Brevet FR2406446A1 — publié le 19790518

La présente invention est relative à un nouvel agent thérapeutique pour les maladies à virus, à son procédé de préparation et à son utilisation. I1 est connu que plusieurs nucléosides, c'est-à-dire des composés ayant un reste de sucre lié à un noyau hétérocyclique, ont des activités antivirales. Parmi eux il peut être mentionné l'ara-A ou 9-(béta-D-arabinofuranosyl)-adéniNE (voir brevet fran- çais BSM 3585 M) et la ribavirine ou (l-béta-D-ribofuranosyl) l,2,4-triazole-3-carboxamide (voir Science, 177, 705, 1972 et Chemotherapy, 21, 505, 1975). L'ara-A a une activité antivirale marquée mais seulement pour certains virus ADN et la ribavirine a un spectre d'activité antivirale large, c'est-à-dire une activité vis-à-vis de différents virus ARN et ADN mais son utilisation est gênée par une marge de sécurité plut8t étroite. Selon la présente invention, on a trouvé que la (S)-9 (2,3-dihydroxypropyl)adénine de formule montre un large spectre d'activité antivirale marquée(vis-à-vis des virus ARN ainsi que ADN) et quelle a une toxicité aiguë très faible. Ceci est surprenant pisqu'il n'était pas entendu que la substitution d'un groupe hydroxypropyle au reste de sucre (comme comparé avec l'ara-A) aurait pour résultat le maintien d'une activité antivirale. De plus, il n'était pas attendu que le composé de la présente invention, indiqué ci-après (s)- DHPA, aurait un spectre large d'activité antivirale puisque l'activité antivirale de l'ara-A est limitée seulement au virus ADN.Finalement sa faible toxicité est surprenante au vu de la toxicité élevée de la ribavirine. On notera que seulement la forme D-glycéro ou la forme énantiomère (S > de la 9-(2,3-dihydroxypropyl)adénine est active et non la forme énantiomère (R) ou la forme L. En outre, la forme RS ou le mélange racémique est presque aussi efficace que la forme S. En outre, on notera que différents composés apparentés ayant un autre noyau hétérocyclique ou une autre chatne latérale aliphatique ne montre aucune activité antivirale, au moins pas à des doses acceptables, comme cela apparattra dans la partie expérimentale de la présente description. Ainsi, l'activité antivirale de (S)-DHPA est encore plus surprenante. En outre, on notera que (S)-DHPA potentialise l'activité antivirale des autres agents antiviraux, tel que ara-A, et il peut en conséquence être utilisé en combinaison avec ces agents antiviraux Sur la base de ces découvertes, l'invention vise une nouvelle composition thérapeutique pour une application dans le traitement des maladies à virus qui comprend une quantité efficace de (S)-9-(2,3-dihydroxypropyl)adénine ou (RS)-9-(2,3-dihydroxypro pyl)adénine comme ingrédient actif. La (s) ou (RS)-8-(2,3-dihydroxy- propyl)adénine peut être utilisée comme seul ingrédient actif ou en combinaison avec d'autres ingrédients actifs, tels que l'ara-A. En outre, la présente invention vise un procédé de préparation d'une telle composition thérapeutique en combinant la (S)-9-(2,3- dihydroxypropyl)adénine ou (RS)-9-(2,3-dihydroxypropyl)adénine avec un excipient pharmaceutiquement acceptable, et une composition pour le traitement des maladies à virus qui peut être administrée à un patient souffrant d'une maladieà virus. Le procédé de préparation de l'énantiomère (S) et la forme racémique (RS) de la 9-(2,3-dihydroxypropyl)adénine est connu. La synthèse de ces composés par conséquent ne fait pas partie de la présente invention. Ainsi selon le procédé publié par Holy Commun.. 40. 187. 