Brevet FR2381103A1 — publié le 19780915

La présente invention est relative à un récipient pour une culture biologique simultanée sur milieux solide et liquide. Elle concerne plus particulièrement la culture d'un prélèvement biologique, par exemple sanguin ou de liquide céphalo-rachidien, sur un milieu i culture en phase liquide et à la surface d'un milieu de culture gélosé, en aérobie ou anaérobie, notamment dans un but d'analyse Actuellement, on utilise à cet effet des récipients formés d'un flacon en verre transparent, de forme généralèment parallélé pipé di que ou trapézoldale, fermé de façon étanche par un bouchon l'une des faces de plus grandes dimensions du flacon est doublée, vers l'intérieur de celui-ci, d'une couche de gélose définissant le milieu solide de culture ; le flacon est par ailleurs partiellement rempli de bouillon de culture liquide, et du mélange gaeux stérile au contact duquel doit se développer la culture, la pression de cette phase gazeuse étant inférieure à une atmosphère pour faciliter l'introduction du prélèvement dans le flacon. Un inconvénient important de tels flacons réside en ce que la couche de gélose solidifiée sur l'une des faces du flacon baigne partiellement dans le bouillon de culture liquide, ce qui d'une part autorise une migration des cultures d'un milieu à l'autre et d'autre part tend à faciliter le décollement de la couche de gelose. Une fixation efficace de cette dernière à la paroi du flacon oblige à donner à celui-ci des formes compliquées, ltadhérence de la gélose au verre étant mauvaise, et l'on ne peut notamment utiliser les flacons cylindriques standards. Enfin, la couche de gélose est difficilement accessible aussi bien visuellement, pour situer et identifier la fin de la culture les différentes colonies de micro-organismes qui se sont multipliées sur la gélosefque par les matériels de prélèvement de ces colonies, respectivement du fait des aberrations chromatiques du verre et du fait que la gélose n'est accessible que par le col du flacon et moyennant de grandes précautions en raison de la proximité immédiate du bouillon de culture liquide. Le but de la présente invention est de remédier à l'ensemble des inconvénients de ces flacons actuelement utilisés pour la culture simultanée sur milieux solide et liquide. A cet effet, il est prévu selon l'invention de loger le milieu solide de culture dans le bouchon du flacons de préférence. On obtient ainsi une bonne dissociation des deux milieux de culture, qui occupent respectivement la partie supérieure et la partie inférieure du flacon ; de plus, le fait que le milieu solide ne baigne plus dans le milieu liquide permet une exploitation maximale de la surface offerte par ce milieu solide, c'est-à-dire en -dlautres termes une économie de milieu solide à surface de culture équivalente et une réduction de l'encombrement des flacons. De plus, la fixation du milieu solide est considérablement améliorée, notamment grace à une conception judicieuse du bouchon, et l'on n'est pas obligé d'utiliser un flacon de forme particulière, tout flacon standard à large col pouvant convenir. Enfin, les colonies développées sur le milieu solide sont plus faciles à observer et à prélever c a r l'on peut dégager totalement la surface du milieu solide offerte à la culture en ôtant le couvercle ; celui-ci est de plus transparent, de préférence, pour faciliter l'observation des cultures en éliminant au mieux les phénomènes de diffraction, sans ouverture du flacon. Le récipient selon l'invention, pour une culture biologique simultanée sur milieux solide et liquide, délimitant intérieurement un volume susceptible de recevoir le milieu liquide de culture à sa partie inférieure, est caractérisé en ee qu'il comporte des moyens pour recevoir le dit milieu solide et pour le retenir dissocié du milieu liquide à l'intérieur du dit volume, au-dessus du milieu maximal du liquide mais en contact avec la même ambiance gazeuse que celui-ci. L'invention sera mieux comprise si l'on se réfère à la description ci-dessous, relative à un mode de réalisation non limitatif, ainsi qu'au dessin annexé qui fait partie intégrante de cette description. La figure unique montre un récipient