Brevet FR2397458A1 — publié le 19790209

La presente invention a trait à un procédé de preparation de vaccin vivant contre les oreillons. La parotidite épidemique est une maladie de grande diffusion A travers le monde. Dans ce pays, plus de 25 000 cas en moyenne sont enregistrés chaque annelez Avec les formes cliniques plus bénignes, on observe fréquemment des troubles sérieux de plusieurs organes et systèmes se terminant très souvent par des altérations durables telles que paralysies, stérilité, diabete, thyroïdite, sur dicté, lésions des reins, du système cardio-vasculaire et du foetus chez la femme enceinte, etc . Dans les villes et villages, les épidémies sont un fait quoti dieu, et dans les villes plus grandes le processus épidémique persiste dtun bout à l'autre de l'année. Cela crée la nécessite d'un moyen efficace de protection contre l'infection de la parotidite. Les premiers essais sur la prophylaxie des parotidites épidémiques avec un sérum se sont révélés infructueux. Les vaccins proposés préparés à partir de virus morts n'ont également aucun effet et ne trouvent pas d'appication en pratique. Les vaccins vivants contre les oreillons semblent avoir plus d'avenir. Aucun de ceux-ci, eependant, nla obtenu jusqu'iei une recodnaissance internationale. Les premiers essais d'envers et assoc (Enders et coll. J. immunol. 54, 1946, 281-291) sont restés dans le domaine des expériences limitees. L'étude de 10 ans, par Smorodintzev A. et Klyachko, du vaccin vivant obtenu de la souche "Léningrad" (Proceedings of the EMI Institute "Pirogov" v.16, 1958, 116-122i; Klyachko N.S. A.A. Smorodintzev - Acta virol., 1958, 3, 145-151) a fini par l'arrêt de son utilisation. Identique fut le sort du vaccin obtenu par Copelovic et assoc. (Copelovic et coll. Cercetari asupera valorii,- Immunogene a uni vaccin antiurlian preparat cutulpini autochtoni, stuor. Cercetari inframicrobiologie, 1962, 4, 473-480). Les essais suivants de Nassibov et Smorodintzev (Nassibov M.N., A.A. Smorodintzev, Vorposi virusologii, 1968, 3, 336-340) et de Andjaparidze et assoc. (Andjap idze et coll. Rev. Children's infections, 1971) avec les nouvelles souches de "Léningrad 1, 2 et 3" sont encore au stade d'experiences de laboratoire. Les essais de Starke et assoc. (Starke G. et colt. Verfahien tur Nherstellung von mumps - lebenvirus impfet. off. Pat. DDR No. 88169) avec la souche "Léningrad 3" adaptée sur des reins de chiots sont aussi à un stade d'expérimentation. Sont également dans un stade initial d'expérimentations les travaux des auteurs japonais sur les souches Towata et Urabe (Hosai et coll. Studies of live attenuated mumps virus vaccine. Biven j 13, 1970, 2, 121-126).C'est seulement aux Etats-Unis que Hilleman et as soc. font des expériences à une large échelle sur leur souche Jeryl Ignn et sur le vaccin obtenu avec elle (Buånak E., B. Hilleman MR, Mem auor Co. Patent U.S.A. No 3 555 149). La souche d'Enders n'a plus d'applicatiqn pour des raisons connues seulement de son auteur. La souche "Léningrad" n'est plus utilise car elle est isolée sur des embryons de poulet sur lesquels le vaccin est également obtenu. Ces embryons de poulet sont porteurs des virus de la leucemie du poulet, c'est pourquoi il existe toujours un danger potentiel de contamination du vaccin par ces virus. Plus tard on a prouvé que cette souche possède un faible pouvoir immunisant. On court le même risque avec les souches de Copelovic et assoc. Les souches "Léningrad 1 et 2.t sont également isolées sur des embryons de poulet et sont abandonnées pour la même raison. La souche "Léningrad 3" est adaptée sur des cultures des cellules fibroblastes de eailles japonaises, mais son utilisation large est pour le moment entrave'e pour des raisons technologiques scientifiques et d'organisations. L'utilisation du vaccin obtenu à partir de la souche "Léningrad 3-Pankov" adaptée en outre sur des reins de chiens nouveauxnés, est abandonnée å cause de troubles d'origine scientifique.La souche Jeryl Lynn est isolée sur des embryons de poussins d'oiseaux aleucemiques - appelés ainsi "golden eggs" - et sur lesquels on obtient également le vaccin ce qui rend sa production chère - une dose immunisante coûte plus de 2 dollars. Sur les mêmes oeufs, on obtient les vaccins à partir des souches Towata et Urabe. L'objet de la présente invention est de mettre au point un procédé de préparation de vaccins vivants contre les oreillons avec une souche locale qui doit être non réactogène,immunogène et épidémiologiquement efficace. On utilise la souche Sofia 6, déposé le 7 décembre 1976, avec le