Brevet FR2439820A1 — publié le 19800523

La présente invention concerne essentiellement un système de diagnostic d'identification microbienne. Plus particulièrement, la présente invention c=eme un procédé d'identification des espèces Neisseria, spécialement N. gonorrhoeae et N. Menlngitidis. La présente invention concerne en autre les réactifs à employer dans le procédé et un dispositif pour la mise en oeuvre du procédé, incluant une bande d'essai ou de test réalisée à partir d'un grand nombre de petits réceptacles ou de petites chambres de réaction contenant chacune un substrat synthétique et un tampon et étant adapté pour contenir un inoculum d'essai pendant l'incubation. L'incidence de la gonorrhée a atteint des proportions épidémiques. Il s'estproduit environ trois millions de cas de gonorrhée aux Etats-Unis en 1975. Un système pour l'identification rapide de N. gonorrhoeae sera une aide importante pour l'identification de l'infection et le traitement subséquent du patient. Le terme "gonorrhée" englobe toutes les infections provoquispar le gonoque Neisseria gonorrhowae. Lisolatron accruede N. gonorrhoeaeà partir de sites non génitaux, ainsi que l'isolation de N. méningitidis et de N. lactamica à partir de sites génitaux présente un problème au laboratoire clinique. Toutes ces espèces de Neisseria auront une croissance sur des milieux employés pour l'isolation de N. gonorrhoeae. En conséquence les isolants devront être en outre caractérisés pour rendre certaine l'identiX de l'organisme. Les techniques conventionnelles pour identification de N. goncrrho.eseimpliquent la culture sur un spécimen sur un milieu sélectif suivi par un test utilisant une oxydase, un essai de coloration Gram et une étude de morphologie pour obtenir une identification par présomption de N. gonorrhoeae. La confirmation dtidentification par des techniques conventionnelles requière une incubation supplémentaire sur un milieu d'enrichissement non sélectif, tel. qu'une plaque agar chocolatée, pour obtenir une croissance suffisante pour les essais confirmatoires. Une incubation de 18 à 24 heures est requise pour obtenir une croissance suffisante. L'excrois sance du milieu précédant est inoculéeà un milieu de dégradation carbohydraté qui consiste habituellement d'une batterie de carbohydrates : les sucres glucose (dextrose), maltose, sucrose, fructose, lévulose et lactose dans une base agar cystine-trypticase avec un indicateur au rouge de phénol.Ilssont incubés dans des conditions aerobie comme requis pour une dégradation par carbohydrate pendant deuxJours au cours deszEls lescarbohydrates peuvent être convertis en produits finis acides. La présence d'acide est détectée par la modification de couleur d'un indicateur, tel que le phénol rouge, dont la couleur passe du rouge au jaune, qu'indique une réaction positive. La technique conventionnelle de confirmation peut requérir jusqu'à trois jours. De tels procédés sont connus pour identification plus rapide de N. zonorrhoeaeo Les procédés rapides connus utilisent une isolation primaire sur un milieu sélectif, comme dans la technique conventionnelle suivie par une inoculation d'une plaque d'isolation primaire pour faire croitre l'inoculum. Les milieux de dégradation par carbohydrate sont ensuite inoculés avec une suspension très dense des bactéries et incubés dans un bain d'eau pendant cinq jours pour produire une réaction acide. C'est-à-dire, ils emploient une petite quantité du substrat, une suspension de bactéries très dense et accélèrent la réaction. Les procédés ne dépendent pas de la croissance de l'organisme dans ces conditions mais dépendent de la présence de l'enzyme préformé qui dégradera les divers substrats. Le milieu modifié Thayer-Martin (MTM) a été largement accepté pour l'isolation primaire du gonocoque et du méningonocoque à partir des sites où ces organismes sont depuis longtemps surpassés en nombre par la flore bactérienne naturelle (Thayer, J.D., et Martin, J.E., Jr. : fllmproved Medium Selective for the Cultivation of N. gonorrhoeae and N. meningitidis". Public Health Rep. 81 : 559-562, Juin 1966). Dans le milieu TM, la surcroissance par des bactéries grampositive et g ram-négative est évitéepar l'addition de vancomycine pour inhiber les contaminants gram-positifs, le colistiméthate de sodium pour la flore gram-négative et la nystatine pour inhiber la levure, qui est parfois une nuisance dans les cultures vaginales et rectales. Le milieu MTM, parcequ'il contient des agents anti-microbiens, supprime la croissance des bactéries et des fonges et de Neisseria autre que N. gonorrhoeae, N. meningitidis et N. lactamica. Des spécimens suspectés pour contenir un gonocoque (GC) ou méningonocoque sont plaqués sur un milieu MTM et incubés sous atmosphère de dioxyde de carbone à 350C pendant trois jours. Les isolats sont choisis parmi