Brevet FR2458583A1 — publié le 19810102

La présente invention concerne une nouvelle glycérol kinase et sa production. La glycérol kinase est déjà connue comme étant une enzyme qui catalyse la réaction suivante ATP + glycérol. ADP + L-alpha-glycé- rophosphate LC 2. 7. 1. 30 ATP: glycérol phosphate transférase, nom courant: glycérol kinase_7 La glycérol kinase déjà connue (on dési- gne ci-après la glycérol kinase par GK) est une enzyme produite par Candida mycoderma L iochem. Z., 239, 320 (1957), ibid., 333, 471 (1961)7, une enzyme produite par Escherichia coli EJ.Biol. Chem. 242, 1030 (196727 et une enzyme provenant du foie de pigeon 2ethod in Enzymology, Vol. 5, 476 (1962), Biochem. Z., 329, 320 (1957), J. Biol. Chem., 211, 951 (195427. On a trouvé qu'une souche de Streptomyces A 2408 isolée à partir d'un échantillon de terre d'un champ de soja de Kakegawa-shi, Shizuoka-ken, Japon, produit une enzyme qui catalyse une réaction avec le glycérol et ATP pour former ADP et du L-alpha-glycé- rophosphate, dans son mycélium, et on a purifié une enzyme électrophorétiquement unique. Comme résultat, cette enzyme appartient au groupe GK, toutefois ses propriétés physico-chimiques et biochimiques sont inconnues jusqu'à présent et on l'a qualifiée de nouvelle enzyme GK. Les propriétés taxonomiques de la souche de Streptomyces A 2408 sont les suivantes. I. Propriétés morphologiques: La couleur des hyphes aériennes portant des spores mûres va d'un gris brunâtre à un brun grisâtre. Mycélium de support brun jaunâtre. Produit un pigment soluble brun jaunâtre. Les observations sur de la gélose à l'ami- don et aux substances inorganiques à 30 C pendant 10 jours sont illustrées comme suit. On observe les mê- mes caractéristiques morphologiques sur de la gélose à la farine d'avoine et de la gélose glycérolée à l'asparagine. Les hyphes aériennes ont de 0, 6 à 0,8p de diamètre, sont droites ou ondulées, se développant par ramification simple et forment de nombreuses chai- nes de spores. Les chatnes de spores forment des spirales comportant 3 à 5 spires lâches, en forme de crochet, de boucle ou flexueuses. Les spores sont de forme globuleuse ou ovale, 0,8 - 1,0 x 1,0 - 1,5À, surfaces avec des épines. Les mycéliums de support sont ramifiés, se développant en hyphes ondulées ou flexueuses de 0,5 - 0,6 u de diamètre et ordinairement sans dédou- blement des hyphes et port de spores. Pas de formation de sporrs flegellaires ni de sporanges. II. Composition de l'acide diaminopimérique: On a détecté de l'acide L-diaminopimérique. III. Caractéristiques sur divers milieux: Des observations sur divers milieux à 30 C pendant 20 jours sont illustrées dans le Tableau 1. -Les indications de couleurs sont basées sur "Color Harmony Manual, 4ème édition 1958" (Container Corp. of American, E.U.A27. IV. Propriétés physiologiques: 1) Température de développement: 12-45 C 2) Liquéfaction de gélatine: positive 3) Hydrolyse de l'amidon: positive 4) Peptonisation du lait écrémé: positi- ve; coagulation, négative ) Formation de pigment du genre mélanine: négative 6) Utilisation de sources de carbone: sont utilisés: L-arabinose, D-fructose, D-glucose, i-inositol, D-mannitol, raffinose, L-rham- nose, sucrose et D-xylose. Comme illustré ci-dessus, la présente sou- che de micro-organisme A 2408 appartient aux Strepto- myces d'après les caractéristiques du mycélium aérien ayant des chaines de spores développées à partir du véritable mycélium de support sans division, le diamè- tre du mycélium, la grosseur des spores et le type L de l'acide