Brevet FR2396020A1 — publié le 19790126

La présente invention, à la réalisation de laquelle ont parti cipé Monsieur Jean-Claude DROGUET, Mademoiselle Marie-Odile MARTIN et Messieurs Dominique BIARD et René ZALISZ, a pour objet de nouveaux glycopeptides acétylés hydrosolubles, extraits de corps microbiens lysés de microorganismes choisis dans le groupe constitué par Hafnia, Aérobacter Cloacae et Klebsiella Pneumoniae, le procédé de préparation et l'application à titre de médicamenX de ces produits. De nombreuses préparations d'origine microbienne constituées par des corps microbiens lysés sont décrites dans la littérature. Il en est ainsi, par exemple, des produits décrits dans les Brevets Spéciaux de Médicaments 5488 M, 6495 M et 6513 M. Ces lysats qui proviennent le plus souvent d'une espèce microbienne déterminée et qui provoquent une immunisation plus spécifique que générale présentent l'inconvénient entre généralement allergéniques. Des extraits hydrosolubles acétylés, issus notamment de corps microbiens lysés d1 Escherichia Coli ont en outre été décrits dans la littérature. Il en est ainsi, par exemple, des extraits hydrosolubles acétylés décrits dans la demande de brevet français publiée sous le numéro 2.269.964. Ces extraits semblent présenter uniquement des propriétés immunostimulantes. La demanderesse a cherché depuis à préparer des nouveaux extrait s présentant à la fois des propriétés antiinflammatoires et immunostimuiantes ainsi qu'une bonne tolérance et elle a trouvé que ce problème pouvait être résolu en préparant de nouveaux glycopeptides acétylés hydrosolubles extraits de corps microbiens lysés de microorganismes choisis dans le groupe constitué par Hafnia, Aérobacter Cloacae et Klebsiella Pneumoniae. La présente demande a ainsi pour objet de nouveaux glycopeptides acétylés hydrosolubles extraits de corps microbiens lysés, caractérisés en ce que les microorganismes sont choisis dans le groupe constitué par HafniasAérobacter Cloacae et Klebsiella Pneumoniae, en ce que lesdits glycopeptides acétylés ont un paids moléculaire apparent compris entre 500 et 200.000, en ce qu'ils renferment au moins 5 % de substances à pouvoir biurétogòne et au moins 25 * d'oses neutres, en ce qu'ils ne renferment pas d'acide diaminopimélîque et présentent un maximum d'absorption dans l'Ultra-Violet à environ 210 m Le poids moléculaire apparent est le poids moléculaire détermi né au moyen d'un gel poreux étalonné à l'aide de solutions macromoléculaires connues. Parmi les gels poreux étalonnés servant à déterminer le poids moléculaire, on peut retenir les gels commercialisés sous la désignation Sephadex et notamment les gels Sephadex G 200. Par substances à pouvoir biurétogène, on désigne les protéines donnant la réaction colorée du biuret. Par oses neutres, on désigne notamment des hexoses neutres tels que le glucose, le galactose ou le mannose. L'absence d'acide diamînopimélique dans les glycopeptides acétylés tels que définis ci-dessus indique ltorigine non membranaire de ceux-ci. Parmi les glycopeptides acétylés de l'invention, on retient notamment ceux caractérisés en ce que le microorganisme est constitué par Rafnia et en ce que lesdits glycopeptides renferment au moins 20 % de substances à pouvoir biurétogène. Parmi ces derniers, on retient plus particulièrement ceux caractérisés en ce que le microorganisme est constitué par Hafnia et en ce que lesdits glycopeptides renferment de 20 ffi à 25 % de substances à pouvoir biurétogène et de 25 % à 40 % d'oses neutres et de préférence ceux caractérisés en ce que le microorganisme est constitué par la souche dlEafnia déposée a l'institut Pasteur à Paris sous le numéro 5731. Parmi les glycopeptides acétylés de l'invention, on retient également ceux caractérisés en ce que les microorganismes sont choisis dans le groupe constitué par Aérobacter Cloacae et Klebsiella Pneumoniae, en ce que lesdits glycopeptides ont un poids moléculaire apparent compris entre 1000 et 200.000 et en ce qu'ils renferment au moins 40 ffi d'oses neutres. Parmi les glycopeptides acétylés de l'invention, extraits de microorganismes choisis dans le groupe constitué par Aérobacter Cloacae et Klebsiella Pneumoniae tel que défini ci-dessus, oa retient plus particulièrement ceux caractérisés en ce que le microorganisme est constitué par Aérobacter Cloacae et en ce que lesdits glycopeptides renferment de 25 ffi à 35 % de substances à pouvoir biurétogène et de 40 % à 50 ffi d'oses neutres et de préférence ceux caractérisés en ce que le microorganisme est constitué par la souche d'Aérobacter Cloacae déposée à l'institut Pasteur à Paris sous le numéro 5549. Parmi les glycopeptides acétylés de l'invention extraits de microorganismes choisis dans le groupe constitué par Aerobacter Cloacae et Klebsiella Pneumoniae tel que défini ci-dessus, on retient plus particulièrement ceux caractérisés en ce que le microorganisme est constitué par Kiebsiella Pneumoniae et en ce que lesdits glycopeptides renferment de 5 % à 15 % de substances à pouvoir biurétogène et de 45 % à 65 % d'oses neutres et de préférence ceux caractérisés en ce que le microorganisme est constitué par la souche de Klebsiella Pneumoniae déposée à l'institut Pasteur à Paris sous le n 52145. Ltinvention a également pour objet un procédé de préparation des glycopeptides acétylés hydrosolubles tels que définis cidessus, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on soumet à une acétolyse des glycoprotéines extraites de corps microbiens lysés de microorganismes choisis dans le groupe constitué par Hafnia, Aérobacter Cloacae et Klebsiella Pneumoniae et possédant un poids moléculaire apparent d'au moins 300r000, pour obtenir un extrait brut de glycopeptides acétylés, traite ce dernier au moyen d'un solvant organique et recueille la phase aqueuse, effectue une db filtration de cette dernière sur membrane poreuse calibrée présentant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 500, recueille la solution n'ayant pas traversé la membrane puis isole de la solution ainsi obtenue le produit recherché. L'acétolyse, ctest-à-dire la coupure en milieu acétique des glycoprotéines extraites de corps microbiens lysés de microorganismes choisis dans le groupe constitué par Hafnia, Aérobacter Cloacae et Klebsiella Pneumoniae est avantageusement effectuée au moyen d'un mélange d'anhydride acétique, d'acide acétique et d'acide sulfurique. Ce mélange est composé de préférence par 10 volumes d'anhydride acétique, 10 volumes d'acide acétique glacial et 1 volume d'acide sulfurique concentré. La réaction est avantageusement effectuée sous agitation pendant au moins 48 heures et de préférence pendant 96 heures à une température voisine de + 40C. 4a réaction d'acétolyse peut être arrêtée par adjonction de glace pilée au mélange. Le pH du mélange réactionnel peut alors