Brevet FR2387240A1 — publié le 19781110

La présente invention se rapporte à un procédé de préparation albumine humaine et en particulier à un procédé de fabrication d'albumine humaine ne contenant ni substance de groupe sanguin ci-après désignée brièvement comme étant une substance de groupe, une substance hypotensive. Récemment le besoin d'albumine humaine de transfusion, en particulier de celle d'une solution de protéines thermostables du plasma humain traité à chaud contenant de 11 albumine humaine s'est considérablement accru pour traiter les hémorragies aiguës, les traumatismes, les bromures, la malnutrition protéinique, l'hypoprotéinémie, etc. On connaissait de nombreux procédés pour récupérer l'albumine purifiée à partir dtinfusion de plasma ou de sérum issu du sang humain. Tous les procédés connus toutefois se sont montrés infructueux pour récupérer économiquement de l'albumine qui soit parfaitement saine en vue des traitements médicaux, si la substance de depart contient une grande quantité d'hémoglobine libre, en d'autres termes, une grandie quantité de parois de cellules rouges contenant de la glycoproteine formée par hémolyse. Ainsi ces procédés sont imparfaits ou non rentables quant à leur performance en vue éliminer des parois de cellules rouges, la substance de groupe qui peut avoir des effets secondaires indésirables.Bien que le placenta soit utile en tant que matière première pour la production d'une préparation de plasma fractionné étant donné se haute teneur en sang et sa disponibilité, il contient cependant 50 % ou plus d'hémoglobine libre dQ au traitement de substance gelée dont ltélimination pose un problème important en ce qui concerne la récupération de l'albumine à partir du placenta. Parmi les procédés connus de purification de l'albumine à partir d'une solution issue du sang humain on peut citer 1- Le sixième processus de Cohn de fractionnement de l'éthanol à basse température et sa modification (Brevet japonais n 265.704, publication du brevet japonais n 5297/60); 2- Procédé dans lequel la force ionique du plasma se trouve diminuée par une resine échangeuse d'ion en vue de précipiter la globuline instable qui est éliminée ensuite (Vox Sanguins, Vol. 3, p. 184 (1956)); 3- Procédé consistant à additionner un acide gras ayant de 12 à 18 atomes de carbone à une solution de composé sanguin fractionné et à chauffer la solution à un pH d'environ 5,2 à environ 55qC pour précipiter la globuline instable qui est alors éliminée (Brevet japonais no 422 934, publication de brevet Japonais n0 24 895/63) 4- Procédé d'introduction d'un ion zinc dans le procédé de fractionnement à l'éthanol à basse température (Vox Sanguinis, Vol. 5, p. 272 (1960));; 5- Procédé de séparation par étape de l'hemoglobine par combinaison du fractionnement au sulfate d'ammonium et du fractionnement à l'éthanol à basse température (publication du brevet japonais n 2869/72) 6- Procédé comportant l'addition d'acide butyrique à une solution de composant sanguin fractionné et le chauffage de la solution à un pH d'environ 5,0 à environ 600C en vue de précipiter l'hémoglo bine ainsi que la globuline instable qui est alors éliminée (brevet japonais no 534 921 ;Publication du brevet japonais n 16 041/68) ; 7- Procédé qui consiste à additionner de l'acide mandélique à une solution de composé sanguin fractionné et a-chauffer le solution à un pH d'environ 4,9 à environ 60DC en vue de précipiter la globuline instable ainsi que l'hémoglobine qui est éliminée ensuite (demande de brevet japonaise "Kokai" mise à la disposition du public n 66 810/74) ; 8- Procédé comportant l'addition d'acide trichloroacétique ayant une concentration en éthanol de 55 % ou plus par rapport à la quantité totale de la solution et à une température de -5 à -10 C en vue d'éliminer la substance de groupe (demande de brevet japonais "Kokai" mise à la disposition du public n 85 218/74 et 85 219/74). Les premier, second et troisième procédés ne sont pas applicables à un sang tel qu' un sang placentaire qui a subi