Brevet FR2325044A1 — publié le 19770415

La bilirubine est une matière colorante présente dans le sang qui est rattachée à la décomposition naturelle de globules sanguins. Son excrétion s'effectue par l'intermédiaire du foie et de la bile. Tandis que de faibles quantités de bilirubine dans le sérum sont parfaitement normales, des valeurs élevées constituent des signes d'une perturbation dans le système d'excrétion du foie et de la bile. Un procédé de décèlement de la bilirubine dans le sérum, connu depuis longtemps, est fondé sur la copulation de cette substance avec de l'acide sulfanilique diazoté.On distingue dans cette réaction la bilirubine qui peut copuler immédiatement (= bilirubine directe) de celle (= bilirubine indirecte) qui n'est capable de copulation qu'après sa mise en liberté à l'aide d'un accélérateur. Pour la plupart des problèmes de diagnostic, le dosage de la bilirubine totale est toutefois suffisante. On détermine donc l'ensemble des bilirubines directe et indirecte en effectuant le dosage en présence d'un accélérateur. Un accélérateur connu, souvent utilisé, est constitué d'une solution de caféine et de benzoate de sodium. Les dosages de bilirubine effectués jusqu'à ce jour présentent l'inconvénient que des solutions d'acide sulfanilique diazoté, préparées à l'avance, ne se conservent que pendant un bref laps de temps. I1 faut donc, avant chaque dosage, préparer une nouvelle quantité de la solution dite "solution diazolque, soit en ajoutant à une solution acidifié d'acide sulfanilique une solution de nitrite de sodium et en faisant réagir le "réactif diazotique", ainsi préparé avec le mélange de l'accélérateur du sérum, soit en commençant par former dans le tube à essai une faible quantité du réactif diazoïque par mélange de faibles quantités d'acide sulfanilique et de solution de nitrite de so- dium, et en y ajoutant ensuite le sérum et l'accélérateur.Dans chacun de ces cas, la préparation du réactif diazoïque nécessite au moins une phase opératoire (pipetage) à part. On vient de découvrir maintenant de façon surprenante qu'on peut faire l'économie d'au moins un pipetage, lorsqu'on mélange un accélérateur, c'est-à-dire une solution de caféine et de benzoate de sodium par exemple, avec l'acide sulfanilique et qu'on convertit ce mélange stable par addition d'une goutte de solution de nitrite de sodium en un réactif à réaction colorée 7 pret à l'emploi pour le dosage de la bilirubine totale. I1 suffit d'ajouter à ce réactif le sérum à essayer et la bilirubine contenue dans le sérum copule immédiatement pour former le colorant azolque correspondant. L'intensité de la coloration de l'échantillon constitue une mesure de la teneur du sérum en bilirubine. La possibilité d'utiliser le mélange susindiqué est d'autant plus surprenanteque l'addition d'acide sulfanilique au mélange accélérateur/nitrite de sodium ne conduit pas à la formation d'un réactif copulable avec la bilirubine. On peut préparer une solution de réactif selon l'invention par exemple à partir d'un mélange de 0,1 - 0,3 mole de caféine, 0,OC5 - 0,02 mole d'acide sulfanilique, 0,3 - 0,6 mole de benzoate de sodium et, si on le désire, 0,1 - 0,3 mole d'une base, de pre- démence organique, par exemple de triéthanolamine, en tant que stabilisateur ; on amène les substances mélangées} suivant les quantités indiquéesà un volume d'un litre par addition d'eau et on acidifie la solution avec un acide minéral, par exemple un hydracide halogéné, l'acide phosphorique ou l'acide nitrique, jusqu'à réaction nettement acide. La solution de nitrite qu'on ajoute peut présenter une concentration de 1 à 9 molaire. L'avantage du réactif selon l'invention et du procédé de dosage de la bilirubine au moyen de ce réactif réside dans le fait que, en dehors du pipetage du sérum, la seule opération quantitative à effectuer est celle de la mise en oeuvre d'une quantité mesurée du réactif, puisque la solution de nitrite peut être ajoutée à partir d'un Tacon compte-gouttes. Le fait que les gouttes peuvent être de volumes