entre ajusté à une valeur voisine de 4,5 par addition de carbonate acide de sodium. L'acétolyse des glycoprotéines possédant un poids moléculaire apparent d'au moins 300.000 est avantageusement précédée par une dessication prolongée sous vide à une température inférieure à 400C, desdites glycoprotéines. Le solvant organique utilisé pour traiter l'extrait brut des glycopeptides acétylés peut avantageusement être constitué par le chloroforme. La phase aqueuse obtenue après traitement par le solvant organique peut avantageusement Entre débarrassée des particules insolubles par centrifugation, ultracentrifugation ou filtration. La filtration peut être réalisée au moyen de filtres "Millipore AP 20 et AP 04 La membrane poreuse calibrée présentant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 500 peut avantageusement être constituée par une membrane commercialisée sous la désignation UM Q5 par la Société AMICON (Amicon Corporation Lexington Massachusetts 02713 U.S.A.). Lorsque l'on cherche à préparer selon la présente invention des glycopeptides possédant un poids moléculaire apparent supérieur à 1000, on peut avantageusement utiliser des membranes poreuses calibrées présentant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 1000. Parmi ces membranes, on peut notamment utiliser celles commercialisées sous la désignation P.S.A.C. 00001 par la Société Millipore ou sous la désignation UM 2 par la Société AMICON précitée. Les membranes poreuses calibrées peuvent également se présenter sous la forme de fibres creuses. La phase aqueuse retenue par la membrane poreuse calibrée peut avantageusement entre lyophilisée pour donner les glycopeptides acétylés hydrosolubles de l'invention Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre de l'invention, le procédé de préparation ci-dessus décrit est ainsi caractérisé en ce que- :: a) l'acétolyse est effectuée au moyen dtun mélange d'anhydride acétique, d'acide acétique et d'acide sulfurique, b) le solvant organique est constitué par le chloroforme, c) la membrane poreuse calibrée présentant un seuil de rétention de subtances dont le poids moléculaire est supérieur à 500, utilisée pour la préparation de glycopeptides acétylés isolés d'Hafnia et ayant un poids moléculaire apparent supérieur à 500 est une membrane vendue sous la désignation UM 05 par la Société AMICON. d) La membrane poreuse calibrée présentant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 500, utilisée pour la préparation de glycopeptides acétylés isolés de microorganismes choisis dans le groupe constitué par Aérobacter Cloacae et Klebsiella Pneumoniae et ayant un poids moléculaire apparent supérieur à 1000 est une membrane vendue sous la désignation UM 2 par la Société AMICON ou sous la désignation P.S.A.C. 00001 par la Société Millipore. La présente demande a aussi pour objet un procédé de préparation tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre au départ de glycoprotéines extraites de microorganismes choisis dans le groupe constitué par Hafnia souche Institut Pasteur n 5731, Aérobacter Cloacae souche Institut Pasteur ne 5549 et Klebsiella Pneumoniae souche Institut Pasteur n 52145. La présente demande a également pour objet des glycopeptides acétylés hydrosolubles obtenus par le procédé décrit ci-dessus. Les glycopeptides acétylés hydrosolubles de l'invention se présentent sous la forme de produits inodores, neutres et beaucoup plus hydrosolubles que les glycoprotéines dont ils dérivent. Ces glycopeptides sont par contre insolubles dans des solvants tels que méthanol, le méthanol, l'acétone, l'éther ou le benzènes Par chromatographie sur Sephadex G 200, on a constaté que le poids moléculaire des produits obtenus est inférieur ou égal à 200.000. Le spectre d'absorption Ultra-Violet montre une absorption aux courtes longueurs tonde (maximum aux environs de 210 caractéristique de la liaison peptidique et une absorption pratiquement nulle aux grandes longueurs d'onde. Le spectre d'absorption Infra-Rouge confirme la nature peptzdique du produit et permet de différencier les glycopeptides obtenus par le procédé, objet de la présente demande, des glycoprotéines dont ils dérivent par la présence de bandes d'absorption à 1730-1700 cm-1 et 1370 cm-1 ainsi qu'à 1270-1200 cm-1 dues aux liaisons esters de l'acide acétique (dans les glycopeptides acétylés de l'invention). Les réactions de caractérisation des sucres (réaction à l'or- cinol et au carbazole) sont positives. Les réactions de caractérisation des liaisons peptidiques (réaction du biuret, de Lowry et à la ninhydrine) sont également positives, Les glycopeptides acétylés de la présente demande ne sont pas dialysables, ils sont pharmacologiquement stables à la chaleur (une heure à 1050C) et aux pH extrêmes ( pH 3 et pH 10 quinze heures à + 40C) ; l'action d'une enzyme protéolytique telle que la pronase (vingt-quatre heures à + 370C) ne modifie pas l'actif vité pharmacologique des produits. L'hydrolyse par l'acide chlorhydrique 6 N à 1100C pendant 24 heures, des glycopeptides acétylés, objet de la présente demande, suivie d'une chromatographie sur plaque de cellulose avec l'un des systèmes solvants suivants r n-butanol, acide acétique, eau (60-30-30), isopropanol, ammoniaque (2/3-1/3) ou méthanolpyridine-acide acétique-eau (18-50-4-28) montre l'absence d'acide diaminopimélique dans ces hydrolysats. Cette absence d'acide diaminopimélique dans les hydrolysats indique l'origine non membranaire des glycopeptides acétylés obtenus selon l'invention. Les produits, objet de la présente invention possédent de très intéressantes propriétés pharmacologiques ; ils sont doués notamment de remarquables propriétés anti-inflammatoires et immunostimulantes ainsi que d'une très bonne tolérance. Ces propriétés sont illustrées plus loin dans la partie expérimentale. Ces propriétés justifient l'utilisation des glycopeptides acétylés hydrosolubles de la présente demande, à titre de médicaments. La présente demande a ainsi également pour objet, l'application, à titre de médicaments, des glycopeptides acétylés tels que définis ci-dessus. Parmi les médicaments de l'invention, on retient entre autres ceux caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les nouveaux glycopeptides acétylés hydrosolubles obtenus au départ de glycoprotéines extraites de microorganismes choisis dans le groupe constitué par Hafnia souche Institut Pasteur nO 5731, Aérobacter Cloacae souche Institut Pasteur nO 5549 et Klebsiella Pneumoniae souche Institut Pasteur nO 52145. Parmi les médicaments de l'invention, on retient notamment ceux caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les glycopeptides acétylés tels qu'obtenus par le procédé de l'invention. Ces médicaments trouvent, par exemple, leur emploi dans le traitement des inflammations de la peau, des muqueuses et