Brevet FR2345464A1 — publié le 19771021

La transformation de stéroEdes par des microorganismes a été très étudiée et a fait l'objet de nombreuses publications0 Apparemment, le travail le plus ancien sur ce sujet est celui de Mamoli et Vercellone, paru en 1937 dans "Ber.", 70, 470 et "Ber." 70, 2079. Ces auteurs ont décrit la réduction de 17-cétostéroSdes en 17f3-hydroxystéroides par fermentation sous action d'une levure. Plus tard, Peterson et Murray ont décrit la 1 la-hydroxylation de la progestérone avec le champignon Rhizopus nigricans (voir brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 2 602 769 (1952).Plus récemment, Kraychy et Collaborateurs (brevet des Etats-Unis d'Amérique No 3 684 657) ont décrit la dégradation microbiologique sélective de composés 17-alkyliques stéroldiques par fermentation d'un stéroTde contenant au moins 8 atomes de carbone dans la channe latérale 17-alkylique avec Mvcobacterium sp.NRRL B-3683 pour préparer l'androst-4-ène-3,17- dione,l'androst-1,4-diène-3,17-dione et la 20a-hydroxyméthyl- prégna-1,4-diène-5-one.Encore plus récemment, Marsheck et Collaborateurs (brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 3 759 791) ont décrit la préparation microbiologique sélective de l'androst-4-ène3,17-dione par fermentation d'un stéroïde de la série du cholestane ou du stigmastane contenant au moins 8 atomes de carbone dans la channe latérale 7-alkylique avec Mycobacterium sp. NRRM B-3805. li'invention concerne des mutants qui sont caracté- risés par l'aptitude à dégrader sélectivement des stéroïdes ayant des chatnes latérales 17-alkyliques-de2 à 10 atomes de carbone et à accumuler de l'androsta-1,4-diène-3,17-dione appelée ci-après ADD, et de l'androst-4-ène-3,17-dione, appelée ci-après AD, dans un bouillon de fermentation.Ces mutants peuvent être obtenus à partir de micro-organismes des genres suivants, en utilisant les procédés de mutation décrits dans le présent mémoire ou d'autres procédés de mutation Arthrobacter, Bacilles, Brevibacterium, Corvnebac- terium, Microbacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia et Streptomyces. Un genre très avantageux est le genre Mycobacterium.Des espèces illustrant ce genre comprennent les es pèces M. phlei, M. smegmatis, M. rhodochrous, M. mucosum, M. fortuitum et M. butyricum. Il sera spécialement question, dans le présent mémoire, des micro-organismes mutants nouveaux appelés Mycobacterium fortuitum NRRL B-8153 et Mycobacterium Phlei, NRRL B-8154, qui sont utilisés pour dégrader sélectivement des stéro!- des ayant des channes 17-alkyliques de 2 à 1 atomes de carbone, en AAD et AD.Des exemples de substrats stéroldiques convenables comprennent le sitostérol, le cholestérol, le stigmastérol, le campestérol et des stéroïdes similaires, à channes latérales 17-alkyliques en C2 à C100 Ces substrats stéroïdiques peuvent être sous la forme pure ou sous la forme brute. Micro-organismes utilisés Des mutants qui sont caractérisés par leur aptitude à dégrader sélectivement des stérides ayant des channes latérales 17-alkyliques en C2 à C0 et à accumuler les substances ADD et AD dans le bouillon de fermentation peuvent entre obtenus par mutation de micro-organismes des genres suivants Arthrobacter, Bacilles Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacterw Serratia et Streptoxyces. Les espèces Mycobacterium fortuitum, AXCC 6842 et Mycobacterium phlei, UC 3533 ont été mutées, comme décrit dans le présent mémoire, pour former de nouveaux organismes mutants de laboratoire. Le catalogue "ATCC" de 1974 indique ce qui suit à propos de ATCC 6842 : "J.C. Cruz 2. Abcès froid. Acta Med. Rio de Janeiro 1:1 (1936). Milieu 90 37C't. M. fortuitum, ATCC 6842,dégrade non sélectivement les stérols en composés de faible poids moléculaire, par exemple C02 + 1120. Ainsi, ce micro-organisme ne convient pas pour dégrader sélectivement les stéroSdes. Ma mutation de