Brevet FR2331350A1 — publié le 19770610

les acides nucléiques qui, sous la forme d'acides désoxyribonucléiques, représentent le matériau de base de l'information génétique de tous les organismes et virus et, sous la forme d'acides ribonucléiques, se trouvent comme ARN (=acides ribonucléiques) messagers, de transfert et ribosomiques, sont déjà connus depuis longtemps. On connatt également les substrats pour la synthèse de ces substances, à savoir les désoxy ou ribonucléosides triphosphates et leurs dérivés. Mis à part L'ANS (= l'adénosinemonophosphate) cyclique, la GNP (= guanosinemonophosphate) cyclique et la guanosine tétra et pentaphosphate, on ne connaissait jusqu'à présent aucun nucléotide ayant des fonctions régulatrices dans des systèmes biologiques. La Dexrnderesse a maintenant préparé par voie de fermentation et aus si par voie chimique des nuoléotides de formule générale I, dans laquelle X est un système mono ou polycyclique ayant 5 à 10 atomes de carbone qui peut contenir jusqu'à 6 atomes d'azote et, en outre, éventuellement jusqu'à 3 atomes oxygène, éventuellement substitué par un groupe -ER1 R'2, dans lequel R' et R'2 sont chacun de l'hydrogène, un groupe alcoyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone, -DR'1 R'2 pouvant également faire partie d'un noyau hétérocyclique éventuellement substitué par l'oxygène, ou un groupe aralcoyle ayant de 7 à 9 atomes de carbone, par un groupe hydroxy éthérifié éventuellement par un reste alcane ayant de 1 à 4 atomes de carbone ou par un groupe mercapto, Y est un atome dthydrogène, un groupe hydroxy, amino ou le groupe -CH(CH3)OC2H5 et Z1 à Z6 représentent chacun un atome d'oxygène oude soufre à-D représentent chacun un atome d'oxygène, le groupe CH2- ou le groupe MI- et m et n représentent 0 ou 1, sous réserve que l'on n'ait pas simultanément X = guanine, Y = OH, Z1 à Z5 et A à C = oxygène, m = O et n = O ou 1, en particulier les nucléotides adénosine-5'-diphosphate-3'-diphosphate, adénosine-5'-triphos phate-3 '-diphosphate, ainsi que adénosine-5 '-triphosphate-3 '-triphos- phate.Elle a également découvert que ces substances inhibent la croissance des tumeurs, elles sont en conséquence appropriées comme médicaments pour le traitement du cancer. La présente demande est donc relative aux composés de formule I, leur préparation chimique et microbiologique, ainsi que leur utilisation pour inhiber ainsi que guérir des maladies tumorales de toutes sortes. Parmi les composés de formule I sont préférés ceux dans lesquels les restes A à D représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'oxygène ou le groupe CH2 et les autres restes ont les significations données ci-dessus. Les composés particulièrement préférés sont ceux dans lesquels Z1 à Z6 représentent un atome d'oxygène et A à D représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'oxygène ou le groupe CH2. Les composés ayant un intérêt particulier sont ceux dans lesquels X représente une base purique ou pyrimidique, en particulier une base purique ou pyrimidique naturelle, Z1 à Z6 ainsi que A à D représentent chacun un atome d'oxygène. Les composés ayant un intérêt tout particulier sont ceux dans lesquels X représente un reste adénine, Z1 à Z6 ainsi que A à D représentent chacun un atome d'oxygène et Y un groupe hydroxy. Les composés de formule I peuvent être préparés comme suit On peut partir de composés de formule II dans lequel X est un système mono ou polycyclique ayant de 5 à 10 atomes de carbone qui peut contenir jusqu'à 6 atomes d'azote et, en outre, éventuellement, jusqu'à 3 atomes d'oxygène, éventuellement substitué par un groupe -NR'1 R'2 dans lequel R'1 et R'2 représentent de lthydrogène, un groupe alcoyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone, -E'1 R'2 pouvant également faire partie d'un noyau hétcrocy- clique éventuellement substitué par un atome d'oxygène, ou un groupe aralcoyle ayant de 7 à 9 atomes de carbone, par un groupe hydroxy éthérifié éventuellement par un reste alcane ayant de 1 