comme anti-prurigineux, en dermatologie, en oto-rhino-laryngologie, en ophtalmologie, en proctologie ou en gynécologie, ainsi que dans le traitement des infections intestinales chroniques ou aigues, telles que les colibacilloses, dans le traitement des toxi-infections alimentaires à Salmonelles et à Staphylocoques entéro toxiques, dans le traitement des syndromes dysentériques d'origine microbienne tels que les Shigelloses, dans le traitement des candidoses digestives et dans le traitement des infections urinaires à Proteus et à Pseudomonas. La dose usuelle, variable selon le produit utilisé, le sujet traité et l'affection en cause, peut Outre, par exemple, de 0,5 mg à 20 mg par jour, par voie orale chez l'homme. L'invention a enfin pour objet les compositions pharmaceutiques qui renferment les glycopeptides acétylés de la présente demande à titre de principe actif A titre de médicaments, les glycopeptides acétylés de la présente demande peuvent outre administrés par les voies digestive, parentérale ou locale. Les compositions pharmaceutiques correspondantes peuvent Titre par exemple, solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utilisées en médecine humaine, comme, par exemple, les comprimés, simples ou dragéifiés, les gélules, les granulés, les solutions, les sirops, les suppositoires, les préparations injectables, les ovules, les crèmes, les pommades, les lotions les gouttes, les collyres ; elles sont préparées selon les méthodes usuelles0 Le ou les principes actifs peuvent y Outre incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras dtorigine animale ou végétale, les dérivés paraf finiques, les- glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs. Les glycoprotéines extraites de corps microbiens lysés dtAérobacter Cloacae, possédant un poids moléculaire apparent supérieur à 300.000 peuvent Outre prêparéescomme indiqué dans la demande de brevet français déposée au nom de la demanderesse le 3 Juillet 1975 sous le n 75-20914 et publiée sous le n 2.315.945. Les glycoprotéines extraites de corps microbiens lysés d'Hafnia, possédant un poids moléculaire apparent supérieur à 300.000 peuvent être préparées comme indiqué dans la demande de brevet français déposée au non de la demanderesse le 27 Janvier 1977 sous le nO 77-02267 et ayant pour objet de "Nouvelles glycoprotéines isolées dtHarnia, procédé de préparation et application à titre de médicaments". Selon cette demande, le procédé de préparation des glycoprotéines extraites de corps microbiens lysés dtEafniat possédant un poids moléculaire apparent dtau moins 300.000 est caractérisé en ce que l'on cultive, sur milieu solide ou liquide, une souche microbienne d'Hafnia, récolte après complet développement les corps microbiens, procède à une lyse de ces derniers, recueille le lysat, traite ce dernier au moyen d'un ou de plusieurs solvants organiques, recueille le produit brut résultant, le met en solution aqueuse, soumet cette dernière à une diafiltration sur membrane poreuse calibrée présentant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est égal ou supérieur à 300,000 et lyophilise la solution ainsi obtenue. Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre de l'invention objet de la demande française précitée, le procédé de préparation est caractérisé en ce que a) la lyse des corps microbiens est une lyse enzymatique ; b) le traitement du lysat au moyen d'un ou de plusieurs solvants organiques est effectué successivement au moyen de l'acétone et du méthanol, c) la membrane poreuse calibrée présentant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est égal ou supérieur à 300.000 est une membrane vendue sous la désignation XM 300 par les Sociétés AMICON ou ROMIOON. Un exemple d'une telle préparation figure ci-après dans la partie expérimentale. Les glycoprotéines extraites de corps microbiens lysés de Klebsiella Pneumoniae, possédant un poids moléculaire apparent d'au moins 300.000 peuvent également Outre préparées par un procédé caractérisé en ce que lton cultive, sur milieu solide ou liquide, une souche microbienne de Klebsiella Pneumoniae, récolte après complet développement les corps microbiens, procède à une lyse de ces derniers, recueille le lysat, traite ce dernier au moyen d'un ou de plusieurs solvants organiques, recueille le produit brut résultant, le met en solution aqueuse, soumet cette dernière à une diafiltration sur membrane poreuse calibrée présentant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est égal ou supérieur à 300.000 et lyophilise la solution ainsi obtenue. Dans des conditions préférentielles de misse en oeuvre, ce dernier procédé de préparation est caractérisé en ce que a) la lyse des corps microbiens est une lyse enzymatique ; b) le traitement du lysat au moyen dtun ou de plusieurs solvants organiques est effectué successivement au moyen de l'acétone et du méthanol, c) la membrane poreuse calibrée présentant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est égal ou supérieur à 300.000 est une membrane vendue sous la désignation XM 300 par les Sociétés AMICON ou ROMICON. Un exemple d'une telle préparation figure ci-après dans la partie expérimentale. L'invention a enfin pour objet, à titre de produits industriels nouveaux, utiles notamment pour la préparation des glycopeptides acétylés hydrosolubles extraits de corps microbiens lysés de Klebsiella Pneumoniae, les glycoprotéines extraites de corps microbiens lysés de Klebsiella pneumoniae, possédant un poids moléculaire apparent d'au moins 300.000, obtenues par le procédé decrit ci-dessus. Il va entre donné maintenant, à titre non limitatif, des exemples de mise en oeuvre de l'invention. Exemple 1 Stade A : acétolyse On sèche à l'étuve sous vide à 400C pendant 24 heures, 5 g de glycoprotéines extraites de corps microbiens lysés d'Aérobacter Cloacae (souche Institut Pasteur n0 5549) possédant un poids moléculaire apparent supérieur à 300.000 préparés comme indiqué à l'exemple 1 de la demande française publiée sous le n .2.315.945. On agite le produit obtenu pendant 4 jours à la température de + 40C dans 250 ml d'un mélange acide acétique-anhydride acétique et acide sulfurique (10/10/1). Après 4 jours, on verse la solution obtenue, goutte à goutte sur 750 g de glace pilée. Après fonte totale de la glace, on amène le pi de la solution à 4,7 par addition de 150 g de carbonate acide de sodium. Stade B : traitement par le solvant organique. On traite la solution obtenue au stade A ci-dessus 8 fois de suite par 750 ml de chloroforme. On recueille la solution aqueuse finale, centrifuge à 15 000 g pendant 30 minutes et recupère le surnageant. On filtre au moyen de filtres t'Millipore AP 20 et AP 04 Stade C : diafiltration. On introduit la solution obtenue dans un appareil à diafiltrer équipé de membranes poreuses dont le seuil de rétention est