Brevet FR2380298A1 — publié le 19780908

La présente invention concerne un nouveau produit à activité antitumorale, ainsi que son procédé de préparation. Le nouvel agent antitumoral, objet de la présente invention, a été obtenu à partir d'un champignon appelé GEOPETALUM Acanthocystis) geogenium (D.C.). La souche de ce champignon pro- ducteur du nouveau produit de la présente invention a fait l'objet d'un dépôt auprès de la Mycotheque du Laboratoire de Cryptogamie du Muséum National d'Histoire Naturelle (12, rue Buffon 75005 PARIS), où il a été enregistré sous le n03126. La présente invention concerne donc un produit qui se caractérise par le fait qu'il est obtenu à partir drun milieu de culture où s'est développé GEOPETALUN geogenium, et qutil répond à la formule brute C21H2205. Les diverses expériences effectuées ont démontré que le produit objet de l'invention était doté de propriétés antitumorales. La présente invention se rapporte donc également aux médicaments et aux compositions pharmaceutiques incorporant à titre de principe actif ledit produit objet de l'invention. La présente invention concerne également un procédé de préparation du produit énoncé ci-dessus, ledit procédé étant caractérisé par le fait que l'on cultive, en anaérobiose limitée, GEOPETALU > I geogenium dans un milieu de culture contenant au moins une source de carbone et au moins une source d'azote, et en ce que l'on extrait ledit produit à partir dudit milieu de culture. D'autres caractéristiques de la présente invention appa raîtront à la lecture de la description détaillée faite ci-après. La souche de GEOPETALUM geogenium doit entre entretenue par repiquage environ tous les six mois sur un milieu L gélosé ou sur carottes en tube de Roux environ tous les ans. Le milieu L gélosé utilisé actuellement pour l'entretien de la souche de GECPETALUt5 geogenium présente la composition suivante Glucose pur 16,50 g Extrait de malt 3,50 g Tartrate d'ammonium 0,35 g 1. Asparagine 0,50 g Hydrolysat de caséine 0,50 g P04H2K 0,50 g SO4Ng,7H20 0,25 g Gélose 10 g Eau distillée q.s.p 1 litre Conformément au procédé de l'invention, on fait donc crot- tre le mycélium dans un milieu de culture contenant au moins une source d'azote et au moins une source de carbone.Divers essais, effectués avec l'utilisation de différentes sources de carbone et d'azote, ont conduit à la conclusion que les meilleures sources de carbone utilisables sont le glucose, le fructose, le mannitol et le mannose, et les meilleures sources d'azote utilisables sont le tartrate d'ammonium, le citrate d'ammonium, le nitrate de sodium, l'asparagine, le tryptophane, l'hydrolysat de caséine et l'acide glutamique. Les différents essais effectués ont par ailleurs montré que l'acide glutamique et lthydrolysat de caséine sont des sources d'azote défavorables lorsque la source de carbone est choisie parent le glucose, le fructose ou le mannitol. En conclusion, les meilleures sources de carbone sont : a > glucose} si la source d'azote est choisie parmi - le tartrate d'ammonium - le citrate d'ammonium - le nitrate de sodium - l'asparagine, et - le tryptophane. b) le fructose, avec les mimes sources d'azote que celles énumérées pour le glucose. c) le mannitol, mais uniquement que si la source dtazote est le tryptophane. d) le mannose, qui est particulièrement favorable avec les sources d'azote énumérées pour le glucose, et qui donne également de bons résultats avec l'hydrolysat de caséine. D'autre part, le milieu de culture de GtCPTALUi: geogenium contient également de façon avantageuse les facteurs de croissance qui peuvent être apportés par exemple par l'extrait de malt. Le procédé de préparation selon l'invention peut par exemple se subdiviser en les étapes suivantes 1) Préparation de la tête de cure". Un fragment du mycélium est transféré du milieu L gélosé dans 25 ml d'un milieu L liquide contenu dans un wrlenmeyer. Le milieu L liquide présente la même composition que le milieu L gélosé, exception faite de la gélose qui a été supprimée. On prépare alors plusieurs Erlenmeyers qui sont mis à incuber pendant environ i à-21 jours (cette durée étant fonction de la pousse du mycélium) dans une chambre obscure en les maintenant à une température constante d'environ 240C, le degré hygrométrique étant sensiblement égal à 70 . 