Brevet FR2400365A1 — publié le 19790316

L'invention est relative à un procédé d'obtention d'antigène de surface du virus de lthépatite B, désigné sous l'abréviation HB5, sous forme purifiée et à forte activité antigénique. L'invention est également relative au procédé pour l'obtention de cet antigène et a' l'utilisation de celui-ci pour la préparation de compositions immunogènes. Les techniques utilisées pour la préparation d'un agent immunogène pour le traitement préventif de l'hépatite B ont sensiblement évolué en fonction même de l'évolution des connaissances de l'étiologie de cette maladie, et en particulier de celles relatives aux antigènes mis en jeu. Il est admis que l'antigène de surface HBS constitue un agent immunogène capable d'induire une réponse immunitaire préventive chez lthdte traité. Cet antigène est obtenu à partir de sérums qui le contiennent par des traitements qui tendent à éliminer le maximum de constituants étrangers, et notamment les protéines sériques. Pour isoler l'antigène HBS, on a en particulier utilisé des techniques connues pour le fractionnement des protéines séri- ques, précipitation, adsorption, ultracentrifugation, chromatographie, etc., ou des combinaisons de ces techniques, dans des conditions qui, compte tenu des connaissances que l'on avait de cet antigène, étaient supposées aboutir a' un antigène aussi pur que possible et d'une innocuité parfaites Des études récentes dans ce domaine ont révélé certaines particularités qui, dans une certaine mesure, remettent en cause les critères de purification et d'innocuité qui étaient reconnus jusqu'à présent. Ainsi, il a été établi que l'antigène HBs dans le sérum formait des immun-complexes, notamment avec des immunoglobulines. La présence de ces immun-complexes, pour une même quantité d'antigène, peut avoir pour conséquence probable une réduction proportionnelle à la concentration en anticorps anti-HBs de l'activité immunogène de la préparation considérée. En outre, la présence d'immun-complexes dans la préparation immunogène signifie que l'hotte traité reçoit, avec l'agent immunogène, des éléments pour le moins superflus et peut-être meme nuisibles dans la mesure où, par exemple, ils seraient susceptibles de déclencher des réactions de type hypersensibilit4 Pour ces raisons, il apparaît hautement souhaitable,dans la préparation des antigènes HBs, de procéder à la dissociation de ces complexes pour isoler l'HB5 à l'état le plus pur possible. Plus récemment encore, des travaux ont montre le rôle important que pouvait jouer une lipoprotAine membranaire des hépatocytes, désigne par l'abréviation LP1, dans le déclenchement de certaines manifestations pathologiques liées à l'hépatite. Cette lipoprotéine isolée et administrée à des lapins a permis d'induire,chez ceux-ci, une hépatite chronique auto-immune.Cette immunité cellulaire vis-à-vis de la LP1 a pu être mise en évidence par transformation lymphoblastique, inhibition de la migration des leucocytes, et par lymphocytotoxicité in vitro vis-à-vis des hépatocytes de lapin et de rat. Le rapprochement de ces observations de ce que l'on sait de la maturation de certains virus, notamment les virus du groupe Herpès, conduit à penser que la LP1 peut s'associer ou s'intégrer à l'enveloppe virale que constitue 1'antigène HBs. , I1 est donc nécessaire de prévoir, dans le cours de la préparation de l'antigène purifié, un ou plusieurs traitements capables d'éliminer la LP1 susceptible de se trouver associée à l'antigène. L'invention a donc pour but la préparation d'un antigène HBs qui n'engendre aucun des risques indiqués ci-dessus et qui, notamment, ne se présente pas sous forme dtimmun-complexes, ou encore ne renferme pas de lipoprotéines étrangères. La parfaite innocuité de l'antigène HB5 selon l'invention, en plus, ne doit pas être obtenue au détriment de ses caractéristiques immunogéniques. Selon l'invention, un procédé pour la préparation d'antigène HBS répondant à ces conditions, à partir de sérums le contenant, comprend, outre des procédés traditionnels pour la séparation et l'élimination des protéines sériques, une opération particulière de fractionnement par précipitation pour l'élimina- tion des p lipoprotéines, la dissociation des immun-complexes de 1HB , et l'élimination des constituants de ces immun-complexes autres que le HBs. I1 est avantageux, pour parfaire la purification1 de procéder à une dénaturation par la chaleur de l'activité antigénique des protéines contaminant ltHBs sans modifier l'activité de ce dernier. Partant d'un sérum complet, la purification de l'antigène HB5 comprend nécessairement des étapes.