Brevet FR2423541A1 — publié le 19791116

L'invention est relative à un procédé de tri parmi une population de micro-organismes, notamment de bactéries, de celui ou de ceux qui sont porteurs ou producteurs d'un constituant intracellulaire particulier, tel qu'un fragment d'acide nucléique determiné, ou de façon plus générale encore de celui qui, de par son patrimoine génétique particulier, est susceptible de libérer un composé intracellulaire recherché, par exemple une protéine déterminée parmi les produits de son métabolisme. L'invention est encore relative à l'application de ce procédé à l'isolement de recombinants génétiques, notamment de plasmides qui portent une séquence d'ADN spécifique. On sait en effet qu'il est possible par recombinaison génétique in vitro de fragments d'acides nucléiques, notamment désoxyribonucléique (ADN), dont un fragment est recherché ou est à étudier, d'une part, et dtun vecteur (tel que plasmide ou bactériophage), d'autre part, de former des molécules hybrides à partir de ces différents fragments, ces hybrides pouvant alors être clonés dans des bactéries, notamment du type Escherichia coli K12. Celles-ci sont alors aptes à assurer la réplication de ces divers hybrides, dont celui contenant le fragment recherché. I1 est alors possible, après identification et isolement de la souche assurant la réplication de cet hybride particulier, de cultiver cette souche, d'où la possibilité d'obtenir des quantités importantes du fragment d'ADN spécifique recherché. Cette méthode, beaucoup plus efficace pour isoler et produire des quantités relativement importantes par exemple d'un gène déterminé, que les méthodes d'extraetion de purification de ces mêmes gènes à partir de leur génome d'origine, reste cependant tributaire des techniques disponibles pour opérer un tri rapide de la souche particulière contenant le recombinant recherché, parmi les souches ayant en même temps assuré la réplication de tous les autres fragments d'ADN recombinés en même temps que le fragment plus spécialement recherché. On a déjà décrit des techniques d'identification mettant en jeu une hybridation du fragment d'acide nucléique recherché avec une sonde radio-active lorsqu'elle était disponible, une telle sonde comportant alors un fragment d'acide nucléique monocaténaire ou d'acide ribonucléique (ARN) complémentaire de l'acide nucléique recherché, celui-ci ayant le cas échéant fait l'objet d'une dénaturation préalable. Ces méthodes impliquent en général le repiquage d'un grand nombre des colonies formées et la réplication renouvelée des ADN dans chacune des colonies soumises à un nouveau cycle de culture, avant que ne puisse être réalisée l'opé- ration d'hybridation, de sorte que ces méthodes ne permettaient guère d'examiner plus de quelques milliers de clones par jour. Un procédé plus perfectionné a été récemment décrit qui permet un tri beaucoup plus rapide des clones recombinants de phage, ce procédé mettant à profit la découverte qu'une seule plage de phages recombinants Agt contenait suffisamment d'ADN de phage adsorbable sur un filtre de nitrocellulose amené au contact direct de la surface du milieu de culture cpmportant les plages, pour être détecté à l'endroit de son adsorption sur le filtre par une sonde marquée radio-activement, formée de l'acide nucléique complémentaire et apte à s'hybrider avec lui (.D. BENTON, R.W. DAVIS, SCIENCE, vol. 196, pages 180-182, 8 avril 1977). On obtient ainsi une véritable technique d'hybridation in situ, car de l'endroit, sur le filtre, où s'est réalisée l'hybridation, révélée par exemple par autoradiographie, découle la localisation imméd-iate de la plage contenant ceux des phages qui ont donné naissance aux ADN ainsi hybridés, à la surface du susdit milieu de culture. Cette technique décrite qui, selon ses auteurs, permet de déceler une plage positive parmi un nombre de plages qui peut atteindre 2 x 104 sur une seule bolte de Pétri, n'est cependant pas applicable au tri de clones recombinants de plasmides ou de façon plus générale de fragments d'ADN qui ne forment pas de plage. L'invention a donc pour but de fournir une technique d'identification par hybridation in situ de clones recombinants mettant en jeu des ADN de toute