Brevet FR2368299A1 — publié le 19780519

La présente invention concerne un procédé et un appareil pour la régulation du sexe de la progéniture des mammifères par séparation des spermatozoides à chromosome X produisant les femelles ayant une certaine densité et un certain potentiel électrique des spermatozoides à chromosome Y produisant les males dont la densité et le potentiel électrique sont différents. Le sexe de la progéniture est déterminé par les chromosomes du spermatozolde particulier qui féconde ltovule. Les spermatozoides contenant le chromosome X, qui sont à l'origine de la progéniture femelle, sont quelque peu plus denses que les spermatozordes contenant le chromosome Y qui sont à l'origine de la progéniture male. De plus, on a déterminé que les surfaces cellulaires des spermatozoides contenant le chromosome X ou le chromosome Y ont un potentiel électrique différent. Ces différences de densité et de potentiel électrique permettent de séparer les spermatozoides en fractions contenant pratiquement la totalité des spermatozoides à chromosome X ou Y.Les techniques de séparation utilisant ces différences de densité et de potentiel électrique peuvent s'appliquer à tous les mammifères, y compris l'homme et les autres primates les bovins, le porc, le mouton, le lapin, le chat, le chien, la chèvre, le chevala ne, le buffle, etc. Tel qu'on le pratique à ce jour, le procédé de séparation utilisant la différence de densité consiste à appliquer une poussée aux spermatozoides pour que les spermatozoides les plus légers atteignent dans le milieu de séparation un niveau différent de celui des spermatozoSdes moins légers. Dans la pratique antérieure, la séparation des spermatozoides à chromosomes X et Y en fonction de leur différence de potentiel électrique a été gênée par le fait que dans le liquide séminal il s'établit un équilibre lié à la constante diélectrique du milieu entre le potentiel zêta positif et négatif des spermatozoides femelles et mules, ce qui rend difficile leur séparation dans un champ galvanique. Bien que l'on ait utilisé divers types de cellules d'électrophorèse pour tenter de séparer les spermatozotdes malles et femelles en appliquant des potentiels continus allant de 200 microvolts à 10 volts, les résultats ont été décevants, en particulier du fait que la concentration des cellules séparées est trop faible pour que la conception soit satisfaisante.L'emploi d'un courant plus élevé permet d'accroitre la pureté de la séparation mais abaisse la viabilité du sperme. Ces problèmes sont pratiquement résolus par l'invention selon laquelle on place des fractions de sperme contenant des populations fortement déséquilibrées de cellules de types X et Y résultant d'une première séparation par sédimentation à contre-courant de convection thermique dans une colonne de convection forcée maintenue entre les deux électrodes d'une cellule d'électrophorèse, si bien que les cellules de charge différente sont attirées préférentiellement par les électrodes correspondantes plus efficacement qu'il n'était possible à ce jour. On a noté dans le passé que la présence de particules étrangères dans le milieu altère la vitesse d'ascension ou de sédimentation des spermatozotdes et leur. mouvement dfl aux forces galvaniques ainsi que leur capacité de fécondation après séparation.L'emploi du milieu universel décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n" 3.816.249 résout pratiquement ce problème et favorise la régulation de l'hyperactivité cellulaire tout en prolongeant la durée de vie des spermatozotdes. L'emploi du milieu universel et d'une température basse immobilisant les spermatozordes empoche que la faible différence de densité (2 à 5%) et de potentiel électrique à la surface des cellules, entre les spermatozordes maIes et femelles, ne soit neutralisée par une activité métabolique cellulaire importante. Dans l'invention, on utilise des poussées positives et négatives en combinaison avec des forces galvaniques pour obtenir une séparation plus efficace des spermatozoides males et femelles dans un mélange de sperme et d'un milieu d8pourvu de particules. Dans la première partie du présent procédé, on maintient le milieu dans une colonne de sédimentation verticale en le soumettant l'effet d'un contre-courant de convection thermique à basse température, pour provoquer la séparation des spermatozotdes selon la densité.Après ce stade de séparation on traite séparément la fraction légère et la fraction lourde contenant les populations déséquilibrées de spermatozoîdes à chromosomes X et Y, dans un appareil de galvanisation à convection forcée en injectant chaque fraction dans une colonne de convection centrale placée entre les deux branches d'une cellule d'électrophorèse contenant une électrode positive et une électrode négative. On applique un potentiel galvanique aux spermatozoSdes alors qu'ils circulent dans la colonne selon un mode de circulation semblable à celui précédemment obtenu dans le contre-courant de convection thermique.La circulation à convection forcée combinée aux conditions contrôlées de temperature, de force ionique, de pH du milieu et de tension, permet de séparer les spermatozotdes de types X et Y avec une pureté atteignant 92% ou plus. Selon l'invention, on produit un contre-courant de convection thermique dans la colonne dé sédimentation pour qu'une portion du milieu qui y est contenu se déplace à la vitesse V vers le haut et une autre portion se déplace a la vitesse V vers le bas. Les spermatozoSdes de types X et Y en suspension dans le milieu se déplacent respectivement avec des vitesses V et Vy, ces vitesses dépendant de la vitesse V du milieu, x de la direction du mouvement du milieu vers le haut ou vers le bas et de la pesanteur qui exerce une force différente sur les spermatozoides de type X et les spermatozoîdes de type Y en fonction de leur densité.Sous l'effet de ces facteurs, les spermatozoedes de type Y qui sont moins denses que les spermatozoides de type X tendent à s'élever plus rapidement dans la portion de milieu ascendante et à sédimenter plus lentement dans la portion de milieu descendante. Au cours du temps des phénomènes font que les spermatozoltdes de type Y moins denses s'accumulent au voisinage du sommet de la colonne de sédimentation, tandis que les spermatozoides de type X plus denses s'accumulent au voisinage du fond de la colonne de sédimentation. Les courants