Brevet FR2453847A1 — publié le 19801107

La présente invention concerne un procédé pour l1 obtention d'ampholytes porteurs utilisables dans les diverses techniques d'électrofocalisation; elle a trait plus particulièrement à un procédé pour l'obtention d'ampholytes porteurs destinés à la séparation et la purification de protéines et autres produits biologiques par électrofocalisation. L'électrofocalisation, ou encore iso-électrofocalisation, est une technique de séparation, de purification et de caractérisation des produits biologiques, et principalement des protéines, actuellement assez bien connue (voir par exemple : "Isoelectric Focusing", J.P. Arbuthnott et J.A. Beeley ed. Butterworth 1975, "Progress in Isoelectric Focusing and isotachophoresis", P. G. Righetti ed. North Holland 1975, et "Biological and Biomedical Applications of Isoelectric Focusing" N. Catsimpoolas et J. Drysdale ed. Plenum Press 1977). Le principe de la méthode repose sur l'é- tablissement, dans un gel ou un milieu liquide, d'un gradient de pH dans lequel les produits à étudier vont migrer sous l'influence d'un champ électrique, pour venir finalement se stabiliser à une valeur de pH oh leur charge électrique totale est nulle : leur point isoélectrique pI. Ce gradient de pH est obtenu à Itaide d'un mélange de molécules amphotères de pI variés qui permettent de réaliser une couverture aussi serrée et régulière que possible du spectre des pH usuels en biochimie. Dans la pratique, cette technique est exclusivement réservée aux laboratoires de recherche, en raison du prix extrèmement élevé des "ampholytes porteurs" nécessaires à ltetablissement du gradient de pB. Le prix élevé de ces ampholytes peut, dans une certaine mesure, trouver sa justification dans le fait que les différents produits commercialisés sont tous synthétisés à partir d'une polyamine à six atomes d'azote (pentaéthylène-hexamine le plus souvent) dont la purification est délicate. De plus,ces polyamines sont relativement difficiles à se procurer ou à préparer. Par ailleurs, les ampholytes obtenus nécessitent souvent des purifi cations, des "relinearisations" ou des décalages (élimination d'acides ou de sels minéraux par exemple) ultérieurs. Classiquement, les ampholytes porteurs stob- tiennent par greffage, sur une polyamine, de groupes acides carboxyliques, sulfoniques ou phosphoniques par une réaction convenable. Par exemple, un groupe carboxylique peut être introduit par réaction de type Michael entre l'acide acrylique et une amine primaire ou secondaire On obtient donc des composés du type Axy = R (N)x (B) y ou Axy représente un ampholyte élémentaire contenant x atomes d'azote ionisables, y fonctions acide, et R symbolise la structure reliant N et B. I1 est important de pouvoir connattre le nombre total des ampholytes élémentaires possibles. On peut chiffrer par le calcul un certain nombre de familles d'isomères. Dans le cas précédent, x est constant et y peut varier de 0 à x + 2. I1 y a donc x + 3 familles qui forment en tout 9.2 x3 + 3.2 (x 4)/2 si x est pair (et 9.2x 3 + 3.2(x 3)/2 si x est impair) ampholytes possibles, ceci dans le cas d'une polyamine linéaire symétrique, type polymère d'aziridine. Ce chiffre est faible. Ainsi, à titre d'exemple, pour une amine en N6 , on ne dispose que de 78 entités pour couvrir une gamme de pH d'environ 4 (ou 3,5) à 9 (ou 9,5) . Donc, dans l'hypothèse, peu probable, d'une répartition régulière des pI de ces ampholytes élémentaires, ils seraient écartés d'environ 0,06 à 0,07 unité pH. Le pouvoir résolutif de tels ampholytes serait donc au mieux de 0,12 à 0,14 unité pH. Les gradients de pH ainsi obtenus sont des "escaliers" dont il s'agit de diminuer la taille des marches. Habituellement, cet objectif est approché à l'aide de mélanges d'amines (N6 + N5 + ....) ou d'aeides(acrylique , méthacrylique, maléique ....). I1 est