Brevet FR2458809A1 — publié le 19810102

245e889 1. Il est bien connu que la détermination de la présence d'un antigène ou d'un anticorps dans les fluides corporels a une grande importance pour le diagnostic ou le traitement de maladies ou d'états en conditions anor- maux ou pathologiques. Récemment, certainscomplexes ou produits de conjugaison.antigène-anticorps étroitement associés à des maladies autoimmunes telles que le lupus érythémateux systémique, l'arthrite rhumatolde et certai- nes néphrites glomérulaires ont été découverts. En consé- quence, la détermination d'un antigène, d'un anticorps ou d'un complexe ou produit de conjugaison antigène-anticorps dans des fluides du corps pour aider au diagnostic ou au traitement d'états ou conditions physiologiques ou patho- logiques tant chez l'homme que chez les animaux gagne actuellement en importance. On notera que les termes "antigène ou anticorps" et antigènes ou anticorps" couvrent ici un "complexe anti- gène-anticorps" et des "complexes antigène-anticorps", sauf indications spéciales contraires. On notera aussi que les termes "complexe antigèneanticorps" et "complexes antigène anticorps" couvrent ici un "produit de conjugaison antigène- anticorps" et des "produits de conjugaison antigène-anti- corps", sauf indications contraires. Un des procédés classiques de détermination des antigènes, dès anticorps, ou des complexes antigène- anticorps est le procédé "du type.surlame". Ce procédé comporte deux opérations. La première consiste à lier une substance qui est spécifiquement liable à un antigène ou a un anticorps à la surface d'un support qui est composé de particules insolubles en grains fins et de mettre en suspension la substance liée dans un liquide approprié. La seconde consiste à mélanger la suspension, qui est pré- parée dans la première opération, avec une solution d'é- chantillon qui contient l'antigène ou l'anticorps à déter- miner. Avec ce procédé, on peut déterminer semi-quantita- tivement diverses espèces d'antigènes et d'anticorps en observant l'agglutination de la suspension. On connait également des procédés pour détermi- ner quantitativement un antigène ou un anticorps dans une 2459B09 2. solution dfdchantillon en mesurant par voie spectrophoto- métrique ou électrique les résultats de la réaction d'ag- glutination, en utilisant les mêmes matières que dans le procédé "du type sur lame" (Croatica Chemica Acta, 42, 457-466 (1970); European Journal of Biochemistry, 20, 553-560 (1971); demande de brevet japonais publiée NO 24.015/1978; demande de brevet japonais publiée NO 69. 824/1 978). :Parmi ces procédés de mesure quantitatifs, le procédé de mesure spectrophotométrique des résultats de la réaction d'agglutination peut être esquissé comme suit: une substance spécifiquement liable à un antigène ou à un anticorps à déterminer, telle que par exemple, l'antigène ou l'anticorps correspondant à l'antigène ou à l'anticorps à déterminer, est physiquement ou chimiquement liée à des particules de support insolubles, finement divisées pour donner des particules de support sensibilisées qui sont ensuite mises en suspension dans un liquide approprié et mises à réagir avec une solution d'échantillon contenant l'antigène ou l'anticorps à déterminer dans des conditions déterminées à l'avance, et le mélange réactionnel est sou- mis à une mesure d'absorbance ou de turbidité pour déter- miner quantitativement l'antigène ou l'anticorps à déter- miner présent dans la solution d'échantillon. On notera que les expressions "particules de support sensibilisées" ou "particule de support sensibilisée" désignent ici la particule de support insoluble sensibilisée par liaison à celle-ci d'une substance spécifiquement liable à l'anti- gène ou à l'anticorps à déterminer. Le procédé spectrophotométrique ci-dessus se heurte cependant à des difficultés pour fournir une déter- mination quantitative précise de l'antigène ou de l'anti- corps. Dans ce procédé, on mesure l'absorbance ou la turbidité d'un mélange réactionnel alors que la réaction est toujours en cours dans ce mélange, de sorte que son absorbance ou sa turbidité tendront à varier fortement avec le temps, puisque la réaction se poursuit même après la période de réaction choisie à l'avance. En conséquence, ce procédé exige que la mesure de l'absorbance ou de la 3. turbidité soit effectuée aussitôt après que la période de réaction prédéterminée s'est écoulée; sinon, les varia- tions des valeurs mesurées seront telles que la précision de la mesure diminuera. Ces difficultés poseront des pro- blèmes dans l'application pratique de ce procédé à la détermination quantitative effective d'un antigène ou d'un anticorps. Dans les procédés quantitatifs classiques, la réaction d'une suspension de particules de support sensie- bilisées et d'une solution d'échantillon peut souvent être effectuée sous agitation pour accélérer la réaction. Ce- pendant, les agrégats formés par la réaction antigène- anticorps peuvent être décomposés aisément par des chocs ou stimuli mécaniques lorsque ceux-ci dépassent le pouvoir de liaison dans les agrégats résultant de la réaction antigène-anticorps. En outre, la mesure dans laquelle les agrégats sont décomposés varie fortement avec les condi- tions d'agitation, de sorte que la précision ou la sensi- bilité de la mesure diminue. Pour fournir un mode opératoire spectrophotomé- trique ayant une sensibilité et une précision améliorées dans la détermination d'un antigène ou d'un anticorps dans une solution d'échantillon, on a effectué des études pous- sées en supposant que les divers problèmes et difficultés associés aux techniques spectrophotométriques classiques seraient surmontés si la réaction d'agglutination ou la réaction d'inhibition de l'agglutination étaient arrêtées à un stade approprié de la réaction et si les agrégats formés par la réaction étaient fixés, ce qui leur éviterait de se désagréger sous l'effet de sollicitations mécaniques telles que l'agitation. Comme résultat de ces études, on a trouvé que l'utilisation d'un composé fixant pouvait arrêter la réac- tion d'agglutination ou la réaction d'inhibition de l'ag- glutination à un stade désiré de la réaction et éviter que les agrégats formés ne se décomposent. En conséquence, le but principal de la présente invention est de fournir un procédé spectrophotométrique pour la détermination quantitative d'un antigène ou d'un 4. anticorps avec une sensibilité et une précision élevées. Un autre but de l'invention est de fournir un procédé de quantification spectrophotométrique d'un anti- gène ou d'un anticorps dans une solution d'échantillon, dans laquelle la réaction d'agglutination ou la réaction d'inhibition de l'agglutination peuvent être arrêtées dans un état de réaction désiré. Un autre but de la présente invention est de fournir un procédé spectrophotométrique pour la quantifi- cation d'un antigène ou d'un anticorps dans une solution d'échantillon, dans lequel des agrégats formés par la réaction d'agglutination ou par la réaction d'inhibition de l'agglutination sont fixés pour éviter ainsi la décom- position lors de sollicitations mécaniques telles que l'agitation. Un autre but de l'invention est de fournir un nécessaire ou une trousse de réactifs pour l'utilisation dans la quantification