Brevet FR2360073A1 — publié le 19780224

La présente invention a pour objet un procédé et un dispositif pour l'immunoprécipitation électrique. Pour déterminer directement les quantités de protéines élémentaires d'origine animale ou végétale dans un mélange de différentes protéines, il n'existe actuellement qu'une seule méthode utilisée sur une large échelle, que l'on appelle la méthode immunologique et qui est pratiquée suivant un grand nombre de variantes. Une méthode particulière est la méthode d'immunoprécipitation.La précipitation de complexes antigènes-anticorps présente dans la recherche biochimique, et encore plus dans la routine quotidienne clinique, une importance fondamentale comme principe de mesure de très nombreuses méthodes d'analyse techniquement différentes, comme le montrent de nombreuses méthodes d'immunodiffusion quantitatives parmi lesquelles les plus importantes sont actuellement d'une façon générale les procédés d'immunoélectrophorèse quantitative, décrits par différents auteurs et connus sous le nom de méthode de "Laurell". La spécificite caractérisée des réactions antigènes-anticorps a conduit à de très nombreuses variantes de la méthode de base. La méthode dite d'électroimmunoprécipitation à une dimension ou à deux dimensions, désignée en abregé par méthode EIP, destinée à l'identification et/ou à la détermination quantitative des protéines d'origine animale ou végétale comme antigènes est utilisée depuis plus de 10 ans presque exclusivement en recourant à l'agarose comme agent support. Or on a constaté qu'avec un mode de travail particulier, on peut remplacer la couche d'agarose par une feuille d'acétate de cellulose (CAF) connue en soi, qui est plus précisément une feuille de diacétate de cellulose et de triacétate de cellulose ; dans ce cas, grâce à une technique de coloration très efficace on rend visibles sur la feuille d'acétate de cellulose les couches très minces de précipité et, à l'aide d'un nouveau dispositif de cadre support et d'application d'antisérum, on peut obtenir des résultats extrêmement satisfaisants avec la méthode d'EIP bidimensionnelle quantitative. A titre d'exemple, on peut obtenir pour un système albumine humaine-albumine antihumaine un coefficient de variation inférieur à 7 %. On peut ainsi simplifier notablement la mise en oeuvre des différentes variantes de méthode d'EIP connues et également abaisser le prix de revient en diminuant le temps nécessaire jusqu'à ce jour pour ces opérations et en diminuant aussi les volumes d'antisérum nécessaires jusqu'à maintenant pour une analyse. Par rapport à la feuille de diacétate de cellulose, la feuille de diacétate/triacétate de cellulose a en outre pour avantage que cette feuille ellemême n'a plus à être conservée humide mais qu'on peut la stocker et l'expédier à sec , il suffit de l'humidifier avant l'utilisation avec une solution-tampon afin d'obtenir la conductibilité nécessaire. Le procédé et le dispositif sont utilisables en principe avec n'importe quelle méthode. Dans les explications suivantes et dans les exemples donnés, le nouveau procédé va être présenté en se réf é- rant aux variantes de la méthode d'EIP pratiquées le plus fréquemment, en remplaçant la couche d'agarose par la feuille d'acétate de cellulose, on verra qu'outre la technique de coloration, le dispositif d'application est un facteur essentiel pour les bons résultats à obtenir. Etant donné qu'on peut considérer comme connue la méthode de base, avec ses variantes, les méthodes connues n'ont pas besoin d' être expliquées en détail. Un article récent très détaillé de CB. Laurell concernant le domaine général de l'électroimmunoprécipitation a été publié dans le "Scand.J.Clin. Lab. Invest." 20, suppl. 124, 21-37, (1972) ; on trouvera également un article de W.Groc, A. Harms et W. Lahn sur la séparation par électrophorèse des protéines du sérum sur acétate de cellulose suivie par électrophorèse dans le gel d'agarose contenant des anticorps dans "Clinica Chimica Acta" 60 (1975), 371-378, et un autre article de J. Roll, publié dans le "Scand.J.Clin. Lab. Invest." 21, 187 à 189, décrit la déterminé tion quantitative des protéines par électrophorese dans une membrane d'acétate de cellulose imprégnée d'antisérum. Krôll utilisait une feuille de diacétate qui, comme il a été dit plus haut, doit être en permanence maintenue humide, même en magasin.Groc et autres, par contre, opèrent en deux étapes et utilisent dans la première opération une feuille de diacétate/triacétate de cellulose et, dans la deuxième opération, de l'agarose. Les travaux effectués sur l'acétate de cellulose ont montré que les résultats n'étaient pas encore satisfaisants ; c'est certainement la raison pour laquelle, depuis sa création pour la méthode de Laurell, et-à une exception près (M.A. Pizzolato, "Clin Chim, Acta" 45 (1973, page 207), dans laquel le on a utilisé des couches de celluloses contenant de la gélatine (Cellogel), , on a employé comme agent inerte de réaction antigènes anticorps l'agarose (agar-agar purifié) afin d'obtenir des résultats satisfaisants. L'inconvénient de l'agarose est que son utilisation demande beaucoup de temps et est très coûteuse. Lorsqu'on remplace dans la méthode d'électro-immunoprécipitation, et en particulier dans la méthode Laurell, l'agarose par les feuilles d'acétate de cellulose comme agent porteur, on se heurte à des difficultés sérieuses pour optimiser les différents paramètres physico-chimiques qui ont de l'importance si on veut obtenir une reproductibilité acceptable. On trouve dans la littérature technique correspondante de nombreuses discussions à ce sujet. Mais on a constaté qu'il est parfaitement possible, avec les moyens techniques connus et avec un dispositif d'application particulier, d'obtenir des résultats excellents qui permettent d'abréger notablement le temps de travail et de réduire considérablement le volume relatif d'antisérum tout en obtenant une qualité au moins égale. Les matériaux et les réactifs utilisés peuvent provenir dans une large mesure des procédés de travail connus, mais doivent être complétés par les moyens auxiliaires dont il sera question plus loin. La nouvelle méthode d'EIP sur feuilles d'acétate de cellulose peut, par exemple, être mise en oeuvre à l'aide d'un équipement d' électrophorèse Boskamp déjà existant. On a présenté ci-dessous le tableau des éléments et des réactifs utilisés dans les exemples décrits ci-après. Ils sont montrés et expliqués sur la figure 1 jointe. Tous les moyens techniques nouveaux nécessaires proposés par l'invention ont été adaptés à la disposition géométrique de la chambre d'électrophorèse Boskamp mais peuvent être également sans difficulté réalisés pour d'autres sys tèmes d' électrophorèse. (a) Chambre d'électrophorèse universelle IL Boskamp avec bloc réfri gérateur ; (b) Cryothermostat pour thermostatisation externe (c) Bloc d'alimentation secteur type Boskamp IL (d) Feuilles d'acétate de cellulose de 75x75 mm2, de la Société Sartorius Membranfilter, GmbH, de Gôttingen (e) Plaques de verre de 76x76x1 mm21 de la Société G.Menzel, de Brunswick (f) Solution-tampon pour électrophorèse (10) : Tris-(hydroxyméthyl) aminométhane (Tris), Glycine(Gly), azide de sodium (NaN3), = 0,003 mol/l (g) Solution de sel de cuisine isotone : 9,12 g/l de NaCl (200C) ; (h) Nigrosine, soluble dans l'eau - Standard-Fluka, de la Société Fluka AG,de Neu Ulm (i) Suspension de Nigrosine dans une solution aqueuse d'acide acé tique, a 15 % ; c = Qt1 % (j) Cadres supports pour feuille d'acétate de cellulose (figure la(9)) (k) Gabarit de marquage (figure 2) (1) Tiroir à coulisse d'application d'antisérum (figure 3) (m) Plaques de recouvrement de feuilles d'acétate de cellulose (figure 4) (n) Système d'application automatique (figure 1-(24)) (o) Divers instruments tels que pinces,cuvettes, rouleaux en caout chouc, spatules, pipettes, papier pour ponts électrolytiques, (par ex. S & S BF, 62,5x230 mu2) , papier de séchage pour feuilles d'acétate de cellulose (par ex. S & S BF, 125x250 mm2), bandes de papier buvard en papier filtre (par ex.S & S Nr 2043 b Mgl, de 12x150 mm),etc. (figure 1) (p) Appareil de mesure de surface électronique, type MOP-AM-O1 Société Kontron-Elektronik GmbH, München-Eching, (q) Tampon Goods : N-Tris-(hydroxyméthyl)méthyl-3-amino acide propa nosulfonique (TAPS), hydroxyde de sodium (NaOh) avec cTAPS 1,0 mol/l, pH = 8,7 (200C) (r) Antisérum humain (A.S.) provenant du lapin : Société Behringwerke AG, Marburg ; pourvenant du cheval : Société Organon, de Munich provenant du mouton : Société Frasenius, de Bad Hombourg (s) rapport de mélange entre tampon Goods et antisérum : 20 pour 1 (en volume) = A.S /tampon (q). Exemple de travail Pour préparer une chambre d'électrophorèse connue, par exemple une ch'ambre.d'électrophorèse Boskamp, les opérations préiiminaires à effectuer sont les suivantes A. Préparation de la chambre d'électrophorèse avec bloc de refroidissement (figure 1, (8) et (15)),pour recevoir les feuilles d'acétate de cellulose humectées avec la solution-tampon. On règle le cryothermostat à la température ambiante et on commence la thermostatisation i on place le cadre support (figure 1, (9) ) dans la chambre, on garnit le cadre aux emplacements prévus avec des plaques de verre carrées et on manoeuvre les vis disposées dans les angles du cadre jusqu'à ce que les plaques de verre reposent avec précision sur le bloc de refroidissement et sur le cadre et on termine en introduisant verticalement dans le tampon des chambres d'électrode les deux papiers ponts d'électrolyte comme pour une "chromatographie ascendante". (figures 2 et 3) B. Les feuilles d'acétate de cellulose sont marquées aux endroits nécessaires à l'aide d'un patron, (figure 2a) correspondant à la variante de la méthode Laurell que l'on veut employer, et d'un crayon à bille, et sont éventuellement munies d'informations brèves, puis sont imprégnées avec la solution-tampon prévue