1975), les deux composés peuvent ch être préparés en chauffant la l-O-p-tolyl-sulfonyl-2,3-0-isopropylidène-D-(ou DL-) glycérine de formule A avec le sel de sodium de l'adénine dans une solution de diméthylformamide à 100'C et en traitant le composé intermédiaire au reflux avec de l'acide acétique à 80%. Comme exemple, 11,4g (40 mmoles) du composé A et 7,8 g (50 mmoles) du sel de sodium de l'adénine dans le diméthylformamide (lOOml) sont chauffés est pendant 8 heures à 1000C, évaporés in vacuo et le résidu/cristallisé dans le méthanol.Le produit cristallin est porté au reflux avec de l'acide acétique b 80% pendant 1 heure, évaporé in vacuo, codistillé avec méthanol (3 x 50ml) et recristallisd dans le méthanol. Rendement 50-60% de (S)- ou (RS)-9-2,3-dihydroxy- propyl)adénine. Forme (S) : P.F. 202-203 C # - 35,40 (c=1, eau). Forme (RS) : P.F. 207-2080C. Spectre UV (pH 7): max 250 nm, #max 14000, #min 228 nm. Selon le certificat PV 1787-77 de l'auteur tchéchoslovaque la (RS)-9-(2,3-dihydroxypropyl)adénine peut être obtenue en chauffant l'adénine avec le carbonate de glycérine-1,2-cylique de rormule B et l'hydroxyde de carbonate de sodium ou de potassium dans une solution de diméthylformamide ou de 1,4-dioxane à 80-1400C. Comme exemple, un mélange d'adénine (1,35 g) de carbonate de glycérine 1,2-cyclique (2,0g) de carbonate de sodium (0,3g) et de diméthylformamide (25 ml) est porté au reflux pendant 1 heure, évaporé in vacuo et le résidu dissous dans 50 ml d'eau bouillante est décoloré par la charbon. Après évaporation in vacuo , le résidu fournit par cristallisation dans le méthanol le racémique (RS)-9 (2,3-dihydroxypropyl)adénine avec un rendement de 60-70%. P.F. 205-206 C, spectre UV (eau) : #max 260nm, #mAX 14000. Les activites antivirales de la (S)-DHPA seront décrites en détail en référence au dessin annexé dans lequel la figure 1 est une représentation graphique montrant l'effet de la (S) DHPA sur les cultures fibroblastes de peau humaine inoculée avec le virus de la stomatite vésiculaire ; la figure 2 est une reprd- sentation graphique montrant l'effet de la (S)-DHPA in vivo chez la souris inoculée par voie intranasale avec le virus de la stomatite vésiculaire; la figure 5 est une représentation graphique montrant l'effet inhibiteur de la (S)-DHPA sur la désamination de l'ara-A par adénosine-désaminase sur la muqueuse intestinale du veau et la figure 4 est une représentation graphique des mêmes données que dans la figure 3 mais avec un tracé réciproque sur 1' ordonnée L'activité antivirale de la (S)-DHPA est explorée daruime variété de cultures de cellules et avec une variété de virus AND et ARN telle qu'indiquée dans le tableau 1. Les cellules de chaque culture de cellules sont inoculées avec un certain virus à une dose d'environ 100 ml Dl50 , c'est-à-dire environ 100 fois la dose nécessaire pour infecter 50% des cellules. Une heure après l'inoculation, des doses variables de la (S) DHPA sont ajoutées à partir de O jusqu'à 40 ug/ml et quelques fois à plus 200 u/ml. Pour chaque système virus-cellules, la DI50 de la (S)-DHPA, c'est-à-dire la dose de (S)-DHPA nécessaire à supprimer 1' effet de maladie de la cellule vivante (cytopathique) du virus à 505 , est déterminée. L'effet cytopathique (CPE) est mesuré dans les cultures de cellules infectées par le virus, non traitées [ dose O de (S)-DHPA J et on l'enregistre aussitat qu'il atteint sa plénitude (selon la méthode décrite par L.J. Rosenthal et I.L. Shechmaister, dans " Tissue Culture ", page 510, Academic