Brevet FR2363107A1 — publié le 19780324

La présente invention concerne une composition améliorée pour la détection et le titrage de fluides aqueux, et plus particulièrement une composition enzymatique pour l'analyse de fluides aqueux qui contiennent de l'acide ascorbique en quantité pouvant gener le titrage du produit à analyser. Elle concerne aussi un produit comprenant cette composition et un procédé d'utilisation. Dans les procédés de titrage enzymatiques de produits spécifiques dans des fluides aqueux tels que le sérum sanguin, procédés qui consistent à oxyder le produit à analyser en peroxyde, puis à faire réagir le peroxyde sur un indicateur pour obtenir un produit décelable, il n'est pas rare que certaines substances réductrices, telles que l'acide ascorbique, aient une action perturbatrice lors du titrage et faussent ainsi les résultats.On peut mettre en évidence des perturbations semblables dans des procédés d'analyse qui mettent en jeu d'autres réactions indicatrices oxydoréductrices bien connues, par exemple le système NAD NADH Le problème est particulièrement critique dans certains procédés de titrage de produits tels que le glucose, l'acide urique, le cholestérol, etc., dans le sérum sanguin ; ces procédés consistent à oxyder d'abord par réaction enzymatique le produit à analyser avec la glucose oxydase, l'urate oxydase, la cholestérol oxydase, etc. pour produire un dérivé oxydé du produit à analyser et un peroxyde Le peroxyde oxyde ensuite une composition indicatrice comprenant une substance ayant une activite peroxydante, par exemple une peroxydase, et une substance qui subit une modification décelable par oxydation en présence du peroxyde et de la substance peroxydante.La modification décelable est habituellement un changement de couleur, qui a lieu avec ou sans couplage concomitant. L'acide ascorbique, qui est un agent réducteur, perturbe de façon apparente l'oxydation du produit à analyser et lloxydation de l'indicateur. On a noté parfois des quantités perturbatrices d'acide ascorbique dans les fluides corporels de personnes qui ont ingéré des quantités relativement élevées d'acide ascorbique (vitamine C) ou ont été traitées avec des anticorps contenant de l'acide ascorbique comme antioxygène ; aussi il est important dans ce cas de trouver des moyens permettant de réduire ou d'éliminer cette perturbation. La technique la plus communément utilisée pour mattrîser l'action indésirable de l'acide ascorbique consiste à diluer au préalable l'échantillon à analyser, de façon à réduire l'effet apparent. D'autres techniques consistent à éliminer, par des moyens physiques ou chimiques, la substance perturbatrice, avant le titrage. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 411 887 décrit une technique pour maitriser la perturbation due à des substances réductrices, telles que l'acide ascorbique, dans de tels titrages ; cette technique consiste à introduire un système de piège dans la composition de titrage.Le système de piège comprend un composé de métal lourd ionisable qui, dans son état ionisé, a un potentiel d'oxydoréduction (EO ) supérieur à celui de l'acide ascorbique ou d'autres red substances réductrices mais inférieur à celui de la substance subissant une modification décelable Dans un article intitulé "Oxidation States of Peroxidase", paru dans Molecular and Cellular Biochemistry, Vol. 2, N01, P 39-52 (1973), Yamazaki, Isao et Yokota indiquent que l'ascorbate réduit l'état d'oxydation de la peroxydase du raifort, mais ne suggèrent pas que ce phénomène est la cause de la diminution d'efficacité des compositions indicatrices qui fonctionnent avec le système peroxyde d'hydrogène-peroxydase. Dans un ouvrage intitulé "Enzyme handbook", Vol. 1, p. 29, Thomas E., Barman décrit les caractéristiques de l'acide ascorbique oxydase (acide Lascorbique : oxygène oxydoréductase 1.10.3.3). On a maintenant découvert qu'on pouvait introduire l'enzyme acide ascorbique oxydase dans des compositions de titrage telles que celles décrites ci-dessus, pour éliminer la perturbation due à l'acide ascorbique, sans effet nuisible apparent sur les réactifs ou les réactions du titrage. On utilise ici le terme "acide ascorbique" pour désigner l'acide ascorbique libre et les ascorbates qui dérivent de cet acide et des divers composés hydroxylés