Brevet FR2412612A1 — publié le 19790720

La présente invention concerne la production de protéines unicellulaires. Selon un autre aspect, la présente invention concerne une nouvelle culture mixte thermophile. Parmi les diverses tentatives faites pour pallier au manque de protéines, on a tenté des biosynthèses dans lesquelles des protéines unicellulaires tSCP) produites biologiquement sont obtenues par croissance de microorganismes sur des substrats contenant du carbone. Les sources de carbone et d'énergie utilisées en tant que substrats dans de tels processus doivent être très répandues, relativement peu coûteuses, uniformes et sûres en ce qutelles ne laissent pas de résidus nocifs dans les produits protéinés finalement obtenus par les conversions microbiennes. Les hydrocarbures de pétrole ont été utilisés comme matières sources de carbone et d'énergie mais ont présente diverses difficultés pratiques dues à leur mangue de solubilité dans lteau, la haute consommation oxygène et éventuellement des traces d'agents potentiellement cancérigènes, en provenance des produits pétroliers pénétrant dans les pro téines ou-y adhérant. D'autres processus ont utilisé des dérivés d'hydrocarbures oxygénés comme sources de croissance en raison de la solubilité dans l'eau de ces dérivés et ainsi de leur facilité de traitement, puisque les processus de conversion microbiens sont essentiellement effectués en milieu aqueux De telles sources de croissance sont couramment disponibles à partir de sources pétrolières, de sources de gaz naturel, de divers traitements de déchets et d'ordure à partir de la fermentation de diverses graines et de la distillation destructive du bois. De tels hydrocarbures oxygénés constituent des produits de croissance très couramment disponibles et relativement peu coûteux pour des processus de fermentation. Un autre avantage réside dans le fait que des demandes dloxygene relativement réduites sont impliquées. Une autre difficulté et un autre facteur de limitation dans la commercialisation de processus de protéine monocellulaire a résidé dans la nécessité d'effectuer. la fermentation à des températures d'environ 20 à 50au, de préférence non-supérieures à 35oc. Les conversions microbiennes sont des réactions d'oxydation exothermique, de grandes quantités de chaleur étant produites. La chaleur doit être enlevée du mélange de fermentation de façon continue et satisfaisante ou bien un risque de surchauffe du dispositif et de mort des microorganismes ou de limitation sévère de la croissance se présente tandis que la température s'élève, d'où il résulte une perte de rendement. De nombreux processus se sont axés sur l'emploi de levures comme microorganismes. Les cellules de levures sont, de façon générale, légèrement plus grandes qu'une cellule de bactérie et permettent parfois une séparation plus facile du milieu de fermentation. Toutefois, les bactéries présentent des avantages, puisqu'un contenu de protéine brut plus élevé de la cellule est obtenu à partir de bactéries par rapport au produit obtenu à partir de levures, de façon générale, puisque les levures présentent des proportions plus élevées de matière structurelle non protéinée dans leurs cellules. Les bactéries présentent habituellement un contenu de protéine nettement plus élevé , fréquemment plus élevé en ce qui concerne les aminoacides contenant du soufre et la lysine qui sont nutritionnellement importants. La découverte de bactéries ayant la capacité de croître rapidement et une haute productivité à des températures de fermentation relativement élevées serait avantageuse. Une opération de croissance à haute température signifie que moins de chaleur doit être enlevée, moins d'appareils de refroidissement utilisés, et finalement de plus petites quantités de chaleur sont nécessaires pour la stérilisation, la coagulation et la séparation. Le danger de contamination par d'autres microorganismes est considérablement réduit quand une fermentation à température élevée peut être utilisée. Ainsi, des bactéries thermophiles ou tolérant la chaleur sont très demandées pour une cormnercialisation du processus de formation de protéi- nes unicellulaires. Une nouvelle culture mixte thermophile de bactéries, contenant trois espèces distinctes de bactéries a maintenant été découverte. Ces bactéries sont individuellement classées comme (1) un grand bâtonnet incurvé gram-positif, division bactéries, classe Schizomycetes, ordre Eubactérîales, famille Bacillaceae, genre Bacillus; (2) un grand batonnet gram-négatif, division bactéries, classe Schizomycetes, ordre Eubactériales, famille Bacillaceae, genre Bacillus; (3) un bâtonnet court gram-négatif, division Bactéries, classe Schizomycetes. la culture thermophile mixte présente des propriétés très souhaitables et utiles.Cette culture mixte "Mc " présente une croissance accrue à des températures plus élevées que les températures classiques, d'où il résulte des rendements de cellules plus élevés et une. tendance à une formation de mousse réduite dans les conditions de fermentation. Cette culture mixte est thermophile, croît effectivement avec une productivité élevée sur des sources d'hydrocarbures oxygénes, en particulier des alcools inférieurs, de préférence du méthanol ou de l'ethanol, à des températures auxquelles la plupart des autres bactéries