Brevet FR2392112A1 — publié le 19781222

La présente invention concerne un procédé d'obtention de protéines à partir de méthanol à l'aide de souches de microorganismes améliorées quant à leurs performances d'utilisation du méthanol (vitesse, rendement BiomassE/Méthanol, affinitb pour le m6- thanol). Dans les procédés de production de protéines à partir d'organismes unicellulaires, la souche de microorganisme a une impartance considérable. Pour l'utilisation d'un substrat carboné donné, de la souche dépendent d'une part la valeur biologique du produit (absence de toxicité, valeur nutritionelle...), d'autre part les conditions économiques de la production industrielle en continu des protéines.Ce sont en particulier les performances cinétiques de la souche qui imposent la taille de l'installation industrielle et donc l'investissement nécessaire. Le procédé mis au point par la demanderesse permet d'utiliser les souches améliorées de microorganismes méthylotrophes utilisant le méthanol par la voie métabolique dite de la 11sérine". L'amélioration des souches, rendant leurs performances cinétiques compatibles avec le développement d'un procédé industriel de production en continu de protéines à partir de méthanol, peut s'appliquer à un grand nombre de microorganismes. Citons de façon non limitative, les microorganismes des genres suivants - Bacillus, Micrococcus, Arthrobacter, Flavobactérium, Pseudomonas, Aéromonas, Méthylomonas, Rhodopseudomonas, Méthylococcus, Klébsiella Rhodospirillum, Rhodomicrobium, Hyphomicrobium, Acinetobacter, Achromobacter, Moraxella. Les microorganismes méthylotrophes facultatifs utilisant le méthanol par la voie de la sérine, sont très répandus. Ceux qui ont été isolés par les méthodes traditionnelles (repiquages succes sifs sur milieu avec du méthanol comme seule source carbonée) ont des performances cinétiques souvent médiocres. Quelques-uns sont décrits dans la littérature, en particulier dans les textes suivants : W. HARDER, MM. ATWOOD, J.R. QUAYLE J. Gen. Microbiol. (1973) 78 f55-163, ASTHANA et Coll. Biotechnol. Bioeng. (1971) 13, 923 et (1971) 8, 923, M. REUSS et Col. Eur. J. Appl. Microbiol. (1975) 1 295-305, WHITTENBURY et al. J. ten. Microbiol. (1970) 61 2D5, HIRSH et CDNTI Archiv. Fin Mikrobiologie (1964) 43 : 358, OGATA et Coll. J. Ferment. Technol. (1970) 48 : 470. Les méthodes d'isolement de souches par sélection continue, permettent certes d'isoler des souches performantes mais l'expérimentation est longue (au moins un mois d'expérimentation en fermenteur continu), délicate et les résultats aléatoires. D'autre part, on ne réalise ainsi qu'un enrichissement, et il est injispensable isoler à partir de la flore complexe obtenue le microorganisme le plus performant. La demanderesse a découvert que parmi les souches métabolisant le méthanol par la voie de la sérine, la résistance à la glycine entrain habituellement une utilisation accrue du méthanol (augmentation de um, diminution du Ks méthanol). Elle a mis au point un procédé qui permet d'utiliser pour la fabrication de protéines à partir de méthanol, une souche améliorée de l'une quelconque des souches présentant la caractéristique précitée (utilisation du méthanol par la voie de la sérine). L'amélioration de cette souche méthylotrophe consiste d'une part en une augmentation de l'affinité pour le méthanol (diminution du Ks) et d'autre part en une diminution du temps de génération sur substrat carboné méthanol. Ces souches méthylotrophes améliorées se distinguent des souches sauvages dont elles sont issues par leur résistance à llef- fet de la glycine. 1.- La souche méthylotrophe améliorée reste insensible à l'action de la glycine, pour des concentrations en cet acide aminé au moins dix fois supérieures à celles provoquant un début d'inhibition de l'utilisation du substrat méthanol (augmentation du Ks) chez la souche sauvage. 