Brevet FR2377040A1 — publié le 19780804

La présente invention concerne un procedé de détection et de mesure des hydrolases d'ester d'acide carboxylique. I1 existe-trois procédgconnus que l'on peut utiliser pour la mesure des hydrolases d'ester carboxylique. Ce sont les procédé suivants s 1. Procédés turbidimétriques. Cesprocédés sont destinés à la mesure d'estérases qui agissent sur les esters insolubles présents sous forme émulsionnée (à l'aide de certains agents émulsifiants) a une dilution suffisante au moment de l'essai de telle sorte que l'on puisse leur appliquer des mesures optiques. Le principe de l'opération réside dans l'effet d'éclaircissement que les produits d'hydrolyse, les acides gras et les glycérides partiels produisent sur la turbidité de la solution d'essai.L'ester le plus communément utilisé dans ce type de procédé est le trioléate de glycérol soit sous forme purifiée soit sous forme d'huile d'olive. Comme l'effet de clarification des acides gras dépend de leur ionisation w ces procédés sont uniquement applicables dans l'intervalle de pH alcalin. De même, compte tenu des différences de conformation dans le cheminement de la lumière pour des différentes spectrophotomètres, ce qui peut être une longueur d'onde acceptable pour un instrument pour des mesures de turbidité n'est pas nécessairement la meilleure longueur d'onde pour tous les instruments (Vogel et Zieve, Clinical Chemistry, 9, 168-181, 1963). En plus, les procédés turbidimétriques sont relativement insensibles et ne présentent pas une bonne linéarité de l'activité mesurée avec la teneur en enzymes plus spécialement pour des teneurs élevées -en enzymes. 2. Mesure des acides gras libérés. On peut mesurer les acides gras produits après l'hydrolyse selon un certain nombre de procédés. On peut les titrer après extraction, ou bien on peut les titrer en continu au cours de l'hydrolyse. Ce dernier procédé permet de réaliser un essai cinétique d'une hydrolase d'ester mais il est limité à l'intervalle de pH alcalin et nécessite un appareil de titration à erregistrement spécial. On peut mesurer des variations de couleur d'un indicateur acide-base au fur et à mesure que l'hydrolyse progresse, ce qui fournit théoriquement un essai très sensible.Toutefois, pour que le procédé soit applicable à un grand nombre d'hydrolases d'ester avec des optima de pH différents, un certain nombre d'indicateurs sont nécessaires et il est nécessaire d'harmoniser leurs pK à l'hydrolase particulière a mesurer de même que le pK de tout tampon présent dans la solution de telle sorte que l'on obtienne des cinétiques d'ordre zéro. La sensibilité de ce type de procédé est inversement proportionnelle a la quantité de tampon presexst. On peut également déterminer les acides gras libérés par première transformation en leurs sels de cuivre, et ensuite mesurés par voie colorimétrique. Le procédé le plus sensible comprend l'utilisation d'esters radioactifs marques dans la fraction acide.On compte l'acide gras libéré après séparation de l'ester non hydrolysé å l'aide dlun compteur de scintillations approprié. Toutefois, ce type de procedé est très long et très cher. 3. Mesure de l'alcool libéré. Certains esters de phénol sont utilisés dans cette technique et on mesure par voie colorimé- trique le phénol libre produit par l'hydrolyse. Ce type de procédé permet un contrôle continu de la réaction seulement dans- linter- valle de pH pour lequel le phénol est coloré.Comme élargissement de ce procédé, et un procédé d'une sensibilité plus grande est celui de l'analyse fluorométrique après couplage du phénol libéré avec un colorant azotique. Toutefois, la spécificité des esters de phénol pour certaines hydrolases est mise en question, plus particulièrement des esters de phénol solubles dans lseau vis-à-vis de la lipase de triglycéride telle que celle que l'on rencontre dans le pancréas. De même, la lipase pancréatique présente une activité spécifique très faible même pour des esters de phénol solubles dans l'eau.Plutôt que des esters phénoliques, d'autres procédés fluorométriques utilisent des esters d'acide carboxylique d'alcools tels que le F -naphtcl, la fluoresceine, ou la 4-méthyl-umbelliferone qui présentent une fluorescence après l'hydrolyse. Toutefois, ces esters sont des supports faibles pour la lipase pancréatique. On a également utilisé des esters de vinyle pour mesurer des hydrolases (Brockerhoff, H., Biochimica et 3iophysica Acta, 212, 92 (1970)et 3rockerhoff, H et coll, Analytical Biochemîstry , 37, 26-31 (1970).Avec ces esters, on ne mesure pas la fraction contenant le vrouFerent OH, mais son produit d'isomérisation, l'acétaldéhyde. Dans la technique de Brockerhoff, on émulsionne l'ester de vinyle ce qui empêche par conséquent toute mesure optique possible au fur et a mesure que la réaction progresse. Des fractions aliquotes du mélange réactionnel contenant l1acétaldéhyde sont couplées à la 3-methyl- 2-benzothiazolone hydrazone, pour donner un produit coloré qui est déterminé par voie colorimétrique à 666 nm. Cependant, l'oléate de vinyle qui est utilisé comme support présente une efficacité de 29,4% par rapport à celle du trioléate de glycérol dans les mêmes conditions en utilisant de la lipase pancréatique de porc pour ces mesures.Toutefois, l'oléate de vinyle est un support bien meilleur que les esters phénoliques ou que les esters des alcools fluorescents ; d'une manière significative, Brockerhoff note que les cinétiques de son procédé ne sont pas linéaires au-dessus d'une absorption d'environ 0,6. Le procédé de Brockerhoff, bien qu'il soit une amélioration par rapport à de nombreux procédés de l'art antérieur, est un procédé qui doit être réalisé manuellement et qui nécessite la préparation de quelques solutions différentes de même qu'une quantité importante d'ordre technicien. Presque tous les procédés notés ci-dessus comprennent