Brevet FR2367496A1 — publié le 19780512

L'invention due à Arutjun Eristoforovich SARKISOV et Svyatoslav Vs evolodovi ch PETROVICH, concerne un nouveau vaccin pour la prévention de la trichophytie chez les chevaux et un procédé pour la préparation de celui-ci. La triclAcphytie chez les chevaux est une affection infec ) e-se d'étiologie fongique. Des contacts fréquents des animaux provenant des fermes différentes quant à leur situation épizootique, ainsi que des hippodromes des sociétés sportives contribuent à l'expansion de l'affection, notamment à l'occasion de nombreuses compétitions sportives. Les chevaux atteints de la trichophytie ne sont pas admis aux épreuves sportives ni à la vente à l'enchère. La mise er oeuvre des mesures curatives, de désinfection et de quarantaine entraîne un long séjour des animaux dans les haras et les hippodromes. Les animaux malades sont un foyer de contagion pour le personnel et les sportifs. L'intérêt constamment croissant pour le sport hippique augmente le danger de l'extension de l'infection parmi les couches les plus diverses de la population. Les mesures de lutte contre la trichophytie sont réduites à la mise en oeuvre des traitements locaux des parties affectées de la peau, avec des agents médicamenteux, à la réalisation des mesures de désinfection et limitation et également à des traitements préventifs du tégunient. Cependant, ce travail difficile ne résout pas le problème de la prévention de la trichophytie chez les chevaux. Dans la littérature, on ne trouve point de données relatives à des remèdes efficaces pour la prophylaxie spécifique de la trichophytie chez les chevaux. Le nouveau vaccin proposé pour la prophylaxie de la tri chophytie des chevaux se présente, conformément à l'invention, sous la forme d'une suspension des microconidies d'une souche immunogène de Trichophyton equinum dans la solution physiologique à pH de 6,2 à 7,0, en concentration de 30 à 45 millions d'unités par ml de solution physiologique stérile. La suspension à côté des microconidies contient des fragments du mycé lium et des macroronidies. Tous les calculs de la concentra ion, de la viabilité du vaccin, etc. sont réalisés d'après les microconidies. Le vaccin revêt l'aspect d'une masse amorphe c'une couleur blanc-grisâtre.Les flacons dont l'obturation est détériorée ainsi que les flacons ouverts mais non utilisés entièrement le jour de l'immunisations ne sont pas aptes au service et leur contenu doit etre détoxifié en les chauffant à la température d'ébullition pendant une heure. Le produit doit être conserve a une température de +4 à +1200. Le vaccin est employé à des fins préventives pour l'immunisation des chevaux, tant c animaux jeunets qu'adultes. L'emploi du vaccin est inoffensif. Vers la fin du premier mois consécutif à l'immunisation les animaux inoculés acquièrent une immunité intense contre la contagion naturelle et expérimentale. La durée de liimmunité est d'au moins 5 ans. L'inection du vaccin aux animaux salins ne provoque pas d'affection trichophytique. Suivant l'invention le vaccin est injecté aux animaux, à des fins préventives, par voie intramusculaire, en doses de 1 à 2 ml, deux fois, à 10 à 14 jours d'intervalle. On injecte le vaccin dans la région du tiers moyen du cou. L'endroit de l'injection est préalablement désinfecté. 7 à 15 jours après la seconde injection, à l'endroit d'introduction du vaccin il apparat une mince crotte superficielle localisée de 15 wm de diamètre. Au bout de 15 à 20 jours la croûte formée se détache d'elle-même. lorsqu'on immunise les animaux infectés qui se trouvent dans la période de prépatence, l'introduction du vaccin accélère l'apparition des signes cliniques de la trichophytie, qui disparaissent habituellement sans emploi supplémentaire des médicaments L'injection aux animaux malades des doses doublées du vaccin (en comparaison avec les doses prophylactiques) aboutit à la guérison des animaux en 15 à 25 jours, sans emploi supplémentaire de médicament quelconque. Dans les conditions d'utilisation à grande échelle, le vaccin a montré une efficacité élevée, notamment de 95 à 98%. L'utilisation du vaccin à des fins prophylactiques supprime pratiquement tout à fait la morbidité des chevaux due à la trichophytie ; les frais et le travail des spécialistes vétérinaires, pour les médications répétées et les traitements visant la désinfection l'inexécution de la vente des chevaux de race et de sport le séjour prolongé des animaux malades dans les haras et les