Brevet FR2379603A1 — publié le 19780901

La tryptophanase est un enzyme anciennement connu, présent notamment chez les Enterobactériacées, qui catalyse, dans les conditions physiologiques, la décomposition du tryptophane en indole, pyruvate et ammoniac. la réversibilité de cette réaction a permis, plus récemment, de l'utiliser dans le sens inverse pour la synthèse de tryptophane. Des cellules entières, préalablement induites pour l'activité tryptophanase, ont notamment etc utilisées pour cette synthèse. Des difficultés se présentent cependant, en particulier : le coût des cellules est important du fait de la consommation de tryptophane pour l'induction de la tryptophanase ; il en est de meme pour le cott de la purification du tryptophane synthétisé qui est relativement compliquée. Pour résoudre ces difficultés, on a mis au point un système de production continue de tryptophane utilisant des cellules immobilisées avec recyclage des réactifs en excès qui fait l'objet de la présente invention. te procédé de synthèse enzymatique de tryptophane ou de l'un de ses dérivées de substitution du noyau, selon l'invention, comprend les étapes suivantes aj On met en contact une solution (A) contenant (1) de l'indole ou l'un de ses ddrivés de substitution du noyau, (2) un sel d'acide pyiuvique et (3) un sel d'ammonium dans un solvant (S) au contact de cellules immobilisées contenant de la tryptophanase, l'indole ou son dérivé étant en quantité limitante par rapport aux autres réactifs, le solvant étant formé d'eau et d'un liquide organique miscible à 11 eau, et le temps de contact correspondant à la conver sion d'au moins 90 % de l'indole ou de son dérivé. b/ On soutire un effluent aqueux (B) appauvri en - ou débarrassé de - l'indole ou de son dérivé, et contenant une quantité appréciable de tryptophane ou de son dérivé. c/ On fait passer l'effluent aqueux (B) au contact d'un agent d'adsorption, de manière à absorber le tryptophane ou son dérivé et à recueillir une solution (C) appauvrie en - ou débarrassée de - tryptophane ou dérivé. d/ On met la solution (C) en contact avec de l'indole solide ou l'un de ses déri- vés solides, la température de ce contact étant choisie de manière à ne per mettre la dissolution de l'indole ou de son dérivé que dans une proportion limitante, et e/ on renvoie à l'étape (a) la solution obtenue à l'étape (d) pour reconstituer la solution (A). L'invention est illustrée par la figure jointe, donnée à titre d'exemple. te tryptophane est synthétisé dans un appareillage représenté dans la figure. Cet appareillage est conçu pour permettre le recyclage continu des réactifs en excès après séparation du tryptophane formé. Il est constitué d'un réacteur A qui peut dtre une colonne (réacteur à lit fixe) ou un réacteur agité.Ce réacteur est alimenti par une pompe C et la conduite 1 en un mélange réactionnel contenant l'indole (ou un de ses dérivés utilisables par la tryptophanase, tel que le 5-hydroxyindole) et un excès d'un sel de l'acide pyruvique tel que le pyruvate de sodium et d'un sel d'ammonium tel que l'acétate d'ammonium. te mélange réactionnel contient en outre une certaine proportion d'un solvant miscible à l'eau, par exemple de l'éthanol à 5-20 % en volume, de préférence 10 % en volume, pour permettre notamment la solubilisation d'une quantité suffisante d'indole. te réacteur A qui contient la préparation de cellules immobilisées est maintenu à une température comprise entre 20 et 500C, habituellement à 370C. te milieu liquide sortant du réacteur A par la conduite 2 et contenant du tryptophane mais pratiquement plus d'indole passe sur une colonne B1 qui contient un adsorbant, de préférence le charbon actif, capable de retenir le tryptophane. tes vannes 4 et 5 sont ouvertes et les vannes 6 et 7 fermées. Le mélange sortant de la colonne B1, débarrassé de tryptophane, passe ensuite par la conduite 3 dans un réservoir D maintenu à une température entre 0 et 400 C, de préférence au-dessous de 150C et généralement entre 0 et 50C.Ce réservoir contient de