Brevet FR2394553A1 — publié le 19790112

La présente invention est relative à un nouveau procédé d'extraction et de purification de 3oQ- et de 3 - hydroxy stérode-deshydrogénase (3OkHSDH) et (3 yHSDH),aux enzymes ainsi obtenues ainsi qu'à l'application de ces enzymes hautement purifiées a divers dosages et synthèses. La lithiase biliaire, qu'elle soit provoquée par une alimentation inadéquate, par la variation pathologique dans la composition de la bile, due à un excès de substances précipitables, ou à un défaut de substances solubilisantes, qu'elle soit provoquée par des facteurs mécaniques ou neurogènes de la stase ou encore par l'inflammation ou l'infection, affecte actuellement près de 10 % de la population adulte. Aussi, les cliniciens portent un très grand intéret aux dosages et en particulier aux microdosages des acides biliaires, notamment dans la bile, afin d'évaluer les risques de lithiases biliaires et l'efficacité du traitement par l'acide chenodesoxycholique. Comme la concentration des acides biliaires est faible (aussi bien primaires que secondaires, sous leur forme libre o conjuguée), c'est donc tout naturellement vers des voies analytiques fines et précises que se sont dirigés les Chercheurs. La chromatographie gaz-liquide s'étant avérée complexe et laborieuse, c'est vers des méthodes enzymatiques fines, préci ses et fiables que les Chercheurs, analystes et cliniciens, se sont tournés. Ainsi, par exemple, les quantités d'acides biliaires peuvent entre mesurées par oxydation spécifique des alcools en 3, en cétones correspondantes : les alcools 3 &alpha; par des oxydoréductases spécifiques 3 ou, les alcools 3 , par des oxydoréductases spécifiques 38. De nombreux Chercheurs ont préconisé et mis au point des techniques analytiques utilisant la méthode enzymatique, aussi bien dans le sérum que dans la bile. On a ainsi isolé, à partir de cultures de Pseudomonas Testosteroni sur des milieux contenant les stéroides, des hydroxystéroïde-deshydrogênases (E.C.1.1.1.50 : 3 &alpha; hydroxystéroïde NAD oxydoréductase et E.C.1.1.1.51 : 3 ss hydroxystéroïde NAD oxydoréductase) : cf. en particulier les travaux de TALALAY et Collaborateurs (Nature 1952 170 p. 620 ; J. Biol. Chem. 1956 218 661-675 ; Biochem. 1965, 4 p. 1825-1833). Malheureusement, les méthodes d'extraction connues, de ces deux enzymes qui sont nécessaires pour effectuer les dosages et les microdosages, qu'elles fassent appel à une méthode de chromatographie sur la carboxyméthylcellulose ( TALALAY et collaborateurs : Biochemistry 1965 4 1825-1833), à la méthode d'éîectrophorèse sur colonne (PORATH et collaborateurs:Biochem. Biophys. Acta 1964 89 398-408), à la méthode de focalisation isoélectrique (B.A. SKALHEGG Eur. J. Biochem 1974 46 117-125) ou meme à la méthode de chromatographie d'affinité (TALALAY et collab.:Methods in Enzymology 1974 Vol. 34 p. 557-566), n'ont pas pu résoudre le problème du dosage des acides biliaires à grande échelle s ces méthodes sont couteuses, et de faible à très faible rendement. En particulier, la méthode d'extraction par chromatographie d'affinité préconisée par TAIAtAY,outre les rendements faibles auxquels elle donne lieu, nécessite des quantités importantes de NAD, coenzyme très coûteux.La méthode de chromatographie d'affinité proposée tout récemment par AUKRUST et collab. (Biochimica et Biophysica Acta 1976 438 p. 13-22) utilise également le nicotinamide-adenine dinucléotide en grandes quantités. On disposait donc jusqu'à présent d'un outil de dosage et de microdosage parfait, mais malheureusement trop cher pour l'utilisation à grande échelle que nécessite la surveillance d'une maladie aussi répandue que l'est la lithiase biliaire. La présente invention