Brevet FR2405264A1 — publié le 19790504

La présente invention concerne la purification et l'isolation d'enzyme oxydase sulfhydryle à partir du lait, et son utilisation pour traiter le lait ayant un gott de brûlé. Une activité enzymatique dans le lait, caractérisée par l'oxydation des groupes sulfhydryles, de la cystéine, du glutathione (GSH), et des protéines du lait en disulfures correspondants, a été démontrée par Freidrick Kiermeier et Ernst Petz (Z.Lebensm. - Unters.-Forsch., Vol. 132, pages 342-351 (1967) ; et Vol. 134, pages 97-102 et 149-156 (1967)). On a suggéré que les réactions catalysées par les préparations brutes correspondaient à l'équation 2 RSH 2 21 O2----- RSSR + H20. Conformément aux règles générales de nomenclature systématique et courante, on a appelé l'enzyme, oxydase sulfhydryle. L'enzyme brut était obtenu par Kiermeier et Petz à partir du petit lait du lait écrémé. On n'a pas réussi à purifier et isoler l'enzyme oxydase sulfhydryle. On a trouvé un procédé pour isoler et purifier l'enzyme oxydase sulfhydryle à partir du lait et qui donne uniformément des préparations purifiées plus de trois mille fois par rapport au lait écrémé. On a constaté que l'oxydase sulfhydryle sous forme purifiée catalyse l'oxydation des groupessulfhydryles à la fois dans les petits composés et les protéines en utilisant l'oxygène comme oxydant. L'enzyme sous forme essentiellement purifiée et immobilisée est utile dans le traitement du lait pour lui enlever son goOt de brûlé, On a également constaté que l'enzyme immobilisé peut être utile à la biosynthèse de disulfure dans certaines protéines. La présente invention a pour objet un procédé de purification et d'isolation d'enzyme oxydase sulfhydryle à partir du lait, et son utilisation pour le traitement du lait ayant un gott de brulé. La présente invention a pour objet un enzyme oxydase sulfhydryle essentiellement purifié qui présente une activité spécifique, notablement et de façon surprenante, plus élevée que celle qui était obtenue dans les préparations d'enzyme brut effectuées auparavant. La présente invention a pour objet un enzyme oxydase sulfhydryle effectivement pur sous forme immobilisé?. La présente invention a pour objet des moyens par lesquels l'activité d'oxydase sulfhydryle essentiellement pur sous forme immobilisée peut etre maintenueet régénérée. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'enzyme oxydase sulfhydryle ayant une activité spécifique au moins cent fois supérieure à celle du lait écrémé. Selon la présente invention, l'enzyme oxydase sulfhydryle est isolé sous forme essentiellement purifiée par un procédé selon lequel a) on obtient une fraction enzymatique impure brute d'oxydase sulfhydryle à partir de lait entier brut, b) on dissout la fraction enzymatique impure brute dans une solution tampon neutre diluée, c) on équilibre la solution de la fraction enzymatique impure, d) on soumet la fraction enzymatique impure à un traitement de séparation pour séparer une première fraction enzymatique des composés de poids moléculaire plus élevé, e) on concentre la première fraction enzymatique pour obtenir une seconde fraction enzymatique, et, f) on sépare la seconde fraction enzymatique pour retirer les composé s de poids moléculaire plus faible et isoler l'enzyme. L'enzyme oxydase sulfhydryle ainsi isolé est sous forme sensiblement purifiée. L'expression "forme sensiblement purifiée" utilisée ici signifie que l'oxydase sulfydryle présente une activité spécifique au moins cinquante fois supérieure à celle de la fraction d'enzyme brut obtenue dans la fraction petit de/laitséparée de lait écrémé obtenu à partir de ;ait entier brut. L'activité spécifique mentionnée ici est définie comme le taux de catalyse par poids d'enzyme. On peut obtenir la fraction d'enzyme brut d'une façon analogue à celle qui est décrite par Kiermeier et Petz. On traite du lait entier brut pour obtenir du lait écrémé (c'est-à-dire qu'on retire la graisse des solides non gras) qu'on traite ensuite le lait écrémé pour obtenir le petit lait par coagulation de la caséine avec de la rennine. On refroidit le petit lait et on ajoute du sulfate d'ammonium en quantité correspondant à la demi-saturation. Le précipité qui se forme est désigné par : fraction enzymatique impure brute. On traite l'enzyme impur brut pour obtenir une oxydase sulfhydryle sous forme essentiellement purifiée qu'on peut ensuite traiter pour obtenir une activité spécifique au moins cent fois supérieure à celle de la fraction enzymatique brute. Comme déjà mentionné, on dissout l'enzyme isolé obtenu dans une solution tampon neutre pour former une troisième fraction enzymatique. On sépare ensuite l'enzyme des composés de poids moléculaire plus faible dont on l'isole ; et l'enzyme présente une activité spécifique accrue à partir de la forme isolée ci-dessus. L'isolation d'oxydase sulfhydryle sensiblement pure donne un enzyme qui, de façon surprenante, présente au moins 