Brevet FR2458587A1 — publié le 19810102

845858? Cette invention concerne le procédé de production du mélange antibiotique A-42355 contenant les facteurs A, B, D et H de l'antibiotique A-30912, et des facteurs séparés, par culture de l'organisme nouvellement isolé, Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440, dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de alucide, d'azote et de sels minéraux, dans des conditions de fermentation aérobie en immersion jusqu'à production d'une quantité substantielle d'activité antibiotique, séparation du mélange antibiotique et du milieu de culture et, si on le désire, isolement des différents facteurs à partir du mélange d'antibiotiques. Le but de cette invention est de fournir le procédé de production du mélange antibiotique A-42355 comprenant les facteurs A, B, D et H de A30912, et les différents facteurs séparés, par culture de l'organisme nouvellement isolé, Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440, dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucide, d'azote et de sels minéraux dans des conditions de fermenta- tion aérobie en immersion jusqu'à production d'une quantité substantielle d'activité antibiotique, séparation du mélange antibiotique et du milieu de culture, et isolement des différents antibiotiques. Le facteur H de A30912 est un antibiotique nouvellement découvert ayant une activité antifonqique. Cette invention fournit le procédé de production du mélange antibiotique A-42355 comprenant les facteurs A, B, D et H de A-30912, et du facteur A de l'antibiotique A-30912, du facteur B de l'antibiotique A-30912, du facteur D de l'antibiotique A-30912 et. du facteur H de l'antibiotique A30912, caractérisé en ce que: a) on cultive Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucide, d'azote et de sels minéraux dans des conditions de fermentation aérobieen immersion jusqu'à production d'une quantité substantielle d'activité antibiotique b) cn sépare éventuellement le mélange antibiotique A-42355 du milieu de culture; et c) On isole éventuellement les facteurs A, B, D et H de l'antibietiaue A-30912 à partir du mélange antibiotique A-42355. L'invention fournit également une culture biologiaue- ment pure du microorganisme Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440. Le facteur A de l'antibiotique A-30912 (antibiotique A-22082) et son procédé de production utilisant Aspergillus nidulans NRRL 8112 sont décrits dans le brevet des E.U.A N 4.024.246; et les facteurs A, B, C, D, E, F, et G de A-30912 et leur procédé de production utilisant Aspergillus rugulosus NRRL 8113 sont décrits dans le brevet des E.U.A. N 4.024.245. Le facteur H de A-30912, facteur mineur nouvellement découvert du mélange A-30912, est décrit dans la demande de brevet N déposée le même jour que la présente demande. Le spectre d'absorption infrarouge du facteur H de A-30912 en pastilles de KBr est donné sur la Ficaure 1 des dessins annexés. La Figure 2 des dessins annexés résume les déplacements relatifs des facteurs de A-30912 en chromateographie sur couche mince (CCM), en utilisant comme absorbant du gel de silice (Merck-Darmstadt), un système solvant 3:2 d'acétate d'éthyle et de méthanol et un bioautographe par Candida albicans pour la détection. La flèche indique le sens du déplacement du solvant; le signe + indique le point de départ. La zone o l'on peut voir les facteurs mineurs E, F et G est indiquée par un crochet. On trouvera dans le brevet des E.U.A. N 4.024.245 (Tableau I, colonne 4) des comparaisons des Rf particuliers du facteur A et des facteurs mineurs E, F et G de l'antibiotique A-30912. Cette invention fournit un nouveau procédé de production des antibiotiques A-30912. Les antibiotiques A-30912 sont produits sous forme d'un mélange comprenant plusieurs facteurs distincts. Le terme "mélange antibiotique" tel qu'utilisé dans le domaine de la fermentation et dans cette description désigne un mélange de facteurs antibiotiques-distincts produits simultanément. Comme le verra la personne connais- sant la production d'antiotiques par fermentation, le rapport des facteurs distincts produits dans un mélange antibiotique variera selon les conditions de fermentation utilisées. Le mélange antibiotique de la présente invention est désigné arbitrairement ici comme le mélange antibiotique A-42355. Cependant, pour éviter toute confusion, les désigna- tions A-30912 seront utilisées pour les facteurs distincts du mélange A-42355 qui sont identiques aux facteurs A-30912. Comme c'est le cas avec le mélange antibiotique A-30912, le facteur A de A-30912 est le facteur principal du mélange antibiotique A-42355; les facteurs B, D et H de A-30912 sont de même des facteurs mineurs dans le mélange A-42355. Le facteur A de A-30912 (antibiotique A-22082) est décrit dans les brevets des E.U.A. N 4.024.245 et 4.024.246. Au moment de la délivrance de ces brevets, on pensait que le facteur A de A-30912 pouvait être différent de l'échinocandine B [voir F. Benz et al., Helv. Chim. Acta 57, 2459-2477 (1974) et le brevet suisse N 568.386 (Derwent Abstract 75884W)]. Par la suite, il a été montré que le facteur A de A-30912 est identique à l'échinocandine B. L'antibiotique SL 7810/F a également été identifié comme étant l'échinocandine B [C. Keller-Juslen, et al., Tetrahedrcn Letters 1976 (46), 4147-4150, et le brevet belge N 834.289 (Derwent Abstract 30159X)]. Keller-Juslen et al., ont proposé la formule développée 1 pour l'échinocandine B (SL 7810/F): , . HO. OH HO H-e--e-H HO -CH:5/ H H - HO_.=o HO= H OH H -- - 0-T- OH " ' / - HO OH 1 R = linoléoyle L'Echinocandine B (antibiotique 32204) est produite par fermentation d'une souche de Aspergillus nidulans var. echinulatus A 32204 (NRRL 3860), comme décrit dans le brevet N 568.386 (Derwent N 75884W). L'antibiotique SL 7810/F est produit par une souche d'Aspergillus rugulosus, Thom et Raper (NRRL 8039), comme décrit dans le brevet belge N 834.289 (Derwent N 30159X). Le procédé selon la présente invention pour produire le facteur A de A-30912 (échinocandine B; SL 7810/F) par culture d'Aspergillus nidulans var. roseus diffère des procédés de la technique antérieure. Pour des raisons de commodité, la désignation facteur A de A-30912 sera utilisée ici pour désigner ces antibiotiques. Les facteurs B et D de A-30912 sont décrits dans le brevet des E.U.A. N 4.024.245. Le facteur B de A-30912 est similaire à, et peut être identique à l'antibiotique SL 7810/-II. Le facteur D de A-30912 est similaire et peut être identique à l'antibiotique SL 7810/-III. Les antibioti- ques SL 7810/-II et SL 7810/-III sont produits par une souche d'Aspergillus rugulosus, Thom et Raper (NRRL 8039), comme décrit dans le brevet belge N 834.289 (Derwent N 30159X). t458587 Facteur H de A-30912 Le facteur H de A-30912 (A-3091211), le composant nouvellement découvert du mélance antibiotique A-30912, est tout à fait similaire