Brevet FR2442889A1 — publié le 19800627

La présente invention,à la réalisation de laquelle ont participé hIal. Pierre JOLLES, Jean FLORENT, Jean LUNEL et Mes- dames Denise MANCY et Danièle MIGLIORE-SAMOUR,concerne de nouveaux composés possédant une utilité i titre d'adjuvants immunologiques, plus particulièrement des dérivés provenant d'extrait hydrosoluble de Streptomyces stimulosus DS 25556 (NRRL 5776), leur procédé de préparation et les compositions qui les contiennent. Plus précisément, les nouveaux composés selon l'invention proviennent du couplage avec des acides aliphatiques à longue chaine d'un mélange, dénommé par la suite tétrapeptide 39592 R.P., de deux constituants principaux de formule (I) et (II) dans un rapport molaire de 4/1 environ où les acides aminés ont les configurations suivantes Ala : L Glu : D Dap :LL Les composés selon la présente invention sont donc constitués d'extrait hydrosoluble de Streptomyces stimulosus DS 25556 (NRRL 5776), couplé avec les acides aliphatiques à longue chaîne, se présentant sous la forme dtun mélange dont les constituants principaux répondent aux formules générales suivantes dans lesquelles X représente un radical RCO et Y représente un atome d'hydrogène ou un radical RCO, ou bien dans lesquelles Y-- représente un radical RCO et X représente un atome dthydrogène ou un radical RCO, étant entendu que, dans ces définitions R représente un radical alkyle ou alcényle contenant il à 19 atomes de carbone en chaîne droite ou ramifiée et dans lesquelles les acides aminés ont les configurations indiquées précédemment .Ces composés sont eux-mêmes hydrosolubles. Selon l'invention, les composés revendiqués peuvent être obtenus par action d'un dérivé activé d'un acide aliphatique de formule générale R-COOH (V) dans laquelle R est défini comme précédemment (par exemple f acide aurique), sur le tétrapeptide 39592 R.P. I1 est particulièrement avantageux d'utiliser comme dérivé activé de l'acide (V) son an hydride, dans un rapport peptide/anhydride voisin de 1/5. Dans ce cas, on opère dans un solvant organique miscible à l'eau, tel que l'alcool butylique tertiaire, à une température comprise entre 15 et 350C, de préférence à une température voisine de 200C, en présence d'une base telle que le carbonate de sodium en solution aqueuse. Les composés selon l'invention sont ensuite isolés du milieu réactionnel par exemple par précipitation, évaporation des solvants ou tous autres moyens appropriés. Les nouveaux composés obtenus selon le procédé de la présente invention peuvent être éventuellement purifiés par des méthodes physiques couramment utilisées pour une purification, telles que précipitation, dialyse, chromatographie, filtrations sur divers supports utilisés à cet effet. Le tétrapeptide 39592R.P. peut être obtenu par purification successives d'extraits, désignés sous le numéro 34129 R.P. de Streptomyces stimulosus DS 25556 (NRRL 5776), au moyen de la chromatographie sur divers supports utilisés à cet effet tels que les Biogels. On opère généralement dans un solvant aqueux très légèrement acide, par exemple l'acide acétique en solution 0,01 N. Les structures des constituants principaux du tétrapep tide 39592R.P. ont été déterminées grace à l'étude de dipeptides ob tenus par hydrolyse acide partielle ainsi que par spectrométrie de masse. Les deux acides N-terminaux, Ala et Gly, ont été mis en évi- dence au moyen des méthodes classiques d'Edman et de dansylation. L'absence de sucres réducteurs aminés ou non aminés a été vérifiée par chromatographie en phase gazeuse. Les caractéristiques d'une substance hydrosoluble désignée par la référence 34129 R.P. sont décrites en détails dans la demande de brevet français N 77.24.092 déposée par la demanderesse le 4 août -1977 pour "Nouvelle substance immunostimulpnt son procédé de préparation et les cpmpositions qui la contiennent". Les extraits de Streptomyces stimulosus DS 25556(NRRL 5776) désignés sous le numéro 34129 R.P. présentent les caractéristiques essentielles suivantes : aspect : poudre crème, amorphe (après lyophilisation) composition a) en acides aminés : alanine (5 à ), acide glutamique (7 à 10%), glycine (2,5 à 40, acide &alpha;,&alpha;-diaminopimélique (= 8%), b) en sucres aminés : N-acétylglucosamine (5 à 100, acide muramique (5 à 10%) Analyse élémentaire C%.= 40 > 4 - 41,4 H : 6,7 - 6,9 N% = 8,0 - 10,6 spectre infra-rouge : (détermination à partir de comprimés en mélange avec KBr). Ce spectre est représenté par la figure 3 annexée sur - laquelle on a porté en abscisses, d'une part, les longueurs d'ondes exprimées en microns (échelle supérieure), et, d'autre part, les nombres d'ondes en cm-1 (échelle inférieure), et en ordonnées les densités optiques. Dans le tableau I ci-apres sont indiquées les principales bandes d'absorption infra-rouge de la nouvelle substance exprimées en nombre d'ondes (cm-1). TABLEAU I 3400 H20 1320 f 3300 ép. 1260 m 3100 ép. 1140 ép. 2970 m 1115 m 2950 m 1075 ép. 2880 ép@ - 1040-F 2600 ép. 975 ép. 2060 tf. 910 f 1850 tF 855 ép. 1590 tF 770 ép. 1450 m 720 ép. 1400 F 690 ép. tF = très forte, tf = très faible, m - moyenne F = forte f = faible , ép = épaulement Le procédé de préparation de la substance hydrosoluble 34129 RP consiste à soumettre à des autolyses répétées des cellules de Streptomyces stimulosus DS 25556 délipidées, puis à fraction- ner la partie soluble dans l'eau par filtration 9 travers des supports de porosité convenable. Le microorganisme Streptomyces stimulosus DS 25556 a été isolé à partir d'un échantillon de terre prélevé en Inde. L'isolement a