Brevet FR2320950A1 — publié le 19770311

La présente invention concerne un procédé pour produire de l'urokinase 8 partir de l'urine humaine et pour puri-fier l'urokinase brute ainsi obtenue. L'urokinase est une enzyme présente dans l'urine humaine. On sait qu'elle provoque par activation la formation de la fibrinolysine qui est une protéase fibrinolytique importante pour dissoudre les caillots. L'urokinase est donc très importante en thérapeutique thrombolytique. La quantité d'urokinase présente dans l'urine humaine est extrêmement faible et son isolement est donc particulièrement difficile et coûteux. Actuellement on prépare dans l'industrie l'urokinase en mettant de l'urine humaine provenant de sujets sains au contact d'une grande diversité d'adsorbants et en éluant l'urokinase adsorbée avec une solution d'une matière alcaline. Cependant, dans ce procédé connu des impuretés telles que des protéines autres que l'urokinase sont adsorbées avec l'urokinase par l'adsorbant. Parmi ces impuretés figurent des matières de type thromboplastine dont la présence est indésirable dans les préparations d'urokinase.Selon le procédé connu d'élution de l'urokinase qui utilise une solution alcaline (ayant un pH supérieur à 11) telle qu'une solution aqueuse d'ammoniaque, la récupération de l'urokinase est faible (moins de 70cl) car l'urokinase est très instable en solution alcaline et de plus de nombreuses protéines autres que L'urokinase et en particulier des matières de type ttlromboplastine sont éluées. On obtient donc une urokinase n'ayant qu'une faible activité spécifique. Dans ce cas on ne peut pratiquement pas éluer l'urokinase en utilisant une solution faiblement alcaline (ayant un pH inférieur à lo) pour obtenir une solution renfermant de I'urokinase. La demanderesse a recherché un agent d'élution permettant d'éluer l'urokinase adsorbée sur l'adsorbant avec un rendement élevé et a découvert que, lorsqu'on met l'urokinase adsorbée sur l'adsorbant au contact d'un agent d'élution constitué d'une solution d'un agent tensio-actif cationique, on peut éluer l'urokinase avec un rendement élevé et obtenir une urokinase très purifiée et très active. De plus l'urokinase purifiée selon l'invention a a une teneur en matières de type thromboplastine remarquablement faible et cette urokinase purifiée selon l'invention peut donc dissoudre rapidement les caillots sanguins formés sans provoquer de coagulation sanguine. L'invention permet donc d'obtenir une urokinase tres purifiée, stabilisée et très active n'ayant pas d'effets secondaires. L'adsorbant utilisé dans l'invention est un agent capable d'absorber l'urokinase. On peut citer comme exemples d'adsorbants les résines échangeuses de cations, une carboxyalkylcellulose telle que des fibres de cellulose, comme du coton absorbant, et de la gaze carboxyalkylées, du carboxyméthylséphadex, des fibres de résine de polyacrylonitrile, du gel de silice-bentonite, de la diéthylaminoéthylcellulose, du diéthylaminoéthylséphadex et de la phosphocellulose. Des fibres de cellulose carboxyalkylées telles que du coton absorbant et de la gaze conviennent particulièrement bien comme adsorbants dans l'invention. Cet adsorbant est nouveau et décrit en détail ci-après. Les fibres de cellulose carboxyalkylées sont constituées par exemple de tibres, de fils rotors, d'articles tricotés ou d'un tissu de coton brut constitué en totalité ou en partie de cellulose naturelle ou régénérée. On préfère le coton brut, le coton absorbant et la gazequ'il est facile de se procurer. On peut effectuer la carboxylation de ces fibres de cellulose selon un procédé connu en soi. Par exemple on met ces fibres de cellulose en contact avec un acide gras a-substitué par un halogène tel que l'acide monochloroacétique, l'acide monobromoacétique et l'acide monochlorobutyrique ou d'un sel de métal alcalin d'un ester ou d'un halogénure d'acide correspondant, en présence d'une matière alcaline telle que l'hydroxyde de sodium, en opérant de façon classique. On peut carboxyalkyler de façon classique ces fibres de cellulose telles quelles ou finement coupées et de préférence