Brevet FR2410476A1 — publié le 19790629

La présente invention concerne l'application des peptidoglycanes extraits de bactéries, en particulier de Bacillus, à titre de médicaments, notamment stimulant l'immunité antitumorale. Elle concerne également les compositions pharmaceutiques contenant, à titre d'ingrédient actif, au moins un tel peptidoglycane. Les peptidoglycanes sont des constituants de la paroi'bacté- rienne, qui contiennent des sucres aminés et des acides aminés. Les peptidoglycanes sont décrits en détail dans l'article de SCHLEIFER KH, KANDLER 01 intitulé : Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomie implications" Bact. Rev. 36 407-477, 1972. D'une façon générale, les peptidoglycanes peuvent être obtenus selon le procédé décrit par PERKINS H.R. et NIETO M. rBiochem. J., 1970, 116, 83-921, procédé auquel peuvent entre apportées des modifications, qui sont à la portée de l'homme de l'art. On a maintenant trouvé que les peptidoglycanes de bactéries, en particulier de Bacillus,possèdent des propriétés stimulantes de l'immunité antitumorale qui sont intéressantes. En effetodes essais pharmacologiques ont montré 1) que les peptidoglycanes de bactéries, notamment de Bacillus Megaterium, de Bacillus Licheniformis et de Corynebacterium poinsettiae inhibent la croissance de cellules tumorales dans certaines conditions 2) que les animaux ayant rejeté la tumeur sous l'effet desdits peptidoglycanes possèdent ensuite une immunité specifique visà-vis de cette tumeur; 3) que les peptidoglycanes activent les macrophages et les rendent cytotoxiques d'une manière non spécifique vis-à-vis des cellules tumorales syngéniques. Des travaux récents ont montré que certaines bactéries, principalement le bacille de Calmette et Guerin (BCG) et Corynebacterium parvum, pouvaient stimuler les moyens de défense contre les tumeurs malignes. Dans ces travaux, le BCG a généralement été utilisé sous forme vivante. Quelques essais ont été faits avec du BCG tué et des extraits bactériens dont la nature chimique n'était pas définie. D'autres travaux ont porté sur des corynebactéries anaérobies (C. parvum) qui sont utilisées sous forme de suspensions bactériennes tuées. Les études sur l'animal ont montré que ces préparations bactériennes pouvaient, dans certaines conditions expérimentales, inhiber ou ralentir le développement de tumeurs. Le produit bactérien est administré, selon les cas, avant l'inoculum de cellules tumorales, en meme temps ou plus rarement quelques jours après. On admet que ces bactéries stimulent les moyens de défense naturels (probablement par l'activation des macrophages) et que celapeut permettre 11 élimination d'un nombre limité de cellules tumurales. Des essais thérapeutiques avec le BCG et avec C. narvum ont été effectués chez l'homme. Certains ont employé ces traitements dans des cas de cancers avancés dont le pronostic était désespéré. D'autres les ont administrés en complément d'untraitement à visée éradicatrice. Les traitements à visée éradicatrice (chirurgie, radiothérapie, chimiothérapie) comportent un certain pourcentage d'échecs, dans la mesure où certaines cellules tumorales peuvent y échapper et être à l'origine de récidives. L'immuno-stimulation bactérienne dirigée contre ces cellules résiduelles pourrait abaisser la fréquence des récidives. Des résultats encourageants ont été rapportés. L'utilisation des immuno-stimulants bactériens se heurte actuellement à certaines difficultés. La première concerne la standardisation. L'efficacité des préparations varie suivant les souches bactériennes mises en oeuvre. En