Brevet FR2321296A1 — publié le 19770318

La présente invention concerne de nouveaux agents antibactériens dénommés BM-123 &gamma;1 et BM-123 &gamma;2, leur procédé de préparation par fermentation, leur récupération et la concentration des solutions brutes et leur purification. L'invention vise également les agents antibactériens sous forme diluée, en concentré brut et sous forme pure. Les effets des nouveaux agents antibactriens sur des micro-organismes spécifiques, ainsi que leuispropriétés chimiques et physiques, les différencient des agents antibactériens précédemment décrits. Les antibactériens BM-123 yl et BM-123 Y2 sont des isomères de structure représentés par les formules développées I et II ci-après respectivement H CH3 HHO a0 H H HOH H0 X 9E H Y--NH HC-N H C=0 H NH 0 H NH Il -C=O I I o I C=NH 2 | ss - NH2 NH2 I trans 9 I ~ CH=CH-C-NH-(CH2)3-NH-(CH2)4 MI2 I, BM-123 H H H3 H O H O H HLr H I HHNHCHN ?H H 0 X H I Il NH C NH H NH H il I I o c=o C=o C=NH I I I NH2 NH2 NH2 trans 9 IbNH-(CH2)3-NH-(CH 3 II, 2 3 2 4 2 Il, Bl23 Les nouveaux agents antibactériens selon l'invention sont des bases et sont donc capables de former des sels addition d'acidesavec divers réactifs salifiables organiques et inorganiques. Les sels d'addition d'acides formés par mélange de l'antibactérien base libre avec jusqu'à 3 équivalents d'un acide, avantageusement dans un solvant neutre, sont donc formés avec des acides tels que l'acide sulfurique, placide phosphorique, l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfamique, l'acide citrique, l'acide maléique, l'acide fumarique, l'acide tartrique, l'acide acétique, l'acide benzoïque, l'acide gluconique, l'acide ascorbique, etc. Les sels d'addition d'acides des agents antibactériens selon l'invention sont en général des solides cristallisés relativement solubles dans l'eau, le méthanol et l'éthanol, mais relativement isolubles dans les solvants non polaires tels qu'éther diéthylique, benzène, toluène, etc. Pour les buts de l'invention, les antibactériens bases libres sont équivalents à leurs sels d'addition d'acides non toxiques.On désignera ci-après par BM-123 7 un mélange en toutes proportions de Boa123 Y1 et de BM-123 Les nouveaux agents antibactériens dénommés Boa123 71 et BP-123 32 sont formés par culture en conditions contrôlées d'une nouvelle souche d'une espèce indéterminée de Nocardia. Cette nouvelle souche productrice d'antibiotiques a été isolée d'un échantillon de sol de jardin recueilli à Oceola dans Iowa et elle est conservée dans la production de cultures de la division Lederle Laboratories de la société demanderesse, à Pearl River, New York, sous le nom de culture n BM-123.Une culture viable du nouveau micro-organisme a été déposée au Culture Collection Laboratory, Northern Utilization Research and Development Division, Département de l'Agriculture des Etats-Unis d'Amérique, Peoria, Illinois, et a été ajoutée à cette collection permanente. Elle est librement accessible au public sous le n NRRL 5646. On trouvera ci-après une description générale du micro-organisme Nocardia sp. NRRL 5646, d'après les caractéristiques diagnostiques observées. On a observé les caractéristiques de culture, physiologiques et morphologiques de l'organisme selon les méthodes décrites en détail par Shirling and Gottlieb dans Internat. Journ. of Syst. Bacteriol. 16 pages 313-340 (1966). La composition chimique de la culture est déterminée par les modes opératoires décrit par Lechevalier et Col. dans Advan. Appl. Microbiol. 14, pages 47-72 (1971). Les couleurs descriptives soulignées et les désignations codées de couleurs sont celles de Jacobson et col. dans Color Harmony Manual, 3ème édition (1948), Container Corp. of America, Chicago, Illinois. Les détails descriptifs sont rassemblés dans les tableau a V ci-après. Croissance Modérée sur géloses à l'extrait de levure, asparaginedextrose, de Benedict, de Bennett, pomme de terre-dextrose et de Weinstein; légère sur géloses de Hickey et Tresner, pâte de tomate, farine d'avoine et gélose nutritive; et à l'état de traces sur géloses amidon-sels inorganiques, flocons d'avoine de Kuster, solution de Czapek et gélose au riz. mycélium aérien Mycélium aérien blanchâtre, s'il existe; produit seulement sur géloses à l'extrait de levure, à l'asparagine-dextrose, de Benediet, de Bennett et pomme de terre-dextrose. Pigments solubles Pas de production de pigments solubles. Couleur de l'envers Incolore à nuances jaunâtres. Réactions physiologiques diverses Pas de liquéfaction de -la gélatine, nitrates réduits en nitrit en 7 jours; pas de formation de pigments mélanoides sur gélose à la peptone-fer; pas de peptonisation ou de formation de caillebote dans le lait de pourpre de bromocrésol; tolérance à NaCI dans la gélose à l'extrait de levure : ) 4% mais Gottlieb dans J.Bacteriol. 