Brevet FR2396078A1 — publié le 19790126

Ltinvention concerne un procédé de production de substances inhibant la ss lactamase, la MC 696 - SY 2-A et la MC 696 - SY 2-B. La ss lactamase est une enzyme produisant la rupture de l'anneau ss-lactame présent dans les antibiotiques fi lactame, y compris les penicillines et les céphalosporines.L'invention concerne plus particulierement un procédé de récupération sé- lective et de purification de la substance MC 696 - SY 2A, agissant comme inhibitrice forte de la ss lactamase, à partir du bouillon de culture obtenu par culture d'une souche du genre Streptomyces susceptible de produire la substance MC 696 - SY 2 et qui est décrite dans les demandes de brevet japonais no 24597/ 76 et 33635/76, ainsi que dans le brevet US Ne 3 928 569. La substance MC 696 - SY 2, découverte par la Demanderesse peut inhiber l'activité de la ss-lactamase de sorte que son administration jointe à celle des pénicillines et/ou des céphalosporines sera utile pour la chimiothérapie des maladies causées par des bactéries résistantes aux pénicillines et aux céphalospo- rines. Le terme "Substance MC 696 - SY 2" utilise ci-après de fa çon générale comprend, sauf mention contraire, la substance MC 696 - SY 2A, la substance MC 696 - SY 2B et les mélanges de ces deux substances. On peut donner comme exemples de souches produisant la substance MC 696 - SY 2 et de techniques de culture des souches, celles mentionnées dans les demandes de brevet japonais et le brevet US mentionnés ci-dessus Par exemple1 on stérilise un milieu contenant 2 % de glycérol, 1,5 X de poudre de soja, 0,26 % de KH2PO4, 0,02 % de K2HPO4, 0,0005 % de CoCl2.6H2O et 0,005 % d'huile de silicone dans de l'eau de ville (pH environ 6,2). On inocule le milieu de culture avec la souche Streptomyces fulvoviridis MC 696 - SY 2 (déposée au "fermentation Research Institute" sous la référence FERM-P 1504 et dans l'"American Type Culture Collection sous la référence ATCC 21954), et on fait incuber dans des conditions appropriées.A la fin de l'incubation, au bout de 2-5 jours, la substance MC 696-SY 2 s'accumule dans le bouillon de culture. On peut déterminer la capacité d'inhibition de pénicillinase (ss lactamase) de la substance MC 696SY 2 par les méthodes décrites ci-dessous de titrage jodométrîque et d'essai sur plaque agar. 1 ) Méthode de titrage iodométrique : on dissout 0,1 ml d'in- hibiteur de pénicillinase dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0), 0,25 ml de pénicillinase dans le même tampon (8000 unités/ ml) préparée à partir de pénicillinase (300 unités/mg ; Nutritional Biochemical Corp., Ohio, U.S.A.) ou à partir de ss-lacta- mase75 produite par E. Coli K-12 W 3630 R75 (H. Ogawara, K. Maeda et H. Umezawa ; Biochemical Biopys. Acta 289, 203-211, 1972) et 0,4 ml de tampon sont placés dans un tube à essai et agités doucement à 37 C pendant 5 minutes. On ajoute un mélange 0,25 ml de sodium pénicilline G (8000 unités/ml) dans le même tampon et on poursuit l'agitation pendant 35 minutes. Le mélange est ensuite chauffé pendant juste une minute au bainmarie bouillant pour stopper la réaction. On prépare de la même manière un contrôle sans inhibiteur, un témoin sans pénicillinase et un autre témoin sans inhibiteur ni pénicillinase pour donner avec le tampon un volume de l mi. On ajoute à tous les tubes à essais, contrôle et témoin, 5 ml d'une solution d'iode 0,01 N. Après 15 minutes on titre l'iode en excès avec du thiosulfate de sodium 0,01 N en utilisant comme indicateur une solution d'amidon à i X. On calcule la valeur As à partir du titre du témoin (sans pénicillinase ni inhibiteur) moins celui du contrôle (sans inhibiteur), et la valeur At à partir du titre d'un autre témoin (sans pénicillinase) moins celui de l'échantillon contenant la pénicilline, la pénicillinase et l'inhibiteur.Le pourcentage d'inhibition est calculé diapres l'équation Inhibition % = 100 - At x 100 As Par titrage selon le procédé ci-dessus1 un échantillon de sel de sodium de MC 696-SY 2A, de pureté maximum, produite selon le procédé de la présente invention donne 50 X d'inhibition (ID50) dans une quantité de 0,1 - 0,3 mg. 2 ) Méthode sur plaque agar On utilise de la pénicillinase (500.000 unités/ml) achetée chez Tokyo Kasei C , On met en suspension du Staphylococcus aureus FDA 209 P sur un milieu incliné d'agar dans 10 ml de solution saline, et on l'utilise comme organisme d'essai. On utilise le milieu agar pour essai de pénicilline. On met sur plaque 10 ml de milieu agar fondu contenant 500 unités de pénicillinase, 100 unités de potassium pénicilline G et la suspension de l'organisme d'essai (1 ). On place sur l'agar, dans un temps variant entre 15 minutes à 2 heures après préparation des plaques, un disque contenant une quantité convenable de l'inhibiteur. Après incubation toute une nuit à 370 C, une zone claire d'inhibition apparait.La relation donnée par la formule d = a log C + ss (a, = constantes) est trouvée entre le diamètre de la zone d'inhibition (d) et la concentration de l'inhibiteur (C) dans la gamme de 0,03 à 5 unités/ml de substance MC 696-SY 2A. Selon le même processus, on a trouvé qu'un échantillon de sel de sodium de substance MC 696 - SY 2A de pureté maximum a une force d'environ 10.000 unités/mg, quand on utilise comme standard présentant une force de 1000 unités/ mg un échantillon de substance MC 696 - SY 2A. En général, la substance-MC 696 - SY 2 est facilement soluble dans lteau, elle existe essentiellement dans la partie liquide du bouillon fermenté de souche Streptomyces fulvoviridis MC 696-SY 2. Elle n'est pratiquement pas extraite par le butarol, l'acétate d'éthyl, l'éther éthylique, le chloroforme, le. benzone etc... On peut utiliser l'extraction avec ces solvants pour éliminer les impuretés au cours de la récupération de la substance MC 696 - SY 2, si nécessaire. Pour cette récupération, on peut obtenir le filtrat de bouillon par filtration ou centrifugation du bouillon de culture pour éliminer les matières solides, les mycelia et la substance MC 696 - SY 2 restant dans le filtrat ou dans une autre solution aqueuse récupérée à l'aide d'un adsorbant.Le