Brevet FR2397426A1 — publié le 19790209

La présente invention concerne des dérivés de stérordes contenant un groupe imidazole, les dérivés étant marqués de façon radioactive. Ces dérivés de stérordes marqués de façon radioactive sont utiles dans des méthodes de radio-détermination d'immunité pour la détermination de stéroïdes analogues non marqués et non dérivés. L'utilisation de traceurs 125I dans des déterminations d'immunité de stéroïdes présente certains avantages en comparaison avec les traceurs au tritium. En plus de l'avantage évi- dent de la plus grande activité spécifique du radio-iode par rapport au tritium, ces traceurs 125I donnent également un système de comptage plus simple et moins cotteux (comptage gamma en opposition à un comptage à scintillation liquide). Pour produire des traceurs 125I utiles pour des techniques de radiodétermination d'immunité (RIA) de stéroïdes, deux tentatives principales ont été utilisées. Dans une tentative, on utilise les dérivés de stéroYdes de tyrosyl méthyl ester (TME) qui peuvent ventre facilement iodés On peut se référer à U. Barbieri, A.Massaglia, M. Zannino, et U. Rosa, J. of Chromat., 69:151 (1972) et A.R. Nidgley1 G. D. Niswender, V. L. Gay, et L.E. Reichert, Recent Proqr. Hormone, 27:325 (1971). Une seconde méthode consiste à ioder des constituants de protéines de stéroïdes qui ont été utilisés pour élever les anti-sérums et à utiliser ces ensembles stéroïdes-protéines comme traceurs. On peut se référer à A. R. Midgley et al., ci-dessus, et S. L. Jeffcoate, E. D. Gilby, et R. Edwards, Clinica Chemica Acta, 42:343 International J. of Applied Radiation and Isotopes, 24:455 (1973), qui a rapporté la synthèse, la purification et l'ioduration des dérivés de cortisol-21-hémisuccinyl-TME et de cortisol-3-(O-carboxyméthyl) oxime-TME. La même année, R. Mavano, C. Dotti, et P. Grosso, Clinica Chemica Acta, 47:167 (1973), ont rapporte l'emploi de cortisol-21-hémisuccinyl-TME marqué 125I comme traceur dans la détermination de liaison de protéine compétitive en utilisant la transcortine comme liant. Comme l'ioduration d'un dérivé estradiol-TME provoque la substitution en iode du noyau A et en conséquence une perte de l'immunoréactivité du traceur (P. W. Nars et W, M. Hunter, J. Endocr., 57:XLYII (1973) et E. D. Gilby, S. L. Jeffcoate, et R. Edwards, J. Endocr., 58:XX (1973), l'histamine a d'abord été iodée et subséquemment couplée à un haptène d'estradiol6-(O-carboxyméthyl)oxime en utilisant une synthèse d'anhydrides mélangés. On peut se référer à B. F. Erlinger, F. Bores, F. M. Beiser, et S. Lieberman, J. Biol. Chem., 228:713 (1957), On a également utilisé la même synthèse pour préparer l'estradiol6-(O-carboxyméthyl)oxime-125I-tyramine (P. Linberg et L. E. Edquist, Clinica Chemica Acta, 53:169 (1974) et la progesterone 125 3-(O-carboxyméthyl)oxime- I-histamine (J. J. Scarisbrick et E. H. D. Cameron, J. of Steroid Biochem., 6:51 (1975)) comme traceurs à utiliser dans une RIA. On a trouvé que, contrairement aux dérivés de tyrosine qui donnent un traceur possédant une plus faible affinité pour les anti-sérums que le stérdide non marqué, et donnant également un comptage non spécifique élevé du mouvement propre dans des fioles en polystyrène et en polypropylène, en particulier en presence de constituants naturels du sérum, les dérivés d'histamine des stéroïdes allègent ces problèmes et par conséquent donnent des haptènes marqués bien supérieurs pour une utilisation dans une RIA. Selon l'invention, des réactifs de radio-détermination d'immunité ayant la formule I qui suit Formule I où l'astérisque (*) indique un-marquage