Brevet FR2376125A1 — publié le 19780728

La présente invention concerne un procédé pour préparer de la L-lysine par fermentation. A ce jour, on prépare par fermentation la L-lysine qui est utile comme additif alimentaire. La demanderesse a découvert que des mutants appartenant aux genres Brevibacterium ou Corynebacterium résistant a la S-(amino-2 éthyl) L-cystéine (désignée ci-après par l'abréviation AEC) et capables de se développer 3000, mais incapables de se développer à 340C lorsqu'on les cultive dans un milieu minimal, peuvent produire de la L-lysine avec un rendement supérieur 9 celui obtenu avec les mutants connus producteurs de lysine.Le milieu minimal est un milieu qui renferme les ingrédients qualitatifs minimaux convenant a la culture des mutants a 300C, c'est-a-dire des sources de carbone, des sources d'azote, du fer minéral et les substances nutritives nécessaires à la culture des mutants a 300C. Les espèces de mutants utilisées dans le procédé de l'invention sont Brevibacterium lactofermentum AJ 11093 (FERM-P 3851), et Corynebacterium acetoglutamicum AJ 11099 (FERH-P 3861). Les références FERM-P correspondent aux numéros d'enregistrement de l'institut de Recherches sur les Fermentations, Ministère des Sciences et Techniques Industrielles, Inage, Chiba-shi, Chiba, Japon, qui met les mutants de l'invention a la disposition de toute personne les demandant. Lorsque, par mutation, les mutants de l'invention présentent des caractéristiques connues pour améliorer la productivité de la L-lysine, telles que le besoin d'alanine ou de nicotinamide, leur productivité est améliorée de façon générale. Les souches dont dérivent ces mutants sont constituées de souches de bactéries connues productrices d'acide L-glutamique des genres Brevibacterium et Corynebacterium, telles que par exemple Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 et Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354. Les modes d'obtention des mutants de l'invention et leurs caractéristiques de culture à 300C ou 340C dans un milieu minimal sont indiqués ci-après. Experience 1 On expose a l'action de 2501ug/ml de N-méthyl N'-nitro N-nitrosoguanidine a 30 C pendant 30 min, des cellules de Brevibacterium lactofermentum AJ 11082 (FERM-P 3840) résistant h 1'AEC (AEC7), résistant a l'a-chloro-caprolactame (CCL7) et nécessitant de l'alanine (Ala ) et on les cultive dans le milieu minimal indiqué ci-après à 30 C ou å 340C. On sépare les mutants capables de se développer a 30 C, mais incapables de se développer a 340C. Parmi les mutants séparés, on obtient la meilleure souche productrice de L-lysine AJ 11093. Milieu minimal Glucose 2,0 g/dl Urée 0,25 g/dl (NH4)2SO4 1,0 g/dl KH2PO4 0,1 g/dl MnSO4,4H2O 1,0 mg/dl MgSO4,7H20 40 mg/dl FeSO4, 7H20 1,0 mg/dl L-alanine 50 mg/dl Nicotinamide 0,5 mg/dl Biotine 5,0 g/dl Thiamine,HCl 10/ug/dl NaCl 5,0 mg/dl pH 7,2 De façon analogue, on obtient Corynebacterium acetoglutamicum AJ 11099 9 partir de la souche AJ 11094 (FEEM-P 3856) (AEC7, Ala-). La souche AJ 11099 se développe 300 C, mais ne peut pas se développer a 340C dans le milieu minimal précité. ftpérience 2 On lave les cellules des souches AJ 11092 et ÂJ 11093 avec le milieu aqueux indiqué ci-après et on les met en suspension dans ce meme milieu aqueux (la densité optique de la dilution au 1/26 de la suspension est de 0,330 562 nm). On introduit des portions de 3 ml du milieu aqueux indiqué ci-après dans des tubes a. essai de 10 ml et on ajoute d chacun des tubes 0,1 ml de la suspension cellulaire. On maintient ensuite le milieu aqueux des tubes A essai å 300C ou à 340C pendant 24 h en agitant. Milieu aqueux Glucose 2,0 g/dl (NH4)2S04 1,0 g/dl KH2P04 0,1 g/dl MgSO4,7H2O 40 mg/dl NaCl 50 mg/dl Urée 0,25 g/dl Biotine 5,0 g/dl Thiamine,HCl 201ug/ dl FeSO4,7H2O 1,0 mg/dl MnS04,4if20 1,0 mg/dl L-alanine 50 mg/dl Nicotinamide 0,5 mg/dl L-leucine voir le tableau I On détermine la croissance des micro-organismes étudiée par mesure de la densité optique a 562 nm de la dilution au 1/26 du liquide de culture obtenu. Les résultats figurent dans le tableau I ci-dessous. La souche AJ 11093 ne se developpe pas a 340C, mais se développe cette température lorsqu'on ajoute 2,5 mg de L-leucine/ml au milieu minimal. TABLEAU I Température L-leucine Croissance ( C) ajoutée (densité