charbon actif constitue un adsorbant préféré, et la substance MC 696 - SY 2 adsorbée sur charbon actif peut être éluê avec l'acétone aqueuse, le butanol aqueux, le propanol aqueux etc... et spécialement avec un bon rendement avec 30 h de propanol dans l'eau à pH proche de 7,0. En raison du caractère acide de la substance MC 696 - SY 2, on peut aussi utiliser, pour effectuer la récupération de la substance MC 696 - SY 2 desrésines échangeuses d'anions et des celluloses échangeuses anions. On peut utiliser dans ce but des résines échangeuses d'anions fortement basiques telles que l'AMBERLlTE IRA-401 de Rohm & Haas C , U.S.A., faiblement basiques telles que l'AMBERLITE IR-4B de Rohm & Haas Ce, U.S.A. ou la DEAE CELLULOSE de Brown C Ltd). La demanderesse a découvert que, quand il faut récupérer la substance MC 696 - SY 2 du bouillon de culture contenant la substance MC 696 - SY 2A, cette substance peut Btre stabilisée pendant les stades de récupération et de purification, par sa conversion en sel et-spécialement en sel d'un métal alcalin ou alcalino terreux, par exemple de sodium ou de baryum. L'invention concerne donc un procédé de production de substance MC 696 - ST 2 A qui consiste à cultiver une souche MC 696 - ST 2 Streptomyces fulvoviridis (identifié comme FERX-P 1504 ouATCC 21954), afin de produire et d'accumuler la substance MC 696 - ST 2 A dans le milieu de culture puis à récupérer cette substance du bouillon de culture contenant la substance MC 696 - ST 2A, alors que cette substance est maintenue sous forme de sel de la substance MC 696 - ST 2 A, après avoir converti, dans une phase appropriée antérieure du processus de récupération et de purification ladite substance en son sel. La demanderesse a également découvert que la substance XC 696 - ST 2A dans le bouillon de culture ou dans le filtrat pouvait être préférentiellement adsorbée sur uue résine échangeuse d'anions fortement basique, telle que l'AMBERLITE IRA 401 (forme sulfate) , qui est ensuite éluée avec une solution aqueuse de chlorure d'ammonium, chlorure de sodium ou sulfate d'ammonium et de préférence avec une solution aqueuse de chlorure d'ammonium 2M pour récupérer, avec un bon rendement, la substance MC 696 - ST 2 A seule. Afin de séparer la substance XC 696 - ST 2A des sels minéraux, on peut utiliser, comme mentionné plus haut, le charbon actif quoiqu'un tamis moléculaire tel que le SEPHADEX G 25 de Pharmacia Chemicals ou un adsorbant synthétique tel que l'AMBERLITE XAD 2 de Rohm & Haas C conviennent aussi dans ce but. On a constaté que la résine DIAION activé), résine polystyrène non-ionique fabriquée par Mitsubishi Kasei C Ltd permet la récupération, avec un très bon rendement, de la substance MC 696 - ST 2A, d'une pureté accrue.La demanderesse a de plus découvert que par un traitement en plusieurs étapes, utilisant le FLORIDIL (silicate de magnésium activé), la cellulose ECTEOLA (Brau C ) et le SEPHADEX G 25 en combinaison, dans lequel le traitement à chaque étape, est effectué avec une résine échangeuse de cations fortement acide, sous forme de sel de baryum, par exemple l'AMBERLITE IR-120 B ou le DOWEX 50W x 4 (forme sel de Ba), l'activité de la substance MC 696 - SY 2A était plus régulière que dans le cas où l'on ne faisait pas ce trai tement. Les expériences ont montré que le sel de baryum brut de la substance MC 696 - ST 2A (environ 400 unités/mg) est traité avec le DOWEX 50W x 4 (forme sel de Na) pour transformer le sel de baryum en son sel de sodium qui est soumis à une chromatographie sur colonne sur SEPHADEX LH 20 en utilisant, comme solvant de développement, du méthanol aqueux à 85-95 % et de préférence a 91 ,', ou à une chromatographie sur colonne sur SEPHADEX LH 20. et sur gel de silice, enutilîsant, comme solvant de développement, l'acétonitrile aqueux à 85-95 % et de préférence à 92 %, et qu'ainsi la substance MC 696 - ST 2A de pureté élevée, qui peut atteindre une force d'environ 10.000 unités/mg est récupérée avec un bon rendement. Le procédé utilisant l'acétonitrile aqueux est utile pour l'obtention de la substance MC 696 - ST 2A, incolore. Le filtrat du bouillon de culture de souche Streptomyces fulvoviridis MC 696 - ST 2 (déposée sous la référence FERM-P 1504 ou ATCC 21954) est avantageusement ajusté à un pH légè- rement acide avec un acide dilué tel que l'acide sulfurique puis traité avec une résine échangeuse d'anions fortement basique telle que l'AMBERLITE IRA-400 ou IRA 401 (forme sulfate) pour adsorber la substance MC 696 - ST 2A.La résine est éluée avec une solution aqueuse de chlurure d'ammonium, chlorure de sodium ou sulfate d'ammonium et les fractions actives des éluats sont traitées au charbon actif pour adsorption de la substance désirée qui est alors extraite a l'acétone aqueuse L'extrait est traité avec une résine échangeuse de cations fortement acide1 par exemple 1'AMBERLITE IR 120 B ou le DOWEX 50W x 4 sous forme de sel de baryum pour transformer la substance MC 696 - ST 2A en son sel de baryum, et l'extrait acétonique ainsi traité est concentré à siccité pour donner une poudre brute contenant le sel de baryum de la substance MC 696 - ST 2A. La poudre brute est dissoute dans l'eau et on fait passer la solution dans une colonne de résine non-ionique adsorbante et poreuse pour adsorber le sel de baryum. La résine est ensuite éluée avec de l'eau désionisée et les fractions actives de l'é- luat sont traitées avec une résine échangeuse de cations fortement acide telle que le DOWEX 50W x 2 (forme sel de Ba) et concentrées à siccité pour donner une poudre brute secondaire. La poudre brute secondaire est soumise à un développement à l'acétone aqueux dans une colonne de silicate de magnésium activé, tel que le FLORIDIL et les fractions actives collectées de ltéluat sont traitées avec une résine échangeuse de cations fortement acide telle que le DOWEX 50W x 2 (forme sel de Ba) et déshydratées pour donner une poudre brute tertiaire. Une solution aqueuse de poudre brute tertiaire est mélangée à un tampon phosphate (pH 7,0) et la solution mélangée est développée avec le même tampon phosphate dans une colonne d'un tamis moléculaire cellulosique tel