Brevet FR2367823A1 — publié le 19780512

la présente invention est relative à un procédé de préparation de t-leupeptines par fermentation, ainsi qu'à leur extraction et leur purification à partir des produits de fermentation. tes leupeptines sont des inhibiteurs des enzymes découverts par Umezawa, l'un des présents inventeurs et ses collaborateurs dans des filtrats de cultures de Streptomyces roseus et dune grande variété de micro-organismes du type Streptomyces. La structure chimique des leupeptines est représentée par la formule générale suivante dans laquelle R1 et R2 représentent indépendamment l'un de l'autre un radical et R3 représente un radical CR3 ou C2H5. Ces leupeptines sont des substances utiles, qui sont peu toxiques et qui ont une activité inhibitrice des protéases, notamment une activité anti-plasmine et une activité anti-trypsine, et qui présentent également une activité anti-inflammatoire et d'autres activités pharmacologiques (cf. brevet japonais N 595 140, brevet des Etats-Unis dtAmérique N 3 840 513). Les composants principaux des leupeptines obtenues à ce jour par fermentation sont les propionyl- et acétyl-L-leucyl-X-leucyl- DL-argininals présentant chacune un groupe argininal en la configuration stérique DS (appelées ci-apres DL-leupeptines ou forme DL) Rondo, S. et al., Chem. Pharm. Bull.(Tokyo), 17, 1896 (1969); brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 840 513]. Antérieurement à la présente invention, on n'avait jamais obtenu de I-leupeptines par fermentation et, en conséquence, on pensait quton obtenait des 1 > 1-leupeptines par fermentation. Shimizu et ses collaborateurs ont réalisé la synthèse chimique de leupeptines ayant un groupe argininal en configuration t (appelées ci-après L-leupeptines ou forme L) et d'autres leupeptines ayant un groupe argininal en configuration D (dites ci-après D-leu- peptines ou forme D). tes essais biochimiques ont confirmé que le principe actif responsable des effets inhibiteurs sur les enzymes est constitué par les t-ieupeptines, tandis que les D-leupeptines sont inactives et que les DL-leupeptines obtenues par fermentation ne présentent que la moitié de 11 activité des t-leupeptines Dhimizu, B. et al., J.Antibiotics, 25, 515(1973); Umezawa, R., Enzyme Inhibitors of Microbial Origin, University of Tokyo Press (1972), p. 24 25 J. La Demanderesse a effectué des boudes poussées sur le processus de fermentation ainsi que sur les processus d'extraction et de purification et, par suite, a découvert tout d'abord les faits énumérés ci-apres qui ont conduit à la présente invention. La présente invention a pour buts - de fournir un nouveau procédé de préparation de L-leupeptinea par fermentation; - de fournir un nouveau procédé d'extraction et de purification des B-leupeptines obtenues dans un bouillon de culture par fermentation. D'autres buts, avantages et caractéristiques de 11 invention apparaitront dans la description qui va suivre. Au dessin annexé, donné uniquement à titre d'exemple la Fig. 1 représente le degré de racémisation des t-leupeptines obtenues par le procédé suivant la présente invention, exprimé en activité relative et en pouvoir rotatoire spécifique, tous deux mesurés en fonction du temps de conservation, en jours; la Fig. 2 représente les spectres d'absorption infra-rouge du chlorhydrate de B-leupeptine (en trait plein) obtenu par le procédé suivant la présente invention et du chlorhydrate de DL-leupeptine préparé par des modes classiques de fermentation et d'extraction (en trait discontinu). (1) Dans la fermentation des leupeptines, où on maintient le pH du milieu de culture à une valeur de 5,0 à 7,0, il y a accumulation de T-leupeptines dans le milieu, tandis que lorsque la réaction du milieu passe dans la gamme des pli alcalins, on obtient des DLleupeptines. Même lorsqutor maintient le pli du milieu de culture entre 5,0 et 7,0, lorsqu'on poursuit la culture après que l'accumulation de B-leupeptines a atteint un maximum, on provoque une racémisation partielle des B-leupeptines obtenues et on obtient des L-leupeptines souillées par la forme D. (2) les L-leupeptines purifiées subissent également une racémisation progressive en milieu légèrement alcalin, par exemple à pH 8,0, à température modérée, par exemple de 230 C, et sont complètement transformées en la forme DL au bout de plusieurs jours. (3) Lorsqu'on fait appel à des modes de purification connus typiques, les leupeptines présentes dans le filtrat de culture sont soumises à des traitements d'adsorption et de désorption pour lesquels on utilise une colonne de charbon activé ou dune résine échangeuse d'ions de type acide carboxylique, par exemple une résine tewatit CEP (résine échangeuse de cations contenant des groupes acide carboxylique, fabriquée par Bayer Co.) ou Amberlite IXC-fO(résine échangeuse de cations, contenant des groupes acide carboxylique, fabriquée par Rohm & Haas Co.) sous forme H et/ou Na.Avec les résines échangeuses de cations de type acide carboxylique, la forme H ne provoque pas la racémisation des Eleupeptines, mais elle n'est pas économique du fait de son faible pouvoir adsorbant, tandis que la forme Na a un pouvoir adsorbant encore plus faible et, en outre, provoque une racémisation complète. Bien qu'un adsorbant de type mixte contenant les formes H et Na en proportions appropriées (7 à 8/3 à 2 en volume) soit supérieur à tout autre adsorbant connu du fait de son pouvoir adsorbant très élevé et des rendements élevés obtenus lors de l'adsorption et de la désorption, il ne convient pas à 11 obtention de L-leupeptines car il provoque une forte raeémisation, même lorsqu'on effectue les traitements en milieu faiblement ou modérément acide. (4) te procédé consistant à faire adsorber les leupeptines d'un filtrat de culture sur du charbon activé puis à désorber à l'aide d'un solvant organique aqueux acide, par exemple à l'aide de méthanol à 80 ffi à un PH de 2,0, fournissait des Di-leupeptines lorsqu'on