Press, New York, 1973. Les résultats de ces expériences sont montrés dans le tableau 1. I1 apparatt du tableau 1 que divers virus ADN et ARN comprenant ceux de la variole, de l'herpès simplex (types 1 et 2), de la rougeole et de la stomatite vésiculaire, sont inhibés par la (S)-DffPA. D'autres virus tels que le virus de la polio, le virus Coxsackie et Sindbis ne sont pas affectés. Le fait que les effetsd'inhibition de la (S)-DHPA sur la cytopathogènicité induite par virus reflète effectivement une inhibition de la multiplication du virus, est déterminé en mesurant le développement du virus dans des cultures de fibroblaste de peau humaine (HSF) qui ont été inoculées avec le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) et ensuite expose à la (S)-DHPA. Dans ces expériences, les mrnocouches confluentes des cellules HSF dans les disques de petri en plastique sont inoculées avec le virus de la stomatite vésiculaire (4,5 log10ml DI50/0,5 ml/ disque de petri) pendant 1 heure à 370C et, immédiatement après, exposées à la (S)-DHPA (100 ug/ml). Les cultures-de cellules sont ensuite incubées pendant des temps variables à 370C. A la fin de la période d'incubation, les cellules sont congelées à -70 C et les homogénéisats sont déterminés pour la teneur en virus par formation de plaques dans les cultures de fibroblaste de souris L-929. Cette méthode est bien connue. Chaque plaque est produite par un virus ayant infecté une cellule, tétant multiplié dans la cellule et ayant fait éclater la cellule.Puisque les monocouches de cellules sont recouvertes par un milieu du type gel (par exemple gélose), les virus libérés lors de la destruction de la cellule ne peuvent envahir que le voisinage des cellules, avec pour résultat la formation d'une zone de destruction des cellules, dénommée plaque. Le nombre de plaque6 est équivalent b la teneur en virus. I,es résultats sont présentés graphiquement dans la figure 1 où UFP signifie unité de formation des plaques. Il apparaît de la figure l que 100 ug/ml de (S)-DHPA provoquent; une grande diminution du titre dit virus, en comparaison avec la culture témoin où il n'est pas ajouté de (S)-DHPA. Cette diminution s'élève approximativement à 4log10 pour les rendements en virus mesures à 24 et 48 heures après l'infection. TABLEAU 1 Activité anti virale de (S)-DHPA dans les cultures de cellules Virus Culture* DI50 (ug/ml) de cellules Virus ADN Variole PRK 10 - 20 Variole HSF 10 - 20 Herpès simplex-l souche KOS PRK 10 Herpès simplex-l souche KOS SF 20 Herpes simplex-2 souche 333 PRK 4 - 10 Herpès simplex-2 souche 333 HSF 7-20 Virus ARN Stomatite vésiculaire PRK 7 - 10 Stomatite vésiculaire HSF 2 - 7 Stomatite vésiculaire fileta > 200 Polio-l HSF > 200 Polio l Heta > 200 Coxsackie B-4 BeLa > 200 Co.csackie B-4 Vero > 200 Rougeole Vero 4 - 40 Sindbis BHK > 200 Abréviations PRK, rein primaire de lapin ; trSF, fibroblas tes de peau humaine;Vero, lignée de cellules continues de cellules de rein de callitriche; BHK, lignée de cellules continues de cellules de rein de jeune hamster L'activité potentielein vivo de la (S)-DHPA est déterminée chez les souris infectées par le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) selon la méthode décrite dans J. Gen.Virol., 5 359 (1969) et J. Clin. Invest., 49 , > 1565 (1970). Des souris femelles NMRI de 20 jours (poids moyen 15g) sont inoculées par voie intranasale avec le virus de la stomatite vésiculaire (2,5 1og10 ml DI50 / 0,01 ml/souris). A la suite de cela, il leur est injecté de façon répétée