Brevet FR2447359A1 — publié le 19800822

La présente invention concerne un procédé de préparation d'acides z-aminés optiquement actifs par hydrolyse biologique des &alpha;-amino-amides correspondants ou des -amino-nitriles correspondants. Dans la technique antérieure on prépare les acides &alpha;-aminés optiquement actifs en général à partir de l'aminoacide racémique par dédoublement des -stéreoisomères, ceci par des techniques connues, en particulier par formation de sels avec d'autres composés optiquement actifs ou bien par la mise en oeuvre de résines présentant certaines caractéristiques stéréospécifiques. Outre le fait que ces techniques sont assez délicates de mise en oeuvre, elles imposent, bien entendu, une étape supplémentaire lors de la synthèse des amino-acides à partir d'autres produits tels que les amino-amides correspondants ou les amino-nitriles correspondants qui sont, en général, les précurseurs normaux de ces amino-acides. Or, la présente invention propose un procédé permettant de préparer, soit à partir des amino-amides, soit à partir des amino-nitriles, directement l'amino-acide sous forme optiquement active. Pour ce faire, la présente invention concerne un procédé-de préparation de X -amino-acides, caractérisé en ce que l'on hydrolyse en milieu liquide l'&alpha;-amino-amide racémique correspondant par un agent contenant une amidase L stéréospécifique et en ce que l'on sépare ensuite le L w-amino-acide obtenu du D -amino-amide non hydrolysé. Dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon la présente invention, le L z-amino-amide racémique est préparé in situ à partir de l'6-amino-nitrile correspondant par action d'un agent contenant une nitrile générale. Dans ce qui va suivre, on entend désigner par itamino-amide" ou !'amino-nitrile" ou "amino-acide" aussi bien les composés sous forme libre que sous forme de sele en particulier de chlorhydrate. les agents utilisés dans le cadre du procédé selon la présente invention sont, de préférence, des bactéries ou des préparations acellulaires d'origine bactérienne ne possédant pas d'amidase générale. Dans le cas où l' -amino-acide est préparé à partir de l' -amino-nitrile correspondant, il est particulièrement intéressant que la bactérie ou la préparation acelulaire d'origine bactérienne possède à la fois l'amidase L stéréospécifique et la nitrilase générale de façon à n'avoir à utiliser qu'une seule souche ou préparation acellulaire d'origine bactérienne. Bien entendu, il est possible, en partant du nitrile, d'effectuer la réaction en deux étapes en utilisant deux agents possédant séparément, l'un l'amidase L stéréospécifique, l'autre la nitrilase générale. les bactéries ou les préparations acellulaires d'origine bactérienne proviennent, de préférence, dsune souche mutante d'une souche possédant elle-même une amide générale, ledit mutant étant capable de croître sur un milieu nutritif contenant du monofluoro-acétamide par perte de l'amidase générale. En effet, on a constaté que lorsque l'on fait croître, sur un milieu nutritif contenant du monofluoro -acétamide, des souches possédant une amidase générale, celles-ci transforment le monofluoro-acétamide en acide monofluoro-acétique selon la réaction lequel est toxique pour ces bactéries, ce qui a évidemment pour effet de faire apparaître des mutants spontanés défectifs, c'est-à-dire ne possédant plus l'amidase générale mais uniquement l'amidase L stéréospécifique. les mutants obtenus dans ces conditions sont des mutants spontanés mais, bien entendu, il est possible d'utiliser des agents mutagènes connus'tels que des rayonnements ultraviolets, X ou W ou des composés chimiques tels que l'éthylméthanesulfonate, l'acide nitreux, les agents alkylants, la nitrosoguanidine, l'acryflavine par exemple, afin d'augmenter la fréquence d'apparition des souches poss-édant l'amidase L stéréospécifique. Parmi les souches possédant une amidase générale, il faut citer plus particulièrement les genres Bacillus, Bacteridium au sens de