Brevet FR2340689A1 — publié le 19770909

La présente invention a pour objet un procédé d'obtention d'un concentré de protéines à partir d'un mélange de mélasses de betteraves sucrières et de dattes. L'une des principales difficultés d'obtention d'un concentré de protéines réside dans la sensibilité de la levure à la concentration élevée des sucres dans un substrat d'hydrates de carbone, analogue à l'effet Crabtree. I1 est bien connu qu'une concentration élevée en sucre dans le milieu a pour effet de réduire les voies métaboliques respiratoires en aérobiose, ce qui a pour conséquence une diminution de la production de masse biologique et une perte notable en sucre et en carbone pour la production d'éthanol. Ces déplacements métaboliques dans la levure ont pour cause la diminution de l'oxygène dans une culture qui se développe dans un milieu à forte concentration en sucre. La diminution de ltoxygène, jointe à une forte concentration en sucre dans le milieu a une influence non seulement sur le métabolisme de la levure mais également sur la morphologie cellulaire. En particulier, les mitochondries sont considérablement réduites à des structures de promitochondries et il en résulte que de nombreuses protéines de structure et enzymes diminuent en quantité ou changent de nature. Les mélasses contiennent également des substances qui risquent d'entre toxiques ou inhibitrices, surtout lorsque l'on utilise des mélasses très concentrées comme milieu de propagation de la levure. L'extraction de ces composés contribue à augmenter le rendement du procédé de fermentation et la qualité du produit. Les procédés de la techmlique antérieure avaient l'in- convénient de ne permettre l'utilisation que d'une faible concentration en sucre ce qui entraînait un rendement global en masse biologique faible car l'augmentation de la concentration en sucre avait en général pour conséquence une perte appréciable du substrat carboné pour la production d'éthanol et un taux de développement de la levure faible. La présente invention a précisément pour objet un procédé d'obtention d'un concentré de protéines à partir d'un mélange de mélasses de betteraves sucrières et de dat tes permettant de pallier l'inconvénient précité en surmontant, de façon notable, un grand nombre de difficultés d'ordre physico-chimique et d'ordre biologique liées à la culture de levure sur un substrat de mélasse. Le procédé objet de l'invention pour l'obtention d'un concentré de protéines par culture d'une levure dans un milieu à haute teneur en hydrates de carbone se caractérise en ce qu'on prépare ledit milieu par traitement en milieu acide par un super-phosphate d'un mélange de mélasses de betteraves sucrières et de dattes et addition audit mélange traité de sels azotés et en ce qu'on réalise la culture d'une souche de candida utilis dans ledit milieu en aérobiose. Le procédé tel que caractérisé ci-dessus a notamment l'avantage de permettre la culture d'une souche stable de Candida Utilis insensible à la répression catabolique, même si la concentration en sucre est élevée. Selon une caractéristique de l'invention, ledit traitement du mélange de mélasses consiste à réaliser une solution acide dudit mélange de pH4, à additionner à ladite solution un superphosphate à raison de 7,5 g/l, à porter à ébullition ladite solution additionnée de superphosphate et à éliminer les composés précipités. Selon l'invention les sels azotés additionnés au mélange traité de mélasses sont de préférence constitués par l'urée ou le sulfate d'ammonium. Selon l'invention, on réalise la culture de Candida Utilis en utilisant de préférence un inoculum de.Candida Utilis à 5 %. Par ailleurs, la composition préférentielle du milieu de culture est la suivante : 7 % d'hydrate de carbone, 0,75 % de phosphate monosodique, 1,3 % de sulfate d'ammonium ou d'urée et 0,08 % de sulfate de magnésium hydraté. On peut noter que la culture de Candida Utilis selon l'invention peut être réalisée aussi bien par lots qu'en continu et est de préférence effectuée à une température de 30 avec une aération de 0,5 à 2 volume de gaz introduit par volume dé milieu de culture et par minute (vvm) et une agitation de 300 à 1000 rotations par minute (RPM). D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparattront plus clairement à la lecture de la description qui suit de deux exemples de mise en oeuvre du procédé de l'invention correspondant respectivement à des cultures par lots et en continu, ces exemples étant donnés à titre illustratif mais nullement limitatif. Cette description sera faite au regard des figures 1 à 3 annexées sur lesquelles on a représenté - sur la figure 1, pour une culture par lots les courbes a et b correspondant respectivement à la variation en fonction du temps de la concentration en masse biologique exprimée en extrait sec et de la concentration en sucres - sur la figure 2, un diagramme présentant la séquence