Brevet FR2390408A1 — publié le 19781208

La pressente invention concerne un procédé de marquage par un isotope radioactif d'un sel hydrosoluble d'oxine, ou de ses dérivés halogénés ou sulfonés, et le produit chimique obtenu par la mise en oeuvre de ce procédé. L'invention colccl-ne egalc- ment le marquage des éléments figurés du sang, au moyen desdits produits chimiques et les produits pharmaceutiques ainsi obtenus. Par éléments figurés du sang, on entend plus spécifiquement les trois principaux groupes, à savoir : les hématies, les plaquettes et les leucocytes. L'invention a trait notamment aux applications médicales des produits radioactifs. Selon l'art antérieur, toxine (8 - hydroxyquinoléïne) était connue en tant que produit chimique, notamment en tant qu'agent complexant des métaux divalents, tels que le Magnésium. Selon une publication récente, du journal of Lab. Clin. Med., de janvier 1977, il est cité dans un article de Mrs. THAKUR, COLEMAN et WELCH, intitulé "In-lîl- labeled leukocytes for the localization of abscesses : preparation, analysis, tissue, distribution and comparison with Gallium-67 citrate in dogs", un nouveau procédé de marquage des leucocytes par un complexe 111 In-oxine, qui présente un intérêt certain, notamment quant au rendement de marquage des leucocytes. Mais cette méthode de marquage présente également de nombreux inconvénients dus plus précisément au fait que l'oxine n'est pratiquement pas soluble dans l'eau.La preparation du complexe nécessitait ainsi la mise en solution de toxine dans de l'éthanol, pis après formation du complexe, celui-ci était extrait dans un égal volume de chloroforme, avec évaporation au bain-marie. La reprise du résidu sec s'effectuait alors par dilution dans de l'méthanol absolu, puis dans du sérum physiologique. De plus, le composé final n'est pas ultra-filtrable, sur un filtre millipore, et ainsi, par suite de la multiplicité des opérations, la stérilité dudit composé est difficile à réaliser. Dans le but de pallier les différents inconvénients sus-précisés, la Demanderesse a cherché à simplifier la méthode de marquage, notamment par l'utilisation d'un sel hydrosoluble d'oxine ou de ses dérivés halogénés ou sulfonés. Selon l'invention, le procédé est caractérisé en ce que l'on prépare une première solution d'un sel hydrosoluble d'oxinc ou de ses dérivés halogénés ou sulfonés dans de liteau distillée, l'on ajuste le pH à une valeur comprise entre 7 et 8, et l'on mélange ladite première solution avec une seconde solution comprenant un isotope radioactif. Un tel procécé offre plus particulièrement l'avantage d'éviter les nombreuses étapes de dilution et d'extraction, nécessaires dans l'art antérieur, et en conséquence une parfaite stérilité du produit obtenu. Selon une réalisation préférentielle de l'invention, le procédé est caractérisé en ce que l'on prépare environ 0,01 à 0,1 ml d'une première solution d'un sel hydrosoluble d'oxine ou de ses dérivés halogénés ou sulfonés, dans de l'eau distillée, à raison d'environ 1 mg par ml, l'on ajuste le pH à une valeur comprise entre 7,3 et 7,5 à l'aide d'un tampon légèrement basique, de manière à obtenir un volume de t a 2 ml, et l'on mélange ladite première solution ainsi tamponnée, arec environ 1 ml d'une seconde solution d'un cation radioactif divalent ou trivalent, présentant une activité comprise entre 0,1 et 10 mCi. Cette réalisation préférentielle permet d'obtenir plus particulièrement un volume total de 1' ordre de 2 à 3 ml, présentant une activité comprise entre Oit et 10 mCi, compatible ainsi avec les nécessités thérapeutiques d'une injection futuredans le système vasculaire du patient à examiner, d'un produit pharmaceutique obtenu à partir de ce produit radioactif. Selon une variante de l'invention, le procédé est caractérisé en ce que l'on ajuste le pH, a l'aide d'une quantité appropriée d'un tampon trisaminol (0,2 M), légèrement basique (pH = 7,8). Ces valeurs ont été soigneusement établies, afin d'obtenir un pH final, compris entre 7,3 et 7,5, préféren- tellement un pH égal à 7,4, afin que les éléments figurés du sang ne soient pas endommagés lors du marquage, et que le produit pharmaceutique ainsi obtenu sot physiologiquement acceptable. Selon une variante de l'invention, on choisit on tant qu'isotope radioactif, l'Indium 1llIn ou 1 13m in. Selon une