Brevet FR2389892A1 — publié le 19781201

La présente invention concerne généralement un procédé pour le dosage de l'acide biliaire dans un échantillon, et plus spécifiquement un procédé pour le dosage de tous les acides biliaires dans un échantillon tel que le sang, l'urine ou la bile. Le dosage des acides biliaires dans le sérum ou produit analogue est un moyen efficace pour déceler les maladies du foie. Jusqu'ici le dosage de l'acide biliaire dans un échantillon était fait par chromatographie en phase gazeuse ou par des enzymes Un procédé enzymatique connu type comprend le passage d'une solution de sérum à travers une colonne remplie d"'Amberlite XAD-2" (Rohm & Haas Co.) pour libérer l'acide biliaire dans un éluat. L'éluat est séché par évaporation puis extrait avec du méthanol. Pour former la cholesténone, la 3--hydroxy-stéroSde déhydrogénase est ajoutée à l'extrait.Une fois que la cholesténone a réagi avec une substance fluorescente telle que l'hydrate d'hydrazine, la quantité de cholesténone est mesurée par analyse fluorométrique. (Voir à ce sujet les points essentiels de la 22ème conférence de la Japanese Society of Clinical Pathology, page 91, 1975). Toutefois, ce procédé est désavantageux, particulièrement pour le dosage de l'acide biliaire dans un échantillon de sang parce qu'il exige l'utilisation de 1 ml ou de plus d'l ml de sé rum. De plus, les procédés pour l'évaporation et l'extraction, nécessaires, sont compliqués et sujets à erreur. Selon un procédé perfectionné, dans lequel analyse fluorométrique est utilisée (Clinical Chemistry, Vol. 4, n 3 et 4, pages 312 à 318, 1976), 0,2 ml de sérum est traité à chaud, par exemple à 670C pendant 20 minutes, puis une solution tampon de tris-HCl 0,1 M (pH 9) contenant la 3-X-hydroxy-stérolde déhydrogénase, la diaphorase, le NAD (nicotinamide adénine dinucléotide) et la résazurine est ajoutée à ce sérum. Le mélange est mis en incubation à la température ordinaire, par exemple à 200 C, pendant 40 minutes, puis la substance fluorescente dans le mélange est mesurée à une longueur d'onde d'émission de 580 nm (longueur d'onde d'excitation 560 nm) Cependant, ce procédé possède égale ment certains défauts.Spécifiquement le taux de récupération en acide biliaire par ce procédé est de 90 % au maximum; des impuretés dans l1 échantillon et dans les réactifs fluorescents interfèrent généralement avec les mesures; et il faut un instrument compliqué tel qu'un fluorophotomètre. Par conséquent, des procédés plus exacts Fouvant être facilement effectués pour le dosage des acides biliaires dans un échantillon tel que le sérum du sang ou produit analogue ont été recherchés. Selon la présente invention, la totalité des acides biliaires dans un échantillon est dosée en acidifiant l'échantillon avec un acide, en ajoutant la 3-a-hydroxy-stérolde déhydrogénase (EC1.1.1.50) (désigné plus loin par 3a-HSD), la diaphorase, le nicotinamide adénine dinucléotide (désigné plus loin par '1NAD'1), un sel de tétrazolium et un produit alcalin ou un réactif tampon, au mélange acidifié pour former un colorant formazane; puis en mesurant par spectrophotométrie l'intensité de la couleur. Dans la présente invention, puisque la 3- -HSD est utilisée, tous les composés stéroides ayant un groupe hydroxyle en position 3o' peuvent être dosés. La plupart des acides biliaires ont un groupe hydroxyle en position 3-o'. Dans le corps humain, les acides biliaires sont présents, soit à l'état libre, soit à l'état conjugué. L'acide glycocholique est un exemple d'un composé conjugué d'un acide biliaire et de glycine. Un autre exemple d'un composé conjugué est l'acidetaurocholique dans lequel