Brevet FR2393009A1 — publié le 19781229

La présente invention concerne de nouveaux dérivés du type oestradiol, répondant à la formule générale dans laquelle R représente un reste tyrosine marqué à l'iode radioactif, un reste ester d'alkyle en C1-C6 de tyrosine marqué à l'iode radioactif, un reste tyrosine ou un reste ester d'alkyle en C1-C6 de tyrosine, ainsi qu'un procédé de détermination radio-immunologique (désigné ci-après par l'expression RIA) pour la détermination de l'oestradiol, en utilisant le composé de formule (I) dans laquelle Rreprésente un reste tyrosine marqué à l'iode radioactif comme traceur En 1969, G. -E. Abraham a pour la première fois mesuré l'oestradiol dans un sérum par un procédé RIA en utilisant un oestradiol marqué par du tritium comme traceur (J. Clin. Endocrinol. Metab., volume 29, page 866 (1969)-). On a depuis poursuivi les recherches pour mettre au point un procédé RIA utilisant un traceur marqué à l'iode radioactif qui soit plus pratique à utiliser qu'un traceur marqué au tritium. En ce qui concerne les antigènes pour produire des-anticorps dans les animaux, on a utilisé différents types de conjugués d'oestradiol de sérum-albumine bo vine (dÇsigné ci-après par l'expression BSA) Comme exemples de ceux-ci, on citera les conjugués d'oestradiol-17 > - BSA (B. G. England et Col., J. Clin. Endocrinol Metal., volume 38, pages 42-50 (1974)) et d'oestradiol-6-(O-carboxyméthyl)oxime-BSA (désigné ci-après par l'expression E2-6-CMO-BSA) (E H. D. Cameron et col., Journal of Steroid Biochemistry, volume 5, pages 749-756(1974)).Parmi ces anti genets, on utilise de préférence le E2-6-CMO-BSA car les groupes spécifiques restent libres (A. E Kellie et col.., Steroid Immunoassay, pages 35-60, édité par E. H. D. Cameron et col., Alpha Omega Publishing Ltd., Cardiff, Wales, U.K. (1975)). On a par ailleurs décrit des ligands de marquage radioactif pouvant être utilisés comme traceurs, tels que le l7-O-hêmisuccinyl oestradiol-histamine marquée à l'iode radioactif, le 3-0-hémisuccinyloestradiol-histamine marquée à l'iode radioactif ou I'oestradiol-6-(0-car- boxyméthyl)oxime-histamine marquée à l'iode radioactif (England et col., et Cameron et col., mentionné ci-dessus). Toutefois, lors de la préparation de traceurs de type histamine marquée à l'iode radioactif, on n'atteint pas un degré suffisant de marquage et la radioactivité du traceur est trop faible pour qu'on puisse utiliser celui-ci dans une détermination radio-immunologique.Lorsqu'on prépare un conjugué d'oestradiol d'histamine pour le marquage, des atomes d'iode radioactif tendent à se substituer sur le noyau A d'oestradiol, ce qui a une influence indésirable sur la spécificité du traceur. On a proposé comme traceur un conjuguéd'oestradiol de sérum-albumine humaine marqué à l'iode radioactif, mais celui-ci ne peut pas etre utilisé à cause de sa faible sensibilité (R. Edwards et col., International Atomic Energy Agency (IAEA-SM-177/25), pages 31-40). Dans ces conditions, oa a jusqu'ici effectué les déterminations radio-immunologiques d'oestradiol en n'utilisant que des traceurs marqués au tritium. La présente invention concerne donc un nouveau traceur. Etant donné qu'on n'a pas décrit jusqu'ici les dérivés du type ester de méthyle de tyrosine (désigné ci-après par TME) de l'oestradiol, on a préparé l'ester de méthyle d'oestradiol-6-(0-carboxyméthyl)oxime- tyrosine (désigné ci-après par E2-6-CMO-TME) et on a étudié les propriétés de son dérivé marqué à l'iode radioactif.On a constaté que l'ester de méthyle d 'oestradiol-6-(O-carboxyméthyl)oxime-tyrosine marquée a. l'iode radioactif (désigné ci-après par E2-6-CMO-TE- i) firme des liaisons non spécifiques avec les extraits de sérum autres que l'anticorps de l'oestradiol, La demanderesse a également découvert qu'il se forme peu de liaisons entre l'oestradiol-6-(O-carboxyméthyl)oxime-tyrosine marquée à l'iode radioactif (désigné ci-après par E2-6-CMO-T-125I) et l'extrait de sérum et que le ligand de marquage radioactif reagit de façon spécifique avec l'anticorps produit par l'E2-6-CMO-BSi. On comprendra mieux l'invention à l'aide de la description suivante. On extrait des échantillons de sérum humain (0,1 1 ml et 0,2 ml) par de l'éther de diéthyle. Après élimination de l'éther par évaporation, on dissout le résidu dans 0,5 ml de tampon phosphate, On ajoute environ 0,02 Ci de E2-6-CMO-TME-125I à la solution mentionnée ci-dessus et à 0,5 ml de tampon phosphate comme référence. Après incubation à température ambiante pendant 60-90 min, on ajoute de la gamma-globuline sérique de chèvre antilapin (le second anticorps) au mélange. On laisse reposer le mélange obtenu à 4 C pendant une nuit et, après séparation, on détermine la radioactivité du précipité (comptage A).On introduit 0,02 Ci de E2-6-CMO-T-125I dans un tube à essai et environ 0,02 Ci de E2-6-CMO-TME-l25I dans un autre tube à essai et on détermine la radioactivité (comptage B). On calcule le ;aux de fization non spécifique à partir de l'équation suivante. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau ci-dessous. Taux de fixation non spécifique (X) = comptage A x 100 comptage B x Taux de fixation non spécifique (%) 125 125 E2-C-CM0-TE- I E2-6-CMO-T- Tampon phosphate (référence) 4,43 1,90 Extrait de 0,1 ml de sérum 18,73 1,37 Extrait de 0,2 ml de sérum 41,90 1,57 Comme cela ressort des résultats ci-dessus, l'E2-6-CMO TME-125I formé précipite de façon importante avec certains constituants du sérum, tandis quela fixation non spécifique de E2-6-CMO-T-125I avec les constituants du sérum est du même ordre que celle de la référence, ce qui est négligeable. Ces résultats montrent que le nouveau traceur marqué à l'iode radioactif, présentant des radicaux tyrosine libres, est particulièrement approprié pour la détermination radio-immunologique de l'oestradiol dans le sérum. Il y a plusieurs manières de synthétiser le nouveau traceur, illustrées comme suit flans ce schéma réactionnel, T représente un reste tyrosine et I représente un atome d'iode radioactif, les autres abréviations ayant la signification mentionnée ci-dessus. On trouvera ci-après la description da quelques modes de préparation du nouveau traceur. On fait réagir le produit de départ, connu par les références mentionnées ci-dessus, avec un ester d'alkyle inférieur de tyrosine, selon un mode opératoire général consistant à former une liaison acide-amide, tel que le procédé à l'anhydride mixte, décrit par exemple dans J, Bill. Chem., volume 232, page 713 (1957), ibid, volume 234, page 1090 tel959), ou le procédé au carbodiimide, décrit par exemple dans l'ouvrage Steroid Immunoassay, page 33, mentionné ci-dessus, ou par le procédé à I'ester activé. On hydrolyse ensuite le dérivé d'ester d'alkyle de tyrosine et on marque l'E2-6-CMO-T obtenu à l'iode radioactif, de manière connue, par exemple par le procédé à la chloramine T (Nature, volume 194, page 494 (1962)), pour obtenir le traceur recherché.On peut également marquer 1'E2-6-CMO--TME par de l'iode radioactif et hydrolyser ensuite le produit marqué à l'iode radioactif pour obtenir l'E2-6-CMO-T- I, En outre, on peut également préparer le nouveau traceur en conjuguant du E2-CMO avec de la tyrosine marquée à l'iode radioactif, comme représenté dans le schéma ci-dessus. En ce qui concerne l'iode radioactif, on peut utiliser 125I et 1311, 125I étant pratique à cause de sa période. On peut utiliser d'autres substances, représentées par la formule générale (I), telles que R2-6-CMO-TME, le composé marqué à l'iode radioactif de celleeci et E2-6-CMO-T, comme produit intermédiaire pour préparer le traceur désiré, et comme résidu ester décrit ci-dessus, on peut utiliser d'autres groupes alkyle inférieur, tels que le groupe éthyle, bien qu'on utilise le plus généralement le groupe méthyle. Pour