Brevet FR2350396A1 — publié le 19771202

La présente invention concerne un milieu pour bouillon de détection de Proteus. Proteus est un micro-organisme que l'on trouve dans l'urine, les matières fécales, etc... La présence de cet organisme dans l'urine est un indicateur fiable d'une infection de l'appareil urinaire. Si Proteus est présent dans un échantillon donné d'urine, il est également possible que Klebsiella et Staphylococcus aureus soient également présents. Le milieu de cette invention est un milieu amélioré conçu pour être utilisé dans un système de détection optique permettant d'analyser des échantillons de façon à déterminer la présence de micro-organismes spécifiques, en utilisant un plateau ou une carte de matière plastique qui contient une série de milieux de culture séchés contenus dans des cellules séparées mais reliées, chacun des milieux étant spécifique vis-à-vis d'un seul organisme. Quand l'échantillon est introduit dans la carte, mélangé au milieu contenu dans les cellules et incubé dans la machine, le ou les organismes présents dans l'échantillon réagissent avec le milieu de culture spécifique à cet organisme et produisent un changement du milieu que la machine lit pour indiquer la présence de cet organisme.Le changement dans le milieu implique un changement des propriétés de transmission de la lumière du milieu, c'est-à-dire un changement de couleur ou un changement de turbidité. Le changement peut être provoqué par l'activité métabolique de l'organisme qui à son tour provoquera la production d'un acide et un changement du pH qui entraine un changement de couleur d'un indicateur sensible au pH dans le milieu. Le changement des propriétés de transmission de la lumière du milieu pourrait également être provoqué par un précipité se formant dans le milieu en raison de l'activité métabolique de l'organisme, ou bien il peut être dû au développement de l'organisme. Les milieux spécifiques conçus pour être utilisés dars les cartes susmentionnées sont tous conçus pour favoriser la croissance d'un micro-organisme et pour inhiber la croissance des autres organismes, peuvent être lyophilisés et peuvent fonctionner dans l'environnement pauvre en oxygène des cuvettes de la carte. Les résultats positifs sont indiqués par un changement de couleur d'une solution indicatrice de pH incorporée dans le milieu, qui provoque une changement détectable des caractéristiques de transmission de la lumière du milieu. Tout l'essai peut être terminé en 12 à 18 heures, alors que les procédés de détection courants nécessitent de 36 à 48 heures. La présente invention fournit un milieu pour bouillon de détection de Proteus comprenant : (a) une source d'agents nutritifs, (b) de l'urée, (c) des tampons permettant d'inhiber les positifs faux dus aux organismes Klebsiella, (d) des inhibiteurs antibiotiques destinés à inhiber la croissance de Xlebsiella et de Staphylococcus aureus et des organismes positifs à l'uréase, (e) un indicateur de pH biologique réagissant à une augmentation du pH vers les valeurs alcalines par modification de sa couleur. On utilise de préférence la colistine pour inhiber la croissance de Klebsiella, et de l'érythromycine pour inhiber la croissance de Staphylococcus aureus, et l'on utilise de préférence de la Protéose-Peptone nQ 3 pour augmenter la sensiiilité du bouillon. Le bouillon de détection contient de préférence de 0,097 à 0,103% d'agents nutritifs, d'environ 1,8 à environ 2,2% d'urée, d'environ 0,0097 à environ 0,0103% d'un indicateur qui indique la croissance positive de l'organisme Proteus, environ 4850 à environ 5150 mg/l de colistine qui agit comme inhibiteur biologique de la croissance de Klebsiella qui donne normalement des résultats positifs dans les essais de détermination de Proteus, et environ 4850 à environ 5150 mg/l d'érythromycine qui agit comme inhibiteur biologique de la croissance de Staphylococcus aureus. La partie nutritive du milieu contient d'environ 0,97 à environ 1,03 g/l de Protéose-Peptone nO 3 de chez Difco. La Protéose-Peptone nO 3 agit en stimulant la croissance de l'organisme Proteus. Un produit de remplacement approprié de la Protéose Peptone nO 3 est le milieu Thiotone-Peptone de chez Baltimore Biological Laboratories, ou une quelconque peptone appropriée ; cepen- dant la Protéose-Peptone nO 3 donne les meilleurs résultats dans le milieu de la présente demande de brevet. Le but de la Protéose-Peptone nO 3 est de promouvoir sélectivement la croissance de Proteus, et d'augmenter ainsi la sensibilité du milieu. Le but de l'urée est de provoquer une augmentation du pH du bouillon par hydrolyse. Cette augmentation de pH rend le milieu alcalin et provoque le changement de couleur de l'indicateur biologique comme expliqué plus complètement ci-après. On utilise comme tampons dans le milieu du phosphate monopotassique KH2PO4 et du phosphate dipotassique K2HPO4. Les organismes Proteus sont des organismes fortement positifs à l'uréase, alors que les organismes Klebsiella sont faiblement positifs à l'uréase. Les tampons retardent l'indicateur à un degré qui empêche la détection de Klebsiella mais pas suffisamment pour empêcher la détection