Brevet FR2441847A1 — publié le 19800613

La présente invention concerne l'immunologie, et elle a plus particulièrement trait à la détection, qualitative ou quantitative, des antigènes, anticorps et haptènes. On sait que le procédé généralement employé pour une telle détection consiste à marquer l'antigène, l'anticorps ou l'haptène qu'on désire doser ou identifier, et ce à l'aide d'une particule radioactive. Une fois, la marque radioactive ainsi appliquée, on soumet l'antigène, anticorps ou haptène à une série d'immuno-réac- tions successives (il s'agit en fait de réactions antigènes/anticorps où entrent en compétition les molécules précitées avec les mêmes molécules non marquées. A l'issue des précipitations successives, on procède enfin au comptage de la radioactivité, ce qui permet, selon les techniques habituelles, une détection quantitative et/ou qualitative. Un tel processus donne des informations suffisamment exactes pour la quasi-totalité des cas pratiques, mais par contre il nécessite un appareillage complexe, lourd et très coflteux (compteurs à scintillations). Aussi, en vue de remédier à ces inconvénients a-t-on proposé d'adopter pour l'étiquetage un marqueur, non plus radioactif, mais enzymatique, la détection finale s'effectuant par colorimetrie et spectrophotométrie. L'appareillage nécessaire à la mise en oeuvre d'une telle méthode est beaucoup plus simple et meilleur marché. Par contre, la sensibilité est moindre dans une mesure considérable, par suite notamment de la détérioration de l'étiquette et/ou de l'agent étiqueté ayant lieu au cours de réactions de coupage il faut, en outre,-noter qu'un tel procédé ne convient pas pour tous les antigè nes,anticorps ou haptènes. La présente invention a pour objet un nouveau procédé de détection qui permet l'obtention de résultats au moins aussi précis et fiables que ceux obtenus à l'aide de la méthode radio-immunologique, sans toutefois impliquer l'emploi d'un appareillage complexe et cher, et ce tout en évitant les inconvénients de l'immuno-enzimologie. L'invention consiste essentiellement à procéder à l'étiquetage par attache d'au moins une molécule d'un lipo-poly-saccharide (L.P.S.) d'origine bactérienne, molécule de Lipide A ou molécule à structures équivalentes, à effectuer les immuno-réactions suivant les techniques radio-immunologiques ou immuno-enzimatiques usuelles, et à procéder enfin à la détection par appréciation spectrophotométrique ou néphélométrique de la turbidité après Limulus Test ou équivalent. On sait que certaines propriétés particulières des L.P.S. bactériens ont été mises en évidence par les études menées par BANG et LEVIN sur les limules, notamment en ce qui concerne l'analyse de leur gélification en présence de toxines bactériennes. Ces travaux ont abouti à la mise au point du Limulus Test qui permet justement l'appréciation ultérieure de la turbidité, laquelle appréciation est susceptible d'être obtenue à l'aide d'appareils très simples, par spectrophotométrie ou néphélométrie. Sur le plan pratique, l'étiquetage de l'antigène, anticorps ou haptène envisagé, c'est-à-dire l'attache d'une ou plusieurs molécules de L.P.S. bactériens ou Lipide A sur l'agent soumis a l'étude ou sur son anticorps, peut étre réalisé soit par liaison ionique, soit encore par absorption ou fixation quelconque sur support inerte. Après étiquetage, on procède de la m8me manière que dans une des techniques radio-immunologiques ou immuno-enzymatiques connues, (par exemple technique du double anticorps, technique sandwich, E.L.I.S.A....) en ayant recours à une succession d'irmnuno-réactions. Il peut, par exemple, intervenir à un moment donné une competition entre molécule étiquétée et molécule identique non étiquetée, et à un autre moment, après la compétition, un moyen de séparation quel qu'il soit entre les particules qui ont pu participer à la competi- tion et celles qui n'ont pas pu y participer. Pour cette séparation, l'anticorps ou le double anticorps peuvent, par exemple, etre fixés sur les supports solides habituels (hématies de mouton, bile de sépharose, séphadex, latex, cellulose, etc..) et la séparation peut se faire par centrifugation. Dans la méthode sandwich, l'antigène est mélangé avec l'anticorps insolubilisé en excès, puis, après lavage par de l'eau apyrétogène, l'anticorps étiqueté par le lipo-poly-saccharide (ou le Lipide A) et en excès par rapport à l'antigène est ajouté au milieu d'incubation ; après nouveau lavage par de l'eau apyrétogene, l'activité liée au support insoluble est testée par le Limulus Test. Cette activité est liée à la quantité d'antigène introduite dans la solution. Dans tous les cas les réactions parasites quand elles existent et quand cela est nécessaire peuvent être neutralisées par du sérum anti-Lipide A ou une substance de nature équivalente. Les essais ont démontré que les L.P.S. bactériens (ou substances synthétisées à structure équivalente) constituaient un marqueur permettant une détection quantitative d'antigène ou d'anticorps et doué d'une très grande sensibilité comparable au moins à celle obtenue par la radio-immunologie. De plus, l'appareillage nécessaire à la mise en oeuvre du procédé suivant l'invention est très simple et peut autre trouvé en pratique dans tous les laboratoires de Biologie. L'activité de l'étiquette est en outre bien moins altérée par le couplage que celle des enzymes. I1 doit d'ailleurs être entendu que la description qui précède n'a été donnée qu'a titre d'exemple et qu'elle ne limite nullement le domaine de l'invention dont on ne sortirait pas en remplaçant les détails d'exécution décrits par tous autres équivalents. R E V E N D I C A T I O N S 1. Procédé pour la détection quantitative ou qualitative des antigènes, anticorps ou haptènes, caractérisé en ce qu'il consiste à étiqueter l'agent considéré par attache d'au moins une molécule d'un lipo-poly-saccharide (L.P.S.) bactérien, molécule de Lipide A ou molécule a structures équivalentes, à effectuer les immunoréactions suivant les techniques radio-immunologiques ou imnunoenzymatiques usuelles, et à procéder à la détection par appréciation spectrophotométrique ou néphélométrique de la turbidité après Limulus Test ou équivalent. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'attache est réalisée par liaison covalente. 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'attache est réalisée par liaison ionique. 4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que 1'attache est réalisée par absorption ou autre fixation sur support inerte. 5. Procédé suivant 1 'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les réactions parasites sont neutralisées par la présence de sérum anti-Lipide A ou autre substance à structure équivalente.