l'excroissance pour identification positive. Cependant, 11 identification des organismes après isolation sur le milieu MTM reste incommode et nécessite du temps. Une purification prend 24 heures suivie par une période supplémentaire de 5 à 48 heures pour l'identification. Ainsi, ldentification (après isolation sur MTM) requière un minimum d'approximativement 30 heures et parfois quatre jours selon le caractère fastidieux de l'organisme et la nature des essais d'identification employés. Après l'isolation sur milieu MTM, un milieu d'enrichissement, typiquement une plaque agar chocolatée, on inocule et incube pendant 18 à 24 heures pour obtenir une excroissance suffisante d'inoculum pour des essais de confirmation. Une fois qu'une excroissance suffisante est disponible on réalise et on emploie un inoculum d'excroissance dans l'eau pour inoculer un mil eu de dégradation par carbohydrate qui consiste habituellement d'une batterie de glucose, sucrose, fructose et sucres analogues. Le but de la dégradation par carbohydrate est de produire des acides à partir de glucose et d'autres sucres lorsqu'ile sont testés dans un milieu agar cystine-Tryptcase (CTA). Un système plus rapide pour l'identification de N. gonorrhoeaea été développé par Kellogg et Turner. (Kellogg, D.S., Jr. and E.M Turner. 1973 2'Rapid Fermentation Confirmation of N:issera Gonorrhoeae" Appl. Microbiolç 25 : 550-552.). Avec le système CTA employant des sucres CTA on réalise une incubation dans l'air à 350C pour promouvoir la croissance de l'organisme. Au fur et à mesure que l'organisme croit, il élabore un enzyme qui dégradera le sucre. Au fur et à mesure que le sucre se dégrade, les produits finis acides sont produits. On détecte la présence d'acides par un indicateur. Dans le système Kellogg la croissance de l'organisme est incidente, et le but est de détecterun enzyme préformé qui devrait être déjà présent. Le système Kellogg utilise une petite quantité de substrats consistant des mêmes sucres carbohydrates employés dans les essais CTA. Kellogg utilise des suspensions cellulaires denses et une solution de sel tamponné pour détecter plus rapidement la signification.La confirmation de la culture comme No goaorrhoeee est disponible dans les 5 heures après qu'on ait inoculé avec succès une plaque de purification avec une colonie en suspension à partir de MTM et qu'on ait incubé pendant 18 à 24 heures. Des facteurs de complication à la fois des essais de digestion des carbohydrates par croissance et non-croissance consistent en ce que le maltose contient fréquemment des quantités excessives de substances contaminantes facilement fermentables qui donneront des mauvais résultats positifs. Egalement, une sous-culture des colonies isolées à partir de MTM sur des plaques chocolatées est nécessaire de façon à réaliser une croissance suffisante pour un inoculum important. Dans la procédure Kellogg on emploie seulement du glucose, du maltose, du sucrose et du lactose et on omet du fructose. La dégradation du glucose caractériserait seulement un isolat comme étant N. gonorrhoea tandis que la dégradation supplémentaire de maltose et d'aucun autre carbohydrate indiquerait N. meningitidis. Le lactose est dégradé seulement par N. lactamica qui se distingue ainsi de N. méningitidis. Une amélioration du procédé Kellogg est décrite par W. Jerry Brown (Brown, MçJ.1974. Modification of the rapide Fermentation Test for Neisseria gonorrhoeae. Appl. Microbiol. 27 : 1027-1030). Brown modifie les solutions de sel tamponné et emploie un inoculum plus lourd ou plus important pour fournir un procédé qui produit une identification positive dans les 4 heures. La modification Brown du procédé Kellogg utilise les même substrats se produisant naturellement comme Kellogg0 On a décrit récemment un procédé de réalisation d'une identification positive en 1 à 4 heures (Morse S.A. et L. Bartenstein, 1976. "Adaptation of the Minitek System for Rapid Identification of Neisseria gonorrhoeae". J. Clin. Microbiol. 3 : 8-13). Minitek produit et vend des plaques microtitrées qui contiennent des creux superficiels. Dans chacun des creux est placé un disque qui contient des substrats naturels à l'état sec. Les carbohydrates sont encore du glucose, du maltose,du lactose et du sucrose comme ils ont été traditionnellement employés. Les creux sont inoculés avec une suspension dense de bactéries obtenues à partir d'une plaque de purification. Le système Minitek est basé sur la production d'acides à partir de carbohydrate et utilise le bicarbonate de sodium comme tampon pour faciliter la lecture de la rédaction négative.Les disques employés dans le papier Morse et al. ci-dessus emploierstcomne substrats du dextrose-nitrate, du dextrose, du maltose, et du onitrophényl- P -D-galactopyranoside, (ONGP). A des densités cellulaires très élevées(supérieures à 5,0 X 