outre, dans le cas du BCG, la proportion de bactéries viables décroît en fonction du temps, au cours du stockage. La deuxième difficulté concerne les effets secondaires. Le BCG peut se multiplier in vivo d'une manière qu'il n'est pas toujours possible de contrôler. D'autre part, l'administration répétée de BCG entrain des phénomènes de sensibilisation (quelques cas mortels ont été rapportés). Selon l'invention, on a trouvé que les peptidoglycanes de bactéries possèdent également la propriété de stimuler l'immunité antitumorale. I1 est connu que les peptidoglycanes de diverses espèces bactériennes possèdent un effet adjuvant sur les réponses immunitaires humorales et cellulaires. A cet effet, on peut se reporter à l'article de NAUCIEL. et al. intitulé "Adjuvant activity of bacterial peptidoglycans on the production of delayed hypersensibility and on antibody response" / eut. J. Immunol. 4:352-356, 1974 /. Des résultats analogues ont été rapportés par d'autres auteurs avec des peptidoglycanes naturels et avec un dérivé synthétique, la N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine,également dénommé Muramyl-dipeptide" rELLOUZ F. et al. Bioch. Biophys. Res. Commun. 1974, 59, 1317-1325 "Minimal structural requirement foradjuvant activity of bacterial peptidoglycan derivatives" 7; Toutefois,l'effet adjuvant n'est observé dans le domaine de l'hypersensibilité retardée (c'est-à-dire de l'immunité cellulaire) que si l'on utilise comme véhicule de l'huile minérale (adjuvant de type "Freund"). L'utilisation de l'huile minérale est déconseillée chez l'homme en raison de sa mauvaise tolérance. L'effet adjuvant, en milieu aqueux, du dérivé synthétique, qui est un produit soluble en milieux aqueux, a été démontré uniquement dans l'immunité tumorale rModulation of the immune response by a synthetic adjuvant and analogs" Proc. Nat . Acad. Sci. USA vol 73, n 7 pp 2472-2475 - July 1976 7. Par ailleurs, il n'existe pas une réelle corrélation entre l'effet adjuvant et l'activité antitumorale d'une substance. En effet, des résultats rapportés dans la littérature indiquent qu'une préparation soluble extraite de mycobactéries, appelee'SSA" et contenant à la fois du peptidoglycane et un arabinogalactane ne possède pas d'effet antitumorai invivo bien qu'elle soit adjuvante [ JUY D. et CHEDID. L. "Comparison between macrophage activation and enhancement of non specific resistance to tumors by mycobac téria immunoadjuvants" Proc. Nat. Acad. Sci. 1975, 72, 41054109]. De meme, il a été rapporté que le dérivé synthétique mentionné précédemment, c'est-à-dire le muramyl-dipeptide,ne possède pas d'activité antitumorale bien qu'il soit adjuvant; à cet effetSon peut se référer à l'article de JUY et CHEDID cité ci-dessus et à l'article de YAMAMURA et al. "Immunological activity 0f synthetic cell-wall peptidoglycan subunits" Proc. Japan Acad. 1976, 52, 58-61]. En sens inverse, les travaux qui ont donné lieu à la présente invention ont montré que le peptidoglycane de Corvnebacterium noin- settiae exerce une action antitumorale alors qu'il ne possède pas de propriétés adjuvantes. Il n'est donc pas possible, à priori, d'indiquer qu'une substance ayant des propriétés adjuvantes possède également des propriétés stimulantes de l'immunité antitumorale. La présente invention concerne donc l'application des peptidoglycanes, en tant qu'extraits naturels et insolubles des bac tueries, en particulier des Bacillusà titre de médicaments, notamment de stimulants de l'immunité antitumorale. Parmi les peptidoglycanes de bactéries on préfère tout particulièrement les