au facteur A de A-30912. Dans les conditions connues jusqu'à présent, A-30912H est un facteur mineur dans le mélange A- 30912, étant présent en quantité comprise entre environ 0,01 et 1,0 % du complexe total. Un autre facteur mineur du mélange A-30912 a été découvert mais il n'a pas été isolé en quantité suffisante pour pouvoir le caractériser. Le facteur H de A-30912 est séparé pour le mieux de ce facteur par CCM sur gel de silice en utilisant un système de solvants 3:2 d'acétate d'éthyle et de méthancl ou :5 d'acétonitrile et d'eau. Dans l'un ou l'autre des systèmes, le facteur mineur non caractérisé est plus polaire que les autres facteurs de A-30912. Le facteur H de A-30912 est un solide amorphe blanc. L'analyse élémentaire de A-30912H donne la composition approximative suivante en pourcentage: carbone, 58,27 %; hydrogène, 7,49 %; azote, 8,67 %; oxygène, 24,99 %. Le facteur H de A-30912 a un poids moléculaire d'environ 1073. Ce poids moléculaire est obtenu sur la corres- pondance des pics (FD/FD) des ions quasi-moléculaires du facteur A de A-30912 (C52H81N7016) et du facteur H de A-30912. On a trouvé que l'ion quasi-moléculaire du facteur H de A-30912 (+Na) avait la masse 1096,5782, 1096,5814. La masse moyenne, 1096,5798,est dans les limites de l'erreur expéri- mentale pour C53H83N7016.-Na, qui a une masse théorique de 1096,57940. On pense donc que la formule brute approximative du facteur H de A-30912 est C53H83N7016 L'analyse élémentaire du facteur H de A-30912 correspond particulièrement bien à la fcrmule brute de C53H83N7016H20 (Calculée C, 58,30; H, 7,79; N, 8,98; O, 24,93). Le spectre d'absorption infrarouge du facteur H de A-30912 en pastilles de KBr est donné sur la Figure 1 des dessins annexes. On observe les maxima d'absorption carac- téristiques suivants: 2,9 (très fort), 3,4 (fort), 3,5 (moyen), 5,9-6,1 (très fort), 6,6 (fort), 6,9 (fort), 7,9-8,1 (moyen), et 9,1 (fort) microns. Le spectre d'absorption ultraviolet du facteur H de A-30912 dans le méthanol neutre et dans le méthanol acide présente des maxima d'absorption à 223 nm (s 13,100) et 275 nm, pic large (c 2,100). Le spectre ultraviolet du facteur H de A-30912 dans le méthanol basique présente des maxima d'absorption à 245 nm (E 14,700) et 290 nm, pic large (c 3,500) et également une absorption finale. Le spectre de résonance magnétique nucléaire 13C du facteur H de A-30912 dans le perdeutérométhanol présente les caractéristiques suivantes: 6 176,07, 174,15, 173,49, 172,56, 172,47, 169,88, 158,45, 133,01., 130,90, 129,52, 129,04, 116,21, 82,15, 77,00, 75,98, 75,71, 71,27, 69,55, 69,42, 68,22, 62,44, 58,69, 57,25, 56,81,56,08, 52,88, 51,32, 39,08, 38,60, 36,89, 32,65, 30,77, 30,45, ,26, 28,18, 27,14, 26,55, 20,11, 19,60, 11,33, Le facteur H de A-30912 a les pouvoirs rotatoires approximatifs suivants: 2a5 - 40 (c 0,5, CH30H) D 3 (c C3H [a]365 = - 151 (c 0,5, CH30H) Le titrage électrométrique du facteur H de A-30912, dans le diméthylformamide aqueux à 66 %, indique la présence d'un groupement titrable avec un pKa d'environ 12,90 (pH initial 7,12). L'analyse des amino-acides du facteur H de A-30912 indique la présence, après hydrolyse, de la thréonine et de quatre autres amino-acides non encore identifiés. Le facteur H de A-30912 est soluble dans divers solvants organiques comme le méthanol, l'éthanol, le diméthyl- formamide, le diméthylsulfoxyde et l'acétate d'éthyle; mais il est insoluble dans les solvants organiques non polaires comme l'éther diéthylique et l'éther de pétrole. Le facteur H de A-30912 est également soluble dans les solutions aqueuses, en particulier celles ayant un pH supérieur à 7,0. Z4S8587 Le facteur H de A-30912 (poids moléculaire 1073) diffère du facteur A de A-30912 (poids moléculaire 1059) de seulement 14 unités de masse. Les deux composés sont très similaires en ce qui concerne leurs propriétés physiccchimiques et les deux composés donnent de l'acide linoléique par hydrolyse. A-30912H a un groupement -CH2- supplémentaire qui est présent sous forme de -O-CH3, remplaçant l'un des groupements -OH de la partie peptidique cyclique de la molécule. A-30912H a la formule développée représentée par la formule suivante 2: H3C\ /OH ---- H-N C \ / 0. 1 CH H *=0 '--e--H- HO _._____ H OH H\ C H /--- '.. H,!, -H H _.__H HO OH 2 R = linoléoyle Le Microorcranisme Le procédé de production des antibiotiques A-30912 de cette invention consiste à cultiver, comme décrit ici, une nouvelle culture qui est une variété d'Asperqillus nidulans. La nouvelle culture a été appelée Aspergillus nidulans var. roseus. Le neuveau microorganisme de cette invention est une culture biclogiquement pure qui a été isolée d'un échantillon de sol provenant de C-reenfield, Indiana, USA. L'une de ces caractéristiques principales est la production des antibioti- ques A-30912. Une scus-culture de ce micrcorganisme a été -45858T déposée le 26 février 1979 et fait partie de la collection permanente de cultures du Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois 61604, o elle est disponible au public sous le numéro NRRL 11440. Comme c'est le cas avec d'autres organismes, les caractéristiques d'Aspergillus nidulans var. rcseus NRRL 11440 sont sujettes à variations. Par exemple, on peut obtenir des variants et des mutants artificiels de la souche NRRL 11440, par traitement par divers mutagènes connus, comme les rayons ultraviolets, les rayons X, les ondes de fréquence élevée, le rayonnement radioactif et les produits chimiques. Tous les variants et mutants naturels et artifi- ciels d'Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 qui conservent la caractéristique de produire les antibiotiques A-30912, peuvent être utilisés dans cette invention. Taxonomie d'Aspergillus nidulans var. roseus La nouvelle culture de cette invention a été étudiée et caractérisée par Thomas H. Sands des Lilly Research Laboratories. Pour des raisons de commodité, la nouvelle culture Aspergillus nidulans var. roseus sera appelée ici culture A42355. La base taxonomique d'après laquelle cette culture a été classée comme une nouvelle variété d'Aspergillus nidulans et appelée A. nidulans var. roseus, est décrite dans les paragraphes suivants. Dans cette discussion, les termes "ISCC-NBS" désignent les noms de couleurs selon la méthode- ISCC-NBS (K. L. Kelly et D. B. Judd, "The ISCC-NBS Methcds of Designating Colors and A Dictionary of Cclor Names", U.S. Department cf Commnerce, Circ. 553, Washington, D.C., 1955). Le terme "Maerz et Paul" désigne les blocs de couleur décrits par A. Maerz et M. R. Paul dans "Dictionary of Colcr", McGraw-Hill Book Company, New York, N.Y., 1950. Les comparaisons sont basées sur le travail de K. B. Raper et D. I. Fennel, "The Genus Asperaillus", Williams and Wilkins, 1965. La culture A42355 atteint un diamètre de 14 mm en sept 84S8S87 jours et de 35 mm en 21 jours quand elle est cultivée sur une gélose de solution de