Brevet FR2401170A1 — publié le 19790323

la présente invention, due à NIELSEN Tage Ejaer, CARÂSIX William, ZITTAN née JENSEN Lena Elisabeth, GIBSON Keith, se rapporte à une composition de glucose-isomérase contenant du fer et plus particulièrement à une composition de glucose-isomérase à l'état de particules et contenant au moins 0,050% en poids de fer qu'on a incorporé à l'état de sel de fer. Les applications industrielles de l'enzyme glucoseisomérase se heurtent à une difficulté fondamentale : il semble que l'enzyme nécessite la présence d'ions cobalt dans le sirop ; or le cobalt est généralement considéré comme une substance toxique et par conséquent, la teneur en cobalt du sirop d'isomérisation produit doit être abaissée à un niveau de quelques parties par trillion, par exemple en soumettant le sirop d'isomérisation à échange d'ions. Jusqu'à maintenant, la méthode exploitée par la demanderesse consistait à régler les conditions opératoires de manière que ltactivation de l'enzyme n'exige pas la présence d'ions cobalt dans le sirop d'alimentation. On pourra trouver la description d'un exemple d'application de cette méthode dans le brevet des Etats-Unis nO 4 025 389. Récemment, on a pu constater que le fer était capable d'activer-les enzymes du type glucose-isomérase. On a proposé d'introduire des petites quantités d'un sel de fer dans le sirop d'alimentation afin d'activer l'enzyme. Cependant on notera que, habituellement, les sirops contiennent souvent des petites quantités de fer à l'état soluble. Néanmoins, l'introduction de sels de fer solubles dans le courant d'alimentation du sirop de glucose est plus facile à proposer qu'à pratiquer. D'une part, l'opérateur, à l'atelier d'isomérisation du glucose, doit avoir un certain niveau de connaissances chimiques et d'autre part l'installation elle-m8me est compliquée. Le sel de fer doit être introduit en quantités dosées dans le sirop de glucose. Il faut procéder périodiquement à un dosage du fer dans le sirop de glucose qui pénètre dans le réacteur d'isomérisation, ne service que pour vérifier le bon fonctionnement des dispositifs de dosage. En second lieu, comme la capacité de fixation du fer par l'enzyme est négligeable ou, au maximum, limitée, il y a beaucoup de chances pour qu'on atteigne le point de saturation au cours d'une opération d'isomérisation de longue durée.De toute manière, à un certain moment au cours des opérations, il y aura passage du fer dans le courant de produit. La présence de fer dans le produit peut conduire à l'apparition de colorations parasitaires qu'il faudra supprimer, par exemple par échange d'ions, ce qui ajoute au prix de revient de la purification. Au total, l'addition de sels de fer au sirop de glucose constitue une source d'ennuis. La demanderesse a cherché à mettre au point un produit enzymatique contenant du fer, car cette solution est en général plus avantageuse, en particulier si le fer est retenu pendant toute la durée de service du produit enzymatique et fixé suffisamment solidement pour qu'il ne se produise pratiquement pas de libération du fer au cours de l'utilisation de l'enzyme. D'autres buts et avantages de l'invention apparaitront à la lecture de la description ci-après. Dans un premier aspect, l'invention concerne un procédé pour activer une glucose-isomérase sous forme de masse cellulaire, procédé qui se caractérise en ce que l'on incorpore dans cette masse au moins OJO5X en poids (sur matières sèches) de fer à l'état de sel de fer hydrosoluble non toxique. Le produit sous forme de masse cellulaire est ensuite mis à l'état de particules et séché, et l'on obtient ainsi un produit enzymatique qui est commercialisable et prêt au trempage0 Dans un second aspect, l'invention concerne un procédé pour activer une glucose-isomérase à l'état de masse cellulaire, ce procédé se caractérisant en ce que l'on incorpore à cette masse au moins 0,05 en poids (sur matières sèches) d'un sel de fer hydrosoluble solide non toxique.La masse cellulaire est ensuite mise sous la forme de particules et séchée, et l'on obtient un produit enzymatique commercialisable et prêt au trempage. Dans un troisième aspect, l'invention concerne un procédé pour activer une glucose-isomérase sous forme de masse cellulaire telle que décrite dans le brevet britannique nO 1 516 704 et/ou le brevet des Etats-Unis nO 3 980 521, dont l'objet tel que défini dans la revendication la plus large est respectivement " procédé de production d'un produit glucose-isomérase insoluble dans l'eau enzymatiquement actif et stable physiquement à à partir de cellules de microorganismes présentant une activité glucose-isomérase, procédé qui comprend la réaction d'un " concentré cellulaire de cellules de microorganismes au moins partiellement rompues, concentré qui contient de O à 75% de cellules intactes et une teneur en matière sèche de 3 à 30 en " poids par volume, avec de 0,01 à 1 partie en poids de glutaral déhyde par partie en poids de matière sèche du