Brevet FR2399663A1 — publié le 19790302

La présente invention concerne une composition et un procédé pour déterminer l'activite transférasique et protéasique. On a décrit dans la littérature des substrats enzymatiques comportant des naphtylamines comme groupes chromogènes unis à des amino-acides pour la détermination des transferases et des protéases telles que la y-glutamyltranspeptidase, la leucine-aminopeptidase, l'ocytocinase et la trypsine (cf. Orlowski et al., Clin. Chim. Acta, 7:755-760 (1962) et les références qui y sont citées).La détermination de l'activité transférasique et protéasique du sérum, de l'urine et des tissus d'origine humaine peut être utile au diagnostic; par exemple, la détermination de l'activité y-glutamyl -transpepti- dasique dans le sérum humain peut être utile pour établir le diagnostic dif ferentiel des affections hépatiques car l'activité enzymatique est particulierement élevée dans l'ictère par obstruction et le cancer du foie, alors qu'on observe des activités plus faibles dans l'hépatite virale et la cirrhose du foie (cf. Orlowski et al., supra et également Rosalki et al., Ann. Clin. Biochem. 7:143 (1970). La majorité des etudes concernant la-détermination de l'activité y-glutamyl-transpeptidasique ont éte effectuées avec ces naphtylamines dans les substrats, ces naphtylamines présentant l'inconvénient d'etre toxiques et cancérigènes, si bien que de façon générale leur emploi au laboratoire est indesirable. Beaucoup des déterminations enzymatiques couramment effectuées par les laboratoires médicaux comportent des séries de réactions qui se terminent par une réduction du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) en sa forme réduite, le NADH. On détecte ensuite le NADH par spectrophotométrie ou fluori métrie. Les méthodes fluorimétriques les plus récentes présentent l'avantage d'être simples, rapides et économiques et souvent d'être plus sensibles.De façon typique dans les determinations fluorimétriques ou l'on utilise le NADH, on utilise un fluorimetre à filtre qui dirige un faisceau de lumière ultraviolette ayant une longueur d'onde d'environ 340 nm contre la surface de l'échantillon et mesure la fluorescence ou la vitesse de variation de la fluorescence pour une longueur d'onde d'émission d'environ 465 nm. On trouvera d-'autres références relatives à l'art anterieur dans les brevets des Etats-Unis d'Amerique Nos. 3 979 447, 3 862 011, 3 773 626, 3 591 458, 3 878 048 et 3 892 631, ainsi que dans Wildes et al., J. Am. Chem. Soc., 95:8, 2610 (1973) et Bayley et al., Eur. J. Biochem. 56 (2), 465-65 (1975). L'invention repose sur la découverte de certaines compositions utilisables comme substrats enzymatiques pour la détermination fluorimétriquedel'activité transférasique (ou transpeptidasique) dans des homogénéisats et des liquides biologiques. Ces substrats sont nouveaux et on peut les utiliser au laboratoire relativement sans risques.Un avantage particulièrement important est que ces substrats produisent, après attaque par les enzymes étudiées, des fragments fluorescents qui présentent un pic d'excitation fluorimétrique et des valeurs d'emission voisines de celles des déterminations utilisant le NADH, Si bien que pour déterminer par fluorimétrie l'activité transférasique ou protéasique avec ces substrats, on peut utiliser les fluorimètres classiques avec les memes filtres que pour les déterminations classiques à partir du NADH. On peut ainsi évaluer l'activité d'une transferase telle que la y-glutamyltranspeptidase avec le même appareillage de fluorimétrie et les mêmes filtres que pour la détermination d'autres enzymes telles que la SGOT, la SGPT, la CPK, la LDH et l'HBD. Les substrats enzymatiques de l'invention sont des dérivés d'acide amino-5 isophtalique de formule générale: dans laquelle: R, et R2 représentent, respectivement, -OH, -NH2, -NHCH3, -NHC2Hs, -N(CH3)2, -N(C2Hs)2, -N(CH3)(C2H5), -OCH3 ou -O(CH2)nCH3; n est un nombre entier de 1 à 4; et R3 represente un fragment d'amino-acide qui peut être séparé du reste- du substrat sous l'effet d'une trans férase ou d'une protéase présentant une activité specifique vis-à-vis du substrat, dans certains cas en présence de glycylglycine ou d'un autre accepteur approprié tel qu'un glutamate, la glycyne ou la glycylglycylglycine. Ces substrats, qui comportent des fragments d'amino-acide (qui peuvent être constitués de plusieurs groupes d'amino-acide) et qui sont spécifiques de diverses transférases et protéases, figurent ci-après (dans chaque cas, le fragment