peptidoglycanes de bactéries du genre Bacillus car ces dernières sont faciles à cultiver, par exemple par cultures en fermenteur. On utilise avantageusement des Bacillus gram positif. A titre d'exemples de bactéries à partir desquelles on peut extraire un peptidoglycane utilisable selon l'invention,on peut citer : Bacillus Megaterium (ATCC 14.581), Bacillus Licheniformis (ATCC 9945) et Corynebacterium poinsettiae (NCPPB 846). L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques contenant un peptidoglycane. Ces compositions se présentent de façon générale sous la forme de suspensions de peptidoglycane en milieu aqueux.Elles peuvent éventuellement contenir un antiseptique, par exemple le formaldéhyde ou le merthiolate. Elles sont ap propriées pour l'administration par voie intra- ou péritumorale, sous-cutanée et intraveineuse. Les peptidoglycanes conviennent à titre de complément des traitements anticancéreux (radiothérapie, chimiothérapie) pour éviter les métastases et les récidives. A titre indicatif} on peut noter que des doses de l'ordre de 1 mg/l0 kg de poids de corps humain peuvent être utilisées en traitement discontinu, c'est-à-dire à raison d'environ 1 à 2 injections par semaine .Les produits selon l'invention agissent très probablement pour stimuler l'immunité antitumorale en mettant en jeu la réaction cellulaire. Leurs effets secondaires, s'ils existent, sont moins marqués que les extraits de C narvum dont l'administra- tion provoque de façon connue des réactions locales et/ou fébriles. L'invention va etre maintenant décrite plus en détail dans les exemples illustratifs mais non limitatifs ci-après EXEMPLE 1 Préparation du peptidoglycane de Bacillus Megaterium. La bactérie Bacillus Megaterium a été cultivée sur du bouil lon nutritif (Merck, Standard I).Un volume de 50 ml de préculture a été inoculé dans 3 flacons d'Erlenmeyer de 6 litres contenant chacun 3 1 de milieu de culture. Une agitation continue a été assurée par un agitateur magnétique et la culture a été poursuivie 16 h à 37"C. Les bactéries ont été récoltées par centrifugation (10.000 tours/mn, 10 minutes), lavées à l'eau distillée puis lyophilisées. On a obtenu 7g de poids sec (soit près de 0,8 g/l). La culture en fermenteur suivie de récolte sur centrifugeuse "Sharpless" peut également être pratiquée lorsque l'on désire des quantités de matériel plus importantes. Les bactéries ont été remises en suspension dans une solution de Na C1 M à raison de 6g de bactéries pour 100 ml,et cassées par traitement aux ultra-sons pendant 20 minutes sous réfrigération. Les parois bactériennes ont été obtenues par centrifugation différentielle. (Cette étape de préparation de parois peut etre omise sans que le résultat final soit sensiblement modifié). Après lavage à l'eau distillée, la préparation de parois (ou de bactéries) a été-remise en suspension dans de l'acide trichloracétique à 10% et portée à ébullition durant 20 minutes. La préparation a été refroidie, lavée à l'eau distillée par centrifugation (20 minutes à 13.000 tours/mn) reprise en tampon phosphate 0,1 M pH 8,0. De la trypsine a été ajoutée dans un rapport enzyme-substrat de 1/25. Après une incubation de 2 h à 370C, on a ajouté du dodécylsulfate de sodium à raison de 1%. Après une'incubation de 10 minutes à 37"C on a lavé 6 fois à l'eau distillée (par centrifugation à 13.000 tours/minute ,20 minutes, à 300C), puis on a liophylisé le culot de centrifugation. On a obtenu 670 mg de produit, soit près de 10% du poids sec bactérien. L'analyse du produit obtenu est donnéedans le tableau I. La portion peptidique