Brevet FR2391472A1 — publié le 19781215

La présente invention est relative à un agent contenant une solution diluée de chlorure de sodium pour la détermination de processus infectieux et immunologiques dans des échantillons sanguins contenant du citrate de sodium. Comme essai pour la détermination de processus ou de phénomènes immunologiques, on connait Tressai de résistance des leucocytes selon Schröder (voir Folia Håematologica 94, 4, 1970, Akademische Verlagsgesellschaft Geestund Portig KG, Leipig; 1970, pages 314 à 325 ("l'essai de résis- tance des leucocytes comme procédé in vitro de détermination de l'effet d'anticorps antilymphocytaires et antigranulocytaires"). Celui-ci présente cependant l'inconvénient notable que les leucocytes doivent être dénombrés dans l'image sanguine et qu'il faut prendre en considération des modifications morphologiques déterminées des leucocytes.Cela conduit å des résultats instables, meme pour du personnel de laboratoire bien entrain et de bonne formation, comme on l'a constaté sur la base de quelques centaines d'expériences.. D'autre s essais immunologiques sont basés sur le principe de l'agglutination. Ceux-ci sont principalement constitués par l'essai de Coombs et ses variantes, dans lesquels on met toujours en contact un sérum contenant de l'antigène avec le sang de la personne à examiner. Tous les essais d'agglutination ne sont pas seulement qualitatifs. I1 y a également des essais de flo- culation du sérum qui donnent un titre, c'est-à-dire qui sont également exploitables quantitativement. Le prototype est constitué par la réaction de Gruber Widal.Cet essai est cependant adapté de manièreorigoureusement spécifique à certaines réactions antigne/anticorps et ne peut pas etre utilise comme base de départ pour d'autres réactions antigène/anticorps. Un inconvénient notable commun de tous les essais connus consiste en ce qu'ils ne donnent une indication quantitative qu'au moyen d'un titre dit de dilution. En outre, des essais connus présentent l'inconvénient que leur utilisation est limitéé à des cas déterminés. Lors de l'utilisation de différents procédés sérologiques connus et lors de ltévaluation des résultats, il a en effet lieu de tenir compte du fait que les anticorps présentent une réactivité spécifique vis-à-vis de l'antigène (c'est-à-dire conditionnée par des structures déterminées de l'antigène), mais que cette réactivité n'est pas nécessairement perçue par chaque procédé sérologique.Ainsi, il y a des anticorps précipitants et non précipitants, des anticorps fixant un complément et des anticorps ne fixant pas de complément, ainsi que des anticorps qui ne réagissent pas en milieu de chlorure de sodium ou qui ne réagissent qu'en milieu de sérum et en dernier ressort, meme des anticorps "réagines'qui, bien qu'ils provoquent une réaction positive de la peau dans l'essai de Prausnitz-Küstner, ne peuvent pas être perçus in vitro par un procédé sérologique connu actuellement. Il est donc clair qu'un anticorps non précipitant ne peut pas être fixé par la réaction de précipitation; il peut l'être par contre par la réaction de fixation de complément, lorsqu'il possède une proporiété de fixation de complément.Un résultat négatif dans le cas de l'utilisation d'un seul procédé sérologique ne doit donc pas nécessairement signifier qu'aucun anticorps n'est présent (Deutsch-Geyer : "Diagnostic de laboratoire, page 622). On connais. en outre un essai d'hémolyse dans lequel on détermine la résistance osmotique des érythrocytes (globules rouges du sang), voir N. Henning, Klinische Laboratoriumsdiagnostik, 3e Edition 1966, page 193. Cet essai ne permet cependant pas d'affirmations spécifiques sur les processus immunolo gique s. L'invention a pour but de procurer un agent pour examens sanguins au moyen duquel on peut déterminer des processus infectieux et immunologiques au cours d'un essai d'hémolyse immunologique qui est hautement spécifique, précis, utilisable de manière générale et déjà appliqué quantitativement en lui-même & qui peut être effectué de manière simple et avec une faible dépense, et