Brevet FR2322871A1 — publié le 19770401

La présente invention a pour objet des perfectionnements apportés à la préparation de l'albumine, plus particulièrement de l'albumine sanguine, à partir de sang, de sérum sanguin ou de plasma sanguin. L' albumine du sang est une protéine hydrosoluble que l'on peut isoler du sang, du sérum sanguin ou du plasma sanguin. L' albumine provenant du sang1 du sérum sanguin ou du plasma sanguin est utilisée en médecine, par exemple comme palliatif à une baisse du volume plasmatique et pour corriger l'hypoprotéinbmie. L'albumine de sérum bovin extraite du sang1 du sérum ou du plasma de bovidés, trouve des utilisations multiples en chimie et en biochimie. Les méthodes actuelles de préparation de l'albumine comprennent la précipitation ou le fractionnement, à l'aide de sels minéraux et/ou de solvants organiques, par exemple le fractionnement selon Cohn. Ces procédés exigent un soin considérable pour leur mise en oeuvre, ce qui entraxe des dépenses importantes. La présente invention a pour objet de réduire au minimum les inconvénients des procédés existants ou tout au moins d'enrichir l'arsenal des procédés de préparation de l'albumine sanguine. Or, la Demanderesse a troussé que lwon peut préparer 1' albumine sanguine en séparant au moyen de résines échangeuses d'ions anioniques, une fraction protéinique contenant de l'albumine du sérum sanguin ou du plasma sanguin, puis en opérant une dénaturation sélective des protéines contenues dans le produit, à l'exception des albumines que l'on peut alors séparer des autres protéines ainsi dénaturées. L'invention a ainsi pour objet un procédé de préparer tion d'albumine sanguine, caractérisé en ce qu'on sépare, à l'aide d'une résine échageuse durions anionique, dont les groupes échangeurs sont choisis parmi des groupes amiflO, alkylamino et guanidino et des ions d'ammoniums quaternaires, à partir de sérum sanguin ou de plasma sanguin, une fraction de protéines sanguines contenant de 1' albumine, ou òrme une solution aqueuse de cette fraction de protéines sanguines contenant de 1' albumine et on ajoute à la solution un agent stabilisant qui empêche la dénaturation de l'albumine par la chialeur, agent composé d'une ou plusieurs subtances choisies parmi l'acétyltryptophane, des acides gras à chatte moyenne, et des sels de ces substances; on soumet la solution à une dégradation par la chaleur des prothéines sanguines autres que l'albumine, puis on sépare les protéines dénaturées du produit obtenu, ce qui laisse l'albumine sanguine en solution. La présente invention comprend aussi 1' albumine sanguine qui a été préparée selon le procédé défini dans le paragraphe précédent. On peut obtenir les sérums sanguins utilisables dans le présent procédés en laissant se coaguler du sang entier, puis en séparant le. sérum liquide des matières solides, par exemple par expression. On peut obtenir les plasmas sanguines par centrifugation de sang entier, en vue de séparer le plasma des cellules sanguines, de préférence avec une centrifugeuse à grande vitesse de type classique. Dans le cas de sang provenant d'animaux, par exemple de sang de bovidés, on peut réaliser aisément la séparation du plasma sanguin aussi bien sur les lieux de la congélation ou en d'autres endroits des abattoirs. Le sang est pris directement sur l'animal, on y ajoute de préférence un anticoagulant tel que de l'oxalate de sodium, on place le sang dans une centrifugeuse, et on collecte la phase légère en l'espèce le plasma. Il va de soi qu'il ncest pas nécessaire d'effectuer la séparation en mole temps ou dans le même lieu que la collecte du sang, à condition que le sang soit convenablement traité par un anticoagulant et qu'il soit stocké dans des conditions appropriées jusqu'à son utilisation. Pour mettre en oeuvre plus facilement le procédé de la présente invention il est préférable de traiter d'abord le sérwn ou le plasma sanguin de façon à obtenir, en solution, une concentration ionique plus basse. Ce résultat peut être obtenu par n'importe quelle méthode connue de dessalage du plasma, par exemple avec un appareil d'ultra-filtration ou au moyen de cellules électrolytiques. Cependant, on préfère abaisser la force ionique en diluant le sérum ou le plasma avec de l'eau distillée. L'augmentation, qui en résulte, du volume de la solution de sérum ou de plasma destinée au traitement ne présente pas d'inconvénient pour le présent procédé. On réalise l'étape de séparation entre les protéines sériques et le sérum ou