Brevet FR2337508A1 — publié le 19770805

Il est connu de conserver divers types de produits végétaux et animaux, généralement destinés à l'alimentation, par ensilage biologique. Ceci comprend une fermentation en acide lactique des hydrates de carbone contenus dans les matières ou ajoutés à ces matières, à l'aide de bactéries formant de l'acide lactique. Au cours de la formation de l'acide lactique, on observe un abaissement du pH, ce qui permet l'effet de conservation. Un faible potentiel rédox est également obtenu, qui inhibe des dégradations par oxydation tels qu'un rancissement. L'ensilage biologique a e été pratiqué de plus en plus pour l'utilisation des aliments qui seraient sinon considérés comme des déchets et ne convenant pas à l'utilisation.Ceci est evi- demment de la plus haute importance au moment d'un manque mondial imminent de nourriture. Dans l'ensilage biologique, un milieu de croissance convenable pour les microorganismes formant de l'acide lactique est nécessaire. Dans les procédés connus jusqu'à présent, il était nécessaire de disposer d'une quantité suffisante d'hydrates de carbone (sucres) pouvant être transformés par fermentation par les microorganismes, ou bien il était nécessaire d'ajouter des enzymes ou des matières de dégradation de l'amidon, par exemple le malt, pour transformer l'amidon présent en hydrates de carbone fermentables. Ces additifs étaient nécessaires en relativement grandes quantités, normalement plus de 20 % des matières contenant de l'amidon. Au cours de l'ensilage, il est très avantageux que le produit ensilé acquière rapidement une teneur en acide lactique suffisamment élevée pour que les réactions de putréfaction ne puissent pas avoir lieu en même temps dans une trop grande mesure. Ceci nécessite de fournir des bactéries au produit ensilé, d'un type qui se développe rapidement aux faibles valeurs de pH régnant dans le produit ensilé. Cependant, dans les procédés d'ensilage antérieurement connus comme ci-dessus, on n'utilisait que des bactéries qui étaient présentes depuis le début dans la matière de départ ou l'additif. Cependant, par suite de variations du type de matière de départ et d'additif, et aussi de variations géographiques et saisonnières d'une matière en principe unique, il se produit des variations au cours de la fermentation, de sorte que l'on obtient des produits ensilés de diverses qualités. Pour obtenir un procédé d'ensilage optimal et reproductible, il serait donc très avantageux de disposer de bactéries ayant des propriétés déterminées pour I'ensIilage. De cette manière, il serait possible de régler le procédé d'ensilage dans un sens désiré et de l'adapter également à différents types de matières de départ. En outre, du fait que les sucres fermentables ainsi que les enzymes et le malt sont relativement coûteux, il est également avantageux de trouver un procédé d'ensilage biologique pouvant être mis en oeuvre en l'absence de ces matières. Cela serait possible si l'on découvrait des bactéries engendrant de l'acide lactique, capable de transformer les types peu onéreux d'amidon en acide lactique. Cependant, selon la littérature déjà connue, il n'existe pas de bactéries douées de telles propriétés. La présente invention est maintenant basée sur la découverte selon laquelle il est devenu possible, par culture sélective, de produire une souche de bactéries capable de transformer par fermentation les sucres en acide lactique à pH bas, ainsi-qu'une souche de bactéries capable de dégrader l'amidon en sucres fermentables. Selon l'invention, la première des souches précitées, ou les deux, sont ajoutées à la matière de départ à ensiler. Lorsque les sucres fermentables de la matière de départ ou de l'additif sont présents en quantité suffisante, il suffit d'ajouter la souche de bactéries qui est active à pH bas. On obtient alors une conversion en acide lactique, qui est plus rapide et plus importante que ce n'était le cas dans les procédés