Brevet FR2458588A1 — publié le 19810102

245858e Procédé pour préparer de l'adénosine-5'-tri- phosphate par fermentation. La présente invention concerne un procédé pour préparer de l'adénosine-5'triphosphate par fermentation et plus particulièrement un procédé pour préparer de l'a- dénosine-5'-triphosphate selon un procédé de fermentation dans lequel on utilise des micro-organismes capables d'assimiler le méthanol. Ces derniers temps, on a recherché de plus en plus à se procurer de l'adénosine-5'-triphosphate (désigné ci-après par l'abréviation ATP) dans le domaine des médi- caments, des réactifs biochimiques, etc., car cette sub- stance joue un rôle important dans le métabolisme éner- gétique comme phosphate riche en énergie dans les orga- nismes vivants. On a étudié l'emploi d'une enzyme, la pyruvate-kinase qui est capable de-régénérer l'adénosine- 5'-diphosphate en ATP, dans le système de régénération de i'ATP pour permettre l'utilisation efficace de I'ATP dans un bioréacteur utilisant de i'ATP. On désire donc se pro- curer de l'ATP à bon marché pour produire des substances biologiques et des coenzymes tels que le flavine adénine dinucléotide, le nicotinamide adénine dinucléotide, etc. On connaît divers procédés pour produire de l'ATP tels que l'isolement direct des muscles des animaux, la synthèse organique, la phosphatation enzymatique de l'a- cide adénylique-5' et la fermentation. En ce qui concerne la production par fermentation, on a proposé différents procedés et en particulier un procédé selon lequel on cultive une bactérie appartenant à Brevibacterium ammo- niaqenes dans un milieu contenant de l'adénine ou un de ses dérivés pour produire et accumuler de i'ATP (brevet publié JA n 17634/1966), un procédé selon lequel on cultive un micro-organisme capable de produire de i'ATP dans un milieu contenant un agent tensio-actif et on récupère l'ATP des cultures (brevet publié JA n 28996/ 1974) et un procédé selon lequel on ajoute au milieu un composé ayant un radical hydroxy phénolique lorsque le rendement en ATP dans le milieu a atteint son maximum (brevet JA n0 6490/1978). Cependant, dans tous ces procédés classiques uti- lisant des techniques de fermentation, on fait fermenter un milieu de culture contenant de l'adénine ou un de ses dérivés tels que l'adénosine, c'est-à-dire qu'on utilise canme substrat l'adénine ou un de ses dérivés que l'on phosphate pour produire et accumuler de 1'ATP. Donc, dans les procédés classiques, on utilise une matière première coûteuse, telle que l'adénine ou un de ses déri- vés et il est donc difficile de les considérer comme des procédés industriels avantageux. La demanderesse a étudié la production industrielle peu coûteuse d'ATP selon des techniques de fermentation et a découvert que 1'ATP s'accumule à une concentration élevée dans un milieu de culture lorsqu'on cultive une bactérie productrice d'ATP capable d'assimiler le métha- nol dans un milieu contenant du méthanol ou une substance chimique métabolisée selon la même voie que le méthanol, ainsi qu'une quantité déterminée d'un phosphate minéral comme substrat au lieu d'un substrat coûteux constitué d'adénine ou d'un de ses dérivés. L'invention repose sur cette découverte. L'invention a donc pour objectif principal un procédé permettant la production industrielle avanta- geuse d'ATP par fermentation. D'autres caractéristiques et avantages de l'inven- tion ressortiront de la description détaillée qui suit. La caractéristique principale de l'invention ré- side dans le choix d'un micro-organisme capable d'assi- miler le méthanol pour produire de lATP et la culture d'un tel microbe