Brevet FR2424535A1 — publié le 19791123

La présente invention concerne de façon générale la mesure quantitative de protéines présentes dans des mélanges, notamment lorsque la matière n'est disponible qu'en très petites quantités. Etant donné l'expansion actuelle rapide des connaissances concernant le rôle des protéines pour la santé et dans les maladies, un procédé d'analyse quantitative des protéines, de façon générale, rapide et relativement peu coûteux, dans des fluides tels que le sérum, le fluide cérébrospinal, des extraits de tissus et analogues, est de plus en plus nécessaire. Les protéines présentes dans de tels fluides sont souvent identifiées par des processus immunochimiques qui reposent sur la précipitation de chaqueproteine par un anticorps spécifique de la protéine. La production de tels anticorps specifiques est simulée lorsque des protéines étrangères (antigènes) sont introduites dans un être vivant. On peut préparer des antisérums contenant des mélanges connus de tels anticorps. La réaction in vitro d'un échantillon de protéines avec un tel antisérum et l'observation de la précipitation résultante ou du manque de précipitation donnent une information utile sur la nature des protéines présentes dans l'échantillon. L'invention concerne l'obtention de valeurs quantitatives de la concentration d'une ou plusieurs protéines présentes dans une solution d'antigènes, par mise en oeuvre de processus d'immunodiffusion qu'on a considéré jusqu'à présent comme des techniques uniquement qualitatives. L'invention concerne une mesure quantitative de la concentration d'une protéine dans un échantillon d'antigène, l'échantillon ayant subi une immunodiffusion avec une source d'anticorps contenant un anticorps spécifique de la protéine, la protéine et l'anticorps diffusant en contact permettant la réaction, en direction sensiblement parallèle a un axe et dans une zone dtun milieu de support initialement dépourvu des deux réactifs, de manière qu'il se forme au moins une zone allongée de précipitation ayant une longueur limitée le procédé de mesure quantitative comprend le balayage de ladite zone par un dispositif optique qui crée des signaux élec triques dépendant de la concentration de précipitine pour un arrangement bidimensionnel de positions qui se trouvent dans ladite zone et en partie en dehors de celle-ci, l'extraction électronique, a partir des signaux électriques, de la valeur correspondante d'un paramètre choisi de la zone, variant de manière caractéristique avec la concentration de protéines, et la comparaison de la valeur obtenue du paramètre avec un jeu de valeurs de référence extraites de façon correspondante de zones de référence produites par immunodiffusion équivalente de plusieurs solutions d'antigènes de référence contenant des concentrations respectives connues de la protéine. La collecte précitée des résultats expérimentaux et les calculs ultérieurs peuvent être réalisés a la main le cas échéant. Le procédé est cependant bien adapté à une collecte semi-automatique des résultats, mettant en oeuvre des dispositifs optiques et électroniques de balayage. En outre, le traitement nécessaire des résultats ou données peut être totalement automatique, par exemple réalisé b l'aide d'un ordinateur d'application universelle ayant une capacité modérée. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les protéines du mélange initial d'antigènes subissent d'abord un fractionnement partiel provoquant leur migration dans une direction, avec des vitesses qui diffèrent de maniere carac téristique entre les diverses protéines.Cette migration sélective peut mettre en oeuvre par exemple une diffusion simple, une électrophorèse ou des techniques plus complexes telles que la chromatographie, sans perturbation fondamentale de la nature des zones de précipitine produites par l'étape ultérieure d'immunodif fusion. Dans le cas considéré de l'électro- phorèse, des différences de mobilités entre les protéines dif férentes provoquent une répartition des protéines dans la direction du champ électrique, en fonction de leur mobilité. Après ce fractionnement initial, la répartition essentiellement rectiligne résultante des protéines est mise au contact de l'antisérum par déplacement dans une autre direction, par exemple par diffusion mutuelle dans un milieu convenable de support a base d'agar ou d'agarose. Les zones de précipitation des protéines respectives sont par exemple entièrement séparées et peuvent être nettement distinguées. La séparation utile des zones de précipitation de plusieurs protéines distinctes peut aussi être réalisée sans étape initiale de fractionnement lorsque l'antigène et l'anticorps peuvent diffuser l'un vers l'autre avec formation de zones allongées de précipitation de longueur limitée, placées transversalement a la direction principale de diffusion. Les mobilités nécessaires à la diffusion des protéines différentes et/ou de leurs anticorps, sont habituellement suffisamment différentes pour que les zones de précipitation se distinguent nettement. Tout recouvrement qui peut apparaître est habituellement limité à des parties des zones, les points extrêmes des zones étant habituellement nettement séparés. Les procédés quantitatifs selon l'invention peuvent être utilement appliqués à une immunodiffusion de ce type. De manière analogue, lorsqu'un antigène et un anticorps sont placés dans des cellules d'immunodiffusion et lorsqu'un champ électrique est appliqué afin qu'il accélère le déplacement de l'antigène et de l'anticorps l'un vers l'autre, comme dans le procédé connu d'électroimmunodiffusion, les zones résultantes de précipitine conservent les mêmes configurations essentielles qu'en l'absence d'un champ électrique. Cette même considération s'applique lorsque ltétape d'immunodiffusion d'une immunoélectrophorèse est facilitée par un champ électrique convenablement dirigé Ainsi, le terme "immunodiffusion" utilisé dans le présent mémoire désigne la diffusion en présence ou non d'un champ électrique accélérateur. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront mieux de la description qui va suivre, faite en référence aux dessins annexés sur lesquels - les figures 1A à 1D sont des vues schématiques en plan d'une plaque dtimmunoélectrophorese, la figure 1A représentant un exemple de répartition de protéines après électrophorèse et les figures 1B, 1C et 1D représentant les étapes successives de la réaction ultérieure de diffusion et d'immu noprécipitation - la figure 2 est une coupe axiale schématique d'un exemple d'appareil de mesure d'une plaque - la figure 3 est un schéma représentant les pro priétés d'une zone de précipitation, utilisée selon l'invenion;; - la figure 4 est un graphique représentant un exemple de variation des points extrêmes d'une zone au cours du temps; - la figure 5 est un graphique représentant un exemple de variation de la longueur d'une zone en fonction du temps ; - la figure 6 est un graphique représentant un exemple de variation du temps d'apparition de la zone initiale en fonction de la concentration des protéines ; - les figures 7 et 8 sont des graphiques représentant des exemples de variation de la longueur d'une zone en fonction du temps et de la concentration des protéines ;; - la figure 9 est un graphique représentant l'intensité réelle obtenue au cours du balayage d'une zone de précipitation pour deux temps d'incubation - la figure 10 est un graphique représentant les pics observés dans des zones de précipitation formées par des concentrations correspondantes de protéines - la figure 11 est un graphique représentant un exemple de variation du paramètre Iz au cours du temps ; - la figure 12 est un graphique représentant un exemple de variation du paramètre 1z et du paramètre dl z/dt avec la concentration des protéines ; - la figure 13 est un graphique illustrant l'extraction des valeurs des concentrations des protéines, par des additions connues de la protéine à l'échantillon inconnu ; et - la figure 14 est un diagramme synoptique d'un appareil de balayage électronique destiné à la mise en oeuvre de l'invention Le procédé avantageux d'immunoélectrophorèse met en évidence de nombreuses caractéristiques de l'invention1 et la description qui suit concerne ce mode de réalisation qui n'est cependant décrit qu'à titre purement illustratif. On sait que l'immunoélectrophorèse est un procédé qualitatif et de nombreux modes de réalisation d'appareil ont déjà été décrits pour sa mise en oeuvre, ces appareils différant plus dans le détail que par le principe. L'électrophorèse et la diffusion et l'immunoréaction ultérieures sont par exemple réalisées dans une couche unique d'un gel à partir d'une fraction ayant une épaisseur d'un à plusieurs millimètres, porté par une feuille transparente à la lumière. Un milieu de support couramment utilisé à titre avantageux est formé d'agarose saturé d'une matière tampon à base de barbital, à un pH de 8,6, avec une concentration ionique de 0,1.Les matières actives sont par exemple placées dans des cavités ou cellules qui peuvent etre découpées dans le revêtement de gel ou formées dans celui-ci lors de son moulage sur son support. Les figures 1A à 1D représentent schématiquement une plaque 20 ayant des cavités formant un exemple d'arrangement