109unités de formation de colonies par millilitre) des réactions positives pourraient être lues dans les 30 mn. 90% des isolats produisent de l'acide détectable à partir du glucose dans les 4 heures. Tous les isolats sont identifiés en 6 heures. Tous les isolats identifiés avec le milieu CTA sont également identifiés par le système Minitek. En outre, la procédure Minitek identifie davantage d'isolats de N. gonorrhoéoe et de N. méningitidis que ceux qui étaient identifiés avec le milieu CTA. Quelques réactions négatives fausses sont occasionnellement observées souvent dfles à un inoculum ayant une faible densité cellulaire, On rencontre des réactions négatives fausses lorsque les inoculatssont préparés directement à partir du milieu de transcroissance ou de plaque T-M employées dans l'isolation initiale de l'organisme. Morse a surmonté le problème en réduisant is isolats sur une moitié d'une plaque agar GC et en incubant toute la nuit. Le procédé Minitek requière uri inoculum réalisé à partir d'une plaque de purification incubée pendant 18 à 24 heures. On pense habituellement que la réaction ONPG est équivalente de la fermentation au lactose0 Si un organisme a la capacité d' hydrolyser le substrat ONPG et de donner une modification de couleur il est habituellement positif au lactose dans des fermentations au sucre CTA pour le lactose. Le N. lactamica est le seul Neisseria présentant un interêt qui peut être différencié à partir de N. meningitidis et de N. gonorrhoéee qui a la capacité d'hydrolyser à la fois l'ONPG synthétique et le ferment de lactose dans un essai de fermentation par sucres conventionnel. Ces organismes sont habituellement capables de crotte sur un milieu MTM, N. gonorrhoe , N. meningitidis N. lactamica, N. gonorrhoeae et N. meningitidis sont habituellement classés comme les seuls deux pathogènes du Neisseria. N. lactamica est habituellement isolé et est habituellement un saprophyte. La différenciation de N. meningitidis à partir de N. lactamica est basée suer la dégradation de lactose ou le test ONPG. Le N. meningitidis et le N. lactamica peuvent à la fois dégrader leglucose et le maltose. 128 sont à la fois des organismes positifs aux oxydases, les diplocoques gram-négatifs capables de croître sur un milieu MTM. L'essai différentiel entre le N. meningitidis et le N. lactamica estl'essai ONPG ou l'essai de dégradation de lactose. Le N. lactamica peut lthydrolyser 1'ONPG et décomposer ou dégrader le lactose; le N. meningitidis ne le peut pas. D'autres espèces de Neisseria peuvent croître éventuellement sur milieu MTM mWis habituellement ne le font pas. Cependant, s'ils ont une croissance sur MTM, avec la technologie existante ils sont facilement différenciés de N. gonorrhoeae, N. meningitidis, N. lactamica par les essais de dégradation de carbohydrate. Les espèces Branhamella et Moraxella peuvent également croître sur milieu MTM mais habituellement ne le font pas. Si elles le font, elles peuvent être différenciées de N. gonorrhoeae, N. meningitidis et N. lactamica par le fait que ces organismes ne dégradentpoe de carbohydrate et ne produisent pas d'acide. Ils ont été étudiés pour déterminer leur schéma enzymatique avec les substrats synthétiques de la présente invention Morphologiquement, ils sont similaires au Neisseria , et ils sont positifs aux oxydases. Les buts ou objets de la présente invention sont atteints et réalisés avec un dispositif d'identification rapide de microorganismes comprenant une base formant support, une pluralité de chambres de réaction miniatures supportées fixement par ladite base,un substrat sec disposé dans chacune desdites chambres de réaction, lesdits substrats étant présents en une quantité comprise entre 25 et 50 nanomoles par chambre de réaction et consistant d'un aminoacide couplé à un chromogène, et un tampon séché disposé dans chacune des chambres de réaction et consistant de 1 à 500 nanomoles d'un tampon choisi parmi une classe consistant de Tris-HCt, Tris-malate et tampon de phosphate contenant K2HPO4, KH2P04 et un polyvinylalcool, grâce auquel par addition de colorant diazoïque dans une solution aqueuse avec un solvant polaire comme agent de détection et un inoculum à identifier et l'incubation jusqu'à 5 heures à 350C, le microorganisme peut être identifié en comparant les réactions positives et négatives se produisant avec un profil , schéma ou graphique d'identification prédéterminé Les buts ou objets de la présente invention par rapport à des microorganismes particuliers sont réalisés avec un dispositif d'identification rapide de Neisseria gonorrhoeae et de Neisseria Meningiditis comprenant une base formant support, une pluralité de chambres de réaction supportées fixement par ladite base, u! substrat sec disposé dans chacune des chambres de réaction consistant de 25 à 50 nanomoles par chambre d'un aminoacide