Czapek à 25 C. La surface de la colonie est radialement bombée, convexe et initialement veloutée à légèrement floculeuse. L'aspect de la surface change avec l'âge en raison de la formation d'un exsudat rose qui, après séchage, donne une surface grêlée. La bordure est fortement crénelée à lobée et nettement délimitée, ne présen- tant qu'une rare culture périphérique sous la surface. Au fur et à mesure que la colonie viellit, la variation de pigmentation provoque un effet de zones. La surface du verso apparaît concave et en contact avec la gélose seulement sur la périphérie. Un pigment soluble rose est produit. La nappe mycélienne est très tenace et ne produit pas d'odeur distinc- tive. La pigmentation chez les colonies jeunes est influencée par les ccnidies immatures qui sent jaune verdâtre pâle (ISCC-NBS 101 et Maerz et Paul 11-K-1). Cette couleur est éventuellement confinée à la périphérie de la colonie. Au bout de 10 jours, des masses sous-sphériques de cellules enveloppes enfermant des cléistothécia pourpre noirâtre sent réparties dans toute la colonie, mais sont plus nettement rassemblées au centre. Au bout de 21 jours, la bordure étroite, légèrement aplatie est jaune verdâtre grisâtre (ISCC-NBS 105 et Maerz et Paul 12-I-2). A l'intérieur de cette bordure, la colonie est rose jaunâtre moyen (ISCC-NBS 29 et Maerz et Paul 11-A-6), et la cculeur est influencée par l'exsudat. Au bout de 21 jours, le centre est foncé par des conidies vert grisâtre et des cléistothécia pourpre noirâ- tre enfermées dans des cellules enveloppes. Le verso a une couleur qui va du brun clair (ISCC-NBS 57 et Maerz et Paul 13-A-7) à brun rougeâtre mvoyen (ISCC-NBS 43 et Maerz et Paul 6-F-9). En trois semaines ou plus, le verso a des teintes de pourpre très foncé, presque noir. La tête conidienne au début est rayonnante et jaune vif, puis devient vert foncé et nettement en fcrme de colonne. Quand elles sont mûres, les têtes ont une longueur comprise entre 93,4g et 116,71, et ont une dimension moyenne de 106 x 471i. Le vésicule a quelque peu une forme de spathe à une forme de poire et, comme le conidiophore, est brun clair. Les vésicules sont fertiles sur les deux tiers supérieurs et ont une dimension comprise entre 10 à 12 p x 8 à 10 p (taille moyenne 9,2 p x 11, 3 p). Les conidiophores sont sinueux, lisses et à parois relativement épaisses. Ils ont une longueur comprise entre 88 p et 112 V (moyenne 101 p). Bien qu'ils aient une largeur comprise entre 4 et 6 p, la plupart ont une largeur de 6 p. Les stéricmates sont bisériés, hyalins à brun clair et sont à parois lisses. Les stérigmates primaires sont presque cunéiformes. Ils ont une longueur de 6,3 p à 10,3 et une largeur de 2 p x 3 p à leur endroit le plus large (taille moyenne: 9,3 p x 2,7 p). Les stéricmates secondaires ont une forme comprise entre la forme ovoede et la focrme inverse d'une poire et ont une dimension comprise entre ,5 p à 11,0 p x 2, 4 p à 3,2 p (dimension moyenne: 9,9 p x 2,9 p). Les conidies sont globuleuses, délicatement dépolies à piquantes et vert foncé. Elles ont un diamètre compris entre 2,4 à 4,0 p avec une moyenne de 3,2 p. Sur une gélose d'extrait de malt à 35 C, il se produit en 7 jours une colonie d'un diamètre de 14 mm. Le diamètre de la colonie atteindra 30 mm en 21 jours. Initialement, la colonie comprend des hyphes aériens blancs. La formation de conidies se produit dans la première semaine et la colonie crénelée, veloutée et relativement plate devient vert jaunâ- tre foncé (ISCC-NBS 137 et Maerz et Paul 24-J-6). La colonie apparaît être divisée en zones en raison de la présence d'anneaux concentriques de masses sphériques jaunes de cellules enveloppes qui entourent ou enferment des cléistc- thécia pourpre foncé. L'état conidiogène sur la gélcse d'extrait de malt ressemble à cet état sur la solution gélosée de Czapek, à l'exception des dimensions. Les têtes conidiennes ont une lonaueur comprise entre 100 p et 170 P, et des dimensions moyennes de 138 p x 50 P. Les conidiophores ont une longueur de 100 p à 210 l (182 p en moyenne) et ont une largeur de 6 p. Les vésicules vent de 8 p à 12 V x 6 p à 12 p (dimensions moyennes: 12 p x 9,2). 24S8587 Les stérigmates primaires ont une dimension de 5,5 p à 8,7 x 2,4 p à 4,0 p (dimensions moyennes: 7,2 p x 6,6 p). Les stérigmates secondaires ont des dimensions de 5,5 V à 10,3 V x 2,0 p à 3,6 p (dimensions moyennes: 7,4 p x 3,5 p). Les conidies ont un diamètre de 2,3 à 3,2 p, mais en moyenne un diamètre de 3,2 p. - L'état asccagène est similaire sur les deux géloses. De nombreuses cléistothécia prcupre foncé sont incrustées dans des cellules enveloppes globuleuses à sous-globuleuses, à parois épaisses de couleur hyalin à jaune pâle qui ont un diamètre de 12,6 p à 18,2 p (en moyenne 15,3 p). Les cléisto- thécia sont globoides à sous-globoides et ont des parois ayant jusqu'à trois couches d'épaisseur, la couche extérieure consistant en cellules pseudoparenchymateuses. Les cléisto- thécia ont un diamètre compris entre 140 p à 800 p, mais ont pour la plupart un diamètre compris entre 165 p et 250 p, avec un diamètre moyen de 229 p. Les asques hyalins à huit spores. sont globoides à sousgloboides ou ellipsoidiques de façon irrégulière. Quand ils sont globoides, ils ont un diamètre de 9,2 a, avec peu d'écart par rapport avec cette dimension. Les asques ellipsoidaux ont une dimension de 9,3 p x 8,3 p. Les ascospores sont à pigment rouge orange, globoides quand ils sont vus superficiellement et en forme de lentilles quand ils sent vus latéralement. On peut voir sur le grand axe de la vue lenticulaire deux crêtes équato- riales parallèles, entières, délicatement plissées. Sur la vue de la surface, on voit une seule crête qui est périphé- rique à la masse principale de spores, qui est lisse et de structure bivalve. La crête a une largeur de 0,5 p; la masse de spores a un diamètre de 4,4 p. La dimension moyenne de la vue lenticulaire est de 4,7 D x 3,7 p. Les conidies rugueuses vert jaunâtre, les têtes coni- diennes en forme de colonne, les conidiophores et les vésicules brun clair à parois lisses, les stérigmates bisériés et la production de cellules enveloppes à parois épaisses globoides placent la culture A42355 dans le groupe Aspergillus nidulans. Ces caractéristiques, combinées avec le fait que la culture a un état ascogène dans lequel des cléistothécia globoides pourpre foncé sont fortement associées à des cellules enveloppes (comme précédemment) ou sont même enfermées dans ces cellules, et qu'elle a des ascospores lenticulaires rouge orange qui sont ornés de deux crêtes équatoriales parallèles plissées, placent la culture A42355 dans le genre Emericella, l'état parfait du groupe A. nidulans. A42355 ne satisfait pas complètement à la description de l'une quelconque des espèces cu variétés publiées du grcune A. nidulans. L'espèce la plus similaire à A42355 est A. nidulans (Eidam) Wint., en