Brevet FR2366306A1 — publié le 19780428

La présente invention est relative ê un nouveau procédé de préparation de clostripaine pure, lyophilisée. La clostripaine est une enzyme d'origine microbienne présente dans le filtrat de culture de l'anaérobie Clostridium histolyticum, de l'ordre des Clostridiales, de la famille des Clostridiaceae (gram-positives), largement répandu dans la nature, surtout dans le sol. Le filtrat de culture de Clostridium histolyticum représente une importante source d'enzymes protéolytiques attendu qu'il contient essentiellement, comme l'ont démontré OACKLEY et WANACK [J. Path. Bact. 53, 335 (1950)] les trois composés suivants z - le composé oCS qui est une toxine léthale et nécrotisante t - le composé ss . ou collagénase, également connue sous le nom de clostridiopeptidase A. qui est présent en proportion moyenne dans le filtrat, accom pagné d'autres protéases - le composé &gamma;, ou protéase activée par la cystéine, qui est la clostripaine. Si la mieux étudiée de ces trois substances est la collagénase, qui dégrade le collagène natif dans ses parties héli cotidales, et dont l'action contribue au développement typique de la gangrène gazeuse dans les plaies infectées, la clostripeine est connue depuis longtemps puisqu'elle a été découverte en 1938 et individualisée en 1948 par KOCHOLATY et collab., & BR Il est de fait que parmi les nombreuses protéases qui accompagnent la collagénase dans le filtrat de culture, la clostripaine est celle qui a attiré le plus l'attention. Il s'agit d'une SH-protéase qui catalyse l'hydrolyse sélective des liaisons peptidiques au niveau du groupe carboxyk des résidus d'arginine. Ainsi, la spécificité de la clostripaine dépasse celle de la trypsine qui agit au niveau des résidus arginine et lysine. La clostripaine figure également dans la littérature sous le nom de "protéase activée par la cystéine", " -protéase". "amidase-estérase" et "clostridiopeptidase B". - Elle porte le n 3.4.4.20 dans la Classification Internationale des enzymes (groupe des peptidyl-peptide-hydrolases). Plusieurs procédés de préparation de la clostripaine à partir du milieu de culture de Clostridium histolyticum ont été proposés : G. LABOUESSE et P. GROS (Bull. Soc. Chim. Biol. 42, (1960) 543-558) sont parvenus à séparer la clostripaïne du filtrat de culture de Clostridium histolyticum par précipita tion de la protéine en présence de sulfate d'ammonium (entre 40 et 70 % de saturation), suivie de l'incubation avec la cystéine et de deux chromatographies successives sur la DEAE cellulose et l'hydroxyapatite. L'activité spécifique de la clostripaïne, obtenue en solution, était de 0,8 kat/mg sur l'ester éthylique de la benzoyl-L-arginine (BAEE) employé comme substrat. W.M. MITCHELL et W.F. HARRINGTON [J. Biol.Chem. 243 (1968) 4683-46923 ont préparé la clostripalne à partir de la collagénase brute du commerce (collagénase obtenue à partir de Clostridium histolyticum) par deux chromatographies succes- sives sur l'hydroxyapatite et sur le tamis moléculaire SEPHADEX G 75 (dénomination commerciale d'un gel de dextrane fabriqué par PHARMACIA ES CHEMICALS). L'activité spécifique de 1' en- zyme, obtenue sous la forme d'une solution. était de l'ordre de 1,0-1,1 ykat/mg. sur le BAEE utilisé comme substrat. D'autres procédés encore ont été proposés fief. en parti culier OGLE et A.A. TYTELL dans Arch.Biochem.Biophys.42, (1953) 327],W.GRASSMANN et collab.[dans Z.Physiol.Chem.332 (1903) 325], pour réaliser la purification de la clostripaïne soit par précipitation par le méthanol soit par électrophorèse. Mais aucun des procédés proposés conformément à l'Art antérieur ne permet d'obtenir la clostripaine pure à l'état lyophilisé,sans désactivation importante : en effet les procédés décrits dans l'Art antérieur conduisent à une solution enzymatique, 'qui présente, au maximum une activité spécifique qui n'est pas supérieure à 1,1 kat/mg et qui lorsqu'elle est lyophilisée, perd plus de 50 % de son activité spécifique. La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à un procédé simple de préparation de la forme lyophilisée de la clostripaïne