Brevet FR2394291A1 — publié le 19790112

La présente invention a pour objet un agent antithrombotique, et plus particulièrement un agent antithrombotique contenant comme constituant le plus actif de l'isonicotinate de benzoyle ayant la formule (ayant par la suite la désignation "BIN") ou les sels non toxiques et pharmaceutiquement acceptables de ce composé. La présente invention est basée sur la découverte du fait que le BIN a la propriété d'éviter l'agragation des plaquettes du sang. Le BIN est un composé bien connu qui a été décrit par exemple dans la publication "Pharmaceutical Bulletin (Japon)" 1 (4), 307-319 (Décembre 1963). Toutefois il n'était pas connu jusqu'ici que le BIN avait une action inhibitrice relative b l'agrégation des plaquettes du sang. La thrombose est provoquée par la formation d'un caillot de sang, et il est connu que celuici résulte le plus souvent des fonctions de coagulation du sang et des fonctions d'agrdgation des plaquettes du sang comme par exemple les fonctions de col- lage, d'agglutination et de décharge de DPA (adénosine diphospha te), etc. voir par exemple wKetsueki to Myakkan" (Blood and Vascular)" 1 [4], 13-24 (Juin, 1970). Etant donné la connaissance du fait que les fonctions des plaquettes du sang jouent directement un rôle dans la formation du caillot sanguin, on a essayé d'éviter la formation des caillots en provoquant l'inhibition des fonctions précitées. On connaît de nombreuses substances ayant un effet d'inhibition "in vitro" de la fonction d'agrégation des plaquettes du sang. Toutefois, un agent antithrombotique ayant un effet optimum doit présenter une activité "in vivo" pendant un laps de temps suffisamment long pour inhiber la fonction d'agrégation des plaquettes du sang pour que l'action antithrombotique soit obtenue réellement. En outre de telles substances doivent pré- senter une toxicité faible. Parmi ces substances, on a déjà étudié les dérivés de l'adénosine, le dextrane, les dérivés du dipyridamole, l'aspirine ainsi que d'autres agents antiinflaa- matoires etc.; rais jusqu'ici aucune substance donnant des effets remarquables n'a été signalée. La demanderesse a maintenant découvert que le BIN présente une action inhibitrice de la fonction d'agrégation des plaquettes du sang. Son action est aussi bonne sinon meilleure que celle des substances bien connues contre l'agrégation par le DPA ou par le collagène. En outre, le BIN présente une très grande sûreté en ce qui concerne la détermination de la dose léthale 50 % (DL50) en ce qui concerne la toxicité aigu, comparativement aux autres substances bien connues. La présente invention a pour objet un agent antithromboti- que contenant comme constituant principal, du BIN ou ses sels pharmaceutiquement acceptables, ainsi qu'une méthode d'inhibition de la thrombose par adiinistration d'une quantité efficace d'un agent antithroibotique contenant comme ingrédient actif principal, du BIN ou ses sels pharmaceutiquement acceptables. Le BIN peut être préparé par les procédés habituels comme indiqué dans la publication "Pharmaceutical Bulletin" 1 (4) 307-319 Décembre, 1953). Selon la méthode précitée, on mélange 37,5 g de benzyl-2-méthyl-4-pyridine obtenue par réaction de -picoline sur le chlorure de benzyle, avec 3,4 litres d'eau, 8C ml d'une solution aqueuse contenant 10 % de soude caustique et 172 g de permanganate de potassium, et l'on chauffe le tout au reflux pendant 3 heures.Après la fin de la réaction, on filtre le mélange réactionnel et l'on mélange le filtrat obtenu avec 60 al d'acide chlorhydrique concentré pour ajuster le pH à 2,5. Après cristallisation par