M. fortuitum. ATCC 6842 et M. phlei UC 3553 (Uc= désigne la Collection de Culture de la firme The Upjohn Company) en utilisant la nitrosoguanidine a entraîné la production de nouveaux mutants qui dégradent sélectivement des stéroïdes ayant des chatnes latérales 17-alkyliques en C2 à C10 pour produire ADD et AD. Ces micro-organismes mutants ont été affectés des numéros respectifs NRRL B-8i53 et NRRL B-8154 par le Northern Regional Research iaboratory, Ministère de l'Agricul- ture des Etats-Unis d'Amérique, Peoria, Illinois, Etats-Unis drA mérique, dans la Collection Permanente duquel ils ont été déposés. Une sous-culture de ces micro-organismes est fournie par cet Institut sur simple demande. il y a lieu de remarquer que la disponibilité des cultures ne permet pas pour autant la mise en pratique de la présente invention,en dérogation à la loi sur les brevets d'invention. lies micro-organismes de la présente invention ont été distingués de Wycobacterium species NRRL B-3805 décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 3 759 791 précité. B'espè- ce NRRL B-3805 a les caractéristiques générales de Mycobacterium Vaccae, qui est une espèce nettement différente de M. fortuitum et de M. phlei de l'invention (voir 1t3ergeyTs Manual of Determinative Bacteriology??, 8ème édition, The Williams and Wilkins Company, 1974, pages 695 et 696, pour une comparaison de ces micro-organismes. lia morphologie et la sensibilité aux médicaments de M. fortuitum NRRL B-8153 et M. phlei NRRL B-8154 ne se distinguent pas de celles des parents respectifs, à savoir M. fortuitum ÂTCC 6842 et M. phlei, UC 3533. lies cultures de M. fortuitum et de M. phlei consistent en bacilles non sporogènes, non motiles, résistant aux acides, appartenant à la famille des Mycobacteriaceae, de l'ordre des Astinomycétales. Conformément à la classification de Runyon (E.H. Runyon, 1-959, "Med. Clin.North America" 43:273), M. fortuitum est une mycobactérie non chromogène du Groupe IV, ctest-à-dire qu'il se développe rapidement aux basses températures en produisant des colonies non pigmentéeisur des milieux relativement simples. M. phlei est aussi une mycobactérie du Groupe IV, mais produit des colonies dont la couleur va du jaune vif à l'orangé par culture sur des milieux simples. M. fortuitum ATGG 6842 et M. fortuitum NRRL B-8153 se distinguent nettement par leur action sur les molécules sté nordiques. somme indiqué ci-dessus, M. fortuitum ATCC 6842 dégrade non sélectivement les stéroSdes, tandis que M. fortuitum NRRS B-8153 effectue une dégradation sélective. Cette propriété de M. fortuitum NRRL B-8153 en fait un micro-organisme de grand intérêt, comme on le démontrera.De plus, M. phlei UC 3533 et M. phlei NRRL B-8154 se distinguent également par leur action sur les molécules de stérordes. M. phlei Un 3533 effectue une dégradation non sélective tandis que NRRL B-8154 est capable d'une dégradation sélective. les mutations respectives de B: Fortuitum ATCC 6842 et M. phlei UC 3533 en M. fortuitum NRRL B-8153 et M. phlei NRRL B-8154 ont été effectuées en utilisant la nitrosoguanidine. lies détails du mode opératoire sont indiqués cidessous. Bien que des processus de mutation soient connus d'une façon générale dans la pratique, aucune technique connue n'enseigne ni ne laisse meme entrevoir le type éventuel de mutants que l'on pourrait obtenir en utilisant le procédé de mutation conforme à l'invention.De même, bien que les procédés de mutation et de transformation décrits dans le présent mémoire soient illustrés pour le cas dtun Mycobacterium, il y a lieu de remarquer que des procédés similaires ou équivalents peuvent entre utilisés avec des micro-organismes d'autres genres, comme décrit dans le présent mémoire. Procédé de transformation La transformation élective de la présente invention peut entre con-duite dans une culture en phase de développement de M. fortuitum NRRL B-8153 ou de M. phlei