Brevet FR2400204A1 — publié le 19790309

L'invention concerne un procédé pour détecter des macromolécules caractéristiques biologiquement et en déterminer la quantité, et concerne en particulier un procédé utilisant des bactéries comme particules spécifiques pour cette détection et cette détermination de quantité Les principaux attributs de toutes les réactions immunologiques sont le spécificité et la sensibilité.La spécificité d'une réaction immunologique est telle que partir dsun mélange donné, complexe, de molécules on peut détecter la présence d'une molécule ou diune classe de molécules spécifique dans ce mélange De plus, en utilisant la sensibilité de la réaction immunologique, et suivant la technique particulière employée cette détection peut être obtenue sur des quantités de macromolécules extremement faibles- Par exemple il est possible de distinguer les isomères d'un composé (Landsteiner, K et J v d.Scheer J Exp Med., 50 407, 1929) et dans ce sens. la spécificité de la méthode immunologique permet meme de faire la distinction entre les dérivés ortho- ou méta- substitués d'un noyau benzènique (Boyds W C., Fundamentals of Immunology Interscience Publ., Inc N Yo, 1947, p 102), ainsi qu'entre des dérivés di- et trisubstitués du benzène. (Boyd, W C, op. cit. ; p 105). Au niveau macromoléculaire, il est possible de faire la distinction entre des protéines de différentes espèces animales, comme on le fait en immunologie de laboratoire et clinique (Boyd, W. C. ; op. cit. p 120). Bien que l'on examine la majorite des macromolécules d'après les variations de la réaction de précipitation (Mancini G. et alto 1965, Immunochemistry 2 : 235), on peut aussi utiliser les variations de la réaction d'agglutination Par exemple, des particules d'un véhiculeur inerte tel que, la bentonite (Bozicevitch, J., Tobie, J. E., Thomas, EH. a Hoyem H. M & Ward S. B 0 Un test de floculation rapide pour la diagnose de la trichinose. Publ. Hlth. Rep. (Wash.) 66 : 806 à 814), le polystyrène (Singer J.M et Plotz C.M, Am. J. Med. 1956. 21 : 888 à 893), et diverses cellules de globules rouges de l'animal (Middelbrook G et Dubos R., Exper. Med. 1948, 88 : 521 , Nater E., Bact. Rev., 1956, 20 : 166a Boyden S. V., J. Exp. Med, 1951,- 93 : 107 r Stavitsky A. B., J Immunol., 1954, 72, 360 à 368), ont été utilisées dans des réactions d'agglutination.Toutes ces réactions sont des agglutinations passives, en ce sens que la particule qui agglutine est simplement un véhiculeur des agents immunologiauement réactifs qui ont été placés à cet endroit soit par adsorption (Stavitscky A. B J Immunolog. 1954, op. cit.; Singer J.M et Plotz C.M., Amer J Med - op citez ou par accouplement chimique (Goodfriend T.L et al 1964 Science, 144 : 1344) et qui n'est pas lui-meme directement intéressé dans la réaction immunologique Les réactions de précipitation telles que celle que l'on effectue habituellement dans des milieux sous forme de gels demandent de nombreuses heures d'incubation avant que l'on obtienne le résultat final, sont limitées aux antigenes complets et ne présentent pas la sensibilité voulue dans de nombreuses opérations diagnostiques quand on les emploie Les examens radioimmunologiques permettent d'évitera en partie, le facteur temps; arrivent a améliorer la sensibilité, mais présentent un certain nombre de facteurs technologiques indésirables tels que les risques courus en travaillant avec des matériaux radioactifs, et le coût élevé de l'appareil- lage qui s'y ajoute. La fixation diimmunoglobuline G de nombreuses espèces animales, y compris l'espèce humaine, au moyen de la portion Fc de la molécule sur des souches de Staphylococcus aureus contenant de la protéine A a été démontrée. (Sjoquist et al., Cold Spring Harbor Symp. quant.Biol., 32 : 577 1967 ; Forsgren A and Sjoquist J., J. Immunol., 97 : 822, 1966 ; Kronvall, G and Williams R C, Jr., J Immunology, 103 : 828, 1969 , and Kronvall G and Frommel D., Immunochemistry. 