concentré, formant ainsi un produit solide cohérent, l'élimination de l'eau " et la mise en forme du produit glucose-isomérase. et " procédé de production d'un produit glucose-isomérase- insoluble dans l'eau enzymatiquement actif et physiquement stable à " partir de cellules de microorganismes présentant une activité glucose-isomérase, procédé qui comprend : a) la concentration et lthomogénéisation des cellules de microorganismes en un "-concentrat contenant des cellules rompues et une teneur en " matière sèche de 3 à 30 en poids par volume ; b) la réaction de " ce concentrat de cellules avec 0,01 à 1 partie en poids de glutaraldéhyde par partie de matière sèche pour former un produit solide cohérent et c) l'élimination de l'eau et le traitement de ce produit cohérent de façon a le présenter sous forme divisée, ce procédé se caractérisant en ce que l'on incorpore à ladite masse au moins 0,05% en poids (sur matières sèches) de fer à l'état de sel de fer hydrosoluble non toxique. La masse cellulaire est ensuite mise sous la forme de particules et séchée, et l'on obtient un produit enzymatique commercialisable et prêt au trempage. Dans un quatrième aspect, l'invention concerne un procédé pour activer une glucose-isomérase sous forme de masse cellulaire telle que décrite dans le brevet britannique nO 1 516 704 et/ou le brevet des Etats-Unis no 3 980 521 précités, ce procédé se caractérisant en ce que lion incorpore à ladite masse au moins 0,05% en poids (sur matières sèches) de fer à l'état de sel de fer hydrosoluble solide non toxique. La masse cellulaire est ensuite mise sous la forme de particules et séchée, et lton obtient ainsi un produit enzymatique commercialisable et prêt au trempage. L'invention comprend également, à-titre de produit industriel nouveau, une glucose-isomérase sous forme de masse cellulaire, activée par du fer, et à ltëtat de particules séchées, à laquelle on a incorporé au moins 0,05% en poids de fer à l'état de sel de fer hydrosoluble non toxique. De préférence, la masse cellulaire est telle que décrite dans le brevet britannique nO 1 516 704 et/ou le brevet des Etats-Unis nO 3 980 521 précités. Ainsi donc, l'invention permet de -parvenir à un produit en particules prêt à être introduit dans une solution de sucre avant l'utilisation pour l'isomérisation. Dans la pratique, l'utilisation du fer en tant que métal activant dans des produits contenant de la glucose-isomérase constitue un progrès technique important parce que le fer, en petites quantités, est reconnu comme non toxique. Naturellement, le sel de fer introduit peut être de qualité alimentaire. On ne craint donc plus de laisser des substances toxiques dans le sirop produit. Une proportion de quelques parties par million de-fer dans le produit est tolérable. La glucose-isomérase est une enzyme intracellulaire--qu'il n'est pas nécessaire d'isoler des cellules de microorganismes pour obtenir un produit enzymatique actif (cf. par exemple brevet des Etats-Unis no 3 821 086, 3 779 869 et 3 980 521). Tous les produits de ce type décrits antérieurement utilisent la cellule de microorganisme, entière ou éclatée, comme base du produit contenant la glucose-isomérase.Dans toute la présente demande, les expressions "sous la forme de masse cellulaire", "produit à l'état de masse cellulaire" et "sous la forme de particules de masse cellulaire" sont utilisées pour désigner des formes, des produits et des particules obtenus, formés ou préparés de toute autre manière à partir de la substance des cellules de microorganismes, et de réactifs organiques, par exemple l'aldéhyde glutarique, des protéines ou des agents agglomérants, par exemple des polyélectroly- tes. La proportion de glucose-isomérase contenue, en poids, dans un produit à l'étant de masse cellulaire représente normalement une très petite fraction du poids total du produit. La demanderesse a découvert que des produits contenant de la glucose-isomérase sous forme de masse cellulaire pouvaient fixer des proportions appréciables de fer et elle a constaté qu'en outre, au cours d'un contact prolongé avec des sirops de glucose ou de glucose-fructose, les pertes de fer étaient relativement minimes. La quantité de fer qu'on peut incorporer dans les produits sous forme de masse cellulaire dépassent de loin les quantités nécessaires pour activer la glucose-isomérase. On peut en particulier incorporer des sels hydrosolubles non toxiques de fer à l'état solide par mélange avec le produit à l'état de masse cellulaire au cours de la formation de ce dernier, par exemple juste avant ltextrusion sous forme de particules. Les sels peuvent également être introduits, dans des circonstances appropriées, sous forme de solutions aqueuses concentrées. Le produit selon l'invention est donc un produit enzymatique sec sous forme de masse cellulaire contenant un sel de fer hydrosoluble non toxique qu'on a incorporé en quantité correspondant à au moins o,os% en poids et en général de 0,05 à 2,0% en poids de fer