56, pages 107-114 (1948) : bonne utilisation du glycérol, de la salicine, du d-tréhalose et du dextrose; assez bonne utilisation du i-inositol; et mauvaise utilisation ou pas d'utilisation du d-fructose, du maltose de l'adonitol, du l-arabinose, du lactose, du d-mannitol, du d-mélibiose, du d-raffinose, du l-rhamnose du saccharose et du d-xylose. Composition chimique L'organisme appartient au type IV de parois cellulaires, c' est-è-dire qu'il contient de l'acide méso-2,6 diaminopimélique et possède un schéma de sucres de cellules entières de type A, c'est A-dire qu'il contient de l'arabinose et du galactose. Les extraits de cellules entières méthylés, soumis à la chromatographie gazeuse indiquent des schémas d'acides gras semblables d ceux produits par Nocardia asteroides ATCC 3308. Micromorphologie Le mycélium aérien s'élève du mycélium de substrat en éléments flexibles de longueur moyenne rarement ramifiés qui se terminent couramment en spirales primitives allongées. Les éléments flexibles sont irrégulièrement segmentés en sections elliptiques à cyclindriques courtes (spores 3) qui se désarticulent facilement. Les portions terminales des spirales sont moins visiblement segmentées. Les segments ont généralement des dimensions de 0,8-1,7 x en moyenne de 0,4 x 1,2 . Diagnostic Les caractéristiques morphologiques de la culture BM-123 sont difficiles à observer et à interpréter à cause du mauvais développement du mycélium aérien sur la plupart des milieux. Par conséquent, on attache une importance considérable, hors nécessité, à llanalyse chimique dans la détermination de la relation de genre de l'organisme. Sur la base du système proposé par Lechevalier et Col., la culture BM-123 contient de l'acide méso-2,6 diaminopimélique dans ses cellules complètes, et l'analyse des sucres montre la présence d'arabinose et de galactose. La culture appartient donc au type IV de parois cellulaires. Une comparaison du diagramme de chromatographie gazeuse due la culture BN-l23, avec celui de Nocardia asteroides ATCC 3308 montre que les deux sont remarquablement semblables. D'autres caractéristiquesde la culture BM-123, qui sont à considérer en rapport avec la notion de Nocardia, sont sa croissance aérienne fragmentée sur certains milieuxet l'absence totale de croissance aérienne sur la plupart des milieux. En l'absence de critères appropriés pour la caractérisation de Nocardia au niveau de l'espèce, on n'a pas tenté d'effectuer cette détermination. On considère donc que la culture BMW123 est une espèce indéterminée de Nocardia, Jusqul ce qu'un diagnostic soit possible. Il est entendu que pour la production de ces nouveaux agents antibactériens, l'invention n'est pas limitée à ce microorganisme particulier ou à des organismes répondant totalement aux caractéristiques de croissance et aux caractéristiques microscopiques ci-dessus. qui sont données seulement à titre d'illustration. En effet, l'invention vise également l'utilisation de mutants produits à partir de cet organisme par divers moyens tels que l'exposition aux rayons X, aux radiations ultraviolettes, à la moutarde azotée, aux actinophages, etc. TJne culture viable d'une telle souche de mutant a été déposée au Culture Collection Laboratory, Northern Utilization Research and Developemet Division, Uni tex States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, et elle a été ajoutée à sa collection permanente sous le n NRRL 8050. Bien que les caractéristiques de culture, physiologiques et morphologiques de NRRL 8050 soient sensiblement les memes que celles de NRRL 5646, le mutant NRRL 8050 produit de plus grandes quantités de BM-123 pendant la fermentation aérobie. Le mutant NRRL 8050 se distingue également de la souche mère IJRXL 5646 par les points suivants (a) réduction plus lente des nitrates en-nitrites et (b) production d'un pigment marron-bois de rose sur gélose de Bennett et gélose à l'extrait de levure. Les agents antibactériens ont été