Brevet FR2354351A1 — publié le 19780106

La présente invention concerne plus particulièrement la résolution d'un mélange d'énantiomères de composés organiques et, plu5 particulièrement, d'acides aminés. Bes produits naturels présentent souvent une activité optique. Les réactions de biosynthese des organismes vivants conduisent,pour certaines molécules, à une configuration déterminée, toujours la même. De même, pour les composés pharmaceutiques possédant un atome de carbone asymétrique, il est fréquent ou'un seul des inverses optiques ait une activité thérapeutique. La séparation des énantiomères présente donc un très grand intérêt industriel dans le domaine de la pharmacie et de la biologie. Depuis très longtemps on résout les mélanges d'énantiomères par un procédé faisant intervenir la formation de diastéréoisomères par réaction des énantiombres à séparer avec des composés optiquement actifs, les diastéréoisomères obtenus ayant des propriétés chimiques suffisamment différentes pour que lton puisse les séparer (par exemple par cristallisation fractionnée), il suffit ensuite de régénérer les enantiomeres à partir des diastéréoisomeres. les dévelopwments récents de techniques de séparation trbs efficaces, comme la chromatographie en phase gazeuse ou en phase liquide, ont conduit les chercheurs à tenter d'appliquer ces méthodes à la séparation des isomères optiques. Pour cela on a déåà proposé d'utiliser dans une technique chromatographique une phase stationnaire elle-mevme optiquement active, Toutefois, les premières tentatives de résolution de mélanges d'énantiomères par les techniques chromatographiques effectuées en utilisant comme support des polymères naturels possédant des atomes de carbone asymétriques (laine, soie, cellulose, amidon) se révélèrent très-décevantes. On eut alors recours à des phases 9 tatiounaires constituées de polymères synthétiques portant un substituant optiquement actif. Dans le cadre de ces recherches, parmi les premières résolutions totales dans le cas des aminoacides, on peut citer Tetrahedron let., 35, 5345-7 (1967), GTL-AV FE@BUSH B. Il s'agit de procédés par chromatographie en phase gazeuse sur des colonnes capillaires ou sur des colonnes classiques (en utilisant une phase stationnaire constituée par des esters cyclohexyliques de N-trifluoroacétyl-LL-dipeptide). L'inconvénient de cette méthode est qu'elle est difficilement extrapolable au stade industriel et que les aminoacides injectés doivent préalablement être traités pour être mis sous forme d'esters N-trifluoroacétylés. Enfin, cette méthode ntest pas utilisable pour des composés thermolabiles (la chromatographie est conduite à 180-190 C) ou pour des composés de forte masse moléculaire. Les brevets suisses n 490 292 et 509 239 décrivent des résolutions dans le cas des aminoacides par une technique de chromatographie en phase liquide en utilisant des phases stationnaires contenant des ions métalliques complexés, mais les résolutions observées sont cependant peu nombreuses et la nenteür du Xractolulement est une gêne considérable pour L'exploitation du procédé sur le plan industriel. Le brevet français n 2 012 102 décrit la résolution de mélanges racémiques d'acides aminés en utilisant une résine aromatique complexée par l'ion d'un métal de transition. Ce procédé permet effectivement des résolutions de certains acides aminés mais ltefficacité du procédé reste cependant assez faible. En effet, une résine donnée ne sépare qu'un nombre restreint d'acides aminés, les résolutions totales sont assez rares et, par ailleurs, le débit étant très faible les temps de chromatographie sont très longs (de l'ordre de 10 heures), ce qui évidemment constitue un handicap sur le plan industriel. Or, la Demanderesse a découvert qu'un certain type de résine permettait la résolution de mélanges d'énantiomères, en particulier de mélanges d'énantismères d'acides aminés et qu'il était possible, en utilisant une technique de chromatographie en phase liquide sous haute pression, non seulement de résoudre à l'aide d'une seule résine la plupart des mélanges d'énantiomères d'acides aminés mais, en plus, d'effectuer ces résolutions en moins d'une heure. La capacité élevée de la résine alliée à la rapidité des séparations permet