-de fractionnement traditionnelles pour l'élimination massive des constituants les plus abondants, en particulier de l'albumine. Toutes les techniques connues pour ce type de fractionnement sont utilisables. De préférence, on utilise,- par commodité, un fractionnement par précipitation sélective tel que ceux qui permettent de séparer les protéines sériques en fonction de leurs masses molaires respectives. Parmi les plus usuels de ces procédés, les méthodes de précipitation au sulfate d'ammonium ou au polyéthylène-glycol sont particulièrement avantageuses pour la mise en oeuvre de la purifié cation selon l'invention. Ces méthodes sont mises en oeuvre de façon traditionnelle. Pour la précipitation au sulfate d'ammonium, on ajoute de préférence au sérum une quantité de sel ou d'une solution du sel telle que la concentration du mélange soit de l'ordre d'environ 45% de la saturation. Lorsque l'on effectue la précipitation au polyéthyîène glycol, on ajoute avantageusement à un sérum, amené à pH 7,4 du polyéthylène-glycol 6000 (sous forme solide), de façon à obtenir une concentration de 5% du mélange. On précipite de cette façon les particules les plus volumineuses dont, en particulier, les virus entiers (particule de Dane) s'il s'en trouve dans le sérum traité. On ajoute ensuite une nouvelle quantité de polyéthylène glycol de façon que la concentration atteigne 16% pour obtenir un précipité contenant l'antigène de surface.Toujours suivant la méthode traditionnelle préférée, le précipité, repris dans 1/20 du volume initial de tampon phosphate, est soumis à une fixé tration sur gel (par exemple du type commercialisé sous le nom "Biogel A5M"), ce qui permet d'éliminer le polyéthylène-glycol en même temps qu'une partie importante des protéines précipitées avec l'antigène HB5. Dans les procédés de purification de l'antigène HBs antérieurs à l'invention, il n'apparat pas d'opération visant à l'é}imination spécifique des p lipoprotéines, notamment par précipitation sélective. En raison de la nature lipoprotéique de l'antigène Ho,,. il était normal de penser que, dans des tentatives de séparation de cette nature, les lipoprotéines et l'antigène HB5 se seraient retrouvés dans les mimes fractions. La demanderesse a montré de façon inattendue que les techniques cpnnues pour précipiter sélectivement les p lipoprotéines sériques ne précipitaient pas l'antigène simultanément, et que, par conséquent, ces techniques pouvaient avantageusement servir à l'élimination des p lipoprotéines d'une préparation sérique contenant cet antigène sans abaisser la teneur de ce dernier. Le procédé de purification de l'antigène HBs selon l'invention comprend une étape de séparation des p lipoprotéines sériques par précipitation sélective de celles-ci. Selon l'invention, cette précipitation des p lipoprotéines est avantageusement réalisée par la méthode décrite par MANN tJ.Immunol., 1967, 98, 1136). Dans cette méthode, l'élimination sélective des p lipoprotéines contenues dans une préparation sérique est obtenue par addition de quantités suffisantes de chlo- rure de manganèse et d'héparine. Des conditions préférees pour cette précipitation sont, pour chaque millilitre de préparation sérique traitée, une addition d'environ 0,05 ml de solution 1 M de Mn Cl2 et d'environ 0,04 mi de solution d'héparine titrant 5000 UTI/ml. Dans un autre mode préféré de précipitation sélective-des p lipoprotéinesa on opère selon le principe décrit par BURNSTEIN (Rev.Franç.Etudes Clin.et Biol. 1958, III, 624-6293, par addition d'une solution d'héparine ou d'un composé du type héparine,comme le sulfate de dextrane, et d'une solution de chlorure de calcium. Des conditions préférées pour la mise en oeuvre de cette précipitation sont pour chaque millilitre de préparation sérique traitée, l'addition d'environ 0,82 mi d'une solution à-1O% de sulfate de dextrane et d'environ 0wl0 mi de chlorure de calcium. En dehors de ces techniques préférées, on peut utiliser toute méthode analogue de fractionnement par précipitation permettant de séparer les p lipoprotéines du reste des protéines sériques. L'élimination des F lipoprotéines peut être effectuée à divers stades du procédé de purification de l'antigène HBs. Elle peut constituer notamment le premier traitement du sérum initial. Elle peut aussi bien être réalisée après qu'un premier fractionnement ait été effectué selon les modes précédemment indiqués pour l'élimination en particulier de l'albumine. Il est préférable d'éliminer les p lipoprotéines avant l'étape d'adsorption-dissociation de l'antigène. En effet, dans les conditions de cette opération,- les lipoprotéines sont également adsorbées. En plus du fait qu'il serait alors nécessaire d'utiliser une quantité beaucoup plus importante d'agent d'adsorp- tion, compte tenu de la compétition de l'HBs et des lipoprotéines pour l'agent adsorbant, la purification recherchée serait rendue plus délicate. Il a déjà été proposé de purifier l'antigène HBs par une adsorption sélective sur un matériau capable de retenir les constituants sériques de nature lipidique. Le but de ce type d'adsorption est d'éliminer, autant qu'il est possible, les protéines non lipidiques encore présentes dans la préparation, puis à récuse rer, par élution, les constituants fixés sur le matériau d'adsorption. Au cours d'une opération d'adsorption de cette nature, les immun-complexes présents sont adsorbés de la meme façon que l'HBs libre, sans modification de leur nature ou des constituants qui les composent. Par ailleurs, on sait qu'il est possible d'effectuer la dissociation des immun-complexes par l'action de certains agents chimiques. Mais ces agents dissociants n'vagissent que tant qu'ils sont présents dans la préparation. Lorsqu'ils sont éliminés dans