Brevet FR2422164A1 — publié le 19791102

L'héparinisation est le traitement de choix pour un certain nombre de conditions pathologiques. En général, il est critique que la teneur en héparine dans le sang soit maintenue dans certaines limites, ces limites dépendant d'un certain nombre de variables. Cependant, un problème majeur dans la thérapie de l'héparine est l'absence d'une technique rapide et sensible pour déterminer sa concentration dans le sang0 Cette situation règne malgré le fait que l'héparine a été utilisée comme anticoagulant depuis plus de 30 ans. Actuellement, un contrôle classique en laboratoire dépend du temps de coagulation du sang entier ou du temps de thromboplastine partielle activée (APTT)0 Les résultats sont habituellement exprimés sous forme de temps de coagulation pluttt que comme unités d'héparine dans le sang en cir relation. Evidemment, c'est cette dernière quantité qui est critique et qui doit servir de base pour décider comment continuer la thérapie de l'héparine. Comme cela est évident, une technique rapide, sensible et fiable pour déterminer la concentration en héparine serait très souhaitable0 Selon lVinvention, un échantillon de sang est prélevé chez le patient, et le sérum en est dérivé par une technique classique de coagulation et de centrifugation, puis le sérum est incubé à 370C pendant une demi-heure, avant son utilisation0 La thrombine humaine est dissoute dans une solution saline et est diluée avec une solution saline isotonique jusqu'à ce que 0,1 ml de la thrombine diluée coagule 0,2 ml de plasma normal et frais à 370C en 12 secondes0 Pour effectuer un essai, on introduit 0,2 ml de plasma normal et frais dans un tube en verre ou éprouvette que l'on place dans un bain d'eau pour ltéquilibrer à 370C.On ajoute 0,1 ml du sérum d'essai à 0,9 ml de thrombine standardisée, on mélange totalement et on place le mélange dans un bain d'eau à 370C et on l'y maintient pendant exactement 2 minutes0 A la fin des 2 minutes, on ajoute 0,1 ml du mélange thrombinesérum de façon forcée, c'est-à-dire dans des conditions telles que les solutions soient totalement mélangées, dans le tube contenant 0,2 ml de plasma qui a été équilibré à 370C. Immédiatement avant ou immédiatement après cette addition, le tube est enlevé du bain. Le temps de coagulation est alors noté. Comme base pour la relation fonctionnelle entre le temps de coagulation et la teneur en héparine, on a traité du sérum d'un certain nombre d'individus normaux in vitro avec des quantités différentes d'héparine0 Les temps de coagulation ont été déterminés comme ci-dessus. La validité des résultats dérivés par le calibrage in vitro fut établie par des patients héparinisants ayant des quantités connues d'héparine, en calculant la concentration d'héparine à laquelle on peut s'attendre dans le sang sur la base du poids du patient, puis en prélevant des échantillons de sang pour des essais par la méthode ci-dessus, les échantillons de sang étant prélevés sur une période suffisamment courte pour qu'on ne puisse s'attendre à une diminution de la concentration de l'héparine dans le sang.La correlation entre les temps de coagulation sur les échantillons in vitro et ceux pris de patitents frais chement héparinisés était satisfaisante0 En conséquence, un objet de la présente invention est une méthode rapide, fiable et précise pour déterminer la teneur en héparine dans le sang d'un patient. Un autre objet de la présente invention est un essai rapide, fiable et précis pour déterminer la concentration en héparine dans le sang dans des conditions telles que la relation entre la teneur en héparine et la concentration d'antithrombine III puisse en être obtenue. L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparat- tront plus clairement au cours de la description explicative qui va suivre, faite en référence au dessin schématique annexé donné uniquement à titre d'exemple illustrant un mode de réalisation de l'invention et dans lequel - la figure unique est un graphique du temps de coagulation sur l'axe des ordonnées en fonction de la concentration en héparine dans le sang sur l'axe des abscisses, quand le temps de coagulation est mesuré selon la présente invention La méthode pour déterminer le temps de coagulation du sérum, et ainsi la concentration en héparine dans le sang, est une modification de celle révélée dans le brevet U.S. No. 