Brevet FR2413466A1 — publié le 19790727

La présente invention a pour objet un procédé et un microcalorimetre vour études biologiques. Le secteur technique de l'invention est celui de la construction des nicrocalorimetres a flux de chaleur continu. On connaît les microcalorimètres a flux de chaleur continu qui comportent une cellule de mesure et des thermocouples qui relient les parois de la cellule un bloc de métal, maintenu a température constante, qui a une grande inertie thermique et que nous appellerons bloc réservoir de calories. On produit dans la cellule une réaction chimique exothermique ou endothermique ou un phénomène biologique ou biochimique qui dégage ou qui absorbe des calories. Le flux de chaleur s'écoule en continu entre la cellule et le bloc réservoir a travers les thermocouples et on mesure la différence de potentiel qui prend naissance aux bornes des thermocouples et qui est proportionnelle au flux de chaleur instantané. L'enregistrement de l'évolu- tion de la différence de potentiel permet d'étudier la cinétiquedes réactions chimiques. Les microcalorimetres sont utilisés en biologie pour étudier, par exemple, la croissance ou l'activité de souches de micro-organismes ou de cultures de tissus animaux ou végétaux dans des milieux de culture déterminés ou au contact d'une atmosphere gazeuse de nature ou de concentration determi- nee. Les calorimètres utilisés en biologie doivent mesurer, avec une grande précision, des flux de chaleur tres faibles, de tordre de quelques dizièmes de calories par heure ou de quelques milliwatts, c'est pourquoi on les appelle des microcalorimètres. Pour éviter les perturbations ou les erreurs de mesure dues aux variations de température ambiante, on place la cellule de mesure et le bloc réservoir de calories a l'intérieur d'une enceinte isotherme dont la tempéra ture.interne est maintenue constante au moyen d'une régulation. De plus, le calorimetre comporte une deuxieme cellule de référence, identique à la cellule de mesure, qui est équipée également de thermocouples. Les tensions délivrées par les thermocouples de la cellule de mesure et de la cellule de référence sont mises en opposition, de sorte que ce montage différentiel supprime ou atténue considérablement les erreurs de mesure dues à des facteurs externes. Les thermocouples vont alternativementfen zig-zag, d'une paroi de la cellule au bloc réservoir, les soudures bimétalliques étant placées alternativement au contact de chaque paroi et les thermocouples successifs sont montes en série, de sorte que les différences de potentiel délivrées par chaque thermopile individuelle s'additionnent. I1 est nécessaire de monter en série un grand nombre de thermocouples pour obtenir une résistance thermique du capteur de flux qui donne une bonne sensibilité. Les microcalorimètres connus à ce jour sont utilisés couramment en biologie et donnent de bons résultats dans 11 étude des croissances microbiennes en anaérobiose. Par contre, les microcalorimètres connus ne conviennent pas pour étudier des croissances microbiennes en aérobiose ou des phénomènes biologiques qui font intervenir des échanges gazeux entre le milieu de culture des microbes ou des tissus et l'atmosphère qui entoure ce milieu. En effet, dans les microcalorimètres connus, l'atmosphère qui surmonte le milieu de culture est une atmosphère confinée et sa composition varie en cours d'expérience par suite des échanges avec le milieu de culture ce qui perturbe l'expérience. Un objectif de la présente invention est de procurer des microcalo rimètres mieux adaptés que les microcalorimètres connus aux études de cultures microbiennes en aérobiose et plus généralement à toutes les études biologiques de cultures de microbes ou de tissus animaux ou végétaux dans un milieu de culture déterminé, dans lesquelles interviennent, comme facteur déterminant,des échanges gazeux ou des échanges d'énergie lumineuse à travers l'interface qui sépare le milieu de culture d'un milieu ambiant, et notamment à travers la surface libre d'un bain de culture liquide qui sépare celui-ci d'une atmos phère gazeuse qui le surmonte. Un microcalorimètres pour études biologiques selon l'invention comporte, de façon connue, au moins une cellule de mesure dans laquée est placé un milieu de culture, et une cellule de référence identique aux cellules de mesure, lesquelles cellules sont obturées par un bouchon étanche et sont placées dans des logements creusés à 1' intérieur d'un bloc réservoir de calories, lequel bloc est disposé à l'intérieur d'une enceinte isotherme et est maintenu a température constante. Chaque cellule est équipée d'un capteur de flux composé de thermocouples montés en série et allant alternativement d'une paroi externe de la cellule audit bloc