Brevet FR2449280A1 — publié le 19800912

La présente invention concerne une méthode de dosage photométrique de deux ou plusieurs composants dans un échantillon liquide par addition de réactifs pour les co:nponts dis rento et mesure de l'absorption de lumière des produits réactionnels respectifs dans une cellule de mesure, une méthode de préparation d'un réactif mixte pour la conduite d'un dosage photométrique de deux ou plusieurs composants d'un échantillon liquide par mesure dé l'absorption de lumière des produits réactionnels des réactifs dans une cellule de mesure, et le réactif mixte ainsi obtenu. Des dosages photométriques de composants d'un échantillon liquide sont effectués en grandes quantités dans de nombreux laboratoires. Dans ces dosages, une réaction est établie par l'addition d'un réactif, éventuellement en association avec plusieurs composés auxiliaires, entre le réactif et l'un des composants de l'échantillon liquide, le réactif étant spécifique de ce composant. Ensuite, la quantité de produit réactionnel obtenue est déterminée par voie photométrique par me sure de l'absorptio n de lumière dans une plage prédéterminée de longueurs d'onde, dans laquelle le produit réactionnel pré- ente un pic d'absorption. Pour la détermination d'un second composant de l'échantillon, une nouvelle quantité de liquide est ajoutée à un autre réactif, éventuellement en présence de composés auxi linaires, et le produit réactionnel est dosé de la même manière que le premier composant par mesure de l'absorption. On vient de découvrir qu'il est possible, lorsque les pics d'absorption des produits indicateurs ne se recouvrent pas, de combiner deux ou plusieurs déterminations par l'addition des différents réactifs à un seul et même échantillon. En conséquence, l'invention propose une méthode de dosage photométrique de deux ou plusieurs composants dans un échantillon liquide par addition de réactifs pour les différents composants et mesure de l'absorption de lumière des produits réactionnels respectifs dans une cellule de mesure, méthode caractérisée par le fait que les réactifs des différents composants sont ajoutés à un seul et même échantillon et la composition des réactifs est donc choisie de manière que les composants individuels pour les différents dosages n'interfèrent pas les uns avec les autres, et les courbes d'absorption des produits réactionnels respectifs sont mesurées simultanément dans cet échantillon. La-méthode convient particulièrement au dosage de composants présents dans des liquides corporels d'êtres humains et d'animaux, tels que des enzymes, des substrats, des composants inorganiques et des électrolytes, des substances pharmaceutiques administrées et leurs métabolites ainsi que des composants biologiques, organiques et inorganiques dans d'autres liquides ne provenant pas d'un organisme. Les longueurs d'ondes qui doivent être utilisées se situent généralement dans la plage de 200 à 900 nm. Les pics d'absorption des produits indicateurs doivent être différents, de manière à obtenir une séparation nette, c'est-à-dire que les courbes d'absorption ne doivent pas se recbuvrir dans la région du maximum. Il y a lieu de remarquer naturellement qu'un certain recouvrement dans les zones de faible extinction peut être autorisé , mais les pics doivent pouvoir être nettement discernés. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants EXEMPLE 1 Un dosage de triglycérides et un dosage du cholestérol doivent tous deux être effectués sur un échantillon de sang humain. On prépare un réactif en faisant incuber une solution préliminaire contenant - 0,055 mole de tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane - 0,033 mole d'acide chlorhydrique - 0,0037 mole de nitrate de magnésium - 0,15 mole de sulfate d'ammonium - 0,55 mole de chlorure d'ammonium - 1,60 mole de méthanol - 0,021 mole d'acétylacétone, et > y1300 1300 U/ml de catalase (EC 1.11.1.6) dans l'eau pendant 45 minutes à 35 C, puis on ajoute - # 100 U/l de cholestéroloxydase (EC 1.1.3.6) 6CO U/l de cholestérolestérase (EC 3.1.1.13) - 6 U/ml de lactate-déshydrogénase (EC 1.1.1.27) - 1 U/ml de pyruvateclnaxe (EC 2.7.1.40) - 80 U/ml de lipase (EC 3.1.1.3) - 0,2 mmole de nicotinamide-adénine-dinucléotide (sous la forme réduite, NADH) - 0,44 mmole de triphosphate d'adénosine - 0,36 mmole de phospho-énol-pyruvate, et - 0,1 % d'hydroxypolyéthoxydodécane et on fait incuber le liquide pendant 10 minutes à 35"C (on l'appellera réactif A par commodité). Ensuite, on prépare une solution de 30 U/ml de glycérolinase (EC 2.7.1.30) dans une solution de sulfate d'ammonium 1M. I1 s'agit du réactif de départ utilisé pour le dosage des triglycérides (réactif B). On ajoute 20 p1 de l'échantillon à 1 ml de réactif A et au bout de 14 minutes, on ajoute à la solution obtenue 50 pl de la solution de glycérolxinase (réactif B). Le dosage des triglycérides est effectué par mesure du maximum d'absorption du NADH (valeur d'extinction décroissante) à 340 nm. Le dosage du cholestérol s'effectue par mesure du maximum d'absorption (valeur d'extinction croissant9 à 405 nm de la 3,5-diacétyl-1,4-dihydrolutidine, qui se forme par réaction du réactif avec le cholestérol. Tous les composés organiques et inorganiques utilisés sont de qualité pour analyse. Les enzymes utilisés doivent être de la plus grande pureté disponible. EXEMPLE 2 Le calcium et le magnésium doivent tous deux être dosés dans un échantillon de sérum humain. On prépare un réactif avec une solution contenant - 0,156 mmole de bleu de xylidyle 1 - 25,0 mmoles d'acide borique - 25,0 mmoles de chlorure de potassium - 21,95 mmoles d'hydroxyde de sodium - 0,23 mmole de bleu de méthylthymol dans un mélange d'eau et d'éthanol (50 % en volume d'éthanol, 50 % en volume d'eau). On prend 1 ml de ce réactif et on détermine l'extinction à 505 nm et à 618 nm. On ajoute 10 pl de l'échantillon au réactif et on attend 5 minutes. On détermine ensuite de nouveau l'extinction. La différence d'extinction due au complexe de magnésium et de bleu de xylidyle à 505 nm est une mesure de la concentration en magnésium. Le complexe de calcium et de bleu de méthylthymol formé est dosé à 618 nm. EXEMPLE 3 Le glucose et l'urée doivent tous deux être dosés dans un échantillon de sérum humain. On prépare un réactif à partir d'une solution con- tenant - 0,11- mmole de rouge de phénol (tamponné, produit Harleco n" 81350A) - 600 U/1 de glucose déshydrogénase (EC 1.1.1.47) - 12,6 U/l de mutarotase (EC 5.1.3.3) et on l'appelle réactif A par commodité. On prépare ensuite un réactif à partir d'une solution contenant : - 23,3 kUil d'uréase (EC 3.5.1.5) - 0,65 mmole de nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD) - 154 mmoles de chlorure de sodium que l'on appelle réactif B par commodité. On ajoute 30 iil de l'échantillon à 1 ml de réactif A. Après une période d'incubation de 4 minutes et 40 secondes à 250C, on ajoute 50 pl de réactif B. On effectue le dosage du glucose en mesurant le maximum d'absorption de NADH (valeur croissante d'extinction) à 340 nm. On effectue le dosage de l'urée en mesurant le maximum d'absorption du rouge de phénol (valeur croissante d'extinction) à 546 nm. EXEMPLE 4 L'albumine et les protéines totales doivent être dosées dans un même échantillon de sérum humain. On prépare un réactif à partir d'une solution contenant : - 0,3 mmole par litre d'acide 2-(4'-hydroxybenzènazo)-benzol- que (C,,HON203) - 0, mole par litre d'hydroxyde de sodium (NaOH) - 41 mmoles par litre de tartrate double de potassium et de sodium (KNaC4H406 .4H20) - 9 mmoles par litre de sulfate