avec lequel on obtient un taux de sécurité très élevé. On obtient ce résultat au moyen de l'agent et du procédé de mise en oeuvre de cet agent selon l'invention. On effectue les examens par mélange des échantillons de sang, préparés préalablement de façon connue avec du citrate de sodium, avec l'agent selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est constitué par a) une solution d'acide borique et une solution de citrate de sodium réunis, b) une solution diluée de chlorure de sodium, c) une solution de substances à examiner diluées de préférence dans un rapport d'au moins 1 in2 , en particulier d'environ 1 : 1012 ou préparées homéopathiquement, qui ont pu être obtenues par voie chimique synthétique ou qui peuvent être d'origine animale, végé tale ou minérale, et/ou d'antigènes de spécificité connue adaptée dans une solution isotonique saline, on sépare ensuite le sérum du mélange à la fin des réactions et on dose alors une substance libérée à partir des érythrocytes comme mesure du degré de l'hémolyse qui a eu lieu. Dans le cas des érythrocytes, les complexes antigènetanticorps se trouvent de manière prédominante à la surface des cellules sanguines rouges plus vieilles. Les complexes antigène/anticorps produisent intracellulairement une transformation de l'hémoglobine en bilirubine. De ce fait les membranes de cellule subissent un début d'endommagement. On a maintenant trouvé de manière surprenante que l'hémolyse borique n'agit que sur la fraction des érythrocytes- qui comportent une membrane de cellule ayant subie un début d'endommagement. En outre, on a trouvé de manière surprenante qu'une augmentation de la teneur intracellulaire en bilirubine des érythrocytes produite par des processus immunologiques, provoque une augmentation de la teneur en bilirubine dans le sérum lorsque l'hémolyse borique a eu lieu, proportionnellement à la quantité des complexes antigène/anticorps. On préfère en particulier la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention au moyen de la détermination de la teneur en bilirubine du sérum et en prenant pour base celle-ci comme mesure, étant donné qu'on obtient ainsi d'une manière particulièrement simple des résultats particulièrement remarquablement précis et hautement spécifiques, ce procédé est le plus sir du fait qu'on ne détermine que la bilirubine libérée à partir des érythrocytes âgés. Un autre avantage particulier de ce mode de réalisation du procédé conforme à l'invention réside dans le fait que la détermination de la teneur en bilirubine satisfait de naEère unique aux exigences du contrôle de qualité. Par ailleurs, il s'agit d'une détermination utilisable de manière routinière et générale. Le fait qu'on peut obtenir les meilleurs résultats au moyen de la détermination de la bilirubine conforme à l'invention est particulièrement surprenant, étant donné que le roule physiologique des érythrocytes, dans la mesure où il est connu jusqu'à maintenant, est rempli par la teneur en hémoglobine, I1 est cependant également possible de déterminer toutes les autres substances contenues dans les érythrocytes, comme l'hémoglobine, l'albumine et le potassium libérés et qui passent lors de l'essai'd'hémolyse borique dans le sérum d'examen. Pour la solution c) on peut utiliser des degrés de dilution allant jusqu'à I / 1030 et même davantage, des substances et/ou des antigènes à examiner, dilués ou préparés homéopatiquement, de spécifité connue appropriée. On peut aussi utiliser des mélanges de différents degrés de dilution des substances et/ou des antigènes de spécifité connue appropriée, à examiner et qui sont dilués ou préparés homéopESquement. Comme exemples de substances qui peuvent être obtenues par production chimique-synthétique ou qui peuvent être d'origine animale, végétale ou minérale, on peut mentionner des préparations médicamenteuses formées d'acide sulfurique, d'acide fluorhydrique et de carbonate de potassium, des préparations médicamenteuses formées d'extraits de plantes, tels que des extraits de digitale ou d'aloès, ainsi que de thuya, de gelsemium ou d'ignatia, des