Brevet FR2359849A1 — publié le 19780224

La présente invention a pour objet un procéde de préparation de plaques déshydratées réhydratables, d'agarose ou de gélose contenant des anticorps dans le but d'effectuer les dosages des protéines sériques par les techniques d'immunodiffusion radiale, d'électroimmunodiffusion, d'immunoélectrophorèse bidimensionnelle et toutes les autres techniques immunochimiques qui en dérivent. Le principe de ces techniques est le suivant Lorsque dans un gel sous forme de plaque contenant un antisérum monospécifique ou polyvalent régulièrement réparti, on fait diffuser Cimmunodiffusion radiale) ou migrer dans un champ électrique (éîectroimmuncdiffusion) le ou les antigènes correspondants, il y a respectivement formation d'un précipité visible sous forme d'un anneau ou d'un pic. Les surfaces couvertes par les précipités sont proportionnelles à la quantité d'antigène mise en jeu. En comparant les résultats obtenus avec des antigènes à concentration connue, il est possible de calculer la quantité d'antigène à doser. L'immunodiffusion radiale permet de doser toutes les protéines sériques sans difficulté car la diffusion des antigènes est régulière et ne dépend pas de la charge de la protéine. Par contre, l'électroimmunodiffusion permet de doser les protéines sériques ayant une mobilité différente de l'anticorps contenu dans le gel. Dans le cas des immunoglobulines sériques dont la mobilité électrophorétique est faible, il est nécessaire pour obtenir des résultats corrects, de procéder à la modification de leur mobilité électrophorétique par traitement au cyanate de potassium ou à la glutaraldShyde, ou encore à la formaldéhyde. Le principe de l'îmmunoélectrophorese bidimensionnelle est la combinaison d'une électrophorèse simple en agarose première dimension) suivie d'une deuxième migration dans un gel contenant les anticorps (deuxième dimension). Les résultats obtenus selon cette technique ne sont qu'une image d'ensemble de la composition protéique du sérum analysé, et l'estimation quantitative est relativement peu précise. Les plaques de gel contenant les anticorps et commercialisés à l'état hydraté par différentes firmes, sont d'une conservation délicate et limitée dans le temps en raison de leur propre état. La quantité d'eau contenue dans ces gels, qui avoisine 99 % du poids total, est un inconvénient majeur car, en dehors du lent dessèchement possible, l'ensemble forme un milieu de culture idéal où les bactéries et les champignons peuvent se développer avec facilité. L'adjonction de produits bactériostatiques ou bactéricides diminue ce risque mais il reste néanmoins l'inconvénient de la présence d'eau. En effet, les anticorps étant des protéines fragiles, se dénaturent peu à peu en milieu aqueux ce qui en définitive limite la durée de conservation de ces produits. Le séchage de ces plaques après préparation pourrait théoriquement résoudre le problème de la dénaturation protéique et pourrait protéger les anticorps vis-à-vis des atteintes bactériennes ; mais en pratique, cela n'est pas concevable car le film sec n'est pas réhydratable après un séjour prolongé dans l'eau. Même s'il est possible d'obtenir des gels secs et réhydratables en incorporant daMs le gel, au moment de sa préparation, des hydrocolloides macromoléculaires naturels ou synthétiques selon le brevet américain nO 2.086.541 du 1er avril 1970, au cours de la réhydratation les anticorps diffusent à l'extérieur du gel supprimant ainsi toute possibilité d'utilisation de la plaque. La présente invention a pour but d'apporter une solution à ces différents problèmes et notamment au problème de la diffusion des anticorps incorporés dans le film au moment de sa réhydratation. Il a été trouvé conformément à la présente invention qu'il était possible d'empêcher la diffusion des anticorps si l'on incorporait dans la structure du gel un produit macromoléculaire hydrosoluble faiblement basique à un pH supérieur au point isoélectrique de la protéine à incorporer (anticorps). Dans ces conditions, la protéine se fixe sur la macromolécule à caractère basique par effet d'échange d'ions et ensuite, elle est emprisonnée dans le gel d'agarose ou de gelose lorsque celui-ci se solidifie par refroidissement. Par ailleurs, le gel contient certains hydroccîloides en quantité appropriée. de telle sorte qu'il soit réhydratable. Au moment de la réhydratation, le