Brevet FR2387241A1 — publié le 19781110

L'invention est relative à des nouvelles compositions pharmaceutiques à base dfurokinase, susceptibles d'être mises en oeuvre dans des conditions qui peuvent être plus favorables que celles qui sont couramment recommandées, compte tenu de la nature de l'urokinase contenue dans ces nouvelles compositions et à un procédé d'obtention d'une telle urokinase. I1 est déjà connu que les urokinases que lton trouve dans le commerce sont souvent constituées par des mélanges notamment de deux types d'urokinase, lesquels se distinguent essentiellement par leurspoids moléculaires, de l'ordre de 33.000 pour l'un d'entre eux, et de l'ordre de 54.000 pour l'autre.Ces deux types, qui seront désignés dans ce qui suit par les désignations "urokinase I" et "urokinase II", respectivement n'ont cependant guère pété l'obJet, jusqu'à ce Jour, d'études ayant abouti à la constatation qu'ils pouvaient présenter des propriétés différentes. I1 manquait également moléculaires, ce jour un procédé permettant dteffectuer leur séparation à grande échelle et, en même temps, avec une simplicité et une sélectivité suffisantes. En effet, un procédé basé sur la seule différence de leurs poids l'échange dont l'écart est trop faible, ne pouvait répondre à de telles exigences. L'invention résulte de la découverte que cette séparation pouvait en fait être réalisée dans de bonnes conditions et avec des rendements satisfaisants, par une technique mettant en Jeu un gel ayant des propriétés permettant été d'ions. L'invention découle également de la découverte qui a faite :dèï propriétés enzymatiques,notablement différentes de ces deux mes d'urokinase vis-à-vis du plasminogène natif, tel qu'il existe dans le sang humain circulant, ces propriétés enzymatiques dif férentes pouvant être mises à profit de façon particulièrement avantageuse, notamment dans l'élaboration de schémas de traitements thérapeutiques qui peuvent se démarquer nettement de ceux déjà utilisés dans l'état de la technique, et plus particulière- ment entre eux selon que l'on utilise l'un ou l'autre des susdits types d'urokinase.Ces schémas thérapeutiques peuvent en outre conduire à une meilleure tolérance et à une réduction importante des doses utilisées,qu'il s'agisse des urokinases elles-mêmes - ce qui constitue un avantage particulièrement bénéfique, ne serait-ce que sur le plan économique, étant donné les coûts de production élevés de l'urokinase - ou d'autres médi caments utilisés dans certains schémas de traitement thérapeutique dans lesquels ils sont mis en oeuvre, en association avec l'urokinase. A cet égard, on peut remarquer qu'il a dé a été proposé, dans le brevet belge n 831.867 du 29 juillet 1975, d'avoir recours à un traitement séquentiel de thrombose ou de déficit de la fonction thrombolytique, plus particulièrement des thromboses veineuses profondes, en ayant recours à des administrations alternées au patient de plasminogène, d'une part, et d'un activateur du plasminogêne, d'autre part. 1'urokinase à certes été mentionnée, au titre de l'activateur du plasminogène, bien qu'elle ne constitue pas, dans les indications thérapeutiques préférées qui avaient été indiquées dans le brevet belge, l'activateur préféré du plasminogene. En tout état de cause, les premiers essais qui avaient été réalisés l'avaient été avec des compositions à base d'urokinase contenant des proportions non négligeables d'urokinase Il. La présente invention concerne cependant des compositions utilisables en thérapeutique et administrables notamment par insection, perfusion ou analogues, a' base d'urokinase I- ou d'urokinase II, respectivement sensiblement exemptes de autre type d'urokinase. L'invention concerne également un procédé de séparation de ces deux urokinases qui est caractérisé en ee qu'il comprend les étapes qui consistent à mettre en contact avec un gel ayant, du point de vue ioniqus les caractères d'une résine échangeuse d'ions, sur laquelle les urokinases sont susceptibles autre fixées, le mélange d'urokinases à séparer au sein d'une solution tamponnée à base d'un sel minéral du type de ceux qui, à une concentration donnée, permettent la retenue ou la fixation des deuxtypes d'urokinase sur le gel, lorsque celui-ci est équilibré avec une telle solution tamponnée, à laver ensuite ledit gel, no notamment avec la même solution tampon Jusqu'à ce que l'effluent ne contienne plus de protéines, à faire passer sur le gel, sur lequel sont fixées les urokinases, une solution tampon semblable sauf que l'on fait progessivement varier sa concentration en sel minéral à partir de la valeur initiale telle--que définie cidessus Jusqu'à la valeur pour laquelle plus aucun type d'urokinase ne peut être retenu sur le gel, dans des conditions de développement propres à permettre les élutions successives, mais sépa rées des deux types d'urokinase. Avantageusement, le gel utilisé est à base d'une agarose dont les channes sont réticulées entre elles, de préférence un gel de ce type comportant des groupes carboxyaéthyla. On obtient des résultats particulièrement avantageux