Brevet FR2455083A1 — publié le 19801121

La présente invention est relative à un nouveau procédé de dosage des protéases et des antiprotéases et notamment des protéases et antiprotéases des systèmes de la coagulation et du complément. L'information sur l'activité enzymatique du sang et notamment des enzymes protéolytiques du type trypsine ("trypsine-like") est capitale pour connaitre les anomalies éventuelles des facteurs de la coagulation. Ce dosage fournit également très souvent de précieux renseignements sur les desordres plus profonds de l'ors gani$me. C'est pourquoi il est primordial de disposer d'une technique sûre et précise de dosage de ces enzymes. Les méthodes de dosage actuellement utilisées consistent principalement en une lecture photométrique (photométrie simple, spectrophotométrie ou photométrie de fluorescence) des groupes chromogènes ou fluorescentsobtenusaprès scission des substrats spécifiques par les enzymes que l'on veut doser. La plupart des substrats utilisés sont des substrats synthétiques. Ils conviennent parfaitement aux dosages des enzymes du sang, de même que pour l'étude des réactions entraînant la formation, l'inhibition ou la consommation de ces enzymes, ou même pour la détermination de facteurs qui influencent ces dif férentes réactions ou qui y participent (cf. notamment les Brevets Français nO 2 183 188, 2 317 278, 2 317 280, 2 293 439). Malheureusement, ces procédés de dosage qui sont précis et élégants ne conviennent bien qu'en milieu homogène. Dans des milieux aussi hétérogènes que le sont les fluides biologiques et notamment le sang total, ils perdent beaucoup de leur précision. Pour éviter cet inconvénient majeur, l'on a proposé d'opérer sur du sang centrifugé, debarrassé de ses éléments solides et convenant donc parfaitement pour des lectures photométriques. Cette opération de centrifugation,outre le fait qu'elle néces- site un matériel adéquat qui est lourd et complexe, outre le fait encore qu'elle constitue une source de pertes inévitable, provoque également un certain "traumatisme'6 du sang qui se traduit par la libération d'une quantité non négligeable de divers facteurs à partir des plaquettes, facteurs qui ont eux-mêmes une certaine activité enzymatique et viennent donc par conséquent fausser les résultats du dosage. La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à un nouveau procédé de dosage des enzymes précitées qui répond mieux aux nécessités de la pratique que les procédés de dosage antérieurement connus, notamment en ce qu'il est simple, précis, fiable et peut être appliqué à tous les milieux, homogènes ou hétérogènes, solutions ou suspensions. La présente invention a pour objet un nouveau procédé de dosage des protéases et des antiprotéases et notamment des protéases et antiprotéases des systèmes de coagulation et du com plément, caractérisé en ce que l'on fait réagir l'enzyme à doser sur un substrat électrochimiquement neutre mais qui fournit après l'hydrolyse par l'enzyme,un produit d'hydrolyse susceptible d'être soit oxydé soit réduit électrochimiquement dans le domaine d'électroactivité du système, lequel produit est ensuite déterminé par ampérométrie à un pH compris entre 8 et 9. Pour que ce dosage électrochimique puisse avoir lieu dans des conditions satisfaisantes, il faut que le substrat spécifique de l'enzyme considérée ne soit pas susceptible d'être lui-même oxydé (ou réduit) électrochimiquement dans les conditions du dosage ; il faut utiliser des électrodes conductrices ou semi-conductrices ; il faut en outre que le produit d'hydrolyse du substrat par l'enzyme soit lui-même électroactif, la mesure ampérométrique étant directement proportionnelle à la quantité d'enzyme dans le milieu considéré. Suivant un mode de réalisation avantageux du procédé de dosage, objet de la présente invention, l'augmentation de la concentration, dans la cellule de mesure, du composé électroactif qui constitue le produit d'hydrolyse du substrat, est suivie périodiquement par la variation de son courant d'oxydation ou de réduction. Suivant une modalité particuliere de ce mode de réalisation, ledit courant d'oxydation ou de réduction est déterminé par l'amplitude du pic voltamétrique