à 4 atomes de carbone, ou par un groupe mercapto, et Y représente le groupe hydroxy et Z1 et Z2 représnntent chacun, indépendamment l'un de l'au- tre, un atome d'oxygène ou de soufre, que l'on fait réagir selon le procédé de Simoncsits et Tomasz. Biochim. Biophys. Acta 340 (1974), 509 515 avec un éther vinyléthylique pour obtenir les composés de formule II dans lequel Y est -CH(CH3)OC2R5. Les composés obtenus sous forme -de leurs sels de tri-n-octylammonium peuvent être transformés dans un solvant approprié, de préférence le dioxanne anhydre, à l'aide de tri-n-octyle-amine et un agent de phosphorylation de formule III dans laquelle Z est un atome d'oxygène ou de soufre, Hal est un atome d'halogène et R est un groupe phényle éventuellement mono- ou disubstitué par une combinaison quelconque des restes suivants : un groupe alcoyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone, un groupe alcoxy ayant de 1 à 4 atomes de carbone, un atome d'halogène, un groupe tri fluorométhyle ou un groupe nitro, de préférence un ester diphényli- que d'acide chlorophosphorique, à une température comprise entre îO0C et le point d'ébullition du solvant, de préférence à la température ambiante, pendant 1 à 10 heures, de préférence 2 heures, en composés de formule I dans lequel X représente un système mono ou polycyclique ayant de 5 à 10 atomes de carbone qui peut contenir jusqu'à 6 atotres d'azotes et en outre, toventuellement, jusqu'à 5 atomes d'oxygène, éventuellement substitué par un groupe NR'î R'2 dans lequel R'1 et R'2 représentent chacun de l'hydrogène, un groupe alcoyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone, SR' R'2 pouvant également faire partie d'un noyau hétérocyclique éventuellement substitué par de l'oxygène, ou un grou pe aralcoyle ayant de 7 à 9 atomes de carbone, par un groupe h roxy éthérifié éventuellement par un reste alcane ayant de 1 à 4 atomes de carbone ou par un groupe mercapto; Z1 à Z6 représentant chacun, indépendammant l'un de l'autre, un atome d'oxygène o-r un atome de sou fre, A à,C un atome d'oxygène, 7 le grouse -CH(CH3)OC2H5 ot n = m = O.Les restes R peuvent être éliminés par traitement à te: ature ambiante avec du monophosphate de tri-n-butyl-ammonium. L es Produits bruts peuvent être traités ultérieurement après év poration du solvant sans purification. Par hydrolyse acide, le groupe -CH(CH3)OC2H5 est élimine pour donner un composé dans lequel Y = OH. Après neutralisation et addition d'eau, on purifie par extraction à l'aide d'un solvant non miscible à l'eau et par chromatographie sur colore. Pour obtenir les composés de formule I dans lesquels n = m = 1 et Y = OX, on part de composés de formule I dans lesquels r = m = O et Y = -CH(CH)OC2H5, dont les produits bruts introduits dans l'eau et extraits à l'aide d'un solvant non miscible à l'eau sont amenés à siccité et sont à nouveau phosphorylés comme décrit ci-dessus. Après hydrolyse acide et chromatographie sur colonne, on obtient des composés de formule I dans lesquels n = m = 1 et Y = OH. Une autre possibilité de préparation des composés de formule I réside dans la réaction de composés de formule II dans laquelle Y = -CH(CH3)OC2H5 avec un carbodiimide, de préférence le di-cyclohexylcarbodiimide (DCC), et une amine de formule IV dans laquelle R1, R2 = H, un groupe alcoyle en C1 -C4 ou un groupe aralcoyle, R1 et R2 pouvant former ensemble un reste alcoylène qui peut être substitué par un atome d'oxygène, de préférence la morpholine, dans un solvant approprié, de préférence le t-butanol, à une température comprise entre la température ambiante et le point d'ébullition du solvant, pendant 2 à 20 heures, pour obtenir des composés de formule V dans laquelle X, Y, Z1 et Z3 sont tels que définis à la formule II. On chasse le solvant, le résidu est traité par addition d'eau, extraction à l'aide d'un solvant non miscible à l'eau, puis porté à sec, dissous dans un solvant approprié, par exemple le méthanol et précipité pour le purifier. Après traitement et évaporation