comprenant deux cavités circulaires 21 et 22 pour antigènes, également espacées des côtés opposés de la rigole ou cavité allongée 24 destinée à l'anticorps, ayant un axe 25, cette cavité étant parallèle à la direction de I'électrophorèse. Pour cette disposition géométrique des cavités, deux solutions distinctes d'antigènes ou deux échantillons de la même solution peuvent être traités simultanément pour une même solution d'anticorps, sur chaque plaque. Le cas échéant, la capacité de chaque plaque peut être multipliée, par exemple par disposition de cavités supplémentaires d'anticorps, à l'extérieur des deux cavités représentées destinées aux antigènes, autres cavités pour antigènes pouvant être formées à l'extérieur. De manière analogue, des cavités supplémentaires pour antigènes peuvent être ajoutées, à une distance des cavités 21 et 22 dans la direction de l'électrophorèsetelleque les diagrammes obtenus ne se recouvrent pas. Ies-zones hachurées 26 et 28 indiquées sur la figure 1A représentent des exemples de répartitions approximatives de quatre variétés de protéines a, b, c et d provenant d'échantillons doubles placés dans les cavités 21 et 22, après un certain temps d'électrophorèse dans la direction de la flèche 23. Bien que toutes les protéines migrent habituellement dans la même direction dans le milieu liquide, le solvant lui-même tend à entraîner une charge résultante et à présenter un courant résultant ou une électroosmose par rapport au gel. En conséquence, les protéines peuvent avoir un déplacement ré sultant dans une direction quelconque par rapport à la cavité. Après la fin de l'électrophorèse et de l'addition de la solution dsanticorps dans la cavité 24, des zones de précipitation se forment par diffusion mutuelle 2es-protéines a, b, c et d de la figure 1A et des anticorps correspondants. Les figures lB, 1C et ID représentent des exemples de zones au cours d'étapes du développement. Les arcs de cercle de précipitine des antigènes non reliés, réagissant avec les anticorps placés à leur contact, se forment indépendamment et peuvent se croiser lorsqu'ils sont suffisamment proches comme indiqué sur la figure 1D, alors que les arcs de cercle d'antigènes qui sont reliés immunochimiquement se raccordent suivant une réaction continue. La zone de précipitation d' des figures 1C et ID indiquent que la région d de la figure 1A contenait en réalité deux protéines distinctes, ce fait indiquant que même des antigènes ayant une mobilité identique pour ltelectrophorèse peuvent former des zones distinctes de précipitation. Les zones d et d' peuvent aussi être considérées comme deux protéines distinctes qui ont été placées initialement dans la cavité 21 et ont subi une immunodiffusion sans électrophorèse initiale. La séparation nette des extrémités respectives des zones serait due à des vitesses différentes de diffusion des protéines ou de leurs anticorps. Dans tous les cas, chacune de ces zones peut être analysée indépendamment, par mise en oeuvre de l'une quelconque ou de toutes les techniques d'ana- lyse décrites dans la suite. Selon l'invention, les zones de précipitation résultant de l'immunoélectrophorèse, subissent des mesures quantitatives directes. Ces mesures peuvent déterminer uniquement la position physique sur la plaque de certaines caractéristiques choisies de chaque zone de précipitation intéressante, ou elles peuvent comprendre des mesures optiques quantitatives d'une intensité lumineuse. Dans les deux types de mesure, le temps est noté et peut être utilisé comme un élément des données relevées. Lorsque l'incubation peut arriver à l'équilibre avec formation d'une configuration de zone presque statique, le temps exact de mesure perd de son importance. Des mesures des positions peuvent être réalisées sur la plaque 20 par exemple à l'aide d'un microscope à faible grossissement. Comme indiqué schématiquement sur la figure 2, la plaque 20 est disposée sur un orifice réglable 32 formé à la partie supérieure d'un boîtier 30 étanche à la lu mière, contenant des lampes 36 et un fond noir 34 formé d'une matière absorbant la lumière, par exemple de-velours noir. Le microscope 40 a un objectif 41, un oculaire 42 et un réticule 43 comprenant par exemple des fils croisés, dans le plan focal.Le microscope est monté au-dessus du boîtier 30, sur un mécanisme 45 à déplacement dans deux directions, ayant un dispositif 46 d'entraînement à vxs et portant des échelles précises qui ne sont pas représentées explicitement mais qui permettent la lecture de la position du microscope sous forme de deux coordonnées. Par raison de clarté, onnå représenté qu'unie seule des coordonnées sur le dessin. I1 est habituellement commode que les coordonnées soient choisies afin que l'axe x soit par exemple parallèle à la direction d'électrophorèse et à la longueur de la cavité d'anticorps, l'origine des coordonnées se trouvant sur l'axe 25 de la cavité ou à proximité comme indiqué sur la figure 1A. Lors des mesures de l'intensité lumineuse, le microscope comprend par exemple un miroir oblique répartiteur 48 qui transmet une partie de la lumière à l'oculaire et une autre partie qui forme une image réelle dans le plan d'un diaphragme 52. Celui-ci transmet alors au transducteur photosensible 50 les seules radiations provenant de la région élémentaire de la plaque 20 qui colncident optiquement avec l'image sur le réticule. Le transducteur 50 est relié élechiquement au circuit amplificateur 54 et au dispositif 56 de mesure. Celuici peut être observé à l'oeil et la valeur peut être enregistrée à la main, ou le dispositif peut comprendre par exemple un mécanisme d'impression et un circuit analogique-numérique qui enregistre automatiquement l'intensité lumineuse à la suite d'un signal d'ordre.De nombreuses modifications peuvent être faites dans l'appareil de la figure 2, notamment le remplacement de l'éclairement sur un fond sombre par un éclairement direct ou par le haut afin que la lumière réfléchie par la zone soit observée ou mesurée.Un exemple d'appareil permettant des mesures totalement automatiques est décrit dans la suite. La figure 3 représente schématiquement certaines caractéristiques avantageuses d'une zone de précipitation, choisies selon l'invention pour la mesure de position lors du développement de la zone. Le trait horizontal 61 tel que y = YAb représente le bord adjacent de la cavité d'anticorps de la lame d'immunoélectrophorèse. Les points E et F de coordonnées (xe, ye) et (Xf,yf) représentent les points extrêmes gauche et droit de la zone allongée 60 En plus des points E et F, on constate que la mesure des coordonnées d'un certain nombre de points intermédiaires de chaque zone est utile. On n'a représenté sur la figure 3 que le seul point G de coordonnées (x 1y) a å titre illustratif. Comme la zone a une certaine largeur dans la direction y, la coordonnée y de chaque point intermédiaire tel que G peut être avantageusement placée soit au point 63, au bord antérieur de la zone le plus proche de la cavité d'anticorps, soit au point 65 au bord postérieur de la zone, soit en un ou plusieurs points 64 placés dans la zone, par exemple au point d'intensité maximale. Lorsque la zone se développe au cours du temps d'incubation, les points E, F et G ont des positions absolues et relatives qui varient progressivement. La figure 4 représente des exemples de valeurs de xe et x f variant au cours du temps pour un exemple de concentration de protéines. Ces positions peuventêtre utilisées directement pour la détermination de la concentration de protéines, par exemple par comparaison des valeurs des paramètres xe et Xf obtenues avec des solutions inconnues avec les valeurs correspondantes obtenues avec des concentrations connues de protéines, aux temps mesurés. Cependant, on obtient habituellement des résultats plus fiables et plus précis par extraction d'une ou plusieurs fonctions des mesures initiales, ces fonctions étant appelées paramètres" par raison de commodité. Un paramètre important de la zone de précipitation, mis en oeuvre selon l'invention, est la différence entre les coordonnées X f - xe, qui est une mesure de la longueur L de la zone de précipitation au moment particulier t de la mesure. ta variation de ce paramètre avec le temps d'incubation est indiquée sur la figure 5 pour les données de la figure 4. Des paramètres de positions autres que la longueur L peuvent être calculés à partir des mesures de la zone lorsqu'elle est développée. Ainsi, la courbure de la zone et sa variation le long de la zone sont des paramètres utiles, de même que des informations relatives à la présence d'un comportement anormal des protéines (comme indiqué dans la suite). Une mesure grossière de ia courbure de l'arc de cercle de la zone dans son ensemble ou dans un segment choisi peut être obtenue par des comparaisons relativement simples des coordonnées x et y de trois points distants, placés sur l'axe de la zone. Lors de mesures plus précises de cette courbure l'axe de la zone est représenté approximativement par une courbe du type y = f(x), f(x) pouvant représenter toute fonction convenable de x. Le rayon de courbure R est alors donné par la formule générale y' et y" représentant les dérivées première et seconde de y par rapport à x. Une fonction