Brevet FR2363103A1 — publié le 19780324

La présente invention a pour objet un dispositif pour la mesure en continu des phénomènes de transport entre un substrat marquable par un agent radio-actif et une substance organique sons forme de particules et son procédé d'utilisation. I1 serait intéressant, dans de nombreux cas, et notamment dans le domaine de la neurologie de pouvoir suivre en continu le transfert entre un substrat et une substance organique se presentant sous forme de particules. Les neurones ne sont pas à proprement parle, reliôs entre eux, mais communiquent par échange de neuro-transmetteurs dans une zone d'rechange ou synapse comprise entre une terminaison presynaptique de l'un avec la membrane post-synaptique de l'autre. Les agents neurotransmetteurs sont libérés par les terminaisons présynaptiques, viennent au contact de la membrane postsynaptique d'un autre neurone avant de revenir et d'être absorbes par la terminaison presynaptique qui les a remises. Les terminaisons présynaptiques des neurones peuvent être détachées,de ceux-ci et se présenter sous forme de petites particules appelées synaptosomes. Les phénomènes de transport actif par les fractions enrichies en synaptosomes ont e été jusqu'à présent étudiés in vitro par incubation des synaptosomes dans un milieu contenant un agent neurotransmetteur marqué par un agent radioactif tel que le carbone 14, puis extraction des particules hors du milieu d'incubation et enfin comptage de la quantité de substrat transporté. Deux méthodes ont été principalement utilisées pour réaliser de telles expériences, à savoir une dans laquelle les particules sont séparées par filtration du milieu d'incubation, et l'autre dans laquelle elles sont séparées du milieu d'incubation par centrifugation. Ces methodes présentent l'inconvénient de realiser des mesures ponctuelles des échanges, sans tenir compte de ce fait des conditions antErieures et postérieures. D'autre part, compte tenu de l'inertie de la réaction et des temps de manipulation non négligeables dans le cas de la filtration comme de la centrifugation, les résultats possèdent de grosses incertitudes pour les faibles temps de réaction. En outre, si l'effet de separation (filtration ou centrifugation) est trop faible, une certaine quantité de produit radioactif demeure au contact des particules, alors que si les moyens mis en oeuvre pour la séparation sont trop violents, certains synaptosomes sont cassés. Un appareil a déjà e été proposé pour réaliser la mesure en continu de la capture active. Cet appareil comprend deux chambres distinotes séparées par un filtre. Dans la chambre inférieure se trouvent des particules telles que des synaptosomes, et-dans la chambre supérieure se trouve le milieu d'incubation. Un compteur à rayons 0 permet de mesurer la radioactivité dans la chambre inférieure, c'est-à-dire dans les particules. Cependant, ce dispositif ne donne pas de resultats reproductibles. I1 est difficile, en effet, de contrôler les conditions d'incubation dans la chambre inférieure, les particules n'étant pas agitées tendent a s'agglomérer et à fausser les mesures, et, en outre, le phénomène de capture dépend de la diffusion du substrat à travers le filtre séparant les deux chambres. La présente invention vise à remédier à ces inconvénients en fournissant un dispositif de mesure en continu de la capture active d'un substrat donnant des résultats reproductibles et linéaires en fonction de la concentration de particules dans le milieu d'incubation. A cet effet, le dispositif qu'elle concerne comporte un compteur à rayons ss placé sous une chambre d'incubation et séparé de celle-ci dont le fond est ouvert, par au moins une feuille étanche aux liquides et perméable aux rayons p , la chambre d'incubation comprenant elle-m8me deux zones dont celle inférieure formant le fond est constitue par un filtre dont le diamètre des pores est inférieur à celui des particules vers lesquelles doit être mesure' le transport de substrat, l'autre partie de la chambre d'incubation servant de réceptacle pour le substrat marqué par un agent radioactif, et les particules organiques dans leur milieu d' incubation. La radioactivité