Brevet FR2381781A1 — publié le 19780922

La présente invention a pour objet le monophosphate de 9-{2-hydroxyéthoxyméthyl)guanine et plus particulièrement les sels de ce composé propres à des usages pharmaceutiques. Elle comprend aussi la préparation de cette substance et de ces sels, ainsi que les médicaments qui les comprennent comme matière active. Les dérivés 9-(2-hydroxyéthoxytéthyliques) de purines sont connus pour exercer une action antivirale contre diverses catégories de virus à ADN et ARN, aussi bien in vitro que in vivo (voir la demande de brevet britannique au nom de la présente Demanderesse NO 38278/74) et en particulier contre le virus de la vaccine et les virus herpétiques, comprenant le virus simplex, celui du zona et celui de la varicelle chez les mammifères, qui sont la cause de maladies comme la kératite herpétique chez le lapin et l'encéphalite herpétique chez la souris. Or, la présente Demanderesse a trouvé que le monophosphate de la 9-(2-hydroxyéthoxymFthyl)guanine non seulement se montrait aussi actif que le composé non-phosphorylé mais qu'il avait aussi l'avantage sélectif d'être beaucoup plus soluble, au moins à des pH de 1 à 7,5. La présente invention a ainsi pour objet les dérivés de la q-(2-hydroxyéthoxyméthyl)-guanine de formule I ci-dessous dans laquelle W et Z, qui peuvent être identiques ou différents, sont chacun l'hydrogène ou bien un cation acceptable pour des usages pharmaceutiques. le cation peut être choisi parmi le sodium, le potassium, le lithium, le calcium/2, le magnésium/2, l'aluminium/3 et le cation ammonium. les composés de formule I dans lesquels Z est le cation sodium, potassium ou ammonium et W l'hydrogène sont préférables, et en particulier ceur dans lesquels Z est le sodium ou le cation ammonium et W l'hydrogène. Dans la définition ci-dessus de W et de Z, les cations polyvalents sont notés calcium/2, magnésium/2 et aluminium/3, ce qui a pour signification le cation divisé par sa valence, c' est-à-dire Ca++/2, Mg+t2 et Al+++/3, pour montrer que le cation calcium ou magnésium est en liaison ionique avec deux oxygènes du phosphate, et l'aluminium avec trois. Cette invention comprend aussi un procédé de préparation des composés de formule I, selon lequel (a) on fait réagir un composé de formule II avec un agent de phosphorylation pour former un composé de for- mule I dans lequel W et Z sont tous deux l'hydrogène ; ou bien (b) on transforme en un composé de formule I un composé de formule III (dans laquelle ou bien M est un groupe 6-hydroxy et G un atome ou un groupe pouvant être remplacé par ou converti en un groupe amino par une ammonolyse sélective, ou bien G est un groupe 2-amino et Mun atome ou un groupe pouvant être remplacé par ou converti en un groupe hydroxy par une hydrolyse sélective), et le cas échéant on transforme le composé de formule I dans lequel W et Z sont tous deux l'hydrogène en un composé dans lequel W cu Z ou les deux sont des cations pharmaceutiquement acceptables, par réaction avec une base ou un sel contenant le cation voulu. Dans la méthode (a), les dérivés de l'acide phosphorique avec un à trois hydroxyles remplacés par des atomes d'halogènes, par exemple de chlore, comme ltoxychlorure de phosphore, constituent les agents de phosphorylation préférés, et jusqu'8 deux des groupes hydroxy peuvent aussi être substitués en groupes alcoxy pouvant éventuellement porter eux-mêmes d'autres substituants comme dans un groupe benzyloxy. Un tel dérivé phosphohalcgénéou phosphate est employé comme à l'ordinaire en milieu neutre ou alcalin, le dernier de préférence avec activation par exemple au moyen d'un carbodiimide comme le dicyclohexyl-carbodiimide, sauf s'il est utilisé sous la forme de l'anhydride. Si deux au moins des groupes hydroxy du dérivé d'acide