7 : 124, 1970) Cette fixation ne doit pas être considérée comme une simple adsorption ou absorption car l'immunoglobuline G, principalement, a fait apparaltre une telle fixation, et apparemment seulement par l'intermédiaire du Fc de la molécule d'immunoglobuline G (IgG). I1 a été démontré par exemple que si 1 Ig G était un anticorps dirigé vers les polysaccharides d'un type spécifique de pneumococcusR il se produira une agglutination spécifique mixte entre les cellules sensibilitées a' l'anticorps et le pneumocoque (Kronvall G. et Williams R.C Jr op cil :: De même, on a utilisé la capacité de liaison 1a G du staphylococcus contenant de la protéine A pour servir comme absorbant en phase solide pour séparer une liaison anticorps-antigène de l'antigène libre dans une recherche radio-immunologique de l'alphafétoprotéine (Jonsson S et Kronwald G J Immunolog 1 414-415, 1972), et de plus dans une recherche radio-immunologique de l'antigène et l'anticorps hépatite B (Figenscban K J et Ulstrupo J C., Acta path microbiol. Scande Section B, 82 : 422à 428, 1974). La présence dans le sérum humain d'une facteur rhumatoide (RF) a été bien établie ( Natnig, J. B., et al., Rheumatoid Arthritis (Ed. by W. Miiler) p. 343, Academic Press, London, 1971 Natnig, J. B. andTurner, M. W.-, 1970, Nature (long) 225 : 855). Le RF a été identifié sou la forme d'une réponse anticorps , dans la plupart des cas, de la classe Ig M, mais dans certains cas de la classe Ig G, quoique, eans tous les cas avec réactivité à l'égard de la portion Fc ae la molécule Ig G I1 est apparu que cette aptitude de ces cellules microbiennes contenant de la protéine-A, pourrait servir en raison de leur aptitude à fixer de façon préférentielle 1 Ig G, et aussi puisque cette liaison est orientée sur la portion Fc de la molécule Ig G, laissant ainsi la partie Fab exempte d'activité anticorps, à constituer un test d'agglutination très utilisable pour identifier beaucoup antigènes et en indiquer la quantité.Par exemple la simple adsorption de gamma-globuline sur des particules de latex dans la préparation d'un test pour le facteur rhumatoide, tel qu'il est couramment pratiqué, on peut-assurer en aucune façon que, seules, les molécules Ig G sont adsorbées sur la surface, ce qui réduit nettement aptitude à fournir un degré élevé de sensibilité et de spécificité.D'autre part, il est apparu que 13utilisation de particules microbiennes contenant de la protéine A, - sensibilisées avec des fragments Fc isolés de Ig G pourraient servir de façon préférentielle pour un examen spécifique détectant le RF. Ainsi, la fixation préférentielle sur la partie Fc de Ig G au moyen de particules microbiennes contenant de la protéine A donne une assurance contre l'adsorption et/ou la fixation nonwspécifique de molécules qui se produit avec le latex et autres systèmes de détection par agglutination utilisés jusqu'ici. I1 est aussi apparu que la fixation de l'anticorps Ig G sur des particules contenant de la protéine A donnerait une liaison plus énergique et qu'on obtiendrait par suite une préparation plus stable que sur des particules de latex ou de bentonite ou des particules similaires utilisées jusqu'ici dans la profession, où l'adsorption sur la surfaire est faible, et ou on obtient une sépia ration du produit biologique sensibilisé pour ces particules, à moins que l'on observe des conditions de haute précision du pH et de la concentration ionique du tampon, De plus;; liinstallation du laboratoire la durée et le travail nécessaires pour réaliser des préparations agglutinbles pour des tests de 'diagnostic seront réduits du fait que les part cules microbiennes contenant la protéine A fixeront préférentielle ment lWIg Go et qu'en conséquence on pourra utiliser le sérum prélevé sur un animal ou un etre humain et contenant 1-' anticorps pour la sensibilisation sans quJil soit nécessaire de procéder a' des travaux de laboratoire laborieux et onéreux pour retirer les immunoglobulines du sérum, afin de les concentrer sur du latex ou d'autres particules utilisées jusqu'ici. L'invention a en conséquence pour objet de réaliser un procédé rapide peu coûteux, hautement spécifique pour détecter des molécules biologiquement caractéristiques et en déterminer la quantité. Elle a aussi pour objet a) de réaliser un procédé rapide peu couteux et spécifique (grâce aux particules sensibilisées au Fc) -pour détecter et déterminer la quantité de RF dans des matières d'origine biologique essayées. b) de réaliser un procédé d'agglutination sensibilisé aux anticorps bactériens, contenant de la protéine A, qui demande moins de temps, mais qui est aussi fidèle et sensible que ceux que l'on utilise couramment pour détecter des macromolécules biologiques et en déterminer la quantité Un avantage de l invention réside en ce que la détection et la détermination