Brevet FR2457692A1 — publié le 19801226

La présente invention concerne la médecine vétérinaire et plus précisément un vaccin vivant de virus cultivé responsable de la maladie de Carré des animaux carnas- siers et son procédé de préparation. la maladie de Carré des animaux carnassiers est une affection contagieuse aiguë des betes à poils et des chiens. Les jeunes visons, renards argentés et renards bleus sont très sujets å cette affection infectieuse. La maladie porte un énorme préjudice économique aux fermes d'élevage des betes a' fourrures à cause d'une haute mortalitre et de l'absence de remèdes thérapeutiques efficaces. Pour la prévention de a maladie de Carre des animaux carnassiers on utilise à llheure actuelle un certain nombre de vaccins vivants de virus cultivés renfermant des souches atténuées de virus de la maladie de Carré adaptées aux cultures de cellules ces reins de chiens, ou des reins de singes ou d'embryons de poules. Le vaccin, contenant une souche atténuée de virus de canine distemper des animaux carnassiers, notamment "Rocborn", obtenue à partir du virus sauvage isolé dans le sang d'un chien malade, est prepaxé dans une culture de cellules des reins de chiens0 Pour pré- parer ce vaccin, la souche de'virus. indiquée est adaptée à une culture de cellules des reins de chiens par plusieurs passages (plus de 50) et on la cultive sur une culture de cellules citée dans une solution de Hanks, contenant 0,5 R d'hydrolysat de lactalbumine et 10 % de serum de cheval ou 20 % de serum de veau ou dans le milieu d'Earle, contenant 0,5 % d'hydrolysat de lactalbumine et 2 r de sérum de cheval ou de veau .On maintient la température d'adap- tation dans des limites entre 30 et 37 OC, de préférence entre 35 et 37 OC. Le vaccin obtenu est stabilisé et lyophilisé (brevet d'ih vention des Etats-Unis d'Amérique n 3 098 011). On connaît également un vaccin contre la maladie de Carre- des animaux carnassiers obtenu à partir d'un virus, ayant subi 10 passages sur une culture de cellules des reins de chiens dans un mi- lieu d'Earle, renfermant 50 S d'hydrolysat de lactalbumine et 5 r de sérum de cheval à une tempe rature de 38,5 C (brevet d'inventio- des Etats-Unis d'Amérique n 3 354 038). Les vaccins indiques possèdent une haute activité innuno- gène mais présentent toutefois un certain nombre dwinconvénients. L'un des inconvénients tient à un bas pouvoir reproductif du virus dans la culture de cellules des reins de chiens. Un autre inconvénient des vaccins susmentionnés est l'utilisation en qualité de substrat pour l'atténuation du virus et la préparation du vaccin, de la culture de cellules des reins de chien Les reins de chiens peuvent être contaminés avec des virus étranger Pour éliminer l'infectiosité des chiens, il est nécessaire de créer un élevage dans lequel les animaux seraient maintenus dans des con ditions strictement contrôlables, mais cela exige des grandes dépenses matérielles. Un autre inconvénient des vaccins tient à la difficulté de la détermination de leur activité biologique, étant donné que la re production du virus s'accompagne d'une action cytopathogene qui n'est pas nette, se manifestant 20 jours après l'inoculation, quand des altérations dégénératives non spécifiques des cellules peuvent apparaître ce qui rend difficile l'évaluation des résultats. Un autre inconvénient des vaccins indiqués préparés sur une culture de cellules des reins de chiens est une croissance lente des cellules (la monocouche de cellules se formeseulement en 5-7 jours), ce qui rend plus long le processus technologique de préparation du vaccin. -Les vaccins.de virus destinés à lutter contre la maladie de Carré des animaux carnassiers, préparés en cultivant la souche de virus sur une culture de cellules d'embryons de poules de 9 jours ou dans les cavités chorioall antoIdiennes d'embryons de poules, peuvent être dangereux à cause d'une haute contamination des embryons de poules par des virus étrangers, et, particulièrement,pal des virus du groupe de la leucosarcomatose (brevets des Etats-Unis d'Amérique nO 2912361, 2965544). Le vaccin préparé sur une culture de cellules d'embryons de poules à partir de la souche connue sous la dénomination K-668 (fibroblast de poule) (URSS) possède également l'inconvénient indiqué. Le vaccin américain (vaccin ASL), est inoffensif et prive de cet inconvénient, parce qu'il est preparé sur une culture de cellules d'embryons de poules sans leucémie. Cependant pour'eIevae des poules sans leucémie, on a besoin d'élevages spéciaux dont la création et le maintien sont coûteux. En outre, la souche vaccinale de virus ne présente pas d'action régulière cytopathique dans la culture de cellules d'embryons de poules, ce qui rend plus comple- xe la mise en oeuvre de la préparation du vaccin. On connaît aussi un vaccin de virus contre la maladie de Carré des animaux carnassiers, préparé en cultivant du virus de la maladie de Carré des animaux carnassiers sur une culture de cellules ces reins de singes verts (brevet d'invention des Etats-Unis åtshmérique nO 4 004 974). Ce vaccin est suffisamment inmunosène, non réactogène, hautement standard et inoffensif. Cependant la chasse aux singes est à l'heure actuelle limitée dans plusieurs pays à cause d'une réduction du cheptel dOs animaux. Etant donné que le vaccin en question prévoit l'utilisation des déchets de la production du vaccin de poli on yébt e pour l'homme et est directement lié à cette production, il est facile de comprendre que la production séparée du vaccin ce la maladie de Carre à base d'une culture cellulaire des reins de singes serait très coûteuse et injustifiée. En effet, le choix du substrat cellulaire pour la préparation du vaccin de virus est compliqué. Une condition obligatoire est l'absence de la contamination du substrat cellulaire avec des virus étrangers ainsi qu'une possibilité de l'obtention du virus de vaccin en quantité suffisante.-- La présente invention a pour objectif la mise au point du vaccin contre la maladie de Carré es animaux carnassiers qui possederait des immunogénicité, antigénicité etinnocuité élevées, ne contiendrait pas de virus étrangers et aurait un bas prix de revient. Conformément à cet objectif, on s'est donc proposé de mettre au point un procédé de préparation au vaccin en utilisant une nouvelle souche de virus de maladie de Carré des animaux carnassiers capable dlêtre cultivé sur un substrat inoffensif et accessible et permettant d'obtenir un vaccin possédant des immunogénicité, anti génicité et innocuité élevées et en absence de virus étrangers. Conformément à l'invention, on propose un vaccin vivant de virus cultivé contre la maladie de Carré- des animaux carnassiers, renfermant une souche atténuée ECM de virus de "la peste des ar;i- maux carnassiers", souche déposée sous le NO 10-76, obtenue à partir du virus "sauvage", isolé dans du sang du vison atteint de la maladie de Carré, par plusieurs passages successivement sur les cul tures de cellules suivantes : 1) culture des cellules -9 de reins de chiens ; 2) culture QonstanLn0ent maintenue de cellules de reins d'embryons d'homme Rh ; 3) culture mixte de cellules, renfermant des cellules de reins de chiens et des cellules d'embryons dc cailles japonaises, souche qui a été adaptée à la culture de cellules d'em- bryons de cailles japonaises et cultivée sur cette culture. Conformément à l'invention, on propose un procédé de préparation d'un vaccin vivant de virus cultivé contre la maladie Oe Carré des animaux carnassiers, procédé consistant à cultiver sur une culture de cellules d'embryons des cailles japonaises dans un milieu nutritif approprié la souche atténuée de virus de la maladie de Carré des animaux carnassiers (ECrt) v déposée sous le N 10-76, obtenue à partir du virus sauvage, isolé du sang du vison atteint de- la malade de Carré par plusieurs passages successivement sur les cultures de cellules suivantes : 1) culture de cellules de reins de chiens 2) culture constamment maintenue de cellules de reins d'embryons d'homme Rh ; 3) culture mixte de cellules renfermant les cellules de reins de chiens et les cellules d'embryons de cailles japonaises avec adaptation subséquente à la culture de cellules d'embryons des cailles japonaises ; à récolter le liquide contenant le virus et à lyophiliser le liquide contenant du virus en présence d'un stabilisant convenable. La souche de virus atténuée indiquée, utilisée pour la préparation du vaccin contre la maladie de Carrédes animaux carnassiers, est dénommée souche ECM de virus de la maladie de Carré des animaux carnassiers. Sous le terme "ECM" on entend les lettres majuscules des mots suivants : embryon de caille, Moscou. La souche en question est une souche de vaccin nouvellement obtenue et est déposée sous le numéro 10-76 à l'institut pansovietique scientifique de controle des préparations vétérinaires du Ministère de 1'Agriculture de l'URSS. (Vessojuznom gosudarstvennom nauchno-controlnom institute veterinarnych preparatov Alinis,erstva selskogo khozjastva SSSR). La souche ECM de virus de la maladie de Carré des animaux car- nassiers, déposée sous le numéro 10-76 est préparée à partir du virus "sau-vagett, isolé du sang du vison atteint delamaladie de Carré par 20 à 40 passages sur une culture de cellules des reins de chiens à une température de 37(1) OC, puis par 5 à 15 passages sur une culture de cellules des reins d'embryons-de l'homme, Rh à une température de 32 (+ 1) OC, et par 2 à 7 passages sur une culture de cellules renfermant des cellulesdes reins de chiens et des cellules d'embryonsdes cailles japonaises à une température de 35(+l)C avecr adaptation ultérieure pendant 4 à 10 passages sur une culture de cellules d'embryons des cailles japonaises (coturnix coturnix japonica). Pour préparer le vaccin, on cultive la souche indiquée sur une culture de cellules d'embryons des cailles japonaises sur un milieu nutritif approprié, par exemple sur le milieu 199 ou le mi- lieu d'Earle avec addition de 10 S de serum