Brevet FR2407475A1 — publié le 19790525

La présente invention se rapporte & un procedrae"' préparation d'un anticorps anti-HCG, utilisable en particulier pour le diagnostic de la grossesse, basé sur le dosage immunow chimique de la gonadotropine chorionique humaine (HCG) éven tuellement présente dans l'urine, On sait que le diagnostic de la grossesse est bas entre autres sur la possibilité de déceler une hormone gonadotrope luteinisante produite par la cellule de Langhans dans le tissu chorionique du placenta, savoir la gonadotropine chorionique humaine, présente dans l'urine de la femme enceinte. On connaît depuis longtemps des méthodes biologiques de diagnostic de la grossesse qui sont basées sur l'activité biologique induite chez des animaux auxquels on a administré de l'urine de femme enceinte, Ces essais biologiques- néces-- sitent l'utilisation d'animaux particuliers, Parmi ceux-ci, les suivants sont particulièrement répandus : l'essai d'Aschein Zondek, qui est basé sur le fait que la HCG provoque la formation de follicules hémorragiques et de corps jaunes dans les ovaires de rates impubères ,' 1 1essai de Freidman, qui est basé sur le fait que l'urine de femme enceinte injectée des lapines pubères provoque la formation de corps hémorragiques dans leurs ovaires ; et l'essai de Galli-Mainini qui est basé sur le fait que l'administration d'urine de femme enceinte provoque l'émission de sperme dans les urines de la grenouille, Tous ces essais présentent des-inconvénients importants dds au fait qu'ils doivent être pratiqués par des médecins ou par un personnel convenablement entraînÉ, queleur exécution demande pour sieurs surset-qu'ils obligent a sacrifier des animaux, En outre, de nombreux hôpitaux ne sont pas équipés des installations nécessaires pour l'élevage des animaux de laboratoire, Un autre inconvénient grave de ces essais est que les animaux utilisés doivent satisfaire à certaines exigences particulières.Les rats doivent être des femelles impubères d'un age bien détermi né, tandis que les lapines doivent être pubères, et ne pas avoir été en contact précédemment avec des lapins mâles. Enfin l'es- sai basé sur l'emploi des grenouilles donne en certaines sai sons des résultats douteux. Pour éviter les nombreux inconvénients que présentent les essais biologiques ci-dessus, on a mis au point récemment des essais basés sur les propriété immunow logiques de 1'HCG. Ces méthodes immunologiques de détection dans les urines de la présence éventuelle de l'hormone gonadotropine chorionique sont basées sur le fait que les bactéries, les particules colloîdales ou les érythrocytes sur lesquels l'antigène hCG soluble est absorbé ou lié s'ils sont mélangés dans un rapport déterminé avec l'antib sérum spécifique anti-HCG, donnent lieu a une réaction"d'ag- glutination passive" qui, dans le cas où la partie corpuscu laire est constituée d'érythrocytes, prend le nom d'hemoagglu- tination, Si l'on ajoute dans un tube & essais à fond hémis phérique contenant les érythrocytes sensibilisés avec de 1'HCG et mélangés à l'antisérum anti-HCG de l'urine de femme enceinte, 1'HCG libre contenue dans l'urine entre en concur ence avec l'anti-sérum, inhltxnt- la réaction-d'hémoag- glutination. I1 en résulte que les érythrocytes non agglu tinées par l'anti-serum sédimentent librement en formant un anneau caractéristique au fond du tube (réaction positive). Par ailleurs, l'addition d'urine d'une femme non enceinte et ne contenant donc pas d'HCG libre n'a aucune influence sur la réaction d'hémoagglutination, et les érythrocytes agglutinés sédimentent en une couche homogène (c'est-à dire sans former d'anneau caractéristique) au fond du tube (réaction négative). L'apparition du dépôt annulaire typique peut donc être utilisée pour déterminer l'existence d'un état de grossesse éventuel. Depuis quelque temps, on peut se procurer facilement des réactifs pour essais immunologiques sous forme de comprimés ou de pastilles solides qui contiennent un réactif à une concentration