Brevet FR2455279A1 — publié le 19801121

L'invention concerne des électrodes à base d'enzy mes destinées à la détermination de la concentration de cofacteurs, en particulier d'adénosinetriphosphate (A2P) ou de nicotineamide dinucléotide (phosphate) I NAD (r > ) . On peut déterminer, avec de telles électrodes, en se basant sur la mesure de l'ÂTP ou du (NÂD (r)), l'activité des ATP-ases et des kinases ou déhydrogèna ses, ainsi que la concentration de leurs substrats, par exemple les glycérol, créatinine, lactate, alcool, ainsi que le nombre de germes dans les solutions de fermentation et physiologiques. Ces électrodes conviennent particulièrement pour entre mises en service dans les laboratoires cliniques, la microbiologie, l'in dustrie alimentaire, ainsi que dans la recherche médicale. Une méthode déjà connue pour la détermination de ltAPT repose sur la luminescence, en fonction de lAXP, de la luciférine en présence de luciférase, L'inconvénient de cette méthode réside dans l'importance de la dépense en appareillage (luomètre), ainsi que dans le prix élevé de la luciférine et de la luciférase. Un autre procédé associe les réactions de l'hexokina- se et de la glucose-6-phosphatedéhydrogdnase (G-6-rH), le G-6-P qui apparait dans la première réaction étant oxydé avec forma tion de NADPH. La mesure de la concentration en ATP s'opère par l'intermédiaire de la quantité de NADPH mesurée au spectrophotomètre. L'inconvénient de cette méthode réside dans la nécessité de disposer d'un spectrophotomètre ainsi que dans la consomma tion de NADP dans chaque mesure (Handbook of Enzymatic Methods of Analysais, G. Guilbaut, M. Dekker -Inc., New York 1976). La méthode qui s'est répandue pour la détermination de la concentration en NAD (P) est le test optique. Il repose sur la mesure de l'absorption 1W du produit de la réduction NAD (P)H vers 340 nM. Cette méthode est aussi utilisée pour la mesu re de la concentration du substrat de déhydrogénases dépendants de NAD (P)H. La mesure électrochimique de la concentration de NAD(P) n'est possible que dans une solution exempte d'oxygène, car les étapes de réduction de H2 2 et de 1.NAD(P) se superpo- sent. La désaération entraîne alors la dénaturation de la molé cule de protéine. Les électrodes à base d'enzymes connues ne convien nent pas pour la détermination de ATP ou de NAD(P). Jusqu'ici, on a combiné seulement ces réactions enzymatiques dans des électrodes bi-enzymatiques, dans lesquelles il se forme du glucose à partir des oligo ou polysaccharides. Les deux enzymes se trouvent ici répartis d'une façon homogène dans une couche d'enzymes. L'invention a pour objet de réaliser une électrode à base d'enzymes destinée à mesurer la concentration de cofacteurs, l'activité enzymatique en fonction des cofacteurs, et la concentration de leurs substrats. On doit aussi faire réagir des enzymes peu cofteux et arriver à de faibles durées de mesure. Le problème de l'invention consiste à obtenir, par combinaison d'enzymes dans une électrode enzymatique, un signal qui soit fonction de la concentration d'un cofacteur. A cet effet, l'invention propose une électrode enzymatique où l'on dispose, à coté de gluxoseoxydase (GOD), pour mesurer l'ATP, de l'hexokinase (HK), et pour déterminer le NAD(P) de la glucosedéshydrogènase (GDH) en commun dans une couche, en amont d'une électrode à oxygène courante, et où l'on ajoute à la solution de mesure une quantité définie de glucose. En l'absence dtATP et de NAD(P), il se produit par oxydation du glucose, une consommation d'O2, qui est proportionnelle à la quantité de glucose ajoutée. (Principe de l'électrode au glucose, F. Scheller et al., Z. med. Lab. Diagn. 18, 312 (1977) ).Quand on ajoute de l'A?P ou du NAD (P) à cette solution, une partie du glucose est consommée par HK ou GDH, de sorte qu'il se produit un affaiblissement du signal afférent au glucose, qui est fonction de la quantité de ATP ou de NAD (P) : GOD Glucose + 02 + H20 GOD ? acide gluconique + H202 (réaction d'indicateur) HK Glucose + ATP # G-6-P + ADP GDH Glucose + NAD (P) A acide gluconique + NAD(P)H + H20 L'électrode enzymatique suivant l'invention permet de déterminer la concentration en ATP ou NAD(P) avec des appareils simples (p02-mètre) , aussi bien par une mesure continue que par une mesure ponctuelle. De cette façon, il est aussi pos- sible de déterminer la consommation de ATP ou de NADP. La mesure de l2ATP ne nécessite pas l'addition d'un cofacteur supplémentaire comme dans les procédés connus. La détermination