en ayant recours au gel constitué par la carboxyméthyl-agarose réticulée en parles, commercialisé sous la désignation "carboxyméthyl-SEPHAROSER". Toutes les opérations sont réalisées de préférence à basse température, avantageusement à 40C environ. Dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon l'invention, la solution tamponnée est maintenue à un pH compris entre environ 4 et environ 7, de préférence de l'ordre de 6, et le sel minéral dont on fait varier la concentration est constitué par le sulfate d'ammonium. La concentration initiale en sulfate d'ammonium de la solution tamponnée est avantageusement comprise entre 0,01 m et 0,06 M, notamment de l'ordre de 0,04 M. La dissolution d'un mélange d'urokinases des types I et II dans une telle solution tamponnée et sa mise en contact avec un gel échangeur d'ions, notamment du type "carboxyméthyl-ssPHAROSE", préalablement équilibré avec une solution tamponnée semblable, permet la fixation de la totalité de l'urokinase initialement contenue dans le mélange, lorsque la quantité de gel mise en oeuvre est suffisante.Avantageusement, l'opération de fixation est réalisée au moyen d'une technique chromatographiqua, le gel étant alors contenu à l'intérieur d'une colonne Les deux types d'urokinase du mélange initial peuvent alors être séparés l'un de l'autre par développement, notamment selon un gradient linéaire, par passage au travers de la colonne d'une solution tamponnée de pH semblable dont on fait progressivement contre la concentration en sulfate d'ammonium jusqu'à une valeur qui peut notamment être comprise entre 0,1 à 0,5 M, de préférence de l'ordre de 0,25 M. Les éluats obtenus peuvent être fractionnés de façon en soi classique, et soumis à des analyses en ce qui concerne notamment leurs teneurs respectives en protéines et leurs activités urokinase, avant d'être rassemblés selon la nature de leur contenu. En particulier, on rassemblera les groupes de fractions qui correspondent à chacun des deux pics distincts d'activité urokinase qui peuvent être ainsi mis en évidence, lorsque l'on règle dans des conditions en soi classiques les différents paramètres d'élution. On indiquera ci-après, à titre illustratif, bien entendu non limitatif, les conditions particulièrement appropriées à la séparation des susdites deux fractions distinctes, lesquelles correspondent respectivement aux deux types d'urokinase re cherchés. Une colonne de carboxyméthyl-SEPHAROSER ER est préparée de manitre à avoir 1 ml de gel pour 0,1 à 1 million d'uCTÂ d'nrokinase, de préférence 1 ml pour 0,4 million d'uCTA. Cette colonne est équilibrée par du tampon sulfate d'ammonium 0,01 N à 0,06 M, de préférence 0,04 M, de pH compris entre 4,0 et 7,0, de préférence 6,0. Le mélange d'urokinase à séparer est dissous dans ce tampon, à raison de 200.000 uCTA/ml et dialysé 8 heures, contre 100 à 200 volumes de ce même tampon. La solution obtenue, après une éventuelle centrifugation pour éliminer l'insoluble ayant pu apparattre au cours de la dialyse, est chargée sur la colonne à un débit de 0,1 à 1 volume dé colonne par heure, de préférence 0,5 volume/heure. La colonne est alors rincée par le tampon d'équilibrage, jusqu'à absence de protéines dans l'effluent de colonne. La colonne est alors développée par un gradient linéaire, obtenu par exemple de manière classique par deux réservoirs contenant un volume identique des tampons suivants - réservoir I : 10 à 30 volumes de colonne, de préférence 20 volumes, de tampon d'équilibrage - réservoir 2 : même volume de tampon sulfate d'ammonium, 0,1 à 0,5 M, de préférence 0,25 M, pH 4,0 à 7,0, de préférence 6,0. cette opération s'effectue de préférence à un débit identique au débit de chargement et de lavage de la colonne. L'effluent de colonne est recueilli dans un collecteur de fractions, et la teneur en protéines de cet effluent est analysée en continu par un spectrophotomètre enregistreur. Le diagramme obtenu lorsque l'on figure la teneur en protéines et en activité urokinase de l'effluent, en fonction du volume d'élution, est du type représenté dans la fig. 1. Les protéines et l'activité urokinase sont séparées en deux pics distincts. Les mesures de poids moléculaires effectuées sur l'urokinase contenue dans le premier pic font appa rare que son poids moléculaire est de l'ordre de 33.000-+3.300. Celui de l'urokinase recueillie dans le second pic est de l'or- dre de 54.000 + 5.400 . Il est ainsi possible de séparer complètement les deux types d'urokinase, au point que l'on peut ainsi obtenir des compositions contenant l'un ou l'autre de ces deux types d'urokinase, avec un degré de pureté qui peut stex- primer par le fait que l'application à cette composition à base d'urokinase d'un procédé comprenant sa dissolution dans une solution de sulfate d'ammonium 0,04 M, de pH 6, la mise en contact de cette solution dans une colonne de chromatographie avec un gel du type carboxyméthyl-SEPHAROSE pris en quantité suffisante et le développement de la colonne selon un gradient linéaire Jusqu'à l'obtention d'un éluat à pH 6 ayant une teneur en sulfate d'ammonium