Brevet FR2458539A1 — publié le 19810102

Cette invention concerne des peptides synthétiques de structure apparentée à celle de la somatostatine, et les intermédiaires utilisés dans leur synthèse. La somatostatine est le tétradécapeptide disulfuré cyclique de formule: HAla-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp Ho-Cys-Ser-Thr-Phe-Thr-Lys I Ce peptide a été identifié comme le "facteur inhibant la libération de la somatotropine", qui est sécrété par l'hypothalamus et régule la sécrétion de l'hormone de croissance pituitaire (HG) (somatotropine). [Voir Brazeau et al., Science, 179, 77 (1973), Buraus et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 70, 684 (1973), et Lina et al., Biochemical and Biophysical Res. Communications, 50, 127 (19731. La forme réduite de la somatostatine est le tétradécapeptide de formule: H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp Ho-CysSer-Thr-Phe-Thr-Lvs II La forme réduite (II) a été préparée par synthèse totale Lvoir Rivier et al., C. R. Acad. Sci. p. Sci. Natur. (Paris), 276, 2737 (1973) et Sarantakis and McKinley, Bicchem. and Biophys. Res. Communications, 54, 234 (1973)] et cette forme (II)peut être transformée en somatostatine (I) par oxydation, grâce à quoi il se forme une liaison de pontage entre les deux groupements sulfhydryles des deux restes aminoacides cystéinyles du tétradécapeptide. La somatostatine inhibe la libération de nombreuses hormones en plus de l'hormone de croissance, y compris celles provenant de l'hypophyse (prolactine), des intestins (gastri- ne, cholecystokinine et secrétine), et du pancréas (insuline et glucagon). Divers polypeptides qui peuvent être considérés comme des modifications structurelles de la somatostatine ont été préparés par voie de synthèse et sont décrits dans la littérature caimique. Ces polypeptides ont certaines caractéristiques structurelles communes avec la somatostatine et diffèrent de la somatostatine en ce que des restes amino- acides particuliers ou des groupements fonctionnels initiale- ment présents dans la molécule de somatostatine sont manquants ou sont remplacés par d'autres restes amino-acides ou groupements fonctionnels. La présente invention concerne de nouveaux polypeptides synthétiques actifs sur le plan biologique, qui peuvent être considérés comme des modifications structurelles de la somatostatine. Les poly- peptides de la présente invention diffèrent de la somato- statine par les points suivants: (a) Le segment H-Ala -Gly est présent ou est remplacé par H-Ala-D-Ala, H-D-Ala-Gly, H-D-Val-Gly, H-Ala-D-Val, HAla-D-Ser, ou H-D-Ser-Gly; (b) Le reste Asn est remplacé par Ala ou D-Ala; (c) Le reste Trp est remplacé par D-Trp; (d) Le reste Phe1 est présent ou est remplacé par D-Phe ou Cha; et (e) Le reste Cys est remplacé par D-Cys. Tous les amino-acides et restes amino-acides optiquement actifs des polypeptides décrits ici ont la configuration naturelle ou-L, à moins d'indication contraire. Les symboles identifiant les amino-acides et les restes amino-acides dans les polypeptides décrits ipi sont ceux adoptés par le IUPAC-IVB Ccrmittee on Biochemical Nc-menclature Recommendation (1971), et sont décrits dans Archives of Biochemistry and Biophysics, 150, 1-8 (1972). Les abréviations suivantes dont la plupart sont bien connues et couramment utilisées dans le domaine, sont utilisées ici: Ala - Alanine Asn Asparagine Cha - Cyclohexylalanine Cys - Cystéine Gly - Glycine Lys Lysine Phe - Phénylalanine Ser - Sérine Thr - Thréonine Trp - Tryptophane DCC - N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide BOC - t-butyloxycarbonyle PMB p-méthoxybenzyle CPOC - Cyclopentyloxycarbonyle Bzy - Benzyle BpOC 2-(p-biphénylyl)isopropyloxycarbonyle Cette invention concerne de nouveaux tétradécapeptides de formule: X-Cys-Lys-Y-Phe-Phe-D-Trp HO-D-CysSer-Thr-Z-Thr-Lys III dans laquelle: X est H-Ala-Gly, H-Ala-D-Ala, H-DAla-Gly, H-D-Val-C-ly, H-Ala-D-Val, H-Ala-D-Ser ou H-D-Ser-Gly; Y est Ala ou D-Ala; et Z est Phe, D-Phe ou Cha; ou leurs sels d'addition d'acide pharmaceutiquement accepta- bles non toxiques. On prépare les composés de Formule III en faisant réagir un composé linéaire correspondant de formule: X-Cys-Lys-Y-Phe-Phe-D-Trp-Lys HO-D-CysSer-Thr-Z-Thr IV o les symboles sont tels que définis précédemment, avec un agent oxydant. Les peptides de Formule III sont bioloaiauement actifs et inhibent la sécrétion de l'hormone de croissance, comme le montrent in vivo chez des rats des modes opératoires d'essai pharmacologiques classiques. Ainsi, les peptides sent particulièrement utiles dans le traitement de l'acremégalie et d'autres états pathologiques (par exemple, le diabète) caractérisés par une sécrétion anormalement élevée de l'hormone de croissance. Comme on le démontre chez les chiens, certains composés, en outre, inhibent sélectivement la sécrétion-de l'hormone de croissance, c'est-à-dire qu'ils inhibent la sécrétion de l'hormone de croissance à une dose qui est nettement inférieure à la dose nécessaire pour inhiber la sécrétion de l'insuline ou du glucagon. Les réalisations préférées des peptides définis par la Formule III comprennent les composés dans lesquels X est H-D-Ala-Gly ou H-D-Ser-Gly. Les réalisations particulièrement préférées comprennent les composés dans lesquels: (i) X est H-D-Ala-Gly, Y est D-Ala et Z est Phe D-la 5 8 -Cs14_ (c'est-à-dire la D-Ala, D-Ala, D-Trp8 D-Cys14 somatostatine); (ii) X est H-D-Ala-Gly; Y est D-Ala, et Z est Cha D-l1 5 8 il (c'est-à-dire la D-Ala, D-Ala5, D-Trp8, Cha1, D-Cys -somatostatine); (iii) X est H-D-Ser-Gly; Y est Ala, et Z est Phe 1 5 8 -Cs14- (d'est-à-dire la D-Ser, Ala, D-Trp, D-Cys - somatostatine); (iv) X est H-D-Ser-Gly; Y est Ala, et Z est D-Phe 1i 5 8 hil (c'est-à-dire la D-SerAla, D-Trp, D-Phe D-Cys -somatostatine); (v) X est H-D-Ser-Gly; Y est Ala; et Z est Cha (c'est-à-dire la D-Ser, Ala, DTrp, Chai D-Cys 14-somatostatine). Les composés (i), (ii) et (iv), quand on les teste chez un chien stimulé par de laL-alanine, n'inhibent pas la sécrétion de l'insuline ou du glucagon. L'invention envisage également la forme linéaire de Formule (IV) du têtradécapeptide de Formule (III): IV X-Cys-Lys-Y-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-ZThr-Ser-D-Cys-OH ou ses sels d'additions d'acide non toxiques; o X, Y et Z ont des significations indiquées précédemment en ce qui concerne la Formule III. Les peptides linéaires définis par la Formule IV sont des précurseurs dans la préparation des peptides de Formule III. Dans la forme cyclique III, les aeux 3 14' restes cystéine (Cys et D-Cys4) sont liés par une liaison disulfure formée entre les fonctions sulfhydryle de la chaîne latérale pour former la cystine. Dans la forme linéaire, les deux restes cystéines ne sont pas liés et les fonctions sulfhydryle des chaînes latérales sont libres. L'invention envisage également les peptides protégés de Formule V: X1Cys(R 1)-Lys(R2)-Y l-Phe-Phe-D-Trp(R)-Lys(R2) 1 4 4 il1 W-D-Cys(R)-Ser(R4) -Thr(R4)-Z -Thr(R) V dans laquelle: X1 est R-Ala-Gly, R-Ala-D-Ala, R-DAla-Gly, R-D-Val-Gly, R-Ala-D-Val, R-Ala-D-Ser(R), ou R-D-Ser(R)-Gly, o R est H ou un groupement protecteur du groupement a-amino; y1 est Ala ou D-Ala; Z est Phe, D-Phe ou Cha; R est un groupement protecteur du groupement sulfhydryle; R est un groupement protecteur du groupement camino; R3 est un atome d'hydrogène ou un groupement formyle; R est un groupement protecteur du groupement hydroxyle et W est -OH, -OCH3 ou -OCH2(résine de polystyrène); et, quand R est H, leurs sels d'addition d'acide pharmaceuti- quement acceptables non toxiques. Les peptides de Formule V sont des intermédiaires dans la synthèse des peptides de Formule III et IV. Dans la synthèse des peptides de Formule III, la chaîne peptidique est construite par étape par copulation séquentiel- le des différents amino-acides en commençant par l'extrémité terminale C de la chaîne. Pendant chaque copulation, les amino-acides doivent être protégés au niveau du groupement a-amino et, si nécessaire, au niveau des groupements fonctionnels réactifs de la chaîne latérale pour empêcher la formation de produits secondaires indésirables. Dans les peptides de Formule V, les groupements protecteurs représentés par R, R, R et R sont utilisés pour bloquer les groupements a-amino ou les groupements réactifs des chaînes latérales dans les différents amino-acides, pendant leur incorporation dans la chaîne peptidique. Les groupements protecteurs représentés par R, R, R et R peuvent donc être un quelconque groupement connu dans le domaine, comme utilisable pour la synthèse par étapes des polypeptides. De tels groupements sont bien connus et le choix d'un groupement protecteur particulier, ainsi que son utilisation, seront facilement évidents pour l'homme de l'art. Des exemples représentatifs de groupements protecteurs R, R1, R et R scnt indiqués ci-dessous: A. Les groupements protecteurs du groupement a-amino envisages pour R sont bien connus de l'homme de l'art. Un grand nombre sont détaillés dans le traité Protective Groups in Organic Chemistry, J.F.W. McOmie, Ed., Plenum