Brevet FR2392674A1 — publié le 19781229

La présente invention a pour objet des com- positions pharmaceutiques ou dermopharmaceutiques contenant de i'élastine. Dans la demande de brevet N 76 16 602 du 2 juin 1976 , la Demanderesse a décrit l'application de l'élastine en cosmétique. La Demanderesse ayant poursuivi ses études physiologiques et pharmacologiques a constaté que l'elas- tine pouvait être utilisée en thérapeutique, notamment sous forme de compositions dermopharmaceutiques L'élastine utilisable selon l'invention est extraite , préparée et purifiée de préférence a la manière décrite dans la demande de brevet N 76 16602.On distinguera d'une part l'élastine fibreuse, constituée essentiellement par des mo lécules de protéine de haut poids moléculaire ( > 50 000), ayant un degré de réticulation élevé et pratiquement insoluble dans tous les solvants et, d'autre part, l'élastine soluble obtenue par hydrolyse de l'élastine fibreuse, constituée par des peptides de poids moléculaire de l'ordre de 500 à 60 000. D'une manière générale la-composition de l'élastine en acides aminés est déterminée génétiquement. et dépend essentiellement de l'espèce dont l'élastine est extraite. Elle est constante pour une espèce choisie. Elle est caractérisée en particulier par le rapport hydroxyproline hydroxyproline + proline qui rend compte de la non contamination de la préparation par le collagène, et par la présence d'amino-acides pontiques dans le rapport desmosine + isodesmosine ~ 0,6 4 lysine qui traduit le degré de pontage de l'élastine (voir P. Comte et L. Robert, Bull. Soc. Chim. Biol.- 50/7-8, 1968, p. 1349 1351). L'élas;LIne utilisable selon l'invention est aussi caractérisée par sa sensibilité à l'élastase pancréatique. A 370C et à pH 7,9 il suffit de 15 minutes pour qu'au moins 98 % de I'élastine fibreuse soit solubilisé par l'élastase utilisée dans un rapport de 1/100. L'exemple ci-dessous donne une méthode pratique de préparation de l'élastine utilisable selon l'invention. EXEMPLE Des ligaments larges de bovidés sont utilisés pour cette préparation. Le tissu sans dégraissage préalable est découpé en petits morceaux à la température de la chambre froide et suspendu dans 1 litre pour 100 g de tissu frais d'un dEter- gent cationique comme par exemple le chlorure de cétylpiridinium à 5 % (50 g par litre). Le tissu est porté à l'ébullition pendant 120 minutes soit encore mis à l'autoclave pour 60 minutes (110 C). Ensuite, le surnageant est décanté et l'opération est répétée une deuxième fois Les surnageants réunis contiennent les protéines autres que l'élastine ; le résidu tissulaire contient I'élastine purifiée. Notamment, on lave à l'acétone ou on lyophilise et on équilibre à environ 20 % d'humidité pour préservation. Pour solubiliser cette élastine purifiée, on y 3 ajoute 100 cm de triglycéride par 100 g d'élastine séchée (trioléine, trilinoléine, tripalmitine), ou encore d'autres esters du glycérol mono- di- ou tri-, selon l'acide gras que l'on souhaite incorporer dans la préparation d'élastine.A ce mélange, on ajoute 1 litre de potasse 1M en solution aqueuseorganique (éthanol aqueux à 80%, butanol tertiaire à 50%, propylène-glycol à 50% ou tout autre mélange de solvants organiques qui pourrait convenir pour le conditionnement des peptides d'élastine. On agite uniformément la suspension à 370 (ou toute autre température plus faible ou plus forte selon que l'on souhaite ralentir ou accélérer la solubilisation de l'élastine). Dès l'obtention d'une solution homogène, on neutralise soit avec l'acide acétique, soit avec l'acide perchlorique, on élimine l'excès de sels soit par passage sur colonne d'échangeur d'ions cationiques, par exemple résine de cholestyramine (Dowex 50) soit par passage sur colonne de gel-filtration de dextrane (Sephadex G25 par