Brevet FR2342338A1 — publié le 19770923

La présente invention concerne un procédé microbiologique pour la production de 12-dihydrostéroides, caractérisé en ce que l'on soumet un l2-hydroxystérotde à l'action d'un micro-organisme producteur de 12-dehydroxylase. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour la préparation dc composés de formule dans laquelle chaque reste X est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy, acyloxy, alcoxy ou un reste oxo (0=) et R est un groupe hydroxy, acyloxy ou alcoxy ou un reste de taurine ou de glycine; ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on soumet un composé de formule dans laquelle X et R sont tels que définis ci-dessus à l'action d'un microorganisme producteur de 12-déhydroxylase choisi dans les genres Clostridium et Bifidobacterium. On préfère selon l'invention les composés dans lesquels chaque reste X est un groupe hydroxy et R peut être un groupe hydroxy ou un reste de taurine ou de glycine. Dans la présente description, une ligne ondulée (5) est utilisée dans les formules de structure pour indiquer que le substituant concerné peut être dans la configuration a ou B, selon les cas. Dans la mise en oeuvre proférée de l'invention, les produits obtenus sont les stérotdes 3,7-disubstitués et peuvent comprendre des composés tels que l'acide b,7cr-dihydroxy-jB-cholar.ique et ses drivés de taurine et de glycine, l'acide 3&alpha;,7ss-dihydroxy-5ss-cholanique et ses dérivés de taurine et de glycine, les acides 3&alpha;,7&alpha;-diacyloxy-5ss-chlolaniques, l'acide 3;7-dioxo-Sg-cholanlque et les acides 3cl,7a-dialcoxy-5B-cholaniques et leurs dérivés, qui sont tous des composé s connus et dont certains possèdent des propriétés pharmacologiques souhaitables, par exemple une activité hypolipémiante. Parmi les dérivés 12-hydroxy de départ préférés que l'on peut utiliser de manière satisfaisante dans la pratique de l'invention, on peut citer les composés tels que l'acide 3,7,12-trihydroxy-5ss-cholanique et ses dérivés alcoxy et acyloxy et ses dérivés de taurine et de glycine; par exemple l'acide 3&alpha;,7&alpha;,12&alpha;-trihydroxy-5ss-cholanique, l'acide 3a,7p12x- trihydroxy-5B-cholanIque et d'autres de ces composés 12-hydroxy de départ. Les radicaux acyloxy préférés selon l'invention sont ceux dérivés d'acides hydrocarburecarboxyliquesjusqu'en C 11: tels que les acides alcanotques, alcénotques, arylcarboxyliques, cycloalcanoTques et cyclo aleénotques. Les radicaux alcoxy préférés selon l'invention sont ceux correspondant aux groupes alkyle inférieurs jusqu'en C6 et comprennent des groupes alcoxy tels que méthoxy, éthoxy, butoxy,etc. Afin de produire les composés préparés selon l'invention, on soumet le composé 12-hydroxy de départ à l'action d'un micro-organisme producteur de 12-déhydroxylase dans les genres Clostridium et Bifidobacterium. Plus particulièrement, on peut soumettre les composés 12-hydroxy de départ soit à l'action de la déhydroxylase du micro-organisme désiré, soit directement à i'action du micro-organisme lui-meme dans les conditions appropriées et dans le milieu nécessaire où le micro-organisme peut pousser. Selon la nature du micro-organisme producteur de 12-déhydroxylase lui-même, on peut faire varier le micro-organisme et le milieu dans lequel il peut pousser pour adapter le micro-organisme pa.ticulier concerné et on peut les modifier selon les resultats désirés ou le micro-organisme utilisé. Parmi les microorganismes que l'on peut utiliser dans la pratique de l'invention, on peut citer d'une manière générale les micro organismes producteurs de 12-déhydroxylase et plus particulièrement ceux des genres Clostrium et Bifidobacterium. Plus particulièrement, les micro organismes producteurs de 12-déhydroxylase comprennent des micro-organiimes tels que Clostridium perfringens, par exemple Clostridium perfringens (ATCC-19574) et Clostridium welchii. En outre, on peut également utiliser les micro-organismes producteurs de 12-déhydroxylase appartenant au genre Bifidobacterium. En général, les conditions de culture du micro-organisme désiré pour les buts de l'invention sont, sauf pour l'introduction du produit 12-hydroxylé de départ, les mimes que dans la culture des organismes analogues b cet effet, c'est-à-dire que l'on fait pousser le micro-organisme soit en milieu aérobie, soit en milieu anaérobie (selon le micro-organisme choisi, par exemple on cultive en général les Clostridia en conditions anaérobies) en contact avec (dans ou sur) un milieu de fermentation convenable. Un milieu approprié comprend essentiellement une source de carbone et d'énergie.Cette dernière peut entre un hydrate de carbone, un acide gras, une graisse et/ou le 12-hydroxystérotde de départ lui-même. Parmi les graisses utilisables, on peut citer le saindoux, l'huile de soja, l'huile de graine de lin, etc. Parmi les acides gras, on citera l'acide stéarique, l'acide palmitique, etc. La source de facteurs azotés peut etre organique (par exemple farine de soja, liqueur de trempage de mais etlou matieres solubles de distilleries) ou synthétique, composée de produits organiques ou inorganiques de synthèse tels que sels d'ammonium, hydrates alcalins, aminoacides, urée, etc.). Ourla fermentation aérobie, on doit maintenir une alimentation appropriée en air stérile. Pour la fermentation anaérobie, les cuves de fermentation doivent être maintenues a l'abri de sources extérieures d'oxygène. On peut ajouter le composé 12-hydroxylé de départ 9 la culture pendant la période d'incubation,ou ou bien elle peut entre contenue dans le milieu avant la stérilisation ou l'inoculation. Une gamme de concentrations satisfaisante mais non limitative du 12-hydroxystérotde de départ, par exemple l'acide 3a,7a,12a-trihydroxy-5ss-cholanique,dans la culture peut être d'environ 0,01 à 0,5%; cependant, on peut augmenter cette concentration selon l'aptitude du micro-organisme à pousser convenablement dans les milieux résultants. La durée de culture, ou plut8t la durée pendant laquelle on soumet le 12-hydroxysteroide de départ a l'action de la 12-déhydroxylase, peut varier considérablement; un intervalle de 2 a 96 h est approprié mais non limitatif. En autre, on peut faire varier le pH du milieu de culture entre environ 5,0 et 7,0 sans modifier le résultat final obtenu. L'exemple suivant illustre l'invention sans toutefois en limiter la portee. EXEMPLE On inocule 50 ml d'un milieu comprenant un bouillon de thioglycolate modifié selon Brewer (vendu par la Société Baltimore Biological Laboratories), en conditions anaérobies avec une culture de réserve de Clostridium perfringens ATCC 19574. On fait incuber le milieu en conditions anaérobies à 370C pendant 96 h et on utiliser la culture résultante pour inoculer un litre du même milieu.Au moment de l'inoculation, on ajoute- 2 g d'acide 3a,7a ,12a-trihydroxy-5B-cholanique dissous dans 15 ml d'éthanol et stérilisé à travers un tampom de Seitz. On incube le flacon en conditions anaérobies pendant 72 h et on filtre ensuite le bouillon sur un Blichner a l'aide d'un adjuvant de filtration et on acidifie ensuite le filtrat à pH 1-2 par HC1, on extrait trois fois par l'éther et on lave à l'eau les extraits éthérés combinés, on sèche sur sulfate de sodium et on évapote à siccité sous vide. On recristallise ensuite le résidu dans un mélange acétate d'éthyle-heptane pour obtenir l'acide 3a, 7a -dihydroxy-5-cholanique brut. Si une purification supplémentaire est nécessaire, on peut traiter encore le produit résultant selon les modes opératoires indiqués dans la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique Serial nO 417 170 déposée le 19 novembre 1973 au nom de la demanderesse. REVEND I C AT IONS 1 - Procédé pour préparer un 12-dihydrostérotde, caracté rlsé en ce que l'on soumet un 12-hydroxystérotde à l'action d'un microorganisme producteur de 12-déhydroxylase dans un milieu convenable et on recueille le 12-dihydrostérotde résultant. 2 - Procédé selon la revendication 1, pour preparer un composé de formule générale dans laquelle chaque reste X est un atone dthydrogène, un groupe hydroxy, acyloxy ou alcoxy ou un reste oxo et R est un groupe hydroxy, acyloxy ou alcoxy ou un reste de taurine ou de glycine, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on soumet un composé de formule générale dans laquelle X et R sont tels que définis ci-dessus à l'action d'un microorganisme producteur de 12-déhydroxylase dans un milieu convenable et on recueille ledit produit final. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit micro-organisme producteur de 12-déhydroxylase est choisi parmi les genres Clostridium et Bifidobacterium 4 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le micro-organisme appartient au genre Clostridium. 5 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le micro-organisme est Clostridium perfringens. 6 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que chaque reste X est un groupe a-hydroxy. 7 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le composé II est l'acide 3a,7a, 12a-trihydroxy-5B-cholanique . 8 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le produit final est l'acide 3a,7a-dthydroxy-5ss-cholanique. 9 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que. ledit 12-dihydrostérotde est acide 3&alpha;,7&alpha;-dihydroxy-5ss-cholanique. 10 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme producteur de déhydroxylase appartient au genre Clostridium.