que ECTEOLA Cellulose, Les fractions actives collectées de l'effluent sont concentrées et le concentrat est développé avec de l'eau désionisée dans une colonne de résine non-ionique adsorbante et poreuse, telle que la résine DIAION HP-20. Les fractions actives de l'effluent sont traitées avec une résine échangeuse de cations fortement acide (forme sel de Ba), puis concentréeset chromatographiées dans une colonne de tamis moléculaire en dérivé de dextrane, tel que le SEPHADEX G 25, opération suivie d'un traitement avec une résine échangeuse de cation fortement acide (forme sel de Ba). La solution résultante du sel de baryum de la substance MC 696-ST 2A ainsi purifiée est déshydratée pour donner une poudre blanche pure de substances MC 696 - ST 2A sous forme de sel de baryum (voir exemples 1-5 ci-après). Ltétape de traitement de la poudre secondaire brute pour obtenir le produit tertiaire peut alternativement être précédée d'un traitement intermédiaire préliminaire dans lequel la poudre secondaire brute est dissoute dans du méthanol aqueux, dans une colonne de tamis moléculaire dextranique tel que le SEPHADEX LH-20, et les fractions actives de l'effluent sont traitées avec une résine échangeuse de cations fortement acide (par exemple DOWEX 50W x 4) sous forme de sel de Baryum puis déshydratées pour donner une poudre brute. Selon une seconde forme de réalisation de ltinvention, la poudre brute tertiaire obtenue selon la première forme de réalisation est soumise à développement avec l'acétone aqueuse dans une colonne de silicate de magnésium activé (tel que le FLORIDIL) et les fractions activées collectées de lteffluent sont traitées avec une résine échangeuse de cations fortement acide telle que le DOWEX CG 50 sous forme de sel de Ba, puis concentrées.Le concentrat est développé avec de l'eau désionisée dans une co lonne de tamis moléculaire dextrannique tel que le SEPHADEX G 25 et les fractions actives de l'effluent sont à nouveau traitées avec une résine échangeuse de cations fortement acide (forme sel de Ba puis déshydratées pour donner une poudre blanche de substance MC 696 - ST 2A sous forme de sel de Ba (voir exemple 7). La substance MC 696 - ST 2A, de nature fortement acide, forme facilement des sels avec des cations de métaux alcalins, tels que les cations sodium, potassium, lithium ou le cation ammonium ou autres et avec les cations de métaux alcalino-terreux, tels que les cations baryum ou calcium. Elle est donc stabilisée sous forme de sel. En particulier, le traitement de la substance MC 696 - ST 2A pour la transformer en son sel de baryum, comme mentionné plus haut, sert à sa stabilisation. Lez sels de sodium et de baryum de la substance MC 696 - ST 2A ont les propriétés physicochimques rassemblées dans la Table I ci-après. Quand ces sels sont traités avce le chlorhydrate d'hydroxylamine, l'absorption à 280 mm dans le spectre I.R. et l'activité d'inhibition disparaissent. Dans le spectre d'absorption IR du sel de Ba, l'absorption à 1770 cm due a la présence de l'anneau ss-lactame reste la même, même quand on mesure le disque KBr du sel de Ba après l'avoir laissé à température ambiante pendant 22 jours (voir fig. 1 et 2 du dessin schématique annexé). Table I - Propriétés physicochimiques de la substance MC 696 - SY 2A Propriétés Sel de Ba Sel de Na Aspect Poudre blanche Poudre blanche Point de fusion Pas de point de fusion Pas de point de fu défini - Décomposition sion défini - Décom- progressive au-dessus de position progressive 1540 C au dessus de 148 C Rotation spécifique [&alpha; ]27 D = -1095 (c = 1,H2O) [&alpha;; ]27 D = -110 (c=0,25, H20) Analyse élémentaire C13H14N2O9S2Ba.H2O C13H14N2O9S2Na2 3H2O 3H20 Cal. (,') Trouvé (%) Cal. (%) Trouvé (%) C 27,79 27,-73 C 30,83 31,00 H 2,87 3,33 H 3,98 3,98 N 4,99 4,82 N 5,53 5,26 Ba24,43 23,80 S 12,66 12,08 Solubilité Soluble dans l'eau Facilement soluble dans l'eau Insoluble dans méthanol, éthanol, butanol, acé tate dtéthyl, éther, chloroforme, benzène,etc Réactions colorées Positive aux réactions Ehrlich, Rydon-Smith, nitrate d'argent, fluorésceine et permanganate de potassium. Spectre d'ab- 1 % = 270 ) 240 nm 1 % sorption ultra- 240 nm (E (E = 305 ) 1 cm 1 cm violet (solu- 1 cm 1 cm 1 % 1 % tion aqueuse) 280 nm (E = 214) 280 nm (E = 220) 1 cm 1 cm Spectre d'asorp- 3500 3000, 1770, 1695 3400, 2950, 1765, 1625, 1590, 1520, 1405 1690, 1620, 1510, tion infrarouge 1385, 1265, 1230, 1070 1390, 1260, 1220. disque KBr) 1040, 1025, 980, 940 1060, 1035, 1020, 9Ù0, 790, 970, 930, 900, La figure 1 montre le spectre d'absorption infrarouge (disque KBr) du sel de sodium de la substance MC 696 - SY 2A préparée selon la présente invention et la figure 2 montre celui du même sel de sodium après maintien du disque KBr dans un dessicateur à température ambiante pendant 22 jours. Les spectres 1H T NMR et 13C NMR des sels de Ba et de Na de la substance MC 696 - SY 2A produite selon l'invention sont rassemblés dans les tables 2 et 3. Table 2 - Spectre 1H - NMR de la substance MC 696 - SY 2A Proton Sel de Ba (# ppm) Sel de Na (S,Ppm) CH3 1,98 d, J = 6 1,99 d, J = 6 COCH3 2,60 s 2,59 s CH2 3,53 dd, J = 10,18 3,54 dd, J = 10,18 3,98 dd, J = 9,18 3,98 dd, J = 9,18 CH 4,44 dd, J = 6, 9 4,42 dd, J = 6 9 CH 4,96 m , J = 6 4,98 m , J = 6 CH 5,38 m , J = 6,8 5,39 m , J = 6,9 CH= 6,87 d , J = 14 6,85 d , J =14 CH = 8,07 d , J = 14 8,05 d , J =14 Mesuré en D20 en référence à TMS (# = O). Table 3 - Spectre 13C NMR de la substance MC 696 SY 2A Carbone Sel de Sel de -Carbone Sel de Sel de Ba (#) Na (#) Ba (#) Na (#) 1 177,7 177,4 8 73,7 73,7 2 173,5 173,5 9 59,0 59,0 3 166,1 165,9 10 54,6 54,7 4 141,1 139,0 11 29,6 29,6 5 139,1 135,6 12 23,0 23,1 6 135,0 135,0 13 19,1 19,3 7 112,1 112,3 Mesuré en D20 en référence au dioxane ( # = 67,4). Les propriétés décrites ci-dessus, ainsi que celles de quelques produits de décomposition de la substance MC 696 - SY 2 A permettent de confirmer que la substance MC 696 - SY 2 A a la formule structurelle suivante En ce qui concerne le sel de Ba (force de 12.400 u/mg) et le sel de Na (force de 10.000 u/mg) et présentant un ID50 de 0,39 nanogrammes), les concentrations inhibitoires minimum