Brevet FR2328194A1 — publié le 19770513

La présente invention concerne une méthode fluorométrique pour déterminer les activités individuelles d'isoenzymes, ainsi qu'une méthode électrophorétique pour séparer la créatinine phosphokinase. Les techniques fluorométriques pour déterminer la présence d'isoenzymes sont bien connues de ceux qui sont compétents en la matière, par exemple dans "Fluorescent Technique To Demonstrate Creatine Phosphokinase isoenzymes", de A. L. Sherwin, Clinica Chemica Acta, 17: 245 à 249 (1967). La technique fluorométrique standard employée par ceux qui sont compétents en la matière consiste à détecter la présence de NADH, NADPH, leurs dérivés et leurs mélanges (appelés ci-après "produit fluorométrique"), dans un milieu électrophorétique. On peut également voir "Demonstration of Serum Creatine Kinase Isoenzyme by Fluorescence Technique", de H. Somer, Clinica Chemica Acta, 40 133 à 138 (1972) ; "Characterization of Tissue Alkaline Phosphatases and their Partial Purification by Starch-Gel Electrophoresis", de D.W Moss, Biochem.J.,81 : 414 à 447 (1961); et "Fluorometric Techniques in Clinical Chemistry1' de F. R. Elevitch, Little, Brown et Co, Boston, Massachusetts (1973). Plusieurs problèmes sont inhérents à la détection du produit fluorométrique dans le milieu électrophorétique. Ces problèmes comprennent la présence d'un artéfact d'albumine (J. Goldberg, "Enzymes in Medicine", Vol.7 NO 3,526 (1973); Helena Update, vol 18 (sont 1973) ; et R. Wong "Cellulose Acetate Electrophoresis of Creatine Phosphokinase Isoenzymes in the Diagnosis of Myocardial Infraction", A. J C. P., 64 : 209 à 216 (1975) ; la présence d'un artéfact de beta-lipoprotéines (C.R. Rowe "Combined Isoenzyme Analysis in the Diagnosis of Myocardial Injury : Application of Electrophorëtic Methods for the Detection and Quantitation of the Creatine Phosphokinase MB Isoenzymen, J. Lab. Clin. Med., Vol. 8, n 4, 577 à 590 (1972) ; l'interférence de drogues dans une détection fluorométrique (F. R. Elevitch, citation ci-dessus) ; et des imprécisions produites par la diffusion de bandes (Rowe, citation ci-dessus et Wong, citation ci-dessus). Un autre problème présent dans les méthodes fluorométriques selon l'art antérieur, pour détecter les produits fluorométriques, est le problème bien connu de l'affaiblissement ou fading, ctest-à-dire la disparition d'une partie de la fluorescence des bandes pendant le séchage. On peut voir H. Somer, citation ci-dessus. La détection des isoenzymes produits dans le milieu du substrat est bien connue dans l'art de la colorimétrie. On peut voir S. S. Kind, "Stable Test-Papers for Seminal Acid Phosphatase", Nature, vol. 182, nO 4646 (15 Novembre 1958) ; J. Clausen "Immunochemical Techniques for Identification and Estimation of Macromolecules", North-Holland Publishing Co., Amsterdam (1969), et G.J. Bremer et C. F Singer "An Introduction to Isoenzyme Techniques", Academic Press, New York, N. Y. Des méthodes fluorométriques dans lesquelles les produits fluorométriques sont détectés dans le milieu du substrat sont également connues, on peut voir le brevet germanique nO 2 136 880. Les problèmes de la diffusion et de l'affaiblissement forment tous deux un défaut important dans les déterminations fluorométriques des isoenzymes, depuis l'introduction de la méthode fluorométrique dans la détection des isoenzymes aux environs des années 1972. La présente invention a surmonté le problème de la diffusion, par la découverte qu'en précipitant le produit fluorescent dans du papier filtre ou autre milieu formant substrat approprié, les bandes sont localisées et la sensibilité de la technique fluorométrique est ainsi accrue. Par aileurs, on a également découvert, selon la présente invention/que le phénomène de l'affaiblissement ou fading pouvait être fortement diminué en déshydratant le milieu du substrat par remplacement du solvant. La présente invention concerne une méthode pour augmenter la sensibilité d'une technique fluorométrique, en précipitant un produit fluorescent in situ dans le milieu du substrat. Le réactif utilisé pour