Brevet FR2402716A1 — publié le 19790406

L'invention se rapporte a un nouveau procédé pour la purification des macromolécules chargées, notamment des macromolécules biologiques ; elle concerne également un dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé ; enfin, elle se rapporteaux macromolécules chargées, biologiques notamment, ainsi prfparées. Les possibilités d'accès à des macromolécules biologiques hautement purifiées revêtent une importance croissante en recherche médicale mais aussi dans l'industrie pharmaceutique, vétérinaire ou alimentaire. Or, les techniques répandues actuellement ne permettent pas toujours d'atteindre de manière satisfaisante le degré de pureté recherché. La plupart des macromolécules biologiquement actives (enzymes, récepteurs, anticorps, protéines transporteuses...) possèdent un site caractéristique qui lie spécifiquement avec parfois une très forte affinité (Ka > 109 M 1), soit une autre macromole- cule, soit des composés chimiques, intervenant ou non dans leur mécanisme d'action. Ces composés susceptibles de se lier au site des macromolécules biologiques sont communément appelés "ligands". La fixation par liaison covalente de ces ligands sur un support inerte, tel que par exemple un gel de polysaccharide du type de celEi commercialisé par#barmacia'1-.sous l'appellation Sepharose, permet la confection de colonnes d'affinité. Lorsque l'échantillon contenant la macromolécule à purifier est filtré à travers la colonne d'affinité, la présence du "ligand" lié de manière covalente au support inerte permet de retenir exclusivement les macromolécules ayant une affinité pour ce ligand. Cela constitue le principe de la méthode bien connue appelée chromatographie d'affinité. C'est une méthode de purification très efficace qui n'a d'intérêt pratique qu'à condition de pouvoir ensuite extraire la macromolécule retenue sur la colonne d'affinité. L' élution ~ des macromolécules retenues sur une colonne d'affinité peut toujours se faire à l'aide d'un excès de ligand libre, mais ce procédé impose la dissociation ultérieure du complexe macromolécule-ligand, particulièrement difficile dans le cas de liaison-de très haute affinité. D'autres techniques d'élu- tion ont été utilisées, faisant appel a des variations de force ionique, de'pH, ou à des additifs chimiques diminuant la force de liaison. Mais ces techniques sont rarement applicables sans dénaturation partielle à des macromolécules ayant une très haute affinité pour le ligand employé. Le problème difficile à résoudre lorsqu'une macromolécule de très haute affinité est retenue sur une colonne d'affinité appropriée est celui de son élution et de sa récupération à l'état non lié. Il s'agit en effet de dissocier une liaison ~e très haute affinité sans dénaturer la macromolécule. On dit qu'une macromolécule est dénaturée notamment lorsqu'elle a perdu de manière irréversible son activité biologique, voire ses propriétés physico-chimiques,de solubilité par exemple, à la suite de dégradations plus ou moins importantes, thermiques, chimiques ou autres. Les principales méthodes utilisées à ce jour et leur principaux inconvénients sont brièvement énumérés ci-après : 1/ Elution par addition d'un exce#s de "ligand libre. Cette méthode permet par compétition du ligand libre avec le ligand ajouté à la colonne de récupérer la totalité des macromolécules retenues mais sous forme liées au ligand-iibre. Après élimi- nation de l'excès de ligand, il reste néanmoins a dissdcier,:le plus souvent par dialyse, le complexe macromolécule-ligand fortement associé, ce qui entraine une importante dénaturation. De plus, la colonne contaminée par l'excès de ligand libre n'est pas#récu- pérable pour d'autres essais. 2/ Variation de la force ionique du tampon d'élution. En présence d'affinités élevées, il faut faire appel a de fortes concentrations d'urée ou de guanidine, ce qui n'est pas toujours suffisant, mais conduit souvent a une importante dénaturation. 3/ Variation du pH ou de la température. Sauf dans quelques cas particuliers, netamment certaines enzymes, il faut atteindre des conditions extrêmes, très dénaturantes. 