Brevet FR2444712A1 — publié le 19800718

La présente invention se rapporte au domaine des milieux de culture et aux procédés pour leur production, et, plus particulièrement, à des milieux de culture contenant de la pectine comme agent de gélification. On décrit, dans la technique antérieure, un nombre considérable de divers milieux de culture et de divers procédés pour leur production. En général, les milieux utilisés pour la croissance de cellules vivantes, de tissus ou d'organismes contiennent certains ingrédients. Ces ingrédients comprennent des produits nutritifs aqueux (généralement une source de carbone, une source d'azote, et de plus petites quan tités d'éléments essentiels), des tampons et souvent un agent de gélification ou de solidification. La majeurepartie des milieux biologiques présents dans la technique anterieure utilise de 1' agar-agar, de la gélatine ou du gel de silice comme agents de solidification, qu'on désigne également sous le nom d'agents de gélification. Les inconvénients sont associés à chacune de ces matières en tant qu'agents de solidification. L'agar-agar est obtenu à partir d'algues marines qui doivent être récoltées à partir de populations naturelles d'algues. La fourniture d'agar-agar, de manière correspondante, est soumise à des fluctuations d'une année à l'autre, alors que l'exigence en agents de solidification continue à croître. Le prix de l'agar-agar a, par suite, constamment augmenté, et le prix actuel est relativement élevé. Un autre problème associé à 1' utilisation de l'agar-agar est la nécessité de distribuer l'agar-agar dans son récipient alors qu'il est très chaud, puis la solution d'agar-agar peut se solidifier à environ 40-45 C. Une température de 450C est trop élevée pour que certaines cellules résistent sans effet nocif. La galatine est facilement obtenue à un prix de revient relativement raisonnable, mais elle est facilement hydrolysée par de nombreux micro-organismes, ce qui amène le gel à se transformer en liquide. Ceci est indésirable, sauf dans les cas où l'hydrolyse est utilisée comme test biochimique de diagnostic. En outre, la gélatine est généralement dis ponible en tant que source de produits nutritifs pour des organismes en contact avec elle et, par suite, peut interférer avec l'expérimentation de sources spécifiques de produits nutritifs. La gélatine a également la propriété indésirable de se liquéfier à des températures très faibles, si bien que des milieux l'incorporant comme agent de gélification ne peut pas être soumis à l'incubation au-dessus de 250C avec l'assurance que le milieu conservera sa consistance solide.Des inconvénients associés au gel de silice comprennent le prix de revient relativement élevé du gel de silice, et le mode opératoire compliqué exigé pour préparer un milieu utilisant du gel de silice. Les pectines sont utilisées d'une manière routinière comme agent d'épaississement ou de gélification dans la production de confitures et de gelees. Cependant, le procédé généralement utilisé implique des concentrations élevées de sucre et un faible pH, ni l'un ni l'autre ne convenant au travail général de culture des microbes ou des tissus. En fait, les caractéristiques de teneur en sucre élevée et de faible pH sont des facteurs utiles pour empêcher l'etablisse- ment d'organismes de contamination, se développant, dans les produits constitués de gelées. La présente invention implique la préparation d'un milieu de croissance biologique gélifié ayant de la pectine comme agent de gélification. Le procédé implique la combinaison d'un milieu de croissance liquide et d'une matière en pectine en faible teneur en groupes méthoxyles avec un gel compatible avec la croissance contenant une quantité convenable et un type convenable de matière à cation métallique pour produire la gélification du milieu de croissance liquide. Dans un exemple de réalisation préféré, un gel d'agar-agar contenant du chlorure de calcium est fourni dans un récipient, tel qu'une boite de Pétri, et un mélange aqueux du milieu de croissance liquide et de la pectine est déversé dans le récipient, et, de ce fait, la gélification du milieu se produit ultérieurement.La présente invention comprend, en outre, la combinaison d'un récipient de croissance de culture et d'un gel compatible avec la croissance, contenant une matière renfermant un cation métallique multivalent. La présente invention sera maintenant décrite en relation avec les dessins ci-joints, dans lesquels La figure 1 est une vue en perspective d'un exemple de réalisation de la présente invention La figure 2 est une vue en élévation latérale de l'exemple de réalisation de la figure 1 ; La figure 3 est une vue en perspective d'un exemple de réalisation, à titre de variante, de la présente invention ; et La figure 4 est une vue en élévation latérale de l'exemple de réalisation de la figure 3. Selon la présente invention, un milieu liquide de croissance de cultures est préparé, ce milieu comprenant une matière en pectine comme agent de gélification. La présente invention utilise une pectine à faible teneur en groupes méthoxyles qui est définie, dans les buts de la présente invention comme ayant une teneur en groupes méthoxyles d'environ 1 % a environ 8 %. En d'autres termes, la pectine à faible teneur en groupes méthoxyles a un. degré de méthoxylation d'environ 7 à environ 50 %, le degré de méthoxylation se référant à l'importance de l'estérification des groupes carboxyles par des groupes méthoxyles.Dans un exemple de réalisation préféré de la présente invention, la pectine à faible teneur en groupes méthoxyles a entre environ 3 et environ 7, et très préférablement approximativement une teneur en groupes méthoxyles de 5 % ou un degré de méthoxylation d'environ 25 à environ 40 %. La pectine doit être présente dans le milieu de croissance en quantité efficace pour fournir une gélification suffisante du milieu de croissance lors de la