Brevet FR2459226A1 — publié le 19810109

La présente invention concerne des réactifs intéressants dans la détermination quantitative d'enzymes protéolytiques. Plus particulièrement, l'invention concerne des dérivés de peptides qui sont des substrats pour les enzymes de la classe E.C.3.4.4. Ces enzymes coupent les liaisons amide dans les chaînes peptidiques du côté du carboxyle des résidus arginine et lysine. Les substrats classiques pour la thrombine, la trypsine et les enzymes apparentées comportent des amides, tels que N -benzoyl-DL-arginyl-pnitroanilide, L-lysyl-p-nitroanilide, Na-benzoyl-DL-arginyl-2naphtylamide et d'autres di- et tripeptides et peptides d'ordre supérieur contenant de l'arginine et de la lysine et comportant des groupes amide chromogènes éliminables; voir B.F. Erlanger et col., dans Arch. Biochem. Biophys. 95,(1961), page 271; A. Riedel et E. Wunsch, Z. Physiol. Chem. 316 (1961, page 1959; R.E. Plapinger et col., dans J. Org. Chem. 30 (1965) , page 1781. L'avantage de prolonger le groupe amino terminal des substrats d'arginyl ou lysyl-p-nitroanilide conduit à un comportement amélioré; voir Svendsen et col., Thrombosis Res. 1 (1972), pages 267-278 et brevet des Etats-Unis d'Amérique n" 3.884.896. En particulier, le brevet des Etats-Unis d'Amérique n0 4.070.245 décrit des composés de structure générale: Al-glycyl-prolyl-A2-NH-A3 dans laquelle A1 représente l'hydrogène ou un groupement bloquant acyle ou sulfonyle, A2 représente un groupe arginyle ou lysyle et A3 représente un groupe hydrocarbure aromatique qui peut porter des substituants. Plus particulièrement, le brevet ci-dessus décrit la structure: glycyl-prolylarginyl-p-nitroanilide (en abrégé: gly-pro-arg-pNA) Le composé de l'art antérieur est un tripeptide ayant un groupe glycyle N-terminal et il a une vitesse de transformation pour la détermination de la combine supérieure à ceux des composés de l'invention. Cette vitesse de transformation élevée pour le gly-pro-arg-pNA a pour résultat que le composé ne convient pas pour la détermination de la thrombine dans un système automatisé effec- tuant plusieurs déterminations pendant une longue durée. La demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique Serial n 970.767 du 18 décembre 1978 décrit un composé homologue, tel que le sarcosyl-prolyl-arginyl-p-nitroanilide. Les composés de l'invention, illustrés de manière caractéristique par les structures suivantes: 3-alanyl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitroanilide (en abrégé: 9-ala-pro-arg-pNA) et y-aminobutyryl-L-prolyl-L-arginyl-pnitroanilide (en abrégé: abu-pro-arg-pNA) sont des tripeptides portant,de préférence,un groupe P-alanyle ou y-aminobutyryle N-terminal ou leurs dérivés. Les composés de l'invention ont des vitesses de transformation appropriées inattendues comme substrats pour la détermination de la thrombine et peuvent être utilisés pour effectuer plusieurs déterminations individuelles sur une longue durée, en particulier dans un système automatisé. Un certain nombre de systèmes automatisés ont été mis au point pour détermtner la concentration d'une substance parti- culière, telle que la thrombine, dans un échantillon chimique, tel que le sang. Par exemple, le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3.748.044 décrit un système de détermination multiple. Dans ce système, on effectue des déterminations de thrombine en des durées de 10 min ou