se basant sur la culture type WIB187 (NRRL 187). Ces cultures sont similaires par la couleur et le type des ascospores, mais diffèrent par la largeur des crêtes. Les cléistothécia sont similaires, mais la paroi de A42355 est formée par plusieurs couches de cellules, au lieu d'une seule couche. Les deux cultures présentent un stade crnidien prédominant vert jaune sur la gélose d'extrait de malt, mais l'état ascogène de A42355 est plus fortement évident que ne l'est celui de la culture type o il est partiellement caché par la culture et est de pigmentation terne. Dans les deux cultures, les hyphes, les ccnidiophores et les vésicules sont à paroi lisse, sans incrustation; cependant, le vésicule de A42355 a une forme de spathe à une forme de poire, tandis que le vésicule de A. nidulans est hémisphérique. Des colonies de A42355 et de A. nidulans, quand elles sont cultivées sur de la solution gélosée de Czapek, diffèrent par la vitesse de croissance, la production d'exsudat, l'abondance et la dimension des têtes conidiennes et dans la majeure partie des autres dimensions mesurées. Bien qu'il existe des similitudes entre A42355 et A. nidulans (Eidam) Wint., il y a suffisamment de différences significatives pour que A42355 soit considéré comme une nouvelle variété que l'on a appelée A. nidulans var. roseus. Culture de A. nidulans var. roseus Le milieu de culture utilisé pour cultiver Aspergillus nidulans var. roseus peut être l'un quelconque d'un certain t458587 nombre de milieux. Pour des raisons d'économie dans la production, de rendement optimal et de facilité d'isolement du produit, on préfère cependant certains milieux de culture. Ainsi, par exemple, une source de carbone préférée dans une fermentation à grande échelle est l'huile de coton ou le glucose, bien que l'on puisse utiliser la mélasse, l'amidon, la dextrine, le lactose, le saccharose, le maltose, le glycérol, les acides gras, etc... Les sources préférées d'azote sont la caséine hydrolysée par voie enzymatique, la farine de soja et la peptone de viande soluble, bien que l'on puisse utiliser les grains de distillation, les nitrates, le glutamate monosodique, etc... Des sels minéraux nutritifs peuvent être incorporés dans les milieux de culture. Ils comprennent les sels solubles habituels pouvant fournir des ions sodium, magnésium, zinc, fer, calcium, ammonium, chlorure, carbonate, sulfate, nitrate, phosphate, etc... Des oligo-éléments essentiels pour la croissance et le développement de l'organisme dcivent également être inclus dans le milieu de culture. Ces oligo-éléments se trouvent fréquemment sous forme d'impuretés dans les autres consti- tuants du milieu, en quantités suffisantes pour satisfaire les besoins de croissance de l'organisme. Il peut être nécessaire d'ajouter de petites quantités (c'est-à-dire 0,2 ml/l) d'un agent antimcussant comme le polypropylèneglycol au milieu de fermentation à grande échelle si la formation de mousse pose des problèmes. Pour la production d'une quantité substantielle du mélange antibiotique A42355, on préfère la fermentation aérobie en immersion dans des réservoirs. De petites quanti- tés du mélange antibiotique A42355 peuvent être obtenues par culture en flacons aaités. En raison du temps de latence de la production d'antibiotique couramment associé à l'inocula- tion de réservoirs importants avec la forme spore de l'organisme, il est préférable d'utiliser un inoculum végétatif. On prépare l'inoculum végétatif en inoculant un petit volume de milieu de culture avec la forme spore ou avec des fragments mycéniens de l'organisme pour obtenir 145858?7 une culture fraTche en croissance active de l'organisme. L'inoculum végétatif est ensuite transféré dans un réservoir plus grand. Le milieu utilisé pour la culture de l'inoculum végétatif peut être le même que celui utilisé pour les fermentations à plus grande échelle, mais cn peut également utiliser d'autres milieux. A. nidulans var. roseus NRRL 11440 peut être cultivé à des températures comprises entre 200 et 430C; l'organisme se développe le mieux à des températures d'environ 30 à 370C. La production optimale du mélange antibiotique A30912 se produit à des températures inférieures à 30'C. Comme il est habituel dans les procédés de culture aérobie en immersion, on insuffle de l'air stérile dans le milieu de culture. Pour une production efficace de l'anti- biotique, il doit y avoir une aération et une agitation suffisantes pour maintenir un taux d'oxygène dissous d'au moins 40 % de la saturation de l'air à la pression atmos- phérique. L'agitation est également-utile pour briser la culture épaisse et lourde qui se forme pendant la fermentation. La production du mélange antibiotique A42355 peut être suivie pendant la fermentation en analysant des échantillons du bouillon fermenté ou des extraits alcooliques de la biomasse ou du bouillon entier pour déterminer l'activité antibiotique vis-à-vis d'un organisme dont on sait qu'il est sensible aux antibiotiques A30912. Un organisme d'essai utile pcur tester la présence des antibiotiques A-30912 est Candida albicans. Le dosage biologique est commodément effectué par dosage sur disque de papier ou sur puits de gélose sur des plaques de gélose ensemencées. En général, on peut détecter l'activité antibiotique dès le second jour de la fermentation. La production maximale d'activité antibiotique se produit généralement entre environ le 6ème et le 8ème jour. Les différents facteurs de A-30912 peuvent être séparés du mélange A42355 et identifiés en utilisant la CCM (voir la Figure 2 des dessins). Le gel de silice est un adsorbant préféré. Les Rf des facteurs A-G de A-30912, en utilisant la CCM sur gel de silice(Merck, Darmstadt), un système de solvants 7:3 de benzène et de méthanol et un bioautographe par Candida albicans, sont donnés dans le Tableau I. TABLEAU I Facteur de A-30912 Rf A 0,35 B 0,45 C 0,54 D 0,59 E 0,27 F 0,18 G 0,13 Les Rf approximatifs des facteurs A, B, C, D et H de A-30912 dans différents systèmes solvants, en utilisant la CCM sur gel de silice (plaque N 60 de gel de silice Merck- Darmstadt, 20 x 20 cm) et un bioautographe par Candida albicans, sont donnés dans le Tableau II. TABLEAU II Facteur de A-30912 Rf - Systèmes solvants a b c d Facteur A 0,28 0,14 0, 28 0,43 Facteur B 0,39 0,21 0,42 0,47 Facteur C 0,46 0,31 0,51 0,58 Facteur D 0,50 0,38 0,57 0,61 Facteur H 0,42 0,27 0,36 0,53 Systèmes solvants a: acétate d'éthyle:méthanol (3:2) b: acetate d'éthyle:méthanol (7:3) c: acétonitrile:eau (95:5) d: acétate d'éthyle:éthanol:acide acétique (40:60:0,25) Récupération des antibiotiques A-30912 Les antibiotiques A-30912 peuvent être recueillis du milieu de fermentation par des procédés connus dans le domaine de la fermentation. Les antibiotiques A-30912 se trouvent généralement dans la partie mycélienne du milieu de fermen- tation. Une récupération maximale est obtenue par extraction du