Brevet FR2446860A1 — publié le 19800814

La présente invention concerne un nouveau procédé de préparation de xanthothricine. La xanthothricine est connue comme antibiotique manifestant une activité antibactérienne. La xanthothricine a été obtenue pour la première fois par synthèse microbiologique à partir d'une culture de Streptomyces albus (Antibiotics and Chemotherapy, 4, 259, 1954). On connait comme producteur de xanthothricine (synonyme: toxoflavine) une culture de Pseudomonas cocovenanus (Rec. trav. chim., 79, 255, 1960). La structure de la xanthothricine a été établie par C.C.Cheng qui a réalise sa synthèse chimique (J.Amer. Chem. Soc., 84, 1724, 1962). Les procédés connus de biosynthèse sont insuffisamment efficaces étant donné que les micro-organismes utilisés ne possèdent pas une capacité productrice suffisamment élevée. Le procédé chimique n'a pas trouvé d'application car il se compose de stades multiples (6 stades}. Le but de la présente invention a été de rechercher un micro-organisme qui ait une forte capacité productrice de la xanthothricine. Les recherches effectuées par la Demanderesse ont abouti à une nouvelle souche productrice de xanthothricine qui est la souche Streptomyces brunneus subspecies xanthothricini. Cette souche a; été isolée des Sols de l'Asie centrale Soviétique et a été déposée à la Collection des cultures de microorganismes de l'institut pansoviétique de recherches sur les antibiotiques (RIA) sous le numéro 1568. Ladite Collection des cultures est inscrite par la Fédération internationale des collections de cultures dans son registre de 1972 sous le numéro 337. Pour la description du micro-organisme on a utilisé la Série des couleurs de Bondartsev (Editions de l'Académie des sciences de 1'URSS, 1954). La- souche Streptomyces brunneus subspecies xanthothricini présente les caractéristiques suivantes I. Caraetéristiques due culture et morphologiques Les sporophores sont droits, disposés d'une manière monopodiale, et sont clairsemés. Les spores sont ovales, oblongues, cylindriques à enveloppe lisse. Les sporanges font défaut. Pas de sclérotis (épines). 1. Sur des milieux synthétiques au saccharose. Le mycelium aérien est bien développé, floconneux, de couleur rose blanchâtre ou rosâtre. Colonies et milieu bruns, bruns foncés. 2. Gélose au glucose et à l'asparagine. Le mycelium aérien est peu développé, presque absent; sa couleur est rose blanchâtre. Colonies et milieux de couleur sable pâle. 3. Gélese à la glycérine-asparagine. Colonies et milieu de couleur brun. Le mycélium aérien est peu développé, velouté, de couleur sable-rose. 4. Gélose à l'amidon. Le mycélium aérien est rose blanchâtre, farineux. Colonies et milieu de couleur jaune-brunâtre. 5. Gélose à la tyrosine. Le mycélium aérien est peu développé, farineux, de couleur rose blanchâtre. Colonies et milieu incolores. 6. Gélose à la viande et à la peptone Le mycélium aérien fait défaut. Colonies de couleur brun foncé. Un pigment brun foncé pénètre par diffusion dans le milieu. 7. Gélose à la levure et au malt. Le mycélium aérien est peu développé, de couleur-roseblanchâtre. Colonies et milieu colorés en brun-fauve. 8. Gélose à la farine d'avoine. Le mycélium aérien est faiblement développé, de couleur sable. Colonies et milieu colorés en brun-foncé. II. Caractéristiques physiologigues- La souche fluidifie la gélatine, peptonise le lait, invertit le saccharose, n'hydrolyse pas l'amidon, ne croit pas sur la cellulose, ne forme pas de H2S, donne un essai à la thyrosinase négatif, forme un pigment mélanolde sur des milieux nutritifs synthétiques. La souche est aérobie. Assimilation des comoosés du carbone Glucose + + Arabinose + + Xylose + Saccharose + + Raffinose + + Rhamnose + Fructose Inositol Mannitol La souche ne possède pas de caractéristiques antimi crobiennes. L'étude de la position taxonomique de la souche Streptomyces brunneus subsp., xanthothricini azoté effectuée en s'appuyant sur les guides suivants : N.A Krassilnikov. "Les Actinomycetes", Editions "Naouka", 1970. G.F.Gauze. "Problèmes de classification des actinomycètes-antagonistes", Editions Medguiz, 1957. S.Waksman, H.Lechevalier. "Guide to the Classification and identification of the Actinomycetes and their antibiotics. Baltimore. 