de sang de bovin. On effectue la première récolte du liquide contenant le virus après l'apparition d'une action cytopathique du virus dans 20-40 S de cellules. On sèche par lyophilisation le liquide contenant le virus obtenu en présence d'un stabilisant convenable, par exemple en présence de 4,5-5,5 , de sorbitol et 1,4-1,6 , de gélatose. La souche vaccinale ECM de virus de la maladie de Carré des animaux carnassiers, déposée sous le numéro 10-76 est une souche hautement atténuée, qui se multiplie sur une culture de cellules d'embryons des cailles japonaises et a une action cytopathique nettement marquée, ce qui simplifie considérablement le processus dl-=5- tention du vaccin. La souche en question est très stable au stockage. Le vaccin suivant l'invention présente les avantages suivants : a) le vaccin est inoffensif, n'a pas d'action toxique ; il est préparé sur une culture de cellules d'embryons des cailles japonaises, qui est une matière première bon marché et accessible, dont l'absence de virus étrangers est contrôlable d'une façon incontestable. Les cailles japonaises sont naturellement résistantes airc vi rus du groupe leuco-sarcomatose, c'est pourquoi la culture de cellules de leurs embryons est le substrat optimal pour la production du vaccin de virus ; b) la-culture de cellules d'embryons des cailles japonaises est douée d'une activité élevée de.prolifération, ce qui permet d'infecter la suspension de cellules sans attendre la formation de monocouche des cellules c) le vaccin présentant une haute activité antigénique con fère aux bêtes inoculées une immunité intense et prolongée, l'utilisation du vaccin dans les foyers d'épizootie de la "peste des animaux carnassiers" supprime rapidement le foyer d'infection d) le vaccin peut etre utilisé non seulement par voie parentérale mais aussi sous forme d'aérosol, ce qui rend plus facile et moins chère la prophylaxie vaccinale e) étant donné que le vaccin est hautement actif, cela permet de produire une préparation commerciale avec un large intervalle de doses (de 1 à 500) dans une ampoule ou un flacon, ce qui est très commode pour l'utilisation individuelle ou en masse du vaccin. Les avantages indiqués et d'autres caractéristiques de 1' invention seront mieux compris à la lecture de la description du vaccin, de son procédé de préparation et de son application. La méthode de préparation du vaccin de virus vivant cultivé est fondée sur un système de virus d'ensemencement. Le système de virus d'ensemencement prévoit la préparation en grand volume du virus vaccinal répondant à toutes les exigences de la souche atténuée ainsi que sa conservation à l'état congelé et son utilisation, au cas de besoin, pour préparer le vaccin. Comme il a été indiqué plus haut, pour préparer le vaccin contre la maladie de Carré des animaux carnassiers, on utilise la souche atténuée ECM déposée sous le numéro 10-76. La souche indiquée a été préparée à partir du virus virulent "Sauvage" de la maladie de Carré des animaux carnassiers, isolé du sang du vison atteint de la maladie de Carré. Ce virus sauvage a été atténué par passages multiples sur diverses cultures de cellules selon la séquence suivante ; 1) sur une culture de cellules des reins de chiens pendant 20 à 40 passages à une température de 37 (+1)OC; 2) sur une culture constamment maintenue de cellules des reins d'embryons d'homme, Rh pendant 5 à 15 passages à une température de 32 (+ o) OC; ; et 3) sur une culture mixte de cellules constituées par les cellules des reins de chiens et les cellules d'embryons des cailles japonaises, pendant 2 à 7 passages à une température de 35 (+1) OC Le processus d'atténuation terminé, le virus subit l'adaptation â la culture de cellules d'embryons des cailles japonaises pendant 4-10 passages. La souche de virus obtenue est classée par une méthode de dilutions limites dans la culture de cellules d'embryons des cailles japonaises.A la suite des actions indiquées la souche de virus acquiert une activité cytopathique se manifestant nettement, laquelle permet de contrôler l-e processus de préparation du vaccin, de récolter le virus dans les délais optimaux, de simplifier considérablement la détermination de l'activité infectieuse du virus et, en outre, permet d'établir la spécificité du virus dans la culture de cellules et d'identifier les anticorps dans le sérum du sang des animaux immunisés.La souche de virus obtenue se distin gue par les caractéristiques suivantes 1) la spécificité dans la réaction de neutralisation sur la culture de cellules d'embryons des cailles japonaises 2) l'innocuité pour les animaux de laboratoire : souris, cobayes, lapins, embryons de poules ainsi que pour les visons et les renards bleus ; 3) l'activité infectieuse dans la culture de cellules d'embryons des cailles japonaises ; 4) l'activité antigénique ; 5) l'activité immunogène 6) l'absence des virus de contamination 7) la stérilité bactérienne, l'absence des mycoplasmes PPIO 8) la stabilité au stockage ; 9) l'absence