Brevet FR2380277A1 — publié le 19780908

La découverte des remarquables propriétés antibiotiques de la pénicilline a beaucoup stimulé l'intérêt dans ce domaine, ce qui a permis de trouver beaucoup d'autres substances antibiotiques intéressantes, comme : les autres pénicillines, la streptomycine, la bacitracine, les tétracyclines, le chloramphénicol, les érythromycines, etc.. En général, l'activité anti-bactérienne de chacun de ces antibiotiques ne comprend pas certaines bactéries pathogènes importantes en cliniques Par exemple, certains sont principalement actifs seulement contre les types gram-positifs de bactéries.La résistance acquise au cours de l'emploi très répandu des antibiotiques existants dans le traitement de l'infection bactérienne a provoqué l'apparition d'un grave problème de résistance0 Ainsi, les déficiences des antibiotiques connus ont stimulé des recherches plus poussées afin de trouver d'autres antibiotiques qui seraient actifs contre une gamme plus large d'agents pathogènes ainsi que contre des souches résistantes de certains micro-organismes. Cette invention concerne un nouvel agent antibiotique. Plus particulièrement, elle concerne la nouvelle substance antibiotique appelée ici désacétyl, dihydro 890Â9r. L'invention comprend l'antibiotique sous ses formes diluées, sous forme de con- centrés bruts et sous ses formes pures. La présente invention a pour objet de fournir ce nousel antibiotique utile, qui est très efficace pour inhiber la croissance de différents micro-organismes gram-négatifs et grampositifs. Cette invention a encore pour objet de fournir un procédé de préparation de cette nouvelle substance antibiotique par désacétylation enzymatique du composé dihydro 890Â9. Les autres objets apparaitront d'après la description détaillée fournie ci-dessous de cette invention. On produit la nouvelle substance antibiotique de la présente invention en hydrolysant le groupe N acétyle du dihydro 890A9 avec une amidohydrolase capable d'hydrolyser le groupe N-acétyle. Comme source pratique d'amidoBydrolase ayant cette capacité on trouve des souches du micro-organisme Protaminobacter ruber productrices d'amidohydrolaseO L'enzyme particulier pro duit par Protaminobacter ruber est la N-acétyldihydro 890A9- amidohydrolase, membre du sous-groupe d'enzymes désigné E.C. 3.5.1 selon lanomenclature enzymatique recommandée par l'Union Internationale de Chimie Pure et Appliquée et l'Union Internationale de Biochimie. Le micro-organisme capable d'effectuer le processus de désacétylation a été isolé d'un échantillon de sol et, d'après des études taxonomiques, a été identifié comme appartenant à l'espèce Protaminobacter ruber-et désigné BE-3528 dans la collection de cultures de MERCK & CO, , Inc., Rahway, new Jersey. Une culture de ce micro-organisme est déposée en permanence sans restriction dans la collection de culture des Northern Regional Research Laboratories, Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, Minis- tère américain de l'Agriculture, Peoria, Illinois, et a reçu le numéro de publication NRRL B-8143. Les caractéristiques morphologiques et culturales de Protaminobacter ruber NRRL B-8143, ainsi que celles qui concernePt l'utilisation du carbone et de l'azote et les réactions biochimiques sont les suivantes t Morphologie s Les cellules sont en forme de bâtonnets à bouts ronds, de 0,9-1,2 x 2,3-4,6 microns, et se présentent seules ou en paires. Les cellules vieilles de 24 et 48 h se colorent en gram-négatifs à apparence granulaire.Les granules, surtout les granules polaires, se colorent en noir avec le noir Soudan 3. Les cellules sont animées de mouvements à 28 C, mais leur motilité est contestable à370C, Caractères culturaux : Les colonies sur gélose nutritive sont tout d'abord minces, punctiformes, semi-transparentes et incolores ; puis elles deviennent faiblement convexes, opaques, lisses, aux extrémités nettes, de consistance quelque peu sèche et de pigmentation rose à rorouge. Les cultures en bouillon nutritif sont uniformément troubles sans pellicule. La production de pigment ne dépend pas de la lumière ou des températures expérimentées (28 C et 37 C). Le pigment est soluble dans l'acétone mais insoluble dans l'eau ou le chloroforme. 1a croissance sur gélose nutritive et gélose dtinfu- sion cervelle-coeur dans des conditions aérobies est un peu lente mais bonne à 280C ; la croissance est modérée à bonne mais plus lente à 370C , il n'y a pas de croissance à 50 C. Utilisation des sources de carbone et d'azote En utilisant un milieu de sels basaux avec le sulfate d'ammonium comme source d'azote, la croissance est bonne avec l'arabinose, modérée avec le amylose et faible avec le dextrose, le fructose, le mannose, le rhsmnose, le lactose, le maltose, le saccharose, le raffinose, la cellulose, l'inositol et le mannitol. On peut utiliser la N-acétyl-éthanolamine comme seule source de carbone et d'azote. Il n'y a pas d'acide ou de gaz produit à partir du dextrose ou du lactose dans le milieu basal d'oxydation-fermentation (Laboratoires DiSco, Detroit, Michigan) dans des conditions aérobies ou anaérobies. Réactions biochimiques les réactions biochimiques se fondent sur les méthodes standard décrites dans le Manual of Microbiological Methode, édité par la Society of American Bacteriologist, McGraw-Rill Book Co., New York, 1957 Catalase - positive Oxydase - négative Amidon non hydrolysé Caséine non hydrolysée Gélatine non liquifiée Lait de tournesol de consistance inchangée, mais de vient légèrement alcalin au bout de 7 jours, Indole - négatif H2S - négatif Nitrates non réduits Uréase - positive Lysine et ornithine-décarbo ylase - négatif. 890A9 est le nom qui s'applique à l'antibiotique ayant la structure La 890A9, sa description et ses procédés de production sont exposés dans la demande de brevet déposée par Cassiez et al., U.S. N de série 742 957, déposée le 17 Novembre 1976, mentionnée ici à titre de référence. Le nouvel antibiotique de la présente invention, désacétyl-dihydro 890A9 possède la formule structurelle : et est préparé par hydrolyse enzymatique du dihydro 890A9, en utilisant une amidohydrolase présente dans une espèce du genre Protaminobacter. Le nouveau procédé de la présente invention concerne la coupure du groupe N-acétyle du composé de structure : qui implique de mettre en contact intime ledit composé avec une amidohydrolase capable dthydrolyser le groupe N-acétyle. Plus précisément, le procédé de la présente invention permet la N- désac6tylation du dihydro 890A9 par mise en contact intime dudit composé avec l'amidohydrolase, la N-acétyl-dihydro-890A9. On met en évidence une homologie inattendue entre la N-acétyl-éthanolamine et le 890A9, grâce à laauelle des extraits de micro-organismes avec l'enzyme, la N-acétyl-éthanolamine- amidohydrolase, sont dans de nombreux cas capables d'hydrolyser le dihydro 890A9. Le composé 890A9 se prépare par fermentation d'un bouillon avec le mciro-organisme Streptomyces flavogriseus. Après des études taxonomiques approfondies, la souche de micro-organismes utilisée dans la présente invention a été identifiée comme appartenant à l'espèce Streptomyces flavogriseus et désignée MA-4638 dans la collection de culture de MERCI & COO, Inc. Rahway, N.J. Une