Brevet FR2348494A1 — publié le 19771110

La présente invention concerne un procédé de mesure de la teneur en acides biliaires à l'aide de dérivés conjugués marqués. On sait de manière générale que la concentration totale en acides biliaires est élevée chez les patients souffrant de troubles hepatobiliaires. Les acides biliaires primaires, l'acide cholique et chénodésoxycholique, sont secrétés par le foie sous forme de conjugués de la glycine ou de la taurine et stockés dans la vésicule biliaire. Bien que quelques uns de ces composés soient absorbés au niveau de la vésicule biliaire et passent dans le sang, la plupart sont envoyés avec la bile, par le canal biliaire commun, vers l'orifice duodénal, où ils facilitent l'absorption du cholestérol, ainsi que la digestion et l'absorption des acides gras. Les acides biliaires conjugués non utilisés sont absorbés par les vaisseaux sanguins au niveau du duodénum et renvoyés vers le foie par le système porte-hépatique. Les acides biliaires non récupérés au niveau du duodénum sont fréquemment transformés en acides biliaires secon- daires sous l'action de la flore intestinale. Ces composés sont ê leur tour absorbés par les vaisseaux sanguins et renvoyés vers le foie par le système porte-hépatique.Chez les sujets normaux, les acides biliaires conjugués sont éliminés de la circulation par le foie et recyclés sous forme d'acides biliaires primaires conjugués. Lorsque les hépatocytes ont été "endommagés" par uoeinfection ou des agents chimiques; ils ne sont plus capables de recycler normalement les acides biliaires. La quantité de cellules affectées se traduit par une relation quantitative entre les différents conjugués d'acides biliaires primaires et leurs conjugués secondaires correspondants. De nombreuses techniques ont été utilisées pour mesurer la teneur en acides biliaires, avec des résultats variés. La chromatographie gaz-liquide (G-LC) a été l'une des techniques les plus intéressantes, mais elle nécessite des échantillons relativement importants du sérum du patient, un équipement motteux, et un prétraitement considérable de l'échantillon pour isoler les acides biliaires conjugués et les acides biliaires non conjugués. Le prétraitement de l'échantillon comprend l'isoliement la saponification, et l'obtention de dérivés, ce qui fait que la G-LC n'est pas A la portée des laboratoires ordinaires. Un essai radioim3unologique sensible (Ru) concernant les conjugués de l'acide cholique, un acide biliaire primaire, a été décrit par Simmonds et coll. Radioimmunoassay of Conjugated Cholyl Bile Acids in Serum; Gastroenterology 65: 705-711 (1973). Ce groupe de la Mayo Clinic a montré que cet RIA était spécifique pour les conjugués de l'acide cholique.D'autres essais cliniques effectués å la Mayo Clinic of Rochester, Minnesota, comme l'indiquent Korman et coll., dans le New England Journal of Medicine, 290:1399 (1974), ont révélé la présence d'une teneur élevée de conjugués du type cholate dans le sérum des patients souffrant d'hépatite chronique, chez lesquels les autres fonctions du foie étaient normales, et chez des patients souffrant d'une hépatite virale anictérique.L'utilité clinique de cet essai a été démontrée chez 38 patients souffrant d'une hépatite active chronique, le Ru des conjugués du type cholate se révélant être un indicateur plus sensible de la maladie que les essais classiques (taux de rétention de la sulfo bromophtaleine, temps de pro-thrombine, teneur en bilirubine dans le sérum, teneur totale en protéines, phosphatase alcaline, et transaminase). Les taux d'acides biliaires dans le sérum exprimés en conjugués du type cholate, précèdent l'élévation de la teneur en enzyme dans le sérum chez les patients qui présentent finalement une diminution. Bien que cette technique de la Mayo Clinic présente une bonne spéclficité pour les conjugués du type cholate, on ne peut pas effectuer de distinction entre les conjugués de glycine et de taurine. G. M. Hurphy et colT. (The Preparation and Properties of an Antiserum for the Radioin'unoassay of Serum Conjugated Cholic kcid, Clinica Chimica Acta, 54: 81-89, (1974)) a repris les travaux de Simmonds et coll., en utilisant une technique différente de couplage hepténique, avec pratiquement les memes résultats. Bien que les acides biliaires, par exemple sulfolitho colique, colique, chénodésoxycholique > désoxycholique, lithocholique et leurs conjugués avec des aminoacides comme la glycine et la taurine puissentetre préparés sous la forme tritiée (3B), que l'on utilise dans les essais décrits ci-dessus, ces composés ne conviennent pas comme marqueurs dans les essais