Brevet FR2327799A1 — publié le 19770513

L'invention concerne un virus herpétique des félidés qui provoque chez ceux-ci une rhinotrachéite qualifiée par les auteurs Anglo-Saxons de "feline viral rhinotracheitis", de même qu'un procédé pour l'atténuer en une forne avirulente antigéniquement active. L'invention concerne en particulier un procédé pour atténuer le virus herpétique des félidés par des paysages en série de ce virus dans des cultures de tissu un certain nombre de fois et dans des conditions d'incubation telles que le virus devienne avirulent, c'est- à-dire perde sa virulence, mais conserve son caractère antigénique. La rhinotrachéite virale des félidés est une infection spécifique par le virus herpétique chez le chat. Le virus herpétique des félidés provoque en particulier une infection et se multiplie dans les cellules épithéliales dune, de la cavité buccale et de la trachée et il provoque de la nécrose s'accompagnant d'éternuements, de toux et de~ca- tarrhe-nasal. L'épithélium de la conjonctive est également attaqué avec établissemwnt d'une grave conjonctivite. Les-bronches et bronchioles majeures peuvent parfois titre infectées aussi.A l'occasion, l'épithelium de la langue est attaqué et conduit à une inflammation ulcéreuse de cette dernière La maladie se manifeste par le développement de la conjonctivite, de catarrhe oculaire et nasal et des éternuements. Dès son premier isolement, il est apparu que le virus herpdtique est généralement présent chez le félidé normal. Le virus herpétique de la rhinotrachéite virale des fé- lidds est un virus à acide désoxyribonucléique spécifique de l'espèce. Les félidés sont les seuls hôtes sur lesquels ce virus est isolé. Le virus peut être propagé dans des cultures de cellules de chat, mais jusqu'à pr- sent ne peut encore outre dans d'autres systèmes comme des cultures de cellules de tissus animaux appartenant à d'autres espèces, des oeufs embryonnés ou des animaux d'essai. Le virus exerce un effet cytopathogène spécifique dans les cultures de cellules de tissu. En outre, des corpuscules intranucléaires inclus peuvent être mis en évidence dans les cultures infectées. Les premiers stades de la rhinotrachéite virale des fé lidés se traduisent par une légère augmentation de la température du corps, des éternuements, de la salivation et un larmoiement sérieux. A mesure que la maladie progresse, la température du corps s'élève, le chat contaminé devient déprimé et des tcoulements mucopurulents abondants s'établissent aux narines et aux yeux. Des crottes apparaissent autour des yeux et du nez, tandis que la nécrose envahit lépithélium et l'os du cornet nasal y compris l'épithélium qui le recouvre. Il stétablit une leucocytose avec un nombre total de leucocytes de 30,000 à 50.000 par ml. Les altérations pathologiques les plus évidentes sont limitées aux voies respiratoires supé- rieures.En général, aucune inflammation pulmonaire ne s'établit, sauf en présence accidentelle de bactéries et de mycoplasmes. Des expériences sur de jeunes chats d'état biologique connue ont montré que le pouvoir pathogène du virus herpétique chez les félidés ne dépend pas de la flore microbienne des voies respiratoires. Des chats d'état biologique connu infectés par voie nasale,p.arlevirus herpétique deviennent fiévreux et prennent une infection grave des voies respiratoires supérieures se caractérisant par des éternuements, de la toux, du catarrhe nasal et oculaire, de la dyspnée, de l'anorexie, de la dépression et de la perte de poids.On observe, outre des altérations sspitheliales, une nécrose de l'épithélium du cornet nasal, tandis que des altérations ostéolytiques nettement perceptibles se développent dans le cornet nasal. I1 a été établi que chez les félidés le virus herpétique se multiplie préférentiellement et induit des nécroses dans les zones de croissance du squelette. Il existe de nombreuses preuves cliniques et expérimentales prouvant que le virus herpétique provoque chez l'homme et les animaux inférieurs des infections des voies gdnitales et les infections in- nées sont connues chez de nombreuses espèces d'animaux. Les preuves expss- rimentales montrent que le virus herpétique peut provoquer des infections dès organes génitaux des félidés et peut provoquer une infection géndrali- sée innée grave chez les jeunes chats nés de chattes qui ont