Brevet FR2412074A1 — publié le 19790713

La présente invention concerne un procédé de dosage de la vitamine B12 dans les liquides. Le procédé de l'invention s'applique en particulier mais non exclusivement au dosage de la vitamine B12 dans des liquides biologiques tels que le sérum humain. I1 est important en médecine de doser de façon précise la vitamine B12 dans le sérum humain. Par exemple, la teneur sérique normale en vitamine B12 peut être comprise entre environ 150 et 1 000 picogrammes par millilitre. Des teneurs inférieures a 150 pg/ml permettent de diagnostiquer une anémie par manque de vitamine B12. Dans le passé, on a utilise des déterminations microbiologiques avec Euglena gracilis. Récemment on a mis au point des radiodéterminations utilisant le facteur intrinsèque comme protéine fixante (voir par exemple Clin. Chim. Acta, 32 (1971), 339). Dans ces radiodéterminations, il est essentiel de traiter tout d'abord le sérum a analyser pour séparer la vitamine B12 de la protéine sérique qui la fixe, la transcobalamine.Pour cela, on dilue le sérum dans~un tampon de bas pH, puis on porte a ébullition pendant environ 15 minutes. Ce traitement dénature la transcobalamine sans altérer la vitamine B12. On effectue ensuite la radiodétermination sur le sérum bouilli. On a constaté que l'emploi de facteur intrinsèque comme protéine fixante dans ces radiodéterminations présente divers inconvénients et on a suggéré (British Journal of Haematology, 25 (1973) 359) que le sérum de poussin pourrait fournir une protéine fixante plus satisfaisante a cet effet. En particulier cet article indique qu'à un pH relativement élevé (de 9 a 12), la fixation entre le facteur intrinsèque et la vitamine B12 diminue considérablement, tandis que la fixation entre le sérum de poussin et la vitamine B12 demeure constante. Par conséquent, les auteurs recommandent d'effectuer la radiodétermination avec du sérum de poussin a un pH d'environ 9,2.De plus, cet article indique que la fixation entre la vitamine B12 et le sérum de poussin n'est pas modifiée par la présence de sérum humain dénaturé (tel qu'on en obtient dans le stade préliminaire indispensable de la radiodétermination qui consiste a porter le sérum a ébullition pour dénaturer la protéine endogène fixant la vitamine B12). Bien que l'on puisse améliorer la technique antérieure connue de radiodétermination de la vitamine B12 avec du facteur intrinsèque par emploi de sérum de poussin comme protéine fixante, cette technique utilisant le sérum de poussin présente cependant de nom breux inconvénients qui dérivent tous fondamentalement de la nécessité d'effectuer un stade de dilution et d'ébullition. Par exemple, les valeurs de la concentration en vitamine B12 sont normalement supérieures (lorsqu'on compte la fraction libre) à celles obtenues (avec les mêmes sérums) selon la technique microbiologique. Ceci est dû b une adsorption non spécifique de la vitamine B12 sur la protéine sérique dénaturée par ébullition. Le stade d'ébullition est en soi indésirable car il prend du temps et il se prête mal a l'analyse automatique continue.De plus, pour éviter une précipitation lors de l'ébullition, il est nécessaire de diluer le sérum au 1/5. La concentration du marqueur radio-actif utilisé est relativement élevée (elle est souvent supérieure à certains des standards de faible valeur), ce qui, avec la nécessite d'un stade de dilution, conduit a une sensibilité médiocre et à un manque de précision pour la partie inférieure -de l'échelle. Ce défaut est particulièrement important car c'est dans l'extrémité inférieure de l'échelle, c'est-à-dire au voisinage et en dessous de 150 pg/ml, que la précision maximale est nécessaire. La demanderesse a mis au point un procédé amélioré de dosage de la vitamine B12 dans les liquides et en particulier dans le sérum humain, qui réduit ou supprime certains des inconvénients des radiodéterminations précédemment décrites. En particulier, la demanderesse a découvert que si l'on effectue le dosage avec du sérum de poussin comme protéine fixante, b un pH d'environ 12,8 à 13,2, il n'est pas nécessaire d'effectuer une ébullition préliminaire de l'échantillon de sérum humain, ni de le diluer. La suppression de la dilution et de l'ébullition simplifie considérablement le mode opératoire, permet l'emploi de techniques en écoulement continu et améliore la précision du dosage. Selon un de ses aspects, l'invention concerne un-proct-dé pour le dosage de la vitamine B12 dans un liquide, qui consiste a former un mélange constitue