naphtylamide, et de 1 à 500 nanomoles par chambre d'un tampon. a méthode de la présente identification diffère de i'art antérieur dans l'utilisation dsubstrats synthétiques plumet que dans les substrats se produisant naturellement ou dans l'application de substrats colorimétriques spécifiques. Les substrats sont sélectivement hydrolysés par des enzymes pendant l'inoubation. Ces activités enzymatiques ne peuvent pas être appliquée pour l'emploi dans l'identification de Neisseria en microtiologie. Les classes d'enzyme peuvent être des aminopeptidases, des lipases, des phosphatases, des phosphodiestérases, des arylaminoacidehydrolases, des aryl et alkylamidases et des glycosidasesO Le procédé de la présente invention permet l'identifiéa- tion de N. gonorrhoeae plus rapidement que soit la technique conventionnelle soit les procédés rapides connus. Dans le procédé de la présente invention, on inocule un spécimen sur un milieu sélectif, tel que le milieu MTM.L'étape de purification de croissance sur un milieu non sélectif, teille que agar chocolaté, est éliminée. Lorsqu'on détecte la croissance sur le milieu sélectif, on réalise une inoculation sur un substrat synthétique La présente invention est basée sur des réactions enzymatiques utilisant des substrats chromogènes. Les substrats synthétiques employés dans le présent procédé sont disponibles commercialement. Au fur et à mesure que l'organisme hydrolyse les substrats synthétiques, un produit est libéré qui peut être détecté par un indicateur. Les substrats qui sont employés dans la pratique de la présente invention sont les suivants : Enzyme Abréviations Substrats détecté d'enzyme 1) ss-naphthyl-ss,D-galactopyranoside ss-galactosidase BGAL 2)N-L- -glutamyl- -naphthylamide ;; -glutamyl aminopeptidase A GAM 3)L-hydroxyproline-ss-naphthylaminde hydroxyproline aminopeptidase OHPAP 4) L-serin -naphthylamide serine aminopeptidase SAP 5) L-arginine- p-naphthylamide arginine aminopeptidase AAP 6) glycine-glycine- -naphthylamide glycyl-glycine aminopeptidase GAP 7) -naphthyl-phosphate acide phosphatase AP 8)p -naphthyl-valérate valérase VAL 9)4-méthoxyleucine-ss-naphthylamide 4-méthoxyleucine aminopeptidase 4-LEU i o) glycine- p-naphthylamide glycine aminopeptidase GLY Des solutions de stockage de substrat sont préparées en dissolvant le substrat dans une solution 0,1 M d'un sel de Tris (hydroxy-méthyl) aminométhane (dénomméci-après en abréviation "TRIS") contenant 0,5 % en poids de polyvinyl alcool (PVA), et en tampon à un pH prédéterminé comme montré au Tableau B. Tableau B Substrat TRIS-sel pH préféré domaine de pH 1 TRIS-HCl 6,8 5,0 - 7,9 2 TRIS-Malate 7,6 6,3 - 8,3 3 TRIS-Malate 7,2 6,3 - 8,0 4 TRIS-Malate 7,2 6,3 - 7,5 5 TRIS-Malate 8,0 6,8 - 8,4 6 TRIS-Malate 8,0 6,8 - 8,4 7 TRIS-HCl 5,5 5,2 - 5,8 8 TRIS-Malate 7,6 6,5 - 8,1 9 TRIS-Phosphate 7,6 6,0 - 8,1 10 TRIS-Phosphate 8,0 6,8 - 8,4 Toutes les solutions de stockage de substrat sont d'une concentration 1 X 10 3molaire (M). Cinquante microlitres de chacune des solutions de substrat sont dispensées dans une cupule sur une bande d'essai. De préférence, un indicîum est imprimé sur la bande d'essai identifiant l'enzyme qui doit être formé dans la cupule adjacente.Les concentrations finales des réactifs dans chaque cupule sont de 0,05 X i -6 moles du substrat et de 5,0 X 10 6 moles du tampon Tris. Les bandes sont séchées sous vide ou dans l'air en dessous de 500C, Lorsqu'elles sont séchées le substrat et les bourrelets ou tampons adhérents à un renforcement poreux. Les tampons suivants sont appropriés pour être substitués aux tampons Tris et phosphate. 1. TES - N - Tris-(hydroxyméthyl)méthyl-3-aminopropane sulfonate. 2. HEPES - N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'2-éthane sulfonate. 3. HEPPS - N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-3-propane sulfonate. 4. CHES - acide cyclohexylaminoéthane sulfonique. 5. CARBONATE - carbonate de sodium ou de potassium, 6. BORATE - borate de sodium ou de potassium. Les tampons sont préparés dans une solution aqueuse contenant 0,2% de PVA pour obtenir une concentration finale de 0,5 M après ajustement de pH. De préférence chacun desdits substrats est placé dans une cupule séparée dMne bande d'essai tel que montré dans les dessins qui ne sont donnés qu'à titre d'exemple et ne sauraient donc en aucune façon limiter la portée de la présente inveri;fon. Dans les dessins - la figure 1 est une vue en perspective d'une bande d'essai biochimique ayant dix chambres réactionnelles individuelles - la figure 2 est une vue en perspective de 1 'une des chambres réactionnelles individuelles - la figure 3 est une vue en coupe selon la ligne III-III de la figure 1. En référence aux figures, la bande d'essai 10 est faite d'un élément 12 supérieur rigide ayant une pluralité d'ouvertures 14 dans lesquelles est insérée une