Brevet FR2439819A1 — publié le 19800523

Ia présente invention se rapporte, en général, à l'indus- trie alimentaire et, plus particulièrement, à un procédé de production de microorganismes, en particulier de levures, sur des produits laitiers ot le lactose est partiellement ou totalement hydrolysé. La présente invention se rapporte aussi aux nouveaux produits obtenus par ce procédé. La fabrication industrielle de fromages a conduit récemment à une augmentation croissante de la quantité de lactosérum et a posé le problème de son utilisation, car il n'est plus possible de le rejeter dans des rivières par suite des problèmes de pollution. On a donc été amené à prendre en considération l'utilisation du lactosérum et ceci a conduit à diverses recherches dans le but de valoriser ce lactosérum. Une première voie a consisté à récupérer les protéines de haute valeur nutritive par déprotéinisation des lactosérums par tout procédé approprié (traitement thermique, ultrafiltration, etc...), ceci conduisant à pallier le déficit mondial en protéines. Une seconde voie a consisté à produire des protéines à partir d'une culture de microorganismes (bactéries, champignons filamenteux ou levuriformes) sur le lactose des sérums déprotéinés pour produire une biomasse. La société des Fromageries Bel a procédé, il y a une vingtaine d'années, aux premières études qui por taient sur la mise au point d'un procédé de sélection et de culture des microorganismes sur du lactosérum, en vue de produire une biomasse, tel qu'indiqué dans le brevet français nO 1.128.063. Ce procédé a été perfectionné dans la demande de brevet français publiée n0 2.292.039, dans lequel on présente une fabrication de levures lactiques où l'won conduit la culture dans un milieu riche en lactose. Dans la demande de brevet français publiée nQ 2.292.233, on introduit, dans un milieu destiné à la culture de microorganismes, une quantité importante de cuivre, en meme temps qu'un agent complexant du cuivre, Un des inconvénients de ce procédé est le faible nombre d'especes cultivables sur du lactose, car une des seules espèces cultivables et a performance particulierement bonne pour l'emploi du stade industriel ast le Kluyveromyces fragilis. Un objet de la,présente invention est de remédier à cet inconvénient important en multipliant à l'infini les souches cultivables. Un autre objet de la présente invention est de réaliser une culture de microorganismes, en particulier de levures,sur un milieu permettant l'obtention d'une grande quantité de biomasse. D'autres objets de la présente invention apparaitront d'après la description suivante. Ces objets sont maintenant atteints par un procédé de culture de microorganismes non plus sur du lactosérum entier ou dépro téiné ou sur du lactose, mais sur du lactosérum hydrolysé ou du lactose hydrolysé. Selon la présente invention, on prévoit un procédé de production de microorganismes, en particulier de levures, carac térisé en ce qu'après séparation des protéines contenues dans du lactosérum et récupération des autres constituants, dont le lactose, on soumet le lactose à une hydrolyse par n'importe quel procédé connu, et on conduit la culture d'un microorganisme sur ce substrat laitier renfermant du lactose hydrolysé. Par rapport au procédé classique, le procédé de la présente invention montre les avantages suivants - possibilité de cultiver sur du glucose (résultant de l'hydrolyse du lactose) n'importe quelle souche. On peut donc choisir des souches a meilleure adaptation aux besoins du marché, en produisant une biomasse utilisable dans l'alimentation humaine ou animale, ou des souches plus performantes ou adaptées à une synthèse particulière; - possibilité de réaliser une culture à bi-étage, permettant d'alimenter avec des concentrations élevées en lactose hydrolysé (50 à 100 g/l). Ceci est intéressantpour le traitement direct de sérums concentrés pour le transport; - peu de modifications des installations existantes de fermentation; - doublement de la productivité. Dans le procédé de la présente invention, les matières premières utilisées peuvent être le lait, le lactosérum provenant de fromageries ou de caséineries ou le babeurre. Dans une étape préliminaire, on sépare les protéines par tout moyen connu, adapté a la pratique industrielle, tel que le traitement thermique et la coagulation au point isoélectrique, l'ultrafiltration ou la chromatographie