Brevet FR2378092A1 — publié le 19780818

La présente invention concerne un polysaccharide doté de propriétés intéressantes d'écoulement et de formation de gel, ainsi qu'un procédé pour sa préparation. Les polysaccharides d'origine microbiologique prennent une importance croissante dans de multiples applications industrielles différentes qui nécessitent des substances possédant des propriétés particulières d'écoulement. Les exopolysaccharides microbiens peuvent posséder des propriétés qui leur sont propres et, en outre, ils peuvent être produits plus aisément que des polysaccharides issus de plantes ou d'algues de manière à correspondre à une norme uniforme. Les polysaccharides tels que la gomme de caroube et les alginates sont largement utilisés dans l'industrie en tant qu'émulsionnants, stabilisants et épaississants. Dans l'industrie alimentaire, ils sont utilisés comme stabilisants d'émulsions pour les crèmes glacées, comme agents gélifiants pour des entre mets lactés, comme épaississants pour des sauces et comme stabi lisants de la mousse pour la bière. Ils servent également dans la fabrication du papier et de textiles, ainsi que pour ltépais- sissement de boues de forage dans l'exploitation pétrolière. Les gommes de xanthane sont elles aussi utilisées de plus en -plus couramment dans toute une gamme d'applications. Or, il a été découvert un polysaccharide qui possède, dans des systèmes aqueux, des propriétés d'écoulement pseudoplastique.et de fluidisation au cisaillement qui sont remarquablement comparables à celles des xanthanes et des alginates, ce qui suggère des applications industrielles similaires. On peut préparer ce polysaccharide en cultivant une souche de Pseudomonas sP génératrice de polysaccharide, déposée à la National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, 135 Abbey Road, Aberdeen, sous le nom NCIB 11264, dans un milieu nutritif approprié. Cette souche génératrice de polysaccharide a été également déposée à l'American Type Culture Collection à Washington DC sous le nom ATCC 31260. Le pseudomonas sp NCIB 11264 (ATCC 31260) a été isolé à partir d'un effluent industriel riche en hydrates de carbone. Sa morphologie et sa physiologie peuvent etre résumées comme suit (toutes les températures étant exprimées en degrés centi grades). Morphologie.- Milieu nutritif à l'agar-agar Oxoid CM3, 250. Gran-négatif, bâtonnets à côtés parallèles petits à moyens, devenant de courts bâtonnets et parfois des coccobacilles. Doué de mouvement . Position du flagelle : unique, polaire (microphotographies électroniques). Colonies (de 6 jours) : 2 mm, blanchâtres, opaques (croissance confluente translucide), circulaires, entières, faiblement convexes, lisses, molles, faciles à disperser, sans variation. Physiologie.- 309C Catalase + Oxyde de Kovac t Croissance à 37 + (taux de croissance des colonies à 370C approximativement egal au taux à 250C) Croissance aux températures dépassant 400C très faible Croissance anaérobie, agaragar/glucose - (légère) Glucose d'Hugh & Leifson par oxydation Sucres de peptonisation à l'eau, indicateur d'Andråde Glucose, lactose, fructose, ) non acide saccharose, maltose, mannitol J glycérine, amidon Citrate de Koser + Hydrolyse de l'amidon A & B de King et al. Arginine (Mollers) - Hydrolyse de la gélatine Hydrolyse de la caséine NH3 de tryptone NO' à Nu 2 ou N2 Uréase de Christensen alcaline #1 1/2 jour DNAse Réaction au jaune d'oeuf sur plaque Test de Voges-Proskauer Rouge méthyle Indole Dégradation des polypectates - Le micro-organisme peut être cultivé, dans des conditions aérobies, dans n'importe quel milieu approprié où il se développera et produira le polysaccharide exocellulaire. Parmi les milieux typiques, on peut citer des bouillons complexes, par exemple un bouillon nutritif à 1.%, ou un milieu défini chimiquement tel que celui qui est décrit par Gray et ses collaborateurs (Biochimica et Biophysica Acta, 117, 22 32, 1966), avec une source supplémentaire de carbone, faite par exemple de glucose ou de saccharose.Un supplément de l'ordre de 2 % en poids par unité de volume dans le milieu est àconseiller. Un milieu défini, particulièrement préféré (milieu de Gray et al. complété de glucose), utilisable pour la culture de Pseudomonas sp. NCIB 11264, a la composition suivante Glucose 20 g/litre NH4C1 2,66 g/litre KH2PO4 5,44 g/litre NaOH jusqu'au pH 7 1,5 g/litre environ Solution d'oligo-éléments + > 6 ml/litre +) Solution contenant MgSO4.7H2O 10 g MnC12.4H2O 1 g FeSO4.7H2O 0,4 g CaCi2. 