diaminopimélique. La souche A 2408 a les caractéristiques suivantes: La couleur du mycélium aérien est d'un gris brunâtre à un brun grisâtre. La chaine de spores est constituée de spirales l&ches de 3 à 5 spires. La surface des spores a des épines. Le mycélium de support est d'un brun jaunâtre. Forma- tion de pigment soluble brun jaunâtre. Large utilisa- tion de sucre. Pas de formation de pigment du genre mélanine. Ces caractéristiques peuvent être détec- tées pour Streptomyces canus (Heinemann et autres E-Antibiotics and Chemotherapy, 3, 1239 - 1242 9195327 dans International Streptomyces Project (ISP) - Inter. J. System. Bacteriol., 18 (2), 95 (1968)7. La comparaison entre la présente souche A 2408 et Streptomyces canus ISP 5017 a montré la ressemblance en ce qui concerne les propriétés morphologiques, cul- turales et physiologiques. En conséquence, la présente souche A 2408 est appelée Streptomyces canus A 2408. Cette souche a été déposée dans l'Institut pour l'Industrie et la Technologie microbiennes au Japon comme collection per- manente FERM-P NO 4977 le 8 mai 1979. Milieu Gélose avec sucrose-nitrate Développement modéré & bon Gélose avec modéré glucose-asparigine Gélose avec bon glycérol-asparagine Gélose avec bon amidon-sel inorganique Gélose à la tylosine bon Gélose à la farine bon d'avoine Gélose avec extrait de levures-extrait bon de malt Gélose glycérolée bon et nitrathe Gélose avec glycérol- amidon-glutamate bon Gélose de Benett bon Gélose d'Emerson modéré Gélose nutritive médiocre à faible Tableau 1 Couleur du mycéllum de support, brun doré (3 pi) brun moutarde (2 pi) brun girofle (3 pl) à brun doré (3 pi) brun doré (3 pi) à brun girofle (3 pl) brun doré (3 pi) brun girofle (3 pi) brun doré (3 pi) brun doré (3 pi) brun girofle (3 pi) brun girofle (3 pl) brun doré (3 pi) or moutarde (2 pe) incolore à blé clair (2 ea) Myvcélium aérien Pigment soluble Modéré à bon: Néant bisque (3 ec) médiocre à modéré Néant naturel (3 de) bisque (3 ec) bon: beige (3 ge) Néant à beige brun (3 ig) bon: beige (3 ge) Néant à gris argent (3 fe) bon: beige (3 ge) Néant à brun à brun beige (3 ig) 6léger pale (4 ng) bon: beige (3 ge) à Néant brun beige (3 ig) bon: naturel (3 de) à gris argent (3 fe) Néant bon: naturel (3 de) à beige (3 ge) bon: beige (3 ge) à tan voilé (2 ge) bon: naturel (3 dc) à gris argent (3 fe petite quantité: blanc (a) Néant brun girofle (3 plJ brun girofle (3 pl Néant Néant Néant r Ln co w co uJ On a trouvé que la GK produite par Strep- tomyces canus A 2408 était une enzyme nouvelle ayant les propriétés physicochimiques et biologiques illus- trées ci-après. On peut utiliser GK comme réactif de re- cherche ou réactif de diagnostic pour le métabolisme de triglycérides dans des liquides du corps comme le sérum. Un but de la présente invention est de fournir une nouvelle GK et un procédé pour sa produc- tion. Un micro-organisme utilisé dans la pré- sente invention peut être mentionné, par exemple Streptomyces illustré cidessus, mais ce n'est pas limitatif et on peut utiliser le présent microorganisme producteur de GK et ses souches mutantes. On peut produire la nouvelle GK en culti- vant un micro-organisme producteur de GK tel qu'une souche productrice de GK appartenant au genre Strep- tomyces dans un milieu classique pour la production d'enzymes. La culture est habituellement une culture en milieu liquide et une culture immergée avec aéra- tion est avantageuse pour une production industrielle. On peut utiliser un milieu nutritif clas- sique pour micro-organismes. En ce qui