préparations médicamenteuses d'extraits d'organismes animaux, tels que d'abeilles ou de Sepia (seiche), et les préparations médicamenteuses de la série dite de Suis, pour lesquelles il s'agit de préparations d'extraits d'organes provenant de tous les organes de porcs possibles ("thérape de cellules franches homéo piquest'), ainsi que des produits allopathiques dits "homéopathisés", comme l'aminophénazone ou l'acide salicilique. Par addition de la solution cL on active des potentiels d'action biologiquement au repos d'une substance active, cette substance active étant elle-même ajoutée dans un état de dilution élevé ou sous forme de préparation homéopathique, ce qui est désigné par "effet de renforcement". On peut ainsi, conformément à l'invention, constater objectivement le médicament homéopathique correct (similum). Le fait qu'on peut utiliser pour les buts ci-dessus pratiquement toutes les substances dissoutes, qui ne doivent être diluées qu'à un degré élevé ou être "homéopathisées" constitue un avantage important de t'in- vention.Par addition d'antigènes fortement dilués ou homéopathisés, de spécificité connue, on obtient dans le cas d'une'spécificité appropriée d'un échantillon sanguin, un autre taux d'hémolyse borique (le plus souvent supérieur, parfois inférieur) que dans le cas d'échantillons ayant une spécifité non adaptée. Le niveau du taux d'hémolyse borique est en outre directement dépendant de la quantité de complexes antigène/anticorps "renforcés"-sur la surface de la cellule. Dans le cas d'un essai en série avec différents allergènes entrant en ligne de compte, on peut faire des affirmations tant qualitatives que quantitatives sur le potentiel antigénique de différentes substances chez un individu.On peut ainsi saisir principalement des antigènes "inférieurs au seuil", qui ne Qe manifestent pas cliniquement par des symptomes allergiques, mais qui sont cependant déjà actifs pathogéniquement dans l'organisme correspondant. Dans la plupart des cas, on obtient par la solution c) une augmentation de l'hémolyse borique (en comparaison avec la solution de comparaison, comme une solution de chlorure de sodium physiologique, à la place de celleci). Dans certains cas par contre, ia solution c) produit une inhibition de lthé- molyse borique. Dans chaque cas, la modification (augmentation ou inhibition) de l'hémolyse borique constitue cependant une valeur spécifique définitive et reproductible à attribuer aux substances à essayer ou aux complexes antigène/ anticorps. Le domaine principal d'utilisation de l'invention est en conséquence la détermination spécifique qualitative et quantitative de complexes antigène/ anticorps. La détermination objective du médicament homéopathique correct constitue également un domaine d'application important de la détermination précitée. On peut déterminer tant des substances individuelles ou des anticorps individuels, par exemple la vitamine B12, qu'un groupe d'anticorps. Lors du mélange de différentes substances à activité antigénique, on doit s'ira- maginer que chaque substance individuelle développe son antigénicité et que le résultat biologique (modification par l'hémolyse borique suivant l'invention) est la conséquence de la somme des différents antigènes et de leurs relations ensemble. Ce phénomène conditionne un certain nombre d'autres anticorps qui possèdent également une relation déterminée l'un par rapport à l'autre. L'ensemble des complexes antigène/anticorps de mélanges d'antigènes avec les réactions complémentaires correspondantes, introduits dans I'immuno-système et les relations qui existent entre eux, produisent dans l'essai d'hémolyse borique une valeur déterminée, définitive et reproductible.On peut donc constater qu'au moyen de l'essai d'hamolyee borique, on peut déceler tant des antigènes individuels ou des anticorps individuels qu'un groupe d'antigènes ou d'anticorps existant naturellement dans une composition déterminée (par exemple dans la feuille végétale). On peut donc au moyen du présent agent déceler des substances qui sont présentes à un degré de dilution