refroidissement, on sépare les cristaux par filtration et l'on obtient 26,2 g de BIN. Le procédé de préparation du BIN n'est pas limité à la sé- thode précitée, et l'on peut également préparer le BIN par d'autres méthodes bien connues. Les sels du BIN non toxiques et pharmaceutiquement acceptables peuvent être préparés par n'importe quelle méthode bien connue. Les sels utilisables dans l'invention sont les sels pharmaceutiquement acceptables comportant les sels solubles dans l'eau tels que le sel de sodium, le sel de potassium, le sel de lithium, le sel d'ammonium ; les sels moins solubles dans l'eau tels que le sel de calcium, le sel de baryum, le sel de procaine ; les sels d'aminoacides à caractère basique tels que le sel de lysine, etc. ; les sels à caractère fortement acide tels que les chlorhydrates5 les sulfates etc. ; les sels d'amines tels que le sel de tridthyl- amine, de diméthylamine et les sels analogues. On a effectué des essais pour déterminer les propriétés pharmacologiques, les doses d'administration, la manière d'effectuer l'administration ainsi que la toxicité du BIN. Ces essais ainsi que les résultats obtenus sont les suivants : (1) Essai d'inhibition de l'agrégation des plaquettes du sont (in vitro). (a) Effet d'inhibition de l'agrégation des plaquettes du sang provoquée par le DPA. Dans cet essai on utilise le DPA pour provoquer l'agrégation des plaquettes du sang, et l'on mesure l'effet d'inhibition de l'agrégation obtenu par le BIN en modifiant les quantités de BIN ajoutées. On observe l'agrégation des plaquettes du sang en utilisant un agrogomètre comstruit par la firme Brysten et CO. et l'on mesure le degré d'agrégation par néphélométrie, c'est-à-dire grâce àla modification de l'absorbance comme indiqué dans la publication "Rinsho Kensa (Climical Examination) 17 [11], Supplemental volume, 187-190 (Novembre 1963)". On place initialement dans chacune des cellules revêtues de silicone de l'agrégomètre, 0,8 ml d'une solution diluée de plasma contenant du sant riche en plaquettes (nombre de plaquettes dans le sang : 300 000-400 000/cm ). Ensuite on ajoute à chaque cellule, 0,1 ml de solution de BIN ayant des concentrations 20 &gamma;/ml, 100&gamma;/ml et 500 &gamma;/ml, de selutions d'adénesine à des concentrations de 20 &gamma;/ml et 100 &gamma;/ml et de l'aspirime à des concentrations de 500 &gamma;/ml, pour effectuer des essai comparatifs. On laisse reposer les solutions pendant 2 minutes et on ajoute ensuite le DPA à chaque cellule, jusqu'à l'obtention d'une concentration finale en DPA de 10-5M. Le volume final de chaque échantillon est ensuite complété jusque 1 ml. La réaction de l'agrégation est enregistrée sur bande et on observe les courbes d'agrégation. Le pourcentage de l'inhibition de l'agrégation est calculé selon les formules suivantes Pourcentage d'inhibition = M - D x 100 (%) M M = Transmittance indiquant le pourcent maximum d'agréga tion pour une solution saline physiologique (témoin) D : Transmittance indiquant le pourcentage maximum d'agrégation par échantillon. Les résultats sont indiqués dans le tableau 1. TABLEAU 1 Agent antithrom- Quantité ajoutée Pourcentage d'inhi botique (concentration finale) bition pour les pla quettes du sang BIN 2 &gamma;/ml 38 % 10 &gamma;/ml 54 % 82 % Adénosine 2 &gamma;/ml 47 % 10 &gamma;/ml 62 % Aspirine 50 &gamma;/ml o % (b) Effet d'inhibition de l'agrégation des plaquettes du sang provoqué par le collagène. On effectue les essais de la même manière que dans (a) cidessus, en utilisant le collagène à la place du DPA pour provoquer l'agrégation des plaquettes du sang. La quantité de collagène