Brevet FR2454448A1 — publié le 19801114

La présente invention est relative à un procédé de pré paration de polymères de cofacteurs possédant le noyau adénine, ainsi qu'a des polymères à taux de greffage élevé obtenus à l'aide de ce procédé et présentant une activité biologique. Les enzymes constituent actuellement un outil précieux dans de nombreuses réactions chimiques et biologiques, non seu lement à l'échelle du laboratoire (besoins analytiques ou bio médicaux), mais également, et de plus en plus, à l'échelle in dustrielle. Ainsi, on produit actuellement de grandes quantités d'enzymes appartenant à tous les groupes. Mais ce qui a permis veritablement l'essor industriel des réactions enzymatiques, c'est le développement de la technologie de l'iinmobilisation des enzymes sur supports solubles ou insolubles [cf.: par exemple, les travaux de W.MARCONI dans "Industrial Aspects of Biochemistry", SPEENER Editeur, Vol.3, part.l, pages 139-186 (1974), ou les travaux de K.MOSBACH dans "Methods in Enzymology", Vol.XLIV, Acad.Press., New-York (1976)] Cependant, si les réactions enzymatiques monomoléculaires ne posent pratiquement plus de problèmes, il n'en est pas de mEme avec les enzymes à cofacteurs, qui ne peuvent étreutilisées que moyennant u n e r é a é n é r a t i o n quantitative de ces cofacteurs (souvent très couteux ) afin que les réactions enzymatiques correspondantes soient exploitables économiquement, ce qui présente d'autant plus d'intérêt qu'il s'agit de réactions aussi importantes que les déshydrogénations, phosphorylations, etc... Différentes tentatives d'immobilisation des cofacteurs sur support ont été décrites ces dernières années. La plupart de ces méthodes préconisent de fixer le cofacteur (ou un dérivé actif du cofacteur) sur un polymère déjà formé. Par exemple, le couplage covalent de NAD+ sur gels d'agarose ou de dextrane /LARSSON et MOSBACH (1971) "Biotechnol. Bioeng. 13,393 et FEBS LETTERS, Vol.46, n01 (1974), pages 119-1227 ou le couplage covalent de AMP, ADP et ATP sur des polymères acryliques /FULLER et BRIGHT, (1977), "J.of Biol.Chem.1', Vol.252, n019, pages 6631 66397 . Ces méthodes, en effet, si elles sont relativement simples et ne nécessitent que peu d'étapes, présentent toutefois les inconvénients de fournir des polymères à taux de greffaae Faibles ou à activité biologique nulle. Le Tableau I ci-après résume les meilleurs résultats obtenus par les différents Auteurs, conformément à l'Art antérieur TABLEAU I Auteur I Nature du I Taux de I Taux de cofacteur greffage cofacteur (% en poids) actir blol. (% en poids) I I MOSBACH FEBS Lett. Vol.46,N 1, NAD 4,2 % 3,4 % (1974) pages 119-122 I I I I I WEIBEL ENZYME ENGINEERING non NAD 4,9 % 2 (1974), pages 203-208 déterminé ZAPPELLI et Coll. non EUROP.J.BIOCHEM., 54 NAD 8,2 % déterminé (1975), pages 475-482 FULLER et BRIGHT I I I J.of BIOL.CHEM. (1977) AMP 21 % 0 % Vol.252,N 19,p.6631-6639 I I Une autre approche pour l'obtention de cofacteurs immobilisés sur support, a été décrite par MURAMATSU et Coll. /Eur. J. Biochem.80,(1977), pages 111-1177. Ces Auteurs ont tout d'abord synthétisé un dérivé polymérisable de cofacteur (NAD puis ils ont procédé à la polymérisation de ce dérivé. Cette méthode est compliquée et très longue : elle ne comporte pas moins de six étapes (et notamment, entre autres, l'étape de préparation de l'ester de N#-acryloyl-L-lysine, l'étape de préparation de N6-(2-carboxyéthyl)-NAD+, l'étape de préparation du propionamide de NAD±N6-[N-(N-acryloyl-l-méthoxycarbonyl-5-aminopentyle], etc...). On