de ce peptidoglycane est la suivante L-Ala-D-Glu mA2pm-D-Ala EXEMPLE 2 Préparation des peptidoglycanes de Bacillus Licheniformis et de Corynebacterium poinsettia On a opéré sensiblement selon le meme mode opératoire que celui décrit dans l'exemple 1 en utilisant du Bacillus Licheniformis ou du Corynebacterium poinsettiae à la place de Bacillus Megaterium. Le peptidoglycane de Bacillus Licheniformis diffère de celui de Bacillus Megaterium par l'amidation de l'acide D-glutamique (en &alpha;). Le peptidoglycane de Corynebacterium poinsettiae possède une structure peptidique différente des deux précédents. La séquence peptidique est la suivante Gly - D-Glu L-Hsr - D-Ala; il faut noter de plus que la liaison interpeptidique n'est pas directe. L'analyse chimique de ce produit est également donnée dans le tableau I: Ala : alanine; Glu : acide glutamique A2pm : acide diaminopimélique, Gly : glycérine, Hsr hémasérine. TABLEAU I Analyse des peptidoglycanes de Bacillus Megaterium et de Bacillus Licheniformis Bactérie Corynebacterium Bacillus poinsettiae : megaterium Consituant : Quantité en nmoL/mg Glu : 840 : 890 : Lys Ala 630 1260 Gly 840 . : Hsr non dosé . Orn : 890 : : : A2pm : - : 860 : : Asp : - : : : :Sueres aminés : 1430 : 1250 EXEMPLE 3 Tests Pharmacologiques 'A - Protocole d' essais 1 - animaux On a utilisé des rats WISTAR AG consanguins provenant du centre d'élevage du Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) d'Orléans -La Source et élevés au laboratoire par appariement frère-soeur. 2 - Tumeurs Les tumeurs qui ont été utilisées sont des tumeurs induites par le méthylchloranthrène (MCA) chez les rats consanguins Wistar AG. La plupart des expériences ont été faites avec une lignée tumorale dénommée IE . Quelques expériences ont été faites également avec la tumeur MCA7 ou la tumeur MCA8. Les tumeurs MCA1, MCA7, MCA8 ont été induites par injection sous-cutanée de 20-méthylchloranthrène chez les rats femelles. Les tumeurs ont été dissociées par digestion avec la trypsine (0,25% dans du sérum physiologique tamponné au phosphate). Les cellules tumorales ont été lavées deux fois dans la solution de Hank et injectées par voie sous-cutanée pour passage d'un animal à l'autre. Les cultures de tissus in vitre ont alors été établies. 3 - Milieu de culture de tissus Le milieu de culture de tissus (MCT) était le milieu minimal essentiel de Eagle (modification de Bulbecco) complété avec 10% de sérum de foetus de veau, 100 unités par ml de Penicilline et 100 Ag/ml de Kanamycine. L'incubation a été réalisée à 370C dans une atmosphère humidifiée à 95% d'air et 5% de CO2. 4 - Préparations bactériennes On a utilisé les peptidoglycanes extraits de Bacillus Megaterium, de Bacillus Licheniformis et de Corynebacterium poinsettiae obtenues selon les exemples 1 et 2.0n a également utilisé, à titre de comparaison, du BCG lyophilisé tué par la chaleur (provenant de 1' "Institut Pasteur', Paris) et une préparation de Cornyebacterium Parvum (provenant de l'Institut Merieux), cette préparation ayant été préalablement lavée pour éliminer le formol. 