Brevet FR2397636A1 — publié le 19790209

La présente invention se rapporte à des instruments convenant pour des analyses chimiques et microbiologiques, par exemple pour l'analyse d'urine, ainsi que d'autres humeurs biologiques, à des procédés pour fabriquer ces instruments et à des procédés analytiques effectués à l'aide de ces instrume:lts. I1 est connu d'utiliser pour des tests rapides des bandelettes de papier ou de matière plastique poreuse ou bien des comprimés qui ont été imprégnés d'un réactif. Un nombre seulement limité de réactions chimiques peuvent être effectuées convenablement dans des bandelettes ou comprimés de ce genre. Les bandelettes ou comprimés sont plongés dans le li quide à analyser et changent de coloration lorsqu 'une certaine substance se trouve dans le liquide de tels procédés d'essai donnent généralement des résultats qualitatifs et parfois semi quantitatifs Ainsi, lorsqu'on utilise une bandelette imprégnée dtun réactif, en combinaison avec un réflectometre, il est possible d'effectuer une détermination quantitative dont l'exacti- tudé est limitée. Pour un dosage plus précis, il est généralement nécessaire d'appliquer des modes opératoires plus compliqués qui sont laborieux et exigent un appareillage élaboré. En principe, il est possible d'automatiser beaucoup d'essais, cependant, en raison du prix de l'appareil nécessaire, llautoma- tisation n'est réalisable que dans de grands laboratoires qui effectuent un grand nombre d'essais du même genre. Il est connu également d'exécuter le dosage radioimmunologique dans des tubes en matière plastique [K.Catt et G.W. Uregear, Science, 158, 1570 (196?)J ou dans des tubes capillaires dont la paroi intérieure est constituée d'un haut polymère (y compris le verre) [voir brevet de la République d'Allemagne nc 2.530.9571 es dosages sont effectués au moyen de tubes ou d.e tubes capillaires dont la paroi intérieure est revêtue d'un anticorps. Suivant le brevet allemand} le diamètre du tube capillaire est de préférence au maximum de 1 mm. La Demanderesse a découvert à présent qu'il est possible d'effectuer convenablement un grand nombre de réactions analytiques dans des tubes capillaires dont le diamètre est supérieur a' 1 mm. Ces tubes capillaires constituent un matériel peu onéreux et facile à manipuler permettant dreffectuer des dosages chimiques qualitatif s, semi-quantitatifs et quantitatifs. L'invention a pour objet un instrument qui consiste en un tube capillaire fait d'une matière inerte et ayant un diamètre intérieur de plus de 1 mm, à la surface intérieure duquel adhèrent un ou plusieurs réactifs. Le réactif peut être présent en une quantité s'échelonnant d'une couche monomoléculaire à la quantité maximale qu'il est possible de fixer à l'intérieur du tube capillaire sans nuire à l'effet de capillarité. Aux fins de l'invention, par 11réactifs", on entend non seulement des substances chimiques,mais également des micro-organismes qui peuvent être modifiés par le liquide soumis à l'essai. te tube capillaire doit être fait d'une matière susceptible d'être mouillée par le liquide à essayer. Pour l'étude de liquides aqueux, les tubes capillaires en verre sont les plus appropriés. te diamètre intérieur du tube capillaire doit être tel que le liquide à essayer s'éleve dans le capillaire lorsque celui-ci est plongé dans ce liquide.Lorsque le diamètre est inférieur à I mm, le réactif laisse subsister une lumière insuffisante pour le liquide, cependant que > lorsque le tube capillaire est trop large, l'effet de capillarité est nul ou insufti- sant de sorte qu'un très petit volume de liquide peut s'élever dans le tube capillaire et que celui-ci ne peut être utilisé de manière adéquate. te diamètre intérieur est de préférence de 1 à 1,5 mm. ta longueur du tube capillaire est de préférence de 30 à 150 mn. Les micropipettes d'environ 100 /ul disponibles dans le commerce conviennent aux fins de l'invention. Lorsoue la cohésion du réactif ou son adhérence à la matière dont est fait le tube capillaire est insuffisante pour qu'il soit maintenu en place dans le tube capillaire7 il est possible d'utiliser un adhésif. Des exemples d'adhésifs appropriés sont les polymères d'origine biologique ou synthétique tels que les protéines, les dérivés de la cellulose et la polyvinylpyrrolidone. Il est évident qu'il convient de choisir un adhésif qui ne nuit pas à l'essai à exécuter. Suivant