combinaison du milieu de croissance avec une matière à cation métallique convenable. La quantité de pectine variera avec le degré de méthoxylation, et également avec d'autres facteurs, tels que l'importance de la gélification désirée. Cependant, la quantité de pectine désirée peut être facilement déterminée par une expérimentation simple et directe. On a déterminé que, très préférablement, la pectine, particulièrement, avec un degré de méthoxylation d'approximativement 5 %, est présente en quantité d'environ 10 à environ 30 g de pectine par litre de milieu de croissance. Le milieu de croissance liquide contenant la pectine à faible teneur en groupes méthoxyles peut comprendre un grand nombre d'autres constituants. En général, le milieu peut correspondre à l'un quelconque du grand nombre de milieux de croissance utilisés dans la technique antérieure pour les cultures microbiennes et/ou de tissus , sauf à un point tel que les composants qui se décomposeraient ou interféreraient avec la pectine, ne doivent généralement pas être inclus. Typiquement, le milieu de culture comprendrait plusieurs autres constituants comprenant 2-10 g/litre d'une source de carbone, tel que du glucose ou d'autres sucres ; 2-10 g/litre d'azote, et d'autres produits micronutritifs sous la forme de produits naturels (par exemple, la tryptone, la peptone, un extrait de boeuf, un extrait de levure, etc.) ou des ma tières synthétiques (le nitrate de potassium, et divers autres micro-éléments). Les produits nutritifs exacts et les concentrations exactes qui sont utiles dans le milieu de croissance liquide employé dans la présente invention sont innombrables et, comme toujours dans la préparation d'un milieu de croissance, il seraient choisis selon la situation particulière. Les limitations pour les autres constituants du milieu préparé selon la présente invention sont généralement les mêmes que celles qui existent pour tout autre milieu de culture. Des gammes typiques pour certains composantsdes milieux ont déjà éte indiquées. Sous un autre aspect, la concentration en sucre du milieu de croissance de la présente invention serait généralement inférieure à environ 10 %, et le pH irait de préférence de 3,5 à 8, principalement d'environ 6 à environ 7. Par opposition, des produits alimentaires, tels que des gelées ou des confitures, comprennent typiquement plus de 50 % et peut être 80 % de sucre en tant que pourcentage de solides totaux dans le produit. Le milieu de croissance biologique produit selon la présente invention comprendrait aussi, de préférence,un ou plusieurs tampons pour contrôler le pH des milieux. Les tampons doivent être non toxiques vis-à-vis des micro-organismes et ne doivent pas dégrader la pectine à un point tel qu'elle serait inutilisable. Généralement, des tampons contenant les éléments potassium ou sodium, en combinaison avec des groupes phosphates ou carbonates, sont non toxiques en quantités peu importantes. Tous les tampons peuvent provoquer la décomposition ou la transformation en complexe avec les pectines, et, en consequence, les meilleurs résultats sont obtenus si le milieu de croissance et les tampons sont séparément stérilisés et puis combinés après refroidissement.Le grand nombre de tampons qui serait utile avec le milieu contenant de la pectine comprend les produits suivants : NaH2P04, NaHP04, Na3P04, NaHC03 et Na2C03 le phosphate trisodique (Na3P04) étant trouvé particulièrement convenable. D'autres tampons utiles comprennent l'acide citrique et le citrate de sodium; l'acide acétique et l'acétate de sodium, l'acide citrique et le phosphate monoacide de sodium (phosphate disodique), l'acide succinique et la soude ; le phosphate diacide de sodium ou de potassium (phosphate monosodique ou monopotassique et le phosphate monoacide de sodium ou de potassium (phosphate disodique ou dipotassique) ; et le tris-maléate. L'aspect convenable d'autres tampons ou d'autres systèmes de tampons peut être facilement prévu et/ou déterminé par expérimentation directe et simple. Selon la présente invention, un gel solide acceptable est obtenu à un pH aussi élevé qu'environ 9. La littérature de la technique antérieure suggère que la pectine en tant qu'agent de gélification, exige un pH acide, typiquement en dessous d'environ 4. C'était, en conséquence, un résultat inespéré selon lequel un milieu de culture utile à un pH aussi élevé qu'environ 9 pourrait être obtenu en utilisant de la pectine comme agent de gélification Le milieu de croissance contenant de la pectine est combiné avec une matière à cation métallique multivalent convenable pour produire la gélification du milieu de croissance. On sait que la pectine à faible teneur en groupes méthoxyles est sensible à la présence de divers cations multivalents, tels que le calcium, et formera des gels par combinaison avec ces cations.Comme cela est bien connu, les divers cations métalliques multivalents peuvent être fournis très facilement sous forme de sels métalliques, très préférablement ceux qui sont solubles dans l'eau. Comme dans le cas de la pectine comprise dans le milieu de croissance,une quantité suffisante de cations métalliques doit être prévue pour produire la gélification souhaitée des milieux de croissance. En général, les quantités relatives de pectine et de cations métalliques pour produire la gélification adéquate sont connues et bien comprises dans la technique, et, en outre, les quantités souhaitées pour l'utilisation dans la présente invention peuvent être facilement déterminées par expérimentation directe. Une quantité suffisante de cations est exigée pour produire une bonne formation de gel ferme, mais cette quantité ne doit pas être si élevée que le gel soit dur, cassant ou tende à la synérèse (écoulement).Les quantités du milieu de croissance contenant la pectine et/ou de matière à cation métallique sont typiquement et de préférence pré dé- terminées pour fournir la gélification