 50 x 4 en éluant avec un mélange de solvants convenables dont l'acidité va en décroissant. Les tétrapeptides (I) et (II) sont élués de la colonne pour une valeur déterminée du pH qui dépend du système de solvants utilisés. Comme solvant d'élution,il est particulièrement intéressant d'utiliser un mélange pyridine-acide acétiqueeau dont le pH est ajusté à la valeur désirée par addition d'acide formique. Dans un tel système le tétrapeptide de formule (I) est élué lorsque le pH atteint 4,1. Chacun des tétrapeptides ainsi obtenus est désalifié par filtration sur une colonne de Biogel P2 en éluant avec de l'acide acétique 0,01 M. La structure des tétrapeptides de formules (I) et (II) a été déterminée par -leur composition en aminoacides: Glu (1,0), Gly (1,0), Ala (1,0) et DAP (1,0). -la détermination des aminoacides N-terminaux par les méthodes classiques d'Edman et de dansylation et aussi par hydrolyse acide partielle. Les tétrapeptides de formules (I) et (II) peuvent être respectivement couplés avec les acides gras en opérant dans les conditions décrites dans le brevet principal. Ainsi, sous un aspect complémentaire,la présente invention concerne également les produits de couplage des tétrapeptides de formules (I) et (II), à savoir d'une part le composé de formule (III) et d'autre part le composé de formule (IV) formules dans lesquelles X représente un radical R-CO- et Y représente un atome d'hydrogène ou un radical RCO, ou bien dans lesquelles Y représente un radical RCO et X représente un atome d'hydrogène ou un radical RCO, étant entendu que, dans ces définitions, R représente un radical alcoyle ou alcényle contenant 11 à 19 atomes de carbone en chai ne droite ou ramifiée et dans lesquelles les acides aminés ont les configurations suivantes: Ala: L, Glu: D, et DAP: L,L. Sous une forme préférées l'invention a pour objet le composé de formule (III). On notera que dans la formule (III) les symboles X et Y peuvent être identiques ou différents, de sorte que le composé de formule (III) peut se présenter sous la forme d'un composé unique ou d'un mélange de composés. Dans la présente description, l'expression "composé de formule (III)" couvre ces diverses possibilités. L'exemple suivant,donné à titre non limitatif,illustre la présente addition. EXEMPLE a. Preparation du tétrapeptide (I) 30 g de cellules délipidées de Streptomyces stimulosus sont mis en suspension dans 300 cm3 d'eau contenant 0,5 cm3 de toluène. Lo suspension est agitée pendant 48 heures à 370C puis elle est centrifugée pendant 30 minutes à 15000 g. Le surnageant est filtré sur une membrane AMICON UM-20 puis sur membrane AMICON UM-2. Les substances hydrosolubles qui sont retenues par la membrane UM-2 sont purifiées par filtrations successives sur des colonnes (240 cm x 1,2 cm) de Biogel P 10, P 4 et P 2 en éluant avec 240 cm3 d'acide acétique 0,01 M. Les peptides (15 mg) ainsi obtenus après filtration sur Biogel P 2 sont chromatographiés sur une colonne Doiex 50 x 4 ( 100 cm x 1,4 cm) tamponnée au départ à pH 2,2 avec un solvant pyridine:acide acétique-eau (16:130:854 en volumes)ajusté au pH désiré avec de l'acide formique. Avec un gradient d'élution de 500 cm3,le pH étant alors de 4,1, le tétrapeptide de formule (I) est obtenu.Il est purifié par filtration sur une colonne de Biogel P2 en éluant avec 240cm3 d'acide acétique 0,01M. On obtient ainsi 7,5mg de tétrapeptide de formule(I). b . Préparation dutomposé de formule (III) (RCO=radical lauroyle) On dissout 15 mg du produit de formule (I) dans 5 cm3 d'un mélange d'une solution aqueuse 0,5 M de carbonate de sodium et d'alcool butylique tertiaire (7/3 en volumes). On ajoute goutte à goutte,sous agitation et à une température voisine de 200C, 0,5 cm3 d'alcool butyllque tertiaire contenant 60 mg d'anhydride laurique. Après avoir agité pendant 30 minutes,on ajoute de l'alcool butylique tertiaire jusqu'à obtention d'un taux d'alcool butylique tertiaire de 80%, I1 se forme alors un précipité que l'on sépare par centrifugation (3000 tours/minute pendant 10 minutes). Le précipité est lavé 2 