on effectue la carboxyalkylation de telle sorte que le degré de substitution par les radicaux carboxyalkyles du produit soit d'environ 0,20 à O, 08. En d'autres termes on trempe et on fait gonfler les fibres de cellulose précitées en utilisant environ 5,5 à 16 moles de matiere alcaline telle qu'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium ou d'hydroxyde de potassium par motif de glucose anhydre, puis on ajoute à cette solution environ 0,? à 1 mole par mole de matière alcaline de l'acide gras a-substitué par un halogène ou d'un dérivé correspondant. On fait réagir la solution obtenue à une température comprise entre environ 30 et 900C pendant environ 1 à 10 heures.On obtient ainsi des produits ayant le degré de substitution par des radicaux carboxyalkyles désiré. On peut déterminer librement le degré de substitution des produits réactionnels par les radicaux carboxyalkyles en augmentant ou diminuant le volume et la concentration de la matière alcaline et de l'acide gras a-substitué par un halogène, ut lisés pour la réaction. Cependant on préfère, en raison du degré et de la vitesse de la réaction, faire réagir environ 2 a 3 équivalents de la matière alcaline précitée par équivalent de l'acide gras a-substitué par un halogène ou du dérivé correspondant, Les produits carboxyalkylés précités dont le degré de substitution par les radicaux carboxyalkyles ne dépasse pas 0,21 laissent difficilement passer les solutions (urine humaine) et on ne peut donc les utiliser comme adsorbants. D'autre part, les produits carboxyalkylés précités dont le degré de substitution par les radicaux carboxyalkyles est inférieur à 0,07 adsorbent difficilement l'urokinase et ne conviennent donc pas dans l'invention. En pratique, pour des considérations relatives au bon passage de la solution, à l'adsorption d'urokinase et au volume d'urokinase adsorbé par unité d'adsorbant, il est souhaitable d'utiliser des produits carboxy alkylés dont le.degré de substitution par les radicaux carboxyalkyles soit compris entre environ O,letO,18. Parmi les produits carboxyalkylés, on préfère particulièrement les produits carboxyméthylés qui sont moins coûteux et plus faciles a préparer et a utiliser et dont la nature convient mieux à. l'adsorption de l'urokinase. il est facile,en utilisant des procédés classiques, de mettre l'urine humaine ou une solution d'urokinase brute provenant de l'urine humaine au contact de l'adsorbant pour adsorber l'urokinase selon l'invention. Par exemple dans l'industrie on fait passer l'urine humaine ou une solution renfermant de l'urokinase brute à travers une colonne garnie de l'adsorbant précité, ou on ajoute l'adsorbant à l'urine ou à la solution d 'urokinase brute, Lorsqu'on utilise l'urine humaine on préfère, pour obtenir de bonnes caractéristiques d'adsorption de l'urokinase sur l'adsorbant, diluer l'urine par l'eau, en particulier dans un rapport de 0,5 W 12 g d'eau par gramme d'urine de départ, plutôt que d'utiliser directement l'urine de départ. On garnit une colonne de 10 cm ayant un diamètre de 4,1 cm avec 3,5 g (40 ml) de coton adsorbant carboxyméthylé (ayant un degré de substitution par les radicaux carboxyméthyles de 0,168 ; voir le produit n 24 indiqué ci-après). On lave ensuite le coton absorbant carboxyméthylé avec une solution d'acide chlorhydrique O,l N, on lave a l'eau puis on fait tremper dans une solution de chlorure de sodium 0,1 N. On utilise le coton absorbant carboxyméthylé ainsi obtenu comme adsorbant. On ajuste à pH 5,6 avec de l'acide chlorhydrique de l'urine humaine fraîche de sujets sains (densité 1,016 a 330C) et on la dilue avec de l'eau désionisée pour obtenir des degrés de dilution divers. On fait passer l'urine humaine diluée ainsi obtenue a travers la colonne précitée garnie de l'adsorbant et on calcule le rapport entre l'urokinase adsorbée et l'urokinase introduite en utilisant la formule suivante ######## ###### ## ########## ### ######## # ### Dans la présente description on calcule l'activité urokinasique å partir de l'international Urokinase Standard de l'Organisation Mondiale de la Santé, selon le procédé standardisé proposé par le Committee of Thrombolytic Agents, N.I.H., U.S.A., en utilisant de la profibrinolysine humaine et du fibrinogène humain qui constitue le substrat physiologique naturel et les résultats sont donc exprimés en unités internationales (U.I.). On dialyse l'urokinase avant d'effectuer la détermination, puis on calcule l'activité. On élue l'urokinase adsorbée en faisant tremper l'adsorbant ayant adsorbé l'urokinase dans une solution tampon à pH 8,01 a 0,03% en chlorure de benzalkonium et 0,5 M en chlorure de sodium. On ajuste cette solution d'urokinase éluée.