Brevet FR2424318A1 — publié le 19791123

La présente invention est relative à un procédé de stérilisation de milieux de fermentation. Plus particulièrement, l'invention concerne l'utilisation du gluataraldêhyde comme agent de stérilisation chimique pour les milieux microbiens et les installations utilisés pour les traitements de fermentation. Les milieux liquides pour la prolifération de microorganismes par fermentation en culture submergée sont très couramment stérilisés à l'aide de vapeur d'eau haute pression avant inoculation avec l'organisme producteur du produit souhaité. Bien que la vapeur haute pression soit un agent de stérilisation efficace pour les milieux de fermentation, son utilisation présente néanmoins de nombreux inconvénients. L'un des inconvenients les plus évidents est la dépense entraînée par les besoins en énergie pour le chauffage et le refroidissement d réacteurs à grande échelle et desvolumes importants de milieux de fermentation couramment utilisés à l'heure actuelle pour les traitements de fermentation.A un moment où les coûts de l'énergie sont élevés et les approvisionnements en énergie sont bas, 1' inconvénient économique de la stérilisation à la vapeur d'eau est significatif. En outre, l'utilisation de vapeur haute pression empêche l'utilisation de matériaux de construction peu onéreux, comme les fibres de verre, dans l'installation de traitement et entraine au contraire l'utilisation de matériaux relativement coûteux comme l'acier inoxydable et l'acier à haute teneur en carbone. En outre, des laps de temps relativement longs sont nécessaires pour efficacement stériliser des volumes importants de milieux microbiens, affectant ainsi de façon défavorable la rentabilité du procédé.De plus, la stérilisation à la vapeur d'eau a souvent pour résultat de provoquer la perte d'éléments nutritifs des milieux microbiens par surchauffe, et peut provoquer des modifications chimiques et physiques indésirables dans les constituants du substrat, aboutissant à une baisse de production des produits souhaitables ainsi qu'a une réduction dans l'efficacité globale du procédé. Le traitement chimique biocide des milieux de fermentation, en tant qu'alternative à la stérilisation par la vapeur d'eau, est bien connu dans la technique. Par exemple, la bêta-propiolactone et 1' oxyde d'éthylène ont été décrits comme étant des agents de stérilisation chimiques efficace cf. "The Chemical Sterilization of Liquid Media with Beta-Propiolactone and Ethylene Oxide", Toplan et al, Journal of Biochemical and Microbiological Technology and Engineering Volume III,n03pages 311-323 (1961).Comme autres agents anti-microbiens chimiques utilisés dans les traitements de fermentation on citera le formaldéhyde (brevet des E.U.A. nO 2.991.231), la furaciline (brevet des E.U.A. nO 3.202.587) ainsi que des antibiotiques comme la pénicilline et la streptomycine (brevet des E.U.A. nO 3.494.832). Toutefois, à part l'oxyde d'éthylene, tous les agents chimiques qui ont été utilisés pour préparer des milieux microbiologiques ne présentent qu'une activité biocide limitée. C'est-à-dire qu'ils sont spécifiques vis-à-vis de certaines classes de microorganismes, ou inhibent simplement la prolifération d'organismes contaminants particuliers, et, de ce fait, ont une valeur limitée. Bien que l'oxyde d'éthylène soit un microbicide a' large spectre capable de réaliser de hauts degrés souhaitables de pureté microbienne, les seules considérations de sécurité empêchent son utilisation dans un procédé industriel. La nature chaudement inflammable de l'oxyde d'éthylène est telle qu'il forme des mélanges explosifs avec l'air à des concentrations très faibles.De ce fait, son utilisation dans un procédé de fermentation est limitée à des autoclaves spécialement concus qu'on doit faire fonctionner avec des précautions de sécurité draconiennes et, par suite, présente peu d'intérêt industriel, en pratique. L'efficacité du glutaraldéhyde comme agent biocide est bien documentée dans la littérature des brevets. Par exemple, les brevets des E.U.A. nO 3.016.328, 3.697.222 et 3.912.450 décrivent des procédés de stérilisation d'objets contaminés comme les instruments chi- rurgicaux et dentaires à l'aide