Brevet FR2361828A1 — publié le 19780317

L'invention concerne la conservation et la valorisation de végétaux frais, afin de permettre leur consommation sous une forme appétente au fur et à mesure des besoins, ultérieurement à leur date de récolte; elle concerne particulièrement un nouveau procédé de conservation par ensilage des végétaux, utilisant un mélange de souches bactériennes définies et d'enzymes spécifiques, sur supports appropriés; elle concerne également les produits et les moyens nécessaires pour la réalisation du procédé. L'invention s'applique également à des sous-produits humides des industries agro-alimentaires-. le problème de la conservation des végétaux, en particulier des fourrages pour l'alimentation du bétail stest posé de tout temps, puisqu'il concerne essentiellement la conservation du fourrage récolté au cours des mois de production, qui doit être consommé tout au long de l'année L'homme cherche à nourrir son bétail avec des aliments ayant gardé leurs qualités organoleptiques, donc avec des aliments frais et appétents, et cela pendant toute l'année, autant que possible à des prix de revient modestes. Toutes les actions de conservation des végétaux ont pour but de bloquer ou de détruire des proliférations intempestives de microorganismes se trouvant normalement à la surface de ces végétaux; ces proliférations permettent l'élaboration dlenzy- mes d'origine bactérienne, en particulier gazogènes, putréfiantes et alcalinisantes, aboutissant à la putréfaction du végétal, le rendant inappétent, voire toxique pour l'animal auquel il est destiné, et par conséquent impropre à la consommation animale. Ainsi connaît-on déåà les traitements par la chialeur, le froid ou la dessication, mais ces traitements sont chers. l'ensilage est un des procédés qui permet de conserver les végétaux sous une forme humide et appétente, à un prix de revient faible; cependant la réalisation de cette technique présente un certain nombre de difficultés que la présente invention contribue à résoudre. L'ensilage repose sur le principe de la conservation de végétaux frais pendant une période plus ou moins longue, dans une enceinte close et étanche, en milieu acide, dans le but d'empêcher le développement des germes putréfiants, alcalinisants et gazogènes, ces germes ne se développant pas en milieu acide.La réalisation d'un bon ensilage est difficile, et elle se heurte à de nombreux obstacles, les principaux étant la formation de produits de fermentation dangereux pour la santé des animaux Pour une meilleure compréhension des pratiques de base d'une bonne conservation, on décrit schématiquement, ci-après, les différentes phases qui se déroulent à la suite de la récolte des végétaux, puis dans le silo. Dès que le fourrage est coupé, les enzymes de la plante agissent sur les glucides et les protéines.Ces glucides sont transformés rapidement et complètement en d'autres sucres qui servent de principales sources d'énergie des microorganismes Une partie des protéines est transformée plus lentement jusqu'au stade d'acides aminés;- cette transformation s'arrête lorsque le pH descend en dessous de 4,5. la plante continue à respirer apres sa mise en silo, tant que l'air emprisonné dans la masse du fourrage contient de l'oxygène : cette respiration produit du gaz carbonique et de l'eau, ce qui entrat- ne une diminution des sucres nécessaires au développement ultérieur des bactéries lactiques.Il convient donc de réduire ces effets par la fermeture rapide et étanche du silo. les microorganismes, situés à la surface de la plante verte, se développent dans le silo, en utilisant comme matière nutritive le suc des cellules végétales, libéré dès que les cellules meurent par manque d'oxygène. Dans les premières heures qui suivent la mise en silo, ce sont des bactéries qui ont besoin d'oxygène qui se développent : elles concourent à la dégradation des protéines; il est donc important d'empêcher la prolifération des germes par une fermeture rapide du silo. Il se développe alors des microorganismes qui sont à la fois aérobies et anaérobies. Ces microorganismes transforment les sucres de la plante en acide acétique principalement, alcool, acide