à pli 7,0 avec une solution d'acide chlorhydrique et on calcule l'activité de l'urokinase ainsi obtenue. On calcule l'activité totale de l'urokinase recueillie à partir de l'urine humaine mise en oeuvre. Les résultats obtenus figurent dans le tableau I ci-après. Comme le montre le tableau I, il est souhaitable, pour que l'adsorption de l'urokinase par l'adsorbant soit bonne, d'utiliser une urine diluée obtenue en diluant l'urine humaine de départ avec de liteau dans un rapport de 0,5 à 12 g d'eau par gramme d'urine de départ (degré de dilution de l'urine humaine : 1,5 à 13). Les fibres de cellulose carboxyalkylées conviennent très bien en pratique comme adsorbant dans l'invention car la nature de ces fibres convient bien au passage de l'urine et à l'adsorption pratiquement complète de l'urokinase. Dans le cas de la gaze carboxyalkylée obtenue dans l'expé- rience 1 ci-après, 100 g de produit carboxyméthylé ont un volume stable d'environ 1.000 ml (on peut facilement modifier la densité selon la pression) et laissent passer plus de 300 litres d'urine humaine a un débit supérieur A 36 litres/heure sans que la facilité de passage de la solution diminue. Donc lorsqu'on utilise un coton absorbant ou une gaze constitués de telles fibres de cellulose carboxyalkylées, on peut facilement traiter rapidement des quantités importantes d'urine humaine. EXPERIENCE I On mélange et on agite convenablement, dans un bêcher 50 g de gaze du commerce (0,309 mole par motif de glucose anhydre), 46 à 184 g d'hydroxyde de sodium et 0,5 à 1,1 litre d'eau. On laisse reposer le mélange pendant 2 heures à la température ordinaire. On ajoute au mélange 60 à 181 g d'acide monochloroacétique en cristaux et on laisse reposer pendant 4 heures à 700C en agitant de temps en temps. On lave les produits à l'eau. On lave une partie des produits avec 2 litres de méthanol et l litre d'acétone, puis on sèche sous vide avec un dessiccateur.On utilise le reste de ces produits tels quels conne adsorbant de l'inveation, sans effectuer de lavage. On obtient des produits ayant divers degrés de substitution par les radicaux carboxyméthyles en utilisant divers volumes ou diverses concen- trations de l'hydroxyde de sodium et de l'acide monochloroacétique dans la réaction précédente. Les résultats obtenus figurent dans le tableau II ci-après. On détermine le degré ae substitution en transformant la capacit d'échange totale (équivalent pour 1 g) obtenue selon "le procédé pour mesurer la capacité d'échange totale dans une résine échangeuse de cations faiblement acide" Ion Exchange Resin Manual (1), publié par Mitsubishikasei Kogyo Ce., lac.) en équivalents chimiques par motif de glucose anhydre, es motifs tant les motifs constitutifs de la cellulose. EXPERIENCE 2 Dans un bécher de 1 litre, on mélange en agitant convenablement 50 g de coton absorbant du commerce (0,309 mole par motif de glucose anhydre), de l'hydroxyde de sodium et 800 ml d'eau. On laisse séjourner le mélange pendant 2 heures à la température ordinaire. On ajoute au mélange des cristaux d'acide monochloroacétique. On effectue les réactions et les traitements de a solution réactionnelle obtenue en opérant comme dans l'expérience l et l'on obtient des produits secs. On obtient des produits ayant divers degrés de substitution ar les radicaux carboxyméthyles en utilisant dans la réaction ci-dessus des volumes différents ou des concentrations différentes de l'hydroxyde de sodium et de l'acide monochloroacétique. Les r-=sultats obtenus figurent dans le tableau III ci-apres. Les