plasma sanguins, de préférence après avoir abaissé la force ionique en solution, en utilisant une résine échangeuse d' ions anionique dont les groupes échangeurs sont choisis parmi des groupes amino, alkylamino et guanidino, et des ions d'ammoniums quaternaires. La résine échangeuse d'ions anionique peut etre formée d'une matrice constituée d'une résine synthétique ou d'un polysaccharide, par exemple de cellulose, apte à retenir des macromolécules organiques, par exemple les protéines. La résine échangeuse d'ions doit titre capable de fixer des macromolécules, entre autres des protéines, sans déformation ni dénaturation de celles-ci.Les résines diétylamino-éthyliques (DEAE), comme la DEAE cellulose et le DEAE- dextranne, se sont avérées particulièrement efficaces, et on leur donne la préférence.Comme résines de ce genre, on peut citer des résines à base de celluloses régénérées réticulées, dont les groupes échangeurs sont des groupes DEY:1 commercialisées en Nouvelle Zélande par Tasman Vaccine Laboratory Ltd sous la désignation nProtion", ainsi que des résines à base de dextranne réticulé, dont les groupes échangeurs sont des groupes DEAE, commercialisées par la firme suédoise Pharmacie, sous le nom "DEAE-Sephadex". On peut effectuer l'étape de séparation, par exemple en amenant le sérum ou le plasma (tels quels ou en solution) en contact avec la résine échangeuse d'ions, selon l'un quelconque des nombreux procédés classiques, entre autres les procédés sur colonne, par échange à contre-courant, ou dans un récipient muni d'un agitateur, fonctionnant en discontinu. On soumet alors la résine à une étape de lavage, puis on l'élue avec une solution tampon appropriée, pour l'essentiel conformément aux techniques classiques de séparation par échange d'ions. Cependant, avec la résine échangeuse d'ions préférée qutest le ProtionZ', on peut se contenter d'agiter la résine dans le sérum dilué ou le plasma dilué, puis de séparer du liquide la résine traitée, par exemple par décantation ou filtration. Après lavage, on peut agiter la résine traitée avec une solution tampon appropriée, en vue de mettre les protéines en solution, puis séparer la solution ainsi -obtenue de la résine régénérée, par exemple par décantation ou par filtration. La solution ainsi obtenue comprend une fraction de protéines sanguines contenant une proportion d'albumine plus ou moins importante, laquelle est composée pour l'essentiel d'albumine et d'autres protéines sanguines, entre autres des - et - globulines. On ajoute à cette solution un agent capable de stabiliser l'albumine contre la dégradation thermique. Comme agents stabilisants appropriés on citera l'acétyl-trypto- phane et des acides gras à channe moyenne (par exemple en C7 C11), ou des sels de ces composés, par exemple des octoates de métaux alcalins ou alcalino-terreux, à faibles concentrations. On a constaté que l'octoate de sodium est un agent stabilisant particulièrement approprié. On peut utiliser des mélanges de deux ou de plus de deux agents stabilisants de ce genre. Après avoir ajouté l'agent stabilisant et, de préférence, ajusté'le pH au voisinage de 7, par exemple à 7,0 + 0,1, on soumet la solution à une opération de dénaturation par la chaleur, par exemple en amenant la solution à une température suffisamment élevée, mais réglée de manière à ce qu'il se produise seulement une dégradation sélective des protéines présentes autres que l'albumine. On refroidit ensuite la solution ainsi obtenue et on en sépare les protéines dénaturées, ce qui laisse l'albumine stabilisée en solution. La séparation des protéines sanguines dénaturées s'effectue de préférence par filtration, par centrifugation, ou par une combinaison des deux procédés. On peut réaliser la filtration avec un adjuvant de filtration, au moyen d'un filtre presse à plateau ou, de préférence, un filtre à tambour préenduit. La centrifugation peut litre effectuée à l'aide d'une centrifugeuse continue à grande vitesse. On débarrasse de préférence encore une fois la solution ainsi obtenue d'albumine diluée des composés à bas poids moléculaire, et en même temps on la concentre par ultra-filtration. Le concentré d'albumine obtenu peut alors être lyophilisé, ce qui donne 1' albumine sous la forme d'une poudre amorphe, ou utilisé pour obtenir une solution d'albumine ayant toute concentration souhaitée. On peut également purifier encore plus le concentré en le diluant avec de l'eau distillée, puis en le soumettant encore une fois à l'ultrafiltration; on