NRRL B-8154 par addition du substrat stéroldique choisi à la culture pendant la période d'incubation ou par l'incorporation de ce substrat au milieu nutritif avant l'inoculation. lie stéroide peut litre ajouté individuellement ou en association avec un autre stéroSde. La gamme préférée,mais non limitative, de concentration du stéroïde dans la culture va d'environ 0,1 à environ 100 g par litre.La culture est effectuée dans un milieu nutritif contenant une source de carbone, par exemple un glucide assimilable,et une source d'azote, par exemple un composé azoté ou une matière protéinique assimilable. lies sources préférées de carbone comprennent le glucose, la cassonade, le saccharose, le glycérol, l'amidon, l'amidon de maïs, le lactose, la dextrine, les mélasses, etc. Des sources avantageuses d'azote comprennent l'extrait soluble de maTs, la levure, le produit d'autolyse de la levure de bière avec les matières sèches du lait, la farine de soja, la farine de graine de cotonnier, la farine de maTs, les matières sèches du lait, le produit de digestion pancréatique de la caséine, la farine de poisson, les matières sèches de distillerie, les liqueurs peptonées animales, les déchets de viande et d'os, les sels d'ammonium, etc. On peut utiliser avantageusement les mélanges de ces sources de carbone et d'azote Les métaux à ltétat de traces, par exemple le zinc, le magnésium, le manganèse, le cobalt, le fer. etc., n'ont pas à autre ajoutés auxmiîieux de fermentation, attendu que l'eau de ville et les ingrédients non purifiés sont utilisés comme composants du milieu avant la stérilisation de ce dernier. La transformation peut durer de 72 heures à 15 jours ou plus. La température d'incubation peut aller d'environ 25 à environ 370C, cette température étant de préférence égale à 300C pour NRRD B-8153 et à 350C pour NRRI; B-8154. lie contenu est aéré à l'air stérilisé et agité pour faciliter la croissance du microorganisme et par conséquent pour améliorer l'efficacité du processus de transformation. Lorsque le processus de transformation est terminé, comme le fait apparattre la chromatographie en couche mince sur des plaques de gel de silice (E. Merck, Darmstadt) en utilisant un mélange de solvants formé d'acétate éthylique et de cyclohexane à 2:3 en volume, les stéroldes transformés désirés sont recueillis par des moyens bien connus dans la pratiquez Par exemple, le mélange réactionnel ayant subi la fermentation (transformation), comprenant la liqueur de fermentation et les cellules, peut entre extrait avec un solvant organique non miscible à l'eau,qui dissout les stéroïdes.Des solvants convenables comprennent le dichlorométhane (solvant préféré), le-chlorure de méthylène, le chloroforme, le tétrachlorure de carbone, le dichloréthylène, le trichloréthylène, ltéther, l'acétate d'amyle, le benzène, etc. A titre de variante, la liqueur de fermentation et les cellules peuvent tout d'abord entre divisées par des opérations classiques, par exemple par filtration ou par centrifugation, puis extraites séparément avec des solvants convenables. lies cellules peuvent être extraites avec des solvants miscibles ou non miscibles à liteau. Ma liqueur de fermentation, débarrassée des cellules, peut litre extraite avec des solvants non miscibles à lteau. lies extraits peuvent entre filtrés sur de la terre de diatomées et le filtrat peut être distillé à sec sous vide. lie résidu obtenu contenant les stérordes transformés désirés peut ensuite entre dissous dans un volume minimal de mélange d'acétate éthylique et de cyclohexane à 20:80. Cette solution peut ensuite entre chromatographiée sur du gel de silice anhydre,en utilisant un mélange de solvants formé d'acétate éthylique et de benzène, à 20:80. lies composés ADD et AD peuvent être séparés du gel de silice par élution avec le mélange de solvants formé d'acétate d'éthyle et de chloroforme à 15::85. lies composés