film immergé dans l'eau distillée gonfle régulièrement, les hydrocolloides sont éliminés progressivement, mais les protéines fixées sur le polymère basique et immobilisées dans le gel sont toujours réparties de façon homogène. Le décrochement de la protéine fixée sur le polymère ne peut se faire en raison de la faible force ionique. Ensuite, lorsque le gel est tamponné pour être utilisé, le pH du tampon et sa force ionique sont tels qu'ils ne permettent pas non plus le décrochement des protéines. Ainsi, on peut obtenir après ré hydratation et équilibrage dans le tampon des gels ayant les caractéristiques des gels frais préparés extemporanément au laboratoire pour être utilisés dans les techniques immunochimiques mentionnées ci-dessus. Après utilisation, le gel doit être lavé dans une solution de chlorure de sodium 0,9-% . dans ce milieu, la force ionique favorise l'échange d'ions, décrochant ainsi les anticorps qui diffusent ensuite dans le milieu. Ce mécanisme d'élimination des anticorps est extremement important. Il permet la coloration des précipités, c'est-à-dire, de les faire apparaître sur fond incolore. Cette formule est la seule possible pour la conservation des documents. Les variables que nous nous sommes proposé d'étudier sont : la nature du support, la nature des hydrocolloides de réhydratation, et, la nature et la concentration des polymères basiques qui font l'originalité de l'invention. En tant que support gélifiable, nous avons utilisé avec succès, les agaroses commerciaux, un agarose particulièrement purifié (pHOT commercialisé par la firme MCI Inc. Rockland Maine - U.S.At, un agarose à forte électroendosmose caractérisé par un nombre élevé de groupements carboxyliques et un agar-agar commercial. Les deux premiers produits sont parfaitement convenables pour les techniques d'électroimmunodiffusion appliquées à des protéines sériques de mobilité électrophorétique nettement anodique, l'agarose à forte électroendosmose peut convenir pour l'étude des protéines à faible mobilité telles que les immunoglobulines, leur donnant ainsi une mobilité cathodique.L'agar-agar par sa nature chimique (produit impur contenant un polysaccharide sulfaté, l'agaropectine, qui le rend inapte à une utilisation en électroimmunodiffusion en raison de sa forte électroendosmose) est utilisé uniquement en immunodiffusion radiale. S'il n'est pas possible d'utiliser ce dernier support en électroimmunodiffusion, il est parfaitement possible en revanche d'utiliser tous les supports énumérés ci-dessus dans les-techniques d'immunodiffusion radiale. Les hydrocolloîdes utilisables pour la réhydratation des films d'agarose ont fait aussi l'objet d'une sélection en fonction de l'utilisation des films dans lesquels ils étaient employés. Il a été trouvé par exemple, que seuls les hydrocolloîdes neutres peuvent convenir pour les techniques d'électroimmunodiffusion, alors que tous les autres, neutres, cationiques et anioniques peuvent être utilisés avec succès dans les techniques d'immunodiffusion radiale. La concentration à laquelle ils sont utilisés est en général comprise entre 0,1 et 0,5 % et ils sont associés au (0)-sorbitol à des concentrations variables entre 0,5 et 5 %. Comme polymères hydrosolubles faiblement basiques, on peut citer en exemple, les polyacrylates basiques fabriqués par la société Dow Chemicals 7581 Greffern GERMANY, et appelés Séparans CP-35 les dérivés diéthylaminoéthyle du Dextran, les copolymères linéaires obtenus par polymérisation radicalaire entre l'acrylamide et le diéthylaminoéthyleméthacrylate et, enfin les hétéropolymères et hétérocopolymères obtenus entre les dérivés basiques du Dextran et l'acrylamide ou un de ses dérivés. Tous ces produits à caractère basique sont utilisés à des concentrations comprises entre 0,1 et 1 %. Le procédé selon l'invention consiste à préparer à la température ambiante une solution d'hydrocolloides à des concentrations inférieures à 1 %, à ajouter une faible quantité de polymère basique, à vérifier le pH et à l'amener à une valeur supérieure de 0,5 - 1 unité au point isoélectrique de la protéine à incorporer dans le gel, à dissoudre à chaud dans cette même solution, une faible quantité d'agarose ou d'agar-agar [inférieure à 1 % en général), à équilibrer la température à 55 -58 C, à ajouter la protéine (anticorps), à couler la solution chaude sur une plaque de verre ou un film