Brevet FR2361912A1 — publié le 19780317

La présente invention concerne le contre immunologique de la fécondité en utilisant le revêtement protéique noncellulaire antigène de l'oeuf des mammifères, à savoir la membrane pellucide. L'invention concerne aussi une forme soluble dans l'eau de la membrane pellucide ; appelée ci-aprésmembrane pellucide solubilisée" ou "SZP" pour abréger (SZP correspondant à l'expression "solubilized zona pellucida").L'invention concerne aussi des vaccins comprenant de la membrane pellucide de mammifère solubilisée ; des antisérums comprenant des anticorps contre la protéine antigène qui constitue la membrane pellucide ; des procédés pour la préparation de cette SZP, de ces vaccins et de ces antisérums ; et des procédés de traitement comprenant l'administration de ces vaccins et de ces antisérums pour le contr8le de la fécondité chez les mammifères femelles. La possibilité d'utiliser des procédés immunologiques pour contrôler la fécondité tant chez le mâle que chez la femelle a été beaucoup étudiée, mais jusqu'à présent on n'a trouvé aucun procédé utilisable. Ces tentatives de la technique antérieure sont caractérisées par l'impossibilité d'isoler une matière antigène à ltétat pur, ce qui est une condition nécessaire pour la production d'anticorps spécifiques de tissus. Un autre point faible de ces tentatives de la technique antérieure est que les antisérums sensiblement spécifiques à un certain tissu génital sont spécifiques à l'espèce, c'est-à-dire que ces antisérums ne donnent pas de signe de réaction immune avec le tissu analogue d'une autre espèce d'animal ; ces résultats caractérisent en outre la spécificité à l'espèce des préparations d'antigènes de la technique antérieure.Les exigences imposées à toute technique immunologique de contrôle de la fécondité doivent comprendre la spécificité au tissu et la réaction croisée (par opposition avec la spécificité à l'espèce) parce qu'en l'absence de la spécificité au tissu, le procédé immunologique ne pourrait pas être considéré comme sûr et sans la réaction croisée, tout procédé immunologique de ce genre serait extrêmement limité car la matière antigène devrait provenir de l'espèce à rendre inféconde -une impossibilité pour le contrôle de la fécondité de la femme. La possibilité d'un contrôle immunologique de la fécondité en utilisant la membrane pellucide antigène de mammifères a été envisagée. Cette structure, la membrane pellucide, et les phénomènes qui y sont associés, y compris la "réaction de zone", ont été beaucoup étudiés dans la biologie de la reproduction à propos de certaines interactions sperme-oeuf : approche, fixation et pénétration. L'approche du sperme vers l'oeuf semble être un processus statistique sans limite numérique. La fixation (du sperme sur la membrane pellucide) semble être attribuable à des sites récepteurs de sperme définis sur la surface de la membrane et selon toute probabilité est limitée numériquement par la surface disponible. La pénetration, toutefois, est limitée à un seul spermatozoide. Lors de la pénétration, les sites récepteurs sont désactivés (réaction de zone). Si les sites récepteurs ou des sites périphériques par rapport à eux sont antigènes, la possibilité de créer des anticorps qui masquent ou modifient la membrane pellucide et empêchent ainsi la fixation et la pénétration est une technique intéressante, non-hormonale,pour contrôler la fécondité. Mais jusqu'à présent, une telle technique s'est heurtée aux deux obstacles examinés ci-dessus, à savoir spécificité à l'espèce et manque de spécificité au tissu.Bien que la demanderesse ne veuille pas etre liée par une théorie quelconque, il semble-que ces tentatives antérieures ont été inefficaces principalement parce que la matière antigène précise, essentielle pour la mise en oeuvre de la présente invention, n'a pas été obtenue dans une forme fonctionnelle par les procédés de la technique antérieure qui comprennent, de façon caractéristique, une extraction saline globale de tissu ovarien entier macéré.Les antisérums préparés à partir de tels extraits salins, bien que rendus dans une certaine mesure