Brevet FR2405298A1 — publié le 19790504

La présente invention, à la réalisation de laquelle ont parti cipé Monsieur Jean Claude DROUET, Mademoiselle Marie Odile MARTIEN et Messieurs Dominique BIARD et René ZALISZ a pour objet de nouvelles glycoprotéines hydrosolubles isolées d'Escherichia Coli, le procédé de préparation et l'application à titre de médicaments de ces produits. De nombreuses préparations d'origine microbienne, constituées par des corps microbiens lysés, sont décrites dans la littérature, par exemple dans les brevets spéciaux de médicaments 5 488 M (Canadian Patents and Development Limited), 6 495 M (Institut de Recherches Scientifiques) et 6 513 M (Institut de Recherches Scientifiques). Ces lysats microbiens, seuls ou associés à un antibiotique servent à déclencher une réaction d'immuni.sation rapide ou à exal ter les défenses de ltorganisme vis-à-vis d'une agression micro bienne. Ces lysats proviennent, en général, d'une espèce micro bienne déterminée et amènent une immunisation plus spécifique que générale. Ils possèdent, l'inconvénient d'8tre généralement allergéniques. Leur emploi répété ne peut, de ce fait, être conseillé. Dans le brevet nO 2 043 475, la demanderesse a décrit une fraction glycoprotéique isolée d'une ou de plusieurs souches sa prophytes ou pathogènes possédant un pouvoir immunitaire et une certaine action anti-inflammatoire. La demanderesse a cherché depuis à préparer de nouveaux extraits glycoprotéiniques présentant des propriétés anti-inflammatoires et immunostimulantes ainsi qu'une bonne tolérance. La présente demande a ainsi pour objet de nouvelles glycopro téines hydrosolubles caractérisées en ce qu'elles sont extraites de corps microbiens lysés d'Escherichia Coli et en ce qu'elles possédent un poids moléculaire apparent égal ou supérieur à 300 000. Le poids moléculaire apparent est le poids moléculaire dotermi- né au moyen d'un gel poreux étalonné à l'aide de solutions macro moléculaires connues. Parmi les gels poreux étalonnés servant à déterminer le poids moléculaire, on peut retenir les gels commer cialisés sous la désignation Sépharose et notamment les gels Sépharose 6 B. Parmi les glycoprotéines de la présente invention, on retient notamment les glycoprotéines possédant un poids moléculaire apparent égal ou supérieur à 1 million. Parmi les glycoprotéines de l'invention, on retient notamment les glycoprotéines telles que définies ci-dessus caractérisées en ce qu'elles renferment de 35 % à 45 ffi de substances à pouvoir biurétogène et de 35 c; à 45 ,0 d'oses neutres, ne renferment pas d'acide diaminopimélique et présentent un maximum d'absorption dans l'Ultra-Violet à 210 mp environ. Par substances à pouvoir biurétogène, on désigne les protéines donnant la réaction colorée du biuret. Par oses neutres, on désigne notamment des hexoses neutres tels que le glucose, le galactose ou le mannose. Absence d'acide diaminopimelique dans les glycoprotéines telles que définies ci-dessus indique l'origine non membranaire de celles-ci. Parmi les glycoprotéines de l'invention, telles que définies ci dessus, on retient plus particulièrement les glycoprotéines ex traites de la souche d'Escherichia Coli déposée à l'institut Pasteur à Paris sous le nO 5 158. L'invention a également pour objet un procédé de préparation des nouvelles glycoprotéines hydrosolubles telles que définies ci-des sus, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on cultive, sur milieu solide ou liquide, une souche microbienne d'Escherichia Coli, récolte après complet développement les corps microbiens, procède à une lyse de ces derniers, recueille le lysat, traite ce dernier au moyen d'un ou de plusieurs solvants organiques, recueille le produit brut résultant, le met en solution aqueuse, soumet cette dernière à une diafiltration sur membrane poreuse calibrée présentant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est égal ou supérieur à 300 000 et lyophilise la solution ainsi obtenue. Les souches d1Escherichia Coli peuvent notamment être cultivées dans des