Brevet FR2324005A1 — publié le 19770408

La présente invention concerne des procédés utilisant une enzyme protéolytique pour effectuer la digestion des protéines sériques de liaison. On a sis au point diverses déterminations in vitro pour mesurer l'activité de la thyroTde. Une des premières tentatives de mesure de la thyroxine sérique totale en utilisant le principe de la liaison compétitive avec des protéines est apparue en 1960 où R.P. Ekins a décrit dans Clin. Chem. Acta., 5:453, 1960, un procédé qu'il appelle "analyse par saturation Dans ce procédé, Ekins extrait la thyroxine de l'échantillon de sérum par précipitation par le butynol. En utilisant des techniques d'électrophorèse il mesure le déplacement de la thyroxine de la globuline à l'albumine, provoqué par l'addition de thyroxine marquée. Murphy, dans Nature, 201:679, 1964 et Murphy et Patee, dans J. Clin. Endo. Metab., 24:187, 1964 ont ensuite décrit un procédé plus rapide et plus simple pour mesurer la thyroxine sérique totale reposant sur le même principe, qu'ils ont appelé "analyse par liaison umpétitve avec des protéines".On sépare la thyroxine du sérum par une simple extraction à l'éthanol et on évalue la teneur en thyroxine à partir de son effet sur le passage d'une thyroxine standard marquée en solution dans le plasma, à travers une colonne de filtration sur gel. On a ensuite remplacé le stade de filtration sur gel par l'emploi d'une résine échangeuse d'anions faible dans un tube. Cas néthodes de détermination nécessitent un procédé rapide et reproductible de séparation de la thyroxine liée à la globuline (TBG), de la thyroxine non liée, apres qu'on a atteint l'équilibre dans les conditions de détermination.Les brevets des Etats-Unis d'Amérique n 3 206 602 et 3 378 114 décrivent un procédé et un appareil de détermination utilisant une résine-éponge qui présentent des avantages Far rapport aux autres dis posl tifs plus compliqués de séparation de la thyroxine liée de la thyroxine libre. Ces résines-éponges sont constituées d'une résine échangeuse d'ions finement divisée, dispersée dans une éponge, si bien que la thyroxine libre est fixée rapidement et quantitativement à la résine-éponge, tandis que la thyroxine liée à la TBG ne l'est pas. Comme il n'existe qu'une petite quantité de globuline fixant la thyroxine dans le sérum, on peut facilement saturer les sites de liaison en ajoutant de petites quantités de thyroxine. Si on ajoute comme marqueur une petite quantité de thyroxine marquée à l'iodle 125, on peut déterminer la fraction de thyroxine liée aux protéines. Plus on rajoute de thyroxine standard non marquée plus la quantité de thyroxine fixée marquée au 125I diminue, car la thyroxine marquée et la thyroxine no.l marquée cintrent en compétition vis-à-vis des mêmes sites de liaison. Lorsque l'équilibre est atteint dans la technique utilisant a rés-ne-éponge, or sépare la thyroxine liée à la TBG, de la thyroxine non liée.Les résultats obtenus pernettent d'établir une courbe standard. Si, au lieu de la thyroxine standard pure; on ajoute un échantillon de sérum, on peut déterminer la quantité de thyroxine qu'il renferme à partir de la libération de thyroxine marquée liée qu'il provoque, par rapport à une courbe standard. Par conséquent, un tel procédé de détermination de la thyroxine sérique totale repose sur la compétition in vitro entre la thyroxine et la thyroxine marquée au 1251 dans la fixation aux sites de la TBG. La résine éponge se comporte comme un site de liaison secondaire de la thyroxine non liée. Le procédé utilisant la résine-éponge permet de mesurer la quantité de thyroxine qui se fixe des façon irréversible à la résine-éponge. Cette quantité dépend de la constante de dissociation de la