Brevet FR2440402A1 — publié le 19800530

La présente invention concerne un procédé d'immobilisation de micro-organismes sur des supports insolubles en vue notamment de la désinfection des fluides ou de l'utilisation des capacités métaboliques des cellules. De nombreuses recherches ont été entreprises dans le domaine de la fixation de cellules bactériennes et les techniques utilisées répondent à trois méthodes générales - les cellules peuvent être immobilisées par liaison ionique sur des échangeurs d'ions insolubles, mais cette immobilisation présente en général un caractère reversible. - les cellules peuvent être immobilisées par liaison covalente en utilisant des réactifs bifonctionnels tels que le gluta raldéhyde ou le toluène diisocyanate - les cellules peuvent être immobilisées par encagement dans une matrice de polymère dans laquelle elles sont physique ment retenues. Ces polymères peuvent être du polyacrylamide, du collagène, du triacétate de cellulose, de l'agar-agar, des alginates ou du polystyrène. De nombreuses préparations correspondant à l'une ou l'autre de ces techniques ont été essayées en vue de l'utilisation des capacités métaboliques des cellules ainsi immobilisées. Parmi les réalisations les plus importantes ayant donné lieu à des applications à l'échelle pilote ou industrielle, on peut citer - la production d'acide aspartique à partir du fumarate d'ammo nium utilisant l'aspartase d'Escherichia Coli. - La production d'acide malique à partir de l'acide fumarique utilisant la fumarase de Brevibacterium Ammoniagenes - la production de citrulline à partir de la L. Arginine uti lisant la L. Arginine deiminase de Pseudomonas putida - la production de l'acide 6-amino-pénicillanique à partir de la pénicilline utilisant la pénicilline amidase d'Escherichia Coli. Tous ces essais ont été effectués à l'aide de bactéries enfermées dans des gels de polyacrylamide. Il a été constaté, dans de nombreux cas, que la stabilité des systèmes enzymatiques des cellules immobilisées était nettement plus importante que celle des cellules libres et pouvait porter sur des périodes de 30 à 180 jours. Dans certains cas, on a pu constater que l'imaobili- sation des cellules de micro-organismes provoquait un accroissement notable de leurs capacités métaboliques. La présente invention concerne la fixation irreversible de micro-organismes à la surface de supports insolubles portant des charges superficielles. En procédant de la sorte, cette fixation est une adsorption conservant aux cellules leurs capacités métaboliques. Un grand nombre de supports peut être mis en oeuvre dans ce procédé tels que les résines échangeuses d'ions plus particulièrement échangeuses d'anions portant en surface des fonctions amine primaire. secondaire ou tertiaire partiellement ou tQtalement salifiées, et ammonium quaternaire, des fonctions phosphine partielle#ent ou totalement salifiées ou de sels de phosphonium ou de sulfonium. Le procédé selon la présente invention comprend les stades opératoires suivants a) le support portant l'une des fonctions citées pré cédemment est tout d'abord lavé abondamment avec de 1'eau dis tillée ou une solution tampon à un pH déterminé, afin d'obtenir l'élimination d'éventuels produits solubles présents dans la préparation. b) les micro-organismes en suspension sont mis en contact avec une quantité de support lavé, dans des conditions telles que ce dernier puisse être saturé. La fixation peut s'effectuer dans une large gamme de température, compatible toutefois avec la résistance des micro-organismes. Le mélange support-micro-organismes est laissé en agitation de quelques minutes à quelques heures. Une autre possibilité est de placer le support lavé dans une colonne qui sera percolée par la sus pension de micro-organismes. Dans les deux cas, le support chargé de cellules est lavé plusieurs fois par mise en suspension à plusieurs reprises dans de l'eau distillée ou une solution tampon afin d'éliminer les micro-organismes excédentaires ou pouvant être retenus entre les grains. Suivant une variante particulièrement intéressante pour utiliser les capacités métaboliques des micro-organismes, on procède de la façon suivante 1) les micro-organismes qui doivent être immobilisés sont cultivés dans un milieu synthétique ou complexe et recueillis en phase exponentielle de croissance ou après la fin de la croissance. Les cellules sont recueillies par filtration ou centrifugation et, de préférence, lavées deux fois avec de l'eau distillée ou une solution tampon. La valeur de pH du tampon utilisé peut varier avec le type de support mis en oeuvre et doit se situer dans la gamme permettant d'obtenir la meilleure efficacité d'adsorption. 