la détermination d'oestradiol dans le sérum, on peut faire appel à des procédés connus de détermination radio-immunologique, tels que des procédés d'absorption, en utilisant du charbon de bois revetu de dextravx, de-la terre à foulon (Florisil), des résines échangeuses dions et analogues, des procédés de précipitation non spécifique (ou de précipitation desyglobulines), en utilisant du sulfate d'ammonium saturé, du polyethylène- glycol, de l'éthanol et analogues, des procédés en phase solide, des procédés à l'anticorps double, etc., comme décrit par exemple dans Anal. Lett. 5 757 (1972), ibid 5 767 (1972), Journal of Analytical Endocrinology et Netabolism 35 219 (1972), G. E. Abraham : "Radioimmunqassay of Plasma Steroid Hormones" dans Modern Methods of Steroid analysais chapitre 21 Academic Press, New York et Londres (1973), The Japanese Journal of Nuclear Medicine 12 123 (1975), Clinica Chimica Acta 66, 319-330 (1976) Clinical st Crinology (Tokyo) 24 339 (1976), Steroid Immunoassay E.H.D. Cameron, édité par Alpha Omega Publishing Ltd., Cardiff. Wales U.K. (1975). On dissout par exemple un extrait éthéré de sérum, ou le produit dégraissé correspondant, dans un tampon phosphate et on effectue des essais sur celui-ci. On prépare en outre des solutions de référence en dissolvant de l'oestradiol dans un tampon phosphate. On ajoute une quantité appropriée de traceur et d'antisérum d'oestradiol dans chacune des solutions échantillons et des solutions de référence. On fait ensuite incuber les mélanges à température ambiante, pendant 60-90 min, ou à 35-40 C pendant 15 min. On ajoute ensuite le second anticorps aux mélanges et on laisse reposer pendant une nuit à 40C. On centrifuge ensuite (2000 G pendant l5 min) pour éliminer la phase surnageante.- On détermine ensuite la radioactivité des précipités de chaque solution échantillon ou de référence. On trace la courbe de référence et on peut déterminer la quantité d'oestradiol dans les échantillons à partir de cette courbe. En ce qui concerne l'antisérum, il est préférable d'utiliser l'anti-E2-6-CMO-BSA, celui-ci pouvant être produit dans des animaux d'espèces différentes, tels que les lapins, les cobayes, les chèvres ou les moutons, et la méthode classique de production d'anticorps étant applicable. Cette méthode est par exemple décrite dans l'ouvrage "Steroids", volume 23, page 49 (1974) ou dans l'ouvrage "Steroid Immuno- assay", page 87 (1975) ou dans d'autres ouvrages mentionnés ci-dessus. On choisit le deuxième anticorps, qu'on peut dans certains cas trouver dans le commerce, selon la nature du premier anticorps. Les exemples non limitatifs suivants illustrent les modes opératoires de préparation du nouveau traceur et de l'anticorps, ainsi que de détermination de l'oestradiol dans le sérum. EXEMPLE 1 On dissout 36 vg de E2-CMO dans 1,7 ml de dioxanne. On ajoute 50 /ul de tri-n-butylamine à cette solution. Après addition de 13 pl de chlorocarbonate d'isobutyle, on agite le mélange pendant 15 min à moins de lO0C. Au mélange obtenu, on ajoute 3 ml d'une solution d'ester méthyle de l-tyroslr.e dans du dioxanne (6y7 mg/ml) et on agite le mélange pendant 1 h. Après avoir éliminé le solvant par évaporation, on ajoute 10 ml d'acide chlorhydrique 0, 1N. On extrait ensuite le mélange psr 10 ml d'acétate d'éthyle.On élimine le solvant par évaporation, on dissout le résidu dans une petite quantité de méthanol, et on le soumet à une chromatographie en couche mince sur gel de silice avec un mélange acétate d'éthyle-benzène-éthanol-acide acétique (30:30:10:0,3 en volume) On recueille la substance révélée pour Rf 0,55 et on l'extrait par de l'éthanol. Après avoir éliminé l'éthanol par évaporation, on obtient 26 g de E2-6-CMO-TME, sous la forme d'une poudre blanche-jaune pâle. EXEMPLE 2 On dissout 5 g de E2-CMO-TME dans 10 l de tampon phosphate 0,45M (pH 7,2). Après addition de 2,5-4,0 mCi de