de la croissance de différents microorganismes ont été déterminés par la méthode de dilution agar en utilisant un milieu agar plan. Les résultats sont rassemblés dans la table 4. De plus, les concentrations inhibitoires minimum du sel de Na (ID50 : 0,36 mg) déterminées par la méthode de dilution agar en utilisant le milieu agar Heart Infusion sont rassemblées dans la table 5. Table 4 - Spectre antimicrobien des sels de Ba et Na de la substance MC 696 - ST 2-A Organismes texts MIC ( g/ml) Sel de Ba Sel de Na Micrococcus flavus FDA/6 25 50 (25 - 63) Micrococcus lysodeikticus 25 50 (25) IF03333 Sarcina lutea PCI 1001 25 25 Bacillus anthracis 50 (100 - 25) Bacillus cereus ATCC 10702 100 tlOO - 25) Bacillus subtilis PCI 219 25 ( 100 - 25) Klebsiella pneumoniae PCI 602 100 (100) Proteus mirabilis n S-2201 100 (100) Proteus vulgaris 0 x 19 100 (50) (100 - 50) Proteus rettgerii CN 466 100 (50) > 100 Salmonella typhimurium T-63 100 (50) (100 - 50) Escherichia coli NIHJ 100 > lOo Escherichia coli W 3630 100 100 Pseudomonas aeruginosa souche 4 > 100 > 100 Mycobacterium smegmatis 607 > 100 > 100 Les valeurs données entre parenthèses correspondent à des concentrations inhibitoires partielles. Table 5 - Spectre antimicrobien du sel de Na de la substance MC 696 ST - 2 A Organismes tests MIC ( g/ml) > 100 24 heures 48 heures après incubation Staphylococcus aureus SMITH 50 > 100 Staphylococcus aureus ATCC 6538 P 25 > 100 Staphylococcus aureus S 642 50 > 100 Staphylococcus epidermidis 50 > 100 ATCC 12228 E. Coli NIHJ 12,5 100 E.Coli K-12 ML 1629 25 Kiebsiella pneumoniae ATCC 10031 25 > 100 Proteus vulgaris OX - 19 1,6 50 Salmonella typhimurium 1406 12,5 > 100 Shigella flexneri 1674 12,5 > 100 Bacillus subtilis ATCC 6633 12,5 50 Bacillus cereus ATCC 10702 > 100 > îoo Sarcina lutea ATCC 9341 12,5 50 Micrococcus flavus ATCC 10240 12,5 100 Pseudomonas aeruginosa > 100 > 100 L'influence de la substance MC 696 - SY 2 A sur l'activité inhibitoire des pénicillines contre différents microorganismes a été examinée.On a déterminé, danse but, les concentrations minimum d'inhibition (MIC) aux microorganismes tests pour l'Ampicilline, la benzylpénicilline, et la carbénicilline, à chacun des quelles on ajoutait de la substance MC 696 - SY 2 A en unité de O, 0,01, 0,1 et 1,0. Les résultats sont rassemblés dans la table 6 qui fait ressortir l'augmentation considérable de l'activité inhibitoire par l'addition de la substance MC 696 - SY 2-A. Table 6 - Effet synergique de la substance MC 696 - SY - 2A sur l'activité inhibitoire des pénicillines. MICROORGANISMES M I C ( g/ml) TESTS pénicillines Ampioilline (force 867 g/mg) Substance MC 696-SY 2 (unité) 0 0,01 0,1 1,0 E. coli K-12 W 3630 1,56 1,56 0,78 0,39 (0,2) E. coli K-12 W 3690 RGN238+ > 100 > 100 (100) 25 (12,5-1,56) Protsus rettgerri GN 624 (100) (100) (100) 100 (50-25) Proteus morganii GN 926 > 100 100 100 (50) 12,5 (6, 25) Proteus vulgaris GN 76 > 100 50 (25) 6,23 (3,12) 1,56 (0,78-0,39) Providence GN 327 12,5 (6,25) 1,25 (6,25) 3,12 (1,56) 0,78 (0,39) Serratia GN 633 100 100 100 50 (25) Klebsiella pneumonia GN 69 > 100 > 100 > 100 (100-50) Staphylococcus aureus S 642 0,1 (0,05) 0,1 (0,05) 0,05 0,0125 (0,006) TABLE 6 (suite) M I C ( g/ml) MICROORGANISMES Benzylpénicilline Carbénicilline TESTS (force 667 /mg) (force 804 g*/mg) 0 0,01 0,1 1,0 0 0,01 0,1 1,0 E.coli K-12 W 3630 25 25 (12,5) 12,5 3,12 12,5 (6,25- 6,25 (3,12 6,25 3,12 (1,56) 1,56) E.coli K-12 W 3630 RGN238+ (100) > 100 100 25 > 100 > 100 > 100 50(25-12,5) Proteus rettgerri > 100 > 100 > 100 > 100 50 25 25 12,5 GN 624 > 100 > 100 > 100 > 50 (25) 6,25 (3,12- 3,12(1,56- 3,12 0,78 Proteus morganii 0,78) 0,78) (1,56 GN 926 0,78) Proteus vulgaris 100 50(25- 3,12 1,56 25 12,5 6,25 0,39 GN 76 12,5) (6,25) Providence GN 327 100 100 25 (12,5) 1,56 1,56(0,78- 0,78(0,39) 0,78 0,39 (0,2) 0,39) (0,39) Serratia GN 633 > 100 > 100 > 100 > 100 50(25) 50(25) 50(25) 50(25) Klebsiella pneumonia GN 69 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 Staphylococcus aureus S 642 0,78 0,78 0,78 > 0,78 0,78 (0,39) 0,39 0,39 0,2 (0,1) On a effectué d'autres tests dans lesquels on a infecté des souris avec Staphylococcus 193 C et 90 minutes après infection, on a administré aux souris, par voie intrapéritonéale de la benzylpénicilline seule ou en mélange avec la substance MC 696 - SY 2A a une dose de 75 unités/souris, ou bien on a administré ce dernier composé seul (par voie intrapéritonéale) aux souris. 48 heures après l'administration1 on compte le nombre de souris survivantes. Les résultats des tests sont rassemblés dans la table 7 qui montre l'amélioration d'activité antibactérienne de la benzylpénicilline combinée à la substance MC 696 - SY 2~A. Table 7 - Influence de la substance MC 696 - SY 2A sur l'activité protectrice de la benzylpénicilline sur des souris infectées par Staphylococcus 193 C Nombre de souris Nombre Benzylpénicilline furvivantes d'essais unités/souris Substance MC 696 - SY 2-A 0 7,5 unités/souris 0 0/8 0/4 20 0/4 1/4 78 0/4 1/4 313 0/4 -1/4 e 1250 1/4 # 4/4 5000 4/4#### 4/4 # indique que la souris est morte " " que la souris est affaiblie et e " que la souris a le poil hérissé et est devenue a veugle mais n'est pas notablement affaiblie. Les exemples suivants illustrent d'ailleurs mieux l'invent ion. Exemple 1 - Un mélange de 1,0 ,' de glycérol, 3,0 % de liqueur de macération de malus, 0,05 % de K2H P04, 0,0005 % de CoCl2, 6H20 et d'huile de silicone KM-72 (Shinetsu Gagaku K.K.) est dissous dans l'eau désionisée et la solution est versée en fractions de 80 ml dans des fioles Sakaguchi de 500 ml et stérilisée à 125 C pendant 15 minutes (pH 6,2 - 0,2). Le milieu de culture liquide résultant est inoculé avec une boucle d'un organisme prélevé d'une culture en pente de souche Streptomyces fulvoviridis MC 969 - SY 2 (déposé sous les références FERM-P i504 et ATCC 21954) puis cultivé sous agitation à 28e C pendant 26 heures avec 135 va-et-vient par minute pour donner une culture primaire. Un autre milieu de culture liquide (50 1) ayant la même composition que ci-dessus est stérilisé à 1200 C pendant 30 minutes dans un récipient de fermentation en acier inoxydable