comparés in vitro avec utilisation de diverses bactéries Gram positives et Gram négatives, ainsi que M smegmatis, selon la technique classique de dilution sur gélose. Les résultats sont exprimés dans le tableau VI ci-après par les concentrations minimales inhibitrices (7/ml). On utilise comme témoin le sulfate de gentamicine. L'agent antibacterien BM-123 Y est également actif in vivo contre divers organismes. Ce nouvel antibactérien est donc potentiellement utile comme agent thérapeutique dans le traitement des infections bactériennes chez les mammifères. On peut s'attendre que le nouvel antibactérien soit utilisé utilement pour traiter ou combattre les infections bactériennes par administration parentérale. L'utilité du nouvel agent antibactérien est mise en évidence par son aptitude h combattre les infenctions létales systèmiques chez les souris. La nouvelle substance présente une activité antibactérienne in vivo chez la souris contre Proteus mirabilis.. ATCC 46713 Klebsiella pneumoniae AD et Escherichla coli US311, lorsqu'on l'administre en une seule dose sous-cutanSe à des groupes de souris Carworth Farms CF-1 d'un poids d'environ 20 g, infectées par vo4e intrapéritonéale avec une dose mortelle de ces bactéries dans des dilutions h 10-,6, 10-4 et de bouillon trypticase-soja TSP, respectivement, d'une culture de sarg TSP de 5 heures. Le tableau VII ci-après illustre l'activité antibactérienne in vivo de BM-123 Y contre ces trois bactéries. On peut cultiver Nocardia sp.NRRL 8050 dans une grande variété de milieux de culture liquide. Les milieux qui sont utiles pour la production des nouveaux antibiotiques comprennent une source de carbone assimilable telle qu'amidon, sucre, mélasses, glycérol, etc.; une source d'azote assimilable telle que protéines, hydrolysant de protéines, polypeptides, aminoacides, liqueur de trempage de mars etc.; et des anions et cations inorganiques tels que potassium, magnésium, calcium, ammonium, sulfate, carbonate, phosphate, chlorure, etc. Des oligo-éléments tels que bore, molybdène, cuivre, etc., sont fournis par les impuretés des autres constituants du milieu.On réalise l'aération dans les cuves et les bouteilles en envoyant a force un courant d'air stérile sous la surface du milieu de fermentation. On agite encore dans les cuves au moyen d'un agitateur mécanique. On peut ajoute, si nécessaire, un agent antimousse tel que Hodag FI > 82. Préparation de l'inoculum pour BM-123 7 On prépare un inoculum primaire de Nocardia sp. NRRL 8050 en flacon agité en inoculant 100 ml de milieu iiquide stérile dans des fioles de 500 mi avec des spores recueillis par grattage ou lavage d'une gélose inclinée de la culture. On utilise ordinairement le milieu suivant Bacto-tryptone 5 mg Extrait de levure 5g Extrait de viande de boeuf 3 g Glucose 10 g Eau q.s.p. 1000 ml On fait incuber les flacons à une température de 25-29 C, de préférence 28 C, et on agite vigoureusement sur une secoueuse rotative pendant 30 à 48 heures.On transvase ensuite les inoculums dans des tubes de culture stériles à bouchon à vis et on les conserve au-dessous de -17,8 C. On utilise cette réserve dtinoculums végétatifs au -lieu de gratter l'inoculum sur la gélose inclinée pour l'incoîuation d'autres fioles agitées dans la préparation de ce premier stade d'inoculums. On utilise ces inoculums de premier stade pour ensemencer des lots de 12 litres du même milieu dans des fermenteurs en verre de 20 litres On aère la bouillie d'inoculum avec de ltair stérile en poursuivant la croissance pendant 30 à 48 h. On utilise des lots de 12 litres dtinoculums de second stade pour ensemencer des fermenteurs contenant 300 litres du milieu liquide stérile suivant pour produire le troisième et dernier stade d'inoculums : Matières solubles de viande 15 g Sulfate d'ammonium 3g Phosphate dipotassique 3 g Carbonate-de calcium 1 g Sulfate de magnésium heptahydraté 1,5 g Glucose 10 g Eau q.s.p. 1 000 ml On stérilise le glucose séparément. On aère l'inoculum de troisième stade avec 0,4 à 0,8 1 d'air stérile par litre de bouillon et par minute et on agite le mélange de fermentation avec un agitateur mécanique tournant à 150-300 tr/mn. On maintient la température à 25-290C > ordinairement 280C. On poursuit la croissance pendant 48 à 72 heures, après quoi on utilise l'inoculum pour ensemencer un fermenteur de 3000 litres. Fermentation en cuve pour le BM-123 