lactique et gaz carbonique, acidifiant ainsi le milieu. Ils cessent de vivre dès que le pH du milieu tombe en dessous de 5,5.Il n'y a pas intérêt à ce que ces.bactéries se développent. les bactéries lactiques agissent alors lorsque le milieu est anaérobie; elles produisent, à partir des sucres solubles disponibles, de l'acide lactique si elles sont du type homofermentaire, et un peu d'alcool et d'acide acétique Si elles sont du type hétérofermentaire. Ces bactéries se développent s'il y a suffisamment de sucres à leur disposition; l'ensilage s'acidifie ainsi rapidement, pour atteindre un pH inférieur ou égal à 4.Il est alors stabilisé, à condition que l'air ne pénètre pas dans le silo, car à ces faibles pH et en présence d'air il peut encore y avoir développement de moisissu res Si la prolifération des bactéries lactiques est insuffisan te, le pH ne descend pas assez rapidement à 4, et les bactéries butyriques, anaérobies peuvent se développer; ces bactéries attaquent les sucres résiduels et les transforment en acides butyrique et acétique, en gaz carbonique et en hydrogène, Élles atta- quent également l'acide lactique, pour former les mêmes dérivés; en outre, ces bactéries s'attaquent aux protéines qu'elles dégradent jusqu'au stade d'ammoniaque ou qu'elles transforment en amines. Elles sont les principaux responsables des échecs d'ensilage. Pour remédier à cette insuffisance d'acidité, en particulier dans le cas des végétaux pauvres en glucides fermentes ci bles, il est connu d'effectuer une acidification chimique par addition d'acides divers, en solution, et de bas prix : l'acide formique est le plus utilisé, ainsi qu'un mélange d'acide sulfurique avec du formAldéhyde. Mais la manipulation des acides n'est pas sans danger pour l'homme et le matériel. Cette addition d'acide s'accompagne d'une formation de jus d'ensilage par plasmolyse, c'est-à-dire passage direct de l'eau cellulaire vers le milieu extérieur.Ces jus, contenant de fortes quantités de substances nutritives, éminemment fermentescibles, telles que glucides solubles, acides amines et vitamines du groupe B, s'écoulent à l'extérieur et constituent une perte sensible de matière sèche, perte pouvant aller jusqu'à 3 à 4 ffi de la masse ensilée. D'autre part, la putréfaction de ces jus est très nauséabonde et constitue un facteur de pollution grave, reproché aux ensilages. Ltuti- lisation d'acide et de formol réduit l'appétence du produit ensilé D'autre part, la répartition de 11 acide au sein des végétaux n'est en général pas faite de façon homogène, ce qui est fréquent, compte tenu de la difficulté de mélange : les parties du silo qui n'auraient pas reçu une quantité suffisante d'acide se conservent mal. Il est également connu d'effectuer une acidification biologique par addition de bactéries très glucidolytîques dont la multiplication a pour conséquence une utilisation partielle des glucides végétaux et ltacidifiCatiOn progressive du milieu avec formation diacide lactique. Cependant, cette acidification biologique, simple dans son principe, est parfois difficile dans sa réalisation.En effet de nombreux obstacles s'opposent à la réalisation d'un bon ensilage : choix de souches, rapidité de leur culture, antagonismes bactériens aboutissant à leur neutralisa tion réciproque, croissance de bactéries indésirables, apportées par les végétaux Les bactéries proposées par l'art antérieur sont presque toujours celles de l'industrie laitière, qui ne se développent pas à la température ordinaire, dans un milieu exempt de lait ou de sous-produits du lait, comme décrit dans le brevet français 1 534 166; l'ensemencement direct de bactéries lactiques dans l'ensilage ne peut être réussi que dans le respect des condit ions complexes des séries de réactions physiques et chimiques décrites précédemment, et en fonction des conditions du: milieu, essentiellement pH, température, présence d'oxygène.De plus, ces bactéries utilisent essentiellement le lactose, rarement le maL- tose, et jamais l'amidon ou la cellulose, On a-décrit également des procédés, dans lesquels on ajoute dans le silo une matière première riche en glucides, par exemple des mélasses, des