de 130 l, et son pH est règlé à 6,2 - 0,2, On inocule 70 ml (0,14 % en volume) de la culture primaire audit milieu de culture, on poursuit par une autre incubation à 28 C sous une pression interne de 1,5 kg/cm2 avec aération (100 %) et agitation à 200 tours/min. en utilisant de l'antimousse ADECANOL LG 109 (Asahi Denka K.K.)dans des moyens de démoussage automatique pour obtenir une culture secondaire. Un autre milieu de culture liquide (300 1) comprenant 2,0 % de glycérol, 1,5 % de farine de soja, 0,26 % de KH2 PO4' 0,02 % de K2H PO4, 0,0005 % de CoCl2, 6H2O et 0,005 % d'huile de silicone, dissous dans de l'eau de ville, est placé dans un récipient de fermentation en acier inoxydable de 570 l et stérilisé à 1200C pendant 30 minutes (pH 6,2 r 0,2). On inocule 61 (2 % en volume) de ladite culture secondaire au milieu de culture liquide et l'on fait incuber 48 heures à 280 C sous une pression interne de 0,5 kg/cm2 avec aeration (300 l/min.) ) et agitation à 220 tours/min. on utilisant l'antimousse mentionné ci-dessus. Après incubation de 20 heures et 33 heures, on règle le pH du milieu de culture à 61 i + 0,1 par addition d'une solution aqueuse à 10 %. d'acide citrique. On ajoute au bouillon de culture résultant (pH 5,75, 300 ml, 140 u/ml) 21 kg d'HIFRO-SUPERCEL, comme adjuvant de filtration et on filtre le mélange sur filtre-presse pour éliminer les matières solides contenant les mycélia. On obtient alors 240 1 de filtrat de bouillon (pH 5,45 - gO u/ml) correspondant à un rendement de filtration de 5i,4 %. Exemple 2 480 l du filtrat de bouillon obtenu par le procédé de l'exemple 1 sont portés à pH 5,2 avec de l'acide sulfurique di lué, auquel on ajoute 5 1 de résine échangeuse d'ions AMBERLITE IRA 401 (forme sulfate, Rohm & Haas C ). Le mélange est agité pendant 30 minutes et filtre pour éliminer la résine qui est ensuite lavée avec 50 ml d'eau désionisée et rassemblée dans une colonne (9,0 x 80 cm). La colonne est éluée au chlorure d'ammonium 2M à 5 C, l'éluat est collecté en fractions de 500 ml et les fractions actives 8-112 sont combinées pour donner 52 1 d'une solution active (pH 5,4, 796 u/ml). La solution active est mélangée à 1 kg de charbon actif (Waco Junyaku K.K.) et agitée pendant 30 minutes pour adsorber la substance active.Le charbon actif est éliminé par filtration, lavé avec 50 ml d'eauet mis en suspension dans 18 l d'acétone aqueuse18 %. Le pH de la suspension est règlé à 8,0 avec de l'ammoniaque diluée puis la suspens ion est agitée à 400C pendant 30 minutes pour per mettre l'extraction de de substance active ; on filtre ensuite pour éliminer le charbon actif qui est lavé avec une petite quantité d'acétone. L'extrait et la solution de lavage sont combinés et la solution combinée (17 1, pH 7,6, 1260 u/mî) sont mélangés à un litre de résine échangeuse d'ions AMBERLITE IR 120 (forme sel de Ba, Rohm & Haas C ) et agités pendant 30 minutes.La résine est ensuite éliminée par filtration et le filtrat (17 1, pH 6,86, 1811 u/ml) est concentré a 300 ml à 404 C sous pression réduite. Le concentrat (pH 4,5, 4000 uXml) est séché par congélation pour donner une poudre brune (rendement 43,9 %) contenant le sel de baryum de la substance MC 696 - ST 2~A. Exemple 3 La poudre brune (6,8 gJ680 u/mg) obtenue dans l'exemple 2 est dissoute dans 10 ml d'eau et la solution (pH 5,4) est règlée a pH 3,0 avec une solution aqueuse 1 N d'acide chlorhydrique, puis on la fait passer dans une colonne (1,7 x 40 cm) remplie de 90 ml de fines particules de résine polystyrène non-ionique (DIAION HP-20 -Mitsubishi Kasei K/K.). La colonne est lavée a l'eau désionisée à 5 C et l'effluent collecté en fractions de 8 ml. On combine les fractions spécialement actives 17-25 et on les traite sous agitation pendant 30 minutes avec 20 ml de résine DOWEX 50W x 4 (forme sel de Bas Dow Chemical C ).La résine est ensuite éliminée par filtration et le filtrat est concentré par évaporation a 40- C et séché par congélation pour donner 766 mg (rendement 70,2 %) d'une poudre brun jaunâtre (4240 u/mg). Exemple 4 766 mg de la poudre (4240 u/mg) obtenue dans l'exemple 3 sont combinés à 887 mg d'une autre poudre (2480 u/mg) préparée de la même manière. La poudre combinée (1,55 g) est soigneusement mélangée a 10 ml de FLORIDIL (marque déposée par Floridil C ) et le mélange est placé en haut d'une colonne de 100 mi (1,7 x 45 cm) remplie d'acétone aqueuse 80 % pour effectuer le développement avec l'acétone aqueuse à 50 C. L'éluat est collecté en fractions de 10 ml, les fractions spécialement actives 8 à 27 sont combinées, on y ajoute 50 ml de DOWEX 50 W x 4 (forme Ba), puis on concentre à une température inférieure à 400 C.Le concentrat est filtré pour éliminer la résine et séché par congélation pour donner 181 mg (rendement 22,3 %) d'une poudre jaune (6700 u/mg). Exemple 5 On dissout 181 mg de la poudre (6700 u/ml) préparée dans l'exemple 4 dans 5 ml d'eau, on traite la solution avec un tampon phosphate 0,01 M (pH 7,0) puis on la fait passer dans une colonne (1,7 x 45 cm) de 100 ml de ECTEOLA Cellulose (Brown C ) préalablement lavée a l'eau. La colonne est lavée avec 300 ml d'eau et développée avec le même tampon à 50 C. L'éluat est collecté en fractions de 10 ml et les fractions spécialement actives 21 à 42 sont combinées et concentrées à un volume de 5 ml, en-dessous de 400 C, sous pression réduite. On fait passer le concentrat dans une colonne (1,3 x 38 cm) de 50 ml de résine DIAION HP-20, puis on effectue le développement a l'eau désionisée à 5 C.L'éluat est collecté en fractions de 5 mi et l'on combine les fractions spécialemnt actives 11 à 14, que l'on mélange et agite pendant 30 minutes avec 5 ml de DOWEX 50 W x 4 (forme Ba). La résine est ensuite éliminée par filtration et le filtrat concentré a 5 ml à 400 C sous pression réduite. On fait passer le concentrat dans une colonne (1,7 x 66 cm) de 150 ml de SEPHADEX G-25 (super-fin) et on rince la colonne â l'eau désionisée à 50 C. L'effluent est collecté en fractions de 5 ml et l'on combine les fractions spécialement actives 24 à 30, dans lesquelles on ajoute 9 ml de DOWEX 50 W x 4 (forme Ba). Le mélange résultant est agité pendant 