optique) (mg/dl) ÂJ 11082 AJ 11093 - 0,390 0,390 30 0,4 0,390 0,350 2,5 0,395 0,350 - 0,320 0,025 34 0,4 0,330 0,025 2,5 0,315 0,315 On peut cultiver les mutants de l'invention dans des milieux classiques renfermant des sources de carbone, des sources d'azote, des ions minéraux et des substances nutritives nécessaires à la culture de ces mutants. Comme sources de carbone, on utilise de préférence des hydrates de carbone (tels que le glucose, le saccharose, les meulasses ou les hydrolysats d'amidon), des acides organiques (tels que l'acide acétique ou l'acide propionique) et des alcools (tels que l'méthanol ou le propanol). Des sources d'azote appropriées sont des sels d'ammonium (tels que le sulfate d'ammonium), l'ammoniac gazeux, l'ammoniaque et l'urée. Lorsqu'il est nécessaire, on ajoute au milieu de culture comme ions minéraux des ions phosphate > potassium, magnésium et autres. Au départ, on cultive les mutants de l'invention à une température inférieure à 330C et de préférence supérieure 9 29 CC, car les mutants ne peuvent se développer a une température supérieure à 340C. Lorsque la culture des mutants a atteint la valeur désirée, on préfère élever la température a plus de 34"C. On effectue la culture en conditions aérobies, en ajustant de préférence le pH du milieu entre 5 et 9. Après 2 à 7 jours de culture, on obtient la L-lysine avec des rendements très élevés. On peut récupérer la L-lysine accumulée dans les liquides de culture obtenus selon des procédés classiques en utilisant par exemple des résines échangeuses d'ions. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 On prépare un milieu de culture aqueux renfermant, par décilitre, 10 g de glucose, 4,5 g de sulfate d'ammonium, 1,0 mg de sulfate de manganèse tétrahydraté, 0,1 g de phosphate monopotassique, 40 mg de sulfate de magnésium heptahydraté, 1,0 mg de sulfate ferreux heptahydraté, 5,0/ug de biotine, 201ut de chlorhydrate de thiamine, 1,5 ml d'hydrolysat de protéines de soja (teneur totale en azote : 77.) et 5 g de carbonate de calcium, dont on a ajusté le pH 9 7,0 et on introduit des portions de 20 ml du milieu de culture aqueux dans des flacons a agitation de 500 ml. On stérilise par chauffage le milieu de culture aqueux, puis on le refroidit et on l'ensemence avec Brevibacterium lactofermentum AJ 11093 ou Corynebacterium acetoglutamicum AJ 11094 que l'on a préalablement cultivés sur un bouillon nutritif gélosé glucose On cultive a 310C pendant 72 h en agitant. On cultive comme précédemment indiqué, a titre comparatif, les souches parentes des mutants précités qui sont Brevibacterium lactofermentum AJ 11082 et Corynebacterium acetoglutamicum AJ 11094. Les concentrations en lysine des liquides de culture obtenus, ex primées en chlorhydrate de lysine, figurent dans le tableau II ci-dessous. TABLEAU II Micro-organisme utilisé L-lysine accumulée (g/dl) AJ 11082 3,8 AJ 11093 4,5 ÂJ 11094 3,0 ÂJ 11099 3,9 On cultive AJ 11093 comme précédemment indiqué et on obtient 1 litre de liquide de culture. On centrifuge le liquide de culture pour éliminer les cellules et le carbonate de calcium et on fait passer le surnageant sur de l"'Amberlite" IR-120 C. On élue la L-lysine absorbée sur la résine avec une solution aqueuse a 3% d'ammoniaque et on évapore l'élut pour cristalliser la L-lysine, puis on ajoute de l'acide chlorhydrique et on refroidit. Les cristaux de chlorhydrate dihydraté de L-lysine pèsent 34,7 g. EXEMPLE 2 On cultive comme précédemment indiqué dans l'exemple 1, Brevibacterium lactofermentum AJ 11093 et AJ 11082, si ce n'est qu'on porte la température d 340C après le délai indiqué dans le tableau III ci-dessous pour obtenir les concentrations en L-lysine indiquées dans ce meme tableau. TABLEAU III Elévation de la température L-lysine accumulée (g/dl) après AJ 11093 AJ 11082 0 h 0,2 3,6 24 h 4,7 3,7 48 h 5,2 3,7 72 h 4,5 3,8 EXEMPLE 3 On cultive Brevibacterium lactofermentum AJ 11093 ou AJ 11082 dans 50 ml du milieu d'ensemencement suivant introduit dans des flacons d'agitation de 500 ml, à 310C pendant 18 h et en agitant. Milieu d'ensemencement Glucose 1,5 g/dl Acétate d'ammonium 0,3 g/dl Urée 0,1 g/dl KH2P 4 0,1 g/dl MgSO4,7if20 40 mg/dl FeSO4,7H2O 1,0 mg/dl NnS0434if20 1,0 mg/dl Biotine 5,O1ug/dl Thiamine,HCl 201ug/dl Hydrolysat de protéines 2 ml/dl de