Brevet FR2401162A1 — publié le 19790323

La présente invention concerne de nouveaux composés d'inhibition desp -lactamases, pouvant avoir eux-memes une activité antibactérienne. Les brevets britanniques n 1.467.413, 1.489.235 et 1.483.142 indiquent que la fermentation de Streptomyces olivaceus peut conduire à la préparation dtantibiotiques désignés par MM4550, MM13902 et MM17880 qui ont respectivement les formules Aucun de ces brevets britanniques ne suggérait qutun autre antibiotique pouvait être obtenu à partir du bouillon de fermentation de Streptomyces olivacens. On a maintenant trouvé d'autres antibiotiques. La présente invention a pour objet les composés des formules (I) et (II) : Yoir formules page suivante et leurs sels. Le plus judicieusement, les composés des formules (I) et (II) sont sous forme dtun sel, étant donné qutil apparaît que les sels de composés des formules (I) et (II) sont plus stables que les acides dont ils proviennent. Comme sels appropriés des composés de formule (I) et (il), on peut mentionner les sels de métaux alcalins et de métaux alcalino-terreux pharmaceutiquement acceptables, tels que les sels de sodium, de potassium et de calcium, et les sels d'addition avec des bases azotées pharmaceutiquement acceptables, tels que les sels d'ammonium, de triméthylamine, de diméthylamine, de pyrrolidine et les sels analogues. Comme sels particulièrement appropriés des composés des formules (I) et (Il), on peut mentionner leurs sels de sodium et de potassium. Un composé préféré selon l'invention est constitué par le sel de sodium dtun composé de formule (I), Un second composé pré féré selon l'invention est le sel de sodium dtun composé de formule (II). Etant donné que les composés de formules (I) et (II) et leurs sels sont destinés à une utilisation dans des compositions pharmaceutiques, on comprendra aisément quwils sont chacun produits sous une forme sensiblement pure, par exemple avec une pureté d'au moins 50 %, plus judicieusement une pureté d'au moins 75 %, de préférence d'au moins 90 %, et plus avantageusement encore d'au moins 95 %.Des préparations impures des composés des formules (I) et (II) et de leurs sels peuvent être utilisées pour préparer les formes plus pures utilisées dans des compositions pharmaceutiques ces préparations moins pures des composés de formule (I) et (II) et de leurs sels doivent contenir au moins 1 %, plus judicieusement au moins 5 %, et de préférence de 10 à 49 % d'un composé de formule (I) ou (II) ou de ses sels. Ces préparations moins pures comprennent le plus utilement un sel du composé de formule (I) et un sel du composé de formule (II). (Les pourcentages sont en poids/ poids). On préfère en général que les sels sensiblement purs du composé de formule (I) ou de formule (II) ne contiennent pas comme impuretés des quantités importantes d'autres agents antibactériens tels que des sels des composés de formules (III), (IV) et (V) ci-avant, obtenus à partir du bouillon de fermentation. Les composés des formules (I) et (II) existent sous des formes cis et trans par rapport au cycle t-lactame. Ces formes peuvent être ainsi représentées par les formules (Ia), ('b), (lia) et (IIb) : On réalisera que les composés précédents peuvent être dénommés comme suit : Ia Acide (5R, 6R)-3-(2-acétamidoéthylthio)-6-[(S)-1- hydroxyéthyl]-7-oxo-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-ène 2-carboxylique Ib Acide (5R, 6S)-3-(2-acétamidoéthylthio)-6-[(S)-1-hydroxy- éthyl]-7-oxo-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-ène-2-carboxylique. IIa (5R, 6R)-3-[(E)-2-acétamidoéthénylthio]-6-[(S)-1-hydroxy éthyl]-7-oxo-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-ène-2-carboxylique. IIb Acide (5R, 6S)-3-[(E)-2-acétamidcéthénylthio]-6-[(S)-1 hydroxyéthyl]-7-oxo-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-ène-2 carboxylique. Les isomères cis et trans des composés des formules (I) et (II) ont tous les deux des propriétés utiles antibactériennes et dtinhibition des F-lactamases, et ainsi l'invention stétend aux composés isolés des formules (Ia) et (b), de même qu'à leurs mélanges, et aux composés isolés des formules (IIa) et (IIb), de même qu'à leurs mélanges. Naturellement, les formes isolées cis et trans seront le plus judicieusement sous la forme de sels pharmaceutiquement acceptables sensiblement purs comme décrits ci-dessus ; ctest-à- dire qutelles doivent avoir une pureté d'au moins 50 %, plus judicieusement d'au moins 75 %, de préférence une pureté de 90 %, et le plus avantageusement une pureté d'au moins 95 %. En outre, on préfère utiliser l'un des composés mentionnés ci-dessus lorsqutil ne renferme pratiquement pas de son isomère en position 6 [c'està-dire (Ia) débarrassé de (Ib), (IIa) débarrassé de (IIb), (Ib) débarrassé de (Ia) ou (IIb) débarrassé de (Ib)].En général, ces composés ne doivent pas contenir plus de 5 , de leur isomère en position 6 et de préférence pas plus de 1 % de leur isomère en position 6. (Une chromatographie en phase liquide sous pression élevée peut etre utilisée pour controler les puretés). Suivant un aspect préféré de l'invention, celle-ci a pour objet un sel de métal alcalin du composé de formule (Ia) ayant un coefficient d'extinction molaire (dans l'eau à pH neutre) non inférieur à 7700 (de préférence non inférieur à 7900) (pour un maximum d'absorption W à environ 298 nm). L'invention a également pour objet, suivant l'un de ses aspects préférés, un sel de métal alcalin du composé de formule (Ib) ayant un coefficient d'extinction molaire (dans l'eau à pH neutre) non inférieur à 7700 (de préférence non inférieur à 7900) pour un maximum d'absorption Uv à environ 301 nm). Suivant un autre aspect préféré, l'invention concerne également un sel de métal alcalin du composé de formule (IIa) ayant un coefficient d'extinction molaire (dans liteau à pH neutre) non inférieur à 13.000 (de préférence non inférieur à 13.500) (pour un maximum d'absorption W à environ 308 nm). Conformément à un autre aspect préféré de l'invention, celle-ci a pour objet un sel de métal alcalin du composé de formule (IIb) ayant un coefficient d'extinction molaire (dans l'eau à pIi neutre) non inférieur à 13.000 (de préférence non inférieur à 13.500) (pour un maximum d'absorption W à environ 308 nm). De préférence, les sels de métaux alcalins précédents sont les sels de sodium. La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique renfermant un composé de formule (I) ou (II) ou un sel de celui-ci et un excipient pharmaceutiquement acceptable. Les compositions selon l'invention renferment en général un sel pharmaceutiquement acceptable d'un composé des formules (I) ou (II), par exemple un sel de sodium ou de potassium. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être adaptées à l'administration orale ou parentérale. De manière judicieuse, les compositions sont présentées sous des formes qui contiennent de'50 à 500 mg d'un composé de formule (I) ou (II) ou de son sel, par exemple environ 100, 150, 200 ou 250 mg. Le plus fréquemment, la composition sera appropriée à l'administration par injection. Ces compositions peuvent contenir des diluants, des liants, des agents de désintégration, des lubrifiants ou d'autres excipients classiques et peuvent être préparées par des procédés classiques de mélange, de remplissage et des procédés analogues. Les compositions peuvent être sous forme de comprimés, de capsules, d'ampoules ou sous d'autres formes similaires. Si désiré, la composition peut avantageusement contenir une pénicilline ou une céphalosporine. Dans de tels cas, le rapport entre l'agent de synergie (c'est-à-dire le composé selon l'in- vention) (de préférence sous fonne d'un sel) et la pénicilline ou la céphalosporine est habituellement compris entre 2:1 et 1:12, plus fréquemment entre 1:1 et 1:5 ; il est par exemple de 1:2, 1:3 ou 1:4 en poids/poids. Gomme pénicillines particulièrement appropriées à une incorporation dans les compositions selon l'invention, on peut mentionner l'ampicilline, l'amoxycilline, la carbénicilline, la ticarcilline et les composés donnant ces pénicillines dans le corps. Lorsque ces composés sont appropriés à l'injection, ils sont pré sentes en général sous forme de leurs sels de sodium. Comme céphalosporines particulièrement appropriées pour leur incorporation dans les compositions selon l'invention, on peut mentionner la cépbaloridine et la céphazoline. Comme pénicillines préférées pour l'incorporation dans les compositions selon l'invention, on peut citer l'ampicilline trihydratée, l'amoxycilline trihydratée, le sel de sodium de l'ampicilline et le sel de sodium de l'amoxycilline. Comme céphalosporines préférées pour l'incorporation dans les compositions selon l'invention, on peut mentionner la céphaloridine, et le sel de sodium de la céphazoline. Le composé de formule (I) ou (II) ou son sel peut être un composé isolé de formule (Ia), ('b-) ou (IIa), (IIb) ou peut être constitué par leurs sels ou des mélanges des composés des formules (Ia) et (Ib) ou (Iia) et (IIb) ou de leurs sels. Gependant, on préfère utiliser un composé de l'une des formules précédentes ne contenant pas son isomère. Ce composé est en général sous forme d'un sel pharmaceutiquement acceptable tel que le sel de sodium. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un composé de formules (I) ou (II) ou de son sel, ce procédé étant caractérisé en ce qu'on effectue une culture d'u- ne souche de production de Streptomyces olivaceus ou Streptomyces gedanesis jusqutà ce qutune quantité substantielle d'un composé de formule (I) ou (II) ou de son sel soit produite, puis on récupère un composé de formule (I) ou (II) ou son sel à partir du milieu de culture. L'expression tStreptomyces olivaceus1t, lorsqutelle est utilisée dans la présente description, est définie conformément à la classification de Hunter R. (dans Systematik der Streptolyceten, S. Korger, Bale, pages 8 à 32). Il y a lieu de remarquer que, suivant cette définition, les souches Streptomyces fulvovoridis, Streptomyces flavus et Streptomyces flavovirens peuvent être considérées comme étant des synonymes de Streptomyces olivaceus. Comme souches .appropriées, on peut mentionner celles décrites dans le brevet britannique n 1.467.413. Un organisme préféré pour l'utilisation dans le procédé selon ltinvention est constitué par Streptomyces olivaceus ATCC 31126 ou par un mutant à rendement élevé de celui-ci. Un autre-organisme préféré pour l'utilisation dans le procédé selon l'invention est constitué par Streptomyces olivaceus ATCG 31365 ou par un mutant à rendement élevé de celui-ci. Comme indiqué antérieurement, la matière récupérée doit avoir une pureté dtau moins 1 %, plus judicieusement de 5 %, plus judicieusement encore d'au moins 50 %, de préférence d'au moins 75 %, et le- plus avantageusement d'au moins 90 %, par exemple d'au moins 95 %. Le terme "cultllre", lorsqutil est utilisé dans la présente description, désigne la croissance aérobie délibérée