pure, qui répond mieux aux nécessités de la pratique que les procédés visant au m8me but antérieurement connus, notamment en ce que non seulement il-n'en- tratne pas la désactivation de la clostripaïne obtenue à l'état lyophilisé, mais en ce qu'il permet d'obtenir une activité spécifique de la clostripaïne lyophilisée égale ou supérieure à 1 Zkat/mg, ce que ne permettent pas d'obtenir les procédés pro posés conformément à l'Art antérieur. Il est à noter que dans la présente description, l'activité enzymatique spécifique de la clostripaîne est exprimée en e at conformément à la recommandation de la Commission des Enzymes qui a défini la nouvelle unité d'activité enzymatique, ou Katal (symbole Kat) comme étant la quantité d'activité qui convertit une mole de substrat par seconde [cf."Enzyme Nomen clature1publié par ELSEVIER (Amsterdam) (1973), page 26], ainsi que ses sous-multiples, les microkatals La présente invention a pour objet un nouveau procédé de préparation de la clostripaine pure, à partir du milieu de culture de Clostridium histolyticum ou à partir de la collagénase brute obtenue à partir de Clostridium histolyticum, caractérisé en ce que la clostripaine pure est obtenue par purification de la matière de départ mise en solution dans un tampon compatible avec le maintien de l'activité enzymatique de la clostripaine, par chromatographie d'affinité à l'aide d'un inhibiteur spécifique de la clostripalne, lié par liaison covalente à un support inerte, insoluble et hydrophile, et en ce que la chromatographie d'affinité est suivie d'un lavage de la colonne de chromatographie par le meme tampon que celui utilisé pour la mise en solution de la matière de départ, puis de l'élution de la clostripaine retenue sur la colonne par le meme tampon que ci-dessus, associé soit à du dithiothreitol, soit à un gradient de sel, après quoi la clostripaine pure est congelée et lyophilisée. La chromatographie d'affinité se distingue des méthodes de purification par chromatographie classiques, par le fait que contrairement à ces méthodes qui séparent les protéines suivant leur charge ou leur poids moléculaire, la chromatographie d'affinité est basée sur la spécificité d'une protéine pour son ligand spécifique et permet ainsi de séparer les protéines, et notamment les enzymes, d'une manière plus simple et plus spécifique. La chromatographie d'affinité en tant que méthode de purification a été introduite par CUATRECASAS et collab. en 1968 croc. Nat. Acad. Sci. USA 61, 1968) 636], et a acquis une importance croissante et une place prééminente parmi les techniques de purification de protéines (cf. en particulier P. CUATRECASAS et C.B. ANfOMSEM dans Am. Rev. of Biochem. vol. 40, (1971) 259-277 et M. WILCHEK et M. GORECKI dans FEBS LETTERS vol. 31. (1973 > n 1 p.149-152). Suivant un mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, les inhibiteurs réversibles de la clostripaïne greffée sur le support insoluble hydrophile sont des substances comportant une fonction amine primaire. par exemple la poly-L-arginine. la L-arginine. l'acétate mercurique de p-hydroxy-amino-4-benzyle, la p-aminobenzamidino. La liaison par covalence entre le support insoluble hydrophile et l'inhibiteur réversible spécifique de la clostripaïne est réalisée par l'intermédiaire d'un résidu carbonyle, notamment par l'intermédiaire d'un résidu de l'acide #-amino- caproique ou de l'acide succinique, par exemples suivant la formule support insoluble hydrophile - résidu carbonyle - inhibiteur, en utilisant, par exemple, la technique décrite par P. CUATRECASAS [J. Biol. Chem. 245 (1970) 3059). qui met en oeuvre le bromule de cyanogène et l'éthyl-1 (diméthylamino-3- propyl) -3-carbodiimide. Le support inerte insoluble, hydrophile est constitué, dr préférence, par le "Sépharose 4B" (dénomination comerciale d*un gel d'agarose commercialisé par la Société PHARMACIA FINES CHEMICALS AB, Uppsala, Suède). ou encore par une cellulose substituée appropriée. Suivant encore un autre mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, lion opère dans des conditions de pH comprises entre 7 et 7,5 et de préférence & BR Suivant un mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, la matière première de départ est constituée par la collagénase brute lyophilisée de Clostri- dium histolyticum contenant environ 1% de clostripaine et/ou par la fraction du milieu de culture de Clostridium histolyticum insoluble entre 65 et 80% de saturation du sulfate d'ammonium en moyenne, mises en solution dans un tampon compatible avec le maintien de l'activité enzymatique de la clostripaïne. Selon un autre mode de-réalisation avantageux du procédé objet de la présente invantion,le tampon compatible avec le maintien de l'activité enzymatique de la clostripaine,utilisé pour la mise en solution de la matière de départ et pour l'élution de la clos tripane,ainsi que pour le lavage de la colonne de chromatogra phie,est un tampon tris (hydroxyméthyl) aminométhane. Suivant un mode de réalisation préféré du procédé objet de la pré sente invention,le tampon utilisé pour la mise en solution de la matière première de départ et pour ltélution de la clostripaine, contient du tris (hydroxyméthyl)aminométhane sous forme de chlor hydrate et du chlorure de calcium. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, le tampon de mise en solution de la matière première de départ con tient en outre du dithiothreitol et/ou de l'eau oxygénée. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, le tampon utilisé pour l'élution de la clostripaine contient du tris(hydroxyméthyl)aminométhane,du chlorure de calcium et du chlo rure de sodium. Conformémént à cette dernière disposition,le chlorure de sodium est ajouté au tampon tris (hydroxyméthyl)aminométhane,en solution suivant un gradient jusqu'à obtention d'une solution finale d'ébtion éaleà IM. Les concentrations molaires respectives des constituants du tampon ci-dessus sont de préférence de l'ordre de 0,05M pour le tris (hydroxyméthyl)aminométhane,0,05M pour le chlorure de calcium, 2,5.10-3M pour le dithiothreitol, 0,1 mM pour l'eau oxygénée. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux du procédé ob jet de la présente invention,le tamponcompatible avec le maintien de l'activité enzymatique de la clostripaine au cours de la purifi cation,utilisé pour la mise en solution de la matière de départ et pour l'élution de la clostripaine, ainsi que pour le lavage de la colonne de chromatographie,est un tampon phosphate,notamment un tam pon phosphate de sodium à pH 8 environ,dont la molarité est com prise entre 0,05 et 0,2 M. Conformément à l'invention,le tampon phosphate de mise en solution de la matière première peut également contenir du dithiothreitolet le tampon phosphate utilisé pour ltélution de la clostripaine est associé soit à du dithiothreitol,soit à un gradient de chlorure de sodium. Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention,la chromatographie d'affinité est précédée par une chromatographie de l'enzyme sur tamis moléculaire. Suivant une disposition avantageuse de ce mode de réalisation,la première chromatographie de purification sur tamis moléculaire qui précède la chromatographie d'affinité est effectuée dans du tampon à pH 7,4 constitué par 0,05M de tris (hydroxyméthyl)aminométhane de préférence sous la forme de son chlorhydrate et 0,05 à 0,1 mM d'eau oxygénée. Suivant une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation,la première chromatographie de purification sur tamis molécu laire qui précède la chromatographie d'affinité,est effectuée dans un tampon phosphate à pH 8,dont la molarité est comprise entre 0,05 M et 0,2 M. Cette chromatographie de purification qui précède la chromatographie d'affinité permet de séparer le mélange de départ en cinq fractions:la première fraction qui contient des peptidases,la deuxième fraction qui contient la collagénase,la troisième fraction dite fraction riche qui contient la clostripaine brute, la quatrième fraction qui contient une protéase neutre et enfin la cinquième fraction qui contient des composés de faible poids molécula ire. Suivant une disposition préférée de-ce mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, c'est la troisième fraction dite fraction riche résultant de la chromatographie de purification qui,après concentration par ultrafiltration, est soumise à la chromatographie d'affinité. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente inventionll'éluat de clostripaine purifiée récupéré à la suite de la chromatographie d'affinité est concentré par ultrafiltration en présence de chlorhydrate de L-arginine sur une membrane qui retient les molécules d'un poids moléculaire supérieur à 10 000, puis soumis à une dialyse rapide pour éliminer les composes de faible poids moléculaire et enfin lyophilisé. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention vise plus particulièrement les procédés de préparation de clostripaine pure conformes aux dispositions qui précèdent, ainsi que les moyens propres à leur mise en oeuvre et les produits résultant de ces procédés. L'invention pourra etre mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente in vention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 - PURIFICATION DE LA CLOSTRIPAINE PAR CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITE SUR LA SEPHAROSE- 9 OCAPROYL-L- ARGININE La colonne de chromatographie d'affinité est constituée par une colonne de Sépharose-#-aminocaproyl-L-arginine de 10 cm de hauteur et 1,2 cm de diamètre intérieur, équilibrée par un tampon à pH 7,4, contenant du chlorhydrate de tris (hydroxyméthyl) aminométhane (0,05 M), du chlorure de calcium (0,05 M) et du dithiothreitol (2,5.10-3M). L'on part de la collagénase brute du commerce (Institut Pasteur) extraite de la souche n 60-16 et 60-34 de la Collection de l'institut Pasteur dont le dosage d'activité de la clostripaine présente a été effectué par la méthode de W.M.MITCHELL et W.F. HARRINGTON [Methods in Enzymology 19 (t970) 635-6423 à l'aide de BAEE ; ce dosage spécifique fait apparaitre pour la collagénase mise en oeuvre, 0,078 kat/mg d'activité clostripaSque. L'on dissout 30 mg de cette collagénase dans 2 ml du tampon ci-dessus et on incube cette solution une heure à 40C avant l'application sur la colonne. Par cette activation, l'activité de l'enzyme en solution monte d'une valeur totale de 2,35 kat à 5,0 kat. On fait passer cette solution ainsi activée, sur la colonne de chromatographie à un débit de 25 ml/heure, en veillant à ce que la température de la solution ne dépasse pas 40C.Les fractions sont collectées toutes les 5 minutes les produits inactifs sont sortis avec le volume mort de la colonne, c'est-à-dire avec les premiers 10 à 24 ml. La colonne est lavée par 16 ml du même tampon. La clostripaine est ensuite décrochée par le tampon ci-dessus complété à 1 M en chlorure de sodium. La chromatographie d'affinité de la collagénase brute du commerce définie plus haut, effectuée dans les conditions qui viennent d'etre décrites, donne lieu à la séparation d'un seul pic contenant exclusivement l'activité clostripaique, tandis qu'aucune activité collagénasique n'a été détectée, comme le montre la figure 1 des dessins annexés, qui représente le diagramme d'élution de la collagénase brute du commerce traitée ainsi qu'il vient d'etre décrit ; dans ce diagramme, l'on a porté en abscisse le volume des fractions collectées, exprimé en ml, et en ordonnée, d'une part l'absorbance des fractions collectées, mesurée par spectrophotométrie à 280 nm, désignée par la référence 1, et d'autre part l'activité clos tripaique d'échantillons de lo yl pris dans chaque fraction, désignée par la référence- 2. On ajoute à la solution sortie de la colonne et contenant la clostripaine, de la L-arginine jusqu'à la concentration de 0,1-0,2 M et de l'eau oxygénée à la concentration de 0,1-1mM. On concentre cette solution à 40C dans une cellule d'ultrafiltration (AMICON Corporation Mass. USA) en utilisant une membrane PM 10 jusqu'à un volume final de 5 ml. On dilue par addition de 45 ml de la solution de chlorure de calcium (1 mM) contenant lJeau oxygénée (o,i-1mM) et on continue l'ultrafiltration. Cette opération est répétée deux fois pour abaisser la conductivité de la solution à 400 fis (ou moins). La solution est ensuite rapidement congelée et lyophilisée. En mettant en