convenable, particulièrement pour préparer les matières sous une forme de petits équipements.Dans un exemple de réalisation préféré de la présente invention, la concentration en cation est environ 50 à environ 125 mg de cations calcium par gramme de pectine. Des quantités équivalentes d'autres cations métalliques multivalents pourraient être également utilisées. En tout cas, la quantité de cation très préférée dépendra du degré de méthoxylation et de la quantité de pectine. En se référant aux figures 1 et 2, la combinaison du milieu de croissance et des cations métalliques dans un récipient pour la croissance de cultures est généralement désignée par 10. Un récipient convenable 11 pour la croissance de cultures, tel qu'une éprouvette ou une boîte de Pétri, est prévu, ce récipient étant défini comme étant un récipient qui est approprié et utilisé pour renfermer le milieu durant la croissance de cultures. Typiquement, le récipient de croissance de cultures est un récipient qui permet ou facilite l'observation ou l'évaluation de la croissance de cultures. Un gel 13 compatible avec la croissance, contenant la matière à cation métallique, est amené à se former dans le récipient de croissance de cultures, typiquement au fond 12, et le milieu de croissance liquide et la matière en pectine y sont ajoutés. Le contact du milieu avec le gel compatible avec la croissance fournira une diffusion des cations à travers la solution de pectine et la formation d'un gel 15 de milieu de croissance, qui en est la conséquence. Comme indiqué, la concentration des cations dans le gel compatible , avec la croissance et/ou la quantité de ce gel dans le récipient de croissance de cultures sont déterminées pour fournir une quantité convenable des cations métalliques pour la gélification du milieu de croissance. Le gel compatible avec la croissance peut comprendre un grand nombre de gels actuellement connus pour l'uti lisation en relation avec des milieux pour la croissance biologique. Comme indiqué et décrit dans la technique antérieure, des gels de ce type peuvent comprendre, par exemple, des gels utilisant de l'agar-agar, de la gélatine, du gel de silice, ou du caraghénan comme agents de gélification ou de modification. D'autres matières pourraient être aussi convenablement utilisées comme supports pour les cations métalliques multivalents. Ces supports doivent être inertes et non toxiques vis-à-vis des cellules vivantes, et ne doivent pas être hydrolysés durant le procédé. Le gel compatible avec la croissance, amené à se former dans le récipient de croissance de cultures,estpréparé et manipulé à la manière ordinaire. Bien que ces gels compatibles avec la croissance puissent inclure des produits nutritifs de croissance et d'autres composants non toxiques ou non interférants, tels que non exigés ou préférés, le gel compatible avec la croissance peut, de manière simple et préféra ble,cprendre seulement les constituants nécessaires pour fournir le gel, ainsi que la matière à cation métallique multivalent comme décrit au préalable. On a noté que la quantité de matière à cation multivalent nécessaire variera selon un certain nombre de facteurs qui n'ont pas besoin d'être totalement décrits, puisque les facteurs apparaissent facilement et que la détermination peut être facilement réalisée par les techniques expérimentales simples et directes. Comme indiqué, une quantité suffisante et un type suffisant de matière à cation multivalent doivent être inclus pour produire la gélification désirée du milieu de croissance par suite de la présence de la matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles.De manière bien compréhensible, les caractéristiques du gel compatible avec la croissance contrôleront à un certain point, la quantité des ma tières à cation métallique multivalent nécessaire pour fournir l'interaction suffisante avec la matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles pour produire le gel désiré. En outre, la configuration du récipient de croissance de culture et du gel compatible avec la croissance, qui y est contenu, contrôlera jusqu'à un certain point, la quantité de matière à cation métallique multivalent dont on exige qu'elle soit présente dans le gel compatible avec la croissance. Par exemple, le rapport entre la surface du gel compatible avec la croissance et le volume du gel compatible avec la croissance affectera la quantité de matière à cation métallique exigée. Dans un exemple de réalisation préféré de la présente invention, le gel compatible avec la croissance est placé dans une boîte de Pétri, sous forme d'une couche de film mince, généralement uniforme, revêtant le fond de la boîte. Dans cet exemple de réalisation, une concentration de chlorure de calcium d'environ 2-5 g pour 100 ml d'une solution d'agaragar à 2 % s'est révélée très préférable, particulièrement quand elle est combinée avec un rapport d'environ 1/10 avec une solution liquide de milieu de croissance contenant environ 10 à environ 30 g de pectine par litre de milieu Le gel compatible avec la croissance ne comprendrait pas, de préférence, une matière en pectine, en tant qu'agent de gélification fonctionnel substantiel. Ainsi, bien que des quantités peu importantes d'une matière en pectine puissent être présentes, on préfère que l'importance substantielle de l'effet de gélification soit le résultat d'autres agents de gélification.Une raison pour utiliser des agents de gélification autres que la pectine, dans le gel compatible avec la croissance est la relation entre la matière en pectine et la matière à cation métallique multivalent pour laquelle le gel compatible avec la croissance constitue un support. Comme indiqué au préalable, un excès de la matière à cation métallique multivalent peut produire la synérèse ou l'écoulement. La quantité de matière à cation métallique multivalent, qui peut être convenablement fournie dans le gel compatible avec la