Brevet FR2368281A1 — publié le 19780519

La présente invention concerne la préparation d'une nouvelle souche de cellules, la culture de virus dans ces cellules et la production de vaccins à partir de ces virus. Bien que des cellules animales primaires soient fréquemment utilisées comme milieux de culture pour le développement de virus, 51 est bien connu que ces cellules sont en général indésirables, attendu que la production répétée de cultures à partir de tissus frais s'impose. Cela est peu pratique du point de vue économique, lorsque de grandes quantités sont requises pour la production industrielle de vaccins. En outre, les cellules primaires portent souvent des impuretés de nature bactérienne et virale. La recherche stefforce constamment de découvrir des souches cellulaires viables et stables ou des lignées cellulaires qui conviennent, du point de vue économique, pour le développement de virus en vue de la production de vaccins destinés à la médecine humaine et à la médecine vétérinaire. Beaucoup de cultures cellulaires ont été trouvées, mais très peu d'entre elles sont acceptables, pour une ou plusieurs raisons. Par exemple, certaines de ces cultures perdent à la longue leur stabilité et n1 assurent pas des vitesses uniformes de développement. D'autres peuvent acqué- rir un pouvoir cancérigène. Chez certaines de ces cellules, les vitesses de multiplication t les rapports de division d'un passage au suivant ne donnent pas satisfaction. On vient de découvrir une nouvelle souche de cellules que l'on peut cultiver et repiquer en un nombre de passages pouvant atteindre environ 75 sans qu'elle perde aucune de ses cazacté- ristiques et qui convient pour le développement de nombreux virus en vue de la production de vaccins. La nouvelle souche de cellules de la présente invention est une souche de cellules diploïdes dérivée du tissu pulmonaire dtun embryon de chien (CLDLu). Les cellules sont préparées à partir du tissu pulmonaire haché dans un milieu propre à leur développement, de préférence le milieu minimal d'Eagle additionne de sérum de foetus de veau et contenant des antibiotiques et un fongicide.La masse de cellules-mères (MCS) résultant du quinzième repiquage est congelée et ce produit MCS est utilisé pour la pré paration de cultures cellulaires en vingt autres passages (MCS+20) que lron conserve en vue dgétudes de caractérisation. lie doublement de la population des cellules à chaque passage apparaît en 2 à 4 jours à 35-37 C. lies caractéristiques suivantes, établies d'après des études portant sur des cellules des produits MCS et MCS+20 passages, définissent la nouvelle souche cellulaire de l'invention 1. lies cellules ressemblent à des fibroblastes. 2. Elles sont diploides d'après l'étude de lrur noyau. 3. Elles sont dépourvues de mycoplasmes, de bactéries, de champignons et dtagents viraux adventices. 4. lies cellules ne sont pas tumorigènes ni oncogéniques. 5. L'appartenance canine des cellules est confirmée par le mode diploide du nombre de chromosomes (78) et par des tests d'immunofluorescence. L'invention concerne également une culture cellulaire qui comprend la souche de cellules diploïdes pulmonaires de foetus de chien dans un milieu nutritif qui convient pour le développement de nombreux virus. De préférence, cette culture cellulaire renferme du sérum de foetus de veau. Il est avantageux que la composition de la culture cellulaire renferme un inoculum d'environ 4 x 106 cellules pulmonaires de foetus de chien dans une solution renfermant environ 80 à 90 % de milieu minimal d'Eagle, environ 0,15 % de solution équilibrée en sel d2Earle contenant du bicarbonate et 10 à 20 % de sérum de foetus de veau (très avantageusement 20 %). D'autres formulations de milieux de culture de tissus peuvent être utilisées pour supporter les cellules pulmonaires de foetus de chien. La culture cellulaire conforme à la présente invention peut être utilisée pour le développement de divers virus, parmi lesquels on mentionne : des rhabdovirus, par exemple les souches PV-12 et HEP Flury du virus de la rage ; des paramyxovirus, par exemple le parainfluenza-virus du type 3 et le virus de la maladie de Carré (souche Cabasso) ; des orbivirus, par exemple le virus de la fièvre catarrhale maligne du