bien définie et qui sont complètement non-réactifs Jusqu'S ce qu'ils soient dissous et mis en con- tact avec la substance liquide à déterminer. En mettant t- profit le fait que ces réactifs sont disponibles, on a pu dernièrement mettre sur le marché des nécessaires à diagnostic "autonomes" pour effectuer le diagnostic de la grossesse au moyen du dosage immunaw chimique de l'HCG, le terme "autonome" signifiant que le nécessaire comprend tous les appareils- Crécipients de verre1 compte-gouttes etc,) et les réactifs nécessaires pour l'execuw tion de l'essai, En particulier, on a mis dans le commerce des nécessaires appropriés à l'usage des utilisateurs ordinaires qui peuvent ainsi, même s'ils sont totalement dépourvus de toute connaissance médicale, effectuer l'essai en suivant les instructions données avec des résultats dignes de foi, Par exemple, le brevet US 3.579.306 décrit un nécessaire autonome pour déterminer la présence de l'hormone de la grossesse comprenant & la fois un récipient transparent muni d'un couvercle également transparent et présentant des parois latérales suffisamment hautes pour que l'on puisse introduire dans le couvercle, lorsque celuiwei est éloigné et retourné, un échantillon d'urine, un miroir plan incliné placé au fond du récipient, reposant par un bord sur le fond adjacent à la paroi frontale du récipient et s'étendant diagonalement à travers le récipient, son bord supérieur éloigné du fond s'appliquant contre la paroi postérieure du récipient et un tube à essai à col fileté sur lequel peut être vissé un bouchon dont la paroi latérale interne porte elle aussi un filetage approprié.Le tube à essais transparent contient un comprimé solide d'erythrocytes sensiblisés avec de la gonadotropine chorionique humaine, un comprimé solide d'anti-sérum de la gonadotropine chorionique humaine et un comprimé solide d'un tampon. Le nécessaire comprend en outre un compte-gouttesmuni de deux repères de niveau, celui du dessous indiquant la quantité d'urine à prélever, et celui du dessus la quantité d'eau (servant de solvant aux réactifs ci-dessus) à prélever, Le récipient transparent renferme en outre une plaquette transparente pour maintenir ce tube à une certaine distance au-dessus du miroir, de façon que les résultats de l'essai réalisé à l'intérieur du récipient en ajoutant l'urine aux réactifs contenus dans le tube à essais soient réfléchis à travers la paroi antérieure du récipient et soient visibles à l'extérieur du récipient. Une amélioration du nécessaire pour l'exécution d'essais de diagnostic de grossesse est décrite dans la demande de brevet déposée par la demanderesse le même jour que la présente demande et irtituléé "Nécessaire diagnostique pour effectuer les diagnostics de grossesse", qui est incorporé a la présente demande à titre de référence, Il est connu que la confiance que l'on peut accorder aux essais ci-dessus dépend en grande partie de la sensibilité et de la spécificité des réactifs utilisés.Par "sensibilité", on entend la quantité minima de HCG que les réactifs sont capables de mettre en évidence, compte tenu du fait que la concentration de HCG augment progressivement avec le temps dans l'urine d'une femme enceinte, excepté dans les cas pathologiques comportant un risque d'avortement ou de grossesse extra-utérine, où les teneurs en HCG sont inférieuresa la normale, tandis que les néoplasies se développant dans le tissu chorionique provoquent au contraire des pics de concentration en RCG nettement supérieurs a la normale. De la sensibilité de l'essai dépend évidemment le temps minimum qui doit s'écouler après l'arrêt des règles pour pouvoir diagnostiquer une grossesse en cours.Par '1spécificité", on entend la capacité des réactifs a réagir sêlectivment avec 1'HCG et non avec d'autres hormones (par exemple l'hormone LE) qui pourraient être présentes elles aussi dans l'urine et qui pourraient interférer avec un essai ayant une sensibilité trop élevée ou donnant des résultats ambigus ou des résultats positifs