Press, N.Y. 1973, chapitre 2, rédigé par J.W. Barton. Pour un groupement a-amino présent dans le reste amino-acide à N-terminal, R peut être: (a) des groupements de type acyle, comme formyle, trifluoroacétyle, phtalyle, p-toluènesulfonyle (tosyle), benzènesulfonyle et nitrophénylsulfényle; (b) des groupements de type uréthane aromatique, comme benzyloxycarbonyle et benzylcxycarbonyle substitué, par exemple: pchlorObenzyloxycarbonyle, p-bromobenzyloxycarbonyle, p-nitrobenzyloxycarbonyle, p-méthoxybenzyloxy- carbonyle, o-chlorobenzyloxycarbonyle, 2,4-dichloro- benzyloxycarbonyle et 2,6-dichlorobenzyloxycarbonyle; (c) des groupements de type uréthane aliphatique comme les groupements t-butyloxycarbonyle, t-amyloxy- carbonyle, isopropyloxycarbonyle, 2-(2-biphénylyl)- isopropyloxycarbonyle et allyloxycarbonyle; (d) des groupements de type uréthane cycloalkylique comme le groupement cyclopentyloxycarbonyle, cyclo- hexyloxycarbonyle, cycloheptyloxycarbonyle et adamantyloxycarbonyle; (e) des groupements de type thiouréthane, comme phénylthiocarbonyle; (f) des groupements de type alkyle comme triphényl- méthyle; ou (g) des groupements trialkylsilane, comme triméthylsilane. Le groupement protecteur préféré défini par R pour le groupement a-amino est un groupement t-butyloxycarbonyle (BOC). B. Pour le groupement sulfhydryle présent dans la cystéine, R peut être un groupement benzyle ou benzyle substitué (par exemple, 3,4diméthylbenzyle, p-méthoxybenzyle, p-méthylbenzyle, p-chlorobenzyle, Enitrobenzyle), trityle, benzyloxycarbonyle, benzhydryle, p-méthoxybenzyloxycarbonyle, benzyl- thiométhyle, éthylcarbamoyle, thioéthyle, tétrahydro- pyranyle, acétamidométhyle et benzoyle. Pour d'autres groupements, se reporter par exemple à Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, "Synthese von Peptiden", Vols. 15/1 et 15/2, (1974), Stuttgart, Allemagne. Le groupement protecteur préféré défini par R pour le groupement sulfhydryle est un groupement p-méthoxybenzyle (MBzl). C. Pour le groupement protecteur du groupement c-amine présent dans la lysine, R peut être l'un des groupements mentionnés ci-avant pour la protection d'un groupement a-amino. Les groupements type comprennent, par exemple, les groupements benzy].oxycarbonyle, p-chlorobenzyloxycarbonyle, Q-bromobenzyloxycarbonyle, o-chlorobenzyloxycarbonyle 2,6-dichlorobenzyloxycarbonyle, 2,4-dichlorobenzyl- oxycarbonyle, o-bromobenzyloxycarbonyle, p-nitro- benzyloxycarbonyle, t-butyloxycarbonyle, isopropyl- oxycarbonyle, t-amyloxycarbonyle, cyclopentyloxy- carbonyle, cyclohexyloxycarbonyle, cycloheptyloxy- carbonyle, adamantyloxycarbonyle et p-toluène- sulfonyle. Le groupement protecteur préféré défini par R2 pour un groupement E-amino est un groupement o-chlorobenzyloxycarbonyle (C1Bzl). D. Pour le groupement hydroxy de la sérine ou de la thréonine, R peut être un groupement alkyle en C1-C4 (par exemple, méthyle, éthyle, t- butyle), benzyle, benzyle substitué (par exemple, p-méthoxy- benzyle, p-nitrobenzyle, p-chlorcbenzyle, o-chlorcbenzyle), alcanoyle en C1-C3 ( par exemple, formyle, acétyle, propionyle), triphénylméthyle ou benzoyle. Le groupement protecteur préféré défini par R pour le groupement hydroxy est un groupement benzyle (Bzl). Le groupement R3 représente un atome d'hydrogène ou un groupement formyle substitué sur l'azote du noyau indole du tryptophane. L'utilisation du groupement formyle comme groupement protecteur est facultative. R est de préférence un atome d'hydrogène. Dans la Formule V, quand W représente "-O-CH2- [résine de polystyrène]" la chaînepeptidique est fixée à la résine de polystyrène par l'intermédiaire d'une liaison ester (-D-Cys-O-CH2-) formée entre le arcupement carboxyle de la partie D-cystéine à C-terminal, et l'un des groupements méthylène présents sur la matrice de résine comme sites pour une telle fixation. La résine de polystyrène est un polymère de styrène qui est réticulé par addition d'environ 0,5 à environ 3 % de divinylbenzène et qui est chlorométhylé ou hydroxyméthylé pour fournir des sites pour la formation de l'ester. Un exemple d'une résine hydroxyméthylée est décrite par Bodanszky et al., Chem. Ind. (London) 38, 1597-98 (1966). Une résine de polystyrène chlorométhylée est disponible dans le commerce chez Lab System, Inc., San Mateo, Californie, USA. La résine est également décrite par Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman and Co., San Francisco, Californie, pp. 1-6. Les tétradécapeptides de formule III peuvent être préparés par des procédes classiques (en solution) ou par le procédé en phase solide, en utilisant des techniques connues de façon générale dans le domaine, pour former des liaisons peptidiques. Le peptide peut être assemblé en copulant chaque aminc-acide séparément, ou en copulant des segments peptidiques préformés appropriés, dans l'ordre désiré. Le procédé préféré de préparation des peptides de formule III et des intermédiaires de formule IV et V est la technique en phase solide dans laquelle la séquence d'amino- acides est construite séquentiellement à partir d'un amino- acide à C terminal,porté par une résine insoluble,initial. Les techniques pour le procédé en phase solide sont décrites par J. Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman and Co., San Francisco, 1969. En général, dans le procédé en phase solide, l'amino- acide correspondant au reste amino-acide à C terminal du peptide désiré, est fixé sur un support de résine insoluble, et la chaîne peptidique est ensuite formée en commençant par l'amino-acide à C terminal sur support de résine, en introduisant un à un les différents amino-acides jusqu'à ce que l'on obtienne la séquence d'amino-acides désirée. Ou bien, on peut préparer de petits fragments peptidiques et les introduire sur la chaîne peptidique dans l'ordre désiré. La chaîne peptidique reste fixée à la résine pendant toute la synthèse et, lorsque la chaîne est terminée, on coupe le peptide de la résine. On copule les amino-acides en utilisant des techniques bien connues dans le domaine pour la formation d'une liaison peptidique. Un procédé consiste à transformer l'amino-acide en un dérivé qui rendra le groupement carbcxy plus réactif pour la réaction avec le groupement amino à N-terminal libre du fragment peptidique. Par exemple, l'amino-acide peut être transformé en un anhydride mixte par réaction d'un amino- acide protégé avec le chloroformiate d'éthyle, le chloro- formiate de phényle, le chloroformiate de s-butyle, le chloroformiate d'isobutyle, le chlorure de pivaloyle ou des chlorures d'acide similaires. Ou bien, l'amino-acide peut être transformé en un ester actif comme un ester 2,4,5-trichlorophénylique, un ester pentachlorophénylique, un ester p-nitrophénylique, un ester formé avec le N-hydroxy- succinimide, ou un ester formé avec le 1-hydroxybenzotriazole. Un autre procédé consiste à effectuer la réaction de copulation avec un agent de copulation approprié, comme le N,N'-dicyclohexylcarbodimide (DCC) nu le N,N'-diisoprcpyl- carbodiimide(DIC). D'autres agents de copulation appropriés seront évidents pour l'homme de l'art [Voir Schroder et Lubke, The Peptides, Academic Press, 1965, Chapitre III]. On verra que le groupement e-amino de chaque amino-acide utilisé dans la synthèse des peptides doit être protégé pendant la réaction de copulation pour éviter des réactions secondaires sur la fonction a-amino réactive. On verra également que certains amino-acides contiennent des groupements fonctionnels réactifs sur la chaîne latérale (par exemple, sulfhydryle, Eamino et hydroxy) et que de tels groupements fonctionnels doivent également être protégés pendant la copulation initiale de l'amino-acide contenant ce groupement et pendant la copulation des amino-acides suivants.. Pour choisir un groupement protecteur particulier, il faut observer les conditions suivantes: Un groupement protecteur du groupement a-amino doit: (1) être stable et rendre la fonction a-amine inerte dans les réactions utilisées dans la réaction de copulation, et (2) doit être facilement éliminable après la réaction de copulation, dans des conditions qui n'éliminent pas les groupements protecteurs des chaînes latérales ou qui ne modifient pas la structure du fragment peptidique. Un groupement protecteur pour la chaîne latérale doit: (1) être stable et rendre le groupement fonctionnel-de la chaîne latérale inerte dans les conditions utilisées dans la réaction de copulation, (2) être stable dans les conditions utilisées pour éliminer le groupement protecteur du groupement a-amino, et (3) être facilement éliminable, une fois terminée la séquence désirée d'aminc- acide, dans des conditions de réaction qui ne modifient pas la structure de la chaîne peptidique. Il sera évident pour l'homme de l'art que les groupements protecteurs connus dans le domaine comme étant utilisables pour la synthèse des peptides, ont une réactivité qui varie vis-à-vis des réactifs acides utilisés pour leur élimination. Par exemple, certains groupements protecteurs, comme les groupements triphénylméthyle et 2-(2-biphénylyl)isopropyloxy- carbonyle sont