Brevet FR2354776A1 — publié le 19780113

-a pressente invention concerne un melange antibiotique A-32390, comprenant des facteurs Ar B, C et D, sa préparation par culture de l'espèce Pyrenochaeta NRRL 5786 dans des conditions aérobies immergées, sa séparation et l'isolement des facteurs A, B, C et D. Elle concerne ie facteur A de l'antibiotique A-32390 et ses esters de tétra-(acyle en C2-C) et leurs compositions avec une polyvinylpyrrolidone présentant un poids moléculaire dans l'intervalle de 10.000 à 360.000.Le complexe A-32390 du mélange antibiotique, le facteur A antibiotique et ses dérivés d'ester d'acyle inhibent la dopamine-P-hydroxylase et présentent une -activité antifongique, antibacterienne et hypotensive. Le terme "mélange antibiotique" tel qu'il est utilisé dans la présente description se rapporte à un mélange de facteurs individuels antibiotiques produits simultanement. Le rapport des facteurs individuels produits dans un mélange antibiotique varie en fonctiondes conditions de fermentation utilisées. Un objet de la présente invention est de.fournir un nouveau mélange antibiotique A-32390, les facteurs A, B, C et D du mélange antibiotique A-32390 et les dérivés d'ester de tétra-(acyle en C2-C4) du facteur A du mélange antibiotique A-32390, Un objet de la présente invention est également de fournir des procédés de préparation et de séparation du mélange antibiotique A-32390 comprenant les facteurs A, B, C et D du mélange antibiotique A-32390, l'isolement des facteurs A, B, C et D, et la préparation des esters de tétra-(acyle en C2-C4) du facteur A de l'antibiotique A-32390. Qn prépare le mélange antibiotique A-32390 en cultivant une nouvelle souche de l'espèce Pyrenochaeta NRRL 5786 dans des conditions de fermentation aérobies immergées jusqu'à ce que l'on obtienne un niveau d'activité antibiotique. On récupère le mélange antibiotique A-32390 à partir du milieu de fermentation en extrayant le bouillon à l'aide d'un solvant organique polaire et en concentrant l'extrait pour obtenir les mélanges antibiotiques sous la forme d'un solide cristallin impur. On sépare le facteur A de l'antibiotique A-32390 des autres facteurs de l'antibiotique A-32390 et on l'isole sous la forme d'un composé individuel par des techniques bien connues telles que la chromatographie de colonne et la chromatographie de couche mince. Les drivés ester de tétra-acyle du facteur A de l'antibiotique A-32390 sont préparés à partir du facteur A par des procédés d'acylation classiques. Un autre objet d la présente invention est de fournir une nouvelle composition d'un composé choisi dans le groupe comprenant le facteur A de l'antibiotique A-32390 et ses dérives ester de tétra- (C2 -C4) -acyle avec un excipient, tel qu 'une polyvinylpyrrolidone présentant un poids moléculaire de 10.000 à 360.000. Le mélange antibiotique A-32390 et le facteur A de l'antibiotique A-32390 inhibent la croissance des organismes qui sont pathogènes pour la vie des animaux et des plantes. Les antibiotiques A-32390 sont plus particulièrement precieux compte tenu de leur activité vis- -vis de champignons tels que Candida albicans. En plus, le melange antibiotique A-32390, le facteur A de l'antibiotique A-32390 et les dérivés ester de tétra-(acyle en C2-C4) du facteur A de l'antibiotique A-32390 inhibent la dopamine-ss- hydroxylase et sont des agents hypotenseurs. La présente invention fournit un nouveau mélange antibiotique A-32390 comprenant des facteurs A, B, C et 3 et les dérivés ester de tétra-Sacyle en C2-C) du facteur A. La présente invention fournit un facteur A antibiotique et ses dérivés ester de tétra-(acyle en C2-C4) de formule dans laquelle tous les groupements R sont identiques et sont choisis dans le groupe constitué de l'hydrogène et des groupements acétyle, propionyle et butyryle. La présente invention fournit également un nouveau procédé de préparation du mélange antibiotique A-32390, comprenant des facteurs A, B, C et D et les dérivés ester de tétra-(acyle en C2-C4) du facteur A comprenant a) la culture de Pyrenochaeta sp NRRL 5768 ou un de ses mutants qui fournit le mélange antibiotique A-32390 dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucide, d'azote, et de sels minéraux sous des conditions de fermentation aérobies immergées jusqu'd ce qu'il se produise une quantité substantielle d'activité antibiotique (b) facultativement la séparation du mélange antibiotique A-32390 du milieu de culture (c) facultativement l'isolement des facteurs A, B, C et D de l'antibiotique A-32390 à partir du mélange antibiotique A-32390 (d) facultativement, l'acylation du facteur A de l'antibiotique A-32390. La présente invention fournit également une nouvelle composition antibiotique comprenant un facteur A de l'antibiotique A-32390 et ses dérivés ester de tétra-acyle de formule dans laquelle tous les groupements R sont identiques et sont choisis dans le groupe constitué de l'hydrogène, et des groupements acétyle propionyle et butyryle et un excipient. Le mélange antibiotiq 32390 de la présente invention comprend au moins quatre facteurs désignés sous le nom de facteurs A, B, C et D. Les facteurs antibiotiques séparés jusqu'ici apparaissent être structurellement en relation l'un par rapport à l'autre et présentent les caractéristiques chimiques, physiques et spectrales d'alcools polyhydroxylés. On prépare simultanément ces facteurs antibiotiques au cours de la fermentation et on les obtient sous la forme'un mélange. On sépare les facteurs, et on isole le facteur A sous la forme d'un composé individuel tel que décrit ci-après. Le