phosphorique sont remplacés par des halogènes, il est nécessaire, après la réaction avec le composé de formule II, d'éliminer les halogènes libres par une hydrolyse aqueuse assez douce, par exemple avec un équivalent molaire d'eau dans un solvant miscible à l'eau tel que l'alcool. Des groupes alcoxy substi,tués ou non introduits avec un phosphate peuvent ensuite être hydrolysés dans un milieu aqueux approprié en présence d'une base, dans une opération ultérieure, tandis que des groupes alcoxy à substituants aromatiques comme le groupe benzyloxy peuvent aussi être soumis à une hydrogénolyse, de préférence en présence d'un catalyseur, suivant les techniques ordinaires d'une telle dissociation réductrice. Une méthode de phosphorylation préférée des composés intermédiaires selon l'invention consiste à faire réagir un composé de formule II avec l'oxychlorure de phosphore en présence d'un phosphate de trialkyle, de préférence à une température de l'ordre de OOC ou moins. D'autres méthodes intéressantes de préparation du monophosphate comprennent la réaction d'un composé de formule II avec l'oxychlorure de phosphore dans de la pyridine anhydre. le composé (II) peut être oonsidéré comme un intermédiaire de la synthèse des composés de formule (I) et il peut être obtenu par les méthodes qui sont décrites dans la demande de brevet britannique au nom de la Demanderesse précitéeN 38278/74. la conversion d'un composé de formule (III) par la méthode bpeut se faire de diverses manières. Par exemple, si G est un halogène ou bien un groupe mercapto ou alkylthio tel que méthylthio, il peut être transformé en un groupe amino par ammonolyse, méthode qui, ainsi que d'autres méthodes connues, se trouvent dans l'ouvrage "'Heterocyclic Compounds - Fused Pyrimidines,Part II,Purines,éd. par D.J. Brown (1971), publié par Wiley - Interscience". M peut aussi être un halogène ou un groupe mercapto ou alkylthio, pouvant être transformé en un groupe hydroxy par des méthodes d'hydrolyse qui sont également dé cri- tes dans l'ouvrage ci-dessus. les composés de formule (III) peuvent être considérés comme des produits intermédiaires de la synthèse des composés (I) et ils peuvent être préparés d'une manière analogue par la méthode (a), qui à leur tour peuvent être obtenus d'une manière analogue selon les méthodes dUcqites dans la demande de brevet britannique précitée. Des sels pour usages pharmaceutiques du monophosphate de 9-(2-hydroxyéthoxyméthyl)guanine peuvent être formés par neutralisation du monophosphate sous sa forme acide avec un équivalent d'une base telle qu'un hydroxyde, un bicarbonate, ou un carbonate du cation voulu tel que sodium, potassium, ammonium, calcium, lithium, magnésium ou aluminium. On peut également les obtenir par des réactions d'échange en traitant un sel du monophosphate avec une solution, de préférence aqueuse, d'un sel du cation voulu, par exemple en traitant le sel de baryum faiblement soluble du monophosphate de 9-(2-hydroxyéthoxyméthyl)guanine, en suspension aqueuse, avec du sulfate de sodium de manière à éliminer le baryum sous forme de sulfate très insoluble et à obtenir en solution le sel sodique du monophosphate de 9-(2-hydroxyéthoxyméthyl)guanine. La présente invention comprend aussi les compositions pharmaceutiques (médicaments) comprenant comme matière active un composé de formule (I) ci-dessus, avec un véhicule pour usages pharmaceutiques. Les véhicules pour usages pharmaceutiques sont destinés à l'administration des médicaments et peuvent être des matières solides, liquides ou gazeuses, inertes et médicalement acceptables et compatibles avec l'ingrédient actif. Les médicaments peuvent être administrés par la voie orale, parentérale, rectale ou vaginale ou encore locale sous forme de pommades ou crèmes, aérosols ou