Brevet FR2393061A1 — publié le 19781229

La présente invention concerne un procédé de-cultu- re de microorganismes notamment de bactéries productrices de substance physiologiquement active. ELle intéresse la produc- tion, par culture immergée, d'antibiotiaues du groupe des Tétracyclines parmi lesquelles : Tétracycline, Oxytétracycline, Chlortétracycline. Dans les procédés utilisés pour produire les antibiotiques du groupe de Tétracyclines, par voie microbiologique, les milieux de culture sont complexes. Ils contiennent généralement de l'amidon, des protéines, farine de soja par exemple, de la liqueur de trempage de mais, des sels minéraux nutritifs. Ces fermentations sont aérobies, l'oxygène nécessaire est fourni à partir d'air insufflé par un compresseur durant toute la culture. Le milieu est généralement agité. Les bactéries sont du genre Streptomyces. Lors de l'évolution de la culture, le milieu sous l'effet conjugué de l'agitation et de l'aération a tendance à mousser fortement. Afin d'éviter une vidange partielle du fermenteur, suite à la formation de la mousse, on introduit périodiquement un ou plusieurs agents anti-mousse, généralement des huiles animales telles l'huile de lard. Ces huiles sont métabolisées par la bactérie au même titre que le subtrat carboné principal. La durée d'un cycle de fermentation est au minimum d'environ 120 heures. La température de fermentation est maintenue constante et se situe géneralement entre 25 et 300 C. L'oxygène dissous est l'un des paramètres principaux a contrôler pour effectuer d'une manière correcte une fermentation d'antibiotique du groupe des Tétracyclines. Lors de la culture d'un Streptomyces producteur d'antibiotique du groupe des Tétracyclines, on note une forte chute de oxygène dissous pendant la première moitié de la culture. Pour que l'antibiotique soit produit a la vitesse optimale, on a constaté aue la teneur en oxygène dissous doit être inférieurs à une valeur minimale. Si la valeur de l'oxygène dissous est trop faible, il s'en suit une réduction de la vitesse de production et un abaissement du titre final. L'oxygène dissous dans le milieu de fermentation est le résultat, d'une part, du transfert d'oxygène réalisé par l'appareil de fermentation et, d'autre part de la demande du mi- croorganisme qui se développe. Il a été trouvé des conditions de culture en atmosphère suroxygénée qui, en maintenant l'oxygène dissous à une valeur convenable pendant la culture, permettent de conserver la vitesse maximale de production d'antibiotiques du groupe des Tétracyclines. Il a été noté que généralement ce procédé permettait d'améliorer le titre final en antibiotiaues, en prenant comme référence une fermentation bien conduite à l'air. Le nouveau procédé présente des avantages à caractère technique, à savoir une diminution des investissements et une sureté absolue du déroulement du procédé. Selon l'invention, la production d'antibiotiques du groupe des Tétracyclines par voie microbiologisue est conduite en présence d'une atmosphère suroxygénée contenant au moins 21 % et jusqu' environ 40 % d'oxygène introduite dans le milieu de fermentation, en maintenant la teneur en oxygène dissous dans le milieu à une valeur au moins égale a 0,30 ppm. Cette teneur est de préférence comprise entre 0,30 et 3 ppm et en particulier entre 0,30 et 1,5 ppm. L'introduction de l'atmosphère suroxygénée est une introduction progressive de quantitéscroissantes d'oxygène de manière telle que la teneur en oxygène dissous soit maintenue dans les teneurs précédemment décrites. En prenant comme référence une fermentation à l'air seul, dont la concentration en oxygène dissous est supérieure à 0,30 ppr, on a constaté dans les cas de culture en atmosphère suroxygénée, un gain d'antibiotique en fin de culture de 5 % 9 30f. Il est donné ci-après des exemples qui illustrent l'invention h titre non limitatif. Exemple 1. PRODUCTION D DXYTETRACYCLINE Dans une série de fermenteurs identicues, de laboratoire, de volume 5 litres possédant arbre et étages d'agitation, on réalise les fermentations suivantes. Les conditions de culture sont identiques a celles de tous les fermenteurs, sauf en ce qui concerne l'agitation et la pression partielle en oxygène