Brevet FR2444465A1 — publié le 19800718

La présente invention concerne un procédé de productlas d'une préparation thrombolytique contenant comme constituant principal une urokinase ayant une mise moléculaire de 54 000 + 10 000. L'urokinase est une enzyme ekistant en quantité infime dans l'urine humaine, et elle a pour fonction d'activer le plasminogène contenu dans le sérum en formant de la plasrine ayant une activité fibrinolytique. Comme elle constitue un activateur efficace du système fibrinolytique, l'urokinase est isolée de l'urine humaine ou de cultures tissulaires de reins et purifiée pour etre utilisée cliniquement sur une grande échelle pour le traitement de divers thromboses, cancers, en association avec des agents carcinostatiques, et d'autres maladies. Ainsi, l'urokinase est devenue très utile dans le domaine pharmaceutique. La demanderesse a effectué des études en vue de favoriser une utilisation plus efficace de l'urokinase dans ses applications thérapeutiques. Les préparations d'urokinase actuellement utilisées comme produits pharmaceutiques sont des mélanges de poids moléculaires différents. On connait deux types d'urokinase, l'un ayant une masse moléculaire d'environ 33 000 + 10 000 et l'autre une masse moléculaire d'environ 54 000 + 10 000. Ceux-ci sont mélangés de façon b présenter une activité définie.Bien que la raison n'en ait pes encore été élucidée, l'existence d'enzymes de masse moléculaire différente dans l'urokinase est supposez provenir de l'existence d'isoenzymes résultant de la différence entre les tissus producteurs d'enzymes, de la transformation en sub-unités par action d'enzymes protéolytiques dans l'urine ou dans d'autres substances ou de la décomposition et de la modification se produisant lorsqu'on recueille l'urine. On peut supposer que des préparations d'urokinase présentant des masses moleculaires différentes ont natuxel- lement des efficacités physiologiques différentes Copendant, l'essai classique in vitro par la méthode de revêtement de fibrine ou par la méthode en deux stades (pharmaceutscals Research, 5 (3), 295-308 (1974,), généralement effectuée pour standardiser l'activité enzymatique des préparations d'urokinase, n'a pas fourni de suggestions suffisantes sur ce problème, ni d'.informations sur une différence importante d1efficacité. En conséquence, lorsqu'on administre la préparation d'urokinase, la standardisation a été effectuée en ajustant l'activité totale par l'effet in vitro. En d'autres termes, l'urokinase a été administré en supposant que son efficacité physiologique était la même si l'activité enzymatique (puissance) in vitro était la même, malgré la diversité des masses moléculaires de llurokinase. Compte tenu de ce qui précède, la diversité des masses moléculaires de préparations d'urokinase a été étudiée, et des essais sur des animaux ainsi que des utilisations cliniques de l'urokinase ont été poursuivies. A l'heure actuelle, la demanderesse a trouvé qu'il existait une différence non négligeable entre l'activité in vitro et le comportement in vivo de l'urokinase suivant la masse moléculaire. Partant de la découverte ci-dessus, la demanderesse a examiné èn outre si l'activité enzymatique in vitro était le reflet exact de l'efficacité enzymatique in vivo, si les urokinases de masse moléculaire différente présentaient la même efficacité biologique in vivo et s'il existait ou non d'autres différences enzymologiques fonction de la différence des masses moléculaires. A la suite de ces études, on a constaté ce fait surprenant qu'il existait une très forte différence en ce qui concerne l'activité thrombolytique entre des échantillons ayant été ajustés a la même puissance sur la base de l'activité enzymatique déterminée par la méthode en deux stades ou par d'autres méthodes in vitro, et qu'il existait une certaine corrélation entre la masse moléculaire et l'activité thrombolytique de l'urokinase.On a trouvé que des urokinases de masse moléculaire supérieuxe présentaient un effet thrombolytique plus élevé, même si la puissance, déterminée in vitro par la méthode en deux stades ou par d'autres méthodes, était la même. On a trouvé en outre que les urokinases présentant des masses moléculaires les plus grandes étaient également supérieures en ce qui concerne l'aptitude à la conservation. On a administré à des groupes de beagles par voie intraveineuse, de