Brevet FR2362388A1 — publié le 19780317

L'invention concerne un dispositif optique pour des mesu rea de dichroïsme. Un tel dispositif permet notamment d'effectuer des mesures de dichroïsme aussi bien circulaire que linéaire dans l'ultraviolet proche et dans l'ultraviolet sous vide. I1 peut etre utilisé également pour faire des mesures d'absorption sur des com- posés possédant une bande d'absorption dans ltultraviolet considé ré. Tous les appareils utilisés actuellement pour faire des mesures de dichroïsme circulaire utilisent un système de dispersion comprenant une source lumineuse intense qui est par exemple un arc à xénon, un monochromateur double, soit i prismes en quartz, soit à réseaux, un polariseur, un modulateur, un porte-échantillon et un détecteur qui est un photomultiplicateur: (voir à ce sujet l'ar- ticle de I.Tinoco et C.R. Cantor "Application of optimal rotatory dispersion and circular dichroïsm to the study of Biopolymers" paru dans "Methods of Biochemical Analysis" Vol. 18 pp. 81-203,1n- tersoience Publishers New York 1971). Pour compenser les pertes d'énergie lumineuse par réflexions multiples sur un grand nombre de surfaces, l'utilisation d'une source de lumière très brillante est nécessaire. L'arc à xénon possède cet avantage, mais son émission intense dans le visible participe & la création d'un taux de lumière parasite appréciable dans l'ultraviolet, ce qui oblige à utiliser un montage avec un double monochromateur.D'autre part, l'émission de l'arc à xénon subit une brusque chute d'intensité dans la région de 2000 A, rendant les mesures de dichroïsme circulaire particulièrement difficiles dans la région de longueurs d'onde plus faibles. I1 faut tenir copte en outre de l'augmentation de l'opacité du quartz des prismes.De plus, lorsqu'on fait des mesures de dichroïsme circulaire en solution, il faut prendre en considération l'opacité des solvants, en particulier de l?eau et de l'oxyde de deutérium, dans l'ultraviolet lointain. I1 convient d'a Jouter que la crainte d'une détérioration rapide des surfaces optiques due à la formation de grandes quantités d'ozone et par con situent une diminution importante de la performance de l'appareil oblige l'utilisateur à maintenir l'ensemble de l'appareillage sous atmosphère d'azote.En utilisant les appareils de la technique an tétieure, on peut effectuer des mesures à des longueurs d'onde conF prises entre I850 et 6500 A (voir les tableaux pp. 98 et 99 de l'article précité). On a trouvé, trouvé, selon la présente invention, qu on peut di- minuter le taux de lumière parasite dans l1ultraviolet sans être obligé d'utiliser un double monochromateur. L'invention permet en outre de réaliser des mesures de dichroïsme circulaire jusqu'à 1200 . D'autre part, il n'est pas obligatoire de purger l'ensemble de l'appareillage avec de l'azote. Suivant un premier aspect, l'invention a donc pour obJet un dispositif optique, essentiellement utilisable pour faire des mesures de dichrotsme circulaire dans l'ultraviolet proche et sous vide, comprenant une lampe, un monochromateur et, après la fente de sortie du monochromateur et sur l'axe du faisceau de sortie, un polariseur, un modulateur, un porte-cuve pour les échantillons à analyser et un photomultiplicateur, ledit dispositif étant carac- brisé en ce que la lampe est une lampe à deutérium dont le maxi mum d'émission se situe vers 2000 A, le monochromateur est un mo nochromateur simple à réseau holographique concave sans autre 1é- ment de reflexion et le photomultiplicateur a une sensibilité ré duite dans le visible. Le dispositif optique selon l'invention est également utS lisable pour faire des mesures de dichrosme linéaire dans l'ultra violet proche (1950 à 3600 ) et sous vide (1200 à 1950 ). L'invention permet d'effectuer rapidement et facilement des mesures de dichroSsme circulaire dans une région spectrale relativement étendue de I200 à 3600 A. Le monochromateur est avantageusement à simple rotation avec fente d'entrée et fente de sortie fixes tel que décrit dans le brevet FR 73 06 120 (POUEY). Le balayage en longueur d'onde s'effectue en imprimant une simple rotation audit réseau hologra phique concave. Pour ce