différents n'a qu'une influence négligeable sur le résultat. Ce procédé permet donc une économie de temps considérable et une extraordinaire augmentation de la précision. La précision est ici le triple de celle réalisable avec les méthodes de dosage antérieures. Ceci se traduit par un écart type relatif (coefficient de variation) de + 0,60 % pour le procédé selon l'invention, alors que la valeur correspondante pour les procédés habituels est comprise entre + 2,0 % et + 3,0 %. En outre,\il est possible de présenter le réactif dans de petits flacons ou cuvettes qui en contiennent une quantité déjà mesurée, de sorte que l'utilisateur n'a plus qu'à ajouter une goutte de la solution de nitrite à introduire à la pipette le sérum à analyser. L'utilisation de ce réactif dans des appareils d'analyse automatiques permet également une simplification considérable du dispositif nécessaire pour le dosage de la bilirubine. La courbe d'étalonnage présente une allure rectiligne jusqu'à des taux supérieurs à 20 mg de bilirubine/1oo ml de sérum. L'exemple suivant décrit l'invention de façon plus détaillée. Exemple: - On prépare un réactif pour le dosage 1 de la bilirubine selon l'invention en dissolvant dans de l'eau 0,2 mole de caféine, 0,014 mole d'acide sulfanilique, 0,42 mole de benzoate de sodium et 0,175 mole de triéthanolamine, en amenant la solution au volume d'un litre et en ajoutant 0,25 mole d'acide chlorhydrique. D'un autre côté, on prépare une solution aqueuse de nitrite de sodium 8,7 molaire. On effectue l'analyse en opérant de la façon suivante On mélange 2,0 ml de réactif pour le dosage~ de la bilirubine avec 1 goutte (0,05 mi) de solution de nitrite de sodium et on ajoute 0,2 ml de sérum exactement mesuré. On prépare un échantillon témoin du sérum, destiné à l'élimination de l'influence de la couleur propre et d'une éventuelle turbidité du sérum, en mélangeant 2,0 ml du réactif selon l'invention avec 0,2 ml de sérum, mais sans ajouter de solution de nitrite de sodium. On effectue la mesure sur l'échantillon, comparativement à l'échantillon témoin, dans un photomètre à Hg 546, 3 minutes après addition du sérum. On calcule la teneur en bilirubine en multipliant l'extinction mesurée par le facteur 13,2, déterminé expérimentalement. Le résultat représente le taux de bilirubine exprimé en mg/4OO ml de sérum. Exemple de calcul : Extinction mesurée : 0,128 Taux de bilirubine : 0,128 x 13,2 = 1,69 mg/ 100 ml de sérum. Comme il va de soi et comme il résulte d t ailleurs déjà de ce qui précéde,ltinvention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation quiont plus spécialement été envisagés; elle embrasse, au contraire, toutes les variantes. REVENDICATIONS 1.Procédé de dosage de la teneur des humeurs de l'organisme en bilirubine totale, effectué de façon en =i oDn o parcopulation de la bilirubine avec de l'acide sulfanilique en présence d'un accé aérateur, lequel procédé est caractérisé par le fait qu'on utilise comme réactif un mélange constitué de l'accélérateur et d'acide sulfanilique et activé par addition d'une goutte d'une solution aqueuse d'un nitrite. 2.Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on utilise, comme accélérateur, une solution de caféine et de benzoate de sodium. 3.Procédé selon la revendication l, caractérisé par le fait qu'on utilise une solution de nitrite de sodium 1 - 9 molaire. 4.Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait qu'on ajoute au réactif un stabilisateur. 5.Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait qu'on utilise, comme stabilisateur, une base organique, de préférence la tri éthanol amine 6.Réactif pour le dosage de la teneur en bilirubine totale des humeurs, lequel réactif est constitué d'une solution aqueuse acide d'un mélange d'un accélérateur avec de l'acide sulfanilique. 7.Réactif selon la revendication 6, caractérisé par le fait que l'accélérateur est constitué d'un mélange de caféine et de benzoate de sodium. 8.Réactif selon la revendication 6, caractérisé par l'addition d'un stabilisateur.