de 1000 (membranes commercialisées par la Société AMICON sous la désignation UM 2), On fait circuler environ 40 volumes d'eau distillée dans l'appareil jusqu'à ce que l'Ultra-filtrat traversant la membrane ne renferme plus de substances dont le poids moléculaire est inférieur à 10900. On recueille la solution n'ayant pas traversé la membrane, centrifuge 30 minutes à 35 000 g, recueille le surnageant et lyophilise. On obtient 2 g de glycopeptides acétylés sous forme d'une poudre jaune hygroscopique. Analyses C % 38,6 Il % 5,1 N % 3,7. Teneurs en - eau - phosphore 0,4 % - chlore O % - protéines - biuret 21 % (liaisons peptidiques) - sucres - orcinol 30 % (hexoses neutres) - carbazole 6,5 % (acides uroniques). Spectres - U.V, maximum d'absorption à environ 210 m @ - I.R. bandes à 1730-1700 cm-1 et 1370 cm-1 -1 bandes à 1270-1200 cm - absence diacide diaminopimélique - poids moléculaire sur Sephadex G 200 inférieur ou égal à 200.000. Exemple 2 Stade A acétolse On sèche à l'étuve sous vide à 400C pendant 24 heures 70 g de glycoprotéines extraites de corps microbiens lysés d'Hafnia (souche Institut Pasteur n 5731), possédant un poids moléculaire apparent supérieur à 1 million. On agite le produit obtenu pendant 4 jours à la température de + 40C dans 3,5 litres dtun mélange acide acétique-anhydride acétique et acide sulfurique (10/10/1). Après 4 jours, on verse la solution obtenue, goutte à goutte sur 10,5 kg de glace pilée. Après fonte totale de la glace, on amène le pH à 4,5 par addition de 2,1 kg de carbonate acide de sodium. Stade B : traitement par le solvant organique. On traite la solution obtenue au stade A ci-dessus 8 fois de suite par 10, 5 litres de chloroforme. On recueille la solution aqueuse finale, centrifuge à 60 000 g en continu avec un débit de 6 litres/ heure et récupère le surnageant. Stade C : diafiltration. On filtre la solution obtenue au stade B ci-dessus sur filtre Millipore AP 20 et AP 04 (1/@) puis introduit la solution obtenue dans un appareil à diafiltrer équipé de membranes poreuses dont le seuil de rétention est de 500 (membranes commercialisées par la Société AMICON sous la désignation UN 05). On fait circuler environ 40 volumes dteau distillée dans l'appareil jusqu'à ce que l'Ultrafiltrat traversant la membrane ne renferme plus de substances de poids moléculaire inférieur à 1000. On recueille la solution n'ayant pas traversé la membrane, centrifuge en continu à 90 000 g avec un débit de 6 litres/heure, recueille le surnageant et lyophilise. On obtient 30,2 g de glycopeptides acétylés sous forme dune poudre beige hygroscopique. Analyses C % 36,5 H % 5,11 N % 4,86 Teneurs en eau 9 5 - phosphore 0,09 s - chlore 0 % - protéines -biuret 23 % (liaisons peptidiques) - sucres -orcinol 29 % (hexoses neutres) - carbazole 2 ,5 % (acides uroniques) Spectres - U.V, : maximum dtabsorption à environ 210 m B - I.R. @ bandes à 1730-1700 cm-1 et 1370 cm-1 bandes à 1270-1200 cm. - absence d'acide diaminopimélique - poids moléculaire sur Sephadex G 200 inférieur ou égal à 200.000. Les glycoprotéines extraites de corps microbiens lysés d'liafnia (souche Institut Pasteur n 5730), possédant un poids moléculaire apparent supérieur à 1 million, utilisées comme produit de départ, peuvent être préparées comme suit. Stade I : culture On prépare un milieu de culture répondant à la formule suivante -extrait de viande.......................... 690 g -chlorure de sodium......................... 690 g -peptone de caséine......................... 690 g -autolysat de levure........................ 690 g -phosphate bipotassique........................ 483 g -phosphate monopotassique....................... 207 g -glucose.................................... 4104 g -peptone papaïnique de soja................. 2760 g -eau distillée q.s.p........................ 138 litres. On prépare le milieu de culture en mélangeant successivement l'extrait de viande, le chlorure de sodium, la peptone de caséine, l'autolysat de levure, le phosphate bipotassique, le phosphate monopotassique dans environ 120 litres d'eau distillée. On ajuste le pH aux environs de 7. On stérilise le milieu à 12000 pendant 40 minutes. Les solutions de glucose et de peptone papainique de soja sont introduites dans le milieu de culture au moment de Stensemence- ment après avoir été stérilisées au préalable La souche d'Hafnia (Institut Pasteur n 5731) cultivée sur milieu gelosé, est ensemencée dans 50 cm3 de milieu de culture. Cette solution, servant d'inooulum est introduite dans le reste du bouillon de culture. On ajuste le volume total du milieu de culture à 138 litres par addition d'eau distillée stérile. Le milieu de culture est maintenu à 3700 et le pli est ajusté automatiquement à 7 (par addition d'une solution d'ammoniaque ou par addition d'une solution d'acide chlorhydrique). La croissance des germes est appréciée au photomètre ; le nombre de germes est calculé en fonction de la densité optique déterminée en comparaison avec une courbe étalon. Après complet développement, soit environ après 7 heures, le milieu renferme environ 1 milliard de germes au cm3. Stade Il : lyse A 138 litres de bouillon de culture obtenus au stade I cidessus, on ajoute une solution aqueuse de chlorhydrate de lysozyme, (stérilisée par filtration sur membrane millipore 0,22 r) afin d'avoir une concentration finale de 160de chlorhydrate de lysozyme par cm3 de milieu de culture. On laisse en contact une heure à 560C en présence de 0,25 g dtEdta par litre de bouillon, de 862,5 mg de mercurothiolate sodique et de 80 g de polysorbate (commercialisé sous le nom de Tween 80) par litre de bouillon de culture. On poursuit la lyse pendant 7 jours à 370C dans des conditions stériles. On recueille le lysat, homogénéise par agitation puis lyophilise. On obtient 7900 g d'une poudre brune. Stade III : traitement a) Par l'acétone On met en suspension dans 138 litres d'acétone froid la totalité de la poudre obtenue au stade II ci-dessus, puis agite vigoureusement pendant 3 heures à 3500 tours/minute. Après 3 heures, la suspension est filtrée sur verre fritté. On recueille une poudre jaune que l'on essore rapidement. b) Par le méthanol La poudre obtenue précédemment (7295 g) est mise en suspension dans 138 litres de méthanol froid et agitée vigoureusement pendant 3 heures à 1500 tours/minute. Après 3 heures, la suspension obtenue est décantée, la plus grande partie du surnageant est soutirée par siphonnage, le restant de la solution est filtré sur verre fritté, La poudre essorée est séchée à température ambiante sous vide pendant 24 heures. On obtient 3988 g d'une poudre beige clair Stade IV : diafiltration On met en solution dans 6 fois 10 litres d'eau distillée contenant 1 g/litre de merthiolate, 6 fois 600 g de poudre obtenue au stade III ci-dessus0 On maintient la solution sous agitation à + 40C