obtenu lors du pilotage d'un signal potentiodynamique. En effet, cette amplitude du pic voitamétrique est proportionnelle à la concentration de l'espèce électroactive (produit d'hydrolyse enzymatique) présente en solution et à la surface de l'électrode indicatrice. Suivant un autre mode de réalisation avantageux du procédé de dosage objet de la présente invention, avant de procéder au dosage proprement dit, l'électrode indicatrice est soumise à un préconditionnement consistant en un balayage ininterrompu de signaux potentiodynamiques triangulaires entre -0,1 V et +0,4 V, à la vitesse de 0,2 V/sec., ledit balayage étant arrêté lorsque ltenregistrement du signal-réponse sur un enregistreur (signal i/V) fait apparaitre une courbe-limite. Ce préconditionnement est nécessaire à cause des très faibles amplitudes des courants mesurés pendant l'hydrolyse, il est destiné d'autre part à conférer à l'électrode un état de surface reproductible et bien défini avant chaque cycle. De plus, g r c e à c e p r é c on d i t ion n e ment, les mesures électrochimiques effectuées conformément à la présente invention sont particu lièrement sensibles et particulièrement fiables. Suivant un autre mode de réalisation avantageux du procédé conforme à la présente invention, les substrats dont la mise en oeuvre est particulièrement préférée, sont les oligopeptides qui libèrent, après la réaction enzymatique, des amines ou des polyamines aromatiques ou hétérocycliques. Suivant un autre mode de réalisation-avantageux de l'objet de l'invention, le substrat est activé par substitution d'un groupe acyle et/ou sulfonyle et/ou tosyle et/ou benzoyle. Suivant une modalité particulière de ce mode de réalisation, le substrat est constitué par lechlom de benzoyl-D,L arginyl-p-aminodiphénylamide (D,L BAPADA), la réaction enz-ymati- que ayant lieu suivant le schéma suivant. D,L-Benzoyl arginine p-aminodiphenyl acide, chlorhydrate (D.L-BAPADA) D,L-Benzoyl arginine p-aminodiphenylamine (pADA) produit électroactif Suivant un autre mode de réalisation avantageux de l'objet de l'invention, et afin d'éviter la précipitation du substrat, on ajoute au milieu réactionnel 2 à 10 % de diméthyl sulfoxyde. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention com prend encore d'autres dispositions, qui ressortiront dela description qui va suivre. La présente invention vise plus particulièrement le nou veau procédé électrochimique de dosage des protéases et des anti protéases des systèmes de coagulation et du complément, notam ment de la trypsine, de la plasmine, de la kallikréine, du fac teur XII(ou facteur de Hageman),du facteur XI (ou plasma-thromboplastine antécédent),du facteur X (ou facteur STUART-PROWER), du facteur IX (ou facteur CHRISTMAS), des enzymes C1 et C3 du sys tème du complément, des antiprotéases telles que l'antithrombine , de lac 2-macroglobuline, de l'antiplasmine, de la i2-anti- trypsine etc..., ainsi que les moyens propres à la mise en oeu vre et à la réalisation de ce procédé, et que les procédés d'en semble et les chaines de fabrication dans lesquels sont inclus le procédé et le substrat conformes à la présente invention. L'invention pourra être mieux comprise à l'aide du com plément de description qui va suivre, qui se réfère à des exem ples de mise en oeuvre de la méthode électrochimique de dosage des protéases et des antiprotéases. I1 doit etre bien entendu, toutefois, que les exemples de mise en oeuvre qui seront décrits ci-après, de meme que les exemples de courbes de calibration et de cinétique d'amidolyse du D,L BPSPADA, représentées aux dessins annexés, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, mais n'en constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLES DE DOSAGE I.