Brevet FR2419278A1 — publié le 19791005

La présente invention concerne un procédé amélioré pour synthétiser une chaîne peptidique par réaction, en solution aqueuse, d'un complexe précurseur d'amino-acide contenant un groupement -amino ou carboxy bloqué et un "porteur" polynucléotide avec un segment d'amino acide, séparation du complexe ayant réagit et de l'acide n'ayant pas réagi par fixation réversible du polynucléotide du complexe sur un adsorbant polynucleotide complémentaire immobilisé sur un support insoluble et élut ion du complexe à partir du support sous forme d'une solution aqueuse. De préférence, le complexe est débloqué par voie enzymatique et utilisé comme précurseur pour répéter la réaction avec un autre acide. De préférence, pendant le procédé, les chaînes qui ne réagissent pas avec un acide donné sont enlevées par degradation enzymatique. Le domaine de la synthèse des peptides a connu des recherches importantes au cours des dernières années. Un problème important existe dans l'obtention par synthèse d'un polypeptide pur de poids moléculaire élevé dans lequel la séquence des amino-acides du peptide réellement préparé correspond a celle recherchee. La réalisation de la synthèse avec la pureté désirée est jusqu'à présent très laborieuse. La préparation par synthèse d'un polypeptide d'un mode opératoire en plusieurs étapes grâce auquel on construit un produit désiré par des réactions chimiques successives d'un précurseur et d'un composé ajouté, le précurseur a une quelconque étape donnée étant le précurseur ayant chimiquement réagi de l'étape précédente. Ainsi, le mode opératoire est répétitif. Dans ce procédé, on fait réagir un premier amino-acide avec un second pour former un dipeptide, schématiquement representé par la formule I On sépare des acides n'ayant pas réagi le peptide ainsi formé à cette tape et on fait ensuite réagir un troisième amino acide avec le dipeptide pour former un tripeptide. On répète le mode opératoire jusqu'à ce qu'on obtienne un polypeptide ayant la série désirée d'amino-acides,couramment appelé le peptide visé. La faillite de la séquence, qui fait qu'une portion des chaînes de polypeptide allongées ont une série inappropriée d'amino-acides, peut provenir de plusieurs causes. L'une peut être une mauvaise élimination de l'acide libre résiduel du mélange réactionnel avant la réaction avec l'amino-acide suivant. La présence d'un tel acide n'ayant pas réagi entraîne la possibilité qu'une portion des chaînes seront improprement allongées par l'acide résiduel plutôt qu'avec l'acide désiré à cette étape de la séquence. Encore une autre cause, peut-être plus importante, de faillite de la séquence, est la réaction incomplète de toutes les chaînes présentes avec l'amino-acide ajouté à chaque étape de la synthèse. Dans la préparation de polypeptides de faible poids moléculaire, la présence de chaînes contenant des nombres différents d'acides peut être déterminée de façon sûre par voie analytique et on peut isoler les chaînes peptidiques désirées. Les techniques analytiques classiques ne permettent pas d'effectuer ceci pour les composés de poids moléculaire supérieur cependant, car la différence du poids moléculaire entre les chaînes synthétisées de façon appropriée et de façon inappropriée est simplement trop faible pour être détectable. Le mode opératoire de synthèse des peptides décrit précédemment a été représenté comme appliquant la réaction séquentielle d'amino-acides avec une chaîne polypeptidique. A cet égard, il y a deux solutions ; l'une étant la croissance du peptide partir de l'extrémité à C terminal (extrémité de la chaîne avec le groupement et l'autre étant la croissance à partir de l'extrémité à N terminal (l'extrémité avec le groupement -NH2). On sait que pendant la synthèse, le groupement alpha amino (route par le N terminal) ou le groupement carboxy (route par le C terminal) de l'acide ajouté doit être bloqué pour que l'acide ajouté réagisse avec la chaîne polypeptidique et qu'il ne puisse se produire une réaction entre les molécules de l'acide ajouté. Il est donc nécessaire que le groupement bloqué de l'acide ajouté soit débloqué, après réaction avec la chaîne, pour l'étape suivante d'addition d'acide. La non-obtention du déblocage à une quelconque étape de la synthèse peut introduire une faillite de la séquence. En outre, le déblocage doit être effectué d'une façon qui ne nuit pas au peptide que l'on synthétise. Pour obtenir la solubilité, les procédés classiques de synthèse de peptide sont généralement effectués dans un milieu non aqueux, en particulier pour les peptides de poids moléculaire élevé contenant des chaînes latérales amino-acide protégees. Ceci a nécessité l'utilisation de réactions de copulation dans des conditions sévères pour effectuer la formation de la liaison peptidique et cela entraîne une probabilité de modification de la chaîne par racémisation ou par fragmentation. En outre, en particulier en ce qui concerne les polypeptides de poids moléculaire supérieur, les solutions réactionnelles non aqueuses ne permettent pas au peptide de prendre sa configuration naturelle. Dans la nature évidemment, les peptides sont fabriqués en milieu aqueux. En conséquence, la présente invention fournit un procédé amélioré de préparation d'un polypeptide pratiquement pur ayant une séquence prévisible d' amino-acides, procédé qui est susceptible d'automatisation et qui peut être utilisé de façon fiable pour préparer des peptides recherchés de poids moléculaire élevé et purs. La présente invention fournit également un procédé pour isoler un polypeptide allongé de son milieu réactionnel de sorte que la séquence appropriée puisse résulter en une réaction supplémentaire, procédé qui est facile à mettre en oeuvre avec une dépense minimale de temps et une perte minimale en peptide. La présente invention fournit en outre un procédé facile permettant de minimiser les difficultés dues à la préparation répétitive de polymères qui résultent de la faillite de la séquence due à la réaction incomplète, en éliminant de façon efficace les produits ratés de la population de chaînes en croissance de sorte que la récupération d'un polypeptide pur désiré peut être effectuéé de façon plus commode Cette invention fournit en outre un nouveau procédé de déblocage d'un peptide qui est facile à mettre en oeuvre et n'entraîne pas la destruction de la chaîne que l'on fabrique. En outre, le déblocage est effectué d'une manière qui assure la pureté optique du peptide que l'on forme. La présente invention fournit en outre un procédé de synthèse des peptides dans lequel l'allongement répétitif de la chaîne en croissance peut être effectué rapidement en milieu aqueux sans modification de la chaîne polymère. En outre, la présente invention fournit un mode opératoire de synthèse des peptides qui ne nécessite pas une protection élaborée des chaînes latérales des amino-acides qui diminue généralement la solubilité aqueuse du polymère que l'on prépare. La présente invention fournit un procédé de synthèse d'une chaîne peptidique ayant une séquence distincte de segments aminoacide qui consiste 1) à faire réagir un complexe précurseur pur, dans lequel un premier segment amino-acide de la chaîne peptidique à préparer est lié de façon covalente à un polynucléotide porteur, et dans lequel ledit segment contient un groupement carboxy terminal libre ou un groupement amino terminal libre, avec un second segment amino acide contenant un groupement N -amino libre et un groupement carboxy bloqué quand le précurseur a un groupement carboxy terminal libre, ou un groupement carboxy libre et un groupement N -amino bloqué quand le précurseur a un groupement amino terminal libre, en milieu aqueux 2) à enlever éventuellement le complexe précurseur n'ayant pas réagi 3) à copuler de façon réversible le polynucléotide porteur du complexe ayant réagi sur un adsorbant polynucléotide complémentaire immobilisé sur un support insoluble ; 4) à séparer le complexe ayant réagi et le second segment d'amino-acide n'ayant pas réagi ; 5) à libérer le polynucléotide porteur de l'agent adsorbant ; 6) à débloquer éventuellement le groupement carboxy ou le groupement amino du complexe ayant réagi 7) à répéter éventuellement les étapes 1 à 6 jusqu a ce que le nombre désiré de segments amino-acide aient été ajoutés au précurseur 8) à libérer éventuellement la chaîne peptidique du porteur et à recuéillir le produit. La présente invention fournit également un procédé de synthèse d'une chaîne peptidique ayant une séquence distincte de segments amino-acide, qui consiste à faire réagir un précurseur pur contenant un premier segment amino-acide de la chaîne peptidique à préparer ayant un groupement carboxy terminal libre ou un groupement amino terminal libre, avec un second segment amino acide contenant un groupement N -amino libre et un groupement carboxy bloqué susceptible d'hydrolyse enzymatique quand le précurseur a un groupement carboxy terminal libre, ou un groupement carboxy libre et un groupement Nt-amino bloqué susceptible d'hydrolyse enzymatique quand le précurseur a un groupement amino terminal libre, dans un milieu aqueux ; et à débloquer le produit peptidique par voie enzymatique. La présente invention fournit en outre un procédé de préparation d'une chaîne peptidique ayant une séquence distincte de segments amino-acide, qui consiste à faire réagir un précurseur pur contenant un premier segment amino-acide de la chaîne peptidique à'préparer