melange antibiWtique A-32390 partiellement pur est une poudre grise qui est soluble dais le diméthylformamide, le diméthylacétamide et le diméthylsulfoxyde ; qui est légèrement soluble dans des alcools inférieurs, l'acétone, l'acétate d'éthyle et le chloroforme ; mais qui est pratiquement insoluble dans l'eau, le benzène, l'hexane, l'éther de diéthyle et-le tétrachlorure de carbone. On sépare les facteurs A, B, C et D partir du mélange antibiotique A-32390 par chromatographie. Par exemple, une chromatographie de couche mince sur gel de silice G (Merck, F-254), en utilisant un système de solvant chloroforme-méthanol (9:1) sépare les facteurs A, B, C et D de l'antibiotique A-32390. En utilisant Sarcina lutea ATCC 3241 comme organisme de détection les valeurs R f des facteurs A-32390 dans ce système sont Facteur A 0,32 B 0,23 C 0,15 D 0,05 Les paragraphes suivants décrivent les propriétés physiques et spectrales du facteur A de l'antibiotique A-32390. Le facteur A de l'antibiotique A-32390 est un composé cristallin blanc qui fond a environ 1620C. La formule empirique proposée pour le facteur A est C18H24N208. L'analyse élémentaire du facteur A fournit la composition suivante en pourcentage carbone 54,63 % ; hydrogène 6,03 % ; azote 7,38 %. L'oxygène par différence serait de 31,96 %. Ceci correspond à une composition calculée en pourcentage de : carbone 54,6 ; hydrogène 6,06 ; azote 7,07 ; oxygène 32,27. Le poids moléculaire du facteur A, par détermination par spectrométrie de masse, est de 396. Le pouvoir rotatoire spécifique observé du facteur A,ta 25 est de +170(c=1, dimethylformamide). Le spectre d'absorption infrarouge du'facteur A de l'antibiotique A-32390 dans une huile- de paraffine de pureté élevée est représenté dans la figure 1 des dessins qui suivent. Les bandes que l'on peut distinguer dans le spectre infrarouge sont les suivantes w=faible ; m=moyen ; s=fort : 2,92(s), 4,64(m), 5,73(m-s), 5,76(m-s), 6,14(w-m), 7,54(m), 7,74 (m), 7,89(w), 8,08(m-s), 8,21(w-m), 8,80(w), 9,15(m-s), 9,40(w), 9,60(w), 10,25(w), 10,45(w-m), 11,05(w), 11,20(w), 12,22(w), 13,00(w-m) et 13,16(w) -microns. Le spectre d'absorption ultraviolet du facteur A de l'antibiotique A-32390 dans l'éthanol a 95 % présente un maximum d'absorption ymax, à 230 nm (27.900). Le spectre de résonance magnétique nucléaire du facteur- A de l'antibiotique A-32390 dans le diméthylsulfoxyde eest représenté sur la figure 2 des dessins qui. suivent. Le spectre présente les caractéristiques suivantes : 2,11 (s), 2,24 (s), 3,61 (dd, J = 9, 7 Hz), 3,77 (dddd, J = 9, 6, 5,5, 2 Hz), 4,21 (dd, J = 11, 6 HzY, 4,45, (dd, J = 11, 2 Hz), 4,42 (d échangeable, J = 7 Hz) et 4,91ppm (d échangeable d, J = 5,5 Hz). Le facteur A de l'antibiotique A-32390 cristallisé dans l'acétone, présente un diagramme de difraction de poudre aux rayons X caractéristique qui est le suivant (radiation du chrome, 2,2896y , filtre de vanadium, d=espace interpianaire en angströms, I/I1=intensité relative) d I/I 18,75 100 9,33 50 7,48 10 6,93 10 6,46 70 6,11 40 5,17 70 4,77 30 4,54 30 4,27 30 3,76 10 3,60 70 3,46 60 3,33 05 3,25 30 3,02 05 2,48 05 2,37 05 Le facteur A de l'antibiotique A-32390 est soluble dans le diméthylformamide, le diméthylacétamide et le diméthylsulfoxyde il est légèrement soluble dans l'acétone, l'acétate d'éthyle et le chloroforme ; mais il est pratiquement insoluble dans l'eau, le benzène, lthexane, l'éther diéthylique et le tétrachlorure de carbone.Le facteur A de l'antibiotique A-32390 est également légèrement soluble dans des alcools inférieurs mais il y est instable. On a déterminé que le facteur A de l'antibiotique A-32390 présente la structure suivante structure que l'on désigne sous le nom de 1,6-di-o-(2-isocyano3-méthylcrotonyl)-D-mannitol. Dans la formule précédente les groupements isocyano sont décrits en tant que groupements -N=C Le facteur A de l'antibiotique A-32390 présente quatre groupements hydroxyle susceptibles d'estérification On prépare les dérivés ester de tetra-(acyle en C2-C4) d facteur A de l'antibiotique A-32390 à partir du facteur A par des procédés d' estérification normaux. Le facteur A de l'antibiotique A-32390 et les dérivés ester de tetra- (acyle en C2-C4) du facteur A de l'antibiotique A-32390 peuvent être représentés par la formule structurelle dans laquelle tous les groupements R sont identiques et sont choisis dans le groupe constitué de l'hydrogène, et les groupements acétyle, propionyle et butyryle. Les dérivés ester de tëtra-(acyle en C2-C4) du facteur A de l'antibiotique A-32390 sont des huiles et on ne peut pas déterminer leurs points de fusion. Une chromatographie en couche mince sur gel de silice G (Merck, F-254) en utilisant un système de solvant chloroforme-méthanol (99:1) sépare les dérivés ester de tétra (acyle en C2C4) du facteur A de l'antibiotique A-32390. En utilisant comme organisme de détection Sarcina lutea ATCC 3241, les valeurs R f sont Dérives du facteur A R f Tétra-acétate 0,30 Tétra-propionate 0,41 Tétra-butyrate 0,45 On isole l'organisme qui produit le mélange antibiotique A-32390 par un procédé de dilution en serie à partir d'un échantillon de terre subtropicale.Cet organisme a été caractérisé par biotaxie comme une nouvelle souche de l'espèce Pyrenochaeta qui appartient à l'ordre Sphaeropsidales de Deuteromycetes (Fungi Imperfecti). Caractéristiques de la culture Agar de solution de Czapek. A 260C la culture se développe faiblement et forme peu de pycnidies dispersées. Agar d'extrait de Malt . Après incubation pendant sept jours à 260C, il se forme des hyphes aériens abondants avec