2) Culture proprement dite de GEOPETALUt eogenium. Les conditions de culture de GEOPETALU geogenium sont du type de celles des cultures de mycélium d'homobasidiés agaricales et aphylophorales. Cependant, dans le cas de GEOPETALUM geogenium, ces conditions générales doivent être adaptées pour la production du principe actif selon l'invention. En effet, la production du principe actif exige des conduit tions de culture en aérobiose relative, clest-à-diwe que le principe actif ne peut pas être obtenu en anaérobiose stricte. Il convient d'observer ici que le barbotage d'air dans le milieu de culture s'est également montré nocif. En revanche, une bonne production du principe actif a été observée dans le cas où l'aération était obtenue par simple agitation. Dans la pratique, les conditions expérimentales qui se sont montrées tout à fait favorables consistaient en une agitation par secousses obtenues par un va-et-vient d'une amplitude de 7 cm avec 100 allers et retours par minute, les cultures étant contenues dans les Srlenmeyers de 100 ml. Toutefois, d'autres conditions expérimentales ne sont pas à exclure et, en particulier à l'échelon industriel, il est possible d'adapter aux fermenteurs des systèmes d'aération plus commodes. Lut étude de la cinétique de production du principe actif montre que le maximum se situe à environ 26 jours (température 24aC + 100). il a été observé qu'en moyenne il fallait environ 3 semaines pour obtenir une bonne activité desdites cultures, mais cette activité persiste si ia culture est poursuivie au delà de cette durée ; il n'y a pas de date critique en-deçà de 4 semaines. Dans toutes les phases actives, quelle que soit la façon de les obtenir, le produit objet de la présente invention se trouve toujouprésent. Il a été notamment pcssible de l'obte- nir à l'état cristallisé de la manière suivante. Après développement du mycélium, le jus de culture est filtré et le filtrat est soumis à une opération de lyophilisation. il convient ici d'observer que toute 17 activité passe dans le jus de culture et qu'il ne s'est pas avéré nécessaire de broyer le mycélium. On procède ensuite à l'extraction du produit à partir du lyophilisat. Cette extraction peut être effectuée au moyen de tout solvant approprié ; dans la pratique le chloroforme a conduit à des résultats tout particulièrement satisfaisants.On peut par exemple effectuer trois extractions successives à froid dans le rapport de 1 g de lyophilisat pour 100 ml de chloroforme. Les phases chioroformiques sont alors évaporées à la température du laboratoire, sous pression réduite, et le résidu est repris dans un solvant tel que le benzène, puis chromatographié dans une colonne de silice Merci. Dans la pratique on a utilisé une colonne de silice d'une hauteur de 47 cm et d'un diamètre de 2 cm. Les éluants utilisés ont été respectivement 1) le benzène 2) ltéther-éthylique 3) le mélange éther-méthanol (90-10), et 4) le méthanol. Cn a constaté que le produit objet de la présente invention passe avec le deuxième éluant et peut donc être recueilli dans la phase éthérée. On observera ici qu'avec le mélange éther/ éthanol (90-10) il ne passe que deux produits, non identifiés, et en très faible quantité. Le méthanol, lui, entraîne tout le résidu complexe qui contient au moins sept produits qui ntont pas été analysés plus en détail. L'éther est alors évaporé et le résidu est à nouveau repris par le chloroforme dans lequel le produit selon l'invention cristallise. La pureté du produit de l'invention est vérifiée en chromatographie couche mince sur plaque de gel de silice merci 60 F 254 (révélateur U.V.). Le produit de la présente invention a fait l'objet de diverses analyses physico-chimiques qui ont conduit aux résultats suivants. Le produit de l'invention est insoluble dans l'eau. En revanche, il est soluble dans ltéther-éthylique, dans le chloroforme et dans le diméthylsulfoxyde. La masse moléculaire du produit, déterminée à partir de son spectre de masse, est égale à 354,1461. D'autre part, le spectre de masse donne une composition centisémale qui répond à la formule brute C21H2205 , la micro-analyse ayant en effet conduit aux résultats suivants : C 71,29 % ; H 6,14 56 0 22,59 96. Ces résultats correspondent bien à la formule obtenue à partir desspectres de masse. Le spectre U.V. du produit selon l'invention, dans le méthanol, présente un maximum d'absorption à 248 nm. Le spectre I.R., en phase KBr, du produit de itinvention présente des pics d'absorption aux fréquences suivantes 3100 cm 1 ; 2800 cm 1 ; 1785 cl 1 ; 1670 cm 1 1225 cm1 et 1115 cm Le spectre R.M.N., en solution de chloroforme