producteur d'ATP dans un milieu conte- nant comme substrat du méthanol ou une substance chimique métabolisée selon la même voie que le méthanol ainsi qu'un phosphate minéral à une concentration de 4 à 35 g/l exprimée en radical acide phosphorique (PO4) pour ainsi produire et accumuler de l'ATP dans le milieu. On entend ici par "substances chimiques métaboli- sées selon la même voie que le méthanol" des substances que l'on peut utiliser selon la même voie métabolique que le méthanol telles que la méthylamine, le formaldé- hyde, l'acide formique et le méthane. On peut citer comme exemples de bactéries produc- trices d'ATP capables d'assimiler le méthanol que l'on peut utiliser dans l'invention: Methylomonas probus FERM-P 3193 (ATCC 20563) et Methylomonas methylovora ATCC 21369 qui appartiennent au genre Methylomonas; Pseudomonas methylotropha NCIB 10508, Pseudomonas rosea NCIB 10597, Pseudomonas insueta ATCC 21276, Pseudomonas methanolica ATCC 21704 et Pseudomonas methanica ATCC 21439 qui appartiennent au genre Pseudomonas; Methano- monas methanooxidansNRRLB 3451 appartenant au genre Methanomonas; Protaminobacter ruber ATCC 8457 et Protamninobacter candidas ATCC 21372 appartenant au genre Protaminobacter; Achromobacter methanolophila ATCC 21275 appartenant au genre Achromobacter; Corynebacterium s.p. ATCC 21232 appartenant au genre Corynebacterium; Hyphomicrobium variabile NCIB 10517 appartenant au genre Hyphomicrobium; Microcyclus polymorphum NCIB 10516 appartenant au genre Microcyclus; et Bacillus cereus ATCC 14579 et Bacillus subtilis var. NB 1001 FERM-P 1373 appartenant au genre Bacillus. On connaît les publications suivantes qui concer- nent des techniques pour produire des substances utiles par utilisation des types précités de bactéries; cul- ture de microbes constituant une source de protéines avec des milieux à base de méthanol (demande de brevet JA n 28988/1977), production de flavine adénine dinu- cléotide (J. Ferment. Technol. 55, 630 (1977)), production de vitamine B12 (Appl. Microbiol. 30, 477 (1975)), produc- tion de lipides et de polysaccharides (Proceedings of the Conference of Japan Agricultural Chemical Society, 1978, Symposium Cl, Utilisation of Microorganisme, 551-556) et production d'amino-acides (référence précédente), mais on ne connaît pas de publication concernant l'utilisation de ces types de bactéries pour produire de 1'ATP. Dans l'invention, on cultive ces types de bactéries dans un milieu contenant du méthanol ou une substance chimique métabolisée selon la même voie que le méthanol et un phosphate minéral à une concentration de 4 à 35 g/l exprimée en P04. On utilise le méthanol ou la substance chimique comme source de carbone dans le milieu, mais on doit noter qu'une concentration trop élevée de ces sub- stances dans le milieu nuit au développement des bacté- ries. La concentration recommandée d'une telle substance dans le milieu est comprise entre 0,2 à 4 % en volume dans le cas du méthanol et de la méthylamine et entre 0,01 et 0,1 % en volume dans le cas de l'acide formique et du formaldéhyde. Dans le cas du méthane, on l'utilise à une concentration correspondant à sa solubilité. On peut ajouter cette source de carbone en une seule fois au milieu au début de la culture, mais on obtient un meilleur rendement en ATP lorsque, au départ, on maintient la concentration de la source de carbone dans le milieu à une valeur faible et on ajoute des quan- tités complémentaires de la source de carbone dans le milieu au fur et à mesure de sa consommation pendant la culture. Dans le procédé de l'invention, il est essentiel que le milieu contienne un phosphate