la taurine et un acide biliaire sont conjugués. Dans le cas des composés conjugués, si la position 3-cr de ceux-ci est libre, c'est-à-dire comporte un groupe hydroxyle, les composés peuvent être dosés par le présent procédé.Par conséquent, tel qu'utilisé ici, le terme " acides biliairesjtotal n désigne tous les acides biliaires portant un groupe hydroxyle en position 3-o' et leuz composés conjugués. Le procédé de la présente invention est applicable pour le dosage des acides biliaires dans un échantillon tel que sérum, urine et bile. Le principe de la présente invention est le suivant. Les acides biliaires réagissent avec le NAD en présence de la 3X-HSD pour former le 3-cétostérolde et le NAD de type réduit (désigné plus loin par "NADH2"). Le NADH2 ainsi formé,réagit avec un sel de tétrazolium en présence de diaphorase pour former le NAD et un formazane qui est une substance colorée. En mesurant la capacité d'absorption à une longueur d'onde de 400 à 600 nm de la substance colorée qui est formée à raison d'une ou d'une molécule et demie, par molécule d'acide biliaire, la quantité d'acide biliaire dans l'échantillon est quantitativement déterminée. Puisque les enzymes dans le sang, tels que la déhydrogénase lactique, la déhydrogénase malique et la déhydrogénase glutamique, empêchent la réaction de l'acide biliaire et du NAD, il est nécessaire d'abord d'inactiver ces enzymes. Pour inactiver les enzymes, l'échantillon est acidifié à pH de 0,1 à 6,0 puis soumis à un traitement thermique à une température de 200 à 450C pendant 1 à 30 minutes. De préférence, des enzymes actives dans des conditions acides, tels qu'une protéase et une peptidase, acides, sont ajoutées pendant le traitement pour décomposer les enzymes inactivés. Après le traitement thermique, un réactif chromogène constitué par la diaphorase, le NAD, un sel tétrazolium, un agent tensioactif et un réactif tampon, est ajouté à la solution et le melange est soumis à un autre traitement thermique à une température de 20' à 500C, pendant 1 à 30 minutes. Dans ce cas, le réactif chromogène peut être ajouté soit sous forme solide, soit à l'étant liqui de. Ensuite, la 3o'-HSD est ajoutée au mélange et le pH de celuici est réglé à 7,5 - 12,5, de preférence entre 9 et 10. Naturellement, la 3a-HSD peut être utilisée sous forme d'une solution alcaline. Après les stades précédents, la capacité d'absorption du mélange est mesurée à une longueur d'onde de 400 à 600 nm. La quantité d'acide biliaire dans l'échantillon peut être calculée en utilisant un coefficient d'extinction moléculaire ou une courbe d'étalonnage. Dans la présente invention la 3a-HSD peut être utilisée avec la solution chromogène. La demanderesse a découvert que 0,01 à 1 ml de sérum ou d'urine, oub bien 0,001 à 0,1 ml de bille, est suffisant pour le dosage selon le procédé de la présente invention. Pour acidifier l'échantillon, des acides minéraux tels que l'acide chlorhydrique et l'acide sulfurique, et des acides organiques tels que l'acide citrique et l'acide malique sont appropriés. Comme sel de tétrazolium utilisé comme réactif chromogène, on peut citer le chlorure de 3- (p-iodophényl) -2-(p-nitrophényl) -5-phényl- 2H-tétrazolium (désigné par la suite par "INT") et le chlorure de 3,3'-(3,3 '-diméthoxy-4,4'-biphénylylène)-bis[2-(p-nitrophényl)-5 phdnyl-2H-tétrazolium] (désigné par la suite par "NBT") et on les utilise à une concentration de 0,1 mM à 50 mM. Un tensio-actif est utile pour augmenter la précision du dosage puisqu'il dissout le sel de tétrazolium, les protéines déna turées, etc. Un tensio-actif approprié est un octyl-phénoxypolyéthoxyéthanol tel que le "Triton-X-lOO"(de