Brevet FR2386035A1 — publié le 19781027

la présente invention concerne le domaine du dosage viro- immunoenzymologique, Elle concerne on particulier un procédé pour le dosage viroimmunoenzymoligique,en milieu liquide, da substances organiques (@i-après dénommées ligands) non-protéiques ou de leurs anticorps , ayant une gamme étendue de poids moléculaires. Les substances organiques (ligands) non-protéiques susceptibles d'être dosées selon l'invention sont, par exemple, les haptènes et leurs anticorps correspondants, tels que les hormones, les médiateurs chimiques (prostaglandines), les drogues (par exemple penicilloyl, acide acéthyl-salicylique, couramment dénommée "aspirine" etc...), les polysaccharides, les anticorps antipolysaccharides, les acides nucléiques et les anticorps anti-acids nucléiques. On sait, d'après les travaux de MAKELA (Assay of antihapton antibody with the aid of hapten-coupled bacteriophage,Immunolo- gy 10, 81-86, 1966) et de HAIMOVCIH et SEIA (Inactivation of poly D-alanyl bacteriophage T4 with antisera specific toward poly DLalanine, The journal of Immunology 97, 3, 338-343,1966),qu'un phage lié de manière covalente à un haptène (et couramment dénommé alors "phage modifié") peut être complexé et désactivé par un sérum anti-haptène, ce qui signifie qu'il n'a plus la propriété de lyser les bactéries. Un tel phage modifié a alors pu Stro utilisé pour doser un anticorps ou un haptène. C'est ainsi que, selon la technique classique dite des plages de lyse on double couche d'agar,on met dans un tube à essai le ligand à doser et une quantité connue d'immunsérum antiligand. On incube à 37 C,pendant un temps donné,le ligand à doser en présence de l'immunsérum anti-ligand. On ajoute ensuite les phages modifiés et on incube à nouveau à 379C pendant un temps donné. Pour révéler la lyse bactérienne duc aux phages modifiés qui n'ont pas été désactivés par l'anticorps,on opère classiquement selon le procédé décrit par Adams dans "Bactériophages" (Inter sci@nce Publishers, New York, 1959):on ajoute dans le milieu réactionnel des bactéries E. coli B, en phase de croissance exponentielle,puis on verse dessus de l'agar liquide. On étale le tout sur une botte de Petri contenant une couche d'agas solide. On met à l'étuve à 37 C, et 12 heures après on compte le nombre de plages de lyse bactérienne.On peut ainsi établir une courbe dose- réponse.Selon un tel procédé, plus la concentration en ligand à doser est forte, moins il y a d'immunsérum anti-ligand libre et, donc, plus il y a de bactéries lysées. Il a été établi que le dosage n'est possible que si on se place en cinétique du premier ordre, représentée par la relation: P/Po = e-K.C.t où K désigne la constante de vitesse de neutralisation du phage modifié par l'immunsérum anti-ligend, C désigne la concentration finale dudit immunsérun, et P et Po représentent le nombre de plages de lyse respectivement en présence et on l'absence d'immun- sérum. Pour se placer dans de telles conditions, on choisit la concentration on immunsérum anti-ligand de telle sorte que cet immunsérum anti-ligand inactive 80-90% des phages modifiés. Classiquement, on se place à temps constant,c'est-à-dire qu'on a K.t = K', et la relation ci-dessus devient = e-K'C Po Selon le procédé classique décrit ci-dessus,il est nécessaire de disposer de, et de préparer, la gélose et des bottes de Pétri: il est aussi nécessaire d'attendre pendant 12 heures. le pour temps vouluque la lyse bactérienne se développe, et il faut procéder à une numération de plages de lyse,notamment à l'aide d'un compteur de colonies bactériennes. On a maintenant trouvé de façon