culture de ce micro-organisme est déposée en permanence sans restriction d'accès dans la collection de culture des Northern Régional Laboratories, Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, Ministère américain de l'Agriculture, Peoria, Ill., et est accessible au public sous le N de publication NRRL 11 020. Streptomyces flavogriseus MA-4638 produit l'antibiotique qui est isolé sous forme pratiquement pure du bouillon de fermentation. Les caractères morphologiques et culturaux de Strepto- myces flavogriseus MA-4638 sont exposés dans le tableau suivant. Morphologie - Bes Sporophores sont des channes rsmi- fiées de spores, droites à flexueuses, formant des touffes. Les charnels ont plus de 10 spores de longueur Les spores sont sphériques à ovales - 0,9 x 1,2 (970x). Caractères culturaux Gélose de farine d'avoine (Milieu ISP 3) Croissance végétative - envers jaune-brun bordé de brun, ridé ; Mycélium aérien - gris clair bordé de gris moyen Pigment soluble - aucun. Gélose Czapek Dox (gélose saecharose-nitrate) Croissance végétative - envers-brun bordé de brun foncé Mycélium aérien - gris moyen, velouté Pigment soluble - léger brunissement du milieu. Gélose d'albumine d'oeuf Croissance végétative - envers- jaune-brun bordé de brun mycélium aérien - gris moyen mélangé de gris jaunâtre (2dc) et de jaune grisé (2db) ; Pigment soluble - léger brun jaunâtre. Gélose glycérol asparagine Croissance végétative - envers brun Mycélium aérien - velouté, gris clair à ton jaunâtre (2dc) Pigment soluble - brun clair. Gélose sels inorganiques-amidon (Milieu ISP 4) Croissance végétative - envers - brun verdâtre-jaunâtre Mycélium aérien - velouté, gris moyen à ton jaune (3fe) ; Pigment soluble - brun très clair. Gélose extrait de levure-dextrose + sels Croissance végétative - envers -brun foncé mycélium aérien - gris foncé mêlé d'un gris plus clair Pigment soluble - aucun. Gélose extrait de levure-malt (Milieu ISP 2) Croissance végétative - envers - brun mycélium aérien - velouté, gris foncé bordé d'un gris plus clair Pigment soluble - aucun. Gélose au lait écrémé Croissance végétative - brun ; Mycélium aérien - clairsemé, blanchâtre Pigment soluble - léger brunissement du milieu ; Hydrolyse de la caséine - bonne; Lait de tournesol Croissance végétative - anneau de croissance modérée, brun ; tyGélium aérien -aucun Couleur - violette Coagulation et/ou peptonisation " Peptonisation complète ; alcalinisation. Lait écrémé Croissance végétative - anneau de croissance modéré, brun ; mycélium aérien - aucun Pigment soluble - brun clair ; Coagulation et/ou peptonisation - peptonisation complète alcalinisation Gélose de tyrosine nutritive Croissance végétative - envers -brun fonce Mycélium aérien - gris foncé bordé de blanc grisâtre Pigment soluble - léger brunissement du milieu ; Décomposition de la tyrosine - positives Gélose peptone-fer-extrait de levure Croissance végétative - brun Mycélium aérien- blanchâtre, modéré ; Pigment soluble -aucun ; Mélanine - aucune Production d'H2S - négative. Gélose nutritive Croissance végétative - envers brun légèrement grisâtre Mycélium aérien - gris clair bordé de gris foncé Pigment soluble - aucun. Gélose d'amidon nutritive Croissance végétative - brun bordé de gris Mycélium aérien - gris moyen ; Pigment soluble - aucun hydrolyse de l'amidon - bonne. Gélose de gélatine nutritive Croissance végétative - brun bordé de gris ; Mycélium aérien - grisâtre-blanc Pigment soluble - aucun ; Liquéfaction de la gélatine - bonne. Bouchon de pomme de terre Croissance végétative - -brun Mycélium aérien - gris moyen à foncé Pigment soluble - aucun. Sérum au sang de Loeffler Croissance végétative - couleur crème mycélium aérien - aucun Pigment soluble -. aucun Liquéfaction - aucune. Cultures repiquées de gélatine Croissance végétative - brun Mycélium aérien - aucun Pigment soluble - aucun ; Liquéfaction de la gélatine - complète. Toutes les données mentionnées ci-dessus ont été prises au bout de 3 semaines d'incubation à 280C, sauf indications contraires. Le pH des milieux utilisés dans cette étude est approximativement neutre, c'est-à-dire pH-, 8-7,2. Les noms de couleurs utilisés-dans la description sont en accord avec les définitions du Color Harmony Manual, 4# Ed. (1958), Container Corporation of America, Chicago, Illinois. On teste également la capacité de Streptomyces flavogriseus MA-4638 à utiliser ou assimiler différents hydrates de carbone. Dans ce but, on fait contre le micro-organisme sur un milieu synthétique basal (Pridham et Gottlieb) contenant 1% de l'hydrate de carbone à 280C, 'pendant 3 joùrs-. le pH des milieux employés dans l'étude est approximativement neutre (6,8-7,2). Le Tableau I nontre l'utilisation de ces sources d'hydrate de c-arbone par Streptomyces flavogriseus MA-4638 ; + indique une croissance, + une croissance faible ou contestable, et - pas de croissance du tout par rapport à un témoin négatif (pas de source de carbone). TABLEAU I Glucose + Maltose + Arabinose + Mannitol + Cellulose - Mannose + Fructose + Raffinose Inositol - Rhamnose + Lactose + Sucrose + Xylose + L'importance de la croissance selon les changements de température et les besoins en oxygène du micro-organisme est la suivante Intervalle de température (gélose extrait de levure-dextrose + Sels) 280C - bonne croissance végétative et aérienne 370C - bonne croissance végétative ; pas d'hyphes aériens 500C - pas de croissance. Besoins en oxygène (culture repiquée dans gélose extrait de levure-dè trose + sels) Aérobie. La présente invention ne se limite pas à l'organisme Streptoxyces flavogriseus ou aux organismes répondant pleinement aux caractéristiques de croissance et microscopiques ci-dessus qui sont donnés à titre d'illustration. Elle est conçue comme devant inclure l'emploi de mutants produits à partir des organismes décrits par différents moyens, comme les rayons 1, les rayons ultra-violets, la moutarde azotée, l'exposition aux phages, etc. Le 89QA9 est produit pendant la fermentation aérobie, dans des conditions bien déterminées, de milieux nutritifs aqueux convenables inoculés avec une souche de l'organisme Streptoxyces flavogriseus. Les milieux aqueux, comme ceux qui sont employés pour la production d'autres antibiotiques, conviennent pour produire le 890A9. Ces milieux contiennent des sources de carbone, d'azote et des sels inorganiques assimilables par le micro-organisme. En général, on peut utiliser les hydrates de carbone comme les sucres, par exemple le dextrose, le glucose, le fructose, le maltose, le saccharose, le xylose, le mannitol, etc.. et les amidons comme la dextrine ou les céréales, par exemple l'avoine, le seigle, l'amidon de maïs, la farine de maïs, etc.. soit seuls soit en combinaison comme sources de carbone assimilable dans le milieu nutritif 0 La quantité d'hydrate de carbone varie généralement entre environ 1% et 6% du milieu en poids. ces sources de carbone peuvent être utilisées séparément, ou bien on peut combiner plusieurs sources de carbone de ce genre dans le milieu. En général, on peut utiliser beaucoup de produits protéiniques comme sources d'azote dans le processus de fermentation. Les sources d'azote convenables contiennent, par exemple, les hydrolysats de