Brevet FR2414729A1 — publié le 19790810

L'invention concerne un procédé immunologique en phase solide pour la détection et la détermination des isoenzymes de créatine kinase La créatine kinase existe sous forme de trois combinaisons d'isoenzymes, désignées par MM, BB et MB. MM est la forme prédominante dans le muscle, BB la forme prédominante dans le cerveau et MB la forme prédominante dans le myocarde. Un taux élevé de MB dans le sérum et un indicateur spécifique d'une lésion du myocarde et sa détection revêt donc une importance particulière dans le diagnostic de l'infarctus du myocarde Les méthodologies existantes pour la mesure des isqenzymes de créatine kinase manquent de sensibilité, ont une spécificité limitée et sont basées sur la détection de l'activité de l'enzyme de créatine kinase.Le procédé décrit ici est un essai immunologique en phase solide qui est sensible, specifique et indépendant de l'activité de l'enzyme de créatine kinase. Plus spécifiquement, l'essai utilise une isoenzyme de créatine kinase immobilisée de façon covalente ou par adsorption sur un support insoluble dans l'eau, tel que des billes ou des particules de polystyrène, de Nylon, de verre, de latex, d'agarose ou de polypropylène. L'isoenzyme immobilisée est incubée avec une quantité connue d'anticorps, spécifique pour la sous-unité d'isoenzyme, l'anticorps étant associé à une enzyme révélatrice, telle que la peroxydase de raifort, et avec un échantillon de liquide contenant l'isoenzyme à déterminer.La quantité d'anticorps marcué à la peroxydase qui devient associée à l'isoenzyme immobilisée est inversement proportionnelle à la quantité de sous-unité d'isoenzyme libre présente dans l'échantillon. Le support insoluble est lavé et on ajoute un substrat approprié pour la peroxydase. Le développement de la couleur est lu visuellement ou par spectrophotométrie. Inversement, un anticorps peut être fixé sur le support. Le procédé selon l'invention est décrit plus en détail en prenant comme exemple l'isoenzyme BB (BB et la partie B de MB sont immunologiquement les mêmes). BB purifiée est immobilisée sur des billes. On incube les billes dans un tampon contenant de l'anti-BB ou de la BB libre de lapin, de chèvre ou de mouton, marquée à la peroxydase de raifort. L'anticorps marqué à la peroxydase se fixe sur la BB présente. La quantité d'anticorps fixée sur les billes recouvertes de BB est inversement proportionnelle à la quantité de BB libre présente. On rince alors les billes avec un tampon ou à l'eau et on ajoute un substrat pour la peroxydase. Après 5 à 30 minutes à la température ambiante, on lit le développement de la couleur dans un spectrophotomètre.La vitesse de réaction et/ou l'absorbance est proportionnelle à la quantité d'anticorps fixés sur les billes et inversement proportionnelle à la quantité de BB libre dans l'échantillon. Alternativement, l'activité de l'enzyme associée à l'anticorps, restant libre dans la solution, peut être mesurée. Les billes de polystyrène utilisées commme décrit ci-dessus 2 ont une surface spécifique de 1,29 cm et sont recouvertes avec une solution de 0,05 à 0,12 mg de BB/ml de tampon tris 0,05 M, pH 9, par incubation d'une heure à la température ambiante à 3 jours à 40C. Les fractions de gamma globuline de sérum anti BB sont associés à la peroxydase de raifort au moyen de glutaraldéhyde. L'activité de la peroxydase est mesurée en utilisant un des substrats suivants a) 4-aminoantipyrine/phénol/peroxyde d' hydrogène, b) Acide 2,2' -azino-di- (3-éthyl-benzthiazoline-6-sulfonique) (ABTS)/peroxyde d'hydrogène ou c) 2,5,3' ,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) Le tampon d'incubation est choisi parmi les suivants: a) tampon de carbonate 0,1 M avec 0,15 M de chlorure de sodium et 1 à 30 % de sérum de lapin normal, pH 9 b) tampon de phosphate 0, 1 M avec 1 à 30 % de sérum de lapin ou de veau normal, pH 7,5, et c) sérum entier. Le tampon de rinçage pour les billes est (a) le même que le tampon d'incubation, mais sans le sérum normal, ou (b) de l'eau. Le processus d'essai peut être résumé comme suit 1. Placer 500 1 du tampon d'incubation dans un tube à essai 2. Ajouter une bille recouverte 3. Ajouter de la BB ou MB libre (échantillon expérimental) 4. Ajouter 25 t'1 d'anticorps marqué à la peroxydase 5. Mélanger 6. Incuber à 450C pendant 2 heures 7. Aspirer le produit surnageant 8. Laver 