Brevet FR2383443A1 — publié le 19781006

La présente invention due à fean-Pierre Bretaudiere et à Phung-Thieu-Hung concerne un procédé de dosage enzymatique de l'acide urique constitué par un mélange de réactifs dont une dricase et et une peroxydase par un mode opératoire avec mesure à l'équilibre ou avec mesure cinétique basée sur les propriétés de la réaction d'ordre 1. Selon l'un de ses aspects, la présente invention est relative à un nouveau mélange de réactifs. Selon un autre aspect, elle -est relative à un produit industriel comprenant un nouveau mélange de réactifs sous forme de comprimé soluble pour donner une solition claire de réactifs lorsque ce comprimé est dissous dans liteau. La détermination de la concentration de l'acide urique dans les liquides biologiques, effectuée pendant longtemps par- desÉméthodes chimiques réductimé- triques peu spécifiques, a été considérablement améliorée par la mise en oeuvre de méthodes enzymatiques faisant intervenir une uricase. Trois types de méthodes enzymatiques ont été proposées. Elles souffrent toutes d'un certain nombre de défauts. a- La méthode de E.PRAETORIUS et H.POULSEN - Scand,J.Clin.tab.Invest., 5, 273,(1953) - mesure la différence de densite optique à 293 nm due à la disparition de l'acide urique transformé par l'action de I'uricase, Cette méthode est peu reproductible parce que sa mise en oeuvre est délicate. b- La méthode à l'uricase et à la caralase selon le principe ci-dessous utilise une réaction de couplage avec une catalase pour doser leperoxyded'hy- drogène produit lors de l'action de l'uricase: Acide urique + 2H2O + 2 uricase Allantoine + CO2 + H2O2 H2O2 + CH3OH Catalase cataias HCHO + 2H2O - ;-;- - HCHO + 2Acétylacétone + NH3 3H2O + 3,5-diacetyl-1,4-dihydrolutidine (coloré à 405 nm) Cette méthode a pour inconvénient d'êfre longue à mettre en oeuvre (environ 60 minutes) si l'on utilise un protocole de mesure à l'équilibre oa d'être pert sensible si l'on utilise un protqcoele avec mesure cinétique. c- La méthode procédant par couplage avec une peroxydase pour doser le peroxyde d'hydrogène formé lor-s de l'action de l'uricase souffre d'un manque de spécificité du à l'utilisation de chromogènes inadéquats. En effet, la réaction de peroxydation nécessite la présence d'un chromogène dit donneur d'hydrogène dont l'oxydation par action de la peroxydase, en présence de peroxyde d'hydrogène, conduit au développement rapide d'une coloration. Cette méthode a pour défauts d'entrainer une coloration instable ou (et) des résultats présentant une erreur par défaut dû à une compétition pour la peroxydase entre le donneur d'hydrogène chromogène et des donneurs d'hydrogène présents à l'état naturel ou artificiel (médicaments) dans les liquides biologiques. Cette erreur par défaut sera d'autant plus minime que l'affinité de la peroxydase pour le chromogène donneur d'hydrogène sera grande. De plus pour avoir une sensibilité suffisante d'une part et une bonne liné arité en concentration d'autre part, lors de l'utilisation d'un protocole avec mesure cinétique, il est nécessaire de disposer d'une uricase dont l'affinité (Rm) pour l'acide urique soit favorable, Actuellement, l'utilisation courante de 1 'uricase isolée de foie de porc ne permet pas d'obtenir simultanement une sensibilité suffisante et une bonne linéarité en concentration. Néanmoins, il est possible de modifier artificiellement le Km de cette uricase de foie de porc en ajoutant au mélange de réactifs un inhibiteur compétitif de l'uricase en considérant l'acide urique comme substrat.Ces inhibiteurs compétitifs concernent principalement et non limitativement des analogues de l'acide urique, à savoir: la 2,6 > 8-trichloropurine, la 2,6-dichloro-8-hydroxypurine, la 2-hydroxy-6,8-diaminopurine... En fait, il est plus pratique pour avoir toujours les mime conditions de mesure de disposer