spectrophotométrique d'un antigène ou d'un anticorps. Un autre but de l'invention est de fournir un nécessaire-ou trousse à réactifs du type applicable au procédé de l'invention. D'autres buts et caractéristiques de l'invention ressortiront de la description ci-après des dessins an- nexés, et de ses modes de réalisation préférés. Pour faire mieux comprendre la présente inven- tion, on décrira à présent, à titre de pure illustration, un mode de réalisation de celle-ci en se référant aux dessins annexés dans lesquels: la Fig. 1 est un diagramme comparant le procédé de mesure de la présente invention avec le procédé classi- que en ce qui concerne la précision de la mesure; la Fig. 2 est un diagramme comparant les effets des divers composés fixants; la Fig. 3 est un diagramme montrant des courbes d'étalonnage dans le procédé de détermination de l'inven- tion utilisant divers supports en particules fixes; la Fig. 4 est un diagramme montrant une courbe d'étalonnage pour mesurer l'" -fétoprotéine de l'exemple 1 5. ci-après; la Fig. 5 est un diagramme montrant une courbe d'étalonnage pour mesurer la gonadotrophine chorionique humaine de l'exemple 2 ci-après; la Fig. 6 est un diagramme montrant une courbe d'étalonnage pour doser l'oestriol par la réaction d'inhi- bition de l'agglutination de l'exemple 3 ci-après; la Fig. 7 est un diagramme représentant une courbe d'étalonnage pour doser le facteur rhumatoîde par le procédé de turbidité de l'exemple 4 ci-après; la Fig. 8 est un diagramme représentant une courbe d'étalonnage pour doser la gammaglobuline humaine de l'exemple 5 ci-après; la Fig. 9 est un diagramme représentant une courbe d'étalonnage pour doser l'c -fétoprotéine de l'exem- ple 6 ci-après; et la Fig. 10 est un diagramme montrant une courbe d'étalonnage pour doser l'oestriol de l'exemple 7 ci-après. La présente invention concerne un procédé de dosage d'un antigène, d'un anticorps, d'un complexe ou produit de conjugaison antigène-anticorps et un nécessaire ou trousse destiné à l'utilisation dans ce dosage. Les réactions immunochimiques sur lesquelles est basé le procédé de l'invention peuvent comprendre la réac- tion d'agglutination immunochimique et la réaction d'inhi- bition de l'agglutination. Le procédé basé sur la réaction d'agglutination immunochimique conforme à l'invention con- siste à effectuer la réaction d'agglutination immunochimi- que d'au moins un membre du groupe formé des antigènes, des anticorps, et des complexes antigène-anticorps à doser avec des particules de support sensibilisé obtenues en liant à des particules de support insolubles un antigène ou un anticorps correspondant à l'antigène ou à l'anticorps à doser et à soumettre le mélange réactionnel à une mesure d'absorbance ou de turbidité par irradiation avec une lu- mière de longueur d'onde appropriée. De son côté, le pro- cédé basé sur la réaction d'inhibition de l'agglutination conforme à la présente invention met en jeu une réaction d'inhibition de l'agglutination immunochimique dans la-, 6. quelle l'antigène ou l'anticorps à doser inhibe la-réac- tion d'agglutination immunochimique des particules de support insolubles avec un agent agglutinant, et la mesure du mélange réactionnel de la même manière que ci-dessus. Conformément à la présente invention, le pro- cédé basé sur une réaction d'agglutination immunochimique peut être effectué de la manière qui sera décrite avec plus de détails ci-après. De son côté, le procédé basé sur la réaction d'inhibition de l'agglutination immuno- chimique peut être effectué pratiquement de la même ma- nière que la réaction d'agglutination sauf indications spécifiques contraires. La mdhode de mesure sur laquelle est basé un mode de réalisation du procédé de l'invention met en jeu les opérations consistant à (1) provoquer une réaction antigène-anticorps entre (a) des particules de support sensibilisées comme premier constituant et (b) un anti- gène, un anticorps ou un complexe ou produit de conjugai- son antigène-anticorps comme second constituant dans une solution d'échantillon, ce premier constituant étant formé en liant (I) une substance choisie parmi le groupe constitué des antigènes, des anticorps et des complexes antigène-anticorps correspondant aux antigènes, aux anti- corps et aux complexes et produits de conjugaison anti- gène-anticorps à doser à (II) des particules de support insolubles finement divisées de telle sorte qu'au moins deux unités dé ces substances soient liées à chaque sup- port particulaire et que ce second constituant soit capa- ble de provoquer la réaction d'agglutination immunochi- nique avec la substance liée aux particules de support sensibilisées, en fixant les agrégats formés par la réac- tion antigène-anticorps par addition d'un composé fixant à la solution d'échantillon, et (2) en irradiant le mé- lange réactionnel avec un rayonnement de longueur d'onde appropriée et enmesurant l'absorbance ou la turbidité du mélange réactionnel, déterminant ainsi la quantité ou la concentration de l'antigène ou de l'anticorps à doser. Dans la réaction d'agglutination immunochimique qui est à la base du procédé de détermination de l'inven- 7. tion, on commence par lier physiquement ou chimiquement un antigène ou un anticorps pouvant être lié spécifique- ment à l'antigène ou à l'anticorps à doser et par exemple correspondant à celui-ci, à des particules de support insolubles finement divisées. On connait un certain nombre de modes opératoires pour lier à des particules de support finement divisées un antigène ou un anticorps spécifique- ment liable à l'antigène ou à l'anticorps à doser. En général, on utilise des procédés de sorption physique ou de liaison chimique (demande de brevet japonais NI 16.623/ 1972 et demande de brevet japonais NO 8.868/1973). Le support en particules fines utilisé dans l'invention peut être n'importe quel support classiquement utilisé comme particules de support sensibilisées desti- nées à l'utilisation dans des réactifs pour essais du type "sur lame" et il comprend un latex de polymère organique tel que un latex de polystyrène, un latex de polystyrène carboxylé, un latex de copolymère styrène-divinyl benzène, un latex de copolymère styrène hydroxylé ou carboxylé- divinyl benzène, un latex d'alcool polyvinylique, un latex d'ester polyalcrylique ou un copolymère acétate-acrylate de vinyle, une matière minérale telle que par exemple de la silice, du noir de carbone ou de l'alumine, ou des cel- lules telles que par exemple des bactéries ou des érythro- cytes. On peut préparer une suspension des particules de support sensibilisées en mettant en suspension les parti- cules de support sensibilisées dans une solution appropriée classiquement utilisée pour donner une suspension de parti- cules de support sensibilisées. Les particules de support sensibilisées peuvent être mises en suspension dans celle- ci à raison d'environ 0,1 à environ 200 mg, de préférence d'environ 1 à environ 50 mg par ml de solution. La solution dans laquelle les particules de support sensibilisées sont mises en suspension peut comprendre de l'eau ou tout autre liquide qui n'affecte pas dans un sens défavorable la réac- tion et les conditions impliquées dans le procédé de mesure conforme à l'invention. On ajoute ensuite à la