poudres, gouttes oculaires ou nasales, suivant qu'il s'agit de traiter des infections virales internes ou externes. Dans le cas d'infections internes, les corps actifs sont donnés à des doses de 0,1 à 250 mg/kg en phosphate libre, de préférence de 1 à 50 mg/kg, de poids corporel du mammifère traité, et ils sont utilisés chez l'homme sous forme de doses unitaires ou unités de prise qui sont administrées par exemple un certain nombre de fois par jour à raison d'une ou plusieurs unités pouvant contenir chacune 1 à 800 mg, de préférence 1 à 250 mg, mieux encore 10 à 200 mg. Pour l'administration parentérale-ou encore l'administration locale en gouttes, par exemple pour le traitement d'infections oculaires, les corps actifs de formule (I) peuvent être présentés en solutions aqueuses à une concentration d'environ 0,1 à 10 % en poids par volume, de préférence de 0,1 à 7 % et mieux encore de 0,2 à 5 %. Par ailleurs, pour des infections de l'oeil ou d'autres tissus externes comme ceux de la bouche ou de la peau, des formules d'application locale telles que solutions, pommades ou crèmes, sont préférables, la concentration du corps actif pouvant être alors de l'ordre de 0,1 à 10 %, de préférence de 0,3 à 6 eX et mieux encore de 3 /4. Cette invention comprend aussi l'utilisation des composés de formule Ci) pour le traitement d'infections virales chez les mammifères par administration d'une quantité antivirale non toxique, efficace in vivo. Les exemples qui suivent illustrent la présente invention. EXEMPLE 1 Monophosphat e de 9-(2-hydroxyé thoxyméthyl) guanine. On ajoute en une seule fois 0,03 ml d'oxychlorure de phosphore à une suspens ion agitée de 20 mg de sehloro-9 42-hydroéthoxyméthyl)hypoxanthine dans 0,3 ml de phosphate de triéthyle, à -80C, puis on laisse revenir la température à OOC en 30 minutes, on agite ensuite le mélange à 0 C pendant 40 minutesed +5 Cpendant 50 minutes, on le verse alors sur de la glace et on ajuste le pH à 7 avec de l'hydroxyde de potassium binormal. On extrait la solution deux fois avec chaque fois 2 ml de chloroforme, on ajuste la phase aqueuse à pH 8-8,5 avec de l'hydroxyde de potassium 2N et on ajoute 105 mg d'acétate de baryum.On sépare par filtration le précipité de phosphate de baryum formé et on traite le liquide surnageant avec un grand excès d'éthanol pour précipiter le sel de baryum brut du monophosphate de 2-chloro-9-(2-hydroxy éthoxyméthyl)hypoxanthine que l'on recueille par filtration et que l'on met en suspension dans de méthanol. La suspension éthanolique est chauffée au bain-marie pendant quelques minutes puis elle est refroidie et filtrée, et en lavant le précipité recueilli avec de l'éther anhydre puis en le séchant, on obtient 26 mg du sel de baryum du monophosphate de 2-chloro-9 (2-hydroxyéthoxyméthyl)hypoxanthine. On ajoute 3,96 mg de sulfate d'ammonium à une suspension agitée de 7 mg de ce sel de baryum dans 0,5 ml d'eau, on continue à agiter le mélange à la température ambiante pendant 15 minutes puis on le refroidit dans un bain glacé, on sépare par filtration le précipité de sulfate de baryum et on le lave avec 1 ml d'eau et 10 ml d'éthanol. Le filtrat et les liquides de lavage réunis sont ensuite évaporés sous pression réduite et la matière restante est dissoute dans 3 ml de méthanol puis la solution méthanolique est placée dans une bombe en acier spécial doublée de Téflon(R) avec 8 ml de méthanol saturés de gaz ammoniac à la température du bain glacé. La bombe scellée est mise dans une étuve à 1220C pendant 4 heures puis elle est refroidie et ouverte et le solvant est évaporé le plus possible. Le mélange restant est analysé par chromatographie en couche mince sur cellulose Eastman sur des feuilles qui sont ensuite développées dans un mélange 70:30 en volumes de n-propanol et d'eau. Les