l'hémolyse et contient de grandes quantités d'hémoglobine libérée et de substance de groupe, car ces procédés n'ont pas d'effet spécifique sur la précipitation de l'hémoglobine ainsi que sur la substance de groupe et en conséquence la séparation de l'albumine à partir de l'hémoglobine et de la substance de groupe est insuffisante. Les quatrième et cinquième procédés sont non seulement onéreux à cause des conditions opérationnelles compliquées de chaque étape ce qui conduit à un processus de fractionnement compliqué mais ils sont également difficiles à mettre en oeuvre à cause de l'emploi d'alcool inflammable et du refroidissement nécessaire au maintien d'une basse température, Les sixième et septième procédés permettent un traitement complet à la température ordinaire, ils sont faciles à mettre en oeuvre en vue d'éliminer l'hémoglobine à partir du plasma humain tel qu'un extrait placentaire contenant une grande quantité d'hémoglobine et ils sont économiques mais l'élimination de la substance de groupe est impossible par ces procédés. Le huitième procédé permet d'éliminer l'hémoglobine et la substance de groupe mais comporte le danger de dénaturer les protéines à cause de l'acide trichloroacétique qui est un dénaturant de protéines (précipitant) ; le procédé comporte également un inconvénient en matière de sécurité à cause de l'emploi d'alcool inflammable à haute concentration et il est onéreux à cause du refroidissement continuel nécessaire au maintien d'une basse température de -5 à -10nC. L'invention a pour but de fournir un p ç é économique et sur pour récupérer l'albumine du sang humain et en particulier du sang humain contenant de l'hémoglobine libérée. A la suite d'études faites en matière de récupération de protéines du plasma humain contenant de l'albumine comme composant majeur à partir du sang humain, les inventeurs ont trouvé un procédé simple et sûr. En combinant ladite découverte avec l'art antérieur il a été possible de réaliser la présente invention en vue de la mise au point d'un procédé économique de récupération de la protéine du plasma humain contenant de l'albumine en tant que composant majeur qui est utilisable en toute sécurité dans les traitements médicaux. La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'albumine humaine qui consiste à traiter une solution aqueuse d'albumine d'origine humaine contenant une substance de groupe sanguin par du polyéthylène glycol en vue de précipiter les protéines contaminantes contenant ladite substance de groupe. La solution aqueuse d'albumine d'origine humaine contenant la substance de groupe utilisable comme substance de départ peut être soit hautement purifiée soit dans un premier stade de purification. On obtient une telle solution d'albumine par élimination de la globuline, de l'hémoglobine et de la phosphatase alcaline du plasma ou du sérum humain et elle contient de l'albumine en quantité d'au moins 50 % et de préférence de 80 % de la protéine totale contenue. Toutes les solutions aqueuses qui ont subi l'hémolyse partielle et contiennent de l'albumine en tant que constituant majeur, et une substance de groupe ainsi que des substances hypotensibles sont convenablesysoit qu'elles aient été obtenues à partir du sang, d'un extrait placentaire, du sang rétroplacentaire ou de placenta issu du sang humain.Un procédé convenable pour le prétraitement consiste en ce que afin d'éliminer l'hémoglobine et la phosphatase alcaline, on chauffe une solution aqueuse de protéine du plasma qui a été libérée à partir de laY-globuline, entre 50 et 650C en présence de 2 à 6 % (P/V) d'acide butyrique et d'acide mandélique et de 0,5-à 1,5 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), de préférence le sel disodique de la EDTA, à un pH compris entre 4,5 et 5,5. Après élimination du précipité formé, le surnageant est prêt à être utilisé. Le polyéthylène glycol utilisable a un poids moléculaire de 2 00D à 10 000 mais il est préféré si son poids moléculaire est compris entre 4 000 et B 000. Lorsque l'on ajoute du