et, encore humides, sont placées sur les plaques de verre dans la chambre d' électrophorèse ; on sèche ensuite ces feuilles en surface à l'aide d'une feuille de papier-filtre, on chasse au moyen d'un rouleau en caoutchouc (figure 1, (13) les bulles d'air qui se sont éventuellement formées entre les feuilles et la plaque de verre, on garnit les feuilles aux emplacements marqués à l'aide des papiers ponts d' électrolyte imprégnés avec la solution-tampon, on les met en contact uniforme avec le papier électrolytique au moyen de tiges de fixation de papier pont électrolytique (figure 1, (14)), et on laisse reposer pendant au moins 1 minute, chambre fermée, pour obtenir un équili- bre de répartition de solution-tampon dans le pont électrolytique et la feuille d'acétate de cellulose. La chambre est ainsi prête pour une opération d'électrophorèse. C. S'il est prévu une électro-immunoprécipitation quantitative à deux dimensions, on applique maintenant, pour déterminer un antigène, une quantité égale ou inférieure à 1 1 de la solution à étudier et de la solution-type respectivement aux emplacements de départ Stl et St2 (figure 2). La solution-type contient l'antigène sous une concentration déterminée. Pour améliorer la reproductibilité de l'expérience, on ajoute aux solutions un deuxième antigène approprié, tel que par exemple dans le cas présent une albumine humaine modifiée par -propiolation, qui a la même concentration dans les deux solutions. On réalise alors les conditions d'électrophorèse (par exemple 0,9 milliampères, à intensité de courant constante, par cm de largeur de feuille d'acétate de cellulose dans la chambre et pour 13 minutes de durée d'opération,l'albunine humaine effectuant alors une migration d' environ 3 cm dans le tampon utilisé ici), et on fait démarrer 1' électrophorèse pour la première direction (figure 2b). D. Immédiatement après cette première phase d'électrophorèse, on prépare la deuxième phase. A l'aide de la spatule (figurel (19)), on éloigne les papiers ponts électrolytiques des feuilles suffisamment pour pouvoir effectuer les manipulations suivantes, en évitant soigneusement de plonger entièrement les papiers dans le tampon. Les plaques de verre avec leurs feuilles d'acétate de cellulose sont soulevées aux angles à l'aide de la spatule, sont retirées à la main du cadre, sont tournées de 900 et remises en place.Les papiers ponts électrolytiques sont à nouveau appliqués et les accumulations d'eau qui se trouvent maintenant sur les côtés et qui se sont formées anodiquement lors de la première phase par suite de l'électro-endosmose sont absorbees à l'aide d'étroites bandes de papier buvard. L'antisérum amené au pH de 8,7 à l'aide d'un tampon Goods concentré est réparti au moyen d'une pipette (de par exemple 15 pl) sur la surface étroite du tiroir d'application d'antisérum (figure 3) qui est directement voisine du bord.Puis, soit à la main, soit à l'aide d'un mécanisme quelconque, (figure 1, (24)), le tiroir est déposé dans la zone (A) de la figure 2b avec un léger coup sur le bord oû se trouve l'antisérum ; avec un angle d'inclinaison d'environ 550 par rapport à la feuille d'acétate de cellulose, on déplace maintenant plusieurs fois le tiroir en lui faisant effectuer un mouvement de va-et-vient parallèlement au premier sens de marche, ce qui permet de répartir au mieux l'antisérum le long du bord posé, puis on le déplace de la façon la plus régulière possible en direction de la zone de la première phase ; on fait alors effectuer au tiroir, en (Z), le même mouvement de va-et-vient qu'en (A), et on le ramène ensuite de façon uniforme en (A) ; on applique alors une bande de papier buvard latéralement sur la surface du tiroir imprégnée avec 1' antisérum, sans le soulever de la feuille d'acétate de cellulose, on le déplace avec la bande papier appliquée sur lui le plus loin possible contre le papier pont placé à l'anode, et ce n'est qu'alors qu' on le soulève de la feuille d'acétate de cellulose ; il faut alors absorber avec la bande de papier buvard étroite qu'on vient d'utiliser les derniers restes d'excédent d'antisérum. Si on veut répartir sur la feuille d'acétate de cellulose plus de 15 pl, r ce qui revient à concentrer la solution d'anticorps, il faut faire effectuer au tiroir n mouvements de va-et-vient n représentant le multiple de 15 1 utilisé ; entre chaque cycle, (entre chaque aller et retour), il faut effectuer une pause dont la durée est fonction de la pénétration de l'antisérum dans la feuille d' acétate de cellulose. On constate la pénétration de l'antisérum en voyant la couche d'antisérum perdre sont brillant et devenir-mate. Lorsque I'antisérum est réparti sur la feuille d'acétate de cellulose, la plaque de recouvrement (figure 4) est posée. Cette plaque doit toujours être posée sur la feuille par le côté qui pré- sente les nervures étroites ; ces nervures se trouvent alors dans le sens de marche et il se forme une petite cavité au dessus de la feuille d'acétate