de solutions de glutaraldéhyde. Toutefois, c'est la puissance même du glutaraldéhyde en tant qu'agent biocide qui l'a rendu indésirable comme agent de stérilisation chimique pour les milieux de fermentation. C'est-à-dire que le glutaraldéhyde est biocide vis-à-vis de pratiquement toutes les espéces de microorganismes, y compris ceux qui sont inoculés dans les milieux microbiologiques afin de produire les produits souhaités, par fermentation en culture.C'est ainsi qu'à l'opposé de la stérilisation à 1' aide de vapeur haute pression, les effets biocides du glutaraldéhyde ne se dissipent pas après la stérilisation des milieux liquides et des installations de fermentation dans lesquels ils sont utilisés. De ce fait, à ce jour, le glutaraldéhyde n'était pas-considéré comme utilisable industriellement de façon viable a' la place de vapeur d' eau comme agent de stérilisation pour les systèmes de fermentation. L'invention décrit un procédé de stérilisation d'un milieu de culture à l'aide de glutaraldéhyde, dans lequel l'activité biocide du glutaraldéhyde est éliminée après que la stérilisation a été menée à bonne fin. Le milieu de culture est initialement mis en contact avec du glutaraldéhyde pendant un laps de temps et à une concentration suffisants pour obtenir le degré souhaité de pureté microbienne. Après stérilisation, le pH du milieu est élevé jusqu'à une valeur supérieure à 6,5 environ et il est ensuite mis en contact avec un ou plusieurs composés azotés choisis parmi l'ammoniac, les amines primaires, les amines secondaires, les amines hétérocycliques, les urées et les amides afin d'inactiver le glutaraldéhyde et d'éliminer ses effets biocides. Le pH du milieu est maintenu au-dessus de 6,5 au cours de ce stade d'inactivation. Le milieu peut ensuite être inoculé avec l'organisme souhaité pour amorcer la fermentation. Par "stérilisation" on entend ici la réduction du taux des agents contamnants microbiens à des valeurs très basses, et on n'utilise pas le mot stérilisation dans son sens technique le plus strict qui serait l'élimination absolue de tous les agents contaminants. Par "composé azoté" on veut désigner un composé contenant au moins une liaison N-H réactive vis-à-vis du glutaraldéhyde, c'est-àdire un composé contenant au moins un hydrogène fixé sur l'azote capable de former un composé dtaddition avec le glutaraldéhyde. Par "amide" on veut désigner un composé répondant à la formule générale suivante: dans laquelle R et R1 représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupe alcoyle ou aryle. I1 est bien entendu que par "alcoyle" et "aryle" on veut englober des groupes insubstitués ainsi que des groupes substitués par des substituants, par exemple des halogènes ou de l'azote. Le degré souhaité de pureté microbienne pour un procédé de fermentation donné détermine les variables opératoires nécessaires pour réaliser la stérilisation, à savoir: la concentration du glutaraldéhyde dans le milieu de culture, le pH du milieu et le temps de traitement. A un pH inférieur à 6,5 environ, une concentration en glutaraldéhyde représentant moins de 0,5% environ du poids du bouillon de fermentation suffit généralement.De façon représentative, pour un milieu de culture a' température ambiante et maintenu à un pH de 5 environ, un traitement de deux heures avec du glutaraldéhyde en une concentration représentant environ 0,05,' du poids du milieu produira le degré souhaité de pureté microbienne; pour une concentration en glutaraldéhyde d'environ 0,ss en poids, le temps de traitement est généralement de l'ordre de 30 minutes, dans les mêmes conditions de température et de pH. La température du milieu liquide, au cours du traitement, peut, de façon appropriée, varier d'environ 15 à 750C, une température d'environ 25 à 300C étant préférable. Le pH du milieu peut être d'environ 2 à 10, mais est de préférence inférieur à 6,5 environ et, mieux, d'environ 5 à 6.A un pH supérieur à 6,5, les sels d'ammonium, souvent présents a' titre de constituants du substrat dans les milieux de fermentation, réagissent chimiquement avec le glutaraldéhyde, nécessitant ainsi des concentrations sensiblement plus élevées de glutaraldéhyde pour stériliser le milieu. I1 va de