Brevet FR2418462A1 — publié le 19790921

L'invention concerne les techniques de dosage utilisées en biochimie, et plus particulièrement celles où il est fait appel a des réactions enzymatiques-. Plus précisément, l'invention a pour objet un procédé de dosage, applicable notamment, bien que non limitativement, au dosage du glucose dans le plasma sanguin, suivant lequel on provoque une réaction enzymatique faisant intervenir un produit a doser, tel que le glucose, en tant que substrat consommable. Les réactions enzymatiques, souvent coupIées en cascades, ont déjà reçu de nombreuses applications dans les techniques de dosage, selon des procédures qui diffèrent suivant qu'il s'agit de doser un enzyme par la mesure d son activité ou de doser un substrat dont la transformation est catalysée par l'enzyme. I1 semble que l'on se soit surtout intéressé aux dosages des enzymes eux-mêmes, qui sont effectués en mesurant la vitesse initiale des réactions en présence de larges excès de substrat, suffisants pour que la vitesse initiale soit pratiquement à la valeur maximale vers laquelle elle tend à la saturation de l'enzyme.Les techniques classiques de dosage des substrats impliquent au contraire qu'on laisse la réaction enzymatique s'effectuer jusqu'à ia consommation totale de substrat pour déterminer la quantité de substrat ainsi transformée. Dans un cas comme dans l'autre, on préfère en général effectuer les mesures d'après la quantité de produit résultant de la transformation du substrat, plutôt que d'après la quantité de substrat disparaissant.On peut avoir recours pour ce faire à tout l'arsenal des procédures de mesure des concentrations, exploitant les propriétés colorimétriques, optiques, thermiques, électriques, ou autres, des produits, mais dans chaque application particulière les p9ssibilités de choix sont en fait réduites compte tenu de la précision et de la sensibilité que l'on demande aux mesures dans les dosages enzymatiques. Dans le cas, par exemple, du glucose, l'hexokinase constitue un enzyme adapté à la mesure, notamment, du taux de glucose dans le plasma. Suivant un procédé connu pour cette mesure, on réalise la réaction de phosphorylation du glucose à partir de l'adenosine-triphosphate (ATP), catalysée par l'hexokinase (HK) : D-glucose + ATP (--) glucose-6-P + ADP, mais les produits résultant de la réaction ne peuvent être directement décelés par distinction avec les produits de départ.Aussi, on couple cette réaction avec une seconde réaction enzymatique, catalysée par la glucose 6-phosphate-déhydrogénase : glucose-6-P + NADP gluconate 6-P + NADPH + et la quantité de NADP transformée en NADPH, aisément accessible par spectrométrie, fournit une mesure indirecte de la quantité de glucose-6-P formée dans la première réaction On conçoit sans peine la complexité de telles mesures qui sont non seulement longues, mais également couteuses, car il faut utiliser des quantités notables de réactifs à prix de revient important. Les réticences que l'on peut éprouver à faire appel à des réactions enzymatiques pour des dosage de substrats, au mépris des impératifs de rapidité et de rentabilité economiques prévalent souvent dans les dosages Jystématiques en série. Dans certaines applications particulieres, comme le dosage de l'urée dans le sang par transformation par l'uréase, on a pu penser se contenter de mesurer la vitesse de la réaction, fonction de la concentration de substrat, sans attendre la transformation complète de celui-ci. Mais il ne s'agit là que de cas très particuliers, alors qu'en général les réactions enzyBatiques utilisées dans les dosages biochimiques ne permettent pas d'obtenir une indication de la concentration de substrat autrement qu'une fois la réaction terminée. La présente invention vise essentiellement à permettre le dosage d'un substrat intervenant dans une réaction enzymatique en observant seulement le début de la réaction. Elle vise également de ce fait à permettre des dosages précis mais rapides, pour un prix qui se trouve réduit aussi bien sur le plan des consommations de réactifs que sur celui du temps de manipulation. Suivant l'invention, le dosage d'un tel substrat en contact avec un enzyme spécifique en présence d'un inhibiteur compétitif en proportion telle que pour les concentrations de substrat à doser, la consommation du substrat dans la réaction enzymatique s'effectue avec une vitessè initiale mesurable, on mesure cette vitesse initiale sur un incrément de temps où elle reste constante, et l'on en déduit après étalonnage la concentration à doser, qui est sensiblement