réservoir. L'objectif de l'invention est atteint au moyen d'un procédé suivant lequel, pendant toute la durée d'une expérience, la composition de l'atmosphe- re gazeuse comprise entre le bouchon de la cellule et la surface libre du milieu de culture est contrôlée. Pendant une expérience, on introduit dans chaque cellule, dans les pace compris entre le bouchon d'obturation et la surface libre du milieu de culture, un gaz de composition détermieà une température voisine de la tem pérature à l'intérieur de ladite enceinte isotherme,et on fait circuler un très faible débit gazeux à travers cette espace. On renouvelle le volume gazeux compris dans cet espace intermédiaire avec un débit compris entre 0,5 et 20 volumes par heure et, de préférence, de l'ordre de 2 à 3 volumes par heure. Chaque cellule d'un calorimetre selon l'invention, comporte deux tubes qui traversent le bouchon d'obturation de la cellule et dont l'extrémité inférieure est située à l'intérieur de la cellule,. au-dessus de la surface libre du milieu de culture. Chaque cellule d'un calorimètre selon l'invention présente la forme~d'un cylindre aplati, dont la hauteur est inférieure à la moitié de la plus grande dimension transversale et seul le fond de chaque cellule est posé sur un capteur de flux composé de thermocouples qui sont connectés en série et dont les soudures bimétalliques sont placées alternativement au contact du fond de ladite cellule et au contact dudit bloc réservoir. De préférence, le bloc réservoir est composé de deux demi-blocs séparés par un plan horizontal et le demi-bloc inférieur comporte, sur sa face supérieure, des logements en creux, de forme circulaire, qui sont prolongés chacun par un canal latéral ouvért qui débouche à la périphérie dudit bloc et chacun de ces logements contient un capteur de flux ayant la forme d'un disque tandis que le canal latéral à ce logement contient les deux conducteurs qui aboutissent aux deux bornes du capteur. Le demi-bloc supérieur comporte des alésages verticaux qui le traversent de part en part et qui se superposent coaxialement à chacun desdits logevents en creux du demi-bloc inférieur et chacun de ces alésages verticaux comporte, à l'extrémité inférieure, un contre alésage dont la hauteur est sensiblement égale à la hauteur d'une cellule et qui contient une gaine en un matériau bon isolant thermique dont le diamètre interne est légèrement supérieur au diamètre externe d'une cellule. Chaque cellule d'un microcalorimètre selon l'invention est composée - d'une cuvette cylindrique aplatie dans le fond de laquelle est placé le milieu de culture; - d'une palette d'agitation placée dans ladite cuvette; - d'un bouchon en un matériau isolant thermique qui obture ladite cuvette; - et d'un fourreau cylindrique vertical, dont l'extrémité inférieure est emboîtée et fixée de façon amovible sur ledit bouchon et dont l'extrémité supérieure est obturée par un bouchon, lequel fourreau traverse ledit bloc supérieur et ladite enceinte isotherme et contient lesdits deux tubes, une seringue graduée et un arbre flexible d'entraînement de ladite palette d'agitation qui traversent le bouchon d'obturation de la cuvette. L'invention a pour résultat un nouveau microcalorimètre spécialement adapté aux études biologiques dans un milieu de culture au cours desquelles interviennent des échanges gazeux à travers la surface libre du milieu de culture qui peut être un milieu liquide ou un gel. Par exemple, un microcalorimètre selon l'invention permet d'étudier efficacement le-développement de bactéries en aérobiose, ou de bactéries qui produisent des dégagements d'hydrogène, de méthane, d'anhydride sulfureux etc.... Ils permettent d'étudier des réactions métaboliques qui se produisent dans certains tissus animaux ou végétaux avec absorption ou dégagement de gaz, par exemple la photosynthèse avec absorption de C02 Ils permettent également de réaliser des expériences biochimiques pour étudier l'activité de certaines diastases ou enzymes. Les expériences comportant des cultures de bactéries aérobies conduisent à un arrêt très rapide du développement de la colonie de bactéries lorsqu'elles sont réalisées dans les microcalorimètres existants, qui comportent une cellule de mesure fermée, sans aucun moyen pour renouveler l'atmosphè- re gazeuse. On a essayé de pallier cette difficulté en faisant barboter de l'air dans le milieu de culture, mais l'agitation due aux bulles d'air perturbe considérablement les expériences. Les microcalorimètres selon l'invention qui comportent des moyens pour contrôler la composition de l'atmosphère gazeuse au-dessus de la surface libre du milieu de culture, permettent de -réaliser des expériences biologiques ou biochimiques dans des conditions opératoires analogues aux