connues sont ou bien relativement non productives, ou bien ne peuvent simplement pas survivre; ou bien sont improductives et ne tolèrent pas une source aux hydrocarbures oxygénés. Cette culture mixte particulière est désignée de la fa çon suivante Nom de la culture Désignation de souche Désignation de dépôt Mc HTB-53 ~ NRRL B-8158 La désignation NRRL B-8158 reflète le fait que la culture mixte thermophile a été déposée auprès du département d'état américain de l'agriculture de dépôt officiel, service de recherche d'agriculture, région centré Nord, centre de recherche régional du nord, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, en déposant trente préparations lyophilisées de la culture mixte, avant de déposer la présente application, et a reçu la dési- gnation de dépôt NRRL B-8158. Par souci de simplicité on désignera ci-après la culture mixte selon l'invention par le sigle abrégé Mc. Cette culture est très productive à des températures de fermentation relativement éle vées, produisant des produits protéinés unicellulaires souhaitables et valables avec un fort contenu de protéine et un équilibre en ami acides souhaitable. Cette culture mixte thermophile est stable en ce qui concerne sa composition. La culture mixte utilisée pour la lyophilisation a été isolée à partir d'un cycle de fermentation et lyophilisée dans des conditions usuelles qui consistent à refroidir rapidement les cellules microbiennes à une température très basse et puis à déshydrater rapidement sous vide et à stocker à température ambiante Pour déterminer la viabilité, certains des échantillons lyophilisés ont été ensuite réactivés et soumis à une croissance de la culture mixte lyophilisée dans les mêmes conditions que celles utilisées précédemment.Les fermentations ultérieures utilisant la culture M c réactivée ont fourni essentiellement les mêmes résultats en ce qui concerne le rendement élevé des cellules et autres, et la composition apparente de la culture de fermentation, comme cela était le cas pour les premiers essais. Un examen au microscope de la culture Mc réactivée indiquait les mêmes trois organismes sous la même forme et les mêmes relations dans la culture constituée que dans la fermentation de source. Cette culture particulière à haute température assure des rendements améliorés de production de protéines unicellulaires avec des besoins de refroidissement réduits, quand une croissance est effectuée sur un substrat de fourniture de carbone et d'énergie constitué d'un hydrocarbure oxygéné, de préférence un alcool inférieur, plus particulièrement du méthanol ou de Méthanol; le produit le plus particulièrement préféré à l'heure actuelle étant un substrat de méthanol ou un substrat contenant du méthanol I1 se présente divers avantages à utiliser la culture mixte thermophile Mc par rapport à l'utilisation d'un thermophile pur, pour la fermentation du méthanol ou d'une matière source de carbone et d'énergie similaire.Le rendement de cellule, comme cela a été décrit ici, est défini comme lenombrede grammes de cellules produit pour 100 grammes de matière source de carbone et d'énergie utilisée, telle que du méthanol. Le rendement de cellule plus élevé constitue un avantage économique et commercial pratique important. Un autre avantage de la culture mixte par rapport à un thermophile pur, réside dans le fait que la génération de mousse est notablement moindre par rapport aux cultures pures étudiées. Les cultures pures tendent de façon générale à produire de grandes quan tités de mousses pendant le processus de fermentation. Alors .que la mousse peut être souhaitable dans certains appareils en tant que moyen pour aider au processus de fermentation pour le transfert de chaleur, et pour aider à fournir les quantités souhaitées d'oxygène moléculaire pour les processus de fermentation aérobie, néanmoins, de nombreux types d'appareils de fermentation ne sont pas conçus ou équipés pour manipuler'les grandes quantités de mousse produites par certains microorganismes de souche pure.Ainsi, les quantités modérées de mousse produites par la culture selon l'invention constituent un avantage notable. Un autre avantage de la culture mixte selon l'invention réside dans le fait qu'elle produit de façon inhérente des protéines unicellulaires qui sont un mélange de plusieurs variétés de cellules. Ainsi, l'équilibre des aminoacides dans les cellules microbiennes obtenues à partir de la culture mixte M c est considéré comme ayant un meilleur équilibre que celui présenté par le produit constitué d'une culture pure unique. Un meilleur équilibre des aminoacides signifie qu'il est moins probable qu'il existe une déficience en un aminoacide essentiel particulier. La culture mixte thermophile a été découverte au cours d'un travail destiné à découvrir et à développer plusieurs cultures pour des processus de conversion microbienne. Un échantillon de sol a éte pris environ 60 cm en-dessous de la surface de la terre recouvrant une conduite de vapeur au centre de recherche de la so ciété dite Phillips Petroieum Company Bartlesville, Oklahoma. Des techniques d'enrichissement classiques en présence de méthanol ont été utilisées pour isoler diverses cultures séparées ou distinctes. Au cours de ce travail, dans lequel plusieurs cultures thermophiles pures ont été isolées, il est devenu