Brevet FR2393307A1 — publié le 19781229

La présente invention concerne un procédé pour détecter et déterminer des antigènes et des anticorps dans des échantillons cliniques de sang et d'autres fluides corporels, et elle concerne plus particulièrement un procédé pour analyser des échantillons liquides pour déterminer quantitativement les antigènes et les anticorps dispersés, en une -période très courte de temps. Selon l'invention, appliquée à la détection ou la détermination quantitative d'anticorps, un échantillon du liquide à analyser est déposé sur un substrat solide inerte. Le liquide dans l'échantillon est volatilisé dans des conditions laissantis anticorps présenta, s'il y en a, sous forme d'un dépôt non modifié sur la surface du substrat. La surface est alors mise en contact avec des antigènes pouvant spécifiquement se combiner avec les anticorps, et portant un agent marqueur pendant une période suffisante pour combiner les antigènes et les anticorps dans une réaction immune, si des anticorps sont présents. Les antigènes non combinés sontilors enlevés de la surface du substrat, et un signal détectable indiquant la présence de l'agent marqueur résiduel sur le substrat est produit.Les antigènes et les anticorps sont interchangeables dans ce processus, le procédé peut donc également être employé pour détecter et déterminerpes antigènes dans un échantillon-. Tandis que l'inventionsea décrite ci-après en se référant à son application pratique actuellement la plus importante, c'est-à-dire l'analyse du sang humain pour l'utiliser dans une banque du sang, elle est généralement applicable à des fluides corporels qui ne sont pas nécessairement d'origine humaine, comprenant l'urine, le liquide cérébro-spinal, la salive, des dispersions liquides de matières fécales et analogues, et on peut l'utiliser pour déterminer des antigènes et des anticprps isolés dispersés dans un liquide ne provenant pas d'un corps vivant. La nature du substrat sur-lequelléchantillon est déposé n'est pas critique tant que le substrat est inerte à l'échantillon et autres matériaux avec lequel il vient en contact pendant l'analyse. Le verre, de nombreuses matières plastiques et métaux font partie des matériaux appropriés que l'on peut utiliser. Il est avantageux d'employer un substrat qui favorise la répartition de l'échantillon déposé sous la forme d'une pellicule mince, mais cela n'est pas critique. Etant donné les très faibles quantités d'échantillon nécessaires dans la mise en pratique de l'invention, lé liquide dans l'échantillon, normalement de l'eau, est spontanément volatilisé à la température ambiante en une minute, le matériau biologique dans l'échantillon n'est donc modifié en aucune façon. Pour éviter ou diminuer la perte du résidu obtenu après volatilisation de l'eau, le matériau contenant des protéines laissé à la surface du substrat est de préférence fixé à cette surface. Une dénaturation par le moyen d'un solvant organique miscible avec l'eau est la plus pratique, mais d'autres fixateurs classiques en eux-mêmes peuvent être utilisés, comme l'oxyde d'osmium. La quantité de 11 élément marqué amené en contact avec le résidu est choisie pour s'adapter au résultat souhaité. Si l'on souhaite simplement établir la présence ou l'absence d'une quantité minimum d'antigène ou d'anticorps, la quantité d'anticorps ou d'antigène marqué peut être plus faible que celle pouvant être combinée au matériau biologique résiduel. S faut une analyse quantitative de l'échantillon, il faut normalement l'élément marqué en excès, et cet excès est enlevé avant analyse de l'agent marqueur dans le matériau combiné. La nature de l'agent marqueur ou marquant n'est pas critique en elle-mtme. Des agents marqueurs connus employés dans des déterminations d'immunité comprennent des radioisotopes, mais également des marqueurs non isotopes comme des enzymes, des érythrocytes, des bactériophages, des colorants fluorescents et des radicaux stables. On peut trouver dans Clinical Chemistry 22 (8) 1243-1255 (1976) de G. Brian Wisdom, une bibliographie récente et compréhensive de methodes de marquage, en particulier pour les radiodéterminations avec des enzymes.Des méthodes pratiques de production d'un signal sensible indiquant la présence ou la quantité de l'agent marqueur sur le substrat selon l'invention, après enlèvement du matériau marqué non combiné, sont disponibles actuellement, pour les isotopes radioactifs , enzymes et colorants fluorescents de marquage comme on le décrira en plus de détail ci-après. Un avantage important de la présente invention est le temps de contact relativement court qui est nécessaire pour combiner les antigènes et les antcorps, et le fait que ltoipuisse obtenir des résultats reproductibles sans contrôler précisément le temps de contact. Une heure est tout à fait appropriée pour une analyse quantitative pratiquement dans toutes les conditions. Des périodes plus longues ne sont pas nuisibles; des périodes plus courtes peuvent être choisies lorsque seule une indication Aualitative est nécessaire. La nature du signal détectable produit n'est pas directement en rapport avec l'invention. Il sera habtuelle- ment visible, mais on peut préférer, dans des conditions appropriées, un signal audible. Le signal primaire peut être électrique et peut être converti en signal détectable souhaité. De même, comme on le décrira, un signal détectable peut être produit directement par l'agent marqueur lié au matériau biologique de l'échantillon sur le substrat. Les exemples qui suivent illustrent le procédé selon l'invention. Exemple 1 Une gouttelette de plasma de sang humain (100 pi) fut placée sur un morceau de filet en nylon (80 mailles par centimètre), de 2,54 cm de côté, et on laissa sécher. L'étoffe