radioactif, où X est tout pont ou liaison approprié, et où Y est un stéroTde, sont d'excellents réactifs de radio-détermination d'immunité parce qu'ils se lient spécifiquement aux anticorps souhaités sans se lier non spécifiquement à d'autres substances (par exemple les protéines dans le plasma ou le sérum d'un patient et les surfaces des récipients de réaction). Les réactifs de radio-détermination d'immunité selon la présente invention ont la formule I, ci-dessus, où 1'astérisque indique un marquage radioactif, où X est tout pont ou liaison approprié et où Y est an stéroYde. Des marqueurs radioactifs que l'on peut citer comme exemple comprennent I125 et I131. De préférence, les réactifs selon la présente invention sont marqués de façon radioactive par 2 I. Des ponts ou liaisons que l'on peut citer comme pouvant être utilisés dans les réactifs de radio-détermination d'immunité selon l'invention comprennent la (O-carboxyméthyl)hydroxylamine (B. F. Erlanger, F. Dorek, S. M. Beiser, et S. Lieberman, J., Biol. Chem., 228:713 (1957)), l'anhydride succi- nique (G. E. Abraham, P. K. Grover, W. D. Odell, et W. Daughaday, Principles of Competitive Protein Binding Assays, Je P. Lippincott, Philadelphie, Penna., page 140, (1971)), et des ponts thio-éther (A. Weinstein, H. R. Lindner, A. Friedlander, et S. Bauminger, Steroids, 20(6):789 (1972)). Si l'on souhaite connecter l'histamine par un pont à la position trois du noyau stéroTde, à laquelle est attaché un groupe céto, le pont préféré est une (O-carboxyméthyl) oxime, Y peut être tout stéroïde. Les stérotdes préférés selon la présente invention sont le cortisol et l'aldostérone. Les-dérivés de stéroïde faits avec l'histamine ne se lient pas de façon non spécifique à d'autres substances (par exemple les protéines dans un plasma ou un sérum d'un patient et les surfaces des récipients de réaction), tandis qu'ils se lient spécifiquement aux anticorps souhaités. On note dans une demande de brevet en cours aux Etats Unis d'Amérique NC 540.809 que "on pense que la réduction de la liaison non spécifique avec un dérivé d'acide imidazoleacétique, en comparaison du dérivé de digoxine correspondant de l'acide p-hydroxyphenylpropionique, est due à la nature polaire du groupe imidazole par rapport aux caractéristiques non polaires du groupe phényle". Par conséquent, étant donnée cette théorie, il est clair que les caractéristiques du stéroïde lié au fragment contenant le groupe imidazole (c'est-à-dire acide imidazoleacétique, histamine, et autres), par tout pont approprié sont immatérielles parce que la faible interférence avec l'albumine, de ces dérivés de stéroïdes contenant un groupe imidazole, n'est due qu'à la présence du groupe imidazole. Les réactifs de radio-détermination d'immunité selon la présente nvention peuvent etre préparés par des techniques bien connues de ceux qui sont compétents en la matière. On peut se référer à G. E. Abraham, Acta Endocrinoloaica, Suppl. 183, pages 11 à 14, (1974), cette publication étant incorporée ici en totalité à titre de référence. Le processus de radio-détermination d'immunité selon la présente invention consiste à utiliser tout processus connu de ceux qui sont compétents en la matière, en employant les nouveaux dérivés de stérordes contenant un groupe imidazole marqués de façon radioactive selon la présente invention. On peut trouver une description générale des processus de radiodétermination d'immunité dans C. S. Skelley, L. P. Brown et p. K. Besch, "Radioimmunoassay", Clinical Chemistrv, Volume 19, N 2, 146-186 (1973), cette publication étant incorporée ici à titre de référence. Les exemples qui