Brevet FR2444081A1 — publié le 19800711

La présente invention est relative à une méthode de culture des microorganismes, en particulier pour analyse bactériologique du sang. L'invention se rapporte plus particulièrement à une amélioration de la méthode de Castaneda, dans laquelle on procède à une culture simultanée sur deux milieux de culture, l'un solide et l'autre liquide, en présence d'une atmosphère stérile constituée par exemple par un mélange d'air et de gaz carbonique sous pression réduite. Usuellement, on utilise un flacon présentant une face latérale plane qui est garnie intérieurement d'une couche de 2 à 15 mm de gélose, qui constitue le milieu de culture solide. Le flacon contient également une quantité convenable, par exemple quelque centilitres,du milieu de culture liquide, et l'atmosphère stérile choisie, à la pression désirée. On introduit dans le flacon, avec les précautions usuelles d'asepsie, l'échantillon à étudier, pàr exemple du sang supposé contenir des microorganismes, on le mélange avec le milieu de culture liquide, et on met celui-ci en contact avec la surface de la couche de gélose, puis on met le flacon dans des conditions d'incubation, en le disposant de telle sorte qu'au moins une partie importante de la surfa cede la gélose ne soit pas en contact avec le liquide.On a longtemps considéré qu'il était préférable que la gélose soit partiellement en contact avec le liquide, ce qui est obtenu par exemple en plaçant le flacon de telle sorte que la face qui porte la géloSe soit verticale. Cette pratique présente cependant certains inconvénients: une fraction plus ou moins importante de la gélose est inutilisable car elle est snus le niveau du liquide si l'échan- tillon contient des antibiotiques, celui-ci diffuse progressivement dans la gélose pendant l'incubation, de façon non contrôlable et la surface utile de la gélose est encore réduite de ce fait. Après un temps d'incubation qui peut varier selon le problème posé, on observe le trouble apparu dans le miliéu liquide ainsi que les colonies qui ont pu se développer, et on procède éventuellement à des prélèvements de celles-ci pour d'autres examens. La méthode usuelle se heurte à un certain nombre de difficultés. La mise en place de la gélose est délicate et ne peut être faite que dans des installations spécialisées. I1 arrive qu au cours du transport vers le lieu d'utilisation, la couche de gélose se déplace ou se décolle, rendant le flaçon inutilisable. Divers procédés ont été proposés pour éviter de tels incidents, par exemple en prévoyant une armature de tissu dans la couche de gélose, mais cela entraine une complication supplémentaire. I1 a également été proposé d'utiliser des flacons de forme triangulaire ou trapézoïdale dans lesquels la face qui porte la gélose fait un angle aigu avec les faces adjacentes, ce qui ltempêche de glisser. L'inconvénient de la forme triangulaire est qu'il est impossible d'empêcher que la gélose soit en contact avec le liquide, lorsque le flacon est posé sur une surface plane. Si le flacon est de forme trapézoidale, il est possible de placer la face portant la gélose en position horizontale, audessus du liquide. Dans ce cas, étant donné que, pour avoir une bonne sensibilité, la face portant la gélose est la plus large, le flacon est en équilibre peu stable.On pourrait, il est vrai réaliser des supports spéciaux pour flacons triangulaires ou tra pézoidaux, de façon à remédier à leurs inconvénients, mais ce serait au prix d'une complication supplémentaire, et on utilise habituellement de tels flacons dans la position verticale. Selon la méthode usuelle, on utilise le même type de flacon pour des cultures aérobies ou anaérobies. Les flacons renfermant une atmosphère de type "anaérobie" sous pression réduite, il suffit d'y faire rentrer de l'air pour opérer en conditions "aérobies". Le bouchon est étanche et a auto-obturation: on entend par là qu'il peut être traversé par l'aiguille d'une seringue tout en conservant son étanchéité même après le retrait de l'aiguille. Ceci est obtenu en constituant le bouchon d'une capsule de caoutchouc, ou matière analogue, d'une épaisseur suffisante, qui pénètre en frottant dans le goulot par sa partie centrale et possède un bord d'appui plus large qui vient en contact avec l'extrémité du goulot. Pour faciliter l'enlèvement du bouchon afin de prélever des colonies en cours ou en fin d'opération, il est prévu une couronne rigide, qui se visse sur la paroi extérieure du goulot et qui pénètre dans une rainure annulaire prévue a la partie su périeure du bouchon de façon a entraîneur celui-ci vers le haut lors du dévissage. Cette disposition présente l'inconvénient