pulpes de betteraves déshydratées dans le but de fournir des glucides aux bactéries lactiques. les résultats obtenus sont irréguliers, car les glucides apportés, par- ticulièrement saccharose, sont relativement peu utilisés- par les bactéries lactiques naturelles.Cet apport-n'a pas d'influence sur les sélections bactériennes et agit davantage par une augmentation de la teneur en matière sèche, qui est un facteur favorisant la croissance des bactéries butyriques, L'incorporation de ces substances est difficile, voire impossible si on ne dispose pas d'une installation particulièrement adaptée. les pulpes dé- shydratées sont très coûteuses pour un apport nutritionnel faible. Un tel procédé est décrit dans le brevet allemand 1 492 903: il consiste à ajouter, dans le milieu à ensiler, un mélange d'orge et de malt. Ce procédé dépend étroitement des propriétés diastasiques du malt qui sont variables et difficiles à contrôler par l'utilisateur.D'autre part, cette action est lente à la température ordinaire, et les quantités nécessaires d'orge, source d'amidon, sont grandes, et leur incorporation dans le milieu d'ensilage est très coûteuse et difficile à réaliser. le rendement de transformation de l'amidon en acide lactique final est faible et la réaction s'établit très lentement. Ainsi, dans les techniques d'ensilage connues actuellement seuls les sucres solubles,contenus dans les végétaux, sont utilisés à la production d'acide lactique. Lorsquton a affaire à des végétaux pauvres en- glucides, notamment ceux du type légumineuses, l'ensilage est pratiquement impossible à réaliser dans de bonnes conditions; les bactéries lactiques n'ayant pas suffisamment d'élément nutritif pour se multiplier, le milieu est insuffisamment acidifié, et des produits toxiques se développent rapidement rendant le fourrage impropre à la consommation. le nouveau procédé suivant l'invention permet d'obtenir une fermentation lactique au détriment d'autres réactions biolo giaues indésirables, en créant les conditions indispensables à cette fermentation, c'est-à-dire, mise à la disposition des bactéries lactiques d'éléments nutritifs dont elles ont besoin pour leur croissance, sans apport d'éléments extérieurs, et destruction des bactéries indésirables.Ce procédé s'applique à la conservation à l'état frais, de toutes sortes d'espèces végétales, aussi variées et difficiles à traiter que, par exemple, le chou, la luzerne ou la betterave, La présente invention apporte un perfectionnement à la stabilisation de végétaux par acidification, qui non seulement s'applique à tous les végétaux utilisables, mais - de plus - augmente leur valeur nutritive. le procédé suivant l'invention permet d'ailleurs d'enrayer complètement toute fermentation butyrique, prolonge la duree possible de conservation qu'il rend pratiquement indépendante de la température, et améliore, dans une forte proportion, l'utilisation de l'azote végétal par les animaux. le nouveau procédé, suivant l'invention, qui comprend L'adjonction au fourrage ou autre végétal à ensiler d'au moins une souche bactérienne, capable de produire de l'acide lactique à partir de sucres fermentescibles présents, est caractérisé en ce que l'on ajoute, en même temps, un facteur de dégradation de glucides supérieurs en sucres fermentescibles. Ainsi, conformément à l'invention, des glucides supérieurs, notamment cellulose, pentosane, amidon, etc., présents dans le végétal à stocker, sont transformés en sucres pour être mis à la disposition des bactéries opérant la fermentation lactique; celle-ci ne peut donc pas être insuffisante et elle ne diminue pas la teneur en sucres fermentescibles du végétal. Le facteur de dégradation de glucides supérieurs peut être constitué par des bactéries capables d'attaquer ces glucides ou/et par des enzymes appropriées. Une des formes d'exécution du nouveau procédé suivant l'invention consiste à introduire dans l'ensilage, au moment de l'exécution de celui-ci, au moins deux sortes de bactéries : les unes choisies parmi celles qui sont capables de dégrader les glucides supérieurs en sucres fermentescibles, et les autres susceptibles de transformer en acide lactique