1 à 3 fois avec le tampon 9. Placer la perle dans 2ml du substrat pour l'enzyme 10. Attendre 5 à 15 minutes à la température ambiante et lire la densité optique du substrat à la longueur d'onde appropriée. Les résultats spécifiques obtenus lors d'un essai selon ce procédé sont les suivants: Système modèle d'isoenzyme de créatine kinase de bovin Matériaux: Support solide billes de polystyrène de 6,3 iwn recouvertes de BB Anticorps anti-BB de lapin marqué à la peroxydase Substrat pour la peroxydase 4-aminoantipyrine Tampon d'incubation tampon de phosphate, 0,1 M, pH 7,5, avec 1 % de sérum de lapin normal Tampon de lavage tampon de phosphate 0,1 M, pH 7,5 Isoenzyme libre BB ou MM de bovin Procédé Ajouter une bille de BB à 0,5 ml de tampon d'incubation dans un tube à essai 2. Ajouter l'isoenzyme libre 3. Ajouter 0,025 ml d'anticorps marqué à la peroxydase 4. Mélanger avec tourbillonnement incuber pendant 2 heures à 450C. 5. Aspirer le tampon et laver 3 fois la bille. 6. Placer la bille dans 2 ml de substrat, incuber pendant 10 minutes 7. Lire la densité optique du substrat à 500 nm après avoir retiré la bille. Résultats Isoenzyme Absorbance à 500 nm Alg BB MM 0 0,643 0,643 0,01 0,567 0,637 0,05 0,477 0,632 0,5 0,314 0,586 1 0,280 0,604 5 0,160 0,569 10 0,119 0,547 Un autre exemple du procédé selon l'invention concerne un système humain utilisant des particules de latex comme support solide. On immobilise sur des particules de latex de la BB de cerveau humain purifié. On incube les particules dans un tube à essai contenant de I'anti-BB humain marqué à la peroxydase et de la BB humaine libre dans du sérum ou un tampon. Après un temps d'incubation approprié, par exemple 1 heure à 450C, on sépare les particules par centrifugation et on lave avec le tampon. On ajoute un substrat pour la peroxydase et après 15 à 30 minutes, on lit le développement de la couleur sur le substrat dans un spectrophotomètre.L'absorbance est proportionnelle à la quantité d'anticorps fixés sur les particules et inversement proportionnelle à la quantité d'isoenzyme libre dans l'échantillon. Les particules de latex décrites ci-après ont 0,8ym de diamètre et sont recouvertes d'une solution de 0,06 mg de BB/ml de tris 0,05 M, pH 9,0, par incubation d'une heure à la température ambiante à une nuit à 40C. On utilise les particules de latex sous la forme d'une suspension consistant en 2 mg de particules par ml de tampon de tris. On peut utiliser une variété de supports solides, comprenant par exemple l'agarose, un acrylate ou d'autres supports avec des groupes fonctionnels pour une fixation covalente des protéines. Les résultats spécifiques obtenus lors d'un essai conformément au procédé décrit ci-dessus sont les suivants: Système humain d'isoenzyme de créatine kinase Matériaux Description Support solide Particules de latex recouvertes de BB Anticorps Anti-BB de mouton marqué à la peroxydase Substrat pour la peroxydase 4-aminoantipyrine Tampon d'incubation Sérum humain Tampon de lavage Tampon de phosphate 0,05 M, pH 7,5 Isoenzyme libre BB humaine Procédé 1. Ajouter 0,5 ml de sérum contenant la BB, dans un tube à essai 2. Ajouter 0,02 ml de particules de latex recouvertes de BB 3. Ajouter 0,03 ml d'anti-BB marqué à la peroxydase 4. Mélanger le contenu du tube, incuber pendant 1 heure à 450C 5. Centrifuger 15 minutes à 2500 tours/mn 6. Aspirer le produit surnageant et laver une fois les particules avec 0,1 ml de tampon de phosphate 0,05 M, pH 7,5 7. Répéter la centrifugation, éliminerle produit surnageant et ajouter 2 ml de substrat pour la peroxydase aux particules 8. Mélanger avec tourbillonnement et incuber 30 minutes à la température ambiante 9. Centrifuger, décanter le produit surnageant dans un tube ou une cuve propre et lire la densité optique à 500 nm. Résultats: Isoenzyme BB Absorption à 500 nm ,ig ~~~~~~~~~~~ o 0,354 0,1 0,335 0,5 0,183 1,0 0,142 5,0 0,036 10,0 0,0 Un témoin comprenant 10 g d'isoenzyme MM n'a montré aucun déplacement. Dans la pratique, on examine un échantillon de sérum de teneur inconnue en isoenzyme, selon le procédé décrit ci-dessus. Les résultats de l'essai peuvent être exprimés qualitativement ou quantitativemement, c'est-à-dire par référence à une série d'échantillons témoins contenant des quantités connues d'isoenzyme ou de sérums témoins normaux et anormaux. Pour mettre en oeuvre le procédé selon