Brevet FR2458070A1 — publié le 19801226

La présente invention se rapporte à un dispositif pour l'identification et le dosage de substances biochimiques antigéniques dans les fluides biologiques. On a déjà décrit de nombreuses methodes de type imniunoenzymologique d'une telle identification et/ou un tel dosage. Dans leurs principes, ces méthodes se fondent sur la mise en oeuvre des etapes essentielles suivantes: 1 - On constitue un immunoadsorbant en fixant sur un support solide une fraction susceptible de caractériser la substance à identifier et/ou à doser; cette fraction peut etre un antigène, pour la recherche d'anticorps, ou un anticorps specifique, pour la recherche de fractions antigeniques. 2 - On fixe la substance à doser sur cet immunoadsorbant en formant un complexe spécifique du type antigene-anticorps, directement à partir du fluide biolo gique hétérogène. 3 - On révèle le complexe ci-dessus, soit directement, soit indirectement, par une réaction permettant un dosage par spectrophotométrie ou comptage isotopique. La révélation sera directe si, dans l'étape 2, on réalise une compétition entre la substance naturelle et son homologue substitué par une enzyme réactionnelle ou un isotope traceur. La révélation sera indirecte si, à la suite de l'étape 2, on combine la substance ainsi fixée ou "piégée" avec une fraction anticorps spécifique de ladite substance piégée, substituée par une enzyme réactionnelle, selon une méthode dite "sandwich", la substance recherchée étant intercalée entre l'anticorps de l'imr,lunoadsorbant forme dans l'étape 1 et l'anticorps marque par 1' enzyme. La révélation, directe ou indirecte, est réalisée dans le cas de l'immunoenzymologie par une réaction de l'enzyme avec un réactif qui lui est sensible (fluorimétrie, colorimétrie, etc.). Les procédés actuellement connus reposant sur ces principes se differencient par l'illeunoadsorbant utilisé dans l'étape 1 et/ou l'enchainement réactionnel mis en oeuvre dans l'étape 3. Ainsi, l'îmmunoadsorbant peut etre une surface plane, d'un tube par exemple, ou des particules utilisables en suspension. La fraction spécifique peut être fixee sur le support par simple adsorption physique ou par action d'une liaison chimique. Cet immunoadsorbant peut être, selon les cas, préparé au moment de l'emploi ou , au contraire, proposé à l'utilisateur prêt à l'emploi" avec une période de conservation variable. Parmi les modes de mise en oeuvre connus, on peut citer le cas ou la fraction active est adsorbée sur la paroi de tubes ou de capsules, par exemple en polystyrène. I1 s'agit des procédés dits "ELISA" (Enzyme Linked Immunoadsorbant Assay). Lorsque la fraction active choisie est une suspension-de cellules pathogenes, elle peut etre fixée directement sur des plaques de verre, par frottis: c'est ainsi qu'on opère par exemple pour la determination par immunofluorescence de la maladie de Chagas, en préparant les plaques réactionnelles à partir de suspensions de Srypatlosoma Cruzi. La fraction active peut être aussi fixée par liaison chimique, sur divers supports, par la mise en oeuvre de nombreux procédés décrits pour l'immobilisation de protéines enzymatiques, parmi lesquels la fixation sur des billes de verre par silanation (Wheetal), sur des polyamides du type nylon par les isocyanates (Goldstein), sur des globules rouges ou autres fractions hétéroprotéidiques par pontage à l'aide de dialdéhydes (Avrameas), ou encore sur des nylons activés grâce à un pontage du type précédent par des aldéhydes (Hornby). On a montré plus récemment que la surface active pouvait être une membrane proteique preparée par coréticulation à l'aide de dialdéhydes et combinée à une électrode de mesure (Boitieux). Ces différents procédés sont appliqués pour la caractérisation de molécules ayant un caractere antigénique, de type et origine très variés: fractions d'origine virale, microbienne ou parasitaire, hormones, antibiotiques peptidiques et, de façon générale, tous types d'anticorps. Leur emploi se répand