que si, entre la préparation du flaçon et son usage, la couronne est tournée accidentellement,il peut en résulter une cassure partielle du vide et/ou un changement de nature de l'atmosphère intérieure du flacon, et même une contamination, cet incident pouvant être indécelable. Il existe dans le commerce de nombreux types de capsules de surbouchage avec des dispositifs qui garantissent qu'un récipient n'a pas été ouvert, mais ceux-ci comprennent généralement une partie déchirable qui est solidaire d'une couronne vissée. Cette partie déchirable ne commence à être détériorée qu'après que la couronne a déjà été tournée d'un certain angle. En effet, ces dispositifs sont destinés a garantir qutil n'y a pas eu prélèvement ou substitution de liquide, et non pas a garantir que le bouchon lui-même n'a pas été déplacé, et que l'atmosphère du récipient n'a pas varié. La présente invention a pour but de supprimer ces différents inconvénients. Elle fournit une méthode de culture de microorganismes dans laquelle on utilise un flacon préparé å l'avance et comportant une face latérale sensiblement plane révêtue intérieurement d'une couche de gélose de 2 å 15 mm d'épaisseur, cette face se raccordant aux faces adjacentes par un angle aigu pour immobiliser la gélose, le flacon contenant en outre un milieu de culture liquide et une atmosphère stérile, et étant pourvu d'un bouchon étanche i auto-obturation, on introduit a travers ledit bouchon un échantillon dont on cherche leiqrm80 mélange le milieu de culture liquide avec l'échantillon, on lui fait mouiller la surface de la couche de gélose en inclinant le flacon, puis on place le flacon dans une position où la surface de la gélose est écartée du liquide et on laisse se développer les colonies de microorganismes sur la gélose et dans le liquide, méthode dans laquelle on utilise un flacon de forme générale rectangulaire, et dont au moins les deux faces latérales adjacentes a celle qui porte la gélose sont bombées vers l'intérieur et se raccordent a la face portant la gélose avec un arrondi dont le rayon moyen est inférieur d'au moins 15% a l'épaisseur minimale de la couche de gélose. Par "rayon moyen de l'arrondi", il faut entendre le rayon du cercle le plus grand qui s inscrit dans l'arrondi en lui étant tangent au moins en trois points. En effet,la forme intérieure d'un récipient, et en particulier d'un flacon en verre relativement épais, ne peut être déterminée avec une grande précision, attendu qu'un tel récipient est usuellement obtenu par soufflage à l'intérieur du moule qui ne détermine avec certitude que la forme extérieure du récipient; aussi, la forme intérieure du récipient dépend du savoir-faire du fabricant de flacons. I1 faut observer a ce sujet que, normalement, le flacon n'est pas recyclé en raison des problèmes de nettoyage et de stérilisation notamment. Une méthode de fabrication aussi peu coûteuse que possible, c'est-à-dire le soufflage,est donc a préférer, aussi bien pour les flacons de verre que pour les flacons de matière plastique. Le rayon moyen-de l'arrondi peut être aussi petit qu'on le veut. Les limites technologiques ne permettent guère de descendre au-dessous d'une fraction de millimètre avec les procédés usuels de soufflage. De préférence, le fond est également bombé vers l'intérieur et se raccorde a la face qui porte la gélose en observant les mêmes régles que pour les faces latérales. Suivant une autre modalité intéressante de l'invention, on utilise un flacon dont le dispositif d'obturation est vissé sur le goulot, ce flacon étant pourvu d'une capsule de surbouchage de garantie, qui comporte sur sa jupe une saillie interne qui s' engage sous une nervure annulaire correspondante du flacon et une languette longitudinale déchirable, ladite capsule pouvant tourner librement autour du dispositif d'obturation. On enlève ladite capsule avant d'introduire le liquideàtravers le bouchon, et on dévisse le dispositif d'obturation seulement après le développement des colonies de microorganismes. L'invention sera exposée plus en détail a l'aide des figures parmi lesquelles Fig. 1 est une demi-coupe, demi-vue de face d'un flacon en verre selon l'invention. Fig. 2 est une demi-coupe, demi-vue de côté du même flacon. Fig. 3 est une demi-coupe selon III-III et demi-vue de dessous du même flacon. Fig. 4 est une demi-coupe du goulot et du dispositif de bouchage. Fig. 5 est une vue en perspective de la capsule de surbouchage. Fig. 6,7, 8 sont des vues d'une autre réalisation du flacon, en matière plastique, respectivement de face, de côté et de dessus. Le flacon décrit aux figures I a 3 est de forme générale rectangulaire. I1 présente deux faces planes 1, 