soja (à 7% d'azote total) pH 7,5 On prépare un milieu de culture aqueux renfermant, par décilitre, 2,0 g de glucose, 0,5 g d'acétate d'ammonium, 0,2 g d'urée, 0,1 g de phosphate monopotassique, 40 mg de sulfate de magnésium heptahydraté, 1,0 mg de sulfate ferreux heptahydraté, 1,0 mg de sulfate de manganèse tétrahydraté, 5,0/ug de biotine, 5,0/ug de chlorhydrate de thiamine, 3,0 ml d'hydrolysat de protéine de soja et 1001ug de nicotinamide et on introduit dea portions de 300 ml de ce milieu de culture aqueux dans des fermenteurs de 1 litre. Après stérilisation å la vapeur, on ensemence les portions de milieu de culture aqueux avec 15 ml de la culture d'ensemencement et on maintient 310C en aérant et en agitant. Pendant la culture, on ajoute au milieu aqueux une solution contenant de l'acide acétique et de l'acétate d'ammonium pour maintenir le pH entre 7,2 et 8,0. On maintient la température du milieu entre 31 et 330C. Après 55 h de culture, on obtient dans les liquides de culture les teneurs en L-lysine indiquées dans le tableau IV ci-dessous. TABLEAU IV Mutants utilisés L-lysine accumulée (g/dl) AJ 11093 8,6 AJ 11082 7,2 Selon un procédé analogue à celui de l'exemple 1, on recueille 18,2 g de cristaux de chlorhydrate de L-lysine dihydratée a partir de 300 ml d'un liquide de culture de la souche AJ 11093. EXEMPLE 4 On ensemence Brevibacterium lactofermentun AJ 11093 ou AJ 11082 dans 50 ml du milieu de culture d'ensemencement indiqué dans l'exemple 3 (on remplace les 0,5 g/dl d'acétate d'ammonium par 0,5 ml/dl d'méthanol et on porte les 0,2 g/dl d'urée 0,3 g/dl) et on cultive en aérobiose a 310C pendant 18 h. On prépare un milieu de culture aqueux renfermant, par décilitre, 1 g de glucose, 1 ml d'éthanol, 0,5 g de sulfate d'ammonium, 0,3 g d'urée, 0,1 g de phosphate monopotassique, 40 mg de sulfate de magnésium heptahydrate, 1,0 mg de sulfate de magnésium tétrahydraté, 1,0 mg de sulfate ferreux heptahydrate, 5,0/ug de biotine, 5 5,0/ug de chlorhydrate de thiamine, 0,1 mg de nicotinamide et 3 ml d'hydrolysat de protéines de soja et on introduit des lots de 300 ml du milieu de culture aqueux dans des fermenteurs de 1 litre, puis on stérilise par chauffage. On ensemence chacun des lots du milieu de culture aqueux avec 15 ml de la culture d'ensemencement précitée et on maintient a 310C en aérant et en agitant. Pendant la culture, on maintient le pH du milieu entre 7,2 et 8,2 avec de l'ammoniac gazeux et on introduit de l'éthanol pour maintenir la concentration en éthanol du milieu a environ 0,3%. Après 48 h de culture entre 31 et 330C, les quantités de L-lysine indiquées dans le tableau V ci-dessous sont accumulées dans les liquides de culture. TABLEAU V Mutants L-lysine accumulée (g/dl) AJ 11098 7,8 (rendement 31%) AJ 11082 6,8 (rendement 27Z) EXEMPLE 5 On ensemence les mutants indiqués dans le tableau VI ci-dessous dans 20 ml du milieu de culture suivant dans des flacons å agitation de 500 ml et on cultive 300C pendant 72 h. Milieu de culture Mélasse de betteraves ou de 10- g/dl (en glucose) cannes à sucre (NH4)2S04 5,0 g/dl KH2PO4 0,1 gldl MgSO4, 7H2O 0,04 g/dl Biotine 50/ug/dl CaC03 (stérilisé séparément) 5 g/dl pif 7,0 Après 72 h de culture à 30"C, les quantités de L-lysine indiquées dans le tableau VI ci-dessous sont accumulées dans les liquides de culture. TABLEAU VI Mutants utilisés L-lysine accumulée (g/dl) Mélasse de betteraves Mélasse de cannes à sucre AJ 11093 4,6 4,4 AJ 11082 3,7 3,7 AJ 11099 4,0 4,0 AJ 11094 3,1 3,0 Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé pour préparer de la Lysine, caractérisé en ce qu til consiste (a) cultiver en aérobiose dans un milieu de culture aqueux un mutant producteur de lysine appartenant aux genres Brevibacterium ou Corynebacterium jusqu'a ce que la L-lysine soit accumulée dans le milieu de culture; ce mutant résistant à la S-(amino-2 éthyl) L-cystéine et étant capable de cultiver à 300C dans un milieu minimal renfermant les ingrédients minimaux qualitatifs convenant a la culture de ce mutant 9 300 C, mais incapable de cultiver a 340C dans ce milieu minimal, et (b) récupérer la L-lysine accumulée dans le milieu de culture. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mutant est Brevibacterium lactofermentum FERM-P 3851 ou Corynebacterium acetoglutamicum FERM-P 3861.