clair qu'une culture mixte très exceptionnellement stable en ce qui concerne la composition des organismes thermophiles avait été obtenue. La culture mixte thermophile est constituée de trois microorganismes séparés Les trois types de bactéries dans la culture mixte thermophile de composition stable sont décrites comme (1) un grand bâtonnet incurvé gram-positif, (2) un grand bâtonnet gram-négatif et (3) un bâtonnet court gram-négatif. Des essais répétés de séparation ont été effectués sur cette culture pour isoler les microorganismes purs. Par exemple, des plaques striées fournissent des colonies isolées des trois organismes sur un milieu agar minéral contenant du méthanol. Toutefois, quand les colonies isolées ont été transférées en milieu aqueux pour une croissance ultérieure avec du méthanol, en tant que source de carbone et d'énergie, de façon surprenante et inattendue aucune croissance n'a pris place. Des efforts répétés de ce type ont été effectués mais sans succès. La croissance en coopération par cette culture mixte indique une relation de symbiose entre les trois microorganismes. I1 apparaît possible qu'un ou plusieurs produits métaboliques d'au moins l'un des microorganismes serve comme substrat nécessaire pour la croissance de l'un ou de l'autre des autres microorganismes. Bien que la nature exacte d'un tel métabolite ne soit pas connue actuellement, il apparaît possible qu'un tel métabolite puisse être toxique pour le microorganisme qui le produit, ce qui expliquerait le besoin de la présence d'un microorganisme supplémentaire pour consommer ce métabolite toxique de sorte que le premier microorganisme continue à croître de façon adéquate. Une autre indication de cette relation de symbiose réside dans le fait que des fermentations utilisant la culture M c produisent sensiblement moins de mousse dans des conditions de fermentation aérobie typiques par rapport aux quantités de mousse normalement observées dans des conditions de fermentation aérobie typiques équivalentes, mais utilisant des bactéries thermophiles pures du genre Bacillus.Ceci suggère que la culture M ne produit pas les c grandes quantités de mousse qui devraient être normalement attendues en raison du fait que, dans une fermentation Mc, un produit extracellulaire, probablement protéiné est consommé par au moins l'un des microorganismes de symbiose, détruisant ainsi continûment ce produit en tant que matière de formation de mousse dans le mélange de fermentation. La source de carbone et d'énergie ou substrat est un hydrocarbure oxygéné. Des hydrocarbures oxygénés comprennent des alcools, des cétones, des esters, des éthers, des acides et des aldéhydes qui sont sensiblement solubles dans l'eau et contiennent de préférence jusqu'à environ 10 atomes de carbone par molécule. Des exemples illustratifs de tels hydrocarbures oxygénés comprennent : le méthanol, l'éthanol, le propanol, le butanol, le pentanol, l'hexanol, le 1,7-heptanediol, le 2-heptanol, le 2-méthyl4-pentanol, l'acide pentanoique, l'acide 2-méthylbutanoTque, le 2pentanol, le 2-méthyl-4-butanol, le 2-méthyl-3-butanol, le 2-butanol, le 2-méthyl-l-propanoî, le 2-méthyl-2-propanol, le 2-propanol, l'acide formique, l'acide acétique, l'acide propanoique, le formaldéhyde, I'acétaldéhyde, le propanal, le butanal, le 2-méthyîpropanal, l'acide de butanolque,l'acide 2-méthylpropanoique, l'acide pentanoique, 1 'acide de glutarique, l'acide hexanolque, l'acide 2-métbylpentanoque, l'acide heptanediolque, l'acide heptanoique, le 4-heptanone, le 2héptanone, l'acide octanolque, l'acide 2-éthylhexanoique, le glycérol, I'éthylèneglycol, le propylèneglycol, le 2-propanone, le 2butanone, l'éther diéthylique, l'éther méthyléthylique, l'éther diméthylique, l'éther di-n-propylique,l '-éther n-propylisopropylique, y compris des mélanges de deux ou plusieurs de ces produites. Des gaz de pétrole, tels que le gaz naturel, le méthane ou d'autres gaz tels que l'éthane peuvent être oxydés pour fournir des mélanges contenant de façon prédominante les alcools correspondants ainsi que des quantités mineures de cétones, d'aldéhydes, d'éthers et d'acides. De façon préférée, ces alcools contiennent de 1 à 7 atomes de carbone par molécule. De tels alcools comprennent des alcools linéaires et ramifiés, primaires, secondaires et tertiaires, mono .hydroxylés et polyhydroxylés. Des exemples d'alcools sont le méthanol, l'éthanol, le propanol, le butanol, le pentanol, l'hexanol, le 1,7-heptanediol, le 2-heptanol, le 2-méthyl-4-pentanol, le 2-pentanol, le 2-metha- nol-4-butanol, le 2-méthyl-3-butanol, le 2-butanol, le 2-méthyl-lpropanol, le 2-méthyl-2-propanol, le 2-propanol, le glycérol, 1'éthy- lèneglycol, le propylèneglycol, y compris des mélanges de deux ou plusieurs de ces produits. Des alcools plus particulièrement préférés sont ceux contenant 1 à 4 atomes de carbone par molécule, en particulier les alcools monohydroxylés en raison de leur disponibilité, de leur solubilité dans l'eau et de leur faible coût. Le méthanol est actuellement un alcool -tout particulièrement préféré en raison de son faible coût, de sa grande disponibilité et de sa solubilité dans l'eau. Une matière actuellement commercialement disponible quelquefois appelée "méthyl Fuel" (C & N, 17 septembre 1973,page 23) constitue un exemple d'un mélange commercialement disponible