Brevet FR2330409A1 — publié le 19770603

La présente invention est relative à un procédé de préparation d'un nouveau vaccin antileptosplrose monovalent et au vaccin obtenu par ce procédé. La leptospirose ou spirochetose ictéro-hémorragique, qui constitue une zoonose maJeure dont l'agent causal est un spirochète, le leptospira icterohaemorrhagiae, est très répandue dans le monde, surtout dans certains milieux professionnels, notamment parmi les mineurs, les employés d'abattoirs et surtout les égoutiers (zoonoses professionnelles typiques) Les formes ictériques graves de cette maladie, qui s'accompagnent d'hépatonéphrite avec des possihilités de com plications hémorragiques, cardiovasculaires, nerveuses ou oculaires, peuvent provoquer la mort. Bien que de nombreuses méthodes de prophylaxie des leptospiroses aient été mises en oeuvre et que des traitements médicaux aient été proposés, il s'est avéré que les mesures prophylactiques et médicales qui ont été proposées sont insuffisantes, alors qu'il s'est avéré depuis longtemps que la vaccination constitue la prophylaxie la plus efficace par l'immunité solide et durable qu'elle confère (cf. en particulier la Communicatlon de B. BABUDIERI à la 5ème Rencontre Internationale de standardisation biologique : "Vaccine aga insu Leptospiros is" parue dans"The Weizman Science Press of Israel'' Jerusalem, 1959, et les travaux de BABUDLERI parus dans le Bulletin de l'organisation mondiale de la Santé, 1961, 24 pages 45-58 et 1973 48, pages 587-590 et les travaux de E. SHENBERG et M. TORTEN dans "The Journal of Infectious Diseases" vol. 128, n 5 (5973) pages 642-651. L'une des principales difficultés que l'on rencontre ors de la préparation d'un vaccin efficace, réside dans le fait que l'on connait actuellement plus de 130 sérotypes de leptospires pathogènes répartis dans une vingtaine de séro groupes, à cEté drune vingtaine de sérotypes de leptospires saprrphytes non pathogènes, répartis dans six à huit sérum groupes. Ces sérotypes diffèrent entre eux par leur constitution antigénique et ils ne permettent pas d'obtenir une immunité croisée.De plus, la répartition géographique des différents sérotypes de leptospires est très variable, en sorte que certains sérotypes abondamment présents dans une zone géographique, sont totalement absents d'une autre zone géographique. C'est la raison pour laquelle il est nécessaire, pour préparer un vaccin efficace, de déterminer quels sont les serotypes présents dans la zone géographique considérée et d'établir lesquels, parmi eux, sont responsables des maladies dont on entend juguler le développement. L'absence d'immunité croisée entre les différents sérotypes a eu pour onséquence, dans la pratique, la mise sur le marché de nombreux vaccins antileptospirose, monovalents ou composés, préparés par des Chercheurs de différents pays et notamment par des Chercheurs Japonais, Italiens, Russes, Polonais, Israéliens, etc.... pour faire face aux infections induites par un ou plusieurs leptospires spécifiques à une zone géographique donnée. Une autre difficulté majeure rencontrée dans la préparation des vaccins antileptospîrose réside dans le fait que pour qu'un vaccin puisse être bien toléré sans provoquer de réactions allergiques locales et/ou systémiques, il est nécessaire qu'il soit totalement dépourvu de protéines entrant dans sa fabrication. En effet, les milieux liquides utilisés pour réaliser les cultures de leptospires utilisées pour la préparation des vaccins, contiennent différents sels, un tampon et du sérum de lapin qui s'est avéré essentiel pour assurer une croissance satisfaisante des leptospires. Il a cependant pu être établi que les réactions allergiques qui ont pu être observées lors de l'inoculation du vaccin, sont dues à la présence dans ce dernier de traces de sérum de lapin. Différentes solutions ont donc été proposées pour éliminer ces réactions allergiques : - cultures en milieu synthétique dépourvu de sérum de lapin - préparation de milieux de culture dans lesquels une partie du sérum de lapin est remplacée par de la vitamine B 12 - élimination des traces de sérum de lapin éventuellement pré sentes, par