Brevet FR2421920A1 — publié le 19791102

La présente invention concerne un procédé d'agglomération et d'insolubili- sation en une seule étape de composés chimiquement et/ou biologiquement actifs, préparés et utilisés sous différentes formes physiques (sphères, grains, bSton- nets) dans des processus chimiques et/ou biologiques tels que extraction, séparation échange d'ions, catalyse enzymatique , par réticulation de composés organiques hydrosolubles au moyen d'agents pontants bifonctionnels. L'inclusion de composés chimiquement et/ou biologiquement actifs dans un réseau polymère tridimensionnel est une réaction bien connue. Elle a été parti culiarement étudiée dans le domaine de 19 immobilisation des enzymes par exemple. La réticulation des protéines enzymatiques consiste à polymériser les molécules d'enzymes et permet l'utilisation directe d'agents réticulants tels que les composés organiques diazotés, dialdéhydes, épihalohydrines. On crée ainsi un réseau par pontage chimique des molécules protéiques soit à t l'intérieur support, soit entre les molécules elles-m & es jusqu'à ce que la taille des molécules ainsi fermées soit assez importante pour assurer leur insolubilité. Ce type de procédé présente les inconvénients suivants - liaison de l'enzyme sur le support assez fragile, - dénaturation de enzyme ainsi immobilisée, d'où perte de son activité catalytique. On connaît également une variante de ce procédé qui consiste à préparer des enzymes sous forme de particules solides de conformations diverses celles que particules sphériques, grains, fibres extrudées, bâtonnets, à partir d'un mélange d'une enzyme et d'une protéine dite "gélifiante", par exemple la gélatine, puis à traiter le mélange par un agent réticulant bifonctionnel.La protéine dite "gélifiante" est utilisée sous forme d'une solution aqueuse dont on peut faire varier la viscosité, par exemple par refroidissement, et dont le but est d'encapsuler l'enzyme. Ce procédé à l'avantage d'être plus simple et plus souples et le choix convenable de l'agent réticulant bifonctionnel permet de conserver une partie importante de l'activité enzymatique initiale. I1 faut cependant noter que ce procédé présente également les inconvénients suivants - dans le cas où la réaction est conduite à basse température, ce qui est un facteur favorable à la conservation de l'activité catalytique de l'enzyme, la viscosité du mélange gélatine - enzyme augmente notablement. I1 en résulte que l'homogénéisation du mélange est insuffisante, ce qui conduit également à une perte d'activité. D'autre part, Si l'on opère en polymérisation en suspension, on aura des difficultés pour obtenir des particules sphériques, - si lton élève la température du mélange gélatine-enzyme, on aura le phénomène inverse et l'activité catalytique en souffrira, - si lton opère en solution gélatineuse diluée à l'eau, l'encapsulation ne sera pas satisfaisante. Le but de la présente invention est de proposer un procédé amélioré d'agglomération et de réticulation en une seule étape de composés chimiquement et/ ou biolog-quement actifs divers tels que résines échangeuses d'ions en poudre, enzymes, anti-corps, hormones, permettant notablement d'éviter les inconvénient mentionnés ci-dessus, par réticulation au moyen d'un agent pontant bi fonccinnnei, d'un mélange comprenant deux composés organiques hydrosolubles et un composé chimiquement et/ou biologiquement actif. Les composés hydrosolubles utilisables dans le procédé conforme à 1' inven- tion sont des composés organiques capables de réagir avec des agents réticulants bifonctionnels ou. plurifonctionnels. Ces composés peuvent hêtre les suivants : alginates, alcool polyvinylique, polyacrylamide, gélatine, albumine. Dans le procédé, on