Brevet FR2391753A1 — publié le 19781222

La présente invention concerne le domaine de la préparation des matières échangeuses d'ions à des fins d'adsorption des toxines endo- et exogènes à partir du sang et, plus précisément, elle concerne un procédé de préparation d'un sorbant pour extraire l'hémoglobine libre. Les sorbants obtenus suivant le procédé proposé peuvent être utilisés pour l'élimination des états hémolytiques d'une étiologie quelconque. On contact un procédé de fixation de substances biologiquement actives, par exemple, des enzymes et des protéines pour la destruction du saccharose (Fillippusson H.,llorrty W.E., Biochem. J. 120, 215 (1970)). Le procédé consiste à faire nitrer un polystyrolène avec une solution de l'acide nitrique dans l'acide sulfurique concentré à une température de OOC, à réduire par une solution à 6% de Na2S203 dans une solution 2N de KOH et à diazoter avec une solution de NaN02 dans une solution 0,6N de HC1. Par traitement de la polystyrolène-amine diazotée obtenue par la B-fructofurannosidase en présence de protéine, on a obtenu des enzymes fixés, la fixation de la protéine ne dépassait alors pas 0,5% à 1% en poids. Cependant, une faible hydrophilie des copolymères ainsi obtenus provoque une certaine dénaturation partielle de la protéine et n'assure qu'une faible sorption de celle-ci de l'ordre de 10 à 60 mg/g. Une faible stabilité du composé diazotique dans des milieux légèrement acides, caractéristiques de la stabilité des solutions protéiques, ne permet de fixer sur le polymère que des quantités insignifiantes du composant protéique. De plus, grâce à une hydrophobie importante, les sorbants ainsi obtenus sont peu actifs dans les processus de la sorption de l'hémoglobine libre à partir du sang. La présente invention se propose de supprimer les inconvénients indiqués. On s'est donc proposé de mettre au point un procédé permettant de préparer des sorbants actifs pour extraire l'hémoglobine libre. La solution consiste en ce qu'on propose un procédé de préparation d'un sorbant pour extraire l'hémoglobine libre dans lequel, conformément à l'invention, on fait interagir un polyampholyte de départ contenant des groupements aminés et des groupements acides sulfoniques ou phosphoniques, après diazotation, avec l'albumine de sérum sanguin ou l'haptoglobine à une température jusqu'à 400C avec un lavage ultérieur visant à séparer le sorbant obtenu de la protéine. Pour fixer une forte quantité des composants protéiques, il est recommandé en qualité de polyampholytes de départ d'utiliser 2 les polyampholytes à surface spécifique au-delà de 10 m /g. Le procédé proposé est mis en oeuvre de la manière suivante. On synthétise des sorbants pour l'hémosorption par fixation de l'albumine ou l'antagoniste de l'hémoglobine-haptoglobine sur la surface des polyampholytes diazotés, contenant simultanément des groupements aromatiques aminés et des groupements acides sulfoniquesou phosphoniques. L'utilisation des polyampholytes dans la réaction de diazotation permet d'obtenir un taux élevé de conversion sur les groupements diazoïques (3,5 à 4,0 millimoles/g), ainsi que d'augmenter la stabilité des groupements diazotques. Lesgroupem#nsdîazorques obtenus sur les polyampholytes, à l'absence de la protéine, sont stables à la température de 00C dans une solution 0,14 N de NaCl pour le compte de la présence dans la structure des groupements acides sulfoniques et phosphoniques, les composés diazoïques obtenus se trouvent alors sous une forme intrasaline stable. En même temps, après l'addition de la solution de protéines au polyampholyte diazoté obtenu suivant le procédé en question, la réaction d'interaction avec la protéine se déroule à un taux de conversion élevé comparativement au procédé connu, pour le compte de la plus forte hydrophobie des polyampholytes. Le procédé proposé permet d'obtenir des sorbants contenant de 250 à 800 mglg de protéines fixées. Le procédé peut être généralement réalisé sur des échangeurs de cations, de préférence sulfonés et phosphorés avec l'obten- tion préalable des polyampholytes de leur nitration et la réduction subséquente. Le procédé peut être effectué pour la fixation de diverses protéines - l'albumine ou