effectuer cette précipitation in situ, est choisi dans un groupe consistant en une composition comprenant de 90 à 100% en poids d'alcool par volumeutaire, cet alcool contenant de 1 à 6 atomes de carbone, et de O à 10 en poids durée par volume unitaire ; des cétones contenant de 3 à 8 atomes de carbone ; une solution inorganique comprenant de l'ordre de 90 à 99,99% d' un solvant choisi dans un groupe consistant en eau et solvants organiques polaires inertes et de l'ordre de 0,01 à environ 10 d'un solide organique ayant pour formule R(Y)2, où R est choisi dans un groupe consistant en Pb+2 Ca+2, Sr+2, et Ba+2 et où Y est choisi dans un groupe consistant en Cl NO3 et Cl04, et leurs mélanges. La présente invention concerne également une amélioration supplémentaire se rapportant à la détection fluorométrique des isoenzymes de créatinine phosphokinase Quand l'enzyme créatinine phosphokinase est séparé de façon électrophorétique, en ses isoenzymes constituants, la technique de détection fluorométrique ci-dessus est encore améliorée en employant un tampon électrophorétique comprenant un acide ayant pour formule HOOC(CH2)nCH(NH2)COOH, dans laquelle n est un nombre entier de 1 à 4, du tri-(hydroxyméthyl) aminométhane et de l'eau. Ce tampon a un pE de 7 à 8,5 à 230C, et une force ionique de 0,02 à 1,5. L'invention sera mieux comprise et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement au cours de la description explicative qui va suivre, faite en référence au dessin schématique annexé, donné uniquement à titre d'exemple, illustrant un mode de réalisation de l'invention et dans lequel - la figure 1 est une comparaison de la séparation électrophorétique de créatinine phosphokinase obtenue en utilisant un tampon de tris-aspartate par rapport à un tampon barbital. Le procédé selon la présente invention peut être utilisé pour mesurer la concentration de tout isoenzyme capable de réagir directement pour produire un produit fluorescent ou de faire partie d'une séquence réactionnelle donnant un produit fluorescent. Des enzymes que l'on peut citer comme ayant des isoenzymes pouvant répondre à la nécessité ci-dessus comprennent la créatine phosphokinase, la lactate déhydrogénase, la glucose-6-phosphate déhydrogénase, l'hexokinase, la malate déhydrogénase, l'isocitrate déhydrogénase, l'aldolase, et l'alcool déhydrogénase. Etant donné leur utilisation courante dans des laboratoires cliniques, la créatinine phosphokinase et la lactate déhydrogénase sont de préférence utilisées dans la présente invention. L'analyse générale des isoenzymes peut être divisée en trois étapes de base. L'étape 1 est la mise en place de l'échantillon contenant un enzyme sur un moyen de support et la séparation physique de l'enzyme en ses divers isoenzymes constituants par l'un des divers moyens de séparation bien connus de ceux qui sont compétents en la matière. L'étape 2 est la localisation de chaque isoenzyme composant. Cela consiste en une série de réactions chimiques catalysées par les isoenzymes composants pour produire un produit chimique détectable, comme un produit fluorescent, dont la quantité est proportionnelle à la quantité d'isoenzyme présent. L'étape 3 est une détermination de la quantité de chaque isoenzyme composant.Cela est accompli en explorant soit le moyen de support ou le moyen formant substrat avec un fluoromètre ou un densitomètre, pour déterminer la quantité du produit chimique obtenu par chaque isoenzyme composant. Divers moyens de séparation des isoenzymes sont bien connus de ceux qui sont compétents en la matière. Ces méthodes comprennent une électrophorèse en gel ( couramment appelée plus simplement "méthode de séparation électrophorétique"), une chromatographie en gel en couche mince, une électrophorèse en couche- mince, et une focalîsation isoélectrique en couche mince. La technique la plus couramment utilisée de nos jours dans des laboratoires cliniques, et par conséquent la technique utilisée de préférence dans la présente invention puur la détection de produits fluorométriques, est la méthode de séparation électrophorétique. En général, la