Brevet FR2397449A1 — publié le 19790209

La présente invention concerne d'une façon générale le marquage de molécules biologiquement actives. Il est bien connu que l'on peut suivre commodément la position de molécules biologiquement actives en fixant divers traceurs ou diverses marques sur les molécules. De telles marques connues comprennent des radioisotopes (voir par exemple le brevet des E.U.A. nO 3 555 143, aux noms de Axen et autres), des matières fluorogéniques (voir par exemple le brevet des 3.U.A. nO 5 940 475, au nom de Gross, et le brevet des E.U.A. no 3 992 631 au nomade Harte) et des enzymes (voir par exemple le brevet des E.U.A. nO 3 645 090, aux noms de Schuurs et autres), toutes ces marques pouvant être fixées sur ou faire partie de substances biologiquement actives telles que des anticorps, des antigènes, des enzymes, des hormones, etc.. Les substances marquées peuvent être utilisées ensuite dans diverses applications comme pour suivre le cheminement de médicaments ou dans des techniques analytiques comme des déterminations immunologiques. k l'exception de la description publiée très récemment du marquage chimioluminescent de la thyroxine par E. R. Schroeder et autres dans Clinical Chemistry, Vol. nO 23, n0 6, page 1132 (1977), la demanderesse n' a connaissance d'aucun rapport antérieur décrivant des marques chimioluminescentes pour des matières biologiquement actives. On a maintenant trouvé que des marques chimioluminescentes peuvent entre fixées sur des matières biologiquement actives pour donner des produits conjugués utiles dans lesquels les propriétés combinées de chimioluminescence et d'activité biologique sont maintenues. On donne ci-après des descriptions détaillées des produits conjugués et de procédés pour les préparer et pour les utiliser. Les produits conjugués biologiquement actifs marqués comprennent une molécule chimioluminescente liée par covalence à une molécule biologiquement active, la liaison étant effectuée par des groupes sur chaque molécule autres que les groupes qui sont essentiels pour la chimioluminescence ou l'activité biologique. Les produits conjugués peuvent aussi être décrits comme des substances ayant deux constituants distincts, un constituant chimioluminescent et un constituant biologiquement actif. Le constituant chimioluminescent comprend une molécule (ou un résidu de molécule) ayant des groupes chimio luminescents fonctionnels et des groupes chimiques non-fonctionnels. Le constituant biologiquement actif comprend une molécule (ou un résidu de molécule) ayant des groupes (ou sites) biologiquement actifs fonctionnels et des groupes chimiques nonfonctionnels.Dans le produit conjugué, 1' enchainement par covalence est effectué par des groupes non-fonctionnels sur chaque molécule et le produit conjugué a les propriétés de chimioluminescence et d'activité biologique. Dans une application, les produits conjugués peuvent être utilisés en tant qu'un cons tituant d'une réaction anticorps-antigène (haptène) et ainsi utilisés pour des déterminations immunologiques. Aux dessins annexés, donnés à titre d'exemples non limitatifs La figure 1 est un graphique illustrant la relation entre la quantité de lumière émise et la concentration de luminol. La figure 2 est un graphique illustrant une courbe de précipitine pour un produit conjugué luminol-immunoglobuline (du lapin). La figure 9 est une courbe dose-réponse obtenue en utilisant un des produits conjugués décrits ici. La figure 4 est une courbe de déplacement pour un produit conjugué luminol-immunoglobuline (humaine). La particularité essentielle de la présente description est la découverte de la demanderesse que des composés chimioluminescents fonctionnels peuvent être liés par covalence à des matières biologiquement actives fonctionnelles pour donner des produits conjugués ayant les propriétés combinées de chimioluminescence et activité biologique. L'expression "composé chimioluminescent" (cil), telle qu'utilisée ici, désigne les composés (ou leurs résidus) qui, dans un environnement approprié de réaction chimique (par exemple dans des conditions d'oxydation), sont capables d'émettre de la lumière (radiation électromagnétique visible). Typiquement, la quantité de lumière émise sera en relation avec la quantité de composé chimioluminescent (ou de résidu présente. Des composés chimioluminescents représentatifs comprennent le luminol et ses dérivés, la luciférine, la lucigénine, l'acridinde, le pyrogallol, des indoles, la riboflavine, la lophine, des colorants thiaziniques, les anhydrides oxaliques, le siloxène, des composés de Grignard, etc.. Pour les buts de la présente description, la seule exigence concernant le composé chimioluminescent (en dehors de sa propriété d'émettre de la lumière dans des conditions appropriées) est que le composé ait au moins un groupe chimique (pas essentiel pour l'émission de lumière) capable de former des liaisons covalentes (directement ou indirectement en passant par des composés intermédiai- res) avec une matière biologiquement active sans inhiber 1' ac- tivité biologique.De tels groupes chimiques non-fonctionnels pour un composé chimioluminescent (SOLO) donné peuvent être déterminés facilement par l'homme de l'art soit par connaissance de la structure du OL soit par des expériences simples. Un CLC tel que décrit ici diffère d'un composé luminescent en ce qu'il émet de la lumière quand il est excité chimiquement plu tôt que quand il est excité par une radiation. L'expression t'substance biologiquement active, telle qu'utilisée ici, désigne les substances (typiquement des composés) qui ont-au moins un groupe fonctionnel ou un site actif participant à au moins une réaction biochimique dans des organismes et au moins un groupe chimique non-fonctionnel (pas essentiel pour la fonction du site actif) qui est disponible pour former des liaisons covalentes (directement ou indirectement en passant par des composés intermédiaires) avec le ou les groupes non-fonctionnels du composé chimioluminescent. Ces composés biologiquement actifs comprennent des anticorps, des antigènes, des haptènes, des enzymes, des cofacteurs, des hormones, des médicaments, des produits pharmaceutiques, etc., qui ont tous des constituants biologiquement actifs ou des sites actifs. Le groupe chimique non-fonctionnel disponible pour. enchatnement sur le CL peut être déterminé facilement par l'homme de l'art. Bien que les produits conjugués biologiquement actifs chimroluminescents selon la présente invention puissent être utilisés dans une application quelconque dans laquelle il est souhaitable de marquer des substances biologiquement actives, les produits conjugués sont spécialement utiles -comme constituants marqués pour des déterminations immunologiques. L'expression "détermination immunologique" désigne n'importe lesquelles de diverses techniques d'analyse qui, à un certain stade, comportent la complexation très spécifique entre un anticorps donné et une substance à laquelle l'anticorps est spécifique (par exemple un antigène ou un haptène). En raison de la spécificité des complexations immunochimiques, les techniques immunologiques se sont révélées spécialement utiles pour déterminer la présence ou la concentration de substances qui sont présentes en très petites quantités dans un liquide donné (par exemple spécialement des liquides du corps humain). Les déterminations immunologiques exigent couramment que l'un des constituants de la complexation immunochimique (l'anticorps, l'antigène ou l'haptène) soit marqué par une substance facilement détectable telle qu'un radioisotope, une matière fluorogénique ou un enzyme. La quantité de cette substance marquée (ou d'une portion de cette substance) est finalement mesurée dans la détermination immunologique. Bien que diverses-techniques de détermination immu biologique aient été élaborées en~réponse à des besois analytiques donnés et à des limitations données, une détermination immunologique typique (dans ce cas illustratif utilisant des antigènes marqués) exige quatre étapes fondamentales : une étape d'incubation, une étape de séparation, une étape de mesure de la