sélective. Ensuite, on récupère l'ensemble des constituants, dont le lactose, et ce lactose récupéré est soumis a une hydrolyse. Ainsi, le lactose produit dans le substrat laitier subit une hydrolyse partielle ou totale avant son utilisation par les microorganismes. Cette hydrolyse peut être effectuée par tout procédé connu et utilisé actuellement, notamment - par voie physico-chimique : dans ce cas, deux technique sont envisageables; selon une première technique, mise au point par la société APPLEXION, la solution de lactose passe sur une colonne de déminéralisation, puis sur une colonne d'hydrolyse à une température de 90-950C et le sérum récupéré est ensuite rééquilibré en charge minérale en vue de la culture. Selon une deuxième technique, les solutions de lactose sont acidifiées au moyen d'acides, de préférence de l'acide sulfurique jusqu'à obtention d'un pH voisin de 1 et portées aux alentours de 950C pendant un temps pouvant atteindre 1 h, puis ajustées au pH optimum de développement de la souche choisie au moyen d'un alcali, de préférence une solution d'am moniaque qui apporte de l'azote assimilable. - par voie enzymatique : dans ce cas, le lactose est traité par des enzymes isolés de Kluyveromyces (forme tétramère) ou d'Asperqillus niger (forme monomère). Plusieurs techniques d'hydrolyse sont utilisables soit en discontinu avec récupération des enzymes en fin d'opération ou "piégeage" dans, par exem ple, des fibres de cellulose, soit en continu selon plusieurs techniques - par fixation des enzymes monomères (genre Aspergillus) sur un support tel que ceux décrits par Rhône-Poulenc ou Corning, - par mise en oeuvre d'un réacteur enzymati que tel que celui décrit par MAUBOIS, par mise en oeuvre de tout autre procédé industriel ada] té et éconornique. Se ion uno rise en pratique particulièrement avantageuse d l'invention, l'yrr('se du lactose se fait par voie enzymatique, en utilisant uno adactosidase extraite des cellules plasmolysée de Kluyveromyces 4=ragilis. L'enzyme est récupérée dans une solution de sulfate d'aemonium a 60 90 après précipitation et élimination de acides nucléiques. Ces procédés utilisent des pH acides (environ 4) et un large intervalle de températures(5 à 500C). De plus, ils permettent une limitation des contaminations. Dans la dernière étape, on produit une biomasse au moyen d'une culture en continu d'un microorganisme, de préférence des levures, à des pH très faibles allant de 2 à 4, et dans un intervalle de températures de 25 à 500C. Dans une réalisation avantageuse de l'invention,on améliore le milieu de culture en ajoutant des oligoéléments, de l'ammoniac et des phosphates pour optimiser les rendements. De plus, la culture est réalisée en milieu aérobie et l'aération est fonction de la concentration cellulaire existant dans le dispositif de fermentation. Les cellules sont récupérées, lavées, concentrées, et utilisées à l'état vivant après compactage, par exemple en pain , ou à l'état tué , par exemple par plas molyse, stérilisées et séchées. Selon la présente invention, on réalise la culture en mono etage en utilisant une levure pouvant employer simultanément un mélanm ge glucose-galactose, et les traces de lactose et d'acide lactique présentes dans le lactosérum. Dans ce but, on peut utiliser comme microorganismes toutes les espèces pouvant croitre sur le substrat cidessus, et des espèces pouvant métaboliser le glucose et le galactose si on réalise une hydrolyse à 100 % du lactose. A titre d'exemple, on peut citer, comme levures métabolisant le lactose, Kluyveromyces fragilis (taux de croissance u = 0,40 h -1) ou Kluyveromyces lactis (taux de croissance w = 0,28 h ). Parmi les souches ne métabolisant pas le lactose, on pourrait travailler avec Saccharomyces cerevisiae (taux de croissance -l w = 0,38 h ) ou Candida tropicalis (taux de croissance = 0,35 h 1). On constate que les levures présentent souvent un phénomène de diauxie , dans lequel le glucose est utilisé avant les autres substrats : galactose, lactose, etc.. Ceci entraîne un taux de dilution extrêmement faible conduisant à la consommation de glucose et à l'enrichissement de I.'effluent en galactose. On récupère celui-ci par des procédés physiques appropriés ou prévus pour une culture secondaire de microorganismes. Selon une autre technique, on réalise la culture en biétage de la manière suivante. Le premier étage dans ce type de culture pure ou par asso