nature, autres que de phage. Elle a encore pour but de fournir un procédé qui soit à ce point sensible qu'il permette l'identification sur une seule boîte de Pétri ou analogue d'une colonie positive de micro-organismes, notamment des bactéries ayant autorisé la réplication du fragment d'ADN recherché, au milieu de centaines de milliers, voire même de millions d'autres colonies. Enfin, elle a pour but de fournir un procédé permettant de façon plus générale encore l'identification de souches particulières parmi beaucoup d'autres, contenant ou capables de produire un constituant intracellulaire particulier, tel qu'un type déterminé d'antigène ou de protéine parmi les produits de leur métabolisme. Le procédé de tri selon l'invention parmi une population de micro-organismes, susceptible de se propager sur un milieu nutritif, dont certains sont susceptibles de produire un constituant intracellulaire décelable par une sonde ou réactif spécifi- que, est caractérisé par l'induction dans une culture de cette population de micro-organismes, lorsque ceu'x-ci ont déjà formé des colonies, d'une transformation des conditions de la culture tendant à produire la lyse d'une partie des individus qui composent ladite colonie, le susdit constituant étant alors transférable par contact sur un support distinct, sur lequel il peut être décelé in situ par la susdite sonde ou le susdit réactif spécifique, en un endroit qui est alors corrélable à l'emplacement dans la culture initiale du micro-organisme ayant produit le constituant intracellulaire ainsi décelé. L'invention met à profit la constatation qui a été faite que pratiquement toute colonie est en fait formée d'une population hétérogène d'individus, dont certains sont réfractaires ou susceptibles d'échapper au processus lytique ainsi induit à partir d'un certain stade de développement de la culture. Ces microorganismes, plus particulièrement bactéries l'dormantes", sont cependant susceptibles de donner naissance à de nouvelles colonies capables de reproduire ou répliquer le même constituant, lorsqu'ils sont ramenés dans des conditions de culture normale. Le procédé selon I1 invention permet donc simultanément, d'une part, le transfert par contact sur un support distinct, avantageusement un papier filtre de nitrocellulose, des constituants intracellulaires libérés par la lyse, par conséquent la localisation dans la culture initiale des colonies ayant donné naissance à un constituant déterminé repérable in situ par une sonde ou réactif déterminé, d'autre part, la récupération, par suite la possibilité de multiplication de la souche recherchée etss par voie de conséquence encore, la production en grandes quantités du constituant cellulaire recherché. Ce procédé est donc directement applicable par exemple au tri rapide par hybridation in situ de souches porteuses de recombinants de fragments d'acides nucléiques et de plasmides. Ce procédé s'avère en outre plus sensible que la technique d'hybridation in situ susmentionnée, utilisée pour le tri des plages de phages. En effet, il y a davantage de bactéries dans une colonie de taille modérée que de phages dans une plage de dimension correspondante (une colonie de 1 mm de diamètre contient de l'ordre de 108 bactéries). En outre, le clonage d'une telle souche avec certains vecteurs plasmides produit, au terme de l'opération de réplication, une accumulation de 10 à 50 copies d'ADN cloné par cellule, d'où la concentration beaucoup plus élevée d'ADN qui peut être transférée par contact et adsorbée dans un filtre de nitrocellulose, en vue de l'hybridation in situ avec la sonde correspondante. L'induction de la susdite transformation des conditions tendant à produire la lyse des individus qui composent les colonies des micro-organismes, plus particulièrement des bactéries en cours de culture, peut être réalisée de toute manière appropriee a -la nature et aux caractéristiques propres de ces micro-organismes. Dans un premier mode de mise en oeuvre avantageux du pro-' cédé selon l'invention, on a recours à des bactéries lysogènes dont la lyse est susceptible d'être induite sous l'effet de conditions déterminées, distinctes de celles requises pour la croissance normale de la culture. Une catégorie de bactéries