été effectué en suivant la méthode générale qui consiste a mettre une petite quantité de terre en suspension dans 11 eau à différentes concentrations, et à étaler un petit volume de chaque dilution sur la surface de boîtes de Pétri contenant un milieu nutritif gélosé. Après une incubation de quelques jours à 260C, qui permet au microorganisme de se développer, les colonies que l'on veut isoler pour en poursuivre l'étude sont prélevées et repiquées sur des géloses nutritives afin d'en obtenir des cultures plus abondantes. Un échantillon de cette souche a été déposé au Northern Regional Research Laboratory de 1'U.S. Department of Agriculture à Peoria, Illinois (Etats-Unis) où il a été enregistré sous la référence NRRL 5776. Ce laboratoire est autorisé irrévocablement à distribuer cette souche à toute personne ayant légalement connaissance du présent document. Streptomyces stimulosus DS 25556 forme des spores cylindriques mesurant 0,6 à 0,8p/1,0 à 1,3 . Les chaînes sporifères, droites ou légèrement flexueuses, sont en général longues et com portent le plus souvent plusieurs dizaines de spores; les sporopylores sont simples ou présentent queiques ramifications en grappes. Par son mode de sporulation, cette souche se classe dans la section Rectus-Flexibilis de la classification de Pridham. S.stimulosus DS 25556 présente un mycélium aérien sporulé de couleur grise. I1 se développe bien à 26 C, mal à 370C et pas du tout à 500C I1 donne une production abondante de pigment mélanique noir sur les milieux organiques, et en particulier sur la gélose spéciale tyrosine - extrait de levure de Waksman ("Melanin formation medium1,) voir "Réf.F" citée ci-après; en outre, dans certaine cas,il produit également, d'une manière plus ou moins abondante, ui pigment soluble allant de violet-bleu à rouge suivant le degré d'a cidité du milieu auquel il est susceptible de communiquer sa teinte.Ce dernier pigment est produit p,articulièrement abondamment sur la gélose au malate de calcium, qui prend une teinte violet bleu intense très caractéristique. Dans ses cultures effectuées à 26 C, il présente les caractères biochimiques suivants - production de mélanine : positive - production de H2S : positive - tyrosinase : positive - liquéfaction de la gélatine : positive - utilisation de la cellulose : positive - production de nitrites à partir des nitrates : positive sur milieux synthétiques aussi bien que sur bouillon nutritif nitrate - hydrolyse de l'amidon : positive - culture sur lait : peptonisation sans co agulation - avec alca linisation du pH qui passe de 6,3 à 7,8 en 1 mois. Les caractères culturaux de Streptomyces stimulosus DS 25556 sont rassemblés dans le tableau ci-dessous. Ce sont ceux de cul tures arrivées à bon stade de développement, c'est-à-dire d'environ 2 à 3 semaines à 260C sauf indications contraires. Ces caractères ont été observés sur des géloses nutritives et des bouillons habituellement utilisés pour déterminer les caractères morphologiques des souches de streptomyces, les cultures sur milieux gélosés étant effectuées sur des géloses inclinées. Un certain nombre des milieux de culture employés ont été préparés d'après les formules indiquées dans " The Actinomycetes", S.A. WAKSMAN, p. 193 -197, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., U.S.A. 1950; dans ce cas, ils sont indiqués par la lettre W suivie du numéro qui leur a été attribué dans "The Actinomycetes".Les références ou consti tut ions des autres milieux de culture sont les suivantes - Réf. A - "Hickey and Tresner's Agar" - T.G. PRIDHAM et col. - Antibiotics Annual, 1956-1957, p. 950. - Réf. B - "Bennett's Agar" - S.A. WAEShIAN - The Actinosy- cetes, vol. 2, p. 331, N 30 - The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961. - Réf. C - Formule W - 23, additionnée de 2% de gélose - Réf. D - "Yeast Extract Agar" - T.G. PRIDHAM et al Antibiotics Annual, 1956 - 1957, p. 950. - Réf. E - "Tomato Paste Oatmeal agar" - T.G. PRIDHAM et col. - Antibiotics Annual, 1956 - 1957 , p. 950 - Réf. F - "Melanin formation medium" - S.A. WAKS.N- The Actinomycetes, vol. 2, p. 333, N 42 - The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961 - Réf. G - W.E. GRUNDY et col. - Antibiotics and Chem. 2 401, 1952 - Réf. H - "Inorganic Salts - Starch Agar" - T.G. PRIDHAM et al - Antibiotics Annual, 1956 - 1957, p. 951 - Réf. I - "Medium 1 with a mineral source of nitrogen" G.F. GAUZE et al - Problems in the classification of Antagonistic Actinomycetes. p. 13 - The american Institute of Biological Sciences, Washington 6, D.C. 1959 - Réf. J - correspond à la formule W-1, où 30g de saccharose sont remplacés par 15 g de glucose - Réf. K - correspond à la formule W-l, oh 30g de saccharose sont remplacés par 15 g de glycérine - Réf. L - Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" - Society of American Bacteriologists, Geneve, N.Y. - II50-19 - Réf. M - correspond à la formule W - 18, oh le saccharose est supprimé et remplacé par de petites bandes de papier filtre immergées par tiellement dans le liquide - Réf.N - "Manual of Methods for Pure culture Study of Bacteria" - Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y. - II50-18 - Réf. P - "Plain gelatin" - préparé suivant les indications du 1,Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria1, Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y. - II50-18 - Réf. Q - Lait écrémé en poudre commercial, reconstitué selon les indications du fabriquant. - Réf. R - Milieu indiqué pour la recherche de la production de H2S par : H.D. TRESNER et F. DANCA- Journal of