Brevet FR2420761A1 — publié le 19791019

ta présente invention concerne un test de détection enzymatique de la présence de lait de vache dans le lait de chèvre. Les différences de prix importantes existant entre le lait de vache et le lait de chèvre poussent quelquefois les fournisseurs de lait de chèvre à additionner ce dernier de lait de vache, afin d'abaisser le prix du produit final obtenu. Cette pratique constitue toutefois une fraude caractérisée qu'il est indispensable de pouvoir déceler rapidement. Plusieurs méthodes ont déjà été mises au point dans ce but, à le demande du Ministère de l'Agriculture et des coopératives laitières. La technique officielle repose sur un procédé d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide (test de PIERRE et PORTMANN). Cette technique a été récemment complétée par deux tests mis au. point par l'institut National de la Recherche Agronomique. n s'agit des tests dénommés C.V. (chèvre-vache) tests I et II. Le C.V. Test I est un test sérologique dont le principe repose sur une réaction d'inhibition de l'hémagglutination en présence d'un anti-sérum anti-lait de vache et de globules rouges sensibilisés par des immunoglobulines bovines. Le C.V. Test Il repose sur l'application d'une technique d'immunodiffusion radiale en milieu gélosé contenant un antisérum spécifique du lait de vache. Ces tests immunologiques, effectués sur des lactosérums, permettent théoriquement de détecter la présence du lait de vache dans du lait de chèvre jusqu'à un seuil de 1 pour mille dans le cas du C.V. I et de 1 pour cent dans le cas du C.V.II.' Dans la pratique courante, une telle sensibilité n'est pas indispensable; en effet on ne trouve aucun bénéfice appréciable à ajouter un litre de lait de vache dans 100 litres de lait de chèvre, et a fortiori, dans 1000 litres de lait de chèvre. La fraude ne devient rentable qu'au dessus de 2 litres de lait de vache pour 100 litres de lait de chèvre. La Demanderesse a mis au point un test de détection rapide et peu onéreux de la présence du lait de vache dans le lait de chèvre qui repose sur un principe entièrement différent de celui des différentes techniques électrophorétiques et immunologiques mentionnées ci-dessus. C'est ainsi que l'invention a pour objet un test enzymatique de détection de la présence de lait de vache dans le lait de chèvre qui est basé sur la mise en évidence colorimétrique de le xanthine oxydase, enzyme dont la concentration dans le lait de chèvre est environ 100 fois plus faible que celle existant dans le lait de vache. Selon lot une caractéristique préférée de l'invention, cette mise en évidence colorimétrique repose sur une réaction de la xanthine et d'un sel de tétrazolium qui, en présence de la xanthine oxydase, conduit à une réduction du sel de tétrazolium en formazan, composé fortement coloré, accompagné de formation d'acide urique Parmi les nombreux sels de tétrazolium utilisables dans le test selon l'invention, on préfère le bromure de 3-(4,5- diméthyl-2-thiazolyl)-2,5-diphényl-2 H - tétrazolium (MAT) ou le chlorure de 3,3'-(3,3'-diméthoxy-4,4'-biphényllylène)- bis-(2-p-nitrophényl-5-phényl-2 H) tétrazolium (nit), ce dernier composé étant avantageusement utilisé en présence de méthosulfate de phénazine (PMS) comme renforcateur de réaction. La réaction colorimétrique est de préférence effectuée à pH 7,8, le maintien de cette valeur étant assuré par la présence de taipon-tris-KCl 0,05 M. La concentration en xanthine du support de la réaction enzymatique se situe de préférence entre 0,5 et 1,0 millimole. On a toutefois constaté gu'il pouvait se produire, sous l'action de composés réducteurs non enzymatiques contenus dans le lait entier de chèvre, tels que par exemple des composés à groupement -SH, une réaction spontanée de décomposition des sels de tétrazolium en formazan. I1 est donc avantageux d'effectuer le test enzymatique sur le lactosérum du lait à tester. La caséine précipitée retient, en effet, la majeure partie des composés réducteurs non enzymatiques, ainsi que les faibles quantités de xanthine oxydase pouvant être contenues dans le lait de chèvre. Par contre, on retrouve toujours, dans