5 - Suppression de la croissance tumorale Les cellules tumorales ont été mises en suspension dans la solution de Hank. Du peptidoglycane lyophilisé a été dispersé par ultrasons dans la solution de Hank et chauffé 3 minutes dans un bain d'eau bouillante (la stérilité a été vérifiée pour chaque culture sur au sang de la gélose/et un milieu nutritif). Des volumes égaux de suspensions de cellules tumorales et de peptidoglycane ont été mélangés et on a injecté 1 ml de ce mélange immédiatement par voie sous-cutanée dans les flancs des rats. Le BCG et la préparation de Corynebacterium parvum ont été utilisés de la même façon. Dans les témoins, la suspension de peptidoglycane a été remplacée par la solution de Hank. La dimension des tumeurs aété mesurée deux fois par semaine et la mortalité a été notée chaque jour. 6 - Activation des cellules péritonéales 500 llg de peptidoglycane dans 1 ml de solution de Hank ont été injectés par voie intraperitonéale chez des rats normaux.Les rats témoins ont reçu un volume équivalent de solution de Hank. Après deux jours, les animaux ont été anesthésiés ét la cavité péritonéale a été lavée avec 50 ml de solution de Hank contenant 10 U /ml d' "Heparine". La suspension cellulaire a été lavée deux fois avec la solution de Hank et remise en suspension dans du milieu de culture de tissus défini ci-dessus (dénommé ci-après MCT). Dans certains essais,les cellules adhérentes ont été éliminées par le mode opératoire suivant : 107 cellules péritonéales en suspension dans 2 ml de MCT ont été placées dans une boite de Pétri (35 x 10 mm -"Falcon Plastics") et incubées pendant 90 minutes à 370C. Les cellules non-adhérentes ont été alors éliminées et la boîte de Pétri lavée deux fois avec 2 ml de solution de Hank. Les cellules non adhérentes ont été réincubées dans une nouvelle botte de Pétri dans les memes conditions et ensuite recueillies. 7 - Mesure de la cytoxicité des cellules péritonéales Le test de microcytotoxicité selon la méthode de HELLSTROM I et HELLSTRt E rt'Colony inhibition and cytotoxicity assays. In vitro methods in cell-mediated immunity (Bloom BR, Glade PR, eds) New-York, Academic Press, 1971, pp 409-414, a été utilisé : 1000 cellules tumorales dans 0,1 ml de MCT ont été ensemencées dans les puits d'une plaque microtest "Nunclon Delta n" 1480" (vendu par Nume, Roskilde, Danemark). Le jour suivant, environ 500 cellules étaient attachées à la base des puits et 0,1 ml de suspension de cellules péritonéales dans MCT a été ajouté (le rapport des cellules péritonéales aux cellules cibles a été calculé à partir du nombre de cellules cibles attachées).Après 48 heures d'incubation, les puits ont été lavés avec la solution de Ilank, les cellules restantes ont été fixées avec du méthanol,tachées avec le produit connu sous la dénomination commerciale "Giemsa", et le nombre des cellules tumorales a été compté avec une grille occulaire. Pour chaque mesure, on a répété 1' expérience dans six puits.Le pourcentage de cytotoxicité a été calculé de la façon suivante nombre de cellules cibles avec des cellules péritonéales 100- activees nombre de cellules cibles avec des cellules péritonéales x 100 témoins 8 - Mesure de la cytotoxicité du peptidoglycane de 3000 cellules tumorales en suspension dans 0,1 ml/MCT ont été ensemencées dans les puits d'une plaque microtest. Après une nuit d'incubation à 370C, 0,1 ml de peptidoglycane en suspension dans du MCT a été ajouté et l'incubation a été poursuivie pendant 24 heures.Pendant les dernières 16 heures,un volume de 50 1 contenant 0,25 pCi de 3H-Proline (activité spécifique 20-30 Ci/mM) a été ajouté.Les cellules ont ensuite été recueillies sur un filtre en fibres de verre avec un collecteur d'échantillons "Ohio Miller" et la radioactivité incorporée a été mesurée avec un compteur à scintillations Beckman CPM 200. Chaque mesure a été effectuée avec quatre puits. 