particulièrement utiles sont celles qui sont porteuses d'un prophage capable d'induire- la lyse à une température supérieure à la température de croissance normale de ces bactéries, l'induction de la susdite transformation impliquant alors simplement de porter ltensemble de la culture à ladite température de lyse. Il est avantageux, surtout lorsque les mêmes bactéries doivent être utilisées pour des procédures d'hybridation répétées, d'avoir recours à des souches dont le prophage comprend une ou plusieurs mutations qui l'empêchent de s'exciser du chromosome qui le porte. Ainsi, même après des inductions multiples, le prophage ne sera pas perdu et la souche restera stable. De préférence, et surtout lorsque le procédé selon l'invention est appliqué au clonage d'hybrides d'acides nucléiques et de plasmides, on aura recours aussi à des bactéries lysogènes thermo-inductibles, dépourvues de système de restriction, pour éviter que les recombinants ne soient tués au moment de leur introduction dans la souche. La lysogénie possible des bactéries cultivées n'est nullement une condition essentielle à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. D'une façon générale, tout type de bactérie peut être mis en oeuvre, dans la mesure où l'on a recours à un procédé lytique susceptible d'agir à l'égard de la culture cellulaire, lorsque celle-ci est en voie de division active. Par exemple, I1 induction de la lyse de certaines bactéries peut être produite par une limitation de la teneur du milieu de culture en l'un des principes nutritif s essentiels dont le manque a pour résultat une lyse des micro-organismes en cours de croissance. Par exemple, cette lyse pourra être induite dans des bactéries dap cultivées sur boîte de Pétri ayant une teneur limitée en acide diaminopimélique cap), l'invention mettant ainsi à profit la propriété qu'ont les bactéries dap de ne pouvoir construire leurs parois que si de l'acide diaminopimélique leur est fourni et de lyser lorsqu'elles sont en cours de croissance, dès lors qu'elles manquent d'acide diaminopimélique. L'induction de la transformation des conditions de culture peut également être réalisée à l'aide d'un agent extérieur, par exemple un antibiotique capable de produire la lyse des bactéries en croissance, étant entendu alors que l'existence de bactéries "dormantes" permettra ultérieurement de récupérer la souche identifiée, notamment comme il sera rappelé ou indiqué ci-après. Bien que l'utilisation de bactéries lysogènes soit pré férée, l'utilisation de bactéries non lysogènes peut également être d'un grand intérêt, notamment dans le cas de souches qu il est difficile de transformer en bactéries lysogènes ou encore lorsque la lysogénéisation de l'hôte n'est pas compatible avec les sécu rités biologiques requises, par exemple des types visés par les abréviations B2 ou EK2 (définies notamment dans la publication "LE PROGRES SCIENTIFIQUE", nO 191, novembre-décembre 1977, et dans l'article de A. SKALKA, "GENE" (1978), 3, pages 29-38). Les produits ou constituants intracellulaires libérés par les bactéries lysées peuvent être transférés sur un support distinct, par exemple selon la technique décrite par BENTON et al, notammenten ayant recours à des filtres de nitrocellulose capables de les adsorber, lorsqu'ils sont amenés au contact de la culture. Il est naturellement avantageux de choisir ceux des supports qui seront aptes à permettre la rétention maximum des produits libérés, par exemple supérieure à 85 % des ADN ainsi libérés. Des filtres particulièrement appropriés, à base de nitrocellulose, sont par exemple ceux commercialisés par SCHLEICHER and SCHULL (BA 85). Pour ce qui est des sondes utilisées, on peut avoir recours à toutes techniques en soi connues ou autres. Lorsque le constituant intracellulaire est constitué par un ADN , la sonde alors constituée par un acide nucléique complémentaire, peut être marquée radio-activement selon des techniques connues. On peut également avoir recours à d'autres types de marquage, par exemple enzymatiques. A cet égard, on peut par exemple avoir recours à une sonde modifiée ehimiquement en vue de son couplage avec une enzyme, antérieurement ou postérieurement à la réaction d'hybridation, la