d'un organisme en présence de sources de carbone, dtazote, de soufre et de sels minéraux assimilables. Une telle croissance aérobie peut avoir lieu dans un milieu solide ou semi-solide, mais en général il est préférable d'utiliser un milieu liquide. Les conditions générales de culture pour la croissance de Streptomyces olivaceus sont celles décrites dans le brevet britannique n 1.467.413. Les conditions générales pour la croissance de Streptomyces gedanensie sont similaires. Le procédé selon l'invention peut astre adapté de manière à fournir un composé de formule (I) ou son sel, un composé de formule (II) ou son sel, ou un composé de formule- (I) ou son sel conjointement à un composé de formule (II) ou de son sel. Normalement, le procédé est adapté en vue de la préparation d'un sel au lieu de l'acide apparenté. Il est préférable que le milieu de culture ne contienne pas de sulfate ajouté, étant donné que ceci conduit souvent à la préparation de MM 4550, MM 13902 et MM 17880 aux dépens de la production des composés des formules (I) et (II) et de leurs selsi Les composés des formules (I) et (II) sous forme de leurs sels peuvent être obtenus-à partir du filtrat de culture (a) en mettant en contact le filtrat avec du carbone jusqu'à ce que l'ac activité antibiotique soit absorbée sur celui-ci, (b) en éluant l'activité antibiotique du carbone par utilisation d'acétone aqueuse, (c) en combinant les fractions contenant des fractions d'inhibition des ss-lactammes, (d) en évaporant l'acétone et une grande partie de lteau de manière à obtenir une solution aqueuse plus concentrée, (e) en appliquant la solution à une colonne échangeuse d'anions, et (f) en éluant les métabolites dtinhibition des ss-lactamases à partir de cette colonne au moyen d'une solution d'un électrolyte tamponné sensiblement à neutralité, de manière à recueillir les fractions contenant le composé de formule (I) ou (II) sous forme de sel, (g) en appliquant la solution résultante à une résine qui sépare les matières inorganiques des composés (I) et (II), et (h) en isolant la préparation solide du sel d'un composé de formule (I) ou (II) de la solution résultante. Les composés des formules (I) et (II) sous forme de leurs sels peuvent aussi etre obtenus à partir du filtrat de la culture (1) en mettant en contact le bouillon de culture clarifié avec une résine échangeuse d'anions à base acrylique, fortement basique, jusqu'à ce que l'activité antibiotique soit absorbée sur celle-ci, (2) en éluant l'activité antibiotique de la résine par utilisation d'une solution aqueuse dtun tampon contenant faculta- tivement également un sel, (3) en combinant les fractions à activité d'inhibition des ss-lactamases, (4) en appliquant les fractions combinées à une colonne XAD-4, (5) en éluant avec de ltiso- propanol aqueux, (6) en combinant les fractions à activité dtin- hibition des ss-lactamases, (7) en éliminant l'isopropanol et en concentrant la solution par évaporation, (8) en appliquant la solution sur une résine échangeuse d'aniorls et en procédant comme dans les stades (f), (g) et (h) indiqués ci-dessus. On préfère en général utiliser une résine échangeuse d'anions (type 1) fortement basique, à base acrylique (sous forme d'un sel d'addition avec un acide, normalement le chlorhydrate), telle qu'Amberlite IRA 458 (qui peut être obtenue par exemple chez Rohm et Haas, par exemple à Lennig House, 2 Massons Avenue, à Croydon, dans le Royaume-Uni). Un avantage d'une telle résine réside dans le fait qutelle permet l'élution successive des composés de formule (I) et (II) en utilisant une solution saline aqueuse, par exemple une solution tamponée d'un chlorure tel que le chlorure de sodium ou un chlorure analogue.Si lton utilise les résines fortement basiques, moins avantageuses, ayant une matrice de polystyrène/divinylbenzène, il est en général nécessaire d'éluer au moyen d'une solution aqueuse dans un alcanol inférieur d'un sel (par exemple un chlorure, tel que le chlorure de sodium), afin obtenir une récupération satisfaisante, et ces solvants peuvent donner une préparation moins pure des matières désirées. (Cette variante du procédé diffère du procédé d'absorption par le carbone en ce que les sels de MM 4550, MM 13902 et MM 17880 sont séparés des sels des composés de formule (I) et (II) au premier stade d'alution). Le procédé selon l'invention diffère fondamentalement du procédé décrit antérieurement en ce que les fractions choisies pour un traitement ultérieur au stade (f) sont celles contenant le sel d'un composé de formule (I) et (II) ne comportant sensiblement pas d'autres antibiotiques. Les acides libres des formules (I) et (II) peuvent être obtenus par acidification soigneuse d'un sel du composé des formules (I) ou (II), suivie par une extraction rapide au moyen d'un solvant organique non miscible à liteau et par une récupération de l'acide de la solution. Dans les procédés selon l'invention ii est fréquemment plus commode d'opérer avec un sel de métal alcalin du composé des formules (I) et/ou (II) tel que les sels de lithium, de sodium ou de potassium, et parmi ces sels on préfère le sel de sodium. Il est possible de préparer d'autres sels par le procédé d'extrac- tion, mais il est habituellement plus judicieux de former d'abord le sel de métal alcalin purifié, en particulier le sel de sodium, et de transformer ensuite celui-ci en un autre sel, par exemple par passage à travers un lit d'une résine échangeuse de cations sous forme de l'autre sel.Ainsi, dans cette description, d'autres électrolytes (tels que les sels de lithium, de potassium ou d'autres sels) peuvent remplacer les sels de sodium décrits, mais en général on préfère opérer avec le sel de sodium. De manière simi Vire, on peut utiliser des sels autres que le chlorure (par exemple le bromure, le nitrate ou les sels analogues), bien quten général on préfère opérer avec un chlorure. Un procédé préféré de purification chromatographique (stades f et g) utilise une solution aqueuse d'un sel de sodium tam ponnée sensiblement à neutralité, conjointement à une résine écran geuse dtions basique. Ainsi, une solution aqueuse de chlorure de sodium (ou d'un autre sel similaire) tamponnée à environ pH 7 au moyen d'un tampon classique, tel qutun tampon au phosphate, peut être utilisée conjointement à des résines de support qui contiennent des groupes amino secondaires ou tertiaires ou des groupes amino quaternaires. Comme supports appropriés, on peut mentionner les celluloses échangeuses d'ions basiques et les dextranes réticulés échangeurs dtions basiques, tels que la cellulose Sephadex DEAE, Sephadex QAE et les agents équivalents. Dans un procédé approprié apparenté de purification chromatographique (stades f et g), on utilise un système solvant comprenant un mélange d'eau et de petites quantités d'un solvant organique non miscible à l'eau tel qutun alcanol inférieur (ctest- à-dire un alcanol en C14), conjointement à une matière de support inerte telle qutun gel de silice ou de la cellulose. Comme systèmes solvants appropriés, on peut mentionner l'isopropanol aqueux, le n-butanol aqueux et les systèmes analogues.On peut par exemple utiliser un mélange d'eau et d'isopropanol dans un rapport tres approximatif de 1:4, et ltisopropanol peut être utilisé en eombi- naison avec un support de cellulose. Le produit obtenu par le mode opératoire précédent contient fréquemment une proportion élevée de chlorure de sodium, de sorte qu'il est avantageux d'éliminer le sel des solutions rassemblées. L'élimination du sel peut être effectuée en faisant passer la solution à travers un lit d'une matière lipophile sur laquelle l'antibiotique est adsorbé, mais qui n'absorbe pas le chlorure de sodium. Comme matières appropriées, on peut mentionner les absorbants polymères à base de polystyrène tels qu'Amberlite XAD-4, Diaion HP20 et les produits analogues. Le produit obtenu par le procédé précédent peut aussi être dessalé par chromatographie sur des agents de filtration appropriés constitués par des gels tels que des dextrines réticulés comme Sephadex G10 et G15 et les gels de polyacrylamide comme Biogel P2.L'antibiotique peut être élué à partir de ces matières en utilisant de liteau, du méthanol aqueux ou un solvant analogue. Les colonnes sont éluées à une vitesse permettant une séparation des antibiotiques en fractions distinctes. En général, des zones distinctes peuvent être éluées de ces colonnes ; cellesci contiennent le sel disodique de MM 4550, le sel disodique de MM 13902 et le sel disodique de MM 17880, les sels de sodium des composés de formule (I) et les sels de sodium des composés de formule (II) étant élués de manière très voisine des fractions des sels de sodium du composé de formule (I). En général, les trois sels disodiques sont séparés par des intervalles assez larges des sels monosodiques sur les résines échangeuses d'anions. Si la colonne n'est pas contrôlée de manière soigneuse, il peut arriver que les sels monosodiques soient obtenus dans des fractions qui se chevauchent.Si ceci. est le cas, on peut soit (a) lyophiliser cette solution de manière à obtenir un complexe utile impur contenant les antibiotiques, qui peut être traité ultérieurement, ou bien (b) rechromatographier la solution elle-meme en contr8lant soigneusement l'éluant pour avoir la certitude qu'on recueille la solution du sel de sodium d1un composé de formule (I) ne comportant pas de sel de sodium d'un composé de formule (II) et/ou qu'on recueille la solution de sel de sodium d'un composé de formule (II) ne comportant pas de sel de sodium d'un compose de formule (I) ; ces solutions peuvent alors être lyophilisées ou être débar- rasées d'une autre manière du solvant. Les fractions choisies pour être recueillies sont celles qui présentent une activité notable dtinhibition des ss-lactamases ou une activité antibactérienne. Comme procédés appropriés pour déceler l'activité d'inhibition des ss-lactamases, on peut mentionner les procédés des brevets britanniques précités, bien que lton puisse utiliser un procédé approprié quelconque. Le schéma réactionnel suivant indique une séquence préférée d'obtention des composés des formules (I) et (ici) sous forme de leurs sels de sodium. Les sels de sodium obtenus de cette manière peuvent être purifiés davantage si désiré, en utilisant les modes opératoires chromatographiques décrits ci-dessus. La trituration des sels des composés des formules (I) et (II) sous un solvant organique tel que de l'acétonitrile ou de l'acétone contenant de l'humidité peut favoriser l'élimination d'impuretés. Filtrat de culture I Absorption sur du carbone Elution avec de l'acétone aqueuse à zo Combinaison des fractions à activité dtinhibition des 6-lactamases Elimination d'acétone et concentra tion par évaporation Golonne échangeuse d'anions de cellulose DE52 Elution avec du tampon de phosphate de pH 7 Sels de sodium Sels de sodium Sels disodiques des composés de des composés de de MM 4550, MM 13902 formule (I ) formule-(II) et MPI 7880 | XAD4 | XAD4 Solution dessalée Solution dessalée I \I Solide lyophilisé Solide lyophilisé Filtrat de culture I Résine acrylique échangeuse d'anions fortement basique Elution avec un tampon Combinaison des fractions avec des fractions dtinhibition des )3-lactamases éluées antérieurement Elimination du sel sur XAD4 Elution avec de l'isopropanol a queux Combinaison des fractions à activité dtinhibition des 3-lactamases | Elimination de l'isopropanol et et concentration par évaporation Résine échangeuse d'anions formée de cellulose DE52 Elution lution avec du tampon de phosphate de pH 7 Sels de sodium Sels de sodium des composés des composés de formule (I) de formule (II) XAD4 1 XAD4 Solution dessalée Solution dessalée I Solide lyophilisé Solide lyophilisé Si désiré, les sels des composés de formules (I) et (II} préparés par les procédés précités peuvent être soumis ultérieurement à des techniques de séparation chromatographique pour obtenir un sel isolé d'un composé de formule (Ia), (Ib), (lIa) ou (IIb). Des procédés de ce genre constituent des aspects préférés de l'in- vention. Normalement, le sel utilisé dans un tel procédé sera un sel monovalent tel que le sel d'ammonium ou un sel de métal alcalin tel que le sel de sodium ou de potassium. Une forme appropriée de chromatographie pour le procédé de séparation est constituée par une chromatographie liquide sous pression élevée, par exemple en utilisant une solution aqueuse tamponnée au formiate d'ammonium. Lorsquton a obtenu des fractions contenant le composé désiré, on peut obtenir une préparation solide par lyophilisation ou par un procédé analogue. Les composés de formule (Ia) et (Ib) peuvent être séparés par chromatographie sur des supports tels que de la cellulose acétylée et en éluant avec des mélanges alcool/eau. Les composés de formule (IIa) et (IIb) peuvent aussi être séparés en utilisant des techniques chromatographiques similaires. Lorsquton a obtenu des fractions contenant le composé désiré, on peut obtenir une préparation solide par lyophilisation ou par un procédé analogue. La présente invention concerne un procédé de préparation d'un sel du composé de formule (Ia) ne comportant pratiquement pas de composé de formule (Ib), ce procédé étant caractérisé en ce quton soumet un mélange des sels précités à une séparation chromatographique sur Diaion HP20 ou une résine équivalente au point de vue chromatographie. La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un sel du composé de formule (Ib) ne comportant pratiquement pas de composé de formule (Ia), caractérisé en ce luron soumet un mélange des sels précités à une séparation chromatographique sur Diaion HP20 ou sur une résine équivalente au point de vue chromatographie. La présente invention vise en outre un procédé de préparation d'un sel du composé de formule (IIa) ne comportant pratiquement pas de composé de formule (IIb), procédé caractérisé en ce luron soumet un mélange des sels précités à une séparation chromatographique sur Diaion HP20 ou sur une résine équivalente au point de vue chromatographie. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un sel du composé de formule (Ilb) ne comportant pratiquement pas de composé de formule (IIa), procédé caractérisé en ce quton soumet un mélange des sels précités à une séparation chromatographique sur Diaion HP20 ou sur une résine équivalente au point de vue chromatographie. Les sels préparés par les procédés précédents seront normalement des sels monovalents tels que les sels de métaux alcalins, par exemple le sel de iithium, de sodium ou de potassium, et seront de préférence le sel de sodium, Les sels préparés par le procédé précédent ne contiendront pas normalement plus environ 5 % et plus judicieusement ne contiendront pas plus d'environ 1 % de l'isomere non désiré. Le Diaion (qui est une marque de fabrique) est un polymère hautement poreux fabriqué par Mitsubishi Chemical Industries. Ce ntest pas une résine échangeuse d'ions, mais un adsorbant synthé- tique qui a une surface spécifique active extrêmement grande sur laquelle peuvent être adsorbés efficacement des composés organiques. Le Diaion HP20 est un copolymère styrêne/divinylbenzène sous forme de grains ou perles ayant une structure macroréticulaire, avec une surface spécifique d'environ 7,8 m2/g et un volume de pores de 1,16 ml/g. D'autres détails sur cette résine peuvent être trouvés sur la feuille des caractéristiques de Diaion (série HP, octobre 1976, incorporée à la présente description) de Mit sur bishi Chemical Industries Ltd. Les bureaux sont situés à 5-2 Marunouchi 2-chrome, Chiyoda-ku à Tokio au Japon ; 277 Park Avenue, New York, NT 10017 aux Etats-Unis d'Amérique ; Ratinger Str. 45, 4 Duesseldorf, R.F.A., etc.). Les résines équivalentes, au point de vue chromatographie, à Diaion HP20 seront également normalement chimiquement et physiquement similaires, ctest-å-dire qu'il stagira en général de résines macroréticulaires à base de copolymères styrène/divinyl- benzène qui ne comportent pas de groupes ionisés. Le plus judicieusement, le mélange dtisomères appliqué à la résine sera d'une bonne pureté et ne comportera sensiblement pas d'autres impuretés organiques, bien que certaines quantités dtimpuretés inorganiques (par exemple un sel de métal alcalin tel aucun chlorure, par exemple un chlorure de sodium) puissent être présentes. Judicieusement, le solvant utilisé sera de l'eau ou de l'eau en mélange avec un alcanol inférieur ou un autre solvant organique miscible similaire. De préférence, le solvant utilisé est de lteau. La matière désirée peut maintenant être obtenue par élimination du solvant; par exemple par évaporation, par lyophilisation ou par un procédé analogue. Selon une variante, la solution peut être rechromatographiée directement sur une résine appropriée (telle que Biogel P2 et/ou Diaion HP20) pour une purification supplémentaire avant l'élimination du solvant. L'eau peut être éliminée des solutions aqueuses des sels selon l'invention par des procédés tels que l'évaporation sous vide à environ i/îo du volume, on ramène au volume original avec de ltéthanol, on reconcentre à environ 1/10 du volume sous vide, on recomplète à nouveau au volume original par addition de toluène et on évapore à siccité sous vide. Les solvants résiduels peuvent être éliminés par conservation sous un vide élevé. Description 1 Préparation de bouillon clarifié Une suspension de spores de Streptomyces olivaceus ATTC 31126 est utilisée pour l'inoculation de 100 ml d'un milieu au stade d'ensemencement, contenu dans un ballon d'Erlenmeyer de 500 ml fermé avec un bouchon de mousse. Le milieu d'ensemencement est formé de 2 ss de glucose et de 1 % de farine de graines de soja, complétés par de l'eau désionisée. (La farine de graines de soja est Arkasoy 50, fournie par British Arkadi Go. Ltd, Old Trafford, Manchester, Royaume-Uni). On effectue la culture du milieu au stade d'ensemencement pendant 48 heures sur un dispositif secoueur rotatif à 260C. On utilise des portions de 5 ml du milieu au stade d'ensemencement ou pour effectuer l'inoculation de fractions de 100 ml du milieu de fermentation contenu dans des ballons Erlenmeyer de 500 ml fermés de bouchons de mousse. Le milieu de fermentation, qui est complété par de l'eau désionisée, a la composition suivante : Glucose 2,0 Forme de graines de soja 1,0 GaGO3 0,02 00012 6H20 0,0001 On soumet à l'incubation les ballons de fermentation à 260C sur un dispositif secoueur rotatif pendant 72 h.On fait la récolte -de 20 ballons et on soumet à la centrifugation le bouillon total résultant, à raison de 2200 g, pendant 10 mn. On préfère également utiliser Streptomyces olivaceus ATCC 31365 dans le procédé ci-dessus. Préparation 2 Préparation d'antibiotiques bruts en solution On soumet le filtrat de culture (1500 ml) obtenu après centrifugation à une purification en utilisant une colonne de carbone comme suit : On prépare une colonne de carbone granulaire Darco de 2,5 x 37 cm dans de l'eau désionisée, on lave la colonne successivement avec un litre de NaOH à 2 %, un litre d'eau désionisée, un litre de HCl 1N et 1 litre d'eau désionisée, le tout à raison de 15 ml/mn. On lave alors la colonne avec un tampon au phosphate 0,05 M de pH 7, jusqu'à ce que le pH de l'éluant soit 7,0. On fait passer le filtrat de culture (1500 ml) sur la colonne de carbone à raison de 15 ml/mn. On élue alors la colonne avec un mélange d'acétone/eau 1/4 à raison de 15 ml/mn et on recueille des fractions de 22 ml. On vérifie les fractions pour leur activité d'inhibition des)3-lactamases vis-à-vis dtune préparation d'enzyme STEM (fournie par le Microbiological Research Establish nuent de Porton). Les fractions montrant la plus grande activité (8-22) sont combinées et on évapore sous pression réduite pour éliminer l'acétone. On conserve la solution aqueuse résultante à l'état congelé avant le traitement subséquent. (L'enzyme RTEM est le type des frlactamases contrôlés par plasmide et peut être remplacé par dtautresJ3-lactamases de facteur R de ce genre si désiré). Exemple 1 Isolement des composés des formules (I) et (II) sous forme de leurs sels de sodium ne comportant pratiquement pas de sels de NM 4550, MM 13902 et MM 17880 La liqueur brute obtenue dans la description 2 est évaporée sous pression réduite à environ 20 ml et on l'applique sur une colonne échangeuse d'anions faiblement basique, formée de cellulose-DEAE, de 3,8 x 27 cm (la cellulose-DEAE est de la cellulose DE52 fournie par Whatman Ltd, Springfield Mill, à Maidstone, Kent, Royaume-Uni) préparée par un tampon au phosphate 0,025 M de pH 7. On élue la colonne avec un tampon au phosphate 0,025 M de pH 7 à raison de 8 ml/mn et on recueille des fractions de 25 ml. On contrôle les fractions en ce qui concerne leur activité dtinhibition des ss-lactamases vis-à-vis d'une préparation de ss-lactamses RTEM' On retient les deux premiers pics d'activité inhibitrice. On combine les fractions de la première bande (13-16) contenant ie sel du composé de formule (I) et on lyophilise avec obtention d'une préFaration solide contenant le sel de sodium du composé de formule (I), ne renfermant pratiquement pas de sels des antibiotiques dibasiques.On combine les fractions de la seconde bande (19-21) contenant le sel du composé de formule (II) et on lyophilise de manière à obtenir une préparation solide contenant le sel de sodium du composé de formule (II), ne renfermant pratiquement pas de sels des antibiotiques dibasiques. (Les fractions 13-16 et 19-21, combinées et lyophilisées, donnent naturellement une préparation contenant un mélange des sels de sodium des antibiotiques des formules (I) et (II). Les sels disodiques de MM 4550, MM 13902 et MM 17880 sont élués après les sels désirés). Exemple 2 Purification partielle des sels de sodium des composés de formule (I) La préparation lyophilisée du sel du composé de l'exemple 1 est dissoute dans de l'eau désionisée (10 ml) et on ajoute du chlorure