Brevet FR2433508A1 — publié le 19800314

La présente invention concerne un épimere de la substance antibiotique appelee negamycine. La negamycine.est un antibiotique de toxicité faible qui possède une activité efficace in vivo aussi bien qu'in vitro contre des bactéries à Gram positif et particulièrement à Gram négatif, y compris les souches Pseudomonas. Elle a été isolee pour la premiere fois des filtrats de culture de trois souches de Streptomyces (S. KONDO, H. YAMAMOTO, K. MAEDA et H. UMEZAWA, J. Antibiotics, 1971, 24, 732). Plus tard, la structure et la stéréochimie de la négamycine ont été déterminées (S. KONDO, S. SHIBAHARA, S. TAKAHASHI, K. MAEDA, H. UMEZAWA et M. OHNO, J. Amer. Chem. Soc., 1971, 93, 6305) et confirmées par synthese chimique (S. SHIBAHARA, S. KONDO, K. MAEDA, H. UMEZAWA et M. OHNO, J. Amer. Chem. Soc., 1972, 94, 4354). La négamycine possède la formule I La négamycine naturelle est dextrogyre et les deux centres asymétriques, numérotés 3 et 5 dans la formule I, possedent la configuration absolue (R). La nomenclature systématique qui désigne la nêgamycine naturelle dextrogyre est donc acide [((3 R,5 R)-diamino-3,6 hydroxy-5 hexanoyl)-2, méthyl-1 hydrazino] acétique. Or, nous avons découvert, et c'est là notre invention, que si le radical hydroxyle à la position 5 du reste acide hexanoique de la negamycine est épim & ise, il est produit un composé qui, sous sa forme racemique, conserve une importante activite antibactérienne. Nous donnons le nom d'épinégamycine à cette nouvelle substance. Nous avons aussi decouvert que l'activité antibacterienne de la forme racémique de ce composé demeure dans un seul des deux antipodes optiques et que cet antipode est levogyre ; il s'agit de I'enantiomere qui possede la configuration absolue (3R,5S) dans le reste acide hexanoique..Il est important de remarquer que les positions 3 et 5 du reste acide hexanoique dans l'epinegamycine correspondent aux positions 7 et 9 de la negamycine elle-même. L'isomère de I'épinegamycine qui possède de l'activité antibactérienne a donc la configuration absolue (7R,9S). Suivant la présente invention il en découle un composé de la formule II qui est, soit sous forme racémique, soit sous forme optiquement active et qui possède alors la configuration absolue (7R,9Slet des sels de ce composé acceptable du point de vue pharmaceutique ou vétérinaire. Il est entendu que, dans la formule II, la stéréochimie indiquée peut être la stéréochimie relative ou la stéreochimie absolue, selon que le produit se trouve sous forme racémique ou sous forme (7R,9S) optiquement active. Des sels de l'invention, acceptables du point de vue pharmaceutique ou vétérinaire, sont par exemple le chlorhydrate, le bromhydrate, le phosphate ou sulfate, ou le citrate, acétate,succinate ou fumarate. Selon un trait supplémentaire de l'invention, il en découle un procédé pour la production du composé de la formule II caractérisé par l'hydrogénation catalytique d'une substance de formule III qui est sous forme racémique ou sous forme optiquement active et qui possède la configuration absolue (7R,9S) et dans laquelle le reste A est un groupe protecteur d'amines sensible à l'hydrogénolyse et dans laquelle le reste B est un groupe protecteur d'acidescarboxyliques également sensible à l'hydrogénolyse Les groupes protecteurs A et B peuvent être des groupes protecteurs décrits dans un livre de chimie peptidique comme, par exemple, l'ouvrage de M.BODANSKY et M.A. ONDETll, intitulé "Peptide Synthesis", Interscience, New York, 1966, chapitre IV De façon avantageuse, le reste A est, par exemple, le groupement benzoloxycarbonyle et le reste B est, par