exemple-ou Sephadex de la série LH lipophyle) soit encore par centrifugation en cas d'utilisation de perchlorate. Cette méthode produit une élastine soluble saturée d'acides gras à la suite de la cohydrolyse des trigly cérides et de l'élastine. On obtient environ 30 g d'élastine à partir de 100 g de tissus.Cette méthode peut être modifiée à volonté par exemple en n'effectuant qu'une hydrolyse partielle de l'élastine sans solubilisation totale pour obtenir des préparations d'élastine saturées de lipides et encore insolubles. I1 suffit pour cela de diminuer la concentration en potasse, la température d'hydrolyse et le temps d'action-de la potasse. L'élastine étant hydrophobe et hydrophile à la fois ,- peut être considérée comme un détersif biologique à action très douce et, à cet effet, peut autre incorporée dans des liquides, pommades, onguents ou gels, etc... . Elle est compatible avec plusieurs types de substances actives aussi bien hydrophiles que lipophiles et peut être avantageusement utilisée en mélange avec de telles substances. En plus, l'élas- tine fibreuse a des propriétés d'adsorption particulières lui permettant d'adsorber et d'éliminer des corps gras hydrosolubles ou liposolubles. L'élastine soluble, à cause de sa compatibilité avec les solvants lipidiques et aqueux, pénètre bien dans les téguments. Ces diverses propriétés ont amené la Demanderesse à effectuer des essais pharmacologiques approfondis en vue de l'utilisation de l'élastine dans le domaine thérapeutique et notamment dermopharmaceutique TOXICOLOGIE a) - Tolérance oculaire Un essai de tolérance oculaire a été éffectué sur le lapin. 0,1 ml d'une solution à 5% d'élastine soluble a été instillé dans la paupière inférieure Aucun signe d'irritation oculaire n'a été observé ni immédiatement ni au cours des 8 jours qui ont suivi le traitement. b) - Tolérance cutanée Un essai de tolérance cutanée a été effectué sur la peau epilée du rat blanc. Deux crèmes à base de mono-distéarate de propylène- glycol émulsionné dans l'eau ont été utilisées : l'une conte- nant 10% d'élastine fibreuse et l'autre 5% d'élastine soluble. 0,5 g de ces crèmes ont été appliquées chaque jour sur les surfaces cutanées prépares et le traitement s'est poursuivi pendant 4 semaines. Les effets ont été comparés à ceux de l'excipient seul appliqué dans les mêmes conditions. Aucun signe d'irritation primaire ni aucun signe d'agressivité superficielle n'ont êté observes ni avec l'une ni avec l'autre des deux crèmes. L'étude histologique d'échantillons de peau prélevés en fin de traitement n'a révélé aucun-signe d'inflamma- tion ou d'irritation au niveau des peaux traitées. Par contre des colorations spéciales (orcéine-piro-indogo-carmin et Mallo- ry-Heidenhain) ont mqntré qu'il y avait plus de matériel prenant la coloration de l'élastine dans le derme des peaux trai tées, faisant penser que l'élastine présente dans les prépara tions pouvait pénétrer dans la peau des rats. PHARMACOLOGIE L'activité pharmacologique des deux crèmes, l'une à 5% d'élastine soluble, l'autre à 10% d'élastine fibreuse a été étudiée d'une part sur la peau non incise, d'autre part sur le tissu cicatriciel cutané. Ces études ont été réalisées chez le rat dont la peau des flancs, préalablement épilée, a été incisée d'un côté sur 3 ou 4 cm, l'incision étant ensuite refermée parties agrafes. Les peaux non incisées et les peaux incisées ont été traitées par applications quotidiennes de l'une-des 2 crè- mes ou du témoin (excipient seul), pendant 4 semaines. A l'issue du traitement, des échantillons de peaux et de cicatrices ont été préIeves pour des études morphologiques ou biochimiques a) - Etudes morphologiques. Les résultats obtenus sur les cicatrices sont identiques quelle que soit la crème utilisée, à ceux obtenus sur les peaux non incisées, à savoir