de sodium (1 g) à la solution. On fait passer cette solution sur une colonne XAD-4 de 1,5 x 15 cm (fournie par Rohm & BR Haas), préparée dans de liteau désionisée. On élue la colonne avec un mélange d'eau/n-propanol 4/1 à un taux de 2 ml/minute et on recueille des fractions de 4 ml. On contrôle les fractions en ce qui concerne le chlorure par leur réaction avec AgNO3, et en ce qui concerne leur activité dtinhibition desft-lactamases vis-àvis d'une préparation de J3-lactamase RTEM. On combine les fractions ayant l'activité inhibitrice la plus élevée et donnant une réaction négative avec le nitrate d'argent (fractions 6-13) et on lyophilise avec obtention d'un solide amorphe (32,5 mg) contenant le sel de sodium du composé de formule (I). Les propriétés de cette préparation sont les suivantes : (A) Propriétés chromatographiques (a) Chromatographie sur un papier échangeur drions Whatman DE81 (papier échangeur d'anions faiblement basique) Eluant : Rf du sel de sodium 1. Tampon au phosphate 0,05M 0,69 de pH 7 2. Tampon au phosphate 0,05M 0,80 de pH 7 contenant NaCL 0,2M (b) Chromatographie sur du papier Whatman n 1 Système solvant :: Rf du sel de sodium q . : 1. Phase supérieure butanol : éthanol : eau 0,12 de 4:1:5 2. Butanol : Pyridine : Eau 0,42 1:1:1 (B) Electrophorèse sur papier à haute tension On effectue l'électrophorèse sur un papier n 20 dans un tampon de pyridine/acide acétique de pH 5,3 à 5000 volts pendant 15 minutes. Les valeurs RM pour le sel de sodium, en prenant la valeur 1,0 pour les benzyl pénicillines, sont également de 1,0. (C) Activité antibactérienne On détermine l'activité antibactérienne de la préparation comme suit, en utilisant le procédé de microtitrage : Organisme CIM ( g/ml) Bacillue subtilis A Enterobacter cloacae Nl 1250 Escherichia coli 10418 150 E. coli JT 410 625 Klebsiella aerogenes A 312 Proteus mirabilie C977 625 Pseugdomonas aeruginosa A > 2500 Salmonella typhimurium CT10 312 Serratia marcescens US39 625 Staph. aureus Russell 150 (D) Inhibition des enzymes On a résumé ci-dessous l'activité inhibitrice des enzymes de la préparation vis-à-vis d'une série de préparations de ss-lac- tamase Préparation de % d'inhibition Concentration ss-lactamase pour 200 g/ml donnant une provenant de : inhibition de 50 % en g/ml Staph. Aureus Russel 40 E. coli JT4 - 95 : Proteus mirabilis C889 : - : 112 -: Pseudomonas aeruginosa : : : : Dalgleish 170 : : Enterobacter cloacae P99: 83 : : : Pseudomonas aeruginosa A 30 : Klebsiella aerogenes E70: 27 : (Procédé du brevet belge n 827.926). Exemple 3 Purification partielle du sel de sodium des composés de formule (II) On dissout la préparation lyophilisée du sel du composé II de l'exemple 1 dans de l'eau désionisée (10 ml) et on ajoute du chlorure de sodium (1 g) à la solution. On fait passer cette solution sur une colonne de XAD-4 (fourni par Rohm et Haas) de 1,5 x 15 cm, préparée dans de l'eau désionisée. On élue la colonne avec un mélange eau/n-propanol 4/1 à raison de 2 ml/minute et on recueille des fractions de 4 ml.On contrôle les fractions en ce qui concerne le chlorure par leur réaction avec AgNO3 et en ce qui concerne l'activité d'inhibition des -lactama ses par leur action vis-à-vis d'une préparation de ss-lactamase PYEM. Les fractions ayant l'activité dtinhibition la plus élevée et qui donnent une réaction négative avec le nitrate d'argent (fractions-7-13) sont combinées et lyophilisées avec obtention d'un solide amorphe (32,5 mg) contenant le sel de sodium du composé de formule (II). Les propriétés de cette préparation sont les suivantes : (A) Propriétés chromatographiques (a) Lorsquton utilise une cellulose DE81 (Whatman) sous forme de papier échangeur d'anions faiblement basique, le sel de sodium a un Rf de 0,54 si on élue au moyen d'un tampon au phosphate 0,05 M de pH 7. (b) Lorsquton utilise un papier Whatman n 1, le sel de sodium a un Rf de 0,20 lorsqu'on effectue l'élution avec une phase supérieure butanol/éthanol/eau de 4/4/5. (B) Electrophorèse sur-papier à tension élevée On effectue ltélectrophorèse sur un papier Whatman n 20 dans un tampon de pyridine/acide acétique de pH 5,3 à 5000 volts pendant 15 minutes. La valeur RM pour le sel, en prenant une valeur de 1,0 pour la benzylpénicilline, est de 0,95. (C) Activité antibactérienne On détermine l'activité antibactérienne de la préparation en utilisant le procédé du microtitrage ; les résultats sont indiqués dans le tableau ci-dessous : Organisme CIM g/ml Bacillus subtilis A 250 Enterobacter aloacae Nl > 1000 Escherichia coli 10418 : 250 : Klebsiella serogenes A 500 Proteus mirabilis C977 500 Pseudomonas aeruginosa A > 1000 :Salmonella typhimurium CT10 : 250 : Serratia marscens US39 q > 1000 :Staph. aureus Oxford : 500 Staph. aureus Russell 250 (D) Inhibition des enzymes On détermine l'activité d'inhibition des ss-lactamases de la préparation vis-à-vis d'une gamme de préparations d'enzymes : Voir tableau page suivante Exemple 4 Purification supplémentaire des sels de sodium des composés de formule (I) On dissout la préparation obtenue dans 1? exemple 2 dans de liteau désionisée et on l'applique sur une colonne de QAE Sephadex A25 (QAE Sephadex A25 est un échangeur d'anions fortement basique vendu par Pharmacia Ltd) préparée dans de l'eau désioni Préparation de % d'inhibition Concentration -lactamase pour 200 g/ml donnant une provenant de inhibition de 50 % en g/ml Staph. aureus Russell - 150 E. coli JT4 : - 72 : Proteus mirabilis C889 : - : 62 : Pseudomonas aeruginosa - 53 Dalgleish Enterobacter cloacae P99 - 10 : Pseudomonas aeruginosa A : 39 e Kelbsiella aerogenes E70 13 : see. On élue la colonne au moyen de solutions de chlorure de sodium à gradient de concentration allant de O à 0,18 M de NaCl dans l'eau désionisée.On vérifie les fractions de la colonne en ce qui concerne leur activité d'inhibition des ss-lactamases visà-vis d'une préparation de RTEM' et celles montrant l'activité la plus élevée sont combinées. On ajoute du NaCl aux fractions combinées de manière à obtenir une concentration finale d'au moins 5 %. On fait passer la solution résultante sur une colonne dcAm- berlite XAD (Rohm & Haas Ltd) et on élue la colonne au moyen d-'un mélange n-propanol/eau 1/4. On combine les fractions contenant le sel désiré, ce qui est révélé par leur activité d'inhibition de ss-lactamases, on évapore sous vide pour éliminer le solvant organique et on lyophilise. Exemple 5 Purification supplémentaire des sels de sodium des composés de formule On peut éliminer le sel des fractions combinées résultant de la chromatographie sur Sephalex QAE de l'exemple 4 et les purifier davantage par chromatographie sur une colonne de gel constitué par du Biogel P2 (Bio-Rad Laboratories Ltd, 27 Homesdale Road, Bromley, Kent, Royaume-Uni) comme suit : On dissout le solide lyophilisé provenant de la colonne de Sephadex QAE dans un petit volume d'eau désionisée et on le fait passer sur une colonne de Biogel B2. On élue la colonne au moyen de butanol aqueux à 1 %.On vérifie les fractions en ce qui concerne leur activité dtinhibition des ss-lactamases et en ce qui concerne leur réaction avec le nitrate d'argent. Celles donnant une réaction négative avec le nitrate d'argent mais ayant une activité dtinhibition des ss-lactamases appropriée sont combinées et lyophilisées. Exemple 6 Purification supPlémentaire des sels de sodium des composés de formule (I) On dissout la préparation obtenue dans l'exemple 2 dans de l'eau désionisée et on l'applique sur une colonne de la résine échangeuse d'anions fortement basique Amberlite IRA 458 (Rohm & BR Haas (UK) Ltd., Lenning House, 2 Mason's avenue, Croydon, Royaume Uni). On prépare la colonne dans un tampon au phosphate 0,05 M de pH 7 et on élue avec un gradient de chlorure de sodium dans un tampon au phosphate. Solution est effectuée en utilisant un tampon qui varie dtun phosphate 0,05 M de pH 7 à un phosphate 0,Q5 M de pH 7 contenant NaCl 1,0 M.Les fractions montrant l'activité dtinhibition des-lactamases la plus élevée sont combinées. On ajoute NaCl aux fractions conibinées, de manière à obtenir une concentration d'au moins 5 5Se On fait passer la solution résultante sur une colonne d'Amberlite XAD-4 préparée dans de l'eau désionisée. On élue la colonne avec un mélange n-propanol/eau 1/4. Les fractions montrant l'activité d'inhibition des ss-lactamases la plus élevée mais donnant une réaction négative avec le nitrate d'argent sont combinées et lyophilisées. Exemple 7 Purification supplémentaire des sels de sodium des composés de formule (I) On peut purifier davantage le sel du composé de formule (I) par chromatographie sur une colonne de cellulose (Cellulose CC31 Whatman, Springfield Mill, Maidstone, Kent, Royaume-Uni) comme suit : On dissout le solide impur contenant le sel du composé de formule (I) dans un minimum d'eau désionisée et on ajoute du a- propanol Jusqutà une concentration d'environ 50 %. On fait passer la solution résultante sur une colonne de cellulose et on élue la colonne avec un mélange n-propanol/eau 4/1. On contrôle les fractions résultantes après dilution au moyen d'eau désionisée, en ce qui concerne leur activité d'inhibition desJ3-lactamases. On combine les fractions contenant le sel désiré, on évapore sous pression réduite pour éliminer le solvant et on lyophilise. Exemple 8 Purification supplémentaire des sels de sodium des composés de formule (II) On peut utiliser le procédé de exemple 4, mais en remplaçant la matière de départ par la préparation obtenue dans l'exemple 3. Exemple 9 Purification supplémentaire des sels de sodium des composés de formule (II) On peut utiliser le procédé de l'exemple 5, mais en remplaçant la matière de départ par le produit obtenu suivant ltexemple 8. Exemple 10 Purification supplémentaire des sels de sodium des composés de formule (II) On peut utiliser le procédé de l'exemple 6, en remplaçant la matière de départ par la préparation obtenue suivant l'exem- ple 3. Exemple Il Purification supplémentaire des sels de sodium des composés de formule (II) On peut utiliser le procédé de l'exemple 7, mais en rem plaquant la matière de départ par la préparation obtenue dans I' e- xemple 3. Exemple 12 Préparation d'antibiotiques bruts à partir du filtrat de culture On fait passer du filtrat de culture (80 ml) préparé sensiblement comme décrit dans la description 1 sur une colonne de 1,5 x 15 cm d'Amberlite IRA 458, qui est une résine échangeuse d'anions à base acrylique fortement basique (Rohm & Haas). On élue la colonne avec un gradient de concentration en chlorure de sodium. Le gradient varie de Nacre O M à 1,0 M dans un tampon au phosphate 0,05 M de pH 7, avec un débit de 2,5 ml/minute, et on recueille des fractions de 5 ml. On vérifie les fractions en ce qui concerne leur activité dtinhibntion des ss-lactamases vis à vis d'une préparation de j3-lactamase RTEM. Les fractions donnant une bonne activité d'inhibition et contenant les sels de sodium des composés des formules (I) et (II) (4-13) sont