Brevet FR2398304A1 — publié le 19790216

L'invention est relative a un procédé de dosage de cellules somatiques (leucocytes et cellules épithéliales,) dans le lait, à l'aide drune simple détermination du triphosphate d'adénosine dans des cellules somatiques, a l'aide de la bio-luminescence (ver luisant). Pour les vétérinaires, dans l'élevage d'animaux et l'industrie laitière, la détection de mastite (affection bactérienne des mamelles) chez les vaches est d'une grande importance pour le bien-etre de ces animaux, et réduit les pertes, de nature économique, dues à la production diminuée du lait, ainsi que pour la protection de la population humaine contre le transfert de bactéries pathogènes provenant du lait. On recherche la mastite en mesurant la quantité de cellules somatiques.Les vaches saines ont normalement un nombre de cellules somatiques inférieur à 150.000 par ml, avec quelques variations dues à l'état de santé de l'animal. A l'état du stade chronique et latent, les cellules somatiques excèdent 500.000 par ml, et, dans le cas de mastite aigu$. le nombre s'élève a plusieurs millions par ml. Les procédés conventionnels pour déterminer le nombre de cellules somatiques dans le lait sont basés sur les principes suivants 1 - comptage microscopique direct 2 - précipitation de DNA (acide lésoxyribonuclélque) par des agents chimiques, tels que les détergents du test dit "California Mastitis Test" (CMT) 3 - comptage des cellules dans un appareil électronique, ou bien avec un ap pareil à fluorescence. Tous ces procédés ont certains inconvénients : le comptage direct par microscope est lent et trop laborieux lorsqu'il s'agit d'examiner un nombre élevé d'échantillons dans une grande laiterie moderne ; le CMT, et d'autres procédés par précipitation, ont un caractère subjectif et sont difficiles à auto - matiser; les appareils de comptage électroniques -sont coûteux et peuvent don. ner des résultats erronés, dûs à la présence de globules de matières grasses dans le lait, et les appareils de comptage par fluorescence sont trop couteaux pour les laiteries de petite et moyenne taille et pour les laboratoires. La présente invention a pour but de pourvoir à un procédé simple, rapide, précis et économique, pour le dosage de cellules somatiques dans le lait cru, qui est facile à automatiser et peut etre utilisé sur le terrain et dans les fermes, ainsi que pour les mesures dans les laboratoires et les laiteries, L'invention a également pour but de proposer un appareil automatique pour la détermination de cellules somatiques dans le lait. La mesure est basée sur la méthode bien. connue de la bio-luminescence (ver luisant) du triphosphate d'adénosine (ATP) provenant des cellules (voir également le brevet américain n 3 745 090). Selon la présente invention, on utilise la méthode de bio-luminescence pour le dosage sélectif de cellules somatiques dans le lait cru Pour le dosage, on dispose, avec une pipette, 10 à 100 l, de préférence 20 ou 50 l, de lait cru (conservé à une température entre 0 et 5 C, pendant une période inférieure à 36 heures), dans une fiole. On ajoute 10 à 500 l, de préférence 50 ou 100 l, du réactif pour libérer des nucléotides dans les cellules somatiques (NRS : Nucleoide Releasing Reagent for Somatic Cells, marque déposée de la Société Lumac System AG, Bâle, cf. demande de brevet français n 78 16 183 ), et on agite.On place la fiole dans un photomètre par luminescence, et on ajoute 10 à 1000 l, de préférence 100 l, de réactif luciferine-luciférase (ver luisant) se trouvant dans une solution tampon ayant un pH entre 7,0 et 8,2, de préférence 7,75, et on mesure l'intensité lumineuse produite par l'échantillon. La concentration de I'ATP, ou le nombre des cellules somatiques, est ensuite calculé, par conversion de la lecture du résultat en une valeur standardisée. Selon une variante, on introduit un échantillon de lait de 20 à 100 l dans une cuvette contenant 100 à 500 l dans un mélange luciférine-luciférase dans un tampon ayant un pH entre 7,0 et 8,2, mais de préférence de 7,75, et de 0 ,1 % de réactif NRS. Après avoir mélangé l'échantillon et le réactif, le mélange est pret pour be dosage. Selon le procédé de l'invention, hT3P est sélectivement libéré des cellules somatiques, ce qui est naturellement important, car le lait cru peut contenir en grande quantité la faune bactérielle normale du lait, et, dans le cas où de l'ATP est libéré à partir des