obtient ainsi une proportion encore plus faible de composés à bas poids moléculaire dans le concentré, ou dans la poudre ou la solution que l'on peut obtenir à partir de ce concentré. On peut utiliser le procédé de l'invention pour préparer n'importe quelle albumine sanguine à partir du sang total, du sérum sanguin ou du plasma sanguin, par exemple pour préparer de l'albumine à partir de sang humain, ou préparer de l'albumine de sérum de bovins à partir de sang de bovidés. L'utilisation d'une résine échangeuse d'ions anionique au début de l'opération conforme à la présente invention présente deux aspects importants. D'une part, elle permet la séparation d'une fraction de protéines sanguines riche en albumine, d'où une diminution des protéines dénaturées qu'il faut séparer après l'étape de dégradation par la chaleur. Ouand on utilise la résine échangeuse d'ions "Protion", on peut obtenir un produit pur à plus de 99%. D'autre part, ce qui est aussi important, ce fractionnement élimine les - globulines qui pourraient résister à l'étape ultérieure de dénaturation par la chaleur et contaminer le produit final.La fraction riche en -globulines séparée peut être utilisée pour la récupération de -globulines. Ce qui suit est un exemple d'exécution de l'invention appliquée à la préparation d'albumine de sérum bovin. EXEMPLE 1) Récolte du sang et séparation du plasma. On recueille du sang de bovin frais, avec un minimum d'agitation mécanique, dans des récipients en acier inoxydable d'une capacité d'environ 12 litres, qui ont été traités sur leur surface interne avec 50 ml d'une solution à 30% d'oxalate de sodium à pH 7,4. On transfère ensuite le sang dans un récipient d'alimentation de 40 1 placé à environ 120 cm au dessus d'une centrifugeuse continue "VestphaliaSAOH 205t qu'on a ajustée avec de l'eau pour obtenir les débits approximatifs suivants Entrée, à 1,20 m de l'alimentation : 240 litres/heure Phase épaisse (1,8 kg/cm2) : 200 litres/heure Phase légère (0,15 kg/cm2) : 40 litres/heure. Après le début d'écoulement du sang dans ces conditions, on peut accrottre la proportion de la phase légère (plasma) jusqu'à environ 50% du produit introduit- Le réglage de ltopération en vue d'obtenir les conditions optimales exige une surveillance continue, mais une amélioration considérable peut être apportée à l'opération si l'on utilise une machine fonctionnant en permanence, c'est-à-dire une récupération du plasma sans surveillance. On recueille la phase légère dans un conteneur transportable, puis on l'amène de l'installation de congélation au laboratoire, en vue du traitement ultérieur. 2) Purification préliminaire de l'albumine. On sépare au préalable l'albumine du plasma en fixant l'albumine ainsi que quelques contaminants sur une résine échangeuse d'ions "Protion A21,, puis en lavant et en éluant la fraction riche en albumine, de la manière décrite ci-dessous. Après régénération d'un cycle précédent, on stabilise le pH du "Protion" à 6,5 à l'aide du tampon A (1380 ml d'acide acétique glacial, 792 ml d!éthylène-diamine diluée à 40 litres, le pH étant ajusté à 6,5), puis on lave à l'eau jusqu'à ce que l'éluat ait une conductance spécifique au plus égale à 5,1 m.mho/ cm à 250C, La résine est alors prête pour recevoir le plasma. On ajuste à 6,5 le pH du plasma, tel qu'il est reçu des installations de congélation, à raide de 1 ml d'acide acétique, on dilue jusqu'à une conductance spécifique au plus égale à 5,1 m.mho/cm à 250, on l'abandonne jusqu'au lendemain à 20C puis on fait passer l'équivalent de 1 litre de plasma par kg de résine sur la colonne à un débit environ 2,3 litres/heure/kg. Le lit de résine utilisé présente un rapport diamètre/longueur d'environ 2/1, mais il existe un grand nombre de dispositions également valables. Il est également-possible d'utiliser un système de tamponnage moins-coflteux que celui mentionné. Après que la totalité du plasma dilué a passé à travers la résine, on lave-avec un volume égal de tampon B (tampon A dilué avec de l'eau dans le rapport 1/20 ou avec un volume de tout autre tampon suffisant pour produire un effluent limpide, presque incolore. On élue ensuite la fraction riche en albumine avec la solution C (1700 g de NaCl + 1 litre de tampon A, dilués jusqu'à un volume de 20 litres), par passage à un débit de 1 litre/heure/kg de résine, en utilisant 2,0 litres par kg de résine. Tandis que l'on soumet la-solution au traitement ultérieur, on régénère la colonne à l'aide delta solution D (1200 g de NaCl + 400. g de NaOH, le tout étendu à 20 litres). 