Brevet FR2320350A1 — publié le 19770304

La présente invention se rapporte d'une manière générale à la fabrication du fromage et concerne plus particulièrement un procédé de production d'un enzyme pour la coagulation du lait ainsi qu'un enzyme obtenu par ce procédé. la production de fromage est généralement obtenue par coagulation du lait avec de la caillette de veau. les fluctuations en quantité et en qualité de la caillette ont conduit à la découverte d'enzymes permettant la coagulation du lait et obtenus à partir de la fermentation de micro-organismes. De tels enzymes doivent évidemment donner le même rendement en fromage que la caillette et doivent être dépourvus d'activités enzymatiques secondaires. Par ailleurs, ils ne doivent pas présenter d'activités enzymatiques capables d'influencer défavorablement la saveur du fromage. Ouest ainsi par exemple que la lipase ou estérase provoquent une hydrolyse conférant au fromage une rancidité plus ou moins marquée qui le rend impropre à la consommation. La présente invention a pour but de pallier les inconvénients précités en proposant un procédé de production d'un enzyme provoquant la coagulation du lait et permettant de fabriquer des fromages avec un très bon rendement et possédant d'excellentes propriétés organoleptiques. PluspWecisément, l'invention a pour objet un procédé de production d'un enzyme pour la coagulation du lait, caractérisé en ce que ledit enzyme est obtenu en cultivant une souche de Mucor miehei NRRL 13042, ou une variante ou espèce mutante de cette souche, isolée de manière naturelle ou artificielle. l'enzyme selon l'invention présente avantageusement une très faible teneur en lipase et/ou estérase. Suivant une autre caractéristique, le procédé de l'invention consiste à inoculer un milieu contenant une source d'hydrates de carbone, une source d'azote et des traces de facteurs de croissance, avec la souche précitée et à cultiver ladite souche dans des conditions aérobies jusqu'à ce qu'une quantité substantielle d'enzyme soit produite, puis à récupérer ledit enzyme à partir du milieu de fermentation. Suivant encore une autre caractéristique de l'invention, on cultive la souche précitée dans des conditions aérobies en travaillant à une température comprise entre 30 à 450C pendant une période de temps de 2 à 14 jours. Suivant une autre caractéristique de l'invention, l'enzyme est obtenu pratiquement sans lipase ni estérase par culture à un p11 compris entre 3,5 et 4,5 pendant la phase finale de fermentation. On peut, selon l'invention, récupérer l'enzyme en solution en ajoutant au milieu fermenté un agent de floculation du type cationique, ou en procédant à une filtration, et en écartant la phase solide contenant le mycélium par filtration ou centrifuga- tion. On peut également, selon l'invention, récupérer l'enzyme précité sous la forme d'une solution concentrée et purifiée, par traitement du filtrat obtenu comme décrit précédemment, en effectuant une ultrafiltration au travers d'une membrane formant barrière pour une valeur moindre que 58.000 daltons. Il faut encore remarquer que, selon l'invention, l'inactivité de la lipase ou de l'estérase précitées est obtenue en traitant-la solution enzymatique à un pH compris entre 2 et 3,9 et à une température comprise entre 30 et 6000. L'invention vise également un enzyme obtenu par le procédé répondant aux caractéristiques susmentionnées, ainsi qu'un procédé pour la production de fromage utilisant en totalité ou en partie ledit enzyme. D'autres caractéristiques eS avantages de l'invention apparaîtront mieux dans la description détaillée et les exemples qui suivent. Pour obtenir un fromage avec un bon rendement et de bonnes propriétés organoleptiques, l'enzyme de coagulation selon l'invention estproduit par une souche de Mucor miehei qui a été déposée sous le numéro NRRD 13042 au Northern Regional Research laboratories, Département américain de l'agriculture, Peoria, Illinois. Cette souche que l'on utilise dans l'invention, présente une activité de lipase ou d'estérase particulièrement marquée. les activités enzymatiques concernant ia coagulation du lait ainsi que la lipase ou l'estérase sont mesurées de la manière suivante. On décrira tout d'abord la façon dont on évalue l'activité de coagulation selon Soxhlet. On prépare un substrat en dissolvant du lait écrémé et séché obtenu dans des conditions douces, dans une solution de Ca Cl2 0,01 M. La concentration de lait est de 100 g par litre. A 10ml de cette solution qui a été précedemment mise à la température de 350C + 0,2 C, on ajoute 1 ml de dilution enzymatique, et le moment de l'apparition de la première floculation est mesuré. le temps de flucolation doit être compris entre 90 et 400 