Brevet FR2421943A1 — publié le 19791102

La présente invention concerne la microbiologie, et notamment un procédé microbiologique de préparation drun acide aminé, a' savoir la L-homosérine. La L-homosérine est utilisée comme produit intermédiaire dans la biosynthèse de la méthionine, de la -hréonine et de l'isoleucine dans tous les organismes vivants. Elle n'est pratiquement pas contenue dans les protéines natives et se trouve rarement et en quantités négligeables dans les produits naturels. La L-homosérine est un réactif'chimique de valeur, utilisé a des fins de recherche scientifique. Cet acide amine est employé dans l'industrie de la parfumerie comme constituant important des crèmes cosmétiques hydratant la peau.La L-homosérine est utilisée dans Il industrie microbiologique comme précurseur pour obtenir la L-thréonine, et comme facteur de croissance indispensable pour les cultures productrices de la lysine. On connaît des procédés chimiques et microbiologiques de préparation de la L-homosérine. Les produits suivants sont utilisés à titre de produits de départ dans la synthèse chimique 1' 4 -bromo- &gamma; -butyro-lactone (brevet DT 922 168, 1955), la &gamma; -chlo ro- p oxybutyrolactone (brevet JA 12264, 1962), l'acide a , , diaminobutyrique ( JA 21520, 1961) et le 3-étha-oxy-propinol (brevet FR 1540774, 1968). La synthèse de lthomosérine dans tous les procédés susmentionnés est fractionnée. Le produit fini est le ra sémique (DL -homosérine). C1 est ltisomere L qui est biologiquement actif.La séparation du racémique en isomères est une opération difcivile et couteuse. Dans les procédés microbiologiques, on utilise des microorganismes spéciaux qui sont des mutants dépendant de la threonine, Micrococcus glutamicus (synonyme - Cor.glutamicum) (brevet FR 1 305 747, 1 306 015) ou des mutants binaires, Brevibactérium Kawasaki, dépendant de la thréonine et de la méthionine (brevet JA 6 811 757 de l'année 1968). Dans les procédés connus, on cultive des microorganismes producteurs dans des conditions de profondeur, sous aération et agitation vigoureuses, sur des milieux nutritifs synthétiques ou semi-synthétiques, contenant comme source de carbone, des carbohydrates purs (le glucose, le maltose) et comme facteurs de croissance indispensables, des acides aminés purs (la L-thréonine, la L-méthionine) et des vitamines (la biotine, la thiamine), soit des préparations rares et coûteuses les contenant telles que des extraits de foie, la peptone, des extraits de viande, l'amine - NZ. On effectue la culture dans des fioles sur une secoueuse, à une température de 24 à 37 OC, pendant 96-120 heures. Le rendement en produit final dans les procédés connus est de 6,5 a 13,6 g/l. On isole la L-homoserine sous forme d'une préparation cristalline dans le liquide de culture obtenu en utilisant des résines échangeuses d'ions (brevet FR 13057473. On connaît des procédés, dans lesquels on utilise un mutant dépendant de la thréonine, oor.hydrocarboclastus, capable d'utiliser activement des hydrocarbures en C11-C14. 120 heures après fermentation sur les substrats indiqués, en additionnant les facteurs de croissance indispensables (la thréonine, la biotine, la thiamine) et des sels (de phosphore, de magnésium, des micro-éléments) il s'accumule dans le liquide de culture, 6,5 g/l de L-homosérine (brevet GB 1186 989 ; brevet US 3 593 701 ; brevet FR 1 581 254). Les procédés microbiologiques de préparation de la L-homosérine, ont un inconvénient important résidant dans le fait qu'il est nécessaire de cultiver les microorganismes sur des milieux nutritifs contenant des sucres purs (le glucose, le maltose), et utiliser comme source de facteurs de croissance, soit les acides aminés purs (la thréonine) et des vitamines (la biotine, la thiamine), soit des préparations coûteuses et rares les contenant telles que : l'amine-NZ, des extraits de foie, etc.. (brevet FR 1 306 015); brevet JA 6 811 757). Pour l'obtention de la L-homosérine, dans le procédé connu décrit dans le brevet FR 1 306 015, on utilise des mutants dépendant de la thréonine, M. glutamicus ATCC 14 296 et ATCC 