exemple, le groupement benzyle. Le procédé de la présente invention peut être effectué dans un solvant ou diluant tel que l'acide acétique aqueux et en présence d'un catalyseur d'hydro- génation tel que le palladium à 5 % (pop) sur charbon. La réaction est effectuée de préférence à température ambiante et â pression ordinaire. Le produit de départ de formule III peut être prépare selon les exemples 1 ou 2. Le composé de cette invention inhibe la croissance d'une gamme large de microbes aussi bien à Gram négatif qu'à Gram positif. On peut mettre cette activité en évidence dans l'un des tests antibactériens standards effectué in vivo ou in vitro L'activité in vivo de ce compose est démontrée en infectant des souris par une quantité mortelle d'une espèce donnée de bactéries et en comparant la durée de survie des souris traitées par voie intrapéritonéale avec ce composé à la durée de survie d'un groupe témoin non traité.Ainsi la forme racémique du composé de cette invention a donne lieu aux durées de survie suivantes (exprimées en jours) par rapport aux groupes témoins de deux souris, les injections intrapéritonéales étant effectuees vingt minutes après l'infection bacterienne et une deuxieme fois 4à 6 heures plus tard. Dose mg/kg i.p. Organisme 200 50 Staph. Aureus 6.1 S 5.6 (Buttle) Salmonella 6.8 S 3.3 (Dublin) S = survie de toutes les souris On voit que le composé est actif à 50 mg/kg i.p., mais qu'à une dose quatre fois plus élevée, il n'y a pas de toxicité apparente puisque toutes les souris ont survécu. Le composé de cette invention a donc une utilité dans le traitement des infections bactériennes chez les animaux à sang chaud, incluant l'homme, et peut. être employé de la même manière que la négamycine compte tenu de la puissance du composé de l'invention en rapport avec la puissance de la négamycine. Selon un trait supplémentaire de l'invention, il en découle une composition pharmaceutique ou vétérinaire qui contient le composé de l'invention en association avec un diluant ou véhicule non toxique acceptable du point de vue pharmaceutique ou vétérinaire. La composition peut être caractérisée par le fait qu'elle est sous une forme qui convient pour une voie d'administration orale, rectale, parentérale ou topicale, et à cette fin, elle peut être formulée par des moyens bien connus sous forme par exemple de tablettes, capsules, solutions ou suspensions, émulsions, suppositoires, gels, pommades, onguents ou lotions. Une composition préférée est celle qui convient pour l'administration parentérale, par exemple, une solution aqueuse stérile injectable. La composition de la presente invention peut contenir également, en plus du composé de la formule I, un ou plus d'un des produits antibactériens connus, par exemple, un ou plus de produits choisis parmi le groupe des sulphonamides, des penicillines, des céphalosporines, des tétracyclines, le chloramphénicol, la streptomycine, la kanamycine, la bacitracine, la polymi xi ne, la tyrothricine, 1 'érythromycine, la novobiocine, la cyclosérine. L'invention est illustrée par les exemples, non limitatifs, suivants. Dans les exemples, le symbole Rf fait allusion à la chromatographie en couche mince sur des plaques de gel de silice. Les systèmes d'gluants utilisés sont les suivants chloroforme/acétate d'éthyle 4/1 v/v (Rf A) acétate d'éthyle (Rf B) méthanol /chl-oroforme 9/1 v/v (Rf C) chlorure de méthylène/éther éthylique 3/17 v/v (Rf D) acétate d'éthyle/cyclohexane 1/1 v/v (Rf E) Exemple 1 : Schema (+)-Epinegamycine racemique : tous les composés sont racémiques ; seul l'un des antipodes est mentionné dans les formules ci-dessous. Préparation de l'acide (3R,5S/3S,5R)- kdiamino-3,6 hydroxy-5 hexanoyl ) - 2 méthyl-1 hydrazinoj acétique (composé 7 (+)-epinégamycine) On fait passer lentement un courant d'hydrogène dans une solution de (3R,5S/3S,5R)- (azido-6 benzyloxycarbonylamino-3 hydroxy-5 hexanoyl)-2 méthyl-1 hydrazino acétate de benzyle (520 mg ; 1 x 10 3molle) dans de l'acide acétique aqueux (5 ml d'eau pour 120 ml d'acide acétique) à laquelle on avait ajouté du palladium à 5 % sur charbon (130 mg) comme catalyseur. Après 3 heures de réaction, on fait barboter un courant d'azote dans la solution pendant quelques minutes, puis on filtre.On évapore le filtrat sous vide à 400C pour fournir une huile qui est introduite sur une colonne de résine Amberlite CG 50 (nu+) (100 g). On élue la colonne d'abord avec de l'eau pour enlever des impuretés mobiles, et ensuite avec de l'ammoniaque à 0,1 %. Les fractions contenant un seul composé (contrôle par électrophorése analytique sur gel de silice) sont réunies et lyophilisées en une poudre blanche (241 mg). Ce produit fond entre 150 et 1800C avec decomposition. Pour des fins de caractérisation, on peut obtenir un dérive de ce composé par sa réaction avec le (diméthyl-4,6 pyrimidine)-2 thiocarbonate de benzyle. On obtient l'acide (3R,5S/3S5R)- (bisbenzyloxycarbonylamino-3,6 hydroxy-5 hexanoyl)-2 méthyl-1 hydrazino acétique. F : 110-118 C. Analyse élémentaire Calcule (%) Trouve (%) C 58.1 56.9 H 6.2 6.2 N 10.9 10.7 On fait réagir ce dernier composé avec le diazométhane en solution dans l'éther éthylique pour obtenir l'ester méthylique correspondant. F : 125-127"C. Analyse élémentaire Calcule (%) Trouve (%) C 58.9 58.3 H 6.5 6.5 N 10.6 9.8 Le (3R,5S/3S,5R)-[(azi d8-6 benzyloxycarbonylamino-3 hydroxy hexanoyl )-2 methyl-1 hydrazinoj acétate de benzyle que l'on utilise comme produit de départ pour cette préparation peut être obtenu selon les modes opératoires suivants. Préparation du (3R,5S/3S,5R) azido-6 benzyloxycarbonylamino-3 hydroxy-5 hexanoate de benzyle (composé 2) Le (3R,5S) azido-6 benzyloxycarbonylamino-3 oxo-5 hexanoate de benzyle (composé 1) est préparé et réduit avec le diborane dans le tétrahydrofuranne et les deux produits diastêréomères sont séparés selon le mode opératoire décrit dans la demande de brevet français numéro 7733758. Le diastéréomère le plus polaire (Rf A 0,31) et qui donne une 6-lactone ayant un point de fusion de 104 C par cristallisation dans le mélange alcool isopropyliquejéther éthylique, est retenu pour les preparations suivantes. Préparation du (3R,5S/3S,5R) azido-6 benzyloxycarbonylamino-3 tetrahydropyran- nyloxy-5 hexanoate de benzyle (composé 3) On additionne, sous atmosphère d'azote sec, à une solution de (3R,5S/3S,5R) azi do-6 benzyloxycarbonylamino-3 hydroxy-5 hexanoate de benzoyle (15 g 36 x 10 3molle) et de dihydropyranne (8 ml ; 80 x 10 3mole) fralchement distillé, dans le chlorure de méthylène sec (150 ml), de l'acide p-toluènesulfonique (6 (6 ml d'une solution à 1 % dans le tétrahydrofuranne). On ajoute quelques grammes de tamis moléculaire à cette solution et on l'abandonne à la température ambiante pendant 15 heures.Ensuite on traite la solution avec de la triéthylamine (10 gouttes), on filtre ; et le filtrat est concentré sous vide. On chromatographi le résidu sur-une colonne de silice désactivée éluée avec un mélange de chlorure de méthylene (17 parties) et d'éther éthylique (3 parties) pour donner une huile jaune (11,3 g). Préparation de l'acide (3R,5S/3S,5R) azido-6 benzyloxycarbonylamino-3 tetrahydropyrannyloxy-5 hexanoique (composé 4) On ajoute, sous agitation, au (3R,5S/3S,5R) azido-6 benzyloxycarbonylamino-3 tetrahydropyrannyloxy-5 hexanoate de