Brevet FR2446836A1 — publié le 19800814

La présente invention concerne un procédé de préparation de l'antibiotique reumycine qui appartient aux composés du groupe des pyrimidino - as-triazones. la reumycine (méthyl-6 pyrimidino (5,4-e)-as-triazine-(6H,8H)-dione-5,7) est un produit qui présente un grand intérêt car il manifeste une action anticancéreuse. On connaît déjà un procédé de préparation de reumycine (synonyme : déméthyî-1 xanthothricine) par synthèse chimique avec mise en oeuvre, comme composé de départ, du méthyl-3 chloro-6 uracile, procédé qui consiste à nitrer ce dernier en C5 et à remplacer ensuite le chlore par un groupement hydrazine avec formation de méthyl-3 nitro-5 hydrazino-6 uracile. On soumet les composés ainsi obtenus à une formylation et on les réduit jusqu'à la formation de méthyl-6 hexahydro-1,2,4,5,6,7 pyrimidino /~5,4-e 7 -astriazinone -5,7. Par agitation de la solution aqueuse de ce composé pendant 4 jours on obtient de la reumycine avec un rendement de 16 % (j. Org. chem., 31, 900, 1966).Toutefois, ce procédé est compliqué car il se compose de 5 à 6 étapes et ne permet pas dsob- tenir la reumycine avec un rendement supérieur à 16 %. Un autre procédé connu de préparation de reumycine consiste à déméthyler la xanthothricine (synonyme : toxoflavine) par le diméthylformamide avec un rendement en reumycine de 85 % (J.Amer. Chem. Soc., 95, 3735, 1973). Toutefois on obtient de cette manière un produit de qualité inférieure dont témoigne son point de fusion qui est de 21000 alors que cette caractéristique tirée de la littérature pour la reumycine donne F = 244 à 24job (J, Antibiotics, 26, 537-538, 1973). Pour cette raison, le rendement réel en reumycine obtenu par le procédé précité est sensiblement plus bas que celui qui a été indiqué. Le but de la présente invention consiste à créer un procédé simple et commode permettant de préparer la reumycine avec un rendement pratiquement quantitatif. Les recherches effectuées par les présents inventeurs ont permis d'aboutir à un nouveau procédé de préparation de reumycine par désalcoylation de dérivés de pyrimido-triazine en les faisant réagir sur des amines et en traitant ensuite le mélange réactionnel par un acide. le procédé suivant l'invention peut être représenté par le schéma suivant Dans la formule (I) précitée R représente un groupement alcoyle inférieur. Les dérivés de pyrimido-triazine (I), utilisés dans la réaction, comprennent des composés connus (notamment la xanthothricine où R représente un groupe méthyle) ainsi que des composés nouveaux qui peuvent être obtenus par un procédé analogue au procédé décrit notamment dans Journal of American Chemical Society, 83, 3904-3905, 1961. La xanthothricine utilisée dans la présente invention peut être obtenue par culture de micro-organismes (notamment de Streptomyces brunneus Subspecies xanthothricine et Pseudomonas cocovenanus) sur des milieux nutritifs. Des liqueurs de culture qui contiennent la xanthothricine ou de la xanthothricine non purifiée peuvent également être utilisées à titre de matières premières. Il est préférable d'utiliser à titre d'amines suivant la présente invention des amines primaires et secondaires. Les amines primaires et secondaires comprennent des amines aliphatiques telles que les mono-(ou di-) alcoylamines (l'alcoyle étant un radical méthyle, éthyle, propyle, butyle,etc..), des alcénylamines (notamment l'allylamine), desaralcovlamines (la benzylamine, la dibenzylamine), des amines cycliques (la pipéridine, la pipérazine, la pyrrolidine, la morpholine, etc..). Comme amines on peut utiliser également des résines échangeuses d'anions faiblement basiques contenant des groupes amine primaires et secondaires, notamment l'Âmberlite IR-45(0H-) (marque de fabrique de Rohm and Haas Co), l'Anionite AH-22 (OH-) (marque de fabrique du Ministère de l'industrie chimique, URSS), qui est une anionite faiblement basique polymère ayant une matrice polystyrénique et contenant des groupes amine primaires et secondaires. Il est préférable d'utiliser des amines ayant un de 2 à 6. Ainsi les amines qui peuvent être utilisées suivant la présente invention ne se limitent pas uniquement à celles