4/ Emploi d'additifs. Selon le cas particulier étudié, des méthodes spécifiques basées sur l'emploi d'additifs, tels que acides, bases, solvants organiques miscibles a l'eau, ont été préconisées, Mais ces mé méthodes ne sont pas généralisables et entrainent, même dans les meilleurs cas, une dénaturation partielle. En outre, elles peuvent aussi rendre les colonnes d'affinité inutilisables pour d'autres essais, les gels de polysaccharides étant assez fragiles. Toutes ces méthodes ne donnent pas satisfaction car elles conduisent presque toujours en présence d'affinités élevées a une contamination des macromolécules purifiées par des macromo lécules dégradées. Cela est un inconvénient majeur puisque la purification ne peut être poussée plus loin, la chromatographie d'afin finité étant pourtant la méthode de purification la plus efficace connue à ce jour. Par ailleurs, ces méthodes ne sont pas aisément généralisables, car elles sont trop dépendantes de la nature de l'interaction macromolécule-ligand. L'un des buts essentiels de l'invention est donc de pouvoir disposer de macromolécules biologiques actives à l'état aussi pur que possible, afin de répondre a ta demande actuelle de la recherche médicale et de l'industrie pharmaceutique. Un autre but est de mettre au point un procédé général simple, et rapide à mettre en oeuvre. Enfin, un autre but vise un appareillage simple général et facile à adapter. Ce nouveau procédé pour la purification de macromolécules chargées notamment de macromolécules biologiques, dans lequel on retient de manière connue lesdites macromolécules par passage à travers une colonne d'affinité pourvue d'un ligand spécifique, fixé de manière covalente au contenu de la colonne, puis on élue cette colonne de manière > récupérer les macromolécules purifiées sous forme non liée , se caractèrise en ce que l'on effectue l'élution par électrophorèse de la colonne d'affinité. Comme on le sait, l'électrophorèse sur gel est une technique largement répandue en biochimie, qui permet de séparer des protéines en fonction de leur charge par application d'un courant continu entre deux électrodes placées de part et d'autre du gel imprégné d'une solution tampon convenable. Des procédés préparatifs ont été décrits qui permettent la récupération des protéines ainsi séparées en fonction de leur charge. En d'autres termes, le procédé selon l'invention consiste à fixer sur un ligand des macromolécules ayant une certaine activité pour ce ligand, de manière à former une colonne dite d'affinité, puis à récupérer ces macromolécules chargées à l'aide d'un courant- électrique directement appliqué à ladite colonne, de manière à faire migrer ces macromolécules chargées -et a les libérer de la colonne. Il va de soi que pour que la migration se produise, on doit opérer le cas échéant dans un tampon de pH éloigné du pH isoélectrique des macromolécules que l'on désire éluer. La présente invention illustre et enseigne la possibilité offerte par la migration électrophorétique effectuée sur la colonne d'affinité dans les conditions décrites ci-après, de dissocier la liaison ligand-macromolécule retenue et d'entraîner la macromolécule ainsi libérée dans le compartiment d'une des électrodes. Il est certain que si généralement on utilise des colonnes, on peut, tout aussi bien sans sortir du cadre de l'invention, disposer le contenu sous forme de plaques ou analogues. On a déterminé que pour obtenir de bons résultats, il faillait en outre, lors du fonctionnement - réduire l'échauffement de la colonne d'affinité et de la partie ou l'on récupère les macromolècules non liées afin d'éviter leur dégradation et/ou leur dénaturation, - mattriser le dégagement gazeux provoqué par la décomposi tion du tampon d'électrophorèse. En pratique - pour réduire l'échauffement de la colonne d'affinité, on refroidit celle-ci de manière connue, notamment à l'inté rieur et a l'extérieur, - pour réduire l'échauffement de la partie où l'on récupère les macromolécules non liées, afin d'éviter une dégradation de ces molécules au contact de l'électrode : d'une part, on dispose une membrane de dialyse entre cette électrode et la colonne à traiter, et d'autre part, on opère à une tem pérature inférieure à la température de dégradation signi ficative de ces macromolécules ; un technicien connaît par faitement ces températures qui dans la plupart des cas pra tiques se situent entre quatre (4) et vingt (20) degrés C. Là également, comme on le sait, (voir notamment Techniques in Protéin Chemistry de J. LEGETT BAILEY pages 250-258, édité par ELSEVIER AMSTERDAM 1967 - 2ème édition) une mem brane de dialyse est destinée a permettre