pendant 24 heures, centrifuge pendant 2 heures à 4000 tours/minute, puis à 90 000 g dans une centrifugeuse en continu avec un débit de 6 litres/heure. On récupère la solution que l'on complète à 10 litres avec de liteau distillée filtrée (sur membrane millipore 0,22 ). On introduit la solution obtenue dans un appareil à diafiltrer équipé de membranes poreuses dont le seuil de rétention est de 300.000 et le diamètre apparent des pores d'approximativement 2 A (membranes commercialisées par la Société AMICON ou par la Société ROMICON sous la désignation 2CM 300). On fait circuler dans l'appareil 50 volumes d'eau distillée, soit un volume de 500 litres. La durée de l'opéra*ion est d'environ 48 heures. La solution diafiltrée est récupérée puis centrifugée en continu à 90 000 g avec un débit de 6 litres/heure. On obtient 9,5 litres d'une solution que l'on lyophilise. On recueille finalement 105 g de glycoprotéines sous forme d'une poudre blanc-beige, cotonneuse et très hygroscopique. Exemple 3 Stade A : acétolzse On sèche à l'étuve sous vide à 400C pendant 24 heures 25 g de glycoprotéines extraites de corps microbiens lysés d'Hafnia (souche Institut Pasteur n0 5731) possédant un poids moléculaire apparent supérieur à 1 million. On agite le produit obtenu pendant 4 jours à la température de + 40C dans 1,250 litre d'un mélange acide acétique-anhydride acétique et acide sulfurique (10/10/1). Après 4 jours, on verse la solution obtenue, goutte à goutte sur 3,750 kg de glace pilée. Après fonte totale de la glace, on amène le pH à 4,5 par addition de 748 g de carbonate acide de sodium. Stade B : traitement par le solvant organigue. On traite la solution obtenue au stade A ci-dessus, 8 fois de suite par 3,750 litres de chloroforme. On recueille la solution aqueuse finale, centrifuge en continu à 60 000 g pendant 30 minutes et récupère le surnageant. Stade C : diafiltration On filtre la solution obtenue au stade B ci-dessus sur filtre Millipore AP 20 et AP 04 (1 ), puis introduit la solution obtenue dans un appareil à diafiltrer équipé de membranes poreuses dont le seuil de rétention est de 500 (membranes commercialisées par la Société AMICON sous la désignation UM 05). On fait circuler environ 40 volumes dteau distillée dans l'appareil jusqu'à ce que l'ultrafiltrat traversant la membrane ne renferme plus de substances de poids moléculaire inférieur à 1000. On recueille la solution n'ayant pas traversé la membrane, centrifuge en continu à 90 000 g avec un débit de 6 litres/heure, recueille le surnageant et lyophilise. On obtient 10,9 g de glycopeptides acétylés sous forme d'une poudre beige hygroscopique. Analyses C % 35,3 H % 5,1 N % 3,29 Teneurs en - eau - phosphore 0,06 % - chlore O * - protéines - biuret 20,5 % (liaisons peptidiques) - Sucres - orcinol 37 es (hexoses neutres) - carbazole 1,7 % (acides uroniques) Spectres - U.V. : maximum d'absorption à environ 210 m - I.R. : bandes à 1730-1700 cm-1 et 1370 cm-1 bandes à 1270-1200 cml - absence dtacide diaminopimélique - poids moléculaire sur Sephadex G 200 inférieur ou égal à 200.000. Les glycoprotéines extraites de corps microbiens lysés d'Haf- nia (souche Institut Pasteur n 5731),possédant un poids moléculaire apparent supérieur à t million, utilisées comme produit de départ peuvent être préparées comme suit : Stades I et Il En opérant comme aux stades I et II de la préparation figurant à exemple 2, on prépare 90 litres de lysat que l'on lyophilise. On obtient 4570 g d'une poudre jaune brun. Stade III : traitement. a) Par l'acétone. On extrait la poudre obtenue ci-dessus au moyen de 90 litres d'acétone froid, comme indiqué au stade III a) de l'exemple 2. b) Par le méthanol On extrait le produit obtenu ci-dessus au moyen de 90 litres de méthanol froid comme indiqué au stade III b) de l'exemple 2. On sèche à froid sous vide et obtient 1765 g d'une poudre beige. Stade IV : diafiltration On met en suspension dans 15 litres d'eau distillée, 600 g de la poudre obtenue au stade III ci-dessus, agite à + 40C pendant 15 heures et centrifuge la solution à 4000 tours/minute pendant 2 heures puis en continu à 90 000 g avec un débit de 6 litres/heure. On obtient 14 litres de solution que l'on introduit dans un appareil à diafiltrer équipé de membranes poreuses dont le seuil de rétention est de 300.000 et dont le diamètre apparent des pores est approximativement de 2 A (membranes commercialisées par la Société AMICON ou par la Société ROMICON, sous la désignation XM 300). Les 14 litres de solution sont lavés par 40 volumes d'eau distillée. La durée de l'opération est de 48 heures environ. La solution finale est centrifugée à 90 000 g puis lyophilisée. On obtient 55,6 g d'une poudre blanc-beige, cotonneuse et très hygroscopique. Exemple 4 t Stade A : Acétolyse On sèche à l'étuve sous vide à 400C pendant 24 heures, 50 g de glycoprotéines extraites de corps microbiens lysés de Kleb- siella Pneumoniae (souche Institut Pasteur n 52145) sérotype capsulaire Il, possédant un poids moléculaire apparent supérieur à 300.000. On agite le produit obtenu pendant 4 jours à la température de + 4 C dans 2,5 litres d'un mélange acide acétique-anhydride acétique et acide sulfurique (10/10/1). Après 4 jours, on verse-la solution obtenue, goutte à goutte, sur 7,5 kg de glace pilée. Après fonte totale de la glace, on amène le pli de la solution à 4,5 par addition de 1,7 kg de carbonate acide de sodium. Stade B: traitement par le solvant organique. On traite la solution obtenue au stade A ci-dessus, 8 fois de suite par 7,5 litres de chloroforme. On recueille la solution aqueuse finale, centrifuge à 30 000 g pendant 30 minutes et récupère le surnageant. On concentre de 11 litres à 8 litres, sous pression réduite et à une température ne dépassant pas 45 C, puis centrifuge à 90 000 g pendant 30 minutes. On filtre sur filtre Millipore AP 20. Stade C : Diafiltration. On introduit la solution obtenue au stade B ci-dessus dans un appareil à diafiltrer équipé de membranes poreuses dont le seuil de rétention est de 1000 (membranes commercialisées par la Société Millipore sous la désignation P.S.A.C. 00001). On fait circuler 11,5 volumes d'eau distillée dans l'appareil, recueille la solution n'ayant pas traversé la membrane, centrifuge 30 minutes à 15 000 g , récupère le surnageant et lyophilise. On obtient ainsi 7,85 g de glycopeptides acétylés sous forme d'une poudre blanche très hygroscopique. Analyses C % 39,6 H % 5,67 N % 1,42 Teneurs en - eau 5 % - chlore 0 % - phosphore 0 O,of - protéines - biuret 8 % C liaisons peptidiques. - lowry 10,4 % - sucres - orcinol 63 % (hexoses neutres) - carbazole 17,5 ,' (acides uroniques) Spectres - U.V. : maximum d'absorption à environ 210 m@ - I.R. : bandes à 1730-1700 cm-1 et 1370 cm-1 bandes à 1270-t22Q cm - absence d'acide diaminopimélique - poids moléculaire sur Sephadex G 200 inférieur ou égal à 200.000 Acides aminés : teneurs exprimées en pourcentage. - acide aspartique 23 Méthionine 10,2 - thréonine 3,3 isoleucine 2,9 - sérine 8,7 leucine 6,2 - acide glutamique 10,5 Tyrosine 2,5 - proline 1,7 phénylalanine 0,1 - glycine 4,7 lysine 5 - alanine 11,5 histidine 1,5 - valine 3,6 arginine 3,7. Les glycoprotéines extraites de corps microbiens lysés de glebsiella Pneumoniae (souche Institut Pasteur n 52145), possédant un poids moléculaire apparent supérieur à 300,000, utilisées comme produit de départ, peuvent être préparées comme suit t Stade I: culture On prépare un milieu de culture répondant à la formule suivan te - extrait de viande................................. 