Brevet FR2425642A1 — publié le 19791207

La présente invention est relative à une nouvelle méthode rapide de dosage du taux dé calcium dans le sang. I1 existe des maladies chez les hommes et les animaux dont les symptomes sont provoqués par une concentration anormale du calcium dans le sang. Une condition préalable nécessaire à l'établissement d'un traitement thérapeutique correct, dans de tels cas,est de disposer d'une méthode rapide et store de dosage du taux de calcium dans le sang. I1 est souhaitable, en particulier en médecine vétérinairet de pouvoir faire le diagnostic immédiatement sur place. Le procédé qui fait l'objet de la présente invention a été mis point dans ce but. G.P. MAYER et Coll. (J. Am. Vet. Med Ass. 146/8, 839842) ont décrit une méthode de dosage qui est fondée sur l'aptitude du tétra-acétate d'éthylènediamine (EDTA) à chélater le calcium et sur le fait que le mécanisme de coagulation du sang dépend des ions Ca2+ libres. Le test décrit par ces Auteurs est effectué avec une série de tubes à essais contenant de 1'EDTA en quantités croissantes. Les tubes sont remplis de sang, qui ne coagule que dans les tubes qui renferment un excès de calcium. On peut ainsi déterminer la concentration du calcium dans les échantillons de sang. Cependant, le test est encombrant et mal commode et il est difficile de déterminer le moment où- cesse la coagulation dans les tubes et lequel des tubes contient la bonne concentration en calcium, parce que le point d'équivalence est indistinct, manifestement en raison de la libération relativement lente du calcium lié aux protéines. La présente invention a pour but de pourvoir à une nouvelle méthode rapide qui permet en un temps bref, d'obtenir un point d'équivalence net et de déterminer si le taux de calcium dans l'échantillon de sang se trouve au-dessus ou au-dessous d'une limite choisie. Selon cette méthode, un excès d'EDTA est utilisé pour fixer le calcium présent dans l'échantillon de sang.Ce mélange est ajouté à une certaine quantité d'ions calcium ou est additionné d'une telle quantité d'ions calcium. L'EDTA qui n'a pas été consommé pour chélater le calcium de l'échantillon, réagit alors avec les ions calcium. Si tous les ions Ca2+ ajoutés sont fixés par 1'EDTA, il ne se produit pas de coagulation ; si, au 2+ contraire, il y a un excès d'ions Ca libres, la coagulation a lieu. Pour réaliser ce test, on n'a besoin que d'une seule éprouvette graduée, contenant un excès d'EDTA. Divers sels d'EDTA conviennent dans ce but, mais étant donné sa bonne solubilité, le sel de potassium est celui qui convient le mieux. La graduation de l'éprouvette représente les concentrations du calcium dans le sang. On introduit dans le tube une quantité de sang entier ou de plasma qui correspond à la valeur-limite choisie sur la graduation; Après avoir mélangé intimement les substances contenues dans l'éprouvette, on ajoute au mélange une certaine quantité d'ions calcium, par exemple du chlorure de calcium et un agent qui favorise la coagulation, par exemple de la thromboplastine (préparée à partir de cerveau de bovin), ou bien on ajoute le mélange au composé contenant des ions calcium et à l'agent qui favorise la coagulation. Le point d'équivalence est atteint en l'espace de 5 minutes. Si la quantité drEDTA utilisée dans le test est suffisante pour fixer la totalité du calcium présent, à savoir la teneur initiale en calcium de l'échantillon et le calcium ajouté, le sang ne coagule pas, mais reste à l'état liquide, ce qui signifie que le taux de calcium de l'échantillon est inférieur à la valeurlimite . Si, par contre, l'éprouvette renferme un excès d'ions calcium libres, le mécanisme de coagulation s'établit et l'échantillon coagule ou quelques caillots apparaissent, ce qui indique que le taux de calcium dans le sang est supérieur à la valeurlimite choisie. En faisant varier la quantité d'EDTA d'échantillon de sang ou d'ions calcium utilisée, on peut choisir diverses valeurs-limites de taux de calcium dans le sang. Le plus facile est de faire varier la quantité d'échantillon de sang ; on ajoute le sang dans l'éprouvette jusqu'à un trait de repère qui correspond à une certaine concentration du calcium dans le sang. Naturellement, il est préférable de choisir des valeurs de référence qui représentent des taux de calcium dans le sang critiques, par exemple 9 mg/100 ml de sérum (2,25 mmoles/litre) et 8 mg/100 ml de sérum (2,00 mmoles/litre). Si l'on choisit comme valeur-limite la concentration en calcium du plasma de bovin (8 ml/100 ml), si l'on ajoute un échantillon de 10 ml de sang total dans l'éprouvette et si l'on empêche ce sang de coaguler avec 10,1 mg de K2EDTA, 2H2O (25,0pM), la quantité de calcium (Ca) supplémentaire requise est alors de 11,7 pM (correspondant à 1,72 mg de Calo, 2H2O), calculés sur la base du rapport d'hématocrite moyen de 33,5 % chez