s s'est, par conséquent, donné pour but de pourvoir à un nouveau procédé de purification des enzymes 3&alpha; HSDH et 3 ssHSDH, qui répond mieux aux nécessités de la pratique que les procédés d'extraction et de purification antérieurement connus, notamment en ce que lton obtient ces deux deshydrogénases avec un degré de pureté voisin de ioo %, par un procédé simple, peu coûteux et avec un rendement élevé, les enzymes obtenues convenant parfaitement, entre autres, aux dosages des steroldes, et en particulier aux microdosages des acides biliaires totaux, primaires et secondaires, du sérum et de la bile. Ce nouveau procédé d'extraction et de purification à partir de cultures de Pseudomonas Testosteroni ou d'Escherichia Coli, a pu être mis au point à la suite de la constatation tout- -fait originale de la Demanderesse que les enzymes 3&alpha;HSDH et 3ssHSDH peuvent être purifiées par chromatographie d'affinité ne nécessitant pas l'utilisation du coenzyme NAD. La présente invention a pour objet un nouveau procédé d'extraction et de purification des enzymes 30NDH et HSDH à partir de cultures de Pseudomonas Testosteroni ou d'Escherichia Coli, caractérisé en ce que les cellules de Pseudomonas Testosteroni ou d'Escherichia Coli sont extraites par un tampon dont le pH est voisin de 7, en ce que le surnageant obtenu est saturé par le sulfate d'ammonium, en ce que le précipité brut est redissous dans le tampon précité et dialysé, en ce que l'on chromatographie la solution dialysée sur une colonne de dérivés de cellulose, équilibrée par le tampon de dialyse, en ce que l'on effectue ensuite une chromatographie d'affinité sur un adsorbant constitué par l'oestrone amino-caproate-agarose, en ce que l'on élue et sépare les deux enzymes adsorbées, par des solutions salines neutres de concentration molaire comprise entre 0,5 et 1,5 M, susceptibles d'augmenter les interactions hydrophobes, et en ce que l'on procède éventuellement ensuite à la purification supplémentaire de ces deux enzymes pures séparées, par filtration moléculaire. Conformément à l'invention, les solutions salines neutres susceptibles d'augmenter les interactions hydrophobes, mises en oeuvre pour éluer et séparer les deux enzymes adsorbées, sont avantageusement des solutions de sulfate d'ammonium de concentration molaire comprise entre 0,5 et 1,5 M. Suivant un mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, le tampon d'extraction des cellules de Pseudomonas Testosteroni ou d'Escherichia Coli est avantageusement constitué par du phosphate 0,03 M, pH 7,2, de 1'EDTA 10 M, du glycérol 20 %. Suivant un autre mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, la saturation par le sulfate d'ammonium avant la dialyse est opérée en deux étapes, à savoir : on commence par éliminer les acides nucléiques en saturant par S04(NH4)2 jusqu'à une concentration de l'ordre de 20 %, puis après 12 heures de repos, on centrifuge et, au cours d'une deuxième étape, on augmente la saturation en S04(NH4)2 jusqu'à 75 %. Suivant un autre mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, le précipité brut d'enzymes relargué et redis sous est dialysé contre un tampon avantageusement constitué par du phosphate 0,001 M, de 1'EDTA lo 10 3M, du glycérol 20 % et du (b-mercaptoéthanol 102M. Suivant un autre mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, après dialyse, la solution d'enzymes est chromatographiée sur une colonne contenant de la DEAE-cellulose équilibrée par le même tampon que celui utilisé pour la dialyse, les deux tampons servant à éluer les enzymes étant : -le tampon de dialyse, et le tampon constitué par du phosphate 0,4M, pH 7,2, de l'EDTA 103M, dans des proportions de 300 et de 500 ml pour