l'indole solide et le mélange se recharge en indole à une concentration qui est de préférence la concentration- saturante d'indole à cette température. te pH est à ce niveau réajusté à une valeur située entre 7 et 9,5, habituellement à environ 9,0 par addition d'ammoniaque. Une électrode de pH qui peut être reliée à un auto-titrateur peut, à cet effet, être immergée dans le réservoir D. te milieu saturé en indole est alors ramené au réacteur A au moyen de la pompe C commandée, si on le désire, par un dispositif qui contrôle le niveau liquide dans le réacteur A. Dans ce cas, une deuxième pompe située en sortie du réacteur A règle le débit dans le dispositif.Lorsque ce réacteur est constitué par une colonne, comme indiqué dans la figure jointe, l'ensemble du dispositif peut être réalisé sans ouverture vers l'extérieur et fonctionner rempli de liquide sans dispositif de contrôle de niveau et avec une seule pompe. Certaines autres caractéristiques de ce mode de fonctionnement sont explicitées ci-dessous e l'indole est introduit en quantité limitante et, de ce fait, peut être complètement consommé dans le réacteur A. Ceci permet une récupération plus aisée du tryptophane qui est alors le seul composé retenu sur le charbon actif. Une autre raison cependant, impose l'emploi d'une concentration d'indole limitée. On a en effet constaté qu'au-delà d'un certain seuil, généralement situé entre 15 et 20 mli d'indole à l'entrée du réacteur A, la vitesse de conversion en tryptophane, chute brusquement. Ceci s'explique probablement par l'inhibition exercée par l'indole sur la tryptophanase.Ce point illustre aussi l'intérêt d'utiliser des cellules entières plutôt que la tryptophanase extraite des cellules pour cette synthèse, car on a constaté que le seuil d'inhibition de cet enzyme par l'indole est en fait beaucoup plus bas (environ 0,1 mE). La concentration préférée en indole est donc située entre 5. et 20 millimoles par litre de milieu. le recyclage continu des réactifs en excès rendu possible. par l'adsorption du tryptophane sur la colonne B1 pose le problème de l'addition en continu d'un solide, l'indole. L'utilisation d'un solvant poserait un problème d'accumulation. Le moyen adopté résout ce problème. On dis-pose donc de deux paramètres pour choisir la concentration de l'indole ajouté : la concentration du solvant dans le milieu réactionnel et la température du réservoir D où se fait l'addition. Les conditions utilisées présentent en outre l'avantage, du fait de la température choisie, de ralentir considérablement une réaction parasite qui intervient entre l'indole et le pyruvate. Cette réaction explique que le taux de conversion de l'indole en tryptophane est toujours inférieur à 100 . Le produit de la réaction parasite n'est pas retenu sur le charbon actif. Pour minimiser le plus possible cette réaction, le contact entre le pyruvate et l'indole a été systématiquement réduit dans le dispositif utilisé puisqu'il n'existe que dans le réservoir D et le réacteur A.Le volume du réservoir D est de préférence choisi le plus petit possible. Quand on veut récupérer le tryptophane, on ferme les vannes 4 et 5 et ouvre les vannes 6 et 7 pour mettre en service la colonne B2 de charbon actif. On fait alors passer dans la colonne B1, par l'intermédiaire d'un circuit de régénération non représenté, un agent d'élution, par exemple un alcool ou une cétone. Avant l'élution, le milieu liquide contenu dans la colonne B1 est de préférence envoyé dans la colonne B2. 