numéro 111, dans la eollection de microbes de Bulgarie à l'institut pour le contrôle des médicaments, 26, VI. Zaimov Blv. Sofia, Bulgarie. La présente invention est la suivante Sur un enfant malade souffrant de la parotidite épidémique, on isole le virus des oreillons sur une culture de cellules de reins de cobayes nouveaux-nés. On fait passer répétitivement de 12 à 15 fois la souche sur la culture, et comme conséquence elle devient atténuée et perd ses propriétés pathogéniques pour les hommes tout en conservant ses propriétés immunogènes. On obtient le vaccin sur la miyne culture, c ctest-à-dire des cellules de reins de cobayes nouveaux-nés, âgés de 3 à 5 jours, avec une multiplicité d'infection de 0,01 à 1,00. Le semi produit recueilli de la culture infectée est versé dans des fioles et lyophilisé après les centrales appropriés. La lyophilisation du vaccin est effectuée pendant 48 heures à une température du condenseur de 500 C, le vide de la chambre de dessication allant jusqu'à 100 microns et la -temp6rature du produit dans la chambre en fin de dessication allant jusqu'à 25 C. Le produit fini subit également des contrales supplementaires. Le vaccin se présente sous forme de comprimé rose clair dans une fiole, et possède une durée de validité d'une année. Avant emploi, le vaccin est dissout dans de l'eau distillée et injecte par voie sous-cutanee à raison d'un volume de 0,5 ml, contenant de 1000 a 10 000 unités infectieuses. L'immunisation ne produit ni élévation de température, ni réactions générales ou locales. Seulement dans des cas isolés, on note une élévation de température, mais on constate lors des contrôles également que la température est due à d'autres causes, le plus fréquemment aides catarrhes des voies respiratoires supérieures. Chez les gens immunisés, le titre d'anticorps stélève jusqu'a. 95 pour cent, avec un titre moyen géométrique des anticorps neutralisant les virus de 1:22,6 ; et d'anticorps inhibant lthémagglutination de 83,5 pour cent avec un titre moyen géométrique de 11,3. L'efficacité épidémiologique satisfaisante du vaccin est établie par son utilisation dans des foyers de parotidite épidémique ainsi que par son utilisation en masse. Après application du vaccin dans des foyers de parotidite épidémique, le processus épidémique est rapidement enrayé, le nombre des malades diminue et le délai de quarantaine est réduit. Ainsi, dans des foyers où l'on a appliqué le vaccin, les épidémies continuent environ 30 jours en moyenne, tandis que habituellement, leur durke est de presque 120 jours. Lors de l'application en masse du vaccin, on prouve également sa grande effi cacité. Ainsi, dans la ville de Plovdiv, après vaccination complète de tous les enfants âges de 1 à 12 ans qui n'avaient pas soufferts de la parotidite épidé- mique, la mortalité décrolt de 12 à 17 fois. Pour le district, le vaccin montre un indice d'efficacité supérieur A 10 et un coefficient de protection allant Jusqu' 97 pour cent. Dans le passé, la parotidite épidémique occupait certains annees les 1ère, 2eme et 3ème places sur la liste des maladies contagieuses, alors qu'a présent elle est une des dernières sur la liste.Autrefois, la parotidite épidémique représentait 22,3 pour cent de toutes les infections et 25,8 pour cent des infections limites tandis quen 1973 elle representait 2,9 pour cent et 4,6 pour cent respectivement. Dans le passe, les foyers de 4 cas et plus étaient supérieurs à 90 pour cent tandis qu'après l'ismunisation le nombre tombait à 5 pour cent. Les résultats obtenus montrent l'avenir du vaccin dans la lutte contre la parotidite épidémique dans ce pays. Le procédé procure les avantages suivants Pour le vaccin, on utilise une souche locale qui est isolée sur une culture, sur laquelle est obtenu plus tard le vaccin lui-meme, préservé de cette façon de contaminations secondaires. On utilise un substrat local à savoir des reins de cobayes sur lesquels on obtient également le vaccin du virus de la rougeole et qui est une garantie en ce qui concerne la pureté vis-à-vis des agents secondaires, et de plus il est facilement disponible et bon marché. On a mis au point une technologie pour la préparation du vaccin assurant un rendement élevé et une production bon marché. Un dose coûte 22 stotinkas.Le procédé permet de préparer un vaccin non réactogène, immunogène, épidémiologiquement efficace et dont la durée de validité est d'au moins une année. L'exemple 1 illustre l'invention de façon non limitative. Exemple 1 : Préparation de la souche Sofia 6 On isole la souche Sofia 6 sur un enfant malade présentant