plusieurs fois avec un solvant sec, de préférence la pyridine, afin de débarrasser complètement le produit d'eau, on traite avec un sel de pyri minium d'acide phosphorique ou un ester d'acide phosphorique ou un composé de formule VI dans laquelle Z'1 et Z'2 = de oxygène ou du soufre, A = de l'oxygè- ne, CH2 ou NB, R' = un groupe phényle éventuellement substitué, dans un solvant, de préférence de la pyridine sèche, pendant plusieurs heures à 100 C, ou à une température allant jusqu'au point d'ébullition du solvant, de préférence à la température ambiante. Après avoir chassé le solvant, soit on réalise immédiatement une hydrolyse acide, soit on traite lors de l'utilisation d'ester phosphorique préalablement avec du monophosphate de tri-n-butyl-ammonium et après neutralisation et chromatographie sur colonne, on obtient des composés de formule I dans lesquels n et m sont tous les deux égaux à O ou 1. Dans le cas où l'on doit obtenir des composés de formule I dans lesquels n = 1, m = O ou N = O, m = 1, on fait réagir des composés de formule VII avec un mélange d'acide phosphorique ou d'ester d'aci de phosphorique et de composé VI et on purifie le mélange obtenu par chromatographie sur colonne. Les composés de formule I peuvent toutefois également être préparés par voie microbiologique. Comme microorganismes on utilise des bacilles, par exemple B. substilis ou B; cereus et d'autres organismes de différenciation comme par exemple B. Dictiostelium discoidium. Des cellules humaines ou animales dans des milieux de culture peuvent cependant aussi entre utilisées dans ce but. A cet effet, les organismes peuvent être cultivés dans différents milieux nutritifs qui contiennent en général du glucose comme source de carbone. tes composés de formule I souhaités apparaissent en général vers la fin de la croissance logarithmique ou au début de la phase stationnaire. Be point de croissance maximale peut être déterminé par chromatographie. Lorsque la quantité maximale s'est formée, on acidifie, de préférence avec de l'acide formique, à pH 3-4, de préférence 3,4, on élimine la masse biochimique par centrifugation et les composés selon l'invention sont séparés par chromatographie sur colonne et purifiés. La purification peut être conduite comme décrit dans Rhaese, Grade und Dichtelmüller, Europ. J. Biochem. 56, 385-392 (1975). En outre, les composés selon la présente demande peuvent être préparés à l'aide de membranes ou de vésicules de membranes des microorganismes mentionnés. Les vésicules de membranes peuvent être obtenues d'après R. Kaback, Methods in Enzymology 22, 99 (1971). Bes membranes peuvent par exemple être obtenues par traitement des microorganismes avec le lysozyme et un détergent qui peut contenir du sulfate de magnésium. Après sédimentation des membranes, ces dernières sont purifiées par centrifugation répétée dans du sucrose à 20 %. La préparation des composés de formule I à l'aide de membranes ou de vésicules de membranes est obtenue dans un milieu réactionnel qui peut être composé de la façon suivante : un tampon, de préférence le tris-(hydroxyméthyl) amino-méthane ("Tampon tris"), des sels de magnésium, ammonium ou potassium, de préférence sous forme d'acétates, un anti-oxydant, par exemple le mercapto-éthanol ou le dithiothreitol, ainsi qu'un nucléoside triphosphate, de préférence l'ATP, ou leurs analogues, au cas où A à D ou Z1 à Z6 ne seraient pas de l'oxygène. Be pH peut être compris entre 5 et 8, de préférence 7,8, la température entre 5 et 550 C, de préférence 370 C et la durée de réaction peut varier entre de larges limites, mais cependant est de préférence 5 heures. Les composés souhaités peuvent être préparés en continu ou en discontinu. La fermentation est stoppée par acidification, de préférence par l'acide formique. Les membranes sont séparées par centrifugation et les composés de formule I dans lesquels m et n peuvent être égaux à O ou 1 sont purifiés par chromatographie. Exemple I Procédé de préparation de composés de formule I par voie biologique. 