concerne les sources de carbone, on peut utiliser avantageusement une source de carbone assimilable, spécialement du glycérol. On peut aussi utiliser d'autres sources de carbone comme du glucose, du sucrose, du lactose, de l'amidon, de la mélasse. En ce qui concerne les sources d'azote, on peut utiliser une source d'azote assimilable comme de la liqueur de macération de mais, de la poudre de soja, de la poudre de graines de coton, de la levure sèche, de l'hydrolysat de caséine, de l'extrai. de levures, de l'extrait de Ad. ::- 2458583 " 6 r'l farine de poisson et de la peptone. On peut utiliser, si nécessaire, un phosphate, un sulfate et un sel inorganique de magnésium, de calcium, de potassium, de fer, de manganèse ou de zinc. La température de culture peut être choisie dans l'intervalle convenable pour le développement :'' des micro-organismes et la production de GK et est :a,'n de préférence de 25-30 C. La durée pendant laquelle on conduit la culture dépend des conditions et elle doit être arrêtée à la production maximale de GK, i' habituellement après 1 à 3 jours. q La présente enzyme peut être isolée à partir du mycélium. On centrifuge le bouillon de culture pour recueillir le mycélium qu'on soumet à une sonication, puis à une centrifugation pour re- * cueillir la solution surnageante. On traite cette solution par relargage en utilisant par exemple du sulfate d'ammonium (appelé ci-après AS) ou du sul- fate de sodium pour séparer les impuretés. On sou- met ensuite le liquide surnageant à un relargage et on effectue une centrifugation pour obtenir le pré- cipité contenant GK. La GK précipitée est ensuite purifiée par relargage avec Sephadex G-25 (nom com- mercial, Pharmacia Co.), Biogel P-2 (nom commercial, Biorad Corp.), par dialyse à travers une membrane ou au moyen de fibres creuses et traitée par échange d'ions comme en utilisant de la DEAE-cellulose. La fraction de GK ainsi obtenue est relarguée et concen- trée au moyen d'une membrane d'ultrafiltration comme d'Amicon XM-50 (nom commercial, Amicon Co.). La ?* - fraction relarguée est soumise à une chromatographie d'absorption comme en utilisant une colonne de gel de phosphate de calcium pour séparation des impuretés et en effectuant ensuite une élution à gradient au moyen d'un tampon phosphate. La fraction contenant GK est relarguée et concentrée à l'aide d'une membra- ne d'ultrafiltration comme d'Amicon XM-50. On sou- met le concentré à une chromatographie par filtration à travers un gel en utilisant par exemple Biogel P-200 (Biorad Co.) ou Sephadex G-150 (Pharmacie Co.), puis la fraction de GK est lyophilisée. La GK obtenue par la technique de puri- fication ci-dessus a les propriétés physico-chimiques et biochimiques suivantes. (A) Titrage de l'enzyme: tampon 0,2 M tris-HCl (pH 9,0) 0,1 M glycérol mM ATP mM MgCl2 0,25% bleu de nitrotétrazolium 1% sérum d'albumine de boeuf mM NAD 0,05% méthosulfate de phénazine glycérophosphate déshydrogénase 0, 4 cm3 0,05 cm3 0,1 cm3 0,1 cm3 0,1 cm3 0,14 cm3 0,1 cm3 0,01 cm3 (Boehringer Co., 2 mg/cm>,65 U/mg 5/i1 On met le mélange ci-dessus (1 cm3) en pré-incubation à 37 C pendant 5 minutes, on y ajoute une solution de GK (50 ul) Fdiluée avec du tampon GL (tampon phosphate 10 mM contenant du glycérol 10 mM, pH 7,5)7 et on met à incuber à 37 C pendant 10 minutes. On arrête la réaction en ajoutant 0,1 N HC1 et on opè- re à 550 nm pour mesurer le pouvoir absorbant (A550 nm). Une unité de GK est définie par la libéra- tion de 1 mole de glycéro-3-phosphate par minute. On calcule l'activité