les caractéristiques cliniques d'une parotidite épidémique du côte droit. On prélève de la salive à l'enfant le troisième jour de la maladie qui après manipulation est cultivée dans 5 tubes à essais contenant des cultures de cellules de reins de cobaye Les cellules infectées ne montrent pas d'altérations morphologiques. L'hémiadsorption faite les 4ème, 6ème, 8ème et poème jours est négative. Le poème jour on fait un mélange général du liquide des cultures de cellule des tubes à essais. La réaction d'bémagglutination est négative. On réalise une nouvelle réinfection de 5 nouveaux tubes à essais "a blind passage" avec la suspension. Les cultures infectées ne présentent pas d'altérations morphologiques, mais les tests d'hémadsorption le 4ème jour donnent des résul-tats positifs. Le liquide des cultures de cellules recueilli le 8ème jour sert de matériau initial pour le passage subséquent. La souche fait 25 passages au total sur la culture de cellules de reins de cobayes avec une sélection unique dans l'une d'elles, et ainsi elle devient atténuée.Le matériau de ces derniers passages agit comme souche vaccinale pourra production de vaccins contre les oreillons. Description de la production d'une série de vaccins Pour la production d'un semi-produit pour une sne de vaccins, on prépare une culture de cellules de reins de cobayes nouveaux-nés, dans 30 récipients d'une capacité de 1200 ml chacun, et 3 récipients d'une capacité de 150 ml chacun. Le 4ème jour apis la formation d'une monocouche, on infecte 27 grands récipients contenant la culture avec le virus vaccinal. La culture restant dans les trois grands récipients et les trois petits n'est pas infectée, à savoir qu'elle est conservé comme contrôle, Le milieu de culture est un Parker (milieu 199) sans sérum de veau. Les 2ème, 4ème et 6ème jours le liquide contenant le virus qui s'est multiplié est recueille et dans les deux premiers cas on ajoute un nouveau milieu de culture, tandis que dans le troisième cas apyres avoir pris le liquide, on a jeté les cultures. Le semi-produit collecté de cette manière est évalué pour le titre du virus, la stérilité, les teneurs d'albumine et la spéeificité, l'inocuité et la non-toxicite chez les animaux. A la fin de la culture, des érythrocytes d'humain, de poulets et de cobayes sont mis dans les trois petits récipients pour établir s'il y a des virus dthEmadsorption secondaires et le liquide dans les trois grands recipients de contrOle est examine pour la stéri- lité et l'absence d'agents virals Après l'évaluation des contrôles, le semiproduit est amené en série, le stabilisant saccharose et la gélatine est aåoutée, après quoi il est reverse dans des fioles de 1 ml et lyophilisé. Le produit sec est à nouveau testé pour vérifier son innocuité et sa non-toxicité sur des animaux de laboratoire, et ses propriétés réactogènes sur 20 enfants, ensuite il est offert à l'usage, les séries ayant un passeport et le dosage dans une fiole ainsi que le délai de validité étant déterminés. REVENDICATIONS 1.- Procédé de préparation de vaccins vivants contre les oreillons, carac térisé en ce qu'on utilise la souche Sofia 6, déposée le 7 décembre 1976 sous le nO 111 dans la collection de microbes bulgares à l'institut de contrôle des médicaments, 26, VI. Zaimov Blv., Sofia, Bulgarie, cette souche étant isolée sur un malade, placée sur une culture de cellules de reins de cobayes nouveauxnés et atténuée par des passages sur la meme culture de cellules, le virus ainsi obtenu étant utilisé pour la production de vaccins vivants contre les oreillons d'après une technique connue. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le nombre de passages pour l'atténuation du virus est compris entre 12 et 25. 3.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que dans la préparation du vaccin, l'infection de la cuture de cellules de reins de cobayes nouveaux-nés est faite avec le virus des oreillons du 3éne au 5ème jour après la préparation de la culture. 4.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'infection est faite avec une multiplicité de 0,01 à 1,00. 5.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le recueillement du virus est effectué trois fois, les 2ème, hème et 6sème jours et qu'on utilise seulement la phase liquide. 6.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la lyophilisation du vaccin est effectuée pendant 48 heures à une température du condenseur de 500 C, le vide de la chambre de dessication allant jusqu'à 100 microns et la température du produit dans la chambre en fin de dessication allant jusqu'à 250 C.