Bacteriology, 76 239-244, 1958. Milieux de Degré de dé- Mycélium végétatif Appareil aérien Pigment Observations et propriétés culture veloppement ou Envers de la (comprenant l'- soluble biochimiques culture ensemble du my célium aérien et de la sporu lation) Gélose de Bon Envers brun noir Gris foncé Noir, Spores cylindriques mesu Hickey et abon- rant 0,6 à 0,8 /1,0 à 1,3 Tresner dant Chaîne sporifères droites (Réf.A) comportant plusieurs dizai nes de spores. Sporophores. Simples ou avec quelques ramifications en grappes Gélose de Bon Envers marron Gris violacé Brun Bennet foncé très (Réf. B) foncé Gélose d'E- Bon Envers brun jaune Gris Brun très foncé noirâ (Réf. C) tre Gélose à Bon Envers brun jaune Gris clair vio- Brun l'extrait foncé à brun noir lacé à gris noirâde Pridham foncé tre (Réf.D) Gélose à la farine d'a- Envers brunjaune Gris foncé Brun voine et à l'ex- foncé trait de toma- Bon (Réf. E) Milieu de Degré de dé- Mycélium végétatif Appareil aérien(com- Pigment Observations et proculture veloppement ou Envers de la prenant l'ensemble solubel priétés biochimiques culture du mycélium aérien et de la sporulation) Gélose glucose Bon Envers brun Gris foncé Brun peptone (W-7) noirâtre noir Géptone nutriti Assez bon Envers brun jaune Gris clair Brun ve (W-5) noirâtre Gélose tyrosi- Assez bon Envers brun noi- Gris rosé clair Noir Production de mélanine ne-extrait de râtre abondant positive (lectures eflevure pour for fectuées selon les re mation de méla- commandations de l'au nine(Réf. F) teur) Gélose au mala- Modére Envers violet Gris modérément Violet Solubilisation du mate de calcium développé bleu a- late positive mais de Krainsky bondant lente Réf.G Gélose à l'oval Pauvre M.V.incolore à gris Grisâtre Gris bumine (W-12) orangé.Très pauvre A l'état de traces orangé ment développé faible Gélose glucose Modéré Envers brun Blanchâtre à gris Rose asparagine(W-2) orangé Très modérément orangé développé faible Gélose glycéri Assez bon Envers brun Blanc-rosé à gris Rouge ne-asparagine orangé Modérément dévelop- brûnatre (W-3) pé Milieux de cul- Degré de dé- Mycélium végéta- Appareil aérien Pigment Observations et propriétés ture veloppement tif ou Envers de (comprenant l'en- soluble biochimiques la culture semble du mycélium aérien et de la sporulation) Gélose amidon- Bon Envers brun jau- Gris et jaunâ- Brun, Hydrolyse de l'amidon:posels minéraux de ne tre jaune, sitive. Spores cylindri Pridham(Réf. H) grisâ- ques mesurant 0,6 à 0,8 tre /1,0 à 1,3 . Chaînes spo rifères droites comportant plusieurs dizaines de spo res. Sporophores simples ou avec quelques ramifica tions en grappes Gélose amidon Envers brun jau- Gris clair à Gris Hydrolyse de l'amidon : nitrate (W-10) Moyen ne à brun noirâtre gris foncé brun positive Gélose avec sour Bon Envers violet Gris foncé Violet ce d'azote miné- foncé grisârale de Gauze tre (Réf. I) foncé Gélose synthéti- Presque nul M.V. peu déve- Blancgrisâtre Nul que de Czapek au loppé A l'état de trasaccharose (W-1) ces Gélose synthéti- Assez bon Envers brun Blanchâtre à gris Brun que de Czapek au jaune Modérément dé- foncé glucose (Réf.J) veloppé Milieux de cul- Degré de dé- Mycélium végéta- Appareil aérien Pigment Observations et propriétés ture veloppement tif ou Envers de (comprenant l'en- soluble biochimiques la culture semble du mycélium aérien et de la sporulation) Gélose synthéti- Assez bon M.V. épais et plis Blanchâtre gris Brun que de Czapek sé se fendillant Très modérément orangé à la glycérine brun orange as- développé foncé (Réf.K) sez foncé Envers brun oran gé foncé Bouillon amidon- Bon Voile épais Gris foncé brun,en Formation de nitrites nitrate (W-19) Envers brun fon- petite positive cé quantité à partir de la surface Bouillon glucose Modéré Léger voile Nul Nul Formation de nitrites: nitrate de Dim- blanc grisâtre positive mick (Réf. L) Bouillon de Cza- Moyen Léger voile Grisâtre clair Nul Formation de nitrites pek à la cellu- blanchâtre Très modérément positive - Utilisation de lose (Réf.M) développé La celulose : positive Bouillon nutri- Moyen voile brunâtre Gris clair à gris Brun Formation de nitrites tif nitraté foncé -Modéré- clair positive Difco (Réf. N) ment développé Milieux de Degré de dé- Mycélium végéta- Appareil aérien Pigment Observations et propriéculture veloppement tif ou Envers de (comprenant l'en- soluble tés biochimiques la culture semble du mycélium aérien et de la sporulation) Culture sur pom- Très bon M.V.épais et plis Blanchâtre à gris N me de terre sé brun orangé à modérément dé (W-27) brun rougeâtre veloppé très foncé,allant vers noirâtre Gélatine pure Bon M.V. brun,jau- Blanchâtre à gri- Brun Liquéfaction positive, à 12% (Réf.P) ne sâtre A l'état jaune boune de traces 1) à 25 C bon Anneau brun jau- Blanc-grisâtre Peptonisation sans coagu Lait écrémé { ne A l'état de traces lation, pH passant de 6,3 (Réf.Q) à 7,8 en 1 mois Peptomisation sansccagulation 2) à 37 C très Anneau brun fon- Nul pH passant de 6,3 à 8,0 modéré cé mal développé en 1 mois Gélose de Bon M.V. brun Blanc-grisâtre Noir Production de H2S posi Tresner et noirâtre A l'état de tra- tive (lectures éffec Danga (Réf. R) ces tuées selon les recom mandation des auteurs Streptomyces stimulosus DS 25 556 présente un ensemble de caractères qui ne coïncide exactement avec aucun de ceux des souches déjà décrites, et c'est pourquoi on doit le considérer comme une espèce nouvelle. En considérant les espèces dont la description est donnée dans "The Actinomycetes" (vol. 2, S.A. WAKSMAN, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961) ainsi que dans le Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (7ème édition, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1957), les deux espèces dont il se rapprocherait le plus sont deux espèces décrites dans "The Actinomycetes1, : Streptomyces phaeopurpureus et Streptomyces purpureofuscus ; comme elles, en effet, S. stimulosus DS 25 556 forme des pigments mélaniques sur les milieux organiques, donne sur la plupart des milieux un mycélium végétatif allant de brun jaune ou brun orangé foncé à brun noir, et sur pomme de terre développe un mycélium végétatif brun orangé à brun rougeâtre en montrant un mycélium aérien modérément développé allant de blanchâtre à gris.Toutefois, il ne peut etre reconnu identique à aucune de ces deux espèces car, d'une part, S. phaeopurpureus forme des spores sphériques a elliptiques, donne une bonne croissance sur gélose synthétique de Czapek au saccharose (saccharose nitrate agar), n'utilise pas la cellulose, ne réduit pas les nitrates et utilise le rhamnose, alors que S. stimulosus DS 25 556 forme des spores cylindriques, donne une croissance pratiquement inexistante sur gélose synthétique de Czapek au saccharose, utilise la cellul:se,réduit fortement les nitrates et n'utilise pas le rhamnose; d'autre part, S. purpureofuscus donne une bonne croissance sur gélose synthétique de Czapek au saccharose, un mycélium végétatif incolore et un pigment soluble brun rougeâtre à brun vineux foncé sur gélose nutritive, un pigment soluble pourpre sur pomme de terre, un pigment soluble vert-jaunâtre sur gélatine, coagule le lait et n' utilise pas la cellulose, alors que S.stimulosus DS 25 556 donne une croissance pratiquement inexistante sur gélose synthétique de Czapek au saccharose, un mycélium végétatif brun-jaune et un pigment soluble brun noirâtre sur gélose nutritive, un pigment soluble noir et non pourpre sur pomme de terre, un pigment soluble brun-jaune sans nuance de vert sur gélatine, ne coagule pas le lait et utilise la cellulose. Si, par ailleurs, on considère les espèces décrites par G.F. GAUZE et al. (Problems in the classification of Antagonistic Actinomycetes- The American Institute of Biological Sciences, Washington, 1959), on constate que S. stimulosus DS 25 556 se classe dans la série "Violaceus" qui est caractérisée par la formation d'un mycélium aérien gris et d'un mycélium végétatif violet-bleu à brun rougeâtre sur "milieu avec source d'azote minérale de Gauze". Dans cette série, les 2 souches dont on pourrait le rapprocher par la couleur violet de son mycélium végétatif sur "milieu avec source d'azote minérale de Gauze" et son mode de sporulation sont Act. violaceorectus et Act. prunicolor.Toutefois, Act. violaceorectus forme sur gélose à l'amidon un mycélium végétatif et un pigment soluble violet, sur pomme de terre un mycélium végétatif et un pigment soluble violetrouge, et en outre n'utilise pas la cellulose et ne réduit pas les nitrates, alors que S. stimulosus DS 25 556 forme sur gélose à l'amidon un mycélium végétatif brun-jaune à brun noirâtre et un pigment soluble gris brun, sur pomme de terre un mycélium végêta- tif brun orangé à brun rougeâtre et un pigment soluble noir, et en outre utilise la cellulose et réduit fortement les nitrates. De son côté Act. prunicolor. contrairement à S. stimulosus DS 25 556, n'utilise pas la cellulose, ne réduit pas les nitrates, et enfin forme un pigment violet qui n'est pas soluble dans le milieu gélosé et par conséquent ne peut etre comparé au pigment soluble violet produit par S. stimulosus Ds 25 556. La capacité de S. stimulosus DS 25 556 à utiliser diverses sources de carbone et d'azote pour assurer son développement a été déterminée suivant le principe de la méthode de Pridham et Gottlieb (J. of Bact. 56, 107-114,1948); le degré de développement a été observé sur le milieu de base indiqué par les auteurs en remplaçant soit le glucose par les diverses sources de carbone respectivement essayées, soit S04(NH4)2 par les diverses sources d'azote respectivement essayées.Les résultats sont indiqués dans le tableau suivant Source de car-: Utilisation Sources d'azote : Utilisation : bone essayées : : essayées : D-ribose : négative : NO3Na : positive : D-xylose : positive : NO2Na : positive L-arabinose positive . S04(NH4)2 : positive L-rhamnose négative PO4H(NH4)2 positive glucose : positive : Adénine : positive : D-galactose : positive : Adénosine : positive : D-fructose : négative : Uracile : négative : D-mannose : positive : Urée : positive : L-sorbose : négative : L-asparagine : positive : lactose : positive : glycocolle : positive : maltose : positive : sarcosine : négative : saccharose : négative : DL-alanine : positive . tréhalose : négative : DL-valine : positive : cellobiose : positive : acide DL- : positive aspartique : raffinose : négative : acide L- : positive glutamique : dextrine : positive : L-arginine : positive : inuline : négative : L-lysine : positive : amidon : positive : DL-sérine : positive : glycogène : positive : DL-thréonine : positive : glycérol : positive : taurine : négative : érythritol : négative : DL-phényl- : positive alanine : adonitol : négative : L-tyrosine : positive : dulcitol : négative : DL-proline : positive Source de car-: Utilisation : Sources d'azote: Utilisation bone essayées : : essayées : D-mannitol : négative : L-hydroxy- : positive : proline : : D-sorbitol négative L-histidine positive : inositol : négative : L-tryptophane : positive : salicine : positive : bétaine : négative Le procédé de préparation des cellules de Streptomyces stimulosus consiste