de convection favorisent et accélèrent le processus de séparation des deux catégories de particules. Dans la seconde portion de l'invention, on soumet à une séparation complémentaire et à une concentration par galvanisation avec convection les fractions de milieu renfermant des populations déséquilibrées où prédominent les spermatozoides à chromosome X ou Y résultant de la séditentation à contre-courant de convection thermique, en utilisant la différence de potentiel électrique à la surface des spermatozoIdes à chromosomes X et Y. On admet de façon générale que les spermatozoides de types X et Y ont une charge globale négative au pH neutre (pH = 7,0) et qu'ils migrent vers l'anode lors de l'électrophorèse. On a cependant découvert que les spermatozoides mules qui contiennent le chromosome Y ont une charge plus négative sur la tête que sur la queue et qu'ils sont donc attirés vers l'anode la tette en avant, tandis que les spermatozoides femelles renfermant le chromosome X sont attirés vers l'anode la queue en avant, car la charge négative de la queue est supérieure à celle de la teste. Donc les sperma tozoides actifs ou mobiles nagent dans des directions différentes lors de l'électrophorèse, les spermatozordes compotantle chromosome Y nageant dans la direction de l'anode, ce qui ajoute la vitesse de la nage à la vitesse de l'électrophorèse. Inversement, les spermatozoides contenant le chromosome X nagent vers la cathode, leur migration électrophorétique étant opposée au sens de leur nage. Les spermatozoîdes immobilisés tels que ceux maintenus à basse température (par exemple 3 à 50C) ont une vitesse de nage très faible, si bien que leur mouvement dépend essentiellement de leur vitesse d'électrophorèse qui est pratiquement la même dans les solutions tampons neutres.Cependant, on a découvert que l'on peut modifier les charges superficielles globales des spermatozoides comportant les chromosomes X et Y en fonction du type de tampon utilisé et du pH de la solution tampon. La séparation des spermatozoedes à chromosomes X et Y dépend donc de l'ajustement de la charge superficielle globale des cellules de types X et Y qui varie selon le pH, la force ionique et la concentration des ions divalents du tampon, ainsi que selon la température, le courant et la tension utilisés dans la cellule d'électrophorèse.Bien que l'on puisse prévoir une vitesse de séparation plus élevée dans la cellule d'électrophorèse lorsque les spermatozoides sont mobiles, il s'est révélé nécessaire, pour que la séparation selon l'invention ait son efficacité maximale, d'immobiliser les spermstozoides immédiatement après l'éjaculation pour empêcher qu'ils n'absorbent des matières dans le liquide environnant ou ne forment des sous-produits métaboliques, ce qui modifierait fortement les différences phénotypiques qui permettent la séparation en fonction de la différence globale de potentiel électrique ainsi que la séparation par suite des différences de densité. Il est donc évident que l'emploi du milieu universel ne renfermant pas de particules décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n" 3.816.249 est important dans l'invention pour contrôler le métabolisme et l'hyperactivité des spermatozoides et permettre l'utilisation des différences phénotypiques de densité et de potentiel électrique cellulaire. I1 s'est également révélé que l'emploi dtune population déséquilibrée dans le stade de galvanisation avec convection, c'est-8-dire l'emploi d'une fraction de milieu renfermant une proportion nettement supérieure d'un type de spermatozoides par rapport à l'autre type, accroît fortement le degré d'efficacité de la séparation et de la concentration galvaniques. Le processus de sédimentation à contre-courant de convection thermique précédemment décrit, qui précède le stade de séparation galvanique, fournit le ddséquilibre de la population nécessaire à l'obtention d'une séparation très efficace par voie galvanique.Bien que la sédimentation à contre-courant de convection thermique constitue le procédé préféré pour produire la population de spermatozoldes déséquilibrée utilisée dans le stade de galvanisation à convection forcée de l'invention, on peut utiliser divers autres procédés de séparation préliminaire des spermatozotdes de types X et Y en combinaison avec le stade de galvanisation à convection forcée décrit, avec divers degrés de succès proportionnels au degré de séparation obtenu dans le premier procédé. La sédimentation 9 contre-courant de convection thermique s'est révélée constituer le plus efficace des procédés de séparation primaire et on préfère dans l'invention l'utiliser en combinaison avec la séparation par galvanisation à convection forcée. I1 convient également de noter que la circulation par convection produite lors de la galvanisation à convection peut être soit une circulation par convection forcée, soit une circulation par convection thermique. Ci-après, on peut donc utiliser la convection thermique au lieu de la convection forcée. On peut également combiner la colonne de sédimentation a contre-courant de convection thermique et la cellule de galvanisation à convection forcée en un seul appareil et effectuer les deux opérations dans la même colonne. Dans ce mode de réalisation, on effectue la sédimentation avec convection thermique jusqu'a ce que l'on ait obtenu la séparation par densité désirée, puis on applique les forces galvaniques au milieu dans la colonne sans transfert dans un autre appareil. On peut poursuivre à la demande la convection thermique pendant la galvanisation. Bien que l'on puisse utiliser, dans le procédé de galvanisation à convection forcée de l'invention, toute solution tampon ionique connue dans l'art antérieur, on préfère le milieu universel décrit dans k breet des Etats-Unis d'Amérique nO 3.816.249. Le milieu universel peut avoir un pH d'environ 6 a environ 8 et une osmolalité généralement comprise entre 250 et 350 mos/kg. De préférence, on utilise un milieu universel ayant un pH compris dans la gamme d'environ 6,8 à environ 7,0 et une osmolalité d'environ 300 mos/kg. On préfère tout particulièrement utiliser un milieu légèrement acide pendant la galvanisation avec convection forcée car il accentue les différences globales de potentiel de surface entre les spermatozotdes S chromosomes X et Y. L'appareil de l'invention, qu'on utilise pour la galvanisation avec convection forcée, est constitué d'une cellule d'électrophorèse ayant une colonne centrale convection forcée, les deux branches de la cellule contenant respectivement l'électrode positive et l'électrode négative communiquant avec cette colonne. il convient de noter que, bien que dans l'art antérieur on a effectué des expériences de séparation électrophorétique ou galvanique des spermatozoides de types X et Y, l'emploi de la galvanisation avec convection en utilisant une circulation par convection des spermatozotdes pendant la séparation galvanique n a jamais été utilisé avant l'invention. Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne un appareil pour effectuer la sédimentation a contre-courant de convection thermique comportant un dispositif adjacent a une colonne de sédimentation pour produire la différence de température requise entre deux portions du milieu contenu dans la colonne. Un dispositif additionnel permet de déterminer l'importance de l'accumulation des deux populations de spermatozoides des niveaux différents dans la colonne de sédimentation pendant et après l'écoulement avec le contre-ocurant de convection thermique. On peut opérer de diverses façons.On peut prélever de petites fractions du milieu pour déterminer l'emplacement et la concentration des spermatozotdes X et Y ou introduire dans la colonne de sédimentation plusieurs petits hydromètres pour mesurer la densité. Sinon, on peut effectuer la détermination en mesurant la conductivité en divers points de la colonne. Dans le mode de réalisation préféré, le dispositif de détermination de l'emplacement et de la concentration des couches sédimentées est constitué d'un laser et d'un détecteur de laser en combinaison avec un dispositif de balayage par le faisceau laser de la longueur de la colonne de sédimentation. On détermine ainsi l'opacité du milieu A une longueur d'onde particulière sans dérangement physique du contenu de la colonne de sédimentation.Ceci facilite également l'enregistrement des variations de la distribution des particules et de l'emplacement et de la concentration des couches séparées de spermatoIdes de types X et Y. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris a la lecture de la description qui va suivre de plusieurs exemples de réalisation et en se référant aux dessins annexés dans lesquels - la figure 1 illustre le mode de réalisation préféré de l'appareil utilisé pour la mise en oeuvre de la première portion du procédé de l'invention; - la figure 2 représente les stades de distribution des spermatozoîdes mules et femelles; - la figure 3 représente un mode de réalisation préféré de appareil de galvanisation avec convection utilisé pour la mise en oeuvre de la seconde portion du procédé de l'invention; et - la figure 4 représente la combinaison d'un appareil de sédimentation et d'un appareil de galvanisation selon ltinvention. Comme le montre la figure 1, qui illustre l'appareil utilisé pour la mise en oeuvre de la première portion du procédé de l'invention, c'est-à-dire la sédimentation à contre-courant de convection tllerme, une colonne de sédimentation 1, contenant le milieu universel 3 dans lequel sont en suspension les spermatozoSdes de types X et Y, est entourée d'une enveloppe d'eau 5 dans laquelle un premier courant d'eau 7 est pompé par une pompe à eau 9. L'eau traverse le réservoir d'eau Il où sa température est réglée par le régulateur de température 13. Ce régulateur peut être constitué d'un élément de refroidissement avec une régulation thermostatique précise. Dans le milieu 3 se trouve une seconde enveloppe d'eau 15 coaxiale à la colonne de sédimentation 1 et comportant une entrée 17 et une sortie 19.Un second courant d'eau 21 traverse l'enveloppe d'eau 15 et peut être pompé par le dispositif 22 à travers le réservoir d'eau 24, la température de l'eau étant réglée par le dispositif séparé 26. Dans le cas où la température du courant d'eau 7 est la meme que celle du courant d'eau 21, la totalité du milieu contenu dans la colonne de sédimentation est à une température uniforme. Si on crée une différence de température entre les deux courants d'eau, il se forme un contre-courant de convection thermique dans le milieu contenu dans la colonne de sédimentation. Bien entendu on peut utiliser, au lieu de liteau, d'autres milieux fluides d'échange de chaleur. Un dispositif d'entrée 23 permet d'introduire les sper -atozoides dans le milieu contenu dans la colonne de sédimentation et un dispositif de sortie 25 permet de prélever les fractions de spermatozotdes correspondant pratiquement à un seul type chromosomique après achèvement de la sédimentation et de les recueillir dans un récipient 27. Pour déterminer l'avancement de la sédimentation et ltemplacement et la concentration des différents types de spermatozoïdes dans le milieu, un dispositif permet de balayer la longueur de la colonne de sédimentation et de déterminer l'opacité relative en différents points. Ce dispositif est décrit en détail dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n" 3.976.197. L'appareil qui vient d'être décrit permet de façon efficace de produire le contre-courant de convection thermique du procédé de l'invention et de déterminer de façon efficace l'emplacement et la concentration des spermatozoides de types X et Y séparés. La figure 3 illustre un mode de réalisation préféré de l'appareil de galvanisation avec convection utilisé pour effectuer la seconde portion du procédé de l'invention, dans lequel on soumet à une séparation complémentaire et à une concentration les fractions contenant une population déséquilibrée de spermatozoedes produites par la sédimentation a contre-courant de convection thermique. Bien que dans la description suivante on utilise la convection forcée, on pourrait dans la pratique de l'invention utiliser la convection thermique. Comme le montre de façon générale la figure 3, une cellule d'électrophorèse à convection forcée 71 comporte une colonne centrale 73 à convection forcée avec la quel le communiquent deux tubes coudés 75 et 77 contenant respectivement les électrodes positive et négative 79 et 81. Ces tubes contenant l'anode et la cathode communiquent avec la colonne à convection forcée sur deux côtés opposés, de façon à rendre maximal le mouvement des spermatozoides de charge opposée sous lteffet des forces galvaniques. Le tube de convection 73 est constitué d'une section supérieure 83 et d'une section inférieure 