1953. S.Waksman. The Actino,mycetes, v. II, Baltimore. 1961 et en procédant à des comparaisons avec les mémoires descriptifs publiés dans la littérature. Par ses caracteristique-s morphologiques et de culture ainsi que par ses propriétés biologiques la souche peut être classée avec llespece Streptomyces brunneus (Krassilnikov, 1970) toutefois elle s'en distingue par un certain nombre de propriétés biochimiques et antibactériennes. C'est ainsi que d'après les données de Krassilnikov la culture Streptomyces brunneus manifeste une acr tion antibactérienne par rapport à Bacillus idosus et Bacillus subtilis et exerce une action antagoniste sur les bactéries des nodosi du du haricot Azotobacter chroococcum et Azotobacter vinelandii, alors que la culture suivant l'invention ne manifeste pas de caractéristiques vis-à-vis des micro-organismes énumérés. Les résultats de comparaison des caractéristiques physiologiques de la souche de Streptomyces brunneus et de la souche suivant l'invention sont réunis dans le tableau Caractéristiques physiologiques Streptomyces Streptomyces brunneus brunneus Subsp.xanthothricini Fluidification de la gélatine + + Peptonisation du lait + + Inversion du sucre 4: + Hydrolyse de l'amidon + + Dégradation de la cellulose + + Formation de H2 O Formation de thyrosinase Formation de pigment mélanoide + + Comportement vis-à-vis dessucres Glucose + ++ arabinose - + + xylose + raffinose + + + + rhamnose + saccharose ++ ++ fructose inositol mannitol Comme cela apparait à la lecture de ce qui précède la souche décrite dans la pressente invention diffère de Streptomyces brunneus par un certain nombre de propriétés et, en outre, est capable de produire de la xanthothricine alors que Streptomyces brunneus ne produit pas de xanthothricine. Les distinctions qui ont été mises en évidence ont permis à la Demanderesse de définir la souche décrite dans le présent mémoire comme Strettomyoes brunneus subspecies xanthothricine. L'aptitude de la souche à produire de la xanthothricine peut être améliorée en la traitant par des rayonnements : rayons ultraviolets, rayons X etc.; par des réactifs chimiques tels que la N-éthyl N-nitro N-nitrosoguanidine (NTG), le bromo-5 uracile, l'amino-2 purine, etc., ainsi que par d'autres procédés généralement utilisés pour la préparation des variants (notamment par transformation, transduction, conjugaison, etc.). La souche Streptomyces brunneus stibspecies xanthothricini sur unmilieusyiithétigue glucosé forme plusieurs variants se distinguant par leur forme, par la préseceou l'absence de mycelium aérien, par sa coloration ainsi que par sa capacité productrice. Les critères de culture et morphologiques des variants sont les suivants Variant nO 1-- Colonies circulaires, saillantes, lisses à bords unis. Mycelium aérien floconneux, de couleur rose. Le mycelium immergé dans le substrat est de couleur brun à brun foncé. Forme un pigment soluble brun. Variant ne 2 - Colonies lisses, non saillantes, à bords unis, revêtues d'un mycelium aérien velouté de couleur blancrose. Le mycelium immergé dans le substrat est de couleur sable clair à brunâtre. Forme un pigment soluble brun. Variant n0 3 - Colonies plissées, faiblement sporulantes. Le mycelium aérien est de couleur rose blanchâtre. Le mycelium immergé dans le substrat est de couleur sable. Tous ces variants