peuvent ensuite être isolés individuellement par évaporation du solvant et recristallisation dans l'hexanes lies produits désirés du procédé de transformation de la présente invention sont les intermédiaires stéroldiques ADD et AD connus. Ces composés sont intéressants à utiliser comme composés intermédiaires dans la synthèse d'hormones stéroïdiques utiles. Par exemple le composé ADD peut litre utilisé pour la préparation de l'oestrone conformément au procédé décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 274 183.De mime, le composé AD peut etr Wtilisé pour préparer la testostérone, conformément aux procédés décrits dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique N 2 143453, N 2 253 798, N 2264888 et N 2356 154. Le procédé et les produits de la présente invention sont illustrés par les exemples suivants, donnés à titre non limitatif. Tous les pourcentages sont exprimés en poids et toutes les proportions des mélanges de solvants sont exprimées en volume, sauf spécification contraire. Exemple 1 Préparation du mutant M. fortuitum NRRL B-8153 à partir de M. fortuitum ATCG 6842. (a) Mutagenèse à la nitrosognnnidine On cultive des cellules de M. fortuitum ÂTCC 6842 à 280C dans le milieu d'ensemencement stérile suivant Bouillon nutritif ("Difco") 8 g/l Bouillon de levure 1 g/l Glycérol 5 g/l Eau distillée, quantité suffi sante pour ... 1 litre On ajuste le pH à 7,0 par addition d'hydroxyde de sodium 1 N avant de stériliser le milieu à 1210C pendant 20 mi nutes. lies cellules sont cultivées jusqu'à une densité de population d'environ 5 x 108 par millilitre, concentrées par cen trifugation puis lavées avec un volume égal de citrate de sodium 0,1 M stérile (pH 5,6). lies cellules lavées sont remises en suspen sion dans le mdme volume de tampon au citrate, un échantillon en est prélevé en vue du titrage (comptage des cellules) et de la nitrosoguanidine est ajoutée jusqu'à une concentration finale de 50 Fg/mle On fait incuber la suspension de cellules à 370C dans un bain-marie pendant 30 minutes, puis on prélève de nouveau un échantillon en vue du comptage des cellules et on centrifuge le reste en lavant le culot de centrifugation a-ec un volume égal de phosphate de potassium 0,1 M stérile (pH 7,0). Enfin, on remet les cellules en suspension dans un milieu minimal stérile contenant des sels, privé de source de carbone, de composition suivante NH4NO3 1,0 g/l K2HP04 0,25 g/l Mg8O4.7H20 0,25 g/l Nacl 0,005 g/l FeSO40 71120 0,001 g/l Eau distillée, quantité suffi sante pour 1 litre On ajuste le pH à 7,0 par addition d'acide chlorhy drique normal avant d'effectuer la stérilisation à 1210C pendant 20 minutes. lies cellules sont ensuite transférées dans des boftes de Pétri pour la sélection des mutants. (b) Sélection et isolement du mutant M. fortuitum NRRL B-8153 Des cellules ayant subi la mutagénèse, comme décrit ci-dessus, sont diluées et les dilutions sont étalées dans des bottes de Pétri contenant un milieu de composition suivante (ver sion modifiée du milieu de Phraser et Jerrel, 1963, "J. Biol. Chem.'1, 205:291-295) Glycérol 10,0 g/l K2HP04 0,5 g/l NH4Cl 1,0 Cl MgSO4. 7H20 o,5 g/l BeCl3.6H20 0,05 g/l Eau distillée, quantité suffi sante pour 1 litre On ajoute 15 g/litre de gélose et on autoclave le milieu à 1210C pendant 30 minutes, puis on le verse dans des bottes de Pétri stériles. La croissance sur ce milieu élimine la plupart des auxotrophes nutritionnels produits par le processus de mutagénèse; par exemple, les cultures qui requièrent des vitamines, des facteurs de croissance, etc., pour se développer sur un milieu chimiquement défini sont éliminées. Après incubation à 280C pendant environ 7 jours, les colonies résultantes sont repiquées dans des bottes d'essai qui conviennent pour la sélection des mutants-puis elles sont ramenées sur des bottes témoins contenant le milieu à base de glycérol. Ces bottes témoins sont préparées