présents dans le liquide à titrer. La figure 1 montre l'effet de trois teneurs différentes en acide ascorbique sur le délai d'apparition de la saturation de couleur, pour des ter.eurs en acide urique de 5 mg/dl et de 15 mg/dl contenues dans une feuille d'analyse qui sera décrite ci-après. La figure 2 donne la densité par réflexion DR, après 5 mn, en fonction de la concentration en acide urique (mg/dl), pour différentes quantités d'acide ascorbique. Le procédé selon l'invention concerne le titrage d'un constituant d'un liquide aqueux qui peut contenir de l'acide ascorbique perturbateur et consiste à mettre un échantillon liquide au contact de réactifs qui, en présence du constituant à analyser, provoquent une modification décelable par au moins une réaction d'oxydoréduction et à faire agir l'enzyme acide ascorbique oxydase en quantité suffisante pour réduire la perturbation due à l'acide ascorbique. L'invention concerne aussi une composition de titrage pour la mise en oeuvre du procédé précédemment défini, composition qui comprend des réactifs qui, en présence du constituant à analyser, provoquent une modification décelable par au moins une réaction d'oxydoréduction et l'acide ascorbique oxydase en quantité suffisante pour réduire la perturbation due à l'acide ascorbique. L'invention prévoit aussi l'utilisation, pour le titrage d'un constituant d'un liquide, d'une feuille d'analyse à plusieurs couches contenant l'acide ascorbique oxydase en quantité suffisante pour réduire la perturbation due à l'acide ascorbique. Suivant un mode de réalisation avantageux, la composition de titrage contient (a) une enzyme capable de catalyser, en présence d'oxygène, l'oxydation de la substance à titrer, en dérivé oxydé et en peroxyde, (b) une composition indicatrice formée d'une substance peroxydante et d'une substance oxydable par le peroxyde, en présence de la substance peroxydante, pour donner un produit décelable, (c) de l'acide ascorbique oxydase en quantité suffisante pour réduire la perturbation due à l'acide ascorbique. On décrira plus loin une feuille analyse, un melange sec reconstituable contenant les composés ci-dessus > et des procédés de titrage utilisant ces compositions. Le terme "reactifs" désigne des substances qui réagissent sur le produit à analyser, sur un précurseur du produit à analyser ou sur n importe quelle eut entre chimique, substance formée au cours de l'analyse. Cette reactlon/catalytlque, comme dans la formation d'un complexe enzyme-substrat, ou toute autre réaction physique ou chimique qui a pour résultat une modification décelable par des mesures appropriées utilisant une énergie rayonnante, habituellement de l'énergie lumineuse.La description ci-après concerne une combinaison particulièrement utile dans laquelle les réactifs sont au moins une enzyme qui catalyse l'oxyde dation du produit à analyser et au moins une composition indicatrice qui, par suite de l'action du peroxyde formé par l'oxydation du produit a analyser, enregistre une modification décelable. Toutefois, on peut utiliser d'autres réactifs pourvu qu'ils correspondent à la définition ci-dessus Le premier constituant de la composition selon l'invention est une enzyme capable de catalyser l'oxydation du produit à analyser en présence d'oxygène pour donner un dérivé oxydé du produit à analyser et un peroxyde. Par exemple, une enzyme aérobie spécifique tel que l'uricate, capable de catalyser l'oxydation d'acide urique en allantotne avec formation concomitante de peroxyde, est utile pour la détection et le titrage de l'acide urique dans les fluides corporels. On peut déterminer de la même façon de nombreuses substances des fluides corporels,autres que l'acide urique, par exemple le glucose, le cholestérol, les L-aminoacides, la xanthine, etc... Pour oxyder chacune des substances cidessus, il faut une enzyme spécifique telle que l'uricase, la glucose oxydase, la cholestérol oxydase, etc. Ces substances sont bien connues dans la technique et il n'est pas nécessaire de les décrire davantage. Le second constituant de la composition selon l'invention est une composition indicatrice qu'on utilise de manière classique avec les enzymes d'oxydation ci-dessus. Ces compositions indicatrices comprennent une substance ayant une activité peroxydante, en général une peroxydase, et une