antérieurs. Lorsque les sucres fermentables sont absents ou qu'ils sont présents en quantité insuffisante dans la matière de départ ou l'additif, il faut également ajouter les bactéries de la souche dégradant l'amidon, car l'addition de la souche qui n'est active qu'a' pH bas entrainerait une fermentation trop lente. Il est évident que des hydrates de carbone contenant de l'amidon doivent être présents dans ce cas. Pour choisir les deux types de bactéries, on prélève deux échantillons d'un produit ensilé biologique précédent, et l'un d'entre eux est soumis à une culture répétée dans un substrat à un pH diminuant jusqu'à 4-4,7, de préférence de 4,5, tandis que l'autre est soumis à une culture répétée dans un substrat contenant de l'amidon comme seule source de carbone. Les souches choisies de cette façon sont ensuite soumises à une culture à plus grande échelle sur un substrat correspondant et sont récupérées par exemple par lyophilisation, pour être mélangées à un support, par exemple des grains sous forme grossièrement broyée jusqu'à former un concentré qui, après dilution supplémentaire, est ajouté à la matière de départ en vue de l'ensilage. Dtaprès ce qui précède, des hydrates de carbone sont ajoutés à la matière de départ pour le procédé d'ensilage, et peuvent être métabolisés en acide lactique par les bactéries ajoutées. Ces hydrates de carbone peuvent consister en diverses matières contenant de l'amidon, de préférence des produits en grains, par exemple sous forme de grains grossièrement broyés pouvant etre avantageusement ajoutés sous la forme d'un diluant du concentré de bactéries. Comme indiqué précédemment, lorsqu'on utilise les deux types de bactéries, il est inutile d'ajouter des sucres fermentables ou des agents dégradant l'amidon, mais il peut etre intéressant d'ajouter ces matières en petites quantités, car elles font démarrer la fermentation en acide lactique plus rapidement.Ceci s'applique en particulier dans le cas de l'ensilage de matières animales, mais se révèle inutile dans le cas de certaines matières végétales qui contiennent souvent des sucres fermentables depuis le début. I1 peut également être avantageux d'ajouter de petites quantités de malt, car ce dernier renferme les deux facteurs biologiques favorisant la croissance des bactéries, et des enzymes dégradant l'amidon. On peut aussi ajouter des produits dérivant du malt qui décomposent l'amidon, par exemple une diastase, ainsi que d'autres matieres dégradant l'amidon telles que des levures ou autres champignons dégradant 1'amidon. Ainsi, en résumé, les bactéries résistant aux acides doivent toujours être présentes pour garantir un démarrage rapide d'une fermentation en acide lactique et l'évolution de cette fermentation à pH bas dans le produit ensilé. Pour obtenir la matière à fermenter par les bactéries résistant aux acides, il existe toutefois diverses possibilités. Ainsi, la matière à ensiler peut elle-même contenir une quantité suffisante de sucres fermentables, ou bien ces sucres peuvent être ajoutés à la matière. De plus, la matière peut contenir de l'amidon ou peut être mélangée à de l'amidon. Dans ce cas, on doit prévoir un élément permettant la dégradation de l'amidon en sucres fermentables, cet élément consistant en malt contenant des enzymes dégradant l'amidon, par exemple une diastase, ou bien en ces dias tases ou autres enzymes dégradant l'amidon sous une forme purifiée. De plus, on peut ajouter d'autres matières dégradant l'amidon, par exemple des levures ou autres champignons dégradant l'amidon. Enfin, on peut utiliser des bactéries dégradant l'amidon, choisies selon la présente invention. I1 est évident qu'on peut utiliser ces matières seules ou en combinaisons. La condition importante est qu'il s'établisse rapidement dans le produit ensilé une fermentation en acide lactique et un faible pH, afin que des fermentations et autres réactions qui peuvent avoir lieu en même temps soient maitrisées. Si l'on désire