proportionnelle à la vitesse initiale. Dans ce procédé, la présence d'un inhibiteur compétitif, suivant la définition usuelle de cette expression, a pour effet de réduire l'affinité de l'enzyme pour le substrat par le fait que l'inhibiteur se fixe sur des sites actifs de l'enzyme, en compétition avec le substrat, et réduit ainsi le nombre de molécules d'enzyme libre, sans subir lui-même de transformation. I1 est a remarquer que bien qu'il s 'agisse d'augmenter la rapidité des dosages, l'invention procède par diminution de l'activité catalytique de l'enzyme, et non pas par augmentation de la vitesse de réaction comme il aurait été normal de l'envisager. Le procédé selon l'invention s'applique notamment avec avantage aux réactions de dosage enzymatique qui font intervenir l'hexokinase dans la phosphorylation des hexoses, et dans ce cadre, l'invention a également pour objet un milieu réactionnel particu lièrement approprié pour la mise en oeuvre du procédé. Conformément a l'invention, on effectue le dosage des hexoses par la réaction de phosphorylation ?ar l'hexokinase en présence de N-acétyl glucosamine comme inhibiteur compétitif. Le milieu réactionnel contient donc cet inhibiteur, avantageusement à une concentration comprise entre 0,001 et 1 M, en plus des autres constituants qui sont usuels pour ce genre de réaction enzymatique, A savoir principalement l'hexokinase, l'adenosine-tri-phosphate (ATP) ou une coenzyme analogue et un tampon accepteur de protons. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, la vitesse initiale de réaction est mesurée par la variation de là conductivité électrique du milieu réactionnel pendant l'incre- ment de temps considéré. tes méthodes conductimétriques sont déjà utilises dans l'étude cinétique de réactions enzymatiques. Elles présentent l'intérêt, entre autres, de pouvoir être mises en oeuvre dans des conditions de coloration ou de turbidité qui rendent l'emploi des méthodes optiques impossibles, y compris sur des suspensions cellulaires ou sur des membranes naturelles ou synthétiques qui permettent par greffage d'immobiliser l'enzyme dans un milieu solide. Mais la sensibilité des mesures aux conditions opératoires, notamment aux variations même très faibles de température, rend en pratique difficile d'appliquer les techniques conductimétriques chaque fois qué la réaction choisie impose des délais notables, comme c'est le cas pour les dosages usuels de substrats. L'invention permet au contraire de tirer profit des avantages des mesures conductimétriques, qui deviennent réalisables du fait qu'il s'agit seulement de mesurer la vitesse de transformation des composés dans les premiers instants de la réaction. Un autre avantage de l'invention, dans ce mode de mise en oeuvre préféré, est que les mesures conductimétriques peuvent permettre une grande sensibilité en fonction de la transformation du substrat sans avoir recours à des réactions secondaires et que ces mesures peuvent conduire à des résultats directement proportionnels à la concentration du substrat à doser, alors que les grandeurs physiques prises en compte dans les méthodes optiques et potentiométriques suivent une loi de variation logarithmique avec la concentration. Dans l'application au dosage des hexoses, il est apparu possible, grace à l'invention, de combiner ces divers avantages, dans un mode de mise en oeuvre particulier du procédé selon l'invention suivant lequel on mesure les variations de conductivité du milieu réactionnel dans la réaction de phosphorylation des hexoses par lthexokinase. Et l'invention trouve ici un terrain d'application de choix dans la recherche du glucose dans le plasma ou le sang.Dans la réalisation pratique du procédé, on a souvent A doser des concentrations en glucose de l'ordre de 0,1 mg/l à 100 mg/l, qui correspondent A celles que l'on peut notamment obtenir dans les analyses de sang pour recherche de la glycémie, après dilution des échantillons dans le milieu réactionnel A des taux compris entre 1/10 et 1/10000, et plus généralement de l'ordre de 1/100 a 1/1000. I1 est alors particulièrement avantageux d'utiliser comme milieu réactionnel une solution aqueuse contenant Concentration Hexokinase (en Unités Internationales/litre) de 0,5 UI/1 à 10 UI/1 ATP de 10 M à 10 M Mg + (notamment sous forme d'acétate) de 10 A 10 2 ion-g/l N-acétylglucosamine de lo 3 1 S M Tampon Tris- HC1 de 10-4 a M A pH de 7 à 9. La réaction peut être effectuée à toute température comprise entre 0 C et 400C, mais maintenue constante à au-moins 0,010C près;pendant la durée de la mesure, celle-ci