ces sucres fermentescibles. Plus particulièrement l'adjuvant des végétaux ou du fourrage, suivant l'invention, comprend au moins une souche microbienne capable de dégrader l'amidon en maltose, et au moins une seconde souche microbienne, transformant le maltose en acidelactique. Ainsi, contrairement à l'art antérieur, la présente invention permet de mettre toujours à la disposition des microorganismes, producteurs d'acide lactique, des quantités de sucre fermentescible suffisantes pour cette production lactique; quelle que soit ltespèce végétale traitée, on arrive ainsi à avoir assez de maltose pour que la formation d'acide lactique puisse avoir lieu jusqu'à un pH inférieur à 4,5* Cette formation est accélérée lorsqu'on ajoute des enzymes pour dégrader les glucides supérieurs En effet, suivant un trait facultatif, mais préféré de l'invention, le fourrage est également additionné d'une ou de plusieurs enzymes susceptibles de scinder des glucides, notamment la cellulose, les amidons, les pentosanes, etc., en sucres fermentescibles; en particulier l'hémi-cellulase et l'amylase sont fort utiles à ce point de vue pour assurer la formation de maltose, nécessaire à la production de l'acide lactique par les bactéries. On entend par hemi-cellulase un complexe à action enzymatique du type galactomanase, pectinase, béta-glucanase, xylanase et cellulase. Grâce à ce trait de l'invention, l'acide lactique est produit au détriment des glucides supérieurs, au lieu des sucres inférieurs de grande valeur nutritive. Cette transformat ion des glucides complexes en sucres assimilables et fermentescibles augmente la valeur nutritive du végétal ensilé : elle permet de meilleures performances zootechniques, par l'utilisation directe de ces derniers sucres, ou du moins par l'activation des bactéries du rumen, auxquelles ceux-ci apportent un supplément d'énergie. les souches de bactéries, utilisées suivant l'invention, présentent les caractéristiques communes suivantes : elles sont toutes susceptibles de faire fermenter le glucose, le réac tif VP (Vôges-Proskauer) et l'oxydase, alors quelles sont sans action sur l'inositol, le sorbitol, le citrate, l'urée et ne produisent pas d h S. Bien qu'il soit possible d'utiliser des ensembles choisis parmi de nombreux micro-organismes connus, en appliquant le principe de l'invention énoncé plus hauts des résultats particulièrement favorables sont obtenus avec certaines bactéries, Gram+, notamment des cocci et des bacilles. Le tableau ci-après donne les caractéristiques de telles bactéries. TABLEAU I Gocci Gram + Bacilles Gram + 1 2 3 4 5 6 7 Glucose + + + t t + + Mannitol ~ + + - + * + Inositol - - - - - - Sorbitol Rhamnose - + + - + + + Saccharose + - + - + * + Mélibiose - + + - + - - Amygdalite + + + - + + + Arabinose t + * - + + + Maltose + + + + - + - Amidon - - - - + - + Gélatine - - - - + - Catalase - - - - + + + O N P G (B galactosidase) - + - - + + + A D H (arginine dihydrolase) - - + - - - + L D C (lysine décarboxylase) - - - - - - T D A (tryptophane désaminase) - - - - - - Citrate H2S Urée - - - - - - Indole - - - - - - - - VP (Voges Proskauer) + + + + + + + Nitrates - - - - + + + Oxydase + + + + 9 + + On peut voir d'après les caractéristiques du tableau précédent que les deux types de bactéries employées exercent des actions complémentaires Ainsi les coques (n 1 à 3) font fermen ter la plupart des glucides simples- et surtout les glucose, saccharose et maltose. Elles prolifèrent donc abondamment tant que ces sucres sont présents dans le fourrage ; cela se traduit par la formation d'acide lactique et une baisse rapide du pH vers 4,5, donc par un arrêt complet de la fermentation butyrique.Cependant, cette prolifération des cocci aboutirait à une forte baisse de la quantité de sucres simples sus-indiqués; par contre, l'amidon, présent dans le végétal, resterait inutilisé, en raison da l'inaptitude de ces coques à l'attaquer : mais alors intervient la prolifération des bacilles (n0 5 & 7) qui scindent l'amidon en sucres assimilables par les autres bactéries du même groupe (nO 4 et 6). les bactéries, utilisables dans le procédé suivant l'invention, peuvent être cultivées à la manière