milieux liquides, agités, dans des conditionsaérobies. Les milieux de culture utilisés sont usuels pour de telles souches. Ces milieux peuvent, par exemple, comprendre des extraits de viande, de la peptone de caséine, de la peptone papainique de soja, des autolysats de levure, des sucres, des éléments miné raux et de l'eau distillée. La lyse des corps microbiens peut titre physique, chimique ou enzymatique. La lyse physique peut avantageusement être effectuée au moyen des ultra-sons ou d'un rayonnement pénétrant ou encore par chauf fage. La lyse chimique peut avantageusement etre:effectuée par adjonc tion d'un agent tensio-actif, tel qu'un sorbate de polyéthylène glycol ou au moyen d'un antiseptique organomercuriel, tel que le mercurothiolate sodique, voire au moyen d'un acide minéral ou organique, tel que l'acide trichloracétique. La lyse enzymatique est avantageusement effectuée au moyen d'une enzyme, telle que le lysozyme, la trypsine, la pronase, la papa lune, l' -chymotrypsine. La lyse, qu'elle soit physique, chimique ou enzymatique, doit de préférence être poursuivie pendant une durée de 7 à 60 jours. Le lysat obtenu peut entre lyophilisé. Le traitement du lysat au moyen d'un ou de plusieurs solvants organiques est avantageusement effectué au moyen de deux solvants organiques qui peuvent être dans l'ordre, l'acétone et le méthanol. Ce traitement a pour effet d'éliminer les lipides et les pigments ; il doit entre pratique en agitant vigoureusement et pendant plusieurs heures le lysat avec le ou les solvants organiques. Les membranes poreuses calibrées présentant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est égal ou supérieur à 300 000 peuvent avantageusement titre constituées par les membranes commercialisées sous la désignation XM 300 par les sociétés ROMICOl; et AIICON (Amicon Corporation-Lexington Massachusetts 0 2713 U.S.A.). Les membranes poreuses calibrées présentant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est égal ou supérieur à 300 000 peuvent se présenter sous la forme de fibres creuses. Parmi ces dernières, on peut retenir notamment les fibres creuses commercialisées sous la désignation HIP 100 par la société AMICON précitée. Selon une variante du procédé, on peut avantageusement effectuer une diafiltration préliminaire au moyen d'une membrane poreuse calibrée présentant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est inférieur à 300 000. Pour ce faire, on peut utiliser par exemple des membranes présentant un seuil de rétention de 100 000 telles que les membranes commercialisées sous la désignation XM 100 par la Société AMICON précitée. Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre de l'invention, le procédé de préparation ci-dessus décrit est caractérisé en ce que : a) La lyse des corps microbiens est une lyse enzy:atique. b) Le traitement du lysat au moyen d'un ou de plusieurs solvants organiques est effectué successivement au moyen de l'acétone et du méthanol. c) La membrane poreuse calibrée présentant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est égal ou supérieur à 300 000 est une membrane vendue sous la désignation XM 300 par les sociétés ZIRCON ou ROMICON. Parmi les lyses enzymatiques, telles que définies ci-dessus, on retient plus particulièrement les lyses effectuées au moyen du lysozyme. Les glycoprotéines de l'invention sont légèrement colorées en beige, inodores, neutres et hydrosolubles jusqu'à une concentration de' 30 mg/ml environ, elles sont par contre insolubles dans des solvants tels que l'éthanol, le méthanol, l'acétone, l'éther ou le benzène. Par chromatographie sur Sépharose 6 B, on a constaté que le poids moléculaire des produits obtenus est supérieur à 1 million. Le spectre d'absorption Ultra-Violet montre une absorption aux courtes longueurs d'onde (maximum aux environs de 210 mlr), caractéristique de la liaison peptidique et une faible absorption à 260 mp et 280 mp, caractéristique des acides nucléiques et des protéines. Le spectre d'absorption infra-rouge confirme la nature en partie