l'utilisation de mélanges de réactifs relativement instables plus particulièrement ceux qui nécessitent un type d'émulsion d'un support insoluble dans l'eau. Les procédés qui utilisent des supports solubles dans l'eau sont soit d'une activité spécifique extrêmement faible vis-à-vis des lipases de triglycéride, ou sont sujets à des interférences avec des hydrolases-d'ester qui agissent sur des supports solubles dans l'eau, ou les deux. De même, les lipases de triglycéride peuvent interférer avec des procédés destinés à mesurer des hydrolases d'ester de supports solubles dans l'eau, puisque les spécificités du support de nombreuses lipases de triglycéride comprennen ussi ceux solubles dans l'eau. Un exemple habituel de système d- zyme multiple de ce type est le sérum ou le plasma sanguin, q : peut contenir une lipase pancréatique venant d'un pancréas enflammé de même qu'une estérase du foie. Un procédé destiné à différencier l'activité des lipases de celle des estérases doit être hautement spécifique pour les premières afin de constituer un instrument de mesure sûr pour la détection des inflammations pancréatiques. Une telle solution de réactif doit être très sensible pour détecter des taux faibles d'activité d'enzymes, stable au stockage pendant des périodes de temps long, capable d'être titrée très rapidement après audition de l'hydrolase d'ester (de préférence en utilisant des techniques de contrôle en continu pour obtenir une titration cinétique), sans effet de turbidité au cours de la réaction et praticable économiquement pour la fabrication. C'est pourquoi; il existe un besoin pour une solution réactive qui presente une sensibilité élevée, une bonne clarté et une bonne stabilité au stockage et qui soit capable de doser rapidement une hydrolase particulière d'ester, comme par exemple la lipase de triglycéride, même en présence d'autres types d'hydrolases d'esters qui peuvent avoir différentes spécificités de supports ou d'autres propriétés. On a atteint les objectifs de la présente invention en prévoyant une solution aqueuse de réactifs constituée d'un mélange d'esters de vinyle d'un acide carboxylique, d'un détergent non ionique, de certains sels minéraux, d'un détergent anionique, d'un détergent cationique et d'un tampon. Selon les modes de réalisation préférés de la présente invention, la demanderesse préfère réaliser l'analyse d'une hydrolase d'ester d'acide carboxylique en mélangeant un échantil lon inconnu, que l'on soupçonne de contenir cet enzyme avec un système de réactif dans lequel on hydrolyse tout d'abord un ester de vinyle de l'acide carboxylique par l'enzyme sous la forme d'acide carboxylique et d'alcool vinylique instable. Comme seconde étape, l'alcool vinylique s'isomérise en l'acétaldéhyde. Cette suite de transformation est indiquée d'une manière schématique comme suit Ester de vinyle acide carboxylique alcool vinylique R = groupement aIkyle, alkënyle, ou alkyl-aryle. kcetaldehyde On peut détecter I'acétaldéhyde de la réaction (2) par un certain nombre de moyens connus dans la technique. Par exemple, des procédés enzymatiques sont illustrés ci-dessous dans les réactions (3a) et (3b), et elles comprennent l'enregistrement de la disparition (3a) ou de l'apparition (3b) de NADH en mesurant son absorption ou sa fluorescence à des longueurs d'onde appropriées. La vitesse dréactions(3a) ou (3b) peut être ensuite égalée avec la réaction (1) lorsque les composants du mélange sont tous en excès suffisant de telle sorte que seule l'activité de l'hydrolase d'ester soit limitée. Les procédés chimiques (3c) peuvent comprendre tout moyen nonenzymatique pour l'analyse quantitative de I'acétaldéhyde. Efhanol Acide acétique (3c) on détecte CH3CHO par voie chimique. NADH = B-dihnrdrcnicotinamide adénine dlnucléotide ADH = alcool hydrogénas e NAD = nicotinamide adénine dinucléotide AD = aldéhyde aéshydrcgénase Les exemples de procédé de détection chimique pour I'acétalr déhyde peuvent comprendre des colorants donnant une base de Schiff tels que la Fuchsine basique, qui sont fortement colorés. On réalise d'une manière plus avantageuse la préparation du réactif de la présente invention en combinant deux préparations séparées, une qui est un mélange support-détergent et l'autre une solution tampon qui peut contenir certains activateurs et agents de stabilisation. Le mélange-support détergent comprend un support d'ester de vinyle carboxylique et une ou plusieurs variétés de détergents non ioniques. Le support croix dépend de la spécificité de l'hydrolase d'ester carboxylique à mesurer. Les hydrolases qui catalysent l'hydrolyse des esters d'acide carboxylique solubles dans l'eau d'origine naturelle, plus rapidement que des esters d'acide carboxylique insolubles dans l'eau à longue chaîne hydrolysent les esters de vinyle carboxylique à chaîne courte plus rapidement que les esters de vinyle des acides carboxyliques à chaîne longue, qui sont de plus en plus insolubles dans l'eau au fur et à mesure que la longueur de chaîne augmente.Des hydrolases qui sont connus pour catalyser des esters d'acides carboxyliques à longue chaîne d'origine naturelle, comme par exemple des triglycérides, ont tendance à catalyser l'hydrolyse des esters de vinyle carboxylique à longue chaîne plus rapidement que les autres hydrolases. Bien qua l'on puisse utiliser comme support tout ester vinylique d'acide carboxylique, des supports préférés sont ceux contenant de 4 à 20 atomes de carbone.Ces supports comprennent l'acétate de vinyle, le propionate de vinyle, le butyrate de vinyle, le crotonate de vinyle, le valérate de vinyle, l'hexanoate de vinyle, l'octanoate de vinyle, le nonaoate de vinyle, le décanoate de vinyle, le neodécanoate de vinyle, le laurate de vinyle, le myristate de vinyle, le palmitate de vinyle, l'oléate de vinyle, le stéarate de vinyle, le subérate de divinyle, et l'omega-phényl nonaoate