de méthanol et de pourcentages contrôlés d'alcools supérieurs contenant jusqu a environ 4 atomes de carbone par molécule et pourrait etre empîoyéecomme substrat approprié. Des processus de fermentation aérobie sont bien -connus dans la technique et des moyens pour fournir de l'oxygène aux mélan ges de fermentation sont également bien connus. De façon générale, la fourniture d'oxygène moléculaire aux mélanges de réaction de fermentation aqueux peut être assurée en faisant passer des volumes adéquats d'air, ou d'air enrichi en oxygène, ou dtair et d'une alimentation supplémentaire d'oxygène pur séparément, à travers le récipient de fermentation. Les gaz dégagés peuvent être récupérés et recyclés si cela est souhaité, pour une réutilisation maximale de l'oxygene, par exemple en séparant le gaz carbonique des gaz d'échappement et en effectuant un recyclage.De façon générale, on peut fournir à titre d'exemple une gamme de 0,1 à lO,et plus couramment de 0,7 à 2,5 volumes d'air par minute au mélange de fermentation par volume de liquide aqueux dans l'enceinte de fermentation, ou en termes d'oxygène, les gammes respectives vont de 0,02 à 2,1 et de 0,14 à 0,55. Les pressions utilisées peuvent varier sur une large gamme. On peut citer à titre d'exemple une gamme de 0,1 à 100 atmosphères, plus couramment de 1 à 30 atmosphères, et de préférence actuelment de 1 à 5 atmosphères. Des pressions supérieures à la pression atmosphérique sont avantageuses puisqu'elles tendent à augmenter le contenu d'oxygène dissous dans le milieu de fermentation aqueux ce qui tend à promouvoir une croissance microbienne plus rapide Des pressions supérieures à la pression atmosphérique sont tout particu lièrement utiles puisque les températures plus élevées utilisées dans la fermentation thermophile tendent à diminuer la solubilité de l'oxygène dans le milieu de fermentation aqueux. La culture des bactéries mixtes M avec la source de c croissance d'hydrocarbure oxygéné peut être avantageusement effectuée à une température dans une gamme de 45 à 650C, et de préférence, pour obtenir des vitesses de-croissance optimales, dans la gamme de 50 à 600C. Des températures plus faibles tendent à inhiber la-croissance. Des concentrations élevées de certains des substrats source d'énergie et de carbone décrits, tels que le méthanol, peuvent inhiber une croissance microbienne satisfaisante ou même être toxique pour les microorganismes dans les fermentations utilisant la culture mixte et doivent être évitées. Le processus de fermentation peut être effectué par lots ou en continu. Un processus en continu est particulièrement approprié quand la matière source de carbone et d'énergie est un alcool infé- rieur, tel que le méthanol ou l'éthanol qui se prête facilement à une alimentation contrôlée. L'utilisation de tels microorganismes et de tels milieux de croissance dans un processus de fermentation par lots est considérée comme non-économique. Toutefois, de tels substrats sont commodément utilisés dans un processus de fermentation en continu avec des rendements d'ensemble élevés et un faible coût. Au cours de la fermentation, après que l'enceinte de fermentation a été convenablement inoculée par les espèces de culture mixte, l'hydrocarbure oxygéné peut être ajouté sous forme d'un flux séparé, ou me- langé à de l'eau sous forme d'un flux aqueux pour la stériliser, ou avec un milieu minéral pour le stériliser, ou l'un quelconque ou tous ces moyens. Habituellement, l'alimentation se fait séparément pour faciliter le contrôle de la concentration du flux d'alimentation dans l'enceinte de fermentation dans la gamme de 2,5 à 35 % en poids, et plus couramment et commodément de 10 à 15 % en poids. La culture est effectuée en milieu de croissance aqueux comprenant un milieu de sel minéral aqueux, la matière source de carbone et d'énergie, de l'oxygène moléculaire, et une inoculation initiale de culture mixte M Les vitesses de croissance de fermentation peuvent être réglées en contrôlant l'alimentation en hydrocarbure oxygéné. La vitesse d'alimentation de la matière source de carbone et d'énergie doit être réglée de sorte que les quantités fournies à l'enceinte de fermentation sont sensiblement les mêmes que les vitesses de consommation par l'organisme pour éviter une accumulation notable dans l'enceinte de fermentation, en particulier de toute matière toxique. Une vérification satisfaisante peut également être obtenue en réglant le produit d'alimentation n'ayant pas -réagi à la sortie de l'enceinte de fermentation à une valeur de O à 0,2 % en poids. De façon générale, la durée de stockage des cellules microbiennes dans l'enceinte-de fermentation au cours d'un processus continu est de l'ordre de 2 à 4 heures dans de telles conditions bien que cela ne soit pas critique. La culture M c nécessite des produits nutritifs minéraux et une source d'azote assimilable, en plus de l'oxygène moléculaire et des sources de carbone et d'énergie décrites. La source d'azote peut être tout composé contenant de l'azote et capable de libérer de 1' azote sous une forme appropriée à une utilisation métabolique par l'organisme. Alors qu'une grande variété de composés source d'azote organique tels que d'autres protéines, de l'urée ou analogues peut être utilisée, des matières sources d'azote minérales sont habituellement