réseau, la distribution de l'énergie lumi neuse réfléchie est maximum pour l'ultraviolet sous vide et l'ul traviolet proche et est essentiellement nulle dans le visible. On notera à ce- propos que cette distribution d'énergie lumineuse dif fractée par le réseau holographique par rapport au flux incident présente une courbe relativement plate sans aucune singularité dansa la région de 3500 A à 15o00 A.L'efficacité maximale possède une valeur de 36 vers 2000 A et décroît légèrement de part et d'autre de la région spectacle d'intérêt pour atteindre des va- leurs de 26% à 3I00 A et de 24% à 1600 A.Dans un exemple pratique de réalisation, le rayon de courbure du réseau holographique est de 500 mm et ce réseau présente I22I traits par mm. L'utilisation conJointe du monochromateur simple 'muni d'un réseau holographique et de la lampe à deutérium à très faible émission dans le visible crée des conditions particulièrement favorables pour la réduction de la lumière parasite dont le taux ne dépasse pas I0-6 dans la régiond'intért. I1 faut souligner qu'un montage dichroïsme circulaire comprenant un monochromateur simple à réseau gravé et une lampe à deutérium permet également de mesurer le di chroSsme circulaire au-dessus de 1900 A, se manifeste par un déplacement-des bandes de dichroïsme circulaire vers les grandes longueurs d'onde et par une diminution de leur intensité. Au cours des mesures, ltensemble du dispositif peut être maintenu sous vide. La pression dans cet ensemble est par exemple de l'ordre de 10'6 torr. Cependant, selon une caractéristique avantageuse de l'invention, on peut maintenir le porte-cuve sous atmosphère inerte, par exemple d'azote ou d'hélium, pour permettre de changer rapidement d'échantillon entre deux mesures et pour faciliter les mesures. Le fait de purger à l'azote cette partie de l'appareil, qui d'ailleurs ne représente qu'un très faible volume, ne réduit pas la région spectrale dtintérêt. Cette conception a l'avantage, par rapport à un appareil entièrement sous vide, de ne pas imposer de limites dans la mesure du dichroïsme circulaire en la rendant aus s rapide et facile que dans la région de l'ultraviolet proche exploitée Jusqu'à maintenant. Le porte-cuve est de préférence thermostaté pour permettre des mesures en fonction de la température, le changement de température s'effectuant soit par circulation d'un liquide, soit thermoélectriquement (effet pelletier). Le polariseur est de préférence un prisme de Rochon en fluorure de magnésium placé après la fente de sortie du monochromateur et il polarise linéairement le faisceau parallèle de lumière avant son entrée dans le modulateur. Le système de modulation par effet photoélastique à haute fréquence suivant le principe de Badoz et Billardon (voir article de Billardon M. et Badoz J., 1966, C.R. Acad. Sc. Paris 262, p. 1672 Série B) est en fluorure de calcium. Le modulateur permet de polariser circulairement le flux lumineux monochromatique polarisé linéairement arrivant du polariseur. Seul le faisceau ordinaire polarisé circulairement arrive ensuite sur le porte-Cuve contenant l'échantillon à étudier. Les échantillons analysés peuvent etre soit sous forme liquide (solution aqueuse notamment) soit sous forme solide (films minces dans uiie cuve à humidité relative contrôlée ou' gels). Pour l'analyse du dichroïsme circulaire, les deux composan- tes du flux lumineux (continue et modulée) transmises par l'échan- tillon sont regues par un photomultiplicateur à fenêtre rrontale en silice fondue qui transmet Jusqu'd 1600 . ce photomultiplica- teur est maintenu comme le porte-cuve sous atmosphère d'azote. I1 peut autre facilement remplacé par un photomultiplicateur à fend tre frontale en fluorure de calcium (transmission jusqu'à 1200 A) ou en fluorure de magnésium (transmission Jusqu'à 1000 ). Comme dans les systèmes de détection décrits précédement (voir chapitre 3) de Velluz L., Legrand M., et GrosJean M, dans Optical Circular DichroSsm Verlag Chemie, Académie Press New York and London, I965, et article de Billardon M., Rivoal J.C. et Badoz J. dans Rev. Phys. Appl. 4 p. 353, 1969), la tension du photomultiplicateur varie afin de maintenir un photocourant