l'urokinase de masse moléculaire élevée (54 000) et de l'urokinase de masse moléculaire plus faible (33 000), respectivement, marquée chacune par 125I, et on a suivi l'atténuation de chacune de ces urokinases dans le temps. On a trouvé que l'urokinase de masse moléculaire la plus élevée restait plus longtemps dans le sang et que sa durée demi-vie atteignait le double de celle de l'urokinase ayant la masse moléculaire la plus faible. Dans les dessins annexés, la Fig. 1 est un diagramme représentant les relations entre le pH d'une solution aqueuse d'urokinase et le rapport d'activité résiduelle, et la Fig. 2 est un diagramme représentant l'atténuation d'urokinases de masses moléculaires différentes, marquées par 125I dans le sang de beagles après injection intraveineuse. Sur la base des résultats d'études effectuées sur l'efficacité pharmaceutique in vivo de la préparation d'urokinase et sur la méthode de récupération de cette urokinase efficace, la demanderesse est parvenue à mettre au point une nouvelle préparation d'urokinase standardisée présentant une haute efficacité biologique contenant comme constituant principal, une urokinase de masse moléculaire élevée. Un des buts de l'invention est de fournir un procédé de production d'une préparation thrombolytique contenant de l'urokinase ayant une masse moléculaire de 54 000 + 10 000 comme constituant principal. Le procédé de production de l'urokinase ayant une masse moléculaire de 54 000 + 10 000 ntest pas spécifique, à moins que le rendement présente de l'importance. L'urokinase peut être isolée d'une manière connue par divers stades de traitements comprenant la séparation de l'urine, la concentration et la purification. L'urokinase purifiée est soumise à un traitement utilisé pour séparer et recueillir une enzyme de masse moléculaire déterminée, tel que fractionnement par filtration sur gel, passage sur une colonne échangeuse d'ions, chromatographie d'affinité ou précipitation fractionnée. La filtration sur gel est une méthode simple de récupérution d'une urokinase ayant une masse moléculaire déterminée et elle donne de bons résultats. Les substances convenant pour la filtration sur gel comprennent un gel de dextrane réticulé, un gel de polyacrylamide et un gel d'agarose préparés pour traiter une substance ayant une masse moléculaire dans l'intervalle de 1 000 à 150 000. La matière filtrante est contenue dans une colonne en équilibre avec uns solution tampon à faible teneur en sel ayant un pH de 5,5 à 9,5. On fait passer sur la colonne une solution aqueuse contenant de l'urokinase, et on recueille la fraction contenant l'urokinase ayant une masse moléculaire de 54 000 + 10 000. Ce procédé est simplement donné à titre d'exemple et n'est pas limitatif. La demanderesse a effectué des études sur l'amélioration du rendement en urokinase ayant une masse moléculaire de 54 000 + 10 000, et a trouvé que le rendement pouvait être amélioré efficacement en maintenant à chaque stade du traitement le pH de la solution aqueuse contenant l'urokinase dans le domaine neutre faiblement acide, de préférence de pH 5,5 à pH 12, en particulier dans l'opération de dialyse pour l'élimination des sels. Lorsque cette condition est satisfaite, la stabilité de l'urokinase est assurée et on recueille efficacement une urokinase ayant la masse moléculaire voulue de 54 000 + 10 000 sans qu'il se produise de décomposition. Ce fait ressort de l'exemple expérimental 1 ci-dessous. Exemple expérimental 1 La corrélation entre le pH et le rapport d'activité résiduelle de l'urokinase ainsi que la répartition des masses moléculaires L'urokinase qui a éte recueillie de l'urine humaine par adsorption sur el de silice est fractionnée par du sulfate d'ammonium et la solution d'extrait est ajustée jusqu'à une puissance en urokinase de 9 800 UI. La solution obtenue est dialysée pendant 40 heures à 40C contre un liquide externe constitué d'eau, d'une solution tampon d'acétate de sodium 1M ayant un pH de 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 11,0 ou 12,0 ou une solution de tampon phosphate 1/15M, en renouvelant le liquide externe à des intervalles de 8 heures.Lorsque la dialyse est terminée, on détermine le rapport de l'activité résiduelle et la répartition de la masse moléculaire est grossièrement évaluée par la technique de tamisage moléculaire par filtration sur gel. Le