utilisera un mélange de deux composés hydrosolubles ayant des viscosités intrinsèques différentes et avantageusement un mélange d'alcool polyvinylique et de gélatine, ce qui permet d'une part de réduire la viscosité du mélange et donc par voie de conséquence d'opérer à température plus basse, et d'autre part, de réguler la vitesse de la réaction de réticulation. Les agents réticulants bifonctionnels appropriés peuvent etre choisis parmi des composés diazotés, des dialdehydes, des épichlorohydrines. Dans le procédé conforme à l'invention, on choisira de préférence le dialdéhyde glutarique. Les produits obtenus conformément à 7'invention peuvent etre préparés sous différentes formes physiques. Si la réaction est conduite en suspension dans un milieu liquide, on obtiendra des particules sphériques. On peut opérer par granulation en lit fluidisé, dans ce cas, les particules auront la forme de grains. On peut également opérer par extrusion du mélange sous forme pâteuse, On peut couper les joncs extrudés et obtenir par solidification de petits ba tonnets. Toutes ces techniques sont bien connues de lthomme de l'art. Les exemples donnés ci-dessous illustrent les possibilités du procédé conforme à l'invention Exemple t On prépare une solution dans 122 cm3 d'eau de 15 g d'alcool polyvinylique (PVA 205 de la Société KURARAY) et de 29 g de gélatine commerciale et à laquelle on ajoute, après dissolution 42 g de micro-ionex CH (échangeur cationique fortement acide en poudre de marque commerciale DUOLITE à 5S5 de matières sèches et ayant une capacité d'échange de 5,t1 eq/Kg). Lorsque la suspension est homogène, on introduit alors 22,5 cm3 d'une solution aqueuse de dialdéhyde glutarique à 25%, et la quantité d'acide chlorhydrique suffisante pour amener le pH de la suspension entre 1 et 6. Le mélange est ensuite introduit sous agitation dans un ballon à trois cols équipé d'un réfrigérant, d'un thermomètre et d'un système d'agitation à vitesse variable, contenant un mélange de 350 cm3 d'huile et 150 cm3 de dichloréthane chauffé à 50 C. On maintient ainsi la réaction pendant 1 heure et on obtient 180 cm3 d'un produit sous forme de particules sphériques ayant une capacité d'échange de 0,56 eq/l et de 2,6 eq/Kg. Exemple 2 Suivant l'exemple 1, on prépare une solution aqueuse contenant 15 g de PVA 205, 30 g de gélatine, 39 g de micro-ionex CMH4 (échangeur cationique fort en poudre sous forme ammonium à 59ç0 de matières sèches et ayant une capacité d'échange de 4,97 eq/Kg), 75 g d'eau, 1,6 cm3 d'acide chlorhydrique en solution normale et il cm3 d'une solution aqueuse de dialdéhyde glutarique à 50%. Ce mélange est introduit sous agitation dans un ballon à trois cols dans un milieu de suspension comprenant 400 cm3 d'huile et 100 cm3 de dichloréthane. On maintient ainsi le mélange réactinnnel pendant 1 heure à 60 OC, Les particules sphériques obtenues sont séparées, dégraissées puis recuites pendant 2 heures à 60 C dans une solution normale d'acide chlorhydrique. Après séparation et lavage, on détermine la capacité d'échange des billes (0,77 eq/l et 2,21 eq/Kg). Exemole 3 Dans la cuve d'un granulateur en lit fluidisé, on introduit 3,9 Kg de Micro-ionex CNH4 (59% de matières sèches et d97 eq/Kg en capacité), que l'on sèche partiellement en le fluidisant par injection d'air tiède dans le granulateur( 30 OC environ). On arrête I'injection d'air et on introduit alors 0,7 Kg de PVA 205 S et 1,4 Kg de gélatine en poudre. Le tout est ensuite fluidisé par injection d'air. Lorsque l'ensemble est bien homogénéisé, on pulvérise deux litres de solu- tion aqueuse de dialdéhyde glutarique à 12,5% sous régime fluidisé à l'air tiède (environ 20 OC). Un peu avant latin de l'introduction, le produit est chauffé vers 30 nC et on pulvérise