le passage des ions et des petites molécules, mais à empêcher celui des macromolécules ; les dimensions des pores de ces membranes sont choisies selon les dimensions des molécules que l'on désire retenir ; ces produits sont actuellement largement répandus et bien connus-des spécialistes de la dialyse, de sorte qu'il n'y a pas lieu de les décrire ici en détail - pour maltriser le dégagement gazeux résultant de la decom- position du tampon d'electrophorèse, on fait également ap pel à une membrane de dialyse disposée, comme précédemment, entre ltélectrode inférieure et la colonne d'affinité. Une seule et même membrane remplit avantageusement ces deux fonctions, a savoir maltaise du dégagement gazeux et ré duction de l'échauffement.A défaut d'une telle précaution, le dégagement gazeux, généralement constitué par de l'hy drogène, de l'oxygène, voire du chlore, selon la nature du tampon employé, d'une part, dégraderait les macromolécules, et d'autre part, réagirait avec le gel de séparation anodique et c#athodique propre a l'electrophoreset en formant une couche gazeuse non conductrice qui localisée à l'interface,- s'oppo serait au passage du courant. On améliore -la maîtrise de ce dégagement gazeux en soumettant l'enceinte où-il se forme à une agitation et une élimination parmanentes. Il va de soi que le ligand choisi doit résister aux conditions de l'électrophorese et au milieu tampon. Par ailleurs, on a déterminé que l'on obtenait les meilleurs résultats si ce ligand'est lié au support inerbede la colonne d'affinité, généralement sous forme de gel, par des liaisons covalentes non hydrolysables. Avantageusement, ce ligand peut être relié au gel de la colonne par des liaisons amides qui résistent aussi bien aucpli acides ou basiques des tampons employés. Ces liaisons amides sont formées de manière connue, par couplage d'une fonction amine ou acide introduite sur le ligand, avec une fonction recpectiven#ent soit acide soit amine placée à l'extrémité d'un chaînon intermédiaire. L'autre extrémité du chaînon intermédiaire doit comporter une ou plusieurs fonctions amines pour effectuer la liaison au gel de polysaccharide par des procédés connus. Un avantage supplémentaire de l'utilisation d'une membrane de dialyse, mais aussi de la nature même du procédé d'élution electrophorétique, est que l'élution de la macromolécule s'effectue sans dilution inutile, ce qui évite les étapes ultérieures de concentration de l'échantillon purifié, par lyophilisation par exemple, qui sont parfois sources de dénaturation partielle. L'invention concerne également un dispositif simple pour la mise en oeuvre de ce procédé. Ce dispositif se compose - d'une colonne destinée à recevoir le produit à traiter et un tampon d'electrophorèse, ladite colonne présentant a à son extrémité inférieure un moyen connu de séparation en deux compartiments anodiques et cathodiques, une électrode reliée à une source de courant electrique, des moyens de réfrigération, - d'une cuve disposée sous la colonne, équipée également de moyens de réfrigération et dans laquelle débouche une élec trode reliée a la susdite source de courant electrique, ladite cuve étant destinée à recevoir également un tampon d'electrophorèse, - d'une membrane de dialyse fixée dans la cuve à l'extrémité inférieure de la colonne et remplie de tampon d'electro phorèse. Avantageusement, la colonne et la cuve inférieure comportent en outre des moyens d'évacuation des gaz et la cuve inférieure des moyens d'agitation du milieu ambiant. En pratique, l'électrode haute est placée dans le tampon au sommet du produit à purifier et l'electrode basse est fixée audessous de. la membrane de dialyse. Avantageusement, la membrane de dialyse peut revêtir la forme d'un sac fixé à l'extrémité inférieure de la colonne, ce qui permet de récupérer commodément dans celui-ci les macromolécules éluées. Selon les dimensions et les caractéristiques de l'appareil que l'on doit réaliser, un technicien peut aisément déterminer les critères spécifiques : débit de la réfrigération, intensité du courant, sections, hauteur et ~volume de gel etc., en tenant compte notamment des impératifs liés a la technique de l'electropho- rèse. La manière dont l'invention peut être réalisée et les avantages qui en découlent ressortiront mieux de la suite de la description a l'appui de la figure annexée et des exemples de réalisation donnés ci-après à titre indicatif et non limitatif. La figure unique représente en coupe un dispositif conforme a l'invention. Ce dispositif se compose - d'un bouchon en verre 1 dont l'extrémité inférieure forme un rodage mal-e 2 ; ce bouchon 1 est équipé de trois (3) sorties hautes, respectivement destinées . 