évident que cette voie est vite limitée. Sous sa forme la plus générale, le procédé pour l'obtention d'ampholytes porteurs utilisables dans les diverses techniques d'électrofocalisation selon la présente invention consiste à faire réagir un acide aminé et/ou une monoamine et/ou des polyamines linéaires ou ramifiées à faible nombre d'atomes azote x dans lesquelles deux atomes d'azote sont séparés par des chaines du type -(CH2)2-, - (oe2)3-, -CH2-CHOH-CH2 ou -CH2-CHOH- CHOH-CH2 -, avec un réactif bifonctionnel convenable en vue de dimériser ou télomériser lesdits produits de départ, et à introduire ensuite de façon connue des fonctions acides au moyen d'un acide organique approprié ou d'un agent analogue. L'acide aminé susceptible d'etre utilisé dans la mise en oeuvre de la présente invention est choisi notamment parmi la ss-alanine, la glycine et autres composés analogues, et la monoamine intervenant peut être l'éthanolamine. La présente invention a donc pour objet un procédé pour l'obtention d'ampholytes porteurs à partir de polyamines à faible nombre d'atomes d'azote. Au sens de la présente description, les polyamines préférées comportent deux, trois ou quatre atomes d'azote. Les amines en N5 et au-delà sont également utilisables, mais présentent moins d'intéret. Ces "petites" polyamines sont commerciales, bon marché et disponibles sous forme purifiée. Dans la présente invention, ces petites polyamines sont partiellement dimérisées à l'aide d'un réactif bifonctionnel convenable, ce qui conduit à une nouvelle polyamine dont le nombre d'atomes d'azote est double par exemple).Après addition sur cette nouvelle polyamine, ou plus exactement sur le mélange obtenu, de fonctions acides, selon des procédés classiques, on obtient des composés du type R (N > x (B) : amine monomère amine dimère. ........ etc ......... où R est un radical hydrocarboné correspondant à l'amine de départ et B représente les fonctions acides. On voit donc qu'une amine en N4 , pouvant conduire seulement à 21 isomères possibles, permet, après dimérisation, d'obtenir 300 isomères et, après trimérisation, 4656 isomères. Le tableau suivant donne, à partir d'une telle amine en N4 , le nombre minimum d'isomères 1 , la résolution théorique 2 , et la masse moléculaire maximum 3 de ces produits 1 2 3 monomère 21 0,3 pH 572 dimère 300 0,018 pH 1200 trimère 4656 0,001 pH 1800 Selon l'invention, il est possible d'obtenir un pouvoir résolutif aussi fin que 0,001 unité grace à la télomérisation des polyamines de départ comme décrit de façon plus détaillée ci-après-. On indique à présent les réactifs utilisés dans la mise en oeuvre du procédé pour l'obtention d'ampholytes porteurs utilisables dans les diverses techniques d'électrofocalisation selon la présente invention. 1 - Amines Dans la présente invention, on fait appel de préférence à des "petites" polyamines à nombre atomes d'azote compris entre 2 et 4 inclus. Les polyamines en N5 et N6 sont également utilisables, bien que dans la pratique ces composés présentent moins d'intérêt. Dans ces molécules, deux atomes d'azote sont séparés par des chaines du type (CH2)2 ,'(CHZ)-I -CH2-CHOH-CH2- ou -CH2-CHOH-CHOH-CH2- . On citera par exemple ltethylène-diamine, la propanol-2-diamine 1-3, la diéthylène-triamine, la triéthy lene-tétramine, désignée par TETA dans la suite de la description. Les produits utilisés peuvent etre indifféremment linéaires ou ramifiés. L'utilisation, en mélange, de l'arginine ou de la guanidine est possible : on peut ainsi obtenir par la suite des gradients de pH pouvant atteindrell contre 9,5, avec les amines simples. De meme, l'utilisation d'un acide aminé tel que la ss-alanine, la glycine, l'acide aspartique et certaines monoamines comme l'éthanolamine permet d'accéder simplement à des gradients de pli plus restreints. 