plus. Les substrats de l'invention présentent une réaction linéaire de l'enzyme pendant toute cette durée et permettent l'enregistrement et l'évaluation convenables de toutes les détermi- nations. Les substrats de la technique antérieure qui ont des vitesses de transformation élevées et ne présentent pas ce caractère lindaire posent un problème,car ils sont trop fortement réactifs vis-à-vis de la thrombine. Comme il est bien connu dans les techniques chimiques, il est essentiel,pour obtenir des renseignements fiables,que les déterminations enzymatiques soient effectuées et évaluées dans une durée o la vitesse de réaction est linéaire avec le temps, voir Biochemical Calculations, I. H. Segel, 2e édition, J. Wiley and Sons Pub. (1976). Le problème rencontré dans l'utilisation de substrats ayant des vitesses de transformation élevées peut être résolu en partie en utilisant des concentrations très élevées des substrats ou des teneurs très faibles de plasma dans la réaction. Ce ne sont pas des solutions pratiques du problème, car l'utilisation de con- centrations élevées en substrats serait très coûteuse, la solubilité de ces substrats dans un milieu aqueux et l'inhibition possible du substrat pourraient présenter des difficultés supplémentaires et de faibles teneurs de plasma conduiraient à une activation incomplète des facteurs intervenant dans la production de thrombine. La solution la plus acceptable pour le problème est l'utilisation de substrats b plus faibles vitesses de transformation. Les composés de l'invention satisfont de manière inattendue ce besoin de substrats à plus faibles vitesses de transformation. L'invention concerne des composés de formule R1NH(CH) -CO-N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-R z= 2\1 4 R2 (CH2)n R3 i3 dans laquelle R1 représente l'hydrogène ou un groupe alkyle inférieur en C1-C4, R2 représente un groupe alkylène en C2C4, R3 représente un groupe amino ou guanidino, R4 représente un groupe nitrophényle, méthylnitrophényle, dinitrophényle, naphtyle ou nitronaphtyle, m est égal à 2 ou 3, et n est égal à 3 ou 4, et leurs sels d'addition d'acides acceptables en biologie. Les composés de l'invention sont des réactifs analytiques intéressants pour la détermination d'enzymes protéolytiques, telles que thrombine et trypsine. L'hydrolyse enzyma- tique des composés de l'invention fournit une amine chromogène qui permet de déterminer par spectrophotométrie la concentration en enzymes protéolytiques. L'invention concerne des composés représentés par la formule R1NH(CH2)- CO-N-CH- CO-NH-CH-CO-NH-R4 R2 (,c2)n R3 et leurs sels d'addition d'acides acceptables en biologie. Dans cette formule, R1 représente l'hydrogène ou un groupe alkyle inférieur en C1-C4, tel que méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle et t-butyle; m est égal à 2 ou 3; R2 représente un groupe alkylène en C2C4 appartenant à un résidu d'aminoacide choisi parmi la L-proline (R2 = propylène), l'acide L-pipécolique (R2 = butylène) et l'acide L-azétidine carboxylique (R2 = éthylène); R3 représente le groupe amino ou guanidino appartenant à un résidu d'aminoacide choisi parmi la L-arginine ou la L-ornithine (n = 3) ou la L-lysine ou la L-homo- arginine (n = 4); R4 est choisi parmi les groupes nitrophényle, méthylnitrophényle, dinitrophényle; naphtyle et nitronaphtyle; R4 est de préférence un groupe nitrophényle, mais on peut le remplacer par d'autres substituants