bandes à Rf 0,16 et 0,34 sont excisées puis mises en suspension dans 0,6 ml de tampon Tris à pH 8, et la cellulose est séparée par filtration. Une déphosphorylation enzymatique avec l'alcaline phosphatase montre que ces bandes comprennent le monophosphate de 9-(2-hydroxyéthoxyméthyi)guanine et le monophosphate de 2-chloro-9-(2-hydroxyéthoxyméthyl)hypoxanthine, qui sont transformés respectivement en 9-(2-hydroxyéthoxyméthyl)guanine et 2-chloro-9-(2-hydroxyéthoxyméthyl)hypoxanthine.On ajoute 2/ul d'alcaline phosphatase de Eo coli au filtrat et on chauffe à 320C pendant 2 heures puis on examine par chroma- tographie en couche mince sur des feuilles de cellulose Eastman Chromatogram CR) dans trois systèmes solvants (a) n-propanol:eau (70:30 en volumes) (b) eau (c) n-propanol : hydroxyde d'ammonium concentré : eau (60:30:10 en volumes). On observe deux taches dans chaque système, qui correspondent à la 9-(2-hydroxyéthoxyméthyl)guanine (A) et à la 2-chloro-9-(2-hydroxyéthoxyméthyl)hypoxanthine (B). Système solvant Rf (A) Rf (B) Rf du produit de la réaction (a) 0,51 0,64 0,51 et 0,65 (b) 0,68 0,97 0,67 et 0,97 (c) 0,51 0,71 0,51 et 0,71 EXEMPLE 2 Monophosphate de 9-(2-hydroxyé thoxyméthyl ) guanine On ajoute 0,76 ml d'oxychlorure de phosphore à un mélange agité refroidi à -100C de 0,225 g de 9-(2-hydroxy éthoxyméthyi)guanine et de 5 ml de phosphate de triéthyle, puis on laisse la température revenir à OOC en 30 minutes et on maintient cette température pendant 2 heures0 On verse ensuite sur un mélange de glace et d'eau, on ajuste le pH à 7 avec de l'hydroxyde de potassium 2N et on extrait la solution deux fois au chioroformet et une fois à l'éther.Le pH de la solution aqueuse restante est ensuite ajusté à 7,1 avec de l'hydroxyde de potassium 2N et la solution est lyophilisée. On dissout la substance solide blanche ainsi obtenue dans 7 il d'eau et on ajoute 7 ml de méthanol pour précipiter les sels minéraux qui sont séparés par filtration. En ajoutant 70 ml d'acétone au filtrat on précipite une matière gommeuse blanche que l'on dissout dans 7 il d'eau, puis on ajoute 7 il d'éthanol et on filtre, et en ajoutant un grand excès d'acétone (70 ml) on précipite de nouveau la matière gommeuse que l'on dissout dans 20 il environ d'éthanol, puis on élimine le solvant par évaporation brusque, ce qui laisse 2,6 g d'une poudre blanche qui est un mélange de sels minéraux et du phosphate cherché.On dissout cette matière solide dans 10 ni d'eau, on verse la solution sur une colonne de 2,7 x 90 ci de Bio-Gel P-2 en grains de 30 8 75 microns et on élue avec de l'eau. La majo- rité du monophosphate est éluée dans un volume de 50 ni après que l'on a recueilli 166 ml d'éluat, ce que montre la chroma- tographie en couche mince sur de la cellulose Eastman Chromagram(R) dans un mélange 70::30 en volumes de n-propanol et d'eau t Rf = 0,26 pour le phosphate de 9-(2-hydroxyéthoxyméthyl)guanine et if - 0,11 pour le sel potassique du phosphate de 9-C2-hydroxy- éthoxyméthyl)guanine. En lyophilisant l'éluat on obtient 0,28 g d'une substance solide dont la spectroscopie ultraviolette montre qu'elle contient 0,2 g du monophosphate formé. Essais de~toxicité pour le monophosphate de 9-(2-hydroxyéthoxymethyl)guanine : A - Résultats de mesures de tissus La DE50 d'inhibition de la division cellulaire par cette substance a été déterminée sur la ligne cellulaire humaine D 98 et sur la lignée cellulaire de la souris (L) : Pour la lignée D 98 : DE50 j 10-4 M I.E. Pas d'inhibition jusqu'a lO M Pour la ligne L : DE50 = 1,4 x lO M B - Résultats sur animaux La substance a été administrée à un nombre limité d'animaux dans la poursuite de l'étude de son métabolisme, pour que l'on observe des symptômes de toxicité Souris (3) : Dose 32 ma/kg voie orale, pas de symptômes