benzyle (0,8 g ; 1,6 x 10 3mole) en solution dans le méthanol (10 ml), une solution aqueuse 1 N de soude (2,4 ml ; 2,4 x -mole). Après 15 heures à température ambiante on évapore le solvant, on dilue le résidu à l'eau et on le lave à l'éther éthylique. La solution aqueuse est alors neutralisée soigneusement avec de l'acide acétique 1 N, en présence d'acétate d'éthyle. On sèche la phase organique et l'évaporation sous vide conduit à un produit huileux (0,4 g) ayant un Rf B de 0,2. Préparation du (3R,5S/3S,5R)- [(azido-6 benzyloxycarbonylamino-3 tetrahydropyrannyloxy-5 hexanoyl) -2 méthyl-1 hydrazino acétate de benzyle (composé 5) On dissout sous atmosphère d'azote dans le tetrahydrofuranne anhydre (10 ml) l'acide (3R,5S/3S,5R) azido-6 benzyloxycarbonylamino-3 tetrahydropyrannyloxy-5 hexanoique (440 mg ; 1,08 x 10 3molle). On refroidit à -200C (bain de carboglace/ tétrachlorure de carbone) et on agite.On ajoute de la N-méthylmorphôline sèche (115,4 mg ; -1,14 x 10 3molle) puis du chloroformiate d'éthyle (117,2 mg ; 1,08 x 10 3molle). Après une agitation d'environ 5 minutes, on additionne une solution de p-toluènesulfonate d'a-méthyl hydrazinoacétate de benzyle (395 mg ; 1,08 x 10 3molle) et de N-mé.thylmorpholine (120 mg ; 1,19 x 10 3mole) dans le tétrahydrofuranne anhydre (15 ml). Ce mélange est maintenu sous agitation pendant 2 heures à -20 C et 2 heures à température ambiante. On dilue la solution avec de l'acétate d'éthyle et on filtre les sels précipités. On lave plusieurs fois le filtrat avec de l'eau et avec de la saumure et une solution saturée de bicarbonate de sodium.On sèche sur sulfate de magnésium et, après évaporation, on obtient une huile (616 mg) ayant un Rf C de 0,57. Préparation du (3R,5S/3S,5R)-0(azido-6 benzyloxycarbonylamino-3 hydroxy-5 hexanoyl)-2 méthyl-13 hydrazinoacétate de benzyle (composé 6) On ajoute de l'acide acétique (10 ml) au (3R,5S/3S,5R)- (azido-6 benzyloxycarbonylamino-3 tétrahydropyrannyloxy-5 hexanoyl)-2 méthyl-1 hydrazino acétate de benzyle (616 mg ; 14 x 10 3molle) et on agite jusqu'à obtenir une solution. On ajoute de l'eau (10 ml) et la solution est chauffée à l'aide d'un bain-marie à 350C pendant 90 minutes. On dilue la solution à l'eau et on extrait à l'acétate d'éthyle. Les extraits organiques sont réunis, lavés avec une solution saturée de bicarbonate de sodium, puis à l'eau, séchés et évaporés pour laisser le produit sous forme d'huile (520 mg) ayant un Rf C de 0,4. Exemple 2 : Schéma (-) Epinégamycine.: tous les composes sont optiquement actifs ; les formules representent la configuration absolue. Préparé selon la Demande de brevet français n 7733758. Préparation de l'acide (-)-[((3R,5S)-diamino-3,6 hydroxy-5 hexanoyl )-2 méthyl-1 hydrazino acétique (-)-Epinégamyci ne (composé 14) On fait barboter pendant quelques minutes un courant d'azote dans une solution de (3R,5S)- [(azido-6 benzyloxycarbonylamino-3 hydroxy-5 hexanoyl )-2 méthyl-1J hydrazino acétate de benzyle (1,2 g) dissout dans un mélange d'acide acétique (46 ml), eau (11,5 ml). On ajoute ensuite du palladium sur charbon à 5 %-(305 mg) à la solution et on fait passer lentement dans la solution un courant d'hydrogène pendant 3 heures. On fait barboter de nouveau de l'azote, puis on filtre pu catalyseur. On réduit le volume du filtrat à 2 ml environ par évaporation sous vide.Cette solution est introduite sur une colonne de résine Amberlite CG-50 (NH=) (60 g). On élue la colonne d'abord à l'eau et les éluants sont écartes. On élue ensuite avec une solution aqueuse d'ammoniaque à 0,1 %. On collecte des fractions de 6 ml qui sont contrôlees en électrophorèse sur gel de silice en utilisant un