mouton ou "blue tongue" ; et des herpesvirus, par exemple le virus de r Chinetrachéite infectieuse bovine.La souche cellulaire de la présente invention, on association avoc le milieu nutritif, a montré une nette supériorité sur de noméreuses autres sodches cellulaires ou lignées de cellules, dans son aptitude à entretenir le développement de nom breux virus, notam@ent le virus de la rage, en donnart des titres très élevés en virus. Un intétêt particulier réside également dans l'utilisation de la culture cellulaire pour produire le virus de la rage en vue de la rréparatîon de vaccins destinés non seule- ment à l'usage vétérinaire, mais aussi à la médecine hnmaine. La production de vaccins entre également dans le cadre de la présente invention. Des virus cultivés 3' partir de la culture cellulaire de l'invention sont traités ensuite pour T1 obtention de vaccins par des prosédés connus dans 'a pratique. ainsi, le produit final d'une culture de @irus peut être utilisé tel quel ou peut être atténué ou inactivé par l'une quelconque des opérations connues pour obtenir une matière antigénique non pathogénique qui peut être présentée sous une forme posologique administrable comme vaccin en vue de stimuler la production diant,ccrps chez l'hête pour réaliser une immunisation active.La forme posologique peut consister en une préparation qui convient pour l'administration intranasale, orale ou parentérale et peut renfermer des adjuvants acceptables du point de vue physiologique ou d'autres substances permettant une libération retardée, ainsi que des sels et/ou des tampons. Un exemplaire de la souche de cellules pulmonaires de foetus de chien de la présente invention a été déposé à 11 institut appelé "American Type Culture Collection", Rockville, Maryland 20852, où la référence A.T.C.C. N CL-175 lui a été attribuée. L'invention est illustrée par les exemples suivants Exemple 1 Production de la souche de cellules Du tissu pulmonaire prélevé sur un foetus du sexe o dégagé dans des conditions aseptiques d'une chienne aux environs du cinquantième jour de gestation est haché, trypsinisé pendant 5 minutes à 370C au moyen d'une solution à 0,25 % de trypsine, et cultivé dans une bouteille offrant une surface de 75 Rcm, dan= un milieu formé de 89,85 % de milieu minimal d'Eagle, 0,15 % de solution équilibrée en sel d'Earle renfermant 1,43 g/l de bicarbonate de sodium, plus un supplément de 10 % de sérum de foetus dc veau. lie milieu de culture renferme des antibiotique (100 anités/ml de pénicilline et 100 g/ml de streptomycine) et us fongicide (2,5 g/ml d'amphotéricine B). La population cellulaire est à pou près doublée à 35-370C en une période de 2 à 3 jours. Après trypsinisation et culture dans le même milieu pendant deux autres passages, on améliore le dévelorpenent des cellules en élevant la concentration du sérum de foetus de veau à 20 % du quatrième au quinzième passage.Au cours du quinzième ropiquage, le milieu est encore modifié par l'inclusion de tampon "HEPES" 0,01 l. Tes cellules obtenues dans Te quinzième repiquage sont congelées pour former un stock de cellules-mores d'ensemencement (MCS) que l'on utilise dans le même milieu modifié et que l'on repique en vingt autres passages (MCS+20). lies cellules a quinzième passage (MCS) et les cellules du trente-cinquième passage (MCS+20) sont ensuite caractérisées. lies cellules des passages MCS et MCS+20 sont toutes du type fibroblastique et sont dépourvues de mycoplasmes, de levure, de bactéries et de champignons, d'après la méthode normalisée P-72 de United States Department of Agriculture (USDA) Animal & BR Plant Health Inspection Service, APHIS, Veterinary Services (antérieurement Veterinary Biologies Services (VBS)). lies résultats de l'étude chromosomique des cellules sont reproduits sur le tableau I suivant et montrent l'appartenance des cellules à 11 espèce canine et la rétention du karyotype d iplolde TABLEAU I Distribution des fréquences des chromosomes dans 50 cellules CLDLu Chromosomes 59 63 65 68 69 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 Cellules- 1 1 2 2 1 3 3 3 3 23(46) 5 2 MCS Cellules- 1 1 2 3 2 2 8 3 22(44%) 3 2 MCS+20 L'analyse karyotypique des cellules MCS et MCS+20 2 confirmé également la similitude morphologique qui se