polyester mouillable comme par exemple, un film Cronar Clear Base, ou ;;n film Scotch-par La13, à attendre la gélification de la solution qui intervient au fur et à mesure du refroidissement et enfin à sécher le gel à une température inférieure à 30 C sous flux d'air pulsé. On obtient ainsi un film sec, souple et transparent, contenant de l'agarose en tant que gel support, les hydrocolloides entant que produits permettant la réhydratation, le polymère basique immobile qui retient sur sa chaine les molécules d'anticorps et environ 5 % d'humidité. Ces films séchés ainsi obtenus, placés dans un sac plastique ou aluminium bien fermé et gardé à une température voisine de 40 C ont une durée de vie prolongée et sont d'un emploi tout à fait commode. Il suffit, en effet, de placer ces films verticalement dans un bécher rempli d'eau de telle sorte qu'ils soient entièrement immergés, pour obtenir au bout d'une ou deux heures un gel aqueux d'agarose ou de gélose contenant l'anticorps. Les copolymères et les hétéropolymères basiques utilisés dans le procédé peuvent etre préparés suivant les méthodes de polymérisation radicalaire en présence de systèmes catalyseurs divers tels que le NNN'N'-tétraméthyléthylènediamine et le persulfate d'ammonium ou le diméthylaminopropionitrile et le persulfate d'ammonium. Le polymère formé en solution aqueuse est ensuite récupéré par précipitation sélective avec un alcool aliphatique et séchage à l'air. Les exemples qui suivent, donnés à titre non limitatif; illustrent l'invention. EXEMPLE 1 Dans un erlenmeyer de 50 ml, on introduit 30 ml d'eau déminéralisée et on ajoute sous agitation magnétique 1,8 g de (0) sorbitol, 90 mg de Separan NP-10 et 45 mg de Separan MGL et on agite jusqu'à solubilisation complète. fin ajoute, ensuite, 150 mg de Separan CP-35 et on poursuit l'agitation environ 30 minutes afin de bien disperser ce dernier produit. On ajoute ensuite 240 mg d'agarose hautement purifié (pHOT) et on commence à chauffer la solution. Lorsque la température de la solution atteint 90 -95 C l'agarose est dissout donnant une solution parfaitement limpide. On équilibre ensuite la température de l'ensemble à 55 -58 C en le plaçant dans un bain thermostaté et on y ajoute 280 l d'antisérum anti-transferrine et on agite quelques minutes. A ce stade la solution est coulée à raison de 14 ml sur un film Scotch-par L-13 ou un film Cronar Clear Base C-72 de 82 cm2 de surface. Une fois, le gel formé on découpe à l'emporte pièce sur une des longueurs, 15 puits de 2 mm de diamètre disposés sur une ligne. On place le film dans un endroit ventilé pendant 8-8 heures minimum ou une nuit maximum. On obtient ainsi un film sec, souple et transparent contenant tous les éléments nécessaires pour une parfaite ré hydratation sans diffusion des anticorps et utilisable dans les techniques d'électroimmunodiffusion pour le dosage de la transferrine sérique, les puits étant disposés côté cathodique. Ce film conditionné dans un sachet plastique bien fermé et gardé à une température voisine de 40 C, conservera parfaitement ses propriétés d'origine. EXEMPLE 2 On opère comme à l'exemple 1 à la différence que l'on remplace les 260 > il d'antisérum anti-transferrine par 260 ijl d'antisérum anti-IgA. On découpe 12 puits de 2,5 mm de diamètre, équidistants et disposés sur l'ensemble de la surface du gel, et ensuite on déshydrate sous courant d'air pulsé à la température de 250 C. On obtient ainsi, un film souple et transparent capable de se réhydrater et utilisable dans la technique d'immunodiffusion radiale. Ce film conditionné sous sachet plastique ou aluminium bien fermé et gardé à 40 C conservera parfaitement ses caractéristiques origine. EXEMPLE 3 On opère comme à l'exemple 1 à la différence que les 150 mg de Separan CP-35 sont remplacés par 300 mg du même produit, que les 240 mg d'agarose hautement purifié sont remplacés par 240 mg d'agarose à haute électroendosmose et que les 260 pl d'antisérum anti-transferrine sont remplacés par 260 ,ul d'antisérum anti-IgM. On découpe 15 puits de 2,5 mm de diamètre, disposés sur une ligne sur un des côtés et on déhydrate à la température du laboratoire sous courant d'air pulsé. On obtient ainsi un film souple et transparent capable de se réhydrater dans l'eau et utilisable dans la technique d'électroimmunodiffusion. Gardé à la température de 40 C, sous sachet plastique scellé, le film