Brevet FR2460674A1 — publié le 19810130

La présente invention concerne un nouveau succédané du sang contenant une hémoglobine modifiée comme substance de transport de l'oxygène. On connaît un succédané du sang contenant une hémoglobine exempte de composant stromal comme substance de transport de l'oxy- gène (S.F. Rabiner et col., J. Ex. Med., volume 126, page 1142 (1967)). D'autre part, on sait également que, lorsque l'on introduit l'hémo- globine par perfusion dans la circulation sanguine, elle est rapide- ment excrétée par le rein et métabolisée par d'autres voies métabo- liques. Diverses propositions ont été faites pour résoudre ce pro- blème, par exemple une hémoglobine réticulée par le glutaraldéhyde (publication de brevet japonais n 76-63920), une hémoglobine couplée avec le dextranne (publication de brevet japonais n' 77-51016) et une hémoglobine combinée avec l'hydroxyéthylamidon (demande de brevet de la République Fédérale d'Allemagne DT-OS n 2 616 086). Cependant, dans le premier cas, l'oxygène est difficile à trans- férer sur des tissus lorsque l'affinité de l'hémoglobine pour l'oxygène est trop forte. Dans le cas des deux dernières tentatives, la concen- tration élevée de l'hémoglobine conduit souvent à des résultats défavorables à cause de sa viscosité élevée. La demanderesse a découvert selon l'invention que, lorsqu'on combine l'hémoglobine avec un polyalkylèneglycol ou son dérivé (composé ci-après dénommé "hémoglobine modifiée"), la capacité de transport de l'oxygène de l'hémoglobine modifiée est presque égale à celle de l'hémoglobine initiale et la durée de passage dans la circulation est d'une longueur satisfaisante. Le polyalkylèneglycol et ses dérivés utilisables dans l'inven- tion comprennent le polyéthylèneglycol, le polypropylèneglycol, les copolymères d'éthylèneglycol et de propylèneglycol, les éthers de l'un des polyalkylèneglycols ci-dessus mentionnés et d'un alcool en C-C 16 tels qu'éther monométhylique, éther monoéthylique et éther mono- oléylique, les esters de l'un des polyéthylèneglycols ci-dessus avec un acide carboxyl!que en C2-C18 tels qu'ester monobutyrique et ester monostéarique, et les produits de déshydratation de l'un des poly- alkylèneglycols ci-desss et d'une amine en C1-C18 telle que propyl- amine et stéarylamine. Les polyalkylèneglycols ci-dessus et leurs dérivés sont dénommés ci-après "polymères utilisés selon l'invention". Le poids moléculaire du polymère utilisé selon l'invention est ordi- nairement de 300-20 000, de préférence de 750-5 000 en termes d'allon- gement de la durée de passage dans la circulation. L'hémoglobine applicable dans l invention comprend les hémo- globines humaine, de vache, de cochon, de mouton, de cheval, de chien, de singe, de lapin et de poule. L'hémoglobine et le polymère utilisé selon l'invention peu- vent être combinés de n'importe quelle manière, par exemple on les combine directement en utilisant un agent de condensation tel que le bromure de cyanogène, ou bien on les combine en utilisant un réac- tif réticulant tel que chlorure de cyanuryle, 2,2'-dichlorobenzidine, p,p'-difluoro-m,m'-dinitrodiphénylsulfone et 2,4-dichloronitrobenzène. On combine 4 à 120 molécules du polymère utilisé selon l'invention avec une molécule d'hémoglobine. L'hémoglobiremodifiée peut être préparée selon les méthodes suivantes: (1) on fait réagir le polyéthylèneglycol avec 2 à 5 propor- tions molaires, de préférence 3 proportions molaires,de bromure de cyanogène à pH 9-10; on élimine le bromure de cyanogène résiduel du mélange de réaction par filtration sur gel, dialyse, etc., et ensuite on fait réagir le produit avec 1/10-1/500 proportion molaire, de préférence 1/50-1/100 de proportion molaire, d'hémoglobine à pH 7-9, de préférence 7, 5-8,en solution aqueuse; (2) on ajoute le polyéthylèneglycol à du benzène contenant un excès de carbonate de sodium et on fait réagir avec 2 à 5 fois la quantité molaire, de préférence 3 à 4 fois la quantité molaire, de chlorure de cyanuryle. On sépare ensuite le produit de réaction polyéthylèneglycol-4.,6-dichloro-s-triazine et on fait réagir avec 11/500 équivalent molaire d'hémoglobine, de