qui peut être utilisée pour la représentation de la courbe est une parabole ayant un axe paral lèle à l'axe y. Une telle parabole peut être représentée par l'une formes équivalentes x2 y = aO + aulx + a2x2 (2a) et y = A(x - B) + C (2b) 2 avec A = a2 B = -a1/2a2 C = a0 - a1 /4a2 Les valeurs des constantes de l'équation (2a) ou (2b) peuvent être déterminées directement à partir des coordonnées de trois points quelconques de l'axe de la zone, ou elles peuvent être déterminées par la méthode des moindres carrés ou d'autres méthodes connues, à partir de tout nombre voulu de points. L'axe de symétrie de la parabole correspond à x = B, et la courbe, au niveau de cet axe, est a une distance C de l'axe x. La formule (1) permet la représentation du rayon de courbure sous la forme Le rayon a sa valeur maximale R sur l'axe de symétrie, et o l'équation (3) se réduit à Ro = 2A (4) L'une quelconque des quantités précédentes qui peut petre extraite comme indiqué a partir d'un nombre de points aussi faible que 3 sur l'axe de la zone, peutêtre utilisée comme paramètre selon l'invention. Un autre paramètre utile pour la détermination de la concentration des protéines selon l'invention est le moment T de la première apparition de la zone. Ce moment est diffi o cilement déterminable par observation directe. L'invention concerne un procédé utile en pratique pour l'obtention d'une valeur fiable et reproductible du moment de la première apparition. Sur les figures 4 eut 5, les courbes en traits pleins représentent les résultats obtenus avec des valeurs expérimen- tales directes. Les figures représentent aussi les extrapolations de ces courbes en traits pleins, vers des moments antérieurs. Ces extrapolations sont indiquées en traits interrompus. Le point 66 d'intersection des courbes extrapolées de la figure 4 représente un temps auquel la zone doit avoir eu une longueur nulle. La courbe extrapolée de la figure 5 recoupe l'axe des temps en un point 67, si bien qu'un procédé équivalent permet la détermination du temps T . Cette extrapolation représente o une définition raisonnable et extrêmement utile du moment de la première apparition de la zone de précipitation. Ce procédé de détermination du temps T présente l'avantage de ne pas o nécessiter une observation continue de la plaque. On considère maintenant les déterminations quantitatives d'intensité de la lumière dans la zone et on note qu'une lecture unique d'intensité lumineuse ne donne pas habituellement une mesure utile de la concentration des protéines. Ce compor tement est dû essentiellement à la variation de la configuration de la zone et de sa vitesse de formation et à la tendance de l'intensité à se modifier lorsque la zone s'agrandit. D'autre part, on constate que la variation de tels facteurs peut être compensée en grande partie par une serie de lectures d'intensité réalisées à des emplacements convenablement choisis et par traitement collectif permettant l'évaluation d'un paramètre d'intensité. Un procédé avantageux comprend des lectures effectuées à intervalles uniformes, suivant un axe placé transversalement à la zone de précipitation, par exemple dans la direction y pour une valeur particulière de x. Une telle série comprend de préférence plusieurs valeurs d'intensité en dehors de la zone, de chaque côté Ces valeurs décalées donnent alors une moyenne qui est une mesure de l'in tensité du fond et qui est soustraite de chaque lecture d'intensité dans la zone.Les valeurs réglées résultant de l'intensité sont alors ajoutées, donnant pratiquement une intégrale linéaire de l'intensité le long d'un axe recoupant la zone pour une valeur choisie de x. On constate qu'une telle somme linéaire de l'intensité Ix a tendance à augmenter au cours du temps d'incubation de manière régulière et reproductible, la valeur à un moment donné augmentant avec la concentration de la protéine réagissante, dans une large plage de conditions expérimentales. La figure 9 représente des exemples de courbes représentant I'intensité relative observée au cours de balayage transversal aux zones. Les deux courbes sont tracées par un appareil semi-automatique du type décrit dans la suite, assurant un balayage dans la direction y pour xg, le point de plus grande proximité des zones de précipitation à la cavité d'anticorps. Les pics indiqués par les références 74 et 77 sur la figure 9 sont dus aux zones formées de part et d'autre de la cavité d'anticorps par des échantillons identiques de protéines dans deux cavités d'antigènes d'une plaque analogue à celle de la figure I. Les deux petits pics 75 et 76 sont dus aux bords de la cavité d'anticorps, donnant une référence commode pour la mesure des distances telles que D à partir de points choisis de la zone jusqu'à cette cavité.Le paramètre Ix, défini précédemment, correspond essentiellement à la surface mesurée sous un pic, par exemple 74 ou 77 sur la figure 9. Les pics 74 et 77 de la figure 9 sont obtenus avec des échantillons identiques d'albumine de sérum humain. Ils indiquent un exemple de développement de zones de précipitation entre deux heures d'incubation (courbe 70 en trait plein) et 4 heures (courbe 72 en traits interrompus). Bien que la position des zones reste remarquablement fixe pendant le temps compris entre les deux jeux de mesures, la surface de chaque pic augmente notablement. La presque identité des pics 74 et 77 est à noter. Les deux courbes sont décalées verticalement d'une distance arbitraire permettant une plus grande clarté dans la représentation. La figure 10 est une courbe schématique représentant des exemples de balayage en direction y de plaques formées avec différentes concentrations de protéine, mesurées pratiquement pour un même temps d'incubation. Le graphique montre clairement la surface croissante des pics individuels et le déplacement de toute la zone vers la cavité d'anticorps, lorsque la concentration de protéine augmente, allant du pic A au pic C. Bien que le paramètre Ix soit très utile pour la détermination des concentrations de protéines, on peut obtenir des résultats encore meilleurs avec un paramètre muLtiple-d'in- tensité, obtenu par addition ou formation de la moyenne de ces sommes linéaires intensité pour différentes valeurs de x. Un exemple d'opération comprend le calcul des sommes linéaires pour xg et a des valeurs disposées de part et d'autre de xg à des intervalles choisis. La formation de la moyenne ou l'addition d'un nombre uniforme prédéterminé de telles sommes linéaires réduit l'erreur expérimentale et améliore la précision globale de la détermination de la concentration des protéines. Selon un autre procédé plus avantageux, chaque fois que la plaque est balayée, le nombre de sommes linéaires compris dans le calcul augmente lorsque la longueur de la zone de précipitation augmente. Un exemple de procédé de ce type com prend la détermination de la somme linéaire de l'intensité pour xg, et le calcul continu de telles sommes de part et d'autre de xg jusqu'à ce que la valeur de la somme tombe audessous d'un seuil choisi. L'addition de toutes les sommes linéaires donne un paramètre 1z qui est essentiellement l'in- tégrale de l'intensité de la zone de précipitation au moment du balayage. Cette approximation peut être obtenue avec une précision aussi grande que voulu, dans les limites de résolution de l'instrument, par réduction des quantités élémentaires x et y séparant les mesures effectuées.La valeur du paramètre 1z varie particulièrement vite en fonction de la concentration des protéines sur une large plage de conditions expérimentales. Ce comportement est dû au fait que, lorsque la concentration augmente, les dimensions de la zone augmentent dans les deux directions x et y, et l'intensité moyenne de la zone a aussi tendance à augmenter. Cette dépendance très nette de la concentration des protéines rend le paramètre d'intensité totale particulièrement efficace comme critère de détermination de la concentration. Après obtention des valeurs expérimentales pour un ou plusieurs paramètres d'un échantillon d'antigène à analyser, les valeurs sont comparées à des jeux convenables de valeurs de référence des paramètres respectifs, obtenues dans des conditions expérimentales très semblables, mais avec une série de solutions de protéines contenant des concentrations connues des protéines intéressantes. Lors de l'obtention d'un tel arrangement de valeurs de réference, des essais de référence sont mis en oeuvre avec ces solutions de référence et les mesures sont effectuées en des points correspondants des plaques convenables, à des moments successifs au cours de l1in- cubation.Les essais de référence sont mis avantageusement en oeuvre dans des conditions qui sont toutes aussi identiques que possible à celles des essais expérimentaux pour lesquels ils doivent donner des valeurs de référence. En fait, on obtient avantageusement un jeu distinct de valeurs de référence pour chaque groupe d'essais. Cependant, dans le cas de mesures de routine dont les pentes des courbes de référence sont connues expérimentalement, un seul essai de référence peut parfois suffire. Les valeurs de référence du paramètre choisi sont tirées des résultats des mesures de référence, par exemple pour chaque concentration et à plusieurs moments. Chaque