de la contagiosité. On prépare le virus d'ensemencement sur une culture de cellules d'embryons des cailles japonaises à partir de la souche de virus indiquée ayant toutes les caractéristiques précitées. Le virus d'ensemencement doit avoir toutes les caractéristiques qualitatives analogues à celles de la souche indiquée. Le virus d'ensemencement est conservé à l'état congelé à une température non supérieure à (-200C) et est utilisé en cas de besoin. Pour préparer le vaccin, on utilise une culture trypsinisée de cellules des tissus d'embryons des cailles japonaises. Le tissu des embryons de 9-10 jours deys cailles japonaises subit le broyage et la trypsination par une méthode courante. A la suspension de cellules obtenue on inocule le virus d'ensemencement et on additionne la suspension d'un milieu nutritif convenable. Comme milieu nu tritif on peut utiliser les milieux conilus utilisés pour cultiver des cellules et des virus, par exemple le milieu 1Ç9, contenant 1CII de sérum de bovin à un pH de 7,0 à 7,5.La culture de cellules infectée subit une incubation dans des flacons en rotation à une te3perature de 35 (+1) OC. Après la formation de la monocouche de cellules et l'apparition de l'action cytopathique du virus dans 20--0 de cellules, on effectue la première récolte du liquide contenant le virus. Pour augmenter les récoltes de virus et utiliser plus entièrement la culture de cellules, on réalise plusieurs récoltes du liquide contenant le virus sur le même échantillon de culture, en -: ajoutant un milieu nutritif frais. Les opérations indiquées sont repétées jusqu'à une dégénération complète des cellules de culture. Pour extraire le virus intracellulaire, on congèle et on décongèle la culture de cellules. On réunit dans un récipient les liquides contenant le virus recueilli après le contrôle de la stérilité et de l'activité infectieuse, on ajoute un stérilisant, on verse dans des flacons ou des ampoules et on lyophilise. La préparation desséchée contient jusqu'à 3 % en poids d'humidité résiduaire. La durée de la validité d'une préparation de vaccin lyophi lisée est non inférieure à un an. Le vaccin lyophilisé est conservé & une température ne dépassant pas 4 OC, La conservation du vaccin à une température encore plus basse prolonge de plusieurs mois la durée de la validité. Pour la dilution du vaccin desséché, on emploie une solution saline préparée à partir de la solution de Hais. La préparation de vaccin obtenue est soumise à un contrôle de 1a stérilité, de l'innocuité, de la spécificité, de l'absence des virus de contamination, de l'activité infectieuse, de l'activité immunogène et antigène et de l'humidité résiduaire. Le vaccin peut être ensuite utilisé tant pour l'immunisation prophylactique des bêtes à poilset des chiens que pour l'application thérapeutique pendant les premiers jours après le contact avec un animal carnassier atteint de la maladie de Carré. La dose moyenne unique pour la vaccination des animaux doit contenir au moins 10 DCT50 (dose cyto- pathique tissulaire). Une augmentation de la teneur en virus jus qu'â 100 000 DCT50 ne provoque pas de réactions indésirables chez les animaux. Oneffectue l'immunisation des animaux par voie intramus culaire sous forme de doses de 0,1 ml de vaccin. Pour vérifier. ltefficacité de la vaccination, on peut rca- liser l'examen sérologique des animaux immunisés 10 à 14 jours après la vaccination et déterminer les titres d' anticorps dans la réaction de neutralisation sur une culture de cellules d'embryon ons des cailles japonaises, en utilisant en qualité d'antigène la souche de vaccin indiquée, présentant un effet cytopathique nettement marqué. Les anticorps sont identifiés chez tous les animaux immunisés avec un titre de 1/16 â 32. L'accumulation maximale des anticorps (avec un titre 1/256) est déjà observée le 30è jour. Les anticorps sont conservés dans le sang pendant 18 mois d'observation.Après la contamination ultérieure des animaux immunisés par une souche virulente de Snyder Hill 1, 3, 6, 12 et 18 mois après l'immunisation par le vaccin indiqué, on n'a pas observé de cas d'infection. Ainsi, le vaccin proposé est doué de 120 % d'activité immunogène et antigène. Le vaccin suivant l'invention a été utilisé dans une ferme d'élevage de bêtes à fourrure au moment de la rechute de la maladie -de Carre chez les renards argentés. Un mois après la vaccination, l'infection a été supprimée et elle nta pas été observée dans la période suivante. Près de la ferme d'élevage de renards il y avait une ferme d'élevage des visons. A cause de la contagiosité élevée du virus de la maladie de Carré des animaux carnassiers, des cas de la maladie sporadioue des visons ont été enregistrés. L'administration immédiate du vaccin proposé a prévenu la rechute de la maladie de Carré chez les visons. Ainsi les résultats obtenus montrent le pouvoir du vaccin préparé à partir de la souche d'ECM de virus de la maladiCrrré des animaux carnassiers, déposée sous le NO 10-76, de supprimer