Brevet FR2419298A1 — publié le 19791005

On obtient un mélange de nouvelles substances antibiotiques de structure chimique inconnue, appelé polymyxine F, en cultivant une souche du microorganisme Bacillus circulans qui a été déposée à l'American Type Culture Collection sous le OA.T.C.C. 31228. La polymyxine F est un mélange de trois acyldécapeptides, ces acyldécapeptides différant seulement par le reste acyle. Le mélange de substances antibiotiques est actif vis-à-vis des bactéries gram-négatives et gram-positives. La figure 1 donne le spectre infrarouge du chlorhydrate de la polymyxine F dans le bromure de potassium. Le microorganisme utilisé pour la production de la polymyxine F est une souche de Bacillus circulans isolée du sol. Une sousculture de l'organisme peut être obtenue à partir de la collection permanente de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A.. Le numéro du microorganisme dans cette collection est A.T.C.C. 31228. Les caractéristiques de Bacillus circulans A.T.C.C. 31228 sont les suivantes Au microscope : bacille formant des spores qui est gramvariable à gram-négatif. Les spores sont centrales à sous-centrales. Les sporanges sont gonflés. Les batonnets végétatifs ne sont pas en longue chaîne et sont motiles.lesbaAtonnets ont une dimension de 0,5-0,7 x 2,0-5,04 A l'échelle macroscopique : dans un bouillon nutritif, la croissance est faiblement trouble et réduite à la partie inférieure du tube. I1 ne se forme pas de membrane. Aucune croissance ne se produit au-dessus de 500C. Sur la gélose nutritive, après 3 jours d'incubation à 280C, la croissance est faible et adhère à la gélose. On voit dans la même culture des types de colonies variables parfois rugueux et parfois lisses. Caractéristiques physiologiques : il y a production de catalase. L'essai de Voges-Proskauer pour la production d'acétyl- méthylcarbinol est négatif. Le pH dans le bouillon de Voges Proskauer est de 4,5 au bout de 7 jours. La croissance est positive sur de la gélose anaérobie BBL faite sans glucose ou indicateur Eh. De l'acide est formé à partir du glucose, de xylose, d'arabinose et de mannitol, mais il n'y a pas production de gaz jusqu'à 30 jours. I1 n'y a pas de production de dextrines cristallines. L'essai pour la production de la dihydroxyacétone à partir du glycérol est négatif. La caséine n'est pas décomposée. Les caractéristiques précédentes correspondent à celles de Bacillus circulans, comme décrit dans la monographie d genre par Gordon, Haynes et Pang (1973), Agr. Handbook N0 427 11The Genus Bacillus agir. Res. Service, U.S.D.A. Bacillus circulans A.T.C.C. N0 31228 produit le mélange antibiotique, polvmyzine F, qui possède une activité vis-à-vis des bactéries gram-ngatives et gram-postives. Pour forme le mélange antibiotique de polymyxine F selon le procédé préféré, on cultive Bacillus circulans A.T.C C. N0 28 à la température ambiante (250C) ou à son voisinage dans des conditions aérobies en immersion dans un milieu nutritif aqueux contenant un glucide et une source d'azote assimilables. On effectue la fermentation jusqu'à ce que le milieu possède une activité antibiotique substantielle, généralement d'environ 60 à 120 heures, de préférence environ 90 heures. Une fois la fermentation terminée, on acidifie le bouillon de fermentation, de préférence à pH environ 2, avec un acide comme l'acide chlorhydrique concentré. On ajoute un adjuvant de filtration au bouillon de fermentation acidifié et on filtre toute la suspension. On lave abondamment les solides avec de l'eau et on réunit les eaux de lavage avec le filtrat. On rejette le solide lavé. On extrait le filtrat plus les eaux de lavage ajoutées avec du n-butanol saturé d'eau, on concentre sous vide l'extrait butanolique à une température inférieure à 450C jusqu'à un faible volume et on dissout le concentre dans un petit volume de méthanol. La polymyxine F précipite par addition d'acétone puis on la lave avec de l'acétone et on la sèche sous vide. On dissout le précipité dans de l'eau, on l'absorbe sur une résine échangeuse d'ions faiblement acide, par exemple la résine Amberlite IRC-50 (Na+), à pH 6,0-7,5 