Brevet FR2394085A1 — publié le 19790105

I1 existe un besoin sans cesse croissant ce doser de très petites quantités de matières organiques présentes à des concentrations de 10 4 à 1G-12 M ou moins. Dans la mise au point de méthodes de dosage de quantités extrêmement faibles de matières organiques présentant un intérêt, les problèmes qui surgissent comprennent l'interférence endogène de la part de matières présentes dans les échantillons et l'interférence introduite dans le système réactionnel par les réactifs, ce qui constitue dans les deux cas un arrière plan indésirable. On peut fréquemment remédier à l'interférence endogène de la part de l'échantillon par traitement préalable de ce dernier. L'interférence introduite avec les réactifs ré- sulte de la difficulté d'obtenir des substances pures avec lesquelles on puisse opérer. Par exemple, dans les titrages par liaison compétitive de protéines, on utilise normalement des anticorps. Les anticorps sont obtenus comme antisérums renfermant une proportion importante d'anticorps qui sont spécifiques de substances autres que la substance à titrer. En conséquence, lors de la conjugaison des antisérums avec un indicateur, non seulement l'antisérum intéressant est marqué, mais les autres le sont tout autant. Ainsi, une portion importante de l'indicateur qui est introduit comme réactif est impliqué avec des anti sérums qui sont sans rapport avec le dosage. Lorsqu'il s'agit du marquage d'un antig.ne, de nombreuses substances intéressantes ne sont disponibles qu en quantités extrêmement faibles et ordinairement, ces substances sont contaminées par d'autres substances ayant des propriétés similaires. Ainsi, lors du marquage d'antigènes, une proportion notable de l'indicateur est souvent liée à une matière qui n'est pas impliquée dans le dosage. Cet indicateur crée alors un arrière plan indésirable, qui peut affecter notablement la sensibilité du titrage. I1 est par conséquent désirable de trouver des méthodes de dosage qui permettent de minimiser l'interférence de la part du signal introduit en arrière plan comme conséquence de la préparation des réactifs. I1 est en outre désirable de trouver des méthodes de titrage qui sont spécifiques et très sensibles et qui se prêtent à des protocoles simples et rapides pour minimiser l'erreur humaine. Le brevet des ntats-Unis c'Amérique NO 3 998 c43 décrit une épreuve d'immunofluorescence à double récepteur. Le brevet des Ctats-Unis d'Amérique " 3 9035 345 décrit une méthode utilisant des anticorps et des paires formées d'un corps fluorescent et d'une substance extinctrice, où les chromophores sont attachés au coordinat ou à l'anticoordinat. On prépare des réactifs dans lesquels un fluorescent est en conjugaison avec un coordinat et un extincteur est en conjugaison avec un antifluorescent. Dans une analyse du coordinat, un anticoordinat est inclus dans le milieu à analyser et le coordinat entre en compétition avec le conjugué coordinat-fluorescent pour fixer 1 'anticoordinat. L'anticoordinat fixé au conjugué coordinat-fluorescent inhibe la fixation de l'antifluorescent au fluorescent. Dans une analyse de l'anticoordinat, tout anticoordinat s'attache au conjugué coordinatfluorescent en inhibant la fixation de l'antifluorescent.La fluorescence subit une extinction du fait de la présence du conjugué extincteur-antifluorescent lié au fluorescent, en sorte que le degré de fluorescence est en relation avec la quantité de coordinat ou d'anticoordinat que l'on cherche à connaitre dans le milieu analysé. Tout fluorescent présent sur des matières autres que le coordinat est efficacement "effacé" par liaison au conjugué extincteur-antifluorescent. La présente invention concerne une méthode nouvelle et sensible de détection d'une grande variété de composés ou de compositions organiques, pour lesquels un récepteur est disponible ou peut être préparé, ou ce récepteur lui-même. Des molécules de fluorescents qui sont conjuguées à des matières non impliquées dans le dosage subissent une extinction efficace, de manière qu'il nty ait pas de participation sensible à la fluorescence totale observée.De plus, les molécules de fluorescents impliquées dans le dosage sous la forme de conjugués coordinat-fluorescent subissent de même une extinction efficace lorsqu'elles sont attachées aux conjugués anti-fluorescentextincteur, de manière à minimiser la valeur de base de la fluorescence, lorsque toutes les molécules de fluorescent qui sont contenues dans le milieu à doser sont attachees au conjugué extincteur-antifluorescent On àonne ci-après la définition de certains termes et de certaines expressions utilisés dans le présent mémoire Un "analyte" est le composé ou la compositicn d analyser, qui peut être un composé mono-épitopique, polyépitopique, antigénique ou hapténique, un composé unique ou un ensemble de composés qui partagent au moins un site épi topique commun, ou un récepteur. Un "coordinat" consiste en tout composé organique pour lequel un récepteur existe naturellement ou peut être préparé. Un "analogue de coordinat" est un coordinat modifié qui peut entrer en compétition avec le coordinat analogue pour s'unir au récepteur, la modification ayant pour but de permettre l'union de l'analogue de coordinat à un fluorescent ou à une autre molécule. Un "chromephore" est une molécule de fluorescent ou d'extincteur ; conformément à l'invention, le fluorescent et l'extincteur sont en liaison étroite. La molécule de fluorescent est un chromophore qui est capable d'absorber de la lumière d'une longueur d'onde et d'émettre de la lumière d'une plus grande longueur d'onde. La molécule d'extincteur est capable.d'inhiber la fluorescence lorsqu'elle se trouve à une faible distance, habituellement moins d'environ 10 A, de la molécule de fluorescent, en captant ltéergie qui serait autrement émise sous forme de lumière fluorescente. L'expression "analogue de coordinat-fluorescent" désigne la liaison de covalence d'un analogue de coordinat avec une ou plusieurs molécules fluorescentes. Gans le cas de petits coordinats, c'est-à-dire ceux dont le poids moléculaire est inférieur à environ 10 GGG, et habituellement inférieur è environ 2000 l'analogue de coordinat est habituellement lié a moins de 10 fluorescents, habituellement = à 10 fluorescents, notamment 1 fluorescent et en général pas plus d'environ 1 fluorescent par 1000 unités de poids moléculaire. Dans le cas d'un grand coordinat, de poids moléculaire au moins égal d 2000 et habituellement au moins égal à environ 10 000, plusieurs fluorescents sont en liaison de covalence avec l'analogue de coordinat ou le coordinat. Le nombre de fluorescents présents est limité par le nombre de fluorescents qui peuvent être in troduits sans trop masquer de nombreux sites épi topiques du coordinat et sans qu'il soit nécessaire d'inhiber la liaison entre l'antifluorescent et le fluorescent lorsque