par voie intrapéritonéale la (S)-DHPA à une dose de 2 mg/souris (environ 133 mg/kg) à 1 heure et 1, 2, 3 et 4 jours après l'infection par le virus.Les morts sont enregistrées journellement et l'ensemble de la mortalité est déterminé. Les résultats pour 14 jours consécutifs sont représentés graphiquement dans la figure 2. Aucune mort ntest not au-delà du 14e jour après l'infection. I1 apparatt dans la figure 2 que les doses répétées de (S)-DHPA à 2 mg/souris provoquent une augmentation importante du nombre final des souris survivantes : 67 % pour les souris traitées par (S)-DHPA en comparaison à 37s5ÇS pour le groupe témoin. Si les nombres des survivants sont comparés au 9e Jour après l'infection, la différence entre le groupe d'essai et le groupe témoin est également importante. Les expériences de la figure 2 sont répétées avec di- férents niveaux de (S)-DfIPA. Les doses répétées de 0,08 mg/souris de (S)-DHPA (environ 5,4 mg/kg) ne confèrent pas de protection tandis que les doses répétées de 0,4mg/souris (environ 27 mg/kg) provoque une légère protection (nombre final de souris survivantes 55%, en comparaison à 37,5% pour le groupe témoin). Des expériences pour l'appréciation de la toxicité aiguë de la (S)-DHPA ont également été effectuées chez des souris mais la valeur DL50 (dose léthale pour 50% des souris) n'a pas pu être déterminée en raison du fait que toutes les souris survivaient (sans aucun signe de maladie) après qu'elles aient reçu des doses de (S)-DHPA allant jusqu'à 1000 mg/kg pour 3 à 5 jours. Des expériences précédentes il est évident que la (S)-DHPA est un agent thérapeutique utile pour les maladies à virus. En plus de (S)-DHPA, diverses substances apparentées ont été examinées dans des systèmes cellules-virus du tableau 1 dans lesquels la (S)-DHPA montrait une activité antivirale marquée: VSV/PRK, variole/PRK et herpès simplex-l (KOS)/PRK. Seulement l'énantiomère (S) de la DHPA se révèle active, L'énantiomère (R), la (R)-DHPA ne l'est pas. Le mélange racémique, la(RS)-DHPA est presque aussi efficace que l'énantiomère (S).Tandis que la (Q) DHPA et la (RS)-DHPA inhibent les effets cytopathiques du VSV, au virus de la variole et l'herpès simplex-l (KOS) à un taux d'environ 10 ug/ml, les congénères suivants de (S)-DHPA ne démontrent pas une activité antivirale à 100 ug/ml (le taux le plus élevé exminé) :: (S)-9-(2,3-dihydroxypropyl)hypoxanthine, RS-9-(2-hydroxypropyl)adénine, 9-(2-hydroxyéthyl)adénine, 9-(2-aminoéthyl)adénine, 9-(S-DL-alanyl)-adénine, S-9-(3,4-dihy- droxybutyl)adénine, RS-9-(3,4-dihydroxybutyl)-adénine, RS-thréo9-(2,3,4-trihydroxybutyl)adénine, RS-9-(3,5-dihydroxypentyl) adénine, S-l-(2,3-dihydroxypropyl)thymine, R-l-(2, 3-dihydroxy- propyl)-thymine, S-3-(2,3-dihydroxypropyl)thymine, S-1-(3,4dihydroxybutyl)uracile, RS-1-(3,5-dihydroxypentyl)uracile, S-1 (2, 3-dihydroxypropyl )uraci-ïc: 9-(3-hydroxypropyl )adénine et 2 (9-adéninyl)propane-1,5-diol. Dans la thérapie des maladies à virus, la (S)-DHPA peut être utilisée comme telle et également sous forme de son mélange racémique (forme RS). En outre, elle peut être utilisée en combinaison avec d'autres substances antivirales telles que ara-A. I1 existe en fait une évidence circonstancielle pour un synergiste dans les activités antivirales de (S)-DHPA et ara-A. La LS)-DHPA a été trouvée tre un inhibiteur fort de l'adénosine désaminase. L'adénos-ine désaminase est un enzyme qui est fréquent dans les cellules, tissus et liquides biologi ques. Ils provoquent la désamination de l'ara-A