Brevet FR2415639A1 — publié le 19790824

L'invention concerne un procédé de préparation d'antigène de surface de l'hépatite B (en abrégé HBsAg). La matière première du HB5Ag purifié de l'invention est un liquide contenant du HBsAg. Le liquide peut être tout liquide biologique humain contenant du HB5Ag, par exemple le plasma, la salive, les extraits fécaux, les sécrétions rhino-pharyngées, la bile le liquide céphalo-rachidien, la sueur, l'urine, le sperme, les sécrétions vaginales ou le sang menstruel. On obtient le plasma de façon classique, par exemple par plasmaphorèse. Le taux de HBSAg dans le liquide biologique humain peut être mesuré de façon connue par tous moyens appropriés, par exemple par hémagglutination passive renversée ou fixation du complément. Quand le liquide biologique est le plasma, on peut le traiter directement ou le refroidir et on peut éliminer par une légère centrifugation le cryoprécipité qui se forme, ou bien on peut aJouter du CaCl2 pour éliminer le fibrinogène et clarifier. On traite le liquide obtenu par le sulfate d'ammonium et on isole le HB8Ag dans le liquide obtenu, par une étape de striation iso pycnique suivie d'une étape de striation zonale de vitesse. Dans la striation isopycnique, on met en contact le concentré partiellement purifié avec un milieu liquide présentant un gradient de masse volumique qui comprend la densité de l'antigène spécifique à isoler. On soumet alors le milieu liquide à l'ultracentrifugation pour atteindre une distribution d'équilibre des constituants du sérum dans le gradient de masse volumique conformément à leur masse volumique individuelle. On déplace des fractions successives du milieu et on sépare celles qui contiennent l'antigène désiré, c'est-à-dire les fractions ayant une masse volumique d'environ 1,21 à 1,24 g/ml. L'application de cette technique à la purification du HB5Ag est décrite dans la demande de brevet allemand publiée 2 049 515 et le brevet des E.U.A. nO 3 636 191.On choisit les concentrations des solutions formant le gradient de manière à embrasser la gamme de masses volumiques d'environ 1,0 à 1,41 g/ml. On peut utiliser le milieu liquide sous la forme d'un gradient linéaire ou d'un gradient échelonné. De préférence, on l'utilise sous la forme d'un gradient échelonné, étant donné sa plus grande capacité inhérente de fractionnement. Dans la striation zonale de vitesse, on soumet le concentré partiellement purifié à l'ultracentrifugation en contact avec un milieu liquide présentant un gradient de densité mais en utilisant cette fois la technique zonale de vitesse, c'est-àdire à une vitesse et pendant un temps tels que l'équilibre ne soit pas atteint, le HBSAg et les autres constituants résiduels du sérum se distribuant dans le milieu selon leurs coefficients de sédimentation dans le milieu. On choisit les concentrations des solutions formant le gradient échelonné de manière à embrasser la gamme de masses volumiques de 1,0 à 1,28 g/ml environ. On conduit l'étape zonale de vitesse jusqu'à ce que le HBsAg réside dans la région de masse volumique de 1,13 à 1,16 g/ml. A ce moment, le HBSAg se sépare du gros des protéines brutes du plasma et, chose plus significative, il se sépare aussi du complément macroglobuline du plasma. Si l'on conduit l'étape zonale de vitesse de façon telle que l'antigène HBSAg désiré atteigne sa position d'équilibre, c'est-à-dire environ 1,18 à 1,20 g/ml, on a trouvé qu'une fraction macroglobuline du plasma apparatt comme impureté dans la fraction désirée d'antigène HBsAg . Les milieux liquides utilisés dans l'étape de striation isopycnique peuvent avoir tout gradient de densité dans les gammes appropriées. Les solutés antérieurs destinés à ces solutions comprennent par exemple le sucrose, le bromure de potassium, le chlorure de césium, le tartrate de potassium etc. On conduit avantageusement l'étape de striation isopycnique dans une centrifugeuse, par exemple 1,Electronucleonics-K", en remplissant de sérum physiologique le rotor fixe puis en déplaçant successivement le sérum physiologique vers le haut par des portions d'une solution de milieu liquide de masse volumique croissante jusqu'à formation d'un gradient échelonné. On introduit le plasma au sommet du rotor et il déplace de bas en haut une partie de la solution de plus grande masse volumique. Typiquement, le volume du plasma représente environ 15 à 40% de celui du gradient échelonné. On porte la centrifugeuse à la vitesse voulue grace à un système programmé de commande de vitesse qui empêche un mélange pendant la phase initiale de réorientation. Lorsque