utilisée est de 0,1 il d'une solution extraite d'une suspension contenant 20 mg/ml de collagène dans une solution saline physiologique. Les quantités de BIN et d'aspirine ajoutées pour les essais comparatifs sont chacune de 0,1 il de solutions ayant des concen- trations respectives de 20&gamma;/ml, 100&gamma;/ml, 200 &gamma;/ml et 500 &gamma;/ml. Les résultats sont indiqués dans le tableau 2. TABLEAU 2 Agent antithrom- Quantité ajoutée Pourcentage d'inhi- botique (Concentration finale bition pour les pla quettes du sang BIN 2 &gamma;/ml 30 % 10 &gamma;/ml 40 % 20 &gamma;/ml 85 % 50 &gamma;/ml 90 % Aspirine 2 10 &gamma;/ml 62 % 20 &gamma;/ml 87 % 50 &gamma;/ml 91 X Comme il apparaît de façon évidente d'après les résultats du tableau ci-dessus, le BIN présente une bonne activité inhibitrice contre l'agrégation des plaquettes du sang provoquée soit par le DPA ou le collagène.Par conséquent on admettra que le BIN a un effet antithrombotique contre les caillots provoqués par les fonctions et les divers facteurs respectifs des plaquettes du sang, dans le corps humain. (2) Effet du BIN comme promoteur de la dissociation de l'agréga tion des plaquettes du sang (in vitro). On a étudié l'effet du BIN comme promoteur de la dissociation d'agrégation des plaquettes du sang, en ajoutant du BIN à du plasma contenant du sang riche en plaquettes auquel on avait ajouté préalablement du DPA pour obtenir un maximum d'agrégation. On a effectué des essais de la même façon que pour l'essai (1) (a), sauf qu'on a effectué l'addition du lIN après avoir obtenu l'a grégation des plaquettes du sang. La concentration finale en DPA ajouté était de 10-5M, et la concentration finale en BIM fait 10&gamma;/ml, 50&gamma;/ml, et 100&gamma;/ml (0,1 ml de solutions ayant des concentrations 100&gamma;/ml, 500&gamma;/ml et 1 000&gamma;/ml, ayant été ajoutées au plasma). Comme échantillon témoin, on a ajouté au plasma une solution saline à la place du ssIN. Le degré de dissociation de l'agrégation a été représenté par un taux d'absorbance de la solution de l'échantillon, S minutes après l'addition du 3IN par rapport à la solution de l'échan- tillon ayant un maximum d'agrégation. Le degré de dissodation obtenu lorsqu'on ajoute une solution saline physiologique était d'environ 12 X. D'autre part on a obtenu un degré de dissociation de 23 % par addition de 10 i/ml de BIN (concentration finale, de mê0 que ci-après), de 37% par addition de 50&gamma;/ml de BIN, et de 44 % par addition de 100&gamma;/ml de BIN. (3) Essai d'inhibition de l'agrégation des plaquettes du sang (in vivo). Lorsqu'on effectue une injection intraveineuse de DPA dans la veine auriculaire chez le lapin, les agrégats de plaquettes sanguines sont prélevés dans les capillaires pulmonaires; et de cette façon le nombre des plaquettes sanguines dans l'artère fémo- rale présente momentanément une forte réduction. L'effet du BIN sur l'inhibition de l'agrégation de plaquettes sanguines a été étudié en mesurant le degré de la diminution précitée et qui a servi d'indice ([Rinsho Byori (Clinical Pathology) 21 (11) 879885 (1973)]. Les lapins ont été anesthésiés par du sel de sodium du thiopental et maintenus sur le dos. On a incisé leurs membres inférieurs pour dégager l'artère fémorale et on a introduit dans cette artère un tube de polyéthylène ayant un diamètre extérieur de 1,8 mm. On a injecté des solutions 10 3 et 10 4M de DPA dans la veine auriculaire à la dose de 1 ml/kg et on a recueilli le sang de temps en temps dans l'artère fémorale (i des intervalles de 10 secondes), dans le but d'effectuer une numéra- tion des plaquettes du