1. Isolement des vésicules de membranes L'isolement est réalisé par analogie avec une méthode de R. Eaback (Methods in Enzymology, 22, 99, 1971). Une masse humide de B. subtilis (1 g) est mise en suspension dans 80 ml de KHP04O,1 M à pH 7,3 et à 20 % de saccharose et incubée à 770 C avec 0,5 mg/ml de lysozyme pendant 60 mn. On centrifuge ensuite à 25 000 x g à la température ambiante. Le sédiment est introduit dans 1 ml de KHP04 0,1 M, à pH 6,6, à 20 9' de saccharose, et contenant 20 mM de Mg 504. La suspension est agitée dans 400 ml d'une solution contenant 50 mM de KHPO4, à pH 6,6 à 370 C. Après 15 mn à 370 C on ajoute 4 ml dtEDTA 1 M et on incube encore pendant 15 mn.Ensuite, on ajoute encore 4 ml de MgS04 1,5 M et on incube à nouveau pendant 15 mn. Après centrifugation à 25 000 x g le sédiment est mis en suspension dans 50 ml de KHPO4 0,1 M, à pH 6,6 et contenant 10 mM d'EDTA. On centrifuge à environ 40 C pendant 5 mn à 400 x g, le sédiment est éliminé et le liquide surnageant à nouveau centrifuge à 30 000 x g pendant 20 mn. Le sédiment est introduit dans 50 ml de KHPO4 0,1 M, à pH 6,6, lavé 2 fois avec KHPO4 0,1 M, à pH 6,6 et enfin conservé à une concentration de 200 à 240 mg/ml dans KHPO4, à p9 6,6 à -8O0C. 2. Isolement des membranes Une masse humide de B. subtilis (1,0 g) est mise en suspension dans 20 ml de Tris 0,1 M à 10 9' de saccharose, à WF 8,0 et est incubée à 37 C avec 0,5 mg/ml de lysozyme dans EDTA 0,05 M (acide éthylènediaminotétraacétique). Après 60 mn, on ajoute 20 ml d'une solution à 20 % de Brij de MgS04 0,05 M et on laisse reposer à température ambiante pendant environ 5 à 10 mn jusqu'au clarification de la suspension. Après centrifugation à 25 000 x g pendant 10 mn, on met en suspension le sédiment dans 80 ml d'un liquide contenant 20 mM de Tris, 15 mM de NgSO4, à PH 8,0; chaque portion de 20 ml est ajoutée à 2 ml d'une solution de saccharose à 20 % dans 20 mN de Tris, 15 mN de MgS04 à pH 8,0 et centrifugée à 40 000 x g pendant 15 mn. Le sédiment est remis en suspension dans des portions de 2 ml de 20 mN de Tris, 15 mM de MgSO4 à pH 8,0, purifié et à nouveau centrifugé à 40 000 x g.Le sédiment est lavé deux fois avec du Tris-acétate 0,1 M, à pH 7,8 et conservé à une concentration de 200-250 mg/ml dans du Tris-acétate 0,1 M, pH 7,8 à -800 C. 3. Masse réactionnelle La réaction est réalisée dans un volume total de 50 pu, qui contient les constituants suivants : Tris-acétate, à pH 7,8 (42 mN) acétate Mg (11,4 mN), acétate NE4 (27 mM), acétate K (10 mN), dithiothreitol (1,4 mM), ATP (2 mN), membranes (50 mg/ml) H20 pour compléter à 50 pl. La masse est incubée pendant 5 heures ou plus à 370 C sous légère agitation. La réaction est arrêtée par addition d'un p1 d'acide formique à 98 9', est incubée à 40 C pendant 15 mn et la solution est clarifiée par centrifugation à 10 000 x g. Le liquide surnageant est conservé à -800 C jusqu'à purification par chromatographie. Le rendement est d'environ 5 à 30 *. a) Variante de la masse d'ineubation Les sels ci-dessus sont utilisés en une concentration 10 fois supérieure. b) Synthèse en continu La masse réactionnelle ci-dessus (une quantité 10 fois supérieure) est introduite dans un tube de dialyse. Ce dernier est suspendu dans 100 ml de la solution réactionnelle ci-dessus (concentration en sels 10 fois supérieure) et la solution de dialyse est agitée à température ambiante ou 370 C. Au fur et à mesure que la réaction progresse, la solution est renouvelée ou le tube de dialyse est rempli avec une solution reactionnelle fraîche. On peut également travailler dans un appareil de dialyse (comme par exemple celui fourni par Amicon). 4. Préparation d'analogues à l'aide de membranes 4.1 - Lorsque dans la masse réactionnelle l'ATP est remplacé par 1mN de u "g -méthylène-ADP et 1 mM d'ATP, on obtient le composé de for- mule I dans lequel X = adénine, A = CH2, C = Z1 4 = oxygène, n = m- O et Y = OH. 4.2 - Avec 2 mM de ,f, &alpha; -méthylène -ATP à la place deATP on obtient le composé de formule I, dans lequel X = adénine, A = C = Z1-4 = oxygène, B = D = CH2, Y = OH et n = m = t. 4.3 - Avec 2 mM de W thio-ATP à la place de ATP, on obtient le composé de formule I dans lequel X = adénine, Y = OH, A - D = Z1 4 = oxygène, Z5 = Z6 = soufre et n = m = 1. 