conservera parfaitement ses propriétés d'origine. EXEMPLE 4 On opère comme à l'exemple 1, à la différence que les 260 pl d'antisérum anti-transferrine sont remplacés par 260 ssul d'antisérum anti alpha1- antitrypsine et que les 240 mg d'agarose hautement purifié sont remplacés par 300 mg d'agar-agar. On découpe 20 puits de 2,5 mm de diamètre, équidistants, disposés sur l'ensemble de la surface du gel et on déshydrate le film sous courant d'air pulsé à température ambiante. On obtient ainsi un film réhydratable utilisable dans la technique d'immunodiffusicn radiale. Ce film conservé sous sachet aluminium et à la température de 40 C, conservera parfaitement ses propriétés initiales. EXEMPLE 5 Pour ce qui concerne la préparation de la solution, on opère comme à l'exemple 1 à la différence que les 260 ul d'antisérum anti-transferrine sont remplacés par 320 ,ul d'antisérum anti-orosomucolde, 270 pl d' antisérum anti-hémopexine et 180 pl d'antisérum anti-haptoglobine. On verse 12 ml de cette solution dans un moule plexiglass de dimensions 82 mm X 102 mm X 2 mm placé verticalement. Pendant la gélification de la solution coulée, on prépare la solution suivante Dans un erlenmeyer contenant 20 ml d'eau déminéralisée, on dissout sous agitation et en chauffant 1,2 g de 103-Sorbitol, 60 mg de Separan NP-10 30 mg de Separan MGL et 160 mg d'agarose hautement purifié. La solution est portée à 800 C puis versée dans le moule jusqu'à remplissage. Une fois cette seconde couche gélifiée, on démoule le gel et on déshydrate sous courant d'air pulsé pendant une nuit.On obtient ainsi, un film transparent réhydratable utilisable dans les techniques d'immunoélectrophorèse bidimensionnelle et par exemple, dans la technique dite "tandem" ; la deuxième couche permet la séparation électrophorétique des protéines et la première, contenant les anticorps, les réactions d'immunoprécipitation. Ce film conditionné dans un sachet plastique et gardé à une température voisine de 40 C conservera parfaitement ses propriétés d'origine. EXEMPLE 6 10 - Préparation de l'hétéropolymàre basique : dans 100 ml d'eau déminéralisée, on dissout 2 g de diéthylaminoéthyl Dextran et on chauffe jusqu'à 7fil0 C. On ajoute 100 mg de Persulfate d'ammonium et on poursuit l'agitation pendant 10 minutes. On ajoute ensuite 10 g d'acrylamide et on poursuit l'agitation jusqu'à polyméri sation de l'ensemble. Dans ces conditions, il y a formation d'un polymère d'acrylamide greffé sur le diéthylaminoéthyl-Dextran. Après refroidis sement de la solution. le polymère est récupéré par précipitation au méthanol ou à l'éthanol. Le précipité obtenu est séparé par centrifugation séché à l'air. On obtient ainsi 10-11 g de polymère sous forme d'une poudre blanche soluble dans l'eau. 20 - Préparation de la plaque de gel On opère comme à l'exemple 1 à la différence que la quantité de (0)-Sorbitol (1,8 g) est diminuée de moitié (0,8 g), que les 150 mg de Separan CP-35 sont remplacés par 150 mg d'hétéropolymère basique et que les 260 pl d'antisérum anti-transferrine sont remplacés par 260 p1 d'antisérum anticérulo-plasmine et que le pH de la solution obtenue est amené à 8,5 par addition de petites quantités de Tris thydroxyméthylaminométhane). On découpe 15 puits de 2,5 mm de diamètre, disposés sur une ligne et sur un côté de la plaque. On déshydrate sous courant d'air à température ambiante.On obtient ainsi un film transparent capable de se réhydrater dans l'eau et utilisable dans la technique d'électroimmunodiffusion. Gardé à la température de 4 C sous sachet plastique scellé, le film conservera parfaitement ses propriétés d'origine. EXEMPLE 7 On opère comme à l'exemple 6 si ce n'est qu'on remplace les 0,9 g de (D3-Sorbitol par 0,75 g du même produit, qu'on remplace les 150 mg d'hétéropolymère par 60 mg du même produit et qu'on remplace les 260 d'antisérum anti-céruloplasmine par 260 pl d'antisérum anti IgA. On découpe 12 puits de 2,5 mm de diamètre sur l'ensemble de la surface du gel préparé et on sèche sous courant d'air à la température ambiante. On obtient ainsi un film réhydratable utilisable dans les techniques d'immunodiffusion radiale. Ce film conservé à la température de 40 C et à l'abri de l'humidité garde ses propriétés initiales. EXEMPLE 8 On opère comme à l'exemple 1 à la différence que les 150 mg de Separan CP-35 sont remplacés par 15 mg de diéthylaminoéthyl-dextran et les 260 P1 