Na125I et de 100 g de chloramine T, on poursuit la réaction pendant environ 1 min, puis on la stoppe en ajoutant 100 g de métabisulfite de sodium.On soumet le produit (E2 -6-CHO-TME-125I) à une chromatographie en couche mince sur gel de silice avec le meme système solvant que celui de l'exemple 1, on recueille la substance révélée pour Rf 0,6, on l'extrait par de l'éthanol. On élimine l'éthanol par évaporation, on dissout le résidu dans 0,3 ml d'hydroxyde de sodium 1N et on hydrolyse l'ester à la température ambiante pendant 15 min. Après addition de 0,3 ml d'acide phosphorique 2N, on extrait le E2-6-CMO-T-125I obtenu par de l'éther de diéthyle. On élimine la plupart du solvant par évaporation et on soumet le résidu à une chromatographie en couche mince sur gel de silice avec le mEze système solvant que ci-dessus. On recueille la substance révélée pour Rf 0,2, on l'extrait par de l'éthanol et on élimine ensuite l'éthanol par évaporation. On dissout le résidu dans un tampon phosphate 0,01M (pH 7,2) et on le stocke afin de l'utiliser pour la détermination radio-imaunologique. On obtient 1-1,5 mCi 125 de E2-6-CHO-T- SI, présentant une activité spécifique de 35Q-50Q mCi/mg. EXEMPLE 3 On dissout 5 %g de E2-6-CMO-TME dans 0,3 ml d'hydroxyde de sodium 1N On hydrolyse à température ambiante pendant 15 min pour obtenir du E2-6-CMO-T. Après addition de 0,3 ml d'acide phosphorique 2N, on extrait le produit par de l'éther de diéthyle. Après avoir éliminé la plupart du solvant par évaporation, on soumet le résidu à une chromatographe en couche mince comme décrit dans l'exemple 1. On recueille la substance révélée pour Rf 0,6 et on l'extrait par de l'éthanol, celui-ci étant ensuite éliminé par évaporation. Après addition de 10 l de tampon phosphate 0,45M (pH 7,2), de 2,5-4,0 mCi de Na125I et de 100 g de chloramine T, on poursuit la réaction pendant environ 1 min, puis on l'arrête en ajoutant 100 g de métabisulfite de sodium. On effectue une chromatographie en couche mince sur gel de silice comme décrit ci-dessus, on recueille la substance révélée pour Rf 0,2 et on l'extrait par de ltethanol, On élimine l'éthanol par evaporation, on dissout le ligand de marquage radioactif obtenu dans un tampon phosphate 0,01M (pH 7,2) et on le stocke afin de l'utiliser pour la détermination radio-immunologique. On obtient 1,5-3 mCi de E2-6-CMO-T-125I, présentant une activité sépcifique de 350-500 mCi/mg. EXEMPLE 4 A une solution de 5 g de myrosine dissoute dans 10 l de tampon phosphate 0,45M (pH 7,2), on ajoute 2,5-4,0 mCi de Na125I et 100 g de chloramine T. On poursuit la réaction pendant 1 min puis on l'arrête en ajoutant 100 g de métabisulfite de sodium. On obtient de la tyrosine marqué l'iode radioactif (T-125I). On combine des solutions dans le dioxanne de 10 l de E2-CMO (1 mg/ml), 5 l de tri-n-butylamine (1 g/ml) et 5 l de chlorocarbonate d'isobutyle (0,5 l/ml) et on effectue la réaction à une température inférieure à 10 C pendant 3 min. On ajoute le T-125I obtenu ci-dessus au mélange réactionnel et on poursuit la réaction pendant 15 min pour obtenir du E2-CMO-T-125I. On extrait le produit par de l'acétate d'éthyle et on le soumet à une chromatographie en couche mince comme décrit dans l'exemple 1.On recueille la substance révélée pour Rf 0,2 et on l'extrait par de l'ethanol. On élimine l'éthanol par évaporation, on dissout le ligand de marquage radioactif obtenu dans une solution de tampon phosphate 0,01M (pH 7,2) et on le stocke afin da l'utiliser pour la détermination radio-immunologique. On obtient 0,3-0,8 mCi de E2-b-CNO-T- I, présentant une activité spécifique de 350-500 mCi/mg. EXEMPLE 5 (Préparation d'anticorps) On dissout 140 mg de BSA dans 2 ml d'eau distillée et on ajoute 0,144 ml d'hydroxyde de sodium 1N à la solution. Après refroidissement à 0 C, on ajoute 2,5 ml de tétrahydrofuranùe au mélange réactionnel et on consetve le melange (solution