Brevet FR2403556A1 — publié le 19790413

La présente invention a pour objet un nouveau matériau capable de fixer de façon réversible des antigènes, ainsi que leur procédé de préparation. On a déjà proposé dans la demande de brevet français NO 76.23176 de fixer par réticulation des antigènes ou des anticorps à la surface du diéthylaminoéthyldextran ou de tout autre polysaccharide cationique lui-même réticulé tapissant la surface d'un support minéral poreux. La présente invention constitue une méthode plus simple pour revêtir des supports minéraux poreux d'une couche d'anticorps solidement et définitivement fixée. Contrairement à la plupart des autres protéines ou antigènes, les anticorps présentent une affinité forte et spontanée pour la silice et pour d'autres supports minéraux poreux à caractère électronégatif. Cette affinité naturelle n'est pas seulement de nature électrostatique, car il est très difficile d'éluer les anticorps ainsi adsorbés même par variation de force ionique ou de pH. On a maintenant découvert que la couche intermédiaire de DEAE Dextran en surface de la silice, qui était necessaire pour attirer puis réticuler des antigènes , n'est pas indispensable pour la fixation des anticorps. L'immobilisation d'anticorps selon le procédé de l'invention sur des silices ou supports minéraux poreux vierges, non transformés chimiquement n'a jamais été décrite. En effet généralement, une première couche d'imprégnation par des silanes aminés notamment le gamma-aminopropyltriethoxysilane était réputée nécessaire et semble avoir été toujours utilisée. On a découvert de façon surprenante que cette couche est inutile et même néfaste car elle diminue l'affinité naturelle des anticorps pour la surface du support minéral poreux. Les anticorps à fixer sur le support minéral poreux peuvent être préparés de façon classique en immunisant des animaux avec une préparation antigénique et en isolant ultérieurement les anticorps formés selon les méthodes connues. La présente invention a pour objet un matériau solide poreux utilisable dans des colonnes de séparation chromatographiquecaractérisé par le fait qu'il est constitué par un support minéral poreux revêtu directement par une couche d'anticorps adsorbés, ladite couche d'anticorps adsorbés étant à l'état réticulé. La réticulation, qui a pour but de stabiliser la couche d'anticorps est effectuée selon les méthodes connues. L'invention a également pour objet un procédé de préparation du matériau de l'invention, ce procédé étant caractérisé par le fait que I 'on fait passer dans une colonne contenant le support minéral poreux une solution d'anticorps jusqu'à saturation homogène du support minéral poreux, puis que l'on fait passer dans la colonne une solution d'agent réticulant et laisse l'agent réticulant en contact avec le support revêtu d'anticorps pendant un temps suffisant pour que la réticulation se produise. Selon un mode de réalisation préféré, on rince la colonne avec une solution tampon avant de faire passer la solution d'agent réticulant. Le support minéral poreux peut être constitué par exemple d'un oxyde métallique tel que la silice, l'alumine, la magnésie, un oxyde de titane ou leurs dérivés synthétiques ou naturels tels que les verres, les silicates, les borosilicates, le kaolin, etc... Le support minéral poreux doit avoir une porosité contrôlée bien définie. La surface interne du support est de préférence inférieure ou égale à 100 m2/g et en particulier comprise entre 5 et 80 m2/g. Le diamètre moyen des pores doit être supérieur ou égal à 25 nm et en particulier compris entre 50 et 1.000 nm. L'agent réticulant peut être tout agent habituellement utilise pour réticuler les molécules de protéines. On peut utiliser notamment des dérivés bifondtionnels tels que des dérivés dicarbonylés, des halohydrines, des diépoxydes, etc... On peut utiliser notamment le glutaraldéhyde, le l,4-butanedioldiglycidylether, I'épichlorhydrine, l'épibromhydrine, ou un diépoxyde de formule : dans laquelle R5 est un alkyle ayant de 1 à 20 atomes de carbone, de préférence un alkyle inférieur ayant de 1 à 4 atomes de carbone et R4 et R6 représentent une chaine hydrocarbonée ayant I à 10 atomes, de préférence un radical alkylène inférieur