Brevet FR2402873A1 — publié le 19790406

La présente invention concerne une méthode permettant la détection du cancer même à un stade précoce, ainsi qu'un réactif permettant une telle détection et une méthode de préparation de ce réactif. On sait que les premières manifestations cliniques du cancer se produisent le plus souvent alors que la maladie est parvenue à un stade avancé, stade auquel une guérison, de toute manière aléatoire, exige des traitements longs et douloureux, impliquant fréquemment le recours à la chirurgie et l'ablation de tout ou partie des organes atteints. L'intérêt d'une méthode permettant une détection précoce du cancer à un stade où la guérison peut, dans de très nombreux cas, être obtenue rapidement et sans recours à la chirurgie ou autres traitements prolongés, est évident. On a déjà proposé un certain nombre de tests en vue d'une telle détection, mais jusqu a présent aucun de ces tests n'a donné de résultats suffisamment probants, ou bien ils sont limités à la détection de certains types définis de cancer. La présente invention se propose de fournir un test fiable, rapide et simple, donc -peu coûteux, permettant de détecter aisément pratiquement toutes les formes de cancer à un stade même precoce. Le test de l'invention se fonde essentiellement sur la découverte qu'il se libère spontanément dans du sang prélevé sur un sujet atteint de cancer, apres un vieillissement suffisamment prolongé, une substance, très probablement un antigène, qui, par un traitement approprié, permet d'obtenir un réactif capable de provoquer, lorsqu'on le mélange avec du sérum prélevé sur une personne atteinte de cancer, un précipité d'aspect caractéristique dont l'importance permet d'apprécier l'-état d'avancement de la maladie. L'invention sera mieux comprise en se reportant à la description suivante, donnée à titre non limitatif, dtun mode de mise en oeuvre possible de l'invention, 1.- OBTENTION DE LA SUBSTANCE DE BASE a. Origine de la substance de base La substance de base a pour origine le sang d'un sujet atteint de cancer à un stade quelConque, mais on utilisera de préférence le sang d'un sujet à un stade avancé, en particulier présentant des métastases (stades III et IV). b. Prélèvemént Il s'effectue dans des conditions strictement stériles, par exemple au moyen de tubes à vide, le sang prélevé étant aussitôt additionné d'un anticoagulant. c. Vieillissement Le sang ainsi prélevé est alors soumis au vieillissement en milieu strictement stérile. A température ordinaire, ce vieillissement peut demander plusieurs mois, voire plusieurs années suivant les caractéristiques des échantillons de sang prélevés. Il est, cependant, possible d'accélérer ce vieillissement en soumettant le sang à divers traitements, en particulier l'élévation de température. On contrôle l'état d'avancement du vieillissement en prélevant à intervalles réguliers des échantillons à partir desquels on prépare du réactif suivant la méthode qui sera décrite plus loin, et en effectuant, à l'aide de ce réactif, le dosage de serums témoins cancéreux et normaux. Le vieillissement est terminé lorsque les précipités obtenus par la réaction sur les sérums témoins présentent les caractères typiques décrits plus loin. On constate, en outre, que l'aspect du sang change en cours de vieillissement, un lot de sang ayant, en principe, atteint une maturité suffisante lorsqu'il présente un aspect homogène après légère agitation et qu'il est de couleur rouge brunâtre fonce. 2.- PRODUCTION DU REACTIF Chaque lot de sang vieilli parvenu à une maturité suffisante est, tout d'abord, homogeneise. Puis, on prélève des échantillons de ce sang, et ceux-ci sont mélangés avec un milieu de culture. Les meilleurs résultats ont été obtenus jusqu' présent en mélangeant 2,5 ml de sang vieilli avec 10 cc d'un bouillon nutritif de Pasteur ayant la composition suivante peptone 10 g extrait de viande 4 g chlorure de sodium 5 g pH final 7,2 Les échantillons de sang et de bouillon de culture sont maintenus en autoclave à une température de l'ordre de 370 C. La durée du séjour en autoclave est de l'ordre de quelques jours, une semaine au plus. Le degré d'avancenent de la culture est apprécié visuellement. On constate, en effet, qu'il se forme un dépôt de l'ordre de 1/10 du volume total et que le mélange prend une coloration brun rouge plus prononce qu'au stade précédent. Lorsque l'échantillon a pris l'aspect défini ci-dessus, on procède à un test avec des sérums témoins cancéreux et normaux. Lorsque le test se révèle positif, on laisse les cultures sédimenter pendant au moins une demi-heure, ou bien on les soumet à une centrifugation, et on recueille le liquide clair surnageant qui constitue le réactif de l'invention. 