un autre aspect de l'invention > on prépare des tubes capillaires pour l'essai en plongeant un tube capillaire dans un liquide dans leauel se trouvent en solution ou en suspension un ou plusieurs réactifs et si nécessaire un adhésif de manière que la solution ou suspension s'élève dans le tube capillaire sous l'effet des forces de capillarite, on retire le tube capillaire de la solution ou suspension et on élimine le liquide contenu dans le tube capillaire, par exemple par lyophilisation. Suivant un autre aspect encore de l'invention, on effectue une détermination chimique ou microbiologique en faisant s'élever un liquide auquel on peut ajouter un ou plusieurs-réactifs, dans un tube capillaire à la paroi intérieure duquel adhèrent un ou plusieurs réactifs sensibles à la substance à déceler. Dans les deux cas, on observe l'effet entre le réactif dans le tube capillaire et le liquide à essayer, par exemple une variation de coloration ou -l'inhibition de la croissance du microorganisme. Les tubes capillaires conformes à l'invention peuvent être utilisés pour des déterminations qualitatives, semi-quantitatives ou quantitatives. I1 est possible d'effectuer une détermination qualitative au moyen d'un seul tube capillaire. L'observation d'une réaction entre le liquide à essayer et le réactif dans le tube capillaire indique la présence d'une substance spécifique en une concentration excédant un certain minimum Lorsqu'on utilise une série de tubes capillaires comprenant des quantités différentes choisies au préalable de réactifs, il est possible d'effectuer une détermination semi-quantitative. Suivant un autre aspect, l'invention a donc aussi pour objet des tubes capillaires faits d'une matière inerte à la surface intérieure desquels adhèrent un ou plusieurs réactifs en des quantités déterminees au préalable. Il est possible d'imposer la quantité de réactifs dans le tube capillaire en aspirant un liquide d'une concentration connue en le réactif jusqu'à un niveau choisi dans le tube capillaire. La détermination peut être basée sur des réactions chimiques courantes, cependant le réactif peut également être un constituant intervenant dans une réaction entre antigène et anticorps, de sorte qu'il est possible d'utiliser les tubes capillaires de 11 invention pour des dosages immunologiques. Dans les essais faisant intervenir des réactions chimiques courantes, il est préférable d'utiliser des réactifs qui se mettent aisément en solution ou en suspension dans le liquide à essayer. Dans de tels cas, la concentration du réactif dans le liquide est impose par les dimensions du tube capillaire et par la quantité de réactif que contient ce dernier. Pour un dosage immunologique, on utilise un réactif, comme un anticorps, qui reste fixé à la paroi de sorte qu'une réaction a lieu à l'interface entre le liquide et la paroi recouverte de réactif du tube capillaire. Dans de tels cas, les tubes capillaires offrent l'avantage que la couche de réactif n'est pas aisément endommagée. Les tubes capillaires peuvent aisément etre vidés, par exemple par contact avec un morceau de papier buvard, et être remplis nouveau de liquide jusqu'au niveau voulu qui correspond à un volume choisi. Ainsi, les tubes capillaires de l'invention permettent d'excécuter aisément des analyses en plusieurs stades sans devoir recourir aux accessoires de distribution tels que des pipettes. On peut observer visuellement (variation de coloration, formation d'un précipité, etc. > ou au moyen d'instruments (par exemplevariation de l'absorbance dans l'infrarouge ou l'ultraviolet) Si une réaction a lieu. Il est entendu que la matière du capillaire doit entre transparente à (aux) largeur(s) d'onde entrant en jeu lorsqu'on utilise des méthodes optiques. Une détermination quantitative de la concentration du produit de la réaction dans le tube capillaire peut être effectuée suivant les techniques analytiques courantes. I1 est possible d'utiliser..des instruments optiques pour mesurer les variations de coloration ou d'absorbance dans le domaine visible, ultraviolet ou infrarouge du spectre. I1 est possible aussi d'effectuer des mesures de radioactivité pour un dosage radio-immunologique lorsque l'antigène ou l'anticorps est déposéou fixé par covalence sur la paroi du capillaire ou sur une couche intermédiaire adhérant à la paroi. Lorsque la réaction implique une variation des propriétés