par rapport au poids du produit. Naturellement, on pourrait incorporer le fer en quantité supérieure à 2,0 en poids mais on n'en tirerait aucun avantage. La teneur préférée en fer se situe dans l'intervalle de 0,2 à 0,5 et plus spécialement d'environ 0,2 à 0,25% en poids. Dans tous les cas, lorsqu'on a incorporé le fer dans le produit sous forme de masse cellulaire en quantité de 0,05 à 2,0 en poids sur-matières sèches1 les quantités de fer libérées dans le sirop pendant la durée de service du produit pour l'isomérisation du glucose sont très faibles, sinon nulles, En fait même, le produit enzymatique contenant du fer peut absorber du fer provenant du sirop. Ainsi par exemple, un sirop pénétrant dans le réacteur d'isomérisation à une teneur en fer de 4 ppm peut fort bien quitter le réacteur d'isomérisation à une teneur en fer inférieure à 1 ppm. Dans la pratique, on a constaté qu'on pouvait encore améliorer la productivité et/ou la stabilité de la glucoseisomérase en mélangeant d'autres composants solides au produit enzymatique. En particulier, la chute de pH initiale qui se produit dans la période de 1 à 2 jours après chargement d'une colonne par de enzyme franche a provoqué certains ennuis. Une diminution du pH dans la colonne est-gênante parce qu' elle consuit à une rétraction du lit d'enzyme, laquelle peut être à l'origine de formation de canaux préférentiels. En outre, on peut constater une diminution de l'activité et, dans les cas les plus graves, une moins bonne stabilité du produit enzymatique. On a pu constater que l'incorporation dans le produit à 11 état de masse cellulaire de 0,5 à 3,0* en poids de magnésie, par rapport au poids sec de glucose-isomérase, remédiait dans une mesure importante à la chute initiale de pit, conduisant à des valeurs de pH relativement stables dans le sirop sortant de la colonne.En outre, le mélange au produit sous forme de masse cellulaire de glucose solide (par exemple de glucose monohydraté), servant principalement de diluant auxiliaire, en quantité de 2 e 15% en poids (sur matières sèches) s'est souvent avéré avantageux. Les particules de glucose-isomérase qu'on préfère dans l'invention sont les produits cellulaires homogénéisés qu'on a fait réagir avec l'aldéhyde glutarique, tels que décrits dans le brevet britannique nO 1 516 704 et/ou le brevet des Etats-Unis nO 3 980 521 précités. Dans le mode de réalisation préféré, le sel de fer hydrosoluble est mélangé avec la magnésie et le glucose, et le mélange est ajouté à la masse cellulaire avant l'opération d'extrusion qui donne les granulés finals. Bien que, dans la pratique de l'invention, on puisse incorporer dans le produit enzymatique sous forme de masse cellulaire un sel de fer quelconque hydrosoluble non toxique, on préfère certains sels de fer, et notamment les suivants sulfate ferrique sulfate ferreux chlorure ferrique lactate ferreux citrate ferrique citrate ferreux citrate ferrique ammoniacal acétate ferreux nitrate ferrique pyrophosphate ferrique. Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée ; dans ces exemples, les indications de parties et de pourcentages s'entendent en poids sauf mention contraire. D'autre part, dans ces exemples, on a fait usage de la terminologie ci-après Définition de l'activité L'unité d'activité est définie comme la quantité d'enzyme formant du fructose à une vitesse initiale de 1 micromole de fructose par minute pour un ensemble déterminé de conditions d'isomérisation. Mesure de l'activité L'activité est déterminée dans les conditions ci-après Sirop 40 en poids de dextrose dissous pH à l'entrée 8,5 Mg++ 0,004 M Température 650C Diamètre de la colonne 2,5 cm Hauteur de la colonne 35 cm Direction de l'écoulement - vers le bas L'activité est exprimée en unités IGIC par gramme. Dans des isomérisations de longue durée, les courbes de dégradation de l'activité sont conformes à des modèles de dégradation exponentiels de la forme Act = Ao x e -bxt Dans l'équation ci-dessus, t est le nombre d'heures après démarrage de l'isomérisation, Act est l'activité au temps t Âo est l'activité au temps t = O et b est la constante de dégradation en hr 1. A partir de cette équation, on définit la période T In 2 1/2 b exprimée en heures. Productivité La productivité est définie comme la quantité en kilogrammes de dextrose d.s. convertie en un mélange de 45% de fructose et 55% de glucose par kilogramme d'enzyme après une durée d'isomérisation déterminée. Dans les exemples qui suivent, la productivité est calculée à l'aide d'une équation de la forme ci-dessus après une durée d'isomérisation de 2 x Tî/2 Fer La teneur en fer est déterminée par la méthode à l'o-phénanthroline (Nordisk Metodik Somite for Levnedsmidler Nr. 22, 1955 U.D.C. 664.7 : 546.72). Coloration La coloration est déterminée par la méthode CIRF Stabilité de couleur La stabilité de couleur est déterminée après 1 heure de chauffage à 1000C et à pH 4,2 (ClEF). La magnésie utilisée est la magnésie lourde ERtB de la firme Pharmelko, Milan, Italie. EXEMPLE 1.