environ 40 g d'extrait brut d'enzymes déposé sur la colonne de chromatographie. Suivant un autre mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, la colonne de chromatographie d'affinité contenant l'oestrone amino-caproate-agarose est équilibrée contre un tampon avantageusement constitué par Phosphate 0,03M, pH 7,2 EDTA 10 3M Glycérol 20 % Sulfate d'ammonium 1,2M et l'élution et la séparation des deux enzymes 3 D(et et 3ss-HSDH est opérée à l'aide de sulfate d'ammonium à gradient décroissant. Suivant un autre mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, la première fraction de la chromatographie d'affinité contenant la 30(-HSDH est purifiée par a) saturation par S04 (NH4)2 à 75 % b) redissolution dans le tampon phosphate 0,03M, pH 7,2 EDTA 10 M, glycérol 20 % c) gel-filtration sur colonne Sephadex G 100 équilibrée contre le même tampon. Suivant un autre mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, la deuxième fraction de la chromatographie d'affinité contenant la 3 DHSDH est purifiée par a) saturation par S04(NH4)2 à 60 % b) redissolution dans le tampon phosphate 0,03M, pH 7,2 EDTA 10 M, glycérol 20 % c) gel-filtration sur colonne Sephadex G 100 équilibrée contre le même tampon. La Demanderesse a pu établir au cours de ses travaux que les enzymes 3det 3 HSDH purifiées obtenues en mettant en oeuvre le procédé objet de la présente invention, s'appliquent non seulement aux dosages des acides biliaires, mais également aux dosages des stéroïdes en général, ainsi qu'aux dosages des haptènes, et également, pour ce qui concerne l'enzyme 30C HSDH,à la synthèse de l'acide chenodesoxycholique. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. La présente invention vise particulièrement les procédés d'extraction et de purification des enzymes 30(et 3 HSDH, conformes aux dispositions qui viennent d'être énoncées, les enzymes hautement purifiées obtenues par ces procédés, ainsi que les moyens pour la mise en oeuvre de ces procédés et l'utilisation de ces enzymes. L'invention sera décrite de façon plus détaillée dans le complément de description qui va suivre, qui se réfère à un exemple de mise en oeuvre du nouveau procédé conforme à la présente invention, ainsi qu'à des résultats analytiques. Il doit être bien entendu, toutefois, que cet exemple et ces résultats sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention et n'en constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE DE PREPARATION DES ENZYMES 3 ET 3 (3 HSDH 1) Préparation de la poudre cétonique Le sédiment cellulaire des cultures de Pseudomonas Testosteroni (cf. par exemple la Thèse de Doctorat es Sciences de J. BOYER du 9 Octobre 1964 à DERSEILLE) est mis en suspension dans une solution tampon de phosphate de potassium à pH 7,0 (1,5 1 de tampon par kg de sédiment) .- on agite lentement et suffisamment longtemps, de manière à obtenir une suspension uniformément crémeuse. Des quantités aliquotes de cette suspension (250 ml) sont alors versées, à très faible débit, dans 2,5 litres d'acétone à -2O0C placés dans le bol d'un mixer, par exemple d'un "Waring Blendor", en poursuivant l'agitation à petite vitesse. Après avoir réuni toutes les suspensions, on les laisse à -200C pendant une nuit, de manière à permettre une sédimentation des particules. On élimine alors par aspiration la plus grande partie du surnageant. La suspension très dense qui reste est diluée par un volume égal d'acétone à -200C et versée dans de larges entonnoirs Büchner d'acier inoxydable de 33 cm de diamètre, qui sont garnis de deux feuilles de papier-filtre. On lave le résidu avec une quantité supplémentaire d'acétone à -200C puis avec de l'éther également à -2O0C. La galette obtenue est alors