d'envisager des séparations à l'échelle préparative. Pour ce faire, la présente invention propose une résine pour chromatographie notamment pour la résolution d'un mélange d'énantiomères, caractérisée en ce qu'elle est constituée essentiellement par un polymère hydrophile comprenant des unités de formule : R étant un radical organique disymétrique. De préférence, R est un radical organique correspondant à la forme D ou à la forme L d'un composé comportant un carbone asymétrique, par exemple d'un acide aminé optiquement actif tel que le radical correspondant à la L-proline ou à la L-phénylalanine, pouvant éventuellement se présenter sous forme d'un dérivé d'acide carboxylique ester ou amide par exemple. Dans un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention la résine utilisée est complexée par des cations métalliques, en particulier le cuivre ou le nickel. Par polymère hydrophile on entend designer dans le cadre de l'invention un polymère qui se mouille bien et en particulier qui peut gonfler dans l'eau. Be polymère peut être constitué presqutexclusivement d'unités de formule I mais peut également présenter, entre deux unités de formule I, des ponts de nature très diverse. Toutefois, il est préférable Toutefois, il est préférable pour que l'efficaeité de la résine soit conservée que ces ponts ne soient pas trop nombreux afin que la densité en sites actifs reste élevée. Par radical organique dissymétrique on entend désigner un radical correspondant à un composé optiquement actif ou un radical d'un composé non optiquement actif mais qui, par fixation sur le squelette du polymère, acquiert un élément de dissymétrie générateur d'activité optique, par exemple, si le radical R est lié par un atome de carbone au squeiette, ce carbone peut être asymétrique alors qu'il ne Tétait pas dans la molécule correspondant à R. La résine selon la présente invention peut être obtenue, de préférence, par polymérisation du méthylolacrylamide et greffage sur le polymère obtenu du composé énantiomère désiré, en particulier un acide aminé optiquement actif. La complexation de la résine par des ions métalliques est conduite de préférence par mise en contact de la résine avec un large excès d'un sel du métal de complexation. La présente invention concerne, en outre, un procédé de résolution d'un mélange d'énantiomères, en particulier d'acides aminés, dans lequel on effectue la chromatographie sous haute pression du mélange d'énantiomères en utilisant, comme phase stationnaire de chromatographie, une résine selon la présente invention, de préférence complexée par des ions métalliques, et dans lequel on récupère les énantiomères obtenus.Ainsi, en utilisant cette technique de chromatographie sous haute pression avec des colonnes de 30 cm de long, on observe en 50 minutes, avec la même résine, la résolution totale des acides aminés tels que la valine, l'isoleucine, la sérine, la thréonine, l'asparagine, la phénylalanine et, avec des colonnes plus longues, la résolution totale de l'alanine, de la leucine et de la méthionine. On peut penser que ltétonnante efficacité des résines selon la présente invention par rapport, en particulier, aux résines décrites dans le brevet français n 2 012 102 provient du fait que la résine utilisée est hydrophile et se présente SOU5 forme d'un gel macroporeux qui gonfle en présence d'eau ce qui augmente son pouvoir de séparation et qu'en outre la résine obtenue comprend de nombreux sites réactifs. Les exemples donnés ci-après sont uniquement destinés à illustrer la présente invention et ne sauraient, bien entendu, la limiter en aucun cas, Préparation de la résine Dans 2 ml d'eau on met en suspension 7,5 g de méthylolacrylamide, 3,5 g de méthylène-bis-acrylamide, 0,1 g de persulfate de potassium et 4 g d'un agent tensioactif "3P.NE1". On met ltensemble en suspension dans 1 l de cyclohexane SOU5 agitation au reflux pendant 30 mn. On obtient la résine polymérisée sous forme de billes que lton filtre et que l'on lave. Le produit obtenu contient environ 60 % en pOids de billes présentant un diamètre compris entre 10 et 40 X qui sont utilisables dans le cadre de l'invention. Sur les billés ainsi obtenues que l'on fait gonfler dans Liteau on fait réagir en excès par rapport à la fonction