ayant un groupement carboxy terminal libre ou un groupement amino terminal libre, avec un second segment amino acide contenant un groupement N -amino libre et un groupement carboxy bloqué quand le précurseur a un groupement carboxy terminal libre, ou un groupement carboxy libre et un groupement N -amino bloqué quand le précurseur a un groupement amino terminal libre, dans un milieu aqueux ; et à enlever le précurseur n'ayant pas réagi par dégradation enzymatique ou à l'aide d'un agent d'épuration. Selon le présent procédé, l'allongement en solution de la chaîne peut être effectué en faisant réagir un complexe précurseur avec le segment séquentiel choisi à ajouter à une étape particulière de la synthèse du polymère. Le complexe précurseur peut évidemment contenir le segment initial de la chaîne ou une chaîne existante de segments sur laquelle des segments supplémentaires doivent être ajoutés. Pour les besoins de cette invention, l'utilisation des expressions "segment" ou "segment amino-acide" comprend éventuellement les dérivés du segment qui existent en fait dans la chaîne finale à préparer. Les expressions "segment" ou "segment amino-acide" peuvent désigner un seul amino-acide ou une série d'amino-acides. Dans la synthèse des polypeptides, le segment ajouté est un reste d'amino-acide et le précurseur est une chaîne peptidique susceptible d'allongement ayant un groupement amino terminal libre ou un groupement carboxy terminal libre. La formation de la liaison peptidique et l'allongement de la chaîne sont donc effectués soit par acylation du groupement amino de la chaîne par le groupement carboxy de l'acide que l'on ajoute (route par le N terminal) soit par acylation du groupement aminod l'acide ajouté par le groupement carboxy de la chaîne en croissance (route par le C terminal). De préférence, le précurseur fait partie d'un complexe soluble dans l'eau plus important qui contient un porteur soluble dans l'eau fixé au précurseur par son extrémité non susceptible d'allongement. C'est-à-dire que pour la croissance de la chaîne par le C terminal, la chaîne est fixée au porteur au groupement Ni du premier reste amino-acide de la séquence. Pour la croissance par le N terminal, la chaîne est fixée au porteur par le groupement carboxy du premier reste amino-acide de la séquence L'allongement de la chaîne se fait donc pendant que le précurseur fait partie du complexe.Pour que le complexe soit stable en milieu aqueux, la fixation entre le porteur et le précurseur est de préférence covalente et effectuée d'une manière qui permet la libération ultérieure de sorte que l'on peut effectuer la récupération éventuelle du fragment visé pur synthétisé. Comme la chaîne en croissance est complexée de façon covalente au porteur soluble dans l'eau, la solubilité aqueuse de la chaîne pendant la réaction d'addition est nettement améliorée, même quand la chaîne est très grande. Les polymères synthétiques solubles dans l'eau forment une catégorie de substances que l'on peut utiliser comme porteurs. Des exemples types de cette catégorie de substances sont l'alcool polyvinylique, la polyvinylpyrrolidone, un copolymère d'acrylamide et d'acide polyacrylique ou l'anhydride polyéthylènemaléique. Des polyamides comme les polymères d'amino-acides contenant un segment acide glutamique ou acide aspartique sont également des substances convenant pour l'utilisation comme porteurs. Une autre substance que l'on peut utiliser comme porteur est le polyéthylèneglycol. Les polynecléotides solubles dans l'eau constituent également une catégorie utilé de substances que l'on peut utiliser comme porteurs. Des exemples types de polynucléôtides rutilés, nommés comme des acides, comprennent l'acide polyadénylique, l'acide polyuridylique, l'acide polythymidylique, l'acide polycytidylique et l'acide polyguanylique. De préférence, les acides ont au moins 10 motifs ribosephosphate et sont disponibles dans le commerce. La façon d'obtenir la fixation du premier amino-acide ou d'une courte chaîne peptidique à un porteur doit être telle que le peptide visé puisse être ensuite enlevé dans des conditions modérées. A cet égard, un autre aspect de la présente invention réside dans l'inclusion, en tant que partie du porteur, d'un élément de liaison spécifique aux endopeptidases sur lequel on ajoute le premier segment amino-acide protégé du peptide visé. La configuration de cet élément de liaison varie selon la voie de synthèse, par la voie à C terminal ou à N terminal, que l'on utilise. L'utilisation d'un élément de liaison spécifique aux endopeptidases a l'avantage de nécessiter des conditions modérées de pH et de température pour l'enlèvement du peptide visé.Bien que par exemple on puisse utiliser une saponification dans une route à N terminal si le premier amino-acide du peptide est fixé directement à un polynucléotide porteur, la saponification se fait dans des conditions sévères et peut.conduire à une racémisation. Ainsi, si l'ôn considère la fixation plus en détail, pour la synthèse par la route par C terminal, le ribose à l'extrémité 3' d'un polynucléotide est oxydé en dialdéhyde avec copulation ultérieure d'un élément de liaison spécifique aux endopeptidases par une alkylation réductrice qui comprend la formation d'un produit d'addition amine-dialdéhyde puis réduction de ce produit d'addition en solution aqueuse avec le borohydrure de sodium, par exemple. Donc l'élément de liaison comporte, à une extrémité, un groupement amino primaire pouvant réagir avec la partie ribose oxydé du nucléotide. L'autre extrémité'contient un groupement carboxy qui, après avoir acylé un groupement N -amino d'un acide ajouté, peut être hydrolysé par l'action d'une endopèptidase. Les polypeptides eux-mêmes contenant un reste arginine ou lysine à terminaison carboxyle constituent une classe utile de tels éléments de liaison, en particulier quand le reste à N terminal ou d'autres restes proviennent d'acides hydrophobes ne necessitant pas de protection comme la glycine, l'alanine ou la valine.Le dipeptide, glycyl-L-arginine, est un elément de liaison utile qui peut être copulé, par alkylation réductrice, à un polynucléotide selon le procédé de Royer, et al, BBRC, 64, 478 (1975). L'élément de liaison dipéptidique, fixé par une liaison amine tertiaire au nucléotide, comporte ainsi un groupement carboxy libre disponible pour l'addition d'un premier amino-acide ou d'un premier segment polyacide à groupement carboxy protégé, pour la préparation d'un peptide visé par la route par C terminal. Quand on désire utiliser comme porteur le polyéthylèneglycol ou l'alcool polyvinylique, le groupement alcool est transformé en dérivé alcoolate, par exemple par réaction avec le t-butylate de potassium, et on fait réagir le dérivé alcoolat avec le bromoacétate d'éthyle pour former le dérivé carboxy-méthylé, On hydrolyse ce dérivé pour obtenir l'acide libre que l'on copule avec l'élément de liaison spécifique aux endopeptidases en utilisant un agent d'activation qui est un carbodiimide soluble dans l'eau. La polyvinylpyrrolidone, le copolymère acrylamide-acide acrylique et l'anhydride polyéthylènemaléique sont soumis à une hydrolyse basique pour former des drivés ayant des groupements carboxy libres. Les polyamides sont choisis parmi ceux ayant un groupement carboxy libre. On copule également ces substances avec l'élément de liaison comme indiqué précédemment. Après préparation, la séparation du peptide visé de son complexe avec le porteur peut être effectuée en utilisant une endopeptidase très spécifique, par exemple la trypsine, qui coupe seulement les liaisons peptidiques dont le groupement carbonyle est celui de l'arginine (ou de la lysine). L'enzyme pour cette coupure peut être utilise soit liée à un support soit libre en solution à un pH alcalin modéré. Pour la synthèse des peptides par le N terminal, la préparer tion du polynucléotide porteur nécessite à nouveau l'oxydation de la partie ribose, un élément de fixation y étant fixé par une liaison amine secondaire par l'intermédiaire d'une alkylation réductrice. Cependant, dans ce cas, l'extrémité de l'élément de liaison prévue pour la copulation covalente avec le premier aminoacide à ajouter doit comporter un groupement amino libre de sorte qu'une croissance de la chaîne par le N terminal puisse se produire. Ainsi, l'élément de liaison contient un groupement amine primaire aux deux positions terminales, un pour la réaction avec le nucléotide l'autre pour la complêxation avec le premier reste acide de la séquence.En outre, pour avoir également l'activité nécessaire de l'éndopeptidase pour une séparation éventuelle du peptide visé et du porteur, le groupement amine utilisé pour la copulation covalente au premier reste acide de la séquence désirée est fourni par le groupement -amino de l'arginine ou de la lysine ou de leurs dérivés. Une manière commode de préparer le porteur pour la croissance de la chaîne par le N terminal consiste d'abord à copuler par voie réductrice une diamine à courte chaîne au nucléotide contenant l'aldéhyde, Royer et al, voir ci-dessus. Puis, on fixe l'arginine ou la lysine à groupement N -amino protégé par l'intermediaire du groupement carboxy acide sur l'amine disponible de la diamine, par exemple en utilisant comme agent d'activation un carbodiimide soluble dans l'eau, et on enlève le groupement protecteur, par exemple en utilisant l'enzyme L-pyrrolidone-carboxylpeptidase, pour obtenir le porteur désiré ayant un groupement amino