d'un échantillon du liquide, de pro téines fixant la vitamine B12 du sérum de poussin et d'un tampon créant un pH de 12,8 a 13,2, pour que la vitamine B12 du mélange se fixe aux protéines fixantes, puis a déterminer la quantité de vitamine B12 présente dans l'échantillon par analyse d'un composant du mélange. Selon un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé de dosage par fixation compétitive de la vitamine B12 dans un liquide, qui consiste à : a) former un mélange constitué d'un échantillon du liquide, de protéines fixant la vitamine B12 du sérum de Poussin, de vitamine B12 marquée et d'un tampon créant un pH de 12,8 a 13,2 ; la quantité des protéines fixantes du sérum de poussin étant insuffisante pour fixer la totalité de la vitamine B12 et de la vitamine B12 marquée présentes ; b) séparer la fraction libre de la vitamine B12 et de la vitamine B12 marquée du mélange de la fraction fixée de la vitamine B12 et de la vitamine B12 marquée du mélange ; et c) analyser la fraction libre ou fixée de vitamine B12 de la vi tine B12 mBrquee pour det=sffinerla teneur en vitamine B12 marquée et connaître ainsi a partir des résultats d'étalonnage la quantité de vitamine B12 présente dans l'échantillon. Lorsqu'on applique le procédé de l'invention au dosage de la vitamine B12 dans le sérum humain, le tampon doit contenir une quantité d ions cyanure suffisante pour transformer la totalité de la vitamine B12 présente dans le sérum humain sous la forme cyano. Normalement, on utilise du cyanure de potassium, bien qu'on puisse utiliser d'autres sources d'ions cyanure (telles que par exemple le cyanure de sodium). La forme cyano de la vitamine B12 peut être dissociée de son liant sérique humain aux pH élevés utilisés dans le procédé de l'invention.Lorsque la concentration en cyanure de potassium dans le tampon utilisé pour le dosage s'accroit, la dissociation entre la vitamine B12 et son liant sérique humain s'accroit. A une concentration en cyanure de potassium d'en- viron 20 pg/ml, la dissociation est supérieure a 92%. Au-dessus de cette concentration on n'observe qu'un léger accroissement de la dissociation et la liaison entre la vitamine B12 et le sérum de poussin commence a être sérieusement gênée. On préfère donc, dans le procédé de l'invention, utiliser le cyanure de potassium (par exemple) dans le tampon a une concentration d'environ 20 Fg/ml. A un pH d'environ 12,9 et plus, -la vitamine B12 est totalement dissociée des protéines qui la fixent (transcobalamine) présentes dans le serum humain. Cependant, on a constaté qu'a ces pH, la vitamine B12 est toujours unie au sérum de poussin. Donc, lorsqu'on utilise le sérum de poussin comme protéine fixante a un pH d'environ 12,9 et plus, la transcobalamine sérique humaine ne provoque plus d'interférence et le sérum de poussin fixe toujours la vitamine B12, ce qui donne une grande précision a la détermination. Dans le procédé de l'invention, le pH est, de préférence, compris entre 12,9 et 13,1. On peut utiliser des pH plus bas ou plus élevés (par exemple de 12,8 ou de 13,2) mais on a constaté qu'à un pH d'environ 12,7, la vitamine B12 ntest pas totalement dissociée des protéines qui la fixent dans le sérum humain. A un pH supérieur a environ 13,1, le degré de fixation entre le sérum de poussin et la vitamine B12 diminue. Dans le procédé de l'invention, on utilise les protéines fixant la vitamine B12 présentes dans le sérum de poussin. On peut utiliser du sérum entier de poussin ou, si on le désire, on peut séparer du sérum de poussin les protéines fixant la vitamine B12 (qui semblent être des transcobalamines sériques de poussin) et les utiliser telles qu'elles. Lorsqu'on utilise du sérum entier de poussin, il est évident que la vitamine B12 qui y est naturellement présente n'est pas gênante car, comme il est évident pour l'homme de l'art, on utilise le sérum de poussin à des dilutions élevées de l'ordre de 10 000. Dans l'art antérieur, on a utilisé des radiodéterminations de la vitamine B12 par fixation compétitive. Dans le procédé par fixation compétitive de l'invention, on préfère utiliser un marqueur radio-actif (tel que 57Co ou 125I), mais on peut utiliser d'autres marqueurs (par exemple des marqueurs fluorescents ou enzymatiques). On peut effectuer la détermination sans utiliser de marqueur, mais on préfère généralement ne pas opérer ainsi car ces techniques nécessitent plus de travail et sont plus sujettes à l'erreur. Ciaprès, ltinvention est décrite relativement à l'emploi d'un marqueur radio-actif, le 