Brevet FR2441172A1 — publié le 19800606

Le développement des compteurs automatiques pour la numération de globules rouges, de glofiules blancs et de plaquettes sanguines, ainsi que la demande toujours croissante pour un contrôle de qualité dans les laboratoires hospitaliers, créent la nécessité de disposer de composants cellulaires stabilisés du sang afin de garantir des résultats reproductibles et la précision des compteurs. On a utilisé de très nombreux composés pour augmenter la rigidité des membranes cellulaires des composants indiqués afin que les cellules ne subissent pas une lyse au vieillissement. Parmi les agents utilisés dans ce but, on peut citer le formaldéhyde, 1'acide tannique, le glutaraldéhyde et l'aldéhyde pyruvique. lies étalons de référence pour la numération de plaquettes sont disponibles dans le commerce aussi bien à base de plaquettes du sang humain que de plaquettes du sang équin. On extrait les plaquettes du sang par centrifugation, on les lave avec une solution saline tamponnée et ensuite on "fixe" avec du glutaraldéhyde. L'étalon final possède une durée de conservation d'au moins six mois à la température ambiante. On utilise cet étalon comme suit 1 - On le mélange intimement pour assurer l'uniformité. 2 - On utilise une micropipette pour enlever 5 microlitres de plaquettes. On place les 5 microlitres dans 15,0 ml d'un diluant iso- tonique. La formule exacte du diluant varie d'un fabricant à un autre, mais en général il contient du chlorure de sodium, du chlorure de po tassium, et un tampon phosphaté afin de maintenir le pH à 7,3. le récipient pour la dilution est en général un récipient jetable en polystyrène comportant un couvercle en polyéthylène monté par enclenchement. Après avoir introduit les plaquettes dans le diluant, on inverse doucement le récipient 2 à 3 fois et on compte les plaquettes dans le mélange. La numération de plaquettes effectuée dans ces conditions est très reproductible (+ 2 %). Cependant si l'on secoue le récipient vigoureusement ou si on le laisse au repos pendant 30 minutes, on constate une diminution du compte des plaquettes. Par exemple, avec une inversion douce du récipient on obtient un compte de 8 400 à 8 900 alors qu'avec un secouage vigoureux, on obtient 5 600 à 6 700. Même après une période de repos de 30 minutes, le compte tombe d'une valeur initiale de il 200 à 11 500 à une valeur finale de 10 000 à 10 100. Les chiffres ci-dessus sont représentatifs de ceux qu on obtient à partir d'échantillons qu'on laisse se déposer ou d'échantillons qu'on secoue vigoureusement; cependant, des variations considérables de la diminution du compte des plaquettes interviennent surtout avec des échantillons secoués en raison de la difficulté d'étalonnage du mode d'agitation. On a présumé que la diminution du compte des plaquettes par suite d'une violente agitation ou d'une période de repos était due à l'adsorption des plaquettes sur la surface du polystyrène. En conséquence, on a essayé des récipients en verre et en verre revêtu d'une silicone, en procédant de la même façon qu'avec les récipients en polystyrène et on a également constaté une diminution de la numération des plaquettes avec le temps et après secouage. On a ensuite étudié une variante de la technique, consistant à traiter les récipients en matières plastiques avec des solvants organiques tels que le chloroforme, l'acétone ou le chlorure de méthylène. Un tel traitement devait autre un rinçage rapide étant donné que si l'on laissait les solvants en contact avec le récipient de polystyrène, les solvants dissolveraient ce dernier. Cependant ces traitements augmentent l'adsorption des plaquettes, ctest-à-dire que le compte des plaquettes diminue. La plus forte adsorption faisant suite à un traitement par un solvant laisse penser que le solvant organique enlève l'ruent de démoulage qu'on trouve normalement à la surface du récipient en polystyrène. les agents de démoulage sont périodiquement pulvérisés sur le moule pour contribuer à la séparation du récipient en matière plastique de son moule (démoulage). tes proportions variables d'un tel agent de démoulage restent sur les récipients en matières plastiques. Toujours en poursuivant la même idée, on a pulvérisé plusieurs agents de démoulage sur la surface intérieure de récipients en polystyrène servant à la numération des plaquettes, on a ensuite rempli les récipients avec le diluant et