Brevet FR2387288A1 — publié le 19781110

La présente invention concerne un procédé pour la production de dérivés d'indanone, en particulier un procédé pour préparer la 3a-H-4-(2-carboxyéthyl)-5-hydroxy-7a-méthylhexahydro-1-indanone et sa -6-lactone (cette indanone et sa lactone sont désignées collectivement ci-après sous le nom d'HIL). Les dérivés dtindanone selon l'invention répondent aux formules suivantes 3a-H-4-(2-carboxyéthyl)-5-hydroxy-7a-méthylhexahydro-1-indanone et lactone de la 3a-H-4-(2-carboxyéthyl)-5-hydroxy-7a-méthylhexahydro-l indanone. On peut utiliser 1 HIL comme produit de départ important pour la production d'hormones stéroïdes telles que l'oestradiol. En ce qui concerne la production de HIL par fermentation, la demande de brevet Japonais non examinée publiée le 2 mai 1977, après la date de priorité du présent document, indique que Mycobacterium forfuitum produit le HIL à partir de stérols dans un milieu de culture La demanderesse a découvert 'selonl'invention que L'HIL est produit à partir de 3-hydroxy- ou 3-oxo-stérotdes disponibles dans le commerce à bas prix, lorsque l'on cultive un micro-organisme du genre Nocardia dans un milieu de culture aqueux contenant les stérotdes. Les produits de départ pour le procédé de l'invention pour la préparation d HIL sont les 3-hydroxy ou 3-oxo-stérotdes et on préfère en particulier le cholestérol et l'acide lithocholique. Les micro-organismes du genre Nocardia capables de produire 1' HIL a partir des 3-hydroxy ou 3-oxo-stérotdes-sont cultivés dans les milieux de culture aqueux contenant les 3-hydroxy ou 3-oxo-stérotdes pour produire li HIL. A titre d'exemple de micro-organisme utilisé selon l'in-- vention on peut citer Nocardia corallina NG-511 (FERN-P 4018) NRRL 11283. Les milieux de culture aqueux contiennent les 3-hydroxy ou 3-oxo-stérotdes, des sources de carbone assimilables, des sources d'azote assimilables et des ions inorganiques. Les 3-hydroxy ou 3-oxo-stéroides sont ajoutés au milieu de culture sous forme de poudre, ou après dissolution dans un solvant tel qu'éthanol, méthanol, acétone, diméthylformamide, diméthylsulfoxyde ou dioxxane, ou après homogénéisation dans l'eau par traitement par les ultrasons. Les concentrations des stérotdes dans le milieu de culture sont'depréfé- rence supérieures a 0,1 g/dl et inférieures à 5 g/dl et si nécessaire les stérotdes sont ajoutés dans le milieu de culture pour maintenir les concentrations préférées de stérotdes. Les sources de carbone assimilables préférées contiennent des hydrates de carbone tels que glucose, saccharose, dextrose ou amidon, des acides organiques tels qu'acide acétique ou acides gras supérieurs, et des alcools tels qu'méthanol ou glycérol. Comme sources d'azote assimilables, on utilise de préférence les sels d'ammonium, l'ammoniaque aqueuse, le gaz ammoniac et l'urée. On ajoute au milieu si nécessaire des ions inorganiques tels que des ions phosphates, des ions ferreux, des ions potassium, des ions magnésium, des ions manganèse ou des ions calcium. En outre, lorsque cela est préféré, on ajoute au milieu de culture de faibles quantités de substances nutritives organiques telles que vitamines ou aminoacides ou des matières premières contenant ces substances telles que peptone, bouillon, extrait de levure, liqueur de trempage de mats, ou hydrolysa t de protéines de soja. La culture des micro-organismes s'effectue dans les milieux de culture mentionnés ci-dessus en conditions aérobies,de préférence a pH 4-8. On maintient pendant la culture une température du milieu de 28 à 37"C. Lorsque l'on poursuit la culture comme mentionné ci-dessus pendant 1 à 7 jours, les 3-hydroxy ou3-oxo-stéro-des sont transformés en HIL qui s'accumule dans le bouillon de culture résultant. On récupère 1'- HIL accumulée dans le bouillon de culture par des techniques classiques par exemple on l'extrait du bouillon de culture par l'acétate d'éthyle et on l'adsorbe sur du gel de silice, on élue avec un solvant organique tel qu'éther de pétrole benzène chloroforme étheréthylique éthanol ou méthanol, et des mélanges aqueux et on recueille 1' HIL à partir de l'éluat. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 Au moyen d'une boucle de platine,on transfère l'inoculum de Nocardia corallina NG 511 d'une tranche de gélose dans 50 ml d'un milieu de culture à pH 7 contenant 0,3 g/dl d'extrait de viande de boeuf, 1,0 g/dl de peptone, 0,5 g/dl de NaCl et 0,2 g/dl de cholestérol dans un ballon de 500 ml. Après une durée de croissance de 24 heures, on transvase 15 ml du cohtenu du ballon dans 750 ml du milieu de culture mentionné ci-dessus dans un Èrlenmyer de 500 ml et on effectue une culture agitée pendant une seconde période de 72 heures à 30"C. On ajuste le bouillon de culture résultant à pH 2 par addition d'acide sulfurique a 20 %, ce qui transforme le produit en lactone, et on extrait la lactone par 1,5 litre d'acétate d'éthyle. On évapore l'acétate d'éthyle et on dissout le résidu dans une faible quantité de chloroforme. On place ensuite la solution chloroformique sur une colonne de gel de silice et on élue le produit par le chloroforme. On soumet une faible quantité des fractions d'élut contenant 1' HIL à la chromatographie sur couche mince de gel de silice. Le solvant de développement contient 10 parties de chloroforme et une partie d'éther éthylique. On recueille le gel de silice sur lequel 1' HIL est adsorbée et on extrait 1' HIL par le méthanol. Après évaporation du solvant, on cristallise 1' HIL dans l'acétate d'éthyle. On obtient 200 mg de cristaux. Par recristallisation dans le méthanol on obtient 120 mg de cristaux purifiés. Par RMN-13C, RNP, spectrométrie de masse, analyse élémentaire, analyse UV et analyse IR, le produit est identifié avec la lactone de la 3a&alpha;-H-4&alpha;-(2-carboxyéthyl)-5&alpha;-hydroxy-7ass-méthyl-hexahydro-1-indanone. EXEMPLE 2 On prépare un milieu de culture aqueux contenant 0,3 g/dl d'extrait de viande de boeuf, 1,0 g/dl de peptone, 0 > 5 g/dl de NaCl, et 0,2 g/dl de chacun des stéroïdes indiqués dans le tableau ci-après et on ajuste le pH à 7,0. On place chaque lot de 5 ml dans un tube à essais et on y introduit au moyen d'une boucle de platine l'inoculum de Nocardia corallina NG 511. On effectue la culture agitée à 3O0C pendant 72 heures. On ajoute ensuite 0,1 ml d'acide sulfurique à 20 7. dans les tubes à essais et on extrait le produit par 5 ml d'acétate d'éthyle, puis on le soumet à la chromatographie sur couche mince de gel de silice. On effectue des mesures colorimétriques à 540 yn sur les taches de la #-lactone de la 3a&alpha;-H-4&alpha;-(2-carboxyéthyl)-5&alpha;-hydroxy-7ass-méthyl- hexahydro-l-indanone sur la couche de gel de silice. Le tableau ci-après indique les quantités de # lactone de la 3a&alpha;-H-4&alpha;[2-carboxyéthyl]-5&alpha;-hydroxy- 7ass-méthyl-hexahydro-l-indanone produites à partir des stérotdes utilisés et les rendements (en poids) obtenus. I1 est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus a titre d'illustration et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. TABLEAU HIL produit Stérotde utilisé Quantité (mg/niL) Rendement (%) cholestérol 0,40 35 chlestanol 0,10 9 ss-sitostérol 0,17 16 Sterols du soja 0,02 2 4-cholestène-3-one 0,20 15 Acide lithocholique 0,46 39 Acide cholique 0+03 6 progestérone 0,42 30 R E V E N D I C A T I O N S 1 Procédé pour la production de dérivés d'indanone, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) on cultive un micro-organisme appartenant au genre Nocardia dans un milieu de culture aqueux contenant du cholestérol ou de l'acide lithocholique, ledit micro-organisme étant capable de produire la 3a-H-4-(2-carboxyéthyl)-5 hydroxy-7a-méthyl-hexahydro-1-indanone et/ou sa # lactone à partir du cho- lestérol ou de l'acide lithocholique, et b) on récupère la 3a-H-4-(2-carboxyéthyl ) -5-hydroxy-7a-méthyl-hexahydro-l- indanone et/ou sa 6 lactone accumulées dans le bouillon de culture résultant. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit micro-organisme appartient au genre Nocardia corallina. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit micro-organisme est Nocardia corallina NRRL 11283.