polyéthylène glycol a une solution aqueuse d'albumine utilisée en tant que produit de départ, il se forme un précipité. Bien que cela dépende de la nature de la solution aqueuse utilisée en tant que substance de départ, la concentration finale efficace en polyéthylène glycol dans la solution aqueuse est comprise généralement entre 10 et 30 % (P/V), mais une solution aqueuse à environ 50 % (P/V) peut entre utilisée si il y a un surplus de capacité de traitement du réacteur. La condition souhaitable est celle de 13 à 20 % (P/V) à une valeur de pH comprise entre 6,6 et 8,0 et 15 à 30 % (P/V) dans une gamme de pH de 8,0 à 9,6. I1 est efficace de régler la concentration en protéine de la solution réagissante entre 5 et 40 g/litre. La concentration d'un sel inorganique est réglée de préférence à 50 g/litre ou moins en ce qui concerne le chlorure de sodium. La température de réaction peut être choisie dans une gamme comprise entre 2 et 300C sans exiger un refroidissement intense excessif. Toutefois, en utilisant la solution de protéines, il faut avoir la précaution d'effectuer la réaction à une température faible comprise autant que possible dans la gamme indiquée ci-dessus.Grâce au traitement indiqué ci-dessus, l'albumine est peu précipitée alors que la substance de groupe comprenant la glycoprotéine est précipitée. Si les protéines contaminantes telles que lthémoglohine, la substance hypotensive comprenant des peptides de poids moléculaire faible compris entre 1 000 et 10 000, et des substances analogues sont présentes, elles sont précipitées avec la substance de groupe et elles sont éliminées de la solution albumine aqueuse. Les conditions de miseen oeuvre du procédé ci-dessus qui consistent à éliminer la substance de groupe peuvent être déterminées en effectuant des essais comparatifs concernant la relation entre le poids moléculaire et la concentration finale du polyéthylène glycol et le pH du mélange réagissant. Par exemple, en traitant une solution d'albumine aqueuse de départ contenant 1 % (P/V) de protéines et un sel ( à savoir le chlorure de sodium) avec du polyéthylène glycol ayant un poids moléculaire moyen compris entre 4 000 et 8 000, la quantité ajoutée de polyéthylène glycol et le pH du mélange réagissant ont été variés afin d'obtenir les résultats d'élimination de substances de groupe comme indiqué dans le tableau i. La détermination de la substance de groupe a été effectuée an utilisant de l'antisérum spécifique de groupe sanguin en suivant la méthode ou sa modification légère du test d'inhibition d'hémaglutination (E.A. Kabat, M.M. Meyer, Experimental Immunochemistry, Vol. 2, p. 97 à 132 (1961)) et les résultats ont été exprimés en tant que quantité minima (taux de dilution maximale) d'antisérum entraînant l'agglutination des érythrocytes sur lesquels l'antisérum peut neutraliser complètement la substance de groupe contenue dans l'échantillon et agglutiner encore les érythrocytes. Dans la description et les revendications la dénomination "% (P/V)1, indique la concentration d'un soluté dans une solution, le pourcentage du soluté étant indiqué en poids et celui de la solution étant indiqué en volume. Tableau I !Poids mo- Concentration de po-: pH de la : Taux de dilution de !léculaire :lyéthylène glycol : solution :l'antisérum de grou-! !moyen du :dans la solution réa: réagissan:pe sanguin efficace !plyéthy- :gissante : te :pour éliminer la !lène : % (P/V) : :substance de groupe !glycol : : : ! ! : : : ! ! : : : ! ! : : : ! ! : : 5 : x 64 ! ! : 10 : 7 : x 128 ! t . 9 : x 64 ! : : 10 : x 64 ! ! : : : ! ! : : : ! ! : : : ! ! : : 5 : x 64 ! ! : 20 : 7 : x 256 9 : x 256 10 : x 128 ! : : : ! ! 4 000 : : : ! ! : : : ! ! : : 5 : x 64 ! ! : 30 : 7 : x 256 ! ! : : 9 : x 256 ! : : : : ! : . 10 : x 128 t ! : : : ! E 5 x 16 !6 ! 35 : 7 : x 64 ! : : 9 : x 124 ! : : 10 : x 128 ! ! : : : ! ! : : : ! ! : : : ! 5 . . 5 : x 64 t ! : 10 : 7 : x 128 ! 9 . . 9 : x 64 t ! : : 10 : x 64 t ! : : : ! ! : : : ! ! : : : ! ! : : 5 : x 128 ! 