autre variante de l'invention, le sel hydrosoluble d'oxine est le sulfate d'oxine. Egalement d'autres sels hydrosolubles peuvent convenir, tel que par exemple le citrate d'oxine ou des sels hydrosolubles de ses dérivés mono ou dihalogènés en position 5 ou 7 ou 5-7 ou sulfonés, tels que par exemple le chlorhydrate de dichloro-hydroxy-8-quinoléine, sul fate de chloriodo-hyàroxy-8-quinoléine, cette liste n'étant pas limitative, mais fixée par l'homme de l'art, de telle manière que la solubilité soit supérieure a 50 mg/litre. Par application du procédé ainsi décrit, l'invention permet ainsi d'obtenir à titre de produit industriel nouveau, un sel hydrosoluble d'oxine, marqué par un isotope radioactif, et plus particulièrement le sulfate d'oxine marqué par un isotope radioactif d'indium, tel que 1clin ou 1t3mIn, mais également les isotopes radioactifs de Cu, Co, Zn, et Ga. L'invention concerne également un procédé de marquage des éléments figurés du sang, l'application médicale des produits radioactifs ainsi obtenus, et les produits pharmaceutiques eux mêmes. A titre d'application médicale, l'invention décrit un procédé de détermination du volume hématique sanguin, carac térisé en ce que l'on introduit dans le système vasculaire à examiner, une solution physiologiquement acceptable d'hématies, préalablement marquées au moyen du complexe sulfate d'oxine Indium radioactif. L'invention décrit également un procédé de détection de foyers thrombo-emboliques récents, caractérisé en ce que l'on introduit dans le système vasculaire à examiner, une solution physiologique acceptable de plaquettes, préalablement marquées au moyen du complexe sulfate d'oxine - Indium radioactif. L'invention décrit également un procédé de détection d'abcès, par introduction dans le système vasculaire à examiner, d'une solution physiologique acceptable de leucocytes préalablement marqués au moyen du complexe sulfate d'oxine - Indium radioactif. Enfin, l'lnvention concerne les produits pharma ceutiques nouveaux, obtenus par marquage d'éléments figurés du sang, au moyen du complexe sulfate d'oxine - Indium radioactif, et plus particulièrement, les produits pharmaceutiques obtenus par marquage des plaquettes, des leucocytes ou des hématies. La description qui va suivre et notamment les exemples cités permettront de mieux comprendre comment l'invention peut être réalisée. Selon la présente invention, on prépare environ 0,01 à 0,1 ml d'une première solution d'un sel hydrosoluble d'oxine, tel que le sulfate d'oxine ou le citrate d'oxine, dans de l'eau distillée, à raison d'environ 1 mg par ml ; puis, à l'aide d'une solution tampon légèrement basique, telle qu'une solution tampon trisaminol (0,2 M) de pH = 7,8, on ajuste le pH à une valeur comprise entre 7,3 et 7,5, sous un volume de i à 2 ml, et enfin, on mélange ladite solution tamponnée avec environ 1 ml d'une seconde solution d'un isotope radioactif, tel qu'une solution d'Indium - 111 dans l'acide chlorhydrique (O,Q4 N), dont l'activité est comprise entre 0,1 et 10 mCi, suivant llapplica- tion médicale désirée.La fabrication du complexe est instantanée et dans une proportion voisine de 100 X. D'autre part, la solution tamponnée est stable, à température ambiante, ce qui permet donc de livrer le produit déjà tamponné à un utilisateur éventuel, sans risque d'évolution trop rapide. Les quantités ainsi spécifiées ont été établies afin d'obtenir un volume total, in fine, voisin de 3 ml, et une acidité telle qu'elle n'endommage pas les éléments figurés du sang, et puisse être injectée dans le système vasculaire du patient à examiner. A titre de solution tampon, on peut également utiliser des phosphates alcalins ou alcalino-terreux, des acides alcools salifiés par des métaux alcalins ou alcalino-terreux, par exemple le tartrate de potassium ; il existe ainsi de nom breuses solutions tampons convenables, facilement imaginables par l'homme de l'art, la seule exigence étant d'obtenir, en faibles quantités, un pH voisin de 7,4. Le produit chimique ainsi obtenu peut servir notamment-au marquage des produits figurés du sang, selon le procédé décrit ci-dessous. Nécessairement le marquage doit s'effectuer en sérum physiologique, car la constante d'association de l'lndium à l'oxine (= 6,8) est inférieure à sa constante d'association à la transférine (= 20), et ainsi, la