Brevet FR2345518A1 — publié le 19771021

t'invention concerne l'obtention de spores durables de champignons pathogènes d' insectes, en particulier d'Entomophthorales, applicables en tant que produits phytosa nitaires,pdncipi L'invention a plus particulièrement pour objet un milieu de culture pour la croissance et la sporulation d'Entomophthorales utilisant une source de carbone dont le prix de revient est compatible avec une production industrielle. L'invention a également pour objet les spores obtenues dans le susdit milieu de culture et notamment celles resultant de souches nouvelles isolées par la Demanderesse ainsi que les produits phytosanitaires renfermant de telles spores. On avait depuis longtemps pensé à utiliser les Entomophthorales dans la lutte biologique contre les aphides, mais l'on se heurtait jusqu'à présent à des difficultés d'ordre technique si importantes qu'il n'était pas possible d'envisager une telle utilisation à grande échelle. En effet, la mise dans le commerce en vue de son utilisation par des non-spécialistes d'un produit phytosanitaire suppose que ce produit puisse se conserver pendant un temps raisonnable (au moins quelques mois) et soit d'un maniement relativement simple. I1 était par conséquent nécessaire de trouver un moyen permettant d'obtenir un inoculum d'Entomophthorales se présentant sous une forme stable, maniable et facilement utilisable en agriculture. On avait observé qu'un certain nombre d'espèces dEntons thorales peuvent donner lieu à la formation de spores durables, c'est-à-dire à.une forme de résistance des Entomophthorales, stable à ltétat sec pendant une période suffisamment longue (au moins supérieure à quelques mois) et qui, mise en présence d'eau, soit apte à germer au moment souhaité pour former des conidies qui représentent la forme directement infectante pour les insectes. Compte tenu de ces différentes propriétés, on a été amené à penser que les spores d'Entomophthorales pourraient représenter l'inoculum maniable et facilement utilisable en agriculture que l'on attendait. Le problème était de produire ces spores sur une grande échelle ; pour cela, on a recherché un milieu de culture approprié. Beaucoup de milieux de culture comprenant une source azotée associée à une source carbonée ne conviennent pas. En particulier, dans certains milieux, on obtient bien des spores mais ces spores sont de mauvaise qualité (membrane mince et/ou globule lipidique central divisé ou petit); elles ne sont pas viables et dégénèrent rapidement. On a cependant déjà pu obtenir des quantités appréciables de spores de bonne qualité en utilisant des milieux de culture solides à base de jaune d'oeuf ou encore des milieux liquides agités dont la source de carbone est constituée par du glucose, du maltose ou de l'amidon notamment. Malheureusement, de tels milieux de culture sont coûteux, et on peut difficilement envisager de les utiliser pour produire industriellement des spores. On a maintenant trouvé qu'il était possible de produire des spores d'Entomophthorales de bonne qualité, avec de bons rendements et à des meilleurs prix de revient, en utilisant un milieu de culture dans lequel la source carbonée est à base de corps gras d'origine animale ou végétale et dans lequel les sources d'azote et de carbone sont présentes en des quantités prédéterminées qui favorisent une bonne sporulation due à l'apparition d'un déséquilibre nutritif au stade de croissance désiré du mycélium. L'invention est relative à un milieu de culture pour la croissance et la production de spores durables d'Entomophthorales comportant une source d'azote et une source de carbone, caractérisé en ce que la source de carbone est à base d'un corps gras d'origine animale ou végétale essentiellement formé d'acides gras comportant au moins 12 atomes de carbone dans leur molécule et/ou de dérivés de tels acides, et en ce que les proportions respectives de la source de carbone et de la source d'azote dans ce milieu sont ajustées de façon telle que, lorsque la culture aura atteint le stade de croissance désiré, la source d'azote sera