d'une uricase dont le Eu est naturellement favorable. La presente invention utilise une uricase isolée de Aspergillus flavus dont le Eu est environ 13 fois supérieur à celui d'uricase de foie de porc qui est égal à 7, permettant ainsi un dosage cinétique de l'acide urique dans de bonnes conditions. Le peroxyde d'hydrogène produit par l'action de l'uricase est dosée dans la présente invention, par couplage avec une réaction faisant intervenir une peroxydase en présence d'un donneur d'hydrogène chromogène, Ce donneur dthydrogene, présentant le minimum d'interférence négative, est constitué par le mélange de deux substances comme le phénol et l'aminophénazone comme l'a décrit TRINDER pour le dosage du glucose - Ann.Clin. Biochem., 6, 24,(1969)- ou l'acide hydroxy-3-benzoîque et l'aminophénazone, La méthode de dosage qui fait l'objet de la présente invention ne possède pas les inconvénients précités et permet l'exécution rapide de dosages avec les avantages suivants: - les dosages peuvent être effectués directement sur des échantillons non déprotéinisés ce qui n'exclut pas la possibilité d'utiliser un matériel déprotéinisé. - les analyses peuvent être exécutées à la température ambiante dans un délai suffisament bref. - il est possible d'utiliser n'importe quel colorimètre ou spectrophtomètre courant sans risque de perte de sensibilité - les perturbations (interférences négatives) dues à l'hémoglobine, à la bilirubine ou aux donneurs d'hydrogène médicamenteux comme l'acide ascorbique sont minimes dans les conditions normales. Néanmoins, il est possible d'éliminer l'influence de l'acide ascorbique, lorsqu'il est présent en grande quantité, en préincubant l'échantillon à doser avec une solution d'ions ferriques ou cuivriques pour avoir une concentration d'ion dans le milieu de préincubation variant de 1 lunule par litre à 10 mmole par litre. - il est possible d'appliquer le procédé de dosage manuellement ou automatiquement tant avec un mode opératoire de mesure à l'équilibre qu'avec un mode opératoire cinetique. La mise en forme et la stabilisation de ce réactif est caractérisé par l'addition de substances conservatrices comme l'avide de sodium ou de potassium, par l'addition de substances protectrices de la coloration comme certains agents tensio-actifs non anioniques ou (et) des polymères supérieurs de l'éthylene glycol et par l'addition d'agents complexants comme l'acide éthylène diamine tétracétique (ou ses sels de métaux) pour éliminer l'influence néfaste des métaux lourds toujours présents dans l'eau distillée,à l'état de trace. Suivant un mode de réalisation préféré, le reactif pour le dosage de l'acide urique conforme à l'invention est donc constitué par un mélange, sous la forme d'une solution aqueuse, ou du mélange de substances solides à dissoudre, ou du mélange d'une partie des substances solides avec des substances sous forme de solution(s) aqueuse(s) ou partiellement organiques, comprenant:: - substances tampons pour avoir un pH compris entre 6,8 et 8,7, - 1 à 300 unités internationales à 250C d'uricase isolée d'Aspergillus flavus par litre, - 1000 à 150000 unités de peroxydase isolee de racine de raifort par litre, - 0,1 à 10 g d'aminophénazone par litre, que - 0,2 à 20 g de phénol ou d'acidehydroxy-3-benzoi (ou ses sels) par litre, - 0,1 à 10 mg de sel de sodium ou de potassium de l'acide éthylène diamine tétracétique par litre, - 0,5 à 10 g de polyéthylène glycol (2000 ou 4000 ou 6000) par litre. Un autre mode de réalisation préféré du réactif pour le dosage de l'acide urique conforme à l'invention est constitue par la réalisation d'un comprimé pesant par exemple 200 mg et comprenant: - 50 à 150 mg de substances tampons pour avoir un pH compris entre 6,8 et 8,7, - 0,01 à 1 mg d'uricase isolée d'Aspergillus flavus, - 0,1 à 10 mg de peroxydase isolée de racine de raifort, - 