minéral à une con- centration de 4 à 35 g/l exprimée en Po4, en plus de ladite source de carbone. Cette concentration en phos- phate minéral dans le milieu est supérieure de plusieurs fois à plusieurs dizaines de fois à la concentration dans les milieux ordinaires de culture des bactéries et est tout à fait spécifique. Si la concentration en phosphate minéral (exprimée en P04) dans le milieu est inférieure à 4 g/l, on n'ob- serve pas d'accroissement de la production d'ATP, tandis que si cette concentration est supérieure à 35 g/l, le développement des bactéries productrices d'ATP est ra- lenti, ce qui réduit le rendement en ATP. Il convient de noter que la concentration élevée en phosphate minéral empêche que lVATP produit soit sécrété hors des bactéries t458S88 et décomposé par une phosphatase. Les phosphates minéraux utilisables dans l'inven- tion sont du type couramment utilisé dans les milieux de fermentation et on peut en citer comme exemples (NH3)2HP04, S KH2PO4 et K2HPO4. Le milieu utilisé dans l'invention peut en plus de la source de carbone et du phosphate minéral contenir un sel minéral tel qu'un sel de potassium, de magnésium, de fer, de manganèse, etc. et dans certains cas un sel minéral d'un métal tel que le zinc, le cobalt, le molybdène, etc. ainsi qu'une source d'azote telle que l'ammoniac, un sel d'ammonium, l'urée, un nitrate, etc. On peut également ajouter un agent tensio-actif, un anti- mousse et d'autres additifs. Un exemple de composition de milieu utilisé dans l'invention figure ci-après: Source de carbone 0,05 - 2 % en volume (NH4)2HP04 5 - 45 g/l (3,5 - 32 g/l en PO4) KH2PO4 0,5 - 2,5 g/l (0,35 1,75 g/l en P04) K2HPO4 0,5 - 2,5 g/l (0,275 - 1,37 g/l en P04) (NH4)2 SO4 O - 1,0 g/l MgsO4,7H20 0,5 - 5,0 g/l FeSO4,7H20 0,05 - 0,5 g/l CaCl2, 2H20 O - 0,2 g/l MnS0414H20 0 - 0,2 g/l On effectue de préférence la culture de la bacté- rie productrice d'ATP dans le milieu de culture précé- demment décrit dans les conditions suivantes: pH = 5,8- 9,0 et de préférence 6,0-8,0, température = 15-50 C, de préférence 30-40 C et vitesse d'aération: 0,5-4,0 v/v. min. (volume d'air (1)/volume de solution de culture (1) min.), en agitant à 40-600 tr/min pendant 2 à 9 jours. Pour ajuster le pH du milieu de culture, on peut utiliser une matièr'alcaline telle que l'ammoniac, une matière acide telle que l'acide sulfurique, un agent tempon tel qu'un tampon phosphate, ou d'autres substances appro- priées telles que l'urée, le carbonate de calcium, etc. Dans le cas o on utilise une matière alcaline, on pré- fère particulièrement l'ammoniac, car il peut servir de source d'azote. Pendant la fermentation bactérienne dans les condi- tions de culture selon l'invention, i'ATP s'accumule dans le milieu à une concentration élevée de 2 à 12 g/l. Lors- que la fermentation est achevée, on élimine les microbes et on sépare et recueille de façon connue i'ATP produit. Par exemple, après avoir éliminé les bactéries du milieu (bouillon) de fermentation, on soumet la solution surna- geante à une combinaison de fractionnement et de concen- tration-précipitation par adsorption et élution avec du charbon activé et une résine échangeuse d'ions et on re- cueille l'ATP produit. Selon l'invention, comme le montrent les exemples suivants, on produit et accumule l'ATP dans le milieu de culture à une concentration élevée supérieure à 2 g/1 sans addition au milieu, d'adénine ou d'un de ses dérivés. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. Dans chacun des exemples, on mesure la quantité d'ATP produite dans le milieu comme indiqué ci-après par emploi de la réaction entre i'ATP et le couple luciférine- luciférase illustrée par les équations suivantes: 1) luciférine + luciférase + ATP Mg2+ adényl-luciférine + pyrophosphate 2) adénylluciférine 2 adényl-oxyluciférine On mesure dans la région des longueurs d'onde de 560 à 580 nm pendant une période déterminée l'intensité de la lumière émise par fluorescence dans la réaction 2) ci-dessus avec un CHEMGLOW PHOTOMETER J4-7441 (American Instrunent Co.) et on rapporte la valeur de l'intégrale correspondante à une courbe d'étalonnage préparée avec une solution standard connue d'ATP pour déterminer la quantité d'ATP produite dans la solution de culture. EXEMPLE 1 Pour préparer un milieu de base, on dissout 7,0 g de (NH4)HPO4, 1,0O g de KH2PO4, 1,0 g de K2HP04, 1,0 g de MgSO4,7H20 et 0,1 g de FeSO4,7H20 dans 1 litre d'eau dé- sionisée et on répartit des volumes de 100 ml de ce mi- lieu de base dans des erlenmeyers de 300 ml, puis, après t2458588 7stérilisation, on introduit dans chaque erlerneyer 1,6 g de méthanol. On ensemence chacun des milieux ainsi prépa- rés avec Methylomonas probus FERM-P 3193 (ATCC 20563) que l'on a préalablement cultivé sur une gélose inclinée de composition similaire et on effectue une culture agitée à 300C. Le quatrième jour après le début de la culture, 2,8 g/l d'ATP sont produits et accumulés dans la solution de culture. On soumet 1 litre de la solution de culture à un traitement de chauffage à 80WC pendant 5 minutes et après refroidissement, on centrifuge pour séparer les bactéries, on ajuste le pH de la solution surnageante à 3,5 avec de l'acide chlorhydrique 3 N, puis on traite avec du charbon actif pour adsorber l'ATP sur le charbon actif, puis on élue l'ATP adsorbé sur le charbon actif avec une solution à 50 % d'alcool contenant 1,4 % d'ammoniac. On concentre l'éluat sous pression réduite et à basse température pour éliminer l'excès d'ammoniac et on ajuste le pH au voisi- nage de 8,0. On fait ensuite passer la solution concentrée à travers une colonne de résine échangeuse d'anions forte- ment basique Dowex (nom commercial) 1-X2 (Cl-) que l'on a préalablement ajustée à la forme Cl-, pour adsorber l'ATP sur la colonne. On lave l'adsorbat avec de l'eau désio- nisée et on élue avec une solution mixte d'acide chlorhy- drique et de chlorure de sodium (solution 0,2 M en NaCl formée par dissolution de NaCl dans une solution 0,02 M d'HCl (pH 1,7)) et on sépare la fraction contenant l'ATP. On neutralise cet éluat avec de l'hydroxyde de so- dium, on fait passer à travers une colonne garnie de char- bon actif et on élue avec de l'eau ammoniacale à 15 %, puis on concentre l'éluat à chaud pour chasser l'ammoniac. Par addition de méthanol à la solution concentrée, on ob- tient 2,2 g de cristaux du sel de sodium de l'ATP. EXEMPLE 2 On introduit dans un fermenteur cylindrique de 30 litres, 20 litres d'un milieu préparé par dissolution de 7,0 g de (NH4)2HP04, 1,0 g de KH2PO4, 1, 0 g de K2HP04, 2458-588 2 g de MgSO4,7H20, 0,2 g de FeS04,7H20 et 0,2 ml d'un agent anti-mousse, le KS-66 dans un litre d'eau désioni- sée et on stérilise à 120 C sous une pression de 1,2 bar pendant 30 minutes. Après refroidissement, on ajoute au milieu 200 ml de méthanol et on ensemence avec 2 % d'une culture d'ensemencement (Methylomonas probus FERM-P 3193 (ATCC 20563)) que l'on a cultivé dans le même milieu, puis on aère à raison de 20 1/20 1 (quantité de liquide) min. (0,5 v/v.min) en agitant à 500 tr/min. à 350C. On élève le débit d'aération à 20 1/20 1. min. (1,0 v/v. min.) au fur et à mesure de la croissance des bactéries et on cultive pendant une durée totale de 96 heures. Pen- dant la culture, on ajuste automatiquement le