3 à recevoir l'electrode haute 13, . 4 recevoir un thermomètre 12, . 5 à permettre l'évacuation des gaz ;; - d'une colonne cylindrique 6 également en verre, dont l'ex trémité supérieure présente un rodage femelle 7 destiné a--recevoir le rodage 2 et dont l'extrémité inférieure est équipée d'une plaque de verre fritté 8, sur les deux faces 8a et 8b de laquelle est polymérisée "in-situ" une couche de gel de polyacrylamide à quatre (4) pour cent, ou de tout autre moyen perméable aux macromolécules ; cette co lonne est réfrigérée par un tube intérieur 9 relié a une amenée 10 et a une sortie 11 de fluide réfrigérant, tel que notamment l'eau froide dans cette colonne 6 débouche . un thermomètre gradué 12, . une électrode 13, constituée par un fil ou une plaque de platine et dont l'extrémité circulaire 14 est placée dans le tampon supérieur d'electrophorèse 15 au sommet du gel 16 contenant les macromolécules biologiques à traiter et qui entoure le tube-réfrigérant 9 afin de faciliter son propre refroidissement ; la hauteur de cette extrémité 14 peut être variable en fonction du volume de gel 16 que la'on désire traiter ; à titre d'exemple, ce gel est avantageusement à base de polysac charide connu sous le nom de Sépharose d'une cuve inférieure 17, également en verre, soudée à la colonne 6, équipée respectivement . de deux évacuations de gaz 18 et 19, l'une ou l'autre pouvant servir au remplissage de la cuve inférieure par du tampon d'électrophorèse, . d'une amenée 20 pour ltelectro e basse 21, également'en platine, vissée sur celle-ci grâce à un bouchon 22, d'un fond en forme de rodage femelle 23, dans lequel rient s'emboîter un bouchon mâle 24 à tête plate, en ver re ou analogue, équipé également'd'amenée 25 et de sor tie 26 de fluide réfrigérant destiné à refroidir la cuve 17 ;; d'une membrane de dialyse éventuellement en forme de sac 28 dont l'extrémité ouverte 29 est fixée 8-la base de la co lonne 6 et plus précisément de la plaque frittée 8, par un collier élastique ou équivalent et dont l'autre extrémité est reliée à un tube "cathétère" de prélèvement 30, placé dans une ouvertute 31 de la cuvel7, destiné à permettre le remplissage du sac 28 au moyen d'un tamppn d'électrophorèse 32 ; une fois ce remplissage effectué, le tube 30 est bouché.Ce-tube 30 serte récupérer, soit en cours de trai tement, soit une fois le traitement terminé, les macromo lécules éluées contenues dans le sac 28 ; il va de soi que le compartiment séparé par la membrane de dialyse 28 et le compartiment de l'électrode inférieure 35 doivent être reliés entre eux par du tampon d'électrophorèse 32, afin que le courant puisse passer ; dans la description ci après, le sac de dialyse 28 baigne dans le tampon d'électro phorèse présent dans la cuve inférieure 17 ; - d'un agitateur magnétique 33 - éventuellement, d'un disque 34 de verre situé juste au des sus de l'électrode basse 21, dont l'extrémité 35 est éga lement circulaire et en dessous du sac de dialyse 28 ; ce disque est destiné à favoriser la déviation et l'évacua tion des gaz par 18 et 19. Selon la nature des produits traités et donc du pH du tampon, soit l'électrode haute, soit l'électrode , basse fonctionne comme anode ou cathode. I1 est indispensable toutefois de récupérer la macromolécule biologique active purifiée vers le bas et précisément dans le sac 28. I1 est à souligner que le bouchon de serrage 22 permet de sortir facilement l'électrode 21 vers le bas et facilite la mise en place du sac de dialyse 28. Par l'extrémité haute 7 de la colonne 6, on introduit le contenu de la colonne d'affinité sur lequel est retenu la macromolécule biologique à purifier,et etle tampon dlelectro- phorèse. Une fois l'appareil en place, les électrodes 3 et 21 sont reliées de manière connue, à une source de courant électrique, par exemple à un générateur de courant continu d'intensité et voltage variables. Le sens de passage du courant est choisi en fonction du pH isoélectrique des macromolécules à traiter et du pH du tampon choisi. Dans les exemples qui suivent, le refroidissement est assuré par un cryostat et est réglé