relativement peu de pycnidies largement dispersées. Agar de dextrose et de pomme dé terre. Après incubation pendant sept jours -à 260C, il se produit des pycnidies nombreuses fréquemment groupées et de courts hyphes aériens. Les deux surfaces supérieure et inférieure de la colonie sont noirbrûnatre. Le diamètre de la colonie est de 35 à 40 mm après huit jours avec une légère croissance supplémentaire par la suite. Caractéristiques morphologiques Les pycnidies sont superficielles, cespiteuses, membraneuses à souscarbonacées, noires, avec ostiole ouvert et légèrement courbé, sétacées, globuleuses à sous-globuleuses, 135 x 155 Il à 235 x 275 , en moyenne 169 x 195 Les soies sont rigides, brunes à noires, lisses, s'effilant vers des extrémités arrondies, avec 3 à 5 cloisons et présentent des extrémités inférieures élargies qui forment un anneau brun foncé autour d'un ostiole à peu près circulaire (effet de giration). Peu fréquemment, des soies n'ayant pas d'extrémité inférieure élargie sont éparpillées sur la surface pycnidiale. Les soies ont une dimension de 63-x 2ji à 112 x 6,211 au voisinage de la base (moyenne 81,25 x 6,211). Des spores unicellulaires sont émises à travers l'ostiole sous la forme d'une masse mucoide. Les spores sont hyalines, cylindriques (quelques unes sont allentoldes) avec des extrémités arrondies, et bigluttulées. Les spores mesurent de 7 à 9 de long et 2,811 de large (moyenne 8,4 x 2,811). ). Elles sont élaborées à partir des phialides qui sortent de la paroi pycnidiale Ces phialides s'effilent de la base au sommet (2,8 à 1,8 11) et elles sont longues de 18,2 à 29,4 (moyenne 2211). Une culture de ltorganisme donnant A-32390 -a été déposée auprès de la collection permanente de cultures du Ministère de l'Agriculture des E.U.A., Service de Recherche Agricole, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois 61604, où elle est déposée sans restriction en ce qui concerne sa mise à disposition et elle a reçu le numéro NRRL 5786. Comme dans le cas des autres organismes, les caractéristiques de . Pyrenochaeta NRRL 5786 la souche qui donne le mélange antibiotique A-32390,sont sujettes a variation. Par exemple, on peut obtenir des variants et des mutants artificiels de la souche NRRL 5790 à l'aide de différents mutagènes connus tels que les rayons ultraviolets, les rayons X, des ondes à haute fréquence, des rayonnements radio-actifs et des produits chimiques. On peut utiliser dans la présente invention tous les variants et mutants naturels ou artificiels qui appartiennent cette espèce Pyrenochaeta et qui produisent le mélange antibiotique A-32390. Le milieu de culture utilisé pour produire le mélange antibiotique A-32390 peut 8trie un des nombreux Milieux puisque l'organisme donnant A-32390 est capable d'utiliser l'énergie venant de différentes sources nutritives. C'est pourquoi, par exemple, on peut introduire un certain nombre de glucides dans le milieu de culture pour apporter ce que l'organisme demande en carbone. De la même manière, on peut utiliser dans le milieu A-32390 différentes sources d'azote, tels que des amino-acides, des extraits de distillerie et des produits semblables. Pour des raisons d'économie en cours de production, de rendement optimal, et de facilité d'isolement de l'antibiotique, on préfère certains milieux de culture.Par exemple, une source de glucides préférée dans la fermentation est le glucose, bien que l'on puisse également utiliser le fructose, le mannose, le maltose, la dextrine et le saccharose. I1 apparaît que l'addition de certains dérivés d'acide crotonique, tels que l'acide 2-cyano-3-méthylcrotonique, le. 2- cyano-3-méthylcrotonate d'éthyle, et le 2-cyano-3-méthylcrotonate de m8thoxyéthyle, aux milieux de culture donne des rendements améliorés en complexe antibiotique A-32390. L'alcool éthylique est un autre agent que l'on peut ajouter au milieu de culture pour améliorer le rendement en antibiotiques A-32390. Des sources préférées d'azote sont des peptones, de la farine de soja, des mélanges d'amino acide et des produits semblables. Comme il est en général habituel dans la production des antibiotiques, on peut incorporer des sels minéraux nutritifs dans le milieu de culture pour la production des antibiotiques A-32390. De tels produits nutritifs minéraux sont les sels habituels susceptibles de fournir du sodium, du potassium, de l'ammonium, du calcium, du phosphate, du chlorure, du carbonate et des-ions semblables. On doit également introduire dans le milieu de culture des éléments essentiels nécessaires pour la croissance et le développement de l'organisme produisant le mélange A-s2390. De tels éléments essentiels sont habituellement nécessaires seulement à 11 état de traces.Ces éléments sous forme de tract se trouvent habituellement sous forme dlimpuretés dans les autres constituants du milieu en quantités suffisantes pour satisfaire les impératifs de croissance de l'organisme donnant l'antibiotique n-32390. La souche ce .'oreanisme utilisée pour produire les antibiotiques A-32390 est capable de croltre dans une large variété de conditions. Par exemple, l'organisme peut croître dans un certain nombre de milieux dans lesquels le pH initial varie assez largement. Toutefois, on a trouvé qu'il était souhaitable de démarrer la fermentation dans un milieu à un pH compris entre environ 6 et environ8 et de préférence entre environ 6 et 7. Habituellement, au cours de la croissance de l'organisme, le pH du milieu diminue légèrement à partir de sa valeur initiale. Le pH final du milieu de culture dépend en partie au moins de tels facteurs