l'anticoordinat est attaché au coordinat. L'expression "poly(analogue de coordinat)-poly- fluorescent" désigne la liaison d'un analogue de coordinat et d'un fluorescent à une molécule-noyau ou molécule centrale polyfonctionnalisée hydrosoluble de haut poids moléculaire (comparativement à l'analogue de coordinat et au fluorescent) pour former plusieurs groupes d'analogue de coordinat et plusieurs groupes de fluorescent répartis à la surface de la molécule, -en sorte que lorsque l'anticoordinat est attaché à l'analogue de coordinat, la liaison de l'antifluorescent au fluorescent est inhibée. Des poly(amino-acides) ou des polysaccharides peuvent avantageusement constituer le noyau central. Un "récepteur" consiste en tout composé ou en toute composition capable de reconnaître une organisation spatiale et polaire particulière d'une molécule, c'est-à-dire un site épitopique et de nature souvent polyvalente, c'est-à-dire présentant au moins deux sites de liaison. Des exemples de récepteurs comprennent des récepteurs naturels, des anticorps, des fragments t'Fab", des enzymes, etc Pour tout coordinat spécifique, le récepteur est considéré comme un anticoordinat par exemple, un anticorps relatif à un fluorescent est appelé antifluorescent. Le récepteur et son coordinat réciproque forment une paire immunologique. Récepteur-extincteur - normalement, il y a en moyenne au moins un extincteur par molécule de récepteur ; ha- bituellement, il y a plus d'une molécule d'extincteur; il n'y a pas plus d'environ une molécule d'extincteur par 1000 unités de poids moléculaire, plus ordinairement, pas plus d'une molécule d'extincteur par 2000 unités de poids moléculaire et, de préférence, pas plus d'environ une molécule d'extincteur par 5000 unités de poids moléculaire.Avec des anticorps, il y a en moyenne environ 2 à 25, ordinairement, environ 2 à 20 molécules d'extincteur par molécule d'anticorps, de préférence 4 à 16, tandis qu'avec des fragments "Fab", il y a en moyennelgéné- ralement, environ 1 à 12, et plus souvent environ 2 à 8 molécules d'extincteur par fragment "Fab". Dans l'exécution de l'analyse, les matières par ticulières utilisées dépendent de ce que l'analyte est coor- dinat ou un récepteur. Lorsque l'analyte est un cooràinat, il y a dans le milieu à analyser l'échantillon inconnu, un anticoordinat, le conjugué analogue de coordinat-fluorescent , ou poly(analogue de coordinat)-polyfluorescent~/ et le conju@ué antifluorescent-extincteur. Dans une analyse d'anticoordinat, le milieu analysé renferme le conjugué analogue de coordi@at- fluorescent et antifluorescent-extincteur. On peut utiliser divers protocoles, l'ordre de l'addi- tion et l'association des réactifs étant régis par l.s vitesses auxquelles le récepteur s'attache au coordinat et auxauell-s le complexe coordinat-récepteur est rompu. Par exemple, dans le cas d'anticorps, la vitesse à laquelle le complexe est rompu est relativement faible. Au contraire, avec des fragments "Fab", la vitesse est relativement grande.Par conséquent, selon les contraintes de temps, on ne doit normalement pas associer un conjugué analogue de coordinat-fluorescent et un anticoordinat lorsque le coordinat est un anticorps, avant l'introduction dans le milieu à analyser, bien qu'on puisse associer le conjugué analogue de coordinat-fluorescent et 1 'anticoordi- nat avant l'introduction dans le milieu à analyser dans lequel l'anticoordinat est un fragment "Fab". Lorsque 1 'anticoordinat est un anticorps, dans une méthode d'analyse d'un coordinat, un anticorps peut avantageusement s'associer avec la substance inconnue, 1 'anticoordinat et l'antifluorescent, avec addition subséquente de la liaison analogue de coordinat-fluorescent ; ou bien un anticorps peut s'associer avec la substance inconnue, la liaison analogue de coordinat-fluorescent et 1 'anticoordinat, avec l'addition subit quente d'antifluorescent ; ou encore, un anticorps pourrait s'associer à peu près en même temps avec tous les réactifs. Lorsqu'un fragment "Fab" constitue l'anticoordinat et/ou 1 'antifluorescent, un fragment pourrait avantageusement s'associer avec la liaison analogue de coordinat-fluorescent, l'anticoordinat et l'antifluorescent en un réactif unique qui est ajouté à l'échantillon inconnu. Après chacue addition de réactif, on peut avoir une période d'incubation. Généralement, les périodes d'incubation peuvent varier d'environ C,5 minute à 16 heures ou plus, mais elles se situent ordinairement entre environ 0,5.minute et 6 heures et, de préférence, entre environ 0,5 rninute et 1 heure. La température d'incubation peut varier largement, cette température étant généralement comprise entre environ 0 et 45 C, et notamment entre environ 15 et 4000. La valeur de fluorescence peut être déterminée comme une vitesse ou comme une valeur à l'équilibre. Lorsqu'il s'agit d'une vitesse, on peut déterminer la vitesse de variation de la fluorescence pendant une période prédéterminée, comptée à partir de l'introduction du réactif final.Lorsqu'il s'agit d'une valeur à l'équilibre, on peut attendre le moment où il n'y a plus de variation appréciable du degré de fluorescence et lire une valeur unique. Dans la recherche d'un anticoordinat, le protocole est sensiblement le même que pour un coordinat, à la différence que l'anticoordinat n'est pas ajouté comme réactif mais est inclus comme substance inconnue. Les concentrations de coordinat que l'on peut titrer varient d'environ 10 4 à 10 14, et plus souvent d'environ 10-5 à 10-12 M. La concentration de la combinaison analogue de coordinat-fluorescent varie également dans la même gamme, et elle ne diffère pas de plus d'un facteur 100 de la concentration minimale ou de la concentration maximale intéressante. Les concentrations en anticoordinat varient généralement entre environ 0,5 à 1000:1 en ce qui concerne le nombre de sites de liaison par site équivalent de liaison de la combinaison analogue de coordinat-fluorescent, notamment dans la gamme d'environ 1 à 10:1 en ce qui concerne ce même nombre. Des gammes similaires sont utilisées pour l'antifluorescent. Les brevets des Etats Unis å'Amérique N 3 690 834 et N 3 817 837 décrivent des méthodes de mesure des sites de liaison. Les rapports particuliers utilisés sont basés sur les rapports qui optimisent la sensibilité du dosage et ils sont en général affectés à un degré appréciable par les constantes de liaison de l'anticoordinat et de l'antifluorescent. Le milieu est normalement un milieu aqueux ; en général, il ne renferme pas plus d'environ 20 ;0 en volume d'un solvant organique polaire. Divers alcools, éthers et esters peuvent être présents en quantités secondaires. Le pH du milieu est ordinairement compris dans la gamme d'environ 5 à 10, notamment dans la gamme d'environ a 9 et de préférence dans la gamme d'environ 7 à 8,5. On peut utiliser divers tampons pour obtenir le pH désiré et pour