et on élue l'antibiotique de la résine en mettant la résine en suspension dans un mélange 1:1 de méthanol et d'eau et en ajustant le pH à environ 1,0 avec de l'acide chlorhydrique. On poursuit l'élution avec un mélange 1:1 de méthanol et a |eau dont le pH a été ajusté à environ 1,5 avec de 'acide chlorhydrique concentré, jusqu ce que l'on ait enlevé de la résine toute la polymyxine F.On concentre sous vide l'éluat combiné jusqu a ce qu'on ait chassé le méthanol, on ajuste le concentré à pH 10,5 avec de l'hydroxyde de sodium et on extrait la polymyxine F dans du butanol. On lave l'extrait butanolique avec de l'acide chlorhydrique 1N et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans du méthanol et on précipite la polymyxine F avec de l'acétate d'éthyle. On lave le précipité avec de l'acétate d'éthyle et on le seche sous vide, ce qui donne de la polymyxine F partiellement purifiée. On dissout l'antibiotique partiellement purifié dans un mélange d'eau et de méthanol, on l'absorbe sur une colonne de carboxyméthylcellulose (Na ) et on l'élue de la colonne avec un gradient de chlorure de sodium.On réunit les fractions actives provenant du composant antibiotique principal , on les acidifie avec de l'acide chlorhydrique 1N et on les extrait avec du butanol. On concentre sous vide l'extrait butanolique et on isole le chlorhydrate de polymyxine F par précipitation dans du méthanol avec de l'acétate d'éthyle, comme décrit précédemment. La polymyxine F est un mélange de substances antibiotiques basiques qui forment des sels avec divers acides minéraux et organiques. On peut commodément transformer le chlorhydrate, préparé par le mode opératoire préce-dent,en un quelconque sel soluble dans l'eau désiré, en utilisant des résines échangeuses d'anions. Ou bien, on peut préparer la base libre en extrayant une solution butanolique du chlorhydrate avec de l'hydroxyde de sodium aqueux dilué, puis en chassant le butanol sous vide. On peut obtenir les sels à partir du résidu par neutralisation avec 1' acide approprié. L'hydrolyse acide de la polymyxine F fournit un mélange d'acide 2,4-diaminobutyrique (Dab), de thréonine (Thr), de sérine (Sér), d'isoleucine (Ile), de leucine (Leu), et d'un acide gras dans un rapport molaire approximatif 5:1:1:1:2:1. L'acide gras est un mélange d'acide 6-méthyloctanoTque, d'acide iso-octanoique et d'acide octanoique. La polymyxine F est ainsi un mélange de trois acyldécapeptides, dont les composants diffèrent par le reste acyle. Les compositions et les formules empiriques de ces composants sont les suivantes Polymyxine F1 Polymyxine FX Polymyxine Fa Dab (5) Dab (5) Dab (5) Thr (1) Thr (1) Thr (1) Ser (1) Ser (1) Ser (1) Ile (1) Ile (1) Ile (1) Leu (2) Leu (2) Leu (2) Acide 6-méthyloctanoique Acide iso-octanolque Acide octanoSque C54HlOlN15 13 (1) C53E99N15 13 (1) C53H99N15 13 (1) La polymyxine F1 est le composant le plus abondant et la polymyxine F est le composant le moins abondant.Chaque composant 3 a quatre groupements amino primaire (les groupements f-amino des quatre restes Dab) et pas d'autre fonction ionique. La polymyxine F forme des sels d'acide ayant une stoechiométrie compatible avec cette structure chimique. L'exemple suivant illustre mieux la préparation de la polymyxine F. Exemple 1 On ensemence des cultures inclinées sur gélose de boeuf et de levure avec Bacillus circulans A.T.C.C. N0 31228, on fait incuber pendant une nuit à 300C et on les utilise pour inoculer 100 ml d'un milieu aqueux de farine de soja contenu dans des flacons Erlenmeyer de 500 ml. La composition du milieu de germination est la suivante Ingrédients Glucose 50,0 Farine Nutrisoy 15,0 Amidon soluble 15,0 CaCO3 10,0 CoC12.6H20 0,005 Eau distillée pour faire 1 1 On stérilise le milieu pendant 30 minutes à 1210C et à une pression de vapeur d'eau de 1,05 kg/cm2 avant l'utilisation. On fait incuber les flacons de germination inoculés à 250C pendant 72 heures sur un agitateur rotatif, fonctionnant à 280 tours/minute sur un arc de 5 cm. On fait un transfert de 59 (volume/volume) des flacons de germination à 10 1 de milieu contenu dans un récipient en verre de 14 1, le milieu et les conditions de fonctionnement étant décrits ci-dessous Ingrédients A. Farine Nutrisoy 150 Amidon soluble 150 CaCO3 100 CoC13. 