Brevet FR2403559A1 — publié le 19790413

La présente invention a pour objet un nouveau réactif biologique utilisable dans le dosage de divers produits physiologiques, sa préparation et son application. Plusieurs auteurs ont déjà décrit qu'une incubation d'une suspens ion de globules rouges avec une solution de gangliosides GMî permet de coupler une certaine quantité de ce ganglioside sur la membrane de ces hématies ; voir par exemple YOKOYAMA M. TRAMS E.G. - BRADY R.O Immunochemical studies with gangliosides., Journal of Immunology (1963), 90, A, 372-380 ;CUATRECASAS P. Gangliosides and membrane receptors for cholera toxin, Biochemistry (1973), 12, 18, 3558-3566 ; KING C.A - VAN HEYNINGEN W.E GASCOYNE N. Aspects of the interaction of vibrio cholerae toxin with the pigeon cell membranes, The Journal of Infectious diseases (1976) , 133 S, 75, 81. Cependant aucun auteur n'a cherché à obtenir des phénomènes d'agglutination spécifique de ces globules rouges en présence de toxine cholérique. La société demanderesse a d'ailleurs constaté qu'il était impossible d'observer les phénomènes d'agglutination attendus avec des hématies sur lesquelles on a fixé du ganglioside G selon les méthodes décrites par les auteurs cités ci-dessus. La société demanderesse a maintenant découvert un procédé permettant de fixer du ganglioside GMl à la surface hématies de façon à réaliser un réactif utilisable dans des réactions d'hémagglutination. On a aussi déjà décrit un test d'hémagglutination passive pour le dosage de la toxine cholérique et des anticorps corres pondants -; voir FINKELSTEIN R.A - PETERSON J.W. In vitro detection of antibody to cholera enterotoxin in cholera patients and laboratory animals, Infection and Immunity (1970), 1, 1, 21-29. Le réactif préparé selon la méthode de FINKELSTEIN consiste en des hématies sur lesquelles on a fixe du choléragène ou du choleragenoide On sait que le choléragène peut être transformé soit naturellement, soit sous l'action de la chaleur, en choléra genoide non pathogène. Ce réactif de FINKELSTEIN est utilisé pour doser la toxine cholérique en utilisant la méthode d'inhibition d'hémagglutination. Le réactif préparé selon la méthode de FINKELSTEIN nécessite de-disposer de choléragène ou de choléragé noise à l'état pur ou très purifié, de telle sorte que l'utilisation de ce réactif apparaît difficile à l'heure actuelle.En outre, le réactif préparé selon la méthode de FINKELSTEIN ne peut être conservé que pendant une seule journée et est impropre à l'utilisation par des personnes non spécialisées. En revanche, le réactif préparé selon la présente invention est stable pendant au moins un an à +40C. Il peut être lyophilisé si nécessaire, ne nécessite qu'une quantité faible et peu onéreuse d'une solution brute de gangliosides, ne nécessite pas de disposer de toxine purifiée, et permet de doser non seulement la toxine et son anticorps spécifique, mais aussi de doser le ganglioside G1 ou ses dérivés. Enfin, la sensibilité du réactif de la présente invention permet des dosages de toxines cholériques à des concentrations de l'ordre de quelques nanogrammes/ml qui ne peuvent pas être détectées par le réactif de FINKELSTEIN. La société demanderesse a découvert qu'il est possible de fixer du ganglioside GM1 ou un de ses dérivés sur des hématies à condition de traiter préalablement celles-ci avec un dérivé carbonylé. D'une façon genérale, l'invention consiste à fixer sur des hématies du ganglioside GM1 ou tout autre ganglioside ou dérivé de ganglioside qui, ainsi fixé sur les hématies, constitue un réactif susceptible d'être agglutiné par la toxine cholérique. On notera que tous les gangliosides ou dérivés de gangliosides utilisables sont englobés, par convention, par les expressions "ganglioside GMl ou l'un de ses dérivés" ou "ganglioside G1" utilisées ci-après. La présente invention a donc pour objet un nouveau réactif biologique caractérisé par le fait qu'il comprend du ganglioside GM1 ou ltun de ses dérivés, fixé sur des hématies préalablement traitées avec un dérivé carbonylé. Le dérivé carbonylé est de préférence le fcrmol ou le glutaraldéhyde. Parmi les dérivés du ganglioside GM1 utlisables