Brevet FR2419674A1 — publié le 19791012

La présente invention concerne le traitement de la maladie du greening des agrumes. Les agrumes sont sujets à deux affections importantes qui sont la maladie du stubborn et la maladie du greening. La maladie du stubborn, bien que très répandue dans le bassin méditerranéen, dans le Proche-Orient et dans le Sud-Ouest des Etats-Unis, n1 atteint cependant pas l'ampleur et la gravité de la maladie du greening dans certaines régions du globe. En effet, la maladie du greening, qui fut observée pour la première fois en Afrique du Sud en 1929, constitue à l'heure actuelle l'une des affections les plus graves des agrumes, non seulement en Afrique du Sud, mais aussi à Nadagascar, dans l1Ile de la Réunion, dans l'Ile Maurice, aux Indes, et dans une large partie de l'ExtrOme-Orient où elle est connue sous des noms différents. La grande diffusion de cette maladie est due à l'existence de deux psylles-vecteurs : le psylle africain, Trioza erytreae del Guercio, et le psylle oriental Dianhorina citri Kuw. En outre, cette maladie peut se transmettre par greffage d'inoculation et c'est la raison pour laquelle on avait admis pendant un certain temps que l'agent causal impliqué dans la maladie du greening était de nature virale. Toutefois, on s'est aperçu par la suite que la maladie du greening ne présentait pas les caractères d'une virose typique et il fut alors suggéré que l'agent causal était un organisme de type mycoplasme. On entreprit alors de lutter contre la maladie du greening en injectant des tétracyclines dans le tronc des plants d'agrumes maladies, Cependant, les tétracyclines ont pour inconvénient majeur d'être phytotoxiques à partir de certaines concentrations, ce qui oblige à en limiter les quantités d'application. Il était donc souhaitable d'éviter les inconvénients du traitement par les tétracyclines en mettant au point un traitement qui ne soit pas phytotoxique. Ces buts sont atteints selon l'invention en traitant les agrumes atteints de la maladie du greening au moyen d'un agent contenant une quantité efficace d'un antibiotique du genre pénicilline ou céphalosporine et plus particulièrement dtun dérivé de pénicilline de formule dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un groupe amino ou un groupe carboxyle. Ainsi, selon que R représente un atome d'hydrogène, un groupe amino ou un groupe carboxyle , le dérivé de formule I est respectivement la pénicilline G, l'ampicilline ou la carbenicilline. L'efficacité de l'agent de traitement de l'invention peut en outre être améliorée en associant le dérivé de formule I à un agent de synergie, comme par exemple la streptomycine. L'agent de traitement sera avantageusement mis sous forme d'une solution aqueuse pour faciliter le traitement qui est réalisé en pratique par injection dans le tronc des plants. Toutefois, à titre expérimental, on peut effectuer le traitement sur de jeunes plants au niveau de leur système racinaire. Dans le cas du traitement au niveau du système racinaire, après arrachage ou dépotage des plants, on lave abondamment leur système racinaire et on plonge le système racinaire dans une solution de l'agent de traitement pendant un temps suffisant pour que l'agent de traitement pénètre dans le système végétal du plant, on replante ensuite le plant et on continue le cas échéant le traitement par des arrosages répétés au moyen d'une solution aqueuse de l'agent de traitement. Comme indiqué plus haut, le traitement doit être effectué en pratique par injection ou incorporation de l'agent de traitement dans le tronc des arbres à traiter afin de ne pas polluer l'environnement et d'éviter 1'émergence possible dans le sel de micro-organismes résistant aux pénicillines. L'agent de l'invention peut être aussi mis sous la forme d'une formulation retard apte à libérer lentement l'an antibiotique dans la sève du plant traité. Ces formulations retard de dérivés de pénicilline sont bien connues dans la technique et consistent en des formes de ces dérivés qui sont hydrolysables lentement. Ces formes correspondent par exemple aux formes ester ou amine des dérivés de pénicilline et par conséquent des dérivés de formule I dans le cas de la présente invention. L'invention concerne également un dispositif apte à assurer l'injection de l'agent de traiter e dans le tronc des ar- bres à traiter , qui comporte au moins une bouteille destinée à renfermer une solution de l'agent de traitement et un tuyau de raccordement permettant