de 0,25 M, ne permet sensiblement l'isolement que d'un pic unique dtactivité urokinase, qu'il s'agisse de l'urokinase I ou de l'urokinase 11. Bien entendu chacune des deux compositions obtenues peut faire l'objet, si besoin, d'une purification supplémentaire en vue d'éliminer le maximum de protéines étrangères et d'accroître leur activité spécifique en urokinase, et ce notamment Jusqu't l'obtention de compositions à base de chacune de ces urokinases ayant une pureté suffisante pour permettre leur utilisation en thérapeutique. Des exemples de telles purifications seront indiqués dans les exemples ci-après. Comme on l'a déjà indiqué plus haut, les deux types d'urokinase se sont révélés présenter des variations sensibles au niveau de leurs activités enzymatiques vis-à-vis de différents substrats, qu'il s'agisse de substrats synthétiques ou de différentes formes de plasminogène, notamment les méthionyl- ou lysylplasminogènes, d'une part, et le glutamyl-plasminogène, d'autre part. Ces différences ont été constatées par la mise en oeuvre des trois techniques de dosage que constituent - la technique de la plaque de fibrine selon PLOUG et KJELDJAARD [PLOUG, J. KJELDJAARD, N, Q, Biochim. biophys. Acta, 24, 278-282 (1957)] ; - la technique sur caillot de fibrine selon les mêmes auteurs [PLOUG, J. EJELDJAARD, N. O., Biochim. Biophys.Acta, 24, 278-282 (1957)] ; - la technique sur substrat synthétique AGLME selon WALTON [WALTON, P.L., Biochim. Biophyl. Acta 132, 104-114 (1967)]. Tous ces dosages ont été effectués par référence à un étalon CTA officiel du "Comité pour les Agents thrombolytiques", de l'institut National du Coeur, aux Etats-Unis (Committee on Thrombolytic Agents, National Heart Institute). Deux types de plasminogène ont été utilisés. Le premier est du type de celui des plasminogènes qui est normalement présent dans le plasma circulant chez l'homme. Ce plasminogène est essentiellement constitué par du glutamyl-plasminogène, ctest-à-dire par un composé du type plasminogène activable en plasmine par l'uro- kinase et dont l'acide aminé terminal qui possède un groupe amine libre est constitué par l'acide glutamique. Le second type de plasminogène est essentiellement constitué par un plasminogène, enzymatiquement inactif, qui peut être considéré comme dérivé d'un-glutamyl-plasminogène qui a perdu un peptide comprenant--le susdit acide aminé terminal constitué par l'acide glutamique. On sait que l'on peut obtenir des quantités importantes de plasminogènes du second type, plus particulièrement des méthionyl- et lysyl- plasminogènes - c'est-à-dire de plasminogènesdont les acides aminés terminaux qui portent une fonction amine libre sont constitués par la méthionine et la lysine - à partir de placentas humains, par ie procédé décrit, notamment dans l'article de Jean-Claude LORMEAU et co-auteurs, intitulé "Purification et propriétés des plasminogènes extraits du placenta humain publié dans les "Annales Pharmaceutiques Françaises", 1976, 34, n 7-8, pp. 287-296. Comme l'ont également constaté ces auteurs, le glutamylplasminogène ne se fixe guère sur des caillots de fibrine. Au contraire, les plasminogènes du second type peuvent à ce point être fixés sur des caillots de fibrine que cette différence de propriétés peut être mise en oeuvre pour réaliser une séparation du glutamyl-plasminogène et des plasminogènes du second type contenus dans l'un de leurs mélanges. D'une façon générale, les plasminogènes du second type peuvent donc être définis comme des glutamyl-plasminogènes ayant perdu une chaine peptidique - qui comprend l'acide glutamique terminal du glutamyl-plasminogène - assez longue pour permettre leur fixation sur un caillot de fibrine. Ces plasminogènes du second type seront désignés dans ce qui suit, pour la commodité de l'exposé, par l'expression "plasminogènes modifiés". Ces plasminogènes modifiés ont en commun avec le glutamylsplas- minogène, d'entre activables en plasmine, sous l'effet d'un activateur tel que l'urokinase, par clivage d'une liaison arginylvaline dans leurs molécules. En ce qui concerne plus particulièrement le comportement des urokinases purifiées selon la présente invention à l'égard de ces divers types de plasminogène, on a eu recours à la technique de dosages sur caillot de fibrine de PLOUG PLOUG, J. KJELDJAARD, N.O. Biochim. Biophys. Acta, 24, 278-282 (1957)3. cette technique ayant cependant été modifiée comme suit : le plasminogène étudié (lysyl- ou glutamyl-plasminogène) ayant été ajouté à du fibrinogène, à raison de 4 mg de plasminogène pour 100 mg de fibrinogène, on a mesuré la variation des temps de lyse d'un caillot formé par addition de thrombine à 1 ml de ce fibrinogène, en présence de quantités croissantes des urokinases testées. Les différentes techniques de dosages qui ont été mises en oeuvre ont ainsi permis de montrer que lesdaux types d'urokinase avaient des activités enzymatiques nettement différentes. Pour l'urokinase II, les activités sur caillot de fibrine, sur plaque de fibrine et sur le substrat AGLME sont du même ordre de grandeur. En revanche, l'urokinase a une