Brevet FR2447194A1 — publié le 19800822

L'invention a pour objet un nouveau composé biologique obtenu des cultures d'un Trématode ainsi que son procédé d'obtention. L'invention a plus particulièrement pour objet un nouveau composé biologique obtenu par extraction des cultures de Schistosoma mansoni; Elle a spécifiquement pour objet un polypeptide de faible poids moléculaire obtenu à partir des cultures de Schistosoma mansoni. Ce peptide possède les réactions d'identité des peptides. Il n'est pas retenu par une membrane de diafiltration telle qu'une membrane de dextrane reticulée vendue sous la marque AMICON retenant des polypeptides d'un poids moléculaire supérieur à 1000. Les mesures de poids moléculaire effectuées soit par des méthodes physiques (centri- fugation, électrophorèse), soit par analyse chimique indiquent que celui-ci est compris entre 500 et 1000. Il est thermostable, soluble dans l'acide trichloracétique et soluble dans l'eau. L'invention concerne également un procédé d'obtention de ce polypeptide caractérisé en ce que l'on incube pendant un temps déterminé des schistosomes adultes dans une solution saline puis procède à une ultrafiltration pour séparer les corps de Trématodes et les débris d'organismes, recueille le filtrat et le dialyse vis-à-vis de l'eau distillée, sépare le liquide dé diafiltration que l'on lyophylise. Le polypeptide ainsi obtenu se présente sous forme d'un produit pulvérulent, soluble dans l'eau et les solutions salines. Selon une modalité particulière du procédé d'obtention, l'ultrafiltration est effectuée à l'aide d'une membrane vendue sous la marque Millipore d'un diamètre de pores de 0,22 pm, la diafiltration du filtrat est effectuée dans une cellule de diafiltration pourvue d'une membrane vendue sous la marque AMICON et l"incubation préalable dure 3 heures. Le polypeptide selon l'invention manifeste des propriétés pharmacologiques tout à fait remarquables. Il inhibe in vitro et in vivo la dégranulation des mastocytes provoquée soit par l'action d'agents chimiques aller gisants soit par une réaction anaphylactique. Cet effet apparaît comme spécifique car le polypeptide n'a pas d'action sur les eosinophiles ni sur les médiateurs des mastocytes. En outre, il est dépourvu d'effet unitogène car il n'entralne pas d'effet s-ur le développement des cellules HeLa ou de la lignée des cellules de monocytes humaines J 111. L'augmentation du taux d'AMP cyclique intracellulaire dans les mastocytes mis en incubation avec une solution du polypeptide semble indiquer que le mécanisme de celui-ci sur la dégranulation des mastocytes peut être expliqué par une modulation de l'AMP cyclique. Le polypeptide selon l'invention exerce aussi un effet inhibiteur vis-à-vis de la toxicité des eosinophiles dépendante des mastocytes à l'égard des schistosomules sensibilisés avec un anticorps IgG2a. Ce mode d'action très spécifique pourrait expliquer le faible pourcentage de manifestations d'allergie observée lors d'affections parasitaires et pourrait constituer le mécanisme de défense du parasite contre les phénomènes de cytotoxicité induits par les eosinophiles sensibilisés par les anticorps. Le polypeptide objet de l'invention, est distinct de la fraction circulante antigénique M précédemment décrite et obtenue par purification des cultures de schistosomes. En effet, cette fraction n'inhibe pas les réactions d'allergie cutanée et possède apparemment un poids moléculaire élevé. En outre, la fraction antigénique circulante M n'entraîne aucune variation du taux d'AMP cyclique après incubation avec des mastocytes. Le polypeptide selon l'invention trouve donc un emploi en thérapeutique comme médicament de l'allergie, de l'anaphylaxie et des migraines. Il est présenté sous forme de compositions pharmaceutiques contenant le polypeptide selon l'invention mélangé à un ou plusieurs excipients inertes, non-toxiques, pharmaceutiquement acceptables. D'une manière préférée, les excipients choisis sont ceux qui conviennent pour l'administration parentérale, permu queuse, percutanée, rectale ou perlinguale. On pourra citer à cet effet les solutions ou suspensions infectables conditionnées en ampoules, en flacons multidoses ou en seringues auto-injectables, les comprimés sublinguaux, les suppositoires, les solutions pressurisées pour l'administration permuqueuse ou les solutions dans un solvant polaire pour l'application percutanée. La posologie utile dépend principalement de l'indication thérapeutique. En raison de la très faible toxicité du polypeptide selon l'invention, il est possible d'augmenter considérablement les doses lorsqu'un effet plus intense est désiré. Les exemples suivants illustrent l'invention. Ils ne la limitent en aucune façon. Exemple I Préparation du polypeptide de Schistosoma mansoni. 