immunologiques habituels, car ils nécessitent 1) l'utilisation de compteurs P comateux, que la plupart des laboratoires cliniques ne possèdent pas; 2) l'utilisation de "cocktails" ou fluides pour scintillation;; 3) l'utilisation de fioles spéciales, pour le comptage, dans lesquelles la solution de marqueur doit etre transférée; et 4) le rejet de résidus radioactifs de solvant organique ("cocktail" usé). On a donc cherché un essai pouvant etre mis en oeuvre directement sur un échantillon de sérum, et donnant des renseignements d'ordre hépatique, en ce qui concerne un conjugué d'acide biliaire primaire spécifique, et son conjugué correspondant d'acide biliaire secondaire, et pouvant etre mis en oeuvre directement à l'aide d'un appareil d'analyse, sans qu'il soit nécessaire d'utiliser des fioles ou solutions spéciales. La présente invention concerne en particulier l'étude des fonctions du foie chez les Entres humains et les animaux å sang chaud, et concerne plus particulièrement un procédé de mesure de la teneur en acides biliaires conjugués avec la glycine, spécifiques, dans le sérum, ce qui donne des renseignements concernant le fonctionnement du foie.Le procédé en question permet de mesurer la teneur, dans un échantillon, d'un acide biliaire primaire conjugué avec la glycine, immunoréactif, spécifique, soit la cholylglycine (CG), soit la chénodésoxycholylglycine (CDG); ce procédé permet également de mesurer la teneur des acides biliaires secondaires correspondants, conjugués avec là glycine, iimminoréactifs, soit la désoxycholylglycine (DG), soit la sulfolithocholylglycine (SL Le procédé comprend les étapes suivantes : obtention d'un antisérum spécifique pour l'un des acides biliaires conjugués avec la glycine; mélange d'un échantillon de sérum avec l'antisérum, et le mame dérivé d'acide biliaire conjugué avec la glycine, dans lequel la fraction tyramine ajoutée peut ensuite etre marquée par un marqueur connu. Comme marqueurs, on citera les substances pouvant etre physiquement décelées, par exemple agents chimiques fluorescents, isotopes radioactifs, enzymes, et analogues; incubation du mélange pour fixer les anticorps de l'antisérum sur l'acide biliaire conjugué avec la glycine, de l'échan- tillon, et sur le dérivé marqué de l'acide biliaire conjugué avec la glycine; séparation des produits ayant fixé l'anticorps des produits n'ayant pas fixé l'anticorps; et mesure de la teneur en dérivé marqué dans l'une des fractions obtenues et séparées, la quantité de conjugué d'acide biliaire spécifique dans ltéchantillon pouvant etre déterminée par comparaison avec un échantillon témoin. Bien que la technique décrite ci-dessus puisse etre utilisée pour mesurer la teneur en acides biliaires conjugués avec la glycine dans un échantillon quelconque, la description ci-après se réfère à un essai non limitatif sur le sérum. L'une des fonctions principales du foie concerne le recyclage des acides biliaires et des conjugués des acides. Une altération de cette fonction se traduit par une altération des diagrammes des conjugués d'acides biliaires dans le sérum. La teneur en conjugués d'acide biliaire spécifiques est donc un moyen de déceler un trouble hépatobiliaire. L'invention propose une technique sensible et directe de détermination et de mesure de la teneur d'un acide bifilaire spécifique conjugué avec la glycine, dans le sérum, servant d'indication sur le fonctionnement du foie, au moyen des dérivés d'acide biliaire conjugué avec la glycine. La technique selon l'invention permet de déterminer si le foie considéré est malade ou endommagé, et de déceler la présence, chez les humains,de troubles hépatobiliaires, parmi lesquels l'hépatite virale, les affections malignes du foie, la cholestase, la cirrhose hépatique, et l'atrésie biliaire. Se-lon la technique de l'invention, il est essentiel d'utiliser un antisérum fortement spécifique pour chacun des acides biliaires conjugués avec la glycine considérés. L'antisérum spécifique pour chacun des conjugués respectifs d'acide biliaire a pour base un acide biliaire pur. Les acides biliaires conjugués avec la glycine, pouvant Strie obtenus dans le commerce, peuvent être purifiés à titre individuel par une chromatographie en couche mince, par les techniques classiques. Les marqueurs portant des radioisotopes émettant un rayonnement 7, ou des enzymes, ou des molécules fluorescentes, ou des conjugués de résonance du spin électronique (ESR) sont supérieurs aux marqueurs tritiés de la technique antérieure, car on peut les utiliser directement dans un instrument d'analyse, sans fioles ou solutions spéciales.Les marqueurs pour acide