conditions naturelles où les bactéries ou les tissus sont placés dans une atmosphère dont la composition reste sensiblement constante malgré les gaz qui sont prélevés ou rejetés dans cette atmosphère. Les microcalorimètres selon l'invention permettent non seulement d'introduire un mélange gazeux déterminé dans la cellule d'expérience mais également d'éliminer les gaz qui sont produits par l'expérience en cours. Le débit de gaz que l'on fait circuler dans la cellule est très faible. I1 suffit d'assurer un nombre de renouvellements du volume gazeux situé dans l'expace intermédiaire entre la surface libre du milieu de culture et le bouchon de la cellule compris entre 0,5 volume et 20 volumes par heure et, de préférence, un nombre de renouvellements égal à 2 ou 3 volumes par heure. Comme le volume de l'expace intermédiaire est faible, de l'ordre de quelques cm3, le débit de gaz en circulation est de l'ordre de 10 ml/heure. Un tel débit suffit à maintenir sensiblement constante la composition de l'atmosphère gazeuse audessus du milieu de culture car les quantités de gaz absorbé ou rejete sont très faibles. Un débit aussi faible n'introduit aucune turbulence dans la cellule de mesure et ne perturbe pas le développement d'une expérience.Les quantités de chaleur évacuées par un débit gazeux aussi faible sort négligeables par rapport au flux de chaleur mesuré et ne perturbent pas exagérément les mesures. L'agitation du milieu de culture au moyen d'une palette rotative permet d'accroître les échanges gazeux et assure lthomogenelte des cultures. Une caractéristique importante des microcalorimètres selon l'invention est la forme géométrique des cellules. La forme aplatie de celles-ci permet d'obtenir un rapport élevé entre la surface libre et le volume du milieu de culture puisque ce rapport est inversement proportionnel à la hauteur du milieu de culture. Ce rapport détermine l'intensité des échanges gazeux qui se produisent à travers l'interface séparant le milieu de culture de l'atmosphère qui le surmonte. La forme aplatie de la cellule coopère avec les moyens pour renouveler l'atmosphère gazeuse dans la cellule afin d'augmenter la densité des échanges gazeux par unité de volume du milieu de culture ce qui permet d'obtenir les conditions expérimentales nécessaires au développement des cultures de bactéries en aérobiose et au déroulement des réactions biochimiques qui consomment ou qui produisent des gaz tels que C02, CO, SH2, H2, AH ete.... Des expériences comparatives de cultures de bactéries aérobies dans des cellules fermées de microcalorimètres connus et dans un microcalorimètre selon l'invention ont montré que l'on pouvait atteindre avec ce dernier un flux de calories 30 fois plus élevé et donc un développement bien plus important des cultures de bactéries aérobies. Les microcalorimètres selon l'invention comportant une cellule de forme aplatie conviennent bien également à l'étude des réactions biochimiques telles que les réactions de photosynthèse qui impliquent un échange d'énergie lumineuse. On peut,en effet, utiliser des cellules obturées par un bouchon transparent et éclairer la surface libre du milieu de culture par un faisceau vertical de lumière. La quantité d'énergie captée par unité de volume du milieu de culture est proportionnelle au rapport entre la surface libre et le volume du milieu de culture. Du fait que les cellules sont aplaties, la surface latérale des cellules est réduite et l'on ne peut plus disposer les thermocouples autour de ces surfaces latérales comme dans les cellules des microcalorimètres connus. Comme le fond de la cellule a une surface identique à la surface libre du milieu de culture, le rapport entre la surface du fond et le volume du milieu de culture est également élevé et il est suffisant d'équiper le fond de la cellule de thermocouples et de faire circuler uniquement à travers ce fond le flux de calories échangées entre la cellule et le bloc réservoir. Les faces latérales des cellules sont donc isolées thermiquement. Un avantage des microcalorimètres selon l'invention réside dans le fait que les cellules peuvent être démontées en plusieurs parties ce qui facilite la stérilisation à l'autoclave. Cette stérilisation est indispensable pour éviter toute contamination des cultures de bactéries par des souches étrangères à une expérience. Bien que ces microcalorimètres soient particulièrement adaptés aux expériences biologiques avec échanges gazeux, ils peuvent trouver des applications dans d'autres domaines. La description suivante se réfère aux dessins annexés qui représentent, sans aucun caractère limitatif, un exemple de réalisation d'un microcalorimètre selon l'invention. La figure 1 est une vué éclatée, en perspective, de la partie centrale d'un