bouillon entier. Il est préférable d'ajouter au bouillon entier un volume égal d'un solvant comme le méthanol et d'abaisser le pH du bouillon filtré à un pH d'environ 4-6, avant extraction. Un autre procédé d'isolement consiste à séparer le mycélium, à extraire le mycélium avec du méthanol et à recueillir les antibiotiques par extraction de l'extrait méthanolique. Le chloroforme est un solvant particulièrement avantageux pour extraire les antibiotiques A-30912 sous forme du mélange A-42355, bien que l'on puisse utiliser d'autres solvants similaires. Les différents antibiotiques A-30912 peuvent être isolés du mélange A42355 séparé, par chromatographie en utilisant divers adsorbants. Les adsorbants appropriés comprennent le gel de silice; les résines à phasesinversées, comme le gel de silice/C8, le gel de silice/C18, Quantum LP-1, ou LiChroprep RP-8 et RP-18; Florisil; Sephadex G-25, LH-20 * et G-15; l'alumine; Diaion HP-20; Amberlite XAD-4 et X-384. Diaion est disponible chez Mitsubishi Chemical Industries, Tokyo, Japon; les résines de type Amberlite sont disponibles chez Rohm et Haas Co., Philadelphie, Pensylvanie, USA; les résines Sephadex sont disponibles chez Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Suède; Florisil est disponible chez Floridin Co., Tallahassee, Florida, USA, et les gels de silice C/8 et C/18 sont disponibles chez E. Merck, Darmstadt, Allemagne. La préparation de gel de silice/C18 de capacité de chargement élevée à partir de gel de silice LP-1 (Whatman) est décrite dans l'Exemple 8. La chromatographie liquide sous faible pression de caractéristiques élevées en phase inversée (CLFP CE) en uti- lisant comme adsorbant du gel de silice/C18 est un procédé préféré pour la purification final des antibiotiques A-30912. Dans ce procédé, le mélange A-42355 (obtenu par exemple par extraction du bouillon filtré avec du chloroforme), dissous dans un solvant, est placé sur une colonne équilibrée avec le même solvant. La colonne est ensuite éluée avec le solvant. Le mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile est un système solvant préféré. Les fractions recueillies sont contrôlées par bioautographe par Candida albicans et/ou par UV (en se basant sur les temps de rétention relatifs). On réunit les fractions contenant le facteur A-30912 désiré. Il est parfois nécessaire d'effectuer une séparation chroma- tographique supplémentaire pour obtenir le facteur de A-30912 sous une forme purifiée. Les facteurs A, B, D et H de A-30912 peuvent étre séparés par CLFPCE en utilisant les conditions suivantes: Colonne: verre, 0,8 x 15,0 cm Garnissage: Nucleosil 10-C18 (Machery Nagel and Company); garni en utilisant le mode opératcire de garnissage en suspension de l'Exemple 8 Solvant: Mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile Volume de l'échantillon: 8 pl Dimmension de l'échantillon: 8 pg Température de la colonne: ambiante Débit: 1,8 ml/minute Pression: environ 14 bars Détecteur: UV à 222 nm (ISCO Model 1800 Variable Wavelength UV-Visible Absorbance Monitor) Pompe: LDC Duplex Minipump Injection: injection sur boucle Les durées de rétention approximatives pour les facteurs A, B, D et H de A-30912 dans ces conditions sont résumées dans le Tableau III. TABLEAU III Facteur de A-30912 Temps de rétention (s) A 792 B 870 Hl 990 D 1 140 Pour illustrer cette invention plus ccmplètement, cn donne les exemples suivants: EXEMPLE 1 Préparation du mélange antibiotique A-42355 A. Fermentation en flaccn acité On prépare une culture d'Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 et on la maintient sur une gélose inclinée de 18 x 150 ml, préparée avec un milieu ayant la composition suivante: Ingrédient Quantité Glucose 5 g Extrait de levure 2 g CaCO3 3 g Jus de légumes 200 ml Gélose 20 g Eau désionisée q.s. pour 1 litre (pH initial 6,1) * Jus V-8, Campbell-Soup Co., Camden, N.J. * Meer Corp. La culture inclinée est inoculée avec Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 puis on fait incuber la culture à 25 C pendant environ sept jours. On recouvre d'eau la culture inclinée mofre et on la gratte avec une anse stérile pour libérer les spores. La suspension résultante est ensuite mise en suspension dans 10 ml d'eau désionisée stérile. On utilise 1 ml de la culture inclinée en suspension pour inoculer 55 ml de milieu végétatif dans un flacon de 250 ml. Le milieu végétatif a la composition suivante: Ingrédient Quantité Saccharose 25 g Mélasse noire 36 g Liqueur de macération de mais 6 g Extrait de malt 10 g K2HPO4 2 g Hydrolysat enzymatique de caséine M 10 g Eau du robinet 1100 ml (pH initial 6,5-6,7) *N-Z-Case, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J., U. S.A. 845858e On fait incuber le milieu végétatif-inoculé à 250C pendant 48 heures, à 250 tours par minute, sur un agitateur de type rotatif. Après 24 heures, on homogénéise le milieu pendant une minute à faible vitesse dans un mélangeur (de type Waring), puis on le fait incuber à nouveau pendant les 24 heures restantes. Ou bien, on peut faire incuber le, milieu végétatif inoculé pendant 48 heures puis l'homogénéiser pendant 15 secondes à faible vitesse. Ce milieu végétatif incubé peut être utilisé pour inoculer un milieu de culture de fermentation en flacon agité ou pour inoculer un milieu végétatif de second stade. On peut également le conserver pour une utilisation ultérieure, en maintenant la culture dans la phase vapeur de l'azote - 15 liquide. On prépare la culture pour cette conservation dans de nombreuses petites ampoules, comme suit: On mélange les cultures végétatives volume/volume avec une solution de suspension ayant la composition suivante Ingrédient Quantité Glycérol 20 ml Lactose 10 g Eau désionisée q.s. pour 100 ml On répartit les suspensions préparées dans de petits tubes stériles à bouchon vissé (4 ml par tube). On conserve ces tubes dans la phase vapeur de l'azote liquide. On peut utiliser une suspension conservée ainsi préparée pour inoculer des cultures inclinées ou des milieux d'ensemencement liquide. On fait incuber les cultures incli- nées à 250C à-la lumière pendant 7 'jours. B. Fermentation en réservoir Pour obtenir un plus grand volume d'inoculum, on utili- se 10 ml-de la culture végétative de premier stade incubé pour inoculer 400 ml d'un milieu de croissance vécétatif de second stade ayant la même composition que celui du milieu végétatif. Le milieu de second stade est incubé dans un flacon Erlen- meyer à large ouverture de deux litres, à 250C pendant 24 heures, sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute. Le milieu de second stade incubé (800 ml), préparé comme décrit ci-dessus, est utilisé pour inoculer 100 litres d'un milieu de production stérile choisi parmi l'un des suivants: MILIEU I Inarédient Quantité ZnSO4 7H20 0,00455 g/l Peptone de viande soluble 30,5 g/l Farine de soja 15,5 g/l Dextrine de tapioca 2,0 g/l Mélasse noire 10, 5 g/l Hydrolysat enzymatique de caséinesk 8,5 g/1 Na2HPO4 4,5 g/l MgSO4. 