Brevet FR2460137A1 — publié le 19810123

La présente invention a pour objet un nouveau médicament anti-viral, sa préparation et son application. L'invention a plus précisément pour objet, a titre de nouveau médicament anti-viral, l'alpha2-macroglobuline humaine. On sait que l'alpha2-macroglobuline ( ou en abrégé a 2-M) est une protéine du sang. Le sérum humain en contient généralement de 220 â 38Omg/lOOml. Il a maintenant été découvert que l'alpha2-macroglobuline présente in vitro et in vivo la propriété d'inhiber ou de neutraliser la multiplication des virus. En particulier, les préparations d'alpha2-macroglobuline possedent la propriété - d'inhiber in vitro la réaction sérologique, dite d'hémagglutination, par des virus hémagglutinants, tels que les virus de la grippe, de la rubéole, de la rougeole, etc...; - de neutraliser in vitro, sur cultures cellulaires des virus divers tels que par exemple les virus de la poliomyélite (petits virus nus), de la grippe (virus habillés), les rhinovirus, les adénovirus; - de modifier et même d'inhiber in vivo l'évolution de l'infection virale, par exemple l'infection par le virus grippal virulent instillé par voie intra-nasale chez la souris. Ces propriétés, jointes a son absence de toxicité, permettent l'utilisation de l'alpha2-macroglobuline comme médicament utilisable dans le traitement et la prévention des affections virales, notamment des affections virales de la sphère ORL et du tractus intestinal, des maladies infantiles virales (rougeole, rubéole), etc... L'invention s'étend a des fragments d'alpha2-Macroglobuline ayant les mêmes propriéGes anti-virales. Les préparations d'alpha=macroglobuline présentent notamment un tres grand intérêt comme médicament agissant par voie locale, soit dans les affections virales de la sphère ORL ou du système respiratoire, comme par exemple les angines, rhinites, pharyngites et pneumopathies virales, et les affections virales du tractus intestinal (par exemple a entérovirus). Les préparations d'alpha2 macroglobuline sont genéralement des mélanges avec une quantité mineure, d'autres constituants sanguins, par exemple d'autres globulines. Dans le médicament de l'invention, la pureté de l'alpha2-macroglobuline est de préférence supérieure à 90%. L'expérience a montré que de tels mélanges ont une activité anti-virale au moins égale à la somme des activités dues à l'effet des alpha2-macroglobulines et des gamma-globulines de type IgA éventuellement présentes à l'état de traces. L'invention s'étend aux compositions pharmaceutiques renfermant comme principe actif le médicament anti-viral tel que défini ci-dessus, en mélange avec un véhicule ou un excipient pharmaceutique. Ces compositions contiennent généralement de 1 à 20% en poids dudit médicament anti-viral. Les compositions pharmaceutiques peuvent être également des compositions en deux parties contenues dans un emballage unique, la première partie contenant l'alpha2-macroglobuline sous forme d'une poudre lyophilisée et la seconde partie contenant un liquide stérile isotonique, cette composition étant munie d'un mode d'emploi indiquant que la poudre lyophilisée doit être dissoute dans ledit liquide au moment de l'emploi. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être administrees par voie intra-veineuse ou par voie locale, l'action par voie locale englobant l'action sur la sphère ORL ou le système respiratoire et l'action sur le tractus intestinal. Le véhicule ou excipient est choisi de façon à permettre une telle utilisation. A cet effet, les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être présentées souS forme de solutions isotoniques stériles contenues dans des flacons, des flacons pulvérisateurs ou des ampoules et utilisables comme solutions pour aérosolthérapie, pour instillation ou pulvérisation nasale ou auriculaire, comme collutoires, ou encore dans des ampoules pour le lavage du nez et des sinus. Les compositions de l'invention sont aussi des compositions agissant localement par voie buccale. Ce sont d'une part