des traitements physiques tels que centrifugations. La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à un procédé obtention d'un vaccin cotre la leptospirose, actif contre les leptospiroses graves, connues en F-aIice, et ne donnant lieu à aucune réaction allergique. La présente invention a pour objet un procédé d'obtention d'un vaccin contre la leptospirose, caractérisé en ce que l'on part d'une souche virulente du sérogroupe icterohaemorrhagiae du sérotype copenhageni et/ou d'une souche virulente du sérogroupe icterohaemorrhagiae du sérotype icterohaemorrhagiae, en ce que l'on effectue des subcultures en milieu de Reiter-Ramme constitué par une solution--centntadt du chlorure de sodium, du tampon phosphate, du sérum de lapin et une faible quantité d'hémoglobine, à une température de 300C environ, en ce que l'on inactive les cultures au bout de 4 à 6 jours de croissance, en ce que les cultures récoltées sont centrifugées à froid à une vitesse supérieure à 10 000 g et en ce que les culots de centrifugation sont lavés avec du tampon Sôrensen formolé et recentrifugés jusqu'à disparition de la totalité des protéines, lesdits culots étant ensuite avantageusement repris par une solution physiologique pour obtenir une suspension-mère à partir de laquelle sont préparées les doses de vaccin prêtes à être administrées. Selon un mode de réalisation préféré du procédé qui fait l'objet de la présente invention, la virulence des souches est exaltée par passages répétées sur cobayes. Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé qui fait l'objet de la présente invention, les suspensionsmères sont constituées par une suspension de leptospires dans une solution physiologique tamponnée à pH 7,4, dont la concentration en leptospires est égale ou supérieure à 18 fois le volume initial de la culture. Conformément à l'invention, les cultures sont inactivées soit par addition d'un agent d'inactivation chimique tel que le formol ou la -propiolactone, par exemple, soit par chauffage à 600 C. Suivant une disposition avantageuse de l'invention, le milieu de Reiter-Ramme mis en oeuvre comme milieu de culture, est constitué par une solution à 8,5 % de chlorure de sodium, 8 % de sérum de lapin, 1 % d'hémoglobine, tamponnée par du tampon phosphate à pH 7,5. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. La présente invention vise particulièrement un procédé d'obtention d'un vaccin anti-leptospirose monovalent icterohaemorrhagiae, conforme aux dispositions qui viennent d'être énoncées, les vaccins obtenus par ce procédé, ainsi que les moyens propres à la mise en oeuvre de ces procédés et à l'utilisation et à l'application des vaccins obtenus. L'invention sera décrite de façon plus détaillée dans le complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du nouveau procédé conforme à l'invention, à des tests et contrles effectués sur les vaccins conformes à l'invention, ainsi qu'à des résultats des mesures des taux d'anticorps anti-icterohaemorrhagiae effectuées chez des vaccinés. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples, tests, et mesures sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de i'invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLES EXEMPLE I.- Obtention d'un vaccin anti-leptospirose mono valent Souches de leptospires choisies 1 / Icterohaemorrhagiae copenhageni déposée le 1er Aott 1975 dans la Collection de l'Institut Pasteur sous le n0 1007, (facteurs immunologiques 41, 48). 20/ Icterohaemorrhagiae icterohaemorrhagiae déposée le 1er Aott 1975 dans la Collection de l'institut Pasteur sous le nO 1006 (facteur immunologique 41). La culture est effectuée en milieu de Reiter-Ramme (solution à 8,5 % de NaCl, Tampon phosphate, 8 % de sérum de lapin et 1 % d'hémoglobine) à une température de 300C environ. Au 5ème jour de la croissance, après contrôle microscopique de la richesse des cultures, les cultures sont inactivées par 0,3 ml de formol du commerce, par tube contenant 30 ml de culture. L'effet d'immobilisation est très rapide. La culture est alors laissée 24 h à la température ambiante, puis un nouveau contrôle d'immobilité des germes est effectué, doublé