Brevet FR2345998A1 — publié le 19771028

La présente invention concerne un perfectionnement apporté aux dentifrices. Un effort très important a été fait, ces dernières années ,dans le domaine des compositions dentifrices. Grtce aux nombreuses formules mises au point il est possible dlen- tretenir et de conserver les dents et les dentiers dans un état de propreté, d'hygiène ou d'éclat satisfaisant. Ces résultats sont atteints par une action d'abrasion mécanique douce, une action chimique où par la conjugaison de ces deux actions. Toutefois le problème posé par la plaque dentaire pour iådétruire, l'inhiber ou la prévenir a certes trouvé des solutions au niveau des formules des compositions dentifrices, mais ces solutions donnent pius ou moins satisfaction. On sait que la plaque dentaire est un dépôt se fixant à la surface des dents et des gencives, apparemment composé d'un agrégat de micro-organismes hétérogènes dans une matrice riche en polysaccharides et en protéines salivaires susceptibles de se minéraliser. Pour s'opposer à la formation de la plaque aussi bien sur les dents naturelles ou artificielles que sur les prothèses ou dentiers, on utilise divers procédés qui consistent, le plus souvent, à inhiber le développement des bactéries ou à agir sur la dégradation des polysaccharides formés. Par ailleurs de nombreux résultats de travaux publiés permettent d'affirmer que les enzymes doivent avoirrune action évldente dans la réduction de la formation de la plaque dentaire.Mais, à la connaissance du Demandeur, il ntexiste pas de compositions dentifrices renfermant des enzymes sus- ceptibles de jouer ce rtle ou bien il ne semble pas que l'on ait su adapter cette faculté des enzymes et réaliser des compositions dentifrices renfermant des enzymes tout en étant stables dans le temps quant å leur activité. On sait en effet que pour qu'unie enzyme soit et- ficace dans une application industrielle notamment, il faut que son site actif ainsi que sa configuration soient préser vés asqutC son utilisation. Or, selon les connaissances ac tuelles, lorsquton incorpore des enzymes dans des compositions dentifrices, ces enzymes perdent, par dégradation au cours du temps, leur activité avant utilisation si bien qu'on ne connaît pas, à ce jour, de compositions dentifrices renfermant des enzymes actives pour lutter contre la plaque den- taire. La composition de dentifrice selon l'invention est essentiellement caractérisée par le fait qu'elle est constituée de deux milieux dits ci-après composants séparés, l'un à base d'une résine sous forme particulaire gélifiée ou non sur laquelle est fixée et stabilisée une enzyme, l'autre à base d'au moins un dés liants ou des ingrédients connus d'un dentifrice et renfermant un agent dont le rôle est de libérer ladite enzyme de son support au moment où ces deux composants sont mis en présence et au contact l'un de l'autre en présence d'humidité. De façon avantageuse, l'enzyme entrant dans la composition dentifrice conforme à I1 invention est une enzyme possédant au moins un groupement SH actif, par exemple une enzyme.protéolytique comme la papaine. Cette enzyme est tout d'abord purifiée par tout moyen connu en soi et en particulier par chromatographie d'affinité sur colonne de résine. L'enzyme purifiée, en solution, est alors fixéesur un support présentant, de par sa composition chimique, des sites susceptibles de réagir avec le ou les groupements SH actifs de l'enzyme pour former des niaisons avec ceux-ci. L'enzyme ainsi "chimiquement fixée et stabilisée" sur son support est disponible à tout instant avec son activité maximale à partir du moment où ces liaisons sont rompues et que l'enzyme se retrouve sous sa forme présentant les SH du site actif. On obtient ce résultat en mettant l'enzyme stabilisée au contact d'un agent réductéur. Lorsque l'enzyme est-, par exemple, la papaïne, celleci est avantageusement purifiée préalablement à sa fixation sur support en en faisant passer une solution sur une colonne de dextrines Pour la fixation on utilise avantageusement une résine à base d'agarose activé par CNBr et sur laquelle on a fait réagir, en vue de la formation d'un pont disulfure, du disulfure de 2,2'-dipyridyle sur du glutathion (gamma-L-glutamyl I,-cystéinylglycine). L'agent réducteur indispensable pour l'obtention du résultat est choisi