peptidique des produits. Les réactions de caractérisation des sucres (réaction à l'or- cinol et au carbazole) sont positives. Les réactions de caractérisation des liaisons peptidiques (réaction du biuret, de Lowry et à la ninhydrine) sont également positives. Les glycoprotéines de la présente demande ne sont pas dialysables, elles sont pharmacologiquement stables à la chaleur (une heure à 1050C) et aux pH extrêmes (pH 3 et pH 10, quinze heures à + 40C); elles résistent à l'action d'une enzyme protéolytique telle que la pronase (vingt-quatre heures à + 37 C). La présente demande a aussi pour objet un procédé, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que l'on utilise la souche d'Escherichia Coli déposée à l'institut Pasteur à Paris sous le n" 5 158. La présente demande a également pour objet les glycoprotéines obtenues par le procédé décrit ci-dessus. Les produits, objet de la présente invention, possédent de très intéressantes propriétés pharmacologiques ; ils sont doués notamment de remarquables propriétés anti-inflammatoires et immunostimulantes ainsi que d'une très bonne tolérance. Ces propriétés sont illustrées plus loin dans la partie expé- rimentale. Ces propriétés justifient l'utilisation des glycoprotéines de la présente demande, à titre de médicaments. La présente demande a ainsi également pour objet, l'application, à titre de médicaments, des lycoprotéines telles que définies ci-dessus. Parmi les médicaments de l'invention, on retient de préférence, les médicaments caractérisés en ce qu'ils sont constituds par les nouvelles glycoprotéines hydrosolubles obtenues à partir de la souche d'Escherichia Coli déposée à Institut Pasteur à Paris sous le nO 5 158. Parmi les médicaments de 11 invention, on retient également ceux, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les glycoprotéines telles qu'obtenues par le procédé de l'invention. Ces médicaments trouvent, par exemple, leur emploi dans le traitement des inflammations de la peau, des muqueuses et comme anti-prurigineux, en dermatologie, en oto-rhino-laryngologie, en ophtalmologie, en proctologie ou en gynécologie, ainsi que dans le traitement des infections intestinales chroniques ou aigues, telles que les colibacilloses, dans le traitement des toxiinfections alimentaires à Salmonelles et à Staphylocoques entérotoxiques, dans le traitement des syndromes dysentériques d'origine microbienne tels que les Shigelloses, dans le traitement des candidoses digestives et dans le traitement des infections urinaires à Proteus et à Pseudomonas. La dose usuelle, variable selon le produit utiliséJle sujet traité et l'affection en cause, peut être, par exemple, de 0,5 mg à 20 mg par jour, par voie orale chez l'homme. L'invention a enfin pour objet les compositions pharmaceuti quels qui renferment les glycoprotéines de la présente demande, à titre de principe actif. A titre de médicaments, les glycoprotéines de la présente demande peuvent être administrées par les voies digestive, parentérale ou locale. Les compositions pharmaceutiques correspondantes peuvent être, par exemple, solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utilisées en médecine humaine, comme, par exemple, les comprimés, simples ou dragéifiés, les gélules, les granulés, les solutions, les sirops, les suppositoires, les préparations injectables, les ovules, les crèmes, les pommades, les lotions, les gouttes, les collyres ; elles sont préparées selon les méthodes usuelles.Le ou les principes actifs peuvent y être incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomne arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs. Il va être donné maintenant, à titre non limitatif, des exemples de mise en oeuvre de l'invention. Exemple 1. Stade A : culture. On prépare un milieu de culture répondant à la formule suivante - extrait de viande................................. viande 175 g - chlorure de sodium ........... 175 g - peptone de caséine ....... 175 g - autolysat de levure............................... levure 175 g - ph.osphate bipotassique .................... .. 