très labiles et peuvent être coupés dans des conditions acides modérées. D'autres groupements protecteurs, comme les groupements t-butyloxycarbonyle, t-amyloxycarbonyle, adamantyloxycarbonyle et pméthoxybenzylcxycarbonyle, sont moins labiles et nécessitent des acides modérément forts 1i (comme l'acide trifluoroacétique, l'acide chlorhydrique, ou le trifluorure de bore dans l'acide acétique) pour leur élimination. Encore d'autres groupements protecteurs, comme les groupements benzyloxycarbonyle, halobenzyloxycarbonyle, p-nitrobenzyloxycarbonyle, cycloalccxycarbonyle et isoprcpyl- oxycarbonyle, sont encore moins labiles et nécessitent des acides forts, comme l'acide fluorhydrique, l'acide bromhy- drique, le trifluoroacétate de bore dans l'acide trifluoro- acétique, pour leur élimination. Une fois terminée la séquence peptidique désirée, il faut couper le peptide protégé du support de résine, et tous les groupements protecteurs doivent ttre éliminés. La réaction de coupure et l'élimination des groupements protecteurs peuvent être effectuées simultanément ou par étapes. Quand le support de résine est une résine de polystyrène chlorométhylée, la liaison fixant le peptide à la résine est une liaison ester formée entre le groupement carboxy libre de la partie cystéine à C terminal, et l'un des nombreux groupements chlorométhyle présents sur la matrice de résine. On verra que la liaison de fixation peut être coupée par des réactifs qui sont connus comme pouvant briser une liaison ester et pénétrer dans la matrice de résine. Un procédé particulièrement commode est le traitement par l'acide fluorhydrique liquide. Ce réactif non seulement coupe le peptide de la résine mais élimine également tous les groupements protecteurs. Donc, l'utilisation de ce réactif fcurnira directement la forme linéaire totalement déprotégée du peptide. Quand on désire couper le peptide, sans enlever les groupements protecteurs,l'ensemble résine-peptideprotégépeut subir une méthanolyse en donnant le peptide linéaire protégé dans lequel le groupement carboxy en C-terminal est méthylé. L'ester méthylique peut ensuite être hydrolysé dans des conditions alcalines modérées pour fcrmer le groupement carboxy à C terminal libre. Les groupements protecteurs de la chaîne peptidique peuvent ensuite Ctre éliminés par traitement par un acide fort, ccrmme l'acide fluorhydrique liquide. Une technique particulièrement utilisable pour la méthanolyse est celle de G. Moore et al., Peptides, Proc. th Amer. Pept. Symp., M. Goodman and J. Meinhofer, Eds., John Wiley, N.Y., 1977, pp. 518-521, o l'ensemble peptide protégé-résine est traité par le méthanol et le cyanure de potassium en présence d'un éther couronne. Un autre procédé de coupure du peptide protégé de la résine est l'ammonolyse ou le traitement par l'hydrazine. L'amide ou l'hydrazide à C terminal résultant peut être hydrolysé en groupement carboxy à C terminal libre, et les groupements protecteurs peuvent être éliminés de façon classique. On verra également que le groupement protecteur présent sur le Groupement a-amino à N terminal peut être éliminé préférentiellement avant ou après la coupure du peptide protégé du support de résine. Lors de la coupure de la résine et de l'élimination de tous les groupements protecteurs, le produit obtenu est sous forme du tétradécapeptide linéaire de Formule IV. Le tétra- décapeptide linéaire peut être cyclisé en tétradécapeptide cyclique final de formule III à l'aide d'un agent oxydant pouvant transformer les deux groupements sulfhydryle de Cys et D-Cys4 en une liaison disulfure. L'exposition à l'air ou le traitement par le ferribyanure de potassium peuvent être utilisés pour effectuer une telle oxydation. Quand on utilise l'air, le pH du milieu doit être environ 2,5 à environ 9,0, et de préférence environ 7,0 à 7,6, et la concentration du peptide ne doit pas être supérieure à 0,4 mg/ml. On prCfëre une concentration d'environ 50 pg/ml. Pour les besoins pharmacologiques, les peptides de Formule III peuvent être administrés sous forme d'un sel d'addition d'acide, préparé par réaction avec un acide organique ou minéral approprié qui est non toxique et acceptable pour les besoins pharmaceutiques. Des acides appropriés sont bien connus dans le domaine. Des exemples de tels acides sont les acides chlorhydrique, bromhydrique, sulfurique, sulfonique, tartrique, fumarique, glycolique, succinique, malonique, citrique, maléique, acétique, phosphorique, benzoique, ascorbique, nitrique, p-toluène- sulfonique, benzènesulfonique, naphtalènesulfonique, propionique, etc... On préfère l'acide acétique. Le procédé préféré pour la synthèse en phase solide des peptides de Formule III et leurs intermédiaires est illustré par les exemples. Dans ce procédé, on fixe d'abord la D-cystéine à groupements a-aminc et sulfhydryle protégés (BOC-D-Cys(MBzl)-OH) à une résine de polystyrène chloro- méthylée selon le procédé de B. Gisin Helv. Chim. Acta., 56, 1476 (1173) o on fait réaair le sel de césium de la D-cystéine protégée avec la résine de polystyrène chloro- méthylée dans le diméthylformamide. Le aroupement protecteur tbutyloxycarbcnyle est ensuite éliminé par traitement par l'acide triflucroacétique dans un mélange chloroforme- chlorure de méthylène. Les différents aminc-acides protégés scnt ensuite copulés séquentiellement en commençant sur la D-cystéine à C terminal porté par la résine jusqu'à obtention du tétradécapeptide désiré. Pendant la synthèse, on utilise comme agent de copulation le N,N'dicyclohexylcarbodiimide et on utilise le groupement t-butyloxycarbonyle (BOC) comme groupement protecteur du groupement a-amino. Les groupements protecteurs de la chaîne latérale sont: le groupement p-méthoxybenzyle (MBzl) pour le groupement sulfhydryle de la cystéine; le groupement ochlorobenzyloxycarbonyle (Clz) pour le groupement E-amino de la lysine; et le aroupement benzyle (Bzl) pour le groupement hydroxy de la sérine et de la thréonine. On utilise l'acide trifluoroacétique dans le chlorure de méthylène pour éliminer préférentiellement le groupement protecteur tbutyloxycarbonyle. Apres chaque déprotection, on neutralise par la triéthylamine le peptide protégé sur la chaîne latérale. Une fois terminée la séquence désirée d'amine-acides, en déprctège le tétradécapeptide résultant et on l'enlève du support de résine de polystyrène par traitement par l'acide fluorhydrique liquide en présence d'anisole et d'éthyl- mercaptan. Le tétradécapeptide linéaire résultant de formule (IV) est facilement transformé en tétradécapeptide cyclique (III), par exposition d'une solution du tétradécapeptide linéaire (IV) à l'oxygène atmosphérique. Le tétradécapeptide cyclique est purifié par chromatographie. Pour l'utilisation pharmacologique, les tétradéca- peptides de Formule III peuvent être administrés seuls ou en combinaison avec des supports ou excipients pharmaceutiquement acceptables. Les supports pharmaceutiques appropriés seront évidents pour l'homme de l'art. L'administration peut se faire par voie orale ou parentérale, selon des procédés classiques dans le domaine. Le procédé de fabrication et l'utilisation des peptides de l'invention sont illustrés dans les exemples suivants. Dans les exemples suivants, on utilise les symboles suivants: t-BuOH = alcool t-butylique t-AmOH = alcool t-amylique DMF = diméthylformamide SUBSTANCES DE DEPART Exemple A Ester de résine hydroxyméthyl-polystyrène de la N-t-butyloxy- carbonyl-D-(S-p-méthoxybenzyl)cystéine On estérifie la résine de polystyrène chlorométhylée par le procédé de F. Gisin., Helv. Chim. Acta., 56, 1976 (1973) On agite une solution du sel de césium de t-butyloxy- carbonyl-D-(S-p-méthoxybenzyl)cystéine (24,95 mmoles) dans 500 ml de DMF, avec 50 g (0,75 mmole de Cl/g) de résine polystyrène chlorométhylée (Lab. Systems, Inc.) à la température ambiante pendant 4 jours. On sépare la résine par filtration et on la lave avec un mélange de 85 % de DMF et 15 % d'eau, puis avec du DMF seul. On répète cette séquence de lavage deux fois supplémentaires. Après deux lavages supplémentaires avec DMF, on met la résine en suspension dans 500 ml de DMF et on agite la suspension avec 8 g (41,7 mrmoles) d'acétate de césium à la température ambiante pendant 3 jours. On sépare la résine par filtration et on la lave avec un mélange de 85 % de DMF et 15 % d'eau, puis avec du DMF seul. On répète cette séquence deux fois supplémentaires. On lave enfin la résine avec du chloroforme et on la met en suspension dans du chloroforme contenu dans une ampoule à décanter. On enlève les fines en soutirant le liquide. On répète cette séparationtrois fois supplémentaires. On recueille la résine par filtration et on la lave successivement avec de l'éthanol à 95 %, du benzène et de l'éthanol à 95 %. On répète les deux derniers lavages deux fois supplémentaires. On sèche la résine pendant une nuit sous vide à 40 C et l'en obtient 58,1 g du produit cité en titre. On titre une portion de la résine pour déterminer la teneur en cystéine après hydrolyse, en utilisant un mélange 1:1 d'acide chlorhydrique concentré et de