de la quantité de macromolécules biologiquement caractéristiques peuvent etre facilement exécutées dans ce procédé, par un personnel relativement peu expérimenté Un autre avantage réside en ce qu en utilisant des frag- ments de parois de cellules de bactéries contenant la protéine Aon évite les complications ultérieures possibles de la dégradation de cellules entières. autolytique ou exogéne et la perte a'activité L'invention sera mieux comprise en regard de la description ci-après et des exemples qui suivent donnés sans aucun esprit de limitation On a réalisé suivant l'invention un procédé pour détecter avec précision et déterminer quantitativement la présence de macromolécules biologiques qui sont caractéristiques pour le diagnostic d' affections L'invention permet de détecter et de déterminer la présence et la quantité de molécules biologiquement caractérist- ques en utilisant des staphylocoques contenant de la protéine A qui fixe par l'intermédiaire de la portion Fc de la molécule d'anti corps spécifique (immunoglobuline G) -qui est dirigée vers la macromolécule que l'on désire détecter, dans une réaction directe d'agglutination passive On a aussi déterminé que la détection d'une macromolécule dont l'identification et le dénombrement sont désirés est nettement améliorée si l'on sensibilise les staphylo= coques avec un anticorps purifié obtenu a partir de colonnes immunoabsorbantes. Dans ces opérations le point terminal du dénombrement d'une molécule que I'on identifie est obtenu en effectuant une série de dilutions successives du matériel d'essai mélangé avec un volume égale staphylocoques sensibilisés La derniere dilution qui donne une agglutination visible multipliée par un facteur de détection des particules sensibilisées (la quantité minimum que la particule soit capable de détecter) donnera une valeur quantita tive pour l'échantillon soumis å l'essai L'invention est aussi destinée a détecter et a affectuer une semi-détermination de la quantité présente de facteur rhumatolde ( RF ) Dans ce procédé les cellules microbiennes contenant la protéine A sont sensibilisées avec un fragment Fc d Ig G humaine La semi-détermination de la quantité est obtenue par des séries de dilutions de la matiere a examiner qui est mélangée avec un égal volume de cellules microbiennes sensibilisées au Fc Le point terminal ou titre0 est la dilution la plus élevée du sérum d'essai qui donne une agglutination visible des particules En résumé, l'invention concerne des combinés de cellules microbiennes contenant de la protéine A et d'immunoglobuline, ces combinés étant employés dans un examen immunoslogique nouveau sensible, qui est capable de détecter la présence d'antigènes pour lesquels il existe un anticorps et d'en déterminer la quantité0 qu'il soit d'origine animale ou humaine et étant employés aussi pour détecter le facteur rhymatoide et d'en déterminer la quantité Le terme antigène tel qu'il est utilisé ci-dessus est considéré comme comprenant toute macromolécule naturelle ou synthétique, qui réagit avec un anticorps spécifique Le terme cellule-microbienne contenant de la protéine A est considérés dans l'utilisation que lon en fait ici, comme comprenant toute cellule microbienne contenant de la protéine A qu'elle soit utilisée sous la forme de cellule entière de fragment de la paroi d'une cellule, membrane cellule, ou toute substance ou dérivé soluble des éléments ci-dessus. Le terme combiné de cellule microbienne contenant de la protéine A et immunoglobuline, tel qu'il 'est utilisé ci-dessus, s'applique à toute molécule entière d'immunoglobuline, fraction d'immunoglobuline en dérivant, ou sérum total contenant des molécules d'immunoglobuline. Les exemples suivants sont donnés à titre d'illustration seulement Exemple 1 On ensemence avec une culture de S. aureus contenant de la protéine A, souche G 128, dans 250 mi de bouillon Todd Hewitt, contenu dans un Erlenmeyer de I litre, et agite dans une agitateur à va et vient pendant 9 heures à 350C par incubation. On fait tourner rapidement, à 3000 tmin, la culture ainsi obtenue pendant 45 min à 50C, remet en suspension dans une solution saline et ajuste pour une lecture au néphélomètre Mac Farland de # 9. Les cellules en suspension dans la solution saline sont ensuite rechauffées, au bain-marie maintenu à 800CI pendant 15 min avec agitation constante, et refroidies immédiatement