142o7. On cultive ces derniers dans des fioles suer une secoueuse, sur un milieu nutritif, contenant comme source de carbone du glucose et du maltose purs, et comme source de facteurs de croissance es extraits de foie, l'amine - NZ ou des acides aninés purs (la thréo- nine) ou des vitamines (la biotine). Le niveau d'accumulation maximum de la L-homosérine est de 12,4 g/I sur un milieu nutritif synthétique, avec la thréo nine et la biotine, et de 7,3 g/l sur un milieu semi-synthétique (en utilisant des extraits de foie et l'amine NZ). On isole l'homosérine obtenue à l'aide de résines échangeuses d'ions. Le rendement en produit est de 61 %. L'inconvénient du procédé décrit réside dans l'utilisation comme source de carbone d'hydrates de carbone purs (le glucose, le maltose), et comme source de facteurs de croissance de produits complexes coû teux tels que l'amine - NZ (préparation de marque déposée) et des extraits de foie. Le but de la présente invention est de mettre au point un procédé microbiologique de préparation de la L-homosérine qui permet d'augmenter le rendement en produit visé. et dten réduire le coût. L'invention vise en outre l'obtention de nouvelles souches mutantes de microorganismes, capables de produire la L-homosérine sur des milieux nutritifs contenant une matière de départ moins coûteuse et plus accessible. La solution consiste en ce que dans le procédé de préparation de la L-homosérine.par culture en profondeur de microorganismes proaucteurs dépendant de la thréonine, de la famille de Brevibacterium flavum ou Corynebacterium glutamicum dans des conditions d'aération, sur un milieu nutritif contenant des sources de carbone, d'azote, de sels minéraux et des sources de facteurs de croissance, on utilise, conformément à l'invention, comme microorganismes producteurs de la L-homosérine, la souche mutante de Brevibacterium flavum B-1006 ou de Corynebacterium glutamicum B-1505. Les nouvelles souches de microorganismes mutantes proposées sont capables de synthétiser la L-homosérine aussi bien sur des milieux nutritifs synthétiques que sur ceux contenant une matière de départ naturelle brute. Comme source de carbone, on peut utiliser aussi bien des hydrates de carbone purs (saccharose, glucose), que des produits de départ industriels (mélasse de betterave ou de canne, sucré roux ou glucose roux) et à titre de source de facteurs de croissance, aussi bien des acides aminés purs (thréonine) et des vitamines (biotine, thiamine), que divers types de matières premières industrielles (des hydrolysats acides et enzymatiques de protéines d'origine végétale ou animale, qui sont des déchets de l'industrie alimentaire, par exemple, des tourteaux d'extraction de cultures oléagineuses, de la farine de poisson,etc. et également des hydrolysats de protéines microbiennes et de levu res, par exemple, des biomasses de microorganismes producteurs, des levures alimentaires ou fourragères obtenues sur des sciures de bois, ou des hydrocarbures de pétrole, des autolysats de levures, etc...). Comme il a été indiqué ci-dessus on utilise comme souches productrices des mutants dépendants de la thréonine, Br. flavum B-1006 et Cor. glutamicum B-1505, obtenus auprès de l'Ins- titut 'ISNII Genetica". Contrairement aux microorganismes producteurs connus à l'heure actuelle, les cultures proposées sont caractérisées Par la faculté d'accumuler environ 20 g/l de L-homosérine sur un milieu synthétique contenant du glucose (ou acétate) et de la L-thréonine. La culture Br. flavum a été déposée le 11 janvier 1974 sous le numéro de B-1006, et la culture de Cor.glutamicum a été déposée le 2 juin 1977 sous le numéro de B-1505. Les deux cultures sont conservées au Musée des cultures de microorganismes industriels de 1'Institut genetiki i selektsii promyshlennyhc micro organismov - (VNIIGENETIKA). Le mutant de Br.flavum B-1006 est obtenu à partir de la souche de l'espèce naturelle de Br.flavum ATCC 14067 à la suite de l'action combinée de deux mutagènes, à savoir des rayons ultraviolets et de l'éthylèneimine. Le mutant de Cor. glutamicum B-1505 est isolé à partir de la souche de