essentiellement à cultiver Streptomvces stimulosus DS 25556 (NRRL 5776) sur un milieu et dans des conditions appropriées et, à séparer les cellules qui se sont multipliées au cours de la culture. La culture de Streptomvces stimulosus DS 25556 peut être effectuée par toute méthode de culture aérobie en surface ou en profondeur, mais cette dernière est à préférer pour des raisons de commodité.On utilise à cette fin les différents courant types d'appareils qui sont d'un usage/dans l'industrie des fer- mentations. On peut en particulier adopter la marche suivant te pour la conduite des opérations Streptomyces stimulosus DS 25556 - stock culture sur gélose s culture en fiole agitée s culture inoculum en fermenteur culture de production en fermenteur Le milieu de fermentation doit contenir essentiellement une source de carbone et une source d'azote assimilables, des éléments minéraux, (notamment des sulfates) et éventuellement des facteurs de croissance, tous ces éléments pouvant être apportés sous forme de produits bien définis ou dans des mé langes complexes, tels qu'on en rencontre dans des produits biologiques d'origine diverses. Comme source de carbone assimilable on peut utiliser des hydrates de carbone, tels que le glucose, le maltose, les dextrines, l'amidon ou d'autres substances carbonées comme des sucres-alcools (glycérol) ou comme certains acides organiques (acides lactique, citrique). Certaines huiles animales ou végétales comme 1'huile de lard ou l'huile de soja peuvent avantageusement remplacer ces différentes sources carbonées ou leur être adjointes. Les sources convenables d'azote assimilable sont extremement variées. Elles peuvent etre des substances chimiques très simples comme les sels minéraux ou organiques d'ammonium, l'urée, certains acides aminés. Elles peuvent aussi etre apportées par des substances complexes contenant principalement l'azote sous forme protidique tels que la caséine, la lactalbumine, le gluten et leurs hydrolysats, les farines de soja, d'arachide, de poisson, les extraits de viande, de levure, distillers solubles, les infusions de céréales (notamment le corn steep). Parmi les éléments minéraux ajoutés, certains peuvent avoir un effet tampon ou neutralisant comme les phosphates alcalins ou alcalino-terreux ou les carbonates de calcium et de magnésium.D'autres apportent l'équilibre ionique nécessaire au développement de Streptomyces stimulosus DS 25 556 comme les chlorures ou sulfates des métaux alcalins et alcalino-terreux. Enfin, certains agissent plus spécialement comme activateurs de la multiplication des cellules; ce sont les sels de zinc, de cobalt, de fer, de cuivre, de manganèse. Le pH du milieu de fermentation au départ de la culture doit etre compris entre 6,0 et 7,8 et de préférence entre 6,5 et 7,8. La température optimale pour la fermentation est de 25 à 300C, mais une production satisfaisante est obtenue à des températures comprises entre 23 et 330C. L'aération de la fermentation peut varier entre des valeurs assez larges. On a cependant trouvé que des aérations de 0,3 å 3 litres d'air par litre de bouillon et par minute conviennent particulièrement bien. Le rendement maximal est obtenu après 2 à 8 jours de culture, ce temps dépendant essentiellement du milieu utilisé. D'après ce qui précède, on conçoit que les conditions générales de la culture de Streptomyces stimulosus DS 25556 peuvent varier dans une assez large mesure et être adaptées à chaque nécessité particulière. Les cellules de Streptomyces stimulosus sont séparées du milieu de fermentation par centrifugation. Généralement, cette opération s'effectue en continu. Les cellules ainsi obtenues peuvent être purifiées et partiellement délipidées par lavages successifs au moyen d'un solvant organique tel que le méthanol, l'éthanol ou l'éther-éthylique ou par un mélange de ces solvants. Les cellules de Streptomyces stimulosus Ds 25556 sont délipidées selon les méthodes habituelles c'est-à-dire par deslavages successifs au moyen d'un solvant organique tel que le chlorure de méthylène, le chloroforme ou le tétrachlorure de carbone. Généralement, au cours de chaque lavage, les cellules sont agitées dans le chloroforme à une température voisine de 20"C pendant 15 à 35 heures. Après chaque lavage, les cellules sont filtrées et séchées sous pression réduite à une température comprise entre 25 et 450C. Les cellules délipidées ainsi obtenues sont soumises à plusieurs autolyses successives à une température voisine de 370C pendant environ 48 heures. Il est particulièrement avantageux d'opérer en présence d'un agent capable d'éviter les fermentations parasites. De préférence,on utilise le benzène ou le toluène. Chaque autolyse s'effectue en agitant lentement les cellules délipidées en suspension dans l'eau. Après chaque opération, la phase aqueuse limpide est séparée de la phase solide par centrifugation et l'opération suivante d'autolyse est effectuée sur le culot de centrifugation. Généralement, il est avantageux de réaliser 2 à 3 opérations d'autolyse. Les phases aqueuses limpides réunies, qui contiennent le 34129RP sont ensuite fractionnées par filtration à travers des supports convenables. De préférence, pour effectue cette séparation, on utilise des membranes de porosité convenable, telles que la membrane AMICON UM 20 et la membrane AMICON UBI 2. Généralement, l'ultrafiltration de la phase aqueuse limpide est effectuée d'abord à travers une membrane permettant de séparer les produits de hauts poids moléculaire puis le perméat obtenu est ultrafiltré à travers une membrane qui permet de