rapport de l'activité résiduelle trouvée et les résultats de l'estimation des masses moléculaires sur des fractions d'urokinase par rapport à des échantillons témoins de masse moléculaire connue sont résumés dans le tableau 1. TABLEAU I CORRELATION ENTRE pH ET RAPPORT D'ACTIVITE RESIDUELLE ET REPARTITION DES MASSES MOLECULAIRES Essai pH du liquide activité rapport Répartition des masses molésculaires N externe après d'activité 33 000 54 000 dialvse résiduelle # 10 000 # 10 000 Témoin solution d'extrait 9 800 100 - ++ " H2O 8 514 86 # # 1 3 6 324 65 ++ 2 4 6 314 64 ++ 3 5 6 426 66 + + 4 6 7 252 74 - + 5 7 8 296 85 - ++ 6 8 10 290 105 - ++ 7 9 9 672 99 - ++ 8 11 9 016 92 - ++ 9 12 8 722 89 - ++ Note : - ... undétectable ; # .... détectable ; +... détectable à un degré considérable ; ++ ... détectable à un degré suffisant Dans la préparation d'urokinase obtenue à partir d'urine humaine, il existe une possibilité de présence de virus causant l'hépatite, des maladies endémiques et autres. Pour pouvoir être administré à l'homme comme produit pharmaceutique, l'urokinase doit subir un traitement d'inactivation des virus, c'est-à-dire le traitement thermique connu (550 à 650C, pendant 9 à 11 heures) qui est le plus simple et le plus sûr à l'heure actuelle. Au cours du traitement thermique, il est également intéressant pour stabiliser l'urokinase, d'ajuster la solution aqueuse d'urokinase à pH 6-8 avec une solution tampon, ayant une concentration en sel de Q,01 à 0,3 M. On obtient un effet stabilisant extrêmement élevé en utilisant un stabilisant thermique choisi parmi les protéines, les aminoacides, la saccharides et les sels neutres, en plus de la condition de pH indiquée ci-dessus Bien que ceci ne soit pas déterminant, l'activité spécifique de l'urokinase est de préférence supérieure à 200, ou mieux encore supérieure à 1 000 (UI) par mg. La proportion d'urokinase dans la solution devant être traitée thermiquement est en général de 0,001 à 5 % (P/V), de préférence de 0,01 à 1 % (P/V), calculé en protéine. I1 est préférable de maintenir le pH de la solution devant être traitée thermiquement à une valeur de 6 à 8 en l'ajustant avec une solution tampon, en particulier une solution tampon au phosphate, ayant une concentration en sel de 0,01 à 0,3 M. Dans les conditions ci-dessus, des stabilisants thermiques appropriés, si on en utilise, sont des amino-acides tels que la glycine, la lysine et l'arginine ; des saccharides tels que le sucrose et la mannite ; des sels neutres tels que le chlorure de sodium ; et des protéines telles que la gélatine. La limite inférieure de la proportion de stabilisants à ajouter est normalement de -5 %,pour la glycine,-le sucrose et la mannite, de 0,1 M pour la lysine et l'arginine, de 0,15 M pour le chlorure de sodium et de 0,1 %, calculé en protéine pour l'albumine et la gélatine. Même lorsque la proportion est abaissée en-dessous de la limite inférieure, le stabilisant ne perd pas son effet brusquement, mais seulement de façon progressive. I1 n'y a pas de limite supérieure a la proportion de stabilisant, à moins qu'on ne prenne en considération l'elimi- nation du stabilisant de la préparation. La température du traitement d'inactivation des virus es t de 50 à 700C, de préférence de 55 à 650C, et la durée de chauffage est de 8 à 12 heures. L'urokinase traitée thermiquement, si nécessaire, est débarrassée des sels présents et des stabilisants thermiques par dialyse ou par un autre procédé. L'urokinase hautement purifiée est répartie dans les flacons et elle est lyophilisée pour obtenir des préparations pharmaceutiques. Dans le cas de l'urokinase brute, elle est transformée de la même façon en préparations pharmaceutiques après avoir été hautement purifiées en utilisant des échangeurs d'ions bien connus, des absorbants spécifiques de llurokinase, ou le sépharose 4B. Pour étudier l'effet du chauffage sur le pouvoir infectieux de virus pouvant exister dans la préparation d'urokinase, on a effectué des expériences de chauffage en présence ou en l'absence de stabilisants thermiques. Les virus ajoutés à la solution aqueuse d'urokinase étaient le virus de la variole, le virus des oreillons, le virus de la stomatite vésiculaire, 1 virus chikungunya, le virus de l'encéphalite japonaise, le virus de l'hépatite B, le virus de la rubéole, le virus de la poliomyélite, le virus de la coxsackie et