séparation électrophorétique des isoenzymes est accomplie en appliquant un échantillon, comme du sérum humain, à un milieu électrophorétique.Le milieu électrophorétique est placé dans une chambre ou enceinte ou cellule électrophorétique, qui contient un tampon aqueux connu sous le nom de tampon électrophorétique. Le milieu électrophorétique est placé en contact direct avec le tampon électrophorétique qui, à son tour, est en contact direct avec deux électrodes séparées (une cathode et une anode). Les électrodes sont connectées à une alimentation en courant continu, ainsi le procédé électrophorétique a lieu quand du courant continu est appliqué au milieu électrophorétique. Pour bien séparer les divers isoenzymes constituants, le procédé électrophorétîque a habituellement lieu à un potentiel électrique établi , par exemple, de l'ordre de 50 à environ 500 volts, et pendant un temps suffisamment long, par exemple de l'ordre de 0,1 à environ 2 heures. La localisation de chaque isoenzyme composant nécessite une mise en contact des isoenzymes séparés avec des réactifs pouvant réagir pour donner un produit détectable. Une méthode bien connue de ceux qui sont compétents en la matière consiste à mettre les isoenzymes séparés en contact avec un milieu formant substrat contenant ces réactifs. Le milieu formant substrat est préparé en incorporant le substrat chimique spécifique requis pour le systèm'îsoenzymes spécifique dans un milieu stabilisant comme un papier filtre, un papier chromatographique, une membrane en acétate de cellulose, du gel agarose et autres. Le milieu stabilisant préféré pour la présente invention est du papier filtre et du papier chromatographique, ce dernier étant le milieu stabilisant choisi.Habituellement, on ajoute au milieu stabilisant, un tampon de substrat, des ions métalliques comme activateurs, des réactifs spécifiques ou substrats, et un coenzyme, c'est-à-dire NAD, NADP, et leuridérivés, et leurs mélanges, qui sert de substrat fluorogénique. Après électrophorèse, le milieu électrophorétique, comme ceux qui sont compétents en la matière le savent, est placé dans une enceinte et le milieu formant substrat est placé en contact direct avec la surface du milieu électrophorétique. Les milieux électrophorétique et formant substrat sont incubés à une température et pendant un temps prédéterminés. Bien que la température et le temps d'incubation ne soient pas critiques, le procédé d'incubation utilisé dans la présente invention a de préférence lieu à une température de l'ordre de 20 à 500C, et mieux de l'ordre de 35 à 39 C, et de préférence pendant une période de l'ordre de 30 à 90 mn et mieux de l'ordre de 45 à 75 mn. Pendant incubation, le substrat chimique se diffuse dans le gel électrophorétique où l'isoenzyme réagit sur le substrat pour produire, c'est-à-dire catalyser, la formation de produits fluorométriques spécifiques. Les produits fluorométriques formés dans les zones où sont placés les isoenzymes, sont libres de se rediffuser dans le milieu du substrat.Les protéines, les lipides et les drogues liées ne se diffusent pas à une quantité appréciable dans le milieu du substrat, étant donné leur dimension physique importante, c'est-à-dire leur poids moléculaire. A la fin de la phase d'incubation, le milieu formant substrat est séparé du milieu électrophorétique. La détection du produit fluorescent est accomplie en excitant le produit fluorescent par une lumièreGltraviolett dans l'étendue de 300 à 400 nm, avec une absorbance maximum à 340-350 nm. Le produit fluorescent entre en fluorescence avec une lumière visible à 400-5QO nm, avec une fluorescence maximum à environ 460 nm. La détection de la lumière fluorescente visible peut être effectuée à l'oeil avec un fluoromètre ou un densitomètre fluorescent. Une autre technique de détection que l'on peut également employer consiste à découper les zones du milieu formant substrat, qui contiennent le produit fluorescent et à placer chaque section dans une solution aqueuse pour redissoudre et éluer le produit fluorescent du milieu formant substrat. Une fois que cela a eu