présence du plasma entrainerait une importante baisse du rendement de marquage. Le procédé de marquage sera décrit d'une manière plus illustrative, au moyen de trois exemples de réalisation d'une manière générale, il consiste à séparer les éléments à marquer du plasma, puis à les traiter aux moyens des produits radioactifs précédemment obtenus. Exemple 1 : Marquage des hématies et essais cliniques. Le marquage des éléments figurés du sang s'effectue donc par fractionnement d'une quantité de sang initialement prélevée de l'ordre de 5 ml. Après avoir écarté le plasma et lavé une fois dans 4 ml de sérum physiologique, les hématies sont remises en solution dans 2 ml de sérum physiologique, dans lequel on ajoute le produit chimique, objet de l'invention, tel que par exemple le sulfate d'oxine tamponné et marqué par l'indium radioactif 1J3mIn (2 mCi). L'ensemble est alors agité par simple retournement et laissé incuber à température ambiante pendant dix minutes. il a été également étudié la possibilité de mélanger préalablement les hématies et a solution de sulfate d'oxine tamponnée. L'addition de la solution d'éléments radioactifs à cette étape du procédé, ne modifiait nullement le rendement de marquage. Ceci permet donc de réaliser notamment la fabrication d'hématies prétraitées. Après marquage et remise en suspension des hématies en milieu plasmatique, puis injection dans le système vasculaire du patient à examiner, l'évolution par heure est de l'ordre de 1 %. L'injection chez l'homme d'hématies marquées à l'indium radioactif 1l3mIn a permis de retrouver des volumes sanguins identiques à ceux trouvés avec les hématies marquées au 99m Tc et au cor. Exemple 2 : Marquage des plaquettes et essais cliniques. La séparation des plaquettes est faite de façon classique à partir d'une quantité initiale de 40 ml de sang, jusqu'à obtenir un plasma riche en plaquettes, de concentration moyenne d'environ 19 plaquettes par ml, pour un concentré de 3 ml. Après centrifugation à 3.500 tours par minute, les plaquettes sont remises en suspension en sérum physiologique et le marquage est effectué comme à l'exemple précédent à l'aide de sulfate d'oxine tamponné et marqué par 1lIn (1,5 mCi). le tableau ci-après donne le rendement de marquage, en fonction de la concentration en plaquettes. C 1 3.107 6.107 9.107 1,2 . 1o8 R 45 X 73 % 84 % 85 % La fragilité des plaquettes à toutes manipulations est bien connue et la nécessité des opérations de centrifugation, dilution et marquage, entrain une dénaturation non négligeable des plaquettes. Ainsi, après remise en solution plasmatique et étude in vitro, il existe, au cours des premières heures, une élution liée à la destruction des plaquettes lésées au cours du marquage et pouvant atteindre 25 à 30 % au bout de trois heures. L'injection des plaquettes entratne une importante activité splénique et hépatique qui reste stable ensuite. L'utilisation de plaquettes marquées permet notamment la recherche de foyers turombo- emboliques récents. Ainsi, les essais cliniques réalisés sur deux malades suspects d'embolie pulmonaire ont mis en évidence, par exploration, plusieurs foyers d'hyperfixation correspondant aux embolies cliniquement et radiologiquement suspectées. Le moment idéal pour faire l'examen est la 30ème minute après l'injection. Exemple 3 : Marquage des leucocytes et essais cliniques. Le marquage est identique à ceux décrits aux exemples précédents, après séparation des leucocytes du plasma, au moyen de sulfate d'oxine tamponnée et marquée par 1111n (1,5 mCi). Le tableau suivant donne le rendement de marquage en fonction du nombre de cellules. n 107 2.107 4.107 8.107 r 30 % 61 ,' 8o X 90 % ce qui nécessite donc un volume initial de sang de l'ordre de 60 à 80 ml. Il existe également une élution précoce, in vivo, des leucocytes endommagés, de l'ordre de 5 à 10 ,' au cours des 48 heures suivantes. Après injection, in vivo, on assise alors à deux phénomènes - Séquestration rapide des leucocytes au niveau des poumons, au cours des quatre premières heures, avec redistribution ensuite de la radioactivité. - Captation splénique et hépatique non négligeable. Une des principales applications médicales est la recherche des abcès ; expérimentalement, la meilleure qualité des images obtenues se situe aux environs de la 24ème heure. Les exemples décrits ci-dessus