spécifiques aux ovaires par adsorption d'anticorps indésirables par mise en contact avec divers tissus somatiques, se soht toujours révélés spécifiques à l'espèce ; de plus, il est extremement douteux que de tels antisérums de la technique antérieure soient même capables de participer à une.réponse immune avec les sites antigènes critiques de la membrane pellucide pour des raisons qui seront expliquées ci-après. D'une manière inattendue, on a découvert qu'un vaccin anti-fécondité spécifique au tissu, indépendant de l'espèce (capable de réaction croisée) peut être préparé à partir de la membrane pellucide de mammifères par un procédé selon lequel on chauffe des membranes pellucides seulement, des oeufs intacts ou du tissu ovarien comprenant des oeufs dans un milieu approprié comme de l'eau de manière que la membrane pellucide protéique soit solubilisée. De telles solutions aqueuses comprenant de la membrane pellucide solubilisée peuvent être évaporées à sec pour donner une forme de la protéine de membrane qui est facilement solubilisée de nouveau en solution aqueuse.Ainsi, pour les buts de la présente invention, l'expression "membrane'pellucide solubilisée" (SZP) est définie comme englobant de la protéine de membrane pellucide de mammifère -sèche ou en solution- qui a été rendue soluble dans l'eau conformément au procédé de la présente invention. Les anticorps préparés à partir de cette membrane pellucide solubilisée ne sont pas spécifiques à l'espèce et réagissent spécifiquement avec la membrane pellucide du mammifère traité pour contrôler la fécondité. Ainsi, c'est un but de la présente invention de fournir un vaccin pour le contrôle immunologique de la fécondité des mammifères femelles qui produit un état réversible d'infécondité sans destruction du cycle oestral normal. Un autre but de la présente invention est de-fournir un tel vaccin pour le contrôle immunologique de la fécondité des mammifères femelles comprenant de la membrane pellucide solubilisée (SZP) et de fournir des antisérums comprenant des anticorps ("anti-SZP") contre la membrane pellucide antigène des mammifères pour contrôler la fécondité ; ces vaccins et antisérums étant spécifiques au tissu et étant actifs sur toutes les espèces de mammifères. D'autres buts de la présente invention sont de fournir des procédés pour la préparation d'un tel vaccin, de tels antisérums (y compris la SZP et l'anti-SZP, isolément) et de fournir des procédés de traitement comprenant l'administration de tels vaccins et antisérums pour le contrôle immunologique de la fécondité des mammifères femelles. On va d'abord définir et décrire les divers aspects de la présente invention -vaccin et compositions pharmaceutiques antisérum (y compris les SZP et anti-SZP isolément), procédés pour'la préparation de ces compositions pharmaceutiques et procédés pour administrer ces compositions pour le contrôle immunologique de la fécondité. On présentera ensuite des informations techniques et des techniques qui décrivent spécifiquement la présente invention dans tous ses aspects, y compris la caractérisation physique et chimique de la membrane pellucide antigène de mammifère isolée et solubilisée ; des vaccins et des antisérums préparés à partir d'elle ; et les effets de ces préparations sur la fécondité des femelles de mammifères.Ces informations de caractérisation et techniques spécifiques indiquent représentativement les principes généraux intervenant dans la mise en oeuvre des aspects décrits en premier lieu de la présente invention et, à partir de ces enseignements représentatifs, on pourra mettre en oeuvre la présente invention dans tous ses modes d'exécution explicites et implicites. Vaccin Le vaccin de la présente invention permet un controle immunologique de la fécondité quand il est administré à un mammifère femelle par les procédés décrits ci-après. Bu point de vue composition, le vaccin comprend de la membrane pellucide de mammifère solubilisée dérivée d'une source autre que la femelle soumise au traitement. La nécessité d'une source autre que la femelle traitée existe parce que les oeufs, à la différence du sperme, sont