7 Pour la production de BM-123 Y en fermentateurs on utilise de préférence le milieu de fermentation suivant Matières solubles de viande 30 g Sulfate d'ammonium 6g Phosphate dipotassique 6 g Carbonate de calcium 2 g Sulfate de magnésium hep tahydra té 3 g Glucose 20 g Eau q.s.p. 1000 ml On stérilise séparément le glucose. On inocule chaque cuve avec 5 à 10% d'inoculum de troisième stade préparé comme décrit ci-dessus. On maintient la bouillie de fermentation à une température de 25-280C, ordinairement 260C. On aère la bouillie avec de l'air stérile à un débit de 0,3-0,5 litre d'air par litre de bouillie et par minute et on agite avec un agitateur mécanique tournant à 70-100 tr/mn. On laisse la fermentation se poursuivre pendant 65-90 heures et on récolte la bouillie. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. Dans ces exemples, on fait référence aux spectres infrarouge et de RNN des dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 représente le spectre infrarouge du mélange BM-123 &gamma;1 + BM-123 72 (BM-123 r) en pastilles de KBr; - la figure 2 représente le spectre infrarouge du BM-123 &gamma;1 en pastilles de KBr; - la figure 3 représente le spectre infrarouge du BM-123 &gamma;2 en pastilles de KBr; - la figure 4 représente le spectre de RMN du BM-123 &gamma;1 dans les deux zones, enregistré avec un appareil fonctionnant à 100 MHz; et - la figure 5 représente le spectre de RMN du BM-123 72 dans les deux zones, enregistré sur un appareil fonctionnant à 100 MHz. Exemple 1 Préparation de l'inoculum pour le BM-123 r On prépare un milieu de composition suivante pour faire pousser l'inoculum de premier et de second stades Bacto-tryptone 5 g Extrait de levure 5 g Extrait de viande de boeuf 3 g Glucose 3g Eau q.s.p. 1 000 ml On inocule deux flacons de 500 ml contenant chaque 100 ml de milieu stérile ci-dessus avec 5 ml chacun d'un inoculum végétatif congelé de Nocardia sp. NRRL 8050. On place les flacons sur une secoueuse rotative et on agite vigoureusement pendant 48 heures à 28 C. On transvase l'inoculum résultant dans un fermenteur en verre de 19 litres contenant 12 litres du milieu stérile ci-dessus.On aère la bouillie avec de l'air stérile et on effectue la culture pendant environ 48 heures, apres quoi > on utilise le contenu du fermenteur pour ensemencer un fermenteur de 380 litres du milieu liquide stérile suivant Matières solubles de viande 15 g Sulfate d'ammonium 3g Phosphate dipotassique 3 g Carbonate de calcium lg Sulfate de magnésium heptahydraté 1,5 g Glucose 10 g Eau q.s.p. 1 000 ml On stérilise séparément le glucose On aère la bouillie d'inoculum de troisième stade avec de l'air stérile injecté dans le fermenteur à un débit de 0,4 litre d'air par litre de bouillie et par minute. On agite avec un agitateur mécanique tournant à 240 tr/mn.On maintient la bouillie à 28CC et on utilise du Hodag FB82 comme agent antimousse Après une durée de croissance de 48 heures, on utilise la bouillie d'inoculum pour ensemencer un fermenteur de 3000 litres. Exemple 2 Fermentation utilisant Nocardia sp. NRRL 8050 pour la production de BM-123 &gamma; On prépare un milieu de fermentation de composition suivante Ratières solubles de viande 30 g Sulfate d'ammonium 6g Phosphate dipotassique 6 g Carbonate de calcium 2 g Sulfate de magnésium heptahydraté 3 g Glucose 20 g Eau q.s.p. 1 000 ml On stérilise séparément le glucose. On stérilise le milieu de fermentation à 120 C par la vapeur sous 9 kg pendant 60 mn. Le pH du milieu après stérilisation est de 6,9. On inocule 3000 1 de milieu stérile dans un fermenteur de -4000 litres, avec 300 litres d'inoculum tel que décrit à 11 exemple 1 et on effectue la fermentation à 260C en utilisant du Hodag FB82 comme agent antimousse. On aère le milieu à un débit de 0,35 litre d'air stérile par litre de bouillie et par minute On agite la bouillie avec un agitateur mécanique tournant à 70-72 tr/mn. On récolte la bouillie apres une durée de fermentation de 67 heures. Exemple 3 Isolement du BM-123 Y On ajuste à pH 7,0 par l'hydroxyde de sodium un lot de 3000 litres de bouillie de fermentation préparée comme décrit à l'exemple 2, ayant un pH de 4,3, et on filtre en utilisant 5% de terre d'infusoire comme auxiliaire de filtration. On lave le gâteau de filtration avec environ 100 litres d'eau et on le jette. On réunit le filtrat et la liqueur de lavage et on envoie par pompage