30 minutes puis filtré pour éliminer la résine et concentré a 2 ml à 400 C som pression réduite. Le séchage par congélation du concentrat donne 34,7 mg (rendement 38,3 %) d'une poudre blanche (13360 u/mg) qui pré sente dans le spectre ultra-violet un H2O 1 % (E ) = 242 nm max 1 cm (270) et 280 nm (214) et un ID50 = 0,3 ng, déterminé par la méthode de titrage iodométrique. Exemple 6 On dissout 385 ml de la poudre (7480 u/mg) préparée dans l'exemple 3 dans 5 ml de méthanol 90 % et on élimine par filtration les matières insolubles. La solution obtenue passe dans une colonne (25 ml, 1,0 x 32 cm) de SEPHADEX LH-20, puis on effectue le développement avec du méthanol 90 % à 5 C. L'éluat est collecté en fractions de 15 ml et les fractions actives 4 à 19 sont combinées, traitées au DOWEX 50 W x 4 (forme Ba), concentrées à 40 C et séchées par congélation pour donner 107 mg (41,6 %) d'une poudre brun-jaunâtre ( 11200 u/mg). Les fractions actives 20 à 49 sont traitées similairement pour donner 66,8 mg (19,1 %) d'une autre poudre brun jau nâtre (8225 u/mg}. La poudre (107 mg) obtenue à partir des fractions 4 à t9 est mélangée à 3 ml de FLORIDIL, puis placée au sommet d'une colonne (1,0 x 38 cm) de 30 ml de FLORIDIL et développée avec l'acétone aqueuse 80 % à 5 C.L'éluat est collecté en fractions de 5 ml et les fractions actives 4-8 sont combinées, traitées avec la résine forme baryum, puis concentrées par évaporation de l'acétone et séchées par congélation pour donner 48,8 mg (48,9 %) d'une poudre jaune pâle (1200 u/mg). La poudre (66,8 mg) obtenue à partir des fractions 20 à 49 est traitée comme ci-dessus, mais on utilise comme solvant de développement acétone aqueuse 90 % ; on obtient 21,6 mg (29,1 %) d'une autre poudre jaune pâle (7400 u/mg). Ces poudres sont combinées (65 mg) et dissoutes dans 2 ml d'eau. On fait passer la solution dans une colonne (50 ml, 1,0 x 45 cm) de SEPHADEX G-25 (super-fin) et on rince la colonne à l'eau désionisée. L'fluent est collecté en fractions de 3 ml (5 C) et l'on combine et séche par congélation les fractions spécialement actives 17-18 pour donner 23,7 mg d'une poudre blanche (12500 u/mg) Rendement 39,7 % (rendement global 10,2 %) H2O 1 % (E ) = 240 nm (292), 280 nm (200) : ID 50 = 0,5 ng. max 1 cm L'absorption caractéristique à 1770 cm-1 due à l'anneau ss-lactame dans le spectre infra-rouge (disque KBr) de poudre blanche ne disparaît pas même après maintien a température ambiante pendant environ trots semaines (voir figures 1 et 2). Exemple 7 On place 387 mg d'une poudre jaune (4320 u/mg) préparé selon un processus similaire à celui décrit dans exemple 4, au sommet d'une colonne (50 ml, 1,3 x 38 cm) chargée de 5 ml de FLORIDIL, et développée avec de l'acétone aqueuse 80 % à 5 C. L'é- luat est collecté en fractions de 10 ml,-on combine les fractions actives 3 à 8 et on les traite avec une résine forme Baspuis on filtre et on concentre à 5 ml en dessous de 40 C. On fait passer le concentrat dans une colonne (50 ml, 1,0 x 69 cm) de SEPHADEX G-25 (super-fin) puis on lave la colonne à l'eau désionisée.L'effluent de la colonne est collecté en fractions de 3 ml (5 C), les fractions spécialement actives 18-19 sont combinées et mélangées à 1,5 ml de DOWEX 50wx4 (forme Ba). Apres agitation pendant 30 minutes, on élimine la résine par filtration et on concentre le filtrat à 2 ml, en dessous de 400c. Le séchage par congélation du concentrat donne 51,6 mg (42 %) d'une poudre blanche (13600 u/mg) de sel de baryum de substance MC 696 - SY 2A.H2O (E 1 %) =242 nm (254) , 280 nm (194) : ID50 =0,5 ng. max 1 cm Exemple 8 On dissout 2,49 g d'une poudre brute de sel de baryum (400 u/mg ID 50 : 81 ng) préparée dans l'exemple 2, dans environ 20 ml d'eau, on règle le pH de la solution à 6,2 puis on la fait passer dans une colonne (2 x 30 cm) de DOWEX 50 W x 4 (forme Na, passage en microns297 à 149), à une vitesse de 1,4 ml/min. On collecte les fractions actives de l'effluent et on sèche par congélation pour obtenir 2,2362 g (95,2 % ) du sel de sodium de la substance MC 696 SY 2A (424 u/mg) ID50 : 65 ng). En suivant le processus ci-dessus, on obtient a partir de 2,501 g du sel de baryum brut 2,366 (94,6 % ) du sel de sodium (400 u/mg).On obtient à partir des deux réCupérations de sel de baryum un total de 2,60g de sel de sodium de la substance MC 696-SY-2A (force moyen. 412u/mg) Exemple 9 On soumet 262 mg de la poudre de sel de sodium (412 u/mg) obtenue dans l'exemple 8 à développement avec du méthanol 91% à 5vC dans une colonne (2x22 cm) de SEPHADEX LH-20 Pharmacia & C 25 - 100 ). L'éluat est collecté en fractions de 300 gouttes et les fractions montrant à la fois l'activité désirée et l'absorption dans l'ultra-violet à 280 nm sont combinées et séchées par congélation.Rendement du sel de sodium : 92,4 mg provenant des fractions 17-19 (130 u/mg), 46,9 des fractions 20-21 (952 u/mg ), 27,8 mg des fractions 22-23 (1136 u/mg), 9,1 mg des fractions 24-26 (285 u/mg). Rendement total 86,7 %. On répète 18 fois le processus ci-dessus en utilisant 4,60 g de poudre brute de sel de sodium (412 u/mg) obtenue dans 1'exemple 8. Les poudres ayant une force au moins égale à 400 u/mg sont combinées pour donner 1,412 g (73 %) de sel de sodium (force moyenne 980 u/mg). Exemple 10 On reprend 251,9 mg de la poudre de sel de sodium (980 u/mg), obtenue dans l'exemple 9, dans une petite quantité (environ 0,5 ml) d'eau et on soumet la solution au développement avec l'acétonitrile 92 % à 50 C dans une colonne (1,5 x 14 cm) de SEPHADEX LH - 20. L'éluat est collecté en fractions de 300 gouttes ce qui permet d'extraire 85,1 % de la substance active dans les fractions 16 - 38 (244 ml), qui sont concentrées à environ 0,5 ml sous pression réduite. On fait passer le concentrat dans une colonne (1 x 36 cm) de SEPHADEX C 10 et on développe à l'eau a 50c. L'éluat est collecté en fractions de 50 gouttes et les fractions actives sont concentrées sous pression réduite et séchées par congélation.La fraction n 5 dans 2,5 mg du sel de sodium purifié (3120 uZmg)et la fraction ne 6 17,05 mg de ce sel (5 800 u/mg, ID50 = 0,82 ng). Rendemet 56,5 %. On répète 6 fois le procédé ci-dessus