retirée du Büchner et sé chée dans une hotte, par pressage sur une épaisse feuille de papier-filtre, de manière à la transformer en une poudre légère, sèche, et qui demeure faiblement colorée en beige. Cette poudre est placée dans de larges boites de Petri qui sont maintenues sous vide, dans un exsiccateur, jusqu'à ce que toute odeur d'acétone ait disparu. La poudre est finalement conservée sous vide à-200C. Dans ces conditions, l'activité enzymatique est stable pendant au moins un an. 2) Extraction de la poudre acétonique 25 g de poudre acétonique sont mis en suspension dans le tampon phosphate 0,03M, pH 7,2 contenant 20 % de glycérol (tampon A). La solution est soumise à agitation douce (par exemple à l'aide d'un agitateur magnétique) pour éviter la formation de mousse. La poudre est ajoutée lentement et progressivement, en pluie, pour éviter la formation d'agglomérats. La suspension est centrifugée (70 000 g x I h) à l'aide de l'ultracentrifugeuse Beckman L35 0 dans le rotor G-35 pendant 1 heure à 30 000 t/min. Le surnageant est recueilli et le culot est remis en suspension dans 100 ml de tampon A , après agitation pendant 2 heures, la suspension est centrifugée comme précédemment (1 h x 70 000 g). L'opération est répétée deux fois. Les surnageants des trois centrifugations sont réunis. La solution enzymatique obtenue a un volume égal à 240 ml. Elle contient 190 unités de 3 bHSDH et 6120 unités de 30(HSDH. L'activité spécifique de la 3 lbest égale à 0,029 U/mg et l'activité spécifique de la 3est égale à 0,69 U/mg. 3) Elimination des acides nucléiques Pour éliminer les acides nucléiques, la solution enzymatique de couleur orange est amenée à une concentration de 20 % de saturation en sulfate d'ammonium par addition de 60 ml d'une solution saturée, neutralisée et refroidie à 40C. Le précipité peu abondant qui est obtenu après 12 heures est éliminé par centrifugation (18 000 g x 1 h) dans une centrifugeuse Beckman J 21 B, Rotor JA14, 13 000 t/min. La solution enzymatique est amenée à une concentration de 70 % de saturation en sulfate d'ammonium par addition progressive et lente de sulfate d'ammonium solide (la solution étant déjà à 20 % de saturation en sulfate d'ammonium, il faut 34 g pour 100 ml pour obtenir une solution à 70 % de saturation). Donc, 102 g de sulfate d'ammonium sont lentement ajoutés aux 300 ml de solution enzymatique. Le pH est mesuré de temps en temps et ajusté avec de l'ammoniaque pure. Un précipité abondant se forme, on le laisse se développer pendant 4 heures. il est recueilli par centrifugation pendant 1 heure à 18 000 g (centrifugeuse J 21 B, Rotor JA14 - 1300 t/min.) 4) Dialyse Le culot obtenu est redis sous dans le minimum de tampon A. La solution obtenue (65 ml) est équilibrée contre du tampon phosphate 1O3M, 20 % de glycérol, 1 % de mercapto-éthanol (tampon B), par dialyse. La dialyse est réalisée dans des tubes de dialyse (Union Carbide). Ces tubes sont soumis à ébullition dans de l'eau désionisée, pendant 15 minutes et rincés très soigneusement à l'eau dés ionisée, avant utilisation. Cette dialyse est conduite pendant 36 heures contre 4 bains d'un litre de tampon B. La molarité est vérifiée à l'aide du conductimètre. 5) Chromatographie sur échangeur d'ions Après ces étapes, le volume de la solution est égal à 72 ml. Elle contient 5616 unités de déshydrogénase 3&alpha;et 149,5 unités de déshydrogénase 3 t. Cette solution est soumise à une chromatographie sur DEAE-cellulose Whatman 52. 