7H20 5,5 g/i FeSO4 71120 0,1 g/l Huile de coton 40,0 ml Antimoussant**m' 1,0 ml Eau du robinet 1000,0 ml (pH initial 6,8-7,0) * Peptone, Amber Laboratories, Juneau, Wisconsin, U.S.A. e* Stadex 11, A.E. Staley Co., Decatur, Illinois, U.S.A. *t* N-Z-Amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J., U.S.A. e*** P2000, Dow Corning, Midland, Michigan, U.S.A. MILIEU II Ingrédient Quantité Glucose 2,5 % Amidon 1,0 % Peptone de viande soluble 1,0 % Mélasse noire 1,0 % CaCO3 0,2 % MgSO4.7H20 0,05 % Hydrolysat enzymatique de caséine** 0,4 % Antimoussant 0,02 % Eau du robinet q.s. pour volume 1 O.M. Peptone es N-Z-Amine A À * Antifoam "A", Dow Corning On laisse le milieu de production inoculé fermenter dans un réservoir de fermentation de 165 1 à une température de 25 C pendant 7 jours. On aère le milieu de fermentation avec de' l'air stérile, en maintenant le niveau d'oxygène dissous supérieur à environ 50 % de la saturation en air. C. Milieu végétatif de troisième stade Si l'on effectue la fermentation dans des réservoirs plus grands que ceux utilisés pour la fermentation par litres, il est recommandé d'utiliser une culture végéta- tive de troisième stade pour ensemencer le réservcir plus grand. Un milieu végétatif de troisième stade préféré a la composition suivante: Ingrédient Quantité Saccharose 25 g Mélasse noire 25 g Liqueur de macération de mais 6 g Hydrolysat enzymatique de caséineM 10 g Extrait de malt 10 g K2HPO4 2g 2 g Eau du robinet 1000 ml (pH initial 6,1) * N-Z-Case EXEMPLE 2 Séparation du mélange antibiotique A-42355 On agite soigneusement le bouillon de fermentation entier (4127 litres), obtenu par le procédé décrit dans l'Exemple 1 en utilisant le milieu de production II, avec 4280 litres de méthancl pendant une heure, puis on filtre, en utilisant un adjuvant de filtration (Hyflo Super- cel, une terre de diatomées, Johns-Manville Products Corp.). On ajuste le pH du filtrat à 4,0 par addition d'HCl 5 N. On extrait le filtrat acidifié deux fois avec des volumes égaux de chloroforme. On réunit les extraits chloroformiques 245858? et on les concentre sous vide jusqu'à un volume de 20 litres. On ajoute ce concentré à 200 litres d'éther diéthylique pour faire précipiter le mélange A-42355. On sépare le précipité par filtration et l'on obtient 2775 g du mélange A-42355 sous forme d'une poudre blanc gris. EXEMPLE 3 Séparation du facteur A de A-30912 On dissout 1 g du mélange antibiotique A-42355, préparé comme décrit dans l'Exemple 2, dans 7 ml d'un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile. On filtre cette solution et on l'introduit dans une colonne en verre de 3,7 cm de diamètre intérieur et de 35 cm de longueur (Colonne de Chromatographie CLFPCE Michel-Miller, Ace Glass Incorpora- ted, Vineland, NJ 08360) garnie de résine à phase inverse de gel de silice LP-l/C18 (10-20 microns),qui a été prénarée conue décrit dans l'Exemple 7, par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes. La colonne est garnie dans le système 7:2:1 de méthanol, d'eau et'd'acétonitrile, à l'aide du mode opératoire de garnissage en suspension décrit dans l'Exemple 8. Une pompe F.M.I. avec une conception de piston sans vannes (débit maximal 19,5 ml/minute) est utilisée pour déplacer le solvant dans la colonne à un débit de 9 ml/minute à 7 bars, des fractions étant recueillies toutes les minutes. L'élution de l'antibiotique est contrôlée à 280 nm en utili- sant un appareil de contrôle UV (ISCO Model UA-5, Instrument Specialist Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) équipé d'une unité optique (ISCO Type 6). Les fractions 112 à 140 sont réunies et ajoutées à 20 ml d'eau. On ajuste le pH de cette solution à 4,0 avec HC1 N. On extrait la solution résultante deux fois avec des volumes égaux de chloroforme. On réunit les deux extraits chloroformiques et on les concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout l'huile dans du buthanol tertiaire et on lyophilise cette solution, ce qui donne 524 mg du facteur A de A-42355 (facteur A de A-30912; A-22082). EXEMPLE 4 Séparation du facteur B de A-30912 On sépare le mélange A-42355 comme décrit dans l'Exemple 2, mais on chromatographie les extraits chlorcformiques concentrés (285 1) sur une colonne de gel de silice (150 1 de gel de silice Grace, qualité 62) à un débit de, 2 1/minute. On lave la colonne avec 200 litres de chloroforme, on l'élue avec 500 litres d'acétonitrile, puis on l'élue continuellement avec un mélange 98:2 d'acétonitrile et d'eau à un débit de 1 1/minute. On recueille des fractions ayant un volume de 200 litres et on les analyse séparément pour déterminer leur activité biologique. L'analyse biologique est effectuée par une analyse sur disque de-papier sur plaque de gélose, ensemencée par Candida albicans. On réunit les fractions 77 à 103 (1365 litres) et on les concentre sous vide. La solution concentrée (4,5 litres) contient un préci- pité qu'on enlève par filtration et l'on-obtient 119 g de mélange A-42355 enrichi en facteur B. On concentre le filtrat à siccité. On redissout le résidu obtenu dans un volume approprié de méthanol. On ajoute la solution méthanolique à volumes d'éther diéthylique pour faire précipiter le complexe antibiotique contenant le facteur B. On sépare également ce précipité par filtration et on le sèche, et l'on obtient 24 g supplémentaires de mélange A-42355 enrichi de facteur B sous forme d'une poudre grise. Le mélange A-42355 enrichi en facteur B ainsi obtenu (1,0 g) est dissout dans 8 ml d'un mélange de 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile. On filtre cette solution et on l'introduit sur une colonne de gel de silice (Colonne Michel-Miller de 3,7 cm de diamètre intérieur x 33 cm) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes. La colonne est garnie d'une résine à phase inversée de gel de silice LP1/C18 (10-20 microns) à l'aide du mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile comme décrit dans l'Exemple 3. Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de ml/minute à environ 7 bars comme dans l'Exemple 3. On recueille une fraction toutes les minutes. On contrôle l'élution de l'antibiotique à 280 nm comme dans l'Exemple 3. On réunit les fractions 102-110 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol et on la lyophilise, ce qui donne 22 mg du facteur B de A-30912. EXEMPLE 5 Isolement du facteur D de A-30912 - On réunit et on chromatographie sur une colonne de gel de silice comme décrit dans l'Exemple 4 les extraits chloro- formiques concentrés de deux essais de fermentation (3800 1 et 4007 1) obtenus par le procédé décrit dans l'Exemple 1. On recueille des fractions ayant un volume d'environ 200 1 et on les soumet à une analyse biologique comme dans l'Exemple 4. On réunit les fractions 47-63 (850 1) et on les concentre sous vide. On ajoute la solution ccncentrée (0,7 1) à 10 volumes d'éther diéthylique pour faire précipiter le mélange A-42355 enrichi en facteur D. On enlève ce précipité par filtration et on le sèche, ce qui donne 32-g de mélange A-42355 enrichi en facteur D sous forme d'une poudre grise. On dissout le mélange A-42355 enrichi en facteur D ainsi obtenu (1,0 g) dans 5 ml d'un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile. On filtre cette solution et on l'introduit sur une colonne de gel de silice.