- MATERIEL UTILISE a) Un potentiostat dont le rôle est de maintenir une différence de potentiel constante entre l'électrode indicatrice et l'électrode de référence ; un générateur de fonctions trian gulaires entre -0,1 et + 0,4 V, à la vitesse de 0,2 V/sec. ; un enregistreur graphique à bonnes performances dynamiques. Une cellule de téflon de contenance 5 ml et pouvant recevoir trois électrodes. b) Electrode indicatrice : elle est constituée par un disque de platine serti dans un cylindre de téflon (embout pour électrode EDI-Tacussel./soléa ; surface géométrique : 0,0314 cm2). Electrode de référence : électrode au calomel sature (SCE) par rapport à laquelle sont mesurés tous les potentiels. Electrode auxiliaire : servant à assurer le passage du courant ; elle est simplement constituée par un fil de conducteur métallique inattaquable (platine). c) Solutions : les solutions-mères d'enzyme (solution E) et de substrat (solution S) sont préparées fraîchement avant leur emploi. On appelle A la solution d'essai à laquelle une quantité aliquote de E est ajoutée au temps t = O de la cinétique. Le tampon pH 8,15 est constitué par le véronal 0,025 M, NaCl, de force ionique F = 0,15. II.- PRECONDITIONNEMENT DE L'ELECTRODE Dans la solution A dépourvue d'enzyme, l'électrode indicatrice est soumise à un préconditionnement destiné à lui conférer un état de surface reproductible et bien défini avant chaque cycle. Ce préconditionnement consiste en un balayage ininterrompu de signaux potentiodynamiques triangulaires entre -0,1 et +0,4 V à la vitesse de 0.2 V/sec. Lorsque l'enregistrement du signal-réponse sur l'enregistreur (signal i/V) fait apparaitre une courbe-limite (soit au bout d'environ detix minutes), le balayage est arrenté. L'électrode peut alors être utilisée pour les déterminations cinétiques, au moyen de cycles de polarisation triangulaires pilotés toutes les 60 secondes, entre -0,1 et +0,4V à la vitesse de 0,2 V/sec. III.- ENREGISTREMENT DU COURANT DE FOND A la fin du balayage continu précédent, l'enregistrement des deux premiers cycles (à 60 secondes d'intervalle) donne le profil du courant de fond limite, dont les valeurs devront être retranchées des courants correspondant aux signaux relevés pendant l'hydrolyse. La figure 1 représente précisément le programme de balayage triangulaire de potentiel appliqué avant et après injection de la solution d'enzyme (2). Les signaux potentiodynamiques des impulsions anodiques sont déclenchés toutes les 60 secondes. Le courant de fond typique (1) est tracé pendant la seconde impulsion. Après l'obtention d'un courant de fond (1) reproductible à 0,01 A près, l'enzyme est injectée au temps t=O correspondant au déclenchement d'un cycle potentiodynamique. Ce signal n'est pas enregistré. L'enregistrement des signaux suivants permet de suivre chaque 60 secondes le degré d'avancement de l'hydrolyse du substrat par l'enzyme. IV. - INTERPRETATION GRAPHIQUE DES RESULTATS Les courants relevés au maximum de chaque vague i = f(V) sont, après déduction du courant de fond au potentiel considéré, proportionnels aux concentrations de l'espèce électroactive libérée lors de l'hydrolyse. Les courants varient linéairement en fonction du temps pour les temps d'hydrolyse courts. La relation entre la concentration en enzyme E (en pg/ml) et la vitesse d'hydrolyse à l'origine représentée par le rapport (di/df en pA/min. Pente à l'origine de la courbe représentative i=f(t) 7, pour une électrode de surface de 1 cm, est représentée par la formule E = K (di/dt)o Le coefficient K dépend de la nature de l'enzyme et du substrat utilisés. V. - TRACE DES VOLTAMMOGRAMMES CYCLIQUES DU pADA A L'ELECTRODE A PATE DE CARBONE La figure 2 représente les voltammogrammes obtenus à pH 8,15, avec une vitesse de balayage de 0,2 V/sec L'électrode est une électrode à pâte de carbone. Le pic d'oxydation du pADA -0,22 mM- (courbe a) résulte d'un transfert global des deux électrons dans une région de potentiel ou il n'y a pas dtinter- férence entre le courant de fond et la réduction d'oxygène. La courbe b représentée à la figure 2 traduit le comportement électroactif du substrat, en l'occurrence le D,L BAPADA 1mM, dans la gamme de tensions anodiques. Par rapport au pic d'oxydation du pADA, le pic attribué au BAPADA est décalé de -0,3 V, comme on le voit nettement sur la figure 2. Cela peut vraisemblablement être attribué à l'influence du groupe benzoyl-arginyle. D'autre part, le fait que le pic d'oxydation est bien moins haut pour le substrat s'explique aisément par le fait que le coefficient de diffusion du substrat est d'environ 40 fois plus petit que celui de l'amine libérée.La courbe c représente le voltammogramme obtenu quand le substrat (D,L BAPADA 1mM) et le produit d'hydrolyse (la pADA 0,22 mM) sont présents ensemble : indifférents au déplacement anodique du pic pADA, les voltammogrammes a et b s'équilibrent avec la courbe c en ce qui concerne l'additivité des courants. Ce processus ampérométrique montre que la relation linéaire de l'amplitude du pic par rapport à la concentration de l'amine (pADA) résulte de la séparation anodique suffisante des pics. VI.