Brevet FR2420572A1 — publié le 19791019

La présente invention concerne le domaine de la détection des staphylocoques dorés pathogènes,et plus particulièrement un procédé pour l'obtention d'un réactif pour le diagnostic de tels staphylocoques. Elle concerne également le réactif obtenu. Actuellement, le test de routine utilisé dans les laboratoires de diagnostic pour la caractérisation de Staphylococcus Aureus est la recherche de la coagulase libre. La réponse à ce test est généralemexitobtenue dans un délai allant de 30 minutes à 24 heures. Les souches de Staphylococcus Aureus comportent en général, à leur surface, une protéine particulière, la protéine A. Cette protéine A est un constituant spécifique de Staphylococcus Aureus qui est capable de se fixer aux immunoglobulines G. On a déjà proposé d'utiliser la technique d'hémagglutination passive pour détecter la présence de la protéine A. Cette technique d'hémagglutination consiste à utiliser des suspensions de globules rouges de mouton, frais ou formolés, sensibilisés par des anticorps anti-globules rouges. A cet effet, on peut se référer aux articles ci-après 1) "Sensitized sheep red cells as a reactant for Staphylococcus Aureus Protein A" de Sten WINBLAD et al. (Acta Path. microbiol. Scand. Section B 81, 150-156,1973), 2) "Détection de la protéine A de Staphylococcus Aureus par hémagglutination conditionnée " J.P. FLANDROIS et al. (Ann. Biol. Cli. 1975, 33, 365-368). Les suspensions de globules rouges frais et sensibilisés ne sont pas stables et doivent donc être utilisées rapidement après leur préparation. Au contraire, les suspensions de globules rouges formolés sont plus faciles à conserver, mais leur sensibilité est moins bonne. A la connaissance du déposant, il n'existe pas de réactif pour la technique d'hémagglutination qui soit à la fois stable à la conservation et d'une sensibilité élevée. On a maintenant trouvé un procédé d'obtention d'un réactif stable et d'une sensibilité élevée pour le dosage de Staphylococcus Aureus par la technique d'hémagglutination. Le procédé selon la présente invention consiste 1) à sensibiliser des globules rouges d'une espèce animale quelconque avec un sérum contenant des immunoglobulines réactives vis-à-vis de la protéine A et ayant une activité anti-globules rouges de ladite espèce animale; 2) à ajouter, après la sensibilisation, du glutaraldéhyde à la préparation résultant de l'étape 1) et 3) éventuellement, à lyophiliser la préparation ainsi obtenue. I1 est connu que le glutaraldéhyde est un agent de couplage des protéines. A cet effet, on peut se référer aux articles ciaprès The Crosslinking of proteins with glutaraldehyde and its use for the preparation of immunoadsorbents" de S. AVRAMEAS et al. Immunochemistry, 1969 vol. 6 pp. 53-66; "Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehyde" de S. AVRAMEAS, Immunochemistry, 1969, p. 43-52. Le glutaraldéhyde n'a toutefois jamais été utilisé, à la connaissance du déposant, pour la préparation de réactif pour détecter la protéine A, c'est-à-dire pour caractériser les staphylocoques. Par ailleurs, il faut noter que le procédé de couplage à l'aide de glutaraldéhyde selon l'art antérieur ci-dessus consiste à mettre en présence les substances à coupler et, immédiatement après, à ajouter du glutaraldéhyde goutte à goutte, c'est-à-dire à ajouter le glutaraldéhyde pendant l'étape de sensibilisation. On a trouvé, de façon inattendue, que l'on peut obtenir un réactif pour le diagnostic des staphylocoques qui est stable à la conservation et qui possède une sensibilité élevée en ajoutant du glutaraldéhyde en quantité déterminée à une suspension de globules rouges sensibilisés, dès que la sensibilisation est terminée. L'étape de sensibilisation des globules rouges est une étape classique qui consiste à ajouter à des globules rouges frais d'une espèce animale donnée un sérum anti-globule rouge de ladite espèce animale et contenant des immunoglobulines G réactives visà-vis de la protéine A. Le temps de sensibilisation est fonction de la température à laquelle est réalisée cette sensibilisation. I1 sera aise à l'homme de l'art de déterminer ce temps en fonction de la température. Toutefois, on indiquera à titre d'exemple que la sensibilisation de tous les globules rouges est généralement atteinte en 1 à 2 heures environ lorsqu'on opère à une température comprise entre environ 37 et 400 C. On peut par exemple utiliser comme globules rouges des globules rouges de mouton et, à titre de sérum, un sérum de lapin anti-globules rouges de mouton. La quantité de sérum à utiliser est déterminée par rapport au titre hémagglutinant dudit sérum. Le titre hémagglutinant est la plus faible dilution du sérum