3,853.710, au nom du demandeur. Pour effectuer 11 essai selon la présente invention, les réactifs sont préparés comme suit Solution de thrombine La thrombine topique est disponible chez Ortho Diagnostic sous le nom de Fibrindex. La thrombine est reconstituée en la dissolvant dans 1 ml de solution saline puis est standardisée en diluant avec une solution saline isotonique jusqu'à ce que 0,1 ml de la solution de thrombine diluée coagule 0,2 ml de.plasma normal et frais à 370C en 12 secondes. Solution de plasma Une solution standardisée de plasma est préparée en ajoutant 48 mg de plasma Warner-Lambert à 5 ml d'une solution saline normale C'est la teneur en fibrinogène de ce plasma qui est le constituant actif. Sérum d'essai Le sérum d'essai est préparé à partir d'un échantillon de sang par les processus classiques de coagulation et de centrifugation. Avant utilisation, le sérum est incubé pendant une demi-heure à 370C. Processus de calibrage Une solution aqueuse d'héparine ayant une activité anticoagulante de 5.000 unités par ml fut utilisée. Du sérum de 5 individus normaux fut héparinisé in vitro en mélangeant des portions de 1,0 ml de sérum à 0,1 ml d'héparine de sodium à des concentrations telles que les échantillons de sérum contiennent respectivement 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 et 4,0 unités d'héparine0 Les concentrations d'héparine dans le sérum furent calculées après correction pour tenir compte de l1hématocrite. Pour chaque essai, 0,2 ml de plasma frais et normal fût introduit à la pipette dans une éprouvette, et on la plaça dans un bain d'eau à 370C. Dans une seconde éprouvette, on introduisit à la pipette 0,9 ml de la thrombine standardisée0 On ajouta 0,1 ml de l'échantillon de sérum dans l'éprouvette de la thrombine, le contenu fut totalement mélangé, et l'éprouvette fut placée dans le bain d'eau à 370C, et y fut maintenue pendant exactement 2 minutes. A la fin des deux minutes d'incubation, on ajouta de force 0,1 ml du mélange thrombine-sérum dans l'éprouvette contenant 0,2 ml de plasma qui avait été équilibré à 370C, l'addition étant effectuée dans des conditions permettant d'assurer un bon mélange. Essentiellement en même temps, l'éprouvette contenant le plasma fut enlevée du bain et une horloge d'arrêt fut mise en marche. Le temps de coagulation fut alors enregistré. Pour s'assurer que les essais faits sur des échantillons de sérum qui avaient été héparinisés in vitro avaient une signification par rapport aux échantillons de sang pris d'un patient héparinisé, les résultats d'essai sur de tels échantillons d'un patient héparinisé furent comparés avec les concentrations d'héparine auxquelles on peut s'attendre dans le sang en circulation du patient, sur la base de la quantité d'héparine ajoutée et de la quantité de sérum calculée sur la base du poids corporel.On suppose généralement que le volume total du sérum en millilitresconstitue 5% du poids du corps en grammes.En conséquence, la crête initiale théorique de la concentration en héparine dans le sérum peut être calculée selon l'équation Concentration d'héparine dans le sérum (u/ml)= Dose d'héParine enu Poids corporel en grammeex 0,05 En réalité, des essais ont montré que la concentration en héparine dans le sang reste constante pendant une période de l'ordre d'une demi-heure après injection. Des essais sur le sérum de patients héparinisés sont bien en correlation avec les résultats obtenus en étudiant le sérum qui avait été héparinisé in vitro. On notera que le sérum prélevé d'un patient est stable pendant environ 8 heures à la température ambiante, donc des essais de détermination d'héparine dbIrst et e effectués pendant cette période. Pour établir l'utilité de l'essai selon la présente invention, on effectua également l'essai APTT0 Le plasma pour cet essai fut préparé à partir de sang citré (une partie de citrate trisodique à 3,8% pour 9 parties de sang). Le plasma fut défibriné en chauffant pendant 5 minutes à 56oC. L'essai fut effectué selon le processus de Spector et Cornu Les résultats des essais APTT et les résultats selon la présente invention, indiqués par AA, sont indiqués au Tableau lo TABLEAU I Changements in vitro produits par l'héparine dans le sérum de sujets normaux. Nombre d'échan- Héparine APTT AA Ecart stan- Antithrombine III tillons Unités/ml (secondes) (secondes) dard de AA (%) 5 0,5 118 17 (87-147) (17-18)* 0,2 94 1,0 250+ 23 (271- > 300) (21-24) 1,2 P.C. 1,5 > 300 31 2,3 P.C. (29-34) 2,0 > 300 41 3,1 P.C. (38-45) 2,5 > 300 61 (57-68) 4,6 P.C. 3,0 > 300 84 (77-84) 5,9 P.C. 3,5 > 300 117 (112-127) 7,3 P.C. 4,0 > 300 169 (151-182) 9,6 P.C. * Etendues entre parenthèses. P.C : Pas de changement. La concentration en antithrombine III fut mesurée dans chaque échantillon par la méthode de détermination d'immunité selon Fagerhof et Abildgaard. La figure 1 montre les résultats expérimentaux obtenus avec les échantillons de sérum héparinisés in vitro, la concentration en héparine en u/ml étant représentée en fonction du logarithme du temps de coagulation en secondes. De façon surprenante, il y a une relation linéaire entre le logarithme du temps de coagulation et la concentration en héparine sur une étendue de O à 4,0 unités par mlO On a considéré les facteurs pouvant interférer avec les résultats du temps de coagulation qui sont considérés comme étant une mesure de la concentration en antithrombine0 Un facteur que l'on a déjà noté est le temps d'échantillonnage par rapport au dosage d'héparine. La détermination d'antithrombine suit de très près la courbe de déclin exponentiel de l'héparine après un plateau qui dure pendant 30-45 minutes après injection d'héparine. En conséquence, en calibrant le processus, il est nécessaire que des échantillons de sang ne soient pas prélevés plus tard que 30 minutes après injection de l'héparine.Le second facteur est la présence de produits de dégradation de la fibrine anticoagulante (FDP) X et Y dans le sang. C'est pour cette raison que la période d'incubation est maintenue à un temps court, c'est-à-dire 2 minutes, contrairement au processus donné dans le brevet ci-dessus noté qui spécifie une période d'incubation de 15 minutes à 370C. Cependant, le processus dans ce brevet est plus particulièrement dirigéversladétermination de la concentration en produits de dégradation de la fibrine dans le sang0 La période d'incubation de 2 minutes selon la présente invention sert simplement à amener l'échantillon à la température en vue de la réaction avec le plasma, car il nty a pas ou peu de réaction avec les FDP pendant la période de 2 minutes0 Les fragments D et E ne réagissent pas avec la thrombine, mais bien qu'ils puissent géner la polymérisation de la fibrine, leur effet sur la détermination de la présente invention est négligeable. Le demandeur a trouvé que des patients ayant des troubles thromboemboliques avaient des déterminations particulièrement faibles, ce qui élimine le souci concernant l'interférence des fragments X et Y dans les déterminations de l'héparine chez ces patients, car ces fragments rallongent le temps de coagulation. Les avantages majeurs de la détermination d'antithrombine ou de 11 essai AA selon la présente invention par rapport à l'essai APTT sont de deux sortes. Le premier avantage est que la relation entre l'essai AA et la concentration en héparine reste linéaire au moins jusqu'à 4 unités d'héparine par millilitre. Par ailleurs,-la concentration en héparine peut être exprimée en terme d'unité d'héparine par millilitre du sérum ou du plasma, plutôt qu'en temps imprécis de coagulation. Le second avantage est que des différences des temps de coagulation peuvent être déterminées jusqu'à des niveaux pouvant atteindre 4,0 u/ml dans le présent essai tandis que par l'essai APTT, les résultats, comme on peut le voir sur le Tableau I, doivent être exprimés sur 300 secondes. En d'autres termes, l'essai APTT se dissocie une fois que la concentration en héparine a atteint un niveau de 1,5 u/ml. Selon Pitney, l'activité de l'antithrombine est la base de effet anticoagulant de l'héparine. La participation d'un complexe héparine-antithrombine III (co-facteur de Irhéparine) dans l'action anticoagulante de l'héparine est bien documentée. Rosenberg a montré récemment que l'inhibition de la thrombine par l'antithrombine III était en rapport avec la formation dtune forte liaison covalente avec le résidu de la sérine en site actif sur la chaîne de sous-unité de la thrombine par l'antithrombine. Il montre de plus que l'addition de l'héparine à ce mélange réactionnel thrombine-antithrombine accelère "dramatiquement" le taux d'interaction.D'une façon analogue, il est probable que l'héparine-antithrombine inhibera d'autres protéases de la sérine, comprenant la plasmine et les