Brevet FR2411202A1 — publié le 19790706

La présente invention, due aux travaux de Messieurs Gérard CROUZAT-REYNES, Michel LECUPEUIL-,Philippe CABILLOT, et Madame Nicole LECUREUIL de la Faculté des Sciences Pharmaceutiques de TOURS et du Commissariat 1'Energie Atomique, a pour objet un procédé d'extraction et de purification de la globuline transporteur d'hormones thyroïdiennes TBG contenue dans une fraction de protéines, obtenue à partir d'un melange de plasmas humains et traitee par la méthode 6 de Cohn. On sait cu'il existe trois protéines spécifiques du transport plasmatique des hormones thyroïdiennes : la globuline transporteur d'hormones thyroldiennes (dite thyroxine-binding- globuline) TBG, la préalbumine transporteur d'hormones thyroïdiennes (dite thyroxine-binding-préalbut;ine) et l'albumine Parmi ces trois protéines, la TBG est actuellement considérée comme celle qui transporte le plus d'hormones thyroïdiennes. En conséquence, de nombreux essais d'isolement et de purification de la TBG ont été proposés jusqu'à ce jour Mais, la purification de la TBG présente beaucoup de difficultés du fait que sa concentration dans le sérum sanguin présumé normal est assez faible, c'est-à-dire de l'ordre de 10 à 30 mg/l alors que la concentration totale en protéines est de l'ordre de 70 g/l. Certains des procédés d'extraction et de purification de la TBG se font à partir de fractions de protéines dites frac tions de Cohn, obtenues par la méthode de Cohn selon laquelle on sépare les protéines contenues dans le sérum sanguin par fraction nement à l'aide d'une solution alcoolique (cette méthode est décrite en détail dans le Journal of American Society 1946, 68, 459-475 "Preparation and Properties of Serum and plasma proteRnss A system for the separation into fractions of the prote and lipoprotein components of biological tissues and fluïds") Ainsi, un procédé assez ancien consistait à soumettre des fractions de Cohn à une chromatographie par échange d'ions sur une résine Dowex. Mais, la TBG ainsi obtenue état impure et présentait peu d'affinité pour la thyroxine. Parmi les procédés de purification de la TBss plus récents, tentés jusqu'a présent, on peut citer un procédé selon lequel, aprés une précipitation préalable d'un échantillon de plasma au sulfate d'ammonium, on effectue deux électrophorèses succès sives sur colonne de cellulose en tampon TRIS (trthydroxyaminov méthane) mandate de pH 8,8, suivies d'une chromatographiè sur DEAE (diéthylaminoéthyl) cellulose à pH 7,8 en tampon phosphatez puis une filtration sur gel de Sephadex et enfin, une électropho rese sur gel de polyacrylamide. Mais, la TBG ainsi obtenue présente une capacité de fixation de la thyroxine assez faible. On peut également citer la méthode consistant a soumettre un échantillon de sérum à une dhromatrographie d'affinité sur Sépharose, sur lequel a été préalablement fixée de la thyroxine puis, après fixation de la TBG sur le complexe thyroxine-Sépharose, à effectuer une élution à l'aide de potasse ensuite, on effectue une deuxième chromatographie sur IEAE Séphadex (le Sépharose est un gel d'Agarose sous forme de billes poreuses calibrées , le Séphadex est analogue chimiquement au Sépharose, mais la porosité est adaptée aux différentes séparations selon les masses moléculaires). Mais, par cette méthode, le rendement de purification est assez faible. I1 existe également une autre méthode qui consiste à partir d'un échantillon de plasma qu'on soumet d'abord à une chromatographie d'affinité, puis à une diromatographie d'échange d'ions sur DEAE Sephadex et enfin à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Mais, la TBG obtenue n'est pas pure et contient plusieurs crsntaminants dont l'albumine. On voit donc que cette purification de la TBG pose un certain nombre de problemes. Or, le procédé, conforme à 