l'ehovirus. Le traitement thermique a été effectué à 600C pendant 10 heures, au cours desquelles on a déterminé le pouvoir infectieux résiduel à des intervalLes de temps déterminés. En 10 heures, le pouvoir infectieux es-t complètement perdu, qu'il y ait ou non un stabilisant thermique.Ces résultats suggèrent que la durée du traitement thermique conforme à l'invention exercera un traitement d'inactivation également sur d'autres virus que ceux utilisé dans les expériences ci-dessus. Ces résultats ressortent des exemples expérimentaux 2 et 3 ci-dessous. Exemple expérimental 2 Relation entre la stabilité de l'urokinase au traitement thermique et le pH; On ajoute une solution de tampon phosphate à diverses concentrations à une solution aqueuse d'urokinase (activité spécifique 15 000 UI/mg ; concentration en protéine : 0,02 % (P/V)) pour préparer des échantillons de solutions d'urokinase ayant des pH de 4, 5, 6, 7, 8, 9 et 10. On chauffe chacun des échantillons à 600C pendant 10 heures, et on compare les activités résiduelles. Après le traitement thermique, on élimine le stabilisant thermique par dialyse et on détermine l'activité d'urokinase pour calculer le rapport d'activité résiduelle en prenant l'activité spécifique avant le chauffage comme égal à 100 %.Comme le montre la Fig. 1, l'urokinase conserve 52 %, 65 % et 50 % des activités initiales au pH de 7, 8 et 9, respectivement, ce qui indique que l'ajustement de la solution aqueuse d'urokinase au pH dans l'intervalle de 6 à 8 est efficace. Exemple expérimental 3 Effet des stabilisants thermiques Dans cet exemple expérimental 3, on a comparé les flans aux autres, divers stabilisants thermiques du point de vue de l'effet stabilisant à la chaleur. Après le-traitement thermique, on a éliminé le stabilisant thermique par dialyse et on a déterminé le rapport d'activité résiduelle en prenant l'activité spécifique avant le traitement thermique comme éqal à 100 %. Les résultats obtenus sont donné dans le tableau 2. Les virus utilisés dans l'expérience étaient les mêmes que ceux décrits dans l'exemple expérimental 2.Dans le tableau 2, témoin (1)", correspond au cas où le stabilisant thermique était absent et où le pH était ajusté à 6,8 avec une solution de tampon au phosphate 0,1 S1, et "témoin (2)" correspond au cas où l'on n'a pas ajouté de solution tampon au phosphate et où par conséquent le pH n'a pas été ajusté. Les activités résiduelles de l'urokinase étaient de 65 à 75 %, 78 % et 79 % en présence de glycine, de lysine et d'arginine respectivement, de 75 à 78 %, 78 % et 71 à 75 % en présence de sucrose, de mannite, de chlorure de sodium , respectivement, et de 88 à 100 % en présence de gélatine, ce qui indique que toutes ces substances sont des stabilisants thermiques efficaces. Lorsque la solution d'urokinase aqueuse était ajustée à pH 6,8, l'urokinase conservait 65 % de son activité initiale en l'absence de stabilisant thermiaue, ce qui indique que l'ajustement de la solution d'urokinase à un pH de 6 à 8, est efficace pour stabiliser l'activité. TABLEAU 2 Stabilisant tberminue Rapport de pouvoir infec l'activité cieux et virus Concentra- résiduelle de Type tion, l'ucoxanase % % 5 65 Glycine 10 70 Aucun 15 75 Lysine 0,1 M 78 " Arginine 0,1 M 79 " 5 75 Sucrose 10 77 15 78 Mannite 5 73 " 10 73 0,15 M 71 Chlorure de sodium 0,3 M 75 TABLEAU 2 (suite) EDTA 0,1 23 Aucun 0,5 88 Gélatine 1,0 91 " 3,0 89 Témoin (1) - 65 " (urokinase seule) Témoin (2) (pas de solution - 0 " tampon) Les essais d'activité thrombolytique, de durée de demi-vie dans le sang après administration intra-veineuse, de stabilité, de toxicité, de dose d'administration et de mode d'administration in vitro et in vivo ont été effectués sur une urokinase ayant une masse moléculaire de 54 000 + 10 000. Les méthodes expérimentales et les résultats sont décrits ci-dessous. Exemple expérimental 4 Détermination de l'activité thrombolytique par la méthode de la boucle de Chandler L'urokinase purifiée est fractionnée en fractions présentant respectivement des masses moléculaires de 33 000 + 10 000 (33 000 pour la plus grande part), 54 000 + 10 000 (54 000 pour la plus grande part), et environ 100 000. On a trouvé que la fraction ayant une masse moléculaire d'environ 100 000 était présente en proportions très faibles et semblait être un produit associé à l'urokinase ayant une masse moléculaire de 54 