hippodromes la réduction des performances sportives des chevaux au cours des compétitions le danger de contagion des hommes. L'invention s 'étend également à un procédé d'obtention du vaccin. Le procédé de préparation du vaccin pour la prophylaxie de la trichophytie des chevaux consiste, conformément à l'inventions à cultiver la culture immunogène de Trichophyton equinum sur un milieu nutritif solide contenant des sources de carbone, d'azote et des substances biologiquement actives, à une température de 26 à 280C pendant 15 à 25 jours jusqu'à l'accumulation optimale des microconidies de ladite culture, à séparer ultérieurement la masse biologique à l'homogénéiser jusqu'à l'obtention d'une suspension de cellules individuelles du microorganisme à lyophiliser la suspension obtenue et à isoler le produit désiré. Il est préférable avant la réalisation de la lyophilisation de porter la suspension obtenue de cellules individuelles du microorganisme jusqu'à une concentration de microconidies de 200 à 400 millions d'unités par ml de milieu de séchage. Il est avantageux d'utiliser en qualité de milieu de séchage une solution renfermant de 35 à 45% en poids de saccharose et de 5 à 7% en poids de gélatine dans l'eau distillée. Le processus de préparation du vaccin comporte les étapes suivantes : ensemencement, culture et accumulation de la masse cultivée de champignon de la culture de la souche productrice du genre de Trichophyton equinum, homogénéisation de la masse de champignon, préparation de la suspension de cellules dispersées du champignon, normalisation, emballage, congélation, lyophilisation et contre du vaccin. En tant que culture immunogène de Trichophyton equinum, on peut utiliser, par exemple, la souche de Trichophyton equinum N L-2251/70 (URSS), déposée à l'institut vétérinaire expérimental de l'URSS, et qui peut être présentée à la demande d'une tierce personne. La souche indiquée présente des propriétés de culture et des aspects morphologiques et biologiques suivants: caractères des cultures. Lorsqu'on ensemence par pingre sur l'agar-moût (pH 6,2-6,8) et on cultive à une température de 26 à 280C, il se développe des colonies rapidement croissantes, étendues, parfois faiblement plissées. Le diamètre d'une colonie âgée de 20 jours est de 3 à 4 fois plus grand que chez les souches des champs. Lorsqu'on ensemence par suspension sur l'agar-moutZ il se forme, au 5ème-7ème jour, sur toute la surface de l'aga une pellicule plane, blanche comme la neige qui est une accusulation de la masse de micro- et macroconidies. Aspects morphologiques. Il se développe sur l'agar-mott des micro- et macroconidies abondantes. Les macroconidies sont rudimentaires et sont constituées en général de 2 à 3 segments, les chlamydospores sont ra ree et sont pratiquement absentes. Grâce à l'existence de la masse de micro- et macroconidies, le lavage de la culture sur la solution physiologique ou l'eau distillée a l'aspect d'une suspension dense couleur de lait. Propriétés antigènes. Le titre des sérums d'animaux immunisés (lapins, chevaux) est de 1:640 à 1:1280 (réaction d'agglutination). Caractères virulents. Lorsqu'on infecte les animaux de laboratoire (cobaye$, lapins) et les chevaux jeunes, il se développe au 7ème-15ème jour des petits foyers de 7 à 5 cm de diamètre. Les signes cliniques se manifestent faiblement. En 10-20 jours les animaux guérissent sans emploi d'agents médicamenteux quelconques. L'introduction d'un antigène vivant dans l'organisme du cheval sain ne provoque pas l'apparition des signes cliniques de la trichophytie chez l'animal. Caractères immunogènes. L'immunisation des chevaux jeunes produit chez eux la formation d'une immunité intense durant au moins 5 ans. L'introduction dés antigènes vivants provoque une prolifération des cellules immunologiquement compétentes. La réaction a d'abord un caractère plasmoblastique et ensuite plasmocytaire. En tant que milieu nutritif pour la culture du champignon on utilise l'agar-moût ou un autre milieu nutritif qui est susceptible d'assurer une propagation abondante de la végétation de champignon sans donner lieu à des pertes d'activité immunogène. Afin d'obtenir la matière d'ensemencement, on resuspend la culture de champignon lyophilisée avec la solution physiologique et on ensemence avec la suspension obtenue des matrices contenant le milieu nutritif On fait croitre la culture pendant 15-25 jours à une température de 26 à 280 C. On prélève la masse de champignon de la surface du milieu