est mesurée exclusivement dans le filtre. Or, les particules ne pénètrent pas dans celui-ci, si bien que l'on suit la variation de la concentration en substrat marqué, à l'inté- rieur du filtre. Il faut considérer que, compte tenu des conditions opératoires, et notamment de l'agitation constante tant mécanique que par barbotage d'oxygène, maintenue dans la chambre d'incubation, il y a homogénéité du substrat dans les deux zones de celle-ci, à savoir dans le filtre et dans la zone servant de réceptacle au liquide, ce qui assure une reproductibilité des résultats. De toute façon, l'invention sera bien comprise à l'aide de la description qui suit en référence au dessin schématique annexé représentant, à titre dtexemple non limitatif, une forme d'exécution de ce dispositif et des résultats obtenus dans le cas du transfert entre des synaptosomes et un neurotransmetteur constitué par de l'acide Gamaaminobutyrique marqué au C14. Figures 1 et 2 sont deux vues en coupe du dispositif de mesure, respectivement, en vue éclatée et en position montée Figure 3 est une vue de différentes courbes indiquant les variations de radioactivité au cours de I'expérience Figure 4 est un graphe mettant en évidence la quantite de substrat capté en fonction de la concentration des particules. Le dispositif, représenté aux figures 1 et 2, comprend une chambre d'incubation constituée par un élément cylindrique creux 2 dont le fond est ouvert, monté sur un support 3 sur lequel il est fixé par vissage par l'intermédiaire de tirants 4. Le support 3 est lui-m;me ajours et placé au-dessus d'un compteur 5 à rayons t monté sur un socle 6. Dans la mesure où le compteur à rayons p est un compteur à gaz non fermi, il est prévu entre le compteur 5 et le support 3 une feuille 7 en une matière étanche à l'hélium, telle qu'en polypropylène, disposée sur une plaque 8 de maintien, le volume compris entre le compteur et la feuille 7 étant rempli dthélium. Entre le support 3 et l'élément cylindrique 2 sont prévues une coupelle 9 et une rondelle 10 ajourée, une feuille 12 étanche au liquide, en polyester, et enfin un filtre 13 formant le fond de la chambre dtincubation. La chambre d'incubation comprend donc deux zones, à savoir celle formée par le filtre 13 et celle 14 délimitée par l'élément cylindrique 2. Les particules sont en suspension dans la chambre 14 qui a un volume de 1 ml, alors que le volume du filtre est de l'ordre de 15 1. Les pores de celui-ci ont un diamètre de tordre de 0,2 micron, ne permettant pas l'accès aux particules d'un diamètre de l'ordre de 1 micron. L'épaisseur du filtre est de 120 microns afin que le comptage ne soit réalisé que dans celui-ci. En effet, il a été constaté que 14 93 % des rayons p émis par le C sont arrêtés par une couche d'eau de 50 d'épaisseur (Loos 1972). I1 est également à noter que, pour éviter toute fuite de liquide par le filtre, les bords de celui-ci sont hydrophobes. Le compteur mesure la radioactivité dans le filtre. Si le composé marqué est capté par les particules, la diminution de radioactivité mesurée par le compteur exprime donc la variation de concentration de substrat dans le milieu d'incubation consécutive à cette capture. Le corps cylindrique 2 et le socle 6 du compteur 5 sont équipés de conduits 15 de circulation de fluide tel que de l'eau permettant la thermo-régulation de l'ensemble à une température déterminée. Enfin, afin d'assurer une bonne homogénéité du substrat en tous les points de la chambre d'incubation 14 et du filtre 13, il est prévu un agitateur 16 mécanique à palettes, et des conduits 17 d'amenée dans la chambre 14 d'un gaz, tel que de l'oxygène qui, outre le barbotage qutil engendre, assure le maintien de conditions d'incubation satisfaisantes pour les particules. Il est donné, ci-après, un exemple de mise en oeuvre de procédé concernant le transfert d'acide Gamaaminobutyrique (ci-après appelé pour plus de simplicité GABA) vers des synaptosomes obtenus a partir de neurones prélevés sur des rats. La première opération consiste à sacrifier des rats males de souches OFA, et à préparer, la fraction brute mitachondriale selon une technique connue (cf. GRAY et WHITTAKER). Les culots