été infectées au dernier stade de leur gravidité. L'avortement peut-être provoqué par exem- ple par inoculation intraveineuse des chattes au dernier temps de leur gravidité.L'infection vaginale des chattes gravides, qui provoque la vaginite p.t des infections systémiques fatales des chats nouveaux-nés, est expériment reproductible. Les jeunes--chats infectés présentent dela bronchopneumonie et des inclusions hépatiques. Bien que la rhinotrachéite virale des félidés soit connue depuis longtemps comme une maladie grave de ces animaux et ait été ltobjet de longues tudes, on ne dispose jusqutà présent d'aucun vaccin pour combattre cette infection et/ou la prévenir. L'invention vise à permett-re la préparation d'un vaccin propre à immuniser différentes espèces de la famille des félidés contre la rhinotrachéitevirale des félidés, qui s'obtient par atténuation d'une souche virulente du virus herpétique jusqu'a l'état non virulent avec conservation du pouvoir antigénique. En rézumé, l'invention concerne un vaccin qu'on pre- pare par un procédé comprenant les stades ci-après: isolement d'un virus herpétique virulent pur chez un fdlidé, inoculation d'une culture de cel lules de tissu au mayen du virus pour en assurer la reproduction, passage en surie du virus ainsi propagé dans des cultures de cellules de tissu supplentaires, avec un nombre de passages suffisant et dans des condi tions telles que le virus soit atténué jusqu'à l'état avirulent sans perdre son caractère antigénique. L'atténuation ou ou la modification du caractère virulent ou pathogène des virus ou des bactéries jusqu'a l'état avirulent ou non pathogène est connue. La modification ou l'atténuation de la morphologie et/ou du caractère pathogène se réalise suivant de nombreux procédés. Parfois, des passages en série répétés dans le tissu de l'hôte atténuent les germes de la maladie, le passage en série dans un tissu différent de celui de l'hôte conduit à une atténuation, le choc chimique de l'organisme, l'irradistion, le passage à basse température et diffdrentes autres techniques sont applicables en bactériologie et en virologie pour obtenir des organismes non pathogènes qui conservent leur capacité de faire apparaître chez l'hôte des anticorps qui sont propres å neutraliser efficacement les germes de la maladie. L'atténuation sans perte du pouvoir antigenique d'un organisme vivant n'est dans l'ensemble pas prévisible et seules des techniques empiriques sont applicables pour établir l'effioacité d'un mode opératoire particulier. Une technique déterminée qui s'est, par. exemple, révélée applicable à un virus d'un certain type n'est pas toujours applicable à un virus d'un autre type.Jusqu'à préaent, aucun procédé n'a été décrit pour l'atténuation du virus herpétique chez le chat. Au cours d'une expérience déterminée, le virus n'a pas été atténué même après 150 passages dans une culture de tissu de chat. Le virus final inoculé à un jeun chat non immunisé s'est révdlé avoir un degré de virulence non inférieur å celui du virus initial. La Demanderesse a toutefois découvert ss présent que lorsqu'une culture de tissu, qui est en état d'entretenir sa croissance, est inoculée d'un virus herpétique des félidés et expose à une tempéra- ture fortement réduite, par exemple du domaine de 23 å 33 C, le virus s'atté- nue jusqu'à l'état avirulent tout en conservant son caractbre antigénique, c'est-à-dire que lorsqu'il est inoculé a un chat sensible, il va inciter le mécanisme immunologique à produire des anticorps viraux. Le chat est alors immunisé contre les infections ultérieures. L'application des passages en série classiques a fait ressortir que le caractère avirulent désiré s'est établi sans perte du pouvoir antigénique après environ 50 passages à une température d'environ 23 à 33 C. I1 est cependant possible d'effectuer environ 250 à 300 passages Suivant un second aspect de l'invention, on peut ob tenir un virus antigénique avirulent à partir d'un virus herpétique viru lent provoquant la rhinotrachéite des félidés chez eux-ci, suivant un procédé comprenant les stades suivants: la mise en culture d'un virus isolé dans une culture de cellules de tissu, par exemple de cellules de rein de chat, susceptible d'entretenir la croissance du virus jusqu'au titre viral désiré, l'inoculation d'une couche unique de la culture de cellules au moyen