Brevet FR2362394A1 — publié le 19780317

La présente invention concerne gènéralement une composition améliorée et un procédez pour la détermination quantitative des phospho lipides dans un dchantillon. Plus spécialement, la présente invention concerne un agent caractéristique utile pour déterminer quantitativement des phospholipides dans le sérum sanguin. Las phospholipides sont présents dans le sérum, les oeufs, la viande, les légumes, etc. Il est important de déterminer la teneur en phospholipides de ces substances pour diagnostiquer des maladies, pour la diététique, ete, Sous ce rapport, la scien ce médicale a reconnu l'utilité de déterminer la teneur en phospholipides dans le sérum sanguin pour aider au diagnostic de maladies telles que l1bypercholestérolémie, la maladie au foie, etc. Un certain nombre d'essais, de procédés et de modes opEra- toires ont été proposés et sont utilisés pour mesurer ou estimer la quantité de phospholipides dans le sang. Parmi les procédés connus, les plus largement utilisés sont les procédés colorimé triques utilisant le molybdate. Certains de ces procédés dépen- dent de la conversion du phospholipide en phosphore minéral par incinération de l'échantillon; la réaction du phosphore avec le molybdate pour former un acide phosphomolybdique; la réduc tion de l'acide phosphomolybdique avec un réducteur pour former le bleu de molybdène; et la mesure de la couleur d'absorption du bleu de molybdène. [(J. Lah. Clin. Med. Vol. 35, 155 (1950); J0 Biol. Chez.Vol. 234, 466 (1959); Shinryo Vol. 16, 677 (1963); Rinsho Byori Vol. 10, 194 (1962 tibia. Vol. 15, 853 (1967)J. Plus récemment, un procédé a été proposé qui envisage la conversion enzymatique des phospholipides présents dans un échan tillon sanguin, en acide phosphorique et la mesure de la couleur de la solution réactionnelle obtenue en faisant réagir l'acide phosphorique avec le molybdate puis en réduisant le mélange résultant (Yatron Document RN 137-K, Patron Co., Ltd.). Las procédés connus pour la détermination quantitative des phospholipides présentetun ou plusieurs inconvénients en nécessi tant des techniques de laboratoire bien au point et exigeant beaucoup de temps pour les elfectuer, ne donnant pas de résultats suffisamment précis et nécessitant des mesuressurblanc, à cause de l'interférence du phosphore contenu dans l'échantillon et les récipients. la présente invention fournit un procédé colorimétrique d'analyse, simple, pratique, et économique pour déceler la pré sence de phospholi.pides dans le sérum et permet ainsi une déter- mination quantitative précise de ceux-ci. Le procédé offre l'avantage d'un développement de la couleur extrêmement rapide et le maintien de l'indice de coloration pendant une longue période De plus, ce procédé peut etre effectué par un personnel non qualifié dans les procédés de laboratoire. En outre, le procédé de la présente invention fournit une détermination complètement enzymatique des phospholipides et par conséquent une amélioration nette de la diagnose médicale routinière et en outre la possibilité d'adapter le procédé es appareils d'analyse automatiques. La présente invention est basée sur la combinaison des rOac- tions enzymatiques, suivante Les phospholipides tels que la lécithine, la sphingomyAline, la lisolécithine, la céphaline, la phosphatidylsérine, etc. sont présentes dans le sérum du sang. Parmi ces phospholipides dans le sérum, la quantité totale de lécithine, de sphingomyé- line et de lisolécithine correspond à environ 95 * de la quan- tité de, phospholipides totale, dans les divers échantillons de sérum. Ces trois phospholipides sont transformés en choline par une réaction enzymatique. Da quantité de la forme réduite d'accepteur produite dans la transformation enzymatique de la choline en glycine-bétaïne0 aldéhyde en présence de choline di déshydrogénase (qui sera dési gnée par l'abbréviation "CLBH") et 9accepteur d'hydrogène, est directement proportionnelle à la quantité de phospholipide dans le sérum sanguin. En outre, la quantité de la forme réduite du nicotinamide-adémine-dinucléotide (d6signée par la suite par "NADH") formée dans la conversion enzymatique du glycine-bétaïne-aldéhyde en bétaïne-aldéhyde en présence de bétaine-aldéhyde-déhydrogénase (désignée par la suite par 9t et du nicotinamide-adénine dinucléotide (désigné par la suite parle AD") ou NÂD consommé dans la réaction enzymatique, est également directement proportionnelle à la quantité de phospholipide dans le sérum