Brevet FR2439205A1 — publié le 19800516

La présenta invention concerne un procédé pour produire de la thymosine. La purification et les propriétés de la thymosine bovine ont été décrites par Hooper et coll., dans Annals New York Academy of Sciences, Vol. 249, p. 125-144 (1975). Le brevet britannique nO 1 195 980 décrit également un procédé pour préparer la thymosine. Une thymosine brute qu'on appelle "fraction 3 de la thymosine" est décrite par Hooper et coll. La fraction 3 de la thymosine est un intermédiaire essentiel de la préparation de la thymosine pure à partir du thymus de veau. La fraction 3 de la thymosine contient toute la thymosine présente au départ dans les thymus de veaux, mais son poids n'est que le centime du poids initial des glandes. La diminution considérable de la masse et la purification de cent fois permettent d'utiliser des techniques connues et habituelles de purification des protéines pour préparer la thymosine pure. On sait que la thymosine purifiée est constituée de diverses protéines ayant des poids moléculaires compris entre 1 200 et 14 000. On a montré que la thymosine purifiée stimule la prolifération du tissu lymphoïde et accroît ainsi l'immunité vis-à-vis des processus infectieux. Des études cliniques récentes relatives aux maladies par insuffisance immunitaire ont montré que la thymosine accroit le nombre des cellules T dans le sang périphérique, ce qui restaure ainsi partiellement la compétence immunologique. Les procédés antérieurs d'extraction de la thymosine à partir des thymus impliquent l'homogénéisation des glandes dans une solution salée et la centrifugation du produit homogénéisé. L'application de ces procédés à l'extraction de quantités importantes de thymus (250 à 500 kg) est malaisée et s'accompagne de l'extraction de constituants graisseux indésirables des glandes qui gênent le traitement ultérieur. Dans les techniques publiées, on précipite les protéines thermolabiles dans l'extrait salé par chauffage de ce dernier à 800C au bain-marie. Dans les techniques antérieures, on mélange directement l'extrait obtenu après élimination des protéines thermolabiles à 5 ou 10 volumes d'acétone froide pour précipiter la fraction 3 de la thymosine. L'invention a pour objet principal un nouveau procédé amélioré pour préparer de la thymosine, selon lequel on prépare la fraction 3 de la thymosine de façon plus simple que dans les procédés antérieurs et avec une très faible production de substances gênantes telles que les graisses et les protéines indésirables ou inactives. L'invention a également pour objet un procédé du type précédemment décrit, plus économique que les procédés connus. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description qui suit. Selon le procédé de production de la thymosine de l'invention, on soumet des thymus à un hachage grossier, on extrait dans une solution salée que l'on filtre et on injecte de la vapeur d'eau dans le filtrat (extrait) pendant une durée brève pour dénaturer les protéines indésirables sans dénaturer la thymosine et obtenir un précipité que l'on sépare par filtration. On concentre le filtrat, on le refroidit et on précipite la thymosine brute par addition du concentré à de l'acétone. Dans la pratique de l'invention, on hache des thymus congelés, par exemple des thymus de veaux, dans un hache-viande, pour former des particules relativement grossières ayant des diamètres d'environ 2 à 5 mm. On extrait ensuite ces particules grossieres par agitation avec une solution salée de façon classique. On filtre les solides en s'aidant de préférence d'un aide de filtration tel que de la terre de diatomées ou d'un autre aide de filtration approprié et on rejette le gâteau de filtre. On met ensuite le filtrat sous forme d'un courant en contact avec de la vapeur d'eau que l'on injecte sous une pression supérieure à la pression atmosphérique pour porter instantanément la température du filtrat à une valeur d'environ 80 à 850C.Le temps pendant lequel on maintient le filtrat à cette température doit être au moins suffisant pour dénaturer les protéines indésirables, mais insuffisant pour dénaturer la thymosine. Généralement la durée de chauffage instantané doit être d'au moins 1 minute. On peut utiliser, pour effectuer le chauffage instantané, de la vapeur d'eau basse pression, par exemple à 1,0 bar manométrique, ou de la vapeur d'eau haute pression, par exemple à 4,1 bars manométriques. Généralement la durée de chauffage ne dépasse pas plusieurs minutas. On obtient ainsi une suspension des protéines précipitées que l'on refroidit de préférence par déversement sur de la glace et qu'on filtra, de préférence en s'aidant d'un aide de filtration tel que par exemple de la terre de diatomées. On effectue de préférence la filtration avec un filtre-presse et on rejette le gâteau de filtra. On concentre de préférence le filtrat obtenu à environ la moitié de son volume et on le refroidit à une température rela tivement basse, généralement voisine de 40C. On ajoute le concentré à un volume important d'acétone que l'on a refroidie à une température inférieure à celle du concentré, de préférence à une température voisine de -10 C. On obtient ainsi un précipité de thymosine brute. On peut décanter le liquide surnageant et recueillir la thymosine par filtration, la laver avec de l'acétone fraiche et sécher sous vide. L'invention est illustrée par l'exemple non limitatif suivant dans lequel les quantités sont exprimées en poids, sauf indications contraires. Exemple On hache avec un hache-viande, 227 kg de thymus de veaux congelés et on mélange aux glandes hachées 700 litres de chlorure de sodium 0,15 M à 40C pendant 5 à 30 minutes. On agite dans le mélange 113 kg d'aide de filtration et on filtre le mélange avec un filtre-presse. On rejette le gâteau de filtre. On porte la température du filtrat à 