(colonne Michel- Miller, 3,7 cm de diamètre intérieur x 30 cm) par l'intermé- diaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes. La colonne a été garnie de résine à phase inversée de gel de silice LP1/C18 (10-20 microns). Le garnissage a été effectué dans un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, comme décrit dans l'Exemple 3. Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 8 ml/minute à environ 3, 1 bars, comme décrit dans l'Exemple 3. On recueille une fraction toutes les 2 minutes. L'élution de l'antibiotique est contrôlée à 280 nm comme décrit dans l'Exemple 3. On réunit les fractions 96-108 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout cette huile dans un petit volume de t-butanol et lyophilise pour obtenir 89 mg du facteur D de A-30912. EXEMPLE 6 Séparation du facteur H de A-30912 On dissout 5,0 g du mélange antibictique A-42355, préparé comme décrit dans l'Exemple 2, dans 35 ml du mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, on filtre la solution résultante et on l'introduit sur une colonne de - verre de 3,7 cm de diamètre intérieur x 42 cm (colonne Michel- Miller) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système de vannes. La colonne est garnie de résine à phase inversée de gel de silice LP1/C18 (10-20 microns) dans un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile comme décrit dans l'Exemple 3. Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 13 ml/minute à environ 8,3 bars, comme décrit dans l'Exemple 3, et l'on recueille une fraction toutes les 2 minutes. On contrôle l'élution de l'antibiotique à 280 nm comme décrit dans l'Exemple 3. On réunit les fractions 112-132 avec les fractions 106-117 d'une seconde purification similai- re. Les fractions réunies sont concentrées sous vide jusqu'à une huile. On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol et on lyophilise pour obtenir 173 mg du facteur H brut de A-30912. On dissout le facteur H brut de A-30912 (150 mg) dans 8 ml d'un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile; on filtre la solution résultante et on la réintroduit sur une colonne de verre de 2,0 cm de diamètre intérieur x 32 cm, comme décrit ci-dessus. Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 8 ml/minute à environ 5,5 bars, comme décrit dans l'Exemple 3, et on recueille une fraction toutes les 3 minutes. On contrCle l'élution de l'antibiotique à 280 nm comme décrit dans l'Exemple 3. On réunit les fractions 17 et 18 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol et on lyophilise pour obtenir 29 mg du facteur H de A-30912. EXEMPLE 7 Préparation de la résine à phase inversée gel de silice/Ci8 Etape]: Hydrolyse On ajoute 1000 g de gel de silice LP-1 (de Quantum Corp., maintenant lqhatman) à un mélange de 1650 ml d'acide sulfurique concentré et de 1650 ml d'acide nitrique concentré dans un ballon à fond rond de 5 1 et on agite pour obtenir une suspension appropriée. On chauffe le mélange sur un bain de vapeur pendant une nuit (16 heures) avec un réfrigérant à refroidissement d'eau fixé sur le ballon. On refroidit le mélange dans un bain de glace et on le filtre soigneusement en utilisant un entonnoir en verre fritté. On lave le gel de silice avec de l'eau désionisée jusqu'à pH neutre. Puis, on lave le gel de silice avec 4 1 d'acétone et on le sèche sous vide à 1000C pendant 2 jours. Etape 2: Première Silylation Le gel de silice sec de l'Etape 1 est transféré dans un ballon à fond rond.et mis en suspension dans 3,5 1 de toluène. On chauffe le ballon au bain de vapeur pendant 2 heures pour chasser toute l'eau résiduelle par distillation azéotrope. On ajoute 321 ml d'octadécyltrichlcrosilane (Aldrich Chemical Company), et on chauffe le mélange réaction- nel à reflux pendant une nuit (16 heures) avec une lente agitation mécanique à 60'C. On prend soin d'éviter que l'agitateur ne soit trop près de la partie inférieure du ballon, pour éviter un broyage des particules de gel de silice. On laisse le mélange refroidir. On recueille le gel de silice silanisé, on le lave avec 3 1 de toluène et 3 1 d'acétone, puis on le sèche à l'air pendant une nuit (16-20 heures). On met le gel de silice séché en suspension dans 3,5 1 d'un mélange 1:1 d'acétonitrile et d'eau dans un ballon de 5 1, on agite soigneusement à la température ambiante pendant 2 heures, on filtre, on lave avec 3 1 d'acétone et on sèche à l'air pendant une nuit. Etape 3: Deuxième Silylation On répète le mode opératoire de la première silylation en utilisant 200 ml d'octadécyltrichlorosilane. On chauffe la suspension à reflux à 60'C pendant 2 heures, tout en agitant soigneusement. On recueille le produit final par filtration, on lave avec 3 1 de toluène et 6 1 de méthanol, puis on le sèche sous vide à 50'C pendant une nuit (16-20 heures). t45858? EXEMPLE 8 Mode opératoire de garnissage en suspension pour les colonnes MichelMiller Renseignements aénéraux A. On peut garnir par ce mode opératoire des colonnes analy- tiques ou préparatives. B. On recommande les garnissages par gel de silice et à phase inversée de gel de silice (par exemple, Quantum LP-1, granulométrie 10-20 microns, LiChoprep RP-8 et RP-18, granulométrie 25-40 microns). Cependant, d'autres gels de silice (par exemple, Shandons ODS Hypersil, granulométrie microns) ainsi que d'autres types de résines ont été utili- sés comme garnissage avec succès à l'aide de ce mode opératoire. C. En général, une pression inférieure à 14 bars et des débits compris entre 5 et 40 ml/minute sont nécessaires pour cette technique de garnissage en suspension; ceci dépend du volume et des dimensions de la colonne. Il est important de noter que la pression de garnissage doit être supérieure à la pression utilisée pendant la séparation réelle de 2 à 3,5 bars; ceci assure qu'il ne se produit pas de tassement ultérieur de l'adsorbant pendant les séparations. Les colonnes garnies selon ce mode opératoire avec du gel de silice à phase inversée peuvent fonctionner pendant plusieurs années, sans perte d'efficacité. D. Une diminution soudaine de la pression peut provoquer des craquelures ou des canaux dans le matériau de garnissage, ce qui réduirait de façon importante l'efficacité de la colonne. Il est donc important de laisser la pression descendre lentement jusqu'à zéro chaque fois que l'on arrête la pompe. E. Volume approximatif des colonnes (Colonnesen verre de Ace, Catégorie No., non garnies): 5795-04, 12 ml; 5795-10,110 ml; 5795-16, 300 ml; 5795-24, 635 ml; et 5796-34, 34 ml. F. Le temps nécessaire pour garnir une colonne en verre peut varier de quelques minutes à quelques heures, selon la dimen- sion de la colonne et l'expérience de l'opérateur. Exemple 1. Relier la colonne de verre à une colonne réservoir par un accouplement (le volume de la colonne réservoir doit être deux fois celui de la colonne). Placer les deux colonnes verticalement avec la colonne réservoir au-dessus. 