Brevet FR2383441A1 — publié le 19781006

La présente invention concerne un nouveau procédé pour le dosage de la peroxydase, procédé qui est particulière- ment iptrtant en rapport avec les tests enmo-immunologiques dans lesquels on utilise cet enzyme pour le marquage d'antigènes ou d'anticorps0 Pour le dosage enzymo-immunologique de constituants dans des liquides physiologiques, dans des tissus ou dans des extraits de cellules ou de tissus, on marque avec des enzymes des antigènes ou anticorps convenables. Jusqu'a présent, on a surtout utilisé, comme enzyme de marquage, la-peroxydase du raifort.Cet enzyme peut être aisément obtenu en une grande pureté, il présente une forte activité spécifique, il est résistant vis-à-vis de la plupart des réactifs chimiques de couplage, il présente une bonne stabilité au stockage et, en tant que molécule protéinique relativement petite CPM = 40 000), on peut aisément le séparer de la peroxydase fixée à l'antigène ou aux anticorps. Pour la détermination d'activité de la peroxydase, on a surtout utilisé, jusqu'à présent, l'o-dianisidine, lto-toluidi- ne, le gaïacol et le 2,6-dichloro-indophénol. Ces chromophores sont en général très peu solubles et ne peuvent donc etre utilisés dans le test qu'en de faibles concentrations. De plus, ils ne permettent pas de protéger efficacement la peroxydase de l'inactivation par H202o Dans différente travaux, on a pu établir que pendant la réaction catalytique, la peroxydase forme constamment avec H2O2 un complexe stable et enzymatiquement inactif, de sorte qu1il y a de moins en moins de peroxydase présente sous forme active.Il en résulte qu'après une durée de réaction de 10 à 20 minutes, à une température d'incubation de 370C, la peroxydase est rendue complètement inactive. Cette inactivation est particulièrement défavorable pour les tests enzymo-immunologiques, étant donné qu'il s'agit souvent de doser des constituants en des concentrations si faibles que, pour obtenir une sensibilité suffisante, on doit faire incuber pendant jusqu'à deux heures, avec la solution tampon et support correspondante, la peroxydase fixée à l'antigène ou à l'anticorps. Le nouveau procédé suivant l'invention est exempt des inconvénients précits. Il permet de déterminer quantitativement les plus faibles quantités de peroxydase et d'atteindre ainsi la sensibilité nécessaire pour les tests enzymo-immunologiques. La présente invention a plus précisément pour objet un procédé de dosage de la peroxydase dans un échantillon, procédé caractérisé par le fait qu'on mélange l'échantillon, dans un tampon permettant de régler le pH entre 3 et 10,5, avec un substrat pour la peroxydase ainsi qu'avec un mélange de 4-amino- antipyrine et d'un ou plusieurs composés de formule dans laquelle R représente de l'hydrogène ou un métal alcalin et F , R2, R3, R4 et R5 représentent de l'hydrogène, du brome, du chlore, un groupe alto, un groupe alkyle inférieur ou un groupe carboxyle, on soumet le mélange ainsi obtenu à une incubation à une température comprise entre 10 et 6000 et l'on dose la peroxydase présente dans l'échantillon en mesurant l'accroissement de l'intensité de couleur par unité de temps. Dans le cadre du procédé de dosage suivant l'invention, on peut examiner directement, pour en déterminer la teneur en peroxydase, l'échantillon d'analyse (par exemple, un liquide physiologique ou un extrait cellulaire). Toutefois, on applique de préférence le procédé suivant l'invention à la détermination d'activité de la peroxydase dans le cadre d'essais enzymo-immunologiques tels que décrits par exemple dans Clin. Chem. 22, 733-738 (1976) ou dans Clin. Chem. 22, 1243-1255 (1976). Dans ce cas, l'échantillon étudié dans la partie enzymatique du procédé immunologique contient la peroxydase sous une forme fixée a' un produit immunologiquement actif (antigène ou anticorps). On désigne par l'expression "produit immunologique- ment actif" tous ceux des constituants de liquides physiologiques, de tissus, d'extraits