alors 500 cm3 d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique (70 cm3 d'acide pur). Le produit est encore chauffé un quart d'heure, puis sorti de ltappareil On obtient ainsi 4,5 Kg d'un produit humide sous forme de grains que l'on caractérise analytiquement comme suit : matières sèches, 68,1 %; densité apparente, 388 g/l de produit sec; granulométrie, 92% du produit compris entre 0,4 et 1,25 mn; capacités d'échange, 1,23 eq/l et 3,33 eq/Kg. Pour améliorer les caractéristiques mécaniques des grains, le produit est retraité pendant 2 heures dans une solution acide chlorhydrique normale à 1QS de chlorure de sodium, chauffée à 60-70 C à reflux. Exemple 4 flans un malaxeur à bras du type Werner, on introduit 560 g d'une résine échangeuse d'ions cationique faiblement acide (Duolite C 433) et 920 g d'une résine échangeuse d'ions anionique faiblement basique (Duolite - A 368), toutes deux en poudre, puis 464 g d'alcool polyvinylique (PVA 205) et 92D g de gélatine et 1,5 litre d'eau. Le mélange est chauffé dans le malaxeur entre 30 et 60 C, puis malaxé pendant 1 heure 30. On ajoute alors 350 cm3 d'une solution aqueuse de dialdehyde glutarique à 50% et on malaxe en refroidissant pendant I heure. Le mélange est ensuite traité dans une extrudeuse de diamètre D = 30 mn et de longueur 12 D. Le fil produit est découpé sous forme de bâtonnets traités pendant 2 heures par une solution acide (HC1) de chlorure de sodium. La prnduction est de 2,2 Kg/heure de fil de I mm de diamètre. Exemple 5 On introduit dans 207 ml d'eau chauffée à 60 C, 50 ml d'une solution tampon phosphate 0,2 M - pH 5, 225 g de glucose, 15 g de fructose, 10 g de microionex en poudre sur lequel on a fixé 2 mg de cobalt et 7 mg de magnésium, et 8g de glucose isomérase (enzyme de la société Miles Kali G.m.b.H, vendue sous la dénomination OPTISWEET P) ayant une activité de 2000 UGiZg (Unité Glucose Isomérase/gramme). Après homogénéisation sous agitation, (5 à 10 heures), on introduit 15 g de PVA 205 et 30 g de gélatine. L'agitation est poursuivie jusqu'à dissolution complète. Le mélange est coulé dans un ballon trois cols contenant un milieu de suspension chaud (60 C) composé de 1500 ml de toluène et 600 ml de tétrachloréthylène. Le mélange phase continue - phase dispersée est refroidi jusqu'à 10 15 OC; puis on ajoute toujours sous agitation et goutte à goutte 15 cm3 d'une solution de dialdéhyde glutarique à 50%. On laisse remonter la température à l'ambiante, puis on sépare les billes obtenues et on les dégraisse. Les billes ont un diamètre inférieur à 1 mm et présentent une activité en enzymatique de 330 UGI/g. sec. Ces mêmes billes broyées ont une activité de 400 UGI/g, sec. L'activité théorique serait de 405 UGI/g. sec et l'exemple prouve bien qu'au cours de ltagglomération il n'y a pas de dégradation de enzyme. Exemple 6 On répète l'exemple 5, mais le cobalt et le magnésium sont introduits dans le substrat enzymatique à l'état de solution (5 ml d'une solution 0,U1M de CoCl2 et 5 ml d'une solution 0,1 M de MySD4). Les billes obtenues, broyées présentent une activité de 380 - 390 UGI/G. sec. Exemple 7 Une composition enzymatique préparée suivant ltexemple 6, mais ayant une activité de 250 UGI/g. sec est traitée par une solution aqueuse à 5% de dialdéhyde glutarique pendant 8 heures d'une part à température ambiante (22 - 23 cC), et d'autre part à température plus basse t10 - 15 C). Les résultats analytiques prouvent qu'à température ambiante l'activité enzymatique du produit aggloméré baisse de 60% alors qu'à température plus basse (15 C), la perte d'activité n'est plus que de 20%. Exemple 8 Dans un granulateur de laboratoire, on fluidise 300 g d'enzyme (activité 300 UGI/g. sec), 100 g de PVA 205 et 200 g de gélatine, le