Brevet FR2450263A1 — publié le 19800926

La présente invention se rapporte a un procédé pour coupler un latex portant en surface des groupes époxyde avec une protéine ou un composant protéique par formation d'une liaison amine. De telles protéines fixées sur support sont particulièrement utiles pour la réalisation de tests immunologiques basés sur la réaction antigène-anticorps. La réaction antigène-anticorps constitue la base de tous les tests immunologiques. En réponse a la présence d'un antigène, c'est-à-dire d'une substance étrangère, habituellement une protéine, dans ses fluides corporels, un organisme animal produit des protéines spéciales appelées anticorps. Cette réponse normale de l'organisme à la présence d'une protéine étrangère a conduit h la mise au point d'un certain nombre de techniques qui sont utilisées pour le diagnostic de maladies et désordres variés chez les etres humains et les animaux. Dans les tests in vitro visant 9 rechercher la présence éventuelle d'un antigène ou d'un anticorps dans un liquide physiologique, on prélève un échantillon du liquide physiologique en question et on y ajoute la contrepartie immunologique, ctest- -dire que, si l'on recherche un anticorps, on ajoute un antigène ou,si l'on recherche un antigène, on ajoute un anticorps Lorsque la protéine recherchée est présente, il se produit une réaction antigène-anticorps qui se manifeste en général par une précipitation ou une agglutination du complexe antigène-anticorps. Toutefois, dans certains cas, ce complexe est lent å se former et les particules qui se forment sont trop petites pour pouvoir entre observées en toute certitude. Dans de tels cas, on peut améliorer la sensibilité de la réaction antigène-anticorps en utilisant un support. Lorsque l'antigène ou anticorps est appliqué en revêtement la surface d'un support, la réaction avec la contrepartie immunologîque conduit a l'apparition d'une masse ou d'un agglomérat visible.L'antigène ou l'anticorps-protéique peut etre adsorbé a la surface de supports tels que des érythrocytes, des cellules bactérennes, de-la bentonite, les particules d'un latex de polystyrène > des résines phénoliques anioniques ou de l'aminocellulose diazotée a l'état de fine division. Cependant, on a constaté que la liaison chimique de la molécule d'antigène ou d'anticorps sur le support était supérieure al'adsorption physique.Dans le brevet des Etats-Unis dtAmérique nO 3.857.931, on décrit la fixation chimique d'antigènes ou d'anticorps protéiques sur un support consistant en un latex de polymère portant en surface des groupes carbonyle, par une liaison amide formée en présence d'un agent couplant hydrosoluble du type carbodiimide. Dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n" 3.806.417, on décrit un procédé pour fixer une protéine sur un composé contenant un groupe époxyde et pour relier l'intermédiaire obtenu avec une matière de support. Un inconvénient de ce procédé réside en ce qu'il faut d'abord faire réagir la protéine avec un composé portant a la fois un groupe époxy et un groupe oléfinique. Le produit de conjugaison obtenu dans ces conditions est ensuite polymérisé avec un autre monomère oléfinique et un agent réticulant bis-oléfinique, ce qui donne finalement l'enzyme fixée sur un support. Les brevets des Etats-Unis d'Amérique 3.639.558, 3.853.708, 3.841.970, 3.844.892, 3.821.084 et 4.086.199 décrivent tous des procédés pour fixer une protéine sur des supports polymères. Dans le cas particulier où on utilise comme support un latex, la technique antérieure décrit des procédés de couplage exigeant l'utilisation d'agents couplants bifonctionnels ou diagents couplants qui forment une liaison entre les groupes réactifs de la protéine et les groupes réactifs des particules du support. Le problème posé par ces procédés réside en ce que les agents couplants sont incapables de distinguer entre les groupes réactifs de la protéine et les groupes réactifs du support. Par suite, il peut se produire des couplages protéine-protéine et meme des couplages intramoléculaires dans la protéine. Ces liaisons indésirables peuvent conduire a des changements de conformation de la molécule de protéine, se manifestant eux-memes par