sanguin. La forme réduite de l'accepteur ainsi produite peut ensuite être décelée en mesurant l'absorption de la couleur de la solution réactionnelle à une longeur d'onde comprise entre 400 et 700 nm. La NADH ainsi produite peut aussi être décelée en meurant l'absorption de la solution réactionnelle à une longueur d'onde de 340 n. La quantité de RAD consommée peut être calculée en soustrayant le NAD restant du NAD ajouté. Le NAD restant dans la solution réactionnelle peut être détecté en mesurant l'absovp- tion de la solution réactionnelle à une longueur d'onde comprise entre 260 et 280 ni. Cea réactions sont chacune connues. C'est-à-dire que la le- cithine réagit catalytiquenent avec la phospholipase D (désignée ici par "PLD") pour former la choline réaction I, J. Biol. Chem. Vol. 231, 703 (1958), ibid, Vol. 172, 191 (1948)]. La sphingomyéline et la lécithine réagissent catalytiquement avec la phospholîpase C (désignée par la suite par "PLC") pour former la phosphoryl- choline [Réaction Il, Biochem. J. Vol. 35, 884 (1946); Biochem. Biophys. Acta, Vol. 59, 103 (1962)], la phos phoryl - choline réagit catalytiquement avec la phosphatase pour forger la choline tReaction III, J. Biol. Chem. Vol. 244, 308 (1969)J. La lysolécithine réagit catalytiquement avec la phospholipase B (désignée par la suite par "PLB") pour former la glycérophosphorylcholine [Reaotion IV, "Biochemist"s Handbook" E. & F. N. Spou Ltd. 282 (1961) ; Nature Vol. 169, 29 (1952); Biochem.J. Vol, 71, 615 (1959)], la glycérophosphorylcholine réagit catalytiquement avec la glycérophosphorylcholine-diesterase (désignée par la suite par "GPD") pour former la choline [Reaction V, J. Biol. Chem. Vol. 206, 647 (1954); Biochem. J. Vol. 62, 689 (1956)]. La choline formée dans la réaction décrite ci-dessus, réagit catalytiquement avec CLDH en présence d'un accepteur dlhy- drogène pour former le glycine-bétaine-aldéhyde et 12a forme. réduite de l'accepteur tReaction VI, Agr. Biol. Chem. Vol. 39, 1513 (1975)]. Le glycine-bétaine-aldéhyde réagit catalytiquement avec BADH en présence de NAD pour former la glycine-b étai- ne et la NADH [Reaction VII, J. Biol. Chem. Vol. 209, 511 (1954)]. Les réactions enzymatiques décrites ci-dessus sont représentées schématiquement de la façon suivante Lécithine Sphingomyéline Lécithine Lysolédithine # # (Réaction II) # (Réaction IV) # PLB # CH2OH # FLD Phosphoryl-choline # (Réaction I) (Réaction III) # Phosphatase Glycérophosphoryl-cgikube HO-CH2CH2N(CH3)3OH- (Réaction V) # GPD choline choline choline Choline | CLDH (réaction VI) | 6 Accepteur dthydrogbne (Enietteur c (metteur d'électroni OIIC-OR(O)0 Ohm + forme réduite de 3 accepteur Gcine-betaine- Détection aldéhyde c BIïDH (Réaction VII) OoCH(CH3)3 + NaDHH Glycine-bétain-. Détection où R1, R2 et R3 représentent des groupes hydrocarbonés. Lha détermination quantitative de la teneur en lécithine dans un échatillon est effectuée selon un procédé comprenant les réactions I et VI (désigné par la suite par procédé D) ou bien comprenant les réactions I, VI et VII (désigné par la la suite par procédé Dt)e La détermination quantitative de la teneur globale de sphingomyéline et de lécithine dans un échantillon: est effectuée selon le procédé comprenant les réactions II, III et VI (désignée par la suite par procédé C) ou bien les réactions Il, III, VI et VII (désigné par la suite par procédé C'). La détermination quantitative de la teneur en lysolécithine dans un échantillon est effectuée selon le procédé comprenant les réactions IV, V et VI (désigné par la suite par procédé B) ou les réactions IV, V, VI et VII (désigné par la suite par procédé B'), La détermination quantitative de la teneur globale en léci- thine, sphingomyéline et lysolécithine est effectuée selon les procédés C et B, les procédés C et B', les procédés C' et B, ou les procédés C' et B'. D'unes façon générale, la présente invention comprend la combinaison d'un système pour transformer les phospholipides dans un échantillon en choline et un sytème pour déceler la choline ainsi formée. De système pour transformer les phospholipides en choline comprend un ou plusieurs enzymes choisis par les groupes comprenant la PLD, PLC et la phosphatase, et la PLB et GPD. Le système de détection de la choline comprend CLDR et un accepteur d'hydrogène ou comprend aussi BADH et RAD et si nécessaire un émetteur d'électrons. Un objet supplémentaire de la présente invention est une nouvelle composition réactive pour transformer les phospholipides daas