Brevet FR2413465A1 — publié le 19790727

La présente invention concerne un procédé de produc tion d'acide L-glutamique par fermentation. La demanderesse a découvert selon l'invention d'excellents mutants producteurs d'acide L-glutamique appartenant au genre Brevi bacterium ou Corynebacterium, qui sont résistants à l'acide fluorocitrique, à l'acide cétomalonique, à l'acide &alpha;-amino-ss-hydroxy-valérianique, à l'acide thréonine-hydroxamique, à l'acide 2-amino-3-phospho-propionique ou à l'acide 5-smino-lévulinique. L'invention concerne un procédé pour la production d'acide L-glutamique par fermentation, qui consiste à cultiver-un mutant producteur d'acide L-glutamique du genre Brevibacterium ou Corynebacterium et résistant à l'acide fluorocitrique, à l'acide cétomalonique, à acide &alpha;-amino-ss-hydroxy-valérianique, à l'acide thréonine-hydroxamique, à l'acide 2-amino-3-phospho-propionique ou à l'acide 5-amino-lévulinique, dans un milieu de culture et à recueillir l'acide L-glutamique accumulé dans le milieu de culture. Des exemples des mutants utilisés selon l'invention sont les suivants Brevibacterium lactofermentum AJ 11211 (FERM-P 4312) (résistant à l'acide fluorocitrique) Brevibacterium lactofermentum AJ 11212 (PERM-P 4313) (résistant à l'acide cétomalonique) Brevibacterium lactofermentum AJ 11213 (FERM-P 4314) (résistant à l'acide a-amino-B-hydroxy-vaIérianique) Brevibacterium lactofermentum AJ 11214 (FERM-P 4315) (résistant à l'acide DL- thréonine-hydroxamique) Brevibacterium lactofermentum AJ 11215 (FERM-P 4316) (résistant à l'acide 2-amino-3-phospho-propionique) Brevibacterium lactofermentum AJ 11216 (FERx-P 4317) (résistant à l'acide 5-amino-lévulinique) Brevibacterium flavum AJ 11217 (FERM-P 4318) (résistant à l'acide cétomalonique) Corynebacterium glutamicum AJ 11218 (FERM-P 4319) (résistant à l'acide cétomalonique) Les numéros FERM-P sont les numéros d'inscription des organismes au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministre of International Trade and Industry, à 2-go, 5-ban, 5-chome, Inagehigashi, Chiba-shi, Japon. Les mutants mentionnés ci-dessus sont dérivés des souches mères du genre Brevibacterium ou Corynebacterium qui sont capables de produire l'acide L-glutamique. Des échantillons des souches mères sont Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium divaricatum ATCC 14020, Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066, Corynebacterium glutamicum (Micrococcus glutamicus) ATCC 13032 et Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870. Les moyens utilisés pour induire les mutants selon ltin- vention à partir de la souche mère sont des moyens classiques, tels que l'exposition de la souche mère à 2000 y/ml de N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine à 0 C pendant 20 min. Les résultats expérimentaux concernant la résistance des mutants aux substances chimiques respectives sont indiqués dans les tableaux I et II ci-après. La croissance relative indiquée dans les tableaux I et II est déterminée de la manière suivante. Les micro-organismes sont préalablement cultivés pendant 24 h à 300C sur des tranches de gélose à pH 7,0 contenant 1 g/dl de peptone, 1 g/dl d'extrait de levure et 0,5 g/dl de NaCl et les cellules sur les tranches sont mises en suspension dans l'eau stérilisée. On transfère chaque suspension dans le milieu de culture à pH 7,0 contenant 0,5 g/dl de glucose, 0,15 g/dl d'urée, 0,15 g/dl de (NH4)2804, 0,3 g/dl de KH2P04, 0,1 g/dl de K2HP04, 0,01 g/dl-de MgS04,7H20, 0,1 mg/dl de CaC12,2H20, 10/ug/dl de thiamine-HCl, 3,ug/dl de biotine, 0,44 mg/dl de Na2B407,10H20, 4,85 mg/dl de FeC12,6H20, 1,95 mg/dl de CuS04,5H20, 0,185 mg/dl de (NH4)6Mo7024,4H20, 44 mg/dl de ZnS04,7H20, 0,36 mg/dl de MnC12,4H20 et les quantités d'acide fluorocitrique, cétomalonique, &alpha;;-amino-ss-hydroxy-valérianique, DL-thréonine-hydroxamique, 2 amino-3 -phospho-propionique