ciation, emploie n'importe quelle souche de levure pour assurer le métabolisme du glucose. Dans une mise en application préférentielle de la présente invention, on utilise des souches ne possédant pas d'acides gras polyinsaturés gênants pour une longue conservation. C'est le cas des Saccharamyces (levures de houlangerie) qui sont produits sans difficulté et quiprésententune grande valeur nutritive. On peut aussi employer, dans ce premier etage, des souches employées en diététique (alimentation humaine) avec de hautes performances, par exemple le Candida utilis (taux de croissance w = 0,55 h 1), le Candida tropicalis tu = 0,35 h 1) et le Candida pseudo-tropicalis. On alimente cet étage avec une- concentration de sucres totaux double de celle utilisée avec le procédé traditionnel. Cette concentration va de 50 à 100 g/l et assure les meilleurs rendements compte tenu des transferts limite des installations utilisées. Les cellules sortant du premier étage sont séparées du-mi- lieu par centrifugation et suivent alors les opérations nécessaires pour obtenir le produit fini désiré. Le deuxième étage est alimenté par l'effluent de la centri fugatflon précédemment décrit Les souches cultivées à ce niveau métabolisent le galactose et, éventuellement, le lactose présents dans un tel milieu. Comme souches cultivables sur ce milieu, on peut citer le Kluvveromvces fragilis, le Kluyveromyces lactis, etc... Tous les paramètres de fermentation (pH, température, temps, aération, concentration en substrat) sont choisis de façon à optimiser le rendement et à épuiser le milieu en ses divers substrats. On sépare alors les cellules obtenues après la deuxième étape et on leur applique les opérations nécessaires à l'obtention du produit fini. L'acide lactique, présent en quantité très variable dans les lactosérums, peut être facilement métabolisé dans l'un ou l'autre des étages, suivant les souches choisies. Suivant une autre forme de réalisation préférée de la présente invention, la culture peut s'effectuer en étages multiples, de la façon suivante - une première tour est ensemencée par une ou plusieurs es pèces, choisies parmi celles déja citées . Le taux de dilution peut être très élevé , allant jusqu a 0,6 h 1 (en effet, le taux de dilution D = volume du moût entrant - est exprimé en h ) suivant la ou volume total du moût en cuve les souches choisies. La croissance s'effectue sur le glucose d'un sérum ayant une concentration en sucres totaux de l'ordre de 30 g/l; la population sera, par exemple de 109 cellules/ml. - une deuxième tour, à volume égal à 1-3 fois celui de la première tour, assurera l'adaptation enzymatique nécessaire à la synthèse des enzymes d'adaptation dégradant le galactose. - une troisième tour, de volume comparable à la première, permet la croissance sur galactose. Le nombre final de cellules est 2.109 cellules/ml. Dans ce dernier procédé, on note une amélioration des rendements sur glucose et galactose, par rapport au lactose, mais la nécessité d'une tour pour l'adaptation enzymatique, où les cellules ne se multiplient pas, est un inconvénient qui n'existe pas dans la culture bi-étagée. La présente invention sera maintenant décrite à l'aide des exemples suivants, qui ne sont donnés qu'à titre d'illustration et non de limitation. EXEMPLE 1 Du lactosérum déprotéiné est concentré pour avoir une teneur en sucres totaux de 90 à 100 g/l. On utilise une culture bi-étagée. Dans la première tour, la souche Saccharomyces cerevisiae hansen (levure de boulangerie) est utilisée. Un taux de croissance de l'ordre de 0,30 h 1 permet d'obtenir environ 12 g/l de biomasse, ainsi que 20 g/l d'éthanol. A la sortie de cette tour, les levures de boulangerie peuvent être conditionnées sous forme active. L'effluent est repris dans une deuxième tour où l'on peut cultiver la même souche ou une ou plusieurs souches à fort métabolisme oxydatif tel que Kluyveromyces fragilis ou lactis. La production de biomasse est de l'ordre de 25 à 30 g/l. Après séparation des cellules, on peut - soit récupérer l'éthanol par une technique classique, - soit cultiver une souche consommant ce substrat, ainsi que des traces des autres substrats restants. Ce procédé permet donc de produire à partir d'un même sérum différents types de produits - de la levure de boulangerie à fort pouvoir fermentaire (première tour), - de la levure aliment plasmolysée et séchée (deuxième tour) destinée à