suivent sont donnés pour mieux illustrer la présente invention, sans en aucun cas la limiter. Exemple 1 Préparation de cortisol-3-oxime : On a dissous 41,54 mg de cortisol, 21,17 mg de carboxy méthoxylamine et 41,43 mg d'acétate de sodium, dans 10,0 ml de méthanol sec et on laissa la réaction se passer pendant une nuit sous agitation à la température ambiante. Deux plaques en couche mince H. F. de préparation de 20 x 20 cm (2 mm, E. Merk, Darmstadt, Allemagne) furent enduites de 420 ml du mélange réactionnel et développées dans une solution de benzène/méthanol (60:40).Le système solvant sépara la cortisol-3-oxime = O, 0,32)du cortisol n'ayant pas réagi ( = 0,78) et d'une faible quantité de cortisol-3,2O-dioxime. La partie contenant la cortisol-3-oxime ftt grattée de la plaque et extraite trois fois avec 10 ml de méthanol. Les extraits combinés furent amenés à siccité sur un évaporateur instantané et re-dissous dans 2 ml de méthanol, Après avoir enlevé toute matière particulaire restante par centrifugation, 30 l de la solution claire furent répartis sur une plaque HF-TLC (chromatographie en couche mince) analytique de 5 x 10 cm (0,25 mm), et développés dans le même système solide.Une seule bande apparut donnant un essai positif avec le réactif bleu de tétrazolium (J. K. McKenzie et J. A. Clements, J. Clin. Endocrinol. Metab., 38:622 (1974)). Ce résultat indique la présence d'un groupe céto C-20, On détermina enfin, par spectroscopie aux ultraviolets, un rendement de 27,8 mg (67%) de cortisol-3-oxime. Exemple 2 Préparation de cortisol-3-oxime-bistamine Une solution de méthanol (1,3 ml) contenant 6,37 mg/ml de cortisol-3-oxime fbt amenée à siccité sous azote dans un récipient de réaction de 2 ml ayant un bouchon vissé. Après addition de 300 pi de dioxane sec, le récipient ftt refroidi dans un bain de glace à 100C pendant 10 à 15 minutes. On ajouta de la tributylamine (10 pi) à 50 pi de dioxane sec et, après mélange, on ajouta 30 pi de la solution résultante à la solution cortisol-3-oxime sous agitation. Après avoir refroidi ce mélange réactionnel à 100 C, on ajouta 30 pi d'une solution contenant 10 l de chloroformiate dtisobutyle dans 100 pi de dioxane sec.Après addition du chlorofonmiate daisobutyle, le mélange réactionnel fflt agité pendant 20 à 25 minutes à 100 C. Pendant la période reactionnelle ci-dessus, 11 mg d'histamine furent dissous dans un mélange de 200 pi de dioxane, 200 pi d'eau et 20 pl d'une solution de soude 0,5 N. Cette solution d'histamine fut également refroidie à 100C, et après la période réactionnelle ci-dessus de 20 à 25 minutes, on l'ajouta à la solution de cortisol-3-oxime dans des anhydrides mélangés contenant le formiate d'isobutyle. On laissa cette étape se produire pendant trois heures à 10 C puis la température Àt graduellement amenée à la température ambiante en laissant le récipient de réaction dans un bain de glace pendant une nuit. Le jour suivant, le mélange réactionnel fut réparti sur deux plaques H. F. -TLC analytiques de 20 x 20 cm (0,25 ml), et les plaques furent développées dans une solution chlorofonmeZ méthanol/eau (18:4:2). Ce système sépara l'histamine n'ayant pas réagi (RF = 0,33) et la cortisol-3-oxime (RF = 0,075) du dérivé de cortisol-3-oxime-histamine (RF = 0,17). L'histamine et le composé d'histamine-cortisol purent tous deux être visualisés par une réaction avec un réactif de Pauley (voir C. W. Easley, Biochem. Biophys. Acta, 107:386 (1965)), tandis que le cortisol et le composé d'histamine-cortisol n'ayant pas réagi furent tous deux identifiés par réaction avec le réactif bleu de tétrazolium.Une spectroscopie aux