un échantillon en choline qui comprend comme premier constituant un ou plusieurs enzymes, choisis parmi les groupes comprenant la PLD, PIC et la phosphatase, et la PLB et GPD; et un second constituant comprenant un réactif pour la dOtec- tion de la choline0 Selon la présente invention, la détermination quantitative des phospholipides peut être être effectuée en conduisant les réactions individuelles graduellement.C'est-à-dire que les réac- tions enzymatiques sont divisées en un groupe quelconque désiré et une fois la réaction du stade précédent terminée, des enzymes successives y sont ajoutées, et la réaction du stade suivant est laissée s'effectuer. Une fois la réaction VI terminée, l'absorption de la partie visible de la solution réactionnelle colorée par la formation de la forme réduite de l'accepteur, est me surée, ou bien une fois la réaction VII terminée, l'absorption de la partie ultraviolette de la solution réactionnelle est mesurée pour déceler le NÂDE formé et le NAD restant. Les indices d'absorption obtenus par un ou plusieurs stades ci-dessus sont comparés avec une courbe étalon: obtenue en effectuant les stades ci-dessus sur le composé type, la teneur en phospholipide de l'échantillon étant déterminée. Selon la présente invention, le procédé actuellement pré féré pour la détermination quantitative des phospholipides dans un échantillon est effectué en soumettant un échantillon à une réaction avec un réactif comprenant des enzymes pour transformer les phospholipides en choline, CLDH et un accepteur d'hydrogbae; et si nécessaire, BADH, NAD , un émetteur d'électron, un tensioactif, etc. dans une solution tampon. Les enzymes utilisés dans la présente invention sont connus et ceux obtenus ,de différentes sources peuvent être utilisées. Une PID quelconque peut être utilisée tant quelle agit seulement sur la lécithine parmi les phospholipides. Des PU) appropriées sont obtenues à partir des choux ou produits analogues, par extraction et purification et sont disponibles commercialement à partir de ces sources chez Sigma Co., U.S.A et Boehringer Mannheim Co., allemagne de ltOuestO Une PIC quelconque peut être utilisée aussi longtemps qu'ellé agit seulement sur la sphingomyéline et la lécithine parmi les phospholipides. Des PLC appropriées sont obtenues à partir de srotoplasmes de micro-organismes appartenant à Escherichia coli par extraction et purification et sont disponibles commercialement à partir de ces sources chez Worthington Co., U.S.A. sous le N de catalogue 5130 et chez Boehringer Mannheim Co., Allemagne de l'Ouest sous le n de catalogue 15 429. Les phosphatases obtenus à partir de protoplasmes de micro-organismes appartenant à l'espèce Clostridium perfrin- gens ou Clostridium welchii, etc. par extraction et purification, peuvent être utilisées et sont disponibles commercialement à partir de ces- sources chez la Worthington Co. sousle n de catalogue . 5640 et la Sigma Co., U.S.A. sous le N0 de catalo gue P 7633, etc0 Toute PLB peut être utilisée aussi longtemps qu'elle agit seulement sur la lysolécithine parmi les phospholipides. Les PLB appropriées peuvent être obtenues à partir de protoplasmes de micro-organismes appartenant à l'espèce Penicillium notatum par extraction [Biochem. J.Vol. 70, 559 (1958)j. Cel les extraites des membranes mugueuses du foie et des intestins de rats, de boeufs et de porcs, etc. sont également appropriées. Des GPD appropriées peuvent être obtenues à partir de pro toplasmes de micro-organismes appartenant à l'espèce Serratia plymuthicum par extraction [J. Biol. Chem. Vol. 206, 647 (1954)] Celles extraites-des foies de rats,de boeufs et de porcs (Biochem. j., vol, 62, 689 (1956)), etc. sont également appropriées. Les CLDH convenables peuvent être obtenues à partir de protoplasmes de micro-organismes appartenant à l'espèce Pseudomonas aeruginosa, [ agir. Biol. Chem. Vol. 39, 1513 - 1514 (1975]. Celles extraites des mitochondria de rats [J. Biol. Chem. Vol. 234, 1605 (1959)], etc. sont également appropriées. Des BADH convenables peuvent être extraites des protoplas- mes de micro-organismes appartenant à l'espèce Pseudomonas aeruginosa [Agr. Biol. Chem. Vol. 39, 1513 - 1514 (1975J. Celles purifiées à partir du produit surnageant de l'homogénat de foie de rats (J. BiolO Chem. Vol0 209, 511 (1954)), etc. sont aussi appropriées. Une certaine quantité d'enzymes peut être utilisée de façon à ce que le phospholipide soit déterminé dans une gamme telle que l'opération de détection puisse être