du virus par application de la technique connue des plaques, suivant laquelle la monocouche est mise en incubation sous une solution nutritive semi-solide, -habituellement un récipient du type des boites de Petri, 11 incubation à ?50C jusqu'à évidence d'une dégénération cellulaire maximale, ha-bituellement après environ 10 à 12 jours, puis la sélection des petites plaques gonflées irrégulières formées qui sont pré sentes en même temps que des plaques plus grandes régulières non gonflées, la conduite de 7 à 3 passages de ces petites plaques dans une couche unique de culture de cellules de tissu de la manière habituelle et la récolte du virus après manifestation brune génération cellulaire maximale Cette tech nique sélective permet d'obtenir un virus antigénique avirulent avec un nombre minimal de passages. On pourrait admettre que l'incubation à une basse temps pérature conduit à un mélange de colonies ou plaques plus atténuées et moins atténuées du virus, après quoi la sélection des petites plaques ou colonies que permet cette technique des plaques conduit à un virus atténué s-ans qu'il soit nécessaire d'effectuer sans interruption des passages à basse température pour atténuer la virulence de l'ensemble de la souche de I'inoculation initiale. Le vaccin contre la rhinotrachéite des félidés faisant l'objet de l'invention peut être administré à des animaux de tout genre de la famille- des félidés par voie extraparentérale ou intraparentérale. Le vaccin sous forme liquide peut être administré par voie intranasale, intra auriculaire, intraoculaire, intramusculaire, intraveineuse, intrapéritonéale etc. A l'état de-poudre sèche, il se prête à l'administration extraparenté- rale. Comme d'habitude pour les vaccins de ce genre, une seule dose administrée contient 3000 à 20.000 unités DI50CT (dose infectueuse cinquante de culture de tissu). Une particularité spéciale du virus de la rhinotrachéite virale des félidés dont on admet qu'elle est unique est que même les jeunes chats qui ont un titre levé en anticorps maternels, c'est-à-dire les jeunes chats d'un âge s'échelonnant de la naissance à environ 5 semaines, se révèlent infectés par le virus herpétique dans les tissus epi- théliaux des canaux du nez et des yeux. I1 est admis que cet état peut exister du fait que le virus tend à se localiser dans le tissu épithélial ot les anticorps circulant du sang ne peuvent neutraliser le virus et à se répandre lentement à partir de cet endroit, tandis que les particules virales sont rendues inoffensives par les anticorps maternels.Lorsqu'ulté- rieurement le titre en anticorps maternels du jeune chat baisse, le virus encours de diffusion peut provoquer une infection systémique du jeune chat, se traduisant normalement par la rhinotrachQite- virale. Les jeunes chats protégés par les anticorps maternels peuvent être inoculés du vaccin conforme à l'invention contre l'infection par la rhinotrachéite virale des félidés par administration extraparentd- rale, par exemple intraauriculaire ou intraoculaire du vaccin. Après la disparition des anticorps maternels, le vaccin antiviral peut être administré par voie extraparentdrale ou parentérale, par exemple intramusculaire, intraveineuse ou intrapéritonéale.Comme l'administration intranasale, intraauricalaire, ou intraoculaire du vaccin est efficace, tant chez les jeunes chats protégez par les anticorps maternels que chez les chats adultes, ce mode d'inoculation est préféré pour la vaccination des jeunes animaux pour lesquels on admet que les anticorps maternels sont encore présents. A ce stade, la détermination du titre en anticorps maternels n1 est pas nécessaire. Les stades du procédé de l'invention sont décrits plus en détail ci-après. I. ISOLEMEMT BU VIRUS Suivant une technique classique, on effectue un frottis chez un chat qui a souffert d'une affection des voies respiratoires supérieures et présenté les symptomes caractéristiques de la rhinotrachéite virale des félidés. On introduit la substance du frottis dans une culture de cellule de tissu rénal de chat et on en isole le virus herpétique des félidés qu'on identifie par les techniques immunologiques habituelles au moyen d'un antisérum monospécifique pour ce virus. 