chromogènes reconnus dans la technique, voir Plapinger, Nachlas, Seligman et Seligman, dans J. Organic Chemistry, 30, (1965), page 1781, et brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3.884.896. Les composés préférés sont représentés par la formule HN(CH) -CO-N-CH-CONH-CH-CO-NH. No 2 2 m \,23 2 (CH2) R3 dans laquelle R2, R3, m et n sont tels que définis précédemment, et leurs sels d'addition d'acides acceptables en biologie. Les composés les plus appréciés sont représentés par la formule H2N (CH2) m-CO-N-CH-CO-NH-CH- CO-NH NO2 H2C CH (CH) \ 2 223 CH2 HN= C-NH2 dans laquelle m est tel que défini précédemment, et leurs sels d'addition d'acides acceptables en biologie. Les composés de l'invention sont préparés par le schéma suivant: R NH(CH) -COOH 1 2 m t HN-CH-CO0 Bu R2 R1NH(CH2) -C0-N-CH-COO Bu R2 N-hydroxysuccinimide 1 2m \1 R O NH2-CH-CO-NH-R 2 4 (CH2)n ( R1NH(CH2) -CO-N-CH-CO-NH-CH-C0O-NH-R4 R2 (CH2)n R3 dans lequel RI, R2, R et R4, m et n sont tels que définis précé- demment et But représente le groupe tertiobutyle. De manière caractéristique, on fait réagir la carbo- benzoxy-g-alanine par la méthode a l'anhydride mixte avec l'ester de tbutyle de la L-proline pour donner, après traitement avec l'acide trifluoroacétique, la carbobenzoxy-p-alanyl-L-proline. On traite ce dernier produit avec le N-hydroxysuccinimide et le dicyclohexylcarbo- diimide pour donner le N-(carbobenzoxy-5-alanyl-L-prolyloxy)-succini- mide. On fait ensuite réagir ce composé avec le bromhydrate de L-arginyl(méthoxybenzènesulfonyl)-p-nitroanilide pour donner le carbobenzoxy-p-alanyl-L-prolyl-L-arginyl-(méthoxybenzènesulfonyl)- p-nitroanilide dont on élimine les groupenments protecteurs, carbo- benzoxy et méthoxybenzènesulfonyle, par un traitement par l'acide fluorhydrique. On prépare de cette manière les composés représentatifs suivants de l'invention: P-alanyl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitroanilide, 9alanyl-L-pipécolyl-L-arginyl-p-nitroanilide, -alanyl-L-azétidinecarbonylL-arginyl-p-nitroanilide, g-alanyl-L-prolyl-L-lysyl-p-nitroanilide, falanyl-L-pipécolyl-L-lysyl-p-nitroanilide, D-alanyl-L-prolyl-L-ornithyl-pnitroanilide, g-alanyl-L-pipécolyl-L-ornithyl-p-nitroanilide, -alanyl-Lazétidinecarbonyl-L-ornithyl-p-nitroanilide, y-aminobutyryl-L-prolyl-Larginyl-p-nitroanilide, y-aminobutyryl-L-pipécolyl-L-arginyl-pnitroanilide, y-aminobutyryl-L-azétidinecarbonyl-L-arginyl-p-nitroanilide, y-aminobutyryl-L-prolyl-L-lysyl-p-nitroanilide, y-aminobutyryl-Lpipécolyl-L-lysyl-p-nitroanilide, y-aminobutyryl-L-azétidinecarbonyl-Llysyl-p-nitroanilide, y-aminobutyryl-L-prolyl-L-ornithyl-p-nitroanilide, y-aminobutyryl-L-pipécolyl-L-ornithyl-p-nitroanilide, y-aminobutyryl-Lazétidinecarbonyl-L-ornithyl-p-nitroanilide, et leurs sels d'addition d'acides acceptables en biologie. Les sels d'addition d'acides des composés de l'invention sont les sels d'acides acceptables en biologie choisis parmi les acides inorganiques, tels qu'acideschlorhydrique, bromhy- drique, sulfurique et phosphorique et les acides organiques, tels qu'acidesformique, acétique, oxalique, tartrique, méthanesulfonique et benzènesulfonique. L'homme de l'art reconnaîtra l'équivalence des autres acides organiques et inorganiques. Un autre mode opératoire pour préparer les composés Li de l'invention consiste à condenser le L-prolyl-N -nitro-L-arginyl- p-nitroanilide avec le dérivé N-(O-carbobenzoxy-p-alanyl) réactif