bactéries, le comptage des cellules somatoques par la méthode de bio-luminescence comportera des erreurs. Dans le brevet americain nb 3745 090 sont décrits d'autres procédés pour l'extraction de l'ATP, mais ceux-ci sont perturbés par la réaction avec la luciférineluciférase, et sont en outre laborieux et difficiles à automatiser. L'SsTP mesure selon le présent procédé correspond aux valeurs obtenues avec un compteur électronique de particules, avec un coefficient de conversion de 0,93 à 0,97. Les coefficients de conversion par rapport au CMT et au compteur par fluorescence sont également compris entre 0,9 et 1.0. (voir Figure 1). Le dosage des cellules somatiques selon la présente invention, et à l'aide d'un photomètre par luminescence manuel,nécessite de 20 à 40 sec. par échantillon, ce qui montre que ce procédé permet une vitesse de mesure élevée. Avec un instrument de mesure automatique, on peut traiter, par heure, un nombre d'échantillons compris entre 200 et 500. Un autre avantage de ce procédé est le fait qu'il peut être effectué à la ferme, avec un appareil portatif, par le personnel de la ferme, par les conducteurs des camions pour le ramassage du lait, par les vétérinaires, ou par d'autres personnes directement liées aux questions dthygiène du lait et de la santé des vaches. Le dosage'est tellement simple que n'importe qui peut 11effectuer et interpréter les résultats obtenus. L'appareillage pour effectuer le dosage peut fonctionner avec une grande variété de systèmes luminescents, tels que le dosage par luminescence de peroxyde (H2O2), ou de superoxydes O2 avec le luminol (hydrazide 3-aminophtalique), de mononucléotide de flavine (FMN), ou de dinucléotide de nicotinamide adénine, ou son phosphate sous forme réduite (NADH ou NADPH), par bio-luminescence de photobactéries, etc., par bio-luminescence, mais de préférence avec la mesure de llATP par bio-luminescence au moyen de luciférine-luciférase (ver luisant), tels que le dosage du nombre de cellules somatiques dans le lait cru par l'intermédiaire du taux d'ATP dans les échantillons, ou par la détermination de la teneur en autres organismes au moyen de la concentration de I'ATP dans les échantillons. A titre d'exemple, on donne ci-après la description de la mise en oeuvre de l'appareil pour le dosage de cellules somatiques dans du lait cru à l'aide de reactitspéciaux, qui produisent un signal lumineux durable facile à enregistrer, On prépare un réactif à base de luciférine-luciférase à partir de 0,005 à 0,02 mole d'un sel de Mg , dans un tampon biochimique d'un pH compris entre 7,0 et 8,2, tel que le tris ou la glycylglycine, mais de préfé - rence on utilise le LUMIT (marque déposée de la Société Lumac Systems AG), contenant, dans un tampon dit "Hepes", 0,01 mole de sulfate de magnésium, 0.001 de l'agent chélatant Versénol, et on met 0,05 à 1,0 ml, de préférence de 0,1 à 0,5 ml, de ce réactif dans une cuvette transparente. On place avec une pipette 10 à 100 1, de préférence 50 1, de lait cru dans la-cuvette contenant le réactif ci-dessus décrit, et on mélange pendant 10 à 15 sec. On place la ivette dans la chambre de réaction du photomètre par luminescence, et on place le capuchon sur la chambre de réaction. On ramène le courant dans l'obscurité à zéro, avec un potentiomètre on baisse le capuchon, et on lit la valeur indiquée par le voltmètre lorsqu'elle est à son maximum. On convertit la valeur Iue en le paramètre désiré, par comparaison de cette valeur avec un standard connu, ou bien l'instrument est calibré avant la mesure avec un standard connu, afin que les résultats soient donnés directement en nombre de cellules somatiques par mi. La présente invention a également pour objet un photomètre simple et peu couteux, qui convient pour la mesure de réactions luminescentes sur le terrain, par exemple pour la mesure de cellules somatiques dans le lait. Ce photomètre, cependant, peut également etre utilisé pour mesurer l'activité des boues activées dans les installations pour le traitement des eaux résiduaires, de la masse biologique des organismes aquatiques, de la masse biologique de microbes du sol, et pour d'autres mesures basées sur la réaction biolumines noir cente (ver luisant), de l'ATP, on/d'autres réactions luminescentes dont la durée est suffisante, ctest-à-dire supérieure à quelques secondes, pour permettre une lecture visuelle, la mesure de la lumière produite par des réactions luminescentes, telles