Brevet FR2417548A1 — publié le 19790914

La présente invention se rapporte à un procédé de préparation de l'acide ss-hydroxy--carboxy-isocaproïque (en abrégé ciaprès HCIA) par fermentation. On sait que le HCIA est un produit précurseur de la synthèse biologique de la L-leucine (Metabolic Maps 1971, 3e édition, Kyoritsu Publishing Company, Ltd., Japon), et un produit de départ de la préparation biologique de la L-leucine. Ces propriétés peuvent être confirmées par l'essai ci-après dans lequel on utilise un micro-organisme connu pour être producteur de L-leucine, Brevibacterium lactofermentum FERN-P 2516 (brevet des Etats-Unis d1Amérique nO 3 970 519). On prépare un milieu de culture è pH 7,0 contenant par décilitre, dans un cas 8,0 g de glucose, 4 g de (NH4)2S04, 0,1 g de KH2P04, 0,04 g MgS04,7H20, 1 mg de FeSO4,7H20, 1 mg de NnSO4, 4H20, lO/1g de biotine, 35joug de chlorhydrate de thiamine, 2 ml d'hydrolysat de protéines de soya, 10 mg de L-isoleucine, 10 mg de L-méthionine et 5 g de CaC03 (stérilisé séparément) et, dans l'autre cas, 8,0 g de glucose et 1,0 g de HCIA avec les autres additifs, on place des fractions aliquotes de 20 ml du milieu dans des flacons à secousses de 500 ml et on stérilise par chauffage. On ensemence ensuite chacune des fractions aliquotes par le micro-organisme FERM-P 2516. On cultive sous secousses à 30oC, pendant 72 h. Dans le milieu exempt de HCIA, on n'accumule que 1,97 g/dl de leucine dans le liquide de culture, alors que dans le milieu contenant le HCIA, on accumule 2,49 g/dl de L-leucine. La demanderesse a maintenant trouvé qu'on pouvait obtenir le HCIA avec des rendements élevés par culture dans un milieu aqueux d'un micro-organisme du genre Brevibacterium ou Corynebacterium et récolte du HCIA qui s'est accumulé dans le liquide de culture. Les micro-organismes utilisés conformément a l'invention appartiennent atzgenres Brevibacterium ou Corynebacterium et sont capables de produire le HCIA. Comme exemples particuliers de ces micro-organismes on citera Brevibacterium flavum AJ 11229, FERM-P 4396 (NRRL B-11425) (mutant nécessitant de la L-leucine) Brevibacterium flavum AJ 11230, FERM-P 4397 (NRRL B-11426) (mutant résistant à la ss-hydroxyleucine) Corynebacterium acetoacidophilum AJ 11231, FERM-P 4398 (NRRL B-11427) (mutant nécessitant de la L-leucine) Corynebacterium acetoacidophilum AJ 11232, FERM-P 4399 (NRRL B-11428) (mutant résistant à la 2-thiazole-alanine) Brevibacterium flavum ATCC 14067. En dehors des micro-organismes mentionnés ci-dessus, on peut dériver des mutants capables de produire le HCIA à partir de souches parentes telles que Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium divaricatum ATCC 14020, Brevibacterium lactoférmentum ATCC 13869, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 et Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, par isolement des mutants nécessitant de la leucine ou des mutants résistant aux analogues de la leucine. Les analogues de la leucine sont des composés chimiques qui inhibent la croissance des micro-organismes des genres Brevibacterium et Corynebacterium, ladite inhibition étant supprimée en totalité ou en partie par la présence de L-leucine. Comme exemples particuliers d'analogues de la leucine, on citera la D-leucine, l'a-méthylleucine, la 8-hydroxyleucine, la carbobenzoxythréonine, la N-lauroylleucine, la N,N'-diméthylleucine, la tertleucine, la 2-thiazole-alanine norvaline et la norleucine. L'essai décrit ci-apres met en évidence le degré de résistance des mutants aux analogues de la leucine. Essai On cultive des mutants résistant aux analogues de la leucine et leurs souches parentes sur géloses inclinées du milieu A (voir ci-après) à 300C pendant 24 h, on recueille les cellules des géloses inclinées et on les lave avec le milieu B. On transfère des parties aliquotes constituées de 0,1 ml de la suspension de cellules lavées dans le milieu B dans 3 ml du milieu B placé dans des tubes à essai, ce milieu B ayant été additionné au préalable de la quantité de ss-hydroxyleucine ou de 2-thiazole indiquée dans les tableaux I et II ci-après. La culture est réalisée en 24 h à 31,50C. Milieu A Extrait de levure 1,0 g/dl Peptone 1,0 gfdl NaCI 0,5 gzdl Glucose 0,5 g/dl Gélose 2,0 g/dl Milieu B: Glucose 2,0 g/dl (NH4)2SO4 1,0 g/dl Kn2P04 0,1 g/dl MgSO4,7H20 0,04 g/dl FeSO4,7H20 1,0 mg/dl MnSO4,4H2O 1,0 mg/dl Biotine 50 g/1 Chlorhydrate de thiamine 200/ g/1 NaCl 0,05 g/dl CaCO3 (stérilisé séparément) 3,0 g/dl (réglage a pH 7,0 par KOHr La croissance est suivie par mesure de la