l'haptoglobîne. La fixation de l'haptoblogine qui est un antagoniste de l'hémoglobine libre, assure l'obtention des capacités dépassant comparativement à l'albumine de 6 fois selon l'hémoglobine libre. La conservation d'une spécificité élevée de l'hapto- globine fixée à la sorption de l'hémoglobine libre permet de confirmer que la modification de la structure native de l'haptogiobine lors de la fixation chimique par le procédé en question est insignifiante. En qualité de produits de départ, on peut utiliser des polyampholytes d'une structure gélatineuse et macroporeuse, cependant, dans le cas d'utilisation d'échangeurs d'ions de basse porosité d'une surface inférieure à 10 m/g, on n'a pas réussi à fixer sur ceux-ci des quantités importantes de composants protéiques. Quand le sang hémolysé est admis dans une colonne de 5 cm2 de section et 7 cm de haut, contenant 19 g de sorbant avec l'haptoglobine fixée, avec un débit de 75 ml/mn pendant 2 h, la capacité de la colonne est de 1,4 à 1,8 g d'hémoglobine libre par colonne, même en l'absence de l'hémoglobine libre à la sortie de la colonne, c'est-à-dire à sa saturation incomplète.L'hémoperfusion dans une colonne de 200 ml de volume dans le même régime permet d'extraire environ 9 g d'hémoglobine libre, ce qui surpasse la quantité totale d'hémoglobine libre dans le sang à l'état pathologique incompatible avec la vie (environ 2 g/l). Les échangeurs d'ions synthétisés par le procédé proposé peuvent être employés dans le traitement des états hémolytiques aigus, caractérisés par une augmentation du niveau de l'hémoglobine libre, tels que le syndrome d'écrasement (large multiplication des tissus avec la destruction des érythrocytes), des brûlures généralisées, une transfusion incompatible, des maladies hémolytiques des nouveaux-nés, des intoxications exogènes avec les toxines hémolytiques (par exemple, l'acide acétique). Le sorbant obtenu suivant le procédé objet de l'invention peut être utilisé en qualité de "piège d'hémoglobine" à la sortie des appareils de la cirulation artificielle, avec des coefficients d'hémolyse de 0,14 à l,09/g d'hémoglobine libre (par 100 litres de sang transfusé par l'appareil) supérieurs à la valeur critique de 0,1. La vitesse normale de l'hémolyse compensée par ltorganisme est d'environ 7,35gd'hémoglobine libre par jour pour l'homme à poids corporel de 70 kg. Le sorbant permet de diminuer la teneur en hémoglobine libre jusqu'à la norme dans le cas des états hémolytiques aigus ou de prolonger la durée de fonctionnement des appareils de la circulation artificielle donnant une hémolyse partielle. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre de plusieurs exemples de réalisation concrets. Exemple 1 10 g de copolymère de styrolène macroporeux avec 20% en poids de divinylbenzène, obtenu en présence de 80% en volume d'isooctane en qualité de solvant inerte, sont soumis à la phosphorylisation par le trichlorure de phosphore en présence de trichlorure d'ammonium, sont hydrolysés, lavés trois fois respectivement avec une solution aqueuse à 3% de NaOH, à lteau et une solution à 3% de HC1, séchés, inondés par 80 mi de mélange d'acide nitrique à 93% et d'acide sulfurique à 95% dans un rapport de 1/2. Le mélange réactionnel est maintenu pendant 24 heures à la température ambiante.On lave le produit avec l'eau, on réduit par un mélange contenant 110 g de SnC12, 2H20 dans 340 ml d'acide chlorhydrique concentré, pendant 10 heures à une température de 100 C. Après réduction, le nombre de groupements aminés constitue 4 milliéquivalents-gramms, la quantité de groupements phosphono-acides étant de 3,2 milliéquivalents#grammes. On place le produit obtenu dans une solution contenant 38 g de NaN02 dans 200 ml d'une solution 6N d'acide chlorhydrique à une température de oac. On maintient le mélange réactionnel pendant 4 h à une température ne dépassant pas 5 C. On lave le polyampholyte 2 diazoté à une surface spéficique de 40 m2/g obtenu avec une solution 0,14N de NaCl à un pH de 8,0 refroidie jusqu'à la température de OOC. La quantité de groupements diazoïques est de 4 à 3,5 milliéquivalents-grammes. On ajoute le polyampholyte diazoté dans une solution à concentration en haptoglobine de 8 mg/ml. On