du Nhydroxy-5-norbornène-2,3-dicarboximide. Le produit de cette condensation est chromatographié sur gel de silice et les fractions résultantes donnent le carbobenzoxy-i-alanyl-L-prolyl-N -nitro-L- arginyl-p-nitroanilide que l'on transforme en P-alanyl-L-prolyl-L- arginyl-p-nitroanilide,2HCl en éliminant les groupements protecteurs carbobenzoxy et nitro par le fluorure d'hydrogène. Dans un mode opératoire caractéristique, on mélange l'enzyme et le substrat dans une solution tampon et l'on suit la réaction par spectrophotométrie. On fait varier la concentration du substrat, tandis que l'on maintient constante la concentration d'enzyme. Comme il est bien connu dans la technique, les variations de la densité optique en fonction du temps donnent une courbe à partir de laquelle on peut déterminer la vitesse de réaction. De manière correspondante, une courbe de LineweaverBurk permet la détermination de Km et Kcat. La vitesse de transformation est représentée par Kcat/Km. Le tableau ci-après donne les informations cinétiques de Michaelis-Menten et illustre l'intérët du g-alanyl-L-prolyl-L- arginyl-p-nitroanilide (ala-pro-arg-pNA) et du y-aminobutyryl-L- prolyl-L-arginyl-p-nitroanilide (abu-pro-arg-pNA) pour la détermi- nation de la thrombine et d'autres enzymes protéolytiques. Le tableau présente également les caractéristiques cinétiques d'un composé de la technique antérieure, le glycyl-prolyl-arginyl-p-nitroanilide (gly-proarg-pNA). Les grandeurs cinétiques ont été obtenues à partir de réactions effectuées dans le TRIS-HC1 0,1 M et le tampon NaCl 0,15 M à pH 7,4. Le mélange de réaction contient de la thrombine 1,5.10 M, de la kallikréine 1.108 M, de la plasmine 6.10-8 M ou de la trypsine 1.10' M et des concentrations variables des substrats gly-pro-arg-pNA, P-ala-pro-arg-pNA, ou abu-pro-arg-pNA en solution dans le tampon. La réaction est analysée au moyen d'un spectrophotomètre Gilford 250 à 405 nm et 37 C. Les constantes de vitesse sont calculées à partir de la vitesse initiale de réaction en fonction des concentrations croissantes en substratset à une concentration constante en enzyme dans des conditions semblables. Cliniquement, les substrats chromogènes sont utilisés pour mesurer l'antithrombine III. L'antithrombine III (AT-III) est le composant principal du système d'anticoagulation. Elle inhibe diverses protéases de la sérine en formant un complexe 1:1 à partir de la sérine, centre actif de ces enzymes. La présence d'héparine augmente d'environ 100 fois la vitesse de réaction de l'AT-III avec ces protéases, ce qui fait de l'ATIII le seul composant du plasma intervenant dans cette réaction rapide d'inhibition. La chimie de l'AT-III est décrite dans les équations suivantes: thrombine + AT-III > (thrombine: AT-III) + thrombine en excès thrombine substrat en excs pepti4e + p-nitroaniline (chromophore jaune- vert) Comme la présence d'héparine potentialise l'activité de l'AT-III, il est possible de délimiter l'inhibition due à l'AT-III, par rapport à celles d'autres protéines du plasma qui peuvent aussi inhiber la thrombine. Ainsi donc, on mesure l'activité totale de l'AT-III commne entité distincte de'l'activité antithrombine progres- sive" qui est mesurée en l'absence d'héparine. Il s'ensuit que l'on peut clairement identifier un défaut du système anticoagulation comme associé à l'AT-III plutôt qu'à d'autres mécanismes d'inhibi- tion des protéines. Cet essai