133,5 g - phosphate monopotassique 52,5 g - glucose 350 g - peptone papainique de soja......................... soja 700 g - eau distillée q.s.pO 35 litres On prépare le milieu de culture en mélangeant successivement l'extrait de viande, le chlorure de sodium, la peptone de caséine, l'autolysat de levure, le phosphate bipotassique, le phosphate monopotassique, dans environ 20 litres d'eau distillée. On ajuste le pH à 7,5 environ. On stérilise le milieu à 120 C pendant 40 minutes. Les solutions de glucose et de peptone papainique de soja sont introduites dans le milieu de culture au moment de l'ensemencement après avoir été stérilisées au préalable. La souche d'Escherichia Coli (souche Institut Pasteur nO 5 158) cultivée sur milieu gelosé est ensemencée dans 50 cm3 de milieu de culture. Cette solution servant d'inoculum est introduite dans le reste du bouillon de culture. On ajuste le volume total du milieu de culture à 35 litres par addition d'eau distillée stérile. Le milieu de culture est maintenu à 370C et le pH est ajusté automatiquement à 7,5 (par addition d'une solution d'anmoniaque ou par addition d'une solution d'acide chlorhydrique). La croissance des germes est appréciée au photométre ; le nombre de germes est calculé en fonction de la densité optique déterminée en comparaison avec une courbe étalon. Après complet développement, soit environ après 7 heures, le milieu renferme environ 100 milliards de germes au cm3. Stade B : lyse. A 35 litres de bouillon de culture obtenu au stade Aci-dessus, on ajoute une solution aqueuse de cnlorhydrate de lysozyme (stérilisée par filtration sur membrane millipore 0,22 p ) afin d'avoir une concentration finale de 80 tue chlorhydrate de lysozyme par cm3 de milieu de culture. On laisse en contact une heure à 560C en présence de 0,25 g d'Edta par litre de bouillon, de 862,5 mg de mercurothiolate sodique et de 34 g de polysorbate (commercialisé sous le nom de Tween 80) par litre de bouillon de culture. On poursuit la lyse pendant 30 jours à 370C dans des conditions stériles. On recueille le lysat, homogénéise par agitation puis lyophilise. On obtient 1961 g d'une poudre brune. Stade C : traitement. a) Par l'acétone. On met en suspension dans 35 litres d'acétone froid la totalité de la poudre obtenue au stade B ci-dessus puis suite vigoureusement pendant 3 heures à 1500 tours/minute. Après 3 heures, la suspension est filtrée sur verre fritté. On recueille une poudre jaune que l'on essore rapidement. b) Par le méthanol. On met en suspension yuans 35 litres de méthanol froid, la poudre obtenue précédemment et agite vigoureusement pendant 3 heures à 1500 tours/minutc. Après 3 heures, la suspension obtenue est décantée, la plus grande partie du surnageant est soutirée par siphonnage, le restant de la solution est filtré sur verre fritté. La poudre essorée est séchée à température ambiante sous vide pendant 24 heures. On obtient 830 g d'une poudre jaune beige. Stade D : dl'afiltration. On met en solution dans 10 litres d'eau distillée contenant 1 g/ l de merthiolate, les 830 g de poudre obtenue au stade C ci-dessus. On maintient la solution sous agitation à + 40C pendant 24 heures, centrifuge pendant deux heures à 4000 tours/minute puis à 90 000 g dans une centrifugeuse en continu avec un débit de 6 1/heure. On récupère 9 litres de solutionque l'on complète à 10 litres avec de l'eau distillée filtrée (sur membrane millipore 0,22 ). On introduit la solution obtenue dans un appareil à diafiltrer équipé de membranes poreuses dont le seuil de rétention est de 300 000 et le diamètre apparent des pores d'approximativement 2 A (membranes commerciàlisées par la société ASXICON oupar la société ROMICON sous la désignation xM 300). On fait circuler dans l'appareil 50 volumes d'eau distillée soit un volume de 500 litres. La durée de l'opération est d'environ 48 heures. La solution diafiltrée est récupérée puis centrifugée en continu à 90 000 g avec un débit de 6 litres/heure. On obtient 9,5 litres d'une solution