Brevet FR2460328A1 — publié le 19810123

La présente invention concerne un procédé de production de la créatinase. La créatinase est une enzyme classée comme étant une amidinohydrolase de la créatine, ayant le numéro d'enzyme 3.5.3.3., catalysant la réaction représentée par l'équation suivante: Créatine + H20 > urée + sarcosine On a jusqu'à présent considéré que l'enzyme était obtenue à partir de microorganismes appartenant aux genres Pseudomonas, Flavobacterium, etc... La demanderesse a trouvé qu'un microorganisme, la souche B-0618, appartenant au genre Bacillus, qui a été isolée à partir d'un échantillon de sol-prélevé-dans une ferme o l'on cultive des arbres à oeufs, Shimosasaki, Fukuchiyama City, Kyoto Prefecture, Japon, peut produire dans ses cellules de la créatinase que l'on peut isoler avec succès. Les caractéristiques de la culture de la souche B-0618, décrites précédemment, sur divers milieux de culture selon les observations faites à l'oeil nu et au microscope, sont les suivantes. A. Caractéristiques de culture (après culture à 30 C pendant 18 à 24 heures) (1) Culture sur bouillon de gélose inclinée Bonne croissance en stries. Couleur blanc grisatre à brun clair. Faible production de pigment en solution. (2) Culture inclinée sur gélose de bouillon de glucose Bonne croissance en stries. Couleur blanc grisâtre à brun clair. Production d'une faible quantité de pigment soluble. (3) Culture sur bouillon liquide Formation d'un nuage uniforme. Pas de formation de pellicule. Il se forme un précipité. (4) Culture sur lait tournesolé. Devient alcaline après 1 à 2 semaines. (5) Culture en tube bouillon/gélatine La croissance se fait simplement à la partie supérieure. Faible liquéfaction en forme d'entonnoir. B. Caractéristiques morphologiques (1) Forme et dimension des cellules Bacille en tige droite et de grande dimension Dimension de 1,0 - 1,5 x 2, 0 - 5 pm, à extrémités arrondies. Généralement seuls ou liés par paires, parfois en chatne courte. (2) Polymorphisme des cellules Inexistant (3) Motilité Motile à l'aide de flagelles réparties sur toute la surface (Après culture sur une culture inclinée de bouill gélosé à 26 C pendant 18 heures) (4) Formation de spores Forme des spores cylindriques ou ellipso5daux au centre ou près de l'extrémité inférieure de - la cellule. Le sporangium n'est pas vraiment gonflé. Dimension des spores: 0,8 - 1,0 x 1,2 x 1,6 pm. (5) Teinture de GRAM Positive (6) Teinture solide aux acides Négative C. Propriétés physiologiques Réduction par les nitrates négai Réaction de dénitration négat Test MR négal Test VP négal Formation d'indole négal Formation d'hydrogène sulfuré posit Hydrolyse de l'amidon négat Hydrolyse de la gélatine posit Hydrolyse de la caséine négal tive tive tif tif tive tive five five tive on Hydrolyse de l'esculine Hydrolyse de la cellulose Utilisation d'acide citrique sur milieu de culture Simons sur milieu de culture Christensen Utilisation des nitrates Utilisation des sels d'ammonium Formation d'ammoniac à partir des nitrates Intervalle des pH de croissance p. Intervalle de températures de croissance Tolérance aux halogènes c jusqu'à 6,0 Caractère aérobie ou anaérobie Test O-F (culture Hugh Leifson) Test O-F (comme la présente souche ne produit pas d'acide à partir du glucose, et ne produit que peu ou pas d'acide à partir des autres glucides, on a utilisé le glycérol comme glucide, avec un milieu de culture de base ayant un pH de 7,2 à 7,4 et comprenant 1,0 g de NH4H2PH4, 0,2 g de KC1, 0,2 g de MgSO4 7H20, 1,0 g de poudre d'extrait de levure, 3,0 g de gélose Bact, ml d'une solution aqueuse à 10 % de BTB, et 1000 ml d'eau distillée) O ( Production d'acide et de gaz à partir des sucres: L-arabinose cellobiose dilcitol érythriol fructose galactose glucose glycérol inositol négative négative négative positive positive négative positive H 6,4 - 9,6 - 42 C roissance % de NaCl aérobie NT oxydation) m + (acide) + (acide) lactose - maltose mannitol + (acide) mannose - mélézitose - mélibiose - raffinose L-rhamnose - salicine L-sorbose - sorbitol - amidon. saccharose tréhalose xylose (pas de production de gaz) Dans les essais mentionnés précédemment, 10 g d'un glucide sont ajoutés à un milieu de culture de base comprenant 1,0 g de NH4H2PO4, 0,2 g de KC1, 0,2 g de MgSO4.7H20, 1,0 g de poudre d'extrait