la suite de la purification, si les constituants du complexe se retrouvent en présence, celui-ci se reforme de lui-même. Pour éviter cette difficulté, selon le procédé de l'inven tion, la dissociation des complexes est réalisée après que ceux-ci aient été fixés sur un matériau adsorbant du type de ceux utilisés précédemment, dans le seul but d'éliminer les protéines libres non lipidiques. Les antigènes et les complexes étant ainsi fixés, on fait agir un agent capable de dissocier les complexes, libérant ainsi les protéines liées à l'antigène, sans conduire à l'élution de l'antigène, ni modifier ses caractéristiquesantigéniques.Une fois que les protéines libérées ont été éliminées, les antigènes sont récupérés par élution dans les conditions qui ont été antérieurement décrites dans la littérature (J.Clin. Microb., 1976, 4 205).De cette façon, les protéines entrant dans la constitution des complexes sont séparées de l'antigène HBs et éliminées en même temps que l'agent dissociant. Le complexe ne peut donc pas se reformer dans l'élut d'antigène, On utilise, pour cette opération, un matériau support solide, inerte, de surface spécifique élevée, capable d'adsorber sélectivement les éléments sériques de nature lipidique. Avantageusement, le matériau d'adsorption utilisé est constitué par une silice colloldale. Un matériau de ce type parti culièrement préféré est constitué par le produit commercialisé sous le nom d' "Aérosil 380" dont l'utilisation a été décrite précédemment dans Vox Sang., 1972, 23, 249. La quantité de matériau d'adsorption utilisée doit être suffisante pour fixer la totalité des antigènes ou des complexes présents dans la préparation sérique traitée. Pour une préparation ayant subi un fractionnement préalable, permettant en particulier l'élimination des B lipoprotéines, on peut avantageusement utiliser une quantité de Tordre de 5 à 20 mg d' "Aérosil 380" par millilitre de préparation sérique (lorsque le volume de celle-ci est d'un ordre de grandeur compa rable à celui du sérum initial)* Pour la dissociation de limmun-complexe, on choisit un agent qui réalise la dissociation sans altérer les propriétés immunogéniques de l'antigène, ni conduire à I'élution de celui-ci. Avantageusement, on utilise une solution d'acide acétique dont le pH est compris entre 2 à 3, et, de façon particulièrement préférée, une solution de pH 2;2 additionnée ou non de dioxanne, pour une concentration finale de 10%. La dissociation du complexe donnant lieu à un état d'équilibre, il est avantageux de répéter l'opération en éliminant à chaque fois la solution contenant les protéines libérées du complexe. Ces opérations sont poursuivies pratiquement jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de nouvelle libération de protéines, et de toute façon le traitement est interrompu avant qu'une éventuelle élution de l'antigène HBs ne puisse se produire. Indépendamment de l'intérêt que représente }'utilisation d'un agent dissociant pour la libération de l'anticorps éventuellement fixé à l'HBS, ce même agent dissociant libère plusieurs protéines sériques adsorbées non spécifiquement au matériau de support. Ces protéines (albumine, ssl C, globuline, haptoglobine, 2 macroglobuline, immunoglobuline non-anticorps anti-HB5) représentent la majorité des protéines que l'on décroche de l'aérosol par le traitement dissociant. Il faut signaler que les nombreux essais effectués par la demanderesse ont montré le caractère très spécifique des agents de dissociation repondant aux conditions précédemment indiquées. Ainsi, les solutions d'ions chaotropiques (NaCl, NaI, NaSCN,...) de même que l'urée ou la-guanid1ne, n'ont pas ou peu d'effet sur l'éluvion des protéines sériques adsorbées avec 1'HBS sur l'agent d' adsorption0 Ceci est intéressant pour la mise en oeuvre de l'invention dans la mesure notamment où la préparation, provenant d'une précipitation au sulfate d'ammonium, peut être traitée telle quelle, sans qu'il soit nécessaire, au préalable, d'éliminer le sel présent de la préparation soumise au traitement d'adsorption-dissociation. Il est possible de contrôler l'action dissociante en mesurant la teneur en protéines libérées dans la solution de dissociation. On peut en particulier mesurer la teneur en protéines par la détermination de la densité optique à la longueur d'onde de 280 nm. A l'issue des opérations de dissociation, le matériau contenant toujours les antigènes est lavé. On procède ensuite à l'éluvion de l'antigène dans les conditions décrites antérieurement et qui permettent de récupérer la totalité de antigène sans risque de le dénaturer. Ainsi, pour l'antigène fixé sur une silice colloidalet notamment du type aérosil7 on préfère effectuer l'éiution avec une solution de pH compris entre 9 et 9,5, et avantageusement à 560C à l'aide d'une solution tamponnée 0,01 M en borax, pH 9,3, contenant une quantité suffisante dun agent tensio-actif constitué par un acide cholique ou un de ses dérivés. Un agent de ce type particulièrement approprié est constitué par le désoxycholate utilisé à une concentration égale ou supérieure à 0,25% dans la solution d'élutione L'élution est réalisée en une ou plusieurs fois jusqu'à ce que