obtenus sont suspendus dans le milieu d'incubation suivant : (5ml de milieu d'incubation pour 1 gramme de cerveau) NaCl : 100 mM, Sucrore : 100 mM, KC1 : 6 mM, Glucose 10 mM, Tris HC1 ph 7,4 : 10 mM. Cette suspension est conservée à 40C sous agitation lente. Le filtre est trempé dans le milieu d'incubation à 37 C puis monté dans la chambre d'incubation. Celle-ci est remplie de 850 de milieu d'incubation. Le compteur indique alors un bruit de fond de 10 + 5 cpm. Le zéro de 1' enregistreur du compteur est réglé sur la valeur moyenne de ce bruit. On ajoute le substrat marqué O,51LCi/ml (GABA C Radiochemical Centre Amersham. Activité spécifique 224 mCi/m mol). Cette introduction correspond à la flèche A de figure 3. Après 5 mn, le compteur indique une radioactivité constante. Une fraction de suspension captante, préincubée pendant 5 mn à 370C est versée dans la chambre d'incubation en même temps que la quantité de GABA C14 nécessaire pour y maintenir une même-concentration globale de substrat (0,5 Ci/ml). Cette introduction est repérée sur le graphe de figure 3 par la flèche B, le volume total du mélange introduit étant de 150 1. Le compteur indique la concentration du GABA C14 à l'intérieur du filtre qui n'est égale à la concentration du GABA C14 dans le milieu d'incubation qu'une fois atteint l'équilibre de diffusion. Pour une concentration de 4,46 M soit 1 Ci/ml le compteur indique alors 1 450 cpm. On a donc la relation d'équivalence 1000 cpm 3,07 M 0,69 Ci/ml (I) Les courbes a et b de la figure 3 montrent que l'établissement de cet équilibre après variation instantanée de la concentration de GABA C14 peut être ajusté par une fonction exponentielle du premier ordre. Une série due 10 expériences identiques a celles de la courbe a a donné : Xo = 727 ± 10 cpm t = 64 + 4 si moyenne et écart type Xo étant la radioactivité à l'équilibre initial et t la constante de temps. Cet appareil permet donc de suivre l'évolution de la concentration du GABA C14 dans le milieu d'incubation de la chambre à condition de tenir compte d'une fonction retard du 1er ordre du gain 1 et de constante de temps t. La courbe c de la figure 3 montre la baisse de la radioactivité dans le filtre consécutive à la capture du GABA (C14) par les particules. Cette expérience a été répétée 9 fois avec 4 préparations différentes de la fraction précitée. On a obtenu Xm = 162 + 7 cpm (moyenne trocart type). Xm étant la radioactivité à ltéquilibre final. Pour des incubations successives, la même suspension peut être conservée a 40C pendant 6 h sans baisse significative de l'effet de capture. La quantité captée par les particules est donc Y = (Xo - Xm) x Volume total d'incubation En utilisant la relation (I) on a ici Y = 1,74 # 0,08 nMol pour une concentration de GABA (C14) dans le milieu Xm = 0,5 M. il est à noter que le GABA non marqué a une concentration (1 mM) très supérieure à celle du GABA C14, inhibe complètement la capture de ce dernier (courbe d figure 3). La quantité de GABA C14 captée par les particules dépend de sa concentration dans le milieu d'incubation. Pour étudier la variation de cette quantité en fonction de la concentration des particules dans le milieu en gardant constant les autres paramètres de la capture, il faut donc ajuster à priori la concentration initiale Xo de GABA (C14) et vérifier qu'on obtient la même concentration finale Xm. La figure 4 montre que la quantité captée peut être ajustée linéairement à la concentration en particules tant qu'on ne dépasse pas 3 mg de protéines par ml. La technique présentée ici donne des résultats reproductibles et linéaires en fonction de la concentration de particules dans le milieu d'incubation. Elle permet de suivre en continu, au cours d'une expérience de transport, L'évolution drupe seule variable la concentration de substrat dans le milieu extraparticulaire. Cette mesure se fait en tenant compte d'une fonction retard simple et de faible constante de temps. Enfin, cette situation expérimentale est particulièrement riche en informations puisque la concentration du substrat varie au coours de l'expérience de capture. Dans l'étude du transport actif, jusqu'à présent seule la vitesse initiale a