de levure, 3,0 g de gélose Bact, 10 ml d'une solution aqueuse à 10 % de BTB et 1000 ml-d'eau distillée, et ayant un pH de 7,2 à 7,4. D'après les propriétés précédentes, la présente souche est identifiée comme étant une souche GRAM-positive, formatrice de spores, aérobie, à grands bâtonnets, motile avec des flagelles sur toute la surface et ne produisant pas d'acide à partir du glucose. Quand on compare ces faits à la description parue dans Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th Edition, 1974, on voit que la souche est un microorganisme appartenant au genre Bacillus. On a en outre comparé la présente souche B-0618 aux souches de Bacillus badius, Bacillus freudenreichii et Bacillus macroides, qui possèdent apparemment des propriétés similaires, les résultats étant indiqués dans le Tableau 1. Les souches des bacilles utilisés pour la comparaison sont les suivantes: -1 5 Bacillus badius ATCC-14574 (souche type dans la collection ATCC) (appelé ci-après 14574); Bacillus freudenreichii ATCC-7053 (ce n'est ni la culture type, ni la souche originale) (appelé ci-après 7053) Bacillus macroides ATCC-12905 (la souche type dans la culture ATCC) (appelé ci-après 12905). Tableau 1 Test O-F1) Test O-F2) catalase oxydase uréase hydrolyse de gélatine hydrolyse de l'amidon hydrolyse de l'esculine formation d'indole formation d'H2S formation d'acétone Test MR réduction des nitrates utilisation des citrates Formation d'acide à partir des glucides arabinose fructose galactose glucose glycérol inositol lactose maltose mannitol mannose Souche 14574 7053 12905 B-0618 Pas de product: o o + + + + (+) + + + + + + +1 + + + ion d'acide pas de pro- duction d'acide + + + (+) + + - Souche 14574 7053 1290. ___ ___ ___ __ ___ ___ __ ___ ___ __ B - 0 6 1 8 sorbitol _ _ _ saccharose _ _ _ _ tréhalose _ _ _ xylose _ _ _: 1) On utilise le milieu de culture Hugh Leifson 2) On utilise le milieu de culture utilisé dans le test O-F mentionné précédemment * De l'acide se forme d'abord qui devient, par la suite, alcalin On compare les productivités dans un milieu de culture de type bouillon, comme indiqué ci-dessous: La présente souche B-0618 a une faible croissance avec un précipité duveteux; La souche 14574 forme un nuage uniforme avec un précipité partiel; La souche 7053 a une faible croissance avec un précipité duveteux; La souche 12905 a une croissance faible et une formation uniforme de nuage, avec un précipité partiel. D'après les résultats des expériences comparatives, on a trouvé que la présente souche B-0618 diffère à un certain degré de Bacillus badius ATCC14574, par la formation d'uréase, la formation d'acide à partir de glycérol (l'acide formé devient alcalin par la suite dans la dernière souche) et la formation d'acide à partir du mannitol. On trouve également que la présente souche diffère de Bacillus freudenreichii ATCC-7053 à un certain degré, par l'hydrolyse de l'esculine et la formation d'acide à partir du fructose, du glycérol et du mannitol, bien que ces deux souches soient plus proches l'une de l'autre que dans le cas de la souche 14574, en ce qui concerne la croissance et la formation d'uréase. Comme la souche Bacillus freudenreichii ATCC-7053 n'est pas la culture type ni la souche originale, il est difficile d'identifier la présente souche B-0618 et on ne peut pas décider si la souche est une nouvelle espèce. La présente souche B-0618 a donc été nommée Bacillus sp. B-0618, a été déposée le 25 novembre 1977 à Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japon, et le numéro FERMI-P No 4049 lui a été attribué. La présente invention est basée sur les découvertes mentionnées précédemment et concerne un procédé de production de créatinase, procédé caractérisé en ce qu'on cultive dans un milieu de culture une souche productrice de créatinase appartenant au genre Bacillus, et on recueille la créatinase à partir du produit cultivé. Le microorganisme que l'on peut utiliser selon la présente invention peut être l'un quelconque 'de ceux appartenant au genre Bacillus qui produisent de la créatinase, et un organisme type est la souche Bacillus sp. B-0618 décrite précédemment. On sait que les microorganismes, y compris la présente souche, ont tendance à subir des variations naturelles ou artificielles. Cependant, on peut utiliser l'un quelconque de