en biologie animale (vétérinaire) et végétale (phytosanitaire). Quand à l'enchainement réactionnel mis en oeuvre dans l'étape 3 ci-dessus pour la "lecture" de la réaction, les procédés connus utilisent selon les cas, soit un dispositif de comptage de radioactivité, si le marqueur est un isotope, soit un dispositif adapte de mesure par fluorescence si le marqueur est fluorescent, soit un spectrophotomètre ou un colorimètre banal si le marqueur est une enzyme qui provoque le virage d'un réacteur coloré (o-dianisidine, par exemple, pour les oxydases). Tous ces procédés présentent des inconvénients qui portent essentiellement, d'une part, sur des imperfections constatées au niveau des propriétés générales des immunoadsorbants utilisés, d'autre part, sur le cout et les difficultés d'emploi des dispositifs de lecture utilisés qui, à des degres divers, imposent le recours à des laboratoires d'analyses spécialises. Dans le cas de l'immunoenzymoloqie, il apparaît notamment que, pour l'adsorption physique, dans les procédés ELISA en particulier, la sensibilite du test est généralement faible parce que l'on utilise peu d'extraits actifs purifiés, le coût de ceux-ci étant très élevé. De plus, ce type d'adsorbant, par sa nature même, n'exclut pas les risques d'erreur par désorption de surface, qui croissent avec le nombre et le type des lavages; cela oblige à un compromis entre un lavage efficace et la qualité de la révéletion. Par ailleurs, même si on indique généralement pour ces réactifs une durée de conservation de deux à trois mois, l'expérience montre qu'une préparation exteniporaire est préférable. Enfin, la faible sensibilité implique une prolongation du temps de réaction, ce qui conduit à une duree moyenne de l'essai de 18 à 24 heures. Toujours pour l'immunoenzymologie, dans le cas des immunoadsorbants réalisés par liaison chimique, il semble que les liaisons chimiques sur polyamides (par isocyanates ou par dialdéhydes) soient les meilleures, car elles provoquent les dénaturations structurales les plus faibles et permettent l'emploi de supports de formes diverses, la stabilité des molécules fixées étant très bonne et permettant une conservation prolongée et des lavages énergiques sans risque de pertes. Par ailleurs, le rendement de fixation en molécules actives peut être élevé, ce qui est favorable à un niveau de sensibilité élevé pour des coûts acceptables en réactifs. Cependant, il n'existe pas actuellement de dispositif mettant en oeuvre des immunoadsorbants sur nylon. Un objet de la présente invention est de fournir un tel dispositif particulièrement commode d'emploi. Le dispositif selon l'invention pour l'identification et le dosage de substances biochimiques est caractérisé en ce qu'il comprend un support en un matériau inerte, au moins semi-rigide, et une masse réactionnelle fixée sur une partie au moins de ce support, ladite masse réactionnelle consistant en une toile de nylon sur laquelle est immobilisée par un procédé connu en soi une préparation antigénique specifique de la substance à identifier. D'autres buts et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description suivante et des figures jointes, données à titre illustratif mais non limitatif. La Figure 1 est une vue en perspective d'une forme de réalisation du dispositif selon l'invention; la Figure 2 illustreun ensemble de dosage comportant des dispositifs tels celui de la Figure 1, sous emballage protecteur étanche et un jeu de flacons de solutions de lavage et de révélation. Si l'on se reporte à la Figure 1, le dispositif selon l'invention, dans la forme de réalisation choisie et représentée consiste en un support 10, en un matériau inerte et au moins semi-rigide, de préférence thermosoudable, sur une partie de la surface duquel est fixée une masse réactionnelle 11. Ce support a, par exemple, la forme d'une languette allongée, à une extrémite de laquelle est fixée la masse 11, l'autre extrémite 12 de cette languette permettant la préhension de celle-ci. La masse réactionnelle 11 est constituée par un rectangle de toile de nylon 6 (ou 6,6) qui est fixé, par exemple -par thermosoudage, sur la languette 11. Dans une forme de réalisation, la languette 10 a une longueur de 8 cm et une largeur de 0,5 cm, tandis que la masse réactionnelle 11 a 0,5 cm de large et une longueur de 1 cm et est thermosoudée en 13 sur une largeur de 0,25 cm. La maille et la section des fils de la toile de nylon n'ont pas des valeurs impératives, mais des résultats très satisfaisants ont été obtenus avec une toile ayant les caractéristiques suivantes: Diamètre du fil ........... 