soi que cette réaction est également indésirable dans la mesure où elle appauvrit le milieu en éléments nutritifs nécessaires pour favoriser la réaction de fermentation De ce fait, la stérilisation de milieux contenant des sels d'ammonium comme le sulfate d'ammonium et le phosphate d'ammonium est de préférence effectuée à un pH inférieur à 6,5 environ, afin de supprimer la réaction du glutaraldéhyde avec les composés a d'ammonium. Comme exemples de composés azotés utilisables pour chimiquement inactiver le glutaraldéhyde conformément à la présente invention, on citera: l'ammoniac , la méthylamine; l'éthylamine; la propylamine la butylamine; la t-butylamine; la nonylamine; l'octadécylamine; la diméthylamine: la diéthylamine: la dipropylamine: la diisopropylamine; la cyclohexylamine; la pipérazine; la morpholine; l'urée; la méthyl urée; l'éthylurée; la diméthylurée, le formamide; le méthylformamide; l'éthylformamide; le N-méthylformamide; le N-éthylformamide; le Npropylformamide; le benzamide; le N-phénylformamide, etc. L'ammoniac est le composé préféré, du fait de son accessibilité et de son coût. Les composés azotés suivant l'invention peuvent être introduits directement dans le milieu afin de réagir avec le glutaraldéhyde libre, ou, éventuellement, peuvent etre formés in situ, à un pH supérieur à 6,5 environ, à partir d'un composé d'ammonium covalent Coor- ding. C'est ainsi, par exemple, qu'on peut introduire de l'hydroxyde d'ammonium et/ou de l'hydroxyde d'éthylammonium dans le milieu dans lequel ils seront convertis, a' un pH supérieur à 6,5, en composés azotés réactifs, c'est-à-dire respectivement en ammoniac et en éthyl amine.Comme exemples de composés d'ammonium covalents coordinés utilisables dans la présente invention on citera: I'hydroxyde d'ammonium, le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, le phosphate d'ammonium, l'acétate d'ammonium, le propionate d'ammonium, l'hydro- xyde de méthylammonium, l'hydroxyde d'éthylammonium; l'acétate de méthylammonium, le sulfate de méthylammonium, l'hydroxyde de diméthyl ammonium, l'acétate de diéthylammonium, l'hydroxyde de dipropylam monium, etc. L'introduction de composés azotés ou, éventuellement, de composés d'ammonium covalents coordinés, dans le milieu peut être effectuée par tout moyen approprié. Si le composé est un gaz, comme l'ammoniac,la méthylamine ou la diméthylamine, on peut le faire barboter directement dans le milieu liquide. Dés liquides comme l'hydroxyde d'ammonium, l'éthylamine, la diéthylamine, etc. peuvent être directement introduits dans le milieu, volumétriquement, ou en proportions pondérales. Des composés solides comme l'urée, le sulfate d'ammonium et le phosphate d'ammonium sont, de façon souhaitable, dilués à l'aide d'un solvant comme l'eau, par exemple, et la solution résultante peut être stérilisée à la vapeur d'eau ou à l'aide d'un agent de stérilisation chimique, ou par filtration, avant introduction dans le milieu. Comme précédemment indiqué, des composés d'ammonium comme le phosphate d'ammonium et le sulfate d'ammonium sont couramment utilisés comme éléments nutritifs dans certains milieux de fermentation. Lorsque le pH du milieu est supérieur à 6,5 environ, ces composés sont convertis en composés azotés qui réagissent chimiquement avec le glutaraldéhyde. Suivant un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, un excès de composé d'ammonium covalent coordiné (excès par rapport à la proportion requise en tant que constituant du substrat du bouillon de fermentation) est introduit dans le milieu au cours de sa préparation initiale. De façon appropriée, l'excès représente à peu près la proportion stoéchiométrique de composé d'ammonium requise pour réagir chimiquement avec le glutaraldéhyde après la stérilisation du milieu. On peut ensuite inactiver leglutaraldéhyde en ajustant simplement le pH du milieu au-dessus de 6,5 environ, afin de favoriser la formation du composé azoté à partir du composé d'ammonium covalent coordiné.Le pH du milieu est ensuite maintenu audessus de 6,5 jusqu'à ce que la réaction avec le glutaraldéhyde soit terminée. L'inactivation du glutaraldéhyde peut être effectuée à toute température appropriée, bien qu'une température