1.400 fois l'activité spécifique du lait écrémé. Comme étape initiale, on traite le lait entier brut pour enlever la graisse des solides non gras et obtenir du lait écrémé. On obtient le petit lait à partir du lait écrémé par coagulation de la caséine avec de la rennine. On retire le petit lait, on refroidit et on l'ajoute à une solution à demi saturée de sulfate d'ammonium pour précipiter l'enzyme brut. Des essais antérieurs d'isolation de l'enzyme par des moyens tels que la chromatographie sur gel n'ont pas été couronnés de succès, contrairement aux traitements ultérieurs suivant la présente invention. On dissout la fraction enzymatique brute obtenue ci-dessus dans une solution tampon neutre diluée ( par exemple un tampon au phosphate ) afin de conserver l'enzyme à ltétat stable. On laisse ensuite l'enzyme en solution s'équilibrer(pendant une durée permettant la dissociation de l'enzyme), de préférence dans des conditions de réfrigération. On soumet ensuite la solution à un traitement de séparation (par exemple centrifugation) pour séparer la fraction enzymatique des composés de poids moléculaire plus élevé. Par centrifugation de la solution , on retire la fraction enzymatique avec le liquide surnageant, on concentre ensuite le liquide surnageant jusqu'à une concentration de protéine d'environ 2 1/2 à 3 1/2% par des moyens tels qu'un ultra-filtre. Cependant, d'autres moyens tels que l'addition de tamis moléculaires secs, ou l'évaporation sous vide sont également appropriés. Une concentration d'au moins 2 1/2 % apparaît comme nécessaire pour accroStre la taille des molécules d'enzyme par réassociation. La fraction d'enzyme est obtenue sous forme de pastilles (-par exemple par centrifugation) en terminant ainsi la séparation des composés de poids moléculaire plus faible.La fraction enzymatique active isolée dans la pastille obtenue présente une activité spécifique au moins 1.400 fois supérieure à celle du lait écrémé. On accrott l'activité spécifique de l'enzyme par dissolution de la pastille renfermant la fraction enzymatique précitée, dans une solution tampon neutre jusqu'à environ une dilution double (volume de liquide), et on soumet la solution obtenue à un traitement de séparation pour obtenir une forme encore plus pure de l'enzyme ayant une activité spécifique augmentée de 3.000 fois par rapport à celle du lait écrémé. On peut conserver l'oxydase sulfhydryle isolée sensiblement purifiée à une température d'envison 40C, sans perte significative d'activité. De préférence, on immobilise l'oxydase sulfhydryle isolée sensiblement purifiée, sinon, l'enzyme devient une partie intégrante du mélange réactionnel et ne peut titre séparé par suite de l'achèvement de la réaction. L'immobilisation de l'en- zyme consiste à modifier la molécule de l'enzyme pour restreindre ses mouvements et la maintenir à l'intérieur d'un espace limité. Ceci peut etre obtenu par différents procédés tels que adsorption de l'enzyme sur un support insoluble, fixation ou inclusion de l'enzyme dans des matrices de gel, couplage chimique covalent avec des supports insolubles, et réticulation intermoléculaire de la molécule d'enzyme. Suivant un mode préféré de réalisation de l'invention, pour immobiliter l'oxydase sulfhydryle isolée, on fixe l'enzyme à des perles de verre. Un procédé approprié est décrit dans Biochim. Biophys.Acta, pages 243-256 (1974). Comme l'oxydase sulfhydryle immobilisée est sensible aux bactéries, à la chaleur, au pH et à la dessiccation, il est essentiel que pendant le stockage l'enzyme ne puisse pas se dessécher. De préférence, on maintient l'oxydase sulfhydryle immobilisée dans une solution tampon neutre (tampon au phosphate) sous réfrigération jusqu'à son utilisation. La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples non limitatifs suivants Exemple I. La purification d'oxydase suXtgdryle de lait de bovins, qui conduit à une purification supérieure à 1400 fois par rapport à du lait écrémé, est obtenue par le procédé suivant. Une association-dissociation de l'enzyme dépendant de la concentration est adaptée au procédé d'isolation suivant. Produits. On recueille du lait brut frais directement dans des récipients de verre au cours de la traite de l'après-midi à partir de vaches,individuellement, et on refroidit et on conserve immédiatement à 40C. Du sucrose et du sulfate d'ammonium de degré enzymatique sont obtenus de Schwarz/Mann. L'acrylamide, N,N'-méthylènebisacrylamide, N,N,N',N'-tétraméthyléthylenediamine 2-ercaptoethanol, et du dodécyl sulfate de sodium proviennent d'Eastman(Rochester, N.Y.). Pour le D-Galactose, la D-galactosamine (degré I) , le L-fucose, l'acide N-acétylneuraminique EDTA, l'o-dianisidine, GSH, DTNB (5,5'-dithiobis/2 nitro benzol que acide) et glutathione réductase (Type III) on utilise des produits de Sigma (St Louis, Mo).Le peroxydase de raifort (Worthington peroxydase D) RNase A ( cristallisé 5 fois), et la levure RNA proviennent de