Brevet FR2327798A1 — publié le 19770513

La présente invention concerne de nouveaux produits utilisables dans le diagnostic et le traitement de tumeurs malignes ou de cancers, et elle se rapporte à des méthodes pour produire de tels produits. L'invention concerne un nouveau groupe de composés appelés ici récognines. On prépare les récognines en traitant des cellules ou des tissus normaux ou anormaux des cellules tumorales ou cancéreuses artificielles puis en séparant les produits recherchés. On peut préparer les produits chimioréciproques des récognines par exemple en mettant ces produits sur un support ou non, au contact avec des fluides corporels. Ces produits chimioréciproques sont utiles dans le diagnostic et la thérapeutique, c'est-à-dire pour traiter et diagnostiquer des cancers. Ce sont des substances qui réagissent en présentant une spécificité de type immunochimique avec des récognines dans des conditions in vivo ou in vitro, par exemple dans un test quantitatif de précipitine, de diffusionouchterlony double ou d'immunofluorescence. L'une des recognines selon l'invention est l'astrocytine. On produit l'astrocytine à partir du tissu tumoral du cerveau et du tissu tumoral du gliôme du cerveau. On extrait d'abord des fractions protéiniquesXcontenant le précurseur de l'astrocytine. On pré fère réaliser cette extraction en traitant le tissu avec un tampon neutre dans des conditions d'homogénéisation ou d'autres techniques amenant la dislocation des cellules et des tissus, afin de solubiliser des fractions protéiniques qui contiennent le précurseur de l'astrocytine. A ce moment le précurseur de l'astrocytine est encore lié en donnant des substances de grand poids moléculaire comprenant des protéines, des glycoprotéines, des lipoprotéines, des acides nucléiques, des nucléoprotéines, etc.... Les protéines solubilisées sont ensuite séparées de l'extrait de tissu résultant. On clarifie ensuite la solution extraite du tissu pour la débarrasser des particules insolubles. Les contaminants de bas poids moléculaires sont ensuite éliminés de la solution résultante par évaporation. On traite ensuite la solution obtenue pour séparer le précurseur d'astrocytine des autres contaminants afin d'obtenir la fraction protéinique présentant un pK compris entre 1 et 4.Ainsi par exemple, on place la solution dans une colonne chromatographique et l'on élue avec des solvants d'acidité croissante. Toutes les fractions qui sont éluées jusqu'à un pE de 4 sont éliminées et les fractions pré sentant un pK de 1 à 4 sont recueillis. L'élua est ensuite traité pour donner un produit ayant un poids moléculaire d'environ 8.000. Pour cela on peut par exemple filtrer la matière pour enlever les substances de bas poids moléculaire, c'est-à-dire celles dont le poids est inférieur à 1.000, puis filtrer à nouveau pour éliminer les produits dont le poids moléculaire est supérieur à 25.000. On recueille enfin l'astrocytine en traitant la fraction ayant un poids moléculaire compris entre 1.000 et 25.000, par exemple par chromatographie sur gel en couches minces (C.G.C.M.). On peut donc produire l'astrocytine en extrayant du tissu tumoral du gliome du cerveau avec un tampon neutre, en réalisant plusieurs homogénéisations et centrifugations à haute vitesse, en séparant de l'extrait résultant la fraction présentant un pK compris entre environ 1 et 4, en séparant dans cette fraction les substances ayant un haut poids moléculaires c'est-à-dire jusqu à environ 250.000, puis en en isolant l'astrocytine présentant un poids moléculaire d'environ 8.000. L'astrocytine ainsi préparée se caractérise en ce qu'elle forme un précipité à ligne unique avec son anticorps spécifique dans des tests quantitatifs de précipitine et dans des test d'ouchterlony de diffusion sur gel, qu'elle est soluble dans l'eau et dans des solutions aqueuses ayant un pH acide ou neutre et insolubles dans les solutions alcalines, qu'elle présente un pic d'absorption photométrique à 280 mu et un poids moléculaire d'environ 8.000 L'astrocytine présente également un très fort pourcentage de résidus d'acide glutamique et d'acide aspartique et un rapport très élevé de ces acides à l'histidine.D'autres données analytiques concernant l'astrocytine sont indiquées ci-dessouso En suivant un procédé analogue à celui qui est decrit plus haut, on peut produire une autre recognine appelée malignine, à partir de cellules cancéreuses artificielles, c'est-à-dire de cellules cancéreuses développées en fermentation in-vitro. La malignité ne présente un poids moléculaire d'environ 10.000 et une teneur en résidu d'amino-acide similaire mais cependant distincte de celle de l'astrocytine, c'est-à-dire quelle contient de grands pourcentages d'acide glutamique et d'acide aspartique et des rapports élevés de ces acides par rapport à l'histidine. D'autres données analytiques concernant la malignine sont indiquées plus loin. On peut donc produire la malignine en extrayant avec un tampon neutre des cellules cancéreuses artificielles obtenues par fermentation, en réalisant plusieurs homogénéisations et centrifugations à haute vitesse, en séparant de 1' extrait résultant la fraction présentant un pK compris entre environ 1 et 4, en séparant de cette fraction les substances ayant un poids moléculaire élevé c'est-à-dire jusqu'8 environ 230.000, puis en en isolant le produit ayant un poids moléculaire d'environ 10.000. Oh peut augmenter la quantité de malignine produite dans la fermentation artificielle des cellules et son pourcentage par rapport aux protéines totales, en- réalisant la culture artificielle de cellules cancéreuses dans des récipients de grande dimension. La malignine préparée selon le procédé de l'invention est caractérisée en ce qu'elle forme un précipité à ligne unique avec son anticorps spécifique dans des tests quantitatifs de précipitine et des test ouchterlony de diffusion sur gel, qu'elle est soluble dans l'eau et dans les solutions aqueuses à pH acide ou neutre et insoluble dans les solutions alcalines, qu'elle présente un picd'absorption spectrophotométrique à la longueur d'onde de 280 mu et un poids moléculaire d'environ 10.000. De plus, les récognines sont capables de former un complexe avec la bromoacétyl-cellulose en donnant des bromoacétyl-celluloserecognines et de produire les anti-corps spécifiques anti-recognines lorsqu'on les injecte dans des mammifères, ces anti-recognines se fixant de façon spécifique au précurseur de recognines in situ. Par exemple, une anti-recognine, une anti-malignine est toxique pour des cellules du cerveau in vitro. Les récognines, comme l'astrocytine, la malignine et d'autres substances similaires sont d'utiles produits susceptibles d'être introduits dans un système biologique en vue de réduire des réactions étrangères par exemple par introduction d'une matière avec une récognine . On peut aussi introduire une récognine pour produire les composés chimioréciproque dans le système biologique. Les récognines peuvent aussi être utilisées dans l'alimentation pour encourager le développement d'un système biologique particulier dont elles font partie. Les récognines permettent aussi de produire des réactifs "cibles" qui comprennent les complexes de la récognine avec un support, ce qui facilite leur application dans des systèmes biologiques. Ainsi par exemple le complexe transporte les caractéristiques physico-chimique de la récognine elle-même. Le support doit entre choisi parmi ceux qui forment un complexe avec la récognines et qui ne présentent aucune activité biologique. La récognine peut être complexée avec une quelconque substance connue dans l'Art et qui est susceptible de former un complexe stable avec des polypeptides ou des protéines. Par exemple on peut utiliser une substance à base de cellulose comme la bromoacétil cellulose. Le support choisi doit être non seulement inerte vis à vis du système biologique mais aussi ne pas modifier les propriétés physico-chimique spécifiques de la récognine qui sont utiles pour atteindre les buts proposés. les complexes formés par la récognine et son support sont utiles pour produire, séparer et identifier leur produit chimio- réciproque dans tout système biologique dans lequel ils sont mis en contact. Le complexe recognine-support sert aussi pour stimuler la production de son précurseur chimioréciproque dans tout système biologique dans lequel il est introduit. Une classe des composés chimioréciproque est formée par les anti-récognine, c'est-à-dire 1' anti-astrocytine et 1' anti-malignine. On peut la produire en injectant la recognine dans un système biologique. On met de la recognine en une dose efficace du point de vue immunologique au contact de fluide ou de tissu corporel de fa çon à induire un anti-corps selon des techniques connues dans l'art pour produire des anti-corps. Les anti-recognines peuvent servir à distribuer des substances tels que des agents diagnostiques, alimentaires et thérapeutiques à des cellules ou sites spécifiques dans un système biologique, on introduit alors cet agent sous forme complexée avec l'anti-recognine dans le système biologique.Les anti-recognines sont aussi interessantss pour diagnostiquer 1a présence de cellules tumorales dans une section histologique; on applique alors à celle-ci l'anti-recognine associée à une substance de marquage comme des colorants ou des substances radio-actives, et l'on détecte ensuite des tâches ou des marquages radio-actives uniquement dans les cellules tumorales. Les anti-recognines servent aussi à accroître le rendement en autres produits chimioréciproques (tel que le AG, décrit plus loin) provenant d'un mammifère; pour cela on injecte de la récognine en dose efficace du point de vue immunologique à un mammifère ou à un autre système biologique. Selon les techniques antérieures, on préparait les complexes glycoprotéiniques à partir du tissu du cerveau et des anticorps à partir de ceux-ci. Des substances séparées connues sous le nom de glycoproteines 10 E produites à partir du cerveau atteint de: la ma ladie de Tay-Sachs' étaient injectées dans des lapins et des anticorps produits de cette façon. On utilisait ces anti-corps de Tay Sachs' dans des examens immunofluorescentsde cerveau contenant des tumeurs : ces anti-corps ne marquent que des glia normaux réactifs non tumoraux et non des glia tumoraux. Au contraire lorsqu'on prépare de l'astrocytine à partir de tissu tumoral, et des anti-corps de l'astrocytine (anti-astrocytine) et qu'on les emploie . dans l'examen immunofluorescent du cerveau, seuls les glia tumoraux et non les glia normaux, c'est;-à-dire non tumoraux, sont colorés par l'anti-astrocytine. Ainsi ces anticorps de Gay-Sachs' et l'anti-astrocytine diffèrent nettement de par le tissu d'origine et la nature de l'anti-corps, ainsi que par le type spécifique de cellules colorées. Une autre classe de composés chimioréciproques est formée par les réactifs "cibles" complexés avec leur chimioréciproque. Par exemple le réactif Target (produit de l'astrocytine complexé avec un support comme la bromoacetyl-cellulose) est mis au contact d' anti-astrocytine. Ce type de composé peut être complexé avec des agents diagnostiques, alimentaires et thérapeutiques, et utilisé pour distribuer ceux-ci aux sites et cellules spécifiques dans un système biologique. Ces composés peuvent être aussi utilisés pour des techniques de purification. Par exemple on peut fabriquer l'an ti-astrocytine en décomplexant la bromoacétyl-cellulos e-astrocyt ine anti-astrocytine par hydrolyse avec un acide ou une enzyme protéinase.Les réactifs "cibles" servent aussi à augmenter la quantité de produits TAG (décrits ci-desnus) dans un système blologiaue; par exemple on peut amener une dose efficace au point de vue immunologique de produits cibles au contact corporel D'autres produits chimioréciproques sont constitués par des réactifs TAG (les globulines se fixant sur une cible). On obtient les produits TAG en mettant des réactifs "cibles" au contact de fluids corporels pendant des périodes de temps variées de façon à former un complexe et à en séparer le produit TAG. A ce propos, deux produits particulièrement interessants sont les produits S~?AG et F-TA. Pour produire le S-TBG (globuline se fixant sur une cible de façon lente) on peut faire réagir le sérum sanguin ou un autre fluide corporel avec la cible (c'est-à-dire de la bromoacetyl-cellulose-malignine) pendant environ deux heures ou plus, à une température basse, par exemple d'environ 40, on sépare ensuite le S-TAG formé par exemple à l'aideWacide dilué pendant environ deux heures à environ 370cl Le produit S-AG ainsi préparé est soluble dans dessolutions tamponnées aqueuses, il forme un précipité à ligne unique avec sa recognine correspondante dans des tests ouchterlony de diffusion sur gel, il n'est pas dialisable dans des membranes de cellophane, il est retenu par des filtres millipores qui ne laissent pas passer les molécules dont le poids moléculaires est supérieur à 25.000, il présente des poids moléculaires en différentes étapes d'agrégation (déterminés en chromatographie en couches minces) d'environ 50.000 ou de ses multiples dans la gamme des macroglobulines et à un pic d'absorption à 280 mu. Pour produire le F-TAG (globulines se fixant à une cible de façon rapide) on peut faire réagir le sérum sanguin ou un autre fluide corporel avec la cible (ctest-à-dire la bromoacetyl-cellulose-malignine) pendant environ dix