Brevet FR2405994A1 — publié le 19790511

Le présente invention concerne la protection des truites contre la Sapticémis Hémorragique Virale. Elle a pour objet principaiement un produit de médication vétérinaire, un procédé pour se préparation et son application au traitement préventif des truites an vue de les prémunir contre cette maladie. La Septicémie Hémorragique Virale, désignée couramment sous l'abréviation SHV, est une maladie virale qui affecte la truite arc-en-ciel et qui entratne des mortalités importantes dans les pis- cicultures d'Europe en particulier. Elle se traduit par des troubles locomoteurs, circulatoires et pigmentaires, prcédant la mort.On observe en particulier une nage en vrille, des oedèmes, des hémorragies viscdrales, de l'exophtalmie, de la mélanose. Suivant la forme de la maladie, les poissons peuvent présenter seulement certains de ces symptSmes. Le plus souvent, on soupçonne la présence de la maladie dans une pisciculture dès qu'on observe l'exophtallie et la mélanose ou la décoloration des branchies, due è l'anémia résultant des hémorragies et une mortalité très importante, On connat le virus qui est responsable de cette maladie. Il s'agit d'un Rhabdovirus appelé, suivant les cas, virus de SHV (ou VHS en anglais) ou virus d'Egtved. Il peut être isolé des organes prélevés sur des poissons malades et identifié par séro-neutre- lisation ou immunofluoreecence en culture cellulaire. Il a été isolé par JENSEN au Danemark en 1963 et sa morphologie fut établie par ZWILLENDERG (1965) 3 son identification sérologique est décrite en particulier par VESTERtAARD-JORGENSEN dans Bull. Off. Int. Epiz., 69 (7-8), p. 985-989 (1968). En pratique, la lutte contre la SHV soulève des problbmes difficiles à résoudre, car, n'ayant constaté aucune réaction immuni- taire à la maladie contractée en pisciculture, les pisciculteurs n'ont pu faire appel è ce jour à d'autre solution qu' une prophylaxie sanitaire sévère. Après désinfection, les pisciculturss doivent autre repeuplées avec des poissons: indemnes et le pisciculteur doit se protéger en évitant toute introduction d'autres poissons. On comprend que ces exigences s'adaptent très mal aux conditions habituelles d'exploitation des piscicultures. De plus, elles interdisent pratiquement les transferts de cheptel, pour éviter l'introduction d'un sujet porteur de virus, alors que meme dans ces conditisons, le pisciculteur n'est pas à l'abri d'une recontamination par la rivière. Ces difficultés peuvent être résolues grâce à la présente invention. A l'origine de cette dernière, on a constat que, contrairement à toutes les suppositions antérieures, il était possible de conférer aux truites une résistance acquise aux infections par le virus de la 5HVt ce qui permet d'envisager un traitement préventif des poissons, beaucoup plus facile à nettre en oeuvre en pratique que les mesures sanitaires qui constituaient à ce jour le seul recours contre cette maladie. Conformément à l'invention, un médicament préventif de la Septicémie Hémorragique Virale de la Truite est constitué par une préparation de virus d'Egtved inactivé. Le médicament selon l'invention se prépare par inactivai tion du virus d'Egtved multiplié en culture cellulaire. Le virus peut se cultiver sur tous types de cellules de poissons permettant sa croissance dans des conditions qui sont en elles-m & s classi- ques. Ces conditions peuvent entre choisies parmi toutes celles qui sont habituellement préconisées pour les cultures de cellules de poissons. Les conditions particulièrement bien adaptées au virus d'Egtved ont été décrites notamment par P. de Kinkelin et R Scherras dans Ann.Rech. Vétér. (INRA), 1 (1), p. 17-30 (1970). Dans le cadre de la mise en oeuvre de la présente invention, il a été trouvé particulièrement avantageux d'opérer la croissance du virus vivant sur des cultures cellulaires de la lignée EPC (Epitheliur Papuiosum Carpio). Cependant, on peut également utiliser d'autres nCes, par exemple les lignées FHM (Fat Head Minnow) et RTG (Rainbow Trout 60nad). Comme milieu de culture, on utilise le plus souvent un milieu de Eagle ou une modification de celui-ci constituée par le milisu de Stoker.Le milieu est de préférence maintenu 9 un pH compris en tra 7 et 8, et de préférence entre 7,4 et 7,6, par un tampon qui peut être notamment du bicarbonate de sodium, du tris ou de l'hépès. I1 est additionné d'une substance nutritive qui peut Autre par exe - ple du sérum d'embryons de bovins. La température est maintenue dans la gamme de températures où le virus se développe facilement, soit de préférence è une température comprise entre +10 C et +20C, et notamment ds l'ordre de 12 à 15*c. La culture peut s'effectuer en couches monocellulaires aussi bien qu'en suspension e Le virus inoculé à la culture cellulaire peut être constitué par toute couche virale du virus d'Egtved, tel qu'il peut être isolé, de manière connue, d'organes de truites malades.La dose d'inoculum est variable dans des gammes très larges. En général, elle est fixée à toute valeur comprise entre 10 -3 et I unité formant plage Kinkelin et R. Scherrer dans l'article déjà cité. Suivant la dose d'inoculum utilisée la récolte du surnageant viral a lieu après un temps plus ou moins long de croissance. Ce temps est avantageusement déterminé de manière qu'il soit suffisant pour que la destruction des cellules par le virus soit complète. A titre d'exemple, dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé, le temps de croissance du virus peut varier de 30 heu res à 3 jours pour une dose d'inoculum variant de 1 à 10 3 unité formant plage par cellule. Conformément à l'invention, la préparation virale constituée par le surnageant liquide de la culture de virus d'Egtved après un ou plusieurs passages en culture cellulaire, est soumise à un traitement d'inactivation propre à conduire à l'inactivation complote du virus. En pratique, on préfère utiliser une prXpara- tion réalisée en un nombre de passages compris entre 2 et 5 environ, chaque passage étant poursuivi jusqu'à la destruction complète des cellules. Ainsi, la préparation virale soumise à inactivation peut être en particulier constituée par le virus récolté à son troisième passage en culture cellulaire de poisson, notamment de la lignée EPC. Elle présente avantageusement un titre compris entre 104 et 109 PFU par millilitre.Pour le traitement d'inactivation, on peut faire appel aux différents modes classiques d'inactivation des virus, comme notamment l'irradiation, le chauffage ou le contact avec un agent chimique inactivant. Dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de préparation d'un médicament préventif selon l'invention, on réalise l'inactivation de la préparation virale de virus d'Egtved au moyen de propiolactone. Dans des conditions de mise en oeuvre préférées, la concentration dep ss propiolactone peut varier entre 1 pour 1000 et I pour 10000 environ en poids par rapport au poids de la suspension virale traitée. Le temps d'action nécessaire pour obtenir 'linactivation complète du virus est en général de l'ordre de 10 heures à 5 jours, à des températures variant de 10 à 40il, et de préférence de l'ordre de 15 à 25su. On peut s'assureur que l'inactivation soit complète, en vérifiant par exemple l'absence d'effet cytopathogêne de la préparation inoculée à une culture cellulaire de poisson. La préparation inactivée ainsi obtenue constitue un mé dicament selon l'invention. Elle présente un titre élevé, le plus souvent compris entre 104 et 109 PFU de virus inactivé par millilitre de préparation et notamment de l'ordre de 0,3 à 5.108 PFU/ml dans le cas préféra. Elle peut éventuellement Autre congelée et être additionne da stabilisants pour être conservée plus facilement. Elle peut également être diluée, notamment à l'eau, jusqu'à toute concentration souhaitée pour son utilisation. D'une manière générale, elle peut être mise sous toutes formes classiques pour les médicaments vétérinaires, en fluide ou solide. et ce