lieu, le produit fluorescent éludé peut être mesurqpar absorbance, fluorescence ou par une méthode de détermination chimique. La quantité et la position du produit fluorescent détecté sont proportionnelles aux isoenzymes placés dans le milieu électrophorétique, et par conséquent à la quantité d'isoenzymes dans l'échantillon qui est examiné. Deux autres méthodes de détection du produit fluorométrique sont la technique de reproduction photographique et la technique d'exploration négative photographique. La première est une méthode qualitative qui consiste à examiner à l'oeil une image prise du milieu formant substrat. La dernière est une méthode quantitative consistant à analyser de façon densitométrique, le négatif d'une photographie du milieu formant substrat. La technique de détection fluorométrique selon la présente invention consiste à modifier les étapes ci-dessus d'analyse des isoenzymes, de façon qu'avant l'étape de détection fluorométrique, le produit fluorométrique soit précipité in situ dans le milieu formant substrat. La précipitation du produit fluorescent peut etre amenée en utilisant un réactif choisi dans un groupe consistant en une composition comprenant de l'ordre de 90 à 100, de préférence 100% en poids d'alcool par volume unitaire, l'alcool contenant de 1 à 10, de préférence de 1 à 3 atomes de carbone et de O à 10, de préférence 0% en poids d'urée par volume unitaire ; des cétones contenant de 3 à 8 atomes de carbone, de préférence de 3 à 5 atomes de carbone ; une solution d'un sel inorganique comprenant de l'ordre de 90 à 99,9 et de préférence de l'ordre de 98 à 99% d'un solvant choisi dans un groupe consistant en eau et solvants organiques polaires inertes, de préférence du groupe consistant en alcool contenant de 1 à 6 atomes de carbone et cétones contenant 3 à 8 atomes de carbone, et mieux du groupe consistant en alcools contenant de 1 à 3 atomes de carbone, et environ 0,01 à environ 10, de préférence de 1 à 2% d'un sel inorganique ayant pour formule R(Y)2, où R est choisi dans le groupe consistant en Pb+2, Ca+2, Sr+2, et Ba+2, et où Y est choisi dans un groupe consistant en c, N03, et ClO4 et leurs mélanges.On peut citer comme autressolvantsorganiques polaires inertes, le diméthylformamide et le diméthylacétamide. Le seul critère qu les solvants organiques polaires inertes doivent satisfaire est qu'ils soient capables de solubiliser le sel inorganique. Le réactif préféré est lnsopropanol. Les réactifs ci-dessus peuvent être utilisés avec addition d'un polymère, par exemple du polypropylène glycol, du polyéthylène glycol, et autres, pour améliorer la précipitation et contrôler les caractéristiques de surface (c'est-à-dire pour empêcner le gondolement ou le plissement) du milieu formant substrat. Il est également souhaitable de déshydrater le milieu formant susbtrat, pour augmenter l'intensité de la fluorescence du produit fluorescent. La déshydratation peut être accomplie par évaporation de l'eau du milieu formant substrat, ou de préférence par remplacement du solvant, comme un remplacement de l'eau par de l'alcool et de l'éther. Pour éliminer le phénomène d'affaiblissement ou fading non souhaitable ci-dessus indiqué, il est préférable de cnmbiner la précipitation et la déshydratation en une seule étape, en plaçant le milieu formant substrat dans de l'alcool pendant une courte période de temps. A ce point, le produit fluorescent peut être détecté par fluorescence, mais pour aider la manipulation, on laisse de préférence l'alcool s'évaporer, ce qui donne un milieu formant substrat sec contenant un produit fluorescent localisé, et ne s'affaiblissant relativement pas. Bien qu'il y ait de nombreux tampons électrophorétiques appropriés connus de ceux qui sont compétents en la matière, que l'on peut utiliser dans l'étape de séparation électrophorétique des isoenzymes ci-dessus décrite, quand on sépare par électrophorèse de la créatinine phosphokinase en ses isoenzymes constituants, il est préférable d'utiliser un tampon électrophorétique particulier comprenant (a) un acide ayant pour formule HOOC(CH2)nCH(NH2)COOH, dans