séquence d'acidè nucléique étant alors révélable in situ sur le filtre par l'action sur le produit d'hybridation de la sonde ainsi transformée et de l'acide nu cléique recherché, par action sur cet hybride d'un substrat de l'enzyme, de préférence un substrat chromogène. Par exemple, la sonde est modifiée chimiquement par des groupes de biotine liés de façon covalente à la sonde, par l'intermédiaire de cytochrome C, l'hybride étant alors ensuite révéié par couplage de ses groupes biotine avec un produit de couplage de l'avidine et d'une enzyme, telle que la B-galactosidase, révélable à son tour par son action sur le substrat chromogène constitué par ltorthonitrophenol galactoside. Par extension, on aura recours à toute autre sonde ap propre, lorsque le produit recherché n'est pas constitué par une sonde nucléique ou un fragment d'acide nucléique, mais par un constituant différent, tel qu'une enzyme ou un antigène. Dans le premier cas, la sonde ou le réactif spécifique peut être constitué par exemple par un inhibiteur marqué connu de l'enzyme ; dans le second cas, la sonde peut être constituée par un anticorps également marqué et visualisable par toute technique connue, par exemple par immunofluorescence. D'une façon générale, et notamment lorsque l'on a recours aux filtres de nitrocellulose sus-indiqués, ceux-ci peuvent être traités avant ou après l'hybridation des ADN adsorbés avec la sonde, par exemple selon la technique décrite dans l'article déjà mentionné de LETTON 50T et al, ou d'une façon plus générale, avant ou après réaction du constituant intracellulaire recherché et de son reactif spécifique. Conformément à une mise en oeuvre préférée du procédé selon l'invention, la lyse des bactéries en cours de division est induite dans la culture êe, notamment sur boîte de Pétri, au contact du filtre de nitrocellulose ou analogue, contact ou ultérieurement amene au contact des produits libérés par la lyse. C'est cette technique qui est préférée, notamment lorsque l'on a recours à des bactéries lysogènes porteuses d'un prophage thermo-inductlble. Une fois "l1image" de la boîte formée sur le filtre, on peut soit conserver la bote telle quelle, au froid, en vue d'une réutilisation ultérieure, soit ramener les conditions de culture à la normale pour promouvoir la poursuite du développement de la culture en l'absence d'effet lysogène, soit encore repiquer celles des cultures ayant libéré le constituant intracellulaire recherché et révélé, par la sonde ou le réactif spécifique susdit, à l'endroit correspondant sur le papier filtre. Selon une variante du procédé selon l'invention, on peut également réaliser un transfert par contact d'une partie des individus de chacune des colonies en cours de développement, notamment par l'intermédiaire d'un support distinct, sur un autre milieu de culture, avant d'induire sur cet autre milieu la susdite transformation des conditions de la culture. En particulier, la simple application d'un papier filtre sur la culture en cours de croissance aura pour effet la retenue d'une partie des colonies développées sur la boîte de Pétri initiale5 les parties de colonies prélevées pouvant alors être appliquées sur une nouvelle boîte de Pétri, les modifications des conditions de la croissance dans le sens visant à produire la lyse des bactéries pouvant alors être réalisées sur cette seconde bolte, sans que les populations bactériennes de la première boîte soient affectées. On peut d'ailleurs également réaliser la lyse des colonies bactériennes prélevées sur le filtre directement sur celui ci, par exemple en induisant la croissance en présence d'un antibiotique, telle que l'ampicilline, ou en présence de tout autre agent, tels que protéases, détergents, etc. On peut mentionner qu'il n'est pas necessaire de maintenir en vie certains des individus des colonies retenues sur le filtre, au cours de l'opéra- tion de détection de la souche recherchée. Lorsque la lyse induite met en jeu des phénomènes métaboliques impliquant ce qui pourrait être qualifié de "autolyse", que ce soit sous l'effet d'un prophage ou en raison d'une concentration limitée du milieu de culture en l'un des constituants nécessaires à leur intégrité structurale, on constate qu'il subsiste