en fonction de l'échauffement produit par le passage du courant. Tous ces exemples ont été conduits sur des anti corps anti-stéroldes. Exemple 1 : Dans les conditions expérimentales définies ciaprès, on va essayer de purifier les anti corps anti-5#-dihydro- testotérone (DHT) obtenus à partir d'haptène carboxyméthyloximino-7#- 50 Le gel de polyacrylamide à 4 % a été polymérisé à 40 C sur la plaque 8 par le persulfate d'ammonium. Le tampon d'électrophorèse a un pH de 4,5 et est constitué par de l'acide acétique-0 alanine. Ce pH est en dehors du pH iso- électrique de ces anticorps qui est compris entre 5 et 8. Aux électrodes 3 et 21, on applique un courant continu de 300 volts et 200 m A. On maintient la température du gel entre 6 et 10 C. Le sac de dialyse 28 est du type"Visking"vendu par Union Carbide. Après 4 heures d'électrophorèse, environ 50 à 60% de l'ac tivité. de liaison des anticorps sont élués dans le sac de dialyse 28, l'affinité étant de 1010 M 1. Les anticorps ainsi obtenus, testés par diverses méthodes, sont purs : aucune détérioration n'est observée. Si on reprend les anticorps ansi élués pour les repasser sur la même colonne d'affinité, puis élués par électrophorèse, on obtient 100% de l'activité de liaison. De plus, on a observé une amélioration notable de la spécificité de ces an#ticorps vis à vis de la testostérone (réaction croisée passant de 60 à 28 %). Par ailleurs, le reste des anticorps restant sur le gel initial peut être élué par un excès de ligand 5&alpha;-DHT. Après dialyse, on observe une affinité plus élevée, de l'ordre de 1011 M-1. Cette limite pourrait être dépassée à l'aide de générateurs de courant électrique plus puissants et un refroidissement adapté en conséquence. Exemple 2 : On répète l'exemple 1 à une seule variante près. Comme anticorps, on utilise l'anti-5&alpha;-DHT obtenu à partir d'haptène carboxyméthyloximino-3-5&alpha;-DHT. On obtient des résultats analogues. Exemple 3 : On répète l'exemple 1 sur une colonne d'affinité d'hémisuccinamido-3ss 1@ 5&alpha;-DHT. On obtient les mêmes résultats en précisant toutefois que l'amélioration de spécificité passe de 60 % à 23 %. Exemple 4 : Ofl répète l'exemple 1 pour#purifier la protéine sérique humaine transporteuse de l'oestradiol et de la testostérone (Te BG), qui est retenue l'aide du ligand carboxyméthyloxy mino-#stradiolet éluéeà pH 8,3 dans un tampon de tris-glycocolle. On obtient des résultats satisfaisants sur le plan de la pureté. Exemple 5 : A titre comparatif, on purifie des anticorps anti-stéroides retenus sur colonne d'affinité en employant des concentrations croissantes (0,1 à 1 M) d'amoniaque par la méthode de SAIRAM et PORATH décrite dans Biochem.--Biophys. Res. Commun. 69 1, 1976; 190-196. On obtient' des taux de récupération analogue a l'exemple 1 de 60 s, Cette méthode à l'ammoniaque ne permet pas d'éluer les mêmes populations d'anticorps que le' procédé de l'invention. De plus, on constate que les anticorps demeurés sur le gel sont dénaturés alors que ceux-ci sont récupérables par un excès de stéroïde avec le procédé de l'invention. Cet exemple illustre parfaitement le progrès obtenu par la mise en oeuvre de l'invention. Il convient de préciser que ce procédé est distinct de la juxtaposition pur e et simple des techniques connues de retenue sur colonne d'affinité et surtout d'électrophorèse sur gel, en ce sens que l'invention montre une possibilité nouvelle qui est l'aptitude de la migration électrophorétique à dissocier une liaison de forte affinité entre la macromolécule et un ligand spécifique fixé de manière covalente sur la colonne et à entraî- ner cette molécule hors de la colonne. Cela constitue le handicap qu'il fallait franchir avant de: mettre au point l'appareil utilisable en pratique. I1 n'était donc pas évident que la combinaison, dans des conditions déterminées, des deux moyens connus, à savoir, la colonne d'affinité et l'électrophorèse, interagissant l'un sur l'autre permettraient de résoudre ce problème de purification poussée qu'on ne savait pas encore résoudre jusqu'alors. En d'autres termes, le procédé et le dispositif décrits permettent, d'une part, une purification plus poussée des macromolécules biologiques chargées et même une purification totale ou presque totale, et d'autre part, de purifier des macromolécules que l'on ne savait pas purifier jusqu'alors, si ce n'est par des méthodes