croissance, est en conséquence limitée dans le cas où l'on utilise la pectine comme agent de gélification ou de solidifcation. Un réseau ou des mailles de matière naturelle ou synthétique peuvent être utilisés avec le milieu de la présente invention, comme avec les milieux de la technique antérieure. Un réseau à dimension de mailles uniforme, telle que 5 mm, a pour fonction de permettre à l'observateur d'avoir des champs mesurés présentés sur la boite de Pétri ou sur un autre récipient. Un réseau ou des mailles permettent également à l'observateur de voir complètement à travers le milieu solidifié plutôt que d'avoir une vision limitée à partir d'un côté, comme cela se produirait avec un tampon ou du papier opaque et absorbant. C'est un aspect particulier d'un exemple de réalisation de la présente invention selon lequel la matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles est utilisée comme seul agent de gélification fonctionnel ou essentiellement comme seul agent de gélification fonctionnel. L'expression "seul agent de gélification fonctionnel" est utilisée ici comme signifiant le seul constituant de la composition qui a une fonction importante comme agent de gélification. Ceci excluerait par exemple l'agar-agar ou la gélatine en tant qu'agents de gélification fonctionnels importants.Cependant, exactement comme dans le cas où des traces d'impuretés n'interféreraient pas nécessairement avec le fonctionnement de la matière en pectine ou contribueraient à ce fonctionnement, des quantités peu importantes d'agar-agar ou d'autres agents de gé li fi cati on pourraient être présentes et sont prévues dans cet exemple de réalisation particulier, si elles ne sont pas présentes suivant des quantités et sous des formes telles qu'elles contribueraient de manière importante à la gélification du milieu de culture. L'expression "pectine à faible teneur en groupes méthoxyles" se réfère à la pectine ayant une teneur en groupes méthoxyles d'environ 1 à environ 8 % ou un degré de méthoxylation d'environ 7 à environ 50 %. Comme indiqué au préalable la quantité de cation métallique exigée dépendra du degré de méthoxylation de la matière en pectine, ainsi que d'autres facteurs. On a déterminé que, plus le degré de méthoxylation de la matière en pectine est faible, plus la pectine devient sensible au contact avec le cation métallique. Par suite, de la pectine ayant un très faible degré de méthoxylation, telle que de l'acide pectique qui a essentiellement une teneur en groupes méthoxyles égale à 0 z est trop sensible pour être facilement utile dans la préparation d'un milieu de culture gélifié. La sensibilité élevée du cation métallique amène un gel à se former immédiatement au voisinage des cations lors de la mise en contact, et des grumeaux et des surfaces inégales dans le milieu en seront le résultat typique. L'effet opposé résultant d'une sensibilité réduite auxcations métalliques se produit avec de la pectine ayant un degré de méthoxylation sensiblement au-dessus de la gamme indiquéepourla présente invention. Dans un procédé préféré de la présente invention, un milieu de croissance biologique gélifié est préparé en combinant des quantités prédéterminées d'un milieu de croissance liquide et d'une matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles avec une quantité prédéterminée de gel compatible avec la croissance contenant une matière à cation métallique multivalent. Ces quantités sont choisies selon les descriptions antérieures pour fournir une formation de gel convenable. Sous cet aspect de la présente invention, la matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles est essentiellement le seul agent de gélification fonctionnel, et, convenablement c'est le seul agent de gélification fonctionnel. Comme décrit au préalable, un ou plusieurs de ces composants sont de préférence préstérilisés, et peuvent être convenablement prévus sous une forme de petit équipement pré-empaqueté. Sous une telle forme de petit équipement, les trois composants peuvent être séparemment empaquetés et stéra lisés, ou le milieu de croissance liquide et la matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles peuvent être mélangés en proportions prédéterminées pour être ultérieurement combinés avec le gel compatible avec la croissance.Le milieu de croissance liquide et la matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles séparément ou sous forme d'un prémélange, sont alors ajoutés au récipient de croissance de cultures et la gélification en résulte par contact de la matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles avec la ma tière à cation métallique multivalent D'autres procédés pour fournir la matière à cation métallique multivalent dans le récipient de croissance de cultures sont prévus.Par exemple, la matière à cation mé tallique peut être convenablement fournie en imprégnant une matière de support, telle qu'un tampon ou un papier filtre, avec une solution de la matière, ou en pulvérisant la matière directement à la surface du milieu de croissance liquide/ matière en pectine, ou simplement en mélangeant les composants avant leur envoi au récipient de croissance de cultures. A titre de variante, une solution de la matière à cation métallique peut être directement appliquée au récipient de croissance de cultures et, ensuite, on la laisse sécher pour déposer la matière à cation métallique sur la surface du récipient de croissance de cultures.Par exemple, une solution de la ma tière à cation métallique multivalent avec de l'eau ou d'autres solvants, peut être pulvérisée, peinte ou autrement appliquée à la surface du récipient de croissance de cultures et on la laisse sécher dessus. De manière très souhaitable, le procédé d'application de la solution fournirait un dépôt uniforme de la matière à cation métallique à la surface. En se référant de nouveau aux dessins, on présente sur les figures 3 et 4 un exemple de réalisation