parmi Ces réducteurs appropriés compatibles avec la composition dentifrice elle-même et l'enzyme. Ce peut être, par exemple, la L-cystéine ou le dithiothreitol. La composition selon l'invention peut contenir en outre de l'acide éthylène diaminotétraacétique (EDTA) qui contribue, d'une part, à la stabilisation de l'enzyme et qui agit, d'autre part, comme agent chélatant de certaines substances qui favorisent la formation de la plaque. Cet acide est avantageusement réparti au sein des deux composants du dentifrice selon l'invention. tans un mode de,réalisati.on préféré, le dentifrice se présente sous la forme finale d'une pâte dont les deux composants se trouvent dans un même tube distributeur mais séparés l'un de l'autre à l'intérieur de ce tube, leur mélange ne se faisant qu'au droit de l'orifice d'éjection du tube pour réaliser une pâte dont les-deux composants mis en présence réagissfent entre eux pour libérer l'enzyme-active. Celle-ci est alors immédiatement disponible au niveau des dents, des prothèses dentaires ou des dentiers sur lesquels cette pâte est appliquée. L'exemple suivant, donné à titre illustratif} nullement limitatif, fera mieux comprendre l'intérêt et la portée de l'invention : Exemple : Préparation de la composition d'enzyme a) Purif-ication de l'enzyme On dissout en chauffant légèrement 75 mg de papaïne deux fois cristallisée (qualité 11WOPTHINGTON" 33 KS 57, 16,7 unités/mg) dans 35 ml d'une solution tampon à pH 8 de tris (hydroxy-méthyl) amino-méthane-HCl O,lM additionné de 5 mM de dithiothréitol 1-4. On fait passer la solution résultante sur une colonne de dextranes. On élue au moyen d'une solution à pH 8 de tris(hydroxyméthyl) amino-méthane-HCl O,1M additionnée de 0,3M de NaCl et de 1 mM de EDTA pour éliminer le dithiothréitol. On recueille l'éluat et on dilue à 150 ml au moyen de la solution ayant servi à l'élution, ce qui donne une concentration totale en enzyme de 0,5 mg par ml soit une concentration de 3,62 x lO rnM de papaine purifiée. b) Préparation du support de l'enzyme On fait gonfler pendant. 15 minutes dans de l'eau bidistillée 8 g d'une résine constituée de perles d'agarose sur lequel on a formé, après son activation par CNBr, des ponts disulfure par suite de la réaction entre,le disulfure de 2,2'-dipyridyle et le glutathion (gamma-L-glutamyl-L-cys teinylglycine). Après gonflement on filtre sur verre fritté et on lave sur le filtre au doyen d'eau bidistillée. c) Fixation de l'enzyme Dans un bécher pn mélange. la solution de papaine telle qu'obtenue sous (a) avec la résine telle qu'obtenue sous (b) et on laisse ce mélange sous agitation pendant 16 heures à 250C. On lave alors la résine au moyen de la solution qui a servi à ia dilution de l'éluat dans la phase (a) de purification décrite ci-dessus et on contrôle la quantité de papaine présente dans cette solution de lavage. On trouve que cette quantité correspond à 1,4 xl0-3 mM. Il est donc resté, sous forme fixée à la résine, 2,22 x lO mM de papaine soit 46 mg. Le volume correspondant de résine est de 32 ml. La concentration de papaïne fixée à la résine est donc de 1,4 mg/ml de résine. La papaïne fixée sur la résine est en milieu neutre contenant 1 mM de EDTA. On a mesuré l'activité in vitro de la préparation d'enzyme ci-dessus (par la méthode décrite ci-après), après conservation à température ordinaire et en libérant l'enzyme en mettant la préparation d'enzyme en question en présence d'une solution réductrice, a savoir une solution de L-cystéine 20 mM dans la solution à pH 8 - O,lM de tris(hydroxyméthyl) amino-méthane-HCl additionnée de O,3M de NaCl et de 1 mM de EDTA. L'activité enzymatique-de départ était de 40 unités/ mg. Cette activité se retrouvait au bout de deux mois de con servation à température ambiante en présence d'un antiseptique. Un nouvél essai réalisé après une conservation de 8 mois à température ordinaire a révélé la même activité. Méthode de détermination de l'activité enzymatique Cette détermination se fait en diluant l'enzyme dans le milieu constitué de 70 ml d'eau, 10 ml de EDTA 10 mM, 0,1 ml de dithiothréitol 30 mM et 10 ml de L-cystéine 50 mM, préparés extemporanément. La concentration de l'enzyme dans ce milieu doit être comprise entre 0,05 et 0,1 mg/ml. On met l'enzyme en présence d'un milieu à base d'un substrat constitué dresser éthylique