effectuée exactement. C1est-à-dire que la quantité suivante d'enzyme peut être utili sée par microgramme de phospholipide PLD 0,005 - 1 IU ; PIC 0,005 - 1 IU; PIB 0,l085 - 1 IU; phosphatase 0,005 - 50 IU ; GPD 0,005 - 1 lu ; CLDH 0,1 - 50 IU BADH 0,1 - 100 lu. Les enzymes précédentes sont utilisées dans une solution tampon appropriée. les concentrations préférées des enzymes dans la solution tampon sont PLD 0,01 - 1 IU/ml; PIC 0,01 1 lU/ml; PIB 0,01 - 7 IU/ml ; phosphatase 0,1 -50 IU/ml; GPD 0,01 - 1 IU/ml ; CLDH - 0,1 - 50 IU/ml ; BADH 0,1 - 100 IU/ml. IU est une unité internationale du facteur enzyme; et le fac teur capable de décomposer une micromole de substrat en une minute est défini comme 1 lu, c'est-à-dire 1 IU = I microloe/ minute. Il/est souhaitable d'avoir la solution tampon à un pH compris entre environ, 5,0 et 10,0, et de préférence entre 6,5 et 7,5. Dans ce but les tampons qui peuvent être utilisés comprennent les phosphate, succinate, citrate, borate, acétate, glycylglycinate, tris-malonate ainsi que d' autres tampons qui sont généralement efficaces dans la gamme des pH de 5,0 à 10,0 La concentration des tampons n'est pas critique.Toutefois, il est préférable d'utiliser un tampon relativement dilué et dans ce but une solution à 0,1 - 0,2 mole/litre est recommandée0 Des exemples d'accepteur d'hydrogène sont le 3,3'-(3,3'- diméthoxy-4,4'-biphénylène)-bis-[chlorure de 2-(p-nitrophényl) 5-phényl-2R-tétrazoliumj (désigné par la suite par "nitro-TB"), le 3,3'-(3,3'-diméthoxy-4,4'-biphénylène-bis-[chlorure de 2,5-bis (para-nitrophényl)-2H-tétrazolium] (désigné par la suite par TNTB) ; le chlorure de 3-(p-indophényl-2-(para-nitrophényl)-5-phényl-2H-tétrazolium (désigné par la suite par INT) ; le 2,6-dichlorophényl-indophénol (désigné par la suite par BCPIP) et le NAD. Quand on utilisée le DCPIP, on utilise un émetteur d'électronstel que le phénazine-méthosulfate, et produit analogue qui accepte un électron de la choline et le donne au DCPIP. Puisque NAD peut être converti en NADH par des enzymes, dont le coenzyme est NAD, il se produit quelquefois une erreur quand ces enzymes sont présents dans le système réactionnel. Par censéquent, il est préférable d'éviter ces combinaisons. La concentration préférée de de accepteur d'hydrogène dans la solution tampon est comprise entre 0,1 et 500 mmoles/l. La concentration préf éréedel1émetteur d'électron est comprise entre 0,1 et 50 mmoles/litre. Des échantillons types dans lesquels la quantité de phospholipides sera déterminée, comprennent des constituants vivants tels que sérum, foie, etc. et divers aliments cels que huile végétale, huile de poisson, légumes, etc. Quand l'éch@ tillon est solide, il doit être broyé, puis soumis à une en traction avec l'eau ou avec de petites quantités de solvant organique tel que alcool, chloroforme/ou etc. Par ailleurs, si l'échantillon est nie huile, un tensio-actif peut être ajouté à le solution réactionnelle pour améliorer l'affinité avec la solution de réactif. Des tensio-actifs convenables compren nent des alcools supérieurs comme le polyéthylèneglycol, etc.De préférence, la concentration en tensio-actif dans la solution réactionnelle est comprise entre 0,01 et 5 g/l. Les réactions enzymatiques sont effectuées à 200 45 C, de préférence entre 300 et 40 C, à pH 5 à 10, pendant 4 à 60 minutes. Une fois les réactions enzymatiques terminées, l'abssorp- tion de la solution réactionnelle est mesurée en utilisant un spectrophotomètre, ou un appareil du même genre. Quand la quantité de la formation de la forme réduite de l'accepteur est déterminée, l'absorption de la partie visible de la solution réactionnelle est mesurée à une longueur d'onde comprise entre 400 et 780 nm. Quand le NAD est utilisé sous forme d'accepteur d'hydro gène dans la réaction VI, la détermination quantitative de la forme réduite de l'accepteur, c'est-à-dire NADH formée dans la réaction VI, est effectuée en mesurant l'absorption de la solution réactionnelle à une longueur d'onde de 340 nm. Si la quantité de NADH est déterminée, l'absorption de la partie ultraviolette de la solution réactionnelle est mesu- rée à 340 nm et quand la quantité de NAD restant est déterminée, l'absorption est mesurée à 260 - 280 zirn. Les couleurs développées dans la réaction en utilisant nitro-TB, TNTB, INT et DCPIP comme accepteur d'hydrogène sont respectivement bleue, brun-rouge, rouge Cou viol@t) et bleu rouge. Quand NAD est utilisé comme accepteur d'hydrogène dans la réaction VI et que