de la présente invention à titre de variante, généralement désigné par 10', où l'on utilise un récipient 11' de croissance de cultures.La matière à cation métallique multivalent forme une couche 13' de film mince sur une surface du récipient, telle que le fond 12' du récipient 11'. Le gel 14' du milieu de croissance se solidifie par dessus. La présente invention prévoit, en outre, un gel de milieu de croissance biologique, tel que produit selon les procédés de la présente invention. Le gel du milieu de croissance, comprend, de préférence, des produits nutritifs de croissance et , essentiellement comme seul agent de gélification fonctionnel, une matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles. La matière en pectine est convenablement le seul agent de gélification fonctionnel dans le gel de milieu de croissance de la présente invention. A cet égard, l'expression "agent de gélification " est comprise comme se référant au fonctionnement de la pectine pour former le gel et à l'exis- tence de la matière en pectine sous forme de réseau ou de structure de gel.Le gel de la présente invention peut comprendre divers constituants selon les descriptions précédentes, se rapportant aux procédés de formation d'un tel gel. Le gel du milieu de croissance biologique se compose convenablement et essentiellement de produits nutritifs de croissance, de tampons, d'eau,et d'une matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles comme seul agent de gélification fonctionnel ou essentiellement comme seul agent de gélification fonctionnel. La matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles, de préférence , est présente en quantité d'environ 10 à environ 50 g de pectine par litre de milieu. Sous un aspect, la présente invention prévoit la combinaison utile dans la préparation d'un milieu de crois sance biologique gélifié, qui comprend un récipient de croissance de cultures et un gel compatible avec la croissance, placé dans le récipient. Le gel compatible avec la croissance est constitué comme décrit préalablement, et, dans cet exemple de réalisation particulier, il comprend une matière à cation métallique multivalent en quantité d'au moins environ 4 g pour 100 ml du mélange eau/agar-agar. De préférence, le gel compatible avec la croissance se compose essentiellement de la matière à cation métallique multivalent d'agar-agar et d'eau. Comme indiqué préalablement, le gel compatible avec la croissance dans cet exemple de réalisation de la présente invention est préparé et amené à se former dans le récipient de croissance de cultures selon les techniques ordinaires.La combinaison du récipient de croissance de cultures et du gel compatible avec la croissance, contenant une matière à cation métallique multivalent , peut alors être ultérieurement utilisée pour fournir un milieu de croissance biologique gélifié selon les procédés préalablement décrits. En bref, un milieu de croissance liquide et une matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles sont envoyés dans le récipient de croissance de cultures et, par contact avec le gel compatible avec la croissance, ils se solidifieront. Un exemple de réalisation, à titre de variante, de la présente invention, comprend la combinaison utile comme milieu de croissance biologique qui, comprend un récipient de croissance de cultures, un gel compatible avec la croissance et un gel de milieu de croissance. Le gel compatible avec la croissance est constitué comme décrit au préalable, et forme une première couche dans le récipient. Le gel de milieu de croissance forme une seconde couche adjacente au gel compatible avec la croissance dans le récipient et est aussi constitué comme décrit au préalable. Le gel de milieu de croissance peut comprendre les composants préalablement décrits par rapport au milieu de croissance liquide, et comprend en outre une ma tière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles essentiellement comme seul agent de gélification fonctionnel, Convenablement, la matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles est le seul agent de gélification fonctionnel pour le gel du milieu de croissance, Par rapport au gel du milieu de croissance, la matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles est de préférence présente en quantité allant d'environ 10 à environ 30 g de pectine par litre de milieu de croissance. Le gel de milieu de croissance peut comprendre, en outre, un ou plusieurs tampons choisis dans le groupe se composant de Na2HP04, NaIl2P04, Na3P04, NaHC03 et Na2C03.On préfère, en outre, que la matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles ait une teneur en groupes méthoxyles d'-approximativement 5 %, et que la matière à cation métallique multivalent comprenne des cations calcium. Très préférablement, les cations calcium sont présents en quantité d'environ 50 à environ 125 mg de cations calcium par gramme de pectine. On préfère que le gel compatible avec la croissance comprenne un gel d'agar-agar bien que les autres gels, comme préalablement indiqué, puissent être aussi utilisés.De préférence, le volume du gel de milieu de croissance est environ 3 à environ 20 fois le volume du gel compatible avec la croissance, et dans un exemple de réalisation particulièrement préféré, on combine environ 10 ml de gel de milieu de croissance avec environ 1 ml de gel compatible avec la croissance, ce qui peut être convenablement réalisé dans une boîte de Pétri de 60 mmde diamètre. La présente invention introduit des concepts et une méthodologie uniques dans le domaine de la préparation des milieux de croissance biologiques et incorpore spécifiquement la pectine dans ces milieux en tant que seul agent de gélification ou de solidification. La présente invention fournit un procédé simple et direct d'utilisation de la pectine comme agent de gélification. Particulièrement, dans le procédé préféré de la présente invention, la préparation