ia rechute de la maladie dans la ferme pendant 3-4 semaines. Le vaccin suivant l'invention peut également etre utilisé pour l'immunisation des betesJpar aérosol. On peut utiliser dans ce but un vaccin préparé pour injections, c'est-à-dire les séries commerciales ordinaires du vaccin. La technique d'aérosol permet d'immuniser un grand nombre d'animaux dans un court délai. Au cours des essais du vaccin suivant l'invention sur les animaux soumis à la prophylaxie il a éte mis en évidence que pra tiquement dans 100 En outre le vaccin était très efficace comme moyen supprimant le foyer de l'infection. Le vaccin suivant l'invention a un prix de revient suffisamment bas, grâce à l'utilisation en qualité de substrat d'une culture de cellules d'embryons des cailles japonaises. La culture indiquée possède des avantages suivants pour production du vaccin comparativement aux autres cultures connues. L'avantage majeur du substrat est le fait que les cailles japonaises ne sont pas naturellement sujettes aux virus du groupe de la leucémie des oiseaux et sont résistantes au cours de leur infection. Un autre avantage important de la culture de cellules des cailles japonaises est le fait qu'elle est dotée d'une haute activité prolifique et la monocouche de cellules est formée 1 à 2 jours après l'ensemencement des cellules. Un avantage encore de cette culture de cellules consiste en ce qu'on peut infecter la suspension cellulaire. Cela permet de réduire additionnellement la durée du processus de la production du vaccin. Un autre avantage de l'invention réside également dans 1' existence de récoltes multiples du liquide contenant le virus (jus qutà 5 récoltes sur un même échantillon de culture). Vu que les cailles japonaises sont accessibles et peu couteuses, le maintien des fermes de cailles ne présentant pas de complications et n'exigeant pas de grandes dépenses matérielles. Il est donc facile à comprendre la valeur commerciale du vaccin proposé. A titre d'illustration de l'invention, on donne ci-après des exemples parmi lesquels l'exemple 1 montre la préparation de la souche EC}I du virus de la maladie de Carre des animaux carnassiers, déposée sous le numéro 10-76, l'exemple 2 décrit le procédé de préparation d vaccin vivant cultivé, les exemples 3-9 montrent l'application du vaccin chez les animaux. EXEBIPLE 1 Préparation de la souche atténuée ECM de virus de maladie de Carrs des animaux carnassiers, déposée sous le NO 10-76, à partir du virus virulent sauvage. Dans chacune des dix éprouvettes, contenant la préculture de cellules des reins de chien, on introduit 0,2 ml de sang défi- briné du vison atteint de la maladie de Carré . Après contact pendant 3 heures à la température ambiante, on lave soigneusement la culture de cellules avec le milieu nutritif 199, on introduit dans chaque éprouvette 1,5 ml de milieu nutritif 199 frais avec 10 ode sé- rum de sang ae bovin et on fait incuber les cultures de cellules a une température de 37 OC, Une ou deux fois par semaine on remplace le milieu nutritif. 62 jours après l'infection on prélève dans toutes les éprouvettes le liquide contenant le virus qu'cn utilise pour l'infection dtune nouvelle portion de culture de cellules des reins de chien. Pour cela dans chacune des 10 éprouvettes contenant la nouvelle culture primaire trypsinisée de cellules des reins de chien, on verse 0,3 ml de liquide obtenu contenant le virus et i ml de milieu nutritif 199 aaditionné de 10 S de serum de sang de bovin et on fait incuber les cultures à une température de 37 OC. Le liquide contenant le virus, recueilli 35-40 jours après l'infection des cultures précédentes sert de matériau d'infection pour les premiers 10 passages. Pour les 23 autres passages du virus, on utilise le liquide -contenant 'virus recueilli 15-20 jours après l'infection et on emploie également le virus isolé à partir des cellules après la con- gélatior > -décongélation des cellules infectées. Après une méthode d'infection analogue, on conduit ensuite 12 passages de virus sur la culture constamment maintenue de cellules du rein d'embryon d'homme Rh à une température de 32 OC. Le liquide contenant le virus, recueilli 15 à-20 jours après l'infection précédente, sert de matériau pour chaque infection subséquente. Puis on effectue l'atténuation du virus par plusieurs passages sur une culture mixte, constituée par 2 millions de cellules des reins de chiens et 2 millions de cellules d'embryons des cailles japonaises, à une température de 35 OC. Sur cette culture mixte, on a effectué 3 passages de virus ; puis on a fait 5 passages du virus sur une culture de cellules d'embryons des cailles japonaises å une température de 35 C dans des flacons en rotation & 4 t/min.Après le cinquième passage, le virus provoquait régulièrement une destruction cytopathique des cellules observée 5 à 7 jours après l'infectionW Ce virus a été cloné par une méthode de dilutions limites dans la culture de cellules d'embryons des cail- les japonaises et utilisé en