enzymatique comme suit: Activité enzy3 _ matique (U/cm) = A A x rapport de dilution 0,05 x 10 = AA- x rapport de dilution = x raprdedlto xZ (B) Propriétés physico-chimiques Action de l'enzyme: catalyse au suivante CH20H ATP + CHOH > !20H et biochimiques: moins la réaction CH20PO3If ADP + HCOH H20 CH20H Masse moléculaire: 72000 + 7200 72000: mesurée par Sephadex G100 65000: mesurée par SDS polyacrylamide Point iso-électricue: pH 4,5 - Valeur de Km: glycérol dihydroxy-acétone D-glycéraldéhyde Spécificité concernant le substrat: (1) spécificité. pour le phosphate de dihydroxyacétone et le (méthode d'essai) 4,8 x 10-5 M 6,6 x 10-4 M 3,5 x 10-4 M 2 x 10-4 M glycérol, le D-glycéraldéhyde Mélange réactionnel: 0,2 M tampon tris-HCl (pH 9,0) 0,1 M glycérol, phosphate de dihydroxy- acétone ou D-glycéraldéhyde mM ATP mM MgCl2 eau distillée 0,4 cm3 0,05 cm3 0,1 cm3 0,1 cm3 0,3 cm3 On met le mélange réactionnel (0,95 cm3) en pré-incubation à 37 C pendant 3 minutes et on y ajoute la solution d'enzyme (dissoute dans du tampon phosphate 10 mM, pH 7,5, 0,05 cm3), puis on fait in- cuber le mélange à 37 C pendant 10 minutes. On ar- rête la réaction par ébullition pendant 3 minutes. Après refroidissement à 37 C, on détermine la quan- tité d'ADP. On détermine ADP en ajoutant une solution de titrage d'ADP (2,0 cm3) comprenant le mélange sui- vant: a 0,1 M tampon phosphate (pH 7,5) 0,2 M tampon diméthylglutarateNaOH (pH 7,5) peroxydase (0,5 g/cm3) 0,2% phénol 0,3% 4-amino-antipyrine mM MnCl2 mM pyrophosphate de thiamine I mM FAD mM phosphoénolpyruvate pyruvate oxydase (100 U/cm3; Toyo Joso Co.) pyruvate kinase (4400 U/cm3; Sigma Chem. Co.) eau distillée 0,1 cm3 0,1 cm3 0,1 cm3 0,1 cm3 0,1 cm3 0, 05 cm3 0,03 cm3 0,01 cm3 0,1 cm3 0,05 cm3 1 il 1,26 cm3 On fait incuber le mélange réactionnel à 37 C pendant 15 minutes. La couleur formée est mesu- rée à 550 nm pour calcul de la spécificité envers le substrat. Substrat: Activité relative glycérol 100% dihydroxy-acétone 74% D-glycéraldéhyde 20% (2) activité spécifique pour les nucléotides: ATP > CTP > ITP " GTP, UTP (Méthode d'essai) Dans la méthode d'essai (1) ci-dessus, on remplace 10 mM ATP par CTP, ITP, GTP et UTP et on me- sure le glycéro-3-phosphate formé. Comme illustré ci-après, tous les nucléotides essayés peuvent être un substrat; on a observé une spécialement haute spé- cificité pour ATP et CTP. Substrat Activité relative (%) ATP 100 CTP 92 ITP 47 GTP 19 UTP 18 pH optimal: pH 9 - 10, comme représenté sur la figure 1. -Sur la figure,,_: tampon diméthyl- glutarate-NaOH (pH 6 - 7,5), -.: tampon tris-HC1 (pH 7 - 9),A -A: tampon phosphate (pH 6 - 8), - A: tampon glycine - NaOH (pH 9 - 10,5)7 Stabilité du pH:pH 5,5 - 10 comme représenté sur la figure 2. On utilise un tampon diméthylglutarate (pH 4 -.7) et un tampon glycine-NaOH (pH 10 - 10,5) con- tenant chacun 10 mM glycérol. L'incubation est ef- fectuée à 37 C pendant 60 minutes. Effet d'ions de métaux et (PCMB):, Réactif Concentration Néant MgC12 CaC12 MnC12 PCMB l 1,0 mM 1,0 mM 1,0 mM ,0 x 10-6M 7,5 x 10-6M du p-chloromercuribenzoate Activité relative (%) Sans Mg++ Avec 1 mM Mg++ o0 La GK de la présente invention vée par Mg++ et inhibée par Ca + et Mn++. de la présente GK est complètement inhibée 6 M de PCMB. est acti- L'activité par 7,5 x Stabilité à la chaleur: stable jusqu'à 45 C comme représenté sur la figure 3. Titrage: tampon 10 mM phosphate (pH 7,8) Il contenant 10 mM glycérol. Incubation à 45 - 75 C pendant 10 minutes chaque fois. Comme illustré ci-dessus, l'enzyme selon la présente invention appartient à un groupe d'enzy- mes catalysant une réaction: glycérol + ATP - ^ADP + L-alpha-glycérate. La comparaison de glycérol kinases connues, la GK de Candida mycoderma (appelée ci-après C.My.