liaison de la thyroxine avec les protéines sériques, du nombre de sites de liaison sur les protéines, du pR, de la température et de la durée d'incubation dans les conditions de la détermination. On utilise généralement l'éthanol dans la technique d'analyse par liaison compétitive aux protéines pour libérer la thyroxine liée des protéines sériques et lui permettre de participer à la liaison compétitive. Une méthode de détermination bien connue utilisant de l'éthanol pour l'extraction de la thyroxine est décrite par B.P. Murphy et C. Jachan, dans J. Lab. & Clin. Med. 66, 161, 1965, dans un article intitulé "THE DETERMINATION OF THYROXINE BY COMPETITIVE BINDING ANALYSIS EMPLOYING AN ANION-EXCHANGE RESIN AND RADIOTHYROXIN". La durée d'extraction nécessaire à la libération de la thyroxine liée, lorsqu'on utilise l'éthanol, est comprise entre 15 et 45 mn et nécessite 3 à 4 stades pour lu on obtienne un rendement d'extraction de 77 /0. De façon générale, les solvants organiques provoquent une précipitation des protéines mais nécessitent une évaporation et leur emploi présente les mimes inconvénients que les techniques d'extraction à l'alcool couramment utilisées.On recherche donc un procédé d'extraction de la thyroxine plus simple et plus rapide, car la détermination de la thyroxine sérique totale est devenue un des essais in vitro principaux pour l'évaluation de la fonction de la thyroïde et est devenue très répandue. Un produit d'extraction idéal de la thyroxine sérique totale est un milieu aqueux extrayant la thyroxine en détruisant ou en dénaturant de façon irréversible les protéines servant de support à la thyroxine. Le produit d'extraction ne doit pas interférer avec le réactif TBG qu'on ajoute apres le stade d'extraction. L'invention concerne donc l'utilisation d'une enzyme protéolytique pour effectuer la digestion des protéines sériques de liaison et libérer ainsi les molécules non protéiques. L'extraction enzymatique s 1applique en particulier à des déterminations où il est nécessaire de libérer des hormones et des médicaments, par exemple des protéines de support. On peut utiliser la digestion enzymatique, par exemple pour libérer la vitamine B-12 du facteur intrinsèque et, de façon générale, les stérotdes de leurs protéines de liaison.On peut utiliser comme produits d'extraction enzymatique des enzymes protéolytiques telles que les aminopeptidases, les protéases bactériennes, les carboxypeptidases, la chymotrypsine, la ficine, la papatne, la pepsine, la prolidase, la rénine, la subtilysine et la trypsine, séparément ou en combinaison avec d'autres réactifs. Bien que le principe de l'extraction enzymatique s'applique de façon générale a diverses déterminations effectuées sur le sérum, pour faciliter sa compréhension, eLle est décrite ci-après relativement a un procédé de détermination de la thyroxine sérique et de la triiodothyronine (5). Les méthodes de détermination les plus courantes de la thyroxine sérique nécessitent un stade d1extraction pour libérer la thyroxine de la TBG. On effectue actuellement l'extraction en utilisant un solvant organique tel qu'un alcool. L'extraction au solvant necessite des stades longs de centrifugation et/ou d'dvaporation. Dans le procédé de l'invention, on utilise une enzyme protéolytique pour effectuer la digestion des protéines sériques, ce qui provoque l'extraction de la thyroxine liée aux protéines Après la digestion, on inhibe l'enzyme qui ne risque donc plus d'altérer les réactifs protéiques qu'on ajoute ensuite. Comme on effectue l'extraction sans aucune précipitation et qu'on opère en milieu aqueux, la centrifugation et l'évaporation sont inutiles. L'enzyme supprime totalement et de façon irréversible la propriété que possèdent les protéines sériques de fixer la thyroxine. Après l'extraction de la thyroxine, on inhibe instantanément l'activité enzymatique en modifiant le pH du milieu ou en utilisant des inhibiteurs d'enzymes qu'on incorpore aux autres agents nécessaires a la détermination de la thyroxine. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris a la lecture de la description qui va suivre et en se référant a la figure unique annexée qui représente une courbe standard obtenue selon le procédé de l'invention. L'invention va être décrite en ce qui concerne l'utilisation de la pepsine comme produit d'extraetion de la thyroxine dans un dosage de la thyroxine, bien qu'on puisse utiliser d'autres enzymes pour effectuer l'extraction protéique dans ce dosage ou dans des déterminations d'autres types. La pepsine est une endopeptidase qui catalyse l'hydrolyse des liaisons peptidiques avec une spécificité réduite vis-a-vis des chaînes latérales. Elle constitue l'enzyme protéolytique principale du suc gastrique des vertébres. A un pH supérieur à 6, la pepsine est dénaturée très rapidement et de façon irréversible. Cette dénaturation est due a la destruction de liaisons hydrogène indispensables au maintien de la structure. Cette propriété de la pepsine empêche qulelle ne provoque une altération quelconque du réactif TBG comme décrit ci-après.Dans la détermination décrite, le réactif TBG est dans du tampon barbital pH 8,6 qui neutralise le mélange réactionnel à pH 7,5, si bien que la pepsine est dénaturée immédiatement après l'addition de la TBG; La détermination de la thyroxine selon l'invention est une détermination par fixation compétitive a une protéine semblable aux procédés connus et dans laquelle on utilise une solution acide de pepsine pour extraire la thyroxine de la TBG. De préférence, on fait digérer 0,1 ml de sérum avec 0,3 ml d'une solution-acide de pepsine pendant 10 à 25 mn au voisinage de la température ordinaire.On ajoute ensuite 1,0 ml de réactif TBG-thyroxine 1251 (qu'on appelle réactif TBG) et, après incubation, on sépare la thyroxine libre de la thyroxine liée aux protéines en utilisant des éponges servant de sites secondaires de liaison, ces éponges pouvant ou non renfermer en dispersion une résine échangeuse d'ions. On prépare une courbe standard à partir de sérum étalon pour déterminer a partir des fixations de la radioactivité sur l'éponge la concentration en thyroxine de l'échantillon de sérum. On prépare une solution de pepsine d'estomac de porc ayant subi une double cristallisation, dans de l'acide chlorhydrique 0,14N. On détermine la concentration de la pepsine dans la solution par son absorbance a 280 nm et son coefficient d'extinction. On détermine l'efficacité d'extraction de la solution de pepsine en utilisant 0,1 ml de sérum renfermant de la thyroxine marquée au 1251. On utilise le mode opératoire précédemment décrit, Si ce n'est qu'on remplace le réactif TBG par 1,0 ml de tampon barbital (0,09 M ; pH 8,6). On mesure l'importance de la dégradation des protéines sériques par l'accrois sement de l'absorbance d'une solution d'acide trichloroacétique a 5,0 X. On mesure l'absorbance initiale a 280 nm de 0,4 ml de sérum avant d'effectuer la digestion avec 1,2 ml de solution de pepsine dans l'acide chlorhydrique pendant 15 mn a la température ordinaire, puis on ajoute 4,0 ml d'acide trichloroacétique a 5 7 pour arrêter la réaction et on filtre le mélange après 5 mn. On mesure l'ansorbance du filtrat å 280 nm en utilisanc un blanc préparé en méiangeant 0,4 ml de sérum a 4,0 ml d'acide trichloroacétique avant l'addition de la pepsine. Le pourcentage de l'absorbance initiale solubilisé dans l'acide trichloroacétique correspond au pourcentage de digestion des protéines