agents tensio-actifs cationiques qu'on utilise comme agents d'élution dans les solutions tensio-actives cationiques de l'invention sont par exemple des sels de tetra-alkyl-ammonium, des sels de cétyltriméthylammonium, des sels de stéaryltriméthylammonium, des sels d'alkyl supérieur aralkylammonium quaternaire, des sels d'alkyl supérieur dimétnylbenzylammonium, des sels de diméthylbenzyllaurylammonium, des sels d'alkylaryl supérieur ammonium quaternaire, des sels d'alkyl supérieur diméthylphénylammonium, des selsd'arylaralkylalkyiammoníum quaternaire, des sels de diméthylphénylbenzylammonium, des sels d'alkylpyridinium supérieur, des sels de laurylpyridinium et des sels de polyalkylnaphtalèneméthylpyridinium, où les radicaux alkyles sont des radicaux alkyles inférieurs renfermant jusqu'à 6 atomes de carbone ou des radicaux allyles supérieurs renfermant environ 10 à 20 atomes de carbone et le radical aryle est un radical phényle. On peut citer comme exenples de tels agents tensio-actifs cationiques, les obels de lauryltriméthylammonium, les sels de lauryl diméthyîbenzylammonium, les sels de cétyltriméthylammonium, les sels de stéaryltriméthylammonium, les sels de tétradécyldiméthylbenzylammonium, sels de benzalkonium), les produits obtenus en condensant la N,N-diéthyléthylènediamine avec un acide gras tel que l'acide oléique et en quaternisant le produit de condensation avec un agent d'alkylation tel que le chlorure de benzyle, l'acide dimethylsulfurique, etc. (Sapamin, BCH, Sapamin MS), les sels de-cétylpyridinium, les sels de stéaramîdeniéthyl- pyridinium, les sels de laurylpyridinium, les sels de cétylquinolinium, les sels de l'ester méthylique de l'acide laurylaminopropionique, les sels métalliques de l'acide laurylaminopropionique, la lauryldiméthylbétaTne, la stéaryldiméthylbetaSne, la lauryldihydroxyéthylbétaine et les sels de benzéthonium. Le radical aryle est normalement un radical phényle. On peut citer comme sels d'ammonium quaternaire du commerce particulièrement utiles dans l'invention (Sapamin) (Emulsept) (Catol) -(Aerosal) On doit ajuster entre 6 et 9 et de préférence entre 7 et 8 le pH de l'agent d'élution utilisé dans l'invention. Lorsqu'on accroît le pi de l'agent d'élution au-delà de 10, les rendements et la pureté de l'urokinase éluée diminuent. La concentration des agents tensio-actifs cationiques dans la solution aqueuse qu'on utilise comme agents d'élution dans l'invention doit être d'environ 0,000001 a 0,5% (p/v). La concentration des agents tensio-actifs des solutions d'élution ne doit pas être élevée au point de dénaturer l'urokinase et les autres protéines. Cette action, qui est purement physico-chimique, est bien connue. Lorsque la concentration de l'agent tensio-actif cationique dans la solution d'élution est trop faible, l'effet d'élution de l'urokinase est très faible, ce qui est indésirable dans l'invention. La gamme des concentrations appropriées varie avec la nature des agents tensio-actifs cationiques. On utilise de préférence, dans le cas des sels de benzalkonium, une concentration de O,OOl à 0,1% (plv), dans le cas des sels de benzéthonium, une concentration de 0,00001 à 0,001 (p/v), dans le cas des sels de pyridinium, une concentration de 0,001 à 0,1% ety dans le cas des sels de stéaryltriméthylammonium, une concentration de 0,0005 à 0,05 (p/v). On peut effectuer l'élution en utilisant des dispositifs et des procédés classiques. Les solutions d'urokinase éluées qu'on obtient selon l'invention renferment des agents tensio-actifs cationiques que l'on peut facilement éliminer de façon classique en utilisant des agents de dialyse ou des tamis moléculaires tels que des membranes filtrantes ou des gels de dextrane. Dans la présente description, on détermine les teLeurs en protéines selon la méthode de Lowry, en utilisant le réactif de Folin, après avoir effectué une dialyse. On utilise comme étalon pour effectuer cette détermination de la sérum-albumine bovine purifiée. On confirme également les teneurs en protéines par la méthode du biurct. Dans la présente description, on détermine la teneur des matières de type