médicament peut contenir la suspension virale inactivée en association avec tous adjuvants usuels. Le médicament selon l'invention est utile an proplylaxie thérapeutique des maladies viralesrdes salmonidés. Appliqué en traitement préventif à des truites arc-en-ciel, il permet de rendre celles-ci réfractaires B une contamination par le virus d'Egtved, en milieu naturellement infecté, alors qu'en l'absence d'un tel traitement, elles y sont particulièrement sensibles. De plus, cette protection peut être obtenue sans incidence nocive pour la santé des truites, le médicament étant pratiquement dépourvu de toxicité à leur égard aux doses actives pour les prémunir contre la maladie. Le traitement des truites peut s'effectuer par n'importe quelle méthode déjà appliquée de manière classique pour administrer des substances médicamenteuses à des poissons. Des administrations par doses individuelles, par voie intrapéritonéale par exemple, peuvent être pratiquées en utilisant la préparation virale inactivée telle qu'obtenue par le procédé de l'invention, éventuellement après dilution, h des doses de l'ordre par exemple de 5.106 à PFU. Cependant, on préfère en général pour ce genre de traitement, les applications collectives dans les piscicultures. Les traitements se pratiquent avantageusement, soit par pulvérisation du produit liquide, éventuellement dilué à l'eau désinfectée, sur des poissons provisoirement en dehors de l'eau, soit par dilution du produit actif dans l'eau où vivent les poissons.Ceux-ci sont alors, de práférence, soumis à un traitement associé pour les rendre plus réceptifs vis à vis des substances médîcament?usas introduites dans leur eau, soit notamment à un choc osmotique, à une dépression, a une élévation de température ou à une combinaison de cas méthodes. D'une manière générale, le traitement peut s'appliquer à des poissons de tous tues. La concentration de virus inactivé dans l'eau de traitement peut entre notamment de l'ordre de 103 à 106 PFU/ml. Un mode d'administration particulièrement approprié con sistre à traiter des alevins ou truitelles de poids inférieur à 5 g, notamment en opérant sur des alevins maintenus dans des éclos arias à l'abri d'une contamination par le virus, moins de deux mois après l'éclosion, après leur avoir fait subir un choc osmotique en les plongeant dans un bain de sel naturel.Aussitôt après la choc osmotique, on maintient les poissons dans un bain contenant la préparation virale inactivée, diluée à une concentration de préférence comprise entre 103 et 105 PFU par millilitre d'eau du bain, pendant un temps de l'ordre de 50*minutes à 3 heures, à une température de bain qui peut entre la température usuelle des écloseries, de l'ordre ds 8-10 C, mais qui peut aussi, et de-préfhrence, atre légèrement supérieure, de l'ordre de 10 à 150C. Pour illustrer l'invention de manière plus détaillé, on se référera maintenant à un exemple de mise en oeuvra particulier. Diverses caractéristiques de l'invention pourront apparattre dans le cours de la description de cet exemple, donnant en particulier le procédé de préparation d'un médicament salon l'invention et les conditions ds son application au traitement préfentif des truites contre la Septicémie Hémorragique Virale Cependant, il doit autre entendu que cet exemple n'est nullement limitatif de l'invention. Le médicament est préparé à partir de virus vivant isolé de manière classique a partir d'un broyat cellulaire prélevé sur des poissons ayant contracté la maladie ou sur des sujets sains por- teurs du virus. Dans le cas décrit, une souche virale de virus d'Egtved est inoculée à une culture cellulaire de poisson de la lignée EPC en couche monocellulaire. L'inoculation est effectuée à faible multiplicité d'infection, soit plus particulièrement environ 2.10 unités formant plage (PFU) par cellule, en utilisant 20 ml de virus dilué à 7.104 PFU/ml pour un tapis de 70.106 cellules.La culture est poursuivie à 140C en milieu de Stoker milieu de Eagle