la détermination quantitative du phospholi- pide est effectuée en mesurant la quantité de NADH produite une fois la réaction VII terminée, la valeur quantitative de NADH déterminée représente le total de NADH forméedans les reac tions VI et VII, et par conséquent la quantité de NADH formée dans la réaction VI/est prise en considération. La réaction VII habituellement se déroule à 100 % et ainsi la quantité de NADH founée dans le réastion VII pout être supposée égale/a la moitié de la valeur tetale. La composition de la présente invention peut étre utili sée sous diverses formes. Par exemple, les ingrédients peuvent être mélangés sous forme liquide ou sous forme dè poudre. La formule liquide peut être facilement reconstituée, pour un usage ultérieur simplement en ajoutant de l'eau ou la solution tampon. Les poudres, si on le désire, peuvent etre moulées en comprimés pour des commodités d'utilisation. La présente invention est illustrée par les exemples des criptits et non limitatifs ci-après. EXEMPLE 1 Détermination quantitative de la teneur en lécithine, sphingomyéline et lysolécithine dans le sérum sanguin normal humain. Dans cet exemple, 20 l de sérum sanguin sont ajoutés à 3 ml d'une solution-tampon contenant 0,15 mole / 1 de phosphate (pH 7,2) 0,04 IU de PLC ; 5 IU de phosphatase, 0,014 IU de PIB, 0,014 IU de GPD, 5 IU de CLDH et 0,6 mmole de TNTB. La réaction enzymatique est laissée s'effectuer pendant 15 mm à 37 C. Une fois la réaction terminée, 11 absorption de la solution réactionnelle à 550 millimicrons est mesurée avec un spectrophotomètre pour déterminer la teneur de la forme réduite de l'accepteur forméedans la solution. La teneur en phospholipides est obtenue en comparant l'indice d'absorption avec une courbe étalon obtenue en appliquant le procédé décrit ci-dessus sur un échantillon normalisé de lécithine(fabriqué par Sigma Co., Ltd, sous le N0 de catalogue L-2004). Comme témoin, le même sérum est soumis à une extraction en utilisant une solution de chloroforme et de méthanol selon le procédé d'extraction Folch. L'extrait résultant est oxydé en utilisant l'acide perchlorique pour former un phosphore minéral et du molybdate ; et, ensuite, on ajoute du sulfate d'hydrazine à la solution résultante pour avoir une solution colorée. L'absorption de la couleur développée à une longueur d'onde de 700 ni est mesurée avec un spectrophotomètre (Rlnsho tyori, Vol. 10, 194 (1962)). Les échantillons sont mesurés 10 fois par chacun des procédés décrits ci-dessus. Les résultats sont indiqués dans le tableau 1.. TABLEAU 1 Essai N0 Teneur en phospholipides (mg/dl) Procédé da brevet Procédé antérieur 1 185,3 189,3 2 187,2 195,2 3 184,4 199,4 4 186,7 190,8 5 185,1 187,2 6 181,9 193,6 7 188,2 195,1 8 187,5 188,8 9 186,3 192,3 10 184,6 190,5 moyenne 185,7 192,2 Ecart type 1,85 3,68 Coefficient de variation 0,99 % 1,91 % Comme on peut le voir d'après le tableau 1, l'écart type et le coefficient de variation dans le procédé du présent brevet sont inférieurs à ceux donnés par les procédés connus. Pour comparer avec le procédé antérieur connu, en ce qui concerne. la teneur en phospholipides, totale, la multiplication par un facteur de 1;0416 donne une moyenne de la teneur en phospholipides, totale, soit 193,4 mg/dl, presque la même valeur numérique que celle du procédé antérieur. EXEMPLE 2 Détermination quantitative de la lécithine, de la sphingomyéline et lysolécithine dans un sérum de malade (type Il b). Dans cet exemple, 20 l du sérum de malade sont ajoutés à 3 ml d'une solution tampon de tris à 0,15 mole/l (pH 7,2) contenant 0,04 IU de PIC, 5 lu de phosphatase, 0,014 lu de PLB, 0,014 lu de GPD , 5 lu de CLDH, 5IU de BADH et 0,09 mmole de NÂl)0 la réaction enzymatique est laissée s'effectuer pendant 15 minutes à 37 C. Une fois la réaction terminée, l'absorption de la solution réactionnelle à 340 millimicrons est mesurée à divers intervalles de temps en utilisant un spectrophotome- tre pour déterminer la teneur en N1XH formée dans la solution. Les valeurs sont données dans le tableau 2. TABLEAU 2 Teneur en phospholipides, totale (mg/dl) 30 secondes 305,2 1 minute 312,1 5 minutes 314,3 15 minutes 313,0 Comme on peut le voir d'après les valeurs du tableau 2, la détermination quantitative en phospholipides totale selon le procédé de la présente invention peut être effectuée en un temps court. EXEMPLE 3 Détermination quantitative de la teneur en phospholipides, totale dans le sérum. Dans cet exemple, le procédé décrit dans l'exemple