950 g - chlorure de sodium................................ 950 g - peptone de caséine................................ 950 g - autolysat de levure............................. 950 g g - phosphate bipotassique............................ 665 g - phosphate monopotassique.......................... 285 g - glucose .......................................... 1900 g - peptone papaïnique de soja * 3800 g - eau distillée q.s.p.............................. 190 litres. On prépare le milieu de culture en mélangeant successivement l'extrait de viande, le chlorure de sodium, la peptone de caséine, l'autolysat de levure, le phosphate bipotassique, le phosphate monopotassique, dans t70 litres d'eau distillée. On ajuste le pH aux environs de 7,5. On stérilise le milieu à 1200C pendant 40 minutes0 Les solutions de glucose et de peptone papainique de soja sont introduites dans le milieu de culture au moment de l'ensemencement après avoir été stériliséés au préalable. La souche de Klebsiella Pneumoniae (souche Institut Pasteur n 52145) cultivée sur milieu gelosé, est ensemencée dans 500 cm3 de milieu de culture. Cette solution, servant d'inoculum est introduite dans le reste du bouillon de culture. On ajuste le volume total du milieu de culture à 190 litres par addition d'eau distillée stérilee Le milieu de culture est maintenu à 370C et le pH est ajusté automatiquement à 7,5 (par addition d'une solution d'ammoniaque ou par addition dttme solution d'acide chlorhydrique). La croissance des germes est appréciée au photomètre ; le nombre de germes est calculé en fonction de la densité optique déterminée en comparaison avec une courbe étalon. Après complet développement, soit environ après 7 heures, le milieu renferme 135 milliards de germes au cm3. Stade II : Lyse Aux t90 litres de bouillon de culture obtenus au stade I cidessus, on ajoute une solution aqueuse de chlorhydrate de lysozyme (stérilisée par filtration sur membrane Millipore 0,22 ) afin d'avoir une conoentration finale de 80 &gamma; de chlorhydrate de lysozyme par cm3 de milieu de culture. On laisse en contact une heure à 560C en présence de 0,25 g dtE.D.T.Ae par litre de bouillon, de 862,5 mg de mercurothiolate sodique et de 34 g de polysorbate (commercialisé sous le nom de Tween 80) par litre de bouillon de culture. On poursuit la lyse pendant 30 jours à 370C dans des condi tions stériles. On recueille le lysat, homogénéise par agitation puis lyophilise. On obtient 11,210 kg d'une poudre brun clair. Stade III : traitement a) Par l'acétone On met en suspension dans 190 litres d'acétone froid, la totalité de la poudre obtenue au stade II ci-dessus, puis agite vigoureusement pendant 3 heures à 1500 tours/minute. Après 3 heures, la suspension est filtrée sur verre fritté. On recueille une poudre jaune que l'on essore rapidement. b) Par le méthanol La poudre obtenue précédemment est mise en suspension dans 190 litres de méthanol froid et agitée vigoureusement pendant 3 heures à 1500 tours/minute. Après 3 heures, la suspension obtenue est décantée, la plus grande partie du surnageant est soutirée par siphonnage, le restant de la solution est filtre sur verre fritté. La poudre essorée est séchée à température ambiante sous vide pendant 24 heures. On obtient alors 2860 g d'une poudre jaune beige. Stade IV : Diafiltration On met en solution dans 70 litres sceau distillée les 2860 g de poudre obtenue au stade III ci-dessus. On maintient la solution sous agitation à + 4 C pendant 24 heures, centrifuge pendant 6 heures à 4000 tours/minute, puis à 90 000 g dans une centrifugeuse en continu avec un débit de 6 litres/heure. On récupère 65 litres de solution que l'on introduit dans un appareil à diafiltrer équipé de membranes poreuses dont le seuil de rétention est de 300.000 et le diamètre apparent des pores d'approximativement 2 A (membranes commercialisées par la Société AMICON ou par la Société RONICON sous la désignation XM 300). On fait circuler dans l'appareil 50 volumes d'eau distillée, soit un volume de 3250 litres. La durée de l'opération est dtenviron 120 heures. La solution diafiltrée est récupérée puis centrifugée en continu à 90 000 g avec un débit de 6 litres/heure. On obtient 62 litres d'une solution que l'on lyophilise. On recueille finalement 410 g de glycoprotéines sous forme d'une poudre blanche beige, cotonneuse et très hygroscopique. Exemple 5 On a préparé des comprimés répondant à la formule - glycopeptides acétylés obtenus à l'exemple 1..... 5 mg - excipient q.s. pour un comprimé terminé à ....... 200 mg (détail de l'excipient : lactose, talc, amidon, stéarate de magnésium). Exemple 6 On a préparé des comprimés répondant à la formule - glycopeptides acétylés obtenus à l'exemple 4..... 5 mg - excipient q.s. pour un comprimé terminé à........ 200 g (détail de l'excipient : lactose, talc, amidon, stéarate de magnésium). Exemple 7 On a préparé une pommade répondant à la formule - glycopeptides obtenus à l'exemple 2............. 200 mg - excipient q.s.p.................................. 100 g Etude pharmacologique a) Activité anti-inflammatoire L'activité anti-inflammatoire des produits a été déterminée sur des rats males par la technique de l'oedème podal à la carraghénine (WINTER Risley, Nuss) Proc. Soc; exp. Biol. Med. 1963, 111 544-547). Les animaux reçoivent dans l'articulation tibio-tarsienne d'une patte postérieure 0,05 ml dtune suspension de carraghénine à 1 %. Le produit étudié est administré par voie intrapéritonéale à des doses de 50 &gamma;/kg, de 100 t/kg ou de 500 &gamma;/kg une heure avant l'injection de la carraghénine. Le volume de la patte traitée est mesuré à l'aide d'un plethyemomètre, avant et 3 heures après l'injection de carraghénine. Les résultats qui sont exprimés en pourcentage de régression de l'oedème par rapport aux témoins figurent dans le tableau 1 ci-après. TABLEAU I ( : ) ( glycopeptides : POURCENTAGE DE REGRESSION DE L'OEDEME) acétylés obtenus à : POUR UNE DOSE DE PRODUIT ETUDIE DE l'exemple. : : 50 /kg t 100 &gamma;/kg : 500 4kg 1 55 % - 80 % 2 68 % 80 % 86 % 3 44 % 63 % 84 % 4 50 % 58 % 79,5 % b) Etude de l'appel cellulaire Les glycopeptides