valeur mesurée de référence du paramètre est donc considérée comme une fonction de la concentration et aussi du temps. Lorsque les sommes linéaires individuelles d'intensité doivent être considérées séparément, une identification com plète nécessite aussi la spécification de la valeur de x. Un avantage de l'utilisation du moment de la première apparition de la zone comme paramètre est que les valeurs de référence de ce moment T ne comprennent pas le temps comme o variable. Ainsi, bien que l'évaluation de T par les procédés o décrits nécessite des mesures à une série de moments déterminés, lorsque T0 a été tiré de ces mesures, les moments des mesures respectives n'ont plus d'importance. Ainsi, les valeurs de T0 peuvent être portées en fonction de la concentration C des protéines et donnent une seule courbe de référence. Celle-ci est schématiquement représentée sur la figure 6, tirée des valeurs obtenues pour des concentrations, par la méthode d'extrapolation décrite en référence aux figures 4 et 5.Les concentrations peuvent être lues directement sur la courbe de la figure 6, pour un échantillon inconnu, lorsque son paramètre T0 a été mesuré. Dans le cas des paramètres tels que L, et et Iz, la préparation des courbes de référence peut être moins directe. Comme les valeurs dépendent des moments des mesures, les séries de solutions de référence doivent être préparées afin qu'elles recouvrent une certaine plage de temps. On ne peut pas toujours mesurer les résultats pour toutes les concentrations au même moment. Chaque valeur mesurée est donc associée au moment de la mesure et les valeurs résultantes de référence pour les concentrations correspondantes sont alors portées sur les courbes séparées en fonction du temps. La figure 7 représente une famille de telles courbes, indiquant la variation des valeurs de référence du paramètre pour trois concentrations, en fonction du temps. On note au passage que l'extrapolation indiquée de ces courbes à L = 0 donne les valeurs de référence T0 permettant le tracé de la figure 6 ou peut donner les valeurs de T permettant la com o paraison avec la figure 6. Les verticales de la figure 7 représentent une série de temps arbitraires telle que tl, t2 et t3. Les intersections avec les courbes donnent un jeu de valeurs de L pour différentes concentrations correspondant toutes au même temps. Chaque jeu de valeurs L est remis sous forme d'une courbe séparée en fonction de la concentration. Le résultat apparaît sous forme d'un arrangement de courbes indiquant chacune L en fonction de la concentration des protéines à un moment particulier. Un tel arrangement est schématiquement représenté sur la-figure 8 et on constate qu'il est plus commode que la courbe tracée en fonction du temps sur la figure 7 pour la comparaison avec une valeur expérimentale du paramètre. Les valeurs de référence permettant la comparaison avec les valeurs expérimentales d'autres paramètres sont obtenues et traitées d'une manière analogue à celle qu'on a décrite pour le paramètre L. On constate cependant que le paramètre Iz d'intensité totale, lorsqu'il est mesuré pour une concentration donnée de protéines a des moments successifs du développement de la zone, augmente linéairement au cours du temps. Cette relation linéaire est indiquée sur la figure 11 qui représente la variation de 1z en fonction du temps pour quatre solutions contenant les concentrations connues indiquées d'immunoglobuline. Les valeurs indiquées pour 1z sont obtenues à l'aide d'un calculateur d'application universelle, convenablement programmé, à partir des mesures d'intensité réalisées automatiquement pour un arrangement bidimensionnel de positions dans la zone, de la manière générale décrite dans la suite. Les points in diqués sur la figure 11 sont tracés automatiquement a l'ori- gine et les droites sont adaptées au mieux à chaque jeu de points par le calculateur. La figure a été ensuite retracée manuellement et reproduite à échelle très réduite. La relation linéaire indiquée par la figure 11 facilite la préparation des courbes de référence qui permettent la lecture de la concentration de protéines correspondant à une valeur expérimentale du paramètre Iz. Une telle courbe tirée des résultats de la figure 11 et indiquant la valeur de 1z en fonction d'une concentration pour le temps 2,4 h, est portée sur la figure 12, comme indiqué par la référence 70. La relation linéaire entre z et le temps indique aussi que la dérivée dl z/dt en fonction du temps ou la vitesse de variation de 1z au cours du temps, est constante. I1 s'agit donc d'un paramètre ayant l'avantage pratique de ne pas dépendre du temps. La courbe 72 de la figure 12 représente un exemple de comportement de ce paramètre en fonction de .la concentration des protéines, chaque point représentant la pente de l'une des courbes de la figure 11. Comme indiqué précédemment en référence au paramètre T0 et à la figure 6, une courbe unique telle que 72 (figure 12) peut constituer en fait une courbe de référence pour le paramètre dIz/dt. L'invention permet aussi l'obtention d'une excellente précision notamment lorsque l'échantillon étudié contient la protéine ou les protéines intéressantes à une concentration relativement faible. Les solutions des échantillons sont alors diluées par addition de quantités connues de telles protéines, directement à des parties connues de l'échantillon lui-même, les solutions obtenues étant traitées en parallèle avec la solution originale et avec des références contenant des concentrations bien connues de la protéine. Le paramètre voulu est déterminé au même moment pour toutes les solutions, par mise en oeuvre de la technique décrite d'interpolation au cours du temps le cas échéant.Le paramètre P obtenu pour les solutions normales de référence est porté en fonction de la concentration des protéines de manière classique comme indiqué schématiquement par la courbe 80 de la figure 13. Les valeurs du paramètre P sont aussi portées pour l'échantillon original d'antigène et pour les parties de l'échantillon dans lesquelles on a ajouté des quantités connues de protéines, comme indiqué par exemple par les points h, i, j et k. Ces points sont portés par rapport à l1axe horizontal des concentrations comme si les solutions ne contenaient que la protéine qui avait été ajoutée. Ainsi, la valeur h pour l'échantillon original est portée pour c = O. La courbe 81 est tracée afin qu'elle passe par ces points. Pour cet exemple de résultats, la concentration des protéines dans l'échantillon original peut être évaluée de différentes manières, donnant toutes pratiquement la même valeur. Ainsi, on peut utiliser tout nombre voulu de telles opérations et les différentes valeurs peuvent former une moyenne. D'abord, la projection horizontale du point h sur la courbe 80, au point h', donne la valeur de la concentration Ch qui correspond au procédé général de comparaison décrit précédemment. En outre, une projection analogue de chaque valeur i, j et k sur la courbe 80 donne une valeur de la concentration, sous forme de la longueur des segments de droite ii', jj' et kk', toutes ces longueurs étant égales en théorie. Lorsque la valeur de P au point h est incertaine, par exemple parce que la zone observee ntestpas très nette, une moyenne de 4 intervalles donne une valeur bien plus fiable. Un autre procédé présente avantage non seulement d'améliorer la précision d'une détermination incertaine du point h, mais aussi de permettre une réponse même lorsque lréchantillon original contient une quantité de protéines inférieure a la valeur de seuil nécessaire à l'obtention d'une zone mesurable de précipitation. Dans ce dernier cas, la partie supérieure de la courbe 81 est tracée à l'aide des points disponibles i, j et k, et elle est extrapolée jusqu'à l'axe P, si bien qu'elle donne la détermination de h sur l'axe P. Dans une telle courbe projetée 81, la courbe 80 de référence est un guide utile.Par exemple, la courbe 80 peut être déplacée entièrement vers la gauche sur la figure 13 jusqu a ce qu'elle représente aussi bien que possible les points i, j et k. Llin- tersection de la courbe 80 avec l'axe P est alors une bonne mesure du point h qui permet la détermination de la concentration Ch. En outre, une extrapolation de la courbe 81 vers les viseurs négatives de l'axe C, à Ch, donne une lecture directe de la concentration qui doit correspondre à la valeur Ch. L'utilisation indiquée de la courbe supplémentaire de référence 81 présente l'avantage important de permettre l'utilisation d'un milieu identique pour les solutions expérimentales et de référence. Lorsque le milieu est un sérum humain d'un patient particulier notamment, cet avantage fait plus que compenser les faibles erreurs qui peuvent apparaître dans l'extrapolation de la courbe de référence. L'augmentation du nombre de quantités différentes de protéines ajoutées, les trois valeurs indiquées en référence a la figure 13 étant purement illustratives, et l'utilisation de plusieurs essais pour chaque quantité permettent l'augmentation presque sans limite de la fiabilité de ltextrapolation, et une bonne indication de l'erreur expérimentale possible peut être obtenue. L'invention concerne aussi des procédés de détection automatique du comportement anormal