de cellulose. Lorsque toutes les feuilles d'acétate de cellulose qui se trouvent dans la chambre ont été enduites d'antisérum et ont été recouvertes, on peut commencer la deuxième phase d'électrophorèse (par exemple~0,9 milliampère, sous intensité constante, par cm de largeur de feuille dans la chambre et pour une durée de 45 minutes). E. Une fois la deuxième phase terminée, les feuilles d'acétate de cellulose sont placées dans une cuvette remplie de solution de sel de cuisine isotonique, et les immuno-précipités sont débarrassés des anticorps non précipités dans un laps de temps compris entre 5 et 30 minutes suivant le volume d'antisérum appliqué. On ne peut réaliser ce lavage nécessaire danstun laps de temps si réduit qu'en remuant de façon intensive la feuille d'acétate de cellulose dans la solution ; on utilisera avantageusement à cet effet un agitateur magnétique et une cuvette rectangulaire de forme allongée et profonde, dans une moitié de laquelle se déplace le noyau de l'agitateur. Les deux moitiés de la cuvette sont séparées par une simple grille en matière plastique. La grille de séparation possède des barreaux verticaux minces dont l'intervalle est juste assez grand pour qu'une feuille d'acétate de cellulose ne puisse pas y passer. Pour un régime de rotation déterminé du noyau de l'agitateur, les feuilles à laver montent et descendent dans la solution en oscillant sans se placer les unes sur les autres. Une fois parfaitement lavées, les-feuilles d'acétate de cellulose sont plongées dansun bain de teinture constitué par une suaxmsicn de Nigrosine à 1 % dans de l'acide acétique à 15 % ; la teinture est terminée au bout de 3 à 15 minutes suivant la capacité de fixation de matière colorante du précipité. On procède ensuite pendant au moins 5 minutes à une opération de décoloration qui prend fin par un lavage pendant environ 1 minute de la feuille d'acétate de cellulose avec de l'eau dessalée. Les feuilles d'acétate de cellulose humides peuvent être con tôlées directement en quantité à l'aide d'un appareil de mesure de surface approprié et d'un simple calculateur. A titre documentaire, on fait sécher les feuilles d'acétate de cellulose. F. Les solutions-tampons qui se trouvent dans les espaces d' électrodes sont mélangées, par exemple au moyen d'un ballon en verre et d'une pompe à eau, lorsque la deuxième phase est terminée, puis elles sont à. nouveau réparties uniformément sur les deux espaces d'électrodes. Comme il a déjà été noté plus haut, la façon dont s'effectue 1' application est essentielle pour que le résultat de l'opération soit satisfaisant ; à cet effet, on a imaginé en particulier un tiroir d'application d'antisérum (figure 3), qui est avantageusement introduit dans unsystème d'application mécanique (figure 1, (24)). En outre, on a également mais au point des cadres-supports de feuille d'acétate de cellulose (figure 1, (9)), un patron de marquage (figure 2), ainsi que des plaques de recouvrement de feuilles d' acétate de cellulose (figure 4). Le dispositif essentiel pour la mise en oeuvre du procédé est le tiroir d'application, notamment en liaison avec le système d'application mécanique. Le tiroir applicateur, dont on a représenté à la figure 3 un exemple particulier adapté à la chambre de Boskamp, est constitué par une plaque qui, pour permettre son utilisation dans le système d'application mécanique, est munie d'uddispositif de retenue approprié, constitué par des perforations en fente dans l'exemple de réalisation représenté. Un point remarquable essentiel de cette plaque est la forme du bord entrant en contact avec la feuille support, qui formeun biseau courbe se terminant en pointe, sous un angle déterminé qui dépend du matériau utilisé. Dans l'exemple représenté, où le tiroir est fait en polyacrylonitrile ("plexiglas"), cet angle est de 120.Du côté du patron où se termine la pointe, une rainure est ménagée dans la surface, à une faible distance de la pointe dans l'exemple représenté, cette rainure à une section transversale en forme de carré dont le côté a une longueur de 1,5 mm, pour une épaisseur totale de 4 mm pour le tiroir. La distance entre cette rainure et la pointe dépend de la quantité que l'on veut appliquer et, dans l'exemple de réalisation représenté, elle est de 1,0 mm pour une quantité à appliquer de 10 à 30 pl, et de 1,5 mm pour quantité à appliquer de 30 à 60 jeu1. La pointe présente un certain décrochement à une petite distance du bord (environ 1,5 mm dans l'exemple représenté), de sorte qu'il se forme un bord latéral plus large de quelques dixièmes de millimètres s'engageant par dessus et empêchant tout décalage latéral lors de l'application. La nervure étroite entre le bord avant, la pointe et la rainure, large d'environ 1,2 mm dans l'exemple représenté, est plane, et la solution à appliquer est déposée sur cette surface plane. Le patron est alors tiré à la main, ou mieux au moyen du système d'application mécanique représenté. en (24) à