Brevet FR2423987A1 — publié le 19791123

La présente invention a trait a un procédé de préparation d'une substance protéinique a partir d'une levure ; elle concerne également ladite substance protéinique en tant que produit industriel nouveau, et son application dans le domaine de la nutrition. On sait que pour pallier la pénurie de viande, notamment dans les pays en voie de développement, on a envisagé de faire appel a des sources de protéines différentes des sources animales. On a ainsi préconisé d'utiliser des sources végétales (soja, luzerne) et des sources biologiques (extraction a partir de levures et de champignon, et, culture de certaines souches notamment sur des hydrocarbures). Selon l'invention, on se propose de préparer une substance protéinique a partir de levure selon un procédé différent des procédés déjà connus, et dans lequel on soumet la levure a une lyse cellulaire par voie mécanique sous pression, puis on soumet le lysat a une série de précipitations. Dans ce qui suit par "substance protéinique" et "protéines" on entend une substance constituée essentiellement (au moins 95 Z en poids) de protéines. Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que successivement a) on soumet la levure a une lyse cellulaire en milieu liquide sous pression ; b) on précipite le milieu liquide résultant au moyen d'au moins un agent choisi parmi ltensemble constitue par les agents précipitant et les agents chelatant, puis on écarte le précipité et recueille la phase liquide ; c) la phase liquide ainsi obtenue est amenée a un pH proche de celui du point isoélectrique ; d) on procede a une précipitation au moyen d'une solution aqueuse de sulfate d'ammonium 4,5 à 6 M et recueille le précipité e) on reprend le précipité ainsi obtenu, et procède à un dessalage, notamment au moyen d'une résine, pour recueillir les protéines désirées. Parmi les levures qui conviennent selon l'invention, on peut notamment citer les souches de Saccharomyces et de Kluyveromyces, en particulier les Saccharomyces cerevisiae et Kluyveromyces fragilis.La levure préférée du point de vue du rendement est le Kluyveromyces fragilis qui offre la particularité de présenter une respiration cellulaire très importante et par suite une croissance rapide (en particulier sa respiration cellulaire est 5 fois plus importante que celle du Saccharomyces cerevisiae). Convient notamment la souche No. CBS-397 du catalogue de la collection du Centraal Bureau voor Schimmelculture de Baarn. Le stade a) est avantageusement mis en oeuvre dans le milieu de culture de la levure. En pratique, le stade a) débute sur des jus de culture renfermant de 100 à 400 g de levure exprimés matière seche pour 1 litre de jus. Si on veut standardiser, on effectuera la lyse cellulaire par voie mécanique sur un jus de culture renfermant 1011 et de préférence 1012 germes/cm3, de liteau, des éléments nutritifs (une source de carbone, une source d'azote et le cas échéant des oligoéléments). La lyse cellulaire est réalisée par voie mécanique sous une pression comprise entre 300 et 760 bars et de préférence entre 300 et 500 bars, et est poursuivie jusqu a ce que au moins 80 % des cellules aient leur membrane rompue. La lyse cellulaire est effectuée en milieu légèrement acide ou neutre à un pH compris avantageusement entre 6,5 et 7. Pour la précipitation du stade b), on peut utiliser (i) un agent précipitant notamment un sel, ou (ii) un agent chelatant les acides nucléiques. L'agent précipitant préféré est (NH4)2S04 et l'agent chelatant préféré est MnC12. En pratique, si on peut utiliser le sulfate d'ammonium seul pour réaliser la précipitation du stade b), il est toutefois recommandé pour obtenir de bons résultats en ce qui concerne la pureté du produit final, d'utiliser MnC12 et (NH4)2S04. Dans ce dernier cas, qui est une double précipitation, le chlorure de manganèse et le sulfate d'ammoniumpeuvent être utilisés en même temps ou l'un après l'autre, par exemple MnC12 avant (NH4)2S04.De façon avantageuse la précipitation du stade b) est mise en oeuvre avec 0,1 volume d'une solution aqueuse de MnC12 1 M pour I volume de milieu liquide résultant du stade a), puis une solution aqueuse de sulfate d'ammonium à 100 - 250 g/l. Au stade c) la phase liquide est amenée à un pH compris entre 3,5 et 4. Le stade d) concerne une précipitation supplémen taire au moyen de (NH4)2S04 pour recueillir le précipité contenant les protéines à extraire. Pour le dessalage du stade e), on utilise avantageusement une résine constituée par un gel de dextrane polymérisé (notamment la résine Sephadex G 25). Lors de ce traitement, les protéines ne se fixent pas sur la résine mais restent en solution dans l'eau. Les protéines ainsi obtenues ont une pureté de l'ordre de 95 à 100 %. Entre le stade b) et le stade c), on peut procéder à l'extraction du cytochrome C contenu avec les protéines,que l'on veut obtenir, dans la phase liquide. A cet effet, on peut mettre en oeuvre le procédé de la demande de brevet français NO 78 12562 déposée ce même jour, ce procédé consistant à fixer le cytochrome C sur une résine echangeuse de cations, puis à traiter l'eau de lavage qui contient les protéines non fixées sur ladite résine comme indiqué au stade c) ci-dessus. Les modalités opératoires qui interviennent, le cas échéant, entre le stade b) et le stade c) ont été décrites à l'exemple 2 ci-après. Les protéines obtenues selon le procédé de l'invention sont utiles dans le domaine de la nutrition tant humaine qu'animale. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de préparation nullement limitatifs. EXEMPLE 1 Obtention de protéines à partir de Kluyveromyces fragilis. a) Extraction Un jus de culture de Kluyveromyces fragilis renfermant 1012 germes/cm3 I soit environ 120 g de levure en poids sec par litre de jus de culturel est soumis à une lyse cellulaire au moyen d'un homogénéisa- teur (de type MANTON-GAULIN; cet appareil commercialisé par la Sté britannique APV, opère en tant que presse en laminant les cellules en milieu aqueux et en soumettant ces cellules à un choc de 450 à 500 bars). Après deux passages dans cet appareil à 450 - 500 bars, la lyse cellulaire est de 90 Z. On obtient un liquide visqueux qui est alors soumis à une double précipitation au moyen de deux agents : MnCl2 1 M et (NH4)2 S04 en solution aqueuse à 250 g/l. Apres une durée de contact de 30 minutes à 1 heure à 4 - 100C, on procede à une centrifugation. Le précipité, qui contient des débris cellulaires, des acides nucléiques et des polysaccharides, est élimité et on recueille le surnageant. b) Isolation On amène le surnageant à un pH voisin de celui du point isoélectrique, c'est-à-dire dans le cas présent à un pH compris entre 3.S et 4. On procède ensuite à une précipitation au moyen d'une solution aqueuse de sulfate d'ammonium 4,5 M - 6 M. Le précipité est recueilli puis repris avec de l'eau avant d'être soumis à une opération de dessalage sur gel de dextrane réticulé (Sephadex G 25), avec 1 volume de gel de dextrane pour 0,3 volume de protéines (en-matière sèche) ) traiter. Les protéines désirées qui ne ssnt pas fixées sur le gel de dextrane restent en solution ou suspension dans l'eau. On obtient ainsi une teneur en protéines de I g/ml. La substance protéinique ainsi obtenue est constituée principalement de cinq protéines différentes dont les poids moléculaires vont de 50.000 (pour la 1ère) à 120.000 (pour la 5ème). Ce mélange de protéines qui est obtenu en milieu aqueux peut être (i) soumis à une cuisson-extrusion selon une technique comme on soi pour des protéines à structure linéaire et sous forme expansoe ; et si nécessaire par broyage on obtient une farine de protéides directement assimilable par l'homme et l'animal, (ii) séché par nébulisation (séchage par projection) an d'obtenir un mélange de protéines sous forme pulvérulente. EXEMPLE 2 Obtention de protéines à partir dé Kîuyveromyces fragilis avec isolation de cytochrome. On procède comme indiqué à l'exemple la avec la différence que lors de la double précipitation on utilise une soiutioa aqueuse de (NH4)2SO4 à 100 g/l. Le surnageant obtenu, qui renferme le cytochrome C et les protéines désirées, est amené à un pH compris entre 8 et 8,25 (de préférence à pH 8,25) au moyen de NaOH à 100 g/l, puis traité avec une résine échangeuse de cations(Amberlite IRC - 50) pour fixer le cytochrome C. On lave la résine à pH 8,25 avec 0,1 volume de NH40H pour ! sue de surnageant initial. La solution de lavage qui contient les protéines désirées est re cueillie puis traitée comme indiqué à l'exemple lb et la résine sur laquelle est fixé le cytochrome C est éluée pour recueillir ce produit comme indiqué dans la demande de brevet ci-dessus désignée. EXEMPLE 3 Obtention de protéines à partir de Saccharomyces cerevisiae. On procède comme indiqué à l'exemple 1 en remplaçant le Kluyveromyces fragilis par le Saccharomyces cerevlsiae. On obtient un mélange constitué essentiellement des 5 protéines de l'exemple 1. Les protéines obtenues selon les exemples I et 3 ont donné de très bons résultats chez le rat soumis à une carence protéinique. Les résultats des essais effectués tant chez l'homme que l'animal ont mis en évidence la valeur nutritive des protéines selon l'invention. REVENDICATIONS I. Procédé de préparation d'une substance protéinique à partir d'une levure, ledit procédé étant caractérisé en ce que successivement a) on soumet la levure à une lyse cellulaire en milieu liquide sous pression ; b) on précipite le milieu liquide résultant au moyen d'au moins un agent choisi parmi l'ensemble constitué par les agents précipitant et les agents chelatant, puis on écarte le précipité et recueille la phase liquide ; c) la phase liquide ainsi obtenue est amenée à un pH proche de celui du point isoélectrique ; d) on procède à une précipitation au moyen d'une solution aqueuse de sulfate d'ammonium 4,5 M à 6 M et recueille le précipité ; e) on reprend le précipité ainsi obtenu, et procède à un dessablage, notamment au moyen d'une résine, pour recueillir les protéines désirées. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la levure est choisie parmi l'ensemble constitué par le Saccharomyces cerevisiae et le Kluyveromyces fragilis. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la lyse cellulaire du stade a) est effectuée sous une pression de 300 à 760 bars, et de préférence sous une pression de 300 à 500 bars. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que au stade b) l'agent précipitant est le sulfate d'ammonium. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que au stade b) l'agent chelatant est le chlorure de manganèse. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que au stade b) on procède à une double précipitation au moyen de MnC12 et de (NH4)2S04. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que au stade c) la phase liquide est amenée à un pH compris entre 3,5 et 4. 8. Substance protéinique caractérisée en ce qu'elle est obtenue selon le procédé de l'une quelconque des revendications I à 7. 9. Substance protéinique selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est essentiellement constituée par un mélange de 5 protéines dont les poids moléculaires vont de 50.000 à 120.000. 10. Application d'une substance protéinique selon l'une quelconque des revendications 8 et 9, caractérisée en ce que ladite substance proteinique est utilisée comme nutriment protéinique.