suspension de particules 8. de support sensibilisées une solution contenant un antigène ou un anticorps à doser pour provoquer la réaction d'agglu- tination immunochimique de l'antigène ou de l'anticorps à doser avec les particules de support sensibilisées. On peut généralement -utiliser à cet effet une proportion aus- si faible qu'environ 0,05 à 1,0 ml du mélange réactionnel obtenu par la réaction d'agglutination immunochimique. Lorsque la quantité de mélange réactionnel est trop faible, de sorte que la mesure de l'absorbance ou de la turbidité du mélange réactionnel serait difficile, on peut y ajouter un solvant approprié tel que du sérum physiologique, lors- que la fixation de la réaction d'agglutination immunochi- mique par un composé fixant est terminée, pour augmenter le volume du mélange réactionnel de façon à pouvoir effec- tuer la miesure d'absorbance du mélange réactionnel. Les températures auxquelles la suspension de particules de support sensibilisées est mise à réagir avec une solution d'échantillon ne sont pas particulièrement limitées et peuvent en général être n'importe quelle tem- pérature arbitraire à laquelle la réaction antigène-anti- corps s'effectue. Les temps pendant lesquels la réaction ci-dessus de la suspension de particules de support sensi- bilisées avec la solution d'échantillon s'effectue peuvent généralement être d'1 minute à 24 heures, mais de préfé- rence d'environ 3 minutes à 120 minutes pour des raisons de précision et de commodité de la mesure. Pour que la réaction s'effectue de manière homogène et régulière, on préfère que le mélange réactionnel soit agité progressive- ment et lentement. Conformément à la présente invention, on utilise un composé fixant pour arrêter la réaction antigène-anti- corps provoquant l'agglutination des particules de support sensibilisées dans la suspension avec l'antigène ou l'anti- corps à doser. Les composés fixants utilisables dans l'inven- tion peuvent comprendre des composés polyfonctionnels tels que par exemple des carbodiimides, comme le 1-éthyl-3-(3- diméthyl-aminopropyl)-carbodiimide (désigné ci-après sous le nom de "propyl carbodiimide") et le 1-cyclohexyl-3-(2- 9. morpholino éthyl)-carbodiimide (désigné ci-après sous le nom de "morpholino carbodiimide"), des dialdéhydes comme le glutaraldéhyde et le succinaldéhyde, des agents acylants comme le N-éthyl-5-phénylisoxazonium3'-sulfonate, le chlorure de succinyle, etc..; ils comprennent aussi des agents de dénaturation des protéines tels que l'acide tannique, le formol, l'acide perchlorique, l'acide trichlo- racétique, l'acide thiocyanique et l'acide thioglycolique, etc.. Les composés fixants utilisables dans l'inven- tion peuvent être ajoutés au système réactionnel à n'im- porte quel moment entre le début et la fin de la réaction d'agglutination. En général, le composé fixant de l'inven- tion sera ajouté après que l'on ait fait réagir le réactif en suspension avec une solution d'échantillon pendant un certain temps qui sera déterminé en tenant compte du sys- tème utilisé. Cependant, le composé fixant peut être ajouté au système en même temps-que les autres constituants pour simplifier et raccourcir les opérations de la réaction. Le temps nécessaire pour la fixation des agré- gats et la concentration optimale du composé fixant néces- saire pour la fixation de ceux-ci sont interdépendants, et on peut en outre les faire varier avec la nature du composé fixant de telle sorte qu'ils ne sont généralement pas limités à des valeurs particulières. En pratique, le temps de fixation peut aller d'environ 3 à environ 120 mi- nutes, et la concentration optimale des composés fixants au moment de la fixation peut de préférence être d'environ 0,1 à 40 % pour le propyl carbodiimide, d'environ 0,1 à 5% pour le morpholino carbodiimide, d'environ 0,1 à 20 % pour le glutaraldéhyde et d'environ 1 à 30 % pour le formol. La concentration du composé fixant peut cependant être un peu inférieure lorsque le composé fixant est ajouté au système en même temps que la suspension de particules de support sensibilisées et la solution d'échantillon. La quantité de composé fixant ajoutée au système réactionnel conformément à l'invention peut généralement aller d'environ 0,001 à 10 ml et de préférence d'environ 0,01 à 3 ml suivant le mélange réactionnel à doser. 10. L'avancement de la réaction peut être pratique- ment arrêté par dilution du mélange réactionnel, car ceci tend à abaisser la vitesse de réaction. Lorsqu'on ajoute au système réactionnel une grande quantité de solution de composés fixants, ceci peut provoquer simultanément l'arrêt de l'avancement de la réaction et la fixation des agrégats. En conséquence, lorsque le mélange réactionnel est dilué, le composé fixant peut être ajouté à une concentration suffisante pour fixer simplement l'agrégat, de telle sorte qu'il n'arrête pas nécessairement la réaction antigène- anticorps. La solution tampon qui peut être utilisée pour diluer le mélange réactionnel à une concentration appro- priée est une solution habituellement utilisée dans le domaine de l'immunochimie; elle comprend par exemple une solution de sérum physiologique tamponnée à la glycine, une solution de sérum physiologique tamponnée au phosphate et une solution de sérum physiologique tamponnée au borate. On peut ajouter à cette solution tampon une quantité appro- priée d'une protéine telle que le sérum albumine de boeuf et/ou le sérum globuline de lapin pour améliorer la repro- ductibilité de la réaction. L'addition de la solution tam- pon peut servir aussi à maintenir le système réactionnel à un pH et à une force ionique appropriés. Lorsque la fixation des agrégats est terminée, le mélange réactionnel contenant les agrégats est soumis à une mesure d'absorbance par des procédés classiques. Bien qu'on puisse utiliser n'importe quels rayonnements ayant des longueurs d'onde dans l'intervalle de 320 à 2400 nm, et de préférence de 400 à 900 nm, une longueur d'onde de mesure appropriée peut être choisie adéquatement dans l'intervalle de longueurs d'onde ci-dessus, car la longueur d'onde appropriée peut varier avec la nature des consti- tuants de la solution d'échantillon et la nature du support en particules fines et/ou la taille de ses particules. La turbidité du mélange réactionnel peut aussi être mesurée à la place de l'absorbance d'une manière classique. La quantification de l'antigène ou de l'anti- corps à doser dans le mélange réactionnel peut s'effectuer i1. par comparaison avec une courbe d'étalonnage de l'antigène ou de l'anticorps à doser. Pour construire la courbe d'é- talonnage de chacun des antigènes ou des anticorps à doser, on peut effectuer une série d'opérations en dissolvant une substance de référence identique en soi, ou identique par sa réactivité, à l'antigène ou à l'anticorps à doser, dans des quantités variables d'une solution tampon appro- priée comme il a été indiqué ci-dessus, pour donner une solution d'essai étalon avec une quantité donnée de la suspension de particules de support sensibilisées dans des conditions prédéterminées, en ajoutant aussitôt après le composé fixant pour empêcher la réaction de se poursuivre, de sorte que les agrégats formés sont fixés, et en mesu- rant dans une cellule de mesure l'absorbance ou la turbi- dité