ne sont donnés qu'à titre purement illustratifs et ne sauraient être considérés comme une limitation à la portée de l'invention. Notamment, de nombreux sels hydrosolubles d'oxine trouvent leur place dans le cadre général de l'invention (citrate, sulfate...), ainsi que de nombreux isotopes radioactifs, dont le choix est plus spécifiquement guidé par l'utilisation thérapeutique, le rayonnement émis et la durée de vie. Ils peuvent notamment être choisis dans le groupe Cu, Co, Zn, Ga, in... REVENDICATIONS : 1. Procédé de marquage par un isotope radioactif d'un sel hydrosoluble d'oxine, ou de ses dérivés halogénés ou sulfonés, caractérisé en ce que l'on prépare une première solution d'un sel hydrosoluble d'oxine ou de ses dérivés halogénés ou sulfonés, dans de l'eau distillée, l'on ajuste le pTI à une valeur comprise entre 7 et 8, et l'on mélange ladite première solution avec une seconde solution comprenant un isotope radioactif. 2. Procédé de marquage par un isotope radioactif d'ur sel hydrosoluble d'oxine, ou de ses dérivés halogénés ou sulfonés, selon la revendication 1, caractérisé en ce que lton prépare environ G,01 a 0,1 mi d'ne première solution d'un sel hydrosoluble d'oxine ou de ses dérivés halogénés ou sulfonés, dans de l'eau distillée, à raison d'environ i mg par ml, l'on ajuste le pEI a une valeur comprise entre 7,3 et 7,5 a l'aide d'un tampon légère- ment basique, de manière à obtenir un volume de i a 2 ml, et l'on mélange ladite première solution tamponnée avec environ 1 ml d'une seconde solution d'un cation radioactif divalent ou trivalent, présentant une activité comprise entre 0,1 et 10 mCi. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on ajuste le pH à l'aide d'une quantité appropriée d'un tampon trisaminol, légèrement basique (pH = 7,8). 4. Procédé selon l'une des revendications 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que l'isotope radioactif est l'indium 1111ii. 5. Procédé selon l'une des revendications 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que l'isotope radioactif est l'indium 113mIn. 6. Procédé selon l'une des revendications 4 à 5, carac terse en ce que lton choisit comme sel hydrosoluble d'oxine, le sulfate d'oxine. 7. A titre de produit industriel nouveau, un sel hydrosoluble d'oxine ou de ses dérivés halogénés ou sul-fones, marqué par un isotope radioactif. 8. A titre de produit industriel nouveau1 le sulfate d'oxine, marque par un isotope radioactif d'indium. 9. Procédé de marquage d'élements figurés du sang, caractérisé en ce que l'on sépare lesdits éléments du plasma, et en ce qu'on les marque au moyen du produit selon la revendication ou ou 8. 10. Procédé de détermination du volume hématique sanguin, caracterisé en ce que l'on introduit dans i système vasculaire à examiner une solution physiologique acceptable d'hématies, préalablement marquées au moyen du produit selon la revendication 8. 11. Procédé de détection de foyers thrombo-emboliques récents, caractérisé en ce que l'on introduit dans le système vasculaire à examiner une solution physiologique acceptable de plaquettes, préalablement marquées au moyen du produit selon la revendication 8. 12. Procédé de détection d'abcès, caractérisé en ce que l'on introduit dans le système vasculaire à examiner, une solution physiologique acceptable de leucocytes, préalablement marquées au moyen du produit selon la revendication 8. 13. Produits pharmaceutiques nouveaux, caractérises en ce qu'ils consistent en une solution physiologique acceptable d'éléments figurés du sang préalablement marqués au moyen au produit selon la revendication 7 ou 8. 14. Produits pharmaceutiques nouveaux1 pour la détermination du volume hématique sanguin, caractérisés en ce qu'ils consistent en une solution physiologique acceptable d'hématies, préalablement marquées au moyen du produit selon la revendication 8. 15. Produits pharmaceutiques nouveaux, pour la determination de foyers thrombo-emboliques récents, caractérisés en ce qu'ils consistent en une solution physiologique acceptable de plaquettes, préalablement marqués au moyen du produit selon la revendication 8. 16. Produits pharmaceutiques nouveaux, pour la détermination d'abcès, caractérisés en ce qu'ils consistent en une solution physiologique acceptable de leucocytes préalablement marqués au moyen du produit selon la revendication 8.