présents tôt dans le développement foetal et ainsi la femelle est tolérante à ses propres membranes pellucides, le revêtement protéique non-cellulaire qui entoure l'ovule des mammifères.Comme décrit ci-après, il n'y a pas d'exigence critique en ce qui concerne la source de la membrane pellucide pour la mise en oeuvre de la présente invention, à part celle indiquée ci-dessus selon laquelle la membrane pellucide solubilisée doit être obtenue à partir d'une espèce d'animal distincte de celle traitée pour le contrôle de la fécondité. Ainsi, par exemple, pour l'immunisation de la femme, les animaux possibles comme source des membranes pellucides comprennent pratiquement n'importe quelle espèce de mammifère inférieur comme le hamster de laboratoire ou la souris de laboratoire, mais pour des raisons pratiques des sources provenant d'abattoirs, comme des vaches, des moutons et des porcs, peuvent être préférées suivant la disponibilité. le vaccin comprend une solution aqueuse de la membrane pellucide de mammifère solubilisée (SZP), isolément ou en combinaison avec un adjuvant approprié comme de l'hydroxyde d'aluminium, une émulsion huile minérale-eau ou des émulsifiants comme de l'alginate de calcium. L'adjuvant particulier n'est pas critique. La composition de vaccin peut être préparée sous la forme de doses unitaires ou en vrac pour dilution ultérieure. En variante, le vaccin peut autre préparé à l'état sec (lyophilisé) à partir de la forme solubilisée pour des raisons de commodité de stockage. La forme de dosage du vaccin peut être préparée à partir de la solution en vrac par dilution avec de l'eau stérile ou avec un adjuvant aqueux tamponné (rH préféré 7,0 à 7,2) de manière que la forme de dosage unitaire pour l'administration par injection comprenne la SZP à raison d'environ 1,0 à environ 10,0 jig par kg de poids du corps. Les aspects du procédé de traitement pour une vaccination efficace, à savoir période et nombre d'injections unitaires, seront déerits plus loin. Antisérums Les compositions d'antisérum de la présente invention comprennent des anticorps contre la membrane pellucide antigène et ces compositions sont utiles comme moyen passif de contrôle immunologique de la fécondité car l'inoculation de tels anticorps fournit une infécondité de courte durée et, de plus, semble empêcher l'implantation utérine d'ovules fertilisés. Les procédés de préparation de tels antisérumsfet les procédés d'administration de ces antisérums sont décrits ci-après. Du point de vue composition, les antisérums comprennent ltanticorps identifié dans des sérums exempts de cellules ou leurs fractions (fractions de Cohn ou forme lyophilisée). Des techniques analytiques bien connues pour caractériser la qualité et la quantité de ces préparations de vaccins et d'anticorps, anti-SZP, comprennent par exemple les suivantes 1) L'immunodiffusion de gel (Ouchterlony, 26 Acta, Pathol. Microbiol. Scand. 507 (1949) ; 2Y -la technique dite de "Sandwich" utilisant un anticorps fluorescent (Coombs, Immunological Methods, éd. par Ackroyd ; Blackwell ; Oxford (1964)) et 3) L'inhibition de la fécondation in vitro (Gwatkin et autres, 30 J. Reprod. Fert. 389 (1972)). Procédé de traitement Dans l'aspect concernant le procédé de traitement de la présente invention, il y a lieu de souligner que le niveau précis de dosage et la période dtinoculation dépendent de l'historique de l'individu qui est traité et en dernière analyse sont laissés à l'appréciation du médecin traitant car ces paramètres sont déterminés facilement d'après les indications générales données ici. En général, la vaccination avec le présent vaccin comprenant de la membrane pellucide de mammifère solubilisée fournit un état réversible d'infécondité de la femelle traitée durant typiquement de 15 à 30 semaines environ. Typiquement, l'immunisation (infécondité) chez la femme est obtenue par injection d'une solution de vaccin comprenant d'environ 70 à environ 700 ng de SZP administrés une seule fois ou avec répétition après un intervalle de 7 à 14 jours. L'état d'immunité et donc d'infécondité peut être déterminé en obtenant un petit échantillon de sang