acétylés obtenus aux exemples 1,2 et 3 sont administrés par voie intrapéritonéale à des lots de cobayes à des doses de 50 &gamma;/kg et 100 &gamma;/kg. Les glycopeptides acétylés obtenus à l'exemple 4 sont administrés dans les mêmes conditions à des doses de 50 &gamma;/kg, 100 &gamma;/ kg et 250 &gamma;/kg. Une numération des cellules péritonéales est effectuée 48 heures après l'injection des glycopeptides. La comparaison de cette numération avec celle effectuée sur des animaux non traités montre qu'il n'y a pas d'appel cellulai re. c) Etude de la tolérance L'administration par voie sous cutanée à des souris des glycopeptides acétylés obtenus aux exemples 1, 2 et 3 a des doses de 250 &gamma;/kg et 1000 t/kg sous un volume de 0,2 ml ne provoque aucune intolérance locale ou générale. De la même manière, l'administration dans les mêmes condi- tions des glycopeptides acétylés obtenus à l'exemple 4 à des doses de 250 &gamma;/kg, 500 &gamma;/kg et 1000 g/kg ne provoque aucune intolérance locale ou -générale. Aucun signe d'inflammation dans le tissu sous cutané n1a été relevé. -d) Activité antibactérienne générale préventive. 1 ) Contre Klebsiella Pneumoniae Les glycopeptides acétylés obtenus à l'exemple 2 sont administrés à des doses de 1000 &gamma;/kg et 5000 4kg, par voie in trapéritonéale, à des lots de 20 souris, 6 jours et 48 heures avant l'injection par la mdme voie de germes d'une souche de Klebsiella Pneumoniae (Institut Pasteur 52145) correspondant respectivement à 100 et 500 fois la DLgQ (dose létale 50). Les glycopeptides acétylés obtenus à l'exemple 4 sont administrés dans les mimes conditions à des doses de 10 &gamma;/kg et 100 &gamma;/ kg, 6 jours et 48 heures avant l'iniection par la même voie de germes d'une souche de Klebsiella Pneumoniae correspondant respectivement à 500 et 12500 fois la DL50. La mortalité est suivie pendant les 7 jours qui suivent l'in- jection des germes de Klebsiella Pneumoniae et comparée à celle d'un lot témoin d'animaux ayant reçu du sérum physiologique à la place du produit étudié. Les résultats exprimés en pourcentage de protection des animaux traités figurent dans le tableau 2 ci-après : TABLEAU 2 (----------------------------------------------------------------) germes glycopeptides (DL50) POURCENTAGE DE PROTECTION POUR acétylés Doses 100 x 500 x 12500 x obtenus en DL50 DL50 DL50 à l'exemple : &gamma;/kg (----------------------------------------------------------------) 2 1000 75 70 5000 100 90 (----------------------------------------------------------------) 4 10 - 100 80 100 - 100 80 (----------------------------------------------------------------) 20) Contre Proteus Morganii Les glycopeptides acétylés obtenus à l'exemple 2 et 3 sont administrés à la dose de 100 &gamma;/kg, par voie intrapéritonéale, à des lots de 20 souris, 6 jours et 48 heures avant l'injection par la même voie de 2 x 107 germes de Proteus Xorganii (Institut Pasteur n A 231) (par souris). La mortalité est suivie pendant les 7 jours qui suivent l'injection des germes et comparée à celle dtun lot témoin d'animaux ayant reçu du sérum physiologique à la place du produit étudié. Après 7 jours, on obtient 85 % de protection chez les animaux traités par les glycopeptides de l'exemple 2 par rapport aux animaux témoins et 100 ss de protection chez les animaux traités par les glycopeptides de l'exemple 3. 3 ) Contre Candida Albicans Les glycopeptides acétylés obtenus à l'exemple 2 sont administrés à la dose de 100 kg, par voie intrapéritonéale à des lots de 20 souris, 48 heures et 24 heures avant 11 injection par la même voie de 4,5 x 107 germes de Candida Albicans (institut Pasteur n 885 sérotype A) (Par souris). La mortalité est suivie pendant les 7 jours qui suivent ltin- jection des germes et comparée à celle d'un lot témoin d'animaux ayant reçu du sérum physiologique à la place du produit étudié. Après 7 jours, on obtient 33 ,' de protection des animaux traités par rapport aux animaux témoins. 4 ) Contre Staphylococcus Aureus En opérant avec le même protocole que précédemment, mais en injectant 20 x 107 germes de staphylococcus Aureus (Institut Pasteur n 75484) par souris, on obtient après 7 jours 100 * de protection chez les animaux traités par les glycopeptides des exemples 2 et 3 par rapport aux animaux- témoins. e) Activité antibactérienne curative (Per Os) a 4 lots de 20 souris, on injecte respectivement et par voie intrapéritonéale, les germes suivants Escherichia Coli, Proteus Morganii, Candida Albicans et Staphylococcus Aureus, aux doses respectives suivantes: 2 x 107 germes, 2 x 107 germes, 4,5 x 107 germes et 20 x 107 germes (par souris). Trente minutes, une heure 30 et 6 heures après l'inJection des germes, on fait ingérer (par voie orale) à chaque souris 5 mg/kg de glycopeptides acétylés obtenus aux exemples 2 et 3, On suit la mortalité pendant 7 jours et la compare à celle d'un lot témoin d'animaux n'ayant pas reçu les glycopeptides acétylés. Les résultats exprimés en pourcentage de protection des animaux traités figurent dans le tableau 3 ci-après : TABLEAU 3 Germes injectés POURCENTAGE DE PROTECTION POUR : : le produit de : le produit de : l'exemple 2. l'exemple 3. Escherichia Coli : : 2 x 107 germes (souche I.P. 54127) 33 % 30 % Proteus Morganii 40 % 30 % 2 x 107 germes (souche I.P. A 231) : : Candida Albicans : 4,5 x 10-7 germes 31 % (souche I.P. 885) Staphylococcus Aureus 20 x to7 germes : 15 % s 20 * (souche I.P. 75484) s : f) Stimulation des défenses non spécifiques Cette stimulation a été étudiée sur le test de la clearance au carbone chez la souris en s'inspirant de la technique d'Hal- pern (C.R. Soc. Biol. 148, 1954, 431). Cette stimulation se traduit par une augmentation de l'activi- té phagocytaire après l'injection du produit par voie intrapé- -ritonéale. Les glycopeptides acétylés de la présente demande, administrés à des doses comprises entre 50 &gamma;/kg et 500 &gamma;/kg entraînent 15 minutes après l'injection du carbone colloïdal un certain pourcentage d'augmentation de la phagocytose. Ce pourcentage, variable avec la dose administrée et le produit étudié figure dans le tableau 4 ci-après : TABLEAU 4 glycopeptides . POURCENTAGE D'AUGMENTATION DE LA acétylés obtenus : PHAGOCYTOSE POUR DES DOSES DE à l'exemple GLYCOPETIDES DE : 50 &gamma;/kg 100 &gamma;/kg 250 &gamma;/kg 500 &gamma; ;/kg --------------------------------------------------------------------------- 1 - 61,5 % 69 % 2 - 55 % - 71 % 3 - 61 % - 76 % 4 65 % 71 % 72 % --------------------------------------------------------------------------- g) Evolution du poids de la rate Deux injections par voie intrapéritonéale à des souris, à 48 heures d'intervalle des glycopeptides acétyles obtenus à l'exemple 1, aux doses de 250 &gamma;/kg, 500 //kg et 100 &gamma;/kg, n'augmentent pas de façon significative le poids de la