d'environ 20 à 300C soit préférable. Le pH du milieu peut varier d'environ 6,6 à 14, mais est de préférence d'environ 7 à 9. Le temps de réaction varie généralement d'environ 0,5 à 4 heures, suivant le pH du milieu et l'activité du composé azoté ou du composé d'ammonium covalent coordiné utilisé. Les sels d'ammonium contenant des fragments acides très faibles, comme le carbonate d'ammonium, nécessitent généralement moins de temps pour inactiver le glutaraldéhyde que les sels d'ammonium contenant des fragments acides forts, comme le sulfate d'ammonium. De ce fait, la réactivité de quelques composés d'ammonium représentatifs est la suivante, par ordre décroissant: hydroxyde d'ammonium, carbonate d' ammonium, acétate d'ammonium, phosphate d'ammonium, chlorure d'ammonium et sulfate d'ammonium. fipiqueEamt, pour un milieu de fermentation à 250C maintenu ê un pH de 7,5 environ, un temps de réaction d' environ 1 à 1,5 heure est nécessaire pour l'inactivation lorsqu'on utilise un composé d'ammonium covalent coordiné comme l'hydroxyde d' ammonium. Pour complètement inactiver le glutaraldéhyde, la proportion de composés azotés dans le milieu doit être à peu près stoéchiométriquement équivalente à celle du glutaraldéhyde dans le milieu En particulier, le nombre de liaisons N-H réactives soit être égal au nombre de groupes aldéhyde libres du glutaraldéhyde; deux groupes aldéhyde étant présents par mole de glutaraldéhyde C'est ainsi, par exemple, qu'il faut 2/3 d'une mole d'ammoniac, présentant trois liaisons N-H par mole, pour réagir stoéchiométriquement avec une mole de glutaraldéhyde. De même, il faut une mole d'éthylamine (ayant deux liaisons N-H réactives par mole) ou deux moles de diéthylamine (ayant une liaison N-H réactive par mole) par mole de glutaraldéhyde. On peut éventuellement utiliser des proportions supérieures à la proportion stoéchianétrique. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention. EXAMPLE 1 On effectue l'essai suivant pour démontrer la stérilisation par le glutaraldéhyde de milieux de production pour la fermentation en culture submergée de Pénicilline-G et pour fournir un élément de comparaison avec la stérilisation par la vapeur d'eau. On utilise trois fermenteurs de 14 litres, munis d'un dispositif de réglage automatique du pH, d'une sonde à oxygène dissous, d'un dispositif automatique d'introduction du glucose, et d'un dispositif automatique de contrôle du moussage. Dans chacun des trois fermenteurs ci-dessus on introduit le milieu de culture suivant: Constituants Quantité (cor) Glucose 20,00 (NH4)2S04 120,00 KH2P04 24,00 CaSO4-2H2O 66,00 Na2SO4 4,00 MgSO4.7H2O 5,60 FESO4, 0,45 MnCl2 0,40 ZnSO4 0,40 CaCl2 0,40 CuSO4 0,06 Eau 8000,00 Dans le dispositif automatique d'introduction du glucose de chaque appareil on introduit une solution aqueuse contenant, en poids, 25% de glucose et 2,08% d'acide phénylacétique. Afin d'assurer leur uniformité, on stérilise ces solutions pendant 30 minutes à l'aide de vapeurd'eail2l'Cet sous une pression de vapeur (absolue) de 2 kg/cm2. Dans les dispositifs automatiques d'introduction de 1 'agent antimoussant on introduit, dans chacun, 100 g de UCON TM Fluid LB-625, un agent anti-moussant pour la fermentation, qu'on utilise pour agir sur la formation de mousse tout au long des essais. On stérilise le fermenteur n 1 et son contenu à la vapeur d'eau pendant 45 minutes à 121 C et une pression absolue de 2 kg/cm2. Après stérilisation, le pH est de 5,2 et on l'amène à 6,8 par addition d'une solution 5,0 N d'hydroxyde de sodium. I1 faut environ 5 heures pour porter le fermenteur et son contenu à 1210 C, maintenir la température pendant le temps prescrit, et refroidir l'installation à 240C aux fins d'inoculation. On ne stérilise pas le fermenteur n02, le pH du milieu contenu est de 5,6. On maintient ce pH pendant une heure, puis on l'amène à 6,8 à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium 5,0 N. La température du milieu est de 240C. On ajoute 32 g d'une solution aqueuse de glutaraldéhyde à 25,2% en poids au contenu du fermenteur n03, obtenant ainsi une teneur en glutaraldehyde d'environ 0,1%, en poids, par rapport à la charge totale. Le milieu est à une température de 240C. Le pH du