minutes par faible température de l'ordre d'environ 4 et lton sépare le F-?AG de la matière résultante, par exemple à l'aide d'acide dilué pendant environ deux heures à une température voisine de 370C.Le produit F-TAG ainsi préparé est soluble dans des solutions tamponnées aqueuses, il forme un précipité à ligne unique avec sa récognine correspondante dans des tests ouchterlony de diffusion sur gel, il n1 est pas dialisable dans des membranes de cellophane, il est retenu par des filtres millipore qui ne laissent pas passer des molécules dont le poids moléculaires dépasse 25.000, il présente des poids moléculaires en différent état d'agrégation (déterminés en C.G.C.i.) d'environ 50.000 ou de ses multiples dans la gamme des macroglobulines et il a un pic d'absorption à 280 mu. Les produits TAG sont utiles pour détecter les tumeurs cancéreuses che les mammifères vivants; pour cela on détermine la concentration de S-TAG et de F-TAG produite par un volume connu de sérum sanguin de mammifère ou dsun autre fluide corporel et l'on compare cette concentration à des quantités dont on sait qu' elles indiquent la présence de cancer. Les produits TAG sont aussi utiles pour diagnostiquer la présence de cellules tumorales dans une section histologique, pour cela on lui applique un produit TAG associé avec une substance de marquage telle que des colorants et des matières radioactives, ce qui provoque la coloration ou ie marquage radioactif des cellules tumorales seulement. De plus les produits TAS exercent un effet cytotoxique vis à vis des cellules tumorales. Ces produits TAG servent aussi à amener des agents diagnostiques, alimentaires et thérapeutiques à des cellules ou sites spécifiques, par introduction de ces agents sous forms com- plexes avec le produit TÂG. La division cellulaire normale dans;les plantes ou les animaux est réduite ou inhibée lorsque les cellules arrivent à occuper complètement un espace particulier. Les mécanismes (a) par lesquels les cellules normales "reconnaissent" qu'elles ont rempli l'espace disponible, et (b) par lesquels l'opération du mécanisme de reconnaissance inhibe à son tour la division cellulaire, sont tous deux inconnus. On sait maintenant produire selon l'invention un groupe de composés dont les précurseurs voient leur concentration augmentée lorsque surviennent une reconnaissance et un apprentissage normaux, et en rapport avec le phénomène de reconnaissance et d'apprentissage dans des cellules et des particules et dans les liaisons des cellules entre-elles. Ces composés sont appelés des récognines.En essayant de produire de tels composés à partir de cellules cancéreuses normales, on a découvert qu'ils sont absents en tant que tels, et que leur structure moléculaire se modifie pendant que simultanément les cellules cancéreuses perdent leur aptitude (a) à reconnaitre qu'elles ont rempli leur volume normal et/ou (b) à stopper toute division lorsqu'elles ont rempli leur volume normal. On a mis au point de nouveaux composés et des méthodes pour produire de tels composés. Ces nouveaux composés sont appelés recognines. Elles ont des caractéristiques physiochimiques qui imi tent ces configurations caractéristiques des cellules cancéreuses quant à leur inaptitude à reconnaitre et à stopper la division cellulaire. L'utilisation des recognines fournit plus qu'un simple aperçu du mécanisme du cancer en ce qu'elle procure des produits et méthodes immédiates qui servent au diagnostic, au traitement ainsi qu'à la prévention du cancer. On a mis au point des méthodes pour produire des malignines à partir de cellules cultivées artificiellement. Ces méthodes permettent de produire les malignines et les nouveaux produits produit à partir d'elles,de façon efficace en quantité pratiquement illimitée. Cette invention dépasse le domaine de la recherche du cancer et elle est immédiatement applicable à un quelconque système biologique dans lequel on souhaite agir sur la croissance et sur le métabolisme. Ainsi en fabriquant le ou les composés particuliers du type de cellule appropriée dans une culture artificielle, puis les produits ultérieurs à partir de ces substances, on peut pour la première fois induire une influence spécifique sur un quelconque tissu, cellule, cellule organelle, molécule sub-organelle ou agrégat moléculaire de tout système vivant. Ces influences alimentaires spécifiques à des moments critiques dans le développement dans les méthodes préventives et curatives et diagnostiques spécifiques, et la construction de système bioélectrique artificiels (citons le cas de transplants d'organes et de tissus) peuvent tous être modifiés pour la première fois.On peut maintenant conférer à ces systèmes bioélectriques artificiels les caractéristiques des récognines, malignines spécifiques ou leur produit chimioréciproque du composant au tissu normal qui vont côtoyer et btre ainsi "reconnus " en tant qu"'étranger" et éviter ainsi les réactions caractéristiques vis-à-vis des substances étrangères, y compris le rejet. La présente invention concerne aussi la production d'un produit intéressant de type anti-corps (anti-astrocytine) pour un produit spécifique du cerveau (astrocytine) permettant l'utilisa- tion de ce produit anti-corps pour former un complexe spécifique et constituer un support spécifique de distriAution vers des points spécifiques du système nerveux de toutes espèces. Les malignines et l'astrocytine sont des recognines. Cette invention concerne aussi la production à partir de fluides biologiques de deux nouveaux produits, des globulines se fixant sur une cible (TAG). Ces produits sont ainsi nommés parce qui ils sont produits à la suite de deux réactions; dans la première, des fluides biologiques réagissent avec un complexe de synthèse contenant des configurations physicochimiques qui ressemblent à celles des malignines et appelées "cibles", dans la seconde, le TAG spécifique se sépare du complexe, en mesurant le TAG ainsi produit à partir des fluides biologiques d'organismes vivants, on obtient ainsi une indication quantitative quant à la présence ou non d'une tumeur dans l'organisme en question. Ceci constitue un test diagnostique pour déterminer la présence de tumeur.Comme les produits TAG et anti-malignines sont physicochimiquement complémentaires des malignines, il sont nommés produits chimioréciproques On a de plus constaté que l'on peut produire deux produits TAG quantitativement et qualitativement distincts selon la durée de réaction du sérum avec la cible spécifique mise en oeuvre et le temps imparti à la séparation du produit recherché. On a déterminé Ms quantité3de ces produits obtenues che un certain nombre d'individus souffrant de tumeur cérébrale et de divers troubles médicaux ainsi que chez des individus sans maladie apparente; cette étude a montré que les quantités de ces deux nouveaux composants susceptibles d'être produites chez un individu donné indiquent Si celui-ci souffre ou non dlune tumeur cérébrale. On dispose ainsi d'un nouveau test diagnostique sur les sérums pour déterminer des tumeurs cérébrales. Ces produits sont non seulement intéressants pour diagnostiquer la présence de tumeur cérébrale ou autre à partir de sérum ou fluide biologique, mais ils sont de plus intéressants en pratique en ce que les composés TAG et anti-récognine se fixe de manière préférentielle sur des cellules tumorales gliales dans une section histologique de tumeur cérébrale et du tissu avoisinant éliminés lors d'un acte chirurgical exercé sur la tumeur cérébrale.Ce marquage préférentiel effectué par des produits TAG et anti-recognines sur les cellules tumorales est mis en évidence par des techniques classiques d'immunofluorescence On dispose ainsi d'une nouvelle méthode pour déterminer par examen histologi que et avec un certain degré de certitude dans quelle mesure des cellules tumorales ont pénétré les bords du tissu enlevé indiquant ainsi la probabilité que la tumeur subsiste encore dans le cerveau ou dans l'autre organe ou que les cellules tumorales sont absentes de la périphérie du tissu éliminé laissant supposé que toute la tumeur a été enlevée du cerveau ou de l'autre organe. De plus on a constaté que les TAG et anti-mallgnines produites selon selon le procédé de l'invention exercefun effetcytotoxique pour les cellules tumorales cérébrales de type gliomedéveloppées dans une culture tissulaire in-vitro. Cette forte affinité pour les cellules tumorales dans un autre milieu, ;ci développée en culture tissulaire, constitue une preuve suFplémentaire du potentiel de couplage spécifique des nouveaux produits TAS et y explique le choix du terme TAG, c'est-à-dire globuline se fixant sur une cible ainsi que réagissent les DAG vis à vis de la cible de synthèse et des cellules tumorales dans une section histologique. De plus la toxicité des TAG et anti-recognines pour des c ellules tumorales fournit un nouveau test diagnostique supplémentaire à réaliser sur le sérum de patient susceptible de souffrir d'une tumeur. Ainsi par exemple on peut faire réagir le sé rum ou un autre fluide corporel de ces patients avec une cible de façon à produire un TAG puis on teste la cytotoxicité manifesté par le produit TAG dans le développement en culture de cellule tumorale. La concentration en TAG est le degré de cytotoxicité manifesté par ce produit TAG qui peut être produit à partir du sérum d'un individu donné présente un intérêt diagnostique, mais aussi permet de suivre la direction du trouble avant et après l'opération chez un malade donné.En associant des produits radioactifs et colorants à un produit TAG on obtient un nouveau produit utile in-vivo dans le diagnostique de tumeur et dans leur localisation exacte. Ainsi en injectant un produit TAG convenablement marqué soit de façon intra-artérielle ou intra-veineuse dans le fluide cérébroapinal ou directement dans le tissu czrébral ou dans ces cavités, on peut démontrer par des moyens radioactifs ou par visualisation du colorant associé, la présence d'une tumeur cérébrale parce que le produit TAG se fixe de manière spécifique uniquement sur les cellules tumorales. De plus, cette méthode permet la visualisation précise de la situation de la tumeur cérébrale.Cela constitue une amélioration de la méthode de diagnostic in-vivo dans laquelle on utilise de l'anti-astrocytine produite dans le sang d'un lapin pour marquer la tumeur du cerveau, parce que l'emploi du TAG produit à partir du sérum humain évite le risque de réaction protéinique étrangère. Comme le TAG et les anti-recognines présentent la spécificité chimique qui permet une fixation préférentielle sur les cellules tumorales contenant du précurseur de l'astrocytine à la fois in-vivo et in-vitro, ces produits peuvent 8tre utilisés en thérapeutique aussi bien que dans le diagnostic, lorsqu'ils sont associés à des agents capturant des protons radioactifs ou à d'autres agents chimiques ou physiques toxiques; ainsi ces substances toxiques peuvent titre localisées de façon préférentielle grâce à la spécificité de ces composés qui se fixent dans les cellules tumorales et non dans les cellules normales voisines. Tout le monde re contact que cette sélectivité est le facteur crucial ou au moins l'un des facteurs critiques pour réaliser une thérapie Dnysique ou chimique efficace des tumeurs; jusqu'à maintenant on a pas encore obtenu cette sélectivité.Comme le produit TAG a montré son aptitude à se fixer de façon préférentielle sur les cellules tumorales il devrait constituer un nouveau produit thérapeutique Ainsi qu 'on le verra dans les exemples ci-dessous, on peut produire un type de produit TAG, le TAG LENT (S-TAG) b distin guer du TAG TÂ&commat; RAPIDE (F-TAG), à partir d'un volume donné de sérum; le sérum de malade atteint de tumeur maligne fournit des quantités relativement plus importantes de S-TAG que le sérum de malade dépourvu de telle tumeur. Cela permet de supposer que la concentration des précurseurs d'origine naturelle du produit TAG (P-AG) augmente ou bien ql'il existe d'autres facteurs qui favorisent la production relative in-vitro de S-TAG par rapport à celle de F-TAG. On a pas encore établi la relation possible de la fonction des produits de synthèse cible et TAG réel vis-à-vis de leur précurseur et ensuite entre les fonctionnements des anti corps en circulation et des antigènes cellulaires dont l'existence est supposée mais non démontrée, qui peuvent exister in-vivo. Ainsi par exemple selon un processus qui ressemble à celui des anti-corps le P~TAG et le S-TAG produisent des lignes discrètes uniques de réaction avec l'astrocytine dans un test de diffusion ouchterlony sur gel; de plus en injectant un produit cible chez des lapins on induit une augmentation dans le rendement de produit TAG à partir du sérum du lapin après réaction avec le produit cible.Le fait que l'on ait trouvé qu'il puisse y avoir un niveau normal d'un en circylation anti-corps/ressemblant à un précurseur par rapport à un antigène cellulaire qui est caché dans la cellule qui ne se divise pas, soulève la possibilité du fonctionnement de la paire. On suppose ici que le précurseur de TAG (P-TAG) et que des substances de type cible existent in-vivo et ont un rôle dans le contrôle de la prolifération cellulaire et dans la mort des cellules.Ainsi par exemple l'exposition d'un constituant cellulaire qui normalement n'est pas directement exposé aux protéines du sérum, peut appa raire durant la division cellulaire. de cette