I est répété sauf qu'on utilise 0,6 mmoles de INT à la place de TNTB, et que l'on utilise du sérum humain normal et des sérums de ma lades (types IIa, IIb et IV). Les résultats sont indiqués dans le tableau 3. la teneur en phospholipides, totale, selon le procédé de la présente invention est obtenue en multipliant par un indice de 1,0416. TABLEAU 3 sérum Teneur en phospholipides, totale (mg/dl) Procédé de la Procédé antérieur présente invention humain normal 194,2 + 14,0 201,5 + 32,3 Type IIa 275,3 + 15,4 278,7 + 40,2 Type IIb 341,0 + 19,5 348,2 + 51,2 Type IV 273,5 + 12,3 263,2 + 52,3 EXEMPLE 4 Détermination quantitative de la teneur en lysolécithine dans le sérum sanguin d'un malade. Dans cet exemple, 100 ul du sérum sanguin sont ajoutés à 3 ml d'une solution tampon à 0,5 mole / litre de phosphate (pH 7,2) contenant 0,014 lu de PIB, 0,014 LU de GPD, 5 IU de CLDH et 0,6 mmole de TNTB. La réaction enzymatique est laissée s effectuer pendant 15 minutes à 37 C. Une fois la réaction terminée, l'absorption de la solution réactionnelle est mesurée àvec un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 550 ni. La coloration brun-rouge de la solution réactionnelle est comparée avec une courbe étalon obtenue en utilisant un composé standard. Comme témoin (procédé connu), le même sérum est développé par chromatographie en couche mince en utilisant du gel de si lice. L'échantillon résultant est incinéré et une couleur est développée en utilisant un réactif acide molybdique. La couleur est mesuree avec un densitomètre. Les résultats sont donnés dans le tableau 4. TABLEAU 4 Essai N0 Teneur en lysolécithine (mg/dl) Procédé de la présente invention Procédé antérieur 1 35,36 35,45 2 35,82 36,85 3 35,14 34,67 4 35,38 35,59 5 34,98 36,98 6 35,67 35,56 7 35,28 36,02 8 35,43 35,95 9 35,33 34,38 10 35,87 35,21 Moyenne 35,42 35,66 Ecart-type 0,28 0,83 Coefficient de variation 0,79 % 2,32 % EXEMPLE 5 sanguin Dans cet exemple, 100 ul de sérum/hnmain normal sont ajoutés à 3 ml d'une solution tampon à 0,15 mole/l de glycylglycine (pH 7,2) contenant 0,04 IU de PLB, 0,04 IU de GPD, 5 lu de CLDH, 5 lu de 3AI)H et 0,09 mmole de NÂD. la réaction enzymatique est laissée s'effectuer pendant 15 minutes à 37 C. Une fois la réaction terminée, l'absorption de la solution réactionnelle à 340 nm est mesurée avec un spectrophotomètre pour déterminer la teneur en NADH formé dans la solution. La teneur en lysolécithine est obtenue en comparant l'indice d'absorption avec une courbe étalon obtenue en appliquant le procédé ci-dessus sur une quantité connue de lysolécithine. (fabriqué par.Sigma Co., Ltd., sous le n de catalogue I 6626). Les resultats sont donnés dans le tableau 5. TABLEAU 5 Teneur en lysolécithine (mg/dl) Echantillon N 30 s 1 mn 5 mn 15 mn 1 13,25 17,66 17,69 17,58 2 11,65 15,35 15,36 15,32 3 15,23 20,10 20,11 20,08 4 12,51 16,83 16,86 16,75 5 11,23 14,92 14,95 14,89 EXEMPLE 6 Détermination quantitative de la teneur en lysolécithine de divers sérums. Dans cet exemple, le procédé décrit dans l'exemple 4 est répété sauf qu'on utilise 0,6 mmol de INT au lieu de TNTB et 10 échantillons de chacun des sérums sanguins humain normal et des sérums de malade (types IIa, IIb et IV) sont utilisés. Les résultats sont donnés dans le tableau 6. TABLEAU 6 Type de sérum Teneur en lysolécithine (mg/dl) Procéné de la présente invention Procédé antérieur Sérum humain normal 17,63 + 4,66 18,43 + 5,42 Sérum de malade type IIa 25,25 + 5,70 26,26 + 7,41 " " type IIb 35,36 # 9,23 35,97 # 11,45 " " type IV 27,08 # 8,64 26,84 # 11,77 EXEMPLE 7 Détermination quantitative de la teneur en lécithine du sérum sanguin de malade. Dans cet exemple, 20 pl de sérum sanguin sont ajoutés à 3 ml d'un tampon à 0,15 mole/l de phosphate (pH 7,2) contenant 0,014 lu de PLD, 5 lu de CLDH et 0,6 mmole de TNTB/ On laisse s'effectuer la réaction enzymatique pendant 15 minutes à 37 C. Une fois la réaction terminée, l'absorption de la solution réactionnelle à 550 nm est mesurée avec un spectrophotomètre. La couleur de la solution réactionnelle est comparée avec une carte de couleur étalonnée obtenue selon le procédé décrit ci-dessus en utilisant de la lécithine comme composé normalisé. Comme témoin, le procédé de la méthode antérieure décrit dans l'exemple 4 est répété sur le même sérum. Les résultats sont indiqués ci-dessous dans le tableau 7. TABLEAU & BR Essai N Teneur en lécithine (mg/dl) Procédé de la présente invention Procédé antérieur 1 126,88 126,88 2 128,47 130,50 3 126,48 138,45 4 