Brevet FR2402204A1 — publié le 19790330

La présente invention concerne un procédé de coloration de préparations hitologiques et plus spécialement de lames hématolo giques. La seule technique qui soit actuellement largement utilisée pour colorer des lames hématologiques est la technique de May Grtnwald Giemsa, encore appelée technique de Pappenheim. Cette technique consiste à recouvrir les frottis secs d'une solution méthylique d'éosinate de Bleu de méthylène (Colorant de May Grunwald), à ajouter de l'eau, puis à traiter par une solution aqueuse d'éosinate d'Azur (Colorant de Giemsa), à laver à l'eau et à sécher. Le principal inconvénient de eette technique est sa durée, qui est de l'ordre de 17 à 20 mn. De plus, pour chaque lame hématologique, la consommation en solutions colorantes est de 15 à 20 ml, ce qui conduit à une consommation importante en colorants pour les laboratoires d'analyses médicales, qui doivent répéter un grand nombre de fois de telles opérations. La présente invention vise à fournir un procédé de coloration de préparations htRologlque6qui soit d'une durée beaucoup plus courte et qui n'entrasse pratiquement pas de consommation de colorants. Le procédé selon la présente invention de coloration de préparations histologiques est caractérisé en ce que l'on traite la préparation histologique successivement a - par de l'alcool méthylique tamponné à pH 6,5 à 7,5 (réactif A), pendant au moins 5 secondes, b - par une solution aqueuse tamponnée à pH 6,5 à 7,5 et contenant de 1,6 à 4 g/l d'un colorant choisi parmi l'Eosine I Bleuatre et l'Eosine Jaunâtre (réactif B), pendant environ 5 secondes, et c - par une solution aqueuse tamponnée à pH 6,5 à 7,5 et contenant de 1 à 2,6 g/l de Bleu de méthylène et de 0,6 i 2,0 g/l d'un Azur de méthylène (réactif C), pendant environ 7 secondes, puis on lave à l'eau et on sèche. La préparation ainsi traitée est alors preste à être examinée. L'Eosine I Bleuâtre est le sel disodique de la 4',5-dibromo 2' , 7' -dinitrofluorescéine. L'Eosine Jaunâtre est la 2',4',5',7'-tétrabromorluorescéine connue également sous le nom de Bromoéosine. Le Bleu de méthylène est le chlorure de méthyl thionine, à savoir le chlorure de 3,7-bis (diméthylamino) phénazathionium. Les Azurs de méthylène sont des mélanges obtenus par oxydation du Bleu de méthylène et contenant principalement les chlorures de di- et trflmethylamino phénazathionium. I1 existe en particulier les Azurs I et II de méthylène qui ne diffèrent que par la teneur en chlorure de di-et de triméthylamino phénazathionium. Pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, on pré férue, comme réactif B, une solution d'Eosine I Bleuâtre et, comme réactif C, une solution de Bleu de méthylène et d'Azur I de méthylène. Le pH des trois réactifs est de préférence compris entre 6,8 et 7,2. Un tel pH peut être obtenu grâce. à un tampon constitué par du phosphate monopotassique et du phosphate disodique. Ainsi, on peut obtenir un pH de 6,8 avec par litre de solution P04H2K 6,25 g P04HNa2 5,0 g On peut obtenir un pH de 7,2 avec par litre de solution P04R2K 0,7 g P04HNa2 1 g L'exemple suivant illustre la présente invention. On prépare les réactifs ayant les compositions suivantes Réactif A - Alcool méthylique exempt d'acétone 500 ml - Phosphate monopotassique (PO4H2K) 6,25 g - Phosphate disodique cristallisé 12,60 g (P04HNa2, 12H20) 12,60 Réactif B - Eosine 1,00 g - Phosphate monopotassique 6,25 g - Phosphate diso4ique cristallisé 12,60 g - Eau distillée 500 ml Réactif C - Bleu de méthylène 0,80 g - Azur I de méthylène 0,50 g - Phosphate monopotassique 6,25 g - Phosphate disodique cristallisé 12,60 g - Eau distillée 500 ml Le réactif A est obtenu par dissolution des phosphates dans l'alcool méthylique. Après avoir laissé reposer 24 h, on filtre. Les réactifs B et C sont obtenus par dissolution des phosphates dans l'eau distillée, addition des colorants et filtration au bout de 24 heures. Le mode opératoire est le suivant On prend un frottis sur lame. On le plonge dans le réactif A pendant 5 secondes. On le sort et le plonge alors dans le réactif B pendant 5 secondes. On le sort et le plonge dans le réactif C pendant 7 secondes. On lave à l'eau du robinet, on sèche et on examine au microscopè. Le temps réel total pour colorer une lame est de 17 à 20 secondes. Ceci constitue un avantage très appréciable par rapport à la technique de coloration de May GrUnwald Giemsa. En outre, il est possible de réutiliser les mêmes réactifs des milliers de fois et les réactifs ont une durde de conservation de 6 mois à 1 an, à la température ambiante. Ia présente invention permet en conséquence de faire des économies très appréciables à la fois en raison d'une durée considérablement réduite et d'un coût plus faible en produit. Le procédé selon l'invention peut être utilisé non seulement pour colorer des lames hématologiques, mais également pour des étuVes cytologiques, notamment de myelogramme, de frottis cervicaux, de frottis urétraux, de spermogrammes et pour des recherches d'hématozoaires. REVENDICATIONS 1. Procédé de coloration de préparations histologiques, caractérisé en ce l'on traite la préparation histologique successivement a - par de ltalcool méthylique tamponné à pH 6,5 à 7,5 (réactif A), pendant au moins 5 secondes, b - par une solution aqueuse. tamponnée à pH 6,5 à 7,5 et contenant de 1,6 à 4 g/l d'un colorant choisi parmi l'Eosine I BleuaAtre et l'Eosine Jaunâtre (réactif B), pendant environ 5 secondes, et c - par une solution aqueuse tamponnée à pH 6,5 à 7,5 et contenant de 1 à 2,6 g/l de Bleu de méthylène et de 0,6 à 2,0 g/l d'un Azur de méthylène (réactif C), pendant environ 7 secondes, puis on lave à lteau et on sèche. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le réactif B est une solution d'Eosine I Bleubtre. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le réactif C est une solution de Bleu de méthylène et d'Azur I de méthylène. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 8 3, caractérisé en ce que le pH des réactifs est compris entre 6,8 et 7,2.