exposition du conssituant cellulaire il peut resulter que celui-ci se convertisse en une substance de type cible à laquelle peut s'attacher une molécule de type P-TAG provenant du sérum; cette fixation aurait pour résultat de stimuler ou d'inhiber la division cellulaire. Dans une variante, une cellule qui ne se divise pas qui est bléssée ou fonctionne mal, peut présenter une substance de type cible pourlaquelle la fixation de molécules de type P-TAG peut btre curatif. Cependant dans certaines conditions cellulaires la fixation de molécules de type P-TAG peut induire la destruction de la cellule (par exemple l'anti-gliome-2AG produit de façon synthétique de la façon décrite ici, présente un effet cytotoxique très net vis-à-vis des cellules tumorales du gliome se développant en culture tissu laire). Cela pourrait représenter un miroir d'un mécanisme normal pour le contrôle de la division cellulaire, et pour soit la réparation, soit l'élimination de cellules individuelles dans le corps pendant la vie de l'organisme.Si l'exposition de constituant cellulaire n' est pas accrue de façon anormale ce qui conduirait à une production de tunntités anormalement importantes de substances cellulaires de type cible, ainsi que cela peut apparattre dans des cellules cancéreuses à division rapide tels que des gliomes du cerveau, on peut induire une augmentation de la concentration de l'un des types de P-UAG du sérum par rapport à un autre. Quelque soit le fonctionnement réel des précurseurs, l'augmentation relative de l'un des types de produit TAG, le TAG IENT (S-TAG) qui peut etre produit in-vitro par les méthodes décrites ici à partir du sérum de malade atteint de tumeur maligne, constitue la base d'un test diagnostique effectué sur le sérum et qui est décrit dans Iés exemples ci-dessous. EXEMPTE I Production d'une fraction brute contenant le précurseur de l'astrocytine. Du tissu tumoral du gliome de cerveau humain est Xoté de façon chirurgiealepuis débarrassé aussi bien que possible de tous vaisseaux sanguins superficiels et du tissu cérébral normal. A partir d'une quantité classique de tissu tumoral disséqué de il grammes on fait six parties de tissu de 1, 5 gramme et deux aliquots de 1,0 gramme. Chaque aliquot est traité de la manière suivante On homogénéise chaque aliquot dans une solution tampon neutre par un procédé sonique ou autre procédé mécanique. Par exemple on homogénéise chaque aliquot dans 100 millilitres par gramme de tissu de solution tampon à 0,005 M de phosphate à pH 7 dans un mélangeur. L'homogénéisation doit être faite à basse température afin d'éviter la dégradation des protéines. Par exemple on peut prérefroidir le mélangeur entre 0 et 50 et le faire travailler enviton trois minutes seulement. Le produit dlhomogénéisation est ensuite centrifugé pour être clarifié, par exemple sous 80.000 G pendant trente minutes dans une ultra-centrifugeuse réfrigérée. On décante le liquide soluble qui surnage et on le garde dans un endroit à basse température. Les résidus insolubles seront réhomogénéisés avec 100 autres centimètres cubes de tampon neutre et centrifugés de la façon décrite plus haut3 on recueille un second extrait soluble que lion associe au premier. On obtient les meilleurs résultats en répétant l'homogénéisation et la centrifugation jusqu'à ce qu'on recueille dans le liquide surnageant moins de 50 microgrammes de protéine par millilitre de solution. Avec la plupart des tissus ce résultat est obtenu après la cinquième extraction. Les solutions ainsi obtenues sont rassemblées et concentrées par perévaporation avec dialyse consécutive, par exemple avec par dialyse au contact d'un tampon phosphate 0,006 M à basse température afin de produire un volume de 15 millilitres. On note le volume de cette solution et on prélève un aliquot pour l'analyse des protéines totales; on fractionne le restant pour recueillir la fraction protéinique ayant un pK compris entre 1 et 4. la méthode préférée de fractionnement est la chromatographie réalisée de la façon suivante. On fractionne la solution à basse température (40) sur une colonne de 2,5 x 11,0 centimètres garniede cellulose DEAE (cellex D), qui a été équilibrée avec un tampon phosphate de sodium O,005M On utilise successivement les solvants d'élutlon suivants (solution) : solution (1) 4,04 grammes de NaH2PO4et o,50 grammes de Na2EP04 sont dissous dans 15 litres d'eau distillée (0,005 molaire pH 7); solution (2) 8,57 grammes de NaH2P04 sont dissous dans 2.480 millilitres d'eau distillée; solution (3) : 17;i grammes de NaH2PO4sont dissous dans 2.480 millilitres d'eau distillée, (0,05 molaire, pH 4,7); solution (4) : 59,65 grammes de 14aH2PO4 sont dissous dans 2.470 millilitres d'eau distillée (0,175 molaire); solution (5) : 101,6 Grammes de NaH2P04 sont dissous dans 2.455 millilitres d'eau distillée (0,3 molaire, pH 4,3); solution (6) 340,1 grammes de NaH2P04 sont dissous dans 2.465 millilitres d' eau distillée (1,0 molaire, 1H 4,1); solution (7) : 283,40 grammes d'acide phosphorique à 80fs (H3P04) sont mis dans 2.460 Killilitres d'eau distillée (1,0 molaire, pH 1,0). On ajoute un extrait de tissu nerveux à raison d'un volume de 5 à 10 millilitres. On fait passer dans la colonne. Ensuite on recouvre de solution (1) et l'on fixe un réservoir de 300 millilitres de solution (1) de façon à ce que celle-ci s'écoule par gravité sur la colonne. On recueille des aliquots de 9 millilitres d'éffluant à l'aide d'un récepteur de fraction automatique. Les solutions d'élution suivantes sont changées par étape au numéro de tube d'élution suivant.Solution (2) : au tube 88 on amène la solution sur le haut de la résine de la colonne puis on recouvre et on fixe un réservoir de 50 millilitres de solution (2); solution (3) : au tube 98 on amène la solution au sommet de la colonne, on recouvre et on fixe un réservoir de 75 millilitres de solution (3); solution (4) : au tube 114 on amène la solution surale haut de la résine, on recouvre et on fixe un réservoir de 150 millilitres de solution (4); solution (5) : au tube 155 on apporte la solution sur le haut de la résine de la colonne, on recouvre et on fixe un réservoir de 125 millilitres de solution (5); solution (6) : au tube 187 on apporte la solution sur la colonne en haut de la résine on recouvre et on fixe un réservoir de 175 millilitres de solution (7), on poursuit l'élution jusqu'au tube 260, l'élution est alors achevée.On utilise de la résine fratchement préparée pour chaque nouveau volume d'extrait de tissu. On analyse la teneur quantitative de protéines pour chaque tube d'effluent. On rassemble les éluats contenus dans les tubes des numéros 212 à 230; ils contiennent les produits bruts qui vont fournir l'astrocytine. La littérature fournit des données concernant cette matière brute appelée fraction 10 3 selon l'art antérieur, Protein Meta- bolism of the Nervous System, PP 555-69 (Plenum Press, 1970; Journal of Neurosurgery, Vol. 33, pp. 281-286 (Septembre 1970), et maintenant selon l'invention on peut accomplir la séparation du produit spécifique appelé ici aEtrocytine à partir de la fraction 10 B. On peut préparer une fraction 10 B brute en des quantités comprises entre 0,1 et 10 Milligrammes/de tissu du dU système nerveux frais initial dont on l'obtient.Cette fraction contient un précurseur de l'astrocytine et également diverses quantités de résidu d'hydrate de carbone liées de façon covalente y compris un certain nombre d'hexoses à savoir : le glucose, le galatose, le mannose, des hexosamines, comme la glucosamine, la galatosamine et la mannosamine; et éventuellement d'autres sucres tels que le fructose le ribose et parfois le rhamnose. Elle renferme également des produits protéiniques à poids moléculaire élevé, plusieurs lipides et des acides nucléiques. EXE4PLE II Production d'astrocytine purifiée à partir de la fraction contenant le précurseur d'astrocytine brut. La fraction contenant le précurseur d'astrocytine est davantage purifiée. Selon la mise en oeuvre préférée on chromatogra phie le matériau dans l'exemple I sur de la résine G-50 dans une colonne classique de 40 centimètres de long, 2,5 centimètres de diamètre et dtun volume de 196 millilitres. On utilise une pression de 40 millimètres de mercure; le débit d'écoulement est de 35 millilitres par heure et le tampon est constitué par une solution tampon de phosphate de 0,05 M à un pH de 7,2. Le premier pic obtenu par écoulement contient le précurseur de l'astrocytine avec quelques impuretés tandis que les pics ultérieurs ne renferment que de l'im- pureté. I1 est avantageux de concentrer alors les produits obtenus dans le premier pic sur du sephadex G-15, puis ensuite de les envoyer sur une colonne de Cellex-D en le traitant avec les mêmes solutions 1 à 7 décrites dans l'exemple I ensuivant les mêmes étapes d'élution. L'astrocytine est présente sous forme d'un pic étroit dans les mêmes tubes portant les numéros 212 à 230 tels que décrits plus haut. Elle conserve donc son comportement en chromatographie sur Cellex-D en l'absence d'une grande quantité de contaminants. On peut alors éliminer des souillures de bas poids moléculaires selon des techniques connues dans l'art telle que par filtration sur disque micropore. I1 est avantageux de débarrasser l'astrocytine de sels et autres contaminants de bas poids moléculaire en filtrant le produit sur un disque Pellicon micropore nO 1.000 de 13 millimètres qui retient des substances dont le poids moléculaire dépasse 1.000 et laisse passer ceux dont le poids moléculaire est inférieur à 1.000. L'astrocytine produit reste sur le disque Pellicon et on peut le récupérer en lavant celui-ci avec une solution (1) de l'exemple I. On obtient alors l'astrocytine en isolant le composant ayant un poids moléculaire d'environ 8.000 à partir de la solution ci-dessus. Il est avantageux pour cela d'utiliser une chromatographie sur gel en couches minces de la façon suivante l'appareillage utilisé est celui qui est disponible industriellement et conçu par la Bochringer Mannehim Gambe, Pharmacia Fine Chemicals and CAMAS (Suisse). La résine est constituée par 2,5 grammes de Séphadex G-200 superfine préparée dans 85 millilitres de NaCl de 0,5 M dans un tampon au phosphate lfa2HP04EH2P04 0,002 M à un pH 6,8 ( compris entre 6,6 et 7,0). On laisse gonfler pendant deux à trois jours à la température ambiante en mélangeant de temps en temps doucement. I1 ne faut pas mettre en oeuvre un agitateur magnétique ou d'autres systèmes du même ordre. Le gel gonflé est alors stabilisé pendant trois semaines à la température réfrigérateur; cependant des bactéries et des champignons peuvent de développer dans le gel gonflé. Si l'on doit conserver le gel pendant une plus longue période de temps, il faut incorporer une petite quantité d'un agent bactériostatique par exemple 0,0296 d' azide de sodium. On utilise 2, 5 grammes de gel sec pour préparer deux plaquettes de O,5 millimètre d'épaisseur sur 20 x 20 centimètres.On laisse ensuite sécher les plaques à la température ambiante pendant dix minutes, puis on les transfère dans une chambre humide dans laquelle on les conserve pendant environ deux semaines; dans une variante, on peut utiliser ces plaques immédiatement après les avoir prééquilibrées généralement au cours d'une nuit comprenant un minimum de douze heures. Le principal rôle de la mise à l'équilibre est de normaliser le rapport entre les volumes des pha 'ses mobiles et stationnaires. Les plaques prééquilibréee étant disposées en position horizontale, on dépose à l'aide de micropipettes les substances à analyser sous forme de tache ou d'une rayure à la ligne de départ.On dépose 10 millilitres à 20 millilitres d'une solution protéinique de 0,2 à 2% au bord d'une lamelle microspique de 18 x 18 millimètres et on la maintient contre la surface du gel. En quelques secondas, la solution pénètre dans le gel. Tous les échantillons sont d'abord préparés sur des lamelles, puis ensuite rapidement appliqués. Si l'o utilise pas suffisamment de matière, il est difficile de localiser des taches distinctes après séparation. Si l'on met en oeuvre une quantité trop grande de substance on ne constate aucune séparation bien définie. Les échantillons sont dilués avec un tampon pour permettre une manipulation facile et la séparation des échantillons est réalisée selon une technique de descente avec une plaque inclinée selon un angle de 220. Ia vitesse la plus avantageuse est comprise entre 1 à 2 centimètres par heures.On applique différentes substances de marquage (le cytochrome C, l'Hémoglobine, la liiyoglobine, ou l'Albumine marquée au bleu bromophénol) en différents points de la plaquette} qui ser vent aussi de protéines de référence pour déterminer la distance relative (mobilité) des substances inconnues. Après application des échantillons on replace les plaques dans l'appareillage et on repousse légèrement vers le bas la mèche de papier pour assurer un bon contact avec la couche de gel. La mèche de papier ne doit pas égoutter. On enlève l'excès d'humidité. On maintient le solvant liquide dans le réservoir à une hauteur constante de 1 centimètre de l'extrémité supérieure du récipient. Les essais sont générale ment achevés en 4 à 7 heures selon les progrès de la séparation. Lorsqu'on utilise des substances colorées la séparation s'observe de rendre directement. Il est facile/visible une tache distincte de protéines en les transférant sur une feuille de papier reproduisant