Brevet FR2459287A1 — publié le 19810109

2459287? La présente invention concerne un procédé pour pro- duire de l'acide L-glutamique par fermentation. Dans les procédés connus de production d'acide L-glutamique par fermentation, pour obtenir le meilleur rendement, on doit ajuster la quantité de L-biotine du milieu de fermentation dans une gamme très étroite. Cependant, les mélasses de betterave ou de canne à sucre qui constituent des sources de carbone de prix raison- nable, contiennent des quantités très importantes de biotine et un milieu de fermentation contenant de telles mélasses contient inévi- tablement un excès de biotine. Pour éviter l'effet indésirable de l'excès de biotine sur la production de l'acide L-glutamique, dans les procédés connus on ajoute des agents tensioactifs ou des anti- biotiques au milieu de fermentation lorsqu'il contient un excès de biotine. La demanderesse a découvert que des mutants du genre Brevibacterium ou Corynebacterium qui résistent à un composé ayant une activité de vitamine P (qu'on appelle ci-après composé de type vitamine P) produisent de l'acide L-glutamique avec un rendement remarquablement élevé même lorsqu'on les cultive sans addition d'agents tensioactifs ou d'antibiotiques dans un milieu de fermentation contenant un excès de biotine. Le procédé de l'invention, pour produire de l'acide L-glutamique, consiste à cultiver dans un milieu de culture aqueux, un mutant du genre Brevibacterium ou Corynebacterium qui résiste à un composé de type vitamine P et à recueillir l'acide L-glutamique accumulé dans le liquide de culture obtenu. Les modes de réalisation préférés de l'invention vont maintenant &tre décrits. On peut citer comme exemples de mutants utilisés dans le procédé de l'invention: Brevibacterium flavum A 11355 (FERM-P 5007, NRRL B-12128) (Esculétine) Brevibacterium flavum-AJ 11356 (FERM-P 5008, NRRL B-12129) (Coumarine) :Y.......2459287 Brevibacterium flavum AJ 11357 (FERM-P 5009, NRRL B-12130) (Dicoumarol) Brevibacterium lactofermentum AJ 11360 i. r,, (FERM-P 5012, NMI B-12133 (Esculétine) !:. Brevibacterium lactofermentum AJ 11361 :::.; (FERM-P 5013, NRRL B-12134) (Coumarine) Brevibacterium lactofermentum AJ 11362 (FERM-P 5014 NRRL B-12135) !i,'i,. -.(Dicoumarol) Corynebacterium glutamicum AJ 11365 (FERM-P 5017, NRRL B-12138) (Esculmtine) .lO BCorynebacterium glutamicum AJ 11366 (FERM-P 5018, NRRL B-12139) e i '... (Coumarine) Corynebacterium glutamicum AJ 11367 'r 20 (FERM-P 5019 NRRL B-12140) (Dicoumarol) Les mutants de type Brevibacterium flavum, Brevi- bacterium lactofermentum et Corynebacterium glutamicum dérivent .:. respectivement des souches parentes suivantes: Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 et Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. On peut utiliser comne souches :.;. Les mparentes Brevibacterium divaricatum ATCC 14020, Brevibacterium ÉtiYSaccharoliticum ATCC 14066, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 et d'autres bactéries productrices d'acide glutamique appartenant aux genres Corynebacterium et Brevibacterium. ,,,:4 On peut provoquer la mutation des souches parentes pour obtenir les mutants de l'invention de façon classique par exemple par irradiation par les rayons ultraviolets ou les rayons X ou expo- sition à l'action d'un agent mutagène. Par exemple on peut, pour ::y!.. :. . i.W.: ]:,,w,,; 245928?7 provoquer la mutation de la souche parente, l'exposer à l'action de 250, ug/ml de N-nitro N'-méthyl N-nitrosoguanidine à 30 C pendant minutes. On peut citer comme exemples de composés de type vitamine P l'acénocoumarine, l'apiine, le coumétarol, le cyclo- coumarol, le dicoumarol, la diosmétine, l'esculétine, l'esculine, le bis-coumacétate d'éthyle, l'éthylidène-3,3' bis-hydroxy-4 cou- marine, l'hespérétine, l'hespéridine, le