facteurs activés XI, IX et Xg A la lumière des observations de Rosenberg, il est important de considérer la quantité d'héparine mélangée à l'antithrombine III en tout moment donné0 A partir des résultats donnés au Tableau I, il est évident que les sujets héparinisés avec des augmentations marquées de la concentration en héparine ne montrent pas d'augmentations de l'antithrombine III. L'effet de l'héparine augmentée, par conséquent, peut être attribuée à la composante d'héparine du complexeképarineantithrombine III. En conséquence, il semble que, dans des individus héparinisés, AA soit une mesure quantitative des molécules d'héparine liées à l'antithrombine III. Les APTT sont des indicateurs sensibles de faibles quantités d'héparine en circulation, mais selon Marder, les doses thérapeutiques d'héparine dépassent en général les limites mesurables de l'essai. Cette conclusion est étayée par les résultats présentés au Tableau I. Dans la modification de Marder du APTT, le plasma est dilué pour réduire la concentration en héparine à une étendue mesurable. Au contraire, quand on utilise l'essai selon la présente invention, c'està-dire AA, on peut employer le sérum non dilué et, de plus, il y a une relation linéaire entre le logarithme du temps de coagulation de l'antithrombîne et la concentration en héparine de O à 4,0 unités par millilitre. Il faut remarquer que les concentrations des divers réactifs utilisés ainsi que la température et les temps d'incubation peuvent être modifiés sur des étendues sensibles, si on le souhaite. Il est seulement nécessaire de déterminer les temps de coagulation par la méthode de l'héparinisation in vitro comme on l'a noté ci-dessus. Cette détermination est bien dans la capacité de ceux qui sont compétents en la matière. La température de 370C est spécifiée pour l'incubation du fait que la plupart des laboratoires biologiques effectuent les processus à cette température, et en conséquence disposent d'un tel bain. En bref, la présente invention ne doit pas être limitée par les concentrations spécifiques, la température et les temps spécifiés. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée au mode de réalisation décrit et représenté qui n'a été donné qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits, ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre des revendications qui suivent, REVENT)ICATI0NS 1. Procédé pour déterminer la concentration en héparine dans le sang, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes d'équilibrer un plasma humain normal à une température choisie, d'ajouter un sérum dérivé par des moyens classiques dudit sang, à une solution de thrombine standardisée et d'incuber le mélange thrombine-sérum résultant à une température choisie et pendant une période choisie, trop rapide pour une réaction sensible entre la thrombine et tous produits de dégradation de la fibrine dans ledit sérum, d'ajouter une partie standard dudit mélange thrombine-sérum incubé audit plasma dans des conditions telles que cela produise un mélange thrombinesérum-plasma essentiellement uniforme, et d'observer son temps de coagulation. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend de plus l'étape d'ajouter des quantités différentes d'héparine à des échantillons de sérum pris d'individus en bonne santé avant d'ajouter ledit sérum à la solution de thrombine, pour déterminer ainsi les temps de coagulation en fonction de la teneur en héparine dans le sérum, et permettre ainsi de spécifier la teneur en héparine dans le sang d'un patient en mesurant le temps de coagulation du sérum pris dans ce sang de ce patient0 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la température d'équilibrage du plasma et d'incubation du mélange thrombine-sérum est de 370C. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution de thrombine précitée est préparée en reconstituant de la thrombine solide et en la diluant jusqu'à ce que 0,1 ml de la solution de thrombine diluée, en mélange avec 0,2 ml de plasma normal frais à 370C ait un temps de coagulation de 12 secondes. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le sérum précité est préparé par une coagulation et une centrifugation normalessuiviesd'une incubation à 370C pendant une demi-heure0 6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le temps d'incubation du mélange thrombine-sérum précité est de 2 minutes.