000. La récupération de cette fraction dans l'urine est industriellement impossible.Chacune des fractions a été dissoute dans du sérum physiologique pour préparer les échantillons suivants de diverses puissances échantillon 1 : 187,75 UI/ml ; échantillon (2), 37,5 UI/ml ; échantillon (3) : 75,0 UI/ml ; échantillon (4), 150 UI/ml ; echantillon (5) : 300 UI/ml, et échantillon temoin (sérum physiologique). La puissance en unités internationales est déterminée par une méthode en deux stades in vitro, consistant à laisser agir la préparation d'urokinase essayée sur du plasminogène purifié utilise comme substrat, pour former de la plasmine, puis à décomposer le substrat secondaire de fibrine par action de la plasmine ainsi formée, et à calculer la puissance à partir du temps de dissolution de la fibrine (pharmaceuticals Research, 5 (3), 295-308 (1974)). Les relations entre les unités internationales et la plug unit habituellement utilisées (B.B.A., 24, 278-282 (1975)) est la suivante : 5 000 plug unit = 6 000 UI. La formation de thrombus et la détermination du rapport de dissolution ont été effectués de la façon suivante Dans un morceau de tube de plastique (3 mm de diamètre interne et 270 mm de long) on place îml de sang frais contenant 3,8 % d'un citrate et 0,1 ml d'une solution de chlorure de calcium 0,25 M. On scelle le tube aux deux extrémités de façon à former une boucle. On forme un thrombus en faisant tourner le tube scellé à 12 t/mn pendant 30 minutes a 370C. On injecte dans la boucle une des solutions d'échantillons d'urokinase ou d'échantillons témoins. On fait à nouveau tourner le tube à 12 t/mn pendant 4 heures à 370C. Le throus résiduel retiré du tube est fixé une nuit avec de la solution (préparée en mélangeant 75 ml d'une solution aqueuse saturée d'acide picrique, 25 ml de formol du commerce et 5 ml d'acide acétique glacial), et on détermine le poids de thrombus pour étudier la corrélation entre la puissance en unités internationales, la masse moléculaire et l'activité thrombolitique. L'activité thrombolitique de l'urokinase est exprimée en termes de rapport pondéral du poids moyen du thrombus et du groupe contenant l'urokinase au poids moven du thrombus du groupe témoin (groupe sérum physiologique). Ce rapport est désigné dans le présent mémoire sous le nom de "rapport thrombolitique (en *)" et il est indiqué dans le tableau 3. TABLEAU 3 RELATION ENTRE LA MASSE MOLECULAIRE DE L'UROKINASE ET LE RAPPORT THROMBOLITIQUE (%) Masse molé- Echan- Echan- Echan- Echan- Echanulaire de tillon tillon tillon tillon tillon l'urokinase (1) (2) (3) (4) (5) 100 000 0 2 62 82 80 54 000 0 1 63 83 81 33 000 O 0 1 13 65 72 Les résultats du tableau 3 montrent que l'urokinase ayant une masse moléculaire de 54 000 présente une excellente activité thrombolitique, tandis que l'urokinase ayant une masse moléculaire de 33 000 a une activité thrombolitique qui est inférieure à la moitié de celle de l'urokinase de masse moléculaire élevée. Bien que l'essai de l'activité thrombolitique par la méthode de la boucle Chandler soit effectuée in vitro, il est reconnu comme une méthode d'essai simple et commode, qui se rapproche le plus souvent des résultats de l'essai in vivo (J. Exp. Physiol., Vol. XLIV (4), 377-384 (1959) et on pense qu'il représente de façon suffisante le comportement d'une urokinase ayant une masse moléculaire de 54 000 + 10 000 utilisée dans la présente invention. Les résultats ci-dessus montrent ce fait surprenant que les préparations d'urokinase considérées jusqu'à présent comme ayant la même puissance, à l'essai par la méthode au tube à essai classique, par la méthode de revêtement ou par la méthode en deux stades (Pharmaceuticals Research, loc. cit.), présentent une activité thrombolitique très différente suivant la masse moléculaire de l'urokinase. Exemple expérimental 5 Essai thrombolitique in vivo (chez le rat) On a examiné sur des rats l'activité fibrinolitique de l'urokinase in vivo par la méthode de Y. Sasaki (Thrombosis Res., 9, 513 (1976) et R.N. Chakravart (Atherosclerosis, 21, 349 (1975)). Le fibrinogène humain a été marqué avec du 125I par la méthode de Greenwood et al. (Biochem. J., 89, 114 (1963)) pour préparer du fibrinogène 125 I-hymain. On a mélangé 4 ml d'une solution de fibinogène 125I-humain à 0,4 % avec 200 UI de thrombine humaine et on l'a laissée reposer pendant 60 mn environ à la température ambiante de façon à former de la fibrine. Après une élimination suffisante de l'eau avec du papier filtre, on a lavé soigneusement la fibrine avec du sérum physiologique sur un papier filtre. On a découpé le papier filtre portant la fibrine en petits morceaux, on l'a mélangé avec 4 ml de sérum physiologique et on l'a trituré suffisamment pour préparer une dispersion de fibrine 125I-humaine, d'un diamètre de particules de 5 à 10 microns. La teneur en fibrine de la dispersion était de 12 mg/ml sur la base du poids humide et la radio-activité du 125I était de 2,93 X 106 c.p.m. On a administré à des rats de souche Wistar (rats mâles pesant chacun 250 g), par la veine caudale, 1 ml de la dispersion puis 30 000 UI d'urokinase ayant une masse moléculaire de 54 000 ou de 33 000. Ensuite, à des intervalles de temps réguliers, on a recueilli à chaque fois, 0,3, 05 ml de sang dans l'artère carotide dans un tube à essai contenant une goutte d'une solution aprotinique (15 000 KIE/ml), une antiplasmine, et on l'a laissée reposer pendant 2 heures à la température ambiante. On a essayé une portion de 0,05 ml du sérum séparé du sang en ce qui concerne les produits de décomposition de la fibrine (PDF) en mesurant la radio-activité. Le pourcentage de formation de 125I-PDF dans le sang a été déterminé au cours du temps à partir de la valeur de la radio-activité par ml du sérum et de la proportion totale de sérum circulant (31,1 ml/kg) en prenant la radio-activité de la fibrine administrée comme étant égale à 100 %. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 4. TABLEAU 4 POURCENTAGE DE FORMATION DE 1251-PDF DANS LE SANG SUR LA BASE DE LA DOSE ADMINISTREE (30 000 UI D'UROKINASE PAR RAT ; INJECTION INTRAVEINEUSE Temps écoulé Urokinase de Urokinase de Sérum apres l'adminis- masse moléculairé faible masse mol physiologique tration, - élevée (m.mol. (masse mol. minute 54 000) 33 ooo) 2)4 o 2J5 2Z4 294 15 27,5 15,6 5,3 30 3893 23,2 6,8 j 45 18,2 1651 9,7 60 20,7 13,2 15,2 75 16,5 16,9 1,0 Le tableau 4 montre qu'une urokinase de masse moléculaire élevée produit une PDF de façon plus précoce qu'une urokinase de faible masse moléculaire, et tant la vitesse de décomposition de la fibrine que la quantité de PDF produite sont plus élevées dans le cas de la première urokinase. Les résultats ci-dessus montrent qu'une urokinase de masse moléculaire élevée présentent in vivo une activité fibrinolytique supérieure et une activité thrombolytique supérieure. Exemple expérimental 6 Influence de la masse moléculaire sur l'atténuation de l'urokinase administrée dans le sang : 125 On a marqué avec du I des préparations d'urokinase ayant des masses moléculaires différentes par la méthode de Greenwood et al (Biochem. J., 89, 114 (1963)). On a administré les urokinases marquées par injection intraveineuse aux groupes d'animaux d'essais et on a comparé l'atténuation de l'urokinase dans le sang. Les urokinases d'une masse moléculaire de 54 000 (urokinase de masse moléculaire élevée ; activité specifique, 100 000 UI/mg de protéine) et 33 000 (urokinase de faible masse moléculaire ; activité spécifique 16Q 000 UI/mg de protéine) ont été marquées avec 1251 avec la méthode à la chloramine T (Biochem. J. 89, 114 (1963)). Les radio-activités spécifiques étaient de 1,28 X 107 c.p.m./mg de protéine pour la première et de 2,24 X 107 c.p.m./mg de protéine pour la dernière. Les animaux d'essais utilisés étaient trois beagles (mâle, pesant chacun 12 à 15 kg) par groupe. La dose d'administration était de 1 000 UI/kg dans les deux cas des urokinases de masse moléculaire élevée et de faible masse moléculaire, et toutes deux ont été administrées par la veine carotide. A des intervalles de temps réguliers après l'administration, on a recueilli dans chaque cas, 5 ml de sang dans la veine de la patte avant, en utilisant une seringue contenant 0,5 ml d'une solution de citrate de sodium à 3,8 %. On a sépare le plasma du sang par centrifugation-et on en a déterminé la radio-acivité avec un compteur à scintillation (Packard Cc). Les résultats obtenus sont donnés à la Fig. 2. La courbe d'atténuation H de l'urokinase de masse moléculaire elevée dans le sang évolue plus lentement que la courbe L de l'urokînase de faible masse moléculaire, le temps de demi-vie de la première urokinase étant double de celui de la dernière. Exemple expérimental 7 