d'un milieu de croissance biologique utilisant la pectine comme agent de gélification est réalisée par l'utilisation de composants préstérilisés n'exigeant pas l'emploi d'équipement de stérilisation spécial, tel qu'un autoclave ou un four.Par exemple, le milieu de croissance liquide comprenant de la pectine peut être de préférence préstérilisé et empaqueté, et le récipient de croissance de cultures ayant le gel compatible avec la croissance comprenant la matière à cation métallique est, de manière correspondante, préstérilisé et empaqueté. Egalement, l'une quelconque ou toutes les matières (milieu de croissance liquide matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles, gel compatible avec la croissance, gel de milieu de croissance et solution de matière à cation métallique) peuvent être et de préférence sont préstérilisées et empaquetées en vue d'une utilisation ultérieure.La préparation d'un milieu de croissance gélifié dans un récipient de croissance de culture peut être en conséquence facilement réalisée sans qu'on ait besoin d'un temps substantiel et sans utiliser d'autres équipements La présente invention est ,en conséquence, particulièrement convenable pour l'utilisation dans des laboratoires d'enseignement ou dans d'autres environnementsoù l'équipement est limité et le temps et/ou habilité des personnes préparant un milieu de croissance sont également limités. Les avantages supplémentaires sont également associés au procédé de la présente invention. Sous un aspect, le milieu de croissance liquide comprenant la pectine à faible teneur en groupes méthoxyles peut être distribué à l'état très chaud, moyennement chaud, ou refroidi, la solidification se produisant dans tous les cas par combinaison dans le récipient de croissance de cultures. Le fait que le procédé soit indépendant de la température est un avantage particulièrement remarquable par rapport au milieu classique en agar-agar dans des techniques telles que la formation de plaques, par dilution pour la détermination de populations ou la séparation d'un mélange de divers types de microbes. Dans la technique par dilution, un mélange aqueux des microbes est ajouté au milieu non gélifié, mélangé pour l'homogénéité, puis déversé dans des boîtes de Pétri et on le laisse se gélifier.Si de l'agar-agar est utilisé comme agent de gélification, pour le gel de milieu de croissance, le milieu doit être à une tempé rature d'environ 450C ou plus, quand les microbes sont ajoutés par suite du fait que la solidification se produira au-dessous de cette température. Une telle température élevée sera nuisible pour de nombreux microbes délicats, et peut en fait tuer ou désactiver de nombreux microbes ou provoquer des changements indésirables, tels que la mutation. On pourrait s'attendre à ce que ceci entraîne une image peu précise du mélange de microbes d'origine. Ces problèmes sont évités par la présente invention puisque les microbes peuvent être mélangés avec le milieu de croissance liquide à une température aussi basse que celle souhaitée. L'utilité du milieu de croissance biologique produit selon la présente invention est mise en évidence par le manque de dépendance du procédé par rapport à la température, comme décrit au préalable, ainsi que par le fait que la plupart des micro-organismes sont incapables d'hydrolyser la pectine gélifiée. Le milieu peut être également utilisé avec des organismes procaryotiques durègne protiste avec des micro-organismes eucaryotiques, ou dans des techniques de cultures de cellules ou de tissus. Le milieu peut être aussi utilisé pour montrer quels microbes produisent des enzymes pectolytiques, puisque ces organismes peuvent affecter l'hydrolyse du milieu.En outre, les milieux produits par les modes opératoires de la présente invention sont facilement reproductibles avec précision à un point tel qu'une série continue d'expériences ou une réalisation en double d'une expérience peut être réalisée avec précision. Les modes opératoires utilisés dans la présente invention sont très directs et bien connus des personnes expérimentées dans la technique. Comme exemple particulier du procédé de la présente invention, le mode operatoire suivant est décrit en détail. D'abord, la pectine est melangée avec la solution de bouillon nutritif en quantité de 20-30 g par litre et de manière à éviter la formation de grumeaux insolubles. Le bouillon de pectine-produits nutritifs est alors tamponné avec Na3P04 pour produire un pH dans la gamme de 6 - 7. Le bouillon de produits nutritifs-pectine est ensuite stérilisé 2 dans un autoclave sous 0,7 - 1,05 kg/cm pendant 10-15 minutes A titre de variante, le bouillon de produits nutritifs-pectine et les tampons peuvent être stérilisés séparément et combinés après la stérilisation.A titre de variante, la pectine peut être dissoute dans l'eau en quantité de 20-30 g par litre et de manière à éviter la formation de grumeaux insolubles, alors que le produit nutritif et le tampon peuvent être combinés séparément et les deux solutions réunis après la stérilisation séparée. Une solution contenant 2 % (2g pour 100 ml d'eau distillée ou désionisée) d'agar-agar et de chlorure de calcium est préparée. A titre de variante, d'autres composés comprenant des cations métalliques mutivalents peuvent être employés comme cela est bien connu dans la technique se rapportant aux agents pour l'utilisation avec la pectine pour fournir un gel. Typiquement, les composés de calcium, comprenant le chlorure, le nitrate ou le phosphate, sont particulièrement souhaitables, et l'agent idéal serait soluble dans l'eau.Comme indiqué au préalable, la concentration de chlorure de calcium ou autre matière à cation métallique multivalent est déterminée pour fournir la concentration de cation métallique convenable pour provoquer la solidification de la composition de produits nutritifs-pectine quand elle est deversée sur le gel d'agar-agar solidifié. La