ltap- pliquait à un prod:it fermenté de façon classique, sans régulation du pH. La Demanderesse a découvert que ce procédé fournit des L- leupeptines lorsquron l'applique sur de la bière préparée par des modes opératoires mis au point suivant l'invention. Toutefois, le rendement obtenu est faible, de 30 à 50 . On remarquera, toutefois, que le charbon activé est utilisable, tout comme le gel de silice ou l'alumine, comme adsorbant à utiliser dans la chromatographie sur colonne à laquelle on fait appelau stade de purification suivant. (5) le procédé suivant l'invention, qui utilise une résine adsorbante poreuse non-ionique, est applicable à la fois au premier stade d'extraction-purification (c'est-à-dire d'adsorption des leu peptines présentes dans un filtrat de culture et de désorption des leupeptines adsorbées)~et au stade ultérieur de purification plus poussée des L-leupeptines présentes dans la solution contenant des B-leupeptines qui a subi la purification préalable, son application au premier stade étant particulièrement avantageuse.Lorsqu'un filtrat de culture contenant des leupeptines est traité par le procédé suivant la présente invention, on obtient des avantages bien supérieurs à ceux de tout procédé connu, notamment un pouvoir adsorbant bien supérieur à celui de tout procédé classique, l'absence de racémisation des 1-leupeptines, ainsi qu'un rendement élevé, de 90 %, environ, au stade d'adsorption-désorption. (6) L'addition de 0,5 à 1,25 ss chaque de L-leucine, de 1parmi nine (sous forme de chlorhydrate) et de glycine au milieu de fermentation des L-leupeptines, accrott la production de L-leupeptines jusqu'à une valeur de 4 à 6 fois supérieure à celle obtenue avec les procédés classiques. (7) Le rendement en L-leupeptines est encore amélioré jusqu'à une valeur de 7 à 10 fois supérieure à celle obtenue avec les procédés classiques, en ajoutant également au milieu précité, contenant lesdits aminoacides, au moins une substance organique naturelle choisie parmi les acides ribonucléiques, l'extrait de levure et les hydrolysats de caséine. (8) Lorsquton utilise un milieu de fermentation contenant les trois aminoacides précités, ledit-milieu ne contenant pas plus de 0,) % pds/vol d'aminoacides (y compris les aminoacides eux-memes ainsi que des substances les contenant comme des peptides, des protéines, etc..) autres que les trois- aminoacides précités, la leupep- tine produite est constituée pratiquement uniquement par de l'acétyl L-leucyl-L-leucylGL-argininal et ne contient pas d'autres leupeptines contenant des groupes propionyle, des restes isoleucine ou des restes valine. La presente invention a été mise au point sur la base des découvertes précitées. On a tout d'abord mis au point un procédé de préparation de t-leupeptines qui sont une forme active, avec un rendement élevé, par fermentation. C'est également une découverte importante, pour la production d'une seule leupeptine de qualité constante, qu'on peut obtenir de lal-leupeptine uniquement constituée par de l'acétyl-t-leucyl-t-leucyl-t-argininal, avec un rendement élevé, en mettant en oeuvre le procédé en utilisant un milieu de culture qui contient de 0,5 à 1,25 ffi chaque de B-leucine, de B-ar- pinne (sous forme de chlorhydrate) et de glycine et qui ne contient pas plus de 0,3 % pds/vol d'aminoacides (y compris les aminoacides eux-mêmes et les substances les contenant, comme des peptides, des protéines, etc..) autres que les trois aminoacides précités. tes avantages fournis par la présente invention sont mis en évidence par les exemples expérimentaux suivants. Suivant la présente invention, l'activité des leupeptines est mesurée comme suit. On ajoute 0,5 ml d'une solution de leupeptine préparée de façon que la concentration soit d'environ 8 mcg d'activité/ml à 2,5 ml d'une solution 1,25 x 10 4 M de chlorhydrate de l'ester méthylique de la p-toluènesulfonyl-l-arginine dans du tampon Tris à pH 8,1. Après pré-incubation à 320 C pendant 5 minutes, on ajoute au mélange 0,1 ml d'une solution aqueuse de trypsine (7,5 mcg/ml). Immédiatement après incubation à 320 C pendant 30 minutes, on soumet le mélange réactionnel à un essai d'absorbance à 247 nm, de façon à obtenir la valeur de l'essai. On obtient la valeur témoin de la même fa çon que ci-dessus, mais sans ajouter de leupeptine. On calcule le degré d'inhibition de la trypsine en divisant la différence entre la valeur témoin et la valeur de l'essai par la valeur témoin. Conformément à ce protocole d'essat, la concentration d'inhibition à 50 % de la trypsine (ID50) du chlorhydrate d1acétyl-l-leucyl-l-leu- cyl-l-arginine ayant la pureté la plus élevée est de 0,98 mcg/ml. On utilise cette substance comme échantillon étalon, et on exprime l'activité des leupeptines en poids, par exemple en mcg d'activité et mg d'activité. les DI-leupeptines les plus pures, obtenues par les procédés classiques de fermentation et de purification, présentent une valeur dlID50 de 1 ,87 mcg/ml. On mesure comme suit la teneur en I-leupeptines d'un mélange de B-leupeptines et de D-leupeptines. On prépare une solution aqueuse des leupeptines soumises à l1es- sai, et on oxyde en acides de leupeptines (le fragment argininal des leupeptines étant oxydé en arginine) à l'aide de permanganate de potassium. On purifie et isole les acides résultants par chromatographie sur charbon activé et chromatographie sur alumine acide. On hydrolyse les acides isolés, à l'acide chlorhydrique 6N, à 1100 C pendant 24 heures. On-détermine la teneur totale en arginine de l'hy- drolysat à l'aide d'un analyseur des aminoacides. D'autre part, on détermine la teneur en I-arginine delthydrolysat par recherche de l'activité biologique, en utilisant des bactéries de l'acide lactique. On suppose que la teneur en t-arginine (%) de l'arginine totale est égale à la teneur en B-leupeptines (pourcentage de la forme t) dans les leupeptines totales.La teneur en forme I de i1 échantillon étalon est de 100 ffi et la