dans le réactif de l'invention, on peut citer notamment le lysoganglioside GM1. On sait que le lysoganglioside GMl est un dérivé du ganglioside GMI obtenu par hydrolyse alcaline des trois groupements amides du ganglioside GM1 qui sont transformés en groupements amine primaire, selon le procédé décrit par HOLMGREN; MANSSON et SVENNERHOLM, Medical Biology (1974), 52, 229-233. Le produit ainsi obtenu possède trois fonctions NH2 par molécule. On peut citer également les produits résultant de l'hydrolyse partielle des groupements amide du ganglioside GM1. L'invention a également pour objet procédé de préparation du réactif decrit ci-dessus. Ce procédé consiste à faire réagir une suspension de globules rouges dans de l'eau physiologique avec un dérivé carbonylé, par exemple avec une solution dans l'eau physiologique du dérivé carbonylé. On met ensuite en contact les hématies ainsi traitées. avec une solution de ganglioside GM1 (ou d'un de ses dérivés). On met ensuite en contact, si désiré, le réactif obtenu avec une solution contenant une quantité infraagglutinante de toxine cho lérique. On rappelle que l'on désigne par "eau physiologique" une solution aqueuse de pH sensiblement neutre contenant 9 g/l environ de chlorure de sodium. De préférence, on laisse en contact les hématies avec le drivé carbonylé pendant 15 minutes à 15 heures à la température pouvant varier de 0 à 60 C. Les hématies ainsi traitées sont ensuite lavées à l'eau distillée puis amenées en solution dans l'eau physiologique. La quantité de dérivé carbonylé varie généralement de 0,01 à 20 g pour 100 ml de suspension d'hématies. Pour fixer le ganglioside GM1 on ajoute à pH supérieur ou égal à 8 une solution de ganglioside à une suspension d'hématies ainsi traitées. Il convient de remarquer qu'il n'est pas nécessaire de préparer de solutions de ganglioside GM1 pur car la contamination de ces solutions par d'autres gangliosides comme le Gela, le GDlb ou le GT1 , n'est pas gênante pour l'utilisation dans la sérologie relative au choléra. De préférence, pour fixer le ganglioside GM1 on opère à un pH voisin de 13. La température d'incubation peut être comprise entre 0 et 600C ; elle est de préférence de 450C environ. Le temps d'incuba- tion est généralement au moins égal à 1 h et est de préférence égal à 15 h environ. La suspension est ensuite centrifugée et le culot de- centri- fugation est lavé et mis en suspension dans l'eau physiologique. Pour fixer le lysoganglioside GM1 sur les hématies on opère de préférence de la façon suivante A la suspension de globules rouges ayant subi le traitement avec le dérivé carbonylé on ajoute une solution de lysoganglioside GM1 à pH supérieur à 5 et de préférence voisin de la neutralité. De préférence, on laisse incuber à température pouvant varier de 0 à 6-00C pendant un temps pouvant varier de 30 mn à 3 h environ. On soumet ensuite la suspension à une centrifugation et recueille le culot de centrifugation que l'on lave et que l'on met en suspension dans l'eau physiologique. Il a été observé qu'il est possible de préparer avec du lysoganglioside G fixe sur des hématies fraiches, un réactif qui permet d'obtenir des phénomènes d'agglutination spécifiques avec la toxine cholérique contenue dans un filtrat de culture de vibrions. Toutefois, on constate des phénomènes fréquents d'hémo- lyse surtout pour de fortes doses de lysogangliosides. Pour cette raison, il est préférable d'améliorer le réactif, comme décrit ci-dessus, en prétraitant les globules rouges par le dérivé carbonylé de manière à les rendre insensibles à toute influence hémolytique. Il a été vérifié que les fonctions aldéhyde présentes sur les globules rouges qui ont été traitées par le glutaraldéhyde n'intérviennent pas dans la réaction de fixation du ganglioside. En effet, on a découvert de façon surprenante que si on effectue une neutralisation chimique préalable de ces fonctions aldéhydes par addition d'une solution de glycocolle à 20g/l à pH compris entre 7 et 11, ce traitement ne gène en rien la fixation ultérieure du ganglioside à pH alcalin. Le réactif de la présente invention peut être préparé avec des hématies d'origine quelconque, par