après. On lave la suspension de culture de S. aureus ainsi préparée, environ 5 à 7 fois par centrifugation, puis la remet en suspension en utilisant comme tampon un phosphate pour avoir un pH de 7,3 (PBS). On met en suspension 10 mg de la suspension de cellules lavées, telle qu'elle a été préparée ci-dessus, dans 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate, à pH 7,4 (PBS), et ajoute à cette suspension 0,2 ml d'une préparation de fragment Fc d'immuno-- globuline humaine Ig G préparée suivant le procédé décrit par Adelman et al. (J. Exptl Med., 112 : 203, 1960). Après 10 min d'agitation à la température ambiante, on centrifuge le mélange à 5000 tmin, à froid, et lave le culot trois fois avec PBS et enfin remet en suspension dans 5 ml de PBS, La préparation peut être utilisée telle que, ou peut être traitée avec quelques gouttes d'un colorant dilué, tel que la Safranine qui sert à donner une couleur codée à la préparation et agit aussi comme aide visuelle pour détecter le résultat final de la réaction d'agglutination. Afin de démontrer que la fraction Fc était en fait, accouplée avec les microcoques contenant la protéine A utilisés dans cet exemple, et a ainsi acquis l'aptitude de détecter le facteur rhymatoide quand il est présent dans des sérums0 et aussi pour démontrer l'augmentation de la spécificité de cette préparation de cellules portant de la protéine AE sensibilisée au Fc pour le facteur rhumatoïde, on a analysé la série suivante d'échantillons de sérums par cinq méthodes. L'analyse "Behring" a été réalisée en utilisant le test-type du facteur rhumatoïde "Rapi/tex" (Behring Diagnostics0 Somerville N. J). La colonne désignée "Hyland" a été obtenue en accord avec les directives d'un réactif de détection du facteur rhumatolde, "RA-TEST" (Hyland Division Travenol Laboratories Costa Mesa, Calif). Les déterminations au Fc représentent le matériel préparé comme il est décrit ci-dessus, et les titres Waaler-Rose représentent les agglutinines du facteur rhumatoldes, Le numérateur indiqué ici ayant été déterminé au moyen d'un antigène gammaglobuline humaine sensibilisée au tatex, et le dénominateur ayant été déterminé au moyen d'un antigène gamma-globuline de lapin sensibilisée. La diagnose du patient a été indiquée quand elle est connu. I1 ressort très nettement de cette série que l'on a réalisé une préparation utilisant un Fc accouplé avec une particule contenant de la protéine As qui fonctionne facilement comme détecteur du facteur rhumatoïde On peut voir aussi que dans d'innombrables cas, spécialement ceux où il n'existe pas un aspect clair pour le-diagnostic d'un arthrite rhumatoldeD le degré d'agglutination est plus souvent absent ou diminué avec le matériel préparé avec Fc qu'avec des réactifs tests de Hyland ou meme de Behring. RESULTATS COMPARATIFS DES TESTS D' GGLUTINATION DU FACTEUR RHUMATOIDE N0 de code de Titre l'échantillon Behring Fc Hyland Waaler- Diagnose rose 82-80. E - - - 82-80 F +++ +++ 82-80 G - - 82-80 H ++++ f+++ ++++ 640/160 arthritis 82-80 I ++++ + 82-80 J - - - hyper gamma 82-80 X ++++ ++++ f+++ 1280/160 arthritis 80-82 L ++++ + ++++ 640/320 82-80 M - - No de code Titre de l'éChan~ Behring Fc Hyland Waaler- Diagnose tillon rose 82-80 N - - - 82-80 0 ++++ ++++ ++++ 640/1280 82-80 P - - 160/320 arthritis 82-80 Q - - ++ carcinome de la prostate 82-80 R - - -~ 82-80 S - - 82-80 T - - - carcinome du penis 82-80 U ++ +/- ++ 82-80 V - - + hyper gamma, cirrhosis 82-80 W - - *** hyper gammas infil tration pleurale 82-80 X +/- - -++ hyper gamma, cirrhosis 82-80 Y - - ++ hyper gamma7alcooli- que 82-80 Z ++++ ++++ ++++ 2560/640 tina synamitis 82-80 AA - + + hyper gamma 82-80 AB +/- - - hyper gammas anemia hepatomia 82-80 AC + - ++ hyper gamma2 cirrhoses 82-80 AD - - - hyper gammas alsin 82-80 AE +++ + ++++ hypergamma, jaunisse 82-80 AF - ++++ + hyper gamma 82-81 A ++ + ++ hyper gamma cirrhosis 82-81 B - - - saignement gastro intestinal 82-81 C - - - VDRL R-2 82-81 D - - + VDRL R-2 82-81 E - - VDRL R-2 82-81 F - - - VDRL WR 82-81 G - - - VDRL R-2 82-81 H - - - VDRL R-2 82-81 T - - - VDRL'WR 82-81 J - - - VDRL WR 82-81 K - - - VDRL WR 82-81 L - - - VDRL WR 82-81 M - - - VDRL WR 82-81 N - + ++ 82-81 0 - - + carcinoma de la prostate 82-81 P - - ++ carcinoma de la prostate 82-81 Q - - - VDRL WR 82-81 R - - - VDRL R-l 82-81 S - - +++ VDRL R-2 82-81 T - - - VDRL WR 82-81 U - - - VDRL WR 82-81 V - - + Cirrhosis 