6H2O 0,05 Eau distillée pour faire 9 litres B. Glucose , 50% dans l'eau 1 litre On stérilise les ingrédients de A séparément du glucose de B. On stérilise les deux sous une pression de 1,05 kg/cm2 à 1210C pendant 15 minutes avant l'utilisation. On ajoute 500 ml d'inoculum à 10 1 du milieu et on fait incuber pendant 90 heures. Pendant l'incubation, on aère le bouillon à raison de 1,4 volume d'air par volume de bouillon par minute et on agite à 750 t/mn. On ajuste à 2,0 le pH du bouillon de fermentation (10 1) avec de l'acide chlorhydrique concentré (75 ml). On sépare les solides par centrifugation à 9000 t/mn et on les lave avec 28 d'un litre d'eau. On réunit les eaux de lavage à la liqueur surnageante pour obtenir 10 1. On rejette le gâteau lavé (750 g). On extrait la liqueur surnageante (10 1) trois fois avec des portions de 3 1 de n-butanol saturé d'eau. On concentre sous vide l'extrait butanolique réuni (7 1) à une température inférieure à 450C jusqu'à un faible volume ( 100 ml). On dilue avec 300 ml de méthanol le concentré d'extrait butanolique provenant de deux fermentations de 10 1, obtenu comme décrit précédemment et on l'ajoute à 7,5 1 d'acétone. On sépare le précipité résultant, on le lave avec de l'acétone et on le sèche sous vide, ce qui donne 13,6 g de solide. On dissout la poudre insoluble dans l'acétone, 13,6 g dans 300 ml d'eau et on agite avec 135 g de resine echangeuse d'ions Amberlite IRC-50 (H+) pendant 12 heures, en ajoutant de l'hydroxyde de sodium 5N comme nécessaire pour maintenir le pH entre 6,0 et 7,5. On sépare la résine, on la lave avec un mélange 1:1 de méthanol et d'eau , puis on l'agite pendant deux heures avec 400 ml d'un mélange 1:1 de methanol et d'eau, en maintenant le pH à 1,0 par addition d'acide chlorhydrique concentré. Puis on place la suspension dans une colonne et on élue la résine avec un mélange 1:1 de méthanol et d'eau, dont le pH a été ajusté à 1,5 avec de l'acide chlorhydrique concentré, jusqu'à ce que l'effluent de la colonne ait une activité antibiotique négligeable. On concentre sous vide les éluats réunis (environ 600 mi) pour chasser le méthanol, ce qui donne une solution aqueuse de polymyxine F. On mélange la solution aqueuse de polyrrqxine F avec du butanol et on ajuste le pH à 6,5 avec de l'hydroxyde de sodium 5N. On sépare la phase butanolique et on la lave deux fois avec de l'hydroxyde de sodium 0,01N puis trois fois avec de l'acide chlorhydrique 1N, on extrait en retour les liquides de lavage acides avec du butanol. On concentre sous vide les extraits butanoliques réunis.On dissout le résidu dans du méthanol et on 11 ajoute à de l'acétate d'éthyle. On lave le précipité résultant avec de l'acétate d'éthyle et on le seche sous vide, ce qui donne 0,94 g de polymyxine F que l'on dissout dans 35 ml dlun mélange 5:2 de méthanol et d'eau et que l'on applique sur une colonne de 2,5 x 50 cm de carboxyméthylcellulose Whatman C > 52 sous forme sodium.On élue la colonn à un dbit de 3 ml/mn, d'abord avec 12 ml d'eau puis avec un gradlent linéaire préparé à partir de 4 litres de chlorure de sod -wm 0,1S N et 4 litres de chlorure de sodium 0,30 N. On recueillie les fractions et on les titre par un essai de diffusion sur gélose avec disque de papier, pour localiser le pic antibiotique principal. On réunit les fractions comprenant le pic d'activité principale. On acidifie la solution résultante avec de 1' acide chlorhydrique et on la laveavec du chloroforme. Puis on extrait l'antibiotique de la phase aqueuse avec du butanol.On chasse le butanol sous vide et on transforme le résidu en une poudre, 0,44 g, par précipitation dans le méthanol avec de l'acétate d'éthyle comme décrit précédemment. Analyse : Calculée pour C54H101N15O13. 