- TRACE DE L'AMPLITUDDE DES PICS ANODIQUES EN FONCTION DE LA CONCENTRATION EN pADA La figure 3 représente la courbe de calibration voltamétrique et l'amplitude des pics anodiques (en ordonnée) en fonction de la concentration en pADA. Le tracé xxx représente les pics anodiques obtenus pour la pADA seule. Le tracé ooo représente les pics anodiques obtenus pour la pADA en présence de 1mM de D,L BAPADA, et Le tracé ### représente les pics anodiques obtenus pour la pADA en présence de 75 Bg/ml de trypsine. Les conditions de l'expérience sont les suivantes - température : 300C - pH = 8,15 (TRIS) - quantité de DMSO ajoutée : 6,35 % - vitesse de balayage : 0,2 V/sec. - électrode de platine polie Comme on le voit sur la figure 3, la courbe est une droite parfaite. C'est seulement à partir de 100 llg/ml de trypsine que le profil du voltammogramme de la pADA est très légèrement altéré, mais il n'y a aucun transfert de charge pour les fonctions triangulaires comprises entre -0,1 et +0,4 V (électrode en calomel saturé - ECSj à la vitesse de balayage de l'ordre de 0,2 V/sec. Bien que l'addition de facteurs de coagulation du sang tels que le fibrinogène, la prothrombine ou la thrombine par exemple, conduise à leur adsorption sur l'électrode de platine Zcf. en particulier les travaux de L. DUIC et alia dans J. Electrochem. Soc. 120 (1973) pages 348-353 et pages 354-3617, et bien qu'il se produise des processus de transfert de charges concernant ces enzymes, transferts qui conduisent à la formation de deux pics, un pic anodique et l'autre cathodique, ces pics ne peuvent être décelés qu'après au moins 10 minutes de balayage cyclique continu à 0,05 V/sec., ce qui ne se produit jamais dans les conditions conformes à la présente invention, d'autant plus q u e les conditions opératoires revendiquées dans la pré sente invention, telles que la presence du tampon (pH 8,15) et le préconditionnement de l'électrode, rendent la formation de ces deux pics pratiquement impossible. VII.- MESURE DE L'ACTIVITE AMIDOLYTIQUE DE LA TRYPSINE La figure 4 représente les voltammogrammes de l'oxydation de la pADA enregistres pendant l'amidolyse du D,L BAPADA par la trypsine. On opère à 300C, à pH 8,15 (tampon Tris) en présence de 6,35 96 de DMSO, électrode de platine polie, la vitesse de balayage étant de 0,2 V/Sec. La solution d'enzyme est injectée à la fin du cycle potentiodynamique servant à tracer le courant de fond (le courant de fond a été déplacé vers le bas : il est représenté par la ligne brisée). Les amplitudes des pics sont converties directement en concentrations en comparant avec la courbe de calibration (figure 3). Le taux d'hydrolyse est déter miné en fonction du temps (temps maximum 30 minutes).La figure 5 représente le taux d'amidolyse du D,L BAPADA en fonction du temps par la trypsine à 5,5 llg/ml (courbe 1), à 8,3 llg/ml (courbe 2) et 11,0 llg/ml (courbe 3). Les conditions opératoires sont les mêmes que celles décrites pour le tracé de l'amplitude des pics anodiques. La figure 6 représente le taux d'hydrolyse en fonction de la concentration de l'enzyme : courbe 1 après 5 minutes d'hydrolyse, e t courbe 2 après 10 minutes d'hydrolyse. La cinétique est d'ordre 1. Les constantes classiques comme la Km et la Vm sont déterminées par la voie usuelle à partir du diagramme LINE-WEAVER-BURK qui représente les taux de la réaction en fonction de la concentration du substrat. La figure 7 représente précisément un tel diagramme LINE-AVER-BURK pour l'amidolyse du D,L 1BPADA par la trypsine (10 Xg/ml). On a porté en ordonnée l'inverse de la vitesse 1/V et en abscisse l'inverse de la concentration du substrat 1/S. L'inverse de la vitesse 1/V est exprimé - soit en [ A/min. 1Oug enzymeg 