chambre de réaction, ou cupule, 16 qui est maintenùe en place par un élément de renforcement 18, qui peuvent être réunis ensemble par un adhésif ou par fusion thermique, ou les deux sont formés à partir de matériaux appropriés, tels qu'une résine thermoplastique. La structure de la chambre de réaction, ou cupule, est montrée à la figure 3. Dans l'exemple représenté, la cupule 7 a une base 20 et une paroi 22 qui est, c)aisunmode de réalisation représenté actuellement préféré, ronde. Un rebord ou une flasque 24 est formée autour de la base, de préférence avec une collerette ou anneau périphérique replié. Le rebord ou épaulement est engagé entre l'élément supérieur 12 et l'élément de renforcement 18 et sert à tenir la cupule fermement en place dans la bande d'essai assemblée. Un tampon 26 est fixé au fond de la cupule 16. Le tampon est de préférence un ouvrage en cellulose blanche, mais peut être un polymère chlorure de polyvinyle ou d'autres matériaux appropriés qui sont inertes vis-à-vis de la réaction à réaliser. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la bande d'essai a environ 10 centimètres de longueur sur 2 centimètres de large. Chacune des cupules a un diamètre de 50 millimètres et fournit 50 millimètres de bord libre audessus du sommet du tampon. Les substrats sont employés à approximativement 1,0 X 10-3M. La concentration exacte de chaque substrat devrait être telle qu'au moins 25-50 nanomoles sont disponibles par cupule. Les réactifs de détection sont préparés immédiatement avant chaque essai à partir de la solution de stockage de détection suivante. Le réactif de détection est formé en mélangeant 10,0 millilitres de la solution de stockage de détection avec 0,4 grammes de BB bleu stable (sel de sodium} Le réactif de détection ne devrait pas être exposé à la lumière vive après le mélange et doit être employé dans l'heure qui suit le mélange. Solution de stockage de détection Tris base 175 g Sodium Lauryl sulfate 50 g Acide hydrochiorique 37% 55 ml 2-Méthoxyéthanol 500 ml eau 500 ml 2 méthoxyéthanol ajouté après que les solides aient été dissous. On a montré que les réactifs colorants diazoïques suivants réagissent de manière spécifique avec le ss -naphtyl ou le -naphtylamine libérés par l'enzyme à partir des substrats i). PDC rouge solide ou stable 7).B bleu solide ("Fast red PDC") ("Fast blue B") 2). B rouge solide 8).CG écarlate solide ("Fast red B") ("Fast scarlet CG") 3). AL rouge solide 9!.B violet solide ("Fast red ALn) ("Fast violet B") 4). TR rouge solide 10).RC rouge Kiazo ("Fast red TR") ("Kiazo red RC") 5). RR bleu solide 11)K noir solide ("Fast @lue RR") (1,Fast black K") 6). GBC grenat solide 12).O-diansidine ("Fast garnit GBC") La réaction des colorants ci-dessus avec le naphtylamine et ne naphtyle a été montrée au laboratoire de la Demanderesse et établie dans la littérature (Biogical Stains, H0J.Conn. Williams and Wilkins 1961) Chaque colorant est dissous dans la solution de stock age de réactif de détection pour obtenir 0,4 g/10 mi. Un exemple typique de l'emploi de n'importe lequel des colorants précités consiste en la préparation, inoculation, et incubation des bandes comme il est décrit dans le texte. Une partie (0,5 g) de n'importe lequel des colorants répertoriés ci-dessus ou du BB bleu solide ("Fast blue BB") est dissoute dans 10 ml de solution de détection de stockage. Une à deux gouttes de la solution ci-dessus est ajoutée à chaque cupule. On laisse la réaction se produire pendant 10 minutes à la température ambiante. Une modification de la couleur à partir d'un contrôle négatif est considérée comme une réaction positive. L'absence de changement de couleur est une réaction négative. Le profil ou modèle observé est comparé au Tableau A et ltorganisme identifié par comparaison. Au Tableau A, la première ligne en face de chaque organisme mantre le notre de pzitifet le nombre testé comme une fraction, la seconde ligne montre le pourcentage de réaction positive et la troisième ligne caractérise la réaction par un symbole. Le symbole "-" indique une réaction prédominante négative le symbole "+" indique une réaction prédominante positive, et le symbole "V" indique une réaction variable. On accomplit l'identification du microorganisme en détectant le chromogène libéré à partir du substrat par clivage enzymatique. Le domaine de détection est compris entre 5 et 40 nanomoles de chromogènes. La réaction a lieu typiquement comme suit Clivage par ENZYME N-L- X -glutamyl-P-nathylamide -napthylamine +#-acide glutamique bleu stable BB (incolore ou jaune pale) colorant DIAZO (violet sombre ou orange). Les classes d'enzymes inclues dans le système d'essai sont 1. Glycosidases 2. Aminopeptidases (Arylamidase) (Aminotransféraees Hydrolytique). 