aboutit enfin à des polymères dont le taux maximum de greffage en cofacteurs est à peine de 14 %. La présente invention s'est, en conséquence, donné pour but de pourvoir à un procédé de préparation de polymères de cofacteurs possédant le noyau adénine (comme le NAD (H), le NADP (H) , le FAD (H) , l'ATP , l'ADP , l'AMP , etc...), qui répond mieux aux nécessités de la pratique que les procédés antérieurement connus, notamment en ce qu'il est simple et économique et permet d'obtenir des polymères solubles ou insolubles, à haute teneur en cofacteurs actifs (teneur qui dépasse fréquemment les 40 %) et dont on peut faire varier à volonté le taux de greffage. La présente invention a pour objet un nouveau procédé de préparation de polymères de cofacteurs possédant le noyau adénine, caractérisé en ce qu'il comprend : - une première étape au cours de laquelle on effectue la synthèse de dérivés polymé- risables des cofacteurs par réaction d'un agent d'alkylation polymérisable sur l'adénine d'un cofacteur approprié, en présence dlions C104 et à un pH légèrement acide, - et-une deuxième étape au cours de laquelle on réalise la polymérisation des dérivés obtenus au cours de la première étape, ladite polymérisation s'effectuant concomitamment avec un réarrangement de Dimroth (passage du groupe alkyle du N1 en N6). On savait déjà par les travaux de WINDMUELLER et KAPLAN [J.of Biol Chem.236, (1961),p.2716-2726; J.of Biol.Chem. 234 (1959),p.895 et J.of Biol, Chen.234 (1959),p.889] que l'oxyde d'éthylène est un agent d'alkylation idéal des atomes d'azote tertiaires hétérocycliques,qui ne réagit en aucune façon avec les fonctions hydnxyle des composts soumis à l'alkylation. C'est en s1 inspirant de cette méthode de WINDMUELLER et RAPLAN, mais en choisissant toutefois des agents d'alkylation polymérisables ,que la Demanderesse a pu obtenir, en deux étapes aussi simples qu'élégantes, des polymères de cofacteurs possédant le noyau adénine. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé conforme à l'invention, la réaction d'alkylation est réalisée en utilisant comme agent d'alkylation polymérisable, l'acrylate de 2- époxy-propyle, suivant l'équation I ci-après où R représente un groupementribose-P-ribose-nicotinamide (H) , ou 2,P ribose-P-ribose-nicotinamide (H), ou ribose-P-P-riboflavine, ou ribose-P,diribose-P-P,ou ribose-P-P-P,ou ribose-P-P-panthétéine. Les dérivés de cofacteurs polymérisables ainsi obtenus au cours de la première étape du procédé ne sont pas actifs biologiquement. C'est grace au réarrangement de Dimroth Lcf. Ann.(1909X,364, p.183-187' qui a lieu concomitamment à la polymérisation, au cours de la deuxième étape du procédé, conformément à l'équation II ci-après, que les popymères-obtenus retrouvent leur activité biologique . selon un autre mocte de reallsatlon avantageux du procédé objet de la présente invention, la réaction de l'agent d'alkylation polymérisable avec le cofacteur a lieu à une température voisine de 40"C environ Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, la polymérisation est effectuée dans un tampon phosphate 0,05 à 0,15 M et à un pH compris entre 7,5 et 8,5 environ. Conformément à l'invention, la polymérisation peut aussi avoir lieu en présence d'acrylamide ou d'un partenaire de copolymérisation analogue. Cette addition permet d'obtenir un polymère dont le taux de greffage est choisi et programme à l'avance en fonction de la quantité d'acrylamide ou analogue ajoutée. Si on le désire, on peut purifier par chromatographie