4.4 - Avec 2 mN de 5'-adénylylimidodipho phate à la place de ATP, on obtient le composé de formule I dans lequel X = adénine A = C = Z1-4 = oxygène, B = D = NH, n = m = 1. De même, on peut obtenir par remplacement de l'ATP par ATP-7-Noxyde, ATP-1-N-oxyde ou par d'autres dérivés de l'ATP comme les dérivés N-6-méthylique, N-6-diméthylique, benzylique ou benzoylique, ainsi que par les composés thio correspondants, les composés de formule I correspondants. 5. Purification sur DEAE-Séphadex G25 Le produit brut obtenu sous le paragraphe 3 est dilué 10 fois et introduit sur une colonne de DEAE-Séphadex (dont la taille est adaptée au volume réactionnel). Après lavage avec KHPO4 0,01 M, à pH 3,4, l'ATP excédentaire est éliminé avec KFIPO4 0,3 M à pH ),4. Ensuite, le produit est élué avec une faible quantité de Tris-RCl, à pH 6,5 et conservé à -80 C. Les rendements sont compris entre environ 5 et 30 % par rapport au triphosphate introduit. 6. Isolation des composés de formule I (X = adénine, Z1 6 = A-D = oxygène, n = m = O ou I ou n = 1 et m = O) à partir-de microorga nismes Des bacilles à sporules comme par exemple B- subtilis ou B. cereus et d'autres forment à la fin de la phase de croissance logarithmique des nucléotides hautement phosphorylés de formule I dont les restes ont les significations données précédemment. Ces nucléotides peuvent être isolés du milieu de culture, en particulier par adsorption sur un échangeur d'irons et élution ultérieure avec un gradient de sels. Pour l'isolation de, par exemple, des composés de formule I dans lesquels X = adénine, Y = OH, Z1 - Z6 et A-D = oxygène et n = m = 1, on récolte le milieu de culture en un point de croissance maximale qui, suivant l'organisme utilisé se trouve entre T (fin de la crois o sance logarithmique) et T2 (2 heures après). Dans le cas de B. subtilis, on ajoute à environ T1 suffisamment d'acide formique pur, à 00 C pour obtenir un pH de 3,4. Après environ 1 heure à 00 C on centrifuge, le liquide surnageant est dilué 10 fois avec de 1'eau et on le fait passer sur QAE-Séphadex. On :remplit une colonne avec le Séphadex et on lave avec ,HOP04 0,01 M, à pH 3,4 jusqu'à ce que la couleur brune ait disparu. Par élution fractionnée avec un gradient de sels linéaire, on peut ensuite isoler les nucléotides désirés en différentes fractions sous forme pure. La fraction souhaitée est diluée 5 fois, adsorbée sur DEAE Séphadex, lavée avec Tris-HCl 0,01 M à pH 7,0 et ensuite éluée avec du bicarbonate de triéthylamine 1 N ou d'autres tampons. Lors de l'utilisation de tampons volatils, on lyophilise. 7. Organismes utilisables D'une façon analogue à celle décrite sous 1 à 6, on peut réaliser l'isolation de vésicules de membranes ou de membranes également à partir d'autres microorganismes à sporules, comme par exemple B.c reus ou B. mégatérium. Etant donné que d'autres cellules d'origine animale ou humaine, dans un milieu de culture, forment ces nucléotides, on peut également obtenir les composés de formule I à l'aide de ces organismes ou organes par l'une des méthodes décrites ci-dessus. Préparation des composés de formule I par voie chimique. Exemple 2 Composés de formule I dans laquelle X = adénine, Y = OH, Z1,6 et A-D = oxygène, n = m = O ou 1 (Schéma 1 : composé XI, X = adénine et composé XII, X = adénine) 2.1 - Adénosine-3'-5'-diphosPhate (VIII. X = adénine) La préparation est décrite dans J. Am. Chem. Soc. 83, 663, (1961). 2.2 - 2'-0-(1"-éthoxyéthyl)-adénosine-3'-5*-diphosphate (IX, X= adénine) Be composé VII est transformé par un procédé analogue à celui décrit dans Biochim. Biophys. Acta 340, 509 (1974) en composé IX. Bes rendements déterminés par spectroscopie sont de 20 à 50 ,. Be produit est chromatographiquement pur. Valeur de Rf : voir Tableau 1. Spectre-UV : identique à celui du composé 7. 