selon l'invention, en coupe par un plan vertical axial dans sa moitié gauche. Cette figure montre un récipient selon l'invention formé d'un flacon 1 en matériau étanche et de préférence transparent, fermé de façon étanche par un bouchon 2 également en matériau étanche et de préférence transparent ; le flacon 1 est par exemple en verre et le bouchon 2 en une matière plastique. Le flacon t peut etre de tout type connu, et par exemple délimité par une paroi 3 cylindrique de révolution autour d'un axe vertical 4,par un fond transversal 9 i il est ouvert à sa partie supérieure par un col 5 ici également cylindrique de révolution autour de l'axe 4 et présentant de préférence un diamètre aussi grand que possible ; ce col 5 porte,ici extérieurement, un filetage destiné-au vissage du bouchon 2. Le flacon 1 est destiné à être partiellement rempli du bouillon de culture liquide 6, au-dessus du niveau maximal 7 duquel on peut introduire tout mélange gazeux voulu ou établir le vide lorsque l'étanchéité est assurée pile joint 13 mis en place sur le bouchon 2. Le bouchon 2 comporte ici une paroi 8 sensiblement plane et circulaire, orientée sensiblement transversalement par rapport à l'axe 4 lorsque le bouchon est en place ; cette paroi 8 est de préférence transparente, et présente de préférence une épaisseur aussi faible que le permettent les impératifs de résistance mécanique; elle peut être avantageusement renforcée de nervures par exemple radiales. Sur la face interne 10 de la paroi 8, c'est-à-dire sur sa face destinée à être tournée vers le flacon, le bouchon comporte un rebord périphérique 11, cylindrique de révolution autour de l'axe 4 lorsque le couvercle est en place, qui présente un diamètre voisin de celui du col 5 du flacon pour épouser extérieurement ce col 5 le rebord périphérique 11 comporte intérieurement un filetage complémentaire du filetage extérieur du col 5 en vue de la fixation du bouchon sur ce dernier. Le bouchon 2 comporte en outre un rebord 12, ici également cylindrique de révolution autour de l'axe 4 mais d'un diamètre inférieur à celui du rebord périphérique 11 de façon à être placé à l'intérieur du flacon lorsque le bouchon est en place sur ce dernier ; le diamètre extérieur du rebord 12 est de préférence légèrement inférieur au diamètre intérieur du col 5 de façon à permettre l'interposition entre eux d'un joint d'étanchéité souple 13 qui comporte à cet effet une partie 14 cylindrique de révolution autour de l'axe 4 lorsque le joint est en place, pour s'intercaler entre le rebord 12 et le col 5 ; le joint 13 comporte en outre, à la partie supérieure de sa partie cylindrique 14, une partie 15 en forme de couronne plate orientée transversaement par rapport à l'axe 4 lorsque le joint est en place et formant saillie vers l'ex- térieur autour de la première partie cylindrique 14, pour s'interposer entre la face interne 10 du bouchon et le bord du col 5. Une telle forme du joint 16 facilite sa mise en place sur le col 5 du flacon avant mise en place du bouchon ; en outre, la partie cylindrique 14, qui forme vers l'intérieur du flacon, parallèlement à l'axe 4, une saillie au moins égale à celle que forme dans la même direction le rebord 12 du bouchon lorsque celui-ci est en place, empêche toute infiltration entre le rebord 12 et le col 5, et notamment toute infiltration du milieu de culture solide lorsque l'on introduit celui-ci à l'état liquide dans le bouchon comme il sera décrit plus loin. La face interne du rebord 12 et la face interne 10 du bouchon 2 définissent en effet une cavité 16 ouverte vers l'intérieur du flacon, pour recevoir le milieu de culture solide en le tenant dissocié du milieu de culture liquide 6, mais en contact avec la même ambiance gazeuse que celui-ci. De préférence, la cavité 16 comporté des moyens d'ancrage du milieu solide de culture ; par exemple, la face interne du rebord 12 porte un crantage 17, par exemple fileté , que le milieu de culture solide épouse lorsquXon viens le couler dans la cavité 16. Un tel crantage permet un maintien parfait du disque de milieu de culture solide et limite les infiltrations de milieu liquide 6 entre ce milieu solide et la paroi du couvercle. La mise en place du milieu