85, la section supérieure étant nettement plus étroite (1 cm de diamètre dans le présent mode de réalisation), que la section inférieure qui a 1,5 cm de diamètre dans le présent mode de réalisation. L'extrémité inférieure du tube de convection comporte un dispositif d'entrée 87 pour raccorder la pompe péristaltique 89 par l'intermédiaire du tube 91, de l'échangeur de chaleur 129 et du tube 92. La pompe est raccordée par le tube 93 à la sortie du réservoir de sperme 95 qui peut être un erlenmeyer.L'entrée du réservoir de sperme est raccordée au tube 97 qui communique avec une sortie 99 à l'extrémité supérieure du tube de convection 73.Le réservoir de sperme 95 est de plus muni d'une entrée 101 pour introduire un mélange de spermes contenant une population déséquilibrée de spermatozodes de types X et Y. L'échangeur de chaleur 129 est à proximité immédiate du dispositif d'entrée 87. On peut ainsi régler la température du milieu s'écoulant dans la cellule pour que les spermatozodes soient immobiles et aient une faible activité métabolique. La cellule d'électrophorèse 71 est de plus associée à une alimentation en courant électrique 103 constituée d'une source de courant continu ou d'un redresseur 105 qui peut être branché à une source ordinaire quelconque de courant alternatif, le courant continu de sortie pouvant titre réglé par un potentiomètre 107 pour qu'on obtienne la tension désirée mesurée par le voltmètre 109. Un ampèremètre 111 permet de surveiller le courant traversant la cellule d'électrophorèse par l'intermédiaire des conducteurs 113 et 115 raccordés respectivement a l'anode et à la cathode de cette cellule. Lorsqu'on a atteint le degré désiré de séparation galvanique avec convection forcée des spermatozoides à chromosomes X et Y, on préleve les fractions désirées par les sorties 117 et 119 qui communiquent respectivement avec les tubes contenant l'anode 79 et la cathode 81. La fraction de milieu soutirée par le robinet 117 de la branche de la cellule contenant l'anode 79 renferme pratiquement la totalité des cellules à chromosome Y qui ont êté entraînées vers l'anode (électrode positive) en raison de leur potentiel de surface global négatif.La portion du milieu soutirée par la sortie 119 communiquant avec la branche de la cellule contenant la cathode 81 contient de façon prédominante les spermatozoides à chromosome X qui ont être entraînés vers la cathode (électrode négative) en raison de leur potentiel superficiel global positif. Il convient de noter que les portions des branches de la cellule contenant les électrodes représentées en 121 et 123 ont légèrement moins d'un centimètre de diamètre, tandis que les portions des branches communiquant avec les électrodes représentées en 125 et 127 sont plus larges (1,5 cm). Le rétrécissement des portions horizontales des branches 121 et 123 et le léger rétrécissement de la partie supérieure du tube de convection 83 par rapport a la partie inférieure 85 favorisent la circulation par convection dans la portion inférieure 85 du tube de convection et la tendance qu'ont les spermatozoides à chromosomes X et Y b être entraînés dans les tubes 75 et 77 contenant les électrodes. La figure 4 illustre un autre mode de réalisation de l'invention dans lequel l'appareil de sédimentation et l'appareil de galvanisation sont combinés. Dans la figure 4, tous les éléments précédemment décrits relativement l'appareil de sédimentation a contre-courant de convection thermique sont identiques à ceux illustrés par la figure 1. Cependant, l'appareil comporte les éléments additionnels suivants. La colonne de sédimentation 1 comporte deux tubes de verre coudés 141 et 143 qui communiquent avec elle a des niveaux verticaux différents. Ces tubes de verre contiennent respectivement une anode 145 et une cathode 147 et comportent respectivement une sortie 149 et une sortie 151. L'alimentation en courant continu peut titre fournie par un dispositif semblable à celui illustré en 103 de la figure 3. I1 est évident que,dans ce mode de réalisation, la colonne de sédimentation 1 joue le rible de la colonne de convection 73 de la figure 3, Comme précédemment indiqué, le milieu que l'on prC-re utiliser dans la colonne de sédimentation dans le procédé de l'invention est le milieu universel décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Aérique n 3.816.249. Ce milieu est constitué d'un mélange de glycocolle, d'acide a-aminopropionique et de jaune d'oeuf en quantités telles que la solution aqueuse prolonge la durée de vie du sperme.De préférence, ce milieu est constitué d'une solution aqueuse ayant un pH compris dans la gamme d'environ 6,0 à 8,0 et renfermant en poids environ 0,01% à environ 1,0% de glycocolîe, environ 0,01% à environ 1,0% d'acide a-aminopropionique, environ C,1% à environ 2,0% de chlorure de sodium, de chlorure de potassium ou de chlorure de calcium, environ 30% à environ 55% de jaune d'oeuf et environ 30;, à environ 70% d'eau et on l'a filtré avec un filtre Millipore ayant des pores de 0,2 Xm. L'osmolalité du milieu universel peut etre comprise entre environ 250 et environ 350 mos/kg.Bien qu'oit préfère ce milieu, on peut, pour la mise en oeuvre de la première ou de la seconde portion du procédé de l'invention, utiliser d'autres milieux ne renfermant pas de particules ayant une composition appropriée, en particulier ceux ayant une composition appro- priée, en particulier ceux ayant un pH et une conductivité ionique convenant à la portion de galvanisation du présent procédé. On recueille du sperme frais renfermant des quantités égales de spermatozoïdes de types X et Y et on le mélange imédiatement avec le milieu universel à 220 C. On dilue le mélange à la concentration de 30.000.000 de cellules par millilitre et on contrôle sa qualité au microscope. On abaisse progressivement la température d mélange à 15 C, puis on l'introduit dans une colonne de sédimentation, psr exemple la colonne 1 de la figure 1. On maintient le courant d'eau extérieur 7 figure 1) à une température de 3,50C pendant toute l'opération et on maintient le courant d'eau 21 contenu dans l'enveloppe d'eau coaxiale 15 à 100C pendant une demi-heure, puis on l'abaisse a 3,53C pendant une autre degré heure en arrêtant simplement la circulation dans le tube coaxial. Il convient de noter que les températures ci-dessus sont purement illustratives. On peut mettre en pratique le procédé à une température quelconque