exemple des hématies humaines des hématies de mouton, de singe, de lapin , de chien, de chèvre, de vache, de cheval; de poule,de pigeon, d'oie, etc Le réactif de l'invention est constitué soit par le réactif décrit ci-dessus, constitué par du ganglioside GMI ( ou l'un de ses dérivés) fixé sur des globules rouges (préalablement traités), et désigné ci-après par "GR - GM", soit par le réactif constitué par du ganglioside GMî (ou l'un de ses dérivés) fixé sur des globules rouges, et sur lequel se trouve fixée en outre une quantité infraagglutinante de toxine cholérique. Ce dernier réactif est appelé ci-après "GR-GM1-Tox". Dans ce qui suit, l'expression "le réactif biologique de l'invention" désigne l'un ou l'autre de ces deux réactifs. Pour préparer le réactif GR-GMl-Tox, on met en contact le réactif GR-GM1 avec une solution contenant une quantité infraagglutinante de toxine cholérique. On laisse en contact par exemple pendant quelques minutes à température ambiante. La présente invention a également pour objet l'application du réactif biologique de l'invention en sérologie. Cette application, qui permet de réaliser divers dosages de produits biologiques, est de façon générale caractérisée par le fait que l'on met en contact une suspension contenant le réactif biologique de l'invention avec diverses dilutions d'une solution du produit à doser qui est soit un produit susceptible de provoquer une hémagglutination dudit réactif, soit un produit susceptible d'inhiber l'hémagglutination dudit réactif et dans ce dernier cas, ces diverses dilutions contiennent en outre une quantité fixe d'un produit agglutinant, et que l'on observe ensuite la présence ou l'absence d'une réaction d'hémagglutination. On en déduit le titre par comparaison avec des dilutions d'une solution étalon. Bien entendu, le réactif de l'invention est ajouté sous forme de suspension aqueuse, en quantité constante, et à volume constant, à un volume donne (pour toutes les dilutions) de la solution du produit a doser. Selon un premier mode de réalisation de cette application, on peut par exemple doser le choléragène ou le choléragénolde par hémagglutination directe en ajoutant le réactif de l'invention GR-GM1 à diverses dilutions de la solution à doser, éventuellement en présence d'anticorps anti-toxine cholériques. Lorsqu'on opère en présence d'anticorps, ceux-ci sont ajoutés en quantité constante à chacune des dilutions du produit à doser. Pour mettre en oeuvre le procédé de dosage du choléragène ou du choléragénoide par hémagglutination directe, il convient bien entendu de connaitre d'abord la sensibilité de la méthode en opérant avec une solution étalon de toxine purifiée. Comme cela sera indiqué dans la partie expérimentale, la méthode de dosage par hemagglutination directe permet de déceler des concentrations de l'ordre de 0,2 Ug/ml en choléragène ou choléragénol-de. La sensibilité de la méthode de dosage du choléragène et du choléragénoîde par hémagglutination directe peut être notablement améliorée si l'on opère en présence d'anticorps anti-toxine cholérique. Pour cela, il convient d'ajouter avant ou après l'addition du réactif GR-GM1 à la solution à doser une solution d'anticorps anti-toxine cholérique. On laisse incuber pendant un temps pouvant varier de 5 minutes à 60 minutes ou davantage, à une température de 0-600C. On constate que les anticorps ne provoquent pas le phénomène d'inhibition de l'hémagglutination que l'on pouvait redouter à priori, mais en outre on constate que la sensibilité de la méthode est multipliée par un facteur allant de 25 à 100. La quantité d'anticorps ajoutés n'est pas déterminante, sauf aux doses très élevées ou il peut y avoir une légère inhibition, comme indiqué ci-après au paragraphe 5.5.On peut indiquer, à titre illustratif uniquement que lorsqu'on opère en présence d'anticorps ceux-ci peuvent être présents par exemple à raison de 1 à 1000 unités agglutinantes, pour le réactif GR-GM1-Tox. Mais en fait on peut ajouter toute quantité d'anticorps inférieure à la quantité élevée qui provoque une légère inhibition. Selon un deuxième mode de réalisation de cette application, on peut doser les anticorps