repose sur le fait que l'AT-III humaine dans un échantillon inhibe l'a-thrombine humaine dans un rapport molaire 1:1. La thrombine en excès est libre et peut hydrolyser un substrat chromogène incolore en un composé coloré. Cette coupure du substrat est analogue à la coupure de la liaison arginylglycine dans le fibrinogène qui conduit à la formation de fibrine. Par enregistrement du développement de la couleur du mélange de réaction, on peut suivre le déroulement de la transformation du substrat par la thrombine. Comme la quantité d'AT-III et la quantité de couleur produite sont inversement propor- tionnelles, on peut facilement déterminer la teneur en AT-III. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 N -Méthoxybenzènesulfonyl-L-arginyl-p-nitroanilide,HBr On dissout 23,0 g de N -carbobenzoxy-N( -(4-méthoxy- benzènesulfonyl)-L-arginine dans 100 ml d'hexaméthylphosphorotriamide. On ajoute à la solution résultante 6,7 ml de triéthylamine et 15,8 g d'isocyanate de p-nitrophényle. On agite la solution à la température ambiante pendant une nuit, puis on la verse dans 1300 ml de solution de bicarbonate de sodium à 5%. On recueille le précipité résultant par filtration et on le lave sur filtre séparément deux fois par 400 ml de solution de bicarbonate de sodium à 5%, 1 fois par 300 ml d'eau, 3 fois par 300 ml d'acide chlorhydrique N et ensuite 2 fois par 200 ml d'eau. On sèche le précipité sur le filtre par essorage sous vide à la trompe, et ensuite on l'extrait 3 fois par 300 ml de méthanol bouillant. On réunit les extraits méthanoliques et on évapore le méthanol sous vide à 35 C. On purifie encore le résidu semi-solide par chromatographie sur gel de silice en utilisant le mélange chloroforme-acide acétique-méthanol (94:5:1) comme éluant. On obtient le Na-carbobenzoxy-NW -(4-méthoxybenzènesulfonyl)-L- arginyl-p-nitroanilide. On dissout 6,0 g de ce produit dans l'acide bromhydrique à 30% dans l'acide acétique. On maintient le mélange de réaction résultant à la température ambiante pendant 45 min et ensuite on le verse dans 400 ml d'éther anhydre. On filtre le sel précipité et on le lave 2 fois par 100 ml d'éther anhydre pour obtenir le bromhydrate de NW-méthoxybenzènesulfonyl-L-arginyl-p- nitroanilide. EXEMPLE 2 Carbobenzoxy-p-alanyl-L-prolyl-N 4 -nitro-L-arginyl-p-nitroanilide On dissout 2,1 g de trifluoroacétate de L-prolyl-N nitro-L-arginyl-p-nitroanilide (vendu par la Société U.S. Biochemicals Corporation) dans une solution contenant 10 ml de diméthylformamide et 0,95 ml de triéthylamine. On ajoute 1,5 g de N-(carbobenzoxy-p- alanyloxy)-5-norbornène-2,3-dicarboximide, préparé selon M. Fujino et col. , Chem. Pharm. Bull. 22 (8), pages 1957-1863 (1974) à la solution, que l'on agite ensuite pendant une nuit. On évapore le solvant sous vide & 3035 C et on distribue le résidu entre 50 ml d'eau et 300 ml d'acétate d'éthyle. On évapore l'acétate d'éthyle sous vide à 30-35 C et on dissout le résidu dans 3 à 4 ml de chlorure de méthylène et on chromatographie sur une colonne de gel de silice en éluant par le méthanol à 2-6% dans le chlorure de méthylène. Les fractions produites par la colonne donnent le carbobenzoxy-p-alanyl-L-prolyl- N -nitro-L-arginyl-p-nitroanilide. EXEMPLE 3 Ester de t-butyle de carbobenzoxy-g-alanyl-L-proline On dissout 4,46 g de carbobenzoxy-5-alanine dans 20 ml de tétrahydrofuranne et on refroidit la solution résultante à -10 C. On ajoute, en