rate. De même, deux injections des glycopeptides acétylés obtenus aux exemples 2, 3 et 4, effectuées dans les mimes conditions mais à des doses de 100 &gamma;/kg, 250 &gamma;/kg et 500 &gamma;/kg n'augmentent pas de façon significative le poids de la rate. h) Toxioité aigue - détermination de la DL50 La dose létale 50 (DL50) par voie intrapéritonéale chez la souris a été déterminée par la méthode de Behrens et Kärber. Elle est de 100 mg/kg pour les glycopeptides acétylés obtenus à l'exemple I, de 17 mg/kg pour ceux des exemples 2 et 3 et enfin de 120 mg/kg pour ceux de l'exemple 40 REVENDICATIONS le - Nouveaux glycopeptides acétyles hydrosolubles extraits de corps microbiens lysés, caractérisés en ce que les microorganismes sont choisis dans le groupe constitué par Hafnia, Aérobacter Cloacae et Klebsiella Pneumoniae, en ce que lesdits glycopeptides acétylés ont un poids moléculaire apparent compris entre 500 et 200.00, en ce qu'ils renferment au moins 5 % de substances à pouvoir biurétogène et au moins 25 chez d'oses neutres1 en ce qu'ils ne renferment pas d'acide diaminopimélique et présentent un maximum d'absorption dans l'Ultraviolet à environ 210 2. - Glycopeptides acétylés tels que définis à la revendication 1, caractérisés en ce que le microorganisme est constitué par Hafnia et en ce que lesdits glycopeptides renferment au moins 20 % de substances à pouvoir biurétogène. 3. - Glycopeptides acétylés tels que définis à la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce que le microorganisme est constitué par Hafnia et en ce que lesdits glycopeptides renferment de 20 eh à 25 % de substances à pouvoir biurétogène et de 25 % à 40 es ptoses neutres. 4. - Glycopeptides acétylés tels que définis à la revendication 3, caractérisés en ce que le microorganisme est constitué par la souche d'Hafnia déposée à l'Institut Pasteur à Paris sous le n 573t. 5. - Glycopeptidês acétylés tels que définis à la revendication 1, caractérisés en ce que les microorganismes sont choisis dans le groupe constitué par Aérobacter Cloacae et Klebsiella Pneumoniae en ce que lesdits glycopeptides ont un poids molécu taisre apparent compris entre 1000 et 200.000 et en ce qu'ils renferment au moins 40 % d'oses neutres. 6. - Glycopeptides acétylés tels que définis à la revendication i ou 5, caractérisés en ce que le microorganisme est constitué par Aérobacter Cloacae et en ce que lesdits glycopeptides renferment de 25 % à 35 es de substances à pouvoir biurétogène et de 40 eh à 50 r d'oses neutres; 7. - Glycopeptides acétylés tels que définis à la revendication 6, caractérisés en ce que le microorganisme est constitué par la souche d'Aérobacter Gloacae déposée à Institut Pasteur à paris sous le n 5549. 8. - Glycopeptides acétylés tels que définis à la revendication 1 ou 5, caractérisés en ce que le microorganisme est constitué par Klebsiella Pneumoniae et en ce que lesdits glycopeptides renferment de 5 % à 15 ss de substances à pouvoir biurétogène et de 45 % à 65 % d'oses neutres. 9. - Glycopeptides acétylés tels que définis à la revendication 8, caractérisés en ce que le microorganisme est constitue par la souche de Klebsiella Pneumoniae déposée à l'Institut Pasteur à Paris sous le N 32145. 10. - Procédé de préparation des nouveaux glycopeptides acétylés hydrosolubles tels que définis à la revendication 1, caractérisé en ce que l'on soumet à une acétolyse des glycoprotéines extraites de corps microbiens lysés de microorganismes choisis dans le groupe constitué par Hafnia, Aérobacter Cloacae et Klebsiella Pneumoniae et possédant un poids moléculaire apparent d'au moins 300.000, pour obtenir un extrait brut de glycopeptides acétylés, traite ce dernier au moyen d'un solvant organique et recueille la phase aqueuse, effectue une diafiltration de cette dernière sur membrane poreuse calibrée présentant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 5005 recueille la solution n'ayant pas traversé la membrane, puis isole de la solution ainsi obtenue le produit recherché, 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que a) l'acétolyse est effectuée au moyen d'un mélange d'anhydride acétique, d'acide acétique et d'acide sulfurique, b) le solvant organique est constitué par le chloroforme. 12. - Procédé selon la revendication 10 ou 11, pour la pré paration de glycopeptides acétylés isoles d'Hafnia, ayant un poids moléculaire apparent supérieur à 500, ledit procédé étant caractérisé en ce que la membrane poreuse calibrée présentant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 500 est une membrane vendue sous la désignation UM OS par la Société AMICON. 13. - Procédé selon la revendication 10 ou 11, pour la pré paration de glycopeptides acétylés isoles de microorganismes choisis dans le groupe constitue par Aérobacter Cloacae et Klebsiella Pneumoniae, ayant un poids moléculaire apparent supé rieur à 100Q, ledit procédé étant caractérisé en ce que la membrane poreuse calibrée présentant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 500 est une membrane vendu. sous la désignation UM 2 par la Société AMICON ou sous la désignation P.S.A.C. 00001 par la Société Millipore. 14. - Procédé selon l'une quelconque des revendications 10, 11, 12 ou 13, caractérisé en ce qutil est mis en oeuvre au départ de glycoprotéines extraites de microorganismes choisis dans le groupe constitué par Hafnia, souche Institut Pasteur n 5731, Aérobacter Cloacae, souche Institut Pasteur n 5549 et Klebsiella Pheumoniae souche Institut Pasteur n 52145. 15e - Les glycopeptides acétylés hydrosolubles obtenus par le procédé de ltune des revendications 10, 11, 12, 13 ou 14. 16. - Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les nouveaux glycopeptides acétylés hydrosolubles tels que définis à la revendication le 17. - Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les nouveaux glycopeptides acétylés hydrosolubles tels que définis à l'une quelconque des revendications 2, 3 ou 4. 18. - Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués Ipar les nouveaux glycopeptides acétylés hydrosolubles tels que définis à l'une quelconque des revendications 5, 6 ou 7. 19. - Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les nouveaux glycopeptides acétylés hydrosolubles tels que définis à l'une quelconque des revendications 5, 8 ou 9. 20. Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les nouveaux glycopeptides acétylés hydrosolubles, tels que définis à la revendication 15. 21. - Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qut elles renferment, à titre de principe actif, l'un au moins des médicaments tels que définis à l'une quelconque des revendications 16, 17, 18 ou 19. 22. - Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qutelles renferment, à titre de principe,actif, 1 'un au moins des médicaments tels que définis à la revendication 20.