inattendue qu'il est possible de réaliser un dosage viroimmunoenzymologique de liands (par exemple d'hatènes ou de leurs anticorps, d'acides nucléiques ou d'anticorps anti-acides nucléiques, de polysaccharides ou d'anticorps anti-polysaccharides, etc.) au lieu du dosage classique viroimmunologique rappelé ci-dessus. la sensibilité du dosage viroimmunoenzymologique selon l'invention est aussi grande que celle du dosage classique. Selon l'invention, dans un procédé pour le dosage de ligands comportant, comme dans le dozage classique rappelé ci-dessus,le méglange du ligand à doser avec une quantité connue d'immunsérum anti-ligand et l'addition ultérieure de phages modifiés, on ajoute des bactéries non constitutives pour une enzyme endocellaire donnée induites pour selle-ci et lavées de façon à ce que les phages modifiés restés libres provoquent la lyze bactérienne qu'on apprécie ensuite au moyen de la libération dais le milieu de l'enzyme endocellulaire chosiei. Dans le procédé selon l'invention, on fait avantageuse ment suivre l'addition d'une quantité déterminée de phages modi fiés d'une incubation à 0 C pendant un temps arbitraire;on notera que ladite durée d'incubation peut être modifiée, si nécessaire, à condition seulement qu'on prenne soin d'adapter la concentration en immunsérum anti-ligand Pour la mise en oeuvre de ce procédé,il convient d'ajou- ter en pratique au ligand à doser une quantité d'immunsérum anti- ligand telle quelle inhibe environ 80-90% des phages ajoutés ult6rieurement. Pour ce faire, il importe de procéder, préalablement au dosage lui-même, à une détermination des concentrations de phages et d'immunsésum anti-liand qui conviennent; à cette fin, on opère par exemple comme suit : - on mélange 0,1 ml de tampon (tel que cclui utilisé pour les dilutions, comme par exemple un tampon constitué de phosphate acide de sodium et de phosphate disodique 0,05 M, pli 6,8 et de 20 g/ml de gélatine), 0,1 mi d'immun- sérum anti-ligand à différentes dilutions (par exemple de 1/10@@ à 1/107) et 0,1 ml de phages modifiés à différentes concentrations; -on incube à 0 C pendant un temps arbitraire do 2 heures;; - on ajoute ensuite les bactéries comme dans le dosage proprement dit selon l'invention et on révèle; -pour chaque concentration de phages modifiés on choi sit la concentration d'immunsérum nécessaire à 80-90% de leur désactivation. Pour cela, il faut obéir à deux impératif: -la concentration en anticorps de l'immunsérum antl- ligand avant l'addition du ligand à doser doit être en large excès par rapport à celle des phages (de l'or- dre de 103 à 196 phages/0,1 ml), - le nombre des phages doit être suffisant pour qu'une lecture de densité optique (DO)soit possible dans le dosage susdit. fas bactéries utilisées, qui sont des bactéries en phase exponentielle capables d'être induites et attaquées par le phage choisi (entre autres des bactéries E coli BB) sont, à cet effet, induites pour une enzyme endocellulaire, par exemple par un galac toside, et en particulier l'isopropyl thio-galactoside (IPTG) ou le lactose pour la ss-galactosidase,puis lavées à 0 C pour éliminer l'IPTG. De manière plus générale, l'inducteur choisi doit pouvoir induire dans les bactéries la synthèse d'une enzyme endocellulaire qui sera libérée dans le milieu après-infection phagique. Pour plus de clarté dans ltexposé, on se référera toutefois toujours dans la suite à la ss-galactosidase, étant entendu que l'hom- me de l'art est parfaitement à même de transposer pour d'autres enzymes endocellulaires convenables ce qui est dit pour celle-ci. Dans la pratique, ltaddition des phages et des bactéries