toujours, dans la pratique, des individus survivant à cette lyse. C'est ainsi que lorsque l'on a recours à une culture de E. coli K12 du type de celle décrite dans l'exemple I ci-après, susceptible de croître dans des conditions normales à une température de 320 C, ces bactéries comportant cependant dans leur génome un prophage thermo-inductible lorsque la culture est incubée à 410 C, on constate que les colonies, comprennent toujours encore des individus survivants même après 40 heures d'incubation du milieu de culture à Li0 C. Il en est de même pour les colonies cultivées en présence d'une quantité limitée du principe actif nécessaire à leur intégrité structurale.Certains des individus de chacune des colonies se révèlent être à l'état or- mant", faute sans doute de bénéficier des métabolites nécessaires à la lyse. Il est significatif que ces bactéries "dormantes't se trouvent dans tous les cas au centre de chacune des colonies. V Le repiquage de ces cellules "dormantes" dans un milieu de culture favorable au développement de ces bactéries conduit, dans la pratique, toujours à un développement de nouvelles colonies identiques aux précédentes. La durée du processus d'induction de la lyse peut s'étendre par exemple de 1 à 20 heures, bien que dans la pratique cette durée pourra être ramenée de 1 à 4 heures. Cette durée pourra être prolongée dans le cas d'un nombre de colonies simultanément développées sur le milieu de culture très considérable, l'effet du nombre étant alors de réduire quelque peu la sensibilité de la détection. Des caractéristiques supplémentaires de l'invention ap- paraltront encore au cours de la description d'exemples de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, description qui n'a aucuncaractère limitatif, mais dont'le but est de faire apparaltre les possibilités considérables du procédé en ce qui concerne ltiden- tification en une seule opération d'une souche productrice d'un constituant intracellulaire déterminé, mélangé à un nombre considérable d'autres colonies. EXEMPLE I : Identification d'un clone bactérien porteur d'un recombinant d'acide nucléique eucaryote et d'un plasmide. Le fragment d'ADN que l'on se propose de rechercher est constitué par une copie d'ADN synthétisé in vitro de l'ARN de l'ovalbumine de poulet. Il comprend environ 1730 paires de bases. I1 peut être recombiné dans un plasmide,notamment un plasmide pCRI ov2-t, connu pour sa capacité à induite une résistance à la kanamycine à l'hôte qu'il peut transformer. Le plasmide recombinant pCRI CV2-1 a été décrit par P. HUMPHRIES et Gals. dans "NUCLEIC ACIDS RES.", 1977, 4, pages 23Sa à 2407. Lorsque ce plasmide est digéré en présence de l'endo- nucléase de restriction HhaI, ce plasmide fournit un fragment comportant 2.400 paires de bases-contenant la totalité de la sé quence d'ADN d'ovalbumine sus-indiquée, liée à de courtes portions adjacentes originaires du plasmide. Ce fragment de 2.400 paires de bases, dénommé ci-après Hhaov, a été marqué au phosphore P, le produit ainsi marqué constituant la sonde qui a été utilisée dans les exemples indiqués ci-après. Elle présente une activité spécifique élevée (1,2 x 108cpm/ g). Le plasmide pCRI 9v2-1 est utilisé pour transformer des bactéries préalablement traitées par une solution de chlorure de calcium, pour sensibiliser leurs parois. Les bactéries qui ont été utilisées pour cet exemple sont des E.coli C600 hsdS (simplement désignées dans ce qui suit par "C600"), qui ont été rendues lysogènes par infection au moyen d'un phage Ac1857. Une souche C600, non rendue lysogène, qui sera utilisée comme témoin, est également transformée par le plasmide. Apres incubation pendant 5 minutes à 320 C, les bactéries sont étalées sur un milieu L (agar DIFCO à 1,5 %) dans des boites de Pétri et incubées pendant 5 minutes à 320 C. Dans ces conditions, les bactéries lysogènes sont transformées aussi efficacement que les bactéries parentes non lysogènes. Après incubation des boîtes de Pétri pendant 18 heures à 320 C, on amène les cultures à la température de 41 C pendant 3 heures. Des filtres de nitrocellulose de SCHLEICHER et SCHUIL (BA 85) sont ensuite appliqués sur les boites pendant 20 minutes. On fait comporter aux filtres et aux boîtes