perpétue dans les vingt passages. Des tests conformes à la norme VBS P-72 ont montré que les cellules étaient dépourvues d'agents viraux adventices. Des tests de tumorigénicté et d'oncogénicité ont été effectués sur des hamsters sous l'effet de la cortisone, conformément à la norme VBS P-72, Annexe B, publiée par la Veterinary Biologics Division de l'USDA, le 1er juillet 1970. On ne note aucun signe de formation de tumeur et aucune anomalie n1 est décelée dans les bajoues ou les organes renfermés dans la cavité corporelle des hamsters. lia recherche des cellules non canines par la technique dlimmunofluorescence conformément à la norme VBS P-72, Annexe D, publiée le 1er juillet 1970, eonfirme l'identité canine de la souche cellulaire et met en évidence ltabsence de contamination par des espèces cellulaires hétérologues coexistant dans les laboratoires dlessai. Exemple 2 Méthode générale de culture de virus dans la souche cellulaire Des cellules CLDLu sont infectées en suspension ou après formation d'une couche monocellulaire confluente dans des récipients de culture tels que des tubes ou des flacons d'une contenance d'erJ- viron 910 ml.On introduit dans les récipients de culture contenant les cellules le virus correctement dilué, par exemple 0,2 ml d'une dilution à 10 2v0 - 10 3'5, représentant une multiplicité dtinfec- tion de 0,0001 à 1 ,0. Si le virus est ajouté aux cellules er suspension, une période d'adsorption d'environ 1 heure à 34-37 C est requise. lie virus dilué qui est ajouté aux couches monocellulaires reste au contact des cellules pendant une période de 0,5 à i heure à 34-37 C pour permettre à l'adsorption de se produire.Pour des cellules infectées en suspension, un milieu de croissance contenant environ 80-85 % de milieu minimal d'Eagle en solution saline équilibrée d'Earle à 0,15 %, plus un supplément de 15 à 20 % de sérum de foetus de veau, offre les substances nutritives nécessaires à la formation de couches monocellulaires. L'exclusion d'impuretés microbiennes est favorisée par la présence simultanée de formulations antibiotiques apportant par exemple 100 unités/ml de péni.cil- line et 100 pg/ml de streptomycine ou 30 unités/ml de néomycine et 30 unités/ml de polymyxine plus 2,5 pg/ml d'amphotéricine B. lie pH du milieu de croissance et d'entretien est ajusté par l!ad- dition de tampon 'HEPES" 0,01 M et de bicarbonate de sodium à 0,19 %. Après incubation à 34-37 C pendant une période suffisante pour que la réplication virale ait lieu, les liquides infectés sont récoltés lorsque, dans le cas de virus cytolytiques, 70 à 90 % des cellules infectées exercent un effet cytopathogénique caractéristique. Pour les virus non cytolytiques, les liquides infectés sont récoltés lorsque le maximum de croissance virale a été atteint, comme indiqué par des études préliminaires de la courbe de croissance, ordinairement 2 à 7 jours après l'infection. Des cycles multiples de récoltes virales de liquides infectés sont également possibles dans le cas de virus non cytolytiques, par élimination du milieu usé, addition de milieu neuf et poursuite de l'incubation des cellules infectées jusqu'à ce qu'un nouveau maximum de croissance virale ait été atteint en 1 à 3 jours. Exemple 3 Culture de rhabdovirus dans la souche cellulaire Pour adapter des rhabdovirus à la culture cellulaire, on fait se développer des souches PV-12 ou HEP Fiury du virus de la rage dans des cellules GLDLu en 5-9 passages pour préparer le virus dtinoculation. Trois ou quatre jours après l'infection des cellules en suspension, lorsque les tests de recherche des anticorps fluorescents révèlent l'existence de 10 à 50 % de cellules fluorescentes, les cellules infectées sont détachées de la paroi de verre du récipient de culture avec une solution de trypsine et d'acide éthylènediaminetétracétique et elles sont remises en suspension dans le milieu de culture. Des cellules de chaque récipient de culture utilisé dans le premier cycle de croissance sont ajoutées à chacun de deux réeipients vierges de culture pour le second cycle de développement. Trois à quatre jours après la division cellulaire dans le rapport 1:2, les tests de recherche des anticorps fluorescents dans les cellules infectées monirent qu'il y a 100 % de cellules