produisent de la xanthothricine à concurrence de 100 microgrammmes au millilitre. Conformément à la présente invention la xanthothricine se forme par culture du micro-organisme producteur de la xanthothricine appartenant aux Streptomyces brunneus subspecies xanthothricini sur des milieux nutritifs contenant des sources de carbone assimilables, de l'azote et des sels minéraux avec une régulation de l'aération réglable. Le milieu nutritif peut être quelconque parmi ceux qui sont utilisés par une souche produisant de la xanthothricine appartenant à l'espèce Streptomyces brunneus subspecies xanthothricini. Les sources de carbone préférées pour le milieu nutritif sont des glucides comme le glucose, le saccharose, l'amidon, ainsi que la glycérine (triol). On peut utiliser également l'arabinose, le xylose, le raffinose,.le rhamnose, etc. Les sources préférées d'azote sont l'extrait de viande, la peptone, l'extrait de mals, l'extrait de levure, le produit d'hydrolyse de la caséine, la farine de soja, la farine de graines de cotonnier, la farine de mais, etc., ainsi que les compo ses azotes organiques ét minéraux tels que les sels d'ammonium (nitrates, sulfates, phosphates, etc.); l'urée, etc. I1 est possible d'ajouter au milieu des sels minéraux tels que le carbonate de calcium, les phosphates de sodium ou de potassium, les chlorures de sodium ou de potassium, les sels de magnésium, de cuivre, etc. Pour obtenir des quantités considérables de xanthothricine on effectue la culture en deux stades, en profondeur en réglant l'åeration. Pour inoculer les fermenteurs on utilise le mycélium végétatif. Le milieu sur lequel on fait croitre le mycélium végétatif peut être le même que celui qui est utilisé pour la biosynthèse de la xanthothricine ou différent de lui. Généralement la fermentation de la xanthothricine est réalisée a une température de 20 à 400C, de préférence de 26 à 290C au cours d'un laps de temps d'environ 30 à 100 heures, le régime d'aération étant de 0,8 à 1 volume d'air par volume du milieu et par minute. La xanthothricine formée par culture d'un micro-organisme la produisant sur un milieu nutritif dans des conditions décrites dans ce qui précède,est purifiée après la séparation du my célium et est isolée par des méthodes généralement adoptées pour l'obtention des antibiotiques. On filtre la liqueur provenant de la culture contenant la xanthothricine, on sépare le mycélium, on soumet le filtrat à une valeur déterminée du pH, à une extraction par des solvants organiques (il est préférable d'utiliser comme agents d'extraction des hydrocarbures chlorés). Dans l'extrait obtenu on cristallise la xanthothricine. La suite et l'association des méthodes peuvent être. modifiés, mais les opérations en cas de besoin peuvent être répétées. La xanthothricine obtenue par le procédé revendiqué se présente sous forme de cristaux, F. = 1721 1730 (dans l'acétate d'éthyle), Rf = 0,09 (chromatographie en couche mince sur gel de silice dans le système acétate d'éthyle/benzène dans un rapport de 3/2); spectre ultraviolet ( éthanol # maxi (1g # ) 261 (4,18), 330 épaulement (3,29), 400 (3,59), spectre IR (kir) :pmaxl 1706, 1680, 1615, 1540 cm spectre de résonance magnétique nucléaire des protons (CDC13) : déplacements J 3, (JH - singulet, 4,16 (3H- singulet), 8,79 (1H singulet), ppm. La formation de la xanthothricine par culture de Streptomyces brunneus subspecies xanthothricini est illustrée par les exemples suivants. Exemple 1 On introduit dans des fioles d'Erlenmeyer d'une capacité de 750 ml, 125 ml d'un milieu nutritif de composition suivante, % extrait de mals 0,25 (poids à l'état sec) carbonate de calcium 0,5 chlorure de sodium 0,5 sulfate d'ammonium 0,35 glucose 1,5 amidon 2,0 eau du robinet 1 litre pH 6,9 à 7,0 Après la stérilisation du milieu sous 