doit être effectuée a des intervalles de temps bien définis, par exemple de 10 s en lots, ou de 5 s en 5 s pour que soit ainsi respecté scrupuleusement le temps d'incubation. On incube à 0 C, pour sensibiliser la méthode (comme décrit par J.M. Andrieu, S. Mamas et F. Dray dans European Journal of Immunol. Vol.4/1974, n06). En pratique, le phage doit s'être développé sur les bactéries qu'il va infecter. On laisse adsorber les phages sur les bactéries pendant un temps approprié, en incubant au minimum 10 minutes à 0 C.gette température est nécessaire pour bien séparer le phénomène d'adsorption de celui de multiplication -lyse. Seuls les phages libres peuvent s'adsorber sur les bactéries pour ensuite lyser ces dernières. On centrifuge ensuite,pour séparer les bactéries des autres éléments de la réaction, à savoir le complexe anticorps-ligand et le complexe anticorps-phage modifié. Dans le,culot de centrifugation se trouvent des bactéries induites et des "bactéries induites-phages modifiés". On reprend le culot de centrifugation pour y ajouter du milieu nutritif liquide,sans inducteur , et on incube, en pratique à 370C. On permet ainsi que se multiplient les bactéries induites libres, tandis que sont lysées celles qui ont adsorbé le phage modifié. A la fin du 3ème ou 4ème cycle de lyse,on est en présence d'une grande quantité de bactéries non induites, de bactéries induites, de parois bactériennes, de capsides de phages et, entre autres substances, de ss-galactosidase et d'une multitude de phages natifs, donc non modifiés. Ces derniers pourraient en théorie lyser les bactéries; or, il reste des bactéries induites non encore lysées. On ajoute donc avantageusement à ce stade, selon une variante préférée du procédé selon l'invention,une quantité appropriéede sérum antiphage,qui, en désactivant le dit phage natif, évite une lyse totale qui empêcherait tout dosage. On centrifuge ensuite et on dose la ss-galactosidase,de manière classique, dans le surnageant. Dans des limites bien définies,qui sont celles découlant d'une mise en oeuvre du procédé comme il a été décrit ci-dessus,il existe une relation linéaire entre la quantité de ss-galactosidase libérée et ainsi dosée et le nombre de phages qui ont lysé les bactéries. Ia p-galactosidase ainsi dosée dans le surnageant de centrifugation a été libérée par les bactéries induite s qui ont fixé les phages et se sont lysées, L'augmentation de la ss-galacto- sidase libérée dans le milieu signifie qu'il y a ou augmentation de la lyse bactérienne, et par là mSm qu'il y a eu plus d'imun- sérum anti-ligand pour complexer le ligand à doser, donc moins d'immunsérum anti-ligand libre on présence des phages modifiés. A l'inverse, plus la concentration de ligand à doser est faible, plus est faible la quantité de ss-galactosidase libérée dans le milieu et dosée selon l'invention. Le substrat utilisé pratiquement pour la mesure da la conscentration enzymatique en ss-galactosidase est l'ortho-nitrophénol-ss-galactoside (ONPG). En présence de ss-galactosidase, il y a dans le milieu de réaction libération d'ortho-nitrophénol (oNP), de couleur jaune , at de galactose, la libération d'ONP étant directement fonction de la quantité d'enzyme présente dans la milieu En présence dtun excès de substrat et pour un temps d'incu- bation déterminé,la Valeur de la densité optique mesurée au colorimètre à 420 na est due à l'intensité de la coloration et varie selon que la quantité de ss-galactosidase présente est plus ou moins grande. Ce procédé de dosage en milieu liquide selon ltinvention permet d'obtenir une courbe dose-réponse dont la sensibilité est très