-GK), la GK d'Escherichia coli (appelée ci-après Pig.-GK) avec la GK selon la présente invention est la suivante. La masse moléculaire de E.Co-GK est de 300 000 et celle de C.My.-GK est de 250 000 (tétramère de la masse moléculaire de 60 000), tandis que la GK selon la présente invention est un monomère d'une mas- se moléculaire de 70 000 environ. La stabilité du pH est: pH 6,5 - 7 pour E.Co-GK, pH 4,5 -5,5 pour Pig.-GK et pH 6,7 pour C.My.-GK, au lieu de pH 5,5 - 10 pour la présente GK. Comme la réaction exigeant ATP exige un ion de métal divalent, la GK ci-dessus exige aussi Mg++, toutefois Mn++ peut y être substitué pour E.Co- GK et Pig.-GK, tandis que Mn++ inhibe fortement la présente GK. De plus, les spécificités concernant les substrats sont différentes pour chaque GK.E.-Co-GK présente une activité presque deux fois plus forte pour le phosphate de dihydroxy-acétone que pour le glycérol, tandis que la présente GK fait montre d'une plus haute spécificité pour le glycérol que pour le phosphate de dihydroxy-acétone. E.Co-GK agit seulement pour ATP, et la présente GK agit pour ATP et CTP et aussi pour ITP, GTP et UTP. Comme ré- sultat, la masse moléculaire, la stabilité du pH, l'exigence en ion de métal divalent et la spécifi- cité envers le substrat prouvent que la présente glycérol kinase est une nouvelle GK. La GK selon la présente invention peut être utilisée comme enzyme pour diagnostic. Par exemple, on peut utiliser la présente GK pour titrage des triglycérides et du glycérol en faisant réagir les triglycérides et de la lipoprotéi- nelipase, en faisant incuber le mélange de réaction avec GK et ATP de manière à former du glycéro-3- phosphate que l'on fait incuber ensuite avec de la glycéro-3-phosphate oxydase, puis on mesure l'oxygène consommé ou l'eau oxygénée libérée. L'exemple suivant illustre la présente invention, mais ne doit pas être considéré comme la limitant. -Exemple Un milieu (100 cm3) (pH 7,0) constitué de peptone 1,0%, glycérol 1,5%, K2HP04 0,1%, MgS04 0,05% et KCl 0,20% dans un erlenmeyer de 500 cm3 est stérilisé à 120 C pendant 20 minutes. On y inocu- le Streptomyces canus A 24-8 FERM-P N 4977 et on cul- tive à 26 C pendant 3 jours. Le bouillon obtenu est inoculé dans un fermenteur cylindrique de 30 litres contenant le même milieu (20 litres) et on conduit la culture dans des conditions aérobies à 26 C pendant heures, 300 tpm, aération 20 litres par minute. Deux litres du bouillon obtenu sont centrifugés (15 000 tpm, pendant 10 minutes) à 4 C pour recueil du mycélium. On met le mycélium en suspension dans du tampon GL (800 cm3) et on le soumet à une sonica- tion à 0 C pendant 5 minutes à l'aide d'un appareil à ultrasons (KUBOTA INSONATOR 200M, non commercial). On centrifuge la solution à 4 C pendant minutes à 15 000 tpm pour obtenir un liquide sur- nageant (760 cm3). Après addition d'une solution à 5% de protamine (23,0 cm3), on précipite les im- puretés par centrifugation à 4 C, 5000 tpm pendant minutes. On ajoute une solution saturée de sulfate d'ammonium (pH 7,5, 1125 cm) au liquide surnageant (750 cm3) et on centrifuge à 4 C, 15 000 tpm pendant minutes pour recueillir le précipité. On ajoute une quantité supplémentaire de solution saturée de sulfate d'ammonium (pH 7,5, 37,2 cm3) à la solution du précipité dans 62 cm3 de tampon GL pour précipiter les impuretés. Le liquide