teneur en DL-leupeptines obtenues par des modes de fermentation classiques est de 52 %. Exemple expérImental 1 On inocule une culture en pente de Streptomyces roseus MA 839-Al (FERM-r No. 3017; ATCC 31245) dans un milieu contenant 2 % de glucose, 2 % d'amidon, 3 % de polypeptone, 0,5 % de NaCl, et 0,3 % de EH2P04, , qui a été introduit dans un ballon et stérilisé, puis on cultive en secouant, à une température de 27 à 280 C pendant 2 jours, afin de préparer l'inoculum (le pourcentage utilisé ici est le pourcentage pondéral par volume, comme dans la suite des exemples). On prépare 20. litres du mgme milieu que ci-dessus, dans un bocal de fermentation de 30 litres, et on inocule avec 200 ml de l'ino- culun ci-dessus. On cultive à 270 C en aérant et en agitant. A intervalles de temps réguliers, on prélève une partie du bouillon de culture et on la purifie, sans racémisation, suivant la présente invention, obtenant ainsi des chlorhydrates de leupeptines sous forme pulvérulente. les résultats des essais d'activité et de pourcentage de la forme B sont indiqués au Tableau 1. TABLEAU 1 Variation de la fermentation des leupeptines en fonction du temps Temps de culture (heures) 24 36 42 48 - 60 72 pH 6,6 6,9 6,5 5,5 4,9 5,6 activité du bouillon de 20 115 330 450 320 280 culture (mcg/ml) activité de la poudre de leupeptine (mcg/mg) - - Pourcentage de leupeptine - - 100 100 92 84 pulvérulente de forme B Il découle du Tableau 1 que l'activité de la leupeptine pulvérulente est de 1000 meg/mg au bout -de 42 heures et 48 heures de culture, et qu'elle décrit à 910 mcg/mg au bout de 60 heures, puis à 620 mcg/mg au bout de 72 heures de culture. la teneur en forme t de la leupeptine pulvérulente passe également de 100 % (au bout de 42 et 48 heures de culture) à 92 % au bout de 60 heures de culture, puis à 84 % au bout de 72 heures de culture. En conséquence, il faut prendre soin d'éviter de prolonger inutilement le temps de culture car, même lorsque le pH est maintenu entre 5,0 et 7,0, la prolongation de la culture, après obtention de l'accumulation maximale de B-leupAp- tines, semble provoquer une racémisation partielle des B-leupeptines obtenues. Exemple expérimental 2 On dissout les chlorhydrates de Eleupeptine obtenus au bout de 48 heures de culture à l'exemple expérimental 1 dans un tampon de phosphate 0,1M à PH 8,0 de façon à obtenir une solution à I %.On abandonne la solution résultante à 230 C et on mesure les variations, en fonction du temps, du pouvoir rotatoire spécifique et de l'activité relative (mcg/mg). les résultats obtenus sont représentés à la Fig. 1. tes leupeptines recueillies au bout de 7 jours présentent une teneur en forme X de 50 % et une activité relative de 490 megZmg, indiquant qu'il y a eu racémisation complète. il découle des résultats ci-dessus que les I-leupeptines subissent une racémisation meme dans des conditions aussi douces qu'un pH de 8,0 et une température de 230 C. Exemple expérimental 9 On compare les deux modes de purification suivants, en utilisant le bouillon de culture obtenu au bout de 48 heures de culture comme décrit à l'exemple expérimental 1. Mode de purification A : On fait passer le bouillon de culture (pH 6,0) sur une colonne de résine Bewatit CNP-80 (forme Na/forme H = 2/8 en volume) afin d'adsorber les 1-leupeptines. On élue l'adsorbat à l'aide de méthanol à 80 ffi contenant de l'acide chlorhydrique IN. Toutes les fractions d'éluat sont acides. On évapore les-fractions actives, de façon à obtenir une solution aqueuse. On extrait les leupeptines de la solution aqueuse, à laide de n-butanol, et on évapore la solution n-butanolique sous pression réduite, afin d'éliminer le n-butanol. On fait ensuite passer la solution aqueuse ré sultante sur une colonne de charbon activé et on élue la phase adsorbée à l'aide d'une solution aqueuse d'acétone à 20 ffi amenée à pH 2,0 à l'aide d'acide chlorhydrique. On recueille les fractions d'effluent actives et on neutralise à l'aide de Dowex 44 (forme OH) (résine de polyamine composée d'amines primaires, secondaires et tertiaires, fournie par Dow Chemical Co.), puis on concentre et lyophilise.On dissout la poudre obtenue dans le méthanol, on adsorbe sur une colonne d'alumine acide remplie de méthanol, puis on développe au méthanol. On recueille les fractions d'effluent aetives et on évapore à sec, obtenant ainsi des chlorhydrates de B-leupeptine purifiés. Le -rendement, à partir du filtrat de culture, est de 33 %. Mode de purification B : On fait passer le même filtrat de culture que celui utilisé au mode de purification A sur une colonne d'Amberlite XAD-2 (une- résine adsorbante non-ionique constituée par un copolymère de styrène et de divinylbenzène, fournie par Rohm and Haas Co.) afin d'adsorber les leupeptines, puis on élue la phase adsorbée à l'aide de méthanol à 50 %, à pH 2,0. On recueille les fractions d'éluat actives et on élimine le méthanol par distillation, obtenant ainsi une solution aqueuse. On extrait les leupeptines de la solution aqueuse à l'aide de n-butanol, après quoi on opère comme décrit à propos du mode de purification A, obtenant ainsi des chlorhydrates de leupeptine purifiés. le rendement, à partir du filtrat de culture, est de 65 %. les résultats obtenus avec les deux modes de purification sont comparés au Tableau 2. TABLEAU 2 Comparaison entre les modes de purification A et B Mode de Rendement Activité relative Teneur en forme purification % de la poudre L de la poudre (mcg/mg) (%) A 33 530 56 B 65 1000 100 Il découle des résultats ci-dessus que, lorsqu'on extrait et purifie les T-leupeptines, si l'on effectue l'adsorption-désorption en utilisant tae résine échangeuse dotions faiblement acide de type acide carboxylique partiellement convertie en la forme Na, une proportion considérable des B-leupeptines subit une racémisation, meme lorsque les solutions contenant des leupeptines restent acides. Exemple ex irimental 4 On compare la productivité en leupeptines entre le milieu suivant l'invention et le milieu classique. 