levure, la levure primaire, la farine de soja, la farine de graine de coton, les bydrolysats de caséine, la liqueur de mais macéré, les distillas solubles, etc.., la source préférée étant les distillats solubles. les sources d'azote, soit seules, soit combinées, sont utilisées à des quantités allant d'environ 0s2 % à 6% en poids du milieu aqueux. Parmi les sels inorganiques nutritifs que l'on peut incorporer dans les milieux de culture on trouve les sels habituels capables de donner des ions sodium, potassium, ammonium, calcium, magnésium, phosphate, sulfate, chlorure, carbonate, etc.. Il faut comprendre également les métaux traceurs comme letobaît, le manganèse et le fer. Les milieux décrits dans les exemples sont simplement des illustrations de la grande variété de milieux que l'on peut employer, et ne doivent pas tre considérés comme étant limitatifs. La fermentation s'effectue à des températures allant d'environ 200C à 370C ; cependant, pour obtenir des résultats optima, il est préférable de procéder à la fermentation à des températures allant d'environ 23 C à 28 C. Le pH initial des milieux nutritifs convenables pour cultiver les souches de la culture de Streptomyces flavogriseus et produire l'antibiotique 890A9 peut varier d'environ 6,0 à 8,0. Bien que l'antibiotique 89OA9 soit produit tant par des cultures de surface que par des cultures en gélose profonde, on préfère effectuer la fermentation en gélose profonde, Il est commode de procéder à une fermentation à échelle réduite de l'antibiotique en inoculant dans un milieu nutritif convenable la culture produisant l'antibiotique et, après transfert dans un milieu de production, de permettre à la fer mentation de s'effectuer à une température d'environ 2400 sur un agitateur pendant plusieurs jours. La fermentation est amorcée dans un ballon stérilisé de milieu nutritif en passant par une ou plusieurs étapes du développement de la semence. Le milieu nutritif pour l'étape d'ensemencement peut entre toute combinaison convenable de source de carbone et d'azote. Le ballon de semence est agité dans une chambre à température constante à environ 280C pendant 1 jour, ou jusqu'à ce que la croissance soit satisfaisante, et on utilise une partie de la croissance obtenue pour inoculer soit une semence de seconde étape, soit un milieu de production.Les ballons de fermentation des stades intermédiaires, lorsqu'on en utilise, sont exploités essentiellement de la même manière, c'est-à-dire qu'on utilise une partie du contenu du ballon du dernier stade de fermentation pour inoculer le milieu de produc tion. On agite les ballons inoculés à une température constante pendant plusieurs jours, et à la fin de la période d'incubation, on centrifuge ou on filtre le contenu du bain. Lorsque l'on travaille à grande échelle, il est préférable de procéder à la fermentation dans des cuves appropriées munies d'un agitateur et d'un système d'aération du milieu de fermentation0 Selon ce procédé le milieu nutritif est préparé dans la cuve et stérilisé par chauffage à des températures allant jusqu'à 1200C environ. Après refroidissement, on inocule dans le milieu stérilisé une semence préalabiement cultivée de la culture productive, et on laisse la fermentation s'effectuer pendant une période allant par exemple de 1 à 6 tours tout en agitant-et/ou en aérant le milieu nutritif et en maintenant la température à environ 22 à 260C. Ce procédé de production de l'antibiotique 890A9 convient particulièrement pour la préparation de grandes quantités de l'antibiotique. Propriétés physiques et chimiques de l'antibiotique 890A9 L'antibiotique 890A9 est une substance acide qui migre vers le pôle positif à l'électrophorèse à pH neutre. A un gra- dient de 50 volts/cm dans un tampon au phosphate de potassium 0,03 M, pH 7,1, l'antibiotique se déplace de 8,0 cm en 30 min, à comparer avec le mouvement de 4,0 cm du 890A1. Le sel diosodique est une poudre blanche ou légèrement jaune lorsqu-'il est lyophilisé à partir d'une solution aqueuse. Dans des conditions acides en solution aqueuse, l'antibiotique est instable sous la forme acide libre.L'antibiotique se trouve donc habituellement sous forme combinée comme sel ou comme autre dérivé plus stable. le sel disodique de l'antibiotique 890A9 a des maxima d'absorption à 308 nm et 228 nm, et un minimum à 262 nm à pH neutre dans l'eau. Pour- la -préparation la plus purifiée, le rapport A308/A260 est de 2,05, et le rapport A308/A220 est de 1,17 et celui de A308/A228 est de 1,05. On peut éteindre plus de 93% de l'absorption à 308 nm par réaction avec l'hydroxyl- amine à pH neutre. Après réaction avec l'hydroxylamine, l'absorption à 260 nm augmente-, et le rapport de l'augmentation à 260 nm à la diminution à 308 nm est d'environ 0,30.La réaction avec l'hydroxylamine, suivie par une diminution de l'AD08 dans les conditions décrites au chapitre "Réaction avec l'hydroxyl- amine" est apparemment du premier ordre, avec une demi-vie à la température ambiante d'environ 25 à 50 sec. Lorsqu'on le mesure pas rapport à un standard d'antibiotique 890A1, l'antibiotique 890A9 a 82 unités/unité HAEA308. L'HAEA308 est décrite au chapitre "Réaction avec l'hydroxylami- ne" Le Tableau II énumère le signal spectral de RMN à 100 MHz de 890A9 dans D2O à 10 C. Les déplacements chimiques sont donnés en ppm par rapport à HOD à 4,70 6 & à 320C ; les cons- tantes de couplage sont données en Hertz. TABLEAU Il CH3CH 1,55 (3H,d,6 Hz) CH3CO 2,12 (3H,s) C6-H 3,91 (1H,d,d;J6-5=5,5 Hz;J6-8=9 Hz) C5-H 4,36 (1H,m) C8-H ~5 (partiellement recouvert par la ligne HOD) C(1)-H2 3,14 (1H;d,d;18,2 + 9,8 Hz) -S-OH=CH-N 6,10 (1H,d,13,9 Hz) et 7,19 (1H,d, 13,9 Hz). Le spectre de masse de TMSI-890A9 est caractérisé par les fragments que donne le Tableau III TABLEAU III m/e 84 227 298/9 339 340 366 456 L'antibiotique 890A9 a la structure moléculaire suivante : Dans la pratique de la présente invention, la chaîne latérale insaturée du 890A9 est réduite en même tempa que ou avant la réaction de l'enzyme N-acétyl-dihydro 890A9-amidro 890A9-amidohydrolase. La chaine latérale insaturée de 890A9 peut 8tre réduite par l'une quelconque des techniques bien connues des hommes de l'art. La réduction de la channe latérale du 890A9 donne le composé dihydro 890A9 ayant a structure suivante : Le composé dihydro 890A9 se désacétyle selon les données de la présente invention pour aboutir aux nouveaux composés, le désacétyl, dihydro 890A9. Le désacétyl, dihydro 890Â9, le composé de cette invention, est un antibiotique utile actif contre diverses bac téries gram-positives et gram-négatives et, par conséquent, est utilisé en médecine humaine et vétérinaire Le composé de cette invention peut être utilisé comme médicament antibactérien pour traiter les infections provoquées par les bactéries gram-positives ou gram-négatives, par exemple contre les souches sensibles de Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Escherichia colis Elebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae et Pseudomonas aeruginosaO Le produit antibactérien de cette invention peut, en outre, être utilisé comme additif aux nourritures animales, pour préserver la nourriture et comme désinfectant.Par exemple on peut l'employer dans des compositions