Brevet FR2338051A1 — publié le 19770812

a présente invention concerne, d'une manière générale, l'immunologie. Elle a plus particulièrement pour objet un procédé de préparation d'un antigène de hépatite de type B applicable à l'échells industrielle pour produire un antigène de grande pureté qui peut être utilisé pour fabriquer industriellement un vaccin contre les contaminations par l'hépatite de type B. Elle concerne également l'antigène tel qu'obtenu par ce procédé, ainsi que les vaccins et autres préparations pharmaceutiques en contenant. La publication Prince Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 60:814-821 (1968) traite d'un antigène détecté pendant la période d'incubation et au début de l'évolution clinique d'une hépatite sééque transfusionnelle. Cet antigène apparaît identique à l'antigène appelé d'AustTalie ( . Prince, Lancet, 2 :462-463 (1968); Blumberg, Sutnick and London, J. Am.Med. Assoc. 207:1895-1896, 1969; and Wright, McCollum and Klatskin, Lancet 2:118-121, 1969), et on interchangeant les réactifs de référence on a démontré l'identité de cet antigène avec "l'antigène d'hépatite" de Gocke et Kavey Lancet 1:1055-1059 (1969). L'antigène a été décrit par Prince, Hargrove, Szmuness, Cherubin, Fontana et Jeffries, N, Envi. J. Med. 282:287-291 (1970) comme étant spécifique du virus de l'hépatite sérique , virus qui apparaît être une cause majeure de l'hépatite sporadique observée chez les adultes vivant en milieu urbain, indépendament de la présence ou de l'absence d'une contamination parentérale par du sang ou des produits sanguins. L'antigène associé à de telles contaminations d'hépatite sérique a déJà reçu à ce jour divers noms tels que antigène d'Australie, antigène SH, antigène Au/Sh, HAVA, chacune de ces dénominations a ses supporters. Toutefois chacune a également des dé- fauts inhérents. Les noms géographiques rendent la vie difficile aux étudiants et aux médecins et le terme HAA ne rend pas compte de la spécificité manifeste de cet antigène vis-à-vis des contagions par le virus d'hépatite type B.Le terme SH se comprend malencontreusement dans le sens que cet antigène est associé avec un virus transmissible seulement par le sérum ou les produits sanguins; cependant de nombreuses séries de faits ont maintenant fait la preuve que le virus d'hépatite B (virus de l'hé- patite sérique) est également "infectieux". Ainsi, continuer utiliser l'expression "hépatite sérique " a de bonnes chances d'entraîner plus de confusion que de clarification.Pour cette raison un sous-comité spécial a été désigné par le Conseil National dels Recherche de l'Académie Nationale des Sciences des Etats-Unis d'Amérique pour tenter, entre autres, de suggérer une meilleure terminologie-. La terminologie choisie en revient aux expressions classiques de virus de l'hépatite type A, et virus de l'hépatite type B,qui ont été utilisées dans les années 1940 et 1950. L'antigène devient ainsi logiquement l'antigène d'hépatite B (HB Ag) et l'anticorps antagoniste à cet antigène devient alors l'anticorps d'hépatite B (HB Ac). C'est cette dernière terminologie qui sera utilisée ici. En 1964 Blumberg, Bull, N.Y. Acad. Med. 40:377-386 (1964) décrivit la découverte de ce qui apparut alors être un-autre polymorphisme des protéines du sérum humain. On releva la présence, dans le sérum d'un hémophilique ayant subi de multiples transfusions, d'un anticorps qui réagissait selon la technique Ouchterlony avec un antigène qui n'était pas une lipoprotéine et dont on observa la présence dans le sérum d'une fraction de certaines populations étrangères et dans le sérum de quelques patients atteints de leucémie. L'antigène fut appelé antigène d'Australie car il fut initialement detecté dans le sérum d'un aborigène australien. Des examens de familles vinrent à l'appui de l'hypothèse selon laquelle cet antigène était un isoantigène déterminé génétiquement.On a ultérieurement démontré la présence de l'antigène d'Australie dans environ 25% de patients hospitalisés atteints du syndrome de Down. Une observation fortuite de Blumberg fournit les bases d'une nouvelle interprétation des découvertes antérieures rappelées ci-dessus. Des échantillons sanguins furent recueillis en série sur un enfant atteint du syndrome de Down. Alors que l'enfant ne présentait pas initialement d'antigène décelable, un échantillon ultérieur donna lieu à des résultats positifs. Les données cliniques révélèrent, presque en même temps, que l'enfant développait une hépatite. Il fut ensuite constaté que l'antigène était présent dans 5 de 48 échantillons de sérum prélevéssur des patients atteints d'hépatite virale. De telles données étaient compatibles avec au moins trois hypothèses : (1) que l'antigène soit un isoantigène sé- rique déterminé génétiquement dont la présence serait en rapport avec une prédisposition à diverses maladies ou agents porteurs de maladies, comme par exemple la leucémie, le mongolisme, l'hépatite, (2) que l'antigène soit un isoantigène déterminé génépi quement dont la menifestation dépendait de la présence d'un virus 1,dérépress eur", (3) que l'entigène soit spécifiquement associé à un virus provoquent l'apparition de l'une ou plusieurs de ces conditions. Tout d'abord, on considéra que la dernière de ces hypothèses était la plus probable ceron n'envissgesit pas qu'un antigène viral puisse circuler chez des porteurs sains en quantité suffisante pour Btre détecté par un essai d'immunodiffusion peu sensible. Toutefois, les résultats d'une étude effectuée en collaboration par Prince et Blumbert sur les caractéristiques physiques de l'antigène, vinrent a l'appui de la troisième hypothèse, car on constata que l'antigène était associé à une particule qui sédimentait à la vitesse d'une petite particule analogue à un virus. La relation de spécificité entre l'antigène d'Australie et l'hépatite ne fut cependant pas établie avant que la composition de la gélose utilisée pour l'essai d'immunodiffusion soit changée. Ce n'est qu'alors que les lignes de précipitation furent suffisamment claires pour permettre un test d'identification. Les résultats obtenus avec le système d'immunodiffusion récemment mis au point sont décrits dans Prince, Proc. Nat. Acad. Sci. 60.814-821 (1968). Jokelainen, Krohn, Prince and Finlayson, (J. Virol 6: 685-689, 1970) examinèrent sous l'aspect de leur structure des particules contenant l'antigène d'hépatite B au moyen d'un microscope électronique et confirmèrent l'existence de grosses particules sphériques (environ 43 nm) et- de particules plus petites -(environ 20nm) en forme de batonnets et de sphères. Les grosses particules semblent comporter des membranes internes et externes et un noyau, d'après les techniques de coloration positive. Les membranes externes des grosses particules semblent similaires aux sphères et bâtonnets de 20 nm de diamètre connus comme possédant l'antigènedhépatite B. Chacune des trois sortes de particules semblent contenir l'antigènedhépatite B car elles sont toutes agglutinées par l'anti-sérum d'hépatite B. Quelques-unes des grosses particules présentent des excroissances de structure identique à celles des formes en bâtonnets et des rétrécissements leur donnent dans certains cas un aspect évoquant une série de petites particules sphériques. Ces