la totalité de l'antigène adsorbé ait été éluée. La purification par adsorption-dissociation décrite cidessus conduit à un produit qui peut encore contenir certaines impuretés, notamment de l'albumine et des lipoprotéines en faible quantité. Divers traitements traditionnels peuvent être envisagés pour éliminer ces restes d'impuretés. Selon l'invention, on préfère avoir recours à une séparation par ultracentrifugation sur gradient de densité. Avant de réaliser cette opération, on préfere compléter la préparation de l'antigène par une dénaturation de l'activité antigénique des protéines sériques encore éventuellement présentes. On sait que l'antigène HB5 résiste bien à une température ne dépassant pas environ 85au. On sait également que le traitement par la chaleur a tendance à dénaturer la spécificité antigénique des protéines sériques. Par ailleurs, la demanderesse a constaté qu'en suivant l'enseignement de l'art antérieur, pour ce qui concerne ce traitement thermique de dénaturation, on aboutit à une diminution très sensible de l'activité antigénique de l'HBs dans la préparation résultante. Cette diminution a pu être expliquée par l'adsorption de l'antigène sur les protéines dénaturées par la chaleur, précipitées ou non. La demanderesse a maintenant montré qu'il était possible d'effectuer un tel traitement thermique sans que le titre de l'antigène HBs soit sensiblement modifié. Pour cela, on réalise le traitement dans des conditions de pH qui ne conduisent pas à la précipitation des protéines, et en présence d'un agent tensioactif qui évite l'adsorption de 1'HB sur les protéines dénaturées. De façon préférées pour éviter la précipitation des protéines, le pH de la solution est maintenu supérieur à 9, et, avantageusement, on se-place à un pH d'environ 9,3 à l'aide d'un tampon borate. - Un agent tensio-actif permettant d'éviter l'adsorption des antiges sur les proteines ddnaturées est avantageusement constitué par les sels biliaires tels que ceux utilisés précédemment pour l'élution des antigènes HB5 > et notamment le désoxycholate. On peut ainsi, selon- l'invention > utiliser directement la solution d'élution pour réaliser le traitement thermique. On maintient, pour ce traitement, la température à une valeur et pendant un temps suffisants pour assurer la dénaturation complète des protéines sans altérer le titre de la préparation de l'antigène HBs. De préférence, on-traite la préparation à une température comprise entre 780C et-820C, et avantageusement à environ 80"C pendant environ 1 heure. Dans les conditions de l'invention, on n'observe pratiquement pas de précipitation ou une précipitation très légère, ce qui se traduit par une.faible diminution de la quantité totale de protéines en solution. Un tel traitement thermique affecte nécessairement une LP1 qui serait éventuellement présente dans l'HBs, celle-ci s'étant avérée être thermolabile (MacFarlane et coll., Clin.Exp. Immunol., 1977. 27, 381). On peut mettre en évidence la dénaturation des protéines demeurant solubles par exemple par des réactions d'immunodiffu- sion. Ces méthodes, appliquées aux préparations traitées selon l'invention, montrent que tous les essais pour caractériser les protéines sériques restent négatifs, alors que le titre de l'antigène HBs n'est pas diminue. L'élimination des protéines dénaturées comme il a été dit plus haut, si l'on préfère éliminer tous les constituants étrangers à 1'HBS, peut être réalisée par des techniques traditionnelles telles que l'ultracentrifugation en gradient de densité. Les antigènes, dans une telle centrifugation, sont regroupés dans des bandes de densité comprise entre 1,19 et 1,21. Grtce au procédé selon l'invention qui vient d'être décrits on peut isoler un antigène HBS pratiquement exempt de constituants sériques, que ceux-ci soient libres ou associés à l'antigène sous forme de complexes. Les critères de pureté de l'antigène HBs sont étudiés à la concentration de 300Jug/ml. En immunodiffusion double, dans des conditions de sensibilité maximale (réservoir de 8 mm de diamètre), cet antigène étudié vis-à-vis d'îmmunsérums antiprotéines sériques très puissants (tels que ceux produits par les Sociétés BEHRING, INSTITUT PASTEUR PRODUCTION, HYLAND) ne laisse apparattre aucune bande de précipitation. Par ailleurs, l'inhibition de l'hémagglutination passive confirme l'absence de contaminants protéiques sériques dans la préparation d'antigène selon l'invention. A titre indicatif, l'inhibition de l'hémagglutination passive, réalisée sur des solutions purifiées de protéines séri ques habituellement contaminantes de l2HBss , détecte ces protéines à la concentration minimale suivante albumine 1,25 Pgtml 2 macroglobuline 5 b lipoprotéine 5 immunoglobuline G 0,30 immunoglobuline M 0,30 L'activité antigénique spécifique de l'antigène HB5 selon l'invention est élevée. En électrosynérèse, vis-à-vis d'un immunsérum, la limite de détection de l'antigène HB5, exprimée enoug de protéines/ml, est. de l'ordre de 0,5 sg/ml L'antigène selon l'invention peut être utilisé pour la préparation de vaccins. Outre la solution d'antigène, on peut utiliser, pour cette préparation, des excipients et adjuvants traditionnels. En