Brevet FR2401995A1 — publié le 19790330

La présente invention concerne un milieu de culture pour la détermination de la sensibilité d'Escherichia Coli à un agent antimicrobien prédéterminé. Un procédé et un appareil permettant d'effectuer des essais de sensibilité d'antibiotiques dans un temps relativement court ont été mis au point, dans lesquels on examine l'échantillon clinique directement sans isoler les micro-organismes suspectés. Le procédé consiste à introduire un échantillon dans des mélanges d'un milieu de culture sélectif et d'agents antimicrobiens connus. Si l'échantillon contient un micro-organisme qui est favorisé par le milieu de culture d'un mélange, et que le microorganisme n'est pas sensible à l'agent, les caractéristiques optiques du mélange seront modifiées. Le problème principal que l'on rencontre dans les essais classiques de sensibilité microbienne est la durée qui s'écoule entre l'obtention d'un échantillon clinique chez le- patient et le choix d'un agent antimicrobien approprié que l'on peut espérer voir agir vis-à-vis des micro-organismes détectés. Un milieu de détection des micro-organismes E. Coli a été mis au point. Cependant, ce milieu ne permet pas de déterminer la sensibilité des micro-organismes E. Coli à une série donnée d'antibiotiques. En conséquence, c'est un but de la présente invention de fournir un milieu qui permettra au médecin de déterminer dans une période de temps relativement courte (d'environ 8 à environ 12 heures) lequel d'une série d'agents antimicrobiens permettra de supprimer efficacement l'activité des micro-organismes infectieux. Le bouillon de la présente invention permettra au médecin de tester simultanément plusieurs antibiotiques pour déterminer leur sensibilité à E. Coli. Les résultats obtenus permettent au médecin de choisir un antibiotique primaire et lui permettent également de choisir un groupe d'antibiotiques de réserve, si l'antibiotique primaire ne permettait pas de traiter l'état du patient. La présente invention concerne un milieu permettant de déterminer la sensibilité des organismes E. Coli à des agents antimicrobiens prédéterminés. Le milieu contient des sources nutritives de carbone et azote, des inhibiteurs permettant d'inhiber la croissance des organismes gram-yositifs et des autres organismes gram-négatifs qui peuvent donner des résultats positifs faux pour E. Coli, et un indicateur coloré qui indique l'activité métabolique dans le milieu. Le milieu de base comprend également un agent prédéterminé dont ltefficacité vis-à-vis de E. Coli est mesurée par l'indicateur coloré susmentionné qui indique le métabolisme de E. Coli. Le milieu de culture de la présente invention contient d'environ 5 à environ 15 g/l d'une source de carbone qui est assimilée par E. Coli ; d'environ 10 à environ 30 ml d'un indicateur qui indique la croissance et le métabolisme de l'organisme E. Coli en changeant de couleur en réaction à la production d'un acide par l'activité métabolique de l'organisme E. Coli dans le milieu ; environ 1,5 à environ 4,5 g/l d'un surfactif ou d'un autre inhibiteur des organismes gram-positifs ; environ 2,5 à environ 7,5 g/l d'une source d'azote ; environ 1,5 9/1 à environ 4,5 g/l d'acide coumarique pour inhiber la croissance d'autres organismes négatifs coliformes qui, par les procédés courants, donnent souvent des résultats positifs dans les analyses de E.Coli ; environ 0,25 g /1 à environ 0,75 g/l d'une source de minéraux et de vitamines ; et environ 2 pg/ml à environ 40 fg/ml d'un antibiotique ; cet antibiotique étant en fait testé pour déterminer son efficacité à empêcher le métabolisme de E. Coli. La source principale de carbone est le lactose. Le but du lactose est de fournir une source