constatations apparaissent en accord avec celles de Dane, Cameron et Briggs, Lancet 1:695-698 (1970), selo-n lesquelles toutes ces formes seraient produits de neuf et les petites sphères et bâtonnets pourraient traduire une production excessive de substances membraneuses. Des examens en coloration négative ont confirmé l'aspect de virus des grosses particules sphériques. D-es examens en coloration positive ont fait apparaître trois points supplémentaies : a) les- grosses particules ont une structure à double membrane ; b) le noyau central de l'élément nucléotide content une substance qui se colore par l'acétate d'uranyle; c) et les petites sphères et bâtonnets ne contiennent aucune substance de noyau. Bien que l'acétate d'uranylene ne puisse pas être considéré comme un colorant spécifique des nucléoprotéines, il est reconnu qu'il est préférentiellement retenu par ces substances et l'on doit s'attendre à observer cette coloration à l'intérieur 'du noyau d'un virus. En conséquence, ces observations viennent à l'appui de l'hypothèse selon laquelle, parmi les trois types de particules contenant de l'antigène d'hépatite B décrites les grosses particules de 40 à 45 nm constituent très probablement le virus d'hé patite B effectif. Krugmantt al, J. Am. Med. Assoc. 217:41w(1971), ont fourni des données préliminaires suggérant que du sérum contenant HB Ag qui a été inactivé par ébullition pendant une minute est non infectieux, immunogénique, et protecteur lorsqu'il est administré à un petit groupe d'enfants volontaires Prince, Szmuness, Hargrove, Jeffries, Cherubin et Kelîner ont présenté un rapport détaillé complet sur l'état de leurs activités de recherches concernant l'examen de l'an- tigène spécifique du virus d'hépatite B dans Perspectives in Virology, Vol. 7, chap. 14, p. 241-296 (Academic Press, Inc., 1971). il a ainsi été démontré que HB Ag est présent dans le sérum pendant la période d'incubation de l'hépatite sérique post-transfusion classique. Un anticorps pour cet antigène a été trouvé chez les patients ayant subi de multiples transfusions, tels que les patients atteints d'hémophilie ou d'anémie de Cooley. La présence de l'anticorps n'est généralement pas décelée dans le sérum de patients convalescents de cas typiques d'hépatite virale. On a observé que l'antigène d'hépatite B est identique à l'antigène d'Australie précédemment décrit et à l'antigène d'hépatite de Gocke, On a montré que l'antigène est associé à des particules ayant l'aspect de virus de 20 à 25 nanomètres de diamètre et qu'il présente une densité par rapport à l'eau de 1,17 dans le sucrose.Dans le sérum de patients atteints d'hépatite virale eigûe, on a recherché la présence de HB Ag pour déterminer si ceci permettrait d'établir une distinction entre les deux principaux types d'hépatite virale. Sur quatre cas de contamination MS-1 avec incubation brève-examinés, aucun n'a permis de déceler de l'antigène, tandis qu'au contraire l'antigène a été identifié dans les huit cas de contamination MS-2 avec longue incubation examinés. De mime, sur 74 cas observésen liaison avec quatre épidémies d'hépatite infectieuse, un seul a révélé la présence d'antigène décelable, et aucun parmi 19 cas sporadiques apparaissant chez des enfants de moins de 14 ans, tandis que des résultats positifs ont été obtenus pour 76 cas sur 116 (6656) consécutifs à une exposition à des aiguilles contaminées, et pour 25 cas post-transfusion sur 43 (58%). La présence de HB Ag a été également décelée chez 71 patients sur 129 (55%) atteints d'hépatite virale sans antécé- - dent d'exposition parentéra3s. Ces observations conduisent à la conclusion que le virus d'hépatite B est la cause majeure de l'hépatite sporadique des adultes vivant en milieu urbain, indépendamment de la présence ou de l'absence d'une atteinte parentérale par du sang ou des produits sanguins. On a observé que le HB Ag est de 10 à 100 fois plus répandu chez les populations tropicales que chez les donneurs de sang volontaires de la ville de New-York. Ces constatations confirment les résultats précédemment obtenus lors de l'examen de l'antigène d'Australie. Bien que 90 à 95 % des patients atteints d'hépatite sérique zigue chez lesquels de l'antigène est décelé n'ont des quantités décelables de HB Ag dans le sang que pendant de courtes périodes, certaines personnes développent une antigénémie à l'hépatite B de longue durée. Une persistance d'antigène de longue durée est également observée chez les individus cliniquement bien portants dans toutes les populations qui ont été examinées. Une proportion de 2 à 3 9t des utilisateurs de médicaments ne manifestant pas de signes d'hépatite aigus ont des quantités décelables de HB Ag. A titre comparatif,- l'antigène peut être décelé chez seulement 0,1 % des donneurs de sang vo. lontaires dans la ville de New York. Quant aux donneurs rétri- bués dont on a signalé qu'ils risquaient au moins tu fois plus que les donneurs volontaires de transmettre l'hépatite, on a également observé qu'ils avaient 12,5 fois plus de chances que les donneurs volontaires qu'on observe la présence de HB Ag dans leur sang, De plus, l'antigène lié à l'hépatite B a été trouvé dans le sérum de 8 chimpanzés sur 138 examinés. La présence de l'antigène a persisté pendant au moins 5 ans chez 3 de ces animaux. Cet antigène n'a pas été observé dans le sérum de 99 babouins et 11 gibbons. Les chimpanzés antigénémiques se sont révélés présenteur des manifestations histologiquesdhépetits chrdnique persistante. Le HB Ag a été trouvé chez 6 chimpanzés sur 138; il était transitoire chez 3 de ces animaux. Le porteur d'antigène chimpanzé fournit un modèle animal utile pour l'étude des particularités des porteurs de virus d'hépatite B et pour aborder sa thérapie. il apparat probable que les porteurs HB Ag chroniques sont également des porteurs de virus d'hépatite B car le sang contenant l'antigène a fait apparaître l'hépatite chez au moins 5 receveurs sur 8 dans une étude et dans 5 sur t2 dans une seconde étude. La présence de HB Ag et de HB Ac peut être détectée quantitativement par diffusion sur gel de gélose en appliquant la méthodologie décrite par Prince, Froc. Nat'1. Acad.Sci.U.S.A. 60:8T4-821 (1968), par IEOP comme décrit par Prince et Burke, Science 169t593-595 (1970) par hémagglutination passive (HA) et inhibition d'hémagglutination (HAI) comme décrit par Vyas et Shulman, Science 170:332-333 (1970) et, depuis une date plus récente, par l'essai radio-immunologique direct (RIA) de Ling et Overhy en utilisant du matériel autrichien fourni par Abbott Laboratories. Il était estimé que le plasma des porteurs de virus d'hépatite B contient environ D1 à 1,0 mg de-protéine associée à l'antigène par ml de plasma. Le plasma porteur peut donc cons taquer une source d'antigène utile pour la production de vaccins. . Conformément à certaines des caractéristiques du procédé objet de ltinvention et des produits qu'il permet d'obtenir, un vaccin actif contre les contagions par l'hépatite de type B peut être constitué par des particules de HB Ag ayant un diamètre d'environ 16 à environ 30 nanomètres, dans un véhicule physiologiquement acceptable, le vaccin étant sensiblement débarrassé des particules de HB Ag d'environ 40 à 45 nanomètres de diamètre, qui ont