préférence 1/10-1/100 équivalent molaire, dans une solution tampon à pli 8-9,5. Les méthodes ci-dessus sont également applicables à d'autres polymères utilisés selon l'invention. L'hémoglobine modifiée est facilement soluble dans l'eau et la solution est de couleur rouge. Dans les dessins annexes, la figure 1 représente le spectre visible de l'hémoglobine modifiée consistant en hémoglobine humaine et polyéthylèneglycol d'un poids moléculaire d'en- viron 4 000 et la figure 2 représente le spectre de résonance magné- tique nucléaire du carbone C de l'hémoglobine modifiée consistant en hémoglobine humaine et méthoxypolyéthylèneglycol d'un poids molé- culaire d'environ 750. L'hémoglobine modifiée est une substance non toxique et la raison en est que l'hémoglobine modifiée est une combinaison d'hémo- globine séparée d'un organisme vivant et des polymères utilisés selon l'invention qui ne sont pas toxiques. Comme l'affinité pour l'oxygène de l'hémoglobine modifiée est sensiblement égale ou légè- rement supérieure à celle de l'hémoglobine naturelle, l'hémoglobine modifiée est préférable pour le transport de l'oxygène vers les tissus. En outre, la durée de passage de l'hémoglobine modifiée dans la circulation est d'environ 2-4 fois plus longue que celle de l'hémo- globine sans stroma elle-même. Comme décrit ci-dessus, l'hémoglobine modifiée est un succédané du sang préféré. En particulier, on sait qu'une protéine modifiée par un polyéthylèneglycol perd le caractère d'antigène de l'hémoglobine (A. Abuchowski et col., J. Biol. Chem., volume 252, page 3582 (1977)) et, en conséquence, il n'y a pas à craindre que l'hémoglobine modifiée agisse comme antigène dans l'organisme. Le nombre de moles de polyalkylèneglycols fixées à une mole de l'hémoglobine décrite dans les exemples ci-après est déterminé de la manière suivante. On détermine la concentration (C) d'une solution d'hémoglobine modifiée par la méthode à la cyanométhémoglobine et on mesure les poids de l'hémoglobine modifiée (Mo) après lyophilisation d'un volume VO (en ml) de la solution. Le nombre de polyalkylèneglycols (N) est donc M -C V o o0o N 1 C V 0O0 M2 o M1 et M2 sont les poids moléculaires du polyalkylèneglycol et de l'hémoglobine respectivement. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 On dissout 2,5 g (0,003 mole) d'éther monométhylique de polyéthylèneglycol de poids moléculaire moyen 750 dans 40 ml d'eau et on ajoute goutte à goutte 1 g (0,0095 mole) de bromure de cyano- gène préalablement dissous dans 5 ml de dioxanne, an refroidissant la soluton au bain de glace. On agite ensuite le mélange pendant 1 h., en le maintenant à pH 9-10 au moyen de NaOH 2N. On ajuste le mélange à pH 7,5 en utilisant HC1 IN et on concentre à 20 ml par ultrafiltra- tion en utilisant une membrane fabriquée par la société Bioengineering Co. , Ltd., sous le nom de "G-05T" pour laquelle le poids moléculaire d'arrêt est de 500 daltons. On dilue le concentré par 300 ml de solu- tion tampon à pH 7,5 et on concentre ensuite à 20 ml à nouveau par filtration. On ajoute au concentré 20 ml de solution aqueuse à 10 % d'hémoglobine humaine en agitant et en refroidissant la solution concentrée au bain de glace. On laisse ensuite reposer le mélange de réaction pendant une nuit à 4 C. On fait ensuite passer le mélange de réaction à travers une colonne garnie de gel CM-Sephadex et préalablement équilibrée à pH 6,0. On élue la colonne par une solution tampon au phosphate 0,05M à pH 6,8 et on recueille les fractions de l'hémoglobine modifiée. On désionise les fractions et on les concentre par ultrafiltration en utilisant unemembrane A-15T pour laquelle poids moléculaire d'arrêt est de 15 000 daltons. On filtre le concentré sur une membrane de 0,45 p; le filtrat contient 3,5 g, en matière sèche, d'une combi- naison d'hémoglobine et d'éther monométhylique de polyéthylèneglycol. Environ 10 molécules d'éther monométhylique de polyéthylèneglycol sont combinées avec 1 molécule d'hémoglobine. EXEMPLE 2 On dissout 7,2 g (0,01 mole) d'éther monométhylique de poly- éthylèneglycol de poids moléculaire moyen 750 dans 500 ml de benzène et on ajoute à la solution 10 g de