de certaines protéines dans un échantillon d'antigène. Des gamma-globulines normale et anormale par exemple ont par exemple des plages de mobilités par électrophorèse qui sont légèrement différentes, mais elles réagissent avec le même anticorps et forment des zones de précipitation ayant une répartition irrégulière et asymétrique de précipitine le long de la zone. Cette irrégularité peut être détectée par comparaison des résultats du paramètre d'in- tensité Ix par exemple pour différentes valeurs de x. L'observation d'une variation asymétrique ou irrégulièred'une. autre manière de ces valeurs indique qu'un comportement anormal a été rencontré, et cette indication est fortement confirmée lorsque plusieurs déterminations indépendantes sont effectuées pour chaque valeur x et lorsque les erreurs expérimentales calculées indiquent que la variation est significative au point de vue statistgue. On peutconsidérer que ce procédé est un cas particulier du procédé général de comparaison des valeurs obtenues expérimentalement pour les différents parcmètres qui ont tendance à avoir une réponse différente au comportement anormal intéressant. Pour certains paramètres, avec un tel comportement, la comparaison des valeurs de la concentration de protéines qui correspondent aux valeurs du paramètre observé peut être plus efficace que la comparaison directe des valeurs des pa ramètres elles-mêmes.Ainsi, la répartition irrégulière indiquée des intensités le long de la zone en présence de gammaglobuline anormale a tendance à faire apparaître la zone plus tôt que la zone normale si bien que les valeurs calculées de la concentration sont supérieures alors que le paramètre d'in tensité totale 1z a tendance à donner des concentrations sensiblement égales pour les protéines normales et anormales. Ainsi, un accord mauvais de façon significative entre les concentrations obtenues avec T et 1z indique la présence de o la protéine anormale. Un autre paramire tres sensible à la présence d'une protéine anormale est la courbure de l'axe longitudinal de la zone. En présence d'un comportement anormal, la courbure a tendance à varier irrégulièrement et asymétriquement le long de la zone, alors que la courbure globale a tendance à etre plus faible qu'avec la protéine normale. On peut presque toujours obtenir d'autres avantages par utilisation de paramètres multiples,sous forme de fonctions particulières de deux ou plusieurs paramètres comme décrit pour les paramètres de position ou d'intensité. Ainsi, la somme de la longueur de la zone et d'un paramètre d'intensité, ces paramètres étant chacun pondérés de façon convenable suivant l'erreur expérimentale de la mesure, constituent un nouveau paramètre qui tend a donner des résultats plus fiables que chacun des deux paramètres utilisés séparément. Une autre combinaison avantageuse est une fonction différentielle de deux paramètres dont l'un augmente avec la concentration des protéines alors que l'autre diminue. Ainsi, un quotient ou une différence de tels paramètres constitue un paramètre multiple dépendant beaucoup plus de la concentration que l'un ou l'autre des paramètres utilisés. Le temps T0 de la première apparition de la zone est un exemple d'un pa ramètre qui varie suivant une fonction inverse de la concentration des protéines, et il est particulièrement utile pour la formation de tels quotients.La distance comprise entre la cavite contenant l'anticorps et la zone pour une valeur voulue de la coordonnée x, par exemple la distance de plus grand rapprochement pour xg, dépend aussi inversement de la concentration et peut être utilisé comme paramètre dans de tels quotients. I1 est en général avantageux que le parametre qui de- pend directement de la concentration soit divisé par le paramètre qui varie inversement avec celle-ci afin que le paramètre multiple obtenu varie dans le même sens que la concentration plutôt qu'en sens inverse. Des valeurs convenables de référence permettant la comparaison à des paramètres multiples déterminés expérimentalement pour des échantillons inconnus sont obtenues à partir des valeurs de référence des paramètres élémentaires utilisés comme décrit précédemment. Bien que les mesures de position et d'intensité et les déterminations de paramètres, décrites précédemment, puissent être effectuées par des opérations individuelles et manuelles directes comme indiqué, un avantage de I1 invention est que ces opérations sont particulièrement bien adaptées à une réalisation partiellement ou totalement automatique. Un procédé particulièrement commode et efficace pour les mesures nécessaires selon l'invention comprend le balayage de la lame par un dispositif optique, par exemple une caméra de télévision, un dispositif de balayage a couplage par charges ou un dispositif équivalent, formant un signal vidéo représatant la luminosité apparente de l'image balayée pour un arrangement bidimensionnel de zones elemen- taires. Le signal de chaque élément est avantageusement mis sous forme numérique puis mémorisé électroniquement avec des signaux représentant les coordonnées x et y de la position correspondante sur la plaque et le moment de l'observation-. L'ensemble de l'arrangement de ces signaux de position, ou le signal d'une position désignée peut être retiré de la mémoire a volonté en vue d'un traitement ultérieur. En outre, toute partie voulue de l'image de la lame peut être affichée soit pendant l'opération de balayage, soit ulterieurement, a l'aide d'un tube à rayons cathodiques ou d'un dispositif équivalent. Les appareils de balayage, de mémorisation et de reproduction d'une image, ainsi que les appareils d'extraction d'un signal vidéo sous forme numerique à partir d'un point choisi d'une image, sont bien connus dans l'industrie électronique, et sont disponibles dans le commerce sous des formes bien adaptées à l'invention. La figure 14 représente schématiquement un exemple d'un tel appareil comprenant une caméra 90 de télévision ayant un objectif 91 destiné à former une image de la plaque 20 sur la surface photosensible de la caméra, un tube à rayons cathodiques 92 d'un moniteur, un appareil 94 de commande de balayage et un calculateur 100 d'application universelle. La plaque 20 peut former une image avec tout grossissement voulu, par réglage convenable de l'objectif 91. Une partie choisie de la plaque peut être centrée dans le champ par déplacement de la position sur le support eclairé, par exemple la boîte 30 à lumière de la figure 2, ou sous la commande de dispositifs électroniques classiques de polarisation des circuits de la caméra. Plus précisément, les mouvements de balayage du dispositif de balayage et du tube à rayons cathodiques syn chronisé du moniteur, le cas échéant, sont commandés de pre- férence par pas suivant les deux coordonnées, les pas étant si petits que le déplacement paraît pratiquement continu sur l'écran. t'image est ainsi divisée en zones élémentaires qui peuvent être identifiées par exemple par spécification des coordonnées x et y. Lors d'un fonctionnement manuel ou semiautomatique, l'affichage du moniteur comprend par exemple un curseur sous forme d'un point brillant formé électroniquement et qui désigne sur l'écran la zone élémentaire dont l'échan- tillon vidéo est extrait, une fois à chaque balayage total. L'opérateur a à sa disposition un dispositif manuel de commutation électronique permettant ledéplacement du curseur sur l'écran, par commande visuelle. Un dispositif peut aussi permettre la disposition directe du curseur entre un point voulu par exemple sous la commande de signaux x et y, sous forme numérique, constituant une adresse d'ordre. De tels signaux peuvent être extraits par commande manuelle ou transmis par un calculateur suivant des instructions convenables d'un programme. Comme indiqué sur la figure 14, un compteur 102 compte les impulsions provenant d'une horloge 103 et crée des lignes multiples 104 de signaux numériques qui représentent des valeurs successives de coordonnée x par exemple. Un circuit 106 transmet par la ligne 107 une tension analogique en gradins sous la commande de ces signaux, un gradin correspondant à chaque valeur élémentaire de x. Le circuit 108 de divi sion compte les balayages du faisceau en direction x, et crée des signaux numériques dans des lignes multiples 109 représentant la coordonnée y pour chaque balayage. Un circuit 110 transmet par une ligne 111 une tension analogique en gradins correspondant au nombre compté, un pas correspondant à chaque valeur élémentaire y. Les tensions en gradins des lignes 107 et 111 commandent le balayage x et y dans la caméra 90 et le tube 92 qui sont ainsi synchronisés.Le signal vidéo de la caméra 90 est transmis par une ligne 112 au tube 92 dont l'écran reproduit les variations de luminosité de la plaque 20. Un circuit 118 de sélection comporte des compteurs x et y qui peuvent être décalés sélectivement dans les deux sens d'une seule unité ou par des séries continues de nombres lors du déplacement manuel de la poignée 119 de commande. Les signaux numériques résultants représentant les coordonnées x et y d'un point choisi pour l'exploration, sont conservés dans le registre 117. Le circuit 114 de comparaison assure constamment la comparaison des coordonnées de l'adresse choisie