l'espèce naturelle de Cor.glutamicum ATCC 13032,après action d'un mutagène chimique qui est la nitrosoguanidine. La caractéristique des mutants est présentée dans le tableau suivant. Caractères culturaux et morphologiques des souches-productrices de la L-homosérine Désignation des signes Br. flavum B-1006 Cor. glutamicum B-1505 caractéristiques 1 2 3 Morphologie Cellules ovales, mesurant de 1, 5 à 2,5 Cellules ovales, mesurant de 1, 0 à de longueur, non sporulées, immobiles, 2,0 de longueur, non sporulées, Gram positif. Gram positif, immobiles. Agar de viande Au 5è jour de croissance à la température Au 5è jour de croissance à la temet de peptone de 28 C, les colonies atteignent un dia- pérature de 28 C, les colonies atmètre de 4 à 5 mm, circulaires à bords lis- teignent un diamètre de 3 à 4 mm, ses plats, centre surélevé sous forme d'un circulaires à bords plats, centre cône, surface lisse, brillante, crème-jau- surélevé, à l'extrémité pli concennâtre. trique, surface lisse, brillante, la couleur de crème Au 2è jour, croissance de stries modérées, Au 2* jour, la croissance de stries extrémité lisse, surface brillante et compacte. est modérée, la surface est brillan La croissance à l'endroit de l'inoculation te et compacte. La croissance à l'enest modérée, essentiellement sur la surface droit de l'inoculation est modérée, du milieu. essentiellement sur la surface du milieu. 1 2 3 Milieu minéral La biotine, la thiamine et la thréonine La biotine et la thréonine sont indisde Glover au sont indispensables pour la croissance. pensables pour la croissan@e. Au 5è glucose Au Sé jour de croissance, jour, les colonies atteignent un diamèatteignent un diamètre de 2,0 à 2,5 mm, tre de 1,0 à 2,0 mm de couleur crèmede couleur crème claire. Au 2è jour la clair. croissance de stries est modérée, compacte. La croissauce de stries au 2è jour est modérée, compacte. Caractères Température : la souche croît à une tempé- Température : elle croît à une tempéraphysiologiques rature de 20 à 37 C, température optima- ture de 20 à 37 C, la température optile est de 28 à 30 C. pH : croît à un pH male étant de 28 & 30 C. pH :croît à un de 6 à 9, le pH optimal étant de 7,6 à pH de 6 à 9, le pH optimum étant 7,6 à 8,0 8,0. Hydrates de carbone : elle utilise Hydrates de carbone : elle utilise bien le bien le glucose, le fructose, le saccha- glucose, le fructose, le saccharose, le malrose, le maltose, le mannose, elle utili- tose, elle utilise moins le galactose, le se moins le galactose; elle n'utilise pas xylose, le mannose; elle n'utilise pas le le lactose, n'hydrolyse pas l'amidon.lactose; n'hydrolyse pas l'amidon. 1 2 Alcools : elle utilise l'éthancl, l'inositol, emploie mais n'utilise pas le sorbitol, le mannitol de dulcitol, la glycérine, Acides organiques : elle utilise bien l'acide acétique, moins l'acide lactique. Sources d'azote : elle assimile bien l'azote ammoniacal NH4 Cl; (NH4)2 SO4; (NH4)2 HPO4, l'urée; n'assimile pas l'azote nitrique. Elle possède une activité d'uréase, elle ne liquéfie pas la gélatine. 3 Alcools : utilise faiblement l'éthanol, n'utilise pas la glycérine, le dulcitol, le mannitol. Acides organiques : elle utilise bien l'acide acétique et lactique, moins les acides fumarique, succinique, pyruvique. Sources d'azote : elle assimile bien l'azote ammoniacal, l'urée; elle n'assimile pas l'azote nitrique. Elle possède une activité d'uréase. Elle ne liquéfie pas la gélatine. Pour la mise en oeuvre du processus de biosynthèse de l'homosérine, on cultive le microorganisme sur un milieu nutritif d'agar de viande et de peptone ou sur le milieu de Hottinger, pendant 24 heures, à une température de 28 à 30 OC, On transfère ensuite la suspension ae cellules dans des flacons avec un milieu d'ensemencement, contenant de la mélasse (4 %), un extrait de mais (3 %) et NaCl (0,4 %); et on conduit la culture sur des secoueuses (220 t/min) pendant 24 heures. On transfère le matériau d'ensemencement développé à raison de 3 à 10 X, dans un milieu de fermentation. On effectue la fermentation soit dans les flacons sur une secoueuse, soit dans un fermenteur sous