substance qui peut s'oxyder en presence de la substance peroxydante et d'un peroxyde en donnant un composé décelable. Le composé décelable est habituellement un colorant ou une substance colorée dont on peut déterminer la concentration, soit visuellement par comparaison avec des échantillons de concentrations différentes et connues, soit spectrophotométriquement ; la concentration de la substance colorée est fonction de la concentration en peroxyde, qui dépend elle-même de la concentration en constituant à analyser dans l'échantillon à titrer. Des substances ayant une activité peroxydante telles que l'hémine, la peroxydase, etc. sont bien connus dans la technique et sont abondamment décrites dans les brevets et la littérature technique concernant l'analyse chimique. Une substance avantageuse est la peroxydase extraite de plantes ou de bactéries. Le composé qui s'oxyde en présence d'une substance peroxydante et d'un peroxyde pour produire un composé décelable, peut être un formateur de couleur tel qu'un dérivé leuco d'un colorant, c"est-à-dire un composé qui se colore par oxydation, ou un composé dont le produit d'oxydation ne produit pas lui-meme de coloration mesurable, mais peut réagir avec un autre composé ou un coupleur pour donner un colorant ou un autre composé décelable. Comme exemples de dérivés leuco de colorant, on peut citer le dichlorhydrate d'o-toluidine, la m-toluidine, la benzidine, I'o-dianisidine, etc.Des compositions de couplage utiles comprennent, comme substances oxydables, le 4-aminoantipyrène, les p-phénylènediamines substituées telles que la N,N-(-cyanoéthyl)-p-phénylènediamine de formule et les pyrazolones substituées, et, comme coupleurs, des phénols, des naphtols, et des composés ayant des groupes méthylène actifs. On peut utiliser aussi un système formateur de colorant par auto couplage ; un tel système comprend des naphtols substitués en position 4 par un radical alkoxy, par exemple le 4-isopropoxy-l-naphtol, qui réagissent de la façon suivante R est un atome d'hydrogène, un groupe alkyle ou un groupe alkoxy ayant de 1 à 12 atomes de carbone. Ces composés sont des précurseurs de colorants qui sont incolores à l'état réduit et qui se couplent sur eux-mêmes pour donner un colorant. On utilise en général, dans la composition préférée selon l'invention, les mêmes concentrations que celles qu'on a utilisées dans la technique antérieure. Ces concentrations ne sont pas en général considérées comme critiques et peuvent varier considérablement, du moment que la concentration en enzyme catalysant l'oxydation est suffisante pour catalyser l'oxydation de toute ou d'une fraction prédéterminée du constituant à analyser présent dans l'échantillon, et que les concentrations en substance peroxydante et en substance z-:ydable par le peroxyde soient suffisantes pour que la réaction avec le peroxyde formé soit pratiquement complète. On peut extraire une acide ascorbique oxydase (Acide L-ascorbique oxygène oxydoréductase, 1.10.3.3.) (appelée ci-après ASO) donnant des résultats satisfaisants dans la composition selon l'invention, de n'importe quelle source bien connue de cette enzyme, telle que des plantes et des microbes. Des sources particulièrement utiles d'acide ascorbique oxydase sont les épluchures des courgettes vertes (Cucurbita pepo medullosa) et des courges (Cucurbita pepo condensa) ; le procédé d'extraction est décrit aux tableaux I et II ci-dessous et produit un extrait qui présente une activité spécifique d'environ 3,0 à 5,5 unités par mg de protéine.Une unité d'activité enzymatique est la quantité d'enzyme qui oxyde I pmole d'acide ascorbique par minute dans un tampon au phosphate de sodium 0,05 M à 370C et à pH 6,80 - 0,05. TABLEAU I Protocole de purification de l'acide ascorbique oxydase extraite de la courgette (Cucurbita pepo medullosa) Bref rinçage à l'eau distillée de courgettes vertes (2,7 à 3,6 kg) Homogénéisation des épluchures dans 2 à 3 volumes d'une solution tampon (P1) 0,05 M de phosphate de sodium à pH = 6,8. (la pulpe est éliminée) Filtration sous pression du produit homogénéisé à travers 2 ou 3 épaisseurs | d'étamine. Centrifugation du filtrat (4080 x g ; 15 mn) pour éliminer des débris cellulaires et et les substances insolubles. Addition de sulfate d'ammonium(en quantité égale à 65 % de la saturation), au