mng. Habituellement, 10 secondes après l'injection de DPA le nombre des plaquettes diminue de moins de le xpar rapport au nombre de plaquettes avant 1' administra- tion.Dans Ce court laps de temps le nombre de plaquettes redevient rapidement normal et la numération initiale est obtenue après 30 è 40 secondes. On effectue des injections intraveineuses de BIN dans la veine auriculaire chez des lapins, à des doses variées (0, 10, 20 et 50 mg/kg), une minute avant l'addition de DPA, et l'on injecte ensuite le DPA (comme indiqué ci-dessus. On récupère le sant dans l'artère fémorale. On é udie l'effet d'inhibition du BIN sur l'agrégation des plaquettes du sang en comparant les numérations respectives des plaquettes sanguines après 10 secondes.On a ainsi trouvé que la diminution des plaquettes sanguines aptès l'addition de solution 10-3M de DPA était inhibée d'environ 40 % par l'administration de 50 mg/kg de BIN, et la diinu- tion obtenue par l'addition d'une solution 10 4M de DPA était inhibée d'environ 50 % par l'administration de 50 mg/kg de BIN. (4) Effet d'inhibition de formation du caillot. Pour déterminer cet effet, on procède à une administration intraveineuse de BIN en rétrécissant une partie de l'artère fémorale, selon la méthode de MAEKAWA sur le lapin (horumon to Rinsho (hormone and Clinic) 23 987-993 (1975). Le caillot est formé de la façon suivante. On anesthésie un lapin et on le maintient sur le dos, on dégage son artère fémora- le et on ligature les branches de cette artère. On place un tube d'acier ayant un diamètre 0,5 mm le long de l'artère dans une position voisine de l'extrémité de la branche centrale, et on le fixe contre l'artère en enroulant un fil de soie épais. Puis on retire le tube d'acier et on obtient ainsi un rétrécissement de l'artère ayant un diamètre extérieur de 0,5 mm. Ensuite on effectue une administration intraveineuse de 10 mg d'acide ellagi que comme agent de formation de caillot, et l'on suture les par ties incisées. Après 24 heures, l'artère fémorale est à nouveau dégagée pour étudier la présence de caillots dans la partie rétrécie de l'artère.Le degré de formation de caillots a été classé de 1 à 4 selon Wessler dans ["J. Appl. Physiol", 14, 943-946 (1959)]. degré 0 ...... pas de formation de caillots degré 1 ...... observations de 2 à 3 filaments de fibrine degré 2 ...... observation de quelques caillots de faible dimension degré 3 ...... chservation d'au moins deur caillots impor tests degré 4 ...... observation d'un large caillot occupant toute la largeur du vaisseau incisé. On étudie l'effet du BIN en effectuant des injections intraveineuses de 25 mg/kg et 50 mg/kg de BIN, de 100 mg/kg d'aspirine, et d'une selution physiologique zaline comme témoin, 10 minutes et 20 minutes avant d'effectuer l'injection intraveineuse d'acide ellagique0 Un groupe de cinq lapins a été utilisé etdes résultats indiquant le degré et le pourcentage de formation des caillots (pourcentage de lapins à partir de deux lapins jusqu'à la tota lité) sont indiqués dans le tableau 3 ci-après. TABLEAU 3 Agent antithrombotique Lapin Poids cor- Formation du N porei en Degré caillot (ex kg primé en %) BIN : 50 mg/kg 1 2,6 2 2 2,5 0 3 2,2 340 % 2 2,6 1 5 2,2 1 moyen ne 1,4 (à suivre) TABLEAU 3 (suite) Agent anti- Lapin Poids cor- Degré Formation du thrombotique N porel caillot (ex (kg) primé en %) BIN : 25 mg/kg 6 2,8 0 7 2,6 2 8 2,9 2 89 % 9 2,6 2 10 2,3 2 moyen ne 1,8 Aspirine : 100 mg/kg 11 2,5 4 12 2,4 2 13 2,2 3 100 % 14 2,4 4 15 2,6 3 moyen ne 3,2 Témoin 16 2,8 4 (solution saline 17 2,6 4 physiologique 18 2,8 2 19 2,8 3 100 % 20 2,6 4 moyen ne 3,4 (5) Effet d'inhibition de la formation du caillot. Pour étudier l'effet obtenu par administration orale du BIN, contre la formation du caillot, on a repris la méthode selon l'essai (4), sauf que l'on a administré oralement les composés à essayer. On a préparé une suspension de BIN et d'aspirine dans une solution contenant 0,5 X de CMC (carboxyméthylcellulose), les deux composés précités étant introduits à une concentration de 1 g/4 mîl On a ensuite administré oralement les composés pré- cités à des doses de 500 mg/kg et 1 g/kg. En outre, on a également administré comme témoin une solution saline physiologique. Les résultats sont indiqués dans le tableau 4. (voir tableau page 9). TABLEAU 4 Agent anti- Dose ad- Lain Formation de thrombotique ministrée N Degré caillot (pourcen tage de lapins ayant atteint un degré 2 ou supérieur) BIN 1 g/kg 1 0 2 1 3 1 20 % 4 1 5 3 moyen ne 1,2 500 mg/kg 6 2 7 1 8 0 60 % 9 3 10 2 moyen ne 1,6 Aspirine 1 g/kg 11 1 12 2 13 2 80 % 14 3 15 2 moyen ne 2,0 500 mg/kg 16 2 17 3 18 2 100 % 19 3 20 2 moyen ne 2,4 Témoin (solu- 21 4 tion saline 22 4 physiologique 23 2 100 % 25 3 moyenne 3,4 fital Les résultats précédents confirment l'efficacité du BIN comme inhibiteur de la thrombose in vive. (6) toxicité aiguë On détermine la toxicité aigus BIN en utilisant un groupe de 5 rats Wistar miles et ayant chacun un poids corporel de 200 g. Pour effectuer l'administration orale du lIN on le met en suspension dans de l'eu distillée utilisable pour injection et contenant 0,5 X de carboxyméthylcellulose. Les doses d'administration orales sont respectivement de 2 500 mg/kg, 3 100 mg/kg, 3 900 mg/kg, 4 800 .g/kg, et 6 100 mg/kg. Dans les résultats indiqués ci-après, la dose LD50 a été calculée selon la méthode de Van der Waerden Dose de BIN administrée (en mg/kg) 2 500 3 100 3 900 4 800 6 100 rats morts/rats traités 0/5 1/5 1/5 3/5 @ 5/5 LD50 4 368 mg/kg Pour l'administration intraveineuse, on a dissous-le BIN dans de la soude normale et on a ajusté le pH à 7 avec de l'acide chlorhydrique normal. Oa a administré la solution ainsi obtenue par des injections intraveineuses à des doses de 800 mg/kg et 1 000 mg/kg. Les résultats sont indiqués ci-après : Dose de BIN administrée (mg/kg) 800 1 000 rats morts/rats traités 0/5 5/5 LD50 900 mg/kg Ces résultats confirment que le composé de l'invention présente une toxicité très faible. (7) Dose et méthode d'administration. I1 est évident, d'après les valeurs de toxicité aiguë indiquées ci-dessus, que le BIN présentant une très grande sé curité, de sorte que les doses d'utilisation ne sont pas particulièrement limitées. Toutefois il est préférable de ne pas dépasser une dose journalière de 10 mg/kg à 150 mg/kg. Le composé de l'invention peut être administré oralement ou par injection. En ce qui concerne l'administration par injection, on dissout le BIN par exemple dans de l'eau distillée avant son utilisation. Une méthode appropriée pour obtenir sa dissolution consiste à dissoudre le composé de l'invention dans es conditions alcalines et de revenir ensuite à une solution correspondant aux conditions physiologiques. Il est préférable d'utiliser l'administration intraveineuse. Dans le cas d'administration orale, le composé peut être administré en capsules, en comprimés, sous la forme d'une poudre ou dans une préparation liquide Ces diverses for d'ad- ministration peuvent être préparées selon des procédés bien connus et qui sont décits dans la pharmacie japonaise.C'est ainsi que le composé de l'invention utillisé sous la forme orale, peut contenir des liants, des excipients ou des produits ana- logues bien connus et