probablement un effet infectieux. Un tel produit antigénique ou vaccin peut être préparé en faisant application d'un procédé de purification qui implique une extraction au Fréon et une précipitation au méthanol suivies d'une ultracentrifugatian zonale. Des procédures d'ultracentrifugation zonale sont décrites par Bond et Hall, J. Infect. Dis. 125: 263-268 (1972). Elles conviennent à la séparation et à la purification de HB Ag dans ses formes morphologi ques.Toutefoisss la procédure décrite est dangereuse et par suite des précautions particulières de sécurité sont nécessaires. De plus,ces procédures d'ultracentrifugation zonale sont extrêmement conteuses et, comme on introduit dans l'ultracentrifugeuse une quantité globale importante de matières par unité de produit obtenu, il en résulte pour l'antigène purifié un coût de fabrication extrê- mement élevé.Dans les modes de mise en oeuvre préférés qui seront définis par la suite, l'invention rend possible la préparation de HB Ag de manière moins conteuse, permettant que les vaccins produits à partir de cet antigène puissent entre mis à la disposition générale du public àun prix acceptable sans effort excessif des particuliers ou du gouvernement. Dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 415 804, Polson décrit des procédés pour fractionner des mélanges de substances proteiniques en utilisant du polyéthylène glycol (PEG) comme inhibiteur de dispersabilité, pour obtenir une phase liquide contenant une première fraction en dispersion et une phase solide contenant une seconde fraction. Quant on utilise le procédé -de Polson, qui implique ltemploi -d'un pH de 7,0, d'une température de 210 C et de concentrations de protéines inférieures à 0,4 g pour 100 mi, une concentration en polyéthylène glycol supérieure à 12% est nécessaire pour précipiter les o(-globulines et l'albumine. D'après Poison, une élévation de la concentration en protéi-nes augmente le recouvrement entre les fractions.De plus, bien que HB Ag soit normalement considéré comme étant associé aux fractions d'O-globuLine, Polson ne décrit aucune méthode permettant de séparer HB Ag de l'une ou l'autre des fractions obtenues à partir de plasma. En outre de très fortes concentrations de polyéthylè- nes glycol sont nécessaires pour effectuer les fractionnements recherchés. Dans Rizzo, Pandey, Wailis et Melnik, Inf. et Imm. 6:335338 (1972) il estdécrit un procédé en deux étapes dè concentration et de purification de H8 Ag au moyen de PEG et de polyélectrolyte 60 (copolymère greffé d'isobutylène et d'anhydride maléique). Dans la première étape, du plasma ayant une concentration de protéine de 79,9 mg/ml est soumis à une précipitation par PEG à un pH de 4,6 et une température de 25 'C, en utilisant une concentration du Perde 8%. Il est indiqué que le précipité contient 100% de H3 Ag initial et seulement 12,5% des protéines initiales. Les protéines contenues dans le précipité comprennent 2mg/ml d'elbumine, 3mg/ml d2 globuline et Smg/ml de gamma-globuline. Il a été précisé que toutes les glohulines &alpha;1, ss, et restaient dans la phase liquide. Le précipité ainsi obtenu, par précipitation par PEG, subissait ensuite une concentration et purification de 1'HB Ag présent au moyen de polyelectrolyte 60. Une purification du HB Ag par- un facteur 8 dans l'étape de pré cipitation par PEG a eté mentionnée par De Rizzo et Al. Toutefois les essais de mise en oeuvre du procédé de De Rizzo et AI effec tués par le demandeur du présent brevet ont montré que cette technique conduit seulement à une purification par un facteur 2. En outre, il a été observé que le procédé de De Rizzo et Al n'est pas reproductible comme indiqué. Dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique no 3 636 191 - Blumberg et Millman ont décrit des procédés de préparation d'un vaccin actif contre l'hépatite virale suivant lesquels le plas ma contenant l'antigène subit une ultracentrifugation, une di gestion par enzyme, une filtration sur gel en colonne, une cen trifugation différentielle par densité dans une solution de su crose, une dialyse, une centrifugation différentielle par densi té dans une solution de chlorure de cesium et une dialyse. Le procédé décrit est.très coOteux et il ne convient pas pour puri fier le HB Ag sur de grandes échelles. On a constaté, en outre, que l'antigène peut Qtre altéré par digestion protéolytique.De plus, il n'apparaît pas- que la technique décrite permette de sé parer les grosses particules associées qui se rencontrent dans le plasma des porteurs donneurs. Selon l'inventibn, on peut réduire notablementy si ce n'est éliminer complètement les inconvénients de l'art anté rieur quiviennent d'être rappelas, par un procédé entièrement repro ductible et à rendemants élevés, permettant une purification à grande échelle de HB Ag convenant à la fabrication industrielle d'un vaccin contre la contagion d'hépatite de type B. Comme subs tance initiale, l'invention prévoit d'utiliser un produit sanguin fluide contenant du HB AgO Conformément à l'invention, on maintient le pH du produit sanguin approximativement compris entre 4,4 et 4,7, tandis que lton mélange à ce produit de 4,0 à 4,5 % en poids environ de polyéthylène glycol, par rapport au poids total du mélange obtenu, pour former un précipité contenant l'antigène. On sépare et recueille le précipité et on lui ajoute de l'eau en quantité suffisante pour obtenir. un produit fluide intermédiaire ayant sensiblement la même concentration en antigène que le produit sanguin initial. On donne à ce produit intermédiaire fluide un pH approximativement compris entre 4,9 et 5,1, pout former ainsi un précipité de substance protéinique et de polyéthylène glycol et une phase fluide contenant l'antigène. On sépare et recueille la phase fluide et on l'ajuste à un pH approximativement compris entre 4,4 et 4,7. Tandis que le pH est maintenu dans cette gamme, on mélange avec la phase fluide environ de 4,0 à 4,5 % en poids de polyéthylène glycol; par rapport au poids total du mélange, pour former un précipité contenant le HB Ag purifié, précipité que l'on sépare et recueille. Selon une caractéristique complémentaire de l'invention, on a observé que les étapes de précipitation effectuées en utilisant du polyéthylène glycol à un pH de 4,4 à 4,7 pour former un précipité contenant le HB Ag purifié, peuvent être rendues beaucoup -plus efficaces si elles sont effectuées à une température comprise entre O et 8 0C environ. Le précipité contenant le HB Ag purifié peut entre avantageusement, en outre, soumis à une purification par absorption des impuretés protéiniques sur hydroxy apatite, suivie d'une répartition par bandes isopycniques, puis d'une ultracentrifugation z o n ale pour séparer les formes morphologiques de l'antigène. Bien que ces dernières techniques soient plutôt onéreuses, comme on l'a déjà~ souligné, la double précipitation par le polyéthylène glycol permet d'obtenir un produit très purifié, de sorte que le volume total introduit dans l'ultracentrifugeuse par unité de quantité recueillie de particules sphériques de 20 nanomètreq relativement non infectieuses, eet notablement diminué par rapport au cas de l'extraction au fréon et précipitation au méthanol et en conséquence le coat de fabrication est sensiblement