particulier en tant qu'adjuvant, on utilise avantageusement une solution de phosphate de calcium ou d'hydroxyde d'aluminium. Lors des essais préliminaires de vaccination sur cobaye (350 g), on a utilisé avantageusement une quantité d'adjuvant telle que-la concentration de ltHBS soit de l'ordre de 2,5yug pour 0,5 ml, L'étude de l'immunogénicité de la préparation de l'antigè- ne HBs selon l'invention montre qu'une stimulation primaire de l'animal avec une dose sous-cutanée d'HBs purifié sans adjuvant induit une réponse anticorps décelable par radio-immunologie chez plus de 50X des animaux. Lors d'une injection de rappel réalisée trois semaines après la première, le même antigène, à la même dose (= 2,5 pigi 0,5 mI) > induit une réponse anticorps chez la totalité des animaux. Les taux atteignent des titres > 500 U/ml en radio-immu- nologie (unités Abbott). EXEMPLE 1.- Purification de l'antigène fixé sur silice. Une préparation d'antigène HBSt obtenue à partir d'un sérum préalablement traité pour éliminer les lipoprotéines et fractionné par des opérations de relargage au sulfate d'ammonium, est adsorbé sur une silice du type commercialisé sous la denomination "Aérosil 380". Le contact est maintenu sous agitation pendant 3 heures à 370C, puis la suspension est centrifugée. Le culot de centrifugation contenant l'aérosil est repris dans un volume de liquide de lavage égal à la moitié du volume de préparation initialement traité par l'aérosil. Après chaque lavage, la suspension est centrifugée, le liquide surnageant analysé pour sa densité optique à 280 nm, et le culot séparé est repris pour une nouvelle opération de lavage. On a effectué ainsi une série de lavages dans les conditions et avec les résultats indiqués ci-après. Nature de la solution de lavage Densité optique à 280 nm sérum physiologique 1 " " " 0,40 acide acétique 2,5 N pH 2,2 + dioxanne 10 % 2 ,t Il ,, 0,46 te " Q,26 " " " " " 0, 16 sérum physiologique 0,02 " " " 0,00 L'utilisation des lavages au mélange acide acétiquedioxanne selon l'invention permet donc bien l'élimination de protéines fixées sur la silice en même temps que antigène HB5, et dont l'entrainement n'est pas possible par les lavages au sérun physiologique. Ceci est confirmé par l'essai comparatif suivant. Une composition sérique est fixée sur aérosil comme indiqué précédemment. L'aérosil est partagé en deux fractions dont l'une est traitée comme il vient d'être dit, avec des lavages "dissociant" à l'acide acétique-dioxanne, tandis que l'autre fraction est lavée abondamment au moyen de sérum physiologique. Dans les deux cas, on élue l'antigène par-deux fois une solution tamponnée au borate 0,01 M pH 9, contenant 0,25; de désoxycholate, le contact étant maintenu 1 heure à 560C. L'analyse immunologique dans la solution provenant de la fraction ayant subi la dissociation révèle la présence d'albumine, de p1 C et de traces d'&alpha;1 lipoprotéines, une teneur totale en protéines d'environ 60C g/ml et une activité spécifique HBs de 3 à 6 pg par unité de précipitation en électrosynérèse.La même analyse, effectuée sur la solution provenant de la fraction n'ayant pas subi de traitement dissociant, indique la présence d'ifr nanoglobulines G,Met A,d'albumine, de ss1C, des a lipoprotéines ,des a2 macxF globulines et dlhaptoglobine, une teneur totale en protéines de 2.500 pgXml et une activité spécifique HBs de 12 à 25 pg/ml. EXEMPLE 2- Influence des conditions de traitement thermique. On utilise une préparation d'antigène en partie purifiée ( elle a subi les étapes d'élimination des p lipoprotéines, de fractionnement au sulfate d'ammonium) contenant Il mg/ml de protéines et dont le titre en HBs est 1/128 en électrosynérèse. Par immunodiffusion, on a montré la présence, dans cette préparation, des protéines seriques suivantes: albumine, p lipoprotéines, immunoglobulines G et M, p1 C, a2 macroglobulines et des traces d'cri lipoprotéines. Cette préparation a été soumise au traitement thermique 1 heure à 800C dans différentes conditions. A pH 7,5 en tampon Tris, il se forme un abondant précipité de protéines insolubilisées. Le titre en HBs de la solution restante n'est plus que de 1/16. Ceci s'explique par la forte tendance de l'antigène à s'adsorber sur les protéines précipitées. Dans la solution, il reste encore de l'albumine et des immunoglobulines en plus de l'antigène. A pH 9 en présence de tampon Tris, le même traitement ne donne pas lieu à la formation d'un précipité visible, mais le titre en antigène HBS de la solution est de la meme façon réduit à 1/16. Le taux de protéines en solution après traitement est de 8 mg/ml selon la méthode de LOWRY. La solution, après centrifuga tion > contient encore de l'albumine, des traces d' lipoprotéines et de p lipoprotéines. En effectuant le traitement de dénaturation dans un tampon borate à pH 9, en présence de O > 25% de désoxycholate, selon les caractéristiques retenues par 1 invention, on n'observe pratiquement pas de précipité. Les protéines sont dénaturées mais restent en solution. En effectuant leur dosage, on trouve une teneur d'environ 10 mg/ml. Mais le plus remarquable est ques contrairement à ce que l'on a noté dans les précédents