Brevet FR2393004A1 — publié le 19781229

L'invention a pour objet un alcaloïde qui présente d'intéressantes propriétés pharmacologiques. Elle vise également un procédé de preparation de cet alcaloïde par extraction à partir d'Alangium Vitiense, une alangiacée récoltée dans l'iîe de VahéXaux Nouvelles Hybrides. L'alcaloIde selon l'invention est un composé qui se présente sous la forme d'une poudre beige avec les caractéristiques physiques suivantes : - point de fusion : 2000C (mesuré au bac Kofler), - formule brute : C28H35N303' 20 - pouvoir rotatoire [&alpha;D] = - 400 (pyridine; c = 1 %), D - spectre ultra-violet : max MeOH : 278-280 log t(4,10) max 0,1 HC1 275 log (4,07) max 0,1 NaOH 280-85 log t(4,02) 305 (3,93) 320-323 (3,65) - spectre de résonance magnétique nucEaire au carbone 13 (dans le DMSO, par rapport au TMS) : & (ppm) = 10,91; 22,48; 22,87; 28,98; 35,87; 36,52; 37,56, 38,47 - 39,38 40,29 (DMSO); 41,26; 48,48; 51,99; 55,95; 61,02; 62,19; 101,64; 106,12; 109,57; 109,96; 110,87; 115,16; 126,73; 127,70; 128,81, 129,85; 138,42, 144,73; 145,70; 149,99. Le procédé selon l'inventionvde de préparation du susdit alcaloïde est caractérisé par le fait que l'on soumet une masse végétale divisée de l'Alangium Vitiense, de préférence constituée par l'écorce du tronc, à un ensemble de traitements comprenant successivement : a) le traitement en milieu basique d'une partie de ladite masse finement divisée, b) l'extraction de la masse traitée sous a) par un solvant orga nique non miscible à l'eau, c) l'extraction de: la phase organique obtenue sous b) par une solution aqueuse acide, d) l'alcalinisation de la phase aqueuse obtenue sous c), e) l'extraction de la phase basique obtenue sous d) par un sol vant, f) la récupération des alcaloïdes totaux à partir de la phase organique obtenue sous e), et g) la séparation de l'alcaloide selon l'invention par chroma tographie sur colonne. Les différentes étapes de ce procédé présentent de préférence les caractéristiques suivantes Le milieu basique utilisé en a) est avantageusement constitué par de la soude aqueuse à 2 %, une solution saturée de carbonate de sodium ou de préférence par de l'ammoniaque diluée au quart; le solvant organique non miscible à l'eau utilisé en b) est avantageusement constitué par du chlorure de méthylène, du chloroforme ou de préférence par de l'éther; la solution aqueuse acide utilisée en c) est avantageusement constituée par de l'acide sulfurique à une concentration de 1 à 5 % ou de préférence par de l'acide chlorhydrique à 2 %; - l'alcalinisation de la phase aqueuse obtenue sous c) est avantageusement effectuée au moyen de soude > de carbonate de sodium ou de préférence au moyen d'ammoniaque concentrée; le solvant organique utilisé en e) est avantageusement constitué par du chlorure de méthylène, du chloroforme ou de préférence de l'éther; la chromatographie des alcaloïdes totaux est avantageusement effectuée sur une colonne de Sephadex puis sur une colonne d'alu- mine d'activité II-III, désactivée par CH3COOH à 10 %; les éluants utilisés étant successivement le benzène, l'éther, l'éther à 5 X, lCSet:20% 20% de méthanol, ou bien de préférence successivement lçéther, le chloroforme, le chloroforme à puis lOwpuis 20 % de méthanol. On donne ci-après un exemple illustratif de l'extraction du nouvel alcaloïde à partir de l'écorce de tronc d'Alangium Vitiense. 