Worthington (Freehold, N.J.), et la rennine cristalline provient de Pierce (Rockford,Ill.). Tous lessels métalliques et tampons sont des produits de qualité réactifs. Comme produit de départ, on utilise une fraction enzymatique impurebrute préparée de façon analogue à celle décrite précédemment par Kiermeier et Petz. Ainsi, on prépare du lait écrémé à partir de lait entier brut par centrifugation à 4,081 x g pendant 30 minutes à 300. On obtient le petit lait (fraction B): à partir de lait écrémé par coagulation de la fraction de caséine avec de la rennine. On ajoute approximativement 2 mg de rennine pour 1010 ml de lait écrémé, et on laisse la réaction se produire pendant 30 minutes à 300. Dans ces conditions, seule la liaison Phe 105-Met 106 de la k-casérne est hydrolisée (25). Le précipité caillebotté obtenu est retiré par centrifugation à 16.300 x g. pendant 45 minutes à 300. On refroidit le petit lait et on ajuste immédiatement à demi-saturation dans le sulfate d'ammonium à 40. Après avoir laissé reposerpendant une nuit à 40, on retire le précipité (enzyme brut, fraction C) par centrifugation à 16.300 x g. pendant 60 minutes à 40. L'enzyme brut (fraction C) est dissout dans du phosphate de sodium 0,047 M. à pH 7,0 pour donner une concentration de 3 % de protéine et on dialyse vis-à-vis du meme tampon à 40. On dilue cette solution avec le tampon à 0,15 % de protéine et on laisse reposer une nuit à 40. Les impuretés qui sédimentent rapidement (fraction D) sont retirées par centrifugation à 2.000 x g. pendant 30 minutes à 40, et le liquide surnageant résultant (fraction E) est concentré dans une ambiance de 40C à approximativement 3 % de protéine avec un dispositif d'ultra-filtration Amicon TCF-10 en utilisant une membrane Amicon PM-10. On centrifuge à nouveau cette solution à 2.000 x g. pendant 30 minutes à 40, mais cette fois-ci l'activité enzymatique apparatt dans la pastille (fraction F). La pastille est constituée d'oxydase sulfhydryle sous forme sensiblement purifiée. Exemple II. On retire les protéines plus petites se trouvant dans la fraction F de l'exemple I, en dissolvant la pastille dans deux fois le volume de la solution précédente, en laissant reposer la solution pendant une nuit à 40pour favoriser la dissociation, et en répétant la centrifugation à 2.000 x g. pendant 30 minutes à 40. La pastille obtenue (fraction H) est considérée comme étant l'enzyme purifié. Les caractéristiques des fractions obtenues au cours des différentes phases du procédé sont indiquées dans le Tableau I. L'activité est déterminée à partir du taux de consommation d'O2, mesurée par une électrode oscillante au platine en utilisant 0,8 mM GSH comme substrat. Une unité d'activité est définie comme une 24molle d'O2 consommée par minute dans le tampon phosphate à pH 7,0 et à 3 Essai d'activité. On a utilisé deux procédés d'essai, un basé sur la disparition des groupes sulfhydryles, et l'autre sur la diminution d'O2. Dans le premier procédé, on mesure la concentration des groupes sulfhydryles par réaction avec le DTNB. Dans un essai typique, le mélange réactionnel contient 1,5 ml de 0,8 mM GSH dans du phosphate de sodium 0,047 M. à pH 7,0 (force ionique 0,1) et 0,2 ml de solution d'enzyme. Le centrale est identique excepté que l'on substitue 0,2 ml de la solution d'enzyme bouillie précédente à l'enzyme natif. Après incubation à 35 , des parties aliquotes de 0,3 ml. sont prélevées à différents moments et ajoutées à 9,7 ml de phosphate de sodium 0,017 M à pH 8,0. Dans les solutions obtenues, on prélève 3 ml qu'on mélange avec 20 ss 1itres de DTNB 0,01 M dans du phosphate de sodium 0,047 M, à pH 7,0. On mesure l'absorbance de cette solution à 4I2 nm après deux minutes. Le taux de réaction catalysé par l'enzyme est déterminé par la portion linéaire de la courbe de la concentration de sulfhydryle en fonction du temps. Dans le second procédé d'essai, le taux de consommation d'O2 est mesuré avec une électrode oscillante au platine en utilisant un oxygraphe Gilson modèle K. Dahs un essai typique, on ajoute 0,2 ml de solution d'enzyme à 1,5 ml de GSH 0,8in qui a été équilibré à 35C dans la cellule d'électrode. Les témoins renfermant de l'enzyme bouilli ne présentent pas de consommation d'O2. Les taux de réaction enzymatique sont calculés à partir des pentes initiales obtenues. Tableau I Purification d'oxydase sulfhydryle bovins. Activité Activité Récupéra Fraction Volume totale spécifi- tion que ml unités unit./mg N Lait écrémé 1.000 160,0 0,032 100 Petit lait-rennine 930 153,9 0,174 96 Enzyme brut (Fract.C) 40 151,4 0,756 95 Pastille de la 1ère centrifugation (Fract.F) 80 96,0 47,1 60 Pastille de la 2ème centrifugation (Fract.H) 24 65,1 103,8 41 La fraction F présente une activité nettement plus élevée que la fraction C. La chromatographie sur gel de la fraction F ne donne seulement que la fraction éluée dans le volume vide. Des essais de protéine éluée à partir des positionne chaque bande dans un