qui provoque une hémagglutination; cette dilution correspond à une unité hémagglutinante. On utilise en général un sérum ayant un titre hémagglutinant de 2 à 4 unités hémagglutinantes, de préférence 3 unités hémagglutinantes, par ex 'emple sous un volume de 6 ml environ. On opère en général en présence d'un tampon physiologique, par exemple le tampon Mayer. Selon un mode préféré de mise en oeuvre du procédé de l'invention, on opère la sensibilisation pendant environ 1 à 2 heures, de préférence environ 1 heure 30 minutes, à une température comprise entre environ 37et 400C, de préférence 400C environ. Lorsque la sensibilisation est terminée, on ajoute ensuite du glutaraldéhyde en quantité suffisante pour que la sensibilité du réactif soit correcte et que ce dernier puisse être conservé. Des quantités de glutaraldéhyde allant d'environ 0,0025 à 0,01% (volume/volume) de la suspension de globules rouges sensibilisés conviennent aux fins de l'invention. Après l'addition de glutaraldéhyde,on maintient avantageusement la préparation ainsi obtenue à une température de 37 à 400C environ pendant environ 10 à 15 heures. Selon l'invention, il est essentiel que l'addition de glutaraldéhyde soit effectuée lorsque la sensibilisation est terminée. En effet, des essais ont montré que lorsque l'addition deglutaraldéhyde est effectuée pendant l'étape de sensibilisation, le réactif obtenu présente une sensibilité moins élevée,de sorte qu'il ne convient pas pour le type de dosage considéré. Par ailleurs, la quantité de glutaraldéhyde mise en oeuvre est importante. Des essais ont en effet montré qu'il était nécessaire de choisir la quantité de glutaraldéhyde dans la gamme ci-dessus mentionnée afin d'assurer la stabilité du réactif tout en conservant au maximum sa sensibilité. Sans vouloir pour autant se lier à une quelconque théorie, on pense que les immunoglobulines G, qui sont les anti-globules rouges contenus dans le sérum mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention, se fixent au cours de la sensibilisation aux globules rouges par l'intermédiaire de leurs fragments Fab. Lorsque le glutaraldéhyde est ajouté selon le procédé de l'invention, on ne modifie vraisemblablement pas l'orientation des fragments Fc. Dans ces conditions, il n'y a donc pas distorsion des molécules de gamma-globulines et leurs fragments Fc conservent toutes les possibilités de réactivité pour la protéine A. On sait en effet que la protéine A est capable de se fixer aux immunoglobulines G, non pas par l'intermédiaire des fragments Fab impliqués normalement dans les réactions antigène-anticorps, mais par l'intermédiaire des fragments Fc de ces immunoglobulines G. Le réactif obtenu selon le procédé de l'invention peut être utilisé tel quel ou lyophilisé. On a trouvé que sa sensibilité maximale, c'est-à-dire la vitesse de la réaction et la taille des agglutinats, est obtenue avec une concentration de glutaraldéhyde de 0,005% (volume/volume). Cependant, à cette concentration, les globules rouges sont hémolysés après lyophilisation. On a déterminé qu'une quantité de 0,0075% (volume/volume) de glutaraldéhyde était nécessaire pour qu'il ne se produise pas d'hémolyse après lyophilisation dans les condi tisons de lyophilisation ci-après. La lyophilisation est réalisée selon un mode opératoire classique qui comprend une première étape de congélation et une seconde étape de sublimation sous vide. On utilise avantageusement comme support de lyophilisation le support "Mayer" additionné d'albumine bovine (lX en poids/volume). Le réactif ainsi obtenu est stable à la conservation et permet de réaliser le diagnostic de StaPhylococcus Aureus en un temps très rapide, environ 30 secondes. Le réactif selon l'invention peut être caractérisé par une réaction d'hémagglutination à l'aide d'un sérum anti-Fc des immunoglobulines. On peut utiliser à cet effet un sérum anti-Fc des immunoglobulines de lapin. La présente invention va être maintenant illustrée par les exemples non limitatifs ci-après EXEMPLE 1 Préparation du réactif selon l'invention a) Sensibilisation des globules rouges On a utilisé des globules rouges frais de mouton; on les a lavés. A 0,4 ml du culot de globules rouges, on a ajouté 9 ml de tampon Mayer et 6 ml de sérum hémolytique de l'institut Pasteur (3 unités hémagglutinantes) au 1/100. La sensibilisation a été réalisée à 40 C pendant 1 heure 30. b) addition de glutaraldéhyde On a ensuite ajouté du glutaraldéhyde à la suspension de globules rouges sensibilisés et on a maintenu le mélange pendant une nuit à 400 C. Les quantités de glutaraldéhyde utilisées allaient de 0,0025 à 0,01% (en volume par rapport au volume final). On a ensuite lyophilisé les réactifs ainsi obtenus