1 - Milieux utilisés (1) Milieu suivant l'invention : 3 % de glycérol, 0,75 % de L- leucine, 0,75 % de chlorhydrate de B-arginine, 0,75 % de glycine, 0,5 % de NH4N03, 0,5 % de NaCl, 0,3 % de E2HP04. (2) Milieu de production classique (témoin) : 1 0 de glucose, 2 % d'amidon, 3 % de peptone, 0,5 % de NaCl, 0,3 % de KH2P04 (cf. brevet japonais N 595 140 et brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 840 513). (3) Milieu de synthèse classique (témoin) : 1 % de glucose, 1 % d'amidon, 0,26 % de 1-leucine, 0,4 % de chlorhydrate d'arginine, 0,3 % de glycine, 0,2 % de NH4NO3, 0,1 % de K2HPO4, 0,05 % de MgSO4. 7H20, 0,05 % de XCl, 0,001 % de FeSO4.7H2O [cf. Umezawa, H. Enzyme Inhibitors of Microbial Origin, University of Tokyo Press (1972), p. 20l. 2- Souche utilise : la même qu'à l'exemple expérimental 1. 3 - Conditions de culture On introduit 100 ml du milieu dans un ballon de 500 ml; on inocule à l'aide de 1 mi de l'inoculum cultivé comme décrit à ltexem- ple expérimental 1. On cultive le milieu inoculé à une température de 27 à 280 C, en secouant à l'aide d'un dispositif fonctionnant à une amplitude de 7 cm et à 135 mouvements de va-et-vient par minute. On prélève des échantillons au bout de 48 et 72 heures et on dose l'activité relative des leupeptines. 4 - Résultats les résultats obtenus sont rapportés au Tableau 3 TABlEAU 3 Temps de culture 48 --. 48 heures 72 heures Milieu ' c--ZZL Milieu suivant l'invention 1650 mcgZml 2500 mcg/ml Milieu de production classique 520 " 630 Milieu de synthèse classique 380 " 440 Il découle du Tableau 3 qu'au bout de 72 heures de culture la productivité en leupeptines du milieu suivant l'invention est de 4 à 6 fois supérieure à celles du milieu de production classique et du milieu de synthèse classique.Bien qu'il comprenne presque les mêmes ingrédients, le rendement obtenu avec le milieu suivant l'invention est 6 fois supérieur à celui obtenu avec le milieu de synthèse classique car, dans le milieu suivant l'invention, les concentrations en 1-leucine, B-arginine et glycine ainsi que leurs proportions relatives ont été améliorées. Exemple expériiental 5 Proportions appropriées de T-leucine, B-arginine et glycine. (1) Milieux utilisés : on ajoute des quantités variables de B-leuci- ne, de chlorhydrate de 1-arginine, et de glycine, comme indiqué au Tableau 4, à un milieu de base comprenant 3,0 % de glucose, 0,5 % de NH4g03, 0,1 % de E2EP04, 0,05 % de MgS04.7H20, 0,05 % de KCl, 0,2 % d'acide ribonucléique, et 0,1 46 d'huile de silicone antimoussante. (2) Souche : la même qu'à l'exemple expérimental 1. (3) Conditions de culture : les mimes qu'à l'exemple expérimental 4. (4) Résultats : les résultats obtenus sont rapportés au Tableau 4. TABLEAU 4 Quantités ajoutées, % Rendement en leupeptines, mcg/ml T-leucine Chlorhydrate Glycine 48 heures 72 heures L-arginine 0,25 0,25 0,25 310 insignifiant 0,50 0,50 0,50 2080 3300 0,75 0,75 0,75 3460 4370 1,00 1,00 1,00 2080 2860 1 ,25 1,25 1,25 400 2560 1,50 1,50 1,50 insignifiant insignifiant il découle du Tableau 4 que lorsqu'on ajoute de la 1-leucine, du chlorhydrate de B-arginlne et de la glycine au milieu, à raison de 0,25 ffi chaque, le rendement en leupeptines au bout de 72 heures de culture est insignixiant tandis que lorsqu'on ajoute de 0,5 à 1,25 ego de chacun de ces aminoacides le rendement en leupeptines au bout du même temps de culture atteint une valeur élevée de 2560 à 4370 mcg/ml. Toutefois, lorsqu'on accrott la quantité de chacun de ces aminoacides à 1,50 %, on n'obtient qu'une quantité insignifiante de leupeptines. Ces résultats confirment qu'on obtient spécifiquement un rendement élevé en leupeptines lorsque la B-leucine, la I-arginine (sous forme de chlorhydrate) et la glycine sont ajoutées au milieu en une proportion de 0,5 à 1,25 % chacune. Exemple expérimental 6 Effet de l'addition de substances organiques complexes naturelles. (1) Milieu : on ajoute les substances organiques naturelles indi quées au Tableau 5 au milieu suivant l'invention utilisé à l'exemple expérimental 4. (2) Souche : la même qu'à l'exemple expérimental 1. (3) Conditions de culture : les mêmes qu'à l'exemple expérimental 4. (4) Résultats : les résultats obtenus sont rapportés au Tableau 5. TABLEAU 5 Rendement en leupeptines mcg/ml Additifs 48 heures 7@ heures Extrait de levure 0,1 1550 2250 n n 0,2 1770 2300 Qasaminoacides 0,1 1970 2540 n 0,2 1780 2550 Acides ribonucléiques 0,1 2040 3420 n " 0,2 2050 3520 Témoin 0 1380 1750 il découle du Tableau 5 que l'addition de 0,1 à 0,2 % d'extrait de levure, de casaminoacides ou d'acides ribonucléiques au milieu initial suivant l'invention (utilisé comme témoin) améliore encore le rendement en leupeptines; en particulier lorsqu'on ajoute des acides ribonucléiques, le rendement obtenu est double de celui obtenu avec le milieu initial. On peut utiliser n'importe lesquels des micro-organismes producteurs de 1-leupeptines dans le procédé suivant l'invention. Comme exemples de ces micro-organismes on citera Streptomyces roseus C2 souches : MA839-Al et MB26?