tels que le pH initial du milieu, les agents tampons qui y sont présents, et la durée de temps laissée à l'organisme pour croître. L'organisme de la présente invention produisant le mélange A-32390 est capable de croître et de produire une activité antibiotique sur différents types de milieux. On peut faire croître l'organisme sur des plans inclinés d'agar, dans des ballons agités, secoués, ou dans des réacteurs de fermentation de capacité moyenne ou forte. Pour la production. de ces antibiotiques à grande échelle, on préfère des conditions de fermentation aérobies immergées. Pour la préparation de quantités relativement petites du complexe antibiotique.A-32390, on peut utiliser une culture dans un ballon agité. Pour réaliser une fermentation aérobie immergée pour obtenir les antibiotiques A-32390, on fait d'abord croître l'organisme sur des cultures inclinées d'agar, ou , de préférence, dans une culture aérobie immergée dans un milieu glycérol-lactose, ce dernier étant conservé dans la phase vapeur de l'azote liquide. On transfère le champignon dans un milieu végétatif pour assurer une croissance rapide de l'organisme sur une échelle faible. On laisse croître ce milieu végétatif inoculé jusqu'à ce qu'on obtienne une culture viable de l'organisme avec laquelle on inocule un réacteur plus important. L'utilisation d'un milieu végétatif comme étape intermédiaire dans la production de l'antibiotique est préférable à l'inoculation directe dans un réacteur de grande capacité. L'inoculation d'un réacteur de grande capacité au moyen d'un milieu végétatif fournit une croissance plus rapide de l'organisme que celle obtenue par inoculation directe au moyen de spores. L'organisme donnant A-32390 crolt à des températures comprises entre environ 18 et environ 370C. Il semble que la production antibiotique optimale se situe à des températures comprises entre environ 22 et environ 280C. Comme il est habituel dans des procédés de culture aérobie immergée, on insuffle de l'air stérile à travers le milieu de culture pendant le procédé de fermentation. Pour une croissance de l'organisme et une production de l'antibiotique efficaces, on préfère utiliser un volume d'air en excès d'environ 0,1 volume d'air par volume de milieu de culture par minute (v/v/m). Dans la fermentation aérobie immergée des antibiotiques A-32390, on obtient des résultats optimaux lorsque le volume d'air utilisé est d'au moins 0,3 v/v/m. En général, lorsque l'on utilise des conditions de fermentation aérobie immergée ou des conditions de culture en ballon agité, la production maximale des antibiotiques A-32390 se situe entre environ 3 et environ 6 jours après l'inoculation du milieu de culture. La production maximale des antibiotiques A-32390 dans des réacteurs de fermentation de grande capacité dans des conditions aérobies immergées se produit à environ 96 heures. On peut suivre le développement de la fermentation en examinant le milieu de fermentation de temps en temps par rapport à un organisme sensible aux antibiotiques A-32390. Un tel organisme que l'on peut utiliser est Sarcina lutea ATCC 9341. Après la production dans des conditions de fermentation aérobies immergées, on peut récupérer les antibiotiques A-32390 a partir du bouillon de fermentation par des procédés utilisés dans l'industrie de la fermentation. Le bouillon filtré contient la majeure partie des antibiotiques A-32390 qui sont produits au cours de la fermentation. Le mycélium contient une quantité relativement faible des antibiotiques A-32390 produits. Dans les conditions utilisées jusqu'à présent, l'organisme décrit ci-dessus et désigné sous le nom Pyrenochaetasp NEE5786 produit le facteur A comme facteur prédominant. En général, le facteur A est présent en quantités d'environ 60 à environ 95 % du total des antibiotiques A-32390 récupérés. On récupère les antibiotiques A-32390 à partir du milieu de fermentation sous la forme d'un mélange antibiotique. Comme la plus grande partie de l'activité antibiotique est associée au bouillon, un procédé préféré de récupération est la filtration du milieu de fermentation. On extrait ensuite le bouillon de fermentation filtré à l'aide d'un solvant organique approprié. On traite l'extrait résultant avec un agent de dessication et on le concentre ensuite à un faible volume pour obtenir le complexe antibiotique A-32390 sous la forme d'un précipité solide semicristallin brut. Des solvants qui, sont des esters, tels que l'acétate d'éthyle, l'acétate d'amyle et l'acétate d'isoamyle sont des solvants appropries à l'aide desquels on extrait le bouillon filtré. On préfère comme solvant d'extraction l'acétate d'éthyle. Une variante de récupération du mélange antibiotique A-32390 est l'adsorption sur une résine macroréticulée telle que Amberlite XAD-2 ou XAD-4 (Rohm et Haas). L'acétone est un solvant d'élution plus particulièrement utile pour ce procédé. Dans une autre variante, on peut extraire la totalité du bouillon de fermentation à l'aide d'un solvant approprié non miscible à l'eau, tel que l'acétate d'éthyle , et on peut concentrer cet extrait comme précédemment pour obtenir le mélange antibiotique A-32390. On peut purifier ulterieurement-le mélange antibiotique A-32390 par des procédés tels que la cristallisation fractionnée ou la chromatographie sur un adsorbant approprié. Des adsorbants appropriés comprennent le gel de silice, le silicate de magnésium et des produits semblables. On sépare le facteur A de l'antibiotique Au 32390 et on l'isole sous la forme d'un composé individuel, le plus facilement par une combinaison de procédés