morin, la naringénine, la phenprocoumone, la quercétine, la querciméritrine, la robinine, la rutine, la scoparone, la skimmine, l'umbelliférone et la war- farine. Un mutant qui résiste à un des composés de type vitamine P résiste généralement aux autres composés de type vita- mine P. Le mutant résistant aux composés de type vitamine P est capable de se développer sur un milieu gélosé contenant une quantité de composé de type vitamine P inhibant le développement de la souche parente. On détermine la résistance à un composé de type vitamine P de la façon suivante: pour préparer un milieu gélosé à pH 7,0, on ajoute la quantité de composé de type vitamine P indi- quée dans le tableau -I ci-après à un milieu de base contenant par décilitre, 3,6 g de glucose, 0,1 g de phosphate monopotassique, 0,1 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 1 mg de sulfate fer- reux heptahydraté, 1 mg de sulfate de manganèse tétrahydraté, 1 g d'urée, 10,0}g de biotine, 20,0 pg de chlorhydrate de thiamine et 2 g de gélose et on coule dans une cuvette en verre peu profonde de 10 cm de longueur, 5 cm de largeur et 3 cm de hauteur munie d'un couvercle de verre. Après stérilisation par chauffage, on met la cuvette en position inclinée pour obtenir un milieu incliné. On coule le milieu de base sur le milieu incliné et on place la cuvette horizontalement pour obtenir ainsi une boite à gradient de concen- tration. On ensemence, en stries rectilignes de l'extrémité à concentration élevée en composé de type vitamine P de la botte vers l'extrémité à concentration plus faible, chaque micro-organisme A étudier que l'on a préalablement cultivé sur un milieu incliné à pH 7,0 contenant 1 g/dl de peptone, 1 g/dl d'extrait de levure, y et 0,5 g/dl de chlorure de sodium pendant 24 heures. La longueur de la bande de développement, sur la boîte, d'un micro-organisme résistant à un composé de type vitamine P est supérieure à celle d'un micro-organisme sensible à ce composé de type vitamine P. On mesure les longueurs des bandes de croissance des micro-organismes étudiés; les résultats figurent dans le tableau I ci-après. . On cultive de façon classique les mutants résistant au composé de type vitamine P pour produire de l'acide L-glutamique. On effectue la culture en conditions aérobies à une température I; a' k, comprise entre 30 et 40 C. Mume lorsqu'on cultive les mutants de l'invention dans ?,. un milieucontenant un excès de biotine (5 à 1 000 g/1) sans addi- tion d'agent tensioactif ou d'antibiotique, ils produisent de et15l'acide L-glutamique avec des rendements très élevés. d'un miOn peut récupérer de façon classique l'acide L-gluta- mique qui-s'est ainsi accumulé dans les liquides de culture obtenus. - desic gL'invention est illustrée par lesa exemples non limi- : ' tatifs suivants. Exemple 1 On prétpare un milieu de culture aqueux contenant par . décilitre, 10 g (en glucose) de mélasse de. canne à sucre, 0,1 g de phosphate monopotassique, 0,05 g de sulfate de magnésium heptahy- draté, 0 001t g de sulfate ferreux heptahydraté, 0001 g de sulfate de manganèse tétrahydraté, 10,0 pg de chlorhydrate de thiamine À...>et 1 ml d'hydrolysat acide de protéines de soja, on ajuste le ph à 7,0 et on place des portions de 5 ml de milieu de culture dans des a..