-Ml de laboratoire, institut of Microbial Chemistry; MA839-Al a été déposé au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japon (KOgyD Gijuteuin Biseibutsu Kogyo Gijustu Eenky- usho) et à l'American Type Culture Collection, SIaryland, Etats-Unis d'Amérique, les N de dépôt étant respectivement FERM-P N 3017 et ATCC 31 245 j, Streptomyces roseochromogenes (3 souches:MA943-Ml, MB456-AEl, MB260-A2), Streptomyces chartreusis (1 souche : MB58-MGl), Streptomyces aibireticuli (1 souche, E26-Al), Streptomyces thioluteus (1 souche, MB321-Al), Sftreptomyces lavendulae (1 souche, MB172 A2), et Streptomyces noboritoensis (1 souche, MB46-AG). les propriétés de ces espèces ont été décrites dans "The Actinomycetes", vol II (par S.A. Waksman, The Williams & Wilkins Company, 1961). les sources de carbone utilisables dans le miliei producteur de leupeptines suivant l'invention sont: l'acide acétique, le glycé- rol, le glucose, la saccharose, le maltose, la dextrine, l'amidon et autres; sont particulièrement utilisables le glycérol et le glu oose. Comme source d'aote minéral, l'azote de l'ammoniac est supérieur à l'azote des nitrates. les aminoacides à ajouter au milieu sont la L-leueine, la B-arginine et la glycine. les substances organiques naturelles à ajouter au milieu sont choisies parmi les acides ribonucléiques, l'extrait de levure et les hydrolysats de caséine; les acides ribonucléiques peuvent avoir été purifiés ou être bruts et on peut également utiliser des substances contenant des acides ribonucléiques en des concentrations relativement élevées. Comme exemples de résines adsorbantes non-ioniques poreuses utilisables suivant l'invention on peut citer les résines Amberlite XAD-1, XAD-2, XAD-4, XAD-5 (fabriquées par Rohm and Haas Co, Etats Unis d'Amerique) et Diaion HP10, HP20, HP30, HP40, HP50 (fabriquées par Mitsubishi Chemical Co., Japon) (ces deux résines sont composées de copolymère styrène-divinylbenzène), Amberlite XAD-7, XAD-8 (adsorbants à base de polymères d'esters acryliques, fabriquées par Rohm and Haas Co.) et Duolite 5-30 (adsorbant à base de résine phénolique, fabriquée par Chemical Process Co., Etats-Unis d'Amérique). les B-leupeptines sont préparées par le procédé suivant la présente invention comme suit le milieu de culture contient, par exemple, de 1,0 à 6,0 % de glycérol, de 0,1 à 1,0 % de NH4N03, de 0,05 à 0,5 % de E2HP04, de 0,01 à 0,1 % de MgSO4, de 0,01 à 0,1 % de KCl, de 0,5 à 1,25 % de B-leucine, de 0,5 à 1,25 % de larginine (sous forme de chlorhydrate), de 0,5 à 1,25 % de glycine, de 0,05 à 0,3 %0 de substances organiques naturelles comme l'acide ribonucléique, l'extrait de levure et les hydrolysa2;8 de caséine, et de 0,01 à 0,3 % d'huile de silicone antimoussante (pH 6,5).Après avoir été stérilisé de la façon habituelle, le milieu est inoculé aseptiquement à l'aide d'une culture d'ensemencement préparée en cultivant une souche productrice de leupeptines comme Streptomyces roseus, souche MA859-Al (FERM-P NO 3017; ATCC 31 245), puis est cultivé à une température de 23 à 370 C, de préférence de 25 à 300 C. Lorsque le pH est supérieur à 7,0, on l'a mene à une valeur de 6,0 à 6,5 par addition d'acide sulfurique ou d'acide phosphorique. L'accumulation des I-leupeptines atteint habituellement une valeur maximale au bout de 3 à 4 jours de fermentation. On filtre le bouillon de culture ainsi obtenu et on traite le filtrat à l'aide d'une résine, afin de recueillir les 1-leupeptines. On peut effectuer le traitement à la résine de différentes manières, mais, le plus efficacement, sur une colonne de résine. On remplit une colonne de résine qu'on active, par exemple en faisant passer une solution aqueuse de méthanol à 80 % sur la résine, et on lave soigneusement à l'eau. On amène le pH du filtrat de culture contenant les leupeptines à une valeur d'environ 5,0 à 6,0, puis on fait passer le filtrat sur la colonne de résine afin que cette dernière adsorbe les leupeptines. Après adsorption, on lave la colonne à liteau et on élue les leupeptines adsorbées.Comme exemples d'éluants utilisables on citera : des alcanols inférieurs comme le méthanol, l'é- thanol, le n-propanol, l'isopropanol, le n-butanol et l'isobutanol; des alcools inférieurs aqueux; l'acétone aqueuse; la méthyl éthyl cétone aqueuse; des solvants organiques contenant de l'eau acidulée; ainsi que de l'eau acidulée. Comme exemples d'éluants utilisables on citera le méthanol aqueux (de 10 à 95 %) amené à un pH égal ou inférieur à 4,0 à l'aide d'un acide minéral comme l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide nitrique ou l'acide phosphorique. la vitesse spatiale appropriée du liquide est de 0,5 à 2,0 au stade d'ad sorption et de 0,1 à 1,0, particulièrement de 5 environ, au stade d'élution. On recueille l'éluat en fractions de quantités définies. On obtient une partie de l'éluat contenant des leupeptines en réunissant les fractions qui présentent une activité anti-trypsine, une réaction de Sakaguchi positive, ou une réaction de Rydon-Smith positive. C'est ainsi qu'on peut obtenir une solution de L-leupeptines partiellement purifiée en effectuant l'adsorption et la désorption en milieu acide.Comme on n'a pas encore découvert de procédé industriellement économique pour la séparation des D- et 1-leupeptines, il est nécessaire, pour la préparation de L-leupeptines par fermentation, de prendre des mesures permettant d'empêcher la racémisation des L-leupeptines tout au long des étapes opératoires de la fermentation et de la purification. l'un des avantages majeurs du procédé suivant l'invention est qu'il permet la récupération efficace des B-leupeptines d'un filtrat de bouillon de culture ne contenant que des 1-leupeptines. On peut ensuite purifier les L-leupeptines ainsi obtenues en faisant appel à une association appropriée de modes de purification connus, par exemple par chromatographie en milieu acide sur charbon activé, sur alumine (de préférence sur alumine acide), ou sur gel de silice et par extraction en solution aqueuse à l'aide de n-butanol, etc.. les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre dtil- lustration de l'invention. Exemple 1 On divise en portions aliquotes de 100 mol un milieu contenant 2 % de glucose, 2 % d'amidon, 3 % de polypeptones, 0,5 ffi de NaCi et 0,3 % de X112P04 et ayant un pH de 7,0. On introduit chaque portion aliquote de 100 ml dans un ballon secoueur de 500 ml et on stérilise à 1200 C pendant 20 minutes. On inocule le milieu stérilisé avec le contenu d'une boucle de platine d'une culture en pente d'une souche productrice de leupeptines g Streptomyces roseus, MA839-Al (Perm-P N03017; ATCC 31 245)2 et on cultive en secouant à 270 C pendant 2 jours.On inocule 200 ml du bouillon de culture résultant dans un bocal de fermentation de 30 litres contenant 20 litres du mEme milieu que celui utilisé