secondes. L'activité de coagulation selon Soxhlet est calculée par la formule M x 2.400 E t M = quantité utilisée de substrat. E = quantité d'enzyme (exprimée en g ou ml) contenue dans la solution enzymatique de 1 ml. t = temps de floculation. Pour la production de fromage, de 0,5 à 1 I d'enzyme avec une activité de 28.500 unités Soxhlet/ml, est utilisé dans 5000 l de lait. On décrira maintenant l'évaluation de l'activité de l'estérase ou lipolytique. L'hydrolyse d'une émulsion de tributyrine est titrée à pH constant. L'activite est calculée selon la quantité e NaOH nécessaire pour la neutralisation de l'acide butyrique lib8ré. La quantité d'enzyme qui libère une micromole d'acide butyrique pendant une minute dans les conditions de l'essai, correspond à une unité BGE (Butyrate Glycérol Estérase). Le substrat est préparé en réalisant une émulsion de 25 g de tributyrine dans 150 ml d'une solution de gomme arabique 10. Ce substrat est neutralisé à pH 7,5. les solutions d'enzyme doivent être faites dans de l'eau distillée et également neutralisées à pH 7,5. L'essai est mené à 400C + 0,-50C. 40 ml de substrat sont versés dans le récipient réactionnel d'un appareil de maintien de la valeur du pH avec titrage automatique. Lorsque le pH se maintient à 7,5, 10 ml de solution enzymatique sont ajoutés. la quantité de solution NaOH 0,02 N utilisée chaque minute pour corriger le pH à 7,5, est enregistrée pendant 15 minutes. La courbe : volume de NaOH 0,02 N en fonction du temps est racée et la pente (ml de Na0H 0,02 N par minute) est mesurée. Activité de l'estérase (BGE) = ml de NaOH 0,02 N x 20 g d'enzyme dans 11 essai de 10 ml EXEMPLE 1 Une préculture de Mucor miehei KRRL 13042 est préparée dans un milieu contenant des hydrates de carbone et de la peptone de caséine. les conditions de culture sont les suivantes : flacons secoués, 2-3 jours, température entre 350C et 4TOC. Par conséquent, le réservoir de production industrielle est inoculé avec une culture vigoureuse. le milieu de culture industriel contient une source d'hydrates de carbone qui peut être de l'amidon hydrolysé ainsi qu'une source d'azote qui peut être du petit lait ou une protéine végétale. Ce milieu est stérélisé puis agité et aéré afin d'assurer la croissance aérobie du micro-organisme. la température est maintenue entre 35 C et 450cl Dès que la croissance micro-organisme sexmanifeste activement, on laisse le pH décrotte et on le corrige ensuite dans l'intervalle 3,5-4,5 pendant tout le temps restant de la croissance et spécialement pendant la phase finale Après avoir écartele mycélium, une solution enzymatiquepfiésentant une activité de coagulation de 9000 unités Soxhlet/ml et une activité d'estérase de moins de 2 BGE/ml, est obtenue. A titre de comparaison, la culture d'une souche quelconque de Mucor miehei dans les mêmes conditions, (même milieu, même agitation et taux d'aération) mais pour laquelle on laisse décroître le pH naturellement jusqu'à 6,5, donne une solution filtrée contenant à côté des 9000 unités Soxhlet/ml, une activité d'estérase de 80 unités SGE/ml. le pH du milieu peut être corrigé, selon les modifications apportées par la croissance du micro-organisme, soit en ajoutant de l'avide (sulfurique, chlorhydrique ou phosphorique), ou de la base (hydroxyde de potassium ou de sodiums ammoniae et cendre de .soude). EXEMPLE 2 Une solution de milieu fermenté obtenue de la même manière que dans l'exemple 1 est traitée afin de rendre l'enzyme de coagulation pratiquement dépourvue de lipase ou d'estérase. le mycélium est écarté après centrifugation ou filtration du mélange fermenté précédemment ajouté, au moyen d'un filtre ou d'un agent de floculation de formule générale : polyacrylamide, polyvinylamide, polyéthylène imine, dans la proportion de 1 à 10 g/l. La solution claire est concentrée et purifiée par ultrafiltration, ctest-à-dire qu'on fait recirculer la solution dans une boucle comprenant un élément de filtration équipé d'une membrane formant barrière pour une valeur moindre que 38 000 daltons. La vitesse de circulation du liquide à la surface de la membrane est comprise entre 1 mètre et 7 mètres/seconde. Une pression positive doit être appliquée au liquide sur la membrane (1 à 8 kg/cm2) afin de favoriser la filtration.En traitant une solution enzymatique selon l'exemple 1, et avec les caractéristiques suivantes activité de coagulation : 9000 unités Soxhlet/ml activité de l'estérase : 2 unités EGE/ml teneur en azote protidique : 0,8 g/l teneur en sel (Ca Cl2) : 1 gel après ultrafiltration, une solution avec un volume compris entre 1/10 et 1/30 du volume de départ, est obtenue, avec les caractéristiques suivantes rapport de concentration : 1 à 10. activité de coagulation : 87500 