du gaz injecté. Le milieu de production de l'oxytétracycline est le suivant amidon 35 g liqueur de trempage de mais 20 g sulfate d'ammonium 7,5 g Carbonate de calcium 7 g Chlorure d'ammonium 1,5 g Chlorure de cobaLt 5 ml d'une solution a 1 g/l Huile d'arachide 5 g eau distillée q.s.p. 1 1 pH = 7 stérilisation 20 mn a L200 C Température de fermentation 280 C Volume utile des fermenteurs 3 litres. La souche productrice d'oxytétracycLine est Streptomyces varsoviensis Le milieu de culture est inoculé par 300 ml d'une préculture de 24 heures. L'huile de lard est utilisée comme agent antimousse. Les conditions d'aération-agitation sont consignées dans le tableau I Tableau I Aération Agitation Caractéristiques du VVM RPH gaz d'aération Fermenteur 1 1 VVM 430 Air + 02 pur Fermenteur 2 1 VVM 430 Air + 2 pur Fermenteur 3 1 VVM 430 Air + 02 pur Fermenteur 4 1 VVM 650 Air Fermenteur 5 1 VWM 430 Air Les termes VVM et RPM désignent respectivement VVM = volume dtair par volume de milieu par minute et RPM = révolution par minute. Dans le fermenteur 1, on maintient L'oxygène dissous a une valeur moyenne de 0,3 ppm par enrichissement de l'air par de l'oxygène pur. Par le même moyen, on maintient l'oxygène dissous à 0,65 ppm dans le fermenteur nO 2 et à 1,5 ppm dans le fermenteur n 3. Dans les fermenteurs 4 et 5, on insuffle seulement de l'air. Dans le cas du fermenteur n 4, la teneur en oxygène dissous au cours de la fermentation n'est pas inférieure à 0,3 ppm. Dans le cas du fermenteur n 5, on relève des zones de plusieurs heures durant lesquelles le taux d'oxygène dissous est nul. En prenant en considération, la vitesse de production de l'oxytétracycline et le titre en antibiotiques à 120 heures de culture, les résultats obtenus figurent dans le tableau 11. Tableau II Vitesse de production de Titre en oxytétracy l'oxytétracycline en dinde à 120 h. g/ml.h. g/ml. Fermenteur 1 55 3.100 Fermenteur 2 55 3.400 Fermenteur 3 55 2.800 Fermenteur 4 55 2.600 Fermenteur 5 25 2.000 La regulation par l'oxygène pur de l'oxygène dissous à une valeur d'au moins 0,3 ppm, a permis d'atteindre la vitesse maximale de production, de l'oxytétracycline. I1 a été noté que les titres en oxytétracycline des fermentations réalisées avec de l'air suroxygéné sont supérieurs au titre de la fermentation réalisée avec augmentation de la vitesse d'agitation (650 RPM) ; suivant les valeurs de régulation, le gain varie de 7 à 30 %. Ces résultats ont été confirmés avec des fermenteurs de laboratoire de taille plus importante. Exemple 2 PRODUCTION DE TETRACYCLINE Dans le cas de cet antibiotique, on conduit l'expe- rimentation dans un fermenteur de 100 litres comportant un arbre avec étages d'agitation. Le milieu contient de l'amidon, de la liqueur de trem- page de mais, de la farine de soja, des sels minéraux, et de 1 'huile de lard comme anti-mousse. Avant inoculation, on stérilise le milieu 20 mn a 1200 C. Durant la fermentation, on maintient la température constante aux environs de 280 C. La souche mise en oeuvre est un Streptomyces producteur de tétracycline. On introduit l'air a un débit d'air de 0,5 vvm, et régule par enrichissement de l'air en oxygène pur la teneur en oxygène dissous du milieu de fermentation, a une valeur de 0,6 ppm. Pour cette valeur, on constate que la vitesse de production de la té tracycline est maximale. REVENDICATIONS I. Procédé de fabrication d'antibîotioues du groupe des Tétracyclines par voie microbiologique, caractérisé en ce que la fermentation est conduite en présence dune atmosphère suroxygénée contenant plus de 21 % et jusqu'a 40 X d'oxygène, introduite progressivement dans le milieu de fermentation par quantités croissantes d'oxygène de manière telle que la teneur en oxygène dissous soit maintenue a une valeur au moins égale a 0,3 p.p.m. 2. Procédé de fabrication d'antibiotiques du groupe des Tétracyclines, selon la revendication 1, caractérisé en ce que la teneur en oxygène dissous dans le milieu de fermentation est comprise entre 0,30 et 3 p.p.m. 3. Procédé de fabrication d'antibiotiques du groupe des Tétracyclines, selon la revendication 2, caractérisé en ce que la teneur en oxygène dissous dans le milieu de fermentation est comprise entre 0,30 et 1,5 p.p.m.