conduit la réaction pendant 2 heures à une température de 200C Ensuite, on porte la température jusqu'à 300C et on maintient encore 2 heures jusqu'à la cessation du dégagement des bulles d'azote. On lave le polyampholyte obtenu avec l'eau distillée. La quantité d'haptoglobine fixéeconstitue 0,8 g/g d'echcngeur d'ions. Le sorbant en question extrait du sang laqué lors de la perfusion pendant 20 mn 1,5 g d'hémoglobine libre par 1 g de sorbant, avec un débit du sang de 40 ml/ma à travers une colonne de 5 ml de volume, chargée de 3 g d'échangeur d'ions. Exemple 2 10 g de copolymère de styrolène avec 30 % en poids de divinylbenzène, obtenu en présence de 100% en volume d'isooctane, sont soumis à la sulfuration, par l'acide sulfurique en présence de Ale13 en qualité de catalyseur, puis lavés 9 l'eau. La capacité statique d'échange sur une solution 0,lN de NaOH est de 4,2 milliéquivalents-grammes. On nitre le sorbant desséché d'une manière ana ligue à celle décrite dans l'exemple 1, avec 80 mi de mélange d'acide nitrique à 93% et d'acide sulfurique à 95% dans un rapport de 1/2 à la température ambiante pendant 12 heures, on lave a l'eau et on réduit par un mélange renfermant 110 g de SnC12, 2H20 dans 340 ml d'acide chlorhydrique concentré. On conduit la réduction pendant 10 heures une température de 1000C. La quantité de groupements aminés est de 3,2 milliéquivalents#gramses. On place le polyampholyte ayant une surface spécifique de 40 m2/g dans une solution contenant 38 g de NaNO2 dans 100 ml d'une solution 6N d'acide chlorhydrique, refroidie jusqu'à la température de OOC. On conduit la réaction pendant 4 heures à une température ne dépassant pas 50C. On lave le polyampholyte obtenu avec une solution 0,14 N de NaCl et à un pH de 8,0 à une température de 0 C. La quantité dé groupements diazoiques est de 3 milliéquivalents-grammes. Le polyampholyte diazoté est ajouté à une solution d'une concentration en haptoglobine de 10 mg/ml. On effectue la réaction pendant 2 heures à une température de 200C et pendant 2 heures à une température de 300C jusqu'à la cessation du dégagement des bulles d'azote. On lave le polyampholyte obtenu à l'eau. La quantité d'haptoglobine fixée constitue 0,8 g/g. Dans les conditions de l'exemple- 1, le sorbant absorbe à partir du sang laqué 0,8 g d'hémoglobine libre par 1 g de sorbant On n'a observé aucune modification du niveau des éléments figurés du sang - les thrombocytes, les leucocytes et les érythrocytes. Exemple 3 Le polyampholyte diazoté, obtenu suivant l'exemple 1, est lavé avec une solution 0,14 N de NaCI à un pH de 8, à une température de 00C et est filtré. Dans une solution d'albumine d'une concentration en celle-ci de 10 mg/ml, on ajoute le polyampholyte diazoté pendant 2 heures à une température de 40 C. Le polyampholyte avec l'albumine chimiquement fixée est lavé à l'eau jusqu'à l'élimination de l'albumine excédentaire. La quantité d'albumine fixée sur le polyampholyte constitue 0,2-0,3 g/g. Le polyampholyte ne détruit pas les thrombocytes et ne provoque pas leur agrégation au cours du processus d'hémosorption. La sorption du potassium constitue 0,5 milliéquivalent-gramme. La sorption de l'ammonium constitue 0,1 milliéquivalent-gramme. Exemple 4 Le polyampholyte diazoté, obtenu comme dans l'exemple 2, est ajouté à la solution d'albumine avec la concentration en celle-ci de 10 mg/ml. On conduit la réaction pendant 3 heures à une température de 200C et pendant 3 heures à une température de 300C. La teneur en albumine fixée est de 250 mg/g. Après lavage d'après l'exemple 2 avec une solution 0,14 N de NaCl, le sorbant ne détruit pas les éléments figurés du sang au cours du contact prolongé avec le sang. En effet, le niveau de thrombocytes après la perfusion pendant 30 mn, sans une pompe, à une vitesse de 50 ml/mn est de 180 000 par mm , à un niveau de départ de 200 000 par mm . Le pourcent d'agrégation des thrombocytes n'a pas changé. Le niveau de leucocytes et d'érythrocytes reste pratiquement sans modification. Exemple 5 Le polyampholyte diazoté, obtenu et lavé d'une façon analogue à celle décrite dans l'exemple 2, est introduit dans une solution d'haptoglobine avec une concentration de 10 mg/ml, refroidie jusqu'à une