Rohm & Hass Co.), et une concentration de 0,001 à 5 % (poids pour volume)(P/V) est préférée. Un tampon de borate ou le tampon de tris peut être utilisé comme tampon. De préférence, les concentrations des autres ingrédients dans le mélange réactionnel sont de 0,1 UI/L à 100 000 UI/L pour la diaphorase, et 0,1 mM à 50 mM pour NAD (UI signifie unité internationale). Bien que la concentration de la 3o-HSD est choisie en fonction de la durée de la réaction, on préfère utiliser 0,0001 UI/L b 100 UI/L. Comme produit alcalin pour alcaliniser le mélange réactionnel, on préfère l'hydroxyde de sodium et l'hydroxyde de potassium. La présente invention est illustrée par les exemples descriptifs et non limitatifs ci-après. EXEMPLE 1 Dans cet exemple, des échantillons de 0,2 ml de sérum provenant d'un malade atteint de cirrhose du foie, sont utilisés. A chaque échantillon, on ajoute 0,2 ml de HC1 0,1 N et 0,3 ml d'eau distillée, puis le mélange est mis en incubation à une température de 370C pendant 10 minutes. Après le traitement thermique, on ajoute au mélange des portions de 2 ml d'une solution chromogène : c'est une solution tampon de borate 0,1 M CH 9) qui contient diaphorase (30 UI/mg) 0,0055 % (piu) NAD 0,32 X (P/V) INT 0,026 % (P.V) Triton X-100 (marque de Rohm & Haas Co.)0,1 % (P.VI Ensuite, 0,3 ml d'une solution tampon de borate 0,1 M (pH 9) contenant 0,1 % (P/V) de 3-HSD (0,984 UI/mg) est ajouté à l'un des mélanges; et, comme témoin, 0,3 ml d'eau distillée est ajouté à l'autre mélange. Ces mélanges sont mis en incubation à 370C pendant 15 minutes, puis la capacité d'absorption est mesurée à 500 nm en utilisant le témoin comme blanc pour obtenir la valeur de 0,352. La concentration de l'acide biliaire dans l'échantillon est trouvée égale à 352 M à partir de la capacité d'absorption et du coefficient d'extinction moléculaire (1,5 x 104) du réactif chromogène, INT, à 500 nm. EXEMPLE 2 Dans cet exemple, le procédé décrit dans exemple 1 est répété sauf que 0,2 ml d'un échantillon qui est un mélange de 10 ml de sérum et de 0,493 mg (100 pM) d'acide glycocholique (C H NO 2b 43 6 1,5 H20, poids moléculaire = 493) est utilisé à la place de 0,2 ml de sérum. La capacité d'absorption est 0,447. L'augmentation de cette capacité d'absorption en ajoutant l'acide glycocholique est trouvée égale à 0,095 å partir de la différence entre la capacité d'absorption obtenue, ctest-à-dire 0,447, et celle obtenue dans l'exemple 1, ctest-à-dire 0,352. Par conséquent, la concentration de l'acide glycocholique décelée est de 95 fM. Le pourcentage d'acide glycocholique retrouvé est calculé de la façon suivante Pourcentage acide glycocholique retrouvé concentration de l'acide glycocholique décelé x 100 concentration de l'acide glycocholique ajouté = 95 x 100 = 95 %. EXEMPLE 3 Dans cet exemple des portions de 0,2 ml de sérum provenant d'un malade atteint de cirrhose du foie sont utilisées comme échantillons.A chaque échantillon, 0,8 ml d'acide chlorhydrique 0,01 N contenant 0,1 % (P/V) de pepsine, 2500 UI/mg, est ajouté et les mélanges sont mis en incubation à 37oC pendant 10 minutes. Ensuite des portions de 2 ml de la solution chromogène suivante sont ajoutées au mélange et les mélanges sont encore mis en incubation à 370C pendant 15 minutes. Solution chromogène : solution tampon de borate 0,1 M (pH 9)contenant diaphorase (30 UI/mg) 0,0055 % (P/V) NTB 0,026 % (P/V) NAD 0,32 % (P.V) 3-o'-HSD (fabriqué par Kyowa Hakko 0,1 % (P.V) Kogyo Co., Ltd., 0,984 UI/mg) Triton X-100 0,1 % (P.V) Comme témoin, 0,2 ml d'eau distillée est traité comme dans l'échantillon mentionné ci-dessus. La capacité d'absorption de l'échantillon essayé est mesurée à 550 nm en utilisant le témoin comme blanc pour obtenir la valeur de 0,230. La concentration de l'acide biliaire dans le sérum est trouvée égale à 190 ZM à partir de la capacité d'absorption et du coefficient d'extinction moléculaire (3,64 x 104) du réactif chromogène, NTB, à 550 nm. EXEMPLE 4 Dans cet exemple, le procédé décritdans l'exemple 3 est répété, sauf que 0,2 ml d'un échantillon qui est un mélange de 10 ml de sérum et de 0,493 mg (100 uM) d'acide glycocholique (C26H43N06 . 