- Addition de citrate ferrique, de lactate ferreux et de sulfate ferrique conjointement avec la magnésie et le dextrose. Addition d'oxyde ferrique, On prépare un gâteau de filtration comme décrit dans l'exemple V du brevet des Etats-Unis n 7 980 521 On met ce gâteau à l'état granuleux à l'aide d'un granulateur oscillant équipé d'une grille à orifice de 1 cm. Le produit granuleux grossier contient environ 76% d'humidité (mesure par séchage à 105oC). On le divise en 6 lots +)A. On extrude 8,5 kg du gâteau de filtration mis à l'état de produit granuleux grossier dans une extrudeuse axiale équipée d'une grille à orifices de 0,8 mm de. diamètre. Le produit extrudé est séché en lit fluidisé avec de l'air à 60-650C jusqu'à une teneur en humidité, d'environ 10%. B. A 8,5 kg du gâteau de filtration mis à l'état de produit granuleux grossier on ajoute un mélange de 20 g de magnésie, 85 g de dextrose monohydraté et 40 g de citrate ferrique à 160 de fer. Après mélange soigné, on extrude et on sèche comme décrit sous A. C. On mélange 8,5kg du produit granuleux grossier avec un mélange de 20 g de magnésie, 85 g de dextrose monohydraté et 40 g de lactate ferreux à environ 19% de fer. Après mélange soignés on extrude et on sèche comme décrit sous A. D. On mélange 8,5 kg du produit granuleux grossier avec un mélange de 20 g de magnésie, 85 g de dextrose monohydraté et 30 g de sulfate ferrique à environ 20% de fer. Après mélange soigné, on extrude et on sèche comme décrit sous A. + > E. On mélange avec soin 8,5 kg du produit granuleux grossier avec un mélange de 20 g de magnésie et 85 g de dextrose monohydraté. On extrude le mélange et on sèche comme décrit sous A. +)F. On mélange avec soin 8,5 kg du produit granuleux grossier avec 25 g d'oxyde ferrique à environ 53% de fer. On extrude le mélange et on le sèche comme décrit sous A. (Nota : +) : exemple comparatif.) Les produits obtenus sont tamisés et on recueille la fraction à une dimension de particule de 0,35 mm à 1,0 mm qu'on analyse. Le pH est mesuré dans le courant de sortie du sirop sur des échantillons prélevés respectivement au bout de 20 h et 43 h. Avant la mesure du pH, les échantillons sont refroidis à 250C. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau I ci-après TABlEAU I Activité pH du sirop sortant au bout de : Produit gain Trouvée corrigée % 20 h. 43 h. IGIC/g IGIC/g 246 246 O 6,68 7,62 B 307 326 33 7,99 8,20 c 296 315 28 7,60 7,98 D 308 328 33 7,90 8,14 254 254 267 8 7,99 8,20 257 257 260 6 6,86 7,65 Les résultats rapportés dans le tableau I montrent que seuls les composés solubles du fer apportent un gain d'activité sensible.Ainsi l'addition d'oxyde ferrique n'apporte qu'un gain d'activité d'environ 6% contre environ 30% pour les sels solubles. EXEtPLE 2. Addition de magnésie + dextrose et de magnésie + dextrose + sel de fer. On prépare un gâteau de filtration comme décrit dans l'exemple V du brevet des Etats-Unis nO 3 980 521. On met le gâteau à l'état de produit granuleux à l'aide d'un granulateur oscillant équipé d'une grille à orifices de 1 cm. Le produit granuleux grossier est à environ 7949 d'humidité. On le divise en 5 lots de 8,5 kg chacun +)A. On extrude et on sèche 8,5 kg comme décrit dans l'exemple 1 -A, sans aucun additif. A A 8,5 kg du gâteau de filtration mis à l'état de produit granuleux on ajoute 25 g de magnésie. Après mélange soigné, on extrude et on sèche comme décrit sous A). +)C. A 8,5 kg du gateau de filtration mis à l'état de produit granuleux on ajoute 25 g de magnésie et 200 g de dextrose monohydraté. Après mélange, on extrude et on sèche comme sous A). +)D. A 8,5 kg du gâteau de filtration mis à l'état de produit granuleux, on ajoute un mélange de 25 g de magnésie et 300 g de dextrose. Après mélange, on extrude et on sèche. (Nota : +) : exemple comparatif). E. On mélange 8,5 kg du gâteau de filtration avec 25 g de magnésie, 200 g de dextrose monohydraté et 40 g de sulfate ferrique à environ 20 de fer. On extrude ensuite et-on sèche0 Les produits séchés sont tamisés et on recueille la fractinn à une dimension de particule de 0,35 à 1,0 mm ; on analyse les produits. Le pH du sirop sortant est mesuré sur des échantillons prélevés respectivement au bout de 20 et 43 heures et refroidis à 250C. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau II ci-après. TABLEAU II Activité IGIC/g i ph du sirop Produit % de matière l sortant au ajoutée trouvée corrigée pour gain bout de la matière ! % 20 h. 43 h. inactive ajoute +)A O 220 220 O 6,85 7,40 i 1 222 224 2 8,18 8,23 10 10 216 240 9 8,14 8,22 14 14 216 251 14 8,15 1,21 E 12 272 309 40 8,15 8,27 Les résultats rapportés dans le tableau Il ci-dessus montrent que seule l'addition d'un sel de fer conduit à une augmentation appréciable de l'activité. Addition de citrate ferrique, de pyrophosphate ferrique, de citrate ferrique ammoniécal et de sulfate ferreux. On divise un gâteau de filtration mis à l'état de produit granuleux grossier, à environ 76% d'humidité, obtenu comme décrit dans l'exemple 1, en 6 lots de chacun 8,5 kg. +)A. On extrude 8,5 kg du produit granuleux et on le sèche comme décrit dans l'exemple I ; le produit obtenu est un produit comparatif. B. A 8,5 kg du produit granuleux grossier on ajoute un mélange de 25 g de magnésie, 25 g de citrate ferrique à environ 16% de fer et 250 g de dextrose monohydraté. Après mélange soigné, on extrude le produit granuleux et on le sèche comme décrit ci-dessus sous A. C. On extrude 8,5 kg du produit granuleux grossier et on le sèche comme décrit sous A après addition de 25 g de magné sie, 50 g de citrate ferrique et 250 g de dextrose monohydraté. D. On traite 8,5 kg du produit granuleux grossier comme décrit sous C mais on remplace les 50 g de citrate ferrique par 30 g de pyrophosphate ferrique à environ 12 de fer. E. A 8,5 kg du produit granuleux grossier on ajoute 25 g de magnésie, 250 g de dextrose monohydraté et 30 g de citrate ferrique ammoniacal à environ 15% de fer. Après mélange soigné, on extrude le produit granuleux et on le sèche comme décrit ci-dessus sous A. F. Au dernier lot de 8,5 kg on ajoute 25 g de magnésie, 250 g de dextrose monohydraté et 30 g de sulfate ferreux à environ 30% de fer. Après mélange soigné, on extrude le produit granuleux et on le sèche comme sous A. (Nota : +) : exemple comparatif). On tamise les produits secs et on recueille la fraction à une dimension de particule de 0,35 à 1,0 mm ; on analyse les produits obtenus. On mesure le pH du sirop sortait au bout de 20 et 47 h. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau III ci-après TABLEAU III Produit Activité, IGIC/g gain pH dy siyop sortant Trouvée Corrigée 20 h. 43 h. +3A 229 229 0 6,64 7,25 B 261 293 28 7,90 8,24 C 273 306 34 7,84 8,22 D 266 299 31 7,79 8,19 E 268 301 31 7,70 8,14 F 263 295 29 7,87 8,03 On n'observe pas i différence appréciable dans l'effet d'activation des sels de fer utilisés. SXEMPI3 4.- (Comparatif) Effet de l'incorporation de la magnésie sur la chute de pH, l'activité et la stabilité. a. On prépare trois produits enzymatique comme décrit dans l'exemple 1. Au gâteau de filtration mis à l'état de produit granuleux sec, on ajoute de la magnésie en quantités suffisantes pour que les produits finals secs en contiennent les proportions ci-après produit B 1 : pas d'additif produit B 2 : 2 % de magnésie produit B 3 : 5 % de magnésie. On procède à des isomérisations dans des colonnes de 60 ml doublées de verre (hauteur 35 cm, diamètre 1,5 cm) avec 15 g de chacun des trois produits. Les conditions d'isomérisation sont les suivantes sirop : 45 % de dextrose redissous pH à l'entrée : : 8,0 + 0,1 Mg ajouté au sirop : 0,0008 M Température : 650C. Un pH d'entrée de 8,0 eet inférieur au pH observé normalement et consideré comme optimal mais on l'a utilisé dans le cas présent pour mettre en évidence l'effet de l'addition de magnésie. On poursuit les isomérisations jusqu'à ce que l'activité des produits s'abaisse à un niveau arbitraire de 20 à 25 micromoles/ mnig. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau IV (a) i ci-après TABLEAU IV (a) i Activité max. Durée de i Période, Productivité au Produit mesurée / au service, bout de bout de, h. h. T1/2, h. 2 x T1 2 B1 88/72 665 257 369 32 143/16 665 238 436 33 124/16 378 161 253 Les pH des sirops en sortie de colonne sont rapportés dans le tableau IV (a) ii ci-après TABLEAU IV (a) ii Produit Heures après démarrage o 17 42 70 140 230 350 665 (trempage) 3 - 6,2 6,2 6,1 6,0 6,0 5,9 6,3 B2 8,4 7,4 7,0 6,7 6,4 6,2 6,2 6,9 B3 9,3 8,6 7,7 7,2 6,7 6,4 6,3 - Les résultats rapportés dans le tableau ci-dessus montrent que l'addition de 5% de magnésie conduis à de forts pH initiaux à la sortie. Il semble que ces forts pH influencent défavorablement l'activité maximale observée comme la stabilité et la productivité. Par contre, avec 2% de magnésie ajoutée, l'isomérisation à un pH d'entrée de 8,0 conduit, comparativement à l'opération effectuée sans additif, à une activité maximale et à une productivité plus fortes. b. Afin de rechercher la quantité optimale de magnésie à ajouter, on prépare 4 autres produits comme décrits dans l'exemple 1. Les teneurs en additifs des produits secs sont les suivantes A. pas de magnésie B. 0,5 % de magnésie + 9% de dextrose C. 1 % de magnésie + 9 % de dextrOse D. 2 % de magnésie + 9 % de dextrose. On procède à des isomérisations dans des colonnes de 60 ml doublées de verre (hauteur 35 cm, diamètre 1,5 cm) dans les conditions ci-après Sirop : 45 ffi de dextrose redissous pH à l'entrée : 8,4 + 0,1 Mg ajouté au sirop : 0,0016 M Température : 65 C. Les isomérisations sont poursuivies pendant 351 h. On obtient les résultats rapportés dans le tableau ci-après Tableau IV (b) i (voir page suivante) TABLEAU IV (b) i Produit Activité max. mesurée/ Activité au bout Activité au bout au au bout de, h. de 351 h. de 351 h. A 103/67 79 397 B 105/18 75 384 C 103/18 72 371 D 98/18 65 354 On a mesuré le pH dans le sirop sortant de la