liquide surnageant à froid (0 C), puis maintien au frais pendant 30 mn. / Mise en suspension des particules Elimination du liquide surnageant dans la solution tampon P1 Ajout pendant agitation, d'un mélange d'acétone froideet de glace (0,9 volume de de la solution enzymatique) Centrifugation (22;450 x g ; 30 mn) "r Mise en suspension des particules dans la solution tampon P1 (volume minimum) s Dialyse contre la solution tampon P1 renouvelée deux ou trois fois Centrifugation pour éliminer les substances insolubles (rotation lente) Enzyme prête à l'emploi ou conservée à -20 C (stable pendant plusieurs mois) TABLEAU LI Résumé de la purification de l'acide ascorbique oxydase Activité spécifique Quantité Quantité totale (Unité/mg totale Récupération de Etape Préparqation de protéine (mg) de protéine d'untés l'activité (%) 1.Produit homogénéisé brut à partir des A 2800 0,67 1876 100 épluchures B 12800 0,89 11392 100 1. Précipitation dans A 2150 0,82 1760 94 le sulfate d'ammonium B 6042 1,71 10331 91 3. Précipitation dans A 1278 0,89 1137 61 l'acétone B 5130 1,61 8259 72 4. Dialyse A 243 3,4 826 44 B 549 5,6 3074 27 Note improtante : Pour ces deux préparations, on utilise, au départ, 3,2 kg de courgette du commerce. La masse réelle à l'état sec de chaque produit après lyophilisation du dialysat est d'environ 2 à 3 fois la masse de protéine déterminée par la méthode Lowry. Ainsi,la préparation A donne environ 0,69 g de produit sec et la préparation B environ 1,7 g. C'est cette masse à l'état sec qui est donnée dans la description, les exemples et les revendications. La concentration en acide ascorbique oxydase utilisée dans toute composition analytique spécifique dépend de divers facteurs tels que la concentration en produit à analyser (des concentrations peu élevées en produit à analyser sont normalement plus sensibles aux perturbations), la sensibilité de la composition de titrage particulière vis-à-vis de l'acide ascorbique, etc. Ainsi, on ne peut pas facilement fixer de limite de concentration en acide ascorbique oxydase, mais I'homme de métier peut facilement déterminer la concentration nécessaire pour maîtriser la perturbation due à l'acide ascorbique dans un titrage donné. On a trouvé que des concentrations de l'ordre de 0,01 à 1,0 U/ml de solution de titrage fournit en général des résultats satisfaisants dans les titrages du glucose, de l'acide urique et du cholestérol. On peut incorporer la composition selon l'invention dans des feuilles d'analyse telles que celles décrites au brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 992 158 et aux brevets français 2 191 734 et 2 280 081. Ces feuilles comprennent une couche d'étalement qui sert à fournir une concentration apparente uniforme en produit à analyser à une couche active hydrophile sous-jacente comprenant au moins une partie des réactifs nécessaires pour donner un composé décelable dont la concentration est fonction de la concentration du produit à analyser dans un échantillon aqueux déposé sur la couche d'étalement. Ces feuilles peuvent comprendre éventuellement un support sur lequel sont appliquée dans l'ordre, la couche réactive et la couche d'étalement. La composition et la préparation de certaines de ces feuilles sont décrites dans les exemples ci-dessous. Dans ces feuilles, les diverses couches sont "en relation d'échange de fluide". Par cette expression, on entend qu'un fluide gazeux ou liquide peut migrer d'une couche à l'autre dans les régions superposées de ces couches, par exemple d'une couche d'étalement à une couche active ou à d'autres couches en relation d'échange de fluide. Autrement dit, les constituants d'un fluide peuvent passer d'une couche d l'autre. Les couches en relation d'échange de fluide peuvent être contiguës, mais elles peuvent aussi être séparées par des couches intermédiaires. Toutefois, ces couches intermédiaires ne doivent pas s'opposer au passage d'un fluide de l'une à l'autre des couches en relation d'échange de fluide. Lorsque l'on utilise ces feuilles d'analyse, on peut incorporer l'acide ascorbique oxydase dans la couche active, dans la couche d'étalement, dans une couche intermédiaire distincte, placée entre la couche d'étalement et la couche active ou dans tout emplacement où peuvent se manifester les perturbations dues à l'acide ascorbique. I1 