la figurel, sur la feuille acétate de cellulose, ce qui assure une application en couche mince, très régulière. Le système d'application mécanique est constitué par deux bras articulés l'un à l'autre, dont l'un peut se déplacer également de façon articulée par son extrémité sur une plaque de base sur laquelle il repose et dont l'autre porte à une extrémité le tiroir d' application d'antisérum au moyen d'un dispositif de fixation approprié. On peut faire passer facilement et uniformément sur la feuille le tiroir en le tirant à la main au moyen d'une poignée qui est disposée sur le bras de levier le plus proche du tiroir d'application. L'ensemble du système peut également être muni d'un dispositif d'entraînement, non représenté. Le cadre support pour feuille d'acétate de cellulose, représenté en 9 à la figure 1, reçoit la feuille en question et ses dimensions sont adaptées à celles de la chambre. I1 en est de même pour les plaques de recouvrement de feuille d'acétate de cellulose qui sont représentées à la figure 4 pour la chambre Boskamp utilisée dans le cas présent. Le patron de marquage, qui est montré sur la figure 2, doit également être adapté à la chambre utilisée, dont la grandeur ellemême dépend de la feuille d'acétate de cellulose utilisée, ainsi qu' au mode de travail choisi. Ici aussi, l'exemple représenté concerne la chambre Boskamp. La vitesse à laquelle on fait passer le tiroir sur la feuille est, dans l'exemple présent, d'environ 3 mm/seconde, et, si on utilise d'autres chambres et d'autres méthodes, il est facile de 1' adapter empiriquement de façon à obtenir les meilleurs résultats. L'exemple ci-après montre combien il est facile d'utiliser la méthode dite méthode de Laurell en remplaçant comme agent porteur l'agarose par la feuille d'acétate de cellulose. Exemple Etant donné que les techniques quantitatives unidimensionnelles et bi-dimensionnelles sont les plus intéressantes, ce sont ces méthodes qui ont été choisies pour montrer les avantages surprenants obtenus avecleprocedé selon l'invention. En recourant à la technique dite "technique des fusées" B. Weeke, "Artzl.Lab.." 18 (1972), 12, on effectùe une série de dilutions d'albumine humaine. Avec un volume d'échantillon de 1,0 1, un volume d'antisérum de 15 p1 (provenant de lapin) une tension constante de 400volts (45 minutes) et une intensité constante de 20 milliampères, (45 minutes) , on obtient des résultats excellents. On a représenté à la figure 5 la droite de régression d'une série de dilutions d'albumine humaine. Le volume d'échantillon étant de 1,0 1, le volume d'antisérum (de lapin), de 20 Sul, la concentration en albumine (c'est-à-dire en albumine humaine traitée au B -propiolactone) était de 0,30 gril. L'électrophorèse a été effectuée de la façon suivante direction : longueur d'électrode effective : 0,53 milliampère/cm ( voir tableau 2), 20 minutes. direction : longueur d'électrode effective : 0,71 milli * ampère/cm ; FAlb surface d'albumine, et FAlb , surface d'albumine Avec le procédé selon l'invention dans les mélanges d'antigène, tels que par exemple sérums, le nombre de pics de précipités fermés, de même que la surface des pics augmentent au fur et à mesure que 1' intensité du courant diminue et que la durée de l'électro-immuno- précipitation augmente. Naturellement, il est possible, en recourant à une technique de domaine intermédiaire, de procéder à l'identification d'un antigène déterminé dans un mélange d'antigènes, ainsi qu'à l'identification d'antisérums spécifiques inconnus. Pour montrer la possibilité d'utiliser le nouveau procédé d' EIP avec les feuilles d'acétate de cellulose, on a déterminé la concentration en albumine dans un sérum de contrôle. Les résultats sont présentés dans le tableau 1 joint. A titre de comparaison, on a présenté conjointement sur le tableau 2 la méthode de Laurell connue et la méthode d'EIP selon l'invention. Les résultats du tabeau 2 doivent être lus en se rapportant à la courbe de régression du tableau 6. Afin d'amener à un taux inférieur ou égal à 7 % la reproductibilité des résultats par rapport à l'exécution du procédé d'EIP quantitatif sur feuille d'acétate de cellulose, les deux conditions cides sous doivent être remplies a) La répartition dela solution-tampon dans une chambre d'élec trophorèse préparée pour recevoir l'échantillon prélevé doit être aussi uniforme que possible depuis un espace d'électrode à l'autre, en passant par les ponts électrolytiques et les feuilles d'acétate de cellulose. b) La température réglée au bloc de refroidissement de la cham bre d'électrophorèse au moyen d'un cryothermostat doit toujours être égale à la température ambiante car l'influence de la température peut mettre en question les résultats finaux si, pendant l'exécution d'une EIP, il se forme des gradients de température importants. Avec les feuilles d'acétate de cellulose, l'influence de la température est plus grande qu'avec l'agarose. Si on néglige ces deux conditions