que l'on lyophilise. On recueille finalement 40,1 g de glycoprotéines sous forne d'une poudre blanc-beige,. cotonneuse et très hygroscopique. Analyses. - C % 46,11 - H % 6,76 - N 7,33. Teneurs en - eau 8 % - phosphore 0,9 O,o - chlore O % - protéines - biuret 42,5 % - lowry 57,9 ';' - sucres - orcinol 55,6 Cjo (hexoses neutres) Spectres - U.V. : maximum aux environs de 218 m - I.R. : confirme la nature en partie peptidique des produits. L'hydrolyse par l'acide chlorhydrique 6 N à-1100C pendant 24 heures, des glycoprotéines isolées d'Escherichia Coli (obtenues ci-dessus), suivie d'une chromatographie sur plaque de cellulose avec l'un des systèmes solvants suivants : n-butanol, acide acétique, eau (60-30- 30), isopropanol, ammoniaque (2/3 1/3) ou méthanol-pyridine-acide acétique-eau (18-50-4-28) montre l'absence d'acide diaminopimélique dans ces hydrolysats. Cette absence d'acide diaminopimélique dans les hydrolysats indique l'origine non membranaire des glycoprotéines obtenues selon l'invention. L'étude de la courbe des densités optiques à 280 mp de l'éluat de la chromatographie sur Sépharose 6 B des glycoprotéines obtenues à l'exemple 1 en fonction des Ve/Vo, montre que celles-ci ont un poids moléculaire supérieur à 1 million. (Le Vo correspond au volume d'élution d'un dextran de poids moléculaire supérieur à 1 million, totalement exclu sur Sépharose 6 B dont le poids moléculaire limite d'exclusion est de 1 million. Le Ve correspond au volume d'élution des glycoprotéines d'Escherichia Coli obtenues), ExemPle 2 : En opérant coLame aux stades A et B de l'exemple 1, on prépare 90 litres de lysat, lyophilise et obtient 4490 g d'une poudre jaune brun. Stade C : traitement. a) Par l'acétone. On extrait la poudre obtenue ci-dessus au moyen de 90 litres d'acétone froid, comme indiqué au stade C a) de l'exemple 1. b) Par le méthanol. On extrait le produit obtenu ci-dessus au moyen de 90 litres de méthanol froid, comme indiqué au stade C b) de l'exemple 1 et obtient 2604 g d'une poudre jaune. Stade D : diafiltration. a) Sur membrane XI 100. On met en suspension dans 15 litres d'eau distillée 850 g de poudre obtenue au stade C ci-dessus, agite à + 40C pendant 15 heures et centrifuge la solution à 4000 tours/minute pendant 3 heures puis en continu à 40 000 g (débit 6 1/heure). On obtient 14 litres de solution, concentre dans un appareil à diafiltrer équipé de membranes poreuses dont le seuil de réten tion est de 100 000 et dont le diamètre apparent des pores est approximativement de 0,005 IL (membranes commercialisées par la société E.IICON sous la désignation XM 100). On obtient 4 litres de solution concentrée que l'on lave par 12 volumes d'eau distillée (48 litres) dans le même appareil équipé des memes membranes poreuses. Après le lavage, la solution est centrifugée en continu à 90 000 g avec un débit de 6 1/heure puis lyophilisée. On obtient 39,5 g de glycoprotéines de poids moléculaire supérieur à 100 000. b) sur membrane XM 300. On met en solution dans 15 litres d'eau distillée à + 40C, 34 g de poudre obtenue en a) ci-dessus et agite pendant 24 heures. On centrifuge la solution obtenue en continu à 90 000 g avec un débit de 6 litres/heure. On introduit la solution obtenue dans un appareil à diafiltrer équipé de membranes poreuses dont le seuil de rétention est de 300 000 et le diamètre apparent des pores d'approximativement 2 (membranes commercialisées par la société AMICON ou par la société ROleICOU, sous la désignation XL 300). Les 15 litres de solution sont lavés par 40 volumes d'eau distillée. La durée de ltopération est de 48 heures environ. La solution finale est centrifugée à 90 000 g puis lyophilisée. On obtient 22,3 g d'une poudre blanc-beige, cotonneuse et très hygroscopique. Analyses. - c 0 43,6 - H S 6,57 - N % 5,13. Teneurs en - eau 7 % - phosphore 0,8 % - chlore 0 ,; - protéines - biuret 37,4 'i', - sucres - orcinol 40,2 ,6 (hexoses neutres) - carbazole 4,6 % (acides uroniques) Spectres - UOV. : maximum à 210 mp - I.R. : confirme la nature en partie peptidique des produits. - absence d'acide diaminopimélique, - poids moléculaire sur Sépharose 6 B supérieur à 1 million. Exemple 3 : On a préparé des comprimés répondant à la formule - glycoprotéines obtenues à l'exemple 1............. 