Brevet FR2424031A1 — publié le 19791123

La présente invention concerne une composition vaccinale stabilisée sous forme lyophilisée ou liquide contenant un virus vivant, de la gélatine partiellement hydrolysée, un alcool polyhydrique à 6 atomes de carbone, un milieu de culture cellulaire et suffisamment de tampon acide physiologiquement acceptable pour maintenir le pH entre 6,0 environ et 6,5 environ. Comme exemples de virus vivants, il faut citer ceux de la rougeole, des oreillons ou de la rubéole, de la varicelle, de la poliomyélite, ou de l'hépatite, etc, ou une combinaison de deux ou plusieurs de ces virus. La gélatine hydrolysée sert à fournir une matrice protéinique soluble, qui ne se gélifie pas, et qui n'a pas ou peu de pyrogénicité ou d'antigénicité. Lorsque l'on parle de gélatine partiellement hydrolysée, il s'agit de gélatine qui a été soumise a' une hydAtyse partielle pour donner une gélatine partiellement hydrolysée ayant un poids moléculaire de 3000 environ. Ce produit d'hydrolyse gélatineux a à peu près la même composition en acides aminés que la gélatine. Contrairement à la gélatine qui forme des gels mais qui est insoluble dans l'eau froide, la gélatine hydrolysée ne forme pas de gel, mais elle est soluble dans l'eau froide et d'autres liquides courants comme le lait et le jus d'orange. La viscosité des solutions aqueuses contenant jusqu'à environ 10%o de gélatine hydrolysée D'augmente pas de manière appréciable.Au-dessus d'une concentration d'environ 10%, la viscosité augmente lentement. Â une concentration d'environ 50%, les solutions sont tout â fait visqueuses. La composition caractéristique de la gélatine hydrolysée en acides aminés est la suivante : Alanine 8,5% liginine 7r94'o Acide aspartique 5,7% Cystine 0,e8% Acide glutamique 9,5%. Glycine 22,8% Histidine 0,77% IIydroxy-prollne 13-14% Isoleucine 1,3% Leucine 2,9% Lysine 4,2% Méthionine 0,78% Phényl-alanine 2,0% Prolixe 13,8% Sérine 3,3% Thréonine 1,9% Tyrosine 0,40% Valine 2,4% On peut obtenir la gélatine partiellement hydrolysee par hydrolyse enzymatique de la gélatine au moyen d'une enzyme protéolitique comme par exemple la papaïne, la chymopapaine et la broméline, bien que l'on puisse employer d'autres moyens d'hydrolyse, par exemple l'hydrolyse acide.On peut obtenir une gélatine hydrolysée convenable auprès de la Société Wilson et Co., Calumet City, Illinois, sous la marque SOI-U-PRO. L'alcool polyhydrique à 6 atomes de carbone peut entre, par exemple, le sorbitol, le mannitol ou le dulcitol. On préfère le sorbitol. Le tampon acide peut être D'importe quel tampon physiologiquement acceptable capable de maintenir le pH désiré entre environ 6 et environ 6,5, par exemple un tampon au phosphate, un tampon à l'acétate ou un tampon au citrate. On préfère le tam pon au phosphate. On dilue le stabilisateur avec d'environ 3 à environ 8 fois, de préférence environ 5 fois 1/2, son poids d'eau distillée avant emploi. Par milieu de culture cellulaire on entend un milieu nutritif permettant la croissance de cellules in vitro. Parmi les milieux nutritifs spécifiques il faut mentionner, par exemple le milieu 199, Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bille & med., 73:1-8 1950 ; le milieu basal Eagle, Eagle, Science, 122, 501-504, 1955 ; In vitro, vol. 6, N 2, 1970 ; le milieu Eagle's modifié de Dulbecco, Dulbecco et al., Virology, 8, 396, 1959 , Smith et al., J. Virol., 12, 185-196, 1960 ; in vitro, vol. 6 N 2, 1970 ; le milieu essentiel minimum (Eagle), Science, 130, 432 (1959) et les milieux RPMI Mendia, Moore et al., 199, 519-524, 1967 ; in vitro, vol. 6, N 2, 1970. La composition stabilisante de la présente invention contient les ingrédients suivants à peu près aux quantités indiquées : Comnosition Parties en poids Gélatine partiellement hydrolysée 2 - 5 Alcool polyhydrique 2 - 55 Milieu nutritif (solide) 0,5 - 1,7 Tampon physiologiquement acceptable pour ajuster le pH à 6,0 - 6,5 q.s. Avec un vaccin liquide, le sorbitol est généralement présent en quantités proches de la limite supérieure de l'intervalle, alors qu'avec un vaccin lyophilisé, le sorbitol est généralement présent en quantités proches de la limite inférieure de l'intervalle. On trouvera ci-dessous les formulations spécifiques du stabilisateur de vaccin viral de la présente invention. On préfère la formulation B pour un vaccin lyophilisé. 