milieu est de 5,5 immédiatement après l'addition, et on maintient ce pli pendant une heure. On amène ensuite le pH du milieu à 7,0, à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium 5,0 N. Pendant les 80 minutes suivantes, le pH du milieu est automatiquement ajusté par le régulateur du pH, et maintenu à une valeur de 6,8.On remarquera que, comme une partie du (tEH4)2S04 en solution est convertie en ammoniac qui, à son tour, réagit sur le glutaraldéhyde, le pH du milieu a tendance à tomber du fait de la presence d'ions sulfate en solution. De ce fait, il faut ajouter un matériau alcalin comme l'hydroxyde de sodium par exemple, à intervalles de temps réguliers, pour maintenir le milieu à un pH constant. Lorsque l'inactivation du glutaraldéhyde est terminée, le pH du milieu reste stable. On inocule chacun des fermenteurs nO 1, 2 et 3 avec 200 cm3 de milieu d'ensemencement cultivé en utilisant comme organisme Penicillium chrvsogenum (A.T.C.C. 12690), et on fait incuber pendant 48 heures dans des ballons à secouer de 500 cm3 à 250C. Le volume humide de mycélium dans l'inoculum est de 16% après centrifugation à 5000 tours/minute pendant 15 minutes. On ajuste la vitesse d'agitation de chaque fermenteur inoculé à 360 tours/minute et on ajuste les débits d'air à 4000 cm3/minute. La température de chaque fermenteur est maintenue a 24,0 + 0,50C tout au long de la fermentation. La teneur en oxygène dissous à saturation de chaque installation est, de 8,8 mg de 02/litre lorsque le dispositif de mesure indique une valeur de 10. Vingt-quatre heures après l'inoculation, la teneur en oxygène dissous du bouillon dans chaque fermenteur est la suivante: n01 97%, n02, laps, et n03, 9515. L'examen microscopique, en utilisant une simple technique de oloration, indique que les ferments n l et n03 contiennent principalement l'organisme Penicillium chrysoqenum avec essentiellement pas de traces d'autres organismes contaminants. Au contraire, le ferment dans le fermenteur n02 ne contient que des traces de Penicillium chrysovenum et des quantités considerables de contamination constituee par-des bacilis et cocci.Du fait de l'importante population d'organismes contaminants dans le fermenteur n02, on est obligé d'arrêter cette fermentation au bout de 30 heures. On laisse les fermentations dans les fermenteurs n0 1 et 3 se poursuivre pendant 196 heures, et on les facilite par l'introduction d'une solution stérile glucose/acide phénylacétiaue dans chaque appareil. Au bout de 196 heures, l'examen microscopique des bouillons indique. que les deux cultures sont essentiellement des cultures de Penicillium chrysogenum et ne contiennent pas de signes visibles de contamination. On mesure la teneur en Pénicilline - G des bouillons par la mé thode de Bethel et Bond (J. Anal. Chem., Volume 86, pages 448-457, 1961). Elle est de 865 unités/ml dans le fermenteur n0l et de 858 unites/ml dans le fermenteur n03. EXEMPLE 2 On effectue l'essai suivant pour démontrer la stérilisation d' un milieu de fermentation de Céphalosporine C par le glutaraldéhyde et obtenir un élément de comparaison avec une stérilisation à la vapeur d'eau. On utilise trois fermenteurs de 14 litres dans chacun desquels on introduit le milieu de fermentation de Céphalosporine suivant: Constituants Quantité (q) Mélasse de betteraves 240,0 Vita Pro 70 (Rath Chemical Company) 320,0 Liqueur de macération de mais (C.Pc. Int.) 40,0 D-L-méthionine 40,0 Oléate de méthyle 160,0 CaC03 12,0 NH4CO3 7,0 SAG TM4l3O Silicone Antifoam (anti-moussant) 0,160 Eau 8000 On stérilise le fermenteur ngl et son contenu à 1210C à la vapeur d'eau sous une pression manométrique del;kg/cm2 pendant 45 minutes. Il faut environ 6 heures pour stériliser le système et réduire la température à 290C aux fins d'inoculation. Le pH du milieu dans le fermenteur n02 est ajusté à 5,5 et la température maintenue à 290C pendant une heure. On amène ensuite le pH à 6,8 à l'aide d'une solution d'hydroxyde d'ammonium ( à 3/0 en poids). On ajoute 64 g d'une solution aqueuse de glutaraldéhyde à 25% en poids au contenu du fermenteur n03 et on maintient la température à 290C. Le pH du milieu, après addition du glutaraldéhyde, est de 5,5 et on maintient ce pH pendant