80-850C par injection de vapeur d'eau dans un courant de l'extrait et on laisse la vapeur d'eau et l'extrait en contact mutuel pendant 1 à 2 minutes. On déverse la suspension de protéines précipitées obtenue sur 91 kg de glace, on ajoute 36 kg d'aide de filtration et on filtre la suspension avec un filtre presse. On rejette le gateau de filtre. On concentre les 757 litres de filtrat à 379 litres et on refroidit à 4 C. On ajoute le concentré à 1 514 litres d'acétone refroidie à -10 C. On obtient un précipité de thymosine brute. On rejette le surnageant, on recueille la thymosine par filtration, on la lave avec de l'acétone fratche et on sèche sous vide. La poudre sèche pèse 2 500 g. Contrairement aux procédés antérieurs selon lesquels on homogénéise les thymus en solution salée et on centrifuge, le procédé de l'invention est plus simple en ce qu'on hache les thymus congelés avec un hache-viande et qu'on extrait les glandes hachées par agitation avec une solution salée. Le procédé de l'invention permet de hacher et d'extraire en 1 heure, 227 kg de thymus de veaux. De plus le hachage grossier présente, par rapport à l'homogénéisation, l'avantage de ne libérer qu'au minimum les substances gênantes, en particulier les graisses et de fournir un extrait pratiquement dépourvu de matieres grasses que l'on peut facilement filtrer avec un filtre-presse. La thymosine est soluble dans une solution salée diluée telle que par exemple une solution aqueuse 0,15 M de chlorure de sodium. On peut utiliser pour l'extraction initiale toute solution aqueuse salée diluée capable d'extraire la thymosine. Alors que dans les procédés publiés on précipite les protéines thermolabiles dans l'extrait salé par chauffage de l'extrait à 800C au bain-marie, dans l'invention on précipite les protéines thermolabiles par injection de vapeur d'eau dans un courant de l'extrait pour porter instantanément la température du courant à 800C et on maintient la température de l'extrait à 800C pendant 1 à 2 minutes. On pompe ensuite la courant sur de la glace pour abaisser sa température, on mélange avec un aide de filtration et on filtre avec un filtre-presse. Ce procédé provoque la précipitation des protéines thermolabiles indésirables, mais le chauffage rapide (contrairement au chauffage au bain-marie) réduit au minimum le temps pendant lequel l'extrait est maintenu à température élevée, ce qui réduit les risques de dénaturation de la thymosine et préserva son intégrité. Tandis que dans les procédés antérieurs on mélange directement l'extrait obtenu après élimination des protéines thermolabiles avec 5 ou 10 volumes d'acétone froide pour précipiter la fraction 3 de la thymosine, dans l'invention on concentre l'extrait sous vide entre 25 et 300C, de préférence à la moitié de son volume initial. On ajoute ensuite l'extrait concentré à quatre à dix fois son volume d'acétone froide pour précipiter la fraction 3 de la thymosine. Le procédé de l'invention fournit la même quantité de fraction 3 que les procédés publiés, mais réduit de moitié la quantité d'acétone nécessaire et simplifie considérablement les opérations de précipitation et de récolte. On voit donc que l'invention facilite considérablement la préparation de la thymosine. Bien que la thymosine brute (fraction 3 de la thymosine) contienne généralement moins de 1% en poids de thymosine, il est évident que l'on peut la soumettre à une purification ultérieure appropriée quelconque, par exemple selon les modes opératoires décrits dans les références précitées. Bien entendu l'invention est susceptible de diverses variantes et modifications dans ses applications pratiques. Ainsi, bien que l'on effectue de préférence le chauffage instantané de l'extrait en solution salée par injection de vapeur d'eau dans un courant de cette solution, on peut également, pour effectuer le chauffage, utiliser des rayons de forte intensité ou des échangeurs de chaleur classiques ou opérer de toute autre façon ne provoquant pas une inactivation ou une dénaturation de la thymosine. On concentre de préférence le filtrat avant l'addition à l'acétone par évaporation sous vida, généralement à une température d'environ 300C. Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemple non limitatif sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé pour préparer la fraction 3 de la thymosine selon lequel on extrait des thymus de veaux en solution salée aqueuse, on élimine les matières non dissoutes, on chauffe le produit liquide obtenu, on refroidit le produit obtenu après chauffage, on élimine le précipité formé par refroidissement, on mélange le liquide obtenu avec de l'acétone en quantité suffisante pour précipiter la fraction 3 de la thymosine et on recueille le précipité obtenu, caractérisé en ce qu'il consiste à (a) hacher grossièrement des thymus de veaux avec un hache-viande, (b) mélanger les glandes hachées avec une solution 0,15 M de chlorure de sodium pour former une suspension, (c) filtrer la suspension obtenue avec un aide de filtration dans un filtre-presse, (d) chauffer instantanément le filtrat obtenu à 80-850C par injection de vapeur d'eau sous une pression supérieure à la pression atmosphérique dans un courant du filtrat, (e) maintenir la température de 80 a 85"C pendant une durée d'environ 1 2 minutes, cette durée étant au moins suffisante pour dénaturer les protéines indésirables, mais insuffisante pour dénaturer la thymosine, (f) refroidir rapidement le produit obtenu, (g) séparer par filtration le précipité formé, (h) concentrer le filtra t å environ la moitié de son volume, (i) ajouter de l'acétone au filtrat concentré en une quantité suffisante pour précipiter la fraction 3 de la thymosine, et (j) recueillir le précipité obtenu. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on refroidit rapidement le produit par déversement sur de la glace.