40 m Pourcentage de vide ........... 30 % Fils au cm linéaire ........... 100 Epaisseur du tissu 70 m L'épaisseur de la languette est choisie pour que cette languette soit suffisamment rigide, tout en présentant une certaine souplesse. immunoadsorbant, dans le dispositif selon l'invention, est prépare par fixation sur la toile de nylon 11, d'une préparation antigenique, spécifique du produit à identifier et doser, à l'aide d'un procédé d'immobilisation connu, soit par la voie des isocyanates, soit à l'aide d'agents bifonctionnels tels que le glutaraldéhyde. Le dispositif selon l'invention est conditionné à sec, soit en vrac dans des flacons appropriés, soit en ensachage individuels, ces sachets étanches pouvant être réunis en chapelet comme représenté en 20 à la Figure 1. I1 est avantageusement accompagné de trois flacons tels A, B, C à la Figure 2 également, contenant trois solutions, l'une de lavage et les deux autres de révélation. La solution de lavage est forée d'une solution à 0,5% d'un détergent polaire et, plus particulièrement, de N-alkyl-dimèthylbétaîne (Empigen BB) ou d'une solution de Teepol à 0,5% dans un tampon phosphate. Les solutions de révélation sont constituées par des reactifs classiques en immunoenzymologie, à savoir, une solution d'anticorps specifique marquée àla peroxydase et un réactif de coloration classique, sensible à la peroxydase. De manière tres générale, le dispositif selon l'invention, selon la nature de la fraction active fixée sur la toile de nylon, est applicable à l'identification directe de toutes les molécules présentant un pouvoir antigénique, notamment, les hormones peptidiques, les antibiotiques, les anticorps et agents pathogènes caractéristiques des maladies humaines ou animales, d'origine virale, microbienne ou parasitaire, telles que, par exemple, l'hépatite B, les trypanosomiases, les leishmanioses et les toxoplasmoses, cette énumération n'étant pas limitative. On donnera ci-dessous deux exemples d'applications du dispositif selon l'invention. EXEMPLE 1 Identification directe de la maladie de Chagas, provoquée par Trypanosoma Crmzy Le support est une toile de nylon 6,6, de type TI-56-HD-Lot 431 005 - 32% de l'UGB-France. L'equivalent de 10g de nylon est mis en suspension, pendant 4h à 20"C, dans 300 ml d'HCl 3N. Après élimination de la solution, on lave par l'eau distillée, l'éthanol puis l'éther éthylique. On sèche à l'air, puis sous vide. On ajoute alors 80 ml d'isopropanol, 20 ml d'acètaldéhyde et 8 ml de diisocyanohexane. On abandonne, sous agitation, pendant 24h à 20"C. On lave ensuite la toile residuelle par 50 ml d'Isopropanol, puis 200 ml d'éther éthylique. On sèche ensuite à l'air, puis sous vide. Dès que le produit est sec (après environ 2h), on fixe la fraction antigénique correspondant à un homogenat total d'épimastogotes de culture de la souche Trypanosoma Cruzi (tehnautepec), dans les conditions suivantes: 50 mg de nylon isocyanate sont traités par 1 ml de tampon tris-HCl-O,lM à pH 7, 1 ml du même tampon contenant 5 mg de protéines de l'extrait de Trypanosoma Cruzi et 0,1 ml d'acétaldéhyde.Après 12h d'agitation à 4"C, en flacon bouché, on lave par l'HCl-0,001 N. Le produit peut être stocké pendant 4 mois à 40"C dans ces conditions, sans perdre son activité. On peut sécher la toile de nylon apres lavage à l'eau distillée. Le support ainsi préparé est monté par thermosoudage sur les languettes