bonne et telle qu'elle permet d'atteindre une limite de détection de 2 à 3 pg. D'autre part, le procédé selon l'invention présente l'avantage pour le dosage des ligand et des anticorps sur le procédé radioimmunologique de ne pas nécessiter de traceur radioactif et de permettre une automatisation du dosage et des économies dO matériels considérables. Seul est maintenant nécessai- re un matériel de laboratoire réduit, comprenant essentiellement: tubes, pipettes, colorimètre, bain-marie avec agitation (ou étuveù à 370C et centrifugeuse non réfrigérée. L'invention a également pour objet un coffret de dosage ou de diagnostic comprenant essentiellement: des- phages modifiés -un immunsérum anti-ligand à une concentration définie, éventuellement lyophilisé, -une gamme du ligand à doser, -des bactéries glycérolées à 30%, -un substrat de l'enzyme, -du sérum anti-phage à la concentration requise,et - des tampons et milieux de cultures,y compris un inducteur. En prstique,il convient de conserver l'ensemble des composants de ce coffret à une température d'environ + 4 C,à l'exception des bactéries qui doivent être conservées, de préférence hors du coffret après la réception de celui-ci par ltutili- sateur, à -20 c environ jusqu'à la période d'utilisation effective. Les composants rentrant dans ledit coffret t leurs quantités ou concentrations respectives peuvent être choisis par l'homme de l'art qui dispose pour ce faire, outre de ses propres connaissances dans le domaine considéré, des indications figurant dans la description ci-dessus et des précisions fournies dans les exemples illustratifs qui vont suivre. En particulier,un tel coffret peut être composé de manière à servir pour le dosage,notamment à des fins de diagnostic, d'haptènes tels que le pénicilloyl ou d'anticorps anticortisol,anti-cestradiol ou anti-pénicilloyl. L'invention s 'applique toutefois de manière générale aux dosages et aux "screenings", par exemple en prévention et en toxibar exemple cologie, et permet de détecter/dans les liquides organiques de faibles quantitiés d'hormones, de médiateurs chimiques tels que des prostaglandines, de drogues, de polysaccharides, d'acides nucléiques et autres substances organiques (ou ligands) non-protéiques. A titre d'exemples illustratifs, mais non limitatifs, du procédé selon l'invention, on décrit maintenant des dosages viroimmunoenzymologiques respectivement du groupe pénicilloyl (pénicylloyl # -aminocaproate , &gamma; -globuline pénicilloyl). EXEMPLE 1 Dosage viroimmunoenzymologique du groupe pénicilloyl. On a formé un complexe penicilloyl-anticorps anti- penicilloyl en mettant en oeuvre,de manière classique,0,1 ml de tampon PG(phosphate monosodique et phosphate disodique 0, 0,05M, pH 6,8,et 20 g/ml de gélatine), 0,1 ml de penicilloyl(à différentes concentrations connues,pour étalonnage, ou à une concentration à déterminer par le dosage subséquent) et 0,1 ml d'immunsérum anti p@nicilloyl dilué dans ledit tampon PG à la concentration adéque te. On a maintenu le tout pendant 30 minutes à 37 C ot pendant 15 minutes à 0 C (soit en pratique à la température de la glace fondante). On a utilisé 0,1 ml de phages-penicilloyl, en dilution dans le même tampon PG que ci-dessus (phages T4-penicilloyl obtenus par la technique décrite par Haimovich J. et al dans Nature, 214, 1369 - 1370,1967 et modifié par Wal J.M. et al dans PEBS Lertters 57, 1,9 -13,1975),et conservés à + 4 C. On a réalisé cette addition,en pratique,de 5s en 5s pour respecter scrupuleusement le temps d'incubation. On a ensuite laissé incuber 2 heures à O C. Pendant ce temps, on a préparé les bactéries comme suit; -on a