sériques. On détermine le point zéro de la TBG en incubant des mélanges de 0,1 ml de TBG pendart 10 mn à la température ordinaire, puis en ajoutant une éponge sans résine et en incubant pendant 30 mn. On détermine le pourcentage de radioactivité demeurant dans les éponges lavées. On détermine l'efficacité d'extraction de la pepsine sur différents types de sérums pour des grotl?es de 10 a 60 sérums de chaque type.Les résultats moyens sont les suivants : sérum standard = 96,4 %, sérum normal = 97,9 X, grossesse = 91,5 Z, régulation de l'ovulation = 97,1 Z, hyperthyrotdie = 92,67, hypotbyrotdie = 96,. Z. Murphy et Jachan, dans J. Lab & Clin. Med., 66 161, 1965, indiquent une efficacité d'extraction de 77 Z lorsqu'on utilise l'éthanol pour extraire la thyroxine de la TBG. On détermine la concentration de la thyroxine d'ur. échantil- lon de sérum en effectuant la digestion de 0,1 ml de sérum avec 0,3 ml de combinaison de pepsine et d'acide chlorhydrique (4 mg/ml selon l'absorbance à 280 nm) pendant 10 à 25 mn à la température ordinaire. Ensuite, on ajoute 1,0 ml de réactif TBG-125I-thyroxine et on mélange. Pour les éponges renfermant une résine échangeuse d'ions, on refroidit le mélange réactionnel au bain-marie glacé pendant 5 mn avant d'ajouter les éponges. Pour les éponges sans résine, on supprime ce stade et on ajoute les éponges après le réactif TBG.On incube les deux types d'éponges pendant 30 a 55 mn, de préférence pendant 5 mn, soit à 0 C pour les éponges renfermant une résine échangeuse d'ions en dispersion, soit à la température ordinaire pour les éponges sans résine. On mesure, pendant le stade d'incubation de l'éponge, la radioactivité initiale de l'ensemble épongej échantillon de sérum et réactif. Après incubation et lavage de l'éponge a l'eau distilée, on mesure la radioactivité résiduelle de l'éponge pour déterminer la fixation par l'éponge. On effectue les mesures de la radioactivité avec un compteur à scintillations 7 approprié.On traite de façon semblable des sérums étalons renfermant des quantités connues de thyroxine pour établir une courbe standard telle que celle de la figure annexée, où la fixation de la radioactivité par l'éponges exprimée en pourcentage, est représentée en ordonnées et la concentration en thyroxine (mg =/6) est représentée en abscisses. Dans tous les cas, on calcule le pourcentage de fixation de la radioactivité par l'éponge de la façon suivante radioactivité résiduelle (coup/mn) Pourcentage de fixation par l'éponge = radioactivité initiale (coup/mn) x 100 Le tableau I ci-après montre les résusltats d'une étude comparative de la détermination précédemment décrite de la thyroxine avec une solution acide de pepsine comme produit d'extraction et du procédé décrit par Murphy et Jachan qui utilise l'éthanol comme produit d'extraction. Comme on le voit, la correspondance entre le procédé de l'invention et la méthode bien connue de Murphy et Jachan est excel-lente. Le procédé de l'invention permet de différencier nettement les cinq catégories de sérums. Les valeurs de la thyroxine obtenues selon le procédé de l'invention et la méthode de Murphy et Jachan, pour cinq catégories de sérums, sont résumées dans les tableaux II à VI ci-après. La concordance entre les deux méthodes est excellente. Sauf pour les sérums normaux, on obtient des valeurs inférieures de la thyroxine avec les éponges sans résine par rapport aux éponges renfermant une dispersion de résine échangeuse d'ions dans le procédé de l'invention. La T3 sérique, comme la T4, est liée à la TBG. Donc, dans les déterminations radio-immunologiques de la T3, il est nécesaire d'empêcher que la TBG de l'échantillon de sérum entre en compétition avec l'anticorps vis-à-vis de l'antigène (T3). Pour