libre disponible pour la synthèse peptidique par la voie à N terminal. Quand on désire utiliser un polymère vinylique ou un polyamide comme porteur, on prépare comme précédemment les dérivés contenant un groupement carboxy libre. On copule le dérivé carboxylé avec une diamine, comme l'éthylènediamine, en utilisant un carbodiimide. L'élément de liaison arginine ou lysine à groupement N-amino protégé est fixé à la diamine comme indiqué précédemment pour les porteurs polynucleotides. La récupération ultérieure du peptide visé à partir du porteur peut être effectuée par l'utilisation en deux étapes d'une endopeptidase spécifique de l'àrginine ou de la lysine comme decrit précédemment puis d'une exopeptidase spécifique de l'arginine ou de la lysine, par exemple la carboxypeptidase B. La première enzyme libère le peptide visé à terminaison arginine ou lysine du reste du porteur alors que la seconde élimine le reste arginine ou lysine à C terminal et libère simultanément le peptide visé. Comme indique précédemment, les deux enzymes peuvent etre utilisées liées ou en solution à un pH alcalin modéré. Si la lysine ou l'arginine doivent être présentes dans le peptide visé, il faut protégé les chaînes latérales de ces segments amino-acide. Si ces chaînes latérales n'étaient pas protégees, le peptide visé lui-même serait fragmenté par l'endopeptidase utilisé pour la séparation du porteur. Les groupements protecteurs types sont le groupement trifluoroacêthyle pour le groupement t -amino de la lysine et le groupement nitro pour la chaîne latérale guanidinium de l'arginine. La déprotection de ces restes peut être effectuée par des modes opératoires classiques bien connus dans ce but. Pour empêcher l'amino-acide ajouté de réagir avec lui-même pendant l'allongement de la chaîne, le groupement oc-amino primaire ou, quand cela est le cas, son groupement carboxy, ainsi que les autres groupements réactifs à l'exception de la partie réactive envisagée, doivent être bloqués ou protégés de façon appropriée. Comme décrit ci-après, un groupement de blocage ou de protection préféré pour un groupement m-amino ou un groupement carboxy est un groupement qui peut être éliminé par voie enzymatique. Un aspect préféré des la présente invention, en particulier en ce qui concerne la synthèse des peptides par la voie par le C terminal, réside dans l'utilisation de dérivés d'esters d'aminoacides non activés contenant un groupement N -amino libre, pour effectuer la réaction avec le précurseur. Des composés appartenant à cette catégorie comprennent ceux préparés à partir d'un seul amino-acide ainsi que d'autres composés, par exemple ceux contenant une ou plusieurs liaisons peptidiques préparées à partir d'aminoacides identiques ou différents.Ces dérivés d'amino-acides contenant un groupement carboxy bloqué par un ester peuvent être représentés par la formule suivante dans laquelle n est un entier de O ou plus ; A est une chaîne latérale d'amino-acide qui peut différer dans chaque motif quand n est autre que 0 ; et R est un groupement de blocage qui empêche le dérivé d'acyler une molécule contenant un groupement amino libre. R est de préférence un groupement alkyle à chaîne droite ou ramifiée et courte, ayant moins d'environ 10 atomes de carbone, qui peut être éliminé par voie enzymatique comme décrit ci-après. D'autres groupements ester appropriés sont les groupements benzylique et nitrobenzylique. On prépare les dérivés représentés par la formule II cidessus par des techniques connues d'esterification comme la réaction à catalyse acide d'un amino-acide avec un alcool. En utilisant ces dérivés, la réaction avec un précurseur contenant un groupement carboxy libre peut être effectuée à une température voisine de O dans l'eau a un pH acide, en utilisant un carbodiimide soluble dans liteau comme réactif de copulation. Quand on choisit une route par le N terminal, les moyens classiques de copulation d'un acide N bloqué à un précurseur à groupement amino libre en utilisant un carbodiimide soluble dans l'eau constitue également une solution attrayante et pratique. De préférence, comme on le décrira, le groupement de blocage sur le Ni peut être enlevé par voie enzymatique. Un autre moyen de copulation comprend l'utilisation de derivés d'amino-acides N - bloqués actifs pour effectuer la réaction avec le précurseur. Les esters actifs d'amino-acide sont un exemple de ces dérivés. Comme on le sait (Bodanszky and Klausner, The Chemistry of Polypeptides, ed.Katsoyannis, p. 21, Plenum, 1973), ces esters actifs forment spontanément des liaisons peptidiques en solution à la température ambiante, avec une racémisation nuisible minimale. On peut préparerles esters actifs en faisant réagir la partie acide d'un amino-acide N-protégé avec un alcool ayant des substituants qui le rendent facilement déplaçable par un groupement amino d'attaque sur la chaîne du précurseur. La réaction préparatoire peut être effectuée dans un solvant organique en présence d'un carbodiimide. Les alcools aliphatiques contenant un ou plusieurs groupements attracteurs d'électrons, les dérivés du phénol (et du thiophénol) et les derivés de l'hydroxylamine sont des alcools utilisables.Des exemples particuliers des esters actifs utiles sont ceux contenant les groupements labiles déplaçables suivants cyanométhyle, carboéthoxyméthyle, propargyle, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphtalimide, p-nitrophényle, 2,4,5-trichlorophényle, ainsi que d'autres donnés dans la référence précédente. Bien que l'on préfère les esters actifs, on peut également utiliser les dérivés d'amino-acide préparés avec d'autres groupements facilement déplaçables sur la partie carboxy. Ces groupements comprennent, par exemple, les groupements azido, imidazole, halo, acyle et phosphoryle. Avec les groupements facilement éliminables par voie enzymatique sur les atomes Nq les dérivés actifs d'amino-acides et en particulier les esters constituent une catégorie utile de composés pour la synthèse peptidique utilisant la voie par le N terminal. La réaction d'acylation avec la chaîne et le mode opératoire de déblocage pour l'allongement ultérieur peuvent tous deux être effectués en solution dans des conditions très modérées, en minimisant ainsi tout effet nuisible sur le polymère que l'on synthétise. Comme on le décrira ci-après, l'utilisation d'esters actifs peut également éviter le blocage d'autres chaînes latérales sur certains amino-acides qui nécessitent habituellement une protection appropriée. Dans leurs aspects essentiels, les composés constituant la classe précédente d'esters actifs sont ceux qui contiennent un dérivé d'amino-acide ayant un groupement carboxylique terminal activé et un groupement de blocage de l'azote susceptible d'élimination par une enzyme spécifique correspondante. Dans un mode de réalisation, ces composés peuvent être représentés comme suit dans laquelle B est un groupement de blocage de l'azote Nt ez éliminable par voie enzymatique ; X est un groupement facilement déplaçable par un groupement amino ; et n et A sont tels que définis dans la formule Il. Le groupement L-pyrrolidonecarboxyle (pyroglutamyle) est un groupement de blocage N-acyle utile. Kurath et Tnomas, Helv.Chim.Acta, 56, 1658 (1973) et Doolittle, Methods in Enzymol, 19, 558 (1970) illustrent la manière selon laquelle on peut utiliser l'acide pyrrolidonecarboxylique pour préparer les dérivés N -L-pyrrolidonecarboxyliques d'amino-acides. Pour obtenir un taux de transformation élevé, la réaction d'allongement peut être effectuée avec un grand excès du segment séquentiel ajouté, semontantà un rapport équivalent d'au moins 2:1, et de préférence 5:1. Cependant, la solution après réaction peut néanmoins contenir du précurseur transformable n'ayant pas réagi . Dans un mode opératoire répétitif, la présence d'un tel précurseur n'ayant pas réagi peut produire une faillite de la séquence. Bien que le blocage du précurseur n'ayant pas réagi puisse être effectué avant la réaction suivante, le blocage ne modifie pas la structure moléculaire du précurseur et la possibilité d'une faillite de la séquence continue à exister si un déblocage venait à se produire par la suite. Donc, un autre aspect de cette invention consiste à l"'elagage". L'élagage est l'élimination sélective et chimique du précurseur n'ayant pas réagi et du composé ayant réagi après formation de ce dernier, ce qui laisse un composé ayant réagi de façon appropriée exempt de substance contenant la structure moléculaire de base du précurseur n'ayant pas réagi . L'élagage est important en ce qu'il permet la séparation et la récupération finales d'un peptide visé pur. En ce qui concerne la synthèse des polypeptides qui sont allongés par acylation d'un groupement amino terminal sur le précurseur en utilisant des segments N-bloqués et à groupement carboxy libre, ou par acylation d'un groupement N-amino libre d'un segment à C terminal et groupement carboxy bloqué à l'aide d'un groupement carboxy libre sur le précurseur, l'élagage peut être effectué en hydrolysant par voie enzymatique les chaînes de précurseurs qui ne se sont pas allongées et en dégradant ainsi ces chaînes. Les chaînes n'ayant pas réagi contiennent encore, evidemment, un groupement amino libre dans le cas de la croissance par le N terminal ou un groupement carboxy dans le cas de la croissance par le C terminal, et peuvent donc être attaquées par voie enzymatique si l'on utilise une enzyme appropriée.D'autre part, les chaînes qui