combinées. (Les sels disodiques de MM 4550, MM 13902 et MM 17880 sont élués en partant de la fraction 17). Aux fractions combinées, on ajoute du chlorure de sodium (3 g) et on fait passer la solution résultante sur une colonne d'Amberlite XAD-4 de 1,5 x 15 cm (Rohm & Haas) préparée dans de liteau désionisée. On élue la colonne avec un mélange n-propanol/ eau 1/4, avec un débit de 3 ml/minute, et on recueille des fractions de 4 ml. On contrôle les fractions en ce qui concerne leur activité d'inhibition des ss-lactamases et leur réaction avec une solution de AgNO3. Les fractions donnant une bonne activité d'in- hibition et une réaction négative avec le nitrate d'argent sont combinées et lyophilisées de manière à obtenir une préparation partiellement purifiée des sels de sodium des composés des formules (I) et (II). On peut purifier davantage cette préparation impure par les procédés décrits ci-dessus. Exemple 13 Préparation d'antibiotiques bruts à partir du filtrat de culture On fait passer le filtrat de culture (305 ml) préparé sensiblement comme décrit dans la description 1 sur une colonne dtAmberlite IRA-458 de 1,5 x 15 cm, qui est constituée par une résine échangeuse d'anions à base acrylique, fortement basique (Rohm & Haas). On lave la colonne avec de liteau désionisée (100 ml) avec un débit de 5 ml/minute et on élue au moyen d'un tampon au phosphate 0,025 M de pH 7, avec un débit de 5 ml/minute, on recueille des fractions de 10 mil. On contrôle les fractions en ce qui concerne leur activité d'inhibition de ss-lactamases vis-à-vis d'une préparation de ss-lactamase RTEM.Les fractions ayant une bonne activité d'inhibition et contenant les sels de sodium des composés de formule (I) et (II) (12-32) sont combinées. On lyophilise les fractions conibinées. On dissout le solide lyophilisé dans de l'eau désionisée (20 ml), on ajoute NaCl (2 g) et on fait passer la solution résultante sur une colonne d d'Amber- lite XAD-4 de 1,5 x 15 cm (Rohm & Haas) préparée dans de l'eau désionisée. On élue la colonne avec un mélange n-propanol/eau 1/4, avec un débit de 2 ml/minute, et on recueille des fractions de 4 ml. On contrôle les fractions en ce qui concerne leur activité dtinhibition des ss-lactamases et leur réaction avec une solution de AgNO3.Les fractions (7= ayant une bonne activité dtinhibition et donnant une réaction négative avec le nitrate d'argent sont combinées et lyophilisées de manière à obtenir une préparation partiellement purifiée des sels des composés des formules (I) et (II). Cette préparation impure peut être purifiée davantage par les procédés décrits ci-dessus. Exemple 14 Conditions de fermentation pour une fermentation de 300L On remet en suspension une ampoule lyophilisée de Streptomyces olivaceus (ATCC 31365) dans 10 ml d'une solution stérile ayant la composition suivante : Glucose 2 % Farine de graines de soja 1 % pH 6,5 préparée dans de l'eau désionisée (La farine de graines de soja est vendue sous la dénomination commerciale Arkasoy "50" par British Arkady Go. Ltd., de Old Trafford, Manchester, Royaume-Uni). On utilise 1 ml de la suspension pour effectuer l'inoculation de 100 ml du milieu de la même composition, contenu dans un Erlenmeyer de 500 ml fermé par un bouchon en mousse.Après inoculation, on effectue l'incubation de l'Erlenmeyer sur un dispositif secoueur rotatif à 28 C pendant 30 heures. On utilise des portions de 5-ml de cette culture d'ensemencement pour effectuer l'inoculation sur des coins de gélose solide dans des bouteilles de Roux, ayant la composition suivante: Jus de légumes V8 20,0 % Agar Bacto (Difco) 2,5 % pH 6,0 préparées dans de l'eau désionisée (Le jus de légumes V8 est fourni par Campbell's Soups Ltd., Kings Lynn, Norfolk, Royaume-Uni, et l'agar Bacto est fourni par Difco Laboratories, Detroit, Michigan, Etats-Unis d'Amérique). On effectue l'incubation de chaque bouteille de Roux à 280C pendant une semaine. Après ce temps, on ajoute 100 ml d'eau désionisée stérile contenant 0,1 % de Triton X (agent tensioactif-marque de fabrique) à une culture dans la bouteille de Roux et on met les spores en suspension en agitant. On ajoute cette suspension de spores comme inoculum à 75 1 de milieu au stade d'ensemencement stérilisé, dans un fermenteur à chicanes en acier inoxydable.La composition du milieu est la suivante : Farine de graines de soja (Arkasoy 50) 1 % Glucose 2 Agent anti-moussant Pluronic L 81 0,03 % Préparée dans de l'eau distillée (Pluronic L81 est fourni par Ugine Kuhlmann Chemicals Ltd.). On stérilise le milieu à la vapeur d'eau dans le fermenteur pendant 20 minutes à 1200C. On agite la culture au stade d'ensemencement à raison de 140 tours par minute au moyen d'un agitateur à disque à ailettes de 19 cm et on alimente en air sté rîle à raison de 75 1/minute à travers un dispositif de distribution à extrémité ouverte. On règle la température à 280C et, après incubation dans ces conditions pendant 48 heures, on ajoute 7,5 1 de cette culture d'ensemencement comme inoculum à 150 1 de milieu de fermentation stérile dans un fermenteur de 300 1 équipé entièrement de chicanes en acier inoxydable.Le milieu de fermentation a la composition suivante : Farine de graines de soja (Arkasoy 50) 0,9 % Glucose 2,0 % Craie 0,02 % CoCl2 6H20 0,0001 % Agent anti-moussant Pluronic L81 0,2 % pH 6,9 avare stérilisation préparée dans de l'eau distillée. On agite le milieu au stade de fermentation à raison de 340 tours par minute au moyen d'un agitateur à disque à turbine de 21,6 cm. On règle la température à 29 C, on alimente en air avec un débit de 50 minute et on maintient le pH à 6,5-7,0. On peut effectuer la récolte des liqueurs de fermentation après des durées comprises entre 48 et 54 heures. Exemple 15 Conditions de fermentation pour un milieu de fermentation de 2000 1. Les conditions de fermentation jusqutau stade d'ensemen- cernent, y compris celui-ci, sont essentiellement celles décrites dans exemple 14. On utilise 75 1 de ce milieu d'ensemencement pour effectuer l'inoculation de 1500 1 de milieu de fermentation stérile contenu dans un fermenteur de 2000 1 en acier inoxydable équipé entièrement de chicanes. Le milieu de fermentation est le ment que celui décrit dans l'exemple 14. On agite le milieu de fermentation avec deux agitateurs à.disque à turbine de 48 cm de diamètre, à raison de 106 tours par minute, et on alimente en air avec un débit de 400 1/mn. On maintient la température à 290C et le pH à 6,5-7,0, et on effectue la récolte du fermenteur après 48 heures. Exemple 16 Mode d'isolement pour la préparation des sels de sodium sensiblement purs des composés des formules (I) et (II) On clarifie 150 1 de bouillon complet préparé sensiblement comme décrit dans l'exemple 14 sur une centrifugeuse à débit continu (Sharples Super Centrifuge) avec un débit d'environ 2,4 1/ minute. On effectue la percolation de 120 1 du filtrat de culture clarifié sur une colonne de 15 cm de diamètre de la résine échangeuse d'anions fortement basique Amberlite IRA-458 (sous forme chlorure-vendue par Rohm & Haas Co., Philadelphie, Pa., Etats Unis d'Amérique) avec un volume de lit de 9,6 l et avec un débit de 400 ml/minute. (La colonne d'Amberlite IRA-458 a été préparée au préalable dans de l'eau désionisée).Après percolation du filtrat de culture, on lave la colonne avec une moitié du volume du lit d'eau, puis on élue avec NaGl 0,2 M dans un tampon au phosphate de sodium 0,05 M de pH 7, avec un débit de 230 ml/minute. On recueille des fractions de 2 1 et on combine celles montrant une bonne activité drinhibition vis-à-vis d'une préparation de ,)-lactamase pour laquelle RTEM a servi d'intermédiaire (fractions 2-11). On ajoute du chlorure de sodium aux fractions combinées (46,75 g/l) pour amener la solution à une concentration 1M en ce qui concerne NaCl. On fait passer la solution résultante sur une colonne de 10,2 cm d'Amberlite XAD-4 (vendue par Rohm & Haas Co) avec un volume de lit de 41 et équilibrée dans une solution de NaGI 1M. Le débit de percolation est de 200 ml/minute. On élue la colonne avec 10 l-d'eau désionisée, puis avec un mélange eau/isopropanol (4/1), chaque fois avec un débit de 100 ml/minute. Les fractions montrant une bonne activité drinhibition desJ3-lactama- ses vis-à-vis d'une préparation d'enzyme RTEM (3-10 et 13-17) sont combinées, évaporées sous pression réduite pour éliminer l'isopropanol et lyophilisées. On prépare une colonne de 3,8 x 30 cm de cellulose DE52 échangeuse d'anions faiblement basique (sous forme chlorure) (fournie par Whatman Ltd, Springfield Mill, Maidstone, Kent, Royaume-Und) dans de l'eau désionisée. On dissout le solide lyophilisé provenant du stade d'élimination des sels dans 300 ml d'eau désionisée et on fait passer sur une colonne de cellulose DE52 avec un débit de 6 ml/minute. On lave la colonne avec de l'eau désionisée (200 ml) et on élue avec un tampon au phosphate de potassium 0,025 M de pH 7, avec un débit de 2,5 ml/minute, et on recueille des fractions de 10 ml.On vérifie les fractions en ce qui concerne leur activité dtinhibition des P-lactamases et on combine séparément les deux maximas principaux dtactivités, ctestà-dire les fractions 30-85 (contenant le sel de sodium du composé de formule (I)) et les fractions 86-130 (contenant le sel de sodium du composé de formule (II)). On fait passer les fractions combinées (30-85) sur une colonne de 3,8 x 29 cm de QAE Sephadex A25 (sous forme chlorure) (fourni par Pharmacia Ltd., Uppsala, Suède) préparée dans de l'eau désionisée. On élue la colonne avec une solution de NaCl 0,1 M, avec un débit de 3 ml/minute, et on recueille des fractions de 18 ml. On combine les fractions montrant une bonne activité dtin- hibition de la.P-lactamase RTEM (58-68). A cette solution (180 ml), on ajoute 9 g de chlorure de sodium et on fait passer la solution résultante sur une colonne d'Amberlite XAD-4 de 1,5 x 15 cm. On élue la colonne avec de l'eau désionisée (135 ml), puis avec un mélange eau/isopropanol (4/1), avec un débit de 3 ml/minute et on recueille des fractions de 4,5 ml.On combine les fractions ayant le spectre UV caractéristique des sels de sodium partiellement purifiés des composés de formule (I) (maximum UV approximativement à 297 mll) (8-16 et 34-40) et on lyophilise de manière à obtenir des solides (respectivement 53 mg et 42 mg) ayant les propriétés caractéristiques des sels de sodium sensiblement purs des compo sès de formule (I). On fait passer les fractions 86-130 provenant de la colonne de cellulose DE52 sur une colonne de QAE Sephadex A25 de 3,8 x 29 cm (sous forme chlorure), on élue la colonne avec une solution de NaCl 0,1 M, avec un débit de 3 ml/mn, et on recueille des fractions de 18 ml. On contrôle les fractions en ce qui concerne leur activité dtinhibition de la J5-lactamase RTEM et on combine celles montrant une bonne activité (94-100) (120 ml). On ajoute du chlorure de sodium (6 g) aux fractions combinées et on fait passer la solution résultante sur une colonne