- - uflacons à agitation de 500 ml et on stérilise. On ensemence chacun des milieux avec un des micro- organismes indiqués dans le tableau II ci-après et on maintient à -,', ' 35 C en agitant pendant la culture en ajoutant de petites portions l'acide solution d'urée à 40 g/dl au milieu pour maintenir le pH entre 6, 5 et 8,0. Après 36 heures on arrête la culture et on détermine le "f tqrendement () d'acide L-glutamique accumulé dans le liquide de cul- ture obtenu par rapport au sucre utilisé. Les résultats figurent dans le tableau II ci-après. Exemple 2 On prépare un milieu de culture contenant par déci- litre, 3,6 g de glucose, 0,2 g d'urée, 0,1 g de phosphate monopo- tassique, 0,04 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,001 g de sulfate ferreux heptahydraté, 0,001 g de sulfate de manganèse tétrahydraté, 1 ml d'hydrolysat acide de protéines de soja, 10,O0 g de chlorhydrate de thiamine et la quantité de biotine indiquée dans le tableau III ci-après et on introduit des portions de 20 ml de milieu de culture dans des flacons à agitation de 500 ml et on stérilise par chauffage. On ensemence les milieux de culture avec les micro- organismes indiqués dans le tableau III ci-après et on cultive à C en agitant. Pendant la culture, on ajoute au milieu de culture de petites portions de solution d'urée à 45 g/dl pour maintenir le pH entre 6,5 et 8,0. On poursuit la culture pendant 24 heures et on déter- mine le rendement en acide L-glutamique accumulé dans le liquide de culture obtenu. Les résultats figurent dans le tableau III ci-après. Exemple 3 On prépare un milieu de culture contenant par décilitre g (en glucose) de.mélasse de betterave, 0,1 g de phosphate mono- potassique, 0,04 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,001 g de sulfate ferreux heptahydraté, 10,0 pg de chlorhydrate de thiamine et 0, 001 ml d'agent antimousse et on introduit des portions de 300 ml de milieu de culture dans des fermenteurs de 1 litre. On cultive en aérobiose dans le milieu à 37 0 les micro-organismes indiqués dans le tableau IV ci-après. On introduit de l'ammoniac gazeux dans les fermenteurs de façon à maintenir le plH à 7,8. Apres 24 heures de culture, on détermine les rendements en acide L-glutamique accumulé dans le liquide de culture obtenu; les résultats figurent dans le tableau IV ci-après. Exemple 4 On prépare un milieu de culture contenant par déci- litre, 1 g d'acétate d'ammonium, 1 g d'acétate de sodium, 0,1 g de phosphate monopotassique, 0,04 g de sulfate de magnésium heptahy- draté, 0,001 g de sulfate ferreux heptahydraté, 0,001 g de sulfate de manganèse heptahydraté, 0,5 ml d'hydrolysat acide de protéines ô- 2459287 de soja, 20,0 ug de chlorhydrate de thiamine et O, 1ug ou 10,0 ug de biotine, on introduit des portions de 20 ml de milieu de culture dans des flacons à agitation de 500 ml et on stérilise par chauffage. On ensemence les milieux de culture avec les micro- 5 organismes indiqués dans le tableau V ci-après et on cultive à 35 C À* pendant 24 heures en agitant. On détermine les rendements en acide :,4 Lglutamique accumulé dans les liquides de culture obtenus; les ?. résultats figurent dans le tableau V ci-après. 2 Exemple 5 On prépare un milieu de culture contenant par déci- :;'X litre 10 g (en glucose) de sucre brut, 0,1 g de phosphate monopo- tassique, 0,04 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,001 g de -. sulfate ferreux heptahydraté, 0,001 g de sulfate de manganèse tétra- hydraté, 0,5 g d'urée, 0,5 ml d'hydrolysat acide de protéines de ó soja, 10 pg de chlorhydrate de thiamine et 10 pg de biotine et on !"" place des portions de 20 ml de milieu de culture dans des flacons à agitation de 500 mi. Apres stérilisation, on ensemence chaque lot É.;'?' de milieu de culture avec un micro-organisme indiqué dans le ta- l:r Adbleau VI ci-après. On cultive à 35 C en agitant. Pendant la culture on ajuste le pH entre 6,5 et 8,0 avec une solution d'urée à 40 g/dl. Apres 36 heures de culture, on détermine les quantités ô-t d'acide L-glutamique accumulées dans les liquides de culture obtenus. Les rendements en acide L-glutamique par rapport au sucre utilisé figurent dans le tableau VI ci-après. %, ^ 25 Exemple 6 :;j+:'- On prépare un milieu de culture contenant par déci- litre 