réduit. Selon une autre caractéristique de l'invention, le HB Ag purifié peut être divisé en trois populations différentes, respectivement riches en chacune des trois formes morphologiques des particules HB Ag, par un procédé suivant lequel on applique une quantité d'un fluide aqueux contenant une concentration notable de HB Ag purifié à une colonne chromatographique d'hydroxy apatite puis on assure l'élution de la colonne au moyen d'un dkiantprogressif à trois paliers, et l'on sépare et recueille ensuite au moins trois fractions distinctes de l'éluat sortant de la colonne. De cette manière on réduit sensiblement la nécessité d'une ultracentrifugation zonale complète, ou même on la supprime entièrement. L'invention sera maintenant plus complètement décrite en faisant réferences à des modes de mise en oeuvre particuliers nul- lement limitatifs, qui en font apparaître d'autres aspects. La description se réfère aux figures 1 à 7 jointes dans lesquelles: La Figure 1 est une représentation graphique des résultats d'analyses par électrophorèse sur acétate d cellulose du contenu en protéines des produits à divers stades-des opérations de précipitation par le polyéthylène glycol, dans le procédé selon l'invention. La Figure 2 constitue une représentation graphique des résultats des étapes de séparation isopycnique du- procédé selon l'invention. La Figure 3 est une représentation graphique des résultats de 1 t étape d'ultracentrifugation zonale du procédé selon l'invention. Les Figures 4, 5 et 6 représentent des microphotographies des produits obtenus après ultracentrifugation zonale. La Figure 7 est une representation graphique de résultats obtenus par chromatographie sur colonne. Conformément à la présente invention le HB Ag purifié est récupéré quantitativement à partir des produits sanguins fluides, tels que le plasma sanguin ou le sérum qui contiennent l'antigène, par une technique de précipitation en deux étapes au moyen de polyéthylène glycol (PEG). Le polyéthylene glycol de -poids moléculaire compris entre 300 et 100 000 stest révélé le plus favorable. Une amélioration importante peut être obtenue si le PEG a un poids moléculaire d'au moins 600 et ne dépassant pas la limite supérieure de 20 000. Les meilleurs résultats sont obtenus avec du PEG ayant un poids moléculaire compris entre 1 500 et 20 000, et par exemple de l'ordre de 6 000.En règle générale on préfère mettre en oeuvre le procédé en utilisant du PEG présentant un domaine de poids moléculaire restreint, et plus précisément constitué de molécules dont les poids moléculaires sont pour l'essentiel compris dans un domaine étroit par rapport à l'étendue globale des poids moléculaires utilisables telle qu'elle est indiquée ci-dessus. toutefois, il est également possible d'opérer avec des mélanges de poids moléculaires très diversifiés. Une purification complémentaire est assurée par adsorp- tion des impuretés protéiniques sur hydroxy apatite selon un mode opératoire discontinu, ou en utilisant des techniques de chromatographie sur colonne. Dans une technique de chromatographie sur colonne, on sépare trois populations distinctes de particules de HB Ag. Quant on applique une précipitation par PEG suivie par une absorption sur hydroxy apatite, on peut assurer une réduction de 1 à 1 000 du volume des échantillons. On peut finalement eliminer les impuretés protéiniques résiduelles au moyen des techniques classiques que constituent la séparation en bandes isopycniques, l'ultracentrifugation zonale et la chromatographie d'exclusion par fixation et exclusion sur Sépharose 4 B. La précipitation par PE6 du HB Ag élimine 96% des impuretés protéiniques du plasma. Une adsorption complémentaire des impuretés protéiniques sur hydroxy apatite (en discontinu) élimine en plus 905E des impuretés protéiniques, en laissant plus de 50% du HB Ag initial dans le surnageant. Après la séparation par isopycnométrie et la centrifugation zonale, le produit est dépourvu de toutes impuretés protéiniques du plasma. Les possibilités de mise en oeuvre de ces procédés ont été éprouvées en les appliquant à la purification de HB Ag à partir de 8 l de plasma de chimpanzé et de lots de 2 à 5 1 de plasma humain Par c,hromotographie en colonne sur hydroxy apa- tite on a montré que le HB Ag peut être réparti en trois différentes populations de particules : 1) une fraction contenant principalement des particules de 27 à 30 nm; 2) une fraction composée d'un mélange de particules de 27 à 30 nm, de filaments et de particules de 40 nm; 3) une fraction contenant principalement des particules de 20 nm. Dans le cadre de l'exemple de mise en oeuvre particulier considéré, on décrit ci-après la purification de antigène d'hépatite B par précipitation par le polyéthylène glycol, ad- sorption sur hydroxy apatite en discontinu, formation en bandes isopycniques, et centrifugation zonale. A- Précipitation de 1'antigène d'hépatite 3 par le polyéthylène glycol. De Rizzo et al, Inf. et Imm. 6: 335-338 (1972 > décrivent la purification de HB Ag au moyen de polyéthylène glycol. Diverses tentatives effectuées pour appliquer la procédure de De Rizzo et al n'ont conduit qu'à une purification de HB Ag par un facteur .2. Gracie aux perfectionnements ci-après on élimine 96% des protéines du plasma en assurant une récupération pratiquement quantitative du HB Ag 1) Pour la purification une unité totale (240ml) de plasma contenant du HB Ag est utilisée. 2) le pH du plasma est ajusté dans la gamme- d'environ 4,4 à 4,7 (valeur optimale:4,6) à la température ambiante normale, en y ajoutant du HCl 1,0 N, et le précipité formé est éliminé par centrifugation. 3) Au surnageant de l'étape 2, on ajoute goutte à goutte une solution à 30% de PEG 6000 dans l'eau distillée, jusqu'à atteindre une concentration de 2%, et le mélange résultant est laissé dans le réfrigérateur, une nuit, à une température d'environ 0 à 8% C de manie à faire précipiter les impuretés protéiniques comprenant le fibrinogène. Le surnageant est clarifié par centrifugation. En ce qui concerne cette étape, on doit reconnaStrs- que l'addition de toute quantité notable de-PEG provoquera la précipitation d'une certaine quantité de protéines comprenant le fibrinogène. En conséquence, il n'existe pas réellement de limite inférieure à la quantité de PEG à ajouter.Par contre, comme l'objet du procédé de l'invention est d'éliminer les impuretés du HB Ag, la présence de l'antigène dans le précipité obtenu dans cette étape doit entre évitée et en conséquence la limite su périeure à respecter pour la concentration de PEG est immédiate ment inférieure au niveau auquel des quantités importantes d'antigène précipiteraient en même temps que la fraction fibrinogène. En pratique, on a constaté qu'une concentration de 3,0 % en poids de PEG provoque la précipitation de quantités notables d'antigène avec la fraction fibrinogène à éliminer, qu'une concentration de 2,5% en poids de PEG est voisine du maximum acceptable et qu'une concentration de 2,0% en poids de polyéthylène glycol assure des résultats optimaux. 