microcalorimètre selon l'invention. Les figures 2 et 3 sont des coupes verticales et horizontales -d'un microcalorimètre selon l'invention sans les cellules. La figure 4 est une coupe verticale d'une cellule. La figure 5 représente un schéma des circuits électroniques d'un microcalorimètre selon l'invention et la figure 6, un thermogramme. La figure 1 représente le coeur d'un microcalorimètre selon l'invention. Celui-ci est composé d'un bloc cylindrique 1, ayant un axe vertical z zl, par exemple un bloc en alliage d'aluminium ou en tout autre métal bon conducteur thermique. Le bloc 1 est maintenu à température constante. Il comporte un alésage 3 dans lequel est placée la sonde 4 d'un capteur de température. Le bloc I sert de réservoir de calories à température constante. A travers le bloc 1 sont creusés des puits tels que le puits 5a, au nombre de trois par exemple. Chacun de ces puits reçoit une cellule 6 telle que la cellule 6c. Une des cellules est une cellule de référence tandis que les autres cellules sont des cellules de mesure. Chaque cellule est équipée d'un capteur de flux de chaleur 7 qui est intercalé entre le fond de la cellule et le bloc 1 et qui délivre une tension proportionnelle au flux instantané de chaleur transitant entre la cellule et le bloc I dans un sens ou dans l'autre. Tout ce qui précède est bien connu dans les calorimètres de type Calvet par exemple. Nous reprenons, ci-après une description détaillée de la figure 1 et des parties originales. Le bloc I est séparé en deux demi-blocs la et lb par un plan horizontal. Ces deux demi-blocs sont assemblés par des vis 2 ou par tout autre moyen d'assemblage équivalent. Le demi-bloc inférieur lb comporte, sur sa face supérieure, trois logements en creux 8a, 8b, 8c, de forme circulaire et de faible hauteur. Chacun de ces logements est prolongé par un canal latéral, respectivement 9a, 9b, 9c qui débouche à la périphérie du bloc. Chacun de ces logements contient un capteur de flux de calories tel que le capteur 7. On a représenté un seul capteur pour la clarté du dessin. Ce capteur a la forme d'un disque et le canal latéral sert de passage aux deux conducteurs 10a et 10b du capteur. L'épaisseur des disques 7 est sensiblement égale à la profondeur des logements 8a, 8b, 8c. Le capteur 7 est un capteur d'un type -connu qui comporte des thermocouples dont les soudures bi-métalliques sont disposées alternativement au contact de la face inférieure qui est placée au contact du bloc lb et au contact de la face supérieure sur laquelle vient s'appuyer le fond d'une cellule 6,. La séparation du bloc I en deux demi-blocs facilite l'usinage des logements borgnes 8 et des canaux 9 et la mise en place dans ceux-ci des fluxmètres 7 ainsi que le remplacement de ceux-ci. Le diamètre des disques 7 est légèrement supérieur au diametre du fond des cellules 6 de sorte que le flux de chaleur s'écoule à travers la totalité du fond de la cellule. Le demi-bloc supérieur la comporte des alésages verticaux 5a, 5b, 5c qui le traversent de part en part et qui se superposent coaxialement à chacun des logements 8a, 8b, 8c. Le diamètre de ces alésages est légère- ment supérieur au diamètre des cellules 6, de telle sorte que celles-ci puissent coulisser le long de ces alésages. Chacun de ces alésages 8a, 8b, 8c comporte, à l'extrémité inferieure, un contre alésage, respectivement lita, llb, llc dont la hauteur est sensiblement égale à la hauteur d'une cellule 6. Chaque contre-alésage lita, lob, 11c reçoit une gaine, telle que la gaine 12c, en un matériau bon isolant thermique,, par exemple une gaine en matière plastique. Chaque gaine 12c appuie sur la périphérie d'un capteur 7 et maintient celui-ci en place. Elle isole thermiquement les parois latérales de la cellule 6 du bloc la, de sorte que le flux de chaleur s'écoule uniquement à travers le fond de la cellule. L'extrémité supérieure de chaque alésage 5a, 5b, 5c comporte un contre-alésage de faible hauteur, respectivement 13a, 13b, 13c et chacun de ces contre-alésage reçoit l'extrémité inférieure d'une gaine telle que la gaine 14a dont le diamètre interne est égal au diamètre interne des alésages 5a, 5b, 5c. Les gaines 14a sont de préférence, des gaines en matière plastique, par exemple en méthacrylate de méthyle. On voit sur la figure 2 que ces gaines 14a traversent les enceintes successives et débouchent sur le dessus de l'enceinte extérieure. Chaque gaine 14a sert à guider une cellule dans son mouvement de descente. Pour la clarté du dessin, on a représenté une seule gaine 12c et une seule gaine 14a. Les figures 2 et 3 représentent l'ensemble d'un microcalorimètre selon l'invention sans les cellules. On voit sur ces figures les deux demi-blocs la, lb assemblés par des vis 2, la sonde 4, les