quantité de marque, et une étape de corrélation. étape dtincubation fait intervenir une compétition entre une quantité inconnue d'antigène (non-marqué) et une quantité connue d'antigène (marqué) pour un nombre limité de sites de complexation sur des anticorps spécifiques à I1 antigène (dans les formes tant non-marquée que marquée). Après une période d'incubation appropriée, les produits complexés (qui doivent comprendre au moins un peu de matière marquée) sont séparés du milieu d'incubation (qui contient la matière marquée restante) par des procédés connus. Pour faciliter l'étape de séparation, on peut fixer un des constituants sur une matière de support insoluble de manière qu'il en résulte une phase dite solide.L'utilisation de supports organiques comme partie d'une telle phase solide est décrite dans le brevet des E.U.A. nO 3 555 143 aux noms de Axen et autres. L'utilisation de supports inorganiques est décrite dans le brevet des E.U.A. n0 3 652 761 au nom de Weetal et dans le brevet des E.U.A. n0 3 975 511 aux noms de Vann et autres. Après séparation, on mesure la quantité de marque associée aux complexes séparés ou à la solution restante et on compare ensuite cette quantité à un étalon (par exemple une courbe étalon) pour déterminer la présence ou la concentration inconnue. il y a lieu de souligner que l'on connalt des variantes à la technique ci-dessus. Voir, par exemple, Radioimmunoassay Methods, Ed. E. E. Kerkham et W. M. Hunter Churchill, Livingston, Edimbourg et Londres (1971). Voir spécialement le chapitre de L,Wide "Solid Phase Antigen-Antibody Systems", pages 405 à 413. Dans les exemples ci-après, l'utilité des présents produits conjugués est illustrée par des techniques courantes de détermination immunologique, bien que, comme spécifié cidessus, les produits conjugués puissent être utilisés dans une application quelconque qui comporte le marquage d'une substance biologiquement active quelconque pour une application quelconque. EXEMPLE 1 Préparation de produits conjugués luminol-immunoglobuline (du lapin) Le luminol est représentatif des composés chimioluminescents qui peuvent être utilisés comme marque pour une molécule d'antigène (ou d'anticorps) dans une détermination immunologique. Le domaine d'application englobe tous les types de déterminations immunologiques comportant une séparation d'antigène libre et lié à un anticorps. Le procédé de détermination fait intervenir l'oxydation du luminol donnant une lumière visible d'une longueur d'onde de 430 nm environ. La quantité d'antigène (ou d'anticorps) marqué au luminol est directement proportionnelle à l'intensité lumineuse mesurée par un tube photomultiplicateur.La quantité d'antigène marqué au luminol lié à l'anticorps diminue avec des quantités croissantes d'antigè- ne non-marqué. Cette courbe dose-réponse peut être utilisée pour mesurer des quantités inconnues antigène dans un sérum. On a effectué une expérience en utilisant de la gamma-globuline de lapin (RIgG) comme antigène marqué et de l'anticorps de chèvre produit contre l'lez du lapin. On a obtenu une courbe doseréponse en utilisant des quantités d'IgG de lapin de 5 à 25/ug. On a déterminé qu'un échantillon de sérum de lapin normal (en abrégé ERS) contenait 10 mg/cm3 d'IgG. Cela est en accord avec ce qu'on considère comme étant la teneur normale en IgG dans le sérum de lapin normal. Comme indiqué ci-dessus, un avantage pratique de la présente découverte est que dans une détermination immunologique on peut utiliser une molécule simple telle que celle du luminol au lieu de traceurs radioactifs ou d'un marquage par enzyme ou spin. La détermination immunologique par chimioluminescence du luminol fait appel à des matières et à un matériel très peu motteux. Le traceur luminol est bien plus stable que des traceurs radioactifs ou du type enzyme. Couplage covalent du luminol Le luminol a la structure Le groupe amine aromatique peut être utilisé de nombreuses manières différentes pour former un complexe cavalent entre le luminol et des protéines, des hormones, des hydrates de carbone ou