conserver le produit ensilé pendant une longue période de temps, on doit également ajouter à la matière de départ ou à l'additif des bactéries ou forme de bâtonnets de la souche Lactobacillus, par exemple Lactobacillus plantarum. Ces bactéries se développent plus lentement dans le produit ensilé que les souches de bactéries précitées, mais résistent à un pH bas et ont donc une influence favorable sur le maintien d'une forte teneur en acide lactique pendant de longues durées de conservation. La matière à ensiler conformément à l'invention peut consister en une matière animale, par exemple divers types de viande et de poisson, et leurs déchets tels que le sang, les rognures de viande, les boyaux de poisson, etc., ou en une matière végétale telle que divers fourrages, par exemple l'herbe, le trèfle, la luzerne et les fanes de betterave à sucre, ou en déchets industriels tels que les drêches de brasseries. I1 est également possible d'appliquer l'invention pour ltensilage de fumier provenant de divers animaux tels que le bétail et la volaille. Pour obtenir un ensilage rapide et sur, les différentes bactéries doivent être ajoutées à la matière de départ ou à l'additif en une quantité fournissant au moins 103 microorganismes environ de chaque type de bactéries par gramme de mélange de matière de départ et d'additif. On opère de préférence en fournissant un concentré contenant chacun des types désirés de bactéries à une concentration de 107 à 108 microorganismes par gramme, après quoi l'utilisateur dilue le concentré avec des produits en grains, par exemple sous la forme de grains grossièrement broyés en une quantité telle que lorsque ce mélange est ajouté à la matière de départ pour l'ensilation, on obtienne la concentration requise de bactéries.Le concentré est, quant à lui, un support auquel on ajoute les bactéries lyophilisées provenant des cultures, dans lesquelles la concentration des bactéries étant habituellement de 1012 bactéries/gramme. Le procédé d'ensilage conforme à l'invention est principalement destiné à la conservation et à la préparation d'aliments, par exemple pour les animaux de ferme, la volaille et les animaux domestiques. Par un choix judicieux des conditions d'ensilage et de la matière première, par exemple des filets de poisson ou de la chair de poisson crue, il est cependant possible également de préparer des aliments destinés à la consommation humaine, ce qui entre également dans le cadre de la présente invention. La matière contenant de l'amidon etXou les sucres fermentables doivent être ajoutés en même temps que les bactéries à la matière de départ à ensiler en une proportion de 1 à 12, normalement de 3 à 10 % en poids, par rapport à la matière de départ. Dans le cas d'un ensilage de matière animale, une proportion de 9 % en poids environ convient. Cette quantité est considérablement inférieure aux quantités de matière amylacée et de malt nécessaires dans les procédés d'ensilage des types antérieurs, dans lesquels au moins 20 % en poids sont nécessaires à l'obtention de bons résultats. Ainsi, ceci constitue un grand avantage de la présente invention.lorsgu 'on ensile des matières végétales, il est généralement préférable d'ajouter 1 à 6 % en poids d'hydrates de carbone (en mélange avec des bactéries), notamment 3 % en poids environ. Le choix des bactéries utilisées selon l'invention s'effectue de la façon suivante On part d'un échantillon, prélevé de préférence d'un produit ensilé antérieur, mais pouvant également être prélevé de céréales différentes, de fourrages verts et de fumier de diverses origines. Cet échantillon est cultivé sur un substrat destiné aux bactéries engendrant l'acide lactique, par exemple de la gélose à la tomate, à environ 28 OC. Pour la culture des bactéries résistant aux acides, un nombre approprié de colonies bactériennes formées sont ensuite prélevées et transférées dans un milieu liquide faiblement tamponné ayant par exemple la composition indiquée