Brevet FR2406201A1 — publié le 19790511

La présente invention concerne de façon générale un nouveau procédé d'analyse différentielle et plus particulièrement un procédé d'analyse différentielle pour déterminer la teneur réelle en acide urique d'un échantillon que l'on pense contenir de l'acide urique. L'acide urique est excrété par les insectes comme un produit final du métabolisme azoté et on a proposé l'analyse de l'acide urique comme indice chimique permettant d'établir l'exls- tence et le degré d'une infestation par les insectes d'une grande diversité d'aliments et de produits alimentaires. L'invention concerne un procédé analytique fiable, sensible, spécifique et économique ne présentant pas les défauts des procédés de l'art antérieur, et qui permet la détermination simple de l'acide urique dans les aliments et produits alimentaires pour évaluer leur degré de contamination. Le procédé selon l'invention d'analyse différentielle pour déterminer la teneur réelle en acide urique d'un échantillon, consiste à soumettre des fragments de cet échantillon, respectivement à une analyse témoin et a une analyse réactionnelle, et à déterminer la teneur en acide urique par la différence des deux mesures, l'analyse témoin consistant a mettre I'échantillon en contact avec un milieu contenant de l'uricase, à traiter le mélange avec un indicateur de l'acide urique et a effectuer la détermination colorimétrique de l'acide urique et l'analyse réactionnelle consistant à mettre l'échantillon en contact avec un indicateur de l'acide urique et à déterminer l'acide urique. On peut effectuer les analyses précitées simultanément ou successivement. De préférence, on effectue les analyses de façon automatique, bien que l'on puisse, sans sortir du cadre de l'invention, les effectuer de façon discontinue. Le milieu contenant de l'uricase peut être constitué d'un système quelconque apportant l'enzyme uricase comme réactif de l'acide urique ; cependant on préfère, dans les analyseurs automatiques, utiliser un serpentin, traversé par l'échantillon, dont les parois sont revêtues de l'uricase immobilisée. Le serpentin est constitué d'un polymère organique comportant des radicaux amino réactifs, de préférence du Nylon. L'indicateur de l'acide urique peut être, dans l'invention, un indicateur redox quelconque capable de réagir avec l'acide urique dans les conditions de réduction-oxydation pour produire un changement que l'on peut mesurer selon une méthode colorimétrique ou électrochimique. Pour l'analyse colorimétrique on préfère un mélange d'acide phosphotungstique et de tungstate de sodium qui présente un changement de couleur que l'on peut mesurer par spectrométrie au voisinage de 660 nm. Dans l'analyse réactionnelle on préfère chauffer le mélange d'échantillon et le détecteur redox a une température comprise dans la gamme d'environ 50 a 550C et, mieux, a une température d'environ 520C. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, on traite l'échantillon avec une solution aqueuse de borate de sodium avant d'effectuer les analyses. L'invention va maintenant être décrite en détail. Le procédé de l'invention permet, selon une technique simple, de déterminer de façon économique, précise et très spécifique, la teneur en acide urique d'un échantillon tel qu'un échantillon d'aliment, que l'on pense contenir de l'acide urique. Le procédé de l'invention est ici décrit relativement a un système analytique automatisé tel que le Technicon AutoAnalyser (marque déposée de Technicon Instruments Corporation), mais, bien entendu, ce procédé peut être appliqué à un système non automatisé, comme décrit ci-après. On sait que la réaction de l'acide urique et de l'enzyme uricase provoque une décomposition chimique de l'acide urique. Donc si l'on combine un tel mélange réactionnel avec un indicateur d'acide urique, l'absence de l'acide urique par suite de sa destruction par l'uricase empêche toute réaction avec l'indicateur de l'acide urique et on n'observe pas de changement que l'on puisse mesurer selon une méthode colorimétrique ou électrochimique. Inversement, si on ne fait pas réagir de l'uricase avec un échantillon contenant de l'acide urique, l'acide urique réagit avec son indicateur, mais la réaction se manifeste par un changement que l'on peut mesurer selon une méthode colorimétrique\ou électrochimique. Cette différence des comportements analytiques permet de mesurer la teneur réelle en acide urique d'un échantillon. Le milieu contenant de l'uricase que l'on utilise dans les analyses témoins est, de préférence, un système constitué d'uricase immobilisée sur la surface intérieure d'un tube de Nylon traversé par l'échantillon. L'emploi de ce système a deux effets importants : il détruit de façon spécifique l'acide urique sans agir sur les substances gênantes pouvant être présentes dans l'extrait d'échantillon, et il apporte un réactif enzymatique sans interférence. L'uricase immobilisée, comme précédemment défini, peut être conservée pendant des durees atteignant 6 mois sans perdre son activité. Pour cela on rince le serpentin avec un mélange constitué de sulfate d'ammonium 3,2 M contenant 1 % d'éthyldne- glycol. On remplit ensuite le serpentin et on le maintient dans cet état en pinçant ses extrémités alors qu'il contient le mélange. On peut conserver