agitation et aération vigoureuse, pendant 60-72 heures , à une température de 24 à 32 OC, à un pH de 6,5 à 7,7, sur un milieu nutritif contenant des sources de carbone, par exemple, de saccharose, du glucose de la mélasse, de lthydrol, des sources d'azote minéral, par exemple, des chlorure, sulfate et nitrate d'ammonium, etc..., de l'urée, des sels du phosphore, par exemple, des phosphates de potassium, d'ammonium, etc..., des sels de magnésium, par exemple, des sulfates, chlorures, etc..., des sources de facteurs de croissance, par exemple, des hydrolysats acides ou enzymatiques de protéines microbiennes biomasse propre) ou de levures, obtenues sur des hydrocarbures de pétrole ou des hydrolysats de bois, des hydrolysats de lactoalbumine, des tourteaux d'arachide, de soja, de tournesol, des autolysats de levures (de boulanger ou de fourrage), de l'extrait de mals, etc..., ou les préparations pures de L-thréonine, d'X -biotine (ou de desthiobiotine) et de thiamine. Après 60 a' 72 heures de fermentation, la liqueur de culture renferme de 6 à 21 g/1 de L-homosérine, 5 à 11 g/l de L-lysine, 1 à 5 g/l de L-alanine, 0,2 à 5,3 g/1 d'acide L-glutamique, 0,9 à 1,2 g/l de L-valine. On peut isoler l'homosérine sous forme de cristaux ou l'obtenir sous forme d'une préparation de qualité technique,sous forme d'un concentrat (liquide ou sec) obtenu par évaporation de la liqueur de culture conjointement avec la biomasse. On obtient la préparation de L-homosérine brute sous forme d'une poudre exempte de matière de charge (forme hygroscopique), soit avec une matière de charge, par exemple, le son de froment ou Ca(OH)2 (forme non hygroscopique). Pour stabiliser l'homosérine, on ajoute un acide dans la liqueur de culture à la fin du processus (HCL ou H2S04) jusqu'à obtention d'un pH de 2,5 à 2,0, ou du bisulfite de sodium (0,3 %), du chloroforme (0,3-1,0 aa) et d'autres antiseptiques. Le procédé de préparation de la L-homosérine présente les avantages suivants 1 - Les souches mutantes indiquées de Er. -lavum B-1006 et Cor. glutamicum B-1505 sont capables d'accumuler jusqu'à 20-21 g/l de L-homosérine sur un milieu nutritif synthétique. Les cultures connues (brevet FR 1 306 015) ne sont capables d'accumuler que 12,4 g/l de L-homosérine sur un milieu nutritif synthétique en utilisant des préparations pures d'hydrates de carbone, de thréonine et de biotine. 2 - Contrairement aux procédés connus, les nouvelles souches mutantes de microorganismes, dans le procédé suivant 1'in- vention, sont capables de synthétiser la L-homosérine non seulement sur des milieux synthétiques mais aussi sur des milieux nutritifs naturels complexes. A titre de source de carbone, on peut utiliser outre des hydrates de carbone purs (glucose, saccharose), une matière -première industrielle les contenant, par exemple de la mélasse de betterave ou de canne à sucre, du sucre et du glucose techniques (bruts), et à titre de source de facteurs dc croissance, non seulement des acides aminés et des vitamines purs, mais aussi divers types de produits de départ industriels tels que des hydrolysats acides et enzymatiques de protéines microbiennes et de levures, par exemple, des biomasses de producteurs de levures alimentaires ou fourragères obtenues sur des sciures de bois ou des hydrocarbures de pétrole. Tout ceci rend le procédé commercialement avantageux. D'autres caractéristiques et avantages de ltinven- tion seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre de plusieurs exemples de réalisation du procédé suivant l'invention (les teneurs sont indiquées en 7, en poids). EXEMPLE 1 Une culture-pendant 24 heures de Br flavum B-1006, sur un agar incliné de Hottinger, est réensemence sur un milieu nutritif liquide, ayant la composition suivante (,0) mélasse 4,0 extrait de mais 2,0 NaCL 0,4 On réalise la culture réensemencée dans des erlenmeyers de 250 cm2 de capacité (le volume du milieu est de 30 cm3) sur une secoueuse (200-220 t/min), à une température de 29#1 C. On transfère le matériau d'ensemencement obtenu, à raison de 5 %, dans un milieu de fermentation de composition suivante (S) Glucose