fluorescent précédemment indique est représenté par l'abréviation (A)3:: Substrat Enzyme (A) -i ys-ala DAP-II (A)-Z-ala-arg-arg Cathépsine B 1 (A)-BZ-val-lys-lys-arg Cathepsine B la (A 2-HCl)CB2-arg-arg Cathepsine B 1 (A-diacétate)-N-CBZ-arg-arg-arg Trypsine 3-HCl)-L-arg-arg DAP III (A)-Z-gly-gly-arg Trypsine anionique, Activateur de la profibrinolysine, Enzyme de convérsion de la proinsuline (A)-pro-arg DAP-I ou Cathepsine C (A)-&alpha;;-BZ-phe-val-arg Thrombine (di-A) -L-cystine Ocytocinase (A)-&gamma;-glutamyle &gamma;-glutamyl-transpeptidase (A formiate)-L-leu-gly-gly (A)-leu Aminopeptidase (A) -BZ-arg-pro-gl y-phe-phe-leu Cathepsine D (A)-phe-pro-ala-met Cathepsine B lb (A)-glutaryl-gly-L-phe (A)-gly-pro DAP-IV (A)-CBZ-pro-ala-gly-pro Collagénase (A)-his-ser DAP I ou Cathepsine C (A)-N-CBZ-L-pro-L-phe-L-his-L-leu-L leu-L-val-L-tyr-L-ser (A)-N-CBZ-gly-L-met Rénine (A) -glutaryl-ala-ala Elastase (A)-BZ-arg-pro-gly-phe-phe-pro Cathepsine D (A)-ala Aminopeptidase B (A)-BZ-arg Trypsine/Cathepsine B 1 (A)-BZ-arg-gly-leu (A)-met (A) -BZ-arg-giy-tyr DAP-I (A) -ser-tyr Cathepsine C Dans les formules ci-avant, on utilise les abreviations habituelles suivantes: aLa (alanine), arg (arginine), BZ (benzoyle), cBz et Z (carbobenzoxy), gly (glycine), his(histidine), leu (leucine), lys (lysine), met (méthionine), phen(phénylalanine), pro (proline), ser (sérine), tyr (tyrosine) et val (valine). Pour accroître les taux de solubilité, on peut, si on le désire, transformer tous ces substrats en des sels tels que, par exemple, les chlorhydrates, bromhydrates, acetates ou formiates des amino-acides. Chacun de ces substrats, lorsqu'on le met aucontact de l'enzyme correspondante, est clivé, le fragment d'amino-acide étant libéré ou couplé a un accepteur approprié tel que la glycylglycine, pour laisser l'amine primaire fluorescente Lc'est-à-dire le substrat (A) précédemment indiqué, ou le symbole R3 représente un atome d'hydrogenel. Toutes ces amines aromatiques fluorescentes présentent un pic d'excitation et des caractéristiques d'émission lorsqu'on les expose à la lumière ultraviolette, suffisamment voisines de celles observées dans les déterminations utilisant le NADH (#es = 340 nm;; #em = 469 nm) pour permettre la mesure de l'activité fluorimétrique avec le même appareillage et les mêmes filtres que ceux employés pour les déterminations classiques utilisant le NADH. Plus particulièrement, ces chromophores ont des pics dsexcitation correspondant à une longueur d'onde comprise dans la gamme de 320 à 380 mm et des pics d'émission correspondant à une longueur d'onde comprise dans la gamme de 420 à 480 nm. Par exemple, si les symboles X, et R2 du substrat (A) sont des radicaux méthoxy, le chromophore presente un pic d'excitation à une longueur d'onde d'environ 335 nm et un pic d'emission à une longueur d'onde d'environ 445 nm. Dans la mise en pratique du procédé de l'invention, on dissout tout d'abord le substrat dans une solution aqueuse stérile renfermant de préférence un tampon approprié afin que le pH soit maintenu à la valeur optimale d'activite de l'enzyme étudiée ou au voisinage de cette valeur. Par exemple, lorsque l'enzyme que l'on désire mesurer est la y-glutamyl-transpeptidase-, on peut effectuer la réaction dans une gamme étendue de pH d'environ 7,5 à 9,0, un pH de 8,2 conduisant à l'activité maximale dans le système de détermination fluorimétrique. On melange la solution du substrat à l'échantillon (suspension ou solution) et on introduit l'ensemble dans une cuve appropriée d'un fluorimètre approprié pour mesurer la fluorescence de la surface avant.La vitesse de formation du composé fluorescent est directement proportionnelle à la quantité de transférase présente dans l'échantillon. D'autres avantages et caractéristiques de la présente invention apparal- -tront à la lecture de la description suivante et des exemples donnés a titre illustratif mais non limitatif. EXEMPLE 1 On peut, pour déterminer par fluorimetrie la y-glutamyl-transpeptidase sérique, utiliser comme substrat le chlorhydrate de l'ester diméthylique de l'acide y-(L-glutamyl)amino-5 isophtalique. Ce substrat répond à la formule développée suivante: La solution réactive a une concentration de 5 mM en substrat, de 55 mM en glycylglycine et de 100 mM en tampon Tris (pH 8,2 a 250C), le volume de la solution étant de 1,5 ml. On chauffe la solution réactive à 37 C, on ajoute l'échantillon (0,05 ml), on mélange et on pompe dans une cuve à écoulement. On mesure ensuite la vitesse d'accroissement de la fluorescence