ces variants dans la présente invention pour autant qu'il conserve la possibilité de production de créatinase. Une caractéristique de la présente invention est donc la fourniture d'une culture biologiquement pure du micro- organisme d'une souche productrice de créatinase appartenant au genre Bacillus, en particulier une culture biologiquement pure de la souche Bacillus sp. B-0618 ayant les caractéris- tiques d'identification de FERM-P No 4049, comme décrit précédemment, culture qui peut produire de la créatinase par développement dans un milieu de culture. Dans la mise en oeuvre de la présente invention, on culture une souche productrice de créatinase appartenant au genre Bacillus, selon le mode opératoire classique de production d'antibiotiques, d'enzymes, etc... La culture peut se faire soit en milieu liquide, soit en milieu solide. Du point de vue industrielle, il est cependant avantageux que des cellules de la souche productrices de créatinase soient inoculées dans un milieu de culture à l'échelle industrielle, pour effectuer une culture en immersion, sous aération et agitation. Comme source nutritive pour le milieu de culture, on peut utiliser de façon générale l'une quelconque de celles utilisées pour la culture classique de micro- organismes. On peut utiliser comme source d'azote l'un quelconque de divers composés d'azote disponibles, comme la liqueur de macération de mais, la poudre de soja, la peptone, divers extraits de viande, l'extrait de levure, le sulfate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, etc... On peut utiliser comme source de carbone un quelconque composé du carbone assimilable, comme le glucose, la mélasse, le glycérol, l'hydrolysat d'amidon, etc... Si nécessaire, on peut utiliser en outre des sels, comme le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le sulfate de magnésium, le phosphate monopotassique, le phosphate dipotassique, etc... Il est préférable d'ajouter de la créatine au milieu de culture pour augmenter les possibi- lités de production de créatinase pendant la culture. La quantité préférée de créatine à ajouter est comprise entre environ 0,5 et 1 %. La température de culture peut être choisie de façon appropriée dans l'intervalle de températures o de la créatinase est produite, mais une température de 260 à 330C est particulièrement avantageuse. La durée de culture varie selon diverses conditions, m'ais une culture de 15à 25 heures est généralement suffisante. On peut arrêter la culture au moment exact o la puissance de l'activité de créatinase atteint sa valeur maximale. La créatinase est contenue ou accumulée dans les cellules du produit cultivé ainsi obtenu. Le procédé d'obtention d'une solution de créatinase brute par extraction ou élution de la créatinase à partir du produit cultivé est décrit à titre d'exemple ci-dessous. Le produit cultivé est soumis à une séparation solides- liquide, et les cellules humides résultantes sont mises en suspension dans un tampon de phosphate ou un tampon Tris-HCl, selon le cas. Puis, on extrait la créatinase des cellules selon un procédé choisi de façon appropriée ou un procédé combiné pour l'extraction des enzymes à partir des cellules, comme un traitement par la lysozyme, un traitement par ultrasons, traitement à la presse, etc..., pour obtenir une solution brute de créatinase. On peut obtenir la créatinase purifiée à partir de la solution brute de créatinase, par les procédés classiques de purification des protéines et des enzymes. Par exemple, on ajoute la solution de créatinase brute à une solution aqueuse de sulfate de protamine, selon le cas, pour en éliminer les acides nucléiques, puis on ajoute un solvant organique, comme l'acétone, le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol, etc..., pour effectuer une précipitation fractionnée, ou bien un sel similaire comme le sulfate à'ammonium, pour relarguer l'enzyme, de façon à obtenir le produit recherché sous forme d'un précipité. On peut purifier le précipité récupéré, si nécessaire, jusqu'à ce qu'il présente une liaison protéinique homogène dans la technique d'électrophorèse. La façon de purifier est avantageusement une façon qui utilise les caractéristiques de la créatinase. Par exemple, on peut dissoudre le précipité dans un milieu comme le tampon Tris-HCl, et le soumettre à