82-81 W - - - VDRL WR 82-81 X - - - VDRL R-2 82-81 Y - - - VDRL R-2 82-81 Z - - - N de code Titre de l'échan- Behring Fc Hyland Waaler- Diagnose tillon rose 82-81 AA - - - Jaunisse Obstructive 82-81 AB - - - VDRL WR 82-81 AC - - - Carcinome de la prostate 82-81 AD - - - VDRL R-2 82-81 AE + + ++ VDRL R-l 82-81 AF - - - VDRL R-l 82-81 AG - - ++ VDRL R-4 82-82 V - - = R/O collagen dis. 82-82 W - - 82-82 X - - " hyper gamma 82-82 Y - - = BPH 82-82 Z ++++ ++++ ++++ 2560/2560 arthritis 82-82 AA - - - hyper gamma monocy topenia 82-82 AB - - hyper gamma 82-82 AC - - - VDRL WR 82-82 AD - - - VDRL WR 82-82 AE - - - VDRL R-2 82-82 AF - - - VDRL R-1 82-82 A +++ + +++ -/60 82-82 B - - - 82-82 C ++++ ++++ ++++ -/160 R A 82-82 D ++++ ++++ ++++ -/160 R A. 82-82 E ++++ ++++ ++++ R A. 82-82-F ++++ ++++ ++++ R. A 82-82 G ++++ ++++ ++++ -/640 R A. 82-82 H ++++ ++++ ++++ -/320 R. A. 82-82 J - - 82-82 K - - 82-82 L ++++ ++++ ++++ -/512 R. A. 82-82 M ++++ ++++ ++++ -/160 R. A. 82-82 N - 82-82 P + + 82-82 Q +++ +++ +++ R. A. 82-82 R ++++ ++++ ++++ -/160 R. A. 82-82 S ++++ ++++ ++++ -/320 R. A. 82-82 T +++ +++ +++ -/80 Ro A. 82-82 U ++++ ++++ ++++ R. A. 82-83 B - - 82-83 C ++ ++ +++ 82-83 D - - 82-83 E - - + 82-83 F ++++ ++++ ++++ 1280/neg. 82-83 G ++++ ++++ ++++ 82-83 H - - 82-83 I - - + Hyper gamma 82-83 J - + ++ 82-83 K - - 82-83 L - - + hypper gamma, hepatitis 82-83 M - - - hyper gamma 82-83 N - - + 82-83 0 - - - VDRL R-2 82-83 P - - hydrothorax RF ( 82-83 Q - - = carcinome du penis N de code Titre de l'échan- Behring Fc Hyland Waaler- Diagnose tillon rose 82-83 R 82-83 S - - - carcinome de la prostate 82-83 T + ++ +++ hyper gamma2 affec tion hépatique 82-83 U + + ++ hyper gamma foie d alcoolique 82-83 V - - ++ hyper gamma, AVH 82-83 W ++ - + hyper gamma 82-83 X - - - hyper gamma, cirrhosis 82-83 X - + ++ hyper gamma, cirrhosis 82-83 Z - - - VDRL + 82-83 AA - - - carcinome du penis 82-83 AB - - - carcinome de la prostate 82-83 AC - - +/ 82-83 AD 71-43 T ++ ++ ++ 320/320 cirrhosis 71-43 R 1?l ++ ++++ 2560/2560 rhumatisme articu laire 71-43 F +++ +++ ++++ 1280/2560 AVH 71-43 E ++++ +++ ++++ 160/320 affection alcoolique du foie 71-43 D ++ ++ +++ 160/neg. rhumatisme articu laire 71-43 S ++++ ++++ ++++ 71-43 H + + ++ 80/neg. CRF 71-43 G - - 71-43 U - - - 80/neg. CVA 82-94 K ++ t +++ 640/nego Arthritis 82-94 L 82-94 N - + ++ 82-940 +++ ++ +++ 640/40 82-94 P - + ++ 64Q/320 Cellulitis - + + + + ++ 82-94 T ++++ ++++ ++++ 320/neg 82-94 U +++ +++ +++ 320/640 Cirrhoses 82-94 V +++ ++ +++ 640/640 71-43 X + + ++ 1600/40 AVH -82-94 X ++ + ++ Arthritis (neg ) 71-43 Y ++ + +++ 320/320 Cirrhosis 82-94 Z ++ ++ ++ 71-43 M - + + 82-94 AB - - hyper gamma, hématu rie aigue 71-44 A - + ++ 160/neg. asthme bronchique 82-94 AD - + ++ 82-94 A ++++ ++++ ++++ 82-94 AF - - 71-43 Q ++ + ++ 160/320 71-44 C + + ++ 320/80 82-94 AI +++ +++ +++ anemia N de code Titre de 1'échan- Behring Fc Hyland Waaler- Diagnose tillon rose 71-43 P + + 1+ 160/20 alcoolisme 71-44 B + + + 320/320 cirrhosis 82-95 D +++ ++ +++ 1280/160 arthritis 71-43 N ++ ++ ++ 80/neg.R/O, dermatomyasitis 82-95 F +++ +++ ++++ 640/1280 - .82-95 G Y - 82-95 H - - 71-44 P ++++ +++t ++++ 640/640 hépatite chronique 71-44 N ++++ ++++ ++++ 1280/640 hépatomégalie 71-44 M - + ++ 160/neg R/o SLE 71-44 K + + ++ 640/320 AVH 71-44 Q + + ++ 640/640 82-95 A - - 82-95 N ~+/- - + 82-95 O ^ hypergamma abcès 82-95 P - - 82-95 Q - - - carcinome de la prostate 82-95 R - + + 160/20 82-95 S - - + 160/320 arthritis 71-44 L ++ ++ +++ 320/neg. foie alcoolique 71-44 J + + ++ 160/160 pancratitis 71-44 H + + ++ 320/320 71-44 G ++ + ++ 320/80 cirrhosis 71-44 F ++ + +++ 2560/1280 rhumatisme articu laire 71-44 D - + ++ 160/160 alcoolisme 71-44 E + + ++ 640/160 goutte 82-95 AA - - - carcinome de la prostate 82-95 AB - + ++ hyper gamma 82-95 AC - - +/- gyper gamma 82-95 AD - - - carcinome de la prostate 82-95 AE - - - hyper gamma, alcooli que 82-95 AF - + ++ hyper gamma, affec tion hépatique Si l'on regard les sérums qui se montrent nettement négatifs à tout degré d'agglutination au test Behring et au test Fc1 mais où le test Hyland donne un certain degré d'agglutination, on trouve 18 de ces spécimens sur 189. Ces 18 spécimens se répartissent en les suivants qui sont nettement non rhumatismaùx d'après les meilleurs éléments de jugement d'après les titres de Waaler Rose, la détermination-clinique et le de faut total d'agglutination aussi