préalables, même la répartition la plus régulière possible d'antisérum telle que le permet 1' invention donnera un résultat insatisfaisant. Les résultats obtenus en utilisant la méthode d'EIP avec les feuilles d'acétate de cellulose montrent que, sur la feuille en question, on réalise totalement la proportionnalité linéaire des surfaces de précipité, directement avec la concentration d'antigènes et inversement avec la concentration d'anticorps. Un décalage d' ordonnées qui affecte la droite de régression a pour cause la faible distance entre la répartition d'antigènes après la première phase d'électrophorèse et la limite de couche d'anticorps au début de la phase. Dans cet intervalle dans l'exemple choisi, les molécules d' albumine émigrent avec une vitesse différente de celle de la formation des complexes albumine-antialbumine après dépassement de la limite d'antisérum. Mais cela ne fait aucun tort à la précision de la méthode. Pour 1'EIP quantitative, on peut utiliser des antisérums polyvalents ou monovalents, le choix dépendant seulement de la facilité avec lequel l'antigène intéressé précipite avec les uns ou avec les autres de ces antisérums, et également du fait qu'en utilisant des antisérums polyvalents, on peut ou non distinguer nettement l'antigène intéressé des autres antigènes voisins éventuellement présents. Les expériences effectuées montrent qulil n'y a pas de différence entre l'utilisation d'une tension constante (inférieure ou égale à 500 C) et celle d'une intensité constante (inférieure ou égale à 21 milliampères par chambre de Boskamp pleine). En cas de parcours de déplacement maximal pré-donné, par exemple parcours de 50 mm sur une feuille d'acétate de cellulose, on peut, en faisant varier la concentration d'antigène et éventuellement aussi la concentration d'anticorps r (par exemple par enrichissement de concentration par ultrafiltration ou par enduction multiple de la zone d'antisérum), obtenir que les antigenes précipitent à l'in térieur du parcours disponible, c'est-à-dire que le pic d'antigène doit avoir sensiblement la forme d'une courbe de répartition norma le, ou courbe de Gauss, car clest seulement avec une application circulaire de l'échantXllon prélevé que la concentration d'antigène maximale au centre de l'ApplXcation de l'échantillon précipite en tièrement En faisant varier l'intensité du champ électrique appliqué, on peut accélérer ou ralentir les "complexes antigènes-anticorps à exédent d'antigène" a vitesse de migration constante. Etant donné que, dans la réaction antigène-anticorps, le produit de solubilité des types de molécule "complexe antigène-anticorps à excédent d'antigène", "complexe antigène-anticorps", et autres groupements, détermine l'intensité de la précipitation limitée localement, la répartition de concentration des types de molécule intéressés est décisive dans des zones déterminées de la couche d' antiserum pour un développement satisfaisant des pics antigènes, cette répartition de concentration est rendue plus mauvaise par un champ électrique plus fort et meilleure par un champ électrique plus faible. Les meilleurs résultats seraient donc obtenus avec des champs électriques faibles. Mais il en résulterait un allongement indésirable des temps d'analyse. Ce fait est confirmé par les présents résultats de sorte que, lorsqu'il s'agit d'une analyse avec les valeurs d'électrophorèse maximales réalisables avec les installations d'électrophorèse existantes, il est bon de commencer avec une répartition d'antisérum constante de 0,40 pl par cm2 de feuille d'acétate de cellulose, et avec des répartitions d'antigène variables. Si alors on ne discerne pas de lignes dé précipité caractérisées, ou si ces lignes sont faiblement caractérisées, il faut réduire d'environ de moitié l'in tensité de champ électrique, en agissant sur la tension ou sur 1' intensité du courant. Suivant le résultat obtenu, on peut maintenant, soit augmenter la concentration d'anticorps, ce qui peut se faire dans certaines limites par une répartition plus élevée d'antisérum (au maximum environ 2,0 1 par cm2 de feuille d'acétate de cellulose), ou par concentration de l'antisérum, soit diminuer encore 1' intensité du champ tout en augmentant en même temps la durée de 1' analyse qui, suivant l'expérience acquise dans ce domaine, avec une intensité de courant d'environ 0,25 milliampêre par cm de longueur d'électrode effective Ç = limite inférieure du poste-secteur utilisé dans le cas présent), ne donne plus d'amélioration de la précipitation pour les protéines de sérum humain après plus de 4 heures. En résumé, on peut dire que le procédé selon l'invention et le dispositif selon l'invention présentent une valeur particulière en ce qui concerne la courte durée de cette analyse immuno-chimique. La méthode proposée est donc pareillement intéressante pour la recherche biochimique, par exemple pour suivre les différentes phases de préparation de la chimie clinique, pour enregistrer des