aqueuses à des concentrations allant de 0,1 à 100 parties d'antibiotique par million de parties de solution ou de préférence à des concentre tisons allant d'environ 1 à environ 10 parties d'antibiotique par million de parties de solution afin de détruire et d'inhi- ber la croissance des bactéries nocives sur l'équipement médical et dentaire et comme bactéricide dans les applications industrielles par exemple dans les peintures à base d'eau et dans la "white water" (eau blanche) des moulins à papier pour inhiber la croissance des bactéries délétères;; L'antibiotique de cette invention peut être utilisé dans l'une quelconque de nombreuses préparations pharmaceutiques comme seul ingrédient actif ou en combinaison soit avec un ou plusieurs autres antibiotiques, soit avec une ou plusieurs substances pharmacologiquement actives. Comme exemple du premier cas, on peut coadministrer un antibiotique à l'eminocyclitol comme la gentemycine afin de minimiser les chances de survie d'organismes résistants. Comme exemple du deuxième cas, on peut combiner du diphénoxylate et de l'atropine dans des formes de base permettant de traiter la gastro-entérite. L'antibintique peut être employé sous forme de capsules ou de comprimés, de poudres ou de solutions liquides, ou comme suspensions ou élixirs. On peut l'administrer par voie orale, topique, intraveineuse ou intra-musculairee Les comprimés et les capsules destinés à l'administration orale peuvent se présenter sous forme de dises unitaires, et peuvent contenir des excipients classiques comme les liants, par exemple le sirop, l'acacia la gélatine le sorbi tol la gomme adragante ou la -polyvinylpyrrolidone ; des agents de remplissage, par exemple le lactose, le sucre, l'aaidon de mains, le phosphate de calcium, le sorbitol ou la glycine ; des lubrifiants, par exemple le stéarate de magnésium, le talc, le polyéthylèneglycol, le silice ; des désintégrants, par exemple l'amidon de pomme de terre ou des agents mouillants acceptables comme le laurylsulfate de sodiums Les comprimés peuvent être enrobés selon des méthodes bien connues des hommes de l'art. les préparations liquides orales peuvent être sous la forme de suspensions aqueuses ou huileuses, de solutions, d'émulsions, de sirops, d'élixirs, etc0., ou être présentées sous forme de produits secs, aux fins de reconstitution avec de l'eau ou d'autres véhicules convenables avant l'emploif. De telles préparations liquides peuvent contenir des additifs classiques comme des agents suspenseurs, par exemple le sirop de sorbitol, la méthylcellulose, le sirop glucose-sucre, la gélatine, l'hy- droxyéthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, le gel de stéarate d'aluminium ou les graisses comestibles hydrogénées ; des agents émulsifiants, par exemple la lécithine, le mono-oléate de sorbitan ou l'acacia ; des véhicules non-aqueux qui peuvent inclure les huiles comestibles, par exemple lthuile d'amande, l'huile de coco fractionnée, les esters gras, le propylèneglycol ou l'alcool éthylique ; les agents de conservation, par exemple les p-hydroxybenzoates de méthyle ou de propyle ou l'acide sorbique-. Les suppositoires contiennent des bases classiques pour suppositoires, par exemple le beurre ce cacao ou un autre glycéride. Les compositions injectables peuvent être présentées en doses unitaires sous forme d'ampoules, ou dans des conteneurs multidoses ajoutées à un agent de conservation. Les compositions peuvent prendre diverses formes, telles que suspensions, solutions, émulsions dans des véhicules huileux ou aqueux, et peuvent contenir des agents de formulation tels que des agents de suspension, des agents de stabilisation et/ou de dispersion.L'ingrédient actif peut aussi entre sous forme de poudre aux fins de reconstitution avec un véhicule convenable, par exemple de l'eau stérile, sans pyrogène, avant l'emploi0 On peut également préparer les compositions sous des formes convenables aux fins d'absorption à travers les membranes muqueuses du nez et de la gorge ou les tissus bronchiaux et peuvent commodément prendre la forme de poudres ou de liquides de pulvérisation ou d'inhalation, de tablettes, de badigeons, etc.. Pour le traitement des yeux ou des oreilles, les préparations peuvent être présentées sous forme de capsules isolées, sous formes liquides ou semi-solides, ou peuvent être utilisées sous forme de gouttes, etc..Les applications topiques peuvent etre formulées dans des bases hydrophobes ou hydrophiles comme les onguents, les crèmes, les lotions, les badigeons, les poudres, etc.. Par ailleurs, outre un support, les présentes compositions peuvent contenir d'autres ingrédients comme les stabilisateurs, les liants, les anti-oxydants, les agents de conservation, les lubrifiants, les agents de suspension, les agents de viscosité ou les agents de sapidité, etc.. En médecine vétérinaire, comme dans le traitement des poules des vaches, des moutons, des cochons, etc.., les compositions peuvent, par exemple, eAtre formulées en préparations intra-mammaires dans des bases permettant soit une action de longue durée, soit une diffusion rapide Le dosage à administrer dépend dans une large mesure de l'état du sujet traité, du poids de l'hôte et du type d'infection, du mode et de a fréquence d'administration, la voie parentérale étant préférée pour les infections généralisées et la voie orale pour les infections intestinales. Dans le traitement des infections bactériennes chez l'homme, le composé de cette invention s'administre par voie orale ou parentérale, selon les procédés classiques de l'administration des antibiotiques, à des quantités allant d'environ 2 à 600 mgtkg/jour et de préférence d'environ 5 à 100 mg/kg/jour à des doses de préférence fractionnées, par exemple 3 à 4 fois par jour. On peut l'administrer en doses unitaires contenant par exemple 25, 250, 330, 400 ou 1000 mg d'ingrédient actif avec des supports ou excipients physiologiquement acceptables0 Les unités de doses sont sous la forme de préparations liquides comme les solutions ou suspensions ou sous forme de solides en comprimes ou en capsules.Il est clair que la dose optimum dans tel ou tel cas dépend du type et de la gravité de l'infection à traiter, et que l'on emploiera des doses plus faibles en pédiatrie, tous ces ajustements étant du domaine du praticien spécialisé. PROCEDE DE DOSAGE DE L'ANTIBIOTIQUE 890A9 r. Biodosage On emploie un procédé de diffusion annulaire sur plaque de gélose avec Vibrio percolans ATCC 8461 comme organisme testeur. On emploie comme standard un échantillon purifié d'antibiotique 890A1. On prépare l'antibiotique 890A1 selon le procédé exposé dans l'Exemple 5. On prépare des plaques contenant Vibrio ercolans ATCC 8461 de la manière suivante : On met en suspension une culture lyophilisée de Vibrio zercolans ATCC 8461 dans 15 ml d'un milieu stérilisé contenant 8 g par litre de bouillon nutritif DiSco et 2 gZl d'extrait de levure dans l'eau distillée "bouillon nutritif-extrait de levu refit (désigné ci-dessous BNEL). On fait incuber la culture pendant la nuit sur un agitateur rotatif à 28 C. On utilise cette culture pour inoculer la surface de cultures en biseau contenant 1,5% de gélose dans REEL, et on fait incuber pendant la nuit les cultures en biseau inoculées à 280C, puis on les garde au réfrigérateur. On utilise jusqu'à 4 semaines après leur préparation les cultures en biseau réfrigérées préparées à partir d'une seule culture lyophilsée, comme suit : On disperse une goutte d'inoculum provenant du milieu en biseau dans 50 ml de NBEL contenu dans un erlenmeyer de 250 ml. On fait incuber la culture pendant la nuit sur un agitateur rotatif à 28 C puis on la dilue à une densité donnant un taux de transmission à 660 nm. On ajoute une fraction de 3552 ml de cette culture diluée à 1 litre de BNEL contenant 15 g de gélose et maintenu à 46 C. On verse le milieu contenant la gélose inoculée dans des boites de Pétri en plastique de 100 x 15 mm, 5 ml par boîte, on refroidit, et on maintient à 2-4 C pendant une durée pouvant aller jusqu a 5 a ours avant utilisation. On plonge des disques de papier-filtre de 12,7 mm de diamètre dans la solution à doser, et on les place sur la gélose. On peut également charger les disques en versant avec une pipette 1/100 de ml de solution sur un disque sec, puis en plaçant le disque sur la gélose On mesure le diamètre de la zone d'inhibition après incubation convenable (12-24 h à 250C)'. Si nécessaire, on fait des dilutions des solutions à doser dans un tampon au phosphate de potassium 0,05 X, pH 7,4 "tampon au phosphate de potassium" (appelé ci-dessous TPK), ou dans l'eau désionisée. Les calculs de puissance s'effectuent de la manière suivante : On détermine une pente en mesurant les diamètres de zone d'une solution d'antibiotique 890A9 et d'une dilution au quart (dans le TPK) de cette solution. On dose deux disques de chaque concentration sur une seule plaque, et on détermine la taille moyenne de la zone à chaque concentration La pente est égale à la moitié des différences entre les tailles moyennes des zones. Les puissances sont alors calculées par la formule : Puissance (unités/ml) = (Puissance du standard) x dilution x 10 oà D est le diamètre moyen des zones formées par l'inconnue, est le diamètre moyen des zones standard, et "dilution" est le degré auquel l'inconnue a été diluée avant dosage. Si l'on n'emploie pas de standard, on suppose que Ds vaut 25 mm et que la (puissance du standard) vaut une unité/ml, lorsqu'elle est mesurée sur Vibrio Percolans ATCC 8461. Le 890A1 pur est défini comme ayant une puissance de 250 unités par unité d'absorption extinguible à l'hydroxylamine à 300 nm, lorsqu'il est utilisé comme standard. II -Procédé de dosage pour déterminer les unités de dosage 890" On emploie une méthode classique de diffusion annulaire sur plaque de gélose avec Vibrio rcolans ATCC 8461 comme organisme testeur, On emploie la céphaloridine comme standard. On prépare les plaques contenant Vibrio percolans ATCC 8461 de la manière suivante. On fait incuber une culture de Vibrio percolans ATCC 8461 dans un extrait bouillon-levure nutritif pendant la nuit sur un agitateur rotatif à 280C puis on la dilue à une densité de transmission de 60% à 660 nm. On ajoute une fraction de 33,2 ml de cette culture diluée à 1 litre d'un milieu composé de gélose nutritive plus 0,2% d'extrait de levure maintenu à-460C. On verse le milieu inoculé contenant la gélose dans des boites de Petri en plastique de 100 x 15 mm, 10 ml par bort, on refroidit, et on maintient à 2-4 C pendant une période allant jusqu'à 5 jours avant emploi. On détermine la concentration de céphaloridine qui est équivalente à 1 unités de 890A1 par dosage sur des plaques préparées comme ci-dessus, mais contenant 5 ml de milieu inoculé par plaque, comme suitO Le standard est constitué par 4 concentrations de céphaloridine - 3,12, 6,25, 12,5 et 25 microgrammes/ ml, 12,5 microgrammes/ml étant la solution de référence.Les diamètres de zone sur une plaque de 5 ml pour le standard sont les suivants Conc. ( g/ml) Diamètre de zone (mm) 3,12 16,8 6,25 22,3 12Z5 25,0 25 29,6 Une unité est définie comme étant la quantité d'antibiotique par ml produisant une zone d'inhibition de 25 mm sur une plaque de 5 ml telle que décrite au chapitre I ci-dessus. Ainsi, dans ce dosage, une concentration de 12,5 icrogrammes/ml de céphaloridine est considérée conme équivalente à une unité de 890Â1 par ml. Etant donné que la pente de la droite pour la céphaloridine est de 4,0, on fait les calculs de la puissance d'un échantillon avec une pente de 4,0. III - Réaction avec l'hydroxylamine L'antibiotique 890A9 réagit avec l'hydroxylamine et produit une substance dont l'absorption est grandement diminuée à 300 nm. Ceci fournit la base d'un dosage quantitatif de l'an- tibotique 890A9. On amène la solution à doser à 0,05 M dans le phosphate de potassium, pH 7,4 en ajoutant 1/20# de volume d'une solution contenant K2HPO4 0,8 M et KH2PO4 0,2 M. On ajoute alors 1/100# de volume de chlorhydrate d'hydroxylamine m M, et on mesure l'ab- sorption à 308 nm à des intervalles d'une demi-minute à 2 minutes. La réaction s'effectue à la température ambiante. On suppose une cinétique du premier ordre et on estime la demi-vie à tartir de la diminution d'absorption pendant les 10 premières minutes. Â partir de cette demi-vie, on estime la durée au-delà de laquelle on ne devrait plus observer de diminution d'absorption et on continue les observations au-delà de cette durée. Si l'on n'observe plus de diminution au-delà de cette durée, on prend la diminution totale d'absorption (en corrigeant l'effet de dilution et l'absorption de l'hydroxylamine) comme étant "llabsorp tion extinguible à l'hydroxylamine à 308 nm (HAEA308)". . Si lton observe une diminution d'absorption au-delà de cette durée, on calcule le taux de diminution de l'absorption du fond, et on corrige la diminution observée à ce moment pour tenir compte de la diminution du fond, en supposant que celle-ci est linéaire avec le temps.On enregistre alors la valeur corrigée comme étant l'HAEA308. le nombre d'unités d'HAEA308 est égal à l'HAEA308 mul- tipliée par le volume en ml. les exemples qui suivent illustrent les procédés par lesquels on peut obtenir les produits de cette invention, Cepen- dant, ces exemples ne sont que des illustrations et tout homme de l'art normalement compétant doit comprendre que cette invention comprend les produits fonctionnellement équivalents et les procédés permettant de les préparer.Ainsi, toute modification des procédés ici décrits qui aboutit à la formation des procédés de cette invention doit être analysée comme constituant un procédé analogue. les processus décrits sont susceptibles de larges variations et toute modification ou écart ou extension secondaire est considéré comme relevant de la technique de l'homme de l'art et comme étant du domaine de cette invention - EXEMPLE 1 Procédé d'isolement d'organismes produitsaut la N-acétyl diydro-890A9 amido-hydrolase On prépare une suspension à 1% (p/v) de sol à pelouse fertile en mettant en suspension 1 g de sol à pelouse dans 100 ml d'une solution de sel physiologique tamponnée au phosphate, ayant la composition suivante Solution de sel physiologique tamponné au phosphate NaCl 8,8 g Tampon phosphaté 1M pH 7,5* 10 ml H20 distillée 1 000 ml *Tampon phosphaté 1L, pH 7.5 On mélange 16 ml de KH2PO4 1M avec 84 ml de D2HPO4 1 M. On ajuste le pH du tampon phosphaté à 7,5 en ajoutant