maintenir le pH pendant le dosage. Des exemples de tampons comprennent des tampons au borate, au phosphate, au carbonate, au tris, au barbital, etc. Le tampon particulier que l'on utilise n'est pas déterminant pour la présente invention, mais dans des dosages particuliers, un tampon peut être préféré à un autre. Dans le cas de certains coordinats et certains fluorescents, il peut y avoir des degrés faibles mais appréciables de liaison non spécifique du coordinat ou du fluorescent à la protéine. il est alors préférable que la concentration en protéine résultant du passage de protéine de l'échantillon dans le milieu d'analyse soit inférieure à environ 1 A0 en poids, de préférence inférieure à environ 0,5 0 en poids et notamment inférieure à environ 0,1 oXÓ en poids. La concentration totale en protéine peut être réduite par un traitement préalable de l'échantillon inconnu par ultrafiltration, filtration sur gel, prici- pitation,dialyse, etc. A titre de variante, des effets de liaison non spécifique peuvent être contrecarrés par l'addition d'un excès de protéine pure, par exemple d'albumine. Des températures modérées sont normalement utili sexes pour la conduite du dosage et ordinairement, on utilise des températures constantes pendant la période de la mesure. Les températures vont normalement d'environ 15 à 4O0C et plus particulièrement d'environ 25 à 4C"C. Dans la conduite de l'analyse, la solution i analyser est introduite dans la cellule fluorimétrique. Le choix de la longueur d'onde d'excitation dépend du fluorescent. La longueur d'onde particulière ou la bande particulière de longueurs d'ondes que l'on mesure pour établir le spectre d'émise sion dépend du maximum d'émission et du degré d'interférence dû à la diffusion de la lumière. On utilise avantageusement une source lumineuse intense d'une seule longueur d'onde. On peut ainsi minimiser l'interférence résultant des effets de diffusion de la lumière. Des sources intéressantes de lumière monochromatique qui donnent une plus grande intensité que les sources classiques liées à un monochromateur comprennent des lampes d'émission à basse pression et des lasers. Comme indiqué ci-dessus, l"'analyten peut hêtre un coordinat ou un récepteur. La nature du coordinat peut varier largement ; normalement, le coordinat a un poids moléculaire au moins égal à 110, plus souvent au moins égal à 125, le poids moléculaire maximal étant il limité bien qu'il ne dépasse pas ordinairement 10 millions. Le facteur important concernant un coordinat réside principalement dans la possibilité de réalisation d'un récepteur de ce coordinat ou dans sa disponibilité. On peut réaliser normalement des récepteurs pour la plupart des composés organiques à fonctionnalité polaire. Des composés pour lesquels des anticorps peuvent être formés par liaison à un composé doué de propriétés antigéniques sont appelés haptènes. Les composés qui entraînent la formation d'un anticorps sans modification chimique sont appelés antigènes (voir Kabat et collaborateurs, TtEx- perimental Immunochemistry", Charles C.Thomas, Springfield, Illinois, 1957. Les composés mono-épitopiques ou hapténiques qui présentent un intérêt ont normalement un poids moléculaire d'environ 125 à 2000. Ces composés comprennent une grande variété de composés qui diffèrent par leur structure, leur fonctionnalité et leurs propriétés physiologiques. Ces composés peuvent être acycliques, alicycliques ou hetérocycliques, tant mono acycliques que polycycliques. Les hétéro-atomes impliqués comprennent des atomes d'oxygène, d'azote, de soufre, dthalogènes (fluor, chlore, brome et iode), de bore, de phosphore, des cations métalliques des groupes 1A et 2A du Tableau Périodique, etc. Les Les fonctionnalités comprennent les fonctions alcool, éther, acide, ester et amide carboxyliques, amine (primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire), halogéno, nitrilo, mercapto, etc. Normalement, les composés ne sont formés que de carbone, d'hydrogène, d 'oxygène, d'azote, d'un halogène et de phosphore, notamment de carbone, d'hydogt'ne, d'oxygène et d'azote et, lorsqu'il s'agit de sels, de l'ion compensateur métallique correspondant ou de l'ion compensateur ammonium. Des noyaux hétérocycliques cui sont présents comprennent les noyaux pyrrole, pyridine, pipéridine, indole, thiazole, pipérazine, pyranne, coumarine, pyrimidine,purîne, triazine, imidazole, etc. En raison de la grande diversité des composés qui peuvent être analyses par la méthode analyticue de l'invention, les différents groupes sont subdivisés en diverses catégories souvent artificielles, soit par la présence d'une fonction particulière ou d'une structure cyclique, soit en raison du partage d'une fonction particulière ou par suite de l'appartenance à une classe connue. La première classe de composés intéressants comprend les composés aui portent un groupe amino, soit comme membre hétérocyclique, soit comme fonction portée par une chai- ne aliphatique. Ces composés ont normalement un poids moléculaire d'environ 110 à 800 et, notamment, d'environ 125 d 650. Le premier groupe de composés intéressants comprend les alcaloïdes et les métabolites de ces alcaloldes qui sont ingérés. Le premier groupe d'alcaloldes Importants comprend les alcaloïdes du groupe de la morphine. On compte dans ce groupe la morphine, la codéine, l'héroïne, le glucuronide de la morphine, etc. Le groupe suivant d'alcaloïdes comprend les alca laides de la cocaIne, parmi lesquels on range en particulier comme métabolites la benzoylecgonine et ltecgonine. Un autre groupe d'alcaloïdes comprend les alcaloldes de la Cinchona, parmi lesquels on compte la cuinine et la quinidine. Les alcaloïdes du groupe de l'isoquinoléine comprennent la mescaline. Les alcaloïdes du groupe de la benzylîsoquinoléine comprennent la papavérine. Les alcaloïdes du groupe phtalido-isocuinolfine comprennent la narcotine, la narcéine et la cotarnine. Les alcaloïdes du groupe indolopyricocoline comprennent la yohimbine et la réserpine. Les alcaloïdes de l'ergot comprennent l'ergotamine et l'acide lysergique. D'autres groupes d'alcaloïdes comprennent les al calories du type de la strychnine, les alcaloldes du type de la pyridine, les alcaloïdes du type de la pipéridine, les al caloldes du type de la pyrrolizidine, etc. Les alcaloïdes d'intérêt primordial comprennent ceux que l'on range dans la catégorie des médicaments dont il est fait un emploi abusif, tels que la morphine, la cocalne, la mescaline et l'acide lysergique, que l'on peut analyser tels quels ou sous la forme d'un métabolite, selon le liquide physiologique sur lequel on effectue la recherche. Plusieurs médicaments synthétiques miment en partie ou en totalité les propriétés physiologiques des médicaments naturels dont il est fait un abus. Parmi ces médicaments, on compte la méthadone, la mépéridine, l'amphétamine, la méthamphétamine, le glutéthimide, la