ultraviolets du dérivé purifié de cortisol-3-oxime-histamine dans le méthanol donna un rendement de 0,65 mg (7,8%). Exemple 3 Processus d'ioduration : Un dérivé de cortisol-3-oxime-histamine (20 pl ; 0,1 g/ l) dans du méthanol sec, 50 pl d'eau, 20 pi d'un tampon de 0,5 M de phosphate de sodium ayant un pH de 7,4, 10 pi de Na125I (2 millicuries) et 20 pi de chloramine-T (5 mg/ml dans un tampon de 0,5M de phosphate ayant un pH de 7,4) furent mélangés et on les laissa réagir pendant 2 minutes à la température ambiante. La réaction fut terminée par addition de 20 l de métabisulfite de sodium (5 mg/ml dans un tampon de 0,5M de phosphate ayant un pH de 7,4). Le mélange réactionnel fut réparti sur une plaque HF-TLC analytique de 5 x 20 cm, et développé dans une solution chloroform:méthanol:eau (18:4:2). La bande contenant le dérivé de cortisol-3-oxime-histamine marqué mono-125I ftt localisée par radio-autographie (RF = 0,53) Le matériau fflt extrait dans du méthanol sec (4 ml) et dilué dans 76 mi d'une solution à 0,1% d'acide acétigue dans liteau. Une induration moyenne produisit environ 800 microcuries d'haptène marqué (rendement de 40%). On peut préparer les dérivés iodés d'aldostérone-3-oxime histamine par un processus analogue à celui indiqué dans les exemples 1 à 3. Exemple 4 Protocole de détermination au cortisol : 1. Marquer vingt tubes en double comme suit : T. C., blanc, Bo, A à F, et CS (sérum témoin). Marquer deux tubes, en double pour chaque échantillon de sérum d'un patient. 2. Ajouter 200 pi d'eau stérile distillée aux tubes blancs. 3. Ajouter 20 pl de tampon aux tubes B 4. Ajouter 20 pi de standards A à F aux tubes appropriés. 5. Ajouter 20 pi de sérum témoin aux tubes CS. 6. Ajouter 20 pi de chaque sérum de patient aux tubes appro priés. 7. Ajouter dans tous les tubes 400 pl du mélange anticorps 1251-cortisol précipitant. Immédiatement avant utilisation, mélanger en tourbillonnant le mélange pendant 5 à 10 se condes. Boucher les tubes T.C. et mettre de côté. 8. Ajouter 200 pl d'anti-sérum de cortisol dilué à tous les tubes a' l'exception du tube T.C. et du tube blanc. Boucher tous les tubes et mélanger en tourbillonnant doucement. 9. Incuber pendant 2 heures à 370C (à l'exception des tubes T.C.). 10. Ajouter 1 ml de solution saline froide (20C à 89C) à cha que tube (à l'exception des tubes T. C.) et boucher les tubes. 11. Centrifuger immédiatement tous les tubes (à l'exception des tubes T.C.) pendant 15 minutes à un minimum de 1500 g. 12. Décanter avec soin chaque tube (à l'exception des tubes T. C.) et jeter le liguide surnageant. Après décantation, sécher doucement le liquide surnageant restant se trou vant autour du sommet du tube, contre un papier absorbant renforcé de plastique. Boucher tous les tubes. 13. Compter tous les tubes, y compris les tubes T. C., pendant un temps assez long pour donner des statistiques raison nables pour chaque tube (en effet, 10.000 comptes donnent 26 erreurs de comptage de 2%). . Cela doit durer entre une et dix minutes. Ce protocole est représenté sous forme de tableau au Tableau I. Tableau I Eau Standard Mélange 125I-cortisol Anti-cortisol distillés Tampon ou anticorps précipitant dilué échantillon Echantillon ( l) ( l) ( l) ( l) ( l) T.C. 0 0 0 400 0 Blanc 200 0 0 400 0 Bo 0 20 0 400 200 A (1 g/dl) 0 0 20-A 400 200 B (2 g/dl) 0 0 20-B 400 200 C (5 g/dl) 0 0 20-C 400 200 D (10 g/dl) 0 0 20-D 400 200 E (20 g/dl) 0 0 20-E 400 200 F (50 g/dl) 0 0 20-F 400 200 Sérum témoin 0 0 20-CS 400 200 Echantillon patient N 1 0 0 20-échantillon 400 200 Echantillon patient N 2 0 0 20-échantillon 400 200 etc. On peut utiliser un protocole analogue dans un processus RIA pour l'aldostérone. Il y a plusieurs méthodes utilisées pour présenter les courbes standard et obtenir la concentration des constituants du sérum.