1. Extraction des alcaloïdes totaux On alcalinise par NH40H diluée au quart, 5 kg d'écorces de tronc finement divisées. On extrait cette préparation par de l'éther au moyen d'un appareil de Soxlhet jusqutà réaction de Mayer négative. La phase organique obtenue est extraite par une solution aqueuse d'acide chlorhydrique à 2 %. L'extrait acide obtenu est rendu basique au moyen d'ammoniaque diluéeauquart et soumis à une extraction par de l'éther. Ce nouvel extrait organique, après évaporation, fournit 27 g d'alcalordes totaux, ce qui correspond à un rendement de 5,4 /oo. 2- Séparation de l'alcalolde selon l'invention. 18 g d'alcaloldes totaux séparés précédemment sont chromato graphiés sur 360 g d'alumine d'activité II-III, désactivée par CH3COOH à 10 %. On élue tout d'abord avec du benzène; on obtient 1,296g d'un premier produit, puis avec du chloroforme : on obtient 0,063 g d'un second produit et enfin on élue avec du chloroforme con tenant 5 % de méthanol. 3 Les fractions recueillies sont de 250 cm . Les fractions 13 à 17 receuillies par élution avec le mélange chloroforme/ méthanol (95/5) renferment le nouvel alcaloide (5,329 g). Après recristallisation dans le chloroforme on obtient 1,2 g de produit pur. Rendement : 6,6 %. Ceci étant, on rappelle que l'on a établi que l'alcaloide conforme à l'invention, notamment obtenu par mise en oeuvre du susdit procédé, présente des propriétés thérapeutiques intéressantes. Ces propriétés, à savoir notamment une activité antimitotique marquée, ont été mises en évidence à l'aide des essais pharmacologiques qui vont être décrits. Etude toxicoîogiciue. La DL 50 a été déterminée chez la souris, elle est de 150 mg/kg par voie intrapéritonéale. Etude toxicologique : Screening primaire : détermination de l'activité cytostatique. Dans ce screening primaire la leucémie employée est la L 1210. C'est une leucémie lymphoblastique induite par le 3-méthylcholanthrène sur une souris de la lignée DBA2; elle est transmise par greffe sur des DBA2. Dans l'expérimentation effectuée la tumeur se pré sente sous la forme ascitique, l'injection des cellules leucémiques ayant eu lieu par voie intrapéritonéale. Chaque souris reçoit 10!5 cellules leucémiques de L 1210 par voie intrapéritonéale. Le lendemain de l'injection des cellules tumorales, les produits étudiés sont injectés aux animaux également par voie intrapéritonéale. L'injection est reprise aux jours + 5 et + 9 sur des animaux non morts de toxicité. Six animaux sont utilisés par dose et dans le groupe "témoin négatif" ne recevant que la leucémie L 1210. Un autre groupe 'témoin positif" est constitué par des animaux traités le lendemain de l'injection des cellules tumorales puis aux jours 5 et 9 par un produit faiblement actif connu (Velbé, 6 MP ou Rubidomycine). La survie des animaux peut ainsi être comparée soit à celle des animaux du groupe "témoin négatif"., soit à celle des animaux traités par le Velbé, la 6 MP ou la Rubidomycine (groupe "témoin positif"). Lorsqu'un produit a manifesté une certaine efficacité sur la L 1210, il est repris sur un plus grand nombre d'animaux, à une dose équivalent à 1/3 de la DL 50 aigüe précédemment déterminée. La survie des animaux traités est comparée à celle des animaux "témoins" selon le test non-paramétrique W de Wilcoxon, les décès des souris n'étant pas distribués selon une loi normale. Selon ce test, on attribue un rang au décès de chaque animal. Le premier décès reçoit le rang 1, le second le rang 2 etc.... La somme des rangs observés ( rg obs.) est comparée à la somme des rangs attendus ( rg. calc.) suivant la formule où : n1 est le nombre d'animaux "témoin" n2 est le nombre d'animaux traités est l'écart réduit Si S est > 1,96; la différence entre les groupes comparés est statistiquement significative. Le degLé de signification