est avantageux d'incorporer l'acide ascorbique oxydase dans une couche intermédiaire. Cette couche intermédiaire distincte a, en général, la composition chimique et les caractéristiques physiques, c'est-à dire la perméabilité, etc., de la couche active, et comprend l'acide ascorbique oxydase en quantité suffisante pour réduire la perturbation due à l'acide ascorbique contenu dans l'échantillon appliqué sur la couche d'étalement. On peut utiliser de la meme façon la composition selon l'invention dans certains produits bien connus dans la technique, produits qui sont préparés par imprégnation (ou autre procédé) de réactifs et qui permettent la détermination d'un produit à analyser. Des produits typiques pour lesquels on peut adapter la composition et le procédé selon l'invention, sont décrits aux brevets des Etats-Unis d'Amérique 3 092 465, 3-418 099, 3 418 083, 2 893 843, 2 893 844, 2 912 309, 3 008 879, 3 802 842, 3 798 064, 3 298 739, 3 915 647, 3 917 453, 3 933 594, 2 936 357, etc. On peut aussi préparer la composition selon l'invention sous forme de mélange sec comprenant des poudres sèches ou des réactifs lyophilisés ; on reconstitue les solutions de réactifs par addition d'eau immédiatement avant leur utilisation. On a décrit la composition et le procédé selon l'invention principalement pour améliorer les titrages et les compositions de titrage d'un produit à analyser qui est oxydé pour former un dérivé oxydé et un peroxyde d'hydrogène mais il est évident que l'acide ascorbique, à cause de son caractère réducteur, perturbe aussi la détection du peroxyde d'hydrogène, quand cette détection est faite avec une substance peroxydante et une substance oxydable par le peroxyde, probablement en réduisant l'état d'oxydation de la substance peroxydante.Cette perturbation est démontrée dans les exemples ci-dessoua C'est pourquoi, comme le montre l'exemple 1, un procédé et une composition améliores pour titrer le peroxyde d'hydrogène avec utilisation d'acide ascorbique oxydase pour mattriser la perturbation due à l'acide ascorbique, font aussi partie du domaine de l'invention. La composition doit bien sûr être du même type que celle qui a été décrite ci-dessus pour titrer un produit à analyser. I1 faut noter que le procédé selon l'invention est également utile dans des systèmes de détection qui utilisent des réactions d'oxydo-réduction autres que la production et Is détection de peroxyde d'hydrogène pour produire des modifications décelables et dans lesquels l'acide ascorbique est un composé perturbateur à cause de son fort pouvoir réducteur. C'est pourquoi le contrale de la perturbation due à l'acide ascorbique dans n'importe quel procédé ou composition, par exemple le procédé utilisant la conversion de NAD+ en NADH avec un changement concomitant de fluorescence, font aussi partie du domaine de l'invention. L'exemple 10 est un exemple de titrage qui ne concerne pas un système de détection de peroxyde d'hydrogène, c'est un titrage d'acide urique utilisant un phosphotungstate. Les exemples suivants illustrent l'invention. EXEMPLE 1 Pour montrer la perturbation causée par l'acide ascorbique dans les titrages de peroxyde d'hydrogène avec une solution comprenant une peroxydase et une substance subissant une modification décelable, colorimétrique ou autre, en présence de peroxydase et de peroxyde d'hydrogène, on prépare des solutions d'o-dianisidine, qui est un dérivé leuco de colorant, et d'une peroxydase, et on ajoute des quantités croissantes d'acide ascorbique et d'acide ascorbique oxydase (ASO). On ajoute ensuite à ces solutions du peroxyde d'hydrogène pour amorcer la réaction. On mesure l'absorption finale à 37"C et à 430 nm ; chaque essai est fait deux fois et on prend la valeur moyenne pour chaque essai ; ces valeurs sont rassemblées au tableau III. TABLEAU III Absorption finale à 430 nm Acide ascorbiq1ue oxydase ajoutée Réponse en Réponse en Réponse en Réponse en pourcentage pourcentage pourcentage pourcentage par rapport par rapport par rapport par rapport Acide ascorbique ajouté O mg au témoin * 0,17 mg au témoin * 0,033 mg au témoin* 0,1 mg au témoin* à 100 à 100 % à 100% à 100 % 0 0,813 100 1,022 100 1,064 100 1,102 100 +0,33 mg/dl 0,732 90 0,941 92 0.996 94 1,092 99 +0,67 mg/dl 0,576 71 0,836 82 0.913 86 1,053 96 +1,0 mg/dl 0,464 57 