1 5 mu, - excipient q.s. pour un comprimé terminé à 200 rig. (Détail de l'excipient : lactose, talc, amidon, stéarate de magnésium). Exemple 4 On a préparé une ponnade répondant à la formule - glycoprotéines obtenues à l'exemple 2........... 2 200 i:ig - excipient q.s.p.................................. q.s.p 100 g. Etude pharmacologique. a) Activité anti-inflammatoire. L'activité anti-inflammatoire des produits a été déterminée sur des rats moles par la technique de l'oedème podal à la carraghénine (WINTER Risley, Nuss) Proc. Soc. Exp. Biol. I.led. 1963, 111, 544-547). Les animaux reçoivent dans l'articulation tibio-tarsienne d'une patte postérieure 0,05 ml d'une suspension de carraghénine à 1 %. Le produit étudié est administré par voie intrapéritonéale à des doses de 10 t/kg et de 100 t/kg une heure avant l'injection de la carraghénine. Le volume de la patte traitée est mesuré à l'aide d'un plethysmomètre, avant et 3 heures après l'injection de carraghénine. Les résultats sont exprimés en pourcentage de régression de l'oedème par rapport aux témoins. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 1 ci-dessous TABLEAU 1 Pourcentage due Pourcentage de dininution Doses Produit 10 tZkg 100 j/kg I de l'exemple 1 : 51,5 : 75 51,5 73 de l'exemple 2 55 71 b) Etude de l'appel cellulaire. Les glycoprotéines obtenues à l'exemple 1 sont administrées par voie intrapéritonéale à ides lots de cobayes à des doses de 50 et 100 t/kg. Une numération des cellules péritonéales est effectuée 48 heures après l'injection des glycoprotéines. La comporaison de cette numération avec celle effectuée sur des animaux non traités montre coutil n'y a pas d'rappel cellulaire. c) Etude de la tolérance. L'administration par voie sous-cutanée à des souris des glycoprotéines obtenues aux exemples 1 et 2 à des doses de 250 Y/kg et 1000 &gamma;/kg sous un volume de 0,2 ml ne provoque aucune intolérance locale ou générale. Aucun signe d'inflammation dans le tissu sous-cutané n'a été relevé. d) Activité anllbactériennegénérale préventive. Les glycoprotéines de l'exemple 2 sont administrées à des doses de 1000 t/kg et 5000 j/kg, par voie intrapéritonéale, à des lots de 20 souris, 6 jours et 48 heures avant l'injection par la même voie de germes d'une souche de Klebsiella Pneumoniae correspondant respectivement à 200 et 500 fois la DL50 (dose létale 50). La mortalité est suivie pendant les 7 jours qui suivent l'.n- section des germes de Klebsiella Pneumoniae et comparée à celle d'un lot témoin d'animaux ayant reçu du sérum physiologique à la place du produit étudié. Les rxsultats exprimés en pourcentage de protection des animaux traités figurent dans le tableau 2 ci-après Tableau 2 (DLso): 100 x 500 x : 100 x 500 x /kg DLr DL50 3 1000 : 60 ffi : 40 C,: 5000 : 80 5; : 70 XJ e) Activité antibactérienne locale curative (Per Os) 1 Contre Proteus Morganii. 2 x germes de Proteus 1iorganti sont injectés par voie intrapéritonéale à des souris. 30 minutes, 1 heure 30 et 6 heures après l'injection des germes, on administre aux. animaux, par voie orale, 3 fois 5 mg/kg de glycoprotéines obtenues à l'exemple 1. On suit la mortalité pendant 7 jours par rapport à un lot témoin n'ayant pas reçu les glycoprotéines. Après 7 jours, le taux de survie chez les animaux traités par rapport aux animaux témoins est de 50 . 2) Dontre Escherichia Coli. 2 x i0' germes d'Escherichia Coli sont injectés par voie intrapéritonéale à des souris. 