2, parallèles, identiques, dont l'une porte la couche de gélose 3. Les deux autres faces 4,5 ainsi que le fond 6 sont bombés vers l'intérieur. Les surfaces extérieures des faces 4 et 5 font avec les faces planes 1, 2 un angle maximum d'environ 1250 , alors que la surface extérieure du fond 6 fait avec les mômes faces planes, 1,2,un angle maximum de 1350. A l'intérieur, les angles sont forcément un peu plus faibles mais ils dépassent très largement 90". On a tracé sur les figures 2 et 3 les cercles 7,8 inscrits dans la surface de raccordement et qui définissent la courbure de celle-ci. On constate que leur rayon est nettement inférieur a l'épaisseur de la couche de gélose, d'environ 35%. On comprend qu'avec une telle disposition, si la gélose commençait a glisser, elle devrait se replier sur elle-même avec diminution de volume, d'où formation d'une zone fortement comprimée qui bloquerait le mouvement. Le flacon comporte un goulot 9, pourvu d'un filetage et, sous celui-ci, d'une nervure annulaire 10. Si on se reporte 9 la figure 4, on constate que le bouchon, en caoutchouc, comporte un corps 11 central qui pénètre dans le goulot 9 et en assure l'étanchéité, une partie élargie 12 qui prend appui sur le bord extérieur du goulot et empêche le corps de s'enfoncer plus profondément sous l'effet du vide, et un prolongement supérieur 13, présentant une rainure circulaire 14 dans laquelle pénètre a force le bord intérieur d'un disque 15 porté par la couronne 16 qui se visse sur le goulot. Cette couronne, en matière plastique rigide, permet la mise en place et l'enlèvement faciles du bouchon. Elle présente, a sa partie supérieure,une nervure annulaire 17, qui monte légèrement plus que haut/le prolongement supérieur 13 du bouchon, et dont on verra ci-dessous l'utilité. La capsule de surbouchage en polyéthylène ou autre matière plastique souple comprend un fond circulaire plan 18, et une jupe légèrement tronconique 19. Elle est retenue par un ergot 20 qui vient s'insérer sous la nervure annulaire 10, mais elle peut tourner librement autour du goulot. La face inférieure du fond 18 repose sur la nervure annulaire 17, avec un faible frot ne tement, et/vient pas au contact de la partie supérieure 13 du bouchon en caoutchouc. La position de l'ergot 18 permet un jeu appréciable de la capsule dans le sens vertical. La capsule comporte une languette d'arrache 21 délimitée par deux lignes d'affaiblissement 22, 23 . Ces deux lignes sont parallèles et verticales, et, au droit de l'extrémité de la languette 21, une échancrure 24 du fond 18 de la capsule facilite l'arrachage de ladite languette.L'ergot 20 est porté par la languette, mais celui-ci ou d'autres ergots pourraient être portés par le reste de la jupe; en effet, l'arrachage de la languette diminue la rigidité de la jupe, qui devient alors assez souple pour être enlevée aisément même si elle porte un ou plusieurs ergots. Ainsi, un choc sur le flacon ou tout autre incident analogue fait tourner la capsule autour de la couronne sans que celle-ci soit dévissée. Le bouchon en caoutchouc ne peut pas non plus être endommagé accidentellement sans que la capsule n'en porte la trace. Dans une autre forme de réalisation de la capsule, celle-ci comporte une jupe 19 dont la hauteur est telle qu'a l'enfon- cement, son bord inférieur vient prendre appui sur le corps du flacon ou sur une partie élargie du goulot avant que le fond vienne en contact avec la couronne 16. La forme de cette dernière peut être simplifiée puisque la nervure 17 n'est plus nécessaire. En revanchessla longueur de la jupe de la capsule doit être adaptée à chaque type de flacon. Les figures 6 a 8 représentent un flacon analogue à celui décrit plus haut, mais réalisé en matière plastique. La min ceur de celle-ci permet de réaliser des raccordements curvilignes plus accusés et le raccordement des faces planes 1 et 2 avec les autres faces 4, 5 se présente l'extérieur, sous forme de bourrelets en forme de demi-cercles, si bien qu'on peut considérer que l'angle des faces planes avec les autres faces atteint 1800. Dans ces conditions, le rayon de l'arrondi peut n'être que de peu intérieur à l'épaisseur de la gélose tout en assurant à celle-ci un maintien efficace. Le fond 6 est également bombé vers l'intérieur mais forme un angle rentrant moins accusé, de l'ordre de 135". Le mode d'utilisation des flacons de deux types selon le procédé se déduit aisément de ce qui précède. Le laboratoire utilisateur reçoit les flacons pourvus de la couche de gélose et contenant quelques centilitres di milieu de culture liquide et une atmosphère convenable, par exemple de l'air enrichi à 10% de gaz carbonique et sous une pression absolue