Brevet FR2424319A1 — publié le 19791123

La présente invention concerne un nouveau procédé de préparation du cytochrome C à partir d'une levure. On sait que le cytochrome C est une hémoprotéine, c'est-a-dire une substance comprenant une partie protéique specifique et une autre partie non protéique, appelée heme et qui est une porphyrine. te rôle du cytochrome C est directement lié aux réactions d'oxydo-réauctian, c'est pourquoi le cytochrome C est un élément essentiel de la chalne des transporteurs d'électrons. On sait aussi que l'on a déjà préconisé de nombreux procédés pour isoler le cytochrome C, notamment a partir de la levure de boulangerie SCf. Keilin, Proc. Roy. Soc. (London) Ser. B 106, 418 (1930) et Hagikara et col. Nature 178, 629 (1956)7, du coeur de boeuf dCf. Kirby et Col., Acta Chem. Scand., 10, 148 (1956)7 et du coeur de cheval tCf. Nozaki et col., J. Biochem. (Tokyo) 44, 453 (1957)7. Selon l'invention, on propose un nouveau procédé de préparation du cytochrome C a partir d'une levure, ce nouveau procédé étant plus interessant que les procédées antérieurs et surtout plus pratique que le procédé actuellement utilisé et qui consiste a extraire le-cytochrome C du coeur de cheval. Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que successivement a) on soumet la levure a une lyse cellulaire en milieu liquide sous pression b) le milieu liquide résultant est soumis a une precipitation au moyen de chlorure de manganese et de sulfate d'ammonium, puis on écarte le précipité et recueille la phase liquide -; c) la phase liquide ainsi obtenue et qui contient le cytochrome C est amenée a un pH compris entre 8 et 8,25, puis fixée sur une résine échangeuse d'ions ; d) la résine sur laquelle le cytochrome C a été fixé est lavée avec une solution aqueuse alcaline à pU 8-8,25, puis éluée au moyen d'une solution aqueuse de sulfate d'ammonium, puis on recueille 1'1ut ; e) l'eluat ainsi obtenu est soumis à une précipitation au moyen d'une solution aqueuse de sulfate d'ammonium de 4,5 M a 6 M f) le précipite ainsi obtenu est repris dans de l'eau, puis précipité au moyen d'un alcool, de préférence C2H5OH. Parmi les levures qui conviennent selon l'invention on peut notamment citer les souches de Saccharomyces et de Kluyveromyces, en particulier les Saccharomyces cerevisiae et Kluyveromyces fragilis. La levure préférée du point de vue du rendement est le Kluyveromyces fragilis qui offre la particularité de présenter une respiration cellulaire tres importante et par suite une croissance rapide (en particulier, sa respiration cellulaire est cinq fois plus importante que celle du Saccharomyces cerevisiae). Convient notamment la souche Kluyveromyces fragilis No. CBS-397 du catalogue de la collection du CentraaL Bureau voor Schimmelculture de Baarn. Le stade a) est avantageusement mis en oeuvre dans le milieu de culture de la levure. En pratique, le stade a) débute sur des jus de culture renfermant de 100 a 400 g de levure exprimés en matiere seche pour un litre de jus. Si on veut standardiser on effectuera la lyse cellulaire par voie mécanique sur un jus de culture renfermant 1011 et de préférence 1012 germes/cm3, de l'eau, des eléments nutritifs (une source de carbone, une source d'azote, et le cas échéant des oligoéléments). La lyse cellulaire est réalisée par voie mécanique sous une pression comprise entre 300 et 760 bars, et de préférence entre 300 et 500 bars, et est poursuivie jusqu a ce qu au moins 80 z des cellules aient leur membrane rompue. La lyse cellulaire est effectuée en milieu légèrement acide ou neutre à un pH compris avantageusement entre 6,5 et 7. Pour la précipitation du stade b), on peut utiliser (i) un agent précipitant, notamment un sel, ou (ii) un agent chelatant les acides