des changements- d'activité. L'invention concerne un procédé pour fixer par liaisons covalentes une protéine portant un groupe réactif qui contient un atome d'hydrogène labile a un latex portant en surface des groupes époxyde. De préférence, le groupe réactif est un groupe amino libre,mais on pourrait obtenir des résultats analogues avec d'autres groupes réactifs tels que des groupes carboxyle, phénol, hydroxy et thiol. Le couplage se produit lorsque les groupes amino de la protéine réagissent avec les groupes époxyde du latex, habituellement à un pH d'environ 7,0 a 9,0, avec formation d'une nouvelle liaison carbone-azote, qu'on appelle ci-après liaison amine et fixation de la protéine à la surface du latex. Ce procédé offre un certain nombre d'avantages sur les procédés antérieurs connus de préparation de produits de conjugaison protéine-latex.Plus précisément, le procédé selon l'invention est relativement simple et commode. I1 n'expose pas la protéine a des conditions de réaction sévères qui pourraient conduire a des changements ou des dénaturations de la molécule de protéine. I1 stagit la d'un avantage spécialement important, car de tels changements de conformation peuvent conduire à une perte d'activité. Le procédé selon l'invention permet également de décharger les groupes époxy résiduels après fixation aux protéines. Et il offre un autre avantage qui est de donner des protéines fixées sur support avec une répartition uniforme des dimensions de particules. L'expression "latex",telle qu'elle est utilisée dans la présente demande, désigne une dispersion aqueuse colloldale d'un polymère insoluble dans lteau. Les latex qu'on utilise dans la pratique de l'invention consistent en particules de polymères sensiblement sphériques un diamètre de 0,15 a 1,5/u et de préférence de 0,45 a-O ~0,90yu. La parti- cule, physiquement, consiste en un noyau interne et une enveloppe entourant ce noyau. Le noyau est polymérisé ou copolymérisé a partir de monomères "durs" tels que le styrène. L'enveloppe est formée par copolymérisation d'un ou plusieurs monomères durs avec un composé copolymérisable a insaturation éthylénique portant un cycle triangulaire époxy.Le cas échéant, et en vue de prévenir une rupture des particules, on peut copolymériser dans le noyau et/ou l'enveloppe, avec le monomere dur, un monomère " mou Telle qu'elle est utilisée dans la présente demande, l'expression "monomères durs" désigne des monomères qui donnent des polymères dont la température de transition vitreuse est supérieure a la température ambiante. L'expression "monomères mous" désigné des monomères qui donnent des polymères dont la température de transition vitreuse est inférieure à la température ambiante. Les monomères polymérisables en émulsion qu'on préfère pour le noyau sont des monomères durs qu'on peut polymériser et/ou copolymériser entre eux dans des proportions quelconques etjou avec d'autres monomères, pour former des polymères non filmogènes. L'expression "non filmogènes", telle qu'elle est utilisée dans la présente demande, s'applique a des particules polymères du latex qui ne sont pas filmogènes ou ne donnent pas lieu a coalescence dans les conditions d'utilisation. Parmi ces monomères, on citera des monomères carbocycliques monovinylidéniques et par exemple le styrène, l'a-méthylstyrene, les dérivés substitués du styrène énumérés ci-après, qui sont tous des produits de substitution sur le noyau : tertbutylstyrène, méthylstyrène, diméthylstyrène, chlorostyrene, tert-amylstyrène, bromostyrène, fluorostyrène, cyanostyrène, méthoxystyrène, éthylstyrène, hydroxyméthyls tyrène, éthoxystyrène, chlorométhylstyrène, dichlorostyrène, clîfluorostyrène, ainsi que le vinylnaphtalène et d'autres monomêres analogues polymérisables en émulsion et ne contenant pas plus de 26 atomes de carbone; des esters d'acides carboxyliques insaturation a,ss-éthyléníque donnant des polymères non filmogènes et, par exemple, les métFacrylates de méthyle, de chloréthyle, de n-butyle, d'éthyle, d'isobutyle, d'isopropyle et de phényle, les chloracrylates de butyle, de cyclohexyle, d'éthyle, de méthyle, d'isopropyle et autres esters analogues capables de donner des polymères durs; des esters à