Brevet FR2449726A1 — publié le 19800919

La présente invention concerne le dosage clinique in vitro d'esters de glycérol dans des liquides corporels et elle a plus particulièrement trait à l'hydrolyse de glycérides en glycérol en vue de l'analyse. La concentration en glycérides, notamment en triglycérides dans les liquides corporels de l'homme et d'autres animaux, revêt de l'importance pour de nombreux états pathologiques et sa détermination est une méthode clinique courante. En général, les triglycérides sont hydrolysés et le glycérol ainsi libéré est titré par diverses techniques. On connaît l'hydrolyse par des moyens tant chimiques qu'enzymatiques, ces derniers étant généralement préférables pour des raisons de sûreté, de spécificité et de commodité.Plusieurs lipases d'une source unique ont été proposées, par exemple la lipase de Rhizopus arrhizus (appelée ci-après LIPR) décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique nO 3 759 793 et la lipase de Pseudomonas fluorescens (appelée ci-après LPL), décrite dans "Clinica Chimica Jacta, 81 (1977 > 125:130. Toutefois, ces lipases de source unique n'hydrolysent pas complètement les glycérides ou ne le font que dans des conditions limitées ou avec des quantités bien trop grandes d'enzyme ou des durées beaucoup trops longues. En conséquence, pour autant que l'on sache, ces lipases de source unique ne sont pas utilisées. Au contraire, on utilise des mélanges d'enzymes, par exemple un mélange de LIPR avec la protéase comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 3 703 591 ; des mélanges de LIPR et de carboxylestérase comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 3 862 -009 ; et des mélanges de LIPR avec la lipase de Candida cylindracea comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 4 056 442. Toutefois, ces mélanges ont aussi des limitations.Les protéases limitent la stabilité du réactif attendu qu'elles finissent par attaquer la protéine du réactif ou de l'échantillon, les carboxylestérases sont difficiles à purifier et des mélanges de LIPR et de lipase de Candida cylindracea sont inhibés par les agents mouillants couramment utilisés dans les réactifs, les échantillons ou les témoins, notamment dans des analyseurs automatiques à écoulement continu. Les analyseurs automatiques à écoulement continu limitent dans une mesure importante les conditions de l'hydrolyse des triglycérides. Souvent, les substances d'étalonnage et les témoins renferment des surfactants! bien que l'util sation d'échantillons de faible volume et de courtes dures de réaction soit courante. Par exemple, l'instrument Tecnicon SMAC" prévoit une durée déterminée d'incubation de 2, minutes à 370C et utilise dans ses substances d'étalonnage des surfactants qui inhibent certaines lipases, comme c'est le cas par exemple du mélange décrit dans le brevet des tats-Unis d'Amérique NO 4 056 442. Après l'hydrolyse de triglycérides, le glycérol libéré peut être titré par toute méthode convenable. La méthode à la glycérol-kinase est couramment utilisée et est décrite dans de nombreuses publications parmi lesquelles on mentionne les brevets des Etats-Unis d'Amérique NO 3 703 59 , NO 3 759 793 et NO 4 056 442 et la publication de la Technicon Instruments Corporation datée de mars 1976 et intitulée "Technicon Method NO SG4-0023PC6". On pourra consulter ces publications. Dans l'une des méthodes, les réactions de titrage sont résumées comme suit - Triglycérides - Glycérol + ATP - ADP + PEP - Pyruvate + NADH Glycérol+A.G.L. DG + ADP ATP + Pyruvate Lactate + NAD Les abréviations utilisées ci-dessus ont les définitions suivantes : A.G.L. = acides gras libres ; ATP = adénosine-rriphosphate ; GK = glycérol-kinase ; PG = phosphate -e glycérol ; ADP = adénosine-diphosphate ; PEP = acide phos-hoénolpyruvique ; LDH = lactate-déshydrogénase ; PK = pyruvate-kinase ; NAD et NADH = nicotinamide-adénine dinucléotie, forme oxydée et forme réduite. La substance NADH absore à 340nm tandis que la substance NAD n'absorbe pas à cette longueur d'onde, la réduction d'absorbance optique à 340nu étant mesurée et étalonnée comme étant une mesure de la concentration des triglycérides dans l'échantillon.Des méthodes qui mesurent la réduction de NAD par d'autres moyens enzymatiques sont également connues et décrites par exemple dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 4 056 442 et dans "Clinica Chimica Acta", 81 (1977), 125:130. On pourra également s'y référer. Conformément à la présente invention, on a trouvé un mélange nouveau de lipases qui sont stables et qui hydrolysent totalement les triglycérides dans des liquides corporels en les courtes périodes