Brevet FR2361650A1 — publié le 19780310

La présente invention, due à Erich BERNT, Peter SCHEIBE et Ingeborg GUTMANN, concerne un procédé pour doser le lactate et un réactif utilisable selon ce procédé. Le dosage du lactate dans le sang, le sérum ou le plasma présente un grand intérêt dans l'appréciation de l'état et le contrôle thérapeutique des diabétiques. On constate également des augmentations de la teneur en lactate dans des cas de chocs, d'infractus du myocarde, d'urémie, de leucémie et de cirrhose du foie. Le dosage du lactate constitue donc un auxiliaire diagnostique indispensable. On connaît déjà plusieurs procédés de dosage spécifique du L-lactate. Ces procédés sont basés sur une conversion du lactate en pyruvate en présence de lactate-déshydrogénase (LDH) et de la coenzyme nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD) avec réduction de cette dernière et formation de NADH. Le NADH formé peut être dosé par des techniques optiques, directement ou en faisant appel à un colorant Rédox. Cependant, le dosage du Lactate, dans de nombreux cas, a l'importance clinique d'un examen d'urgence, ce qui doit être réalise dans les délais les plus courts possibles. Ainsi par exemple, dans la thérapeutique du diabète sucré par le biguanide, il peut survenir une lactacidose qui peut conduire à la mort. Dans de tels cas, le dosage rapide du lactate est dont absolument indispensable. Or, le procédé décrit ci-dessus et utilisant la LDH a un inconvénient : le dosage demande une durée considérable, en général plus d'une heure, car il doit être effectué au voisinage de l'équilibre chimique de la réaction catalysée par la LDH. On a donc déjà tenté à plusieurs occasions d'écourter la durée du dosage. Ainsi, par exemple, dans la demande-de brevet publiée avant examen, DT OS 1.944.911, on recommande de faire suivre la réaction décrite ci-dessus d'une seconde réaction dans laquelle le pyruvate formé réagit avec le glutamate en présence de glutamate-pyruvate-transaminase {GPT) avec formation dlalanine et d'alpha-cetoglutarate. Effectivement, l1équilibre chimique est ainsi amélioré, mais le dosage dure toujours plus d'une demiheure et ne convient donc pas pour les cas d'urgence. On a egalement proposé de déplacer l'équilibre par addition d'hydrazine, servant à capter les cétones, ou de remplacer le NAD par l'acétylpyridine-adénine-dinucléotide (APAD) (H.U. Bergmeyer : Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie, Weinheim, volume Il (1974) pages 1510 à 1526). On a également tenté d'utiliser la LDH de coeur de boeuf et de porter la température de réaction à 450C (Klin.,Biochem.7,94 (1974)). Tous ces procedés ont cependant un inconvénient en commun: la diminution de la durée du dosage ne suffit pas pour répondre aux besoins cliniques. L'invention avait donc pour but de trouver un procédé pour le dosage du lactate qui puisse être mis en oeuvre dans des temps beaucoup plus courts, de préférence de 10 mn au maximum. Ce but a été atteint, conformément à l'invention, grâce à un procédé pour la détermination quantitative du L-lactate par réaction avec le NAD en présence de LDH avec formation de NADH et de pyruvate, réaction de ce dernier avec du glutamate en présence de GPT avec formation d'alanine et- d'alpha-cétoglutarate en solu- tion alcaline tamponnée et dosage de NADH formé, lequel procédé est caractérisé en ce que la réaction est effectuée en présence d'au moins 0,4 mole/l de carbonate ou de bicarbonate. L'invention repose sur le fait que l'on a trouvé de façon surprenante que les ions carbonate et bicarbonate, à certaines concentrations relativement élevées, ont la capacité d'activer dans une mesure considérable la glutamate-pyruvate-transaminase et permettent ainsi un déplacement déterminant de l'équilibre dans la réaction combinée avec la LDH et la GPT. Dans la demande de brevet DTOS n0 1.944.911 précitée, on décrit déjà un réactif servant au dosage du