pratiquement épuisée. On a de préférence recours à des corps gras essentiellement formés d'acides gras comportant de 12 à 20 atomes de carbone dans leur molécule et/ou de dérivés de tels acides. Avantageusement,le corps gras présent dans le milieu selon l'invention est constitué par une huile végétale ou un mélange de plusieurs huiles végétales. Du point de vue industriel, l'emploi des huiles présente différents avantages, en particulier par rapport aux sources carbonées utilisées dans les milieux décrits dans l'art antérieur. Pour une valeur énergétique égale, le coût des huiles est généralement très inférieur à celui du jaune d'oeuf ou du glucose par exemple. On a de plus observé que la croissance du mycélium est plus rapide sur huile que sur glucose. Par exemple, pour une même concentration de 12 g de carbone, l'optimum de croissance est obtenu deux fois plus vite avec l'huile qu'avec le glucose. Par ailleurs, lorsqu'on utilise du glucose comme source carbonée, il est nécessaire de se limiter à des domaines de concentrations relativement restreints. En effet, la pression osmotique du milieu augmente avec la concentration du glucose. Par exemple, pour une concentration de 100 g/l de glucose (soit 40 g de carbone), on observe un net ralentissement de la croissance du mycélium, tandis que si l'on remplace le glucose par de l'huile, le développement fongique est encore très satisfaisant pour une concentration en huile de 320 ml/l (c'est-à-dire 220 g de carbone) à condition, bien entendu, que la source d'azote soit suffisante (de l'ordre de 10 à 40 g/l d'hydrolysats de protéines par exemple). La source azotée est avantageusement choisie dans le groupe des produits protéiques tels sue protéines peptides, produits de transfbrmation de nrotélnes ou hydrolysats de protéines. On peut également avoir recours à des produits analogues. Lorsque le milieu comprend une source carbonée constituée par de l'huile et une source d'azote constituée par des produits protéiques ou analogues, les quantités par litre de milieu de ces deux types de produits sont respectivement comprises entre 10 et 200 ml, de préférence entre 80 et 150 ml, d'une part, et entre 0,5 et 100 g, de préférence entre 10 et 40 g, autre part. Avantageusement, le rapport pondéral des produits protéiques aux lipides dans le milieu se situe entre 1/20 et 1/2 De préférence, le rapport-de la teneur en carbone à la teneur en azote du milieu est compris entre 2 et 32. Toutes les huiles végétales essentiellement formées d'acides gras comportant au moins 12 atomes de carbone dans leur molécule et/ou de dérivés de tels acides conviennent bien comme source carbonée dans les milieux selon l'invention. Toutefois, les huiles de maïs, olive, soja, tournesol, lin et blé constituent les sources carbonées les plus favorables au développement des Entomophthorales. On peut également avoir recours à des graisses animales comme le beurre et le saindoux. Avantageusement, le pH du milieu de culture est fixé à une valeur comprise entre 6 et7,Set il est de préférence de 6,5-7. Pour des pH inférieurs à 6, la croissance est très lente et pour des pH supérieurs b 8, on observe une lyse du mycélium. Selon la présente invention, on a également mis au point un procédé pour la production de spores durables d'Entomophthorales consistant à cultiver en fermenteur des Entomophthorales sporulables au sein du milieu selon l'invention, sous agitation et insuflation d'air, à laisser la sporulation s'effectuer lorsque la croissance est pratiquement terminée et à séparer ensuite les spores du milieu de culture. La culture est formée de préférence à partir d'un inoculum constitué de corps hyphaux d'Entomophthorales âgés de 4 à 8 jours selon l'espèce et la souche utilisées. Des espèces sporulant bien et que l'on choisit de préférence sont E. virulenta HALL et DUNN (1957) et E. obscure HALL et DUNN (1957) qui ont été décrites pour la première fois par Hall, I.M. et Dunn, P.H. en 1957 dans l'article intitulé "Entomophthorous Fungi parasitic on the spotted alfalfa aphidw Hilgardia, Berkeley, 27 (4), pages 159 à 181,et les