tendances pathologiques et pour effectuer des contrôles de qualité, par exemple dans la fabrication des sérums et antisérums. (voir tableau 1 page 14) TABLEAU 1 Determination de l'albumine humaine dans un résum de contrôle (Firme Behringwerke, Marbug, Batch n 127C "Fluinorm-N" (Cprot 66 g/1 (63-69 g/l) CAob = 50 g/l (48-52 g/l) ; Zone 2s, méthode de fixation de colorant) Nombre de Concen- Concen- Concen- Coefficient de tration tration tration de va valeurs protei- protéine albumine riation mesurées ne-N (% rela (n) (g/l) (g/l) (g/l) tif) (I) Détermination protéine-N 3 1,059 - - env. 2,0 (28) (II)Protéine to tale calculée depuis I avec a)FProt.N= 6,25 - - 66,2 - b)Fprot.N = 6,35+ - - 67,2 - (III)Electropho rèse sur feuille d'acétate de cellulose (22-24). (Colorant : noir diamid.l0 B) a) non corrige, par rapport à IIa/IIb 5 - - 50,5/51,3 env. 5,0 b) après correction ++ par rapport à IIa/IIb - - - 41.9/42.6 (IV) Qu. d'EIP sur FAC 6 - - 43,1 3,0 + Calculé sur une teneur moyenne en protéine-N en prenant comme base pour les pourcentages en protéine N de sérum normal : p = 14,90 % pour la -pré-albumine, p = 16 % pour l'albumine, p = 11,90 % pour 1' &alpha;-globuline, p = 14,84 e pour la ss-globuline ; p = 16,03 % pour la #-globuline, ainsi que les valeurs relatives de ces fractions de protéine de l'électrophorèse sur feuille d'acétate de cellulose (29,30). ++ La fixation du colorant s'effectue sur les groupes NH2 des pro téines ; l'albumine possède nettement plus de lieux de fixation par molécule que la globuline : 1,42 mole % de NH2 pour 1 mole % c'est-à-dire qu'en teignant avec le noir diamid. 10B, on trouve des concentrations d'albumine trop élevées, qu'il faut adapter à la réalité en les multipliant par le facteur de correction K = 0,83 (pour corriger les pourcentages relatifs en albumine mesurés en premier avec l'électrophorèse sur FAC, il faut retirer de même une valeur relative de 17 %) (31-33). (Voir tableau 2 pages 16) TABLEAU 2 Comparaison des opérations essentielles et des conditions à remplire pour des opérations avec la méthode "Laurell" connue (26) et avec la méthode d'EIP selon l'invention, Méthode Laurell Méthode de EIP sur FAC 1. Matériau Aragose Feuille d'acétate de cellulose (FAC) 2. Support de matériau Plaque de verre Plaque de verre 3. Surface du matériau (variable; ici :) 50 x 50 mm2 75 x 75 mm2 4. Garniture du support lé direction : L'agarose chaud Mise en place de la FAC humectée par (55 ) est versé sur la plaque de la solution tampon;absorption du tamverre et refroidi à 20 C pon se trouvant à la surface de la 2é direction : La babde étroite d'feuille à l'aide de papier filtre ; d'agarose chargée par les compo- les bulles d'air prises entre feuille sants séparés est séparée du res - et plaque de verre sont choisies à te de la couche d'agarose;la bandel'aide d'un rouleau en caoutchouc contenant le composant est arrosée avec une solution chaude (55 ) d' agarose et d'antisérum et est refroidi à 20 C 5. Point de départ dans le Découpage d'un trou de départ Marquage au crayon à bille et à l'aimatériau de d'un patron avant humectation par le tampon (les inscriptions supplémentaires nécessaires devant être faites légèrement) 6. Antisérum Arrosage avec l'antisérum à 55 C Est réparti uniformément à l'intérieur (voir 4) des marquages à température ambiante, soit à l'aide d'un tiroir applicateur mécanique, soit à la main. 7. Volume d'échantillon 1,5 1 # 1 1 8. Volume d'antisérum (variable; ici :) 25 1 de 10 à 30 1 ou de 20 à 60 1 (voir figure 2) 9. Thermostatisation 15-18 C Régler sur la température ambiante (évacuation de la chaleur due à l'effet Joule pendant l'électrophorèse) Indications relatives aux figures. Figure 1 : Appareils et moyens pour l'i-mmuno-précipitation électri que sur feuilles d'acétate de cellulose et explications correspondantes Figure 2 : a) Patron (feuille de polyester) pour le marquage des feuilles d'acétate de cellulose. b) Feuille d'acétate de cellulose marquée avec indica tions pour l'immuno-precipitation électrique quantita tive bi-dimensionnelle. Figure 3 : Tiroir applicateur d'antiserum (en plexiglas) ; à gauche: sa forme générale ; à droite: son humectation par anti sérum. Figure 4 : Plaque de recouvrement pour une feuille d'acétate de cellulose (plexiglas). Figure 5 : Droite de régression d'une série de dilutions d'albumine humaine. Volume d'échantillon : 1,0 p1 ; volume d'anti sérum : 20 1 (de lapin). Concentration en albumine+ (c'est-à-dire albumine humaine traitée au -propiolacto- ne) : 0,30 g/l. Electrophorèse : le direction, 0,53 ma par cm de longueur effective d'électrode (voir tableau 2), 20 minutes. 