d'Amberlite XAD-4 de 1,5 x 15 cm.On élue la colonne avec de l'eau désionisée (90 ml), puis avec un mélange eau/isopropanol (4/1), dans chaque cas avec un débit de 3 ml/minute, et on recueille des fractions de 4 ml. On combine les fractions ayant le spectre caractéristique des sels de sodium impurs des composés de formule 1II) (maxi mum à environ 308 mll) (10-16 et 26-32) et on lyophilise avec obtention de solides (respectivement 9,7 mg et 21,7 mg). Ces soli -des ont des propriétés en accord avec les sels de sodium sensiblement purs des composés de formule (II). Exemple 17 Variante du mode dtisolement pour les sels de sodium des composés de formule (I) et (II) On traite par chromatographie un filtrat de culture (120 1) contenant les sels de sodium des composés de formules (I) et (II) sur Amberlite IRA 458 (sous forme du chlorure) et on élimine le sel sur Amberlite XAD-4, sensiblement comme décrit dans l'exemple 16 ci-dessus. On dissout le solide lyophilisé provenant du stade d'alimination des sels dans 300 ml d'eau désionisée et on fait passer sur une colonne de cellulose DE52 de 3,8 x 25 cm (sous forme du chlorure). On lave la colonne avec de l'eau désionisée (200 ml), on élue avec un tampon au phosphate 0,025 M de pH 7, avec un débit de 6 ml/mn et on recueille des fractions de 20 ml. On combine les fractions montrant une bonne activité dtinhibition de la J3-lactasse RTEM (350 ml) et on fait passer sur une colonne de QAE Sephadex A25 de 3,8 x 30 cm. On élue la colonne avec une solution de NaGl 0,18 M, avec un débit de 3 ml/minute, et on recueille des fractions de 20 ml.On contrôle les fractions en ce qui concerne leur spectre UV et an combine séparément celles montrant l'absorption caractéristique des sels de sodium des composés de formule (I) (50-56) et l'absorption caractéristique du sel de sodium du composé de formule (II) (88-97). Aux fractions combinées (50-56), on ajoute du chlorure de sodium (15 g) et on fait passer la solution résultante sur tune colonne d'Amberlite XAD-4 de 1,5 x 15 cm. On lave la colonne avec de l'eau désionisée (15 ml) et on élue avec un mélange eau/n-propanol (IF/1), avec un débit de 3 ml/minute. On recueille des fractions de 3 ml. On combine les fractions ayant le spectre UV caractéristique des sels de sodium purifiés des composés de formule (I) (9-15), on évapore sous pression réduite de manière à éliminer le propanol, et on lyophilise avec obtention d'un solide (35 mg) ayant des propriétés en accord avec les sels de sodium sensiblement purs des composés de formule (I). Aux fractions conibinées (88-97) provenant de la colonne de Sephadex QUE, on ajoute du chlorure de sodium (24 g) et on soumet la solution- à une percolation à travers une colonne d'Amberlite XAD-4 (1,5 x 15 cm)-. On élue la colonne avec un melange eau/n-propanol (4/1) après lavage à l'eau désionisée (15 ml). On combine les fractions ayant les spectres UV caractéristiques des sels de sodium sensiblement purs des composes de formule (Il). On évapore les fractions combinées sous pression réduite pour éliminer le propanol et on lyophilise avec obtention des sels de sodium sensiblement purs des composés de formule (II) (34 mg). Exemple 18 Variante du mode opératoire d'isolement pour les sels de sodium des composés de formules (I) et (II) On prépare un filtrat de culture (105 1) sensiblement comme décrit dans l'exemple 16 et on traite sur Amberlite IRA 458 et sur Amberlite XAD-4 comme décrit dans le même exemple On évapore les fractions brutes provenant de la colonne d'Amberlite XAD-4 à environ la moitié du volume initial, sous pression réduite, de manière à éliminer l'isopropanol, et on conserve à 5 0C pendant environ 65 heures.On fait passer la solution résultante (800 ml) sur une colonne de QAE Sephadex A 25 de 3,8 x 30 cm préalablement préparée dans de l'eau désionisée. On elue la colonne avec une solution de NaCl 0,05 M (80Q ml), puis avec NaCI 0,1 M, dans chaque cas avec un débit de 4 ml/minute, et on recueille des fractions de 20 ml. On contrôle les fractions en ce qui concerne leur activité d'inhibition des )s-lactamases RTEM et leurs spectres W, et on combine séparément celles contenant essentiellement les sels de sodium des composés de formule (I) (73-80) et les sels de sodium des composés de formule (1I) (112-125). On évapore les fractions combinées (73-80) sous pression réduite à environ 15 ml et on fait passer sur une colonne de Biogel P2 de 3,8 x 30 cm (0,074 mm - 0,037 mm) (fourni par Bio Rad Laboratories, 27 Homesdale Road, Bromley, Kent, Royaume-Uni) préalablement préparée dans de l'eau désionisée contenant 1 % de butanol. On élue la colonne avec un débit de 3 ml/minute avec de l'eau désionisée- contenant 1 % de butanol et on recueille des fractions de 6 ml.On vérifie les fractions en ce qui concerne leurs spectres UV et la réaction avec le nitrate dtargen:b. On combine les fractions contenant les sels de sodium des composés de formule (I) donnant une réaction négative avec AgNO3 (29-39) et on lyophilise avec obtention d'un solide (72 mg) ayant les pro priétés caractéristiques du sel de sodium purifié du composé de formule (I). On-évapore les fractions combinées (112-125) sous pression réduite à environ 15 ml de leur volume. On chromatographie cette solution sur une colonne de Biogel P2de 3,8 x 30 cm (préparée comme ci-dessus). On élue la colonne avec de l'eau désionisée contenant 1 % de butanol, avec un débit de 3 ml/minute, et on recueille des fractions de 6 ml. On combine les fractions ayant les spectres W caractéristiques des sels de sodium des composés de formule (II) mais donnant une réaction négative en ce qui concerne le chlorure (43-48). On lyophilise les fractions combinées avec obtention dtun solide (27 mg) ayant les propriétés caractéristiques des sels de sodium sensiblement purs ases composés de formule (11). Exemple 19 Variante d'isolement pour les sels de sodium des composés des formules (I) et (II) On clarifie 1500 1 du bouillon entier préparé sensiblement comme décrit dans l'exemple 15 par filtration, en utilisant un ad juvant de filtration connu sous la dénomination Dicalite 478, sur un filtre à prérevêtement rotatif, avec obtention de 400 1 de filtrat de culture. On soumet ce filtrat de culture à une percolation à travers une colonne d'Amberlite IRA 458 de 30 cm de diamètre (sous forme chlorure) (volume de lit 100 1), avec un débit de percolation moyen de 4 1/minute. On élue la colonne avec un débit de 1,6 1/minute avec NaGl 0,2 M dans un tampon au phosphate de sodium 0,05 M de pH 6,7, et on recueille des fractions de 20 1.On recueille les fractions montrant une bonne activité antibactérienne lorsquton les teste sur Klebsiella aerogenes A (une variante de NCTC 418) (1-5). On ajoute du chlorure de sodium aux fractions combinées, avec obtention dtune concentration finale de 1,0 M, et on fait passer la solution résultante sur une colonne d'Amberlite XAD-4 de 15 cm de diamètre (volume de lit de 22,4 1) avec un débit de 1,2 1/minute. On élue la colonne d'Amberlite XADC avec 20 1 d'eau désionisée, puis avec un mélange eau/isopropanol (4/1) selon un débit de 500 1/minute, et on recueille des fractions de 8 1. On combine les fractions contenant les sels désirés (2-4) (24 1) et on concentre à 11,4 1 par évaporation. On conserve le concentré pendant environ 65 h à 5"C après réglage à pH 7,0. On concentre davantage cette solution à 3,75 1 et on fait passer la solution résultante sur une colonne de cellulose DE52 de 7,8 x 31 cm, selon un débit de 6 ml/minute. On élue la colonne avec un tampon au phosphate de potassium 0,025 M de pH 7, avec un débit de 4 ml/minute, -et on recueille des fractions de 22 ml. On contrôle les fractions en ce qui concerne l'activité dtinhibition de la P-lactamase RTEM, les fractions 60-135 et 136-210 montrant une bonne activité étant combinées séparément. On fait passer les fractions combinées 60-135 (1580 ml) sur une colonne de QAE Sephadex A25 de 4,8 x 25 cm, selon un débit de 6 ml/minute. On élue cette colonne avec NaCl 0,1 M selon un débit de 4 ml par minute et on recueille des fractions de 20 ml. On contrle-lbs fractions par leurs spectres W et celles ayant un spectre caractéristique des selsde sodium des composés de formule (I) (50-70) sont combinées de manière à être prêtes pour leur traitement ultérieur. On fait passer les fractions combinées (136-210) provenant dtune colonne de cellulose DE52 sur une colonne de QAE Sephadex A25 de 4,8 x 25 cm, selon un débit de 6 ml/minute. On élue la colonne avec NaCl 0,1 M selon un débit de 4 ml/minute et on recueille des fractions de 20 ml. On combine les fractions montrant des spectres d'absorption caractéristiques des sels par tellement purifiés des composés de formule (II) (91-104). Aux fractions combinées, on ajoute du chlorure de sodium (25 g) et on fait passer la solution résultante sur une colonne d'Amberlite XAD-4 de 2,4 x 32 cm, selon un débit de 6 ml/minute. On lave la colonne avec approximativement 50 ml d'eau désionisée et on élue avec un mélange eau/n-propanol (4/1) selon un débit de 5 ml/minute, et on recueille des fractions de 10 ml. On combine les fractions donnant une réaction négative avec le nitrate d'arguent en ce qui concerne le chlorure, mais ayant des spectres UV caracteristiques des sels de sodium des composés de formule (II) (17-30). On évapore les fractions combinées sous pression réduite de manière à éliminer le n-propanol et on lyophilise avec obtention de 585 mg des sels de sodium sensiblement purs des composés de formule (II). Exemple 20 Propriétés des sels de sodium des composés des formules (I) et (Il) 1. Spectres UV : Les sels mixtes de sodium des composés de formule (I) ont un maximum caractéristique à environ 297 m. Les sels mixtes de sodium des composés de formule (II) ont un maximum caractéristique à environ 307 m (un sur deux). 