surnageant (82 cm3) est obtenu par centrifugation à 4 C, 15 000 tpm pendant 10 minutes, puis on ajoute une solution saturée de sulfate d'ammonium (pH 7,5, 20,5 cm3). Une centrifu- gation supplémentaire à 4oC, 15 000 tpm pendant 10 minutes donne un précipité. On dissout le précipité dans du tampon GL (11,0 cm3) et on charge la solution sur une colonne de Sephadex G-25 (3 x 30 cm3) remplie du même tampon, puis on élue avec le même tampon à 25 C, débit cm3/h. On recueille les fractions présentant une absorption à 280 nm (environ 21 cm3). On charge ces fractions sur une colonne de DEAE-cellulose (2,2 x 17 cm) remplie de tampon GL, on lave avec du tampon GL (80 cm3) (débit 25 cm3/h, 5,8 cm3 par fraction), en- suite on élue les impuretés avec du tampon GL conte- nant 0,1 M KCl (débit 25 cm3/heure, 5,8 cm3 par frac- tion). On recueille les fractions actives N 63 à 79 par élution à gradient linéaire avec un tampon GL contenant 200 cm3 de 0,1 M KCl et un tampon GL conte- nant 200 cm3 de 0,4 M KCl(débit 25 cm3/h, chaque fraction 5,8 cm3). Un éluat actif combiné (98 cm3) est relargué et concentré par Amicon XM-50 à 40C pendant 4 heures pour donner la solution concentrée (10 cm3). On charge le concentré sur une colonne de gel de phosphate de calcium (2,0 x 17,2 cm) rem- plie de tampon GL, on lave avec du tampon GL (loo cm3) et on élue par un gradient linéaire de 200 cm3 de tam- pon GL à 100 mM de tampon phosphate contenant 200 cm3 de 100 mM glycérol (débit 25 cm3/h, 6 cm3 par fraction). On recueille les fractions actives N0 48 à 58 et la solution combinée est concentrée par Amicon X-50 pour donner le concentré (2 cm3). On charge ce concentré sur une colonne de Biogel P-200 (3 x 60 cm) remplie de tampon GL, on élue avec le même tampon (débit cm3/h, 6 cm3 par fraction) et on recueille les fractions actives NI 17 à 20, qui sont combinées et lyophilisées pour donner la GK purifiée (activité spécifique 57,6 U/mg, 16,9 mg de protéine). Explication simple des dessins: Figure 1: Courbe de pH optimal de la présente GK. Figure 2: Courbe de stabilité du pH de la présente GK. Figure 3: Courbe de stabilité à la chaleur de la présente GK. REVENDICATIONS 1) Une nouvelle glycérol kinase ayant les propriétés suivantes: la réaction (1) Action enzymatique: catalyse au moins suivante: CH2OH ATP + CHOH - CH2H CH20H (2) (3) CH2O-PO3I- ADP + HC-OH CH20H Masse moléculaire: 72 000 + 7 200 Point iso-électrique: 4,5 (4) Valeur de Km: glycérol dihydroxy-acétone D-glycéraldéhyde ATP 4,8 6,6 3,5 x 10-5 M x 10-4 M x 10-4 M x 10-4 M (5) Spécificités pour les nucléotides: ATP > CTP ' ITP l" GTP, UTP (6) pH optimal: pH 9 - 10 (7) Stabilité du pH: pH 5,5 - 10 (8) Effet des ions de métaux: Stimulation par Mg++ Inhibition par Ca++ et Mn ++ (9) Stabilité à la chaleur: stable jusqu'à 2) Un procédé pour la production de glycérol kinase caractérisé en ce qu'on cultive un micro-organisme producteur de glycérol kinase dans un milieu nutritif contenant des sources de carbone et d'azote et un sel inorganique, de manière à isoler la glycérol kinase ainsi produite. 3) Un procédé selon la revendication 2, carac- térisé en ce que le micro-organisme producteur de gly- cérol kinase est un micro-organisme producteur de glycérol kinase appartenant au genre Streptomyces. 2458S83 4) Un procédé selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que le micro-organisme pro- ducteur de glycérol kinase est Streptomyces canus A 2408. 5) Un procédé selon l'une des revendications 2, 3 et 4, caractérisé en ce qu'une source de carbone est du glycérol.