se sont allongées de façon appropriée auront leur groupement réactif terminal (amino ou carboxy) protégé par un groupement de blocage et ne subiront pas l'hydrolyse. Un procédé préféré d'élagage enzymatique consiste a faire passer la solution de réaction dans une colonne qui contient un materiau de support insoluble dans l'eau sur la surface duquel est immobilisée une enzyme qui hydrolyse sélectivement les substances à N terminal ou à C terminal. Une ariinopeptidase, comme l'amino- peptidase M ou l'aminopeptidase de la leucine, convient pour l'hydrolyse sur le N terminal (Royer et Andrews, 1973, J. Biol. Chem, 248, 1807). L'hydrolyse est effectuée à une température comprise entre 00 et 500C et à un pH de 6,5 à 7,5. Pour l'hydrolyse concernant un C terminal, une carboxypeptidase comme la carboxypeptidase A, B, C ou Y est utilisable. On a démontre que ces enzymes Y et C, à pH 4-6, ont une activité d'exopeptidase sur le C terminal non spécifique.Hayashi et al, Jsiolchem, 248, 2296 (1973) et Kuhn et al, Biochemistry, 13, 3871 (1974). On utilise une température de 0 à 600C. Toutes ces enzymes sont spécifiques vis-à-vis des restes L - amino-acide et, comme il sera décrit ci-après, le précurseur n'ayant pas réagi sera présent seulement sous la forme isomère L. Une autre méthode d'élagage consiste à éliminer le précurseur n'ayant pas réagi de la solution réactionnelle, par exemple en le fixant à un support insoluble dans l'eau puis en séparant la solution du support. En ce qui concerne un précurseur ayant une terminaison amino libre, une façon d'effectuer ceci consiste à immobiliser sur un support un réactif électrophile qui a une réactivité covalence spécifique pour le groupement amino terminal libre du précurseur n'ayant pas réagi puis à faire passer la solution de réaction en contact intime avec le support pour y fixer le précurseur ayant pas réagi . Un réactif électrophile approprié est le disulfure mixte formé par réaction d'un dérivé de thiol et de l'anhydride mercaptosuccinique.Pour l'élimination par le C terminal, on peut utiliser un support contenant des groupements amino primaires libres en conjonction avec des carbodîimides solubles dans l'eau. Après l'élagage du précurseur n'ayant pas réagi , on sépare les chaînes allongées de façon appropriée de l'excès d'amino-acide n 'ayant pas réagi . On effectue de préférence cette séparation pendant que le complexe allongé est copulé de façon réversible à un support insoluble. La copulation réversible, pour les besoins de la présente invention, doit être considéree comme une fixation à l'aide d'une association non covalente et non ionique entre deux substances qui ont une affinité spécifique l'une vis-à-vis de l'autre dans un milieu aqueux, affinité qui peut être dissipée sans réaction chimique. La copulation réversible permet ainsi la fixation au support et la libération à partir du support sans utilisation de conditions sévères qui pourraient nuire au composé transformé. Pour permettre une copulation réversible au support, le précurseur peut être une partie d'un complexe soluble dans l'eau plus important qui contient un polynucléotide porteur fixé au précurseur par son extrémité non susceptible d'allongement. Le support insoluble est commodément contenu dans une colonne et comporte, fixé par covalence sur sa surface,un polynucléotide adsorbant qui a une affinité spécifique pour le polynucléotide porteur complexé au précurseur ayant réagi . Lorsque la solution contenant le complexe traverse la colonne, le précurseur allonge est copulé de façon réversible au support insoluble par la réaction d'affinité entre le porteur et l'adsorbant.La séparation des chaînes allongées, sous forme complexée, et des substances non apparentées au point de vue chimique, comme le réactif amino-acide n'ayant pas réagi qui ne contient pas le porteur lié par covalence, est donc effectuée. La copulation peut être simplement inversée par la chaleur, la présence d'une association concurrente ou un changement de pH. Pour obtenir une copulation réversible, le polynucléotide choisi comme porteur doit avoir une base qui est complémentaire, en ce qui concerne la disposition spaciale et l'action d'affinité, avec la base du polynucléotide adsorbant. Des exemples de paires de bases complémentaires utilés sont l'adénine avec l'uracile ou la thymine et la cytosine avec la guanine.On verra que l'on peut également utiliser des polynucléotides du type "copolymère" en particulier quand ils ont la forme séquence contenant des segments alternés et répétés de paires de bases complémentaires. Dans ce cas évidemment, on peut utiliser le même polynucléotide comme porteur et comme adsorbant. Quand on effectue la réaction d'allongement en utilisant un précurseur qui contient un polyethylène glycol, un polymère vinylique ou un polyamide comme porteur, on effectue de façon classique la séparation du segment amino-acide ajouté n'ayant pas réagi . Une autre caractéristique préférée de la présente invention fournit un procédé permettant de débloquer par voie enzymatique le complexe allongé avant de l'utiliser comme autre précurseur dans les étapes ultérieures. I1 est évidemment nécessaire que le groupement de blocage sur le complexe allongé soit sélectivement dégradable par action enzymatique. En considérant d'abord cet aspect de la présente invention dans lequel on effectue l'allongement de la chaîne par l'extrémité à C terminal d'une chaîne en croissance par réaction avec un segment amino-acide de formule II, le groupement de blocage sur le segment acide est de préférence un groupement alkyle à courte chaîne ou un groupement benzyle copulé à l'acide par une liaison ester. Une raison pour ceci est que le déblocage après la réaction avec le précurseur peut être effectué par-voie enzymatique en utilisant une estérase, en hydrolysant ainsi le groupement ester pour obtenir le groupement carboxy à C terminal libre pour l'allongement ultérieur de la chaîne. Une carboxypeptidase, comme la carboxypeptidase Y, est utilisable dans ce but pour autant que l'on maintienne le pH entre 8 et 9, de préférence à 8,5. A un pH de 8,5, cette enzyme présente une activité optimale d'estérase à l'exclusion de l'activité de peptidase, alors que, comme indiqué précédemment, à un pH inférieur c'est exclusivement une exopeptidase. On effectue la réaction d'hydrolyse à une température comprise entre 0 et 600C. Un autre avantage significatif utilisant l'utilisation de cette enzyme pour le déblocage est que l'hydrolyse est seulement effectuée sur les esters des L-amino-acides. Ainsi, les chaînes contenant des esters bloqués de D-amino-acides ne sont pas hydrolysées par l'enzyme et ne sont pas disponibles pour la croissance ultérieure. Par suite, on peut obtenir un degré élevé de pureté optique dans le peptide visé. Quand on désire une croissance à partir de la terminaison en N, le groupement L-pyrrolidonecarboxy est un groupement de blocage utile pour le groupement -amino sur l'acide ajouté. Le complexe allongé contenant ce groupement de blocage est ensuite exposé à une enzyme, comme la L-pyrrolidonecarboxypeptidase, qui a la spécificité nécessaire à une température comprise entre 0 et 600C et un pH de 7 à 8. Cette enzyme est efficace dans le déblocage de seulement les dérivés des L-amino-acides. Ainsi, toutes les chaînes à terminaison isomère D restent bloquées et ne sont donc plus disponibles pour la croissance ultérieure. Dans l'un ou l'autre des cas précédents, un contact intime doit être obtenu entre le groupement de blocage sur les chaînes et l'enzyme pour effectuer de façon pratiquement totale le déblocage des chaînes à terminaison isomère L. En conséquence, on préfère que le contact soit effectué pendant que le précurseur allongé est dissous dans un milieu aqueux. En outre, pour séparer facilement le composé débloque ét enzyme et minimiser les pertes en enzyme, l'enzyme est de préférence immobilisée sur un support insoluble dans l'eau.Donc une façon préférée d'effectuer le déblocage consiste à faire passer la solution aqueuse du complexe allongé bloqué dans une colonne qui contient un support insoluble sur lequel est immobilisée l'enzyme Comme on le verra, en ce qui concerne la synthese par le C terminal, une colonne contenant la carboxypeptidase Y immobilisee sur un support insoluble dans l'eau peut être utilisée tant pour l'élagage du précurseur n'ayant pas réagi que pour le déblocage du groupement carboxy terminal du complexe allongé bloqué, en ajustant simplement le pH pour obtenir respectivement l'activité d'exopeptidase ou d'estérase désirée. Considérons maintenant l'utilisation combinée des caractéristiques précédentes dans une synthèse préférée de polypeptides en plusieurs étapes ; l'étape initiale est la réaction d'un premier dérivé amino-acide avec un porteur pour former un complexe covalent soluble dans l'eau contenant le premier reste amino-acide de la séquence prévue. L'acide ajouté contient un groupement protecteur éliminable par voie enzymatique sur le groupement N amino ou Ccarboxy, selon la route choisie. On élimine le dérivé amino-acide n'ayant pas réagi de la solution réactionn9lle contenant le complexe initial, en faisant passer la solution sur une colonne contenant un support insoluble dans l'eau à la surface duquel est immobilisé un adsorbant qui peut réagir par affinité avec le porteur.De préférence, quand le porteur et l'adsorbant sont des polynucléotides, on maintient la solution à environ 40C. On lave ensuite le support