1 à 25 mg d'aminophénazone, - 1 à 5 mg de polyéthylène glycol (2000 ou 4000 ou 6000), - 1 à 100 mg de lactose ou de mannitol ou de polyvinylpyrolidone ou de sorbe tol, qui doit être dissout dans 10 ml d'une solution aqueuse contenant par exemple: - 0,2 à 20 g de phénol ou d'acide hydroxy-3-benzo}que (ou ses sels) par litre - 0,1 à 10 mg de sel de sodium ou de potassium de l'acide éthylène diamine tétracétique par litre. Un autre mode de réalisation préféré du réactif pour le dosage de l'acide urique conforme à l'invention est constitué par la réalisation d'un comprimé pesant, par exemple, 200 mg, à dissoudre dans 10 ml d'eau et comprenant: - 50 à 150 mg de substances tampons pour avoir un pH compris entre 6,8 et 8,7, - 0,01 à 1 mg d'uricase isolée d'Aspergillus flavus, - 0,1 à 10 mg de peroxydase isolée de racine de raifort, - 1 à 25 mg d'aminophénazone, - 1 à 5 mg de polyéthylène glycol (2000 ou 4000 ou 6000), - 1 à 100 mg d'acide hydroxy-3-benzolque (ou ses sels), - 0,001 à 0,1 mg de sel de sodium ou de potassium de l'acide éthylène diamine tétracétique, - 1 à 5 mg de polyéthylene glycol (2000 ou 4000 ou 6000) - 1 à 100 mg de lactose ou de mannitol ou de polyvinypyrolidone ou de sorbitol. D'autres formes de présentation des réactifs, conformes à la présente invention, peuvent etre réalisées. Il est possible, par exemple, de procéder à une lyophilisation d'une solution aqueuse contenant tout ou partie des substances. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs de tout ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à celui de ses modes d'application, non plus qu'à ceux des modes de réalisation de ses diverses parties, ayant été plus spécialement indiqués; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. REVENDICATIONS 1. Procédé pour le dosage enzymatique de l'acide urique avec une uricase isolée de Aspergillus flavus et une peroxydase permettant de doser le peroxyde d'hydro- gène formé par l'action de l'uricase à l'aide d'un donneur d'hydrogène chromogène caractérisé en ce que ce donneur d'hydrogène chromogène est constitué par 11 association de deux substances à savoir le phénol et l'aminophénazone (phényl1-diméthyl-2,3-amino-4-pyrazolone-5) ou l'acide hydroxy-3-benzoique (ou ses sels) et l'aminophenazone, qui est transformé par l'action de la peroxydase en un dérivé coloré stable. 2. Procédé selon la revendication 1., caractérisé par le fait qu'il est constitué par un mélange, présenté sous la forme d'une solution aqueuse ou partiellement organique ou sous une forme solide de la totalité ou d'une partie des constituants, comprenant: - substances tampons pour avoir un pH compris entre 6,8 et 8,7, - 1 à 3.00 unités internationales à 250C d'uricase isolée de Aspergillus flavus par litre, - 1000 à 150000 unités de peroxydase isolée de racine de raifort par litre, - 0,1 à 10 g d'aminophénazone par litre, - 0,2 à 20 g de phénol ou d'acide hydroxy-3-benzolque (ou ses sels) par litre, - O,1 à 10 mg de sel de sodium ou de potassium de l'acide éthylène diamine tétracétique par litre, - 0,5 à 10 g de polyéthylène glycol (2000 ou 4000 ou 6000) par litre. 3. Procédé selon la revendication 2., caractérisé par le fait que le réactif est constitué par un mélange d'une partie ou de la totalité des substances ad ditionnés d'adjuvants pour la réalisation d'un comprimé tels que le lactose, le mannitol, la polyvinylpyrolidone, le sorbitol à des concentrations de 0,1 à 10 g par litre. 4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé par le fait que l'interférence des donneurs d'hydrogène naturels ou médicamenteux est élininée par la préincubation de l'échantillon contenant l'acide urique à doser avec une solution de sels cuivriques ou ferriques pour avoir une concentration d'ion cuivrique ou ferrique dans le milieu de préincubation comprise entre 0,001 et 10 immoles par litre.