bien au test Behring qu'aux particules Fc Carcinome 3 VDRL positif 3 cirrhose 3 infiltration pleurale 1 alcoolique 1 hyper-gamma 3 divers 4 Si llon compare les résultats Hyland avec les résultats Behring, on trouve que dans 34, 4 % des cas ou sur 65 syr 189 spécimens examinés, le Hyland donne toujours une plus forte avidité d'agglutination que le Behring.Si l'on compare le Hyland avec les particules sensibilisées au FcS les résultats montrent que le Hyland donne un degré d'avidité de réaction plus élevé dans 40,2 % de tous les sérums examinés, soit 76 sur 189. Ces chiffres correspondent avec un rapport de Mac Sween et colle (Jal of Clin. Patch. page 368, vol 27/1974) où il est montré que le test Hyland RD donne le plus faible pourcentage de corrélation avec les sérums Waaler Rose-négatifs ; en d'autres termes, ctest le moins spur de tous les tests RF étudiés du fait qu'il donne ce qu'on peut appeler de faux positifs avec des sérums négatifs avec Waaler-Rose. Ces chiffres renforcent l'amélioration de spécificité en accord avec l'affirmation (Ilter and Turner, Clin exp. Immunology 1973, 15, 93 à 101) d'après laquelle c'est la portion Fc qui réagit spécifiquement avec le facteur rhumatoïde et en conséquence, cette préparation assure ainsi une nette amélioration de la spécificité et donne un nombre réduit de faux positif s. La préparation de cellules sensibilisées par le Fc utilisait dans cet exemple des cellules intactes, mais on peut aussi utiliser des fragments de parois de cellules contenant de la protéine A d'une manière similaire à ce qui est décrit ici sans s'écarter des préceptes de base de l'invention. Exemple 2 On a effectué une préparation de cellules contenant de la protéine A de S. aureus souches G-l à 8, comme il est décrit dans l'exemple 1 jusqu'au lavage, répété 5 à 7 fois avec PBS à pH 7,3, après quoi on a brisé les cellules en utilisant des moyens mécaniques par exemple en utilisant un micro-broyeur Eperbach. L'addition de billes de verre de 120 microns a facilité la rupture des cellules microbiennes. On a séparé les particules de parois de cellules du reste du contenu en particules ou cytoplasmique soluble par centrifugation différentielle, et on les a soigneusement lavées avec de l'eau distillée avec des centrifugations répétées. La matière finale constituée de parois de cellules a été lyophilisée. On a mis en suspension 10 mg d'une suspension de parois de cellules lavées, préparée comme ci-dessus dans 5 ml d'une solution de sel tamponnée au phosphate, pH 7,4; et on a ajouté'la même quantité d'une préparation de fragments Fc, comme il est dit dans l'exemple 1, après quoi on a procédé aux mêmes tests que l'on avait fait comme il est décrit dans l'exemple I ; les résultats ont été essentiellement les mêmes ce qui prouve la possibilité de sensibiliser des fragments de parois de cellules de micro-organismes contenant de la protéine A au moyen de fragments de Fc qui provoqueront ensuite une agglutination en présence d'un facteur rhumatoïde ExemPle 3 On a préparé des polysaccharides provenant de culture de Cryptococcus néoformens, comme il est indiqué par Bloomfield et al. (Proc. Soc. Exptl. Bill. 2ndMed., 114 : 64 à 67, 1963). Les polysaccharides de Cryptococcus, si on les injecte convenablement à des lapins, provoquent la formation d'un antisérum qui réagira aux polysaccharides du Cryptococcus. On a utilisé le sérum de lapins ainsi immunisés pour sensibiliser d'une part des particules de latex et d'autre part des cellules de Micrococcus contenant de la protéine A afin de démontrer la possibilité d'utiliser cette dernière matière comme agglutinine sensibilisée pour détecter la présence de polysaccharides du Cryptococcus dans des spécimens cliniques. On a préparé une suspension de particules de latex de 0,81 microns (Dow, Midland, Michigan) en mélangeant 2 ml d'une solution à 10 % de particules de tatex de 0,81 microns avec 28 ml d'une solution tampon glycine-sel à pH 8,2 (GBS). A 0,5 ml de la suspension de latex préparée comme ci-dessus, on a ajouté un volume égal d'antisérum Cryptococcus préparé à partir d'un lapin (#64 179), sérum que l'on avait dilué 1 : 10 en utilisant du GBS pH 8,2. On a fait une préparation similaire en utilisant une dilution 1 : 50 du même sérum. On a préparé une suspension de Micrococcus contenant de la protéine A comme il est décrit dans l'exemple 1 ci-dessus, et on a ajouté, à 