3. Phosphatases 4. Carboxylases. En ce qui concerne l'emplacement des enzymes relativement à la cellule bactérienne ; les enzymes détectables peuvent être soit extracellulaires, périplasmique; ou liés aux cellules. Les enzymes libérés par autolyse sont également détectables. On doit noter que les essais ou titrages employés dans le système d'essai mesurent la somme des activités d'une classe d'enzymes plutôt qu'unie entité enzymatique unique. Une modification de couleur du jaune pale au violet ou orange indique une réaction positive. Les exemples suivants requièrent une colonie unique à tester ayant 2 millimètres Qu supérieure en taille. Exemple 1. Cet exemple illustre un procédé d'identification de N. sonorrhoe . On met en suspension au moins 2 millimètres d'excroissance à partir de colonie importante unique de N. gonorrhoeae suspectée dans 0,5 ml de 0,85% de chlorure de sodium stérile avec 0,05 % de chlorure de calcium et 0,05 % de bicarbonate de sodium dans l'eau. La croissance peut être obtenue à partir du milieu Thayer-Martin modifié (MTM), un milieu agar chocolaté (CA), milieu NYC (NYC), ou milieu de transcroissance ttransgnrth'3 (TM) après 24 heures d'incubation (plaque d'isolation primaire). On emploie une goutte de suspension pour réaliser un essai d'oxydase conventionnel et un essai de coloration Gram. On inocule le reste dans les cupules de la bande d'essai, une goutte de suspension par cupule. On incube la bande d'essai dans une chambre plastique couverte humide à 35-370C pendant I heure. On place une goutte de réactif de détection dans chaque cupule de la bande d'essai. On laisse la réaction se poursuivre pendant 10 mn à la température ambiante. On réalise l'identification du microorganisme en comparant la couleur de la masse réactionnelle avec le Tableau A. Exemple 2. Cet exemple illustre un procédé alternatif d'identifica- tion deNgonorrhoea9. On enlève l'excroissance bactérienne de la surface d'une plaque agar chocolatée enrichie, de milieuIbayer-Martin (MTM),ou d'un milieu Neisseria-permissif similaire après croissance pendant 18 à 24 heures à 350C dans 5,0% de bioxyde de carbone et on met en suspension dans une solution de chlorure de sodium à 0,85%. On ajuste la suspension à un standard nepthalomètre n0 3 MacFarland avec une solution de chlorure de sodium à 0,85%. Ensuite on ajoute 20 en 50 microlitres de cette suspension comme inoculum dans chacune des cupules de la bande d'essai pour analyse enzymatique. On incube la bande d'essai dans une chambre fermée humide à 35 à 370C pendant 1 heure. On place une goutte du réactif de détection dans chaque cupule de la bande d'essai. On laisse la réaction se poursuivre pendant 10 mn à la température ambiante. On réalise l'identification du microorganisme en comparant la couleur de la masse réactionnelle avec le Tableau A. Exemple 3. Cet exemple illustre une méthode alternative dsidentifi- cation d'une colonie de N. gonorrhoeae suspectée. Dans ce procédé un tampon de phosphate, pH 7,3 est substitué au 0,1 M Tris-Malate pH 8,0. Le tampon phosphate contient par litre K2HPO4.......................... 4,0g KH2P04 . .1 , Og Polyvinylalcool (PVA)........... 5,0g Comme alternative, les substrats peuvent être dissous dans de l'eau distillée, et le tampon incorporé dans le milieu. On enlève une colonie unique de N. gonorrhoeae suspectée d'une plaque a'isolation primaire, de préférence une plaque MTM. Le diamètre de la colonie devrait être supérieur à 1,5mm. On met en suspension vigoureusement la colonie dans un milieu de croissance contenant les ingredients suivants par litre. Proteose Peptone + 3 ............... 7,Og Glucose.......................... 4,0g H2HOP4........................... 4,0g KH2PO4........................... 1,0g NaHCO 0,5g ISoVital X ..................... 10,0ml Dénomination Commerciale Difco, BBL) Te milieu décrit par R.T. Jones et RsSs Talley (J. Clin. Microbiol. 1977. 5 : 9-14) peut tre substitué par le milieu ci-dessus. On peut employer tout milieu supportant la croissance rapide de Neisseria qui est incolore On place de 20 à 50 microlitres du milieu inoculé en contact avec les solutions de substrat. TABLEAU A Organisme Nombre testé B-GAL #GAM OHPAP AAP SAP GAP AP VAL 4-LEU GLY 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 N. gonorrheae 37 0/37 0/37 37/37 36/37 1/37 3/37 0/37 36/37 19/37 7/37 0 0 100 97.2 2.7 8.1 0 97.2 45.9 18.9 - - + + - - - + v v N. meningitidis 16 0/16 16/16 1/16 16/16 3/16 11/16 4/16 6/16 15/16 15/16 0 100 6.2 100 18.7 68.7 25 40 100 93.3 - + - + - v v v + + N. lactamica 15 15/15 0/15 15/15 14/15 14/15 14/15 14/15 5/15 15/15 14/15 100 0 100 93 93 93 93 33.3 100 93 + - + + + + v + + + N. mucosa 11 0/11 0/11 11/11 11/11 10/11 9/11 11/11 0/11 10/11 11/11 0 0 100 100 91 82 100 0 91 100 - - + + + + + - + + N. sicca 7 0/7 0/7 6/7 7/7 6/7 1/7 6/7 1/7 7/7 7/7 0 0 86 100 86 14 86 14 100 100 - - + + + v + - + + N. flavescens 5 0/5 0/5 5/5 5/5 5/5 5/5 0/5 0/5 5/5 5/5 