nutritif et on la transfère dans un homogénéisateur. On ajoute de l'eau physiologiqlle stérile et après homogénéisation on normalise la suspension, on la met dans des flacons, on congèle et on lycphilise. Il est préférable, avant de réaliser la lyophilisation, de porter la suspension obtenue de cellules du microorganisme jusqu a une concentration en microconiaies de 20C; à 400 millions d'unités parmldu milieu de séchage. Il est désirable d'utiliser en tant que milieu de séchage une solution contenant de 35 à 45% en poids de saccharose et de 5 à 7% en poids de gélatine dans l'eau distillée.En taut que milieu de séchage on peut utiliser n'importe quel autre milieu qui est susceptible d'assurer la conservation d'une quantité nécessaire de cellules vivantes après la réalisation de la lyophilisation. Le vaccin fini est soumis au contrôle pour vérifier l'absence de la microflore étrangère, la concentration des cellules vivantes du champignon, l'innocuité et l'activité immunogène L'invention sera mieux comprise à la lecture des exemples d'essai du vaccin et d'exécutiondl procédé procédé d'obtention de celui-ci. EXEMPLE 1. Essai et emploi du vaccin. Le vaccin a eté essayé sur des petits animaux de laboratoire et sur des chevaux. Les essais effectués sur les poulains âgés de 1 à 4 mois ont montré que la formation active d'une immunité intense s'est produite chez eux 14 à 30 jours après inoculation. L'étude de la durée et de l'intensité de l'immunité après introduction du vaccin a porté sur les 79 poulains qui dans 1,2,3, 4,8,12 mois et 1,5;3 et 4 ans après la vaccination ont été infectés avec les souches virulentes des germes responsables de la trichophytie. Les animaux non vaccinés et non atteints e trichophytie étaient choisis comme analogue et avaient servi de controle. Les animaux vaccinés ne sont pas tombés malades, tous les animaux témoins (non vaccinés) ont présenté des foyers trichophytiques caractéristiques. Dans les conditions d'entretien dans les fermes où l'on avait enregistré des cas de trichophytie, les chevaux immunisés n'ont pas été atteints de la maladie pendant 5 ans. Les animaux vaccinés se montraient résistants aux diverses souches épizootiques des germes générateurs de la trichophytie des chevaux. Les essais de commission du vaccin proposé ont été effectués sur les 32 poulains âgés de 6 à 9 mois. Les animaux d'essais ont été vaccinés et ceux de contrôle ont été laissés sans traitement dans le meme local. Un mois après l'immunisation les animaux expérimentaux ont été vérifiés quant à la réceptivité à la contagion à la trichophytie par onction des germes générateurs de Trichophyton equinum et Trichophyton mentagrophytes dans des sections scarifiées du tégument. Les essais effectués ont montré que 9yYo d'étalons vaccinés ont manifesté une résistance marquée à la contagion expérimentale avec des cultures virulentes de germatophytes : 10/0 d'animaux du groupe témoin sont tombés malades avec des signes cliniques marqués de la trichophytie et l'apparition des foyers secondaires de l'affectione L'étape suivante des essais sur l'efficacité prophylactique du vaccin consistaitdanslavaceination de tous les nouveau-nés dans un des haras du pays, où l'on observait chaque année la trichophytie des chevaux. Sur 280 poulains inoculés, on n'a observé la trichophytie pendant 5 ans (délai d'observation) que chez 3 animaux.L'éradication de la maladie dans la ferme était totale Un travail analogue a été réalisé dans un des hippodromes centraux, où tout le cheptel de chevaux tant présent qu'entrant a été vacciné. On a vacciné plus de trois mille chevaux au total de diverses races, tant de selle que de trot. L'observation, qui avait pour objet des animaux vaccinés n'a montré aucun cas de la trichophytiee Ensuite, le vaccin a été utilisé dans plusieurs haras, hippodromes et écoles de sport hippique où l'on avait enregistre des cas de trichophytie. Plus de 20 mille chevaux ont été vaccinés au total, ce qui a donné la possibilité de prévenir les nouvelles rechutes de la trichophytie, d'annuler les restrictions assignées aux fermes en ce qui concerne la vente des animaux de race, d'envoyer les chevaux de sport aux hippodromes g les frais pour la médication des animaux atteints de la trichophytie et pour la mise én oeuvre des mesures obligatoires de désinfection étaient complètement supprimés. EXEt2LE 2. Préparation de 25 mille doses du vaccin. En tant que milieu nutritif pour la culture du champignon de Trichophyton equinum lors de la