des opérations de mise en oeuvre du procédé de l'invention pour une culture en continu ; - sur la figure 3, les courbes c et d correspondant respectivement à la variation en fonction du taux de dilution de la concentration en masse biologique exprimée en extrait sec et de la productivité. Selon l'invention, le procédé de l'invention est mis en oeuvre pour une culture par lots comme suit On traite préalablement des milieux de mélasse en vue d'éliminer les composés toxiques et inutiles, comme par exemple les ions métalliques lourds et les composés azotés dans un vase cylindrique de verre muni d'-un agitateur, d'un dispositif de contrôle et de réglage du pH, d'un dispositif de contrôle de la température, d'un dispositif anti-mousse, ainsi que d'un appareil de siphonnage. On incsîduit dans ce vase les quantités voulues de mélasse, on les dilue dans l'eau et on règle le pH-à 4 en ajoutant de l'acide sulfurique concentré du commerce. Après avoir ajouté du super-phosphate (7,5-g/l dans le milieu final) on fait bouillir la solution de mélasse pendant vingt minutes. On chasse, après refroidissement, la solution limpide par siphonnage, ce qui laisse les précipités au fond du récipient. On ajoute ensuite à la solution limpide des sels et on la dilue dans l'eau pour finalement obtenir la composition suivante sucre = 7 Na2HPO4 = 0t75 % Urée ou (NH4)2SO4 = 1,3 % MgS04.7H 0 = 0,08 % Le pH du milieu de culture est de 4,5 On utilise normalement un inoculum à 5 % avec des cellules à croissance exponentielle On prépare cet inoculum dans un récipient de 3 litres qui, muni d'un agitateur, renferme un milieu de culture ayant la mEme composition que celui qui est utilisé pour la fermentation ultérieure. Puis on transfère l'inoculum et le milieu de culture précités dans un fermenteur semi-pilote de 100 litres (par exemple du type Marubishi) qui peut régler automatiquement la quantité d'oxygène dissous dans la culture à la valeur voulue par réglage de l'aération et par agitation. A la fin de la phase logarithmique, lorsque la population augmente considérablement, on introduit dans la culture de l'air auquel on a ajouté des traces d'oxygène pur afin d'éviter le risque d'insuffisance d'oxygène et, par conséquent, la perte en sucre et carbone pour la production d'méthanol Après extraction du gaz carbonique, on fait recirculer liait dans la culture. Les conditions expérimentales choisies pour réaliser de la manière indiquée ci-dessus la culture de Candida Utilis en fermentation par lots sont : température : 300C, pH 4,5, aération de 0,5 à 2 wm, agitation : 300 à 1000 RPM. Pour de telles conditions, la figure 1 présente en fonction du temps (en heure) la consommation en sucres du milieu de culture (courbe b) et l'élaboration de la masse biologique, les concentrations en masse biologique exprimées en extrait sec et en sucre étant données en g/l. Au vu de cette figure, on voit que l'on obtient une concentration absolue en masse biologique de 37,5 g/l, ce qui donne un coefficient de rendement de 0,53. Le Candida Utilis atteint un taux de croissance maximum de 0,57 h lo L'accumu- lation d'éthanol au cours du développement est très faible ce qui indique que les voies respiratoires sans fermentation prédominent dans la levure. Par ailleurs, pour de telles conditions, la teneur en protéine (protéine brute déterminée par le procédé Kjeldahl), la teneur totale en acide nucléique et la teneur en éthanol sont données dans le tableau 1 ci-dessous, ces teneurs précitées ayant comme maxima respectif : 62 %, 11,5 % et 2,5 g/l. Temps en Protéines Acide Ethanol incubation (%) Nucléique (%) (en g/l) 4 57,0 10,5 0,8 8 59,4 10,0 2,1 12 62,0 11,5 2,5 16 61,0 11,5 2,3 20 60,7 9,9 1,9 24 60,5 10,0 1,8 Le tableau 2 ci-dessous donne la composition en aminoacides de la masse biologique en pourcentage de protéine brute Amino-acides % en protéine brute Isoleucine 4,8 Leucine 7,0 Phénylalanine 4,2 Tyrosine 3,2 Thréonine 4,5 Valine 5,2 Arginine 5,7 Histidine 2,0 Lysine 7,9 Cystine 1,3 Méthionine 1,5 On relève une teneur en amino-acides bien équilibrée, ce qui indique que la masse biologique de Candida Utilis peut être utilisée comme source de protéines de qualité élevée pour l'alimentation du bétail. Ainsi, on remarque que le procédé selon l'invention est particulièrement satisfaisant en raison de la concentration très élevée en masse biologique de la culture obtenue par ré glage de toutes les conditions nécessaires au développement de la levure. Les conditions les plus importantes sont le traitement préalable convenable des mélasses avant leur utilisation pour le développement de la levure, l'utilisation de quantités de substrat très élevées et la réalisation de la fermentation en aérobiose dans les conditions optimum d'environnement. Les caractéristiques dominantes de ce procédé sont d'une part, la réalisation de la fermentation en aérobiose malgré une population microbienne