1,5 H20, poids moléculaire = 493) est utilisé à la place de 0,2 ml de sérum. La capacité d'absorption est 0,348. L'augmentation de la capacité d'absorption en ajoutant de l'acide glycocholique est égale à 0,118 d'après la différence entre la capacité d'absorption obtenue dans l'exemple présent, 0,348, et celle obtenue dans l'exemple 3, c'est-à-dire 0,230. Par conséquent, la concentration en oxyde glycocholique décelé est 97 pM. Le pourcentage d'acide glycochloique retrouvé est calculé de la façon suivante. % d'acide glycocholique retrouvé ~ concentration de l'acide glycocholique décelé x 100 concentration de l'acide glycocholique ajoute = lio x 100 = 97 % 100 EXEMPLE 5 Dans cet exemple, 2 ml de la solution chromogène utilisée dans 1 ,'exemple 1, 0,5 ml d'une solution tampon de borate 0,1 M (pH 9) et 0,3 ml de solution tampon de borate 0,1 M (pH 9) contenant 0,1 % (P/V) de 3o'-HSD 0,984 UI/mg,sont mélangés et mis en incubation à 37"C pendant 10 minutes.Ensuite, des portions de 0,2 ml d'un produit étalon tel que le désoxycholate de sodium(22 (233,4 yM) (désigné plus loin par "SDC"), chénodéoxycholate (211,4 pM) (désigné plus loin par "CDC"), l'acide glycocholique (209,4 pM) (désigné plus loin par nGCB") et le taurocholate de sodium (196,3 pM) (désigné plus loin par "STC"), sont ajoutés à des échantillons séparés des mélanges. Les mélanges sont mis en incubation à 37 C pendant 5 minutes et les capacités d'absorption sont mesurées à 500 nm. Les capacités d'absorption trouvées et calculées et le pourcentage des produits étalons retrouvés sont les suivantes (voir page 7) Produits étalons SDC CDC GCA STUC. Capacité d'absorption trouvée 0,230 0,201 0,210 0,192 Capacité d'absorption calculée 0,233 0,211 0,209 0,196 % retrouvé 99 % 95 % 100 % 98 % EXEMPLE 6 Dans cet exemple, 7 ml d'urine d'un homme adulte en bonne santé sont réglés à pH 5. A l'échantillon est ajouté 0,25 UI de p-glucuronidase (fabriquée par Boehringer Mannheim GmbH, 3 UI/mg). La solution d'urine est mise en incubation à une température de 500C pendant 15 heures, puis diluée avec de l'eau à 10 inl. Le procédé décrit dans l'exemple 3 est répété, sauf que 0,2 ml de la solution diluée est utilisé comme échantillon. Comme résultat, la quantité d'acide biliaire dans l'échantillon est trouvée égale à 53 pM en se basant sur la valeur de capacité d'absorption mesurée à 550 nm, c'est-à-dire 0,045. EXEMPLE 7 Dans cet exemple, pour déterminer la reproductibilité des dosages d'acide biliaire, le procédé décrit dans l'exemple 3 est répété, sauf que des portions de 0,2 ml de sérum d'un autre malade atteint de cirrhose du foie sont utilisées à la place des échantillons du malade, utilisés dans 11 exemple 3.Les résultats sont les suivants : Echantillon N Quantité d'acide biliaire dosée CpM) 1 76 2 i4 3 75 4 75 5 76 6 74 7 77 8 75 9 74 10 76 D'après le tableau ci-dessus, la valeur moyenne, l'écart type et le coefficient de variance sont obtenus de la façon suivante Moyenne (x): 75,2 pM Ecart type (SD) : 1,032 Coefficient de variance (CV); 1,3 % EXEMPLE 8 Dans cet exemple, la corrélation entre le résultat de dosage de l'acide biliaire obtenu par le procédé