Brevet FR2341593A1 — publié le 19770916

La présente invention concerne un procédé d'extraction d'enzymes à partir de cultures de vibrion chosérique (Vibrio cholerae). Lors de la préparation de fractions antigéniques utilisables notamment comme vaccins, on cultive un germe pathogène puis on isole le microorganisme, en général par centrifugation ou par filtration. Le microorganisme sert à préparer le vaccin et le surnageant était jusqu'à présent jeté comme déchet (voir par exemple le brevet français N 73.03734 ou la demande de certificat d'addition NO 74.06983 à cette dernière, relatives à des fractions antigéniques provenant de souches telles que le vibrion cholérique). ta Demanderesse a isolé des enzymes utiles, en particulier des lipases et du labferment (présure), à partir du surnageant obtenu après séparation des cultures de vibrion cho lérique et propose une nouvelle source d'obtention de ces enzymes. La présente demande concerne donc une méthode d'isolement d'enzymes, notamment de lipases et de labferment (présure), caractérisée en ce qu'on utilise comme matière première des milieux de culture de vibrion cholérique. Le vibrion cholérique est cultivé de manière habituelle en boite de Roux, en fioles de Fernbach ou en fermenteur industriel. Les germes utilisables pour la préparation de vaccins peuvent etre recueillis par centrifugation, par exemple à 3000-5000 tours/mn pendant environ 20 minutes , ou par filtration, par exemple sur filtre millipore de 0,45 yu. te surnageant (le cas échéant le filtrat) servant de matière de départ peut être fractionne par traitement avec du sulfate d'ammonium et centrifugation. Les enzymes ainsi isolées peuvent être séparées de manière connue, par exemple par chromatographie ou par dialyse. Les exemples suivants illustrent l'invention. EXEMPLE 1 aJ Isolement de la lipase On cultive les vibrions cholériques en fioles de Fernbach de 500 ml pendant 48 heures, en utilisant comme liquide nutritif de la peptone trypsinée de veau (PTV) en solution aqueuse. L'inoculum est composé de la souche Vibrio cholerae el tor Inaba (souche NO 9292 à ;'Institut Pasteur) pour une fiole et de la souche Vibrio cholerae el tor Ogawa (souche NO IIK1 à l'institut Pasteur) pour une autre fiole. On recueille les germes par centrifugation et on les utilise par exemple à la préparation d'une fraction vaccinante. On mélange les surnageants et on traite pendant 12 heures à la température du laboratoire par 70 g de (Nfl4)2S04 cristallisé pour 100 ml de milieu. Après avoir centrifugé le milieu à 12 000 t/mn pendant 20 minutes à + 40C, on recueille le culot et on le dissout dans une quantité de solution tampon phosphate 0,1 M de pH 7,2 suffisante pour redissoudre la totalité du culot (environ 15 ml). On reprécipite par 50 ml d'une solution de (NH4)2S04 saturé à pH 7. On recueille le culot par centrifugation à 10 000 t/mn. I1 est constitué en particulier de lipase non purifiée (environ 5 g dans les conditions de l'expérience). b) Activité On a recherché l'activité de ces lipases sur quatre types de corps gras - Tween 20 (ou polysorbate 20) palmitate de sorbitol poly oxyéthyléné. (P.M. = 1200). - Tween 40 (ou polysorbate 40) laurate de sorbitol polyoxyéthyléné (P.M. = 1280). - Tween 60 (ou polysorbate 60) stéarate de sorbitol polyoxyéthyléné (P.M. = 1300). - Tween 80 (ou polysorbate 80) oléate de sorbitol polyoxyéthyléné (P.M. = 1300). On utilise un substrat gélifié préparé à partir de la solution suivante peptone (Bactopeptone Difco) 10 g NaCl 5g Caca21 H20 O,10g eau distillée 1000 ml On ajuste la solution à pH 7,4 avec NaOH N/10. On ajoute 12 g de gélose (Agar Biomar) et 