agitant constamment la solution, 2,4 ml de N-méthyl- morpholine,puis 2,6 ml de chloroformiate d'isobutyle et on agite ensuite le mélange de réaction résultant pendant environ 5 min à -10 C. On ajoute 4,16 g de chlorhydrate d'ester de t-butyle de L-proline dans 20 ml de diméthylformamide et 2,8 ml de triéthylamine au mélange de réaction que l'on agite ensuite pendant une nuit, tandis qu'il se réchauffe lentement à la température ambiante. On évapore le solvant à 30-35 C sous vide. On dissout le résidu dans 800 ml d'acétate d'éthyle que l'on lave 2 fois par 150 ml d'une solution à 10% d'acide citrique, 1 fois par 150 ml d'eau, 2 fois par 150 ml de solution saturée de bicarbonate de sodium et ensuite 2 fois par 100 ml d'eau. On sèche la couche organique sur sulfate de magnésium anhydre et on évapore le solvant pour donner l'ester de t-butyle de carbobenzoxy-9-alanyl-L-proline. EXEMPLE 4 Carbobenzoxy-g-alanyl-L-prolyl-N -méthoxybenzènesulfonyl-L-arginyl- p-nitroanilide On dissout 1,0 g d'ester de t-butyle de carbobenzoxy- -alanyl-L-proline dans une solution de 5 ml de chlorure de méthylène et 5 ml d'acide trifluoroacétique. On fait réagir le mélange résultant pendant environ 30 min à la température ambiante. On évapore le solvant sous vide à la température ambiante. On lave le résidu 2 fois par 50 ml de benzène, que l'on élimine par évaporation sous vide à la température ambiante. On sèche le résidu sous vide pendant environ h. On dissout le résidu dans 10 ml de tétrahydrofuranne et on ajoute 5 ml de diméthylformamide et 0,3 g de N-hydroxysuccinimide. On refroidit la solution à 4 C, on ajoute 0,52 g de dicyclohexyl- carbodiimide en agitant et on continue à agiter pendant encore 1 h. On ajoute successivement à cette solution 1,3 g de bromhydrate de N >méthoxybenzènesulfonyl-L-arginyl-p-nitroanilide dissous dans ml de diméthylformamide et ensuite 1,0 ml de triéthylamine. On agite le mélange de réaction résultant à la température ambiante pendant environ 48 h et on évapore ensuite le solvant à 30-35 C sous vide. On dissout le résidu dans 400 ml d'acétate d'éthyle que l'on lave ensuite 2 fois par 75 ml de HCl N, 1 fois par 75 ml d'eau, 2 fois par 75 ml de solution saturée de bicarbonate de sodium et à nouveau 1 fois par 75 ml d'eau. On sèche ensuite la couche d'acétate d'éthyle sur sulfate de magnésium anhydre et on l'évapore sous vide à température ambiante. On dissout le résidu dans l'acétate d'éthyle et on ajoute de l'hexane, ce qui donne un précipité consistant en carbobenzoxy-p-alanyl-L-prolyl-NG -méthoxybenzènesulfonyl-L-arginyl- p-nitroanilide. EXEMPLE 5 -Alanyl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitroanilide,2HCl On fait réagir 450 mg de carbobenzoxy-g-alanyl-L- prolyl-N' -méthoxybenzènesulfonyl-L-arginyl-p-nitroanilide avec 15 ml de fluorure d'hydrogène liquide à 0OC pendant 1 h dans un appareil de Sakakibara pour la réaction avec le fluorure d'hydrogène, comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4.070.245. On éva- pore le fluorure d':ydrogëne et on distribue le mélange résiduel entre ml d'éther anhydre et 30 ml d'acide chlorhydrique N. On sépare la couche aqueuse et on la lyophilise. On dissout le produit lyophilisé dans 1-2 ml d'acide acétique à 30% et on chromatographie sur colonne de "Sephadex G25" (Société Pharmacia AB) en éluant par l'acide acétique à 30%. On réunit les fractions appropriées produites par la colonne et on ajoute 