activité sur caillot de fibrine environ trois fois plus faible que ses activités sur plaque de fibrine et le caillot AGLME A l'égard des composés de type plasminogène, les observations suivantes ont été faites 10) 1'urokinase I est 2,5 fois moins active que l'uro- kinase II à l'égard du glutamyl-plasminogène 20) cependant l'urokinase I et l'urokinase Il ont la même activité à l'égard du lysyl-plasminogène et enfin 30) l'urokinase II est aussi active à l'égard du lysylplasminogène que du glutamyl-plasminogène. Il a au surplus été constaté que l'urokinase II coupe de façon spécifique les chaînes du plasminogène au niveau de la liaison arginyl-valine susmentionnée. L'urokinase I est moins spécifique et produit des coupures en d'autres sites de la molécule. Ces constatations ont été faites, notamment par mise en contact des urokinases à étudier avec du plasminogène pendant des durées variables (de 15 minutes à 24 heures) et par analyste des produits obtenus par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. De ces constatations découlent des conséquences importantes au niveau de l'application de ces différentes urokinases en thérapeutique, notamment pour des traitements thrombolytiques, que ce soit avec l'urokinase I ou avec l'urokinase II, en particulier dans le cadre des schémas thérapeutiques envisagés ciaprès. I1 est tout d'abord clair que l'utilisation dans des traitements thrombolytiques de compositions essentiellement cons tituées d'urokinase Il, est particulièrement indiquée en raison de sa capacité d'activation aussi élevée vis-à-vis du glutamylplasminogène, c'est-à-dire du plasminogène naturel circulant, que des plasminogènes modifiés. Il en résulte par conséquent une possibilité d'accroissement notable de l'activité thrombolytique, autorisant une diminution des doses d'urokinase vis-à-vis de celles qui sont pratiquées dans les traitements actuels avec des mélanges d'urokinases I et II, et plus particulièrement avec les urokinases commerciales, dans lesquelles l'urokinase I est souvent prédominante. La diminution des doses d'urokinase nécessaires ne se traduit pas seulement par un avantage économique, mais plus encore et surtout par une réduction des incidents secondaires bien connus que peuvent entraîner les traitements à l'urokinase. La grande sélectivité d'action à-l'égard des plasminogènes de l'urokinase II, et la moindre activité vraisemblable qui en résulte sur les autres facteurs de coagulation, en font un médicament perfectionné de valeur particulièrement importante, au point que son utilisation peut être maintenue même chez des patients soumis à une intervention chirurgicale, sans accroissement des risques hémorragiques. A l'opposé, les constatations faites dans le cadre de l'invention permettent également une valorisation des urokinases commerciales, lorsque celles-ci contiennent des proportions importantes d'urokinase I et des compositions purifiées d'uroki- nase I, du fait de l'activité de cette dernière, équivalente à celle de l'urokinase- Il vis-a-vis du lysyl-plasminogène, et ce gracie à l'administration préalable aux patients traités d'un plasminogène modifié, lequel permet ainsi, du fait de sa capacité de s'adsorber sélectivement sur les thrombi, de rendre ceux-ci plus accessibles à l'action lytique induite par l'urokinase I. A ce titre, l'invention concerne donc plus particulièrement aussi les associations d'urokinase I et de plasminogène modifié (tel que lysyl-plasminogène ou méthionyl-plasminogène) étant naturellement entendu que les administrations de ces deux principes actifs doivent etre décalées l'une par rapport à l'autre, l'administration du ou des plasminogènes modifiés (ou de compositions contenant des proportions substantielles de plasminogènes modifiés) devant intervenir un temps suffisant, notamment de l'ordre de 2 à 4 heures avant celle de l'urokinase I, pour permettre l'adsorption préalable de ces-plasminogènes modifiés sur les thrombi à lyser.Cette procédure peut alors permettre, notamment dans le cas du traitement des embolies pulmonaires, une réduction importante des doses nécessaires d'urokinase I, lorsqu'on les compare à celles qui sont requises en l'absence de tout prétraitement avec un plasminogène modifié. Il convient de noter que dans le cas de certains traitements avec l'urokinase II, il peut être souhaitable aussi de prévoir une administration d'un plasminogène modifié, préalablement à celle de'l'urokinase Il. Naturellement cette administration préalable de plasminogène modifié se justifie dans de tels cas, non plus par une rapidité d'action accrue de l'urokinase, mais par les plus grandes quantités de plasminogène lysable in situ dans les thrombi. A noter enfin que le procédé selon l'invention permet d'obtenir des urokinases purifiées à très haut titre, notamment des compositions à base d'urokinase II contenant au moins 100.000- uCTA/mg de protéine, quel que soit le substrat utilisé pour le dosage. L'invention concerne également les médicaments formés avec de telles urokinases. Elle concerne aussi des urokinases du type urokinase I ayant une