l'équilibre est atteint et que le produit est dans sa po sition voulue de densité, on ralentit le rotor grâce au même système pour empêcher le mélange lors de la réorientation à la configuration primitive. Puis on vidange le gradient par le bas et on recueille la fraction de masse volumique voulue. On applique une technique similaire dans la triation zonale de vitesse. La fraction de densité voulue donnée par la striation zonale de vitesse est le concentré désiré d'antigène d'hépatite B. Etant donné la petite dimension du HBsAg, environ 20 nm, l'étape de striation isopycnique prend beaucoup de temps, soit environ 18 heures de centrifugation. Par suite, même en opérant 24 heures par jour 7 jours par semaine, il est seulement possible de traiter environ 4 lots par centrifugeuse par semaine. On peut augmenter la productivité, évidemment, en utilisant des centrifugeuses supplémentaires. Toutefois, cela implique un investissement considérable étant donné que chaque centrifugeuse est très coûteuse. On a trouvé maintenant que l'on obtient des accroissements notables de productivité et un coût de fonctionnement notablement réduit en traitant le liquide biologique humain par le sulfate d'ammonium avant de le soumettre à des conditions de striation isopycnique. La quantité de sulfate d'ammonium utilisée doit être au moins suffisante pour précipiter pratiquement tout le HBSAg du liquide tout en évitant de précipiter une matière pro téinée supplémentaire indésirable. Grace à cette précipitation, on peut soumettre le HBsAg provenant de plusieurs litres de liquide à la striation isopycnique en un seul lot alors que sans précipitation par le sulfate d'ammonium, on ne peut soumettre à la striation isopycnique qu'une quantité beaucoup moindre de liquide en.un seul lot. Généralement, quand le liquide biologique est un plasma, on utilise environ 200 à 250 g de sulfate d'ammonium par litre de plasma et de préférence environ 225 g/l. Les quantités moindres ne précipitent pas tout le HBsAg tandis que de plus grandes quantités précipitent une matière protéinée supplémentaire indésirable. Quand le liquide est le plasma, avec la précipitation par le sulfate d'ammonium le HBsAg contenu dans 20 litres environ peut être soumis à la striation isopycnique en un seul lot ; sans précipitation par le sulfate d'ammonium, on ne peut soumettre à la striation isopycnique qu'environ 1,5 litre de plasma. Après avoir ajouté le sulfate d'ammonium, on agite le liquide pour faciliter la dissolution du sulfate d'ammonium. De préférence, on agite le liquide au moins 3 heures environ à une température abaissée -qui est d'environ O à 100C, de préférence d'environ 50C, et de préférence pendant au moins 4 heures environ. Une agitation dépassant 4 heures environ n'est pas nuisible. On recueille par centrifugation le précipité qui se forme, on remet les grains en suspension dans du sérum physiologique et on les dialyse contre du sérum physiologique pour éliminer le sulfate d'ammonium. On soumet alors le concentré liquide obtenu à une striation isopycnique en utilisant une matière à gradient ayant une gamme de masse volumique permise d'environ 1,1 à 1,4 g/ml. On dialyse le produit de striation isopycnique contre du PBS solution tampon au phosphate) pour éliminer la matière à gradient si elle est dialysable. On soumet alors le produit à une striation zonale de vitesse Jusqu'à ce que le HBSAg se situe dans la gamme de masse volumique d'environ 1,13 à 1,16 g/ml. On peut utiliser toute matière à gradient qui donne cette gamme de masse volumique et qui est physiologiquement tolérée. Typiquement, cette striation prend de 16 à 20 heures environ, de préférence de 17 à 18 heures environ, à environ 30 000 tours/mn. Aux plus grandes vitesses il faut moins de temps et aux moindres vitesses il faut davantage de temps. Selon un aspect préférentiel de l'invention, la matière à gradient est formée de bromure de sodium. A la différence des matières utilisées antérieurement, le bromure de sodium a de nets avantages. La solubilité du bromure de sodium permet d'utiliser des solutions de forte densité dans la formation de gradients aux températures du réfrigérateur (2 à 60C). Il y a de nets avantages économiques à utiliser le bromure de sodium plutôt qu'un sel tel que le chlorure de césium, outre qu'on n'a pas à lutter contre la toxicité que présentent pour l'homme les ions césium résiduels et liés au HBSAg. Dans une matière à gradient formée de bromure de sodium, tous les ions liés au HB 5Ag par suite de caractéristiques biophysiques sont des ions sodium qui sont très