qualité de couche vaccinale.La souche atténuée obtenue de virus de larnlad4n c xrx O. sizimaux carnassiers adaptée à la culture de cellules d'embryons des cailles japonaises a subi plusieurs contrales tels que 1) la spécificité (identification) dans la réaction de neutralisation sur une culture de cellules d'embryons des cailles japonaises 2) l'innocuité (sur des animaux de laboratoire : souris, embryons, cobayes, lapins et également visons et renards bleus); 3) l'activité infectieuse sur une culture de cellules d'em- bryons des cailles japonaises ; 4) l'activité antigénique 5) l'activité immunogène ; 6) l'absence des virus de contamination 7) la stérilité bactérienne, absence de mycoplasmes (PPIO); 8) la stabilité de la préparation au stockage 9) l'absence de la contagiosité. EXEMPLE 2 Préparation du virus d'ensemencement et du vaccin a) préparation du virus d'ensemencement. On prépare le virus d'ensemencement à partir de la souche ECM 10-76, obtenue comme dans l'exemple 1. On utilise alors des embryons de 9 à 11 jours des cailles japonaises > - fournis par une ferme de cailles spéciale contrôlable. On trypsinise 100 embryons par une méthode connue et on obtient 3 300 000 000 de cellules qu'on met en suspension dans 4 120 1 de milieu nutritif 199, on ajoute 10 % de sérum de bovin et 100 mg/ml de monomycine. On distribue 300 ml de suspension cel lulaire, à raison de 150 ml, dans deux flacons de 1 litre, qu'on laisse pour le contrôle. Dans une autre partie de la suspension cellulaire on introduit 10 ml de liquide cultivé contenant la so - che vaccinale ECM 10-76 et on répartit, à raison de 150 ml, dans des flacons de 1 litre. On fait incuber la suspension dans les flacons en rotation à une température de 35 C. On élimine le nilieu nutritif 3 jours après l'ensemencement et l'infection des cellules et on introduit du milieu frais 199 a' 100 mg/ml de monomycine dans les. flacons. 6 jours après l'infection des cellules, lorsque les foyers de l'activité cytopathique du virus apparaissent, on recueille le liquide contenant le virus à partir tous les flacons, on prélève des échantillons pour le contrôle approprié et on introduit du milieu 199 frais dans les flacons. On prélève le liquide contenant le virus plusieurs fois, jusqu'à ce que la teneur en cellules reste égale à 50 %. Pais, on introduit 70 ml de milieu 199 frais, on congèle la culture de cellules sur de la carboglace et on décongèle pour isoler le virus intracellulaire. A toutes les étapes de préparation du virus d'ensemencement, on effectue le prélèvement des échantillons pour contrôle. Le virus d'ensemencement doit subir les contrôles suivants ; controles de spécificité, d'innocuité, d'activité infectieuse, dtantigénici- té, d'immunogénicité, d'absence des virus de contamination, de stérilité, d'absence de contagiosité. Le virus d'ensemencement répondant aux exigences indiquées du contrôle, est conservé à l'état congelé à une température non supérieure à -20 OC. b) Préparation du vaccin. On utilise pour cela des embryons de 9 à 11 jours des cailles japonaises fournies par une ferme de cailles spéciale contrôlable. On trypsinise 200 embryons d'après une technique connue et on obtient 6 600 000 000 de cellules qu'on met en suspension dans 8 250 1 de milieu nutritif 199, on ajoute 10 % de serum de bovin et 100 mg/ml de monomycine. On répartit 750 ml de suspension cellulaire dans 5 flacons de 1 litre à raison de 150 ml qu'on laisse pour le contrôle. Dans l'autre partie de la suspension cellulaire on verse 10 ml de liquide cultivé contenant le virus d'ensemencement de la souche ECM 10-76, obtenue suivant le point "a", et on répartit à raison de 150 ml, dans des flacons de 1 litre.On fait incuber le liquide cultivé dans les flacons en rotation à une température de 35 OC 3 jours après l'ensemence- ment et l'infection des cellules; on évacue le milieu nutritif et on introduit du milieu 199 frais et 100 mg/n.l de monomycine dans les flacons 6 jours après l'infection de la suspension cellulaire, quand apparaissent les foyers d'activité cytopathique du virus dans 30 % des cellules, on recueille le liquide contenant le virus dans des flacons, on prélève les échantillons pour le contrôle correspondant et on verse du milieu 199 frais dans les flacons. On récolte ultérieurement le liquide contenant le virus plusieurs fois jusqutà ce que la teneur en cellules soit de 50 % et on introduit 70 ml de milieu 199 ; on congèle la culture de cellules sur de la carboglace et- on décongèle pour isoler le virus intercellulaire. On réunit toutes les récoltes stériles de virus dans un récipient, on y ajoute un stabilisant constitué par 5 2,O de sorbitol et 1,5 % de gélatose, on répartit le vaccin dans des ampoules ou flacons et on lyophilise. Ce pool représente une seule série de vaccin. Le vaccin obtenu peut être distribué dans des flacons ou ampoules de diversescapacitésde 1 à 33 ml et peut contenir de 1 à 500 doses dans un flacon ou une ampoule suivant le désir du consommateur. A A toutes les étapes de préparation du vaccin, on effectue le prélèvement des échantillons pour le contrôle. Le vaccin doit subir les contrôles suivant s : contrôle de specificité, d'innocuité d'activité infectieuse, d'activité antigénique et immunogène, d'absence des virus de contamination, de stérilité et d'absence de contagiosité. La série de vaccin, répondant aux indices de contrôlesir.ai- qués, peut être utilisée pour l'immunisation des animaux. Dans cet exemple, une série contient 360 000 doses de vaccin. EXEttPLE 3 Epreuve de l'innocuité du vaccin. Le vaccin est utilisé à une dose de 1 ml, contenant 100 DCTso de virus, après une dilution préalable par la solution de Hanks. Le vaccin a été administré par voie intra-musculaire. 