thromboplastine en mesurant le raccourcissement du temps de coagulation du plasma recalcifie selon des techniques classiques, en utilisant du Plasma-Coagulation-Control (plasma humain citraté lyophilisé produit par Ortho Co., Inc.). On doit dialyser les échantillons contre de l'eau salée avant d'effectuer la détermination. On utilise comme étalon de thromboplastine l'Ortho Brain Thromboplastin (thromboplastine de cervelle de lapin lyophilisée produite par Ortho Co., mc.). La mise en évidence du caillot plasmatique est si difficile à effectuer selon les techniques classiques, lorsque la concentration en urokinase est élevée, qu'on mesure le temps de coagulation avec un thromboélastographe (Hellige Co., Inc.). L'examen au thromboélastographe montre que l'urokinase obtenue dans l'invention a une activité thrombolytique élevée provoquant la fibrinolyse du caillot de plasma. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre de plusieurs exemples de réalisation et en se référant à la figure annexée qui est un diagramme d'élution correspondant à l'exemple 5. EXEMPLE 1 On garnit une colonne de 9 ml de 3 g de carboxyméthylcellulose en poudre pour chromatographie de Serva Co., Inc. On prépare ainsi six colonnes garnies de cette poudre de carboxyméthylcellulose. On fait passer à travers chaque colonne, à 50C, 100 ml d'urine diluée par l'eau d'hommes sains adultes, ayant une activité de 560 U.I. L'urokinase adsorbée sur la poudre adsorbante de carboxyméthylcellulose est de 510 U.I. par colonne. On lave les colonnes avec une solutionde chlorure de sodium 0,1 N, puis on fait passer à travers les six colonnes six échantillons de 25 ml d'agent d'élution, à 50C, pour éluer l'urokinase adsorbée. L'activité de la matière première dérivant de l'urine humaine est de 5,6 unités/ml et 40 unités/l mg de protéines.Les résultats figurent dans t tableau TV ci-après. Comme le montre le tableau IV ci-après, on ne peut éluer l'urokinase avec une solution d'ammoniaque à pH 8,0 (50C), tandis qu'on 'ut éluer pratiquement la totalité de l'urokinase adsorbée en utilisant, dans les mêmese conditions de pH, comme agent d'élution, une solution agents tensio-actifs cationiques selon l'invention. Ces agents tensio-actifs cationiques accroissent l'activité de l'urokinase et, après récupération, activité urokinasique est supérieure à 100%. Si l'on considère que ces agents tensio-actifs cationiques, à la concentration utilisée, accroissent de 1,2 à 1,5 ois l'activité urokinasique, on voit que la récupération moléculaire de l'urokinase est supérieure à 90%.L'activité spécifique de i'urokinase obtenue est de 11.000 à 15.000 U.I./l mg de protéines et le facteur de purification de l'urokinase est donc d'environ 300. Lorsqu'on opère de façon semblable en éluant l'urokinase avec une solution aqueuse d'anxnoniaque à pH 11,8 (5 C) comme agent d'élution, le rendement de la récupération, exprimé par l'activité urokinasique, est de 55% et l'activité spécifique de la solution d'urokinase éluée est de 440 U.I./1 mg de protéines. EXEMPLE 2 On fait passer 50C, 50 ml d'urine humaine de sujets sains adultes à travers une colonne garnie de 1 g de fibres synthétiques de polyacrylonitrile Vonnel. On lave la colonne à l'eau. On fait ensuite passer à travers la colonne, à 5 C, 15 ml d'une solution tampon 1/100 M de Na2HPO4-NaH2PO4 et 0,5 M en chlorure de sodium (pH = 7,2 a 5 C) renfermant 0,oe3% de chlorure de benzalkonium (produit de Takedayakuhin Kogyo Co. > Inc.) à 50C et on élue et récupère 120 U.I. d'urokinase. L'activité urokinasique totale de l'urine humaine de départ est de 175 U.I., l'activité de l'urokinase adsorbée sur l'adsorbant est de 105 U.I. et on élue 114% de l'urokinase adsorbée. Après avoir adsorbé l'urokinase comme dans l'expérience ci-desssus, on fait passer de la mbme façon à travers la colonne une solution tampon 1/100 M en Na2HP04-NaH2P04 et 1/2 M en chlorure de sodium (pH = 7,2 à 5 C) sans chlorure de benzalkonium sans pouvoir éluer d'urokinase. On répète l'expérience ci-dessus en utilisant, au lieu de Vonnel, des fibres synthétiques de polyacrylonitrile Exlan. On obtient le même