du mélange réactionnel, qui peut être dilué si néces- saire avec un liquide ou une solution tampon appropriés. La courbe d'étalonnage peut être construite pour donner les relations entre la quantité ou la concentration de la substance étalon et son absorbance ou sa turbidité. La quantification de l'antigène ou de l'anticorps à détermi- ner peut s'effectuer en faisant réagir les particules de support sensibilisées avec un échantillon inconnu pratique- ment de la même manière et dans les mêmes conditions que * pour la courbe d'étalonnage pour une solution d'échantil- lon étalon, en mesurant l'absorbance ou la turbidité du mélange réactionnel, et en comparant les résultats de l'essai à la courbe d'étalonnage ainsi préparée, ce qui permet la quantification de l'antigène ou de l'anticorps à doser dans l'échantillon inconnu. Pour augmenter la sensibilité de la mesure, on préfère utiliser une suspension de particules de support sensibilisées ayant une concentration un peu plus élevée. On peut ainsi être amené à opérer avec une telle concen- - tration relativement élevée. Dans les procédés de mesure classiques, le mé- lange réactionnel est soumis directement à la mesure sans dilution car la dilution du mélange réactionnel peut dé- truire les agrégats formés. En conséquence, lorsque la concentration de la suspension est trop élevée, il est 12. difficile de mesurer le mélange réactionnel, de sorte que l'utilisation de procédés de mesure classiques est limi- tée à un mélange réactionnel dans lequel la concentration de la suspension est inférieure à 0,6 % en poids (deman- de de brevet japonais nO 24.015/1978). Cependant, dans la présente invention, le mélange réactionnel peut être utilisé même dilué, si nécessaire, de sorte que la pré- sente invention peut donner la sensibilité de réaction la plus élevée même lorsque la concentration de la sus- pension est d'environ 1 % en poids. Le procédé basé sur la réaction d'inhibition de l'agglutination immunochimique de l'invention consiste à mesurer les variations d'absorbance et de turbidité provoquées par la réaction d'inhibition de l'agglutina- tion immunochimique dans laquelle l'antigène ou l'anti- corps à doser inhibe la réaction d'agglutination immuno- chimique des particules de support insolubles ci-dessus avec un agent agglutinant. L'agent d'agglutination qui doit être utilisé dans un des modes de réalisation de l'invention est un agent qui peut provoquer l'induction de l'agglutination de la suspension de particules de support sensibilisées lorsque la solution d'échantillon ne contient qu'une quantité d'antigène ou d'anticorps à doser faible, ou très faible, voire nulle. Il comporte généralement un antigène ou un anticorps spécifiquement liables aux parti- cules de support sensibilisées et un antigène ou un anti- corps qui est lié au support en particules fines insolu- bles. Le procédé de mesure sur lequel est basé l'autre mode de réalisation du procédé de l'invention consiste à provoquer la réaction antigène-anticorps entre des parti- cules de support sensibilisées comme premier constituant, un antigène ou un anticorps à doser comme second consti- tuant, et un agent d'agglutination comme troisième consti- tuant, ce premier constituant étant formé en liant une substance choisie parmi les antigènes, les anticorps et les complexes antigène-anticorps correspondant aux anti- gènes, aux anticorps, et aux complexes et produits de 13. conjugaison antigène-anticorps à doser, à des particules de support insolubles finement divisées de telle sorte qu'au moins deux unités de ces substances soient liées à chaque support particulaire, ce second constituant étant capable de provoquer la réaction d'agglutination immuno- chimique avec la substance liée aux particules de support sensibilisées, et ce troisième constituant étant au moins une substance choisie parmi les antigènes, lesanticorps et les complexes antigène-anticorps capables de provoquer la réaction immunochimique avec ce premier constituant, à fixer les agrégats formés par la réaction antigène-anti- corps par addition d'un composé fixant à la solution d'échantillon, à irradier le mélange réactionnel avec un rayonnement de longueur d'onde appropriée, et à mesurer l'absorbance ou la turbidité du mélange réactionnel, pour déterminer ainsi la quantité ou la concentration de l'an- tigène ou de l'anticorps à doser. A une solution d'échantillon additionnée de l'agent d'agglutination, on ajoute une quantité déterminée du composé fixant. L'addition du composé fixant peut être effectuée aussitôt après l'inhibition de la réaction anti- gène-anticorps. Il est possible, cependant, d'ajouter l'agent agglutinant en même temps que les autres ingré- dients nécessaires pour le procédé de mesure de l'inven- tion basé sur la réaction immunochimique d'inhibition de l'agglutination pour simplifier et raccourcir le mode opératoire. Lorsque la réaction antigène-anticorps visée est une réaction d'agglutination, le nécessaire ou la trousse de réactifs de mesure de l'invention comprend (a) une sus- pension de particules de support sensibilisées, (b) une solution tampon et (c) un composé fixant. Lorsque la réaction antigène-anticorps visée est une réaction d'inhi- bition de l'agglutination, le nécessaire ou la trousse de réactifs de mesure de l'invention comprend (a) une suspen- sion de particules de support sensibilisées, (b) une solu- tion tampon, (c) un agent d'agglutination et (d) un com- posé-fixant. Une partie ou la totalité du nécessaire de me- 14. sure de l'invention peut être constituée de réactifs lyo- philisés. Dans ce cas, on peut joindre au nécessaire de mesure un solvant approprié, qui sera utilisé pour dissou- dre les réactifs lyophilisés lors de l'utilisation du nécessaire.Pour utiliser commodément le nécessaire de me- sure de l'invention, on peut lui joindre un tube à essais, une pipette et d'autres accessoires. Comme antigènes ou anticorps que l'on peut doser au moyen du procédé et du nécessaire de mesure de l'inven- tion, on peut citer des hormones protéiniques telles que la gonadotrophine chorionique humaine, l'insuline, et l'hormone de croissance humaine, des substances protéini- ques telles que l't(-fétoprotéine)le virus de l'hépatite B (HBS), l'immunoglobuline, des complexes antigène-anticorps, la céruloplasmine et la transferrine, et des haptènes tels que la thyroxine, la testostérone, la phénitoine et le phénobarbital. Le procédé de l'invention présente les avantages suivants: Comme la réaction antigène-anticorps est stop- pée par addition du composé fixant au mélange réactionnel, la réaction ne se poursuit pas plus avant pendant que l'on mesure l'absorbance. En conséquence, les variations des valeurs mesurées peuvent être réduites et la précision de la mesure peut être améliorée. Comme les agrégats formés par la réaction sont fixés par le composé fixant, la résistance mécanique des agrégats est augmentée et la désagrégation des agrégats formés par agitation du mélange réactionnel ou transfert du mélange réactionnel, par exemple dans une cellule de mesure de l'absorbance ou de la turbidité, peut être re- marquablement réduite. En conséquence, la variation des valeurs mesurées ou la réduction de la précision de la me- sure attribuée à la désintégration des agrégats formés