30 minutes, 1 heure 30 et 6 heures après l'injection des Lermes, on administre aux animaux, par voie orale, 3 fois 5 n g/kg de glycoprotéines obtenues à l'exemple 2. On suit la mortalité pendant 7 jours par rapport à un lot témoin n'ayant pas reçu les glycoprotéines. Après 7 jours, le taux de survie chez les animaux traités par rapport aux animaux témoins est de 50 / * f) Stimulation des défenses non spécifiques. Cette stimulation a été étudiée sur le test de la clearance au carbone chez la souris en s'inspirant de la technique d'Halpern (C.R. Soc. Biol. 148, 1954, 431). Cette stimulation se traduit par une augmentation de l'activité phagocytaire après l'injection du produit; par voie intiapéritonéale. Les glycoprotéines des exemples 1 et 2 donnent respectivement une augmentation de 70 et 75 SjJ à la dose de 250 Jv/kg et de 54 et 55 ,0 à la dose de 100 &gamma;/ka. g) Evolution du poids de la rate. Deux injections pr voie intrapéritonéale à des souris, à 48 heures d'intervalle, des glycoprotéines obtenues aux exemples 1 et 2, aux doses de 100, 250 et 500 t/kg n'augmentent pas de façon significative le poids de la rate. h) Toxicité aigue - détermination de la DL50 La dose létale 50 (DL50) par voie intrapéritonéale chez la souris a été déterminée par la méthode de Behrens et Barber. Elle est de 56,7 mg/kg pour les glycoprotéines obtenues à l'exemple 1. R E V E N D I C A T I O N S 1.Nouvelles glycoprotéines hydrosolubles, caractérisées en ce quelles sont extraites de corps microbiens lysés d'Escherichia Coli et en ce qu'elles possédent un poids moléculaire apparent égal ou supérieur a 300 000. 2. Glycoprotéines telles que définies à la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles possédent un poids moléculaire apparent égal ou supérieur à 1 million. 3. Glycoprotéines telles que définies à la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce qu'elles renferment de 35 SJ à 45 ;o de substances à pouvoir biurétogène et de 35 0 à 45 4. Glycoprotéines telles que définies à la revendication 1, 2 ou 3, caractérisées en ce que la souche d'Escherichia Coli est la souche déposée à l'institut Pasteur à Paris sous le nO 5 158. 5. Procédé de préparation des nouvelles glycoprotéines hydroso lubles, telles que définies à la revendication 1, caractérisé en ce que l'on cultive, sur milieu solide ou liquide une souche microbienne d'Escherichia Coli, récolte après complet développement les corps microbiens, procède à une lyse de ces derniers, recueille le lysat, traite ce dernier au moyen d'un ou de plusieurs solvants organiques, recueille le produit brut résultant , le met en solution aqueuse, soumet cette dernière à une diafiltration sur membrane poreuse calibrée présentant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est égal ou supérieur à 300 000 et lyophilise la solution ainsi obtenue. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que a) La lyse des corps microbiens est une lyse enzymatique. b) Le traitement du lysat au moyen d'un ou de plusieurs solvants organiques est effectué successivement au moyen de l'acétone et du méthanol. c) La membrane poreuse calibrée présentant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est égal ou supérieur à 300 000 est une membrane vendue sous la désignation Ew 300 par les sociétés AMICON eu ROMICON. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la lyse enzymatique est effectuée au moyen du lysozyme. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5, 6 ou 7, caractérisé en ce que l'on utilise une souche d'Escherichia Coli telle que définie à la revendication 4. 9. Les glycoprotéines obtenues par le procédé de l'une des revendications 5, 6, 7 ou 8. 10. Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les nouvelles glycoprotéines hydrosolubles telles que définies à la revendication 1, 2 ou 3. 11. édicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les nouvelles glycoprotéines hydrosolulles telles que définies à la revendication 4. 12. Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les glycoprotéines telles que définies à la revendication 9. 13. Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment, à titre de principe actif, l'un au moins des médicaments, tels que définis à l'une des revendications 10 et 11. 14. Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment, à titre de principe actif, l'un au moins des médicaments, tels que définis à la revendication 12.