Brevet FR2419725A1 — publié le 19791012

Une substance anti-cancéreuse et anti-tumorale vraie doit distinguer les cellules tumorales des cellules saines, et tuer les premières, sans porter préjudice aux secondes. On a trouvé que trois alcaloïdes extraits de végétaux et appartenant au groupe des béta-carbolines quaternaires, possèdent ces propriétés anti-cancéreuses et anti-tumorales, et peuvent être utilisés comme médicaments pour le traitement des cancers chez les humains.Ce sont : la serpentine, de formule I, alcaloïde du Rauwolfia serpentina, qui a été extraite à ltetat pur de cette plante par un procédé amélioré faisant l'objet de l'invention ; l'alstonine, de formule II,ualcalo;de de diverses variétés de Rauwolfia (obscura, vomitoria) de Vinca rosea et autres apocynacées qui a été extraite de Rauwolfia obscura par un procédé amélioré faisant également l'objet de l'invention ; et la sempervirine, de formule III, alcaloide de gelsemium sempervirens (jasmin jaune de Caroline) qui peut également être synthétise. Les formules I, II et III de ces trois alcaloides sont représentées ci-après dans la figure 1. On a mis au point un procédé perfectionné selon l'invention, d'extraction de la serpentine à partir de Rauwolfia serpentina, qui permet d'obtenir la serpentine pure, c'est- -dire débarrassée entièrement de certains produits toxiques, hypotenseurs ou cancérigènes qui se trouvent également dans la plante. Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le résidu d'évaporation à sec de l'extrait méthanolique de Rauwolfia serpentina, qui contient la totalité des alcaloldes, est repris par l'eau à pH 7,- et extrait par un égal volume de chloroforme ; a ce pH la serpentine reste essentiellement dans la phase aqueuse, alors que les autres alcaloldes passent dans le chloroforme.Le procédé d'isolement de la serpentine, selon l'invention, est le suivant : Les racines, écorces et brindilles de Rauwolfia serpentina, très finement pulvérisées, sont extraites au méthanol chaud, plusieurs fois, jusqu'à extraction de la totalité des alcaloldes. L'épuisement de la serpentine est vérifié grâce a la puissante fluorescence de cet alcaloide : une goutte de méthanol contenant de la serpentine, posée sur papier Whatman, et séchée, présente, en lumière ultra-violette, une fluorescence bleu-clair extrêmement vive. Les extraits méthanoliques sont évaporés à sec sous vide ; le résidu est repris en phase aqueuse et le pH est ajusté à 7,-. On ajoute alors un égal volume de chloroforme et agite vigoureusement.On sépare la phase aqueuse contenant essentiellement la serpentine et on recommence plusieurs fois l'extraction au chloroforme, de façon à éliminer de la phase aqueuse tous les autres alcaloldes et obtenir une solution contenant essentiellement la serpentine. La phase chloroformique peut être traitée de nouveau à pH 7,- avec de l'eau et le reste de serpentine est récupéré à l'aide de méthyléthylcétone. Une chromatographie en couche mince sur plaque de gel de silice (solvant alcool à 960) permet de suivre les étapes de purification , car la serpentine ne migre pratiquement pas dans l'alcool alors que les autres alcaloïdes se déplacent assez rapidement sur le chromatogramme. La serpentine ainsi extraite de Rauwolfia serpentina présente les mêmes proprietés que la serpentine pure du commerce (ROTH) ; en particulier, son spectre dans l'ultra-violet est caracteristique, avec deux maxima d'absorption, l'un à 252 nm et un autre a 308 nm. L'alstonine peut être extraite a partir de différentes variétés de Rauwolfia, telles que R. obscura, R. vomitoria, par un procédé perfectionné faisant également l'objet de l'invention. Ce procédé est caractérise par le fait que les extraits méthanoliques de Rauwolfia, évaporés à sec et repris par l'eau sont ajustés à pH 7,3-7,4 une première extraction par le chloroforme fait passer une partie de l'alstonine dans ce solvant, l'autre restant dans la phase aqueuse ; on récupère ensuite I'alstonine