une heure. Puis on amène le pH à 6,8 par addition d'une solution d'hydroxyde d'ammonium, et on maintient à pH constant pendant une heure. On inocule ensuite chacun des fermenteurs n0l, 2 et 3 avec 500 cm3 de milieu d'ensemencement cultivé pendant 48 heures en utilisant comme organisme Cephalosporium acremonium (A.T.C.C. nO 11550) et on effectue les fermentations à 290C en agitant à 300 tours/minute et avec un débit d'air de 4000 cm3/minute. Au bout de 96 heures de fermentation, les fermenteurs n 1 (stérilisé à la vapeur d'eau) et n03 (traité au glutaraldéhyde) contiennent chacun plus de 500 unités/ml de Céphalosporine C. Le fermenteur n02 (n'ayant pas subi de traitement de stérilisation) ne contient pas de traces de Céphalosporine C et est envahi par au moins 5 types différents d'organismes contaminants, comme détermine par un examen microscopique. EXEMPLE 3 On effectue l'essai suivant pour démontrer la stérilisation par le glutaraldéhyde de milieux de production utilisés pour la prapara- tion d'alcool éthylique par fermentation anaérobie et pour obtenir un élément de comparaison avec les résultats obtenus avec une stérilisation par la vapeur d t eau. On utilise deux fermenteurs de 4 litres dans chacun desquels on introduit 2000 cm3 d'eau distillée et 500 g de mélasse de betteraves (Minnesota Beet Molasses). On autoclave le fermenteur n01 à la vapeur d'eau à 121 C et sous une pression de vapeur de 1 kg/cm2 au manomètre pendant 15 minutes. Le pH du milieu dans le fermenteur est ensuite amené à 4,9 à l'aide d'acide lactique. On introduit dans le fermenteur n02 5 g d'une solution aqueuse de glutaraldéhyde à 25% en poids, à un pH de 5,6 et à une température re de 250C. Au bout de 20 minutes, on amène le pH à 7,0 à l'aide de 8 cm3 d'une solution d'hydroxyde d'ammonium à 30 ,0 en poids, et on maintient ce pH pendant une heure. On amène ensuite le pH à 4,9 à 1' aide d'acide lactique. On inocule les fermenteurs n0 1 et n02 avec 2 g de Saccharomyces cerevisiae (Wine Arts Company) sec et on effectue les fermentations à 250C On détermine la teneur en alcool éthylique des bouillons par chromatographie gazeuse, obtenant ainsi les résultats suivants: Pourcentage d'éthanol en volume (+ 0,1%) Temps Fermenteur Fermenteur (heures) n 1 n02 O o 0 12 1,1 1,4 24 4,6 4,8 48 6,0 5,8 EXEMPLE 4 Cet exemple illustre la stérilisation par le glutaraldehyde des milieux de production utilisés pour la préparation de gomme de xanthane et pour obtenir un élément de comparaison avec les résultats obtenus lorsqu'on stérilise à la vapeur d'eau.Cet exemple illustre en outre l'effet obtenu lorsqu'on élève simplement le pH du milieu de culture au-dessus de 6,5 après la stérilisation, mais sans introduire de composé azoté dans le milieu afin d'inactiver le glutaraldéhyde (fermenteur n02). On utilise 3 fermenteurs de 14 litres dans chacun desquels on introduit le milieu de production de gomme de xanthane suivant: Constituants Quantité (q) Extrait de levure 24 Extrait de malt 24 Bacto peptone 40 Glucose 160 Eau distillée 8000 On stérilise le fermenteur n0l à la vapeur d'eau à 121 C et sous une pression manométrique de 1 kg/cm2 pendant 20 minutes. On amène le pH du milieu à 7,0 par addition d'hydroxyde de sodium. On stérilise le fermenteur n02 à 290C par addition de 30 g d'une solution aqueuse de glutaraldéhyde à 25ó en poids, en ajustant le pH à 5,5. On maintient le pH à 5,5 pendant une heure. Puis on amène le pH à 7,0 a' l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium 5N, et on maintient à pH constant pendant 2 heures. On stérilise le fermenteur n03 à 29 C par addition de 32 g d' une solution de glutaraldéhyde à 25% en poids, en ajustant le pH à 5,5. On maintient le pH à 5,5 pendant une heure. On amène ensuite le pH à 7,0 à l'aide d'environ 8 cm3 d'une solution dthydroxyde d'ammonium à 30 en poids, et on maintient à pH constant pendant 2 heures. On inocule chacun des 3 fermenteurs à l'aide de 1000 cm3 de milieu d'ensemencement contenant des cultures pures de Xanthamonas campestris (N.R.R.L. 1492A) et on effectue les fermentations à 290C avec un débit d'air égal à 4000 cm3/minute et une vitesse d'agitation de 300 tours/minute. Immédiatement après inoculation, la teneur en