essais, le titre en antigene HBs n'est pas réduit par ce traitement thermique. Il s'établit à 1/256 et est donc meme légèrement supérieur à celui de la solution avant traitement thermique, sans doute du fait d'une dénaturation et d'une libération des anticorps fixés sur l'HBs. A l'issue de ce traitement, on a déterminé dans la solution, par immunodiffuswon, la présence de traces d'albumine, d'a1lipo- protéines et de p lipoprotéines. Le traitement thermique, opéré dans les conditions de l'in vention, présente donc l'avantage de dénaturer la spécificité antigénique de protéines sériques sans réduire le titre en anticorps. de la solution traitée. L'élimination des protéines ainsi dénaturées peut être ultérieurement réalisée par une méthode traditionnelle de purification telle que l'ultracentrifugation dans une solution de chlorure de césium (CsCl, CîNa 0,14 X, P04-H2K, P04 HNa2 0 > 01 M à pH 8), l'antigène étant récupéré dans le$ zones de densité 1,19 à 1,21, tandis que les protéines dénaturées se trouvent à des densités supérieures Une séparation directe des protéines et de l'antigène par l'ultracentrifugation ne peut pas être substituée au traitement thermique suivi de l'ultracentrifugation.Si le traitement thermique est omis > on retrouve, dans la fraction contenant l'antigène HB , des a1 lipoprotéines qui peuvent être mises en évidence immunochimiquement et par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Le traitement thermique permet en effet, en particulier, la dénaturation des a1 lipoprotéines présentes à lzétat de traces, qui sont thermolabiles. EXEMPLE 3.- Préparation complète d'antigène HBs purifié. Pour cet essai, on utilise 980 ml d'un sérum dont le titre initial en antigène HBs est de 1/32. a) Elimination des plipoprotéines Le mode utilisé est celui décrit par MANN. Les Rlipopro- téines sont précipitées par addition, pour chaque millilitre de sérum, de 0,05 ml de solution 1 M de Mn.Cl2 4 H20 et 0,04 ml d'une solution d'héparine dont le titre est 5000 U V ml, L'addition étant effectuez on agite le mélange pendant 20 minutes en maintenant la température à 40C. On centrifuge ensuite à 5500 g pendant 30 minutes, et on sépare le sérum surnageant du culot contenant les plipoprotéines. Un essai pour rechercher la présence d'antigène HBs dans le culot reste négatif. Le surnageant récupéré a un volume de 1040 ml et son titre en HB5 est de 1/32. Cette opération permet l'élimination quasi totale des ss lipoprotéines sans perte d'antigène. b) Fractionnement du sérum. Au sérum débarrassé des lipoprotéines, on ajoute une quantité égale de sérum physiologique (1040 ml) et une solution saturée en sulfate d'ammonium à pH 7 (1701 ml), le mélange résultant correspondant à une solution de sulfate d'ammonium à 45% de la saturation. Le mélange est agité pendant 30 minutes à 40C, puis centrifugé pendant 30 minutes. On sépare le culot de précipitation du surnageant. On ne décèle pas la présence de l'HB5 dans le surnageant. Le culot repris dans 1040 ml de sérum physiologique montre un titre de 1/32 en HB5. Une deuxième précipitation est effectuée par addition de 851 mi de solution de sulfate d'ammonium saturée (pH 7) aux 1040 ml dans lesquels le premier culot a été redissous. Le mélange est agité 30 minutes à 40C, puis centrifugé 15 minutes à 7000 g. Comme précédemment, on sépare culot et surnageant. Le surnageant est négatif en HB5. Le culot, repris dans 1040 ml de sérum physiologique, titre 1/32. Une troisième précipitation est réalisée dans des conditions identiques à celles de la seconde précipitation. Le culot obtenu par centrifugation est repris cette fois dans 520 ml de sérum physiologique et son titre est 1/64. Par ce fractionnement traditionnel, on élimine la plus grande partie de la sérumaîbumine sans perte d'antigène. c) Adsorption sur gel de silice On utilise une silice présentant une surface spécifique élevée, commercialisée sous le non "Aerosil 380". Cette silice est dtabord lavée. On disperse 5,2 g d'aérosil dans 500 ml d'eau bidistillée. La suspension est centrifugée à 8000 g pendant 10 minutes. Le culot d 'aérosil récupéré est lavé une nouvelle fois dans les mêmes conditions, puis centrifuge. Le culot d'aérosil lavé (5,2 g) est mis en contact avec la préparation d'antigène HB5 dans le sérum physiologique provenant des étapes de fractionnement au sulfate d'ammonium. La suspension est agitée pendant 3 heures à 37QC, puis centrifugée à 8000 g pendant 15 minutes Le surnageant est négatif au test effectué pour déceler l'antigène HBs et présente une densité optique de 22,4. La mesure de la densité optique (à 280 nm, longueur d'onde caractéristique des protéines) des différentes solutions au contact de l'aérosol permet d'apprécier l'élimination des protéines primitivement fixées sur 1'aérosol. Dans toutes les opérations suivantes, la durée de contact et les conditions de récupération par centrifugation sont identiques: on agite la suspension pendant 30 minutes à 560C, on centrifuge à 800Q g pendant 15 minutes. Le tableau suIvant indique la nature de la solution de lavage, son volume, le résultat de l'analyse faite pour déterminer la présence éventuelle d'antigène HBs et la densité optique à 280 nm du