plus économiques et pratiques.De façon typique, de tels composés contenant de l'azote minéraux comprennent l'ammoniac ou l'ammoniaque ainsi que divers autres sels d'ammonium tels que le carbonate d'ammonium, le citrate d'ammonium, le phosphate d'ammonium, le sulfate d'ammonium et le pyrophosphate d'ammonium. L'ammoniac gazeux est particulièrement commode et peut être utilisé par barbotage à travers le milieu de fermentation aqueux en quantités appropriées. Le pH du mélange de fermentation microbien aqueux doit être dans la gamme de 5,5 à 7,5, et de préférence dans la gamme de 6 à 7. La fourniture d'ammoniac aide à contrôler le pH souhaité, puisque, autrement, le milieu aqueux tend à être légèrement acide. Bien sûr, les gammes de pH préférées pour les microorganismes dépendent généralement dans une certaine mesure du milieu utilisé et ainsi le pH préféré peut changer au moins légèrement avec un changement de milieu minéral. En plus de l'oxygène, de l'azote et de la source de carbone et d'énergie, il est nécessaire de fournir des produits nutritifs mi néraux choisis en quantités et proportions nécessaires au milieu d'alimentation pour assurer la croissance convenable de microorganismes et pour maximiser l'assimilation de l'hydrocarbure oxygéné par les cellules dans le processus de conversion microbienne. Une source de phosphate ou autres ions de phosphore, magne- sium, calcium, sodium, manganèse, molybdène et cuivre est propre à fournir les minéraux essentiels. Un milieu nutritif minéral désigné ici par FM-1 est utilisé dans le processus de fermentation et est in diqué dans le tableau ci-dessous en même temps qu'une solution minérale en trace qui fait partie du milieu nutritif FM-12. FM-12 Composant Quantité H3P04 (85 %) 2 ml KC1 lg MgS04. 7H20 1,5 g CaC12.2H20 0,2 g NaCl 0,1 g Solution minérale en trace 5 ml Eau distillée Quantité suffisante pour 1 litre Solution minérale en trace CuSO4 5H20 0,06 g RI 0,08 g FeC13.6H20 4,80 g MnS04.H20 0,30 g Na2MoO4. H20 0,20 g ZnS04. 7H20 2,00 g H3B03 0,02 g H2S04 (conc.) 3 ml Eau distillée Quantité suffisante pour I litre D'autres concentrations de milieu minéral peuvent être utilisées dont des exemples sont fournis ci-après. Dans le cas d'un fonctionnement par lots ou en continu, tous les divers equipements, enceintes ou autres récipients, tubes, dispositifs de circulation et de refroidissément liés et analogues doivent être stérilisés par exemple par l'emploi de vapeur, à une température d'au moins 1200C pendant au moins plusieurs minutes, par exemple 15 minutes, avant le début du fonctionnement. On inocule alors dans le réacteur stérilisé, la culture en présence de tous les produits nutritifs requis, y compris l'oxygène moléculaire et l'alimentation en hydrocarbures oxygénés. Une instrumentation appropriée peut être prévue pour mesurer la densité de cellule, le pH, le contenu d'oxygène dissous, la concentration d'hydrocarbure oxygéné dans le mélange de fermentation, la température, les vitesses d'alimentation et analogues. I1 est considéré comme préférable que les matières fournies à l'encein- te de fermentation soient stérilisées avant d'y être introduites. Quand l'hydrocarbure oxygéné est une matière propre à stériliser les autres matières, comme dans le cas de 1'méthanol et du méthanol, il peut être commode d'ajouter ce composé à d'autres flux d'entrée, tels que le milieu minéral, en quantités propres à effectuer la stérilisation, et de réaliser ainsi plusieurs buts sans nécessiter une stérilisation à chaud distincte. Lladdition d'un milieu anti-mousse au mélange de fermentation doit être évitée puisque des produits anti-mousse tels que les silicones peuvent nuire au contenu d'oxygène dissous aux températures de fermentation élevées recommandées et peuvent amener les organismes à croître à une vitesse plus lente, ou même à mourir. La mousse pro duite par la culture n'est pas nocive a la croissance et, en défini- tive, aide de façon bénéfique au maintien des organismes dans un dispositif à contenu d'oxygène dissous élevé. La mousse aide à fournir des surfaces relativement grandes d'interfaces de contact gaz/liquide. Ainsi, la fermentation peut êtreaméliPrée et le transfert de chaleur amélioré en ce qui concerne le contrôle, l'uniformité, et la suppression de points chauds. Bien sûr, une substance favorisant la production de mousse telle que certains détergents, de préférence non ioniques, pourrait être utilisée, si on le souhaite, pour aider ou provoquer une formation de mousse supplémentaire, bien que ceci ne soit normalement ni nécessaire ni souhaitable. La récupération de cellules microbiennes peut être réalisée par les techniques habituelles, par exemple par acidification de l'effluent de fermentation à un pH d'environ 4, et chauffage de lteffluent acidifié, à une température propre à tuer les mîcroor- ganismes, par exemple environ 800C, bien que suffisamment basse pour ne pas endommager le produit protéiné. L'effluent peut alors être centrifugé, lavé et recentrifugé pour récupérer les cellules microbiennes à partir de l'effluent de l'enceinte de fermentation. Les cellules peuvent être traitées pour provoquer la lyse pour accélérer la récupération de protéines et d'autres matières à partir de la cellule.La fermentation produit également un certain nombre de sousproduits souhaitables