2) On procède ensuite comme décrit sous (b) dans la variante précédente et enfin 3) lorsque le support chargé de cellules a été lavé, il peut être conservé dans l'eau distillée ou dans une solution tampon, de préférence à une température comprise entre 20C et lO0C. Les essais réalisés dans le cadre de la présente invention permettent de citer quelques exemples. EXEMPLE 1 Utilisation du support résine DEAE Sephadex A 25 utilisé sous la dénomination Rol. Ce support possède la formule générale suivante La fixation est réalisée dans les conditions suivantes: 40 g de résine sèche sont mouillés puis mis en suspension dans 200 ml d'eau distillée. Le pH est ajusté au voisinage de 9,7 et la suspension est agitée pendant 2 heures à 20 C. Après filtration, la résine est reprise et traitée 20 fois dans les mêmes conditions. Pour l'utilisation de la souche d'Escherichia Coli, les micro-organismes sont cultivés sur milieu minéral contenant le glucose comme source de carbone. Les cellules sont récoltées par centrifugation après la fin de la croissance et lavées 2 fois avec de l'eau distillée. Puis on réalise le mélange suivant - quantité de résine Rol lavée : 50 mg - volume de tampon borate pH 9 : 26 ml - concentration bactérienne : 8,2.106gers/ml - temps de contact : 120 min. Dans ces conditions, la résine Rol a une capacité d'adsorption de 5.1010 germes/g de résine sèche. Des essais de même type ont été réalisés en utilisant d'autres germes-test tels que - Pseudomonas aeruginosa IP A 22 - Streptococcus faecalis ATTC 10541 - Salmonella Typhimurium I.R.C.H.A. 26 - Salmonella Bredeney - Salmonella Choleraesuis Ces différents micro-organismes activés dans des milieux convenables et récupérés en fin de croissance ont été mis en contact avec la résine Rol dans des conditions similaires à celles utilisées pour la souche d'Escherichia Coli. Dans tous les cas, la capacité d'adsorption de la résine est de l'ordre de 1.101 germes/g de résine sèche. Parallèlement à ces résultats, des essais ont montré que les cellules bactériennes adsorbées sur ce support conservent leurs capacités métaboliques. Pour cela, un échantillon de résine ayant fixé des micro-organismes a été lavé 10 fois, remis en suspensions dans l'eau distillée,puis une partie aliquote a été utilisée pour montrer qu'il n'existait plus de cellules libres entre les grains. Cette résine a été mise dans un milieu contenant du glucose radioactif et l'on a pu mesurer la vitesse de dégradation du glucose ainsi que celle de la production de C02 marquée au 14C . Les résultats obtenus permettent de montrer que les germes adsorbés à la surface de la résine ont conservé leur pouvoir de métabolisation ainsi que leur pouvoir de prolifération, la croissance des bactéries s'effectuant même en dehors des grains de résine. EXEMPLE 2 Utilisation du support:résine Spherosil DEA utilisée sous la référence R05. Ce support possède la formule générale suivante Les essais de cette résine ont été faits dans des conditions semblables à celles de la résine R01 mais en tampon phosphate pH 7. La capacité d'adsorption de ce support vis-àvis de la souche d'Escherichia Coli se situe aux environs de 109 germes/g de résine sèche. Contrairement à la résine R01 dont la capacité d'adsorption varie peu pour des pH compris entre 6,5 et 9,5, la capacité d'adsorption de la résine R05 présente un optimum marqué entre pH 6,5 et 7,5. De la même façon, cette résine montre une capacité d'adsorption de l'ordre de 10 germes/g de résine sèche pour d'autres souches telles que Pseudomonas Aeruginosa et Streptococcus faecalis. EXEMPLE 3 Utilisation du support : résine Amberlite IRA 401. Cette résine possède la formule générale suivante Les essais réalisés avec E. coli comme germe-test montrent que l'adsorption passe par un optimum pour un pH de suspension compris entre 7,25 et 9. La capacité de cette résine vis-è-vis d'E. coli est d'environ 108 germes/g de résine sèche. EXEMPLE 4 Utilisation du support : résine Duolite A366 référencée R07. Il s'agit d'une résine possédant un squelette polyacrylique macroporeux et portant des groupements fonctionnels amine seconcaire. Cette résine présente un optimum d'adsorption aux environs de pH 8,5 et montre une capacité pour E. Coli de 108 germes/g de résine sèche. L'adsorption des cellules bactériennes sur les différentes résines présente un caractère pratiquement irréversible. Les suspensions de résine laissées en agitation dans de l'eau distillée ou une solution tampon ne laissent apparaître aucune cellule libre même après un temps de 24 heures ou 48 heures. L'utilisation de conditions plus dures pour effectuer la désorption, fait apparaître une grande stabilité de la liaison entre la cellule bactérienne et la résine. Les essais de désorption