une chromatographie utilisant une substance échangeuse d'anions, comme la diéthylaminoéthylcellulose et un gel de diéthylaminoéthyldextrane,.ou un agent de filtration sur gel, comme un gel de dextrane ou un gel de polyacrylamide. Il est évident que la purification peut être effectuée par une combinaison appropriée de ces modes opératoires. Enfin, on peut obtenir une poudre de créatinase purifiée en séchant le produit, par exemple par un processus de lyophilisation. Dans les dessins annexés, la Figure 1 représente la dépendance de la créatinase vis-à-vis d'un pH optimum; la Figure 2 représente la stabilité de la créatinase vis-à-vis du pH; la Figure 3 représente la stabilité thermique de la créatinase; et la Figure 4 représente la température optimale d'activité de la créatinase. La créatinase telle qu'obtenue selon la présente invention a été analysée par la méthode de détermination d'activité des enzymes, et a des propriétés physico-chimiques, ces deux caractéristiques étant décrites ci-dessous. (1) Méthode de dosage de l'activité enzymatique Dans 0,5 ml d'un mélange réactionnel, comprenant 0,05 ml de tampon phosphate 0,2 M (pH 7,5) et 0, 45 ml d'une solution 50 mM de créatine, on agite 10 pl d'une solution d'enzyme, et on fait incuber le mélange à 37 C pendant 5 minutes. Puis, on arrête la réaction en ajoutant 0,5 ml d'une solution 0,5 mM de PCMB, et on détermine la quantité de sarcosine formée par la réaction en utilisant la sarcosine-oxydase (E.C.1.5.3.1). Pour cela, on ajoute au mélange réactionnel mentionné précédemment, 0,5 ml d'une solution de réactif, contenant 0,1 ml de tampon Tris-HC1 0,2 M (pH 8,0), 0,05 ml d'une solution à 0,3 % de 4-amino- antipyrine, 0,05 ml d'une solution à 0,2 % de phénol, 0,05 ml d'une solution à 0,05 % de peroxydase (poids/volume), 0,1 ml d'une solution de sarcosine-oxydase (30 U/ml) et 0,15 ml d'eau distillée, et on fait incuber le mélange à 37 C pendant 20 minutes. Apres addition de 1,5 ml d'eau distillée, on analyse le mélange réactionnel par colori- métrie à 500 nm, pour effectuer une estimation de la quantité de peroxyde d'hydrogène formé, quantité d'après laquelle on calcule la quantité de sarcosine formée par l'action de la créatinase. Une unité (1 U) d'activité enzymatique est définie comme la quantité d'enzyme qui fourme 1 pmole de sarcosine à partir de la créatine, à 37 C en 1 minute. (2) Réaction L'enzyme catalyse la réaction qui forme 1 mole d'urée et de sarcosine à partir d'l mole de créatine, avec consommation d'l mole d'eau. (3) pH optimum On trouve que le pH optimum de la créatinase est environ 7,5 - 9,0 (voir la Figure 1). Les solutions tampon utilisées sont le tampon NaOH/glucarate de diméthyle (pH 5,0 - 7,0), le tampon phosphate (pH 6,0 - 7,5), le tampon Tris-HCl (pH 7,5 - 9,0) et le tampon glycine,'NaOH (pH 9,0 - 10,0), comme indiqué sur la Figure 1. (4) Stabilité au pH On ajoute l'enzyme à chacun des tampons ayant des pH différents, préincubés à 37 C pendant 60 minutes, puis on détermine l'activité résiduelle. Les tampons utilisés sont les mêmes que ceux décrits précédemment. La créatinase est stable à environ 6,0 - 9,0, comme indiqué sur la Figure 2. (5) Stabilité thermique On traite 1 ml de solution de créatinase dans un tampon phosphate 10 mM (pH 7,5) à diverses températures pendant 10 minutes et on détermine l'activité résiduelle selon la méthode de dosage de l'activité enzymatique décrite précédemment. La créatinase se révèle être stable à une température approximativement inférieure à 40 C, comme indiqué sur la Figure 3. (6) Température optimale de réaction La température optimale de réaction de la créatinase est environ 40 C, comme le montre la Figure 4. (7) Poids moléculaire Environ 74 000 (déterminé par la méthode de filtration sur gel) (8) Point isoélectrique Environ pH 4,9 (déterminé par électrophorèse de focalisation isoélectrique, en utilisant un support ampholyte). Comme mentionné précédemment, l'enzyme de la présente invention, la créatinase, est une enzyme classée comme une créatine-amidinohydrolase avec le numéro d'enzyme 3.5.3.3., du fait qu'elle réagit avec la créatine pour former de l'urée et de la sarcosine avec consommation d'eau. La créatinase de l'invention peut être utilisée selon diverses façons, y compris l'utilisation comme réactif enzymatique pour des