d'après les indications données par G.E. Peterson, H.,li. Lexis et J.R. Davis, 1962, dans "Preparation of uniform dispersions of cholesterol and other water-insoluble carbon sources in agar mendia", J.Lipid Research 3:275-276 . lie milieu minimal contenant les sels que lton utilise dans ces bottes est celui qui a été décrit ci-dessus, dans la partie (a) de l'exemple 1. On ajoute de la gélose (15 g/litre) et une source convenable de carbone (1,0 g telle quelle sitostérol ou llantrostène-dione (AD), et on autoclave la suspension résultante pendant 30 minutes à 121 C. lie mélange chaud stérile est ensuite versé dans un mélangeur stérile, agité pendant plusieurs minutes, puis versé dans des bottes de Pétri stériles. Un moussage tend à se produire dans cette opération, mais on peut réduire la mousse en agitant le mélange à chaud et en flambant la surface de la gélose fondue contenue dans les bottes.On obtient ainsi des dispersions uniformes de sources de carbone insolubles dans l'eau, ce qui facilite la préparation de plaques de gélose très homogènes, mais opaques. Les colonies qui se sont développées dans les bottes témoins, mais non dans les bottes dressai contenant AD comme unique source de carbone sont purifiées par inoculation en stries de plaques de gélose nutritive. Après développement à 28'C, les clones individuels sont prélevés sur les plaques de gélose nutritive à l'aide de cure-dents stériles et testés de nouveau par inoculation de bottes quadrillées contenant la substance AD comme source de carbone0 Des isolats purifiés --qui diffèrent par le phénotype de la culture-mère sont ensuite mis à l'épreuve dans des fioles agitées par secousses. (c) Epreuve en fioles agitées par secousses On utilise des fioles de 500 ml contenant 100 ml de milieu de biotransformation renfermant les ingrédients sui vante Glycérol 10,0 g/litre K2HPO4 0,5 g/litre NH4C1 1,0 g/litre MgS04.7H20 0,5 g/litre FeCl3.6H20 0,05 g/litre Eau distillée, quantité suffi sante pour i litre On incorpore au milieu 1 g/litre de farine de soja, puis on y incorpore également 10 grammesZlitre de sitostérol. Après avoir autoclavé les fioles pendant 30 minutes à 1210C, on les laisse refroidir à 280C puis on les inocule avec 10 ml dtun inoculum préparé comme suit : lies isolats purifiés venant de la partie (b) sont cultivés sur gélose inclinée,à 280C. On utilise les cellules prélevées à l'aide d'une once sur une culture inclinée pour inoculer une fiole de 500 ml contenant 100 ml de milieu stérile d'ensemencement renfermant les ingrédients suivants Bouillon nutritif (1tDifcofl) 8 g/l Extrait de levure 1 g/l Glycérol 5 g/l Eau distillée, quantité suffi sante pour 1 litre On ajuste le pH à 7,0 par addition d'hydroxyde de sodium 1N avant d'autoclaver les fioles à 1210C pendant 20 minu tes. On fait incuber les fioles d'ensemencement à 289C pendant 72 heures0 Comme décrit ci-dessus, on utilise ensuite 10 mi d'inoculum pour inoculer des fioles de 500 ml contenant chacune 100 ml de milieu stérile de transformation.On fait ensuite incuber les fioles à 28-300C sur une secoueuse rotative et on prélève à divers intervalles des échantillons de 10 ml que l'on extrait par agitation par secousses avec trois volumes de chlorure de méthylène. Des portions des extraits sont analysées par chromatographie en couche mincie, en utilisant du gel de silice et le mélange de solvants décrit ci-dessus, c'estc-dire un mélange d'acétate éthylique et de cylohexane à 2:3 en volume, ainsi que par chromatographie gaz-liquide. La présence des substances ADD et AD confirme la dégradation sélective du sitostérol par le mutant nouveau produit à partirde Mo fortuitum ATCC 6842. Exemple 2 Transformation du sitostérol en ADD et AD. lie milieu utilisé est le meme que dans l'exemple 1 (paragraphe (c))O Ce milieu est stérilisé par autoclavage pendant 30 minutes à 121 OC puis il est refroidi à 3000 et inoculé avec dix parties