des compositions telles que dragées ou pastilles à sucer, afin d'obtenir une action locale dans la cavité bucco-pharyngée, ou bien sous forme de compositions contenant un enrobage résistant au suc gastrique, telles que des gélules ou comprimés enrobés, et pouvant ainsi agir localement après passage dans l'estomac au niveau de la lumière intestinale. Pour l'action locale dans l'intestin, les compositions peuvent également se présenter sous forme de suppositoires. Enfin, pour l'application sous forme de pulvérisation, les compositions pharmaceutiques de la présente demande peuvent être présentées, soit dans un flacon souple muni d'un orifice supérieur étroit, soit dans un flacon sous pression muni d'une valve (dit flacon aérosol) et contenant, outre la solution de l'ingrédient actif, un agent propulseur tel qu'un gaz inerte dissous ou un gaz liquéfié sous pression. Enfin, pour l'administration par voie intraveineuse, les compositions de l'invention se présentent sous forme de solutions isotoniques stériles généralement administrées apres dilution dans un flacon de plasma. La posologie varie notamment en fonction de la voie d'administration, et du poids corporel. Par exemple, chez l'adulte, elle peut varier entre 1 et 20g par jour de principe actif, et de préférence de 1 à 10g, en particulier lorsque le traitement doit être poursuivi pendant plusieurs jours. Pour l'action locale on utilise généralement de 100mg à 1g d'ingrédient actif par prise. L'invention a également pour objet l'application du médicament de 11 invention au traitement ou à la prévention des affections virales, caractérisée par le fait que l'on administre par voie locale, buccale, rectale, ou intraveineuse, une quantité efficace du médicament tel que défini ci-dessus. L'invention a notamment pour objet un procédé de traitement ou de prévention des affections virales en administrant ledit médicament par voie locale, caractérisé par le fait que l'on administre dans la sphère ORL, par pulvérisation ou instillation, le médicament tel que défini ci-dessus à l'aide d'une composition sous forme de solution utilisable pour l'ad- ministration par voie locale. L'invention a également pour objet un procédé de préparation du médicament tel que défini ci-dessus. Dans ce procédé, on utilise comme produit de départ une fraction sanguine, d'origine plasmatique ou placentaire, enrichie en alpha2-macroglobuline par élimination, selon les procédés classiques, de la majorité des autres constituants tels que le fibrinogène, les gamma-globulines, le plasminogène ou la plasmine, la prothrombine, les isoagglutinines, etc..., et d'une grande partie de l'albumine. On peut notamment utiliser comme produit de départ la fraction IIIo, ou toute fraction analogue, obtenue à titre de sous-produit dans la préparation des gamma-globulines plasmatiques humaines, par la méthode de fractionnement décrite par E.J.COHN et coll, J.A.C.S, 68, 459-475 (1946) et J.L. ONCLEY et coll, J.A.C.S 71, 541-550 (1949). La fraction IIIo peut être obtenue notamment en mettant en oeuvre la méthode 6 de COHN et la méthode 9 de ONCLEY, ces méthodes étant décrites dans les deux références de littérature qui viennent d'être citées. On entend par fraction analogue à la fraction IIIo toute fraction obtenue après séparation des gamma-globulines dans un procédé de fractionnement par précipitation sélective des constituants sanguins. L'invention a donc pour objet un procédé d'obtention d'une fraction purifiée contenant de l'alpha2-macroglobuline, au départ d'une fraction sanguine enrichie en alpha2-macroglobuline, telle que par exemple la sous-fraction IIIo telle que définie cidessus ou toute fraction analogue, principalement caractérisé par le fait que, dans le but notamment d'éliminer la plus grande partie des gamma-globulines G et A présentes à titre d'impureté, on met ladite fraction, sous forme de solution aqueuse, à pH acide, de préférence compris entre 3 et 5, en contact avec une résine échangeuse de cations, et on recueille l'éluat qui contient 