surnageant après centrifugation. Nature Volume HBs Densité mi optique sérum physiologique 520 - 1,9 " . " 520 - 0,39 acide acétique 2,5 M, dioxanne 10% - pH 2,2 520 - 5,3 " " " " 520 - 1,26 " " " " 520 - 0,56 " " " " 520 - 0,54 sérum physiologique, mélange neutralisé par NaOH - pH 7,8 520 - 0,007 " " " " 520 - 0 On constate, d'après ces résultats, que le "lavage" selon l'invention à l'aide d'acide acétique additionné ou non de dioxan- ne à 10%, dans les conditions précisées, permet l'élimination d'une quantité non négligeable de protéines fixées sur l'aérosil en même temps que l'HBs et que la solution de sérum physiologique ne suffit pas en entrainer. En outre, cette élimination de protéines étrangères est obtenue sans que l'antigène soit lui-mSme désorbé. L'éluvion de antigène est obtenue au moyen de 260 ml d'une solution alcaline tamponnée au borate O,Ol M, pH 9,3,conte- nant 0,25% de désoxycholate de sodium. La suspension d'aérosil est maintenue pendant 30 minutes sous agitation à 560C, puis centrifugée à 8000 g pendant 15 minutes. Le surnageant est récupéré et l'on renouvelle l'élution du culot d'aérosil dans les mêmes conditions que précédemment. Les deux solutions surnageantes, après centrifugation, sont réunies. On récupère ainsi 520 ml d'une solution titrant 1/81 en antigène HBs, donc légèrement plus active que la solution avant fixation sur aérosil. Un dosage de cette solution par la méthode traditionnelle de LOWRY donne une concentration en protéines de 154 g/ml.Outre l'antigène HBs, l'analyse par immunodiffusion révèle la présence d'albumine, de ss1 C, d'&alpha;1 lipoprotéines, d'immunoglobulines A et G. d) Dénaturation des proteines étrangères. Cette dénaturation ou déspécification est obtenue par chauffage, pendant 1 heure à 800C, des 520 ml de solution prove nant de l'élution. La solution est ensuite centrifugée à 10000 g pendant 30 minutes. On sépare culot et surnageant (515 ml). On ne décèle pas d'antigène HB5 dans le culot. Le titre en HBs de la solution surnageante est 1/100. Le dosage des protéines par la méthode de LOWRY donne 140 pgfml. La teneur totale en protéines est donc légèrement moindre, mais, en immunodiffusion, seuls l'antigène HBs et l'albumine sont décelables, montrant ainsi la dénaturation de toutes les autres protéines. e) Concentration et purification finale La solution précédemment obtenue est concentrée de 515 à 80 ml. Son titre s'établit alors à 1/650 et sa concentration en protéines à 884 pg/ml. On ajoute à cette solution du chlorure de césium en quantité telle que la densité de la solution soit de 1,10 g/ml, et le pH est ajusté à 7,8 On utilise, pour la centrifugation, une ultracentrifugeuse de type "MSE 6S't (rotor B XIV)9 le rotor contenant un gradient de chlorure de césium de densité 1,10 à 1,40 en tampon physiologique à pH 7,8. On introduit dans le rotor la solution de chlorure de césium contenant antigène, et l'on recouvre avec 50 ml de tampon phosphate physiolog qus à pH 7,8. On centrifuge pendant 20 heures à 39000 tr/mn. Le gradient est recueilli en introduisant par le fond une solution lourde de CsCl (d = 1,40 g/ml). Le gradient est fractionné. Les fractions sont analysées par électrosynérèse pour rechercher la présence de l'HB5. Les fractions positives sont rassemblees-et dialysées contre un tampon phosphate physiologique de pH 7,8. Dans la préparation dialysée ainsi obtenue, la seule protéine décelable en immunodiffusion est l'antigène HB5. f) Caractéristiques détaillées de l'antigène préparé. Pour déterminer la présence éventuelle de traces de protéines sériques etrangères, on a effectué une série d'analyses de la solution d'antigène par immunodiffusion double vis-à-vis d'immunsérums antiprotéines sériques, soit total, soit spécifiques des diverses protéines. On a utilisé des immunsérums puissants (HyLAND). Les puits sont espacés de 3 mm, la source d'antigène est constituée par 150 pi d'une solution d'HB contenant de 200 à 300 pg/ml de protéines. Cette même solution réagit vis-à-vis d'un immunsérum anti-HB5 à la dilution de 1/500. Dans ces conditions particulièrement sensibles, il n' a été possible de mettre en évidence aucune des protéines sériques recherchées. De la même façon, la préparation d'antigène HBs purifié à 300 pg/ml n'inhibe pas l'hémagglutination passive de globules rouges, sensibilisés au préalable, séparément, aux différentes protéines sériques, par ltimmunsérum spécifique correspondant. Ont été recherchées de cette façon : l'albumine, les a2 macroglobulines, les plipoprotéines, les immunoglobulines G et M. Compte-tenu des caractéristiques de sensibilité de cette analyse, les taux de ces différentes protéines dans la préparation HBs purifiée sont respectivement inférieurs à albumine 1,25 pgXml a2 macroglobuline 5 Flipoprotéine 5 immunoglobuline G 0,30 immunoglobuline M 0,30 En électrophorèse sur gel d'acrylamide à 5%, et pour un dépôt correspondant à 30 à 50 g de protéines de la préparation d'antigène, une seule bande apparat, correspondant à l'HB5. La limite de détection en électrosynérèse de l'HBs purifié selon l'invention, vis-à-vis d'un immunsérum de mouton,atteint 0,5 g/ml. Dans les mêmes condltionst les préparations d'antigè- nes obtenues selon les méthodes de purification antérieurement connues ont un minimum de sensibilité beaucoup plus élevé, traduisant la présence, dans la préparation, d'une proportion importante de constituants dépourvus d'activité antigénique HBS. Observées au microscope électronique, les particules de HB5 purifiées selon l'invention conservent leurs caractéristiques structurales initiales. -REVENDICATIONS - 1.