20 : 7 : x 256 ! : : 9 : x 128 ! ! : : 10 : x 256 ! ! : : : ! ! : : : ! Tableau 1 (suite) ! 8 000 : : 5 : x 32 ! ! : : 7 : x 256 ! ! : 30 : 9 : x 256 ! ! : : 10 : x 128 ! ! : : : ! ! : : : ! ! : : : ! ! : : 5 : x 32 ! ! : 35 : 7 : x 128 ! ! : : 9 : x 128 ! ! : : 10 : x 128 ! ! : : : ! ! : : : ! ! : : : ! ! Substance de départ non : x 4 ! ! traitée : ! ! : ! ! : ! ! Salution saline normale : x 256 ! ! : ! Après élimination des protéines contaminantes sous forme de précipité, le surnageant est fractionné pour récupérer l'albumine. Comme presque toutes les protéines contaminantes ont été éliminées, la récupération de l'albumine ne nécessite pas de technique spécifique mais elle est effectuée par précipitation de toutes les protéines par un fractionnement bien connu au sulfate d'ammonium ou à l'alcool. Un procédé préféré consiste à utiliser le fractionnement au polyéthylène glycol. On peut effectuer une récupération efficace de la fraction d'albumine en utilisant le polyéthylène glycol en milieu acide, de préférence à un pH compris entre 4,5 et 5,6 et à une concentration finale de 20 à 30 % (P/V). Ainsi, la récupération de l'albumine du surnageant peut être effectuée de façon conventionnelle en ajoutant simplement si nécessaire une quantité supplémentaire de polyéthylène glycol afin de conserver le pH du surnageant dans la gamme indiquée ci-dessus. On peut préparer une protéine de plasma sans danger d'infection au virus de l'hépatite en introduisant une étape du traitement de chauffage habituel de cette fraction d'albumine ainsi obtenue à 60oC pendant 10 heures en présence d'un stabilisateur convenable. En vue de l'utilisation en médecine, il est souhaitable que l'albumine obtenue finalement sous forme de précipité soit soumise à la dialyse en vue éliminer les sels et ensuite à la filtration des bactéries. On peut obtenir une réduction de la teneur en polyéthylène glycol en lavant le précipité avec de l'eau distillée ayant un pH acide et contenant du polyéthylène glycol à faible concentration. On peut ainsi obtenir une protéine d'albumine contenant peu de polyéthylène glycol. Si besoin est, on peut soumettre en outre la protéine de l'albumine à une électro dialyss avec de bons résultats. Le produit est ensuite déshydraté de façon convenable en vue d'obtenir une préparation 'standard de référence sèche. Les avantages surprenants de la présente invention résident non seulement dans l'élimination de la substance de groupe mais également dans la diminution de la substance hypotensive et de celle de la substance pyrogénique qui peut accompagner éventuellement la substance de départ. Ces impuretés sont également contenues dans le précipité formé lors de l'addition du polyéthylène glycol et se trouve ainsi éliminées. D'aprèsl'annlys'eparéîectrophorèse (T. Kawai et N. Aoki, l'Frac- tionation of serum proteins by cellulose acetate electrophoresis", p. 35 (Yagi Publishing Co., Tokyo, 1972)), l'albumine standard de référence avait'une composition en protéine contenant de 95 à 98 ,% d'albumine et 2 à 5 % d' a-globuline et de ss -globuline. Lorsque l'on a fait l'analyse par ultracentrifugation (T. Isemura et al., J. Biochem., Vol 44, p. 443 (1957)), on a relevé un pic simple qui indique l'existence d'une protéine pure. La teneur en substance de groupe a été estimée par la méthode du test d'inhibition par hémagglutination en utilisant un antisérum spécifique du groupe sanguin.On a découvert que la substance de groupe était éliminée à un degré comparable à celui relatif à la solution saline normale, après mesure du taux de dilution de l'antisérum (voir tableau I). La teneur en substance hypotensible a été évaluée en administrant une préparation d'échantillon à un chien adulte et en mesurant le pourcentage de dépression de la pression sanguine par rapport à la pression artérielle avant administration. Le pourcentage de de dépression était de 10 % ou -moins ce qui indiquait que l'échantillon était suffisamment exempt de la substance hypotensible pour être utilisable médicalement. Comme indiqué ci-dessus et conformément à