l'invention, il est préférable d'utiliser une trousse à réactifs contenant: (a) un support solide recouvert d'isoenzyme de créatine kinase BB. (b) un anti-BB marqué à la peroxydase, (c) un substrat pour la mesure de l'activité de la peroxydase (d) des témoins Les isoenzymes MM et BB sont immunologiquement distinctes et BB n'est généralement pas présente dans le sérum. En conséquence, lorsque I'échantillon expérimental liquide est un sérum ou un plasma et qu'on utilise une isoenzyme BB immobilisée dans le procédé cidessus, le système d'essai mesure la quantité de MB présente dans l'échantillon. Dans ce cas, l'anticorps marqué à la peroxydase se fixe sur la sous-unité B de l'isoenzyme MB. Les procédés pour détecter les isoenzymes de créatine Kinase peuvent être classés en 6 groupes généraux: électrophorèse, échange d'ions, différenciation cinétique, activation sélective, radioimmuno Bogie et isrunologie(Clin.Chem.23, 2ème partie, 1:205-10,1977). Les procédés ilmnunolo giques sont rapportés comme suit Clin.Chim.Acta 58:223-32, 1975 Clin.Chim.Acta 73(3) :445-51, 1976 Klin.Wschr. 53:329-33, 1975 Z.Anal.Chem.279 (2) :174-5, 1976 Klin.Wschr. 54(8) :357-60, 1976 Z.Anal.Chem.279(2) :173, 1976 et sont basés sur la détermination enzymatique de l'activité totale de la créatine kinase, l'immunodépréciation de l'isoenzyme choisie et la détermination de l'activité résiduelle. Les procédés de détermination des antigènes et des anticorps utilisés dans un constitutant marqué par une enzyme sont décrits par exemple dans les brevets US 3 654 090 et 4 016 043. Dans le premier, on utilise une hormone immobilisée et dans le second une technique "sandwich" Le "Derwent Patent Abstract"32973 Y de la demande de brevet allemand 2 548 963 concerne la détermination de l'activité de l'isoenzyme MB de créatine kinase par pré-incubation de l'échantillon expérimental avec des anticorps contre la sous-unité M de la créatine kinase, c'est à dire en utilisant un anticorps inhibiteur. Le brevet US 3 932 221 décrit l'utilisation d'un anticorps précipitant, dans le même but. Ces deux procédes mesurant l'activité résiduelle de la créatine kinase après une exposition à l'anticorps. On ne trouve aucune trace dans la technique antérieure d'un procédé immunologique en phase solide pour déterminer les isoenzymes de créatine kinase, dans lequel une isoenzyme immobilisée est incubee avec un échantillon expérimental et un anticorps spécifique pour la sous-unité d'isoenzyme, fixé de façon covalente sur une enzyme. Le procédé ne repose pas sur l'activité enzymatique de la créatine kinase et fournit des résultats plus précis pour la sous-unité, car le procédé dépend de la sensibilité immunologique. REVEND ICAT IONS 1. Procédé de détection et de détermination d'isoenzyme de créatine kinase dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comporte les stades suivants (a) incuber une isoenzyme decréatine kinase immobilisée sur un support insoluble dans l'eau, avec un anticorps spécifique pour la sous-unité d'isoenzyme, associé de façon covalente à une enzyme, et avec l'échantillon de liquide contenant l'isoenzyme à déterminer; (b) séparer le support insoluble; et (c) déterminer l'activité de l'enzyme associée à l'anti corps fixée sur le support insoluble, qui est une mesure de la quantité de sous-unité d'isoenzyme présente dans l'échantillon. 2.Procédé de détection et de détermination d'une isoenzyme de créatine kinase dans un échantillon liquide suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte les stades suivants (a) incuber l'isoenzyme BB de créatine kinase immobilisée sur des billes, avec un anti-BB marqué à la peroxydase, et avec l'échantillon de liquide contenant l'isoenzyme à déterminer; (b) séparer les billes; et (c) déterminer l'activité de la peroxydase fixée sur les billes avec un substrat pour la peroxydase, qui est une mesure de la quantité de sous-unité d'isoenzyme libre pré sente dans l'échantillon. 3. Troussé de réactifs pour la détection et la détermination d'une isoenzyme de créatine kinase, caractérisée en ce quelle contient (a) un support insoluble dans l'eau recouvert d'isoenzyme BB de créatine kinase, (b) un anti-BB marqué à la peroxydase, (c) un substrat pour la mesure de l'activité de la peroxy dase; et (d) une série d'échantillons témoins contenant des quanti tés connues dtisoenzyme ou de sérums témoins normaux et anormaux.