suffisamment basse pour que l'activité des spermatozotdes ne gene pas le processus de sédimentation.Pendant la période où il existe une différence de tempéra- ture entre les portions centrale et extérieure du milieu dans la colonne de sédimentation, il se produit un contre-courant de convection thermique représenté schématiquement en 55 sur la figure 2, qui produit la poussée positive dans ce mode de réalisation. La sédimentation sous l'effet de la pesanteur constitue la poussée négative et elle se maintient lorsque la différence de température devient nulle et que le mouvement du milieu cesse. On obtient une séparation satisfaisante en 0,5 à 8 heures après l'introduction du mélange de sperme et de milieu universel dans la colonne de sédimentation. Pendant cette période, selon un mode de réalisation préféré, on détermine la distribution des spermatozoides dans la colonne de sédimentation à des périodes de temps différentes, comme représenté en 57, 59, 61 et 63 de la figure 2, en utilisant le système à balayage à laser décrit en détail dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n" 3.976.197. Lorsqu'on arrete la séparation avec convection, la concentration des cellules par sédimentation se poursuit, les spermatozoides les plus légers et les plus lourds étant entraînés vers le fond.L'utilisation d'un enregistreur à bande 51, raccordé au détecteur de faisceau laser 33, permet d'enregistrer et d'observer la distribution des spermatozoîdes à différents moments de la période de séparation. Lorsqu'on considère que la distribution est convenable, on peut ouvrir le dispositif de sortie 25 et laisser le liquide tomber dans le récipient 27 à un débit d'environ vingt gouttes par minute. Les premières fractions recueillies à partir de la colonne de sédimentation renferment les spermatozoides les plus lourds à chromosome X, tandis que des fractions successives renferment moins de spermatozoides à chromosome X et plus de spermatozoides à chromosome Y, jusqu'aux fractions finales qui sont constituées pratiquement en totalité de spermatozoides à chromosome Y. A ce moment, on peut centrifuger séparément la fraction légère à chromosome Y et la fraction lourde à chromosome X pour concentrer et purifier les produits et utiliser les fractions de types X et Y pour l'insémination. Il est cependant souhaitable de soumettre à une concentration complémentaire et à une purification les fractions à chromosomes X et Y selon le procédé de galvanisation d convection forcée décrit ci-après. Après avoir prélevé de l'appareil de sédimentation la fraction désirée de milieu renfermant une population déséquilibrée de spermatozotdes à chromosomes X et Y, on mélange la fraction dont le volume est de préfdreace de l'ordre de 50 ml, à 150 ml de milieu frais, entre 3 et 50C. On introduit ce mélange dans l'erlenmeyer 95 de la figure 3 et on règle la pompe péristaltique 89 à très faible débit pour forcer le liquide de l'erlenmeyer dans le milieu de la colonne de convection par l'entrée 87. Préalablement, on a rempli la totalité de la cellule d'électrophorèse, y compris les branches latérales 75 et 77 et la colonne de convection 73, de milieu frais à la température désirée que l'on maintient au moyen-de l'échangeur de chaleur 129 et de la pompe 89.Lorsque le milieu universel contenant le sperme est forcé par l'entrée 87 dans le milieu du tube, la portion rétrécie 83 de la colonne de convection crée dans la direction opposée un reflux facilité par l'existence de la portion plus large 85 du tube, ce qui crée la circulation par convection illustrée par les flèches dans la portion inférieure du tube de convection 73. Cette convection entraîne les spermatozoides à charge opposée dans l'ouverture des tubes latéraux 75 et 77 qui contiennent respectivement l'anode et la cathode de la cellule d'électrophorèse. On met en service l'alimentation électrique 105 et on utilise le potentiomètre 107 pour régler de façon précise la tension et le courant dans le système.Bien que la tension utilisée dans l'invention puisse avoir une valeur quelconque comprise dans la gamme d'environ 1 a environ 5 volts, avec un courant de l'ordre de plusieurs centaines de micro-ampères, la gamme préférée correspond à une force galvanique d'environ 2 à environ 4 volts, ce qui crée un courant d'environ 100 à environ 400 micro-ampères selon la concentration ionique du milieu utilisé. En pratique, la limite inférieure de la tension utilisable est celle nécessaire pour provoquer une migration importante des spermatozoides vers les électrodes correspondantes en une durée convenable et la limite supérieure de la tension est celle pour laquelle il n'y a pas d'altération permanente de la motilité ou du pouvoir fécondant des spermatozoSdes. I1 convient de noter que le liquide circulant dans le système a une concentration relativement faible en spermatozotdes (15.000.000/cm3), cette faible concentration évitant l'agglutination des spermatozoîdes qui se déplacent dans la direction opposée au champ galvanique. Lors de l'application de la tension aux électrodes 79 et 81 et de son réglage, les spermatozordes circulant dans la colonne de convection sont soumis à l'effet des forces galvaniques. Ces forces galvaniques sont accrues par l'emploi dans la cellule d'électrophorèse d'un milieu ayant un pH et une concentration ionique appropriés. Bien que l'on puisse utiliser dans l'invention des milieux ayant un pH d'environ 6,0 à environ 8,0, on a constaté que la différence globale de potentiel électrique à la surface des spermatozoîdes à chromosomes X et Y est accrue dans un milieu ayant un pH d'environ 6,8 à environ 7,0.Comme indiqué, la concentration ionique ou osmolalité du milieu est également importante dans le présent procédé et, bien qu'on puisse utiliser des compositions ayant des osmolalités comprises entre environ 200 et environ 400 mos/kg ou comprises dans une gamme plus étendue, on préfère des valeurs de 250 à 350 mos/kg et l'osmolalité la plus utile dans le présent mode de réalisation est d'environ 300 mos/kg Pendant la galvanisation avec convection forcée, l'hydro- gène et l'oxygène libérés par les électrodes respectives sont emprisonnés à la partie supérieure des tubes latéraux coudés 75 et 77 d'où ils s'échappent facilement pour se mélanger au liquide circulant.Ceci constitue un avantage net par rapport aux autres cellules dans lesquelles l'hydrogène et l'oxygène naissants peuvent