et en titrant sa portion sérum par immunodiffusion de gel contre SZP. L'agglutination à un titre de plus de 1:16 indique une teneur en anticorps assez élevée pour assurer l'inféeondité. Le retour de la fécondité est indiqué par une chute rapide du titre en anticorps. Le procédé de traitement comprenant l'administration dssantisérums décrits ci-dessus s'effectue, dans le cas du traitement de la femme, par injection d'une fraction de sérum riche en globuline provenant d'un animal immunisé tel que le cheval, le mouton, le porc, etc. Une telle fraction est préparée par précipitation par un alcool froid (méthode de Cohn) et typiquement la dose unitaire par injection comprend d'environ 10 à environ 20 mg par kg de poids du corps. Unelqjection administrée jusqu'à environ 14 jours après un colt avec possibilité de conception est typiquement suffisante pour empêcher une grossesse, mais des injections répétées administrées chaque jour jusqu!au quatorzième jour fournissent une plus grande assurance d'efficacité.En variante , les cpmpositions anti-SZP peuvent etre utilisées comme moyen de contrôle à court terme de la fécondité. L'administration par injection de doses unitaires d'environ 10 à environ 20 mg par kg de poids du corps de la fraction décrite ci-dessus fournit un état stérile durant au moins 5 jours, le retour de la fécondité étant déterminé comme décrit ci-dessus. Vaccin. Procédé de Préparation Comme indiqué précédemment, il n'y a pas d'exigence critique en ce qui concerne la source de la membrane pellucide de mammifère, mais pour des raisons pratiques les espèces suivantes dJanimaux sont préférées pour la récolte de membranes pellucides pour la préparation de vaccins à utiliser sur des humains et sur des animaux domestiques : des animaux de laboratoire tels que des souris, des hamsters, des rats et des lapins et des animaux d'abattoirs tels que des génisses, des moutons et des porcs. La solubilisation de la membrane pellucide est effectuée en chauffant des membranes intactes à des températures comprises entre environ 65 et environ 1000C dans un milieu aqueux comprenant en variante une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, ayant la composition en g/l : Cati2 0,1 ; KC1 0,2 KH2P04 0,2 ; MgC12.6H20 0,1 ; N2C1 8,0 ; NtHP04.2H20 1,15 ou des solutions salines tamponnées de manière similaire fournissant un pH compris entre 7,0 environ et 7,4 environ. Dans la pratique, la solubilisation de la membrane pellucide protéique peut être effectuée directement sur un tissu-ovarien global qui a été broyé mécaniquement'avant chauffage. De préférence, le tissu ovarien provient d'animaux non adultes car le nombre d'ovocytes produisant des membranes pellucides diminue rapidement avec l'age. En variante, et dans le cas de préparations à petite échelle, les membranes pellucides peuvent étre séparées mécaniquement des ovules. Cela peut être effectué, par exemple, en aspirant les ovules complets à travers une ouverture ayant environ 1/2 à 3/4 de son diamètre normal. En opérant de cette manière, la membrane pellucide est arrachée de l'ovule tandis qu'il est tiré à travers l'ouverture. La membrane pellucide ainsi solubilisée peut hêtre ensuite isolée ou purifiée des matières polluantes par le procédé généralisé suivant : centrifugation ; dialyse de la solution clairerésultante à travers de la cellulose régénérée dans un bain aqueux ; puis chromatographie sur colonne. Les fractions actives de SZP provenant d'une telle colonne sont identifiées par des techniques normalisées énumérées plus haut comme par immunodiffusion et par essai de fécondation in vitro. La pureté de la SZP résultante peut autre déterminée par l'une quelconque des techni-ques bien connues suivantes 1) Ultracentrifugation ; 2) Electrophorèse sur des gels composites agarose-acrylamide (7 Biochemistry 668 (1968)) 3) Inhibition de la fécondation du hamster in vitro ; et 4) Immunodiffusion contre un antisérum spécifique pour la protéine de membrane pellucide. Àntisérums. procédé de préparation En général, on prépare les compositions d'antisérums de la présente invention en injectant, à un animal hôte, la membrane