laquelle n est un nombre entier de l'ordre de 1 à 4, de préférence de 1 à 2, (b) du tris(hydrométhyl) aminométane, et (c) de lteau, et de préférence de l'eau distillée ou désionisée et leurs mélanges. Ce tampDi:ylectrophorque a un pH de l'ordre de 7 à environ 8,5, de préférence de l'ordre de 7,2 à environ 7,7, et mieux de 7,5 à 23 C et une force ionique de l'ordre de 0;02 à environ 1,5, de préférence de l'ordre de 0,03 à environ 0,07kt mieux de l'ordre de 0,05. Il y a plusieurs raisons pour lesquelles le tampon électrophorétique ci-dessus est préféré pour la séparation par électrophorèse des isoenzymes de créatinine phosphokinase. Une raison est que l'utilisation de tampons au barbital, ou autres tampons semblables, donne un artefact d'application. L'artéfact d'application provient de l'enzyme créatinine phosphokinase connu par CPK3 qui est localisé par électrophorèse au point d'application de la limite l'échantillon, produisant ainsi un contour de ia zone d'application quand le milieu électrophorétique est exploré par densitométrie. De même, ces tampons selon l'art antérieur séparent électrophorétiquement l'isoenzyme créatinine phosphokinase connu par CPK1 en une zonetitans laquelle l'albumine du sérum est présente. Ce type de séparation interfere avec l'action enzymatique de l'isoenzyme CPK1. On peut se reporter à B. A. Nealson , J. Clin. Pathol., 28 (10), pages 834 à 836 (1975).Par ailleurs,le pH des tampons selon l'art antérieur est de l'ordre de 7,5 à 9, tandis que le pH optimum pour la détermination des isoenzymes de créatinine phosphokinase est de 6,8. Contrairement aux inconvénients ci-dessus, en utilisant le tampon ci-dessus décrit, l'artéfact de l'échantillon est éliminé, parce que l'isoenzyme CPK3 est localisé totalement du côté cathode du point d'application de l'échantillon. De même, l'interférence de l'albumine du sérum avec l'isoenzyme CPK1 est également éliminée, parce que cet isoenzyme de créatinine phosphokinase est placé totalement du côté anode de la zone occupée par l'albumine du sérum. Par ailleurs, bien que la courbe de titrage du pH du tampon ci-dessus décrit soit semblable à la courbe du tampon au barbital, le pH plus faible du tampon ci-dessus, en comparaison du pH élevé du tampon au barbital, permet d'utiliser moins de tampon de substrat, pour abaisser le pH du milieu électrophorétique à la gamme optimale de pH pour les isoenzymes de créatinine phosphokinase. Les exemples qui suivent sont donnés pour mieux illustrer la présente invention sans en restreindre le cadre. EXEMPLE 1 Analyse d'Isoenzymes créatinine phosphokinase par détection fluorométrique de NAD réduit. I. Technique électroohorétictue 1. Tampon électrophorétique : Pour préparer le tampon électrophorétique, dissoudre les réactifs qui suivent dans un litre d'eau distillée. a) 6,7 g de tris(hydroxyméthyl)aminométhane b) 6,0 g d'acide DL-aspartique 2. Gel agarose : Pour préparer un gel agarose, on dissout un g d'agarose dans 100 ml de tampon électrophorétique à la chaleur. On applique 12 ml de la solution d'agarose tamponnée chaude à une feuille de 70 x 165 mm d'une pellicule de polyester de marque Mylar (Mylar est une marque de fabrique de la firme du Pont de Nemours & Co, Wilmington, Delaware), qui a été enduite d'une couche de résine hydrophile. On place dans la solution d'agarose chaude 4 tiges en acier de 12,7 x 0,79 mm d'une façon linéaire, sur la largeur et à peu près à 75 mm à partir de l'extrémité de la feuille en Mylard. Une fois que la solution d'agarose s'est solidifiée puur former un gel, on enlève les quatre tiges en acier avec un aimant, formant ainsi quatre fentes dans la matrice en gel, qui peuvent être utilisées pour contenir les échantillons pour la séparation électrophorétique. La surface du gel est légèrement séchée avec une feuille de papier chromatographique Whatman n02, avant que les échantillons ne soient appliqués au gel. 3. Echantillon a) Sérum d'un sang fraichement coagulé b) Fluide corporelcomme un fluide pleural c) Extraits de tissu 4. Application de l'échantillon : appliquer 5 pl de l'échantillon à chaque fente du gel, avec une seringue d'un microlitre. Placer le gel dans une cellule électrophorétique qui contient un tampon électrophorétique. 