4) Après centrifugation, le précipité obtenu à étape 3 est jeté et la concentration en PEG du surnageant est ajustée pour être comprise approximativement entre 4,0 et 4,5 % en poids. Puis le surnageant est à nouveau conservé une nuit au réfrigérateur à une température d'environ 0 à è 8 C. En fait il pourrait être possible en pratique d'utiliser de-ns cette étape une concentration de PEG s'élevant à 8,0% en poids; toutefois, une augmentation de la concentration en PEG accroît également le risque de faire précipiter les ss et &alpha;-globulines et albumines en mssme temps que l'antigène. De ce point de vue, -on doit estimer qu'alors qu'une concentration élevée de polyéthylène glycol pourrait etre préférable , ou terme nécessaire, à la température ambiante, une concentration de 4,0 à 4,5% en poids de polyéthylène glycol convient aux températures de O à 80C. 5) Le précipité issu de l'étape 4 est consolidé par centrifugation et le culot est remis en suspension dans environ 200 ml d'eau distillée afin d'obtenir un mélange ayant approximativement le même volume que le plasma initial. 6) L'essentiel du PEG et une faible quantité de protéines sont éliminés de la suspension de 1'étape 5 par centrifugation après avoir ajusté le pH de la suspension dans une gamme approximative de 4,9 à 5,1 (valeur optimale 5,0) par une addition de NaOH 1,0 N goutte à goutte. En général, une buée blanche se produit pendant cet ajustement. 7) Le pH du surnageant limpide de étape 6 est à nouveau ajusté à environ 4,4 à 4,7 (optimal: 4,6) par une addition goutte à goutte de.HCl 1,0 N et du PFG est ajouté jusqu'à atteindre une concentration finale d'environ de 4,0 à 4,5% en poids0 Les produits sont à nouveau conservés une nuit dans le -réfrigérateur à environ O à 80 C et ils sont ensuite centrifugés. il convient de noter que les mêmes considérations exposées en liaison avec l'étape 4 s'appliquent également dans ce cas. Le précipité de l'étape 7, qui contient l'antigène, est remis en suspension dans environ 100ml d'eau distillée, afin d'obtenir un mélange ayant approximativement la moitié du volume du plasma initial. La purification qui précède peut être suivie sur la Figure 1, qui illustre les résultats de la répartition des protéines par électrophorèse sur acétate de cellulose après chaque étape individuelle de la purification. Sur la Figure 1, la ligne 1 représente et illustre les fractions protéiniques présentes dans le plasma initial contenant HB Ag, qui présente une allure typique de la répartition des protéines de plasma. La ligne 2 représente le surnageant après ajustement du pH à 4,6 (étape 2) et fait apparat tre des pertes dans le fibrinogène et dans la région des protéines La ligne 3 montre que la teneur en impuretés (en particulier fibrinogène) est encore abaissée par la précipitation à 2% d PEG (étape 3). La ligne 4 montre qu'unie grande quantité de protéines a été éliminée dans le premier surnageant à 4,0 à 4,5% PEG (étape 4).De la ligne 5, on peut conclure que le précipité d'HB Ag remis en suspension (étape 5) contient encore une quantité relativement importante d'impuretés protéiniques et de la ligne 6 on peut observer que l'allure de répartition des protéines n'a pas été sensiblement modifiée après précipitation de l'essentiel du PEG à un pH d'environ 5,0 (étape 6). La seconde précipitation à une 'concentration de 4,0 à 4,5% PEG (étape 7) élimine des quantités importantes d'impuretés du surnageant comme le montre la ligne 7 et la ligne 8 montre que le précipité final de HB Ag (à une concentration double ) ne comporte un pic important que dans la région &alpha; 2 et présente deux pics peu importants dans les régions de l'albumine et du fibrinogène (étape 8). Les résultats des étapes précédentes de purification sont résumés sur le tableau 1 d'où il apparaît clairement que: 1) dans les étapes de pré-purification (étapes 2, 3 et 4) 16% des protéines contaminantes sont éliminées sans perte de HB Ag; 2) la première précipitation à 4,0 à 45% de PEG (étape 5) assure une purification d'un facteur 4 ; 3) la seconde préci TABLEAU I PURIFICATION DE HB Ag PAR PEG 6000 ETAPE PRODUIT VOLUME (ml) PROTEINES (g) % DES PROTEINES TITRE HB Ag (CEP) INITIALES 1 Plasma 240 14,2 100 256-512 2 Plasma pH 4,6 240 13,2 93 256-512 3 2% PEG, surnageant 250 12,0 84 256-512 4 4,5% PEG, surnageant 270 8,2 58 0 5 4,5% PEG, précipité 200 3,6 25 256-512 6 4,5% PEG, précipité 200 3,4 24 256-512 pH 5,0 7 4,5% PEG, surnageant 230 2,4 18 2-4 8 4,5% PEG, précipité 100 0,5 3,6 512-1024 pitation à 4,0 à 4,5% de PE!; (étape 8) assure au total une purification du HB Ag par un facteur de plus de 24. Les facteurs qui contribuent à l'amélioration des résultats sont : 1) l'emploi de deux étapes successives de précipitation à une concentration en PEG d'environ 4,0 à 4,5 % en poids, et d'une étape intermédiaire dans laquelle le pH est légèrement augmenté jusqu'à 5,0 environ pour assurer une précipitation de certaines impuretés, conduit à une récupération quantitative élevée de l'antigène 2) l'utilisation de deux étapes de prépurification contribue également à l'élimination des impuretés génantes constituées par des protéines du plasma; 3) le titrage au moyen de solutions concentrées plutôt que de PEG solide , conduit à un meilleur contre des conditions de purification; 4) le fait d'abaisser la température après chaque addition de PEG a pour résultat que de plus faibles concentrations de PEG sont nécessaires pour une précipitation sélective et quantitative de HI) Ag B. Purification de l'antigène d'hépatite B sur hydroxy apatite. L'antigène dthépatite B, préparé par précipitation au moyen de PEG comme décrit ci-dessus,subit une purification complémentaire sur hydroxy apatite Comme la chromatographie en colonne sur hydroxy apatite implique de très faibles débits, on opère de préférence de manière discontinue. On ajoute au produit obtenu par l'étape 8 ci-dessus 100 ml d'veau distillée, de manière à constituer un échantillon comprenant approximativement 200 ml de produit sanguin fluide contenant approximativement 500 mg de protéine et ayant un titre de HB Ag de 256-512 (CEP). Le pi de l'échantillon est amené à 6,8 par addition de 10 ml de tampon phosphate 0,5 M. On ajoute à la solution 150 ml de sédiment d'hydroxyapatite en remplissage, et lton maintient le mélange sous agitation pendant une nuit à la température ambiante. Le mélange est ensuite centrifugé deux minutes à 2000 tr/mn ( en Sorvall ) et le surnageant est recueilli. Le sédiment est lavé deux fois avec 100 ml de tampon phosphate de 0,02 M à un pH de 6,8. Le surnageant et les liqueurs de lavage sont réunis ensemble, concentrés par ultrafil traton , et le volume est ajusté à 1 2 ml à l'aide d'un tampon phosphate 0,02 M contenant 0,02 % d'azide de sodium. Le sédiment d'hydroxyapatite ainsi lavé est élué deux fois à l'aide de 100 ml de tampon phosphate 0,1 M à un pH de 6,8 et deux fois avec 100 ml de tampon 0,2 M. Les éluats sont réunis et concentrés par ultrafiltration et le tampon est remplacé par du phosphate 0,02 M à pH 6,8. Enfin, l'échantillon est ajusté à 12 ml au moyen d'un tampon 0,02 M contenant 0,02 % d'azide de sodium. La concentration de protéine est déterminée par mesure de la D.O. (densité optique) à 280 nm ( E = 1,42 ) comme indiqué sur le tableau 2 TABLEAU 2 Protéines Total Echantillon Volume D.O. 280 nm mg/ml protéines Surnageant et liqueurs de lavage 12 ml 1662 (îOxdil) 4,7 56 mg Eluats phosphate 0,1- 0,2 M 12 ml 2.455(10xdil) 17,3 208 mg L'activité antigénique est mesurée par CEP (Coefficient d'efficacité protéique ).Les résultats sontindiqués sur le tableau 3 TABLEAU 3 Total Titre Echantillon Volume protéïnes HB Ag Produit initial con tenant HB Ag soumis à adsorption sur hy- 200 ml 500 mg 256-512 droxy apatite. Surnageant et liqueurs de lavage. 