d'anode constant indépendamment de l'intensité du flux lumineux arrivant sur la photocathode. Le signal à la fréquence de modulation est filtré, amplifié puis reçu par un détecteur sensible à la phase. Le signal rectifié est proportionnel au dichroïsme circulaire de l'échantillon. Le dispositif décrit ci-dessus, permet également, ainsi qu'on l'a indiqué précédemment, de mesurer le dichroïsme linéaire avec une très grande sensibilité. Le polariseur produit une lumière polarisée à 450 par rapport aux axes de biréfringence du modulateur. Si l'on place après le porte-cuve un second polariseur orienté à 450, c'est-à-dire ayant son axe à 900 par rapport au premier polariseur, on peut dans ces conditions détecter le dichroïsme linéaire double de la fréquence de modulation. Cependant, les mesures de dichroSsme li néaire peuvent entre obtenues sans placer le second polariseur : il suffit par exemple, comme dans le cas de l'étude des macromolécules orientées ou de fibres, d'orienter l'échantillon à 450 par rapport à l'axe du polymère ou de la direction de l'étirement des fibres. Ce dispositif trouve une application dans toutes les branches de la biologie ou de la chimie devant effectuer des mesures de dichrotsme circulaire ou linéaire. En particulier, le dispositif de l'invention trouve une a lication particulièrement int- ressante dans le vaste domaine de la biologie moléculaire et de chimie des composés, dont les bandes dtabsorption se trouvent dans itultraviolet proche et sous vide. On peut par exemple faire des spectres d'absorption sur des composés aliphatiques ou des composés cycliques saturés. L'appareil est adapté pour la conversion analogique-digitale des mesures et le traitement des données numériques par ordinateur. On peut ainsi réaliser les mesures suivantes I) Dichroïsme circulaire différentiel par calcul et traduction des résultats sous forme définitive. 2) Calcul de la dérivée du dichrorsme circulaire en fonction de la température. D) Mesure de l1absorption. Le dispositif obJet de la présente invention est illustré sans Etre aucunement limité, en référence aux figures annexées qui représentent Fig. I : un dispositif optique pour les mesures de dichros- me circulaire dans l'ultraviolet proche et sous vide. Fig. 2 : un spectre de dichroïsme circulaire obtenu à l'aide du dispositif de la rigure I. La figure I représente un montage comprenant une lampe à deu- cérium L de 200 Watts par exemple associée à un monochromateur à simple rotation M. Ce monochromateur M comporte un réseau R, qui est un réseau holographique concave, ainsi qu'une fente d'entrée rixe FI et une fente de sortie F2. Le faisceau lumineux issu de L après diffraction sur R traverse le polariseur P qui génère deux faisceaux séparés ordinaire et extraordinaire polarisés linéairement et le modulateur photoélastique NI module les faisceaux lumi neux à une fréquence de 50 K HZ Un potentiomètre 40 tours (non re présenté) couplé i l'axe de rotation du réseau du monochromateur règle la tension appliquée au modulateur.Ledit modulateur h est lui-meme couplé avec l'oscillateur. Le faisceau lumineux,après passage dans le modulateur MI, est polarisé circulairement. Seul le faisceau ordinaire traverse le porte-cuve C ayant un volume d'environ 500 cm3 où est placé 1'*- chantillon E, et les deux composantes du flux lumineux (continue et modulée) sont reçues par un photo multiplicateur PM. Le système de détection est le suivant. Le courant d'anode du photomultiplicateur est maintenu constant par variation de la haute tension couple à l'amplificateur continu. A la sortie du pho- tomultiplicateur,le signal modulé à une fréquence de 50 XHZ,corres- pondant au flux lumineux elliptiquement polarisé transmis par l'é chantillon, est initialement amplifié et filtre par un a;nplifica- teur sélectif passe-bande (Q = 100) suivi par un détecteur syn ebrone ou le signal est démodulé et rectifié. En maintenant constante à toutes les longueurs d'onde la tension correspondant à la composante continue du flux lumineux, le signal à la sortie du détecteur est proportionnel à la différence de l'absorption de la lumière polarisée ciroulairement gauche et celle polarisée