2 - Agents de dimérisation de l'amine Dans le but d'obtenir un procédé de préparation simpleset donc économique, on a retenu, dans le large éventail des réactifs bifonctionnels disponibles, les diépoxydes, les diamides di-insaturés et l'anhydride maléique. D'autres substances sont également utilisables comme l'épichlorhydrine qui conduit à Cependant, la libération d'une mole d'acide chlorhydrique nécessite une purification des ampholytes finalement obtenus, avant leur utilisation définitive. I1 en est de même avec l'épibromhydrine, la dichloracétone ou la dibro moacétone. De plus, la présence du groupe carbonyle peut conduire à la formation d'imines, réversibles et difficilement contrôlables. I1 en est de même avec la pentadiène 1-4, one-3 ou divinyl-cétone La divinyl-sulfone, également utilisable, conduit à des produits présentant une certaine instabilité en milieu fortement alcalin.Ce produit est cependant utilisable dans les domaines de pi inférieurs à 8,5. A - Diepoxydes Le diépoxyde le plus simple est le diépoxy 1-2, 3-4 butane ou diépoxyde de butadiène.Ce composé est susceptible de réagir sur les amines pour conduire à des dimères du type Les produits de ce type sont stables, hydrophiles, ils se forment en milieu aqueux et ceci des la température ambiante. De plus,cette réaction n'est pas accompagnée de libération de sels ou d'acides minéraux, devant être éliminés par la suite par des procédés longs,délicats et coûteux. I1 est évident que de nombreux autres diépoxydes peuvent être intéressants dans une telle réaction; on peut mentionner, par exemple, le diépoxyde du pentadiène 1-4Jet des éthers glycidiques comme le diéther glycidique de l'éthylène- glycol répondant aux formules Cependant, la plus petite molécule est la plus intéressante, car il n'y a pas d'intérêt à grossir inutilement la molécule d'ampholyte (maximum de fonctions ionisables par unité de poids). B - Diamidesdi-insaturés Le représentant type de la série est le N,N' méthylène-bisacrylamide Comme tous les acrylates ou acrylamides, ce produit peut conduire à des réactions de Michael avec les amines, avec dimérisation de l'amine de départ Comme dans le cas précédent, les produits obtenus sont stables, hydrophiles, se forment en milieu aqueux et à température modérée. On a également utilisé avec succès l'acide N,N'-bisacrylamido acétique (CH2=(hEI-CONH-) 2CH-COOH Dans ce cas, on doit tenir compte de la présence de la fonction acide carboxylique dans les réactions ultérieures. Par contre, le glyoxal-bisacrylamide : conduit à des produits qui présentent une stabilité relativement mauvaise dans les zones de pH alcalines. I1 est cependant utilisable dans les domaines de pi inférieurs à 8,5. C - Anhydride maléique L'anhydride maléique est un réactif bifonctionnel des amines. I1 conduit à des produits de structure 3 - Introduction des fonctions acides En partant de la polyamine dimérisée ou télomérisée comme décrit précédemment, on utilise,dans la seconde étape du procédé de l'invention, les techniques classiques d'introduction des fonctions acides : condensation de l'acide acrylique ou de la propane sultone (sulfonate cyclique de l'acide hydroxy-3, propane-l sulfonique).On obtient alors des composés du type Les dérivés sulfoniques étant plus aci des que leurs analogues carboxyliques, conduisent à des ampholytes permettant de couvrir des zones de pH pouvant descendre jusqu'à pH 2, contre 3,5 pour les carboxyliques. L'acide chlorométhyl-phosphonique conduit aux ampholytes phosphoniques. Cependant, cette condensation s' accom- pagne de libération d'une molécule d'acide chlorhydrique, ce- qui implique une purification ultérieure. L'invention est illustrée de façon non limitative, par les exemples suivants. EXEMPLE 1 Dans un tricol rodé de 500 ml, muni d'un agitateur, d'une arrivée d'azote, d'un réfrigérant, d'un thermomètre, d'une ampoule a brome et contenant 0,2 mole (29,2g) de TETA distillée (triéthylène tétramîne), en solution dans 40 ml d'eau distillée, on introduit goutte à goutte, à température ambiante, 0,1 mole (8,6g) de diépoxy 1-2,3-4 butane en solution dans 10 ml d'acétone distillée. L'addition est peu exothermique. A la fin de l'addition (1/2h), on porte progressivement la température du mélange à 500C à l'aide d'un bain d'huile. A cette température1 on ajoute lentement (3/4h) 0,4 mole (28,8g) d'acide acrylique fraîchement distillé.L'addition terminée, on laisse sous agitation pendant 2h 1/2 à 700C.Après refroidissement,on ajoute encore 40 ml d'eau distillée de façon à obtenir une concentration finale voisine de 40%. EXEMPLE 2 On utilise le même matériel que dans l'exemple 1; à 0,2 mole (29,2g) de TETA en solution dans 40 ml d'eau distillée, on introduit 0,12 mole (18,5g) de N,N'-méthylène bisacrylamide (désigné par MBA ci-après) sous forme solide. Après dissolution totale vers 300C (environ 1 heure) on porte à 500C. A cette température, on ajoute lentement (3/4 h) 0,6 mole (43,2g) d'acide acrylique fraîchement distillé. L'addition terminée, on laisse sous agitation 2 h 1/2 à 700C. Après refroidissement on ajoute encore 40 ml d'eau distillée. EXEMPLE 3 On opère dans les mêmes conditions que dans l'exemple 2, mais le MBA est remplacé par 0,1 mole (9,8g) d'anhydride maléique. L'acide acrylique introduit corresponda- lors à 0,35 mole (25,2g). EXEMPLE 4 On opère dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, mais l'acide acrylique est remplacé par 0,4 mole (48,8g) de propane sultone. EXEMPLE 5 On opère dans les mêmes conditions que dans l'exemple 2, mais l'acide acrylique est remplacé par 0,6 mole (73,2go de propane sultone. EXEMPLE 6 On opère dans les mêmes conditions que dans l'exemple 3, mais l'acide acrylique est remplacé par 0,35 mole (42,7g) de propane sultone. EXEMPLE 7 On opère dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, mais l'addition d'acide acrylique est remplacée par 0,2 mole (24,4g) de propane sultone suivie, après 2 heures à 500C, de 0,2 mole (14,4g) d'acide acrylique. EXEMPLE 8 On opère dans les mêmes conditions que dans 1 'ex- emple 2, mais l'addition d'acide acrylique est remplacée par 0,3 mole (36,6g) de propane suîtone,suivie, après 2 heures à 500C, de 0,3 mole (21,6g) d'acide acrylique. EXEMPLE 9 On opère dans les mêmes conditions que dans l'ex- emple 3,mais l'addition d'acide acrylique est remplacée par 0,175 mole (21,35g) de propane sultonessuivie, après 2 heures à 500C, de 0,175 mole (12,6g) d'acide acrylique. EXEMPLE 10 En utilisant le même matériel que dans l'exemple 1, contenant 0,2mole (34,8g) d'arginine (base) etO,l mole (14,6g) de TETAensolution dans 140 ml d'eau distillée,on introduit goutteàgoutte,etàtempérature ambiante,0,lmole (8,6g) de dié poxybutaneensolution dans lOml d'acétone.L'addition est peu exothermique.A la fin de l'addition (1/2h)on porte progressivement la température du mélange à 500 C.A cette température,on ajoute lentement (3/4h) 0,2mole (14,4g) d'acide acrylique.L'addition terminée,on laisse sous agitation pendant 3heures 9 700C. EXEMPLE ll On opère dans les mêmes conditions que dans ltex- emple 10, mais l'addition du diépoxy-butane est remplacée par 0,1 mole (15,4g) de MBA, introduit en poudre. Après la dissolution totale (environ 1 heure à 500C),l'acide acrylique est introduit dans les conditions précédentes. EXEMPLE 12 On opère dans les mêmes conditions que dans latex emple 2,mais le MBA est remplacé par 0,12 mole (23,76g) d'acide N,N-bisacrylamido acétique.L'acide acrylique est alors limité à 0,48 mole (34,56g). EXEMPLE 13 En utilisant le même matériel que dans l'exemple 1 contenant 0,2 mole (34,8g) d'arginine (base), 0,1 mole (14,6g) de TETA et 0,1 mole (6,lg) de monoéthanolamine dans 100 ml d'eau distillée,on introduit 0,15 mole (23,lg) de MBA en poudre.On porte ensuite 3 heures à 700C.I1 faut remarquer