du substrat de kinases ou déshy drogènases peut s'effectuer par l'intermédiaire de la mesure de ltATP ou NAD(P) formé ou consommé dans la solution; les kinases ou déhydrogènases spécifiques pour le substrat en question, et le cofacteur(NAD(P) ou NAD(P)H, ou ATP ou ADP), étant ajoutés à la solution de mesure. Pour déterminer les concentrations en substrat, il y a avantage à munir la couche d'enzyme pour GOD et HE ou GDH, supplémentairement, de la kinase (par exemple glycérol-ou créatinine-kinase) ou déhydrogénase (par exemple lactateou alcool-déhydrogénase) spécifique pour le substrat dont il s'agit. La détermination du cofacteur avec l'électrode enzymatique suivant l'invention, convient particulièrement pour les travaux de routine avec les analyses très fréquentes, en raison de la simplicité de son exécution. L'invention sera mieux comprise en regard de 5 exemples d'exécution du procédé dont la description suit : ER[PIM 1 S On dissout, dans 0,3 ml d'une solution de 5 mg da- crylmmide, 2000 U de GOD, et 300 U de "K, et étale sur une surface de 2 cm2 entre deux lames de verre, puis photopolymérise. On place un morceau de la pellicule de 3 x 3 mm, sur la feuille de polyéthylène d'une électrode de Clark, immédiatement avant l'électrode indicateur (Pt). On serre sur la couche d'enzyme, un tube à dialyse au moyen d'une bague torique, sur l'enveloppe de l'électrode. On plonge l'électrode enzymatique ainsi préparée dans la solution de mesure maintenue sous agitation, constituée de 0,1 N de tampon phosphaté, à pH 6 avec 10 mM MgC12, et la raccorde à un p02-mètre pourvu d'un enregistreur. Après que la tension de base se soit établie, on ajoute une certaine quantité de glucose, de façon que la concentration dans la solution de mesure se monte à 0,5 mM. Deux minutes après, le courant atteint sa valeur fixe et on procède 8 fois à l'addition de 0,25 mM d'ATP (établissement de la courbe étalon). I1 se produit chaque fois un affaiblissement du signal du glucose, le passage à une zone constante s'effectuant après la chute rapide constatée après l'addition dATP. La valeur de mesure se traduit par le point d'intersection de l'extrapolation linéaire des deus zones. Pour mesurer l'activité de l'ÀTP-ase, on introduit dans la cellule de mesure, une solution qui contient 0,5 mx de glucose et 2 mM d'ATP. Lorsque la tension a pris une valeur constante, on ajoute l'échantillon d'ATP-ase. I1 se produit, en raison de la réaction de l'enzyme, une remontée de la courbe tension-temps, car la concentration en ATP s'abaisse, On pourra calculer ainsi l'activité de l'AUP-ase d'après la courbe étalon. L'addition dtinhibiteurs de l'ATP-ase, l'ouabaïne par exemple, provoque une diminution de cette remontée. En faisant varier la concentration en inhibiteur, on détermine la concentration nécessaire pour inhiber à 50 l'ÂTP-ase. Cette grandeur est une mesure de l'efficacité cardiaque des médica mentis. 3XEMPIE 2 : On applique une couche d'enzyme photopolymérisée, qui contient seulement de la GOD, comme dans l'exemple 1, sur l'électrode à 02. Ensuite, on pose, sur la couche de GOD, une seconde couche de polyacrylamide de 100 d'épaisseur, qui contient 30 U HK et 20 U glycérokinase par cm2 et fixe, avec un tube à dialyse sur la surface frontale de l'enveloppe de l'électrode. Cette électrode plonge dans 5 ml d'une solution de base tamponnée, qui contient 0,5 mM de glucose, 1 mM d'ÀTP, et 1 mx NgCl2, dans 0,1 M de tampon phosphaté, pH6.Lorsque la tension s'est stabilisée, on ajoute 100 1 de l'échantillon de mesure contenant du glycérol. Dans la réaction enzymatique, il est consommé une quantité d8ATP proportionnelle à la concentration originelle en glycérol, quantité que l'on détermine au moyen de la courbe étalon d'après la modification de la tension. La mesure dure 2 minutes. EXEMPLE 3 t On serre, sur l'enveloppe de lélectrode, un tube à dialyse, sur lequel on fixe, avec un second tube à dialyse, une couche d'enzyme contenant GOD et HK (comme dans l'exemple 1). L'électrode-an Pt est polarisée à + 600 mV par rapport à l'élec- trode de référence, de sorte qu'elle englobe l'oxydation H2020 On raccorde l'électrode à un différenciateur analogique qui indique la montée maximum de la courbe tension-temps. La tension de base s'établit dans 2 ml d'une solution tampon à pH 6, avec 0,5 mM de glucose, 1 mM de MgCl2. Ensuite on opère l'addition de 501,1 du filtrat de la solution de fermentation, traitée avec de l'acide trichloracétique. La vites se de la chute de tension est proportionnelle