circulairement droite caractérisant la substance étudiée. Le signal analogique à la sortie du détecteur synchrone est soit directement enregistré soit subit une conversion numérique et est traité par mini ordinateur. La sensibilité de l'appareil a été déterminée dans la région spectrale d'intérêt et est supérieure à = io-7, c'est-à-dire d'un à deux ordres de grandeur meilleure que celle des appareils commerciaux existants. La figure 2 représente un spectre de dichroïsme circulaire enregistré entre 1600 et 2600 du poly- &gamma; - méthyl glutamate (en hélice qui représente un modèle d'une protéine). L'ordonnée A A représente l'absorption dichroque. Cette reférence a été faite sous forme liquide, le poly -&gamma;- méthyl glutamate étant en solution dans le trifluoéthanol. REVENDICATIONS I. Dispositif optique, essentiellement pour des mesures de di chrisme circulaire dans l'ultraviolet proche et dans l'ultraviolet sous vide, comprenant une lampe, un monochromateur et, après la fente de sortie du monochromateur et sur l'axe du. faisceau de sortie, un polariseur, un modulateur, un porte-cuve pour les échantillons à analyser et un photomultiplicateur, ledit dispositif étant caractérisé en ce que la lampe est une lampe à deutérium dont le maxi m',I d'émission se situe vers 2000 A, le monochromateur est un mono chrosateur sigle à réseautiolographique concave sans autre élément de rérlesion et le photomultiplicateur a une sensibilité réduite dans le visible. 2. Dispositif optique selon la revendication I, caractérisé en ce que le monochromateur est à simple rotation avec fente d'entrée et fente do sortie fixes. 3. Dispositif optique selon l'une des revendications I ou 2, caractérisé en ce que la distribution de l'énergie lumineuse réflé- chie par le réseau est maximum pour l'ultraviolet sous vide et l'ultraviolet proche et est essentiellement nulle dans le visible pour le réseau holographique concave 4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications I ou 3, caractérisé en ce que la lampe à deutérium a une région spectrale d'utilisation s'étendant d'environ I200 A à 3600 A. 5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications I à 4, caractérisé en ce qu'il est à une pression de l'ordre de I016 torr. 6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications I à 4, caractérisé en ce que l'ensemble monochromateur, polariseur, modulateur est à une pression de l'ordre de 10-6 torr tandis que le porte-cuve est maintenu sous atmosphère inerte, par exemple sous atmosphère d'azote ou d'hélium. 7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications I à 6, caractérisé en ce que le polariseur est un prisme de Rochon et le modulateur est du type photoélastique. 8. Dispositif selon la revendication 7, caractérisé en ce que le polariseur et le modulateur sont en fluorure de calcium, en fluorure de magnésium ou en quartz très pur. 9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications I à 8, caractérisé en ce que le porte-cuve est thermostaté, le changement de température s'effectuant soit par circulation d'un liquide, soit thermoélectriquement (effet Pelletier). IO. Dispositif selon l'une quelconque des revendications I à 9, caractérisé en ce que les échantillons dans le porte-cuve sont sous forme liquide ou solide. II. Dispositif selon l'une quelconque des revendications I à IO, caractérisé en ce que le photomultiplicateur est sous atmosphère d'azote et comporte uné fenetre frontale en silice fondue ou bien en fluorure de calcium ou de magnésium. I2. Dispositif selon l'une quelconque des revendications I à II pour faire des mesures de diehroSsme linéaire dans l'ultraviolet, caractérisé en ce qu'il comporte, après le porte-cuve, un second polariseur orienté à -45 . I3. Dispositif selon l'une quelconque des revendications I à I2 pour faire des mesures de diéhroIsme linéaire dans l'ultraviolet sur des échantillons de macromolécules orientées ou de fibres, caractérisé en ce que l'échantillon est orienté à 45 par rapport & BR 14. Application du dispositif selon l'une quelconque des revendications I à I3 à la mesure de l'absorption des composés dont les bandes d'absorption se trouvent dans l'ultraviolet.