pellucide solubilisée d'une espèce donneuse distincte et en recueillant ensuite les anticorps du sérum. Plus particulièrement, on utilise le mode opératoire suivant : un animal approprié tel qu'un cheval, un mouton ou une chèvre reçoit une injection intramusculaire de SZP en solution (5 à 10 pg de SZP par kg de poids du corps) dans 0,5 à 1,0 em3 d'adjuvant de Freund complet). A partir de 10 jours plus tard, on effectue des injections similaires dans l'adjuvant de Freund incomplet à des intervalles de 10 jours. Les animaux sont alors saignés et on mesure le titre d'anticorps par immunodiffusion contre de la SZP purifiée. Les exemples suivants illustrent spécifiquement, mais ne limitent pas les aspects concernant les compositions pharmaceutiques et le procédé de traitement de la présente invention. En fait, les exemples particuliers suivants décrivent des modes opératoires qui sont généralement applicables -n'exigeant que des modifications non-critiques pour la pratique de tous les modes de mise en oeuvre explicites et implicites de la présente invention. Exemple 1 Préparation et propriétés de membrane pellucide de hamster solubilisée et techniques d'analyse Des membranes pellucides de hamster sont isolées à partir d'ovules intacts par une technique de rupture. Dans cette technique, des ovules individuels sont aspirés à travers une ouverture étroite (pipette de 60 p d'alésage) de manière que la membrane se rompe et se sépare de l'ovule intact (vitellus). Deux mille membranes pellucides ainsi obtenues sont placées dans 100 microlitres de solution saline aqueuse tamponnée au phosphate (PBS 99, J. Exp. Ned. 167 (1954)) et chauffées à 650C pendant 35 minutes, et les membranes sont alors complètement dissoutes pour donner une solution claire. L'analyse par ultracentrifugation indique que la solution contient une seule espèce moléculaire d'une masse moléculaire de 8,9 x 106. L'espèce moléculaire est une protéine, constituée de 17 amino acides (Tableau I). TABLEAU I Composition en amino acides de la protéine de membrane pellucide de hamster Amino acide % par rapport au total des amino acides tir 9,31 PHE 10,40 LYS 6,78 HIS 4,88 ARG 2,11 ASP 4,27 GLU 7,77 THR 6,99 SER 6,71 PRO 5,89 Alla 5,23 GLY 6,54 VAL 7,25 CYS 0,92 NET 0,32 ILE 0,24 LEU 14,38 D'une manière compatible avec la composition en amino acides, on a trouvé que la protéine de membrane pellucide de hamster (SZP de hamster) est neutre ou faiblement basique. L'électrophorèse sur gel de la protéine de SZP de hamster ainsi obtenue (10 ffi de polyacrylamide : pH 7,0 ; 2 milliampères par tube de 5 mm de diamètre) ne déplace pas la protéine après 18 heures -l'échantillon restant sous la forme d'une seule bande au sommet de la colonne de gel. La bande se colore fortement avec la coloration pour protéines (vert fixe). La bande ne se colore pas avec le bleu 8'alcian" ce qui suggère que la protéine de SZP ne contient que peu ou pas du tout d'hydrate de carbone.Quand on traite la SZP de hamster avec de l'urée et du mercaptoéthanol, elle se dissocie en trois sous-unités inférieures ayant des masses moléculaires de 100 000, 80 000 et 55 000 comme révélé par migration dans le gel d'électro phorése décrit ci-dessus ; on effectue la dissociation en chauffant à 500C pendant 45 minutes un mélange de 10 > il de SZP de hamster, dune goutte de glycérol et de 10 311 d'une solution qui comprend 100 mg de dodéeyl sulfate de sodium, 2,4 g d'urée, 100 l de solution aqueuse à 1,2 % de mercaptoéthanol et 10 cm3 d'eau distillée ; le mélange est ensuite appliqué à un gel à 10 % pour électrophorèse contre des étalons de référence. Une technique d'analyse pour déterminer l'activité de la SZP de hamster consiste à déterminer son interaction avec des spermatozoides de hamster "capables", c'est-à-dire capables de traverser la membrane pellucide pour la fécondation finale de l'oeuf. La détermination de cette capacité du sperme in vitro est effectuée couramment en traitant du sperme obtenu à partir de l'épididyme pendant 6 heures dans un milieu de culture de tissu contenant des cellules "cumulus" provenant de l'oviducte d'animaux "super ovulés" 20 heures