de faibles quantités soit de KH2PO4 1 M soit de K2HPO4 1M. On emploie des fractions de cette suspension de sol de base pour préparer des dilutions au 100, au 1000 et au 10000. On ajoute des fractions d'1 ml de la suspension-mère ou des fractions d'1 ml des dilutions au 100, au 1000 et au 10000 à des fractions de 2 ml de solutions stériles de gélose à 1,0% à 4800. On verse rapidement les mélanges sur la surface de boites de Petri stériles de 85 min de diamètre contenant 20 ml de milieu A. Le milieu A a la composition suivante s Milieu A KH2PO4 3,0 g K2HPO4 7,0 g MgSO4 0,1 g Eau distillée 1- 000 ml Solution de N-acétyl éthanolamine * 8,5 ml *Solution de N-acétyléthanolamine On dilue la N-acétyléthanolamine 10 fois dans l'eau et on stérilise au moyen d'une membrane. On ajoute cette solution après passage à l'autoclave. Pour les milieux solides : ajouter 20 g de géloses On fait incuber les boites de Pétri pendant 18 jours à 28 C. On prélève des colonies bien isolées et on ensemence en stries le milieu B. Le milieu B a la composition suivante t Milieu B Bouillie de tomate 40 g Farine d'avoine moulue 15 g Eau distillée 1 000 ml pH ajusté à 6 avec NaOH Pour les milieux solides :ajouter 20 g de gélose On choisit et on cultive des clones isolés pendant 2 jours à 280C sur des surfaces en biseau de milieu 3. On utilise une fraction de la croissance des milieux en biseau pour inoculer un erlenmeyer de 250 mi contenant 50 ml de milieu Â ; un erlenmeyer de 250 ml contenant 50 ml du milieu B enrichi (enrichi après passage à l'autoclave avec 0,4 ml d'une solution stérilisée par une membrane de N-acétyléthanolamine di fluée 10 fois avec de l'eau) ; et un erlenmeyer de 250 mi contenant 50 mi de milieu Ce Le milieu C a la composition suivante : Milieu C Dextrose 20 g Pharmamédia 8 g Liqueur de maSs macérée (base humide) 5 g Eau distillée 1 000 mi pH ajusté à 7 avec NaOE ou HCl Solution de N-acétyl éthanolamine* 8,5 ml *Solution de N-acétyléthanolamine On dilue la N-acétyléthanolamine 10 fois dans H20 et on stérilise avec une-membrane. On ajoute cette solution après passage à l'autoclave. On agite les ballons à 280C sur un agitateur à 220 tpm (50,8 mm d'amplitude de secousse) pendant 4 jours. On centrifuge une fraction de 30 mi de chaque ballon pendant 15 min à 8000 tpm. On retire la fraction surnageante, en e laissant seulement assez pour former une suspension épaisse de cellules et de solides du milieu. On soumet la moitié de la suspension à une rupture intra- sonore au moyen d'un émetteur d'ultra-sons modèle LS-75 de Branson Instrument avec une sonde de 12,7 mm. La puissance d'entrée est réglée sur la position N 4, et on utilise 4 cycles successifs de 15 secondes d'irradiation, tout en refroidissant la suspension dans l'eau glacée pendant la rupture et entre les cycles. Pour déterminer la présence d'une activité de la N-acétyldihydro 890A9-amidohydrolase, on mélange une fraction de 10 micro-litres du produit soumis aux ultra-sons avec 25 microlitres d'une solution de dihydro 890A9 contenant 500 microgrammes par ml.On exécute la meme opération avec des témoins contenant lan- tibiotique et le tampon seul ; et des cellules soumises aux ultra-sons et du tampon sans antibiotique. Après incubation pendant la nuit à 28 C, on dépose des quantités de 10 micro-litres sur un papier Schleicher et Schuell N 2043-B. Avec un tampon de phosphate de potassium 0,03 M, pH 7,1, on applique un gradient de voltage de 50 vblts/cm pendant 30 min. On place lepa- pier sur une plaque de Staphylococcus aureus ATCC 6538P et on fait incuber à 37 C pendant 18 h. Dn prépare les plaques de dosage comme suit : on dilue avec du bouillon nutritif plus 0,2% d'extrait de levure le résultat de la croissance pendant la nuit de l'organisme du dosage, Staphyloccocus aureus ATCC 6538P pour donner une suspension ayant un taux de transmission de 60% à une longueur d'onde de 660 nm. On ajoute cette suspension à une glose nutritive Difco à laquelle on a ajouté 2,0 g/i d'extrait de levure Difco entre 470C et 48 C, pour obtenir une composition contenant 33,2 mi de la suspension par litre de gélose. On verse 40 mk de cette suspension dans des boutes de Pétri de 22,5 x 22,5 cm, et on-refroidit ces plaques et on les maintient à 40C jusqu'à utilisation (5 jours maximum). La tache de dihydro 890A9 bioactif inchangé migre de 8 cm vers le pôle positif. On détecte une nouvelle tache bioacti- ve due au désacétyl, dihydro 890A9 qui migre de 4 cm vers le pôle positif. Les nélanges d'incubation témoins d'antibiotique plus le tampon, et de cellules soumises aux ultra-sons, ne produisent pas de produit bioactif migrant de 4 cm vers le p8le positif. - EXEMPLE 2 On dégèle lentement ceux flacons glacis contenant chacun 1 mi de bouillon de culture de MA-4638, et on transfère le contenu aseptiquement dans deux erlenmeyer de 250 ml munis de trois aéflecteurs, contenant chacun 50 mi de milieu d'ensemencement C. On bouche les erlenmeyers avec du coton0 milieu C Levure autolysée (Ardamine*) 10,0 g Glucose 10,0 g MgSO4.7H2O 0,05 g Tampon phosphaté ** 2,0 mi Eau distillée 1 000 ml pH ajusté à 6,5 avec NaOH avant passage à l'autoclave *Ardamine : Yeast Products, Inc. **Solution de tampon phosphaté KH2PO4 91,0 g Na2HPO4 95,0 g Eau distillée 1 000 ml On agite les ballons de semence pendant 20 à 24 h à 28 C # 1 C sur un agitateur giratoire à 210 tpm, avec 50,8 mm d' amplitude de secousse. On réunit le contenu des ballons et on l'utilise pour inoculer des ballons de production0 On inocule 10 ballons agités de 2 1 munis d'un déflecteur, contenant chacun 300 ml de milieu de production D, avec 10 ml par ballon du bouillon provenant du ballon de semence. On recouvre les ballons de production de couvercles de gaze. Milieu D Dextrine (amidon modifié CPC) 40,0 g Distillats solubles 7,0 g Extrait de levure 5,0 g CoC12.6E20 50,0 mg Eau distillée 1 000 ml pi ajusté à 7,3 avec NaOH avant passage à l'autoclave Après l'inoculation, on fait incuber les ballons de production à 24 C + 100 tout en agitant sur un agitateur giratoire à 210 tpm, avec 50,8 mm d'amplitude de secousse, pendant 3 jours.On récupère le contenu des ballons, on en rassemble le contenu et on dose l'activité du bouillon0 Age de la récolte (heures) 72 pH 6,5 dosage du 890 (unités/ml) 30,45 On centrifuge 2 litres du bouillon total des ballons de production KR ci-dessus dans des fractions de 200 ml à 9000 tpm pour donner 1,7 l de surnageant à pi 6,8 On introduit le surnageant dans une colonne de Dowex1 x 2 (Cl-) de 0,297-0,149 mm d'ouverture de maille, dimensions du lit 3,9 cm x 25 cm, à un rythme de 5-10 ml/min. On lave la colonne avec 50 ml d'eau désionisée, suivis par 2 1 de NaCI 0,15 M + tampon Tris-HC pH 7,0 + 25 micromoles d'EDTA neutre dans le méthanol aqueux à 50% (v/v). On élue alors le produit avec NaCl à 30 g/l + tampon Tris-HCl 0,02 M, pH 7,0 + 25 micromoles d'EDTA dans le méthanol aqueux à 8050/ (v/v) à un rythme de 5 ml/min. On recueille des fractions de 10 mlO La bioactivité/apparaît dans les fractions 5 à 180, avec un maximum pour les fractions 25 à 70. On mélange les fractions 12 à 105 et on concentre à 15 ml sous une pression réduite. On ajuste le pH à 6,5 avec HCl 1 M, et on introduit le concentré dans une colonne (3,4 x 55 