résultat que précédemment. EXEMPLE 3 On garnit la colonne de 0,15 g (0,5 ml) de diéthylaminoéthylcellulose (produit de Brawn Co., Inc.). A travers la colonne on fait passer 5 ml d'urokinase brute (2.200 U.I./I mg de protéines) provenant d'urine humaine ayant une activité de 10.000 U.I. L'activité urokinasique adsorbée par la colonne est de 5.500 U.I. A travers cette colonne on fait passer 2 ml de solution tampon 1/100 M en Na2HPO4-NaH2PO4 et 3110 M en chlorure de sodium (pH = 6,0 à 5 C), renfermant 0,02% (p/v) de chlorure de benzal- konium, comme agent d'élution. On obtient 6.600 U.l. d'urokinase. La récupération de l'urokinase est de 125%. L'activité spécifique de l'urokinase obtenue est de 92.000 U.I./l mg de protéines. On adsorbe de l'urokinase comme dans l'expérience ci-dessus et on fait passer à travers la colonne, en opérant comme précédemment, ml de solution tampon 1/100 M en Na2HPO4-NaH2PO4 et 3/10 M en chlorure de sodium (pH = 7,2 à 50C) sans chlorure de benzalkonium et on obtient 300 U.I. d'urokinase. La récupération de l'urokinase est de 5%. Comme le montrent ces résultats, lorsqu'on utilise selon l'invention un sel de benzalkonium. l'élution de l'urokinase est améliorée. EXEMPLE 4 On garnit une colonne mesurant 106 mm x 57 mm de 50 g (500 ml) de coton carboxyméthylé obtenu dans l'expérience 2 (produit n 24 ayant un degré de substitution par les radicaux carboxyméthyles de 0,168). On fait passer à travers cette colonne, à 20 C, avec une vitesse spatiale (5V) de 36. Pendant le passage de l'urine humaine, la vitesse d'écoulement de la solution ne diminue pas. Le rapport de l'urokinase adsorbée à l'urokinase introduite est supérieur à 95%. L'activité de l'urokinase adsorbée par le volume de la colonne est de 275.000 U.I./l ml. L'activité de l'urokinase adsorbée par gramme de coton carboxyméthylé sec est de 5.500 U.I. L'efficacité du traitement de l'urine humaine est de 36 RV (volume de résine) par heure. Dans cette expérience, le traitement dure 5,5 heures. Peu après ce traitement, on fait passer a travers la colonne, à 50C, 1.250 ml d'une solution tampon 1/100 M en Na2HPO-NaH2P04, 1/2 M en chlorure de sodium, a 0,02% (p/v) de chlorure de benzalkonium (pH = 9,0 à 50C) et on élue les matières adsorbées. Rapidement après on neutralise l'éluat renfermant l'urokinase avec une solution d'acide chlorhydrique. L'activité urokinasique de l'éluat est de 385.000 U.I. La récupération totale de l'activité urokinasique (adsorption et solution de l'urokinase) est de 140%. On recueille donc 7.700 .I. d'urokinase par gramme de coton carboxyméthylé sec. On répète l'exemple 4 ci-dessus en utilisant 4es cotons carboxyméthyles obtenus dans l'expérience 2 : produit n 21 (ayant un degré de substitution par les radicaux carboxyméthyles de 0,05) et produit n 39 (degré de substitution par les radicaux carboxymêthyles de 0,22,. Dans le premier cas (produit n 21) en adsorbe moins de 30% d'urokinase. Dans le second cas (produit n 39) l'urine humaine ne passe pas et l'activité urokinasique de l'urine est perdue. On effectue l'expérience suivante pour établir une comparaison avec l'invention. On garnit une colonne ayant un diamètre de 106 mm et une longueur de 57 mm avec 150 g (500 ml de poudre de carboxyméthylcellulose pour chromatographie du commerce (produit de Serva Co., Inc.). On fait passer à travers cette colonne, à 200C, 100 litres d'urine humaine obtenus par dilution de 50 litres d'urine de sujets adultes sains avec 50 litres eau. A partir du début de cette opération, la vitesse d'écoulement de l'urine chargée diminue. Ce ralentissement s'accentue dans le temps. La première heure, 1,5 litre d'urine passe et,dans les six premières heures, 3 litres d'urine passent. Après 6 heures, l'urine ne passe plus. On récupère l'urokinase en opérant comme ci-dessus. On ne peut traiter que 3 litres d'urine humaine (activité urokinasique totale : 15.000 U.I.) et on voit donc que ce procédé ne peut être utilisé dans l'industrie. On traite les 3 litres d'urine pour les analyser. Quatre-vingt-dix % de l'urokinase sont adsorbés sur l'adsorbant de la colonne. On divise cette