diphénylhydantoine et les médicaments qui entrent dans la catégorie des benzdiazocycloheptanes, des phénothiazines et des barbiturates. Les médicaments qui présentent un intérêt en raison de leurs propriétés physiologiques comprennent ceux que l'on appelle catécholamines. Parmi les catécholamines, on mentionne l'épinéphrine, l'éphédrine, le L-dopa et la norépinéphrine. Un autre médicament intéressant est le tranquillisant appelé méprobamate. D'autres composés intéressants comprennent le tétrahydrocannabinol, le cannabinol,et leurs dérivés, notamment des composés dérivés de la marijuana, ses modifications synthétiques et ses métabolites. Un autre groupe de composés importants comprend les stéroïdes. Les stéroïdes comprennent des oestrogènes, des gestogènes, des androgènes, des hormones adrénocorticales, des acides biliaires, les glycoides cardiotoniques, les algycones, les saponines et les sapogénines. Une autre classe de composés comprend les vitamines telles que la vitamine A, les vitamines du groupe B telles que les vitamines B1, B6 et Bon2, les vitamines t, K, etc. Une autre classe de composés comprend les sucres, tant monosaccharides que polysaccharides, en particulier les disaccharides et les polysaccharides supérieurs. Une autre classe de composés comprend les prostaglandines. Un autre groupe de composés comprend les antibiotiques tels que la pénicilline, l'actinomycine, la chloromycétine, etc. Des composés individuels importants comprennent la sérotonine, la spermine et l'acide phénylpyruvique. Une autre classe de composés importants comprend des pesticides tels que les fongicides, les insecticides, les bactéricides et les nématicides. Une autre classe de composés comprend les aminoacides, les polypeptides et les protéines. Les polypeptides renferment habituellement environ 2 à îOC motifs amino-acide (poids moléculaire ordinairement inférieur à environ 12 000). Les polypeptides plus grands sont arbitrairement appelés protéines et sont d'ordinaire composés d'environ 4 à fO chaînes polypeptidiques. Le terme "poly(amino-acide)" est utilise comme terme générique pour désigner des polypeptides et des protéines. Des amino-acides d'un intérêt particulier comprennent les thyronines, tant triodées que tétraiodées. Les poly(aminoacides) utilisés conformément à l'invention, avec deux anticorps comme réactifs, ont des poids moléculaIres généralement compris entre environ 5000 et lo7, notamment entre et 10. Des polypeptides et protéines / poly(amino-aciàes) / particulièrement intéressants comprennent des hormones, des globulines, des antigènes et des composés déployant une activité physiologique spécifique. Compte tenu de la grande diversité des protéines, on peut considérer la famille des protéines ayant des caractéristiques structurales similaires, la famille des protéines ayant des fonctions biologiques particulières, la famille des protéines en relation avec des micro-organismes spécifiques, notamment des micro-organismes pathogènes, etc. On indique ci-apres des classes de protéines apparentées par leur structure protamines histones albumines globulines scléroprotéines phosphoprotéines mucoprotéines chromòprotéines lipoprotéines nucléoprotéines protéines non classées, par exemple somalotropine, prolactine, Insuline, pepsine. Plusieurs protéines qui se trouvent dans le plasma humain sont importantes du-point de vue clinique et comprennent les suivantes Préalbumine Albumine al -lipoprotéine a1 -glycoprotéine acide a1 -antitrypsine ai glycoprotéine Transcortine 4,6S-postalbumine &alpha;1-glycoprotéine à faible teneur en thryptophane al --glycoprotéine globuline fixant la thyroxine Inter O(.trypsine-inhibiteur Gc-globuline (Gc 1-1) (Gc 2-1) (Gc 2-2) Haptoglobine (Hp 1-1) (Hp 2-1) (Hp 2-2) Céruloplasmine Chol inestérase a2 -lipoprotéine(s) a2 -macroglobuline &alpha;2-HS-glycoprotéine Zn-a2-glycoprotéine &alpha;;2-neuramino-glycoprotéine Erythropolétine ss -lipoprotéine Transferrine Hémopexine Fibrinogène Flasminogène p 2-glycoprotéine I ss 2-glycoprotéine II Immunoglobuline G (IgG) ou &gamma;G-globuline Formule moléculaire : k ou 22 22 Immunoglobuline A (IgA) ou &gamma;A-globuline Formule moléculaire : : (&alpha;2#2)n ou (&alpha;2#2)n Immunoglobuline M (IgM) ou &gamma;M-globuline Formule moléculaire ( 2#2)5 ou ( 2#2)5 Immunoglobuline D (IgD) ou &gamma;D-globuline (&gamma;D) Formule moléculaire (#2#2) ou $(#2#2) Immunoglobuline E (IgE) ou &gamma;E-globuline (&gamma;E) Formule moléculaire (#2#2) ou (#2#2) Chaines légères libres Fractions du complément :: C'1 C'1q C'1r C'ls C'2 C'3 p1A a2D C'4 C'5 C'6 C'7 C'8 C'9 Les facteurs importants de la coagulation sanguine comprennent les suivants TABLEAU I Facteurs de la coagulation sanguine Désignation internationale Nom I Fibronogène II Prothrombine IIa Thrombine III Thromboplastine tissulaire V et VI Proaccélérine, facteur accé lérateur VII Proconvertine VIII Globuline antihémophile (AHG) IX Facteur Christmas, facteur thromboplastique plasmatique (PTC) X Facteur Stuart-Prower, autoprothrombine III XI Facteur prothromboplastique (PTA) XII Facteur Hagemann XIII Fibrinase Les hormones protéiniques importantes comprennent les suivantes Hormones peptidioues et protéiniques Hormone parathyroide (parathormone) Thyrocal citonine Insuline Glucagone Rel axine Erythropoïétine Mélanotropine (@@@@@@@ @@@@@ (hormone mélanocytostimulante ;; intermedine) Somatotropine (hormone de croissance) Corticotropine (hormone adrénocorticotropique) Thyrotropine Hormone folliculo - stimulante Hormone lutéinisante (hormone cyto ~ stimulante interstitielle) Hormone lutéomammotrope (lutéotropine, prolactine) Gonadotrophine (gonadotrophine chorionique) Hormones tissulaires Sécrétine Gastrine Angiotensine I et II Bradykinine Lactogène placentaire humain Hormones peptidiques de la neurohypophyse Oxytocine Vasopressine Facteurs stimulants (KF) CRF, LRF, TRF, Somatotropine-RF, GRF, FSH-RF, PIF, MIF D'autres matières polymères intéressantes comprennent des mucopolysaccharides et des polysaccharides. Des exemples de polysaccharides antigéniques dérivés de micro-organismes comprennent les substances suivantes Nom spécifique des Hémosensitine élaborée micro-orqanismes Streptococcus pyogenes Polysaccharide Diplococcus pneumoniae Polysaccharide Neisseria meningitidis Polysaccharide Neisseria gonorrhoeae Polysaccharide Corynebacterium diphtheriae Polysaccharide Actinobacillus mallei ;Extrait brut Actinobacillus whitemori Francisella tularensis Lipopolysaccharîde Polysaccharide Pasteurella pestis Pasteurella pestis Polysaccharide Pasteurella multocida Antigène capsulaire Brucella abortus Extrait brut Haemophilus influenzae Polysaccharide Haemophilus pertussis Brut Treponema reiteri Polysaccharide Veillonella Lipopolysaccharide Erysipelothrix Polysaccharide Listeria monocytogenes Polysaccharide Chromobacterium Lipopolysaccharide Mycobacterium tuberculosis Extrait