de toxicité Rat (1) : Dose 25 m/ko voie orale, pas de symptômes de toxicité Chien (1) : Dose 32 m/k voie orale, pas de symptômes de toxicité Chien (1) : Dose 80 m/ka voie orale, pas de symptômes de toxicité. Exemple 3 Sel d'ammonium du monophosphate de 9-(2-hydroxyéthoxy méthyl) guanine On dissout 0,28 g de phosphate de 9-(2-hydroxy éthoxyméthyl)guanine dans 30 ml d'eau, on ajuste le pH de la solution à 6 avec de l'acide chlorhydrique 6N et on fait adsorber le produit sur 14 ml de charbon actif tassé (Fischer 5-690B, en grains de 75 à 300 microns, lavé à l'acide et désactivé avec du toluène). Le charbon est ensuite bien lavé à l'eau puis on élue avec 70 ml d'éthanol aqueux à 60 % contenant 2 z d'hydroxyde d'ammonium concentré, et l'évaporation du solvant sous pression réduite laisse 0,048 a du sel d'ammonium du monophosphate de 9-(2-hydroxyéthoxyméthyl)guanine ; Rf = 0,30 sur cellulose Eastman dans le mélange 70:30 en volumes de n-propanol et d'eau. EXEMPLE 4 : Comprimé Sel sodique du phosphate de 9-(2-hydroxyéthoxyméthyl) guanine ............... ............. 100 mg Lactose ...................................... 200 mg Amidon 0 50 mg Polyvinyl-pyrrolidone ......................... 5 mg Stéarate de magnésium ......................... 4 mg Poids total : 359 mg EXEMPLE 5 :Solution ophtalmique Sel sodique du phosphate de9-(2-hydroxyéthoxyméthyl) guanine ................................ 1,0 g Chlorure de sodium, réactif analytique .......... 0,9 g Thimerosal ....................................... 0,001 g Eau purifiée q.s. pour ......................... 100 ml pH ajusté à ..................................... 5,5-7,5 BZu-LPLE 6 s Solution injectable Sel sodique du fiho6Fhate de 9-(2-hydroxyéthoxDméthyl) guanine ................................. 0,775 g Tampon au phosphate stérile, apyrogène, à pH 7 25 mi EXEMPTE 7 Sel disodique du phosphate de 9-(2-hydroxyéthoxy méthyl ) guanine On ajoute en 3 heures 54 ml d'oxychlorure de phosphore à un mélange agité et refroidi entre -30 et -200C de 25 g de 9-(2-hydroxyéthoxyméthyl)guanine et de 250 ml de phosphate de triéthyle, puis on laisse la température revenir à 0 C en 45 minutes et on maintient cette température pendant encore 45 minutes. On verse alors dans un mélange de glace et d'eau, on ajuste le pH à 1 environ avec de l'hydroxyde de sodium binormal et on extrait la solution une fois au chloroforme et une fois à l'éther. Le pH de la solution aqueuse restante est ensuite ajusté à 6,8 avec de l'hydroxyde de sodium 2N puis à 7,3 avec de l'hydroxyde de sodium 10N, ce qui donne un volume final de 2 litres 1/2. La solution neutralisée est versée sur une colonne de 2.000 g de Dowex I x 8 qui a été équilibrée avec 50 mM de KHCO3, on élue avec 30 1 de KHCO3 suivant un gradient linéaire de 50 à 500 mM puis on lave avec 30 1 de ENC03 à 500 m8. Les fractions contenant le produit sont réunies et la majeure partie du XHCO3 est enlevée par addition de Dowex 50-H+ et élimination du C02 sous vide. Le volume est ensuite réduit à 2 1 sous vide et le produit est précipité à 40C par addition de 10 1 d'acétone. Le précipité séché (55 g) est appliqué sur une colonne de 10 x 110 cm de Bio-Gel P-2 et on élue à liteau, ce qui donne 22 g de matière solide que l'on recristallise à 40C sous la forme du sel acide à partir d'une solution aqueuse à pH 3, et on obtient une nouvelle quantité de matière de la liqueur mère par cristallisation dans de méthanol à 20 % à pH 3.Le sel acide est dissous dans un volume minimal d'eau, on ajuste à pH 8,5 avec NaOH et on précipite avec 2 volumes d'éthanol à 40C. On dissout le précipité dans 100 ml d'eau et en reprécipitant avec 9 volumes d'éthanol à 40C, on obtient 15,1 g du sel disodique du monophosphate de 9-(2-hydroxyéthoxy- méthy)guanine sous la forme du dihydrate. La pureté de ce produit est confirmée par l'ana- lyse élémentaire, la chromatographie en phase liquide à haute pression et les spectres UV. Formule brute : C8H12N5O6P 2Na 2H2O calculé s C 24,94 % ; H 3,66 * ; N 18,19 % ; P 8,04 % trouvé s C 25,20 % ; H 3,63 % ; N 18,10 % ; P 7,89 % Spectres W : Solvant # max # #min ep 0,1M HCl 254 12970 225 272 pH 7 209 14060 219 266 0,1m NaOH 255-264 11760 228 Pureté par chromatographie liquide à haute pression : 99 %. Rapport base/phosphate : 1,00/1,01. REVENI)ICÂTION8 t.