d'énergie pour le métabolisme et la croissance des organismes coliformes. Ces organismes, comprenant E. Coli, font fermenter le lactose et produisent des acides de sorte que l'utilisation de lactose est importante dans ce milieu. L'utilisation du lactose par E. Coli est connue dans la technique. Une autre source de carbone utilisée est le L-arabinose que l'on utilise dans le milieu de détection car il peut être fermenté par les quelques souches (moins de 10 %) de E. Coli qui ne font pas facilement fermenter le lactose. Ainsi, ce milieu qui utilise une combinaison de sucre réagira à toutes les souches de E. Coli. Des sources appropriées d'azote sont les protéines ou les peptones, comme Gelysate, Trypticase, Phytone et Polypeptone. Ces matériaux constituent une source d'azote nécessaire pour l'activité métabolique complète de l'organisme. Les surfactifs appropriés sont les mélanges de sels biliaires Bile Salts Mixture de BBL-ou le mélange de sels biliaires N03 Bile Salts N03 de Exoid, et des produits similaires préparés par d'autres fabricants. Le but des sels biliaires est d'inhiber la croissance des organismes gram-positifs. D'autres composés que l'on peut ajouter pour inhiber la croissance des bactéries grampositives sont l'acide désoxyçholique (0,1-1,0 %) ; l'acide cholique (0,1-1,0 %) ; l'acide taurodésoxycholique (0,05-0,25 %) l'acide lithocholique (0,005-0,045 %) ; l'acide taurocholique (0,1-0,3 %) ; le Vert Brillant (0,001-0,008 %) ; le violet cristallisé (0,0001-0,00005 %) et le Tergitol 7 (0,005-0,1 %). Les organismes gram-positifs sont, en tant que catégorie, sensibles aux matériaux de type surfactif. Une source appropriée de minéraux et de vitamines est l'extrait de levure. Un indicateur de pH biologique approprié est le bleu d'aniline réduit ou décoloré. Le bleu d'aniline mesure le changement de pH vers les pH acides et passe de l'incolore à une couleur bleue lorsque le pH se déplace vers les régions acides. L'acide coumarique utilisé comme inhibiteur chimique agit en inhibant sélectivement l'activité métabolique des espèces Klebsiella et Enterobacter sans nuire de façon appréciable a l'activité métabolique de E. Coli. On peut utiliser dans cette invention l'acide méta-coumarique et l'acide ortho-coumarique. Cependant, l'acide para-coumarique est beaucoup plus efficace que les composés méta ou ortho correspondants. En plus de ce qui précède, on ajoute au milieu un antibiotique pour déterminer la sensibilité de E. Coli à l'antibiotique particulier que l'on essaye. Les antibiotiques suivants peuvent être utilisés dans cette invention dans les intervalles indiqués : Céphalothine (Sodium) environ 7 g à environ 21 pg/ml Acide nalidixique environ 10 g à environ 30 pg/ml Ampicilline trihydratée environ 15 g à environ 30 ssg/ml Colistiméthate de sodium environ 2 g à environ 7 g/ml Nitrofurantolne environ 20 g à environ 40 Mg/ml Chlorhydrate de tétra cycline environ 7 g à environ 15 g/ml Sulfate de gentamicine environ 2,5 pg à environ 7 pg/ml Sulfate de kanamycine environ 6 pg à environ 15 pg/ml Triméthoprime-Sulfaméthoxa zole (1:20) environ 7 yg à environ 15 rg/ml Carbénicilline-sodium environ 20 pg à environ 40 pg/ml Chloramphénicol environ 15 pg à environ 25 pg/ml Les quantités précédentes sont basées sur l'activité. EXEMPLE I Pour préparer 100 ml d'un milieu doublement concentré, on prépare un bouillon d'essai de sensibilité de E. Coli en ajoutant 9,0 g d'acide p-coumarique à 45 ml de NaOH 1N On chauffe le mélange jusqu'à ce que l'acide p-coumarique se dissolve. On ajuste le pH à 7,0 en utilisant HCl 1N. On ajoute suffisamment d'eau distillée au mélange pour atteindre un volume de 1500 ml. On ajoute au mélange les agents nutritifs suivants après dissolution de