dont on dispose dans des analyseurs à écoulement continu et en la présence de surfactants. Ce mélange peut être utilisé dans des méthodes manuelles ou dans d'autres méthodes, mais il est spécialement conçu pour une épreuve instrumentale continue rapide. Après l'hy- drolyse avec ce mélange, on utilise toute méthode convenable pour titrer le glycérol libéré, par exemple la méthode NADH/NAD à la glycérol-kinase décrite ci-dessus. Le nouveau mélange est formé d'un mélange de lipase de Rhizopus arrhizus (LIPR) et de lipase de Pseudomonas fluorescens (LPL) dans un rapport en unités/millilitre de chaque lipase compris entre environ 2:1 et environ 10:1, de préférence entre environ 4:1 et 10:1, ce rapport étant notamment égal à environ 5:1. Ainsi, le mélange doit renfermer, par 100 unités de lipase totale, environ 65 à 91 unités de LIPR et 35 à 9 unités de LPL. On doit utiliser une quantité totale suffisante de lipase pour hydrolyser l'échantillon dans l'intervalle de temps disponible. On doit utiliser environ 150 unités de lipase totale pour hydrolyser rapidement environ 20 microlitres d'échantillon contenant jusqu'à 5 g/l de triglycéride ou même plus. On apprécie un mélange contenant 250 unités/millilitre de lipase de Rhizopus arrhizus et 50 unités/ml de lipase de Pseudomonas fluorescens.Le mélange doit être tamponné à un pH compris entre environ 6,0 et 7,0, notamment entre 6,4 et 6,5 et il est de préférence lyophilisé pour assurer cette stabilité, ou préparé sous la forme dsune poudre anhydre. La lipase de Rhizopus arrhizus (E.C. 3.1.1.3) est décrite dans la publication ci-dessus et un procédé permettant de l'obtenir est décrit dans le brevet des Etats Unis d'Amérique No 3 513 073. La lipase de Pseudomonas fluorescens et des procédés permettant de l'obtenir sont décrits dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 3 431 175 et dans "Clinica Chimica Acta", 81 (1977), 125:130. Toutes deux sont disponibles dans le commerce et les organismes sont déposés dans des collections officielles. Une unité d'activité de lipase, au sens du présent mémoire, est la quantité d'acide gras neutralisée par une micromole d'hydroxyde de sodium en une minute à 250C à un pH égal à 8. Le mélange de lipases dont on apprécie l'utilisation pour l'hydrolyse conformément à la présente invention est une solution aqueuse dont la composition est indiquée dans l'exemple 1 ci-après. Elle est avantageusement présentée sous une forme anhydre ou déshydratée en vue de sa stabilité pendant l'entreposage et on la reconstitue à l'eau distillée au moment de son utilisation. EXEMPLE 1 Unités de lipase/ml -LIPR ) 250 - LPL ) 50 Phosphate de potassium, mM/l 90 Sérum-albumine de boeuf, g/l 3,8 pH 6,5 Pour l'analyse dans un instrument continu tel que l'instrument "Technicon SUMAC à temps déterminé d'incubation ou de réaction de 2,5 minutes à 370C, on dilue un échantillon de sérum dans un rapport de 1:6 en volume avec de l'eau distillée contenant une petite quantité de surfactant, par exemple 0,1 % de "Triton X-100" (DuPont) et on ajoute à chaque partie d'échantillon dilué 4,25 parties en volume du réactif consistant en lipase reconstituée. On utilise 118 pl d'échantillon dilué dans l'instrument indiqué ci-dessus et on ajoute environ 0,4 ml de lipase pour chaque essai. Une hydrolyse totale est obtenue en 2,5 minutes. Des essais comparatifs ont été effectués dans un instrument "Technicon" à marche continue, avec une durée déterminée de réaction de 2,5 minutes (370C) en utilisant (1) le réactif aqueux de l'exemple 1 et (2) les mélanges enzymatiques normalisés fournis par la firme "Technicon Instrument Corporation", formés de LIPR et de protéase comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 3 703 591. On obtient une bonne corrélation comme l'indiquent les résultats caractéristiques reproduits sur le tableau I ci-dessous, ces résultats étant exprimés en mg de triglycérides par décilitre. TABLEAU I Echantillon Exemple 1 Valeurs attendues 1 103 100 2 269 266 3 574 4 138 133 5 90 82 6 135 131 7 284 270 8 577 565 Les échantillons 1 à 8 sont des sérums de patients dont les concentrations en triglycérides ont été mesurées après que l'hydrolyse a été effectuée au moyen de la formulation appréciée de lipases de l'exemple 1 sur un instrument '1Technicon SMAC" et la "Valeur Attendue" de chaque sérum a été déterminée en utilisant comme réactif une lipase du commerce, du type décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 3 703 951. La corrélation de ces sérums montre que les surfactants utilisés dans l'étalonnage de l'instrument inhibent pas la réaction de la lipase.Dans chaque essai, le glycérol libéré par