ont été réalisés dans différentes conditions, en tampon pH 4, dans une solution de NaCl 0,25M, en HC1 N/10, en NaOH N/10, dans une solution de NaCl 0,25M ajustée à pH 1, dans une solution de Tween 80 à 3 % ou à l'aide d'ultrasons. En aucun cas le pourcentage de bactéries désorbées n'a été supérieur à 8 % des cellules adsorbées. Des différents essais présentés, on peut conclure - que les cellules bactériennes peuvent être adsorbées sur une grande variété de supports possédant une charge nette posi tive - que des cellules bactériennes de souches très différentes peuvent être adsorbées - que les cellules adsorbées conservent leurs capacités méta boliques - que l'adsorption observée est pratiquement irréversible. De ce fait, la présente invention peut avoir des applications dans différents domaines parmi lesquels on peut essentiellement citer - la désinfection des eaux et des fluides contaminés par diffé rentes espèces bactériennes - l'immobilisation des micro-organiemes pour l'utilisation des capacités métaboliques des cellules 1) Désinfection. A l'heure actuelle, la désinfection des eaux peut être accomplie soit par des moyens physiques tels que la microfiltration et les radiations ultraviolets, X ou qr soit à l'aide de désinfectants oxydants classiques comme le chlore et ses dérivés, l'ozone ou les permanganates. Les premières méthodes ont le désavantage d'être de fortes consommatrices d'énergie et sont en outre d'une mise en oeuvre souvent délicate. L'emploi de désinfectants oxydants présente deux inconvénients majeurs : - d'une part, une partie importante du désinfectant est consommée pour oxyder les matières réductrices présentes dans l'eau et l'efficacité de l'action antimicrobienne est conditionnée par la présence d'un certain excès de désinfectant - d'autre part, l'eau traitée contient à la fois un excès de désinfectant et des produits d'oxydation des matières orga niques dont on connaît mal la biodégradation et la toxicité. L'utilisation d'un désinfectant insoluble, tel que les résines décrites dans la présente invention ou des supports insolubles présentant les mêmes propriétés, peut permettre de réduire la population microbienne des eaux ou de différentes solutions sans altérer la composition des matières dissoutes. L'emploi d'un tel produit permettrait en outre la suppression du problème de dosage du désinfectant. Dans les circuits industriels, l'emploi d'un produit insoluble permettrait de réaliser la désinfection tout en évitant la présence de traces de désinfectants dans l'eau, souvent indésirables du fait de leur interférence avec le processus de fabrication ou de la corrosion qu'ils engendrent. Un exemple de désinfection par un support insoluble peut être fourni de la manière suivante Vérification du caractère insoluble de l'agent désinfectant. Pour cela on a enfermé 3 g de résine R01 lavé, amenés à pH 9,75, dans un sac à dialyse ayant une limite d'exclusion de 10 000, lui-même placé dans 100 ml d'une suspension d'Escherichia Coli à 106 germes/ml au même pH. Après 7 heures de contact, la numération des germes viables permet de montrer qu'il n'y a aucune activité désinfectante soluble, cependant qu'une préparation témoin mettant directement en contact la résine lavée et les germes montre une élimination de 99,998% des cellules bactériennes présentes au début de l'opération. Désinfection. Des essais réalisés avec la résine R01 ont permis de préciser son pouvoir désinfectant. L'étude a été menée dans les conditions suivantes 3 g de résine lavée mis en suspension dans 100 ml d'eau distillée à pH 8,5 ont été mis en contact avec différentes souches bactériennes à différentes concentrations. Le mélange a été agité à 200C pendant 120 minutes et on a effectué des numérations sur les surnageants après filtration. Les résultats obtenus sont les suivants germes au To Pourcentage en 106/mol d'élimination après 120 min. Escherichia Coli 2,3 99,999 X Pseudomonas aeruginosa 2,8 99,90 Streptococcus faecalis 0,66 99,90 Salmonella choleraesuis 5,1 99,98 Salmonella Typhimurium 3,5 99,90 Un essai en colonne avec la résine R01 a été réalisé dans les conditions suivantes - diamètre intérieur de la colonne 1,5 cm - hauteur de la colonne 30 cm - Quantité de résine sèche 1 g - hauteur du lit de résine 7 cm - débit 32 ml/h - alimentation suspension de bactéries marquées au 14C contenant germes/ml. Le pH de la suspension de résine et de la suspension de germes était de 9. Le temps de rétention dans la colonne était de 13 min. Dans ces conditions, la capacité d'adsorption d'Escherichia oli sur la résine s'établit à 5.1O10 germes/g de résine sèche. L'influence de divers paramètres sur la capacité d'adsorption de la résine RO1 a été étudiée - température : aucune modification pour des températures de 13 C, 220C et 32 C, ce qui permet d'envisager l'utilisation d'une telle résine en toutes saisons - pH : aucune modification- pour des pH compris entre 6,4 et 9,9 - force ionique : capacité de 1,7.1010 germes/g de résine sèche pour une force ionique de 0,085 contre 3,5.1010 germes/g de résine sèche pour une force ionique de 0,04. Une force ionique de 0,085 correspond à une valeur d'environ dix fois supérieures à celle d'une eau de boisson considérée comme "chargée" en sels minéraux. - dureté : capacité d'adsorption d'environ 2,6.1010 germes/g de résine sèche dans une eau à 100 F de dureté - matières organiques : la présence de matières organiques telles que peptone de fibrine à 160 mg/l ou extrait de viande à 110 mg/l amène la capacité d'adsorption à 1,3.1010 germes/g de résine sèche au lieu de 3,5.1010 en absence de matières organiques. Les essais montrent que les supports utilisés peuvent garder un pouvoir de désinfection très élevé même en présence de différents composés interférants pouvant se trouver dans les eaux ou dans les solutions à désinfecter. 2) Immobilisation en vue de l'utilisation des capacités méta boliques des cellules. On a vu que l'utilisation des cellules immobilisées pouvaient présenter un intérêt aussi bien pour des études de laboratoire que pour des réalisations industrielles. Les résultats présentés ont montré que les bactéries adsorbées sur les résines ont conservé leurs capacités métaboliques. La nature irréversible de l'immobilisation rend ce type de préparation, facile à mettre en oeuvre, particulièrement favorable dans ce domaine. L'adsorption des cellules à la surface des grains de résine permet une bien meilleure accessibilité du substrat par les cellules que dans le cas d'un encagement dans un gel ou un polymère. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre purement explicatif et nullement limitatif et que toute modification utile pourra y être apportée sans sortir de son cadre tel que défini par les revendications ci-après. REVENDICATIONS 1. Procédé d'immobilisation de micro-organismes par mise en contact avec des résines synthétiques, caractérisé en ce que l'on rend cette immobilisation pratiquement irréversible en appliquant un support ou résine insoluble portant des charges superficieilcs#tele qu'une résine échangeuse d'ions. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support est une résine échangeuse d'anion portant, en surface, des fonctions amine primaire, secondaire ou tertiaire partiellement ou totalement salifiées et ammonium quaternaire, des fonctions phosphine partiellement ou totalement salifiées ou de sel de phosphonium ou de sulfonium. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend les stades opératoires suivants - - le support est lavé abondamment à l'eau distillée ou au moyen d'une solution tampon à un pH approprié pour éliminer d'éventuels produits solubles; - les micro-organismes en suspension sont mis en contact avec la quantité appropriée dudit support lavé, de manière que ce dernier puisse être saturé, à une température compatible avec la résistance des micro-organismes. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la misé en contact des micro-organismes en suspension se fait en plaçant le support lavé dans une colonne et en procédant à une percolation de celle-ci au moyen de ladite suspension de micro-organismes. 5. Procédé selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que le support chargé de cellules est lavé plusieurs fois par mise en suspension, à plusieurs reprises dans l'eau ou une solution tampon pour éliminer les micro-organismes excédentaires ou pouvant être retenus entre les grains dudit support. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le support répond à l'une des formules suivantes 7. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, à la désinfection des eaux et des fluides contaminés par différentes espèces bactériennes. 8. Application selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'on met en oeuvre ledit procédé en utilisant directement lesdites eaux ou lesdits fluides pour leur mise en contact avec lesdits supports insolubles. 9. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 à l'immobilisation des micro-organismes pour l'utilisation des capacités métaboliques des cellules. 10. Application selon la revendication 9, caractérisée en ce que les micro-organismes à immobiliser sont préalablement cultivés et recueillis en phase exponentielle de croissance ou après la fin de la croissance, lavés en ajustant le pH en fonction du support mis en oeuvre pour obtenir la meilleure efficacité d'adsorption puis mis en suspension et amenés au contact dudit support.