1' alpha2-macroglobuline purifiée. On peut utiliser par exemple comme résine échangeuse de cations une résine du type SP Séphadex équilibrée avec une solution tampon. On opère par exemple avec un tampon acétate tel qu'un tampon acide acétique/acétate de sodium, de molarité comprise entre 0,01 et 0,1M. Lorsque le produit de départ contenait à titre d'impureté des traces d'albumine, on peut faire suivre cette purification sur résine échangeuse de cations, d'une purification sur résine échangeuse d'anions, telle que par exemple une résine DEAE Cellulose ou analogue à pH compris entre 7 et 9, qui élimine pratiquement toute trace d'albumine encore présente. La résine est équilibrée par exemple avec un tampon phosphate de molarité comprise entre 0,01 et 0,1M. Dans ces conditions, l'albumine se fixe sur la résine et l'éluat constitue une solution purifiée d'alpha2-macroglobuline. Dans un mode d'exécution preféré, on peut, antérieurement à ces stades de purification en presence de résine échangeuse d'ions, enrichir la fraction de départ en alpha2-macroglobuline par précipitation sélective à l'aide de Rivanol. De préférence, cette précipitation par le Rivanol est effectuée en deux temps. Dans un premier temps, on ajoute progressivement une solution de Rivanol pour éliminer la plus grande partie de l'albumine présente qui se trouve dans le précipité. Après élimination du précipite, et en poursuivant l'addition de Rivanol, on précipite les alpha2-macroglobulines sous forme de complexe avec le Rivanol. Ce complexe Rivanol/alpha2-macroglobulines peut être dissocié selon les méthodes connues, par exemple par dissolution dans une solution de chlorure de sodium. Ce traitement au Rivanol peut être effectue par exemple à pH compris entre 5 et 8 Par exemple, lorsque le produit de départ est la fraction IIIo ou une fraction analogue, mise en solution aqueuse, et ajustée à 50g par litre environ en protéines, on peut ajouter une solution de Rivanol à 5g/litre environ dans une proportion de 200 à 250ml/litre de solution environ. Le pH est ajusté par exemple entre 6 et 7. Le précipité obtenu est éliminé et on ajoute à nouveau au surnageant, à température ambiante, une solution de Rivanol à 5g/litre environ, dans la proportion de 300 à 400ml/litre environ, le pH étant maintenu comme précédemment entre 6 et 7. Le précipité obtenu est cceuilla, dissous dans l'eau, à pH compris entre 7,5 et 8,5 environ, et le Rivanol est éliminé par précipitation, par addition de chlorure de sodium dans une proportion comprise entre 20 et 100g/litre L'invention a également pour objet le médicament obtenu par le procédé décrit ci-dessus. I1 convient de remarquer que dans ce procédé, c'est l'étape de traitement en présente dune résine échangeuse de cations à pH acide qui s'est révélée particulièrement avantageuse. On a en effet constaté que les préparations d'alpha2macroglobuline obtenues par ce procédé presentent une activité anti-virale accrue. Comme indiqué ci-dessus, le médicament de l'invention peut etre également constitué par tout sous-fragment d'alpha2macroglobuline qui présente les propriétés anti-virales de celleci. L'obtention de ces sous-fragments d'alpha2-macroglobuline peut être effectuée selon les méthodes classiques pour la préparation de fragment de macromolécules protéiniques, par exemple par coupure enzymatique. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE 1 On utilise comme produit de départ une solution obtenue par purification de la fraction IIIo, contenant de l'alpha2macroglobuline avec une pureté de 40-60%. On effectue une chromatographie sur résine SP Séphadex en bain, à pH 3,5, équilibrée avec un tampon acide acétiqueacétate de sodium à 0,05M, pH 3,5. La quantité de résine sèche est égale à deux fois le poids des protéines présentes dans la solution. Cette étape a pour but d'absorber sur la résine les contaminants de type IgA présents. L'éluat, après chromatographie, contient la majorité de l'alpha2-macroglobuline. Dans le cas présent, le produit de départ était obtenu de la façon suivante