ci-après. Au début, le pH du milieu est de 6-6,2, mais il diminue rapidement pendant la culture (en 1 jour) à moins de 4,5. On maintient à pH bas cette culture pendant une longue période de temps (environ 3 semaines) à 28 OC pour choi sir les couches résistant le mieux au milieu acide. Au bout de ce temps, les bactéries viables sont transférées dans un nouveau milieu de même composition et on abandonne de nouveau la culture pendant 3 semaines environ. Là encore, il se produit une rapide diminution du pH à moins de 4,5.Les bactéries sont encore transférées toutes les 3 semaines et ceci à 8 reprises, après quoi la souche choisie ne subit plus d'autres changements notables. Ensuite, les bactéries peuvent être cultivées à grande échelle et être liophilisées pour servir de matière de départ au concentré de bactéries. Le milieu utilisé a la composition suivante Peptone 10 g Extrait de viande 10 g Levure Glucose 20 g "Tween 80" 1 ml K2HP04 2g Acétate de sodium 5 g Citrate diammonique 2 g MgS04.7H20 200 mg MnS04.4H20 50 mg Eau distillée jusqu'à 1 litre "Tween 80" est une marque de fabrique du monooléate de polyoxyéthylène-(20)-sorbitanne. Le pH du milieu est de 6,0. Si, pour l'ensiîation, on désire utiliser le malt comme additif, il convient également d'ajouter au milieu 0,1 % d'extrait de malt afin de favoriser une meilleure croissance des bactéries dans un milieu contenant du malt. On a constaté que les bactéries choisies de cette façon sont de l'espèce Streptococcus faecalis et ont les caractéristiques suivantes Réaction Gram + Réaction à la Catalase Croissance à 15 OC + Croissance à 45 OC + Croissance à 50 OC NH3 dérivant d'arginine + Fermentation de Lactose + Maltose + Arabinose Mélézitose Mélébiose Tréhalose + Amidon Les caractéristiques de ces bactéries correspondent à la description dans "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" Edition de 1957, page 522, avec l'avantage supplémentaire de résister parfaitement à un pH inférieur à 4,5, et de se développer rapidement dans ces conditions. Pour produire les bactéries transformant l'amidon, un nombre approprié de colonies bactériennes sont prélevées de la première culture préparative et sont inoculées dans un milieu contenant de l'amidon comme seule source essentielle de carbone et, sont cultivées à environ 28 OC pendant 2 semaines, en sorte que les bactéries sont stimulées pour la production d'enzymes dégradant l'amidon. Le pH du milieu est de 6-6,2 environ. Les bactéries ainsi obtenues sont encore transférées sur un nouveau substrat avec de l'amidon comme seule source de carbone, et on répète ce procédé jusqu'à obtention d'une souche dégradant fortement l'amidon au cours d'essais sur de l'amidon coloré en bleu. Les bactéries sont ensuite cultivées à grande échelle d'une manière microaérophile sous anhydride carbonique et sont lyophilisées pour servir de matière de départ au concentré de bactéries. Lorsqu'on incorpore du malt dans l'additif pour 1'ensilage, de l'extrait de malt peut être ajouté au milieu de culture, également pour stimuler la croissance des bactéries dans un milieu comportant du malt. Le milieu de culture utilisé a la composition suivante Peptone 7 g Extrait de viande 5 g Extrait de levure 2,5 g Amidon (farine de blé) 14 g "Tween 80" 1 ml K2HP04 2,1 g Jus de tomate 35 ml Eau jusqu'à 1 litre Extrait de malt (facultatif) 1 g Ce milieu a un pH de 6,2. Les bactéries choisies de cette manière sont du genre Streptococcus et Leuconostoc, en particulier S. lactis et L. mesenteroides. Elles ont les caractéristiques suivantes Réaction Gram + Réaction à la Catalase Croissance à 15 OC + Croissance à 45 OC Croissance à 50 OC NH dérivant d'arginine + F-lnentation de Fermentation de : Lactose + Maltose + Arabinose Nélésitose - Nélibiose + Tréhalose + Amidon + Raffinose + Xylose + Les propriétés de ces bactéries correspondent à ce qui est décrit dans "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", Edition de 1957, page 525 et 531, avec