les plaquettes et on a secoué.On a pensé que si l'agent de démoulage était responsable de la variation des comptes obtenus entre un récipient et un autre et aussi d'une diminution plus rapide des comptes après traitement par des solvants organiques, alors après la pulvérisation de l'agent de démoulage sur le récipient, on ne devrait pas constater de diminution du compte des plaquettes. On a constaté qu'un récipient ayant éte rincé avec du trichlorométhane et ayant été ensuite séché ne procure pas la stabilité désirée; en effet, le compte tombe de 9 900 après une inversion douce,à 6 700 après secouage vigoureux à 6 reprises. Cependant, avec l'agent de démoulage "I;1$-122" qui est un télomère fluorocarboné vendu par Miller-Stephenson Chemical Co, Inc. Danbury Conn. on obtient un compte de 10 239 après une inversion douce et de 10 182 après 6 secouages vigoureux. Après avoir discuté de la question avec plusieurs fabricants d'agents de démoulage, le demandeur est finalement arrivé à la conclusion qu'il se pourrait fort bien que ce soient les propriétés tensio-actives des agents de démoulage qui empêchent l'adsorption des plaquettes à la surface du polystyrène. Pour cette raison, le demandeur a étudié divers agents tensio-actifs aussi bien cationiques, qu'anioniques et non-ioniques. les surfactifs cationiques provoquent invariablement une agrégation des plaquettes. La plupart des surfactifs non-ioniaues et anioniques empêchent les diminutions des comptes qui ont lieu après une période de repos ou après secouage des plaquettes.Bien que la solution du problème recherché ait semblé être proche, un examen des grosseurs des plaquettes traitées par des surfactifs à l'aide d'un appareil Coulter Z3I, qui est un instrument servant à la détermination de la grosseur de certaines particules telles que les plaquettes et les globules blancs du sang, indiquait une forte diminution de la grosseur des plaquettes. Cependant lorsqu'on examine les plaquettes sous un microscope comportant un micromètre oculaire, on ne détermine aucun changement de la grosseur des plaquettes. Le principe du compteur Coulter est qu'il mesure les chan gements de conductivité; les surfactifs modifient la conductivité et les plaquettes paraissent ainsi plus petites lors d'un examen à l'ins trument. Tous les surfactifs testés jusqu'à ce stade provoquent ce changement apparent de la grosseur. Une diminution de la grosseur apparente est un changement inacceptable étant donné que la plupart des instruments servant à compter les plaquettes auraient réalisé un comptage inexact dans ces conditions. le demandeur a ensuite essayé plusieurs polyéthylène-glycols. On connait le polyéthylène-glycol 400, le polyéthylène-glycol 4 000, le polyéthylène-glycol 6 000 et le polyéthylène-glycol 20 000. le nombre qui suit le polyéthylène-glycol est sa masse moléculaire approximative. les polyéthylène-glycols sont des polymères de l'oxyde d'éthylène de formule générale HOCH2 (CH20CH2)n CH2OH dans laquelle n représente le nombre moyen des groupes d'oxyéthylène. Tous les polyéthylène-glycols diminuent la tension superficielle. lies polyéthylène- glycols liquides (200, 300, 400), quand on les ajoute à des suspensions de plaquettes, n'empdchent pas l'adsorption des plaquettes, c'est-à-dire qu'une diminution du compte intervient quand même.Les PEG - 4 000, 6 000 et 20 000 sont tous efficaces pour-empêcher la diminution du compte après secouage. Cette différence est incompréhensible étant donné que tous les PEG ont le même effet sur la tension superficielle. Les PEG liquides ainsi que les PEG solides en solutions aqueuses ont des tensions superficielles d'environ 70 dynes/cm à 250 C aux faibles concentrations et ces tensions tombent à 45-50 dynes/cm à des concentrations de 30 à 70 ,'. Par l'utilisation d'une petite quantité d'un polyéthylène-glycol sol-ide (0,1 à 0,5 g) par litre de la dilution de l'étalon de référence des plaquettes, on peut stabiliser l'étalon contre une diminution du compte aussi bien au repos que lors d'un secouage vigoureux et sans diminution apparente de grosseur ce qui aurait Dour résultat un compte faible et faux avec les instruments de comptage. Après la découverte selon laquelle les faibles quantités de polyéthylène-glycol stabilisent l'étalon de référence des plaquettes, le demandeur a entrepris une recherche de la technique antérieure pour déterminer la façon dont les polyéthylène-glycols