supports. Pour la détection qualitative de la présence d'anticorps anti-rypanosoma Cruzi dans le sang, on prépare une dilution au 1/40e du sérum du patient dans une solution saline tamponnée (SST-classique). On trempe la bandelette dans cette solution, pendant 10 mn à 30"C. On lave ensuite trois à quatre fois rapidement en agitant dans du SST. On dépose alors sur la partie réactionnelle 0,1 ml (équivalent de 2 gouttes) d'une solution d'antisérum, marqué à la peroxydase. L'ensemble est incubé 10 mn à 30"C. On lave à nouveau rapidement dans le SST, dans les mêmes conditions que précédemment. On dépose enfin 0,1 ml du réactif de Graham et Karnovsky et on laisse la réaction se developper 10 mn. La réaction est positive pour une coloration brune et négative pour une coloration beige clair. EXEMPLE 2 Identification des anticorps spécifiques des antigènes de surface de l Hépatite B (HBSAS) Le support est une toile de nylon 6,6 présentant les mêmes caractéristiques que celles décrites à 1'Exemple 1. L'équivalent de 10Q de nylon est mis en suspension, pendant 4h à 20"C, dans 300 ml d'HCl 3N. On lave à l'eau distillée, puis on ajoute 25 ml d'une solution de glutaraldéhyde à 5% dans du bicarbonate de sodium 0,2M (pH 9,5). On agite 3G mn à la température ordinaire, puis on rince avec du tampon acétate 0,02M à pH 4,5 et de l'eau distillée. Le tissu ainsi active est mis en contact avec une solution de protéine A à la concentration de 2 mg/ml dans du tampon phosphate 0,1M à pH 7, contenant 2 mM d'EDTA et 0,85 mM de dithioérythritol. On abandonne sous agitation, pendant 16h, à 4"C. Les toiles de nylon, prépares comme décrit ci-dessus, sont montées par thermosoudage sur des bandelettes-supports, dans les conditions décrites à la Figure 1. Pour la détection des anticorps anti-HBsAg, on prépare des dilutions successives de serum avec de l'antigène marqué à la peroxydase et on incube 10 mn, à 37"C. On trempe alors pendant 2 mn une bandelette dans chaque tube, puis on lave dans les mêmes conditions qu'à l'Exempte 1. On révèle ensuite dans les conditions classiques avec le réactif de Bergmeyer à l'orthodianisedine - H202. La réaction est stoppée après 60 mn par addition d'une goutte d'HCl 5N. I1 se developpe une coloration jaune en cas de réaction positive. On peut lire l'intensité de la coloration dans un colorimètre à 400 nm. EXEMPLE 3 Détermination de gonadotropine chorionique humaine Dans les conditions identiques à celles décrites à 1'Exemple 1, on immobilise des anticorps antiglobulines sur une toile de nylon 6, présentant les caractéristiques de 1'Exemple 1. A partir du fluide biologique à tester, on ajoute par dilution une quantité connue de gonadotropine chorionique humaine marquée à la peroxydase. La solution est ensuite additionnée d'un exces d'anticorps antigonadotropine chorionique humaine et on laisse incuber le mélange pendant 10 mn, à 37 C. On trempe alors la bandelette de nylon chargée en anticorps antiglobulines et on laisse en contact 10 mn. La bandelette est ensuite lavée avec une solution saline tamponnée à pH 7, additionnée de 0,5% de Tween 80. On révèle ensuite la peroxydase fixée sur la bandelette, par la méthode classique de coloration. A partir de cette réaction par inhibition compétitive, on dose par spectrophotométrie en référence à un témoin, l'intensité de la coloration étant inversement proportionnelle à la quantité d'hormone présente. Le dispositif selon l'invention s'utilise indifféremnient par trempage dans le sérum à tester ou (une solution diluée de ce sérum), ou par dépôt à la pipette sur la toile réactionnelle d'une goutte du serum à tester. Dans de nombreux cas, il sera avantageux de laisser au contact du sérum pendant 10 à 15 mn, afin d'atteindre l'optimum de complexation. Le dispositif selon l'invention se présente sous la forme d'un produit consommable, utilisable dans certains cas sans appareillage de lecture grâce à une visualisation directe de la réaction sur l'immunoadsorbant lui-même. I1 est applicable à tous les types de