sur résines échangeuses d'ions le dérivé N1 alkyle du cofacteur obtenu au cours de la première étape. Cette puri fication,qui élimine notamment le cofacteur non alkylé en N1, n'est toutefois pas absolument nécessaire : le cofacteur non alkylé est aisément séparable, s'il n'est pas polymérisé. Suivant un autre mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, la polymérisation est effectuée à une température comprise entre 35 et 450C et de préférence, entre 36 et 380C et sa durée est de 4 à 6 jours. Suivant un autre mode de réalisation avantageux de l'objet de la présente invention, la polymérisation est effectuée apres désoxygénation par un courant d'azote et elle est amorcée par du persulfate de sodium en présence de TEMED (triéthylène méthyldiamine). Suivant une modalité particulière de ce mode de réali sation, la quantité de persulfate de sodium mise en oeuvre est comprise entre 30 et 40 mM et celle de TEMED entre 50 et 60 mM. Le réarrangement de Dimroth (passage du groupe alkyle de n1 en N6) s'effectue généralement à des pH et des tempéra tures élevées. Ces conditions sont, par contre, préjudiciables aux cofacteurs eux-memes. La Demanderesse a constaté qu'en prolongeant la réaction de polymérisation pendant plusieurs jours à pH 8 sans application de température élevée, on obtient un réarrangement presque total sans préjudice aucun pour les cofacteurs. Conformément à l'invention, les polymères obtenus sont purifiés par chromatographie sur gel d'exclusion et/ou par ultrafiltration. Suivant un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, en introduisant dans la deuxième étape du procédé, avant la polymérisation, un monomère usuel de réticulation (tel que le N,N'-méthylène diacrylamide,l'éthylene,lzcoldiyéthylacryvlate, ou analogues), l'on obtient des copolymères insolubles des cofacteurs Cela peut en effet présenter parfois un grand intérêt, par exemple lorsqu'on désire opérer sur colonnes. La présente invention a également pour objet les polymères,solubles ou insolubles ,-homopolymères ou copolymères à taux de greffage élevé ,obtenus conformément au procédé qui fait l'objet de la présente invention. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre. La présente invention vise plus particulièrement les nouveaux procédés de préparation de polymères de cofacteurs comportant un noyau adénine, conformes aux dispositions qui précèdent, ainsi que les polymères solubles ou insolubles, homopolymères ou copolymères , à taux de greffage programmable et pouvant atteindre des valeurs élevées (plus de 40 %) obtenus par ces procédés. La présente invention vise également les moyens propres à la mise en oeuvre de ce procédé, ainsi que les moyens propres à l'utilisation desdits polymères. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre , qui se rapporte à des exemples de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention. I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples et les parties descriptives correspondantes sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLES EXEMPLE 1 -Synthèse du N1 acryloxy-2 hydroxy-propyle de NAD+ On dissout 2 g (soit 3 mmoles) de NAD+ dans 60 ml d'eau distillée et le pH est ajusté à 6,5 avec la NaOH 3M. L'acrylate de 2-3 époxy-propyle (préalablement mélangé à 20 ml de diméthylformamide) est ajouté à la solution de NAD+. Ce mélange est maintenu à 400C, sous agitation magnétique, et à pH 6,5 à l'aide d'un Phstat METROHM E512 chargé d' HC104 0,5 N. Toutes les 24 heures, on ajoute 1 ml d'acrylate de 2-3 