alésages 5a et 5c, une gaine 12a et une gaine 14a et un capteur de flux 7. La figure 2 montre la disposition en zig-zag des thermocouples du capteur -7 dont les soudures bimétalliques sont situées aux points hauts et bas. La figure 3 montre en plan, la disposition en spirale des conducteurs bimétalliques qui constituent les thermocouples en série. Le bloc 1 est placé à l'intérieur de deux enceintes cylindriques coaxiales, une enceinte intérieure 15 et une enceinte extérieure 16, toutes deux fermées de façon étanche par un couvercle 17 et 18. L'enceinte extérieure 16 est entourée d'une résistance de chauffage 19 qui est commandée automatiquement par un capteur de température placé entre les deux enceintes de façon à maintenir dans l'espace intermédiaire une température constante à 0,10C près ce qui suffit pour maintenir très constante la température du bloc 1. L'ensemble des deux enceintes 15 et 16 est placée à l'intérieur d'une cuve extérieure coaxiale 20 qui comporte intérieurement une garniture isolante thermique 21, par exemple de la laine de verre. Les gaines 14a, 14b, 14c traversent les couvercles 17, 18 et le toit de la cuve 20. Afin d'homogénéiser la température dans l'espace intermédiaire entre les deux enceintes 15 et 16, on a disposé entre celles-ci des palettes 22a, 22b de brassage d'air qui sont entraînées en rotation autour de l'axe z zl. Ces palettes sont suspendues, par exemple sous une couronne 23 qui est portée par au moins trois galets à gorge 24 fixés de façon rotative au toit 18. L'un des galets est entraîné en rotation par un petit moteur électrique 25 et il entraîne en rotation,par frictionela couronne 24. Un ressort 26 maintient la gorge des galets appuyée contre la périphérie interne de la couronne 24. Les figures 1 et 4 représentent une cellule de mesuresou de réf- rence. Celle-ci comporte une cuvette cylindrique 6c de forme aplatie, c'est-à-dire une cuvette dont la hauteur est inférieure au rayon. Cette cuvette est, de préférence, en acier inoxydable ou en tout autre métal compatible avec le milieu de culture placé dans. la cuvette. Ce milieu de culture 27 occupe seulement une fraction de la hauteur. La cuvette 6c contient une palette d'agitation 28, de préférence en matière plastique. La cuvette 6c est obturée de façon étanche par un bouchon 29 en matière plastique, par exemple en polytétrafluoréthylène ou en tout autre matériau isolant thermique et stérilisable. Le bouchon 29 comporte un prolongement vers le haut 29a, qui est cylindrique, à un diamètre externe inférieur au diamètre du bouchon 29 et qui est muni d'une gorge périphérique 29b. Sur ce prolongement est emboîtée l'extrémité inférieure d'un fourreau tubulaire 30, par exemple un fourreau en méthacrylate de méthyle. Ce fourreau est fixé de façon amovible au bouchon 29 par une vis 31 qui traverse le fourreau 30 et s'engage tangentiellement dans la gorge 29b. Le fourreau 30 a une hauteur supérieure à celle des gaines 14a, 14b, 14c et sert à descendre la cellule 29 le long d'un puits 14 jusqu'à ce qu'elle repose sur un capteur de flux 7. L'extrémité supérieure du fourreau 30 est obturée par un bouchon 32. Elle traverse un chapeau 33 qui est fixé au couvercle de la cuve 20. Le fourreau 30 comporte, dans sa partie supérieure,une collerette 34 sur laquelle s'appuie un ressort 35 qui est comprimé par le chapeau 33, La poussée du ressort maintient le fond de la cellule 29 appuyé contre le capteur de flux 7, de sorte que le contact entre le fond de la cellule et le capteur de flux est bon et que le flux due chaleur s'écoule normalement. Le fourreau 30 contient divers équipements qui communiquent avec la cuvette 6c. Il contient une ou plusieurs seringues graduées 36, équipées d'un piston plongeur 37, prolongé par un poussoir 38 dont l'extrémité su périeure traverse le bouchon 32 et émerge au-dessus de celui-ci, de sorte que l'on peut manoeuvrer indépendamment le piston de chaque seringue une fois que la cellule est en place dans le bloc 1. Une des seringues 36 contient "l'inoculum", par exemple une souche de bactéries ou de fragments de tissus dont on désire étudier le développement et/ou l'activité dans un milieu de culture déterminé 27 qui a été placé dans la cuvette 6c. Les autres seringues peuvent contenir des substances à injecter au cours du développement cellulaire pour étudier l'influence de divers facteurs tels que antibiotiques, facteurs de croissance etc.... L'extrémité inférieure 39 de la seringue 36 traverse le bouchon 29 et débouchedans la cuvette 6c. Le poussoir 38 permet d'injecter le contenu des seringues dans la cellule 6c après que la température de la cellule engagée dans le bloc 1 a été stabilisée. L'instant de l'injection de l'inoculum détermine le début d'une expérience. Le