physiologique (sel) de mycobactéries extraites au phénol à 90 % et fraction polysaccharidique de cellules et tuberculine Klebsiella aerogenes Polysaccharide Klebsiella cloacae Polysaccharide Salmonella typhosa Lipopolysaccharide, polysaccharide Salmcnella typhi-murium ;Polysaccharide Salmonella derby Salmonella pullorum Shigella dysenteriae Polysaccharide Shigella flexneri Shigella sonnei Polysaccharide brut Rickettsiae Extrait brut Candida albicans Polysaccharide Entamoeba histolytica Extrait brut Cutre les composts présentant un intérêt, des cellules, des virus et d'autres éléments biologiques qui sont antigéniques ou pour lesquels on peut trouver des récepteurs naturels peuvent aussi être analysés. Les micro-organismes qui sont analyses meuvent être intacts, lysés, broyés ou autrement fragmentés, et la composition ou portion résultante, obtenue par exenple par extraction, peut être titrée. Des micro-organismes intéressants comprennent les suivants Corynebactéries Corynebacterium diphtheriae Pneumocooues Diplococcus pneumoniae Streptocoques Streptococcus pyogenes - Streptococcus salivarius Staphylococues Staphylococcus aureus Staphylococcus albus N ei sseri ae Neisseriae ner,inditidis Neisseria gonorrheae Enterobacteriaceae tscherichia coli Aerobacter aerogenes Bactéries coliformes Klebsiella pneumoniae Salmonella typhosa Salmonella choleraesuis ) Slmonellae Salmonella typhimurium ) Shigella dysenteriae 3 Shigella schmitzii Shigella arabinotarda Shigellae Shigella flexneri Shigella boydii Shigella Sonnei' Autres bacilles intestinaux Proteus vulgaris Proteus mirabilis Espèces du genre Proteus morgani Proteus Pseudomonas aeruglnosa Alcaligenes faecalis Vibrio cholerae Groupe hemophilus-Bordetella Hemophilus influenzae, H. ducreyi H. hemophilus H. aegypticus H. parainfluenzee Bordetella pertussis Pasteurellae Pasteurella pestis Pasteurella tulareusis Brucellae Brucella melitensis Brucella abortus Brucella suis Bacilles sporoqènes aérobies Bacillus anthracis Bacillus subtilis Bacillus megaterium Bacillus cereus Bacilles sporogènes anaérobies Clostridium botulinum Clostridium tetani Clostridium perfringens Clostridium novyi Clostridium septicum Clostridium histolyticum Clostridium tertium Clostridium bifermentans Clostridium sporogenes Mycobactéri es Mycobacterium tuberculosis hominis Mycobacterium bovis Mycobacterium avium Mycobacterium leprae Mycobacterium paratuberculosis Actinomycètes (bactériesfonqoldes) Actinomyces israelii Actinomyces bovis Actinomyces naeslundii Nocardia asteroides Nocardia brasiliensis Spirochètes Treponema pallidum Spirillum minus Treponema pertenue Streptobacîllus monili formis Treponema caracteum Borrelia recurrentis Leptospira icterohemorrhagiae Leptospira canicola Mycoplasmes Mycoplasme pneumoniae Autres agents pathogènes Listeria monocytogenes Erysipelothrix rhusiopathiae Streptobaclllus moniliformis Donvania granulomatis Bartonella bacilliformis Rickettsiae (parasites bactériformes) Rickettsia prowazekii Rickettsia mooseri Rickettsia rickettsii Rickettsia conori Rickettsia australis Rickettsia sibiricus Rickettsia akari Rickettsia tsutsugamushi Rickettsia burnetii Rickettsia quintana Chlamydia (parasites de classification bactérienne/virale incertaine) Agents du genre Chlamydia (dénomination incer taine) Champignons Cryptococcus neoformans Blastomyces dermatidis Histoplasma capsulatum Coccidioides immitis Paracoccidioides brasiliensis Candida albicans Aspergillus fumigatus Mucor corymbifer (Absidia corymbifera) Rhizopus oryzae ) Rhizopus arrhizus ( Phycomycètes Rhizopus nigricans I Sporotrichum schenkii Fonsecaea pedrosoi Fonsecaea compacta Fonsecaea dermatitidis Cladosporium carrionii Phialophora verrucosa Aspergillus nidulans Madurella mycetomi Madurella grisea Allescheria boydii Phialophora jeanselmei Mocrosporum gypseum Trichophyton mentagrophytes Keratinomydes ajellol Microsporum canis Trichophyton rubrum Microsporum andouini Virus Adénovirus Herpès virus Herpes simplex Varicelle Herpe Zoster (zona) Virus B Cytomegalovirus Poxvirus Variole Vaccine Poxvirus bovis Paravaccine ;;olluscum contagiosum iicornavirus Poliovirus Coxs acki evirus Echovirus Rhinovirus Myxovirus Influenza (A, B et C) Parainfluenza (1-4) Virus des oreillons Virus de la maladie de Newcastle Virus de la rougeole Virus de la peste bovine Virus de la maladie de Carré Virus Syncytial respiratoire Virus de la rubéole Arbovirus Virus de l'encéphalite équine de l'Est Virus de l'encéphalite équine de l'Ouest Virus Sindbis Virus Chikungunya Virus de la forêt de Sernliki Virus Mayora Virus de l'encéphalite de St.Louis Virus de l'encéphalite de Californie Virus de la fièvre à tiques du Colorado Virus de la fièvre jaune Virus de la Dengue Réovirus Reovirus Types 1-3 Hépatite Virus de l'hépatite A Virus de l'hépatite B Virus tumoraux Virus de la leucémie de Raucher Virus de Cross Virus de la leucémie de naloney Virus de la leucémie de Prend Virus de la tumeur mammaire de la souris Virus de la leucose aviaire Virus du sarcome de Rous Virus du polyome Virus simien 40 Virus du papillome Les préparations de micro-organismes comprennent les suivantes Protéine de Streptococcus pyogenes Toxine protéinique de Pasteurella pestis Toxoide de Clostridium tetani a-lécithinase de Clostridium perfringens filtrats d'Escherichia coli Extrait protéinique de Treponema reiteri Anatoxine de Corynebacterium diphtheriae Protéine de Mycobacterium tuberculosis Cytoplasme de M. tuberculosis Filtrat de culture et tuberculine de N. tubercu losis Antigène "brut" de Mycoplasma pneumoniae. Analogue de coordinat-fluorescent L'analogue de coordinat ne diffère que légèrement du coordinat. Dans la plupart des cas, l'analogue ae coordinat remplace un atome d'hydrogène du coordinat par une liaison à un groupe de coordination. Par exemple, dans le cas de la morphine, l'atome d'hydrogène du groupe hydroxyle phénolique peut être remplacé par une liaison avec le méthylène d'un groupe acétyle. L'atome d'hydrogène qui est remplacé par une liaison avec un groupe d'enchainement peut être attaché à du carbone, aliphatique ou aromatique, de l'oxygène ou de l'azote. Dans quelques cas, un groupe oxocarbonyle peut former le site de liaison par modification de l'oxocarbonyle en une oxime. Dans d'autres cas, l'hydroxyle d'un groupe carboxyle peut être remplacé pour former un groupe de liaison, par formation d'un ester ou d'un amide. D'autres variantes comprennent l'introduction de fonctions, par exemple de fonctions hydroxyliques à partir desquelles des éthers peuvent être formés, de fonctions amino à partir desquelles des amides peuvent être formés, o fonctions amino à partir desquelles des groupes diazo peuvent être formés, etc. L'important pour l'analogue de coordinat est que cet analogue possède une similitude structurale avec le coordinat suffisante pour qu'il soit reconnu par l'anticorps relatif au coordinat. Du fait que le mode