gel non coloré montrent que l'activité enzymatique ne se produit qu'au sommet du gel d'espacement et à l'intersection des gels d'espacement et de séparation. Les protéines de la fraction F qui apparaissent dans le gel de séparation sont effectivement retirées par centrifugation d'une solution légèrement plus diluée. Seules deux bandes, toutes deux à activité enzymatique, sont détectées par électrophordse sur gel de la fraction H. En outre, seule une bande colorée de protéine est visible après électrophorèse sur gel et sur disque de cette fraction dans du dodécyl sulfate de sodium. Ce procédé de purification est décrit dans un article de Janolino et Swaisgood intitulé "Isolation et caractérisation d'oxydase sulfhydryle de lait de bovins." J. of Bio. Chem., Vol 250, No 7, pp. 2532-2538 (10 avril 1975). Il apparatt que le fer fait partie intégrante de l'enzyme. Le traitement de l'enzyme avec de 1'EDTA conduit à une perte totale de l'activité qui peut ensuive etre réobtenue par dialyse avec 1* M du sulfate ferreux , En outre, l'analyse par absorption atomique et l'analyse par activation des neutrons de préparationsd'enzyme distinctes indique 0,5 atome de fer par sous unité. Contrairement aux suggestions de Kiermeier et Petz mentionnées ci-dessus, on a constaté par étude de la stoechiométrie des réactions catalysées par l'oxydase sulfhydryle que la réaction effectivement catalysée est celle d'une oxydase aérobie suivant l'équation Les procédé des exemples I et II ont été répétés wde nombreuses fois de façon à obtenir un produit reproductible représentant un accroissement d'activité spécifique supérieur à 1.400 - 3.000 fois par rapport au lait écrémé. Exemple III L'activité de l'enzyme purifié obtenu dans l'exemple II en fonction de la température et du pH est examinée avec comme substrat du GSH. Un maximum d'activité est observé à une température de 350. Une dépendance en forme de cloche, symétrique, de l'activité en fonction du pH est observée avec un p Hoptimum de 6,8 à 7,0, et des valeurs de pKa apparent de 5,5 et 8,1 déterminant les branches ascendantes et descendantes respectivement. On ajoute 0,2 ml de solution d'enzyme à 1,5 ml de GSH 0,8 mM qui a été équilibré à 350 dans une cellule à électrode. Des témoins renfermant de l'enzyme bouilli ne présentent pas de consommation d'O2. Les taux de réaction enzymatique sont calculés à partir des pentes initiales obtenues. On effectue des études de poids moléculaire sur l'enzyme purifié obtenu dans l'exemple II. Les préparations purifiées de l'Exemple Il présentent deux zones, toutes les deux ayant une activité, par électrophorèse sur gel et disque de polyacrylamide, mais seulement une zone par électrophorèse sur gel et disque dans le dodécyl sulfate de sodium. On examine l'oxydase sulfhydryle en utilisant une série de contrations d'acrylamide. A partir d'un certain nombre d'expériences avec l'enzyme purifié, on a trouvé des poids moléculaires moyens apparents de : 91.200 - 1.200, 89.800 + 800, 89.000 - 400, 89.000 -400 pour des concentrations d'acrylamide de 5,0 ; 7,5 ; 10,0 ; et 12,5 %, respectiv=ment. Pour chaque concentration, la courbe étalonnée du logarithme du poids moléculaire par rapport à la mobilité est essentiellement linéaire. Pour des concentrations de 10 et 12,5 % d'acrylamide, les valeurs obtenues pour quatre préparations indépendantes d'enzyme sont en très bonne concordance, donnant un poids sous-unitaire moyen de 89.000 + 900. Dans chaque cas, on observe une seule bande de protéine pour des concentrations de gel et des charges d'enzyme variables. On effectue également des études de compositions chimiques par analyse d'amino-acide ainsi que par analyse de carbo-hydrate. L'analyse d'amino-acide est effectuée par pesée d'échantillons lyophilisés d'enzyme purifié, dans des tubes d'ignition à paroi épaisse et on ajoute HC1 (approximativement 6 N) en ébullition constante les les solutions obtenues sont gelées, desaérées et on fait le vide dans les tubes et on les obture. On détermine le pourcentage d'humidité dans les échantillons lyophilisés par séchage jusqu'à poids constant à 75C sous vide au-dessus de P205. On effectue l'hydroltse dans un bain de toluène à reflux pendant 16, 24 et 72 heures, et on analyse les hydrolysats avec un analyseur d'amino acide Beckman modèle 116. On détermine la teneur en demi-cystine indépendamment sous forme d'acide cystéique après oxydation avec l'acide performique. On détermine le tryptophane par analyse chromatographique après hydrolyse enzymatique avec la pronase. Conformément à l'analyse de carbohydrate, le contenu total en hexose est déterminé par le procédé à l'acide phénol sulfurique. Après hydrolyse dans HC1 0,1 N pendant une heure, l'acide sialique est mesuré par la méthode d'Aminoff en utilisant un témoin d'acide N-acétylneuraminique. La quantité d'Hexosamine est déterminée après hydrolyse dans HC1 2N pendant 16 heures. On utilise la gaMctosamine comme témoin et les valeurs 8opt-reportées comme N-acetylhexosamine. On estime le fucose (6-deoxy-I.