carbonate de sodium. On ajoute ,5 g (0,03 mole) de chlorure de cyanuryle en refroidissant la solution au bain de glace et en agitant vigoureusement. On agite vigoureusement le mélange de réaction pendant une nuit à la tempé- rature ambiante. On sépare le précipité par filtration et on ajoute au filtrat un litre d'éther de pétrole (E. 30-70 C). On sépare le précipité de 2-O-méthoxypolyéthylèneglycol-4,6-dichloro-s-triazine (polyéthyièneglycol activé) et on le lave suffisamment à l'éther de pétrole. La quantlté de polyéthylèneglycol activé sec est de 11,5 g. On dissout 0,5 g 0,0077 millimole) d'hémoglobine dans 100 ml de solu- tion tampon au bozate à pH 9,2 et on ajoute 1,7 g (1,8 millimole) de polyéthylèneglycol activé sec en refroidissant la solution au bain de glace. On agite le mélange pendant 1 h au bain de glace et on répète deux fois l'ultrafiàtration en utilisant une membrane PM-30 de la société Amicon Co., et on élimine ainsi l'hémoglobine restante et le polyéthylèneglycol activé. Le résidu contient 2,1 g de l'hémoglo- bine modifiée, calculée en substance sèche. Environ 50 molécules d'éther monométhylique de polyéthylèneglycol sont combinées avec 1 molécule d'hémoglobine. EXEMPLE 3 On active 19 g (0,01 mole) d'éther monométhylique de poly- éthylèneglycol de poids moléculaire moyen 1900 en utilisant 400 ml de benzène, 10 g de carbonate de sodium et 5,5 g (0,03 mole) de chlorure de cyanuryle de la même manière qu'à l'exemple 2, et on obtient ainsi 24 g du polyéthylèneglycol activé. On traite 6,4 g (3,1 millimoles) du polyéthylèneglycol activé ainsi produit par 2 g (0,031 millimole) d'hémoglobine et 200 ml de solution tampon au borate à pH 9,2 de la même manière qu'à l'exemple 2 et on obtient 5,6 g de l'hémoglobine modifiée. Environ 57 molécules d'éther monométhylique de polyéthylèneglycol sont combinées avec 1 molécule d'hémoglobine. EXEMPLE 4 On active 50 g (0,01 mole) d'éther monométhylique de poly- éthylèneglycol de poids moléculaire moyen de 5 000 en utilisant 500 ml de benzène, 10 g de carbonate de sodium et 5,5 g (0,03 mole) de chlorure de cyanuryle, de la même manière qu'à l'exemple 2, et on obtient ainsi 53 g du polyéthylèneglycol activé. On traite 40 g du polyéthylèneglycol activé par 20 ml de solution à 10 % d'hémoglobine et 450 ml de solution tampon au borate à pH 9,2 de la même manière qu'à l'exemple 2 et on obtient 14 g d'hémoglobine modifiée. Environ molécules d'éther monométhylique de polyéthylèneglycol sont combinées avec 1 molécule d'hémoglobine. EXEMPLE 5 On mélange 40 g (0,002 mole) de polyéthylèneglycol de poids moléculaire 20 000 avec 1 litre de benzène, 10 g de carbonate de sodium et 1,1 g (0, 006 mole) de chlorure de cyanuryle et on agite le mélange pendant une nuit à la température ambiante. On ajoute 1 litre d'éther de pétrole et on traite le précipité formé de la même manière qu'à l'exemple 2 pour obtenir 39 g de polyethylène- glycol activé. On ajoute 10 g (0,0005 mole) du polyéthylèneglycol activé ci-dessus à un mélange de 20 ml (0,00003 mole) de solution d'hémoglobine à io % et 400 ml de solution tampon au borate à pH 9,2 préalablement refroidie au bain de glace et on agite ensuite pendant 1 h. On concentre le mélange de réaction par ultrafiltration en utilisant une membrane XM-100 de la société Amicon Co, et l'hémo- globine modifiée est adsorbée sur une colonne de gel de CM-Sephadex préalablement équilibrée avec une solution tampon au phosphate 0,05M à pH 6,0. On jette la première fraction élude en utilisant une solu- tion tampon au phosphate à pH 6,3 et on recueille la fraction suivante éluée en utilisant une solution tampon au phosphate à pH 6,8. On concentre la fraction en utilisant la membrane XM-100 et on obtient 3 g d'hémoglobine modifiée, en matière sèche. Environ 4 molécules de polyéthylèneglycol sont combinées avec 1 molécule d'hémoglobine. EXEMPLE 6 En utilisant 12,5 g (0,005 mole) de monostéarate de poly- éthylèneglycol de poids moléculaire moyen 2500, 400 ml de benzène, 5 g de carbonate de sodium et 2,75 g (0,015 mole) de chlorure de cyanuryle, on effectue le même traitement qu'a l'exemple 2 et on obtient ainsi 13,5 g de polyéthylèneglycol