de vinyle. On préfère plus particulierement, l'omega-phényl octanoate de vinyle qui a eté préparé par modification du procédé de Cattérjee et coll (P.C. Catterjee, H. Dakshinamurty, et J.S.Aggarval, Indian J.Technol., 4, 173-175 (1966). L'omega-phényl octanoate de vinyle et l'omega-phenyl nonanoate de vinyle ont eté synthétisés pour la première fois. L'intervalle utile de la concentration du support est de 5 à 15 mM, et l'intervalle préféré est de 7 à 10 mM. La concentration préférée du support dépend en particulier du Km de l'enzyme pour un support particulier. Pour des raisons de cinétique, on recommande une concentration de support d'environ 10 fois le Km. Les détergents non ioniques les plus efficaces que l'on a trouvés utilisables dans le réactif de la présente invention sont des alcools polyoxyéthylénés ou des alkylphénols polyoxéthylénés et leurs éthers (classe 1 A 2, de Rosen et Goldsmith, Systematic Analysis of Surface-Active Agents, 2ème édition Wiley-Interscience, New York, 1972. Bien que l'on puisse utiliser tout composé tensio actif non ionique de ce type qui ne contient pas des liaisons d'ester d'acide carboxylique comme partie du détergent de ce mélange détergent-support, lesdétergents préféres sont l'éther de polyoxyéthylène (23) et de lauryle, le tertio-octylphénol polyoxyéthylèné (de 7 à 40 moles de-OE), et leurs mélanges. La formulation préférée du mélange support-détergent à utiliser dans un système de titration particulier dépend de plusieurs facteurs suivants 1) l'équilibre hydrophile-lipophile (HLE) des détergents non ioniques 2) l'hydrophobicité du support 3) les propriétés de l'hydrolase d'ester à mesurer 4) les propriétés du liquide dans lequel l'hydrolase d'ester se trouve. L'activité spécifique des hydrolases d'ester d'acide carboxylique est partiellement affectée à la fois par le HLE et la quantité totale de détergent non ionique présent dans le système de titration. Bien que un des rôles du détergent non ionique de la présente invention est de servir à solubiliser le support, pour tout support insoluble dans l'eau il doit y avoir une quantité minimale de détergent non ionique nécessaire pour réaliser une solubilisation complète et pour éviter la dissolution au repos. Cette quantité minimale de détergent non ionique dépend de la solubilité dans l'eau du support et du HLE du detergent non ionique. En général, les supports les plus hydrophobes nécessitent plus de détergent non ionique pour la solubilisation que les supports les plus hydrophiles. L'intervalle des rapports molaires de détergent au support qui est utilisable dans la présente invention est d'environ 1:1 à 10:1 (c'est-à-dire 5 â150 mM de détergent non ionique), mais on préfère un intervalle de 1,50 à 5,00:1. Plus le HLE d'un détergent est faible, plus il solubilisera efficacement un support hydrophobe. L'intervalle de HLE qui est utilisable va d'environ 13 à 18, mais on préfère l'intervalle d'environ 14 à 16. On peut mélanger conjointement 2 ou plusieurs détergents non ioniques pour obtenir un HLE souhaité. En général, pour obtenir l'activité spécifique la plus élevée d'une l'hydrolase d'ester vis-à-vis d'un support particulier dans la présente invention, on doit rechercher l'utilisation drune quantité aussi faible que possible de détergent non ionique et d'un HLE aussi élevé que possible. En plus, on doit considérer la source d'hydrolase d'ester carboxylique en déterminant le mélange support-détergent préféré Par exemple, si l'on doit analyser le sérum ou le plasma sanguin du point de-vue de l'hydrolase d'ester, un serum très lipémique peut conduire à des variations de turbidité de durée de temps telle ( > 5 minutes) que l'analyse spectrophotométrique est interdite jusqu'au ce qu'on n'ait pas utilisé un mélange support-détergent approprié.Pour une interférence minimale pour le sérum lipémique en utilisant comme support l'omega-phenyl octanoate de vinyle, l'intervalle de HLE du détergent qui est utilisable est d'environ 14 à environ 18 mais on préfère d'environ 15 à 16. L'intervalle préféré peut varier lorsque l'on utilise d'autres supports. Comme second composant de cette solution de réactif, on prépare une solution tampon qui peut contenir certains activateurs et produits de stabilisation. Dans la préparation-du composant de tampon, on doit prendre en considération les eldments suivants (1) on doit ajuster le pH de la solution tampon pour l'assortir au pH optimal pour l'hydrolase d'ester à mesurer. Cé pH est habituellement d'environ 6 a 10. (2) Le tampon utilisé doit avoir une bonne capacité tampon au pH utilisé. On emploie le phosphate de potassium comme tampon pour des intervalles de pH d'environ 6 à 7,5, du pyrophosphate de potassium pour des intervalles de pH d'environ 6 à 9,5. On peut utiliser également des sels de sodium. I1 faut prendre soin d'eviter d'utiliser:un tapor. qui présent un groupement amine primaire, comme par exemple le tris(hydroxyméthyl)aminométhane, qui formera une base de Schiff avec l'acétaldéhyde, et par conséquent, interférera avec le dosage quantitatif -de l'acétal- déhyde. (3) La concentration du tampon doit tre suffisamment élevée pour être efficace au stockage et pour compenser tout acide ou toute base qui peut être ajout conjointement à l'hydrolase d'ester. LT intervalle de concentration du tampon peut etre d'environ 0,05 molaire jusqu'aux limites de solubilité mais il est de preférence de 0,05 M à 0,5 molaires. Afin d'améliorer la sensibilité de la solution de réactif claire et stable de la présente invention, on peut y introduire des agents activateurs d'enzymes. On peut utiliser comme agent activateur dans les systèmes de la présente invention des sels biliaires (ou les acides biliaires correspondants) qui sont connus dans la technique comme agents activateurs pour la lipase pancréatique. Parmi ces sels biliaires utilisables comme agents activateurs