d'autres molécules biologiquement actives. On a utilisé trois techniques de couplage différentes. Tout d'abord, on a utilisé la diazotation directe du luminol en utilisant du nitrite de sodium dans de l'acide acétique Le luminol diazoté réagira avec les résidus de tyrosine et d'histidine dans des protéines pour former une liaison diazo. La deuxième technique a consisté à utiliser une oxydation au périodate de groupes hydrate de carbone sur des glycoprotéines ou des molécules d'hydrate de carbone pour former des groupes aldéhyde. Ces groupes aldéhyde réagiront avec le groupe amino du luminol pour former une liaison imine (ou base de Schiff). On a utilisé cette technique pour le couplage du luminol avec l'ifs de lapin. On a utilisé une troisième technique pour préparer d'abord un dérivé dichloro-triazinyle du luminol en utilisant du chlorure cyanurique comme suit Le groupe chloro du DUAL réagira alors avec de nombreux nucléophiles différents tels que des groupes amine ou hydroxyle pour former une liaison chimique stable avec de nombreuses molécules différentes. Produit conjugué lumino-IgS de lapin Le mode opératoire a consisté à dissoudre d'abord 1 mg de luminol et 10 mg d'ego de lapin dans 5 cm3 d'eau. Ensuite, on a ajouté 3 cm3 d'une solution contenant 1,5 mg/cm3 de ICI04 et on a réglé le pH à 4,7 avec du HCl 4N. On a agité la solution dans l'obscurité pendant 45 minutes. On a ajouté ensuite 1 cm3 supplémentaire de la solution de KlO4 et on a réglé le pH à 7,2 avec du NaOH 4N.Ensuite, après 2 heures supplémentaires dans l'obscurité, on a fait passer la solution à travers une colonne de Sephadex G-25-Fine pour éliminer le luminol n'ayant pas réagi Les fractions contenant de la protéine ont été combinées et ensuite on a déterminé leur activité chimuminescente. Les mesures ont indiqué une concentration équivalente de lumi nol de 8 x 17 M mu La teneur estimée en protéine était d'envi- ron 3,5 x 10-7 M. Ainsi, le complexe avait une activité spécifique du luminol dtenviron 1 molécule de luminol pour 4 molé- cules d'IgO. Mesure de l'activité chimioluminescente La réaction chimique est l'oxydation du luminol donnant un anion phtalate, de l'azote et des photons H202 est l'oxydant et l'hémine sert de catalyseur. D'autres composés qui peuvent être utilisés comme catalyseurs ou pour augmenter la vitesse sont des ions métalliques tels que de Fe(II), Fe(CN)63, Cr(lT) et Co(II). D'autres oxydants générateurs de chimioluminescence (CL) comprennent les oxydants hypochlorite, iode, permanganate et oxygène. Le mélange de luminol, de H2Qet d'hémine est effectué dans une cellule à écoulement continu qui est placée près d'un tube photomultiplicateur (PMT), La lumière est produite avec un temps de montée de 1,5 seconde environ et atteint une intensité maximale 30 secondes après le mélange des corps en réaction. Le courant de sortie du PMT est amplifié et ensuite enregistré sur un enregistreur à bandes. L'introduction d'un échantillon contenant du luminol produit une impulsion carrée sur l'enregistreur. La hauteur de l'impulsion, ou pic, est directement proportionnelle à la concentration molaire du luminol. Cela est montré sur la figure 1 qui montre une représentation graphique de la hauteur du pic en fonction de la concentration du luminol.Cette courbe de référence est utilisée pour déterminer la concentration équivalente de luminol (en abrégé X pour les complexes de luminol. Mesure de l'activité inmmunologique de l'I; de lapin marquée au luminol On a utilisé la réaction de précipitine entre l'anti IgG de chèvre et l'IgG de lapin pour déterminer l'activité immunologique du complexe luminol-IgS de lapin (RigG-LUM). Le mode opératoire utilisé a été le suivant Une concentration finale de 8 x 10-7 M de RIgS M a été mise à incuber avec différentes quantités de sérum de chèvre anti-IgG de lapin variant de 1,0 à 50,0 l toute une nuit à 250C dans une solution saline tamponnée au phosphate 0,03 M (PBS O,O3M) - 0,1% BES pH 7,5, un volume final de 0,4 cm3. Les précipités formés ont été centrifugés à 1000 g pendant 45 minutes à 40G et