plusieurs fois avec un tampon de phosphate à pH 7,5 à cette température. Puis on élue le complexe du support sous forme d'une solution aqueuse exempte du dérivé ainsi ajouté, simplement en faisant passer du tampon dans la colonne à une température élevée, de préférence de 40C à 600C. Puis on fait passer la solution ainsi obtenue dans une autre colonne pour éliminer le groupement de blocage sur le segment acide terminal du complexe. En conséquence, cette colonne contient un support insoluble sur la surface duquel est immobilisée une enzyme ayant une spécificité vis-à-vis du groupement protecteur, Puis on introduit à nouveau la solution dans un récipient de réaction propre et, comme le groupement de blocage a été enlevé, on peut effectuer l'allongement de la chaîne avec le second aminoacide de la série prévue. Comme avec le premier acide, on utilise un dérivé du second acide pour qu'il soit bloqué de façon appropriée sur le NZ ou le C. Puis on répète le mode opératoire précédent pour ajouter successivement les acides désirés sur le complexe contenant la chaîne polypeptidique en croissance jusqu a ce qu'on ait préparé un polypeptide court, par exemple un hexapeptide. On notera que jusqu'à ce point on n'a pas utilisé l'élagage des chaînes qui n'ont pas réagi avec l'acide ajouté. Comme on le verra, il n'y a pas d'avantage particulier à obtenir de l'inclusion de cette étape dans les premiers stades de la synthèse, bien -qu'on puisse l'utiliser sans conséquence nuisible si on le désire. A ce moment, on traite-par voie enzymatique la solution recueillie après séparation de l'acide n'ayant pas réagi et du peptide à chaîne courte, pour libérer du porteur les chaînes allongées. On fait passer de nouveau la solution sur le support contenant l'adsorbant immobilisé pour enlever le porteur séparé, et on isole de la solution le peptide visé à chaîne courte à groupement amino ou carboxy terminal bloqué. Comme l'apparition d'une faillite de la séquence dans l'une quelconque des etapes précédentes entraîne la présence de chaînes ayant moins de six, par exemple, restes amino-acide, lâ séparation et l'isolement du peptide à chaîne courte désirée peut facilement être effectué par des techniques classiques, comme une chromatographie par échange d'ion ou par filtration sur gel. La préparation de polypeptides à longue chaîne par le procédé de la présente invention utilise comme précurseur un polypeptide à chaîne courte. Le précurseur polypeptidique à chaîne courte peut être préparé par le présent procédé comme illustré précédemment, ou préparé par synthèse selon d'autres procédés. En outre, on peut utiliser comme précurseur des polypeptides naturels à chaîne courte. Dans tous les cas, le polypeptide à chaîne courte pur est fixé au porteur biospecifique, on effectue le déblocage enzymatique puis on utilise le complexe du peptide à chaîne courte comme précurseur pour l'allongement de la chaîne avec le dérivé d'amino-acide suivant. C'est à ce point que l'on commence de préférence l'élagage des chaînes n'ayant pas réagi décrit précédemment.A cette fin, on fait passer la solution réactionnelle, qui contient le complexe du polypeptide allongé, l'acide bloqué en excès n'ayant pas réagi et le complexe n'ayant pas réagi du précurseur polypeptidique à courte chaîne, sur une autre colonne contenant un support insoluble à la surface duquel est immobilisée une exopeptidase spécifique vis-à-vis des groupements amino ou carboxy terminaux. Par passage sur cette colonne, les chaînes de précurseur n'ayant pas réagi , qui contiennent un groupement amino ou carboxy terminal non bloqué, sont dégradées par voie enzymatique et sont donc élaguées de la population des chaînes désirée. Par la suite, cette étape est incorporée dans le mode opératoire séquentiel répétitif décrit précédemment lorsque l'on allonge la chaîne avec des dérivés amino-acide supplémentaires Enfin, après la préparation du polypeptide visé désiré, on libère les chaînes polypeptidiques du porteur biospécifique et on sépare et'on purifie le peptide visé. On verra que, en raison de l'incorporation de l'étape de dégradation enzymatique pour chaque séquence après la préparation du précurseur polypeptidique à chaîne courte, la solution réactionnelle finale contient très peu, et de préférence pratiquement pas de chaînes polypeptidiques qui diffèrent du peptide visé d'un nombre d'amino-acides inférieur au nombre de restes amino-acide dans le précurseur. Ainsi, on peut utiliser des techniques de separation-classiques. En outre, on verra que le mode opératoire répétitif précédent décrit de manière générale est utile pour les voies de synthèses des peptides par le C terminal et le N terminal. Les principales différences entre les deux routes résident en la manière selon laquelle on fixe la chaîne en croissance au porteur et dans le choix des groupements de blocage et des enzymes. I1 peut également y avoir une différence dans la manière selon laquelle on effectue l'activâtion pour l'allongement de la chaîne, par exemple utilisation d'esters actifs pour la croissance par le N terminal au lieu d'une copulation activée par un carbodiimide. On préfère cette dernière technique, qui est utilisable tant pour la croissance par C terminal que pour la croissance par N terminal.On préfère nettement la solution par le C terminal pour l'allongement des chaînes. En raison de la description précédente, on verra que les difficultés associées à une faillite de la séquence à un quelconque stade peuvent être éliminées de façon substantielle pour autant que (1) on utilise un précurseur transformable pur pour la réaction à un certain stade intermédiaire du mode opératoire et (2) que l'on utilise la dégradation du précurseur n'ayant pas réagi dans tous les stades ultérieurs. Le point minimum auquel l'utilisation d'un précurseur polypeptidique pur est nécessaire depend du poids moléculàire final du polypeptide à préparer. On peut considérer le poids--moléculalre du précurseur polypeptidique pur comme la différence minimale de poids moléculaire qui existera dans la solution de polymère finale entre le polypeptide désiré et les chaînes polymères impures.Donc, lorsque le poids moléculaire du polypeptide désiré augmente, la différence minimale entre le poids des chaînes pures et des chaînes impures devient plus faible pour un quelconque précurseur polypeptidique pur donné, et la difficulté de la purification finale augmente. En conséquence, bien qu'un précurseur hexapeptidique pur conviénne quand la préparation finale d'un polypeptide contenant 20 à environ 35 restes amino-acide, il est entendu qu'il faut utiliser initialement des précurseurs polypeptidiques purs correspondants plus longes pour la préparation de polymères purs de poids moléculaire supérieur. Ainsi, on voit que le procédé illustré peut être utilisé lui-même pour préparer des précurseurs purs de poids moléculaire élevé que l'on utilisera ensuite dans la préparation de composés de poids moléculaire encore plus important. Par exemple, un polypeptide contenant 35 restes acide préparés comme décrit précédemment peut lui-meme être utilisé comme précurseur pur pour la préparation d'un polymère contenant jusqu'à 100 restes amino acide. Le procédé de la présente invention peut être utilisé dans la synthèse de peptides comme le glucagon, l'enképhaline, l'hormone adrénocorticotrope, la calcitonine, la vasopressine, la pentagastrine et l'endorphine. Comme indiqué précédemment, les groupements réactifs autres que le groupement -amino ou carboxy sur certains amino-acides doivent être bloqués ou protégés pendant l'allongement de la chaîne. Comme on le sait, ces groupements sont le groupement C-amino de la lysine, le groupement imidazole de l'histidine, le groupement hydroxy phénolique de la tyrosine, les groupements carboxy des acides glutamique et aspartique, le groupement thiol de la cystéine et le groupement guanidinium de l'arginine. Typiquement, l'élimina- tion de ces groupements de blocage est l'étape finale du mode opératoire de synthèse totale. Le tableau suivant donne des exemples des groupements protecteurs connus ; voir également Solid Phase Peptide Synthesis, Stewart et Young, Freeman and Co, 1969, pp. 13-23, pour trouver des groupements de blocage ainsi que les conditions dans lesquelles on peut les éliminer. TABLEAU Acide Groupement de blocage Enlèvement Lysine acétamido ou ^ pH 9,hydrazine trifluoroacétyle 1,2 M ou pipéridine 1 M à OOC. Histidine éthoxyformyle pH 9, hydrazine 1,2 M Tyrosine acétyle pH 9, hydrazine 1,2 M Cystéine acétamidométhyle mercurique puis (Veber et al, 1972, H2S (à enlever J. Am. Chem. Soc, 94, en dernier) 5456) Arginine nitro hydrogénolyse catalytique Un aspect particulier de la présente invention réside dans le fait que seulement une certaine protection minimale des groupements secondaires est nécessaire. Ce fait, en combinaison avec l'utilisation d'un porteur biospécifique de poids moléculaire élevé, est avantageux pour obtenir la solubilité dans l'eau du polypeptide en croissance. Ainsi, quand on utilise les esters actifs décrits précédemment des amino-acides pour l'allongement de la chaine (croissance par le N terminal), il est necessaire de bloquer seulement le groupement | amino de la lysine et le groupement thiol de la cystéine. Ceci permet les avantages accompagnant la préparation initiale des amino-acides et permet d'éviter la nécessité d'un déblocage final et d'un effet nuisible potentiel sur le polypeptide préparé. Pour la croissance sur le C terminal, il est nécessaire de protéger les groupements secondaires carboxylate des acides glutamique et aspartique .Egalement, en raison du mode opératoire décrit précédemment pour séparer le peptide du porteur, dans les deux routes de synthèse, le groupement E-amino de la lysine et le groupement guanidinium de l'arginine nécessitent également une protection quand l'un ou l'autre de ces acides sont compris tant dans le porteur que dans le peptide visé. Il a été indiqué qu'on utilise un support insoluble dans l'eau pour l'adsorbant immobilisé et les enzymes immobilisées. Bien que l'on puisse utiliser diverses substances connues insolubles dans l'eau, organique3 ou minérales, pour autant qu'elles ne nuisent pas à la chaîne de polymère en croissance ou au complexe formé avec cette chaîne, le support est de préférence rigide et stable au point de vue dimensionnel lorsqu'il change de solution, de sorte qu'il-puisse tolérer diverses conditions de réaction. Les billes de verre poreuses constituent une catégorie particulièrement préférée de support rigide. Comme illustré ciaprès, ces billes peuvent être traitées pour former des dérivés appropriés et pour être activées de façon à effectuer l'immobilisation des enzymes et des adsorbants. Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, est une source commerciale de telles billes qui sont fabriquées par Corning lforRs. Un support particulièrement utile est constitué par les billes de verre poreuses "Glycophase" G. Ces billes sont le dérivé de 2,3-dihydroxypropyloxypropyltriméthoxy silane du verre poreux. I1 est également entendu que les solutions aqueuses auquelles on se réfère ici peuvent contenir des solvants organiques ou d'autres ingrédients qui ne modifient pas les caractéristiques désirables des modes opératoires décrits. L'utilisation de solvants organiques comme le diméthylformamide ou le méthanol est en fait considérée comme indiqué pour la préparation de polypeptides de poids moléculaire élevé pour assurer la solubilité. Cependant, leur type et leur quantité doivent être choisis pour ne pas nuire à la copulation réversible dans l'étape de séparation. Les exemples suivants illustrent la manière selon laquelle on peut mettre en oeuvre la présente invention. EXEMPLE 1 A. Préparation des enzymes immobilisees On prépare cinq colonnes contenant chacune une enzyme particulière immobilisée sur 10 grammes de billes de verre poreuses "Glycophase" G (74-126 microns, diamètre des pores d'environ 550 ansstromsr obtenues chez Pierce Chemical Company ou, en ce qui concerne la carboxypeptidase Y, de CL-Sepharose de chez Pharmacia. Selon l'enzyme utilisée, on active le verre pour faciliter la fixation de l'enzyme par l'une des trois solutions. La solution (a) consiste à ajouter 10 grammes des billes à un bécher contenant de l'eau. On ajoute ensuite 10 grammes de bromure de cyanogène et, tout en maintenant la température de solution à 200C, on maintient constant à 11 le pH de la solution en agitant continuellement de l'hydroxyde de sodium 6 N froid. L'activaticn est considérée comme totale, généralement en environ 15 minutes, quand la nrise d'hydroxyde de sodium s'arrête, comme l'indique un changement du pH. A ce moment, on filtre les billes de la solution et on les lave avec une solution de bicarbonate de sodium 0,1 M à un pH de 9,5.La solution (b) comprend la réaction de 10 grammes des billes avec 0,5 gramme de bromure de paranitrobenzyle dans 50 ml de dioxannependant 24 heures à la température ambiante, puis on chauffe à 1000C dans une solution aqueuse à 10 % de dithionite. On lave avec de l'eau distillée les billes de Glycophase G à dérivé arylamine et on les active par diazotation dans 30 ml d'HCl 0,5 N à 0 C avec un excès de NaNO2, puis on lave les billes activées avec 3 litres d'acide sulfamique à 3 % et 20 litres d'eau distillée. La solution (c) comprend la réaction avec Nais4, Royer et al, voir ci-dessus. Les colonnes et le procédé de fixation d'enzyme (200 mg d'enzyme utilisée) sont donnés dans le tableau suivant. Solution Colonne Enzyme d'activation Méthode de fixation 1 L-pyrrolidonecarboxyl- (a) 6 heures à pH 8, 4 C dans peptidase un milieu aqueux 0, Im en 2-pyrrolidone contenant un tampon bicarbonate. 2 Aminopeptidase M (b) à pH 7,6 dans Tris contenant lmM de MnCl, Royer et al., J. Bio. Chem., 248 (5), 1807 (1973). 3 Carboxypetidase Y Transformation de Sepharose em dérivé d'hexaméthylène diamine par alkylation réductrice puis copulation de l'enzyme avec un carbo diimide soluble dans l'eau à pH 4,5, 12h, 0-4 C. 4 Trypsine (c) Alkylation réductrice 5 Carboxypeptidase B (c) Alkylation réductrice B. Préparation du polynucléotide adsorbant immobilisé On prépare et on active par la solution (b) ci-dessus le dérivé arylamine de billes de verre poreuses Glycophase G. On fait réagir les billes à 0 C pendant 3 heures avec 100 mg d'acide polyadénylique du commerce (Poly A) (poids moléculaire supérieur à environ 1000) dans un tampon à pH 8.Après lavage, les billes contiennent environ 1 % en poids de l'acide. EXEMPLE 2 (Synthèse nar le N terminal) A. Préparation des esters actifs des Ni-L-pyrrolidonecarboxy- L-amino-acides On obtient des échantillons des amino-acides bloqués par des groupements L-pyrrolidonecarboxyle suivants, sous forme pratiquement pure, selon le procédé de Kurath et Thomas, voir ci-dessus L-Alanine ; L-Arainine ; Glycine ; L-Leucine S-ACM-L-Cystéine ; L-Sérine ; L-Phénylalanine ; L-Tyrosine ; -TFA-L-Lysine ; L-Valine. Ainsi, on refroidit à dans 100 ml de 1,2-diméthoxyéthane 0,1 mole d'un acide pyrrolidone carboxylique protégé disponible dans le commerce (Z-PC-OH) et 0,11 mole de N-hydroxysuccinimide (NHS). On ajoute 0,11 mole de dicyclohexylcarbodiimide. On agite le mélange réactionnel pendant 2 heures à 0-400C puis pendant une nuit à la température ambiante. On enlève par filtration la dicyclohexylurée et on lave avec du 1,2-dimethoxyethane supplémentaire. On réduit le volume desfiltrats à 400C sous vide. L'ester de N-hydroxysuccinimide de l'acide pyrrolidonecarboxylique à N protégé (Z-PC-NHS) cristallise dans le 2-propanol. Puis on dissout 6,0 moles de Z-PC-NHS dans 20 ml de dioxanne.On ajoute 10 ml d'une solution contenant 7,6 mmoles de NaCO3.H2O et 7,6 mmoles de llamino- acide désiré et on agite le mélange pendant 4 heures à la température ambiante. On réduit le volume à 4 ml. Après neutralisation avec HC1 1 N, il se forme un précipité qu'on lave avec deux portions de 2 ml d'eau. On recristallise la substance (Z-PC-Acide) dans du 2-propanl. On place environ 1 g de Z-PC-Acide, 1 g de noir de palladium et 200 ml de méthanol aqueux à 50 % dans un ballon à 3 tubulures. On fait passer de l'hydrogène gazeux dans la suspension pendant 3 heures u la température ambiante.Après élimination du méthanol et de l'eau, on cristallise dans un mélange de méthanol et d'éther l'amino-acide bloqué par un groupement L-pyrrolidonecarboxyle. Lorsqu'on a obtenu l'amino-acide bloqué par un groupement L-pyrrolidonecarboxyle selon le procédé précédent, on en prépare l'ester actif de N-hydroxysuccinimide en ajoutant un equivalent de chaque acide bloqué à des récipients de réaction séparés contenant de l'acétate d'éthyle, un équivalent de N-hydroxysuccinimide et 1,1 équivalent de dicyclohexylcarbodiimide. L'estérification du groupement carboxy libre s'effectue en agitant pendant 4 heures à la température ambiante. Puis on enlève des récipients les solutions réactionnelles. On filtre la dicyclohexylurée qui a précipité et on purifie les esters actifs par recristallisation dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole. B. Préparation du complexe polynucléotide-premier acide On oxyde 10 mg d'acide polyrridylique (Poly U) avec 0,01 M de Nais4 pendant 18 heures. On alkyle par réduction avec de lthexaméthylène-amine le produit contenant de l'aldéhyde résultant, selon Royer et al, Biochem,Biophys.Research Commun., 64, 478 (1975). On fait passer la solution à 40C dans la colonne préparée dans l'exemple 1B contenant du Poly A immobilisé qui adsorbe sélectivement le Poly U à dérivé diamine. Après lavage de la colonne et élévation de sa température à 550C, on en élue le Poly U à dérivé diamine dans un tampon de phosphate (pH 7,5). Puis on lie PC-L-arg-OH à Poly U à dérivé amine en utilisant du 1-éthyl-3-(3- diméthylaminopropyl)-carbodiimide soluble dans l'eau à pH 4,75 puis on élimine le groupement de blocage PC en faisant passer la solution dans la colonne 1 préparée comme dans l'exemple 1A. Ensuite, on ajoute à la solution un grand excès de l'ester activé de l'acide valine préparé comme dans l'exemple 2A, et on agite la solution pendant 2 heures. C. Le mode opératoire On fait passer 200 ml de la solution de 2B ci-dessus, contenant le complexe valyl-porteur, à 40C, par aspiration à 5 ml/ minute dans la colonne préparée dans l'exemple 1B contenant les billes d'acide polyadénylique immobilisé. Puis on lave la colonne à 40C avec des portions de 1 litre d'eau à 15 ml/minute pour enlever l'acide n'ayant pas réagi . PuIs on élève la température de la colonne à 550C et l'on fait passer 200 ml de tampon de phosphate (pH 7,5) à cette température dans la colonne à raison de 5 ml/mn, pour éluer le complexe polynuclétide-valine. Puis on fait passer la solution contenant le complexe, à pH 7,5 et à 250C, à 5 ml/mn, dans la colonne garnie 1 contenant la pyrrolidonecarboxypeptidase immobilisée pour enlever le groupement de blocage pyrrolidonecarboxyle, en fournissant ainsi 200 ml