3 Gélatine partiellement hydrolysée 35,7 g 35,7 g Sorbitol 526- g 35,7 g Milieu 199 11,O6g 11,06g Tampon au phosphate de sodium 1 X, pH 6,0 100 ml 100 ml Eau distillée qsp 1 litre qsp I litre En outre, le stabilisateur peut contenir, et de préférence, une petite quantité de NaRCO3 et de rouge de phénol. Dans le cas de la formulation précédente, le Na003 peut être présent à une quantité d'environ 1,2 g et le rouge de phénol à une quantité d'environ 0,01 g. Bien que l'on ait décrit cidessus des formulations particulières, il faut comprendre que l'on envisage toutes les variations de taux et de concentration de chaque ingrédient. On dilue généralement un volume de vaccin global avec d'environ 2 à environ 12 volumes de stabilisateur. Les exemples suivants illustrent la présente-invention sans pour autant lty limiter. - EXEMPLE 1 On dégèle 80 ml de concentré de virus de rougeaole (ayant été conservé à -700C) dans un bain d'eau à 250C puis on le garde à 4-8 . On sépare alors le concentré viral liquide en deux fractions de 40 ml chacune. a) On dilue une fraction de 40 ml de ce fluide viral dans 210 ml du stabilisateur stérile de formulation B précédemment décrit. La formulation s'effectue dans des conditions aseptiques et sous une hotte de circulation laminaire. Pour prévenir la croissance microbienne, on ajoute 10,5 mg de Déo- mycine à la préparation. On répartit le vaccin dilué dans des ampoules en verre de 2 ml (0,7 mi de vaccin par ampoule) qui sont immédiatement scellées à la flamme et gardées à 4-800. b) On traite la seconde fraetion de 40 ml comme la première, sauf à utiliser, au lieu du stabilisateur de formulation B, un diluant vaccinai commercial standard (sPGÂ). Le tableau suivant donne la stabilité de conservation des vaccins: vitres(4) des vaccins liquides gardés à 2-8 C Durée Stabilisateur de Stabilisateur formulation B SPGA 0 3,4 3,6 4 mois 3,2 0,6 (1) Les titres sont exprimés en DICT5o/0,1 mi DICT50 signifie la dose infectieuse de culture de tissus à 5096, c'est-à-dire la dilution qui est efficace pour infecter 50% du système testé, par exemple 50% des puits d'une plaque de microtitrage pour une dilution donnée. - Exemple 2 - On dégèle 32 ml de concentré de virus de rou geole (ayant été gardé à -70 C) dans un bain d'eau à 250C puis on le garde à 4-8 . On sépare alors le concentré viral liquide en deux fractions de 16 ml chacune. a) On dilue une fraction de 16 mi de ce fluide viral dans 48 ml du stabilisateur stérile de formulation B précédemment décrit. La formulation s'effectue-dans des conditions aseptiques et sous une hotte de circulation laminaire. Pour empêcher la croissance microbienne, on ajoute 2,5 g de néomycine à la préparation. On répartit le vaccin dilué dans des ampoules en verre de 2 mi (0,7 mi de vaccin par ampoule) qui sont immédiatement scellées à la flamme et gardées à 3700. b) On traite la seconde fraction de 16 mi comme la première, sauf à utiliser, au lieu du stabilisateur de Formulation B, le stabilisateur de Formulation A. Le tableau suivant donne la stabilité de conservation des vaccins : Ditres(1)des vaccins liquides Raraés à 370C Stabilisateur de stabilisateur de Durée formulation 3 formulation A O 2,9 2,7 24 heures 1,6 2,1 48 heures 1,2 1,8 72 heures 0,6 1,4 (1) Les titres sont exprimés en DICT5O,1 mi. - EXEMPLE 3 On dégèle 80 ml de