qui peuvent être récupérés à partir de l'ef- fluent de l'enceinte de fermentation. Ces produits extracellulaires peuvent être économiquement utiles dans le processus d'ensemble, puisqu'ils comprennent des produits valables tels que les polysaccharides, des aminoacides, tels que l'acide glutamique, des enzymes, des vitamines et analogues. Le produit protéiné unicellulaire selon l'invention est une source valable de protéines pour les êtres humains ainsi que pour les animaux. Pour la consommation humaine, les cellules peuvent être traitées pour réduire leur contenu en acide nucléique, si on le souhaite, bien que pour l'alimentation animale, un tel traitement n'apparaisse pas nécessaire. La présente invention va être exposée plus en detail à l'aide des exemples suivants qui ne sont donnés qu'à titre d'illustration et non de limitation de la présente invention EXEMPLE 1 Un cycle de fermentation en continu utilisant la culture mixte thermophile selon la présente invention a été effectué. Une enceinte de fermentation de 7 litres équipée d'un aérateur d'un mélangeur, d'un dispositif de surveillance de l'oxygène dissous et de moyens pour mesurer et commander la température et le pH du mélange de fermentation a été chargée avec environ 500 ml d'un mélange de réaction de fermentation en provenance d'un cycle de fermentation précédent utilisant la culture mixte thermophile selon l'invention, et 10 ml de méthanol comme inoculant. Le réacteur a également été chargé par 2 litres de. milieu minéral de fermentation FM-12. La vitesse d'agitation a été maintenue à 1.000 tours par minute tout au cours du cycle et le pH a été régulé entre 6,2 et 6,35 par addition, quand nécessaire, d'une solution d'ammoniaque. De l'air a été introduit dans l'enceinte de fermentation à une vitesse de 2 litres par minute au cours du cycle. Après 6 heures, de l'oxygène essentiellement pur a également été introduit dans l'en- ceinte de fermentation à une vitesse de 0,5 litre par minute, augmentée à 0,75 litre par minute au bout de 118 heures, à 1,5 litre par minute au bout de 174 heures, et à 2 litres par minute au bout de 190 heures. Au boutde 22 heures, le milieu minéral a été modifié en une composition aqueuse de 7,5 % en volume de méthanol en plus du milieu FM-12 plus 0,75 gramme de chlorure de potassium, deux fois le contenu minéral en trace normal, trois fois le contenu normal de composant manganèse (tout cela sur une base par litre) et en omettant le chlorure de sodium.Au bout de 166 heures, l'alimentation a été modifiée en une composition aqueuse de 10 % en volume de méthanol, 2,5 ml d'acide phosphorique (à 85 %) par litre, 2 grammes par litre de chlorure de potassium, 1,75 gramme par litre.de sulfate de magné sium,7H20, 0,25 gramme par litre de chlorure de calcium 2H20, 20 ml par litre de sulfate de manganèse H20 en solution aqueuse (0,3 g/l) et 35 ml par litre de la solution minérale en trace précédemment décrite. La vitesse d'alimentation du milieu était située dans une gamme comprise entre 700 ml par heure à la 22ème heure et 817 ml par heure à la 118eme heure, 781 ml par heure à la 166ème heure et 763 ml par heure à la 382ème heure. Des échantillons de l'effluent de fermentation ont été extraits de temps à autre pour en récupérer les cellules Les valeurs obtenues pour le contenu en cellule en termes de poids sec de cellules en grammes par litre et les rendements calculés sont présentés dans le tableau I. Le tableau I indique également des valeurs calculées pour la productivité en termes de grammes de cellule par litre et par heure. Au bout d'environ 126 heures, les échantillons du mélange de fermentation sont extraits et préparés pour une lyophilisation de cellules microbiennes selon les procédés connus dans la technique. Ces échantillons lyophilisés sont alors stockés pour une utilisation ultérieure dans un autre cycle de fermentation et pour fournir des échantillons de HTB-53 propre à un dépôt de microorsanismes effectué ar le déDartement d'état américain de l'aariculturer laboratoire de recherche de la région du Nord à Peoria, Illinois. Des échantillons ont été également prélevés périodiquement du mélange de réaction de fermentation pour un examen microscopique des cellules microbiennes en ce qui concerne leur morphologie d'ensemble. Cet examen microscopique a montré que la culture M c était composée d'un grand bâtonnet incurvé gram-positif, d'un grand bâtonnet gram-négatif et d'un petit bâtonnet gram-négatif. Occasionnellement, un grand bâtonnet gram-positif (non incurvée a également été observé, mais on estime qu'il s'agit d'une variante transitoire du grand bâtonnet gram-positif. TABLEAU I Temps - I (heures) 46 118 166 190 286 358 Temps de retenue (heures) 2,36 2,27 2,38 2,83 2,33 2,43 Cellu les (a) (g/l) 26,86 27,13 27,04 35,21 35,53 35,57 Soli des (b) (g/l) 26,82 27,66 27,87 35,5 36,66 36,76 Rende ment de cellu le (c) (%) 44,7 46,1 46,47 1 44,4 45,8 45,9 Produc tivi té(d) (g/i/h) 11.4 12.2 11.7 12.5 15.7 1 15.1 (a) Valeur obtenue en faisant évaporer un échantillon de 10 ml d'effluent de l'enceinte defermentation pendant une nuit à 1000C et en soustrayant le poids des solides minéraux contenus dans 10 ml du milieu. (b) Valeur obtenue par centrifugation d'un échantillon de 100 ml de l'effluent de fermentation, en faisant resuspendre les soli des dans