d'addition peut varier largement, les constantes de liaison du coordinat et de l'analogue de coordinat peuvent être différentes, mais la différence ne doit pas excéder un facteur de 103 et notamment de 10'. L'analogue de coordinat a pour l'essentiel la même ou sensiblement la même structure et la même distribution des charges (organisation spatiale et polaire) que le coordinat, pour une partie importante sinon la majeure partie du volume moléculaire. Attendu que souvent, le site de liaison pour un haptène est le même dans la préparation de l'antigène pour la production d'anticorps utilisés pour la liaison au fluorescent, la même portion de la molécule de coordinat qui constitue le support de l'anticorps est exposée par l'analogue de coordinat lorsqu'il est lié au fluorescent. En raison de l'inhibition stéricue due à la présence d'un anticorps empêchant la liaison d'un autre anticorps à la combinaison analogue de coordinat-fluorescent, le groupe de liaison est normalement relativement court. Ordinairement, le groupe de liaison est sensiblement inférieur à 25 , plus souvent inférieur à 20 et notamment inférieur à 15 . Normalement, le groupe de liaison est compris entre 1,5 et 10 A. Lorsque les coordinats sont de grandes molécules ou macromolécules, par exemple des polypeptides et des protéines, il existe plusieurs épitopes différents disponibles à la surface de la molécule, chacun d'eux ayant un anticorps cornF,1- mentaire. Lorsque la macromolécule est en conjugaison avec le fluorescent, il y a normalement plusieurs molécules de fluorescent attachées à la macromolécule. Selon la relation spatiale qui existe entre la molécule de fluorescent et un épitope, il peut ou non y avoir un empêchement stérique de la liaison simultanée de l'anticorps à l'épitope du coordinat et de l'anticorps au fluorescent. Toutefois, il y a normalement plusieurs paires de sites épi topiques et de molécules de fluorescent pour lesquelles, à des degrés divers, il existe un empêchement stérique entre les deux anticorps différents.Parmi les molécules formées entre un analogue de coordinat et un fluorescent, il y a des molécules pour lesquelles il existe au moins une paire épi tope-fluorescent qui est en juxtaposition correcte pour une interaction stéarique. Ce qui a été mentionné à propos de I'em- pêchement stérique de molécules simples ayant un seul épi tope et un seul fluorescent s'applique normalement aux paires épitopefluorescent présentes dans des macromolécules. Dans le choix du fluorescent, des considérations très variées interviennent. Comme on l'a déjà indiqué, le choix du fluorescent est régi à un certain degré par le coordinat. Par conséquent, un facteur à considérer est que le fluorescent absorbe à de plus grandes longueurs d'ondes qu'un coordinat de fluorescent ou qu'un coordinat lié à un anticorps. Outre, les considérations qui s'adressent au coordinat particulier sur lequel porte l'analyse, il existe plusieurs autres considérations qui limitent le choix particulier du fluorescent. En pratique, puisqu'il s'agit d'une variation du spectre d'émission résultant de la liaison ou de l'absence de liaison avec un antifluorescent, il doit y avoir un grand effet ambiant sur l'intensité d'émission à une-longueur d'onde particulière. Cela peut être la conséquence d'une variation notable du rendement quantique ou d'une variation du spectre d'émission ou d'absorptIon lors du passage du fluorescent lié au fluorescent non lie. Attendu que des protéines absorbent à une longueur d'onde d'environ 280, le fluorescent doit avoir un maximum d'absorption d'environ 300 habituellement d'environ 350 et de préférence supérieur à 400 nm. Le coefficient d'extinction doit être supérieur à 10, de préférence supérieur à 1o3 et notamment -1 supérieur à 10 M cm fln outre, il est désirable aue le fluor@s@nt ait un grand déplacement Stokes. Cela veut dire qu'il est pré- férable qu'il y ait un étalement ou une différence appréciable des longueurs d'ondes pour le fluorescent entre son maximum d'absorption et son maximum d'émission. Une autre considération, lorsqu'il s'agit de liquides physiologiques, réside dans la liaison non spécifique du fluorescent à une protéine. Les fluorescents préférés ont une liaison non spécifique minimale, en sorte que le principal effet ou le seul effet perçu est la liaison du fluorescent à son anticorps. Plusieurs fluorescents/différents ont été décrits par Brand et Zohlke dans "Annual @eview of Biochemistry", 41 843-868 (1972) et par Stryer dans "Science", 162, 526 (1968). Un groupe de fluorescents doués d'un certain nombre des propriétés avantageuses indicuées ci-dessus comprend les colorants de la classe du xanthine, parmi lesquels on men- tionnne les fluorescéines dérivées du 3,6-dihydroxy-9-phényl- xanthydrol et les rosamines et rhodamines dérives du 3,6-di- amino-9-phénylxanthydrol. Les rhodamines et les fluorescéines ont un groupe 9-ortho-carboxyphényle et sont des dérivés du 9-o-carboxyphénylxanthydrol. On trouve dans le commerce des formes de ces composés portant des substituants sur le groupe phényle, que l'on peut utiliser comme site de liaison ou comme fonctionnalité de liaison. Par exemple, il existe des fluorescéines à substituants amino et isothiocyanato. Un autre groupe de composés fluorescents comprend les naphtylamines, qui portent un groupe amino en position alpha ou bêta, habituellement en position alpha. rrni les composés naphtylaminés, on mentionne le 5-sulfonate de 1-diméthyl- aminonaphtyle, le sulfonate de 1-anilino-8-naphtalène et le sulfonate de z-p-toluidinyl-6-naphtalène Lcs composes naphta- léniques ont une certaine liaison non spécifique avec la protéine, en sorte que leur application nécessite de les utiliser dans un milieu d'analyse dans lequel la quant té de pro est minimisée. Comme on l'a déjà indiqué, le groupe de liaison peut être dérivé d'une fonction qui existe sur le fluorescent ou d'une fonction qui existe sur l'analogue de coordlnat. Le fluorescent ou l'analogue de coordinat peut être modifié de manier qu'il y ait la liaison nécessaire entre les ceux co,l- posés. Le coordinat et le fluorescent peuvent être conjugués à des noyaux centraux pour former un poly(analogue de coordinat)-polyfluorescent. Le noyau central est normalement une molécule rendue polyfonctionnelle, ayant généralement un poids moléculaire d'environ 5000 à un million, notamment d'environ 30 000 à 600 OCO. Généralement, il n'y a pas plus d'un fluorescent ou d'un coordinat par 1000 unités de poids moléculaire et, plus souvent, il n'y a pas plus d'un fluorescent et/ou d'un coordinat par 5000 unités de poids moléculaire ; en général, il y a au moins un coordinat ou un fluorescent par 50 000 unités de poids moléculaire et plus couramment, au moins un coordinat ou un fluorescent par 30 000 unités de poids moléculaire.Le noyau central peut être un poly(amino-acide), naturel ou synthétique, par