Brevet FR2457492A1 — publié le 19801219

La présente invention concerne la détection des maladies cancéreuses. Les maladies cancereuses, comprenant les leucémies et les néoplasies malignes, représentent la troisième cause de mortalité chez l'homme. La progression d'une néoplasie dans l'invasion du tissu sain dépend principalement du taux de prolifération cellulaire des cellules néoplastiques. Bien d'autres facteurs tels que la localisation de la tumeur, et l'état de santé général du sujet ainsi que sa résistance immunologique entrent en cause, mais la malignité d'une tumeur ou d'une leucémie dépend en premier lieu de, et est directement proportionnelle au taux de prolifération de ses cellules. Jusqu'à présent, le seul-procédé de détection de la malignité té des cellules tumorales, généralement accepté, est basé sur l'observation de la morphologie des cellules tumorales. Une morphologie cellulaire indifférenciée et un appareil nucléaire anormal sont communs dans des cellules qui, de même que les cellules embryonnaires indifférenciées, montrent un taux de prolifération ou un taux de multiplication élevé.Le procédé morphologique histologique ou qualitatif, préalablement utilisé pour le diagnostic de la malignité d'une tumeur, ne donne pas entière satisfaction, étant donné qutil dépend de la perception visuelle par des pathologistes de signes morphologiques mal définis, et en raison du fait que, normalement, les décisions chirurgicales, les pronostics et autres sont basés sur l'examen de quelques centiemes de milligrammes seulement du matériel suspect. Un examen histologique peut êtra complété par exemple par une comparaison immunologique entre la tumeur et l'hôte, mais même cette évidence corroborative, accompagnée ou non de l'observation de signes cliniques, peut parfois s'avérer insuffisante ou meme erronée.Lorsqu'on sait que de nombreuses décisions thérapeutiques, économiques et sociales dans le cas de patients atteints de cancer reposent uniquement sur le diagnostic de la malignité d'un cancer et le pronostic en résultant, il est évident qu'il est nécessaire de disposer d'un procédé réel, quan titatif et précis pour évaluer les degrés relatifs de malignité ou de bénignité, basé sur-la détermination du taux de prolifération cellulaire. Cette nécessité est particulière- ment significative dans le cas de tumeurs telles que les polypes intestinaux et les tumeurs de l'ovaire ou du sein qui montrent souvent un taux de prolifération cellulaire élevé, tout en paraissant morphologiquement bénignes. Dans ces cas, une évaluation morphologique seule peut conduire à des délais fatals lorsque des décisions chirurgicales doivent 8- tre prises. La glycolyse aérobie (la production d'acide lactique à partir du glucose en présence d'oxygène) semble être une caractéristique métabolique unique des cellules cancéreuses et embryonnaires. Les biochimistes pensent généralement qu' une glycolyse aérobie importante est associée à un degré élevé d'indifférenciation biochimique, et on admet de façon générale que la vitesse de la glycolyse aérobie dans des cellules tumorales correspond de très peu au taux de prolifération cellulaire. Le Demandeur a découvert que la glycolyse aérobie dans des cellules cancéreuses est attribuable au défaut d'inhibée tion de l'enzyme glycolytique, la pyruvate kinase, par l'adé- nosine triphosphate (ATP). Dans des cellules normales, en présence d'oxygène, 1'ATP engendrée par les mitochondries inhibe pratiquement totalement, par voie allostérique, deux enzymes dans le cheminement métabolique du glucose à l'acide lactiques c'Xst-à-dire, la phosphofructokinase et la pyruvate kinase. En conséquence, dans un tissu normal, il nty a pas de glycolyse en présence d'oxygène.Cependant, il semble maintenant que dans des cellules tumorales, 1'ATP n'inhibe que partiellement la phosphofructokinase et qu'elle inhibe la pyruvate kinase partiellement ou pas du tout. Des procédés connus peuvent être appliqués à la détermination du degré auquel les enzymes dans le processus métabolique sont inhibés par 1'ATP. Le Demandeur a découvert un degré de corrélation élevé entre, par exemple, le degré d'inhibition par 1'ATP de la pyruvate kinase dans des cellules cancéreuses et les effets de Crabtree et de Pasteur montrés par ces cellules. De plus, on constate également un degré de corrélation éleve