l'invention, la substance de groupe peut être éliminée complètement de façon économique et en meme temps on peut éliminer la substance hypotensive. On fournit ainsi, de façon très efficace, une protéine de plasma contenant une quantité majeure d'albumine sans avoir peur des effets secondaires dûs à la présence des contaminants indiqués ci-dessus. En combinant le présent procédé aux techniques conventionnelles de préparation de l'albumine, on fournit un moyen de préparer des infusions d'albumine, qui apportent leur contribution au traitement médical. L'invention est illustrée ci-après en référence aux exemples sans aucun caractère limitatif. Exemple I Des placentas expulsés ont été enfermés immédiatement dans un sac en plastique propre et refroidis en vue de leur stockage dans un réfrigérateur à basse température à -200C. De tels placentas gelés ont été recueillis dans des hôpitaux et des maternités. Des sacs en plastique contenant 1 000 placentas gelés ont été lavés extérieurement avec de l'eau distillée sans pyrogène et ont été broyés grossièrement au moyen d'un broyeur à glace. Les sacs en plastique étaient éliminables facilement. Les placentas gelés et grossièrement broyés ont été broyés finement au moyen d'un hachoir à viande. On a ajouté 700 litres d'eau salée à 1 % à environ 600 kg des placentas broyés finement. On a agité le mélange à une température inférieure à 120 C pendant 45 minutes en vue d'extraire le composé sanguin. On a centrifugé extrait pour éliminer les résidus placentaires et pour séparer la solution surnageante (extrait de placenta). En ce qui concerne les protéines, l'extrait placentaire contenait 3,5 % de la protéine totale, 2,3 % de l'hémoglobine et 1,2 % d'autres protéines du plasma. On a ajouté 285 g de sulfate d'ammonium à 1 litre de l'extrait ci-dessus et on a éliminé le précipité formé contenant de la Y-globuline. On a conservé dans la couche du surnageant l'hémoglobine, la plus grande partie de la substance de groupe et l'albumine. Comme la concentration en protéines dans le surnageant est faible, le total de la protéine a été rassemblé sous forme de précipité par addition au surnageant de 200 g/litre de sulfate d'ammonium et par réglage du pH entre 6 et 7. On a déshydraté le précipité autant que possible et on l'a dissous dans de l'eau distillée exempte de pyrogène dans ure proportion de 4 à 7 litres par kg du précipité.Quelle que soit sa quantité, le sulfate d'ammonium qui avait adhéré à la protéine pendant le traitement et qui avait été porté par la protéine n' avait aucun effet sur les traitements ultérieurs . La solution ainsi obtenue a été mélangée, tout en agitant, avec de l'acide mandélique d'une manière connue jusqu' à ce que la concentration de ce dernier soit de 4 %. En maintenant le pS entre 4,9 et 5,0, la solution a été maintenue entre 58 et 600C pendant environ 1 heure pour précipiter complètement les protéines thermolabiles. Grâce à ce traitement, la plupart de l'hémoglobine a été éliminée ainsi que la globuline thermolabile tandis que l'activité développée de la substance de groupe, des substances hypotensives et de l'albumine passait dans le surnageant. La protéine du surnageant contenait 1,5 % d'albumine. Afin d'éliminer la substance de groupe et les substances hypotensives, on a réglé le surnageant à une concentration en protéines comprise entre 5 et 40 litre et à une concentration en sel de 5 % ou moins en chlorure de sodium. Au surnageant obtenu, on a ajouté 220 g de polyéthylène glycol ayant un poids moléculaire de 6 000 pour 1 litre du surnageant et le pH a été réglé à 8,0 de façon à précipiter quelques protéines. On a éliminé le précipité en laissant un surnageant contenant seulement un composé de protéines comprenant I'albumine recherchée en tant que constituant majeur. Comme la concentration en protéine du surnageant était faible, les protéines contenues dans le surnageant ont été rassemblées à nouveau sous forme de précipité en réglant simplement le pH dans les valeurs acides. Dès que le polyéthylène glycol