sépare les produits de bas poids moléculaire, le 34129 RP étant contenu dans le rétentat de cette ultrafiltration. Par lyophilisation de ce rétentat, on obtint la substance hydrosoluble 34129 RP. Les composés selon l'invention, c'est-à-dire provenant du couplage avec des acides gras du tétrapeptide 39.592 R.P. lui-meme obtenu par purification de la substance hydrosoluble 34.129 R.P., sont des adjuvants immunologiques exerçant leur activité potentialisatrice sur la production d'anticorps et sur les réactions d'hypersensibilité retardée; ils sont non arthrogbnes, ca pables d'exercer leur activité adjuvante en solution ou suspension aqueuse, sans qu'il soit nécessaire de les administrer en solution huileuse. Administrés en solution aqueuse,ils exercent un pouvoir adjuvant significatif, nettement plus marqué que celui des extraits hydrosolubles non couplés dont ils dérivent. Ce pouvoir adjuvant est déterminé par des tests d'hypersensibilité et de production d'anticorps chez le cobaye en utilisant comme antigène par exemple l'o valbumine r selon le principe de la méthode de R.G. WHITE et al. Immunology, 7, 158 (1964) 7. Le pouvoir adjuvant chez le cobaye s'exerce à des doses comprises entre 0 > 01 et 0,5 mg/kg Les composés selon l'invention exercent, in vitro, à des concentrations de 0,1 à 100 g/cm une activité mitogène sur les lymphocytes spléniques de la souris. Les composés selon l'invention se montrent également actifs dans la technique de JERKE chez la souris où, administrés par voie intraveineuse à des doses comprises entre 0, 1 et 25 mg/kg, ils exercent une action stimulante sur la production de cellules formatrices d'anticorps dans la rate. A tous ces égards, le tétrapeptide 39.592 R.P. couplé avec l'anhydride laurique a été trouvé d'un intérêt tout particulier. L'exemple suivant, donné à titre non limitatif, illustre la présente invention. EXEMPLE On dissout 15 mg de tétrapeptide 39592 R.P. dans 3 5 cm d'un mélange d'une solution aqueuse 0,5M de carbonate de sodium et d'alcool butylique tertiaire (7/3 en volumes). On ajoute goutte à goutte, sous agitation et à une température voisine de 200C, 0,5 cm3 d'alcool butylique tertiaire contenant 60 mg d'anhydride laurique. Après avoir agité pendant 30 minutes, on ajoute de l'alcool butylique tertiaire jusqu'à obtention d'un taux d'alcool butylique tertiaire de 80%. I1 se forme alors un précipité que l'on sépare par centrifugation (3000 tours/minute pendant 10 minutes). Le précipité est lavé 2 fois par 10 cm3 d'alcool butylique tertiaire et centrifugé à chaque fois dans les mêmes conditions que ci-dessus.Tous les surnageants de centrifugation sont réunis et concentrés à sec à l'évaporateur rotatif sous pression réduite (20 mm de mercure) à une température inférieure à 30OC. Le résidu d'évaporation est repris par 50 cm3 d'eau distillée et dialysé à travers une membrane Diaflo (AMICON) UM-05, afin d'éliminer la majorité de l'acide laurique provenant de l'hydrolyse de l'anhydride laurique n'ayant pas réagi. La solution qui n'a pas dialysé est lyophilisée. On obtient ainsi 30 mg d'une poudre blanche amorphe contenant encore 10% d'acide laurique.La composition relative des acides aminés dans cette substance, déterminée par un autoanalyseur après hydrolyse totale, est la suivante (entre parenthèses est indiqué le nombre entier le plus proche en accord avec des expériences effectuées après différents temps d'hydrolyse) Ala = 1,08 (1); Glu : 0,79 (1); Gly = 1,0 (1); Dap = 0,83 (1). Le spectre infra-rouge de cette substance est représenté par la figure 1. Le tétrapeptide 39592 R.P. peut être obtenu de la manière suivante 300 mg de 34129 R.P. (extraits de Streptomyces stimulosus) sont dissous dans 2 cm3 de solution'aqueuse d'acide acétique 0,01N. La solution est filtrée sur une colonne de 2,40 m de hauteur et de 2 cm de diamètre remplie de Biogel P 10 (Biorad) en éluant avec de l'acide acétique 0,0lN. La substance recherchée est éluée entre 400 et 550 cm Elle est filtrée à nouveau sur une colonne identique à la précédente en éluant toujours avec une solution aqueuse d'acide acétique O,01N. Après avoir 3 éliminé une première fraction de 170 cm3, on recueille ltéluat passant entre 200 et 230 cm3.Cet éluat est passé successivement sur deux colonnes de 2,40 m de hauteur et de 1,2 cm de diamètre remplies respectivement de "Biogel P 4" et de "Biogel P 2" en éluant avec une solution aqueuse d'acide acétique O,01N. Après avoir élué la dernière colonne avec 135 cm3 du solvant d'élution, on recueille la fraction sortant entre 135 et 140 cm3; celle-ci, après lyophilisation, fournit 15 mg de tétrapeptide 39592 R.P. sous forme d'une poudre blanche amorphe dans laquelle les acides aminés, déterminés avec un autoanalyseur après hydrolyse totale, se trouvent dans les proportions suivantes Ala = 1,27 (1); Glu = 1,0 (1); Gly 1,0 (1); Dap = 1,07 (1) (entre parenthèses est indiqué le nombre entier le plus proche). Le spectre IR de cette substance est représenté par la figure 2. Les extraits de Streptomyces stimulosus DS 255nu (NRRL 5776) désignés sous le numéro 34129 R.P. peuvent être obtenus de la manière suivante a) Fermentation On charge dans un fermenteur de 170 litres peptone 1200 g extrait de levure 600 g glucose monohydraté 1200g amidon partiellement hydrolysé 2400 g eau de ville complément pour 110 litres 3 Le pH est ajusté à 7,30 par addition de 40 cm de soude 10 N. On stérilise le milieu par barbotage de vapeur à 122 Cpendant 40 minutes. Après refroidissement, du fait de la condensation de la vapeur en cours de stérilisation, le volume du bouillon