de la présente invention, on préfère le taurode7soxy- cholate de sodium, le cholate de sodium, le chénodésoxycholate de sodium et le désoxych5Bte de sodium. Parmi ceux-ci, le sel biliaire plus particulièrement préféré est le désoxycholate de sodium. L'intervalle des concentrations du desoxycholctede sodium (ou son acide libre) va de 0 à environ 25 mM, mais l'intervalle préféré va d'environ 15 à environ 21 mM pour la l-ipase pancréatique du porc pour l'extrait brut de pancréas humain-, et pour la lipase dans le sérum du sang humain. L'estérase du foie de porc, est seulement légèrement activé par des concentrations en désoxycholate de sodium supérieures à environ 25 mM.Le taurodésoxy cholate de sodium de 0 à 25 mM, le cholate de sodium de 0 å 10 mM, et le cheesoxycholate de sodium entre 0 et 15 mM activent tous légèrement la lipase pancréatique du porc et l'estérase du foie de porc à peu près dans la même mesure en utilisant l'omega- phényl octanoate de vinyle comme support dans ce système, mais les concentrations préférées dans chaque cas sont de approximativement la limite supérieure de chaque intervalle examiné. On peut également réaliser l'activation de lå lipase pancréatique du porc et l'extrait brut de pancréas humain a l'aide de différents composés cationiques d'alkyle et d'alkylaryle d'ammonium quaternaire tels que le bromure de cétyltriméthyl ammonium (CTAB), et le chlorure de cétyldiméthylbenzyl ammonium (CDMBAC), en l'absence de sels biliaires. L'intervalle utilisable des concentrations de CTAB pour l'activation de la lipase pancréatique du porc est d'environ 4 à environ 12 mM, mais l'intervalle plus particulièrement préféré est compris entre 7-et 9 mM. L'intervalle utilisable des concentrations de CDMBAC pour l'activation de la lipase pancréatique du porc est compris entre environ 2 et 9 mM, mais plus préférentiellement entre 5 et 9 mM.Lorsqu'on les utilise conjointement, le désoxycholate de sodium (ou son acide) et le CTAB ou le CDMBAC activent la lipase pancréatique du porc d'environ 10 fois par rapport à l'activité sans ces composants utilisés simultanément. Le desoxycholete sodium et le CTAB sont utiles lorsqu'on les utilise conjointement dans les intervalles de 0 à 25 mM et de 0 à 15 mM respectivement, mais les concentrations préférées sont de 10 =S à 20 mM pour le désoxycholate de sodium et de 4mM à 10 mM pour le CTAB.Lorsqu'on utilise conuointement le désoxycholate et le CTMBAC pour l'activa-tion de la lipase pancréatique du porc, les concentrations utilisables de déoxycholate sont comprises entre 0 et environ 20 mM, mais les concentrations préferees sont comprises entre 10 mM et 20 mM de dipxycholate et entre 10 mM et 4 mM de CDMBAC. L'extrait brut de pancréas humain présente également une activation par la combinaison du dwoxycholate et du CDMBAC, dans l'intervalle de concentration de O à 16mM de CDMBAC et de 0 à environ 4 mM de dexycholate. Lorsque la concentration de déoxycholate est supérieure à 4 mM la lipase humaine est activée beaucoup plus fortement en l'absence de CDMBAC. On peut ajouter à la solution tampon certains produits de stabilisation de protéines. Ces stabilisants comprennent le dithioérythritol, le dithiothreitol, l'albumine dé sérum, l'acide éthylènediamine tétraacétique et le mercaptoéthanol. Les composés de sulfhydrale sont particulièrement utilisables pour donner la stabilisation de l'activité. Des stabilisants préférés sont le dithioér1rthritol, le dithiothreitol, et l'albumine de sérum de boeuf. Pour le dithioérythritol et le dithio threitol la concentration préférée utilisée dans la présente invention est d'environ 1 x 10 3M. Ces deux stabilisants sont assez semblables et on peut les utiliser d'une manière interchangeable, Pour les stabilisants d'albumine de sérum, la concentration préférée est d'environ 0,1% (poids/volume) à environ 1,0% (poids/ volume). Si on utilise trop d'albumine de serum, et Si la force ionique de la solution est très élevée, il peut se produire un relargage de la protéine. La force ionique du système d'analyse est importante pour l'activité spécifique optimale. De nombreuses hydrolases de triglycérides augmentent l'activité spécifique au fur et a mesure que la force ionique augmente. D'autres hydrolases sont inhibées par une augmentation de la force ionique. On peut ajuster ce parametre pour obtenir la spécificité la plus élevée de l'essai pour une hydrolase particulière. Bien que l'on présume que l'on puisse utiliser une variété de sels neutres pour augmenter la force ionique du réactif, on préfère KC1 et Nazi. Ces composés doivent être utilisés en concentration de 0 à environ 3 M, en fonction de l'hydrolase d'ester carboxylique que l'on doit mesurer. L'intervalle de concentration préféré dans le réactif pour la mesure de la lipase pancréatique de porc et de la lipase pancréatique humaine est d'environ 2,5 Y à environ 3,0 M L'estérase de foie de porc est inhibée par une augmentation de la force ionique c'est pourquoi, il est préférable de ne pas ajouter de sels neutres au réactif pour la mesure de cet enzyme. En vue de détecter la formation de l'acétaldéhyde produit par l'hydrolyse enzymatique de l'ester de vinyle, on peut utiliser un certain nombre de procédés analytiques. On peut facilement utiliser des systèmes de couplage enzymatiques comprenant un enzyme et son cofacteur pour la detection en continu de l'action de l'hydrolase de l'ester carboxylique.De tels couples enzyme cofacteur peuvent comprendre un alcool déshydrogénase et le ss - dihydronicotinamide adénine dinucloéotide (NADH), un aldéhyde déshydrogénase etless -nicotinamide adénine dinucléotide (NAD ou le phosphate ss-nicotinamide adénine dinucléotide (NADP+), et un aldéhyde oxydase et soit des accepteurs artificiels d'électrons de 2,6-dichlorophenolindophenol soit le cytochrome C. Tous ces procédés de détection de l'aldéhyde sont bien connus dans