0,5 ml de cette suspension de cellules, un volume égal du même sérum (lapin 64 179) dilué 1 : 10 ; et une autre préparation avec la dilution 1 : 50. Ces préparations ont constitué quatre séries que l'on a testées par agglutination sur verre en présence d'une série de dilutions d'antigène-polysaccharide Cryptococcus (87-93F). Le tableau suivant indique les réactions où 4+ représente une agglutination sur verre très énergique et 4/ représente le plus faible test d'agglutination détectable : le test négatif est indiqué par (-). (contrôle) antigène 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 GBS BSA Latex Dow 1:10 - - +/- - - - 1:50 - - - - - Cellules à 1:10 ++ ++ +++ ++ ++ + protéine A 1:50 + + + + + + Il ressort nettement du tableau ci-dessus que les cellules de Micrococcus contenant de la protéine A donnent une réaction d'agglutination plus énergique, les autres facteurs du test restant égaux. On attribue cette amélioration de l'agglutination à l'adsorption spécifique des globulines Ig G du sérum sur les particules contenant de la protéine A, alors que le latex adsorbe beaucoup d'autres protéines du sérum en plus des immunoglobulines. Cette particularité est clairement indiquée si l'on prend le même sérum utilisé dans cette expérience, précipite les gammaglobulines et répéte la sensibilisation avec les particules de latex Dow de 0,81 micron.En utilisant la quantité équivalente à la gammaglobuline sous forme de sérum total, on peut voir que l'on peut obtenir une agglutination beaucoup plus énergique. I1 a été mis sur le marché (Industrial Biological Laboratoried, Inc., Rockville, Maryland), un test commercial pour la détection des polysaccharides de Cryptococcus neoformenso dans un matériel clinique utilisant des particules de latex, et il ressort nettement de la littérature consacrée à ce produit qu'on a réalisé un test de contrôle séparé afin de déterminer qu'il ne se présente aucun résultat faussement positif du à la présence du facteur rhumatoïde qui pourrait se trouver dans le sérum négatif aux polysaccharides du Cryptococcus. I1 a été nettement déterminé que les cellules sensibilisées comme il est dit avec l'antisérum Cryptococcus ne réagissent pas avec les sérums connus contenant le facteur rhumatolde, et que l'on obtient ainsi l'avantage de réduire ou éliminer les réactions potentiellement faussement positives comme il est indiqué ci-dessus. L'invention ici décrite peut aussi être utilisée pour identifier les immunoglobulines et en déterminer la quantité. Exemple 4 On lave une suspension de cellules intactes telle que celle décrite dans l'exemple 1 ci-dessus, une fois, par centrifugation à 2 500 tpm1 pendant 15 minutes à 500C, et remet en suspension dans la solution tampon glycine-sel à pH 8,2. On effectue une préparation d'immunoglobuline de mouton Ig A anti-humain (spécifique de la chaine alpha)o comme il est décrit couramment dans la littérature. On ajoute 3,9 ml de la suspension de cellules lavées à 0,1 ml de sérum de mouton anti-Ag A, et laisse l'ensemble réagir à la température ambiante pendant environ une heure. On prépare une série de dilutions standardisées d'Ig A en utilisant la solution tampon glycine-sel à pH 8,2, ce qui donne une double dilution partant de 500/ug/ml jusqu'à 8/ug/ml. On dépose une goutte des différentes dilutions de la préparation standard d'Ig A sur une lame de verre, et on y ajoute une goutte de la préparation de cellules sensibilisées avec le sérum de mouton anti-Ig A, et fait tourner la lame de verre sur un agitateur tournant à environ 120 tpm pendant 5 min. .Ce temps écoulé, on lit les résultats de l'agglutination comme sus : IgA standards (ug/ml) 500 250 125 68 34 17 8 contrôle (GBS pH 8,2) l'anti IgA particules +++ +++ +++ +++ + - - sensibilisées à On voit nettement un point terminal brutal à 68/ug/ml, au-delà duquel il ne se produit plus qu'une très faible agglutination s'il s'en produit une.Ceci indique que la sensibilisation des particules a été réalisée pour détecter un minimum de 68/ug/ml de Ig A, On a ensuite utilisé la préparation de cellules ainsi sensibilisées pour tester le sérum de patients où les valeurs Ig A avaient été déterminées par radioimmunodiffusion, et l'on a trouvé les résultats suivants Sérum NO Radial Immunodiffusion Particules de protéine A 71-116A 274 265 71-116B g5,0 71-116C 185 165 Afin de s'assurer que les cellules sensibilisées étaient