biliaire ou conjugué d'acide biliaire correspondant à chacune de ces classes peuvent etre préparés de la manière suivante I. rsdioisotopes émettant un rayonnement Y (1251, 131I 75Se) I Se > Ces radioisotopes peuvent etre incorporés par préparation des dérivés suivants d'acide biliaire - - X ou BA - R - X Dans ce composé BA représente l'acide biliaire ou son conjugué, généralement avec la glycine ou la taurine; R représente un groupe d'espacement ou de liaison consistant en un reste aliphatique, aryle ou arylaliphatique; X représente un reste de composé pouvant etre marqué par un radioisotope émettant un rayonnement 7. On citera en particulier la tyrosine, la tyramine, l'histidine et l'histamine.Les polymères ou copolymères contenant ces groupes sont également utiles en ce qui concerne leur marquage par le radicisotope. Pour les acides biliaires et conjugués contenant des groupes sulfate, le groupe sulfate peut etre remplacé par un groupe sélénosulfate contenant comme radioisotope l'élément 75Se, selon la technique décrite par D. L. Klayman, Klayman and Gunther, editors, Organic Selenium Compound: Their Chemistry and Biology, Interscience, New York, 1973,p.151. D'autres réactions permettant d'introduire l'élément 75Se dans le marqueur pour acide biliaire peuvent être trouvées aux chapitres III, IV, et dans d'autres chapitres de cet ouvrage. La cholylglycyltyramine est préparée de la manière ci-dessous et est marquée par l'iode -125, par une modification de la technique à la chloramine T de Greenwood et coll., (Greenwood, F. C., Hunter, W. M., and Glover, J.S. Biochem. J., 89, 114 (1963)).L'iodation a lieu sur le cycle tyramine et le composé cholylglycyl-iodotyramine se révèle être impossible à distinguer, d'un point de vue immunologique, de la cholylglycine, lorsque l'on utilise un antisérum de lapin correspondant à un produit de conjugaison de cholylglycine et d'albumine du sérum bovin. Ce marqueur répond à la formule - x dans laquelle BA représente la cholylgycine et X représente l'iodotyramine (I-125) ou BA -R-X dans laquelle 'k représente l'acide cholique, R représente 1 glycine, et X représente l'iodotyramine (I-125). II. Acides biliaires marqués par un composé fluorescent On peut les préparer par fixation de molécules fluorescentes sur l'acide biliaire ou son conjugué. Ces composés répondent à la formule BA -F ou sA - R - F dans laquelle 'k représente l'acide biliaire ou son. conjugué, R représente un groupe d'espacement ou de liaison tel que défini sous I ci-dessus, et F représente une molécule fluorescente, par exemple isocyanate de fluorescéine, 4-méthylumbelliférone, ou naphtyîamîne. On fait réagir la cholylglycine sur I'éthylènediamine, en utilisant un carbodiimide soluble dans l'eau, pour donner (I) la cholylglycyléthylamine. On fait ensuite réagir ce composé (I) sur l'isocyanate de fluorescéine pour donner le composé de formule Cholylglycyl fluoresceine III. Acides biliaires a marquage de spin On utilise ces composés avec un appareillage permettant l'étude de la résonance du spin électronique, et on les prépare de manière analogue aux acides biliaires à marquage fluorescent, sauf en ce que l'on remplace le groupe isocyanate de fluorescéine par un N-isocyanate, N représentant un groupe fonctionnel contenant un électron non apparié, de préférence un groupe oxyde d'azote ou "nitroxide". Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 Dérivé de la tyramine de la sulfolithocholylglycine. Cette substance est obtenue sous la forme d'un produit solide jaune ptle correspondant au sel de pyridinium de la 3-sulfolithocholylglycyltyramine. On pense qu'il s'agit d'un monohydrate de poids moléculaire 730. Ce composé est très soluble dans le méthanol et 1'méthanol, légèrement soluble dans l'eau, et presque insoluble dans Itéther ou le chlorure de méthylène. Sa pureté est estimée à 95 % sous la forme obtenue. La préparation comprend les étapes suivantes 1. Le sel de diammonium de l'acide 3-sulfoglycolithocholique est préparé par la technique décrite par Palmer et Bolet, J. Lipid Research, 12, 671 - 679, (1971), en partant du sel de sodium de l'acide glycolithocholique, qui est un produit connu; 2. le sel de diammonium est converti en le sel de di-pyridinium; 3. on fait réagir sur la tyramine, en utilisant le dicyclohexylcarbodiimide (DCCI) dans la pyridine; 4. on élimine la dicyclohexylurée et les autres sousproduits par un traitement alterné par l'eau, le chlorure de méthylène et le méthanol. Une chromatographie en couche mince (TLC) révèle la présence d'une nouvelle substance principale, et d'une petite quantité d'une impureté plus lipophile. La tyramine