-galactose) par le procédé acide thioglycolique acide sulfurique avec le fucose comme témoin. Les résultats des analyses d'amino acides et de carbo hydrates sont indiqués dans le Tableau II. Ces données indiquent que sensiblement tout le poids de léchantillon (97 %)est représenté par des résidus d'amino acide et de carbohydrate dont 89 % sont représentés par des résidus d'amino-acide et 11 % de carbohydrate. TABLEAU II. Composition en amino-acide et carbohydrate d'oxydase sulfhydryle purifiée. Les valeurs d'amino acide indiquées sont des moyennes de 16, 24 ,48 et 72 beures d'hydrolyse excepté pour Thr, Ser, Val, Ile, Leu, Tyr, and TrP. Les valeurs pour Thr, Ser et Tyr sont obtenues par extrapolation à o de la durée d'hydrolyse, celles pour Val, Ile et Leu par extrapolation à un temps d'hydrolyse infini. La valeur de demi Cys est corrigée pour une récupération supposée de 95 % d'acide cystéique après oxydation par l'acide performique. Trp est déterié après digestion par la pronase. Résidu Composé moles/mg g/100 g Nombre/89000 g Entier le plus proche. Amino acides Lys 0,504 # 0,014 6,46 44,9 45 His 0,124 # 0,004 1,70 11,0 11 Arg 0,332 # 0,012 5,19 29,5 30 Asp 0,698 # 0,01 8,03 62,1 62 Thr 0,475 4,80 42,3 42 Ser 0,519 4,52 46,2 46 Glu 0,811 # 0,018 10,47 72,2 72 Pro 0,416 # 0,010 4,04 37,0 37 Gly 0,845 # 0,035 4,83 75,2 75 Ala 0,967 # 0,026 6,88 86,1 86 Demi-Cys 0,061 # 0,001 0,63 5,4 5 Val 0,630 6,24 56,1 56 Met 0,082 # 0,044 1,08 7,3 7 Ile 0,360 4,08 32,0 32 Leu 0,680 7,70 60,5 61 Tyr 0,203 3,32 18,1 18 Phe 0,326 # 0,012 4,80 29,0 29 Trp 0,058 # 0,005 1,08 5,2 5 Carbohydrates Fucose 0,030 0,44 2,7 3 N-Hexose total 0,444 # 0,002 7,19 39,5 40 N-Acétylhexosamine 0,143 # 0,002 2,90 12,7 13 N-Acétylneuraminique 0,013 0,41 1,2 1 acide EXEMPLE IV.- L'immobilisation de oxydase sulfhydryle purifiée obtenue dans l'exemple 2 est menée à bien par la fixation de l'enzyme sur des perles de verre. Les perles de verre au succinilate sont préparées à partir de perles de verre / -amino-propyle (0,25 à 0,42 mm ou 40-60 mesh, diamètre des pores 2000 ) commercialisées par la firme CORNING GLASS WORKS, qui sont ensuite lavées avec de l'eau distillée et équilibrées pendant.24 heures dans une solution tampon de phosphate 0,2M pH = 4,75. Les perles sont dégazées et environ 0,5 g de perles cristallines de l-éthyl-3-diméthyl-aminopropyl carbodiimide (EDC)est ajouté, la réaction étant réalisée pendant 20 mn à 250C à pH constant et égal à 4,75.Les perles sont ensuite lavées à l'eau distillé et avec une solution tampon froide de phosphate neutre pour éliminer l'excédent de 1'EDC. L'enzyme isolé (0,1 5 en poids/volume) dans la solution tampon phosphatée est ensuite mis en contact avec les perles de succinilate pendant un temps compris entre 16 et 24 heures, après quoi les perles sont lavées avec une solution tampon 0,1 M phosphate à pH 7. Il en résulte un couplage covalent entre l'enzyme isolé et les perles de verre conduisant à une oxydase sulfhydryle immobilisée. Comme cela a été précisé précédemment, l'enzyme isolé non utilisé ne devra pas être séché et soumis à une température extrême au cours du stockage par refrigération dans une solution tampon à pH 7. EXEMPLE V.- La réactivation de l'oxydase sulfhydryle immobilisée est menée à bien par contact de l'enzyme immobilisé désactivé avec une solution aqueuse de sulfate ferreux. Comme cela a été noté du fer apparat comme faisant partie intégrante de l'oxydase sulfhydryle. Le traitement de l'enzyme avec l'EDTA entraîne la perte complète d'activité comme cela est illustré dans le tableau IV. Une dialyse sur l Le cuivre ne pourrait être déterminé dans les mêmes conditions; et l'analyse pour d'autres métaux indique seulement des traces de zinc et de cobalt.Le molybdène et le manganèse n'ont pu être décelés. De ce fait le fer apparat comme étant nécessaire pour l'activité enzymatique de l'oxydase sulfhydryle. TABLEAU IV Effet des ions métal sur l'activité de l'oxydase sulfhydryle Des essais ont été effectués dans du phosphate à pH = 7,0, à 350C et en utilisant le substrat GSH 0,8 mM. Une partie de la solution d'enzyme fut extraite et essayée en présence d'EDTA l,OmM. Après le traitement des autres parties de la solution par de 1'EDTA, celles-ci furent dyalisées par des solutions l,OmM de divers ions métal. Des contrôles furent préparés à partir d'un enzyme bouilli et d'un dyalisat contenant l'ion métal. Dans les deux cas une consommation significative d'oxygène ne fut pas observée. Traitement Activité enzymatique consommation d'O2 en pmol/mn Oxydase sulfhydryle (contrôle) 0,368 Enzyme + EDTA (l,OmM) 0, 012 + sulfate ferreux 0,256 + sulfate de cuivre 0,109 + chlorure de manganèse (II) 0,085 + chlorure de cobalt 0,021 + sulfate de zinc 0,029 + dibromure a de molybdène 0,008 a Bien que le dibromure de molybdène fut utilisé pour préparer la solution, on a probablement atteint d'autres