d'injecter cette solution dans l'arbre gracie i un orifice pratiqué dans le tronc de l'arbre. Dans un mode de réalisation préférentiel, ce dispositif comporte deux bouteilles permettant d'injecter la solution de traitement par deux orifices symétriques pratiqués de part et d'autre du tronc de l'arbre. Les bouteilles sont suspendues au-dessus du niveau des orifices pratiqués dans le tronc de l'arbre et l'écoulement de la solution de traitement peut être réalisé par simple gravité comme dans le cas d'une perfusion ou de préférence sous pression, les bouteilles étant étanches et ayant été préalablement mises sous pression. Dans l'état actuel d'avancement de ses recherches sur la maladie du greening, le demandeur considère que l'agent causal de cette maladie est certainement un microorganisme de type bactérien, ce qui confirmerait à la fois les résultats des études au microscope électronique qu'il a entreprises sur cet agent causal et les bons résultats qusil a obtenus par le traitement au moyen des dérivés de formule I La microscopie électronique a montré en effet que l'enveloppe cellulaire de l'organisme associé au greening n'est pas une simple membrane plasmique du type unitaire, épaisse d'environ 100 nm, mais un système plus complexe ayant une épaisseur totale d'environ 250 nm et présentant trois feuilles deux feuilles denses aux électrons, l'un interne, l'autre externe, séparés par un feuillet médian peu dense aux électrons. Il a même été possible, dans certaines conditions, d'observer que le feuillet externe et le feuillet interne se détachent nettement l'un de l'autre. Le Demandeur a en outre observé que chacun de ces deux feuillets, épais d'environ 90 nm, a une structure trilamellaire. il semble donc très probable que le feuillet interne est la membrane cytoplasmique et que le feuillet externe a lui aussi une structure mem branaîre. La couche interne de cette membrane externe est parfois plus épaisse que la couche externe et suggère une couche à peptidoglyeane. Les organismes associés à la maladie du greening ne sont donc pas des mycoplasmes, mais vraisemblablement des bactéries, c'est-à-dire des trocaryotes qui possèdent outre la membrane plasmique interne une paroi cellulaire externe à peptidoglycane. Pour démontrer que les organismes associés au greenlng sont des bactéries, il faudrait pouvoir montrer qu'ils possèdent un peptidoglycane puisque celui-ci est l'élément caracteristique de la paroi bactérienne. Etant donné que les organismes associés au greening n'ont pas encore pu autre cultivés in vitro, la recherche du peptidoglycane n'a pu se faire qu'in directement au moyen des organismes in situ. On sait que l'action antibiotique des dérivés du genre pénicilline et céphalosporine s'exerce exclusivement au niveau du peptidoglycane de la paroi bactérienne en inhibant l'une des étapes tardives de la biosynthèse du peptidoglycane et plus précisément la liaison des chaînes du glycane entre elles par des ponts peptidiques. Au contraire, les tétracyclines agissent en bloquant la synthèse peptidique au niveau des ribosomes. Ainsi, les tétracyclines exercent leur action tant sur les mycoplasmes que sur les bactéries, alors que la pénicilline nta aucune action sur les mycoplasmes et n'est active que sur les bactéries. Compte tenu des bons résultats obtenus par le Demandeur en traitant des agrumes atteints de la maladie du greening avec les agents de l'invention, il semble que les organismes associés au greening sont des bactéries. L'invention sera mieux comprise à la lecture des exemples détaillés qui vont suivre, cités uniquement à titre illustratif, et montrant le traitement d'agrumes au moyen d'agents selon l'invention. EXEMPLE I Mode opératoire On a utilisé dans cette expérience des plants d'oranger (Citrus Sinensis (L.) Obs.) de variété Hamlin ou de variété Madame Vinous qui étaient atteints de greening depuis plusieurs années et qui en manifestaient les sympt8mes d'une façon sévère. A l'origine, ces orangers, obtenus de semis, avaient été contaminés par l1agent causal du greening par greffage d 'inoculation. Dans cette expérience, on a utilisé cinq souches de greening. Six plants étaient contaminés par la souche de greening de Taiwan (Likubin, -PD-T9-10), quatre plants par le greening des Indes (souche "pure" de Poona), deux plants par le greening des Philippines (souche de Lipa), deux plants par le greening d'Afrique du Sud (souche "Prétoria" de McLean) et deux plants par le greening de l'île de la