insaturation a,-éthylénique d'acides carboxyliques non polymérisables conne le benzoate de vinyle, le toluate de-vinyle, l'éthylbenzoate de vinyle, l'éthylbenzoate d'allyle (dans ces deux cas, le groupe éthyle est fixé sur le noyau), le pivalate de vinyle, le trichloracétate de vinyle et d'autres monomères analogues dans lesquels la fraction insaturée contient de 2 a 14 atomes de carbone et la fraction acide de 2 d 12 atomes de carbone; des nitriles a insaturation a,ss-éthylénique, et contenant par exemple pas plus de 12 atomes de carbone; d'autres monomères vinyliques polymérisables comme le chlorure de vinyle, le bromure de vinyle et les monomères analogues.Parmi tous ces monomères, les monomères aromatiques carbocycliques monovinylidéniques, en particulier le styrène et les mélanges de styrène, de méthacrylate de méthyle et d'acrylonitrile, sont particulièrement appréciés. Parmi les monomères mous qu'on peut ajouter le cas échéant, on citera les acrylates d'alkyle comme les acrylates d'éthyle, de butyle et de 2-éthylhexyle; les méthacrylates d'alkyle supérieur comme les méthacrylates d'hexyle et de 2-éthylhexyle; et les diènes conjugués comme l'isoprène et le butadiène. Pour le copolymère de l'enveloppe, on part de préférence d'un mélange d'un ou plusieurs monomères durs tels que décrits ci-dessus et d'un composé copolymérisable h insaturation éthylénique portant un cycle triangulaire époxy. Comme exemples particuliers de monomères époxydés, on citera des esters glycidyliques d'acides alcénolques, des oxydes d'alcenyle et de glycidyle, des oxydes de cycloalcényle et de glycidyle, des oxydes d'alcénylphényle et de glycidyle, et les monoépoxydes des monomères du type diène. Parmi les esters glycidyliques qui conviennent on citera le méthacrylate et lacrylate de glycidyle, les esters glycidyliques des acides crotoniques et des acides gras insaturés a longue chaine et acides analogues; on citera encore les oxydes d'alcényle et de glycidyle comme l'oxyde de vinyle et de glycidyle, l'oxyde d'isopropényle et de glycidyle, l'oxyde d'oléyle et de glycidyle, les oxydes d'allyle et de glycidyle et de méthallyle et de glycidyle et les oxydes analogues; on citera encore, parmi les oxydes de cycloalcényle et de glycidyle et les oxydes d'alcénylphényle et de glycidyle, l'oxyde de 4-vinylcyclohexyle et de glycidyle, l'oxyde de p-vinylbenzyle et de glycidyle, l'oxyde d'o-allylphényle et de glycidyle et les monomères analogues; parmi les monoépoxydes de monomères du type diène, on citera le monoépoxyde de butadiène, le monoépoxyde de chloroprène, le 3,4-époxy-1-pentène, le 4,5-époxy-l-pentène, le 4,5-époxy-2-pentène, le 4,5-époxy-l-hexène, le 3 > 4-époxy-l-vinylcyclo- hexène, le mono-oxyde du divinylbenzène et les monomèresanalogues. La quantité exacte de monomères époxydiques nécessaire pour préparer les latex conformément a l'invention est fonction de la quantité de groupes époxy superficiels nécessaire pour un couplage optimal avec la protéine envisagée. Ainsi, par exemple, pour coupler de la gonadotropine chorionique humaine à un latex de styrène-méthacrylate de glycidyle, on obtient des résultats satisfaisants avec une densité de sites de couplage d'environ un motif époxy pour une surface de 5 à 40 angstroms carrés ( ); on obtient les meilleurs résultats une densité d'environ un motif époxy pour 8 a 20 . Cette meme densité des sites de couplage conviendrait également pour d'autres protéines telles que l'insuline par exemple.A la préparation de protéines fixées sur des latex pour l'utilisation dans -des tests immunologiques, on a constaté que des latex monodispersés, c'est-a-dire des latex présentant une dimension de particule pratiquement uniforme, donnaient de meilleurs résultats parce que l'uniformité de dimension assure une répartition statistique égale des molécules d'antigène ou d'anticorps a la surface des particules du latex. Pour un poids de polymère déterminé, la surface spécifique totale du latex augmente lorsque la dimension de particule diminue et inversement. Ainsi, dans un latex à une répartition de dimensions de particules variées > les particules les plus petites ont une plus grande surface spécifique et, par conséquent, offrent au total