cm) de XAD-2 préalablement lavé avec 2,5 l d'acétone aqueuse à 60% (v/v), 2,5 1 d'eau désionisée, et 2,5 1 de NaCl à 5% dans l'eau désionisée.On rince la colonne avec des fractions de 3 x 5 ml d'eau désionisée et on l'élue avec de liteau désionisée à 10 ml/min. On recueille des fractions de 10 ml. La bioactivité apparait dans les fractions 32 à 270 avec un maximum pour les fractions 42 à 62. L'élution totale de bioactivité est de 2ió de l'activité du bouillon original. On rassemble les fractions 40 à 240, et on ajoute les fractions 12 à 24 réunies de la colonne de XAD-2 de l'Exemple 1 que l'on a gardé. On concentre l'ensemble des fractions réunies sous une pression réduite à 50 ml, contenant 120 unités HAEA304. On dilue le concentré avec 200 ml de méthanol, et on l'introduit à 2 ml/min dans une colonne (2,15 x 40 cm) de Dowex1x4 d'ouverture de maille supérieure à 0,031 min, préalablement lavé avec 2 1 de NaCl à 30 g/l dans le méthanol aqueux à 80%, et 1 litre de méthanol aqueux à 80co Après avoir introduit l'échantillon, on lave la colonne avec 100 ml de méthanol aqueux à 80% (v/v) et on l'élue avec 2,5 1 de NaCl 0,22 M + NH4Cl 0,01 M + KH3 0,0002 M dans le méthanol aqueux à 80% (v/v) suivi par 3 1 de NaCl 0,31 M + NH4Cl 0,01 M + NH3 0,0002 M dans le méthanol aqueux à 80% (v/v). Le débit est de 2 ml par min, et on recueille des fractions de 10 ml chacune. On sépare l'antibiotioue 890A9 sur la colonne de Dowex1x4 éluée dans les fractions 280 à 350, comme on le mesure par dosage sur ATCC -8461. On rassemble les fractions 307 à 338 de Dowex-1x4 et on les concentre à 7,6 ml sous une pression réduite, et on ajoute 30 jil de NaOE 1 M pour amener le pli dans l'intervalle allant de 7s0 à 7,5. On dilue le concentré avec 7,6 ml de méthanol, et on centrifuge la solution pour retirer le précipité salé. On concentre le surnageant sous une pression réduite à 4 mi, et on ajoute à ce concentré 6 mi de méthanol.On laisse le précipité salé reposer et on introduit ce surnageant avec une pipette dans une colonne (2,2 x 70 cm) de -Sephadex G-10, préalablement lavée avec 2 ml de NH3 1M dans le méthanol aqueux à 80 suivi par 1 litre de NH3 0,0001 M dans le méthanol à 80%. Après introduction de l'échantillon, on rince la colonne 3 fois avec 1 ml de Nh3 0,0001 M dans le méthanol à 80%, et on la lave avec 400 mi du même solvant à un rythme d'1 ml/min. On élue alors la colonne avec MI3 0,00005 M dans le méthanol aqueux à 50% à un rythme d' 1 ml/min et on recueille des fractions de 10 ml, le numérotage partant de la première introduction de l'éluat à 50% de méthanol. Un pic d'absorption à 305 nm apparaît dans les fractions 9 à 22 avec un maximum à la fraction 12. On réunit les fractions 11 à 17, contenant 17 unités A305, dont 9,1 sont extinguibles à 1 'hydroxylamine0 On concentre les fractions réunies à 2 mi sous une pression réduite ; on les dilue à 10 mi avec D20 à 99,7%, puis on les concentre à 1,5 ml sous une pression réduite, et on gèle et on lyophilise. On analyse par spectroscopie RMN la poudre blanche obtenue, constituée par le produit 890A9 et plus de 5 mg de chlorure de sodium. - EXEMPLE 3 On absorbe 10 mg de 890A9 préparés selon l'Exemple 2 dans 5 ml d'eai. On utilise comme réducteur 10 mg d'oxyde de palladium dans 5 ml d'eau préalablement traitée avec de l'hydrogène sous une pression d'une atmosphère. On place dans un micro-appareil d'hydrogénation le 890A9 dans l'eau avec l'oxyde de palladium traité dans l'eau pendant 30 min sous- une pression d'hydrogène d'une atmosphère. Au bout de 30 min, on retire l'échantillon et on sépare l'oxyde de palladium par filtration. On lyophilise le filtrat pour donner le dihydro 890A9. - EXEMPLE 4 Désacylatien du dihydro 890A9 On utilise une fraction de la croissance sur un milieu incliné de Protaminobacter ruber B-3528 pour inoculer un erlenmeyer de 250 mi contenant 50 mi de milieu C. Le milieu C a la composition suivante : Milieu C Dextrose 20 g Pharmamédia 8 g Liqueur de mais macérée (base humide) 5 g Eau distillée 1000 ml pH ajusté à 7 avec NaOH ou HCl Solution de N-acétyléthanol amine* 8,5 mi Solution de N-acétyléthanolamine On dilue la N-acétyléthanolamine 10 fois dans F O et on stérilise avec une membrane. (On ajoute cette solution après passage à l'autoclave. On agite le ballon à 260C sur un agitateur à 220 tpm (50,8 mm d'amplitude de secousse) pendant 4 jours. On centrifuge une fraction de 25 ml du ballon pendant 15 min à 8000 tpm. On retire le surnageant et on enlève en raclant les cellules de surface des solides des milieux pour les introduire dans 0,5 ml de tampon au phosphate de potassium 0,05 M, pH 7,4. On soumet la suspension obtenue à une rupture au moyen d'ultra-sons avec un émetteur modèle LS-75 de Branson Instrument avec une sonde de 12,7 mm en position 4 pendant quatre'intervalles de 15 secondes, tout en refroidissant la suspension dans l'eau glacée pendant et après la rupture. On mélange une fraction de 10 microlitres du produit soumis aux ultra-sons avec 25 microlitres d'unè solution de dihydro 890A9 contenant 500 g par ml.On effectue la m8me opération avec des témoins contenant l'antibiotique et le tampon seuls, et des cellules soumises aux ultra-sons et le tampon sans antibiotique. Après incubation pendant la nuit à 280C, on dépose des quantités de 10 l sur un papier Schleicher & Schuell N 2043-B. Avec un tampon au phosphate de potassium 0,03 X, pH 7,1, on applique un gradient de voltage de 50 volts/cm pendant 30 min. On place le papier sur une plaque de dosage à Staphylococcus aureus ATCC 6538P et on fait incuber à 370C pendant 18 h. On prépare les plaques de dosage de la manière suivante: On dilùe avec du bouillon nutritif, plus 0,2% d'extrait de levure la croissance pendant la nuit de l'organisme du dosage, Staphylo- coccus aureus ATCC 6538P, dans un bouillon nutritif plus 0.2% d'extrait de levure pour donner une suspension ayant un taux de transmission de 6c' à une longueur d'onde de 660 nmO On ajoute cette suspension à une gélose nutritive Difco à laquelle on ajoute de l'extrait de levure Difco à 2,0 g/l entre 47 et 480C pour donner une composition contenant 33,2 ml de la suspension par litre de gélose.On verse 40 ml de cette suspension dans des bout tes de Pétri de 22,5 x 22,5 cm, puis on refroidit ces plaques et on les maintient à 4 C jusqu'à utilisation (5 jours maximum). Outre la tache de dihydro 890A9 bioactif inchangé migrant 8 cm vers le pôle positif, on trouve une nouvelle tache bioactive due au désacétyl, dihydro 890A9 migrant de 4 cm vers le pôle positif. Les mélanges d'incubation témoins d'antibiotique + tampon, et de cellules soumises aux ultra-sons + tampon ne produisent pas de produit bioactif migrant de 4 cm vers le pôle positif. - EXEMPLE 5 Préparation de l'antibiotique 890A1 On ouvre aseptiquement un tube de culture lyophilisée de Streptomyces fiavogriseus MA-4600a et on met le contenu en suspension dans un tube contenant 1,5 ml de milieu A stérile ayant la composition suivante Milieu A Extrait de levure 1090 g Glucose 10,0 g MgSO4.7H2O 0,05 g Tampon phosphaté* 2 mi Eau distillée 1000 mi *Solution de tampon phosphaté KH2PO4 91,0 g Na2HPO4 95.0 g Eau distillée 1000 mi On utilise cette suspension pour inoculer un erlenmeyer de semence de 250 