124,08 117,50 5 128,88 118,50 6 128,67 143,51 7 127,87 141,24 8 126,08 114,71 (à suivre) TABLEAU 7 (suite) Essai N Teneur en lécithine (mg/dl) Procédé de la présente invention Procédé antérieur 9 124,28 124,48 10 129,07 134,46 Moyenne 126,57 126,02 Ecart type 1,97 9,96 Coefficient de variation 1,55 7,90 EXEMPLE 8 Détermination quantitative de la teneur en lécithine du sérum humain sanguin normal. Dans cet exemple, 20 l de sérum sanguin sont ajoutés à 3 ml d'une solution tampon à 0,15 mole/1 de glycylglycine (pH 7,2) contenant 0,04 lu de PLI), 5 lu de CLDH et 0,09 mmol de RAD et la réaction enzymatique est laissée s'effectuer pendant 15 minutes à 37 C. La teneur en NÂDE formée dans la solution réactionnelle est déterminée en utilisant un spectrophotomètre. Une augmentation dans l'absorption à 340 n est contrôlée pendant 15 mi nutes. Les résultats sont donnés dans le tableau 8. TABLEAU 8 Teneur en lécithine (mg/dl) Echantillon 124,6 124,8 128,3 126,61 3 s 1 mn 5 mn 15 mn 1 2 126,8 127,7 130,1 128,1 3 125,2 126,0 128,6 127,2 4 123,8 123,7 124,4 123,8 5 128,6 128,4 132,0 130,7 EXEMPLE 9 Dans cet exemple, on répète le procédé décrit dans l'exem- ple 7, sauf qu'on utilise 0,6 mmol de INT à la place de TNTB et 10 échantillons de chacun des sérums sanguins humains normaux et des séruns sanguins de malade sont utilisés (types IIa, IIb et IV). Les résultats moyens sont donnés dans le tableasu 9. TABLEAU 9 Type de sérum Teneur an lécithine (mg/ml) Procédé de la pésente invention Procédé antérieur humain normal 128,3 # 4,8 128,85 # 8,75 type lia 175,18 # 9,8 173,68 + 12,34 type IIb 219,90 + 10,8 226,05 + 12,84 type IV 174,88 + 11 ,04 173,69 + 16,72 EXEMPLE 10 Détermination quantitative de la teneur en sphingomyéline dans le sérum sanguin. (1) Détermination de la teneur totale en lécithine et sphingo myéline dans le sérum sanguin. Dans cet exemple, 20 l de sérum sanguin sont ajoutés à 7 ml (pH 7,2) d'une solution à 0,15 mole/l de phosphate conte- nant 0,04 lu de PIC, 5 lu de phosphatase, 5 IU de CLDH et 0,6 mmol de TNTB. On laisse s'effectuer la réaction enzymatique pendant 15 minutes à 37 C. Une fois la réaction terminée, l'absorp- tion de la solution réactionnelle à 550 nm est mesurée et l'indice d'absorption est comparé avec une carte de couleur calibrée obtenue en déterminant selon le procédé décrit ci-dessus et en utilisant une quantité connue de L-&alpha; -lécithine comme composé normalise. Comme résultat, la teneur totale en lécithine et en sphingomyéline est obtenue. 2) Détermination de la teneur en lécithine dans le sérum. Dans cet exemple, le procédé décrit dans la détermination ci-dessus de la teneur totale en lécithine et sphingomyéline est répétée sauf qu'on utilise 0,04 lu de PLD à la place de PIC et de la phosphatase. Comme résultat, la teneur en lécithine dans le sérum sanguin est obtenue. La teneur en sphingomyéline est calculée en soustrayant la teneur en lécithine de la valeur totale. Comme témoin, le procédé du mode opératoire connu décrit dans l'exemple 4 est répété sur le même sérum. Les résultats sont donnés dans le tableau 10. TABLEAU 10 Procédé de la présente invention Procédé Essasi N (mg/dl) Lécithine antérieur + Sphingo Sphingo- Lécithine myéline myéline 1 167,20 126,88 40,32 41,69 2 171,35 128,47 42,88 3 165,56 126,46 39,08 37,85 4 163,85 124,08 39,77 42,32 5 169,53 125,88 43,65 37,01 6 170,20 128,67 41,53 38,35 7 168,35 127,87 40 > 48 43,32 8 171,12 128,08 43,04 41,51 9 165,35 124,28 41,07 40,21 10 168,82 129,07 39,75 39,35 Moyenne 168,13 126,97 41,15 40,78 Ecart type 2,57 1,78 1,57 2,80 Coefficient de variation 1,53 1,40 3,81 6,86 EXEMPLE 11 Détermination quantitative de sphingomyéîine dans le sérum sanguin. (1) Détermination de la teneur totale en lécithine et sphlngo- myéline. Dans cet exemple 20 pl de sérum sanguin sont ajoutés à 3 ml d'une solution tampon renfermant 0,15 mole/1 de glycyl-glycine (pH 7,2) et contenant 0,04 lu de PLO, 5 IU de phosphatase, 5 IU de ONDE, 5 lu de BADH et 0,09 mmol de NAD, On laisse s'effectuer la réaction enzymatique pendant 15 minutes à 37 C. Une fois la réaction terminée, l'absorption de la solution réactionnelle à 340 nm est mesurée1 pour déteemi- ner la NADH formée dans la solution réactionnelle1 avec un spectrophotomètre. La courbe d'étalonnage décrite dans l'exemple 10 est utilisée comme courbe étalon. (2) Détermination de la teneur en lécithine. Dans cet exemple, le procédé décrit dans la détermination ci-dessus de. la teneur totale en lécithine et sphingomyéline