12 mi 56 mg 1024- 2048 Eluats phosphate 0,1- 0,2 M. Les résultats indiqués ci-dessus montrent qutenviron 50 % du HB-Ag, mais seulement 10 % des protéines totales sont élués de l'hydroxyapatite. C- Traitement d'une préparation de HB Ag exclue d'hydroxyapatite, par formation de bandes isopycniques. Un échantillon de HB Ag purifié par précipitation par PEG et par adsorption des impuretés protétniquas sur hydroxyapatite (comme décrit ci-dessus ) est soumis à une purification complémentaire par formation de bandes isopycniques. Un échantillon de 12 mi contenant 56 mg de protéine et ayant un titre de HB Ag (CEP) de 1024-2048 est concentré par ultrafiltration à 3,0 mi. La solution est divisée par fractions égales et répartie dans trois tubes à gradient CsCl linéaire, plais centrifugés dans un rotor SW 65 Spinco à 35 OD0 tr/mn pendant 24 heures.Des fractions de 10 gouttes sont recueillies à ltécoulement de la partie inférieure.Ces fractions,après dilution à 0,5 ml à l'aide d'un tampon Tris 0,05 à pH 7,5 sont analysées en ce qui concerne les protéines, en mesurant la D.O. à 280 nm et l'activité antigénique par des techniques de CEP. -La Fig.2 représente les résultats des mesures d'analyse des protéines ( D.0. 280 nm), d'activité HB Ag et de densité dans CsCl. Les échantillons recueillis au voisinage du pic d'activité- antigénique ( fractions 18 à 28) sont réunis, dialysés et concentrés à 3 ml de volume. Il apparait clairement des résultats de la Fig.2 que la plupart des impuretés protéiniques de haute densité ( premier pic D.0.) sont éliminées par l'adsorption sur hydroxyapatite. D Centrifugation zonale de vitesse en gradient sucrose L'échantillon, après précipitation par PE6, traitement sur hydroxyapatite et par formation - de bandes i so p y c n i q u e s, subit une purification supplémentaire par ultrafiltration zonale, Un gradient de sucrose linéaire est préparé par mélange de fractions égales, chacune de 14,5 ml, de solutionscontanant 25 % en poids et 10 76 en poids de sucrose dans du phosphate 0,02 M à pH 7,6 et contenant 0,02 % en poids d'azide de sodium. L'échantillon est appliqué en trois parties aliquotes de 1 ml et centrifugé à 23 000 tr/mn pendant 18 heures. Des fractions d'environ 0,5 mi chacune sont recueillies goutte à goutte à la partie inférieure. Les protéines des échantillons sont analysées par mesure de la D.O. à 280 nm et l'activité antigénique est déterminée par les deux tech niques de CEP (coefficient d'efficacité protéinique) et RIA (Essai radio-immunologique ). Les résultats des analyses sont représentés sur la Fig.3. L'luat, selon la Fig.3, est réparti en sept fractions, dialysé et concentré. On ne trouve qu'une faible quantité d'impuretés de faible poids moléculaire ( deux petits pics D.O.) qui sont séparées distinctement du pic de grande largeur contenant Ag. Les fractions concentrées sont soumises à une autre- analyse par immunoélectrophorèse.Les fractions I à IV réunies ne montrent aucune présence d'impuretés de protéines sériques, en utilisant de l'antisérum contre les protéines sériques humaines. L'analyse par microscopie électronique des fractions I à IV révble principalement des filaments courts dans la fraction I (Fig.4), une dimension moyenne de 27 nm de particules rondes dans la fraction II -( Fig. 5), principalement des particules de 20 nm dans la fraction III (Fig.'6),et des particules de 20 nm et des particules plus petites dans la fraction IV'( non illustrée). Les résultats de la procédure globale de purification peuvent être suivis sur le tableau 4. Celui-ci montre clairement que la precipitation par PEG a pour résultat une purification du HB Ay par un facteur de plus de 24 et une r écu pération de 83 S; de l'activité initiale. Le HB Ag est séparé en deux fractions par le traitement sur hydroxyapatite. Le surnageant de l'étape d'adsorption sur hydroxyapatite, représentant 40 % de l'activité HB Ag initial, est encore purifié par formation de bandes isopycniques et ultracentrifugation zonale de vitesse. Des fractions de cette dernière étape sont réunies comme le montre la Fig.3 et des études analytiques détaillées sont poursuivies.Ces fractipns ne contiennent aucune impureté protéinique sérique normale qui soit décelable par une technique dtimmunoélectrophorèse sensible. De plus,elles traduisent une purification de HB Ag de 400 à 1200 fois, et contiennent 43 % de l'activité de départ. Ainsi que le montrent les Fig.4 à 6, la fraction I contient essentiellement les filaments courts, la fraction II est principalement constituée de particules sphériques mesurant 27 nm de diamètre et la fraction III contient notamment des sphères de 20nanomètres. La fraction III se distingue par une forte activité antigénique et un meilleur rendement de récupération de l'activité initiale (tableau 4). TABLEAU 4 RESULTATS DE LA PURIFICATION PROTEINES TITRE ACTIVITE ETAPE ECHANTILLON VOLUME TOTAL (CEP) SPECIFIQUE RENDEMENT UNITES/mg % Plasma initial 240 ml 14,2g() 256-512 4,3-8,6 100 I 1er Précipité PEG 200 ml 3,6g() 256-512 14-28 83 II 2ème Précipité PEG 100 ml 0,5g() 512-1024 102-104 83 III Hydroxy-apatite, Surnageant 12 ml 56mg() 1024-2048 205-410 40 Hydroxy-apatite, Eluat 12 ml 208mg() 1024-2048 51-102 40 IV Fractionnement isopycnique du 16,3mg( ) 225-450 surnageant d'hydroxy-apatite 3 ml 43,0mg() 3200-6400 600-1200 31 V Ultracentrifogation Fraction I 3 ml 1,06( ) 640-1280 1800-3600 3 Fraction II 2,5ml 1,93( ) 1280 1600 5 Fraction III 3 ml 6,84( ) 6400-12800 2800-5600 31 Fraction IV 3 ml 0,45( ) 800 5300 4 () Kjehldahl () E 0,1% 1 cm = 1,42 ( ) E 0,1% 1 cm = 3,73 E- Purification à grande échelle d'antigène d'hépatite B impliquant une chromatographie sur hydroxyapatite. L'antigène d'hépatite B est purifié à partir de 8 1 de plasma de chimpanzé ( type ad), 5 l de plasma humain ( type adx ) et 2 1 de plasma humain ( type ayx). La procédure de purification comprend une précipitation deux fois par du polyéthylène glycol conformément aux modes opératoires indiqués ci-dessus, suivie par une chromatographie sur colonne d'hydroxyapatite. Les résultats obtenus pour la purification de l'antigène de chimpanzé sont indi- qués à titre d'exemple. a- Précipitation par le polyéthylène glycol. On soumet 800 mi de plasma sanguin à une précipitation par PEG conformément à la méthode décrite ci-dessus. Toutes les conditions sont identiques, sauf les quantités du produit et l'ori- gine du plasma initial. Les résultats de ces opérations sont indiqués ster le tableau 5 ci-après. TABLEAU 5 Echantillon Volume Tite HB Ag Protéines(mg/ml) # # (CEP) Plasma initial 8 000 ml 1:500 55 Second précipité 250 ml 1: 10 000 52 Ainsi, on a obtenu par rapport au HB Ag une purification par un facteur 20. b- Chromatographie sur colonne. Une fraction aliquote (50 ml) d second précipité de PEG dans l'eau est appliquée à une colonne de 500 ml d'hydroxyapatits et la colonne est éluée avec un élurent progressif à 3 paliers comportant un gradient interrompu de tampons phosphate de 0,02 M, 0,05 