E. sphaero- sperma FRES,que l'on définit comme étant capables de former des spores de diamètre moyen inférieur à 28 , des conidies primaires de longueur moyenne inférieure à 22 P avec un rapport longueur/ diamètre inférieur ou égal à 3, des conidies secondaires (formées au sommet de tubes capillaires) de longueur moyenne inférieure à 18)r, largement fusiformes ou amygdaliforees. Parmi les E. Virulent HALL et DUNN,- la souche celle citée est /décrite sous le nom de Entamophthora nr. thaxteriana dans l'article de Soper, R.S. et Bran, P.A. de 1974 intitulé "Mammalian Safety of aphid-attacking fungus Entomophthora nr. thaxteriana"dans Environ.Entomology, 2, pages 346 et 347,cettesaxhe a été enregistrée dans la Collection Centrale de l'institut Pasteur à Paris sous le n I 009, conduit à la formation de spores de bonne qualité avec de bons rendements. Le procédé selon l'invention permet également de préparer de nouvelles spores des espèces E.obscura et t.sphaerosperma définies plus haut à partir de nouvelles souches isolées par la Demanderesse. Ces nouvelles souches, qui ont été déposées dans la Collection Centrale de l'institut Pasteur à Paris le 22 mars 1976, sont - pour l'espèce E.obscura - les souches déposées sous les numéros I 010 à O14, isolées d'AcYrthosiphon pisum HARR sur Féverole, à Lusignan (Vienne), le 9 janvier 1974, - la souche déposée sous le numéro I 015, isolée d'Aphis armata HAUSM sur Diqitalis purpurea au Rosskopf (Moselle), le 26 juillet 1974. - pour l'espèce E.sphaerosperma : - les souches déposées sous les numéros 1016 à I025 isolées du Lipidoptère Tortrix viridana L. sur Quercus dans la forêt de Dourdan (Essonne), le 27 mai 1975. Dans une variante de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, on peut provoquer la sporulation avant l'épuisement d'au moins 1 des constituants du milieu en rempla çant le milieu de culture par de l'eau, évitant ainsi l'effet néfaste de produits de métabolisme qui peuvent, dans certains cas, gêner l'apparition des spores. L'invention vise également les spores obtenues par mise en oeuvre du procédé selon linvention, en particulier lorsqu'on utilise les nouvelles souches isolées par la Demanderesse, ainsi que les compositions phytosanitaires, notamment pour la destruction des aphides, qui contiennent dans leur principe actif les spores obtenues par mise en oeuvre du procédé selon l'invention. L'invention vise plus particulièrement de telles compositions phytosanitaires qui contiennent dans leur principe actif des spores durables d'Entomophthorales comportant un globule lipidique central dont le diamètre est au moins égal à 60% du diamètre de la spore et dont la membrane représente au ème moins environ l/lOème du diamètre de la spore. Avantageusement, les spores sont obtenues à partir de souches d'au moins l'une des espèces E. virulenta, E. obscura et E. sphaerosperma définies précédemment. Pour la mise en oeuvre de l'invention, il est avantageux de procéder comme suit Préparation du milieu de culture La source azotée est mise en solution dans de l'eau distillée contenue dans le fermenteur devant être utilisé, le pH est amené à 6,5 par adjonction d'acide chlorhydrique et le milieu est tamponné à l'aide d'un tampon au phosphate. On ajoute ensuite la source carbonée à base de corps gras et, de préférence, un antimousse (par exemple celui commercialisé sous la marque RHODORSIL 426 R3, dans la proportion de 2 à 8 pour 1000. Le fermenteur et ses annexes (filtre à air et éventuellement sonde de pH et sonde à oxygène dissous) sont maintenus pendant environ 20 minutes à 1140C dans un autoclave. Le pH du milieu est vérifié avant utilisation. Préparation de l'inoculum : L'inoculum nécessaire pour un fermenteur contenant de 1 à 1,3 1 de milieu de culture est obtenu à partir d'une culture liquide de 50 ml, agée de 4 à 8 jours, en fiole de type Erlenmeyer agitée (110-120 secousses par minute). Si le mycélium a tendance à former des aggrégats, on les dissocie par agitation magnétique énergique pendant 5 à 10 minutes chaque jour à l'aide d'un barreau magnétique placé dans l'Erlenmeyer. Lorsque