Brevet FR2359873A1 — publié le 19780224

L'invention a pour objet un procédé de préparation de plaques d'un nouveau gel-polymere employé seul ou en association avec des polysaccharides tels que l'agar-agar ou l'agarose pour la séparation électrophorétique des lipoprotéines sériques ou plasmatiques sous l'action d'un gradient discontinu. Ledit gel-polymère est, par ailleurs, fixé sur un film polyester transparent qui sert de support mécanique. L'invention concerne également les plaques séchées et réhydratables obtenues par le procédé. Actuellement, la séparation des lipoprotéines humaines est effectuées sur des supports naturels tels que l'agarose, l'agar-agar et le gel d'amidon ou sur des supports synthétiques tels que l'acétate de cellulose ou les gels de polyacrylamide. ? Dans le cas des supports à base d'agarose de gélose et d'acétate de cellulose, la séparation éleotrophorétique obtenue montre quatre fractions caractéristiques appelées dans l'ordre croissant de leur mobilité : bêta lipoprotéines, pré-béta lipoprotéines, alpha lipoprotéines, et pré-alpha lipoprotéines. Lorsque dans des cas pathologiques, il y a présence dans le sérum de micelles de corps gras en suspension appelées chylomicrons, l'électrophorèse présente normalement une trace plus ou moins forte au point de départ de la migration, révélée par les colorant liposolubles. Dans la majorité des cas néanmoins, le mécanisme est plus compliqué. En raison de la variabilité de leur taille, les chylomicrons se séparent en trois parties : une partie sur une ligne (ou trace) située au point de départ, une partie sur une trainée entre le départ et la fraction béta et une partie sur une bande de mobilité pratiquement identique à celle des pré-béta lipoprotéines. Les quantités de ces trois formes varient suivant les cas et surtout suivant le support utilisé pour l'électrophorèse. I1 est évident que ce résultat n'est pas une image de la réalité, ce qui entraîne des interprétations difficiles et des erreurs analytiques importantes. Dans le cas de supports classiques à base de polyacrylamide et de gel d'amidon, la difficulté se situe au niveau de la migration des béta et des pré-béta lipoprotéines. En effet, en raison de la très petite taille des pores des gels, ces molécules ne peuvent pas se déplacer. Des tentatives permettant la migration des lipoprotéines en gel discontinu de polyacrylamide ont toutefois été effectuées endiminuant à llextrême la concentration du polymère. Ces gels, trop mous pour etre manipulés sont coulés à l'intérieur d'un petit tube en verre dans lequel s'effectue la migration électrophorétique. Malgré les assez bons résultats obtenus, leur interprétation reste difficile en raison de l'impossibilité d'effectuer une évaluation quantitative correcte des fractions colorées, par densitométrie. Les plaques préparées selon l'invention permettent d'éviter la plupart des inconvénients. Les chylomicrons sont arrêtés en totalité au niveau du réservoir de départ, les pré-béta lipoprotéines sont arrêtées au niveau du gradient discontinu, les bêta lipoprotéines, les alpha et pré-alpha lipoprotéines sont séparées par leur différence de mobilité dans la zone plus concentrée du gel-polymère. La lecture densitométrique d'une telle image ne présente plus l'inconvénient des cylindres et enfin, il y a la possibilité de sécher la plaque à l'air après utilisation pour obtenir ainsi un film souple et transparent de conservation facile. La plaque est constituée d'un support plastique polyester transparent sur une face duquel est stratifié le gel-polymère. La face du support plastique qui reçoit le gel est préalablement traitée par des procédés chimiques courants pour la rendre mouillable. Le gel-polymère se divise en deux zones de concentration différente, la première occupant les deux tiers de la surface disponible. La ligne de séparation des deux gels de même nature mais de concentration différente, est rectiligne. Le gel-polymère est obtenu par polymérisation radicalaire sous l'action des péroxydes ou de rayons ultraviolets de la N-méthylol-acrylamide et d'un agent allylique ou acrylique bifonctionnel assurant la réticulation et ainsi la disposition tridimensionnelle du polymère. Comme excipient conférant une bonne harmonie à la migration, il a été trouvé conformément à