densité optique à 562 mu d'une dilution de 26 fois du milieu.La croissance relative des micro-organismes soumis aux essais ressort des résultats rapportés dans les tableaux I et II ci-après TABLEAU I ss-Hydroxyleucine ajoutée, Croissance relative, % mg/1 ATCC 14067 AJ 11230 0 100 100 100 15 88 300 11 94 1000 11 59 3000 7 6 Le micro-organisme ATCC 14067 est la souche parente du micro-organisme AJ 11230. TABLEAU II Croissance relative, % 2-Thiazole-alanine ajoutée, Croissance relative % Z mg/l ATCC 13870 AJ 11232 O 100 100 250 65 100 500 25 101 1000 0 100 1500 O 97 2000 83 Les micro-organismes selon l'invention sont cultivés pour production du HGLi dans des milieux de culture de type classique contenant des sources de carbone, des sources d'azote, des ions minéraux et, lorsque c'est nécessaire, des substances nutritives organiques mineures telles que des vitamines ou des aminoacides. Les sources de carbone sont de préférence des hydrates de carbone, comme le glucose et le saccharose, des mélasses ou des hydrolysats d'amidon contenant ces hydrates de carbone, des acides organiques tels que l'acide acétique et les acides gras supérieurs, et des alcools tels que l'éthanol. Les sources d'azote sont, par exemple, des sels d'ammonium, de l'ammoniaque en solution aqueuse, du gaz ammoniac et de l'urée. Les ions minéraux sont les ions phosphates, les ions potassium, les ions magnésium et les ions analogues nécessaires. La culture est avantageusement réalisée dans des conditions aérobies à un pH dans l'intervalle de 4 à 8 et à une température dans l'intervalle de 25 à 38 C. Au cours d'une période de croissance qui est typiquement de 1 à 7 jours, le HCIA s 'accumule dans le milieu. Le HCIA qui s'est accumulé dans le milieu de culture peut entre recueilli par des techniques classiques telles que des techniques d'extraction et des techniques d'échange d'ions L'exemple qui suit illustre l'invention sans toutefois en limiter la portée; dans cet exemple, les indications de parties et de pourcentages s'entendent en poids sauf mention contraire. EXEMPLE On prépare un milieu de culture aqueux contenant 10 g/dl de glucose, 1,5 g/dl de sulfate d'ammonium, 0,1 gldl de KH2PO4, 0,04 g/dl de MgS04,7H20, 0,001 go dol de FeS04,7H20, 0,001 g/dl de Mn804,4H20, 250 g/1 de biotine, 200pg/l de chlorhydrate de thiamine, 1,5 ml/dl d'hydrolysat de protéines de soya (contenant 6,5 g/dl d'azote total) et 5 g/dl de CaC03 (stérilisé séparément) et on le règle à pH 7,0 par KOH. On place des fractions de 20 ml du milieu de culture aqueux dans des flacons à secouer de 500 ml et on chauffe à la vapeur à 1100C pendant 10 min. On inocule ensuite les milieux de culture aqueux à l'aide d'une boucle de platine des micro-organismes énumérés dans le tableau III ci-après cultivés au préalable sur gélose inclinée au glucose et au bouillon et on cultive sous secousses pendant 96 h à 31, 50C. La quantité de HCIA qui s'est accumulée dans chacun des liquide de culture est rapportée dans le tableau III ci-après. TABLEAU III Micro-organisme utilisé HCI & accumulé, g/1 AJ 11229 3,70 AJ 11230 1,30 AJ 11231 2,40 AJ 11232 1,20 ATCC 14067 0,20 REVENDICATIONS I - Procédé de préparation de l'acide -hydroxy-ss- carboxy-isocaproique, caractérisé en ce que l'on soumet un micro-organisme du genre Brevibacterium ou Corynebacterium capable de produire l'acide -hydroxy-ss-carboxy-isocaproSque à culture aérobie dans un milieu de culture aqueux et on recueille l'acide -hydroxy-ss-carboxy-isocaproSque qui s'est accumulé dans le liquide de culture. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme utilisé est un mutant qui nécessite de la L-leucine pour sa croissance. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme utilisé est un mutant résistant aux analogues de la leucine. 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme utilisé est un mutant résistant à la B-hydroxyleucine. 5 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le micro-organisme est un mutant résistant à l'a-thiazole- alanine. 6 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme utilisé est Brevibacterium flavum AJ 11229. 7 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme utilisé est Brevibacterium flavum AJ 11230. 8 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme utilisé est Corynebacterium acetoacidophilum AJ 11231. 9 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme utilisé est Corynebacterium acetoacidophilum AJ 11232. 10 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme utilisé est Brevibacterium flavum ATCC 14067.