10.000 schistosomes obtenus sur des Hamsters infestés depuis 40 jours sont placés en incubation à 37O dans 10 ml d'une solution de chlorure de sodium hypotonique pendant 3 heures. Le produit d'incubation est ensuite filtré sur membrane Millipore de pores d'un diamètre de 0,22 pm. Le filtrat clair est ensuite dialysé dans une cellule de diafiltration contre 10 ml d'eau distillée. La fraction dialysable est ensuite lyophylisée. Pour les tests pharmacologiques ultérieurs, le polypeptide ainsi obtenu est remis en solution ou en suspension dans 1 ml de serum physiologique. Cette solution sert ensuite pour la mise en pratique des tests pharmacologiques. Exemple II Etude de la libération de serotonine par les mastocytes. La technique utilisée est celle décrite précédemment par Mademoiselle Mazingue J.ofImmunol. Methods 21 (1978) 65. On prélève des cellules de péritoine sur des rats de souche Wistar et on les incube avec le complexe sulfate de créatine - 5-hydroxytryptamine tritiée (G-3H) titrant 10 Ci/mmole - à la dose de 2 fCi pour 1 million de masto cytes. L'essai est pratiqué sur des plaques de microtitration Limbro (Flow lab, Scotland). La dégranulation des mastocytes est déclenchée soit par des agents chimiques soit par une réaction antigène-anticorps. A cette fin, on ajoute à 50 rl de la suspension de mastocytes (5 x 104 mastocytes) à 50 pl d'un milieu minimum essentiel d'Eagle (MEM) de l'institut Pasteur Production, 50 pl d'une solution de 5 rg de sulface de polymixine ou 50 pl d'une solution de 0,5 g du composé 48/80 (Sigma Co.St Louis, Missouri). On laisse les cellules incuber pendant 15 mn à 370, puis centrifuge à 1000 g pendant 10 mn. On prélève 50 du surnageant et on les tranfère dans une fiole de comptage. On soumet la suspension de cellules à l'action de 50 pl d'un enzyme digestif (Digestin, Merck Darnistadt) pour permettre la détermination de la quantité de serotonine libérable par les mastocytes. On ajoute aux fioles de comptable 10 ml d'une solution à 7 g/litre de butyl PPD dans un mélange à parties égales Triton-toluène. On mesure la radioactivité de la suspension par un compteur à scintillation. Le pourcentage de serotonine libérée est exprimé par application de la formule : Q% = X - S x 100 T-S dans laquelle X est la radioactivité mesurée S est la libération spontanée T est la libération de serotonine après traitement par la digestine. Dans le cas de la réaction anaphylactique antigèneanticorps, on ajoute 50 ul de serum non dilué anti-ovalbumine à 50 rl de la suspension de mastocytes. On effectue une sensibilisation passive des mastocytes par incubation pendant 15 mn à 370, suivie d'une compétition avec 50 d'une solution d'ovalbumine à 1 mg/ml à 370 Dans le cas des tests de dégranulation par des agents chimiques, on effectue l'incubation avec 50 pl d'une solution à 10 pg/ml de composé 48/80 ou à 100 pg/ml de sulfate de polymyxine B. Exemple III Inhibition "in vitro" de la dégranulation des mastocytes. L'activité du polypeptide selon l'invention a été déterminée sur des mastocytes de rats in vitro sensibilisés avec 50 pl d'antiserum non dilué anti-ovalbumine et soumis à une incubation supplémentaire avec 50 11g d'ovalbumine. On procède à une incubation préalable des mastocytes avec de 10 à 30 pl de la solution de polypeptide dans le serum physiologique 30 mn avant réaction de sensibilisation. Les mastocytes ainsi activés inhibent d'une manière significative la libération de serotonine tritiée causée par l'ovalbumine, alors qu'on n'observe aucune libération significative induite par addition de polypeptide à la suspension de mastocytes non sensibilisés. Le même essai a été effectué en présence du