cellulaires et d'extraits tissulai- res pour lesquels un partenaire de réaction lamunologique est présent ou peut être formés Ce sont notamment des amines primaires, des amino-acides, des peptides, des protéines, des lipoprotéines, des glucoprotéides, des stérols, des stérodes, des lipoSdes, des acides nucléiques, des enzymes, des hormones, des vitamines, des polysaccharides et des alcaloSdesO Des produits immunologiquement actifs particulièrement préférés sont la gonadotrophine chorionique humaine, le facteur rhumatoSde, les toxoplasmes, candida, trypanosomes, l'antigène CEA et la myoglobine. Pour la mise en oeuvre de l'invention, on utilise un système tampon permettant de régler le pH entre 3 et 10,5 et, de préférence, entre 6 et 9. On préfère tout particulièrement que le pH soit compris entre 6,5 et 7,5. Des systèmes tampon appropriés sont par exemple le tampon au phosphate, le tampon au TRIS (tris-(hydroxrméthyl)- aminométhane) et le tampon au borate. la concentration en agent tampon n'est pas critique mais elle est de préférence comprise entre 50 et 200 mmoles/1. Comme substrat pour la peroxydase, on utilise H202 qu'on peut, soit mettre en oeuvre directement, soit former au cours de la réaction au moyen de systèmes enzymatiques appropriés. De tels systèmes d'enzymes sont par exemple le système glucoseoxydase/glucose ou le système uricase/acide urique. Dans la mise en oeuvre directe de H2O2, on choisit une concentration de 0,05 à 10 mmoles/1 et, de préférence, de 0,2 à 1 mmole/l. Le composé de formule générale I utilisé dans le procédé suivant l'invention forme, conjointement avec la 4-aminoantipyrine, sous l'effet de R202 et de la peroxydase, un colorant dont la vitesse de formation est directement proportionnelle à la quantité de peroxydase présente et qui peut être dosé par mesure de l'intensité de couleur résultante, dans des conditions d'essai définies. Des représentants appropriés de composés de formule générale I sont le phénol, I'o-chlorophénol, le m-chlorophénol, le p-chlorophénol, le 2X4-dichlorophénol, le 2,5-dichlorophénol, le 3,4-dichlorophénol, le 2,4-dibromophénol, l'o-nitrophénol, le m-nitrophénol, le p-nitrophénol, l1o-crésol, le m-crésol, le p-crésol, le 2,4-diméthylphénol, le 2,4-dinitrophénol et l'acide 4-hydroxybenzoSque. On préfère particulièrement le phénol. La concentration du composé de formule I est avantageusement comprise entre 1 et 200 nmiolesjl et, de préférence, entre 10 et 50 mmoles/1. La concentration en 4-amino-antipyrine est de préféren- ce comprise entre 0,1 et 10 mmoles/1 et, plus particulièrement, entre I et 3 mmolesfl. On ajoute les réactifs précités dans un ordre de succession tel que pour compléter le système, on ajoute en dernier lieu soit la peroxydase sous forme de l'échantillon, soit le substrat pour la peroxydase. La température de réaction est critique. On peut la choisir comprise entre 10 et 60 C, de préférence entre 25 et 400C, et l'on doit la maintenir constante pendant toute la durée de la réaction. Pour une température de réaction donnée, la durée d'incubation dépend de la teneur de l'échantillon en peroxy- dase. Pour des tests enzymo-immunologiques, elle est comprise entre 1 minute et 4 heures et, de préférence, entre 30 et 120 minutes; On détermine la teneur en peroxydase de l'échaptillon par mesure de l'intensité de couleur résultant de la réaction enzymatique dans des conditions d'essai bien définies (concentration des réactifs, pH, température, durée d'incubation). On mesure une différence d'extinction qui correspond a' l'augmentation de l'intensité de couleur et qui est donc directement proportionnelle à la quantité de peroxyde présente. La mesure de l'intensité de couleur s'effectue avantageusement au moyen d'un photomètre, a' une longueur d'onde comprise entre 450 et 580 nm > . Le procédé suivant l'invention convient aussi bien à des dosages manuels qu'à des dosages automatiques de la peroxy dase Les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre du procédé suivant l'invention sont de préférence emballés dans une trous- se qui contient, avantageusement dans plusieurs récipients:: a) un ou plusieurs composés de formule dans laquelle R représente de l'hydrogène ou un métal alcalin et R1 R2, R3, R4 et R5 représentent de l'hydrogène, du brome, du chlore, un groupe nitro, un groupe alkyle inférieur ou un groupe carboxyle, b) de la 4-amino-antipyrine, c) éventuellement un tampon pour le réglage du pH à une valeur comprise entre 3 et 10,5 et d) éventuellement, un substrat pour la peroxydase. La trousse de réactif peut également contenir un récipient garni d'une solution témoin ou d'une solution d'étalonnage et/ou un récipient garni d'un réactif pour le stoppage de la réaction et/ou de réactifs pour l'exécution d'un dosage immunologique. Il n'est toutefois pas nécessaire de conserver tous les réactifs dans des récipients séparés. L'invention comprend aussi une trousse de réactifs dans laquelle quelques-uns des constituants nécessaires à la mise en oeuvre du procédé suivant l'invention sont conservés conjointement dans un meme récipient, Par exemple, la substance tampon peut être conservée conjointement avec la 4-amino-antipyrine dans un seul récipient. Les différents réactifs peuvent être conditionnés aussi bien à l'état liquide qu'à l'état solide. Les exemples suivants illustrent la mise en oeuvre de l'invention. - EXEMPLE 1 Dans un tampon à 0,1 mole/l de phosphate disodique, Na2HPO4, on dissout une quantité, pesée exactement, de peroxydase de raifort d'un haut degré de pureté et l'on en prépare d'autres solutions à différents degrés de dilution. Pour la détermination d'activité de ces solutions de peroxydase, on mélange 0,05 ml de chaque échantillon à 2,0 ml de solution d'essai (0,01 mole/l de tampon au phosphate de pH 7,25 avec 25 mmoles/1 de phénol, 2 mmoles/l de 4-amino-antipyrine et 0,8 mmole/1 de H2O2) et l'on détermine a' 370C la différence d'extinction par période de 30 minutes a' la longueur d'onde de 492 nm. Teneur en peroxydase #E492 nm/30 nm/37 C de l'échantillon 0,2 g/ml 0,940 0,1 g/ml 0,465 0,05 g/ml 0,240 0,025 g/ml 0,115 0,0125 g/ml 0,058 0,00625 g/ml 0,030 0 g/ml 0,002 Au moyen des valeurs de mesure précitées, on établit une courbe étalon. On répète les opérations ci-dessus avec des échantillons de nature inconnue et, pour la détermination de leur teneur en peroxydase, on compare avec la courbe étalon les valeurs de mesure ainsi obtenues. - EXEMPLE 2 Pour la détermination de la teneur en antigène carcinoembryonnaire (ACE), on soumet des échantillons avec de l'antisé- rum ACE de lapin à une incubation de 24 heures à la température ambiante dans un tampon au borate de pH 8,4. On ajoute ensuite à ce mélange une quantité déterminée d'ACE marqué par de la peroxydase de raifort et l'on poursuit l'incubation à la température ambiante, dans l'obscurité, pendant 16 heures A cette-solution, on ajoute alors de l'immunoglobuline de chèvre anti-lapip fixée à une matière solide. Au bout de 30 minutes, on sépare la phase solide de la phase liquide et, dans la solution surnageante, on détermine l'activité de la peroxydase de la manière suivante : A 1,0 ml de la solution surnageante, on mélange 1,0 ml de solution d'essai (0,2 mmole de tampon au phosphate, de pH 7,25, avec 50 mmoles/l de phénol, 4 mmoles/1 de 4-amino-antipyrine et 1,6 mmoles/l de H2O2). On détermine ensuite, au moyen d'un photomètre et à 492 nm, à 3700, la différence d'extinction par unité de temps; On calcule la teneur en ACE de l'échantillon au moyen d'une courbe étalon d'ACE ayant été tracée après l'exécution du procédé décrit avec des solutions standard d'une teneur appropriée en ACE. REVENDICATIONS 1) Procédé pour le dosage de la peroxydase dans un échantillon, caractérisé par le fait qu'on mélange l'échantillon, dans un tampon permettant de régler le pH entre 3 et 10,5, avec un substrat pour la peroxydase ainsi qu'avec un mélange de 4 amino-antipyrine et d'un ou plusieurs composés de formule dans laquelle R représente de l'hydrogène ou un métal alcalin et R, R2, R3, R4 et R5 représentent de l'hydrogène, du brome, du chlore, un groupe nitro, un groupe allyle inférieur ou un groupe carboxyle, on soumet le mélange ainsi obtenu à une incubation à une température comprise entre 100 et 600C et l'on dose la pero xydase présente dans l'échantillon en mesurant l'augmentation de l'intensité de couleur par unité de temps. 2) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on règle le pH entre 6,5 et 7,5. 3) Procédé suivant la revendication 1 ou la revandication 2, caractérisé par le fait que la concentration en tampon est comprise entre 50 et 200 mmoles/1. 4) Procédé suivant l'une des revendications 1 caractérisé par le fait que le tampon est un tampon au phosphate. 5) Procédé suivant l'une des revendications I a 3, caractérisé par le fait que le substrat pour la peroxydase est H202; 6) Procédé suivant la revendication 5, caractérisé par le fait que la concentration en H202 est comprise entre 0,05 et 10 mmoles/1. 7) Procédé suivant la revendication 6, caractérisé par le fait que la concentration en H202 est comprise entre 0,2 et 1 mmole/l. 8) Procédé suivant l1une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que la concentration en composés de formule I est comprise entre 1 et 200 mmoles/1. 9) Procédé suivant la revendication 8, caractérisé par le fait que la concentration en composés de formule I est comprise entre 10 et 50 mmoles/1. 10) Procédé suivant l'une des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait qu'on utilise, comme composé de formule I, le phénol. 11) Procédé suivant l'une des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait que la concentration en 4-amino-antipyrine est comprise entre 0,1 et 10 mmoles/1. 12) Procédé suivant la revendication 11, caractérisé par le fait que la concentration en 4-amino-antipyrine est comprise entre 1 et 3 mmoles/1. 13) Procédé suivant l'une des revendications 1 à 12, caractérisé par le fait que la température d1incubation est comprise entre 25 et 400C. 14) Procédé suivant ltune des revendications 1 à 13, caractérisé par le fait que la peroxydase à doser est fixée à un produit immunologiquement actif. 15) Procédé suivant la revendication 14, caractérisé par le fait que ledit produit immunologiquement actif est l'antigène carcino-embryonnaire. 16) Trousse de réactifs pour le dosage de la peroxydase dans un échantillon, caractérisée par le fait qu'elle contient, dans plusieurs récipients : a) un ou plusieurs composés de formule dans laquelle R représente de l'hydrogène ou un métal alcalin et R1, R2, R3, R4 et R5 représentent de l'hydrogène, du brome, du chlore, un groupe nitro, un groupe alkyle inférieur ou un groupe carboxyle, b) de la 4-amino-antipyrine, c) éventuellement, un tampon pour le réglage du pH à une valeur comprise entre 3 et 10,5 et d) éventuellement, un substrat pour la peroxydase. 17) rousse de réactifs suivant la revendication 16, caractérisée par le fait que le tampon efit un tampon au phosphate. 18) Trousse de réactifs suivant l'arevendication 16 ou la revendication 17, caractérisée par le fait que le substrat pour la peroxydase est H202. 19) Trousse de réactifs suivant l'une des revendications 16 à 18, caractérisée par le fait qu'on y utilise, comme composé de formule I, le phénol. 20) Application d'un mélange d'un ou plusieurs composés de formule dans laquelle R représente de l'hydrogène ou un métal alcalin et RI. R2, R3, R4 et R5 représentent de l'hydrogène, du brome, du chlore, un groupe nitro, un groupe alkyle inférieur ou un groupe carboxyle, et de 4-amino-antipyrine au dosage de la peroxydase dans un échantillon. 21) Application d'un mélange suivant la revendication 20, au dosage enzymo-immunologique d'un produit immunologique- ment actif dans un échantillon. 22) Application d'un mélange suivant la revendication 21, caractérisée par le fait que le produit immunologiquement actif est l'antigène carcino-embryonnaire0