états d'oxydation plus élevés. De ce qui précede et des exemples donnés, on peut constater que le meilleur procédé d'isolation suivant la présente invention utilise les caractéristiques de dissociation-association en fonction de la concentration pour obtenir de façon inattendue un enzyme pratiquement pur et ayant un haut degré inhabituel d'activité spécifique. L'invention concerne également un procédé apte à éliminer le gott de caramélisé ou de brûlé du lait traité par de la chaleur. Lorsque du lait est traité à une température supérieure à 68 OC pendant des durées variables, il est connu qu'il acquiert un goût de caramélisé ou de brillé. Du lait liquide est couramment pasteurisé ou "ultra-pasteurisé't par un traitement à la chaleur à des températures variant entre 60 et 73,9DC pendant des durées comprises entre 30 mn et 2 secondes. Un tel traitement est nécessaire pour détruire les bactéries porteuses de germes nocifs pour l'homme et enrayer l'activité des bactéries de fermentation que l'on trouve dans la plupart des laits crus.Cependant, toutes les bactéries de tous les laits crus ne sont pas tuées par un tel traitement d'où il s'ensuit que le lait a une durée d'utilisation très limitée et doit être réfrigéré à des températures voisines de 40C au cours de son transport, sa manutention et son stockage. Des procédés de stérilisation à très haute température (UHT) sont connus. De tels procédés sont décrits par exemple dans les ouvrages de H.BURTON "Dairy Science Abstr.31"(1969) aux pages 287 à 297 et de T.R.ASHTON "J.Soc.Dairy Tech." vol.18, NO 2, p.65 à 83 (1965). Bien que le procédé UHT a une signification légèrement différente aux E.U.A. et au Canada de celle admise en Europe, chacun recommande que le traitement du lait soit effectué à des températures au moins égales à 87,80C pendant des durées variables et géné- ralement à 148,90C pendant environ 4 secondes. Malheureusement, lorsque le lait esttraité à.de telles températures élevées (ou même à des températures inférieures pendant des périodes de tempsErolongées), il se développe un goût de caramel ou de brûlé indésirable et désagréable qui le rend impropre à la commercialisation, notamment aux E.U.A. De nombreuses recherches ont été effectuées pour déterminer la nature de ce goût et mettre au point les moyens à mettre en oeuvre pour l'éliminer. Les auteurs J.P. HUTTON et consortsdans leur journal J. of Dairy Science, 35, p.699 (1952) et H.BURTON dans le compte-rendu du "15th International Dairy Congress 3, "p.1729 (1952) ont avancé l'idée que le goût de caramélisé du lait chauffé est dû à la libération de groupes sulfhydryles dans le lait.La dernière communication de BURTON (Dairy Sci.Abstr.31, p.295 - 1969) aussi bien que les déclarations d'autres auteurs ont émis des doutes quant à l'importance de groupes sulfhydryles dans le lait. Avant la présente invention, on ne connaissait pas de procédé pour éliminer le gott de branlé provoqué par le procédé de chauffage du lait stérilisé UHT et d'autres laits traités de façon analogue. Dans certains cas, le gott de brillé a été réduit mais pas eliminé, par réfrigération. En 1971, environ 20 billions de kilos de lait fluide ont été vendus aux Etats-Unis, toute cette quantité nécesszitant une réfrigération poussée. Bien que la stérilisation de lait fluide aurait l'avantage évident d'économiser l'énergie et le fuel pour le traitement, d'accroitre la durée de vie du produit, de permettre l'expédition, la vente et le stockage à température ambiante, la présence d'un goût de brûlé accompagnant couramment un tel lait le rend généralement non vendable. On a découvert que le goût de brûlé associé au lait fluide traité thermiquement peut être éliminé par le procédé suivant l'invention. L'invention a pour objet un procédé dans lequel le goût de brûlé associé au lait fluide traité thermiquement est éliminé. L'invention a pour objet des moyens de production d'un lait fluide commercialisable qui peut être expédié, vendu et stocké à température ambiante ordinaire sans détérioration et sans déchet. L'invention a pour objet des moyens pour obtenir un lait fluide ayant une durée de vie prolongée sans nécessiter une réfrigération. L'invention a pour objet un procédé de traitement du lait qui reste sain sans réfrigération et présente un goût agréable que le consommateur moyen ne peut distinguer de celui d'un lait fralchement pasteurisé et homogénéisé. qui Le goût de brûlé dans le lait fluide/provient du fait qu'on a soumis le lait à une chaleur suffisante pendant un certain temps, est éliminé en mettant en contact le lait fluide traité thermiquement avec un enzyme oxydase sulfhydryle immobili sé. L' expression l'gott de brûlé" utilisée ici se réfère au goût insipide ou de craie qui accompagne le lait fluide traité à des températures d'environ 680C. Un tel lait peut être désagréable à la fois au goût et à l'odeur et ressemble à du choux bouilli. Bien que cette odeur de choux puisse disparattre