Brevet FR2374417A1 — publié le 19780713

"Procédé de dégradation biologique du méthanol" La présente invention concerne un procédé d'obtention de souches de microorganismes améliorés quant à leurs performances d'utilisation du méthanol (vitesse, rendement, affinité), par rapport aux souches mères. Ce procédé s'applique à l'amélioration de toutes les souches de microorganismes méthylotrophes utilisant le méthanol par la voie métabolique dite de "la sérine". Ce procédé d'amélioration peut s'appliquer à un grand nombre de microorganismes. Citons, de façon non limitative, les microorganismes des genres sui vante - bacilles, Micrococcus, Arthrobacter, Flavobacterium, Pseudomonas, Aeromonas, Méthylomonas, Rhodopseudomonas, Méthylococcus, Klebsiella, Rhodospirillum, Rhodomicrobium, Hyphomicrobium. Les microorganismes méthylotrophes facultatifs utilisant le méthanol par la voie de la sérine, sont très répandus. Ceux qui ont été isolés par les méthodes traditionnelles (repiquages successifs sur milieu avec du méthanol comme seule source carbonée) ont des performances cinétiques souvent médiocres. Quelques-uns sont décrits dans la littérature, en particulier dans les textes suivants : W. HARDER; MM. ATWOOD; J.R. QUAYLE J. Gen.Microbiol. (1973) 76 155-163, ASTHANA et Coll. Biotechnol. Bioeng (t971) 13, 923 et (1971) a, 923, M. REUSS et Colt. Eur. J. Appl. Microbiol. (1975) 1 295-305, WHITTENDURY et al. J. Gen. Microbiol. (1970) 61 205, HIRSH et CONTI Archiv. Fin Mikrobiologie (1964) 43 : 358, OGATA et Coll. J. Ferment. Technol. (1970) 46:470 Les méthodes d'isolement de souches par sélection continue, permettent certes d'isoler des souches performantes mais l'expérimentation est longue (au moins un mois d'expérimentation en fermenteur continu), délicate et les résultats aléatoires. D'autre part on ne réalise ainsi qu'un enrichissement, et il est indis pensable ensuite d'isoler à partir de la flore complexe obtenue le microorganisme intéressant. La demanderesse a mis au point un procédé qui permet à partir d'une quelconque des souches présentant la caractéristique précitée (utilisation du méthanol par la voie de la stérine), d'obtenir rapidement (24 à 120 h) une souche ayant des performances améliorées : augmentation du rendement d'utilisation du méthanol,augmentation de l'affinité pour le méthanol (diminution du K8), et diminution du temps de génération sur substrat carboné méthanol. Ce procédé permet une sélection rapide des souches et, contrairement aux procédés utilisant une fermentation continue, ne nécessite pas pour sa mise en oeuvre un appareillage spécialisé et délicat. Il s'agit de sélectionner des mutants de régulation déréprimés pour la glycine à partir de souches méthylotrophes fa cultatives. On utilise un milieu de culture qui comprend essentiellement des sels minéraux, de l'azote sous forme minérale et du méthanol en concentration variable de 0,1 % à 2 % (poids/volume). Le méthanol stérilisé par filtration est ajouté au milieu autoclavé à 1200C durant 30 mn. La culture est effectuée en fioles stériles bouchées au coton, avec une agitation telle que l'aération ne soit pas limitante, et à des températures pouvant varier de 250 à 450C. Les cellules sont récoltées de préférence en phase exponentielle de croissance, puis étalées sur le crible de sélection (milieu solide pour microorganismes méthylotrophes + 0,5 à 2 % de glycine) soit directement, soit après l'action préalable d'un agent mutagène physique ou chimique. Toutes les souches ainsi sélectionnées présentent le caractère de résistance à la glycine (en concentration de 0,5 à 2 46), Les souches obtenues par le procédé de la présente invention peuvent entre employées en particulier pour la synthèse de protéines à partir du méthanol, l'épuration biologique du méthanol d'un effluent, la diminution éventuelle du méthanol dans des boissons fermentées et en général toute fermentation impliquant le méthanol en tant que substrat carboné. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter - Exemnle I Une souche identifiée comme étant du genre Pseudomonas stuzeri, est mise en culture sur le milieu suivant : Milieu de culture (M1) NH4Cl : 3 g Na2HP04 : 3 g KH2P 4 : 0,5 g CaC12 i0,01 g FeSO4 : 0,001 g Ajusté à pH 6,8 ZnCl : 0,001 g MnSO4 : 0,001 g MgS04 : 0,5 g CH3OH : 5 g q.s.p. : 1 litre La température de culture est de 300C. Le temps de génération de cette souche est alors de 120 mn et sa constante diaffinité apparente pour le méthanol est K = 1090 ppm. s La production effective de biomasse au bout de 3 jours de culture est de 0,30 g pour t g de méthanol. La suspension cellulaire récoltée de cette culture est diluée dans liteau physiologique de manière à étaler 108 à 109 cellules par ml, avant étalement sur milieu M1 gélosé à 2,5 % et complété avec 2 % de glycine. Les bottes de pétri sont placées à l'étuve à 300C. L'apparition de mutants résistants se manifeste au bout de quelques jours. Les colonies sont prélevées et ensemencées en milieu liquide (M1) afin de tester leurs caractères méthylotrophes. On obtient plusieurs mutants résistants à la glycine. L'étude des performances cinétiques d'un de ces mutants a donné les résultats suivants - temps de génération 100 mn - K ~ 20 ppm s La production effective de biomasse au bout de 3 jours de culture est de 0,40 g pour 1 g de méthanol. - Exemple 2 D'autres mutants de la souche citée en 1, résistants à 2 % de glycine, ont été isolés avec un traitement préalable de la suspension cellulaire avec 2 % d'éthylméthane sulfonate durant 2 h à 300C à pH 7,4. On constate les mêmes améliorations que sur le mutant de l'exemple 1 à savoir diminution du temps de génération et surtout forte diminution du K s - Exemple 3 Le traitement utilisé dans le premier exemple est appli qué à une souche de Pseudomonas aéruginosa méthylotrophe. On isole sur crible de sélection (milieu M1 + 0,5 % glycine) des mutants résistants à la glycine. Les performances cinétiques de ces nouvelles souches sont nettement améliorées par rapport au sauvage. Souche sauvage Souche mutante g = 5 h 45 mn g = 3 h 30 mn K5 830 ppm K8 100 ppm - ExemPle 4 Le traitement utilisé dans le 1er exemple est appliqué à une souche de Micrococcus VariansMéthylotrophe et a permis dtiso- ler des souches présentant sur méthanol des performances améliorées par rapport à la souche sauvage. Souche sauvage Souche mutante g = 4 h 20 mm g = 3 h 30 mn K 450 ppm K = 150 ppm s REVENDICATIONS 1.- Procédé d'obtention de mutants de régulation dans le métabolisme du méthanol caractérisé par une sélection des microorganismes à partir de souches méthylotrophes facultatives cultivées en milieu solide contenant 0,5 à 2 % de glycine. 2.- Procédé de dégradation biologique du méthanol caractérisé par l'utilisation de mutants de régulation obtenus selon la revendication 1. 3.- Procédé de synthèse de protéines à partir de méthanol caractérisé par l'utilisation des mutants de régulation obtenus selon la revendication 1.