fourreau 30 contient un arbre d'entraînement 40 de la palette d'agitation 28. Cet arbre d'entraînement est composé d'un fil métallique central 40a, par exemple un fil flexible en acier inoxydable qui est engagé dans une gaine en matière plastique 40b. Seul le fil métallique traverse le bouchon 29 à travers un guide autolubrifiant 40c. Il porte la palette 28 à son extrémité inférieure. L'arbre 40 est équipé d'un embout d'entraînement mâle 41 qui est accouplé avec un embout femelle 42 placé à l'extrémité d'un arbre d'entraînement 43 qui est entraîné en un mouvement oscillatoire lent par un petit moteur, un excentrique et une biellette non représentés. Le fourreau 30 contient encore un tube d'arrivée 44 et un tube de sortie 45 de gaz. Seul le tube 45 est visible sur la figure 4. Chacun de ces tubes, en matière plastique, est emboîté sur une aiguille creuse 45a qui est plantée à travers le bouchon 29 L'extrémité inférieure des aiguilles 45a est située dans l'espace intermédiaire entre le bouchon 29 et la surface libre 27a du milieu de culture 27, Elle ne plonge pas dans le milieu de culture. Les tubes 44, 45 se prolongent au-dessus du fourreau 30. Le tube 44 est connecté sur un appareil permettant de faire circuler, pendant toute la durée d'une expérience, un très faible débit d'un gaz de composition déterminé, par exemple sur une pompe volumétrique du type pompe péristaltique 46 ou tout autre appareil équivalent. Le gaz qui circule dans le tube 44 entre dans la cellule et ressort par le tube 45. il se produit ainsi à l'intérieur de la cellule 6c un balayage de l'espace 47 intermédiaire entre le bouchon 29 et la surface libre 27a du milieu de culture 27. La composition de l'atmosphère gazeuse contenue dans l'espace 47 peut être maintenue sensiblement constante pendant toute la durée d'une expérience ce qui permet de réaliser des expériences biologiques ou biochimiques comportant des échanges gazeux à travers l'interface 27a dans des conditions de concentration gazeuse sensiblement constante pendant toute la durée d'une expérience. On peut également contrôler la composition de l'atmosphère gazeuse dans l'espace 47 en la faisant varier au cours d'une expérience. On peut ainsi étudier, par exemple, l'inhibition d'une culture de bactérie par un gaz toxique en envoyant par le tube 44 un gaz contenant une concentration en gaz toxique bien déterminée et croissante. On peut également étudier l'influence de la concentration d'un gaz déterminé sur le métabolisme cellulaire d'une culture. On peut aussi injecter successivement dans la cellule un gaz contenant de l'oxygène et un gaz inerte ou inversement afin d'étudier la transition entre l'aérobiose et l'anaérobiose ou la transition inverse. On a représenté sur la figure 4 le tube 45, par lequel sortent les gaz, qui est connecté sur un dispositif qui recueille les gaz sortant de la cellule de mesure pendant toute la durée d'une expérience. Ce dispositif est par exemple, une éprouvette à-eau comportant un tube 48 qui est renversé sur une cuvette 49 contenant de l'eau et dont l'extrémité inférieure est connectée par un tube souple 50 sur l'extrémité supérieure du tube 45, de sorte que les gaz sortant du tube 45 s'accumulent dans le haut du tube 48 et on peut les analyser à la fin d'une expérience. Bien entendu, on peut recueillir les gaz au moyen de tout autre dispositif équivalent. Grâce à cette possibilité de recueillir les gaz, les microcalorimètres selon l'invention permettent de recueillir des informations intéressantes sur la nature et la quantité des gaz produits pendant une expérience et sur la cinétique de production de ces gaz. La cellule 6c a des dimensions relativement réduites par exemple un diamètre de l'ordre de 4 cm et une hauteur inférieure à 2 cm. L'espace 47 a un volume de l'ordre de 10 cm3. Le nombre de renouvellements horaires du volume de gaz contenu dans l'espace 47 dépend de la nature de l'expérience et de la quantité de gaz absorbés ou rejetés par la-culture en cours d'expéreince. Le nombre de renouvellements horaires est compris entre 0,5 volume et 20 volumes/heure. il est, de préférence, de l'ordre de 2 ou 3 volumes par heure, ce qui conduit à des débits de gaz très faibles, de l'ordre de 20 à 30 ml/heure. La quantité de calories entraînées par une circulation de gaz aussi faible ne perturbe pas les mesures calorimétriques. On introduit les gaz à une température très voisine de la température qui règne à l'intérieur de l'enceinte isothermique. Le gaz injecté dans la cellule peut être de l'air dans le cas de cultures de bactéries aérobies. Un gaz neutre, argon ou azote par exemple, peut également servir de vecteur, dans le cas de cultures anaérobies, pour évacuer les gaz produits tels que l'hydrogène, l'anhydride sulfureux, le