d'exploration provenant du registre 117 avec l'adresse des faisceaux de balayage des lignes 104 et 109. Lorsque le point de balayage atteint l'adresse mémorisée, par exemple une fois à chaque balayage complet, le circuit 114 transmet une impulsion de validation au circuit 120 de commutation.Le signal vidéo de la caméra 90 est ainsi transmis au circuit analogiquenumérique 122. te registre 125 reçoit ainsi par les lignes 123, une représentation numérique de la luminosité de la lame balayée 20 au point choisi pour l'exploration. L'impulsion de validation provenant du circuit 114 parvient aussi au circuit 126 de commande de curseur qui superpose au signal vidéo une impulsion d'intensification de faisceau qui identifie le point choisi sur l'écran du moniteur comme indiqué schématiquement par la référence 127. Le registre 125 reçoit aussi les signaux de coordonnées x et y des lignes 115 et 116 et un signal numérique représentant de façon continue le temps et formé par le circuit 128 de rythme sous la commande de l'horloge. Tous ces signaux sont par eXemple conservés dans le registre 125 et transmis au cal culateur 100 sous la commande de signaux de décharge qui peuvent être transmis soit par commande manuelle par l'intermé- diaire de la ligne 129, depuis le sélecteur 118, soit sous la commande du calculateur par l'intermédiaire de la ligne 130. Le calculateur 100 comporte avantageusement un dispositif destiné à désigner indépendamment une adresse d'exploration et obtenant ainsi une information correspondant au point de la plaque 20 qui correspond aux critères particuliers d'un programme utilisé pour la commande. Ce dispositif d'exploration peut comprendre un circuit analogue essentiellement au sélecteur 118, au registre 117 et au circuit 114 de comparaison, le sélecteur fonctionnant sous la commande de signaux électroniques qui indiquent sélectivement le sens voulu de déplacement du point d'exploration ou l'adresse numérique de la position nécessaire.La figure 14 indique que cet appareil n'est pas utilisé en double, le calculateur commandant le sélecteur 118 par des signaux électroniques transmis par les lignes multiples 132 et supplantant la commande par la poignée 119 lorsque le commutateur 133 est mis de la position manuelle à la position automatique. Lorsqu'une telle commande est disponible, le calculateur peut etre facilement programmé afin qu'il assure les mesures de position et d'intensité et les formations de paramètres des types généraux indiqués precé- demment. Lors du balayage automatique des zones1 les plaques d'un jeu peuvent être transportées successivement d'une chambre d'incubation a une position de balayage déterminée avec précision, sous un éclairement convenable. I1 est en général avantageux, notamment lorsque le dispositif de balayage optique est à la fois leger et peu encombrant comme dans le cas d'un dispositif à couplage par charge par exemple, que le dispositif de balayage soit placé sur une plate-forme mobile suivant deux directions au-dessus de l'arrangement fixe des plaques d'immunodiffusion ou d'immunoélectrophorèse. Cette disposition facilite l'utilisation du circuit de balayage de même que le remplissage des cavités d'antigènes et d'anticorps. A cet effet, un distributeur à commande numérique est monté en position fixe mais décalée par rapport au dispositif de balayage. Des signaux vidéo provenant du dispositif de balayage parviennent au calculateur qui est convenablement pro grammé afin qu'il reconnaisse les configurations des cavités individuelles ou qu'il identifie des symboles lisibles par une machine et associés à ces cavités. Lorsque la plateforme portant le dispositif de balayage et le distributeur se déplace sous la commande du calculateur au-dessus des plaques, elle peut facilement s'arrêter lorsque l'axe du dispositif de balayage se trouve avec précision au-dessus d'une cavité choisie d'antigènes.La plate-forme peut alors se déplacer d'une quantité élémentaire fixe afin qu'elle centre le bout distributeur au-dessus de la cavité et que la charge convenable soit distribuée avec précision dans cette cavité. Lorsque toutes les cavités sont remplies de cette manière les solutions convenables d'antigènes, avec lavage convenable du distributeur entre lesopérations, l'electrophorèse commence. Une opération analogue de chargement est effectuée par exemple pour le remplissage des cavités d'anticorps, soit après la fin de l'electrophorese, soit juste après le remplissage des cavités d'antigènes lorsque l'electropho- rèse est supprimée. Après le temps voulu de diffusion, le même dispositif de balayage se déplace successivement vers toutes les positions dans lesquelles les zones de précipitation doivent être balayées dans l'arrangement des plaques. La possibilité du balayage est avantageusement utilisée aussi pour le balayage de l'arrangement de plaques avant le chargement des cavités. te calculateur est programme afin qu'il compare les positions observées des cavités d'antigènes et d'anticorps, et il enregistre toute différence par rapport aux dimensions ou positions relatives uniformes des plaques de l'arrangement. Toute plaque ou cavité individuelle qui s'écarte trop de la référence peut ainsi être omise automatiquement lors de l'opération de chargement, et les plus petits écarts peuvent être compensés par transmission automatique de corrections convenables aux valeurs des paramètres qui sont ensuite formés par le calculateur. Le balayage initial de la zone comprend par exemple une demande par le calculateur d'une information vidéo à des adresses successives~d'exploration, pour une valeur choisie de x, les valeurs y étant décalées progressivement d'un intervalle spécifié au-dessus de la région dans laquelle la formation de la zone est prévue. Les intensités vidéo provenant du registre 125 sont conservées avec les données x, y et t pour chaque point exploré. Après chaque balayage y, la coordonnée x est modifiée d'un intervalle spécifié et un balayage analogue y est réalisé, et les résultats sont enregistrés jusqu'à ce que l'ensemble de la zone intéressante ait été couvert. Chaque intensité reçue est comparée par exemple aux valeurs déjà reçues et mémorisées.Lorsque les varations ob servées dépassent un seuil fixe caractéristique du fond, indiquant la présence d'une zone de précipitation, chaque in tensité de la zone est ainsi désignée dans la mémoire. En outre, à chaque balayage y, l'intensité maximale lors du balayage de la zone, est identifiée et enregistrée, l'axe de la zone étant fixé sous forme d'une série de valeurs y, pour des valeurs x uniformément espacées. Les points extrêmes de chaque zone sont identifiés comme valeurs terminales x dans chaque direction dans laquelle une intensité maximale a été identifiée. Si les points extrêmes doivent être localisés de façon plus précise, le calculateur reçoit des instructions lui indiquant d'assurer d'autres balayages dans une région déterminée au voisinage de chaque point extrême, avec des intervalles x et y réduits. Les zones de précipitation existantes étant ainsi localisées et enregistrées, les opérations arithmétiques simples sont réalisées sur les données mémorisées et donnent le paramètre de somme d'intensités précitées Ix pour chaque balayage transversal d'une zone en direction y, et l'addition de ces valeurs donne le paramètre d'intensité totale 1z pour la zone.La soustraction des valeurs x aux extrémités de la zone donne le paramètre L. On peut obtenir des paamètres supplémentaires par calcul convenable le cas échéant Les mesures décrites sont effectuées de préférence en une seule opération sur un jeu complet de plaques comprenant un ou plusieurs échantillons inconnus et aussi un jeu de solutions de référence du type décrit précédemment, et suffisamment complet pour que les échantillons inconnus puissent être pleinement évalués. Après chaque balayage d'un tel jeu de plaques, le calculateur est avantageusement commandé afin qu'il donne les concentrations de chacune des protéines pour lesquelles des zones de précipitation ont été observées.Lorsque des essais de référence multiple sont incorporés, de façon avantageuse, l'erreur expérimentale probable peut être déterminée pour chaque concentration calculée. Des sous-programmes du calculateur destinés à ces calculs sont bien connus. Plusieurs déterminations indépendantes sont de préférence effectuées pour la concentration de chaque protéine dans l'échantil- lon, par exempleenréférence a des paramètres différents, et une moyenne et alors calculée, chaque valeur étant pondérée de manière classique en fonction de l'erreur probable. Lorsque llerreur probable calculée pour la moyenne est comprise dans la plage spécifiée pour l'échantillon particulier étudié, aucune mesure supplémentaire n'est nécessaire. Le calculateur imprime ou enregistre alors d'une autre manière classique les résultats, avec la quantité de résultats originaux qui peut être demandée par le programme. Ainsi, le médecin pour qui l'analyse est réalisée peut demander une copie totale de toutes les données sur bande magnétique ou analogue, afin qu'il puisse ultérieurement s'y référer. En outre, des photographies de la plaque d'immunodiffusion peuvent être prises directement ou à l'aide du tube du moniteur. Habituellement, un