ont été utilisés précédemment en relation avec le sang, en général, et les plaquettes du sang en particulier. Cette recherche a révélé l'utilisation de substances tensio-actives telles que les produits "Pluronic". Ce sont les produits de condensation de poly(oxypropylène)/ poly(oxyéthylène) ayant des masses moléculaires de 1 000 à 15 000 fabriqués par BASF Wyandotte. L'utilisation des produits "Pluronic" est décrite dans Bibliotheca Anatomica NO 12, pages 208-212 (1973). Bien aue l'addition d'un produit "Pluronic" à un étalon de référence des plaquettes empêche l'agrégation ou la congélation et l'adsorption sur le récipient, il n'en reste pas moins que, dans les 10 minutes qui suivent l'addition du produit "Pluronic" aux plaquettes, la forme apparente commence à diminuer.Celà est étonnant étant donné que le rapport étroit qui existe entre les produits "Pluronic" et le polyéthylène-glycol fait penser que les produits "Pluronic" pourraient être également satisfaisants. Une autre référence de la technique antérieure découverte par le demandeur est décrite dans Cryopreservation Techniques, Transfusion Nai-Juin 1975, Volume 15 NO 3, pages 219-225. Cette technique concerne également l'utilisation d'additifs aux plaquettes en vue d'une congélation et on indique que le diméthyl-sulfoxyde (D2ASO) et le polythylène-glycol (PEG) conviennent dans ce but, les résultats avec DMSO étant supérieurs. Cependant, le DMSO ne réussit pas à stabiliser les plaquettes. L'invention va maintenant cotre décrite plus en détail en regard du dessin annexé, sur lequel la Fig. 1 représente deux explorations Coulter de plaquettes fortifiées avec PEG 6 000, espacées d'environ trois semaines; la Fig. 2 représente deux explorations Coulter de plaquettes fortifiées par un surfactif du commerce, espacées d'environ quatre jours. Une composition représentative, selon l'invention, dans laquelle un PEG solide est ajouté à une suspension de plaquettes, comprend les ingrédients suivants par 100 ml de la suspension de plaquettes 2,0 ml de glutaraldéhyde à 25 ç 1,5 g de ma2 HPO4 10-20 g de PEG 6 000 ou PEG 4 000. On règle le pH à 7,4, on introduit 3,3 microlitres de la suspension de plaquettes dans 20 ml de diluant et on compte. On secoue vigoureusement cette composition et l'on n'observe aucun changement du compte des plaquettes. On obtient les mêmes résultats quand on ajoute 6,6 microlitres à 20 ml de diluant. A titre de variante, on introduit directement le PEG dans le diluant, selon la formule suivante 0,3 g/l de chlorure de potassium 7,8-g/l de chlorure de sodium 2,4 g/l de phosphate disodique (pH : 7,4) C,110,5 g/l de PEG 4 000 ou PEG 6 000 Les plaquettes introduites dans ce diluant ne sont pas adsorbées dans les récipients et on ne constate aucune diminution du compte après une période de repos dans les récipients. Il est particulièrement important de faire remarquer que si on ajoute le PEG 6 000 aux plaquettes dans la composition précédemment indiquée, on ne constate aucune diminution de la grosseur apparente des plaquettes. Sur la Fig. 1 on voit l'exploration des plaquettes dans PEG 6 000, aussi bien initialement qu'après 3 semaines,à 400 C, montrant l'absence d'une altération de la forme apparente. D'autre part, l'invention est avantageusement utilisable pour des plaquettes franches, c'est-à-dire n'ayant pas subi de fixage. Les plaquettes humaines fraîches fortifiées avec un PEG solide donnent un compte de 22 564 et, après un secouage vigoureux, un compte de 22 258. D'autre part, les mêmes plaquettes sans PEG donnent un compte de 22 565 avant agitation et de 16 817 après agitation. Les surfactifs énumérés ci-après ont été testés sans apporter de résultats avantageux selon l'invention - surfactifs fluorochimiques "FC-128" - "FC 134" - FC-170" fabriqués par 3M Company - "EL 620", "El 719", qui sont des surfactifs non-ioniques fa briqués par GAF Corporation, et qui sont des huiles végétales polyoxylées. Le surfactif "190" de DOW Corning qui est un polymère de silicone/glycol Le surfactif "193" de DOW Corning qui est un agent de prémoussage siliconique et plus précisément un copolymère de silicone/oxy aikylène. Tous les produits suivants fabriqués par GAF corporation, Linden, New Jersey. Gafac RP-71O" ester d'acide "Gafac RE-610" ester d'acide Gafco LO-529" sel sodique partiel de phosphate "tntarox BL-225" polyéther aliphatique linéaire modifié "Antarox BL-240" polyéther