lactate pouvant contenir également du bicarbonate ou du carbonate. Mais les concentrations indiquées sont de 0,1 mole/l et au-déssous et se situent par conséquent dans un intervalle où l'on n'observe aucune activation. On ne pouvait donc nullement en déduire une possibilité d'activation à des concentrations beaucoup plus fortes des mêmes composés. Les réactions qui sont à la base du procédé selon l'invention sont les suivantes 1. lactate + NAD+ pyruvate + NADH + 2. pyruvate+glutamate L-alanine + -cétoglutarate. Comme il y a formation d'ions H+ dans la réaction 1, on opère en milieu alcalin. Dans le procédé selon l'invention, on opère de préférence dans un tampon carbonaté à la concentration de OAS à 1,0 mole/l. On a ainsi obtenu des résultats particulièrement favorables à des pH de 9,5 à 10,5 alors que jusqu'à maintenant, la réaction couplée avec la LDH et la GPT était effectuée à pH 8,9. Le procédé selon l'invention peut être appliqué aussi bien au sang comolet, après élimination des protéines à l'aide d'acide perchlorique par exemple, qu'au sérum ou au plasma. Pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, on peut opérer de la manière suivante : au mélange des réactifs qui contient tous les réactifs à l'exception des enzymes, on ajoute le sans déprotéiné, le sérum ou le plasma. On divise ensuite le mélange en deux parties égales. A la première moitié, on ajoute les enzymes ; la deuxième moitié sert pour l'essai à blanc. Au bout de 10 mn, on mesure l'extinction sur l'échantillon analytique et l'échantillon à blanc. La différence entre l'extinction de l'échantillon à blanc et l'extinction de l'échantillon analytique sert à calculer la concentration en lactate. Le procédé selon l'invention est non seulement simple et rapide, mais il se distingue par sa précision et son exactitude. La précision dans une série de mesures est de + 2% et reste à ce niveau d'un jour à l'autre. Dans des sérums témoins, on a retrouvé 99% de la teneur en lactate. Un autre avantage du procédé selon l'invention réside dans la possibilité de diminuer la consommation en enzymes. Ainsi la quantité minimale de GPT, relativement conteuse, par ml de volume d'analyse, n'est plus que de 2 unités internationales contre 4 unités dans le procédé connu. La quantité minimale de LDH pour cette quantité de GPT est de 30 unités internationales par ml. Un autre objet de l'invention est un réactif pour la mise en oeuvre du procédé décrit ci-dessus. Le réactif selon l'invention contient de la LDH, de la GPT, du NAD et du glutamate et est caracteris en ce qu'il contient en outre de 0,40 à 1,2 mole/l de tampon au carbonate à pH 9,5 à 10,5. Dans un mode de réalisation préféré, le réactif selon l'invention consiste en 0,45 à 1,0 mole/l de tampon au carbonate à pH 9,5 - 10,5, 50 à 150 millimoles/l de glutamate, 3 à 10 millimoles/l de NAD, 20 à 60 unités internationales de LDH et 2 à 4 unités internationales de GPT par ml de solution tapon. Avantageusement, le réactif contient en outre, en tant que stabilisant, de 2 à 30 millimoles d'azothydrure alcalin, par litre de solution tamponnée. Pour un dosage, on utilise en général 5 ml du réactif cidessus. Après mélange, le réactif peut être conservé pendant au moins une journée 4 C. Pour assurer une plus longue stabilité au stockage, on conserve avantageusement les enzymes de façon séparée et on prépare chaque jour, par mélange, la quantité de réactif nécessaire pour la journée. On notera que le procédé selon l'invention convient non seulement pour le dosage du L-lactate mais aussi pour celui de la L-alanine. Dans ce dernier cas, les réactions sont effectuées en sens inverse, comme décrit par H.U.Bergmeyer, dans Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie, T:-7einheim, volume Il (1974), page 1727. Dans le procédé fondamental connu, le dosage, selon la concentration de L-alanine, dure de 30 à 60 mn, et il faut utiliser 10 unités internationales GPT