nucléiques. L'agent précipitant préféré est (NR4)2S04 et l'agent chelatant préféré est MnC12. En pratique, si on peut utiliser le sulfate d'ammonium seul pour réaliser la précipitation du stade b), il est toutefois recommandé pour obtenir de bons résultats en ce qui concerne la pureté du produit final, d'utiliser MnC12 et (NH4)2S04 Dans ce dernier cas, qui est une double précipitation, le chlorure de manganèse et le sulfate d'ammonium peuvent être utilisés en même temps ou l'un apres l'autre, par exemple MnC12 avant (NH4)2504. De façon avantageuse, la précipitation du stade b) est mise en oeuvre avec 0,1 volume de MnC12 I M pour un volume de milieu liquide résultant du stade a), et avec 100 g/l de (NH4)2S04. - - Le milieu liquide obtenu au stade b) renferme le cytochrome C et d'autres protéines, ces dernieres vont être écartées au stade c) car non fixées sur la résine. La résine échangeuse d'ions du stade c) est une résine anionique, de préférence une résine du type polystyrene réticulé présentant des groupes acides S03H,C02H, par exemple une résine Amberlite IRC 50. On utilisera un volume de 10 a 15 litres de résine pour fixer 250 g de cytochrome C. Avant usage, la résine sera mise sous forme Na Le lavage du stade d) est réalisée de façon avantageuse avec une solution aqueuse ammoniaqueefun volume de NH40H pour un volume de phase liquide du stade b) ; l'solution est mise en oeuvre avec une solution aqueuse renfermant (NH4)2 S04 a environ 150 gil et a pH compris entre 8 et 8,50 (le pH étant réglé avec NH3). Au stade f) on peut faire appel a un alcool aliphatique inférieur, tel que CH30H, C2H50H, ce dernier étant le préféré. Après le stade e) et avant le stade f) on peut envisager, le cas échéant, une précipitation avec acide trichloroacétique, ou un traitement sur résine. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de préparation nullement limitatifs. exemple 1 - Obtention du cytochrome C a partir de Kluyveromyces fragilis a) Extraction Un jus de culture de Kluyveromyces fragilis renfermant 1012 germes.'cm3 (soit environ 120 g de levure en poids sec par litre de jus de culture) est soumis à une lyse cellulaire au moyen d'un homogénéisateur (de type MANTON-GAULIN; cet appareil commercialise par la Sté britannique APV opère en tant qie presse en laminant les cellules en milieu aqueux en soumettant ces cellules a un choc de 450 a 500 bars).Après deux passages dans cet appareil à 450-500 bars, la lyse cellulaire est de 90 %. On obtient un liquide visqueux qui est alors soumis à une précipitation au moyen de deux agents utilisés en même temps : MnC12 1 M et (NH4)2 so4 en solution aqueuse à 100 g/l. Après une durée de contact de 30 minutes à 1 heure à 4-lO0C, on procède à une centrifugation. Le précipite, qui contient des débris cellulaires, des acides nucléiques et des polysacchar-ides est éliminé. Le surnageant que lton recueille est amené à pH 8,25 au moyen d'une solution aqueuse de NaOH à 100 girl. b) Purification sur résine On fixe le surnageant obtenu ci-dessus et qui contient le cytochrome C à extraire, sur une résine échangeuse de cations Amberlite IRC 50 sous forme Na+, la fixation s'effectuant jusqu'à saturation des deux tiers de la capacité de la résine. On lave avec 0,1 volume de NH4OH (à pH 8,25) pour 1 volume de surnageant initial, puis on élue avec une solution aqueuse de (NH4)2 S04 diluée (150 g/l, pH réglé à 8,5 au moyen de NH3). c) Purification par précipitation L'éluat obtenu ci-dessus est précipité avec une solution aqueuse de (NH4)2S04 4,5 M. On laisse floculer une nuit à une température comprise entre O et lO0C (detpreference a 40C), on filtre pour récupérer le précipité que l'on reprend dans de l'eau. d) Isolation La solution aqueuse obtenue ci-dessus est précipitée au moyen