de culture solide dans la cavité 1Q s'effectue en introduisant ce milieu à l1 état liquide, chaud, dans le flacon puis, après fermeture de ce dernier par le bouchon 2 et stérilisation par autoclavage, en retournant l'ensemble : le prend milieu de culture gélose toujours a l'état liquide place a l'intérieur de la cavité 16, où il se fige et s'immobilise du fait de la présence du crantage 17. Pour permettre l'introduction du milieu de culture liquide 6, la mise sous vide du flacon, ltintroductien éventuelle du mélange gazeux en présence duquel doit s'effectuer la culture, par exemple une dose définie d'anhydride carbonique, et l'introduction du prélèvement biologique à analyser, le bouchon 2 présente un col d'ensemencement 18, ici tubulaire de révolution autour de l'axe 4 et traversant de part en part la paroi 8 à l'intérieur de la cavité-16. A son extrémité transsersab tournée vers l'extérieur du flacon, le col d'ensemencement 18 est fermé par un opercule du type perfusiori! 19 fixé par exemple au moyen d'une bague métallique de sertissage 20 ; cet opercule 19 est réalisé en un matériau propre à autoriser sa perforation par une aiguille en conservant l'étan chéité de la fermeture aussi bien autour de l'aiguille lorsque celle-ci est en place qu'après le retrait de cette aiguille. L'opercule 19 est par exemple réalisé en un matériau élastiquement déformable tel que du caoutchouc. A son autre extrémité transversale, en 21, le col d'ensemencement 18 est ouvert vers l'intérieur du flacon en dehors de la cavité 16 ; en d'autres termes, dans l'exemple illustré où le col 18 traverse la cavité 16, où il porte extérieurement un crantage de retenue du milieu solide de c u 1 t u r e -, la saillie formée par le col 18 à l'intérieur du flacon, par rapport à la face interne 10 du bouchon, est au maths égale et de préférence supérieure à la saillie formée par le rebord 12 de façon que l'ouverture 21 soit placée en dehors du milieu solideengagé dans la cavité 16. Ceci évite d'une part un bouchage du col d'ensemencement ls lors de la mise en place du milieu de culture solide, et d'autre part une contamination accidentelle de ce milieu de culture solide lors de l'introduction du prglèvement biologique à analyser, avant dilution de ce prélèvement dans le bouillon de culture 6. Le processus d'utilisation d'un tel dispositif est le suivant, après mise en place des deux milieux de culture et établissement de l'ambiance gazeuse désirée dans le volume restant du flacon, généralement en dépression par rapport à l'extéricur - on introduit une aiguille d'un dispositif à prélèvement à l'intérieur du flacon via le col d'ensemencement 18, par perforation de l'opercule 19 en piquant la deuxième aiguille par exemple dans le bras du patient s'il s'agit d'un prélèvement sanguin ; la dépression régnant à l'intérieur du flacon permet l'aspiration directe de ce prélèvement ; - on dilue le prélèvement dans le milieu de culture liquide ; - on ensemence le milieu de culture solide en retournant le flacon, lequel était initialement dans la position debout illustrée où le col 5 est tourné vers le haut ; le milieu liquide entre alors en contact avec le milieu solide contenu dans le bouchon ; on replace alors le flacon dans sa position debout illustrée ; - après incubation et développement des colonies, on peut facilement, par ouverture du flacon, réisoler les colonies se trouvant à la surface du milieu solide, celle -ci étant très accessible Naturellement, l'invention est sujette à de nombreuses variantes touchant notamment à la forme du flacon 1 et du bouchon 2, et aux matériaux dans lesquels ils sont réalisés. Ces matériaux sont de préférence transparents, de façon à permettre l'observation des colonies se développant, et résistant à la stérilisation par autoclavage ; ils sont de plus imperméables à l'air. On ne sortirait pas du cadre de l'invention en plaçant la cavité recevant le milieu solide à l'intérieur même du flacon, dans la paroi latérale de celui-ci mais à un niveau supérieur au niveau maximal 7 du milieu liquide 6 du moins en ce qui concerne ltouverture de cette cavité vers l'intérieur du flacon. A titre indicatif, on a obtenu de bons résultats aux essais en