en plus le fait qu'elles sont capables de dégrader l'amidon et de le transformer en acide lactique par fermentation. Les exemples non limitatifs suivants illustrent davantage le procédé d'ensilage de l'invention. Dans ces exemples, l'ensilage de matières animales et végétales selon l'invention est indiqué en comparaison des procédés d'ensilage antérieurs. Exemple 1 Dans cet exemple, on prépare quatre lots d'ensilage contenant chacun 10 kg de hareng de la Baltique ainsi que les additifs indiqués ci-après. Après mélange, on met de côté les différents lots à 24 OC pendant un mois, après quoi on analyse les produits ensilés obtenus. Les résultats des analyses obtenus sont récapitulés sur le Tableau I suivant. Les quatre lots d'ensilage ont la composition suivante Lot A : 10 kg de hareng de la Baltique + 1,5 kg de grains grossière- ment broyés Lot B : 10 kg de hareng de la Baltique : 1,5 kg de grains grossièrement broyés auxquels on a ajouté par gramme de produit ensilé 104 bactéries dégradant l'amidon choisies conformément à ce qui précède. Lot C : 10 kg de hareng de la Baltique + 0,9 kg d'un mélange de 5 parties en poids de grains grossièrement broyés et 1 partie en poids de malt. Lot D : 10 kg de hareng de la Baltique + 0,9 kg d'un mélange de 5 parties en poids de grains grossièrement broyés et 1 partie en poids 4 de malt, et contenant 104 bactéries, par gramme de chacune des bac- téries résistant aux acides et dégradant l'amidon, choisies de la manière précédente. TABLEAU I Lot A B C D Substance sèche 31 31 26,4 35,6 Azote total 2,70 2,77 2,73 2,68 Azote d'ammoniac 0,96 0,97 1,05 0,31 NH3 - N/N total, % 35,6 35,0 38,5 11;5 Acide lactique v 0,1 z 0,1 1,5 3,6 Acide butyrique 1,59 1,61 1,5 0,0 pH 7,2 7,1 6,5 4,8 Dans le Tableau, les concentrations sont indiquées en % en poids. Pour déterminer la qualité d'un produit ensilé, on indique généralement la concentration d'acide lactique, qui doit être élevée, ainsi que la teneur en acide butyrique et le rapport de l'azote d'ammoniac à l'azote total, ces valeurs devant être aussi faibles que possible. Si le rapport de l'azote d'ammoniac à l'azote total d'un produit ensilé dépasse 20 %, le produit ensilé peut être considéré comme putréfié ou sur le point due l'être.La teneur en acide butyrique ne doit pas dépasser quelques dixièmes de pour cent. I1 ressort du tableau que le produit ensilé D préparé selon l'invention est d'une qualité considérablement supérieure aux autres et présente une forte teneur en acide lactique, tandis que la teneur en acide butyrique et le rapport de l'azote d'ammoniac à l'azote total sont faibles. Exemple 2 Dans cet exemple, on ensile de la luzerne, qui est une plan te de pâturage qu'il est généralement difficile d'ensiler. On prépare quatre lots ayant la composition ci-après et que l'on ensile et conserve pendant un mois à 28 OC, après quoi on analyse les produits ensilés obtenus. Les résultats figurent sur le Tableau II suivant. Les quatre lots d'ensilage ont la composition suivante Lot E : Luzerne + 5 % en poids de grains grossièrement broyés, Lot F : Luzerne + 5 % en poids de grains grossièrement broyés + bactéries dégradant l'amidon. Lot G : Luzerne + 5 % en poids de grains grossièrement broyés + bactéries résistant aux acides. Lot H : Luzerne + 5 bien poids de grains Grossièrement broyés + bactéries degradant l'amidon + bactéries résistant aux acides. Les diverses bactéries sont ajoutées dans chaque cas en une quantité fournissant 105 microorganismes par gramme de la matière de départ destinée à 1'ensilage. TABLEAU II Lot E F G H Substance sèche 16,5 19,5 19,7 22,0 Azote total 0,60 0,62 0,68 0,71 Azote d'ammoniac 0,19 0,099 0,070 0,029 Rapport NH3-N/Azote total,% 31 14 11 4 Acide lactique 0,1 0,3 1,0 1,7 Acide butyrique 0,23 0,01 0,01 0,01 pH 7,5 5,1 4,9 4,3 Sur le tableau, les concentrations sont indiquées en % en poids. I1 ressort de ce tableau que les lots F, G et H donnent tous des résultats acceptables, mais que le lot H