pendant une durée minimale de 4 mn avec un appareil de détermination de la fluorescence de la surface avant (#ex = 365 nm; #em = 465 nm). On mesure ainsi la vitesse de variation de la fluorescence du produit final (ester diméthylique de l'acide amino-5 isophtalique) produit par l'hydrolyse du substrat et on calcule la pente pour connaitre la variation de la fluorescence par minute de rédaction. EXEMPLE 2 On compare les résultats de déterminations effectuées sur des échantillons de sérum, comme indiqué dans l'Exemple 1. aux résultats de déterminations colorimétriques effectuées sur les mêmes echantillons avec le réactif GGTP commercialise par Dade Division of American Hospital Supply Corporation que l'on utilise selon les indications de la notice jointe. Pour faciliter l'interpré- tation des résultats, on transforme la valeur AF/min en unités internationales par litre (UI/l) par totalisation de UI/l et AF/min et determination du facteur Ut/AF. On analyse les sérums en deux groupes de 14, un groupe correspondant à des états non-diagnostiqués et l'autre, à des etats diagnostiqués. Les resultats obtenus sont consignes dans le tableau ci-après. Ces résultats montrent l'excellente correlation entre le procédé fluori metrique et le procédé colorimétrique classique dans la determination des teneurs sériques en y-glutamyl-transpeptidase. Activité #-glutamyl-transpeptidasique (UI/l) Echantillon Fluorimétrie Calorimétrie 1 ................................. 47 45 2 .................................. 52 51 3 .................................. 12,5 17 4 ................................... 85,4 79 5 ................................... 113,4 110 6 .................................. 196,9 195 7 ...................................... 14,5 17 a .................................. - 14,5 18 9 ...................................... 345 344 10 .--- 43,4 48 11 .................................... 48,8 72 12 .................................... 236,4 225 13 ................................... 212,3 198 14 ...................................... 259,6 260 15 ...................................... 80,9 87 16 Cancer à métastases .................. 87,5 119 17 Gastrites ..................... 89,5 94 18 Déshydratation ....................... 166,4 172 19 Ictère par obstruction ............... 23 26 20 Colostomie ...................... 181 184 21 Hépatomégalie ........................ 250,4 264 22 Cancer de la vessie ............. 146,7 148 23 Ictère ................................ 164,0 167 24 Problèmes de hanche .... 215,4 200 25 Maladie de Hodgkin..................... 14,7 14 26 Douleurs thoraciques, Hypertension 62,8 47 27 Embolie pulmonaire 174,2 150 28 Sarcaldose ......................... 193,5 178 EXEMPLE 3 Pour préparer le chlorhydrate de l'ester diméthylique de l'acide y-(L-glutamyl)amino-5 isophtalique utilisé comme substrat dans l'ExempLe 1, on peut melanger 13,2g (0,051 mole) d'anhydride phtaloylglutamique et 10,4g (0,050 mole) d'ester diméthylique de l'acide amino-5 isophtalique dans 60 ml de dioxanne et agiter au bain-marie à 55-60 C pendant 1,5 heure. Après évaporation du solvant, on dissout le résidu dans 200 ml de méthanol et 7,5g (0,15 mole)d'hydrate d'hydrazine. On filtre ensuite la solution et on la laisse reposer pendant deux jours à la température ordinaire. On recueille un précipite blanc qu'on lave avec 100 mi d'eau et 25 mi d'étha- nol, qu'on agite dans 100 mi d'acide chlorhydrique 0,5N, puis que l'on filtre. On traite le filtrat avec du bicarbonate de sodium pour porter le pH entre 6,5 et 7,0 et on recueille le précipité (89), puis on le sèche. On peut ensuite, pour préparer le chlorhydrate, dissoudre-1g du dérivé glutamylique dans une solution de 0,3 ml d'acide chlorhydrique concentré et 6 ml de méthanol. Apres évaporation du méthanol, on seche le solide sous pression reduite. EXEMPLE 4 On peut utiliser le mode opératoire suivant pour préparer d'autres dérivés d'acide amino-5 isophtalique que lton peut copuler avec des amino-acides appropries comme indiqué. Lorsqu'on désire former un amide, on remplace dans l'équation, ROH par RNH2. Dans tous les cas, on fait ensuite réagir le produit final avec l'amino-acide particulier désire sous la forme appropriée(comme illustré dans l'Exempte 3 pour l'anhydride phtaloylglutamique) afin d'obtenir le dérivé d' amino-acide d'acide aminophtalique final qu'on utilise comme substrat pour la détermination de l'activité transpeptidasique et/ou protéasique. Bien entendu, la presente invention n'est nullement limitée aux exemples et modes de mise en oeuvre mentionnés ci-dessus; elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans que l'on ne s'écarte de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1.