aussi élevée et d'autre part, l'insensibilité relative de la levure à la répression. cata- bolique. Le procédé de l'invention peut également tre mis en oeuvre pour une culture de Candida Utilis en continu. La figure 2 représente la séquence des opérations à effectuer pour réaliser une telle culture. Ainsi, on voit que les opérations successives requises selon l'invention pour une culture en continu sont les suivantes - traitement préalable du mélange de mélasses dans le récipient 2 muni d'un dispositif de contrôle et de réglage du pH et de la température 2a, d'un agitateur 2b et de moyens d'admission de vapeur en 2c, ce traitement préalable consistant à diluer dans l'eau le mélange de mélasses introduit dans ledit réci pient 2 en 2d, a régler le pH à 4 avec de l'acide sulfurique à porter à l'ébullition la solution obtenue pendant 20 minutes après addition de superphosphate à raison de 7,5 g/l - traitement dans une centrifugeuse continue 4 du mélange de mélasses ainsi traité sans le laisser refroidir ; - préparation en 6 en additionnant des sels inorganiques au mélange de mélasses traité et centrifugé, d'un milieu de cul ture de pH 4,5 ayant la composition suivante :: sucre = 7 Na2HPO4 = 0,75 % Urée ou (NH4)2SO4 = 1,3 % MgSO4.7H2O = 0,08 % - stérilisation de la solution limpide par stérilisation con tinue en 8 - refroidissement en 10 - fermentation continue dans un fermenteur 12 de vingt litres (du type Chemap) dans lequel un inoculum à 5 % de Candida Utilis est introduit en 12f, ce fermenteur étant équipé des dispositifs 12e permettant de régler la fermentation comme pour le procédé par lots décrit plus haut. Les conditions de culture du Candida Utilis et la composition du milieu utilisé sont les mêmes que pour la culture par lots Le taux de dilution (D) est égal au taux spécifique de croissance et on le règle par réglage du débit du milieu frais. - centrifugations successives en 14 eut.16 - séchage en 18 et récupération des protéines en 18 g. On peut noter que sur la-figure 2 les références 20 désignent des pompes de mise en circulation des différentes solutions traitées. Ainsi, on a récolté des échantillons correspondant à au moins dix générations de développement pour les mêmes conditions du milieu et l'on a recueilli des données cinétiques du développement données sur la figure 3. Cette figure donne en fonction du taux de dilution (en h'l) la concentration en masse biologique en g/l exprimée en extrait sec (courbe c) et la productivité g/l x h"l (courbe d > . Cet exemple montre de façon évidente que l'on peut obtenir, avec ce procédé un rendement de 9,25 g/l à l'heure. Les principaux avantages de ce procédé sont : une productivité considérable, un fort coefficient de rendement et l'obtention d'un produit riche en protéines à teneur bien équi librée en amino-acides. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'un concentré de protéines par culture d'une levure dans un milieu à haute teneur en hydrates de carbone, caractérisé en ce qu'on prépare ledit milieu par traitement en milieu acide par un superphosphate d'un mélange de mélasses de betteraves sucrières et de dattes et addition audit mélange traité de sels azotés et en ce qu'on réalise la culture d'une souche de candida utilis dans ledit milieu en aérobiose. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit traitement du mélange de mélasses consiste à réaliser une solution acide dudit mélange de pH4, à additionner à ladite solution un superphosphate à raison de 7,5 g/l, à porter à ébullition ladite solution additionnée de superphosphate et à éliminer les composés précipités 3.Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits sels azotés sont choisis dans le groupe comprenant l'urée et le sulfate d'ammonium 4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit milieu comporte 7 % dshydrate de carbone, 0,75 % de phosphate monosodique, 1,3 % d'urée et 0,08 % de sulfate de magnésium hydraté 5 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit milieu comporte 7 % d'hydrate de carbone, 0,75 % de phosphate monosodique, 1,3 % de sulfate d'ammonium et 0,08 % de sulfate de magnésium hydraté 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 et 5, caractérisé en ce que le pH dudit milieu est de 4,5. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on réalise ladite culture de candida utilis en utilisant un inoculum de candida utilis à 5 %O 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce dugon réalise la culture de candida utilis par lots. 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on réalise la culture de candida utilis en continu. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 et 9, caractérisé en ce que ladite culture est effectuée à une température de 300 avec une aération de 0,5 à 2 volume de gaz introduit par volume de milieu de culture et par minute (vvm) et une agitation de 300 à 1000 rotations par minute (RPM).