peut être empêchée et la mesure peut être effectuée avec une haute précision et une sensibilité élevée. Un autre avantage de l'invention est qu'elle ne nécessite pas d'appareil de mesure spécial. Plus précisé- ment, dans le procédé de mesure de l'invention, comme la r i 15. poursuite de la réaction est arrêtée par addition du com- posé fixant, on dispose d'un temps suffisant pour faire passer le mélange réactionnel dans une cellule pour la mesure de son absorbance. En outre, comme les agrégats formés sont fixés d'une manière stable, la désintégration des agrégats par transfert du milieu réactionnel peut être empêchée efficacement, En conséquence, l'opération peut être effectuée en utilisant un récipient à réaction ordi- naire, et aucun appareil spécial n'est nécessaire. Un autre avantage du procédé de dosage de l'in- vention est que toutes les opérations de dosage peuvent être rendues automatiques. Plus précisément, comme il a été décrit précédemment, la résistance mécanique des agré- gats peut être augmentée par addition du composé fixant dans le procédé de dosage de l'invention, et par conséquent la désintégration des agrégats formés par transfert ou agitation du mélange réactionnel peut être remarquablement réduite. En conséquence, toutes les opérations, y compris les opérations de transfert et d'agitation, peuvent être automatisées. Un autre avantage du procédé de l'invention est que la mesure quantitative peut être effectuée en utili- sant des réactifs pour la détermination semi-quantitative classique effectuée sur une lame. Le nécessaire ou trousse de dosage de l'invention ne diffère du nécessaire à réac- tifs pour la détermination semi-quantitative classique que par l'addition du composé fixant. En conséquence, lorsqu'on utilise le nécessaire de dosage de l'invention, la réaction qui était effectuée jusqu'ici sur une lame est effectuée dans un tube à essais, et l'absorbance ou la turbidité est alors mesurée conformément au mode opératoire indiqué ci- dessus, qui permet de réaliser une détermination quantita- tive. En conséquence, si le composé fixant de l'inven- tion est associé au nécessaire à réactifs classique, on peut choisir suivant les besoins, le procédé de détermina- tion semi-quantitatif par l'essai à la lame, ou le procédé de détermination quantitative mesurant-l'absorbance. La Fig. 1 est un diagramme comparant la préci- 16. sion de mesure pouvant être obtenue par le procédé de- l'inven&tion dans lequel les agrégats sont fixés par addi- tion d'un composé fixant au mélange réactionnel, avec la précision de mesure pouvant être atteinte par le procédé classique n'utilisant pas de composé fixant. Plus préci- sément, conformément au procédé décrit dans l'exemple 1 ci-après, on fait réagir un latex sensibilisé à l'anti-u fétoprotéine avec une solution d'un échantillon étalon d'" -fétoprotéine, et on ajoute au mélange réactionnél une suspension de propyl carbodiimide à 10% comme %omposé fixant, ou on n'en ajoute pas du tout. Dans chaque cas, le transfert du mélange réactionnel dans un récipient différent est répété plusieurs fois, et l'absorbance du mélange réactionnel est mesurée pour examiner les varia- tions dans les valeurs mesurées du fait des transferts répétés ci-dessus. Comme il ressort de la figure 1, dans le procédé classique n'utilisant pas de composé fixant, l'absorbance augmente à chaque transfert du mélange réac- tionnel, on constate par conséquent que les agrégats formés sont désintégrés par le stimulus mécanique provo- qué par le transfert. Au contraire, conformément au procédé de l'inven- tion utilisant un composé fixant, la variation de la va- leur mesurée sous l'effet du transfert est très faible et on constate que les agrégats ne se désintègrent pratique- ment pas. La Fig. 2 montre les résultats d'une comparaison des effets de divers composés fixants. Plus précisément, on fait réagir de la manière décrite ci-dessus un latex sensibilisé à l'anticorps anti- 0-fétoprotéine avec une solution d'échantillon étalon d'> -fétoprotéine, et on ajoute séparément au mélange réactionnel divers composés fixants pour construire les courbes d'étalonnage de la Fig. 2. La Fig. 2 montre que lorsqu'on utilise ces compo- sés fixants, on obtient des courbes d'étalonnage plus abruptes et que la fixation des agrégats formés par la réaction antigène-anticorps est d'une grande utilité. La Fig. 3 donne des exemples de courbes d'étalon- nage obtenues en préparant des réactifs sensibilisés à un 17. anticorps anti-o-fétoprotéine conformément au procédé décrit dans l'exemple 1 ci-après en utilisant divers sup- ports de particules fines et en mesurant un échantillon étalon d'C -fétoprotéine en utilisant ces réactifs. On constate aisément d'après la Fig. 3 que des courbes d'étalonnage analogues peuvent être obtenues quel- le que soit la nature du support utilisé. Les exemples non limitatifs suivant sont donnés à titre d'illustration de l'invention. ExemDle 1 Cet exemple illustre le dosage de l' -fétopro- téine (AFP) (a) On dissout un anticorps anti-AFP à la concentration de 0, 08 % dans une solution de sérum physiologique tamponnée à la glycine (GBS) ayant un pH de 8,2, et on ajoute 5 ml de la solution à 5 ml d'une suspension à 10 % de latex de polystyrène (produit par Dow Chemical Co. à Midlang, Michigan; taille moyenne de particules = 0,48 um) et on effectue l'incubation à 450 C pendant 60 minutes pour sensi- biliser le latex de polystyrène avec l'anticorps anti-AFP. Après la sensibilisation, on élimine le liquide surnageant par séparation centrifuge et on met le précipité en sus- pension dans 50 ml de GBS contenant 0,1 % de sérum albu- mine de boeuf (B3SA) pour former un latex sensibilisé par l'anticorps anti-AFP. (b) On extrait i'AFT du fluide ascitique d'un malade atteint d'un hépatome par le procédé de Nishi et al. ancer Res. 30, 2507-2523(1970)_7, et on dissout l'AFP purifié dans une solution à 0,1 % de BSA à une concentration de 103, 102, 101 ou O ng/ml en tant que solution d'échan- tillon étalon. Puis on place dans un tube à essais 25,,1 de la solution d'échantillon étalon, 50,ul de GBS, et 25jul du latex sensibilisé à l'anticorps anti-AFP préparé en (a) ci- dessus. On effectue la réaction à la température ambiante pendant 40 minutes sous agitation modérée. Après la réac- tion, on ajoute 0,1 ml d'une solution de propyl carbodiimi- de GBS à 10 % en tant que composé fixant au mélange réac- tionnel et on effectue la réaction pendant 20 minutes en 24S8809 18. agitant. Après la réaction, on ajoute au mélange réaction- nel 4 ml d'une solution de sérum physiologique et on mesure l'absorbance à une longueur d'onde de 500 nm avec un spec- trophotomètre (Hitachi modèle 624, fabriqué par Hitachi Ltd, Tokio, Japon) . La mesure est effectuée 2 fois pour chaque solution étalon. Les résultats obtenus sont portés sur un graphique, ce qui fournit la courbe d'étalonnage de la Fig. 4. (c) La concentration de l'AFP dans les sérums de malades atteints d'hépatomes est déterminée à l'avance par un pro- cédé semi-quantitatif, et chacun des sérums est dilué d'une manière appropriée sur la base des résultats obtenus. On introduit 25.ul du sérum dilué dans un tube à essais et on mesure l'absorbance suivant le mode opératoire décrit en (b) ci-dessus. Les concentrations de 