-Les méthodes utilisées comprennent : B/T ou B/Bo en fonction de la concentration ou concentration logarithmique. T/B en fonction de la concentration, ou B/Bo logarithmique en fonction de la concentration logarithmique. La méthode du graphique de B/T en fonction de la concentration logarithmique est la suivante 1. Utiliser la formule qui suit pour calculer la quantité de cortisol marqué lié à l'anti-cortisol en l'absence de tout cortisol non marqué. Bo comptes - blanc % B = X 100 T.C. comptes - blanc B doit être entre 40 et 60%. 2. Déterminer la quantité de cortisol marqué lié à l'anti cortisol dans les fioles standards et d'échantillon de patients comme suit : B comptes pour standard ou échantillon patient -blanc % B = x 100 T.C. comptes - blanc 3. Représenter les valeurs de B%, des standards par rapport au cortisol, ,ig/dI sur un papier pour graphique semi logarithmique à deux cycles, avec le cortisol, g/dl sur 1'échelle logarithmique. 4. Déterminer les concentrations en cortisol dans lséchan- tillon du patient et le sérum témoin à partir de la cour be standard. Les données obtenues en suivant le processus de l'exemple 4 sont indiquées au Tableau Il. Ces données peuvent être représentées graphiquement comme on l'a dis cuté ci-dessus, pour permettre ainsi de produire une courbe standard. Tableau II Standards ou sérums Concentration Concentration extrapolée témoins %B ( g/dl) de la courbe standard, g/dl Bo 52,0 0 Bo 54,8 0 A 48,1 1,0 A 49,3 1,0 B 44,5 2,0 B 44,3 2,0 C 36,2 5,0 C 36,1 5,0 D 24,8 10,0 D 26,2 10,0 E 17,9 20,0 E 18,1 20,0 F 9,5 50,0 F 9,3 50,0 Beckman CS 17,0 23,4 # 0,1 Beckman CS 17,0 23,5 # 0,1 Ortho I 23,0 13,2 # 0,7 Ortho I 24,4 11,9 # 0,7 Le tableau II indique également les résultats de RIA obtenus en utilisant des sérums témoins de Beckman et Ortho I. Comme dans le cas de la digoxine, les dérivés de stéroTdes iodés de la formule I, c'est-à-dire les dérivés iodés de cortisol et d'aldostérone, contenant un groupe imidazole, allègent divers problèmes associés aux dérivés de stéroTdes selon l'art antérieur, par exemple la plus faible affinité pour les antisérums que le stérotde non marqué, le fort comptage de mouvement propre non spécifique dans les récipients de réaction, et autres. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée au mode de réalisation décrit qui n'a été donné qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre des revendications qui suivent. REVERNDICATIONS 1. Réactif de radio-détermination d'immunité, caractérisé en ce qu'il a la formule choisie dans un groupe consistant en où Z est un marqueur radioactif. 2. Réactif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il a pour formule 3. Réactif selon la revendication I, caractérisé en ce qu'il a pour formule 4. Réactif selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que Z est 125I, 5. Procédé de radio-détermination d'immunité pour déterminer un stéroYde choisi dans un groupe consistant en cortisol et aldostérone, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser un réactif de radio-détermination d'immunité selon la revendication 1. 6. Procédé de radio-détermination d'immunité selon la revendication 5 pour la détermination du cortisol, caractérisé en ce que le réactif a la formule 7. Procédé selon la revendication 5, pour déterminer l'aldostérone, caractérisé en ce que le réactif à la formule 8. Procédé selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que Z est 125I.