été mesurée. En prenant en considération l'ensemble de la cinétique conduisant à un équilibre entre la quantité de produit captée et sa concentration dans le milieu, on doit aboutir à une meilleure description des phénomènes de transport actif. Cet appareil est particulièrement bien adapté à cet objectif ainsi qu'â l'ôtude des modifications du transport actif par différents agents pharmacologiques par exemple. - REVENDICATIONS 1. - Dispositif pour la mesure en continu des phénomènes de transport entre un substrat marquable par un agent radioactif et une substance organique sous forme de particules, caractérisé en ce qutil comporte un compteur à rayons p placé sous une chambre d'incubation et séparé de celle-ci dont le fond est ouvert, par au moins une feuille étanche aux liquides mais perméable aux rayons la chambre d'incubation comprenant elle-même deux zones dont celle inférieure formant le fond est constituée par un filtre dont le diamètre des pores est inférieur à celui des particules vers lesquelles doit être mesuré le transport de substrat, l'autre partie de la chambre d'incubation servant de réceptacle pour le substrat marqué par un agent radioactif, et les particules organique s dans leur milieu d'incubation. 2. - Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que, dans le cas où le compteur à rayons t est un compteur à gaz non fermé, il est prévu, entre le compteur et la chambre dtincuba- tion1 une feuille réalisée en matériau étanche à I'hélium. 3 - Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que la chambre d'incubation est constituée par un élément cylindrique en appui sur un support sur lequel il est fixé par vissage, des plaques ajourées étant prévues pour les maintiens respectifs de la feuille tanche à I'hélium et de la feuille étanche aux liquides. 4. - Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le socle sur lequel est monté le compteur et les parois de la chambre d'incubation.sont équipés de conduits de circulation de fluide permettant leur thermorégulation. 5. - Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la chambre dtincubation est équipée de moyens d'agitation constitués, d'une part, par au moins une palette entraînée mécaniquement et, d'autre part, par des conduits d'amenée d'un gaz qui, outre un barbotage, assure le maintien de conditions d'incubation satisfaisantes pour les particules. 6. - Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que la feuille étanche aux liquides est réalisée en polyester alors que la feuille étanche à I'hélium est réalisée en polypropylène. 7. - Dispositif selon l'une quelconque des revendications i à 6, caractérisé en ce que le filtre monté au fond de la chambre d'incubation a une épaisseur supérieure â 100 microns. 8 - Procédé pour l'utilisation du dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il consiste à préparer la substance organique vers laquelle doit être effectuée la mesure du transport, sous forme d'une suspension dans un milieu d'incubation, à imprégner le filtre de ce milieu d'incubation avant de réaliser son montage, à remplir la chambre du milieu d'incubation précité, du substrat marqué et de suspension captante, puis à suivre la variation de radioactivité du substrat marqué- dans le filtre et, par suite la variation de concentration du substrat marqué dans le milieu d'incubation. 9. - Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il consiste à remplir la chambre du milieu d'incubation, puis du substrat marqué, à attendre quelques instants afin que le compteur indique une radioactivité constante, puis à verser dans la chambre une fraction de suspension captante, préincubée pendant quelques instants, en même temps qu'une certaine quantité de substrat marqué afin de-maintenir constante la concentration initiale, et enfin à suivre la variation de radioactivité du substrat marqué dans le filtre, et par suite la variation de concentration du substrat marqué dans le milieu d'incubation, afin d'en déduire, par soustraction, la quantité captée par les particules. '0. - ApBlication du procédé selon l'une quelconque des revendications 8 et 9 à la mesure de-s échanges de neurotransmetteurs dans les synaptosomes.