en utilisant 1,412 g de poudre de sel de sodium (980 u/mg). Les poudres ayant une force égale ou supérieure à 4 000 n/mg sont combinées pour donner 118 ng (46,4 %) du sel de sodium purifié (force senne 5463 u/mg). Exemple Il 118 mg de la poudre (5463 u/mg) obtenue dans l'exemple 10 sont a nouveau soumis à chromatographie sur colonne (1,2 x 11cm) de SEPHADEX LH 20 en utilisant l'acétonitrile 92 % comme solvant de développement. L'êluat est collecté en fractions de 300 gouttes et 74,9 % de substance active est extrait dans les fractions 9-33 (262,5 ml).Les fractions sont concentrées à environ 0,3 ml sous pression réduite et à nouveau soumises à chromatographie sur colonne (1 x 20 cm) de gel de silice (forme A, Merck C') en utilisant comme développeur l'acétonitrile 92 %. Ltéluat est collecté en fractions de 300 g, et on extrait 76,5 % de substance active dans les fractions 9-29 (220 ml), dont on règle alors le pH à 6,25 et que l'on concentre à 0,5 ml sous pression réduite. Le concentrat est développé à l'eau dans une colonne (1 x 36 cm) de SEPHADEX G 10. L'éluat est collecté en fractions de 25 gouttes et on règle le pH de chacune de ces fractions à 6,5, on concentre sous pression réduite et on sèche par congélation. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le Table 8. Table 8 1 % Fraction Poids Force (u/mg) ID50(ng), H2O (nm) (E ) 1 cm 10 7,4 7,056 0,7 240(335), 280 (183) 11 12,4 9,600 0,5 240(283), 280(193) 12 12,5 10,528 0,4 240(304), 280(218) 13 6,85 4,680 - REVENDICATIONS 1 - Procédé de production de substance MC 696-SY 2-A inhibant la ss lactamase, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver une souche MC 696-SY 2 Streptomyces fulvoridis (identifié comme FERM-P 1504 ou ATCC 21954), afin de produire et d'accumuler la substance MC 696 - ST 2 A dans le nilieu de culture puis à récupérer cette substance du bouillon de culture contenant la substance MC 696 - ST 2A, alors que cette substance est maintenue sous forme de sel de la substance MC 696- ST 2 A, après avoir converti, dans une phase appropriée antérieure du processus de récupération et de purification ladite substance en son sel. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la substance MC 696-sY 2A dans le bouillon de culture de la souche est adsorbée sur une résine échangeuse d'anions fortement basique sous forme de sulfate, qui est ensuite éluée avec une solution aqueuse de chlorure d'ammonium, chlorure de sodium ou sulfate d'ammonium et que l'on récupère de l'éluat ainsi obtenu, la substance MC 696 - ST 2 A brute. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver la souche Streptomyces fulvoviridis MC 696-SY 2, à règler le filtrat du bouillon de culture obtenu à un pH légèrement acide par addition d'acide dilué, à traiter le filtrat du bouillon de culture acidifié avec une résine échangeuse d'anions fortement basique sous forme sulfate pour adsorber la substance MC 696-SY 2A, à éluer cette résine avec une solution aqueuse de chlorure d'ammonium, chlorure de sodium ou sulfate d'ammonium, à collecter les fractions actives contenant la substance MC 696~SY 2 A, a traiter ces fractions actives avec du charbon actif, pour adsorber la substance désirée, à extraire cette résine active à l'acétone aqueuse, à traiter l'extrait acétonique aqueux obtenu avec une résine échangeuse de cations fortement acide sous forme de sel de baryum, pour transformer la substance MC 69 6-ST 2A en son sel de baryum, a concentrer à siccité l'extrait acétonique contenant ledit sel de baryum de la substance MC 696 - ST 2 A pour obtenir une poudre brute de sel de baryum de la substance MC 696 SY 2~A, à dissoudre ladite poudre brute dans liteau, à faire passer la solution aqueuse obtenue dans une colonne de résine adsorbante poreuse non-ionique pour adsorber le sel de baryum, à éluer la ré sine adsorbante avec de liteau désionisée pour collecter les fractions actives de l'éluat, à traiter les fractions actives avec une résine échangeuse de cations fortement acide sous forme de sel de baryum puis à concentrer à siccité pour obtenir une poudre brute secondaire de sel de baryum de substance MC 696-SY 2A1 à faire passer une solution de cette poudre brute secondaire dans de l'acétone aqueuse dans une colonne de silicate de magnésium activé, à éluer avec de l'acétone aqueuse pour collecter les fractions actives de l'éluat, à ajouter aux fractions actives une résine échangeuse de cations fortement acide sous forme de sel de baryum, à filtrer et à concentrer le filtrat à siccité pour obtenir une poudre brute tertiaire de sel de baryum de substance MC 696 ST 2A, à mélanger une solution de cette poudre brute tertiaire dans l'eau avec un tampon phosphate (pH 7,0), à développer le mélange résultant dans une colonne de tamis moléculaire cellulosique, à collecter l'effluent en fractions, à concentrer les fractions actives, à développer avec de l'eau désionisée la solution résultante concentrée dans une colonne de résine adsorbante poreuse non-ionique, à collecter les fractions actives de l'ef- fluent, à traiter avec une résine échangeuse de cations fortement acide sous forme de sel de baryum, a concentrer les fractions actives, à chromatographier la solution résultante concentrée dans une colonne de tamis moléculaire en dérivé de dextrane, a collecter les fractions actives de l'effluent de la colonne de tamis mo moléculaire, à traiter avec une résine échangeuse de cations fortement acide sous forme de sel de baryum pour obtenir une solution de sel de baryum purifié de substance MC 696 SY 2A, et à déshy- drater cette solution pour obtenir une poudre blanche pure de sel de baryum de substance MC 696 ST 2A. 