Réunion. D'autre part, six orangers non inoculés, deux de la variété Hamlin et quatre de la variété Madame Vinous, ont été utilisés comme témoins sains. A titre comparatif, on a également utilisé quatre orangers de la variété Madame Vinous atteints par la maladie du "Leaf cure", quatre orangers de la variété Madame Vinous infectés par Spiroplasma citri qui est le mycoplasme responsable de la maladie du stubborn des agrumes, et six plants de pervenches (Vinca rosea L.) contaminés par les mycoplasmes de la phyllodie. Pour chaque lot de plants, la moitié a été traitée à la pénicilline G, l'autre moitié a subi les mêmes traitements, mais en l'absence de cet antibiotique. Pour réaliser cette expérience, les plants ont été dépotés et les racines ont été lavées abondamment à l'eau ordinaire. Les plants ont été laissés pendant une heure à racines nues puis ils ont été placés jusqu'au collet dans l'eau ou dans une solution de pénicilline G à 1 g par litre de 17 heures le soir à 10 heures le lendemain matin, soit pendant une durée de 17 heures. Chaque plant a été ensuite rempoté dans du sable blanc des Landes, lavé et stérilisé, contenu dans un pot en matière plastique noir de 10 litres. Un premier traitement a été effectué les 3 et 4 mars 1977, un second traitement dans les mêmes conditions les ler et 2 juin 1977, et enfin un troisième traitement les 12 et 13 juillet 1977. L'arrosage et l'alimentation des plants ont été assurés au moyen d'une solution nutritive appropriée aux agrumes et contenant tous les macro-éléments et les microéléments nécessaires. La solution nutritive des plants ayant été traités à la pénicilline renfermait 0,2 g de pénicilline G par litre pour les arrosages effectués pendant les trois semaines qui ont suivis le premier traitement de trempage des racines nues dans la solution d'antibiotique. L'expérience s'est déroulée en serre climatisée, la température étant maintenue entre 20 et 250C. Pour vérifier que la pénicilline G était bien absorbée et se retrouvait dans les feuilles des plants traités, la pénicilline présente dans les nervures des feuilles a été déterminée au moyen d'un essai biologique utilisant Sarcina lutea, qui est une bactérie très sensible à cet antibiotique. Résultats Les racines d'oranger placées pendant 17 heures dans une solution de pénicilline G à l g par litre ont absorbé cet antibiotique dont la concentration dans les nervures foliaires a atteint, à la fin du traitement, environ 0,02 mg par g de nervures. Six jours après le traitement, on ne détectait plus de pénicilline G dans les plantes Les traitements à la pénicilline G n'ont eu aucun effet ni sur les orangers sains, ni sur ceux atteints de leaf curl, ni sur ceux contaminés par le mycoplasme du stubborn. Aucun effet nta été constaté sur les pervenches atteintes de phyllodie, alors qutun traitement au chlorhydrate de tétracycline a produit une rémission spectaculaiiemais temporaire des symptdmes. En revanche, les orangers atteints de la maladie du greening ont réagi au traitement à la pénicilline G. En effet, onze semaines après le premier traitement, les huit plants traités par la pénicilline avaient émis 269 feuilles apparemment normales sur des pousses nouvelles totalisant 476 cm, alors que les plants témoins non traités n'avaient produit que 31 feuilles sur 251 cm de pousses. A la fin de l'expérience soit 21 semaines après le premier traitement, les plants traités par l'antibiotique avaient émis un total de 377 feuilles normales sur 699 cm de pousses contre 75 feuilles sur 377 cm de pousses pour les plants témoins. La vigueur plus grande des plantes traitées à la pénicilline traduit l'effet de l'anti- biotique sur les racines. En effet à la fin de l'expérience les plantes ont été dépotées pour examiner leurs racines.Dans tous les cas, les plants traités avaient émis un abondant système de racines nouvelles alors que sur les plants témoins le système racinaire était resté médiocre. En conclusion, il apparat que les seuls plants qui ont réagi au traitement par la pénicilline sont ceux atteints par le "greening". L'antibiotique n'a eu aucun effet ni sur les plants sains, ni sur les orangers infectés par le mycoplasme spiralé, Spironlasma citri, ni sur les pervenches infectées par l'organisme de type mycoplasme associé à la phyllodie, ni sur des orangers atteints par le nleaf curl" dont agent est probablement de nature virale. Il en résulte que l'effet bénéfique de la pénicilline dans le cas des plants atteints de