d'antisérum anti-transferrine par 260 ul d'antisérum anti-céruloplasmine que le pH de la solution est amené à 8,5 par addition de petites quantités de Tris-(hydroxyméthylaminométhane). On découpe 15 puits de 2,5 mm de diamètre disposé sur une ligne et sur un des côtés de la plaque, on déshydrate sous courant d'air à température ambiante. On obtient ainsi un film transparent capable de se réhydrater dans l'eau et utilisable dans les techniques d'électroimmunodiffusion. Gardé à la température de 40 C sous sachet plastique scellé, le film conservera parfaitement ses caractéristiques d'origine. EXEMPLE 9 On opère comme à l'exemple 8 à la différence que les 260 ul d'antisérum anti-céruloplasmine sont remplacés par 260 U1 d'antisérum anti-IgA. On découpe ensuite 15 puits de 2,5 mm de diamètre équidistants, répartis sur la surface du gel et on sèche à l'air libre. On obtient ainsi un film sec utilisable dans les techniques d'immunodiffusion radiale. Ce film gardé a 40 C et à l'abri de l'humidité, conservera parfaitement ses propriétés d'origine. EXEMPLE 10 On opère comme à l'exemple 1 à la différence que la quantité de tD)-Sorbitol t1,8 g) est diminuée à 0,3 g, que les 30 mg de Separan NP-10 et les 45 mg de Separan MGL sont remplacés par 150 mg d'alginate sodique hautement purifié et les 260 pl d'antisérum anti-transferrine par 180 pl d'antisérum anti-albumine humaine. On découpe 15 puits de 2,5 mm de diamètre, disposés sur une ligne et sur un côté du gel. On sèche sous courant d'air pulsé à la température d'environ 250 C. On obtient ainsi un film souple et transparent capable de se réhydrater et utilisable dans la technique d'immunodiffusion radiale. Ce film conditionné sous sachet plastique ou aluminium scellé et gardé à 40 C conservera parfaitement ses propriétés d'origine. EXEMPLE 11 On opère comme à l'exemple 5 à la différence qu'on remplace dans la première solution les trois antisérums par 500 p1 drantisérum anti-protéines sériques humaines. On obtient ainsi un film en deux couches, réhydratable utilisable dans les techniques d'immunoélectrophorèse bidimensionnelle. Le film sec conditionné sous sachet plastique imperméable et à la température de 40 C, conservera parfaitement ses propriétés initiales. REVENDICATIONS 1) - Procédé de préparation de gels déshydratés et réhydratables d'agarose ou d'agar-agar contenant des anticorps immobilisés. par échange d'ions sur un haut polymère faiblement basique, se trouvant dans les mailles du gel. 23 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la nature du gel est de l'agarose normal ou hautement purifié ou de l'agarose spécial à forte électroendosmose ou de l'agar-agar. 3) - Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que la concentration en agarose ou agar-agar est comprise entre 0,5 et 2 %. 4) - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il s'agit de films déshydratés et réhydratables dans l'eau. 53 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les anticorps sont fixés à l'intérieur des mailles d'agarose sur des chaines d'un polymère à caractère basique par effet d'échange d'ions et que lesdit anticorps ne diffusent pas dans l'eau au moment de la réhydratation du film. 6) - Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que le polymère faiblement basique est un produit synthétique connu sur le marché sous le nom de Separan CP-35 ou un produit semisynthétique comme par exemple, le diéthylaminoéthyl-dextran ou un hétéropolymère obtenu par polymérisation radicalaire de l'acrylamide au sein d'une solution de Diethylaminoéthyl dextran ou un copolymère d'acrylamide avec le diethylaminoéthylméthacrylate 7) - Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que le polymère à caractère basique est inclus dans les mailles d'agarose de façon permanente 83 - Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que la concentration du polymère à caractère basique est comprise entre 0,1 % et 5 %. 9) - Associations constituées par une plaque deshydratée telle que définie dans les revendications 1 et 4 et un support plastique polyesther mouillable connu sous la dénomination commerciale de "Scotch-par L-13" ou "Cronar Clear Base C-72". 10) - Utilisation, après réhydratation des associations selon la revendication 9 dans les techniques immunochimiques telles que l'immunodiffusion radiale, 1' électroimmunodiffusion et l'immunoélectrophorèse bidimen sionnelle.