du contrôle de sécurité effectué par une subculture exécutée en milieu neuf. Préparation de la suspension-mère : Une fois l'immobilité des germes parfaitement établie, les cultures sont rassemblées pour centrifugation refroidie, pendant 3G minutes à 12 000 g. Les culots sont alors repris en tampon de Sörensen formolé à 5 p. 1 ooc et lavés jusqu'à élimination de toute trace de sérum de lapin, puis recentrifugés dans les mêmes conditions. Ces culots lavés sont ensuite repris dans un faible volume d'eau physiologique tamponnée (eau physiologique 900 ml. tampon phosphate : 100 ml, pH ajusté à 7,4). La suspension-mère ainsi obtenue est une suspens ion de leptospires 20 fois plus concentrée par rapport au volume initial de culture. La préparation des doses de vaccin en suspension, prêtes à l'emploi est réalisée à partir de la suspension-mère, qui est stockée à 4 C. EXEMPLE II.- Obtention d'un vaccin antileptospirose mono valent Les sérotypes de leptospires mentionnés à 1 t Exemple I ont été mis en culture cosse décrit dans ledit Exemple I, après quoi, au 5ème jour de la croissance les cultures sont inactivées à l'aide de 2 -propiolactone ajoutée à la dose de i p. 1 000 dans les tubes de culture (souche virulente). Après un contact de 18 heures, on lave par centrifugation, puis on remet en suspension en eau physiologique, et on concentre deux fois jusqu'à obtention de la moitié du volume de départ. L'on prépare ensuite la suspension-mère comme décrit à l'Exemple I, de même que les doses unitaires de vaccin. EXEMPLE III.- Obtention d'un vaccin antileptospirose monovalent L'on procède comme décrit à l'Exemple I, sauf en ce qui concerne l'inactivation des cultures, qui effectuée comme suit : les tubes de culture (souche virulente) ont été immergées dans un bain-marie à 600C pendant 30 minutes, après quoi ies cultures rassemblees sont centrifugées, les culots sont lavés, puis remis en suspension en concentrant deux fois. La préparation de la suspension-mère, et des doses unitaires de vaccin a lieu comme décrit à l'Exemple I. Les suspensions inactivées conformément aux Exemples I à III ci-dessus, les suspensions-mères obtenues à partir de ces suspensions inactivées et les préparations prêtes à l'emploi, ont été soumises à des contrles, qui sont énoncés, avec leurs résultats, dans le Tableau ci-dessous TABLEAU ContrElrs aux différentes phases de la fabrication du vaccin antileptospirose monovalent conforme à l'invention préparé conformément aux Exemples I à III. Contrôles effectués Resultats 1.- Contrôle des suspensions inactivées - Recherche des leptospires mobiles a microscope à fond noir Néant -Subculture en milieu spécial Néant - Stérilité Absence de contamination 2.- Contrôle des suspensions-mères Stérilité (sur bouillon, gélose, Absence de à différentes températures) contamination Innocuité (sur cobaye et hamster) par inoculation d'un grand volume de vaccin Observation pendant un mois ni température ni - Activité Protection active : sur cobayes vacci nés 2 injections à 8 jours d'intervalle a) inoculation intra-péritonéale de 10, 50 et 100 DL 50 de la souche virulente DL 50 Survie b) après scarification de la peau rasée : pénétration transcutanée de la souche virulente Survie Témoins : vaccin seul Survie souche virulente seule morts 100 % Protection passive neutralisation in vigro : culture de la souche virulente + vaccin = contact et inoculation du mélange "neutralisé" au cobaye Doses : variées) Temps de contact: divers ( Survie - Densité : - au néphélomètre : selon étalon de tubes à densité connue 3.