correspondantes des repères permettant d'établir une correspondance respectivement entre les emplacements sur le filtre dans lesquels une hybridation sera éventuellement constatée et l t emplacement de la colonie bactérienne de la boite correspondante qui aura libéré l'ADN ainsi hybridé. Les filtres sont ensuite retirés et les boîtes de Pétri initiales réincubées à 320 C pendant quelques heures au moins, de préférence jusqu'au lendemain, puis conservées à basse température. Les filtres sont alors mis en contact pendant 10 minutes avec une solution de NaOH 0,1 N et de NaCl 1,5 M. Ils sont ensuite lavés pendant 20 secondes d'abord avec un tampon TRIS-HCl 200 mM à pH 16,2 contenant de l'EDTA 2 mN5 puis dans un milieu SSC x 2, EDTA 2 mM, phosphate de sodium 25 mM à pH 7,2. Pour mémoire, un milieu n x SSC (abréviation de l'expression anglaise "standard saline citrate" est constitué d'une solution contenant du chlorure de sodium et du citrate de sodium à des concentrations respectivement de n x C,15 rL et de nx0,015 M, pH 7.Les filtres sont ensuite séchés sur du papier à température ambiante pendant environ 30 minutes5 puis pendant 2 heures à 800 C Après préincubation pendant 4 heures à 680 C dans une solution 6 x SSC, 1 x Denhardt (D. DENHARDT,(1966) "BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUM.", 23, pages 641-646), les filtres sont trans férés dans un tampon phosphate à pH 7,2 pour hybridation contenant 0,5 % de sodium dodecyl-sulfate (SDS), ce tampon comprenant 2 x SSC, EDTA 2 mN5 1 x Denhardt, phosphate de sodium 25 mM. On utilise en général 3 ml de cette solution et 450.000 cpm de la sonde dénaturée Hhaov pour chaque filtre. L'hybridation est en général effectuée pendant une durée de 16 heures à 680 C, le filtre étant ensuite lavé quatre fois avec une solution 2 x SSC, 1 x solution de Denhardt, SDS 0,5 %, à 680 C.Les filtres sont ensuite lavés successivement dans une solution 2 x SSC à 50 % de formamide et 0,5 r-0 de SDS pendant 1 heure, puis dans une solution 0,5 x SSC, contenant 50 r de formamide et 0,5 % de SDS pendant quelques minutes et finalement dans une solution 2 x SSC pendant quelques minutes. Les filtres sont séchés à température ambiante et font ensuite l'objet d'une autoradiographie, avec des films "flash-activés KODAK ROYAL X-O MAT" (R.A.LASKEY et Coll., IF E B S LETTERS", (1977), 82, pages 314 à-316) avec ou sans ecran amplificateur d'intensité (HI-PLUS, DUPONT DE NE.MOURS) à -7O C pendant 16 heures ou plus. On oit alors apparaître sur les autoradiogrammes, en l'absence même d'écrans d'amplification, des taches traduisant une hybridation in situ dans certains emplacements des filtres5 ces taches étant plus intenses à leur périphérie qu'à leur centre, ce qui indique, comme déjà mentionné plus haut, qu'une partie des Indivaus au centre de la colonie ainsi repérée sont des cellules "dormantes" qui n'ont pas été lysées. On observe pratiquement aucune hybridation dans les cultures témoins constitues par les souches C600 non rendues lyso zendes et ayant sur exactement le même processus, d'une part, et les cellules lysogènes transformées, mais dont la lyse n'a pas été induite par le traitement thermique à 41 C, d'autre part. EXEMPLE II : Induction de la lyse de bactéries non lysogènes et hybridation in situ de fragments d1ADN déterminés, libérés à la suite de cette lyse. Quelques centaines de bactéries C600 formées par le plasmide pCRI ov2-1 sont étalées sur un milieu de culture L dans des boîtes de Pétri très sèches et incubées jusqu'au jour suivant jus qulz 370 C. Des filtres de nitrocellulose sont ensuite appliqués doucement sur les boîtes de Pétri pendant 20 minutes5 pour prélever une partie des colonies formées, puis enlevées et réappliquées sur du milieu L contenant 20 "g par ml d'ampicilline, dans d'autres boîtes de Pétri. Ces dernières sont incubées à 370 C pendant 6 heures, tandis que les boîtes initiales sont réincubées à 370 C pendant 3 heures, puis conservées au froid. Les filtres sont alors traités comme dans l'exemple I en vue de lthybridation in situ. La lyse des colonies bactériennes transférées est confirmée par les taches obtenues sur les autoradiogrammes témoignant d'une hybridation in situ avec la sonde utilisée (la même que