Brevet FR2418457A1 — publié le 19790921

La présente invention a pour objet un dispositif pour analyser une solution contenant un composé biologique susceptible de réagir avec un composé antagoniste spécifique dudit composé biologique. Le dispositif conforme à l'invention s'applique notamment a l'analyse d'une solution contenant un antigène au cours de laquelle on utilise la réaction antigène-anticorps mise en évidence par la méthode de radio-immunologie. On rappelle que la plupart des antigènes donnent naissance à des anticorps spécifiques de l'antigène et se combinent a ces anticorps pour donner un complexe. On utilise cette réaction antigène-anticorps pour déterminer la quantité d'antigène dans un milieu donné ; cette mesure quantitative , tout d'abord de la réaction antigène-anticorps, pour en déduire la quantité d'antigène dans un milieu donné, peut être effectuée par des techniques biologiques, sérologiques, immunologiques. Parmi les techniques immunologiques, on peut signaler les méthodes utilisant un traceur dont la méthode de radio-immunologie. La méthode radio-immuncb9ique consiste à étudier la réaction antigène-anticorps a l'aide d'un traceur obtenu en marquant l'antigène ou l'anticorps par une substance radioactive telle que par exemple, de l'iode 125.Plusieurs modes opératoires Sort possibles en particulier la méthode dite de compétition avec antigène en excès ou en défaut. Par exemple, dans le cas de l'antigène marqué en excès, l'antigène marqué et l'antigène non marqué entrent alors en competition pour se lier à l'anticorps, en quantité limitée par rapport a la quantité d'antigène totale. L'antigène marque et l'anticorps sont ajoutés en quantité identique dans différents tubes de dosage ; des quantités connues croissantes d'antigène non marqué sont ajoutées dans les tubes, ce qui permet de tracer une courbe d'étalonnage : en effet, à tout moment, l'antigène libre peut être séparé de l'antigène lié a l'anticorps et la répartition de la radioactivité entre l'antigène libre et le complexe lié est mesurée pour chaque tube. De façon plus précise, on met dans un certain nombre de tubes contenant une certaine quantité connue d'anticorps, une quantité connue d'antigène marqué et différentes quantités connues, allant en croissant, du même antigène non marqué. L'antigène marqué et l'antigène non marqué entrent alors en compétition pour se lier a la quantité limitée d'anticorps. On sépare alors le complexe de l'antigène libre et, par mesure de la radioactivité du complexe, on détermine la quantité de complexe anticorps-antigène forme, ce qui permet de tracer une courbe standard en fonction de la quantité d'antigène non marqué ajoutée. Ensuite, dans un tube contenant toujours la même quantité d'anticorps et dans laquelle on a additionné la même quantité d'antigène marqué, on ajoute la solution dans laquelle on a une quantité d'antigène non marqué inconnue ; a l'aide de la courbe standard, après avoir mesuré par radioactivité la quantité de complexe antigène-anticorps formé, on en déduit la quantité d'antigène contenue dans la solution a analyser. On voit donc que, dans les méthodes de radioimmunologie, il se pose le problème de la séparation du complexe antigène-anticorps et de l'antigène libre. Différentes méthodes de séparation ont été envisagées telles que l'adsorption préférentielle de l'antigène libre par exemple : séparation par chromatoelectrophorèse, sé- paration sur poudre absorbante, séparation par filtration sur gel etc... ; ces méthodes sont complexes et peu satisfaisantes. Dans le but de faciliter ces techniques de séparation du complexe antigène-anticorps de l'antigène libre, on emploie actuellement la méthode dite du "coated tube" selon laquelle le complexe est adsorbé en phase solide ; cette méthode consiste à utiliser des tubes enpolystyrène, notamment, sur la face interne desquels on fait adsorber l'anticorps en y mettant un certain temps le sérum contenant l'anticorps, puis en vidant ce sérum une fois que l'anticorps est fixé et en effectuant ensuite les opérations rappelées ci-dessus ; mais, actuellement, il n'est pas possible de faire des tubes tous identiques, c'est-a-dire présentant un état de surface tel qu'ils adsorbent tous la même quantité d'anticorps.On essaie également de fixer préalablement l'anticorps sur des billes ou sur des disques que l'on met ensuite dans le tube dans lequel on effectue ensuite les différentes réactions t mais ceci pose également quelques problèmes pratiques (distribution des billes ou des disques dans les tubes, lavage, transfert et dispersion après usage d'objets radioactifs). Le dispositif