cela, on peut détruire la TBG ou bloquer ses sites de fixation de la T3 avec des agents de blocage tels que l'acide anilinonaphtalènesulfonique (ANS). La détermination de la T3 selon l'invention est une détermination radio-immunologique semblable aux méthodes connues, mais dans laquelle on utilise une solution acide de pepsine pour extraire la T3 de la TBG. De préférence, on fait digérer 0,1 ml de sérum avec 0,3 ml d'une solution acide de pepsine pendant 5 a 25 mn au voisinage de la température ordinaire. On ajoute ensuite 0,5 ml d'anticorps anti-T3 et, après avoir laissé incuber pour que la réaction antigène-anticorps s'effectue, on sépare la T3 libre du complexe antigène-anticorps en utilisant des éponges servant de sites secondaires de liaison qui peuvent ou non renfermer en dispersion une résine échangeuse d'ions. On détermine la concentration en T3 des échantillons de sérum a partir de la fixation de la radioactivité par les éponges, en utilisant une courbe standard préparée à partir de sérums étalons La comparaison des résultats obtenus dans cette détermination et de ceux obtenus avec une méthode radio-immunologique utilisant 1'ANS conne agent de blocage figure dans les tableaux VII à IX ci-après. Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'entre décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. TABLEAU I Comparaison du dosage de T4 avec divers produits d'extraction. (valeur en g% de T4) Sérum N G RO HY HO Pepsine-HCl Réaine + éponge 8,7 15,6 14,3 19,1 4,1 Eponge saus 9,1 14,6 12,9 17,7 3,8 résine Alcool Méthode de Murphy et Jachan Résine + éponge 9,5 15,4 13,1 16,9 4,5 les résultats correspondent au dosage en double de 20N, 30 G, 30 RO, 20 Hy et 20 HO. N = = normal; G = grossesse; RO = régulation de l'ovulation ; = hyperthyrotdie ; HO = hypothyroïdie. TABLEAU II Pepsine Pepsine Sérum (résine + éponge) (éponge sans résine) Ethanol (1) (1) (2) Normal 1 9,2 10,1 9,4 2 10,1 9,8 10,2 3 10,3 - 10,3 10,7 4 10,7 11,0 10,7 5 10,8 11,7 11,7 6 7,1 8,2 7,5 7 6,8 7,8 8,3 8 7,5 7,6 7,8 9 10,8 11,4 11,4 10 10,3 10,4 11,2 11 7,2 8,0 7,9 12 7,9 8,2 8,2 13 7,9 7,6 8,3 14 8,9 9,5 9,7 15 8,3 8,4 8,7 16 8,9 10,0 9,9 17 9,0 9,0 11,1 18 7,0 7,5 8,3 19 6,6 6,8 7,9 20 9,0 8,6 10,4 Moyenne 8,7 9,1 9,5 (1) A partir de la courbe standard établie avec des sérums étalons. (2) Méthode de Murphy &alpha; Jachan, J. Lab. &alpha; Clin. Med., 66, 161, 1965. On dose les sérums en double. TABLEAU III Sérum (résine + épouge) (éponge sans résine) Ethanol (1) (1) (2) Grossesse 1 15,0 14,4 15,2 2 16,7 14,3 13,6 3 16,0 13,8 15,1 4 20,0 19,3 17,1 5 17,2 15,1 15,6 6 14,1 13,2 14,8 7 14,3 12,6 14,7 8 18,3 15,5 16,5 J 9 15,2 13,3 15,1 10 13,5 14,7 11 16,5 14,6 16,0 12 12,6 14,2 14,8 13 17,0 17,5 16,6 14 16,5 15,0 15,5 15 13,5 14,0 14,7 16 18,0 15,5 17,0 17 16,3 15,7 16,2 18 17,0 15,0 16,8 19 14,3 14,3 14,3 20 11,6 11,5 13,3 Moyenne 15,6 14,6 15,4 (1) A partir de la courbe standard établie avec des sérums étalons. (2) Méthode de Murphy & Jachan, J. Lab. & Clin. Med., 66, 161, 1965. TABLEAU IV Pepsine Pepsine Sérum (résine + éponge) (éponge sans résine) Ethanol (1) (1) (2) Régulation de 1 13,7 12,2 l'ovulation 2 2 14,9 13,5 14,7 3 14,6 13,5 12,2 4 16,3 13,6 11,9 5 14,5 13 > 3 13,2 6 # 14,8 14,3 12,5 7 16,6 11,5 14,9 8 13,6 13,2 13,9 9 14,2 12,0 13,5 10 13,1 12,2 12,9 11 13,8 13,1 13,5 12 15,3 14,6 15,2 13 12,9 10,3 12,5 14 11,6 11,0 11,2 15 13,4 1@,0 1@,0 16 13,5 12,6 12,5 17 # 14,9 15,0 14,3 18 13,5 11,3 12,3 19 16,3 14,3 13,6 20 12,1 10,1 10,9 Moyenne 14,3 12,9 13,1 (1) A partir de la courbe standard établie avec des sérums étalons. (2) Méthode de Murphy # Jachan, J. Lab. & Clin. Med., 66, 161, 1965. TABLEAU V Pepsine Pepsine Sérum (résine + épouge) (épongé snas résine) Ethanol (1) (1) (2) Hypothyroîdie 1 2,2 2,0 3,1 2 2,6 2,5 2,7 3 3,5 3,7 5,0 4 6,0 5,7 6,5 5 4,1 2,5 6,0 6 1,8 2,0 2,8 7 7 1 . 