solution de l'agar-agar à 2 % et de la matière à cation métallique est préparée par des moyens convenables tels qu'en dissolvant les matières dans de l'eau chauffée 2 sous une pression de 0,7 - 1,05 kg/cm et à environ 1200C dans un autoclave. Le mélange d'agar-agar stérile est alors distribué, en étant chaud, dans une boite de Pétri en quantité suffisante pour recouvrir le fond de la boîte stérile. Le mélange se solidifie rapidement en formant un film de gel adhérant à l'intérieur de la base de la boîte de Pétri. A titre de variante, le mélange d'agar-agar peut être distribué dans des boîtes ou des récipients de Pétri non stériles, et , après solidification, ils peuvent être stérilisés selon les manières habituelles telles que l'emploi d'oxyde d'éthylène gazeux ou par rayonnement. Le bouillon de produits nutritifs-pectine, ou le milieu de croissance liquide, est de préférence préstérili- sé, et puis est distribué dans les botes ou autres récipients de croissance de cultures,au-dessus du film de gel d'agaragar, compatible avec la croissance. La présence des cations métalliques multivalents amène le milieu de croissance liquide à se solidifier généralement à peu près en 2 - 4 heures. Le milieu de croissance solidifié est alors inoculé avec des micro-organismes, et est soumis à l'incubation en ayant le côté droit vers le haut ou sens dessus dessous. La présente invention est utile avec un grand nombre de récipients de croissance de cultures. La présente invention est particulièrement bien adaptée à une utilisation avec des récipients pouvant être jetés. De préférence, le volume du gel de milieu de croissance est environ 3 à environ 20 fois le volume du gel compatible avec la croissance. Dans le cas de l'utilisation avec des boîtes de Pétri et d'autres récipients, on a trouvé qu'une combinaison convenable était environ 2 ml de gel compatible avec la croissance pour environ 10 ml de gel de milieu de croissance dans une boîte de Pétri de 60 ml. Les exemples suivants sont d'autres exemples de milieux biologiques préparés selon la présente invention. EXEMPLE 1 Un milieu biologique général pour la croissance de bactéries, de moisissures et de levures a été formulé comme suit Tryptone , 2 g Pectone , ,. * , 2 g Extrait de levure . 2 g Glucose *,. 2 g Pectine dite LM , ..... 25 g Eau désionisée ,., , 1 litre Cette formulation est stérilisée par passage à l'autoclave et, après le passage à l'autoclave et le refroidissement du milieu , on ajoute une combinaison de Na3P04 et de Na2C03 (préstérilisés) pour régler le pH du milieu. On a fait croître avec succès sur cette formulation de nombreuses bactéries, de nombreuses levures et de nombreuses moisissures. EXEMPLE 2 Un milieu différentiel spécifique, connu sous le nom d'agar-agar-bleu de méthylène-éosine, est utilisé pour identifier la présence d'Escherichia coli à partir d'autres bactéries semblables. L'E. coli croit avec un reflet vert sur ce milieu, par comparaison avec llEnterobacter aerogenes qui croît sous forme d'une culture rose, à aspect gommeux. On a préparé le milieu suivant qui, dans des tests préliminaires, fonctionnait très bien pour différencier ces deux organismes. Peptone .... 5 g Lactose .... 5 g Eosine dite y ,., 0,4 g Bleu de méthylène .... 0,065 g Pectine dite LM ,, , 25 g Eau désionisee , *, 1 litre La formulation indiquée ci-dessus a été stérilisée et puis réglée à un pH de 7,1 avec Na3P04 et Na2C03 préstérilisés). EXEISLE 3 Comme indiqué au préalable, les milieux indiqués ci-dessus des exemples 1 et 2 ont été utilisés pour préparer un milieu de croissance biologique gélifié selon la présente invention. Initialement, un mélange d'agar-agar préparé comme décrit au préalable a été envoyé dans une boîte de Pétri, on l'a laissé refroidir, et, en conséquence, il s'est solidifié. Les formulations des exemples 1 et 2 ont été alors ajoutées à différentes boîtes de Pétri contenant le mélange d'agar-agar solidifié. Ce mode opératoire est suivi en utilisant les différentes proportions des formulations, le gel d'agar-agar allant d'environ 3 à environ 20 fois le volume de chaque formulation par rapport au volume du gel d'agar-agar. D'excellents résultats sont obtenus. EXEMPLE 4 Les modes opératoires de l'exemple 3 sont suivis, sauf qu'au lieu du mélange d'agar-agar, d'autres formulations de gel standard ont été utilisées pour fournir le gel compatible avec la croissance. Les autres gel compatibles avec la croissance comprenaient la gélatine, le caraghénan et du gel de silice comme agents de solidification ou de gélification. L'addition des formulations des exemples 1 et 2 produisaient d'excellents gels de milieu de croissance. EXEMPLE 5 Les modes opératoires de l'exemple 3 sont répétés, sauf qu'au lieu d'utiliser un gel d'agar-agar comme support pour le chlorure de calcium, une solution du chlorure de calcium a été appliquée directement à des botes de Pétri. Les solutions ont été appliquées diversement en pulvérisant avec un atomiseur et en peignant la solution directement sur les boîtes. Par combinaison avec les formulations des exemples 1 et 2, des gels convenables ont été produits.Ces modes opératoires sont réalisés en utilisant une solution aqueuse de chlorure de calcium et, également, un mélange comprenant 5-10 g de méthylcellulose et environ 4 g de chlorure de calcium pour 100 ml d'eau, et des résultats semblables ont été obtenus. Comme d'autres exemples des procédés et du gel des milieux de la présente invention, des variantes des exemples ci-dessus sont réalisées. En réalisant les procédés des exemples ci-dessus en utilisant,à titre de variante, une matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles ayant une teneur en groupes méthoxyles d'environ 1, 3, 5 et 8% , on fournit dans chaque cas un gel de milieu de culture convenable.En mettant en pratique le procédé des exemples précédents, de manière semblable, on produit un gel convenable quand le milieu de