oeuvre le procédé ci-dessus, le produit lyophilisé, objet de la présente invention, obtenu, dosé par la méthode de MITCHELL et HARRINGTON mentionnée plus haut, à l'aide de BAEE, a fait apparaître une activité spécifique d'au moins 1 kat/mg, et généralement de l'ordre de 1-1,2 Xukat/mg. La Demanderesse a également pu mettre en évidence que la clostripatne obtenue conformément à la présente invention, a un poids moléculaire de 50 000 et que sa composition quantitative en acides aminés correspond aux données de la bibliographie [MITCHELL W.M., HARRINGTON W.F., J. Biol. Chem. 243, (1968) 4683-46923. Elle a également pu prouver de façon très nette le fait que la clostripaïne obtenue est totalement et irréversiblement inactivée par la N&alpha;-p-nitrobenzyloxycarbonyl- arginine chlor méthylcétone, sous les conditions décrites pour l'inactivation de la trypsine de boeuf par E. SHAW et G.GLOVER [Arch. Biochem. Biophys. t39 (1970) 298-3053. EXEMPLE 2 - PüRIFICATION DE LA CLOS rRIPAINE PAR CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITE SUR LE SEPHAROSE-#-AMINOCAPROYL-ACETATE MERCURIQUE DE p-AMINOBENZYLE La colonne de chromatographie est constituée par une colonne de Sépharose- -aminocaproyl-acétate mercurique d'amino-4-benzyle, de A partir de fractions contenant la clostripaine (entre 50 et 70 ml de tampon d'élution), l'enzyme pure est isolée à l'état sec par les méthodes décrites à l'Exemple 1. EXEMPLE 3 - PURIFICATION DE LA CLOSTRIPAINE PAR CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITE SUR LE SEPHAROSE-#-AMINOCAPROYL-ACETATE MERCURIQUE DE p-AMINOBENZYLE La colonne de chromatographie est constituée par une colonne de Sépharose- -aminocaproyl -acetate mercurique d'amino-4-benzyle, de 10 cm de hauteur et 1,2 cm de diamètre intérieur,équilibrée par un tampon de phosphate de sodium, à pH 8, dont la molarité peut varier entre 0,05 et 0,2 M.L'on part de la collagénase brute décrite à l'Exemple 1 ; on la dissout dans le phosphate de sodium précité (f0 mg/ml) et l'on fait passer la solution ainsi formée sur la colonne, à un débit de 12 ml/heure à +40C. Les produits sortis avec le volume mort entre 10 et 20 ml contiennent 10 % de l'activité totale de la clostripaine. La colonne est lavée par 20 ml du meme tampon phosphate de sodium que ci-dessus. La clostripaine purifiée (85-90 % de l'activité totale) est ensuite décrochée par le tampon ci-dessus auquel on a ajouté du dithiothreitol à une concentration de 2,5.tO M. Le diagramme d'élution obtenu est superposable à celui de la figure 2. L'enzyme pure est isolée à l'état sec à l'aide des méthodes décrites à l'Exemple t. EXEMPLE 4 - PURIFICATION DE LA CLOSTRIPAÏNE PAR CHROMATOGRAPHIE D' AFF INITE SUR LA SUCC INYL-AMINODODECYLCELLULOSE-4 AMINOBENZAMIDINE Le procédé est essentiellement le même que celui décrit à l'Exemple 1, avec une solution de collagénase brute et une activation de t heure à 40C avant l'application sur la colonne. La colonne de chtomatographie est constituée par la succinylaminododecylcellulose-4-amino-4-benzamidine (produit du commerce vendu par la Société MERCK, Darmstadt, Allemagne Fédérale). La figure 3 annexée représente le diagramme d'élution, qui fait également apparattre l'existence d'un seul pic 6 d'activité clostripaïque (la courbe 5 représentant, comme dans les Exemples précédents, l'absorbance des fractions collectées). EXEMPLE 5 - PURIFICATION DE LA CLOSTRIPAÏNE PAR DEUX CHROMA- TOGRAPHIES SUCCESSIVES RESPECTIVEMENT SUR TAMIS MOLECULAIRE ET PAR CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITE On part de la fraction du filtrat de culture de Clostridium histolyticum précipitée par le sulfate d'ammonium entre 65 et 80 % de saturation. 