10 ml de Tween. On traite en autoclave pendant une heure à 1200C. On laisse refroidir le substrat qui se gélifie. Les cls sont répartis dans des boites de Petri. On les perfore dvL'c un trocart de 3 mm de diamètre. Dans chaque cavité ainsi creusée, on dépose par capillarité une goutte de la solution dans laquelle on recherche les lipases. Après 12 heures à l'étuve, on observe une zone de précipité d'acide gras autour des cavités. c) Scparation- On sépare les lipases par chromatographie sur colonne de dextrane en grains de 40 à 120 o (Séphadex G 200). L'éluant est alors un tampon phosphate 0,1 M pH 7,2. Les fractions sont récupérées sur un collecteur. Par exemple, dans les conditions d'expérience, la lipase active sur le Tween 80 passe dans les tubes 31 à 33, la lipase active sur le Tween 20 passe dans les tubes 43 à 48 ; les lipases actives sur Tween40 et Tween 60 passent groupées dans les tubes 40 - 42 et 55 - 57. EXEMPLE 2 a) On ensemence 500 ml d'eau peptonée PTV en fiole de Fernbach. L'inoculum est composé d'un tube de 10 ml d'eau peptone dans laquelle on a cultivé pendant 6 heures à 370C une souche de Vibrio cholerae el Tor Ogawa HKl. On conserve douze heures en étuve à 370C. On centrifuge les germes à froid (+ 40C), à 6000 t/mn pendant 20 mn. On ajoute 70 g de (NH4)2804 par 100 ml de surnageant, soit 350 g dans un ballon muni d'un agitateur magnétique. On laisse en contact 4 heures à + 40C. On récupère le culot par centrifugation. Le surnageant est rejeté et le culot pesé en poids humide (7,2 g). b)On recherche l'activité des lipases sur gélose additionnée de Tween 20, 40, 60 et 80, en opérant comme dans l'exemple lb). Partant de 7,2 g de lipase non purifiée, une dilution à 1/80 est susceptible d'altérer 0,20 ml de Tween 20. Partant de 7,2 g de lipase non purifiée, une dilution de 1/320 est susceptible d'altérer 0,20 ml de Tween 40 ; une dilution de 1/320 est susceptible d'altérer 0,20 ml de Tween 60 et une dilution de 1/40 est susceptible d'altérer 0,20 ml de Tween 80. EXEMPLE 3 On cultive les vibrions cholériques en fioles de Fernbach de 500 il pendant 48 heures, en utilisant comme liquide nutritif de la peptone (PTV) en solution aqueuse additionnée de 1 % de Tween 20, 40, 60 et 80 respectivement. te traitement est identique à celui de l'exemple 1, 1'inoculum étant une couche de Vibrio cholerae Ogawa el tor Marquez (Institut Pasteur). Le Tween déjà introduit dans le milieu de cul ture permet de vérifier la production de lipases ; de plus il présente un effet stabilisateur.Les quantités de lipases obte nues et leur activité sont rassemblées ci-dessous Milieux additionnés de Tween 20 40 60 80 Rendement en grammes de lipases non puri fiées 7,17 9,26 8,5 10 Dilution correspondant à une activité sur gé lose additionnée de - Tween 20 1/32 1/32 1/32 1/16 - Tween 40 1/64 1/128 1/64 1/32 - Tween 60 1/100 1/128 1/160 1/120 - Tween 80 1/100 1/128 1/120 1/160 EXEMPLE 4 a) Isolement des enzymes On cultive le vibrion cholérique en fiole de Fernbach de 500 ml pendant 48 heures à 370C en utilisant comme liquide nutritif de la peptone trypsinée de veau en solution aqueuse. L'inoculum est composé de la souche de Vibrio cholerae el tor Ogawa Marquez, récemment isolée. On recueille les germes par centrifugation et on les utilise par exemple à la fabrication d'une fraction vacci nante. On traite le surnageant par 70 g de (NH4)2S04 cristallisé pour 100 ml pendant 12 heures. On centrifuge puis on recueille le culot et on le dissout dans une solution tampon phosphate 0,1 M de pH 7,2 suffisante pour redissoudre la totalité du culot. Cette solution possède un certain nombre d'activités enzymatiques