57Co. Dans le procédé par fixation compétitive de l'invention, il est nécessaire dans le stade (b) de séparer la fraction libre de vitamine B12 (marquée et non marquée) de la fraction fixée de vitamine B12 (c'est- -dire la vitamine B12 marquée et non marquée qui s'est fixée aux protéines sériques de poussin). On connaît deux techniques préférables pour faciliter cette séparation. Dans la première, on met le mélange en contact avec une matière solide, de préférence en particules, qui peut adsorber sélectivernent ou fixer sélectivement la fraction libre de vitamine B12 ou la fraction fixée de vitamine B12 mais non les deux. La demanderesse a découvert que des particules de charbon revêtues d'albumine conviennent à cet effet, car elles adsorbent sélectivement la fraction libre.On peut utiliser d'autres particules, comme il est évident pour l'homme de l'art. On sépare ensuite la matière solide du me lange et on peut analyser cette matière solide pour déterminer sa teneur en vitamine B12 marquée ou analyser le mélange restant. Selon la seconde technique, on utilise dans le stade A une matière en particules sur laquelle on a immobilisé les protéines fixantes du sérum de poussin, la fraction de vitamine B12 fixée est ainsi immobilisée (elle est fixée aux protéines sériques de poussin). On peut ensuite séparer du mélange les particules solides qui portent la fraction fixée de vitamine B12 mais non la fraction libre. De préférence les particules sont constituées d' une matière attirable par un aimant, ce qui permet de les séparer facilement du mélange. On trouvera des détails relatifs a l'emploi de telles particules dans la demande de brevet France nO 77 07264 du 11-3-77 au nom de la présente demanderesse. On trouvera ci-après des exemples d'application générale de ces deux techniques relativement à un dosage de sérum humain. Selon la première technique, on mélange le sérum humain a analyser avec une solution de vitamine B12 marquée, par exemple de vitamine B12 marquée au 57Co, et d'un extrait de sérum de poussin (contenant les protéines fixant la vitamine B12) dans un tampon a un pH d'environ 13. On incube le mélange, puis on ajoute du charbon revêtu d'albumine. Le charbon revêtu adsorbe la vitamine B12 libre, mais non les complexes formes entre la vitamine B12 et les protéines fixantes du sérum de poussin. On sépare ensuite le charbon et on détermine le 57Co dans le liquide restant, ou mieux dans le charbon séparé.A partir des résultats obtenus par analyse de solutions ayant des concentrations connues en vitamine B12, on peut déterminer la quantité de vitamine B12 présente dans le sérum hu 1257 main analysé a partir de sa teneur en Co, en particulier avec des courbes d'étalonnage. Selon la seconde technique, on immobilise les protéines fixant la vitamine B12 du sérum de poussin sur des particules solides. Par exemple on peut les coupler a des particules de cellulose (ou revêtues de cellulose) activées avec du bromure de cyanogène. La technique d'immobilisation de composés réagissants sur de petites particules est connue dans l'art. On préfère utiliser des particules contenant une matière attirable par un aimant (telle que Fe304) par faciliter le stade ultérieurde séperation.On mélange les parti- oSesavec le sérum humain a analyser et de la vitamine B12 marquée, par exemple de la vitamine B12 marquée au 57Co, et on agite le mélange, -puis on l'incube. Ensuite, on sépare les particules et on détermine la teneur en 57Co du liquide restant ou des particules séparées. Bien que le procédé de l'invention convienne particulièrement bien à l'analyse du sérum humain, on peut également l'utiliser pour déterminer la teneur en vitamine B12 dans d'autres liquides. Par exemple, on peut l'utiliser pour déterminer les analogues chimiques de la vitamine B12 qui présentent une fixation avec le sérum de poussin. Donc, dans la présente description et les revendications, le terme vitamine B12 englobe les analogues chimiques de cette vitamine que l'on peut également doser selon le procédé de l'invention. Dans une application visant l'analyse du sérum humain, le tampon contient des ions cyanure en une quantité suffisante pour transformer la totalité de la vitamine B12 du sérum humain en la forme cyano. Le cas échéant, on effectue la détermination sans soumettre le sérum humain à une ébullition. L'invention englobe, pour la mise en pratique du procédé visé, un ensemble de réactifs contenant : une série de solutions de vitamine B12 ayant des concentrations connues, des protéines de sérum de poussin fixant la vitamine B12, un ou plusieurs sérums 57 standards et de la vitamine B12 marquée au Co, ces composants étant emballés séparément dans l'ensemble. On peut mettre en pratique le procédé de l'invention selon les techniques générales d'écoulement continu bien connues dans l'art. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants et les dessins annexés dans lesquels - la figure 1 représente une courbe d'étalonnage pour la détermination de l'exemple I - la figure 2 représente une courbe d'étalonnage pour la détermination de l'exemple 2 , - la figure 3 est une courbe de corrélation entre les résultats obtenus dans l'invention (exemple 2) et ceux obtenus par dosage microbiologique. EXEMPLE 1 (détermination en phase solide) On couple la protéine fixant la vitamine B12 du sérum de poussin a des particules de cellulose et de Fe304 (ayant une taille moyenne de 2 à 3 microns) par activation préalable classique de la cellulose par le bromure de cyanogène, puis on incube le sérum de poussin avec les particules activées pendant 72 heures a 40C environ. Le tampon que l'on utilise pour les déterminations et pour la dilution préalable des composants à la composition suivante KC1 = 50 mM, KCN = 0,002 %, NaN3 = 0,1 %, pH ajusté a 13,0 avec de l'hydroxyde de sodium 2N. On se procure dans le commerce la vitamine B12 marquée au 57Co et elle a une activité spécifique de 100 300 fici/fig. On ajoute les constituants suivants dans l'ordre indiqué: standard ou sérum 50 Co-B12 (4,4 pg) 150 fil phase solide-sérum de poussin. 100 pl. On utilise le réactif phase solide-sérum de poussin a la di -lution de 1 g-dans 640 ml, la détermination d'une courbe standard dose-réponseayant préalablement montré que cette dilution était optimale pour le dosage. On mélange les matières à incuber en continu par rotation par renversement pendant 3 heures a la température ordinaire. On sépare les particules par centrifugation, on lave les particules au tampon et on compte la phase solide (fraction fixée) pendant 5 minutes avec un compteur gamma. Avec des solutions standards de B12, on établit la courbe d' étalonnage illustrée par la figure 1. Avec cette courbe, on analyse dix sérums et on -observe, par rapport au dosage microbiologique avec E. gracilis, une corrélation correspondant a une ligne de régression y = 0,90 x + 31 et un coefficient de corrélation de 0,93. EXEMPLE 2 (détermination en phase liquide) On prépare un extrait de protéines fixant la vitamine B12 a partir du sérum de poussin de la façon suivante. On isole la fraction protéique précipitant avec du sulfate d'ammonium entre 35% et 80% de la saturation. On redissout cette fraction dans du bicarbonate d'ammonium 10 zM, on l'applique a une colonne de DE-52 cellulose et on élue avec un gradient de bicarbonate d'ammonium. On utilise des portion de cet extrait dans toutes les déterminations en phase liquide suivantes. Le tampon que l'on utilise pour la détermination et pour la dilution préalable des constituants a la composition suivante KC1 = 50 mM, KCN = 0,000 2%, NaN3 = 0,1%, pH ajusté a 13,0 avec de l'hydroxyde de sodium 2N. On ajoute les constituants suivants dans l'ordre indique standard ou sérum 50 p1 57Co-B12 (4,4 pg) 100 tampon 1 250 p1 extrait de sérum de poussin 100 1. On utilise l'extrait de sérum de poussin a la dilution de 1/12 800, l'établissement d'une courbe standard dose-réponse ayant montré que cette dilution était optimale pour le dosage. Après mélange des constituants, on laisse incuber à la température ordinaire pendant 2 heures. Pour séparer la fraction fixée de la fraction libre, on ajoute 0,3 ml d'une suspension de charbon préparée de la façon suivante charbon Norit-OL 5 g/100 ml d'eau distillée sérum-albumine bovine 0,5 g/100 ml d'eau distillée. On mélange les constituants, on centrifuge le charbon revêtu de sérum-albumine bovine pour éliminer l'excès de sérum-albumine bovine et les fines et on remet le charbon en suspension dans le volume d'origine (200 ml). On ajoute de l'azidede sodium à la concentration finale de 0,1%. Après addition du charbon, on mélange les tubes a essai et on centrifuge pendant 10 minutes a environ 3 000 tr/min. On aspire le surnageant et on compte le culot de charbon (fraction libre) pendant 5 minutes avec un compteur gamma. Avec des solutions standards de vitamine B12,-on établit la courbe d'étalonnage illustrée par la figure 2. Avec cette courbe, on analyse vingt sérums humains et on compare les résutlats a ceux obtenus selon la méthode microbiologique. On obtient un coefficient de