'ltAFP dans les sérums des malades sont déterminées à partir des valeurs obtenues respectivement en utilisant la courbe d'étalonnage construite en (b) ci-dessus. Le tableau 1 donne les résul- tats obtenus. Tableau 1 Exemple 2 Cet exemple illustre le dosage de la gonadotro- phine chorionique humaine (HCG). (a) conformément aux modes opératoires décrits dans l'exem- ple 1 (a), on mélange un anticorps anti- HCG et un latex de polystyrène carboxylé (produit par la Dow Chemical Co.; taille moyenne de particules = 0,25 um) et on les fait incuber pour former un latex sensibilisé parl'anticrps anti-HoG. Echantillon Concentra Malade matière rapport de absorbance tion de NO dilution l'AFP (fois) (ng/ml) 1 sérum 1 0,611 62 2 sérum 40 0,541 4520 3 sérum 40 0,581 450 3 sérum 40 0,581 3450 4 sérum 1 0,321 298 sérum 30 0, 553 3600 (b) On dissout de 1'HCG (ayant une activité spécifique de 6000 U. I./mg dans de la GBS aux concentrations de 8, 4, 2, 1, 0, 5 et 0,25 U.I. /ml) pour former des solutions d'échantillon étalon. On place dans un tube à essais 25 ,ul de la solution d'échantillon étalon, 50,nl d'une solution tampon et 25/u1 du latex sensibilisé à l'anticorps anti-HCG préparé en (a) ci-dessus. On effectue la réac- tion à la température ambiante pendant 60 minutes sous agitation modérée. Après la réaction, on ajoute 4ml de solution de glutaraldéhyde à 10 % au mélange réactionnel et on poursuit la réaction pendant 30 minutes. On mesure l'absorbance à 500 nm pour obtenir la courbe d'étalonnage de la Fig. 5. (c) On traite du sérum ou de l'urine humains par les modes opératoires décrits en (b) ci-dessus et on déter- mine l'absorbance. Puis on détermine la quantité de HCG dans l'échantillon de sérum ou d'urine sur la base de la courbe d'étalonnage construite en (b) ci-dessus. Le ta- bleau 2 donne les résultats obtenus. Les résultats obte- nus par le procédé de l'essai sur lame (sensibilité mini- ma: 1 U.I./ml) et par le procédé radio-immunologique (procédé RIA) sont également donnés dans le tableau 2 à titre de référence. TABLEAU 2 _, Echan:illon concentration rocédé procde MAàlàde matière raonort absorbance le i'HCG S e l'es- R.I.A. N dçê i.lu- N tî_.,Iion- (moyenne) (U.i./m m sur (U./.) (fois) úalne (). 1 urine 1 0 589 0,28 0,41 2 urine 1 0,421 099 + 1,02 3 urine 1 0,458 0,86 + 0189 4 urine 0,212 2193 + 3,21 urine 10 0339 13,67 17,36 6 serUn 1 07543 0,54 0, 66 7 serum 1 0,203 3,32 ++ 3,12 8 serum 1 0,551 0,86 + 0,91 9 serum 1 0, 458 0,50 0,57 seran 1 0,309 1,55 + 2,26 -: as de HCG ou 1 l U.I./r!l de FCG +: env. 1 U.I./ml de HCG : >1 U.I./ml de ECG +: très'supérieur 1 U.I. /mrl de HCG 20. Exemple 3 Cet exemple illustre un mode de réalisation du procédé basé sur la réaction d'inhibition de l'agglutina- tion. (a) Conformément aux modes opératoires décrits dans l'exem- ple 1(a) on sensibilise un latex de copolymère styrène hydroxylé/divinylbenzène (produit Rh8ne-Poulenc, Paris, France; taille moyenne de particules: 0,33am) avec un anticorps antioestriol préparé en utilisant un produit de conjugaison oestriol-16,17- dihémisuccinate/sérum albumine de boeuf (désigné ci-après par "E -BSA") pour former un latex sensibilisé à l'anticorps anti-oestriol. (b) On dissout l'E3-BSA dans une solution de sérum physio- logique à la concentration de 160, 80, 40, 20, 10 et 5 ng/ ml pour former une solution étalon. On ajoute 25 oIl de latex sensibilisé à l'anticorps anti-oestriol préparé en (a) ci-dessus, 25 El d'une solution à 100 "g/ml d'un com- plexe oestrone-17-(0-carboxyméthyl) oxine/sérum albumine de boeuf (désigné ci-après par "E1-BSA") comme agent agglu- tinant et 25 jil de la solution étalon et on effectue la réaction à la température ambiante pendant 40 minutes. Après la réaction, on ajoute 4 ml d'une solution de propyl carbodiimide à 10 % et on effectue la réaction pendant 20 minutes. Puis on mesure l'absorbance.du mélange réactionfel et on obtient la courbe étalon de la Fig. 6. (c) On dilue d'une manière appropriée l'urine de femme enceinte avec une solution de sérum physiologique dont le rapport de dilution a été fixé par les résultats de l'exa- men préliminaire par la détermination semi-quantitative. Par les modes opératoires décrits en (b) ci- dessus, on détermine quantitativement la concentration de l'oestriol dans l'urine. Le tableau 3 donne les résultats obtenus. 21. Tableau 3 N de la semaines Echantillon Concentra- femme de matière rapport Absor- tion de enceinte grossesse de di- bance l'oestriol lution (mg/Il (fois) 1 4 urine 1 0,455 0,08 2 16 urine 10 0, 299 0,48 3 28 urine 50 0,200 1,21 4 31 urine 500 0,534 5,30 36 urine 1000 0,483 9,80 Exemple 4 (a) On sensibilise un latex de polystyrène avec de l'immu- noglobuline (IgG) conformément au mode opératoire décrit dans l'exemple 1(a), pour former un latex sensibilisé à l'IgG dénaturée. (b) On dilue un sérum facteur-rhumatoîde positif comme échantillon étalon à un rapport de dilution de 1600, 800, 400, 200 et 100 fois pour préparer une solution d'échantil- lon étalon. On introduit dans un tube à essais 25 ul de la solution d'échantillon étalon, 50 il de solution tampon et u1 du latex sensibilisé à l'IgG dénaturée préparé en (a) ci-dessus, et on effectue la réaction à la température am- biante pendant 40 minutes. Après la réaction, on ajoute 0,1 ml d'une solution à 10 % de propyl carbodiimide et on effectue la réaction pendant 20 minutes. Puis on ajoute 4 ml de solution de sérum physiologique au mélange réac- tionnel et on mesure la turbidité au moyen d'un turbidi- mètre (Corona UT-11) en considérant la graduation complète comme égale à 100. Un exemple des courbes d'étalonnage est donné à la Fig. 7. (c) En utilisant le sérum d'un malade à la place de la solu- tion étalon, on dose le facteur rhumatoide dans le sérum de la même manière qu'en (b) ci-dessus. Le tableau 4 donne les résultats obtenus. 22. Tableau 4 -: négatif en facteur rhumatoïde +, ++, +++: positif en facteur rhumatoide Exemple 5 (a) Suivant les modes opératoires décrits dans l'exemple 1-(a), on sensibilise un latex de polystyrène avec un anticorps anti- gammaglobuline humaine (HGG) pour obtenir un latex sensibilisé à l'anticorps anti-HGG. (b) On prépare la solution d'échantillon étalon en dissol- vant l'HGG dans une solution tampon à une concentration de 80, 40, 20, 10 et 5 mg/ml. On introduit dans un tube à essais 25 u1 de la solution d'échantillon étalon, 50 1 d'une solution tampon et 0,1 ml d'une solution de propyl carbodiimide à 1 %, on ajoute 25 >l du latex sensibilisé à l'anticorps anti- HGG préparé en (a) ci-dessus et on - effectue la réaction à la température ambiante pendant 40 minutes. Après la réaction, on ajoute 4ml d'une solution de sérum physiologique et on mesure l'absorbance à 500 nm. La Fig. 8 donne un exemple des courbes d'étalonnage ainsi obtenues. La concentration de l'HGG peut être déterminée en utilisant la courbe d'étalonnage de la Fig. 8. Exemple 6 (a) on met en suspension du noir de carbone ("Show black", fabriqué par A. A. Chemical; taille moyenne de particules: 0,02 - 0,04 pm) dans de la GBS à la concentration de 10 %. Puis on mélange 0,5 ml de la suspension avec 2 ml d'une solution d'un anticorps anti-AFP, et on fait incuber à 56 C pendant 20 minutes. Après l'incubation, on élimine le liqui- Echantil- Echantil- Turbidité Rapport