anti-choléragène ou anti-choléragénol- de. On a, à ce propos, découvert comme indiqué ci-dessus, que ces anticorps n'inhibent pas l'agglutination du réactif GR-GM1 par la toxine cholérique. On a par contre découvert qu'en ajoutant au réactif GR-G1 une quantité infraagglutinante de toxine cholérique, le réactif obtenu (GR-GM1-Tox) donne alors avéc les anticorps anti-choléragène ou anti-choléragénoïde, une réaction d'hémagglutination. De préf é- rence, la dose infraagglutinante de toxine utilisée varie de 1/2 à 1/100 de la dose agglutinante minimale. Pour doser les anticorps selon ce deuxième mode de réalisation, on ajoute au réactif GR-GM1 une quantité infraagglutinante de toxine cholérique, puis on ajoute une quantité constante dudit réactif ainsi modifié à diverses dilutions de la solution d 'anti- corps à doser, on observe la présence ou l'absence d'une réaction d'hémagglutination et on en déduit le titre par comparaison avec les dilutions d'une solution étalon. Bien entendu pour mettre en oeuvre le dosage des anticorps selon ce deuxième mode de réalisation, il convient de connaitre d'abord la sensibilité de la méthode en opérant avec diverses dilutions d'une solution étalon d'anticorps anti-texine cholérique, et on repère qu'elle est la plus grande dilution qui permet d'observer une agglutination. Selon un troisième mode de réalisation de l'application du réactif de l'invention il est possible de doser le ganglioside GM1 ou ses dérivés meme parmi d'autres gangliosides n'ayant pas d'affinité pour la toxine cholérique. Pour cela, on ajoute, à des volumes constants de diverses dilutions de la solution à titrer une quantité constante, 2 volume également constant, de toxine cho lérique. Cette quantité constante de toxine cholérique doit être suffisante pour pouvoir provoquer (en l'absence d'inhibiteur3 une réaction d'agglutination du réactif de l'invention.Il convient de noter toutefois que plus la dose de toxine ajoutée est faible, plus la sensibilité de la détection du ganglioside G1 par le présent test est élevée. I1 convient donc de préférence d'ajouter à chaque dilution de la solution à doser une quantité de toxine aussi faible que possible, de préférence égale ou très légèrement supérieure à la dose minimale agglutinante. On ajoute ensuite le réactif GR-GM1. On repère alors à partir de quelle dilution de la solution de gangliosides il n'y a plus d'inhibition de l'hémagglutination du réactif par la toxine.Bien entendu, pour pouvoir utiliser ce dosage il faut d'abord connaitre la sensibilité de la méthode en opérant avec diverses dilutions d'une solution de titre connu en ganglioside G On observe alors quelle- est la plus grande dilution de la solution étalon de ganglioside GMl pour laquelle il n'y a plus inhibition de l'agglutination du réactif par la toxine. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE 1 - Traitement des hématies par le formol Des hématies de mouton sont lavées 4 fois en eau physiologique (pH 7,2 - Na Cl 9 g/l) de façon à obtenir un surnageant de lavage final parfaitement clair. Les hématies sont amenées à une concentration de 8 e en eau physiologique et additionnées d'un volume égal d'une solution de formaldéhyde à 3 % en eau physiologique. Après une incubation de 18 h à 37"C, les hématies formolées sont lavées quatre fois en eau distillée, puis amenées à 10 v en eau physiologique. EXEMPLE 2 - Traitement des hématies par le glutaraldéhyde Des hématies de mouton sont lavées 4 fois en eau physiolo gique puis amenées à une concentration de 10 % et enfin addi tonnées d'un volume 20 fois plus faible de glutaraldéhyde à 5% en eau physiologique pH 7,2. Après un temps d'incubation de 2 h à température ambiante, les hématies glutaraldéhydées sont lavées en eau distillée,puis amenées à 10 % en eau physiologique. EXEMPLE 3 - Fixation du ganglioside GM1 sur les hématies préalablement traitées avec un dérivé carbonylé Les globules rouges formolés ou glutaraldéhydés obtenus aux exemples précédents sont lavés par une solution de NaOH 0,1 N ou de toute autre solution basique de pH alcalin #8 et de préférence égal à 13. Un volume de cette suspension à 10% est incubé avec 1 volume d'une