de bas en haut à travers trois colonnes parallèles de 21 x 122 cm en acier inoxydable contenant chacune 15 litres de résine CK Sephadex C-25 (forme Na+). On lave les colonnes chargées avec un total d'environ 390 litres et ensuite on développe avec 200 litres de chlorure de sodium aqueux à 1% puis 560 litres de chlorure de sodium aqueux à 5%.On clarifie 1'éluat de chlorure de sodium à 5% par filtration sur terre d'infusoires et on fait passer le filtrat clarifié sur une colonne en verre de 23 x 152 cm contenant 25 litres de charbon actif granulaire DARCO (0,42-0,84 mm). On lave la colonne chargée avec 120 litres d'eau et ensuite on développe avec 120 litres de méthanol aqueux à 15% puis 340 litres de méthanol aqueux à 50% et enfin 120 litres d'acétone aqueuse à 50%. On ajuste l'éluat méthanolique à 50% de pH 4,65 à 6,0 par de la résine Amberlite IR 45 (forme OH ). On sépare la résine par filtration, et on concentre le filtrat sous vide jusqu'à environ 6,3 litres et ensuite on lyophilise pour obtenir 213 g de substance consistant principalement en BM-123 &gamma;. On ajuste l'éluat acétonique à 50% de pH 4 > 0 à 6,0 par l'Amberlite IR 45 (forme OH-). On sépare la résine par filtration et on concentre le filtrat sous vide jusqu'à environ 1,5 litre et ensuite on lyophilise pour obtenir 56 g de BM-123 Y impur. Exemple 4 Purification du flN123 Y On verse une bouillie de résine CM Sephadex C-25 (forme NH4+) dans le chlorure d'ammonium aqueux à 2 X dans une colonne de verre de 2,6 cm de diamètre jusqu'à une hauteur de résine d'environ 62 cm. On élimine l'excès de chlorure d'ammonium aqueux à 2% et on dissout un échantillon de 5,0 g de BM-123 r préparé comme décrit à l'exemple 3 dans environ 10 ml de chlorure d'ammonium aqueux à 2% et on applique la solution sur la colonne. On élue ensuite la colonne avec un gradient entre 6 litres de 2 à 4% de chlorure d'ammonium aqueux. On recueille automatiquement toutes les 15 minutes des fractions d'environ 75 mi chacune. On localise l'antibiotique DM-123 7 par passage de l'effluent à l'ultraviolet et par bioautographie par la technique du disque de papier sur de grandes plaques de gélose ensemencées avec Klebsiella pneumoniae, souche AD. La majeure partie du BM-123 r est localisée entre les fractions 71 et 107 incluses. on met en suspension dans l'eau 730 mi de charbon activé Darco granulaire (0,42-084 irna); on fait passer dans une colonne en verre, on laisse déposer et on élimine l'excès d'eau. On combine les fractions 84-96 incluses de la chromatographie sur CM Sephadex ci-dessus et on fait passer sur la colonne de charbon granulaire. On lave la colonne chargée avec 600 ml d'eau et ensuite on développe avec 1 litre de méthanol aqueux à 20% puis 1 litre d'acétone aqueuse a 50%. On concentre sous vide ces éluats qui contiennent tous deux le BM-123 Y pour obtenir des phases aqueuses qui donnent par lyophilisation un total de 886 mg de BM-123 Y sous la forme chlorhydrate.On obtient un échantillon microanalytique en répétant le procédé ci-dessus avec la substance obtenue. L'antibiotique BM-123 7 ne possède pas de point de fusion défini,mais la décomposition progressive démarre au voisinage de 200 C. La micro-analyse d'un échantillon équilibré pendant 24 heures dans une atmosphère à 22,20C et 23% d'humidité relative donne les résultats suivants: C 39,44%, H 6,10%, N 16,19%, Cl (ionique) 11,54%, pertes au séchage 8,19%. Le BM-123 7 en solution dans l'eau donne un maximum d'absorption dans l'ultraviolet à 286 nm avec E1cm1%=250. La position de ce maximum ne varie pas avec le pH. Le BM-123 y a une rotation spécifique [&alpha;]D25 =+71 (c=0,87 dans l'eau). L'antibiotique BM-123 Y présente des absorptions caractéristiques dans l'infrarouge à 770, 830, 870, 930, 980, 1035, 1105, 1175, 1225, 1300, 1340, 1370, 1460, 1510, 1555, 1605, 1660, 1740, 2950 et 3350 cm-1. Un spectre d'absorption infrarouge standard de BM-123 r dans une pastille de KBr est représenté à la figure 1 du dessin annexé. Exemple 5 Isolement du BM-123 On verse une bouillie de CM Sephadex C-25 (forme Na+) dans le chlorure de sodium aqueux à 2% dans une colonne de verre de 2,6 cm de diamètre à une hauteur de résine d'environ 70 cm. On élimine l'excès de chlorure de sodium aqueux à 2% et on dissout dans 10 ml de chlorure de sodium aqueux à 2% un échantillon de 4,11 g contenant essentiellement du BM-123 &gamma;1 avec un peu de