2. REPRODUCTION DU VIRUS On prépare des cultures de cellules de tissu rénal de chat. On ensemence un fermenteur en verre ordinaire au moyen d'une suspension trypsinisée de cellules rénales de chat contenant suffisamment de milieu nutritif pour que les cellules soient immergées à une profondeur d'environ 13 mm. On atilise du Milieu Minimum Essentiel n'Eagles (voir Science 130: 432 (1959)) avec 5% de sérum foetal de veau. On peut toutefois utiliser tout milieu de culture normal; comme du milieu à l'hydrolysat de lactalbumine dans de la solution saline équilibrée de Rank, entre autres. On met le fermenteur en incubation à 37 C pendant 1 à 3 jours, de manière à obtenir une couche monocellulaire de cellules de rein de chat. -On inocule lefermenteur au moyen du virus herpétique isolé en appliquant les techniques d'asepsie normales et après 24 à 72 heures d'incubation à 370C, on constate que l'effet cytopathologtque sur les cellules est pratiquement complet, ce qui indique que le virus s'est reproduit. Un titrage par dilution indique que le titre est d'environ 106 DI50CT/ml. On administre par voie extraparentérale 100 DI50CT/ml de la culture à un chat sensible-à l'infection. Après 5 à 7 jours, on constate les symptômes cliniques d'un cas typique d'infection par la rhinotrachéite virale des félidés, ce qui démontre que- la dose administréecon- tient du virus herpétique virulent. Le Tableau ci-après donne une description d'uneinfec- tion typique par la rhinotrachéite virale des félidés. Dates O--b s e r v a t i o n s 26-4-73 La chatte N-5 met bas 5 jeunes chats apparemment sains. La chatte ne présente pas de particularités. Un frottis de gorge de la chatte se regèle contenir du virus herpétique. 2-5-73 La chatte et les 5 jeunes chats sont photographiés et un frottis de gorge est realisi chex les chatons. Les yeux de ces derniers ne sont pas encore ouverts. Le virus herpétique n'est pas isolé chez les jeunes chats. 18-5-73 Les premiers symptômes cliniques se manifestent chez 3 des Jeunes chats par un certain catarrhe oculaire. On photographie les jeunes chats et on effectue des frottis de gorge qui se révèlent positifs pour le virus herpétique. 23-5-73 Mucopurulence des yeux chez les 5 jeunes chats. 29-5-73 Mucopurulence des yeux et des narines chez les 5 jeunes chats. 1-6-73 Mucopurulence des yeux et des narines chez les 5 jeunes chats. 4-6-73 Paupières fortement @ collées fermées par l'exsudat mucopurulent chez les 5 jeunes chats. 5-6-73 Engorgement grave des yeux et des narines chez les 5 jeunes chats, et respiration difficile par la cavité buccale. 8-6-73 Tableau clinique très grave d'infection par le virus de la rhino trachéite chez les 5 jeunes chats. On les photographie et on effectue des frottis de gorge qui se révèlent positifs pour le virus herpétique. 10-6-73 Mort d'un, jeune chat, attribuée après autopsie à la rhinotra chiite des félidés. 12-6-73 Mort de deux jeunes chats, attribuée après autopsie à la rhino trachéite virale des félidés. 13-6-73 Mort d'un jeune chat, attribue après autopsie à la rhinotra chiite virale des félidés. 21-6-73 Mort d'un jeune chat, attribue après autopsie à la rhinotra chéite virale des félidés. 3. ATTENUATION On prépare des cultures de cellules rénales de chat en couches monocellulaires dans du Milieu Minimum Essentiel d'Eagles dans des flacons pour culture de cellules de tissu de type classique. On inocule les flacons au moyen d'environ 100 1I50CT/ml du virus isolé et on met les flacons ainsi inoculés en incubation à 25 C. Après environ 8 à 10 jours, on peut observer un petit domaine de dégénérescence cellulaire et on effectue un second passage en série avec une petite quantité du milieu liquide. On poursuit l'incubation à 25 et, après chaque passage en série, on constate l'accroissement de l'effet cytopathologique. Après environ 15 à 20 passages en série, on atteint l'état cytopathologique complet en 3 à 5 jours d'incubation à 25 C. On observe soigneusement l'atténuation et à peu près tous les 10 passages en série, on inocule par voie intranasale des chats sensibles au moyen d'environ 106 DI50CT/ml du virus. Tous les chats ainsi infectés manifestent le tableau clinique typique de la rhinotrachéite virale des félidés jusqu'au 50e passage ensérie. Ensuite, les symp- tômes deviennent progressivement de moins en moins graves, prouvant ainsi que le virus s'affaiblit dans les conditions d'incubation à basse tempéra- ture. Pour démontrer que le passage en série du virus aux