Prévot, Micrococcus et Brevibacterium au sens de Bergey. De façon encore préférable, ces bactéries sont choisies parmi les souches de la collection de la chaire de génétique et microqbiologie de l'Ecole Nationale Supérieure Agronomique de Montpellier (R 332, R 340, R 341, A 111, 3 222, A 112, A 13, A 14-1, A 142, B 211, B 212, B 221, C 211-, R 21, R 22, R 311, R 312, R 331 ou parmi celles déposées au Centraalbureau voor Schimmelcultures sous les numéros : 717-73, 494-74, 495-74, 496-74, 497-74, 498-74, 499-74. Ces souches possédant une amidase générale présentent les caractéristiques communes suivantes - Gram positif ; alcoolo-acido résistance négative. - Aérobiose stricte ; catalase positive. - Utilisation du glucose, du saccharose, du maltose et du lactose par voie oxydative sans production de gaz et sans acidification. Aucune souche ne forme d'alcool. L'amidon n'est pas hydrolysé mais il y a croissance sur pomme de terre, - Test de recherche de la -tyrosinase sur pomme de terre négatif. - Besoin en vitamines. - Absence d'hydrolyse de la gélatine. - Croissance sur ammoniaque et sur nitrates comme seule source d'azote. - Pas de dégagement d'hydrogène sulfuré. - Absence de croissance en présence de bouillon hypersalé. TABLEAU I : CARACTEROSTOPIES MORPHOLOGIQUES Souche Spore Mobilité Morphologie Morphologie des colonies cellulaire R 332 + faible Batonnets Circulaires, lisses, convexes (1.8-3.6) 0,9 rosées,à bord entier R 340 + - Batonnets Circulaires, petites, blan 2,7 X 0,9 ches,à bord diffus R 341 + - Batonnets Grosses, très granuleuses, 2,7j, x 0,9 blanches,plates A 111 - - Coques Circulaires. petites, plis 0,9 1,8 sées, convexes. roses à bord lobé B 222 - + Batonnets Cireulaires, petites, de cou (3,6-4,5) X 0,9 leur jaune orangée A 112 - faible Batonnets Petites, opaques, en relief, (1,8-3,6) X 0,9 à bord lobé, roses orangées A 13 - faible Batonnets Circulaires,lisses,opaques, 2,2 X 0,9 oranges-ross, à bord entier A 141 - - Batonnets Petites,presque plates, (1,8-3,6) X 0,9 opaques, granuleuses, oranges rpses. à bord lobé A 142 - - Batonnets Circulaires,lisses,opaques, (3,6-4,5) X 0,9 oranges, à bord entier B 211 - - Batonnets Circulaires,bom.bées-,petites 1,8y x 0,9 lisses,rosées,à bord. entier B 212 - - Batonnets Circulaires,bombées,lisses, 3,6 X 0,9 rosées, à bord entier B 221 - . faible Baronnets Circulaires, très lobées, (3,6-4) X 0,9 en relief, de couleur jaune orangée C 211 - faible Batonnets Circulaires,lisses,bril (3,6-8, V X 0,9 lantes, roses, à bord entier R 21 - - Batonnets Circulaires, plates, roses 5,4 X 0,9 granuleuses, à bord légère ment lobé R 22 - faible baronnets Circulaires,lisses,oranges, 2,7 X 0,9 en relief, à bord entier R 311 - faible Batonnets Ciroulaires, jaunes, en (1,8-3,6) X 0,9 relief, à bord entier R 312 - - Batonnets Circulaires, convexes, jaunes (4,5-9) x 0,9y à bord entier R 331 - - Batonnets Circulaires,roses,plates 4,5y x 0,9y diffuses et opaques TABLEAU II :PRINCIPAUX CARACTERES PHYSIOLOGIQUES Utilisation Hydrolyse Production pH acétyl Souche Test Indole acide du Outimum méthyl oxydase citrique blane d'oeuf earbinol R 332 - - - - - 6.5 forte R 340 - + .+ - 6,5 R 341 - + + - 6,0 A 111 - + + légère 6,5 faible B 222 -+ - + - 6,0 - A 112 - + + - 6,5 A 13 - + - - 6,0 faible A 141 - - + - 6,5 faible A 142 - + + . - 6,0 faible B 211 - + + - 6,5 forte B 212 - - + + 6,0 3 221 - + + - 6,5 - C 211 - + - - 6,0 R 21 ~ + + + - - 7,5 R 22 - + + - 6,0 R 311 - + + - 6,0 faible R 312 - - - + légère 6,0 R 331 - + - + . 