activité sur caillot de fibrine au moins égale à 50.000 uCTA/mg de protéine et des activités sur substrat AGLME et sur plaque de fibrine au moins égales à 150.000 uCTA/mg de protéines. L'invention concerne donc là également les médicaments contenant de telles urokinases. Des caractéristiques supplémentaires de l'invention appa rairont encore au cours de la description qui suit d'exemples de mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Se mélange initial des urokinases I et II est celui qui est obtenu à partir d'urines humaines et par le procédé décrit dans le brevet n 71 34435 du 24 septembre 1971. Il représente 20 millions d'unités CTA d'urokinase, ayant une activité spécifi que de 40.000 uCTA/mg de protéines. Dans les exemples qui suivent, le dosage des protéines est effectué par la technique de LOWRY (J. Biol. Chem., 1951, 193, p. 265), en ayant recours àun mélange d'albumine et de gamma globulines à titre d'étalon. Les poids moléculaires sont déterminés par titration sur le gel connu sous la désignation commerciale SEPHADEX G100, au sein de tampons sulfate ammonium 0,25 M, pH 5. Les mesures de poids moléculaires des types d'urokinase sont faites en utilisant, au titre des substances de référence, l'albumine (PM 67.000), l'ovalbumine (PM 45.000), le chymotrypsinogène (PM 25.000) et la myoglobine (PM 17.800). Les dosages d'activités urokinase sont faits selon les tech niques dont les références ont déJà été rappelées plus haut. Toutes les opérations de séparation qui seront décrites s'effectuent à + 400. Bes rig. 1 et 2 comprennent les courbes représentatives des teneurs, dans les deux exemples indiqués ci-après, des différentes fractions en protéines, exprimées par les densités optiques me surées à 280 nanomètres (D.O. 280 ns, sur l'axe des ordonnées) et les activités urokinase de ces mêmes fractions, dosées sur pla que de fibrine et exprimées en surfaces de lyse, en millimètre 2 carrés (AUk, mm , sur l'axe des ordonnées), en fonction du nu- méro (E) des fractions successivement éluées. EXEMPLE I. Une colonne de diamètre 2,6 cm, hauteur 10 cm, contenant 50 ml de CM-SEPHAROSE est équilibrée par du tampon sulfate d'am monium 0,04 M, pH 6,0 (volume de tampon utilisé : 400 ml). Le susdit mélange d'urokinases est dissous dans 100 mlde tampon d'équilibrege, et la solution est dialysée 8 heures contre 15 li tres de ce même tampon. Les 180 ml de dialysat obtenus sont centrifugés 10 minutes à 10.000 g, afin d'éliminer le léger insoluble apparu au cours de la dialyse. La solution limpide obtenue est alors percolée à travers la colonne, à un débit de 25 ml/heure. La colonne est ensuite lavée par du tampon d'équilibrage, jusqu'à absence de protéines dans effluent (volume de tampon utilisé : 320 ml). Elle est ensuite développée par un gradient linéaire produit par deux réservoirs, le premier contenant 1 litre de tampon sulfate d'ammonium 0,04 M, pH 6,0, le second contenant 1 litre de tampon sulfate d'ammonium 0,25 n, pH 6,0. L'effluent de colonne est recueilli dans les tubes d'une culture de fractions de 20 ml et sa teneur en protéines est analysée en continu. La courbe A est représentative des variations de la teneur en protéines et la courbe B de la variation de l'activité urokinase des fractions successives, en tout 40 fractions, qui ont été éluées (fig. 1). Les numéro successifs des fractions sont indiqués bur l'axe des abscisses de la fig. 1. Les tubes n 8 a 18 du collecteur de fractions sont regroù- pés et constituent la fraction UK I. Les tubes n 24 à 37 constituent la fraction UK Il. Les tubes n 19 à 23 constituent la fraction UK III. La fraction UK III constituée d'un mélange des fractions UK I et UK II est écartée ; les fractions UK I et UX II ont les caractéristiques analytiques qui sont indiquées dans le tableau I ci-dessous. TABLEAU I ux I UK II Volume 220 ml 280 ni Protéines 160 mg 375 mg Activité sur AGLME 1,5 million uCTA 16 millions d'uCTA Activité sur plaque 1,5 million uCTA 19 millions d'uCTA de fibrine Activité sur caillot 0,5 million uCTA 19 millions d'uCTA de fibrine Poids moléculaire de l'urokinase contenue 33.000 54.000 dans la fraction uCTA (sur AGLME) né 200 uCTA 80 uCTA cessaires pour lyser en 1 heure un caillot formé à partir de 1 ml de plasma EXEMPLE Il. Une colonne de carboxyméthyl-SEPHAROSE (CM-SEPHAROSE CL 6 B) (26 mm x 100 mm) est équilibrée au moyen d'un tampon sulfate d'ammonium 0,04 M pH 6,0. L'urokinase est chargée sur la colonne à un débit de 30 ml heure. Puis la colonne est rincée par du tampon 0,04 M pH 6,0 jusqu'à absence de protéines dans lleffluent. Elle est ensuite développée par un gradient linéaire produit par deux réservoirs, le premier contenant 1 litre de tampon sulfate d'ammonium 0,04 n pH 6,0, le second contenant I litre de tampon sulfate à'ammonium 0,25 M pH 6,0. L'effluent de colonne est recueilli en fractions de 18 ml. Les courbes a et b sont, comme dans le cas de l'exemple précédent, respectivement représentatives de la concentration en protéines (courbe a) et de l'activité urokinsse (courbe b) des différentes fractions prélevées dont les numéros sont