classique sur gélose avec un milieu nutritif comprenant des farines de céréa les,.Elles sont telles que par exemple Streptococcus lactis, lactobacillus plantarum, leuconostoc mesentéroides (Betacoccus) etc.. les quantités de mélange sur support des bactéries en question, employées par tonne de fourrage haché, sont d'environ 10 à 15 kg, ce mélange sec renfermant une quantité de l'ordre de 100 000 à 1 million de cocci et 100 000 à 1 million de bacillus/ gv Au moment où le pH d'environ 3,8 à 4,2 est atteint dans la matière ensilée, ensemencée avec ces bactéries, le nombre de germes vivants, par gramme de matière, est de l'ordre de ?Oq, fles essais ont été effectués dans des silos de 4m3 de capacité sur du dactyle Lucifer récolté en juin, en début d'épiaison.Ce fourrage était haché finement et soumis au stockage dans trois conditions différentes A) sans aucun traitement; B) traité avec 3 litres d'acide formique/m3, à la manière connue et, C) additionné de 7 kg de la culture de 7 bactéries sur support, dont les caractéristiques sont indiquées plus haut (nO 1 à 7). Après 90 à 120 jours, l'analyse des trois ensilages conduit aux résultats ci-après (Tableau II). On peut voir que c1 est le traitement suivant l'invention qui conduit au pH le plus bas et à la teneur en acide lactique la plus forte; il présente l'avantage de ne donner lieu ni à ABLL N du N Solu Acides organiques et alcools NH NR3 ble g/kg MS pH % du au % du du action Acéti- Propio- Buty-cools N Tot. N Tot. que que que e rique non traité 4,34 14,1 49,8 77,6 29,1 2,5 0 7,8 B traite ment formi que 4,05 7,7 42,7 69,9 : 25,3 0,8 6,7 traité suivant l'inv. 4,02 7,7 48,1 95,0 , 14,7 0 0 11,0 ~ la formation de l'acide propionique, ni à celle de l'acide butyrique et seulement à environ la moitié de ltacide acétique qui se forme dans les autres procédés. La digestibilité et l'ingestibilité de ces ensilages ont été mesurées sur des moutons; on a trouvé après traitement à l'acide formique 0,68 UF/kg, tandis que le traitement suivant l'invention conduit à 0,74 UF/kg Le bilan de l'azote sur animaux en croissance conduit également à des résultats montrant l'intérêt du traitement suivant l'invention, comme on peut le voir au tableau III. TABLEAU III N Fécal N N Fécal urinaire N retenu ingéré % N Cjo' N N g/j g/j in- g/j in- g/j in géré géré géré t : non traité 20,3 7,45 36,8 12,70 62,7 0,12 0,6 trenatite formi j que 18,7 7,16 38,3 10,50 56,4 1,02 5,5 C : traité suivant l'inv. 16,7 6,28 37,7 8,24 49,5 2,14 12,8 Ainsi l'azote retenu est plus que double de celui que l'on obtient après le traitement formique. D'autres essais similaires ont été effectués sur du chou, la culture des bactéries ajoutées étant accompagnée d'une faible addition d'amylase et dthemicellulase. Dans ces conditions, on a constaté une diminution marquée de la teneur en cel lulose brute dans l'ensilage traité suivant l'invention, comme on peut le voir au tableau IV. DABIZAU IV A B C Non Traitement; Traité sui traité formique vant l'in Eau 92,67 88,22 vention Matières minérales Protéines brutes 2,07 2,80 1,94 Cellulose brute 1,72 1,66 1,02 Azote ammoniacal Q,095 0,074 0,055 Rapport NH3/N 28,8 16,5 17,7 Acide lactique 0,06 0,08 1,74 Acide butyrique 0,02 0,007 néant Acide propionique 0,09 0,06 néant Acide acétique 0,21 0,50 0,23 pH 5,30 4,55 3,95 le tableau V, qui suit, indique les caractéristiques de deux groupes de bactéries Gram +, Bacilli B8 à B14 et Streptocoques 54 à 57, convenant à la réalisation de l'invention. Ces bactéries ont été isolées d'une farine d'orge par la méthode sur gélose UP en tubes longs et étroits avec isolement par épuisement, ainsi que par la méthode de l'anaérobiose en bottes de Pétri, sur gélose. (Voir Tableau V page 11). les bacilles B8 et B9 sont des Lactobacillus plantarum, B10 et B11 sont des bacilles longs, B12 très longs, alors que les 313 et 314 sont des bacilles trapus. le Streptocoque 54 est un coque spécial, différent des autres; S5 est le Streptocoque lactique, tandis que les S6 et S7, aux réactions biochimiques identiques, se présentent tous deux en très fines colonies, mais diffèrent l'un de l'autre en ce que le Strepto S6 apparaît au gram sous la forme