1' inven- tion, pallie les inconvénients rappelés ci-dessus et nermet d'obtenir une TBG de grande pureté ayant le, même comportement électrophorétique et immunologique que la TBG native. Le procédé d'extraction et de purification de la TBG conforme à l'invention, consiste à partir d'une fraction de protéines obtenue à partir d'un me'langue de plasmas humains et traitée par la méthode 6 de Cohn. Ce procédé se caractérise en ce qu'il comprend successivement : une première étape selon laquelle on soumet ladite fraction de Cohn à une dhromatographie par échange d'ions comportant notamment la mise en contact d'une solution de ladite fraction avec du DEAE Sephadex, puis une élution à 1' aide d'une solution tampon de phosphate et de chlorure de sodium ayant une concentration voisine de 0,13 M en chlorure de sodium ; une deuxième étape selon laquelle on soumet les fractions éluées ainsi obtenues à une caromatographie d'affinité comportant notamment la mise en contact des dites fractions avec une suspension de Sepharose sur laquelle a été fixée de la thyroxine, puis, une élution à l'aide d'une solution de potasse, la concentration en potasse de ladite solution augmentant progressivement de O M à environ 0,004 M au fur et à mesure de l'elution;; une troisième étape selon laquelle on soumet les fractions éluées ainsi obtenues à une deuxième chromatographie par échange d ions comportant notamment la mise en contact desdites fractions avec un gel de DEAE Sephadex A50,puis une élution par une solution de chlorure de sodium dans une solution tampon TRIS NaC1, la concentration en NaC1 de ladite solution croissaIli progressivement d'environ 0,1 M à 0,25 M au fur et à mesure de l'é- lution; enfin, une dernière étape de purification finale des fractions éluées ainsi obtenues. La dernière étape de purification finale peut comporter plusieurs opérations telles que chromatographie de perméation, électro phorèse,etc.... A titre indicatif, mais nullement limitatif, on signale qu'un mode de réalisation préféré de cette dernière étape de purification finale peut comprendre - un premier stade selon lequel on soumet les fractions éluées obtenues à une chromatographie de perméation comportant notamment la mise en contact desdites fractions avec un gel Sephadex G 200, puis une élution par une solution tampon de phosphate 0,05 M et pH 7,5 environ, - un deuxième stade selon lequel on soumet les fractions éluées obtenues à une chromatographie de perméation comportant notamment la mise en contact desdites fractions avec un gel Sephadex G 150, puis une élution à l'aide-d'une solution tampon de phosphate 0,025 X et pH 7,5 environ, -un troisième stade selon lequel on soumet les fractions éluées obtenues à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide et l'on recueille la TBG ainsi purifiée au moyen d'une élution par une solution tampon TRIS 0,06 M NaCl 0,1 M et pH 8,6 environ. De façon plus precise, les différentes étapes successives du procédé de l'invention, s'effectuent de la façon suivante - la première étape de chromatographie par échange d'ions consiste à mettre en contact ladite fraction de Cohn, préalablement diluée, additionnée de thyroxine marquée à l'iode 125 à l'état de traces et ajustée à un pH voisin de 7, avec du DEAE Sephadex-ASO, à filtrer la solution obtenue, à laver le gel de DEAE Sephadex ayant fixé les protéines avec une solution tampon de phosphate 0,05 M et pH 7,5 environ, puis avec une solution tampon de phos phate et de chlorure de sodium de concentration voisine de 0,03 M en chlorure de sodium, à éluer ensuite a l'aide d'une solution tampon de phosphate et de chlorure de sodium de concentration voisine de 0,13 M en chlorure de sodium, à dialyser les fractions éluées ainsi obtenues contre de l'eau distillée, jusqu'à ce que la concentration en chlorure de sodium soit