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé ce qu'il consiste à cultiver la souche Streptomyces fulvoviridis MC 696 SY 2, a règler le filtrat du bouillon de culture obtenu à un pH légèrement acide par addition d'acide dilué, à traiter le filtrat du bouillon de culture acidifie avec une résine échangeuse d'anions fortement basique sous forme sulfate pour adsorber la substance MC 696 SY 2A, à éluer cette résine avec une solution aqueuse de chlorure d'ammonium, chlorure de sodium ou sulfate d'ammonium, à collecter les fractions actives contenant la substance MC 696 SY 2A, à traiter ces fractions actives avec du charbon actif, pour adsorber la substance désirée, à extraire cette résine active à l'acétone aqueuse, à traiter l'extrait acétonique aqueux obtenu avec une résine échangeuse de cations fortement acide sous forme de sel de baryum, pour transformer la substance MC 696 ST 2A en son sel de baryum, a concentrer à siccité l'extrait acétonique contenant ledit sel de baryum de la substance MC 696 - ST 2A pour obtenir une poudre brute de sel de baryum de la substance MC 696 ST 2A, a dissoudre ladite poudre brute dans l'eau, à faire passer la solution aqueuse obtenue dans une colonne de résine adsorbante poreuse non-ionique pour adsorber le sel de baryum, à éluer la résine adsorbante avec de l'eau désionisée pour collecter les fractions actives de ltéluat, à traiter les fractions actives avec une résine échangeuse de cations fortement acide sous forme de sel de baryum puis à concentrer à siccité pour obtenir une poudre brute secon daire de sel de baryum de substance MC 696 SY - 2A,, à dissoudre cette poudre brute secondaire dans du méthanol aqueux, à développer la solution méthanolique obtenue dans une colonne de tamis moléculaire faite dé dérivés dextraniques en utilisant comme solvant de développement le méthanol aqueux, à collecter les fractions actives de l'effluent, à traiter lesdites fractions actives avec une résine échangeuse d'anions fortement acide sous forme de sel de baryum, à déshydrater les fractions actives ainsi traitées pour obtenir une poudre brute du sel de baryum de MC 696 SY 2A, puis à dissoudre cette poudre brute dans l'acétone aqueuse, à faire passer la solution obtenue dans une colonne de silicate de magnésium activé, à éluer à l'acétone aqueuse pour collecter les fractions actives de l'éluat, à ajouter aux fractions actives une résine échangeuse de cations fortement acide sous forme de sel de baryum, à filtrer et à concentrer à siccité le filtrat pour obtenir une poudre brute du sel de baryum de la substance MC 696 SY 2A, à mélanger une solution de cette poudre brute dans l'eau avec un tampon phosphate (pH 7,0), à développer le mélange obtenu dans une colonne de tamils moléculaire cellulosique, à collecter l'effluent en fractions, à concentrer les fractions actives, à développer la solution concentrée obtenue dans une colonne de résine adsorbante poreuse non ionique avec de l'eau désionisée, a collecter les fractions actives de l'effluent, à traiter avec une résine échangeuse de cations fortement acide sous forme de sel de baryum et à concentrer les fractions actives, à chromatographier la solution concentrée obtenue dans une colonne de tamis moléculaire en dérivés du dextrane, â collecter les fractions actives de lteffluent de la colonne de tamis moléculaire, a traiter avec une résine échangeuse de cations fortement acide sous forme de sel de baryum pour obtenir une solution de sel de baryum purifié de substance MC 696 ST 2A, à déshydrater cette solution pour obtenir une poudre blanche pure de sel de baryum de la substance MC 696 ST 2A. 5 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver la souche Streptomyces fulvoviridis MC 596 ST 2 , à règler le filtrat du bouillon de culture obtenu à un pH légèrement acide par addition d'acide dilué, à traiter le filtrat du bouillon de culture acidifié avec une résine é- changeuse d'anions fortement basique sous forme sulfate pour adsorber la substance MC 696 ST 2A, a éluer cette résine avec une solution aqueuse de chlorure d'ammonium, chlorure de sodium ou sulfate d'ammonium, à a collecter les fractions actives contenant la substance MC 696 ST 2A, a traiter ces fractions actives avec du charbon actif, pour adsorber la substance désirée, à extraire cette résine active à l'acétone aqueuse1 à traiter l'extrait acétonique aqueux obtenu avec une résine échangeuse de cations fortement acide sous forme de sel de baryum, pour transformer la substance MC 696 ST 2 A en son sel de baryum, a concentrer à siccité l'extrait acétonique contenant ledit sel de baryum de la substance MC 696 - ST 2A pour obtenir une poudre brute de sel de baryum de la substance MC 696 SY 2A, à dissoudre ladite poudre brute dans l'eau, à faire passer la solution aqueuse obtenue dans une colonne de résine adsorbante poreuse non-ionique pour adsorber le sel de baryum, à éluer la résine adsorbante avec de l'eau désionisée pour collecter les fractions actives de ltéluat, a traiter les fractions actives avec une résine échangeuse de cations fortement acide sous forme de sel de baryum, puis à concentrer a siccité pour obtenir une poudre brute secondaire de sel de baryum de substance MC 696 ST - 2A, à faire passer une solution de cette poudre brute secondaire dans de l'acétone aqueuse dans une colonne de silicate de magnésium activé,à éluer avec de l'acétone aqueuse pour collecter les fractions actives de l'éluat, a ajouter aux fractions actives une résine échangeuse de cations fortement acide sous forme de sel de baryum,à filtrer et à concentrer le filtrat à siccité pour obtenir une poudre brute tertiaire de sel de baryum de substance MC 696 SY 2A, à développer une solution de ladite poudre brute tertiaire dans l'acétone aqueuse dans une colonne de silicate de magnésium activé en utilisant l'acétone aqueuse comme solvant de développement, a collecter les fractions actives de l'effluent puis a traiter lesdites fractions actives avec une résine échangeuse de cations fortement acide sous forme de sel de baryum, à concentrer les fractions actives ainsi traitées, a développer la solution concentrée ainsi obtenue dans une colonne de tamis moléculaire faite d'un dérivé du destrane cn utilisant de l'eau désionisée comme solvant de développement, å collecter les fractions actives de l'effluent de la colonne de tamis moléculaire puis a traiter avec une résine echangeuse de cations fortement acide sous forme de sel de baryum pour obtenir une solution de sel de baryum purifié de substance MC 696 ST 2A, à déshydrater cette solution pour obtenir une poudre blanche du sel de baryum de substance MC 696 ST 2A.