Brevet FR2334955A1 — publié le 19770708

La gresente invention cencerne le titrage enzyma @@qu@ de l'éthanol, en particulier dans des liquides corporels tels qu@ la salive, le sérum et l'urine, titrage dans lequel @n seul composé chimique joue la double rôle d'un tampon et d'un agent de fixation par lequel l'un des produits de la réaction imp@@quée est éliminé. Une méthode intéressante de dosage de la teneur en @@hanol d@ liquiles, en particulier de liquides corporels@ lorsqu'on l'utilise comme un test d'absorption récente d'alcool, est basée sur la réaction enzymatique dans laquelle l'éthanol est @ransformé @n acétaldéhyde par @'action de l'alcool-déshydrogé nas@ @uivant un @@@@@@ssus dans lequel le nicotinamide-adénine di@@@@éstide (NAD) joue @e rôle d'un coenzyme qui prend à son te@@ sa forme @réduite (DADH).On détermine l'évolution et le dagré de la réaction par colorimétrie en lumière ultiaviolette à 340 n@@omètres, longueur d'onde à laquelle le composé NAD @'absorbe pas la lumière ultraviolette, tand@s que la forme NADH absorbe cette lumière. Pour que la réaction soit utilisée dans un titrage pratique, il est nécessaire qu'elle soit complète et, naturellement, cela n'est pas assuré par la présence de l'enzyme et du @oenzyme seuls. Au contraire, il est nécessaire de séquestrer ou de fixer d'une certaine façon l'un des produits de réaction, et il s'agit presque toujours de l'acétaldéhyde. De même, comme c'est le c@s de la plupart des réactions enzymatiques, la présence d'un tampon est nécessaire pour assurer le maintien du pH dans @a gamme optimale pour la réaction enzymatique particulière dont il est question. Un agent de fixation qui a été trouvé convenable est l'aci@e amino-oxyacétique décrit conjointement avec une méthode de titrage de l'éthanol dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 493 467 et dans un article publié par Jones, Gerber et Drell dans la rev@e "Clinical Chemistry" 16 402-407 (1970). Postérieurement à la parution de l'article que l'on vient de mentionner, on a constaté que l'acide amino-oxyacétique subissait manifestement und réaction avec le composé NAD, entraî nant des variations sans ordre de l'absorption du blanc. Get inconvénient a fait l'objet d'un article publié dans "Clinical Chemistry" li [5] 458-460 (1971).On vient de découvrir que deux composés étroitement apparentés, de même que leurs mélanges en toutes proportions, fournissent non seulement la capacité requise de tampon pour un mélange de titrage basé sur la réaction enzymatique définie ci-dessus, mais permettent aussi 11 élimina- tion totale de l'acide amino-oxyacétique, ces composés ou leurs mélanges jouant de façon très surprenante le rôle d'un agent de fixation de l'acétaldéhyde produit par la réaction. L'élimination de l'acide amino-oxyacétique donne un mélange stable de titrage dans lequel l'absorption du blanc est sensiblement constante et prévisible et elle permet également de simplifier con sidérablement la formulation dudit mélange, attendu qu'une seule et même substance assume maintenant deux fonctions séparées. les deux composés sont le 2-amino-2-hydroxyméthyl1,3-propanediol et le 2-amino-2-méthyl-1,3-propanediol. le premier de ces deux composés est appelé communément "Trosamino" ; on peut aussi le nommer tris(hydroxyméthyl)aminométhane. Il est mentionné dans "Merok Index", 8ème édition 1968, page 1083, sous le nom "générique" de trométhamine. Le second composé en question est mentionné à la page 57 du "Merck Index" sous le nom donné ci-dessus, correspondant à la nomenclature de Genèse. Ces deux composés, qui ne diffèrent que par un radical hydroxyle comme on peut le constater, donnent en solution aqueuse diluée un pH légèrement supérieur à 10.Lorsqu'on les neutralise partiellement avec un acide tel que l'acide chlorhydrique jusqu'à un pH compris dans la gamme générale de 8,9 à 9,2, ils se comportent comme des tampons ayant une bonne capacité, et ils déploient de même lteffet fixateur qui a déjà été mentionné. On peut utiliser l'un quelconque des procédés classiques auxquels on a recours en pratique pour mettre en présence les composants individuels de manière à former la composition de l'invention. Par exemple, tous les composants peuvent autre dissous