ramenée à environ 0,03 M, à lyophiliser ensuite ladite solution. - la deuxième étape de chromatographie d'affinité consiste, après avoir dialysé la solution obtenue par dissolution de la poudre produite après lyophilisation lors de la première étape, contre une solution tampon de bicarbonate 0,1 M et pH 8,6 environ, à nettre en contact cette solution avec une suspension de Sepha rose 4B sur laquelle on a fixé de la thyroxine, à laver l'ensem- ble avec une solution tampon de bicarbonate, puis à éluer à l'aide d'une solution de potasse, la concentration en potasse de ladite solution augmentant progressivement de 0 M à environ 0,004 M au fur et à mesure de l'élution, à dialyser les frac tions éluées ainsi obtenues contre une solution tampon TRIS 0,06 M NaCl 0,1 M et pH 8,6 environ, enfin, à lyophiliser les fractions ainsi traitées. - la troisième étape de chromatographie par échange d'ions consis te à dialyser la solution, obtenue par dissolution de la poudre produite après lyophilisation lors de la deuxième étape, contre une solution tampon TRIS 0,06 M NaCl 0,01 M et pH 8,6 environ, à mettre en contact la solution ainsi traitée avec un gel DEAE Sephadex A50, préalablement mis en contact jusqu'à équilibre avec tn tampon TRIS 0,06 MNaCl 0,01 Met pH 8,6 environ, puis à éluer à laide d'une solution tampon de TRIS et NaCl, la concen tration de NaCl de ladite solution croissant progressivement de environ 0,01 M à 0,25 M au fur et à mesure de ltélution, enfin à concentrer les fractions éluées ainsi obtenues par ultrafil tration. La dernière étape de purification finale des fractions ainsi obtenues comprend : - un premier stade de chromatographie de perméation qui consiste à mettre en contact les fractions concentrées, obtenues lors de la troisième étape, avec m gel Sephadex G 200 dans un tampon de phosphate 0,05 M et pH 7,5 environ, puis à éluer à l'aide d'une solution tampon de phosphate 0,05 X et pH 7,7 environ, enfin, à concentrer les fractions éluées ainsi obtenues par ultrafiltration;; - un'deuxième stade de chromatographie de perméation qui consiste à mettre en contact les fractions concentrées obtenues avec un gel Sephadex G 150 dans un tampon de phosphate 0,025 M et pH 7,5 envi ron, puis à éluer à l'aide d'une solution tampon de phosphate 0,025 M et pH 7,5 environ, enfin, à lyophiliser les fractions éluées ainsi obtenues. - un troisième stade d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide qui consiste à mettresen contact la poudre, obtenue après lyophilisation avec un gel de polyacrylamide dans un tampon TRIS 0,0049M glycine 0,032 M environ, puis à éluer la TBG à l'aide d'une solution tampon TRIS 0,06 M NaCl 0,1 M et pH 8,6 environ Ainsi, grâce à l'association et la succession dans un ordre bien défini des trois premières étapes de traitement décrites ci-dessus, au choix de la fraction de protéines de départ et au choix de certains composés et de certains paramètres de concentration, qui constituent le procédé de la demande, on obtient une TBG très pure.En particulier, le fait d'effectuer la deuxième étape de chromatographie d'affinité après une étape de chromatographie par échange d'ions, qui a permis d'éliminer préalable- ment beaucoup d'autres proteines, est tout à fait intéressant. De plus, les différentes elutions effectuées respectivement avec une solution de potasse et avec une solution de chlorure de sodium, la concentration en potasse ou en chlorure de sodium desdites solutions allant en croissant progressivement au fur et à mesure de l'élution, permettent d'obtenir de meilleurs résultats. L'solution par la potasse de la deuxième étape en particulier est dégradante or,la rupture de la liaison thyroxine-TBG se fait dès le début du gradient de concentration .Il est donc avantageux dgéluer par un tel gradient et non pas par une solution de concentration fixe de valeur moyenne comme il était pratiqué antérieurement. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit, donnée à titre non limitatif, d'un exemple de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention. EXEMPLE On prend une fraction protéique, obtenue à partir d'un mélange de plasmas humains et traitée par la méthode 6 de Cohn, qui correspond à un volume initial de plasma de 80 litres , cette fraction se présente comme me plate dont la masse est de tordre de 1 kg et qui contient environ 70% de mélange hydroalcoolique à 80C d'alcool, 29,7 % de protéines, et 0,3 % de sels correspondant aux solutions tampons utilisées dans la méthode de Cohn. On met cette pate en suspension dans 5 litres d'eau distillée froide et on mélange le tout énergiquement de façon à le rendre homogène ; on ajuste le pH à me valeur de 7 par addition de soude 2N. On ajoute à 6 litres de cette suspension 3,?53iCi de thyroxine marquée à l'iode 125, cette thyroxine marquée ayant pour roule de servir de traceur interne de façon à caractériser la TBG lors de la mise en oeuvre du procédé. On procède alors à la première étape de chromatographie par échange d'ions On met la suspension en contact avec un échangeur d'ions DEAE Sephadex A50 (diméthyl-amino-éthyl Sephadex A50) pendant lh30 sous agitation à 40C.On verse ensuite la suspension sur la plaque filtrante en verre fritté d'un entonnoir filtrant ; cet entonnoir filtrant est du type "Schott" (volume : 2,7 litres, diamètre de la plaque filtrante : 175 mm, porosité : 2, diamètre équivalent du pore le plus grogs : 40 à 90p). Le diamètre des grains de DEAE Sephadex ASO sec étant de 40 à 120 0', la porosité de la plaque filtrante utilisée est suffisante pour retenir les grains gonflés de DEAE Sephadex et permettre un écoulement rapide du liquide intersticiel Après avoir éliminé le liquide intersticiel par une filtration sous un vide modéré, on lave trois fois le gel de DEAE Sephadex avec un litre de solution tampon de phosphate 0,05 M de pH 7,5 à 4aC. On lave ensuite, à nouveau, le gel quatre fois avec un litre de solution tampon de phosphate de concentration 0,03 M en chlorure de sodium. On procède ensuite à l'solution de la fraction de protéines contenant la TBG, fixée sur le gel DEAE Sephadex, à une température de 40C de la façon suivante Le gel de DEAE Sephadex, contenu dans l'entonnoir filtrant est percolé pendant 14 heures par une solution tampon de phosphate de concentration 0,13 en chlorure de sodium à un debit de 250 iti/heure. On recueille ainsi 3,5 litres d'une solution contenant la quasi-totalité de la TBG correspondant à la fraction de de' part . La solution ainsi obtenue est dialysée pendant 15 heures contre de lteau distillée jusqutà ce que la concentration en chlorure de sodium ne soit pas supérieure a 0,03 M.Elle est ensuite lyophilisee, ce qui permet d'obtenir 20 grammes d'un échantillon de protéines. On procède ensuite à la deuxième étape de chromatographie d'affinité Tout d'abord, on place, dans une colonne, une suspension de 500 ml de Sepharose 4B activée par du bromure de cyanogène ; immédiatement après l'activation, on forme 'n complexe Sépharose- thyroxine par mise en contact pendant 15 heures, à une température de 49C, du gel activé et d'un litre de solution de thyroxine à 1,6 g/l dans la soude 0,02 N. Ensuite, on met ce gel, préalablement lavé et équilibré avec une solution tampon de bicarbonate 0,1 M 2 de pH 8,6, dans une colonne de 20 cm de section et de 30 cm de longueur, réfrigérée à 40C. D'autre part, on prend l'échantillon de protéines, obtenu à la fin de la première étape précédemment décrite, et on le dissout dans un litre d'eau distillée puis on fait dialyser cette solution pendant 15 heures, à 4OC, contre 10 litres de- solu- tion tampon de bicarbonate 0,1 M de pH 8,6. On fait alors passer cette