ayant I à 4 atomes de carbone. L'invention a également pour objet l'application des matériaux poreux revêtus d'anticorps à la séparation d'antigènes ou à la purification de solutions contenant des antigènes. Cette application est caractérisée par le fait que l'on réalise une colonne chromatographique à l'aide du materiau-poreux revêtu d'anticorps, que l'on fait passer dans cette colonne une solution contenant de l'antigène correspondant à l'anticorps fixé sur le matériau poreux, et que, si désiré, on élue l'antigène selon les méthodes usuelles. Pour dissociér le complexe choléragène-anticorp, on sait que l'on peut opérer par élution avec une solution tampon acide, ou en présence d'une forte concentration en urée, en guanidine, en iodure (par exemple iodure de sodium), en thiocyanate (par exemple SCNK) ou en présence d'autres agents chaotropiques ou dénaturants. Gracie à cette application, on peut par exemple effectuer les opérations suivantes - préparer une solution d'antigènes purifiés pouvant servir à la préparation d'un vaccin - débarrasser une solution de toute trace d'un antigène détermine - préparer ensuite des anti-sérums vis-à-vis de ces deux types de solutions. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE 1 - Fixation des anticorps antitoxine choleriqu-e Préparation des ant-i-oo-rps De marnière classique ces anticorps sont préparés en immunisant des animaux (lapins, moutons, chevres ou chevaux par exemple) avec une préparation de toxine cholérique de préférence purifiée. a) une première méthode consiste -à hyperimmuniser des animaux avec une solution de choléragène purifié, préparée selon la méthode de FINKELSTEIN et distribuée sur demande par le National Institute of Health aux Etats-Unis ou commercialisée par la firme américaine SCHWARTZMAN. b) une deuxième méthode consiste à hyperimmuniser des animaux avec de la toxine cholérique purifiée par chromatographie d'affinité biospécifique. c) une troisième méthode consiste à hyperimmuniser des animaux avec un vaccin à base de toxine cholérique. d) une quatrième méthode consiste à hyperimmuniser des animaux avec du filtrat de culture de vibrions cholériques. Dans cette quatrième méthode (et éventuellement dans chacune des trois autres, si la préparation de toxine cholérique n'est pas absolument pure), les animaux synthétiseront des anticorps dirigés contre les autres protéines et antigènes du filtrat de culture, ou contre les impuretés éventuellement présentes dans les préparations de toxine utilisées. Un procédé très simple à mettre en oeuvre permet d'éliminer tous les anticorps indésirables autres que les anticorps spécifiquement dirigés contre la toxine cholérique. En effet par chromatographie d'affinité biospécifique sur des supports revêtus de ganglioside GMl ou de lyspganglioside GM1, il est facile de préparer un filtrat de culture de vibrions chôlériques complètement débarrassé de toxine cholérique, car la toxine cholérique est la seule protéine à se fixer sur le ganglioside GM1 et de ce fait se trouve sélectivement éliminée. I1 suffit alors de mélanger dans des proportions convenables la solution du mélange de gammaglobulines non spécifiques obtenu, avec la solution de filtrat de culture débarrassé de toxine cholyrique. Après incubation de 1 h à 20aC et de 15 h à +4 0C, les anticorps parasites sont tous neutralisés et précipités par les antigènes correspondants du filtrat de culture sans toxine cholérisque. Après centrifugation et filtration de la solution ainsi purifiée, les gammaglobulines contenant les anticorps spécifiquement dirigés contre la toxine cholérique sont précipitées par addition d'une solution à 300 g/l de sulfate d'ammonium à pH 6,8. Le précipité obtenu est récolté par centrifugation, dissous en tampon phosphate 0,025 M pH 6,8 et dialysé contre le même tampon. Après chromatographie d'échange d'ions sur Sphérosil imprégné de DEAE Dextran (selon la demande de brevet français N0 73.23176) dans ce même tampon, un pic non adsorbé sort directement de la colonne et représente les gammaglobulines à activité spécifique antitoxine cholérique;. ce pic peut éventuellement être concentré par ultrafiltration et filtré stérilement pour être conservé avant le stade de fixation sur support