plus de sites de réaction que les particules plus grosses. La répartition inégale de l'antigène ou de l'anticorps sur les particules du latex conduira à une agglutination inégale des particules et à des résultats de diagnostic mal définis. Un autre avantage de l'utilisation de particules uniformes de latex en tant qu'agents de diagnostic réside en ce que ces particules conviennent mieux à l'analyse instrumentale. Des particules de dimension uniforme floculent, s'agglutinent ou sédimentent à la même vitesse, alors que les particules de dimensions différentes s'agglutinent à des vitesses variables. Ainsi donc, une méthode instrumentale basée sur l'absorption ou la transmission de lumière au travers d'une suspension agglutinée de latex sera plus exacte, plus reproductible et plus facile à normaliser et à interpréter avec des particules uniformes de latex qu'avec des latex ayant des dimensions de particules variées.Les produits de conjugaison de gonadotropine chorionique humaine et du latex de styrèneméthacrylate de glycidyle selon l'invention n'ont pratiquement pas varié dans leur activité immunologique après conservation pendant des durées atteignant un an à une température d'environ 4 à 6"C. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter; dans ces exemples, les indications de parties et de pourcentages s'entendent en poids, sauf mention contraire. On décrira d'abord la préparation de trois latex monodispersés de styrène-méthacrylate de glycidyle. Pour ces préparations, on est parti de latex de polystyrène monodispersés du commerce sur lesquels on a polymérisé un mélange de styrène et de méthacrylate de glycidyle. h=sMPtE 1 1 Dans un ballon de 1 a 3 tubulures équipé d'un agitateur, d'une tubulure d'introduction d'azote et d'un condenseur, on place les constituants ci-après Poids sec Poids humide, parties parties latex de polystyrène (dimension de 60,5 188 particule (0,761u) dihexyl-sulfosuccinate de sodium 0,3 6 persulfate de potassium 0,3 6 bicarbonate de sodium 0,3 6 styrène 45 45 méthacrylate de glycidyle 15 15 eau - 134 On agite le mélange de réaction et on purge le ballon à l'azote pendant 10 à 20 min. On porte la température de réaction à 65 C et on maintient à ce niveau pendant 4 h sous pression d'azote. On refroidit le latex obtenu et on le filtre.La dimension de particule moyenne de ce latex, déterminée au microscope électronique, est d'environ 0,91/u (diamètre). EXEMPLE 2 En suivant le mode opératoire général de l'exemple 1 ci-dessus, on prépare à partir des constituants ci-après un latex monodispersé présentant une dimension de particule moyenne d'environ 0,59/u. Poids sec, Poids humide, parties parties latex de polystyrène (dimension de 30,1 95 particule 0,503/u) dihexyl-sulfosuccinate de sodium 0,15 3 persulfate de potassium 0,15 3 bicarbonate de sodium 0,15 3 styrène 15 15 méthacrylate de glycidyle 15 15 eau - 266 EXEMPLE 3 On suit le mode opératoire général des exemples 1 et 2 pour la préparation d'un latex monodispersé présentant une dimension de particule moyenne de O 0,20/u (de diamètre) à partir des constituants ci-après Poids sec, Poids humide, parties- parties latex de polystyrène (dimension de 30 300 particulé 0,176/u) dihexyl-sulfosuccinate de sodium 0,15 3 persulfate de potassium 0,15 3 bicarbonate de sodium 0,15 3 styrène 15 15 méthacrylate de glycidyle 15 15 eau - 61 Pour chacun des latex préparés ci-dessus, on a déterminé la teneur en groupes époxy exprimée en milliéquivalents de groupes oxirane par g o2 et par la surface en A par groupe oxirane. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau ci-dessous. TABLEAU Latex de Dimension dc 2 , \ Milliéquivalents de l'exemple n0 particule, /U A /^CH-CH2 groupes I'exemple ~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ CH-CH2/g 1 0,907 15,0 0,07 2 0,592 9,4 0,17 3 0,201 17,0 0,278 Pour la détermination de la teneur en groupes oxirane en milliéquivalents par g de polymère, on a traité un échantillon de latex contenant une quantité connue de polymère par une quantité connue d'iodure d'hydrogène.On a titré en retour l'excès d'iodure d'hydrogène restant dans le latex a l'aide d'une solution étalon de nitrate d'argent, d'où l'on a déduit la quantité d'iodure