greening ne peut s'expliquer que par son action sur le micro-organisme associé au greening si ce procaryote est sensible aux antibiotiques du genre pénicilline-céphalosporine, il doit posséder un peptidoglycane et il doit donc s'agir d'une bactérie. EXEMPLE II Cet exemple illustre le traitement d'agrumes atteints de la maladie du greening par injection d'une solution aqueuse d'un agent selon l'invention dans le tronc des arbres malades. La technique d'injection utilisée consiste à faire pénétrer dans arbre malade deux litres de la solution aqueuse de traitement contenant 3000 ppm dtun dérivé de formule I au moyen de deux bouteilles pouvant être mises sous pression et reliées chacune au tronc de l'arbre par un tuyau souple muni d'un ajutage. Les deux ajutages sont introduits respectivement dans deux orifices symétriques pratiqués de part et d'autre du tronc et sont maintenus dans ces orifices au moyen de barrettes de serrage. Le dispositif utilisé pour ce traitement par injection sera maintenant décrit en référence au dessin annexé, sur lequel - la figure 1 représente un arbre équipé du dispositif de traitement par injection selon l'invention, - la figure 2 représente une bouteille du dispositif de la figure 1 équipée de son tuyau de raccordement, et - la figure 3 représente une vue de dessus des deux barrettes de serrage du dispositif de la figure 1. Le dispositif représenté sur la figure l comprend deux bouteilles 10 et 12 suspendues aux branches d'un arbre 14 à traiter et renfermant chacune une solution aqueuse d'un agent selon l'invention que l'on fait pénétrer dans le tronc de l'arbre malade par l'intermédiaire de deux tuyaux de raccordement 16 et 18 reliés respectivement aux bouteilles 10 et 12. Les bouteilles 10 et 12 ont une capacité de 1,5 litre chacune et sont légèrement transparentes pour pouvoir vérifier le niveau du liquide introduit dans chacune d'elles. Elles sont réalisées en polyéthylène et peuvent supporter une pression interne de 7 kg/cm. La fermeture étanche des bouteilles 10 et 12 est obtenue respectivement par deux fermetures de type "cannette" 20 et 22. Ces fermetures sont couramment emplo yées pour assurer ltobturation des bouteilles de bière ou de boissons gazeuses du même genre. Les bouteilles 10 et 12 sont munies chacunes de moyens permettant d'assurer sa mise sous pression. Ainsi la bouteille 10 est munie d'un raccord 24 équipé d'une valve pour permettre le branchement d'un appareil apte à fournir de l'air soispression (cf Fig. 2). En pratique on peut utiliser un gonfleur pour pneu d'automobile comportant un manomètre de pression de manière à mettre la bouteille sous la pression convenable. Le tuyau 16 relié à la bouteille 10 est un tube en polyéthylène blindé transparent dont une extrémité est montée de façon étanche sur une sortie ménagée dans le fond de la bouteille 10. L'autre extrémité du tuyau 16 est pourvue dtun ajutage mâle 26 destiné à être introduit dans la partie femelle dcun ajutage mixte 28 monté sur une barrette de serrage 30 (cf. Fige. 1 et 3). De même, le tuyau 18 est équipé d'un ajutage mêle destiné à être introduit dans la partie femelle d'un ajutage mixte 32 monté sur une barrette de serrage 36. Les barrettes 30 et 34 sont constituées de deux sections de cornière de longueur identique équipées en leur milieu respectif desdeux ajutages mixtes 28 et 32. Les parties mâles des ajutages mixtes 28 et 32 sont destinées à être introduites respectivement dans deux orifices symétriques pratiqués en opposition de part et d'autre du tronc de l'arbre 14, alors que les parties femelles sont destinées à recevoir par embottement les ajutages mâles prévus aux extrémités des tuyaux 16 et 18. Les parties mêles des ajutages mixtes 28 et 32 sont maintenues dans les orifices pratiqués dans le tronc de l'arbre gracie à des tiges filetées 36 et 38 traversant les barrettes de serrage 30 et 34 et pourvues d'écrous 40, 42, 44 et 46. En disposant les barrettes de serrage 30 et 34 autour du tronc de l'arbre 14 comme représenté sur la figure 1 et en serrant les écrous 40, 42, 44 et 46 on assure le maintien étanche des raccords mixtes 28 et 32 dans les orifices correspondants du tronc de l'arbre 14. Des joints annulaires de caoutchouc 48 et 50 sont insérés entre l'écorce du tronc et le bord des ajutages 48 et 50 pour assurer l'étanchéité et éviter des meurtrissures sur l'écorce. Le dispositif s'utilise de la manière indiquée ciaprès. Tout d'abord on effectue le perçage du tronc en pratiquant deux