1 ml de HC1 N. On lyophilise ces fractions réunies qui don- nent le dichlorhydrate de P-alanyl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitroanilide. EXEMPLE 6 Dichlorhydrate de P-alanyl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitroanilide En suivant le mode opératoire de l'exemple 5, mais en remplaçant le carbobenzoxy- -alanyl-L-prolyl-N -méthoxybenzènesulfo- nyl-L-arginyl-p-nitroanilide par le carbobenzoxy-g-alanyl-L-prolyl- NS -nitro-L-arginyl-p-nitroanilide, on obtient le dichlorhydrate de galanyl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitroanilide. EXEMPLE 7 Acide N-carbobenzoxy--y-aminobutyriqgue A un mélange de i0o ml d'eau et 120 ml de tétrahydro- furanne, on ajoute successivement 12,4 g d'acide y-aminobutyrique, ,4 g de bicarbonate de sodium et 30 g de N-benzoxycarbonyloxy- succinimide. On agite le mélange de réaction pendant environ 3 h min à la température ambiante et ensuite on évapore le tétrahydro- furanne sous vide. On dilue le résidu par 200 ml d'eau et on extrait 2 fois par 300 ml d'éther anhydre. On acidifie ensuite la couche aqueuse à pH 1-2 par l'acide chlorhydrique N et on extrait 3 fois par 400 ml de chlorure de méthylène. On recueille et on réunit les extraits chlorométhyléniques et on lave ensuite 3 fois par 200 ml de solution de saumure, on sèche sur sulfate de magnésium anhydre et on évapore le solvant sous vide à la température ambiante. Le résidu donne l'acide N-carbobenzoxy-y-aminobutyrique. EXEMPLE 8 N-Carbobenzoxy-y-aminobutyryl-L-prolyl-No -nitro-L-arginyl-p-nitro- anilide On dissout 474 mg d'acide N-carbobenzoxy-y-amino- butyrique et 345 mg de N-hydroxysuccinimide dans 6 ml de diméthylformamide. On refroidit la solution résultante dans un bain d'eau et de glace à O'C et on ajoute 412 mg de dicyclohexylcarbodiimide en agitant la solution. On agite ensuite le mélange de réaction résultant pendant environ 1 h. On sépare ensuite par filtration la dicyclohexyl- urée. On ajoute ensuite le filtrat goutte à goutte à une solution contenant 503 mg de trifluoroacétate de L-prolyl-N4à-nitro-L-arginyl- p-nitroanilide dissous dans 5 ml de diméthylformamide et 0,5 ml de triéthylamine. On agite ensuite le mélange de réaction résultant à la température ambiante pendant une nuit. On évapore le solvant de réaction à 30-35 C sous vide. On lave le résidu 2 fois par 5 ml d'eau. On dissout ensuite le résidu dans 2 à 3 ml de chloroforme et on chromatographie sur une colonne (2,2 x 30 cm) de gel de silice en éluant par le méthanol à 1-4% dans le chloroforme. Les fractions appropriées produites par la colonne donnent le N-carbobenzoxy-7- aminobutyryl-L-prolyl-N -nitro-L-arginyl-p-nitroanilide. EXEMPLE 9 Dichlorhydrate de y-aminobutyryl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitroanilide On fait réagir 118 mg de N-carbobenzoxy-y-aminobutyryl- L-prolyl-Nw-nitro-L-arginyl-p-nitroanilide avec 10 ml de fluorure d'hydrogène liquide à 0 C pendant 1 h dans un réacteur de Sakakibara, comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4.070.245. On évapore le fluorure d'hydrogène et on distribue le mélange rési- duel entre 100 ml d'éther anhydre et 30 ml d'acide chlorhydrique N. On sépare la couche aqueuse et on la lyophilise. On dissout le produit lyophilisé dans 2-3 ml d'acide acétique à 30% et on chromatographie sur une colonne de"Sephadex G-25"en éluant par l'acide acétique à %. On réunit les fractions appropriées produites par la colonne et on ajoute 1 ml de HC1 N. On lyophilise les fractions réunies et on obtient le dichlorhydrate de ?