conforme a l'invention pallie justement les inconvénients rappelés ci-dessus et permet d'analyser une solution contenant un antigène en utilisant la technique de radio-immunologie sans rencontrer les problèmes de la séparation du complexe antigène-anticorps et de l'antigène libre évoqués ci-dessus. Le dispositif pour analyser une solution contenant un composé biologique susceptible de réagir avec un composé antagoniste spécifique dudit composé biologique, objet de l'invention, se caractérise en ce quXil est constitué d'un tube ferme à sa base et d'une pièce engagée et immobilisée dans la base dudit tube de façon a laisser un volume entre le fond dudit tube et son extrémité inférieure, ladite pièce présentant une grande surface développée et ayant une forme susceptible de permettre l'accession de la solution a analyser jusqu'au fond dudit tube et ladite pièce étant constituée d'un matériau présentant une certaine déformation élastique et apte a fixer une quantité déterminée soit du composé biologique, soit du composé antagoniste spécifique du composé biologique. Selon une caractéristique dé l'invention, la hauteur de la pièce est telle que le volume de la solution a analyser soit juste suffisant pour la submerger. Le volume de la solution entre le fond du tube et l'extrémité inférieure de la pièce permet d'assurer un mélange correct a la suite d'une brève agitation au début de l'incubation. Selon une variante de réalisation du dispositif considéré, la pièce a la forme d'un manchon cylindrique dont la face externe est munie d'ailettes disposées sur la hauteur du manchon. De préférence, ces ailettes sont recourbées a leur extrémité de façon a être en contact avec la face interne du tube de façon tangentielle. Selon une autre variante de réalisation du dispositif de l'invention, la pièce comprend une tete de fixation élastique en-dessous de laquelle est fixé au moins un serpentin. Cette tete de fixation élastique peut être constituée par un disque percé d'un orifice central ou par un anneau muni d'ailettes. La pièce est en un matériau élastique, insoluble dans la solution a analyser, telle qu'un polymère naturel ou synthétique ; ce peut être, par exemple, du nylon. Ce matériau, constituant la pièce, fixe le composé biologique ou le composé antagoniste spécifique du composé biologique par adsorption ou par liaison covalente,l'immobilisation de la piece en fond de tube, obtenue grace a sa déformation élastique, offre l'avantage de permettre une séparation aisée du complexe fixé sur ladite pièce et de la solution, ceci par simple retournement du tube. L'invention sera mieux comprise a la lecture de la description qui suit, faite en se référant aux figures jointes qui représentent schématiquement deux modes de réalisation du dispositif considéré.Bién entendu, les deux modes de réalisation décrits ne présentent aucun caractère limitatif vis-a-vis de l'invention. Sur la Fig. 1, on a représentéten perspective le tube 1 et la pièce 2, engagée et immobilisée dans la base du tube 1. La pièce 2 a la forme d'un manchon cylindrique 3 qui comporte des ailettes 4 disposées sur toute la hauteur du manchon 3. On voit que la pièce 2 présente une grande surface développée et permet l'accession de la solution, par l'orifice central 5 du manchon et par les espaces libres 6 laissés entre les ailettes 4, jusqu'au fond du tube 1. Sur la Fig. 2, on a représenté, vusde face, le tube 1' et la pièce 2'. La pièce 2' comprend une tête 7 de fixation élastique en-dessous de laquelle est fixé un serpentin 8. La tête de fixation élastique 7 peut être constituée par un disque percé d'un orifice central prenant appui sur les parois internes du tube 1' ou par un anneau muni d'ailettes qui prennent appui sur les parois internes du tube 1'. L'utilisation du dispositif conforme a l'invention se fait avantageusement de la façon suivante Dans un premier temps, on laisse une certaine quantité d'anticorps se fixer sur la pièce en 1'immergeant dans une solution de cet anticorps. On lave ensuite la pièce, puis on la sèche. On introduit alors la pièce dans le tube. On effectue la même opération, avec la même quantité d'anticorps, avec un certain nombre de pièces et de tubes identiques. On ajoute alors une certaine quantité d'antigène marqué dans ces tubes, puis on y additionne des quantités croissantes d'antigène non marqué. Au bout d'un certain temps, on vide les tubes et on mesure la quantité de complexe antigène-anticorps fixé sur la pièce par mesure de la radioactivité. On peut alors tracer une courbe standard donnant la quantité de ce complexe en fonction des quantités d'antigène non marqué additionnées