Brevet FR2368037A1 — publié le 19780512

La présente invention concerne un procédé perectionné pour la détermination imnunologique d'anticorps à des organismes microbiens. Le perfectionnement fait intervenir l'utilisation d'anti-IgG humaine diluée pour produire un agglutinant non visible du produit de l'union antigène microbien-anticorps du sérum. Ce produit permet une fixation marquée maximale et donne ainsi une sensibilité maximale à la détermination par rapport au procédé de précipitation du produit de l'union utilisé antérieurement. Le présent procédé est particulièrement utile dans une détermination radio-immunologique pour détecter les anticorps à Neisseria gonorrhoeae (N.g.) dans les sérums. Une des techniques pour la détermination d'anticorps à des organismes microbiens fait intervenir la formation d'un produit d'union entre l'anticorps et un antigène dérivé du microbe comme par exemple de sa paroi cellulaire. Le produit de l'union est précipite de la solution d'essai par la présence d'un anticorps dérivé d'une espèce de mammifère différente. Par introduction d'un marquage approprié dans le produit d'union en utilisant un antigène marqué ou un anti-anticorps marqué, il est possible de déterminer la concentration de l'anticorps dans l'échantillon en utilisant une courbe de référence établie à l'avance. Ainsi, par exemple, la détection d'anticorps à la blennoragie dans le sérum humain est décrite dans le brevet US N0 3 974 269. Le procédé est basé sur ltutilisation d'un antigène produit par l'organisme Neisseria gonorrhoeae dont l'isolement est décrit plus en détail dans la demande de brevet allemand N0 2 343 264. Dans un mode d'exécution particulier de détermination radio-immunologique décrit dans le brevet US NO 3 974 269, les anticorps à N.g. dans le sérum sont détectés par un procédé selon lequel A. - On ajoute de l'antiwimmunoglobuline IgS humaine au sérum analysé dans un milieu aqueux tampon ; B. - On ajoute ensuite un antigène labile à chaud marqué par un élément radio-actif. C. - On fait incuber le mélange résultant entre 4 et 4500 environ pendant une période comprise entre 24 et 2 heures environ à un pH compris entre 6,5 et 8,5 environ de manière à former un produit conjugué antigène-anticorps quand des anticorps sont présents dans le sérum ; et D. - On détermine le niveau de radio-activité comme mesure de la présence du produit conjugué antigène-anticorps. Le produit onjugué précipité est séparé de la solution par filtration ou centrifugation. Selon les connaissances et les pratiques antérieures, la quantité d'anti-immunoglobine IgG humaine utilisée par rapport à la quantité de sérum dans l'Etape A est réglée de manière qu'on obtienne une précipitation maximale. On a toujours suppose qu'une précipitation maximale est équivalente à une production maximale de radioactivité. On règle donc le rapport en volume entre l'anticorps anti-IgG humaine et l'échantillon de sérum à sensiblement plus de 1/1 ; on utilise habituellement un rapport de 6/1. Plusieurs problèmes subsistent avant que de telles techniques puissent être utilisées comme base pour des essais de présélection en série. un problème majeur est le fait que le niveau positif de coupure se trouve à trois écarts-type au-dessus de la moyenne d'un groupe de sérums négatifs même à la sensibili- té maximale. Ainsi, l'esssidécèlera des sérums positifs ayant des teneurs relativement fortes en anticorps, mais ne décèlera pas avec précision des sérums ayant des teneurs en anticorps faibles ou limite qui représentent pourtant des sujets atteints d'infections positives par les agents microbiens en question.De plus, pour que l'on atteigne ce niveau de sensibilité, il est absolument nécessaire d'ajouter les réactifs dans un ordre particulier, c'est-à-dire d'ajouter L'anti-Ig; humaine au sérum d'essai tamponné et d'ajouter ensuite l'antigène marqués L'utilisation de l'or- dre normal selon, lequel l'antigène est ajouté au sérum et ensuite l'anti-IgG humaine donne un essai qui est indiqué comme étant d'une sensibilité insuffisante pour distinguer entre des sérums positifs et négatifs avec un degré utile de fiabilité. La présente invention concerne un procédé perfectionné pour la détermination immunologique d'anticorps à des organismes microbiens dans le sérum de mammifères. En particulier, le