2H2O 0,1 g Eau distillée q.s.p. 1 litre. La culture peut être effectuée par charges successives ou de façon continue, selon la pratique traditionnelle. Les cultures continues sont menées de préférence dans des conditions de limitation de l'azote, par exemple 0,5 g environ de NH4Cl/litre. Avec un milieu complété de glucose, le taux de conversion du glucose est de l'ordre de 30 % dans les cultures par charges successives, mais il peut atteindre 75 % dans les cultures continues. Une température comprise entre 250C et 350C est satisfaisante, l'optimum étant une température de l'ordre;de 300C. De façon générale, on constate que la production de polysaccharide est favorisée en présence d'un excès de source carbonée dans des conditions de limitation de l'azote. De preférence, le pH du milieu ne doit pas s'abaisser au-dessous de 6 et il peut être opportunément compris entre 6,5 et 8,0. Le polysaccharide exocellulaire peut être isolé du liquide surnageant de la culture (dépourvu de cellules) par précipitation avec un solvant organique miscible à l'eau tel que l'isopropanol, puis il peut être désionisé, par exemple par un procédé classique d'élimination des sels par dialyse. Les matières cellulaires indésirables peuvent etre éliminées opportunément par digestion par la trypsine, par exemple par digestion d'une solution aqueuse du polyoside tamponnée à un pH de 7 à 8, en utilisant par exemple le tampon HEPES 0,2M, à 300C environ en présence d'un bactériostat tel que le chlorure mercurique. Par exemple 3,6 litres de solution, tamponnée à un pH de 7 à 8 avec HEPES 0,2M, sont traités par 20 mg de 11 enzyme et du chlorure mercurique (1,5 ml d'une solution alcoolique saturée) pendant 5 jours à 3O0C. A la suite de la dialyse, la substance isolée peut être séchée par congélation pour donner l'exopolysaccharide sec purifié. L'analyse a montré que le polysaccharide purifié était un polysaccharide comportant une unité répétitive qui contient les éléments suivants : 7 unités qluco-D, comprenant 1 unité de glucose substitué en position 6, 2 unités de glucosedisubstitué en position 4, 2 unités de glucose substitué en position 3 et 2 unités de glucose bi-substitué en positions 4,6 t 1 unité galacto-D constituée par du galactose substitué en position 3 ; 1 unité acétate ; et 1 unité pyruvate g ces éléments contenant 1 point de ramification sur le glucose substitué en positions 4,6 et une chaine latérale se terminant par une unité 4,6-O- (1- carboxyéthylidène)-glucose-n. Le polysaccharide purifié présente une rotation optique ~/22 = 150 (c 0,68Wc i qui indique que tous les sucres sont liés d'après la configuration n -D. Les propriétés de viscosité et d'écoulement du polysaccharide de la presente invention peuvent être définies par l'indice de consistance k et l'indice de comportement à llécoule- ment n, selon ce qui a été proposé par Krumel et Sarkar, "Flow Properties of Gums useful in the Food Industry", dans Food Technology, avril 1975, pp. 36-44, vol. 29(4i. La viscosité apparente ( l) en centipoises a été mesurée à l'aide d'un viscosimètre à cône et à plaque pour différents taux de cisaillement (D) en s 1. Une représentation graphique de logent en fonction de log D, pour une solution à 1 % en poids du polyoside selon la présente invention à 250C, a donné un tracé en ligne droite dont on a tiré une valeur k (NLextrapolé -1 à un taux de cisaillement de 1 s ) de 4600 cP et une valeur n (pente du tracé graphique plus 1) de 0,22. Un échantillon commercial de gomme de xanthane de qualité alimentaire, vendue sous le nom de marque Keltrol par Kelco de San Diego (Californie), a donné dans les mêmes conditions des valeurs de 5000 et de 0,23 pour k et pour n respectivement. Les exemples suivants illustrent l'invention. Exemple 1.- Fermentation par charges de 10 litres. La production d'exopolysaccharide par Pseudomonas sp NCIB 11264 a été effectuée en une fermentation par charges de 10 litres, sans réglage du pH, pendant 50 h à 300C, avec aération volume/volume et une vitesse de la roue à aubes de 350 tr/mn. Le temps de doublement du micro-organisme dans ces conditions a été de 140 mn. La croissance logarithmique s'est poursuivie pendant quelques 18 h et, à ce moment (E520 6,0), tous les éléments nutritifs étaient apparemment en excès, bien que l'on n'ait pas déterminé les tensions d'oxygène. On sait toutefois que la synthèse des exopolysaccharides atteint un maximum lorsque la tension d'oxygène n'est pas limitatrice. A ce stade, le polysaccharide a pu être détecté par précipitation par l'isopropanol, bien que la présence d'exopolymère ait été décelable dans des quantités croissantes dans des liquides surnageants de cultude à partir de 12-13 h à la suite de l'inoculation, à l'aide d'un examen viscosimétrique plus sensible.Ainsi, bien que la production d'hexopolysaccharide ait apparemment débuté pendant la phase exponentielle tardive de croissance, la formation a été maintenue au maximum pendant une autre période de 20 h au cours de la phase de croissance stationnaire, avant que le taux de production n'ait commencé en fin de compte à décrôitre. Ce profil de fermentation est typique d'un métabolite secondaire. Du glucose utilisé, 30 % seulement ont été convertis en esopolysaccharide; les 70 z restants étant métabolisés pour l'établissement et l'entretien de la culture. Exemple 2.