carboxyméthylcellulose en deux parties égales. On mélange une partie de cette carboxyméthylcellulose à 50C avec 750 ml d'une solution aqueuse d'ammoniaque a pH 11,8 et on mélange l'autre partie de la carboxyméthylcellulose avec 750 ml de solution tampon 1/100 M en Na2HPO4-NaH2PO4, 0,5 M en chlorure de sodium, à 0,02% (p/v) de chlorure de benzalkonium (pH = 9,0 à 5 C) qui constitue un agent gluant selon l'invention. On sépare ensuite l'éluat renfermant l'urokinase de la poudre de carboxyméthylcellulose en centrifugeant. Dans le premier cas, l'activité urokinasique récupérée par solution est de 5.400 U.I. (récupération : 36%). Dans le second cas, l'activité urokinasique récupérée par l'élution est de 10.800 U.I. (récupération : 71%). On considère que cette récupération réduite est due une perte de l'activité de l'urokinase sur la carboxyméthylcellulose avant 1 'élution. La comparaison des résultats cbtenus ci-dessus pour un passe partiel de l'urine montre que le procedé de l'invention est excellent. On répète l'expérience ci-dessus en utilisant des poudres de carboxyméthylcellulose pour chromatographie du commerce produites respective- ment par Brown Co., Inc. et Whatman Co., Inc., et on obtient les mêmes résultats indésirables. EXEMPLE 5 On garnit une colonne (2 ml ; l/d = 5) de 0,7 g de poudre de carboxyméthylcellulose pour chromatographie (CM-32 de Whatman Co., 1:'.. On fait passer à travers la colonne, à 50C, pour adsorber l'urokinase sur l'adsorbant, 100 ml d'une solution d'urokinase brute (100 U.I./ml, activité spécifique : 2.000 U.I./l mg de protéines, ayant une activité de thromboplastine correspondant à 1 mg de thromboplastine de cervelle de lapin, ce qui correspond à un rapport thromboplastine/urokinase = 0,1 g/l U.I.). On lave à l'eau la colonne de carboxyméthylcellulose ainsi obtenue. On ajuste à pH 9,0 à 50C une solution aqueuse l M en chlorure de sodium a 0,01% (p/v) de chlorure de de benzalkonium, en ajoutant une petite quantité d'une solution aqueuse d'ammoniaque pour obtenir un agent d'élution. On fait passer a travers la colonne 5 C, 25 ml de l'agent d'élution ainsi obtenu à un débit de 5 ml/heure et on recueille l'éluat avec un collecteur de fractions. L'activité urokinasique (11.000 U.I.) est présente dans la fraction allant de O à 2 RV (entre O et 4 ml) à partir du départ. On recueille dans cette fraction 110% de l'urokinase adsorbée. L'activité urokinasique spécifique de cette fraction est de 41.000 U.I./1 flg de protéines (ce qui corresond à un facteur de purification de 20,5), l'activité de thromboplastine est de 100 g, ce qui correspond à un rapport thromboplastine/urokinase de 0,01 pg/l U.I., l'opération ayant rédult le rapport initial. On obtient donc avec un rendement élevé une urokinase de bonne qualité, très purifiée, ne renfermant que des traces de thromboplastine. La fraction comprise entre 8 et 10 RV (entre 16 et 20 ml) de l'éluat a une activité de thromboplastine de 450 g (récupération : 45%). Cette fraction n'a pas d'activité urokinasique. Par conséquent on recueille dans la totalité de l'éluat 55% de la thromboplastine de la solution de départ mise en oeuvre. Le diagramme d'élution est illustré par la figure annexe l'échelle des abscisses correspond aux fractions exprimées en volumes de résine (RV), l'échelle des ordonnées de gauche représente l'activité orokinasique exprimée en U.I./ml et l'échelle des ordonnées de droite correspond à l'activité de thrombopiastine exprimée en g/ml, les zones "U" correspondant à l'urokinase et les zones "T" correspondant à la thromboplastine. On calcule l'activité de la thromboplastine comme précédemment. Les exemples précddents montrent donc que, lorsqu'on éle l'urokinase avec un agent d'élution de l'invention, on récupère avec un rendement élevé de l'urokinase très purifiée et qu'on peut facilement éliminer les matières de type thromboplastine qu'il est difficile d'éliminer selon les procédés classiques. Bien entendu diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. TABLEAU I Poids d'eau @ Volume de Vitesse Taux d'ab- Activité Echan- (g) ajoutée Degré de solution d'alimen- sorption récupérée tillon par gramme dilution mise en tation (%) par rapport n d'urine hu- oeuvre à l'activit maine frai RV 8V . de départ che (%) 1 0 1 72 18 9 4 2 0,5 1,5 108 27 25 16 3 1 2 144 36 72 92 4 2 3 216 54 82 100 5 3 4 288 72 78 94 6 6 5 6 432 108 63 80 7 7 7 8 576 144 54 71 8 10 11 792 198 - 60 9 9 . 