est répété sauf qu'on utilise 0,04 lu de PLD à la place de PLC et de phosphataseO La teneur en sphingomyéline est calculée de la même manière que dans l'exemple 10. Les résultats sont donnes dans le tableau 11. TABLEAU 11 Procédé de la présente invention (mg/dl) Procédé Essai N -------------------------------------- antérieur lécithine SphIngo- (mg/ml) Lécithine myéline Sphingo myéline 1 213,6 161,3 52,3 56,3 2 215,4 459,6 55,8 51,7 3 209,5 162,1 47,4 49,6 4 210,3 161,2 49,1 55,8 5 213,2 160,8 52,4 52,7 6 211,2 163,0 48,2 48,6 7 208,9 159,4 49,5 43,8 8 214,3 156,3 58,0 52,8 9 215,0 162,1 53,9 49,6 10 214,2 159,6 54,8 58,4 Moyenne 212,5 460,5 52,1 51,9 Ecart type 2,37 1,91 3,53 4,28 Coefficient de 1,1 1,2 6,7 8,2 variation EXEMPIE 12 Dans cet exemple, les procédés décrits dans les exemples 10 et Il sont répétés sur 10 échantillons de sérum.Quand la détermination guantitative de la sphingomyéline est calculée, la corrélation par combinaison de la détermination de la forme réduite de l'accepteur (absorption dans la partie visible) et celle de NADIR (absorption dans la partie ultraviolette) est étudiée. les résultats sont donnés dans les tableaux 12 et 13. TABLEAU 12 Procédé selon Procédé selon l'exemple 10 l'exemple 11 P Q P' Q' Echantillon N Lécithine Lécithine + Lécithine + Lécithine sphingo- sphingo myéline myéline 1 167,2 128,4 166,7 127,9 2 213,3 464,1 214,5 165,3 3 269,8 204,2 267,3 208,3 4 233,6 175,2 233,8 174,5 5 214,5 162,4 212,3 159,9 6 267,9 202,3 268,3 203,1 7 283,2 219,9 281,9 220,1 8 201,0 159,3 200,3 261,1 9 226,7 174,9 224,3 173,8 10 174,2 132,1 173,1 133,0 TABLEAU 13 Teneur en sphingomyéline (mg/ml) P - Q P' - Q' P - Q' P' - Q 1 38,8 38,8 39,1 38,8 2 49,2 49,2 48,0 50,4 3 65,6 59,0 61,5 63,1 4 58,4 59,3 59,1 58,6 5 52,1 52,4 54,6 49,9 6 65,5 65,2 64,8 66,0 7 63,3 61,8 63,1 62,0 8 41,7 39,2 39,9 41,0 9 51,8 50,5 52,9 49,4 10 40,3 40,1 39,4 41,0 Corrélation entre P et P' Coefficient de corrélation &gamma; = 1,00, Y = 0,99X + 1,54 Corrélation entre Q et Q' Coefficient de corrélation &gamma;= 11,00, Y = 1,02X - 3,03 Corrélation entre P-Q et P'-Q' Coefficient de corrélation &gamma; = 0,98, Y = 0,93X + 2,56 Corrélation entre P-Q' et P'-Q Coefficient de corrélation &gamma; = 0,97, Y = 0,96X + 1,82 R E V E N D I C A T I O N S 1. - Composition pour la détermination de phospholipides dans un échantillon comprenant : - un premier constituant comprenant au moins un enzyme choisi parmi le groupe consistant en phospholipase D, phospholipase C et phosphatase,} et phospholipase B et glycérophospho- rylcholine-diestérase; et - un second constituant comprenant un réactif pour la détection de la choline. 2.- Composition selon la revendication ol, caractérisée par le fait que ledit réactif de la choline est la choline déhydrogénase et un accepteur d'hydrogèe. 3.- Composition selon la revendication 2, caractérisée par le fait qu'elle contient en outre la bétame-aldéhydeZdéBydro- génase et le nicotinamide-adénine-dinucléotide. 4.- Composition selon la revendication 1, caractérisée par le fait que ledit phospholipide est la lécithine et que ledit premier constituant est la phospholipase D. 5.- Composition selon la revendication 1, caractérisée par le fait que ledit phospholipide est la lysolécithine, et que ledit premier constituant est la phospholipase B et la glycérophosphorylcholine-diestérase. 6;- Composition selon la revendication 1, caractérisée par le fait que ledit phospholipide comprend la lécithine et la sphingomyéline et que ledit premier constituant est la phospholipase C et la phosphatase. 7.- Composition selon la-revendication 1, caractérisée par le fait que ledit phospholipide comprend la lécithine, la sphingomyéîine et la lysolécithine, et que ledit premier constituant comprend la phospholipase B, phospholipase C, phosphatase et glycérophosphorylcholine-diestérase. 8.- Procédé pour déceler les phospholipides dans un échantillon qui comprend la réaction dudit échantillon avec un système de formation de la choline constitué par un ou plusieurs enzymes choisis dans le groupe consistant en phospholipase D, phospholipase C et phosphatase, et phospholipase 3 et glycérophosphorylcholine-diestéase, pnis la réaction de la solution résultante avec un système détecteur de la choline comprenant une choline-déhydrogénase et un accepteur d'hydrogène. 9.- Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que ledit système détecteur de choline comprend en outre la bétaine-aldéhyde- et le nicotinnmide-adéiine - dinucléotide.