concentré de virus de rougeole (ayant été conservé à -700C) dans un bain d'eau à 200C puis on lés garde à 4-80C, On sépare le concentré viral liquide en deux parties de 40 mi chacune. a) On dilue une fraction de 40 ml de ce fluide viral dans 210 mi du stabilisateur stérile de formulation B précédemment décrit. La formulation s'effectue dans des conditions aseptiques et sous une hotte de circulation laminaire. Pour empêcher la croissance microbienne, on ajoute 10;5 g de néomycine à la préparation. On répartit le vaccin dilué dans des flacons en verre de 3 mol (0,7 ml de vaccin par flacon) que l'on lyophi lise, que l'on bouche et que lton garde à 37 C. b) On traite la seconde fraction virale de 40 mi comme la première, sauf que l'on utilise, au lieu du stabilisateur de formulation B, un diluant commercial standard (le milieu 19g contenant du SPGA)o Le tableau suivant donne la stabilité de conservation de ces vaccins : Titres(1)de vaccins lyophilisés gardé à 370C Stabilisateur de Stabilisateur Durée formulation B SPGA 0 3,5 3,5 7 jours 3,6 0,6 (1) Les titres sont exprimés en log DICT50/0,1 ml - EXEMPLE 4 On reconstitue dans l'eau distillée (0,7 ml par flacon) des flacons lyophilisés préparés comme dans l'Exemple 3 et on les garde à 2-800. Le tableau suivant donne la stabilité de conservation de ces vaccins : Titres(1)des vaccins reconstitués gardés à 2-8 O Stabilisateur de Stabilisateur Durée formulation B SPGA 0 3,70 3,43 4 jours 3,17 2,20 I semaine 3,23 2 8 semaines 3,03 Pert (log/semaine) 0,030 0,649 (1) Les titres sont exprimés en log DICT50/0,1 ml. REVENDICAvIONS 1) Un vaccin caractérisé en ce qu'il comprend un virus inactivé ou atténué et un stabilisateur constitué essentiellement, sur une base pondérale, d'environ 2 à environ 5 parties de gélatine partiellement hydrolysée, d'environ 2 à environ 55 parties d'un alcool polyhydrique à 6 atomes de carbone, d'environ 0,5 à environ 1,7 partie d'un milieu de culture cellulaire et une quantité suffisante de tampon phy siologiquement acceptable pour ajuster le pH d'environ 6,0 à environ 6,5. 2) Un vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'alcool polyhydrique à 6 atomes de carbone est le sorbitol. 3) Un vaccin selon la revendication I, caractérisé en ce que le tampon est un tampon au phosphate. 4) Un vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que le virus est celui de la rougeole, des oreillons, de la rubéole, de la varicelle, de la poliomyélite ou de l'hépatite, l'herpès simplex 1 ltherpès simplex 2 ou des combinaisons de ces virus, 5) Un vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que le stabilisateur est constitué essentiellement, sur une base pondérale, d'environ 3,6 parties de gélatine partiellement hydrolysée, d'environ 3,6 parties de sorbitol, d'environ 1,1 partie de milieu 199 et d'une quantité suffisante de tampon au phosphate pour ajuster le pH entre 6,0 et 6,5 environ. 6) Un vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que le stabilisateur est constitué essentiellement, sur une base pondérale, d'environ 3,6 parties de gélatine partiellement hydrolysée, d'environ 53 parties de sorbitol, d'environ 1,1 partie de milieu 199 et d'une quantité suffisante de tampon au phosphate pour ajuster le pH entre 6,0 et 6,5 environ0 7) Un vaccin stabilisé obtenu en reconstituant un vaccin lyophilisé contenant un stabilisateur selon la revendication I. 8) Un vaccin stabilisé obtenu en dégelant un vaccin gelé contenant un stabilisateur selon la revendication 1. 9) Un vaccin selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il contient -d'envlron 2 à environ 12 volumes de stabilisateur pour environ 1 volume de vaccin. 10) Un procédé de stabilisation d'un vaccin, caractérisé en ce dugon ajoute au vaccin une quantité suffisante de stabilisateur selon la revendication 1 pour stabiliser le vaccin.