2. Les sels de sodium ont des absorptions caractéristiques du carbonyle du cycle ss-lactame à 1750 cm-1 dans leur spectre IR. 3. L'activité antibactérienne in vitro de la matière préparée sensiblement comme décrit ci-dessus est la suivante : Sel de sodium Sel de sodium Organisme du composé de du composé de formule (I) formule (II) CIM ( g/ml) CIM ( g/ml) Bacillus subtilis A 0,8 0,2 Enterobacter clacae Nl 25,0 25,0 : Escherichia coli 10418 : 1,5 : 1,5 Klebsiella aerogenes A : 12,5 : 6,25 Proteus mirabilis C977 6,25 6,25 : Pseudomonas aeruginosa A : > 100 : > 100 Salmonella typhimarium CT10 3,12 0,8 Serratia marcescens US39 50,0 25,0 Staphylococcus sureus Oxford 0,8 1,5 Staphylococeus aureus Russell 3,12 1,5 Exemple 21 Séparation des sels des composés des formules (Ia) et (Ib) On sépare par chromatographie liquide sous pression élevée une préparation sensiblement pure des sels mixtes de sodium des composés des fomules (Ia) et (Ib), selon le mode opératoire suivant : Colonne : 300 mm x 3,9 mm, remplie d'une garniture "bondapack @ C18 (Waters Associates, Milford, Massachusetts, USA) Solvant : Acétate d'ammonium 0,05 M, réglée à pH 4,5 avec de l'acide acétique dans un mélange de 5 % d'acétoni trile - 95 % d'eau. Débit : 2,5 ml par minute. Détection : Absorption UV à 295 nm. Charges : 50 ,ul d'une solution de 1,6 mg dans 0,5 ml d'eau. Les deux sels de sodium sont séparés en deux pics avec des durées de rétention de 3,45 et 4,45 minutes. L'éluat pour cha que pic est combiné séparément et neutralisé à pH 7 par une solution diluée d'hydroxyde de sodium. On évapore les solutions combinées séparées de manière à obtenir les sels solides désirés des composés des formules (Ia) et (Ib). Exemple 22 Séparation des sels des composés des formules (lia) et (IIb) On utilise le même système que celui décrit dans l'exemple 21 et on sépare les sels mixtes de sodium des composés de formules (IIa) et (IIb) par chromatographie en phase liquide sous pression élevée, avec des durées de rétention de 6,0 et 7,1 minutes. Exemple 23 Voir schéma page suivante (Dans cet exemple, la référence à (Ia), (IIa), (Ib) et (nib) signifie la référence à leurs sels de sodium.) On prépare des spores de Streptomyces olivaceus ATCC 31365 sensiblement comme décris dans l'exemple 14. On utilise la suspension de spores provenant d'une bouteille de Roux comme inoculum pour 75 1 de milieu au stade d'ensemencement stérilisé contenu dans un fermenteur de 100 1 en acier inoxydable, à chicanes. La composition du milieu est la suivante Farine de graines de soja (Arkasoy 50) 1 % Glucose 2 pro Agent anti-moussant Pluronic L81 0,03 % Préparé dans l'eau distillée. On stérilise le milieu à la vapeur dteau dans le fermen- teur pendant 20 minutes à 120 C. On agite la culture au stade d'en- semencement à 140 tours par minute au moyen d'un agitateur à disque à ailettes de 19 cm et on alimente en air stérile à raison de 75 1/minute (à travers un dispositif de distribution à extrémité ouverte). On règle la température à 280C et, après incubation pendans 48 heures, on ajoute 75 1 de la culture d'ensemencement comme inoculum à 1500 1 du milieu de fermentation contenu dans un fermenteur de 2000 1 en acier inoxydable entièrement équipé avec des chicanes. La composition du milieu de fermentation est la suivante : Farine de graines de soja (Arkasoy 50) 2,0 % Glucose 0,9 % Craie 0,02 Vo CoCl2 6H2O 0,0001 % Exemple 23 FILTRAT DE CULTURE ABSORPTION SUR UNE RESINE FORTEMENT BASIQUE FORLiEl3 D'AMBERLITE IRA 458 Elution avec NaC1 0,2 M dans un tampon COMBINAISON DES FRACTIONS CONTENANT Ia, lb, IIa et IIb Elimination des sels sur XAD-4 Elution avec isopropanol/eau EVAPORATION SOUS PRESSION REDUITE POUR ELL'IINER LE: FROPANOL Chromatographie sur Sephades QAE la, lb lIa, IIb Elimination des Elimination des sels sur XAD-4 sels sur XAD-4 ry FRACTIONS DE LYOPHILISATION FRACTIONS DE LYOPHILISATION CONTENANT Ia, Ib GONTENANT IIa, IIb Chromatographie | Chromatographie sur Sephadex ,I sur HP 20 QAE FRACTIONS CONTENANT Ia, lb FRACTIONS FRACTIONS Chromatographie | CONTENANT IIa CONTENANT IIb sur Diaion HP2O Chr Chromatographie t SC sur Biogel P2 I FRACTIONS FRACTIONS sur CONTENANT Ia CONTENANT Ib FRACTIONS FRACTIONS CONTEN NT IIa CONTENANT IIb Chromatographie sur HP 20 et FRACTIONS FRACTIONS lyophilisation CONTENANT Ia CONTENANT lb Chromatographie lIa Ilb sur HP2O et II Ia lb Agent anti-moussant Pluronic L81 0,2 % (Milieu complété avec de l'eau distillée, pH réglé à 6,0 avant stérilisation.) On agite le milieu de fermentation avec deux agitateurs à disque à turbine de 48 cm de diamètre à raison de 106 tours par minute et on alimente enair à raison de 400 1/mn. On maintient la température à 290C et le pH à 6,5-7,0. On fait la récolte du fermenteur après 48 heures. On prépare du filtrat de culture supplémentaire convenant pour l'extraction des composés (la), (Ib). (IIa), et (IIb) comme suit On utilise une suspension de spores de S. Olivaceus préparée à partir des bouteilles de Roux comme décrit ci-dessus pour effectuer l'inoculation sur 150 1 de milieu au stade d'ensemencement stérilisé contenu dans un fermenteur de 300 1 en acier inoxydable entièrement équipé de chicanes. Le milieu et les conditions de croissance de ce stade d'ensemencement sont essentiellement tels que décrits ci-dessus. Après 48 h, on utilise 150 1 du milieu au stade d'ensemencement pour effectuer l'inoculation de 3000 1 de milieu de fermentation contenu dans un fermenteur en acier inoxydable équipé entièrement de chicanes.On poursuit le stade de fermentation dans des conditions sensiblement similaires à celles décrites ci-dessus, sauf que l'on effectue la récolte de fermentation après 55 heures. Toute la liqueur provenant des fermenteurs de 2000 1 et 5000 1 préparée comme décrit ci-dessus donne un volume combiné de 4525 1. On clarifie la liqueur par filtration sur un filtre rotatif à vide à prérevêtement, les filtrats combinés donnant 4200 1 de liqueur clarifiée. On soumet la liqueur clarifiée à une percolation avec un débit de 10 1/minute à travers des colonnes de résine échangeuse d'anions fortement basique constituée par de l'Amberlite IRA 458 (sous forme de chlorure).On lave la résine avec 60 1 d'eau désionisée, puis on effectue ltelution au moyen d'une solution aqueuse de NaC1 0,2 M et de phosphate de sodium 0,075 M à pH 6,7. L'élution de Ia, Ib, IIa et IIb commence lorsque la conductibilité de l'éluant atteint celle de NaCl 0,1 M, et elle est terminée lorsquton a recueilli 450 1 d'éluant. Lorsque cela est nécessaire, on détermine la présence de (Ia), (Ib), (IIa) et (IIb) en utilisant un système- de chromatographie analytique en phase liquide sous pression élevée avec le procédé de préparation décrit dans l'exemple 21. Aux éluats combinés contenant (Ia), (Ib), (IIa) et (IIb) provenant de la colonne IRA 458, on ajoute de l'Amberlite XAD-4 (poids à l'état humide 90 g). On règle le mélange à pH 6,0 en utilisant de l'acide chlorhydrique à 50 % et on agite doucement à 5 C pendant 1 heure. On filtre alors la résine et on la lave à l'eau désionisée à 50C jusqu'à ce que la conductibilité des liqueurs de lavage soit inférieure à celle d'une solution de NaCI 0,05 M. On met la résine lavée en suspension dans 42 1 d'un mélange isopropanol/eau (1/1) et on ajoute du NaOH à 20 % en poids/ volume jusqutà ce que le pH soit constant à 7,5. On filtre lté- luant et on le conserve.On répète ltélution de la résine avec une autre portion d'isopropanol/eau ( et finalement on répète le processus en utilisant un mélange isopropanol/eau (1/3). On combine les éluats (130 1) et on évapore sous pression réduite pour éliminer l'isopropanol. On effectue la percolation de la solution résultante (67 1) avec un débit de 15 1/beure sur une colonne de QAE Sephadex A25 (15 x 43 cm) prééquilibrée dans NaCl 0,1 M. On lave la colonne avec 7,5 1 de solution aqueuse de NaCl 0,05 M, on élue avec NaCl 0,1 M avec un débit de 7,8 1/heure, et on recueille des fractions de 500 ml. On contrôle les fractions en ce qui concerne la présence de (Ia), (Ib), (IIa) et (Ilb) par chromatographie liquide sous pression élevée.On combine les fractions (12,6 1) contenant (Ia) et (Ib), qui sont éluées ensemble, et celles contenant (IIa) et (IIb), qui sont éluées ultérieurement, sont également combinées (5,9 l). Aux fractions combinées contenant (Ia) et (Ib), on ajoute 44,16 g/l de NaCl. On soumet la solution résultante à la percolation avec un débit de 5,8 1/heure à travers une colonne d'Amberlite XAD-4 (10 x 36 cm). On lave la colonne avec 3 1 d'eau désio nisée à raison de 2,9 l/h, puis on élue avec un mélange isopropanol/eau de 1/9. L'éluant contenant (la) et/ou (lb) selon des concentrations appropriées, ce qui est révélé par une chromatographie liquide sous pression élevée, est recueilli après que la conductivité de l'éluant soit tombée à un niveau équivalent à celle d'une solution aqueuse de NaCI O,OlM.La solution de ltéluat (7,7 1) contenant (Ia) et (Ib) est réglée à pH 7,0 en utilisant NaOH à 20 % en poids/volume, on la concentre sous pression réduite et on lyophilise avec obtention d'un solide (38,5 g). On traite de façon analogue les éluats combinés provenant de la colonne de QAE Sephadex A25 contenant (IIa) et (IIb), avec obtention d'un solide (13,7 g). On dissout le produit lyophilisé (38,5 g) provenant de la colonne XAD-4 contenant (Ia) et (Ib) dans de l'eau désionisée (50 ml) et on fait passer sur une colonne de QAE Sephadex A25 (7,8 x 30 cm) préparée dans de l'eau désionisée. On lave la colonne avec 4 1 de solution aqueuse de NaCl 0,05 M, puis on élue avec NaCl 0,08 M, dans les deux cas avec un débit de 8 ml/minute. On recueille des fractions d'environ 20 ml à partir du débit de l'é- lution, on contrôle les fractions en ce qui concerne leur spectre UV et celles ayant des spectres en accord avec la présence des composés (la) et (lb) (130-170) sont combinées (950 ml). On effectue la chromatographie sur une colonne de Sephadex QAE à 50C. On prend une partie (450 ml) des fractions combinées contenant (Ia) et (lb) provenant de la chromatographie sur Sephadex QAE et on ajoute NaGl (23,8 g). On fait passer la solution résultante sur une colonne de Diaion HP20 (4,8 x 62 cm) (Mitsubishi Ghemicals Std, Agents Nippon Rensui Co., Fuji Bldg, 2-3 Marunou- chi, 3-Chrome, Chiyoda - Ku, Tokyo 100, Japon) selon un débit de 12 ml/mn et on recueille des fractions d'environ 20 ml. On contrôle les fractions par leurs spectres UV et on combine séparément celles contenant (Ia) (58-74) et (lb) (78-97), on concentre par évaporation sous pression réduite et on lyophilise avec obtention respective de 490 mg et 357 mg de solides. On traite les éluats combinés restants provenant de la colonne de QAE contenant (Ia) et (lob) d'une manière similaire, avec obtention de 363 mg et 258 mg de solides contenant respectivement (Ia) et (Ib). On dissout une partie (538 mg) du solide contenant (Ia) provenant du procédé ci-dessus dans de l'eau désionisée (25 ml) et on fait passer sur une colonne de Biogel P2 (particules de 0,074mm -0,037 mm) (7,8 x 40 cm). On élue la colonne avec de l'eau désio- nisée selon un débit de 3 ml/minute et on recueille des fractions de 25 ml. On effectue la chromatographie à 50C. On contrôle les fractions par leur spectre UV et celles ayant un spectre caractéristique de (la) très purifié (37-42) sont combinées, On concentre les fractions combinées par évaporation sous pression réduite à environ 10 ml. On fait passer la solution résultante sur une colonne de Diaion HP20 de 3,0 x 50 cm (qualité pour chromatographie). On élue la colonne avec de l'eau désionisée selon un débit de 5 ml/minute et on recueille des fractions de 10 mi. On contrôle les fractions par leur spectre UV et celles ayant un spectre caractéristique de (Ia) très purifié (50-62) sont combinées, on concentre sous pression réduite et on lyophilise avec obtention d'un solide (40 mg) de (la). On dissout une partie (5,8 mg) des solides contenant (lb) provenant de la chromatographie sur HP20 dans environ 25- ml désionisée et on fait passer la solution résultante sur une colonne de Biogel P2 de 7,8 x 40 cm. On élue la colonne avec