dans un solvant unique qui peut commodément consister en eau, et la solution peut ensuite autre lyophilisée puis broyée ou tami sée de manière à donner une poudre. A titre de variante, les composants peuvent être mélangés intimement les uns avec les autres à lrétat sec, et il est alors commode d'utiliser un broyeur à billes. On obtient ainsi une composition homogène sous la forme d'une poudre fine. De plus, on peut améliorer la stabilité de la composition en la préparant en deux parties.L'une des parties peut renfermer avantageusement le NAD, les autres composants se trouvant dans la seconde partie Pour effectuer le titrages on dissout dans l'eau en agitant des quantités prédéterminées de chacune des parties. le liquide à titrer pour déterminer la teneur en éthanol est ajouté en quantité (volume) prédéterminée et l'absorption de la solution est déterminée avant et après l'incubation dans des conditions choisies, par exemple pendant 8 à 10 minutes à 3000. On effectue un blanc de la manière usuelle de maniere à pouvoir apporter automatiquement la correction qui convient La conduite de la méthode réelle d'absorption suit l'ordre usuel et il n'est pas nécessaire d'en donner une description détaillée Un protocole représentatif que l'on recommande est donne dans l'article précité de Jones et collaborateurs (1970) et dans le brevet des Etats-Unis dXAmérique N 3 493 467 précité ; on pourra consulter cet article et ce brevet. Naturellement, lorsque les composants ne sont pas présentés en deux portions mais en un mélange unique, une quantité prédéterminée de ce mélange est dissoute dans l'eau et le titrage est effectué comme déjà décrit. On donne, ci-après quelques exemples pratiques. Exemple 1 On prépare un mélange sec des ingrédients suivants 2-amino-2-hydroxyméthyl-1,3- propanediol - 842 mg acide succinique 104 mg 'sel tétrasodique d-'acide éthylène-diamine-tétracétique 26 mg licool-déshydrogénase 216 U.I.* 17,2 mg * unités internationnales 'les ingrédients mentionnés ci-dessus sont tout d'abord déshydratés séparément par dessiccation à la température ambiante, avantageusement sur du pentoxyde de phosphore, puis ils sont mélangés à sec pour former la composition de l'invention. En pratique, on ajoute 13,5 ml d'eau et on laisse la composition se dissoudre.Pour la conduite du titrage, on dilue une quantité convenable de liquide corporel, par exemple 0,1 ml de sérum, de salive, etc., avec 4,9 ml d'eau ou, le cas échéant, de solution saline isotonique (solution aqueuse à 0,9 % de chlorure de sodium). On mélange 'cette dilution avec la solution titrante en proportion de 0,1 ml de dilution (sérum ou autre liquide) et de 2,6 ml de solution titrante. Il convient d'effetuer parallèlement à cette préparation un essai à blanc dans lequel on ajoute 0,1 ml de la solution saline seule à 2,6 ml de la solution titrante.Ces opérations sont avantageusement effectuées en introduisant les solutions' dans une petite cuve conçue pour des mesures photométriques. les deux petites cuves sont maintenues à 300C pendant 8 à 10 minutes, puis l'absorption ultraviolette des deux cuves est déterminée à 340 nm. La quantité dialcool présente dans le liquide corporel peut être calculée aisément par tout opérateur expérimenté et, en fait, l'appareil particulier qué l'on utilise peut avantageusement entre étalonné par .l1exécu- tion d'une série d'essais conduits en utilisant de l'alcool dilué à diverses concentrations. Exemple 2 On utilise la composition et les modes opératoires de l'exemple 1, à la différence que l'on remplace les 842 mg de 2-amino-2-hydroxyméthyl-1,3-propanediol par 733 mg de 2-amino2-méthyl-1,3-propanediol. Exemple 3. On utilise la composition et les modes opératoires de l'exemple 1, mais on remplace les 842 mg de 2-amino-2-hydroxyméthyl-1,3-propanediol par 421 mg de 2-amino-2-hydroxyméthyl1,3-proanediol en association avec 369 mg de 2-amino-2-méthyl1,3-propanediol. exemple 4 On utilise la composition et les modes opératoires de exemple 1, de la manière indiquée, à la différence que l'on omet le sel tétrasodique de l'acide éthylène-diamine-tétracéti- que Exemple 5 On utilise la composition et les modes opératoires de ltexemple 2, à la différence que l'on omet le sel tétrasodique de 11 