ensuite lavés dans du NaCl 0,15 M. L'activité du luminol a été déterminée dans les précipités après dissolution avec 0,1 cm3 de KOH 0,5M pendant 30 minutes et ensuite réajustement au pH 7,5 avec PBS 0,O3M et 0,1 cm3 de HCl O,5M au volume final de I cm3. On a déterminé ensuite l'ELC dans 0,1 cm3 de cette dernière solution. Les résultats de l'étude de la réaction de précipitine sont présentés sur la figure 2. L'ELC observée dans le précipité est exprimée en pourcentage d'ELC totale offerte ou % lié. Le % lié est reporté graphiquement en fonction de la quantité en /ul d'anti-sérum de chèvre complet ajoutée dans chaque tube. Les concentrations d'anti-sérum et d'IgG marquée donnant le % lié maximal ont été utilisées ensuite pour obtenir une courbe dose-réponse ou de déplacement avec l'lgG de lapin non-marquée. Déplacement de RIgG-Bllmnnol avec RIgG A une concentration finale de 8 x 10 7 M de RIgG-LUE et de 20/ul de sérum GARIgG dans un volume de 0,4 cm3, on a ajouté des portions de 5/ug d'IgG de lapin, de O à 25 g. Les mélanges ont été mis à incuber toute une nuit à 250C dans PBS O,03M - 0,1% BSA pH 7,5. Les précipités ont été contrifugés à 1000 g pendant 45 minutes à 40C et ensuite lavés dans une solution saline 0,15 M. L'activité chimioluminescente a été déterminée après dissolution des précipités dans EOE 0,5 M et réajustement du pH à 7,5 avec HCl 0,5 M et PBS 0,03 M à un volume final de 1 cm3.On a déterminé ensuite l'ELC dans 0,1 cm3 de cette dernière solution. La courbe de référence dose-réponse est présentée sur la figure 3. Le % d'ELC lié est reporté en fonction de la quantité d'IgG de lapin par tube exprimée en loglug. Une représentation semi-logarithmique linéaire est obtenue pour l'intervalle de 5 à 25/ug d'IgG de lapin. On a déterminé ensuite la teneur en IgG de trois échantillons de sérum de lapin normal (ERS) en utilisant le même mode opératoire que celui utilisé pour obtenir la courbe de référence. Les résultats ont indiqué que ce sérum de lapin particulier contenait 10,3 + 1,4 mg IgG/cm9. On considère que le ERS usuel contient 10 mg IgG/cm3. Ainsi, la conclusion est qu'une détermination immunologique à base de luminol peut être utilisée pour déterminer les quantités d'IgG dans le sérum. EXEMPLE 2 Produits conjugués lumino-IRG humaine Du luminol a été combiné chimiquement par la technique du periodate avec de l'IgG humaine en utilisant le même mode opératoire que celui utilisé pour le couplage du luminol avec l'IgG de lapin (décrit ci-dessus). Le complexe avait une acti vité spécifique de luminol d'environ I molécule de luminol pour 6 molécules d'IgG. En utilisant une technique de détermination immunologique similaire à celle utilisée pour l'IgG de lapin, une courbe dose-réponse a été établie pour le produit conjugué luminol-HIgG du présent exemple. Cette courbe est présentée sur la figure 4 où on a reporté le % d'activité de luminol dans l'immuno-précipité (en utilisant de la R-anti-IgG humaine) en fonction de l'Ig; humaine non-marquée ajoutée. Pour l'obtention des résultats présentés sur la figure 4, les tubes à essai ont été mis à incuber pendant 48 heures à 40C.On a obtenu des résultats similaires en utilisant une période d'incubation de 16 heures à 25 C. Ensuite, une détermination immunologique utilisant le marquage luminol-HIgG a été effectuée sur des échantillons normaux de sérum disponibles dans le commerce ayant des concentrations connues d'IgG humaine dans les zones de forte, moyenne et faible concentration. Les déterminations ont été effectuées comme suit Procédé à la préciPitine HIRG-LUM On a établi une courbe normale de déplacement avec 0,05 cm3 de HIgG-LUM (5 x 10-6 M) et des concentrations de O, 5, 10, 15, 20, 25 et 50/ugZtube de HIgO (Cappel) et 0,05 cm3 de la fraction d'IgG; de sérum anti-HIg; de lapin provenant de Miles.Des sérums HIgG normaux provenant de Hyland ont été soumis à des déterminations avec des échantillons de 0,1 cm3 des sérums de référence I et II dilués à 1:100 et du sérum de ré férence III dilué à 1:20 dans PBS 0,03 M - o,tX BSA pH 7,5. Les tubes ont été mis