solution dialysée, dont la densité optique est de l'ordre de 12, de haut en bas de la colonne de chromatographie à un débit de 90 ml par heure. Au cours de ce passage, la TBG se fixe sur la colonne par l'intermédiaire de la thyroxine couplée chimiquement avec le Sépharose, alors que les autres protéines ne se fixent pas de façon spécifique sur la colonne. On lave ensuite la colonne avec une solution tampon de bicarbonate jusqu'à ce que la densité optique ne dépasse pas 0,05 (le débit de la solution de lavage est de 100 m1 par heure au debut , puis il est progressivement augmenté et atteint 120 ml par heure en fin de lavage). On procède ensuite à ltélution de la TBG à l'aide d'une solution de potasse, ladite concentration en potasse de la solution variant progressivement au fur et à mesure de ltélution. Pour cela, on relie la colonne à un mélangeur à gradient linéaire con- tenant de l'eau distillée dans un des récipients et une solution de potasse dans l'autre. On effectue l'élution å stade de cette solution de potasse, à un débit de 120 ml par heure, la concentration en potasse passant progressivement de O M à 0,004 M. On mesure la densité optique de la solution qui s'écoule de la colonne et que l'on collecte par fraction de 45 ini. On obtient un 1,pic" de densité optique très peu étalé (4 ou S fractions de 45 nl) qui apparat dès le début du gradient linéaire de concentration de la solution de potasse ; ainsi, les protéines se trouvent en solution dans une concentration très faible de potasse inférieure à 0,002 M. On rassemble les fractions correspondant à ce pic de protéines et on les met à dialyser contre un tampon TRIS 0,06 M NaCl 0,1 M de pH 8,6 pendant 15 à 20 heures à 40C. On procède ensuite à la lyophilisation des fractions ainsi traitées. On procède alors à la troisième étape de chromatographie par échange d'ions. On met un gel de DERME A 50 Sephadex, équilibré en tampon TRIS 0,06 M NaCl 0,1 M de pH 8,6, dans une colonne de 20 cm de section et de 32 cm de longueur, réfrigérée à 40C. On prend la poudre correspondant aux fractions lyophilisées, obtenue à la fin de la deuxième étape décrite précédemment, et on la dissout puis on la dialyse contre uie solution tampon TRIS 0,06 M NaCl 0,1 M de pH 8,6. On obtient ainsi 210 ml d'une solution dont la densité optique est égale à 5,6 . A Q stade du procédé, on ajoute à cette solution une quantité de thyroxine marquée à l'iode 125 telle que l'on ait une radioactivité totale de l'ordre de 30 000 cpm (coups par minute), de façon à pouvoir suivre plus facilement la TBG au cours des opérations suivantes, On fait ensuite passer cette solution dans la colonne, à un débit de 90 ml/h, puis on lave le gel par une solution tampon TRIS NaC1 pendant 48 heures ; à la fin de ce lavage, la densité optique de la solution à la sortie de la colonne est inférieure à 0,03. On procède alors à l'élut ion des protéines fixées sur la colonne au moyen d'une solution de chlorure de sodium dans le tampon TRIS NaCl, la concentration en chlorure de sodium de ladite solution passant progressivement de 0,1 M à 0,25 M au fur et à mesure de l'élution. Pendant llélution, qui s' effectue toujours au neume débit de 90 ml/h, on recueille a' la sortie de la colonne des fractions de 30 ml dont on mesure la densité optique et la radioactivité. Le diagramme d'élution (en traits pleins); c'est-à-dire la courbe de la densité optique 10 en fonction du volume d'élution en ml, est représenté sur la figure 1 Jointe ; on note que le "pic" de radioactivité (en pointillés), assez étroit, coïncide assez bien avec l'un des "pics" de densité optique.On rassemble 15 fractions correspondant à ce pic et l'on obtient ainsi 395 ml d'une solution qui contient environ 80% de la radioactivité totale, c'est-à-dire de la TBG issue de la colonne La solution ainsi obtenue est concentrée