50 g de poudre de DEAE-cellulose sont mis en suspension dans 100 ml de tampon phosphate 0,6M, pH 7,2 puis lavés avec 2 litres d'eau désionisée. La colonne (10 x 3 cm) est équilibrée contre 200 ml de tampon B. La molarité est vérifiée à l'aide du conductimètre. Le dépôt de la solution enzymatique est assuré par une pompe péristaltique à débit constant, environ 80 ml à l'heure. Les deux déshydrogénases 3Zet 3 ne sont pas retenues sur cette colonne, alors que l'isomérase à faible molarité est retenue sur DEAE. On voit distinctement le haut de la colonne se colorer en jaune alors qu'à la sortie est recueillie une solution de couleur rose qui contient les deux déshydrogénases. Ces enzymes sortent aussitôt après la solution qui correspond au volume mort de la colonne : environ 56 ml. Un collecteur recueille les frac tions contenant la 3 bet 3et la 3sspour ne pas risquer de diluer la solution enzymatique. Chaque tube contient 7 ml. Le contenu des tubes 8 à 21 est rassemblé.Le volume est égal à 95 ml, la solution recueillie après DEAE contient 4373,5 unités 3&alpha; et 91 unités 3t3. L'activité spécifique de la 3pest égale à 12,83 Umg, celle de la 3 oest égale à 0,23 U/mg. Après avoir lavé la colonne avec 200 ml de tampon B, on peut éluer l'isomérase par un gradient de molarité croissante en phosphate (150 ml de B et 200 ml de tampon phosphate 0,4M ; pH = 7,2)]. 6) Chromatographie d'affinité Aux 95 ml de solution enzymatique contenant les deux déshydrogénases, sont ajoutés 5 ml de tampon phosphate 0,6M, pH 7,2, 20 % de glycérol,pour augmenter la molarité de la solution jusqu'à 0,03M. Cette solution est ensuite amenée à une concentration de 30 % en sulfate d'ammonium en ajoutant 41 ml d'une solution de sulfate d'ammonium saturée et neutralisée. Les 136 ml sont déposés sur la colonne de chromatographie d'affinité (1 = 8 cm, diamètre = 4 cm) dont la phase oestrone amino-caproate-agarose est préparée selon "Methods in Enzymology", 34, part B, pp 555557, 1974. Cette colonne avait tout d'abord été équilibrée en sulfate d'ammonium par 100 ml de tampon phosphate 0,03M, pH 7,2, 20 % glycérol à 30 % de saturation en sulfate d'ammonium 1,2M (Tampon C). Après le dépôt, le lavage est e,fWectué par 200 ml de tampon C et l'élution est réalisée grâce à un gradient négatif en concentration de sulfate d'ammonium et établie entre 200 ml de tampon C et 400 ml de tampon A. Au cours du dépôt et du lavage, les activités déshydrogénases sont contrôlées, la 3eest entièrement retenue sur cette colonne. Par contre, la 3 dest un peu éluée au cours du lavage (saturation de la colonne). Les résultats de l'élution sont donnés dans les Tableaux I et Il ci-après. Le volume des fractions est égal à 11 ml. TABLEAU I 3&alpha; 3ss Numéro des Absorbance Activité/m. Activité spéci- Activité/ml Activité spé Tubes (U.I.) fique (U.I./mg) (U.I.) cifique (U.I./mg) 2 0,13 3 23 4 0,156 3,5 22,4 6 0,183 4,05 22 8 0,198 5,25 26,52 10 0,202 10,2 50 12 0,260 15 72,12 14 0,288 19,2 66,67 0,05 0,174 16 0,323 19,2 59,44 0,75 0,232 18 0,346 14 40,46 0,15 0,58 20 0,347 9,45 27,23 0,4 1,15 22 0,327 4,95 15,14 0,55 1,68 24 0,294 2,25 7,05 0,65 2,20 26 0,234 0,75 3,21 0,75 3,21 28 0,183 0,65 3,56 30 0,132 0,50 3,80 32 0,095 0,20 2,10 34 0,065 0,10 1,54 36 0,047 0,075 1,15 38 0, TABLEAU II BILAN DE LA CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITE 3&alpha; 3ss Action de la- Volume Absor- Activité m. Activité Activité Activité Activi- Activité vage + tube UI/ml UI/ml spécifi- totale UI/ml té spé- totale que UI/mg UI cifique UI UI/mg 1 # 9 230 0,34 5 14,5 1150 10 # 18 98 0,27 19 70 1850 0,04 19 # 23 55 0,35 4,8 7,4 265 0,3 24 # 32 98 0,186 0,9 0.65 3,5 63,5 32 # 36 55 0,05 0,1 7) Filtration sur sel Les deux fractions obtenues (la première contenant la 30C et la seconde contenant la 3 HSDH)sont saturées avec le sulfate d'ammonium à 75 % et à 60 % respectivement. Les précipités obtenus sont dissous dans un faible volume (5 à 8 ml) du tampon A et