Brevet FR2406989A1 — publié le 19790525

La présente invention se rapporte a un nécessaire d'essai pour effectuer le diagnostic de la grossesse par dosage immuno-chimique de la gonadotropine chorionique humaine (HCG) dans l'urine. Le diagnostic de la grossesse est basé sur la pos sibilité de mettre en évidence une hormone gonadotrope lutéinisante produite par la cellule de Langhans dans le tissu chorionique du placenta, à savoir la gonadotropine chorionique humaine, présente dans l'urine de la femme enceinte. On contact depuis longtemps des méthodes biologiques de diagnostic de la grossesse qui sont basées- sur l'activité biologique induite chez des animaux auxquels on a administré de l'urine de femme enceinte. Ces essais biologiques nzces- sitent l'utilisation d'animaux particuliers.Parmi cerur-ci, les suivants sont particulièrement répandus : l'essai d'P,schein Zondek, qui est basé sur le fait que la HCG provoque la formation de follicules hémorragiciues et de corps jaunes dans les ovaires de rates impubères ; l'essai de Freidman, qui est basé sur le fait que l'urine de femme enceinte injectée a des lapines pubères provoque la formation de corps hémorràafoue,s dans leurs ovaires ; et l'essai de Galli-Mainini qui est basé sur le fait que l1adminîstration d'urine de femme enceinte provoque l'émission de sperme dans les urines de la crrenouille. Tous ces essais présentent des inconvénients importants dûs au fait qu'ils doivent étre pratiqués par des médecins ou par un personnel convenablement entraîné, oueleur exécution demande plusieurs Jurset qu'ils obligent d sacrifier des animaux. En outre, de nombreux hôpitaux ne sont pas équipés des installations nécessaires pour l'élevage des animaux de laboratoire. Un autre inconvénient grave de ces essais est que les animaux utilisés doivent satisfaire a certaines exigences particulières tes rats doivent être des femelles impubères d'un âge bien détermi né, tandis que les lapines doivent être pubères, et ne pas avoir été en contact précédemment avec des lapins mâles.Enfin lese sai basé sur l'emploi des grenouilles donne en certaines sa## sons des résultats douteux. Pour éviter les nombreux inconvénients que présentent les essais biologiques civdessus, on a mis au point récemment des essais basés sur les propriété immunoo logiques de 1'HCG. Ces méthodes immunologfques de détection dans les urines de la présence éventuelle de l'hormone gonadotropine chorionique sont basées sur le fait que les bactéries, les particules collovdales ou les érythrocytes sur lesquels l'antigène HCG soluble est absorbé ou lié s'ils sont mélangés dans un rapport déterminé avec l'ante sérum spécifique anti-HCG, donnent lieu à une reaction"d'ag- glutination passives qui, dans le cas oh la partie corpusculaire est constituée d'érythrocytes, prend le nom d'hêmoagglu- tination. Si l'on ajoute dans un tube d essais a fond hémis phérique contenant les érythrocytes sensibilisés avec de 1'HCG et mélangés a l'antisérum anti-HCG de l'urine de femme enceinte, l'HCG libre contenue dans l'urine entre en concurence avec l'anti-sérum, inhibant la réaction d'hémoag- glutination. Il en résulte que les érythrocytes non agglutinées par l'anti-serum sédimentent librement en formant un anneau caractéristique au fond du tube (réaction positive). Par ailleurs, l'addition d'urine d'une femme non enceinte et ne contenant donc pas a'HCG libre n'a aucune influence sur la réaction d'hêmoagglutination, et les érythrocytes agglutines sédimentent en une couche homogène (c'est-à-dire sans former d'anneau caractéristique) au fond du tube (réaction négative). L'apparition du dépit annulaire typique peut donc être utilisée pour déterminer l'existence d'un état de grossesse éventuel. Depuis quelque temps, on peut se procurer facilement des réactifs pour essais imumurologiques sous forme de comprimés ou de pastilles solides qui contiennent un réactif à une concentration bien définie et qui sont complètement non-réactifs jusqu'à ce qu'ils soient dissous et mis en con-. tact avec la substance liquide a déterminer. En mettant CI profit le fait que ces réactifs sont disponibles, on a pu dernièrement mettre sur le marché des nécessaires a diagnostic "autonomes" pour effectuer le diagnostic de la grossesse au moyen du dosage immuns chimique de 1'HCG, le terme autonome signifiant que le nécessaire comprend tous les appareils Crécipients de verre, compte-gouttes etc) et les réactifs nécessaires pour 1 'exécu- tion de l'essat. En particulier, on a mis dans le commerce des nécessaires appropriés a l'usage des utilisateurs ordinaires qui peuvent ainsi, méme s' ils sont totalement dépourvus de toute connaissance médicale, effectuer l'essai en suivant les instructions données avec des résultats dignes de foi. Par exemple, le brevet US 3.579.306 décrit un nécessaire autonome pour déterminer la présence de l'hormone de la grossesse comprenant a la fois un récipient transparent muni d'un couvercle également transparent et présentant des parois latérales suffisamment hautes