en quelques jours après traitement du lait le goût de brûlé et de craie qui éventuellement produit un goût de papier reste. On a constaté qu'en fait le goût de brûlé provient de llexposition et des réactions des groupes sulfhydryles dans les protéines du lait dues à la dénaturation thermique du lait fluide. L'enzyme oxydase sulfhydryle obtenu à partir de lait entier brut et- utilisé suivant la présente invention, catalyse la conversion des groupes sulfhydryles en disulfure. Apparemment, l'oxydation des groupes sulfhydryles dans le lait chauffé par contact avec l'oxydase sulfhydryle immobilisée élimine le goût de brûlé. L'utilisation d'oxydase sulfhydryle immobilisée,comme catalyseur, suivant la présente invention, présente l'avantage que l'enzyme est obtenu à partir de lait entier brut et est ainsi un constituant naturel. En outre, l'utilisation de l'enzyme sous sa forme immobilisée, suivant la présente invention, signifie qu'il n'y a pas d'additif dans le lait traité. Exemple VI Un réacteur biocatalytique renfermant de l'oxydase sulfhydryle immobiliséeest obtenu en remplissant une colonne de verre de 6 mm de diamètre avec 1,4 cc d'enzyme oxydase sulfhydryle immobilisé par fixation à des perles de verre ayant des pores d'environ 2.000 . Le réacbeur est une colonne de verre qui contient l'enzyme immobilisé et est adapté à recevoir du lait traité thermiquement (entrée) qui s'écoule à travers la colonne et le lit d'enzyme immobilisé avec des moyens appropriés pour l'évacuation ultérieure du lait après contact avec l'enzyme immobilisé. Le réacteur peut être disposé de façon à permettre un procédé en continu par couplage direct avec une unité de traitement UHT. Exemple VII Du lait de bovins qui a été soumis à une température d'environ 1500C pendant environ 4 secondes présente un goût de brûlé notable,on le fait passer à travers un réacteur biocatalytique décrit dans l'exemple I, à une température entre 30-31dC et avec un débit d'environ 40 ml par heure. L'odeur désagréable et le goût de brûlé du lait avant le traitement sont éliminés. Le pourcentage d'oxydation des groupes sulfhydryle dans le lait traité thermiquement et la stabilité du réacteur décrit ci-dessus sont indiqués dans le Tableau V. Tableau V Stabilité du réacteur d'oxydase sulfhydryle utilisée avec du lait écrémé stérilisé UHT. Un réacteur de 1,4 cc est utilisé avec un débit de 40 millilitres/heure à 350C. Jour de fonction- Durée de fontionnement Pour cela nement (heure) tage d'oxyda tion Frais 5 45 Cinquième Jour 3 34 Dixième Jour 5 31 On préfère utiliser des perles de verre ayant des pores de dimensin supérieure à environ 700 pour immobiliser l'enzyme utilisé dans le traitement du lait suivant la présente invention. Des dimensions plus petites conduisent à des résultats défavorables, et une activité optimum est obtenue avec des pores d'environ 2.000 . On doit éviter de mettre en contact le lait et l'enzyme immobilisé à des températures élevées auxquelles l'enzyme pourrait perdre son activité. On peut opérer à des températures de contact de 20 à 450C et de préférence 30 à 350C, sans perte significative de l'activité de l'enzyme. Comme l'activité de l'enzyme immobilisé diminue au cours de l'utilisation normale suivant la présente invention, une réactivation peut être obtenue en mettant en contact l'enzyme immobilisé avec une solution aqueuse franche de sulfate ferreux. Les conséquences de la mise en contact de lait liquide traité thermiquement avec l'enzyme oxydase sulfhydryle immobilisé peuvent être plus importantes qu'une simple élimination d'un goût de brûlé, car ce traitement empeche également le développement d'autres goûts indésirables et la déstabilisation des protéines du lait. Le traitement du lait traité à haute température, suivant la présente invention permet d'obtenir du lait liquide aseptisé et/ou stérile ayant un goût comparable à celui du lait ordinaire pasteurisé et homogénéisé. Lorsqu'on utilise l'enzyme oxydase sulfhydryle pour le traitement du lait stérilisé, l'enzyme lui-mme ainsi que les moyens de fixation, par exemple les perles de verre sur lesquelles l'enzyme est immobilisé doivent être stériles. L'enzyme oxydase sulfhydryle ne peut cependant pas être stérilisé par la chaleur car un traitement thermique suffisant pour détruire les micro organismes détruirait également l'enzyme. Il est également clair que beaucoup d'agents de stérilisation chimiques réagiraient avec l'enzyme, ce qui entraînerait sa décomposition chimique, et par conséquent il est important d'employer un traitement de stérilisation qui détruise tous les micro-organismes sans modifier chimiquement l'enzyme. Heureusement, on dispose pratiquement d'un temps illimité pour la stérilisation de l'enzyme oxydase sulfhydryle et des perles de verre sur lesquelles l'enzyme est immobilisé, et par conséquent, on peut utiliser des agents de stérilisation non nocifs. On a constaté que la stérilisation des perles de verre et/l'enzyme