élevé et qui échappent à une autre analyse quantitative chimique, et à cet égard il y a lieu de mentionner par exemple le gluconate de calcium. On peut diagnostiquer toutes les maladies quelconques faisant partie du domaine de l'immunologie clinique comme par exemple celles qui sont cataloguées dans l'ouvrage de K. O. Vorlaender, Pratique de l'immunologie, Thieme Verlag, Stuttgart, 1976. Grâce à l'agent conforme à l'invention on peut aussi déterminer objectivement le Similimum dit homéopathique. Le procédé de mise en oeuvre du présent agent est donc hautement spécifique pour la détermination d'un antigène ou d'un anticorps déterminé ou d'une composition déterminée d'un groupe de tels antigènes ou anticorps existants à l'état naturel et l'importance pratique de ce procédé réside dans le fait qu'il permet de diagnostiquer toutes les maladies faisant partie de l'immunologie clinique, ce procédé étant tellement sensible qu'il permet d'appréhender également des antigènes faibles, auxquels ne sont pas sensibles d'autres procédés. Avantageusement, on effectue la séparation du sérum par centrifugation, celui-ci étant obtenu comme partie supérieure On préfère effectuer l'analyse du sérum par photométrie. On peut ainsi déterminer en particulier sa teneur en bilirubine, mais également sa teneur en hémoglobine. Il y a également lieu de remarquer qu'il peut se produire non seulement des déviations positives du photomètre, mais également des déviations négatives (dans le cas de l'inhibition de l'hémolyse borique). Dans ce dernier cas, on peut procéder en posant la valeur zéro pour l'échantillon contenant la solution c) et en mesurant 1' échantillon contenant une solution physiologique de chlorure de sodium, à la place de la solution c), par rapport au premier échantillon, la déviation négative du photomètre étant ainsi retenue comme valeur positive. Dans la présente description il s'agit, en ce qui concerne les indications de pourcentage, toujours de pourcentages en poids exprimés en concentration enolume. L'invention sera maintenant décrite au moyen des exemples non limitatifs suivants Exemple 1 On effectue un prélèvement de sang comme d'habitude, par 3 aspiration de sang veineux dans deux seringues de 10 cm à utilisation unique, 3 contenant dans chaque cas 3, 0 cm d'une solution à 3, 8 alo de citrate de sodium. On mélange dans un tube à essais le mélange ainsi obtenu désigné ci-dessous comme "sang au citrate". Ensuite, dans un essai en série à tubes, dans lequel les tubes sont numérotés de manière continue, on a pipeté dans chaque tube : a) 2,5 cm d'une solution formée de 3 parties en poids d'acide borique à 3 % et d'une partie en poids d'une solution à 3, 8 % de citrate de sodium; b) 0,5 cm d'une solution à 0, 9 % de chlorure de sodium, c) 0,5 cm d'une solution d'une substance à examiner diluée dans un rapport de 1 : 10 ou préparée homéopathiquement, qui a pu être obtenue par voie chimique synthétique ou qui peut être d'origine animale, végétale ou minérale, ou d'un antigène de spécificité connue adaptée dans une solution isotonique, et 3 d) 1, 0 cm de sang au citrate.On secoue bien tous les tubes et on laisse séjourner pendant 20 minutes à la température ambiante. Ensuite, on soumet à la centrifugation tous les tubes exactement pendant 10 minutes à raison de 3000 tours/minute et on transvase la partie surnageante soigneusement chaque fois dans un tube frais comportant le même numéro. Ensuite, on détermine dans la partie surnageante ainsi obtenue la teneur en bilirubine selon l'un des procédés habituels, par exemple au moyen du photomètre de Lange ou du photomètre Eppendorf L. Jendrassik et P. Grof, Biochem. Z. 297 (1938), page 81 ; L. Jendrassik et R. Cleghorn, Biochem. Z. 289 (1937), page 1; G. Schellong et U. Wende, Arch. Kinderheilk. 162 (1960), page 126 ; G. Schellong et U. Wende, Klin. Wschr. 