1 g du précipité est dissous dans le tampon contenant le chlorure du tris (hydroxyméthyl) aminométhane (0,05 M), du chlorure de calcium (0,05 M) et de l'eau oxygénée (0,1 mM) à pH 7,4 et rapidement dialysée contre le meme tampon.Après concentration par ultrafiltration, la solution est appliquée sur une colonne de chromatographie constituée par une colonne d' "Ultrogel AcA 44" de 190 cm de hauteur et 2 ,8 cm de diamètre intérieur (la Marque "Ultrogel" est une Marque commerciale déposée par LKB INSTRUMENTS, Suède), équilibrée par le tampon décrit ci-dessus. On fait passer la solution dialysée et concentrée à un débit de 6 à 8 ml/heure à 4 c, suivie par le tampon décrit ci-dessus. La chromatographie définie plus haut, effectuée dans les conditions qui viennent d'entre décrites, donne lieu, comme le montre le diagramme représenté à la figure 4, à la séparation de cinq pics, dont le troisième, désigné par la référence 8, contient la forme oxydée de la clostripalne, tandis que le pic 9 représente l'activité des peptidases, le pic 10 l'activité de la collagénase, le pic il l'activité de la protéase neutre et le pic 12 les composés de faible poids moléculaire. Les fractions contenant la clostripaine sont réunies, et concentrées dix fois par ultrafiltration et dialysées rapidement contre le tampon contenant du chlorhydrate de tris (hydroxyméthyl) aminométhane (0,05 M), du chlorure de calcium (0,05 M) et du dithiothreitol (2,5.10 3M) à 40C. On fait passer cette solution sur la colonne de chromatographie constituée par la Sépharose- -aminocaproyl-barginine, dans les conditions qui ont été décrites à l'Exemple 1. Il résulte de la description qui précède que, quels que soient les modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application adoptés, l'on obtient un nouveau procédé de préparation de clostripalne pure qui présente par rapport aux procédés antérieurement connus visant au m8me but, d'importants avantages, et notamment celui de permettre d'obtenir cette enzyme à l'état lyophilisé, avec une activité spécifique égale ou supérieure à i )zkat/mg, alors qu'avec les procédés de l'Art antérieur, la lyophilisation de la clostripalne provoquait une désactivation importante de cette dernière. Ainsi que cela'ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'etre décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière sans s'écarter-du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 - Procédé de préparation ds la clostripaïne pure, à - partir du milieu de culture de Clostridium histolyticum ou à partir de la collagénase brute obtenue à partir de Clostridium histolyticum, caractérisé en ce que la clostripaine pure est obtenue par purification de la matière de départ, mise en solution dans un tampon compatible avec le maintien de l'activité enzymatique de la clostripaine, par chromatographie d'affinité à l'aide d'un inhibiteur spécifique réversible de la clostripaine greffé sur un support insoluble et hydrophile qui comporte une fonction amine primaire et de préférence la poly-L-arginine, la L-arginine, l'acétate mercurique de p-hydroxy-amino-4-benzyle et la p-aminobenzamidine, cet inhibiteur étant lié audit support par covalence par l'intermédiaire d'un résidu carbonyle, et en ce que la chromatographie d'affinité est suivie d'un lavage de la colonne de chromatographie par le même tampon que celui utilisé pour la mise en solution de la matière de départ, puis de ltélution de la clostripaïne retenue sur la colonne, par le même tampon que ci-dessus, associé soit à du dithiothreitol, soit à un gradient de chlorure de sodium, la clostri patine pure étant ensuite lyophilisée. 2 - Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que l'on opère dans des conditions de pH comprises entre 7 et 7,5 et de préférence à pH 7,4. 30- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 et 2, caractérisé en ce que 1 'on opère à une température comprise entre 1 et 40C. 40- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la matière première de départ est constituée par la collagénase brute lyophilisée de Clostridium histolyticum contenant environ 1 % de clostripaine et/ou par la fraction du milieu de culture de Clostridium histolyticum insoluble entre 65 et 80% de saturation du sulfate d'ammonium en moyenne, mises en solution dans un tampon compatible avec le maintien de l'activité enzymatique de la clostripaine. 