ou 5-amino-lévulinique indiquées dans les tableaux I et II ci-après. Après 24 h de culture à 300C, on détermine la croissance en mesurant la densité optique du milieu de culture aqueux. Pour produire l'acide L-glutamique avec les mutants, on peut utiliser n'importe quelle technique utilisée pour la production d'acide L-glutamique. Les milieux de culture comprennent n'importe quels milieux de culture classiques contenant des sources de carbone, des sources d'azote, des sels inorganiques et, si nécessaire, d'autres substances nutritives organiques mineures, telles que vitamines et aminoacides. Les sources de carbone sont, par exemple, les hydrates de carbone, tels que mélasses de betterave ou de canne et hydrolysat d'amidon, acides organiques tels qu'acide acétique et alcools tels qutéthanol. Les sources d'azote sont, par exemple, l'ammoniac gazeux, l'ammoniaque aqueuse, les sels d'ammonium et l'urée. Comme il est bien connu de l'homme de l'art, lorsquele milieu de culture contient de trop grandes quantités de biotine pour la production d'acide L-glutamique, on ajoute au milieu une substance supprimant la biotine, telle que monopalmitate de polyoxyéthylènesorbitanne et pénicilline. On effectue la culture en conditions'aérobies à une température de 24 à 370C en maintenant le milieu à pH 6-9. L'acide L-glutamique accumulé dans le bouillon de-culture résultant peut entre recueilli par des techniques connues, comme celles utilisant une résine échangeuse d'ions. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 On place dans des flacons de 500 ml sur une secoueuse des lots de 20 ml d'un milieu de culture à pH 7,0 contenant 10 g/d1 de glucose, 0,1 g de KH2PO4, 0,1 g/dl de MgS04.7H20, 20 /ug/dl de thiamine,-HCl, 36 mg (en azote total)/dl d'hydrolysat de protéines de soja, 2,0 g/dl de (NH4)2S04, 1 mgldl de FeSO4, 7H2O, 1 mg/dl de MnSO4.4H2O et 3 /ug/l de biotine et on les stérilise à 1150C pendant 10 min. On inocule chaque lot du milieu avec le micro-organisme indiqué dans le tableau III ci-après et on agite à 31,50C. On ajoute au milieu de culture 5 g/dl de CaCO3 pour le maintenir à pH 6,5-8,0. Après 24 h de culture, on ajoute au milieu 2,5 g/dl de sulfate d'ammonium et on cultive pendant encore 22 h. L'acide L-glutamique est produit dans les bouillons de culture résultants avec les rendements pondéraux indiqués dans le tableau III ci-après. EXEMPLE 2 On place dans des flacons de 500 ml sur une secoueuse dés échantillons de 30 ml d'un milieu de culture à pH 7,0 contenant 10 mg/mlde sucre de mélasse de betteraves et 1 mg/ml de KH2PO4 et on les stérilise à 115 C pendant 10 min. On inocule le milieu avec les micro-organismes énumérés dans le tableau IV ci-après et on cultive à 31,50C en culture agitée, en ajoutant de petites portions de solution d'urée à 400 mg/ml pour maintenir le pH à 6,5-8,0. Lorsque la densité optique à 562 m du milieu de culture à la dilution 26 x atteint 0,3, on ajoute 4 mg/ml de monopalmitate de polyoxyéthylènesorbitanne. Après 30 h de culture, on obtient les rendements en acide L-glutamine indiqués dans le tableau IV ci-après. EXEMPLE 3 On prépare un milieu de culture aqueux contenant 1,0 g/dl d'acétate d'a Lonium, 1,0 g/dl d'acétate de sodium, 0,2 g/dl de KH2PO4, 0,08 g/dl de MgSO4, 7H2O, 2 mg/dl de FeS04,7H20, 1 mg/dl de MnSO4,4H2O, 36 mg/dl (azote-formol) d'hydrolysat de protéines de soja, 20 #/dl de thiamine-HCl et 0,06 r/dl de biotine et on ajuste à pH 8,0 par KOH. On place des échantillons de 30 ml du milieu de culture aqueux dans des flacons de 500 ml sur une secoueuse et on chauffe à 115 C pendant 10 min. On inocule chaque échantillon du milieu avec l'un des micro-organismes énumérés dans le tableau V ci-après et on le maintient à 31,50C en agitant.Lorsque la concentration d'acide acétique dans le milieu de culture est inférieure à 0,1 g/dl, on ajoute au milieu de culture une solution d'acide acétique cris