9 - Résultats L'effet du peptidoglycane de Bacillus Megaterium administré en mélange avec des cellules tumorales est indiqué dans le tableau Il. Ces expériences ont été réalisées avec la tumeur MCA1 définie ci-dessus et qui est une tumeur immunogénique. Avec un inoculum de cellules tumorales élevées tous les animaux sont morts, mais le temps de survie moyen a été accru par rapport aux témoins. Le BCG tué a été utilisé à titre comparatif, dans deux expériences; il n > y a eu avec le BCG qu'un seul survivant; le temps de survie moyen de tous les autres n'était pas plus long que chez les rats ayant reçu du peptidoglycane de Bacillus Megaterium. Avec un inoculum plus faible, un nombre important d'animaux ont survécu. Chez certainsla croissance de la tumeur a été totalement supprimée, tandis que chez d'autres la tumeur a régressé Dans la gamme de doses de peptidoglycane de Bacillus Megatérium utilisées on n' a pas noté d'effet en fonction de la dose. Les animaux qui avaient rejeté le mélange de cellules tumorales et de peptidoglycane sont résistants à une seconde épreuve avec des cellules tumorales seules. Le rejet des cellules tumorales sous l'effet du peptidoglycane de Bacillus Megaterium est donc suivi d'un état d'immunité tumorale spécifique ainsi que le montrent les résultats consignés dans le tableau III. Le peptidoglycane de Bacillus Megaterium est efficace lorsqu'il est injecté au même endroit que les cellules tumorales. Par contre il n'a pas d'effet, dans le modèle expérimental choisi, lorsqu'il est injecté à un endroit différent.Les résultats d'essais concernant le rôle de ila voie d'administration sont donnés dans le tableau IV. Lorsque le peptidoglycane de Bacillus Megaterium est ajouté à des microcultures de cellules tumorales pendant 24 heures, même à cencentration élevée, la viabilité des cellules tumorales mesurées par incorporation de 3H-proline n'est pas affectée comme le montrent les résultats du tableau V. I1 en résulte que l'effet du peptidoglycane de Bacillus Megaterium sur la croissance de la tumeur n'est pas en rapport avec une action cytotoxique directe sur les cellules tumorales. Après l'injection intrapéritonéale de 500 g de peptidoglycane de Bacillus Megaterium chez des rats normaux, les cellules péritonéales, récoltées 48 heures après, sont cytotoxiques contre les cellules tumorales par comparaison aux cellules péritonéales d'un animal témoin (voir tableau VI). Lorsque les cellules adhérant à une surface plastique sont éliminées, la cytotoxicité est perdue. Ainsi, les cellules cytotoxi- ques sont probablement des macrophages (voir les résultats du tableau VI). La cytotoxicité est non spécifique : elle est dirigée contre toutes les lignées de cellules tumorales ainsi que le mon trent les résultats consignés dans le tableau VII. L'effet du peptidoglycane de Bacillus Licheniformis ou de Corynebacterium poinsettiae administré en mélange avec des cellules tumorales est indiqué dans le tableau VIII. Ces résultats montrent que ces peptidoglycanes ont un effet analogue au peptidoglycane de Bacillus Megaterium. I1 faut noter par ailleurs que des essais ont montré que le peptidoglycane de Corynebacterium poinsettiae était dépourvu de propriétés adjuvantes. Essais comparatifs Dans une autre série d'essais on a mesuré l'effet de l'ad ministration simultanée de cellules tumorales et de peptidoglycane de Bacillus MeGgaterium, de BCG tué ou de Corynebacterium parvum. Les résultats de ces essais sont rapportés dans les tableaux IX, X et XI. Ces résultats montrent que le temps moyen de survie est supérieur avec le peptiglycane de Bacillus Megaterium. Dans une autre série d1 essais, on a comparé l'effet du peptidoglycane de Bacillus Megaterium à celui de Muramyl-dipeptide lors de l'injectionsimultanée de 2105 cellules