dioxanne, en présence d'une petite quantité de diméthylsulfoxyde. On trouve: 0,237 mmole de cystéine par gramme de résine. Exemple B Ester de résine hydroxyméthyl-polystyrène de la N-t-butyloxy- carbonyl-D-alanyl-glycyl-L-(S-p-méthoxybenzyl)cystéinyl-L-(N - o-chlorobenzyloxycarbonyl)lysyl-D-alanyl-L-phénylalanyl-L- phénylalanyl-D-tryptophyl-L-(NE-o-chlorobenzyloxycarbonyl)- lysyl-L-(O-benzyl)thréonyl-L-phénylalanyl-L-(O-benzyl)thréonyl- L-(O-benzyl)séryl-D-(S--méthoxybenzyl)cystéine On place 7,0 g de l'ester de résine hydrcxyméthyl- polystyrène de la N-t-butyloxycarbonyl-D-(S-p-méthoxybenzyl)- cystéine, tel que préparé dans l'Exemple A, dans la chambre de réaction d'un appareil de synthèse de peptide Backman 990, et on traite selon le programme A (indiqué ci-dessous), la N-t-butyloxycarbonyl-L-(O-benzyl) sérine étant utilisée comme amino-acide ajoutée dans l'Etape 11 de ce programme. Après le lavage final par le chlorure de méthylène (Etape 18), on lave le produit trois fois avec du DMF et on le recopule en suivant l'Etape 1l du programme A. On lave ensuite le produit trois fois avec du DMF et on le retraite en suivant les Etapes 12-18 du programme A. D'une manière similaire, on incorpore les amino-acides protégés suivants, séquentiellement dans la résine peptidique N-t-butyloxycarbonyl-L-(Obenzyl)thréonine N-t-butyloxycarbonyl-L-phénylalanine N-tbutyloxycarbonyl-L-(O-benzyl)thréonine N-t-butyloxycarbonyl-L-(N -o-chlorobenzyloxycarbonyl)- lysine N-t-butyloxycarbonyl-D-tryptophane N-t-butyloxycarbonyl-Lphénylalanine N-t-butyloxycarbonyl-L-phénylalanine N-t-butyloxycarbonyl-Dalanine N-t-butyloxycarbonyl-L-(NC-o-chlorobenzyloxycarbonyl)- lysine N-t-butyloxycarbonyl-L-(S-E-méthoxybenzyl)cystéine N-tbutyloxycarbonyl-glycine N-t-butyloxycarbonyl-D-alanine * On ne répète pas les Etapes 10-18 du programme A pendant l'incorporation de BOC-Ala. Après incorporation du reste amino-acide à N terminal, (D-alanine), on sèche l'ensemble peptide-résine sous vide. L'analyse des amino-acides (obtenus en chauffant à reflux une portion du peptide pendant 72 heures dans un mélange 1:1 d'acide chlorhydrique concentré de dioxanne) donne les résultats suivants, la lysine étant utilisée comme référence 2 Thr, 2,24; Ser, 1,01; Gly, 1,01; 2 Ala, 2,10; 3 Phe, 2,97; 2 Lys, 2,00. PROGRAMME A [Protocole d'enlèvement du groupement protecteur tbutyloxycarbonyle d'un groupement a-amino et copulation de l'amino-acide à l'ensemble peptide-résine] 1. Laver avec CHC13, trois fois. 2. Pour enlever le groupement protecteur t-butyloxy- carbonyle du groupement "-amino, traiter par un mélange d'acide trifluoroacétique (28,8 %), de CH2Cl2 (17,5 %), de CHC13 (47,9 %) et de triéthylsilane (5,8 %), pendant vingt minutes. Répéter une fois. 3. Laver avec CHC13, deux fois. 4. Laver avec CH2C12, une fois. 5. Laver avec un mélange de 90 % de t-BuOH et de 10 % de t-AmOH, trois fois. 6. Laver avec CH2C12, trois fois. 7. Pour neutraliser, traiter avec 3 % de triéthyl- amine dans CH2C12, trois fois. 2 2' 8. Laver avec CH2C12, trois fois. 9. Laver avec un mélanae à 90 % de t-BuOH et 10 % de t-AmOH, trois fois. 10. Laver avec CH2C12, trois fois. 11. Pour copuler l'amino-acide, traiter avec l'amino- acide protégé (1,0 mmole/g de résine) et le N,N'-dicyclo- hexylcarbodiimide (1,0 mmole/g de résine) dans CH2C12. Laisser une durée de réaction de 2 heures. 12. Laver avec CH2C12, trois fois. 13. Laver avec un mélange à 90 % de t-buOH et de 10 % de t-AmOH. 14. Laver avec CH2C12, trois fois. 15. Pour neutraliser, traiter par 3 % de triéthylamine dans CH2C12, trois fois. 16. Laver avec CH2C12,trois fois. 17. Laver avec un mélange à 90 % de t-BuOH et à 10 % de t-AmOH, trois fois. 18. Laver avec CH2C12, trois fois. Le volumede solvant utilisé pour chaque étape est 8 ml par g de résine. A moins d'indication contraire, la durée de contact pour chaque étape est trois minutes. Exemple C Ester de résine hydroxyméthyl-polystyrène de la N-t-butyloxy- carbonyl-D-alanyl-glycyl-L-(S-p-méthoxybenzyl)cystéinyl-L- (N -o-chlorobenzyloxycarbonyl)lysyl-D-alanyl-L-phénylalanyl- L-phénylalanyl-D-tryptophyl-L-(NC-o-chlorobenzyloxycarbonyl)- lysyl-L-(O-benzyl)thréonyl-L-cyclohexylalanyl-L-(O-benzyl)- thrécnyl-L-(O-benzyl)séryl-D-(S-p-méthoxybenzyl)cystéine On place 7,0 g d'ester de résine hydroxyméthyl- polystyrène de la N-t-butyloxycarbonyl-D-(S-p-méthoxybenzyl)- cystéine, tel que préparé dans l'Exemple A, dans la chambre de réaction d'un appareil de synthèse de peptidesBeckman 990, et on traite selon le programme A (décrit dans l'Exemple B), la N-t-butyloxycarbonyl-L-(Obenzyl)sérine étant utilisée comme amino-acide ajouté dans l'Etape 11 de ce programme. * Après le lavage final au chlorure de méthylène (Etape 18), on lave le produit trois fois avec le DMF et on le recopule en suivant l'Etape 11 du Drogramme A. On lave ensuite le produit trois fois avec du DMF et on le retraite en suivant les Etapes 12-18 du Programme A. D'une manière similaire, on incorpore successivement les amino-acides protégés suivants dans l'ensemble peptide- résine: N-t-butyloxycarbonyl-L-(O-benzyl)thrécnine N-t-butyloxycarbonyl-Lcyclohexylalanine o0 N-t-butyloxycarbonyl-L-(O-benzyl)thréonine N-t-butyloxycarbonyl-L-(NE-o-chlorobenzyloxycarbonyl)- lysine N-t-butyloxycarbonyl-D-tryptophane N-t-butyloxycarbonyl-Lphénylalanine [5 N-t-butyloxycarbonyl-L-phénylalanine N-tbutyloxycarbonyl-D-alanine N-t-butyloxycarbonyl-L-(NE-o-chlorobenzyloxycarbonyl)- lysine N-t-butyloxycarbonyl-L-(S-p-méthoxybenzyl)cystéine N-tbutyloxycarbonyl-glycine N-t-butyloxycarbonyl-D-alanine ! Apres introduction de BOC-Phe en position 6, on divise l'ensemble peptide-résine.en deux parties égales et on intro- duit BOC-D-Ala et les restes amino-acides restants en n'utilisant qu'une portion. * On ne répète pas les Etapes 10-18 du Programme A pendant l'incorporation de BOC-Ala. Apres incorporation du reste amino-acide à N terminal (D-alanine), on sèche sous vide l'ensemble peptide-résine. L'analyse des amino-acides (obtenus en chauffant à reflux d'une porticn du peptide pendant 72 heures dans un mélange 1:1 d'acide chlorhydrique concentré et de dioxanne) donne les résultats suivants, la lysine étant utilisée comme référence: 2 Thr, 2,26; Ser, 1,03; Gly, 1,04; 2 Ala, 2,18; 2 Phe, 2,14; 2 Lys, 2,00; Cha, 1,14. Exemple D Ester de résine hydroxyméthyl-polystyrène de la N-t-butyloxy- carbonyl-D-séryl-glycyl-L-(S-p-méthoxybenzyl)cystéinyl-L-(N - o-chlorobenzylcxycarbonyl)lysyl-L-alanyl-L-phénylalanyl-L- phénylalanyl-D-tryptophyl-L-(NE-o-chlorobenzyloxycarbonyl)- lysyl-L-(O-benzyl)thréonyl-L-phénylalanyl-L-(O-phényl)- thréonyl-L-(O-benzyl)séryl-D-(S-p-méthoxybenzyl)cystéine On place 5,5 g de l'ester de résine hydroxyméthyl- polystyrène de la N-t-butyloxycarbonyl-D-(S-p-méthoxybenzyl)- cystéine, préparé dans l'Exemple A, dans la chambre de réaction d'un appareil de synthèse de peptide Beckman 990, et on le traite selon le Programme A (décrit dans l'Exemple B)., la N-t-butyloxycarbonyl-L-(Obenzyl)sérine étant utilisée comme amino-acide ajoutée dans l'Etape 11 de ce programme. Après le lavage final au chlorure de méthylène (Etape 18), on lave le produit trois fois avec du DMF et on le recopule en - suivant l'Etape 11 du Programme A. On lave ensuite le produit trois fois avec du DMF et on le retraite en suivant lesEtapes 12-18 du Programme A. D'une manière similaire, on incorpore les amino-acides protégés suivants, séquentiellement dans l'ensemble peptide- résine: N-t-butyloxycarbonyl-L-(O-benzyl)thréonine N-t-butyloxycarbonyl-Lphénylalanine N-t-butyloxycarbonyl-L-(O-benzyl)thréonine N-t-butyloxycarbonyl-L-(N -o-chlorobenzyloxycarbonyl)- lysine N-t-butyloxycarbonyl-D-tryptophane N-t-butyloxycarbonyl-Lphénylalanine N-t-butyloxycarbonyl-L-phénylalanine N-t-butyloxycarbonyl-Lalanine N-t-butyloxycarbonyl-L-(N -o-chlorcbenzyloxycarbonyl)- lysine N-t-butyloxycarbonyl-L-(S-p-méthoxybenzyl)cystéine N-tbutyloxycarbonyl-glycine N-t-butyloxycarbonyl-D-sérine * On ne répète pas les Etapes 10-18 du Programme A pendant l'incorporation de BOC-Ala. Apres incorporation du reste amino-acide à N terminal (D-valine), on sèche sous vide l'ensemble peptide-résine. Une analyse des amino-acides (obtenus en chauffant à reflux une portion du peptide pendant 72 heures dans un mélange 1:1 d'acide chlorhydrique concentré et de dioxanne) donne les résultats suivants, la lysine étant utilisée comme référence: 2 Thr, 1,80; 2 Ser, 1,52; Gly, 1,02; Ala, 1,07; 3 Phe, 2,88; 2 Lys, 2,00. Exemple E Ester de résine hydroxyméthyl-polystyrène de la N-t-butyloxy- carbonyl-D-séryl-glycyl-L-(S-2-méthoxybenzyl)cystéinyl-L-(Ne-. o-chlorobenzyloxycarbonyl)lysyl-L-alanyl-L-phénylalanyl-L- phénylalanyl-D-tryptophyl-L-(N -o-chlorobenzyloxycarbonyl)- lysyl-L-(O-benzyl)thréonyl-D-phénylalanyl-L-(O-benzyl)- thréonyl-L-(O-benzyl)séryl-D-(S-p-méthoxybenzyl)cystéine On place 3,5 g de l'ester de résine hydroxyméthyl- polystyrène de la N-t-butyloxycarbonyl-D-(S-R-méthoxybenzyl)- cystéine, préparé dans l'Exemple A, dans la chambre de réaction d'un appareil de synthèse de peptide Beckman 990, et on traite selon le Programme A (Voir Exemple B), la