de l'eau désionisée selon un débit de 3 ml/minute et on recueille des fractions de 25 ml. On combine les fractions contenant (lob) très purifié (32-37), ce qui est révélé par leur spectre UV. On évapore les fractions combinées sous pression réduite à environ 10 ml et on fait passer la solution résultante sur une colonne de Diaion HP20 de 2,4 x 40 cm (qualité pour chromatographie).On élue la colonne à l'eau désionisée à raison de 5 ml/minute et on recueille des fractions de 10 ml. On vérifie les fractions par leur spectre UV, on combine celles contenant (lob) très purifié (35-48) et on lyophilise avec obtention de 53 mg de (lob) solide. On dissout une partie du solide lyophilisé (7 g) provenant du stade d'élimination du sel sur XAD-4 contenant (IIa) et (IIb) dans de l'eau désionisée (50 ml) et on fait passer sur une colonne de Diaion HP20 de 4,8 x 57 cm. On élue la colonne avec-de l'eau désionisée à raison de 10 ml/minuté et on recueille des fractions d'environ 20 mi. On vérifie les fractions par leur spectre UV, on combine séparément celles contenant (IIa) (49-63) et celles contenant (nib) (71-110) et on lyophilise avec obtention respective de 875 mg et de 1,47 g de solides. On traite le solide (IIa) et (IIb) restant provenant du stade XAD-4 d'une manière similaire, avec obtention de 860 mg et de 1,44 g respectivement de (IIa) et de (IIb). On dissout une partie (860 mg) de (lia) préparé ci-dessus dans 25 ml d'eau désionisée et on fait passer sur une colonne de Biogel P2 (particules de 0,074 mm - 0,037 mm) (7,8 x 40 cm). On élue la colonne à l'eau désionisée à raison de 3 ml/minute et on recueille des fractions de 25 mi. On combine les fractions contenant (IIa) très purifié, ce qui est révélé par leur spectre UV (42-50). On concentre les fractions combinées à environ 10 ml par évaporation sous pression réduite et on charge sur une colonne de Diaion HP20 de 2,8 x 40 cm (qualité pour chromatographie).On élue la colonne à l'eau désionisée, on contrôle les fractions par leur spectre UV et on combine celles avec un spectre caractéristique de (IIa) très purifié (52-64). On concentre les fractions combine nées par évaporation et on lyophilise avec obtention d'un solide (95 mg) de (IIa). On dissout une partie (750 mg du (IIb) préparé ci-dessus dans environ 25 ml d'eau désionisée et on fait passer sur une colonne de Biogel P2 (particules de 0,074 - 0,037 mm) (7,8 x 40 cm). On élue la colonne à l'eau désionisée à raison de 3 ml/ minute et on recueille des fractions de 25 ml. On combine les fractions contenant (IIb) très purifié, ce qui est révélé par leur spectre W (47-55). On évapore les fractions combinées sous pression réduite à environ 10 ml et on applique cette solution sur une colonne de Diaion HP20 de 2,8 x 42 cm (qualité pour chromatographie). On élue la colonne à l'eau désionisée à raison de 5 ml/minute. On recueille les 25 premières fractions sous forme de fractions de 5 ml et les fractions restantes sous forme de fractions de 10 ml.On contrôle les fractions par leur spectre W, on combine celles contenant (IIb) très purifié (77-91) et on lyophilise avec obtention d'un solide (105 mg) de (IIb). Exemple 24 Propriétés des sels de sodium des composés des formules (Ia), (lb), (lIa) et (IIb). Les matières préparées en principe comme décrit dans lieu xemple 23 et sensiblement pures ont les propriétés suivantes (1) Spectres UV Ia Un seul maximum à 298 nm (extinction molaire =8.131) (voir figure 1) Ib Un seul maximum à 301 nm (extinction molaire #=7.930) (voir figure 2) IIa 2 maxima à 228 et 308 - 309 nm (= 13.627) (voir figure 3) Ilb 2 maxima à 229 et 308 - 310 nm ( = 13.933) (voir figure 4) (Sur les Fig. 1 à 4, les absorptions sont portées en ordonnées et les longueurs d'ondes en millimicrons en abscisses). (2) L'activité antibactérienne des sels de sodium déterminée par le procédé de microtitrage est indiquée dans le tableau A. (3) L'activité d'inhibition des ss-lactamases des sels de sodium est indiquée dans le tableau B. (4) Spectres RMN Ia Voir figure 5 pour le spectre dans D20 Ib Voir figure 6 pour le spectre dans D20 IIa Voir figure 7 pour le spectre dans D20 IIb Voir figure 8 pour le spectre dans D20 (5) L'activité de synergie des sels de sodium est indiquée dans le tableau C. (6) Les sels de sodium ne produisent pas d'effets toxiques manifestes chez les souris lorsqu'ils sont administrés en solution aqueuse par voie sous-cutanée à raison de 50 mg/kg. La posologie d'administration des composés suivant l'invention est adaptée à la nature et à la gra vité de l'infection, selon les règles usuelles en matière d'antibiotiques. TABLEAU A CIM ( g/ml) Ampi Souche Ia Ib IIa IIb cilline B. subtilis 0,16 1,2 0,08 2,5 #3,0 Enterobacter : 2,5 : 10 : 2,5 : 10 : 200 Cloacae Nl E. coli 10418 0,3 2,5 0,3 5,0 #3,0 E. coli JT 39 s 5,0 : 2,5: 5,0 : 5,0 800 E. coli JT 68 D 5,0 : 2,5: 10 : 5,0 1600 E. coli JT 410 0,6 5,0 0,6 5,0 200 Klebsiella A 2,5 : 5,0: 1,2 : 5,0: 100 Klebsiella E70 : 10 : 5,0: 10 : 10 : 400 Klebsiella Ba95 : 40 : 10 : 40 : 10 > 6400 proteus mirabilis 0,6 10 0,6 10 #3,0 C977 Proteus mirabilis: 5,0 : 10 : 10 : 20 : 400 : C889 Proteus morganii 2,5 10 2,5 20 100 1580 Proteus vulgaris 5,0 10 10 20 400 Q3618 : Pseudomonas : aeruginosa A : > 160 > 160 > 160 : > 1600 : Salmonella CT10 0,3 2,5 0,3 5,0 #0,3 Serratie US39 20 10 20 10 1600 Staph. Oxford 1,25: 1,2: 0,3 : 2,5: # 3,0 Staph. Russell 0,6 2,5 0,3 2,5 400 Staph. Smith : 0,6 : 2,5: 0,6 : 2,5: # 3,0 Strep. faecalis : 1,25: 20 : 1,2 : 20 : # 3,0 TABLEAU B I50 ( g/ml) Composé Entero- Ps.aerug proteus E.coli Staph bacter P99 A C889 JT4 Russell IIa 0,02 3,0 0,04 > 2,0 0,08 IIb 0,04 4,0 0,4 0,1 > 2,0 Ia 0,02 4,0 0,1 > 2,0 3,25 Ib 0,04 4,0 > 2,0 0,28 > > 2,0 TABLEAU C CIM ( g/ml) Composé Staph aureus E.coli JT39 Russell Ampicilline seule 1000 2000 0,1 g/ml > 10 > 500 +(Ia) 1 g/ml - 500 0,1 g/ml > 10 500 +(Ib) 1 g/ml 10 31,2 0,1 g/ml 10 > 500 +(IIa) 1 g/ml - 500 0,1 g/ml > 10 500 +(IIb) 1 g/ml 10 31,2 REVENDICATIONS t.- Composé de formule (I) ou (II) : ou sel de ce composé. 2.- Composé de formule (Ia) ou sel de ce composés 3.- Composé de formule (Ib) ou sel de ce composé. 4.- Composé de formule (IIa) ou sel de ce composé. 5.- Composé de formule (IIb) ou sel de ce composé. 6b Sel pharmaceutiquement acceptable suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5. 7.- Sel de métal alcalin ou alcalino-terreux suivant la revendication 6, notamment sel de sodium ou de potassium. 8.- Sel suivant la revendication 6 ou 7, ayant une pureté d'au moins 50 X, plus particulièrement d'au moins 75 % et plus spécialement d'au moins 90 %. 9.- Sel du composé de formule (Ia) suivant l'une quelconque des revendications 6 à 8, ne renfermant pas de sel du composé de formule (Ib). 10.- Sel du composé de formule (Ib) suivant l'une quelconque des revendications 6 à 8, ne renfermant pas de sel du composé de formule (Ia). 1.- Sel du composé de formule (IIa) suivant l'une quelconque des revendications 6 à 8, ne renfermant pas de sel du composé de formule (IIb). 12.- Sel du composé de formule (IIb) suivant l'une quelconque des revendications 6 à 8, ne renfermant pas de sel du composé de formule (IIa). 13.- Sel de métal alcalin, notamment sel de sodium du composé de formule (Ia). ce sel de métal alcalin ayant un coefficient d'extinction molaire, lorsqu'il est dissous dans l'eau à pH neutre, non inférieur à 7700 et plus spécialement non inférieur à 7900. 14.- Sel de métal alcalin, notamment sel de sodium, du composé de formule (Ib) : ce sel de métal alcalin ayant un coefficient d'extinction molaire lorsqu'il est dissous dans l'eau à pH neutre non inférieur à 7700, et plus spécialement non inférieur à 7900. t5.- Sel de métal alcalin, notamment sel de sodium, du composé de formule (IIa) : ce sel alcalin ayant un coefficient d'extinction molaire non inférieur à 13.000 et plus spécialement non inférieur à 13.500 lorsqu'il est dissous dans l'eau à pH neutre. I6.- Sel de métal alcalin, notamment sel de sodium, du composé de formule (IIb) : ce sel de métal alcalin ayant un coefficient d'extinction molaire non inférieur à 13.000 et plus spécialement non inférieur à 13.500 lorsqu'il est dissous dans l'eau à pH neutre. 17.- A titre de médicament, composé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 16. 18,- Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle renferme un composé suivant l'une quelconque des revendications t à 17 et un excipient pharmaceutiquement acceptable. 19.- Composition sutant la revendication 18, caractérisée en ce qu'elle contient de 50 à 500 mg d'un composé suivant l'une quelconque des revendications t à 17. 20.- Composition suivant la revendication 19, adaptée en vue de son administration par injection. 21.- Composition suivant l'une quelconque des revendications 18 à 20, caractériséè en ce qu'elle renferme une pénicilline ou une céphalosporine. 22.- Procédé de préparation d'un composé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on cultive une souche de production de Streptomyces olivaceus ou Streptomyces qAnensis jus qu'à ce qu'une quantité notable de ce composé soit produite, puis on récupère le composé précité à partir du milieu de culture. 23.- Procédé suivant la revendication 22, caractérisé en ce qu'on utilise Streptomyces olivaceus ATCC 31126 ou Streptomyces olivaceus ATCC 31365 ou encore un mutant à rendement élevé de l'une de ces souches. 24.- Procédé de préparation d'un sel du composé de formule (Ia) ne renfermant pratiquement pas de composé de formule (Ib), caractérisé en ce qu'on soumet un mélange des sels précités à une séparation chromatographique sur une résine Diaion HP 20 ou sur une résine chromatographiquement équivalente. 25.- Procédé de préparation d'un sel du composé de formule (lob) ne renfermant pratiquement pas de composé de formule (la), caractérisé en ce qu'on soumet un mélange du sel précité à une séparation chromatographique sur une résine Diaion HP 20 ou sur une résine chromatographiquement équivalente. 26.- Procédé de préparation d'un sel du composé de formule (IIa) ne renfermant pratiquement pas de composé de formule (IIb), caractérisé en ce qu'on soumet un mélange des sels précités à une séparation chromatographique sur une résine Diaion HP 20 ou sur une résine chromatographiquement équivalente. 27. Procédé de préparation d'un sel du composé de formule (IIb) ne renfermant pratiquement pas de composé de- forlnule (IIa), caractérisé en ce qu'on soumet un mélange des sels précités à une séparation chromatographique sur une résine Diaion HP 20 ou sur une résine chromatographiquement équivalente. 28.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 24 à 27, caractérisé en ce que le sel est un sel de métal alcalin tel que le sel de sodium. 29.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 24 à 28, caractérisé en ce que le solvant utilisé est de l'eau. 30.- Composé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'il est préparé par le procédé suivant l'une quelconque des revendications 22 à 29.