A) à 0-40C. On dissout 43 mg de E2-6-CMO dans 2 ml de tétrahydrofuranne. Après avoir ajouté 31,5 l de tri-n-butylamine, on refroidit le mélange à 0 C. On ajoute 16,6 l de chlorocarbonate d'isobutyle au mélange et on poursuit la reaction à 0 C pendant 30 min (solution B). On mélange la solution B et la solution A et on poursuit la réaction pendant 4 h, en ajustant le pH entre 6,4 et 6,8 par de l'hydroxyde de sodium 1N, et on dialyse la solution obtenue contre de l'eau courante, pour obtenir du E2-6-CHO-B,SAS On dissout 500 mg du conjugué de BSA obtenu ci-dessus dans 1 ml de sérum physiologique On émulsionne cette solution avec un volume égal d'adjuvant complet de Freund et on 11 injecte par voie intradermique ou sous-cutanée à un lapin en plusieurs endroits (40-50 endroits). Un mois après l'injection, on effectue une injection de rappel de la même manière et on recueille du sang de la veine de l'oreille, 10-14 jours après I'injection de rappel. On sépare le sérum par fractionnement et on obtient l'antisérum. EXEMPLE 6 (détermination radio-immunologique de l'oestradiol) A partir d'échantillons de sérum de 5-120 l, on extrait l'oestradiol par de l'éther de diéthyle. Après élimination de l'éther, on dissout le résidu dans 0,5 ml de tampon phosphate 0,01M (pH 7,2), on le mélange avec environ 0,02 Ci de traceur (E2-6-CMO-T-125I) et 0,1 ml d'antisérum de lapin, obtenu dans l'exemple 5 (dilué environ 20 000 fois). On fait incuber le mélange à 35-40 C pendant environ 15 min. A ce mélange, on ajoute 0,1 ml de #-globuline sérique de chèvre antilapin (le deuxième anticorps, dilué environ 7 fois) et on laisse reposer le mélange à 4 C pendant une nuit. On recueille par centrifugation (2000 G pendant 15 min) le précipité blanc obtenu et on élimine la phase surnageante. On détermine la radioactivité du précipité et on déduit la quantité d'oestradiol à partir de la courbe de référence La figure 1 représente une courbe d'étalonnage d'oestradiol et la figure 2 représente les quantités d'oestradiol dans les échentil- lons de sérum obtenus. EXEMPLE 7 On extrait de l'oestradiol par de l'éther de diéthyle, à partir d'échantillons de sérum (5-500 /ul). Après élimination de l'etherX on ajoute 0,4 mi de méthanol à 50 % et lml de n-hexane au résidu. On agite vigoureusement le mélange et on élimine la couche de n-hexane par aspiration. On ajoute à nouveau 2 ml de n-hexane au mélange obtenu et on élimine à nouveau la couche de n-hexane par aspiration. Après avoir élimine le méthanol par évaporation, on ajoute au résidu 0,5 ml de tampon phosphate 0,01M (ph 7,2), environ 0,02 Ci de traceur (E2-6-CMO-T-125I) et 0,1 ml de l'antisérum de lapin, préparé dans l'exemple 5 (dilué environ 20 000 fois) et on fait incuber le mélange a température ambiante pendant 1 h puis à 35-40 C pendant 15 min. On ajoute 0,1 ml de #-globuline sérique ds chèvre antilapin (le deuxième anticorps, dilué environ 7 fois) au mélange obtenu et on laisse reposer la mélange a 4 C pendant une nuit. On recueille le précipité blanc obtenu,par centrifugatioa à 2000 G pendant 15 min, et on détermine sa radioactivité. On déduit les quantités d'oestradiol dans les échantillons de sérum à partir de la courbe étalon, celles-ci étant portées sur la figure 3. I1 est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus a titre d'illustration et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de ltesprit de l'invention. R E V E N D I C A T I O N S 1. Composé, caractérisé en ce qu'il consiste en l'oestradiol-6-(0- carboxyméthyl)oxime-tyrosine marquée à l'iode radioactif. 2. Procédé de détermination radio-immunologique de ltoestradiol, caractérisé en ce qu'on utilise un composé selon la revendication 2 comme traceur. 3. Composés intermédiaires nécessaires à la préparation du composé selon la revendication 1, qui sont l'oestradiol-6-(0-carboxyméthyl)oxime- tyrosine et ses esters d'alkyle en C1 à C6.