N-t-butyloxycarbonyl-L-(O-benzyl)sérine étant utilisée comme amino-acide ajouté dans l'Etape 11 de ce programme. Apres le lavage final au chlorure de méthylène (Etape 18), on lave le produit trois fois avecduDITFet on le recopule en suivant l'Etape 11 du Programme A. On lave ensuite le produit trois fois avec du DMF et on le retraite en suivant les Etapes 12-18 du Programme A. D'une manière similaire, on incorpore séquentiellement les amino-acides protégés suivants dans l'ensemble peptide- résine: N-t-butyloxycarbonyl-L-(O-benzyl)thréonine N-t-butyloxycarbonyl-Dphénylalanine N-t-butyloxycarbonyl-L-(O-benzyl)thrécnine N-t-butylcxycarbonyl-L-(NE-o-chlorobenzyloxycarbonyl)- lysine N-t-butyloxycarbonyl-D-tryptophane N-t-butyloxycarbonyl-Lphénylalanine N-t-butyloxycarbonyl-L-plhénylalanine N-t-butyloxycarbonylL-alanine* N-t-butyloxycarbonyl-L-(NC-o-chlorobenzyloxycarbonyl)- lysine N-t-butyloxycarbonyl-L-(S-2r-minéthoxybenzyl)cystéine N-tbutyloxycarbonyl-glycine N-t-butylcxycarbonyl-D-sérine * On ne répète pas les Etapes 10-18 du Programme A pendant l'incorporation de BOC-Ala. Apres incorporation du reste amino-acide à N terminal (D-valine), on sèche sous vide l'ensemble peptide-résine. L'analyse des amino-acides (obtenus en chauffant à reflux une portion du peptide pendant 72 heures dans un mélange 1:1 d'acide chlorhydrique concentré et de dioxanne) donne les résultats suivants, la lysine étant utilisée comme référence: 2 Thr, 2,00; 2 Ser, 1,72; Gly, 1,25; Ala, 1,09; 3 Phe, 2,97; 2 Lys, 2,00. Exemple F Ester de résine hydroxyméthyl-polystyrène de la N-t-butyloxy- carbonyl-D-séryl-glycyl-L-(S-p-méthoxybenzyl)cystéinyl-L-(N - o-chlorobenzyloxycarbonyl)lysyl-L-alanyl-L-phénylalanyl-L- phénylalanyl-D-tryptophyl-L-(N.-o-chlorobenzyloxycarbonyl)- lysyl-L-(O-benzyl)thréonyl-L-cyclohexylalanyl-L-(O-benzyl)- thréonyl-L-(O-benzyl)séryl-D-(S-p-méthoxybenzyl)cystéine On place 7,0 g de l'ester de résine hydroxyméthyl- polystyrène de la N-t-butyloxycarbonyl-D-(S-p-méthoxybenzyl)- cystéine, préparé dans l'Exemple A, dans la chambre de réaction d'un appareil de synthèse de peptide Beckman 990, et on traite selon le Programme A (décrit dans l'Exemple B), la N-t-butyloxycarbonyl-L-(Obenzyl)sérine étant utilisée comme amino-acide ajouté dans l'Etape 11 de ce programme. Après le lavage final au chlorure de méthylène (Etape 18), on lave le produit trois fois avec du DF et on le recopule en suivant l'Etape 11 du Programme A. Puis, on lave le produit trois fois avec du DMF et on le retraite en suivant les étapes 12-18 du Programme A. D'une manière similaire, on incorpore les amino-acides protégés suivants, séquentiellement dans l'ensemble peptide- résine: N-t-butyloxycarbonyl-L-(O-benzyl)thréonine N-t-butyloxycarbonyl-Lcyclohexylalanine N-t-butyloxycarbonyl-L-(O-benzyl)thréonine N-t-butylcxycarbonyl-L-(N -o-chlorobenzyloxycarbonyl)- lysine N-t-butylcxycarbonyl-D-tryptcphane N-t-butyloxycarbonyl-Lphénylalanine N-t-butyloxycarbonyl-L-phénylalanine N-t-butyloxycarbonyl-Lalanine N-t-butylcxycarbonyl-L-(Ne-o-chlorobenzyloxycarbonyl)- lysine N-t-butyloxycarbonyl-L-(S-2-méthoxybenzyl)cystéine N-tbutyloxycarbonyl-glycine M-t-butylcxycarbonyl-D-sérine Apres introduction de BOC-Phe en position 6, on divise l'ensemble peptide-résine en deux portions égales, et on introduit BOC-D-Ala et les autres restes amincacides en n'utilisant qu'une seule portion. ** On ne répète pas les Etapes 10-18 du Programme A pendant l'incorporation de BOC-Ala. Apres incorporation du reste amino-acide à N terminal, (D-sérine), on sèche sous vide l'ensemble peptide-résine. L'analyse des amino-acides (obtenus en chauffant à reflux une portion du peptide pendant 72 heures dans un mélange 1:1 d'acide chlorhydrique concentré et de dioxanne) donne les résultats suivants, la lysine étant utilisée comme référence: 2 Thr, 2,32; 2 Ser, 2,48; Gly, 1,45; Ala, 1,26; 2 Phe, 2,06; 2 Lys, 2,00; Cha, 1,23. PRODUITS FINALS Exemple 1 D-alanyl-glycyl-L-cystéinyl-L-lysyl-D-alanyl-L-phénylalanyl- L-phénylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-thréconyl-L-phénylalanyl- L-thréonyl-L-séryl-D-cystéine. On mélange 5,58 g de l'ensemble peptide protégé-résine préparé dans l'exemple B (à un taux de substitution de 0,78 mmole/g de résine) avec 10,2 ml d'anisole et 10,2 ml d'éthyl- mercaptan. On refroidit le mélange avec de l'azote liquide et on ajoute par distillation 145 ml d'acide flucrhydrique liquide. Puis, on porte le mélange à 0 C et cn l'agite pendant deux heures. L'élimination de l'acide fluorhydrique par distillation donne un résidu auquel on ajoute de l'éther à 0 C. On recueille le solide, on le lave avec de l'éther et on le sèche. On sépare le peptide de la résine en extrayant le solide avec de l'acide acétique 0,2 M et de l'acide acétique à 50 %. On filtre l'extrait sur un papier filtre en fibre de verre pour éliminer les matières insolubles en suspension. On chromatographie le filtrat sur une colonne Sephadex G-25 Fine dans les conditions suivantes: solvant: acide acétique 0,2 M dégazé; dimensions de la colonne: 7,5 x 225 cm; température: 26 C; débit: 1317 ml/heure; vclume des fractions: 22,0 ml. On recueille un échantillon de 6637 ml dans des grands flacons et on le rejette avant de recueillir des fractions individuelles. Un diagramme de l'absorbance à 280 mp de chaque fraction en fonction du numéro de la fraction présente un larae pic avec un épaulement du côté avant. L'analyse spectrographique UV indique que les fractions représentées par le pic large contiennent le produit désiré. On réunit donc les fractions 52-85 (7754-8502 ml, pic à 8229 ml). L'analysespectrographique UV- d'un échantillon des fractions réunies indique que l'on à obtenu 514 mg de produit. Teneur en groupements sulfhydryle libres: 98,0 % de la valeur théorique (par titrage d'Ellman). Exemple 2 Disulfure cyclique (3 -> 14) de la D-alanyl-aglycyl-L-cystényl- L-alanyl-L-phénylalanyl-L-phénylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl- L-thréonyl-L-phénylalanyl-L-thréonyl-L-séryl-D-cystéine. On oxyde à l'air le peptide linéaire préparé dans l'Exemple 1 pour obtenir le peptide cyclique correspondant, selon le mode opératoire suivant: On dilue les fractions réunies obtenues dans l'Exemple 1 (748 ml, contenant théoriquement 514 mg de peptide) avec 9532 ml d'eau distillée pour obtenir une soluticn finale ayant une concentration de 50 pg/ml. On ajcute suffisamment d'hydroxyde d'ammoniumconcentré pour amener le pH à 6,7. Puis, on agite la solution à la température ambiante à l'obscurité pendant 19 heures, moment auquel un titrage d'Ellman d'une partie aliqude indique une oxydation complète. On concentre la solution sous vide jusqu'à un volume d'environ 110 ml. On ajoute 110 ml d'acide acétiqueéglacial et on dessale la solution par chromatographie sur une colonne Sephadex G-25 Fine en utilisant les conditions suivantes: solvant: acide acétique à 50 % dégazé; dimensions de la colonne: 7,5 x 210 cm; température: 26 C; débit: 1038 ml/heure; volume des fractions: 22,5 ml. Un diagramme de l'absorbanceà 280 mp de chaque fraction en fonction du numéro de la fraction présente deux pics importants. Le premier représente les formes agglomérées du peptide tandis que le second représente le matériau mono- mère. On réunit les fractions 64-103 (4320-5220 ml) et on les lyophilise à siccité à l'obscurité. On dissout les solides dans 36 ml d'eau et on tamponne la solution par addition de 2 ml d'un mélange acide fcrmiqueformiated'ammcnium 1M, pH 4,25. On dépose la solution sur une colonne de verre de cm de longueur garnie avec 1540 ml de gel de silice en phase inverse (environ 20 microns, C18, 16,3 % de C), pré- équilibrée avec 28 % d'acétonitrile dans un tampon acide formiqueformiate d'ammonium 0,5 M, pH 4,25. On élue la colonne avec le même solvant et on réunit les fractions éluant entre 2740 ml et 3230 ml. L'échantillon réuni contient 193,5 mg de peptide, comme le montre le spectre UV. Cet échantillon présente un rapport de l'absorbance à 281 nm et de l'absorbance à 249 nm de 2,01. On dilue l'échantillon réuni dix fois avec de l'eau distillée et on le pompe sur une colonne (2,5 x 26 cm) garnie de résine Amberlite XAD-2 (Rohm and Haas Co.). Puis, on lave la colonne avec 250 ml d'eau et on élue enfin l'échantillon de la résine avec 50 % d'acétonitrile et 1 % d'acide acétique dans de l'eau distillée. On recueille un total de 103 ml en se basant sur le contrôle du spectre UV du courant d'éluant. Il contient environ 197 mg de peptide, avec un rapport (281/249 nm) de 2, 02. On lyophilise la solution et l'on recueille le solide résultant. Poids global: 204,5 mg dont 176,5 mg est du peptide en se basant sur l'analyse spectrale UV. Analyse des amino-acides: Gly, 1,01; Cys, 2,35; Lys, 2,0; Ala, 2,08; Phe, 2,97; Thr, 2,00; Ser, 0,89. Les résultats précédents sont exprimés en rapports vis-à-vis de Lys/2. Toutes les valeurs sont la moyenne de 2 hydrolyses, sans addition d'agents de fixation. La valeur pour D-Trp n'a pas été déterminée. Exemple 3 D-alanyl-gcrlycyl-L-cystéinyl-L-lysyl-D-alanyl-L-phénylalanyl- L-phénylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-thréonyl-L-cyclohexyl- alanyl-L-thréonyl-L-séryl-D-cystéine. On