électriques (par exemple de la conductivité), il est possible de mesurer ces variations au moyen d'instruments convenables. Dans certains cas, une seule mesure au terme de la réaction suffit. Dans d'autres cas, il est.nécessaire de suivre la variation du paramètre durant un certain laps de temps, par exemple dans les dosages immunologiques enzymatiques pour lesquels la réaction entre l'indicateur et }'enzyme est suivie au moyen d'un absorptiomètre. Les réactions de coagulation peuvent étre suivies par mesure de la viscosité, par exemple par observation de l'écoulement du liquide lorsque le tube capillaire est retourné ou de la durée nécessaire pour que le tube capillaire se vide sur un morceau de papier buvard. La croissance de micro-organismes dans le tube capillaire peut etre mesurée par turbidimétrie. De la sorte, il est possible d'évaluer la sensibilité aux antibiotiques et réciproquement, de déterminer la concentration en antibiotique au moyen d'une suspension normalisée de microorganismes sensibles. t'énumération ci-dessus de techniques pour lesquelles il est possible d'utiliser les tubes capillaires de l'invention n'est donnée qu'à titre d'exemple et ne limite pas la portée de l'invention. De manière générale, les tubes capillaires peuvent etre utilisés pour l'analyse de toutes les humeurs biologiques et sécrétions et pour la détermination de toutes les substances ayant un intérêt pour le diagnostic. Du fait que les tubes capillaires ont un diamètre relativement grand (en comparaison de ceux utilisés suivant le brevet allemand précité), des petites variations de dimensicn n'ont pas beaucoup d'influence sur la fiabilité des déterminations quantitatives. Cependant, pour certaines fins, en particulier lors de déterminations quantitatives suivant des techniques optiques, les variations doivent rester dans certaines limites. De préférence, le diamètre intérieur et l'épaisseur de paroi ne s'écartent pas de plus de 2% de la valeur moyenne au sein du mene tube capillaire.Lorsqu'une détermination nécessite l'utilisation de deux tubes capillaires ou davantage pour une mesure cozparative (par exemple Qe l1absorbance lumineuse), les différences entre leurs dimensions tombent de préférence dans les memes lites. Suivant un autre aspect, l'invention a donc pour objet un emballage ou une trousse comprenant deux tubes capillaires ou davantage dont l'épaisseur de paroi et le diamètre intérieur ne 'écartent pas de pus de 2% de la vapeur moyenne pour les tubes capillaires que comprend l'emballage ou la trousse. 3es exemples d'essais qu'il est possible d'effectuer au moyen des tubes capillaires de l'invention sont donnés ciaprès: dans l'urine: lactate, glucose; dans le sérum ou le plasma: glucose, cholestérol, azote uréique du sang, acide urique, triglycérides, protéines totales, phosphatase alcaline, transaminase glutamique-oxaloacétique sérique, transaminase glutamique-pyruvique sérique, créatine phosphokinase, p-nydroxyoutyrate, lactate déshydrogénase; dans le liquide amniotique: enzymes ou métabolites dont la présence ou l'absence indique des troubles innés du metabo- lisme, par exemple galactokinase, galactose-l-phosphate uridyle, l,4-glucosidase, arylsulfatase A, cl l-iduronidase, acide pyruvique, acide lactique, acide 2-oxoglutarique; dans le liquide cérébro-spinal: glucose, protéines. De manière générale, ces déterminations peuvent être effectuées à l'aide des réactions classiques. Par exemple, il est possible de déceler et doser le lactate au moyen de lactate déshydrogénase et d'un colorant comtale le dichlorophénolindophénol; la lactate deshydrogénase au moyen de lactate et d'un colorant comme le dichlorophénol indophonol; le glucose au moyen de glucose-oxydase, de peroxydase et d'un colorant comme l'o- toluidine; le cholestérol au moyen de cholestéroloxydase, de peroxydase et d'un colorant; d'une protéine au moyen d'un réactif du type des biurets ou d'un colorant indicateur de pH,par exploitation de 1 'effet appelé protéique; le -Bydroxybutyrate au moyen de -Bydroxybutyrate déshydrogénase et d'un colorant, et ainsi de suite. ta préparation d'un tube capillaire d'essai conforme à l'invention est décrite dans l'exemple c-après. EXEMPLE 1. - - On dissout 2,4 millimoles de dichlorophénolindophé- nol dans 1 litre d'eau distillée et on ajoute à cette solution 10 l d'hydroxyde de sodium HT. On fait alors barboter de l'oxygène pur dans