le serpentin rempli a une température d'environ 50C. I1 convient de noter que même si des contaminants sont présents dans l'échantillon qui réagit avec l'indicateur d'acide urique, le processus sur lequel repose l'invention n'est pas altéré car la mesure différentielle permet de faire disparaitre ces substances gênantes. La mesure obtenue est la teneur réelle en acide urique de l'échantillon. I1 est évident pour l'homme de l'art que pour l'analyse discontinue on peut utiliser un milieu quelconque contenant de l'uricase a condition qu'il se produise une décomposition de l'acide urique après mélange. L'indicateur d'acide urique que l'on utilise dans le procédé de l'invention est un système redox dans lequel l'acide urique réagit dans des conditions de réduction-oxydation pour former une substance ayant un degré d'oxydation différent, cette modification pouvant être mesurée selon une méthode colorimétrique ou électrochimique. Un mélange d'acide phosphotungstique et de tungstate de sodium s'est révélé très souhaitable pour la détermination colorimétrique. Avec ce système l'acide urique réagit avec le mélange précité dans des conditions basiques et un composant est réduit ou oxydé sous une forme chimique différente. Ce changement se manifeste par un virage de l'incolore au bleu. On mesure ce virage par spectrophotométrie au voisinage de 660 nm et l'intensité constitue une mesure directe de la concentration en acide urique de 1' échantillon. Bien entendu, l'indicateur coloré redox que l'on peut utiliser dans le procédé de l'invention peut être constitué d'un système quelconque, susceptible de réagir avec l'acide urique, et dont le changement de couleur peut être mesuré selon une méthode colorimétrique ou électrochimique. On mesure un changement électrochimique selon des procédé dés classiques bien connus de l'homme de l'art. Dans un tel procédé électrochimique, on mesure la différence de potentiel entre la forme oxydée et la forme réduite de l'acide urique. Comme la détermination de la teneur réelle en acide urique dans un échantillon constitue une analyse différentielle, on effectue la mesure correspondant a l'analyse témoin et la mesure correspondant a l'analyse réactionnelle, la différence de ces mesures permettant la détermination de la teneur réelle en acide urique Dans un système discontinu ou non automatique, on effectue l'analyse réactionnelle, par exemple, dans un dispositif constitué de verre ou d'une autre matière transparente, semblable par sa configuration 9 un diapason dont les deux branches constituent deux compartiments séparés, l'un contenant l'indicateur d'acide urique (A), de préférence sous une forme lyophilisée, et l'autre constituant une cellule optique (B).On introduit l'échantillon dans le compartiment contenant l'indicateur d'acide urique par une ouverture de la tubulure commune, en inclinant le dispositif pour que l'échantillon descende sous l'effet de la pesanteur dans le compartiment (A) contenant l'indicateur d'acide urique. On peut éventuellement placer un filtre dans la tubulure commune du dispositif, juste au-dessous de l'orifice d'entrée servant à l'introduction de l'échantillon, pour éviter que les contaminants solides éventuels de l'échantillon passent avec l'echan- tillon dans le compartiment contenant l'indicateur d'acide urique. On mélange l'échantillon et l'indicateur d'acide urique par agitation dans le compartiment A, puis on transfère le mélange dans le compartiment B en inclinant le dispositif pour que le liquide puisse s'écouler dans la direction désirée. Eventuellement on peut placer un autre dispositif de filtration entre le fond et le haut du compartiment B pour éliminer les contaminants solides additionnels éventuels du mélange présent dans le compartiment A. Dès que le mélange est introduit dans le compartiment B, on le chauffe avec un dispositif de chauffage extérieur, par exemple un bain-marie, à 52-550C pendant environ 3 à 4 minutes. On place ensuite le compartiment B, qui contient une cellule optique, dans un dispositif de mesure tel qu'un spectrophotomètre, et on détermine la teneur en acide urique. On effectue l'analyse témoin dans un second dispositif qui est essentiellement un serpentin constitué d'une matière polymère renfermant des radicaux amino réactifs tels que du Nylon, dont la surface intérieure est revêtue d'uricase (enzyme immobilisé). On fait passer une quantité mesurée de solution d'échantillon a travers le serpentin en 3 à 4 minutes, et on la prélève dans le serpentin en utilisant, par exemple, une seringue. On transfère ensuite l'échantillon recueilli dans un dispositif tel que celui décrit pour l'analyse réactionnelle, et on le soumet au même traitement. La différence des lectures correspondant a l'analyse témoin, et à l'analyse réactionnelle fournit la teneur réelle en acide urique de l'échantillon. Bien entendu, la configuration des dispositifs qui viennent d'être décrits peut être différente, tant qu'elle permet l'application du même principe. De plus les dispositifs peuvent être a usage unique et jetés après l'emploi. L'invention est illustrée par l'exemple non limitatif suivant. EXEMPLE Cet exemple illustre l'application du procédé de l'invention un système automatique (Technicon AutoAnalyzer). On extrait un échantillon d'aliment contenant