l'acide coumarique Gelysate 15,0 g Lactose 15,0 g L-Arabinose 15,0 g Mélange de sels biliaires 9,0 g Extrait de levure 1,5 g L'ordre d'addition est déterminant pour éviter d'hydrolyser le lactose Après dissolution de tous les ingrédients précédents, on ajuste le pH à 7,0. On ajoute au mélange 60 ml du réactif bleu d'aniline réduit préparé selon la description de la demande de brevet française nO 77 04119 déposée le 14 février 1977. On doit ensuite ajuster si nécessaire le pH à 7,3 et stériliser le milieu par filtration. On peut ajouter une base si nécessaire, mais un acide ne doit pas être ajouté. On prélève dans le mélange 12 parties aliquotes de 100 ml. On place chaque partie dans un bécher pré-étiqueté contenant un antibiotique. On utilise les antibiotiques suivants dans les quantités indiquées pour IQO ml de milieu Céphalothine (sodium) 2 800 Acide nalidixique 4 000 Ampicilline trihydratée 4. 200 Colistiméthate de sodium 1 000 Nitrofurantolne 6 000 Chlorhydrate de tétracycline 2 000 Sulfate de gentamicine 60Q Sulfate de kanamycine 1 600 pg Triméthoprime-sulfaméthoxazole (1:20) 2 000 Carbénicilline-sodium 6 000 Chloramphénicol 4 000 Les quantités précédentes sont basées sur l'activité. REVENDICATIONS 1. Milieu de culture pour déterminer la sensibilité d'Escherichia Coli à un agent antimicrobien, comprenant (a) une source d'agents nutritifs, (b) un inhibiteur des organismes gram-positifs, (c) de l'acide coumarique en tant qu'inhibiteur de la croissance des autres organismes coliformes qui donnent normalement des résultats positifs dans les analyses de E. Coli, (d) un agent antimicrobien prédéterminé, et (e) un indicateur permettant de montrer visuellement le métabolisme de l'organisme E. Coli. 2. Milieu selon la revendication 1, ol l'indicateur est le bleu d'aniline réduit. 3. Milieu selon la revendication 1 Ou 2, où la source d'agents nutritifs comprend un mélange de lactose et de L-arabinose. 4. Milieu selon la revendication 1, 2 ou 3, où l'acide coumarique est l'acide para-coumarique. 5. Milieu selon la revendication 1, qui comprend (a) d'environ 1,5 à environ 4,5 g/l d'acide coumarique, (b) d'environ 5 à environ 15 g/l d'une source de carbone, (c) d'environ 2,5 à environ 7,5 g/l d'une source d'azote, (d) d'environ 1,5 à environ 4,5 g/l d'un inhibiteur des organismes gram-positifs, (e) d'environ 0,25 à environ 0,75 g/l d'une source de minéraux et de vitamines, (f) d'environ 10 à environ 1000 ml d'un indicateur biologique de pH, et (g) d'un antibiotique prédéterminé, à un pH d'environ 7,5. 6. Milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, où l'antibiotique prédéterminé est choisi dans le groupe comprenant la céphalothine-sodium, l'acide nalidixique, l'ampicilline, le colistiméthate de sodium, la nitrofurantolne, la tétracycline, le sulfate de gentamicine, la kanamycine, le mélange triméthoprimesulfaméthoxazole, la carbénicilline et le chloramphénicol. 7. Milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, où l'antibiotique prédéterminé est choisi dans le groupe comprenant environ 7 Ug à environ 21 yg/ml de céphalothine-sodium, environ 10 fg à environ 30 Vg/ml d'acide nalidixique, environ 15 pg à environ 30 pg/ml d'ampicilline trihydratée, environ 2 rg à environ 7 g/ml de colistiméthate de sodium, environ 20 g à environ 40 yg/ml de nitrofurantaine, environ 7 g à environ 15 g/ml de chlorhydrate de tétracycline, environ 2,5 g à environ 7 yg/ml de sulfate de gentamicine, environ 6 g à environ 15 g/ml de sulfate de kanamycine, environ 7 g à environ 15 g/ml d'un mélange 1: :20 de triméthoprime-sulfaméthoxazole, environ 20 g à environ 40 g/ml de carbénicilline et environ 15 g à environ 25 g/ml de chloramphénicol, les quantités étant basées sur l'activité.