erronés. A l'heure actuelle, on admet en général que la sensibilité idéale pour un essai de grossesse est de 1 U.I./ml. La nature des réactifs actuellement utilisés, à savoir les érythrocytes sensiblilisés à l'HÇG et l'anti-sérum anti-HCG est telle qu'elle ne permet pas d'obtenir la sensibilité et la spécificité désirées pour l'essai de gros sasse. En fait, la sensibilité des essais actuellement dispo- nibles n'est généralement pas inférieure à 1 U,I/ml tandis que la présence dans l'urine d'hormong différentes de la gonat dotropine chorionique humaine influe très sensiblement sur la précision de l'essai, ce qui montre son manque de spécificité. Un autre inconvénient de 1 'essai généralement utilisé actuellement est le temps (ordinairement non inférieur à au moins deux heures) qui s'écoule entre le mélange des réactifs avec l'échantillon d'urine à examiner et la formation du dépôt Etant donné que durant ce temps le récipient (tube à essais ou flacon) contenant les réactifs et l'échantillon d'urine doit rester absolument immobile et ne pas être exposé à des chocs ou vibrations qui pourraient compromettre la fiabilité de l'essai, il en résulte évidemment qu'il serait souhaitable de disposer d'un essai dont le résultat pourrait être obtenu en un temps nettement plus court que celui indiqué ci-dessus, diminuant ainsi la probabilité d'apparition de phénomènes perturbant l'essai. On a découvert conformément à l'invention un nouvel anticorps anti-HCG et un procédé pour sa préparation, lequel utilisé en association avec un échantillon d'érythrocytes humains sensibilises par une HCG préparée par les procédés indiqués, permet de mettre au point un essai de diagnostic de grossesse ne présentant pas les inconvénients indiqués pour les essais connus. La présente invention a donc pour but de fournir un procédé de production d'un anticorps anti-HCG permettant de réaliser un essai de grossesse dont la sensibilité et la spécificité sont nettement améliorées par rapport à l'essai généralement utilisé actuellement. Un autre but de l'invention est de fournir un procédé dé de production d'un anti-corps anti-HCG permettant d'effectuer un essai diagnostique de grossesse dans lequel le temps s 'écoulant entre le mélange des divers réactifs avec l'échantillon d'urine à analyser et la formation du dépôt est nettement réduit par rapport à celui nécessaire avec les essais indiqués, ce temps étant réduit à 1 heure environ seulement, Conformément à l'invention, le procédé de préparation d'un anti-corps anti-HCG particulièrement utile pour le diagnostic de la grossesse, est caractérisé essentiellement en ce qu'il comprend les stades suivants a) préparer une émulsion d'HCG en dissolvant l'HCG dans une solution physiologique stérile à 0,8 - 1 % de chlorure de sodium en ajoutant de d'adjuvant complet de Freund et en émulsionnant ;; b) inoculer l'émulsion & des lapins au moyen d'une première injection suivie, à d8 jours d'intervalle , d'une seconde injection (de rappel) , c-) contrôler la réaction immunologique après environ 14 jours après la seconde injection ; d) prélever le sang des lapins présentant la réaction immunologique optimale, coaguler le sang et le centrifuger, ajouter de l'azide de sodium au sérum surnageant et soumettre à une filtration stérilisante ;; e) préparer de l'urine lyophilisée en soumettant l'urine d'une femme ménopausée à une dialyse avec de l'eau distillée, en filtrant et en évaporant à environ 1/10 du volume initial, en refroidissant, en ajoutant de ltethanol, en filtrant et en soumettant à une lyophilisation. f) ajouter au sérum obtenu au stade d, 1 % (V/V) de sérum humain masculin et 0,5 % (P/V) de l'urine lyophilisée obtenue au stade e). g) faire adsorber le sérum obtenu au stade f) sur des érythrocytes humains stabilisés lavés avec une solution physiologique contenant du chlorure de sodium et de l'azide de sodium, ce qui donne une suspension 7 h) laisser la suspension sous agitation lente pendant environ 60 minutes, centrifuger pour éliminer les cellules