2.3 - 2'-0-(1"-éthoxyéthyl) adénosine-3'-5'-dipyrophosphate (composé X, X =adénine) Be sel tétrakis-tri-n-octylammonium du composé de formule II (préparé à partir de 20 Moles du sel de bis-triéthylammonium) est laissé au repos avec 72 yM d'éther diphénylique d'acide chlorophosphorique et 47 r de tri-n-octylamine dans du dioxane exempt d'eau à 250 C. Après environ 1 heure, on ajoute une solution de monophosphate de tri-n-butylammonium 0,5 M dans 0,4 ml de pyridine, et on laisse au repos à nouveau pendant 30 mn à 250 C. ta solution est évaporée à sec et l'huile résiduelle est évaporée à siccité plusieurs fois avec de la pyridine absolue.Ce produit brut est utilisé pour les synthèses suivantes 2.4 - Adénosine-5B-5'-dipyrophosPhate (XI, X = adénine) Bye produit brut du composé X est traité avec un ml d'acide acétique à 10 ffi à 250 C pendant 30 mn. Après neutralisation avec NH4OH dilué, on ajoute de l'eau distillée jusqu'à un volume de 30 ml et on extrait cette solution plusieurs fois à 1V éther. On verse la solution sur une colonne de DEAE (1 x 16 cm), on lave à liteau, et on élue le composé XI avec un gradient linéaire de bicarbonate de triéthylammonium 0-0,5 M, à pH 7,5. Par chromatographie en couche mince, on détermine les fractions contenant le composé XI.Ces dernières sont réunies , concentrées à sec introduites dans du méthanol (i ml) et précipitées avec 10 ml d'éther sec. Be rendement est d'environ 10 j (détermination spectrophotometrique). Be produit est chromatographiquement pur. 2.5 - Adénosine-3'-triphosphate-5'-triphosphate (Xiî, x =adénine) te produit brut du composé XI est introduit dans environ 30 ml d'eau et extrait plusieurs fois à l'éther. La solution est évaporée à sec et additionnée d'ester diphénylique d'acide chlorophosphorique (70 moles), de tri-n-octylamine (40 moles), et de 5 à 10 ml de dioxane exempt d'eau) et laissée au repos pendant 60 mn à 250 C. Ensuite, on ajoute 0,4 ml d'une solution 0,5 M de monophosphate de tri-n-butylammonium dans 0,4 ml de pyridine et on laisse au repos pendant 30 mn à 250 C. On concentre alors à sec, on additionne d'1 ml d'acide acétique à 10 % et on laisse encore au repos pendant 30 mn à 250 C. On neutralise avec Mt4OH et on complète à 30 ml avec de l'eaù distillée. Après extraction à l'éther, la solution aqueuse est versée sur une colonne de DEAE (forme carbonate, 1 x 16 cm), cette dernière est lavée à I1 eau et le produit réactionnel est séparé avec un gradient. linéaire de bicarbonate de triéthylammonium 0-1,0 M. Par chromatographie en couche mince, on détermine les fractions contenant le composé de formule XII, celles-ci sont réunies et concentrées à sec.Après introduction dans 1 ml de méthanol, le composé XII est précipité avec 10 mi d'éther. Be produit est instable et doit etre conservé à environ -200 C. L'addition d'ATP à 10-30 % convient pour stabiliser le produit. Be rendement du composé XII est d'environ 10 % par rapport au composé brut de formule XI introduit (détermination spectrophotométrique). Schema 1 Exemple 3 Composé de formule I dans laquelle X = adénine, Y = OH, Z1 6 = A-D = oxygène, n = m = O (Schéma 2 : composé XI, X = adénine) 3.1 - 2'-0-(1"-éthoxyéthyl)-adénosine-3'-5'-diphosphomorpholi- date (XIII. X = adénine) Le 2'-0-(1"-éthoxyéthyl)-adénosine-3'-5'-diphosphate (X) est converti en sel de morpholinium comme décrit par J.G. Moffat et E.G. Khorana dans J. Am. Chem. Soc. 83, 674 (1961). Ce composé (1 mmol) est dissous dans un mélange de 10 ml d'H20, 25 ml d'alcool t-butylique et 0,7 ml (8 mmol) de morpholine et ensuite on ajoute 10 mmol de dicyclohexylcarbodiimide. Après ébullition sous reflux pendant 3 heures, on évapore l'alcool t-butylique, on porte la solution aqueuse résultante à 25 ml avec de l'eau et on extrait plusieurs fois à l'éther. Ensuite, on concentre à sec sous vide. Le résidu est dissous dans un minimum de méthanol et la solution est concentrée sous vide avec précaution jusqu'à un volume d'environ 4 ml. On ajoute ensuite de l'éther absolu.Le précipité qui apparat est filtré et après lavage à l'éther on obtient le 2'-0-(1"-éthoxyéthyl)-adénosi- ne-3'-5'-diphosphomorpholidate (XIII). 