deuthéré , (référence T.X.S.) du produit de l'invention présente des pics d'absorption correspondant aux ppm suivants : 6,8 ; 5,48 4,52 ; 2,4 ; 1,95 ; 1,4 et 0,95. Le spectre R.N.N. du 13C du produit de l'invention présente des pics d'absorption aux ppm suivants 186,69 136,08 52,09 32,72 20,19 185,4 102,94 48,71 30,56 174,77 73,81 47,23 24,85 143,8 71,39 44,61 23,93 137,95 69,47 39,34 22,50 il a été déterminé que le produit de l'invention contenait une fonction lactone et au moins deux fonctions carbonyle. Selon une autre caractéristique de ce procédé, si l'on désire obtenir le produit de l'invention sous une forme hydro soluble, il convient d'éliminer, du milieu de culture où s'est développé GE:OPETALUM geogenium, les substances insolubles dans le méthanol. Ces substances ont été identifiées comme étant principalement des sucres et des acides aminés. On donnera ci-après à titre d'exemple un mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention tendant à conduire à une forme hydrosoluble du produit de l'invention. Un fragment provenant de la culture d'entretien est ensemencé stérilement dans le flacon contenant le milieu liquide pour la culture de production. Celle-ci se développe à la température de 240C + 1 C pendant environ 4 semaines, avec un degré hygrométrique de 70 56. Le milieu est ensuite filtré sur filtre-presse et le filtrat est lyophilisé, ce dernier se présente sous forme de paillettes brun clair. Un poids connu de ces paillettes est dissous dans de l'eau distillée dans la proportion de 1 g de lyophilisat pour 20 ml d'eau. On ajoute ensuite deux fois ce volume de méthanol et l'on laisse au réfrigérateur pendant environ une nuit Le lendemain le produit est filtré et le méthanol est évaporé sous vide très poussé à une température voisine de l'ambiante. La solution aqueuse restante est alors neutralisée par exemple par du bicarbonate de soude et devient ainsi prête à l'administration par voie parentérale. Sous sa forme hydrosoluble, le produit de l'invention a été administré par voie parentérale à des souris Swiss sur lesquelles des tumeurs ascitiques d'Ethrlich ont été préalablement greffées. Lors de ces expériences, il a été constaté que sous l'effet de cette thérapeutique, la tumeur traitée involuait sans que ne se manifeste d'activité de type antimitotique ou de type cytotoxique. Lorsque l'on suit l'involution de la tumeur par ltétude de son évolution cytologique, il apparaît que les nouvelles cellules qui sé forment perdent petit à petit leur caractère tumoral pour reprendre l'aspect des cellules saines. Il convient de rapporter ici que tous les animaux traités ont guéri et ont survécu. L'utilisatimde la tumeur d'Ehrlich a été effectuée conformément à un test classique qui se trouve par exemple décrit par LETTRE (H.) dans Z.Physiol. Chem., (1941), 268, 59-76 et par KLEIN (G.) dans Cancer (1950), 3, 1052-1061. Alors que les souris cancéreuses témoins meurent en moyenne en 14 jours en présentant une ascite déjà visible au 7ème jour et qui va croissant avec de très nombreuses cellules cancéreuses, les souris traitées ne présentent pas d'ascite et survivent aussi longtemps que les souris non cancéreuses. L'évolution cytologique de la tumeur peut se résumer ainsi. Alors que chez les souris cancéreuses non traitées les cellules d'Ehrlich apparaissent en très grand nombre sur un frottis d'ascite, qu'elles sont hyperchromes et peuvent se ranger en trois catégories suivant leur diamètre (environ 16 microns, 22 microns, supérieures à 50 microns), chez les souris traitées, on ne trouve bientôt que des cellules beaucoup plus petites, normochromes, sans anomalies nucléaires et enfin quelques cellules mésenchymateuses normales. L'étude toxicologique a montré que le produit objet de l'invention n'était pas toxique aux doses de traitement utilisées il a été simplement constaté qu'avec les doses du produit actif qui conduisent à la guérison des souris, ces dernières présentaient un léger amaigrissement qui se produisait lors des premières injections,puîs qu'elles reprenaient du poids pour enfin retrouver une allure parfaitement normale Les médicaments et compositions pharmaceutiques contenant, à titre de principe actif, le produit selon l'invention et/ou ses dérivés physiologiquement acceptables, sont donc utilisables en médecine humaine ou vétérinaire, et peuvent se présenter sous une forme convenant à l'administration par voie parentérale. Le produit selon l'invention ainsi que ses dérivés physiologiquement acceptables peuvent donc constituer le principe actif de compositions pharmaceutiques ou de médicaments destinés au traitement de toutes tumeurs cancéreuses. REVENDICATIONS i) A titre de produit industriel nouveau, un produit caractérisé par le fait qutil est obtenu à partir d'un milieu de culture où s'est développé GEOPETALUN geogenium, et qu'il répond à la formule brute C21H2205. 