5 - Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le tampon compatible avec le maintien de l'activité enzymatique de la clostripaine utilisé pour la mise en solution de la matière première de départ etpour l'solution de la clostripaïne, contient du tris (hydroxy- méthyl) aminométhane sous forme de chlorhydrate ,et du chlorure de Ca. 60- Procédé selon la Revendication 5, caractérisé en ce que le tampon de mise en solution de la matière première de départ contient en outre du dithiothreitol et/ou de l'eau oxygénée. 70- Procédé selon la Revendication 5, caractérisé en ce que le tampon utilisé pour l'élution de la clostripanne contient du tris (hydroxyméthyl) aminométhane, du chlorure de calcium et du chlorure de sodium. 80- Procédé selon la Revendication 7, caractérisé en ce que le chlorure de sodium est ajouté au tampon tris (hydroxyméthyl) aminométhane en solution suivant un gradient jusqu'à obtention d'une solution finale d'élution de l'ordre de IN. 90- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 5 à 8, caractérisé en ce que les concentrations molaires respectives des constituants du tampon sont de préférence de l'ordre de 0,05 M pour le tris (hydroxyméthyl) aminométhane, 0,05 M pour le chlorure -de calcium, 2,5.10 M pour le dithiothreitol, 0,1 mM pour l'eau oxygénée. 10 - Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le tampon compatible avec le maintien de l'activité enzymatique de la clostripanne au cours de la purification, utilisé pour la mise en solution de la matière de départ et pour l'élution de la clostripaine, -ainsi que pour le lavage de la colonne de chromatographie, est un tampon phosphate. 11 - Procédé selon la Revendication 10, caractérisé en ce que la concentration molaire du tampon phosphate mis en oeuvre est comprise entre 0,05 et 0,2 M, pH de l'ordre de 8. 120- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 10 et 11, caractérisé en ce que le tampon phosphate mis en oeuvre est un tampon phosphate de sodium. 130- Procédé selon la Revendication 10, caractérisé en ce que le tampon phosphate mis en oeuvre pour 1' élution contient également du dithiothreitol. 140- Procédé selon la Revendication 10, caractérisé en ce que le tampon phosphate mis en oeuvre pour la mise en solution de la matière de départ contient en outre du dithiothreitol. 15 - Procédé selon la Revendication 10, caractérisé en ce que le tampon phosphate utilisé pour la mise en solution de la matière de départ contient en outre un gradient de chlorure de sodium. 160- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 15, caractérisé en ce que la chromatographie d'affinité est précédée par une chromatographie de l'enzyme sur tamis moléculaire. 170- Procéde selon la Revendication 16, caractérisé en ce que la première chromatographie de purification sur tamis moléculaire qui précède la chromatographie d'affinité, est effectuée dans du tampon à pH 7,4 constitué par 0,05 m de tris (hydroxyméthyl) aminométhane de préférence sous la forme de son chlorhydrate et Q,05 à 0,1 mN d'eau oxygénée, et en ce que seule la fraction riche en clostripaine brute recueillie à l'issue de la première chromatographie de purification est soumise à la chromatographie d'affinité. 180- Procédé selon la Revendication 16, caractérisé en ce que la première chromatographie de purification sur tamis moléculaire qui précède la chromatographie d'affinité,est effectuée dans un tampon phosphate à pH 8, dont la molarité est comprise entre 0,05 M et 0,2 M. 190- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 a 18,caractérisé en ce que l'éluat de clostripaine purifiée récupéré à la suite de la chromatographie d'affinité est concentré par ultrafiltration en présence de chlorhydrate de L-arginine sur une membrane qui retient les molécules d'un poids moléculaire supérieur à 10 000, puis soumis à une dialyse rapide pour éliminer les composés de faible poids moléculaire, et enfin lyophilisé. 200- ClostripaSne pure lyophilisée, caractérisée en ce quelle est obtenue en mettant en oeuvre le procédé selon 1'une quelconque des Revendications 1 à 19 et en ce qu'elle présente une activité spécifique au moins égale à 1 pkat/mg et une stabilité élevée. 210- Application de la clostripatne pure lyophilisée, selon la Revendication 20, en tant que réactif de laboratoire.