indiqués sur l'axe des abscisses. La droite c de la fig. 2 est elle-meme représentative du gradient de sulfate d'ammonium exprimé en "molarité SO4(NH4)2". Comme dans l'exemple précédent, les courbes de la fig. 2 font apparaître que l'activité urokinase se sépare en deux fractions distinctes. Les tubes 13 et 22 sont regroupés (fraction I), ainsi que les tubes 30 à 48 (fraction II). Les tubes 23 à 29, représentant 20% de l'activité déposée sur la colonne, mais susceptibles de contenir un mélange des fractions I et II, sont écartés, Ces fractions sont concentrées par précipitation au sulfate d'ammonium (500 g/l) à pH 5, et redissolution du précipité dans un minimum d'eau distillée. Les caractéristiques analytiques des fractions I et II sont indiquées dans le tableau II ci-après. TABLEAU II Caractéristiques des fractions I et II FRACTION I FRACTION II -------------------------------------------------------- Volume 198 ml 472 ml -------------------------------------------------------- Activité AGLME 9830 uCTA/ml 25400 uCTA/ml -------------------------------------------------------- Activité sur pla- 11870 uCTA/ml 42500 uCTA/ml que de fibrine -------------------------------------------------------- Activité sur cail- 3050 uCTA/ml 31660 uCTA/ml lot de fibrine -------------------------------------------------------- Protéines 0,90 mg/ml 0,6 mg/ml -------------------------------------------------------- Pourcentage de 11 % 60 % l'activité dépo séc sur la colonne -------------------------------------------------------- Afin de permettre l'étude des comportements enzymatiques des urokinases obtenues dans les fractions I et II, celles-ci ont fait l'obJet de purifications supplémentaires dans des conditions identiques pour chacune de ces deux fractions. Une première purification consiste dans une filtration sur le gel connu sous la désignation ULTROGEL ACA 4/4 de chacune de ces fractions au sein d'une solution tamponnée en sulfate d'ammonium 0,25 M, pH 5,0. La filtration a été effectuée sur une colonne de 5 cm x 1 m et effluent a été recueilli par fractions successives de 7 ml. Comme dans le cas précédent, on a regroupé celles des fractions éluées contenant l'activité urokinase. Les fractions regroupées sont désignées dans le ta blean III ci-après sous les entêtes "fraction IA" et fraction IIA". TABLEAU III Caractéristiques des fractions IA et Il A ----------------------------------- FRACTION IA FRACTION IIA Volume 123 ml 100 ml -------------------------------------------------------- Activité AGLME 6830 uCTA/ml 33570 uCTA/ml -------------------------------------------------------- Activité sur pla- 6510 uCTA/ml 35100 uCTA/ml que de fibrine -------------------------------------------------------- Activité sur cail- 1970 uCTA/ml 43950 uCTA/ml lot de fibrine -------------------------------------------------------- Protéines 0,06 mg/ml 0,35 mg/ml -------------------------------------------------------- Une purification encore plus poussée a été obtenue par chromatographie d'affinité dans les conditions indiquées dans le paragraphe B ci-après, sur une matrice dont les conditions de préparation sont décrites dans le paragraphe A ci-après. A) Préparation de la matrice 20 ml d'agar-agar en perles sont mis en suspension dans du tampon carbonate de soude 0,2 M, pH-11,0. La suspension est agitée assez fortement, sous une hotte correctement ventilée. 2 grammes de bromure de cyanogène préalablement dissous dans 4 ml de diméthyl-formamide sont ajoutés à la suspension. Le pH de la suspension est alors maintenu à 11 par addition de- soude 8 N. La réaction étant exothermique, la température de 11 ensemble est maintenue à +12 C, par addi tion de glace pilée à la suspension. Lorsque la consommation de soude cesse, la température de l'ensemble est abaissée rapidement à 0 C par addition d'une grande quantité de glace pilée. L'agar est alors filtré rapidement sur büchner et rincé par 200 ml de tampon bicarbonate 0,05 n, pH 8,9, + 400. Il est ensuite, immédiatement mélangé à 40 ml d'une solution à 10% de lysine, dans du tampon 0,05 M bicarbonate pH 8,9, à +4 G. La suspension obtenue est agitée doucement à +4 C pendant 18 heures. L'agar-agar est alors filtré sur büchner et lavé par 300 ml de tampon bicarbonate 0,05 M, pH 8,9, puis par 200 ml d'eau distillée. Les lavages sont poursuivis par 400 ml de dioxane. L'agar est alors séché brièvement sur buchner, puis mélangé à 40 ml de dioxane. 0,4 gramme d'hydroxylamine, puis 1,2 gramme de MN'dicyclohéxyl carbodiimide sont alors ajoutés. La suspension est agitée doucement 24 heures à température ambiante. L'agar-lysine est alors récupéré par filtration sur büchner et lavé par 100 ml de dioxane, 200 ml de méthanol, puis finalement 400 ml d'eau distillée. Il est séché briève- ment sur büchner, et mis en suspension dans 40 ml de tampon phosphate 0,3 M, pH 7,0, sous agitation modérée. 