et réchauffer le sérum ainsi obtenu à 55-600C pendant 30 minutes environ i) fractionner l'antisérum sur une colonne contenant de la diéthylalkylestercellulose (DEAE > cellulose) ; j) soumettre à une filtration stérile la fraction d'antisérum contenant les T -globulines, puis introduire dans des flacons et lyophiliser. L'exemple non limitatif suivant est donné à titre d'illustration de l'invention. Exemple Preparation-de l'émulsion d'HCG On dissout une ampoule de taille 3 de 10.000 U.I. d'HCG-sigma dans 15 ml d'une solution physiologique stérile à 0,9 Fde chlorure de sodium. On ajoute à cette soltution 15 ml d'adjuvant de Freund complet. Puis on transforme le tout en émulsion au moyen d'une seringue, On laisse reposer l'émulsion pendant 60 minutes, au cours desquelles il ne doit pas se produire de séparation des phases. Inoculation à des lapins A des lapins mâles d'un poids corporel d'environ 3,5 kg, âgés d'environ 120 jours (qui ont été acclimatés à titre de précaution), on inocule 1500 U,I d'HCG (correspon- dant à 1,5 ml d'émulsion) dans les deux gluaei maximi, Quarante-huit jours après la première injection, on effectue une injection de rappel avec la même quantité d'émulsion d'hormone. Contrôle de la réaction immanologique Quatorze jours après la seconde injection, on prélève environ 5 ml de sang dans la veine du bord de l'oreille du lapin. Après coagulation et rupture du coagulum à l'aide d'un agitateur de verre, on centrifuge à 6000 tours/minute. On sépare alors le liquide surnageant du coagulum. On dilue 1 ml de sérum centrifugé à 100 ml dans un ballon de verre taré avec une solution présentant la composition suivante (pour 100 ml) : phosphate disodique anhydre (Art. Merck 6586) 0,194 g phosphate monopotassique anhydre (Art. Merck 4873 > 0,101 g Saccharose (Art. C. Erba RPE) 5,000 g azide de sodium (Art. Merck 6688) 0,100 g EDTA - Na 2 (titriplex III Merck) 0,150 g albumine de sérum de boeuf (fraction V) 0,200 g Eau distille: Q,S. pour 100 ml Prélèvemnt du9 ng On prélève la totalité du sang présentant la réaction immunologique optima par ponction intra-cardiaque.On laisse coaguler pendant 30 minutes à la température ambiante le sang prélevé séparément sur les lapins, et, après avoir dispersé le coagulum t l'aide d'une baguette de verre on centrifuge dans une centrifugeuse réfrigérée (température + 40c) à 6000 tourszmn. On ajoute au sérum surnageant de l'azide de sodium à O,1 % puis, après filtration stérile sur un filtre Millipore, on le recueille dans un récipient stérile et le conserve à l'état congelé (temp. -20 à -30 C). Purification Préparation de l'urine lyophilisée On dialyse 2lides d'uSnede femme ménopausée a jeun avec de l'eau distillée pendant 24 heures, puis on les filtre et les évapore à 1/10e du volume initial. Après refroidissement, on ajoute 15 n (V/V) d'méthanol à 95 %, on filtre et on lyophilise. Traitement par l'urine lyophilisée Au sérum stérile conservé a l'état congelé, on ajoute après décongélation 1 % (V/V) de sérum humain mâle et 0,5 % (P/V) d'urine lyophilisée et on le laisse reposer 48 heures à + 40C. Absorption sur cellules stabilisées On traite 250 ml de sérum par 30 ml de cellules stabi usées préalablement lavées 5 fois avec une solution physiologique contenant 0,9 % de chlorure de sodium et 0,1 % d'azide de sodium. On laisse la solution ainsi obtenue sous agitation lente pendant environ 60 minutes1 puis on sépare les cellules par centrifugation et on traite le sérum pendant 30 minutes a 56 C. Fractionnement sur colonne Le fractionnement s'effectue sur une colonne contenant de la résine de DEAE-cellulose Filtration stérile - Mise en flacons et lyophilisation La fraction d'antisérum contenant les &gamma; - globulines ainsi obtenuesest soumise à une filtration stérile et répartie dans des flacons de verre neutre, puis lyophylisée sur support de saccharose. Suivant un mode opératoire de lyophilisation préféré, la lyophilisation de l'anticorps est effectuée de telle sorte que chaque flacon (ou tube) contienne