altérer les spermatozoldes. On maintient la circulation lente du milieu dans la cellule d'électrophorèse comme précédemment décrit, jusqu'à ce que l'on ait atteint le degré de séparation désiré, ce qui, dans le cas du présent mode de réalisation, peut nécessiter environ 30 minutes pour chaque fraction traitée. Lorsque la séparation a atteint le degré désiré, on arrête la circulation et on cesse d'alimenter les électrodes. On prélève les fractions de milieux males.et femelles des deux tubes contenant les électrodes par les sorties 117 et 119 en surveillant soigneusement la quantité de milieu prélevée pour empêcher que des quantités importantes de milieu circulant encore dans le tube de convection central ne soient entrainées. On peut ensuite renvoyer dans le flacon le liquide de la colonne centrale.Sinon, on peut tout d'abord renvoyer dans l'erlenmeyer le liquide de la portion centrale de la colonne en s'assurant dans ce cas que la totalité de la population des spermatozoîdes séparés a été entraînée vers les électrodes au-delà des branches coudées des tubes latéraux 75 et 77, de telle sorte que, lorsqu'on évacue le liquide de la colonne centrale, la portion de milieu s'écoulant des sections latérales 121 et 123 ne renferme pas de quantités importantes de spermatozoides séparés qui se mélangeraient par reflux dans la colonne de convection centrale. On peut ensuite évacuer par les sorties 117 et 119 les fractions contenues dans les portions inférieures des branches latérales, c est-è-dire les portions 125 et 127. Dans le cas où on utilise l'appareil de sédimentation et de galvanisation combiné illustré par la figure 4, on opère selon un mode opératoire semblable à celui précédemment décrit en l'absence des stades de transfert des spermatozoides d'un appareil à l'autre. Lorsque la sédimentation à contre-courant de convection thermique est achevée, on ralentit la circulation et on applique Hes forces galvaniques aux électrodes 145 et 147 de l'appareil illustre par la figure 4. Une population constituée de façon prédominante de spermatozaTde à clsira- mosome Y s'accumule au voisinage de la partie supérieure de la colonne de sédimentation, ces spermatozoides ayant un potentiel électrique de star ace global négatif et leur attraction dans le tube latéral 141 vers l'anode (électrode positive) 145 produit une concentration complémentaire. i::ne pop-- lation semblable, constituée de façon prédominante de spermatozotdes à chromosome X ayant une charge globale positive est présente au voisinage du fond de la colonne et l'attraction dans le tube latéral L43 vers la cathode 147 la soumet à une concentration complémentaire. On peut ensuite prélever respectivement les fractions désirées par les sorties 1L9 149 et 151. Bien que l'on puisse traiter les fractions séparées comme on le désire, on utilise de préférence le procédé sui*want. On utilise des quantités égales de milieu universel (renfermant environ 20% de glycérol) pour diluer les fractions prélevées par les sorties 117 et 119 et les amener au volume désiré et à la concentration souhaitée, qui est de préférence d'environ 60.000.000 de cellules par milli- litre, puis on maintientles mélanges entre 5 et 8"C pendant 4 à 6 heures pour qu'il s'établisse un équilibre entre le glycérol et les cellules. On peut ensuite conditionner la dilution dans des ampoules de 1 ml que l'on scelle, que l'on repère maltes ou femelles ou mélange dans le cas de la fraction prélevée par le tube de convection central, puis qu'on congèle et qu'on conserve dans l'azote liquide. On peut évaluer la pureté des fractions soles et femelles obtenues selon le procédé précédemment décrit par voie sérologique par production d'anticorps ou au moyen des tests des corps B ou des corps F. On notera que l'on peut traiter de la façon suivante les fractions de sperme tozoides obtenues directement à partir d'un quelconque des modes de réalisation précédemment décrits ou de leur combinaison.On centrifuge plusieurs fois avec du milieu frais les fractions légères et lourdes de la colonne de sédimentation ou les fractions anodique et cathodique de l'appareil de galvanisation avec convection forcée pour concentrer et purifier les diffé- rents types de spermatozotdes. On considère que le sédiment des fractions lourdes et le surnageant des fractions légères, après les centrifugations et les lavages répétés, constituent les formes les plus pures des spermatozotdes femelles et malles. -Le mode d'essai sérologique utilisé est décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique nO 3.O92.897, colonne 3, lignes 11 à 43 et colonne 5, lignes 5 à 55. Sinon, on peut déterminer la pureté des spermes séparés ou non séparés selon le test des corps B. Ce test repose sur le fait que les spermatozoides de type Y de l'homme et des primates tendent à entrer en fluorescence avec une brillance particulière lorsquton les colore avec le chlorhydrate de quinacrine ou la quinacrine-moutarde, la technique de coloration étant simple et couramment utilisée. Bien qu'on ait tenté dans le passé d'utiliser cette technique pour identifier les spermatozoîdes males et femelles des animaux domestiques, en plus de ceux de l'homme et des primates, on a signalé de nombreux échecs. De façon surprenante on a découvert une technique couronnée de succès pour colorer les spermatozoides de type Y selon ce procédé chez d'autres espèces.Après avoir utilisé différentes enzymes à différentes concentrations, températures, pH, etc., on a constaté que la protéase de papaya (fournie par Sigman Chemicals, Etats-Unis d'Amérique) permettait d'obtenir le mEme effet sur les membranes cellulaires des spermatozoides des animaux domestiques. - On opère de la façon suivante : on lave au soluté salé environ 1 ml de sperme ou de mélange (renfermant environ 20.000.000 a 50.000.000 de cellules) et on centrifuge trois fois à 2.500 g pendant 15 minutes. Cette centrifugation et ce lavage sont facultatifs s'ils viennent s'ajouter à la centrifugation et au lavage précédemment décrits. Dans le présent exemple, après avoir dilué le sédiment avec 1 ml de soluté salé frais, on mélange trois gouttes de la suspension à 5 mg de protéase et on laisse digérer pendant environ 10 minutes à la température ordinaire. On ajoute ensuite une goutte de quinacrine-moutarde à 0,005% d une goutte du mélange digéré, on place sur une lame et on monte immédiatement pour l'examen microscopique.Après