modifié), tamponné à pH 7,6 par du tampon tris à 0,16 M et additionné de 2 % de sérum d'embryons de bovins Après 3 jours de culture, le tapis cellulaire est complè tersent détruit. On recueille alors le surnageant infectieux et on en inocule à nouveau 20 ml a une température cellulaire analogue. On effectue ainsi trois passages en culture cellulaire, chaque passage étant poursuivi jusqu'à l'effet cytopathogène complet (des- truction totale des cellules). Le surnageant liquide du troisième passage est recueilli et clarifié par centrifugation pendant 10 minutes à 4000 g. La préparation virale est soumise à un traitement d'inactivation du virus. Celui-ci s'effectue par addition de ss propiolactone à la concentration de 1/6000 en poids par rapport à- la préparation virale. Le mélange est maintenu à +20OC sous agitation permanente. Après 3 jours d'action de la propiolactone, l'inactivation est complète. L'excédent d'agent inactivant se détruit par hydrolyse, sans autre intervention. Le titrage de la préparation est effectué, avant inactivation, par la méthode des unités formant plage (PFU) déjà men- tionnées, telle que décrite dans l'article de P. de Kinkelin et R. Scherrer cité, mais en remplaçant la lignée FHM par la lignée EPC. I1 révèle un titre de 4,108 PFU par millilitre de liquide. Le produit peut être utilisé en tant que médicament vétérinaire préventifs directement sous cette forme, ou entre lyophilisé pour entre ensuite reconstitué, au moment de l'emploi, par dissolution dans un diluant inerte tel que l'eau distillée. L'inocuité du produit est vérifiée. Un premier contr8le consiste è s'assureur de l'inactivation complète du virus A cet effet, un échantillon de préparation virale inactivée est cultivé sur tapis monocellulaire de poisson. Aucun effet cytopathogèna n'est constaté. D'autre part, on injecte la préparation par voie intrapéritonéale à des truites arc-en-ciel apparamment indemnes, à le dose de 0,2 cm3 par poisson de 10 g. Cette dose est très largement supérieure aux doses suffisantes pour protéger les poissons. Néanmoins, elle est parfaitement tolérée. A titra de comparaison, sur un lot de truites témoins auxquelles on injecte du virus vivant, on constate une mortalité de 80 % dix jours après l1injection alors que dans le méme temps l'injection de le préparation inacti vée à un autre lot équivalent de truites n'entraPne aucun décès par SHV. Dans une première expérience de traitement préventif de truites au moyen de la préparation inactivée selon l'invention, 40000 truitelles de 3 g prelevées d'un bassin de piscicultúre non infecte de SHV sont plonges par lots successifs dans un bain de sel de mer naturel à 53 g/l, pendant 2 minutes. Après ce choc osmotique, elles sont introduites dans un bain de traitement prFa- lablement préparé par dilution de la préparation virale inactivée, en quantité telle que la concentration dans le bain corresponde à un titra de 1500 unités PFU par millilitre. Une diffusion d'oxygène est assurée dans ce bain. Les truitelles sont maintenues dans ce bain pendant 1 heure, puis réintroduites dans un bassin de pisciculture en alimentation naturelle où la température etait de 140C. Au bout de 4 mois le nombre de poissons morts est inférieur à 1200, ce qui correspond à une mortalité normale de 3 %. Sur un lot temoin de 200DA truitelles non traitées, le nombre de morts au bout de 4 mois est de 15000. La différence s'expliqua par la sensibilité des poissons non traités à une réinfaction naturelle par la SHV. Dans une autre expérience, on traite des alevins de 0,1 g en les plongeant une heure dans un bain d'eau à 10'C contenant de la préparation virale inactivée à la concentration de 40000 PFU/ml obtenue par une addition de 10 ml de préparation dans 100 1 d'eau. Le choc osmotique est préalablement réalisé comme précédemment. Les alevins sont maintenus ensuite pendant 1 mois en milieu indemne de SHV puis introduites en pisciculture non isolée. Sur 18 lots de 33000 alevins chacun, la mortalité après 1 