3.2 - Adénosrne-3'-5'-dinyrophosphate (XI, X = adénine) Le composé XIII (0,2 mmol) est séché par concentrations répétées avec de la pyridine absolue, de mdme que 0,6 mmol de sel de pyridine de l'acide phosphorique (préparé à l'aide de Dovex 50R, sous forme pyridine). Les deux composés sont réunis, on additionne à nouveau de la pyridine absolue, on concentre à sec et on dissout finalement dans de la pyridine absolue (10 ml > . Après 15 heures à température ambiante on concentre à sec. Après évanoration répétées sous vide avec de l'eau, on élimine la pyridine. Ensuite on ajoute de l'acide acétique à 10 9', on neutralise après 30 mn à température ambiante, on porte à 30 ml le volume et on introduit la solution sur une colonne de DEAE-Séphadex (1 cm x 15 cm). Après lavage à l'eau, on élue avec un gradient linéaire de 0-0,5 M de bicarbonate de triéthylamine. Par chromatographie en couche mince, on détermine les fractions contenant le composé XI, on les réunit et on poursuit le traitement comme décrit ci-dessus. Be rendement est d'environ 30 9'. La synthèse des analogues peut être conduite comme décrit cidessus lorsque l'on utilise à la place d'acide phosphorique de l'acide thiophosphorique ou d'autres composés analogues. Exemple 4 Composé de formule I dans lequel X = adénine, Y = OH, Z1-6 = A-D = oxygène, n = m = 1 (Schéma 2; composé XII, X = adénine) Adénosine-3-triphosphate-5'-triphosphate (I X =adénine) Le composé XIII est rendu anhydre comme décrit sous 3.2, de même pour le sel de pyridinium de l'acide pyrophosphorique. Les deux composés sont réunis et traités comme décrit sous 3.2. Be traitement est réalisé de la même manière que ci-dessus, sous réserve cependant qu'un gradient linéaire de 0,0 à 1 ,O M de bicarbonate de triéthylamine est utilisé. Le produit que l'on peut obtenir avec un rendement d'environ 10 à 20 % est identifié par analyse chromatographique en couche mince.L'adénosine-3'-triphosphate-5'-triphosphate est instable et ne doit être conservée qu'à -300 C. Ba purification par chromatographie sur colonne peut 4tre réalisée de façon appropriée à environ 40 C. Par utilisation de méthylenepyrophosphate ou de dithiopyrophosphate on peut obtenir les analogues correspondants avec des rendements compris entre 10 et 30 96. Schema 2 TABLEAU Valeur de R f des composés Composés Rf Cruanosine-5 I-triphosphate 0,50 Adénosine-5'-triphosphate 0,68 Adénosine-3'-5'-diphosphate 0,61 2'-O-(1"-éthoxyéthyl)-adénosine 0,76 3',5'-diphosphate ' Adénosine-3',5'-dipyrophosphate 0,44 Adénosine-3' ,5'-ditriphosphate 0,01 2'-O-(1"-éthoxyéthyl)-adénosine-3',5'- 0,95 diphosphomorpholidate Système solvant : phosphate tampon 1,5 M, pH 3,4. Chromatogramme en couche mince de Macherey et Nagel DWren/Rheinland, République Fédérale d'Allemagne (MN 300, polygram), à base de polyéthylèneimine de cellulose). REVENDICATIONS 1. Compost de formule dans laquelle X est un système mono ou polycyclique ayant 5 à 10 atomes de carbone qui peut contenir jusqu'à 6 atomes d'azote et, en outre, éventuellement jusqu'à 3 atomes d'oxygène, éventuellement substitué par un groupe -NR'l R'2, dans lequel R'1 et R'2 sont chacun de l'hydrogène, un groupe alcoyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone, -NR'l R'2 pouvant également faire partie d'un noyau hétérocyclique éventuellement substitué par l'oxygène, ou un groupe aralcoyle ayant de 7 à 9 atomes de carbone, par un groupe hydroxy éthérifié éventuellement par un reste alcane ayant de 1- à 4 atomes de carbone ou par un groupe mercapto, Y est un atome d'hydrogène, un groupe hydroxy, amino ou le groupe -CH(GH3)0C2H5 et Z1 à Z6 représentent chacun un atome d'oxygène de soufre, A à D représentent chacun un atome d'oxygène, le groupe CH2- ou le groupe NH- et m et n représentent O ou 1, sous réserve que l'on n'ait pas simultanément X = guanine, Y = OH, Z1 à Z5 et A à C = oxygène, m = O et n = O ou l. 2. Procédé de préparation de composés de formule I selon la revendication 1, dans lesquels on peut avoir également et simultanément X = guanine, Y = OH, Z1 à Z5 et A v C = oxygène et m = O et n = O ou 1, caractérisé en ce qu'on transforme un composé de formule II dans laquelle X, Z1 et Z2 ont les significations données à la revendication 1 et Y représente un groupe hydroxy, à l'aide d'éther éthyl- vynilique, en un composé de formule II, dans laquelle X , Z1 et Z2 sont tels que définis ci-dessus et Y = -CH(CH3)0C2H5 et on transforme ce composé à l'aide d'un composé de formule III dans laquelle Z est un atome d'oxygène ou de soufre, Hal un atome d'halogène et R un groupe phényle éventuellement mono ou di-substitué par un groupe alcoyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone, un groupe alcoxy ayant de 1 à 4 atomes de carbone, un atome d'halogène, un groupe trifluorométhyle ou un groupe nitro, pour obtenir un composé de formule I, dans laquelle X a la signification donnée à la revendication 1, Y est le groupe-CH2(CH3)0C2H5, A et C représentent chacun, indépendamment l'un dé l'autre un atome d'oxygène ou de soufre et n = m = O, et pour les composés de formule I dans lesquels n = m = O et ppur lesquels les autres restes ont les significations données au début de cette revendication, on hydrolyse. ou on transforme à nouveau à l'aide d'un composé de formule III ayant les définitions données ci-dessus pour les restes Z, Hal et R, en un composé de formule I, dans lequel les restes ont les significations données pour le composé de formule II, Y étant toutefois = -CH(CH3)0C2H5, et on hydrolyse; toutefois dans le cas où Y dans la formule II représente un atome dthydrogène, un composé de formule II peut Aetre directement mis à réagir avec un composé de formule III, ou on transforme un composé de formule II, dans laquelle X ainsi que Z1 et Z2 ont les significations données ci-dessus et Y est -CH(CH3)0C2H5, à laide d'un carbodiimide, de préférence le dicyclohexlcarbodiimide, et une auxine secondaire de formule IV dans laquelle R1, R2 = H, un groupe alcoyle en G1 4 ou un groupe aralcoyle, R1 et R2 pouvant représenter ensemble un reste alcoylène qui peut Aetre substitué par de l'oxygène, de préférence la morpholine, en un composé de formule dans laquelle X, ainsi que Z1 et Z3 ont les significations données à la revendication l, Y est -CH(CH3)OC2H5 et R1 et R2 ont les significations données pour la formule IV et on transforme ce dernier soit avec un composé de formule VI dans laquelle Z'1 et z t 2 sont de l'oxygène ou du soufre, A est de ltoxygene, un groupe CH2 ou NH, R' est H ou un aroupe phenyie éven tellement substitué auquel cas un groupe Rl doit être de l'hydrogène, en un composé de formule I dans lequel les restes ont les significations données à la revendication 1, avec toutefois n = m = 1, soit avec un acide phosphorique ou un acide thiophosphorique pour obtenir un composé de formule I dans lequel les restes ont les significations données à la revendication 1 avec toutefois n = m = O et A ainsi que C ne pouvant être un groupeCH2 ou,NH. 3. Procédé de préparation de composés de formule I selon la revendication 1, dans laquelle on peut cependant avoir simultanément X = guanine, Y = OH, Z1 à Z5 et A-C = oxygène et m = O et n = O ou 1, caractérisé en ce que la préparation est réalisée à l'aide de microorganismes ou de parties de ces derniers, par exemple des membranes, des vésicules de membranes ou des ribosomes, en présence de tampons, de sels, de nucélosides triphosphates ou leurs analogues. 4. Médicament ayant notamment une activité dans le traitement des tumeurs, caractérisé en ce qu'il comprend à titre de principe actir un composé de formule I selon la revendicatinn i dans laquelle X, Y, Z1 à Z6 A à D ainsi que m et n ont les significations qui y sont données, avec toutefois la possibilité d'avoir simultanément X = guanine, Y = OH, Z1àZ5 et A à C = oxygène et m = O et n = O ou 1.