et contient notamment des lipases et du labferment. b) Séparation. I1 est possible de séparer ces différentes activités enzymatiques par filtration sur une colonne de chromatographie de dextrane en grains de 40 à 120 A (Séphadex G 200). On élue par du tampon phosphate 0,1 M pli 7,2. Les fractions sont récupérées sur un collecteur. Dans les conditions de l'expérience, le labferment passe dans les tubes 66 à 80, tandis que les lipases actives sur Tween 20 passent dans les tubes 45 à 55, les lipases actives sur Tween 40 dans les tubes 101 à 110, les lipases actives sur Tween 60 dans les tubes 96 à 100 et les lipases actives sur Tween 80 dans les tubes 101 à 110. Un autre moyen de séparation consiste à dialyser le précipité obtenu par addition de sulfate d'ammonium et repris par du tampon phosphate O,lN contre le même tampon phosphate 0,1 N pendant 48 heures à + 4QC. On ajuste le pH à 4 paru C1 0,1 N. On precipite le produit par du méthanol et on évapore le solvant, ce qui fournit le labferment débarrassé de lipase, sous forme d'une poudre sèche. c) Activité.- On détermine l'activité coagulante du labferment obtenu ci-dessus par rapport à l'activité d'une présure normalisée (A.P.N.). L'A.P.N. d'une présure est définie comme le nombre d'unités présure par gramme de produit par rapport à un extrait de présure étalon du commerce. On donne à cet extrait la valeur A.P.N. = 100, donc une unité présure est l'activité de 10 mg d'extrait de présure étalon. Selon les modalités décrites on obtient 20 ml d!une fraction de labferment titrant 1000 A.P.N. EXEMPLE 5 Selon les mêmes modalités que dans l'exemple 4, mais avec la souche de Vibrions 4Z, (souche O.M.S), on a obtenu 20 ml d'une fraction de labferment titrant 125 A.P.N. EXEMPLE 6 Selon les mêmes modalités que dans l'exemple 4, mais en cultivant la souche Marquez sur de l'eau peptonée Organon, on a obtenu 25 ml d'une fraction de labferment titrant 1000 A.P.N. La présente invention permet donc d'obtenir facilement à partir de cultures de vibrions cholériques des lipases, produits trs utiles notamment pour la destruction des corps gras. Elles ont trouvé de nombreuses autres applications telles que la conservation du pain et le dosage des corps gras. L'invention permet également d'obtenir du labferment utilisable pour la coagulation du lait en vue de la fabrication du fromage. La coagulation du lait est habituellement réalisée à l'aide de présure, obtenue à partir de caillettes (membranes tapissant le 4ème estomac) de veaux nourris au lait. La quantité et la qualité de la présure disponible sont donc fonction essentiellement du nombre et de l'espèce des veaux abattus à des fins alimentaires. L'invention permet donc de disposer d'une nouvelle source d'enzymes utiles qui peut s'avérer d'un grand intérêt. REVENDICATIONS 1.- Procédé d'obtention d'enzymes, notamment de lipases et de labferment, caractérisé en ce qu'on utilise comme matière première des milieux de culture de vibrion cholérique. 2.- Procédé selon la revendication 1, carac térisé en ce qu'on isole les solutions d'enzymes par centrifugation des milieux de culture 3.- Procédé selon la revendication 1, carac térisé en ce qu'on isole les solutions d'enzymes par filtration des milieux de culture. 4.- Procédé selon la revendication 2 ou la revendication 3, caractérisé en ce qu'on fractionne les solutions d'enzymes par précipitation au sulfate d'ammonium suivie de centrifugation. 5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on sépare les enzymes par chromatographie de leurs solutions. 6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on sépare le labferment par dialyse.