libre est absente. Le spectre de RMN révele-la présence des systèmes cycliques lithocholique, de tyramine, et de pyridine, ainsi que le groupe CH2-glycine, approximativement dans les proportions attendues. Le groupe sulfate est décelé par le spectre IR (pas -l tille de KBr) qui révèle une absorption à 1215 cm , et également par l'analyse élémentaire du soufre. Analyse élémentaire Calculée (monohydrate) Calculée (dihydrate) Trouvée C39H57N307S,H20 G39H57N307S , 2fil20 S 4,67 4,39 4,29 C 62,6 64,1 62,6 H 8,30 8,14 8,21 N 5,90 5,75 5,63 Cendres Aucune Par des techniques semblables, on prépare la cholyglycinetyramine, la lithocholictyramine et la désoxycholictyramine. REVENDICATIONS 1. Procédé de mesure de la teneur en un acide biliaire conjugué avec la glycine, spécifique, choisi parmi la cholylglycine, la chénodésoxycholylglycine, la désoxycholylglycine, et la sulfolithocholyl- glycine, dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes (a) obtention d'un antisérum spécifique vis-à-vis de l'un des acides biliaires conjugués avec la glycine; (b) mélange de l'échantillon avec ledit antisérum et le dérivé de tyramine du méme acide biliaire conjugué avec la glycine, marqué par un marqueur;; (c) incubation du mélange de l'étape (b) de manière à fixer les anticorps dudit antisérum sur l'acide biliaire conjugué avec la glycine dudit échantillon, et sur ledit dérivé marqué de tyramine de l'acide biliaire conjugué avec la glycine; (d) séparation des substances ayant fixé l'anticorps des substances n'ayant pas fixé l'anticorps; et (e) mesure de la radioactivité dans l'une des fractions obtenues à l'étape (d), ce qui permet de déterminer la quantité de conjugué de l'acide biliaire spécifique, par comparaison avec un témoin. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en 125 ce que le marqueur consiste en l'isotope radioactif 125I. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la fraction séparée soumise à la mesure est celle contenant le dérivé de tyramine de l'acide biliaire conjugué avec la glycine, marqué par un élément radioactif, et fixé aux anticorps. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la fraction soumise à la mesure est celle contenant le dérivé de tyramine d'acide biliaire conjugué à la glycine, marqué par un élément radioactif, mais non fixé aux anticorps. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'antisérum est spécifique vis- -vis de la sulfolithocholylglycine, et en ce que le dérivé de tyramine d'acide biliaire conjugué à la glycine, marqué, est la sulfoîithochoîylglycyltyramine. 6. Procédé selon la revehdication 1, caractérisé en ce que l'antisérum est spécifique vis- -vis de la chénodésoxycholylglycine et en ce que le dérivé de tyramine de l'acide biliaire conjugué à la glycine, et marqué, est la chénodésoxycholylglycyltyramine. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'antisérum est spécifique vis-b-vis de la cholylgycine et en ce que le dérivé de tyramine de l'acide biliaire conjugué à la glycine, et marqué, est la cholylglycyltyramine. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'antisérum est spécifique de la désoxycholylglycine et en ce que le dérivé de tyramine de l'acide biliaire conjugué la glycine, et marqué, est la désoxycholylglycyltyramine. 9. Procédé de mesure de la teneur en sulfolithocholylglycine dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes (a) obtention d'un antisérum spécifique de la sulfolitho cholylglycine; (b) mélange de l'échantillon avec ledit antisérum et la sulfolithocholylglycyltyrantine marquée par le radioisotope I; (c) incubation du mélange de l'étape (b) de manière à fixer les anticorps dudit antisérum sur la sulfolithocholylglycine dans ledit échantillon, et sur ladite sulfolithochoîylglycyltyramine marque; (d) séparation des substances ayant fixé les anticorps, d'avec les substances n'ayant pas fixé les anticorps; ; (e) mesure de la radioactivité dans la fraction contenant la sulfolithocholylglycyltyramine a marquage radioactif, n'ayant pas fixé les anticorps; et (f) comparaison du pourcentage de radioactivité des substances n'ayant pas fixé les anticorps avec le pourcentage de radioactivité comparable, dans une solution témoin. 10. Nouveau composé, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi la sulfolithocholylglycyltyramine, la chénodésoxycholylglycyltyramine, la cholylglycyltyramine et la désoxycholylglycyltyramine. 11. Nouveau composé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il consiste en la sulfolithochoiylglycyltyramine. 12. Nouveau composé selon la revendication 11, caractérisé en ce qutil est marqué par 1251.