pour que l'on puisse introduire dans le couvercle, lorsque celui-ci est éloigné et retourné, un échantillon d'urine, un miroir plan incliné placé au fond du récipient, reposant par un bord sur le fond adjacent à la paroi frontale du récipient et s'étendant diagonalement à travers le récipient, son bord supérieur éloigné du fond s'appliquant contre la paroi postérieure du récipient et un tube a essai a col fileté sur lequel peut être vissé un bouchon dont la paroi latérale interne porte elle aussi un filetage approprié. Le tube a essais transparent contient un comprimé solide d'érythrocytes sensiblisês avec de la gonadotropine chorionique humaine, un comprimé solide d'anti-sérum de la gonadotropine chorionique humaine et un comprimé solide d'un tampon. Le nécessaire comprend en outre un cpmpte-gouttesmuni de deux repères de niveau, celui du dessous indiquant la quantité d'urine a prélever, et celui du dessus la quantité d'eau (servant de solvant aux réactifs ci-dessus) a prélever. Le récipient transparent renferme en outreune plaquette transparente pour maintenir ce tube t une certaine distance au-dessus du miroir, de façon que les résultats de l'essai réalisé a l'intérieur du récipient en ajoutant l'urine aux réactifs contenus dans le tube a essais soient réfléchis a travers la paroi antérieure du récipiént et soient visibles a l'extérieur du récipient. Les nécessaires d'essai basés sur l'utilisation des réactifs ci-dessus contenus dans des tubes a essais ou des flacons munis de bouchons sont cependant peu satisfaisants, car ce type de bouchage non hermétique du tube x essais ou du flacon constitue une voie d'accès possible a l'humidité, laquelle peut avoir une influence défavorable sur la conservation du nécessaire d'essai. Cet inconvénient peut se manifester en particulier lorsque les réactifs contenus dans les tubes ou flacons sont très hygroscopiques, comme c'est le cas pour les réactifs lyophilisés. Un autre inconvénient des récipients d'essai actuellement utilisés pour effectuer le diagnostic de grossesse est la spécificité insuffisante, qui n'est pas, comme il serait souhaitable, strictement et uniquement liée a la gonadotropine chorionique humaine, mais également a la présence dans certaines conditions physiologiques d'autres hormones (telles que l'hormone LH) qui pourraient interfgrer avec un essai de sensibilité trop élevé , en conduisant a des résultats douteux ou considérés a tort comme positifs.D'autre part, une très grande spécificité des réactifs est une condition absolument nécessaire lorsqu'on désire avoir un essai très sensible, c'est-a-dire fournissant un résultat sûr dans le délai le plus bref possible entre la fécondation et le moment oh l'on effectue l'essai. Un autre inconvénient des nécessaires pour le diagnostic de la grossesse se trouvant actuellement dans le commerce est le temps, généralement non inférieur à au moins deux heures, qui s'écoule entre le mélange des réactifs avec l'échantillon d'urine et la formation du déport. Etant donné que durant ce laps de temps le tube a essai contenant les réactifs et l'echan- tillon d'urine doit rester absolument immobile et ne pas entre soumis a des chocs ou a des vibrations qui pourraient compromettre la fiabilité de l'essai, il est évident qu'il serait souhaitable de disposer d'un nécessaire permettant d'établir le résultat de l'essai dans un temps nettement plus court que celui indiqué ci-dessus. Le but général de la présente invention est donc de fournir un nécessaire pour l'essai diagnostique de la grossesse par dosage imnuno-ch#m#tque de la gonadotropine chorio- nique humaine dans l'urine qui ne présente aucun des inconvé- nients indiqués ci-dessus. En particulier, l'invention concerne un nécessaire du type ci-dessus dans lequel les réactifs ne risquent pas d'entrer en contact avec l'humidité même pendant des durées très prolongées, c' est-â-dire un nécessaire de longue conservation. L'invention fournit également un nécessaire du type ci-dessus danslequel le temps s'écoulant entre le mélange des divers réactifs avec l'échantillon d'urine et la formation du dépôt est nettement réduit par rapport a celui pouvant être obtenu avec les nécessaires connus, puisqu'il est abaissé à environ une heure seulement. Conformément à l'invention, on fournit un nécessaire pour effectuer le diagnostic de grossesse par dosage immunochimique de la gonadotropine chorionique humaine qui comprend a) un conteneur en forme de boite comprenant un certain nombre de logements pour au moins un compte-goutte et au moins deux flacons, des moyens pour soutenir un flacon verticalement par rapport au fond de ce conteneur et un miroir au fond de ce conteneur en forme de boîte placé sur des moyens de support, grâce auquel le résultat de l'essai effectué a l'intérieur du flacon est réfléchi a l'extérieur du conteneur en forme de boîte b) au moins un flacon transparent contenant un échantillon solide d'érythrocytes sensibilisés par 1'HCG et un échantillon solide d!anti-sérum anti-HCG, ce flacon transparent