températures d'incubation normales a un effet faible sinon nul sur la virulence du virus, on administre des échantillons du virus de la rhinotrachéite des félidés, pris au 60e passage en série et au 103e, à 35 C par voie intranasale à des chats sensibles, en quantité de 0,5 ml de virus d'un titre de 106DI60CT/ml. On observe soigneusement les chats dont on mesure la température rectale. Les résultats obtenus dans cette série sont rassemblés aux Tableaux I et II. Légende Pour les tableaux: O = pas de symptèmes earactéristiquesde l'infection par la rhinotrachéite virale des félidés, 1 = activité réduite, vois faible, 2 = éternuements 3 = larmoiement, yeux humides, catarrhe séreux, nez humide, 4 = diminution de l'appétit, 5 = appétit pratiquement nul, consommation d'un peu de lait et d'eau, 6 = exsudat mucopurulent aux yeux, et au nez, 7 = obstruction du nez, respiration par la cavité buccale, 8 = animal tout à fait malade, y compris symptômes 5, 6 et 7, l'animal ne réagit plus du tout et a un aspect négligé pitoyable, 9 - mort de l'animal. T A B L E A U I (Passage 60 à 35 C) Chat TOTAL N jour 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 009 Temp. C 39,11 39,44 39,89 40,22 40,00 39,89 39,44 39,11 39,22 39,33 39,33 39,44 39,11 67 Symptôme 0 0 2 2 2 4 4 5 5 6 6 7 8 8 8 010 Temp. C 39,22 39,89 40,00 40,56 39,89 39,44 39,33 39,11 39,44 39,33 39,11 38,89 38,78 56 Symptôme 0 0 0 2 2 2 3 4 5 5 6 6 6 7 8 011 Temp. C 29,33 39,44 39,89 40,44 40,00 39,33 39,44 39,11 39,44 39,11 38,89 39,11 39,33 53 Symptôme 0 0 0 1 2 2 2 3 4 5 6 6 6 8 8 012 Temp. C 38,89 39,33 40,56 40,11 40,22 40,22 39,56 38,89 39,11 38,89 39,33 38,33 38,78 44 Symptôme 0 0 0 1 1 2 2 2 2 4 4 5 6 7 8 T A B L E A U II (Passage 103 à 35 C) Chat TOTAL N jour 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 267 Temp. C 39,33 39,78 40,00 40,33 40,00 39,89 39,44 39,33 ND ND 38,89 39,33 38,78 Symptôme 0 0 0 1 2 3 5 5 5 6 6 6 7 8 8 62 268 Temp. C 38,89 40,11 40,33 39,89 40,56 40,11 39,33 38,67 ND ND 38,78 38,33 38,44 Symptôme 0 0 0 1 1 2 3 3 5 5 6 6 7 8 8 55 269 Temp. C 39,22 39,89 40,56 40,11 39,89 40,00 39,56 39,22 ND ND 39,11 38,89 39,67 Symptôme 0 0 2 2 2 3 3 5 5 6 6 6 7 7 8 62 270 Temp. C 39.89 40,22 40,00 39,78 40,44 40,00 39,33 39,78 ND ND 39,44 39,33 39,00 Symptôme 0 0 0 1 2 2 3 3 3 5 5 6 6 7 8 51 La comparaison des résultats au Tableau I et au Tableau II montre que le virus est pratiquement aussi virulent au 103e passage qu'au 60e; que l'atténuation du virus est donc a peu près nulle. Les Tableaux ci-après montrent l'effet du passage en série du virus conformément a' l'invention. Les valeurs sont représentatives des résultats d'une administration intranasale du virus d'un titre de 106 DI50CT/ml, en quantité de 0,5 ml, après 48, après 75 et après 85 passages en série à la température d'incubation de 25 C. L'examen des résultats montre que l'atténuation augmente encore au niveau du 85e passage en série. T A B L E A U III (Passage 48 à 25 C) Chat TOTAL N jour 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 247 Temp. C 39,44 39,78 39,00 38,78 39,22 40,56 39,33 39,22 38,89 39,00 38,89 38,78 Symptôme 0 0 0 0 1 2 2 3 3 3 3 2 2 0 0 21 249 Temp. C 39,56 40,11 40,22 40,00 39,56 39,44 39,22 39,33 38,78 38,89 39,11 39,00 Symptôme 0 0 0 2 2 2 4 4 3 3 3 3 2 0 0 28 253 Temp. C 39,33 39,67 39,89 39,33 39,44 39,56 39,33 39,11 39,44 39,11 39,00 39,11 Symptôme 0 0 0 2 2 2 4 4 3 3 3 2 2 0 0 27 258 Temp. C 39,44 39,33 39,67 39,44 39,33 39,33 39,44 39,22 39,11 39,33 39,11 39,00 Symptôme 0 0 0 0 2 2 2 4 4 3 3 2 2 0 0 24 Chat N jour 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 C 97 Temp. C 39,00 39,33 39,44 39,89 39,33 29,11 39,00 38,89 39,00 39,22 38,89 38,61 38,3 Symptôme 0 0 0 0 2 2 2 3 3 2 2 2 0 0 0 C 108 Temp. C 39,00 39,22 39,78 39,44 39,33 39,11 39,11 38,89 39,33 39,11 39,00 38,89 39,0 Symptôme 0 0 0 0 2 2 2 2 3 3 2 2 0 0 0 C 122 Temp. C 38,89 39,11 39,33 40,00 39,56 39,33 39,11 38,89 38,89 39,11 39,00 38,78 38,8 Symptôme 0 0 0 0 1 2 2 2 3 3 2 2 2 0 0 C 124 Temp. C 39,33 39,22 39,78 39,44 39,22 39,11 39,11 39,22 39,00 38,89 38,78 38,89 38,7 Symptôme 0 0 0 0 1 1 2 2 2 3 3 2 2 2 0 T A B L E A U V (Passage 65 à 25 C) Chat TOTAL N jour 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 A5K6 Temp. C 38,00 38,56 38,78 39,11 39,17 39,44 39,00 39,33 39,11 39,00 38,89 39,11 39,00 38,89 Symptôme 0 0 0 0 2 2 2 2 2 2 0 0 