ayant lieu sur un incrément de temps généralement de l'ordre de 10 à 40 secondes dans la première demi-minute de la réaction. On a constaté que dans ces conditions préférées, les variations de conductivité sont effectivement proportionnelles a la concentration du glucose initialement introduit dans le milieu réactionnel. Cependant, il est également possible de varier les conditions opératoires sans sortir du cadre de l'invention. On peut en particulier remplacer l'acétate de magnésium par un autre sel rendant 1'ATP actif dans la réaction, tels que le chlorure de magnésium ou tout autre sel de magnésium, ou remplacer le tampon Tris par un autre tampon accepteur de protons, tel que l'imidazole HC1, et faire varier le pH entre 5 et 9. D'autre part, les mêmes conditions préférées peuvent intéresser des applications de procédé autres que le dosage du glucose dans le plasma ou le sang. Elles peuvent être utiles en particulier pour tous autres dosages de glucose, dans l'industrie pharmaceutique, dans l'industrie alimentaire, ou dans tout autre domaine, y compris la bactériologie, où le dosage peut servir par exemple A déterminer la consommation de glucose par des bactéries. Elles peuvent aussi être employées pour le dosage d'autres hexoses, comme le fructose. L'actLvite de l'hexokinase est similaire pour le fructose et le glucose. Mais le procédé selon l'invention convient également aux dosages des autres hexoses, bien que l'activité de l'hexokinase à leur égard soit moindre. La composition du milieu réactionnel et les conditions opératoires peuvent être facilement adaptées A chaque application particulière. L'invention sera maintenant plus complètement décrite en se référant A un exemple particulier de mise en oeuvre, nullement limitatif, dans le cadre de son application au dosage du glucose plasmatique . Dans cet exemple, le milieu réactionnel est constitué par une solution aqueuse contenant Hexokinase 4C Vg/ml N-acétylglucosamine 0,1 M ATP 2.10 3 M Acétate de magnésium 2.10 3 M Tampon Tris-HC1 10,-2 M à pH 7,7. Les constituants sont disponibles dans le commerce - Heokinase, de levure (E.C. 2.7.1.1.) fournie par Sigma (type VI), titrant environ 75 UI/mg, - ATP fournie par Boehringer (sel disodique), - Tris fourni par Merck (qualité pour analyse), - H20 bi-distillée, - Acétate de Mg fourni par Merck (qualité pour analyse). Dans une cellule d'analyse conductimétrisue, à double paroi, munie d'un système d'agitation continue par barreau aimanté et reliée à un thermostat A circulation, on introduit 5 ml du milieu réactionnel. Cette cellule est reliée à un conductimètre qui est utilisé pour déterminer les variations de conductivité du milieu lorsque l'on y ajoute du glucose, celui-ci déclenchant la réaction de phosphorylation qui est en elle-même bien connue Mg - ATP + glucose glucose-6-P + Mg-ADP + Dans des essais d'étalonnage, la réaction est déclenchée par l'injection de volumes variables de 10 à 50 ul d'une solution de glucose à 5 g/l et de KC1 à 5.10 3 M.La présence du chlorure de potassium permet d'ajuster la conductivité de la solution de glucose à une valeur du même ordre de grandeur que celle du milieu réactionnel contenant l'enzyme et d'éviter ainsi une trop grande variation de conductivité au moment de l'injection de la solution de glucose. La conductivité est de l'ordre de 800 pMho.cm 1 dans exemple rapporté. La température de mesure est fixée à 25 f 0,20C et elle est maintenue constante à 0,010C près pendant chaque mesure. Les variations de conductance dG sont mesurées sur des incréments de temps dt de 10 ou 20 secondes après une durée initiale de mélange de 1 seconde partant de l'instant d'injection du glucose. La vitesse de la réaction enzymatique s'exprime par la relation 1000 K dG avec v en mole/l.mn RE dt avec dG/dt en Mho/mn. Dans cette équation, K est une constante de cellule K = a/G (cm 1), a étant la conductivité spécifique (Mho/cm) et G la conductance (Mho) et RE est le rendement expérimental de la mesure, défini par R E = 1000 Ac/C (Mho.cm2/mole), où Ao est la variation globale de conductivité qui apparaît après la transformation enzymatique de C mole/l de substrat, RE pouvant être déterminé par étalonnage, à condition qu'il y ait relation linéaire entre la consommation de glucose et l'augmentation de conductivité observée. Dans le cas particulier considéré, le rendement expérimental est particulièrement élevé, ce qui conduit à une grande sensibilité des mesures R E = 64 Mho.cm2/eq. = 0,35 Mho.cm2/g (1 équivalent = 180 g glucose). L'observation de la variation de la conductivité pour