Le précipité IIIo de COHN est dissous dans de l'eau apyrogène, de telle manière à obtenir un taux protéique de 50g/litre. Le pH de la solution est ajusté à 6,4. On ajoute lentement une solution de Rivanol (lactate de 2-éthoxy-6,9diamino-acridine) à 5g/litre, à raison de 225ml/litre de solution. Le précipité formé est éliminé par centrifugation et le volume du surnageant mesuré. On procède alors à une deuxième addition de solution de Rivanol à 5g/litre, sous agitation, à raison de 360ml/litre de surnageant. Le pH est inchangé à 6,4. Le mélange est mis à déposer pendant une nuit à + 40C. Le précipité formé est séparé par centrifugation, pesé, dissous dans une solution de chlorure de sodium à 50g/litre. Le pH de la suspension est ajusté à 8 et celle-ci est mise à déposer pendant 24heures, à + 40C. Le complexe formé entre le Rivanol et les protéines se dissocie et on observe la formation d'un précipité de rivanolate de sodium qui est éliminé par centrifugation et par filtration. Le filtrat obtenu est dialysé pour éliminer les sels présents dans la solution. Il contient à ce stade entre d0 et 60% d'alpha2-macroglobuline. EXEMPLE 2 Le produit de l'exemple 1 peut être soumis à une deuxième chromatographie en bain à pH 8,6 pour séparer l'albumine encore présente dans la solution d'alpha2-macroglobuline. La résine utilisée est une résine DE52 Whatman prégonflée (DEAE Cellulose). La chromatographie est effectuée par équilibrage avec un tampon phosphate 0,01M, pH 8,6. La quantité de résine est égale à 15fois celle du poids des protéines à traiter. Dans ces conditions, l'albumine se fixe sur la résine et la solution d'alpha2-macroglobuline est relarguée dans l'éluat. Après chromatographie, le pH est à nouveau ajusté à 7. Le produit est dialysé contre une solution aqueuse isotonique de C1Na pour eliminer les phosphates. Le produit obtenu présente les caractéristiques suivantes La solution obtenue présente une seule bande en électrophorèse en acétate de cellulose et en gel de polyacrylamide, caractéristique de la migration de l'alpha2-macroglobuline. En immunoélectrophorèse, on observe la présence de traces d'immunoglobulines, types IgG et IgA. Le titrage en immunodiffusion radiale quantifie 95-972 d'alpha2-macroglobuline et 3 à 5% d'immunoglobulines de type IgA essentiellement. En électrofocalisation ionique, le pic majeur a un point isoélectrique de 5,4, caractéristique des alpha-macroglo- bulines. En analyse en gel de pefléation, sur gel type Pharmacia Sépharose 6B, le pic majeur a un poids moléculaire de 800.000 environ (Alpha2-macroglobuline). EXEMPLE 3 Exemple de préparation d'une composition sous forme de solution ou de poudre lyophilisée. La solution diluée d'alpha2-macroglobuline obtenue à l'exemple précédent est filtrée. Elle peut être reconcentrée par ultrafiltration sur membrane ultrafiltrante type 100.000. La solution est ajustée à 50-100 mg/ml en protéines. Elle contient plus de 90% d'alpha2-macroglobuline. A ce stade, on recherche la présence de pyrogènes qui seront éventuellement éliminés par addition d'une quantité de Charbon 2 SA égale à la quantité de protéines, à 370C, sous agitation pendant deux heures. La solution peut être soit lyophilisée (la poudre lyophilisée est facilement redissoute dans l'eau), soit rendue isotonique, par exemple par addition de glycocolle à 20g/litre et de NaCl à lg/litre et constituer une solution de conservation. EXEMPLE 4 Avec la solution isotonique obtenue à l'exemple précédent, on remplit des ampoules de 5ml et de lOml que l'on scelle. Le contenu de ces ampoules peut être utilisé pour le lavage du nez et des sinus. EXEMPLE 5 Avec la solution isotonique obtenue à l'exemple 3, on remplit des ampoules de 50ml. Le contenu de ces ampoules, dilué dans un flacon de 0,Slitre de plasma peut être administré par voie intra-veineuse. EXEMPLE 6 On réalise des gélules en matériau gastro-protecteur contenant 0,5 g d'alpha2-macroglobuline sous forme de poudre lyophilisée (obtenue à l'exemple 3). R E V E N D I C A T I O N S 1. Nouveau médicament anti-viral caractérisé par le fait qu'il renferme congrue principe actif l'alpha2-macroglobuline humaine, ou des sous-fragments de celle-ci. 2. Compositions pharmaceutiques, caractérisées par le fait qu'elles renferment comme principe actif le médicament antiviral tel que défini dans la revendication 1 en mélange avec un véhicule ou excipient pharmaceutique. 