susmentionnée en son métabolite ara -Hx [9-(béta-D-arabinofuranosyl)hypoxan- thine 7 qui est moins actif comme agent antiviral que l'ara-A (voir Ann. N.Y. Acad.Sci., 284, 60, 1977). Contrairement à l'ara-A, la (S)-DIlPA ne sert pas de substrat pour l'adénosine désaminase des extraits de cellules bactérielles (Eseherie1a coli, Salmonella typhimurium) ou d'extraits de cellules de mammifères (cellules primaires dé rein de lapin ). Toutefois, la (S)-DHPA inhibe fortement la désamination de l'ara-A par l'adénosine désaminase, extraite de la muqueuse intestinale du veau. La pré- paration de ce dernier enzyme est un produit Calbiochem. La figure 3 est une représentation graphique montrant l'effet inhibiteur de la (S)-DHPA sur la désamination de l'ara-A par l'adénosine désaminase de la muqueuse intestinale du veau. La désamination de l'ara-A est mesurée selon la méthode de Kalckar (voir J. Biol. Chem., 167, 461, 1972), modifiée par Trams et Lauter (voir Biochem. J. > 152, 681, 1975). Le degré de désamination est équivalent à la diminution de l'absorption à t (longueur d'onde) = 265 nm. La diminution d'absorption à 265 nm est 0,11 si 50 nmoles de ara-A sont utilisées et 0,16 si100 nmoles de ara-A sont utilisées (figure 3A). En présence de (S)-DHPA, la désamination de l'ara-A (comme rapporté par la diminution d'absorption) est inhibée proportionnellement à la concentration en (S)-DHPA. La figure 4 représente un tracé réciproque des résultats présentés dans la figure 3. Les inhibiteurs d'adénosine désaminase sont connus pour potentialiser l'activité antivirale de l'ara-A, Un exemple typique de tels inhibiteurs d'adenosine désaminase est le (R) 3-(2-désoxy-béta-D-érythro-pentofuranosyl)-D,6,7,8-tétrahy- droimidazo-4,5-d)-(1,3)-diazépin-8-ol, indiqué CO-V ou CO-vidarabine (voir Ann. N.Y. Acad. Sci., 284, 9 et 284, 60, 1977). La (S)-DHPA potentialise remarquablement l'activité antivirale de l'ara-A. Le synergisme des activité antivirales de la (S)-DHPA et de l'ara-A est déterminé dans les cultures PRK (reins primaires de lapin) qui ont été inoculés avec levirus de la variole. Dans ces expériences, les monocouches confluentes de cellules PRK dans les disques de petri en plastique sont inoculées avec le virus de la variole (4,5 log10ml DI50.0,5ml/ disque de petri)pour 1 heure à 37 C et, immédiatement après, exposées soit à (S)-DHPA seul ou à ara-A seul ou à la combinaison de (S)-DHPA et ara-A. Les deux composés sont utilisés à diverses concentrations (1,3,10,30 ou 100 ug/ml). Les cultures de cellules sont ensuite mises a' incuber pendant des temps variables à 37 C. A la fin e la période d'incubation, les cellules sont congélées à -700C, et les homogénéisats de cellules sont examinés pour leur teneur en virus par la formation de plaques dans les cultures de cellules PRK. Selon le procédé de formation de plaques décrit ci-dessus pour le virus de la stomatite vésiculaire dans les cultures de fibroblastes de souris L-929. Les résultats d'une expérience représentative sont montrés dans le tableau 2. Tableau 2 Synergie dans les activités antivirales (S)-DHPA et ara-A dans les cultures de cellules primaires de rein de lapin (PRK) Tnfecies avec le virus de la variole Traitement Rendement en virus (1og10 VFPiml) Jours après infection 1 2 3 (1) Témoin (infecté, non traité) 3,6 5,0 5,3 (2) (S)-DHPA à 30 Zg/ml 3,6 4,9 5,4 (3) Ara-A à 3 Rg/ml 2,1 4,0 5,0 (4) Traitement combiné (2) et (3) 2,0 1,8 2,1 I1 apparat t du tableau 2 qutunecombinaison de (S)-DHPA (50 ssg/ml) et d'ara-A (3 ug/ml) réalise