24 petits de visons et 12 petits de renards bleus ont été vaccinés. On a pris pour le contrôle encore 16 petits de visons et 8 petits de renards bleus. Les animaux vaccinés ont été observés quotidiennement pendant 28 jours. Tous les animaux ont été cliniquement sains. Aucune réaction pathologique telle que refus de manger, accablement, indigestion, n'a été observée. Les animaux qui se trouvaient en contact avec les animaux vaccinés, n'ont pas été atteints de la maladie de Carré. EXED E E 4 Epreuve de l'antigenicité du vaccin. Chez les animaux vaccinés avec une dose de la préparation, comme il est indiqué dans l'exemple 3, on a réalisé des prélève entes des échantillons du sang 10 à 14 jours après la vaccination et on a déterminé les titres d'anticorps dans la réaction de ne'tra lisation sur une culture de cellules d'embryons de la caille japonaise, en utilisant en qualité d'antigène la souche vaccinaleECO. de virus de la maladie denSrre des animaux~carnassiers, déposée sous le N 10-76. Les anticorps ont été déterminés chez tous les animaux avec un titre de 1/16 â 32. L'accumulation optimale des anticorps (avec un titre de 1/256) a eu lieu dans 30 jours. Les anticorps ont été conservés pendant 18 mpis de l'observation. EXEMPLE 5 Epreuve de l'immunogénicité et de la durée de l'immunité du vaccin a) le vaccin dilué contenant 100 DCT50 de virus a été administré à 24 petits de visons et 12 petits de renards bleus par voie intra-musculaire, à raison de I ml. 16 petits de visons et 8 petits de renards bleus ont été choisis pour le contr8le. L'infec- tion des animaux vaccinés et ceux de contrôle avec le virus virulent a été faite 30 jours après (Snyder Hill - pour les visons et Gaujassky - pour les renards bleus). Les animaux ont été observés quotidiennement. Les animaux de contrôle (non inoculés) ont péri de la maladie de Carre, et les animaux inoculés n'ont montre aucune réaction apres l'introduction du virus virulent de h1mEladie de Cqrr6. Les animaux vaccinés demeuraient cliniquement sains pendant tous le délai d'observation (21 jours après l'infection). b) une année et une année et demi après la vaccination, les animaux ont été de nouveau infectés avec le virus virulent. Snyder Hill et Gaujassky. Aucun des animaux vaccinés n'a été atteint de la maladie de Carré et tous étaient vivants. EXEwLE 6 Epreuve du vaccin dans des conditions d'élevage. Dans 15 fermes d'élevage de bêtes à fourrure, avec le but de prophylaxie, dans la période de la vaccination d'été, ont été vaccinés 1 400 000 renards, 45 500 renards bleus, 2 500 zibelines, 300 000 visons et 255 chiens. Aucune des betes n'a été atteinte de.la maladie bien que des cas de maladie de Carre aient été observés dans les régions où se trouvaient les fermes. EXEMPLE 7 Epreuve du vaccin dans un foyer de maladie de Carre des animaux carnassiers. Dans une ferme où l'on avait enregistré plusieurs cas de maladie 7e -rMrre parmi parmi les jeunes bêtes - ^en -s 5, confirmés par analyses de laboratoire), l'épi@@cotie des e Se jeunes betes atteignait 120 petits par Jour. La vaccination de tous les animaux a été réalisée. Deux mois après la vaccination, l'épizootie des renardeaux est diminuée de deux fois et en un mois elle s'est entière- ment terminée. Dans une ferme de visons, qui se trouvait à la proximité directe de la ferme de renards, on avait enregistré des cas très rares de la maladie. Par la vaccination spéciale de tous les visons, on a prévenu la rechute de la maladie dans la ferme. EXETPLE 8 Comparaison de la préparation suivant l'invention par rapport aux vaccins connus. Dans une ferme d'élevage de visons, où l'on avait enregistré plusieurs cas de maladie de Carré des animaux carnassiers parmi les jeunes bêtes, tout le cheptel avait subi l'immunisation avec le vaccin connu K868 (URSS). Après l'administration du vaccin l'é- pizootie n'avait pas diminué et avait atteint 180 petits par jour. Une immunisation réitérée de 14 612 bêtes avait été réalisée d'urgence avec le vaccin suivant l'invention et 15 580 bêtes avec le vaccin d'ASL (USA). Après l'immunisation avec les vaccins indiqués, l'épizootie des jeunes bêtes avait nettement diminue, et au bout de deux mois l'apparition de la maladie avait été abolie. Ainsi, le vaccin proposé n'est pas inférieur au vaccin connu ASL quant à son efficacité. EXEMPLE 9 Epreuve du vaccin introduit sous forme d'aérosol. Pour l'administration par aérosol, on a utilisé le vaccin préparé d'une façon analogue à celle décrite pour le vaccin destiné pour administration par voie intramusculaire. 