de solution qui contient le complexe porteur-valine avec un groupement -amino libre. Puis on place à nouveau cette solution dans un récipient de réaction propre et on répète le mode opératoire précédent avec addition séquentielle d'échantillons contenant les lysine, phénylalanine, cystéine, glycine et alanine activées et bloquées. Après préparation de la solution d'hexapeptide exempte de dérivé d'alanine n'ayant pas réagi et avant enlèvement du groupement de blocage, on fait passer la solution dans une colonne 4 contenant de la trypsine immobilisée, pour libérer les chaînes du porteur. La séparation de l'hexapeptide bloqué pur est ensuite effectuée en faisant passer la solution sur la colonne contenant l'acide polyadénylique immobilisé pour enlever le porteur, puis en effectuant une chromatographie de filtration sur gel. On réactive ensuite par estérification le groupement carboxyle de l'hexapeptide et on recomplexe sur le porteur comme dans 2A et B ci-dessus, on débloque (colonne 1) et on fait réagir avec l'échantillon d'arginine préparé comme dans 2A. On effectue ensuite le passage de la solution résultante, à 5 ml/mn et à 350C, dans la colonne contenant l'aminopeptidase M immobilisée (colonne 2) pour dégrader toutes les chaînes hexapeptidiques qui n'ont pas réagi avec l'arginine. On introduit par la suite cette étape dans le mode opératoire de synthèse pour l'addition de la leucine, de la tyrosine et de la sérine. Après fixation de la sérine sur la chaine en croissance et séparation du complexe du mélange réactionnel, on fait passer la solution contenant le complexe dans la colonne 4 pour enlever le porteur et on traite avec de la pipéridine 1 M à OOC pendant 1 heure pour enlever le groupement de blocage trifluoroacétyle sur le reste lysine.On fait passer la solution résultante à 5 ml/mn dans la colonne garnie de pyrrolidonecarboxylpeptidase immobilisée (colonne 1) pour enlever le groupement pyrrolidonecarboxyle terminal du reste acide, sérine, puis on traite la solution a pH 4 avec de l'acétate mercurique et on l'agite pendant une heure à 250C pour enlever le-groupement protecteur acétamidométhyle du reste cystéine. On forme le composé thio résultant en faisant barboter H2 S dans la solution. Enfin, on sépare le décapeptide ainsi préparé et on l'isole du Poly U résiduel et des autres ingrédients comme illustré précédemment EXEMPLE 3 On prépare une autre colonne de billes de verre poreuses garnie.On utilise des billes de Glycophase G et on les fait réagir initialement à 400C dans le dimethylformamine avec du c8lorure -de tosyle (10 % en poids des billes) et un équivalent de triéthylamine par rapport au chlorure. Puis on filtre le verre, on le lave et on le fait réagir avec un excès d'acide thioacétique pour déplacer les groupements tosyle sur la surface des billes. Puis on sépare les billes du milieu réactionnel et on les place dans un récipient contenant de l'eau pour hydrolyser l'acide et obtenir son dérivé thiol. On fait ensuite réagir les billes dans de l'eau à 250C avec de l'anhydride mercaptosuccinique pour obtenir des billes comportant un du sulfure mixte immobilisé sur leur surface. Le disulfure mixte est un réactif électrophile qui a une réactivité covalente spécifique pour les groupement amino primaires terminaux. On répète à nouveau l'exemple 1 sauf que la colonne contenant le disulfure immobilisé remplace la colonne 2 contenant l'aminopeptidase M immobilisée.Au lieu de dégrader les chaînes n'ayant pas réagi , le passage dans cette colonne sert à retenir ces chaînes par la réaction covalente entre le disulfure et le groupement amino terminal libre sur les chaînes n'ayant pas réagi . Donc, les chaînes polypeptidiques n'ayant pas réagi sont enlevées de la solution de réaction que l'on recueille à partir de la colonne. Après chaque opération d'enlèvement, on fait passer dans la colonne à 250C une solution aqueuse (pH 8) de borohydrure de sodium (0,5 M) pour en enlever les chaînes liées par covalence. On réactive ensuite la colonne par traitement par l'anhydride mercaptosuccinique pour restaurer le pont disulfure. EXEMPLE 4 (Synthèse par le C terminal) A. Préparation des amino-acides proteaés par des esters éthyliques On estérifie les amino-acides indiaués dans l'exemple 2A par réaction avec l'éthanol, à reflux, en présence d'une quantité catalytique d'HCl anhydre. On concentre le mélange réactionnel et par refroidissement les esters d'amino-acide cristallisent sous forme de chlorhydrate. Ces acides protégés sont également disponibles dans le commerce. B. Préparation du complexe porteur-eremier amino-acide On traite 10 mg de Pcly U par 0,01 M de NalO4 pendant 18 heures. Le dialdéhyde résultant est copule à gly-L-ara par alkylation reductrice selon Royer et al, Biochem.and Biophys Research Commun., 64, 478 (1975). On fixe l'ester éthylique de la valine, préparé comme dans 5A, par réaction en présence d'un carbodiimide soluble dans l'eau à pH 4,75, 0-40C, 12 hèures. C. Le mode opératoire Le mode opératoire répétitif de base est le même que pour la synthèse par le N terminal, sauf que l'on effectue le déblocage et l'élagae des chaînes n t ayant pas réagi en utilisant la colonne 3 contenant la carboxypeptidase Y immobilisée. Pour l'élagage, le pH est de 5,5 dans un tampon de phosphate. Pour débloquer, on ajuste le pH de la solution, avant passage dans la colonne, à 8,5 par addition de NaOH. Dans les deux cas, on utilise une température de la colonne de la solution de 350C. Pour la séparation du peptide et du porteur, on utilise un passage successif dans la colonne 4, dans la colonne de l'exemple lB et dans la colonne 5, les solutions respectives étant à un pH de 8 (en utilisant le tampon Tris) et en utilisant une température de solution et de colonne de 350C. EXEMPLE 5 Synthèse de H-Leu-Phé-Leu-OH A. Préparation du complexe porteur PEG-CH2-CO-Gly-Arg(NO2) On dissout 14 g de polyéthylèneglycol (PEG) (poids moléculaire 6000-7000) et 10 g de t-butylate de potassium dans 150 ml de tbutanol en chauffant à 400C. On ajoute 5 ml de bromoacétate d'éthyle en 10 minutes et après 2 heures supplémentaires d'agitation à 400C, on chasse le solvant dans un évaporateur rotatif. On dissout le résidu dans 100 ml de NaOH 2 N et on le conserve à la température ambiante pendant 2 heures. Puis on ajuste le pH du mélange à 2,0. On extrait le PEG deux fois dans 200 ml de CHC13. On lave à l'eau l'extrait organique puis on le sèche sur Na2SO4. L'évaporation du solvant fournit 12 g de carboxyméthyl-PEG. On fixe de la glycine au carboxyméthyl-PEG avec un carbodiimide soluble dans l'eau comme suit. On dissout 1,4 de Gly-OEt-HCl et 3,4 g de carboxyméthyl-PEG dans 25 ml de H2O. On ajuste le pH à 6,0 avec de la triéthylamine. On ajoute 2 g d'ethyl diméthylaminopropylcarbodiimide.HC1 (EDC) et on maintient le pH à 6,0 avec un pH-stat. Après 3 heures à la température ambiante, on acidifie le mélange réactionnel à pH 2,0 et on extrait le produit dans CHC13. On lave la couche organique avec HC1 1 N et de l'eau. Après séchage sur Na2SO4, on évapore le solvant sous pression réduite. On dissout 3,2 g de PEG-CH2CO-Gly-OEt dans 20 ml d'eau et on ajuste le pH à 10,5. On suit la saponification à ce pH en utilisant un pH-stat. Le produit de titrage est NaOH 0,1 N. On consomme environ 4 ml de base pendant la période de réaction d'une heure. L'acidification et l'extraction avec CHOC13 donnent 3,3 g de produit. L'analyse des amino-acides indique 100 mmoles de glycine/ mg de polymère. On fait réagir Arg(NO2)OMe.HCl d'une manière analogue à la copulation de lester éthylique de la glycine. On traite 3,30 g de PEG-Gly-Arg On maintient le pH avec NaOH 0,1 N pendant 5 heures à la température ambiante. On 'recueille par filtration l'enzyme liée. B. Préparation de PEG-CH2 COGly-Arg(NO,)Leu-Phé-Leu-OH On ajoute successivement Leu-OEtt Phé-OEt et Leu-OEt comme décrit précédemment. La vitesse de déprotection s'améliore de façon importante lorsque la longueur de la chaîne augmente. L'analyse des amino-acides pour le peptide final est en accord avec la théorie. C. Libération du peptide On dissout 1 g du produit final dans 20 ml d'un mélange 1:1 de méthanol et de cyclohexane. On ajoute 250 m de noir de palladium fraîchement préparé et on agite le mélange réactionnel au reflux pendant une heure. On filtre le catalyseur et on sèche le produit sous vide (0,9 g). On dissout le produit dans un tampon 0,1 M d'acétate de N-éthyimnrphoiine à pH 8,0 et on ajoute 1 g de trypsine liée (préparée selon Royer et al, Méthodes in Enzymol, (1977) 47, 40). On fait tourner en tourbillonnant la suspension pendant 6 heures. On suit la libération du peptide par chromatographié sur couche mince en utilisant comme étalon H-Leu-Phé-Leu-OH authentique. Le rendement en produit est 80 %, par rapport au nombre de sites d'amorçage disponibles sur le porteur PEG. Les modes opératoires illustrés dans les exemples précédents sont faciles à mettre en oeuvre, facilement susceptibles d'automatisation et applicables à la préparation synthétique aqueuse de polypeptides à partir d'amino-acides contenant des groupements amino primaires en position alpha. Comme on le verra, ceci comprend tous les amino-acides sauf la proline et ses homologues. En ce qui concerne la proline, le groupement amino acylable est un groupement amine secondaire et n'est pas suscéptible de blocage et de déblocage avec le groupement pyrrolidonecarboxyle. En conséquence, quand le polypeptide à préparer doit contenir le reste proline et