la plaque C.G.C.X. lorsque la saparation chromatographique est achevée; on les colore ensuite à l'aide d'un mélange de métanol + eau + acide acétique en un rapport 90:5:5 pendant 48 heures. La feuille de papier est un papier filtre de trois millimètres. On place une feuille de papier de 20 x 18 centimètres sur la couche de gel et on la presse (avec un rouleau) juste suffisamment pour assurer un contact avec le gel. Il faut bien prendre soin à ne pas laisser des bulles d'air sous le papier (double) et de ne pas abîmer la couche de gel.La phase liquide est extraite de la couche de gel par le papier et éliminée au bout d'environ une minute, elle est ensuite immédiatement séchée dans une étuve à 60 pendant 15 minutes, puis colorée dfune façon normale selon une technique classique de coloration. On peut réaliser la coloration en pulvérisant sur le papier de reproduction une solution à 0,05% d'acide sulfanilique diazoté dans du carbonate de sodium à 10Zs (réactif de Pauley's). On peut aussi effectuer la coloration à l'aide d'une solution saturée de noir amido dans de l'acide acétique-méthanol (rapport en volume 10 à 90); la durée nécessaire à la coloration est comprise entre 5 et 10 minutes.Pour décolorer on rince avec deux voliges d'une solution 90:10 de méthanol:acide acétique mélangée avec un volve d'eau. I1 est difficile d'obtenir une faible coloration en arrière plan sans effectuer un lavage très poussé. Les plaques ellesmeAmes peuvent aussi séchées à environ 600C (dans une étuve à circulation d'air) mais seulement dans le cas où l'on veut colorer l'astrocytine. Dans des buts d'isolation, il faut seulement sécher la plaque à la température ambiante. Un chauffage excessif peut conduire à la formation de fissures on évite généralement ce phénomène en travaillant entre 50 et 600C ce qui sèche la plaquette de Sephadex G-200 en 15 à 90 minutes.On laisse ensuite gonfler les plaques sèches pendant 10 minutes dans un mélange de méthanol + eau + acide acétique (75:20:5) puis on colore avec du noir amido saturé dans le même système solvant pendant 5 heures et enfin on lave les plaques en les trempant dans le même solvant pendant 2 heures avant de les sécher.Pour déterminer le poids moléculaire, on mesure la distance comprise entre la ligne de départ et le milieu de chaque zône avec une précision de 0,05 millimètres; on opére soit directement sur l'impression (reproduction) soit sur le densitogramme. Le résultat est exprimé en valeur R qui est défini comme étant le rapport des m distances de migration de la protéine testée (dp) à celle du cytochrome C ou de la myoglobine (dm) qui sert de protéine de référence. On relie la distance de migration de la substance testée à la substance standard selon la formule (-R@=dp/d) On obtient une courbe d'étalonnage rectiligne en reportant le logarithme du poids molélulaire des substances standard utilisées en fonction des valeurs Rm. Â l'aide de cette courbe on peut ensuite déterminer le poids m moléculaire de la protéine inconnue. Pour obtenir les résultats les plus exacts, on mélange des parties égales de solution protéinique inconnue et de protéine connue, dans ce cas de cytochrome C, avant de l'appliquer sur la plaquette.En réalisant la chromatographie selon la procédure indiquée plus haut, on observe l'astrocytine sous forme d'une tâche distincte à une distance d'environ o,83+/-,02 par rapport au cytochrome C standard ce qui indique un poids moléculaire approximatif de 8.000 pour l'astrocytine. De cette façon on peut séparer plusieurs produits distincts de 1' astrocytine en fonction de légère différence de poids moléculaire. Ainsi on a pu détecter et éliminer par chromatographie, trois produits amenés jusqu a cette étape sous forme d'impuretés, et ayant des poids moléculaires d'environ 64.000, 148.000, et 250.000 et de temps en temps, un produit ayant un poids moléculaire de 32.000, l'astrocytine est aspirée avec le gel dans lequel il est contenu sous forme sèche, puis dissous dans la solution (1) et débarrassé de toutes résines à la suite d'une centrifugation ou d'un autre moyen similaire. L'astrocytine ainsi obtenu à cette étape est soluble dans l'eau distillée, soluble dans des solutions neutres ou acides et insolubles dans des solutions alcalines. Il présente un pic d'ab sorption spectrophotométrique à 280 mu. C'est un polypépide dont le poids moléculaire ainsi qu il est décrit plus haut est d' environ 3.000.On recueille ces amino acide liés de façan covalente à la suite d'une hydrolyse avec HC1 6N; une détermination automatique quantitative fournit ensuite la composition moyenne suivante d'amino acide Nombre approximatif de résidus Acide aspartique 9 Thréonine 5 Sérine 6 Acide glutamique 13 Prolixe 4 Glycine 6 Alanine 9 Valine 4 1/2 Cystéine 2 Méthionine 1 Isoleucine 2 Leucine 8 Tyrosine 2 Phénylalanine 3 Lysine 8 Histidine 2 Arginine 4 Total approximatif 88 On ne trouve pas de quantité détectable d'acide cystéique, d'hydroxyproline, de norleucine, d'ammoniac, dtisodesmosine, de desmosine, dthydroxylysine, de lysinonorleucine et d'acide gammaaminobutyrique; il peut se trouver une trace de gluco-samine. Selon la procédure décrite plus haut on produit environ 3 grammes dtastrocytine purifiée à partir des li grammes de tissu tumoral cérébral. EXEI4PLE 2 A PRODUCTION DE LA RECOGNINE DE "REGELER" La maladie de Reeler est un trouble génétique dans lequel les animaux sont incapables d'exercer une activité motrice coordonée stable, produisant un état de chancellement, du à l'absence de migration de certaines cellules nerveuses vers une place particulière du cerveau, le cérébellum, à un moment particulier du développement. Au cours d'examens menés en microscopie électronique, on a montré que des cellules gliales particulières fournissent les axes verticaux de type poteau le long desquels les cellules nerveuses se déplacent vers leur nouvelle position dans l'état normal.On pense que dans cette maladie, l'incapacité des cellules nerveuses à gravir ces fibres gliales est dA à quelques perturbations dans les cellules nerveuses ou dans les glia ou dans les deux. En suivant les méthodes décrites dans les exemples I et II on produit de la récognine à partir du cerveau de souris atteintes de la maladie de Reeler et on compare celles-ci avec la récognine produite par le cerveau d'une souris normale. Le poids moléculaire de la récognine produite à partir de toutes les zones du cerveau d'une souris normale est de 8.000. Le poids moléculaire de la récognine de "Reeler" est de 3.600 à 5.000. La récognine de "Reeler" est anormale ainsi que le montre son poids moléculaire beaucoup trop faible. De plus, la quantité de récognine qui peut être produite à partir du cérébellum du cerveau de la souris malade est beaucoup plus faible par rapport à la quantité que l'on obtient avec le cerveau normal. Le tableau I met ces faits en évidence. TABLEAU I Concentration de la récognine dans le cerveau de la souris, milligramme par gramme. Souris normale "Reeler" Cerebellum (souris de 16 jours) 2,50 0,71 Cortex (souris de 16 jours) 0,60 0,96 Cortex (souris de 4 jours) 0,29 0,53 "Brainstem" (souris de 16 jours 0,90 1,64 Cerveau entier (souris de 17 jours) 1,27 1,53 Cerveau entier (sourie de 1 jour) 5,00 5,86 Le tableau I montre qu'alors que la concentration de la récognine dans le cerebellum de la souris diminue nettement, on trouve des quantités analogues ou supérieures de récognines dans d'autres régions du cerveau. La récognine ne peut pas se déplacer depuis les autres régions du cerveau vers le cerebellum ou bien la légère augmentation dans les autres zones du cerveau atteint par la maladie peuvent indiquer une certaine action compensatoire. Cette récognine pathologique dans le cerveau malade est reliée avec l'incapacité pour les cellules cérébrales à se épla- cer afin de réaliser les contacts nécessaires pour obtenir un placement correct, ce qui confirme le rôle des récognines dans la reconnaissance et l'apprentissage dans les cellules. Par analogie, on peut préparer les anti-récognines de la récognine produite à partir du cerveau de la souris malade et les utiliser chez la souris comme on utilise l'astrocytine et l'antimalignine airsi qu'il est décrit ici. EXEMPLE III Production de précurseur de malignine dans des fermentations de culture cellulaire cancéreuse artificielle. En général on travaille scrupuleusement dans des conditions stériles. Toutes les solutions( par exemple le sel tamponné de Hank's (BSS), le milieu nutritif B-10, le sérum de veau foetal, la solution de trypsine) sont mises à incuber au bain-marie pendant environ 20 minutes ou davantage à 35 C avant utilisation. On élimine des cellules du tissu tumoral et on les fait croula tre in-vitro pendant plusieurs générations en utilisant un milieu convenable tels que décrits ci-dessous. les récipients doivent être pré-rincés avec une solution stérilisante, par exemple une solution de 12 proponal plus amphyl et créoline. Selon une mise en oeuvre préférée, on fait croître les cellules cancéreuses artificielles (c'est-à-dire des cellules dévelop- pées in-vitro pendant plusieurs générations) dans des flacons de 250 millilitres. Le milieu liquide dans lequel se développent les cellules est versé dans les récipients bien rincés. On lave alors doucement les cellules avec de 5 à 10 millilitres de solution Hank's 333 ou d'une autre solution similaire pendant environ 70 secondes. Il faut éviter d'agiter. Toutes les parois et les surfaces sont lavées. La solution est débarrassée de cellules par centrifugation à basse température pendant 10 minutes à 5.000 tours minute. Le milieu est versé dans un récipient rincé. On ajoute une petite quantité de solution d'enzyme protéine tamponnée et on rince rapidement pour éviter toute digestion des cellules. I1 est particu iièrement avantageux d'ajouter 1 à 2 millilitres de solution de trypsine (EDTA) et de ne rincer que pendant 10 secondes. On rejette la solution de trypsine. On ajoute un volume similaire de solution de trypsine fraîche et on laisse incuber jusqu'à ce aue lton voit les cellules se séparer des parois de la chambre à l'examen microscopique. Cela demande en général de 5 à 10 minutes. On ajoute un milieu de développement convenable tel que 50 millilitres d'une so de sérum lution formée par 7 à 10%/de veau foetal dans 100 millilitres de milieu nutritif F-1O. On transfère 25 millilitres du milieu frais avec cellules dans une nouvelle chambre de développement afin qu'il se propage. Les deux chambres sont placées dans un incubateur à 35 C pendant environ 7 jours. En suivant la procédure de cet exemple jusqu'à ce point uneXceJtue cancéreuse artificielle se divise en deux cultures franches environ tous les 7 jours. La méthode entière peut être répétée aussi souvent que dés ré à des intervalles d'environ 7 jours pour chacune des chambres de développement. Ainsi le nombre de cellules croissant in-vitro peut il ; Stre doublé environ tous les 7 jours. On peu-t extraire les cellules afin de produire la malignine après environ 7 jours de développement.Par exemple des cellules croissant dans chaque chamnbe de développement de 250 millilitres ainsi qu'il est décrit ci-dessus, peuvent 8tre récupérées de la façon suivante On transfère le milieu dans un tube convenable et l'on centrifuge à 3.000 tours par minute à basse tampérature pendant 10 Minutes. On évacue le milieu. Les cellules restant dans la chambre de croissance sont détachées des parois de la chambre et lavées dans les tubes de la centrifugeuse à l'aide d'une solution tampon neutre. Les cellules sont lavées deux fois avec une solution tampon neutre, centrifugées à nouveau à 3*00C tours minute à basse température, puis le milieu liquide est évacué.Les cellules lavées sont mises en suspension dans 10.millilitres de tampon phosphate neutre jusqu'au moment de l'extraction de la fraction blllte contenant le précurseur de malignine. EXEMPLE IV Production de fraction brute contenant le précurseur de malignine. On brise mécaniquement les cellules lavées en suspension dans le tampon neutre obtenu à la fin de l'exemple III, dans des conditions telles qu'on évite la dégradation de la plus grande partie des protéines. Il est particulièrement avantageux de traiter les cellules lavées à basse température, de façon sonique pendant 20 secondes. Après le traitement sonique on centrifuge les résidus cellulaires a 30.000 tours par minute pendant 30 secondes et l'on décante le liquide surnageant. On utilise des aliquots de 10 millilitres de solution tampon pour laver les résidus cellulaires restants. On répète le traitement sonique et la centrifugation et on rassemble les liquides surnageants. on recommence le procédé une fois de plus. On évapore le liquide surnageant global jusqu'à un volume final de 30 à environ 6 ou 7 millilitres. On prélève une fraction de ce volume pour réaliser l'analyse des protéines-totales et l'on fractionne le restant selon les méthodes de l'exemple I à propos du précurseur d'astrocytine. Exemple V Production de malignine purifiée à partir de la fraction brute contenant la malignine. La malignine est davantage purifée::-selon les méthodes décrites dans exemple II b propos de l'astrocytine. Dans l'étape de chromatographie selon la mise en oeuvre préférée de l'invention, on observe la malignine produite sous forme d'une tâche discrète située à une distance d'environ 0,91 +/ 0,02 par rapport au cytochrome C standard; cela indique un poids