d'hydrogène qui a réagi avec les groupes époxy et, par le calcul, le nombre de milliéquivalents de groupes époxy. Les latex préparés comme décrit ci-dessus se sont avérés convenir a l'utilisation dans la pratique de l'invention. On a couplé des échantillons de chacun de ces latex avec de la gonadotropine chorionique humaine (en abrégé ci-après HCG). Cette hormone est une glycoprotéine qui gouverne la production et la sécrétion de progestérone par le corps jaune. Elle est normalement sécrétée par le tissu chorionique du placenta au cours de la grossesse. L'HCG fixée sur latex peut & re utilisée dans le diagnostic de la grossesse. EXEMPLE 4 On ajoute sous agitation une solution contenant 5.000 UI de HCG dans 7 ml de tampon phosphaté a pH 8,0 (I = 0,05; NaCl 0,1 M; 1:10.000 thimerosal) dans un ballon de 25 ml siliconé contenant 1,61 g du latex de styrène-méthacrylate de glycidyle préparé dans l'exemple 1 ci-dessus. On agite la suspension de latex pendant 4 jours a la chambre froide (50C). On lave le mélange de réaction par filtration sur membrane pendant 3 h environ dans une cellule à filtre de Diaflo avec 145 ml de tampon phosphaté. Le latex lavé et les rinçages sont dialysés sur Cellophane contre du tampon 0,1 M a la glycine, pH 8,2.Après 2 jours de dialyse > on obtient 16,4 g du produit de conjugaison HCG-latex de styrène-méthacrylate de glycidyle, présentant une sensibilité de détection de 0,9 UI HCG/ml. EXEMPLE 5 Le produit de cet exemple est préparé par un mode opératoire identique à celui de l'exemple 4, a l'exception des détails ci-après. Au bout de 3 jours, le mélange de réaction est traité par 1 ml de tampon a la glycine, pH 8,2, pour décharger des groupes époxy résiduels. Après agitation pendant encore une journée a froid, on lave 9,9 g du mélange de réaction par filtration sur membrane avec 188 nil de tampon phosphaté a pH 7,0 (I = 0,05; NaCl 0,1 M). Le produit obtenu et les rinçages sont traités par 13 mg d'azothydrure de sodium servant de préservateur. Le produit obtenu a une sensibilité de détection de 1,8 UI HCG/ml. EXEMPLE 6 On place 3,08 g du latex préparé dans l'exemple 2 (0,46 g de polymère) dans un ballon de 25 ml équipé d'un agitateur magnétique revêtu de Téflon. On ajoute lentement dans le ballon une solution contenant 5.000 UI de HCG dans 8 nil de tampon phosphaté froid a pH 8 (I = 0,05; NaCI 0,1 M; 0,01% de thimerosal). On agite avec modération pendant 90 a 96 h a & 5 C environ. On lave le produit de conjugaison HCG-latex avec 110 a 115 nil de tampon phosphaté par ultrafiltration pendant 70 a 110 min environ. Le produit de conjugaison latex-HCC et les rinçages combinés sont dialysés sur Cellophane a soc pendant 24 h. Le produit obtenu par ce procédé présente une sensibilité de détection de 0,9 a 1,8 UI HCG/ml. Toujours par les memes modes opératoires, on a couplé 1'HCG au latex de l'exemple 3. On a préparé toujours par le même mode opératoire d'autres échantillons de produits de conjugaison HCG-latex. Les facteurs qui se sont avérés importants, affectant la qualité du produit final, sont discutés ci-après. Les exemples ci-dessus décrivent la mise en oeuvre de l'invention. Parmi les autres facteurs qui se sont avérés agir sur le couplage de 1'RCG au latex monodispersé de styrène-méthacrylate de glycidyle, on signalera l' ge du latex et la manière de conserver le latex avant le couplage. Le latex doit etre conservé sous réfrigération et utilisé dans des réactions de couplage aussitôt que possible. Le latex de l'exemple 2 ci-dessus s'est avéré donner des résultats satisfaisants dans la réaction de couplage avec 1'HCG après conservation pendant une durée atteignant un mois sous réfrigération. A la préparation de produits de conjugaison HCG-latex présentant une activité ilumunologique, on a constaté que la source de HCG constituait un facteur important pour la sensibilité. Les préparations deHCG venant du commerce doivent faire l'objet de contrôles permettant de déterminer celles qui conviennent le mieux pour les applications particuluères. Bien que I'on puisse coupler avec le latex des quantités variables de protéines, on n'obtient pas les meilleurs résultats en fixant des quantités maximales de HCG au latex.Bien que