à la concentra- tion en ÂTP, de sorte que le nombre de germes peut être obtenu d'après la concentration en AXP constatée. Quand les échantillons mesurés contiennent du glucose, on détermine la concentration en glucose, avant de mesurer l1ÂTP au moyen d'une électrode enzymatique ne contenant que de la GOD, et en tient compte au cours de 1' évaluation. EXSXEIE 4 : On dissout, dans 0,3 ml d'une solution de 5 mg d'acrylamide, 200 U de GOD et 50 U de GDR avec 3 U de mutarotase, étale sur une surface de 2 cm2 entre deux lames de verre et photopolymérise. On met en place un morceau de pellicule de 3 x 3 mm sur la feuille de polyéthylène de l'électrode de Clark immédiatement avant l'électrode indicateur (Pt). On serre, sur la couche d'enzymes un tube à dialyse, sur l'enveloppe de 11 électrode, au moyen d'une bague torique. On plonge l'électrode enzymatique ainsi préparée, dans la solution de mesure de 0,1 M de tampon phosphaté, pH 7t6 maintenue sous agitation, et raccorde avec un pO2-mètre muni d d'un enregistreur. Quand la tension de base s'est établie, on ajoute une quantité de glucose telle que la concentration dans la solution de mesure se monte à 0,5 mM. Deux minutes après, la tension a pris une valeur fixe, et on procède, 8 fois, à l'addition de chaque fois 0,25 mM de NAD (établissement de la courbe étalon). Il se produit ici, chaque fois, un affaiblissement du signal du glucose, la chute brusque immédiatement après l'addition de NAD étant suivie d'un retour à une zone constante. La valeur de mesure est donnée par le point d'intersection de l'extrapolation linéaire des deux zones. Pour mesurer l'activité du lactate-déhydrogènase (LDH), on introduit dans la cellule de mesure, une solution qui contient 0,5 mM de glucose et 1 mM NAD, ainsi que 0,1 M de lactate. Lorsque la tension a retrouvé une valeur constante, on ajoute 20 P 1 de la prise de sérum contenant du XDH. En raison de la réaction enzymatique, il se produit une remontée de la courbe tension-temps, car la concentration en NAD diminue. On peut ainsi calculer l'activité LDH d'après la courbe étalon. EXBNPIS 5 s On applique, comme dans l'exemple 1, sur l'électrode à 02, une couche d'enzyme photopolymérisée, qui contient seulement de la GOD. On applique ensuite une seconde couche de polyacrylamide, de 20 d'épaisseur, qui contient 30 U GDH, et 20 U d'alcooldéhydrogènase par cm2, sur la couche de GOD, et fixe sur la surface avant de l'enveloppe de l'électrode, à l'ai- de d'un tube à dialyse. Cette électrode plonge dans 5 mi d'une solution de base adoucie, qui contient 0,5 mM de glucose, i mM de NAD dans 0,1 M de tampon phosphaté à pH 7,6. Lorsque la tension s'est stabilisée, on ajoute 100 l de la prise destinée à la mesure, contenant de léthanol. Il est consommé, par la réaction enzymatique, une quantité de NAD équimoléculaire à la concentration en éthanol, et par suite la tension monte. Cette élévation de la tension donne la concentration en éthanol d'après la courbe étalon qui a été établie dans des conditions identiques. R E V E N D I C A T I O N S 1.- Electrode à base d'enzymes pour la détermination de cofacteurs, en particulier d'ÀTP ou de NAD(P), au moyen d'électrodes indiquant 02 ou H202, caractérisé en ce que l'élec- trode est recouverte d'une couche d'enzymes dans laquelle de la glucoseoxydase et un enzyme réagissant avec le glucose en fonction d'un cofacteur, ainsi qu'éventuellement un autre enzyme réagissant avec un cofacteur sont appliqués d'une façon homogène ou en couches séparées, et est aussi recouverte dun tube à dialyse, la solution de mesure contenant une quantité définie de glucose. 2.- Electrode pour la détermination dtATP suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la couche d'enzymes contient, en plus de la glucoseoxydase, de l'hexokinase. 3.- Electrode suivant la revendication 1 pour la détermination de NAD(P) , caractérisée en ce que la couche d'enzymes contient en plus de la glucoseoxydase, de la glucose déhydrogènase. 4.- Electrode suivant les revendications 1 et 2, pour la détermination de substrats d'enzymes dépendants de 1ATP caractérisée en ce que la couche d'enzymes contient, en plus de glucoseoxydase et d'hexokinase, de la glycéroikinase ou de la créatininkinase. 5.- Electrode suivant les revendications 1 et 3, pour la détermination de substrats d'enzymes dépendants du NAD(P) caractérisée en ce que la couche d'enzymes contient, en plus de glucoseoxydase et de glucosedéhydrogènase, de la lactatedéhydrogènase ou de l'alcooldéhydrogènase.