moléculaire approximatif de 10.000 pour la malignine. La malignine ainsi produite à cette étape est soluble dans l'eau distillée, soluble dans des pH neutres ou acides et insoluble dans des pH alcalins; elle présente un spectre d'absorption spectrophotométrique à 280 mu. c'est un polypeptide dont le poids moléculaire est d'environ 10.000. Les poids moléculaires de malignine produite dans des cultures de fermentation stabilisées au cours de générations successives des cultures ainsZfiue le montre la détermination en chromatographie sur gel en couches minces sont indiqués dans le tableau II. La re productivité de la détermination de poids moléculaire est remarqua- ble compte tenu des limites inérantes au procédé de chromatographie utilisé. TABLEAU II Reproductibilité du poids moléculaire de la malignine produite. Essai n Poids Essai n Poids Essai n Poids moléculaire moléculaire moléculaire 9,500 9 10,000 17 10,180 2 8.900 10 10.180 18 10.190 3 10.000 11 10.180 19 10.190 4 10.050 12 10.180 20 10.180 5 10.100 13 10.180 21 10.000 6 10.000 14 10.050 22 9.500 7 10.150 15 10.180 23 10.180 8 12.500 16 10.190 A la suite d'une hydrolyse avec du HC1 bN on observe les amino acide liés de façon covalente de la malignine; la détermination quantitative de ceci fournit la composition moyenne suivante d'amino acide Nombre approximatif de résidus Acide aspartique 9 Thréonine 5 Sérine 5 Acide glutamique 13 Proline 4 Glycine 6 Alanine 9 Valine 6 1/2 Cystéine 1 Méthionine 2 Isoleucine 4 Leucine 8 Tyrosine 3 Phénylalanine 3 Lycine 6 Histidine 2 Arginine 5 Total approximatif 89 L'acide cystéique, l'hydroxyproline, la norleucine, l1ammo- niac, l'isodesmosine, la desmosine, l'hydroxylysine, la lysinonorleucine et l'acide gamma aminobutyrique ne figurent pas en quantité détectable. En général le rendement en malignine pure obtenue à partie de 12 chambre, de réaction de 250 millilitres selon la procédure de l'exemple III 'est d'environ 1 milligramme. Les structures de la malignine et de l'astrocytine sont confirmées par une étude complète réalisée sur ordinateur dans laquelle on compare leur composition avec celle de pratiquement toutes les substances protéiniques connues. La composition de la malignine et de l'astrocytine la quantité relative et absolue de chacun de ces composants amino acide en termes du nombre total de résidu amino acide et les quantités absolues et relatives de chacun des composants/amino acide en termes de pads moléculaire de la molécule ont été soumises à une analyse matricielle sur ordinateur par rapport au plus grand ensemble de données concernant la structure protéinique dans le monde à savoir la bibliothèque de la National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. À la suite de cette analyse comparative de plusieurs centaines de milliers de protéines et de fragments protéiniques on a trouvé aucune structure identique ou même très voisine de celle de l'astrocytine ou de la malignine. Les seules proteines qui ont quelques rapports structurels de quelques sortes sont indicuées dans le tableau III; on y trouve également leur composition d'acide aminé et leur poids moléculaire. L'ordinateur est programmé de façon à identifier parmi plusieurs centaines de milliers de possibilité tout degré de similitude dans la structure. Ainsi par exemple, des protéines de poids moléculaire beaucoup 'plus grands ou plus petits ne conviennent pas; on rejette aussi ceux qui présentent plus de 95 et moins de 85 résidus au total, ou ceux qui ont moins de 12 ou plus de 15 résidus d'acide glutamique, ceux qui ont moins de b et plus de 11 résidus d'acide aspartique et ainsi de suite pour chacun des vingt acides amino concernés. TABLEAU III 22 La "dactylos copie" présente donc quelques/variables distinctes à assortir. Certaines substances conviennent vis-àvis de l'une, de quatre ou de cinq variables, mais aucune ne répondent aux 22 -carac- téristiques. Bn fait aucune ne s'accorde sur plus de 14 variables ce qui laisse des différences dans 8 variables. Ainsi ce qui s'en rapporche le plus est le cytochrome b5 (humain). Ainsi qu 'on le voit dans le tableau III les nombres Se résidus d'alanine, d'arginine, d'asparagine, d'acide aspartlque, de cystéine, de glutamine, d'histidine, de méthionine, de tyrosine, et de tryptophane diffèrent tous nettement ou fortement de ceux que présente l'astrocytine et la malignine. Comme le cytochrome b contient 7 histidines tandis que l'astrocytine et la maligninjn'en contiennent que 2, ces produits ne peuvent pas présenter la même structure chimique. Le fait le plus curieux concernant la composition de l'astrocytine et de la malignine est la forte concentration en acide glu T A B L E A U III Comparaison des structures de l'astrocytins et de la malignine avec les structures les proches déterminées par recherche sur ordinateur astro- malignine Cyto- Ferre- Ferre- Acyl Meuro- Neuro- Gonado cytine chrome domine doxine Carrier physine physine tropine b5 Luc.Gl. Alf.E.Coli bovine porc libéré acide Aspartique 9 9 9 10 8 7 2 3 0 Thréonine 5 5 6 4 6 6 2 2 0 Serine 6 5 5 7 8 3 6 7 1 Acide glutamique 13 13 14 13 13 14 9 9 0 Proline 4 4 3 5 3 1 8 7 1 Glycine 6 6 6 7 7 4 16 14 2 Alanine 9 7 4 6 9 7 6 7 0 Valine 4 6 4 6 9 7 4 2 0 1/2 Cystéine 2 1 0 5 5 0 14 14 0 Methionine 1 2 1 0 0 1 1 1 0 Isoleucine 2 4 4 4 4 7 2 2 0 Leucine 8 8 7 10 6 5 6 7 1 Tyrosine 2 3 3 3 4 1 1 1 1 phenylalanine 3 3 3 3 2 2 3 3 0 Lysine 8 6 7 5 5 4 2 2 0 Histidine 2 2 7 1 2 1 0 0 1 Arginine 4 5 3 2 1 1 7 5 1 Asparagine 0 0 0 0 1 2 3 2 0 Tryptophane 0 0 1 1 1 0 0 0 1 Glutamine 0 0 0 4 3 4 5 4 0 Nombre total des résidus 88 89 87 96 97 77 97 92 10 Poids Moléculaire 8.000 10.000 10.035 10.493 8.509 tamique. On pourrait s'attendre à en trouver que 5 ou 6 résidus dans les 89. D'autres substances qui se rapprochent beaucoup sont les ferredoxines du leucaené glauca et de l'alfalfa, respectivement, mais leur teneur en 5 ou 6 amino acide diffère fortement et deux autres diffère notablement et de plus ils ont 96 et 97 résidus respectivement. Ensuite vient la protéine acyl support de E. Coli 26, mais leur nombre de résidus de il amino acide diffère notablement de ceux de la malignine et de l'astrocytine et de plus elle/comprend que 77 résidus. Quelques autres protéines cérébrales (la neurophysine du boeuf et du porc, et l'hormone libérant ld gonadotropine) sont indiquées dans le tableau III afin de montrer dans quelle mesure la composition des plusieurs centaines de milliers de fragments pro téiniques restant dans la banque mémoriale d-e l'ordinateur diver ge de la composition des produits selon l'invention. Des protéines respiratoires peuvent renfermer des métaux et/ou des composants du hème dans leur état in-situ, mais le fragment protéinique isolé, par exemple pour l'apocytochrome b5 n'en contient pas. Une micro analyse supplémentaire de l'astrocytine et de la malignine a montré qu'elles sont dépourvues de fer, de souffre de magnésium, et de phosphore (quantite-toutes inférieures à 0,01%) de plus les caractéristiques spectrales montrent une absorption typique à 280 mu. En recombinant thème avec l'apoproteine, on restant le spectre d'absorption classique situé entre 400 et 450 mu. Bien que la structure de l'astrocytine et de la malignine soit unique par rapport à toutes les autres protéines et fragments protéiniques, il faut noter, et peut être ce fait est de grande importance que les structures qui s'en rapprochent le plus sont celles des protéines respiratoires. Il est bien connu dans irart que l'on peut tirer de nombreuses relations importantes à la fois au point 'de vue génétique du développement et dtun point de vue fonctionnel dans le type de structure représanté.Si l'astroeytine et la mali produits gnine sont de nouveaux/protéiniques dont les équivalences structu- rales in-situ représentent des fonctions respiratoires, et comme ces protéines sont reliées à la malignité ainsi qu'on le sait maintenant, on dispose alors d'une possibilité pour résoudre l'un des plus grand problème du cancer, à savoir la provenance de 1' énergie utilisée par ces cellules malignes voraces et qui se reproduisent rapidement. À c3té de l'importance théorique de cette découverte, les donnes fournies ci-dessus concernant l'augmentation de pourcentage de malignine dans les cellules plus malignes, et les données ci-dessous Indiquant que l'anti malignine se fixe non seulement au groupement chimique de type maligne de la cellule cancéreuse, mais étant ainsi fixée présente une activité cytotoxique vis-à-vis de ces cellules, prennent ensemble toute leur signification.Si les composés in-situ ressemblant à des malignines dans les cellules cancéreuses sont des protéines respiratoires, comme les produits anti-malignine selon l'invention se fixent de façon préférentielle sur ces composés in-situ, puis si les groupes respiratoires fonctionnels sont impliqués dans cette fixation, il est facile de com prendre comment il en résulte la mort des cellules cancéreuses. Les possibilités thérapeutiques des anti malignines et d'autres produits chimioréciproques similaires, sont fortement renforcés par cette information structurelle sur la malignine et astrocytine ainsi que par la relation qu'on vient de démontrer concernant la quantité de malignine par rapport au degré de malignité. EXEPLE 5 A Démonstration de l'augmentation du rendement, du degré de malignité et de la proportion de malignine, résultant de la mise en oeuvre d'un volume plus grand et d'une plus grande aire superficielle au cours de la fermentation. On répète les procédures décrites dans les exemples III à V en utilisant des flacons de 1.000 millilitres au lieu de 250 millilitres. Toutes les quantités des réactifs sont multipliées par trois. Te rendement en malignine après 7 jours de croissance de l'inoculum est presque doublé lorsque 1' espace disponible pour la croissance des cellules malignes passe de 250 à 1.000 cc. Le tableau IV montre le rendement en protéine totale en milligramme et la malignine produite sous forme d'un pourcentage de la protéine totale d'aide pour des générations successives de cultures par fermentation dans chaque dimension de flacon. Dans les flacons de 250 millilitres la quantité moyenne totale de protéines produites est de 17,5 milligrammes. Dans les flacons de 1.000 millilitres, la quantité totale moyenne de protéines obtenues est de 40,4 milligrammes. Il est surprenant de constater que la croissance de cellules malignes (degré de malignité augmente par période de développement de 7 jours lorsque, un espace et une surface plus grande sont disponibles pour la croissance cellulaire, la quantité de malignine produite, en pourcentage des protéines totales, augmente de manière nette. Le pourcentage de protéines totales qui est représenté par la malignine augmente depuis une moyenne de 10,7% dans le cas des flacons de 250 millilitres à une moyenne de 28,3% pour les flacons de 1.000 millilitres pour une période de croissance constante de 7 jours. La relation existant entre la proportion de maligne produite et le degré de malignité (c'est-à-dire une fonction de l'importance de la croissance de la cellule maligne in-vitro en 7 jours mesurée par rapport à la quantité totale de protéines produites) et indiqué dans la Fig. 1 TABLEAU IV Rendement amélioré au cours des générations successives de production de malignine en culture sous fermentation. Dimension du Malignine Total des protéines % de Malignine récipient mg. mg. 250 cc. 0,33 6,4 5,1 0.16 6.7 2.4 0.21 8.9 2.4 n 1.3 26.3 4.8 1.4 21.6 6.4 2.6 17.9 14.4 1.8 16.4 10.7 1.3 13.4 9.8 2.0 17.8 11.3 2.3 18.9 12.0 2.1 19.4 10.8 1.6 13.8 11.6 2.2 15.1 14.6 4.4 21.6 20.4 " 3.3 14.0 23.2 2.2 23.0 9.7 2.1 23.2 9.0 2.8 22.3 12.5 2.4 18.9 12.7 2.4 24.5 9.8 doyenne 17.5 mg. 10.7 % TABLEAU IV (suite) Dimension du Malignine Total des protéines % de Malignine récipient mg. mg. 1.0CO cc. 9.8 41.3 23.6 7.2 25.4 28.4 5.9 24.9 23.6 11.7 37.5 31.2 13.3 44.8 29.8 16.5 56.5 29.4 9.5 41.3 22.9 " 10.7 38.8 27.5 " 12.5 41.6 29.9 15.3 46.7 29.4 t' 11.6 45.2 25.7 Moyenne 44.4 mg. 28.3 fo La Fig. 1 montre qu'en changeant la dimension du récipient on triple pratiquement la quantité de malignine produite. La Fig. 1 montre également une relation entre la malignine et le degré de malignité. La ligne en pointillé indique une relation linéaire idéale. Cette relation démontrée n'est évidemment pas sans intérNt puisque la proportion de malignines présentes augmente à mesure que la croissance des cellules n'est plus aussi limitée (elle est pathologique). La fonction normale de la récognine in-situ concerne, ainsi qu'on l'a établi plus haut, l'inhibition par contact de la croissance des cellules. Plus est pathologique la croissance des cellules malignes et moins l'inhibition par contact opére, et plus la malignine devient la protéine principale. L'exemple 5 IL montre que la croissance de la culture cellulaire de cancer artificiel dans des récipients de grands dimensions conduit de façon surprenante à la production d'une quantité de malignine accrue, c'est-à-dire à un accroissement du pourcentage de protéines totales produites qui est la malignine. On entend selon l'invention, un récipient de développement de grandes dimensions celui dans lequel le rapport du volume du récipient au volume du milieu total avec cellules utilisé selon les méthodes décrites dans l'exemple 3 est supérieur à environ 8 à 1, par exemple ce rapport est compris entre 7 à 1 et 10 à 1. L'exemple 5 A