l'invention, qu'il était possible d'ajouter des polysaccharides anioniques contenant uniquement des groupements C00H comme par exemple, l'agarose à forte électroendosmose connu sur le marché sous la dénomination d'AGAROSE HEEO et vendu par la société Marine Colloids, Inc., Rockland, Maine 04841, U.S.A. Le procédé de préparation selon l'invention consiste à préparer à chaud deux solutions aqueuses ou tamponnées de polysaccharide à forte électroendosmose contenant chacune les éléments nécessaires à la formation du polymère. On verse chacune des solutions à des temps bien déterminés dans un moule plastique contenant le film polyester, on laisse refroidir le gel, on démoule le gel, et on le lave dans une solution isotonique. On obtient ainsi un gel tamponné d'une épaisseur donnée, de forme préétablie par le moule et fixé sur la feuille de polyester. L'ensemble dénommé lipofilm, peut être conservé à la température de 40 C, protégé par une enceinte telle que : une boîte plastique fermée ou un sachet polythène ou aluminium scellé. Les concentrations en monomères sont de 2,5 % et de 7,5 % de réticulation pour la première couche et de 2,0 % et 10-17 % de réticulation pour la deuxième couche. La concentration en polysaccharide peut etre variable et comprise entre 0,1 % et 1 %. La polymérisation radicalaire peut être effectuée par un des systèmes catalyseurs suivants - NNN'N' Tétraméthyléthylènediamine-persulfate d ' ammonium - NNN'N' Tétraméthyléthylénediamine-Riboflavine-Eau oxygénée-rayons ultra violets. Les produits allyliques ou acryliques bifonctionnels servant à la réticulation peuvent être de nature différente selon la nécessité d'obtenir un gel insoluble ou un gel soluble. La détermination de cette caractéristique du gel est fonction du procédé choisi pour l'évaluation quantitative des fractions lipopro téiques : gel insoluble pour une étude densitométrique, gel soluble dans des solvants chimiques appropriés pour une étude par élution. Les monomères bifonctionnels sont les suivants - NN' méthylène bis-acrylamide : gel insoluble - Diallyltartramide : gel soluble dans 2 % d'acide périodique - Ethylène-diacrylate : gel soluble en milieu basique. Conformément à l'esprit de l'invention, les plaques de gel-polymère peuvent aussi être traitées de façon à les rendre déshydratées et réhydratables par des traitements chimiques simples. En effet, il a été établi que si le gel est lavé dans une solution composée d'un mélange d'un sucre simple, d'un di ou triol et d'un polysaccharide carboxylique. préalablement traitée par un agent de réduction. il est possible d'obtenir un gel qui peut être séché à l'air et reprendre ses caractéristiques initiales par réhydratation dans l'eau distillée. Le sucre simple peut être, par exemple, le sorbitol utilisé à des concentrations inférieures ou égales à 10 %. Pour les polysaccharides carboxyliques, il s'agit des alginates de sodium ou d'ammonium purifiés et de la carboxyméthyl cellulose soluble sous forme de sel de sodium. Ces produits se caractérisent par une parfaite solubilité en milieu aqueux et par une viscosité inférieure à 30 centipoises à 200 C en solution aqueuse à 1,2 %. Leur concentration dans la solution de lavage est inférieure ou égale à 0,5 %. Le diol et le triol sont respectivement l'éthylène-glycol et le glycérol utilisés à la concentration de 1 %. Les agents de réduction sont des sels minéraux comme par exemple la borohydrure de sodium ou de potassium et l'hydrure d'aluminium lithium utilisés à la concentration de 0,02 %. La réduction doit être effectuée une fois les produits bien solubilisés dans l'eau et elle se, manifeste aussitôt après l'addition de l'agent de réduction, par un- dégagement plus ou moins important d'hydrogène natif. Les exemples suivants donnés à titre non limitatif illustrent l'invention EXEMPLE 1 Dans deux erlenmeyers contenant l'un 40 ml et l'autre 20 ml de tampon trisglycine dont la composition est la suivante Tris hydroxyméthylaminométhane 6 g/l - glycine 26,8 g/l, on dissout respectivement 1,66 ml et 0,66 ml d'une solution aqueuse à 60 % de N-méthylol-acrylamide et 78 mg et 52 mg de N-N'-méthylène-bis-acrylamide. On place les deux solutions dans un bain marie réglé à 450 C. Dans la première solution on introduit 0,02 ml de NNN'N'-Tétraméthyléthylènediamine et 0,53 ml d'une