diagnostics cliniques. Par exemple, on peut l'utiliser pour déterminer la créatinine dans le sérum ou l'urine, en combinaison avec la créatininase et la sarcosine-oxydase, ou bien elle peut être utilisée dans le dosage de la créatininase. La présente invention sera illustrée plus concrètement en se référant à l'exemple suivant qui ne doit, en aucune façon, être considéré comme limitant l'invention. Exemple 1 On place 100 ml d'un milieu de culture (pH 7,0) comprenant 0,5 % de créatine, 0,5 % de matières solubles de poisson, 0,2 % d'extrait de levure, 0,3 % de KC1, 0,1 % de K2HPO4 et 0,05 % de MgSO4.7H2O, dans un flacon Erlenmeyer de 500 ml et on stérilise à 120 C pendant 20 minutes. On inocule dans le milieu de culture le micro- organisme consistant en la souche de Bacillus sp. B-0618, FERM-P No 4049, et on cultive à 30 C pendant un jour, en obtenant ainsi une culture d'ensemencement. On place dans un fermenteur d'un volume de 30 litres, 20 litres du milieu de culture ayant la même composition que celle décrite précédemment et on le stérilise. Après transplanta- tion de la culture d'ensemencement, on cultive le milieu sous aération et agitation à une température de 30 C pendant 20 heures, avec une agitation à 200 tours par minute et un débit d'air stérilisé de 20 1/minute. Le bouillon résultant ou produit cultivé est centrifugé pour recueillir 12 g de cellules humides, qu'on rince avec un tampon phosphate 10 mM (pH 7,0), qu'on met en suspension dans le même tampon, qu'on additionne de lysozyme (concentration finale de 0,2 mg/ml), qu'on fait incuber à 37 C pendant minutes, puis qu'on centrifuge à 5 000 tours par minute pendant 15 minutes, pour obtenir une liqueur surnageante (activité enzymatique en créatinase: 800 U). On ajoute à la liqueur surnageante résultante 2,5 ml d'une solution aqueuse à 2 % de sulfate de protamine et on centrifuge pour en éliminer les acides nucléiques. Puis, on ajoute à la solution une solution saturée de sulfate d'ammonium et on sépare le précipité se décantant dans les fractions ayant une concentration de 50 % à 70 % de sulfate d'ammonium, et on le dissout dans 20 ml d'un tampon Tris-HCl 10 mM (pH 8,0). On dessale la solution résultante en la faisant passer sur une colonne (diamètre de 3,5 cm x 30 cm) garnie de Sephadex G-25 (Farmacia) et l'on introduit dans une colonne (diamètre de 2,0 cm x 18 cm) de DEAE-cellulose (fabriquée par Brown) que l'on a équilibrée avec le tampon Tris-HCl 10 mM (pH 8,0). Apres lavage avec le même tampon contenant KC1 0,1 M, on élue l'enzyme avec des solutions aqueuses de KC1 avec un gradient de concentration de 0,1 M à 0,5 M. On recueille la fraction active éluée avec la solution 0,3 M de KC1, on la concentre à l'aide d'un appareil d'ultrafiltration (fabriqué par Amicon), on la dialyse pendant 10 heures vis-à-vis d'un tampon phosphate mM (pH 7,5), puis on la lyophilise en obtenant ainsi une poudre de créatinase (220 U d'activité totale, 38 mg de protéine, 5,8 U/mg d'activité spécifique, et 27,5 % de récupération. REVENDICATIONS 1. Procédé de production de créatinase, caractérisé en ce qu'on cultive, dans un milieu de culture, une souche productrice de créatinase appartenant au genre Bacillus, et on recueille la créatinase à partir du produit cultivé. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite souche productrice de créatinase est la souche Bacillus sp B-0618, déposée au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japon, portant le numéro FERM-P No 4049. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit milieu de culture contient de la créatine. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la quantité de créatine dans le milieu de culture est de 0,5 à 1 %. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue la culture en milieu liquide dans des conditions d'aération et d'agitation. 6. Culture biologiquement pure d'une souche appartenant au genre Bacillus, caractérisée en ce qu'elle peut produire de la créatinase par culture dans un milieu approprié. 7. Culture biologiquement pure d'une souche de Bacillus sp. B-0618, ayant les caractéristiques d'identifi- cation de la souche FERM-P No 4049, numéo attribué par Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japon, ladite culture pouvant produire de la créatinase par culture dans un milieu de culture.