tumorales MCA1 et de 100 ,ug d'immunostimulant. Les résultats de cet essai, rapportés dans le tableau XII,montrent que le peptidoglycane de Bacillus Megaterium augmente le temps de survie tandis que le Muramyl-dipeptide n'a aucun effet puisqu'on a observé sensiblement le meme temps de survie qu'avec les témoins. Les nouveaux médicaments peuvent etre présentés sous une forme convenant à l'injection, par exemple au sein d'un véhicule de sérum physiologique.Ils se présentent sous forme d'une suspension d'agent actif dans le milieu aqueux. L'administration peut etre locale ou générale. Dans ce dernier cas, la voie d'administration est la voie sous-cutanée ou intraveineuse. Les effets thérapeutiques obtenus sont au moins égaux à ceux de C.parvum , mais l'index thérapeutique est supérieur dans le cas des produits de l'invention car on peut administrer une quantité plus grande de peptidoglycane sans effet secondaire indésirable. Les peptidoglycanes trouvent principalement application comme agents actifs pour stimuler l'immunité antitumorale. Ces produits peuvent également être stimulants de l'immunité antiinfectieuse. TABLEAU II MORTALITE DE RATS INOCULES PARVOIE SOUS-CUTANEE AVEC UN MELANGE DE CELLULES TUMORALES (MCA1) ET DE PEPTIDOGLYCANE DE BACILLUS MEGATERIUM Nombre de peptidoglycane BCG tué témoin cellules tumorales 1 g 10 g 100 g 1 000 g 100 g 1.000 g 3 X 106 - 3/3(35+12)a) 3/3(40#23) 3/3(21#3) 2/3 3/3 (18 # 1) 5 X 105 - 3/3(53#27) 3/3(40#6) 3/3(32#8) 3/3(38#2) 3/3 (20 # 3) 1 X 105 3/5 3/5 3/5 6/6 1 X 105 1/4 4/4 5 X 104 0/4 3/4 5 X 104 - 2/5 1/5 5/5 1 X 105 1/4 4/4 2 X 105 5/5 4/5 3/5 5/5 2 X 105 2/5 5/5 a) nombre de rats morts/nombre de rats inoculés - entre parenthèses,temps moyen de survie en jours. TABLEAU III IMMUNITE TUMORALE APRES REJET D'UN MELANGE DE CELLULES TUMORALES MCA1 ET DE PEPTIDOGLYCANE DED BACILLUS MEGATERIUM. Inoculum d'épreuve tumeur nombre de cellules MCA1 1 X 105 MCA7 1 X 105 a) nombre de rats avec tumeur/nombre de rats inoculés b) rats ayant rejeté, 45 à 65 jours avant , un mélange de cellules tumorales MCA1 (5 X 104 ou 1 x 105) et de peptidoglycane (100 g ou 1 mg). TABLEAU IV INFLUENCE DE LA VOIE D'ADMINISTRATION DU PEPTIDOGLYCANE DE BACILLUS MEGATERIUM SUR LA CROISSANCE DE DLA TUMEUR. Cellules tumorales Voie d'administration du MCA1 peptidoglycane (lmg)a) Mortalité 5 x 104 sous-cutanée en mélange avec 0/4 les cellules tumorales 5 x 104 sous-cutanée dans les flancs 3/4 opposés 5 x 104 intrapéritonéale 4/4 5 x 104 3/4 a) Le peptidoglycane a été administré en même temps que les cellules tumorales. TABLEAU V INCORPORATION DE 3H-PROLINE PAR LES CELLULES TUMORALES MCA1 INCUBEES 24h AVEC DU PEPTIDOGLYCANE DE BACILLUS MEGATERIUM Peptidoglycane cpma) - 2.699 # 941 100 g/ml 2.409 # 696 500 g/ml 2.406 # 403 a) moyenne de quatre puits contenant 3.000 cellules tumorales. TABLEAU ACTIVITE CYTOTOXIQUE DES CELLULES PERITONEALES APRES INJECTION INTRAPERITONEALE DE PEPTIDOGLYCANE DE BACILLUS MEGATERIUM Cellules péritonéales témoins stimulées % cytotoxicité non fractionnées 1202 # 142b 393 # 41 68 non adbérentes 1140 # 128 1094 # 58 5 néant 1154 # 68 a) cellules péritonéales récoltées 48h après l'injection intrapéritonéale de 500 g de peptidoglycane b) nombre de cellules cibles (MCA1) par puit après 48h d'incubation avec des cellules péritonéales au taux de 50/1 (moyenne de six puits # écart type). TABLEAU VII ACTIVITE CYTOTOXIQUE DE CELLULES PERITONEALES ACTIVEES SUR DIFFERENTES CELLULES TUMORALES rapport cell cellules sffectrices/ cellules % % % cellules péritonéales MCA1 cytotoxicité MCA7 cytotoxicité MCA8 cytotoxicité