- Contrôle des préparations finales - Identité : par examen au microscope à fond noir : morphologie - Stérilité: recherche de contamination sur bouillon, gélose Néant - Densité : au néphélomètre à la cellule - Innocuité : observation pendant un mois du lot de cobayes ayant reçu Survie un grand volume de vaccin - Activité : Protection active Protection passive ( cf. para ) ) graphe 2 ci dessus - Stabilité examinée après un an Excellente imraunologie des vaccinés Le vaccin a été inoculé à des patients, en injections sous-cutanées d'1 ml chacune (concentration : 2.1Q8 ml) puis le taux d'anticorps anti-icterohaemorrhagiae présents dans le sérum de ces patients a été déterminé.Les résultats de cette détermination figurent dans le Tableau ci-dessous, Patients avant vaccin après 2 iniections après in vaccin ection de rappel 10 mois plus tard NO 2 Négatif 1/30 1/50 NO 7 " 1/30 1/50 NO 8 " 1/60 1/îoe Ne 13 " 1/40 1/80 N 25 " 1/70 1/500 N 32 " 1/30 1/350 N 38 " 1/40 1/100 N 45 " 1/80 1/100 N 49 " 1/30 1/60 N 56 " 1/20 1/100 N 64 " 1/30 1/80 N 76 " 1/150 1/500 Il résulte de la description qui précède que, quels que soient les modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application adoptés, laon obtient un nouveau procédé d'obtention d'un vaccin monovalent anti-leptospirose conduisant à un vaccin très actif, stable et d'une innocuité parfaite ; le produit conforme à la présente invention présente en outre l'avantage d'être particulièrement actif et immunisant contre les leptospiroses frappant certains milieux professionnels de nos--contrées. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite c i - d e s s u s , elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1o- Procédé de préparation d'un vaccin contre la leptospirose, caractérisé en ce que l'on effectue des sbcul- tures d'une souche virulente du sérogroupe icterohaemorrhaglae du sérotype copenhageni et/ou d une souche virulente du sérum groupe icteronaemorrhaglae du sérotype icterohaemorrhagiae, en milieu de Reiter-Ramme constitué par une solution contenant du chlorure de sodium, du tampon phosphate, du sérum de lapin et une faible quantité d'hémoglobine, à une température de 300C environ, en ce que l'on réalise tout d'abord l'inactivation des cultures récoltées, au bout de 4 à 5 jours de crois- sance, en ce que les cultures récoltées et inactivées sont ensuite centrifugées à froid à une vitesse supérieure à 10 000 g et sn ce que les culots de centrifugation sont lavés avec le tampon Sôrensen formolé et recentrifugés jusqu'à disparition de la totalité des protéines, lesdits culots étant ensuite avantageusement repris par une solution physiologique pour obtenir une suspension-mère à partir de laquelle sont préparées les doses de vaccin prestes à être administrées. 20- Procédé de préparation de vaccin selon la Revendication 1, caractérisé en ce que la virulence des souches de dé- part est exaltée par passages répétés sur cobayes. 30- Procédé selon l'une quelconque des Pevendications 1 et 2, caractérisé en ce que les suspensions-meres sont constituées par une suspens ion de leptospires dans une solution physiologique tamponnée à pH 7,4, dont la concentration en leptospires est égale ou supérieure à 18 fois le volume initial de la culture. 40 Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que les cultures sont inactivées par addition d'un agent d'fnac- tivatlon chimique pris dans le groupe qui englobe en particulier le formol et la 6-propiolactone. 50 Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que les cultures sont inactivées par chauffage à 600C environ. 60 Vaccin antileptospirose monovalent, caractérisé en ce qu'il est préparé à partir d'une souche virulente du sérogroupe icterohaemorrhagiae du sérotype copenhageni, éventuellement associée à une souche virulente du sérogroupe icterohaemorrhagiae du sérotype icterohaemorrhagiae. 7 - Compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles contiennent le vaccin antileptospirose monovalent se 1 on la Revendication 5. 8 - A titre de moyen constituant un élément du procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 5, pour la fabrication d'un vaccin antileptospirose monovalent selon la Revendication 6, une souche virulente de leptospires du sérogrpe ictershaemorrhagiae du sérotype copenhageni telle que déposée à l'INSTITUT PASTEUR sous le n 1007 en date du 1er Août 1975. 9 - A titre de moyen constituant un élément du procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 5, pour la fabrication d'un vaccin antileptospirose monovalent selon la Revendication 6, une souche virulente de leptospires du sérogroupe icterohaemorrhagiae du sérotype Icterohaemorrhagiae telle que déposée à l9ïtiSTITUT PASTEUR sous le n 1006 en date du 1er Août 1975.