mélange l'ensemble peptide protégé-résine préparé dans l'Exemple C (5,53 g, à un taux de substitution de 0,176 mmole/? de résine) avec 10,1 ml d'anisole et 10,1 ml d'éthyl- mercaptan. On refroidit le mélange avec de l'azote liquide et on ajoute par distillation 126 ml d'acide flucrhydrique liquide. Puis, on porte le mélange à 0 C et on l'agite pendant 2 heures. L'élimination de l'acide fluorhydrique par distillation donne un résidu auquel on ajoute de l'éther à 0 C. On recueille le solide, en le lave avec de l'éther et on le sèche. On sépare le peptide de la résine en extrayant le solide avec de l'acide acétique 1 M et de l'acide acétique à 50 %. On lyophilise l'extrait à l'obscurité à siccité. On ajoute au matériau sec 300 ml d'acide acétique 0,2 M, et on chauffe la solution nour effectuer la dissolution. On chromatographie la solution sur une colonne de Sephadex G-25 Fine dans les conditions suivantes: solvant: acide acétique 0,2 M dégazé; dimensions de la colonne: 10 x 210 cm; température: 26 C; débit: 2572 ml/heure; volume des fractions: 64,3 mrl. On recueille un échantillon de 11776 ml dans des flacons de crande dimension et on le rejette avant de recueillir des fractions distinctes. Un diagramme de l'absorbance à 280 mp de chaque fraction en fonctien du numéro de la fraction présente un pic large avec un épaulement du côté arrière. L'analyse spectro- graphique UV indiaue que les fractions représentées par le pic large contiennent le produit désiré. On réunit donc les fractions 19-45 (12 923-14 673 mi, pic à 13 798 m1). L'analyse spectrographique UV d'un échantillon des fractions réunies indique que l'on a obtenu 702 mg de produit. Récupération: 45,0 %. Teneur en groupements sulfhydryle libres: 96,1 % de la valeur théorique (par titrage Ellman); Exemple 4 Disulfure cyclique (3 + 14) de la D-alanyl-glycyl-L-cystéinyl- L-lysyl-D-alanyl-L-phénylalanyl-L-phénylalanyl-D-tryptophyl- L-lysyl-L-thréonyl-L-cyclohexylalanyl-L-thréonyl-L-séryl-D- cystéine. On cxyde à l'air le peptide linéaire préparé dans l'Exemple 3 pour obtenir le peptide cyclique correspondant, selon le mode opératoire suivant: On dilue les fractions combinées obtenues dans l'Exemple 3 (1750 ml, contenant théoriquement 702 mg de peptide) avec 12 290 ml d'eau distillée pour obtenir une solution finale ayant une concentration de 50 pg/ml. On ajoute suffisament d'hydroxyde d'ammonium concentré pour amener le pH à 6,7. Puis, on agite la solution à la tempéra- ture ambiante à l'obscurité pendant 41 heures, après quoi un titrage d'Ellman d'une partie aliquote indique une oxydation totale. On concentre la solution sous vide jusqu'à un volume d'environ 80 ml. On ajoute 100 ml d'acide acétique glacial et on dessale la solution par chromatographie sur une colonne Sephadex G-25 Fine dans les conditions suivantes: solvant: acide acétique à 50 % dégazé; dimensions de la colonne: 7,5 x 211 cm; température: 26 C; débit: 113 ml/heure; volume des fractions: 19, 8 ml. On recueille un échantillon de 2 975 ml dans de grands flacons et on le rejette avant de recueillir des fractions individuelles. Un diagramme de l'absorbance à 280 mp de chaque fraction en fonction du numéro de la fraction indique deux pics importants. Le premier représente les formes agglomérées du peptide tandis que le second représente la forme monomère. On réunit les fractions 109-128 (4 988-5 362 ml) et on les lyophilise à siccité à l'obscurité. On dissout le solide résultant dans de l'acide acétiaue 0,2 M déaazé (25 ml) et on chromatographie la solution sur une colonne Sephadex G-25 Fine dans les conditions suivantes: solvant: acide acétique 0,2 M dégazé; dimensions de la colonne: 5 x 215 cm; température: 26 C; débit: 800 ml/heure; volume des fractions: 14,65 ml. On recueille un échantillon de 2303 ml dans un flacon de grande dimension et on le'rejette avant de recueillir des fractions distinctes. Un diagramme de l'absorbance à 280 mp de chaque fraction en fonction du numéro de la fraction présente un seul pic. L'analyse spectrographique UV indique que les fractions représentées par la partie principale de ce pic contiennent le produit désiré. On réunit les fractions 85-106 (3 530-3 854 ml; pic à 3 667 ml) et on les lyophilise à l'obscurité pour obtenir le peptide cité en titre. L'analyse spectrographique UV des fractions réunies avant lyophilisation indique que l'on a obtenu 236,5 mg du produit. Récupération, 33,7 % (par rapport à la forme linéaire). Analyse des amino-acides: Gly, 1,01; Cys, 2,05; Lys, 2,0; Ala, 2,15; Phe, 2,19; Thr, 2,14; Ser, 0,85. Les résultats précédents sont exprimés sous forme de rapports vis-à-vis de Lys/2. Toutes les valeurs sont les moyennes de 2 hydrolyses, sans addition d'agents de fixation. La valeur pour D-Trp n'a pas été déterminée. Le pic pour Cha chevauche le pic de NH3 dans l'analyse des amino-acides, de sorte que Cha n'a pas été déterminée. Exemple 5 D-séryl-glycyl-L-cystéinyl-L-lysyl-L-alanyl-L-phénylalanyl- L-phénylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-thréonyl-L-phényl- alanyl-L-thréonyl-L-séryl-D-cystéine. On mélange 6,029 g ie l'ensemble peptide protégé- résine préparé dans l'Exemple D (à un taux de substitution de 0,162 mmcle/g de résine) avec 11 mi d'anisole et 11 ml d'éthyl- mercaptan. On refroidit le mélange avec de l'azote liquide et on ajoute par distillation 150 ml d'acide flucrhydrioue liquide. Puis, on porte le mélange à 0 C et on l'agitependant une heure etdemie. L'élimination de l'acide flucorhydrique par distillation donne un résidu auquel on ajoute de l'éther à 0 C. On recueille le solide, on le lave avec de l'éther et on le sèche. On sépare le peptide de la résine en extrayant le solide avec de l'acide acétique 1 M et de l'acide acétique à 50 %. On lyophilise l'extrait à l'obscurité à siccité. On ajoute au matériau séché un mélange de 10 ml d'acide acétique 0,2 M et de 4 ml d'acide acétique glacial, et on chauffe la solution pour effectuer la dissolution. Au cours du refroidissement, il se sépare une petite quantité de précipité. On ne l'enlève pas par filtration. On chromato- graphie l'échantillon sur une colonne Sephadex G-25 Fine dans les conditions suivantes: solvant: acide acétique 0,2 M dégazé; dimensions de la colonne: 7,5 x 150 cm; température: 26 C; débit: 1644 ml/heure; volume des fractions: 24,67 ml. Un diagramme de l'absorbance à 280 mp de chaque fraction en fonction du numéro de la fraction présente un pic large avec un épaulement du côté arrière. L'analyse spectro- graphique UV indique que les fractions représentées par le pic large contiennent le produit désiré. On réunit donc les fractions 205-230 (5 081-5 755 ml, pic à 5 506 ml). L'analyse spectrographique UV d'un échantillon des fractions réunies indique que l'on a obtenu 524 mg de produit. Teneur en groupements sulfhydryle libres: 91,1 % de la valeur théorique (par titrage Ellman). Exemple 6 Disulfure cyclique (3 - 14) de la D-séryl-glycyl-L-cystéinyl- L-lysyl-L-alanyl-L-phénylalanyl-L-phénylalanyl-D-tryptophyl- L-lysyl-L-thréonyl-L-phénylalanyl-L-thréonyl-L-séryl-D- cystéine. On oxyde à l'air le peptide linéaire préparé dans l'Exemple 5 pour obtenir le peptide cyclique correspondant, selon le mode opératoire suivant: On dilue un échantillon des fractions réunies obtenu dans l'Exemple 5, contenant théoriquement environ 260 mg de peptide, avec de l'eau distillée pour obtenir une solution finale ayant une concentration de 50 pg/ml. On ajoute suffisamment d'hydroxyde d'ammonium concentré pour amener le pH à 6,7. Puis, on agite la solution à la température ambiante àl'obscurité pendant 41 heures, après quoi un titrage Ellman d'une partie aliquote indicue une oxydation complète. On concentre la solution sous vide jusqu'à un petit volume. On ajoute de l'acide acétique glacial (jusqu'à 31 ml) et on dessale la solution par chromatographie sur une colonne Sephadex G-25 Fine dans les conditions suivantes splvant: acide acétique à 50 % dégazé; dimensions de la colonne: 5,0 x 215 cm; température: 260C; débit: 243 ml/heure; volume des fractions: 21,6 ml. Un diagramme de l'absorbance à 280 mp de chaque fraction en fonction du numéro de la fraction présente plusieurs pics importants se chevauchant. On réunit les fractions 93 - 110 (2044 - 2508 ml) et on les lyophilise à siccité à l'obscurité. On dissout le solide résultant dans de l'acide acétique à 50 % dégazé et on le rechromatographie sur une colonne de Sephadex G-25 Fine, comme précédemment. On réunit les fractions éluées entre 2034 et 2214 ml et on les lyophilise à siccité à l'obscurité. On dissout le solide résultant dans 12 ml d'acide acétique 0,2 M dégazé et on chromatographie la solution sur une colonne de Sephadex G-25 Fine dans les conditions suivantes: solvant: acide acétique 0,2 rl dégazé; dimensions de la colonne: 2,5 x 215 cm; température: 260C; débit: 119 ml/heure; volume des fractions: 12,5 ml. Un diagramme de l'absorbance à 280 mi de chaque fraction en fonction du numéro de la fraction présente un seul pic. L'analyse spectrographique UV indique