quand on utilise la voie par le N terminal, il est nécessaire de bloquer cet acide par des techniques classiques, comme avec le groupement carbobenzoxy (Z) puis d'effectuer le déblocage avec par exemple un mélange d'HBr et d'acide acétique glacial. Donc, quand on synthetise un polypeptide contenant la proline à partir de la terminaison N, on arrête le mode opératoire décrit précédemment après avoir fixé à la chaîne la proline bloquée. On peut ensuite libérer la chaîne du porteur, l'isoler et enlever ie groupement de blocage. On fixe ensuite à nouveau la chaîne au porteur et l'on replète le mode opératoire décrit précédemment pour l'addition des acides suivants à la chaine. Bien que les exemples précédents aient illustré de manière particulière un procédé de préparation de polypeptides utilisant les aspects préférés de la présente invention en combinaison, on verra qu'un grand nombre des caractéristiques utilisées ont des possibilités d'application générale en dehors des modes opératoirés specifiques illustrés, tant en ce qui concerne la synthèse d'un polymère que d'autres modes opératoires de transformation moléculaire re en plusieurs étapes comprenant des réactions chimiques ensérie. Par exemple, la manière d'éliminer les problèmes associés à une réaction incomplete du précurseur par élagage est applicable à un quelconque mode opératoire de transformation moléculaire en plusieurs étapes où le précurseur n'ayant pas réagi peut être dégradé par voie enzymatique ou éliminé à l'aide d'un agent d'élimination. La même chose est vraie pour l'aspect de déblocage enzymatique décrit ici pour autant que le mode opératoire nécessite un groupement de blocage pouvant être enlevé. Ainsi, en ce qui concerne la préparation classique des peptides en phase solide où l'on effectue l'allongement de la chaîne lorsque la chaîne est fixée de façon covalente à un support insoluble, on verra que l'on peut faire passer successivement sur le support des solutions enzymatiques appropriées pour enlever les chaînes n'ayant pas réagi et pour effectuer le déblocage à chaque stade du mode opératoire répétitif. En ce qui concerne les procédés classiques en solution dans des solvants organiques, l'utilisation d'enzymes immobilisées comme illustré ici peut, par exemple, être employée de façon commode en isolant simplement la population des chaines peptidiques après chaque réaction d'addition d'acide séquentiel et en la dissolvant dans un milieu aqueux. On verra également que la caractéristique de copulation réversible écrite ici a des possibilités d'application au-delà du mode opératoire répétitif pris en exemple. Cette copulation est applicable de manière générale à des modes opératoires de transformation moléculaire en plusieurs stades dans lesquels, après la réaction chimique d'un précurseur transformable, il est nécessaire de séparer le produit transformé du composé ajoute n'ayant pas réagi . Bien que particulièrement applicable à la synthèse répétitive des polymères, comme les autres caractéristiques, la copulation réversible peut également être utilisée dans d'autres transformations moléculaires en plusieurs étapes prévues pour construire des composés par des réactions chimiques en série. Plus particulièrement, en ce qui concerne la synthèse des polymères plutôt que la séparation de la manière décrite ici de façon spécifique, le porteur de la chaîne en croissance peut être utilisé pour-copuler la chaîne à un support insoluble pendant la réaction avec le segment ajouté désiré et pendant la séparation. Ainsi, on peut utiliser un mode opératoire en phase solide pour l'allongement des chaînes. Les avantages particuliers envisagés sont que la réaction peut être effectuée en milieu aqueux et que la chaîne peut être facilement séparée du support une fois la chaîne terminée ou à un quelconque stade intermédiaire, sans qu'il soit nécessaire d'utiliser des conditions sévères. REVENDICATIONS 1. Procédé de synthèse d'une chaîne pentidique comportant une séquence distincte de segments amino-acides, qui consiste 1) à faire réagir un complexe précurseur pur, dans lequel un premier segment amino-acide de la chaîne peptidique à préparer est lié de façon covalente à un polynucléotide porteur, et où ledit segment contient un groupement carboxy terminal libre ou un groupement amino terminal libre, avec un second segment amino acide contenant un groupement Ni-amino libre et un groupement carboxy bloqué quand le précurseur a un groupement carboxy terminal libre, ou un groupement carboxy libre et un goupement N#amino bloqué quand le précurseur a un groupement amino terminal libre. dans un milieu aqueux ; 2) à recueillir éventuellement le complexe précurseur n'ayant pas réagi ; 3) à copuler de façon réversible le polynucléotide porteur du complexe ayant réagi à un polynucléotide adsorbant complémen- ta ire inxbilise sur un support insoluble 4) à séparer le complexe ayant réagi et le second segment amino-acide n'ayant pas réagi 5) à libérer le polynucléotide porteur de l'adsorbant 6) à débloquer éventuellement le groupement carboxy ou le groupement amino du complexe ayant réagi 7) à répéter éventuellement les étapes 1 à 6 jusqu'à addition du nombre desiré de segments amino-acide au précurseur 8) à libérer éventuellement la chaîne peptidique du porteur et à recueillir le produit 2. Procédé selon la revendication 1, àù le polynucléotîde porteur est l'acide polyuridylique et l'adsorbant est l'acide polyadénylique. 3. Procédé selon la revendication 2, ôù le polynucléotidé porteur est libére de l'adsorbant par chauffage. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2 et 3, où le groupement bloqué est débloqué par action enzymatique 5. Procédé de synthèse d'une chaîne peptidique ayant une séquence distincte de segments amino-acide, qui consiste à faire réagir un précurseur pur contenant un premier segment amino-acide de la chaîne peptidique à préparer ayant un groupement carboxy terminal libre ou un groupement amino terminal libre, avec un second segment amino-acide contenant un groupement N#-amino libre et un groupement carboxy bloqué susceptible d'hydrolyse enzymatique quand le précurseur a un groupement carboxy terminal libre, ou un groupement carboxy libre et un groupement N -amino bloqué susceptible d'hydrolyse enzymatique quand le précurseur a un groupement amino terminal libre, dans un milieu aqueux ; et à débloquer par voie enzymatique le peptide obtenu. 6. Procédé selon la revendication 5, où le précurseur contient un premier segment amino-acide lié de façon covalente à un nucléotide porteur. 7. Procédé selon la revendication 5, où le précurseur contient un premier segment amino-acide fixé à un polyéthylèneglycol porteur. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, où le second segment amino-acide contiént un groupement carboxy bloqué et le groupement de blocage est un groupement ester. 9. Procédé selon la revendication 8, où le groupement ester est un groupement ester alkylique. 10. Procédé selon la revendication 9, où le groupement carboxy est débloqué par voie enzymatique en utilisant une estérase. 11. Procédé selon la revendication 10, où le groupement carboxy est débloqué en utilisant' la carboxypeptidase Y pH 8,9, de préférence à pH 8,5. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, où le second segment amino-acide contiént un groupement amino bloqué et le groupement de blocage est le groupement L-pyrrolidonecarboxyle. 13. Procédé selon la revendication 12, où on débloque le groupement amino en utilisant la L-pyrrolidonecarboxypeptidase. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, où on enlève par voie enzymatique le complexe précurseur n'ayant pas réagi 15. Procédé de préparation d'une chaîne peptidique ayant une séquence distincte de segments amino-acide, qui consiste à faire réagir un précurseur pur contenant un premier segment amino-acide de la chaîne peptidique à préparer ayant un groupement carboxy terminal libre ou un groupement amino terminal libre, avec un second segment amino-acide contenant un groupement N-amino libre et un groupement carboxy bloqué quand le précurseur a un groupement carboxy terminal libre, ou un groupement carboxy libre et un groupement N amino bloqué quand le précurseur a un groupement amino terminal libre, dans un milieu aqueux ; et à enlever le précurseur n'ayant pas réagi par dégradation enzymatique ou à l'aide d'un agent d'élimination. 16. Procédé selon la revendication 14 ou 15, où le complexe précurseur contient un groupement carboxy terminal libre et le complexe n'ayant pas réagi est éliminé en utilisant la carboxypeptidase Y à un pH de 5 à 6. 17. Procédé selon la revendication 14 ou 15, où le complexe précurseur contient un groupement amino terminal libre et on enlève le complexe n'ayant pas réagi en utilisant l'aminopeptidase M. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, où on enlève à l'aide d'un agent d'élimination le complexe précurseur n ayant pas réagi 19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, 14 ou 18, où le porteur est fixé au premier segment amino-acide par I'intermédiaire d'un élément de liaison susceptible d'une coupure enzymatique. 20. Procédé selon la revendication 19, où la chaîne peptidique est libérée du porteur par voie enzymatique. 21. Procédé selon la revendication 1, où la chaîne peptidique est fixée au porteur par un reste arginine ou lysine. 22. Procédé selon la revendication 21, où la chaîne peptidique est libérée du porteur par la trypsine.