méthane afin d'éviter l'accroissement de concentration de ces gaz au-dessus du milieu de culture. On peut également introduire du gaz carbonique pour étudier la photosynthèse. On peut projeter dans les gaines 30 un faisceau vertical de lu mière d'une longueur d'onde déterminée ou ayant un spectre déterminé afin d'étudier des réactions de photosynthèse. Dans ce cas, le bouchon 29 est en un matériau transparent aux longueurs d'onde utilisées, par exemple en méthacrylate de méthyle. On a représenté sur la figure 2 un boîtier 51 placé à l'inte- rieur de l'enceinte isotherme 15. Ce boîtier contient les circuits électroniques. Comme la température dans l'enceinte est constante, on évite ainsi les erreurs de mesure qui seraient dues à une dérive des circuits électroniques entraînée par les variations de température. Le figure 5 représente schématiquement les circuits électroniques d'un microcalorimètre selon l'invention. On retrouve sur ce schéma les trois capteurs de flux de calories 7a, 7b, 7c. Le capteur 7b équipe la cellule de référence tandis que les capteurs 7a et 7c équipent deux cellules laboratoire ou cellules de mesure dans chacune desquelles a lieu ltexperience biologique ou biochimique à étudier. On peut effectuer la même expérience dans les deux cellules 7a et 7c ou bien deux expériences différentes. Ltune des bornes de sortie des trois capteurs est connectée à la terre. Les circuits comportent deux amplificateurs opérationnels Al et A2, de haute stabilité, utilisés en montage différentiel, un pour chacun des deux capteurs équipant les deux cellules de mesure. La borne d'entrez de polarité positive de l'amplificateur Al est connectée à la sortie du capteur 7a tandis que la borne d'entrée de polarite négative est connectée à la sortie du capteur 7b, de sorte que l'amplificateur Al délivre une tension différentielle égale à la différence des tensions délivrées par les deux capteurs 7a et 7b. De même les deux capteurs 7c et 7b sont connectés en opposition sur l'amplificateur A2. Le signal délivré par chaque amplificateur est filtré par un filtre F1 ou F2 qui élimine les bruits de fond. Les signaux de sortie V1 et V2 sont enregistrés. On peut évidemment utiliser un enregistreur multivoies qui enregistre par point les deux signaux V1 et V2. Les circuits électroniques comportent deux commutateurs C1 et C2 qui permettent de connecter les entrées de chaque amplificateur sur deux résistances identiques, respectivement RI, R'1 et R2, R'2, de sorte que les amplificateurs sont isolés des capteurs pendant la manipulation des cellules et la préparation d'une expérience. Les deux amplificateurs possèdent un potentiomètre de réglage, respectivement P1 et P2 > qui permet d'ajuster la tension de sortie de chaque amplificateur à une valeur nulle lorsque les deux entrées de cet amplificateur sont connectées par l'intermédiaire de C1 ou C2 respectivement sur les résistances R1 et R'1 ou R2 et R'2. Pour étalonner I'échelle, c'est-à-dire le coefficient de proportionnalité entre la tension de sortie V et le flux de calories on remplace une cellule de mesure par une cellule d'étalonnage qui contient une résistance électrique connue ce qui permet de dégager dans cette cellule une puissance connue. La figure 6 représente deux thermogrammes T1 et T2 qui ont été relevés au cours de deux expériences comparatives, Les abscisses représentent la durée en heures de l'expérience et les ordonnées.la puissance instantanée en milliwatts. La courbe T1 représente le thermogramme obtenu sans circulation de gaz et avec agitation nulle sur une culture de bactéries aérobies de l'espèce coli K12 322 dans un milieu nutritif de succinate à 0,5 g/litre. La courbe T2 représente le thermogramme obtenu dans un microcalorimètre selon l'invention pendant une culture de la même bactérie sur un milieu nutritif contenant 1g/litre de succinate avec une agitation de 40 tours/minute de la palette 28 et une circulation d'oxygène avec un débit de 15 ml/heure. On voit sur cette figure que le flux maximum de la chaleur qui était de l'ordre de 0,1 m Watt dans la première expérience, passe à 3m Watts dans la deuxième, ce qui illustre clairement l'intérêt des procédés et des calorimètres selon l'invention, Bien entendu, sans sortir du cadre de l'invention, les divers élé- ments constitutifs des microcalorimètres qui viennent d'être décrits à titre d'exemple, pourront être remplacés par des éléments équivalents remplissant les mimes fonctions. REVENDICATIONS 1 - Procédé pour études biologiques dans un microcalorimètre comportant au moins une cellule de mesure dans laquelle est placé un milieu de cul ture et une cellule de référence identique aux cellules de mesure, lesquelles cellules sont obturées par un bouchon et sont disposées