préparation du vaccin on utilise l'agar-moût. Pour le préparer, on dilue le moût de bière non houblonné, stérilisé au préalable; avec de l'eau du robinet pure jusqu a ce que la teneur en hydrates de carbone d'après. Baling soit de 7% en poids, en ajustant le pli du mott à 6,8 7,0, on ajoute 2,5 à 3% en poids de gélose, en chauffant jus qu'à sa dissolution, on verse à raison de 300 ml, dans des matras (1,3 à 1,5 litres) et on stérilise pendant 40 minutes sous 0,5 à 0,7 atm. Après stérilisation, le pH de l'agar-moût est de 6,4 à 6,8. Pour obtenir la matière d'ensemencement, le contenu d'une ampoule renfermant de 3 à 5 ml de suspension desséchée de a souche productrice de Trichophyton equinum, est resuspendu dans 500 ml de solution physiologique stérile. La suspension ainsi obtenue, après avoir été maintenue pendant une heure à la température ambiante, est prise dans la pipette de flore ou-placée dans un siphon et est ensemencée dans des matras contenant l'agar-moût, à raison de 5 à 7 ml de suspension par matras. La croissance visuelle de la culture sur l'agar-moft est observée au 3ème ou 5ème jour. La durée de la croissance de la culture est de 15 à 25 tours. Pour la préparation de 25 mille doses du vaccin on utilise 50-100 matras contenant la culture de la souche immunogène. Toutes les opérations sont effectuées dans une cellule sous les conditions absolument stériles. Les matras contenant la culture sont ouverts au-dessus de la flamme d'un brûleur à alcool. On prélève la masse biologique de la surface du milieu nutritif et on la transfère dans des boites de Pétri. Ensuite, dans un homogénéisateur stérilisé on introduit la masse et on y ajoute l'eau distillée stérile à raison de 300 à 400 ml d'eau distillée pour la masse prélevée de 5 à 10 matras. On obture l'homogé- néisateur. En vue d'éviter la contamination, toutes les opérations de prélèvement de la masse et de son transfert à. -1 'ho- mogénéisateur sont effectuées au-dessus de la flamme d'une torche à alcool.L'homogénéisateur est mis en marche pour 15 à 20 minutes, åusqu'à l'obtention d'une suspension de cellules dispersées du microorganisme. On transvase la masse biologique de champignon homogénéisée dans des ballons, en portant la concentration de cellules à 200 à 400 millions de -micro- et macrosconidies par ml au moyen de la solution de saccharose et de gélatine. En tant que milieu protecteur du séchage, on prépare la solution de saccharose et de gélatine mentionnée. Pour la préparer, on ajoute à l'eau distillée chaude la gélatine à raison de 4 à 8% en poids et après sa dissolution on ajoute le saccharose à raison de 10 à 30% en poids, on filtre et on ajuste le pli à 7,0 - 7,4. On stérilise à la vapeur 3 jours consécutifs pendant 30 minutes ou pendant 40 minutes sous 0,5 à 0,7 atm. Après stérilisation, le pli doit être de 6,2 à 6,8. La suspension de cellules dispersées du microorganisme est versée dans des flacons stériles de 15 à 20 ml de capacité, à raion de 2 ml de suspension dans chaque flacon. Les flacons contenant la suspension, prêts au séchage, sont placés pour 10 à 20 heures dans des chambres de refroidissement à une température de -50 à 6000. Ensuite on place les flacons dans un appareil pour le séchage par sublimation. Le séchage est opéré pendant 40 à 60 heures. Après I à 3 heures de séchage, lorsque le vide atteint de 9 à 10 p, on branche le chauffage à une température de i25 à +40 C, et après 10 à 15 heures on règle le chauffage des soles du sublimateur de l'appareil de séchage à une température de 20 à 250C.L'humidité résiduelle du produit ne doit pas être inférieure à 1% et supérieure à 3fui. On effectue ensuite le contre du vaccin, sa solubilité, l'humidité résiduelle, la pureté à- l'égard des bactéries et la moisissure, la concentration en microconidies ainsi que la quantité de cellules vivantes, l'innocuité et l'activité immunogène. Pour étudier la dissolution, on introduit 10 ml de solution physiologique dans un flacon contenant le vaccin desséché. Le contenu des flacons sous agitation doit être dissous sans aucun résidu en 2 à 3 minutes. La vérification de l'absence de la microflore étrangère est effectuée par ensemencement sur des milieux nutritifs du contenu des flacons au choix. Pour l'identification de la flore bactérienne, on utilise les milieux suivants : agar à base de viande et de peptone, bouillon de viande et de peptone, milieu de Kitt-Tarozzi, et pour identifier les champignons étrangers on utilise des tubes à essai contenant le