-aminobutyryl-L-prolyl-L-arginyl- p-nitroanilide. EXEMPLE 10 Acide N-carbobenzoxy-4-éthylaminobutyrique En suivant le mode opératoire de l'exemple 7, mais en remplaçant l'acide y-aminobutyrique par l'acide 4-éthylamino- butyrique, préparé comme décrit par W. Reppe, Ann. 596, page 201 (1955), on obtient l'acide N-carbobenzoxy-4-éthylaminobutyrique. EXEMPLE 11 N-Carbobenzoxy-4-éthylaminobutyryl-L-prolyl-N -nitro-L-arginyl-p- nitroanilide En suivant le mode opératoire de l'exemple 8, mais en remplaçant l'acide N-carbobenzoxy-y-aminobutyrique par l'acide N-carbobenzoxy-4-éthylaminobutyrique, on obtient, après chromato- graphie, le N-carbobenzoxy-4-éthylaminobutyryl-L-prolyl-N -nitro- L-arginyl-p-nitroanilide. EXEMPLE 12 Dichlorhydrate de 4-éthylaminobutyryl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitro- anilide -En remplaçant dans le mode opératoire de l'exemple 9 le N-carbobenzoxy-T-aminobutyryl-L-prolyl-N( -nitro-L-areinyl-p- nitroanilide par le N-carbobenzoxy-4-éthylaminobutyryl-L-prolyl- NW -nitro-L-arginyl-p-nitroanilide, on obtient, après chromatographie, le dichlorhydrate de 4-éthylaminobutyryl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitro- anilide. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustra- tion et que l'homme de l'art pourra y apporter des modifications sans sortir du cadre de l'invention. TABLEAU Vitesses de transformation Thrombine Kallikréine humaine | Plasmine humaine Trypsine K Kcat Kca /KK m K /K K K I K /K K K K at/K Subs trat. _ll 4 1àX104M s-1 4 1 -1 X104 X41 1 -1 Xl04 xlO4 i4 ii 1s OMMS 1) gly-proarg-pNA 2) p-ala-pro-arg-pNA 3) abu-pro-arg-pNA 2,8 14,0 9,1 13,3 ,0 1,85 1,4 12,4 7,6 ,0 31,0 8,0 12,6 2,5 1,05 0,63 12,5 2,3 1,05 1,05 0,18 0,075 0,065 4,1 2,5 3,8 33,0 7,5 11,5 8,0 3,0 3,0 n- uji tu tn 1%> o N rv r-3 R E V E N D I C A T I 0 N S 1. Nouveaux amides de tripeptides, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule générale R1NH(CH2) -CO-N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-R4 R2 (CH2) d'acides acceptables en biologie. 2. Composés selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule générale R2N(CH2)m-CO-N-CH-CO-NR-CH-CO-NH NO2 -R2 (CH2)n 2, 2 n R3 dans laquelle R2, R3, m et n sont tels que définis ci-dessus, et leurs sels d'addition d'acides acceptables en biologie. 3. Composés selon la revendication 2, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule H m N(CH) -CO-N-CH-CO-NH-CH-CO-NH NO H C CH (CH) 2\1 2,23 CH NH HN=C-NH2 dans laquelle m est tel que défini ci-dessus, et leurs sels d'addition d'acides acceptables en biologie. 4. Composé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il consiste en 9-alanyl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitroanilide. 5. Composé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il consiste en chlorhydrate de g-alanyl-L-prolyl-L-arginyl- p-nitroanilide. 6. Composé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il consiste en -y-aminobutyryl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitroanilide. 7. Composé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il consiste en chlorhydrate de -y-aminobutyryl-L-prolyl-L- arginyl-p-nitroanilide. 8. Application des composés selon l'une quelconque des revendications 1-7 à la détermination quantitative d'enzymes protéoly- tiques.