une plus grande réduction dans le titre en virus qu'il ne le serait soit avec (S)-DHPA ou ara-A lorsqu'ils sont utilisés individuellement. En conséquence la LS)-DHPA peut être considérée comme augmentant l'activité antivirale d'ara-A. Cette augmentation est plus probablement due à l'excès inhibiteur de la (S)-DHPA sur la désamination de 1 'ara-A par l'adénosine désaminase. Des compositions pharmaceutiques comprenant la (a)-DHPA ou son mélange racémique (R*DHPA, comme ingrédient actir peuvent prendre la forme de poudre, suspensiors, solution, émulsions ainsi que pommades et pâtes et elles peuvent être utilisées pour des injections parentérales (intraveineuse, intradermique, intramusculaire, intrathécale, ...) pour une administration orale, rectale, intravaginale ou intranasale ou pour une application topique (par exemple à des lésions de la peau, de muqueuses et des yeux). Ces compositions peuvent être préparées en combinant les ingrédients actifs avec des excipients pharmaceutiquement acceptables qui sont normalement utilisés dans ce but. Ces excipients peuvent comprendre des solvants aqueux ou non aqueux, des stabilisants, des agents de mise en suspension, des agents dispersants, des agents mouillants, et autres agents analogues qui sont bien connus de l'homme de l'art dans le domaine pharmaceutique. En outre, les compositions peuvent comprendre des additifs appropriés tels que polyéthylèneglycol et, si nécessaire, des colorants, des parfums et des composés analogues. La composition pharmaceutique contiendra au moins 0,1% en poids de l'ingradient actif. La concentration actuel dépendra de la maladie et de la voie choisie d'admisnitration. En général, c8;te concentration sera comprise entre 0,1% et 100 %. Un avantage particulier de (RS)-DHPA et de (S)-DHPA est leur stabilité remarquable qui permet la stérilisation thermique des solutions neutres et faiblement acides ou faible alca lins Dans la forme pure leur stabilité est pratiquement illimitée. Le coût de la production de (RS)-DHPA et de (S)-DHPA est notablement plus faible que le coût de la production des autres médicaments antiviraux tels que ara-A ou ribavirine. REVENDICATIONS 1. Composition thérapeutique pour l'application au traitement des maladies à virus caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité efficace de (S)-9-(2,3-dihydroxypropyl)adénine ou (ns)-9- (2,3-dihydroxypropyl)adénine comme ingrédient actif. 2. Composition thérapeutique pour l'application au traitement des maladies à virus caractérisée en ce qu'elle comprend la (S)-9-(2,3-dihydroxypropyl)adénine et la (ES )-9- (2, 3-dihydroxy- propyl)adénine en combinaison avec l'ara-A. 3, Procédé de préparation d'une composition pour le traitement des maladies à virus caractérisé en ce qu'il consiste à combiner à (S)-9-(2,3-dihydroxypropyl)adénine ou la (RS)-9-(2,3 dihydroxypropyl(.adénine) avec un excipient pharmaceutiquement acceptable. 4. Procédé de préparation d'une composition pour le traitement des maladies à virus, caractérisé en ce qu'il consiste à combiner la (s)- ou (RS)-9-(2,3-dihydroxypropyl)adénine avec l'ara-A et un excipient pharmaceutiquement acceptable. 5. Composition thérapeutique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 ou obtenues par le procédé selon ltune queléonque des revendication 3 ou 4, pour une administration à un patient souffrant d'une maladie provoquée par un virus appartenant au groupe comprenant les virus de la variole, de l'herpès simplex, de la rougeole et de la stomatite vésiculaire.