est de 120 litres; le pH est de 7,00. On ensemence avec 200 cm3 d'une culture en erlenmeyer agitée de Streptomyces stimulosus DS 25556.La culture est développée à 300C pendant 23 heures en agitant et en aérant avec de l'air stérile; elle est alors convenable pour l'ensemencement de la culture productrice. La culture productrice est effectuée dans un fermenteur de 800 litres, chargé avec les substances suivantes corn steep (à 50% de matières sèches) 8 kg huile de soja 6 litres sulfate d'ammonium 0,8 kg solution de chlorure de cobalt hexahydraté à 20 g/l 0,4 litre eau de ville q.s.p. 360 litres Après avoir ajusté le pH à 6,40 par addition de 3 600 cm de soude 10 N, on ajoute carbonate de calcium : 2 kg. Le pH du milieu est alors égal à 6,50. On stériles se le milieu par barbotage de vapeur à 1220C pendant 40 mn. Après refroidissement, du fait de la condensation de la vapeur au cours de la stérilisation, le volume du bouillon est de 390 litres,- il eot complété à 400 litres par addition de 10 litres de solution aqueuse stérile contenant glucose monohydraté 4 kg Le pH du milieu est alors égal à 7,00. On ensemence avec 40 litres de la culture inoculum en fermenteur de 170 litres décrite ci-dessus. La culture est développée à 270C durant 71 heures en agitant avec une turbine tournant à 205 tours/mn et en aérant avec un volume d'air stérile de 20 m3/h; le pH de la culture est alors de 7,45 et le volume du moût de 380 litres. b) Isolement des cellules 100 1 du moût obtenu précédemment sont centrifugés en continu pour séparer les cellules, sous 3000 g (4000 tours/ minute) et au débit de 50 litres à l'heure. On recueille ainsi 6,4 kg de cellules humides. La pâte de cellules est diluée dans 20 1 d'éthanol. Le produit insoluble est isolé par centrifugation sous 3000g (4000 tours/minute) et au débit de 25 litres à l'heure. On obtient ainsi 2,4 kg de cellules humides qui sont reprises dans un mélange de 7 1 d'éthanol et de 7 1 d'éther éthylique. On laisse reposer la suspension pendant 24 heures à une température voisine de 20OC. L'insoluble est séparé par centrifugation sous 3000 g (4000 tours/minute) et au débit de 25 litres à l'heure, puis séché sous pression réduite (5 mm de mercure) à 350C. On isole ainsi 852 g de cellules de Streptonyces stimulosus DS 25556. c) délipidation des cellules 750 g de cellules séchées de Streptomyces stimu losus fl325556 sont mises en suspension dans 6 1 de chloroforme et agitées pendant 24 heures à une température voisine de 20OC. Après essorage sur un buchner muni d'un papier-filtre, le chloroforme est éliminé. Les cellules sont traitées ensuite 3 fois comme précédemment. Les cellules isolées sont séchées sous pression réduite (5 mm de mercure) et à 350C. On obtient ainsi 690 g de cellules de Streptomyces stimulosus DS 25556 délipidées. d) autolyse des cellules 30 g de cellules délipidées obtenues comme indi 3 qué précédemment sont mises en suspension dans 500 cm d'eau contenant 0,5 cm de toluène. La suspension est agitée pendant 48 heures à 37OC, puis elle est centrifugée pendant 30 minutes à 15.000g. Le surnageant est isolé pour être traité ultérieurement et le culot est remis en suspension dans 500 cm3 d'eau et 0,5 cm3 de toluène et la suspension est agitée pendant 48 heures à 37OC. Le surnageant est isolé comme précédemment et le culot soumis une troisième -fois à l'autolyse dans les mêmes conditions, un troisième surnageant est isolé. Les trois surnageants obtenus sont traités ultérieurement selon le même procédé et peuvent être utilisés ensemble ou séparément. e) traitement sur membrane ultrafiltrante 300 cm3 de surnageant précédemment obtenu sont ultrafiltrés sur membrane AMICON UM 20. La solution est d'abord concentrée a environ 100 cm3 puis est dialysée par 500 cm3 d'eau 3 en restant à volume constant 100 cm . Le rétentat obtenu est éli- miné et le perméat est ultra fi ltré sur une membrane AMICON UM 2 pour être d'abord concentré à environ 100 cm3 puis ensuite dialysé par 1000 cm3 d'eau en maintenant le volume constant à 100 cm3. Le perméat est éliminé et le rétentat est lyophilisé. On obtient ainsi 155 mg de substance hydrosoluble 34129 R.P. dont les caractéristiques sont les suivantes - analyse élémentaire : = = 40,4 - 41,4 H% = 6,7 - 6,9 N% = 8,0 - 10,6 - composition a) en acides aminés : alanine (5-7%), acide glutamique (7-10%), glycine (2,5-4%), acide a,a-diaminopimélique (5-8%). b) en sucres aminés : N-acétylglucosamine (5-10), acide muramique (5-10X). La présente invention concerne également les compositions pharmaceutiques qui contiennent au moins un composé selon l'invention, en association avec un ou plusieurs diluants ou excipients compatibles et pharmaceutiquement acceptables. Ces compositions peuvent être utilisées comme adjuvants de vaccins (par exemple vaccin antigrippal composé de sous-unités hémagglutinantes, vaccin antipolyomyélitique à virus inactivé, vaccin antimalarique) en injection simultanée avec l'antigène (viral, bactérien, parasitaire, fongique, tumoral) à l'égard duquel on souhaite augmenter la production d'anticorps ou la réactivité cellulaire spécifique. Leurs propriétés adjuvantes peuvent être également mises à profit dans les procédés de désensibilisation contre les allergènes (pollens, etc....). Ces compositions pharmaceutiques peuvent etre également employées comme immunostimulants non spécifiques en vue (h d'augmenter la résistance de lthôte/(ou a%TiaI domestique) vis-à- vis des infections,ou en immunothérapie antitumorale. En tant qu'adjuvants, les produits peuvent être administrés soit en solution aqueuse