colonne aux intervalles indiqués dans le tableau ci-après TABLEAU IV (b) ii Produit Heures après démarrage 19 43 67 140 210 703 A 6,6 6,7 7,7 7,4 7,2 A 6,6 6,7 7,0 7,3 7,4 7,2 B 7,1 7,1 7,1 7,3 7,5 7,5 7,1 C 7,4 7,6 7,7 7,6 7,6 7,2 D 8,4 8,Q 7,8 7,6 7,5 7,2 Les résultats rapportés dans les tableaux ci-dessus ne font pas ressortir de grandes différences dans les activités, stabilités ou productivités des 4 produits. Par contre, les pH sortants sont influencés. B'addition de 1% de magnésie conduit à un pH de sortie presque constant durant l'opération et, par conséquent, constitue la proportion de magnésie préférée. Aussi bien avec 0,5% qu'avec 2% de magnésie, il y a un effet sur le pH de sortie, comparativement à l'opération témoin, mais dans les deux cas il se produit des variations de pH au cours des 150 premières heures. EX2DIPIE 5. Essais d1 isomérisation. On prépare un gâteau de filtration et on le met à l'état de produit granuleux grossier comme décrit dans le brevet des Etats-Unis n 3 980 521 t exemple V. Ce gâteau de filtration contient environ 77% d'eau. On s'en sert dans les opérations ci-après +) 410/A : pas d'addition +) 410/3 : on ajoute environ 10 parties du mélange I ci-après à environ 90 parties (sur matières sèches) du gâteaul de filtration. Le mélange I consiste en 100 parties de dextrose et 8 parties de magnésie. 410 / C : on ajoute environ 2 parties du mélange -II à environ 98 parties du gâteau de filtration (surmatières sèches). Le mélange II consiste en 100 parties de dextrose, 10 parties de magnésie et 12 parties de sulfate ferrique. 410 / D : on ajoute environ 7 parties du mélange I-I à environ 93 parties-du gâteau de filtration (sur matières sèches). 41 O/E : pas d'addition. (Nota : +) : exemple comparatif). On extrude ensuite les mélanges 410/A à 410/E sur une grille à orifices de 0,8 mm puis on sèche en lit fluidisé jusqu'à une teneur en humidité d'environ 10%. Les teneurs en fer des 5 produits finals, déterminées par l'analyse, sont les suivantes 410/A : 0,04 % 410/3 : 0,03 0 410/C : 0,08 00 410/D : 0,18 % 410/E : 0,04 ffi On procède à des isomérisationsavec les produits 410/A, 410/B, 410/D et 410/E dans les conditions ci-après Sirop : 45 % de dextrose redissous pH à l'entrée : 8,4 + 0,1 1-F Mg : 0,0016 M Température : 620C Dimensions de la colonne : hauteur 40 cm, diamètre 5,8 cm, volume 1 l. Poids d'enzyme : 260 g L'enzyme est trempée pendant 2 heures à température ambiante dans le sirop ci-dessus mais à pH 8,0, puis introduite dans la colonne. lies résultats obtenus sont rapportés dans le tableau ci-après TABLEAU V (a) Activité Durée totale pH à la sorie ériode Activité produit max. d'opération, au bout de : T,h. du produit mesurée h. 21h. 48h. 92h. au bout de 410/A 158 1293 6,9 6,8 7,2 842 1880 410/B 155 936 7,4 7,7 8,0 818 1790 410/D 202 1316 7,3 7,5 7,7 843 2295 410/E 151 1147 6,9 6,9 7,7 828 1755 On a dosé le fer dans le sirop sortant de ces colonnes. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau V (b) ci-après ?ABIEAU V(b) Produit Ee, ppm, dans le sirop sortant 2 h 30 après 21 heures après 27 heures après démarrage démarrage démarrage 410/A 410/B s1 41 410/D approx.41 1 410/E 41 > 1 41 On procède à une seconde série d'essais d'isomérisation avec les produits 410/C, 410/D et 410/E dans les conditions ci-après Sirop : 45% de dextrose redissous pH à l'entrée : 8,4 + 0,1 Mg++ 0,0016 M Température : 650C Dimensions de la colonne : hauteur 20 cm,diamètre 2,5 cm, volume 100 ml Poids d'enzymes : 20 g. On fait tremper l'enzyme pendant une heure à température ambiante dans le sirop ci-dessus puis on introduit dans la colonne. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau V(c) ci-après TABLEAU V (c) Produit Activité Durée totale pH à la sortie Période Activité max. d'opération, au bout de : T1/2h. du produit mesurée h. au bout 200h d 17h. 45h. 200h. 2xT1 2 h. 410/C 210 900 7,0 7,8 8,1 512 1510 410/D 250 900 7,5 8,0 8,2 484 1725 410/E 190 900 6,9 7,4 8,2 485 1340 On a dosé le fer contenu dans le sirop sortant de ces colonnes ; les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau V (d) ci-après TABLEAU V (d) Heures après démarrage Produit 0 24 72 140 850 (trempage) 410/C 0,8 (0,5 i 0,5 ( 0,5 0,5 ; 410/D 3,6 ( 0,5 - 0,5 ( 0,5 j 0,5 410/D ),6 o 5 0,5 x 5 0,5 42que ( 0,5 x 0,5 0,5 0,5 0,5 On a également déterminé la coloration CIRP du sirop sortant de ces colonnes ; les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau V(e) ci-après TABLEAU V (e) Ooloration CIRF du sirop Produit Heures a rès démarrage 0 24 72 (trempage) 410/C 0,266 0,030 0,019 410/D 0,247 0,036 0,020 410/E 0,232 0,036 0,022 A titre de comparaison, la coloration CIR? des 3 échantillons correspondants du sirop à l'entrée, au cours de cette période d'essai, est respectivement de 0,019, 0,012 et 0,014. On a également déterminé la stabilité de coloration du sirop sortant de ces colonnes. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau V (f) ci-après TABLEAU V (f) Stabilité de coloration du sirop Produit O h. 24 h. après 72 h. après (trempage) démarrage démarrage 410/C 0,21 0,040 0,014 410/D 0,21 0,050 0,017 410/E 0,22 0,044 0,017 A titre de comparaison, on a également mesuré la stabilité de coloration de trois-échantillons du sirop d'entrée utilisé au cours de cette période. On a trouvé respectivement 0,004, 0,002 et 0,004. On a dosé le fer dans les produits enzymatiques avant et après utilisation. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau V (g) ci-après TABLEAU V (g) mg de fer dans la colonne garnie de 20 g d'enzyme Produit ~~~~~~ au démarrage au bout de 900 h. 41 oc 16 24 410/D 36 42 410/E 8 14 On notera que la teneur en fer au bout de 900 h. est supérieure à la teneur initiale. L'enzyme a donc adsorbé du fer contenu dans le sirop mis en oeuvre. Comme on n'a pas ajouté de fer au sirop mis en oeuvre, le fer adsorbé par l'enzyme provient de traces de fer présentes naturellement dans les solutions de dextrose cristallisé. Le dosage du fer dans le sirop à 45% de dextrose redissous indique une teneur inférieure à 0,5 ppm et d'environ 0,1 ppm de fer. Dans le cours des 900 h.d'opération des colonnes, on a fait passer environ 75 kg de sirop dans chacune des colonnes contenant 20 g d'enzyme. Si la concentration moyenne en fer du sirop mis en oeuvre est de 0,1 ppm, le fer total contenu dans le sirop mis en oeuvre est donc de 75000 x 10-7 g = 7,5 mg. Ce résultat correspond bien à la quantité adsorbée par les produits enzymatiques au cours des opérations. Conclusions L'addition de magnésie a une influence notable sur le pH de sortie dans la période de O à 100 h. après le démarrage. Avec la magnésie, comme dans le cas des produits 410/B et 410/D, le pH de sortie est supérieur de 0,5 à 1,9 unité à celui observé en l'absence de magnésie, comme dans le cas des produits 410/A et 410/E. L'addition d'un sel de fer, comme dans le cas du produit 410/D, accroît l'activité sans affecter la stabilité, donnant lieu à une augmentation globale de productivité de 20 à 90. L'addition de plus-petites proportions de magnésie et de sel de fer, comme dans le cas du produit 410/C, conduit à une plus petite augmentation du pH de sortie et de la productivité mais ces augmentations sont encore appréciables. EXEMPI;E 6.- Comparaison entre les sels ferreux et les sels ferriques. On ajoute à des échantillons du giiteau de filtration mis à l'état de produit granuleux selon le brevet des Etats-Unis nO 3 980 521, exemple V, un mélange de sel de fer, de dextrose et de magnésie. On extrude ensuite le mélange au travers d'une grille à orifices de 0,8 mm et finalement on sèche en lit fluidisé jusqu'à une teneur en humidité d'environ 10%.La composition et les proportions du mélange consistant en sel de fer, dextrose et magnésie sont telles que les produits finals ont les compositions ci-après TA31EAU VI (a) Produit Sel de fer Dextrose lAagnésie- IG 403 II C 1 ,2% de sulfate 8 % 1 0 ferrique IG 403 Il D 1,2% de sulfate 8 % 1 % ferreux lG 403 Il E néant 8 % 1 % Le dosage du fer dans les produits obtenus donne les résultats ci-après IG 403 II C : 0,22 ss IG 403 Il D : 0,27 % IG 407 II E : 0,05 % On procède à des isomérisations dans les conditions ci-après : Sirop : 45 % de dextrose redissous pH à Itentrée : 8,4 + 0,1 Mg++ : 0,0016 M Température : 65 C Dimensions de la colonne : hauteur 20 cm, diamètre 2,5 cm, volume 100 ml, Poids d'enzyme : 20 g. On fait tremper l'enzyme pendant une heure à température ambiante dans le sirop ci-dessus puis on introduit dans la colonne. On obtient les résultats ci-après TABLEAU VI (b) Activité max. Durée totale Période Productivité Produit mesurée d'opération T1/2, h. au bout de h. 2 x T1 2 IG 403 II C 290 755 482 2093 IG 403 II D 274 755 467 1914 lG 403 Il E 254 755 431 1635 On a déterminé les teneurs en fer des produits enzymatiques avant et après l'utilisation ; les résultats obtenus sont rapportés ci-après : Produit mg de Fe dans la colonne garnie de 20 g d'enzyme au démarrage au bout de 755 h. IG 403 II C 44 52 IG 403 II D 54 68 IG 403 II E 10 16 Ici encore, la teneur en fer augmente légèrement au cours de l'opération, ce qui indique que les produits adsorbent du fer provenant des traces de fer existant dans le sirop de dextrose redis sous. Conclusion: aussi bien avec du sulfate ferreux qu'avec du sulfate ferrique, on constate une augmentation de l'activité et de la productivité du produit enzymatique. EXEMPLE 7. Mise en évidence de la saturation en fer. On utilise un gâteau de filtration mis à 1' état de granulés grossiers comme décrit dans le brevet des Etats-Unis n 3 980 521, exemple V, pour préparer les produits ci-après 415/A pas d'additif 415/B on ajoute environ 10 parties du mélange II à environ 90 parties du gâteau de filtration, sur matières sèches. Le gåteau de filtration contient environ 77 % d'humidité. Le mélange II consiste en 100 parties de dextrose, 10 parties de magnésie et 12 parties de sulfate ferrique. On extrude ensuite les mélanges 415/A et 415/3 sur une grille