la solution pour assurer l'oxydation com- plète. On dilue cette solution avec 5 litres d'une solution contenant par litre 0,18 mole de phosphate de potassium comme tampon et 1,2 millimole d'acide éthylènediamine tétraacétique. On dissout alors de la lactate déshydrogénase de levure en quantité apportant 90.000 unités et ayant une activité spécifique de 17,2 unit & par mg de protéine. La concentration finale en dichlorophénolindophénol est donc de 0,4 millimole par litre. On plonge dans cette solution des tubes capillaires en verre d'un diamètre intérieur de 1,5 mm et d'une longueur d'environ 60 mm (capacité d'environ 100/ul) et on laisse la solution s'é- lever jusqu'à environ 22 me de manière que la quantité de solution dans chacun des tubes capillaires soit d'environ 40 l. Immédiatement ensuite, on congèle les tubes capillaires et on les lyophilise pendant environ 17 heures. te niveau jusqu'auquel les tubes capillaires ont été remplis est nettement visi ble sur les tubes capillaires secs. ta lactate déshydrogénase de levure utilisée dans les opérations ci-dessus s'obtient de la manière suivante. On lyophilise et on amène à l'état de poudre fine 800 g de levure de boulangerie compressée fraîche. On l'extrait alors et on la fractionne au moyen d'acétone comme décrit en détail par A. Spyridakis et t.F. Naslin dans Biochemie , 195-205 (1971),si ce n'est qu'on effectue l'autolyse pendant 20 heures à + C. On extrait le précipité rose pendant 1 heure à une température de -2 à O C au moyen d'une solution aqueuse contenant par litre 0,15 mole de lactate de sodium, 0,1 millimole d'acide éthylènediaminetétraacétique, 1 millimole de MgSOW et 150 g d'acétone. te pH de la solution est de 6,8. Ce pH évite la dialyse du précipité poisseux roseXqui se traduirait par une grande perte d'activité. On traite alors ltex- trait comme décrit par R.K. Morton et E. Shepley dans Biochem. J. 89, pages 257-262 (1963) jusqu'à obtenir l'extrait dans le pyrophosphate qu'on sature alors au moyen de sulfate d'ammonium jusqu'à 70%,puis on conserve-la solution jusqu'au lendemain à -200C. Après centrifugation pendant 50 minutes à 11.000 g à oac, on dissout la lactate déshydrogénase de levure brute dans 10 ml d'un tampon 0,1 M en chlorhydrate de tris-(hydroxyméthyl) aminométhane à pH 8,0 et on chromatographie la solution à 4 C sur une colonne de la diéthylaminoéthylcellulose vendue sous le nom de Sephadex A 25 par la Société Pharmacia AB, Uppsala, Suède d'une longueur de 30 cm et d'un diamètre de 2,5 cm. On élue la lactate déshydrogénase de levure au moyen d'une solution O,lM d'un tampon au chlorhydrate de tris-(hydroxyméthyl)aminométhane à pH 8,0. On peut conserver la solution d'enzyme. saturée de sulfate d'ammonium jusqu'à 70% à -20 C ou la concentrer par centrifugation. L'activité spécifique du produit peut s'élever à 17 unités d'enzyme par mg de protéine au total. Aux fins de l'invention~, 1 unité de lactate déshydrogénase de levure est définie comme étant la quantité qui réduit 1 mole de ferricyanure par minute à. 2500 dans une solution -contenant par litre 0,1 mole d'un tampon au phosphate à pH 7,2, 5,0 millimoles d'ion ferricyanure, 20,0 millimoles de L(+)-lactate de lithium, la mesure étant effectuée par observation de la baisse dé l'extinction à 420 nm (maximum d'absorption du ferricyanure). La lactate déshydrogénase de levure obtenue de la sorte a une activité spécifique suffisamment élevée pour le dosage du lactate comme décrit à l'exemple 2. La Demanderesse a constaté qu'une activité spécifique de 10 à 20 unités par mg de protéine au total convient pour un tel dosage. Une activité spécifique plus faible exigerait des quantités assez grandes de protéine au total pour que la quantité d'enzyme suffise, ce qui tendrait à provoquer le colmatage des tubes capillaires. Une activité spécifique plus élevée impliquerait une quantité de protéine insuffisante pour la fixation du réactif solide sur la paroi des tubes capillaires, auquel cas un agent de fixation supplémentaire serait nécessaire. te dosage du lactate au moyen d'un tube capillaire préparé conformément à l'exemple 1 est décrit à l'exemple ciaprès. ESEDGPLE 2 On vérifie ltefficacité de quelques uns des tubes capillaires secs en y introduisan-t,à raison de 40 Sul,des solutions qui contien-nent par litre des quantités connues de lactate ~ de sodium, en les agitant en vue d'un mélange intime et en