ci-dessus, et on cultive à 270 C pendant 48 heures, sous un débit d'air de 20 litres/minute et en agitant à 400 tours/mi nute. les échantillons prélevés au bout de 24, 36, 42 et 48 heures de culture présentent respectivement un pH de 6,7, 6,8, 6,4 et 6,7 et, respectivement, une activité de leupeptine de 35, 230, 420 et 670 mcg/mi. On mélange le bouillon de culture ainsi obtenu avec 5 % (pds/ vol) d'un adjuvant de filtration (Hyflo Super-Cel, fourni par Johns Manville Co., Etats-Unis d'Amerique), on filtre et on amène à pH 5,5 à l'aide d'acide chlorhydrique dilué, obtenant ainsi environ 15 litres de filtrat de culture présentant une activité de leupeptine de 665 mcg/ml. On fait passer 4 litres (activité totale = 2600 unités) du filtrat de culture sur une colonne remplie de 100 ml d'Amberlite XAD-2, résine adsorbante non-ionique, à une vitesse spatiale de 1, afin de faire adsorber les leupeptines par la résine. Après lavage à l'eau, on élue les leupeptines adsorbées à l'aide de méthanol aqueux à 80 % amené à pH 2,0 à l'aide d'acide chlorhydrique.On réunit les fractions d'éluat actives, on les débarrasse du méthanol par distillation sous pression réduite et on amène la solution aqueuse résiduelle à pli 5,5 à l'aide d'une solution diluée d'acide chlorhydrique, obtenant ainsi 100 ml d'une solution aqueuse présentant une activité de 24,5 mg/ml (le rendement, à partir du filtrat de culture, est de 92 %). On extrait cette solution aqueuse par 2 x 70ml de n-butanol, on réunit les couches d'extrait qu'on débarrasse du n-butanol par distillation sous pression réduite tout en ajoutant de liteau, afin d'obtenir 50 ml d'une solution aqueuse ayant une activité de 47 mg/ml (l'activité totale est de 2350 unités et le rendement, à partir du filtrat de culture, est de 88 %).On amène la solution aqueuse ainsi obtenus à pH 2,0 à 11 aide d'acide chlorhydrique dilué et on introduit dans une colonne à chromatographier remplie de 85 ml de charbon activé (qualité pour chromatographie "Refined Shirasagin fournie par Takeda Chemical Co.) afin d'adsorber les leupeptines. On élue les leupeptines adsorbées à l'aide d'une solution aqueuse d'acétone à 20 %. On réunit les fractions actives de l'éluat qu'on débarrasse de l'acétone par distillation, obtenant ainsi une solution aqueuse. On neutralise cette solution aqueuse à pH 5,5, à l'aide de Dowax 44 (forme OH) et on lyophilise, obtenant ainsi 3,31 g d'une poudre jaune pale ayant une activité de 582 mcg/mg (l'aetivité totale est de 1 926 mg et le rendement, à partir du filtrat de culture, est de 72 %). On dissout la poudre dans 30 ml de méthanol, on introduit la solution dans une colonne remplie de 90 g d'alumine acide, en même temps que du méthanol, puis on développe au méthanol à une vitesse spatiale de 0,5. On réunit les fractions actives de l'effluent et on évapore à sec. On dissout la poudre ainsi obtenue dans de l'eau, on filtre les substances insolubles, puis on lyophilise, obtenant ainsi 1,85 g de chlorhydrates de B-leupeptine ayant une activité de 988 mcg/mg. L'activité totale de la poudre est de 1828 mg et le rendement, à partir du filtrat de culture, est de 69 % environ. La teneur en forme L de la poudre est de 100 %. Exemple 2 On introduit dans des Erlenmeyer de 500 ml des portions aliquotes de 100 ml d'un milieu (pH 6,5) contenant 2 % de glycérol, 1 % de polypeptone et 1 % d'extrait de viande, on stérilise à 1200 C pendant 30 minutes, on inocule à l'aide du contenu d'une boucle de platine d'une culture en pente de Streptomyces roseus, MA839-Al (FERM-P NO 3017, ATCC 31 245), et on cultive en secouant à 270 C pendant 24 heures, obtenant ainsi un bouillon précultivé.On introduit, dans un ballon due 500-ml, une portion aliquote de 100 ml d'un autre milieu (pH 6,5) contenant 3 ss de glycérol, 0,75 % de B-leuci- ne, 0,75 % de chlorhydrate de.l-argin.ine, 0,75 % de glycine, 0,5 % de NX4NOD, 0,1 % de E2HP04, 0,05 % de MgS04.7H20, 0,05 % de KCl, 0,2 % d'acide ribonucléique et 0,1 % d'anti-moussant à base de silicone, on stérilise à 1200 C pendant 30 minutes, puis on inocule aseptiquement à l'aide de 1 ml du bouillon précultivé ci-dessus, et on cultive à 270 C pendant 3 jours sur un appareil secoueur fonction nuant à une amplitude de 7 cm et à 210 mouvements de va-et-vient par minute. les résultats obtenus en fonction du temps sont rapportés au Tableau 6. TABLEAU 6 Résultats de la culture, en fonction du temps Temps de culture (heures) 24 - 48 72 pi 6,7 5,9 5,7 leupeptine (mcg/ml) 1430 3230 4250 Au bout de 72 heures de culture, on filtre le bouillon de culture afin d'éliminer le mycélium; on amène à pli 6 le filtrat résultant (800 ml) ayant une teneur en leupeptine de 4070 mcg/ml et on le fait passer sur une colonne remplie de 120 ml de Diaion HP40 afin d'adsorber la leupeptine. Après lavage à l'eau, on élue la leupeptine adsorbée à l'aide de méthanol aqueux à 50 %, à pH 2, recueillant ainsi 235 ml d'une fraction de leupeptine.Après élimination du méthanol par distillation à 400 C sous pression réduite de la fraction de leupeptine, on obtient 170 ml d'une solution aqueuse qu'on amène à pH 5,5 à l'aide d'une solution aqueuse diluée d'hydroxyde de sodium et on extrait par 3 x 50 ml de n-butanol. On réunit les couches d'extrait qu'on distille à 400 C afin d'éliminer le n-butanol sous forme d'azéotrope avec l'eau, et on obtient 100 ml d'une solution aqueuse ayant une activité de 28 mg/ml de leupeptine. On amène la solution aqueuse ainsi obtenue à un pK de 2, à l'aide d'acide chlorhydrique, et on élimine le filtrat obtenu, par filtration.On fait passer le filtrat sur une colonne remplie de 100 ml d'un charbon activé (de qualité "Refined Shirasagitt, fabriqué par Takeda Chemical Co.), afin d'adsorber la leupeptine. Après lavage à l'acide ôhlorhy- drique dilué à pH 2, on élue la leupeptine adsorbée à l'acétone aqueuse à 20 % à pli 2. On obtient ainsi 210 ml d'une fraction de leupeptine qu'on amène à pH 5,0 à l'aide de résine Dowex 44 (forme