3,6 g (en glucose) de mélasse de canne à sucre, 0,1 g de phos- phate monopotassique, 0,04 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,001 g de sulfate ferreux heptahydraté, 0,001 g de sulfate de man- ganèse tétrahydraté, 10 ug de chlorhydrate de thiamine et 0,5 ml r ' d'hydrolysat acide de protéines de soja et on introduit des portions s; de 20 ml du milieu de culture dans des flacons à agitation de 500 ml et on stérilise par chauffage. a.., On ensemence chaque lot de milieu avec un des micro- organismes indiqués dans le tableau VII ci-après et on maintient à ?,i,, 31,5 C, 35 C ou 37 C en agitant. Pendant la culture on ajuste le :_::! pH entre 6,5 et 8,0 avec une solution d'urée à 40 g/dl. 245928-7 Après 24 heures de culture, on détermine les rende- ments en acide L-glutamique par rapport au sucre utilisé; les résultats figurent dans le tableau VII ci-après. Bien entendu diverses modifications peuvent Etre apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limita- tifs sans sortir du cadre de l'invention. TABLEAU I N Na Co n ce Micro-organismes étudiés Composé de type vitamine P contenu Degré de résistance (longueur de dans la couche inférieure de la botte la bande (cm)) Mutant Parent Composé Concentration Mutant Parent (g/dl) AJ 11355 ATCC 14067 Esculétine 0,5 7,5 3,2 AJ 11356 " Coumarine 1,0 8,0 4,0 AJ 11357 " Dicoumarol 1,0 6,2 3,3 AJ 11360 ATCC 13869 Esculétine 0,5 6,6 3,3 AJ 11361 " Coumarine 1,0 7,6 4,2 AJ 11362 " Dicoumarol 1,0O 7,0 3,6 AJ 11365 ATCC 13032 Esculétine 0,5 7,8 3,5 AJ 11366 " Coumarine 1,0 7,7 2, 8 AJ 11367 " Dicoumarol 1,0 7,2 4,1 o0 1,,, ,, - e - -;: -, _e_ ----e -_ - : '-', e, -i i jI-- -, ê. - f;,,, - --- --, ij _1_1-. I 1.. - ' ' -'I'. 1..1 1 245928? TABLEAU II Rendement en acide L-glutamique 1%.) AJ 11355 25 AJ 11356 20 AJ 11357 32 ATCC 14067 5 AJ 11360 33 AJ 11361 29 AJ 11362 31 ATCC 13869 6 AJ 11365 18 AJ 11366 30 AJ 11367 30 ATCC 13032 5 TABLEAU III Rendement en acide L-glutamique (7.) Micro-organismes Micro-organismes Biottne ajoutée (}g/1) 2 20 200 AJ 11355 46 48 50 AJ 11356 40 40 51 AJ 11357 42 41 48 ATCC 14067 45 2 0 AJ 11360 46 47 45 AJ 11361 49 48 50 AJ 11362 50 53 48 ATCC 13869 43 3 0 AJ 11365 52 53 49 AJ 11366 '50 53 48 AJ 11367 52 53 53 ATCC 13032 47 4 0 TABLEAU IV TABLEAU V Micro-organismes Rendement en acide L-glutamique (%) AJ 11355 35 AJ 11361 40 Rendement en acide L-glutamique (%) Micro-organismes Biotine ajoute au milieu (pg/dl) 0,1 10,0 ATCC 14067 46 4 AJ 11355 45 50 TABLEAU VI Micro-organismes Rendement en acide L-glutamique (_) AJ 11355 32 AJ 11356 35 AJ 11357 41 ATCC 14067 5 AJ 11360- 33 AJ 11361 41 AJ 11362 40 ATCC 13869 6 AJ 11365 29 AJ 11366 25 - AJ 11367 30 ATCC 13032 5 TABLEAU VII Rendement en acide L-glutamique (%) Micro-organismes Température de culture ( C) 31,5 35 37 AJ 11360 28 34 37 AJ 11366 26 31 34 R E V E N D I C A T I ONS 1. Procédé pour préparer de l'acide L-glutamique par fermentation, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver en aéro- biose, dans un milieu de culture aqueux, un mutant du genre Brevi- bactérium ou Corynebacterium résistant à un composé ayant une activité de vitamine P et à récupérer l'acide L-glutamique accumulé dans le liquide de culture obtenu. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé ayant une activité de vitamine P est l'esculétine, la coumarine ou le dicoumarol. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mutant est Brevibacterium flavum NRRL B-12128, Brevibacterium flavum NRRL B-12129, Brevibacterium flavum NRRL B-12130, Brevi- bacterium lactofermentum NRRL B-12133, Brevibacterium lactofermen- tum NRRL B-12134, Brevibacterium lactofermentum NRRL B-12135, Corynebacterium glutamicum NRRL B-12138, Corynebacterium glutamicum NRRL B-12139, ou Corynebacterium glutamicum NRRL B-12140.