38 (1960), page 703 ; R. Richterich, Klinische Chemie, Akademische Verlagsgesellschaft Frankfurt a. M. (1968) page 412. On porte les valeurs ainsi obtenues dans une échelle imprimée préalablement. Exemple 2 On répète d'exemple 1 à la différence que l'on détermine par voie photométrique dans la partie surnageante de centrifugation obtenue la teneur en hémoglobine libérée au lieu de la teneur en bilirubine. Exemple 3 On utilise une solution de 0, 5 g de gluconate de calcium et de 3 0, 875 g de lactobionate de calcium dans 10 cm de solvant, désignée brièvement ci-dessous par "solution de gluconate de calcium". On ajoute 5 gouttes de la solution de gluconate de calcium concen 3 trée ci-dessus à 5 cm de sang au citrate provenant d'un sujet examiné quel- conque, préparé comme décrit à l'exemple 1 et qu'on fait ensuite incuber pendant 45 minutes à 37 C. A partir de la solution de gluconate de calcium ci-dessus, on pré 3 pare un liquide de dilution élevée comme suit : on dissout 0, 1 cm de la solution 3 de gluconate de calcium dans 9, 9 cm de solution de chlorure de sodium phy- siologique et on secoue cette solution dans un tube à essais. 80 fois dans le sens vertical. De la solution ainsi obtenue, désignée ci-dessous comme solution C1, 3 3 on prélève 0, 1 cm et on dilue à nouveau ceux-ci de 9, 9 cm de solution phy- siologique et on secoue à nouveau 80 fois. On désigne la solution ainsi obtenue comme solution C2. On continue à opérer de cette manière en fractionnant et 12 en diluant jusqu'à obtention d'une dilution de 1 : 10 de la solution de gluconate de calcium, qui est désignée comme solution C6. On effectue ensuite l'essai d'hémolyse borique décrit dans l'exem- ple 1 à la différence qu'on l'applique deux fois. On prépare un premier échantillon en traitant comme décrit à l'exemple 1, le sang au citrate préparé comme décrit ci-dessus auquel on a ajouté la solution concentrée de gluconate de calcium, et on utilise comme solution c) 0,5 cm de la solution de gluconate de calcium fortement diluée, préparée comme décrit ci-dessus (solution C6). On prépare un deuxième échantillon à la différence près qu'on omet 1 'addition de la solution fortement diluée de gluconate de calcium, c 'est-dire qu'on utilise en outre de la solution formée d'acide borique et de la solution de citrate de sodium, uniquement une solution à 0, 9 % de chlorure de sodium (solution physiologique de chlorure de sodium).La constatation de la teneur en bilirubine des deux solutions a lieu de façon relative, c'est-à-dire qu'on met en rapport la teneur en bilirubine de l'échantillon contenant uniquement la solution physiologique de chlorure de sodium, avec celle de l'échantillon contenant également la solution fortement diluée de gluconate de calcium (solution C6):: à 3 On ajoute/1 cm de la partie surnageante de chaque échantillon, 3 0, 25 cm d'une solution d'acide sulfanilique à une concentration de 29 milli- moles/l et 0, 5 cm3 d'une solution diazoique qu'on a préparée antérieurement en ajoutant à 3 cm3 de solution physiologique de chlorure de sodium, 3 gouttes de réactif diazoïque (solution de nitrite de sodium ayant une concen tration de 25 millimoles de nitrite de sodium/1) Aux deux solutions ainsi ob 3 tenues, on ajoute encore chaque fois 0, 5 cm de solution physiologiqué de chlorure de sodium.La valeur mesurée permet de constater une augmentation importante de l'hémolyse borique en ce qui concerne l'échantillon contenant la solution fortement diluée de gluconate de sodium, par rapport à l'échantillon contenant uniquement la solution physiologique de chlorure de sodium. Exemple 4 On utilise une teinture originale qu'on trouve dans le commerce, c'est-à-dire un extrait alcoolique concentré d'une substance d'origine animale par exemple une teinture originale d'Apis mel. (abeille à miel). 