3) Elimination des autres protéines. On dilue la fraction riche en albumine jusqu'à une concentration de 1% en albumine et on ajoute 15 ml/litre d'une solution d'octoate de sodium (40 g de NaOH + 80 ml d'acide octoSque, le tout étendu à 500 ml). Après un bon mélange, on ajuste le pH à 7,0 puis on chauffe aussi vite que possible à 700C (environ en 10 à 15 minutes, ou, de préférence, encore plus rapidement), on la maintient à cette température pendant environ 25 à 30 minutes et on la refroidit rapidement à 300, et à ce moment on ajuste le pH à 4,5 au moyen d'HCl 10%. Le programme exact de chauffage doit être adapté en fonction de l'appareillage utilisé, pour que la solution soit maintenue à 700C pendant le laps de temps minimum nécessaire pour une dénaturation complète de toutes les autres protéines. Dans certains cas une durée de 20 minutes srest montrée appropriée, mais on constate que c'est là le minimum absolu. Après mélange pendant environ une minute, on amène rapidement la solution au voisinage de son point de congélation. La température à laquelle s'effectue l'abaissement du pH modifie la nature du précipité et des expériences récentes tendent à montrer qu'il vaut mieux effectuer cet abaissement à 20. On peut appliquer deux procédés pour clarifier cette solution a) on abandonne la solution jusqu'au lendemain, au voisinage de son point de congélation, puis, au matin, on soutire le surnageant limpide. Celui-ci est mis de c8té et la solution restante est diluée avec un volume égal d'veau et on ajoute un agent de filtration ( UHyfloSSuper-Cel'') à raison de 25 g/litre. On filtre ensuite la bouillie sur un filtre-presse à cadre et plaque, en utilisant des pièces de calicot prérevêtues de 2 mm de "Hyflo Super-Celn. En utilisant la presse indiquée on fait passer 250-g d'adjuvant de filtration mis en bouillie dans 20 litres d'eau, pour 6400 cm2 de plaque. b) On filtre directement la solution comme décrit ci-dessus, en commençant par l'addition de l'adjuvant de filtration. Si la solution a été obtenue par la méthode a), on combine le surnageant et le filtrat. Si elle a été obtenue par la méthode b), on continue de la traiter telle quelle. Les conditions de filtration dépendent dans une grande mesure de l'appareillage utilisé. On soumet la solution ci-dessus à une filtration clarifiante finale en la faisant passer à travers un lit dad- juvant de filtration de 2 mm d'épaisseur. Pour finir, on ajuste le pH à 7,0 avec 1 mole de NaOH (environ 26,4 ml/litre) et 1 mole d'acide acétique si nécessaire. 4) Ultrafiltration et déssalage. A ce stade, la concentration de la solution d'albumine purifiée est de 1% ou moins, et il est nécessaire de la concentrer jusqu'à environ 15% avant le séchage final. Pour réaliser cette concentration, on conserve la totalité de la solution au voisinage de son point de congélation et on la fait circuler à l'aide d'une pompe péristaltique, à un débit d'environ 200 ml/mn, à travers un filtre ayant un revêtement de 1 micron et deux "Dow Miniplant Ultrafilters C/HFU-10", montés en série. Les "Miniplants" fonctionnent sous pression réduite (400 à 600 torrs), ce qui donne un débit d'ultrafiltrat de 7 litres/heure pour une solution d'albumine à 1%, débit qui tombe à 1,4 litre par heure pour une solution d'albumine à 12%.Après la concentration initiale, on mesure les taux d'albumine et de NaCl et, d'après les résultats obtenus, on dilue le concentré à l'eau, puis on le reconcentre de façon à ce que, lorsqu'on obtient un produit pulvérulent, la teneur de celui-ci en NaCl soit comprise entre 0,8f et 1,2%. Etant donné que l'appareil à ultrafiltration utilisé a un pouvoir séparateur pour un poids moléculaire de 30 000, toute substance ayant un poids moléculaire inférieur à cette valeur est éliminée, à moins qu'elle ne soit liée à l'albumine. 5) Lyophilisation. Le séchage de la solution à 15% prend normalement environ 10 heures par litre sur un cryo-dessicateur centrifuge Edwards Modèle 30 P 2/677. La chambre de séchage fonctionne à 380C, sous une pression de 0,16 Torr. Une fois sèche, la poudre doit être transférée rapidement dans des récipients étanches, car l'absorption d'eau est très rapide. Si possible, on utilise une chambre à faible degré hygrométrique. On pense qu'un "Rotary-Drum Vacuum Filter" (filtre à vide à tambour tournant ) avec une couche Hyflo Super-Cel et une racle, à l'entrée d'un micromètre automatique, peuvent convenir pour la clarification ou la filtration grossière de la solution résultant de la dénaturation par la chaleur. Avec cet appareil, l'opération est rendue semi-automatique, d'où une moindre dépense de main oeuvre. Gracie au procédé de l'invention, il est possible obtenir de l'albumine de sérum bovin répondant aux spécifications BSA suivantes 1) Description : Poudre d'un blanc cassé. 