déposés sur une colonne (15Q x 3 cm) contenant le gel G100 Sephadex, équilibré auparavant contre le même tampon A. 8) Résultats Le bilan total des opérations est résumé dans le Tableau III (en ce qui concerne la 3HSDH) et dans le Tableau IV (en ce qui concerne la 3ss HSDH). TABLEAU III ETAPE DU PROCEDE VOLUME UNITES TOTA- PROTEINE UNITES/ RENDEMENT PURIFICATION LES MG/ML MG PROTEINE TOTAL DE L'ETAPE Extrait brut 650 26 000 52,3 0,79 100 Précipité par sulfate d'ammonium 370 28 200 41,6 1,82 108 108 2,3 à 75 % Dialyse 450 27 200 22,4 3,74 104 96,5 4,75 DEAE : effluent 600 21 600 2,7 13,3 83 80 17 Chromatographie d'affinité : ef- 1 000 14 700 0,17 86,5 56,5 68 110 fluent Précipité par sulfate d'ammonium 30 9 384 2,6 120 36 64 152 à 75 % Sephadex G 100 :: effluent 56 7 100 0,42 300 27,4 76 380 TABLEAU IV ETAPE DU PROCEDE VOLUME UNITES TOTA- PROTEINE UNITES/ RENDEMENT PURIFICATION LES MG/ML MG PROTEINE TOTAL DE L'ETAPE Extrait brut 650 540 52,3 0,017 100 Précipité par sulfate d'ammonium 370 580 41,6 0,037 107 107 2,18 à 75 % Dialyse 450 440 22,4 0,044 81,5 76 2,58 DEAE : effluent 600 366 2,7 0,26 67,5 83 15,3 Chromatographie d'affinité : ef- 416 250 0,18 3,33 46,5 69 195 fluent Précipité par sulfate d'ammonium 6 220 4 4,5 40,7 88 265 à 60 % Sephadex G 100 : effluent 30 165 0,55 10 30,6 75 590 METHODES ANALYTIQUES EMPLOYEES a) Mesures d'activité enzymatique Les mesures d'activité enzymatique ont été effectuées par voie spectrophotométrique à 340 nm dans des cuves de 1 cm thermostatées à 250C et en utilisant le spectrophotomètre BECKEN Acta III. Une unité enzymatique correspond à la quantité d'enzyme formant une micromole de NADH par minute. b) Détermination des protéines Ces déterminations ont été effectuées à 280 nm. c) Détermination des étapes de purification Les différentes étapes de purification ont été contrôlées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide suivant la technique de DAVIS (Ann. N.Y. Sci. 121, 1964, p. 404.) Il résulte de la description qui précède que, quels que soient les modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application adoptés, l'on obtient un nouveau procédé d'extraction et de purification de 3&alpha; et de 3ss HSDH qui présente l'avantage de permettre d'obtenir ces enzymes à un degré de pureté voisin de 100 %, et ceci par un procédé simple, peu comateux et avec un excellent rendement. Les enzymes obtenues conviennent non seulement aux microdosages des acides biliaires, comme il a été signalé plus haut, mais également aux dosages des stéroïdes en général, ainsi qu'aux dosages des haptènes et il s'est avéré que l'enzyme 3 ou HSDH convient particulièrement bien pour réaliser la synthèse de l'acide chenodésoxycholique. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite dans ce qui précède ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 - - Procédé d'extraction et de purification des enzymes 3 MHSDH et 3 ssHSDH à partir de cultures de Pseudomonas Testosteroni ou d'Escherichia Coli, caractérisé en ce que les cellules de Pseudomonas Testosteroni ou d'Escherichia Coli sont extraites par un tampon dont le pH est voisin de 7, en ce que le surnageant obtenu est saturé par le sulfate d'ammonium, en ce que le précipité brut est redis sous dans le tampon précité et dialysé, en ce que l'on chromatographie la solution dialysée sur une colonne de dérivés de cellulose, équilibrée par le tampon de dialyse, en ce que l'on effectue ensuite une chromatographie d'affinité sur un adsorbant constitué par 1 cestrone-amino-caproate-agarose, en ce que l'on élue et sépare les deux enzymes adsorbées, par des solutions salines neutres de concentraticn-molaire ooop. n se entre 0,5 et 1,5M,-susceptibles d'augmenter les interactions hydrophobes, et en ce nue 1 'on procède éventuellement ensuite à la nurification supplementaire de ces deux enzymes pures séparées, par filtration moléculaire. 