4HCl: C, 49,34 H, 8,05 5 N, 15,99 ; Cl, 10,79 Trouvée : C, 49,68 ; H, 8,05 ; N, 16,13 C1, 10,96 Le spectre infrarouge de la polymyxine F sous forme du tétrachlorhydrate dans KBr est représenté par la figure 1. La mobilité électrophorétique de la pclymyxine F sur papier, en utilisant un tampon consistant en formiate de sodium 0,05M dans un mélange 1:2:7 d'acide formique, de t-butanol et d'eau, est 0,84 par rapport au phloroglucinol qui sert d'indicateur électroosmotique (mobilité 0,0) et la polymyxine B (mobilité 1,00). La chromatographie sur papier de la polymyxine F sur papier Whatman N01, en utilisant la phase supérieure d'un mélange 4:1:5 de butanol, d'acide acétique et d'eau, donne un Rf de 0,72. La polymyxine F est soluble dans l'eau et le méthanol et insoluble dans l'acétone, l'éther, l'acétate d'éthyle, le benzène, etc.. L'hydrolyse de 0,09 mg de polymyxine F dans l'acide chlorhydrique EN à 1100C pendant 16 heures, fournit un mélange contenant 0,325 micromole d'acide 2,4-diaminobutyrique, 0,066 micromole de thréonine, 0,053 micromole de sérine, 0,049 micromoles d'isoleucine et 0,141 micromole de leucine, comme le montre l'analyse classique Stein-Moore. Une analyse par chromatographie en phase gazeuse indique également la présence, en quantité décroissante, d'acide 6-methyloctanolque, d'acide iso-octanolque et d'acide octanoTque. Les pouvoirs rotatoires du tétrachlorhydrate de polymyxine F sont les suivants Eor]22 (C = 0,5 dans HCl 0,5 N) 589 nm - 439 578 - 470 546 - 540 436 - 970 365 -1500 Le point de fusion du tétrachlorhydrate de polymyxine F, déterminé dans un tube capillaire sous vide, est 213-2190C. Le spectre UV du tétrachlorhydrate de polymyxine F dans l'eau n'a pas de maximum aux longueurs d'onde supérieures à 200 nm il y a cependant une absorption finale à 220 nm avec un Elcm de 47. Activité biologique Des essais de double dilution en tube avec plusieurs microorganismes donnent les résultats suivants. La polymyxine F utilisée dans cette étude est le tétrachlorhydrate. Organisme CIM (AgJml) Staphylococcus aureus FDA 209P 50 Streptococcus pyogenes C 203 6,3 Escherichia coli ATCC 10536 1,2 Escherichia coli SC 8294X 2,4 Pseudomonas aeruginosa SC 8329t 3,1 Organismes provenant-de la collection de culture de Squibb. Une comparaison des activités des polymyxines B et F montre que la polymyxine F a une activité substantielle vis-à-vis de certains organismes qui sont résistants à la polymyxine B. CIM (gg/ml) Organisme Polymyxine B Polymyxine F Escherichia coli SC8599* 0,1 1,2 Escherichia coli SC8600a > 100 18,7 Escherichia coli SC9251t 0,06 0,4 Escherichia coli SC9252*b 18,7 9,4 Escherichia coli SC9253 50,0 12,5 eOrganismes provenant de la collection de culture de Squibb. Variant résistant à la polymyxine de E. Coli SC8599 bVariants résistants à la polymyxine de E. Coli SC9251 Des essais avec des souris que l'on infectées par voie intrapéritonéale par Escherichia coli SC8294 en suspens ion dans de la mucine gastrique de porc à 5 % en quantité correspondant à 500 fois la DL50, montre que 50 % des souris survivent aprds une injection souscutanée de 4,2 mg/kg de têtrachlorhydrate de polymyxine F une heure après l'infection. Aucune des souris ne survit à l'infection quand l'antibiotique n'est pas administrée. REVENDICATIONS 1. Polymyxine F ou un de ses sels d'addition d'acide, ladite polymyxine F étant un mélange de trois peptides basiques comprenant, dans un rapport molaire approximatif de 5:1:1:1:2:1, de l'acide 2,4-diaminobutyrique, de la thréonine, de la sérine, de l'isoleucine, de la leucine, et un mélange des restes acyle de l'acide 6-méthyloctanolque, de l'acide iso-octanolque et de l'acide octanoique ; le tétracblorhydrate de la polymyxine F ayant le spectre infrarouge dans le brome de potassium tel que représenté sur la figure 1 et les caractéristiques physiques suivantes : analyse élémentaire approximative C, 49,58 ; H, 8,05 ; N, 15,13 C1, 10,96 ; et un point de fusion d'environ 213-2190C sous vide. 2. Procédé de production de la polymyxine F, qui consiste à faire fermenter Bacillus circulans A.T.T.C. N 31228 dans des conditions de fermentation aérobie en immersion dans un milieu nutritif aqueux comprenant une source de carbone assimilable et une source d'azote assimilable. 3. Composition antibiotique comprenant comme ingrédient actif la polymyxine F ou un de ses sels selon la revendication 1.