cibles contrôle 828 # 83a) 815#55 920# 116 50/1 stimuléb) 383 # 38 54 375#81 54 400# 75 57 contrôle 1158 # 117 826#162 1241#103 100/1 stimulé 426 # 103 64 158 #21 81 395# 85 69 contrôle 1295 # 144 840# 77 1251# 180 200/1 stimulé 275 # 49 79 121 # 35 86 283 # 43 78 @a) nombre de cellules cibles par puits après 48h d'incubation avec des cellules péritonéales (moyenne de six puits # écart type) b) voir tableau VI. TABLEAU VIII MORTALITE DES ANIMAUX AYANT RECU ON MELANGE DE CELLULES TUMORALES ET DE PEPTIDOGLYCANE AUX DOSES INDIQUEES. Cellules tumorales Peptidoglycane 0 10 100 1.000 Témoin MCA1 g 105 B.licheniformis 5/5 2/5 3/5 5/5 5/5 (28# 6) (45) (53 # 28) (44 # 7) (28) 2.105 C.poinsettiae 5/5 4/5 (37 + 8) (59 # 14) 105 C.poinsettiae 575 2/5 (28 # 6) (60) Les valeurs représent le nombre de morts par rapport au nombre d'animaux inoculés. Entre parenthèses figure la survie moyenne des animaux ayant succombé, en jours (avec l'écart-type). TABLEAU IX MORTALITE DES ANIMAUX AYANT RECU,LORS DE LA MEME EXPERIENCE,DES CELLULES TUMORALES ASSOCIEES A DU PEPTIDOGLYCANS DE B.NEGATERIUM ou à C.PARVUM. Cellules tumorales Immunostimulant ( g) n 1 10 100 MCA1 2.105 peptidoglycane de 5/5 5/5 4/5 3/5 B. megaterium 2.105 C.parvum 5/5 3/5 4/5 TABLEAU X EFFET DE L'ADMINISTRATION SIMULTANEE DE CELLULES TUMORALES ET DE PEPTIDOGLYCANE DE BACILLUS MEGATERIUM, OU DE BCG TUE. Expérience Cellules Immunostimulant Mortalité Survie moyenne tumorales (jours) 1 MCA1 3.106 - 3/3 18,5 BCG 100 g 3/3 21 BCG 1 mg 2/3 67,5 Peptidoglycane 100 g 3/3 35 Peptidoglycane 1 mg 3/3 40 2 MCA7 106 3/3 42 Peptidoglycane 100 g 3/3 78 Peptidoglycane 1 mg 3/3 83 3 MCA1 5.105 - 3/3 20,5 BCG 100 g 3/3 32 BCG 1 mg 3/3 38 Peptidoglycane 100 g 3/3 53 Peptidoglycane 1 mg 3/3 40 4 MCA1 5.104 - 5/5 Peptidoglycane 100 g 2/5 Peptidoglycnae 1 mg 1/5 5 MCA1 5.104 - 3/4 Peptidoglycane 1 mg 0/4 TABLEAU XI ESSAI COMPARATIF AVEC C. PARVUM ET BCG TUE Inoculum 5.105 cellules MCA1 Dose d'immunostimulant 100 g Immunostimulant Mortalité Témoin 5/5 (25 # 3) X) Peptidoglyoane 4/5 (53 # 27) de B. megaterium C. parvum 5/5 (43 # 8) BCG tué 5/5 (38 # 11) x) survie moyenne en jours (# écart standard) des animaux ayant succombé. TABLEAU XII COMPARAISON AVEC MURAMYL DIPEPTIDE 2 105 MCA1 immunostimulant mortalité (survie moyenne) 0 5/5 (30 # 6) peptidoglycane de B. megaterium 100 g 5/5 (46 # 8) Muramyl dipeptide 5/5 (29 # 3,5) 100 G REVENDICATIONS 1. Application des peptidoglycanes, en tant qu'extraits naturels et insolubles des bactéries2 en particulier des Bacillus à titre de médicaments, notamment de stimulants de l'immunité antitumorale. 2. Application selon la revendication 1, caractérisée en ce que le peptidoglycane est celui de Bacillus Megaterium (ATCC 14581) 3. Application selon la revendication 1, caractérisée en ce que le peptidoglycane est celui de Bacillus Licheniformis (ATCC 9945). 4. Application selon la revendication 1, caractérisée en ce que le peptidoglycane est celui de Corynebacteriua poinsettiae (NCPPB 846). 5. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle con tient,g titre d'ingrédient actif, un peptidoglycane de bactéries, en particulier de Bacillus. 6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que le peptidoglycane est celui de Bacillus Megaterium (ATCC 14.581), Bacillus Licheniformis (ATCC 9945) et Corynebacterium poinsettiae (NCPPB 846). 7. Composition selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme d'une suspension aqueuse contenant éventuellement un antiseptique. 8. Composition selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme apte à l'injection.