de cristallisation fractionnée et de chromatographie. Par exemple, on isole le facteur A du mélange antibiotique A-32390 par chromatographie sur gel de silice et cristallisation ultérieure dans 11 acétone. Des faibles quantités des facteurs B, C et D sont présentes dans la liqueur mere après cristallisation et séparation du facteur A. On peut ultérieurement séparer les facteurs mineurs par exemple par chromatographie préparative de couche mince. On donne les exemples suivants-afin de mieux illustrer les méthodes et les procédés de la présente invention. EXEMPLE 1 A. Culture inclinée de A-32390 On prépare une culture de l'espèce Pyrènochaeta 5786 sur un plan incliné d'agar présentant la composition suivante Composés Quantité Agar (Meer, lavé 3 fois) 20,00 g Dextrose 20,00 g Peptone 5,00 g KH2PO4 0,50 g MgSO4,7H20 0,02 g FeSO4,7H20 0,01 g Eau déionisée qsp 1 litre On ajuste le pH du milieu à pH 6,2 par addition d'hydroxyde de sodium. Le pH du milieu après stérilisation est, d' environ 5,4. On inocule le plan incliné avec Pyrenochaeta NRRL 5786 et on incube le plan incliné inoculé à 250C pendant 7 jours. B. Fermentation en ballon agité de A-32390 On gratte à l'aide d'une aiguille stérile la moitié de la culture du plan incliné arrivée à maturité et on l'utilise pour inoculer 50 mi d'un milieu végétatif présentant la composition suivante Composé Quantité Glucose 25 g Mélasses.comestibles 36 g Liqueur de macération de mais 6 g Extrait de malt 10 g N-Z Casek 10 g Solution- mère minérale de Czapekk 2 ml eau déionisée q.s.p. 1100 ml Produit de digestion enzymatique de la caséine, Sheffield Chemical Co., Norwich, New York, U.S.A La La solution-mère minérale de Czapek présente la composition suivante Composé Quantité FeS04, 7H20 (dissous dans 2 ml HCl conc. 2 g KC1 100 g MgSO4,7H2O 100 g Eau déionisée q.s.p. 1 litre On incube le milieu végétatif inoculé, dans un flacon d'Erlenmeyer d'un capacité de 250 ml pendant 2 jours à 250C sur un agitateur rotatif selon un arc d'un diamètre de 5 cm à 250 t/mn. On peut utiliser directement le milieu végétatif incubé pour inoculer le milieu végétatif de deuxième étape ou, dans une autre variante, on peut le stocker en maintenant la culture dans la phase vapeur de l'azote liquide. On prépare la culture pour ce dernier usage dans de nombreuses fioles de petites dimensions de la manière suivante redans chaque fiole on place 2 ml du milieu végétatif incubé et 2 ml dtune solution glycérol-lactose présentant la composition suivante Composé Quantité Glycérol 200 g Lactose 100 g Eau déionisée q.s.p, 1 litre On stocke les solution préparées dans la phase vapeur de l'azote liquide. On utilise 1 ml d'une suspension stockée ainsi préparée pour inoculer 50 ml d'un milieu végétatif de première étape présentant la même composition que celle décrite ci-dessus pour le milieu végétatif. On incube deux répliques de flacons inoculés de 250 ml pendant 2 jours a 250C sur des agitateurs tournant sur des arcs de 5 cm à 250 t/mn. Afin d'obtenir un volume plus important d'inoculum, on utilise 10 ml du milieu végétatif incubé de première étape pour inoculer 200 ml d'un milieu végétatif de deuxième étape présentant également la même composition que celle du milieu végétatif. On incube quatre répliques de flacons inoculés (d'un volume d'un litre) pendant un jour à 25 C sur des agitateurs tournant sur des arcs de 5 cm à 250 t/mn. C. Fermentation de A-32390 en réacteur On utilise le milieu végétatif incubé de deuxième étape (800 ml) pour inoculer 100 1 de milieu de production stérile présentant la composition suivante Composé Quantité Saccharose 30,00 g/l Glucose 15,00 g/l Farine de graine de coton 5,00 g/l KCl 0,50 g/l K2HPO4 0,20 g/l FeSO4,7H2O 0,01 g/l NaNO3 0,50 g/l MgSO4,7H2O G,50 g/l Agents anti.-mousse 0,70 g/l Solution-mère minérale de Czapek 2,00 ml/l Ethanol (95 t) 14,00 ml/l Eau déionisée q.s.p. 1 litre Ce milieu présente un pH qui n'a pas été ajusté de 6,6.On réalise l'ajustement du pH à 7,3 par addition d'environ 10 ml d'hydroxyde de sodium 10 N avant stérilisation. Le milieu présente un pH de 6,4 après stérilisation à 120 C pendant 30 minutes sous une pression de 1,12 à 1,27 kg/cm . Dans un réacteur de fermentation d'une capacité de 165 1, on pratique la fermentation du milieu de production inoculé pendant quatre jours à une température de 250C. Pendant ce temps, on aère le milieu de fermentation à l'aide d'air stérile-sous un débit de 0,25 v/v/m. On agite le mélange à l'aide d'un agitateur conventionnel sous une vitesse de 200 t/mn. EXEMPLE 2 Séparation du mélange antibiotique A-32390 On filtre 100 litres du bouillon de fermentation, préparé comme décrit dans l'Exemple 1, en utilisant 3 à 5 % d'un adjuvant de filtration (Hyflo Supercel). On extrait le filtrat de bouillon (environ pH 7,0) ainsi obtenu avec de l'acétate d'éthyle (deux fractions de 60 litres) On évapore sous vide les extraits combinés à l'acétate d'éthyle à un volume de 1 litre. On refroidit cette solution à 50C pendant 24 heures. On sépare par filtration le précipite semicristallin qui se forme, on le lave avec 50 mi d'acétate d'éthyle froid, et on le sèche sous vide pour obtenir le complexe antibiotique A-32390. EXEMPLE 3 Isolement du facteur A-32390 On-met en suspension 5 g du mélange antibiotique A-32390, préparé tel que dans l'Exemple 2,dans 100 ml de benzène. On traite cette suspension dans une colonne de gel de silice 3,7 x 90 cm (Matheson, qualité 62) qui a été préparée dans le benzène. On élue successivement la colonne avec 2 litres de benzène, 3 litres d'un mélange 1:1 benzène-acétate d'éthyle, et 