d'un inoculum de la mycobactérie mutante M. fortuitum NRRS B-8153 préparée comme décrit en (c) dans l'exemple 1. On fait incuber le mélange inoculé à 30 C pendant 336 heures en agitant pour activer la croissance en immersion. Après l'incuber tion, on extrait le mélange au dichlorométhane. On déshydrate extrait sur du sulfate anhydre de sodium et on chasse le solvant par distillation sous vide.On dissout le résidu résultant dans un volume minimal de mélange d'acétate éthylique et de cyclohexane à 20:80. On chromatographie ensuite cette solution sur du gel de silice anhydre en utilisant un mélange de solvants formé d'acétate éthylique et de benzène à 20:80. La présence d'androst 4-ène-3,17-dione et d'androsta-1 ,4-diène-3, 1 7-dione est mise en évidence par la chromatographie en couche mince. Ces composés sont séparés du gel de silice par élution en utilisant comme solvant un mélange d'acétate éthylique et de chloroforme à 15:85. lies composés sont ensuite isolés par évaporation du solvant et recristallisation dans l'hexane. Exemple 3 En remplaçant M. fortuitum NURI 3-8153 par M. Phlei NRRL B-8154 dans l'exemple 2 et en remplaçant dans cet exemple également la température d'incubation de 3000 par une température d'incubation de 350C, on obtient un mélange de ADD et AD. Exemple 4 En remplaçant le sitostérol par le cholestérol dans les exemples 2 et 3, on obtient un mélange de ADD et de AD. Exemple 5 En remplaçant le sitostérol par le stigmastérol dans les exemples 2 et 3, on obtient un mélange de ADD et AD. Exemple 6 En remplaçant le sitostérol par le campe stérol dans les exemples 2 et 3, on obtient un mélange de ADD et AD. Exemple 7 En ajoutant une association de tous les stéroldes des exemples 2 à 6 au sitostérol ou en remplaçant le sitostérol par cette association dans les exemples 2 et 3, on obtient un mélange de ADD et AD. Exemple 8 En substituant dans ltexemple 1 un micro-organisme des genres Arthrobacter, Bacilles. Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia et Streptomyces aux micro-organismes Mycobacterium fortuitum ATGC 6842 et Mycobacterium phlei UC 3533, on obtient des micro organisme * utants qui sont caractérisés par leur aptitude à dégrader sélectivement des stéroldes présentant des channes latérales 17-alkyliques en C2 à C10 et à accumuler les substances ADD et AD dans le bouillon de fermentation. Exemple 9 En remplaçant Ma fortuitum NRRS B-8153 et M. phlei NRRS B-8154 dans les exemples 2 à 7 par les mutants obtenus dans l'exemple 8, on obtient les substances ADD et AD. REYiNDICATIONS 1. Nicro-organisme mutant choisi dans les genres Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia et Streptomyces, ce mutant étant caractérisé par son aptitude à dégrader sélectivement des stéroïdes ayant des channes latérales 17-alkyliques de 2 à 10 atomes de carbone et à accumuler de l'androsta-1,4-diène-3,17- dione et de l'androst-4-ène-3,17-dione dans le bouillon de fermentation, dans un bouillon nutritif aqueux, dans des conditions aérobies, en présence d'un stéroïde contenant 2 à 10 atomes de carbone dans la channe latérale 17-alkylique. 2. lie mutant nouveau de laboratoire appelé Mycobacterium fortuitum NRRL B-8153 suivant la revendication le 3. Le mutant nouveau de laboratoire appelé Myeobacterium phlei NRRL B-8154 suivant la revendication t. 4. Utilisation d'un micro-organisme suivant l'une des revendications 1 et 2 pour la préparation d'un mélange d'androsta 1,4-diène-),17-dione et d' androst-4-ène-3, i 7-dione, caractérisée par le fait que le micro-organisme est cultivé dans un milieu nutritif aqueux, dans des conditions aérobies, en présence d'un ou de plusieurs stéroIdes contenant chacun 2 à 10 atomes de carbone dans la chaine latérale 17-alkylique. 5. Utilisation suivant la revendieation 4, caractérisée par le fait que les stéroïdes sont choisis entre le sitostérol, le cholestérol, le stigmastérol et le campestérol.