3 On ajoute 2 gouttes de la teinture ci-dessus à 5 cm de solution physiologique de chlorure de sodium. Pour éliminer l'alcool qui gênerait par la suite en combinaison avec le sang le résultat, on fait bouillir une fois brièvement la solution physiologique ainsi préparée et on la laisse ensuite séjourner pendant 24 heures à température ambiante, dans un récipient ouvert. On écarte un dépit éventuellement formé de la solution par filtration ou centrifugation. La solution maintenant limpide, même si elle est éventuellement colorée selon la substance, constitue la partie analogue à la solution concentrée (de gluconate de calcium) utilisée dans l'exemple 3 et on en utilise dans le présent exemple , 5 gouttes à la place des 5 gouttes de la solution de l'exemple 3. Par ailleurs, on procède de manière analogue à celle de l'exemple 3. En procédant ainsi, on constate de manière analogue à 11 exemple 3, pour les échantillons contenant une teinture originale d'une substance d'origine animale, des modifications importantes de la valeur mesurée au photomètre, par rapport à l'échantillon ne contenant que la soluti on physiologique de chlorure de sodium. Exemple 5 On répète exemple 4 à la différence qu'on utilise une teinture originale qu'on trouve dans le commerce, c'est-à-dire un extrait alcoolique concentré d'une substance d'origine végétale, par exemple une teinture de Thuya (arbre de vie). On constate de manière analogue à l'exemple 3, en ce qui concerne les échantillons contenant une teinture d'une substance d'origine végétale, des modifications importantes de la valeur mesurée au photomètre par rapport à l'échantillon ne contenant que la solution physiologique de chlorure de sodium. Exemple 6 On répète l'exemple 4 à la différence qu'on utilise une teinture originale qu'on trouve dans le commerce, c'est-à-dire une solution alcoolique aqueuse d'une substance d'origine minérale, par exemple une teinture de Silicea (acide silicique). On constate de manière analogue à l'exemple 3, en ce qui concerne les échantillons contenant une teinture d'une substance d'origine minérale, des modifications importantes de la valeur mesurée au photomètre par rapport à l'échantillon ne contenant que la solution physiologique de chlorure de sodium. REVENDICATIONS 1. Agent contenant une solution diluée de chlorure de sodium destiné en particulier à la détermination de processus infectieux et immunolo- giques dans des échantillons sanguin s par voie d'hémolyse, caractérisé en ce qu'il consiste en un mélange de a) une solution d'acide borique et une solution de citrate de sodium réunis, b) une solution diluée de chlorure de sodium, c) une solution de substancesà examiner diluées de préférence dans un rapport d'au moins 1 : 10, en particulier d'environ 1 : 1012 ou préparées homéopathiquement, qui ont pu être obtenues par voie chimique-synthétique ou qui peuvent être d'origine animale, végétale ou minérale, et/ou d'antigènes de spécificité connue adaptée dans une solution isotonique saline. 2. Agent selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution de citrate de sodium est une solution à environ 3, 8 jlo de citrate de sodium. 3. Agent selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la solution d'acide borique est une solution- à environ 3 % d'acide borique. 4. Agent selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la solution de chlorure de sodium diluée est une solution à environ 0, 9 % de chlorure de sodium. 5. Agent selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les solutions réunies d'acide borique et de citrate de sodium constituent une solution dans laquelle le rapport de la solution d'acide borique à la solution de citrate de sodium est d'environ 3 : 1. 6. Agent selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le rapport solution a) : solution b) : solution c) est d'environ 2, 5 : 0, 5 : 0, 5. 7. Application de l'agent selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 à la détermination de processus infectieux et immunologiques, caractérisée en ce que l'on mélange l'agent avec des échantillons sanguins auxquels a été ajoutée préalablement une solution de citrate de sodium, de préférence à 3, 8 %, on isole après avoir effectué ce mélange, le sérum, et en ce qu'ensuite on dose une substance libérée à partir d.es-érythrocytes, dont le taux de libération est une mesure pour le degré d'hémolyse. 8. Application selon la revendication 7, caractériseéen ce que l'on dose la teneur en bilirubine du sérum. 9. Application selon la revendication 8, caractérisée en ce que l'on effectue l'analyse du sérum par voie photométrique.