cependant qu'en fonction des lots de TETA utilisés,on a parfois été conduit à faire varier légèrement les diverseslproportions u tilisées.En effet,l'analyse élémentaire C,H,N de!TETA fratche- ment distillée ne boucle pas à 100%. ANALYSE DES PRODUITS OBTENUS Outre divers tests de routine, les produits obtenus sont analysés en fonction des critères suivants - linéarité des gradients de pH, pouvoir tampon, - pouvoir résolutif - qualités optiques. A - Linéarité des gradients de pli et pouvoir tampon Ces paramètres sont analysés par électrofocalisation en veine liquide (colonne de 110 ml de capacité), en présence d'un gradient de densité (saccharose) et en l'absence de tout matériel biologique. Après 18 heures de focalisation sous un potentiel de 500 V et à une température de 100 C, la colonne est vidée à l'aide d'une pompe péristaltique, et l'on obtient environ 120 fractions de 0,8 ml. Le pH de chaque fraction est mesuré à l'aide d'un pH-mètre au 1/1000ème, et la conductivité de chaque fraction est déterminée. B - Pouvoir résolutif Le pouvoir résolutif est apprécié par électrofocalisation en gel de polyacrylamide. Le gel (125 x 250 x 2 mm) est obtenu par polymérisation sous lumière ultraviolette d'une solution de 4,2 g d'acrylamide, 110 mg de MBA dans 60 ml d'eau distillée et dégazée, contenant en outre 1 ml d'une solution à 4 mg dans 100 ml de riboflavine et 1% (en concentration finale) du système d'ampholytes à étudier. Après 18 heures de focalisation sous un potentiel de 500 V et à une température de 10 C, le gradient de pH est mesuré à l'aide d'une micro-électrode de contact (les mesures sont moins fiables que celles obtenues en veine liquide). Ensuite, le gel est examiné en lumière rasante et photographié. Eventuellement,la photographie est analysée au densitomètre. Les irrégularités de la surface du gel sont caractéristiquest de légers sauts de pH éventuels des ampholytes porteurs. Ces sauts ne sont en général pas appréciables en veine liquide. C - Qualités optiques Chaque préparation est testée par son absorption optique dans le visible et le proche UV, en solution à 1% dans l'eaudistillée, aux longueurs d'ondes suivantes : 254,280 et 365 nm. Les préparations décrites dans les exemples précédents permettent d'obtenir les gradients de pH suivants pH 4-9 : exemples 1,2, 3 et 12; pH 2-9 : exemples 4, 5, 6, 7, 8, 9 ; pH 7 - 11 : exemples 10 et ll; pH 9-11 : exemple 13. Ces gradients présentent tous une bonne linéarité. Cependant, les plus performants sont ceux des exemples 7, 8 et 9 : on obtient de l'ordre de-l de déviation par rapport à la théorie sur 80% des fractions. On obtient des résultats équivalents par mélange d'une préparation des exemples 1, 2 ou 3 à l'une des préparations des exemples 4, 5 ou 6. La linéarité des gradients partiels 7-11 et 9-11 est moins bonne (de l'ordre de 3%3. Dans tous les cas, la conductivité est constante pendant plus de 80% de la zone utile (aux erreurs de mesure près). L'électrofocalisation en gel de polyacrylamide est particulièrement spectaculaire : on constate l'absence pratiquement totale d'ondulations (résolution meilleure que 1/1000 ème de pH dans toute la gamme. Cet aspect n'a été rencontré que dans le système d'ampholytes proposé dans la présente invention. Dans le proche W, les valeurs moyennes d'absorption sont 254 nm : 0,30 DO , 280 nm : 0,05 DO, 365 nm : 0,10 DO. Ces valeurs peuvent être considérées comme satisfaisantes. La masse moléculaire des produits obtenus a été a nalysée par chromatographie de perméation de gel : environ 98% des mélanges présentent une masse moléculaire inférieure à 2500. Ces produits ne traversent pas facilement les membranes à dialyse classiques. Cependant, lorsque l'on désire obtenir des pro téines totalement exemptes d'ampholytes porteurs après une électrofocalisation préparative, la technique de choix est de faire suivre cette