de l'alpha-N-benzoyl-L- arginine (BAEE) à une concentration de 0,041M. Le milieu d'essai contient 592 mg de BAEE dans 30 ml d'eau, 1,6 ml de EDTA 10 mM et 1,6 ml de B-cystéine 50 mM. On le dilue à l'eau jusqu'à 42 ml et on contrôle le pH qui doit être dé 6,2. L'essai s'effectue en utilisant un pH-stat avec 5 ml du milieu ci-dessus- de BAEE, 5 ml d'une solution aqueuse de NaCl 3M, 5 ml de H2Q et l ml de la solution d'enzyme dans son diluant tel que défini ci-dessus. L'activité se titre avec une solution de NaOH 1/lOON en notant le nombre de ml de solution de NaOH par minute nécessaire pour maintenir le pH à 6,2. L'activité spécifique est alors également donnée par la relation Activité spécifique = . nb. de ml NaOH par minute x 1000 x 0,01. mg d'enzyme utilisée Les limites de toxicité due au dentrifice réalisé selon l'invention sont celles de l'enzyme utilisé, limites qui, dans le cas de la papaine, sont bien connues. Par ailleurs, appliqué en pâte dont l'un des. composants est une pâte de pH 6 à 6,5 à base par exemple de glycérol renfermant de la L-cystéine (ou du dithiothréitol 30 mM) à la concentration de 50 mM et de ltEDTA à la concentration de 10 mM par îoe ml de pâte et l'autre composant est une préparation de papaine fixée sur sa résine telle que décrite ci-dessus eventuellement additionnée de glycérol à raison de 20'à 40 % en vue de parfaire sa stabilité, ces deux composants se trouvant séparés dans un tube unique et se mélangeant à la sortie de ce dernier, le dentrifice ainsi réalisé s'est avéré être excessi vement actif contre la plaque dentaire pour détruire celle-ci et la prévenir aussi bien sur les dents naturelles que sur des prothèses. Des essais ont en effet été effectués en laboratoire pour mon- trer cette activité en procédant sur des prothèses recouvertes de dépôts, lesquels ont pu être éliminés par simple brossage avec le dentrifice selon l'invention. De façon pratique et avantageuse, il ressort de ces essais que si l'on prend comme référence la quantité de protéines, en poids, fixées par la plaque dentaire sur l'ensemble des dents, soit environ 15 mg à détruire par brossage, il faut environ 0,5 ml de résine à la papaine pour détruire en une minute ces protéines : Il s'ensuit que pour un brossage indispensable de 3 minutes, il faudra au maximum 0,15 ml de cette préparation. Ces 0,15 ml devront se mélanger extemporanément avec l'autre constituant qui sera par exemple constitué par un gel glycériné contenant, pour 1 litre de gel 20 mM cystéine pH=8 Tris(hydroxyméthyl)aminométhane-HCl - 0,1M ) 0,3M NaCl 1 mM EDTA Pour chaque brossage, le tube devra fournir les constituants du dent'ifrice dans une pr proportion de 2 ml de ce gel pour 0,15 ml de la résine-papaïne active. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre purement explicatif et nullement limitatif et que toute modification utile pourra y être apportée sans sortir de son cadre tel que défini par les revendications ci-apres. REVENDICATIONS 1. Composition de dentifrice, caractérisée par le fait qu'elle est constituée de deux milieux ou composants séparés, l'un à base du produit résultant de la condensation d'une résine sous forme particulaire gélifiée ou non comportant dans sa structure moléculaire un pont disulfure et d'une enzyme à groupement SH dans son site actif, l'autre à base d'au moins un des liants ou des ingrédients principaux connus d'un dentifrice et renfermant un agent réducteur libérant de son support la dite enzyme sous sa forme active au moment où ces deux composants sont mis en présence et au contact l'un de l'autre en présence d'humidité. 2. Composition de dentifrice selon la revendication 1, caractérisée par le fait que l'enzyme est une enzyme protéolytique à groupement SH dans son site actif- telle que la papaïne. 3. CompGsition de dentifrice selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée par le fait que l'agent réducteur est la L-cystéine ou le dithiothréitol. 4. Composition de dentifrice selon l'une quelconque des revendications- 1 à 4, caractérisée par le fait qu'au moins l'un de ses deux composants renferme en outre de l'acide éthylènediamino-tétraacétique. 5. Dentifrice destiné à lutter contre ou à prévenir la plaque dentaire, caractérisé par le fait qu'entre dans sa composition une enzyme contenant un groupement SH dans son site actif.