après l'injection de 30 I.U. de HCG (Gwatkin et autres, 30, J. Reprod. Fert. 389 (1972)). Quand de tels spermatozoides capables sont mis à incuber avec de la SZP de hamster, la mesure dans laquelle les sperma tozoides sont incapables de pénétrer dans des oeufs exempts de "cumulus" est une mesure de l'activité de la SZP. Par exemple* on détermine l'activité de la SZP de -hamster décrite ci-dessus en ajoutant 10 g1 de la solution la contenant à 30 311 de la solution comprenant les spermatozoides de hamster capables, 5 x 106 spermatozoides par cm3. Après une incubation de 30 minutes, on ajoute 20 oeufs de hamster exempts de "cumulus" et on note la pénétration des spermatozoides après un laps de temps de 90 minutes.Des spermatozoldes capables prétraités avec de la SZP de hamster, quoique mobiles, sont complètement incapables de pénétrer dans les oeufs. Quand de la SZP de souris obtenue à partir de souris de laboratoire par un mode opératoire identique est substituée à la SZP de hamster, on obtient des résultats positifs dans l'essai décrit ci-dessus. Cela fournit la preuve que la SZP n'est pas spécifique à l'espèce. Une deuxième indication, directe, de réaction croisée (absence de spécificité à l'espèce) est fournie par l'immunisation contre la fécondité, décrite ci-après, où on montre que la vaccination d'espèces d'animaux distinctes, allant de la souris de laboratoire à divers primates, avec de la SZP de hamster rend ces espèces d'animaux infécondes comme observé sur des accouplements naturels et comme observé par immunofluorescence d'oeufs provenant d'espèces laparotomisées qui ont été vaccinées (primates). Un autre essai analytique comprenant l'immunofluorescence d'oeufs traités avec des antisérums contre la membrane pellucide solubilisée indique aussi l'absence de spécificité à l'espèce du présent vaccin. Ainsi, par exemple, un antisérum préparé sur des souris contre la SZP de hamster décrite ci-dessus réagit avec les oeufs de hamster, de souris, de vache, de singe rhésus et de sagouin. Cette réaction est évidente quand les oeufs sont traités avec de la globuline anti-souris fluorescente toutefois, la concentration de l'antisérum nécessaire pour produire la fluorescence varie avec l'espèce. La vaccination de hamsters femelles avec la SZP de hamster ne produit, comme prévu, aucune réponse immune détectable, mais quand on administre à des souris femelles des injections de vaccin (le vaccin comprenant 4 Xg de SZP de hamster dans 0,5 cm3 d'adjuvant de Freund -complet pour la première injection, incomplet pour les injections suivantes) par voie intramusculaire et de nouveau à des intervalles de 10 jours pour un total de 4 injections, l'analyse du sérum, comme décrit ci-dessus, montre que des anticorps contre la membrane pellucide sont établis. Quand ces souris sont accouplées, elles se révèlent infécondes. Pour démontrer l'absence de spécificité à l'espèce dans la réponse immune, des antisérums provenant des souris vaccinées sont recueillis de la manière suivante : une micropipette en verre est introduite dans le sinus orbital et on laisse couler le sang dans la pipette. Ce sang est transféré dans un tube en verre, on le laisse coaguler et il est ensuite centrifugé à 1 000 g pendant 5 minutes. Quand de tels sérums contenant des anticorps anti-SZP sont testés pour l'interaction avec des oeufs de mammifères de diverses espèces (hamster, souris, vache, sagouin et singe rhésus) on observe une fluorescence brillante sur la membrane pellucide des oeufs ainsi traités quand ils sont exposés à de la globuline anti-souris fluorescente. Toutefois, la réaction anticorps-antigène est spécifique à la structure de la membrane pellucide car quand le même antisérum est mis en contact avec divers tissus comme de la cornée de hamster, des oeufs de hamster sans membrane pellucide, des cellules "cumulus" de hamster et du sperme de hamster, on n'observe pas de réaction immune. Ces résultats constituent encore un autre moyen d'analyse pour essayer les préparations de vaccin et d'antisérum et pour déterminer l'efficacité de la vaccination. Une autre technique d'analyse pour la détermination