6 grammes d'anhydride succinique sont ajoutési.Le pH de la réaction est maintenu à 7,0 par addition continue de soude 10 N. La consommation de soude dure 20 minutes ; 6 g d'anhydride succinique sont alors de nouveau ajoutés, et le pH est de nouveau maintenu à 7,0. Après 30 minutes, le pH est stable, et l'agitation est encore maintenue une heure. L'agar-agar est récupéré par filtration sur büchner, et lavé par 20C ml d'eau distillée, 100 ml de solution de NaCl 1 M, puis 400 ml d'eau distillée.Il est séché brièvement sur büchner et mis en suspension dans 40 ml d'eau distillée. 0,6 g de chl-orhydrate de paraaminobenzamidine et 1,3 g de N cyclohéxyl-N'-[ss-(N méthyl morpholinio)éthyl] carbodiimide-paratoluène sulfonate, sont alors aåoutés. Le pE est maintenu à 5,0 par addition intermittente de soude 2 N. Après 2 heures de réaction, le pH est stable. On laisse la réaction se poursuivre pendant 24 heures. La matrice est alors récupérée par filtration sur bAchner et lavée successivement par les solutions suivantes - 100 ml d'eau distillée - 100 ml de solution NaCl 1 M, pH 9,0 par NH40H - 100 ml d'eau distillée - 100 mi de solution NaCl 1 M, pH 3 par CH3COOH - 200 ml d'eau distillée B) Chromatoqraphie d'affinité La colonne contenant la matrice d'affinité (10 mm x 70 mm) est équilibrée par du tampon Tris-Hcl 0,05 M pH 7,5 - 0,5 M NaCI. L'urokinase à purifier est dissoute dans ce tampon puis chargée sur la colonne. La colonne est rincée par ce même tampon, puis par du tampon Tris-Hcl 0,5 M.1 NaCl, jusqu'à absence de protéines dans l'effluent. L'urokinase est éluée par du tampon glycocolle-HCl 0,3 M, pH 3,5 et conservée telle quelle. Elle peut alors être lyophilisée. Les-urokinases I et II purifiées présentent des caractéristiques analytiques, indiquées dans le tableau IV ci-après. TABLEAU IV Caractéristiques des fractions 1B et IIB B FRACTION Ig FRACTION IIB Activité AGLME (uCTA/mg de 165.000 104.000 protéines) Activité sur plaque de fibrine 170.00Q 128.000 (uCTA/mg de protéines) Activité sur caillot de fibrine 54.000 126.000 (uCTA/mg de protéines Le tableau V contient les résultats des mesures d'activités des urokinases des fractions lB et-Il8 à l'égard de deux types de plasminogène.Les mesures ont été faites en ayant recours à la technique de dosage de PLOUG modifiée. TABLEAU V Comparaison des avtivités des fractions IB et IIB sur glutamyl-et lysyl-plasminogènes FRACTION IB IIB Nature du glutamyl lysyl glutamyl lysyl plasminogène plasminogène plasminogène plasminogène plasminogène UCTA (dosées sur AGLME) 3 4,5 6 7,5 3 4,5 6 7,5 3 4,5 6 7,5 3 4,5 6 7,5 temps de lyse (en ninutes et secondes) 16'35" 12'55" 11'05" 9'30" 9'30" 7'55" 6'40" 6" 9' 7'35" 6'45" 6'10" 9' 7'45" 6'20" 5'55" On peut constater à l'examen de ce tableau que l'activité de l'urokinase II est sensiblement la même à ltégard du glutamyl-plasminogène que du lysyl-plasminogène. On constate égale- ment qu'à doses égales, l'urokinase I et l'urokinase II ont des activités équivalentes à l'égard du lysyl-plasminogène. Enfin, on constate que 3 uCTA de l'urokinase II ont vis-à-vis du glutamyl-plasminogène une activité du même ordre de grandeur que celle de 7,5 uCTA d'urokinase I. L'invention concerne donc également des compositions pharmaceutiques à base d'urokinase I, d'une part, et des compositions pharmaceutiques à base d'urokinase II, d'autre part, dans lesquelles ces urokinases se trouvent associées à des véhicules permettant leur administration. De préférence, elles se présen tent- sous la forme de solutions isotoniques stériles, susceptibles d'être administrées par injection, perfusion ou par l'intermédiaire notamment de cathéters à proximité immédiate du thrombus ou des thrombi à lyser. A titre indicatif, on signale que pour le traitement des embolies pulmonaires, on peut recourir soit à une perfusion lente, soit à l'administration directe dans le système artériel pulmonaire par cathéter, notamment cathéter d'angio- pneumographie, de la quantité d'urokinase ou bolus requise par le traitement thrombolytique. Des schémas posologiques qui peuvent être utilisés sont les suivants. Dans le cas de l'urokinase II, qui peut être utilisée seule, les doses à administrer se situent notamment dans les fourchettes qui sont indiquées ci-après. Administration lente par perfusion : de 75.000 à 150.000, en moyenne de l'ordre de 112.000 uCTA/heure d'urokinase pendant 24 heures Administration par cathéter in situ au contact du thrombus d'un bolus, notamment de 800.000 à 1.000.000 d'uCTA, administré en une dizaine de minutes. Dans le cas où l'urokinase utilisée est l'urokinase I, ces doses sont les mêmes, mais sont précédées par la perfusion de 90 à 150, notamment de l'ordre de 150 WKatal de plasminogène modifié, tel que le lysyl-plasminogène . Ces chiffres, qui ne sont indiqués qu'à titre d'exemple, permettent d'apprécier, en ce qui concerne plus particulièrement l'urokinase I, l'importance de la réduction des doses nécessaires, par un facteur de 2 à 3, par rapport aux schémas thérapeutiques généralement préconisés, ce qui représente un progrès important et réduit notablement les incidents secondaires. Comme il va de soi, et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui-précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. REVENDICATIONS l - Procédé de séparation