de l'acide urique avec une solution de borate de sodium 0,01 M et on filtre l'extrait. On aspire une portion de l'échantillon et on l'introduit dans un courant segmenté par de l'air constitué d'une solution de borate de sodium 0,01 M (pH 9,2), on la fait passer dans un serpentin à 10 spires, puis à travers un dialyseur. Le courant receveur est constitué d'un mélange, segmenté par de l'air, de borate de sodium 0,OlM et d'une solution de chlorhydrate d'hydroxylamine à 0,2 %. A la sortie du dialyseur, on mélange le courant avec une solution à 25 % de tungstate de sodium, puis on ajoute une solution diluée d'acide phosphotungstique. On fait ensuite passer le mélange à travers un serpentin de chauffage maintenu a une température d'environ 520C.On fait passer le courant, quittant l'unité de chauffage, a travers un serpentin à dix spires, et on effectue une mesure colorimétrique à 660 nm avec une cellule à écoulement de 50 ml. Ceci constitue l'analyse réactionnelle. Simultanément, ou successivement, on effectue l'analyse témoin. Pour cela on remplace le serpentin à dix spires, fixé du coté donneur du dialyseur, par un serpentin de Nylon (long de 100 m) contenant de l'uricase immobilisée. La différence obtenue, lorsqu'on soustrait la valeur témoin de la valeur réactionnelle, correspond à l'absorbance due à la présence d'acide urique dans l'échantillon. L'emploi d'une solution de borate de sodium comme courant receveur évite le colmatage et le remplacement fréquent de la membrane. L'utilisation de l'unité de chauffage accroît l'intensité de la coloration. On a également utilisé un système à deux canaux pour déterminer simultanément les valeurs réactionnelles et les valeurs témoins, et on a obtenu de façon correspondante de bons résultats. Dans ce système, on divise l'échantillon en deux parties, dont l'une est envoyée vers un canal contenant le serpentin de Nylon à uricase immobilisée (valeur témoin), tandis que la seconde est conduite directement à l'autre canal pour être traitée directement avec l'indicateur d'acide urique (analyse réactionnelle). Le procédé de l'invention peut être appliqué à toute catégorie d'échantillons alimentaires dont on désire analyser l'acide urique. En raison de sa simplicité, de sa sensibilité et de sa spécificité, le procédé de l'invention est particulièrement utile, dans les laboratoires, pour l'analyse courante de l'acide urique dans une grande diversité d'aliments et de produits alimentaires, avec des systèmes automatiques ou non. I1 est entendu que les dispositions décrites et représentées pourront faire l'objet de modifications et variantes sans sortir, pour autant, du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé d'analyse différentielle pour déterminer la teneur réelle en acide urique dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre des portions d'échantillon, respectivement à une analyse témoin et à une analyse réactionnelle et a déterminer la teneur réelle en acide urique par la différence des mesures des deux fragments d'échantillon, l'analyse témoin consistant à mettre le fragment d'échantillon en contact avec un milieu contenant de l'uricase, à traiter le mélange avec un indicateur d'acide urique et à effectuer la détermination colorimétrique de l'acide urique, et l'analyse réactionnelle consistant a mettre le fragment d'échantillon en contact avec un indicateur d'acide urique et à déterminer l'acide urique. 2. procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue simultanément l'analyse témoin et l'analyse rFac- tionnelle. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue successivement l'analyse témoin et l'analyse réactionnelle. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue l'analyse différentielle de façon automatique. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue l'analyse différentielle de façon discontinue. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu contenant de l'uricase est un serpentin, traversé par la portion d'échantillon, dont les parois intérieures sont revêtues d'uricase immobilisée, ce serpentin étant constitué d'un polymère organique contenant des radicaux amino réactifs. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le polymère est du Nylon. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'indicateur d'acide urique est constitué d'un détecteur redox quelconque capable de réagir avec l'acide urique dans des conditions de réduction-oxydation pour présenter une variation susceptible d'être déterminée selon une méthode colorimétrique ou électrochimique. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le détecteur redox est un mélange d'acide phosphotungstique et de tungstate de sodium, qui présente un changement de couleur par réaction avec l'acide urique, ce changement pouvant être mesuré selon une méthode spectrophotométrique au voisinage de 660 nm. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'analyse réactionnelle consiste à chauffer le mélange du fragment d'échantillon et du détecteur redox dans une gamme de températures d'environ 50 à 550C. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la température est d'environ 520C. 12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'avant analyse on soumet les échantillons à un prétraitement avec une solution aqueuse de borate de sodium.