avoir laissé le colorant pénétrer pendant 40 minutes dans la structure interne des spermatozoides, ce qui est facilité par la digestion par la protéase de la membrane exterieure, on observe les spermatozoedes avec un microscope Leitz Ortholux en utilisant le filtre KP-490 Eciter ayant une longueur d'onde de transmission de 530 nm avec deux filtres de chaleur, HP 430 et HP 460. Les spermatozoides humains ainsi traités peuvent prendre une coloration foncée sans identification des spermatozoTdes contenant le chromosome Y; cependant, les spermatozoides de taureau et de cheval portant le chromosome Y présentent une tache brillante nette avec une excellente visibilité (corps B), les spermatozoides de type X prenant une coloration terne et diffuse. On a déterminé les corps B du sperme non traité de taureau, d'homme et de cheval et du sperme de taureau traité comme technique courante d'évaluation de la pureté du produit selon l'invention. Les résultats de 523 expériences sont regroupés dans le tableau ci-dessous où l'on compare les résultats des tests du corps B à ceux des tests biologiques. TABLEAU Etude comparative de la pureté du produit (fraction femelle) pour le test du corps B et le test biologique. Nombre Cellules % de % de Test du corps B d'essais comptées mâles femelles 1. Non traité 16 5.242 48,5 51,5 2. Sédimentation à contre-courant de tonvection 65 26.000 40,9 59,1 3. Sédimentation à contre-courant de convection et galvanisation avec convection 28 11.200 30,3 69,7 Test biologique 4. Sédimentation à contre-courant de convection 414 43,5 56,5 Il convient de noter que la combinaison de la sédimentation à contre-courant de convection et la galvanisation avec convection, comme indiqué ligne 3, accroît nettement la pureté du produit par rapport aux résultats obtenus par sédimentation à contre-courant de convection seule. Un autre procédé d'identification des spermatozoides mules de l'homme et des primates est le test des corps F qui repose sur le fait qu'un des bras du chromosome Y des cellules somatiques tend à entrer en fluorescence par coloration avec la quinacrine. Lorsqu'on soumet à la coloration des corps F des éjaculations humaines non traitées, on constate que la moitié pratiquement de la population des spermatozotdes présente une fluorescence. Bien qu'un test biologique soit impossible chez l'homme, la conclusion est évidente que la population entrant en fluorescence correspond aux ceJWRs somatiques portant le chromosome Y, c'est-à-dire les cellules malles.On a vérifié la reproductibilité de la technique de détermination des corps F et elle est maintenant admise comme technique courante d'identification des spermatozoides males dans le sperme humain. En utilisant la sédimentation à contre-courant de convection thermique précédemment décrite, la galvanisation avec convection ou une combinaison de ces techniques, on peut éliminer la majeure partie des spermatozoides lourds ou légers ou des spermatozoides à caractéristiques phénotypiques anormales que l'on considère ne constituer qu'une faible fraction de la population des spermatozoSdes, ces spermatozoides à chromosomes anormaux pouvant provoquer des malformations congénitales.Ceci permet de réduire les cas de syndrome de Klinefelter et de Turner et les anomalies autosomiques provoquées par la non disjonction et la translocation des chromosomes par rejet des spermatozoides anormaux denses et légers ou des spermatozoides ayant des caractéristiques phénotypiques anormales associées S des modifications de leur potentiel électrique de surface. Comme précédemment indiqué, la différence de potentiel de surface est liée directement à la structure chromosomique de chaque cellule et la classification soigneuse des spermatozotdes selon leur différence de potentiel électrique de surface permet facilement de mettre en évidence et de rejeter les chromosomes exceptionnels ou anormaux. I1 ressort de la description précédente que la combinaison de la sédimentation à contre-courant de convection thermique à la galvanisation avec convection selon le procédé de l'invention est utile chaque fois où on désire effectuer la régulation du sexe de la progéniture des mammifères. La combinaison des procédés ci-dessus ainsi que l'utilisation séparée de la sédimentation à contre-courant de convection thermique ou de la galvanisation avec convection forcée ont une extrême importance pratique et industrielle car elles permettent de répondre aux besoins croissants en animaux d'élevage, en particulier les bovins et les porcins, en choisissant une progéniture femelle. L'éleveur ou le fermier peut choisir le sexe des animaux. Par exe}nple, un fermier producteur de lait ou un éleveur de bétail exotique peuvent désirer ne produire que des femelle pour n'élever que des animaux producteurs de lait et non des males ou au contraire des ongles exotiques plutôt que des femelles selon le cas.En ce qui concerne la procréation humaine, le procédé et l'appareil de l'invention permettent à des parents normaux de choisir le sexe de leurs enfants pour satisfaire rapidement leur désir d'avoir un enfant d'un sexe particulier, ce qui permet de réduire le nombre total d'enfants. La fécondité élevée des spermatozoides obtenus selon le procédé de l'invention permet de façon générale le succès de l'insémination artificielle. Dans le cas de parents atteints d'anomalie génétique, le procédé de l'invention permet de façon strie d'accroître les chances d'avoir des enfants normaux par élimination des spermatozoides imparfaits dont les caracteristiques phénotypiques de densité et de potentiel électrique de surface sortent de la norme. Bien entendu, diverses modifications peuvent etre apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Appareil pour séparer des particules en suspension dans un milieu, caractérisé en ce qu'il est constitué de - une cellule d'électrophorèse contenant une paire d'électrodes; - une colonne à convection communiquant avec cette cellule d'électrophorèse et disposée entre lesdites électrodes; - un dispositif pour introduire dans la cellule d'électrode phorèse un milieu contenant des- particules de potentiels électriques différents; et - un dispositif adjacent à chacune desdites électrodes pour-éliminer les fractions désirées des particules ayant le même potentiel électrique dans le milieu contenu dans la cellule d'électrophorèse. 2. Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte de plus : - une colonne de sédimentation; - un dispositif pour introduire dans la colonne de sédimentation un milieu contenant en suspension des particules de densités différentes et de potentiels électriques différents; - un dispositif adjacent à la colonne de sédimentation pour produire une différence de température entre deux portions du milieu contenu dans la colonne de sédimentation pour créer un contre-courant de convection thermique; - un dispositif pour éliminer de ladite colonne de sedi- mentation une fraction de milieu ayant subi une séparation partielle des particules selon la densité; et - un dispositif pour transporter cette fraction de milieu de la colonne de sédimentation à la cellule d'électrophorèse. 3. Appareil selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la colonne de convection comporte une portion supérieure et une portion Inférieure, une de ces portions supérieure ou inférieure ayant un diamètre plus faible que l'autre desdites portions, et en ce que les portions contenant une électrode de ladite cellule d'électrophorèse communiquent avec la colonne à convection entre ses portions supérieure et inférieure. 4. Appareil selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte de plus un dispositif pour produire un courant de convection dans ladite colonne à convection. 5. Appareil selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la colonne à convection comporte un dispositif d'entrée à l'une de ses extrémités et un dispositif de sortie à son autre extrémité, cet appareil comportant de plus une pompe raccordée entre le dispositif d'entrée et le dispositif de sortie de la colonne à convection pour créer un écoulement forcé par convection du milieu dans la colonne. 6. Appareil selon la revendication 4, caractérisé en ce que le dispositif pour produire un courant de convection dans la colonne à convection est un dispositif produisant une convection thermique dans la colonne en portant une portion du milieu qu'elle contient à une température différant nettement de celle d'une autre portion du milieu qu'elle contient en produisant ainsi une circulation par convection thermique du milieu dans la colonne à convection. 7. Appareil pour séparer des particules ayant des densités différentes et des potentiels électriques différents en suspension dans un milieu, caractérisé en ce qu'il est constitué de - une colonne de sédimentation; - un dispositif pour introduire dans la colonne de sédimentation un milieu contenant en suspension des particules de densités différentes et de potentiels électriques différents; - un dispositif adjacent la colonne de sédimentation pour produire une différence de température entre deux portions du milieu contenu dans la colonne de sédimentation et créer un contre-courant de convection thermique;; - une cellule d'électrophorèse constituant une partie de la colonne de sédimentation constituée de deux tubes de verre contenant chacun une électrode, chaque tube communiquant avec la colonne à un niveau vertical de celle-ci différent; et - un dispositif pour éliminer les fractions désirées du milieu de la colonne de sédimentation et des tubes contenant les électrodes. 8. Appareil selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte de plus un dispositif pour déterminer les variations de la distribution des particules dans la colonne de sédimentation. 9. Procédé pour séparer les spermatozoïdes du sperme2 caractérisé en ce qu'il consiste à - mélanger le sperme à un milieu liquide de mise en suspension; - appliquer une force galvanique au milieu en le soumettant à une circulation par convection de façon que les spermatozoides ayant un certain potentil électrique global de surface atteignent dans le milieu une position différente de celle des spermatozoides ayant un potentiel électrique global de surface différent; et - prélever une fraction du milieu contenant le type de spermatozotdes désiré. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce queue plus, on soumet le mélange de sperme et de milieu liquide de mise en suspension à une séparation créant un rapport déséquilibré entre les cellules à chromosome X et les cellules à chromosome Y dans le milieu liquide de mise en suspension avant qu'on applique la force galvanique. 11. Procédé selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce que la circulation par convection est produite par circulation par convection forcée du milieu. 12. Procédé selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce que la circulation par convection est produite par circulation par convection thermique du milieu. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisé en ce que la séparation consiste à immobiliser les sper matozoides par refroidissement du mélange et à appliquer aux spermatozoSdes des poussées positive et négative pour que les spermatozoides les plus denses atteignent dans le liquide un niveau différent de celui des sper matozoides moins denses. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'on applique les poussées positive et négative en créant une différence de température entre des portions du mélange de spermatozoîdes et de milieu de façon à faire circuler les spermatozoides sous l'effet du contre-courant de convection thermique. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 14, caractérisé en ce qu'on centrifuge la fraction prélevée pour effectuer une purification complémentaire des spermatozoides désirés. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 15 caractérisé en ce que le milieu est constitué d'un mélange de glycocolle, d'acide a-aminopropionique et de jaune d'oeuf en quantités telles qu'il prolonge la durée de vie des spermatozoides en solution aqueuse. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 16, caractérisé en ce qu'on détermine le rapport des spermatozoides à chromosome X aux spermatozoides à chromosome Y présents dans la fraction prélevée du milieu en soumettant cette fraction de milieu au test de détermination des corps B. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 17, caractérisé en ce que les spermatozotdes contenu dans la fraction prélevée du milieu sont de façon prédominante des spermatozoides à chromosome X ou des spermatozoîdes à chromosome Y que l'on introduit ultérieurement dans l'organisme d'une femelle de l'espèce appropriée pour que la conception s'effectue et que l'on obtienne une progéniture du sexe désiré.