dans l'exemple préeédent) et des ADN correspondants libérés par cette lyse. EXEMPLE III : Sensibilité de la méthode d'identification d'un clone bactérien parmi dTautres. On fait usage dans cet exemple d'une souche rendue lysogène par un phage Oc1857 modifié, comportant une délétion de ses gènes cIII à int. En raison de cette délétion, le phage ne peut pas s'exciser du génome bactérien, meme après plusieurs lyses induites des bactéries utilisées dans les conditions qui ont été utilisées plus haut et cultures renouvelées des bactéries survivantes dans des conditions normales de croissance, respectivement. Les bactéries utilisées dans cet exemple sont celles désignées par les abréviations ED8739 (supE, supF, hsdS , met-) décrites par N.E. NURRAY et Coll. ("MOLEC. GEN. GENET." (1977) > 150, pages 53-61) On étale alors sur chacun des milieux de culture d'une série de boites de Pétri environ 100 cellules de la bactérie lysogénisable susdite préalablement transformée par le plasmide pCRI ov2-1, en présence de quantités croissantes d'une boîte à l'autre des mêmes bactéries cependant non transformées au préa- lable par le plasmide, ces quantités s'étendant de O à 106 cellules par boîte. Les cultures sont d'abord incubées à 320 C jusqu'au lendemain, puis incubees pendant 3 heures à 410 C dans le but d'in- duire une lyse due à l'induction du prophage. Les produits libérés par les cellules lysées sont absorbés sur des filtres de nitrocellulose qui sont ensuite soumis à l'essai d'hybridation avec la sonde radio-active Hhaov marquée au phosphore 32, dans les memes conditions que celles décrites à l'exemple I. Les boîtes contenant jusqu'à 25.000 colonies donnent lieu au nombre préestimé de sites dthybridation repérés par autoradiographie. Il est alors aisé d'isoler à partir des emplacements de la culture initiale correspondant à ceux des sites d'hybridation sur les papiers filtres5 celles des colonies qui se révèlent être ensuite resistantes à la kanamycine. Dans les boites comprenant davantage de cultures, les résultats sont moins nets, en raison de la confluence alors atteinte dans les cultures. Cependant, en prolongeant l'exposi- tion on voit apparaître un nombre qui reste réduit de taches correspondant à des sites d'hybridation supposés. Toutes les colonies isolables à partir des emplacements correspondants de la culture initiale ne sont pas résistantes à la kanamycine. Il faut alors opérer un tri supplémentaire. La spécificité de la détection en une seule fois peut cependant être retrouvée même en présence de 106 colonies sur la même boîte de Pétri, par accroissement de l'activité spécifique et/ou de la quantité de sonde mise en oeuvre. Ces résultats font néanmoins apparaître que la technique selon l'invention~doit désormais permettre le tri sur un nombre réduit de boîtes de Pétri de la totalité des fragments d'ADN isolables à partir d'un génome de mammifère- (ou dthomme), lequel ne contient pas plus de 250.000 fragments de 1Q7 daltons. On obtient donc une méthode de detection extremement sensible, comme l'atteste encore l'intensité des signaux suscep tables d'être perçus au niveau de chaque site d'hybridation (de l'ordre de 1000 à 3000 désintégrations par'minute (dpm) correspondant à la dose d'ADN hybridable libérable par une seule colonie5 intensité d'autant plus remarquable que l'intensité correspondante des signaux d'hybridation, obtenus à l'occasion de la détection de l'ADN libéré au niveau d'une plage produite par un phage recombinant contenant l'ADN recherché,et obtenue selon la technique antérieure déjà mentionnée, ne dépasse pas quelques centaines de cpm. Le procédé selon l'invention permet donc de trier des millions de souches sur une seule boite de Pétri. I1 est applicable a tous les isolements de gènes pour lesquels on possède une sonde appropriée, à des fins d'usage agricole, industriel ou medical. Pour ne prendre que le dernier domaine d'application envisagé à titre exemple, on percevra immédiatement l'éventail considérable des analyses que le procédé selon l'invention permet d'envisager. En voici quelques exemples --détection de la présence ou non, de l'intégrité ou non, d'un gène particulier d'ADN de mammifère, notamment humain ; - détection de la présence ou non d'une enzyme déterminée dans un échantillon non biologique, par détection de l'enzyme elle même, directement, ou du gène codant cette enzyme au niveau cellulaire. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes, y compris la détection de protéines ou de polypeptides par leur activité enzymatique ou antigénique, libérés des bactéries qui les contiennent par les procédés de lyse décrits plus haut. RETJEfDICATIONS 1 - Procédé de tri parmi une population de micro-organismes, notamment bactéries, susceptibles de se propager sur un milieu nutritif, dont certains sont susceptibles de produire un constituant intracellulaire décelable par une sonde ou réactif spécifique caractérisé par l'induction, dans une culture de cette population de micro-organismes, lorsque ceux-ci ont déjà formé des colonies, d'une transformation des conditions de la culture tendant à produire la lyse d'une partie des individus qui composent lesdites colonies, le susdit constituant étant alors transférable par contact sur un support distinct et sur lequel il peut être décelé in situ par la susdite sonde ou le susdit réactif spécifique en un endroit qui est alors corrélable à l'emplacement dans la culture initiale du micro-organisme ayant produit ce constituant intracellulaire. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractériséen ce que l'on transfère par contact une partie des individus de chacune de ces colonies, notamment par l'intermédiaire d'un support dis tinct, sur un autre milieu de culture avant d'induire sur cet autre milieu de culture la susdite transformation des conditions de la culture. 3 - Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, earactérisé en ce que les susdits micro-organismes sont des bactéries lysogènes dont la lyse est susceptible d'être induite sous effet de conditions déterminées, distinctes de celles requises pour la croissance normale de la culture. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les susdits micro-organismes sont des bactéries porteuses dtun prophage capable d'induire la lyse à une température supérieure à la température de croissance normale de ces microorganismes et que lasusdite induction est réalisée en portant l'ensemble de la culture à ladite température de lyse. 5 - Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que l'induction de la lyse susdite est produite par une limitation de la teneur du milieu de culture en l'un des principes nutritifs essentiels, dont l'absence dans le milieu est susceptible de produire la lyse de ces micro-organismes, lorsqu'ils sont en cours de croissance. 6 - Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la lyse partielle est induite en mettant les colonies en contact avec un agent lytique extérieur, tel qu'un antibiotique. 7 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la lyse partielle est induite avant transfert des produits libérés par contact sur le susdit support distinct, celui-ci étant constitué par un matériau, tel que filtre de nitrocellulose ou analogue, capable d'absorber lesdits produits libérés, le facteur recherché étant décelable par la mise en contact du support retenant lesdits produits avec ladite sonde ou ledit réactif spécifique. 8 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le facteur recherché est un fragment d'ADN et en ee que l'on procède si besoin à sa dénaturation avant sa mise en contact avec la sonde correspondante5 constituée par un acide nucléiquecomplémentaire à brin unique ou un ARN complémentaire portant un marqueur. 9 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que lton prélève celles des colonies de a culture initiale dont les positions sur le milieu initial correspondent à celles du support susdit, comportant le produit ayant donné lieu à une réaction de détection avec ladite sonde ou ledit réactif spécifique, et en ce que lton repique cette colonie sur un autre milieu, la cultive et, si besoin, répète la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 à la nouvelle culture ainsi formée. 10 - Application à l'identification et à la productionde clones d'un acide nucléique determiné, susceptible de s'hybride der avec une sonde également déterminée, du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à -9.