2. Peser le matériau de garnissage (100 a pour 200 ml de colonne). 3. Ajouter 5 volumes de solvant au matériau de garnissage; utiliser un mélange de 70-80 % de méthanol et de 20-30 % d'eau. 4. Bien agiter jusqu'à ce que toutes les particules soient mouillées, laisser reposer pendant une nuit ou plus longtemps pour assurer une imprégnation complète des particules par le solvant. Décanter la liqueur surnageante. 5. Délayer la résine avec suffisament de solvant pour remplir la colonne réservoir. Verser rapidement dans le réservoir. NB: La colonne doit être pré-remplie avec le même solvant et la colonne réservoir doit être partiellement remplie du solvant avant de verser la suspension.-L'utilisation de volumes de suspension plus grands peut également donner de bons résultats; cependant, ceci nécessite (a) un réservoir plus grand ou (b) plusieurs remplissages du réservoir pendant l'opération de garnissage. 6. Fermer le réservoir avec le bouchon de Teflon en dessous de la colonne (voir la Figure 1 du brevet des E.U.A. N0 4.131.547, bouchon N0 3); relier à la pompe; et ccmmen- cer immédiatement le pompage du solvant dans les dispositifs au débit nxiurn si l'on utilise une pompe Ace Cat. No. 13625- 25, ou un système de distribution de solvant similaire (20 ml/minute). 7. Continuer jusqu'à ce que la colonne soit complètement remplie de l'adsorbant. La pression ne doit pas dépasser la tolérance maximale de la colonne pendant cette opération -35 (14 bars pour les colonnes importantes et 21 bars pour les colonnes analytiques). Dans la plupart des cas, des pressions inférieures à 14 bars seront suffisantes. 8. Si la pression dépassait les valeurs maximales, réduire 245858? le débit et la pression diminuera. 9. Après remplissage de la colonne par l'adsorbant, arrêter la pompe; laisser la pression tomber à zéro; débrancher le réservoir; remplacer le réservoir par une pré-colonne; remplir la pré-colonne de solvant et d'une petite quantité d'adsorbant, et pomper à la pression maximale jusqu'à ce que la colonne soit complètement garnie. Pour une information supplémentaire, voir le mode opératoire général. N.B.: Toujours laisser la pression descendre lentement après arrêt de la pompe; ceci empêchera la formation de toutes craquelures ou canaux préférentiels dans le matériau de garnissage. 10. Supprimer la pression et débrancher soigneusement la pré-colonne. Avec une petite spatule, enlever quelques milli- mètres (2-4) de garnissage au sommet de la colonne; placer 1 ou 2 filtres au sommet de la colonne; appuyer doucement jusqu'au sommet du matériau de garnissage, et placer un bouchon de Teflon au sommet de la colonne jusqu'à confirmation de l'étanchéité. Relier la colonne à la pompe, introduire la pression (généralement moins de 14 bars) et observer par la paroi de verre au sommet de la colonne si la résine se tasse davantage. Si le matériau de garnissage doit continuer à se déposer (ceci peut être le cas avec les colonnes de dimensions importantes), un certain espace mort apparaîtra ou bien, il se formera des canaux préférentiels et l'étape 9 doit être répétée. REVENDICATIONS 1. Procédé de production du mélange antibiotique A-42355 comprenant les facteurs A, B, D et H de A-30912; et du facteur A de l'antibiotique A30912, du facteur B de l'antibiotique A-30912, du facteur D de l'antibiotique A-30912 et du facteur H de l'antibiotique A-30912, caractérisé en ce que: a) on cultive Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucides, d'azote et de sels minéraux dans des conditions de fermentation aérobie en immersion, jusqu'à production d'une quantité substantielle d'activité antibiotique; b) on sépare éventuellement le mélange antibiotique A-42355 du milieu de culture; et c) cn sépare éventuellement les facteurs A, B, D et H de l'antibiotique A-30912 à partir du mélange anti- biotique A-42355. 2, Procédé selon la revendication 1, de production du mélange antibiotique A-42355 comprenant les facteurs A, B, D et H de A-30912, caractérisé ence que: a) on cultive Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucide, d'azote et de sels minéraux, dans des conditions de fermentation aérobie en immersion jusqu'à production d'une quantité substantielle d'activité antibiotique; et b) on sépare du milieu de culture le mélange anti- bictique A-42355. 3. Procédé selon la revendication 1, de production du facteur A de A30912, caractérisé en ce que: a) on cultive Asperqillus Nidulans var. roseus NRRL 11440 dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucides, d'azote et de sels minéraux, dans des conditions de fermentation aérobie en immersion, jusqu'à production d'une quantité substantielle d'activité antibiotique; b) on sépare du milieu de culture le mélange anti- biotique A-42355, et c) on isole le facteur A de A-30912 à partir du mélange antibiotique A-42355 séparé. 4. Procédé selon la revendication 1, de production du ir B de A-30912, caractérisé en ce que: a) on cultive Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucide, d'azote et de sels minéraux, dans des conditions de fermentation aérobie en immersion, jusqu'à production d'une quantité substantielle d'activité antibiotique; b) on sépare du milieu de culture le mélange anti- biotique A-42355; et c) on isole le facteur B de A-30912 à partir du mélange antibiotique A-42355 séparé. 5. Procédé selon la revendication 1, de production du r D de A-30912, caractérisé en ce que: a) on cultive Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucide, d'azote et de sels minéraux, dans des conditions de fermentation aérobie en immersion, jusqu'à production d'une quantité substantielle d'activité antibiotique; b) on sépare du milieu de culture le mélange anti- biotique A-42355; et c) on isole le facteur D de A-30912 à partir du mélange antibiotique A-42355 séparé. 6. Procédé selon la revendication 1, de production du r H de A-30912, caractérisé en ce que: a) on cultive Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucide, d'azote et de sels minéraux, dans des conditions de fermentation aérobie en immersion, jusqu'à production d'une quantité substantielle d'activité antibiotique: b) on sépare du milieu de culture le mélange anti- facteu facteu facteu biotique A-42355; et c) on isole le facteur Hi de A30912 à partir du mélange antibiotique A-42355 séparé. 7. Culture biologiquement pure du microorganisme Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.