l'inoculum est prêt, il est introduit dans le fermenteur à travers le bouchon du fermenteur à l'aide d'une seringue. Conduite de la fermentation Le fermenteur est maintenu à la température de 20"C à l'aide d'un bain-marie. De l'air est envoyé à travers la solution sous une pression de 1 bar et à raison de 20 à 100 I/heure. Pendant toute la durée de la fermentation, on agite à raison de 100 à 1200 tours/minute. Toutes les 24 heures, on prélève de 1 à 5 il du milieu , selon les essais à effectuer, de façon à suivre la croissance et l'évolution morphologique de la culture. Pour des concentrations en matière sèche faibles (10 g dthydrolysat de-protéine et 20 g d'huile par exemple), le maximum de croissance est atteint en 3 ou 4 jours. Si l'on a recours à des concentrations plus élevées (2d g de peptone et 80.1 d'huile par exemple), la phase de croissance a une durée approximative de 10 jours. Les préspores apparaissent à la fin de la croissance et les spores atteignent leur maturation complète en 3 ou 4 jours. Selon la concentration et l'espèce de champignons utilisées, la durée de fermentation est de 8 à 15 jours et augmente lorsque les concentrations en matière sèche augmentent. Extraction des snobes : résultats obtenus Lorsque la fermentation est achevée, les deux phases du contenu du fermenteur sont séparées par exemple par centrifugation, le culot est rincé à l'eau et centrifugé plusieurs fois, puis séché à la température ambiante. Les rendements en spores varient en fonction de l'espèce cultivée et atteignent par exemple 2.106 pour E.virulenta et environ 106 pour E.obscura par mi de milieu de culture. L'exeaple suivant, non limitatif, décrira mieux l'inten- tion Préparation du milieu Dans un fermenteur de 2 1 contenant 1 1 d'eau distillée, on dissout 5 g de peptone et 5 g d'extrait de levure commercia- lisés sous la marque DIFCO. Le pH du milieu est amené à 6,5 par adjonction d'acide chlorhydrique. Le milieu est ensuite tamponné par un tampon au phosphate (3,2 g de phosphata monopotassique et 12,9 g de phosphate disodique). On ajoute ensuite 80 1 d'huile de tournesol et 100 gouttes d'antimousse (RHODORSIL 426 R.). Le fermenteur et ses annexes sont maintenus dans un autoclave à 1140C pendant 20 minutes. Le pH est ensuite vérifié. Préparation de l'inoculum : L'inoculum est apporté par une culture liquide de 50 ml obtenue à partir de la souche I 015 de l'espèce E.obscura, âgée de 6 jours, préparée dans un Erlenmeyer de 150 ml agité à raison de 110-120 secousses par minute et dans lequel se trouve également un barreau magnétique permettant de dissocier les boules de mycélium qui peuvent se former (agitation énergiqùe pendant 5 a 10 minutes chaque jour.) L'inoculum-est introduit dans le fermenteur au moyen d'une seringue à travers le bouchon du fermenteur. Fermentation et rendements obtenus Le fermenteur baigne dans un bain-marie dont la température est régulée à 20"C. L'air est introduit dans le fermenteur a raison de 50 1/heurte et sous une pression de 1 bar. L'agitation est fixée à 600 tours/minute. Des prélèvements effectués toutes les 24 heures permettent de constater que la croissance est pratiquement terminée au bout de 6 jours. Les préspores apparaissent alors et les spores atteignent leur complète maturation au bout de trois jours. Extraction des spores On récolte les spores le iOe jour de la fermentation par centrifugation du fermenteur. Le culot apparu dens le fermenteur est ensuite rincé à l'eau et centrifugé plusieurs fois puis séché à la température ambiante. On obtient environ 10 g de spores. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement aux modes de réalisation qui ont été plus particulièrement décrits elle en embrasse au contraire toutes les variantes. REVENDICATIONS 1. Milieu de culture pour la croissance et la production de spores durables d'Entomophthorales comportant une source d'azote et une source de carbone, caractérisé en ce que la source de carbone est à base d'un corps gras d'origine animale ou végétale essentiellement formé d'acides gras comportant au moins 12 atomes de carbone dans leur molécule et/ou de dérivés de tels acides, et en ce que les proportions respectives de la source de carbone et de la source d'azote dans ce milieu sont ajustées de façon telle que, lorsque la culture aura atteint le stade de croissance désiré, la source d'azote sera pratiquement épuisée. 