oxygène dissous du bouillon dans chaque fermenteur tombe à environ 92% de la saturation, indiquant la prolifération de Xanthamonas camPsStris. Au bout de 15 minutes, la teneur en oxygène dissous du fermenteur n02 est de l0,, ce qui indique que les propriétés biocides du glutaraldéhyde sont toujours présentes, du fait qu'on n'a ajouté ni composé d'ammonium ni composé azoté au milieu pour effectuer l'inactivation. La teneur en oxygène dissous du fermenteur n02 reste à 100 tout au long des 48 heures de fermentation, et on ne remarque pas de modification de la viscosité. La teneur en oxygène dissous des fermenteurs n01 et n03 continue à tomber, et devient voisine d'une saturation de 0% en 12 heures. On ajuste la vitesse d'agitation de ces fermenteurs à 500 tours/minute afin de maintenir une teneur en oxygène dissous d'environ 20 à 30%. La viscosité des bouillons dans les fermenteurs n01 et n03 continue à croître tout au long des 48 heures suivantes et, à la fin des fermentations, les bouillons sont essentiellement top visqueux pour s'écouler. L'examen microscopique des fluides extrêmement visqueux dans les fermenteurs n0l et n03 indique que les cultures contiennent principalement l'organisme Xanthamonas campestris. L'examen microscopique du liquide basse viscosité dans le fermenteur n02 indique la présence d'une très faible population de cet organisme. REVENDICATIONS 1. Procédé de stérilisation d'un milieu microbiologique à utiliser en fermentation microbienne, caractérisé en ce que: (1) on met le milieu en contact avec du glutaraldéhyde afin d'obtenir le degré souhaité de pureté microbiologique; (2) on ajuste le pH du milieu stérilisé obtenu au stade (1) à une valeur supérieure à 6,5 environ, et (3) on met le milieu stérilisé en contact avec une quantité suffisante d'au moins un composé azoté choisi parmi l'ammoniac, les amines primaires, les amines secondaires, les amines hétérocycliques, les urées et les amides, afin d'inactiver le glutaraldéhyde, obtenant ainsi un milieu microbiologique stérilisé pouvant être inoculé avec le microorganisme souhaité, aux fins de fermentation. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le composé azoté est l'ammoniac. 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on maintient le pH du milieu à une valeur inférieur à environ 6,5 au cours de la sterilisation par le glutaraldéyde. 4. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce qu'on maintient le pH du-milieu à une valeur d'environ 5 à 6. 5. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on maintient le pH du milieu stérilisé à une valeur d'environ 7 a 9 au cours de l'inactivation effectuée à l'aide du composé azoté. 6. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le composé azoté est formé in situ à partir d'un composé d'ammonium covalent coordiné introduit dans le milieu. 7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que le composé covalent coordiné est l'hydroxyde d'ammonium. 8. Procédé de préparation de Pénicilline-G par fermentation en culture submergée suivant lequel le milieu microbiologique est stérilisé avant d'être inoculé avec le microorganisme souhaité pour la fermentation, caractérisé en ce qu'on stérilise le milieu microbiologique par un procédé suivant la revendication 1. 9. Procédé de préparation de Céphalosporine C par fermentation en culture submergée suivant lequel le milieu microbiologique est stérilisé avant d'être inoculé avec le microorganisme souhaité pour la fermentation, caractérisé en ce qu'on stérilise le milieu microbiologique par un procédé suivant la revendication 1. 10. Procédé de préparation d'alcoot éthylique par fermentation en culture submergée, suivant lequel le milieu microbiologique est stérilisé avant d'être inoculé avec le microorganisme souhaité pour la fermentation, caractérisé en ce qu'on stérilise le milieu microbiologique par un procédé suivant la revendication 1. 11. Procédé de préparation de gomme de xanthane par fermentation en culture submergée, suivant lequel le milieu-microbiologique est stérilisé avant d'être inoculé avec le microorganisme souhaité pour la fermentation, caractérisé en ce qu'on stérilise le milieu microbiologique par un procédé suivant la revendication 1.