de chaînes courtes, tandis que S7 forme de petits amas de grosses coques. Par culture de ces souches on obtient les produits, suivant l'invention, à mélanger au fourrage au moment de la mise en silo. Bien que la culture puisse être effectuée à la manière connue en soi, il est préférable de la conduire de la façon suivante. Pour es Bacillus, milieu peu tamponne, pH 5 à 7,5, TABLEAU V Bacillus Streptocoques B8 B9 B10 B11 B12 B13 314 S4 S5 56 57 glucose + + + + t + + + + + + mannitol - - + + + + + + + inositol - - - - ~ ~ ~ ~ sorbitol - - - - - - - t t - m rhamnose - - + + + + + + + - o fi saccharose - - + + + + + + - + + m melibiose - - + + - + - + .+ - urPITdaline + + + + + + t a + arabinose + + + + + + -fr ~ catalase + + + O ONPG + Q + + ADH - + H - - + + + - - rl ai IDO - - - - - - - - - - ODC - - - - - - - - ~ ~ ~ X TDÂ - - - - - - - - - m citrate - - - - - - - - - - " H2S - - - - - - - - - - 0 urée - ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ indole - - - - - - - - - - V.P + + + + + + + + + + + nitrates - - + + + + + + + oxydase + + + + + + + + + + + assez riche en protéines, par exemple,en g/l : extrait aminé de levure de bière : 10 peptone pancréatique ou caséine 1,25 peptone Chapoteaut : 10 glucose : 4 NaCI : 5 lait écrémé : 5 Le milieu doit, au contraire, être fortement tamponné à pH 7-7,2; sa constitution peut être celle d'un bouillon glucosé ordinaire, par exemple (en g/l) : extrait aminé de levure de bière : 3,75 peptone pancréatique : 1,25 peptone Ghapoteaut : 10 NaCl 5 glucose 4 phosphate monopotassique : 0,7 phosphate disodique 8,3 Les cultures obtenues sont, de préférence, employées à l'état sec, en particulier lyophilisées. ~ VENDICA2IONS 1. Procédé de conservation et valorisation de végétaux en vert par acidification lactique à l'aide de bactéries ajoutées avant ensilage, caractérisé en ce que les bactéries capables de pro voquer la fermentation lactique sont accompagnées d'un facteur de dégradation de glucides supérieurs, notamment de la cellu lose et de l'amidon, en sucres fermentescibles, utilisables par les bactéries produisant la fermentation lactique. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le facteur de dégradation des glucides supérieurs est constitué par des bactéries susceptibles de faire fermenter le glucose, le réactif V P et l'oxydase, alors qu'elles sont sans action sur l'inositol, le sorbitol, le citrate et l'urée, et ne con duisent pas à la formation d'H2S, 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le facteur de dégradation des glucides supérieurs est constitué par une ou plusieurs enzymes, en particulier amylase ou/et hemi-cellulase. 4. Procédé suivant une des revendications I à 3, caractérisé en ce que les bactéries capables de produire la fermentation lac tique sont employées conjointement avec à la fois des bacté ries susceptibles d'attaquer des glucides supérieurs et des enzymes pouvant dégrader ces glucides. 5 Procédé suivant une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les bactéries, utilisées en vue de la fermentation lac tique, présentent également les caractéristiques de la reven dication 2, c'est-à-dire qu'elles peuvent faire fermenter le glucose, le réactif VP et l'oxydase, mais sont sans action sur l'inositol, le sorbitol, le citrate et l'urée, et ne produisent pas de H2S.- 6. Procédé suivant une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les bactéries employées sont Gram et appartiennent aux familles de bacilles et de coques. 7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que les bactéries sont des Bacillus, des Streptococcus ou/et Betacoc cus, en particulier des Streptococcus lactis, Lactobacillus plantarum et Leuconostoc mesentéroides. & Procédé suivant une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les bactéries utilisées sont obtenues par culture de souches isolées de céréales, en particulier de l'orge. 9. Procédé suivant une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la quantité de culture bactérienne avec son support, à l'état sec, ajoutée par tonne de végétaux à ensiler, est d'en viron 10 à 15 kg, cet additif renfermant 100 000 à 1 000 000 de germes vivants par gramme.