de Proteus. On utilise dans le milieu-du thioglycollate de sodium pour réduire le taux en oxygène. Cette réduction augmente l'activité de l'uréase et augmente ainsi la vitesse de l'indicateur. Un indicateur de pH biologique approprié est le bleu de bromothymol. On utilise cet indicateur car il passe d'une couleur verte à une couleur bleue quand le pH de la solution passe d'une valeur neutre à une valeur alcaline. Ce changement de couleur modifie les caractéristiques de transmission du milieu, changement qui est observé et enregistré par un analyseur microbien automatique. On utilise de l'acide chlorhydrique pour ajuster le pH du milieu à une valeur d'environ 6,8 à environ 6,9. Un aspect important de cette invention réside dans l'action des inhibiteurs chimiques, la colistine et l'érythromycine. Ces inhibiteurs ont pour rôle d'empêcher la croissance des organismes autres que Proteus. La croissance d'espèces de Klebsiella, de Staphylococcus aureus et d'organismes qui donnent des rendements élevés de résultats positifs par des procédés de détection dans des analyseurs microbiens automatiques, est inhibée par ces inhibiteurs chimiques présents dans le procédé. La concentration de la colistine peut être d'environ 4850 à environ 5150 mg/l, et est la plus efficace à 5000 mg/l. La concentration de l'érythromycine peut être d'environ 4850 à environ 5150 mg/l, et est la plus efficace à 5000 mg/l. Si la concentration d'un quelconque inhibiteur est trop faible, on obtient un rendement supérieur en positifs faux non désirés. Si la concentration est trop élevée, on a un rendement inférieur en résultats positifs. Une autre caractéristique importante de cette invention est l'utilisation de Protéose-Peptone nO 3 comme source d'agents nutritifs. Cette peptone active la croissance de Proteus EXEMPLE I Pour préparer un milieu doublement concentré dans une quantité de 100 ml, on prépare un bouillon de détection de Proteus en mélangeant soigneusement les composants suivants dans les quantités indiquées Urée 4,0 g Protéose-Peptone nO 3 0,2 g Thioglycollate de sodium 0,4 g KH2PO4 0,16 g K2HPO4 0,24 g Colistine 1000 mg Erythromycine 1000 mg Eau distillée 88 ml Avant de pouvoir ajouter le bleu de bromothymol au mélange précédent, il faut le dissoudre dans un récipient séparé. Pour chaque 100 ml de bouillon de détection a une double concentration, il faut d'abord dissoudre 0,02 g de bleu de bromothymol dans une solution comprenant 3 ml d'hydroxyde de sodium 1N et 7 ml d'eau distillée. Après dissolution du bleu de bromothymol, on ajoute toute la solution de bleu de bromothymol au mélange précedent. Puis on ajuste le pH à 6,86 avec de l'acide chlorhydrique. Le milieu est à une double concentration, concentration habituelle utilisée dans les cuvettes et cartes que l'on emploie dans un analyseur microbien automatique. REVENDICATIONS 1. Milieu pour bouillon de détection de Proteus, comprenant (a) une source d'agents nutritifs, (b) de l'urée, (c) des tampons permettant d'inhiber les résultats positifs faux dus aux organismes Klebsiella, (d) des inhibiteurs antibiotiques permettant d'inhiber la croissance de Klebsiella et Staphylococcus aureus et des organismes positifs à l'urêase, et (e) un indicateur biologique de pH réagissant à une augmentation du pH vers les valeurs alcalines par-un changement de sa coloration. 2. Milieu selon la revendication 1, où la source d'agents nutritifs est la Protéose-Peptone nO 3. 3. Milieu selon la revendication I, où on utilise environ 0,97 à environ 1,03 g/l de Protéose-Peptone nO 3. 4. Milieu selon la revendication 1, 2 ou 3, où les tampons sont K2HPO4 et KH2PO4. 5. Milieu selon la revendication 4, où on utilise environ 0,79 à environ 0,81 g/l de KH2PO4 et environ 1,19 à environ 1,21 g/l de K2HPQ4. 6. Milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, où l'inhibiteur de Klebsiella est la colistine. 7. Milieu selon la revendication 6, où on utilise environ 4850 à environ 5150 mg/l de colistine. 8. Milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, où l'inhibiteur de Staphylococcus aureus est l'érythromycine. 9. Milieu selon la revendication 8, où on utilise environ 4850 à environ 5150 mg/l d'érythromycine. 10. Milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, où l'indicateur est le bleu de bromothymol. 11. Milieu selon la revendication 1, comprenant par litre de milieu (a) environ 18 à 22 g d'urée, (b) environ 0,97 à environ 1,03 g de Protéose Peptone nO 3, (c) environ 1,9 à environ 2,1 g de thioglycollate de sodium, (d) environ 0,79 à environ 0,81 g de KH2PO4, (e) environ 1,19 à environ 1,21 g de K2HPO4, (f) environ 4850 à environ 5150 mg de colistine, (g) environ 4850 à environ 5150 mg d'érythromycine, (h) environ 0,097 à environ 0,103 g de bleu de bromothymol, et (i) de l'eau distillée,à un pH de 6,9. 12. Milieu selon la revendication 1, comprenant par litre de milieu (a) 20,0 g d'urée, (b) 1,0 g de Protéose-Peptone nO 3, (c) 2,0 g de thioglycollate de sodium, (d) 0,8 g de KH2PO4, (e) 1,2 g de K2HPO4, (f) 5000 mg de colistine, (g) 5000 mg d'érythromycine, (h) 0,1 g de bleu de bromothymol, et (i) de l'eau distillée jusqu'à 1 litre, à un pH de 6,9.