2,1 2,0 2,6 8 4,7 4,7 5,2 9 3,9 3,4 4,1 10 1,8 2,0 2,4 11 5,5 4,2 5,7 12 6,2 5,6 5,4 13 1,6 2,0 2,1 14 6,2 5,6 5,7 1 15 4,8 4,8 4,9 16 6,0 5,3 6,0 17 5,4 4,8 4,8 18 5,4 5,1 5,4 19 4,5 4,0 4,4 20 4,5 4,7 5,4 Moyenne 4,1 4,5 (1) A partir de la courbe standard établie avec des sérums étalons. (2) Méthode de Murphy & Jachan, J. Lab. & Clin. Med., 66, 161, 1965. TABLEAU VI Pepsine Pepsine Sérum (résine + éponge) (éponge sans résine) Ethanol - (I) (1) (2) Hyperthyroïdie 1 17,5 15,4 17,0 2 16,5 16,0 16,5 3 16,0 15,2 14,3 4 27,0 20,3 23,9 5 15,5 13,8 14,4 6 19,2 14,0 18,0 7 24,0 22,0 19,8 8 17,7 18,3 14,7 9 17,0 19,2 15,7 10 17,6 15,1 15,1 11 14,0 14,8 13,9 12 20,0 18,0 16,6 13 23,5 20 > 5 19,8 14 17,3 11,4 1 15,7 15 19,4 21,5 15,7 16 16,3 14,0 14,0 17 20,5 19,0 15,3 18 17,6 16,3 15,3 19 19,9 29,2 25,0 20 25,8 29,2 25,0 Moyenne 19,1 17,7 16,9 (1) A partir de la courbe standard établie avec des sérums étalons. (2) Méthode de Murphy & amp; Jachan, J. Lab. &alpha; Clin. Med., 66, 161, 1965. TABLEAU VII Comparaison du procédé décrit de dosage de la triiodothyronine et du procédé à 1'ANS et au charbon Euthyroïdie Procédé décrit Procédé a l'ANS et au charbon (1) 1 135 130 2 155 150 3 155 108 4 4 145 135 5 124 100 6 157 120 7 7 150 118 8 8 160 132 9 9 184 140 10 174 145 11 11 165 115 12 160 114 13 165 155 14 170 135 15 132 130 16 160 127 17 156 110 18 80 79 19 - 165 145 20 140 132 21 163 130 22 235 208 23 156 140 24 125 115 25 156 150 26 135 120 27 130 125 28 110 117 29 165 145 30 120 100 31 - 170 180 32 140 120 33 145 145 34 160 160 35 155 145 36 123 130 37 126 128 38 132 124 39 120 125 40 103 95 TABLEAU VII (suite) Euthyroîdie Procédé décrit Procédé à l'ANS et au charbon (1) 41 130 130 42 200 165 43 145 125 44 165 135 45 175 150 46 120 112 47 174 155 48 108 117 49 122 130 50 120 125 Moyenne 147 131 (1) T3 RIA Diagnostic Kit commercialisé par Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois. TABLEAU VIII Comparaison du procédé décrit de dosage de la triidothyronine et du procédé à l'ANS et au charbon Procédé à l'ANS Régulation de Procédé à l'ANS Grossasse Procédé décrit et au charbon l'ovulation Procédé décrit et au charbon 1 270 180 1 215 185 2 240 190 2 125 90 3 305 230 3 145 142 4 215 163 4 230 190 5 260 180 5 160 160 6 310 230 6 180 167 7 275 190 7 130 125 8 195 147 8 255 230 9 235 150 9 195 130 10 225 157 10 200 170 11 175 185 11 200 185 12 165 168 12 190 208 13 153 163 13 185 225 14 245 195 14 153 167 15 205 190 15 195 230 16 222 175 16 140 180 17 185 165 17 120 163 18 220 197 18 142 170 19 175 168 19 125 168 20 220 215 20 130 180 21 195 190 21 112 140 22 215 195 22 128 143 23 255 240 23 152 180 24 195 178 24 185 173 25 175 175 25 155 153 Moyenne 221 184 Moyenne 165 170 TABLEAU IX Comparaison du procédé décrit de dosage de la triidothyronine et du procédé à l'ANS et au charbon Procédé à l'ANS Procédé à l'ANS Hypothyroîdie Procédé décrit et au charbon Hyperthyroîdie Procédé décrit et au charbon 1 75 112 1 390 385 2 76 65 2 > 400 725 3 65 85 3 > 400 525 4 25 10 4 275 310 5 > 0 10 5 285 275 6 22 13 6 210 235 7 90 65 7 > 400 360 8 90 70 8 > 400 420 9 42 60 9 > 400 465 10 42 49 10 235 245 11 80 58 11 150 128 12 115 113 12 225 170 13 95 80 13 160 120 14 52 42 14 215 200 15 70 65 15 140 135 16 17 5 16 > 400 800 17 55 65 17 255 260 18 47 50 18 298 270 19 65 100 19 215 185 20 87 93 20 220 189 21 55 43 21 150 140 22 > 400 435 Moyenne 60 59 Moyenne 275 306 REVENDICATIONS 1 - Procédé de dosage d'un échantillon de sérum nécessitant l'extraction des molécules non protéiques des protéines sériques de liaison, caractérisé en ce que - on ajoute une solution acide de pepsine au sérum; - on incube le mélange de l'échantillon de sérum et de la solution de pepsine; et - on ajuste le pH du mélange de l'échantillon de sérum et de la solution de pepsine à une valeur atteignant au moins 6, pour inactiver la pepsine. 