réalisé et maintenu une nuit à 37 C une solution (dénommée dans la suite Solution C, pour simplifier l'exposé) de 0,1 ml de solution de E. coli BB,glycérolée à 30% dans 10 de solution de bactotryptone (milieu bactotrypone 10g/1, NaCl 5g/1 d'eau distillée). On peut d'ailleurs conserver cette solution C pendant 5 Jours à + 4 C. La solution de E. coli utilisée étai@t une solution de E. coil BB né 10.582 (Collection Institut Pasteur) (thiamine, maltose, lactose , non lysogène, SMS) conservée à - 20 C dans du glycérol à 30%. -on a mis 0,3 ml de cette solution C dans 10 ml de baototryptone + inducteur (milieu bactotryptone 10g/1, NaCl 5g/1 d'eau disitillée, avec en plus de l'isopropyl thio-galactoside 10-4M ou du lactose 10-3M) et on a maintenu pendant 1 heure à 3700. ta densité optique à 650 nm était située entre 0,1 et 0,2, -on a centrifugé la culture ainsi réalisée,pendant 5 minutes à 3500 g, -aprbs avoir éliminé le surnageant, on a repris le culot de centrifugation par 10 ml de milieu bactotrypeone 10g/1,NaCl 5g/1 d'eau distillée,préalablement refroidi dans de la glace fondante On a agité au vortex et on a maintenu le milieu agité dans de la glace fondante jusqu'à son utilisation (obtenant ainsi 108 à 109 bactéries par ml). Pour réaliser l'adsorption des phages sur les bactéries, on a ensuite ajouté (de 58 bn 58, pour respecter scrupuleusement le temps d'incubation) 0,5 ml de bactéries E. coli BB (18 à 109 bactéries par ml induites comme indiqué ci-dessus pour la ss-galactosidase et lavées. On a laissé les phages s'adsorber sur les bactéries pendant au moins 10 minutes à 0 C,puis on a centrifugé pendant 5 minutes à 3500 g et on a éliminé le surnageant. Pour révéler la lyse bactérienne, on a ensuite repris le culot de centrifugation par 0,5 ml de milieu bactotrptone 10/1 NaCl 5g/1 d'eau distillée, on a agité au vortex et on a maintenu pendant 2 h 30 au bain marie à 37 C avec agitation. On a ajouté 0,1 mi d'immunsérum antiphage T4 au 1/100 pour bloquer les phages natifs libérés lors de la lyse bactérienne et on a centrifugé pendant 5 minutes à 3500 g. Pour doser l'haptène par mesure enzymatique selon une mthéode olassique,on a prélevé 0k,2 ml du surnageant de cette der@- nière centrifugation et on y a ajouté 1,0 ml d'un tampon "PM@" constitué de phosphate monosodique et de phosphate disodique 0,1 M en PO4- , de MgSO4 10-3M, de Mn SO4 5.10-3M, de Mg titriplex 5.10-3M et de M-mercaptoéthanol 0,1M (0,7 ml/100 ml de tampon). On a équilibré au bain-marie à une température choisie de 370C ou de 45 C. On a ajouté 0,5 ml d'une solution à 0,4% dans le même tampon d'ONPG (orthonitrophényl-ss-D-galactopyranoside),équilibrée à la même température. On a agité et incubé jusqu'à l'apparition d'une coloration jaune,mesurable à l'aide d'un colorimètre. On a arrêté la réaction par 1.ml de Ga2C03 1N et on a alors noté le temps,en minutes, au bout duquel cette coloration jaune était apparue. On a lu la densité optique à 420 nm(comme indiqué par Craven G.R et al.dans J. B@@ol,Chem. 240.2468,1965). DOx étant la densité optique lue contre le témoin bactéries (B = bactéries seules),DOmax est la densité optique maximale (phage + B = phage-penicilloyl + bactéries),et DOmin la densité optique minimale(As + phage + B =immunsérum anti-penicilloyl + phage penicilloyl + bactéries). On rapporte toutes les DO au mSme temps en retranchant le témoin bactéries. Pour réaliser la courbe dose-réponse, on porte en abscisse le logarithme de la concentration en pénicilloyl (en pg/0,1 1 mi) et on ordonnécle rapport s anticorps non lid l'haptène - Cx Ln (DO, /DOG;aX) anticorps total Cx - Ln (DO,i /O ax) On sait en