pH du mi- lieu entre 6,0 et 7', 2 avec de l'eau ammoniacale, on me- sure la consormmation du méthanol par chromatographie gazeuse et on introduit automatiquement du méthanol pour que sa concentration demeure toujours entre 0,3 et 2,0 %. Dans les 96 heures qui suivent le début de la culture, ,3 g/l d'ATP sont produits et accumulés dans la solution de culture. On recueille 1'ATP de la solution de culture comme décrit dans l'exemple 1. EXEMPLE 3 On effectue une culture dans les mêmes conditions que dans l'exemple 2, si ce n'est qu'on porte la concen- tration en (NH4)2HP04 du milieu à 20 g/l. Dans les 96 heures qui suivent le début de la culture, 12 g/l d'ATP sont produits et accumulés dans la solution de culture. On recueille l'ATP selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 1. EXEMPLE 4 On répète la culture de l'exemple 2, mais avec une concentration en (NH4)2HP04 dans le milieu de 30 g/l. Dans les 96 heures qui suivent le début de la culture, 7 g/l d'ATP sont produits et accumulés. On recueille l'ATP comme décrit dans l'exemple 1. EXEMPLE COMPARATIF 1 On cultive dans les mêmes conditions que dans l'exemple 2 si ce n'est qu'on réduit la concentration 9, en (NH4)2HP04 du milieu à 3 g/l. Dans les 96 heures qui suivent le début de la culture, on obtient seulement 0,2 g/l d'ATP dans la solution de culture. EXEMPLE COMPARATIF 2 On cultive dans les mêmes conditions que dans l'exemple 2, si ce n'est qu'on porte la concentration en (NH4)2HP04 à 50 g/l. Dans les 96 heures qui suivent le début de la culture, seul 1,0 g/1 d'ATP est produit dans la solution de culture. EXEMPLE 5 On cultive dans les mêmes conditions que dans l'exemple 3 avec les souches indiquées dans le tableau suivant. Les rendements en ATP figurent dans le même ta- bleau. TABLEAU Souche Rendement en ATP (g/1) Methylomonas methylovora ATCC 21369 3,5 Pseudomonas methylotropha NCIB 10508 4,5 Pseudomonas rosea NCIB 10597 2,8 Psuedomonas insueta ATCC 21276 3,1 Pseudomonas methanolica ATCC 21704 3,6 Pseudomonas methanica ATCC 21439 3,2 Protaminobacter ruber ATCC 8457 2,7 Protacminobacter candidus ATCC 21372 2,5 Corynebacterium s.p. ATCC 21232 2,3 Bacillus cereus ATCC 14579 2,2 Microcyclus polymorphum NCIB 10516 2,1 Hyphomicrobium variabile NCIB 10517 2,2 Achromobacter methanolophila 2,4 ATCC 21275 REVENDICATIONS 1. Procédé pour produire de l'adénosine-5'-triphos- phate par culture d'une bactérie produisant de l'adénosine- '-triphosphate dans un milieu de culture pour produire et accumuler de l'adénosine-5'-triphosphate dans le milieu de culture, puis récupérer le produit, caractérisé en ce que la bactérie productrice d'adénosine-5'triphosphate est une bactérie capable d'assimiler le méthanol et appar- tenant à un genre choisi parmi Methylomonas, Pseudomonas, Methanomonas, Protaminobacter, Achromobacter, Corynebacti- rium, Hyphomicrobium, Microcyclus et Bacillus et en ce que le milieu de culture contient comme substrat du méthanol ou une substance chimique métabolisée selon la même voie que le méthanol et un phosphate minéral à une concentra- tion de 4 à 35 g/l exprimée en radical acide phosphorique (P04). 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on choisit la substance chimique métabolisée selon la même voie que le méthanol parmi le méthane, la méthylamine, le formaldéhyde et l'acide formique. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on choisit le. phosphate minéral parmi (NH4)2HP04, KH2PO4 et K2HPO4. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce qu'on effectue la culture dans les conditions suivantes: pH = 6,0-8,0, température = 30-40 C, vitesse d'aération = 0,5-4,0 v/v. min.