époxypropyle. Après une semaine, 90 % du NAD+ ont éte convertis en N1 (acryloxy-2 hydroxy-propyl)NAD+ comme le montrent la chromatographie analytique (Rf 0,77 pour N1 alkyl NAD+ et 0,40 pour NAD+) et le spectre d'absorption de la solution (apparition d'un épaulement entre 290 nm et 310 nm). Le pH du milieu est alors ajusté à 3 avec HC104 . Le Nlalkyl NAD + est précipité 3 fois par six fois le volume d'acétone froid. Ce précipité est recueilli par centrifugation, dissous dans 10 ml d'eau distillée, puis lyophilisé : on obtient 1,8 g de produit. Une partie de ce lyophilisat (200 mg) est dissoute dams 10 ml d'eau distillée et le pH est ajusté @ 7,5. Il est appliqué sur une résine échangeuse d'ions Dowex 50 (200-400 mesh)H+ (sur colonne 1x22 cm) préalablement lavée avec HCl 5N, puis par de l'eau distillée. Une fois l'échantillon déposé, la resine est lavée abondamment par de l'eau distillée et ensuite, I'élution est effectuée avec HCl 0,01 N. Le N1 alkyl-NAD+ est trouvé dans la fraction présentant un pic principal absorbant à 260 nm . La produit est totalement purifie comme le montre l'absence de NAD+ par la chromatoaraphie en couche mince (CCM).Les fractions correspondant à ce pic sont lyophilisées et l'on obtient 95 mg de N1 (acryloxy-2 hydroxy-propyl)NAD+. EXEMPLE 2 - Synthèse du N1 acryloxy-2 hydroxy-propyle d'ATP. On dissout 2 g d'ATP dans 60 ml d'eau distillée et on procède de la meme manière qu'indiqué dans l'Exemple 1. Après lyophilisation, 1,85 g de produit brut sont obtenus dont 80 * sont constitués par l'ATP N1 (acryloxy-2 hydro:ypropyle). Le produit brut, comme d'ailleurs l'acryloxy-2 hydroxy-propyle de NAD+ brut obtenu au cours de l'Exemple 1, peut parfaitement convenir pour l'étape suivante de polymérisation. Si on le désire, ce produit brut peut etre purifié Pour cela,une fraction de ce produit brut (200 mgj est dissoute dans 10 ml d'eau distillée et ajustée à pH 7,5. Cet échantillon est déposé sur une résine échangeuse d' anions Dowex 1x8 sous forme de Cl- (en colonne de 1x32 cm) préalablement lavée avec HCl 5N et de l'eau distillée. La résine est éluée avec un gradient linéaire de LiCl : 1 litre d'HCl 0,001 N dans la chambre de mélange et 1 litre de LiCl 0,2 M pH 2 dans le réservoir Le N1 alkyl-ATP est trouvé dans les fractions présentant un pic principal absorbant à 260 nm. Le produit est complètement purifié comme le montre la CCM (Rf 0,82 pour N1 alkyl-ATP et 0,43 pour ATP). Les fractions contenant le produit purifié sont lyophilisées et l'on obtient 106 mg d'ATP N1-(acryloxy-2 hydroxy-propyle). EXEMPLE 3 - Synthèse du N1 acryloxy-2 hydroxy-propyle d'ADP On procède comme pour le dérivé d'ATP décrit dans l'Exemple 2. Le Rf pour le dérivé N1-alkyl-ADP = 0,8,tandis que celui de 1'ADP est de 0,44. EXEMPLE 4 - Polymérisation des N1 -alkyl-cofacteurs Les polymérisations sont toutes effectuées dans du tampon phosphate 0,1 M à pH 8,2 pendant 5 jours, à 370C. La concentration en N1-alkyl-cofacteur est de 30 mM. Les polyméirisations sont amorcées par du persulfate de sodium (34 mM) en présence de TEMED (53 mM), après que les solutions aient été désoxygénées par un courant d'azote. Ces polymérisations ont lieu soit enl'absence totale d'acrylamide : homopolymères (groupe I), soit en présence de 56 mM d'acrylamide (groupe II), soit en présence de 112 mM d'acrylamide (groupe III), soit en présence de 224 mM d'acrylamide (groupe IV). Les résultats sont rassemblés dans le Tableau II ci-après. Après la polymérisation, les solutions, légèrement visqueuses, sont fractionnées