que les fractions représentées par la partie principale de ce pic contiennent le produit désiré. On réunit les fractions 82-89 (1011-1111 ml; pic à 1034 ml) et on les lyophilise à l'obscurité pour obtenir le peptide cité en titre. L'analyse spectrographique UV des fractions réunies avant lyophilisation indique que l'on a obtenu 24,4 mg de produit. Récupération: 9 % (à partir de la formule linéaire). Analyse des amino-acides: Gly, 0,98; Cys, 1,50; Lys, 2,0; Ala, 1,03; Phe, 2,89; Thr, 1,84; Ser, 1,62. Les résultats précédents sont exprimés sous forme d'un rapport vis-à-vis de Lys/2. Toutes les valeurs sont la moyenne de 2 hydrolyses, sans addition d'agents de fixation. La valeur pour D-Trp n'a pas été déterminée. Exemple 7 D-séryl-glycyl-L-cystéinyl-L-lysyl-L-alanyl-L-phénylalanyl-L- phénylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-thréonyl-D-phénylalanyl- L-thréonyl-L-séryl-D-cystéine. On mélange 3,511 g de l'ensemble peptide protégé-résine préparé dans l'Exemple E (à un taux de substitution de 0, 158 mmole/g de résine) avec 6,4 ml d'anisole et 6,4 ml d'éthyl- mercaptan. On refroidit le mélange avec de l'azote liquide et on ajoute, par distillation, 73 ml d'acide fluorhydrique liquide. Puis on porte le mélange à 0 C et on l'agite pendant une heure et demie. L'élimination de l'acide flucrhydrique par distillation donne un résidu auquel on ajoute de l'éther à 0 C. On recueille le solide, on le lave avec de l'éther et on le sèche. On sépare le peptide de la résine en extrayant le solide avec de l'acide acétique 1 M et de l'acide acétique à %. On lyophilise l'extrait à siccité à l'obscurité. On ajoute au matériau sec un mélange de 10 ml d'acide acétique 0,2 M et de 4 ml d'acide acétique glacial, et on chauffe la suspension pour effectuer la dissolution. Par refroidissement, il se sépare une petite quantité de précipité. L'addition de ml d'acide acétique alacial suivie d'un chauffage effectue la dissolution. On chromatographie l'échantillon sur une colonne Sephadex G-25 Fine dans les conditions suivantes: solvant: acide acétique 0,2 M dégazé; dimensions de la colonne: 7,5 x 150 cm; température: 26 C; débit: 1602 ml/heure; volume des fractions: 24,4 ml. Un diagramme de l'absorbance à 280 mp de chaque fraction en fonction du numéro de la fraction présente un pic large. L'analyse spectrographique UV indique que les fractions représentées par le pic large contiennent le produit désiré. On réunit donc les fractions 217-242 (5227-5870 mi, pic à 5581 ml). L'analyse spectrographique UV d'un échantillon des fractions réunies indique que l'on a obtenu 388,8 mg de produit. Teneur en groupements sulfhydryle libres: 86 % de la valeur théorique (par titrage Ellman). Exemple 8 Disulfure cyclique (3 -> 14) de la D-séryl-glycyl-L-cystéinyl- L-lysyl-L-alanyl-L-phénylalanyl-L-phénylalanyl-D-tryptophyl- L-lysyl-L-thréonyl-D-phénylalanyl-L-thréonyl-L-séryl-D- cystéine. On oxyde à l'air le peptide linéaire préparé dans l'Exemple 7 pour obtenir le peptide cyclique correspondant, selon le mode opératoire suivant: On dilue les fractions réunies obtenues dans l'Exemple 7 (643 ml, contenant théoriquement 388,8 mg de peptide) avec 7137 ml d'eau distillée pour obtenir une solution finale ayant une concentration de 50 pg/ml. On ajoute suffisamment d'hydroxyde d'ammonium concentré pour amener le pH à 6,7. Puis, on agite la solution à la température ambiante à l'obscurité pendant environ 40 heures, après quoi un titrage d'Ellman d'une partie aliquote indique une oxydation complète. On concentre la solution sous vide jusqu'à un volume d'environ 35 ml. On ajoute 35 ml d'acide acétique glacial et on dessale la solution par chromatographie sur une colonne Sephadex G-25 Fine dans les conditions suivantes: solvant: acide acétique à 50 % dégazé; dimensions de la colonne: ,0 x 215 cm; température: 26 C; débit: 243 ml/heure; volume des fractions: 22,8 ml. Un diagramme de l'absorbance à 280 mp de chaque fraction en fonction du numéro de la fraction présente deux pics importants. Le premier représente les fcrmes agglomérées du peptide tandis que le second représente la forme monomère. On réunit les fractions 90-125 (2034-2797 ml) et on les lyophilise à siccité à l'obscurité. On divise le solide résultant en deux parties à peu près égalesetl'on reprend chacune dans environ 25 ml d'acide acétique à 50 % et on la rechromatographie comme précédemment dans de l'acide acétique à 50 %. On lyophilise à siccité à l'obscurité les fractions réunies correspondantes provenant des deux essais refaits. On dissout les solides résultants dans 15 ml d'acide acétique 0,2 M dégazé et on chromatographie la solution sur une colonne Sephadex G-25 Fine dans les conditions suivantes: solvant: acide acétique 0,2 M dégazé; dimensions de la colonne: 5,0 x 150 cm; température: 26 C; débit: 450 ml/heure; volume des fractions: 15,75 ml. Un diagramme de l'absorbance à 280 my de chaque fraction en fonction du numéro de la fraction présente un seul pic. L'analyse spectrographique UV indique que les fractions représentant la partie principale de ce pic contiennent le produit désiré. On réunit les fractions 171-181 (2688-2864 ml; pic à 2757 ml) et on les lyophilise à l'obscurité pour obtenir le peptide cité en titre. L'analyse spectrographique UV des fractions réunies avant lyophilisation indique que l'on a obtenu 86 mg du produit. Récupération: 22,1 % (par rapport à la forme linéaire). Analyse des amino-acides: Gly, 0,97; Cys, 1,51; Lys, 2,04; Ala, 1,03; Det L-Phe, 2,85;- Thr, 1,83; Ser, 1,69. Les résultats précédants sont exprimés sous forme de rapports par rapport à Ala + Gly/2. Toutes les valeurs sont la moyenne de 2 hydrolyses, sans addition d'agents de fixation. La valeur pour D-Trp n'a pas été déterminée. Exemple 9 D-séryl-glycyl-L-cystéinyl-L-lysyl-L-alanyl-L-phénylalanyl-L-- phénylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-thréonyl-L-cyclohexyl- alanyl-L-thréonyl-L-séryl-D-cystéine. On mélange 5,64 g de l'ensemble peptide protégé-résine préparé dans l'Exemple F (à un taux de substitution de 0,169 mmole/g de résine) avec 10,3 ml d'anisole et 10,3 ml d'éthyl- mercaptan. On refroidit le mélange avec de l'azote liquide et on ajoute 72 ml d'acide fluorhydrique liquide par distillation. Puis, on porte le mélange à 0 C et on l'agite pendant 2 heures. L'élimination de l'acide fluorhydrique par distillation donne un résidu auquel on ajoute de l'éther à 0 C. On recueille le solide, on le lave avec de l'éther et on le sèche. On sépare le peptide de la résine en extrayant le solide avec de l'acide acétique 1 Met de l'acide acétique à 50 %. On lyophilise l'extrait à l'obscurité jusqu'à 25 ml. On ajoute 275 ml d'une solution d'acide acétique 0,2 M à la solution de peptide, et on chauffe la suspension pour effectuer la dissolution. On chromatographie le filtrat sur une colonne Sephadex G-25 Fine dans les conditions suivantes: solvant: acide acétique 0,2 M dégazé; dimensions de la colonne: 10 x 210 cm; température: 26 C; débit: 2626 ml/heure; volume des fractions: 65,6 ml. On recueille un échantillon de 11 869 ml dans des flacons de grandes dimen- sions et on le rejette avant de recueillir les fractions *distinctes. Un diagramme de l'absorbance à 280 m. de chaque fraction en fonction du numéro de la fraction présente un pic large avec un épaulement du côté arrière. L'analyse spectro- graphique UV indique que les fractions représentées par le pic principal contiennent le produit désiré. On réunit donc les fractions 18-42 (12991-14626 ml, pic à 13854 ml). L'analyse spectrographique UV d'un échantillon des fractions réunies indique que l'on a obtenu 742,5 mg de produit. Récupération: 48,2 %; teneur en groupements sulfhydryle libre: 93,5 % de la valeur théorique (par titrage d'Ellman). Exemple 10 Disulfure cyclique (3 + 14) de la D-séryl-glycyl-L-cystéinyl- L-lysyl-L-alanyl-L-phénylalanyl-L-phénylalanyl-D-tryptophyl- L-lysyl-L-thréonyl-L-cyclohexylalanyl-L-thréonyl-L-séryl-D- cystéine On oxyde à l'air le peptide linéaire préparé dans l'Exemple 9 pour obtenir le peptide cycliaue correspondant, selon le mode opératoire suivant: On dilue les fractions réunies obtenues dans l'Exemple 9 (1635 ml, contenant théoriquement 742,5 mg de peptide) avec 13 215 ml d'eau distillée pour obtenir une solution finale ayant une concentration de 50 pg/ml. On ajoute suffisament d'hydroxyde d'ammonium concentré pour amener le pH à 6,7. Puis, on agite la solution à la température ambiante à l'obscurité pendant 41 heures, après quoi un titrage d'Ellman d'une partie aliquote indique une oxydation complète. On concentre la solution sous vide jusqu'à un petit volume et on ajoute de l'acide acétique à 50 % jusqu'à un volume total d'environ 250 ml. On dessale la solution par chromatographie sur une colonne Sephadex G-25 Fine dans les conditions suivantes: solvant: acide acétique à 50 % dégazé; dimensions de la colonne: 7,5 x 211 cm; température: 260C débit: 200 ml/heure; volume des fractions: 20,2 ml. Un diagramme de l'absorbance à 280 mp de chaque fraction en fonction du numéro de la fraction présente un large pic bas. On réunit