de dilu- lon N lon tion (fois) du Appré- sérum facteur ciation RA-positif 1 sérum 89,0 0 2 sérum 66,8 700 ++ 3 sérum 89,7 O0 4 sérum 56,5 300 +++ sérum 77,9 1000 + 23. de surnageant par centrifugation, on met en suspension le précipité résiduel dans 5,5 ml de GBS contenant 0,1 % de BSA, et l'on obtient un noir de carbone sensibilisé à *l'anticorps anti-AFP. (b) On introduit dans un tube à essais 25jul de la solution étalon d'AFP préparée à l'exemple 1-(b), 50/ul d'une solu- tion tampon, et 25 Fl du noir de carbone sensibilisé à l'anticorps anti-AFP préparé en (a) ci-dessus, et on ef- fectue la réaction à la température ambiante pendant 10 minutes. Après la réaction, on ajoute 0,1 ml d'une solution de propyl-carbodiimide à 10 % et on effectue la réaction pendant 20 minutes. Puis on ajoute au mélange réactionnel 4 ml d'une solution de sérum physiologique et on mesure l'absorbance à 500 nm. La Fig. 9 donne un exemple des cour- bes d'étalonnage. La concentration de l'AFP dans le sérum peut être déterminée en utilisant la courbe d'étalonnage. Exemple 7 (a) Conformément au mode opératoire décrit dans l'exemple 1-(a), on sensibilise un latex de copolymère styrène hy- droxylé-divinylbenzène avec de l'E1-BSA pour préparer un latex sensibilisé par l'E1-BSA. (b) On introduit dans un tube à essais 25 1 du latex sen- sibilisé à l'E1-BSA préparé en (a) ci-dessus), 25 ?l d'une solution tampon, et 25 ul de la solution d'échantillon étalon préparée dans l'exemple 3-(b), on ajoute 25 pl du latex sensibilisé à l'anticorps-antioestriol préparé à l'exemple 3-(a) et on effectue les opérations suivantes de la même manière qu'à l'exemple 3. On obtient la courbe d'étalonnage de la Fig. 10. Exemple 8 En suivant les modes opératoires de l'exemple 3, on place dans un tube à essais 25 jul du latex sensibilisé à l'anticorps anli-oestriol, 25/il de la solution d'échan- tillon étalon, 25 pl de l'agent d'agglutination et 1 ml d'une solution tampon, et on effectue la réaction à la tem- pérature ambiante pendant 40 minutes. Après la réaction, on ajoute 0,1 ml d'une solution de propyl carbodiimide à % et on effectue la réaction pendant 20 minutes. On me- sure l'absorbance du mélange réactionnel pour construire 24e8809 24. une courbe d'étalonnage. On répète les opérations ci-dessus de la même manière en utilisant de l'urine de femme encein- te à la place de la solution d'échantillon étalon. On ob- tient des résultats semblables à ceux de l'exemple 3. Exemple 9 (a) On met en suspension Serratia marcescens à une concen- tration de 10 % en poids dans une solution de sérum phy- siologique tamponnée par un phosphate (pH 7,2, PBS), on ajoute à la suspension une quantité égale d'une solution à 3 % de formol dans de la PBS et on agite le mélange à 371C pendant 4 heures. On recueille les cellules par cen- trifugation, on les lave soigneusement à l'eau distillée et on les met en suspension dans de l'eau distillée à la concentration de 5 % en poids. On chauffe la suspension à 1200C pendant 20 minutes, et on recueille les cellules par centrifugation. (b) On détermine la concentration de l'AFP dans le sérum d'un malade de la manière décrite à l'exemple 1 en utili- sant les cellules obtenues en (a) ci-dessus comme support. Les résultats sont semblables à ceux obtenus à l'exemple 1. Exemple 10 Cet exemple illustre un nécessaire ou trousse à réactifs de dosage pour le dosage basé sur la réaction d'agglutination. On prépare un nécessaire à réactifs pour le dosage de l'HCG contenant les réactifs décrits ci-des- sous. (a) Cinq ampoules contenant un échantillon étalon lyophi- lisé de HCG à raison de 4 U.I./ampoule. (b) Un flacon contenant 1,5 ml d'un latex sensibilisé par un anticorps anti-HCG. (c) Un flacon contenant 3 ml d'une solution de sérum phy- siologique tamponnée à la glycine (pH 8,2). (d) Cinq ampoules, contenant chacune un produit lyophilisé préparé en lyophilisant 0,5 ml de solution de propyl carbo- diimide à 24 %. Le dosage à l'aide de ce nécessaire à réactifs s'effectue par exemple comme suit. On dissout une ampoule de l'échantillon étalon de HCG dans une solution de sérum physiologique pour prépa- 24S8809 25. rer des solutions d'échantillon étalon aux concentrations de 4, 2, 1, O, 5 et O U.I./ml, respectivement. On introduit dans un tube à essais 25/pl de la solution d'échantillon étalon, 50 Pl de la solution de sérum physiologique tam- ponnée à la glycine et 25,il du latex sensibilisé à l'an- ti-corps anti-HCG, et on effectue la réaction à la tempé- rature ambiante et sous agitation modérée pendant 40 minutes. On ajoute 1,2 ml d'une solution de sérum physio- logique à une ampoule de propyl carbodiimide, pour servir de solution de produit fixant avant la fin de la réaction ci-dessus. Après la réaction, on ajoute au mélange réac- tionnel 0,1 ml de la solution de composé fixant et on effectue la réaction de fixation à la température ambiante pendant 20 minutes. Après la réaction de fixation, on ajoute 4 ml de solution de sérum physiologique au mélange réactionnel et on mesure l'absorbance à 500 nm pour cons- truire une courbe d'étalonnage. On répète les opérations ci-dessus en utilisant du sérum ou de l'urine d'un malade à la place de la solution d'échantillon étalon, et on détermine la concentration de HCG dans le sérum ou l'urine. Exemple 11 Cet exemple illustre un nécessaire ou trousse de réactifs de dosage pour le dosage basé sur la réaction d'inhibition de l'agglutination. On prépare un nécessaire de dosage de l'oestriol comprenant les réactifs suivants. (a) quatre flacons contenant 1 ml chacun de solutions d'échantillon étalon contenant E3 à des concentrations de , 100, 50 et 25 ng/ml, respectivement, dans une solution de sérum physiologique. (b) un flacon contenant 1,7 ml d'un latex sensibilisé à l'anticorps anti-oestriol. (c) six ampoules, contenant chacune un produit lyophilisé préparé par lyophilisation de 0,5 ml d'une solution à 24% de propyl carbodiimide. (d) un flacon contenant 3,2 ml d'une solution de E1-BSA (5 ug/ml) comme agent agglutinant dans une solution tampon. (e) une pipette graduée (1,2 ml) (f) trente pipettes compte-gouttes (25j1/goutte) 24t880f 26. Le dosage au moyen de ce nécessaire à réactifs s'effectue, par exemple, conformément au mode opératoire suivant. On introduit dans un tube à essais 251l du latex sensibilisé à-l'anticorps anti-oestriol et 50Opl de la solution de E1-BSA (agent agglutinant), on ajoute 255pl de la solution d'échantillon étalon et on effectue la réac- tion à la température ambiante sous agitation modérée pen- dant 40 minutes. Des opérations telles que l'addition de la solution du composé fixant sont effectuées de la même façon qu'à l'exemple 10, et on détermine la concentration de l'oestriol dans le sérum ou l'urine. Comme la pipette graduée et les pipettes compte-gouttes sont annexées au nécessaire à réactifs, lorsqu'on utilise ce nécessaire de dosage, le dosage peut aisément être effectué même en un endroit o l'on ne dispose pas d'instruments ou d'appareil- lage d'expérience. 27. REVENDICATIONS 1.