2) Solubilité : Très soluble dans l'eau. 3) Couleur de la solution : E 1%cm #0,050 (solution aqueuse à 10%, A # 0,5) à 404 nm, cellules de 10 mm. 4) pH de la solution aqueuse à 10% : 7,0 + 0,1. 5) Teneur en humidité : 3,0% après passage sur P205 à 11000 sous une pression inférieure à 5 torrs pendant 16 heures, N.M.T. 6) Cendres (sulfatées) : 20% (N.M.T.) 7) Teneur en azote : 15,50% (N.M.T ) 8) Acides gras : # 2 moles/mole d'albumine. 9) Métaux (Cu, Zn, Hg, Pb) : 20 ppm au total (N.M.T.). 10) Electrophorèse Acétate de cellulose (NLT) = 99,5% Gel d'acrylamide : 2 à 3 bandes. 11) Teneur en NaCI : 0,8 à 1,2%. REVENDICATIONS 1.- Procédé de préparation d'albumine sanguine, caractérisé en ce que l'on sépare à l'aide d'une résine échangeuse d'ions anionique, dont les groupes échangeurs sont choisis parmi des groupes amino, alkylamino et guanidino et des ions d'ammoniums quaternaires, à partir de sérum sanguin ou de plasma sanguin, une fraction de protéines sanguines contenant de l'albumine, on forme une solution aqueuse de cette fraction de protéines sanguines contenant de l'albumine et on ajoute à la solution un agent stabilisant qui empêche la dénaturation de l'albumine par la chaleur, agent composé d'une ou de plusieurs substances choisies parmi l'acétyltryptophane, des acides gras à channe moyenne et des sels de ces substances, on soumet la solution à une dégradation par la chaleur des protéines sanguines autres que l'albumine, puis on sépare les protéines dénaturées du produit obtenu, ce qui laisse l'albumine sanguine en solution. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractErisé-en ce que l'on prépare de l'albumine sanguine à partir de sérum sanguin. 3.- Procédé-selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on prépare de l'albumine sanguine à partir de plasma sanguin. 4.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la résine échangeuse dolions anionique est une résine diéthylaminoéthylique. 5.- Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la résine diétylaminoéthylique est une résine de cellulose régénérée réticulée, les groupes échangeurs étant des groupes diéthylaminoéthyles. 6.- Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la résine diéthylaminoéthylique est une résine de dextranne réticulée, les groupes échangeurs étant des groupes diFthylamino- éthyles. 7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'agent stabilisant est un octoate de métal alcalin ou alcalino-terreux. 8,- Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'agent stabilisant est ltoctoate de sodium. 9.- Procédé selon l'une quelconque des revendications pré cédentes, caractérisé en ce que l'on abaisse la concentration ionique du sérum ou du plasma sanguin avant l'étape de séparation par échange d'ions. 10.- Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'on abaisse la concentration ionique du sérum ou du plasma sanguin par dilution avec de l'eau distillée. 11.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution de la fraction de protéines sanguines contenant de l'albumine, après addition de l'agent stabilisant, est ajustée à un pH voisin de 7 et soumise à une dénaturation par la chaleur à une température suffisamment élevée, mais réglée de manière à dénaturer sélectivement les protéines sanguines, à l'exception de l'albumine, puis elle est refroidie et acidifiée. 12.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les protéines dénaturées sont séparées par filtration et/ou centrifugation du produit provenant de l'étape de dégradation par la chaleur, ce qui laisse l'albumine sanguine en solution. 13.- Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la solution d' albumine obtenue est débarrassdedes matières à bas poids méloculaire et simultanément concentrée par ultrafiltration. 14.- Procédé selon la revendication 13., caractérisé en ce que la solution concentrée d' albumine obtenue est lyophilisée, puis diluée avec de l'eau distillée jusqu'à la concentration souhaitée, ou bien elle est purifiée par dilution avec de l'eau distillée et ultraìltration. 15.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on utilise pour la préparation d'albumine du sérum de bovin.