fournit les meilleurs résultats lorsquton utilise les deux types de bactéries. Le fait que l'on obtienne des résultats acceptables en n'utilisant que les bactéries résistant aux acides est dû au fait que la luzerne contient normalement une petite quantité de sucres qui peuvent être fermentés. Ceci est souvent le cas lors de l'ensilage de matières végétales. I1 ressort également des chiffres figurant au tableau que les influences des deux types de bactéries se renforcent fortement mutuellement lors du procédé de fermentation, c'est-à-dire qu'il y a un effet de synergie. Les deux nouvelles bactéries isolées mentionnées ci-dessus ont été déposées à la collection des cultures du Collège Royal d'Agriculture Ultuna Suède avec les références suivantes Streptococcus faecalis 10528 (Souche F), Streptococcus lactis/Leuconostoc mesenteroides 10531-68-NSM. R E V E N D I C A T I O N S 1 - Procédé d'ensilage biologique de matières végétales et/ ou animales à l'aide de bactéries formant de l'acide lactique, dans lequel les hydrates de carbone qui peuvent être transformés en acide lactique et des bactéries formant de l'acide lactique sont ajoutés aux matières de départ à ensiler1 ce procédé étant caractérisé en ce qu'il consiste à ajouter aux matières de départ les additifs suivants A) des bactéries formant de l'acide lactique et résistant aux acides, choisies parmi les bactéries naturelles des espèces Streptococcus faecalis par culture répétée dans un milieu ayant un pH compris entre 4 et 4,7, de préférence de 4,5, et au moins l'une des matières suivantes B) des hydrates de carbone fermentables;; C) des matières qui dégradent l'amidon en le transformant en hydrates de carbone fermentables D) des bactéries dégradant l'amidon et formant de l'acide lactique choisies parmi des bactéries naturelles des genres Streptococcus et Leuconostoc, en particulier Streptococcus lactis et Leuconostoc mesenteroides, par culture répétée dans un milieu contenant de l'amidon comme seule source essentielle de carbone. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on ajoute des bactéries en forme de bâtonnets de l'espèce Lactobacillus plantarui aux matières de départ ou à l'additif pour maintenir une teneur élevée en acide lactique pendant une longue période de temps. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les bactéries choisies après culture à grande échelle et lyophilisation sont mélangées avec des produits en grains pour former un concentré qui, après dilution, est ajouté aux matières de départ destinées à l'ensilage. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que chacune des diverses bactéries est ajoutée à la matière de départ ou à l'additif en une quantité fournissant au moins 103 bactéries par gramme de la matière de départ et de l'additif combinés. 5 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les matières dégradant l'amidon en hydrates de carbone fermentables consistent en malt, en enzymes dégradant l'amidon provenant du malt ou en levures dégradant l'amidon ou autres champignons dégradant l'amidon. 6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que du malt est ajouté à la matière de départ, et l'extrait de malt est ajouté aux milieux nutritifs utilisés dans la sélection des bactéries en une quantité de 0,1 pour cent en poids. 7 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les bactéries résistant aux acides A) et les bactéries dégradant l'amidon D) sont ajoutées aux matières de départ ou à l'additif pour le procédé d'ensilage ainsi qu'avec de l'amidon comme seule source d'hydrate de carbone pouvant être transformé en acide lactique. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il consiste à ensiler des matières végétales. 9 - Procédé selon la revendication 1, destiné à 1'ensilage de matières animales, caractérisé en ce que les bactéries résistant aux acides et des hydrates de carbone fermentables sont ajoutés à la matière de départ ou à l'additif destinés à 1'ensilage.