20 - Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que les solutions salines neutres susceptibles d'augmenter les interactions hydrophobes, mises en oeuvre pour éluer et séparer les deux enzymes adsorbées, sont avantageusement des solutions de sulfate d'ammonium de concentration molaire comprise entre 0,5 et 1,5M. 30 - Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que le tampon d'extraction des cellules de Pseudomonas Testosteroni ou d'Escherichia Coli est avantageusement constitué par du phosphate 0,03M, pH 7,2, de l'EDTA 10 3M, du glycérol 20 %. 40 - Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que la saturation par le sulfate d'ammonium avant la dialyse est opérée en deux étapes, à savoir : on commence par éliminer les acides nucléiques en saturant par S04(NH4)2 jusqu une concentration de l'ordre de 20 %, puis après quelques heures de repos, on centrifuge et, au cours d'une deuxième étape, on augmente la saturation en 504(NH4)2 jusqu'à 75 %. 50 - Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le précipité brut d'enzymes relargué et redissous est dialysé contre un tampon avantageusement constitué par du phosphate O, 001 M, de l'EDTA lo-3M, du glycérol 20 % et du ss-mercaptoéthanol 1O2M. 60 - Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 5, caractérisé en ce que, après dialyse, la solution d'enzymes est chromatographiée sur une colonne contenant de la DEAE-cellulose équilibrée par le même tampon que celui utilisé pour la dialyse, les deux tampons servant à éluer les enzymes étant : -le tampon de dialyse et le tampon constitué par du phosphate 0,4M, pH 7,2, de l'EDTA 103M, dans des proportions de 300 et de 500 ml pour environ 10 g d'extrait brut d'enzymes déposé sur la colonne de chromatographie. 79 - Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la colonne de chromatographie d'affinité contenant l'oestrone amino-caproate-agarose est équilibrée contre un tampon avantageusement constitué par Phosphate 0,03M, pH 7,2 EDTA 10-3M Glycérol 20 % Sulfate d'ammonium 1,2M et l'élution et la séparation des deux enzymes 3o(et 3 ssHSDH est opérée à l'aide de sulfate d'ammonium à gradient décroissant. 80 - Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la première fraction de la chromatographie d'affinité contenant la 3 O(HSDH est purifiée par a) saturation par 504(NH4)2 à 75 % b) redissolution dans le tampon phosphate 0,03M, pH 7,2, EDTA 10-3M, glycérol 20 % c) gel-filtration sur colonne Sephadex G 100 équilibrée contre le même tampon. 90 - Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la deuxième fraction de la chromatographie d'affinité contenant la 3 HSDH est purifiée par a) saturation par 504(NH4)2 à 60 % b) redissolution dans le tampon phosphate 0,03M, pH 7,2, EDTA 10-3M, glycérol 20 % c) gel-filtration sur colonne Sephadex G 100 équilibrée contre le même tampon. 100 - Application des enzymes 3 &alpha;et 3('HSDH obtenues en mettant en oeuvre le procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 9, aux dosages des stéroides. 110 - Application des enzymes 3&alpha;et 3 ssHSDH obtenues en mettant en oeuvre le procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 9, aux dosages des acides biliaires. 120 - Application des enzymes 3&alpha;et 3 HSDH obtenues en mettant en oeuvre le procédé selon l'une quelconque des Revendica tions 1 à 9, aux dosages des haptènes. 130 - Application de l'enzyme 3 &alpha; HSDH obtenue en mettant en oeuvre le procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 9, à la synthèse de l'acide chenodesoxycholique.