si on compare le pourcentage d'inhibition par 1'ATP de B pyruvate kinase dans des échantillons de cellules examinés, avec la malignité ou-la bénignité de cancers chez des sujets dont on a prélevé les cellules, telle que déterminée par une étude morphologique, biologique et clinique de l'évolution de la maladie.Le tableau I ci-dessous permet une comparaison de la malignité relative de cancers chez des sujets de diverses espèces, avec le pourcentage dVinhibition par 1sATP de la pyruvate kinase dans des homogênéisats de cellules cancéreuses provenant de ces sujets. TABLEAU I Tissu Espèce Pourcentage Malignité maximal d'in hibition de la pyruvate kinase par 1'ATP Tissu normal Rat 99 % Pas de proli fération cellulaire Foie normal Homme 99 % dO Adénome fibromammaire Rat 49 % Très bénin Ependymome cérébral Homme 40 % Bénin Ascite de Erhlich Souris 39 % Lente proli (Souche de Rome) fération Leucémie lympho- Modérément blastique -aiguë Homme 32 % maligne Leucémie P-P388 Souris 25 % Maligne Carcinosarcome de Walter Rat 22 % Malin Carcinosarcome mammaire Homme 17 % Malin Leucémie 1210 Souris 16 X Très maligne Gliome Homme 15 % Malin Carcinome ovarien Homme 10 % Malin TABLEAU I (suite) Tissu Espèce Pourcentage Malignité maximal d'in hibition de la pyruvate kinase par 1'ATP ~~~~~~~~~~ l'ATP ~~~~~~~~~~~ Gliome multiforme Homme 4 % Malin Ascite de Erhlich (souche de Paris) Souris 4 % Taux de proli fération très élevé Une mise en évidence expérimentale supplémentaire de l'effet notable de l'inhibition par 1'ATP de la pyruvate kinase, dans des cellules cancéreuses, est présentée par M. Gosalvez et al., dans Cancer Research 38, 142-148 (1978). La présente invention a pour objet un procédé d'evaluation de la malignité ou de la bénignité des cellules dans un échantillon de cellules, lequel procédé consiste à déterminer si l'activité de la pyruvate kinase dans les cellules est inhibée par la présence d'adénosine triphosphate. Tel qu'il est appliqué de façon usuelle, le procédé consiste à (a) préparer â partir de l'échantillon un homogénéisat contenant la pyruvate kinase extraite des cellules ; et (b) déterminer si l'action de la pyruvate kinase sur son substrat de phosphoénol pyruvate est inhibée å un degré quelconque Zr la présence d'adénosine triphosphate. La base théorique de ce nouveau procédé est décrite ci-après en détail, La dégradation progressive du glucose en acide pyruvique, selon le processus bien connu d'Embden Myerhof, a lieu selon la réaction suivante Phosphoénol- Pyruvate pyruvate où 1'ADP et 1'ASP sont respectivement l'adénosine diphosphate et l'adênosine triphosphate. Dans des cellules saines, cette réaction est supprimée par l'inhibition par 1'ATP de l'enzyme pyruvate kinase. Comme mentionné ci-dessus, on a découvert que dans des cellules cancéreuses, la réaction a lieu de façon plus ou moins prononcée, en rapport avec le degré de malignité, proportionnellement au degré du défaut d'inhibition de l'activité de la pyruvate kinase par 1'ATP. Un test préféré implique donc ltévaluation de la progression de la réaction ci-dessus en présence de différentes teneurs en ATP calculées pour exprimer le degré, s'il y a lieu, auquel l'activité de la pyruvate kinase provenant de l'échan- tillon est inhibée par 1'ATP. Le degré de cette inhibition peut être caractérisé selon un pourcentage relatif à la réaction précédente, 0 56 indiquant l'absence de toute inhibition, 100 % une inhibition totale, et " le pourcentage maximal d'inhibition de l'activité de la pyruvate kinase" indiquant le point sur l'échelle au-delà duquel une addition supplémentaire dlATP n'affecte plus la progression de la réaction. Le test de détermination de l'activité de la pyruvate kinase dérivée d'un échantillon peut débuter à n'importe quel moment avant la conversion du phosphoénol pyruvate selon le processus d'Embden-Meyerhof (voir par exemple, J.D. Watson, Molecular Biology of the Gene, pp. 34-35 (3ème éd. 1977) W.A. Benjamin Inc. Publ. Menlo Park Ca.), à condition que les substrats, les co-facteurs, les enzymes et les co-enzymes nécssaires soient fournis au milieu expérimental. (Tel qu'il est utilisé ici, le terme "milieu expérimental de pyruvate kinase" désigne une solution contenant les ingrédients actifs nécessaires au test de détermination de l'activité, autres que 1'ATP ajouté ensuite). Mais, de préférence, la