5. Paramètres électriques : Accomplir la séparation électrophorétique à 150 volts pendant 30 mn. II. Technique de recouvrement du substrat 1. Substrat : utiliser tout réactif de créatinine phosphokinase commercialisé. 2. Recouvrement de substrat a) saturer une feuille de 70 x100 mm de papier chromatographique Whatman n0542, de 1,5 ml de solution du substrat. b) Une fois que l'électrophorèse est terminée, enlever le gel agarose de la cellule électrophorétique et le placer dans une petite boîte d'incubation en matière plastique. Avec une feuille de papier chromatographique Whatman N02, essuyer doucementta surface en posant le papier de recouvrement du substrat sur la surface du gel, en un mouvement roulant puur éviter que des bulles d'air ne soient piégées entre la surface du gel et le papier de recouvrement du substrat. c) Placer un couvercle sur la boute d'incubation e > hatière plastique et incuber l'ensemble papier de recouvrement du substrat-gel à 370C pendant 60 mn. 3. Précipitation et déshydratation La précipitation et la déshydratation du NAD réduit sont accomplies en enlevant le papier de recouvrement du substrat de la surface du gel, et en immergeant ce papier dans 100 ml de 2-propanol pendant 5 mn. On place ensuite le recouvrement sur une serviette en papier, et on le laisse sécher. III. Détectinn de la fluorescence 1. Source d'excitation Exposer le papier de recouvrement de substrat séché à une source de lumière ultraviolette dans la région spectrale de 300 à 400 nm. 2. Détection de la fluorescence a) Observation visuelle directe b) Densitomètre fluorescent d'exploration c) Fluorometre d) Reproduction photographique EXEMPLE 2 Analyse des isoenzymes de lactate déhydrogénase par détection fluorométrique de NAD réduit, I. Technique électroPhorétique 1. Tampon électrophorétique : pour préparer le tampon électrophorétique, dissoudre le réactif suivant dans un'litre d'eau distillée. a) 2,6g de sodium barbital b) 1,15g d'acide citrique c) 3,5 g de tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane 2. Gel agarose :voir exemple 1 3. Echantillon : voir exemple 1 4. Application de l'échantillon : voir exemple 1 5. Paramètres électriques : accomplir la séparation électrophorétique à 150 volts pendant 45 mn. II. Technique de recouvrement du substrat 1. a) 30 mg de lactage de L-lithium b) 15 mg de -nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) c) 1,5 ml de tampon électrophorétique 2. Recouvrement du substrat : voir exemple 1 3. Précipitation et déshydratation : voir exemple 1 III. Détection de la fluorescence : voir exemple 1. D'autres enzymes, par exemple glucose-6-phosphate déhydrogénase, hexokinase, malate déhydrogénase, isocitrate déhydrogénase, aldolase, et alcool déhydrogénase peuvent être analysés par fluorométrie d'une façon analogue à ce qui est indiqué aux exemples 1 et 2. EXEMPLE 3. Pour démontrer la capacité de divers tampons de s'approcher du pH optimum pour la détermination de l'isoenzyme créatinine phosphokinase, on mélangea séparément 8 ml des tampons électrophorétiques des exemples 1 et 2, à 1 ml de substrat de créatinine phosphokinase et on mesura le pH du mélange. Les résultats dérivés de ces expériences sont indiqués au tableau I. TABLEAU I Tampon électrophorétique pH du tampon pH du substrat pH du tampon + CPK substrat CPK Tampon de l'exemple 2 8,55 6,8 7,5 Tampon de l'exemple 1 7,40 6,8 7,0 TABLEAU II Tampon électrophorétique Emplacement des zones, mm CPK3 Fente CPK2 Albumine CPK1 d'échantillon Tampon au barbital 8 à 10 et 10 à 11 21 à 24 29 à 34 33 à 36 de l'exemple 4 11 à 13 Tampon de l'exemple 1 6 à 9,5 10 à 11 16 à 19 20 à 25 28 à 31 Le tableau I indique clairement que le tampon électrophorétique selon la présente invention, représenté par le tampon électrophorétique de l'exemple 1, se rapproche plus du pH souhaitable du substrat de créatinine phosphokinase que ne le fait le tampon électrophorétique selon l'art antérieur de l'exemple 2. EXEMPLE 4 L'enzyme