aux différents tubes. Et en utilisant cette courbe, on peut effectuer des dosages d'antigène dans une solution comme il est indiqué précédemment. L'anticorps est fixé sur la pièce du dispositif soit par adeorption, soit par liaison covalente. Dans le cas ou l'on désire fixer l'anticorps par une liaison covalente, on peut envisager de modifier la surface de la pièce par greffage d'un composé chimique approprié (dans le cas d'une pièce en nylon par exemple, on peut envisager le greffage de polyacrylamide sur ce nylon, puis réaction de glutaraldéhyde avec le polyacrylamide greffé, ce glutaraldéhyde étant susceptible de réagir et de fixer l'anticorps par liaison covalenbe). On donne, ci-dessous, a titre non limitatif, deux exemples d'utilisation du dispositif selon l'invention ; le premier exemple se rapporte a l'analyse d'une solution de thyroxine dont l'anticorps spécifique sont les immunoglobulines contenues dans un sérum de mouton anti-thyroxine ; le deuxième exemple se rapporte au dosage de thyroxine-binding-globuline dite HTBGR dont l'anticorps est contenu dans un sérum anti-TBG de lapin. Pour ces deux exemples, on a utilisé le dispositif représenté sur la Fig. 1 ; la pièce est en nylon commercialisé sous le nom de "Zytel" par la Société Dupont de Nemours et fixe l'anticorps par adsorption. Exemple 1- Tout d'abord, on fait une estimation de la quantité d'anticorps anti-thyroxine, ctest-a-dire de la quantité d'immunoglobulines, que peut fixer la pièce du dispositif de l'invention en fonction du temps. Pour cela, on met sept pièces dans 12 ml d'une solution contenant environ 200 vg d'immu noglobulines dont une très faible quantité est marquée a l'iode 125 et on retire ces pièces respectivement a des temps différents allant de 1/2 h à 24 heures. On rince les pièces a l'eau distillée et on les sèche une heure a 370C sous vide primaire avant de mesurer leur radioactivité.Le tableau I, ci-dessous, donne, en fonction du temps d'immersion dans la solution d'immunoglobulines dites "Ig",le poids d'immunoglobulines fixées par pièce. TABLEAU I Temps (heures) 1/2 : 1 2 4 5 6 24 - Poids Ig . . . . par pièce(g): 1,0 : 1,4 : 2,1: 3,3 : 3,7 : 3,8: 6 Ainsi, la pièce du dispositif de l'invention fixe une telle quantité d'Ig que toutes les méthodes d'analyse peuvent être utilisées, notamment les méthodes de radio-immunologie par excès, puisqu'elle peut fixer jusqu'a 6 Vg par pièce. D'autre parts on effectue le dosage proprement dit. On prend quatre pièces ayant fixé de l'anti-thyroxine de la façon suivante : on les a immergées pendant quatre heures a la température ambiante dans une solution a 2 pg/ml d'immunoglobulines en tampon phosphate (6,176 g de Na2HPOd, 2H20 et 2,082g de KH2P04 pour un litre de volume final) de pH voisin de 7,2, obtenue a partir d'une solution a 40 mg/mi d'un sérum de mouton anti-thyroxine. On lave ces quatre pièces deux fois à l'eau distillée et on les sèche une heure à 370C sous vide primaire, puis on les introduit dans quatre tubes en polystyrène. On ajoute dans ces tubes 100 p1 d'une solution de thyroxine dite "T4" marquée å l'iode 125 et 390 p1 du même tampon phosphate que ci-dessus ajusté a 0,3 % en albumine sérique bovine. L'activité totale moyenne de ces tubes est de 89.056 chocs par minute (cpm). On additionne alors a chacun des tubes 10 p1 de solutions standard, c'est-a-dire de solutions de thyroxine T4 non marquée en solution dans le tampon décrit ci-dessus ayant des concentrations respectives en T4 non marquée de O ng/ml, 20 ng/ml, 80 ng/ml et 200 ng/ml. On laisse les pièces immergées pendant trois heures a température ambiante sans agitation Puis, on vide les solutions des tubes, on les lave et on détermine la radioactivité de chacun de ces tubes. On effectue exactement les mêmes opérations avec une série de tubes contenant des pièces ayant fixé de l'anti-thyroxine à partir d'une solution å 20 ug/ml d'immunoglobulines, puis avec une autre série de tubes contenant des pièces ayant fixé de l'anti-thyroxine a partir d'une solution 100 pg/ml d'immunoglobulines. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau II ci-dessous : TABLEAU II Cencentration Activité ACTIVITE LIEE POUR de la solution totale moyenne: O ng/ml 20 ng/ml 80 ng/ml 200 ng/ml d'Ig 2pgvml 89056 17393 : 15547 13626 12155 : 20pgvml : 89056 : 26535 : 24284 : 22604 : 18733 : 100 g/ml 95932 : 27984 : 27335 : 24575 : 23269 D'après le tableau II, on voit que l'on peut tracer la courbe d'étalonnage donnant la quantité de complexe lié en fonction de la quantité de thyroxine contenue dans la solution standard. A partir de ces courbes, on pourra déterminer la quantité de thyroxine contenue dans une solution dont on ne contact pas la concentration en thyroxine. Exemple II On prend six pièces ayant fixé des anticorps anti-TBG de la façon suivante : on les a immergées, pendant dix-huit heures a la température ambiante, dans une solution de sérum de lapin anti-TBG humaine en tampon phosphate 0,1 M, de pH voisin de 7,4, solution dont la concentration est de 1/3 000 de la concentration initiale du sérum de lapin. On lave ces six pièces trois fois avec la même solution tampon et on les sèche une demi heurte a 370C a pression ambiante ; puis on les introduit dans six tubes en polystyrène On ajoute dans ces tubes 100 p1 d'une solution de TBG humaine marquée a l'iode 125 et 300 l de tampon phosphate 0,05 M, pH voisin de 7,2. L'activité totale moyenne de ces tubes est de 15.050 cpm. On additionne alors a chacun des tubes 100 ijl de solutions standard obtenues par dilution dans le tampon décrit ci-dessus d'un pool de sérum humain étalonné en TBG humaine non marquée, ayant donc des concentrations correspondant respectivement a des dilutions du sérum au 1/50, 1/100, 1/200, 1/400 et 1/800. On laisse les pièces immergées pendant cinq heures, sans agitation. Puis, on vide les solutions des tubes, on les lave a l'eau et on détermine la radioactivité de chacun de ces tubes. Les résultats obtenus sont donnés dans-le tableau III ci-dessous : TABLEAU III Concentration Activité: ACTIVITE LIEE POUR de la solution totale d'anti-TBG hu- (cpm) .dilution dilutrs dibtodiluticc:diluiin Tampon: maine sérum : sérum : sérum Sérum : sérum: seul: humain humain humain humain humain 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/3000 de la concentration initiale da : 15 050 : 823,5 : 1255 : 1757 : 2042 : 2288 : 3800 : sérum de lapin lapin: D'après le tableau III, on voit que l'on peut tracer la courbe standard, à partir de laquelle on pourra déterminer la quantité de TBG contenue dans un sérum humain. Ainsi, le dispositif conforme a 11 invention présente beaucoup d'avantages, tant au niveau de la fabrication que de l'utilisation. En effet, différentes pièces identiques du dispositif considéré peuvent être fabriquées aisément de façon reproductible et, du fait que la pièce est immobilisée dans le tube, il ne se pose pas de problèmes lors des lavages. REVENDICATIONS 1. Dispositif pour analyser une solution contenant un composé biologique susceptible de réagir avec un composé antagoniste spécifique dudit composé biologique, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un tube fermé a sa base et d'une pièce engagée et immobilisée dans la base dudit tube de façon à laisser un volume entre le fond dudit tube et son extrémité inférieure, ladite pièce présentant une grande surface développée et ayant ure forme susceptible de permettre l'accession de la solution a analyser jusqu'au fond dudit tube et ladite pièce étant constituée d'un matériau présentant une certaine déformation élastique et apte à fixer une quantité déterminée soit du composé biologique, soit du composé antagoniste spécifique du composé biologique. 2.- Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que la hauteur de la pièce est telle que le volume de la solution a analyser soit juste suffisant pour la submerger. 3. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la pièce a la forme d'un manchon cylindrique dont la face externe est munie d'ailettes disposées sur la hauteur du manchon. 4. Dispositif selon la revendication 3, caractérisé en ce que les ailettes sont recourbees a leur extrémite de façon a être en contact avec la face interne du tube de façon tangentielle. 5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la pièce comprend une tête de fixation élastique en-dessous de laquelle est fixé au moins un serpentin. 6. Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce que la tête de fixation élastique est constituée par un disque percé d'un orifice central. 7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la pièce est en un matériau élastique, insoluble dans la solution a analyser , tel qu-'un polymère naturel ou synthétique. 8. Dispositif selon la revendication 7, caractérisé en ce que la pièce est en nylon. 9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 8, caractérisé en ce que le matériau constituant la pièce fixe soit le composé biologique, soit le composé antagoniste spécifique du composé biologique par adsorption. 10. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 a 8, caractérisé en ce que le matériau constituant la pièce fixe soit le composé biologique, soit le composé antagoniste spécifique du composé biologique par liaison covalente.