solution de persulfate d'ammonium à 100 mg/ml et on l'injecte immédiatement dans le moule en plastique (ou en verre) prévu à cet effet jusqu'au niveau désiré. Après une attente d'environ 45 minutes, afin que la polymérisation soit complète, on injecte la deuxième solution après avoir dissous à O,D1 ml de NNN'N'-Tétraméthyléthylenediamine et 0,1 ml d'une solution aqueuse de persulfate d'ammonium à 100 mg/ml. Une fois la deuxième polymérisation terminée, le gel est utilisé directement dans le moule. EXEMPLE 2 Dans deux erlenmeyers contenant l'un 40 ml et l'autre 20 ml d'eau distillée ou déminéralisée, on dissout sous l'action de la chaleur respectivement 200 mg et 100 mg d'agarose HEEO. Ensuite, on opère selon l'exemple 1 à la différence que le gel obtenu après polymérisation et refroidissement est démoulé et lavé dans la solution tampon tris-glycine de composition donnée dans l'exemple 1. Après lavage, le gel peut être utilisé ou conservé à 4P C dans un sachet plastique étanche et scelle. EXEMPLE 3 On opère comme à l'exemple 2, à la différence que le moule est formé sur une face par une feuille plastique polyesther activé hydrophile servant de support et sur l'autre par un plastique hydrophobe. Le gel obtenu a une durée de conservation prolongée à l'abri de la chaleur et enfermé dans un sachet plastique étanche. EXEMPLE 4 On opere comme à l'exemple 3, à la différence qu'on remplace le système catalyseur NNN'N' -Tétraméthyléthylénediamine-Persulfate d'ammonium par un système catalyseur composé de NNN 'N' -Tétraméthyléthylènediamine-Riboflavine- eau oxygénée sous l'action de rayons ultraviolets. Les proportions des composants chimiques sont de 0,02 ml de NNN'N'-Tétraméthyléthylènediamine. 0,26 ml de solution aqueuse de Riboflavine à 0,0865 %, 0,028 ml de solution aqueuse d'eau oxygénée à 3 % pour la première couche et de 0,01 ml de NNN'N' Tétraméthyléthylènediamine, 0,13 ml de solution aqueuse de Riboflavine à 0,0865 %, 0,014 ml de solution aqueuse d'eau oxygénée à 3 % pour la deuxième couche. La durée d'exposition aux rayons ultraviolets du moule contenant les solutions à polymériser est de 30-60 minutes pour la première couche et de 60 minutes pour la deuxième couche. Après lavage du gel dans un tampon approprié, le lipofilm peut être immédiatement utilisé ou conservé à 40 C enfermé dans un sachet plastique étanche. EXEMPLE 5 On opère comme à l'exemple 3, à la différence que la NN'méthyléne-bis-acrylamide est remplacée par une quantité égale de diallyltartramide. Le gel obtenu tout en conservant les caractéristiques des gels précédents peut être solubilisé dans une solution d'acide périodique à 2 %, ce qui permet d'éluer les fractions lipoprotéiques pour faire une étude spectrophotométrique sur les solutions obtenues ou pour toute autre étude particulière. EXEMPLE 6 On opère comme à l'exemple 5, à la différence que le diallyltartramide est remplacé par une quantité égale d'éthylène-diacrylate. Le gel obtenu tout en conservant les caractéristiques des gels précédents peut être solubilisé dans une solution d'alcali, ce qui permet d'éluer les fractions lipoprotéiques pour faire une étude spectrophotométrique sur les solutions- obtenues ou pour toute autre étude particulière. EXEMPLE 7 On opère comme à l'exemple 4, à la différence que la NN'méthylêne-bis- acrylamide est remplacée par une quantité égale de diallyltartramide ou d'éthylène-diacrylate. Le gel obtenu par polymérisation photochimique sous l'action des rayons ultraviolets démoulé et lavé peut être utilisé comme indiqué par l'un des exemples 5 ou 6. EXEMPLE 8 On opère comme à l'exemple 3, à la différence que la solution de lavage tampon Tris-glycine est remplacée par une solution permettant d'avoir un gel réhydratable après séchage. Le mode opératoire est le suivant Dans un erlenmeyer contenant 95 ml d'eau distillée ou déminéralisée on dissout sous agitation magnétique 10 g de tD)-Sorbitol, 1 ml d'éthylène-glycol et 0,2 g d'alginate sodique purifié, de viscosité de 20 centipoises, en solution à 1,2 % à 200 C. Après solubilisation complète, on ajoute 20 mg de Borohydrure de sodium. L'agitation est poursuivie jusqu'à extinction totale du dégagement d'hydrogène. La solution obtenue est versée dans un bac placé sur un agitateur horizontal et le gel est plongé dans la solution. Après