- Procédé de traitement d'une préparation sérique pour l'obtention d'antigène HBs purifié, caractérisé en ce qu'il comprend, en plus d'opérations traditionnelles pour le fractionne- ment et l'élimination des protéines sériques, des opérations pour: -l'élimination des p lipoprotéines, -la dissociation des immun-complexes impliquant 1'HB , en phase insoluble avec élimination des protéines contaminantes, -la dénaturation sans insolubilisation des protéines contaminantes résiduelles. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la dénaturation sans insolubilisation des protéines résiduelles est réalisée par un traitement thermique dans des conditions ne permettant pas l'adsorption de l'antigène HBS sur ces protéines dénaturées. 3.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue l'élimination des plipoprotéines par une précipitation au moyen de sel de manganèse et d'héparine. 4.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue l'élimination des plipoprotéines par une précipitation au moyen de sel de calcium et de sulfate de dextrane. 5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la dissociation des immun-complexes de HBS est réalisée alors que les antigènes et les immun-complexes sont adsorbés sur une silice colloSdale. 6.- Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les complexes de HB5 sont dissociés au moyen d'une solution acide dont le pH est compris entre 2 et 3. 7.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la dissociation est obtenue au moyen d'une solution d'acide acétique à pH 2,2 additionnée ou non de dioxanne à 10%. 8.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 a' 7, caractérisé en ce que l'éluvion de l'antigène est conduite avec une solution dont le pH est compris enyte 9 et 9,5, et contenant un agent tensio-actif. 9.- Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'agent tensio-actif est constitué par un sel d'un acide de type colique. 10.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, caractérisé en ce que la dénaturation des protéines par la chaleur est conduite dans une solution de pH supérieur à 9, en pre- sence d'un agent tensio-actif. 11.- Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la température est comprise entre 780C et 82 C, le pH est d'environ 9, et l'agent tensio-actif est constitué par un sel d'acide de type cholique. 12,- Procéde selon la revendication 1, comprenant successivement les étapes suivantes: a) élimination des Blipoprotéines par addition au sérum d'une quantité suffisante de chlorure de manganèse et d'héparine, d'heparine, ou de dextrane et de chlorure de calcium, puis récupération de la solu- tion ; b) le fractionnement de la solution obtenue en a) au moyen de sulfate d'ammonium en quantité telle que la solution résultante soit à 45% de la saturation, la récupération du précipité (les étapes a) et b) pouvant entre interverties) c) la reprise du précipité obtenu en b) dans du sérum physiologique et le traitement par une quantité suffisante de silice colloïdale pour adsorber la totalité des constituants de nature lipidique; d) la dissociation des immun-complexes de HBS adsorbés sur la silice au moyen d'une solution d'acide acétique,additionnée ou non de dioxanne,de pH 2,2; e) ltélution des antigènes adsorbés à 560C au moyen d'une solution à pH 9,3, contenant 0,25 h de désoxycholate; f) la dénaturation des protéines sériques résiduelles par traite ment,à800C pendant 1 heure, de la solution à pH 9 contenant 0,25 de désoxycholate et provenant de e); g) l'uîtracentrifugation sur un gradient de densité dont on récupère les bandes de densité 1,19-1,21. 13.- Antigène HBS purifié obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12. 14.- Antigène HB5, caractérisé en ce que son seuil minimum de détection en électrosynérèse, vis-à-vis d'un immunsérum, est de l'ordre de 0,5 pg/ml. 15.- Antigène HB5, caractérisé en ce que, vis-à-vis d'un immunsérum, son seuil de détection est inférieur à une dilution 1/500 en électrosynérèse pour une concentration protéique d'HB de 300 pg/ml. 16.- Antigène HB5 selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que, par les méthodes immunochimiques traditionnelles, il se révèle ne contenir aucune trace de protéines sériques contaminantes ayant conservé leurs propriétés antigéniques. 17.- Antigène HBs, caractérisé en ce que, en solution à 300 > ig/ml, les tests immunochimiques permettant de déceler des protéines sériques aux teneurs respectives suivantes: albumine 1,25 g/ml 2 macroglobuline 5 g lipoprotéines 5 immunoglobuline G 0,30 immunoglobuline M 0,30 restent négatifs. 18.- Vaccin contenant un antigène HBs selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, et e-entuellement des excipients et adjuvants d'immunité pharmaceutiquement acceptables.