qui viennent d'être citées, mais comprennent toutes les amines dont le pKb est compris entre 2 et 6. On effectue généralement la réaction suivant la présente invention au sein de solvants. les solvants utilisés comprennent des alcools (le méthanol, ltéthanol, le propanol, etc..), des cétones (l'acétone, la méthyléthyl cétone, etc.), l'eau ainsi que leurs mélanges. La désalcoylation s'effectue à des valeurs de pH correspondant à des milieux basiques (de préférence un pH de 8 à 12), notamment en présence de bases (hydroxydes de métaux alcalins ou d'ammonium). Etant donné que les amines utilisées comme réactifs sont également des bases, l'addition au mélange réactionnel des bases énumérées ci-dessus n'est pas obligatoire. La température à laquelle on effectue de préférence la réaction est approximativement de 1000 à 300C. Généralement on effectue la réaction à la température ambiante. la réaction de la xanthothricine sur les amines aboutit à la formation de sels quaternaires ammoniacaux d'amines avec la reumycine ayant la structure suivante R' et R" étant des substituants des amines énumérées précédemment et entrées en réaction. Ces composés n'étaient pas connus auparavant et sont des corps intermédiaires nouveaux. Pour obtenir la reumycine on traite le mélange réactionnel formé par un acide soit organique (par exemple l'acide formique, l'acide acétique, etc.), soit'minéral (par exemple l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, etc.). Avant d'effectuer le traitement par l'acide il est recommandé de concentrer le mélange réactionnel et, à cet effet, on en élimine au préalable le solvant sous pression réduite. On purifie la reumycine (II) obtenue en utilisant des méthodes courantes, par exemple la cristallisation. Telle qu'obtenue par le procédé de la présente invention, la reumycine (méthyl-6 pyrimidino (5,4-e) as-triazine (6H,8H) -dione 5,7) se présente sous la forme de cristaux jaunes, F. = 242 à 2430C (dans l'éthanol) ; Rf 0,50 (chromatographie en couches minces sur gel de silice dans un système acétate d'éthyle benzène 3/2j ; spectre W (éthanol) : ,\maux (lg r ) 235 (4,25), épaulement 265 (3,49), 340 (3,72), 400 nm (2,87). Spectre IR (KBr) : 4 3400, 3170, 3110, 3080, 3020, 2995, 2950, 2900, 2870, 2815, 1738, 1700, 1670, 1685, 1630, 1590, 1480, 1445, 1429, 1380, 1342, 1295, 1270, 1258, 1213, 1180, 1130, 1070, 1065, 970, 943, 930, 840, 830, 770, 750, 730, 716, 700, 690, 580, 560, 470 cm 1 ; spectre de RMN (des protons) (pyridine D5, référence tétraméthylsilane) déplacements XS 3,39 (3H, singulet), 9,84 (1H, singulet), 10,94 (1H, singulet élargi) ppm. Solubilité (pour 100 cm3 de solvant) : eau 2,04 g sérum physiologique 2,00 g ; éthanol 0,55 g. Analyse : trouvé, % : C 40,9 ; H 2,7 ; N 39,1. Calculé % pour C6H5N502(179,14) : a 40,2 ; H 2,8 N 39,1. A l'encontre des autres antibiotiques du groupe des pyrimidino- g 5,4-e 7 as-triazines la reumycine obtenue par le procédé suivant la présente invention présente une toxicité sensiblement plus basse ce qui permet de créer au sein de l'organisme des concentrations qui exercent un effet anticancéreux marqué sans manifestations de toxicité du composé en question. Dans les tests de l'activité biologique de la reumycine obtenue par le procédé de l'invention on a établi des effets marqués sur les tumeurs de la Souris sous la forme solide : carcinome 755, mélanome de Harding-Passy et sous la forme ascitique : lymphadénie de Fischer, carcinome d'Ehrlich. Les données sur l'activité anticancéreuse sont réunies dans le tableau 1. Tableau 1 Activité anticancéreuse de la reumycine : : Inhibition de croissance d'une : cumeur, % Dose :Méthode d'ad-:Régime d'ad- :carcinome:lympha-:carci-:méla mg/kg :ministration ministration d'Ehr- : dénie . nome nomede lich ' :ministratlon :- lich : de ' 755 Hardis : : : :Fischer: :Passy -2,5 à voie intra- 1 e 9 47 à57,0 55,0 47a 51 45,0 3,5 veineuse -1,5 à intrapéri- 1 > 9 41,0 65 à 66 58à61 54,0 à 2,5 tonéale 56,0 -50 à per os 1 3 9 30,0 45,0 47à 51 55 à.60 75,0 L'activité de la reumycine se manifeste dans le cas d'une administration de celle-ci à-plusieurs reprises pendant 9 jours à des doses (en mg/kg) de 2,5 à 3,5 par voie intraveineuse, de 