exemple, une protéine ou un polypeptide, un composé polyhydroxylique tel que cellulose ou dextranne, etc. Les fonctions qui peuvent être utilisées pour fixer le coordinat au fluorescent peuvent aussi servir à attacher le coordinat et le fluorescent au noyau central. Les antifluorescents sont normalement des anticorps préparés en introduisant le fluorescent conjugué à un antigène dans l'organisme d'un vertébré de man ère à produire des antisérums spécifiques du fluorescent. Les antisérums peu vent ensuite être recueillis et purifiés par des techniques classiques, par exemple par fractionnement, précipitation, chromatographie, etc. L'extincteur peut ensuite être conjugué aux antisérums par tout procédé classiqùe. Les procédés utilisés pour conjuguer l'analogue de coordinat au fluorescent peuvent être utilisés de même pour la conjugaison de l'extincteur à l'antifluorescent, en reconnaissant le fait que la fonction la plus pratique présente dans l'antifluorescent est le groupe amino.Des procédés pratiques de conjugaison utilisent des dérivés d'acides carboxyliques pour former des amides, des imida- tes pour former des amidines et des groupes carbonyle, notamment des aldéhydes,pour former des imines cui peuvent être réduites en amines. Normalement, il y a au moins une molécule d'extincteur par 100 000 unités de poids moléculaire de l'antifluorescent, plus ordinairement une molécule d'extincteur par 75 COC unités de poids moléculaire de l'antifluorescent et habituellement, il n'y a pas plus d'une molécule d'extincteur par 1000 et notammentpar 2000 unités de poids moléculaire de l'antifluorescent. Le principal facteur à considérer est un facteur de splubilité, attendu que de nombreux colorants sont peu solubles dans l'eau et peuvent désolubiliser le récepteur Le plus souvent, le nombre de molécules d'extincteur est compris entre environ 2 et 25, ordinairement entre 2 et 20 et de préférence entre 4 et 16, notamment environ 6 et 16 lorsque des anticorps (gamma-globuline) sont impliqués. Les extincteurs sont des colorants que l'on choisit de manière qu'il y ait une bande d'absorption qui recouvre la bande d'émission du fluorescent. En ce qui concerne les bandes d'absorption et d'émission du fluorescent et de l'extincteur, il s'agit des bandes telles qu'on lcs observe dans le milieu à analyser, telles qu'elles sont influencées par ledit milieu et la conjugaison avec la protéine, et non les bandes telles qu'on les observe dans un milieu différent. On peut aussi utiliser comme extincteurs des molécules qui ont été considérées ci-dessus comme des fluorescents. Par exemple, la rhodamine peut être utilisée comme extincteur de la fluorescéine. D'autres associations peuvent aussi être trouvées dans la littérature. De nombreux avantages résultent de l'utilisation d'une combinaison antifluorescent-extincteur dans l'analyse en question. Dans la préparation d'une combinaison analogue de coordinat-fluorescent, notamment avec des matières naturelles de haut poids moléculaire, il y a ordinairement un degré notable de contamination. Lorsqu;un fluorescent est conjugué avec l'analyte dont il est question, les impuretés sont fréquemment conjuguées elles aussi. Par conséquent, lorsqu'on introduit la combinaison analogue de coordinat-fluorescent dans le milieu à analyser, une quantité notable de fluorescent est égale- ment introduite avec les impuretés.Bien que l'ant-ifluorescent puisse modifier grandement le degré de fluorescence d'un fl-uorescent lorsqu'il est lié à ce dernier, il peut y avoir une augmentation ou une diminution, et même dans le cas d'une diminution, il y a dans l'analyse un fond important de fluores cerce De plus, la fluorescence du fluorescent lié à l'analogue de coordinat est aussi incomplètement inhibée. Par conséquent, même lorsque le fluorescent présent dans le milieu à analyser est lié en totalité à l1antifluorescent, il y a encore un degré notable de fluorescence dans le milieu.Ainsi, dans la conduite de l'analyse, on doit soustraire deux nombres relativement grands pour obtenir un petit nombre L'essai est d'autant moins sensible à de petites variations de concentration de l'analyte que les différences entre les deux grands nombres sont plus petits. En utilisant un extincteur conjugué à l'antifluorescent, on peut "éteindre" 95 ' ou plus de 95 % de la fluo rescence Par conséquent, les fluorescents accidentellement introduits par conjugaison du fluorescent avec des impuretés accompagnant le coordinat ne font qu'introduire un degré extrêmement faible de fluorescence de fond dans le milieu à analyser.En outre, le fluorescent conjugué à l'analogue de coordinat subit également une extinction notable lorsqu'il est attaché à l'antifluorescent conjugué à l'extincteur. Par conséquent, le fond est grandement réduit, en sorte que l'on ne doit soustraire du résultat observé qu'un fond de faible grandeur. L'invention est illustrée par les exemples suivants, donnés à tItre non limitatif. Toutes es températures sont exprimées en degrés centigrades, sauf spécification contraire. Sans autre indication, tous les pourcentages sont exprimés en poids, excepté lorsqu'il s'agIt de mélanges de liquides, auquel cas les pourcentages sont en volume. On a utilisé les abréviations suivantes SAB = sérum albumine de boeuf ; DMF = diméthylformamide. Exemple 1 Préparation du conjugué fluoresceine-SAB On introduit dans une fiole à scintillation 180 mg de SAB (2,6 x 10 6 moles) ('!Pentexl', forme cristallisée) en solution dans @ ml d'eau contenant 180 mg de carbonate de potassium. On ajoute à cette solution 18,@ mg d'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (4,o5 x 10-5 moles) et on bouche la fiole contenant le mélange, on le recouvre d'ure feuille d' alu- minium puis on la place dans l'évidement central d'un mélan- geur tourbillonnaire et on l'ag@te modérément par s@cousses pendant environ o heures à la température ambiante.Le lendemain matin, on acidifie le mélange réactionnel à un H égal à 4 par addition d'acide chlorhydrique 1 N (précipité dense), puis on l'alcalinise å un pH égal à 8 par addition d'hydroxyde de sodium décinormal, on charge le mélange sur une colonne de 2,5 x 3G cm de "Sephadex G-10" et on élue la colonne avec un phosphate O,Cb 2 (pH 8,0 à un débit de 5,4 ml/h (on recueille des fractions de C,9 ml). On rassemble les fractions 4~ à 72. On calcule le nombre d'haptènes d'après l'absorption ultraviolette du conjugué à 493 m et on trouve pour la fluorescéine liée à la protéine un coefficient d'extinction de 7,2 x Le calcul donne donc un nombre d'haptènes de 14,5. Le conjugué ci-dessus a été utilisé pour préparer des antisérums antifluorescéines par des procédés connus. Exemple 2 Conjuqaison de la rhodamine à l'anti (fluorescéine) On précipite une portion aliquote de l ml d'antisérums relatifs à la fluorescéine à l'aide de sulfate d'ammonium saturé à 50 % et on dissout le précipité