0 0 0 12 A5K7 Temp. C 37,83 38,22 38,89 39,11 39,00 39,11 38,67 38,89 39,11 39,00 39,22 38,75 38,78 38,89 Symptôme 0 0 0 0 2 2 2 2 2 2 2 0 0 0 0 14 B1K4 Temp. C 38,67 39,11 38,89 39,33 39,44 39,78 40,33 39,44 39,33 39,11 38,89 59,00 38,89 39,1@ Symptôme 0 0 0 0 2 2 3 3 2 2 2 2 0 0 0 12 B1K5 Temp. C 38,33 38,89 39,11 39,22 39,22 38,67 39,22 39,11 38,89 39,11 39,00 38,78 38,89 38,78 Symptôme 0 0 0 0 2 2 2 2 2 2 0 0 0 0 0 12 Des chats qui ont été inoculés au moyen du virus du type que conoernent les Tableaux III, IV et V, échappent à la rhinotrachéite vi- rale des félidés lorsqu'ils sont exposds à des virus virulents, ce qui dé montre que le virus avirulent n'a pas perdu son activité antigénique. 4. PREPARATION DU VACCIN On cultive en grandes quantités le vaccin atténue ob tenu comme d8crit ci-dessus, et dans le même milieu de culture que précé- demment, dans des flacons normaux pour couches monocellulaires de cellules de rein de chat. On met les flacons en incubation jusqu'à effet cytopatho logique complet, c'est-à-dire habituellement pendant 3 à 4 jours. On col lecte ensuite le milieu de culture qu'on mélange avec une solution stabili- sée prisé en quantité égale et on le répartit en doses unitaires environ 1.000 à 10.000 DI50CT/ml dans des -f-i-oles à vaccin ordinaires. On lyophilise ensuite le contenu des fioles qu'on scelle ensuite. Bien que la culture et la propagation du virus herpé- tique aient été déorites comme stex8cutant avec des cellules rénales de chat, il convient de noter que toute lignée cellulaire stable de tissu de chat convient. Les lignées cellulaires peuvent être obtenues par des pas sages en série de cellules de chat ou être d'origine commerciale. Par cul ture de cellules de'tissu, il convient d'entendre, aux fins de l'inven tion, soit les cellules rénaIes primaires de chat,.soit les lignées cellu laires stables qui en proviennent. En résumé, l'invention concerne donc un nouveau vaccin contre la rhinotrachéite virale des félidés et un procédé pour le préparer. Le procédé de l'invention comprend les stades suivants: introduction d'un virus herpétique virulent et vivant dans une culture de cellules de tissu; incubation de la culture jusqu'à evidente cytopathologie cellulaire; rk- colte d'une fraction du virus ainsi reproduit et nouvelle inoculation du virus récolté dans une nouvelle culture de tissu; répétition di passage en série du virus dans de la culture de tissu un nombre suffisant de fois à une température d'incubation qui est suffisante pour la production d'un virus avirulent vivant,antigéniquement actif et isolement de ce dernier virus à partir du milieu de culture du tissu précité. Le domaine de temps rature d'incubation choisi par préférence s'étend de 23 à environ 33 C avec une préférence particulière pour la température de 25 C. - Lors de l'application des techniques classiques de passa- ge en série, il faut-environ 50 passages pour atténuer suffisamment le virus. Toutefois, lors de l'application de la technique des plaques, l'atténuation requise peut être atteinte plus rapidement. Du tissu de chat, par exemple du tissu rénal de chat ou une lignée cellulaire stable qui en provient, se à la multiplication du virus. REVENDICATIONS: 1. Procéda pour, produire un virus herpdtique vivant de félidés, atténué et antigéniquement actif, caractérisé en ce qu'il comprend les stades-suivants: a) introduction d'un virus herpétique virulent et vivant dans une culture de cellules de tissu; b) incubation de la culture jusqu'à évidence de cytopathologie cellulaire; c) récolte du virus ainsi produit et introduction du-virus récolté dans une nouvelle culture de tissu; d) répétition du passage en série du virus dans de la culture de tissu un nombre de fois suffisant à une température d'incubation suffisante pour produire un virus avirulent, vivant et antigéniquement actif; e) isolement du virus précité du milieu de culture de tissu précité. 2. Procédé suivant la revendication i, caractérisé en ce que la culture de cellules de tissu précitée est une culture de cellules d'un tissu d'un membre de la famille des félidés. 3. Procédé suivant la revendication 1-, caractérisé en ce. que la culture de cellules de tissu précitée est une culture de cellules de tissu de chat. 4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la culture -de cellules de tissu précitée est une culture de cellules de tissu rénal de chat. 5. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la température d'incubation pour les passages en série est maintenue à une valeur d'environ 23 à 3300. 6. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en-ce que- la température d'incubation à chaque passage en série est d'environ 25 C. 7. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le passage en série est exécuté au moins 50 fois. 8. Procédé suivant la ievendication 1, caractérisé en ce que les passages en série sont exécutés au nombre d'au moins 50, à une température d'incubation d'environ 23à 33tC. 9. Procédé suivant la revendication i, caractérisé en ce que la culture de cellules de -tissu précitée est une culture de lignée cellulaire stable dérivant d'un tissu primaire de chat. 10. - Procédé pour produire un virus herpétique vivant att nué antigdniquement actif; caractérisé en ce qu'il comprend les stades suivants: a) introduction d'un virus herpétique virulent et vivant dans une couche monocellulaire d'une culture de cellules de tissu provenant de cellules rénales de chat b) incubation de la culture pendant environ 3 à 5 jours à une température de 35 C jusqu'à cytopathologie pratiquement complète des cellules c) récolte d'une fraction du virus ainsi produit et introduction du virus récolté dans une couche monocellulaire fraichement préparée dérivant d'un tissu rénal de chat d) incubation de la culture précitée à une température d'environ 25 C pendant une durée suffisante pour conduire à la cytopathologie d'au moins une partie des cellules de tissu de chat e) passage en série d'une partie du virus ainsi produit dans des cellules provenant de tissu de chat à raison d'au moins 50 fois à une température d'incubation d'environ 250C pour l'obtention d'un virus avirulent vivant, antigéniquement actif f) isolement du virus précité du dernier passage en série. 11. Vaccin de virus herpétique vivant atténué, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité efficace de virus herpétique vivant, avirulent, antigéniquement actif produit par un procédé comprenant les stades suivants a) introduction d'un virus herpétique virulent et vivant dans une culture de cellules de tissu b) incubation de la culture jusqu'à évidence de cytopathologie cellulaire ;; c) récolte du virus ainsi produit et introduction du virus récolté dans une nouvelle culture de tissu d) répétition dc passage en série du virus dans de la culture de tissu un nombre de fois suffisant à ne température dlincubation suffisante pour produire un virus avirulent, vivant et antigéniquement actif e) isolement du virus précité du milieu de culture de tissu ci-dess1s ; et f) addition du virus isolé précité à une solution stabilisante pour en former un vaccin. 12. Vaccin suivant la revendication 11, caractérisé en ce que la culture des cellules de tissu précitée est une culture de cellules d'un tissu d'un membre de la famille des félidés. 13. Vaccin suivant la revendication i1, caractérisé en ce que la culture de cellules de tissu précitée est une culture de cellules de tissu de chat. 14. Vaccin suivant la revendication 11, caractérisé en ce que la culture de cellules de tissu précitée est une culture de cellules de tissu rénal de chat. 15 Vaccin suivant la revendication 11, caractérisé en ce que la température d'incubation pour les passages en skie est maintenue à une valeur d'environ 23 à 33 C 16. Vaccin suivant la revendication il, caractérisé en ce que la température d'incubation à chaque passage en série est d'environ 2500. 17. Vaccin suivant la revendication 11, caractérisé en ce que le passage en série est exécute au moins 50 fois 18. Vaccin suivant la revendication 11, caractérisé en ce que les passages en série sont exécutés au nombre d'au moins 50, à une température d'incubation d'environ 23 à 33 C. 19. Vaccin suivant la revendication 11, caractérisé en ce que la culture de cellules de tissu précitée est une culture de ligne cellulaire---stable dérivant d'un tissu primaire de chat. 20. Vaccin de virus herpétique vivant atténué, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité efficace d'un virus herpétique visant avirulent antigéniquement actif, produit par un procédé comprenant les stades suivants: a) introduction d'un virus herpétique virulent et vivant dans une couche monocellulaire d'une