par ultrafiltration sur une membrane DIAFLO PM 10 jusqu'à Q que son volume soit de 5,4 ml. On procède alors à la dernière étape de purification finale. Tout d'abord, on effectue un premier stade de chromatographie de perméation On place, dans une colonne de section 5,3 cm2 et de longueur 95 cm, réfrigérée à 40C, un gel Sephadex G 200 dans un tampon de phosphate 0,05 N ae pH 7,5 D'autre part, on prend la solution concentrée obtenue à la fin de la troisième étape, qui présente une densité optique de 25,5, et on la dépose au sommet de la colonne. On procède alors à l'élution par une solution tampon de phosphate de 0,05 M de pH 7,5 a un débit de 12 ml/h, A la sortie de la colonne, on collecte des fractions de 4 ml dont on mesure la densité optique et la radioactivité. La figure 2 jointe montre le diagramme d'élution , on peut constater que- le pic de radioactivité (en pointillés) coïncide avec le pic le plus important de densité optique (en trait plein) ce qui prouve que la purification en TBG est déjà très avancée On sélectionne les fractions correspondant aux volumes d'élution compris entre 290 et 330 ml et on les rassemble, ce qui représente une solution de volume égal à 40 ml, dans laquelle on retrouve environ 80% de la radioactivité déposée sur la colonne. On concentre cette solution par ultrafiltration sur membrane rcAFLo PM 10" jusqu'à ce qu'elle ait un volume de 4,9 mi. On procède ensuite au deuxième stade de la purification finale consistant à effectuer une deuxième chromatographie de perméation On utilise un gel Sephadex G 150 dans un tampon de phosphate 0,025 M de pH 7,5, placé dans une colonne de section 5,3 cm2 et de longueur 92 cm, réfrigérée à 4 C. On dépose au sommet de cette colonne la solution con- centrée obtenue à la fin du premier stade précédemment décrit dont le volume est égal à 4,9 ml et la densité optique à 6,7. Après fixation de cette solution sur le gel, on effectue l'élution à l'aide d'une solution tampon de phosphate 0,025 M de pH 7,5, que l'on fait circuler dans la colonne à un débit de 15,4 ml/h. On recueille à la sortie de la colonne des fractions de 3,90 ml que l'on rassemble et dont on mesure la densité optique et la radioactivité. Le diagramme d'élution est représenté sur la figure 3 jointe. On constate que le pic de radioactivité (en pointillés) coïncide avec un pic de densité optique (en trait plein) pratiquement unique. On donne ci-dessous, un tableau qui donne, pour chaque fraction recueillie à la sortie de la colonne, le rapport P de la radioactivité caractérisant la TBG du fait de sa propriété de lier la thyroxine donc la thyroxine marquée à l'iode 125, sur la densité optique caractérisant la somme des protéines et le volume écoulé à partir du début de l'élution. n fraction 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 . .. . I écoulé 269,1 273 276,9 280,8 284,7 288,6292,5 296,4 300,3 304,2 (mI) P 1859 3081 3550 3640 3820 3720 3520 3374 2905 Ce tableau montre que pour les fractions comprises entre les n03 et n 7, le rapport P peut être considéré comme constant avec me bonne approximation.Ainsi, le diagramme d'élution de la figure 3 et le tableau ci-dessus montrent qu'à ce stade du procédé on obtient une solution qui ne contient pratiquement plus que de la TBG. On prend donc ces cinq fractions, correspondant aux n 3 à 7, on les rassemble et on les soumet à me lyophilisation, on obtient donc une poudre de TBG présentant un degré de pureté élevé. On procède enfin au troisième stade de la purification finale, qui consiste à effectuer une électrophorèse sur gel de polyacrylamide de la façon suivante : on met, dans les huit tubes d'une chambre d'e'lectrophorese (oes tubes présentant un diamètre intérieur de 6 mm) d'abord un gel de fractionnement à 7% d'acrylamide sur une hauteur de 5 cm, puis un gel intermédiaire à 2,5 z