et on a déterminé s'il y avait hémolyse ou non. Les résultats sont indiqués dans le tableau ci-après : % de glutaraldéhyde : hémolyse après : dans le réactif : lyophilisation . (volume/volume) . : 0,0025 oui : 0,0050 oui : 0,0060 oui 0,0075 non : 0,010 non EXEMPLE 2 Utilisation du réactif obtenu selon l'exemple 1 pour la détection de la protéine A. On a utilisé 686 souches, dont 589 souches humaines et 97 souches bovines. Parmi les souches humaines il y avait 139 souches coagulase positive et 459 souches coagulase négative. Les souches bovines comprenaient 52 souches coagulas positive et 45 souches coagulase négative. Dans le tableau I ci-après on a donné la corrélation des caractères coagulase libre et protéine A pour ces 686 souches. Avec les souches coagulase négative, le test d'hémagglutination réalisé avec le réactif selon l'exemple 1 s'est révélé négatif. Par contre, avec les souches coagulase positive, le test d'hémagglutination réalisé avec le réactif de l'exemple 1 était positif dans pratiquement tous les cas.Le réactif selon l'invention permet donc de détecter très rapidement l'espèce Staphylococcus Aureus dans au moins 85% des cas. Le test d'hémagglutination consiste à dissocier une colonie de la bactérie à tester,provenant d'une culture de 16 à 24 heures, dans environ 20 microlitres de réactif selon l'invention. L'hémagglutination survient en moins d'une minute. La culture est réalisée sur un milieu approprié. I1 faut noter à cet effet que les milieux hypersalés, tels que le milieu de "Chapman" ne conviennent pas parce qu'ils réduisent la production de protéine A. TABLEAU I CORRELATION DES CARACTERES COAGULASE LIBRE ET PROTEINE A POUR LES 686 SOUCHES DE STAPHYLOCOQUES EXAMINEES ORIGINE DES SOUCHES Nombre de Protéine A liée détectée par hémagglutination souches positive négative Souches humaines 589 Coagulase positive 139 133 6 Coagulase négative 450 0 450 Souches bovines 97 Coagulase positive 52 44 8 Coagulase négative 45 0 45 REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'un réactif pour le diagnostic de Staphylococcus Aureus, caractérisé en ce qu'il consiste 1) à sensibiliser des globules rouges d'une espèce animale quelconque avec un sérum contenant des immunoglobulines réactives vis-à-vis de la protéine A et ayant une activité anti-globules rouges de ladite espèce animale, 2) à ajouter à la préparation ainsi obtenuewet après sensibilisation,du glutaraldéhyde, et 3) éventuellement, à lyophiliser la préparation ainsi obtenue. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape de sensibilisation est réalisée à une température comprise entre environ 37 et 400C pendant environ 1 à 2 heures. 3.Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la préparation obtenue à l'étape (2) est maintenue à une température de 37 à 400C environ pendant environ 10 à 15 heures. 4. Procédéselon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la température dans les étapes 1) et 2) est de 400C et en ce que la quantité de glutaraldéhyde est comprise entre 0,0025% et 0,01% (volume/volume). 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les globules rouges sont des globules rouges de mouton et en ce que le sérum utilisé pour la sensibilisation est du sérum de lapin anti-globules rouges de mouton. 6. Réactif pour le diagnostic de Staphylococcus Aureus obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 7. Réactif pour le diagnostic de Staphylococcus Aureus, caractérisé en ce qu'il est obtenu par le procédé qui consiste 1) à sensibiliser des globules rouges d'une espèce animale quelconque avec un sérum contenant des immunoglobulines réactives vis-à-vis de la protéine A et ayant une activité anti-globules rouges de ladite espèce animale, 2) à ajouter à la préparation ainsi obtenue,et après sen sibilisation, du glutaraldéhyde et, 3) éventuellement, à lyophiliser la préparation ainsi obtenue. 8. Réactif selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il est obtenu par le procédé qui consiste 1) à sensibiliser des globules rouges d'une espèce animale quelconque avec un sérum contenant des immunoglobulines réactives vis-à-vis de la protéine A et ayant une activité anti globulesrouge de ladite espèce animale, ladite sensibilisation étant réalisée à une température comprise entre 37 et 400C pendant environ 1 à 2 heures; 2) à ajouter à la préparation ainsi obtenue du glutaraldéhyde etAmaintenir ladite préparation pendant 10 à 15 heures à une température comprise entre 37 et 400C; et 3) éventuellement, à lyophiliser la préparation ainsi obtenue. 9. Réactif, selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il provoque une réaction d'hémagglutination en présence d'un sérum anti-Fc d'immunoglobulines.