2 - Procédé pour déterminer la teneur en thyroxine d'un échantillon de sérum, caractérisé en ce qu'il consiste à a) ajouter une solution enzymatique à l'échantillon de sérum pour libérer la thyroxine de la TBG; b) incuber le mélange de l'échantillon de serum et de la solution d'extrac tion ; c) ajouter au mélange un réactif constitué de TBG-125I-thyroxine ; d) placer une matière apportant des sites secondaires de liaison en contact intime avec le mélange d'échantillon de sérum, de solution d'extraction et de réactif; e) incuber le mélange de la matière apportant des sites secondaires de liaison, de l'échantillon de sérum, de la solution d'extraction et du réactif; f) mesurer la radioactivité initiale du mélange combiné avec un dispositif de détection approprié; g) séparer la matière apportant des sites de liaison secondaires du mélange; h) laver la matière apportant des sites de liaison secondaires; et i) mesurer- la radioactivité résiduelle de cette matière. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'enzyme de la solution d'extraction enzymatique est choisie parmi les aminopeptidases, les protéases bactériennes, la carboxypeptidase, la chymotrypsine, la ficine, la papaïne, la pepsine, la prolidase, la rénine, la subtilysine et la trypsine. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'enzyme est constituée de pepsine. 5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la matière apportant des sites secondaires de liaison est constituée d'une éponge de matière plastique ne renfermant pas d'échangeur d'ions. 6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la solution dTextraction constituée de pepsine est acide, sa concentration en acide étant comprise entre 0,1 et 0 > 4N. 7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la concentration en pepsine de la solution d'extraction est comprise entre 0,25 et 6 mg/ml. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'après incubation, on ajuste le pH du mélange de l'échantillon de sérum et de la solution acide de pepsine à une valeur supérieure à 6. 9 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on incube le mélange de l'échantillon de sérum et de la solution de pepsine pendant une durée d'environ 10 à 25 mn au voisinage de la température ordinaire, et en ce qu'on incube le mélange de l'éponge, de l'échantillon de sérum, de la solution d'extraction et du réactif pendant environ 30 à 55 mn, à une température comprise entre environ 0 C et la température ordinaire. 10 - Procédé pour déterminer la teneur en triiodothyronine d'un échantillon de sérum, caractérisé en ce qu'il consiste à a) ajouter une solution enzymatique à l'échantillon de sérum pour libérer la triiodothyronine de la TBG; b) incuber le mélange de l'échantillon de sérum et de la solution d'extraction; c) ajouter au mélange un réactif constitué d'anticorps antitriodothyronine-125I triiodothyronine; d) placer une matière apportant des sites secondaires de liaison en contact intime avec le mélange de l'échantillon de sérum, de la solution d'extrac tion et du réactif; e) incuber le mélange de la matière apportant des sites secondaires de liaison, de l'échantillon de sérum, de la solution d'extraction et du réactif; f) mesurer la radioactivité initiale du mélange combiné avec un dispositif de detection approprié; g) séparer la matière apportant des sites secondaires de liaison du mélange; h) laver la matière apportant des sites secondaires de liaison; et i) mesurer la radioactivité résiduelle de cette matière.