orifices symétriques de 6 cm de profondeur de part et d'autre du tronc dans l'aubier à laide d'une mèche à bois d'un diamètre de 14 mm. On évite ainsi de pénétrer dans le coeur du bois dont la consistance plus dure rend plus difficile la pénétration et entraîne une usure rapide de la mèche. Les bouteilles sont alors remplies chacune de 1 litre de solution de traitement et sont portées à une pression de 5 kg/cm2, ce qui provoque unelegère augmentation de leur kg/cm , volume qui sous l'effet de la pression atteint 1,75 litre. il suffit alors de brancher les ajutages des tuyaux avec les ajutages mixtes et d'introduire ces derniers dans les orifices du tronc en assurant leur maintien avec les barrettes de serrage. Pour éviter l'introduction d'air sous pression dans les tissus conducteurs de l'arbre, il convient de purger les tuyaux et les ajutages, puis de remplir de solution de traitement les orifices pratiqués dans le tronc avant le branchement, Chaque bouteille 10 et 12 contient une bille de polystyrène expansé destinée à obstruer sa sortie lorsque toute la solution de la bouteille s'est écoulée ce qui évite ainsi une surveillance fastidieuse et des injections d'air accidentelles. La mise en pression des deux orifices du tronc doit autre simultanée car si l'un des deux orifices restait béant pendant que l'autre était en pression, il laisserait suinter du liquide de traitement. Le temps nécessaire au passage des deux litres de solution varie de 15 minutes à 3 heures et est fonction : 1 - de ltétat d'hydratation des arbres (irrigation, heure de la journée) 2 - du niveau de perçage des orifices du tronc. La durée d'injection décroSt selon que les orifices sont pratiqués dans la ligne de greffe, au niveau du greffon ou au niveau du porte-greffe. Les avantages présentés par ce type d'injection sont les suivants : 1) possibilité de remettre en circuit rapidement les bouteilles. 2) homogénéité duiraitement. 3) diminution des risques de dégradation des composés de la solution de traitement. Dans le cas d'une injection par gravité, il faut au moins 24 à 48 heures pour faire absorber 2 litres de solution. L'écart dans le temps d'absorption peut dépasser 2 à 3 jours suivant les sujets. Les performances ne sont guères améliorées à l kg/cm2 de pression. 2 Dans le cas d'une injection à 5 kg/cm de pression initiale les temps obtenus sur 85 arbres ont été de 1H42 en moyenne avec un coefficient de variation de 1,45% seulement. L'agent de l'invention permet de traiter les plants d'agrumes, atteints de la maladie du greening, tels que notamment les plants d'orangers, de citronniers et autres plants de la meme famille. L'agent de l'invention a pour avantage essentiel de notre absolument pas phytotoxique à l'égard des plants traités et d'en disparaitre en quelques jours, ce qui permet de l'utiliser sans risque dans le traitement de la maladie du greening. REVENDICATIONS 1 - Agent de traitement de la maladie du greening des agrumes, caractérisé en ce qu'il contient une quantité efficace dtun dérivé de pénicilline répondant à la formule dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un groupe amino ou un groupe carboxyle. 2 - Agent selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient une quantité efficace d'un dérivé de pénicilline de formule I dans laquelle R représente un atome d'hy- drogène. 3 - Agent selon la revendication I, caractérisé en ce qu'il contient une quantité efficace d'un dérivé de pénicilline de formule I dans laquelle R représente un groupe amino. 4 - Agent selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il contient en outre un agent de synergie. 5 - Agent selon la revendication 4, caractérise en ce que l'agent de synergie est de la streptomycine. 6 - Agent selon l'une des revendications I à 5, caractérisé en ce qu'il est mis sous forme d'une solution aqueuse. 7 - Agent selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est mis sous la forme d'une formulation retard. 8 - Procédé de traitement de plants d'agrumes atteints de la maladie du greening, caractérisé en ce que l'on utilise un agent selon l'une des revendications 1 à 7. 9 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on met le système racinaire des plants à traiter en contact avec une solution aqueuse d'un agent selon ltune des revendications 1 à 7. 10 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on injecte dans le tronc des plants à traiter une solution aqueuse d'un agent selon l'une des revendications 1 à 7.