de 0,5 ou O, 8 atmosphère, ces flacons étant bouchés et pourvus de leur capsule au moment du remplissage.L'opérateur arrache la languette de la capsule et stérilise la face supérieure du bouchon de caoutchouc et injecte à travers celui-ci l'échantillon, par exemple du sang. I1 agite le flacon pour obtenir un mélange de l'échantillon avec le milieu liquide, et on met ce mélange en contact avec la surface de la gélose en plaçant le flacon couché, face portant la gélose en bas, puis on place le flacon dans un incubateur, le flacon étant alors couché mais avec la face portant la gélose en haut. Les observations se font soit de face, soit par transparence a travers la gélose. La forme du flacon permet en effet des observations faciles selon les deux manières, sans qu'on soit gêné par des aberrations optiques, et ce, malgré la grande dimension de la surface utile de la gélose. Un autre avantage du flacon selon l'invention est de permettre son empilage sous un faible volume. D'autre part, sa forme symétrique facilite les manutentions par les machines. Enfin, la conception du système d'obturation et de la capsule assure une sécurité inégalée pour un prix réduit. REVENDICATIONS 1. Méthode de culture de micro-organismes dans laquelle on utilise un flacon préparé à l'avance et comportant une face latérale sensiblement plane revetue intérieurement d'une couche de gélose de 2 à 15 mm d'épaisseur, cette face se raccordant aux faces adjacentes par un angle aigu pour immobiliser la gélose, le flacon contenant en outre un milieu de culture liquide et une atmosphère stérile et étant pourvu d'un bouchon étanche à autoobturation, on introduit à travers ledit bouchon un échantillon dont on cherche 16 germes, on mélange le milieu de culture liquide avec l'échantillon, on lui fait mouiller la surface de la couche de gélose en inclinant le flacon, puis on place le flacon dans une position où la surface de la gélose est écartée du liquide et on laisse se développer les colonies de micro-organismes sur la gélose et dans le liquide, caractérisée en ce qu'on utilise un flacon de forme générale rectangulaire, et dont au moins les deux faces latérales adjacentes à celle qui porte la gélose sont bombées vers l'intérieur et se raccordent à la face portant la gélose avec un arrondi dont le rayon moyen est inférieur d'au moins 15% a l'épaisseur minimale de la couche de gélose. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le fond du flacon est bombé vers l'intérieur et se raccorde a la face portant la gélose avec un arrondi dont le rayon moyen est inférieur d'au moins 15% à l'épaisseur minimale de la couche de gélose. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, et dans laquelle on utilise un flacon dont le dispositif d'obturation est vissé sur le goulot, caractérisée en ce qu'on utilise un flacon pourvu d'une capsule de surbouchage de garantie, qui comporte sur sa jupe une saillie interne qui s' engage sous une nervure annulaire correspondante du flacon, et une languette longitudinale déchirable, ladite capsule pouvant tourner librement autour du dispositif d'obturation, en ce qu'on enlève ladite capsule avant d'introduire l'échantillon à travers le bouchon, et on dévisse le dispositif d'obturation seulement après le développement des colonies de microorganismes. 4. Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que le dispositif d'obturation comporte une nervure circulaire en saillie vers le haut, en matériau à faible frottement, qui supporte le fond de la capsule de surbouchage. 5. Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que le bord inférieur de la capsule de surbouchage vient prendre appui sur le corps du flacon ou sur une partie élargie du gou lot, sans que le fond de la capsule puisse s'appuyer sur le dispositif d'obturation. 6. Flacon pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'une des revendications 1 à 5, et de forme générale rectangulaire, caractérisé en ce qu'au moins les deux faces latérales adjacentes a celle qui doit porter la gélose sont bombées vers l'in térieur et se raccordent a ladite face avec un arrondi dont le rayon moyen est inférieur d'au moins 15% à l'épaisseur minimale prévue pour la couche de gélose. 7. Capsule de surbouchage pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'une des revendications 1 a 5, et comportant une languette longitudinale déchirable et une saillie interne susceptible de s'engager sous une nervure annulaire du flacon, caractérisée en ce que le diamètre interne de ladite capsule est nettement supérieure au diamètre extérieur dkdispositif d'obturation si bien que ladite capsule peut tourner librement autour dudit dispositif d'obturation.