300 petits de visons agés de 45 à 60 jours ont été immunisés par aérosol. La pulvérisation du vaccin s'effectuait de sorte qutun groupe de visons recevait une dose unique ordinaire, le deuxième groupe -trois doses ordinaires ; les doses ordinaires sont des doses admises pour administration par voie intramusculaire. Les anticorps au virus de la maladie de Carré des animaux carnassiers dans le serun du sang des animaux immunisés ont été déterminés dans la réaction de neutralisation sur une culture de cellules d'embryons de la caille japo naise, en utilisant en qualité d'antigène la souche vaccinale ECM 10-76.Dans le groupe de visons vaccinés avec une dose, les anticorps ont été déterminés avec une dilution de 1/8, dans l'autre groupe de visons qui avait recu trois doses, les anticorps ont été déterminés avec une dilution de 1/32. On n'a pas observé de différence considérable de la valeur des titres des anticorps neutralisant le virus chez les animaux inmunisés par voie d'aérosol et intramusculaire (d'après l'exemple 4). Pour vérifier l'intensité de l'immunité chez les animaux vaccinés par voie d'aérosol on a utilisé la méthode d'infection par le virus virulent Snyder Hill. On n'a observé aucun cas de canine distemper chez les animaux vaccinés par voie d'aérosol après l'infection avec le virus virulent indiqué. Comme il ressort de exemple 9, le vaccin suivant l'invention préparé à partir de la souche ECM de la maladie de Carre des animaux carnassiers, déposée sous le N0 10-76est efficace, tant. pour les injections que pour l'immunisation par voie d'aérosol. REVEN DICATIONS 1 - Vaccin vivant de virus cultivé contre la maladie de Carré des animaux carnassiers, contenant une souche atténuée de virus de la maladie de Carré des animaux carnassiers, caractérisé en ce qu'il contient à titre de souche, la souche atténuée ECM de virus de la maladie de Carré des animaux carnassiers, déposée sous le nO 10 obtenue à partir du. virus sauvage, isolé du sang de vison atteint de la maladie de Carré par plusieurs passages successifs sur les cultures de cellules suivantes 1) culture de cellules de reins de chiens ; 2) culture constamment maintenue de cellules des reins d'embryons d'home Rh ; 3) culture mixte de cellules constituée par les cellules de reins de chiens et les cellules d'embryons de cailles japonaises, souche qui a été adaptée à la culture de cellules d'embryons de cailles japonaises et cultivée sur cette culture. 2 - Procédé de préparation du vaccin vivant de virus cultivé contre la maladie de Carré des animaux carnassiers suivant la revendication 1, qui consiste à cultiver la souche atténuée de virus de Ba maladie de Carré des animaux carnassiers sur une culture de cellules dans un milieu nutritif ; à récolter le liquide contenant le virus et à lyophiliser le liquide recueilli contenant le virus en présence d'un stabilisant, caractérisé en ce qu'àtitre de souche atténuée on utilise la souche ECM de virus de la maladie de Carré des animaux carnassiers, déposée sous le numéro 10-76, vb- tenue à partir du virus sauvage, isolé du sang du vison atteint de la maladie de Carré par plusieurs passages successifs sur les cultures de cellules suivantes : 1) culture de cellules de reins de chiens ; 2) culture constzuent maintenue de cellules de reins d' embryons d'homme Rh ; 3) culture mixte de cellules renfermant des cellules de reins de chiens et des cellules d'embryons de cailles japonaises, adaptée à la culture de cellules d'embryons des cailles japonaises, et on cultive la souche indiquée sur une culture de cellules d'embryons des cailles japonaises. 3 - Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce qu'on utilise la souche précitée de virus de la maladie de Carré des animaux carnassiers, qu'on obtient par 20 à 40 passages sur une culture de reins de chiens à une température de 3? (+1) OC, puis par 5 à 15 passages sur une culture constamment maintenue de cellu les de reins d'embryons d'homme Rh à une température de 32 (+1) OC, 2 à 7 passages sur une culture mixte de cellules constituée par des cellules de reins de chiens et d'embryons de cailles japonaises à une température de 35 (+1) OC avec adaptation ultérieure pendant 4 à 10 passages à la culture de cellules d'embryons des cailles japonaises. 4 - Procédé suivant les revendications 2-3, caractérisé en ce qu'on effectue la première récolte du liquide contenant le virus après l'apparition de l'action cytopathique du virus dans 20 à 40 X de cellules de la culture indiquée. 5 - Procédé suivant les revendications 2-4, caractérisé en ce qu'on effectue la lyophilisation du liquide recueilli contenant le virus en présence de 4,5 à 5,5 X en poids de sorbitol et 1,4 à 1,6 % en poids de gélatose.