minéral Un contre très simple en immunodiffusion permet de vérifier que cette préparation d'anticorps antitoxine cholérique donne une ligne de précipi- tation avec le filtrat de culture normal et que cette ligne de précipitation n'existe pas avec le filtrat de culture débarrassé de toxine cholérique.Ceci montre bien la spécificité des anticorps antitoxine cholérique ainsi préparés. Les supports revêtus de ganglioside GM1 de lysoganglioside GM1 peuvent être prépares de la façon suivante : on effectue un revêtement d'un support minéral poreux par un polymère polysaccharidique ou par un polysaccharide modifié (par exemple aminé), on effectue si nécessaire une réticulation pour stabiliser ce revêtement, on soumet ledit revêtement à une oxydation periodique, on fait réagir le support revêtu du polymère oxydé avec le lysoganglioside GM1, puis on soumet le dérivé iminé obtenu à l'action d'un agent réducteur capable de réduire la liaison imine en liaison amine. On obtient ainsi un support sur lequel sont fixées chimiquement des molécules de gangliosides GM1 ou de lysogangliosides GMl. De tels supports revêtus de gangliosides GM1 ou de lysogangliosides GM1 sont décrits en détail dans la demande de -brevet français, déposée le même jour que la présente demande, et inti tulée : "Nouveau matériau capable de fixer de façon réversible des macrmolécules biologiques, -sa préparation et son application." Fixation-des anticorps -an-titoxine~eholeriqu-e sur support minéral poreux 10 g de Sphérosil XOC 005 sont montés en colonne et celle-ci est équilibrée par du tampon phosphate 0,025 M pH 6,8.La solution précédente d'anticorps est introduite dans la colonne et recyclée 3 fois de suite pour assurer une saturation homogène-des sites adsorbants de la silice. Comme la capacité de fixation est d'environ 40 à 60 mg d'anticorps par gramme de silice, il est bon d'introduire une quantité excédentaire, par exemple de 600 mg + 10 %, soit environ 660 mg au moins de gammaglobulines dans la solution d'anticorps introduite dans la colonne. La colonne est alors rincée par 50 ml de tampon pour éli- miner les anticorps non adsorbés. Retioulati-on des anticorps à -1-a sur-fa-c-e-du support La couche d'anticorps ainsi adsorbée est alors définitivement et irréversiblement fixée et stabilisée par réticulation avec le glutaraldéhyde par exemple. Ainsi 100 ml d'une solution de glutaraldéhyde à 0,5 O en tampon phosphate 0,025 M de pH 6,8 sont introduits dans la colonne à un débit de 100 ml/h. Après un temps de réaction de- 1 h la colonne est rincée par le tampon phosphate pour éliminer le glutaraldehyde en excès. Puis les fonctions aldéhyde encore présentes sur cette couche réticulée sont neutralisées pendant une nuit par une solution de glycocolle- -(20 g/l) de pH 8,2. Après des lavages avec une solution aqueuse d'HCl 0,1 N (ou NaOH 0,1 N éventuellement) et retour en tampon de chromatographie, la colonne est alors prête à 11 emploi et douée d'affinité biospécifique pour la toxine cholérique. En suivant rigoureusement la même technique de fixation on a préparé des matériaux poreux sur lesquels sont fixés respectivement les anticorps spécifiques suivants : anti-albumine, anti-gammaglobuline, anti-alpha-foeto protéine, anti-virus herpès, anti-virus grippal, anti-virus HB , anti-toxine tétanique, anti-toxine diphtérique, et de préparer grace à ces matériaux disposés dans des colonnes des solutions très purifiées des antigènes correspondants. EXEMPLE 2 - Application à l'isolenient et à la purification de la toxine cholérique On sait qu'en se développant dans un milieu de culture approprié le vibrion cholérique secrete une toxine appelée cho léragène ou entérotoxine qui est responsable des diarrhées pro voquées chez l'homme par ce germe. Après centrifugation et filtration du milieu de culture final, il est possible d'obtenir un "filtrat de culture brut" contenant la toxine cholérique mélangée à de nombreuses autres macromolécules du milieu de culture initial ou secrétées par les vibrions. La toxine cholérique se transforme partiellement et progressivement en forme non toxique appelée choléragénoide Le cholé ragénorde a une structure voisine de celle du choléragène, mais le cholêragène possède en plus une chaine