BM-123 &gamma;2 et d'autres impuretés, préparé comme décrit à l'exemple 3, on on l'appliqua sur la colonne. On élue ensuite en réalisant un gradient de concentration avec 4 litres de NaCl aqueux à 2% et 4 litres à 4%. On recueille automa tiquement toutes les 15 mn des fractions d'environ 75 ml chacune.On localise l'antibiotique BM-123 &gamma; par examen de l'effluent de la colonne en lumière ultraviolette et bioautographie, par la méthode au disque de papier sur de larges plaques de gélose ensemencées avec Klebsiella pneumoniae souche AD. La majeure partie du BM-123 Y est localisée entre les fractions 64 et 90 incluses; les fractions initiales(64-80) contiennent un mélange de BM-123 Y1 et BM-123 &gamma;2, tandis que les dernières fractions(81-90) contiennent du BM-123 Y1 sensiblement pur. On met en suspension dans 11 eau 100 ml de charbon actif DARCO granulaire (0,42-0,44 mm), on le place dans une colonne de verre, on laisse déposer et on élimine l'excès d'eau. On combine les fractions 81 à 90 incluses de la chromatographie ci-dessus sur CM Sephadex et on fait passer sur la colonne de charbon granulaire.On lave la colonne chargée avec 500 ml d'eau et on développe ensuite avec 500 ml de méthanol aqueux 10% puis 1 litre de méthanol aqueux à 50%. L'éluat méthanolique aqueux à 50% contient la majeure partie du BM-123 &gamma;1 on ajuste à pH 5,9 à 6,0 par la résine Amberlite IR-45 (forme OH);on sépare la résine par filtration et on concentre le filtrat sous vide jusqu'à une phase aqueuse et on lyophilise pour obtenir 294 mg de BM-123 &gamma;1 amorphe blanc sous la forme chlorhydrate. L'antibiotique BM-123 &gamma;1 ne possède pas de point de fusion défini mais la décomposition progressive commence au voisinage de 2000C. La micro-analyse d'un échantillon équilibré pendant 24 heures en atmosphère à 220C et 60% d'humidité relative donne les résultats suivants: C 37,84%, H 5,73%, N 15,58%, Cl (ionique) 10,01%, pertes au séchange 10,45%. Dans le méthanol, le BM-123 &gamma;1 donne un maximum d'absorption dans l'ultraviolet à 286 nm avec E1cm1%=225. La position de ce maximum ne varie pas avec le pH. Le BM-123 Y1 possède une rotation spécifique de + 55 (c = 0,803 dans l'eau). L'antibiotique BM-123 &gamma;1 présente des absorptions caractéristiques dans l'ifrarouge à 770,830,870,930,980,1045,10,80, 1110,1125,1175,1225,1305,1345,1380,1465,1515,1560,1605,1660, 1730,2950 et 3350 cm-1. Un spectre infrarouge standard du BM-123 &gamma;1 dans une pastille de KBr est représenté dans la figure 2 du dessin annexé. Un spectre de résonance magnétique protonique standard du BM-123 &gamma;1 en solution dans D20 avec un spectromètre fonctionnant à 100 NEZ est représenté à la figure 4 du dessin annexé. Exemple 6 Isolement du BM-123 &gamma;2 On dissout un échantillon de 25g contenant principalement du BM-123 Y2 préparé comme décrit à l'exemple 3 dans environ 120 mi du chlorure de sodium aqueux à 2% et on l'applique sur une colonne contenant 1800 ml de CM Sephadex C-25 (forme Na+) dans le chlorure de sodium aqueux à 2%. On élue ensuite la colonne en réalisant un gradientavec 20 litres de Nal aqueux à 2% et 20 litres à 4%. On recueille les 12 premiers litres d'éluat dans une grande bouteille et on jette.On recueille ensuite automatiquement des fractions d'environ 800 mi toutes les 40 minutes. On localise l'antibiotique BM-123 Y en examinant les fractions en lumière ultraviolette, La majeure partie du BM-123 r est comprise entre les fractions 7 et 18 incluses. Les fractions (7 à 15) comprennent du BM-123 &gamma;2 sensiblement pur et les dernières fractions a6 à 18) contiennent un mélange de BM-123 &gamma;1 et BM-123 On met en suspension dans l'eau 600 ml de charbon actif Darco granulaire (0,42-0,44 m), on verse dans une colonne en verre, on laisse déposer et on élimine l'excès d'eau.On combine les fractions 7 à 15 incluses de la chromatographie ci-dessus du CM Sephadex et on fait passer sur la colonne de charbon granulaire. On lave la colonne chargée avec 3 litres d'eau et ensuite on développe avec 3 litres de méthanol aqueux à 10%, puis 6 litres de méthanol à 50%. On ajuste l'éluat hydrométhanolique à 10% de pH 5,8 à 6,0 par la résine Amberlite IR-45 (forme OH-). On sépare la résine par filtration et on concentre le filtrat sous vide en une phase aqueuse que l'on lyophilise pour obtenir 595 mg de BM-123 72 amorphe blanc sous la forme de