par extraction par la méthyléthylcétone, d'une part à partir du résidu sec chloroformique repris par l'eau, d'autre part, à partir de la phase aqueuse. Le procédé selon l'invention est décrit en détail ci-après La poudre de racine ou d'écorce de Rauwolfia est extraite au méthanol au bainmarie bouillant. Les phases méthanoliques sont conservées et le résidu sec réextrait à plusieurs reprises par le méthanol. Les phases organiques sont évaporées sous vide à chaud, le résidu est repris dans de l'eau distillée et le pH ajusté à 7,3-7,4. Un égal volume de chloroforme est ajouté une agitation vigoureuse plusieurs minutes, puis une centrifugation permettent de faire passer une partie de l'alstonine dans le chloroforme. L'opération est répétée plusieurs fois ; les phases organiques sont réunies et évaporées à sec sous vide. Les phases aqueuses sont également évaporées à sec et conservées pour un traitement ultérieur. Le résidu sec du chloroforme est repris dans un peu d'eau puis additionné d'un meme volume de méthyléthylcétona Une agitation vigoureuse suivie d'une centrifugation permettent d'obtenir l'essentiel de l'alstonine dans la methyléthylcétone. L'opération est répétée plusieurs fois. Le solvant est évaporé à sec et le produit récupéré sous forme de poudre pour la partie provenant du chloroforme. La phase aqueuse subit le même traitement avec la méthyléthylcétone et lorsque ce solvant est évaporé à sec, le résidu est repris dans de l'eau distillée, le pH ajusté à 7,3-7,4. Une brève centrifugation permet d'éliminer le précipité éventuellement présent. Le surnageant est traité plusieurs fois par le chloroforme et les extraits chloroformiques sont conservés après centrifugation et évaporés à sec. Le résidu est récupéré sous forme de poudre.La chromatographie sur gel de silice (solvant alcool à 960) montre que les deux poudres ainsi isolées sont essentiellement de l'alstonine, détectable comme la serpentine par sa fluorescence très vive et bleu pale dans l'ultra-violet. Dans un spectrophotomètre, on vérifie les deux maxima d'absorption, l'un à 252 et l'autre à 308 nm, caractéristiques de l'alstonine et de son isomère la serpentine. En utilisant la serpentine commerciale comme substance de référence on peut démontrer l'excellente correspondance entre la quantité d'alstonine déterminée par la pesée et celle déterminee par l'absorption à 252 nm. I1 en est de meme pour la serpentine isolée selon le procédé de l'invention. Action de la serpentine, de l'alstonine et de la sempervirine sur les cellules cancéreuses et sur les cellules saines, cultivées in-vitro On a trouvé que les trois alcaloides selon l'invention ont une activité anti-cancereuse vraie, c'est- -dire qu'ils détruisent les cellules cancéreuses, mais ne détruisent pas les cellules saines. Des cultures de cellules saines (cellules primaires de reins de singe, cellules de lignée "Vero" et "SIRC") et des cultures de cellules cancéreuses (cellules K.B., cellules Hela, cellules Hep II et cellules L) ont reçu une dose de 200 /ug, soit de serpentine, soit d'alstonine, soit de sempervirine, par ml de culture. Les résultats sont résumés dans le tableau I ci-après : toutes les cellules cancéreuses étaient détruites, aussi bien par la serpentine, que par l'alstonine et par la sempervirine en 24 à 48 heures par contre, il n'y avait aucune destruction des cellules saines au bout de huit jours d'observation. L'effet cytotoxique spécifique, vis-à-vis des cellules tumorales utilisées, ne s'est jamais démenti au cours des très nombreuses expériences effectuées. Par contre, pour affecter les cellules saines il faudrait des quantités d'alcalo1des au moins dix fois plus grandes (plus de 2 mg/ml). (Les cultures de cellules in-vitro sans mycoplasmes ont été effectuées dans les conditions classiques et en l'absence d'antibiotiques qui pourraient fausser les résultats). L'activité anti-cancéreuse des trois alcalo1des selon l'invention a été confirmée par des expériences