0,8 atm pendant 30 minutes on effectue l'ensemencement par un bloc de gélose d'une culture de 10 à 12 jours de Str. brunneus Subsp.xa.nthothrici ni RIA - 1568. On place les fioles sur des agitateurs rotatifs à secousses dont la vitesse de rotation est de 230 à 240 tr/mn et on effectue l'incubation pendant 48 heures à une temperature de 26 à 280C.On transfère le mycelium végétatif de 48 heures ainsi obtenu à raison de 2,5 cm3 dans des fioles d'Erlenmeyer d'une capacité de 750 cm contenant chacune 125 cm d'un milieu nutritif stérile de même composition. On effectue la biosynthèse de l'antibiotique dans les mêmes conditions que la croissance de la semence pendant 72 heures. Ensuite on sépare le mycelium par filtration à partir de 6 litres de la liqueur de culture qui contient 0 mi microgrammes par cenl-imètre cube due xanthothricine, on acidifie la liqueur obtenue à l'acide sulfurique dilué jusqu'à un pH de 5,6 à 6,0, et on effectue l'extraction par le chloroforme.On sèche l'extrait par du sulfate de sodium anhydre et on réduit le volume par évaporation sous vide (20 mm) à 35 OC. On dissout le -résidu dans 20 cm3 d'alcool isopropyliqùe et on l'abandonne pendant 6 heures à une température de 50C. On sépare les cristaux précipités de xanthothricine par filtration tandis qu'on isole une seconde portion de substance à partie de la liqueur-mère par évaporation partielle et par recristallisation dans l'alcool isopropylique (au total 363 milligrammes, F. = 172 à 1730C) Exemple 2 On charge un fermenteur d'une capacité de 45 litres de 25 litres d'un milieu nutritif de la même composition que celle qui avait été indiquée dans l'exemple 1. On stérilise le milieu à une température de 122 à 1240C pendant 35 minutes et on l'inocule par le milieu d'ensemencement selon l'exemple 1 à raison de 2 % du volume du milieu. La durée de fermentation est de 65 à 72 heures. On effectue la biosynthèse avec l'aération à raison de 0,8 à 1 volume d'air par volume du milieu par minute avec addition comme anti-mousse d'huile de cachalot. On sépare le mycelium de 20 1- de liqueur de culture, on extrait la liqueur obtenue au chloroforme. Après la separation de la couche au chloroforme on acidifie la couche aqueuse jusqu'à pH 5,0 et on extrait à l'acétate d'éthyle. On réunit les résidus après l'évaporation partielle des couches au chloroforme et a l'acétate d'éthyle et on les analyse par chromatographie dans une colonne remplie de 300 grammes d'acide silicique anhydre (150 à 200 mesh). Au cours de l'élution par acétate d'éthyle on recueille la fraction de RF = 0,08 (gel de silice, acétate d'éthyle), d'où l'on isole 962 milligrammes de xanthothricine.F. = 172 à 1730C (lamelles jaunes dans l'acétate d'éthyle). Exemple 3 On sépare par filtration le mycelium à partir de 6 litres de liqueur de culture obtenue suivant l'exemple 1 et on ajoute à la solution 3,6 kilogrammes de sulfate d'ammonium. On sépare le précipité formé par filtration et on extrait le filtrat au chloroforme. On effectue le traitement ultérieur d'une façon analogue à celle de l'exemple 1. REVENDICATIONS 1 - Procédé de réparation de xanthothricine par culture d'un micro-organisme sur un milieu nutritif contenant des sources de carbone, d'azote et des sels minéraux, avec séparation subséquente du produit visé à partir de la liqueur de culture, caractérisé en ce qu'à titre de micro-organisme on utilise Streptomyces brunneus subspecies xanthothricini. 2 --Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise Streptomyces brunneus Subspecies xanthothricini RIA-1568 et ses variants. 3 - Procédé suivant les revendications let 2, caractérisé en ce qu'on effectue la culture à une température de 26 à 290C. 4 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on effectue la culture dans des conditions aérobies.