croissance liquide et la matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles sont séparés ou en combinaison , et le procédé comprend aussi de manière convenable l'addition du milieu de croissance liquide et du cation métallique multivalent avant l'addition de la matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles, En faisant varier la quantité de pectine présente dans le gel de milieu de culture, dans la gamme d'environ 10 à environ 30 g de pectine par litre de milieu, on produit également les gels convenables suivant les exemples antérieurs. Très preférablement, la matiere à cation métallique multivalent comprend un sel de calcium, et la variation de la quantité de cations calcium d'environ 50 à environ 125 mg de cations par gramme de pectine, fournit un gel convenable selon les exemples antérieurs. Bien que les gammes très préférées pour la quantité de pectine et la quantité de matière à cation métallique multivalent aient été indiquées ici, des gels convenables peuvent être fournis à l'extérieur de ces gammes. La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de variantes et de modifications qui apparaîtront à l'homme de l'art. REVENDICATIONS 1 - Procédé de préparation d'un milieu de croissance biologique gélifié, caractérisé en ce qu'il consiste a) à prévoir une quantité prédéterminée d'un milieu de croissance liquide ; b) à prévoir une quantité prédéterminée d'une matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles c) à prévoir un récipient de croissance de cultures ayant un gel compatible avec la croissance, le gel compatible avec la croissance contenant une matière à cation métallique multivalent convenable pour produire la gélification de la matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles ; et d) à ajouter le milieu de croissance liquide et la matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles au récipient de croissance de cultures pour produire un milieu de croissance gélifié ayant la matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles essentiellement comme seul agent de gélification fonctionnel. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les étapes a) et b) consistent à fournir un mélange de quantités prédéterminées d'un milieu de croissance de liquide et d'une matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles a une teneur en groupes méthoxyles d'approximativement 5 %. 4 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le milieu de croissance liquide comprend entre environ 10 et environ 50 g de pectine par litre de milieu de croissance 5 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le volume du milieu de croissance liquide et de la matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles est environ 3 à environ 20 fois le volume du gel compatible avec la croissance. 6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le récipient de croissance de cultures est une boîte de Pétri ayant un gel compatible avec la croissance, présent sous forme d'une couche de film. 7 - A titre de produits industriels nouveaux, milieux de croissance biologiques gélifiés obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 8 - Combinaison utile comme milieu de croissance biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend un récipient de croissance de cultures; un gel compatible avec la croissance formant une première couche dans le récipient, ce gel compatible avec la croissance comprenant une matière autre qu'une matière en pectine comme agent de gélification fonctionnel substantiel, la matière à cation métallique compatible avec la croissance étant convenable pour produire la gélification d'une matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles ; et un milieu de croissance formant une seconde couche adjacente au gel compatible avec la croissance dans le ré- cipient, ce gel de milieu de croissance comprenant un milieu de croissance et, essentiellement comme seul agent de gélification fonctionnel, une matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles. 9 - Combinaison selon la revendication 8, caractérisée en ce que la matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles est présente en quantité d'environ 10 à environ 30 g de pectine par litre de milieu de croissance. 10 - Combinaion selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un tampon choisi dans le groupe se composant de Na2HP04, NaH2P04, Na3P04, NaHC03 et Na2C03. Il - Combinaison selon la revendication 8, caractérisée en ce que la matière en pectine à faible teneur en groupes méthoxyles a une teneur en groupes méthoxyles d'approximativement 5 %. 12 - Combinaison, selon la revendication 11, caractérisée en ce que la matière à cation métallique multiva lent comprend des cations calcium. 13 - Combinaison selon la revendication 12, caractérisée en ce que les cations calcium sont présents en quantité d'environ 50 à environ 125 mg de cations calcium par gramme de pectine. 14 - Combinaison utile pour préparer un milieu de croissance biologique gélifié, caractérisée en ce qu'elle comprend un récipient de croissance de culture ; et un gel compatible avec la croissance, placé dans le récipient, ce gel compatible avec la croissance comprenant une matière autre qu'une matière en pectine comme agent de gélification fonctionnel substantiel, ce gel compatible avec la croissance renfermant , en outre, une matière à cation métallique multivalent en quantité d'au moins environ 4 g/100 ml. 15 - Combinaison selon la revendication 14, caractérisée en ce que le gel compatible avec la croissance est composé essentiellement de la matière à cation métallique multivalent d'agar-agar et d'eau. 16 - Combinaison selon la revendication 15, caractérisée en ce que le récipient de croissance de cultures est une boîte de Pétri ayant une base comprenant une surface de fond intérieure, la matière à cation métallique multivalent formant un film mince sur la surface de fond intérieure.