0,767 75 0.821 77 1,020 93 +1,33 mg/dl 0,342 42 0,658 64 0.743 70 0,934 85 * Le témoin à 100 % est donné par l'absdorption finale obtenue sans acide sacorbique pour chaque vleur d'ASO. Le tableau III montre que la perturbation due à 0,33 mg/dl d'acide ascorbique est pratiquement éliminée quand on ajoute 0,1 mg d'oxydase, et que la perturbation due à 1,33 mgldl d'acide ascorbique passe d'environ 58 % sans oxydase à environ 15 % avec 0,1 mg d'oxydase. EXEMPLES 2 à 6 On prépare une série de feuilles d'analyse pour titrer l'acide urique ces feuilles comprennent les couches suivantes Couche :eEtkte de cellulose 'blanc" d'étalement contenant Ti02 Couche intermédiaire -Gélatine :5,4 g/m2 d'acide ascorbique désioni:eée oxydase -Tampon, pH 9,0 2 -Acide ascorbique :de O à 2376 U/m oxydase (ASD) (voir détails au Tableau IV) Couche Gélatine * :10,8 g/m active Diméthoxy :270 mg/m Peroxydase :6.500 UnitésAm Uricase :215 Unités/m Tampon, pu 9,0 Support de :177 m polyester #2(3',5'-diméthoxy-4'-hydroxyphényl)-4,5-bis(4-diméthylaminophényl)- imidazole On On peut former une couche "blanche" de polymère sur un support de la façon suivante : on dissout un polymère dans un mélange de deux liquides, dont l'un est bon solvant du polymère, et l'autre, qui présente un point d'ébullition plus élevé que le premier, est un non solvant ou, au moins, un mauvais solvant de ce polyère ; on applique cette solution en couche sur le support et on sèche dans des conditions déterminées. Comme le bon solvant du polymère s'évapore plus facilement par suite de son point d'ébullition plus faible, la couche s'enrichit en celui des deux liquides qui est un mauvais solvant ou un non solvant ; au fur et à mesure que l'évaporation se produit, dans des conditions convenables, il se forme une couche poreuSe isotrope. Le tableau IV indique les quantités d'acide ascorbique oxydase utilisées dans chacun des exemples 2 à 6. TABLEAU IV Acide ascobiqug oxydase Exemple N (Unités/m) 2 0 (témoin) 3 1176 4 1580 5 1837 6 2376 Le tableau V ci-dessous montre clairement que, sans ASO (exemple témoin), la perturbation due à l'acide ascorbique dans le titrage de l'acide urique, pour toutes les teneurs en acide urique utilisées, est assez importante. On calcule arbitrairement la perturbation due à l'acide ascorbique d'après la formule suivante Dn (sans acide ascorbique, après 5 mn) -DR(avec acide ascorbique, après 5 mn) PR A100 DR (sans acide ascorbique (témoin), après 5 mn) On prend comme valeur de densité par réflexion (DR) la moyenne d'au moins trois essais. Ce sont ces valeurs de perturbation calculées arbitrairement qui sont données au tableau V.Toutes les solutions déposées sur la feuille d'analyse contiennent 7 g/dl d'albumine de sérum de bovin. Celles qui contiennent de l'acide ascorbique sont fratchement préparées toutes les 1 à 2 h. Les deux feuilles contenant de l'acide urique seul donnent des résultats pratiquement semblables, différents de moins de 1 à 1,5/100. Dans les exemples 2 à 6, où l'on ajoute l'enzyme dans une couche distincte, il y a une nette réduction de la perturbation due à l'acide ascorbique dans le titrage de l'acide urique, dans tout l'intervalle de concentration en acide urique utilisé et pour les deux concentrations en acide ascorbique représenta tives essayées. I1 y a aussi une tendance à.la diminution de la perturbation due à l'acide ascorbique quand on augmente les teneurs en ASO de 1176 à 2376 U/m2. Pour une teneur en ASO de 2376 U/m2, il est clairement démontré que la perturbation due à l'acide ascorbique, qui est plus importante dans les produits témoins pour des teneurs en acide urique de 2,5 et de 5 mgldl, est réduite à moins de 5 % pour des teneurs en acide ascorbique de 2 ou 3,5 mg/dl. A des teneurs en acide urique plus élevées (10 à 15 mg/dl), la perturbation due à l'acide ascorbique est pratiquement éliminée (O à 3 %). TABLEAU V Perturbation (%) due à l'acide ascorbique (pour des teneurs de 2,0 et 3,5 mg/dl respectivement) dans des oproduits contenant de l'acide ascorbique oxydase (ASO) à diverses teneurs. Teneurs en Teneurs en Ex.2 Ex. 3 Ex. 4 EX. 5 Ex. 6 acide urique acide ascorbique Témoin ASO ASO ASO ASO (mg/dl) (mg/dl) (sans ASO) (1176 U/m) (1580 U/m) (1837 U/m) (2376 U/m) 2,5 2 28 4,8 11,7 5,8 0,5 3,5 68,9 17,1 18,6 11,7 5,3 5,0 2 18,7 4,1 4,5 5,0 2,1 3,5 37,8 