créatinine phosphokinase présent dans un échantillon de sérum humain fut séparé par sous un courant électrique de 1 ,4 volt par centimètre pendant 30 mn. Cette séparation fut accomplie dans un tampon tris-aspartique et un tampon de barbital. Le tampon de barbital se composait de 5,1 g en poids de barbituate de diéthyl-sodium et de 0,92 g en poids d'acide diéthyl-barbiturique. Le tampon tris-aspartique employé était le tampon électrophorétique de l'exemple 1. Les localisations des divers isoenzymes sont illustrées graphiquement sur la figure 1 et numériquement sur le tableau II. Sur la figure 1, A indique le tampon de tris-aspartate et B indique le tampon de barbital. Les signes négatifs entourés sur la figure 1 représentent la cathode et les signes positifs représentent l'anode. L'échell46nétrique de la figure 1 est employée pour mesurer la distance que les isoenzymes parcourent à partir de la limite de l'échantillon (b) (point d'application de l'échantillon), ainsi que la largeur des diverses zones représentées sur la figure 1. CPK1, CPK2 et CPK3 sont les trois isoenzymes présents dans la créatinine phosphokinase et l'albumine (a) est une protéine également présente dans le sérum humain. La figure 1 indique clairement que lorsque la créatinine phosphokinase est séparée électrophorétiquement en utlisant le tampon au barbital, l'isoenzyme CPK3 est présent des deux côtés de la limite de l'échantillon, ce qui produit un artéfact d'application. Cependant, quand la créatinine phosphokinase est séparée électrophorétiquement en utilisant le tampon tris-aspartique, l'isoenzyme CPK3 n'est placé que du côté cathode de la limite de l'échatillon, ce qui élimine l'artéfact ci-dessus mentionné. La figure 1 représente également clairement que, quand la créatinine phosphokinase est séparée par électrophorèse en utilisant le tampon au barbital, la zone occupée par l'albumine recouvre la zone occupée par l'isoenzyme CPK1. Ce recouvrement, comme on l'a noté ci-dessus, interfère avec l'action enzymatique de l'isoenzyme CPK1. Comme il n'y a pas de recouvrement présent quand la créatinine phosphokinase est séparée électrophorétiquement en utilisant le tampon tris-aspartique, cette interférence est totalement éliminée. Le tableau II représente, sous forme numérique, la même information que celle donnée par la figure 1. Les millimètres indiqués au tableau I correspondent à l'échelle métrique sur la figure 1. La figure 1 et la tableau II montrent clairement que le tampon électrophorétique selon la présente invention, exemplifié par le tampon électrophorétique de l'exemple 1, permet d'éliminer à la fois l'artéfact du point d'applicaton et l'interférence de l'albumine présents dans la séparation électrophorétique au tampon au barbital selon l'art antérieur. Tandis que diverses méthodes et réactifs ont été décrits en détails, on comprendra que des changements et modifications peuvent être faits sans se départir du cadre de la présente invention. Par exemple, on a décrit ci-dessus un tampon tris-aspartique comme étant capable d'améliorer la séparation électrophorétique de la créatinine phosphokinase quand les isoenzymes de créatinine phosphokinase sont détectés par la technique fluorométrique selon la présente invention, mais il est clair que ce tampon tris-aspartique peut également être employé pour la séparation électrophorétique de créatinine phosphokinase si les isoenzymes sont détectés par des techniques fluorescentes et non fluorescentes selon l'art antérieur. Bieakntendu, l'invention n'est nullement limitée au mode de réalisation décrit et représenté qui n'a été donné qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits, ainsi que leurs combinaisons si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mibes en oeuvre dans le cadre des revendications qui suivent. REVENDICATIONS 1.