1,5 à 2,5 par voie intrapéritonéale, et de 50 à 75 per os. le taux d'inhibition de croissance du carcinome 755 et du mélanome de Harding-Passy lors de l'administration de l'antibiotique par voie intrapéritonéale, par voie intraveineuse et per os a oscillé entre 45 et 61 fo. Dans les conditions du test médical on a établi l'activité anticancéreuse pour toutes les voies d'administration intraveineuse, intrapéritonéale et per os. La reumycine n'exerce pas d'effets négatifs sur la croissance et le développement de jeunes animaux. Dans le cas d'une injection sous-cutanée de reumycine au Cobaye, trois semaines apyres la sensibilisation on n'a pas détecté de réaction allergique lors d'une administration subséquente simple de cette substance. La reumycine obtenue par le procédé de l'invention peut être utilisée comme spécialité anticancéreuse sous des présentations médicinales traditionnelles en associant la reumycine à des excipients variés pharmaceutiquement acceptables. les différentes présentations médicales comprennent un produit administrable per os (capsules, granules, poudres, comprimés, pilules, etc.), un produit administrable par voie rectale, et un produit pour injections. Les excipients servant à préparer les différentes présentations pharmaceutiques peuvent être choisis parmi les suivants 5 n9s amidon cellulose, méthylcellulose, carboxymé thylcellulose, talc, citrate de sodium, carbonate de calcium, stéarate de magnésium, eau distillée, etc. Les doses du produit peuvent varier comme suit d'après le mode d'administration et les autres facteurs : pour une présentation administrable per os de 100 à 150 pour, pour les présentations administrables par les voies intraveineuse et intramusculaire de 20 à 40 mg/jour, et pour les présentations administrables par voie sous-cutanée de 40 à 60 mg par jour. le procédé de l'invention sera mieux compris à la lecture de la description des exemples de mise en oeuvre qui vont suivre Exemple 1 On dissout 500 milligrammes (2,59 millimoles) de xanthothricine dans 30 cm3 d'une solution aqueuse à 70 % de diéthylamine. 30 à 40 minutes après, on réduit le volume de la solution par évaporation sous vide, on acidifie le résidu à l'acide acétique dilué, on réduit à nouveau son- volume par évaporation et on purifie la reumycine par cristallisation dans un solvant, notamment dans ltéthanol. le rendement est de 451 milligrammes (97 % du rendement théorique). F = 242 à 2430C, spectre UV (éthanol) q max (log & ) 235 (4,25), épaulement 265 (3,49), 340 (3,72), 400 nm (2,87). Exemple 2 On traite 500 milligrammes (2,59 millimoles) de xanthothricine dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 1 par une solution aqueuse à 1,70 % de monoéthylamine. le rendement en reumycine est de 394 milligrammes (85 %), F = 242 à 2430C. Exemple 3 On ajoute à une solution de 260 milligramms (1,35 millirres) de xanthothricine dans 150 cm3 d'eau à pH = 8 à 9, par portions, de l'Amberlite IR-45 (OB) jusqu'à la disparition de la coloration jaune (au total 350 cm3). On lave l'anionite à l'eau distillée (250 cm3) et on élue la reumycine de la résine avec un acide dilué, notamment avec de l'acide acétique. On évapore partiellement les produits d'élution et on purifie la reumycine par cristallisation, notamment dans ltéthanol. Rendement 229 milligrammes (95 %), F = 242 à 2430C. Exemple 4 On ajoute à une solution de 193 milligrammes (1 millimole) de xanthothricine dans 60 cm3 d'eau à pH = 8,8, par portions, de I'Anionite AH-22 (OH -) jusqu'à la disparition de la coloration jaune (au total 500 cm3). On effectue le traitement subséquent comme dans l'exemple 3. le rendement est de 152 milligrammes (85, F = 242 à 2430C. Exemple 5 On fait passer une solution aqueuse de xanthothricine (300 milligrammes par 100 cm3) à travers une colonne (3 x 75 cm) remplie d'Amberlite IR-45 (OH ), on lave l'Anionite à l'eau (1,5 litre) et on élue la reumycine par de l'acide acétique à 5 % (2,5 litres). On réduit par évaporation partielle sous vide le volume des fractions contenant la reumycine et on cristallise le résidu dans l'alcool éthylique. Le rendement en reumycine est de 250 milligrammes (90 ), F = 242 à 2430(3, Rf = 0,50 (gel de silice, acétate d'éthyle/benzène 3/2). Exemple 6 On fait passer une solution aqueuse de xanthothricine (340 milligrammes par 100 cm3) à travers une colonne (4 x 65 cm) remplie dtAnionite AH-22 (OH ). On effectue le traitement subséquent dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 5. le rendement en reumycine est de 268 mg (85 ), F = 242 à 2430C, Rf = 0,50 (gel de silice ; acétate d'éthyle/benzène 3/2). Exemple 7 L'exemple qui va suivre illustre la préparation de reumycine par interaction de la xanthothricine avec d'autres amines. On ajoute à une solution de 193 milligrammes (1 millimole) de xanthothricine dans 15 cm3 d'eau 3 à 4 millimoles d'amine, on agite la solution à la température ambiante suivant l'amine mise en réaction pendant 30 à 190 minutes. En surveillant la formation de la reumycine par spectrophotométrie on détermine le temps au bout duquel le rendement en reumycine atteint le maximum. Ensuite on réduit le volume du mélange réactionnel par évaporation, on acidifie le résidu à l'acide acétique, on réduit à nouveau le volume par évaporation et on cristallise le produit dans l'alcool. Les amines utilisées et les rendements en produit sont indiqués dans le tableau 2. Tableau 2 Temps de Rendement Amine utilisée réaction, en reumycine minutes 1. Méthylamine 30 89,5 2. Allylamine 75 73,2 3. Benzylamine 90 85 4. Diméthylamine 40 98 5. Diéthylamine 40 97,1 6. Dibutylamine 170 97,5 7. Dibenzylamine 190 75,0 8. Pipéridine go 77,6 9. Pipérazine 120 84 10. Pyrrolidine 75 93 11. Morpholine 120 79,5 Exemple 8 On dissout 410 milligrammes (2,1 millimoles) de xantho thricine dans 100 cm3 d'acétone et on ajoute 3,5 cm3 (21 millimole) de dibutylamine. Au bout de 2,5 heures on acidifie le mélange réactionnel jusqu'à pH 3 à 4 avec de l'acide chlorhydrique décinormal, on réduit son volume par évaporation et on recristallise le résidu dans l'éthanol.Le rendement en reumycine est de 332 milligrammes (87 % du rendement théorique), F = 242 à 243 C. Exemple 9 On dissout 200 milligrammes (1 millimole) de xanthothricine dans 250 cm3 d'éthanol absolu et on ajoute 1,75 cm3 (10,5 millimoles) de dibutylamine. On poursuit le traitement comme dans l'exemple 8. On obtient 164 milligrammes de reumycine (88 % du rendement théorique), F = 242 à 243 C. Exemple 10 On dissout 285 milligrammes (1,5 millimole) de xanthothricine dans 50 cm3 d'un mélange éthanol/eau pris dans un rapport de 1/1 et on ajoute 10 milligrammes (12 millimoles) de pipérazine. Au bout de 1,5 heure on acidifie le mélange réactionnel jusqu'à pH 3-4 avec de l'acide chlorhydrique décinormal, on réduit le volume par évaporation et on recristallise le résidu dans ltéthanol. Le rendement en reumycine est de 225 milligrammes (85 % du rende ment théorique), F = 242 à 243 C. Exemple il On sépare le mycelium de 6 litres de liqueur de culture de Streptomyces brunneus Subsp. xanthothricini, on acidifie la liqueur native ayant une activité de 90 microgrammes/cm3 avec de l'acide sulfurique jusqu'à pH 5,8à 6,0 et on extrait au chloroforme. On sèche l'extrait au sulfate de sodium anhydre et on réduit son volume par évaporation à 400(3. On dissout le résidu dans 50 cm3 d'eau distillée alcalinisée jusqu'à pH 8,0 à 10,5, on ajoute de l'Anionite AH-22 (OH jusqu'à décoloration. On sépare l'anionite, on la lave à l'eau distillée et on élue la reumycine à l'acide acétique à 5 %. Après réduction du volume de l'éluat et cristallisation on obtient 410 milligrammes de reumycine (76 % du rendement théorique), F = 242 à 243 C. REVNDICATIONS 1.- Procédé de préparation de reumycine de formule par désalcoylation de dérivés de pyrimido-triazine de formule dans laquelle R est un groupe alcoyle inférieur, caractérisé en ce qu'on effectue la désalcoylation par des amines, et on sépare le produit final par des procédés connus. 2.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue la désalcoylation par des amines primaires. 3.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue la désalcoylation par des amines secondaires. 4.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue la désalcoylation par des échangeurs d'anions faiblement basiques contenant des groupes amine.