dans l'ordre à partir du fond une couche d'anticorps lyophiliset une couche d'érythro- cytes sensibilisés par l'FCG, déposés sur un support de saccharose et lyophilisés. Dans les flacons,-le rapport volumique de la couche d'anticorps lyophilisés à la couche d'érythrocytes humains sensibilisés par l'HCG et lyophilisés est de préférence d'environ 3 : 1 Pour réaliser cette succession ordonnée de couches lyophilisées, on utilise un mode opératoire comportant les stades suivants - mise en flacons de l'anticorps en solution, - première congélation fournissant une première couche d'anticorps congelée au fond des flacons, - mise en flacons de la suspension d'érythrocytes sur la première couche d'anticorps congelée, - seconde congélation, donnant une double couche congelée, puis - lyophilisation fournissant le lyophilisat stratifié. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un anticorps anti-ECG, particulièrement rutile pour le diagnostic de la grossesse, caractérisé en ce qu'il comprend les stades suivants : a) préparer une émulsion de HCG en dissolvant l'HCG dans une solution physiologique stérile de chlorure de sodim 0,8-1 % en ajoutantdel'adjuvant complet de Freund et en émulsionnant ; b) inoculer l'émulsion à des lapins au moyen d'une première injection suivie, au bout de 48 jours environ, d'une seconde injection (de rappel) , c) contrôler la réaction immunologique environ 14 jours après la seconde injection ;; d) prélever le sang des lapins présentant la réaction immunologique optimale, coaguler le sang et centrifuger, ajouter de l'azide de sodium au sérum surnageant et soumettre a une filtration stérilisante ; e) préparer de l'urine lyophilisée en soumettant des urines de femmes ménopausées a une dialyse contre de l'eau distillée, en filtrant et en évaporant 8 1/1 De environ du volume initial, en refroidissant, en ajoutant de ltéthanol, en filtrant et en lyophilisant. f) ajouter au sérum obtenu au stade d) 1 % (V/V) de sérum humain mâle et 0,5 % (P /V) de l'urine lyophilysée obtenue au stade e) g) faire adsorber le sérum obtenu au stade f) sur des érythrocytes humains stabilisés préalablement lavés avec une solution physiologique contenant du chlorure de sodium et de l'azide de sodium, ce qui fournit une suspension, h) laisser la suspension sous agitation lente penw dant environ 60 minutes, centrifuger pour éliminer les cellules et réchauffer le sérum ainsi obtenu à 55-600C pen dant envrion 30 minutes i) fractionner l'antisérum sur une colonne contenant de la résine de DEPE-cellulose (diéthylalkylester--cellulose), j) soumettre S une filtration stérile la fraction d'antisérum contenant les t -globulines, puis mettre en flacons et lyophilyser. 2, Procédé. suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la mise en flacons et la lyophilysation de l'anti- corps comprennent les stades suivants > mise en flacons de l'anticorps en solution, première congélation fournissant une première couche d'anticorps congelée au fond de flacons a fond hémisw phérique, mise en flacons de la suspension d'érythrocytes sur la première couche d'anticorps congelée ; - seconde congélation, fournissant une double strate congelée, puis, - lyophilisation fournissant le lyophi-lisat en couches. 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce qu'on met en flacons l'anticorps en solution, puis la suspension d'érytlirocytes humains dans un rapport volumique tel que l'on obtienne un rapport volumique entre la couche d'anticorps lyophilise et la couche d'érythrocytes humains sensibilisés environ 3 :1 4. Agent de diagnostic de la grossesse, constitué d'une couche de l'antisêrum lyophilisé obtenu suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3 en solution tampon avec un support de saccharose et d'une autre couche constituée d'HCG sensibilisée, sur support de saccharose et d'érytro cytes humains lyophii sés. 5. Utilisation de l'antisérum obtenu suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3 comme réactif pour le diagnostic de la grossesse.