pharmacologiques sur des souris atteintes de différents types de cancers Action sur le cancer mammaire greffable de la souris Vingt souris de 18 à 20 g, de eouche Rho III ont été inoculées, par voie sous-cutanée, par 0,2 ml d'un extrait de tumeur MS 301, broyé. Dix souris ont été gardées comme témoins ; dix autres recevaient, le troisième jour après l'inoculation, 400 g d'alstonine au niveau de l'implantation tumorale, deux fois par jour, pendant quinze jours. Au seizième jour, les souris étaient anesthésiées et sacrifiées, les tumeurs excisées et pesées. La même expérience fut effectuée avec de la serpentine au lieu d'alstonine. Les résultats sont donnés dans le tableau II ci-dessous TABLEAU II POIDS MOYEN (en grammes) DES TUMEURS, AU 16e JOUR Souris témoins Souris traitées par la Souris traitées par serpentine l'alatonine 32, (compris entre 1,6 (cimpris entre 1,7 (compris entre 2,6 et 3,8) 0,9 et 2,5) 0,8 et 2,6) Signification statistique p : 0,01 Activité vis-à-vis du lymphome YC 8 de la souris Trente souris BALB C de 17 à 20 g sont inoculées par voie intrapéritonéale par 103 cellules ascitiques du lymphome YC 8 de la souris, fraîchement prélevées. Dix souris sont gardees comme témoins. Dix souris sont traitées, le 3e jour après l'inoculation, par l'alstonine deux fois par jour par voie intrapéritonéale et pendant huit jours consécutifs (400 g par jour). Dix souris sont traitées le 3e jour après l'inoculation, par un mélange alstonine + cyclophosphamide. Dans ces expériences l'alstonine peut être remplacée par la serpentine. Les résultats sont présentés dans le tableau III ci-après et illustrent la survie des animaux pendant trois mois (une survie de quelques jours n'est pas prise en considération). Chez les souris témoins la tumeur ascitique se développe en 20-22 jours environ et la souris atteint alors un poids de 32-36 g. Les quatre souris ayant survécu au traitement par l'alstonine ont plus de trois mois. Elles sont tout à fait normales et leur poids initial a faiblement et normalement progressé (23-24 g). Lorsqu'on applique, par voie intra-péritoneale, un traitement par un mélange d'alstonine et de cyclophosphamide (doses par jour et par souris de 4OOug d'alstonine et 2 mg de cyclophosphamide) neuf sur dix souris survivent parfaitement sans amaigrissement ni récidive (Tableau III ci-après). TABLEAU III TEMPS DE DES SOURIS TEMOINS ET TRAITEES Traitées par Traitées par Jours de survie Témoins l'alstonine alstonine + cyclophosphamide 0 10/10 10/10 10/10 22 0/10 7/10 9/10 60 - 4/10 9/10 90 - 4/10 9/10 Par contre, lorsque le cyclophosphamide seul est administré, on constate que les souris sont guéries, mais ceci n'est qu'une apparence car après 1-3 mois, l'amaigrissement est tel qu'elles meurent et que chez d'autres l'apparition de nouvelles tumeurs s'observe. I1 faut noter que des souris porteuses du lymphome YC 8 et traitées par l'alstonine seule, aux mêmes doses par voie sous-cutanée, ne survivent pas plus longtemps que les souris témoins. Par contre, l'administration simultanée par voie sous-cutanée d'alstonine et de cyclophosphamide, pendant 4 à 5 jours consécutifs, se traduit par une survie parfaite de toutes les souris traitées (6/6). Activite vis-à-vis des tumeurs "Ascite d'Ehrlich"chez la souris 5 x 103 cellules Ascite dShrlichsont inoculées à des souris blanches Swiss de 20-24 g, par voie intrapéritonéale. Divers traitements furent appliqués des le quatrième ou le cinquième jour et pendant dix à quinze jours. Nous pouvons conclure que ni le cyclophosphamide injecté seul, par voie intrapéritonéale ou sous-cutanée, ni l'alstonine seule, ni la serpentine seule, ne peuvent définitivement arrêter la tumeur ascitique d > Ehrlich.Un net ralentissement du développement des tumeurs est observé, mais les tumeurs repartent après arrêt du traitement. Dans le cas du cyclophosphamide seul, le redémarrage peut être plus tardif qu'avec la serpentine ou l'alstonine.Par contre, l'association de serpentine (400 pg par jour) et de cyclophosphamide (2 mg par jour) par voie I.P. permet d'obtenir une survie définitive (survie définitive : survie normale pendant trois mois sans perte de poids) et le pourcentage des survivants varie de 80 à 100 X (Tableau IV ci-après). Les souris ainsi guéries augmentent normalement de poids et après quatre à six mois celui-ci est de 24 à 26 g. Leur aspect est absolument normal et rien ne les distingue de souris saines. (Dans les expériences, seule la survie sans récidive est prise en considération). TABLEAU IV SURVIE DES SOURIS PORTEUSES DE TUMEURS ASCITIQUES D'EHRLICU Traitées par Traitées par Jours de Traitées par la le cyclo- Serpentine survie Témoins serpantine phosphamide + (I.P.) (i.P.) tyclophosphamide (I.P.) 0 10/10 10/10 6/6 10/10 25 : 0/10 : 10/10 : 6/6 : 10/10 35 : 0/10 : 6/6 : 9/10 60 : - : - : 2/6 : 9/10 120 - . - : 0/6 : 9/10 La figure 2, où sont portés en abscisses le nombre de jours de traitement et en ordonnées le poids (en gramme) des souris, montre l'évolution de la tumeur ascite d'Ehrlichchez les souris traitées, soit par la serpentine seule (courbe 2), soit par le cyclophosphamide seul (courbe 3), soit par la serpentine + cyclophosphamide (courbe 4) par voie intra-péritonéale et aux doses indiquées ci-dessus. Les deux traitements, soit par la serpentine, soit par le cyclophosphamide seul, permettent d'obtenir un net ralentissement du poids des tumeurs avec toutefois un amaigrissement très fort de la souris traitée par le cyclophosphamide seul. Aucun de ces deux traitements ne permet d'obtenir une survie définitive. Par contre, le mélange de serpentine et de cyclophosphamide permet d'obtenir une survie définitive. Inoculées par voie sous-cutanée, aux doses indiquées ci-dessus, et séparément, l'alstonine et la serpentine sont sans effet sur la survie définitive des souris, alors que l'association alstonine (ou serpentine) + cyclophosphamide par voie sous-cutanée, provoque l'arrêt de l'évolution de la tumeur et la survie des souris ainsi traitées est normale. Activité vis-à-vis de l'ascite solide d'Ehrlichde la cuisse, chez la souris Le muscle interne de la souris de souche Swiss reçoit 106 cellules de l'ascite d'Ehrlichpar voie intramusculaire. Le traitement n'est commencé que lorsque la tumeur est apparente. La serpentine, ou l'alstonine, est administrée seule par voie intramusculaire dans la région de la tumeur aux doses de 0,8 mg par jour et pendant dix jours consécutifs. Après 26 jours, les souris sont sacrifiées, les tumeurs excisées et pesées. On constate que l'alstonine (ou la serpentine) réduit le poids moyen des tumeurs, de l'ordre de 40 à 50 Z (comme on peut le voir d'après le tableau V ci-après), ce qui, lorsque les souris ne sont pas sacrifiées se traduit par une survie de quelques jours seulement. Par contre, l'administration d'alstonine (ou de serpentine) et de cyclophosphamide dans la tumeur elle-même (40zig d'alstonine + 2 mg de cyclophosphamide) par jouret pendant 10 jours consecutifs, conduit à lå nécrose de la tumeur. La souris retrouve une mobilité normale. Le taux de survie des souris ainsi traitées est de l'ordre de 80 Z. Lorsque le traitement est arrêté trop tôt (avant 5 jours) quelques souris présentent une récidive. De nouvelles injections de serpentine (ou alstonine) + cyclophosphamide, permettent d'arrêter définitivement le développement de la tumeur. TABLEAU V Régression de la tumeur solide d'Ascite d'Ehrlich POIDS MOYEN DES TUMEURS (en gramme) Souris témoins Souris traitées par Souris traitées par l'alstonine alstonine + cyclophosphamide Poids moyen 114, ; Poids moyen 7,8 ; Poids moyen 0,07 ; compris entre compris entre compris entre 10,4 et 12,4 5,5 et 10,4 0,04 et 0,11 p : 0,01 Les expériences présentées ont été répétées plusieurs fois. Toxicité Chez la souris (de- souche Swiss ou Balb C) la DL 50 par voie intrapéritonéale de la serpentine est de 70 mg/kg ; celle de l'alstonine est de 80 mg/kg ; celle de la sempervirine