Masse moléculaire et stabilité de l'activité enzymatique En utilisan-t de l'urokinase du commerce, on a examine les relations entre la masse moléculaire et la stabilité de l'activité enzymatique. L'urokinase du commerce a été fractionnée en fractions de masse moléculaire 20 000, 33 000, 54 000 et 100 000 par filtration sur gel (Sephadex G-75 ; une solution de tampon au phosphate 70 mM à pH 8,0 ; colonne de 2,6 X 80 cm). Chaque fraction a été ajustée à 10 000 UI/ml (solution aqueuse), conservée 40C ou -100C, et on a examiné la variation de l'activité avec le temps. Le tableau 5 montre le temps nécessaire pour atteindre une activité résiduelle de 50 %. De l'expérience ci-dessus, on déduit que la stabilité d'urokinase ayant une masse moléculaire de 54 000, est environ triple de celle de l'urokinase de faible masse moléculaire. TABLEAU V TEMPS ECOULE JUSQU'A OBTENTION D'UNE ACTIVITE RESIDUELLE DE 50 % Masse molé culaire 20 000 33 000 54 000 100 000 Teppérature de stockage 40C i jour 5 jours 15 jours 11,5 jours -10 C 2,5 jours 6 jours 10 jours 20 jours Exemple expérimental 8 Essai de toxicité Pour l'essai de toxicité, on a utilisé cinq souris et cinq cobayes (pesant chacun environ 20 g, bien nourris et en bonne santé).On a dissous de l'urokinase de masse moléculaire élevée ayant une masse moléculaire de 54 000 (15 000 UI) dans 25 ml d'eau pour ltinjection. On a administré à chaque souris et à chaque cobaye, par voie sous-cutanée, respectivement 0,5 ml et 5 ml de la solution d'urokinase ci-dessus. Sept jours après l'administration, on n'a observé aucun cas mortel. Dans ce cas, la quantite d'urokinase à administrer était respectivement de 300 UI pour une souris et de 3 000 UI pour un cobaye. Pour l'utilisation clinique de la préparation de l'invention, on dissout 50 à 30 000 UI de la préparation d'urokinase de l'invention dans 0,5 à 5 ml d'eau pour l'injection (Pharmacopée Japonaise) et on les administre, en tenant un compte approprié de l'âge, des symptômes, des progrès de la maladie, par injection intraveineuse, percolation intraveineuse, injection goutte à goutte, injection subconjonctive ou injection rétrobulbaire. La préparation trhombolytique de l'invention contenant comme ingrédient principal de l'urokinase d'une masse moléculaire de 54 000 + 10 000 est une préparation ayant une masse moléculaire uniforme, une ecellente aptitude à la conservation et une activité thrombolytique élevée, ce qui permet de la mélanger et de standardiser la dose. En outre, la préparation thrombolytique de l'invention présente un effet thrombolytique suffisant à un taux de dosage de faible puissance. Ainsi, la présente invention fournit une préparation pharmaceutique utilisable dans le domaine thérapeutique. Les exemples suivants sont donnés a titre d'illus tration supplémentaire de l'invention. Exemple 1 On ajuste à pH 7,2, de l'urine fraîche recueillie sur des mâles adultes. On introduit 5 1 de l'urine ajustée au sommet d'une colonne garnie de 50 ml de L-arginine-agarose (mise en equilibre avec une solution de chlorure de sodium à 2 % a pH 7,2) pour faire adsorber l'urokinase sur la colonne. On lave la colonne avec 100 ml d'une solution de chlorure de sodium à 2 % à pH 7,5, et on élue l'urokinase avec un courant descendant de 50 ml d'une solution 1M de chlorure de sodium à pH 6,0. On concentre l'éluat à environ 10 ml et on l'introduit dans une colonne de 2,6 X 80 cm, garnie de Séphadex G-75 (Pharmarcia Co ; mise en équilibre avec une solution de tampon phosphate 70 mM à pH 8,0) et on le soumet à une filtration sur gel à un débit de 20 ml/h, en utilisant la même solution tampon que pour la mise en équilibre. On recueille le filtrat par portions de 0,5 ml et on recueille les fractions contenant de l'urokinase ayant une masse moléculaire de 54 000 + 10 000. On analyse la solution aqueuse recueillie contenant de l'urokinase par la méthode simplifiée pour la détermination de la masse moléculaire par électrophorèse SDS sur gel de polyacrylamide (Colowick Kaplan, Method in Enzymology, 26, 3 (1972)).La masse moléculaire est confirmée par un pic unique correspondant à celui de l'echan- tillon d'urokinase témoin de masse moléculaire d'environ 54 000. On dialyse la solution aqueuse contre du sérum physiologique et on la lyophilise pour obtenir un échantillon d'urokinase ayant une activité spécifique de 17 000 UI/mg. Exemple 2 On