- Les dérivés de la 9-hydroxyEthox > séthyl guanidine de formule I ci-dessous dans laquelle W et Z, qui peuvent être identiques ou différents, sont chacun l'hydrogène ou bien un cation acceptable pour des usages pharmaceutiques. 2.- Composé sella la revendication 1, dans lequel le cation est le cation sodium, potassium, calcium, magnésium, aluminium, lithium ou ammonium. 3.- Composé selon la revendication 2, dans lequel Z est le sodium, le potassium ou le cation ammonium et W l'hydrogène. 4. - Composition pharmaceutique (médicament) comprenant comme matière active un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, avec un véhicule pour usages pharmaceutiques 5.- Procédé de préparation des composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, selon lequel on fait réagir un composé de formule II avec un agent de phosphorylation pour former un composé de formule I dans lequel W et Z sont tous deux l'hydrogène, et le cas échéant on transforme ce composé en un composé dans lequel W ou Z ou les deux sont des cations pharmaceutiquement acceptables, par réaction avec une base ou avec un sel contenant le cation voulu. 6. - Procédé de préparation des composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, selon lequel on transforme en un composé de formule I un composé de formule III (dans laquelle ou bien Y est un groupe 6-hydroxy et G un atome ou un groupe pouvant être remplacé par ou converti en un groupe amino par une ammonolyse sélective, ou bien G est un groupe 2-amino et M un atome ou un groupe pouvant être remplacé par ou converti en un groupe hydroxy par une hydrolyse sélective), et le cas échéant on transforme le composé obtenu en un composé dans lequel W ou Z ou les deux sont des cations pharmaceutiquement acceptables, par réaction avec une base ou avec un sel contenant le cation voulu. 7.- Procédé selon la revendication 5, dans lequel l'agent de phosphorylation est un dérivé de l'acide phosphorique pouvant avoir un à trois hydroxyles remplacés par des halogènes, en particulier l'oxychlorure de phosphore. 8.- Procédé selon la revendication 7, dans lequel jusqu'à deux groupes hydroxy de l'acide phosphorique sont substitués en groupes alcoxy pouvant éventuellement porter d'autres substituants. 9.- Procédé selon la revendication 7, dans lequel on fait réagir le composé de formule II avec l'oxy- chlorure de phosphore en présence d'un phosphate de trialkyle à une température de OOC ou moins. 10.- Procédé selon la revendication 7, dans lequel on fait réagir le composé (II) avec 1'oxychlorure de phosphore dans de la pyridine anhydre. 11.- Procédé selon la revendication 6, dans lequel on transforme en composé de formule I par ammonolyse, un composé de formule III dans lequel M est un groupe 6-hydroxy et G un halogène ou bien un groupe mercapto ou alkylthio. 12.- Procédé selon la revendication 6, dans lequel on transforme en composé de formule I, par hydrolyse, un composé de formule III dans lequel M est un halogène ou un groupe mercapto ou alkylthio et G un groupe 2-amino. 13.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 12, dans lequel la base avec laquelle on fait réagir le composé de formule I dans lequel W et Z sont tous deux l'hydrogène est un hydroxyde1 un bicarbonate ou un carbonate du cation voulu.