fois par 10 cm3 d'alcool butylique tertiaire et centrifugé à chaque fois dans les mêmes conditions que cidessus. Tous les surnageants de centrifugation sont réunis et concentrés à sec à l'évaporateur rotatif sous pression réduite (20 mm de mercure)à une température inférieure à 300C.Le résidu d'évaporation est repris par 50 cm3 d'eau distillée et dialysé à travers une membrane Diaflo (AMICON) UM-05,afin d'éliminer la majorité de l'acide laurique provenant de l'hydrolyse de l'anhydride laurique n'ayant pas réagi. La solution qui n'a pas dialysé est lyophilisée. On obtient ainsi 30 mg d'une poudre blanche amorphe contenant encore 10% d'acide laurique,30 mg de ladite poudre sont filtrés sur Spherosil XOA-400 (qui est une résine à base de silice en particules sphériques poreuses de granulométrie comprise entre 100 et 300 microns,dont le volume poreux est de 1 ml/g et le diamètre des pores voisin de 80 angströms mise sur le marché par Rhône-Poulenc Industries) dans une colonne de 25 x 1 cm dans le solvant chloroforme-méthanol-eau (75/25/2). L'acide laurique est élué dans le volume mort de la colonne et le composé (III) est élué par le mélange butanol tertiaire-eau (50/50). La composition relative des acides aminés dans le composé (III),déterminée par un autoanalyseur après hydrolyse totale,est la suivante (entre parenthèses est indiqué le nombre entier le plus proche en accord avec des expériences effectuées après différents temps d'hydrolyse): Ala= 1,08 (1); Glu: 0,79(1);Gly=1,0 (l);Dap=0,83 (1). Le composé de formule (III) possède des propriétés d'immunomodification. Les indications concernant ses applications thérapeutiques et ses propriétés pharmacologiques sont les mêmes que celles décrites au brevet principal. I1 suffira donc de se reporter,si besoin est,à la description du brevet principal,pour tout ce qui concerne l'utilité du composé (III) comme médicament ainsi que celle des compositions pharmaceutiques le contenant. REVENDICATIONS 1.Composé choisi parmi les composés de formules (III) et (IV)ci-après: formules dans lesquelles X représente un radical R-CO- et Y représente un atome d'hydrogène ou un radical RCO,ou bien dans lesquelles Y représente un radical RCO et X représente un atome d'hydrogène ou un radical RCO,étant entendu que, dans ces définitions, R représente un radical alcoyle ou alcényle contenant 11 à 19 atomes de carbone en chaîne droite ou ramifiée et dans lesquelles les acides aminés ont les configurations suivantes : Ala: L,Glu : D et DAP : L,L. 2. Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le radical RCO est le radical lauroyle. 3. Procédé pour l'obtention des composés selon la revendication 1,caractérisé en ce qu'on fait réagir un dérivé d'acide aliphatique,de formule R-COOH, oh R est tel que défini précédemment ,avec l'un ou l'autre des tétrapeptides de formules (I) et (II) ci-après: dans lesquels l'alanine est sous forme L,l'acide glutamique est sous forme D et l'acide diaminopimélamique-est sous forme L,L.,le tétrapeptide (I) conduisant au composé de formule.(III) et le tétrapeptide (II) au composé de formule (IV). 4.Procédé selon la revendication3,caractérisé en ce que le dérivé d'acide aliphatique est l'anhydride. 5. Procédé selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce que le dérivé d'acide aliphatique est l'anhydride laurique. 6. A titre de moyen pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5,le tétrapeptide de formule (I) et le tétrapeptide de formule (II) 7. Application de l'un ou l'autre des composés de formules (III) et (IV)selon l'une des revendications 1 ou 2 à titre d'adjuvants immunologiques. 8. Compositions pharmaceutiques utilisables en thérapeutique humaine ou vétérinaire, caractérisées en ce qu'elles contiennent,à titre d'adjuvant immunologique au moins un des composés définis à l'une des revendications 1 ou 2. 9. Composition pharmaceutique selon la revendication 8,caractérisée en ce qu'elle contient une quantité thérapeu tiquement active du composé de formule (III) en association avec un véhicule convenant à l'administration.