2 L'agent d'adsorption peut être quelconque, pourvu qu'il soit capable de retenir le tryptophane et de pouvoir être régénéré facilement. On peut par exem, ple utiliser le charbon actif, la silice, l'alumine, une terre activée, ou une résine du type polystyrène ou copolymère styrène-divinyl benzène etc.. l'immobilisation des cellules peut être réalisée de toute manière connue, par exemple au moyen d'un polyacrylamide. On peut notamment utiliser comme monomères d'amide acrylique les suivants : acrylamide, N,N'-méthylène-bisacrylamide, N,N'propylène-bis-acrylamide, diacrylamidediméthyléther. Comme cellules microbiennes on peut utiliser n'importe quel microorganisme pourvu qu'il soit capable de produire la tryptophanase. On peut citer par exemple Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis,-etc... On peut également utiliser un amorceur et/ou un accélérateur de polymérisa tion. Comme amorceurs de polymérisation, on peut utiliser le persulfate de potassium, le persulfate d'ammonium, la vitamine B2, le bleu de méthylène, etc... Comme accélérateurs de polymérisation on peut utiliser le ss -(diméthyl-amino)propionitrile, la N,N,N',N'-tétraméthyIènediamine, etc... La réaction de polymérisation peut être effectuée à la température ordinaire ou en chauffant. Elle peut durer de 10 minutes à 1 heure environ. L'invention peut entre appliquée non seulement à l'indole mais également à ses dérivés, par exemple le 5-hydroxyindole, le 5-aminoindole ou le 5-méthylindole. te pyruvate et le sel d'ammonium sont utilisés en excès par rapport à l'indole, c'est-à-dire en quantité telle qu'ils restent présents à raison d'au moins 0,1 g/litre dans le milieu lorsque l'indole a été pratiquement totalement consommé. Le pyruvate est de préférence utilisé sous forme de sels de sodium, de potassium ou d'ammonium, ou d'acide libre à condition de maintenir le pH à la valeur convenable par addition d'une base. te sel d'ammonium peut être quelconque, par exemple le pyruvate, le carbonate, le chlorure, le sulfate ou l'acétate.- On peut aussi introduire les ions ammonium au moyen d'ammoniac. On peut également ajouter des vitamines, par exemple du pyridoxal ou de la pyridoxine, des agents tampon, des agents tensioactifs, etc... EXEMPLES DE FONCTIONNEMENT EXEMPIE 1 - Culture des cellules. On utilise une souche connue d'Escherichia coli (E. coli K12) que l'on cultive à 370C sur un milieu contenant par litre, 10 g de peptone pancréatique, 5 g d'extrait de levure, 5 g de chlorure de sodium, 10 g de Tween 80 et 1 g de tetryptophane. te pH est ajusté à 7,4 et les cellules sont récoltées en fin de croissance exponentielle par centrifugation. Immobilisation des cellules. Ia technique d'immobilisation dans un gel de polyncrylamine a été utilisée mais toute autre technique convenable est utilisable. On met 1,8 g (poids frais) de cellules en suspension dans 4 ml de tampon phosphate de potassium 0,04M(pE 8,0). On y ajoute 500 mg d'acrylamide, 40 mg de N,N'-méthylène-bis-acrylamide, 0,5 ml d'une solution de diméthyl aminoproprionitrile à 5 % et 0,5 nl d'une solution de persulfate d'ammonium à 2,5 %. On ajoute au mélange des billes de verre (diamètre 2 mm) entre lesquelles se loge la préparation ce qui, après polymérisation, permet une fragmentation aisée du gel. Après 15 mn d'incubation à 370C les billes sont éliminées et la préparation est lavée avec le tampon phosphate 0,04 X (pE 8,0). tes particules de gel contiennent 0,3 g de bactéries (poids frais) par gramme de gel. SYnthèse du Gtrgptophane. Le milieu d'incubation contient du pyruvate de sodium à une concentration 0,5 M, de l'acétate d'ammonium 0,6 M et de l'indole 0,01 M dans une solution aqueuse contenant 10 % d'éthanol et on ajuste le pi à 9 par KOX 6N. le réacteur A, maintenu à 370C est constitué par une colonne contenant 10 g de gel de cellules immobilisées. te réservoir de recharge D est maintenu à 20C. te débit du milieu dans le système est 52 ml/h. Le tryptophane formé est adsorbé sur une colonne d'adsorption B (de volume 1200 ml contenant 120'g de charbon actif mélangé à 240 g de terre de diatomées) laissée à température ambiante.Quand cette colonne est saturée en tryptophane elle est remplacée par une autre colonne identique et la première est éluée par une solution aqueuse contenant 5 % d'ammoniaque et 20 % d'éthanol. te tryptophane est récupéré par évaporation sous pression réduite de ltéluat. Dans ces conditions on a obtenu un taux de conversion d'indole en tryptophane de 85 %. La production de tryptophane était déterminée par le dosage fluorimétrique à la fluorescamine décrit