1graduation de gauche - soit en [ mole 10 /min. 10 g enzyme de pADA/ -1 graduation de droite Les points O représentent chacun une moyenne de dix vitesses instantanées et les points X représentent la moyenne graphi que. Chaque point est obtenu à partir d'une nouvelle solution mère d'enzyme.Les conditions expérimentales sont les suivan tes - quantité de trypsine : 10 pg/ml - température : 300C - pH : 8,15 (TRIS) - DMSO : 6,35 % La constante de MICHAELIS MENTEN Km et le taux de vitesse maximum Vm calculés d'après le diagramme LINE-WEAVER-BURK représenté à la figure 7 sont de 8.10-4 moles/litre et 9,6.10 mole/min. rg respectivement. On opère de manière semblable quelle que soit l'enzyme dosée et quel que soit le substrat choisi. Le Tableau I ciaprès résume les conditions de dosage de deux protéases la trypsine et la thrombine. Dans le cas de la thrombine, les données cinetiques sont les suivantes Km = 10-5 mole/litre Vm = 1,1.10-7 mole/min. U.I. TABLEAU I ENZYME TRYPSINE THROMBINE Substrat benzoyl D,L arginine p-aminodiphényl- H-D-phénylalanyl-L pipécolyl amide, HCl D,L BAPADA L valyl-L arginyl p-amino diphénylamide, 2HCl (HDL) Espèce électro- p-aminodiphénylamine pADA active libérée pADA Solution de subs- 7,65 mg de D,L BAPADA dans 1ml de DMSO 0,40 mg dans 1 ml de trat S tampon véronal Solution d'essai 0,2 ml de solution S + 3 ml de tampon 0,4 ml de solution S + 2 ml A véronal pH 8,15 à 0,025 M de force du tampon véronal ionique 0,15 Standardisation un courant de 0,295 A/cm d'électrode un courant de 0,217 A/cm est obtenu après hydrolyse du substrat est obtenu par hydrolyse du par 1 mM de trypsine pendant une substart 0,1 mM par 0,01 UI minute de thrombine pendant une minute Résultats Relation entre la concentration d'enzyme Relation entre la concentra E (en g/ml) et la vitesse d'hydrolyse à tion d'enzyme E (en U.I.) l'origine représentée par le rapport et la vitesse d'hydrolyse à (di/dt)o avec une électrode de surface de l'origine représentée par le 1 cm E= 3,39 (di/dt)o rapport (di/dt)o avec une E = en g/ml électrode de 1 cm de surfa (di/dt)o en A/min. ce E = 0,046 (di/dt)o 3n A/min. VIII.- DOSAGE D'UNE ANTIPROTEASE : EXEMPLE DE DOSAGE DE L'ANTITHROMBINE DANS LE SANG Le sang est recueilli sur citrate de sodium dans les conditions normales. On incube 0,2 ml de ce sang avec 2,8 ml de tampon vénal hépariné à 4 000 UI/litre pendant une minute à 400C. On ajoute ensuite 50 rl d'une solution de thrombine à 60 U.I./ml et on laisse incuber 4 minutes. On ajoute ensuite sous agitation 250 l de substrat HDL à 0,7 mg/ml en dilution dans 2 ml de tampon véronal, préincubé à 400C. Après 30 secondes d'incubation exactement, la cinétique est bloquéé par addition d'acide acétique glacial et le courant est mesuréS oit un échantillon T qui contient de la thrombine et du tampon, mais pas de sang, et un échantillon P qui contient de la thrombine, du tampon et du sang.Sachant que les valeurs mesurées pour un sang normal sont Tn et Pn respectivement, l'activité de l'antithrombine est donnée par la formule ir - ip /@ x 100 Tn Pn en % de l'activité d'antithrombine par rapport au sang normal. IX.- EXEMPLE DE PREPARATION DU SUBSTRAT D,L BAPADA On pèse 4,68 g (soit 0,0168 mole) de benzoyl-L-arginine que l'on dissout dans un mélange d' 1 équivalent d'acide orthophosphorique concentré à 85 % et 25 ml de diéthylphosphite. On chauffe dans un bain d'huile. On ajoute alors 1 équivalent de pADA, 2 équivalents de triéthylamine pure et un mélange de 2 équivalents de pentaoxyde de phosphore préalablemet dissous dans 20 ml de diéthylphosphite. On agite le tout et le mélange réactionnel est chauffé sous bonne agitation sous un courant d'azote. On refroidit et on sépare le produit brut de la solution riche. On ajoute alors 300 ml d'HCl N et on chauffe. On laisse ensuite reposer une nuit au réfrigérateur et on décante la solution surnageante. L'huile résiduelle est extraite et lavée avec l'acétone glaciale, puis on recristallise du mélange éther/éthanol. Le rendement est de l'ordre de 55 %. Analyse élémentaire : (BAPADA - C25 H29 O2N6 Cl) C H N O P C1 Calculé : 62,5 6,02 17,5 6,67 0 7,38 Trouvé : 60,9 6,16 16,6 8,60 0,2 7,20 Les spectres IR, W et NMR indiquent que le produit obtenu est bien du D,L BAPADA I1 résulte de la description qui précède que quels que soient les modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application adoptés, l'on obtient un procédé de dosage des protéases et des antiprotéases qui présente par rapport aux procédés de dosage antérieurement connus l'avantage d'entre sensible, fiable et praticable dans tous les milieux aussi bien homogènes qu' hétérogènes. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'etre décrits de façon plus explicite dans ce qui précède ; elle en embrasse au contraire, toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 - Procédé de dosage des protéases et des antiprotéases et notamment des protéases et antiprotéases des systèmes de la coagulation et du complément, caractérisé en ce que l'on fait réagir l'enzyme à doser sur un substrat électrochimiquement neutre mais qui fournit après l'hydrolyse par l'enzyme, un produit d'hydrolyse susceptible d'être soit oxydé, soit réduit électrochimiquement dans le domaine d'électroactivité du système, lequel produit est ensuite déterminé par ampérométrie à un pH compris entre 6 e 10. 20- Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que l'augmentation de la concentration, dans la cellule de mesure, du composé électroactif qui constitue le produit d'hydrolyse du substrat, est suivie périodiquement par la variation de son courant d'oxydation ou de réduction. 30- Procédé selon la Revendication 2, caractérisé en ce que ledit courant d'oxydation ou de réduction est déterminé par l'amplitude du pic ou de la vague voltamétrique obtenu lors du pilotage d'un signal potentiodynamique. 40- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 3, caractérisé en ce que, avant de procéder au dosage proprement dit , l'électrode indicatrice est soumise à un préconditionnement consistant en un balayage ininterrompu de signaux potentiodynamiques triangulaires entre -0,1 V et +0,4V, à la vitesse de 0,2 V/sec., ledit balayage étartarreté lorsque l'enregistrement du signal-réponse sur un enregistreur (signal i/v) fait apparaitre une courbe-limite. 5"- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les substrats dont la mise en oeuvre est particulièrement préférée, sont les oligopeptides qui libèrent, après la réaction enzymatique, des amines ou des polyamines aromatiques ou hétérocycliques. 60- Procédé selon la Revendication 5, caractérisé en ce que le substrat est activé par substitution d'un groupe acyle et/ou sulfonyle et/ou tosyle et/ou benzoyle. 70- Procédé selon l'une quelconque. des Revendications 5 et 6, caractérisé en ce que le substrat est constitué par le chlorure de benzoyl-D,L arginyl-p-aminodiphénylamide (D,L BAPADA), la réaction enzymatique ayant lieu suivant le schéma suivant ,L-Benzoyl arginine p-aminodiphényl amide, chlorhydrate (D,L-BAPADA) D,L-Benzoyl arginine p-aminodiphenylamine (pADA) produit electroactif 80. Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'on ajoute au milieu réactionnel 2 à 10 e de diméthylsulfoxyde. 9". Composé nouveau nécessaire pour le dosage des protéases et des antiprotéases selon l'une quelconque des Revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il est constitué par le chlorure de benzoyl-D,L arginyl-p-aminodiphénylamide (D,L-BAPADA). 10 . Composé nouveau nécessaire pour le dosage des protéases et des antiprotéases selon l'une quelconque des Revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il est constitué par le H-D-phénylalanyl-L pipécolyl-L valyl-L arginyl p-amino-diphénylamide, 2 HCl (HDL). 110. Utilisation des composés selon les Revendications 9 et 10 en tant que substrats dans les réactions de dosage de protéases et d'antiproteases, et notamment des protéases et des antiprotéases des systèmes de a coagulation et du complément. 12 - Ensemble nécessaire pour effectuer le dosage des protéases et des antiprotéases et notamment des protéases et antiprotéases des systèmes de la coagulation et du complément selon l'une quelconque des Revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il est composé de : - un générateur chimique et/ou un générateur des signaux - un enregistreur ampérométrique - des tubes contenant les substrats.