composé 48/80 et de polymixine B. La libération de serotonine normalement provoquée par ces substances est inhibée par incubation préalable des mastocytes avec 10 ou 20 pl de la solution saline de polypeptide. Le même essai a été effectué après avoir chauffé la solution de polypeptide dans le serum physiologique pendant 1 heures à 1000. Les mastocytes préalablement incubés avec 10 pl de la solution de polypeptide chauffée ou non chauffé, sont ensuite traités par le serum antiovalbumine et l'ovalbumine. Dans les deux cas, l'inhibition de la dégranulation des mastocytes a été pratiquement la meme (46 et 48% respectivement). On peut donc en conclure que le polypeptide selon l'invention, est thermostable. Le tableau I rassemble les résultats obtenus. Exemple IV Inhibition des réactions d'allergie cutanée L'effet antiallergique du polypeptide selon l'invention, a été déterminé sur les réactions cutanées anaphylactiques actives (ACA), sur la PCA et les réactions d'allergie provoquées par des substances chimiques comme le composé 48/ & et le sulfate de polymixine B. Les réactions cutanées ont été très sensiblement inhibées par infection intradermique préalable de 0,1 ml de la solution saline de polypeptide au point d'injection. Les tests de réactions anaphylactiques actives sont effectués par injection intrapéritonéale de 10 d'ovalbumine ainsi que d'une suspension aqueuse de 5 x cellules de Bordeteila pertussés. Trente jours plus tard, on provoque la réaction anaphylactique cutanée par injection intradermiques d'une solution de 1 lug ovalbumine dans 0,1 ml de serum physiologique. On injecte simultanément par voie intraveineuse 4 mg de Bleu Evans dans 1 ml de serum physiologique. Les rats sont tués 30 mn après cette injection et les zones de diffusion du Bleu Evans sur la face interne de la peau sont mesurées à l'aide d'un planimètre. Les réactions d'anaphylaxie passive (PCA) sont effectuées selon la méthode décrite par Ovary Prop. Allergy 5 (1958) 1159. Dans ce test, on injecte à des rats mâles Wistar par voie intradermique 0,1 ml de serum anti-ovalbumine ou de serum de rat injecté par Schistosoma mansoni. 48 heures plus tard les réactions de PCA sont provoquées par injection dans la veine pénienne dorsale de 4 mg de Bleu Evans et 5 mg d'ovalbumine ou 2 mg d'antigène de Schistosoma mansoni en solution dans 1 ml de serum physiologique. Les rats sont tués et examinés dans les mêmes conditions que pour les tests d'ACA. Les réactions d'anaphylaxie active (ACA) sont inhibées d'une manière significative vis-à-vis de l'ovalbu- mine par injection de 0,1 ml de solution du polypeptide au point d'injection alors que l'injection de serum physiologique 15 mn au préalable au point d'injection ne produit aucun effet. Les réactions d'anaphylaxie passive (PCA) sont également inhibées après injection préalable, 15 mn avant l'injection de serum, de la solution de polypeptide par voie intradermique au point d'injection de l'antiserum anti-ovalbumine ou de l'antiserum anti-Schistosoma mansoni. L'essai à blanc ne produit aucun effet. On a varié les doses du polypeptide selon l'invention. L'inhibition ne semble pas être plus grande avec des doses très élevées ainsi que le montrent les résultats rassemblés dans le tableau IV. Il semble qu'il y ait un délai optimum pour faire apparaitre l'effet anti-anaphylactique du polypeptide vis-à-vis de l'ovalbumine. Une injection 48 heures avant l'ovalbumine n'entraîne aucune inhibition. Par contre, l'effet est maximum lorsque le polypeptide est injecté 30 mn ou 3 heures avant l'antigène. L'injection intradermique du polypeptide simultanément avec l'administration intraveineuse de l'antigène n'inhibe pas la réaction d'anaphylaxie passive. Exemple V Inhibition du choc anaphylactique L'injection intrapéritonéale d't mg d'ovalbumine aux cobayes sensibilisés à l'ovalbumine, provoque des convulsions, de la dyspnée et la mort dans un délai de 30 mn à 2h30. L'injection préalable de 3 ml de la solution de polypeptide dans le serum physiologique par voie intrapéritonéale supprime toute mortalité. La seule manifestation observée consiste en une àugmentation de la diurèse alors que l'injection de 3 ml de serum physiologique n'inhibe aucunement le phénomène de