d'acide trichloracétique jusquà pH 3. Après centrifugation le culot de centrifugation est repris à l'eau puis a nouveau précipité au moyen de C2HSOH. On centrifuge à nouveau, reprend le précipité avec de l'eau a pH faiblement alcalin (pH 7,5 environ), puis on lyophilise. Le cytochrome C ainsi obtenu présente des pics d'absorption en milieu oxydé a 420, 520 et 550 nm, et en milieu réduit à 360, 410 et 530 nm. Son activité biologique est vérifiée sur la cytochrome C oxydase d'une part, et sur un tissu cellulaire en état d'hypoxie selon les techniques usuelles. Le rendement en cytochrome C est de 250 g de produit électrophorétiquement pur pour I tonne (en poids sec) de levure. Exemple 2 - Obtention du cytochrome C à partir de Kluyverowyces fragilis On procède comme indiqué à l'exemple I en modifiant toutefois le stade d) comme suit La solution aqueuse obtenue à l'exemple 1 c) est passée sur une résine échangeuse d'ions, du type Sephadex G 25 pour procéder à un dessalage. L'éluat recueilli est précipité deux fois de suite au moyen de C2H5OH, puis repris dans de l'eau faiblement alcaline (pH 7,5), et enfin soumis à une lyophilisation. On obtient ainsi un produit (le cytochrome C) identique à celui de l'exemple 1. Exemple 3 - Obtention du cytochrome C à partir de Saccharomyces cerevisiae On procede comme indiqué à l'exemple 1 et on obtient un produit final ayant les mêmes caractéristiques que celui des exemples 1 et 2. R E V E N D I C A T I O N S REVENO~~C~A~T~TON~S 1. Procédé de préparation du cytochrome C à partir d'une levure, ledit procédé étant caractérisé en ce que successivement a) on soumet la levure à une lyse cellulaire en milieu liquide sous pression ; b) le milieu liquide résultant est soumis à une précipitation au moyen d'au moins un agent choisi parmi l'ensemble constitué par les agents précipitant les protéines et les agents chelatant, puis on écarte le précipité et recueille la phase liquide c) la phase liquide ainsi obtenue et qui contient le cytochrome C est amenée à un pH compris entre 8 et 8,25, puis fixée sur une résine échangeuse d'ions ; d) la résine sur laquelle le cytochrome C a été fixée est lavée avec une solution aqueuse alcaline à pH 8-8,25, puis éluée au moyen d'une solution aqueuse de sulfate d'ammonium, puis on recueille l'élut e) l'éluat ainsi obtenu est soumis à une précipitation au moyen d'une solution aqueuse de sulfate d'ammonium de 4,5 M à 6 M ; f) le précipité ainsi obtenu entrepris dans de l'eau puis précipité au moyen d'un alcool, de préférence C2H5OH. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la levure est choisie parmi l'ensemble constitué par le Saccharomyces cerevisiae et le Kluyveromyces fragilis. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la lyse cellulaire du stade a) est effectuée sous une pression de 300 à 760 bars, et de préférence sous une pression de 300 à 500 bars. 4. Procédé selon la revendication I caractérisé en ce que au stade b) l'agent précipitant est le sulfate d'ammonium. 5. Procédé selon la revendication I caractérisé en ce que au stade b) l'agent chélatant est le chlorure de manganèse. 6. Procédé selon la revendication I caractérisé en ce que au stade b) on procède à une double précipitation au moyen de MnC12 et de (Nil4) 2S04. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la précipitation du stade b) est réalisée au moyen de 0,1 volume de MnC12 I M et d'une solution aqueuse de (NH4 > 2S04 à 100 gil 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le lavage du stade d) est réalisé au moyen d'une solution aqueuse ammoniaquée. 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'élution du stade d) est réalisée au moyen d'une solution aqueuse de pH compris entre 8 et 8,50 et renfermant 150 g/l environ de (NH4)2S04.