mois + est de 4 % pour les pct. sons traités, contre 70 % pour les poissons témoins non traités. Dans une troisième expérience, 40000 alevins sont traités comme prcédemment en utilisant un bein contenant 20 ml de la pré- paration à 4.108 PFU/ml pour 100 1 d'eau. Ils sont ensuite élevés dans une pisciculture en alimentation non desinfectSe, Une contamination accidentelle par la SHV 3 mois après rntratne une mort rapide de tous les poissons non traités alors que la mortalité reste normale à 4 % chez les animaux traités. Naturellement, l'invention n'est nullement limitée aux conditions particulières qui ont été décrites dans le cadre de l'exemple particulier de mise en oeuvre ci-dessus. REVENDICATIONS 1. Médicament préventif de la Septicémie Hémorragique Virale de la truite, caractérisé en ce qu'il contient essentiellement une préparation de virus d'Egtved inactivé. 2. Médicament selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué essentisiiement d'une préparation de virus d'Egtved obtenue en culture cellulaire de poisson, de titra compris entre 104 et 109 PFU/ml, et de préférence de l'ordre de 3.107 a 5,I08 PFU/ml, où le virus est inactivé. 3. Procédé de préparation d'un médicament préventif de la Septi demie Hémorragique Virale de la truite, caractérisé en ce que l'on fait subir à du virus d'Egtved en culture cellulaire de poisson un traitement d'inactivation jusqu'3 inactivation complète du virus. 4. Procédé selon la revendication 3, caracgérisé en ce que l'i- nactivation s'effectue par contact avec de la ss propiolactone. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on cultiva du virus d'Egtved par plusieurs passages successifs en culture cellulaire de poisson, on recueille le surnageant liquide contenant le virus et an le soumet à un traitement d'inactivation par la ss propiolactone jusqu'à inactivation complète du virus, la préparation inactivée ainsi obtenue constituant ledit médicament. 6. ProcSdé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la culture du virus s 6effectue en un nombre de passages compris entre 2 et 5, chaque passage étant poursuivi jusqu'à destruction complète des cellules. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisé en ce qu'unie suspension virale constituée par le surnageant liquide d'une culture de virus d'Egtved en culture cellulaire de poisson, de titre compris entre 104 et 109 unités PFU par millilitre, et de préférence da l'ordre de 3,107 à 5,108 PFU/ml, est traitéF par contact avec de la lS propiolactone, d une concentration comprise entre 1/1000 et 1/10000 du poids de la suspension virale, à une température comprise entre 10 et 400C, et de préférence entre 15 et 25'C, pendant un temps suffisant pour assurer l'inactivation complète du virus. B. Procédé selon la revendication 7, caractérisé an ce que le virus vivant, est cultivé en culture cellulaire de poisson, notamment de la lignée EPC, dans un milieu nutritif qui est de préférence un milieu de Eagle, éventuellement moditid et qui est tamponné à un pH compris entre 7 et a et de pré férence entre 7,4 et 7,6 et maintenu à une température comprise antre 10 et 200C, et notamment de l'ordre de 12' à 15'C et en ce que le surnageant liquide recueilli au dernier passage d'une série de 2 à 5 passages en culture cellulaire constitue la sus- pension virale sounise au traitement d'inactivation. 9. Médicament préventif de la Septicémie Hémorragique Virale de la truite tel qu'obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 8. 10. sspplication du médicament selon l'une quelconque des revendictions 1, 2 et 9, au traitement préventif des truites contre la Septicémie Hémorragique Virale. 11. Application selon la revendication 10, caractériaCe en ce que l'on traite des truites arc-en-ciel préalablement soumises à un choc osmotique, en les maintenant pendant environ 50 minutes à 3 heures, dans un bain aqueux contenant ledit médicament, dilué dans le bain à une concentration comprise entre 103 et 105 PFU/ml de virus inactivé.