par Nakamura et Pisano (Archives of Biochemistry and 3iophysics 172, 38- 101 (1976)) sùr des échantillons prélevés en sortie de réacteur. On a ainsi déterminé une production de 12 g de L,tryptophane en 10 jours à partir de 12 g d'indole. Après élution de la colonne de charbon actif et évaporation sous pression réduite de l'éîuat on a récupéré ll g de cristaux à 85 ffi de pureté de L-tryptophane. EXEMPLE 2 - te réacteur A est un réacteur agité au moyen d'une hélice tournant à 1 tour/sec. I1 contient 3 g de gel dans 15 ml du milieu de synthèse déjà décrit. te débit de milieu est de 6 ml/h. te reste des conditions est comme dans l'exemple 1. On a, dans cet essai en 6 jours produit 1 g de Gtryptophane à par tir de 1 g d'indole. REVENI)ICATI0NS 1 - Procédé de synthèse enzymatique continue de tryptophane ou de l'un de ses dérivés de substitution du noyau, caractérisé en ce que a/ on met en contact une solution (A) contenant (1) de l'indole ou l'un de ses dérivés de substitution du noyau, (2) un sel d'acide pyruvique et (3) un sel d'ammonium dans un solvant (S) au contact de cellules immobili sées contenant de la tryptophanase, l'indole ou son dérivé étant en quanti té limitante par rapport aux autres réactifs, le solvant étant formé d'eau et d'un liquide organique miscible à l'eau, et le temps de contact corres pondant à la conversion d'au moins 90 % de l'indole ou de son dérivé, b/ on soutire un effluent aqueux (B) appauvri en - ou débarrassé de dole ou de son dérivé, et contenant une quantité appréciable de trypto phane ou de son dérivé, c/ on fait passer l'effluent aqueux (B) au contact d'un agent d'adsorption, de manière à absorber le tryptophane ou son dérivé et à recueillir une solution (C) appauvrie en - ou débarrassée de - tryptophane ou dérivé, d/ on met la solution (C) en contact avec de indole solide ou l'un de ses dérivés solides, la température et la concentration du liquide organique dans le solvant lors de ce contact étant choisies de manière à ne permettre la dissolution de l'indole ou de son dérivé que dans une proportion limi tantes et e/ on renvoie à l'étape (a) a solution obtenue à l'étape (d) pour reconsti tuer la solution (A). 2 - Procédé selon la revendication 1, dans lequel la température de l'étape (a) est 20 - 500C et celle de liétape (d) est inférieure à 150C. 3 - Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le contact de l'étape (d) est poursuivi jusqu'à saturation de la solution en indole ou son dérivé. 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel, au cours de l'étape (d) et/ou (e), on ajoute à la solution les réactifs complémentaires nécessaires. 5 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel l'agent d'adsorp tion est le charbon actif 6 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel, pour l'étape (a), les cellules immobilisées sont disposées en lit fixe dans une colonne et dans lequel la solution circule à travers ledit lit fixe. 7 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel, pour l'étape (a), les cellules immobilisées sont disperseés'par agitation dans la solution. 8 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel le liquide organi que miscible à l'eau de l'étape (a) est lléthanol et sa concentration dans l'eau est de 5 à 20 % en volume. 9 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel de l'ammoniac est ajouté à la solution pour maintenir son pH entre 7 et 9,5. 10 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel la concentration en indole ou en son dérivé de la solution utilisée à l'étape (a) est au maxi mum égale à 20 millimoles par litre. 11 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, dans lequel le sel d'acide pyruvique et le sel d'ammonium sont fournis simultanément par le pyruvate d'ammonium. 12 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, dans lequel on interrompt périodiquement le contact de l'étape (c), on lave l'adsorbant au moyen d'un solvant du tryptophane ou son dérivé et l'on sépare le tryptophane ou son dérivé de la solution résultante.