chlorhydrate. On ajuste l'éluat de méthanol aqueux à SOZ de pH 4,6 à 6,1 par la résine Amberlite IR-45 (forme OH-).On sépare la résine par filtration et on en concentre le filtrat sous vide en une phase aqueuse qu'on lyophilise pour obtenir 3,645 g de BM-123 amorphe blanc sous la forme chlorhydrate. L'antibiotique BM-123 72 ne possède pas de point de fusion défini, mais la décomposition progressive commence au voisinage de 200 C. La micro-analyse d'un échantillon équilibré pendant 24 heures en atmosphère à 22 C et 60% d'humidité relative donne les résultats suivants: C 36,14%, H 5,67%, N 15,1%, Cl (ionique) 11,11%, pertes au sèchage 10,87%. Dans le méthanol, le BM-123 &gamma;2 donne un maximum d'absorption dans l'ultraviolet à 286 nm avec E1cm1%=220. La position de ce maximum ne varie pas avec le pH. Le BM-123 &gamma;2 possède une rotation spécifique de +60 (c=0,853 dans l'eau). L'antibiotique BH-123 &gamma; présente des absorptions caractéristiques dans l'infrarouge à 770, 830, 870, 950, 980, 1035, 1110, 1175, 1225, 1285, 1345, 1380, 1470, 1515, 1560, 1605, 1660, 1755, 2950 et 3350 cm-1. Un spectre infrarouge standard du BM-123 &gamma;2 dans une pastille de Kir est représenté dans la figure 3 du dessin annexé. Un spectre de résonance magnétique protonique standard du BM-123 Y2 en solution dans D20 avec un spectromètre fonctionnant à 100 MHz est représenté à la figure 5 du dessin annexé. Exemple 7 Chromatographie de distribution sur papier et chromatographie en couche mince du BM-123 r Les agents antibactériens peuvent être distingués par chromatographie sur papier. A cet effet, on fait, sur des bandes de papier Whatam n 1 des taches avec une solution aqueuse ou méthanolique des substances et on laisse stétablir l'équilibre pendant 1 à 2 heures en présence des phases supérieure et inférieure. On développe les bandes pendant-une nuit avec la phase inférieure (organique) obtenue dans le mélange phénol à 90a :m-crésol: acide acétique pyridine: eau (100 : 25 . 4 : 4 : 75 en volume).On retire les bandes développées de la chambre chromatographique, on sèche à l'air pendant 1 à 2 heures, on lave à l'éther pour éliminer le phénol résiduel et on soumet à la bioautographie sur de grandes plaques de gélose ensemencées avec Klebsiella pneumoniae souche AD. Le BM-l23 Y a un Rf de 0,85. 85. TABLEAU I Caractéristiques de culture de Nocardia sp.NRRL 5646 Incubation: 14 jours Température: 32 C Mycélium aérien et/ou Pigment Couleur de Milieu Croissance spores soluble l'envers Remarques Gélose-extrait Moyenne Mycélium aérian blan- Mustard Zones foncées dans le mycélium de de levure châtre clair (2 le) substrat Corémies formées sur le mycélium de surface Gélose de Hickey Pas de mycélium Non Incolore à Zones périphériques des colonies et Tresner aérien vert-jaunâtre devant vert olive Gélose, aspa- Modérée Traces de mycélium Non Amber Surfaces légèrement plissée ragine, dex- blanchâtre (3 lc) trose Gélose de Modérée Mycélium aérien Non Nude Tan Corémies formées en abondance sur Benedict blanchâtre clair (4 gc) le mycélium de surface Gélose de Modérée Traces de mycélium Non Camel Surface légèrement plissée Bennett aérien blanchâtre (3 ie) Gélose-amidon Traces Pas de mycélium Non Incolore sels inorgani- aérien ques TABLEAU I (suite) Milieu Croissance Mycélium aérien et/ou Pigment Couleur de Remarques spores soluble l'envers Gélose aux Traces Pas de mycélium aérien Non Incolore flocons d'avoine de Kuster Gélose à la Traces Pas de mycélium aérien Non Incolore solution de Czapek Gélose de Moyenne Mycélium aérien,blan- Non Camel pomme de châtre clair (3 ie) terre Dextrose Gélose pâte Légère Pas de mycélium aérien Non Incolore de tomatefarine d'avoine Gélose Légère Pas de mycélium aérien Non Incolore nutritive Gélose au riz Traces Pas de mycélium aérien Non Incolore Gélose de Moyenne Pas de mycélium aérien Non Incolore à Incolore à Weinstein jaunâtre Gélose aux Traces Pas de mycélium aérien Non Incolore flocons d'avoin de Kuster TABLEAU Il Micromorphologie de Nocardia Sp.NRRL 5646 Milieu Mycélium aérien et/ou structures sporifères Gélosé- Le mycélium aérien s'élève du mycélium de substrat en éléments extrait flexibles rarement ramifies, qui se terminent couramment en de spirales primitives allongées. Les éléments flexibles sont levure irrégulièrement segmentés en sections courtes (spores @) qui se désarticulent facilement. Les portions terminales