dans des logements creusés à l'intérieur d'un bloc réservoir de calories qui est placé à l'intérieur d'une enceinte isotherme et qui est maintenu à température constante, chaque cellule étant équipée d'un capteur de flux composé de thermocouples, montés en série, allant alternativement d'une paroi externe de ladite cellule audit bloc réservoir de calories, caractérisé en ce que, pendant toute la durée d'une expérience, on introduit dans chaque cellule, dans l'espace intermédiaire compris entre le bouchon de la cellule et la surface libre du milieu de culture, un gaz de composition déterminée, à une température voisine de la tempé rature à l'intérieur de l'enceinte isotherme et on fait circuler un très faible débit gazeux à travers cet espace intermédiaire afin de contrôler la composition de l'atmosphère gazeuse comprise dans l'espace intermédiaire entre le bouchon de ladite cellule et la surface libre du milieu de culture. 2 - Microcalorimètre pour la mise en oeuvre d'un procédé selon la revendica tion 1, caractérisé en ce que chaque cellule comporte deux tubes qui traversent ledit bouchon d'obturation et dont l'extrémité inférieure est située à l'intérieur de la cellule au-dessus de la surface libre du milieu de culture. 3 - Microcalorimètre selon la revendication 2, caractérisé en ce que chaque cellule présente la forme d'un cylindre aplati, dont la hauteur est inférieure à la moitié de la plus grande dimension transversale et seul le fond de chaque cellule est posé sur un capteur de flux composé de thermocouples qui sont connectés en-série et dont les soudures bimétal- liques sont placées alternativement au contact du fond de la cellule et au contact dudit bloc réservoir. 4 - Microcalorimètre selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit bloc réservoir est composé de deux demi blocs séparés par un plan hori zontal et le demi bloc inférieur comporte, sur sa face supérieure, des logements en creux, de forme circulaire, qui sont prolongés chacun par un canal latéral ouvert qui débouche à la périphérie dudit bloc et chacun de ces logements contient un capteur de flux ayant la forme d'un disque tandis que le canal latéral à ce logement contient les deux conducteurs qui aboutissent aux deux bornes du capteur. 5 - Microcalorimètre selon la revendication 4, caractérisé en ce que le demi bloc supérieur comporte des alésages verticaux qui le traversent de part en part et qui se superposent coaxialement à chacun desdits logements en creux du demi bloc inférieur et chacun de ces alésages verticaux compor te, à l'extrémité inférieure, un contre-alésage dont la hauteur est sensi blement égale à la hauteur d'une cellule et qui contient une gaine en un matériau bon isolant thermique dont le diamètre interne est légèrement supérieur au diamètre externe d'une cellule. 6 - Microcalorimètre selon la revendication 5, caractérisé en ce que chaque cellule est composée - d'une cuvette cylindrique aplatie dans le fond de laquelle est placé le milieu de culture; - d'une palette d'agitation placée dans ladite cuvette; - d'un bouchon en un matériau isolant thermique qui obture ladite cuvette;; - et d'un fourreau cylindrique vertical dont l'extrémité inférieure est emboîtez et fixée de façon amovible sur ledit bouchon et dont l'extré- mité supérieure est obturée par un bouchon, lequel fourreau traverse ledit demi bloc supérieur et ladite enceinte isotherme et contient les dits deux tubes, une seringue graduée et un arbre flexible d' entraîne- ment de ladite palette d'agitation, qui traversent le bouchon d'obtura tion de la cuvette, 7 - Microcalorimètre selon la revendication 6, caractérisé en ce que le fourreau comporte, dans sa partie supérieure, une collerette externe contre laquelle s'appuie un ressort qui est comprimé par un chapeau de maintien de la cellule fixé sur le couvercle de l'enceinte isotherme. 8 - Microcalorimètre selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, dans lequel l'enceinte isotherme comporte au moins deux enceintes cylindriques coaxiales qui délimitent entre elles un espace annulaire, caractérisé en ce qu' il comporte une ou plusieurs palettes disposées dans ledit espace annulaire qui sont suspendues à une couronne coaxiale avec lesdites en ceintes, qui est entraînée en rotation autour de son axe. 9 - Microcalorimètre selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite couronne est supportée par au moins trois galets à gorge dont l'un est entraîné en rotation et entraîne la couronne par friction. 10 - Microcalorimetre selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, carac térisé en ce que l'un des deux tubes de chaque cellule de mesure est connecté sur un dispositif destiné à recueillir les gaz sortant de la cellule pendant une expérience,