présent perfectionnement concerne des déterminations immunologiques d'anticorps dans lesquelles on ajoute un deuxième anticorps au mélange de réaction immunologique de manière à favoriser la précipitation efficace du produit conjugué antigène-anticorps microbien spécifique à Partir du milieu.Ce deuxième anticorps provient d'une espèce de mammifère autre que celle à laquelle appartient le sérum soumis & l'essai et est spécifique à la fraction d'IgG de cette dernière espèce, c'est-à-dire est un anticorps anti-IgG Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé pour la détermination immunologique d'anticorps microbiens dans un sérum de mammifère comprenant les étapes selon lesquelles : A. On forme un mélange réactionnel comprenant un milieu aqueux tamponné ; le sérum à étudier ; de l'antigène dérivé des microbes et de l'anticorps au sérum à essayer, cet antigène ou cet anticorps portant une marque détectable B, On fait incuber ce mélange réactionnel entre 4 et 450C environ pendant une période comprise entre 24 et 2 heures environ à un pH compris entre 6,5 et 8,5 environ de manière à former un produit conjugué antigène-anticorps quand l'anticorps microbien est présent dans l'échantillon de sérum ; et C. On détermine la quantité de la marque comme mesure de la présence du produit conjugué antigène-anticorps ; ce procédé étant caractérisé en ce que le rapport en volume entre l'antanticorps et l'échantillon de sérum est réglé à un niveau suffisant pour former un agglutinat, mais audessous de celui nécessaire pour effectuer une précipitation du produit conjugué antigène-anticorps. Comme indiqué ci-dessus, il est classique dans cette technique d'utiliser un plus grand volume de sérum anti-IgG que de sérum d'essai quand on effectue une telle détermination. Cela est dû au fait qu'on désire une précipitation maximale, considérée comme équivalente au recueil d'une quantité maximale d'antigène ou d'anticorps marqué. C'est l'efficacité de ce recueil qui a une grande influence sur la sensibilité du procédé. On a maintenant découvert que, contrairement à ce qu'or pensait jusqu'à présent, la récupération maximale de marque n'est pas obtenue lors d'une précipitation maximale du produit conjugué anticorps-antigène. Plut8t, d'une manière très surprenante, on a observé qu'une récupération maximale de marque est obtenue dans ce procédé quand on règle le rapport en volume de l'antianticorps à l'échantillon de sérum de manière à produire une agglutination non visible du produit conjugué. Le rapport nécessaire pour produire cette agglutination est sensiblement audessous de celui nécessaire pour la précipitation.Bien que les limites précises des rapports en volume utilisables pour effectuer l'agglutination varient suivant la nature des réactifs particuliers utilisés dans la détermination, ces rapports seront ordinairement inférieurs à I et compris en général entre 1/2 et 1/250. Ainsi, par exemple, dans une détermination d'anticorps à la blennoragie, le rapport en volume est compris de préférence entre 1/5 et 1/250. Comme les volumes de réactifs qu'on utilise dans les déterminations immunologiques sont relativement petits, pouvant être par exemple de l'ordre d'environ 5 l pour l'échantillon de sérum dans des déterminations radio-immunologiques, il est plus commode de diluer l'anti-anticorps et d'ajouter des volumes égaux de ce réactif dilué au sérum soumis à l'essai. On peut effectuer la dilution en utilisant du sérum de l'espèce de mammifère de laquelle provint l'anti-@@ticorps ou une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) comme diluant. Le procédé perfectionné selon la présente invention peut Entre utilisé dans des déterminations immunologîques visant à la détection d'anticorps présents dans le sérum sanguin de mammifères qui s'opposent à des organismes microbiens. Ainsi, le présent procédé peut être utilisé comme examen de dépistage pour détecter une infection par de tels organismes microbiens. Parmi les organismes microbiens auxquels le procédé peut s'appliquer, on peut citer, non limitativement, des bactéries telles que Neisseria gonorrg\hoeae, Neissria meningiditis, Treponema palli dum et ex Streptococcus yogenes ; des champignons comme Histo las- ma capsalatum ; des levures comme candida albicans ; et des pa rasites comme Trichomonas vaginalis-. La