hydrolyse a été dialysé dans un courant circulant de réactif analytique, en utilisant les réactions NAD - NADHNAD définies ci-dessus, la variation résultante d'absorption étant déterminée par des moyens optiques à 340nm et mise en correspondance avec la concentration en triglycérides dans l'échantillon. Un réactif mixte apprécié pour la détermination du glycérol libre est indiqué dans l'exemple 2 ci-dessous, les quantités étant exprimées par lit e composition aqueuse. EXEMPLE 2 I. Réactif glycérol-kinase GK, unités # 2610 Chlorhydrate de triéthylamine, -X! 100 II. Réactif substrat du glycérol Tampon TRIS, mM 32 Sulfate de magnésium, mM 8,6 ATP, mM 8,6 PEP, mM 0,306 NADH, mM 0,273 LDH, unités ; 2400 PK, unités ) 1200 Ces réactifs ont été utilisés dans la détermination des résultats de l'exemple 1, rapportés sur le tableau I. Pour qu'une conservation prolongée soit possible, on peut ajouter des stabilisants ioniques et prctéiniques classiques. Des réactifs du commerce (Tecncon Instrument Corporation) ont été utilisés pour obtenir les résultats indiqués sous le titre "Valeurs Attendues". D'autres essais ont indiqué que les lipases LIPR et LPL ne sont capables ni l'une ni l'auXre, individuellement, d'hydrolyser totalement un triglycérde contenu dans un échantillon ou dans un liquide d'étalonnage en une période d'incubation de 2,5 minutes à 370C, et oue l'association selon l'invention a un effet synergique. On peut utiliser le cas échéant de plus longues périodes et des températures allant approximativement de la température a=biante à environ 500C. Une quantité suffisante d'enzyme total dans les limites des rapports indiqués ci-dessus doit etre utilisée pour obtenir une hydrolyse totale pendant la période disponible et dans la plage de concentrations à déterminer par l'analyse. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Composition destinée à l'hydrolyse d'un ester e glycérol dans un milieu aqueux, caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange d'environ 65 à 91 unités de lipase de -thizcous arrhizus et d'environ 35 à 9 unités de lipase de seudomonas fluorescens par 100 unités de lipase totale présente. 2. Composition suivant la revendication 1, aractérisée en ce que le rapport de la lipase de Rhizopus arrhizus à la lipase de Pseudomonas fluorescens se situe entre environ 2:1 et 10:1. 3. Composition suivant la revendication 2, caractérisé en ce que le rapport est égal à environ 5:1. 4. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient au moins environ 300 nitrés de lipase totale par millilitre dans un milieu aqueux tamponné à un pH compris entre environ 6,0 et 7,0. 5. La compostion suivant la revendication 4, sous sa forme déshydratée. 6. Composition analytique destinée à la détermination de la concentration en triglycérides du sérum par hydrolyse des triglycérides en glycérol et en acides gras libres et mesure de l'absorption de la lumière d'un liquide aqueux contenant le glycérol hydrolysé, caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange d'enzymes suivant la revendication 1 conjointement avec une substance chimique permettant d'effectuer une variation d'absorption du liquide aqueux proportionnelle à la quantité de glycérol libérée dans le sérum. 7. Composition analytique destinée à la détermination de la concentration en triglycérides du sérum par hydrolyse des triglycérides présents en glycérol et mesure de l'absorption de la lumière d'un liquide aqueux contenant ce glycérol, caractérisée en ce qu'elle consiste en un mélange enzymatique déshydraté suivant la revendication 5, conjointement avec une substance chimique permettant d'effectuer une variation d'absorption du liquide aqueux proportionnelle à la quantité de glycérol libéré dans le sérum. 8. Composition analytique suivant la revendication 7, caractérisée en ce que la substance chimique est c:noisie entre ia glycérol-kinase, l'adénosine-triphosphate, l'acide phosphoénol-pyruvique, la substance NADH, la iactate-désnydrogénase, et la pyruvate-kinase. 9. Composition analytique suivant l'une quelcon aue des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle contient également comme agent stabilisant de la sérum-albu ine de boeuf. 10. Méthode d'hydrolyse d'un ester de glycérol et de détermination de la quantité d'ester de glycérol présente dans un liquide corporel aqueux, caractérisée en ce au'elle consiste à faire incuber le liquide avec un mélange d'enzymes suivant l'une des revendications 1 et 4 pendant une période inférieure à environ 10 minutes pour hydrolyser totalement l'ester de glycérol, et à déterminer la quantité de glycérol ou d'acide gras libérée par l'hydrolyse.