2) Produit selon la revendication 1, caractérisé par le fait que son spectre U.V,, dans le méthanol, présente un maximum d'absorption à 248 nanomètres. 3) Produit selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que son spectre I.R., en phase KBr, présente des pics d'absorption aux fréquences suivantes : 3100 cm 1 2800 cm 1 ; 1785 cm 1 ; 1670 cm 1 ; 1225 cm-i et 1115 cm1. 4) Produit selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que son spectre R.M.N., en solution dans le chloroforme deuthéré (référence T.M.S.), présente des pics d'absorption correspondant aux ppm suivants : 6,8 ; 5,48 ; 4,52; 2,4 ; 1,95 ; 1,4 ; et 0,95. 5) Produit selon l'une des revendications 1 à 4, caracté 13 risé par le fait que le spectre R.N.N. du C dudit produit présente des pics d'absorption aux ppm suivants 186,69 136,08 52,09 32,72 20,19 185,4 102,94 48,71 30,56 174,77 73,81 47,23 24,85 143,8 71,39 44,61 23,93 137,95 69,47 39,34 22,50 6) Produit selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait qu'il comprend une fonction lactone et au moins deux fonctions carbonyle. 7) Procédé de préparation du produit selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que l'on cultive, en anaérobiose limitée, GEOPiTALUts geogenium dans un milieu de culture contenant au moins une source de carbone et au moins une source d'azote, et en ce que l'on extrait ledit produit à partir dudit milieu de culture. 8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que les conditions de culture en anaérobiose limitée sont obtenues par aération du jus de culture par simple agitation. 9) Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que le milieu de culture est un milieu de culture liquide dans lequel la source d'azote est constituée par du tartrate d'ammonium, la source de carbone est constituée par du glucose pur, et par le fait que le milieu de culture contient des facteurs de croissance pouvant par exemple être apportés par de l'extrait de malt. 10) Procédé selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé par le fait que l'extraction dudit produit à partir du milieu de culture de GEOPETALUM geogenium est obtenue au moyen de chloroforme, ladite extraction étant avantageusement suivie d'une opération de purification. 11) Procédé selon l'une des revendications 7 à 1G, caractérisé par le fait que l'on réalise les opérations suivantes * on cultive GEOPETALU geogenium dans un milieu de culture liquide + on filtre le jus de culture ainsi obtenu * on lyophilise le filtrat obtenu * on réalise-une extraction au chloroforme à partir du lyophilisat obtenu * on évapore les phases chloroformées; * on reprend dans du benzène le résidu ainsi obtenu, et * on procède à une opération de purification de la solu tion benzénique dudit produit. 12) Procédé selon l'une des revendications 10 et 11, caractérisé par le fait que l'opération de purification est obtenue par chromatographie sur colonne de silice, les éluants étant respectivement constitués par le benzène et ltéther-éthylique, ledit produit se trouvant dans la phase éthérée. 13) Procédé selon l'une des revendications 7 à 12, caractérisé par le fait que, pour obtenir ledit produit sous une forme hydrosoluble, on élimine, du milieu de culture où s'est développé GEOPETALUN geogenium, les substances insolubles dans le méthanol. 14) Procédé selon l'une des revendications 7 à ;3, caractérisé par le fait que le milieu de culture se presente sous la forme d'un milieu de culture liquide contenant du glucose pur, un extrait de malt, du tartrate d'ammonium, de 1 t asparagine, un hydrolysat de caséine, P04H2K, S04t'.g.7H20, et de l'eau distil lée. 15) Produit obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 7 à 14. 16) A titre de médicament nouveau, le produit selon l'une des revendications 1 à 6 et 15, ainsi que ses dérivés physiolo giquement acceptables. 17) Composition pharmaceutique, caractérisée par le fait qu'elle contient à titre de principe actif, le produit selon l'une des revendications 1 à 6 et 15, ou l'un de ses dérivés physiologiquement acceptables.