l'on puisse travailler avec d'autres quantités, les quantités de HOG qu'on préfère pour l'utilisation dans la réaction de couplage sont d'environ 1.000 a 25.000 Ul par g de polymère; la quantité préférée est d'environ 11.000 UI par g de polymère. La concentration préférée pour les matières solides polymères a la réaction est d'environ 4 à 5%. En général, la réaction de couplage est effectuée a un pH 7,5 à 8,5 et de préférence d'environ 8,0. On utilise en général un tampon phosphaté pour le couplage de 1'HCG au latex. Avec des protéines telles que 1'HCG contenant de fortes proportions d'hydrates de carbone, les tampons au borate, en général, ne conviennent pas. On a également constaté qu'on pouvait ramener la durée de la réaction de couplage à environ un jour ou moins en opérant a température ambiante au lieu de-50C comme dans les exemples ci-dessus. Toutefois, si l'on n'utilise pas d'appareil de réfrigération, il faut surveiller correctement les risques de contamination microbienne. Après couplage de 1'HCG sur le latex, il est essentiel d'éliminer du mélange de réaction 1'HCG qui n'a pas réagi et les autres impuretés. L'ultrafiltration suivie d'une dialyse sur Cellophane ou une centrifugation a haute vitesse suivie d'une dialyse sur Cellophane donne un produit satisfaisant. La dialyse sur fibres creuses, bien qu'elle puisse encore Btre exploitée, est moins efficace dans l'élimination de l'excès de HCG du mélange de réaction. Si le produit de conjugaison final HCG-latex est tamponné a l'aide du tampon préféré, le tampon a la glycine a pH 8,2, il est inutile de décharger les groupes époxy résiduels. Si toutefois, on désire un système tampon neutre, il est recommandé de procéder a une opération supplémentaire de décharge des groupes époxy résiduels (comme décrit dans l'exemple 5 ci-dessus) En général, on a constaté qu'un vieillissement du produit de conjugaison final HCG-latex améliorait nettement son activité immunologique. La durée de vieillissement nécessaire pour parvenir a l'activité immunologique optimale dépend de la température de ce vieillissement : plus basse est la température et plus longue est la durée de vieillissement.On a obtenu des résultats satisfaisants avec un produit vieilli pendant 3 à 5 jours a une température d'environ25"C. Si le produit est conservé a 5"C environ, il faut le conserver pendant deux semaines environ pour parvenir à I'activité optimale. Le produit de conjugaison HCG-latex peut être introduit dans un nécessaire contenant tous les réactifs indispensables la recherche immunologique de la grossesse. Un tel nécessaire contiendrait une première composition réactive constituée du produit de conjugaison HCG-latex selon l'invention et une seconde composition réactive constituée de sérum anti HCG tamponné, en général obtenu à partir de lapins blancs de Nouvelle Zélande (cf. J. Clin. Endocr. 33, 988 (1971)). Les réactifs fondamentaux peuvent également être accompagnés de composants auxiliaires tels qu'une plaque de verre opaque portant des surfaces creuses pour le mélange et un bâtonnet applicateur. Lorsque le produit de conjugaison est destiné à servir dans des applications immunologiques, il peut également etre avantageux de colorer les particules du latex avant couplage avec la protéine afin de faciliter la détection de l'agglutination. On parvient facilement a ce résultat en mélangeant le latex avec une solution de colorant contenant un solvant capable de pénétrer dans les particules du latex. Ainsi, par exemple, le colorant du commerce Calco Oil Blue N de la Firme American Cyanamid, en solution dans du benzène, a donné des résultats satisfaisants. Avant couplage avec la protéine, le benzène est éliminé à l'évaporateur. Les exemples qui suivent décrivent le couplage de l'insuline sur un latex styrène-méthacrylate de glycidyle. EXEMPLE 8 On introduit 2,5 g du latex préparé dans l'exemple 1 (0,75 g du polymère) dans un flacon contenant 2,5 ml de solution d'insuline (15 mg d'insuline) et on ajoute 5 gouttes de solution 0,1 N d'hydroxyde de sodium. Le pH final est de 8. On agite le mélange de réaction a 5 C pendant 90 h puis on lave 4,4 g du mélange de réaction en latex (4,8 g au total) par filtration sur membrane dans