est de 140 mg/kg. Dans les expériences pharmacologiques, chez les souris porteuses de tumeurs (soit l'ascite d > Ehrlich, soit le lymphone YC 8) une dose journalière de serpentine ou Alstonine de 400 à 800pu par voie intra-péritonéale, est facilement tolérée pendant 15 jours successifs. La même tolérance est observée lorsque les mêmes doses sont administrées par injections intramusculaires, ou par voie buccale. I1 faut souligner d'autre part le fait que la serpentine et l'alstonine sont éliminées moins de trois heures après l'injection de 8001ug par voie intra-veineuse. Par contre, dans l'association serpentine (ou alstonine) + cyclophosphamide l'alcalolde n'est élimine qu'au bout de 18 heures. La destruction des cellules cancéreuses et tumorales est obtenue par administration d'un mélange, fraîchement préparé, de -serpentine, ou d'alstonine et de cyclophosphamide. L'alstonine, la serpentine et la sempervirine peuvent être utilisées dans le traitement des cancers chez les humains, et en particulier dans le traitement des cancers du sein. Ces produits peuvent être administrés par voie intrapéritonéale, par voie intramusculaire, par voie intraveineuse ou par voie buccale, soit seuls, soit, au mieux, en association avec le cyclophosphamide ou d'autres médicament anti-cancéreux. Par voie I.M. et I.V. on utilise de préférence une association de 5 mg de serpentine (ou d'alstonine) et de 50 mg de cyclophosphamide, cette dose étant administrée une fois par jour, et le traitement pouvant etre poursuivi plusieurs mois. Par voie orale, on peut administrer 5 a 10 mg de serpentine (ou d'alstonine) + 50 mg de cyclophosphamide, une fois par jour, pendant plusieurs mois. TABLEAU I Action de la serpentine, de l'alstonine et de la sempervirine sur les cellules en culture, provenant de tissus sains et de tissus cancéreux Sur cellules normales Cellules primaires ) en culture de 7 jours + 200 g de serpentine/ml, ou alstonine ou sempervirine Pasde destruction de reins de singe ( Pendant 8 jours ) dès l'ensemencement + 200 g de serpentine/ml, ou alstonine ou sempervirine " Cellules "Vero" ) en culture de 3 jours + 200 g de serpentine/ml ou d'alstonine " (cellules de lignée) ( dès l'ensemencement + 200 g de serpentine/ml ou d'alstonine " Cellules "SIRC" ) en culture de 3 à 5 jours + 200 g de serpentine/ml ou d'alstonine " (cellules de lignée) ( dès l'ensemencement + 200 g de serpentine/ml ou d'alstonine Sur cellules cancéreuses Cellules K.B. ) en culture de 3 jours + 200 g de serpentine/ml ou alstonine ou sempervirine Destruetion totale ( en 24-48 heures ) dès l'ensemencement + 200 g de serpantine/ml ou alstonine ou sempervirine " Cellules Hela ( en sulture de 3 jours + 200 g de serpantine/ml ou d'alstonine " ) dès l'ensemencement + " " " Cellules Hep II ( en culture de 3 jours + " " " ) dès l'ensamencement + " " " Cellules L ( en culture de 3 juous + " " " ) dès l'ensemencement + " " " Nephroblastome ) tumeurs humaines + " " " Neuroblastome ( en culture + " " " Tératome ) primaire + " " " REVENDICATIONS 1. A titre de médicaments, utiles notamment pour inhiber spécifiquement le développement des cellules cancéreuses et tumorales, les alcaloïdes appartenant au groupe des/3-carbolines quaternaires, représentés par les formules I, II et III de la figure 1, et dénommés serpentine, alstonine et sempervirine. 2. Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles contiennent, comme principe actif, au moins Ilun des médicaments selon la revendication 1, associé à un véhicule pharmaceutique acceptable, convenable pour les voies orale, intra-veineuse, intramusculaire ou intra-péritonéale. 3. Compositions selon la revendication 2, caractérisées en ce qu'elles contiennent, associé à llun des médicaments selon la revendication 1, un autre médicament anti-cancéreux. 4. Compositions selon la revendication 3, caractérisées en ce quelles contiennent une association de l'un des médicaments selon la revendication 1, et de cyclophosphamide.