les bovins. En évaluant les quantités de réactifs requises, la Demanderesse est partie d'un volume de cellules sanguines de 33,5 % en volume et du fait qu'l ml de sang total contient 40 pg de calcium lorsque le taux de calcium du sérum est de 6 mg/100 ml, ce qui correspond à une concentration de 1 mole/ml. Si l'on ajoute à cela 1 ml d'une solution 0,001 N d'EDTA, le point d'équivalence est atteint, c'est-à-dire que la totalité du calcium est chélaté. Si le mélange d'échantillon de sang et d'ETDA est ajouté au calcium, l'exécution du test requiert alors deux éprouvettes. Si, toutefois, l'addition est effectuée en sens contraire, on peut éviter l'usage d'une pipette en introduisant le calcium sous forme solide, sous la forme d'une poudre ou de pastilles. La valeur-limite dépend du diagnostic à faire. Par exemple, pour s'assurer que le taux de calcium dans le sang d'une vache est inférieur à la normale, la valeur-limite est établie à 9 mg%. Si l'on doit déterminer le taux du calcium dàns le sang en relation avec certaines maladies (par exemple, dans la dégénérescence musculaire de la colimastitis septique, meme une concentration en calcium légèrement élevée peut etre fatale), la valeur-limite est fixée à 8 mg%. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. I1 doit etre bien entendu, toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre sont donnes uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention,dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1. Diagnostic de l'hypocalcérnie chez le bétail Un tube à essais A contenant de 1'EDTA est rempli de sang provenant directement du vaisseau sanguin, jusqu'au trait de repère correspondant à la valeur-limite choisie (8 ou 9 mg%). On fait tourner le tube 20 fois ; il ne doit pas etre secoué la formation de mousse empeche toute observation. On ajoute à une ampoule en verre B qui contient du chlorure de calcium et de la thromboplastine, une dizaine de gouttes d'eau distillée puis on secoue le tube. Le mélange de sang-EDTA est transféré de A dans B. L'ampoule est fermée et les substances qu'elle contient sont intimement mélangées en la retournant à vingt reprises. On laisse reposer l'ampoule cinq minutes, puis on la dispose horizontalement pour en examiner le contenu. Si l'échantillon a coagulé, son taux de calcium est supérieur à la valeur-limite. Si l'échantillon reste liquide, la concentration en calcium est inférieure à la valeur-limite : l'animal est hypocalcémique. Des essais effectués sur le terrain (au total 159 essais) ont montré que la méthode conforme à l'invention est une méthode simple et store pour le diagnostic de la parésie puerpérale. Lorsque les échantillons de sérum correspondants ont été analysés par spectrophotométrie d'absorption atomique, on a constaté qu'avec une tolérance de + 0,5 mg/100 ml, la fiabilité du test est de 100 %. Des différences entre les résultats obtenus avec les deux méthodes sont principalement lues à des variations des rapports d'hématocrite. La méthode conforme à la présente invention mesure le taux de calcium dans le sang total ou dans le plasma, tandis que les méthodes classiques ne permettent de mesurer la concentration en calcium que dans le sérum ou le plasma. Il résulte de la description qui précède que, quels que soient les modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application adoptés, l'on obtient une méthode de dosage du taux de calcium dans le sang qui présente par rapport aux méthodes visant au meme but antérieurement connues, des avantages importants dont certains ont été mentionnés dans ce qui précède et dont d'autres avantages ressortiront de l'utilisation de ladite méthode. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite , elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s 'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1. Méthode de dosage du taux de calcium danse sang ou le plasma, fondée sur l'aptitude du tétra-acétate d'ethylene- diamine à chélater le calcium et sur le fait que le mécanisme de coagulation du sang est dépendant des ions calcium libres, laquelle méthode est caractérisée en ce que le calcium présent dans l'échantillon de sang est lié à un excès de tétra-acétate d'éthylènediamine et en ce que ce mélange est ajouté à une certaine quantité d'ions calciumet d'un agent qui favorise la coagulation, ou bien on ajoute à ce mélange ladite quantité d'ions calcium et d'agent qui favorise la coagulation. 2. Méthode selon la Revendication l, caractérisée en ce que le tétra-acétate d'éthylènediamine utilisé est le sel de sodium ou de potassium. 3. Méthode selon la Revendication 1 ou la Revendication 2, caractérisée en ce que le calcium agouté est du chlorure de calcium. 4. Méthode selon l'une quelconque des Revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'agent qui favorise la coagulation est de la thromboplastine.