de la pureté de la membrane pellucide de mammifère solubilisée consiste à conduire des évaluations d'immunodiffusion et d'immunoélectrophorèse dans lesquelles on observe l'interaction de la SZP avec un anticorps produit à partir d'elle.A propos de la SZP de hamster décrite ci-dessus et de l'antisérum, on observe qu'une seule bande de précipitine est formée, ce qui indique que la membrane pellucide solubilisée est constituée d'un seul antigène. Exemple 2 Isolement de SZP à partir d'ovaires et Préparation dè vaccin Des ovaires complets (100) de génisses (âgées de 5 à 7 mois) sont recueillis dans de la glace, en provenance d'un abattoir. Chaque ovaire comprend environ 180 000 follicules et ainsi une quantité d'environ 2,0 mg de membrane pellucide est présente. Les ovaires sont hachés avec des ciseaux et pour chaque gramme de leur poids à l'état humide on ajoute 5,5 cm3 de solution saline tamponnée au phosphate (Phosphate Buffered Saline") (PBS) de Dulbecco (99 J. Exp. Ned. 167 (1964)). Le mélange est homogénéisé pendant 1 minute dans un mélangeur universel "Sorval Omnimixer" refroidi avec de la glace.Le mélange homogénéisé est versé dans des tubes en Pyrex de 25 cm3 de centrifugeuse, lesquels tubes sont placés dans un bain d'eau bouillante pendant 15 minutes. Les tubes sont ensuite centrifugés à 12 000 g pendant 8 minutes. On verse le liquide surnageant clair résultant et on se débarrase de la pastille. Le liquide surnageant dans un tube à dialyse à la cellulose est dialysé contre un volume de 100 x de milieu aqueux de bicarbonate d'ammonium O,01M pendant toute une nuit à 50C. La matière dialysée -est lyophilisée. L'extrait lyophilisé est dissous dans la quantité minimale de PBS pour la mise en place sur une colonne chromatographique chargée de Biogel A-5M de Biorad en vue de la séparation de la SZP des espèces de masse moléculaire plus basse ayant une masse moléculaire inférieure à 5 x 106.Les fractions actives, éluées avec du PBS (fractions comprenant la SZP de vache) sont identifiées par immunodiffusion et essai de fécondation in vitro. Les fractions actives sont ensuite placées sur une colonne chromatographique chargée de Biogel A50M, qui effectue une séparation dans l'intervalle de masse moléculaire de 106 à 5 x 107. Les fractions actives sont identifiées de nouveau par immunodiffusion et essai de fécondation in vitro. Les fractions actives, ainsi identifiées, donnent une seule bande contre le sérum anti-SZP (souris) qui rencontre la bande trouvée avec la SZP de hamster, ce qui indique l'identité immunologique. Les fractions actives bloquent la fécondation des oeufs de hamster in vitro. Les fractions résultantes comprenant de la SZP de vache en solution sont lyophilisées pour l'utilisation ultérieure. Un vaccin utilisable pour le contrôle immunologique de la fécondité de la femme sous la forme de doses unitaires par injection intramusculaire est préparé en dissolvant 500 g de la SZP de vache préparée ci-dessus (forme lyophilisée) dans 1,0 cl3 de solution stérile de PBS. REVENDICATIONS 1) A titre de produit industriel nouveau, de la membrane pellucide solubilisée. 2) Un vaccin pour le contrôle immunologique de la fécondité chez les mammifères femelles, comprenant de la membrane pellucide solubilisée. 3) Une composition d-'antisérum comprenant lfanticorps anti-membrane pellucide solubilisée. 4) Une composition pharmaceutique injectable comprenant de l'anti-membrane pellucide solubilisée pour le contre de la fécondité chez les mammifères femelles. 5) Un procédé de préparation d'un vaccin anti-fécondité selon lequel on solubilise de la membrane pellucide dans un milieu aqueux en chauffant cette membrane pellucide à des températures comprises entre 650C environ et 1O00C environ. 6) Un procédé de contrôle immunologique de la fécondité chez les mammifères femelles selon lequel on administre par injection de la membrane pellucide solubilisée. 7) Un procédé de contre immunologique de la fécondité chez les mammifères femelles selon lequel on administre par injection de l'anti-membrane pellucide solubilisée. 8) A titre de médicament, de la membrane pellucide solubilisée0