6,0- Toutes les souches donnent de l'ammoniaque en fin de culture sur nitrates ; en outre, elles donnent des nitrites sauf les souches B 221, B 211, B 212 et C 211. La souche B 222 donne un dégagement gazeux à partir des nitrates La souche R 332 appartient au genre Bacillus, mais présente une faible activité protéolytique. les souches R 340 et R 341 sont voisines du genre Bacteridium au sens de Prévot. lies autres souches sont asporulées. La souche A 111 est un Microcoecus. Toutes les autres souches sont voisines du genre Brevibacterium au sens de Bergey. Il est à noter que la souche B 222 est très voisine de Brevibacterium imperiale. Parmi les souches utilisables possédant une amidase L stéréospécifique et une nitrilase générale, il faut citer plus particulièrement la souche A4 déposée sous le n I.MD 79.2 au Centraalbureau voor Schimmelcultures. le procédé selon la présente invention permet donc d'obtenir le B a-amino-acide ainsi qu'un P -amino-amide non hydrolysé. Ce dernier amide peut être racémisé puis retraité selon le procédé de l'invention afin de préparer une nouvelle quantité de L &alpha;-amino-acide. La racémisation peut être conduite par tout procédé connu, en particulier par chauffage en présence de cétone ou d'acide. Comme on a, d'autre part, constaté que les différentes souches mentionnées précédemment possédant une amidase générale ne possédaient pas de racémase, si l'on traite le D a-amino-amide obtenu par ces souches, on obtient directement le D -amino-acide correspondant. l'invention concerne également l'application du D cc-amino-amide obtenu à la préparation de D &alpha;-amino-acide correspondant par hydrolyse en présence d'un agent contenant une amidase générale tel que les souches décrites précédemment. le procédé selon la présente invention permet donc de préparer à l'état pur les deux stéréoisomères bien isolés. Bien entendu, bien qu'il soit préférable d'utiliser les bactéries, comme les procédés selon la présente invention ne nécessitent pas la croissance des bactéries, -il est possible également d'utiliser les préparations acellulaires provenant de ces bactéries qui peuvent se présenter, par exemple,- sous la forme d'enzymes fixées ou sous la forme de cellules~ branchées ou fixées sur un support ou absorbées par lui-,. ce qui peut, dans certains cas, faciliter leur manipulation. le procédé selon la présente invention permet donc d'obtenir les acides -aminés naturels à activité optique comme par exemple l'ct-alanine, la méthionine, la phénylalanine, la leucine, la valine. Il est également possible, bien sûr, de synthétiser des acides a-aminés sous leur forme D optiquement purs. Enfin, il est possible d'obtenir des acides -aminés à activité optique qui ne figurent pas parmi les constituants habituels des protéines. Bien que les paramètres particuliers de mise en oeuvre du procédé selon la présente invention ne soient pas critiques, il est intéressant d'opérer à température et pression ambiantes. le procédé est conduit de préférence en milieu aqueux. Bien que dans certains cas la faible solubilité dans liteau du nitrile pose un problème, ceci n'entrave pas notablement l'activité nitrilasique ou B-amidasique des bactéries utilisables dans le procédé selon l'invention. Un avantage du procédé selon l'invention est qu'il est possible de recycler les bactéries qui sont encore actives à la fin du procédé. Enfin, le pH du milieu est de préférence compris entre 6 et 9. les exemples suivants sont donnés afin d'illustrer la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention sans pour autant, bien entendu, la limiter en aucune façon. EXEMPLE 1 Préparation du mutant A4 On effectue un étalement en masse d'une culture de la- souche CBS 717.73 -sur "Yeast natural broth" (YNB)-acétate d'ammonium 0,5 %-fluoro-acétamide 1 % gélosé (pH 6,5). Au bout de 8 à 10 jours des colonies résistantes apparaissent elles sont prélevées sur un milieu YNB-acétate d'ammonium 0,5 % sans fluoro-acétamide (pH 6,5). Leur résistance au fluoroacétamide est ensuite testée en milieu liquide comparativement à la souche sauvage. La souche mutante est ensuite testée en milieu liquide comparativement à la souche sauvage.La souche mutante est ensuite étalée sur YNB-acétate d'ammonium 0,5 % (pH 6,5) pour vérifier l'homogénéité et l'on effectue un "replica-plating" sur YNB-acétamide 0,5 % (pH 6,5) et YNB-acétate d'ammonium 0,5 %-fluoro-acétamide 1 % (pH 6,5). Plusieurs mutants défectifs ont été ainsi criblés à partir de la souche R 312 (CBS 