de cuivre (CuSC4.5H2C) - 15 mmoles par litre d'iodure de potassium (KI) On prélève 1 ml de ce réactif et. on mesure ltex- tinction à 482 nm et 560 nm. On ajoute 40 p1 de l'échantillon a ce réactif et on attend 15 minutes à une température de 370C. On mesure de nouveau l'extinction. La différence d'extinction due au complexe albumine-azo à 482 nm est une mesure de la concentration en albumine. Le complexe protéine-cuivre formé est dosé à 560 nm et donne une mesure de la concentration en protéines totales. EXEMPLE 5 On doit doser la t-glutamyltransférase (EC 2.3.2.2) et l'acide uréique dans un même échantillon de sérum humain. On prépare un réactif à partir d'une solution contenant : - 100 mmoles par litre de tampon tris, de pH 8,25 - 100 mmoles par litre de glycylglycine - 9 mmoles par litre de phénol - 3000 U par litre de peroxydase (EC 1.11.1.7) - 180 U par litre d'uricase (EC 1.7.3.3) - 25 immoles par litre de 4-aminophénazone On prélève 1 ml de ce réactif et on mesure l'ex- tinction à 505 nm. On ajoute 100 pl de l'échantillon et on attend 7 minutes à 370C. On ajoute ensuite 100 p1 d'une solution à 45 mmoles par litre L-g-glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilide. On mesure de nouveau l'extinction à 505 nm. On mesure la différence d'extinction par minute à 405 nm. La différence d'extinction à 505 nm est une mesure de la concentration en acide urique. La différence d'extinction par minute à 405 nm est une mesure de l'activité en -glutamyltransférase. Pour le dosage de l'acide urique, on doit faire un essai à blanc sur le sérum. REVENDICATIONS - - Méthode de dosage photométrique de deux ou plus de deux composants dans un échantillon liquide par addition de réactifs pour les différents composants et mesure de l'absorption de lumière des produits réactionnels respectifs dans une cellule de mesure, caractérisée en ce que les réactifs pour les différents composants sont ajoutés à un seul et même échantillon, la composition des réactifs étant choisie de manière que les composants individuels pour les différents dosages n'interfèrent pas les uns avec les autres, et les courbes d'absorption des produits réactionnels respectifs sont mesurées simultanément dans cet échantillon. 2. - Méthode suivant la revendication 1, caractérisée par le fait que l'échantillon est un liquide corporel provenant d'un être humain ou d'un animal. 3. - Méthode suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisée par le fait que les triglycérides et le cholestérol sont dosés simultanément dans un sérum humain ou un sérum d'animal. 4. - Méthode suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisée par le fait que le calcium et le magnésium sont dosés simultanément dans du sérum humain. 5. - Méthode suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que le glucose et l'urée sont dosés simultanément dans du sérum humain. 6. - Méthode suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisée par le fait que l'albumine et les protéines totales sont dosées simultanément dans un sérum humain. 7. - Méthode suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que la g-glutamyltransférase (EC 2.3.2.2) et l'acide urique sont dosés simultanément dans du sérum humain. 8. - Procédé de préparation d'un réactif mixte destiné à la conduite d'un dosage photométrique de deux ou plus de deux composants dans un échantillon liquide par mesure de l'absorption de lumière des produits de réaction des réactifs dans une cellule de mesure, caractérisé par le fait que le réactif mixte est formé de deux ou plusieurs réactifs ou mélanges de réactifs qui sont choisis de manière que les composants indivi duels pour les différents dosages n'interfèrent pas les uns avec les autres. 9. - Un réactif mixte obtenu par le procédé suivant la revendication 8.