OH) et concentre à sec sous pression réduite, ce qui fournit 4,00 g d'une poudre presque blanche ayant une activité de 580 mcg/mg.On dissout la poudre dans le méthanol, on fait passer sur une colonne contenant 60 g d'une alumine acide (fournie par Woelm Co., Rdpubli- que Fédérale Allemande) en suspension méthanolique, et on développe au méthanol afin de recueillir des fractions de leupeptine. On réunit les fractions de leupeptine qu'on concentre à sec sous pression réduite, obtenant ainsi 2,22 g de chlorhydrate de leupeptine pulvéru- lent blanc présentant une activité de 1000 mcgZmg, le rendement, à partir du- filtrat de culture, étant de 68 %. la poudre ci-dessus a un pouvoir rotatoire spécifique [&alpha;]D25 de -750 (c - I, li20) et un point de fusion de 143146o C (déeomp.), présente une réaction de Sakaguchi positive, une réaction de Rydon Smith positive et une réaction négative à la ninhydrine. Elle ne présente pas d'absorption spécifique dans l'ultra-violet, mais seulement une absorption finale. Comme illustré à la Fig. 2, le spectre d'absorption infra-rouge de la poudre coincide avec celui d'une DL-leupeptine obtenue par un procédé classique. On hydrolyse 20 mg des chlorhydrates ci-dessus hall'aide d'acide chlorhydrique 6N en tube scellé à 1000 C, pendant 24 heures, et on extrait à l'éther éthylique l'acide gras libre présent dans l'hydro- lysat. On concentre la couche d'extrait qu'on soumet à une chromatographie gazeuse sur colonne remplie de Chromosolbb 101 (25C à 177 microns) (fabriquée par Nippon Euromato Kogyo Co.,); on ne décèle que de l t acide acétique. En conséquence, cela confirme que la poudre est un chlorhydrate de leupeptine dans lequel le groupe acyle est uniquement le groupe acétyle. On dissout ensuite environ 200 mg du chlorhydrate dans 8 mi d'eau. On additionne la solution de chlorhydrate d'une solution de 52 mg de permanganate de potassium dans 2 mi d'eau, goutte à goutte, en agitant, à température ambiante, puis on agite pendant encore 2 heures afin de mener l'oxydation à bonne fin. On neutralise ensuite l'excès de permanganate de potassium par le thiosulfate de sodium et on fait passer sur une colonne remplie de 5 mi d'un charbon activé. Après lavage à lrsseau, on élue la phase adsorbée par l'acétone aqueuse à 20 fa (pH 2,0) et on recueille les fractions présentant une réaction de Sakaguchi positive.On réunit ces fractions, on amène à pli 5,0 à l'aide de résine Dowex 44 (forme OH) et on évapore à sec, obtenant ainsi 170 mg d'une poudre. On dissout la poudre dans 1 ml de méthanol et on fait passer sur une colonne remplie avec 5 g d'alumine acide en suspension dans le méthanol, puis on développe à l'ai- de de 15 ml de méthanol suivis de 25 ml de méthanol aqueux à 50 % (pli 3,0). On réunit les fractions d'effluent donnant une réaction de Sakaguchi positive, on amène à pH 5,0 à l'aide de résine Dowex 44 (forme OH) et on évapore à sec, obtenant ainsi 75 mg d'acide de leupeptine (acyl-I-leucyl-L-leucyl-arginine).On pèse exactement environ 10 mg de cet acide, on mélange avec 2 ml d'acide chlorhydrique 6N et on hydrolyse en tube scellé à 1100 C, pendant 24 heures. On évapore la solution dthydrolysat à sec, puis on dissout à l'eau. On analyse qualitativement et quantitativement les aminoacides constitutifs sur une partie de la solution résultante. On soumet le reste de la solution à des essais d'activité biologique, en utilisant comme organisme d'essai une bactérie de l'acide lactique ayant besoin de 1-arginine afin de ddterminer la teneur en t-arginine. TABLEAU 7 Composition en aminoacides de l'hydrolysat d'acide de leupeptine Analyse des aminoacides Quantité d'acide B-leucine Arginine B-arginîne de leupeptine totale utilisée pour lthydrolyse 8,10 mg 3,95 mg 2,56 mg 2,61 mg (30,1 umol (14,8 pmol (102 % de I'ar Rendement 89%) Rendement 87%) ginine totale) il découle des résultats ci-dessus que l'acide de leupeptine soumis à l'hydrolyse contenait de la B-leucine et de la L-arginine en un rapport molaire de 2/1 et ne contenait ni valine, ni isovaline, ni D-arginine. Cela confirme que la leupeptine obtenue dans cet exemple est un composé unique à savoir l'acétyl-L-leucyl-L-leucyl-L-argi- ninal. Exemple 2 Dans un ballon de 500 mi on introduit 100 ml d'un milieu (pH 6,5) contenant 3 % de glycérol, 0,75 % de L-leucine, 0,75 % de chlorhydrate de 1-arginine, 0,75 % de glycine, 0,5 % de NH4NQ3, 0,1 % de K2EPO4, 0,05 % de MgSO4.7H2O, 0,5 % de ECl et Q,1 ffi d'anti-moussant à base de silicone et on stérilise à 1200 C pendant 30 minutes.On inocule le milieu stérilisé à l'aide de 1 ml de bouillon précultivé préparé comme décrit à exemple 2, et on cultive à 270 C pendant 3 jours sur un appareil secoueur fonctionnant à une amplitude de 7 cm et à 210 mouvements de va-et-vient par minute. les résultats de la culture, en fonction du temps, sont rapportés au Tableau 8. TABLEAU 8 Résultats de la culture en fonction du temps Temps de culture (heures) 24 48 72 pli 6,6 6,3 5,9 L-leupeptine (mcg/ml) 830 1610 2460 On extrait la L-leupeptine à partir du filtrat de culture (2350 mcg/ml; 800 ml) en opérant comme décrit à l'exemple 2, mais en utilisant de l'Amberlite XAD-4 au lieu de Diaion HP40. On obtient ainsi 1,22 g de chlorhydrate de 1-leupeptine. Exemple 4 Dans un ballon de 500 ml on introduit 100 ml d'un milieu (pH 6,5) contenant 3 % de glucose, 0,75 % de S-leucine, 0,75 % de chlor hydrate de 1-arginine, 0,75 % de glycine, 0,8 % de (NH4)2S04, 0,1 % de K2HPO4, 0,05 % de MgSO4.7H2O, 0,05 ffi de KCl, 0,2 % d'acide ribonucléique et 0,1 % d'anti-moussant à base de silicone, et on stérilise à 1200 C pendant 30 minutes.On inocule le miliei stérilisé à l'aide de 1 ml d'un bouillon de culture d'ensemencement préparé comme décrit à l'exemple 2, et on cultive à 270 C pendant 7 jours, sur un appareil secoueur fonctionnant à une amplitude de 7 cm et présentant 210 mouvements de va-et-vient par minute. les résultats de la cul ture, en fonction du temps, sont rapportés au Tableau 