activé. On traite 10,5 g (0,004 mole) du polyéthylèneglycol activé ci-dessus avec 25 ml (0,04 millimole) de solution d'hémoglobine à 10 % et 900 ml de solution tampon au borate à pH 9,2 de la même manière qu'à l'exemple 2 et on obtient 8 g de l'hémoglobine modifiée. Environ 52 molécules de monostéarate de polyéthylèneglycol sont combinées avec 1 molécule d'hémoglobine. EXEMPLE 7 En utilisant 5 g (0,005 mole) d'éther monooldylique de polyéthylèneglycol de poids moléculaire 1000, 400 ml de benzène, g de carbonate de sodium et 2,75 g (0,015 mole) de chlorure de cyanuryle, on effectue le même traitement qu'à l'exemple 2 et on obtient 6 g de polyéthylèneglycol activé. On traite 5,3 g (0,002 mole) du polyéthylèneglycol activé cidessus avec 1,3 g (0,02 millimole) d'hémoglobine de boeuf fabriquée par la société Sigma Co., et 400 ml de solution tampon au borate à pH 9,2 de la même manière qu'à l'exemple 2 et on obtient 4,2 g de l'hémoglobine modifiée. Environ molécules d'éther monooléylique de polyêthylèneglycol sont combinées avec 1 molécule d'hémoglobine. EXEMPLE 8 On dissout 12 g (0,003 mole) de polypropylèneglycol de poids moléculaire moyen 4000 dans 120 ml d'eau. En utilisant 0,0095 mole de bromure de cyanogène, on traite la solution de la même manière qu'à l'exemple 1 et on obtient ainsi un concentré d'ultrafiltration. En utilisant 2 g d'hémoglobine de porc fabriquée par la société Sigma Co., on traite le concentré de la même manière qu'à l'exemple 1, et on- obtient ainsi 7 g de l'hémoglobine modifiée. Environ 15 molécules de propylèneglycol sont combinées avec 1 molécule d'hémoglobine. Expérience On mesure la durée de passage dans un vaisseau sanguin et l'affinité pour l'oxygène des hémoglobines modifiées. On utilise comme échantillon deux rats ayant un poids moyen de 350 g. On injecte aux rats par la veine fémorale 5 ml/kg de poids corporel d'hémoglobine modifiée à 4-6 % et on prélève chaque fois 0,5 ml de sang, 5, 10, 15, 30, 60, 90 et 120 min après l'injection. On centrifuge chaque échantillon de sang et on détermine la concentra- tion de l'hémoglobine modifiée dans le plasma par la méthode spec- trale à- la cyanométhémoglobine. On porte les résultats sur un graphique et on détermine à partir de la courbe la période de séjour de l'hémo- globine modifiée injectée dans le plasma. Les résultats sont indiqués dans le tableau I ci-après. Pour la solution d'hémoglobine modifiée (solution de NaCl M à pH 7,40),on détermine la pression partielle d'oxygène à laquelle l'hémoglobine est à demi-saturée par l'oxygène (valeur P50) par la courbe de dissociation d'oxygène mesurée en utilisant -un appareil Hem-O-Scan de la société Aminco Co. Les résultats sont indiqués dans le tableau II ci-après. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustration et quel'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. TABLEAU I Hémoglobine Période dans le plasma Hémoglobine modifiée de l'exemple 1 150 min Produit de Hémoglobine modifiée de l'exemple 2 120 min l'invention Hémoglobine modifiée de l'exemple 3 110 min Hémoglobine modifiée de l'exemple 4 210 min Hémoglobine naturelle 50 min Témoin Polyhémoglobine de la publication 100 min de brevet japonais n0 76 63920 TABLEAU II _ _ _ _ i Hémoglobine50 P50 Hémoglobine modifiée de l'exemple 2 13,5 mmHg Produit de Hémoglobine modifiée de l'exemple 3 15,0 mmHg l'invention Hémoglobine modifiée de l'exemple 5 19,5 mmHg it l Hémoglobine naturelle 15,0 mmHg Témoin Polyhémoglobine de la publication 9,0 mmHg de brevet japonais n 76 63920 Dextranne-hémoglobine de la publica 10,0 mmHg tion de brevet japonais n 77 51016 RE V E N D I CAT I ON Sdccédané du sang contenant une hémoglobine modifiée comme matière de transport de l'oxygène, caractérisé en ce que l'hémoglobine est combinée avec un polymère choisi parmi le polyéthylèneglycol, le polypropylèneglycol, les copolymères d'éthylèneglycol-propylèneglycol, les éthers des polyalkylèneglycols ci-dessus et d'un alcool en C1-C16, les esters des polyalkylèneglycols ci-dessus et des acides carboxy- liques en C2-C18 et les produits de déshydratation des polyalkylène- glycols ci-dessus et d'une amine en C1-C!8.