utilisant un dispositif du type illustré présentant les dimensions suivantes : diamètre extérieur du flacon : 53 mm hauteur du flacon : 85 mm diamètre extérieur de la cavité du bouchon : 35 mm diamètre intérieur de la cavité du bouchon : 6 mm épaisseur de la cavité du bouchon : 7 mm où ces dimensions de la cavité correspondant sensiblement à celles du milieu de culture solide. niveau du milieu de culture liquide par rapport au fond du flacon : 35 mm On voit que l'utilisation optimale des volumes et surfaces internes disponibles du dispositif selon l'invention permet de reduire au maximum le volume de 1 'eiisemble, pour une surface de milieu de culture solide suffisante et une dose de milieu liquide nécessaire et suffisante. Outre l'avantage qui on résulte du point de vue encc et spositif, la hauteur du dispo- sitif décrit à titre d'exemple étant limité à 100 mm, il en résulte une grande éeonomie de réalisation et d'emploi. Naturellement, les dimensions mentionnées sont données à titre purement indicatif, et pourraient varier en fonction des différentes applications possibles du dispositif selon l'invention. REVENDICATIONS 1) Recipient pour une culture biologique simultanée sur milieux solide et liquide, délimitant intérieurement un volume susceptible de recevoir le milieu liquide à sa partie inférieure et le milieu solide, et dans lequel on peut établir une ambiance gazeuse déterminée, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens pour recevoir le dit milieu solide et pour le retenir dissocié du milieu liquide à l'intérieur du dit volume, au-dessus du niveau maximal du milieu liquide mais en contact avec la même ambiance gazeuse que ce dernier. 2) Récipient selon la revendication 1 comportant un flacon en matériau étanche délimitant un volume interne accessible par un col et un bouchon en matériau étanche susceptible de s'adapter sur le dit col pour fermer le flacon de façon étanche, caractérisé en ce que le bouchon présente, sur sa face tournée vers l'intérieur du flacon, au moins une cavité ouverte vers l'intérieur du flacon et susceptible de recevoir et de retenir le milieu solide de culture. 3) Récipient selon la revendication 2 caractérisé en ce que la cavité comporte des moyens d'ancrage du milieu solide de culture. 4) Récipient selon la revendication 3, caractérisé en ce que la cavité présente au moins une face crantée. 5) Récipient selon 1 'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que la cavitéSdtelimitée par la face du bouchon tournée vers l'intérieur du flacon, qui est sensiblement plane, et par un rebord périphérique en saillie.par rapport à la dite face vers l'intérieur du flacon. 6) Récipient selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que le bouchon comporte des moyens pour introduire et/ou extraire un liquide et/ou un gaz via une aiguille dans le flacon fermé en conservant la fermeture étanche de celui-ci pendant l'introduction de l'aiguille7après le retrait de celle-ci. 7) Récipient selon la revendication 6, caractérisé en ce que les dits moyens comportent un col tubulaire de guidage traversant le bouchon de part en part, ouvert vers l'intérieur du flacon hors de la dite cavité et fermé vers ltextérieur du flacon par un opercule perforable susceptible de se refermer de façon étanche après perforation. 8) Récipient selon les revendications S et 7, caractérisé en ce que le col tubulaire est situé à l'intérieur de l'espace délimité par le rebord périphérique de la cavité et forme vers l'intérieur du flacon, par rapport à la dite face du bouchon tournée vers ltintérieur du flacon, une saillie au moins égale à la saillie formée par le dit rebord périphérique. 9) Récipient selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce qu'il comporte un joint d'étanchéité respectivement entre la fasse du bouchon tournée vers 1 !intérieur du flacon et le bord supérieur du col de celui-ci, et entre la face du dit rebord périphérique de la cavité tournée vers l'extérieur de celle-ci et la face du col du flacon tournée vers l'intérieur de elui-ci. lO) Récipient selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, caractérisé en ce que le bouchon et le flacon sont transparents et imperméables au gaz.