Brevet FR2389134A1 — publié le 19781124

La présente invention a trait au domaine des méthodes d'analyse et de réalisation de réactions chimiques, biochimiques, immunochimiques et analogues. Elle concerne tout particulièrement un nouveau procédé de mise en contact de substances chimiques ou autres mettanteet oeuvre des récipients réac- tionnels de type bien particulier. Les méthodes de dosage en chimie, biologie ainsi que les réactions entre diverses substances s'effectuent gendralement dans des récipients conventionnels tels que : tubes à essais, ballons ou ampoules de verre, cuvettes de diverses formes..., les dimensions des réceptacles utilisés étant habituellement adaptées au type d'opération à entreprendre. Il est toutefois devenu.courant, au cours de ces dernières années, dese servir de récipients jouant simultanément le r81e de vases de réaction et de mesure, comme par exemple les cuvettes spectrophotométriques qui peuvent être jetées après usage.De nombreuses méthodes de biochimie clinique. procèdent ainsi de ce principe, Par exemple, on peut dtudier dans une cuvette de ce type la réaction colore qui se développe après mélange, au temps zéro, entre un substrat chromogène d'un enzyme et le sérum d'un malade contenant une quantité inconnue de cet enzyme ; et l'on analyse dans la même cuvette la cinétique de dèveloppement de cette rdaction grace à une série de mesures spectrophométriques effectudes in situ. La mise en oeuvre de tels récipients è double usage constitue un net progrès car elle permet une grande simplification des manipulations ainsi qu'unie meilleure évaluation de la cinétique en raison de l'absence de transfert. I1 a maintenant été trouvé que l'on pouvait encore améliorer considérablement cette technique de réaction-analyse en un même milieu gracie B la mise en oeuvre, comme récipient de mesure, d'un microtube capillaire. Le nouveau procédé de l'invention peut convenir à tous types de réactions et de dosages en chimie et parachimie. Outre sa large portée d'applications pratiques, il présente une série* > d'avantages parmi lesquels connotera tout particulièrement les suivants les quantités d'échantillon à analyser et de réactifs peuvent etre considérablement réduites et n'être plus, par exemple,que de quelques microlitres à quelques dizaines de microlitres La limite inférieure de sensibilité se trouve notablement augmentée, tout particulièrement lorsqu'on effectue des mesures spectrophotométriques ; en effet, dans ce cas, le trajet optique de la mesure a lieu dans l'axe du capillaire.On peut par exemple déduire de la loi de Lambert-Beer su'une lecture spectrophotométrique de densité optique faite sur un trajet optique de dix:centimètres est dix fois plus forte que celle faite sur le trajet habituel de un centimètre environ Le rapport surface/volume, considérablement augmenté dans un tel récipient cylindrique allongé de faible diamètre, permet d'envisager des microréactions et microanalyses qu'il était impossible de détecter et de suivre dans les ré ceptacles classiques.En outre, il est possible d'immobiliser, par un phénomène d'absorption ou par liaison covalente, sur les parois du capillaire, un réactif cXiique, biochimique ou immunochimiqlepuis d'introduire le microéchantillon d'un autre produit et de suivre, par méthode radiométrique, ondemétrique , Spectre- métrique ou autre, l'évolution du milieu en effectuant les dosages correspondants avec une extrdme précision. En pratique, lestubes capillaires utilisés selon la présente invention peuvent avoir des longueurs et des diamètres variant entre d'assez larges limites. Il a cependant été trouvé spécialement avantageux, dans la plupart des cas, de mettre en oeuvre des capillaires rectilignes d'une longueur comprise entre 2 et 15 centimètres environ et de diamètre pouvant aller de 1 à 5 millimètres environ. De tels tubes sont facilement accessibles dans leveommer- ce et peuvent être réalisés en divers matériaux tels que notamment en matière plastique ou, mieux, en verre tel que Pyrex ou analogue. A titre expérimental, le procédé de l'invention a été mis en oeuvre pour le dosage enzymo-immunologîque