à incuber pendant 48 heures à 40G dans un volume final de 0,4 cm3 dans PBS 0,03 M - 0,1% BSA pH 7,5. Le précipité formé a été centrifugé à 3000 tpm pendant 30 mr- nutes, le liquide surnageant a été éliminé par aspiration et le précipité a été lavé une fois dans t cm3 de 0,15 M NaCI. Pour déterminer le luminol, le précipité a été redissous dans XOH 0,5 N, réglé avec HCl au pH 7, complété à 1 cm3 dans du PBS et ensuite dilue à 1:5 dans du PBS pour lecture. Les résultats trouvés sont en bonne corrélation avec les concentrations normales. Les résultats (déterminations uniques) sont résumés dans le tableau. TABLBÂU I Plages de concentration Par le présent Concentrations = sérums normaux) procédé normales Fortes (I) 16,5 mg/ml 15,3 mg/ml Moyennes (II) 7,5 7,4 Faibles (III) 2,2 2,6 EXEMPLE: 3 Produits conjugués luminol-digoxine Une substance de masse moléculaire peu élevée représentative, la digoxine, a été liée par covalence au luminol comme suit : On a d1 abord dissous 3 mg de digoxine dans 3 cm3 d'alcool de la qualité réactif (alcool éthylique à 95% - dénaturé). On a ajouté ensuite cette solution à une deuxième solution contenant 15 mg de luminol dans du tampon phosphate 0,1 M, pH 7,2. Finalement, on a ajouté goutte à goutte, en agitant, 5 cm3 d'une solution contenant 1,8 mg de méta-periodate de potassium par cm3.On a continué la réaction dans l'obscurité pendant 5 heures à la température ambiante en continuant à agiter. On a effectué la séparation entre le luminol n'ayant pas réagi et le produit conjugué luminol-digoxine en utilisant une colonne de Sephadex G-lO traitée au préalable avec une solution de digoxine. B'analyse du produit conjugué digoxine-luminol par activité du luminol et absorption UV pour la digoxine a indiqué 1 molécule active de luminol pour 25 molécules de digoxine. EXEMPLE 4 Produits conjugués ll1minol-gonadotrophine chorionique humaine (HCG) On a lié par covalence du luminol à de la HCG en faisant réagir du luminol diazoté avec de la HGG que l'on avait fait réagir au préalable avec l'agent d'acylation ester d'acide D-(4-hydroxy-phényl)propionique et de N-hydroxy succinîmide (réactif de Bolton-Hunter) (BHR).La raison pour laquelle on a fait réagir d'abord la HCG avec du BHR était de former sur HCG des résidus supplémentaires du type tyrosine pour réaction avec le luminol diazote. Le mode opératoire utilisé a été le suivant : Tout d'abord, on a dissous 0,5 mg de HCG purifiée dans 5 cm3 de 0,05 M NaHCO3 pH 9, puis on a refroidi la solution à OOC. On a ajouté ensuite 3,5 mg de BHR et on a agité la solution à O C pendant 60 minutes. Tandis que la HCG réagissait avec HBR, on a diazoté le luminol comme suit : On a d'a- bord dissous 2,3 mg de luminol dans 3 cm3 d'acide acétique glacial.On a ajouté ensuite 4 cm3 d'eau et on a refroidi la solution à 000. A ce moment, on a ajouté 1 ,3 mg de NaNO2 et on a laissé la réaction de diazotation se poursuivre pendant 35 minutes à O C. Le luminol diazoté a été ajouté ensuite à la solution de réaction HCG-HBR maintenue à O C. On maintenait le pH à 9 en utilisant 4N NaOH. On a continué la réaction pendant 20 heures à pH 9, à 40C. Ensuite, on a séparé les produits chimiques n'ayant-pas réagi du produit conjugué ECG-luminol en utilisant une colonne de Sephadex G-25 (super-fin).Les fractions contenant HCG ont été soumises à des déterminations d'activité de luminol et de teneur en HC. On a déterminé l'activité de luminol comme décrit ci-dessus et on a déterminé HCG en utilisant la technique RIA. Les résultats ont indiqué un produit conjugué HCG-luminol avec effectivement 1 molécule de luminol pour 2 molécules de HCG. EXEMPLE 5 Produits conjugués luminol-aibumine de sérum bovin (3SA) On a fixé du luminol sur de l'albumine de sérum bovin ( en abrégé) en -formant d'abord du dichlorotriazinyl aminoluminol (DTAL), le produit de la réaction de luminol avec du chlorure cyanurique.On a fait réagir ensuite le DTAL avec ESA. Le mode opératoire utilisé a été le suivant : On a dissous d'abord 60 mg de luminol dans 75 cm3 d'alcool méthylique chaud et on a refroidi la