portant le résidu sec fut immergée dans l'acétone pendant cinq minutes pour fixer les solides du plasma, et on laissa le solvant s'évaporer à la température ambiante. Lefilet fut alors roulé pour s'adapter dans une éprouvette de 50 mm de long et de 6 mm de diamètre, on ajouta, pour couvrir le matériau sec sur le filet, 0,5 ml d'une solution d'anticorps associé à l'hépatite humaine marqué 1251(un produit commercialisé par Abbott Laboratories), et le tube ou éprouvette fut placé dans un four de laboratoire- à 200C pendant 60 minutes. Le filet fut alors lavé trois fois pendant 30 secondes dans 40 ml d'une solution saline et séché à l'air. On détermina sa radioactivité avec un compteur à scintillation, et on obtint 1500 comptes par minute. Dans des buts de comparaison, on répéta le processus avec plusieurs échantillons de plasma sanguin connus comme ne contenant pas d'antigène associé à l'hépatite, et l'on obtint moins de 400 comptes par minute. Dans une série d'essais sur des échantillons de sang contenant un antigène associé à l'hépatite, toutes les lectures étaient entre 800 et 16000 par minute, et étaient très près des analyses obtenues de façon classique. Exemple 2 On laissa une gouttelette de plasma sécher sur un carré de filet de nylon de 2,54 cm de c8té et on la fixa dans 1' acétone comme dans 1 exemple 1. Le filet fut roulé comme nécessaire pour l'insérer dans une éprouvette de 50 x 6 mm. 500 pi d'anticorps de l'hépatite B, conjuguéà la fluorescéine, en dispersion aqueuse (produit commercialisé par Behringwerke AG, Allemagne ) furent dilués avec 10 volumes d'une solution tampon (pH 7,1) et ajoutés au filet en nylon dans l'éprouvette qui fut ensuite maintenue à 200C pendant 60 minutes. Le filet en nylon fut lavé deux fois dans 40 ml d'un mélange à 2:1 (volume) de solution saline et d'acétone, et une fois dans l'acétone, chaque lavage prenant environ 30 secondes. Après séchage à l'air, le filet fut trempé 10 minutes dans 3 ml d'une solution de soude normale, puis fut jeté. La solution alcaline fut exposée à un seul éclair lumineux de 10-4 secondes dans le dispositif décrit dans la demande de brevet U.S. NO 689.535 déposée le 24 Mai 1976, et ia fluorescence résultante fut indiquée comme tension de -sortie d'un circuit à tube photomultiplicateur.La tension mesurée inférieure à 1X5 volts indiquait l'absence d'anti- gène de l'hépatite dans l'échantillon de plasma. Une série d'environ 1500 essais en suivant le même processus donna des lectures de l'ordre de 1,5 à 15 volts sur des échantillons où les antigènes de l'hépatite purent également être détectés par une radiodétermination immunité classique. Exemple 3 Un échantillon de plasma fut appliqué à un carré de filet en nylon, séché et fixé dans les exemples qui précèdent et on l'inséra dans une éprouvette. On l'incuba pendant 60 minutes à 37 C avec 0,5 ml d'anticorps de l'hépa- tite B conjugué au raifort-péroxydase, puis on lava trois fois avec 40 ml de solution tampon (pH 7,1) contenant 0,9% de Nazi. Le filet en nylon fut alors immergé 15 minutes dans 10 ml d'une solution préparée à partir de 50 mM de tampon tris (pH 7,4) contenant 5 mg de 3,3'-diaminobenzidine et 0,036% de péroxyde d'hydrogène, il se produisit ainsi une tache bleue sur le filet. La tache fut éluée en agitant le filet avec 3 ml d'un mélange à 2:1 (en volume) de solution saline et d'acétone, et on analysa la solution bleue résultante dans un spectrophotomètre. Une série d'essais accomplie decette façon sur des échantillons de sérum contenant des quantités connues de l'antigène de l'hépatite donna un ddErfflxxkmpirique de lecture du photomètre en fonction de la concentration en antigènes. Les échantillons sans antigène donnèrent des éluats dUne teinte très légèrement bleuteX mais l'intensité de la couleur augmentait rapidement avec l'augmentation de la quantité de l'antigène lié au filet. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée au mode de réalisation décrit et représenté qui n'a été donné qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits, ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre des revendications qui suivent. REVENDICATIONS 1. Procédé pour analyser un liquide volatil à la recherche de la présence d'un élément du groupe consistant en antigène et anticorps pouvant se combiner spécifiquement audit anticorps, ledit élément étant dispersé dans ledit liquide,l'autre élément dudit groupe portant un agent marqueur, caractérisé en ce qu'il consiste à déposer un échantillon dudit liquide sur un substrat solide inerte; volatiliser ledit liquide dans des conditions laissant ledit premier élément sous forme d'un dépôt à la surface dudit substrat; mettre ladite surface en contact avec l'autre élément pendant une période de temps suffisante pour combiner lesdits éléments si ledit premier élément est présent; enlever d,e ladite surface toute quantité dudit autre élément non combinée avec ledit premier élément; et produire un signal sensible indiquant la présence dudit agent marqueur sur ledit substrat après l'enlèvement. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le liquide précité est aqueux. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent marqueur précité est un isotope radioactif, un matériau fluorescent, ou un enzyme. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le substrat précité, après volatilisation précitée et avant mise en contact précite est maintenu en contact avec un solvant organique miscible avec de l'eau pendant une période suffisante pour fixer le premier élément précité audit substrat. 5. Procédé selon la revendication 4, catactérisé en ce que le premier élément précité est un antigène associé à l'hépatite, le liquide précité étant une solution aqueuse de plasma humain.