de l'eau distillée et en centrifugeant à nouveau pour récupérer les solides qui sont séchés pendant une nuit à 1000C. (c) Valeur obtenue en divisant les solides récupérés (g/l) par le méthanol fourni (g/l) x 100. (d) Valeur obtenue en divisant les solides récupérés (g/l) par la durée de retenue (heure. EXEMPLE 2 Après environ un mois, un tube unique de la culture microbienne HTB-53, lyophilisée en provenance du cycle de fermentation de 1 "exemple 1 ci-dessus a été ouvert de façon aseptique par des procédés classiques et ajouté à 100 ml d'un milieu de fermentation appelé IM2 qui contenait également 0,5 % de méthanol.La composition du milieu IM2 est la suivante Milieu IM2 Composant Quantité, (g) KH2P04 2,0 R2HP04 3,0 MgS04.7H20 0,4 CaC122H20 0,04 NaCl 0,1 (NH4) 2S04 2,0 Solution minérale en trace 0,5 ml Eau distillée Quantité suffisante pour 1 litre Le tube rempli de la culture lyophilisée revivifiée a été incubé en l'agitant à 550C. Au bout de 24 heures, le tube présentait une bonne croissance de la culture et 5 ml du mélange ont été trans férés aans 100 ml du milieu IM2 contenant également 1,5 8 en volume de méthanol. Une bonne croissance s'est opérée en 24 heures et un troisième transfert a été fait vers le même milieu dans deux récipients contenant chacun 500 ml de milieu IM2 plus 1,5 % en volume de méthanol. Ce troisième transfért impliquait 100 ml de la culture ajoutée à chacun des deux récipients. La culture a été autorisée à croître pendant 32 heures et a été ensuite utilisée comme inoculant pour un cycle de fermentation continu dans l'appareil décrit ci-dessus dans l'exemple 1. L'enceinte de fermentation a été chargée par 1000 ml de milieu FM-12 et 1000 ml de l'inoculant auquel a été ajouté 10 ml de méthanol. La température a été maintenue à 55"C et le pH a été régulé entre 6,25 et 6,4 par addition continue d'une solution d'ammoniaque comme précédemment.Initialement, l'agitateur a été actionné à 300 tours par minute et de l'air a été introduit à une vitesse de 0,5 litre par minute tandis que la culture a été autorisée à se développer elle-même dans l'enceinte de fermentation. Au bout de 7 heures, une introduction continue de milieu d'alimentation ayant la même composition que le dernier milieu d'alimentation mentionné indiqué dans l'exemple 1 a été effectuée. En outre, la vitesse de l'air a été augmentée à 2 litres par minute tandis que le nombre de tours par minute de l'agitateur a été réglé à 1.000. Au bout de 30 heures, la vitesse de l'air a été réduite à 1,75 litre par minute, tandis que de l'oxygène était introduit à 0,75 litre par minute, puis à 1 litre par minute à la 54ème heure, à 1,5 litre par minute à la 198ème heure. A nouveau, l'effluent de fermentation a été prélevé de temps à autre pour fournir des données sur le contenu en cellules en termes de grammes par litre sur la base d'un poids sec et en termes de rendement et de productivité de fermentation. Les données obtenues au cours du cycle sont présentées dans le tableau II ci-dessous. TABLEAU II ;Temps, (heures) 70 ! 166 190 214 Temps de re Itenue (heu res) 2,60 2,70 2,63 2,64 Cellules (g/1) 34,33 33,56 33,87 34,84 Solides t (g/l) 34,44 35,4 34,55 35,52 Rendement j de cellule l ≈ (*) 43,6 44,2 43,2 44,2 Productivité ( /1 ) 13,2 13,1 13,1 13,5 Des échantillons de culture microbienne ont également été obtenus au cours du cycle de fermentation pour un examen micros copique comme dans le cas de l'exemple 1. Dans cet exemple on a également observé les-grands bâtonnets gram-positifs incurvés et les grands et petits bâtonnets gram-négatifs. Au cours de 238 heures du cycle, la culture a été perdue tandis qu'on essayait de modifier l'alimentation pour une concentration d'alcool plus élevée. EXEMPLE 3 Le tableau III ci-dessous indique des données analytiques caractérisant la culture microbienne obtenue dans le cycle de l'exemple 1 en terme d'analyse chimique des cellules microbiennes récupérées Le tableau IV présente également une analyse du contenu en aminoacides des cellules microbiennes récupérées à partir d'un autre cycle de fermentation en utilisant la culture thermophile mixte selon l'invention. Dans des buts de comparaison, une analyse du contenu d'aminoacide d'un microorganisme thermophile pur obtenu au cours de l'isolation des thermophiles à partir de l'échantillon de sol initial précédemment décrit est également présenté dans le tableau IV. TABLEAU III Analyse chimique microbienne Cellules obtenues dans un cycle avec HTB-53 Protéines brutes(a), % en poids 85,63 Cendres, % en poids 9,19 Azote des groupements aminés t % en poids 13,4 Carbone, % en poids - 44,7 Hydrogène, % en poids 6,79 Azoté, % en poids 13,7 Phosphore, % en poids 1,71 Potassium, % en poids ^ 0,91 Magnésium, % en poids 0,26 Calcium, % en poids 0,1 Sodium, % en poids fer, ppm 1300 Zinc, ppm 55,8 Manganèse, ppm 126 Cuivre, ppm ppm 20 (a) Contenu d'hydrogène (13,7) x 6,25 TABLEAU IV Contenu d'aminoacide de cultures thermophiles obtenues par croissance sur du méthanol :Grammes pour 100 grammes de produit aminoacides Pur (HTB-7) Valeurs chi- Mixte (HTB-42) Valeurs essentiels miques (1) chimiques (2) (1) Leucine 5,37 75 5,76 104 Isoleucine 4,56 83 4,90 118 ! Lysine 5,54 96 5,67 141 Méthionine 1,50 { 34 1,22 34 36 Cystine Thréonine 1 2,95 90 2,79 88 Phénylala nine 2,68 80 2,78 Tyrosine 2,55 t 2,72 k