acide ethylène-diamine-tétracétique. Exemple 6 On utilise la composition et les modes opératoires de l'exemple 3, à la différence que l'on omet le sel tétrasodique de l'acide éthylène-diamine-tétracétique. Exemple 7 On prépare la composition de l'exemple 1 et on la dissout dans 13,5 ml d'eau distillée. On lyophilise ensuite la solution pour obtenir un mélange anhydre homogène que l'on utilise pour la conduite du titrage décrit dans l'exemple 1. Exemple 8 On suit le mode opératoire de l'exemple 7, à la différence que l'on utilise la composition de l'exemple 4 au lieu de la composition de l'exemple 1. Sn ce qui concerne les proportions de divers composants, des quantités représentatives ont été données aans les exemples qui précèdent. Il est pratique de considérer les quantités nécessaires pour un seul titrage, pour lequel on peut admettre, à titre'd'exemple, un volume de 2,6 mi de solution titrante par essai, comme indiqué dans l'exemple 1. Tes quantités illustrées dans l'exemple 1 sont suffisantes pour cinq titrages, comme le font apparattre les détails donnés ci-après. Ainsi, on préfère utiliser les quantités suivantes, par lot de composants anhydres pour cinq essais 1) agent tampon et de fixation 6,99 milli moles 2) acide - quantité suffisante pour ajuster le pH à 8,8-9,2 3) alcool-déshydrogénase 200 - 220 U.I. 4) NAD 16 - 18 mg 5) agent de séquestration des métaux lourds 10 - 50 mg Il est évident que lorsque la composition varie dans les limites indiquées ci-dessus, la solution titrante doit entre étalonnée par l'utilisation d'une quantité connue d'alcool dilué. En tout cas, pour obtenir une fixation efficace de ltacétaldéhyde produit pendant la réaction enzymatique, 11 agent tampon et de fixation doit entre présent dans la solution mixte de titrage à une concentration d'au moins 0,3 M. Un excès n'est pas gênant, mais sa présence représente naturellement un gaspillage. Une concentration de trois moles représente une limite supérieure pratique, bien que cette concentration puisse même entre dépassée sans affecter le titrage conforme à l'invention. Comme on l'a mentionné, les deux types d'agent tampon et de fixation utilisés conformément à la présente invention ont une alcalinité naturelle légèrement supérieure au pH optimal de la réaction enzymatique impliquée, en sorte que l'on introduit un acide aans la composition de l'invention. lorsque cette composition est préparée en mélangeant ensemble des ingrédients secs, il est désirable d'ajouter un acide solide, notamment un acide qui ne renferme pas d'eau de cristallisation dans sa molécule. L'acide succinique convient bien à cette fin et ctest généralement celui que l'on trouve le plus avantageux. L'acide tartrique sous l'une quelconque de ses formes isomères peut aussi être utilisé de même que d'autres acides solides tels que l'acide fumarique, l'acide gluconique, l'acide citrique, l'acide malique, etc. lorsque la composition titrante est préparée par une dissolution préliminaire puis lyophilisée, on peut utiliser les acides mentionnés ci-dessus de même que des acides non solides tels que les acides chlorhydrique, sulfurique, phosphorique, etc. les proportions d'acide et d'agent tampon et de fixation sont choisies de manière que le pH soit compris dans la gamme mentionnée ci-dessus lorsque le mélange solide de titrage est dissous dans l'eau dans une proportion choisie de manitre que la molarité soit au moins égale à 0,3 en ce qui concerne l'agent tampon et de fixation.Il va sans dire que la proportion en poids varie en fonction de l'acide particulier ou du mélange d'acides que l'on choisit; Une proportion représentative en poids est donnée dans les exemples. Il est préférable de choisir des composants qui sont entièrement exempts de toùte contamination par des ions de métaux lourds. Il est parfois difficile de trouver des sources commerciales d'agents tampons et de fixation de pureté suffisante aux fins de l'invention bien que, naturellement, ces agents puissent être purifiés en vue de leur utilisation dans la méthode. de l'in- vention. Par conséquent, par mesure de précaution, il est prati-. que d'incorporer un agent de séquestration des métaux lourds à la composition de l'invention, même si l'on suppose que les