solution de ganglioside contenant du ganglioside GMl dans la soude 0,1 N contenant 100 pg d'acide sialique par ml. La température d'incubation peut être comprise entre O et 600C mais est de préférence ajustée à 450C. Le temps de contact est maintenu pendant plus d'une heure de préférence pendant 15 h. La suspension est alors centrifugée, le dosage d'acide sialique dans le surnageant permet d'estimer le pourcentage de fixation du ganglioside sur les globules rouges à environ 50%. Après 3 lavages à l'eau physiologique, la suspension finale est reprise et conservée à une concentration de 10 %. Le réactif est alors prêt à l'emploi pour les tests sérologiques décrits plus loin. EXEMPLE 4 - Fixation du lysoganglioside GM1 sur des hématies préalablement traitées avec un dérivé carbonylé Une suspension de globules rouges formolés ou glutaral déhydês à 10 %, préparée comme dans les exemples 1 ou 2 est addi tionnée de 2 mg de poudre lyophilisée de lysoganglioside GMî Une quantité de 0,1 à 10 mg donne également des résultats satisfaisants. Le pH d'incubation est de 7,2 mais peut évidemment aussi être alcalin comme dans la méthode précédente. Le temps d'incubation est de 30 mn à 3 h. La température d'incubation peut varier de 0 à 600C mais a été choisie égale à 37 C. Après centrifugation, le surnageant de couplage ne contient plus que 1 à 5 % du lysoganglioside initial, ce qui montre l'efficacité de cette méthode de fixation. Enfin, apres 3 lavages en eau physiolcgique, la suspension finale est reprist et conservée à une concentration de 10%. Le réactif est alors prêt à l'emploi pour les tests sérologiques. Le lysoganglioside GM1 utilisé comme prcduit de départ est préparé par hydrolyse alcaline selon le procédé décrit par HOLMGREN, MANSSON et SVENNERHOLM, Medical Biolcgy (1974). 52. 229-233. Le produit obtenu, qui possède trois fonctions MH2 par molécule, est appelé lyscganglioside. EXEMPLE 5 - Applications sérologiques du réactif de l'invention 5.1 - Détails c constants Dans ce qui suit nous désignerons par GR -GM1 les hématies revêtues de ganglioside GM1 ou de lyscganglioside GM1 indiffé remment. Les titrages en hémagglutination directe ou en inhibition d'hémagglutination s'effectuent de manière classique dans des microplaques commercialisées sous l'appellation dde marque "MICROTITER" contenant chacune 8 rangées de 12 cupules à fonds coniques en V, La solution à doser est diluée de 2 en 2 dans le tampon de dilution choisi, sous un volume de 50 1. Le réactif est amené à une concentration de 0,125 % en eau physiologique contenant 3 mg/ml d'albumine bovine à pH 7,2. Un volume de 50 pl est additionné dans chacune des cupules. Après les temps d'incubation nécessaires à la réaction, les microplaques sont centrifugées par exemple pendant 1 mn à 1000 t/mn puis inclinées à 60 sur un portoir oblique approprié. La lecture de l'agglutination ou de l'absence d'agglutima- tion peut alors se faire très rapidement. Si les hématies sont agglutinées, la pastille déposée au. fond (culot de centrifugation) n'évoluera pas, même après 1 heure d'inclinaison. Si les hématies ne sont pas agglutinées, au contraire la pastille déposée au fond du ne de la cupule coulera doucement dès les premières minutes et glissera en moins de 30 mn en prenant une forme caractéristique en accent circonflexe. Les agglutinations partielles donnent des formes intermédiaires faciles à différencier. Cette méthode de lecture nécessite une centrifugation nais est ainsi beaucoup plus rapide et beaucoup plus précise que les méthodes classiques de lecture faisant appel à la sédimentation naturelle des hématies. Toutefois l'utilisation de cette dernière méthode est possible, mais dans ce cas l'emploi d'hématies nucléées d'oiseaux, sédimentant en moins de 1 heure, est conseille . 