était contenu à une concentration de 20 % ou plus, la protéine désirée a été précipitée en réglant simplement le pH du surnageant entre 4,5 et 5,6. On a séparé le précipité en déshydratant et on a obtenu une protéine de plasma purifiée comprenant, en tant que constituant majeur, une albumine contaminée sans substance de groupe et sans substance hypotensive ! On a dissous le précipité ainsi obtenu dans de l'eau distillée exempte de pyrogène et on a fait une analyse par électrophorèse.On a trouvé que la protéine avait la composition suivante : 95 à 98 % d'albumine et 2 à 5 % d' a-globuline et de B-globuline. Après analyse par ultracentrifugation, la protéine présentait un pic unique d'albumine ce qu-i prouvait la présence d'une protéine pure. Cette protéine pure ne présentait aucun signe d'altération telles que la formation de précipités ou une apparence de trouble. Elle ne présentait aucune toxicité après administration à des souris, à des cochons d'inde, des lapins ou des chiens et elle n'avait pas de propriétés néfastes tel que le développement d'activité de substance de groupe ou d'effet hypertensif. Le rendement en protéine de plasma ainsi obtenu était de 2,3 g par placenta. Exemple 2 En suivant le procédé de l'exemple 1 pour traiter l'extrait placentaire, on a pu obtenir de la protéine de plasma pure contenant de l'albumine en tant que constituant majeur également à partir du sérum contenu dans- le sang rétroplacentaire utilisé comme substance de départ ou à partir de sang veineux ayant subi lthémo- lyse également utilisé comme substance de départ. Le rendement était d'environ 11 g et 17 g respectivement pour un litre de sérum rétroplacentaire et de sérum de sang veineux ayant subi l'hémolyse. Exemple 3 On a répété le procédé de l'exemple 1 en ajoutant toutefois le EDTA à la solution à une concentration finale de 1 mM dans l'étape o l'acide mandélique était ajouté à la solution à une concentration finale de 4 % et la solution était chauffée entre 58 et 600C pendant environ 1 heure tout en maintenant le pH de la solution dans la gamme acide entre 4,5 et 5,5. La protéine du plasma contenant de l'albumine comme constituant majeur a été complètement libérée non seulement de la substance de groupe mais des substances hypotensives, de l'hémoglobine et égaiement de la phosphatase alcaline. On a mesuré l'activité enzymatique de la phosphatase alcaline par la méthode décrite dans Journal of Biological Chemistry, vol. 164, p. 321 (1946). REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'albumine humaine, caractérisé en ce qu'il consiste à traiter une solution aqueuse d'albumine d'origine humaine contenant une substance de groupe sanguin au moyen de polyéthylène glycol pour précipiter les protéines contaminantes contenant la substance de groupe sanguin et à récupérer l'albumine du liquide surnageant. 2. Procédé selon la revendication t, caractérisé en ce que la solution aqueuse d'albumine provient du placenta humain ou du sang rétroplacentaire humain. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution aqueuse d'albumine contient au moins 50 % d'albumine par rapport à la protéine contenue au total. 4. Procédé selon la revendication t, caractérisé en ce que le polyéthylène glycol a un poids moléculaire moyen compris entre 2 000 et 10 000. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le traitement est mis en oeuvre à une concentration en polyéthylène glycol de 13 à 30 46: (P/V) dans la solution aqueuse d'albumine à un pH compris entre 6,6 et 9,6. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration en protéine de la solution aqueuse de l'albumine est comprise entre 5 et 40 g/litre. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution aqueuse d'albumine contient 50 g/litre ou moins de chlorure de sodium d'un sel inorganique. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'albumine est récupérée en précipitant l'albumine à une concentration en polyéthylène glycol de 20 à 30 % (P/V) dans le liquide surnageant à un pH compris entre 4,5 et 5,6.