compatibles avec le système biologique humain et ne posent aucun problème de toxicité. La solubilité du NaBr qui est supérieure à celle du KBr à basse température permet d'utiliser des températures abaissées plus favorables à la stabilité des matières biologiques. L'utilisation d'un gradient échelonné plutôt que linéaire est préférable étant donné que les impuretés s'accumulent ainsi aux limites d'échelons et que cela permet de traiter un plus grand volume de plasma dans une seule matière à gradient. L'exemple suivant illustre l'invention sans toutefois la limiter. Exemple On filtre 20 litres de plasma darifié provenant de donneurs ayant souffert d'hépatite B sur un filtre de 293 mm contenant une membrane filtrante AP 20 ('Millipore"). On aJoute au filtrat 4,53 kg de sulfate d'ammonium puis on agite doucement une nuit à 50C. On recueille le précipité formé par centrifugation discontinue à 7000 G pendant 30 mn enttilisant le rotor JA-lO (capacité 3 litres par lot). On met en suspension les grains obtenus après centrifugation dans environ 2,25 litres de sérum physiologique. On dialyse alors la suspension concentrée contre 40 litres de sérum physiologique pour éliminer le sulfate d'ammonium. On introduit 8400 ml de tampon phosphate dans le rotor d'une centrifugeuse "Electronucleonics K". Après avoir fait fonctionner le rotor jusqu'à 10 000 tours/mn pour dégazer le système, on pompe dans le fond du rotor immobile la matière de gradient échelonné suivante 1) 2000 ml de NaBr à 1096, = 1,08 2) 1000 ml de NaBr à 20%, p - 1,17 3) 1500 ml de NaBr à 30%, p = 1,28 4) 3900 ml de NaBr à 4046, p . 1,41. On refoule la suspension dialysée contenant HBsAg, à raison de 2250 ml, dans le haut du rotor immobile en déplaçant 2250 ml de NaBr à 40% du bas du rotor. On accélère le rotor Jusqu'à 30 000 tours/mn et on le fait marcher à cette vitesse pendant 18 heures. Après avoir arrêté le rotor, on recueille 2000 ml de matière riche en HBSAg dans la région de masse volumique de 1,21 à 1,24 g/ml et on la dialyse contre un tampon phosphate. On remplit alors le rotor de tampon phosphate dégazé comme ci-dessus et on pompe dans le bas du rotor immobile la matière de gradient échelonné suivante 1) 2000 ml de sucrose à 5%, p = 1,02 2) 1650 ml de sucrose à 15%, P = 1,06 3) 1750 ml de sucrose à 25%, P X 1,10 4) 3000 ml de sucrose à 5046, = 1,23. On refoule au sommet du rotor 2000 ml de la matière riche en HBSAg provenant de l'étape de striation isopycnique de NaBr, en déplaçant 2000 ml de sucrose à 50% du bas du rotor. On fait alors fonctionner le rotor à 28 000 tours/mn pendant 18 heures. Après avoir arrêté le rotor, on recueille 1000 ml de matière riche en HBSAg dans la gamme de densité de 1,135 à 1,165 g/ml. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'antigène de surface de l'hépatite B (en abrégé H3 5Ag) à partir de liquide biologique tiré de donneurs humains ayant souffert d'hépatite B, caractérisé par le fait que l'on traite le liquide par le sulfate d'ammonium en quantité suffisante pour précipiter pratiquement tout le HBSAg du liquide mais insuffisante pour précipiter une quantité notable de matière protéinée supplémentaire, que l'on soumet la fraction précipitée à une striation isopycnique et à une striation zonale de vitesse et que l'on récupbre un H35Ag d'une gamme de masse volumique d'environ 1,13 à 1,16 g/ml. 2. Procédé selon la revendicaticn 1, caractérisé par le fait que le liquide est le le plasma. . Procédé selon la revendication 2 , caractérisé par le fait que la quantité de sulfate d'ammonium est au maximum d'environ 250 g/l de plasma. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérXsé par le fait que la quantité de sulfate d'ammonium est d'environ 200 à .250 g/i de plasma. 5. Procédé selpn la revendication 2, caractérisé par le fait que la. quantité de sulfate d'ammonium est d'environ 225 g/l de plasma. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'après l'addition de sulfate d'ammonium, on agite le liquide entre 0 et 100C environ pendant au moins 3 heures cnvi ron. 7. Procédé selon la revendication I caractérisé par le fait qu'après l'addition de sulfate d'ammonium, on agite le liquide entre O et 100C environ pendant au mois 4 heures environ. 8 . Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que l'on conduit l'agitation à environ 50C. 9 . Procédé selon le. reverdication 1 calactérisé par le fait que la matière à gradient de striation isopycllique est le NaBr. 10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que 12 matière à gradient de striation zonale de vitesse est le sucrose.