spécifiques pour l'Ig A, n a répété les tests avec la série de dilutions, en remplaçant 'Ig A par les immunoglobulines Ig G et Ig M, mais n'a constaté atl-2une agglutination. croisée. I1 est évident que les pa~-;icules de Micrococcus sensibilisées à l'Ig A sont spécifiques t sur l'Ig A puisqu'il ne se produit aucune réaction avec lg M, ni Ig G. En outre, la corrélation de la détermination de quantité d'Ig A dans le sérum des patients se situe dans les limites de l'erreur expérimentale acceptable puisqu'elle colncide avec les résultats trouvés par les procédés de radioimmunodiffusion. Bien entendu l'invention n'est pas limitee aux exemples de réalisation, ci-dessus décrits et représentés à partir desquels on pourra prévoir d'autres modes et d'autres formes de réalisation, sans pour cela sortir du cadre de l'invention. R E V E N D I C A T I O N S 10) Procédé pour détecter la présence d'un antigène spécifique suspectée dans un spécimen biologique d'origine animale et d'en déterminer la quantité, caractérisé en ce.qulil comprend une phase où l'on combine le spécimen contenant antigène dont la présence est suspectée avec une particule couplee å de la protéine A, en suspension, la particule étant sensibilisée avec un anticorps spécifique pour l'antigène suspecté de telle façon que la partie Fc de l'anticorps est fixée à la protéine A, qui, à son tour, est fixée sur la particule, de sorte qu'il se produit une agglutination si le test est positif. 20) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'au cours de la détection on détermine la quantité en combinant de la façon connue des dilutions successives du spécimen examiné avec une concentration standard de la suspension sensibilise à l'anticorps spécifique. 30) Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que, dans la détection, on détermine la quantité en combinant des dilutions du spécimen d'une série connue avec une combinaison standard de la suspension sensibilisée avec Fc, le spécimen biologique étant un sérum. 40) Particules contenant de la protéine A, en suspension caractérisées en ce qu'elles sont sensibilisées avec un anticorps dans des conditions telles que l'anticorps Fc est fixé sur la protéine A, fixée elle-même, à son tour, sur les particules. 50) Suspension utilisée dans le procédé suivant l'une des revendications 1 et 4, caractérisée en ce que l'anticorps est spécifiquement l'immunoglobuline G (Ig G). GO) Procédé pour détecter la présence dtun antigène spécifique, suspectée dans un sérum, caractérisé en ce qu!il comprend la phase qui consiste à combiner le sérum contenant l'antigène suspecté, avec une particule, contenant de la protéine A et sensibilisée avec l'anticorps Ig G, spécifique pour l'antigène suspecté de telle façon que la partie Fc de l'anticorps est fixée sur la particule, de sorte qu'il se produit une agglutination si le test est positif, et en ce qu'on détermine la quantité d'anti gène en combinant des dilutions successives connues du spécimen avec une concentration standard de la suspension d'anticorps spécifique. 70) Procédé pour la préparation de particules microbiennes sensibilisées à un anticorps, caractérisé en ce qu'on prépare une suspension de micro-organismes contenant de la protéine A, brise ces organismes pour prévenir toute perte dactivité due à la dégradation des cellules, et sensibilise ces organismes brisés avec une fraction Fc spécifique de l'immunoglobuline, de façon telle que l'immunoglobuline soit fixées par son extrémité Fc à la protéine A. 80) Procédé pour préparer des particules contenant de la protéine A sensibilisées aux anticorps, destinées à identifier un antigène dont la présence est suspectée et pour déterminer la quantité de cet antigène, par agglutination, procédé caractérisé en ce que l'on prépare une suspension des particules et sensibilise ces dernières avec une fraction spécifique Fc d'une immunoglobuline, dont l'extrémité Fc sera fixée sur la protéine A, dans une proportion déterminée de façon à produire un point terminal d'agglutination pour une concentration minimale en antigène. 90) Procédé suivant l'une quelconque des revendications 5 et 8, caractérisé en ce que le Fc est spécifique pour le facteur rhumatoide. 100) Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1, 2, 7, 8 et 9, caractérisé en ce que le micro-organisme est choisi dans le groupe formé par les Staphylococcus et Micrococcus