que celles dans le système bio-luminescent à base de hlciférine-lucHérase pour le dosage quantitatif de l'ATP, est effectnée avec un photomètre ou avec des compteurs de photons. Dans les photomètres, la mesure de l'intensité lumineuse se fait avec un détecteur tel qu'un tube de photomultiplication ou une cellule photosensible, telle que la diode au silicium ou à l'arséniure de gallium. Ces détecteurs transforment l'énergie lumineuse en un courant électrique, qui est rendu visible par un voltmètre à aiguille ou digital, un enregistreur à rouleau ou un oscilloscope. Dans les compteurs de photons, on trouve comme détecteur un photomultiplicateur, et ces appareils enregistrent l'intensité lumi neuse sous forme d'impulsions électriques hautement amplifiées (104 - 109 fois), qui sont produites chaque fois par un photon qui frappe la cathode photosensible. Le photomètre selon l'invention est représenté, à titre d'exemple, dans les Figures du dessin joint. Dans ce dessin - la Figure 1 montre un diagramme schématique du circuit électrique du photomètre par luminescence portatif - la Figure 2 représente schématiquement les composants méc-aniques du photomètre lorsqu'il est adapté pour le dosage de cellules somatiques dans le lait. Le schéma de la Figure 1 montre la photodiode à silicium I qui convertit l'intensité lumineuse émise par l'échantillon 2,dans une cuvette 3, en un courant électrique amplifié par le préamplificateur 4, et enregistré par un voltmètre à aiguille 5 sous forme d'un signal continu. La Figure 2 montre la construction du photomètre portatif. L'échantillon 2 se trouve dans une cuvette transparente 3, placée dans la chambre de réaction 6 qui est étanche à la lumière, cette étanchéité étant obtenue à l'aide d'un joint circulaire 7 et d'un capuchon 8, ce dernier comportant un tampon 9 qui sert à abaisser la cuvette 3, de telle manière que le repoussoir 10,. qui-forme un joint étanche à la lumière avec l'anneau circulaire 11 lorsque la chambre est vide, est repoussé vers le bas afin de placer l'échantillon 2 devant le détecteur à la diode au silicium, pour la mesure de l'intensité lumineuse émise par l'échantillon en présence de réactifs par bioluminescence (ver luisant). Un bouchon fileté 12 forme le fond de la chambre de réaction.Le courant électrique venant de la diode 1 est amplifié dans le préamplificateur 4 et le circuit de mesure 13, et est rendu visible par un voltmètre à aiguille 5. Avant d'effectuer la mesure, on met le circuit sous tension avec le contacteur 15, on ramène l'aiguille à zéro avec le potentiomètre 16, et on place l'échantillon dans une cuvette se trouvant dans la chambre de réaction. Après l'abaissement du capuchon 9, le voltmètre 5 montre l'intensité lumineuse sous forme d'un signal continu (intensité de la lumière incidente à un moment donné). II est possible de calibrer l'appareil afin de lire directement le nombre de cellules ou la concentration de l'ATP,ou d'un quelconque autre substrat utilisé dans les systèmes luminescents, par la mesure d'un échantillon standard connu, et en ajustant la lecture du voltmètre afin de la ramener au paramètre mesuré, avec le potentiomètre 17, qui règle le degré d'amplification. REVENDICAT IONS 1- Procédé pour le dosage de cellules somatiques dans le lait, caractérisé en ce que l'on effectue le dosage à l'aide de la réaction entre la luciférineluciférase et le triphosphate d'adénosine (ATP) dans l'échantillon. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on traite l'échantillon de lait avec un agent tensio-actif non ionique afin de libérer l'ATP, de façon sélective, des cellules somatiques. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on mesure la concentration de l'ATP à l'aide d'un photomètre par luminescence après l'addition du réactif luciférine-luciférase (ver luisant) dans un tampon dont le pH est compris entre 7,4 et 8,0,et ayant une concentration en magnésium comprise entre 0,005 et 0,02 mole par litre. 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on convertit la concentration de 1'ATP en le nombre de cellules somatiques par ml, par l'application d'un facteur de conversion obtenu par la mesure d'un échantillon standard. 5 - Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce que l'on mesure les nombres de cellules somatiques sur le terrain, avec un photomètre portatif, et par l'intermédiaire de la concentration de l'ATP dans l'échantillon de lait.