sur colonnes (2,5x100 cm) contenant un gel d'exclusion (BIOGEL P10). L'élution est effectuée par de l'eau distillée et elle est suivie à 254 nm avec un enregistreur "OSI". Deux pics sont observés pour chaque échantillon: - l'un ayant la méme migration que les coenzymes correspond au N1-alkyl-cofacteur qui n'a pas été polymérisé, - l'autre - qui a la meme migration que le bleu dextrane - cor respond aux polymères préparés. Les polymères obtenus sont ensuite ultrafiltrés sur différentes membranes,permettant d'avoir une estimation de leurs poids moléculaires (voir Tableau II ci-apres). Le réarrangement de Dimroth a eu lieu durant l'opération de polymérisation, comme le démontre le spectre d'absorption des polymères obtenus : l'épaulement 290-310 nm a totalement disparu et la longueur d'onde maximale d'absorption est de 266 nm, longueur caractéristique des N6-alkyl-adénines. TABLEAU Il CARACTERISTIOUES DES POLYMERES OBTENUS Poids Cofacteur Taux de Groupe Cofacteur greffage moléculaire moles/g (en %) NAD 15-20.103 447 30 I ADP 20-35.103 667 39 ATP 20-25.103 580 34 NAD 20-25.103 320 21 II ADP 20-25.103 754 44 III NAD 20-30.103 232 15 IV NAD # 30.103 145 9 L'alkylation en N1 par l'agent d'alkylation est suivie par le spectre d'absorption des produits obtenus : un déplacement caractéristique entre 290 et 310 nm apparait au fur et à mesure de l'alkylation. Les spectres de résonance magnétique nucléaire des N1-alkyl-cofacteurs montrent les signaux correspondant aux protons du groupement acrylate introduit # = 5,55 ppm COC-Ch Les polymeres obtenus par polymérisation des N1-alkyl- cofacteurs présentent des spectres d'absorption en ultra-violet différents des composés de départ : l'absorption maximale s'est déplacée de 259 nm à 266 nm et l'épaulement entre 290 et 310 nm a disparu.Cette évolution spectrale est caractéristique d'un réarrangement de Dimroth, celui-ci ayant lieu dans le cas présent, simultanément à la polymérisation. Les coéfficients d'extinction molaire à 266 nm sont égaux à 21 800 M 1 cm-1 et 16 400 M 1 pour le polymère de NAD+, pour les polymères d'ADP et d'ATP respectivement ; ils sont en concordance avec les données de la Littérature pour des composés similaires [cf.WINDMUELLER et KAPLAN (1961),J.Biol.Chem.236, p.2716-2726]. COMPTE-RENDU D'EXPERIMENTATIONS RELATIVES A L'ACTIVITE DES POLYMERES DE COFACTEURS A.- TESTS ENZYMATIOUES Le Tableau III ci-après indique les quantités de NAD+, , d'ADP et d'ATP actifs en moles/g de polymère. Les enzymes mises en oeuvre sont 1. La laotate-dàshydrogénase (LDH) Volume réactionnel 3 ml, tampon glycine pH 9,2,300pm, L-acide lactique 150 pm, NAD 0,2 à 0,6 pm (exprimé en NAD+ fixé aux polymères),enzyme 20 UI. 2. L'alcool déshydrogénase de foie (LADH) : Volume réactionnel 3 ml, tampon pyrophosphate pH 8,2,300 pm, éthanol 500 m, chlorhydrate de semi-carbazide 150 m, NAD+ 0,2 à 0,6 m (exprimé en NAD+ fixé aux polymères), enzyme 20 UI. 3. L'alanine-déshydrogénase (ALADH) Volume réactionnel 3 ml, tampon carbonate de Na pH 10 300 pm, L-alanine 300 pm, NAD+ 0,2 à 0,6 pm (exprimé en NAD+ fixé aux polymères), enzyme 20 UI. 4. La créatine kinase (CK) Volume réactionnel 3 ml, tampon triéthanolamine (TEA) pH 7, 250 m, glucose 55 ijm, acétate de magnésium 25 m, NADP 20 pmol, créatine phosphate 25 m, glutathion 25 m, ADP 0,2 à 0,6 m (exprimé en ADP fixé sur le polymere), hexokinase et glucose 6-P-déshydrogénase 0,2 pg, créatine kinase 20 UI. On mesure l'absorption à 340 nm (température 370C pendant 40 minutes). 