observant toute variation de coloration. tes solutions contenant jusque 0?4 millimole de lactate de sodium par litre ne provoquent aucune décoloration des tubes capillaires dans un délai de 2 minutes, au contraire des solutions contenant plus de 0,4 millimole de lactate de sodium. On note la durée nécessaire pour la décoloration et on établit au moyen de ces résultats une courbe d'étalonnage.Cette courbe est représentée au dessin annexé qui porte en ordonnées la durée en minutes et en abscisses la concentration en lactate en millimoles par litre. il est possible dresti- mer à partir-de cette courbe l'excès d'ions lactate.On consi dère qu'une concentration en lactate de plus de O,'4 millimole par litre est excessive du fait qu'une concentration atteignant cette valeur est normale dans l'urine humaine,mais que des concentrations plus élevées indiquent un état pathologique comme le diabète, la glycogénose, l'acidose lactique congénitale, les troubles par prolifération de néoplasmes ou un mauvais fonctionnement des reins On soumet aux essais de la manière suivante des échantillons d'urine contenant différentes quantités connues de lactate de sodium et d'acide ascorbique. On ajoute d'abord à chaque échantillon une petite quantité de carbone actif en poudre et on agite le mélange pour obtenir une dispersion homogène. Immédiatement après, on sépare le carbone par filtration et on soumet le filtrat aux essais au moyen d'un tube capillaire comme décrit à l'exemple 1. On constate que l'adsorption de l'acide ascorbique sur le car bone actif est pratiquement complète et que l'adsorption du lactate est négligeable. Il est nécessaire d'élimIner l'acide ascorbique du fait que celui-ci peut également être oxydé durant l'essai. On a également décelé dans l'urine l'ion l-hydroxy butyrate,mais celui-ci n'inzeluence pas le dosage du lactate. On conserve à l'obscurité à -200C pendant des durées atteignant 6 mois un certain nombre des tubes capillaires preparés conformément à l'exemple 1. Lorsqu'on utilise les tubes capillaires ainsi conservés en appliquant le mode opératoire de l'exemple 2 et qu'or compare les résultats avec ceux relevés au moyen de tubes capillaires frais provenant du même lot, on ne constate aucune différence sensible. Dans l'essai décrit à l'exemple 2 il est possible d'utiliser de la lactate déshydrogénase isole de muscles de mam miSères plutôt que de la lactate déshydrogénasede levure. La lactate déshydrogénase isolée de muscles de mammifères a une activit é optimale à un pH de 10 et est satisfaisante à un pH de 9,6 à 10,3. Il est possible également de recourir à toute autre enzyme comparabletuelle que soit l'enzyme utilisée il est toujours nécessaire d'ajuster le pH à une valeur proche du pH optimal de l'enzyme par addition d'un mélange tampon au réactif du fait que le pH de l'urine peut varier beaucoup. En plus du dichlorophénolindophénolX il existe ai. vers oxydants colorés qui ont un potentiel d'oxydation convenable et qui n' oxydent pas la plupart des composés se retrouvant régulièrement ou parfois dans l'urine en l'absence d'une enzyme comme catalyseur, mais qui oxydent sélectivement l'ion lactate en présence d'une lactate déshydrogénase. Des exemples d'autres oxydants qui peuvent être utilisés avec la lactate déshydrogenase de levure sont l'ion ferricyanure, le bleu de méthylene et l'o-phe'nanthroiineassoeie'eà l'ion Fe+++ Cependant, dans le cas d'une lactate déshydrogénase de muscle, il est possible d'utiliser un mélange de nicotinamide adénine dinucléotide, de méthosulfate de phénazine et de chlorure de te'trazolium-bleu nitre'. Sous la forme oxydée chacun de ces composés est coloré,cependant que sous la forme réduite chacun d'entre eux est soit incolore, soit d'une couleur dif férente. De préférence, l'oxydant utilisé subit une variation de coloration rapide et intense au moment où il a été totalement réduit et la forme réduite n est pas susceptible d'une réoxydation aisée sous l'eff et de l'air,qui pourrait rendre les résultats douteux. L'oxydant ne peut pas être hydroscopique et est de préférence ais ment soluble dans l'eau. te dichlorophénolincophénol présente une très bonne combinaison de ces propriétés et a une coloration bleu intense sous la forme d'un de ses sels alcalins oxydés (pH de plus d'environ 6) en étant incolore sous la forme acide oxydée ou sous la forme réduite. La forme bleue du dichlorophénolindoplle'nol