dissout l'urokinase (activité spécifique 17 000 UI/mg) obtenue à l'exemple 1 dans une solution de tampon au phosphate 0,05 M à pH 7,0 pour obtenir 20 litres d'une solution aqueuse d'urokinase (3 000 UI/ml; teneur en protéine : 0,02 % (P/V)). On chauffe la solution à 600C pendant 10 heures, puis on la refroidit brusquement dans de l'eau glacée et on la filtre à travers un filtre bactériologique. On divise le filtrat en portions de 2 ml et on le lyophilise pour obtenir une préparation d'urokinase dont les virus sont inactivés. Exemple 3 A 5 1 d'une solution aqueuse dlurokinase (10 000 UI/ml; teneur en protéine 2,5 % (P/V)) préparée en dissolvant de l'urokinase brute (activité spécifique 400 UI/mg) dans une solution de tampon au phosphate 0,1 M pH 6,8, on ajoute 0,3M de chlorure de sodium dissout dans la même solution tampon que précédemment. On agite suffisamment la solution obtenue, puis on la chauffe à 600C pendant 6 heures. On dialyse la solution ainsi traitée contre une solution de chlorure de sodium 0,0075 M à pH 7,0 à travers un tube à dialyse fabriqué par la Visking Co. On introduit la solution aqueuse dialysée dans une colonne garnie de 1 kg de bentonite en poudre mise en équilibre avec une solution aqueuse 0,0075 M de chlorure de sodium à pH 7,0.L'urokinase est adsorbée sur la bentonite tandis que les impuretés traversent la colonne sans être adsorbées. On lave les impuretés adhérant à la bentonite avec une solution de chlorure de sodium 0,1 M à pH 9,0, On élue l'urokinase avec une solution aqueuse à 2,0 %-P/V) de lactate de 6,9-diamino-2-éthoxyacridine hydrate. La solution d'urokinase obtenue contient environ 70 % de l'urokinase initialement présente dans le produit de départ et sa pureté est de 11 000 UI/mg. Après avoir été dialysée contre du sérum physiologique, la solution d'urokinase est filtrée à travers un filtre bactériologique, elle est divisée en portions.de 2 ml et elle est lyophilisée de façon à obtenir une préparation d'urokinase dont les virus sont inactivés. La solution aqueuse d'urokinase recueillie ci-dessus a été analysée par la méthode simplifiée pour la détermination de la masse moléculaire par électrophorèse SDS sur gel de polyacrylamide (Colowick-Kaplan, Method in Enzymology, 26, 3 (1972)). La masse moléculaire est confirmée par un pic unique correspondant à celui de l'échantillon témoin d'urokinase ayant une masse moléculaire d'environ 54 000. REVENDICATIONS 1. Procécé de production d'une préparation thrombolytique, caractérisé en ce que parmi les conditions de traitement de la production de lurokinase, le pH est maintenu dans le domaine neutre ou faiblement alkalin sur toute la durée de chaque stade du traitement pour produire une préparation thrombolytique contenant de l'urokinase ayant une masse moléculaire de 54.000 + 10.000 comme ingrédient principal. 2. Procédé de production d'une préparation thrombolytique suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le pH condition de traitement est maintenu dans le domaine de 5,5 à 12 pendant toute la durée de chaque stade du traitement dans la production de l'urokinase. 3. Procédé de production d'une préparation thrombolytique suivant la revendication 1, caractérisé en ce que parmi les conditions de traitement au stade de la dialyse pour éliminer les sels dans la production de l'urokinase, le pH est maintenu dans l'intervalle de 5,5 à 12. 4, Procédé de production d'une préparation thrombolytique suivant la revendication 1, caractérisé en ce que dans le stade de traitement thermique de la production de l'urokinase, la solution aqueuse contenant de l'urokinase est ajustée à un pH de 6 à 8 avec une solution tampon, puis soumis au traitement thermique pour inactiver les virus. 5. Procédé de production d'une préparation thrombolytique suivant la revendication 4, caractérisé en ce qu'on ajoute un stabilisant thermique de l'urokinase à la solution aqueuse contenant de l'urokinase. 6. Procédé de production d'une préparation thrombolytique suivant la revendication 5, caractérisé en que le stabilisant thermique est choisi parmi les amino-acides, les saccharides, les sels neutres et les protéines. 7. Procédé de production d'une préparation thrombolytique suivant la revendication 5, caractérisé en ce que le stabilisant thermique est la glycine, la lysine, l'arginine, le sucrose, la mannite, le chlorure de sodium1 ou la gélatine.