- Dans un procédé de dosage d'un antigène, d'un anticorps, ou d'un complexe ou produit de conjugaison antigène-anticorps, comprenant les opérations consistant (1) à provoquer une réaction antigène-anticorps entre (a) un support particulaire sensibilisé préparé en liant (I) au moins une substance choisie parmi le groupe constitué. d'un antigène, d'un anticorps et d'un complexe ou produit de conjugaison antigène-anticorps, à (II) un support cons- titué de particules insolubles, finement divisées, de telle sorte qu'au moins deux unités de cette substance soient liées au support particulaire et (b) au moins une substance choisie parmi le groupe constitué d'un antigène, d'un anticorps, d'un complexe ou d'un produit de conjugaison antigène-anticorps à doser et capable de provoquer une réaction immunologique avec cette substance (I) liée à ces particules de support sensibilisées; et (2) à mesurer l'absorbance ou la turbidité du mélange réactionnel formé dans l'opération (1) en irradiant ce mélange réactionnel avec un rayonnement ayant une longueur d'onde d'environ 320 à environ 2400 nm, ce procédé de dosage consistant à déterminer la quantité ou la concentration de l'agrégat formé par cette réaction antigène-anticorps, le perfection- nement caractérisé en ce qu'on ajoute un composé fixant au mélange réactionnel formé dans le système réactionel de l'opération (1). 2.- Dans un procédé de dosage d'un antigène, d'un anticorps ou d'un complexe ou produit de conjugaison antigène-anticorps, les opérations consistant (1) à provo- quer une réaction antigène-anticorps entre (a) un support particulaire sensibilisé préparé en liant (1) au moins une substance choisie parmi un antigène, un anticorps et un complexe ou produit de conjugaison antigèneanticorps, à (II) un support composé de particules insolubles finement divisées de telle sorte qu'au moins deux unités de cette substance soient liées au support particulaire, (b) au moins une substance choisie parmi un antigène, un anticorps, un complexe ou un produit de conjugaison antigène-anticorps à doser et capable de provoquer la réaction antigène-anti- 28. corps avec cette substance (I) liée à ce support particu- laire sensibilisé, et (c) un agent d'agglutination qui est au moins une substance choisie parmi un antigène, un anti- corps et un complexe ou produit de conjugaison antigène- anticorps et capable de provoquer une réaction immunochi- mique avec le support particulaire sensibilisé (a); et (2) à mesurer l'absorbance ou la turbidité du mélange réac- tionnel formé dans l'opération (1) en irradiant ce mélange réactionnel avec un rayonnement ayant une longueur d'onde d'environ 320 à environ 2400 nm, ce procédé de dosage consistant à déterminer la quantité ou la concentration de l'agrégat formé par cette réaction antigène-anticorps, le perfectionnement caractérisé en ce qu'on ajoute un composé fixant au mélange réactionnel formé dans le système réac- tionnel de l'opération (1). 3.- Procédé de dosage suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ce composé fixant est ajouté au mélange réactionnel après qu'une réaction antigène- anticorps a été provoquée dans l'opération (1). 4.- Procédé de mesure suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ce composé est ajouté en même temps que l'on amorce la réaction antigène-anticorps de l'opération (1), de sorte que la formation d'agrégats par cette réaction et la fixation de ces agrégats sont réalisées simultanément. 5.- Procédé de dosage suivant la revendication _1 ou 2, caractérisé en ce que ce composé fixant est au moins un membre du groupe formé par les composés polyfonc- tionnels et les agents de dénaturation des protéines. 6.- Procédé de dosage suivant la revendication , caractérisé en ce que ce composé polyfonctionnel est choisi parmi un carbodiimide, un dialdéhyde, un imide ester et un agent d'acylation. 7.- Procédé de dosage suivant la revendication 6, caractérisé en ce que ce composé polyfonctionnel est choisi parmi le 1-éthyl-3-(3-diméthyl-aminopropyl) carbo- diimide, le 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoéthyl) carbodiimide, le glutaraldéhyde, le succinaldéhyde, le N-éthyl-5-phényl- isoxazonium-3-sulfonate, et le chlorure de succinyle. 29. 8.- Procédé de dosage suivant la revendication , caractérisé en ce que cet agent de dénaturation des protéines est choisi parmi l'acide tannique, le formol, l'acide perchlorique, l'acide trichloracétique, l'acide thiocyanique et l'acide thioglycolique. 9.- Procédé de dosage suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que cette substance (b) est liée à un support composé de particules finement divisées. 10.- Nécessaire ou trousse de réactifs de dosage pour une réaction d'agglutination immunochimique en vue de déterminer la quantité ou la concentration d'un antigène, d'un anticorps ou d'un complexe ou produit de conjugaison antigène-anticorps, caractérisé en ce qu'il comprend comme éléments constitutifs indispensables: (a) une suspension de particules de support sensibilisées préparées par liaison d'au moins une substance choisie parmi les antigènes, les anticorps, les complexes ou pro- duits de conjugaison antigène-anticorps, à un support com- posé de particules insolubles finement divisées; (b) une solution tampon, et (c) un composé fixant. 11.- Nécessaire ou trousse de réactifs de dosa- ge pour la réaction immunochimique d'inhibition de l'ag- glutination en vue de déterminer la quantité ou la concen- tration d'un antigène, d'un anticorps ou d'un complexe ou produit de conjugaison antigène-anticorps, caractérisé en ce qu'il comprend comme éléments constitutifs indispensa- bles: (a) une suspension de particules de support sensibilisées préparées en liant au moins une substance choisie parmi les antigènes, les anticorps, et les complexes ou produits de conjugaison antigène-anticorps, à un support composé de particules insolubles finement divisées, (b) une solution tampon, (c) un composé fixant, et (d) un agent d'agglutination. 12.- Nécessaire de réactifs de dosage suivant la réaction 10 ou 11, caractérisé en ce que le composé fixant est au moins un membre du groupe constitué des réac- y0. tifs polyfonctionnels et des agents de dénaturation des protéines. 13. - Nécessaire de réactifs de dosage suivant la revendication 12, caractérisé en ce que le réactif polyfonctionnel est choisi parmi un carbodiimide, un dial- déhyde, un imide ester et un agent d'acylation. 14.- Nécessaire de réactifs de dosage suivant la revendication 13, caractérisé en ce que ce composé -polyfonctionnel est choisi parmi le 1éthyl-3-(3-diméthyl aminopropyl) carbodiimide, le 1-cyclohexyl-3-(2-morpho- linoéthyl) carbodiimide, le glutaraldéhyde, le succinal- déhyde, le N-éthyl-5-phénylisoxazonium-3-sulfonate et le chlorure de succinyle. 15.- Nécessaire de réactifs de dosage suivant la revendication 12, caractérisé en ce que cet agent de dénaturation des protéines pst choisi Panrmi l'acide tannique, le formol, l'acide perchlorique, l'acide trichloracétique, l'acide thiocyanique et l'acide thioglycolique. 16.- Nécessaire de réactifs de dosage suivant la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce qu'au moins un des réactifs constitutifs est lyophilisé. 17.- Nécessaire de réactifs de dosage suivant la revendication 11, carabtérisé en ce que l'agent d'ag- glutination est choisi parmi un antigène, un anticorps, ou un complexe ou produit de conjugaison antigène-anti- corps, soit ndn liés, soit liés à un support composé de particules insolubles finement divisées.