effet que l'équation de cinétique de neutralisation du phage-haptène par l'immunsérum anti-haptène s'écrit : où P et PO représentent la lyse (visualisée classiquement par le nombre de plages ou détectée par l'hydrolyse enzymatique de l'ONPG selon l'invention, mesurée par la densité optique), respectivement en présence et en l'absence d'immunsérum. Sans anticorps, la DO est maximale (DOmax.) A la concentration maximale en anticorps (Cmax), c'est dire à la concentration qui inhibe 90% des phages, on a une DO minimale. Quand une certaine proportion s'en trouve fixée sur l'haptè- ne, la concentration en anticorps devent Cx et on a etZ si on fait le rapport Dans le tableau ï ci-dessous, on rapporte les valeurs de la densité optique de l'ONPG hydrolysé par la ss-galactosidase qui a été libérée par la lyse bactérienne pour chaque concentration (en triple exemplaire) de l'haptène de référence, à savoir le pénicilloyl # -amino caproate. Dans cette expérience, la concentration en immunsérum était de 1/7000 pour 8000 phages viables (donnant des plages de lyse). La sensibilité du dosage butait très bonne et la limite de détection était d'environ 2 pg. TABLEAU I Courbe dose-réponse pour le penicillcyl-#-amincoaprcate (Dansité optique de l'ONP formé en 10 minutes Gamme Densité optique à 420 nm Moyenne Cx/Cmax(%) (pg/0,1 ml) des triples # + B 1758 1664 1714 1712 0 AS + # + B 284 293 314 297 100 2 h 15,0 C @@@ @@@ @@@ @@@ 127 130 112 123 1000 1634 1620 1664 1639 2,1 100 1278 1496 1580 1451 8,1 80 1488 1504 1430 1474 7,3 60 1388 1372 1384 1381 10,5 40 1300 1328 1242 1290 13,9 20 893 858 836 862 34,6 10 696 778 771 748 42,1 5 424 501 494 473 68,4 2 375 351 390 372 83,7 AS = immunsérum anti-pénicilloyl # = phage penicilloyl B = bactéries On peut faire varier la quantité de phages, à condition d'utiliser la concentration adéquate d'immunsérum. Dans le tableau II, on a noté la sensibilité du dosage dans les cas d'une gamme penicilloyl- # aminocaproate et d'une gamme &gamma; -globuline penicilloyl (immunogène spécifique de l'immunsérum) suivant ces concentrations. TABLEAU II &gamma;- globuline pénicilloyl Penicilloyl -aminoca proate Limite infé- 50% de liai-Limite in-50% de rieure, pg/0,1ml son pg/0,1 férieure liaison ml pg/0,1 ml pg/0,1ml 116,000 # [ AS ] 1/5000 25 40 20 55 11,600 # [AS] 1/17000 5 10 3 16 Dans le tableau III enfin, on compare les sensibiltiés des courbes dose-réponse pénicilloyl-#-amincoaproate obtenues respectivement par les techniques radioimmunologique (TRI), immunocnzymologique (TIE), viroimmunologique (TVI) et viroimmunoenzymatique selon l'invention (TVIE), avec le même immunsérum. TABLEAU III Limite infé- 50% de liaison Concentration finale rieure pg/0,1ml pg/0,1 ml du sérum anti-pénicil loyl TRI 100 1500 1,7 x 10-5 TIE 30 160 2,7 x 10-5 TVI 2 7 9 x 10-7 (5h,0 C) TVIE 3 16 5 x 10-6(2h,0 C) EXEMPLE 2 Dosage viroimmunoenzymologique de 17ss-cestradiol. On a formé un complexe 17ss-oestradiol-anticorps anti-17ssoestradiol 6-CMO (ou 6-carboxyméthoxime) SAB en mettant en oeuvre, de manière classique, 0,1 ml do tapon PG (phosphate monosodique et phosphate disodique 0,05 M > pH 6,8 et 20 g/ml de gélatine), 0,1 ml de 17ss-oestradiol (à différentes concentrations connues, pour étalonnage, ou à une concentration à déterminer par le dosage subséquent) et 0,1 ml d'immunsérum anti-17ss-oestradol dilué dans ledit tampon PG à la concontration adéquate. On a maintenu le tout pendant 30 minutes à 370C et pendant 15 minutes à 0 c (soit en pratique à la température de la glace fondante). On a utilisé 0,1 ml de phages 6-CMO-I7p-oestradiol,en dilution dans le môme tampon PG que ci-dessus (phages T4-6-CMO- 17ss-oestradiol obtenus par la technique décrite par Andrieu, S. Mamas et F. Dray dans European Jouranl of Immunology 1974, volume 4, n 6) et conservés à + 4 C. On a réalisé cette addition,en pratique, de 5 s en 5 s pour respecter scrupuleusement le temps d'incubation. On a ensuite laissé incuber 2 heures à 0 C. Pendant ce temps,on a-préparé les bactéries en suivant le mode opératoire indiqué dans l'exemple 1. Pour réaliser l'adsorption des phages sur les bactéries, on a ensuite ajouté (de 5 s en 5 s, pour respecter scrupuleusement le temps d'incubation) 0,5 ml de bactéries E. coli BB (108 à 109 bactéries par ml) induites comme indiqué dans l'exemple 1 pour la ss-galactosidase et lavées. On a laissé les phages s'adsorber sur les bactéries pendant au moins 10 minutes à 0 C,puis on a centrifugé pendant 5 minutes à 3500 g et on a éliminé le surnageant. Pour révéler la lyse bactérienne,on a a ensuite repris le culot de centrifugation par 0,5 mi de milieu bactotryptone 10 g/1, NaCl 5 g/1 d'eau distillée;on a agité au vortex et on a maintenu pendant 1 h 45 au bain-marie à 370C avec agitation. On a ajouté 0,1 ml d'immunsérum antiphage T4 au 1/100 (3ème cycle de lyse) et on a continué l'incubation pendant 45 minutes à 370C sous agitation. On a centrifugé pendant 5 minutes à 3500 g. Pour doser l'haptène par mesure enzymatique,on a ensuite opéré comme il est indiqué dans l'exemple 1. Dans le tableau IV ci-dessouson rapporte les valeurs de la densité optique de l'ONPG hydrolysé par la ss-glactosidase qui a été libérée par la lyse bactérienne pour chauqe concentration (moyenne de 2 mesures) du ligand (présentement un haptène) de référence, à savoir le 17ss-oestradiol. Dans cette expérience,la concentration en immunsérum était de 1/27000 pour environ 10 000 phages viables (donnant des plages de lyse). La limite de détection était de 2 pg. A C 2 = 50%, on a dosé 13 pg de 17 ss-oextradiol. TABLEAU IV Courbe dose-réponse pour le 17ss-cestradiol(Densité optique de l'ONP formé en 7 minutes) Gamme Densité optique à 420 nm Cx / Cmax(%) (pg/0,1 ml) (moyenne des doubles) # + B 525 0 AS + # + B 46 100 2 h à 0 C B O 100 327 15 50 343 17 20 252 30 10 115 62 5 90 72 2 16 100 As =immunsérum anti-17ss-oestradiol. # = phage 17ss-oestradiol B = bactéries. -REVENDICATIONS 1.Procédé pour le dosage viroimmuoenzymologique de ligands, en milieu liquide,oomportant le mélange du ligand à doser avec une quantité connue d'immunsérum anti-ligand et l'addition ultérieure de phages modifiés, de façon à neutraliser le sérum anti-li,gand resté libre initialement, ledit procédé étant caracté- risé en ce qu'il comprend l'addition de bactéries non constituti- ves pour une enzyme endocellulaire donne, induites pour celle-ci et lavées de façon à ce que les phages modifiés restés libres provoquent la lyse bactérienne, qu'on apprécie ensuite au moyen de la libération dans le milieu de l'enzyme endocellulaire choisie. 2. Procédé selon la revendication l,caractérisé en ce qu'on fait suivre l'addition des phages modifiés, en une quantité déterminée, d'une incubation à OC, pendant un temps donné auquel il convient d'adapter la concentration en immunsérum anti-ligana. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2,caracté- risé en ce qu'on effectue, préalablement au dosage lui-même, une détermination des concentrations de phages et d'immunsérum antiligand qui conviennent. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3,caractérisé en ce qu'on fait on sorte que la concentration on anticorps de l'immunsérum anti-ligand soit largement supérieure à celle des phages avant l'addition du ligand à doser. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4,caravtérisé en ce qu'on ajoute au ligand à doser une quantité d'immunsérum anti-ligand telle qu'elle inhibe, en l'absence de ligand, environ 80 à 90 des phages ajoutés ultérieurement. 6.Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5,caractérisé en ce qu'on choisit les concentrations de phages et d'immunsérum anti-ligand de telle façon qu'on se place en cinétique du premier ordre, conformément à la relation P -K.C.t Pc n e -K.C.t dans @aquelle K désigne la constante de vitesse de neutralisation du phage modifié par l'immunsérum anti-ligand, C désigne la concentration dudit immunsérum,et P et Po représentent le nombre de phages de lyse respectivement on présence et en l'absence d'immunsérum. 7.Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractéisé en ce qu'on utilise des bactéries E. coli,notamment des E. coli BB. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre dSs bactéries E. coli en phase exponentielle et on les induits pour la ss-galactosidase au moyen d'un galactoside,notamment au moyen d'isopropyl thiogalactoside (IPTG) ou du lactose. 9.Procédé selon la revendication 8,caractérisé en ce qu'on lave à 0 C des bactéries induites pour éliminer l'inducteur @ à savoir le galactoside ou le lactose. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre des phages qui se sont développés sur les bactéries qu'ils doivent infecter. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'on utilise des phages choisis parmi les phages T2, T4, T4b et autres. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'on sépare les bactéries des autres éléments de la réaction, à savoir l'anticorps ligand et le phage modifiéanticorps, notamment par centrifugation. 13. Procédé selon la revendication 12,caractérisé en ce qu'on opère par centrifugation et on reprend le culot de centrifuga- tion,on y ajoute du milieu nutritif liquide, sans inducteur, et on incube, avantageusement à 37 C 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé on ce qu'on ajoute ensuite une quantité appropriée de sérum antiphage quiererçant une désactivation des phages natiis, permet un dosage convenable. 15. Procédé selon la revendication 14,carzctérisé en ce qu'on centrifuge ensuite et on dose l'enzyme, de manière classique, dans le surnageant. 16. Procédé selon la revendication 15,caractérisé en ce qu'on dose la ss-galactosidase. 17. Procédé selon la revendication 16,caractérisé on ce que, en vue de la détermination de la concentration enzymatique en ss-galactosidase, on met en oeuvre comme substrat de l'orthonitrophénol galactoside et on mesure au spectrophotomètre la densité optique due à la coloration jaune produite par l'orthonitrophénol libéré. 18.Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisé on ce qu'il est mis en oeuvre pour le dosage, notamment dans les liquides organiques, de faibles quantités d'haptènes, d'anticorps anti-haptènes, d'acides nucléiques, d'anticorps antiacides nucléiques, de polysaccharides, d'anticorps anti-polysaccharides, d'hormones, de médiateurs chimiques tels que des prostaglandines, de drogues et autres ligands non-protéiques ou substances organiques non protéiques ayant une gamme étendue de poids moléculaires. 19. coffret de dosage pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement: -des phages modifiés, - un immunsérum anti-ligand à une concentration définie, éventuellement lyophilisé, -une gamme du ligand à doser, -des bactéries glycérolées à 30#, - un substrat de l'enzyme, -du sérum anti-phages à la concentration requise, et des tampons et milieux de culture, compris un inductour.