0 0 100 100 100 100 0 0 110 100 - - + + + + - - + + N. flava 17 0/17 0/17 17/17 16/17 15/17 4/17 2/17 17/17 16/17 17/17 N. perflava 0 0 100 94 88 23 12 100 94 100 N. subflava - - + + + v v + + + b. catarrhalis 8 0/8 0/8 3/8 8/8 8/8 8/8 0/8 7/8 8/8 8/8 0 0 37.5 100 100 100 0 87.5 100 100 - - v + + + - + + + TM-1 6 0/6 0/6 6/6 6/6 0/6 6/8 0/6 0/6 6/6 6/6 0 0 100 100 0 100 0 0 100 100 - - + + - + - - + + TABLEAU A APl Organisme Nombre testé B-GAL #GAM OHPAP AAP SAP GAP AP VAL 4-LEU GLY CODE 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M-3 3 0/3 0/3 2/3 3/3 1/3 1/3 3/3 2/3 3/3 3/3 &num;Pos. 0 0 67 100 33 33 100 87 100 100 %Pos. - - v + v v + v + + Resction M-4 5 0/5 6/6 0/6 6/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 " 0 100 0 100 0 0 0 0 0 0 " - + - + - - - - - - " M-5 6 0/6 0/6 6/6 6/6 6/5 6/6 0/6 0/6 6/6 6/6 " 0 0 100 100 100 100 0 0 100 100 " - - + + + + - - + + " M-6 9 0/3 0/3 3/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 " 0 0 100 0 - 0 0 0 100 0 " - - + - 0 - - - + - " M. osloensis 6 0/6 0/6 1/6 6/6 0/5 6/6 6/8 6/6 6/6 6/6 " 0 0 16.6 100 0 100 100 100 100 100 " - - v + - + + + + + " M. nonliquafaciens 3 0/5 0/5 0/5 5/5 3/5 5/5 5/5 2/5 5/5 5/5 " 0 0 0 100 60 100 100 40 100 100 " - - - + + + + + + + " M. lacunata 4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 0/4 4/4 4/4 " 0 0 0 0 0 0 100 0 100 100 " - - - - - - + - + + " M. phanylpyruvica 2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 2/2 2/2 0/2 " 0 0 0 0 0 0 0 100 100 0 " - - - - - - - + + - " M. kingü 2 0/2 0/2 2/2 0/8 0/2 2/2 2/2 2/2 2/2 2/2 " 0 0 100 0 0 100 100 100 100 100 " - - + - - + + + + + " Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits et représentés qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre des revendications qui suivent. REVENDICATIONS 1. Procédé d'identification rapide de microorganismes, caractérisé en ce qu'il comprend des étapes de a. Ajouter une quantité prédéterminée de solution de sel contenant un microorganisme à identifie à une solution contenant un réactif de détection constitué par un colorant diazoïque dans une solution aqueuse avec un tampon et un substrat et à incuber à environ 350C jusqu'à 5 heures et à comparer les réactions positives et négatives avec un profil ou diagramme d'identification, ledit substrat étant choisi parmi le groupe consistant de 1.) t-naphthyl- t ,D-galactopyranoside 2.) N-L-#-glutamyl-ss-naphtylamide 3.) L-hydroxyproline-ss-naphthylamide 4.) L-serine- ss -naphthylamide 5.) L-arginine- -naphthylamide 6.) glycine-glycine-ss-naphthylamide 7.) ss-naphtyl-phosphate 8.) ss-naphtyl-valerate 9.) 4-méthoxyleucine- p -naphthylamide 10.) glycine- ss -naphthylamide 2. Procédé d'identification rapide de microorganismes, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape de a. Ajouter une quantité prédéterminée d'une solution de sel contenant n microorganisme à identifier à une solution contenant un réactif de détection comprenant du & bleu stable (sel de sodium) et une solution de stockage de base Tris, du laurylsulfate de sodium, de l'acide hydrochlorique 37%, du 2-méthoxyéthanol et de l'eau, un tampon choisi parmi le troupe consis tant de Tris-HCl, Tris-malate, phosphate mnnopotassique et phosphate dipotassique dans un polyvinylalcool et un substrat et à incuber à environ 350C jusqu'à 5 heures et à comparer les réactions positives et négatives avec un profil ou un diagramme dtidentifi- cation, ledit substrat étant choisi parmi le groupe consistant de 1.) 5 -naphthyl-t ,D-galactopyranoside 2.) N-L--glutamyl- ss -naphtylamide 3.) L-hydroxyproline- ss -naphthylamide 4.) L-serine-t ss -naphthylamide 5.) L-arginine- ss -naphthylamide 6.) glycine-glycine- ss -naphthylamide 7.) ss-naphtyl-phosphate 8.) -naphthyleucine-t -naphthylamide 9.) 4-méthoxyleucine- -naphthylamide 10.) glycine- ss -naphthylamide 3.Dispositif d'identification rapide de Neisseria Gonorrhooee dans un specimen contenant seulement l'un parmi N. gonorrhoeae, N. méningitidis ou N. lactamica , caractérisé en ce qu'il comprend a. une base formant support b. au moins deux chambres de réaction supportées fixement par ladite base c. un substrat sec disposé dans chacune desdites chambres de réaction chacune d'elle contenant un substrat choisi parmi ss -naphthyl- P ,D-galactopyranoside, et L-hydroxyproline- -naphthylamide ; et d. un tampon sec ou anhydride disposé dans chacune desdites chambres réactionnelles; grace auquel lors de l'emploi, une réaction négative dans la chambre de réaction contenant le ss-naphtyl-ss,D galactopyranoside et une réaction positive dans la chambre de réaction contenant L-hydroxyproline- t-naphtylamide identifie le N. gonorrho e . 