polypeptidique A responsable de la toxicité. En passant un filtrat de culture de vibrions cholériques additionné de 10 g/l de NaCI sur une colonne remplie du matériau décrit à l'exemple 1 il est facile de vérifier que le choléragène et le choléragénofde s'accrochent sur le support. En effet à condition de rester en dessous de la capacité maximale de fixation de la colonne, le filtrat obtenu en sortie de colonne est complètement dépourvu d'activité toxique mesurable par les tests connus. Après lavage par le tampon de chromatographie pour éliminer les proteines non fixées, il est possible de récupérer le choléragène et le choléragénoide fixés, par élution avec le tampon citrate - acide citrique 0,05 M pH 2,8. La dénaturation est apparemment négligeable puisque les rendements obtenus varient de 50 à 100%, mesurés par les tests classiques de dosage de la toxine cholérique, La pureté de la préparation peut être évaluée par chromatographie sur Sephadex G-200 (le choléragène donne un pic corres- pondant à un poids moléculaire de 34- 000, le choleragenoide donne un pic correspondant à un poids moléculaire de 56 000) ou par des méthodes immunochimiques avec des antisérums de contrale. (Un antisérum anti-filtrat de culture ne possédant pas d'anticorps antitoxine cholérique ne doit pas donner de ligne de précipitation avec ces préparations purifiées) - Les applications possibles sont les suivantes : - préparer une solution de choléragène et de -choléragénoide purifiés pouvant servir à la préparation d'un vaccin. - débarrasser un filtrat de culture de vibrions cholériques de toute trace de choléragène et de choléragénoïde. - préparer ensuite des antisérums vis à vis de ces deux types de solutions. REVENDICATIONS 1. Matériau solide poreux utilisable dans des colonnes de séparation chromatographique, caractérisé par le fait qu'il est constitué par un support minéral poreux revêtu directement par une couche d'anticorps adsorbés, ladite couche d'anticorps adsorbés étant stabilisée par réticulation. 2. Matériau selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le support minéral poreux est un oxyde métallique tel que la silice, l'alumine, la magnésie, un oxyde de titane, ou leurs dérivés synthétiques ou naturels tels que les verres, les silicates, les borosilicates ou le kaolin. 3. Matériau selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que 15 anticorps est choisi dans le groupe constitué par les anticorps anti-albumine, anti-gammaglobuline, anti-alpha-foeto protéine, anti-virus herpès, antivirus grippal, anti-virus "B, anti-toxine tétanique, anti-toxine diphtérique. 4. Matériau selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que l'anticorps est un anticorps antitoxine cholérique. 5. Matériau selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'anticorps est réticulé par un agent habituellement utilisé pour réticuler les molécules de protéine. 6. Matériau selon la revendication 5, caractérisé par le fait que l'agent réticulant est un composé bifonctionnel choisi dans le groupe constitué par des dérivés dicarbonylês, les diépoxydes et les halohdrines. 7. Matériau selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'agent réticulant est le glutaraldéhyde. 8. Procédé de préparation du matériau tel que défini dans l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on fait passer dans une colonne contenant le support minéral poreux une solution d'anticorps jusqu'à saturation homogène du support minéral poreux-, puis que l'on fait passer dans la colonne une solution d'agent réticulant et laisse l'agent réticulant en contact avec le support revêtu d'anticorps pendant un temps suffisant pour que la réticulation se produise. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'on rince la colonne avec une solution tampon avant de faire passer la solution d'agent réticulant. lO. pplication du matériau tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée par le fait que l'on réalise une colonne chromatographique contenant ledit materiau, que l'on fait passer dans cette colonne une solution contenant l'antigène correspondant à anticorps fixé sur ledit matériau, puis que, si désiré, on élue l'antigène, fixé sur le matériau, selon les méthodes usuelles.