10,1 12,7 8,3 4,1 10,0 2 10,2 2,9 2,9 2,8 1,2 3,5 23,5 8,0 8,3 5,8 3,1 15,0 2 9,7 2,6 2,6 4,0 0 3,5 15,3 5,4 3,4 4,6 1,4 EXEMPLES 7 à 9 On prépare une série de feuilles d'analyse pour illustrer la réduction de la perturbation due à l'acide ascorbique obtenue en incorporant ltASO dans la couche active contenant l'uricase, la peroxydase et un composé chromogène, plutôt que dans une couche distincte de gélatine. TABLEAU VI Perturbation due à l'acide ascorbique dans des feuilles d'analyse pour l'acide urique avec et sans acide ascorbique oxydase dans la couche active +3,5 mg/dl d'acide ascorbique mg/dl sans % Exemple 7 Acide urique Acide ascorbique par rapport DR DR (après 5 mn) au témoin sans acide ascorbique Témoin (sans ASO) 2,5 0,4882 0,1099 22,5 5 0,7269 0,4364 66,0 10 1,1579 0,9944 86.0 15 1,5979 1,3602 85,1 Exemple 8 1176 U/m ASO dans une couche 2,5 0,4722 0,3969 84,1 interméjdiaire distincte, comme 5 0,7356 0,6671 90,7 dans les exemples 2 à 6 ci-dessus. 10 1,1941 1,1168 93,5 15 1,6178 1,4678 90,7 Exemple 9 1176 U/m ASO dans la 2,5 0,4970 0,3439 69,2 couche active 5 0,7511 0,6409 85,3 10 1,1945 1,1317 94,7 15 1,6181 1,4518 89,7 EXEMPLE 10 Pour démontrer l'utilité de l'enzyme ASO dans la réduction de la perturbation due à l'acide ascorbique dans un procédé de titrage n'utilisant par un peroxyde, on fait les essais suivants dans un procédé de titrage d'acide urique utilisant un phosphotungstate.Ce procédé est décrit dans l'ouvrage 'tFundamentals of Clinical Chemistry" de N.W. Tietz, (W.B. Saunders Cie) (1970), page 727. On prépare deux solutions d'acide urique en introduisant des quantités pesées d'acide urique dans des solutions à 7 g/dl d'albumine de sérum de bovin, de façon à obtenir des concentrations en acide urique de 5 et de 10 mg/dl. On prend trois échantillons de 1 ml de chaque solution. Le premier échantillon de l'une et l'autre solution (5 mg/dl et 10 mg/dl d'acide urique) sert de témoin ; on ajoute au deuxième 2 mg/dl d'acide ascorbique et au troisième 2 mg/dl d'acide ascorbique et 0,2 unité d'enzyme ASO. On titre acide urique dans chacun des 6 échantillons en utilisant le procédé au phosphotungstate décrit dans l'ouvrage ci-dessus.Les résultats sont rassemblés au tableau VII. TABLEAU VII Effet de l'Acide ascorbique sur le titre de l'acide urique dans un procédé au phosphotungstate avec et sans ASO Teneur th6orique Teneur en urate obtenue en urate (pesée) Solution (mg/dl) 1. Urafte seul (Témoin) 5,1 5 mg/dl 2. urate + 2 mg/dl d'Acide ascorbique 6,3 3. 2. ci-dessus + 0,2 I.U. d'ASO (0,1 mg) 5,2 10 mg/dl 1. Urafte seul (Témoin) 9,8 2. urate + 2 mg/dl d'Acide ascorbique 10,8 3. 2. ci-dessus + 0,2 I.U. d'ASO (0,1 mg) 9,7 Le tableau montre que la présence d'enzyme ASO élimine la perturbation produite par l'acide ascorbique dans le titrage de acide urique par le procédé au phosphotungstate. REVENDICATIONS 1 - Procédé pour le titrage d'un constituant d'un échantillon liquide aqueux qui contient de l'acide ascorbique en tant que perturbateur, consistant à mettre l'échantillon liquide au contact de réactifs qui, en présence du constituant à titrer, provoquent une modification décelable par au moins une réaction d1oxydo-réduction et à examiner la modification décelable, caractérisé en ce que l'on fait agir, avant l'examen de la modification décelable, l'enzyme acide ascorbique oxydase en quantité suffisante pour réduire la perturbation due à l'acide ascorbique. 2 - Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise une enzyme acide ascorbique oxydase provenant de l'espèce Cucurbita pepo medullosa. 3 - Procédé conforme à l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'on met l'échantillon liquide qui contient du peroxyde d'hydro gène à titrer au contact d'une composition de réactifs qui comprend une substance peroxydante et une substance qui agit sur le peroxyde d'hydrogène, en présence de la substance peroxydante, pour former un produit décelable. 4 - Procédé conforme à l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'on met l'échantillon liquide au contact d'une composition de réactifs qui comprend (1) une enzyme capable de catalyser ltoxydation du constituant à titrer en présence d'oxygène pour former un dérivé oxydé du constituant å titrer et un peroxyde et (2) une composition indicatrice comprenant une substance peroxydante et une substance pouvant être oxydée par le peroxyde, en présence de la substance peroxydante, pour former un produit décelable. 