de substances antigènes, notamment pour l'alpha-foeto-protéine (AFP) humaine, selon la même méthode que celle dé crite par Maiolini et Masseyeff (J. Immunol. Methods 8 p.223-234,1975) mais en l'adaptant à l'utilisation de capillaires comme vases de réaction et de mesure. On a revêtu un capillaire, de diamètre intérieur de 1,3mm et de longueur 75 mm, d'un anticorps anti-AFP (obtenu sous forme de fraction de précipitation par Na2SO4 à 18 % d'un sérum de mouton hyperimmunisé par l'AFP humaine) selon le procédé de Robinson & Al (Biochem.Biophys.Acta 242 p.659-661 ,1971). La solution de gamma-globulines ainsi fixées était à la concentration de 2mg/iL On a alors introduit dans les capillaires précités des échantillons contenant respectivement : 5,12,40,120 et 400 flanogrammes (ng) d'XFP/ml et on les a laissés pendant 5 heures 8 la température ordinaire. Après ce temps, on a rincé les capillaires par une solution de lavage tamponnée à pli 7,2 par un phosphate et contenant 0,9 % de Na-Cl et 0,05 % d'agent mouil lant "tween 20 puis on les a rempli par une solution d'anticorps marqués à la glucose-oxydase dont les caractéristiques étaient identiques à celles décrites dans l'article précité de Maiolini et Maseeyeff. On a laissé réagir ces anti corps marqués pendant 10 heures à la température ordinaire. PUis, après nouveau rinçage au moyen de la méme solution de lavage, on a rempli rapidement les capillaires par la solution de substrat de détermination de l'activité glucoseoxydasique utilisée par les auteurs susmentionnés. On a alors effectué des lectures de densité optique au travers de la lumière des capillaires, ce qui représentait un parcours optique de 7,5 mm à l'aide d'un spectrophotomètre adapté à cet effet, pour une longueur d' onde de 405 nanomètres. Au bout de 6 minutes, on a pu effectuer les lectures suivantes sur les divers échantillons échantillon Densité optique (à 405 nm) 3 ng 0,069 12 ng 0, 335 40 ng 1,583- 120 et 240 ng supdrieur å 2 Ces résultats montrent qu'il est possible de déceler grâce à cette technique aux microcapillaires, des quantités très faibles dtun antigène.La limite de sensibilité peut d'ailleurs être encore très abaissée en prolongeant le temps de mesure de l'activité enzymatique. Bien entendu, il est possible d'associer de nombreuses autres substances de nature diverse (minérale, organique, biochimique) à la paroi du capillaire, Par exemple on a entrepris un essai de couplage d'un enzyme tel que la glucose-oxydase selon le m4me procédé que Robinson & Al (article précité). On a ainsi pu suivre avec une grande précision, par mesure de densité optique l'apparition et le développement de la coloration lors de l'intro- duction dans un capillaire-de type précitez d'une solution de glucose (comme du sdrum humain) et d'un réactif chromogène (tel que celui utilisé dans le procédé précité) ; on peut ainsi doser la quantité de glucose dans un échantillon et évidemment adapter le procédé à une très grande variété de substrats. Ces exemples illustratifs ne limitent en rien la portée de l'invention qui s'applique a tous types de réactions et de dosages dans les laboratoires et l'industrie de la chimie, biochimiel, pharmacie et disciplines dérivées REVENDICATIONS 1. Procédé de mise en contact de réactifs et d'analyse de diverses substances dans un même récipient de faible taille servant de microvase de réaction et de mesure, caractérisé en ce que lton utilise comme récipient un microtube capillaire. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le capillaire est rectiligne et a une longueur de 2 810 centimètres environ pour un diamètre compris entre 1 et 5 millimètres environ. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le ca- pillaire est en matière plastique ou en verre. 4. Application du-procéd selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 à tous types de réactions et d'analyses dans les domaines chimiques, pharmaceutique, biochimique et dérivés. 5. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 A 3 aux réactions immunologiques de composants à affinités spécifiques dont 1' un au moins est fixé sur la paroi du capillaire.