illustre le cas d'un récipient pour lequel ce rapport est à environ 8 à 1. kxE'4PLE VI Production de réactif cible à partir de récognines. L'astrocytine préparée selon la procédure de l'exemple 2 ci dessus où la malignine préparée selon la procédure de l'exemple 5 ci-dessus, est complexés avec un support en vue de produire un réactif cible. Selon une mise en oeuvre préférée, on dissout l'astrocytine ou la malignine dans un tampon comprenant du NaH2P04 0,15 M-citrate, pH 4,0. Par ailleurs on prépare une bromoacétyl-résine, par exemple de la bromoacétylecellulose (BAC) ayant un milliéquivalent brome de 1,0 à 1, 5 par gramme de cellulose et conservé à basse température, dans un tampon NaH2P04 0,15 M, pH 7,2. On amène le tampon à un pH 4 en rejetant la solution tampon à pH 7,2 et en ajoutant un tampon NaH2P03 à 0,15 M-citrate , pH 4,0. On agite ensemble la solution d'astrocytine ou de malignine et la solution BAC (rapport BAC à malignine de 10 à 1) pendant 30 heures à la température ambiante, puis on centrifuge. Il est avantageux que tous les sites sur le BAC susceptibles d'être disponibles pour recevoir la récognine soient liés. On peut réaliser ceci de la manière suivante. Le liquide surnageant recueilli après la centrifugation est lyophilisé et la teneur en protéines est déterminée de façon à connattre la quantité d'astrocytine ou de malignine qui n'est pas encore complexée avec le BAC. Le complexe BAC astrocytine ( ou BAC malignine) est remis en suspension dans un tampon au bicarbonate 0,1 M pH 8,9, puis agité pendant 24 heures à 40 afin de permettre la formation de lais on chimique entre le BAC et l'astrocytine ou la malignine. Au bout de 24 Heures on centrifuge la suspension/et l'on détermine la teneur en protéines du liquide surnageant.Le complexe formé par le BAC et l'astrocytine ou le BAC et la malignine est remis en suspension dans un tampon d'aminoétha- nol 0,05 M-bicarbonate 0,1 M à pE 8,9 afin de bloquer tout brome n'ayant pas réagi. la suspension est centrifugée et le liquide surnageant est conservé mais non analysé en raison de la présence de l'aminoéthanol. On élimine toute l'astrocytine et la malignine qui n'est pas fixée en centrifugeant et en remettant en suspension après trois lavages dans du NaCl o,15 M jusqu'à ce que l'analyse en spectrophotométrie ne présente plus de pic d'absorption à 266 mu. On -agite ensuite le complexe BAC astrocytine ou BAC malignine dans de l'uréa 8 8 M, pendant 2 heures à 380C; on centrifuge puis on lave (3 fois suffisent en genéral) avec de l'urée 8 It jusqu'à ce que les produits de lavage ne présentent plus de-pic d'absorption à la longueur d'onde de 266 mu. Ou lave ensuite 2 fois le complexe avec du NaCl 0,15 t4 pour le débarrasser de l'urée.On agite ensuite le complexe à 770C dans de l'acide acétique 0,25 iR pendant 2 heures pour démontrer sa stabilité. On centrifuge et 11 analyse spectrophotométrique du liquide surnageant ne doit présenter aucun pic d'absorp- tion à 266 mu.Ce produit BAC astrocytine ou BAC malignine complexé chimiquement est donc stable et peut maintenant être utilisé comme réactif dans les méthodes ci-dessous. Par réactif stable, on entend ici un complexe produit de façon synthétique dont les propriétés chimiques et physiques imitent celles du précurseur stable lié aux cellules de l'astrocytine ou de la malignine lorsqu'il se trouve à un état susceptible de réagir avec les composants du sérum. Pour le conserver, on centrifuge le réatif cible et on le lave jusqu'd ce qu'il soit neutralisé à l'aide d'un tampon NaH2PO4 0,15 M avec un pH de 7,2. On peut préparer les réactifs cibles à partir de supports ligants de type bromoacétyl autre que la cellulose, telles que des résines bromoacétylées ou même du papier filtre. EXE4?LE 7 Production d'anti-sérum d'astrocytine, malignine et cible. On peut produire les anti-sérum d'astrocytine, de malignine et les réactifs cibles en induisant une réponse anti corps chez un mammifère. La procédure suivante à donné des résultats satisfaisants. On injecte dans le pelote de patte de lapin mâle blanc, 1 mi. ligramme de récognine (astrocytine ou malignine) avec un adjuvant classique deFreund's, puis on fait la même injection par voie intrapéritonéale une semaine plus tard, puis 10 jours après, puis si besoin est 3 semaines plus tard. On peut déjà détecter des anticorps spécifiques dans le sérum sanguin de ces lapins au bout d'une semaine ou dix jours après la première injection. On procède de la même manière pour l'antigène cible en injectant la quantité de cible qui renferme 1 milligramme a' astrocytine ou de malignine, la quantité de protéines étant déterminée selon la méthode Folin-Lowry L'anti corps spécifique de l'astrocytine est dénommé l'anti- astrocytine. l'anti corps spécifique de la malignine est dénommé anti-malignine. De même l'anti corps spécifique du réactif cible est dénommé anti-cible. Ces anti-corps sont clairement mis en évidence sur des tests ouchterlony de diffusion sur gel standard pour des réactions antigè- ne anti-corps avec lignes de réaction nettes uniques et spécifiques produites avec leurs antigène spécifiques. La présence d'anti-corps spécifiques dans le sérum peut aussi être testée par le test standard quantitatif de précipitine pour les réactions antigène anti-corps. On recueille de bonnes précipitines quantitatives et on peut en déduire les microgrammes d'anti-corps spécifiques produits. On peut fournir une autre preuve de a présence des anticorps spécifiques dans le sérum en réalisant l'absorption de l'anticorps spécifique anti-astrocytine sur le bromoacétyl-cellulose-astrocytine (BAC -astrocytine) préparé ci-dessus . On peut faire réagir l'anti-sérum contenant 1'anti-astrocytine spécifique avec le complexe BAC-astrocytine. Lorsqu'on fait passer le sérum sur le complexe BAC-astrocytine, seuls les anticorps spécifiques à l'astrocytine se fixent sur leur astrocytine antigène spécifique.Comme l'astrocytine est liée de façon covalente à la bromoacétyle-cellulo- se, l'anti-corps spécifique l'anti-astrocytine, est maintenant fi- xé au complexe BAC-astrocytine et donne le BACastrocytine-anti- astrocytine (BAC-A-anti-astrocytine). Ceci est prcuvé par l'examen du restant du sérum qui est lavé afin d'entre débarrassé du complexe BAC-astrocytine.On en conclut donc que tous les anticorps spécifiques (anti-astrocytine) dont on a montré la présence dans le sérum plus haut, a été absorbé par le complexe BAC-astrocytine. De plus lorsque l'anti-astrocytine ert détaché du complexe 3AC-astro- cytine il est ainsi isolé et débarrassé de tous anti-corps contami- nants. On peut détacher l'anti-astrocytine en lavant le produit BAC-A-anti-astrocytine avec de l'acide acétique 0,25 M (4 C pendant 2 heures) dont on a montré plus haut qu'il ne brise pas la liaison S astrocytine. Une autre preuve encore de la présence d'anti-corp3 sécifi- ques dans le sérum peut être obtenu par l'absorption de l'anti-cots anti-malignine spécifique sur la bromoacétyl-ce7lulose-malignine (BAC-malignine) préparé cl-dessus. On peut faire réagir l'antisérum contenant l'anti-malignine spécifique avec le complexe aC- malignine. Lorsque l'on fait passer le sérum sur le complexe BAC malignine, seuls les anti-corps à la malignine se fixent sur leur malignine antigène spécifique.Comme la malignine est liée de façon covalente au bromoacétyl-cellulose, l'anti-corps spécifique l'antimalignine est maintenant fixé au complexe BAC-malignine et fournit le BAC-malignine-anti-malignine (AC'i1-anti-malignine). Ceci est prouvé par l'examen du restant du sérum que l'on lave pour le débarrasser du complexe BAC-malignine. Sur un test ouchterlony standard il ne reste maintenant aucun anti-corps dans le sérum qui va réagir avec la malignine. On en conclut donc que tous les anticorps spécifiques (anti-malignine) dont on a montré la présence dans le sérum, ont été absorbés par le complexe îBAC-maflgnine. De plus, lorsque l'anti-malignine est libéré du complexe BAC-mali- gnine elle est ainsi débarrassée et isolée de tous les anti-corps contaminants.Ce détachemert de l'anti-malignine peut être effectué par le lavage du complexe BACM-anti-malignine avec de l'acide acétique 0,25 SI (40C, pendant 2 heures), dont on a montré plus haut qu'il ne brise pas la liaison EAC-malignine. Les anti-corps à la cible sont clairement mis en évidence sur des tests ouchterlony et standard de diffusion sur gel pour des réactions antigène anti-corps avec des lignes de réaction spédifiques uniques produites avec la cible, qui montrent une ligne identique à la ligne de réaction aux anti-sérum , d'anti-astrocytine ou d'anti-malignine (c'est-à-dire ceux qui sont produites par injection d'astrocytine ou de malignine elles-mêmes).On a noté que certains lapins présentent une certaine quantité d'anti-cible dans leur sang avant qu'on ne leur ait injecté une cible. Ces substances anti-cible lorsqu'on les fait réagir de façon spécifique avec le réactif cible de la façon décrite dans les essais sur sérum humain, conduit à la production de quantités pratique ment équivalentes des deux types de produits TAG, le S-TAG et le F-TAG (voir les exemples suivants). EXEMPLE VIII Détection de tumeur maligne par production quantitative invitro de globuline se fixant sur une cible (TiiG) à partir de fluide biologique. On prépare le réactif cible selon la procédure décrite dans l'exemple VI puis on le lave pour éliminer toutes récognines non liées qui pourraient être présentes par suite d'une dégradation. La méthode décrite ci-après donne de bons résultats. On agite le réactif cible pendant 2 heures à 37 C avec de l'acide acétique, puis on centrifuge et on décante le liquide surnageant dont on détermine la densité optique à la longueur d'onde de 266 mu. Si l'on constate une absorption quelconque, on renouvelle le lavage jusqu' à ce qu'il n'y est plus de substances qui se solubilisent.On remet ensuite la cible en suspension dans une solution salée tamponnée de phosphate pH 7,2 (si on en dispose, on peut utiliser du S-TAG ou du F-TAG purifié standard provenant de réactions précédentes du sérum humain selon les procédures décrites ci-apres, comme standard de référence pour tester le réactif cible, de même cue le peut le sérum de lapin entier dont il a été déterminé qu'il renferme du S-TAG et du F-TAG par d'autres préparations cibles). La détermination de la présence du S-TAG (TAG lent) est réalisée de la manière suivante : il ne faut pas utiliser du sérum congelé conservé pendant plus de quelques jours. On prépare soigneusement du sérum à partir d'un sang entier fraichefaent obtenu ou autre fluide corporel selon des techniques classiques dans l'art On a obtenu de bons résultats avec la procédure suivante. On laisse du sang se coaguler en le laissant reposer pendant 2 heures à la température ambiante dans un tube à essai en verre. On dépare les caillots des parois à laide d'une baguette en verre, puis on laisse reposer le sang à 40C pendant un minimum de 2 heures (ou pendant la nuit).On sépare ensuite les caillots du sérum en centrifugeant le système à 20.000 tours par minute à 4 C pendant 45 minutes. Le sérum est décanté dans un tube convenable et soumis à nouveau à une centrifugation à 2000 tours par minute à 40C pendant 45 minutes. On décante le sérum et on y ajoute une solution à 1% de méthiolate (t gramme dans 95 millilitres d' eau et 5 millilitres de tampon bicarbonate 0,2 IfI, pH 10) à raison de 1% du volume de sérum. rré On dispose d'échantillons de 0,2 millilitres de façon décrite pus haut ou selon une autre procédure; on ajoute à chacun des fractions de 0,25 millilitres de contenant 100 à 200 microgrammes de récognine par 0,25 millili- tres de réactif cible en essai double. On mélange la suspension à 4 C de façon à éviter la formation de boulettes. Par exemple on peut utiliser un petit bouchon de caoutchouc et secouer pendant 1 à 2 secondes et ensuite les tubes étant légèrement inclinés, ils peuvent entre secoués dans un secoueur Thomas pendant environ 2 heures ou plus. Le réactif cible et la protéine qui s'est fixée dessus sont séparés du sérum.Voici une des procédures qui ont donné de bons résultats. On soumet alors les tubes à une centrifugation à 2.000 tours par minutes pendant 20 minutes à 4 C, on dé cante le liquide oui surnage; on lave 3 fois la boulette qui s' est formée au cours de la centrifugation, en remélangeant et secouant à températu-re ambiante avec des portions de 0,2 à 0,) millilitres de solution saline de 0,15 X, on centrifuge et on évacue les liquides surnageant. la protéine qui reste fixée à la cible en est séparée et déterminée de façon quantitative, par exemple on ajoute 0,2 millilitre d'acide acétique 0,25 M , on secoue la suspension pendant 1 à 2 heures dans un incubateur à 370C. On soumet alors les tubes à une centrifugation à 2.000 tours par minute à 40C pendant 30 minutes. On décante soigneusement le liquide surnageant afin d'éviter le transfert de particules et l'on détermine la densité optique du liquide surnageant à la longueur d'onde de 280 mu. La valeur de la densité optique est divisée par un facteur 1,46 pour fournir un résultat en microgrammes par millilitre de protéine du sérum (S-TAG).Les déterminations effectuées en double ne doivent pas différer de 5ss. On peut mettre en oeuvre un autre procédé quelconque pour déterminer la teneur en protéines teleque la méthode de détermination de Folin-Lowry, mais il faut bien spécifier les standards pour déterminer