par millilitre de volume d'analyse. L'invention permet de diminuer de moitié cette durée de réaction. t'exemple qu suit illustre l'invention sans toutefois en limiter la portée. Exemple : On utilise 5 ml d'un mélange réactionnel contenant 0,5 mole/l de tampon au carbonate à pH 10,0, 100 millimoles/l de glutamate, 15 millimoles/l d'azothydrure de sodium et 5 millimoles/l de NAD. On ajoute 3 la pipette 0,1 ml de sérum eu de plasma ou 0,2 ml de sang total (déprotéiné par un volume égal d'acide perchlorique N). On prélève à la pipette 2,5 ml de ce mélange qu'on transfère dans un deuxième récipient ; on ajoute 0,05 ml d'une solution d'enzymes consistant en 54 à 138 unités internationales de LDH et 5 à 10 unités internationales de GPT dans 50 microlitres de solution 3,2 M de sulfate d'ammonium. Le reste du mélange est laissé dans le premier récipient. Au bout de 10 minutes, on trans fere le contenu du premier récipient, gui constitue l'é chantillon à blanc, dans une cuvette d'un centimètre d'épafsseur de couche et on mesure l'extinction à 365 nm (Hg), 334 nm (Hg) ou 340 nm. Dans la même cuvette, on mesure l'extinction du contenu du deuxième récipient, qui constitue l'échantillon analytique. On soustrait l'extinction de l'échantillon à blanc de l'extinction de l'échantillon analytique #E = E échantillon analytique -E échantillon à blanc. La différence d'extinction # E sert nour le calcul de la te- neur en lactate. Lorsau'on a opéré sur du sérum ou du plasma et qu'on a mesuré l'extinction à 365 nm (Hq), l'équation qui sert au calcul est la suivante millimoles lactate/1 = #E. 52,02. 1000 3,4. 1O3 Lorsqu'on a opéré sur du sang total après déprotéination, l'équation est la suivante millimoles lactate/1 = E 49,06. 1000 3,4. 52,02 et 49,06 sont les facteurs respectifs de dilution de l'échantillon dans le mélange servant à l'analyse. 3,4. 10 cm/millimoles est le coefficient d'extinction du NADH à 365 nm (Hg). Comme il va de soi, et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'apnlication et de réalisation qui ont e-té plus spécialement envisagés ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la détermination quantitative du L-lactate par réaction avec le nicotinamide-adénine-dinucléotide en présence de lactate-dishydrogénase avec formation de nicotinamide adénine-dinucléotide réduit et de pyruvate, réaction de ce dernier avec le glutamate en présence de glutamate-pyruvatetransaminase avec formation d'alanine et d'alpha-cétoglutarate en solution alcaline tamponnée, et dosage du nicotanamide-adéninedinucléotide réduit qui s'est formé, lequel procédé est caractérisé en ce que l'on effectue la réaction en présence d'au moins 0,4 mole/l de carbonate ou de bicarbonate. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on opère dans une solution contenant au moins 0,4 mole/l de carbonate ou de bicarbonate. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on opère à une concentration de 0,45 à 1,0 mole/l de tam-pon au carbonate. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on opère à pH 9,5 à 10,5. 5. Réactif pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, contenant de la lactatedéshydrogénase, de la glutamate-nyruvate-transaminase, du nicotinamide-adénine-dinucléotide et du glutamate, lequel réactif est caractérisé en ce qu'il contient de 0,40 à 1,2 mole/l de tampon au carbonate à pH 9,5 à 10,5. 6. Réactif selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il contient de 0,45 à 1,0 mole/l de tampon au carbonate à pH 9,5 à 10,5 avec 50 à 150 millimoles/l de glutamate, 3 à 10 millimoles/l de nicotinamide-adénine-dinucléotide, 20 à 60 unités internationales de lactate-déshydrogénase et 2 à 4 unités internationales de glutamate-pyruvate-transaminase par millilitre de solution tampon. 7. Réactif selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il contient en outre de 2 à 30 millimoles d'azothydrure alcalin par litre de solution tampon.