formation de l'agglutinat de produit conjugué anticorps microbien-antigène peut être détectée par un certain nombre de techniques connues de l'homme de l'art. On peut marquer d'une manière en elle-meme connue soit l'antigène dérivé du microbe concerné, soit l'anticorps. Ces marques peuvent comprendre un élément radio-actif détectable comme 3H, 14C, 125I, etc..; une enzyme comme décrit dans le brevet US N 3 817 837 un groupe à résonance de spin électronique comme décrit dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique Nos 3 453 288, 3 481 952, 3 507 876 et 3 690 834 ; un fluorophore comme la fluorescamine, NSPS, la fluorescéine, la rhodamine, l'auramine, etc.. ; ou des chromophores. L'anti-anticorps utilisé dans la mise en oeuvre de l'invention provient d'une espèce da mammifère différente de l'espèce dont le sérum doit être soumis à une détermination concernant l'anticorps microbien. Âinsi, par exemple, si c'est du sérum de sang humain qui est soumis à la détermination, on peut utiliser de l'anti-IgG humaine dérivée de sérum de mouton ou de chèvre. De telles matières sont disponibles comme articles du commerce. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, on effectue la détection de l'agglutinat en utilisant un antigène marqué, d'une manière particulièrement préférable un antigène marqué au moyen de 125I, On peut introduire une telle marque en utilisant des procédés connus dans la technique, par exemple comme décrit par tyvanen et autres dans J. Biol. Chem. 248, 3762 (1973) ou le procédé modifié décrit dans le brevet des Etats Unis d'Amérique N 3 974 269. Le produit conjugué dont il s'agit ici est formé par une réaction qui se produit dans un milieu aqueux à un pH compris entre 6,5 et 8,5 environ durant une période comprise entre 2 et 24 heures environ à une température de 4 à 450C environ. On effectue la réaction en mélangeant le sérum soumis à la détermination avec le tampon aqueux, l'antigène marqué et l'anti-corps. L'ordre d'addition n'est pas critique. Dans un mode opératoire typique pour la détection d'anticorps microbiens par détermination radio-immunologique, on prépare un mélange réactionnel comprenant 0,1 cm3 de solution saline tamponnée au phosphate (pE 7,2) ; 5 pl de sérum d'essai 5 l d'anti-anticorps dilué à raison de 1/2 à 1:200 avec un tampon ou du sérum normal ; et 50 pl d'antigène marqué au moyen 125I (8 000 cpm à une efficacité de comptage de 70%). Le mé lange réactionnel est mis à incuber à 40 jusqu'au lendemain (16 heures environ) et à la fin de cette période on ajoute 0,5 cm3 de PBS. La matière agglutinée obtenue est séparée par filtration au moyen d'un filtre Whatman GF/C de 2,4 cm en utilisant un appareil de filtration à usages multiples Millipore. Bien que le produit conjugué agglutiné ne soit pas visible, il est retenu par le filtre dans le traitement ci-dessus. Le filtre est ensuite bien lavé à l'eau distillée et on détecte la marque en comptant la radio-activité Pour réduire au minimum la fixation non-spécifique d'antigène, il est avantageux-de prélaver le filtre. Le milieu préféré de prélavage est de l'albumine de sérum bovin, mais on peut utiliser aussi d'autres réactifs comme de l'immunoglobuline de sérum humain, de l'ovalbumine et de l'hémoglobine. Le prélavage préféré est effectué avec 0,5 cm3 d'une solution contenant 2% en poids de fraction V BSA en même temps qu'un agent chélateur comme de l'acide éthylènediamino-tétracétique (EDUA) 0,01 1. - EXEMPLE 1. Procédé Dans une opération typique pour la détection d'anticorps de Gc, on ajoute les réactifs suivants et on mélange bien : 0,1 cm3 de solution saline tamponnée au phosphate, pH 7,2 ; 5 pl du sérum du patient, 5 pl d'une dilution 1/16 d'anti-1gG humaine de chèvre dans du sérum normal de chèvre et 50 jil d'antigène de Gc marqué au moyen de 125I (8000 cpm). L'ordre d'addition des réactifs nrest pas important. Après incubation jusqu'au lendemain à 4 C, on ajoute 0,50 cm3 de PBS de manière à obtenir un volume assez grand pour faciliter la manipulation. On sépare l'agglutinat antigène-anticorps par filtration à travers un filtre Whatman GP/C de 2,4 cm en ut lisant un Millipore Manifold (les filtres doivent être préalablement mis à tremper dans une solution d'albumine de sérum bovin). Après lavage soigneux du filtre, il est séché sous vide modéré et