température de 50C, est maintenu à cette température pendant 12 heures. La teneur en haptoglobine fixée est de 0,4 g/g. Dans les conditions de l'exemple 1 lors de la perfusion pendant 20 mn, le sorbant absorbe 0,6 g d'hémoglobine libre du plasma hémolysé par I g de sorbant. ExemBle 6 On a injecté à un chien bâtard, pesant 18 kg, l'eau distillée stérile par voie intraveineuse, goutte à goutte. De cette façon, la concentration en hémoglobine libre a été portée jusqu'au niveau de 240 % mg. Après cela, on a ouvert l'artère fémorale et la veine fémo- rale du chien sous anesthésie locale. Après canulation de ces vaisseaux, on a branché un système de perfusion constitué d'une colonne contenant 50 g de sorbant, obtenu comme dans l'exemple 3, d'un piège à air, des magistrales artérielle-et veineuse. Le sang de l'artère du chien passait avec une vitesse de 60 ml/mn par la colonne, dans laquelle après un contact immédiat avec les granules de sorbant, il se débarrassait de l'hémoglobine libre et revenait à travers la magistrale veineuse dans l'organisme de l'animal. Au bout de 40 mn de la perfusion, la concentration en hémoglobine libre à diminuée de 240 ~h mg à 34% mg, ce qui correspond à 70Z d'hémoglobine libre éliminée. Les paramètres physiologiques du sang : indices de l'équilibre acido-basique, niveau de protéine globale, de glucose, d'ion chlore ne sont pas modifiés avec une probabilité de #0 > 95. L'échangeur d'ions, obtenu suivant l'exemple 3 et lavé avec la solution physiologique, adsorbait le potassium, le calcium, le magnésium. L'échangeur d'ions, obtenu suivant l'exemple 3 lavé par la solution de Ringer Lock n'a pas changé le niveau des électrolytes cationiques avec une probabilité de On On On n'a pas observé de modification des éléments figurés du sang à la sortie de la colonne comparativement à la concentration initiale. Le pourcent d'agrégation des thrombocytes est diminué de 40 à 10%. Exemple 7 Pour la simulation d'une crise hémolytique causée par un trauma mécanique du sang, on a utilisé un appareil de circulation artificiel le (ACA) avec une pompe à galet. Pour faire cela, l'animal sous la narcose à la morphine-hexenale a été intubé pour la respiration contrôlée. On a effectué la thoracotomie transartérielle, on a connecté l'appareil de circulation artificielle à l'oreillette droite et on a simultanément ouvert la veine fémorale dans laquelle le shunt veineux de 1'ACA a été connecté. Une colonne, contenant 20 g de sorbant, obtenu selon l'exemple 1, a été connectée aux magistrales du sang, de pair avec une pompe et oxygénateur à l'aide des shunts de déviation. La vitesse de passage du sang à travers la colonne est de 60 ml/mn. La dynamique de la modification du niveau de l'hémoglobine libte lors du fonctionnement de 1'AGA avec la colonne connectée parallèlement, chargée de sorbant esi représentée sur le t#blo# T TABLEAU I Temps du travail de 1'ACA, en mn 0 30 60 90 120 Concentration en hémoglobine libre, % mg 0 130 170 150 80 Le tableau Il résume la dynamique du changement du niveau de l'hémoglobine libre dans l'essai de centrale (lors du travail de l'ACA sans colonne chargée de sorbant). TABLEAU Il Temps du travail de 1'ACA, en mn 0 30 60 90 120 Concentration en hémoglobine libre % mg 0 230 280 320 480 De ce fait, la connexion parallèle de la colonne chargée du sorbant contenant l'haptoglobine chimiquement fixée à 1'AGA, diminue considérablement la concentration en hémoglobine -libre du sang, en créant par cela les conditions pour un fonctionnement plus prolongé de l'ACA au cours des opérations chirurgicales graves avec un débrayage prolongé du coeur. R E V E N D I C A T I O N S 1. Procédé de préparation de sorbant pour extraction de l'hémoglobine libre, caractérisé en ce qu'on soumet à la diazotation le polyampholyte de départ, contenant des groupements aminés et groupements acides sulfoniques ou phosphoniques et à l'interaction avec l'albumine du sérum sanguin ou l'haptoglobine à une température jusqu'a 400C avec un lavage ultérieur visant à débarrasser le sorbant de la protéine. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'à titre de polyampholytes de départ on utilise des polyampholytes 2 à une surface spécifique supérieure à 10 m /g.