500 ml d'acétate d'éthyle. Une élution ultérieure par 12,5 litres d'acétate d'éthyle sépare les fractions contenant le facteur A de A-32390. On combine ces fractions et on les évapore à siccité sous vide. On dissout le résidu ainsi obtenu dans 50 ml d'acétone chaude. Le facteur A de A-32390 cristallise par refroidissement. On sépare le facteur A par filtration, on le lave avec 10 ml d'acétone froide et on le sèche sous vide (rendement 1,5 g). EXEMPLE 4 Préparation du Tétraacétate du facteur A de A-32390 On Dissout 206 mg du facteur A de l'antibiotique A-32390, prépare comme-décrit dans l'Exemple 3, dans 5 ml de pyridine sèche distillée. On ajoute à cette solution 2,5 ml d'anhydride acétique. On abandonne au repos la solution résultante pendant une nuit à température ambiante et on la concentre ensuite sous vide jusqu'à obtention d'un résidu. On aissout ce résidu dans un mélange eau-acétone, et on évapore à nouveau sous vide la solution résultante jusqu'à obtention d'un résidu. On redissout d'une manière répétée le residu dans le chloroforme et on le reevapore sous vide jusqu'à ce que le résidu résultant ne presente plus d'odeur détectable de pyridine. On place le résidu final, dissous dans 2 ml de chloroforme, dans une colonne de gel de silice (Grace, qualité 62, 1,5 x 30 cm). On élue la colonne au chloroforme sous un débit de 3 ml par minute. On recueille 25 fractions de 15 ml. On combine les fractions actives 7 à 11 et on les concentre sous vide jusqu'à obtention d'un résidu sirupeux. On redissout ce résidu et on le réévapore dans l'éther diéthylique et on le sèche ensuite sous vide pour obtenir 268 mg du tétraacétate du facteur A de A-32390 sous la forme d'un sirop (rendement 91 ). EXEMPLE 5 On prépare le dérivé tétrapropionate du facteur A de l'antibiotique A-32390 (430 mg) en faisant réagir 827 mg du facteur A de A-32390 et dé l'anhydride propionique dans la pyridine en utilisant les procédés décrits dans l'Exemple 4 (rendement 52 %). EXEMPLE 6 On prépare le tétrabutyrate du facteur A de l'antibiotique A-32390 (549 mg) par réaction de 820 mg du facteur A de A-32390 et d'anhydride butyrique dans la pyridine, en utilisant les procédés décrits dans l'Exemple 4 (rendement 67 t). Au cours de la discussion qui suit sur l'utilité des produits, on appelle "composés antibiotiques A-32390" le facteur A individuel, le mélange antibiotique A-32390, et les dérivés ester de tetra-(acyle en C2-C4) du facteur A de la présente invention, pour plus de brièveté. Les composés antibiotiques A-32390 inhibent la croissance des micro-organismes qui sont pathogènes vis-à-vis des animaux et des plantes. Les activités in vitro du facteur A individuel de A-32390 et des différents esters de tétraacyle du facteur A visà-vis d'organismes représentatifs sont résumées dans le tableau I. On mesure l'activité comme étant le diamètre de la zone d'inhibition créée par le composé d'essai lorsqu'il est présent à un niveau de 1 mg/ml. TABLEAU I Diamètres de zone Organisme Facteur A Tétra- Tétra- Tétraacétate propionate butyrate Staphylococcus aureus 30 20 12 trace: Bacillus subtilis 30 20 11 - Sarcina lutea 28 24 12 9 Mycobacterium avium 26 10 -- - Saccharomyces pastorianus 24 24 22 10 Neurospora crassa 20 18 16 9 Candida tropicalis 19 15 14 - Fusarium moniliforme -- 28 17 - Trichophyton mentagrophytes -- 22 11 - Escherichia coli 30 27 19 -- Il existe un besoin pressant pour des agents antifongiques améliorés, plus particulièrement pour des agents qui sont systématiquement actifs. I1 existe seulement un médicament systématique de choix, l1Amphotéricine B, qui soit présentement disponible pour le traitement d'un grand nombre de maladie d'origine fongique.Toutefois, on a rapporté que ce mêdlcament présente divers effets secondaires néfastes. L'activité anti fongique systématique des composés antibiotiques A-32390 est par conséquent un aspect important de la présente invention. Par exemple, le facteur A de A-32390 est actif in vivo vis-à-vis de Candida albicans. Dans des tests sur des souris, le facteur A de A-32390, lorsqu'on l'administre soit par voie sous cutanée soit par voie intrapéritonéale fournit une protection vis-à-vis des infections par Candida albicans. Dans des essais répétés, on traite successivement des souris infectées par Candida albicans par quatre doses (25 à 50 mg/kg ; voie intrapéritonéale) du facteur A de A-32390. La durée de vie de ces souris infectées mais traitées est de 100 % supérieure à la duree de vie de souris témoins infectées de la même manière mais non traitées. Les composés antibiotiques A-32390 sont relativement non toxiques. Par exemple, la DLo (dose aigue la plus faible pour laquelle il n'y a pas de décès des animaux à l'essai) pour le facteur A de A-32390 chez les souris (sc) est supérieure à 1000 mg/ kg. Lorsqu'on les utilise comme agents antifongiques, on administre les composés antibiotiques A-32390 par voie parentérale. Bien que ceci ne soit pas essentiel, les composés antibiotiques A-32390 sont plus bioactif s lorsqu'on les utilise comme agents antifongiques si on les formule conjointement avec une polyvinylpyrrolidone (PVP) sous la forme d'une composition. Compositions antibiotiques Au cours de la discussion sur le facteur A de l'antibiotique A-32390 des compositions antibiotiques et de ses dérivés ester de tétraacyle, on continuera à les appeler "composés antibiotiques A-32390". Des nouvelles compositions A-32390 : polyvinylpyrrolidone (PVP) contiennent une partie d'un composé antibiotique de A-32390 conjointement avec une à quinze parties d'une PVP présentant un poids moléculaire