réaction du phosphoénol pyruvate est directement réglée par apport de phosphoénol pyruvate et d' ADP à la pyruvate kinase provenant de l'échantillon, en suivant la réaction résultante, de préférence par voie spectrophotométrique, en présence de différentes quantités d'ATP. Il est donc particulièrement avantageux de fournir à l'utilisateur du nouveau procédé un coffret de diagnostic selon l'invention qui comprend (a) un milieu pour la détermination de l'activité de la pyruvate kinase ; et (b) de 1 'adénosine triphosphate. Un procédé particulièrement préféré pour suivre la réaction par voie spectrophotométrique implique un essai optique complexe dans lequel on observe l'influence de la réaction étudiée sur une réaction secondaire avec un produit final observable (Voir Felu, FEBS Letters, 50, 334 (1975) et Bucher T. et al. dans "Methods in Enzymology, vol.I (S.P. Colowick et N.0. Kaplan eds.) Academic Press, N.Y. p.345). C'est ainsi que dans la réaction du composé excès de phosphoénol- Pyruvate kinase pyruvate + ADP ++ + + ATP Mg et K ou (NH4) + * H+ Déshydrogénase lactique lactate + NADH + H en excès, ajoutée à la pyruvate kinase l'activité de la pyruvate kinase peut être surveillée en observant le taux de disparition de la bande (à 340 mJu) du donneur d'hydrogène NADH tnicotimamide adénine dinucléotide, sous forme réduite).Des répétitions successives de l'essai avec différentes. quantités d'ATP ajoutées permettent de déterminer le point au-delA duquel une addition d'ATP n'influence plus la vitesse de disparition du donneur d'hydrogène. C'est ainsi, par exemple, qu'une comparaison graphique de la diminution de l'absorbance en absence d'ATP et à diverses concentrations en ATP, montre le point maximal d'in- hibition allostérique au point d'inflexion de la courbe. Les échantillons pour l'essai peuvent être obtenus sous la forme d'un tissu complet (par exemple un volume de 3 1 â 10 mm ) dans le cas des tumeurs supposées,par biopsie intraopératoire ou biopsie avec une aiguille. Dans le cas de malignités supposées dans le sang, il suffit de recueillir les globules blancs du sang (leucocytes) par centrifugation différencielle . On garde les échantillons sur de la glace pendant la préparation des homogênéisats nécessaires à l'es- sai. L'homogénéisation libère la pyruvate kinase contenue dans les cellules, pour l'essai, et implique la rupture des cellules par des techniques classiques qui évitent, à un degré utile, la destruction des noyaux, des mitochondries et d'autres particules cellulaires.Typiquement, l'échantillon peut être placé dans un homogénéiseur manuel fourni avec le coffret d'essai, dans une solution isotonique tamponnée, et homogénéisé avec un pilon. Selon l'importance de ltéchantillon, on utilise par exemple de 0,1 à1 ml de la solution tamponnée. Comme tampon approprié, on peut mentionner entre autres une solution contenant 50 mM de Tris-HCI, pH 7,0, O,lmM d'EDTA et 0,5 mM de dithioérythritol.Dans le mode de mise en oeuvre préféré de 11 invention, l'homogénéisat est de nouveau centrifuge, par exemple entre environ 5 000 et 10 000 tours/minute dans un tube de centrifugation conique pendant 10 minutes, puis on dialyse le produit surnageant contre de lteau (par exemple 2 heures à 2 a 4 GC environ). On transfère alors le contenu du sac de dialyse dans un tube immergé dans de la glace. Dans le cas d'échantillons importants, on peut supprimer les opérations de centrifugation et de dialyse, comme le savent les spécialistes. Mais, de préférence, un sac de dialyse est fourni dans le coffret. Tel qu'il est utilisé ici, le terme "homogénéisat1' désigne un produit d'homogénéisation contenant l'enzyme libre, qu'il soit accompagné ou non d'autres débris cellulaires. Dans le mode de mise en oeuvre par9iulièrement pré feré de l'invention, le coffret de diagnostic comprend un milieu d'essai de pyruvate kinase qui, lorsqu'il est dilué de 5 à 10 fois avec de l'eau distillée, a la composition suivante : 50 mM de chlorhydrate d'imidazole, pH 7,0, O, 1 M de KC1, 5 mM de MgC12, 0,25 MM de NADH, 1 mM d'ADP de Mg, 2 mM de phosphoénol pyruvate et 1 unité/ml de déshydrogénase lactique. On ajoute un petit échantillon d > homogénéisat a, par exemple, 3 ml du milieu dressai dans une cuve dans laquelle on ajoute également de 1'ASP provenant d'une troisième solution mère pour déterminer l'absorbance