717.73). Ils sont stables en multiplication végétative. Une seule souche mutante a été utilisée dans les applications la souche A4 (collection de la chaire de génétique et microbiologie). EXEMPLE 2 Préparation de L-méthionine à partir de chlorhydrate d'&alpha;-amino-&gamma;-méthylthiobutyronitrile DL Une solution à 6 % de chlorhydrate da:-amino-S- méthylthiobutyronitrile (pH compris entre 6,5 et 8,5) est traitée par des bactéries de la souche A4 à la concentration d'environ 30 g de matière sèche par litre. La transformation est quantitative en L-méthionine (50 %) et en D-amide correspondant (50 %) en 2 à 3 heures. les produits sont séparés par les techniques connues. L'amide D est racémisé et peut 8tre recyclé. EXEMPLE 3 Préparation de D-méthionine à partir du chlorhydrate d'&alpha;-amino-&gamma;-méthylthiobutyronitrile DL le traitement commence dans les mêmes conditions que ci-dessus. Après séparation, l'&alpha;-amino-&gamma;-méthylthiobutyramide D est traité par des bactéries de la souche R 312 (CBS 717.73) dans les mêmes conditions. On obtient ainsi la D-méthionine. L'hydrolyse de 1 l'&alpha;-amino-&gamma;-méthylthiobutyronitrile permet donc d'obtenir, bien séparées, de la L-méthionine et de- la D-méthionine. EXEMPLE 4 Préparation de B-méthionine à partir du chlorhydrate d'&alpha;-amino-&gamma;-méthylthiobutyramide DL le traitement d'une solution à 6 % de chlorhydrate d'&alpha;-amino-&gamma;-méthylthiobutyramide Pli dans l'eau (pH 6,5 à 8,5) est effectué par une suspension de cellules de la souche A4 à 20 à 40 g par litre de matière sèche. On obtient quantitativement de la B-méthionine (50 fio) et de la D-méthionamide (50 ). Cet amide D peut être, soit hydrolysé en D-méthionine par action de la souche R 312 (CBS 717.73), soit racémisé et recyclé en vue de la préparation de L-méthionine. EXEMPLE 5 Préparation de L-phénylalanine à partir de chlorhydrate d'amino-2-phényl-3-propionitrile DL Une solution à 5 % de chlorhydrate d'amino-2-phényl-3propionitrile (pH compris entre 6,5 et 8,5) est traitée par des bactéries de la souche A4 à la concentration de 20 à 40 g de matière sèche par litre. La transformation est quantitative en L-phénylalanine (50 ) et en Amide correspondant (50 ) en 2 à 3 heures. les produits sont séparés par les techniques connues. L'amide D est racémisé et peut être recyclé. EXEMPLE 6 Préparation de D-phénylalanine à partir de chlorhydrate d'amino-2-phényl-3-propionitrile DL le traitement commence dans les mêmes conditions que ci-dessus. Après séparation, l'amino-2-phényl-3-propionamide D est traité par des bactéries de la souche R 312 (CBS 717.73) dans les mêmes conditions. On obtient ainsi la D-phénylalanine. L'hydrolyse de I D-phénylalanine. EXEMPLE 7 Préparation de L-phénylalanine à partir du chlorhydrate d'amino-2-phényl-3-propionamide DL Le traitement d'une solution à 5 C/a de chlorhydrate d'amino-2-phényl-3-propionamide dans l'eau (pH compris entre 6,5 et 8,5) est effectué par une suspension de cellules de la souche A4 à 20 à 40 g de matière sèche par litre. On obtient quantitativemènt de la L-phénylalanine (50 %) et du D-amide correspondant (50 %). Cet amide D peut être, soit hydrolysé en D-phénylalanine par action de la souche R 312 (CBS 717.73), soit racémisé et recyclé en vue de la préparation de L-phénylalanine. EXEMPLE 8 Préparation de L-&alpha;-alanine à partir de chlorhydrate d'&alpha;-amino-propionitrile DL Une solution à 6 % de chlorhydrate d'&alpha;-amino-propio- nitrile dans l'eau (pH compris entre 6,5 et 8,5) est traitée par des bactéries de la souche A4 à la concentration de 20 & 40 g de matière sèche par litre. La transformation est quantitative en L-&alpha;-alanine (50 %) et en D-a-aminopropionamide (50 %) en 2 à 3 heures. Les produits sont séparés par les techniques connues. Amide D est racémisé et peut être recyclé. EXEMPLE 9 Préparation de D-&alpha;-alanine à partir de chlorhydrate d'o-aminopropionitrile DL Le traitement commence dans les mêmes conditions que ci-dessus. Après