9. TABlEAU 9 Résultats de la culture en fonction du temps emps de culture (heures) 24 48 72 pli 4,8 7,0 B-leupeptine (meg/ml) - 3170 4050 On extrait la B-leupeptine du filtrat de culture (3880 mcg/ml; 800 ml) et on purifie comme à l'exemple 2, mais en utilisant du Diaion HP20 au lieu de Diaion HP40. On obtient ainsi 1,96 g de chlorhydrate de 1-leupeptine. Exemple 5 On introduit, dans des ballons de 500 ml, des portions aliquotes de 100 ml d'un milieu (pH 6,5) contenant 3 % de glycérol, 2 % de peptone, 0,5 % de 1-leucine, 0,5 % de chlorilydrate de B-arginine, 0,5 % de glycine, 0,5 % de NaCl, 0,2 % de KH2PO4, 0,1 % d'acide ri bonucléique et 0,05 % d'anti-moussant à base de silicone, et on stérilise à 1200 C pendant 20 minutes.On inocule chaque portion ali quote à l'aide de 1 ml d'un bouillon précultivé préparé comme décrit à l'exemple 2 et on cultive à 270 C pendant 3 jours sur un disposi- tif secoueur fonctionnant à une amplitude de 7 cm et présentant 210 mouvements de va-et-vient par minute. les résultats obtenus sont rapportés au Tableau 10. TABLEAU 10 Résultats de la culture en fonction du temps Temps de culture (heures) 24 48 72 pH 6,5 6,3 6,6 B-leupeptine (mcg/ml) 1060 2580 3870 On isole la I-leupeptine du filtrat de culture (3700 mcg/ml; 800 ml) comme décrit à 'exemple 2, mais en utilisant du Diaion HP30 au lieu de Diaion HP40. On obtient ainsi 1 ,93 g de chlorhydrate de 1-leupeptine. Exemple 6 Dans un bocal de fermentation de 30 litres on introduit 20 litres d'un milieu (pH 6,5) contenant 3 % de glycérol, 0,75 % de I- leucine, 0,75 % de chlorhydrate d'arginine, 0,75 % de glycine, 0,5 % de NH4N03, 0,1 % de K2HPO4, 0,05 % de MgSo4.7H20, 0,05 % de KCl, 0,2 % d'acide ribonucléique et 0,05 % d'anti-moussant à base de silicone, et on stérilise à 1200 C pendant 30 minutes. On inocule le milieu stérilisé avec 200 ml d'un bouillon de culture d'ensemense- ment préparé comme à exemple 2, et on cultive à 270 C pendant 48 heures, dans les conditions suivantes: vitesse de l'agitateur: 400 tours/minute; débit d'air : 20 litres/minute. les résultats obtenus sont rapportés au Tableau 11. TABLEAU 11 Résultats de la culture en fonction du-temps Temps de culture 24 36 42 48 (heures) pli 6,5 5,0 5,3 5,5 L-leupeptine (mcg/ml) 1550 3400 4250 4450 On isole la L-leupeptine du filtrat de culture (4350 mcg/ml; 800 ml chacun) comme décrit à l'exemple 2, mais en utilisant Amberlite XAD-1, XAD-5, XAD-7, XAD-8, Diaion HP10, HP5Q et Duolite B-30 au lieu de Diaion HP40. On obtient ainsi, respectivement, 2,05 g, 2,20 g, 1,80 g, 1,75 g, 2,18 g, 2,22 g et 2,01 g de chlorhydrate de B-leupeptine. REVENDICATIONS l - Procédé de préparation de L-leupeptines, caractérisé en ce qu'on inocule une souche de Streptomyces productrice de leupep tides dans un milieu contenant des sources d'éléments nutritifs, on. cultive la souche en milieu aérobie à un pH de 5,0 à 7,0 afin de produire et d'accumuler des L-leupeptlnes dans le milieu et on sé pare les L-leupeptines contenues dans le bouillon de culture, à un pH égal ou inférieur à 7,0. 2 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on sépare les L-leupeptines contenues dans le bouillon de cul ture en utilisant une résine adsorbante non-ionique poreuse, à un pli égal ou inférieur à 7. 3 - Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce qu'on effectue la séparation à un pli de 5 > 0 à 7,0. 4 - Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la résine adsorbante non-ionique poreuse est un copolymère styrène divinylbenzène, un polymère d'ester acrylique ou une résine pnénolique. 5 - Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en-ce que la résine adsorbante non-ionique poreuse est une résine Amberlite XAD-1, Amberlite SAD-2, Amberlite XAD-4, Amberlite XAD-5, Diaion HP?O, Diaion HP20, Diaion HP30, Diaion HP40 ou Diaion HP50. 6 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le milieu contient de 0,5 à 1,25 % pds/vol chaque de B-leucine, de X-arginine sous forme de chlorhydrate, et de glycine. 7 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le milieu contient de 0,5 à 1,25 % pds/volume de Leucine, de 1-arginine sous forme de chlorhydrate et de glycine, et de 0,05 à 0,3 % pds/volume d'au moins une substance choisie parmi l'extrait de levure, les hydrolysats de caséine et les acides ribonucléiques. 8 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la souche productrice de leupeptines est Streptomyces roseus MA839-Al (FERI4-P N 3019, ATCC 31 245). 9 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la souche productrice de leupeptines est Streptomyces roseus MB262-Ml, Streptomyces roseochromogenès 943-1t1l, Streptomyces roseochromogenes PB465-AEl, Streptomyces roseochromoge- pes MB260-A2, Streptomyces chartreusis MB58-MGl, Streptomyces aibi- reticuli MB26-Al, Streptomyces thicLuteus MB321-Al, Streptomyces lavendulae MB172-A2 ou Streptomyces noboritoensis MB46-AG. 10 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la B-leupeptine est l'acétyl-l-leucyl-l-leucyl- L-argininal. 11 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le milieu contient de 0,5 à 1,25 % pds/vol chaque de B-leucine, de B-arginine sous forme de chlorhydrate et de glycine, et ne contient pas plus de 0,3 % pds/vol d'au moins une substance choisie parmi les aminoacides et les substances les contenant autres que les trois aminoacides précités pour obtenir l'acé tyl-I-leucyl-l-leucyl-l-argininal. 12 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le milieu contient de 0,5 à 1,25 % pds/vol chaque de L-Leucine, de 1-arginine sous forme de chlorhydrate et de glycine, et de 0,05 à 0,3 % pds/vol d'au moins une substance choisie parmi extrait de levure, les hydrolysats de caséine et les acides ribonucléiques, et ne contient pas plus de 0,3 % pds/vol d'au moins une substance choisie parmi les aminoacides et les substances les contenant autres aue la 1-leucine, la B-arginine et la glycine pour obtenir i 'ac étyl-l-leucyl- I-legeyl-I-argininal.