12 13 936 234 - 52 15 16 1 152 288 TABLEAU II Poids de Poids d'aci- Rapport Volume % pondé- Degré de Produit NaOH de mono- molaire d'eau ral de substi- n (g) chloroacé- NaOH/acide (ml) NaOH tution tique (g) monochlo roacétique 46 60 1,81 610 7 0,03 3 46 120 1,27 1.080 4 0,02 4 68 90 1,78 570 11 0,06 7 91 120 1,79 570 14 0,12 9 91 91 2,36 500 15 0,16 11 Il 121 91 6,33 800 13 0,07 14 184 181 2,40 800 19 0,23 20 TABLEAU III Poids de Poids d'acide Rapport mo- % pondé- Degré de Produit NaOH monochloroacé- laire NaOH/ ral de substitution n (g) tique acide mono- NaOH (g) chloroacé tique 68 90 1,78 11 0,06 21 91 90 2,38 10 0,08 22 120 118 2,38 13 0,089 26 128 126 2,38 14 0,110 27 136 134 2,38 14,5 0,124 28 146 144 2,38 15,4 0,168 24 160 158 2,38 16,7 0,193 31 184 181 2,38 18,7 0,218 39 204 202 2,38 20,3 0,230 40 128 142 2,10 13,8 0,120 34 144 126 2,70 15,2 0,116 32 TABLEAU IV Composition de la solution d'élution Activité Activité ré- activité U.I. Facteur de Colonne NaCl pH (NH3 Tensio-actifs cationiques urokina- cupérée pour 1 mg de purifican aqueux) (% p/v) sique éle- (%) protéines tion* vée (U.I.) 1 0,5 M 8,0 0 0 0 0 2 " " 0,01% de chlorure de benzal- 605 120 15.000 375 konium 3 " " 0,0002% de chlorur de benzé- 560 110 14.000 350 thonium 4 " " 0,03% de chlorure de stéaryl- 670 130 12.500 313 triméthylammonium 5 " " 0,05% de chlorure de lauryl- 680 135 11.000 275 pyridinium 6 " 11,8 0 280 55 440 11 *Facteur de purification : activité de l'urokinase purifiée/activité de l'urokinase brute. R E V E N D I C A T I O N S Procédé pour produire de l'urokinase, caractérisé en ce qu'il consiste à (1) mettre de l'urine humaine ou une solution d'urokinase brute provenant de l'urine humaine au contact d'un adsorbant pour adsorber l'urokinase, et (2) éluer l'urokinase adsorbée avec une solution d'un agent tensio actif cationique. 2. Procédé pour préparer de l'urokinase selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'adsorbant est choisi parmi une résine échangeuse de cations, une carboxyalkylcellulose, le carboxyméthylséphadex, des fibres d'une résine de polyacrylonitrile, du gel de silice-bentonite, de la diéthylaminoéthylcellulose, du diéthylaminoéthylséphadex et de la phosphocellulose. 3. Procédé pour préparer de l'urokinase selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent tensio-actif cationique est choisi parmi les sels de tétraalkylammonium, les sels de cétyltrime-thylammonium, les sels de stéaryltriméthylammonium, les sels d'alkyî supérieur araLkylammonium quater- naire, les sels d'alkyl supérieur diméthylbenzylammonium, les sels de diméthylbenzyllaurylammonium, les sels d'alkylaryl supérieur ammonium quaternaire, les sels dlalkyl supérieur diméthylphénylammonium, les sels d'arylaralkylalkyl- ammonium quaternaire, les sels de diméthylphénylbenzylammonium, les sels d'alkylpyridinium supérieur, les sels de laurylpyridinium et les sels de polyalkylnaphtalène-méthylpyridinium dont le radical alkyle est un radical alkyle inférieur renfermant jusqu'à 6 atomes de carbone ou un radical alkyle supérieur comportant environ 10 à 20 atomes de carbone et le radical aryle est le radical phényle. 4. Procédé pour preparer de l'urokinase selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on obtient l'urine humaine en diluant de l'urine humaine de sujets sa nus de départ avec de lleau, dans un rapport de 0,5 à 12 g d'eau par gramme d'urine de départ. 5. Procédé pour préparer de l'yurokinase selon la revendication t, caractérisé en ce que la carboxylakylcellulose est constitue de fibres de cellulose, telles que du coton absorbant ou de la gaze carboxyalkylées. 6. Procédé pour préparer de l'urokinase selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on arrête l'élution de l'urokinase avant 1'élution (désorption) de l'activité de thromboplastine.