la technique. Le couple enzyme-cofacteur plus particulièrement préfére est -l'al- cool: déshydrogénase et le ThADE. Un avantage de détection de l'alcétaldéhyde par ces moyens est qu'il n'y a pas de variations nettes du pH tout au long de la réaction. L'alcool déshydrogénase est commercialement disponible sous la forme cristallisée et est relativement bon marché. Gn a utilisé d'une manière routinière l'enzyme obtenu à partir de levure dans les systèmes de la présente invention et on le préfre compte tenu de ce qu'il est une des formes les moins cheires parmi celles commercialement disponibles.On peut également utiliser un alcool déshydrogénase venant d'autres sources. L'activité de l'alcool déshydrogénase, ou de tout autre enzyme de couplage utilisé doit avoir au moins une activité 10 fois supérieure à l'activité la plus élevée de l'hydrolase d'ester qui est ajoutée au système d'essai pour s' assurer que l'activité mesurée est en fait due à l activité de l'hydrolase d'ester et non à l'enzyme de couplage. L'intervalle de concentration d'alcool déshydrogénase utilisée pour l'analyse d'environ 50 pi de sérum sanguin est compris entre environ 1 à 5 unités par millilitre de réactif. La concentration en NADH doit être suffisamment élevée pour saturer le ADH et pour donner une durée suffisante à l'essai permettant d'obtenir une mesure vraie de l'activité de l'hydrolase d'ester. L'intervalle utilise des concentrations en NADH est compris entre environ 0,08 mg/ml et environ 0,4 mg/ml. Si la concentration est très supérieure à 0,4 mg/ml, llabsorption initiale à 340 nm peut dépasser les limites de certains spectrophotomètres. Si la concentration est très inférieure à environ 0,08 mg/ml, l'alcool déshydrogénase peut ne pas être suffisamment saturée en NADH pour donner activité maximale.D'une manière typique, l'absorption à 340 nm du réactif est lue après addition du NADH afin de s'assurer qu'il y a suffisamment de composé sous la forme réduite. Llintervalle utilisable de l'absorption initiale apres addition du NADH est compris entre environ 0,6 et jusqu'à environ 3,0. La limite supérieure dépend habituellement des limitations dans la conception du spectrophotomètre. L'intervalle préféré d'absorption préféré à 340 nm avec un cheminement lumineux de 1 cm est compris entre 1,0 et 2,0.Une solution de réactif d'un volume total de 1,15 ml (comprenant 50 L de sérum) et une absorption initiale de 2,0 à 340 nm peut servir à titrer une activité d'hydrolase d'ester d'environ 3,7 à 1200 milliunités/ml de sérum avec un temps de préincubation de 3 minutes et un temps d'incubation de 2 minutes pendant lequel on enregistre l'absorption. La limite inférieure de 3,7 mu mol de sérum est basée sur une limite de sensibilité de 0,001 A par minute dans le spectrophotometre. Si l'on rencontre des activités plus élevées, on peut alors utiliser moins de sérum ou un sérum dilue. On peut utiliser des procédés chimiques pour suivre la formation de L'acetaldéhydeen remplacement du système de couplage enzymatique mentionné ci-dessus. Comme procédé préféré, on peut coupler l'acétaldéhyde avec une amine pour donner une base de Schiff. Celle-ci peut être déterminée par des techniques standard par spectrophotométrie ou fluorométrie. La température à laquelle on utilise le réactif peut varierdans un large intervalle dans la mesure ou elle reste constante tout au long de la mesure. On peut utiliser des températures d'environ 0,0 C à environ 50 C dans le procédé d'analyse de la présente invention. On pratique habituellement des titrations enzymatiques d? 25 Les vitesses d'oxydation du NADH au stockage à 300C, à la température ambiante (230C), et à la température de la glace (40C) dans un réactif avec le support oméga-phényl-octanoate de vinyle dans une expérience sont respectivement de 0,0262 mole/ heure, 0,0165 nmole/heure, et 0,038 pmole/heure. Dans le cas d'un réactif dont l'absorption ) 340 nm est intialement d'environ 1,3, le temps de vie du réactif, c'est- -dire, le temps au bout duquel l'absorption tombe en-dessous de 0,6, à 300, 330 et 40C est par conséquent respectivement de 4,9, 7,8 et 33,9 heures. Le pH du réactif est de 7,2. On peut restaurer le caractère utile du réactif simplement en ajoutant de NADH. On doit comprendre que bien que le réactif de la présente invention soit préparé manuellement sous la forme drune solution aqueuse, il est possible de soumettre la préparation aqueuse à une lyophilisation et par conséquent de former un réactif sous forme de poudre sèche. Un tel réactif peut être activé par addition de la quantité requise d'eau. Après avoir décrit l'invention d'une manière générale, celle-ci sera mieux comprise en se référant à certains exemples spécifiques qui sont fournis présentement uniquement à titre illustratif et qui ne sont pas limitatifs sauf indication contraire. EXEMPLE Pour la préparation d'un litre du système réactif pour la détermination de l'activité de l'hydrolase, on formule les mélanges suivants (1) Mélange support-détergent. Le procédé de melange du mélange supportrdétergent n'est pas critique. Une façon pour le préparer est de mélanger 1,985 gnd'oméga-phényl-octanoate de vinyle avec 9,081 gade 1,1,3, 3-tétraméthyl-1-phénoxy (polyéthoxy) n butane (n = valeur dispersée, moyenne 9) et 9,133 gnd'un mélange aqueux à 70% d'un composé semblable dans lequel n a une valeur dispersée, de moyenne 30. On homogénéise le mélange visqueux résul- tant.On peut préparer une quantité importante de ce mélange selon ce qui est souhaité et le stocker indéfiniment à température ambiante dans un récipient fermé. (2) olio tampon. Bien que le procédé de préparation de la solution tampon ne soit-pas critique, un procédé de préparation est le suivant : on pèse dans un récipient de un litre 3,134 gm de 1,1,3,3-tétraméthyl-1-phénoxy(polyethoxy)n butane (n = valeur n dispersée, moyenne 9) et 12,912 gnde 1,1,3,3,-tetraméthyl-1- phénoxy(polyéthoxy) butane à 70t (n = valeur dispersée, moyenne 30). On ajoute environ 800 ml d'eau déionisée et redistillée dans un appareil en verre et on agite à l'aide d'un barreau agitateur magnétique jusqu'à ce que les détergents soient dissous. On ajoute 9,534 gnde oeoxycholate de sodium et on poursuit l'agitation jusqu'à dissolution. On ajoute ensuite 25,652 gnde pyrophosphate tétrasodique (Na4P207. 