mélange d'eau (900 parties), d'acide acétique (75 parties) et d'acide formique (25 parties) comme electrolyte à 900 volts. Les plaques sont révélées à l'aide de la nihydrine. Lesffractions indiquant une tache unique sont réunies et lyophilisées en une poudre blanche (0,35~g) ayant un ='9,90 (C =3,5 ,HRO). La configuration absolue du composé 14 écoule de la méthode de synthese à partir de l'acide L-(+) aspartique et par le rapport stéréochimique de cette méthode avec celle employee pour la synthèse de la (+)-negamycine, de configuration absolue connue, qui est décrite dans la Demande de Brevet Français, numéro 7733758. Le (3R,5S)-p(azido-6 benzyloxycarbonylamino-3 hydroxy-5 hexanoyl )-2 méthyl-13 hydrazino acétate de benzyle utilisé comme produit de depart dans cette préparation peut être obtenu selon les modes opératoires suivants. Préparation du (3R,5S) azido-6 benzyloxycarbonylamino-3 hydroxy-5 hexanoate de benzyle (composé 9) A une solution dans le tétrahydrofuranne anhydre (70 ml) de (+)-3R azido-6 benzyloxycarbonylamino-3 oxo-5 hexanoate de benzyle (5,6 g ; 13,6 x 10 3molle) (préparé selon la Demande de Brevet Français , numéro 7733758) sous azote, on ajoute une solution de diborane 0,9 M dans le tétrahydrofuranne (22 ml ; 20,4 x 10 3mole). On suit l'évolution de la réaction par chromatographie sur couche mince en utilisant des plaques de gel de silice. Dans le système A, le produit de départ a un Rf de 0,52et les produits d'arrivée ont des Rf de 0,31 et 0,49. Lorsque la reaction est terminée, on refroidit la solution dans un bain de glace avant d'ajouter de l'eau et quelques gouttes d'acide chlorhydrique 2 N.On extrait la solution à l'éther éthylique. Les extraits sont séchés et évaporés pour donner un mélange du produit recherché plus son diastéréomere (3R,5S). On sépare ces deux diastéreomères par la technique de la chromatographie sur colonne sèche (décrite par exemple par B. LOEV et M.M. GOODMAN, Chemistry and Industry, 1976, 2026). On utilise du gel de silice préalablement désactivé à l'eau (15 parties d'eau pour 85 parties de silice) en rapport de 70 grammes de silice desactivée par gramme de mélange. On élue la colonne avec un mélange d'éther éthylique (15 parties) et de chlorure de méthylene (85 parties). L'isomère (3R,5S) retenu pour la préparation suivante est le plus polaire des deux diastéréomères produits dans cette réduction et a un Rf A de 0,31 et un Rf D de 0,45. On obtient l'isomère (3R,5S) (2,0 g) sous forme d'huile incolore. Préparation du (3R,5S) azido-6 benzyloxycarbonylamino-3 tetrahydropyrannyloxy-5 hexanoate de benzyle (compose 10) On fait dissoudre l'alcool (3R,5S) obtenu dans la preparation précédente dans du chlorure de méthylène sec (20 mi) et sous atmosphère d'azote. On ajoute du dihydropyranne fraichement distillé (1,1 ml ; 12 x 10 3mole) suivi d'acide p-toluenesulfonique (0,8 mi d'une solution à 1 % dans le tetrahydrofuranne). On contrôle la disparition du produit de depart (Rf E de 0,4) par chromatographie sur couche mince. Lorsque la réaction est complète, on ajoute quelques gouttes de triéthylamine et on lave la solution organique à l'eau. Après séchage et évaporation, on obtient le produit recherche sous forme d'huile ayant un Rf E de 0,62. Ce produit est utilisé sans purification ulterieure pour la préparation suivante. Préparation de l'acide (3R,5S) azido-6 benzyloxycarbonylamino-3 tetrahydropyran- nyloxy-5 hexanoique (compose 11) On ajoute, sous agitation, goutte à goutte, une solution aqueuse 1 N de soude (7,2 ml ; 7,2 x 10 3molle) à une solution de (3R,5S) azido-6 benzyloxycarbonylamino-3 tétrahydropyrannyloxy-5 hexanoate de benzyle (2,38 g ; 