M et 0,10 M ( 1 litre chacun ) ayant un pH de 6,8. On recueille des fractions de 10 ml. Le HB Ag présent dans l'éluet est déterminé par CEP et les protéines sont analysées par mesure de la D.O. à 280 mn. Les résultats sont indiqués dans la Fig.7. Les fractions de pic de l'éluat, selon la 'Fig.7, sont réunies, concentrées par ultrafiltration et analysées. Les résul tats sont résumés par le tableau 6. Une microscopie électronique du premier pic de HB Ag révèle principalement des particules de 25 à 30 nm, la fraction de pic II contient des particules de dimensions variables comprenant de gros filaments et des particules de 40 nm, et la fraction de pic III contient essentiellement des particules de 20 nm. Il est évident de ce qui précède que la chromatographie sur colonne d'hydroxyapatite remplit un double but : (1) éliminer une grande quantité d'impuretés protéiniques. (2) séparer trot populations différentes de HB Ag. Les explications données dans le cours de la description qui précède de quelques modes de mise en oeuvre préférés du procédé selon l'invention ainsi que les indications chiffrées qui figurent dans cette description et dans les tahleaux et figures auxquels elle se réfère, font clairement apparattre les propriétés et caractéristiques du produit que ce procédé permet d'obtenir, dans ces différents modes de mise en oeuvre.Ces données indiquent en partiuulier les caractéristiques d'activité antigénique contre l'hépatite de type B que présentent ces produits,sous forme du titre en antigène de surface d'hépatite-B ( titre CEP) ou du nombre d'unités d'activité spécifique par milligramme,en liaison avec les particularités de leur mode de préparation, ainsi que les caractéristiques de répartition des particules et de pureté protétnique Ces produits entrent avantageusement dans la constitution de préparations pharmaceutiques, contenant l'antigène de surface actif contre hépatite B de tels produits selon i'invention,dans un milieu physiologiquement acceptable. Ces préparations,qui font également ltobjet de l'invention,peuvent entre utilisées comme vaccin pour prévenir les contagions hépatite de type B. Des produits et préparatbns préférés se distinguent par : - l'antigène est présent sous forme de particules et filaments de 27 à 30 nanomètres et de particules de 40 nanomètres; - l'antigène est présent sous forme de particules de 27 à 30 nanomètres principalement, - l'antigène est présent sous forme de particules d'environ 20 nanomètres;; - et par les titres (CEP) et les activités spécifiques en antigène de surface hépatite B qui sont indiquées par le tableau 4, TABLEAU 6 ECHANTILLON VOLUME HB Ag DILUTION D.O. 280nm PROTEINES PROTEINES (CEP) mg/ml (*) TUTAL mg Fraction I (tubes 1-85) 4 ml 10000 1/10 2,26 15,7 62,7 Fraction II (tubes 85-100) 6ml 10000 1/10 2,079 14,6 87,8 Fraction III (tubes 101-120) 5ml 10000 1/100 0,526 37,0 185,2 Fraction IV (tubes 121-150) 6ml 800 1/10 2,620 18,5 110,7 Fraction V (tubes 151-186) 6ml 800 1/10 1,730 12,2 73,1 Fraction VI (tubes 187-210) 10ml 50000 1/100 1,407 99,1 991,0 Fraction VII (tubes 211-240) 7ml 12000 1/100 0,691 48,7 340,6 (*) E0,1% = 1,42 les fractions étant définies par les figures et la description correspondante. Selon le mode de mise en oeuvre, le titre est avantageusement de l'ordre de 512-1024, 256-512, 1024-2048, 640-1280 ou 6400- 12800, et l'activité spécifique de l'ordre de 205-410,225450, 600-1200, 1800-3600, 1600, 2800-5600 ou 5300. Naturellement, il doit dtre entendu que ces modesde mise en oeuvre de ltinvention ne sont nullement limitatifs. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'antigène dthépatite de typez très purifié à partir de produits sanguins fluides contenant cet antigène, par élimination des impuretés que contiennent ces produits, caractérisé en ce qu'il comporte des étapes suivant lesquelles : on maintient le pH d'un produit sanguin approximativement compris entre 4,4 et 4,7, on mélange à ce produit, dont on maintient ainsi le pH, du polyéthylène-glycol de préférence en concentration de 4,0 à 4,5% en poids environ par rapport au poids total du mélange obtenu, pour former un précipité contenant l'antigène d'hépatite, de type B, on sépare et recueille ledit précipité et on lui ajoute de l'eau en quantité suffisante pour obtenir un produit fluide intermédiaire ayant sensiblement la même concentration en antigène d'hépatite de type B que le produit sanguin initial, on donne audit produit intermédiaire un pH approximativement compris entre 4,9 et 5,1 pour former ainsi un précipité contenant des substancesprot,éiniques et du polyéthylène-glycol et une phase fluide contenant l'antigène d'hépatite de type B, on sépare et recueille ladite phase fluide et l'on ajuste son pH à un pH approximativement compris entre 4,4 et 4,7, on mélange à ladite phase dont on maintient le pH entre ces valeurs du polyéthylèneglycoL de préférence en concentration d'environ 4,0 'à 4,5% en poids par rapport au poids total du mélange, pour former ainsi un précipité qui contient l'antigène d'hépatite de type X, et l'on sépare et recueille ledit précipité contenant l'antigène purifié. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'après chacune des étapes de mélange, la température des mélanges, à une concentration de polyéthylène-glycol de l'ordre de,, 4,0 à 4,5% en poids, est maintenue approximativement comprise entre O et 8 C pendant la formation du précipité correspondant. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 cara-ctérisé en ce que, le produit sanguin initial contenant du fibrinogène., il comporte en outre- des étapes suivant lesquelles- :- on mélange audit produit sanguin initial, tandis que l'on maintient son pH ap proxima*ivement- entre 4,4 et 4,7, une quantité de polyéthylèneglycol provoquant la précipitation du fibrinogène, quantité d'au plus 2,596 du poids total du mélange, pour former un précipité contenant le fibrinogène, et l'on sépare ledit précipité du reste du produit; précipité que l'on élimine. 4.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la température des mélanges, après chacune des étapes de mé- lange, est maintenue approximativement comprise entre 0.et 80C pendant la formation du précipité correspondant. 5. Procédé selon la revendication I ou 2, caractérisé en ce que les étapes consistant à séparer et recueillir un précipité comportent une centrifugation. 6. Procédé selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce qu'il comporte, préalablement à l'étape de précipitation de fibrinogène, des étapes suivant lesquelles on ajuste le pH du produit sanguin initial approximativement entre 4,4 et 4,7 et on élimine tout précipité éventuellement formé. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que chacune des étapes consistant à séparer et recueillir, à sé- parer ou à éliminer un précipité, comporte une centrifugation. 8. Procédé selon llune quelconque des revendications 1,2 et 5 caractérisé en ce que le polyéthylène-glycol utilisé dans chacune des étapes du mélange est sous forme d'une solution aqueuse. 9. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que la so- lution de polyéthylène-glycol contient 30% en poids environ de polyéthylène-glycol. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications3,4,6 et 7 caractérisé an ce que le polyéthylène-glycol utilisé dans chacune des étapes du mélange est sous forme de solution2aqueuse. 11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que la - solution de polyéthylène-glycol contient 3D en poids environ de polyéthylène-glycol. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-à 11, caractérisé en ce qu'il comporte une purification complémentaire de l'antigène contenu dans ledit précipité contenant l'antigène purifié recueilli, par adsorption des impuretés protéiniques successivement sur hydroxy apatite, par formation de bandes isopyc niques et par ultracentrifugation zonale. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications t à 11, caractérisé en ce qu'il comporte une purification complémentaire de l'antigène contenu'dans ledit précipité contenant l'antigène purifié recueilli, par adsorption sur hydroxy apatite. 14. Procédé selon la revendication 13; caractérisé en que l'ad- sorption est effectuée par chromatographie en colonne. 15. Procédé de préparation d'antigène d'hépatite de type B très purifié à partir de produits sanguins fluides contenant cet antigène, par élimination des impuretés que contiennent ces produits, caractérisé en ce qu'il comporte des étapes suivant lesquelles on maintient le pH d'un produit sanguin approximativement compris entre 4,4 et 4,7, on mélange à ce produit, dont on maintient ainsi le pH, de 4,0 à 4,5% en poids environ de polyéthylène-glycol, par rapport au poids total du mélange obtenu, pouryformer un précipité contenant l'antigène d'hépatite de type B, on sépare et recueille ledit précipité et on lui ajoute de l'eau en quantité suffisante pour obtenir un produit fluide intermédiaire ayant sensiblement la même concentration en antigène d'hépatite de type B que le produit sanguin initial, on donne audit produit intermédiaire un pH approximativement compris entre 4,9 et 5,1 pour former ainsi un précipité contenant des substances protéiniques et du polyéthylène-glycol et une phase fluide contenant l'antigène d'hépatite de type X, on sépare et recueille ladite phase fluide et l'on ajuste son pH à un pH approximativement compris entre 4,4 et 4,7, on mélange à ladite phase dont on maintient le pH entre ces valeurs, environ 4 > 0 à 4,5% en poids de polyéthylène-glycol par rapport au poids total du mélange, pour former ainsi un précipité qui contient l'antigène d'hépatite de type B, on sépare et recueille ledit précipité contenant l'antigène purifié, et l'on soumet ledit précipité contenant l'antigène purifié à une adsorption sur hydroxy apatite en colonne chromatographique en utilisant un gluant progressif à trois paliers. 16. Procédé de préparation d'antigène d'hépatite de type B, caractérisé en ce que l'on applique une certaine quantité de fluide-aqueux contenant un antigène d'hépatite detype B purifié en concentration notable à une colonne de chromatographie d'hydroxy apatite, on élue la colonne au moyen d'un éluant progressif à trois paliers et l'on recueille séparément au moins trois fractions distinctes de l'éluat de la colonne. 17. Préparations contenant de l'antigène d4hépatite de type B telles qu'obtenues -parle procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 18. Préparations pharmaceutiques, utilisables notamment en tant que vaccins, contenant de l'antigène d'hépatite de type B tel qutob- tenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 dans un milieu physiologiquement acceptable. 19. Préparation selon la revendication 17 ou 18, caractérisée en ce que l'antigène est présent -sous forme de particules de dimensions inférieures à 40 nanomètres, et de préférence de l'ordre de 20-30 nanomètres. 20. Préparation d'antigène d'hépatite B, caractérisée en ce qu'elle contient, dans un milieu physiologiquement acceptable, de l'antigène de surface d'hépatite B concentré, présent essentiellement sous forme de particules de 27 à 30 nanomètres. 21. Préparation d'antigène d'hépatite B; caractériséeen ce qu'elle contient, dans un milieu physiologiquement acceptable, un mélange de particules et filaments de 27 à 30 nanomètres et de particules de 40 nanomètres d'antigène de surface d'hépatite B. 22. Préparation d'antigène d'hépatite B concentrée contenant es- sentieXllement.des particules d'antigène de surface d'hépatite B de 20 nanomètres. 23. Préparation selon la revendication 22, caractérisée en ce qu'elle présente seulement un pic important, dans la régiontls 2, à l'examen par électrophorèse sur acétate de cellulose. 24. Préparation selon la revendication 23, caractériséeen ce qu'elle est dépourvue d'impuretés protéiniques. 25. Préparation selon la revendication 22 ou 23, caractérisée en ce qu'elle présente deux pics peu importants, dans les régions de l'albumine et du fibrinogène, à l'examen par électrophorèse sur acétate de cellulose. 26. Préparation selon l'une quelconque des revendications 20 à 25, caractérisée an ce qu'elle présente un titre en antigène de surface d'hépatite B de 512-1024 CEP. 27. Préparation selon l'une quelconque des revendications 20 à 25, caractérisÉe en ce qu'elle présente un titre en antigène de surface d'hépatite B de 256-512 CEP. 28. Préparation selon l'une quelconque des revendications 20 à 25, caractérisée ence qu'elle présente un titre en antigène de surface d'hépatite B de 1024 2048 CEP. 29. Préparation selon l'une quelconque des revendications 20 à 28, caractériséeen ce qu'elle est dépourvue d'impuretés protéine ques décelables par immunoélectrophorèse. 30. Préparation d'antigène d'hépatite B de surface, caractérisée en -ce qu'elle présente une activité antigénique de surface visà-vis de l'hépatite B de 205-410 unités d'activité spécifique par milligramme. 31. Préparation d'antigène d'hépatite B de surface, caractérisée en ce qu'elle présente une activité antigénique de surface visà-vis de l'hépatite B de 225-450 unités d'activité spécifique par milligramme. 32. Préparation d'antigène d'hépatite 13 de surface, caractérisée en ce .qu'elle présente une activité antigénique de surface visà-vis de l'hépatite B de -600-1200 unités d'activité spécifique par milligramme. 33. Préparation d'antigène d'hépatite 13 de surface, caractérisée en ce qu'elle présente une activité antigénique de surface visà-vis de- l'hépatite B de 1800-3600 unités d'activité spécifique par milligramme. 34. Préparation d'antigène d'hépatite B de surface, caractérisée en ce qu'elle présente une activité antigénique de surface visà-vis de l'hépatite B de 1600 unités d'activité spécifique par milligramme. 35. Préparation d'antigène d'hépatite B de surface, caractérisée en ce qu'elle présente une activité antigénique de surface visà-vis de l'hépatite B de 2800-5600 unités d'activité spécifique par milligramme. 36. Préparation d'antigène de surface d'hépatite B à 5300 unités d'activité spécifique par milligramme. 37. Préparation selon la revendication 35, caractériséeen ce qu'elle présente un titre d'antigène de surface d'hépatite B de 6400-12800. 38. Préparation selon la revendication 33, caractérisée an ce qu'elle présente un titre d'antigène de surface d'hépatite B de 640-1280. 39. Application pharmaceutique d'une préparation selon l'une quelconque des revendications 20 à 38, notamment en tant que vaccin pour son activité antigênique vis-à-vis de l'hépatite de type B.