brut 12,0 3,5 MgSO4.7 H2O 0.05 KH2P04 0,3 FeSO4.7H2O 0,001 MnSO4.7H2O 0,001 CaCO3 5,0 L-thréonine 0,045 biotine 40 Mg/l thiamine 200 g/1 On effectue la fermentation dans des erlenmeyers de 3 750 cm de capacité, contenant chacun 25 cm de milieu nutritif, sur une secoueuse (à 220 t/min), a' une température de 29#1 C, pendant 66 à 72 heures. A la fin de la fermentation la liqueur de culture renferme 20,5 g/1 de L-homosérine et 5,2 g/1 de L-lysine. On peut isoler la L-homosérine à partir de la liqueur de culture de la manière suivante On acidifie la liqueur de culture et on la soumet à une centrifugation pour séparer la biomasse On fait passer le liquide de centrifugation à travers une colonne remplie d1un échangeur sulfocationique sous forme NH4 (Dia Jonsk) pour la sorption de la lysine. On acidifie la liqueur de culture obtenue, contenant la L-homosérine, jusqu'à pH 2,2 et on fait passer a nouveau à tra + vers une colonne chargée du sorbant indiqué, mais sous forne H (HCL-2N). On élue la L-homosérine de la colonne au moyen d'une solution à 3,5 % dramsoniaque. On réduit le volume de l'éluat par evaporation, on le concentre sous vide à la température de 50 C et on clarifie sur du charbon actif.On précipite la L-homosérine par l'éthanol. Les cristaux de L-homosérine précipités sont séparés sur filtre et séchés. EXEMPLE 2 La culture, le procédé de préparation de la semence et les conditions de fermentation sont analogues à ceux décrits à l'exemple 1. La seule différence est la conposition du milieu de fermentation, contenant les constituants suivants (,%) sucre brut 10,0 ctest-à-dire non purifié (NH4)2S04 3,0 K2HPO4 0,15 MgS04.7H20 0,05 C1CO3 3,0 autolysat de levure fourragère obtenu sur des paraffines de pétrole (azote aminé - 0,9 %) -. 1,5. Après 72 heures de culture, il s'accumule 13,3 g/l de L-homosérine, 6,3 g/l de L-lysine et 1,3 g/l d'alanine dans la liqueur de culture. EXEMPLE 3 Une culture de Brev.flavum B-1006 est développée sur un milieu d'ensemencement suivant exemple 1. On effectue la biosynthèse de l'homosérine dans des fioles Erlenmeyer de 250 ml de capacité (volume de milieu - 12 ml) sur une secoueuse (220 t/min), à une température de 29-+ 1 OC, pendant 72 heures, sur un milieu nutritif ayant la composition suivante (%) mélasse 20,0 (NH4)2SO4 2,6 K2HPO4 0,2 MgS04.7H20 0,05 CaCO3 3,0 hydrolysat de levure fourragère obtenue sur des paraffines de pétrole - 0,75. Après 72 heures de culture, il s1 accumule dans la liqueur de culture 13,3 g/l de L-homosérine, 6,3 g/l de L-lysine et 0,8 g/l dtalanine. Après addition de 0,3 % de bisulfite de sodium sous forme de cristaux, la liqueur de culture obtenue est évaporée sous vide à une pression résiduelle de 0,07 à 0,2 atm. eff. jusqu'à une teneur en substances sèches de 30 S dans un évaporateur rotatif à film liquide ou un évaporateur inversé à courant descendant. La teneur en L-homosérine du produit fini est de 26 g/l. EXEMPLE 4 On effectue la fermentation comme à exemple 1, à cette différence près que la source de facteurs de croissance est différente. On utilise comme source de facteurs de croissance un hydrolysat acide de tourteaux de coton à raison de 0,8 S. Après 70 heures de culture du microorganisme producteur, il s'accumule dans la liqueur de culture 9,8 g/l de L-homosérine et 8,5 g/l de L-lysine. EXEMPLE 5 Une culture pendant 24 heures de Cor.glutamicum VNIIGenetika B-1505, est développée sur un milieu d'ensemencement de façon analogue à celle décrite à 1'exemple 1. On réalise la fermentation sur un milieu nutritif ayant la composition suivante (S): mélasse 17 (NH4)2SO4 2,5 CaCO3 2,0 extrait de mais 2,0 Le mode de culture est analogue à celui de l'exemple I. Après 72 heures de culture de l'organisme producteur, il s'accumule dans la liqueur de culture 9,4 g/l de L-homosérine, 6,2 g/l de L-lysine, 2,3 g/l d'acide L-glutamique et 3,0 g/l de L-alanine. EXEMPLE 6 On réalise dans cet exemple une culture de Br.flavum B-1006. La culture d'ensemencement est effectuée en deux étapes. La première étape est conduite comme à l'exemple 1. Au cours de la deuxième étape, on cultive la culture