que le matériel possédant les propriétés tinctoriales de l'élastine est beaucoup plus abondant dans le derme des cicatrices traitées par l'élastine, le collagène étant, au contraire, prépondérant dans celles traitées par l'excipient. Par ailleurs, la trame conjonctive est plus dense dans le tissu cicatriciel des animaux traités que chez les te- moins, bien que la cicatrisation soit terminez chez les uns comme chez les autres. b) - -Etudesbiochimiques Des échantillons de peau et de tissu cicatriciel ont été incubés en présence de proline-C14 puis extraits par différents solvants pour séparer les 4 macromolécules du conjonctif dermique : protéines solubles, collagène, glycoprotéines de structure et élastine Le dosage des proteines et des hexosamines, l'incorporation de la proline-C14 dans les différents extraits a permis d'apprécier l'activité biosynthétique des peaux trai tées. De cette étude, il ressort que les deux préparations exercent une action nette sur la biosynthèse des macromolécules de la matrice intercellulaire cutanée. Cette action est différente selon qu'il s'agite peau non incisée ou de cicatrices. Sur la peau non incisée, les produits agissent surtout sur la biosynthèse des protéines de l'extrait MgC12 (protéoglycanes, protéines solubles) et de l'extrait T.C.A., c'est-à-dire acide trichlnracétique (collagène) : voir Tableau A ci-dessous. Sur les cicatrices, les produits agissent surtout sur la biosynthèse de l'extrait guanidine (glycoprotéines de structure) et potasse-éthanolique (élastine) voir Tableau B ci-dessous. T A B L E A U A Excipient Elastine soluble Elastine fibreuse 5% 10% MgCl2 % % % Protéines 4,8 mg 11,3 7 mg 13,5 4,7 mg 13,8 Radioactivité 191.331 cpm/mg 40,8 178.567 cpm/mg 49 140.380 cpm/mg 37,2 Haxosamibes 265 g 3,5 380 g 6,4 T.C.A. Protétines 26,4 mg 62,4 30 mg 58 18,4 mg 54 Radioactivité 3.652 cpm/mg 0,7 8,226 cpm/mg 2,3 6,380 cpm/mg 1,7 Hexosanines 477 g 1,18 675 g 1,7 T A B L E A U B Exeipient Elastine soluble Elastine fibreuse 5% 10% % % % Guanidine Protéines 13,3 mg 19,6 12,1 mg 20 12,1 mg 27,6 Radioaotivitè 119.325 cpm/mg 20,6 90.905 cpm/mg 21,5 77.325 cpm/mg 25,2 Hexosamines 208 g 2,7 495 g 3,7 KOE-EtOH Protéines 2,7 mg 4 2,9 mg 4,8 3,3 mg 7,3 Radioactivité 187.770 cpm/mg 32,4 187.073 cpm/mg 44,3 81.366 cpm/mg 26,3 Il est intéressant de constater l'action obtenue avec la crème à 5 % d2élastine soluble ; elle consiste en une augmentation de l'activité biosynthétique des protéines de l'extrait contenant l'élastine fibreuse. Ces résultats recoupent ceux des études morphologiques et prouvent que l'élastine contenue dans les préparations, augmente le contenu en élastine des cicatrices traitées soit en y pénétrant, soit en y stimulant l'élastigénèse, soit les deux. Par conséquent, elle peut être utilisée en dermopharmacie, notamment pour le traitement des plaies, brulures, gerçures et de toute affection cutanée nécessitant un reconditionnement metabolique des cellules du derme et de l'épiderme. Exemples de formulations de médicaments Crème traitante (émulsion) Elastine soluble , 5 5 parties Mono/distéarate de propylèneglycol. 17 Agent conservateur..............0,01" Eau distillée q.s.p.. 100 parties. Gel Elastine soluble ................. 3 parties Polymère carboxyvinylique (Carbopol 940).................. 2 " Agent conservateur.............. 0,01 " Eau distillée q.s.p. 100 parties. Crème Elastine polymérique .......... 2 parties Huile de flétan .................. 1 Lactosérum .................... 17 Lanoline - 40 Vaseline ...................... 40 REVENDICATIONS 1.- Composition pharmaceutique ou dermopharmaceutique contenant de l'élastine. 2.- Composition dermopharmaceutique contenant de 1 à 20 % en poids d'élastine fibreuse. 3.- Composition dermopharmaceutique contenant de 1 à 10 % en poids d'élastine soluble.