Tryptopha ne 0,60 43 0,89 90 Valine 5,13 91 5,46 121 Alanine 5,65 6,19 Arginine 3,39 3,01 Acides as portiques 6,50 6,26 Glycine 3,71 4,19 Acide glu tamique 10,47 10,69 Histidine 1,26 1,22 Proline 2,32 2,38 Sérine 2,09 1,75 Aminoacides totaux es sentiels 30,88 32,19 Tctal des aminoacides 66,27 67,88 Protéines brutes 85,63 84,4 (x = non détecté) (1) Valeurs chimiques : base 100 pour le contenu d'aminoacide de l'oeuf pour un même poids de protéines. (2) Basé sur des moyennes à partir de cinq cycles de thermophiles purs On peut noter que le pourcentage total d'aminoacides qui sont essentiels est légèrement plus élevé pour le produit de culture mixte (47 %) que pour le produit de culture pur. En outre, si les aminoacides essentiels contenant du soufre sont fournis par addition de méthionine de synthèse, les valeurs chimiques montrent que le produit de la culture mixte est deux fois meilleur au point de vue nutritionnel que le produit de culture pur, sur la base de la valeur chimique de ltaminoacide essentiel immédiatement suivant. L' appréciation de certaines des valeurs de mesures indiquées ci-dessus doit tenir compte du fait qu'elles proviennent de la conversion d'unités anglo-saxonnes en unités métriques. La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de variantes et de modifications qui apparaitront à l'homme de l'art. REVENDICATIONS 1 - Procédé d'obtention de protéines unicellulaires par culture aérobie d'une population mixte de bactéries thermophiles à une température dans la gamme de 45 à 650C, en milieu aqueux contenant un ou plusieurs hydrocarbures oxygénés, en tant que source de carbone et d'énergie, une source d'azote et un produit nutritif minéral, caractérisé en ce que les bactéries ont la désignation de dépôt NRRL B-8158 et comprennent les bactéries désignées en outre comme suit (1) un grand bâtonnet incurvé gram-positif, division Bactéries,classe Schizomycètes, ordre Eubactériales (2) un grand bâtonnet gram-négatif du même genre; et (3) un bâtonnet court gram-négatif,division bactéries,classe Schizomycètes. 2 - Procédé selon la revendication l,caracterise en ce que l'hydrocarbure oxygéné est un alcool, une cétone, un ester,un éther, un acide ou un aldéhyde,soluble dans l'eau, ou leur mélange contenant jusqu'à 10 atomes de carbone par molécule. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'hydrocarbure oxygéné est l'un des produits contenus dans le groupe suivant ou le mélange de deux ou plusieurs de ces produits le méthanol,l'éthanol,un propanol, un butanol, un pentanol, un hexanol, le 1,7-heptanediol, le 2-heptanol, le 2-méthyl-4-pentanol, l'acide pentanolque, l'acide 2-methylbutanolque, le 2-pentanol,le 2-methyl-4-butanol, le 2-méthyl-3-butanol, le 2-butanol, le 2methyl-l-propanol, le 2-méthyl-2-propanol, le 2-propanol, l'acide formique, 11 acide acétique, l'acide propionique, le formaldéhyde, l'acetaldehyde, le propanal, le butanal, le 2-méthylpropanol, l'acide butanoique, l'acide 2-méthylpropanoique, l'acide pentanol- que, l'acide glutarique, l'acide hexanolque, l'acide 2-methylpenta- nique, l'acide heptanediolque, l'acide heptanoique, le 4-heptanone le 2-heptanone, l'acide octanoique, l'acide 2-étbylhexanoique, le glycérol, I'éthylèneglycol, le propylèneglycol, la 2-propanone, la 2-butanone, l'éther diethylique, l'éther méthyléthylique, l'éther diméthylique, l'éther di-n-propylique, l'éther n-propylisopropy- lique. 4 - Procédé selon la revendication 2, caractérisi en ce que l'hydrocarbure oxygéné comprend un alcool moochydroxylé ou polyhydroxylé contenant de 1 à 7 atomes dé carbone par molécule. 5 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la culture est effectuée à une température de fermentation dans la gamme d'environ 50 à environ 600C. 6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le milieu de culture est maintenu dans un pH dans la gamme de 5,5 à 7,5. 7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le pH est maintenu dans la gamme de 6 à 7. 8 - Procédé selon l'une quelconque des renvendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'hydrocarbure oxygéné est du méthanol et que les conditions sont maintenues de sorte que la quantité de méthanol dans l'effluent de l'enceinte de fermentation se trouve dans une gamme de O à 0,2 % en poids. 9 - Procédé selon ltune quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu' entre 0,02 et 2,1 volumes d'oxygène sont fournis par-minute par volume du liquide dans le milieu de culture et En ce que le milieu de culture est maintenu sous une pression dans la gamme de Q,1 à 100 atmosphères. 10 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la culture est effectué dans des conditions de fermentation de culture moussante. 11 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les cellules microbiennes sont soumises à une lyse. 12 - Matière protéinée obtenue selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 11. 13 - A titre de produit industriel nouveau, culture biologiquement pure de bactéries ayant les caractéristiqUeE d'identification de NRRL B-8158. 14 - Culture selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle peut produire des quantités récupérables de protéines unicellulaires par fermentation dans un milieu nutritif aqueux contenant des quantités assimilables de carbone d'azote et de produits nutritifs minéraux.