mi muni d'un triple déflecteur et contenant 54 mi de milieu de semence B ayant la composition suivante :: Milieu B Levure autolysée (Ardamine*) 10,0 g Glucose 10,0 g MgSO4.7H2O 0,05 g Tampon phosphaté** 2,0 ml Eau distillée 1000 ml pH ajusté à 6,5 avec NaOH *Ardamine : Yeast Products, IncO **Solution de tampon phosphaté KH2PO4 91,0 g Na2HPO4 95,0 g Eau distillée 1000 mi On bouche le ballon de semence avec du coton et on l'agite pendant 30 h à 280C + 100 sur un agitateur giratoire à 220 tpm (50,8 mm d'amplitude de secousse). On' inocule 50 erlenmeyers de production de 250 ml non munis de déflecteurs, contenant chacun 40 mi de milieu de production C avec 1 ml par ballon du bouillon provenant du ballon de semence0 On bouche les ballons de production avec du coton0 Milieu C Bouillie de tomate 20,0 g Levure primaire 10,0 g Dextrine (Amrdex) 20,0 g CoCl2.6H2O 5,0 mg Eau distillée H2O 1000 ml pH ajusté à 7,2-7,4 avec NaOH Après inoculation, on fait incuber les ballons de production à 280C + 100 tout en agitant sur un agitateur giratoire à 220 tpm (50,8 mmd'amplitude de scousse) pendant 3 jours.On dose l'activité des ballons contre des plaques de dosage standard à Vibrio nercolans ATCC 8461 en utilisant des disques de dosage de 12,7 mm plongés dans des échantillons de bouillon de fermentation centrifugés. On dilue les échantillons avec un tampon phosphaté 0,05 M, pH 7,4. Les résultats se trouvent ci-dessous: Age de la récolte (heures) 72 pH 6,4 Vibrio Percolans (dilution 1/100) dosage 23 mm Dosage de 890, unités/ml 103 On centrifuge l'ensemble du bouillon en fraction de 200 ml dans des bouteilles en polycarbonate à 9000 tpn pendant 15 min pour donner 1600 mi de surnageants combinés avec une puissance de 104 unités par mi. A ceci on ajoute 0,5 ml d'EDTA neutre. On adsorbe le bouillon centrifugé sur une colonne Dowex-1x2 (Cl-), de 0,297-0,149 mm d'ouverture de maille, dimensions du lit 3,8 x 22 cm, à un rythme de 6 à 20 ml/min. On rince la colonne avec 100 ml d'eau désionisée et on élue avec 1 litre d'eau désionisée contenant 50 g de chlorure de sodium, un tampon Tris HOl 0,02 M, pH 7,0, et 25 mol d'EDTA neutre à un rythme de 6 ml/minO On recueille des fractions de 10 mi. L'antibiotique 890A1 apDaratt dans les fractions 13 à 81, avec un maximum pour les fractions 25 à 33, en comptant à partir de la première introduction de l'éluat salé. On combine les fractions 24 à 44, ayant les plus hauts taux de biopuissance/ A200 aux fins de traitement ultérieur. Les fractions combinées ont un total de 29 000 unités, ou 17% de la bioactivité introduite. On concentre l'éluat Dowet à 10 ml, on ajuste le pH à 6,5 avec de l'acide chlorhydrique dilué, et on introduit le concentré sur une colonne de XA1)-2, dimensions du lit 3,3 x 36 cm, préalablement lavée avec 2 l d'acétone aqueuse à 60%, 2 1 d'eau désionisée, et 2 l de chlorure de sodium à 5% (p/v) dans l'eau désionisée. On élue l'échantillon avec de l'eau désionisée à un rythme de 6 ml/min. On recueille des fractions-de 40 à 260 ml. L'activité antibiotique apparat dans les fractions 6 à 14, s'étendant de 220 à 2560 mi de volume élué. Le pic se situe aux fractions 9 et 10, s'étendant de 370 à 590 mi de volume élué. Les fractions 9 à 12, s'étendant de 370 à 1060 ml de volume élué, ont les plus hauts taux de Haea300/A220, et on les combine aux fins de traitement ultérieur. Ces fractions ont 36 600 unités, égales à 126% de l'activité apparente introduite. On concentre les fractions 9 à 12 réunies à 100 ml et on introduit le concentre sur une colonne de Dowex-1x4 (Cl-), d'ouverture de maille supérieure à 0,031 mm, dimensions du lit 2,2 x 41 cm, à un rythme de 2 ml/min. On rince la colonne avec 50 mi d'eau désionisée, et on élue avec 3 1 de NaCl 0,07 M + 4Ol 1 0,005 M + NE3 0,0001 E dans l'eau désionisée, à un rythme de 2 ml/min. On recueille des fractions de 10,8 mi, en partant de la première introductionde l'éluant. Le principal pic d'antibiotique 890A1 apparaît dans les fractions 181 à 217, avec un maximum pour la fraction 198. On réunit les fractions 186 à 210, contenant au total 114 unités d'absorption à 300 nmO On concentre à 4,0 mi les fractions réunies, et on ajuste le pH à 7,3 par addition de 16 l de NaOH 1 M. On introduit le concentré dans une colonne de Bio-Gel P-2, de 0,074- 0,031 mm d'ouverture de maille, dimensions du lit 2,15 x 70 cm, et on le lave avec 3 x 1 ml d'eau de lavage d'eau désionisée et on élue avec de l'eau désionisée à 0,96 ml/min. On recueille des fractions de 3,85 ml. Le principal pic de l'antibiotique 890A1 apparat dans les fractions 24 à 44, avec un maximum pour les fractions 33 et 34. On combineles fractions 27 à 38, ayant les taux A300/A245 les plus élevés, aux fins de lyophilisation. Ces fractions com- binées ont un total de 72 unités A300. Pour effectuer la lyophilisation, on concentre les fractions réunies à 3,0 ml et on ajuste le pH du concentré à 7,5 en ajoutant 10 l de NaOH 0,1 M. On divise l'échantillon en deux fractions de 1s50 mi chacune, puis on gèle rapidement les fractions de façon séparée et on lyophilise à partir de flacons en verre de 14 mi à bouchon vissé. Chaque échantillon contient 1,73 mg de 890A1, correspondant à 35n8 unités A300. Une culture de Streptomyces flavogriseus désignés MA-4600a dans la collection de culture de giCK & Co., Inc. a été placée en dépôt permanent sans restriction d'accès dans la collection de culture des Northern Regional Laboratories, Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, Ministère américain de l'Agriculture, Peoria, Illinois, et est accessible au public sous le numéro de publication ERRL 8140. REVENDICATIONS 1) Le composé désacétyl, dihydro 890A9 de structure et ses sels utilisables en pharmacie. 2) Un procédé dc production du composé désacétyl, dilue. dro 890A9 de structure qui Implique de mettre en contact intime le composé dihydro 890A9 de structure avec une enzyme capable d'hydrolyser le groupe N-acétyle. 3) le procédé selon la revendication 2 où ladite enzyme est une amidohydrolase. 4) Le procédé selon la revendication 3 où l'amidohy. drolase est une N-acéthyléthanolamine-amidohydrolase. 5) Le procédés selon la revendication 3 où l'amidohydro- lase est une N-acétyl-dihydro-890A9-amidohydrolase. 6) Un procédé selon la revendication 5) caractérisé en ce qu'on utilise un N-acétyl-dihydro-890A9-amidohydrolase conte nu dans des micro-organismes sélectionnés par un procédé impliquant de choisir les micro-organismes capables d'utiliser pour leur croissance la N-acétyl-éthanolamine puis de chercher dans ces micro-organismes la présence de la N-acétyl-dihydro890A9-amidohydrolase. 7)Le procédé selon la revendication 2) où le procédé s'effectue avec une amido-hydrolase produite par une souche productrice d'amidohydrolase du micro-organisme Protaminobacter ruber. 8) le procédé de production du désacétyl, dihydro 890A9 qui implique de mettre en contact intime le dihydro 890A9 avec l'enzyme N-acétyl-dihydro-890A9-amidohydrolase produite par une souche productrice d'amidohydrolase du micro-organisme Protaminobacter ruber. 9) Une composition comprenant une quantité antibactérienne efficace du composé désacétyl, dihydro 890A9 selon la revendication 1) et un support non-toxique, utilisable en pharmacle.