choc. Exemple VI Caractérisation par voie immuno-chimique On a procédé à une caractérisation préliminaire des propriétés biochimiques du polypeptide selon l'invention, en utilisant le système ovalbumine anti-ovalbumine utilisé pour la réaction de PCA. Dans un premier test, le polypeptide est traité par l'acide trichloracétique et après neutralisation, la solution trichloracétique inhibe la réaction d'allergie. Dans un second test, la solution de polypeptide est passée sur une colonne garnie d'immuno-absorbant anti Schistosoma mansoni. La colonne est ensuite lavée avec une solution saline. La solution effluente ainsi que le serum physiologique n'ont aucune action sur les réactions de PCA. Par contre, l'éluat manifeste un pouvoir inhibiteur à 75% par rapport à l'effluent. Exemple VII Propriétés pharmacologiques générales du polypeptide. L'injection intradermique des solutions de polypeptide ne provoque aucune réaction locale, ce qui indique cue le polypeptide ne provoque aucune lésion cutanée ou vasculaire. Toutefois, il peut apparaître un phébnomène de vasoconstruction. Exemple VIII Effets du polypeptide sur le taux d'AMP cyclique dans les %astocytes. a a de jà été décrit re la dégranulation des mastocytes s'accompagne d'une baisse du taux d'AMP cycli que intracellulaire. Le polypeptide selon l'invention augment de 450% environ 1 taux d'AMP cyclique des mastocytes après 5 mn d'incubation avec la solution de polypeptide. Le taux d'AMP cyelique des mastocytes non incubés est de 4,74 # 1,75 p. mol. pour 106 mastocytes. Exemple IX frets du polypeptide sur les cellules HeLa et sur les monocytes humains. L'addition de 10 l d'une solution de polypeptide à une suspension de 5 x 105 cellules HeLa ou de 2,5 x 105 ceilules monocytiques humaines par piaque provoque un très léger et transitoire effet sur la viabilité des celiules et leur prolifération. Il apparait à 24h, une légère diminution du nombre des cellules HeLa (p A 3 heures, 8 heures et 72 heures, on ne constate aucune différence significative. Le polypeptide selon l'invention, n'est donc ni nitrogène ni inhibiteur de la multiplication cellulaire. T A B L E A U I Essai Préincubation avec Libération spontanée Pourcentage de Pourcentage anti-ovalbumine de serotonine sérotonine libérée d'inhibition et ovalbumine milieu 0 20,1#0,3 polypeptide 10 l 0,03 9,2#0,4 54 (p 20 l 0,48 6,1#0,2 70 (p 30 l 1,86 9,8#2,1 51 (p Composé 48/80 milieu 17,1#1,7 polypeptide 10 l 15,1#1,2 12 MS 20 l 10,4#1,3 39 Polymixine B milieu 29,7#0,3 polypeptide 10 l 19,5#1,8 34 p 20 l 13,5#1,6 55 p INHIBITION DE L'ANAPHYLAXIE PASSIVE A L'OVALBUMINE Pré injection Surface moyenne Pourcentage en mm2 d'inhibition Serum physiologique 153 + 12 Polypeptide de l'invention dilué au 1/10 111 + 22 27 (NS) dilué au 1/4 108 + 16 29 (NS) dilué au 1/2 49 + 6 68 (p non dilué 42 + 1 73 (p Le polypeptide en solution dans le serum physiolo gique est injecté 15 mn avant l'injection de serum anti-ovalbumine. REVENDICATIONS L'invention a pour objet: 1, Un polypeptide soluble, thermostable, soluble dans l'acide trichloracétique obtenu à partir de cultures de Schistosoma mansoni, et d'un poids moléculaire compris entre 500 et 1000 2. Un procédé d'obtention du polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on incube pendant un temps déterminé des schistosoms adultes dans une solution saline, prodède une ultrafiltration pour séperer les corps des Trématodes, ecueille le filtrat, le soumet à une diafiltration vis-à-vis de l'eau distillée, reprend le liquide de dialyse que l'on évapore à sec par lyophylisa- tion. 3. Un procédé selon la revendication 2, dation 2, dans lequel le temps d'incubation est de ?:- heures environ 4 Un procédé selon la revendication 2, dans lequel l'ultrafiltration est effectuée sur une plaque poreuse dont les pores ont un diamètre de 0,22 m. 5. Un procédé selon la revendication 2, dans lequel la dialyse est effectuée à l'aide d'une membrane de dextrane réticulée retenant les molécules d'un poids moléculaire supérieur à 1000. 6. Les compositions pharmaceutiques renfermant a titre de principe actif le polypeptide de la revendication 1 en association ou en mélange avec un excipient ou un véhicule inerte non-toxique pharmaceutiquement acceptable.