ayant un volume suffisant pour recevoir un échantillon d'urine a analyser et un solvant des échantillons d'érythrocytes et d'anti-sérum, et qui est caractérisé essentiellement en ce que (1) ce flacon transparent contient, en couches successives a partir du fond de ce flacon, une couche d'anti-sérum lyophilisé en solution tampon avec un support de saccharose et une couche d'érythrocytes humains sensibilisés avec de 1'HCG, sur support de saccharose et lyophilisés et (2) il comprend en outre au moins un flacon contenant la dose de solvant nécessaire pour reconstituer le liophylisat, de préférence 0,4 ml d'eau distillée. Selon un mode de réalisation préféré, le rapport volumique entre la couche d'anti-sérum lyophilisé et la couche d'érythrocytes humains sensibilisés par 1'ZCG lyophilisé est d'environ 3:1. Par exemple, le volume de la couche d'anti-sérum lyophilisé sera d'environ 0,3 ml, tandis que le volume de la couche d'érythrocytes humains sensibilisés par 1'HCG lyophilisé sera de 0,1 ml. Le conteneur en forme de botte pour l'exécution de 11 essai sera de préférence celui décrit dans la demande de brevet pour modèle d'utilité italien nj 21431 B/77, déposée au non de la demanderesse de la présente invention le 30 mai 1977. En ce qui concerne les réactifs, c'est- -dire les érythrocytes humains sensibilisés avec de 1'HCG humaine et l'anti-serum anti-HCG, alors que les premiers sont préparés par des techniques connues (on se référera par exemple au brevet US 3 548 051, qui est incorporé au présent mémoire a titre de référence), l'anti-serum anti-HCG est préparé par un procédé qui est décrit dans la demande de brevet déposée le même jour que la présente demande par la demanderesse, et intitulée "Procédé de préparation d'un anticorps anti-HCG, en particulier pour le diagnostic de la grossesse, Cette demande de brevet est incorporée à la présente demande a titre de référence. Comme il a été indiqué precedemment, les er dzxsytes humains sensibilisés avec de l'nCG.=,ont iyo#hilisés tout comme le sérum anti - HCG . On a trouvé qu'il était commode d'opérer de la façon suivante : dans le flacon qui sera hermétiquement fermé par la suite, et dont le contenu restera donc a l'abri de l'atmosphère et de l'humidité jusqu'au moment de l'utilisation, on introduit d'abord le volume désiré d'anti-sérum en solution tampon avec du saccharose comme support. On congèle cette solution. Sur la couche congelée, on dépose le volume désiré de suspension d'érythrocytes humains sensibilisés avec de 1'HCG et sur support de saccharose. On congèle également cette suspension et l'on obtient une seconde couche. On procède ensuite a la lyophilisation du flacon et a sa fermeture hermétique par les techniques traditionnelies. REVENDICATIONS 1. Nécessaire diagnostique pour effectuer le diagnostic de la grossesse par dosage #x#imuno-chimique de la gonadotropine chorionique humaine dans l'urine, comprenant a) un conteneur en forme de botte comprenant un certain nombre de logements pour au moins un compte-goutte et au moins deux flacons, des moyens permettant de soutenir verticalement un flacon par rapport au fond du conteneur en forme de botte et un miroir sur le fond de ce conteneur en forme de botte placé sur ces moyens de support, grâce auquel le résultat de l'essai effectué dans le flacon est réfléchi par le miroir de façon a être visible a l'extérieur du conteneur en forme de botte ;; b) au moins un flacon transparent contenant un échantillon solide d'érythrocytes sensibilisés par de 1'HCG et un échantillon solide d'anti-sérum anti-HCG, ce flacon transparent ayant un volume suffisant pour recevoir un échantillon d'urine a analyser et le solvant des échantillons d'érythrocytes et d'anti-sérum, caractérisé essentiellement en ce que : 1) ce flacon transparent contient, superposées a partir du fond de ce flacon, une couche d'anti-sérum lyophilisé en solution tampon sur support de saccharose et une couche d'érythrocytes humains sensibilisés par 1'HCG sur support de saccharose et lyophilisés, et 2) il comprend en outre au moins un flacon contenant la dose de solvant nécessaire pour la reconstitution du lyophilisat, de préférence 0,4 ml d'eau distillée. 2. Nécessaire suivant la revendication 1, caractérisé en ce que dans ce flacon transparent le rapport volumique entre la couche d'anti-sérum lyophilisé et la couche d'érythrocytes sensibilisés avec de 1'HCG lyophilisé est d'environ 3 : 1. 3. Procédé de fabrication du flacon transparent suivant la revendication 1, caractérisé en ce que - on introduit dans un flacon un volume prédéterminé d'anti-sérum anti-HCG en solution tampon avec du saccharose comme support, - on congèle cette solution, ce qui donne une première couche, - on introduit sur cette première couche un volume prédéterminé de suspension d'érythrocytes sensibilisés avec de 1'HCG et sur support de saccharose, - on congèle cette suspension, ce qui donne une seconde couche, - on lyophilise les couches congelées prEcédemnent obtenues, et - on bouche hermetiquement le flacon.