5.2 - Première méthode de dosage du choléragène et du choléragénoïde par hémagglutination directe En incubant 1h a 20 C des dilutions de filtrat de culture de vibrions cholériques, ou des dilutions de toxine cholérique purifiée, avec des GR-GM1' une agglutinatinri spécifique est visible pour des concentrations supérieures ou égales a 0,2 pg/ml de choléragène ou choléragénoïdde.En effet, une solution étalon de toxine purifiée (provenant de la firme SCHWARTZMAN) ajustée a une concentration de 9 mg/ml, donne un titre hémagglutinant de 1/5000. Comme le dosage utilise 50 ul, on peut dire que cette technique permet de déceler une quantité minimale de 0,01 'Rg de choléragène ou choléragénoide par cupule a de dosage. Grâce a cet étalonnage, on peut en déduire la concentra- tion de ces es antigènes dans des filtrats de culture de vibrions cholériques. L'indication obtenue est précieuse puisqu'elle permet d'avoir presque instantanément, å pu de frais, sans moyens sophistiqués, une information qui permet de déduire la qualité de la toxine brute produite cu de s'orienter vers d'autres conditions de culture. Nous avons constamme noté une corrélation très satisfaisante entre les titres donnés par le test de CRAIG des "blueing doses sur cobayes ou lapins et les titres obtenus avec le réactif précédent. En particulier pour différentes préparations brutes et fraiches de toxine cholérique, c'est-à-dire différents filtrats de culture, les concentrations minimales visibles au teste de CRAIG (réputé le plus sensible de tous) ont été regu- lièrement de 20 à 519 fois inférieurs aux concentrations minimales décelables en hémagglutination avec le réactif précédent.Cette constante proportionnelle était indépendante de la richesse en toxine du filtrat de culture. Cependant, le test d'he-magglutina- tion est sensible a la fois au choléragène toxique et au choléra- génoïde non toxique. Or les tests biologiques de dosage ne sont sensibles qu'au choléragène. De ce fait pour des préparations inactivées par chauffage 1 h a 56CC ou anormalement riches en choleragenolde, il y aurait absence de corrélation entre les deux tests. En effet, l'inactivation biologique de la toxine qui annule la réponse du test de CRAIG, ne modifie en rien le titre hémagglutinant avec le réactif utilisé. Cette remarque est très importante car elle souligne l'intérêt du réactif qui permet un contrôle de la qualité d'une préparation purifiée, même après inactivation. Bien que cette méthode soit moins sensible que le test de Craig, il faut remarquer que les informations obtenues avec ce réactif sont très rapides et suffisantes dans la plupart des cas. En outre, la sensibilité de ce test peut être améliorée comme cela sera décrit plus loin. 5.3 - Deuxième méthode de dosage du choléragène et du choléragénolde par hémagglutination directe en présence d'anticorps anticholéragène Dans la technique de dosage décrite au paragraphe 5.2, il suffit d'ajouter avant ou après l'addition des 50 ijl de GR-GM1, 50 iil d'une solution d'anticorps antitoxine cholérique contenant 10 unités d'hémagglutinantes pour le réactif GR-GMl-Tox. Si lton adopte un temps d'incubation de 30 mn à 200C, on constate alors dans la lecture du test d'hémagglutination final, que la toxine cholérique agglutine toujours les GR-GM1 (il n'y a donc pas de phénomène d'inhibition que l'on pouvait craindre à priori), mais que la sensibilité du test est multipliée de manière systématique par un facteur constant d'environ 50. Le tableau récapitulatif suivant compare les titres (facteurs de dilution) obtenus par ces deux techniques et les titres du test de CRAIG pour différentes préparations de toxine. On voit notamment que cette deuxième technique donne des titres du même ordre que ceux donnés par le test de CRAIG; réputé très sensible. TABLEAU RECAP ITULAT IF Toxine Test de CRAIG Test HA (Hémagglu- Test HA avec lot N (#) tination) normal anticorps 1 > 1000 128 6400 à 12 800 2 20 a 100 4 à 8 400 3 500 1000 16 800 4 500 & 1000 16 800 5 2500 | 128 6400 6 400 000 | 5000 200 000 () dilution donnant une tache bleue de 6 à 8 mm de diamètre. 