solution à 000. Ensuite, on a dissous 64,5 cm3 de chlorure cyanurique dans 5 cm3 d'acétone, on are- froidi la solution à OOG et on l'a ajoutée ensuite à la solution de luminol. On a laissé la réaction se poursuivre pendant 63 heures à la température ambiante. A ce moment, un précipité jaune a été séparé par filtration, lavé à l'acétone froide et ensuite séché à 25 C dans une étuve sous vide. Le couplage de DTAL-avec BSA a été effectué comme suit : On a dissous d'abord 13,3 mg de BSA dans 2,5 cm d'acide borique 0,1 M à pH 9. Ensuite, on a dissous 4,5 mg de DTAL dans 8 cm3 d'acide borique 0,1 M à pH 9 et on a ajouté la solution à la solution de BSA et on les a fait réagir pendant 20 heures à 4 C, Finalement, on a séparé le DTAL n'ayant pas réagi du produit conjugué BSA- luminol en utilisant une colonne de Sephadex G-25. On a déterminé l'activité de luminol des fractions contenant BISA. Les résultats ont indiqué un produit conjugué BSAAuminol avec une concentration effective de 1 molécule de luminol pour 10 molécules de BSA. EXEMPLE 6 Produit conjugué lucifén.ne-B En utilisant un autre composé chimioluminescent, la luciférine} qui émet de la lumière en présence de luciférase, Mg+2 et ATP, on a préparé un produit conjugué luciférine-BSh en utilisant un composé de diazonium bîfonctionnel formé par synthèse en diazotant de la 4,41-méthylène dianiline (MDA). Le composé bis-diazoique formé en utilisant MDA a formé ensuite des liaisons covalentes tant avec BSÂ qu'avec la luciférine. Le mode opératoire a été le suivant : D'abord, on a dissous 1,3 g de MDA dans 3 cm3 d'eau, On a réglé le pH à 1,8 en utilisant HOl 4N et ensuite on a refroidi la solution à 000. On a ajouté ensuite 1,6 mg de NaN02 et on a laissé la diazotation se poursuivre pendant 35 minutes. En même temps, on a dissous 2 mg de luciférine en même temps que 19,3 mg de ESA dans 8 cm3 de Na2CO3 0,1 M, pH 10, et ensuite on a refroidi la solution à 000. La MDA diazotée a été ajoutée ensuite à un mélange équimolaire de BSA et de luciférine et on a laissé la réticulation se poursuivre pendant 20 heures à 4 C.Ensuite, les produits chimiques n'ayant pas réagi ont été séparés de 3SA en utilisant une colonne de Sephadex G-25. On a déterminé l'activité de luminol des fractions contenant ESA et les résultats ont indiqué que le produit conjugué contenait une concentration effective de 1 molécule de luciférine pour 50 molécules de BSA. EXEMPLE 7 Produits conjugués lucigénine-BSA En utilisant un troisième composé chimioluminescent, la lucigénine, qui émet de la lumière en présence d'eau oxygénée et dthématine, on a préparé un produit conjugué lucigénine BSA en utilisant la réactivité directe de la molécule de lucigénine. La lucigénine réagit avec divers nucléophiles conformément au mécanisme suivant On a couplé la lucigénine à ESA comme suit : D'abord, on a dissous 10 mg de ESA et 6 mg de lucigénine dans 10 cm3 diacide citrique 0,1 M, pH 6. Ensuite, on a agité le mélange à la température ambiante pendant 24 heures.Finalement, on a séparé la lucigénine n'ayant pas réagi du produit conjugué lucigénine BSA en utilisant une colonne de Sephadex G-25. On a contrôlé I1 activité chimioluminescente de la lucigénine du produit conjugué en utilisant la même cellule à écoulement que celle décrite ci-dessus. Les résultats ont indiqué un produit conjugué avec 1 molécule de lucigénine possédant une activité chimioluminescente pour 30 molécules de BSA. Le Tableau III donne la liste des produits conjugués décrits ci-dessus et indique que les présents produits conjugués peuvent entre préparés avec des composés biologiquement actifs de masse moléculaire variable et par diverses techniques de couplage. On indique aussi dans le Tableau III le nombre effectif de résidus chimioluminescents associés à chaque résidu de molécule biologiquement active. TABLEAU III Rapport molaire apparent du constituant Masse moléculaire luminescent au Méthode Produit de la molécule constituant de conjugué conjuguée conjugué couplage Luminol-IgG 160 000 1:6 périodate Buminol- 780 1:25 'I digoxine Luminol-HCG 