séparation, l'&alpha;-aminopropionamide D est traité par des bactéries de la souche R 312 (CBS 717.73) dans les mêmes conditions. On obtient ainsi la D-o-alanine. L'hydrolyse de l'&alpha;-aminopropionitrile permet donc d'obtenir, bien séparées, de la L-W-alanine et de la D-&alpha;-alanine. EXEMPLE 10 Préparation de L-&alpha;-alanine à partir du chlorhydrate d'&alpha;-aminopropionamide DL Le traitement d'une solution à 6 % de chlorhydrate d'a-aminopropionamide dans l'eau (pH compris entre 6,5 et 8,5) peut être effectué par une suspension de cellules de la souche A4 à 20 à 40 g de matière sèche par litre. On obtient quantitativement de la L-o;-alanine (50 %) et du D- -aminopropionamide (50 %). Cet amide D peut être, soit hydrolysé en D-&alpha;-alanine par action de la souche R 312 (CBS 717.73), soit racémisé et recyclé en vue de la préparation de L-&alpha;-alanine. REVENDICADIONS 1) Procédé de préparation de L -amino-acide, caractérisé en ce que lton hydrolyse en milieu liquide l'w-amino- amide racémique correspondant, sous forme libre ou sous forme de sel, par un agent contenant une amidase B-stéréo- spécifique et en ce que l'on sépare le L a-amino-acide obtenu du D a-amino-amide non-hydrolysé. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l' l' -amino-nitrile correspondant, sous forme libre ou sous forme de sel, par action d'un agent contenant une nitrilase générale. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les agents utilisés sont des bactéries ou des préparations acellulaires d'origine bactérienne ne possédant pas d'amidase générale. 4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les bactéries ou les préparations d'origine bactérienne proviennent d'une souche possédant à la fois une amidase B-stéréospécifique et une nitrilase générale. 5) Procédé selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisé en ce que les bactéries ou les préparations acellulaires d'origine bactérienne proviennent d'une souche, mutante d'une souche possédant une amidase générale, ledit mutant étant capable de croître sur un milieu nutritif contenant du monofluoro-acétamide. 6) Procédé selon la- revendication 5, caractérisé en ce que les souches possédant une amidase générale sont choisies dans les genres Bacillus, Bacteridium au sens de Prévot, Micrococcus et Brevibacterium au sens de Bergey. 7) Procédé selon l'une des revendications 5 et 6, caractérisé en ce que les souches possédant une amidase générale sont choisies parmi les souches n R 332, R 340, R 341, A 111, B 222, A 112, A 13, A 141, A 142, B 211, B 212, B 221, C 211, R 21, R 22, R 311, R 312, R 331, déposées à la chaire de génétique de l'école Nationale Supérieure Agronomique de Montpellier et présentant les caractéristiques morphologiques et physiologiques décrites dans les tableaux I et II de la description. 8) Procédé selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que les souches possédant une amidase générale sont choisies parmi les souches déposées au Centraal bureau voor Schimmelcultures à Delft sous les n C 211 CBS 499.74, R 312 CBS 717.73, B 222 CBS 498.74, A 111 CBS 497.74, R 341 CBS 496.74, R 340 CBS 495.74, R 332 CBS 494.74. 9) Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'agent possédant une amidase L- stéréospécifique est la souche A4 déposée sous le n SMD 79.2. 10) Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'hydrolyse est conduite à un pH compris entre 6 et 9. 11) Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'hydrolyse est conduite en milieu aqueux. 12) Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'-amino-amide racémique est préparé par racémisation du D &alpha;-amino-amide non hydrolysé d'une préparation précédente. 13) L -amino-acide obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 12. 14) D w-amino-amide obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 12. 15) Application du D -amino-amide selon la revendication 14 à la préparation de D z-amino-acide par hydrolyse en présence d'un agent contenant une amidase générale.