milieu de Czapek et l'agar-moût. On place les tubes à essai pour 10 jours dans des étuves réglées aux températures de +37 et +260G, Tous les ensemencements doivent être purs et ne doivent pas donner la croissance d'une microflore étrangère.L'humidité résiduelle est déterminée par séchage du vaccin pendant une heure sous pression atmosphérique à une température de 100 à 105 C d'après les méthodes courantes. La concentration en micro- et macroconidies est déterminée par calcul dans une chambre de comptage pour le calcul des éléments figurés du sang (par exemple, la chambre due Goryaev) Pour vérifier la viabilité (survie) des cellules de champignon, on resuspend le vaccin avec une solution physiologique stérile à pH de 6,2 à ?,0 jusqu'à son volume de départ (si le vaccin a été préconditionné dans des flacons de 2 ml on ajoute 2 ml de solution physiologique ; si le vaccin a été préconditionné dans des flacons de 4 ml, on ajoute 4 ml de solution physiologique, respectivement etc;).On prépare des dilutions du vaccin resuspendu en séries de 10 1 à 10 8 On ensemence le contenu des 6ème, 7ème et 8ème éprouvettes sur l'agar-moût. D'après les deux dernières dilutions dans lesquelles on observe la croissance des cellules de champignon, on déduit la quantité de cellules viables dans 1 ml de vaccin. L'innocuité et l'activité immunogène des séries du vaccin sont vérifiées sur des lapins ou des cobayes et des poulains. On introduit le vaccin resuspendu jusqu'à la dilution de travail par voie intramusculaire aux lapins en dose de 1 ml et aux cobayes en dose de 0,3 à 0,5 ml. On observe les animaux pendant 10 jours. Les lapins ou les cobayes doivent rester vivants pendant le temps d'observation. Les séries provoquant la mort d'un des animaux ou la complication à l'endroit d'introduction sous forme d'un abcès ou de nécrose du tissu, subissent une vérification réitérative sur un nombre doublé d'animaux visant à déterminer la présence de la microflore étrangère. Si l'un des animaux meurt ou qu'on met en évidence la présence de la microflore étrangère, la serie en uestion sera considérée inapte à l'immunisation. L'activité immunogène du vaccin est vérifiée sur des poulains âgés de 7 à 10 mois. Le critère pour estimer l'activité du vaccin est 1) la conformité du nombre de cellules viables d'au moins 200-300 millions ; 2) l'apparition d'une réaction locale après la vaccination des poulains, qui est exprimée par la formation à l'endroit d'introduction du vaccin d'un oedème maladif. L'oedème doit se former au 1er - 2ème jour après l'inoculation et se résorber en 3 à 5 jours. Le vaccin destiné à l'immunisation est conservé dans une armoire frigorifique à une température de +4 à +12 C. Avant utilisation, le vaccin desséché est dissous dans la solution physiologique stérile à pH de 6,2 à 7,0 à raison de 5 ml de solution physiologique par ml de suspension desséchée. A cette dilution la concentration en microconidies constitue de 30 à 45 millions dans îml de solution physiologique stérile. REVENDICATIONS 1. Vaccin pour la prophylaxie de la trichophytie des chevaux, caractérisé en ce qu'il est formé d'une suspension de microconidies de la souche immunogène de Trichophyton equinum dans la solution physiologique à pli de 6,2 à 7,0; en concentration de 30 à 45 millions d'unités dans 1 ml d'une solution physiologique stérile. 2. Procédé de préparation du vaccin pour la prophylaxie de la trichophytie des chevaux suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on fait croître la culture immunogène de Trichophyton equinum sur un milieu nutritif solide contenant des sources de carbone, d'azote et des substances biologiquement actives, pendant 15 à 25 jours à une température de 26 à 280C jusqu'à l'accumulation optimale des microconidies de ladite culture, on sépare ensuite la masse biologique, on la soumet à lthomogénéisation jusqu'à l'obtention d'une suspension de cellules dispersées du microorganisme et on isole le produit visé par lyophilisation de la suspension obtenue. 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce qu'avant la lyophilisation on porte la suspension de cellules individuelles du microorganisme obtenue à une concentration en microconidies de 200 à 400 millions d'unités par ml de milieu de séchage, 4. Procédé suivant la revendication 2 ou la revendication 3, caractérisé en ce qu'à titre de milieu de séchage on utilise une solution contenant de 35 à 45% en poids de saccharose et de 5 à 7% en poids de gélatine dans l'eau distillée.