le lactosérum de vache, une forte proportion de cette même xanthine oxydase. La présente invention sera d'ailleurs mieux comprise à l'aide de l'exemple suivant décrivant, à titre non limitatif, un mode d'exécution du test de détection enzymatique selon l'invention. On inocule un support classique pour réaction enzymatique, qui peut être par exemple constitué par la nappe de fibres de viscose décrite dans la demande de brevet français N 76 05 165 qe la bêmanderesse, avec 100 nanomoles de xanthine dissoute dans un tampon tris-HCl 0,05 M, pH 7,8; après sèchage à 370 C le support imprégné de substrat xanthine, prêt à l'emploi est placé dans les cupules d'une boite de titrage. Âuioment du test, on introduit dans une des cupules 120 microlitres du sérum à contrôler, puis on ajoute, à l'aide d'un compte-gouttes, une goutte de réactif de révélation dont la composition est la suivante - 60 mg de NBT (jaune clair) - 3 mg de PNB (jaune) -100 lal d'eau On place ensuite la cupule sur une plaque chauffée à 370 C et on le maintient 15 minutes à cette température. On bloque enfin la réaction à l'aide d'une goutte d'HCl IN et l'on compare la hauteur de ton de la nuance violette obtenue à une échelle de coloration étalon. A titre d'exemple, avec un système de notation visuelle de 1 à 10, le test décrit ci-dessus a permis d'obtenir les résultats suivants : lactosérum chèvre pur O à 1 lactosérum vache pur 10 itlange 1% vache/chèvre 1 à 2 mélange 2% vache/chèvre 2 mélange 5% vache/chèvre 3 à 4 Lors de la pratique de ce test, il est utile de disposer d'un témoin lactosérum de chèvre pur et d'effectuer la lecture contre ce témoin. Ce test enzymatique peut également être effectué sur les fromages fabriqués à partir de lait de chèvre. Dans ce cas on broie une quantité aliquote de fromage dans 5 ml d'eau et la détermination est effectuée comme ci-dessus. Toutes les manipulations sont effectuées à l'abri de la lumière directe en raison de l'extrême sensibilité à la lumière du réactif de révélation qui, de plus, doit être conservé au froid et à l'obscurité. L'exemple ci-dessus permet de juger de l'intérêt du test selon l'invention. En effet, puisqu'il ne nécessite aucun équipement spécial, il peut être pratiqué n'importe où et en particulier sur le terrain. I1 s'agit de plus d'un test très simple à lettre en oeuvre, rapide (15 minutes) et d'un prix de revient très faible. Ce test est en outre suffisamment sensible pour permettre de déceler les fraudes économiquement rentables pour le producteur. REVENDICATIONS 1.-Test de détection enzymatique de la présence de lait de vache dans le lait de chèvre, caractérisé en ce qu'il est basé sur la mise en évidence colorimétrique de la xanthine oxydase dont la concentration dans le lait de chèvre est environ 100 fois plus faible que celle existant dans le lait de vache. 2.- Test de détection selon la revendication 1, caractérisé en ce que la mise en évidence colorimétrique de la xanthine oxydase repose sur une réaction de la xanthine et d'un sel de tétrazolium qui, en présence de l'enzyme, conduit à une réduction du sel de tétrazolium en formazan, composé fortement coloré, accompagné de formation d'acide urique. 3.- Test selon la revendication 2, caractérisé en ce que le sel de tétrazoliumestle bromure de 3 - (4,5-dimAthyl-2- thiazolyl)-2,5-diphényl-2 H tétrazolium (NIT) ou le chlorure de 3,3'-(3,3'-diméthoxy ,4'-biphényllylène)-bis-(2-p-nitro- phényl-5-phényl-2 H) tétrazolium (nit), ce dernier composé dotant avantageusement utilisé en présence de méthosulfate de phénazine (PMS) comme. renforçateur de réaction. 4.- Test selon les revendications 2 et 3, caractérisé en ce que le réaction colorimétrique est effectuée à pH 7,8 en présence de tampon tris-HCl 0,05 M. 5.- est selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que la concentration en xanthine du support de la réaction enzymatique se situe entre 0,5 et 1,0 millimole 6.- est selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il est effectué sur le lactosérum du lait à examiner. 7.- Test selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce gu'il-est effectué sur le fromage fabriqué avec du lait de chèvre.