a réaction positive vis-a-vis de l'antigène rabique. Les liquides infectés sont récoltés, rassemblés et conservés à -70 C en échantillons identiquesi. Les titres de ces récoltes de virus yent de 105,5 à 107'5 D.L.O pour le souris, par ml. Exemple 4 Culture du paramyxovirus dans la souche de cellules lie parainfluenza-virus tyre 3 est préparé à partir de collules ATCC TK-15 infectées par ce virus, cette matière représentant 3 ou 4 passages du virus sur une culture de tissu. Quatre à six jours après l'inoculation des cultures de cellules CLDLu, les cellules montrent nettement des signes de dégénérescence au moment où elles sont récoltées. Les cellules et les liquides sont rassemblés et conservés à -70 C en échantillons identiques. Les titres de ces récoltes de virus vont de 106,0 à 107,0 D.I.C.T. 50/ml. On prépare de la même façon le virus de la maladie de Carré (souche Cabasso) à pariir de suspensions d'embryon de poulet à infection virale, cette matière représentant 40 à 45 repiquages du virus. Trois à quatre jours après l'inoculation de la suspension de cellules CLDLu, les cellules présentent une certaine dégénérescence et elles sont alors récoltées. lies cellules et les liquides sont rassemblés et conservés à -70 C en échantillons identiques. lies titres de ces récoltes de virus vont de 103,0 à 104'0 D.I.C.T. 50/ml. Exemple 5 Culture de l'herpesvirus dans la souche de cellules lie virus de la rhinotrachéite infectieuse bovine est préparé à partir de cellules primaires de rein de boeuf à infection virale, cette matière représentant 3-4 passages du virus en culture de tissu. Quatre à six jours après l'inoculation des cultures de cellules CLDLu, environ 75 % de les cellules sont infectées, et on les récolte à ce moment. lies cellules et les liquides sont rassemblés et conservés à -700C en échantillons identiques. lies titres des récoltes de virus vont habituellement de 105,5 à 106,0 D.I.C.T. 50/ml. Exemple 6 Culture de l'orbivirus dans Ta souche cellulaire le virus de la fièvre catarrhale maligne du mouton est préparé à partir d'une suspension d'embryon de poulet à infection virale, cette matière représentant 45 à 50 repiquages du yirus. Quatre à sept jours après l'inoeulation des cultures de cellules CLDLu, environ 75 % de ces cellules sont infectées, et on les récolte à ce stade. lies cellules et les liquides sont rassemblés et conservés à -70 C en échantillons identiques. Lîc titres des récoltes de virus couvrent ordinairement une gamme de 105,0 à 106,5 D.I.C.T.50/ml. REVENDICATIONS 1. Culture de cellules destinée à la production de virus, caractérisée par le fait qutelle consiste en cellules diplopies d'une souche de cellules pulmonaires de foetus-de chien dans un milieu nutritif de culture. 2. Culture de cellules suivant la revendication 1, caractérisée par le fait que la souche de cellules pulmonaires de foetus de chien est désignée par la référence A.g.C.C. N0 CL-175. 3. Culture de cellules suivant les revendications 1 ou 2 caractérisée par le fait que le milieu nutritif consiste en sérum de foetus de veau. 4. Culture de cellules suivant la revendication 3, caractérisée par le fait qu'elle renferme environ 10 à environ 20 ffi de sérum. 5. Procédé de préparation d'un vaccin au moyen d'une culture de cellules suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'il consiste a) à maintenir une culture viable de cellules diploïdes d'une souche de cellules pulmonaires de foetus de chien dans un milieu nutritif de culture, b) à inoculer ledit milieu avec un virus auquel lesdites cellules sont sensibles, c) à cultiver ledit virus dans ledit milieu et a) à faire une récolte du virus dans ledit milieu de culture. 6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé par le fait que le virus est un représentant du groupe comprenant le virus rabique, le virus de la rhinotrachéite infectieuse bovine, le virus de la maladie de Carré, le parainfluenza-virus type 3 et le virus de la fièvre catarrhale maligne du mouton. 7. Un vaccin destiné à 8tre administré à un animal pour stimuler la production d'anticorps, préparé par le procédé suivant la revendIcation 5. 8. Vaccin suivant la revendication 7, caractérisé par le fait que le virus est le virus rabique et 11 animal est un être humain.