soumis à un comptage dans un compteur à scintillations gamma. IL. Comnaraison du présent procédé avec celui du brevet US N 3 974 269 On effectue une série de déterminations sur 5 sérums (1-5) à résultats négatifs de culture concernant Gc et sur 12 sérums (6-17) à résultats positifs de culture concernant Gc, en utilisant le présent procédé et aussi celui. du brevet US N 3 974 269. Comme om le voit d'après le Tableau I, tous les sérums positifs sont détectés par le présent procédé tandis que quatre sérums sur douze, ou 33%, ne sont pas détectés par le procédé du brevet US N0 3 974 269. La sensibilité du procédé selon la présente invention est donc supérieure à celle du brevet US précité. il est important aussi de noter que la fixation de la marque est aussi bien plus forte. Le rapport des résultats de comptage obtenus par le présent procédé et par le procédé du brevet US N 3 974 269 est en moyenne de 3,25 (valeurs extrêmes 1,15-5,59). T A B L E A U I Rapport Echantillon Résultats Brevet US N Présent procédé de culture 3 974 269 cpm selon le présent procéde cpm selon le brevet US (cpm) Résultats (cpm) Résultats 1 - 165 - 123 2 - 137 - 98 3 - 129 - 120 4 - 97 - 204 5 - 154 - 207 6 + 204 - 1000 + 4,90 7 + 97 - 524 + 5,40 8 + 225 - 788 + 3,50 9 + 111 - 817 + 3,60 10 + 575 + 662 + 1,15 11 + 444 + 915 + 2,06 12 + 534 + 789 + 1,47 13 + 1783 + 2319 + 1,30 14 + 698 + 2266 + 3,20 15 + 394 + 2206 + 5,59 16 + 517 + 2052 + 3,59 17 + 1333 + 2542 + 1,90 REVENDICA?IONS 1) Un procédé immunologique pour déterminer la présence d'anticorps microbiens dans un sérum de mammifere comprenant les étapes selon lesquelles : A. On forme un mélange réactionnel comprenant un milieu aqueux tamponné ; le sérum à étudier ; de l'antigène dérivé ou l'anticorps portant une marque détectable B. On fait incuber ce mélange réactionnel entre 4 et 450C environ pendant une période comprise entre 24 et 2 heures environ à un pH compris entre 6,5 et 8,5 environ de manière à former un produit conjugué antigène-anticorps quand l'anticorps microbien est présent dans l'échantillon de sérum ; et C.On détermine la quantité de la marque comme mesure de la présence du produit conjugué antigène-anticorps ce procédé étant caractérisé en ce que le rapport en volume entre l'anti-anticorps et l'échantillon de sérum est réglé à un niveau suffisant pour former un agglutinat, mais audessous de celui nécessaire pour effectuer une précipitation du produit conjugué antigène-anticorps. 2) Un procédé de détermination immunologique selon la revendication 1, caractérisé en ce que le rapport en volume de l'anti-anticorps à l'échantillon de sérum est compris entre 1/2 et 1/250 environ. 3) Un procédé de détermination immunologique selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la marque est un élément radio-actif et que la détermination immunologique est une détermination radio-immunologique. 4) Un procédé de détermination immunologique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le microbe est Neisseria gonorrhoeae ; le sérum de mammifère est du sérum humain ; la marque détectable est de l'antigène de Neisseria gonnorrhoeae marqué au moyen de 125I ; l'anti-anticorps est de l'anti-IgG humaine ; et le rapport en volume de l'anti-anticorps à l'échantillon de sérum est compris entre 1/5 et 1/250 environ. 5) Un procédé de détermination immunologique selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l'incubation est effectuée à 4-OC environ pendant 16 heures environ à un pH de 7,2 environ. 6) Un procédé de détermination immunologique selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on utilise des volumes égaux d'anti-anticorps et d'échantillon de sérum, cerapport en volume désiré étant obtenu par dilution de l'antianticorps. 7) Un procédé de détermination immunologique selon la revendication 6, caractérisé en ce que le diluant est choisi parmi un tampon aqueux et un sérum normal de mammifère. 8) Un procédé de détermination immunologique selon l'une des revendications 4 à 7, caractérisé en ce que le produit conjugué agglutiné est séparé du mélange de réaction par filtration et que le filtre est ensuite lavé et soumis à un comptage de radio-activité pour détermination de la quantité de produit conjugué recueillie qui est proportionnelle à la quantité d'anticorps microbien dans l'échantillon de sérum.