d'ensemencement dans 3 des fermenteurs de 10 m de capacité, pendant 16 à 22 heures, sur un milieu nutritif contenant de la mélasse (4 %), de l'extrait de mais (3 %) et NaCI (0,4 %). Pour ensemencer le milieu de fermentation, on utilise la culture d'ensemencement de la deuxime étape e la transférant à raison de 2 à 10 S (en volume). On réalise la fermentation dans des fermenteurs de 100 m de capacité sur un milieu de fermentation ayant la compost tion suivante (%) mélasse 17,0 extrait de mals 3,0 (NH4)2HPO4 0,15 MgSO4.7H2O 0,05 On conduit en continu la fermentation à une température de 29#1 C, à raison de 0,5 à 1,0 volume d'air pour 1 volume de milieu et par minute, sous une agitation à l'aide'd'un agitateur à 180 t/min, le pH étant maintenu au niveau de 6,8 à 7,7 en adaitionnant un réactif approprié (NH4OH ou HCL). Après 68 heures de culture, il S'accumule dans la liqueur de culture 10,3 g/l d'homosérine et 8,3 g/l de lysine. On évapore la liqueur de culture obtenue, de façon analogue à celle décrite à l'exemple 3, et on sèche par pulvérisation, en ayant porté préalablement le pH à 11,5-12,0 par addition de Ca(OH)2 broyé. Le concentré obtenu se présente sous forme d'une poudre sèche à l'air, contenant (en % en poids) : 4 % d' homosérine, 3 % de lysine, 0,5 à 0,8 % de valine et 0,5 à 1,5 % d'alanine. EXEMPLE 7 La culture et le procédé de préparation de la culture d'ensemencement sont analogues à ceux décrits à l'exemple 1. On conduit la fermentation dans es fermenteurs du type "Bioflo" de 0,5 1 de capacité, munis d'un capteur de pH, d'une agitation (agitateur à 850-900 t/min) et d'une aération intense (1 volume d'air par 1 volume de milieu), à une température de 29 1 1 C, sur un milieu nutritif ayant la composition suivante, (%) : acétate de NH4 1,2 autolysat de levure fourragère cultivée sur des hydrocarbures de pétrole 2,5 K2HPO4 0,2 MgS04.7H20 0,05 MnSO4.7H2O 0,001 FeS04.7H20 O, 001 Le pH au début de la fermentation est de 6,5 à 6,8 après 6 à 8 heures, on atteint un pH de 7,5 à 7,6. On met en circuit l'alimentation automatique en mélange d'acétate, dont l'introduction est réalisée automatiqJement d'après le signal au capteur ae pH. Composition d'alimentation d'appoint (%) acétate de NH4 15,0 l'acide acétique 45,0 autolysat de levure fourragère cultivée sur des hydrocarbures de pétrole 3,0 Après 72 heures, il s'accumule dans la liqueur de culture 15,8 g/1 de L-homosérine et 8,3 g/l de lysine. EXEMPLE 8 Cet exemple illustre la préparation de L-homosérine sur un milieu nutritif contenant un acétate et des composants purs de facteurs de croissance. La culture, le procédé de préparation de la culture d'ensemencement et le procédé de culture sont analogues à ceux décrits à l'exemple 1. La seule différence réside dans la composition du milieu nutritif et de l'alimentation d'appoint. Composition de milieu nutritif (%) : acétate de NH4 1,2 saccharose 1,5 K2HP04 0,3 MgSO4.7H2O 0,05 MnSO4.7H2O 0,001 FeSO4.7H2O 0,001 L-thréonine 0,06 desthiobiotine 60 P g/l thiamine 200 g/1 Composition de l'alimentation d'appoint (%)d acétate de NH, - 15,0 l'acide acétique - 45,0 L-thréonine 0,04 Après 72 heures, il s'accumule dans la liqueur de culture 20,8 g/1 de L-homosérine et 4,2 g/l de lysine. R E V B N D I C A T I O N S 1 - Procédé de préparation de L-homosérine par culture en profondeur de microorganismes producteurs dépendant de la thréonine, de ltespèce de Brevibacterium flavum ou Corynebacterium glutamicum, dans des conditions aérobies, sur un milieu nutritif, contenant des sources de carbone, azote, ae facteurs de croissance et de sels minéraux, caractérisé en ce qu'on utilise comme microorganismes producteurs de la L-homosérine, les souches mutantes de Brevibacterium falvum B-1006 ou Corynebacterium glutamicum B-1505. 2 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on conduit la culture sur un milieu nutritif, contenant comme source de carbone de la melasse, du sucre et du glucose bruts ou de acide acétique, et comme source de facteurs de croissance un hydrolysat de protéines d'origine végétale ou animale ou un autolysat et des hydrolysats de levure.