5 - Procédé conforme à la revendication 4, caractérisé en ce que l'on utilise une peroxydase comme substance peroxydante. 6 - Procédé conforme à la revendication 5, caractérisé an ce que l'on titre l'acide urique, le glucose ou le cholestérol contenu dans l'échantillon liquide et en ce que l'enzyme est respectivement une uricase, une glucose oxydase ou une cholestérol oxydase. 7 - Procédé conforme à la revendication 6, caractérisé en ce que l'échantillon liquide est formé par du sérum sanguin. 8 - Composition de titrage pour la mise en oeuvre du procédé conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant des réactifs qui, en pré sence du constituant à titrer, provoquent une modification décelable par au moins une réaction d'oxydo-réduction, caractérisée en ce qu'elle contient une enzyme acide ascorbique oxydase en quantité suffisante pour réduire la perturbation de à l'acide ascorbique. 9 - Composition conforme à la revendication 8, caractérisée en ce que l'acide ascorbique oxydase provient de l'espèce Cucurbita pepo medullosa. 10 - Composition conforme à l'une quelconque des revendications 8 et 9, carac térisée en ce qu'elle comprend une substance peroxydante et une substance qui réagit avec du peroxyde d'hydrogène à titrer en présence de la substance peroxydante. 11 - Composition conforme à l'une quelconque des revendications 8 et 9, caracté risée en ce que les réactifs comprennent (1) une enzyme capable de catalyser l'oxydation du constituant à titrer en présence d'oxygène pour former un dérivé oxydé du constituant à titrer et un peroxyde et (2) une composition indicatrice comprenant une substance peroxydante et une substance pouvant être oxydée par le peroxyda, en présence de la substance peroxydante, pour former un produit décelable. 12 - Composition conforme à la revendication 11, caractérisée en ce que la substance peroxydante est une peroxydase. 13 - Composition conforme à la revendication 12, caractérisée en ce que la substance pouvant être oxydée par le peroxyde est un dérivé leuco de colorant. 14 - Composition conforme à la revendication 13, caractérisée en ce que le dérivé leuco de colorant est choisi dans le groupe formé par l'o-dianisidine, le dichlorhydrate d'o-toluidine, la métatoluidine et la benzidine. l - imposition conforme à la revendication 12, caractérisée en ce que la composition indicatrice comprend une espèce chimique oxydable par le peroxyde avec formation d'un composé incolore et un coupleur qui réagit avec ce composé incolore pour donner un produit coloré. 16 - Composition conforme à la revendication 15, caractérisée en ce que l'espèce chimique oxydable est un 4-aminoantipyrène, une para-phénylènediamine substituée ou une pyrazolone substituée et en ce que le coupleur est un phénol, un naphtol ou un composé possédant des groupes méthylène actif. 17 - Composition conforme à la revendication 12, caractérisée en ce que le constituant à titrer est l'acide urique, le glucose ou le cholestérol contenu dans l'échantillon liquide et en ce que l'enzyme est respectivement une uricase, une glucose oxydase ou une cholestérol oxydase. 18 - Composition conforme à la revendication 17, caractérisée en ce que l'échan tillon liquide est formé par du sérum sanguin. 19 - Feuille d'analyse à plusieurs couches pour le titrage d'un constituant d'un échantillon liquide aqueux suivant le procédé conforme à l'une quel conque des revendications I à 7 comprenant une couche d'étalement et une couche de réactifs, en relation d'échange de fluide dans les conditions d'utilisation, caractérisée en ce qu'elle comprend de l'enzyme acide ascorbique oxydase en quantité suffisante pour réduire la perturbation due à l'acide ascorbique. 20 - Feuille conforme à la revendication 19, caractérisée en ce qu'elle comprend un support et dans l'ordre une couche de réactifs et une couche d'étalement en relation d'échange de fluide 21 - Feuille conforme à la revendication 20, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une couche intermédiaire située entre la couche de réactifs et la couche d'étalement et qui est en relation d'échange de fluide avec celles-ci et en ce qu'elle contient l'acide ascorbique oxydase.