un lavage d'une durée minimale de douze heures, le gel est mis à sécher à l'air libre. On obtient ainsi un film transparent et souple capable de se réhydrater complètement en deux heures dans un bain d'eau déminéralisée ou distillés. Le gel réhydraté possède toutes les caractéristiques des gels fabriqués aux exemples 1 à 7. EXEMPLE 9 On opère comme à l'exemple 8, à la différence que dans la solution de lavage, l'alginate sodique est remplacé par une quantité égale de carboxyméthylcellulose sodique hydrosoluble ayant les mêmes caractéristiques de viscosité que l'alginate sodique dans l'exemple précédent. Le film obtenu après séchage à l'air possède toutes les caractéristiques d'un gel réhydratable sans qu'il y ait modification de ses caractéristiques initiales. REVENDICATIONS 13 Procédé de préparation de nouveaux gels à l'état hydraté ou réhydratable stratifiés sur un film polyester, caractérisés par le fait qu'ils sont constitués par un haut polymère de N-méthylol-acrylamide dans la structure duquel est inclus un polysaccharide gélifiable contenant des groupements carboxyliques. Lesdits gels sont utilisables pour les séparations électrophorétiques des lipoprotéines sériques ou plasmatiques. 23 Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que le polymère est formé par copolymérisation de la N-méthylol-acrylamide avec un agent allylique ou acrylique bifonctionnel. 33 Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que l'agent bifonctionnel de copolymérisation est de la N-N'-méthylène-bis-acrylamide dans le cas de l'obtention de gels insolubles,de la diallyltartramide dans le cas de l'obtention de gels solubles dans de l'acide périodique à 2 % ou de l'éthylène-diacrylate, dans le cas de l'obtention de gels solubles dans des solutions d'alcalis. 4] Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que le gel est coulé en deux couches de concentration différente (gradient discontinu). 5) Procédé selon la revendication 4 caractérisé par le fait que les concentrations en monomères et en agents de réticulation sont respec tivement de 2,5 % et 7,5 % pour la première couche et de 2 % et 10-17 % pour la deuxième couche. 63 Association selon la revendication 1 caractérisée par le fait que le gel de polysaccharide inclus dans le polymère est un gel d'agarose à forte électroendosmose contenant uniquement des groupements carboxyliques. 73 Procédé selon la revendication 6 caractérisé par le fait que la concentration en polysaccharide est comprise entre 0,1 % et 1 %. 83 Association selon la revendication 1 caractérisé par le fait que le film plastique polyester utilisé comme support est pourvu d'une face hydrophile activée. 93 Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que les gels formés contiennent en association des produits permettant la réhydratation du gel sec. 103 Procédé selon la revendication 9 caractérisé par le fait que les produits permettant la réhydratation du gel sec sont d'abord traités et ensuite inclus dans le gel formé, par lavage. 11) Procédé selon la revendication 10 caractérisé par le fait que les produits permettant la réhydratation sont des polysaccharides à faible poids moléculaire correspondant à une viscosité inférieure à 30 centipoises pour une solution à 1,2 % à 200C. 12) Procédé selon la revendication Il caractérisé par le fait que les poly saccharides utilisés sont chargés négativement par la présence de groupements carboxyliques sous forme de sels de sodium ou ammonium. 13) Associations de polyols aux polysaccharides à faible poids moléculaires utilisés selon la revendication Sa caractérisés par le fait qu'il s'agit de produits simples tels que le Sorbitol, l'éthylène-glycol, et le glycérol utilisés dans des proportions variables entre 1 et 10 %. 143 Procédé selon la revendication 10 caractérisé par le fait que les produits permettant la réhydratation sont traités par des agents de réduction. 15) Utilisation selon la revendication 14 de produits de réduction d'origine minérale appelés hydrures. 16) Utilisation selon la revendication 15 de produites de réduction tels que le Borohydrure sodique ou potassique et l'hydrure d'aluminium Lithium. 173 Utilisation des gels selon l'une quelconque des rayendications 1 à 9 dans les techniques de séparation des lipoprotéines sériques par électropho ruse.