10 H20) et on agite jusqu'! ce que les cristaux soient dissous. On ajoute sous agitation sous forme de cinq fractions approximativement égales une quantité totale de 231,51 g de chlorure de potassium, en laissant chaque fraction se dissoudre presquecompltement avant addition de la fraction suivante. On arrête l'agitation lorsque tout le KC1 est dissous. On ajoute 1,15 gndalbumine de sérum de boeuf en le versant à la surface du liquide.Lorsque tout leA$B est dissous, on reprend l'agitation et cn ajoute de l'eau pour porter le volume jusqu'à environ 950 ml. On ajuste le pH à 9,1 à l'aide d'une solution diluée de HCl. On place la compensation de température sur le pH mètre à la température à laquelle les titrations sont réalisées (300C dans cet exemple). On retire les électrodes de pH de la solution et on ajoute 0,1775 gnde dithioérythritol sous agitation. On transfère quantitativement la solution dans un ballon titré de 1 litre et on ajoute de l'eau jusqu'au reperde. On mélange intimement. Dans un récipient de 1 litre, on combine le mélange support-détergent et le tampon sous agitation jusqu'à mélange intime. On ajoute très lentement sous agitation 1 ml d'une solution d'alcool déshydrogénase provenant de levure et contenant 40 mg de ADH /ml d'un tampon d'une composition semblable à celle décrite ci-dessus. On filtre le reactif à travers un papier filtre ne402 (Carl Schleicher et Schuelle Co) pour éliminer tout produit insoluble étranger. On peut réfrigérer le réactif dans un recipient non ferme, et soutirer des fractions aliquotes au fur et à mesure des besoins de l'analyse.Par exemple, pour analyser un groupe de 100 échantillons de serum, du point de vue de leur activité de la lipase pancréatique, on prélève une fraction de 100 ml du réactif. On ajoute 30 mg de NADH et on agite jusqu'a dissolution. Après avoir réduit tout l'acétaldéhyde endogène dans le réactif et après avoir diminué ltoxydation correspondante du NADH jusqu'à la valeur dlun échantillon témoin normal, l'absorption à 340 nm dans une cellule de mesure d'une longueur 1 cm est approximativement de 1,5 On pipette 1 ml du réactif et 0,1 ml d'eau dans une cellule appropriée de spectrophotomètre et on incube à 300C pendant environ 10 minutes.Ensuite on place la cellule dans un compartiment de cellule maintenu à température constante (300C) dans le spectrophotomètre et on enregistre la variation d'absorption à 340 nm sur un enregistreur calibré à papier pour obtenir une valeur à blanc. On ajoute ensuite au réactif 50 microlites d'un sérum, on mélange en retournant plusieurs fois et on place à nouveau dans le compartimentde,cellule. On enregistre à nouveau la variation d'absorption sur l'enregistreur à papier. La vitesse devient habituellement lineaire en moins de 3 minutes après l'addition du sérum. Après un temps suffisant pour obtenir une ligne droite de la variation d'absorption, on calcule la valeur nette tA/minute en soustrayant la valeur à blanc de la valeur après que le sérum ait été ajouté. On calcule l'activité de la lipase dans le sérum de la manière suivante, en utilisant 6,22 A/cm . Fmole comme étant le coefficient d'extinction du NADH hA/minute x 3698 = Unité international de lipase/litre. On définit une unité internationale comme étant la transformation de une pmole du support par minute par litre de solution. Après avoir décrit complètement l'invention, il apparaîtra aux techniciens qu'elle peut subir de nombreuses variations et modifications sans sortir de l'esprit et du domaine de la présente invention. REVENDICATIONS 1. Solution stable et claire de réactif pour l'analyse des hydrolases d'esters d'acide carboxylique caractérisée en ce qu'elle comprend un ester de vinyle insoluble dans l'eau d'un acide carboxylique, un détergent non ionique, un tampon et éventuellement un système de détection de l'acétaldéhyde. 2. Solution de réactif selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend un ester de vinyle insoluble dans lteau d'un acide carboxyli- que, un détergent non ionique, et un tampon. 3. Solution de réactif selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'on y ajoute des activateurs d'enzyme choisis dans le groupe constitué de sels biliaires, d'acides biliaires, de composés d'alkylammonitrn quaternaire, de composés d'alkylaryle amraanium quaternaire et de leurs mélanges. 4. Solution de réactif selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'ester de vinyle insoluble dans l'eau est un ester d'alkyle, d'alkényle, ou d'alkylaryle en C4 à C20 ; en ce que le détergent non ionique est choisi dans le groupe constitué d'alcools polyoxyéthylénés, d'alkylphénols polyoxyé- thylénés, de leurs éthers et de leurs mélanges, et en ce que le tampon est un tampon phosphate, un tampon pyrophosphate ou ou un tampon N,N-bis (2-hydrcxyéthyl) glycine. 5. Solution de réactif selon la revendication 3, caractérisée en ce que lesdits activateurs d'enzyme sont choisis dans le groupe constitué de l'acide désoxycholique, d'un sel de l'acide désoxycholique, du bromure de eétyltriméthylammonium, du chlorure de cétyldimSthylbenzylammonium et de leurs me- langes. 6. Solution de réactif selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'ester de vinyle insoluble dans l'eau d'un acide carboxylique est l'cirtéga- phényloctanoate de vinyle, en ce que le détergent non ionique est le tert-octylphénol polyoxyéthyléné, en ce que le tampon est un tampon pyrophosphate, et en ce que les activateurs d'enzyme sont un mélange de désoxycholate et de chlorure de cétyldiméthylbenzylammonium. 