2. Milieu de culture selon la revendication 1, caractérisé en ce que les susdits corps gras d'origine animale ou végétale sont essentiellement formés d'acides gras comportant de 12 à 20 atomes de carbone dans leur molécule et/ou de dérivés de tels acides. 3. Milieu selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le corps gras est constitué par une huile végétale ou un mélange de plusieurs huiles végétales. 4. Milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la source d'azote est formée par des produits protéiques, tels aue protéines, peptides, oroduits de transformation de protées ou hydrolysats de protéines ou des produits analogues. 5. Milieu selon les revendications 3 et 4 prises ensemble, caractérisé en ce que le milieu est sous forme d'une composition d'huile dans l'eau et que ses teneurs, par litre de milieu, en huile et en produits protéiques ou analogues, sont respectivement comprises entre 10 et 200 ml d'une part, et 0,5 et 100 g, d'autre part. 6. Milieu selon la revendication 5, caractérisé en ce que les susdites teneurs, par litre de milieu, sont respectivement comprises entre 80 et 150 ml d'huile, d'une part, et entre 10 et 40 g de produits protéiques ou analogues, d'autre part. 7. Milieu selon l'une quelconque des revendications 5 et 6, caractérisé en ce que, dans le milieu, le rapport pondéral des produits protéiques aux lipides se situe entre 1/20 et 1/2. 8. Milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le rapport de la teneur en carbone à la teneur en azote du milieu est compris entre 2 et 32. 9. Milieu selon l'une quelconque des revendications 3 à 8, caractérisé en ce que l'huile végétale utilisée seule ou en mélange est choisie dans le groupe comprenant les huiles de mars, olive, soja, tournesol, lin et blé. 10. Milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que son pH est compris entre 6 et 7,5de préférence de l'ordre de 6,5-7. 11. Procédé pour la production de spores durables d'Entomophthorales, caractérisé par le fait qu'il consiste à cultiver en fermenteur des Entomophthorales sporulables au sein du milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, sous agitation et insufflation d'air, à laisser la sporulation s'effectuer lorsque la croissance est pratiquement terminée et à séparer ensuite les spores du milieu de culture. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la culture est formée à partir d'un inoculum, constitué de corps hyphaux d'Entomophthorales âgés de 4 à 8 jours. 13. Procédé selon la revendication il ou 12,, caractérisé en ce que la souche cultivée appartient à l'une des espèces E. virulenta, E. obscura et E. s.phaerosperma. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que l'on favorise la sporulation par remplacement du milieu de culture par de l'eau. 15. Spores d1Entomophthorales telles que celles obtenues par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 14. 16. Spores selon la revendication 15, obtenues à partir d'au moins une des seize souches d'Entomophthorales déposées dans la Collection Centrale de l'institut Pasteur sous les numéros I 010 à I 025. 17. Composition phytosanitaire, notamment pour la destruction des aphides, caractérisée par le fait qu'elle contient dans son principe actif des spores selon la revendication 15 ou 16. 18. Composition phytosanitaire, caractérisée en ce qu'elle contient dans son principe actif des spores d'Entomophthorales comportant un globule lipidique central ayant un diamètre au moins égal à 60% du diamètre de la spore et en ce que l'épais- setr de la membrane représente au moins environ 1/10 du diamètre de la spore. 19. Composition phytosanitaire selon la revendication 18, caractérisée en ce que les spores sont dérivées d'au moins l'une des especes E. virulenta, E. obscura et E. sphaerosperma.