à orifices de 0,8 mm puis on les sèche en lit fluidisé jusqu'à une teneur en humidité d'environ 10 %. Le dosage du fer dans les deux produits finals donne les résultats ci-après 415/A : 0,03 % 415/B : 0,26 %. On procède à des isomérisations avec les produits 415/A et 415/B dans les conditions ci-après Sirop : 45% de dextrose redissous pH à l'entrée : 8,3 + 0,1 mu 0,0016 M Fe : 0,00007 M (4 ppm) Température : 6500 Dimensions de la cqlonne : hauteur 20 cm, diamètre 2,5 cm, volume 100 ml Poids d'enzyme : 20 g. On fait tremper l'enzyme dans le sirop pendant une heure à température ambiante puis on introduit dans la colonne. On obtient les résultats rapportés dans le tableau ci-après TABLEAU VII (a) Activité max. urée pour Durée totale Période Producti Produit mesurée tteindre d'opération, T vité au l'activité h. bout de max., h. h. h. 2 x 415/A 272 160 906 611 2560 415/B 275 20 906 547 2260 On a déterminé la concentration en fer du sirop sortant de ces colonnes.Les résultats obtenus sont rapportés ci-après TABLEAU VII (b) Fe, ppm, dans le sirop sortant au bout de : Produit au bout de O h. i 20 h. 70 h. t 350 h. 900 h. (trempage) . 415/A 415/A K w5 u s5 \ 0,5 X 05 ow5 415/B 7 O,5 0,5 0,5 0,6 On a dosé le fer dans les produits enzymatiques avant et après utilisation. Les résultats obtenus sont rapportés ciaprès Préparation mg de fer dans la colonne garnie de 20 g d'enzyme au démarrage au bout de 900 h. 415/A 6 320 415/B 52 380 Conclusions Le produit 415/A conduit à unè productivité supérieure de 130 à celle obtenue avec le produit 415/B. Cependant, on notera que le produit 415/B contient environ 10% de substance non enzymatique. Si donc le calcul est rapporté au gâteau de filtration initial contenant l'enzyme, les deux produits donnent à peu près la même productivité. L'activité du produit 415/A augmente au cours des 160 premières heures d'opération. Par contre, pour le produit 415/B, l'activité maximale est atteinte au bout de 20 heures. Ce résultat montre que le produit 415/A adsorbe lentement du fer provenant du sirop mis en oeuvre, avec une lente activation résultante. Cette lente activation constitue également la raison de la période deddégradation exponentielle plus longue observée dans le cas du produit 415/A, c'est-à-dire que l'activation et la dégradation exponentielle se produisent simultanément. Au cours des 900 heures d'opération, on a fait passer environ 90 kg de sirop dans chacune des colonres contenant 20 g de produit enzymatique. La teneur en fer du sirop est de 4 ppm. Les 90 kg de sirop contiennent donc 360 mg de fer. Le fer contenu dans les deux colonnes augmente de 314 et 328 mg. Ainsi donc, la plus grande partie du fer contenu dans le sirop mis en oeuvre est éliminée par les produits enzymatiques. Les résultats obtenus montrent qu'après 900 h. d'opération, la teneur en fer du sirop sortant-commence à augmenter. Ce fait suggère que les produits enzymatiques approchent de la limite de leur capacité d'adsorption du fer. REVENDICAtIONS 1. Procédé pour activer la glucose-isomérase sous forme de masse cellulaire, le procédé se caractérisant en ce que l'on incorpore à la masse au moins 0,05% en poids (sur matières sèches) de fer à l'état de sel de fer hydrosoluble non toxique. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on ajoute le fer sous forme de sel hydrosoluble non toxique solide. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que, après incorporation du fer, on met la glucose-isomérase sous forme de particules qu'on sèche, obtenant ainsi un produit enzymatique prêt au trempage. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 3,caractérisé en ce que la glucose-isomérase sous forme de masse cellulaire a été préparée en concentrant et homogénéisant des cellules de microorganismes présentant une activité glucose isomérase, pour former un concentrat cellulaire homogénéisé contenant des cellules dont les parois sont rompues et une teneur en matière sèche de 3 à 30% en poids par volume, en faisant réagir ce concentrat cellulaire avec 0,01 à 1 partie en poids de glutaraldéhyde par partie de matière sèche pour obtenir un produit solide cohérent, et ensuite en éliminant l'eau et en traitant ce produit cohérent de façon à le présenter sous forme divisée, 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que lton mélange avec le fer une proportion d'au moins 0,5fo de magnésie, par rapport au poids sec de la glucoseisomérase sous forme de masse cellulaire, et au moins 2% en poids (sur matière sèches) de glucose solide, après quoi on extrude la masse et on la met sous forme de granules. 6. Glucose-isomérase sous forme de masse cellulaire, activée par le fer, à l'état de particules séchées, caractérisée en ce qu'elle contient au moins 0,05% en poids de fer incorporé sous forme de sel de fer hydrosoluble non toxique. 7. Procédé pour isomériser la glucose, caractérisé en ce que l'on utilise à cet effet ur.eglucose-isomérase sous forme de masse cellulaire selon la revendication 6.