3. Compositions selon la revendication 2, caractérisées par le fait qu'elles contiennent de 1 à 20% en poids dudit médicament. 4. Compositions selon l'une quelconque des revendications 2 et 3, caractérisées par le fait que ledit véhicule ou excipient est choisi de façon à permettre une utilisation par voie intraveineuse. 5. Compositions selon lagune quelconque des revendications 2 et 3, caractérisées par le fait que ledit véhicule ou excipient est choisi de façon à permettre une utilisation par voie locale. 6. Compositions selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisées par le fait qu'elles se présentent sous la forme d'une solution isotonique stérile contenue dans un flacon ou une ampoule. 7. Compositions selon la revendication 6, caractérisées par le fait que ledit flacon est un flacon pulvérisateur. 8. Compositions selon l'une quelconque des revendications 2, 3 et 5, caractérisées par le fait qu'elles se présentent sous la forme de compositions agissant localement par voie buccale. 9. Compositions selon la revendication 8, caractérisées par le fait qu'elles se présentent sous la forme de dragées ou de pastilles à sucer. 10. Compositions selon la revendication 8 caractérisées par le fait qu'elles se presentent sous la 0rr4e de compositions contenant un enrobage résistant au suc gastrique et pouvant ainsi agir localement dans le tractus intestinal 11. Compositions selon lgune quelconque des revendications 2 et 3, caractérisées par le fait qu'elles se présentent sous la forme de suppositoires. 12. Application du médicament tel que défini dans la revendication 1, au traitement ou à la prévention des affections virales, caractérisée par le fait que l'on administre par voie locale, buccale, rectale ou intraveineuse une quantité efficace dudit médicament. 13. Application selon la revendication 12, caractérisée par le fait que pour traiter ou prévenir les affections virales en administrant ledit médicament par voir locale, on administre dans la sphère ORL, par pulvérisation ou instillation, ledit médicament à l'aide d'une composition sous forme de solution utilisable pour l'administration par voie locale. 14. Procédé de préparation du médicament tel que défini dans la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on utilise comme produit de départ une fraction sanguine enrichie en alpha2-macroglobuline par élimination, selon les procédés classiques, d'au moins une partie des autres constituants sanguins, et par le fait que, dans le but notamment d'éliminer la plus grande partie des gamma-globulines G et A présentes à titre d'impureté, on met ladite fraction, sous forme de solution aqueuse, à pH acide, de préférence compris entre 3 et 5, en contact avec une résine échangeuse de cations, et on recueille l'éluat qui contient l'alpha2macroglobuline purifiée. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé par le fait que le produit de départ est la fraction IIIo. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 et 15, caractérisé par le fait que la résine échangeuse de cations est une resine du type SP Sephadex. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisé par le fait que l'on fait suivre le traitement sur résine échangeuse de cations d'une purification sur résine échangeuse d'anions, à pH compris entre 7 et 9, afin d'éliminer -I'albumine encore présente. 18. Procédé selon l'une quelconque des-revendications 14 à 17, caractérisé par le fait que, antérieurement au stade de purification sur résine échangeuse de cations, on enrichit la fraction de départ en alpha2-macroglobuline par précipitation sélective à l'aide de Rivanol. 19. Procédé selon la revendication 18, dans lequel,