soit en émulsion huileuse soit encore sous forme de liposomes avec l'antigène à l'égard duquel on souhaite obtenir une réponse immunitaire augmentée ou améliorée par la voie utilisée pour cet antigène (par exemple sous-cutanée ou intra-musculaire) et dans des proportions variant entre 0,01 et 10 fois la quantité d'antigène avec lequel ils sont mélangés avant d'être injectés. Pour l'application comme immunostimulant non spécifique, ces produits peuvent être utilisés par voies intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intranasale, éventuellement orale ou rectale, soit en solution aqueuse, soit en émulsion huileuse, soit encore sous forme de liposomes. Dans ce cas, la dose de composé selon l'invention qui est administrée est généralement comprise entre 0,01 et 25 mg/kg. En thérapeutique humaine, les doses journalières dépendent de l'effet recherché. Elles peuvent être comprises entre 0,1 et 10 mg pour un adulte. Comme compositions solides pour administration orale peuvent être utilisés des comprimés, des pillules, des poudres ou des granulés. Dans ces compositions, le produit actif selon l'invention est mélangé à un ou plusieurs diluants tels que saccharose, lactose ou amidon. Ces compositions peuvent également comprendre des substances autres que les diluants, par exemple un lubrifiant, tel que le stéarate de magnésium. Comme compositions liquides pour administration orale, on peut utiliser des émulsions pharmaceutiquement acceptables, des solutions, des suspensions, des sirops ou des élixirs contenant des diluants inertes, tels que l'eau ou l'huile de paraffines. Ces compositions peuvent comprendre des substances autres que les diluants, par exemple des produits mouillants, édulcorants ou aromatisants. Les compositions pour administration parentérale peuvent être des solutions stériles aqueuses, des suspensions ou des émulsions.Comme véhicule dans ces derniers cas, on peut employer le polyéthylèneglycol, le propylèneglycol, les huiles végatales, en particulier l'huile d'olive, et les esters organiques injectables par exemple I'oléate d'éthyle. Ces compositions peuvent contenir également des adjuvants, en particulier des agents mouillants, émulsifiants ou dispersants. La stérilisation peut se faire de plusieurs façons, par exemple à l'aide d'un filtre bactériologique, en incorporant à la composition des agents stérilisants ou par chauffage. Elles peuvent être également préparées sous forme de compositions solides rendues stériles par irradiation (rayons ss) qui peuvent être dissoutes dans de l'eau stérile ou dispersées dans tout autre milieu stérile injectable, éventuellement au moment de l'emploi. Les compositions pour administration intra-nasale peuvent être des solutions stériles aqueuses, des suspensions ou des émulsions qui peuvent être éventuellement associées à un agent propulseur compatible. Les compositions pour administration rectale sont des suppositoires qui peuvent contenir, outre le produit actif, des excipients, tels que le beurre de cacao ou le produit connu sous la dénomination "suppo-cire". L'exemple suivant, donné à titre non limitatif, illustre une composition selon l'invention. EXEMPLE On prépare selon la technique habituelle une solution administrable par voie intra-veineuse ayant la composition suivante - substance hydrosoluble préparée selon l'inven tion, décrite à l'exemple 1: 50 mg 3 - soluté injectable 5 cm REVENDICATIONS 1. Composé hydrosoluble caractérisé en ce qu'il est constitué d'extrait hydrosoluble de Streptomyces stimulosus DS 25556 (fRRL 5776) couplé avec des acides aliphatiques à longue chaine, se présentant sous la forme d'un mélange dont les constituants principaux dans le rapport environ 4/1 sont représentés respectivement par les formules générales suivantes dans lesquelles X représente un radical RCO et Y représente un ai me d'hydrogène ou un radical RCO, ou bien dans lesquelles Y reprit sente un radical RCO et X représente un atome d'hydrogène ou un dical RCO, étant entendu que, dans ces définitions, R représente un radical alcoyle ou alcényle contenant 11 à 19 atomes de carboi en chaIne droite cru ramifiée et dans lesquelles les acides aminés ont les configurations suivantes : Ala : L, Glu : D et Dap : I.L 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé ce que le radical RCO est le radical lauroyle. 3. Procédé pour l'obtention de dérivés selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir un extrait hydrosoluble purifié provenant de Streptomyces stimuo1 avec un dérivé d'acide aliphatique contenant 12 à 20 atomes de c bone, ledit extrait hydrosoluble purifié étant constitué d'un mé ge dont les constituants principaux répondent aux formules sui vantes et sont dans un rapport molaire de 4/1 environ. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le dérivé d'acide aliphatique est l'anhydride. 5. Procédé selon les revendications 3 et 4 pour la préparation du composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que I'on utilise l'anhydride aurique. 6. A titre de moyen pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 3, l'extrait hydrosoluble purifié constitué du mélange dont les constituants principaux (dans un rapport molaire environ de 4/1) répondent aux formules suivantes 7. Application des dérivés selon l'une des revendications 1 ou 2 i titre d'adjuvants immunologiques. 8. Compositions pharmaceutiques utilisables en thérapeutique humaine ou vétérinaire, caractérisées en ce qu'elles contiennent,à titre d'adjuvant immunologiques,au moins l'un des dérivés selon l'une des revendications 1 ou 2.