2è direction : 0,71 ma par cm de longueur effective d'électrode. FAlb surface d'albumine et FAlb* , surface d'albuminee . Les indices des figures 1 et 2 désignent les éléments suivants Figure 1 1 - Feuilles d'acétate de cellulose 2 - Patron de marquage 3 - Feuilles d'acétate de cellulose disposées pour le marquage 4 - Crayon à bille de type courant 5 - Pince 6 - Cuvette en verre avec solution tampon 7 - Plaque de base pour 8 - Chambre d'électrophorèse 9 - Cadre support pour feuilles d'acétate de cellulose 10 - Plaques de verre 11 - Papier pour pont électrolytique 12 - Papier filtre pour absorber l'excédent de solution tampon sur les feuilles d'acétate de cellulose 13 - Rouleau en caoutchouc 14 - Tige de fixation pour papier de pont électrolytique 15 - Système de thermostat 16 - Bloc-secteur pour électrophorèse 17 - Pointes de pipette en "Teflon" (c 1 ul) 18 - Pipette (t 1 ul) 19 - Spatule mince 20 - Pointes de pipette en polypropylène (# 10 ul) 21 - Pipette (5.10 ul) 22 - Bandes de papier filtre 23 - Tiroir applicateur d'antisérum 24 - Système applicateur mécanique 25 - Plaque de recouvrement de feuilles d'acétate de cellulose 26 - Bac en verre avec solution de NaCl (19,12 g/l) 27 - Bac en matière plastique avec eau distillée 28 - Bac en verre avec solution colorante 29 - Bac en verre avec solution décolorante 30 - Ballon en verre + pompe à eau 31 - Agitateur magnétique Figure 2 a) Patron de marquage b) Feuille d'acétate de cellulose marquée pour immunoélectro phorèse instantanée avec indications pour l'application de la couche d'antisérum E.B. = Surface d'application du pont électrolytique St1/2 = Points de départ pour la première électrophorèse (lère direction) 1-7 = Points de départ en technique dite de fusée RT = Technique de fusée QuKIE = Immunoélectrophorèse instantanée bidimentionnelle quan titative IT = Technique de zone intermédiaire A.S.-G = Limite antisérum A.S. = Antisérum CA = Acétate de cellulose CAF = Feuille d'acétate de cellulose v = Vitesse du tiroir applicateur dans la répartition d'anti sérum AZA = ler cycle de répartition d'antisérum REVENDICATIONS 1. Procédé pour l'immuno-précipitation électrique par réactions antigène-anticorps connues en soi sur une coucha support inerte, caractérisé en ce qu'on utilise comme couche support inerte une feuille de diacétate et de triacétate de cellulose et en ce qu'on applique de façon connue en soi l'antisérum au moyen d'un tiroir applicateur coulissant. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le tiroir applicateur fait partie d'un système applicateur mécanique comportant une fixation pour ledit tiroir qui effectue un mouvement de va-et-vient vers l'avant et vers l'arrière. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la feuille d'acétatede cellulose est montée sur un cadre support qui lui est adapté. 4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la feuille d'acétate de cellulose est recouverte de plaques de recouvrement qui lui sont adaptées. 5. Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 4, ca ractérisé en ce que la feuille d'acétate de cellulose est marquée au préalable à l'aide d'un patron de marquage. 6. Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 5, ca ractérisé en ce que la feuille d'acétate de cellulose est humectée à l'aide d'une solution-tampon. 7. Procédé selon une quelconque des revendications 1 à'6, ca ractérisé en ce que la feuille est colorée à l'aide d'une suspension à 1% de Nigrosine dans de l'acide acétique à 15 %. 8.Dispositif adapté à la mise en oeuvre du procédé selon une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comporte un tiroir applicateur d'antisérum constitué par une plaque de largeur égale à celle de la feuille à munir de l'antisérum, dont le bord situé le plus près de la feuille est biseauté en courbe de l'arrière vers l'avant et se termine par une arête, une rainure étant prévue à faible distance de l'arête dans la surface jouxtant ladite arête. 9. Dispositif selon la revendication 8, caraatérisé en ce que la nervureentre l'arête et rainure transversale est creusée. dans le sens transversal. 10. Dispositif selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce qu'il est muni de dispositifs de fixation faisant partie du dispositif mécanique d'application. 11. Dispositif selon une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que le tiroir appl1;cteur et en poîyacrylonitrile (plexiglas). 12, Dispositif selon une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisé en ce que l'angle que forme l'arête avec la perpendiculaire imaginaire à la surface voisine de cette arête est d'environ 120. 13. Dispositif selon une quelconque des revendications 8 à 12, caractérisé entre que le bord de l'arête est légèrement en retrait à une faible distance des deux extrémités et en ce que ces extrémités forment des rebords légèrement en relief. 14. Dispositif selon une quelconque des revendications 8 à 13, caractérisé en ce que la plaque du tiroir applicateur peut être montée sur un bras de parallélogramme de guidage qui, lorsque la plaque effectue son mouvement de va-et-vient par dessus la feuille, maintient cette plaque sous un angle déterminé. 15. Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'angle d'inclinaison prédéterminé est compris entre 50 et 600 et est de préférence égal à 55 .