présente un maximum d'absorption à 600 nm avec un coefficient dtextinc- tion de 20,1 x 103 cm2/miilimole. A cette longueur d'onde, la lactate déshydrogénase isolee de muscles a une absorption de la lumière très importante, au moins sous la forme utilisée de préférence qui contient encore un peu de la protéine initiale associée,et et il est donc préférable d'utiliser cet oxydant en combinaison avec la lactate déshydrogénase isolée de levure qui ne présente pas une telle absorption. La lactate déshydrogénase de levure offre l'avantage supplémentaire que son pH optimal est plus proche des valeurs du pH normalement rencontrées dans l'urine qui peuvent être d'à peine 4,4. L'utilisa- tion d'une enzyme dont le pH optimal est plus bas permet 1 'uti- lisation de moindres quantités de tampon pour l'établissement du pH optimal,indépendamment du pH de l'échantillon d'urine. Une autre différence entre les deux types de lactate déshydrogénase est que celle isolée de muscles conduit à une réoxydation de l'oxydant plus rapide sous l'effet de l'air, ce qui est évidemment indésirable. R E V E N D I C A T I O N S. 1 - Instrument analytique, caractérisé en ce qu'il consiste en un tube capillaire fait d'une matière -inerte, dont le diamètre intérieur est supérieur à 1 mm et à la surface intérieure duquel adhèrent un ou plusieurs réactifs. 2 - Instrument analytique suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est fait de verre. 3 - Instrument analytique suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que son diamètre intérieur est de 1 à 1,5 mm. k - Instrument analytique suivant la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce ome le volume de la lumière est d'environ 100/ l. 5 - Instrument analytique suivant la revendication 1, 2, 3 ou 4, caractérisé en ce que ltepaisseur de paroi et le dia- mètre intérieur ne s'écartent pas de plus de 2% de leur valeur moyenne. 6 - Jeu de 2 instruments ou davantage suivant la revendication 5, caract-erisé en ce que le diamètre i=bérieur et l'épaisseur de paroi de chacun des tubes capillaires ne s'écartent pas de plus de 2% de la valeur moyenne pour le Seu. 7 - Emballage ou trousse, caractérisé en ce qu'il contient -un jeu de tubes capillaires suivant la revendication 6. 8 - Procédé pour préparer un instrument analytiquesion l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'on pion- ge un tube capillaire convenable dansun agent de mise en 501.tw tion ou en suspension contenant un ou plusieurs réactifs etXsi nécessaire,un adhésif de manière que le liquide s'élève dans le tube capillaire sous l'effet des forces capillaires, on retire le tube capillaire du liquide et on élimine l'agent de mise en solution ou en suspension contenu dans le tube capillaire. 9 - Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce qu'on élimine l'agent de mise en suspension ou en solution par lyophilisation-. 10 - Procédé pour effectuer une détermination chimique ou microbiologique, caractérisé en ce qu'on aspire un liarde auquel con peut ajouter un ou plusieurs réactifs dans In tube capillaire suivant l'une quelconque des revendications-1 à 5 contenant un ou plusieurs réactifs sensibles à la substance a déceler et cn obse renet mutuel du ou des réac titis dans le tube capillaire et du liquide soumis à l'essai. Il - Instrument suivant ltune quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il contient le ou les réactifs en quantités déterminées au préalable. 12 - Instrument suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5 et 11, caractérisé en ce que le ou les réactifs se mettent aisément en solution ou en suspension dans le liquide soumis à l'essai. 13 - Instrument suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5 et 11, caracterisé fnoe que le ailes reactifs restent fixés à la paroi du tibe capillaire directement ou par une couche intermédiaire. 14 - Instrument suivant l'une quelconque des reven dictions 1 à 5, 11 et 12, caractérisé en ce que les réactifs sont le dichlorop'iénolindophénol et la lactate déshydrogénase de levure. 15 - Procédé suivant la revendication 8 ou 9, ca caractérisé en ce que le liquide qui s'élève dans le tube capillaire contient du dichlorophénolindophénol et de la lactate déshydrogénase de levure. 16-- Procedé suivant la revendIcation 10, caractérisé en ce qu'on utilise un instrument suivant la revendication 14 pour la détermination du lactate.