l'alimentation humaine ou animale, - un lactosérum enrichi en protéines de levures ou de la levure aliment séparée ou de l'éthanol au niveau de la troisième étape. EXEMPLE 2 L'objectif est dans ce cas la production rapide et massive de levures destinées à l'alimentation humaine ou animale. La technologie à mettre en oeuvre fait appel, suivant une pratique préférée de l'invention, à deux fermenteurs avec séparation des cellules entre les deux et après le second. La première tour est ensemencée par une souche capable de se multiplier rapidement sur glucose, telle que, par exemple, Candida utilis (u = 0,55 h 1). Pour une concentration en sucres totaux de 60 à 80 g/l, la biomasse sera de 20 à 30 g/l que l'on sépare par centrifugation et que l'on conditionne, suivant l'usage, en cellules vivantes ou mortes. La deuxième tour est alimentée par l'effluent de la premier re centrifugation ; l'espèce choisie présente une vitesse de croissance sur galactose voisine de celle cultivée dans la première tour Ce pourrait être, par exemple, Xluyveromyces fragilis (u = 0,52 h 1 cultivé sur glucose, galactose, acide lactique. La biomasse sera du même ordre de grandeur que dans la première tour. Dans ces conditions, il est possible de produire deux produits différents selon les besoins et de traiter des sérums concentrés,sans que cela soit préjudiciable à la bonne marche de l'instal lation. La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de variantes et de modifications qui apparaîtront à l'home de l'art REVENDICATIONS 1 - Procédé de production de microorganismes, en particulier de levures, caractérisé en ce qu'après séparation des protéines contenues dans du lactosérum et récupération des autres constituants, dont le lactose, on soumet le lactose à une hydrolyse par n'importe quel procédé connu et on conduit la culture d'un microorganisme sur le substrat laitier renfermant du lactose hydrolysé. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le lactose présent dans le substrat laitier subit une hydrolyse partielle ou totale, avant son utilisation par les microorganismes. 3 - Procédé selon la revendication l,caractérisé en ce que le procédé d'hydrolyse est effectué par voie physico-chimique ou enzymatique. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'hydrolyse est effectuée par voie enzymatique. 5 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le milieu de culture est amélioré par addition d'oligo-éléments, d'ammoniac et de phosphates. 6 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la culture a lieu à un pH d'environ 2 à 4 et dans un intervalle de temperaturesd'environ 25-50 C. 7 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est effectué en mono-, bi- ou multi-étages,avec séparation éventuelle de la biomasse entre chaque étage. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que, dans la culture à bi- ou multi-étages, la levure cultivée au premier étage est n'importe quelle levure cultivable sur glucose, et les levures cultivées dans l'étage supérieur ou les étages supérieurs sont des levures utilisant le galactose, le lactose et, éventuellement, l'acide lactique et l'éthanol. 9 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les microorganismes utilises pour la production de biomasse sont choisis parmi une ou plusieurs espèces de levures non pathogènes. 10 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les levures cultivées sont des levures de boulangerie, du type Saccharomyces cerevisiae. il - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les levures cultivées sont des levures utilisées dans l'alimentation humaine. 12 - Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que les levures sont choisies dans le groupe comprenant le Candida utilis, le Candida tropicalis, le Candida pseudo-tropicalis, le Kluyveromyces fraqilis et le Kluvveromyces lactis. 13 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les produits recueillis à chaque étage sont soumis aux opérations nécessaires à l'obtention du produit fini. 14 - Procédé selon l'unequelconque des revendications 1 à.11, caractérisé en ce que les levures récupérées sont lavées, concentrées et utilisées vivantes,ou tuées, stérilisées et séchées selon le produit final désiré. 15 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que les produits (biomasses) sont employés pour l'alimentation humaine ou animale, ou pour enrichir un lactosérum concentré.