4. Dispositif pour l'identification rapide de Neisseria gonorrohoese dans un spécimen contenant seulement l'un des N. gonorrhoeae, N. méningitidis ou N. lactamica, caractérisé en ce qu'il comprend a. une base formant support b. au moins deux chambres de réaction supportées fixement par ladite base c. un substrat sec ou anhydre disposé dans chacune des chambres de réaction chacune d'elle contenant un substrat choisi parmi -naphtyl- P , D-galactopyranoside, et L-hydroxyproline-ss-naphtylamide ; et d. un tampon sec disposé dans chacune des chambres de réaction ; ledit tampon étant choisi parmi les groupes consistant de Tris-HCl, Tris-malate, phosphate monopotassi que et phosphate dipotassique dans un polyvinylalcool par lequel lors de l'emploi, une réaction négative dans la chambre de réaction contenant le -naphtyl -D-galactopyrano- side et une réaction positive dans la chambre réactionnelle contenant le L-hydroxyproline-ss-naphtylamide identifie N. gonorrhoeae. 5. Dispositif pour l'identification rapide de Neisseria gonorrhoeae dans un spécimen contenant seulement l'un des N. gonorrhoeae, N. meningitidis, ou N. lactamica, caractérisé en ce qu'il comprend a. une base formant support b. au moins trois chambres de réaction supportées fixement par ladite base c. un substrat sec disposé dans chacune des chambres de réaction chacune contenant au moins un substrat parmi: b ss -naphthyl-ss ,D-galactopyranoside 2. N-L-k-glutamyL-B -naphtylamide 3. L-hydroxyproline-ss-naphthylamide ; et d. un tampon sec disposé dans chacune des chambres de réaction. Grâce auquel lors de l'emploi, une réaction positive dans la chambre de réaction contenant le L,hydroxyproline-/ naphthylamide et une réaction négative dans les deux autres chambres de réaction identifie Neisseria gonorrhoeae. 6. Dispositif pour 11 identification rapide de Neisseda gonorrhoeae d'un spécimen contenant seulement l'un des N. gonorrhoeae, N. meningitidis ou N. lactamica, caractérisé en ce qu'il comprend a. une base formant support b. une première chambre de réaction supportée fixement par ladite base contenantss-naphtyl-ss-D-galacto- pyranoside c. une seconde chambre de réaction supportée fixement par ladite base contenant N-L-#-glutamyl-ss-naphtylamide ; et d. une troisième chambre de réaction supportée fixement par ladite base contenant le L-hydroxyproline-ss- naphtylamide Gracie auquel lors de l'eamploi une réaction positive dans ladite troisième chambre de réaction et une réaction négative à la fois dans lesdites première et seconde chambres de réaction identifie le Neisseria gonorrhoeae. 7. Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend entoure un tampon disposé dans chacune desdites chambres. 8. Dispositif selon la revendication 7, caractérisé en ce que le tampon précité est choisi parmi le groupe consistant de Tris-HCl, Tris-malate, phosphate monopotassique et phosphate dipotassique dans un polyvinylalcool. 9. Dispositif permettant de faire la distinction parmi Neisseria gonorrhoeae, N. mensmgitidia et N, lactamica dans un spécimen contenant seulement l'un d'entre eux, caractérisé en ce qu'il comprend a. une base formant support b. une première chambre de réaction supportée fixement par ladite base contenant le ss-naphyl- -D-galacto- pyranoside c. une seconde chambre.de réaction supportée fixement par ladite base contenant le N-L- -glutamyl- - naphtylamide d. une troisième chambre de réaction supportée fixement par ladite base contenant le L-hydroxyproline-t naphtylamide ; et e0 un tampon sec disposé dans chacune desdites chambres de réaction ; ledit tampon étant choisi parmi le groupe consistant de Tris-HCl, Tris-malate, phosphate monopotassique et phosphate dipotassique dans un polyvynylalcool, Par lequel une réaction négative à la fois dans les première et seconde chambres et une réaction positive dans la troisième chambre identifie N. gonorrhoeae, une réaction positive dans la seconde chambre identifie N. meningitidis et une réaction positive dans seulement la première chambre identifie N. lactamica. 10. Dispositif d'identification rapide de Neisseria gonorrhoeae et Neisseria meningitidis, caractérisé en ce qu'il comprend a, une base formant support b. une pluralité de chambres de réaction supportées fixement par ladite base c. de 1 à 500 nanomoles par chambre d'un tampon choisi parmi le groupe consistant de Tris-HCl, Tris-malate et de composition de phosphate contenant K2HP04,KH2P04 et un polyvinylalcool ; et d. un substrat sec disposé dans chacune desdites chambres de réaction consistant de 25 à 50 nanomoles par chambre d'un élément choisi parmi le groupe consistant de 1.) g-naphtyl- p ,D-galactopyranoside 2.) N-L-g-glutamyl- ss -naphthylamide 3.) L-hydroxyproline- p -naphthylamide 4.) L-sérine- ss -naphthylamide 5.) L-arginine- -naphthylamide 6.) glycine-glycine-ss -naphthylamide 7.) ss-naphthyl-phosphate 8.) B -naphthyl- ralérate 9. 4-méthcxyleucine-t -naphthylamide 10.) glycine- -naphthylamide 11. Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend 10 chambres de réaction0