tests enzymoimmunologiques, et particulièrement au diagnostic rapide et aux dépistages systématiques des populations sur leurs lieux de viè, dans les établissements publics (écoles notamment) et dans les cabinets médicaux. Dans une variante d'utilisation, les bandelettes sont montees en rubans continus de façon à utiliser une révélation par fluorescence au lieu d'une révélation enzymatique, les échantillons pouvant être dosés en continu à l'aide d'un dispositif classique de spectrofluorimétrie, muni d'un defilement automatique du ruban monté sur bobine. Dans une autre variante d'utilisation, on utilise la bandelette réaction- nelle pour une détermination quantitative, en effectuant la révélation colorée en phase liquide à partir du produit complexé par la fraction marquée par l'enzyme. La solution colorée obtenue peut, dans ce cas, être dosée par colori métrite. Selon une autre variante encore, on parvient à une estimation semi-quantitative par comparaison visuelle des colorations obtenues à partir d'une gamme de dilution avec une échelle de référence. Dans une forme de réalisation particulière, on prépare avantageusement des bandelettes réactionnelles polyvalentes applicables à la caracterisation des anticorps de type IgG, résultant de la réaction d'immunisation vis- -vis d'agents pathogènes variés. Cette bandelette comporte une fraction de protéine A, immo bilisée sur le nylon; cette protéine est connue pour se combiner, de façon tres rapide et quantitative, avec la partie non spécifique des IgG. Le sérum à tester sera alors incube préalablement avec un antigène marqué à la peroxydase, specifique de l'anticorps à caractériser, de type IgG. Le complexe spécifique IgG Antigène marqué est alors fixé sur la bandelette-protéine A, qui sera révélée ensuite selon l'une des voies décrites ci-avant. Bien entendu, la présente invention n'est nullement limitée aux exemples et modes de mise en oeuvre mentionnés ci-dessus; elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans que l'on ne s'écarte de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1.- Dispositif pour l'identification et le dosage de substances biochimiques antigèniques par voie immunoenzymologique, caractérise en ce qu'il comprend un support en un materiau inerte, au moins semi-rigide, et une masse réactionnelle fixée sur une partie au moins de ce support, ladite masse réactionnelle consistant en une toile de nylon sur laquelle est immobilisée par un procédé connu en soi une préparation antigénique spécifique de la substance à identifier et doser. 2.- Dispositif selon la revendication 1 pour l'identification de la Maladie de Chagas, provoquée par Trypanosoma Cruzi, caractérisé en ce que la masse reactionnelle consiste en une toile de nylon sur laquelle est immobilisé un homogénat total d'épimastigotes de culture de la souche Trypanosoma Cruzi. 3.- Dispositif selon la revendication 1 pour l'identification des anticorps anti-HBsAg (Hépatite B), caractérisé en ce que la masse réactionnelle consiste en une toile de nylon préalablement activée par immersion dans une solution de glutaraldèhyde, puis plongée dans une solution de protéine A dans un tampon phosphate. 4.- Dispositif selon la revendication 1 pour le dosage de la progestérone, caractérisé en ce que la masse réactionnelle consiste en une toile de nylon sur laquelle sont immobilisés des anticorps antiglobulines. 5.- Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le support est une languette allongée à une extrémité de laquelle est fixée la toile de nylon. 6.- Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérise en ce que la toile de nylon est formée d'un fil de diamètre de 40 pm, présente un pourcentage de vide de 30% et comporte 100 fils au centimetre linéaire, l'épaisseur du tissu etant de 70 um 7.- Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le nylon est du nylon 6 ou du nylon 6,6. 8.- Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caracterise en ce que la toile de nylon est fixée par thermosoudage.