immobilisé sur les perles de verre peut être effectuée au moyen d'un liquide ou d'un gaz de stérilisation, qui n'affecte pas l'enzyme, et on peut citer l'alcool éthylique comme liquide de stérilisation approprié, tandis que comme gaz de stérilisation approprié on peut citer l'oxyde d'éthylène. La stérilisation des perles de verre et de l'enzyme est effectuée de façon que les perles, avant d'être introduites dans la chambre de réaction où le lait stérilisé ayant un goût de brûlé est mis en contact avec l'enzyme sur les perles de verre,soient conservées dans un liquide de stérilisation, par exemple l'alcool éthylique, pendant le temps nécessaire pour obtenir une stérilisation complète, par exemple de 10 minutes à 5 heures. Comme déjà mentionné, on peut également conserver les perles de verre et l'enzyme dans une chambre renfermant un gaz de stérilisation, par exemple l'oxyde d'éthylène, pendant une durée convenable avant d'introduire les perles de verre dans la chambre de réaction du lait. Bien entendu l'invention n'est nullement limitée aux exemples décrits, elle est susceptible de nombreuses vanantes accessibles à l'homme de l'art suivant les applications envisagées sans qu'on s'écarte pour cela du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé pour isoler l'enzyme oxydase sulfhydryle du lait, caractérisé en ce que : a) on prépare une fraction enzymatique brute et impure d'oxydase sulfhydryle à partir de lait entier brut, b) on dissout ladite fraction enzymatique impure dans une solution tampon diluée neutre, -c) on équilibre ladite fraction enzymatique impure, -d) on soumet la fraction enzymatique impure dans ladite solution tampon à un traitement de séparation pour séparer une première fraction enzymatique des composés de poids moléculaire plus élevé, -e) on concentre la première fraction enzymatique de l'étape d) pour obtenir une seconde fraction enzymatique, et - f) on sépare ladite seconde fraction enzymatique pour retirer les composés de poids moléculaire plus faible, et on isole l'enzyme. 2. Procédé suivant la revendication I, caractérisé en ce qu'on dissout l'enzyme isolé dans l'étape f) dans une solution tampon neutre pour obtenir une troisième fraction enzymatique, on sépare l'enzyme des composés de poids moléculaire faible, et on isole l'enzyme pour obtenir un enzyme d'activité spécifique accrue. 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la première fraction enzymatique est concentrée dans l'étape e) au moyen d'un ultra-filtre. 4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que enzyme isolé dans l'étape f) est immobilisé sur des perles de verre. 5. Procédé suivant la revendication 1 , caractérisé en ce qu'on sépare les première et seconde fractions enzymatiques par centrifugation. 6. Procédé pour régénérer l'activité d'enzyme oxydase sulfhydryle obtenu suivant le procédé de la revendication I, et immobilisé, caractérisé en ce qu'on met en contact ledit enzyme avec une solution aqueuse d'ions ferreux. 7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que la solution est une solution aqueuse de sulfate ferreux. 8. Procédé de stérilisation d'enzyme oxydase sulfhydryle obtenu suivant le procédé de la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise un agent liquide chimique ou un gaz de stérilisation choisi dans le groupe comprenant l'alcool éthylique et l'oxyde d'éthylène. 9. Enzyme oxydase sulfhydryle immobilisé et sensiblement purifié, obtenu suivant le procédé de la revendication 1, caractérisé en ce que ledit enzyme a une activité spécifique au moins cinquante fois supérieure à celle de la fraction d'enzyme oxydase sulfhydryle brut obtenu dans la fraction de petit lait séparée du lait écrémé obtenu à partir de lait entier brut. 10. Enzyme oxydase sulfhydryle caractérisé en ce qu'il est obtenu par un procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 8. il. Procédé de traitement de lait liquide ayant un goût de brûlé et ayant été chauffé au-dessus d'environ 680C pendant une durée suffisante pour produire un goût de brûlé, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'on élimine sensiblement le goût de brulé dudit lait liquide en le mettant en contact avec un enzyme oxydase sulfhydryle immobilisé. 12. Procédé suivant la revendication ll, caractérisé en ce qu'on met le lait en contact avec l'enzyme à une température d'environ 20 à environ 450C. 13. Procédé suivant la revendication ll, caractérisé en ce que 1'enzyme est immobilisé sur des perles de verre. 14. Procédé suivant la revendication 13, caractérisé en ce qu'avant le traitement du lait, on stérilise les perles de verre sur lesquelles l'enzyme oxydase sulfhydryle est immobilisé. 15. Lait caractérisé en ce qu'il a été traité suivant le procédé de l'une quelconque des revendications 11 à 14. 16. Lait ayant subi un traitement à ultra :.haute température caractérisé en ce qu'il a été traité suivant le procédé de l'une quelconque des revendications 11 à 14.