7. Solution de réactif selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'ester de vinyle insoluble dans l'eau d'un acide carboxylique est l'cmdga- phényloctanoate de vinyle, en ce que le détergent non ionique est un tert-octylphénol polyoxyéthyléné en ce que le tampon est un tampon pyrophosphate et en ce que les activateurs d'enzyme sont un mélange de désoxycholate et de bromure de cétyltriméthylammonium. 8. Solution de réactif selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle contient d'environ 5 à environ 15 mM d'omEga-phényloctanoate de vinyle, d'environ 5 à environ 150 mM de tert-octylphénol polyoxyéthyléné d'environ 0,05 à environ 0,5 M de tampon pyrophosphate, d'environ 0 à environ 25mM de chlorure de cétyldiméthfiylbenzylammonium. 9. Solution de réactif selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle contient d'environ 0 à environ 25mM de désoxycholate et d'environ 0 à environ 15 mM de bromure de cétyltriméthylammonium. 10. Réactif selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on y ajoute des sels neutres pour augmenter la force ionique dudit réactif. 11. Solution de réactif selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend un ester de vinyle insoluble dans l'eau d'un acide carbocyli- que, un détergent non ionique, un tampon et un système de détection de l'avec taldéhyde. 12. Solution de réactif selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit système de détection de l'acétaldéhyde est un système enzymatique et en ce qu'il est basé sur l'oxydation ou la réduction dudit acétaldéhyde avec respectivement réduction ou oxydation simultanée d'un donneur ou d'un accepteur d'électrons approprié que l'on peut mesurer par voie spectrophotométrique ou par voie fluoranétrique. 13. Solution de réactif selon la revendication 12, caractérisée en ce que ledit système de détection enzymatique de l'aldéhyde consiste en alcool déshydrogénase et en ss - dihydronicotamide adénine dinucléotide (NDH), que l'on ajoute en quantité suffisante pour réduire ledit acétaldéhyde en éthanol et pour oxyder ledit NXDH en ss -nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+), ce par quoi on peut mesurer quantitativement la vitesse d'hydrolyse dudit ester de vinyle par la vitesse de disparition du NADH. 14. Solution de réactif selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit système de détection de l'acétaldéhyde est un système chimique et en ce qu'il est basé sur la combinaison dudit acétaldéhyde avec un colorant d'amine donnant une base de Schiff colorée que l'on peut déterminer par voie spec trophctométrique ou par voie fluoranétrique. 15. Solution de réactif selon la revendication 2, caractérisée en ce que ladite solution de réactif est préparée pour subir une lyophilisation et en ce qu'il en résulte un réactif pulvérulent sec. 16. Procédé d'analyse d'une hydrolase d'ester carboxylique caractérisé en ce qu'il comprend l'addition à une solution de réactifs comprenant un ester de vinyle insoluble dans liteau d'un acide carboxylique, un détergent non ionique, un tampon et éventuellement un système de détection de l'acetaldehyde, d'un liquide contenant une quantité inconnue de ladite hydrolase d'ester car baxylique. ~ 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comme prend l'addition à une solution de réactifs comprenant un ester de vinyle insoluble dans l'eau d'un acide carboxylique, un détergent non ionique et un tampon, d'un liquide contenant une quantité inconnue de ladite hydrolase d'ester carboxylique. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que ladite solution de réactif contient des activateurs d'enzyme choisis dans le groupe constitué de sels biliaires, d'acides biliaires, d'un composé d'alky- ammonium quaternaire, de opposés d'aIkylarylammcnium quaternaire, et de leurs mélanges. 19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que lesdits activateurs d 'enzyme sont choisis dans le groupe constitué de l'acide désoxycholique (ou un des sels de l'acide désoxycholique) du chlorure de cétyldiméthyl benzylammonium, du bromure de cétyltriméthlylammonium, et de leurs mélanges. 20. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'ester de vinyle insoluble dans l'eau est un ester en C4 à C20' en ce que le détergent non ionique est choisi dans le groupe constitué d'alcool polyoxyéthyléné, dlal- kylphénol-polyoxyéthyléné, d'alkylphdnol-polyoxyéthylené et de leurs éthers, et en ce que le tampon est un tampon de phosphate ou un tampon pyrophosphate. 21. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que les activateurs d'enzyme sont un mélange de ddsoxycholate et de bromure de cetyltri- méthylammonium. 22. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'ester de vinyle insoluble dans l'eau d'un acide carboxylique est l'oméga-phényloctano- ate de vinyle, en ce que le détergent non ionique est le tert-octylphénol polyoxyéthyléné,en ce que le tampon est un tampon pyrcphosphate et en ce que les activateurs d'enzyme sont un mélange de désoxycholate et de chlorure de cetyl- diméthybenzylammonium. 23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'on utilise environ 5 à 15 rtM d'cmega-phényloctanoate de vinyle, d'environ 5 à 150 mM de tert-octylphénol polyoxyéthyléné, d'environ 0,05 M à 0,5 M de tampon pyrophos phate, d'environ 0 à 25 mM de désoxycholate, et d'environ 0 à 15 nM de chlorure de cétyldiméthylbenzylammonium. 24. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que l'on utilise d'environ 0 à 25 mM de désoxycholate et d'environ 0 à environ 15 mM de bromure de cétyltriméthylammonium. 25. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que ladite solution de réactif contient des sels neutres, pour augmenter la force ionique de ladite solution de réactif. 26. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il con- prend l'addition à une solution de réactif comprenant un ester de vinyle insoluble dans l'eau d'un acide carboxylique, un détergent non ionique, un tampon et un système de détection de l'acétaldéhyde, d'un liquide contenant une quantité inconnue de ladite hydrolase d'ester carboxylique. 27. Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que ledit système de détection de l'acétaldéhyde est un système enzymatique et en ce qu'il est basé sur l'oxydation ou la réduction dudit acétaldéhyde avec respectivement réduction ou oxydation simultanée d'un donneur ou d'un accepteur d'électrons ap proprié que l'cn peut détecter par voie spectrqphotzmétrique ou par voie fluorométrique. 28. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que ledit système de détection enzymatique de l'acetaldéhyde consiste en alcool déshydrogénase et en ss -dihydronicotinamide adénine dinucléotide (NSDH), que l'on ajoute en quantité suffisante pour réduire ledit NADH en p -nicotinamide adénine dinucléotide (D+) ce qui permet de titrer quantitativement la vitesse d'hydrolyse dudit ester de vinyle par la vitesse de disparition du NSDH. 29. Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que ledit système de détection de l'acétaldéhyde est un système chimique et en ce qu'il est basé sur la combinaison dudit acétaldéddde avec un colorant d'amine, pour former une base de Schiff colorée que l'on peut déterminer par voie spectrocho- métrique ou par voie fluorométrique. 30. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que ladite solution de réactif est préparée pour subir une lysphilisation et en ce qu'il en résulte un réactif pulvérulent sec. 31. A titre de produit nouveau utilisable carène ester de vinyle d'un acide carboxylique selon la revendication l,l'anégaényl octanoate de vinyle. 32. A titre de produit nwveau utilisable oomme ester de vinyle d'un acide carboxylique selon la revendication 1, l'omEga-phényl nonanoate de vinyle. 33. Réactif selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite hydrolase d'ester d'acide carboxylique est d'origine humaine. 34. Réactif selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite hydrolase d'ester d'acide carboxylique n'est pas d'origine humaine. 35. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que ladite hydrolase d'ester d'acide carboxylique est d'origine humaine. 36. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que ladite hydrolase d'ester d'acide carboxylique n'est pas d'origine humaine. 37. Solution stable et claire de réactif pour l'analyse des hydrolase d'ester d'acide carboxylique caractérisée en ce qu'elle comprend un ester de vinyle insoluble dans l'eau d'un acide carboxylique, un détergent non ionique, un tampon et des sels neutres, dans laquelle la valeur HIE dudit détergent est de 13 à 18, ladite valeur de HIE étant choisie pour obtenir l'activité spEcifi- que la plus forte pour ladite hydrolase d'ester ; dans laquelle la force ionique de ladite solution est ajustée par introduction desdits sels neutres pour obtenir l'activité spécifique la plus élevée pour ladite hydrolase d'ester ; et dans laquelle les quantités dudit ester, dudit détergent et dudit tampon, ladite valeur HEE et ladite force ionique sont choisies de telle sorte que lorsque ladite hydrolase est mélangée avec ledit réactif, le mélange est clair et présente une absorption stable en spectrootsmétrie. 38. Procédé d'analyse d'une hydrolase d'ester carboxylique nnracte risé en ce qu'il comprend l'addition, à une solution de réactif comprenant un ester de vinyle insoluble dans l'eau d'un acide carboxylique, un détergent non ionique, un tampon, et des sels neutres, dans laquelle la valeur HIE dudit détergent est de 13 à 18, ladite valeur HCE étant choisie pour obtenir l'activité spécifique la plus élevée et pour ladite hydrolase d'ester ; dans laquelle la force ionique de ladite solution est ajustée par introduction desdits sels neutres pour obtenir l'activité spécifique la plus élevée pour ladite hydrolase d'ester ; et dans laquelle les quantités dudit ester, dudit détergent et dudit tarq?on, ladite valeur HLE et ladite force ionique sont choisies de telle sorte que lorsque 1 Ton mélange ladite hydrolase avec ledit réactif, le mélange soit clair et présente une absorption spectrqphotmétrique stable, un liquide contenant une quantité inconnue de ladite hydrolase d'ester carboxylique et, la mesure de la quantité de l'acétaldéhyde produit. 39. Réactif selon la revendication 37, caractérisé en ce que ladite hydrolase est une lipase et en ce que ladite force ionique est par conséquent obtenue lorsque la concentration des sels neutres est entre 2,5 et 3,0 M. 40, Réactif selon la revendication 37, caractérisé en ce que ledit HLE est compris entre 15 et 16. 41. Réactif selon la revendication 37, caractérisé en ce que la concentration dudit ester est comprise entre 5 et 15 mM ; la concentration dudit détergent est canprise entre 5 et 150 mM ; et la concentration dudit tampon est canprise entre 0,05 jusqu'à sa limite de solubilité. 42. Procédé selon la revendication 38, caractérisé en ce que ladite hydrolase est une lipase et en ce que ladite force ionique est celle obtenue lorsque la concentration des sels neutres est canprise entre 2,5 et 3,0 M. 43. Procédé selon la revendication 42, caractérisé en ce que ledit HIE est compris entre 15 et 16. 44. Procédé selon la revendication 38, caractérisé en ce que la concentration dudit ester est comprise entre 5 et 15 nM ; la concentration dudit détergent est comprise entre 5 et 150 rflM ; et la concentration dudit tampon est comprise entre 0,05 jusqu'à sa limite de solubilité. 45. Réactif selon la revendication 37, caractérisé en ce que ladite hydrolase est l'estérase de foie de porc. 46. Procédé selon la revendication 38, caractérisé en ce que ladite hydrolase est l'estérase de foie de porc.