les fractions 35-135 (3577-5619 ml) et on les lyophilise à siccitë à l'obscurité. On dissout le solide résultant dans 25 ml d'acide acétique 0,2 M dégazé et on chromatographie la solution sur une colonne Sephadex G-25 Fine dans les conditions suivantes: solvant: acide acétique 0,2 M dégazé; dimensions de la colonne: 5,0 x 215 cm température: 260C; débit: 860 ml/heure; volume des fractions: 15,8 ml. On recueille un échantillon de 2120 ml dans un grand flacon et on le rejette avant de recueillir des fractions distinctes. Un diagramme de l'absorbance à 280 mp de chaque fraction en fonction du numéro de la fraction présente un seul pic. L'analyse spectrographique UV indique que les fractions représentées par la partie principale de ce pic contiennent le produit désiré. On réunit les fractions 97-115 (3634-3935 ml; pic à 3720 ml) et on les lyophilise à l'obscurité pour obtenir le peptide cité en titre. L'analyse spectrographique UV des fractions réunies avant lyophilisation indique que l'on a obtenu 164,1 mg de produit. Récupération, 22,1 % (par rapport à la forme linéaire). Analyse des amino-acides Gly, 0,89; Cys, 1,75; Lys, 2,0; Ala, 0,91; Phe, 1,87; Thr, 1,81; Ser, 1,65. Les résultats précédents sont exprimés sous forme des rapports vis-à-vis de Lys/2. Toutes les valeurs sont les moyennes de 2 hydrolyses, sans addition d'agents de fixation. La valeur pour D-Trp n'est pas déterminée. Le pic pour Cha chevauche le pic de NI3 dans l'analyse des amino-acides, de sorte que Cha n'a pas été déterminé. Les effets des tétradécapeptides de formule III sur l'inhibition de l'hormone de croissance, de l'insuline et du glucagon peuvent être mis en évidence et démontrés dans les modes opératoires d'essai suivant: A. Inhibition de l'hormone de croissance chez les rats Cet essai est une modification du procédé deP. Brazeau et al., Endocrinolocy, 94, 184 (1974). On répartit en trois groupes de huit rats chacun des rats mRles pesant 100-110 g. On administre à chaque rat du pentobarbital sodique à une dose de 4 mg/rat (par voie intrapéritonéale, I.P.) pour stimuler la sécrétion de l'hormone de croissance. De façon simultanée, un groupe de rats reçoit le composé d'essai (par voie sous-cutanée, S.C.); le second groupe reçoit de la somatostatine (S.C.); et le troisième groupe (groupe témoin) reçoit unesolution saline (S.C.). Vingt minutes plus tard, on décapite les animaux et on recueille les échantillons de sang. On détermine par dosage radioimmunologique la concen- tration de l'hormone de croissance dans le sérum. La concen- tration moyenne de l'hormone de croissance ( l'écart type de la moyenne) est calculée pour chaque groupe. On calcule ensuite le pourcentage d'inhibition de la libération de l'hormone de croissance (par rapport aux témoins recevant la solution saline) pour le composé d'essai et pour la somatostatine. Quand on les essaie comme indiqué précédemment, les peptides des Exemples 2, 4, 6, 8 et 10, représentatifs des peptides de Formule III, donnent les résultats donnés ci- dessous dans le Tableau I: TABLEAU I Inhibition de l'hormone de croissance D-l1 Al5 Tr8, - 14_ (A) D-Ala la, DTrp8, D-Cys4-Somatostatine (Exemple 2) Concentration de HC dans le sérum (ng/ml)! Dose Solution Exp. (U/kg) Saline Somatostatine Composé Somato 1 50 -- 65,6 18,6 2,0 0,3 52 2 -- 84,1 18,5 7,1 3,8 39 % d'inhibition statine Composé 98,6 1 94,9 8,15 34,5 151,5 40,9 34,3 20,1 37,5 11,9 ,1 13,5 27,4 11,9 14,8 10,9 51,0 14,1 2,8 0,2 ,6 16,0 2,5 0,25 _ _ 57,9 __ 86,7 81,9 __ w 0% 81,8 37,4 98,2 79,8 rN Ln co ul Un noq TABLEAU I (suite) D-l 5 8 il -Cs14_ (B) D- D -Ala, D-Trp, L-Cha, DCys -Somatostatine (Exemple 4) Concentration de HC dans le sérum (ng/ml) % d'inhibition dose Exp. (lia/kg) Saline Somatostatine Composé S ! 50 -- 10,3 1,6 8,4 3,4 2 -- 80,6 28,1 5,5 0,7 - 109,6 40,2 -- -- 1 58 -Cs14-S (C) D-Ser, Ala5, D-Trp, D-Cys -Somatostatine (Exemple 6) Concentration de HC dans le sérum (ng/ml)m Saline 73,2 + 36,7 Somatostatine ,5 1,4 32,0 9,9 _ _ Composé 4,0 0,5 ,5 5,4 Domatostatine Composé % d'inhibition omatcstatine Composé 93 95 56 79 Exp. dose (pg/kg) 4-f Ln Co Ol Liq Só TABLEAU I (suite) D-Ser1 5 8 il14 (D) D-Ser, Ala5, D-Trp, D-Phe1, D-Cys -somatostatine (Exemple 8) Concentration de HC dans le sérum (ng/ml) % d'inhibition Dose Exp. (pg/kg) Saline Somatostatine Composé Scmatostatine Comrposé 1 50 -- 24,7 + 17,8 40,0 + 13,4 64 39 2 -- 76,8 + 21,0 79,6 + 36,2 0 0 -- 66,0 + 32,9 -- -- D-er 5 -p8, Ch1iJ.D-y 14- o (E) D-Ser, Ala5 D-Trp8, Chall, D-Cys4somatostatine (Exemple 10) Concentration de HC dans le sérum (ng/ml) % d'inhibition Co Dose Exp. ( cg/kg) Saline Somatostatine Composé Somatostatine Composé 1 50 -- 2,0 + 0,1 2,2 + 0,1 98 98 2 -- 74,6 + 27,3 68,8 + 28,2 28 34 -- 103,5 + 36,3 -- Moyenne + E.T. Co Ln o %0m B. Inhibition de l'insuline et du glucagon chez les chiens On fait jeûner pendant une nuit un chien-normal. On commence une perfusion intraveineuse du composé d'essai (dissous dans une solution saline). Trente minutes après, on commence une perfusion supplémentaire de L-alanine (dissoute dans la solution saline) et on la poursuit pendant un total de 15 minutes de sorte que l'on administre une dose totale d'environ 1 imole de L-alanine par kg de poids corporel. On poursuit la perfusion du composé d'essai pendant 15 minutes supplémentaires. On prélève périodiquement des échantillons de sang avant (à - 20, - 10 et - 1 minutes) et après (5, 10, 15, 30, , 40, 45, 50, 60, 90, 120 et 150 minutes) le début de la perfusion du composé d'essai. On détermine par dosage radio- immunologique les concentrations en insuline et en glucagon dans le sérum sanguin. On trace un diagramme des concentra- tions en glucagon et en insuline en fonction du temps. On compare le diagramme obtenu pour le composé d'essai aux diagrammes obtenus pour la somatostatine et la solution saline (témoins) dans des expériences similaires. La perfusion de L-alanine (en l'absence de somato- statine ou de composé d'essai actif) provoque une augmentation brutale des concentrations en insuline et en glucagon dans le sérum. Les concentrations reviennent au niveau de base une fois que l'on arrête la perfusion de L-alanine. La perfusion de somatostatine (seule) provoque une diminution des concen- trations de base dans le sérum en insuline et en glucagon. En présence de L-alanine, la somatostatine inhibe l'augmen- tation des concentrations en insuline et en glucagon induites par la L-alanine. Quand on les essaie selon le mode opératoire décrit précédemment, les peptides des Exemples 2, 4, 6, 8 et 10 donnent les résultats suivants: Dose perfusée ( -g/kg/mn) Exemple 2 Exemple 4 Exemple 6 Exemple 8 Exemple 10 0,098 0,181 0,291 0,05 0,05 0,20 0,06 Pas d'inhibition du glucagon et de l'insuline Pas d'inhibition du glucagon et de l'insuline Inhibition significative du glucagon et de l'insuline Pas d'inhibition du glucagon et de l'insuline Inhibition partielle du glucagon et de l'insuline. Peptide Résultat IREVENDICATIONS I. Tétradécapeptide cyclique de formule X-Cys-Lys-Y-Phe-Phe-D-Trp- IIO-D-Cys- Ser-Thr-Z-Thr-Lys dans laquelle: X est H-Ala-Gly, H-Ala-D-Ala, Il-D-Ala-Gly, Il-D-Val-Gly, H-Ala-D-Val, Il-Ala-D-Ser ou H-D-Ser-Gly; Y est Ala ou D-Ala; et Z est Phe, D-Phe ou Cha; ou un de ses sels d'addition d'acide pharinaceutiquement accepta- bles non-tcxiques. 2. II-D-Ala-Gly-Cys-Lys-D-Ala-Phce-Phle-D-Trp t I HO-D-Cys-Ser-Thr--Phe Thr-Lys 3. II-D-Ala-Gly-Cys-Lys-D-Ala-Phe-Phe-D-Trp I I HO-D-Cys-Ser-Thr- Cha-Thr-Lys 4. II-D-Ser-Gly-Cys-Lys-Ala-Phe-Phe-D-Trp 1 LI HO-D-Cys-Ser-Thr-Phe-Thi r-Lys 5. Il-D-Ser-Gly-Cys-Lys-Ala-Phe-Phfe-D-Trp I i Ho-D-Cys-Ser-Thr-D-Pie-TlJr-Lys G6. I1-D-Ser-Gly-Cys-Lys-Ala-Phe-PheD-TrP IIO-D-Cys-Ser-Thr-Cha-Tih r-Lys 7. Procédé de préparation d'un Létradécapeptide cyclique de Formule III selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir un peptide linéaire de formule X-Cys-Lys-Y-Phe-Phe-D-Trp _., __.__.1V I1O-D-Cys-Ser-Thr-Z-Thr-Lys dans laqluelle X est H-Ala-Gly, HI-Ala-D-Ala, lI-D-Ala-Gly, H-D-Val-Gly, I-Ala-D-Val, 1l-Ala-D-Ser ou H-D-Ser-Gly; Y est Ala ou D-Ala; et Z est Phe, D-Phe ou Cha; ou un de ses sels d'addition d'acide pharmaceutiquement acceptables non toxiques, avec un agent oxydant. 8. Procédé selon la revendication 7, o l'agent o10 oxydant est l'air. 9. Tétradécapeptide linéaire de formule X-Cys-Lys-Y-Phe-Phe-D-Trp HO-DCys-Ser-Thr-Z-Thr-Lys IV dans laquelle les symboles sont tels que définis précédem- ment, à titre d'intermédiaire utilisé dans le procédé selon la revendication 7 pour préparer les composés de formule III. 10. H-D-Ala -Gly-Cys-Lys-D-Ala-Phe-Phe-D-Trp HO-D-Cys-Ser-Thr-Phe-Thr-Lys 11i. I-D-Ala -Gly-Cys-Lys-D-Ala-lPhe-Phle-D-Trp HO-D-Cys-Ser-Thr-Cha-ThrLys 12. HI-D-Ser-Gly-Cys-Lys-Ala-Phe-Phie-D-Trp IIO-D-Cys-Ser-Thr-PlheThr-Lys 13.II-D-Ser-Gly-Cys-Lys-Ala-Phe-PhIe-D-Trp HO-D-Cys-Ser-Thr-D-PheThr-Lys 14. H-D-Ser-Gly-Cys-Lys-Ala-Phr-PhIe-D-Trp HO-D-Cys-Ser-Thr- Ch la-Thr-Lys 15. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient comme ingrédient actif un composé de Formule III selon la revendication 1, avec un support pharmaceutique- ment acceptable.