tout étant broyé finement. Par la buse d'injection du granulateur, on pulvérise 500 ml d'un subtrat contenant 100 g de glucose, 100 g de fructose, 50 ml d'une solution O,01N de CoC12, 50 ml d'une solution 0,1 M de MgSO4 et la quantité suffisante de soude pour amener le pH à 7 - 8. Lorsque l'introduction de ce substrat est terminée, on sèche partiellement le produit par injection d'air tiède (20 C), puis on pulvérise 200 cm3 d'une solution de dialdéhyde glutarique à 25%. Après séchage à l'air tiède, on obtient un produit sous forme de grains ayant une activité de 140 UGI/g. sec. Exemple 9 Dans un malaxeur à bras hélicoidaux , on introduit 300 g de cellule contenant de la glucose isomérase (activité 300 UGI/g. sec), 50 g de PVA 205, 100g de gélatine et 1000 ml d'un substrat contenant 125 g de glucose, 100 g de fructose, 50 ml d'une solution 0,01M de CoCl2, 50 ml d'une solution 0,1 M de MgSO4 et 250 ml d'une solution tampon phosphate 0,2 M à pH 7,5. Le mélange est malaxé pendant 2 heures entre 20 et 50 OC, puis extrudé et coupé sous forme de bâtonnets de 1 mm de diamètre et 1 mm de longueur. Ces bâtonnets sont récupérés dans une solution froide (O à 10 C) de dialdéhyde glutarique à 5v On obtient un produit ayant une activité enzymatique de 200 UGI; g. sec. La définition de l'unité de mesure de l'activité enzymatique U6I utilisée dans l'analyse des produits cités dans les exemples 5-6-7-8-9 est la suivante une unité de glucose isomérase (UGI) est la quantité d'enzyme qui dans des con dit ions opératoires déterminées permet de produire 1 mole de fructose par mi- nute par transformation enzymatique du glucose. Le fructose transformé est dosé par la méthode de DTSCHE et BORENFttEUND en milieu sulfurique concentré; le fructose donne avec le carbazole en présence de cystéine, une coloration violette dont l'intensité est proportionelle à la concentration en fructose. L'absorption de la solution est mesurée à 560 nm (nanonètres) en cuve de 10 mm. Les exemples ci-dessus notés (en particulier les exemples comparatifs 5 6-7 dércntrent que les composés chimiquement et/ou biologiquement actifs préparés selon le procédé conforme à l'invention ne perdent pratiquement pas leur activité après leur mise en forme. REVENDICATIONS 1 - Procédé de préparation et de mise en forme de composés chimiquement et/ou biologiquement actifs utilisables dans des processus industriels tels que, extraction, séparation, échange d'ions, catalyse enzymatique, caractérisé par le fait, qu'en une seule étape, les dits composés sont agglomérés dans un melange de deux agents organiques hydrosolubles ayant des viscosités intrinsèques dif férentes et que lton réticule ltensemble par un agent pontant bifonctionnel. 2 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en que le mélange de composes organiques hydrosolubles est constitué d'alcool polyvinylique et de gélatine. 3 - Procédé selon les revendications 1 et 2 caractérisé en ce que les propor tions des deux constituants du mélange alcool polyvinylique/yélatine sont dans un rapport d'environ 50/50. 4 - Procédé selon les revendications 1, 2 et 3, caractérisé en ce que l'agent réticulant bifonctionnel est le dialdéhyde glutarique. 5 - Procédé selon les revendications 1, 2, 3 et 4 caractérisé en ce que les composés chimiquement et/ou biologiquement actifs peuvent être des résines échangeuses d'ions en poudre (anioniques ou cationiques fortes ou faibles ou mélange de 2fonctions,anionique et cationique), des anti-corps, des hormones, des enzymes. 6 - Préparation de produits chimiquement etpou biologiquement actifs confor- mément aux revendications ci-dessus suivant des techniques permettant leur utilisation sous forme de particules sphériques, de grains, de fibres ou de b ton- nets.