culture de celuiules de tissu provenant de cellules rénales de chat; b) incubation de la culture pendant environ 3 à 5 jours à une température de 35 C jusqu'à cytopathologie pratiquement complète des cullules; c) récolte d'une fraction du virus ainsi produit et introduction du virus récolté dans une couche monocellulaire fraichement préparée dérivant d'un tissu rénal de chat; d) incubation de la culture précitée à une température d'environ 25 C pen dant une durée suffisante pour conduire à la cytopathologie d'au moins une partie des cellules de tissu de chat; e) passage en série d'une partie du virus ainsi produit dans des cellules provenant de tissu de chat à raison d'au moins 50 fois à une température d'incubation d'environ 25 C pour l'obtention d'un virus avirulent vivant, ant igéniquement actif; f) isolement du virus précité du dernier passage en série. 21. Procédé pour protéger des chats sensibles contre l'infection par le virus herpétique, caractérisé en ce qu'on administre aux chats un vaccin de virus herpétique vivant atténué qui comprend une quantité efficace d'un virus herpétique vivant attdnué, antigéniquement actif produit par un procédé comprenant les stades suivants: a) introduction d'un virus herpétique virulent et vivant dans une culture de cellules de tissu; b) incubation de la culture jusqu'à évidence de cytopathologie cellulaire; c) révolte du virus ainsi produit et introduction du virus récolté dans une nouvelle culture de tissu; d) répétition du -passage en série du virus dans de la culture de tissu un nombre de fois suffisant à une température d'incubation suffisante pour produire un virus avirulent, vivant et antigéniquement actif; e) isolement du virus précité du milieu de culture de tissu précité; f) addition du virus isolé précité à une solution stabilisante aux fins d'en former un vaccin. 22, Procesdé suivant la Eevendication 21, caractérisé en ce que la culture de cellules de tissu précitée est une culture de cellules d'un tissu d'un membre de la famille des félidés. 23.- Procédé suivant la revendication 21, caractérisé en ce que la culture de cellules de tissu précitée est une culture de cellules de tissu de chat. - 24. Procédé suivant la revendication 24 caractérisé en ce que la culture de cellules de tissu précitée est une culture de cellules de tissu rénal de chat. 25. Procédé suivant la revendication 21, caractérisé en ce que la température d d'incubation pour les passages en série est maintenue à une valeur d'environ 23 à 330C. 26. Procédé suivant la revendication 21, caractérisé en ce que la température d'incubation à chaque passage en série est d'environ 25 C. 27. Procédé suivant la revendication 21, caractérisé en- ce que le passage en série est exécuté au moins 50 fois. 28. Procédé suivant la revendication 21, caractérisé en ce que les passages en série sont exécutés au nombre d'au moins 50, à une tem- pérature d ' incubation d'environ 23 à 33 C. 29. Procédé suivant la revendication 21, caractérisé en ce que la culture de cellules de tissu précitée est une culture de lignée cellulaire stable dérivant diun tissu primaire de chat. 30. Procédé pour protéger des chats sensibles contre une infection par le virus he-rpétiquet caractérisé en ce qu'on administre aux chats une dose efficace d'un vaccin de virus herpétique atténué vivant, préparé par un procédé herpétique comprenant les stades suivants: a) introduction d'un virus herpétique virulent et vivant dans une couche monocellulaire d'une culture de cellules de tissu provenant de cellules rénales de chat b) incubation de la culture pendant environ 3 à 5 jours à une température de 359C jusqu'à cytopathologie pratiquement complè- te des cellules ; ; c) récolte d'une fraction du virus ainsi produit et introduction du virus récolté dans une couche monocellulaire fraichement préparée dérivant d'un tissu rénal de chat d) incubation de la culture précitée à une température d'environ 250C pendant une durée suffisante pour conduire à la cytopathologie d1au moins une partie des cellules de tissu de chat e) passage en série d'une partie du virus ainsi produit dans des cellules provenant de tissu de chat à raison d'au moins 50 fois à une température d'incubation d'environ 250C pour l'obtention d'un virus avirulent vivant, antigéniquement actif f) isolement du virus précité du dernier passage en série.