d'acrylamide sur une hauteur de 1 cm, enfin, un gel à 2,5 % d'acrylamide contenant en outre la poudre obtenue à la fin du deuxième stade précédemment décrit . On réalise alors l'électro- phorèse dans un tampon TRIS 0,0049 M glycine 0,032 M ; la migration dure i h 30 sous 100 volts. La quantité de protéines traitées pour les huit tubes est de l'ordre de 600 g. Immédiatement après la migration, les gels sont démoulés et découpés en tranches de 3 mn d'épaisseur. On procède alors à l'élution de la TBG hors de Qs tranches de gel à l'aide d'une solution de 1 ml de tampon TRIS 0,06 M NaCl 0,1 M et pH 8,6 par tranche ; on repère la TBG éluee par la radioactivité de la thyroxine radioactive ajoutée en début de procédé On rassemble les solutions d'élution correspondant à la TBG, on les concentre, et on les congèle. On peut utiliser la TBG ainsi obtenue, qui présente un haut degré de pureté, pour préparer un sérum anti-TBG. REVNICATIONS 1. Procédé d'extraction et de purification de la globuline transporteur d'hormones thyroIdiennes (dite thyroxine-binding-globuline) TBG contenue dans une fraction de protéines obtenue à partir d'un mélange de plasmas humains et traitée par la méthode de Cohn, caractérisé en ce qu'il comprend successivement :une première étape selon laquelle on soumet ladite fraction de Cohn à une chromato-graphie par échange d'ions comportant notamment la mise en contact d'une solution de ladite fraction avec du DEAE Sephadex, puis une élution à l'aide d'une solution tampon de phosphate et de chlorure de sodium ayant une concentration voisine de 0,13 M en chlorure de sodium; une deuxième étape selon laquelle on soumet les fractions éluées ainsi obtenues à une chromatographie d'affinité comportant notamment la mise en contact desdites fractions avec une suspension de Sepharose sur laquelle a été fixée de la thyroxine, puis, une élution à l'aide d'une solution de potasse, la concentration en potasse de ladite solution augmentant progressivement de 0 M à environ 0,02 M au fur et à mesure de l'élution ; une troisième étape selon laquelle on soumet les fractions éluées ainsi obtenues à une deuxième chromatographie par échange d'ions comportant notamment la mise en contact desdites fractions avec un gel de DEAE Sephadex A 50, puis une élution par une solution de chlorure de sodium tampon TRIS NaCl, la concentration en NaCl de ladite solution croissant prpgressivement d'environ 0,1 M à 0,25 M au fur et à mesure de l'élution ; enfin, une dernière étape de purification finale des fractions éluées ainsi obtenues. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la dernière étape de purification finale comprend un premier stade selon lequel on soumet les fractions éluées obtenues à une chromatographie de perméation comportant notamment la mise en contact desdites fractions avec un gel Séphadex G 200, puis une élution par une solution tampon de phosphate 0,05 M et pH 7,5 environ. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la dernière étape de purification finale comprend un deuxième stade selon lequel on soumet les fractions éluées obtenues à une chromatographie de perméation comportant notamment la mise en contact desdites fractions avec un gel Sephadex G 150, puis une élution à l'aide d'une solution tampon de phosphate O,025 M et pH 7,5 environ. 4. Procede selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérise en ce que la derniere étape de purification finale comprend un troisième stade selon lequel on soumet les fractions éluées obtenues à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide et l'on recueille la TBG ainsi purifiée au moyen d'une élution par une solution tampon TRIS 0,06 M NaCl 0,1 M et pH 8,6 environ. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la première étape de chromatographie par échange d'ions consiste à mettre en contact ladite fraction de Cohn, prealablement diluee, additionnée de thyroxine marquée à l'iode 125 à ltétat de traces et ajustée à un pH voisin de 7, avec du DEAE Sephadex A50, à filtrer la solution obtenue, à laver le gel de DEAE Sephadex avant fixé les protéines avec une solution tampon de phosphate 0,05 M et pH 7,5 environ, puis avec une solution tampon de phosphate et de chlorure de sodium de concentration voisine de 0,03 M en chlorure de sodium, à éluer ensuite à l'aide d'une solution tampon de phosphate et de chlorure de sodium de concentration voisine due 0,13 M en chlorure de sodium, à dialyser les fractions éluées ainsi obtenues contre de l'eau distillée, jusqu'à Q que la concentration en chlorure de sodium soit ramenée à environ 0,03 M, à lyaphiliser ensuite ladite solution. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la deuxième étape de chromatographie d'affinité consiste, apres avoir dialysé la solution obtenue par dissolution de la poudre produite après lyophilisation lors de la première étape ,contre une solution tampon de bicarbonate 0,1 M et pH 8,6 environ, à mettre en contact cette solution avec une suspension de Sepharose 4B sur laquelle on a fixé de la thyroxine, à laver L'ensemble avec une solution tampon de bicarbonate, puis à éluer à l'aide d'une solution de potasse, la concentration en potasse de ladite solution augmentant progressivement de 0 M à environ 0,004 M au fur et à mesure de ltélution, à dialyser les fractions éluées ainsi obtenues contre une solution tampon TRIS 0,06 M NaCl Q,1 M et pH 8,6 environ, enfin, à lyophiliser les fractions ainsi traitées. 7. Procédé selon L'lue quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en Q que la troisième étape de chromatographie par échange d'ions consiste à dialyser la solution, obtenue par dissolution de la poudre produite après lyophilisation lors de la deuxième étape, contre une solution tampon TRIS Q,06 M NaCl 0,01 M et pH 8,6 environ, à mattre en contact la solution ainsi traitée avec un gel DEAE Sephadex A50, préalablement mLs en contact jusqu'à équilibre avec un tampon TRIS 0,06 Y NaCl 0,01 M et pH 8,6 environ, puis à éluer à l'aide d'une solution tampon de TRIS et Nazi, la concentration de NaCl de ladite solution croissant progressivement d'environ 0,01 N à 0,25 M au fur et à mesure de ltélution, enfin à concentrer les fractions éluées ainsi obtenues par ultrafiltration. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que le premier stade de chromatographie de perméation de la dernière étape de purification finale consiste à mettre en contact les fractions concentrées, obtenues lors de la troisième étape, avec tri gel Sephadex G 200 dans un tampon de phosphate 0,05 M et pH 7,5 environ, puis à éluer à l'aide d'une solution tampon de phosphate 0,05 M et pH 7,7 environ, enfin, à concentrer les fractions éluées ainsi obtenues par ultrafiltration. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisé en ce que le deuxième stade de chromatographie de perméaticn de la dernière étape de purification finale consiste à mettre en contact les fractions concentrées, obtenues lors du premier stade, avec un gel Sephadex G 150 dans un tampon de phosphate 0,025 M et pH 7,5 environ, puis à éluer à l'aide d'une solution tampon de phosphate 0,025 M et pH 7,5 environ, enfin, à lyophiliser les fractions éluées ainsi obtenues. 10. procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, caractérisé en ce que le troisième stade d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide de la dernière étape de purification finale consiste à mettre en contact la poudre, obtenue après lyophilisation lors du deuxième stade, avec un gel de polyacrylamide dans un tampon TRIS 0,0049M glycine 0,032 Menviron, puis à éluer la TBG à l'aide d'une solution tampon TRIS 0,06 M NaCl 0,1M et pH 8,6 environ.