d'une urokinase de poids moléculaire de l'ordre de 33.000 (urokinase I) à partir d'un mélange contenant cette urokinase I et une urokinase de poids moléculaire de l'ordre de 54.000 (urokonase Il), caractérisé en ce qu'ilcomprend les étapes qui consi stent à metire en contact avec un gel ayant, du point de vue ionique, les caractéristiques d'une résine échangeuse d'ions sur laquelle les urokinases sont susceptibles d'être fixées, le mélange d'urokinase à séparer au sdn d une solution tamponnée à base d'un sel minéral du type de ceux qui, à une concentration donnée, permettent la retenue ou la fixation des deux types d'urokinase sur le gel, lorsque celui-ci est équilibré avec une telle solution tamponnée, à laver ensuite ledit gel, notamment avec la même solution tampon, jusqu'à ce que l'effluent ne contienne plus de protéines, à faire passer sur le gel, sur lequel sont fixées les urokinases, une solution tampon semblable sauf que l'on fait progressivement varier sa concentration en sel minéral à partir de la valeur initiale telle que définie ci-dessus jusqu'à la valeur pour laquelle plus aucun type d'urokinase ne peut être retenu -sur le gel, dans des conditions de développement propres à permettre les élutions successives, mais séparées des deux types d'urokinase, et en ce que l'on recueille la fraction contenant l'urokinase I 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le gel utilisé est à base d'une agarose dont les channes sont réticulées entre elles, de préférence un gel de ce type qui comporte des groupes carboxyméthyle, tel que celui connu sous la désignation "carboxyméthyl-SEPHAROSER". 3 - Procédé selon la revendication l ou la revendication 2, caractérisé en ce que le pH de la solution tamponnée est compris entre environ 4 et environ 7, de préférence de l'ordre de 6, et le sel minéral dont on fait varier la concentration est constitué par le sulfate d'ammonium, la concentration initiale en ce sel, qui permet la fixation des urokinases sur le gel, étant comprise entre environ 0,01 M et 0,06 M, notamment de l'ordre de 0,04 M et la concentration finale en ce sel, au terme de l'élution des urokinases fixées sur le gel, étant comprise entre environ 0,1 et 0,5 M, de préférence de l'ordre de 0,25 M 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on met en oeuvre un volume de gel à raison de l ml de gel pour 130.000 à 1.000.000 d'uCTA d-urokinase 5 - Urokinase, ayant un poids moléculaire 33.000 (- 3 300), pratiquement exempte d'urokinase de poids moléculaire de l'ordre de 55.000, ayant une activité sur caillot de fibrine au moins égale à 50.000 uCTA/mg de protéines et des activités sur substrat AGLME et sur plaque de fibrine au moins égales à 150.000 uCTA/mg de protéines,le degré de pureté de cette urokinase étant tel que l'application à cette urokinase d'un procédé comprenant sa dissolution dans une solution de sulfate d'ammonium 0,04 M, de pH 6, la mise en contact de cette solution dans une colonne de chromatographie avec un gel du type carboxyméthyl-SEPHAROSE pris en quantité suffisante et le développement de la colonne selon un gradient linéaire jusqu'à l'obtention d'un éluat à pH 6 ayant une teneur en sulfate d 'ammonium de 0,25 M, ne permet senss- blement l'isolement que d'un pic unique d'activité urokinase. 6 - Composition pharmaceutique à base d'urokinase pour l'administration notamment par injection, perfusion ou analogues, caractérisée en ce que l'urokinase qu'elle contient est constituée de façon quasi exclusive par de l'urokinase I 7 - - Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que le degré de pureté du type d'urokinase qu'elle contient est tel que l'application à cette urokinase d'un procédé comprenant sa dissolution dans une solution de sulfate d 'ammonium 0,04 M, de pH 6, la mise en contact de cette solution dans une colonne de chromatographie avec un gel du type carboxyméthyl-SEPHAROSE pris en quantité suffisante et -le développement de la colonne selon un gradient linéaire jusqu 'à l'obtention dun éluat à pH 6 ayant une teneur en sulfate d 'ammonium de 0,25 M, ne permet sensiblement l'isolement que d'un pic unique d 'activité urokinase 8 - Composition selon la revendication 6 -caractérisé en ce que l'urokinase qu'elle contient est celle de la revendication 5. 9 - Association de médicaments dont les principes actifs sont destinés à entre administrés l'un après l'autre, en vue d'un traitement thrombolytique, caractérisée en ce que le principe actif destiné à être administré en premier est constitué par un plasminogène modifié ou par une composition contenant un ou des plasminogènes modifiéS à titre prédominant et en ce que le secnnd principe actif est constitué par l'urokinase I ayant un degré de pureté tel que défini dans la revendication 5 10 - Composition pharmaceutique constituée par une solution d'urokinase I, pratiquement à l'exclusion d'urokinase -11, au séin d'un milieu isotonique stérile autorisant l'administration de cette composition par injection, perfusion ou par l'intermé- diaire-de cathéters à proximité immédiate du thrombus ou des thrombi à lyser