composants individuels sont suffisamment purs. En effet, cette pré-, caution est en tout cas efficace contre- les ions nickel, chrome ou fer qui pourraient autre introduits par inadvertance au cas où l'opérateur utilise de l'eau qui à été en contact avec de ltacier-inoxydable. L'agent de séquestration des métaux lourds que l'on préfère utiliser est l'acide éthylène-diamine-tétracétique qui peut être ajouté sous la forme acide ou sous la forme dé ses sels de sodium.La quantité utilisée est toujours faible, en sorte que la forme utilisée d'acide ou de sel n'est pas dé- - terminante, notamment attendu que toute acidité venant de ce corps ést automatiquement compensée au moment où l1an détermine la quantité de l'acide choisi qui est nécessaire pour ajuster le pH dans la gamme 'indiquée. On peut utiliser de nombreux autres agents de séquestration des métaux lourds,-par exemple l'acide diéthylène-triamine-penta-acétique ; la 8-hydroxy,quinoléine ; l'orthophénanthroline ; le bipyridyle ; ainsi que de nombreux autres composés connus des spécialistes en matière de chimie de coordination.L'agent séquestrant peut être utilisé par exemple en quantités d'environ 1 à 5 parties par 100 parties agent tampon et de fixation. La méthode et la composition de, titrage décrites dans le présent mémoire peuvent être utilisées dans des domaines qui diffèrent beaucoup de la chimie-méd-icale. Par exemple, il est souvent désirable dans des procédés industriels de pouvoir déter miner la teneur en éthanol de divers liquides de traitement, par exemple des liqueurs usées de distilleraie, ainsi que dans la récupération et le traitement d'eau susceptible d'une pollution par fermentation, comme il peut s'en produire dans des rivières et des estuaires qui reçoivent divers résidus industriels. Cette technique peut donc autre une opération de fabrication. Il va de soi que de la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de'nombreuses modifications, concernant notamment le choix des ingrédients, des proportions, des conditions réactionnelles, etc. peuvent y entre apportées sans sortir de son cadre. REVENDICADIONS 1. Nouvelle composition destinée à être utilisée comme réactif dans la détermination de la teneur en éthanol de liquides corporels, caractérisée par le fait qutelle contient a) l'enzyme alcool-déshydrogénase b) le coenzyme nicotinamide-adénine-dinucléotide c) un agent tampon de fixation de l'acétaldéhyde choisi entre le 2-amino-2-hydroxyméthyl-1,3. propane-diol, le 2-amino-2-méthyl-1 ,3-propane- diol et leurs mélanges d) un acide en quantité suffisante pour abaisser le pH d'une solution aqueuse dudit mélange à une valeur comprise entre environ 8,8 et 9,2 ; ledit mélange étant exempt de tout autre agent de fixation de ltacétal- déhyde. 2. Composition suivant la revendication 1, caractérisée par le fait qutelle est sous la forme de deux portions dont l'une contient le coenzyme et 11 autre contient le reste des ingrédients mentionnés. 3. Composition suivant la revendication 1, caractérisée par le fait qu'elle contient un agent de séquestration des métaux lourds. 4. Composition suivant la revendication 3, caractérisée par le fait que l'agent séquestrant est l'acide éthylène diamine-tétracétique ou un sel de sodium de cet acide. 5. solution titrante destinée à entre utilise'e dans la détermination de la teneur en éthanol de liquides corporels, caractérisée par le fait qu'elle est essentiellement constituée par la composition suivant la revendication 1 dissoute dans un volume d'eau suffisant pour que la concentration de l'agent tampon de fixation de l'acétaldéhyde soit d'au moins 0,3 M. 6. Composition suivant la revendication 1, caractérisée par le fait qu'elle contient pour chaque portion de 6,99 millimoles d'agent tampon de fixation de lacétaldéhyde, 16 à 18 mg de NAD et 200 à 220 unités internationnales d'alcooldéshydrogénase. 7. Solution titrante destinée à être utilisée pour la détermination de la teneur en éthanol de liquides corporels, caractérisée par le fait qu'elle est essentiellement constituée par la composition suivant la revendication 6 dissoute dans un volume d'eau suffisant pour que la concentration en agent tampon de fixation de l'acétaldéhyde soit d'au moins environ 0,3 M.