du NADH à 340 mp.Dans des déterminations successives, les différentes concentrations en ATP, initialement dans le milieu d'essai, peuvent être par exemple de 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4 et 5 mM. Une courbe de la diminution de l'absorbance en fonction de la concentration en ATP montre le pourcentage maximal d'inhi- bition de la pyruvate kinase par l'ATP. Les spécialistes de la technique peuvent également déterminer un résultat "ouinon" en comparant ltinhibition de la pyruvate kinase pour une concentration particulière optimale en ATP, aux valeurs préalablement déterminées à cette concentration avec des é- chantillons,de malignité connue, de chaque type différent de cancer examiné. Dans son aspect le plus large, l'invention est basée sur la découverte que la sensibilité de la pyruvate kinase provenant des cellules, vis-à-vis de lEnhibition par 1'ATP, est en rapport avec le taux de prolifération cellulaire relatif et le degré d'indifférencia*ion, et par conséquent avec la malignité des cellules dont provient l'enzyme. Ltin- vention fournit donc un procédé biochimique quantitatif pour le diagnostic et le pronostic des maladies cancéreuses. REVENDICATIONS 1 - Procédé d'évaluation de la malignité ou de la bénignité cancéreuse des cellules dans un échantillon de cellules, caractérisé en ce qu'il consiste à déterminer si l'activité de la pyruvate kinase dans ces cellules est inhibée par la présence d'adénosine triphosphate. 2 - Procédé selon la revendication 1, pour ltévaluation de la malignité ou la bénignité cancéreuse des cellules dans un échantillon de cellules, caractérisé en ce qu'il consiste à : (a) préparer & partir de l'échantillon un homogénéisat contenant la pyruvate kinase provenant des cellules ; et (b) déterminer si l'action de la pyruvate kinase sur son substrat de phosphoénol pyruvate est inhibée à un degré quelconque par la présence d'adénosine triphosphate. 3 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on détermine le degré maximal auquel la pyruvate kinase est inhibée par l'adénosine triphosphate. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la détermination a lieu par voie spectrophotométrique. 5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la détermination est effectuée par un essai optique complexe. 6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qua l'échantillon et l'adénosine triphosphate sont ajoutés à un milieu d'essai de pyruvate kinase contenant du phosphoénol pyruvate, de l'adénosine diphosphate, de la déshydrogénase lactique et un donneur d'hydrogène, et la détermination est effectuée en verifiant la vitesse de disparition du donneur d'hydrogène par spectrophotométrie. 7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le donneur d'hydrogène est la forme réduite du nicoti namide adénine dinucléotide. 8 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que la détermination est répétée en utilisant différentes quantités d'adénosine triphosphate de façon à déterminer le point au-delà duquel une addition d'une autre quantité d'adénosine triphosphate n'affecte plus la vitesse de disparition du donneur d'hydrogène. 9 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on détermine la vitesse de disparition du donneur d'hydrogène en l'absence de tout adénosine triphosphate ajouté. 10 - Coffret de diagnostic utilisable dans l'évaluation de la malignité ou de la bénignité cancéreuse des cellules dans un échantillon de cellules, caractérisé en ce qu'il contient (a) un milieu pour la détermination de l'activité de la pyruvate kinase ; et (b) de l'adénosine triphosphate. 11 - Coffret de diagnostic selon la revendication 10, caractérisé en ce que le milieu est un milieu pour l'essai optique d'un composé pour déterminer 11 activité de la pyruvate kinase. 12 - Coffret de diagnostic selon la revendication 11, caractérisé en ce que le milieu contient de la déshydrogénase lactique, du phosphoénol pyruvate, de l'adénosine diphosphate et un donneur d'hydrogène. 13 - Coffret de diagnostic selon la revendication 12, caractérisé en ce que le donneur d'hydrogène est la forme réduite du nicotinamide adénine dinucléotide. 14 - Coffret de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisé en ce qu'il contient une quantité d'une solution isotonique tamponnée pour la préparation dtun homogénéisat de cellules.