différentes concentrations de glucose, dans les conditions choisies pour la mesure de vitesse initiale, montre que cette variation a reste sensiblement proportionnelle à la concentration initiale de glucose (de même que la vitesse initiale de réaction), jusqu'à au moins 50 mg/l de glucose dans la cellule d'analyse, et donc a la dose de glucose introduite dans le milieu réactionnel, le volume de l'échantillon étant très petit par rapport à celui de la cellule. La pente de la droite représentant ces variations permet de calculer la valeur de R E comme indiqué ci-dessus. On a obtenu notamment les résultats suivants Concentration de Conductance Vitesse initiale de réaction glucose (C g/l) Mho v mole/l.mn 0,01 environ 650 2,30.10 5 0,02 " 4,30. 0,03 " 5,40. 0,04 " 7,90. 0,05 " 9,80. La valeur du rendement expérimental R E ne varie pas sensiblement lorsqu'on fait varier la concentration d'hexoklnase entre 5 et 50 ug/ml. Elle reste très favorable si l'on abaisse la teneur en ATP a 10 M et la teneur en ions Mg++ à 10 3 ion-g/l. I1 est toujours souhaitable de faire varier ces deux teneurs corrélativement de manière à les maintenir l'une par rapport à l'autre dans un rapport de l'ordre de 1. Après étalonnaga, la cellule peut être utilisée, avec d'autres cellules identiques, pour mesurer les concentrations de glucose que l'on rencontre pour les valeurs habituelles de la glycémie. On peut utiliser par exemple des prélèvements de volume 10 p1 se trouvant dilués au 1/500 à leur injection dans la cellule. On peut aussi utiliser des prélèvements de plus faible volume, étant donné que la sensibilité-de la méthode avec le dispositif utilisé dans ce cas particulier permet de mesurer des vitesses de réaction aussi faibles que 10-6 mole/l.mn et d'observer la transformation de doses de quelques nanomoles de glucose dans la cellule d'analyse. Le procédé tel que décrit permet d'éviter des opérations de dilution supplémentaires qui amèneraient des risques d'erreurs dans les manipulations et les résultats. Des déterminations de glycémie peuvent être effectuées sur des échantillons de 1 ul dans des cellules contenant 1 ou 2 ml de milieu réactionnel. Il est en général préférable d'introduire l'enzyme dans le milieu réactionnel avant l'opération de dosage, mais en variante, on peut également provoquer la réaction par addition de l'enzyme après introduction de l'échantillon glucosé. Naturellement, bien d'autres variantes peuvent encore être apportées au procédé sans sortir pour autant du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé de dosage de substrats intervenant dans des réactions enzymatiques, caractérisé en ce que l'on met le substrat A doser en contact avec un enzyme spécifique en présence d'un inhibiteur compétitif en proprotion telle que pour les concentrations de substrat à doser, la consommation du substrat dans la réaction enzymatique s'effectue avec une vitesse initiale mesurable, on mesure cette vitesse initiale sur un incrément de temps où elle reste constante, et l'on en dédui après étalonnage la concentration à doser, qui est sensiblement proportionnelle à la vitesse initiale. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la vitesse de la réaction est mesurée par la variation de la conductivité du milieu réactionnel. 3. Procédé seion la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est appliqué au dosage du glucose dans des prélèvements sanguins par la réaction de phosphorylation du glucose sous l'effet de l'hexokînase. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le substrat a doser étant le glucose, on réalise la réaction enzymatique de phosphorylation de glucose par l'hexokînase en présence de N-acétylglucosamine en tant qu'inhibiteur compétitif. 5. Procédé selon 1a revendication 4, caractérisé en ce que la réaction est provoquée par mise en contact d'un échantillon contenant le glucose à doser avec un milieu réactionnel constitué essentiellement par une solution aqueuse contenant Concentration Hexokinase (en Unité Internationale) de 0,5 A 10 ATP de 10'5ex à 10-2M Mg++ (notamment sous forme d'acétate) de 10 5à1a-2 ion-g/l N-acétylglucosamine de 10 A 1 M Tampon Tris-HCl de 10-4 à 10-1M - pH entre 5 et 9 et de préférence de 7 A 8,5. 6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la conductivité de l'échantillon est ajustée à une valeur du même ordre de grandeur que celle du milieu réactionnel. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que l'échantillon est dilué dans le milieu réactionnel jusqu'à une concentration de glucose à doser pouvant varier entre 0,1 et 100 mg/l.