aliphatique linéaire modifié "Emulphor EL-620" huile végétale polyoxyéthylée "Emulphor EL-719" huile végétale polyoxyéthylée Surfactifs fluorés de Dupont de Nemours "Zonyl FSB" amphotère "Zonyl FSN" nonionique nZonyl FSC" cationique "Zonyl FSV" anionique "Zonyl FSP" anionique "Zonyl FSA" anionique Wous ces produits exceptés BUSC" empêchent la diminution du compte des plaquettes après secouage. Pour tester chaque surfactif, on l'introduit dans la suspension de plaquettes. On introduit ensuite à l'aide d'une pipette la suspension de plaquettes (6,6 microlitres) dans 20 ml d'un diluant salin en vue de la numération cellulaire. La quantité nécessaire pour empêcher une diminution du compte des plaquettes est comprise entre O,1 et 0,5 ml dans 20 ml de suspension de plaquettes. Parmi tous les surfactifs, celui qui provoque le plus faible changement de la conductivité des plaquettes ou de la grosseur "apparente" est le produit FSN qui est non ionique. Un exemple de l'utilisation de FSN dans la suspension de plaquettes est le suivant : On utilise 0,1 ml de FSN par 20 ml de suspension de plaquettes. On introduit à l'aide d'une pipette 6,6 microlitres de la suspension contenant le surfactif dans 20 ml de diluant. On effectue ensuite le comptage dans le diluant contenant les plaquettes et on trouve un chiffre initial de 9 958. On secoue vigoureusement 6 fois et la valeur du compte tombe à 7 526. On ajoute 0,5 ml de "Zonyl FSN" à 20 ml de la suspension de plaquettes. Après une inversion douce, le compte est de 7 622. Après secouage pendant 30 minutes dans un récipient en polystyrène, le compte est de 7 670. Il est évident à l'examen de ces résultats que lorsqu'on utilise une quantité appropriée de FSN, le phénomène d'adsorption disparate.A titre de témoin, on ajoute la suspension de plaquettes non traitée (6,6 microlitres dans 20 ml de diluant) et lors d'une inversion douce, le compte est de 10 643 mais après six secouages vigoureux, le compte tombe à 5 800. le produit "Zonyl" utilisé comprend 50 ffi de matières solides dans un mélange d'isopropanol et d'eau. On règle ensuite les essais de stabilité dans lesquels on ajoute 0,5 ml de "Zonyl FSEN à 20 ml de suspension de plaquettes et on place le tout dans un récipient hermétique à 400 C, 250 C et 50 C. Les essais initiaux des plaquettes, outre le numération, consistent à mesurer la grosseur des plaquettes à l'aide de l'appareil Coulter ZBI.On répète cette opération tous les trois jours pour déterminer d'éventuels changements, aussi bien de la numération que des grosseurs des plaquettes avec le temps. Après trois jours, l'appareil ZBI indique que la grosseur des plaquettes a changé. Comme expliqué plus haut, on ne constate en fait aucun changement des dimensions physiques des plaquettes'au microscope. Sur la Fig. 2, on voit que les deux explorations sont très différentes l'une de l'autre et cette différence est encore plus prononcée avec une plus forte concentration de FSN. L'utilisation du verre ou du verre revêtu de silicone, comme mentionné plus haut, ne permet pas d'atteindre les objectifs de l'invention, comme on peut le constater à l'examen du résumé suivant. Verre revêtu de silicone Verre 9 800, inversions douces 10 100, 3 mélanges doux 7 780, 6 secouages vigoureux 7 719, 6 secouages vigou reux 7 300, 6 secouages vigoureux 7 401, 6 secouages vigou reux Il va de soi qu'on peut apporter diverses modifications aux modes de mise en oeuvre qui ont été décrits sans sortir pour celà du cadre de l'invention. Revendications 1 - Procédé de préparation d'un étalon de référence stabilisé pour la numération des plaquettes du sang, caractérisé en ce qu'on ajoute un polyéthylène-glycol solide à une suspension de plaquettes ou à un diluant pour ladite suspension de plaquettes, et ensuite on ajoute l'autre composant au mélange résultant de la première addition, obtenant ainsi un étalon qui est notablement stable avec le temps et dans des conditions d'agitation. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on ajoute le polyéthylène-glycol à la suspension. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on ajoute environ 10 à 20 g de polyéthylène-glycol à 100 ml de suspension. 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on ajoute le polyéthylène-glycol au diluant. 5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on ajoute environ 0,1 à 0,5 g de polyéthylène-glycol par litre de diluant.