4,8 x mole) dans le méthanol (30 mi). On abandonne la solution à température ambiante pendant 15 heures, et ensuite on évapore le methanol sous vide. On dilue le résidu à l'eau (20 ml) et on lave la solution avec un mélange d'éther éthylique (1 partie) et d'acétate d'éthyle (1 partie). On élimine la phase organique et on acidifie la phase aqueuse avec une solution aqueuse 1 N d'acide acétique (7,2 ml). On extrait la phase aqueuse acide à l'acétate d'éthyle. Après séchage des extraits et évaporation, on obtient le produit recherche (1,6 g) ayant un Rf B de 0,65 et un Rf C de 0,34. Préparation du (3R,55)f(azido-6 benzyloxycarbonylamino-3 tétrahydropyrannyloxy-5 hexanoyl)-2 méthyl-1 hydrazino acétate de benzyle (composé 12) On dissout l'acide (3R,5S).azido-6 benzylaxycarbonylamino-3 tétrahydropyrannyloxy-5 hexanoique (1,6 g ; 3,8 x 10 3mole) dans le tétrahydrofuranne anhydre (30 ml) sous atmosphère d'azote et on refroidit la solution à -20 C à l'aide d'un bain de carboglace-tétrachlorure de carbone.On ajoute, sous agitation, de l'N-méthylmorpholine (0,44 ml ; 4 x 10 3mole) suivie de chloroformiate d'éthyle (0,37 mi ; 3,8 x 10 3mole). Trois minutes après, on ajoute rapidement, et sous agitation, une solution de N-méthylmorpholine (0,46 mi ; 4,2 x 10-3mole) et de toluènesulfonate de a-méthylhydrazinoacétate de benzyle (1,4 g ; 3,8 x 10-3mole) dans le tétrahydrofuranne anhydre (45 ml). On laisse le mélange réactionnel à -20 C pendant -2 heures, puis on le laisse revenir à la température ambiante. On filtre la solution des sels, après avoir dilue le filtrat à l'acétate d'ethyle (100 ml) on le lave à l'eau. Après séchage et évaporation sous vide, on obtient le produit recherché (2,3 g) ayant un Rf C de 0,69. Préparation du (3R,5S) uazido-6 benzyloxycarbonylamino-3 hydroxy-5 hexanoyl)-2 methyl-1] hydrazinoacétate de benzyle (composé 13) On dissout le (3R,5S) (azido-6 benzyloxycarbonylamino-3 tétrahydropyrannyloxy-5 hexanoyl)-2 méthyl-1 hydrazino acétate de benzyle (2,2 g ; 3,7 x 10-3mole) dans l'acide acétique (35 ml), on dilue à l'eau (35 ml) et on chauffe la solution à 35 C pendant 2 heures. On dilue la solution à l'eau et on extrait à l'acétate d'éthyle. On reunit les extraits et on les lave à l'eau, puis avec une solution saturée de bicarbonate de sodium. On sèche et evapore la solution pour obtenir une huile que I'on reprend dans l'éther éthylique. On dilue cette solution avec de l'éther de pétrole pour precipiter le produit recherché (1,3 g) ayant un Rf C de 0,32. REVENDICATIONS 1. Un composé de la formule qui est sous forme racémique ou sous forme optiquement active avec la configuration absolue (7R,9S) et ses sels d'additions acceptables d'un point de vue pharmaceutique ou vétérinaire. 2. Un procédé ppur la préparation d'un compose répondant à la formule II de la revendication 1. Ce procédé est caractérisé par le fait qu'il consiste en l'hydrogénation catalytique d'une substance de formule qui peut être sous forme racémique ou sous forme optiquement active avec la configuration (7R,9S). Dans cette formule le reste A signifie un groupement protecteur d'amine qui peut être enlevé par hydrogenolyse, et le reste B signifie un groupement protecteur d'acide carboxylique également sensible à lthydrogenolyse. 3. Une composition à usage pharmaceutique ou vétérinaire caracterisee par le fait qu'elle contient un composé suivant la revendication 1 en association avec un diluant ou véhicule non toxique acceptable du point de vue pharmaceutique ou vétérinaire. 4. Une composition suivant la revendication 3, caractérisée par le fait qu'elle est sous une forme qui convient pour l'administration parentérale.