la gamme de contrôle et les valeurs tu moralenie concentration S-TAG moins F-TAG. La détermination de la teneur en F-TAG (TAG rapide) est réalisé de la façon suivante : on ne doit pas mettre en oeuvre du se rum congelé conservé depuis plus de quelques jours. On prépare soigneusement du sérum à partir du sang entier fraîchement recueilli ou d'un autre fluide corporel selon des techniques classiques dans l'art. La procédure donnée ci-dessus dans cet exemple à propos de la préparation du sérum donne de bons résultats. Des échantillons de sérum préparés selon la méthode ci-dessus ou selon une autre procédure sont laissés reposés/pendant une période de temps inférieure de 10 minutes à la période de temps totale utilisée pour la détermination du sérum S-TAG lorsque le sérum était en contact avec le réactif cible ci-dessus (par exemple, on laisse reposer 1 heure et 50 minutes si la détermination du S-TAG à été effectuée pendant 2 heures) on équilibre ainsi l'histoire des températures des déterminations de S-TAG et F-TAG. On ajoute des échantillons de 0,2 millilitre de sérum dont la température a été équilibrée à chacune des fractions de 0,25 millilitre de réactif cible en suspension contenant 100 à 200 microgrammes de récognines pour 0,25 millilitre de réactif cible on fait des essais en double. On mélange ensuite la suspension à 40c pendant environ 10 minutes de façon à éviter la formation de boulettes. Par exemple, on peut utiliser un petit bouchon de caoutchouc et secouer rapidement pendant 1 à 2 secondes et ensuite les tubes tubes étant légèrement inclines ceux-ci peuventZsecous dans une secoueuse Thomas pendant environ 10 minutes. Le réactif cible et la protéine qui est fixée sur lui sont séparés du sérum. L'une des procédures qui a donné de bons résultats est la suivante.Les tubes sont alors soumis à une centrifugation à 2.000 tours par minutes pendant 20 minutes à 40C, le liquide surnageant est décanté et la boulette qui est formée au cours de la centrifugation est lavée par 3 fois avec remélange et secousse à la température ambiante avec des portions de 0,2 à 0,3 millilitres de solution saline 0,15 M centrifugé et ensuite débarrasé des liquides surnageant. La protéine qui reste fixée à la cible en est séparée et déterminée quantitativement. La procédure décrite ci-dessus dans cet exemple à propos de la détermination de la concentration en S-TAG donne de bons résultats. On peut utiliser une autre procédure efficace pour déterminer la teneur en protéines telle que la méthoda de Folin-Lowry, mais on doit bien spécifier les standards de façon à déterminer la gamme de contrôle et les valeurs de tumeur de concentration de S-TAG moins F-TAG. Les résultats finaux sont estimés en microgramme de TAG par millilitre de sérum et égalent la valeur S-TAG moins F~TAG. Dans le cas de malade ne souffrant pas de tumeur cérébrale ou chez d'autres témoins on obtient des valeurs de TAG habituellement comprises entre 0 (ou un nombre négatif) et 135 mierogrammes par millilitre de sérum. Lorsque l'on obtient un résultat supérieur a 100 microgrammes par millilitre il est préférable de recommencer la déter nation. Certaines autres tumeurs peuvent fournir de hautes valeurs de TAG en particulier si il y a des tumeurs secondaires (métastases) présentes dans le cerveau.Dans le sérum de malade souffrant de tumeur cérébrale les valeurs de tAG sont généralement comprises entre 1)6 et 500 ou plus microgrammes par millilitre de sérum. Dans le 1er essai effectué en aveugle et portant sur 50 échantillons de sang conduit selon les procédures décrites dans cet exemple utilisant un réactif cible préparé à partir d'2strocy- tine et de bromoacétyl-cellulose, on a détecté correctement 11 tumeurs cérébrales des 11 tumeurs cérébrales et 28 sur les 32 éléments normaux.L'une des quat-e personnes supposées normales (c'est à-dire un témoin ne souffrant pas de tumeur cérébrale) se révéla souffrir d'un cancer de la glande thyrolde qui avait apparemment été traité avec succès quelques années auparavant.Les trois autres individus normaux restants âgés de 50 à 70 ans jouissaient d'une médiocre santé, et peut-être par suite d'un cancer non diag nostiqué. Parmi les 7 cas restant on a identifié correctement 3 des 3 cas de maladie dite de Hodgkin's; pour un cas, la valeur était comprise dans la gamme tumorale (136 à 500 microgrammes de TAG parmillilitre) et correspondait à un malade souffrant d'une gliosis sévère, et enfin pour 3 cas dont la valeur TAG était com non prise dans la gamme/tumorale (0 à 135 microgramme de TAG par millilitre) correspondait à des patients ayant respectivement un diagnostic de masse intercranienne incertain mais non tumoral, un ostéosarcome (tumeur non cérébrale) et un sarcome mélanotique (tumeur non cérébrale). Un autre examen conduit selon les procédures de cet exemple utilisant un réactif cible préparé à partir de malignines apportées sur des tumeurs cérébrales malignes et des éléments normaux. Une autre étude aonduite selon les procédures de cet exemple a étendu le nombre total de spécimens de sérum humain essayé de 50 à 114. L'utilité de ces produits et de ces techniques est mise en évidence dans le Tableau V qui rassemble les résultats de ces essais. EXEMPLE IX Diagnostic de cellules tumorales par immunofluorescence. On a montré que les composés anti-astrocytine, anti-malignine, et S-TAG se fixent de façon préférentielle sur les cellules tumorales. Cette spécificité permet l'emploi de ces composés pour diagnostiquer des cellules tumorales dans des sections histologi- ques par l'association de colorants cu de substances radio-actives à l'anti-astuocytine, l'anti-malignine ou le S-TAG. On peut égale mettre ment/en oeuvre des techniques de marquage standard. Voici une mé- thode pour utiliser le S-TAG. On a obtenu de bons résultats avec la méthode modifiée St. Marne. On gèle des spécimens de tumeurs cérébrales humaines et I' on découpe des sections de 5 microns d'épaisseur. On les conserve dans un récipient en atmosphère humide à moins 700C pendant 4 à 8 semaines avant de les colorer. L'élément associé peut store un antisérum standard telle que l'association chèvre anti-lapin. L'élé- ment conjugué est marqué selon des techniques classiques à ltaide d'une substance fluorescente ou d'une autre substance de marquage. On peut utiliser le conjugué chèvre anti-lapin marqué par de la fluorescéine disponible industriellement. La technique de fluorescence est classique : on incube une solution de 1:200 à 1:400 de TAG pendant environ 30 minutes ou plus sur la section tumorale puis on lave plusieurs fols pour éliminer les TAG qui ne se sont pas fixés. Il suffit en général d'effectuer 5 lavages avec une solution saline tamponnée avec du phosphate. On réalise ensuite l'incubation conjuguée avec le conjugué marqué à la fluorescéine puis on effectue plusieurs lavages, et enfin une étude au microscope. Des cellules normales et leurs prolongeraerts ne se colorent pas dans les sections tumorales ni dans les sections témoins du cerveau non tumoral normal. La fluorescence est nettement visible dans les cellules gliales tumorales et leurs prolongements. EXEI(iPLE x Démonstration de îT7Mti9cité de l'anti-astrocytine, l'antimalignine et du S-TAG vis-à-vis de la crcissance des cellules tumorales dans la culture tissulaire. On peut utiliser des essais standard pour déterminer la cytotoxicité. En général on compte le nombre de cellules dans une chambre de comptage donnée, en général disposée de manière à conte nir environ 100 cellules vivantes. On traite ensuite ces cellules avec un agent à étudier et on dénombre le nombre de cellules qui reste encore envie. Dans un essai standard de cytotoxicité d'une solution de S-TAG obtenue selon les procédés décrits dans exemple VIII visà-vis des cellules de culture tissulaire provenant d'un malade souffrant d'un gliblastome de niveau III à IV, bien caractérisé comme ayant une origine gliale, le S-TAG produit la mort de toutes les cellules dans la chambre de comptage même pour des hautes dilutions de 1 et 1,' ce qui ne représente que 0,2 et 0,02 microgramme de S-TAG par millilitre de solution. On recueille des résultats avec des hautes solutions d'anti-astorcytine et dtanti-mali- gnine. Sa spécificité présentée dans l'exemple IX et la cytotoxicité mise en évidence dans l'exemple X ont un rapport très étroit avec les possibilités thérapeutiques de l'anti-astrocytine et de l'anti-malignine et du S G vis-à-vis des tumeurs cérébrales chez l'homme. Ces utilisations thérapeutiques s' ajoutent à la possibilité pratique de diagnostic de chacun de ces phénomènes pour le T A B L E A U V Tumeurs cérébrales Autres tumeurs Autres tumeurs Diagnostic Normaux malignes primaires malignes céré- malignes non incertain de tu brales secon- cérébrales meurs malignes daires secondaires cérébrales TAG TAG TAG TAG TAG en TAG en TAG en Tag en en en en en ug/ml ug/ml ug/ml ug/ml ug/ml ug/ml ug/ml ug/ml de sérum de sérum de sérum de sérum de de de de sérum sérum sérum sérum 124 19 54 65 459 270 36 4 165 8 113 55 27 113 397 257 31 5 144 5 105 51 41 130 236 188 442 14 13 5 130 82 21 79 137 205 288 14 209 10 127 44 27 61 298 157 7 75 10 38 127 21 123 397 184 11 100 31 0 14 241 27 11 125 0 14 20 241 110 12 30 125 62 41 217 192 15 250 118 38 34 147 39 89 93 93 127 363 99 6 21 48 185 4 13 0 20 253 31 270 120 82 253 42 7 16 20 565 34 58 20 55 277 76 24 113 0 137 48 62 73 78 13 85 89 138 89 650 160 Normaux comprenant, troubles non tumoraux d'ordre médical et chirurgical. 1) très malade, non diagnostiqué, 2) masse intracranienne extra-cérébrale, non diagnostiquée, 3) gliosis marqué 4) Mélanome malin, 5) estéosarcome, 6) Fluide de kyste cérébral, 7) Adenocarcinome du colon 8) gastrectomie, 9) Maux de tête, 10) Emphysème, 11) Polymyalgie, 12) Cancer du colon, 13) Convulsions, 14) Cancer secondaire de la prostate, 15) Normal du point de vue clinique. Normaux du point de vue clinique quelques mois plus tôt, lorque l'on a obtenu cette valeur anormale de TAG, il présentait des maux de tête sérieuses, perte de lodorat et du goût. tissu tumoral éliminé en opération mais nécéssitant le diagnostic par histologie déjà mis en évidence ici. EXEMPLE XI Découpage des recognines par hydrolyse. On laisse reposer à basse température une solution de reco- gaines, soit d "astrocytine ou de malignines, à un pk compris entre 1 et 2. Au bout de 7 à 14 jours la chromatographie en couches minces indique que le poids moléculaire du produit s'est réduit de 200. Lorsqu'on laisse reposer plus longtemps la solution, d'autres unités de poids moléculaire d'environ 200 se séparent tous les 7 à 10 jours. Ainsi avec l'astrocytine le poids moléculaire est réduit depuis 8.000 et avec la malignine le poids moléculaire est réduit depuis 10.000 et dans chaque cas par unités d'environ 200 et de façon sécantielle. Les spécificités physiochimiques de l'astrocytine sont conservés pour chaque produit jusqu'à ce que le produit présente un poids moléculaire de 4.000. Les spécificités physiochimiques de la malignine sont conservées pour chacun des produits intermédiaires jusqu a ce qu'on obtienne un produit de poids moléculaire d'environ 5.000. Ce fait est démontré par des tests ouchterlony de diffusion sur gel par rapport à l'anti-astrocytine et l'anti-malignine respectivement. être Le découpage peut également/effectué par voie enzymatique par exemple avec ia tryspine ou d'autres protéinases en donnant des résultats similaires. Les poids moléculaires des composés successifs préparés par découpage hydrolytique de récognines peuvent a peu près etre définis par les formules suivantes : pour les produits ayant les spécificités physiochimiques de l'astrocytine : 4.000 + 200x = Y pour les produits ayant les spécificités physiochirniques de la malignine : 5.000 + 200x = Y dans lesquels Y est le poids moléculaire du produit et x est un entier compris entre 0 et 19. EXEMPLE XII Production d'organe du tissu artificiel avec des récognines. On dispose d'un tube à paroi rigide en plastique, métal ou autre matériau rigide convenable; on le plonge ou on l'imprègne d'une solution visqueuse extrtmement concentrée (10 milligrammes par millilitre) de récognines c'est-à-dire ici soit i'astrocytine ou de malignine, jusqu'à ce que toutes les surfaces scient enduites de récognines. Dans une variante on peut faire passer la solution de récognines tout autour et dedans le tube sous pression jusqu'à ce que toutes les surfaces soient parfaitement enduites. Le tube est alors séché à l'air ou sous vide ou lyophilisé. l'enduction est répétée plusieurs fois de façon à établir plusiems couches moléculaires d'enduit de récognines. Le tube est maintenant prêt à entre disposé dans une cavité ou dans un tIssu qui renferme des précurseurs ressemblant à l'astrocytine ou a ia malignine dans la fluide ou le tissu contiga d'bai mammifère vivat. Cet organe ou tissu artificiel peut être utilisé pour réduire au minimum ou éliminer toute réaction vis-àvis de substances étrangères que l'absence d'enduit de récognines induirait. On peut produire de manière similaire des organes ou tissus artificiels ou d'autres formes géométriques. R E V E N D I C A T I 0 N S 1. Procédé pour produire de l'astrocytine caractérisé en ce que l'on extrait du tissu tumoral de gliome cérébral avec un tampon neutre en brisant/repétée les tissus afin de solubiliser des fractions protéiniques, que l'on sépare de l'extrait résultant de protéines solubilisées la fraction dont le pK est compris entre environ 1 et 4, et que l'on er isole un produit présentant un poids moléculaire d'environ 8.000. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'on éffectue l'étape de séparation de la fraction ayant un pK compris entre environ 1 et 4 en introduisant cet extrait de protéines solubilisé dans une colonne chromatographique et en éluant avec des solvants de plus en plus acides. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on réalise cette isolation en filtrant l'éluat de manière à obtenir une fraction comprenant l'astrocytine uis en/séparant l'astrocytine en chromatographie. 4. L'astrocytine préparée selon le procédé de la revendication 1, est caractérisée en ce qu'elle forme un précipité en ligne unique avec son auti-corps spécifique dans des tests quantitatifs de précipitine et dans des tests ouchterlony de diffusion sur gel, qu'elle est soluble dans l'eau et dans les solutions aqueuses acides ou neutres et insoluble dans les solutions à pE alcalin qui présente un pic d'absocption spectrophotométrique à la longueur d'onde de 280 mu et un poids moléculaire de l'ordre de 8.000. 5. L'astrocytine. 6. Produit selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il forme un précipité avec son anti-corps spécifique dans des tests quantitatifs de précipitine et des tests ouchterlony de diffusion sur gel, qu'il est soluble dans l'eau et dans les solutions aqueuses ayant un pli acide ou neutre, et insoluble pour un p9 alcalin, qu'il présente un pic d'absorption spectrophotométrique à la longueur d'onde de 280 mu et d'un poids moléculaire d'environ 8.000. 7. Produit selon la revendication 6 caractérisé en ce que de plus il présente la composition approximative en amino acide suivant ombre approximatif de résidus Acide aspartique 9 Thréonine 5 Sérine 6 acide glutamique 13 Doline 4 Glycine 6 Alanine 9 Valine 4 1/2 Cystéine 2 Méthionine 1 Isoleucine 2 Leucine 8 Tyrosine 2 Phénylalanine 5 Lysine 8 Histidine 2 Arginine 4 Total approximatif 88 l'acide cystéique, l'hydroxyproline, la norleucine, l'ammoniac, l'isodesmosine, la desmosine, l'hydroxylisine, la lysinonorleucine et l'acide gamma-aminobutyrique n'étant pas présent en quantité décelable. 8. Produit selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il est de plus capable de former un complexe avec la bromoacétyl-cellulose en donnant de la bromoacétyl-cellulose-astrocytine et de produire les anticorps spécifiques anti-astrocytine lorsqu'on/Tin- jecte chez des mammifères, cette anti-astrocytine étant toxique vis-à-vis des cellules tumorales cérébrales in-vivo et produisant la fluorescence des cellules du gliome lorsqu'on l'associe à de la fluorescéine. 9. Elément choisi dans la classe formée par l'anti-astrocytine, la brozoacétylcellulose-astrocytine, la bromoacétyl-cellulo se-astrocytine-antiastrocytine, l'anti-malignine, la bromoacétylcellulose-malignine et la bromoacétyl-cellulose-malignine-anti-ma- lignine. 10. Procédé pour produire de la malignine caractérisé en ce que l'on extrait avec in tampon neutre acs cellules cancéreuses artificielles développées en culture avec fermentation, en brisant de façon répétée le tissus afin de solubiliser des fractions protéiniques, que l'on sépare de l'extrait résultant la fraction dont le pK est compris entre environ 1 et 4 et sue l'on en isole le produit dont le poids moléculaire est d'environ 10.000. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'on réalise la séparation de la fraction ayant un pK compris entre environ 1 et 4 e introduisant cet extrait de protéine solubilisé dans une colonne chromatographique et en éluant avec des solvants d'acidité croissante. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu' on réalise l'isolation en filtrant l'éluat de façon à obtenir une fraction comprenant la malignine et que l'on sépare cette malignine par chromatographie sur bel en couches minces. 13. Malignine produite selon le procédé de la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle forme un précipité unique en ligne avec son anticorps spécifique dans des essais quantitatifs de précipitine et des essais ouchterlony de diffusion sur gel, qu'elle est soluble dans l'eau et dans des solutions aqueuses ayant un acide ou neutre,et insoluble pour un pH alcalin, qu'elle présente un pic d'absorption photométrique à la longueur d'onde de 280 mu et un' poids moléculaire d'environ 10.000 14.Malignine 15. Produit de la revendication 14, caractérisé en ce qu'il forme un précipité avec son anti-corps spécifique dans les tests quantitatifs de précipitine et dans les tests ouchterlony de diffusion sur el, qu'il est soluble dans l'eau et dans les solutions aqueuses ayant un pH acide ou neutre et Insoluble pour un pH alca- lin, qu'il présente un pic 'd'absorption à a longueur d'onde de 280 mu et un poids moléculaire d'environ 10.000. 16. Le produit de la revend cation 15 est caractérisé en ce qu'il présente de plus la composition approximative an amino-acide suivante ombre approximatif de résidus Acide aspartique 9 Thréonine 5 Sérine 5 acide glutamique 13 Prolixe 4 Glycine 6 Alanine 7 Valine 6 1/2 Cystéine 1 Méthionine 2 Isoleucine 4 Leucine 8 Tyrosine 3 Phénylalanine 3 lysine 6 Histidine 2 Arginine 5 Total approximatif 89 l'acide cystéique, l'hydroxyproline, la norleucine, l'ammoniac, l'isodesmosine, la desmosine, l'hydroxylisine, la lysinonorleucine et l'acide gamma-aminobutyrique n'étant pas présents en quantité détectable 17.Produit selon la revendication 16, caractérisé en ce qu' il est de plus capable de former un complexe avec la bromoacétylcel- lulose en donnant de la bromoacétylcellulose-malignine et de produire les anti-corps spécifiques anti-malignine lorsqu'on l'injecte chez le mammifère, ces anti-malignine étant toxiques vis-à-vis des cellules tumorales in-vitro et produisant la fluorescence des cellules tumorales lorsqu'on les associe avec de la fluorescéine. 18. Procédé pour produire une globuline fixant une cible de manille lente (S-TAG) caractérisé en ce que l'on fait régir du sérum sanguin ou un autre fluide corporel avec de la bromoacétylcel- lulose-astrocytine ou de la bromoacétyl-cellulose-malignine, pendant environ 2 heures ou davantage à basse température de façon à empêcher toute réaction de dégradation et l'on traite la matière résultante par de l'acide dilué pour en détacher le S-TAG. 19. Produit S-TAG préparé selon le procédé de la revendication 18, caractérisé en ce qu'il est soluble dans les solutions tamponnées aqueuses, qu'il forme un précipité en ligne unique avec l'astrocytine ou la malingine dans des tests ouchterlony de diffusion sur gel, qu'il n'est pas dialysable dans des membranes de cellophane, qu'il est retenu sur des filtres millipore qui conservent les molécules/dont le poids moléculaire dépasse 25.000, qu'il présente des poids moléculaires à différents états d'agrégation tel qu'on les détermine en chromatographie sur gel en couches min de ces d'environ 50.000 ou de ses multiples dans la gamme/macroglobu- line et qu'il présente un pic d'absorption spectrophotométrique à la longueur d'onde de 280 mu. 20.Procédé pour produire une globuline fixant une cible de façon rapide (F-TAG) caractérisé en ce que lton fait réagir du sérum sanguin ou du fluide corporel avec de la bromoacétylcelluloseastrocytine ou de la bromoacétylcellulose-malignine pendant environ 10 minutes à basse température de façon à éviter la formation de réaction de dégradation et que l'on traite la matière résultante avec de l'acide dilué de façon à en séparer le B-24G. 21 q Produit F-TAG préparé selon le procédé de la revendica tion 20 caractérisé en ce qu'il est soluble dans une solution tamponnée aqueuse, qu'il forme un précipité à ligne unique avec l'astrocytine ou la malignine dans les tests ouchterlony de diffusion sur gel, qu'il n'est pas dialysable dans des membranes de cellophane, qu'il est retenu par des filtres millipore qui ne laissent pas passer des molécules dont le poids moléculaire dépasse 25.000 çJf-il présente des poids moléculaires en différents états d'agrégation tel quton les détermine en chromatographie sur gel en couches minces, d'environ 50.000 OU DE ses multiples dans la gamme des macroglobulines et qu'il présente un pic d'absorption spectro photométique à la longueur d'onde ae 250 mu. 22. Méthode pour détecter les tumeurs cancéreuses chez les mammifères vivants, caractérisée en ce que l'on détermine la concentration de S-TAG et de BAC produit par un volume connu du sérum/sanguin du mammifère ou d'un autre fluide corporel; 23. Produit ayant les spécificités physiochufliques de l'astrocytine caractérisé en ce qu'il présente un poids moléculaire déterminé approximativement par la formule : 4.000 + 200x = Y par laquelle Y est le poids moléculaire du produit et x est un entier compris entre O et 19. 24. Produit ayant les spécificités physicochimiques de la maligne caractérisé en ce qu'il présente un poids moléculaire défini approximativement par la formule : 5.000 + 200x = Y Y est dans laquelle/le poids moléculaire du produit et x est un entier de O à 19. 25. Méthode de production d'anti-astrocytine caractérisé en ce que lton induit chez un mammifère une réponse de type anticorps à l'astrocytine. 26. Méthode de production dé bromoacétylcellulose-récognine caractérisée en ce que l'on mélange la récognine avec la bromoac4- tylcellulose de manière convenable pour formes un complexe, la récognine étant l'astrocytine ou la malignine. 27. Méthode pour produire de la bromoacétylcellulose-reco gnine-anti-recoggine caractérisée en ce que l'on fait réagir de l'anti-récognine avec de la bromoacétylcellulose-récoghine de manière convenable de façon à former un complexe, la récognine étant l'astrocytine ou la malignine. 28. Méthode de production dtanti-récognine caractérieée en ce que l'on décomplexe une bromoacétylcellulose-récognine-anti- recognine par hydrolyse avec un acide ou une enzyme protéinase, la recognine étant choisie entre la malignine et l'astrocytine. 29. Méthode de production d'anti-malignine caractérisée en ce que l'on induit chez le mammifère une réponse de type anticorps à la malignine. 30. Procédé pour diagnostiquer la présence de cellules tumorales gliales dans une section histologique caractérisé en ce qu' on applique à cette section un élément de la classe formée par un composé TAG associé à de la fluorescéine et une anti-racognine associée à de la fluorescéine, il apparat ainsi une fluorescence sur les cellules tumorales gliales seulement, la récognine étant choisie entre l'astrocytine et la malignine. 31. Procédé pour augmenter le rendement en produit TAG chez un mammifère, caractérisé en ce qu' on- lui injecte une dose efficace au point de vue biologique d'un élément choisi dans le groupe formé par les récognines, les anti-récognines et les récognines complexées- avec des supports. 32 . Récognines. 53. Récognines selon la revendication 32 caractérisées en ce qu'elles sont capables de produire des anti-récognines lorequ' on les injecte chez les mammifères, ces anti-récognines étant toxiques vis-à-vis de cellules tumorales in-vitro et produisant une fluorescence dans les cellules tumorales lorsqu'on les associe à la fluorescéine. 34. Produit chimioréciproque du produit selon la revendication 32. 35. Produit salon la revendication 32 caractérisé en ce qu' ils sont complexés avec des supports. 36. Produit selon la revendication 35 caractérisés en ce qu'ils sont compléxés avec leurs chimioréciproques. 37. Procédé amélioré de production de malignine comprenant l'obtention de précurseur de malignine darus une culture avec fermentation de cellules cancéreuses artificiel'es, suivi de la production de fraction brute cortenant du précurseur de malignine puis de produits malignine purifiés à partir de cette fraction brute contenant la malignine, caractérisé en ce que l'on réalise la culture en fermentation des cellules cancéreuses artificielles dans des récipients de développement de grandes dimensions. 38. Procédé pour produire des récognines, caractérisé en ce qu'on extrait à l'aide d'un tampon neutre un tissu malade ou normal réalisant ainsi des ruptures rejetées du tissu afin de solubiliser des fractions de protéines, que l'on sépare de 11 extrait résultant de protéines solubilisées la fraction dont le pK est compris entre/1 et 4 et que @@@@/en un produit dont le poids moléculaire est compris entre environ 3.000 et 25.000. 39. Procédé selon la revendication 38 caractérise an ce que l'on sépare la fraction ayant un pK compris entre I et 4 en introduisant cet extrait de protéine solubilisée dans une colonne chromatographique et en éluant avec des solvants à acidité croissante. 40. Procédé selon la revendication 59 caractérisé en ce que l'on réalise l'isolation en filtrant l'éluat de façon à obtenir une fraction comprenant une récognine et en en séparant cette récognine par chromotographie sur ;el en couches minces. 41. Une récognine préparée selon le procédé de la revendi- cation 58, caractérisée en ce quelle forme un précipité en ligne urique avec son anti-corps spécifique dans des tests ouantitatifs de précipitine et des tests ouchterlony de diffusion sur gel, qu'elle est soluble dans l'eau et dans des solutions aqueuses ayant un pH neutre ou acide et insoluble pour un pH alcalin, qu'elle présente un pic d'absorption spectrophotométrique à la longueur d'onde de 280 mu et un poids moléculaire compris entre environ 3.000 et 25.000.