alcool, le sel de sodium de la L-prolinet cette réaction est conduite à la température ambiante ou à une température supérieure à la température ambiante pouvant aller jusqu'à 80 C. La résine ainsi préparée présente une capacité d'environ 2 meq/g. On obtient ainsi des billes de résine selon la présente invention. Ces billes sont ensuite conditionnées dans une solution aqueuse contenant des ions cuivriques en large excès. Après conditionnement les billes sont lavées à l'eau. Exemple de séparation Les séparations suivantes ont été effectuées sur un chromatographe en phase liquide sous haute pression Waters Associates ALC 201 muni d'un détecteur réfractométrique et d'un détecteur polarimétrique en série (Perkin Elmer 241 MC) qui permet de mesurer en continu le pouvoir rotatoire du produit élué. Sur cet appareil on adapte une colonne en acier inoxydable de 30 cm de long et d'un quart de pouce (6,3 mm) de diamètre préalablement remplie de la résine préparée précédemment. Il est à noter que le remplissage de la colonne est effectué en suspension dans l'eau. On utilise lXeau comme éluant avec un débit de 0,5 ml par minute et l'on injecte une solution saturée d'un mélange racémique d'un acide aminé. Le tableau ci-dessous donne en fonction de l'acide aminé et du volume injecté les volumes d'élution des isomères D et L. 1 Volume in ecté Volume Volume d'élution Volume d'élution Acide aminé ( l) isomère D (ml) isomère L (ml) Valine 30 7 11 Leucine 50 9,5 11 Isoleucine 50 8,5 11 Serine 30 11 17 Thréonine 30 12 18 Méthionine 50 11 13 Asparagine 100 12 18 Phénylalanine 200 14 25 Tryptophane 500 30 72 Tyrosine 500 20 36 On constate que les isomères D et L de ces acides aminés sont séparés très rapidement (environ une demi-heure) et que pour certains acides aminés tels que la tyrosine et le tryptophane qui sont bien séparés on peut utiliser des colonnes beaucoup plus courtes (de l'ordre de 5 cm). Il est également possible lors de la séparation des acides aminés portant une fonction ionisable d'utiliser comme éluant une solution aqueuse de force ionique plus élevée. Ainsi, en utilisant une solution 10 1 X d'acétate d'ammonium, la D-lysine est éluée à 7 ml et la L-lysine est éluée à 8 ml. Des essais ont également été effectués en utilisant comme radical R la L-phénylalanine. Une étude a également été effectuée en utilisant comme métal de complexation le nickel. Bien que les résultats obtenus soient moins bons, on observe néanmoins des séparations à l'aide de ces résines. Si cela est nécessaire, il est possible, afin de diminuer la quantité d'ions métalliques présents dans l'éluat, de prévoir une petite colonne supplémentaire ne contenant que de la résine et que l'on adapte à la sortie de la colonne principale de chromatographie. REVENDICATIONS 1) Résine pour chromatographie, notamment pour la résolution d'un mélange d'énantiomères, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un polymère hydrophile obtenu sous forme de gel macroporeux, contenant des unités de formule : R étant un radical organique dissymétrique. 2) Résine selon la revendication 1, caractérisée en ce que R est un radical organique correspondant à l'énantiomère d'un acide aminé optiquement actif sous forme d'acide ou sous forme de dérivé d'acide. 3) Résine selon la revendication 2, caractérisée en ce que R est le radical organique correspondant à la L-proline ou à la L-phénylalanine. 4) Résine selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est complexée par des cations métalliques. 5) Résine selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est complexée par des ions Cu (II) ou Ni (II). 6) Résine selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par : - polymérisation de méthylolacrylamide en présence de méthylène bis-acrylamide, - réaction du polymère obtenu avec un sel de sodium de lténan- tiomère d'un acide aminé optiquement actif, 7) Procédé de séparation d'un mélange d'énantiomères, caractérisé en ce que lton effectue la chromatographie liquide sous haute pression dudit mélange d'énantiomères en utilisant une colonne chromatographique contenant une résine selon l'une des revendications 1 à 6. 8) Application du procédé selon la revendication 7 à la résolution des mélanges d'énantiomères d'acides aminés,