pharmacoutiquement acceptables Un agent antithrombotique contenant du BIN ainsi préparé ou bien ses sels comme composant principal selon l'invention, présente une toxicité très faible et son action pout s'exercer d'une façon significative sur le corps humain vivant.Il en résulte que 19agent antithrombotique de l'inention est utile comme médicament aussi bien pour l'homme que pour l'animal La fonction et les effets du BIN ne sont pas constitués soule- ment par l'effet d'inhibition de l'agr6gation des plaquettes sanguines, mais également par 1 l'effet promoteur de la dissocia- tion de l'agrégation des plaquettes sanguines comme cela a été observé in vitro, ce qui permet de suggérer que l'agent contenant du BIN est utile comme médicament pour prévenir et pour soigner la thrombose. En outre on présume que l'utilisation simultanément du BIN selon l'invention et d'un agent de dissolution du caillot est utile comme médicament9 pour soigner la thrombose grâce aux différences de fonction des agents précités et des conséquences fonctionnelles qui en résultent. Certains modes de mise en oeuvre spécifique de la présente te invention sont illustrés dans les exemples suivants EXEMPLE 1 (injection) On dissout 10 g de sel de sodium du BIN dans 200 ml d'veau distillée pour injection, et on filtre le tout dans des conditions aseptiques à travers la membrane d'un filtre. On place ensuite des portions de 2 ml de filtrat dans des récipients en verre et on les seche par congélation. On scelle ensuite les récipients en verre. Dans ces conditions le compose de l'inven- tion peut être stocké en vue d'une reconstitution du liquide d'injection pour une administration ultérieure. (comprimé) BIN 500 g Lactose 500 g Amidon de pomme de terre 315 g Alcool polyvinylique 20 g Stéarate de magnésium 15 g 1 350 g Les constituants indiqués ci-dessus sont pesés respectivexent et l'on mélange d'une façon uniforme le lIN, le lactose ainsi que l'amidon de pommes de terre. Ensuite ces trois constituants ainsi mélangés sont mis sous la forme de granules selon un procédé habituel en utilisant comme solution de pétrissage, l'alcool polyvinylique dissous dans 450 ml d'eau. Les granules ainsi obtenus sont mélangés avec le stéarate de magnésium et on obtient des comprimés dans une machine utilisant des emporte-pièces à surface plane de 9 mi à bords biseau- tds, pour obtenir des comprimés ayant une épaisseur de 3,4 mm et un poids de 270 mg. EXEMPLE 3 (Capsule) III 125 g Lactose 860 g Stéarate de magnésium 15 g 1 000 g Les constituants mentionnés ci-dessus sont pesés respectivexent et mélangés de façon uniforme. On remplit ensuite des capsules n 3 en gélatine durcie, avec des portions de 200 mg de la poudre obtenue. EXEMPLE 4 (poudre) BIN 50 g Lactose 950 g 1 000 g Les constituants précités sont respectivement pesés et mélangés uniformément pour en obtenir une poudre. REVENDICATIONS 1. Agent antithrombotique, caractérisé par le fait qu'il comprend, comme ingrédient actif, de l'isonicotinate de benzoyle ou un de ses sels non toxiques pharmaceutiquement acceptables. 2.- Procédé d'inhibition de l'agrégation des plaquettes sanguines, en vue de son application à l'homme ou à un nimal, caractérisé par le fait qu'on administre un agent contenant, corme ingrédient actif, de lisonicotinate de benzoyle ou l'un de ses sels non toxiques pharmaceutiquement acceptables, à une dose journalière de 10 mg/kg à 150 mg/kg. 3.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait qu'on effectue une administration intraveineuse. 4.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait qu'on effectue une administration orale.