5.4 - Méthode de dosage du ganglioside GM1 ou de ses dérivés doués d'affinité pour la toxine cholérique par inhibition d'hémagglutination 5.4.1 - Les figures dhémagglutination observées entre les GR-GM1 et la toxine cholérique sont spécifiquement inhibées en présence de ganglioside GM1 ou de lysoganglioside GM1. Cela confirme bien que c'est grâce au ganglioside GM1 présent sur la membrane des globules rouges que le choléragène ou le choléragénoide agglutine les GR-GM1. D'autres expériences montrent que la toxine cholérique n'agglutine pas du tout des hématies franches, ou formolées, ou glutaraldéhydées, non traitées Dar les diverses solutions de ganglioside. Enfin, il a été constaté que seul le ganglioside GM1 ou ses dérivés proches (lyso GM1) étaient capables de cette inhibition spécifique. Les autres gangliosides et en particulier le GD le GDlb, le GT1 n'ont pas d'effet inhibiteur. Cette inhibition spécifique permet en outre le dosage très rapide, très sensible et très spécifique du ganglioside GMl ou de ses dérivés doués d'affinité pour la toxine cholérique. 5.4.2 - Comme l'indique le paragraphe précédent, le ganglioside GM1 ou le lysoganglioside GM1 est capable d'inhiber les figures d'hémagglutination entre la toxine cholérique et les GR-GM1. Cela permet un dosage spécifique du ganglioside GM1 au sein d'une population d'autres types de gangliosides, d'une manière très simple et très rapide. La solution de GM1 à titrer est diluée de 2 en 2 sous un volume de 50 1. 2 unités agglutinantes de toxine sont ajoutées sous un volume de 50 l. Après une incubation de 10 mn à température ambiante, le réactif GR-GM1 est ajouté sous un volume de 50 l et la lecture se fait de la manière habituelle. La sensibilité de cette méthode permet de détecter le ganglioside r3Ml jusqu'S une concentration de 50 à -100 g/ml. Cette méthode permet également un dosage très rapide de l'activité neutralisant la toxine cholérique, après diverses transformations chimiques du ganglioside GMl et d'apprécier ainsi la part de telle ou telle configuration chimique dans cette affinité. 5.5 - Méthode de dosage des anticorps anti-oholéragène ou anti -c hol éragénoîde Ces anticorps ont en commun de reconnaitre la chaine polypeptidique de type B présente dans le choléragène et le choléragénoide. Avec ces anticorps comme avec le ganglioside GM1, on devrait pouvoir observer une inhibition des figures d'agglutination obtenues entre la toxine cholérique et les GR-G1. Or, il a été observé que, de façon surprenante, il n'y a pas dans ce cas de phénomène d'inhibition. Toutefois pour des concentrations très fortes d'anticorps (sérum hyperimmum non dilué ou dilué au 1/10) une inhibition légère pouvait être obtenue. Le dosage de ces anticorps ne pouvant pas être relisé par la technique d'inhibition de l'hémagglutination, la technique suivante a alors été imaginée. Un volume de GR-GM1 est incubé quelques minutes avec un volume égal d'une dilution de toxine cholérique (filtrat de culture) 10 fois plus faible que la dernière dilution capable d'agglutiner spécifiquement les GR-GM1, c'est-à-dire avec une dose infraagglutinante. Par exemple, si le titre (en dosage par hémagglutination) de la toxine est de 1/128, la dilution de toxine choisie sera de 1/1280. Dans ces conditions la suspension de GRGMî n'est pas du tout agglutinée et se conserve très bien. De plus, une très faible quantité de toxine se trouve sur certains sites occupés par le GM1. On a ainsi "sensibilisé" les GR-GM1 avec une quantité infini tésimale de toxine (sans avoir eu besoin de toxine purifiée) et on prépare ainsi un nouveau réactif que l'on peut nommer par abréviation : GR - G - Tox. Il est alors facile de montrer qu'une solution d'anticorps anti-toxine cholérique agglutine le réactif GR-GMl-Tox et n'agglutine pas du tout le réactif GR-Gml. On peut donc doser ces anticorps par hémagglutination directe du réactif GR-GM1-Tox selon les techniques usuelles analogues à celles décrites ci-dessus. Par cette technique de dosage les titres d'anticorps antitoxine cholérique chez des animaux immunisés avec de la toxine purifiée varient de 1/5000 à 1/100.000. La sensibilité de cette méthode est environ 1000 fois plus grande que celle de la technique d'immunodiffusion double. REVENDICATIONS 1. Réactif biologique, caractérisé par le fait qu'il comprend des hématies traitees avec un dérivé carbonylé, sur lesquelles se trouve fixé du ganglioside G ou l'un de ses dérivés, et sur lequel se trouve éventuellement furie en outre une quantité infraagglutinante de toxine cholérique. 2. Réactif selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le dérivé carbonylé est le formol ou le glutaraldéhyde. 3. Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que le dérivé du ganglioside GM1 est le lysoganglioside G Ml 4. Réactif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il est constitué par des hématies préalablement traitées avec un dérivé carbonylé, sur lesquelles se trouve fixé du ganglioside G ou l'un de ses dérivés. 5. Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3,caractérisé par le fait qu'il est constitué par des hématies préalablement traitées avec un dérivé carbonylé, sur lesquelles se trouve fixé du ganglioside G ou l'un de ses dérivés, et sur lequel se trouve fixée en outre une quantité infraagglutinante de toxine cholérique. 6. Procédé de préparation du réactif tel que défini dans l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on fait réagir une suspension de globules rouges dans de l'eau physiologique avec un dérivé carbonylé, on lave pour éliminer l'excès de dérivé carbonylé puis ajoute à la suspension d'hématies traitées une solution contenant le ganglioside ou l'un de ses dérivés, puis que l'on met en contact si désiré,le réactif obtenu avec une solution d'une quantité infraagglutinante de toxine. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que pour fixer du ganglioside GMl on ajoute, à pH supérieur ou égal à 8, une solution de ganglioside contenant du ganglioside G 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que l'on fixe le ganglioside GM1 à pH voisin de 13. 9. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que, le dérivé du ganglioside est le lysoganglioside GM1 et que pour fixer le lysoganglioside G sur les hématies, on ajoute, à pH su--érieur à 5, la solution de lysoganglioside GM1. 10. Application du réactif décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée par le fait que l'on met en contact une suspension contenant ledit réactif avec diverses dilutions d'une solution du produit à doser qui est soit un produit susceptible de provoquer une hémagglutination dudit réactif, soit un produit suscep tible d'inhiber l'hémagglutination dudit réactif, et dans ce dernier cas lesdites dilutions contiennent en outre une quantité constante d'un produit agglutinant, puis que l'on observe la présence ou lgab- sence d'une réaction d'hémagglutination, et que l'on détermine le titre du produit à doser par comparaison avec une solution étalon. 11. Application selon la revendication 10, caractérisée par le fait que, pour doser le choléragène ou le choléragênoide par hAmagglu- tination directe, on ajoute des volumes constants du réactif de la revendXcation 5 à diverses dilutions de la solution à doser, éventuel- lement en présence d'anticorps anti-toxine cholérique, et observe la présence ou l'absence d'une reaction dhemagglutinationO 12.Application selon la revendication 10, caractérisée par le fait que pour doser le ganglioside G. ou ses dérivés on ajoute à des volumes constants de diverses dilutions de la solution à titrer une quantité constante, à volume constant, de toxine cholérique, puis on ajoute une quantité constante du réactif biologique et observe à partir de quelle dilution de la solution de ganglioside il n'y a plus inhibition de 1 'hémagglutination du réactif biologique par la toxine. 13. Application selon la revendication 12, caractérisée par le fait que ladite quantité constante de toxine cholérique est une quantité aussi faible que possible mais suffisante pour pouvoir provoquer (en l'absence d'inhibiteur) une réaction d'agglutination du réactif. 14. Application selon la revendication 10, caractérisé par le fait que pour doser les anticorps anticholéragène ou anticholérage-- nolde, on ajoute au réactif GR-GM1 une quantité infraagglutinante de toxine cholérique, puis on ajoute une quantité constante dudit réactif ainsi modifié à diverses dilutions de la solution d'anticorps à doser, on observe la présence ou l'absence d'une réaction d'hemagglutination et on en déduit le titre par comparaison avec les dilutions d'une solution étalon. 15. Application selon la revendication 14, caractérisée par le fait que ladite dose infraagglutinante varie de 1/2 à 1/100 de la dose agglutinante minimale.