tallisable et d'acétate d'ammonium de manière que le milieu contienne 1,4 g/dl d'acide acétique. On effectue cette addition à deux reprises. On arrête la culture 36 h après le début et on obtient les rendements en acide L-glutamique à partir de l'acide acétique (X en poids) indiqués dans le tableau V ci-après, EXEMPLE 4 On prépare un milieu de culture aqueux contenant 5 mg/ml dréthanol, 1 mg/ml de KH2PO4, 1 mg/ml de MgS04,7H20, 0,01 mg/ml de MnSO4,4H2O, 0,01 mg/ml de FeS04,7H20, 3 #/1 de biotine, 0,011 mg/ml d'hydrolysat de protéines de soja et 200 #/ml de thiamine,HCl et on place des lots de 300 ml du milieu de culture aqueux dans un fermenteur de 1,5 1 et on chauffe à 1150C pendant 10 min. On inocule chaque lot du milieu avec l'un des micro-organismes indiqués dans le tableau VI ci-après et on le maintient à 31,5 C. On ajuste le pH du milieu au-dessus de 7,8 par l'ammoniac gazeux, lorsque l'éthanol initial a été consommé et on commence à introduire une solution contnant500 mg/ml d'éthanol, 1 mg/ml de KH2PO4, 1 mg/ml de MgS04,7H20, 0,01 mg/ml de MnSO4,4H2O, 0,01 mg/ml de FeS04,7H20, 200 y/l de thiamine-HCl et 1,5 P l/ml d'hydrolysat de soja lorsque le pH du milieu atteint 7,85 (le pH du milieu augmente lorsque l'éthanol contenu dans le milieu a été consommé). On cultive pendant 48 h et on obtient les rendements en acide L-glutamique indiqués. dans le tableau VI-ci-après, par rapport à la quantité d'éthanol consommée. Il est entendu que l'invention ntest pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustration et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. TABLEAU I Croissance relative de Concentration Substance ATCC AJ AJ AJ AJ AJ AJ mg/d1 13869 11211 11212 11213 11214 11215 11216 0 100 100 acide fluoro- 5 100 100 citrique 10 100 100 50 60 95 0 100 100 acide céto- 5 100 100 malonique 10 90 95 50 8 80 0 100 100 acide &alpha;;-amino-ss- 5 90 100 hydroxy-valéria- 10 50 90 nique 50 14 76 0 100 100 acide DL-thréo- 5 100 100 nine-hydroxamique 10 85 100 50 60 95 0 100 100 acide 2-amino-3- 5 95 100 phospho-propio- 10 65 95 nique 50 22 79 o 100 100 acide 5-amino 5 95 100 lévulinique 10 90 100 50 70 100 TABLEAU II Croissance relative de Acide cétomalonique Brevibacterium flavum Corynebacterium glutamicum concentration, mg/ml ATCC 14067 AJ 11217 ATCC 13032 AJ 11218 0 100 100 100 100 5 100 100 100 100 10 77 100 62 100 50 0 44 0 72 TABLEAU III Rendement en acide L-glutamique Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 48 % AJ 11211 52 % AJ 11212 53 % AJ 11213 51 % AJ 11214 53 % AJ 11215 52 % AJ 11216 50 % Brevibacterium flavum ATCC 14067 46 % AJ 11217 49 % Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 45 % AJ 11218 48 % TABLEAU IV Rendement en acide L-glutamique Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 58 % AJ 11212 62 % TABLEAU V Rendement en acide L-glutamique Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 45 % AJ 11212 49 % TABLEAU VI Rendement en acide L-glutamique Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 60 % AJ 11212 63 % R E V E N D I C A T-I O N S 1. Procéde pour la production d'acide L-glutamique par fermentation, caractérisé en ce que l'on cultive un mutant producteur d'acide L-glutamique dans un milieu de culture jusqu'à ce que l'acide L-glutamique soit accumulé dans le milieu de culture et on recueille l'acide glutamique accumulé, ledit mutant appartenant au genre Brevibacterium ou Corynebacterium et étant résistant à l'acide fluorocitrique, a l'acide cétomalonique, à l'acide a-amino-p-hydroxy-valérianique à l'acide thréonine-hydroxamique, à l'acide 2-amino-3-phospho-propionique ou à l'acide 5-amino-lévulinique. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit mutant est résistant à l'acide cétomalonique. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit mutant dérive de Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum ou Corynebacterium glutamicum.