5. La pyruvate kinase (PK Volume réactionnel 1 ml, tampon triéthanolamine pH 8,150 pm, acétate de magnésium 20 iim, chlorure de potassium 120 m, phosphoénol pyruvate et lactate déshydrogénase 20 UI. On suit la réaction par décroissance d'absorption à 340 nm. 6. L'hexokinase (HK) Volume réactionnel 3 ml :comme 4. ci-dessus, sans mettre de créatine phosphate et de créatine kinase. Tampon TEA pH 7, 250 iim. En moyenne, l'activité observée se situe entre 23 et 36 % suivant les déshydrogénases utilisées, et de 13 a 84 % suivant les kinases utilisées. TABLEAU III E N Z Y M E S DESHYDROGENASES KINASES POLYMERES LDH LADH ALADH CK PK HK NAD+ NAD+ NAD+ NAD+ NAD+ NAD+ ADP ADP ADP ADP ATP ATP UTILISES actif actif actif actif actif actif actif actif actif actif en m/g NAD+ en m/g NAD+ en /g NAD+ en m/g ADP en m/g ADP m/g ATP total total total total total total Homopolymère NAD+ 160 36% 124 28% 90 21% (Groupe I) Copolymère de NAD+ 75 23% 83 26% 38 25% (Groupe II) Copolymère de NAD 67 29% 67 29% 20 27% / (Groupe III) Copolymère de NAD+ 48 31% 38 26% 10 33% (Groupe IV) Homopolymère d'ADP 560 84% 100 13% (Groupe I) Homopolymère d'ADP 264 35% 37 5% (Groupe II) Homopolymère d'ATP 480 82% (Groupe I) B.-VITESSES RELATIVES DES REACTIONS ENZYMATIQUES La vitesse relative des polymères des cofacteurs est le rapport des vitesses de la réaction avec le cofacteur seul exprimées en mole/minute de cofacteur consommé sur la vitesse de la réfaction des polymères de cofacteur conformes à la présente invention. Les différentes vitesses relatives ont été mesurees et elles sont rassemblées dans le Tableau IV ci-après TABLEAU IV E N Z Y M E S LADH ALADH PK LADH COPOLYMERES insolubilisée sur support (agarose) Homopolymère NAD+ 81 45 36 (Groupe I) Copolymère de NAD+ 52 22 15 (Groupe II) Copolymère de NAD+ 47 10 15 (Groupe III) Homopolymère d'ADP 12 (Groupe I) Il ressort des résultats rassemblés dans ce Tableau, que les vitesses relatives de réduction des polymeres NAD+ sont inversement proportionnelles a la quantité d'acrylamide incorporée dans les polymères. Pour l'homopolymère, on note une très bonne vitesse relative puisqu'elle atteint 81 % de celle du NAD+ seul. I1 résulte de la description qui précède que, quels que soient les modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application adoptés, l'on obtient des polymères des cofacteurs possédant le noyau adénine,à taux de greffage élevé et programmable, homopolymères ou copolymères, solubles ou insolubles, et l'on obtient également un procédé de préparation de ces polymères simple et économique, qui présentent par rapport aux polymères et aux procédés visant au méme but antérieurement connus, des avantages importants dont certains ont déjà été mentionnés dans ce qui précède . Les alkylcofacteurs selon l'invention sont, en outre, très stables, notamment en milieu alcalin, avantage très important, car la plupart des déshydrogénases travaillent à des pH voisins de 9. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de realisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 10. Procédé de préparation de polymères de cofacteurs possédant le noyau adénine, caractérisé encre qu'il comprend - une première étape au cours de laquelle on effectue la synthèse des dérivés polymérisables des cofacteurs par réaction d'un agent d'alkylation polyiérisable avec un -cofacteur approprié possédant un noyau adénine en présence d'ions ClO4 et à un pH légèrement acide - et une deuxième étape au cours de laquelle on realise la polymérisation des dérivés obtenus au cours de la première étape, ladite polymérisation s'effectuant concomitamment avec un réarrangement de Dimroth. 20. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que la réaction d'alkylation est réalisée en utilisant comme agent d'alkylation polymérisable, l'acrylate de 2-3 époxy propyle, suivant l'équation I ci-après ou R represente un groupement ribose-P-ribose-nicotinamide (H), ou 2'P ribose-P-ribose-nicotinamide(H) ou ribose-P-P-riboflavine, ou ribose-P,ou ribose-P-P,ou ribose-P-P-P, ou ribose-P-P-panthétéine. 3 . Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la réaction de l'agent d'alkylation polymérisable avec le cofacteur a lieu à une température voisine de 400C environ. 40. Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la polymérisation est effectuée dans un tampon phosphate 0,05 à 0,15 M et à un pH compris entre 7,5 et 8,5 environ. 5 . Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'étape de polymérisation est effectuée en présence d'un partenaire de copolymèrisation. 60. Procéde selon la Revendication 5, caractérisé en ce que le partenaire de copolymérisation est constitué par l'acrylamide. 7w- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 h 6, Ca- ractérisé en ce que l'on ajoute avant la polymérisation, un un monomère usuel de réticulation pris dans le groupe qui contient le N,N'-méthylène-diacrylamide, l'éthylèneglycoldiméthylacrylate et analogues. 8 - Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'on purifie par chromatographie sur résines échangeuses d'ions le N1 (acryloxy-2 hydroxy-propyle) du cofacteur obtenu au cours de la première étape. 9 - Procédé selon l'une quelconque des Revendications l à 8, caractérisé en ce que la polymérisation est effectuée à une température comprise entre 35 et 450C et, de préférence, entre 36 et 380C et sa durée est de 4 a 6 jours. 10 - Procédé selon l'une quelconque des Revendications l à 9,caractérisé en ce que la polymérisation est effectuée après désoxygénation par un courant d'azote et elle est amorcée par du persulfate de sodium en prd- sence de TEMED (triéthylèneméthyldiamine). 11 - Procédé selon la Revendication 10, caractérisé en ce que la quantité de persulfate de sodium mise en ceuvre est comprise entre 30 et 40 mM et celle de TEMED entre 50 et 60 nL 12 - Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 11, caractérisé en ce que les polymères obtenus sont purifiés par chromatographie sur gel d'exclusion et/ou Far l'ultrafiltration. 13 - Intermédiaires pour la fabrication de polymères de cofacteurs possédant le noyau adénine, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des dérivés N1 (acryloxy-2 hydroxy-propyle) de cofacteurs possédant le noyau adénine de formule générale I ciaprès : dans laquelle R représente un groupement rilose-P-ribose-nicoti- namide (H) ,ou 2'P ribose-P-ribose-nicotinamide (H) ,ou ribose-P-Priboflavine, ou ribose-P,ou ribose-P-P,ou ribose-P-P-P,ou ribose P-P-panthétéine, obtenus en mettant en oeuvre le procédé selon les Revendications 1 et 8. 140. Homopolymères de cofacteurs possédant le noyau adénine de formule générale II ci-après obtenus en mettant en oeuvre le procédé selon 1' une quelconque des Revendica- tions 1,2,3,4,8,9,10,11 et 12, R ayant la même signification que précédemment. 150. Copolymères de cofacteurs possédant le noyau adénine, obtenus en mettant en oeuvre le procédé selon les Revendications 5 et 6. 160. Copolymères sur support insoluble de cofacteurs possédant le noyau adénine, obtenus en mettant en oeuvre le procédé selon la Revendication 7.