unités Soxhlet/ml. activité de l'estérase : 20 unités BGE/ml. teneur en azote protidique : 5 g/î. teneur en sel (Ca Cl2) : 2,5 g/l. EXEMPLE 3 La solution obtenue selon l'exemple 2 est traitée pour rendre inactive la lipase ou l'estérase restante par chauffage dans des conditions acides. Le pH peut être corrigé entre 2,3 et 3,9. La température est élevée entre 32 et 600C. Par exemple, la solution enzymatique selon l'exemple 2 est traitée pendant 2 heures à pH 3,7 et 57 C ou pendant 5 heures à pH 2,25 et 320C, selon l'installation dont on dispose. Pour corriger le pH, n'importe quel acide tel que l'acide chlorhydrique, sulfurique ou phosphorique peut être utilisé. Après refroidissement, une solution enzymatique contenant moins de 0,1 unité EGE/ml (pour 87 500 unités Soxhlet/ml) est obtenue au lieu de 20 unités 3GE/ml au début. EXEMPLE 4 Pour la production du fromage connu sous le nom de camembert, la proportion de un litre d'enzyme de coagulation (28500 unités Soxhlet/ml) pour 5000 litres de lait, est utilisée. L'utilisation d'un enzyme de coagulation avec une activité d'esté rase moindre que 0,5 unité BGE/ml pour une activité de coagulation de 28 500 unités Soxhlet/ml, conduit à l'obtention d'un camembert strictement similaire à un camembert obtenu avec de la caillette d'animal, du point de vue organoleptique. D'un autre côté, l'utilisation d'un enzyme de coagulation de même activité mais contenant 2,5 unités EGE/ml conduit à l'obtention d'un camembert rance. EXEMPLE 5 Pour la production du fromage connu sous le nom de Cheddar, la proportion d'un litre d'enzyme de coagulation (28 500 unités Soxhlet) pour 5000 litres de lait, est généralement utilisée. Un tel enzyme avec une activité d'estérase moindre que 0,5 unité EGE/ml, conduit à l'obtention d'un Cheddar de bonne qualité après six mois de maturation. D'un autre côté, l'utilisation du même enzyme avec une activité d'estérase de 2,5 unites EGE/ml donne un cheddar ayant un gout de rance après une maturation de trois mois, et par conséquent un tel fromage ne peut pasetre commercialisé. Bien entendu, la présente invention n'est nullement limitée aux moyens et aux exemples de réalisation qui ont été décrits. Elle comprend tous les équivalents techniques des moyens qui ont été décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci ont été exécutées dans l'esprit de l'invention et mises en oeuvre dans le cadre des revendications qui suivent. R E V E N D I C A T I O N S BEVENDICATIONS 1. Procédé de production d'un enzyme pour la coagulation du lait, caractérisé en ce que ledit enzyme présentant une faible teneur en estérase ou lipase, est obtenu en cultivant une souche de Mucor miehei NRRS 13042, ou une variante ou espèce mutante de cette souche, isolée de maniere naturelle ou artificielle. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à inoculer un milieu contenant une source d'hydrates de carbone, une source d'azote et des traces de facteurs de croissance, avec la souche précitée et à cultiver ladite souche dans des conditions aérobies jusqu'à ce qulune quantité substantielle d'enzyme soit produite, puis à récupérer ledit enzyme à partir du milieu de fermentation 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la culture aérobie de la souche précitée est effectuée avec fermentation profonde à une température comprise entre 30 et 45 C pendant une période de temps de 2 à 14 jours. 4. Procédé suivant l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'enzyme provoquant la coagulation du lait est obtenu pratiquement sans lipase ou estérase par culture à un pH compris entre 3,5 et 4,5 pendant la phase finale de fermentation. 5. Procédé suivant l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il permet la récupération de l'enzyme en solution en ajoutant au milieu fermenté un agent de floculation du type cationique, ou en procédant à une filtration et en écartant la phase solide contenant le mycélium par filtration ou centrifugation. 6. Procédé permettant la récupération de l'enzyme précité sous la forme d'une solution concentrée et purifiée, caractérisé en ce qu'on traite le filtrat obtenu suivant la revendication 5 par ultrafiltration au travers d'une membrane formant barrière pour une valeur moindre que 38 000 daltons. 7. Procédé suivant l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'inactivité de la lipase ou de l'estérase précitées est obtenue en traitant la solution enzymatique à un pH compris entre 2 et 3,9 et à une température comprise entre 30 et 600C. 8. Procédé pour la production de fromage utilisant en tetalité ou en partie l'enzyme obtenu par le procédé suivant l'une des revendications 1 à 7. 9. Enzyme obtenu par le procédé suivant l'une des revendications 1 à 7.