cycle de balayage ne permet pas une détermination quantitative convenable d'une protéine a moins que sa concentration Soit élevée. Après un temps convenable d'incubation supplémentaire qui peut varier entre quelques minutes et une heure ou plus par exemple, le balayage précité est répété, par exemple pour tout le jeu de plaques et les références correspondantes. Le calculateur est commandé afin qu'il explore les zones des plaques dans lesquelles on prévoit la présence de zones mais dans lesquelles on n'en a pas trouvé lors du balayage précédent, ainsi que dans les zones correspondant aux zones antérieurement déterminées et enregistrées de précipitation, de préférence compte tenu de l'expansion ou du déplacement spécifié des zones, indiqué dans le programme d'après l'expérience antérieure.Ainsi, les opérations du calculateur peuvent assurer une continuité de traitement des zones des protéines entre un balayage et le suivant. Deux zones de précipitation dues à des protéines dif férentes peuvent parfois être si proches que leur croissance normale provoque finalement un recouvrement. Dans les zones formées par immunoélectrophorese, ce recouvrement s'effectue normalement aux extrémités ou à leur voisinage et provoque un croisement des zones comme indiqué par exemple par les zones a et b de la figure 1D. Lorsque l'immunodiffusion est réalisée sans fractionnement initial, le recouvrement a tendance à se limiter aux parties centrales des zones, par exemple lorsque les zones d et d' de cette figure croissent ensemble. Le calculateur est programmé afin qu'il prévoie un tel recouvrement, qu'il le reconnaisse lorsqu'il s'est présenté et qu'il modifie alors convenablement le procédé et détermine les divers paramètres. Lorsque les protéines étudiées sont telles que des recouvrement sont prévus, chaque plaque est balayée par exemple à un moment précoce du développement avant les recouvrements de zones (figure 1B). L'axe de la zone et les points extrêmes peuvertalors être localisés sans ambiguité. Le calculateur est par exemple programmé afin qu'il effectue une partie du traitement normal de chaque balayage et vérifie des recouvrement réels, par exemple par comparaison des coordonnées x, y de chaque point mesuré de l'axe d'une zone avec celles des zones adjacentes, une colncidence, pour un seuil spécifié, indiquant un recouvrement. Tous les balayages comprennent aussi avantageusement une vérification des recouvrements des potentiels. Ainsi, le calculateur extrapole chaque axe de zone au-delà des points extrêmes observés et compare les points extrapolés des zones adjacentes. Cette extrapolation suivant l'axe peut comprendre un prolongement linéaire simple d'après la pente de l'axe a proximité de chaque extrémité. Dans une variante, l'axe observé de la zone peut être adapté à une parabole ou une autre courbe qui peut alors être extrapolée avec précision. Le recouvrement des zones peut aussi être détecté par calcul de la vitesse de variation de la pente de l'axe ou du rayon de courbure de cet axe en une sëbe de points de la zone. Tout écart par rapport à une variation régulière normale de ces fonctions indique que la zone peut comprendre au moins deux zones qui se recouvrent Lorsqu'un recouvrement réel est déterminé dans une moitié d'une zone, une compensation suffisamment précise peut souvent être assurée par simple remplacement des intensités observées dans la zone de recouvrement par les valeurs ob servées en des points correspondants de l'autre moitié de la zone.Cette correspondance entre deux points de la zone, due à une immunoélectrophorèse, est par exemple obtenue pour des espacements x égaux de part et d'autre de la coordonnée xg du point le plus proche de la cavité de l'anticorps, et, dans le cas des zones dues à une immunodiffusion directe, cette correspondance est égale à l'espacement y des côtés opposés de l'axe de la zone. L'axe compris dans la zone de recouvrement peut habituellement être localisé par extrapolation. Le cas échéant, on peut aussi utiliser des procédés plus élaborés et précis de compensation. Ainsi, le calculateur peut être commandé afin qu'il règle la mesure en un point choisi placé symétriquement de la moitié de zone non affectée afin qu'il tienne compte de tout défaut réel de symétrie de la zone. Cette asymétrie peut être déterminée par exemple par comparaison des valeurs obtenues à partir de deux points au oors d'un balayage antérieur, précédant le recouvrement, le rapport des valeurs obtenues constituant un facteur de correction. Un autre procédé de compenation tient compte aussi de l'intensité mesurée réellement dans la région du recouvrement et qui est due évidemment en partie a une zone et en partie à l'autre. Le calculateur est commandé afin qu'il divise la valeur observée en chaque point de recouvrement suivant un rapport convenable. Un rapport approximatif convenable peut être obtenu par comparaison des valeurs mesurées des deux zones en des points placés symétriquement comme décrit précédemme avec ou sans réglage des valeurs comme indiqué précédemment. Lorsqu'elle est possible, l'utilisation d'au moins deux procédés distincts de calcul pour la compensation des zones de recouvrement est préférable, avec formation de la moyenne des résultats et détermination de l'erreur probable. Cependant, il faut noter que la région de recouvrement constitue habituellement une petite fraction de la surface totale d'une zone. En conséquence, des erreurs mêmes importantes sur une approximation de la valeur véritable du recouvrement peuvent ne pas affecter le résultat final d'une façon importante. En outre1 pour chacun des types indiqués de recouvrement, il est possible habituellement que la détermination de la concentration des protéines soit effectuée d'arcs des paramètres définis dans des parties de la zone qui ne sont pas affectées par le recouvrement. Ainsi, les mesures sont avantageusement celles qui sont proches du centre, dans des opérations analogues à l'immunoélectrophorèse, ou proches des extrémités dans les opérations analogues l'immunodiffusion directe. Les spécialistes peuvent noter que de nombreuses caractéristiques des procédés décrits peuvent être remplacées par des équivalents évidents, dans le cadre de l'invention. Par exemple, les valeurs des paramètres qui ne nécessitent pas une série de mesures à des temps successifs d'incubation peuvent etre obtenues à partir de mesures effectuées après que l'incubation a permis la mise à l'équilibre. Ces mesures présentent l'vannage de donner des configurations pratiquement statiques des zones, si bien que le moment exact de la mesure n'estpas primordial. Dans un autre exemple, à un moment voulu de l'incubation, les zones de précipitation peuvent être teintées de manière connue par un colorant convenable, et les mesures des zones peuvent être réalisées en lumière transmise sélectivement. Ce procédé de mesure est habituellement le plus utile lorsque l'équilibre a été atteint car il n'est pas alors nécessaire qu'un moment précis de mesure soit attribué. Ainsi, l'invasion concerne des procédés permettant l'utilisation de l'immunodiffusion, de l'immunoélectrophorèse et de processus analogues pour l'obtention d'une mesure réellement quantitative des concentrations des procédés individuelles dans des fluides biologiques. La mise en oeuvre réelle des procédés décrits montre que les concentrations des protéines peuvent être déterminées à 5 % près ou mieux, L'invention concerne donc un procédé efficace et commode permettant des déterminations expérimentales et de diagnostic extrêmement diverses. REVENDICATIONS 1. Procédé de mesure quantitative de la concentration d'une protéine dans un échantillon d'antigène qui a subi une immunodiffusion sous l'action d'une source d'anticorps contenant un anticorps spécifique de la protéine, la proteine et l'anticorps diffusant en contact avec réaction en direction sensiblement parallèle à un axe et dans une région d'un milieu de support initialement dépourvu des deux réactifs afin qu'il se forme au moins une zone allongée de précipitation de longueur limitée, -ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend le balayage de la zone par un dispositif optique afin que des signaux électriques correspondant à la concentration de précipitine dans un arrangement bidimensionnel de positions disposé en partie dans la zone et en partie en dehors de celle-ci soient formés, la détermination électronique, a partir des signaux électriques, de la valeur correspondante d'un paramètre choisi de la zone, ce paramètre variant de manière caractéristique avec la concentration de protéines, et la comparaison de lavlleur résultante du paramètre avec un jeu de valeurs de référence obtenu de façon correspondante à partir de zones de référence produites par immunodiffusion équivalente de plusieurs solutions d'antigène de référence contenant des concentrations connues de protéines, si bien que la concentration de la protéine dans l'échantillon peut être mesurée quantitativement. 2. Procédé selon la revendication 1, caracterisé en ce que, avant l'immunodiffusion, l'échantillon d'antigène a subi une migration sélective des protéines en direction sensiblement perpendiculaire audit axe. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le paramètre est la distance séparant les extrémités de la zone de précipitation. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le balayage de la zone est réalisé transversalement à celle-ci suivant plusieurs trajets distants et parallèles de balayage qui comprennent des trajets recoupant la zone et des trajets formés au-delà des extrémités de la zone, et la détermination d'une valeur du paramètre comprend la comparaison des signaux électriques de trajets choisis de balayage adjacents aux extrémités de la zone et la détermination de la distance séparant les trajets choisis 5.Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le paramètre est l'intensité intégrée dans la zone, les signaux électriques représentent l'intensité lumineuse dans des positions correspondantes de l'arrangement, et la determination d'une valeur d'un paramètre comprend l'ad- dition des valeurs des signaux dans des positions comprises dans la zone, après correction d'après des valeurs de positions adjacentes qui se trouvent en dehors de la zone. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le paramètre est le temps d'apparition initiale de la zone, le balayage de la zone est répété à plusieurs moments choisis lorsque la zone se forme, et la détermination du paramètre comprend la détermination à partir des signaux électriques, pour chaque balayage, d'une valeur d'un second paramètre qui varie de façon caractéristique en fonction du temps et a une valeur connue au moment de l'apparition initiale de la zone, avec extrapolation des résultats obtenus pour le second paramètre, en. arrière dans le temps jusqu'à la valeur connue. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le balayage de-la zone, permettant la formation de signaux électriques, comprend la formation d'une image optique de la zone sur une surface d'un tube d'une caméra vidéo, la représentation de l'intensité de l'image formée sur cette surface pour chaque position sous forme d'une représentation numérique, et la conservation dans une mémoire as sociée à un calculateur numérique, des représentations numériques et des adresses numériques identifiant les positions sur l'image. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il comprend la formation sur l'écran d'un tube à rayons cathodique d'une image correspondant aux signaux électriques et représentant la zone. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le balayage de la zone est répété à plusieurs moments lorsque la zone se forme, et les signaux électriques représentent des mesures d'intensité lumineuse en plusieurs positions dont les coordonnées x et y correspondent aux mesures réalisées, avec les valeurs des temps de balayage. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la détermination d'un paramètre comprend la formation d'un premier signal qui augmente avec la concentration de protéines, la formation d'un second signal qui diminue lorsque la concentration de protéines augmente, et la détermination d'un paramètre combiné sous forme dlun troi sième signal qui représente une combinaison différatielle du premier et du second signal. 11. Procédé selon llune des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'arrangement de positions comprend au moins une position comprise dans la zone d'un côté de celleci et dans une région de recouvrement avec une autre zone, et le balayage de la zone permettant la formation de signaux électrique comprend la création d'un signal électrique en une seconde position qui at placée de façon correspondante de l'autre côté de la première zone et dans une région dépourvue de recouvrement, le second signal de position étant utilisé pour la détermination du signal électrique de la première position. 12. Procédé selon l'une des revendication 1 et 2, caractérisé en ce que des parties respectives de l'échantillon d'antigène ont été enrichies par addition de quantités dif férentes connues de protéine avant l'immunodiffusion de chaque partie d'échantillon, le procédé comprenant le traitement de la zone résultante, pour chaque partie d'échantillon, au cours des opérations de balayage, de détermination des valeurs du paramètre et de comparaison des valeurs obtenues avec le jeu de valeurs de référence. 13. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que des parties de l'échantillon d'antigène ont été enrichies par addition de quantités différentes connues de protéine avant l'immunodiffusion de chaque partie d'échan- tillon, et le procédé comprend le traitement de la zone résul tante de chaque partie d'échantillon par les opérations de balayage et de détermination des valeurs des paramètres, ces valeurs correspondant aux diverses parties d'échantillon étant portées sur un graphique en fonction de la concentration de protéine ajoutée, la courbe obtenue étant extrapolée afin qu'elle donne une valeur de la concentration de protéine dans l'échantillon original. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il comprend la teinture de la zone de précipitation par un colorant avant le brayage de la zone. 15. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il comprend la détermination électronique, à partir des signaux électriques, de la valeur correspondante d'un paramètre supplémentaire de la zone qui diffère de façon caractéristique du premier paramètre en présence de certains comportements anormaux de la protéine, et la comparaison des valeurs du premier paramètre et du paramètre supplémentaire afin que la présence des comportements anormaux soit détectée. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'un des paramètres est essentiellement l'intensité intégrée dans la zone et l'autre est le moment de l'apparition initiale de la zone, et les valeurs des paramètres sont comparées sous forme des concentrations de protéines obtenues à partir des valeurs. 17. Procédé selon lrune des revendications I et 2, caractérisé en ce qu'il comprend la détermination électronique, à partir des signaux électriques, des valeurs correspondantes de la courbure de la zone en plusieurs segments, et la comparaison des valeurs obtenues en fonction des positions des segments le long de la zone afin que la présence d'un comportement anormal de la protéine soit détectée. 18. Appareil de mesure quantitative de la concentration d'une protéine dans un échantillon d'antigène qui a subi une immunodiffusion sous l'action d'un anticorpsspécifique de la protéine, cette dernière et l'anticorps diffusant dans un milieu de support à partir de sources respectives distantes le long d'un axe et réagissant avec formation d'au moins une zone allongée de précipitation ayant une longueur limite" ledit appareil tant caractérisé en ce qu'il comprend un dispositif optique et électronique destiné au balayage automatique de la zone afin que des signaux électriques vidéo réprésentant I'intensité lumineuse dans des positions respectives de l'arrangement bidimensionnel disposé en partie dans la zone et en partie en dehors de la zone, soient créés, chaque signal vidéo étant associé à des signaux électriques de position identifiant la position correspondante dans l'arrangement, et un dispositif qui, d'après les signaux vidéo et les signaux de position, détermine la valeur correspondante d'un paramètre choisi de la zone, variant de manière carac téristique avec la concentration de protéine. 19. Appareil selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend un dispositif commandant la répétition par intermittence du balayage assuré par le dispositif optique et électronique, et un dispositif destiné a associer des signaux électriques de temps aux signaux vidéo. 20. Appareil de mesure quantitative de la concentration d'une protéine dans un échantillon d'antigène, par traitement de l'échantillon par une immunodiffusion en présence d'une source contenant un anticorps spécifique de la protéine, les réactifs diffusant à partir de cavités respectives d'antigène et d'anticorps dans une plaque avec formation d'une zone de précipitation, la plaque faisant partie d'un arrangement de plaques d'immunodiffusion disposées pratquement dans un plan commun, ledit appareil étant caractérisé en ce qu'il comprend un dispositif de balayage optique des plaques, formant des signaux électriques vidéo représentant l'intensité lumineuse dans des positions dudit plan au niveau des cavités de la plaque et entre ces cavités, chaque signal vidéo étant associé à des signaux électriques identifiant la position correspondante dans l'arragement de plaques, un dispositif de distribution d'un antigène et d'un anticorps sélectivement dans des ca vités respectives sous l'action de signaux électriques de commande, et une commande qui reçoit les signaux vidéo et les si- gnaux de position et qui, dans un mode de fonctionnement, détecte la position du dispositif de distribution par rapport à chaque cavité individuelle et transmet un signal de commande au dispositif de distribution à la suite de cette détection afin que la cavité reçoive un réactif choisi, la commande ayant un autre mode de fonctionnement dans lequel elle détermine électroniquement, a partir des signaux vidéo et de position, la valeur correspondante d'un paramètre choisi de la zone, ce paramètre variant de manière caractéristique avec la concentration de la protéine précipitée.