corrélation de 0,97cet une ligne de régression y = 1,15x - 6,92 (figure 3). L'invention concerne également un ensemble de réactifs pour effectuer une radiodêtermination de la vitamine B12 selon le procédé de l'invention. Cet ensemble de réactifs peut, par exemple, être constitué d'une gamme de standards de vitamine B12, d'un extrait de sérum de poussin, de sérums de contrôle et de Co-B12. Ces composants peuvent être tous sous une forme lyophilisée. L'ensemble de réactifs peut également contenir une suspension de charbon revêtu. REVENDICATIONS 1. Procédé pour doser la vitamine B12 dans un liquide, caractérisé en ce qu'il consiste à : former un mélange constitué d'un échantillon du liquide, de protéines du sérum de poussin fixant la vitamine B12 et d'un tampon créant un pH compris dans la gamme de 12,8 a 13,2, pour que la vitamine B12 du mélange se fixe aux protéines fixantes, puis a déterminer la quantité de vitamine B12 présente dans l'échantillon par analyse d'un composant du mélange. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on incorpore au mélange du sérum entier de poussin pour apporter lesdites protéines fixantes. 3. Procédé de dosage de la vitamine B12 dans un liquide par fixation compétitive, caractérisé en ce qu'il consiste à a) former un mélange constitué d'un échantillon du liquide, de protéines fixant la vitamine B12 du sérum de poussin, de vitamine B12 marquée et d'un tampon créant un pH de 12,8 à 13,2, la quantité des protéines fixantes de sérum de poussin étant insuffisante pour fixer la totalité de la vitamine B12 et de la vitamine B12 marquée présentes b) séparer la fraction libre de vitamine B12 et de vitamine B12 marquée du mélange de la fraction fixée de vitamine B12 et de vitamine B12 marquée du mélange ; et c) analyser la fraction libre ou la fraction fixée de vitamine B12 et de vitamine B12 marquée pour déterminer sa teneur en vitamine B12 marquée, puis déterminer à partir de résultats standards la quantité de vitamine B12 présente dans l'échantillon. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que, dans le stade (b), on met le mélange en contact avec une matière solide qui adsorbe sélectivement ou fixe sélectivement la fraction libre ou la fraction fixée et, qu'après cette adsorption ou cette fixation, on sépare ladite matière du mélange. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la matière solide est constituée de particules de charbon revêtues d' albumine, qui adsorbent sélectivement la fraction libre. 6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que dans le stade (a) on utilise des protéines fixant la vitamine B12 du sérum de poussin qui sont des protéines immobilisées sur une matière en particules solides et en ce que, dans le stade (b), on sépare du mélange la matière en particules solides portant les pro téines et la fraction fixée. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les particules sur lesquelles les protéines fixantes sont immobilisées sont constituées d'une matière attirable par un aimant et en ce que, dans le stade (b), on sépare la matière en particules du mélange par l'emploi d'un aimant. 8. Procédé selon une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que, dans le stade (a), on incorpore du sérum entier de poussin au mélange pour apporter les protéines fixant la vitamine B12. 9. Procédé selon une quelconque des revendications 3 à 8, caractérisé en ce que le marqueur de la vitamine B12 marquée, est un atome radioactif. 10. Procédé selon une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le liquide à analyser est du sérum humain, et en ce que le tampon contient des ions cyanure en une quantité suffisante pour transformer la totalité de la vitamine B12 du sérum humain en la forme cyano 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'on effectue la détermination sans soumettre le sérum humain à une ébullition. 12. Procédé selon une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le tampon donne an mélange un pH de 12,9 a 13,1. 13. Procédé selon une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on le met en pratique selon des techniques automatiques en écoulement continu. 14. Ensemble de réactifs pour la mise en pratique du procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il contient : une série de solutions de vitamine B12 ayant des concentrations connues, des protéines de sérum de poussin fixant la vitamine B12, un ou plusieurs'sérums standards et de la vitamine B12 marquée au 57Co, ces composants étant emballés séparément dans l'ensemble.