dans z ml de K2HP04 O,l M puis on dialyse la solution vis-a-vis de la même solution pour obtenir une nouvelle solution de concentration égale à 9 mg/ml. On introduit dans un récipient de réaction 0,4 ml (3,6 mg) des antisérums anti(fluorescéines) et 0,17 ml de glycérol, on ajuste le pH à 9,5 ct on ajoute en agitant, à la température ambiante, 0,8 mg d'isothiocyanate de tétraméthyl- rhodamine dans 100 1 de DMF.Après avoir poursuivi la réaction pendant 3 heures, on verse la solution sur une colonne de 0,9 x 15 cm de "Sephadex LH-20" et on recueille l'antifluores- céine dans un volume de 1 ml: Exemple 3 Conjugaison de gamma-globuline humaine (hIgG) avec la fluorescéine (FhIqG) On dissout 3 mg de hIgG (IgG humaine) dans 0,4 ml de tampon au phosphate 0,1 (pH 7,5) et on ajuste le pH de la solution à 9,5 par addition de carbonate de sodium cristallin. On ajoute une solution (10 l) de FITC (70 g) dans l'acétone en agitant, et on maintient le mélange sous agitation pendant 3 heures à la température ambiante.La solution résultant te est séparée deux fois sur une colonne (1 x 15 cm) de "Sephadex G-25(M)" équilibrée avec un tampon au phosphate 0,05 M (pH 8,0). La solution éluée de conjugué FITC-hIgG a une concentration de 0,58 mg/ml et a un rapport D/P égale @ 5,5 (1/), d'après le nomographe de tells. Pour démontrer l'utilité des composés de l'invention, on a effectué les analyses suivantes Dans la conduite de l'analyse, on réunit 200 l de tampon (K2HPO4 0,1 M, pH 7,8, 0,05 % de NaN3) avec 30 l de hIgC (1,6 x 10 @ M) en conjugaison avec 12 fluorescéine, ayant un rapport fluorescéine/hIgG de 14:1, et la quantité prescrite d'anti(hIgG), puis on fait incuber le mélange à la température ambiante pendant 0,5 heure. A la fin de cette période, on ajoute 2,75 ml de tampon et SOAl de l'anti(fluorescéine) conjuguée à la rhodamine, dans un rapport d dilution de 1:10. On effectue ensuite des lectures de la fluorescence de l'échantillon. Le tableau suivant indique la quantité de antithIgG) ajoutée à une concentration de 2,4 mg/ml. TABLLAU II anti (hIgG), Fluorescence l - 2 1 17,5 ; 18,5 2 21,5 ; 21,5 5 2;,5 ; z4,5 10 29,5 ; 30,5 25 31,5 ; 33,5 Les résultats donnés ci-dessus démontrent que l'anti(fluorescéine) conjuguée à la rhodamine constitue un extincteur efficace de la fluorescence. De plus, des quantités croissantes d'anti(hIgG) améliorent la protection de la fluorescence d'une extinction par l'anti(fluorescéinc). Dans l'analyse suivante, on a utilisé des concentrations variables de hIgG que l'on a fait entrer en compéti tion avec le produit de conjugaison de hIgG et de fluorescéine pour une quantité limitée d'anti(hIgG). La méthode d'expérimen- tation implique la mise en présence de 100 l de hIgG (1,6 x 10 9 M) conjugué à la fluorescéine, 100 l de hIgG à des concentrations variables et 20 l d'antiShIgG) à une concentration d'environ 0,4 mg/ml. On fait incuber le mélange pendant 0,5 heure à la température ambiante puis on ajoute 2,75 ml de tampon (voir ci-dessus) et 50 l de conjugué rhodamine-anti (fluorescéine) dans un rapport de dilution de 1:10 et on fait incuber le mélange pendant encore 0,5 heure. On effectue ensuite des mesures de fluorescence, au bout de 0,5 heure.Le tableau suivant indique les résultats obtenus. TABLEAU III hIgG, Fluorescene Tvl 85, 84 1x10-7 1 x 10-8 10, 11 1 x ;0 59, 63 1 x 10-10 76, 80 1 x 10-11 82, 87 La présence de hIgG a pour effet de fixer l'anti (hIgG-) et de réduire la quantité disponible d'anti(hIgG) pour la liaison avec le conjugué fluorescéine-hIgG. Ainsi, pour de fortes concentrations en hIgG, la fluorescéine n'est pas protégée par la présence d'anti(hIgG) et elle subit une extinction de plupart du conjugué rhodamine-antifluorescéine. Il ressort des résultats qui précèdent qu'en utilisant le produit de conjugaison d'un antifluorescent avec un extincteur, la fluorescence du fluorescent est sensiblement éliminée lorsque l'antifluorescent est lié au fluorescent, et par conséquent les valeurs de fond sont grandement réduites. En outre, des coordinats qui sont relativement impurs peuvent/etre utilisés dans la préparation de la combinaison analogue de coordinat-fluorescent, ce qui évite les opérations coûteuses de purification. L'invention est également avantageu- se dans le cas de coordinats hapténiques, en éliminant sensiblement la fluorescence venant d'une combinaison analogue de cent-extincteur. Du fait de la réduction de la fluorescence de fond, on obtient des analyses plus sensibles et plus précises. REVENDICATIONS 1. Nouvelle méthode de détection de la présence d'un coordinat ou d'un anticoordinat dans un échantillon, cacao- térisée par le fait qu'elle consiste à réunir, dans un milieu aqueux , ledit échant lon, une combinaison analogue de coorcinat-fluorescent, dans lacuelle ledit analogue de coordinat pout être spécifique- ment reconnu par ledit anticoordinat, et le coordinat et le fluorescent sont attachés de manière suffisamment étroite par un groupe de liaison pour que la liaison simuQtanc'e de l'anti- coordinat et de l'anticorps au fluorescent subisse un empêche- ment stérique, un anticoordinat pour la détermination du coordinat ; et un extincteur en conjugaison avec un antifluorescent ; et d déterminer à au moins une longueur d'onde l'intensité de la fluorescence émise par ledit milieu comparative- ment à un témoin renfermant une quantité connue de coordinat ou d'anticoordinat. 2. Méthode suivant la revendication 1, caractérisée par le fait que le pH ou milieu aqueux est compris entre environ 6 et 9, la concentration de la combinaison analogue de coordinat-fluorescent est comprise entre environ 10-4 4 et 10 12 M et la température dudit milieu est comprise entre environ 15 et 40 C. 3. Méthode suivant la revendication 2, caractérisée par le fait que le conjugué extincteur-antifluorescent a un rapport moyen extincteur:antifluorescent environ 2:25. 4. méthode suivant la revendication 2, caractérisée par le fait que le coordinat est un polyamino-acide, un alcalol- de, un stéroïde ou un médicament de synthèse. 5. Méthode suivant la revendication 2, caractérisée par le fait que le fluorescent est la fluoresceine et l'extincteur est la rhodamine. 6. Nécessaire à réactifs destiné à être utilise dans une méthode suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il comprend une combinaison analogue de coordinat-fluorescent et un antifluorescent, dans un rapport apte à optimiser la sensibilité de la méthode. 7. Nécessaire à réactifs suivant la revendication 6, caractérisé par le fait que l'antifluorescent est en conjugaison avec l'extincteur. 8. Nécessaire à-réactifs suivant l'une des revendications 6 et 7, caractérisé par le fait qu'il comprend un anticoordinat. 9. Le produit de conjugaison d'un extincteur et d'un anti-fluorescent 10. Méthode suivant la revendication 1, -caracté- risée par le fait que la fluorescence provient dudit fluorescent.