de la présente invention et celui obtenu par un procédé utilisant analyse fluorométrique est étudiée. Le procédé décrit dans l'exemple 3 est répété en utilisant 10 échantillons de sérum de différentes origines. Dans l'analyse fluorométrique, le procédé de Osuga et collaborateurs (Clinical Chemistry Vol. 4, Nv 3 et 4, pages 312, 318, 1976) èst utilisé. Les résultats sont les suivants Echantillon Nv Procédé de la présente Analyse fluorométrique invention (y) (x) 1 12 (M) 15 (lux) 2 8 7 3 22 24 4 40 38 5 35 36 6 125 129 7 13 16 8 76 64 9 10 Il 10 6 7 D'après le tableau ci-dessus, le coefficient de corrélation et la régression entre le procédé (y) de la présente invention et le procédé (x) par analyse fluorométrique, sont les suivants Coefficient de corrélation : 0,99 Régression ; y = 1,01x - 0,35. REVENDICATIONS 1.- Procédé pour le dosage des acides biliaires totaux dans un échantillon, caractérisé par le fait qu'il comprend : l'acidification de l'échantillon; l'addition de la 3-a-hydroxystéroide déhydrogénase, de la diaphorase, de la nicotinamide adénine dinucléotide, d'un sel de tétrazolium, d'un tensio-actif et d'un produit alcalin ou d'un réactif tampon, audit échantillon acidifié, pour former un formazane coloré; puis la mesure par spectrophotométrie de l'intensité de la couleur. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la quantité de ltéchantillon va de 0,01 à 1 ml de sérum ou d'urine, ou de 0,001 à 0,1 ml de bile. 3.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ladite acidification comprend le réglage du pH dudit échantillon de 0,1 à 6,0 avec un acide et le traitement thermique dudit échantillon à une température de 20'C à 450C pendant 1 à 30 minutes. 4.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que ledit acide est choisi parmi l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide citrique et l'acide malique. 5.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait qu'il comprend l'addition d'une enzyme active dans des conditions acides audit échantillon acidifié pour décomposer les enzymes inactivées. 6.- Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que ladite enzyme est choisie parmi le groupe de la protéase et de la peptidase, acides. 7.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le sel de tétrazolium est choisi parmi le chlorure de 3 (p-iodophényl)-2-(p-nitrophényl)-5-phényl-2H-tétrazolium et le chlorure de 3,3 '-(3,3 '-diméthoxy-4, 4' -biphénylylène) -bis-2-Cp- nitrophényl) -5-phényl-2H-tétrazoliumj. 8.- Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que la concentration dudit sel de tetrazolium dans ledit mélange va de 0,1 pM à 50 fM. 9.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit tampon est un tampon de borate ou un tampon de tris-HCl. 10.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la concentration de ladite diaphorase dans ledit mélange va de 0,1 UI/L à 100 000 UI/L. 11.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la concentration dudit nicotinamide-adénine-dinucléoti- de dans ledit mélange va de 0,1 pM à 50 fM. 12.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la concentration de ladite 3-hydroxy-stérolde-déhydrogénase dans ledit mélange va de 0,0001 UI/L à 100 UI/L. 13.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la concentration dudit tensio-actif dans ledit mélange va de 0,001 à 5 % (poids/volume). 14.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit produit alcalin est choisi parmi l'hydroxyde de sodium et l'hydroxyde de potassium. 15.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ladite intensité de la couleur est mesurée à une longueur d'onde de 400 à 600 nm.