- Technique pour mesurer des concentrations en isoenzymes, du type où des enzymes sont placés sur un moyen de support et séparés en isoenzymes constituants par un moyen de séparation, où ledit moyen de support contenant lesdits îsoenzymes séparés est mis en contact avec un milieu formant substrat comprenant un substrat et un milieu stabilisant, où ledit milieu formant substrat et ledit moyen de support sont séparés, et où un produit fluorescent est détecté par fluorométrie dans ledit milieu formant substrat, caractérisée en ce qu'elle consiste à:: mettre en contact ledit milieu formant substrat, à la suite de sa séparation dudit moyen formant support, et avant détection fluorométrique, avec un réactif choisi dans un groupe consistant en une composition comprenant de 90 à 100 % en poids d'alcool par volume unitaire, ledit alcool contenant de 1 à 6 atomes de carbone, et de O à 10 % en poids d'urée par volume unitaire ; des cétones contenant de 3 à 8 atomes de carbone ; une solution d'un sel inorganique comprenant de l'ordre de 90 à 99,99 % d'un solvant choisi dans un groupe consistant en eau et solvants organiques polaires inertes et de l'ordre de 0,01 à environ 10 % d'un sel inorganique ayant pour formule R(Y)2, où R est choisi dans un groupe consistant en Pb+2, Ca+2, Sr+2 et Ba+2, et où Y est choisi dans un groupe consistant en Cul , N03-, et Cl04 ; et leurs mélanges, de façon que le produit fluorescent soit précipité in situ dans ledit milieu formant substrat, pour localiser ainsi sa présence et augmenter la sensibilité de la technique fluorométrique. 2.- Technique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'on déshydrate le milieu formant substrat précité à la suite de son contact avec le réactif précité et avant détection fluorométrique. 3.- Technique selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'enzyme précité est choisi dans un groupe consistant en créatinine phosphokinase, lactate déhydrogénase, glucose-6-phosphate déhydrogénase, hexokinase, malate déhydrogénase, isocitrate déhydrogénase, aldolase, et alcool déhydrogénase ; en ce que le milieu stabilisant précité est choisi dans un groupe consistant en papier filtre et papier chromatographique ; en ce que le milieu formant substrat et le moyen de support mis en contact précités sont incubés à une température de l'ordre de 20 à 5Q C pendant environ 30 à 90 mn ; en ce que le réactif précité est choisi dans un groupe consistant en alcool contenant de 1 à 3 atomes de carbone. 4 - Technique selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'enzyme précité est choisi dans le groupe consistant en créatinine phosphokinase et lactate déhydrogénase en ce que le milieu stabilisant précité est du papier chromatographique ; en ce que le milieu formant substrat précité et le moyen de support précité mis en contact sont incubés à une température de l'ordre de 35 à 390C pendant environ 45 à 75 mn j en ce que le réactif précité est dgilisopropanol, 5 - Technique électrophorétique pour séparer la créatinine phosphokinase en ses îsoenzymes constituants, du type où un échantillon contenant de la créatinine phosphokinase est appliqué à un milieu électrophorétique, ledit milieu électrophorétique est placé dans une cellule électrophorétique dans laquelle se trouve un tampon électrophorétique en contact avec deux électrodes, et lesdits isoenzymes sont séparés en appliquant un courant électrique continu audit milieu électrophorétique, caractérisée en ce qu'elle consiste à: utiliser comme tampon électrophorétique un tampon comprenant a) un acide ayant pour formule HOOC(CH2)nCH(NH2)C00H dans laquelle n est un nombre entier de l'ordre de 1 à 4, b) du trisShydroxyméthyl)aminométhane, et c) de l'eau, ledit tampon électrophorétique ayant un pH de l'ordre de 7 à 8,5 à 230C, et une force ionique de l'ordre de 0,02 à 1,5. 6 - Technique selon la revendication 5, caractérisée en ce que n est un nombre entier de l'ordre de i à 2 ; en ce que le tampon électrophorétique précité a un pH de l'ordre de 7,2 à 7,7 à 25 C et une force ionique de l'ordre de 0,03 à 0,07 ; et en ce que l'eau précitée est choisie dans un groupe consistant en eau distillée, eau désionisée et leurs mélanges. 7 - Technique selon la revendication 6, caractérisée en ce que le tampon électrophorétique précité a un pH de l'ordre de 7,5 à 23 C et une force ionique de l'ordre de 0,05.