2. - La souche méthylotrophe améliorée peut croître sur un milieu composé de substrat méthanol et de glycine (0,5 à 2 %), alors que la souche sauvage correspondante est incapable de croître en pré sence de ces concentrations de glycine. Le procédé de l'invention consiste à sélectionner des mutants résistants à la glycine, à partir de souches méthylotro- phes facultatives. La culture de la souche à améliorer est effectuée de la zanibre suivante : Les cellules sont récoltées de préférence en phase exponentielle de croissance, puis étalées sur le crible de sélection (milieu solide pour microorganismes méthylotrophes + 0,5 à 2 % de glycine) soit directerent, soit après l'action préalable d'un agent mrtagène physique ou chimique. Toutes les souches ainsi sélectionnées présentent le caractère de résistance à la glycine (en concentration de D,5 à 2 %). Les souches améliorées sont inoculées dans un milieu de culture qui comprend des sels minéraux, de l'azote sous forme minéraie et du méthanol en concentration variable de 0,1 à 2 J (poids/ volume). Le méthanol stérilisé par filtration est ajouté au milieu autoclave à 120 C durant 30 in. Le pH est ajuster entre 6 et 8. La culture est effectuée en fioles stériles, avec une agitation telle que l'aération ne soit pas limitante, et à des te pératures pouvant varier de 25 à 45 C. Les récoltes de cellules sont faites par centrifugation. La mesure des taux de croissance spécifique est faite en mesurant l'augaentation du poids sec de cellules par unité de volume en fonction du temps. La concentration du méthanol dans le milieu de culture est mesurée par chromatographie en phase gazeuse. Les souches obtenues peuvent être employées non seulement pour la synthèse de protéines à partir du méthanol, Mais aussi pour l'épuration biologique du méthanol d'un effluent, la diminu- tion éventuelle du méthanol dans des boissons fermentées et en général dans toute fermentation impliquant le méthanol en tant que substrat carboné. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la liaiter = - Exemple 1 Une souche identifiée comme étant du genre Pseudoionas stuzeri, est lise en culture sur le milieu suivant : Milieu de culture (M1) NH4Cl : 3 g Na3HPO, : 3 g KH2PO4 : 0,5 g CaCl2 : 0,01 g FeSO4 : 0,001 g ZnCl2 : 0,001 g MnS04 t 0,001 g MgS04 : 0,5 g CH3OH : 5 g q.s.p. : 1 litre La température de culture est de 30 C. Le temps de génération de cette souche est alors de 120 mn et sa constante d'affinité apparente pour le méthanol est Ks = 1090 ppm. La production effective de biomasse au bout de 3 jours de culture est de 0,30 g pour 1 g de méthanol. La suspension cellulaire récoltée de cette culture est diluée dans l'eau physiologique de manière à Établir 108 à cellules par ml, avant étalement sur milieu M1 gélosé à 2,5 % et complété avec 2 % de glycine. Les boites de pétri sont placées à l'étuve à 30 C. L'apparition de mutants résistants se manifeste au bout de quelques jours. Les colonies sont prélevées st ensemencées en milieu liquide (M1) afin de tester leurs caractères-méthylotrophes. On obtient plusieurs mutants résistant à la glycine. L'étude des performances cinétiques d'un de ces mutants a donné les résultats suivants sur le milieu de culture M1. . temps de génération : 100 mn . Ks méthanol : 20 ppm La production effective de biomasse au bout de 3 jours de culture est de 0,40 g pour 1 g de méthanol. - Exeanle 2 D'autres mutants de la souche citée en 1, résistants à 2 % de glycine, ont été isolés avec un traitement préalable de la suspension cellulaire avec 2 % d'éthylméthane sulfonate durant 2 h à 30C à pH 7,4. Dn constate les mêmes améliorations que sur le mutant de l'exemple 1 a savoir diminution du temps de génération et surtout forte diminution du Ks : ) g = 120 mn ) g = 88 mn Souche sauvage ) Ks = 1090 ppm Souche mutante ) Ks = 20 ppm - Exemple 3 Le traitement utilisé dans leoeemier exemple est appliqué à une souche de Pseudomonas aéruginosa méthylotrophe. On isole sur crible de sélection (milieu M1 + 0,5 % glycine) les mutants résistants à la glycine. Les performances cinétiques de ces nouvelles souches (sur milieu M1) sont nettement améliorées par rapport au sauvage. Souche sauvage Souche mutante g = 5 h 45 mn g = 3 h 30 mn Ks = 830 ppm Ks = 100 ppm - Exemple 4 Le traitement utilisé dans le 1er exemple et appliqué à une souche de Micrococcus Varians Méthylotrophe et a permis d'isoler des souches présentant sur méthanol des performances améliorées par rapport à la souche sauvage. Souche sauvage Souche mutante g = 4 h 20 mn g = 3 h 30 mn Ks = 450 ppm Ks = 150 ppm REVENDICATIONS 1. - Procédé d'obtention de protéines à partir de méthanol, caractérisé par l'emploi de souches méthylotrophes résistantes à la glycine