opération d'une chromatographie sur résine échangeuse d'ions. Les ampholytes porteurs, contenant beaucoup de fonctions ionisables, sont très fortement retenus, tandis que les protéines sont éluées rapidement. En outre, une purification supplémentaire de la protéine peut être ainsi obtenue car deux protéines de même pI peuvent présenter des nombres différents de fonctions ionisables et être séparées à cette éta pe. En réalité, la séparation d'une protéine purifiée par électrofocalisation des ampholytes de meme pI, ayant servi à cet usage, n'est pas un problème de masse moléculaire. L'expérience montre que si l'on utilise des ampholytes de faible masse moléculaire (donc peu résolutifs), la dialyse ne permet pas d'éliminer totalement les ampholytes porteurs. On ne peut donc trouver que des avantages à utiliser des ampholytes porteurs très résolutifs, en dépit d'une masse moléculaire plus élevée. L'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation représentés et décrits en détails, car diverses modifications peuvent y etre apportées sans sortir de son cadre REVENDICATIONS 1. Procédé pour ltob1;ention d'ampholytes porteurs, caractérisé en ce qu'il consiste i faire réagir un acide aminé et/ou une monoamine et/ou des polyamines linéaires ou ramifiées à faible nombre d'atomes d'azote x dans lesquelles deux atomes d'azote sont séparés par des chaînes du type -(CH2)2-,-(CH2)3-, -CH2-CHOH-CH2- ou -CH2-CHOH-CHOH-CH2-avec un un réactif bifonc- tionnel convenable en vue de dimériser ou télomériser lesdits produits de départ, et à introduire ensuite de façon connue des fonctions acides au moyen d'un acide organique approprié ou d'un agent analogue. 2. Procédé pour l'obtention d'ampholytes porteurs selon la revendication 1, caractérisé en ce que le nombre d'atomes d'azote x des polyamines est compris entre 2 et 4 inclus. 3. Procédé pour l'obtention d'ampholytes porteurs selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que les polyamines à faible nombre d'atomes d'azote sont l'éthylè- ne-diamine, la propanol-2-diamine 1-3, la diéthylène-triamine, la triéthylène-tétramine, l'éthanolamine ou leurs mélanges compatibles, un mélange d'arginine ou de guanidine. 4. Procédé pour l'obtention d'ampholytes porteurs selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le réactif bifonctionnel convenable est choisi parmi les diépoxydes, les diamides insaturés, l'anhydride maléique, l'épichlorhydrine, l'épibromhydrine, la dichloracétone, la dibromoacétone et la divinyl-sulfone. 5. Procédé pour l'obtention d'ampholytes porteurs selon la revendication 4, caractérisé en ce que le diépoxyde est le diépoxy-1,2,3,4-butane ou le diépoxyde du pentadiène 1-4 de formule ou un éther glycidique, notamment le diéther glycidique de l'éthylène glycol de formule 6. Procédé pour l'obtention d'ampholytes porteurs selon la revendication 4, caractérisé en ce que le diamide diinsaturé est le N,N'-méthylène bisacrylamide de formule ou 1 acide N,N'-bisacrylamido-acétique de formulé (CH2 = CH - CONH)2 CH-COOH. 7. Procédé pour l'obtention d'ampholytes porteurs selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'agent approprié servant à l'introduction des fonctions acides est l'acide acrylique ou la propane sultone (sulfonate cyclique de l'acide hydroxy-3 , propane-l sulfonique). 8. Procédé pour l'obtention d'ampholytes selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide aminé est choisi parmi la p-alanine, la glycine et autres composés analogues. 9. Procédé pour l'obtention d'ampholytes porteurs selon la revendication 1, caractérisé en ce que la monoamine est ltéthanolamine. 10. Ampholytes porteurs obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, et présentant des gradients partiels de bonne linéarité. 11. Application des ampholytes porteurs selon la revendication 10 aux diverses techniques d'électrofocalisation.