spécifiques et complexes; et enfin de disposér d'un procédé rapide et apte a traiter la plupart de ces macromolécules. I1 va de soi que ce procédé peut être combiné aux méthodes antérieurement connues pour opérer des élutions partielles. Le procédé et le dispositif de l'invention peuvent être utilisés avec succés pour l'obtention à l'état pur et non lié de toute macromolécule chargée, notamment de macromolécules biologiques, susceptible d'être retenue sur colonne d'affinité appropriée. Le principe de cette méthode reposant essentiellement sur un critère physico-chimique (pH isoélectrique et migration électrophorétique), il existe seulement des limites de stabilité et de force d'association des macromolécules avec les ligands employés. Un technicien peut aisément, sans sortir du cadre de l'invention, choisir de manière appropriée le tampon, les caractéristiques de courant, etc., en fonction des produits à traiter. Ce procédé et ce dispositif peuvent recevoir de nombreuses applications, notamment dans le domaine pharmaceutique, vétérinaire, alimentaire et surtout celui de la recherche médicale. REVENDICATIONS 1/ Procédé pour la purification de macromolécules chargées, dans lequel, on retient de manière connue lesdites macromolécules par passage à travers une colonne d'affinité pourvue d'un ligand spécifique, fixé de manière covalente au contenu de la colonne, puis on élue -cette colonne de manière à récupérer les macromolécules purifiées sous forme non liée, ca#ractérisé en ce que l'on effectue l'élution par électrophorèse de la colonne d'affinité. 2/ Procédé selon revendication l, caractérisé en ce que la macromolécule chargée est une macromolécule biologique. 3/ Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que pendant l'électrophorèse, on refroidit la partie où l'on récupère les macromolecules non liées à une température inférieure à la température de dégradation de ces macromolécules. 4/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que pendant l'électrophorèse on refroidit la colonne d'affinité. 5/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que pendant l'électrophorese, on élimine le dégagement gazeux produit. 6/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on récupère les macromolécules non Iiées > éluées dans un compartiment séparé de l'électrode inférieure par une membrane de dialyse disposée à l'extrémité de la colonne d'affinité et en dessus de l'une des deux électrodes d'électrophorèse. 7/ Procédé selon l'une desrevendications 1 à 6, caractérisé en ce que le ligand est lié au support inerte de la colonne d'affinité par des liaisons covalentes non hydrolysables. 8/ Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ce ligand est relié au support inerte constituant la colonne par l'intermédiaire de fonctions amides. 9/ Dispositif pourla mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il se compose - d'une colonne 6 destinée à recevoir le produit à traiter et un tampon d'électrophorèse, ladite colonne présentant à à son extrémité inférieure, un moyen connu 8, 8a, 8b de séparation en deux compartiments anodique et cathodique, une électrode 3-14, reliée 'à une source de courant élec trique, des moyens 9, 10 et 11 de réfrigération, - d'une cuve 17 disposée sous la colonne 6, équipée également de moyens de réfrigération 25-26 et dans laquelle débouche une électrode 21-35 reliée à la susdite source de courant électrique, ladite cuve étant destinée a recevoir également un tampon d'électrophorèse, - d'une membrane de dialyse 28 fixée dans la cuve 17, à l'ex trémité inférieure de la colonne 6 et remplie de tampon d' électrophorèse. 10/ Dispositif selon revendication 8, caractérisé en ce que la colonne 6 et la cuve inférieure 17 comportent des moyens, respectivement 5-18 et 19 pour évacuer les gaz. 11/ Dispositif selon l'une des revendications 8 et 9, caractérisé en ce qu'il comporte , dans la cuve inférieure 17, un moyen 33 pour agiter le milieu ambiant. 12/ Dispositif selon l'une des revendications 9 a 11, carac térisé en ce que la membrane de dialyse a la forme d'un sac 28 fixé à l'extrémité inférieure 8 de la colonne 6, relié à l'extérieur en 31 à un moyen 30 de récupération produits purifiés. 13/ Macromolécules chargées purïfiées,notaaent xnacratolécuies biologiques, caractérisées en ce qu'elles ont #été préparées par la mise en oeuvre du procédé défini à l'une des revendications 1 à 8.