dans l'intervalle d'environ 10.000 à environ 360.000. Bien que le poids moléculaire de la PVP ne soit pas un élément caractéristique de la composition, des compositions préférées sont celles préparées avec une PVP présentant un poids moléculaire dans l'intervalle d'environ 10.000 à environ 60.000, par exemple, la PVP commercialement disponible présentant un poids moléculaire d'environ 40.000.On prépare les compositions en dissolvant séparément le compose antibiotique de A-32390 et la PVP, en mélangeant les deux solutions et en évaporant la solution résultante. I1 est fréquemment avantageux d'ajouter à la composition A-32390:PVPune faible quantité d'agent mouillant tel que, par exemple, le mono-oléate de polyoxyéthylene (20) sorbitanne. Un procédé commode de préparation de telles compositions est de dissoudre l'agent mouillant, la PVP, et le composé facteur A de A-32390 séparément dans des solvants appropriés, de mélanger ensuite les trois solutions et de les évaporer conjointement pour obtenir la composition souhaitée. Une composition A-32390:PVP donne une forme plus bioactive du composé antibiotique de A-32390. Au fur et à mesure que la quantité de PVP augmente dans la composition, la quantité de composé antibiotique de A-32390 nécessaire pour une activité antifongique diminue. Lorsqu'il est utilisé comme agent antifongique, la dose de composé antibiotique de A-32390 dépend également d'autres facteurs, tels que la nature et la sévérité de l'infection particulière concernée. Toutefois en général on peut obtenir des résultats satisfaisants avec des doses quotidiennes dlun compose antibiotique de A-32390 entre environ 120 et environ 600 mg/kg de poids corporel de l'animal ou avec des doses quotidiennes d'une composition A-32390:PVP entre environ 30 et environ 600 mg/kg de poids corporel de l'animal. On administre habituellement cette quantité conjointement avec un support ou un diluant acceptables sur le plan pharmaceutique et on peut l'administrer en doses divisées telles que 2 à 4 fois par jour. EXEMPLE 7 Préparation de compositions facteur A dé A-3239d:PVP On prépare des compositions A-32390:PVP en dissolvant le facteur A de A-32390 dans l'acétone et en dissolvant la PVP d'un poids moléculaire de 40.000 dans le chloroforme. On mélange les deux solutions, on ajoute au mélange de l'acétone et/ou-du chloroforme jusqu'à ce que la solution soit limpide. On évapore la solution résultante sous vide pour obtenir un résidu cristallin que l'on broye en une poudre fine.Des compositions de facteur A de A-32390:PVP préparées de cette maniere comprennent les suivantes Rapport Quantité du Quantité de A-32390:PVP facteur A de PVP A-32390 1:1 750 mg 750 mg 1:3 500 mg 1500 mg 1:4 500 mg 2000 mg 1:9 500 mg 4500 mg EXEMPLE 8 Préparation de compositions facteur A de A-32390:PVP contenant un agent mouillant On prépare des compositions A-32390:PVP contenant un agent mouillant en dissolvant le facteur A de A-32390 dans l'acétone, en dissolvant la PVP d'un poids moléculaire de 40.000 dans le chloroforme, et en dissolvant 0,01 % de Tween 80 (Polysorbate 80) dans l'acétone (1 mg/ml). On mélange les trois solutions. On ajoute de l'acétone et/ou du chloroforme au mélange jusqu'à ce que la solution soitlBmpide .On évapore la solution résultante sous vide pour obtenir un résidu cristallin que l'on broye en une poudre fine. Des compositions facteur A de A-32390:PVP-préparées de cette manière comprennent les suivantes Rapport Quantité du Quantité de Quantité de A-32390:PVP facteur A de PVP Tween 80 A-32390 1:1 750 mg 750 mg 150 mcg 1:3 500 mg 1500 mg 200 mcg 1:4 500 mg 2000 mg 250 mcg 1:9 500 mg 4500 mg 500 mcg Dans un autre aspect de l'invention, les composés antibiotiques de A-32390 inhibent la dopamine-p-hydroxylase et sont des agents hypotenseurs. La dopamine-p-hydroxylase est uneenzyme qui prwoquelthydroxylation de la dopamine en noradrénaline.Par conséquent l'inhibition de la dopamine-p-hydroxylase donne comme résultat une réduction des teneurs en noradrénaline. Des essais in vivo chez des rats démontrent que des doses de 3 à 200 mg/kg de facteur A de A-32390 reduisentes teneurs dc noradrénaline dans le coeur pendant une periode de 1 à 2 jours. Des résultats de certains de ces essais sont résumés dans le Tableau III. METHODE D'ESSAI On utilise des rats mâles (Harlan Industries, Cumberland, Ind.) en groupes de cinq. On administre par injection intrapéritonéale des suspensions de gomme arabique contenant des taux de doses variables du compose d'essai. Après 48 heures on décapite les rats, on retire les tissus, on les congèle rapidement sur de la neige carbonique et on les maintient congelés jusqu'à l'analyse. On mesure les catécholamines par voie fluorométrique en utilisant le procédé de Chang CInt. J. Neuropharmacol. 