3.- CONDITIONNEMENT Les lots de réactif ainsi obtenus, dont les tests se sont révélés satisfaisants, sont rassemblés et homogénéisés dans un flacon stérile, puis la solution est répartie en flacons stériles bouchés et sertis de 2 ml, du type de flacons à pénicilline. Les flacons sont congelées à -40" C, puis conservés et stockés a 200 C. 4.- UTILISATION DU REACTIF Le prélèvement de sang sur le patient doit être effectué à jeun. On sépare le sérum par décantation ou centrifugation. Le liquide surnageant clair est additionné d'fun volume égal d'une solution-tampon à pH 8 (par exemple une solution borate-HCl). Onramène un flacon de réactif à température ambiante, on ajoute 2,5 mol de tampon pH 8 et on prélève des quantités égales, par exemple 100 microlitres de réactif; qui sont introduits chacun dans un tube à essais. On ajoute alors dans chacun des tubes des volumes croissants du mélange sérum solution-tampon, par exemple pour 100 microlitres de réactif successivement 300 (tube 1), 400 (tube 2), 500 (tube 3), 600 (tube 4) et 700 (tube 5) microlitres du mélange. Les tubes sont agités manuellement et placés au bain-marie à 41 C pendant une heure. En principe, on procédera à une batterie de tests sur une série de sérums provenant d'un certain nombre de patients et on terminera sur un test identique au moyen de sérums témoins cancéreux et normaux. On laisse ensuite reposer une demi-heure, le temps nécessaire pour que les tubes reviennent à la température ambiante. La lecture peut etre effectuée par simple examen oculaire, l'importance du précipité dans chaque tube étant appréciée par rapport à une échelle arbitraire dans laquelle O correspond à l'absence totale de précipité et 4 le précipité obtenu dans le tube l pour le sérum témoin. Entre les deux extrêmes définis ci-dessus, les valeurs attribuées sont l'indication d'une croissance monotone de la quantité de précipité, celle-ci étant fonction directe de la concentration. On peut alors estimer l'importance de la réaction pour chaque patient par rapport à celle obtenue sinultanément pour le sérum cancéreux témoin. Par exemple, pour des résultats ramenés au même degré par rapport à un sérum témoin donné, on a obtenu les résultats suivants : TYfE DE CANCIIR 'ue 1 /Tube 2 Fube 3 jTube 4 I:ube 5 T(ar-+ Glioblastome 2 1 0,5 0 3,/ Carcinome épidermo?de Carcinome epidertolde invasif du col, stade III 2 1 I 0,5 0,2 4,7 Epitelioma glandulaire du sein généralisé 1,5 0,7 0,7 . 0,2 0 3,1 Glioblastome (phase post-operatoire) 1,5 i 0,7 0,2 : 0 0 2,4 Tumeur maligne hypophysaire 2 1 0,5 0,2 0 3,7 Témoin 4 3,2 2,4 1,6 0,8 12 Outre la détermination par simple examen des tubes, il est évidemment possible de procéder à une mesure par toute méthode appropriée, par exemple par photométrie au moyen d'un photomètre de Vernes, par néphélométrie ou par spectrophoto métrie, le but de l'opération étant toujours de comparer l'intensité de la réaction donnée par le sérum d'un patient à celle obtenue avec un sérum témoin. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la préparation d'un réactif pour la détection du cancer caractérisé en ce que ledit procédé consiste à vieillir en milieu stérile du sang d'un sujet atteint de cancer, de préférence à un état avancé, å additionner le sang vieilli d'un milieu de culture, et à laisser séjourner à température contrôlée jusqu'à formation d'un précipité, à séparer ledit précipité et à recueillir le liquide contenant ledit réactif. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit milieu de culture est constitué par un bouillon de Pasteur. 3. Procédé selon la revendication I ou 2 caractérisé en ce que le vieillissement 5' effectue à la température ambiante pendant une durée allant de quelques mois à quelques ans, eten ce que le séjour du mélange sang-milieu de culture à température contrôlée s'effectue à une température d'environ 370 C pendant une semaine environ. 4. Réactif pour la détection du cancer caractérisé en ce que ledit réactif est obtenu par le procédé de l'une des revendications 1 à 3. 5. Procédé pour la détection du cancer au moyen du réactif de la revendication 4 caractérisé en ce qu'on mélange un échantillon tamponné de sérum du- sujet testé avec un échantillon dudit réactif et en ce qu'on apprécie l'importance du précipité obtenu avec celle de précipités obtenus avec des sérums témoins.