est donné par la table statistique. Screening secondaire. Le produit s'étant révélé actif sur la leucémie L 1210 après deux expériences répétitives, il a été essayé sur d'autres tumeurs expérimentales. L'un de ces essais a donné des résultats particulièrement intéressants avec la tumeur P 388 qui est une leucémie lymphocytaire, également induite par le 3-méthylcholanthrène, de forme ascite, sur des souris de lignée DBA2 et hybrides, avec des inoculum de 106 cellules leucémiques par voie intrapéritonéale. Les résultats obtenus sont réunis dans le tableau suivant: Tumeur Nature Dose Jours 7 Résultats mg/kg d'injec- ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ Survie T/c; Signt- (*) fica tion L 1210 Leucémie 40 1,5,9 109 ++ Lymphoïde 50 1,5,9 125 ++ P 388 Leucemie 50 1,5 130 Lymphocy- 50 1,5 130 taire (*) T/c% = temps de survie des animaux traités/temps de survie des centrales x 100 Ces résultats montrent que le produit selon l'invention est actif contre les leucémies lympholdes. Par conséquent ce composé peut être appliqué au traitement des proliférations lymphoïdes malignes chez l'homme. La posologie moyenne par voie intraveineuse est avantageusement de 50 mg/m2 par jour, pendant 5 jours; ce traitement étant répété à des intervalles de 3 semaines. Les médicaments renfermant le nouvel alcaloïde selon l'invention se présentent de préférence sous forme de solutions injectables. Par exemple la formule pour 1 ampoule est - substance selon l'invention : 10 mg - chlorure de sodium : 90 mg - eau bidistillée qsp : 10 ml Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. REVENDICATIONS I. Nouvel alcaloYde présentant les caractéristiques suivantes - point de fusion : 200C (mesuré au banc Kofler), - formule brute : C28H35N303, 20 - pouvoir rotatoire : [&alpha;D] = - 40C (pyridine; C = 1 %), D - spectre ultra-violet max MeOH : 278-280 log Q (4,10) max 0,1 HC1 275 log # (4,07) max 0,1 NaOH 280-85 log t(4s02) 305 (3,93) 320-323 (3,65) - spectre de résonance magnétique nucléaire au carbone 13 (dans le DOM50, par rapport au TMS) : &alpha; (ppm) = 10,91; 22,48; 22,87; 28,98; 35,87; 36,52; 37,56; 38,47 - 39,38 40,29 (DMSO); 41,26; 48,48; 51,99; 55,95; 61,02; 62,19; 101,64; 106,12; 109,57; 109,96; 110,87; 115,16; 126,73; 127,70; 128,81; 129s85; 138,42; 144,73; 145,70; 149,99. 2. Procédé pour la préparation du nouvel alcaloide selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on soumet une masse végétale divisée de l'Alangium Vitiensé, de préférence constituée par l'écorce du tronc, à un ensemble de traitements comprenant successivement : a) le traitement en milieu basique d'une partie de ladite masse finement divisée, b) l'extraction de la masse traitée sous a) par un solvant orga nique non miscible à l'eau, c) l'extraction de la phase organique obtenue sous b) par une solution aqueuse acide, d) l'aîcalinisation de la phase aqueuse obtenue sous c), e) l'extraction de la phase basique obtenue sous d) par un sol vant organique non miscible à l'eau, f) la récupération des alcaloides totaux à partir de la phase organique obtenue sous e), et g) la séparation de l'alcaloide selon l'invention par chromato graphie sur colonne. 3. Médicament caractérisé par le fait qu'il renferme le nouvel alcaloïde selon l'invention dans sa substance active. 4. Médicament selon la revendication 3 notamment pottr le traitement des proliférations lymphoides malignes caractérisé par le fait qu'il est administré chez l'homme par voie intraveineuse avec une posologie moyenne de 50 mg/m2 par jour pendant 5 jours en répétant ce traitement toutes les 3 semaines.