des spirales sont moins visiblement segmentées. Les segments ont généralement des dimensions de 0,8-1,7 x 0,3-0,5 r en moyenne de 0,4 x 1,2 . TABLEAU III Réactions physiologiques diverses de Nocardia sp. NRRL 5646 Milieu Période d'incubation Croissance Réaction physiologique Gélatine 7 jours légère pas de liquéfaction Gélatine 14 jours bonne liquéfaction Bouillon organique 7 jours bonne nitrates réduits en au nitrate nitrites Bouillon organique 14 jours bonne nitrates réduitd en au nitrate nitrites Gélose peptone-fer 24-48 heures bonne pas de reproduction pigments de mélamine Lait au pourpre de 7 jours bonne pas de peptonisation bromocrésol ou formation de caillebotte Gélose-extrait de 7 jours moyenne tolérance à NaCl # 4% levure plus (4, 7, 10 mais 7% et 13%) de NaCl TABLEAU IV Utilisation des sources de carbone par Nocardia sp. NRRL 5646 Incubation: 10 jours Température: 32 C. Source de carbone Utilisation Adonitol O l-Arabinose 0 Glycérol 3 d-Fructose 1 i i-Inositol 2 Lactose 0 d-Mannitol 0 Salicine 2 d-Mélibiose 0 d-Raffinose 0 Rhamnose. O Maltose 1 Saccharose O d-Tréhalose 3 d-Xylose 0 Dextrose 3 Témoin négatif 0 3- bonne utilisation 1- mauvaise utilisation 2-assez bonne utilisation 0- pas d'utilisation TABLEAU V Composition chimique de Nocardia sp. NRRL 5646 Type de paroi cellulaire Constituants principaux Type IV méso-DAP, arabinose, galactose TABLEAU VI Concentration minimale inhibitrice (&gamma;/ml) Sulfate de Organisme BM123&gamma;BM123&gamma;1 BM123&gamma;2 gentamicine Mycobacterium smegmatis ATCC 607 0,25 0,1 0,25 0,1 Staphylococcus aureus Rose ATCC 12154 0,25 0,25 0,25 0,1 Staphylococcus aureus Smith ATCC 13709 0,25 0,1 0,25 0,05 Staphylococcus aureus 4050B122-3 0,25 0,25 0,5 0,25 Bacillus cereus ATCC 9634 1 0,25 0,5 0,25 Bacillus globigii 0,25 0,1 0,1 0,025 Bacillus subtilis No. 17 Stansly R-78 0,25 0,1 0,1 0,025 Bacillus subtilis No. 18 Stansly R-76 0,5 0,25 0,25 0,1 Corynebacterium xerosis NRRL B-1397 0,25 0,25 0,25 0,025 Streptococcus faecalis GK 5 2,5 2,5 2,5 Sarcina lutea ATCC 9341 1 0,5 1 0,25 Enterobacter aerogenes 0,25 0,1 0,1 0,1 Escherichia coli U-311 0,25 0,1 0,1 0,05 TABLEAU VI (suite) Concentration minimale inhibitrice (&gamma;/ml) Sulfate de Organisme BM123&gamma;BM123&gamma;1 BM&gamma;2 gentamicine Escherichia coli No. 29 0,25 0,05 0,1 0,05 Klebsiella pneumoniae AD 0,1 0,05 0,05 0,05 Proteus mirabillis ATCC 4671 0,25 0,25 0,25 0,25 Proteus morganii ATCC 8019 0,25 0,1 0,1 0,1 Proteus vulgaris ATCC 9484 0,25 0,1 0,1 0,1 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 5 2,5 5 2,5 Pseudomonas aeruginosa 1A7 10 5 10 5 Salmonella gallinarum 605 0,1 0,1 0,1 0,05 Salmonella typhosa ATCC 6539 0,1 0,05 0,05 0,1 Shigella shiga 0,25 0,25 0,25 0,25 TABLEAU VII Dose unique sous-cutanée, Taux de survie des souris mg/kg 7 jours apres infection BM123 Proteus Mirabilis 4 20120 2 9/25 1 2/20 Témoins non traités Mortalité 68/70 en 1 jour infectés après infection 4 5/5 2 8/10 1 4/10 0,5 0/10 Témoins non traités Mortalité-20/20 en 2 jours infectés après infection Dose unique sous-cutanée, Taux de survie des souris mg/kg 7 jours après infection 4 10/10 2 9/10 1 5/10 0,5 4/10 0,25 3/10 0,12 1/5 Témoins non traités Mortalité 18/20 en 3 jours infectés après infection REVENDICATIONS 1. Nouvel agent antibactérien dénommé BM-123 &gamma;1 caractérisé en ce qu'il répond à la formule CH3 H + HH H HOH o H H H NB-C-H X HO 01uNH H l-N H NB I H NCO I o | c=o CrNH NH2. I 1H2 NB2 NH2 o -trans ,, H-CH-C-NB- (CH2 > 3NB (CH2 )4NB2 et ses sels d'addition d'acides acceptables pour l'usage pharmaceutique. 2. Nouvel agent antibactérien dénommé BM-123 &gamma;2 caractérise en ce qu'il répond à la formule H H H3 H OH H OH g z zH H H H H OH H H H X NH-C-HN u H -NH NB H NB C'ti- -SH NH H O J . C=O CaNH NII2 1 NH2 NH2 l o trans . ~Ng-(CH2)3-NH-(CH2)4 NH2 2 3 (2)4-NB2 et ses sels d'addition d'acides acceptables pour l'usage pharmaceutique. 3. Procédé pour la production microbiologique des antibiotiques selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'on utilise comme micro-organisme certaines souches d'espèces indéterminée de Nocardia, ou leurs mutants, notamment Nocardia sp.NRRL 5646 ou NRRL 8050. 4. Compositions thérapeutiques caractérisées en ce qu'elles contiennent comme ingrédients actifs au moins un antibactérien selon la revendication 1 ou 2. 5. Formes d'administration des compositions selon la revendication 4.