- Composé utile comme substrat pour la détermination fluorimétrique de l'activité transferasique et protéasique, caractérisé en ce qu'il a pour formule: dans laquelle: Ri et R2 representent, respectivement, -OH, -NH2, -NHCH3, -NHC2H5, -N(CH3)2, -N(C2H5)2, -N(CH3)(C2H5), -OCH3 ou -O(CH2)nCH3; n est un nombre entier de 1 à 4; et R3 représente un fragment d'amino-acide pouvant être clivé du reste du sub strat en presence d'une transferase ou d'une protéase ayant une activite spécifique sur ce substrat. 2.- Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que: R3 represente un fragment d'amino-acide pouvant etre transféré à la glycylglycine lorsqu'on fait réagir ce substrat avec la glycylglycine en présence d'une transferase présentant une activité spécifique sur ce substrat. 3.- Composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que: R, et R2 représentent, respectivement, -OCH3, ce substrat étant utile pour la détermination fluorimetrique de la y-glutamyl transpepti dase. 4.- Réactif utile pour la détermination fluorimétrique de l'activité trans ferasique de la y-glutamyl-transpeptidase, caractérisé en ce qu'il est constitué du dérive y-glutamylique de l'ester diméthylique de l'acide amino-5 isophtalique ou d'un sel correspondant; d'un accepteur du fragment glutamyle lorsque ce dérivé est clivé en présence de y-glutamyl-transpeptidase; et d'un tampon pour maintenir le pH dans la gamme de 7,5 à 9,0. 5.- Réactif selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'accepteur est la glycylglycine. 6.- Procede fluorimétrique pour la détermination de l'activité des trans férases et des protéases dans des échantillons de liquides biologiques, selon lequel on mélange et fait reagir un substrat et un échantillon de liquide biologique contenant une transférase ou une protéase capables de cliver ce substrat, puis on expose ce mélange à l'action d'une lumière ultraviolette ayant une longueur d'onde comprise dans la gamme de 320 à 380 nm et on mesure la vitesse de variation de la fluorescence à une longueur d'onde comprise dans la gamme de 420 à 480 nm, caractérisé en ce que le substrat est choisi parmi un compose de formule: dans laquelle:: R1 et R2 représentent, respectivement, -OH, -NH2, -NHCH3, -NHC2Hs, -N(CH3)2, -N(C2H5)2, -N(CH3)(C2H5), -OCH3 ou -O(CH2)nCH3; n est un nombre entier de 1 à 4; et R3 représente un fragment d'amino-acide pouvant être clivé du reste du sub strat en presence d'une transférase spécifique de ce substrat. 7.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on expose le mélange réactionnel à l'action d'une lumière ultraviolette ayant une longueur d'onde d'environ 365 nm. 8.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on mesure la variation de la fluorescence à une longueur d'onde d'environ 465 nm. 9.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que dans le stade de mélange, on mélange de la glycylglycine au substrat et à l'échantillon et en ce que le symbole R3 représente un fragment d'amino-acide pouvant être transféré sur la glycylglycine lors de ce stade de melange. 10.- Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que: R3 représente le radical y-glutamyle et la transférase est la y-glutamyltranspeptidase. 11.- Procéde fluorîmétrique pour la détermination de l'activité de la y-glutamyl-transpeptidase dans un échantillon de liquide biologique, caractérisé en ce qu'il consiste à melanger et à faire reagir un dérivé y-glutamylique de l'ester diméthylique de l'acide amino-5 isophtalique ou un sel correspondant, avec un accepteur de y-glutamyle, un tampon pour maintenir le pH dans la gamme de 7,5 à 9,0 et un échantillon de liquide biologique contenant de la y-glutamyl-transpeptidase, puis on expose le mélange à l'action d'une lumière ultraviolette ayant une longueur d'onde comprise dans la gamme de 320 à 380 nm et on mesure la vitesse de variation de la fluorescence à une longueur d'onde comprise dans la gamme de 420 à 480 nm. 12.- Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on expose le mélange réactionnel à l'action d'une lumière ultraviolette ayant une longueur d'onde d'environ 365 nm. 13.- Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on mesure la variation de la fluorescence à une longueur d'onde d'environ 465 nm. 14.- Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que ltaccepteur est la gîycylglycine.