3, 643-649 (1964)3 pour le tissu cardiaque.On utilise dans tous les cas des courbes étalons internes (quantités connues de la catécholamine appropriée, dans ce cas la noradrénaline, ajoutées à des compositions homogènes de tissus) pour transformer les intensités de fluorescence en teneurs en catécholamine. Les teneurs sont exprimées en moyenne + e.t.m TABLEAU III Dose de facteur A Teneurs en noradrénaline de A-32390 (mg/kg) (mcg/g tissu) pourcent O (témoin) 0,87 + 0,03 100 3 0,73 t 0,04 84# 10 0,80 + 0,07 92 32 0,62 + 0,04 71te 100 0,33 t 0,07 382* P Les composés antibiotiques de A-32390 sont également utilisables comme agents hypotenseurs. Dans des essais représentatifs, le facteur A de l'antibiotique A-32390 diminue d'une manière efficace la pression sanguine sur des rats artificiellement hypertendus. METHODE D'ESSAI On anesthésie des rats mâles sevrés (Sprague-Dawley) et on les soumet à une uninéphrectomie. On implante dans ia région du coup une pastille de 25 mg d'acétate de désoxycorticostérone (DOCA). On laisse les animaux se remettre pendant 1 semaine, et on remplace ensuite l'eau de boisson par une solution saline à 1 %. On maintient les animaux sous boisson saline pendant 3 semaines. A ce moment là les rats sont hypertendus et conservent une tension sanguine élevée sans qu'il soit besoin de suppléments de NaCI. On détermine la tension sanguine par voie indirecte, en utilisant la queue du rat et une technique électrosphygmographique. On réchauffe les animaux à 390C pendant 10 minutes pour détecter toute impulsion de pression. On détermine une tension sanguine témoin pour chaque rat avant administration du composé d'essai. On mesure également la tension sanguine 3, 6, 24 et 48 heures apres l'administration du composé d'essai. Le tableau IV résume les résultats de ces essais avec des rats auxquels on a administre des taux de dose variables en facteur A de l'antibiotique A-32390 (par voie intrapéritonéale). TABLEAU IV Tension sanguine (mmHg + e.t.m.)# Dose de facteur Témoin Temps après administration (heure A de A-32390 (ip) 0 3 4 24 48 200 mg/kg 233 # 5 164 # 9 160 # 10 157 # 8 213 # 11 200 mg/kg 192 # 7 162 # 11 138 #7 128 # 13 132 # 16 100 mg/kg 205 # 14 163 # 14 159 # 24 175 # 26 163 # 21 50 mg/kg 221 # 13 140 # 12 147 # 10 202 # 17 217 # 8 25 mg/kg 218 # 14 154 # 38 152 # 23 - # Moyenne de quatre animaux Lorsqu'on les utilise soit pour inhiber la dopamine-p- hydroxylase ou pour diminuer la pression sanguine, on administre normalement les composés antibiotiques de A-32390 selon la présen- te invention par voie parentérale sous la forme d'une préparation pharmaceutique contenant une quantité thérapeutiquement active d'un composé antibiotique de A-32390 incorpore sur un support acceptable sur le plan pharmaceutique. Bien que la quantité de dosage dépende de facteurs tels que le composé A-32390 utilisé, la méthode d'administration et l'efficacité thérapeutique souhaitée, la dose varie en général-d'environ 2 à-environ 30 mg/kg de poids corporel de l'animal. Un intervalle de dose préféré est compris entre environ 4 et environ 10 mg/kg de poids corporel de l'animal. REVENDICATIONS 1. Mélange antibiotique A-32390 comprenant les facteurs A, B, C et D et les dérivès ester tetratacyle en c2-c4) du facteur A. 2. Facteur A de l'antibiotique A-32390 et ses dérivés ester de tétra-(acyle en C2C4) de formule dans laquelle tous les groupements R sont identiques et sont choisis dans le groupe constitué de l'hydrogène, et des groepernents acétyle, propionyle et butyryle. 3. Facteur de l'antibiotique A-32390 qui est le composé de la revendication 2 dans lequel R est l'hydrogène. 4. Composé selon la revendication 2 dans lequel R est le groupement acétyle. 5. Composé selon la revendication 2 dans lequel R est le groupement propionyle. 6. Composé selon la revendication 2 dans lequel R est le groupement butyryle. 7. Facteur B de l'antibiotique A-32390, présentant une valeur Rf de 0,23 par chromatographie en couche mince sur gel de silice G en utilisant un système de solvant chloroforme-méthanol (9:1). 8. Facteur C de l'antibiotique A-32390, présentant une valeur Rf de 0,15 par chromatographie en couche mince sur gel de silice G en utilisant un système de solvant chloroforme-méthanol (9:1). 9. Facteur D de l'antibiotique A-32390 présentant une valeur Rf de 0,05 par chromatographie en couche mince sur gel de silice G en utilisant un système de solvant chloroforme-méthanol (9:1). 10. Procédé de préparation d'un mélange antibiotique A-32390 contenant des facteurs A, B, C et D et les dérivés ester de tétra (acyle en C2-C4) du facteur A comprenant a) la culture de Pyrenochaeta sp NRRE5768 ou d'un de ses mutants qui produit le mélange antibiotique A-32390 dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucides , d'azote, et de sels minéraux dans des conditions de fermentation aérobies immergées jusqu'à ce que l'on produise une quantité substantielle d'activité antibiotique ; et b) facultativement la séparation du mélange antibiotique A-32390 du milieu de culture c) facultativement l'isolement des facteurs antibiotiques A, B, C et D du mélange antibiotique A-32390 , et d) facultativement l'acylation du facteur A de l'antibiotique A-32390. 11.Procédé selon la revendication 10 dans lequel on prépare le produit de l'étape d) par réaction du facteur A de l'antibiotique A-32390 avec un anhydride d'acide choisi dans le groupe constitué de l'anhydride acétique, de l'anhydride propionique et de l'anhydride n-butyrique. 12. Composition antibiotique contenant le facteur A de l'antibiotique A-32390 ou ses dérivés ester de tétra-(C2-C4)-acyle de formule dans laquelle tous les groupements R sont identiques et sont choisis dans le groupe constitue de l'hydrogène, et des groupements acétyle, propionyle et butyryle,et un excipient. 13. Composition antibiotique selon la revendication 12 dans laquelle l'excipient est une polyvinylpyrrolidone présentant un poids moléculaire dans l'intervalle 10.000-360.000. 14. Composition selon la revendication 13 contenant une partie d'un facteur A d'antibiotique A-32390 ou d'un deses dérivés ester de tétra- (acyle en C2-c4)et une à quinze parties d'une polyvinylpyrrolidone d'un poids moléculaire dans l'intervalle 10.000-60.000. 15. Composition selon les revendications 12, 13 ou 14 dans laquelle le composé antibiotique de A-32390 est le facteur A de l'antibiotique A-32390.