40 000 1:2 diapo modifié Luminol-BSA 60 000 1:10 triazine Buminol-Ab de lapin 160 000 1:6 périodate Luciférine-BSA 60 000 1 :50 bis-diazo Lucigénine-BSA 60 000 1:30 directe Autres expériences Dans un autre travail, la demanderesse a couplé du luminol avec des molécules d'anticorps de lapin et a obtenu des immuno-précipités ayant une activité de luminol. il est évident que l'invention n'est pas limitée aux modes de mise en oeuvre décrits et qu'on peut y apporter toutes variantes. REVEEDICAXIONS I. Produit conjugué biologiquement actif marqué, caractérisé en ce qu'il comprend deux constituants distincts, un constituant chimioluminescent et un constituant biologiquement actif, les deux constituants étant couplés l'un à autre par une liaison covalente, le constituant chimioluminescent comprenant une substance ayant un groupe chimioluminescent fonc tionnel et au moins un autre groupe chimique disponible pour réaction chimique, le constituant biologiquement actif comprenant une substance ayant un site biologiquement actif fonctionnel et au moins un autre groupe chimique disponible pour réaction chimique, la liaison covalente entre les deux constituants étant réalisée par les groupes sur chaque constituant qui sont disponibles pour réaction chimique. 2. Produit conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que le constituant biologiquement actif est choisi parmi les anticorps, les antigènes, les haptènes, les enzymes, les hormones et les substances pharmaceutiquement actives. 3. Produit conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que le constituant chimioluminescent est choisi parmi le luminol et ses dérivés, la luciférine, la lucigémine, l'acridine, le pyrogallol, les indoles, la ribaflavine, la lophine, les colorants thiaziniques, les anhydrides oxaliques, le siloxène, et les composés de Grignard. 4. Produit conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que le constituant chimioluminescent est lié au constituant biologiquement actif parue liaison diazo. 5. Produit conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que le constituant chimioluminescent est lié au constituant biologiquement actif par une liaison imine. 6. Produit conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que le constituant chimioluminescent est lié au constituant biologiquement actif par une liaison triazine. 7. Produit. conjugué biologiquement actif marqué, caractérisé en ce qutil comprend une molécule chimioluminescente liée par covalence à une molécule biologiquement active, la liaison étant réalisée par des groupes chimiques sur chaque molécule autres que les groupes essentiels pour la chimioluminescence ou l'activité biologique. 8. Produit conjugué selon la revendication 7, caractérisé en ce que la molécule chimioluminescente est celle du luminol et en ce que la liaison avec la molécule biologiquement active est réalisée par une liaison diazo au moyen du résidu amino du luminol. 9. Produit conjugué selon la revendication 7, caractérisé en ce que la molécule biologiquement active est une protéine. 10. Procédé pour déterminer la présence ou la concentration d'une espèce d'une réaction antigène-anticorps dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes (a) on met à incuber un échantillon aqueux contenant l'espèce à déterminer avec une espèce de la réaction antigène-anticorps dans un état non-marqué et l'autre espèce dans un état marqué et comprenant cette espèce liée par covalence à une molécule chimioluminescente; l'incubation étant effectuée dans des conditions suffisantes pour assurer la formation d'au moins certains complexes immunochimiques, dont au moins certains comprennent l'espèce marquée; (b) on sépare les complexes du milieu d'incubation; (c) on détermine la quantité d'espèce marquée associée aux complexes séparés ou au milieu restant; et (d) on compare la détermination de l'étape (c) à un étalon pour déterminer la présence ou la concentration de l'espèce. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'espèce non-marquée est liée à un support insoluble dans 11 eau.