une cellule à filtre Diaflo avec filtre Nillipore de O,l/u et tampon au borate pH 8. On travaille à une pression hydrodynamique atteignant 3,5 kg/cm2 et on examine l'effluent aux rayons ultraviolets pour déterminer la présence d'insuline non couplée. On poursuit la filtration jusqu'a ce qu'on ne trouve plus d'insuline dans 1'effluent. L'électrophorèse sur couche mince confirme que l'insuline est fixée chimi quement sur le latex. EXEMPLE 9 On ajoute 6,3 g de latex de l'exemple 1 ci-dessus (0,92 g de polymère) une solution contenant 7,33 mg de peroxydase de raifort dans 10 ml de sérum physiologique tamponné au phosphate a pH 8. On couvre le mélange et on agite pendant 5 jours environ d 50 Les résultats obtenus sont rapportés ci-après Echantillon n" Durée de réaction Densité optique * (min et s) 1 4 min 55 s 0,53 2 5 min 17 s 0,62 3 9 min 1-7 s 0,65 4 10 min 13 s 0,005 (liquide surnageant) i A 400 nanomètres Les résultats obtenus font apparaître une très faible activité enzymatique (oxydation de la dianisidine) dans le liquide surnageant du mélange de réaction (échantillon nO 4). Ainsi donc, l'activité enzymatique du produit peroxydase-latex est due essentiellement l'enzyme immobilisée sur les particules du latex et non à de la peroxydase résiduelle soluble se trouvant dans le liquide surnageant. REVENDICATIONS 1. Procédé pour coupler une protéine portant un groupe réactif qui contient un atome d'hydrogène labile sur un latex, caractérisé en ce que les particules dudit latex ont un diamètre d'environ 0,15 a 1,5 micron et sont constituées d'un noyau intérieur et d'une enveloppe extérieure, ledit noyau intérieur étant formé par polymérisation ou copolymérisation d'un ou plusieurs monomères durs et ladite enveloppe extérieure étant formée par copolymérisation d'un ou plusieurs monomères durs et d'un composé copolymérisable à insaturation éthylénique portant des groupes époxy libres, ledit noyau. et ladite enveloppe contenant facultativement un monomère mou copolymérisé, ce procédé consistant en ce que l'on fait réagir ledit latex et ladite protéine a un pH de 7,0 a 9,0 pendant une durée suffisante pour former une liaison covalente entre le groupe réactif de la protéine et le groupe époxy libre du latex, après quoi on élimine la protéine qui n'a pas réagi du produit de conjugaison protéine-latex. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le latex est un latex monodispersé et le groupe réactif de la;grotéine est un groupe amino. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le latex est un latex de styrène-méthacrylate de glycidyle. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la protéine est la gonadotropine chorionique humaine. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la protéine est l'insuline. 6. Procédé-selon la revendication 3, caractérisé en ce que la protéine est une enzyme. 7. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la densité des sites de couplage du latex styrène-méthacrylate de glycidyle correspond environ un motif époxy pour 5 à 40 Angstroms carrés de la surface spécifique de la particule et en ce que la quantité de gonadotropine chorionique humainS utilisée pour la préparation du produit de conjugaison protéine-latex, est de 1 000 à 25 000 Unités Internationales par gramme du polymère. 8. Produit de conjugaison protéine-latex obtenu par le procédé selon la revendication 1 ou 2. 9. Produit de conjugaison protéine-latex selon la revendication 8 caractérisé en ce que la protéine consiste en gonadotropine chorionique humaine et le latex est un latex de styrène-mé thacrylate de glycidyle. 10. Produit de conjugaison protéine-latex selon la revendication 8, caractérisé en ce que la protéine est l'insuline et le latex est un latex de styrène-méthacrylate de glycidyle. 11. Produit de conjugaison protéine-latex selon la revendication 8, caractérisé en ce que latex est coloré. 12. Nécessaire pour les tests immunologiques de recherche de la grossesse, ce nécessaire comprenant un premier réactif contenant un latex de styrène-méthacrylate de glycidyle monodispersé sur lequel on a fixé de la gonadotropine chorionique humaine et un second réactif contenant du sérum antigonadotropine chorionique humaine.