- Production d'exopolysaccharide en régime constant. Des cultures de Pseudomonas sp. NCIB 11264, génératrices d'exopolysaccharide, ont été maintenues en régime constant pendant des durées atteignant 500 h. Le milieu défini, basé sur celui qui a été décrit par Gray et ses collaborateurs (1966) et complété de glucose (10 mg/ml), a été utilisé dans toutes les études précitées sur cultures continues. A la suite de ces recherches, on a réduit les concentrations initiales de certains des éléments et on a mené la production continue de polymère dans des conditions de limitation dazo- te. Les meilleures conditions ont été obtenues à un pH de 7,0 t 0,1, avec une température de croissance de 30 + l0C et un taux d'aération de 500 ml/mn. A la suite de l'inoculation, on a laissé la culture se développer à la manière d'une charge et s'établir pendant 24 h, avant de régler le débit à 44 mlXh. Le déroulement de la fermentation, mené à un taux de dilution de 0,08 h'l, a été suivi pendant 500 h. Une vitesse dela roue à aubes de 900 + 10 tr/mn a été maintenue pendant toute cette période.Les valeurs en régime constant, concernant la densité totale des cellules, le taux de polysàccharide et le taux de conversion du glucose, sont restées constantes - au bout de 100 h, ces valeurs étaient respectivement de 0,26 (E520 x l01), de 1,6 mg/ml et de 40 %, tandis qu'au bout de 500 h, elles étaient de 0,26 tE520 x 10 ), de 1,6 mg/ml et de 45 %. Rien n'a indiqué une altération de la culture ou le développement de souches mutantes. Les échantillons analysés de polysaccharide avaient une composition constante et les solutions du polymère (0,1 mg/ ml) avaient une viscosité relative similaire (1,7 + 0,05) à la mesure à 250C avec un viscosimètre du type à cylindre rotatif de Zimm-Crothers modifié (55 mA), ce qui indique qu'il nty a eu aucune variation du poids moléculaire de 'xopolymère produit pendant toute la période dela fermentation. R E V E N D I C A T I O N S 1.- Procédé pour la préparation d'un polysaccharide, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver Pseudomonas sp. NCIB 11264 (ATCC 31260) pour obtenir un polysaccharide exocellulaire. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la culture est effectuée de façon continue. 3.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la culture continue est menée dans des conditions de limitation de l'azote. 4.- Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que la culture est effectuée dans un milieu de Gray et al., complété par une source supplémentaire de carbone. 5.- Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le milieu est un milieu de Gray et al., complété de glucose ou de saccharose. 6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la culture est effectuée à une température se situant entre 250C et 350cri 7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le pH du milieu de culture est maintenu au-dessus de 6. 8.- Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le pH est maintenu entre 6,5 et 8. 9.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le polysaccharide exocellulaire est isolé par précipitation avec un solvant organique miscible à l'eau, puis est désionisé. 10.- Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le polysaccharide isolé est séché par congélation. 11.- Polysaccharide, préparé par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10. 12.- - Polysaccharides produit par Pseudomonas sp.NCIB 11264 (ATCC 31260), formé d'une unité répétitive qui contient 7 unités gluco-D comprenant 1 unité de glucose substitué en position 6, 2 unités de glucose substitué en position 4, 2 unités de glucose substitué en position 3 et 2 unités de glucose bi-substitué en position 4,6 ; 1 unité galacto-D constituée par du galactose substitué en position 3 ; 1 unité acétate ; et 1 unité pyruvate les unités contenant un point de ramification sur le glucose bisubstitué en position 4,6 et une chaîne latérale se terminant par une unité 4,6-O-(l-carboxyéthylidène)-glucose-D ; ce polysaccharide ayant une rotation optique [&alpha;]22 de -15 (c 0,68H2O).