Brevet FR2356727A1 — publié le 19780127

-La présente invention a pour objet des endoantigènes de Staphylococcus aureus, leur préparation et leur application comme réactifs pour recherches sérologiques. Elle concerne en particulier l'application des endoantigènes ainsi obtenus comme réactifs pour la mise en évidence d'anticorps floculants et précipitants dans les sérums humains et animaux. Les Demandeurs ont découvert qu'il était possible de préparer des endo-antigènes de Staphylococcus aureus capables de visualiser la réaction de précipitation et de floculation de ces antigènes sur des anticorps antistaphylococciques à la condition de préparer ces endo-antigènes selon un procédé particulier. Le but du procédé de l'invention est donc d'obtenir des endo-antigènes de Staphylococcus aureus dépourvus de parois par une méthode d'altération déterminée par autolyse enzymatique en présence d'acides aminés, par exemple de glycocolle. De façon générale, le procédé de préparation d'endoantigènes de Staphylococcus aureus de l'invention est caractérisé par les étapes consistant à cultiver une souche bactérienne de Staphylococcus aureus sur un milieu de culture, à extraire les bactéries du milieu de culture, à effectuer la lyse des bactéries extraites, à centrifuger le lysat et à recueillir le surnageant contenant les endo-antigènes, et à détoxifier les endo-antigènes du surnageant. Selon un mode préféré de réalisation de ltinvention en combinant la lyse des bactéries à action d'un agent tel que le polyvinylpyrrolidone, on obtient des endo-antigènes plus volumineux qui facilitent la visualisation de la réaction de ces endo-antigènes sur des anticorps antistaphylococciques. Dans ce mode préféré de réalisation, le procédé comprend les étapes consistant à cultiver une souche bactérienne de Staphylococcus aureus sur un milieu liquide contenant de la peptone, du chlorure de sodium, de l'extrait de levure et du glucose, à centrifuger le milieu de culture et à recueillir le culot contenant les bactéries, à mettre le culot en suspension dans une solution de glycocolle additionné de polyvinylpyrrolidone et à le maintenir à 3700 pendant le temps nécessaire à la lyse des bactéries, 2 à centrifuger le lysat et à recueillir le surnageant, et à traiter le surnageant par urie solution de mercurothiolate de soude pour détoxîfier les endo-antigènes. Dtautres caractéristiques et avantages du procédé de l'invention apparattront à la lecture de exemple illustratif qui va suivre. Dans cet exemple, le milieu liquide de culture utilisé est prépare conformément au procédé indiqué ci-dessous. Formule ( pour 1 litre ) - Extrait de levure 5g - Peptone Chapoteaut (peptone sèche) 40 g - Chlorure de sodium 5 g - Glucose 2g Mode de préparation On dissout à chaud ltextrait de levure, la peptone et le chlorure de sodium dans de l'eau distillée dans un récipient en émail. On ajuste le pH à 7,8 , on complète et on filtre. On laisse le mélange 20 minutes à 1206C dans un autoclave. On filtre le mélange, on y ajoute le glucose et on le stérilise à 1100C pendant 20 minutes. EXEMPLE On fait croître des bactéries de Staphylococcus aureus, prélevées de sang de malade par hémoculture, sur un milieu solide constitué par une gélose ordinaire trypticase soja. Àu moyen de la culture ainsi obtenue, on ensemence des fermenteurs contenant un milieu liquide obtenu comme indiqué pré cédemment On effectue la culture des bactéries sur ce milieu liquide pendant 24 heures à 37 C. On centrifuge ensuite la culture jusqu'à leobtention d'un surnageant clair et on recueille le culot contenant les bactéries. Le culot ainsi recueilli est mis en suspension dans une solution de glycocolle additionnée de polyvinyl-pyrrolidone. Pour cela, on ajoute 35 ml dtune solution à 10 % de glycocolle pour 200 ml de culot de culture et on ajoute ensuite 0,1 ml d'une solution à 35 so de polyvinyl-pyrrolidone pour 10 ml de l'émulsion de culture obtenue précédemment. On maintient ce mélange pendant environ 20 jours à 370C et on effectue une nouvelle centrifugation dont on recueille le surnageant. Ce surnageant est additionné d'une solution au 1/250e de mercurothiolate de soude, à raison de 1 ml de solution pour 39 ml de surnageant, et laissé au contact pendant environ 8 jours à 2O0C. La solution obtenue peut être utilisée directement comme réactif pour recherche sérologique, comme il sera indiqué plus loin. Souche utilisée On utilise une souche de Staphylococcus aureus prélevée par hémoculture à partir de sang de malades humains. La souche qui a donné les meilleurs résultats correspond aux caractéristiques suivantes : STAPHYLOCOCCUS AUREUS, Institut Pasteur de Layons NO 1158. - Lysotype groupe I - Cocci Gram + en amas immobiles. - Pousse en 24 h sur milieux ordinaires Trypticase soja. - Pousse en milieu hypersalé à 7,5 g O,o/ - Hémolytique sur gélose sang mouton. - Colonies dorées. - Fermente Catalase + Mannitol Coagulas + Sorbitol Phosphatase + N-acétyl-glucose DN ASE + Maltose Ribose Lactose Galactose Saccharose d (+) glucose d (+) Tréhalose d (-) lévulose Arginine d (+) mannose Cette souche a été déposée sous le numéro L M D 76.3 auprès du "Laboratory for Microbiology .of.the Technical- Uuiversity of DelStt à Delft aux Pays-Bas. Application comme réactifs Les endo-antigènes obtenus par le procédé de ltin- vent ion, dont le volume a été augmenté par métabolisation du polyvinylpyrrolidone, permettent de visualiser la réaction de précipitation et de floculation de ces endo-antigènes sur des anticorps antistaphylococciques. Ils peuvent donc être utilisés comme réactifs pour recherches sérologiques en vue de la mise en évidence d'anticorps antistaphylococciques floculants et précipitants dans les sérums humains et animaux. La mise en évidence d'anticorps précipitants dans le sérum d'un sujet correspondant à une propriété du sérum qui s'apparente à une défense de l'organisme de ce sujet vis à vis des staphylocoques. En cas de réaction positive, on peut en déduire que l'organisme du sujet considéré présente une telle propriété de défense, cette propriété étant soit acquise au début de la vie de ce sujet ou ayant été acquise plus tard. La mise en évidence des anticorps précipitants s'effectue avantageusement par une micro-méthode au moyen de tubes capillaires. A cet effet, on utilise des tubes capillaires transparents ayant, par exemple, unelongueur de 10 cm et un diamètre intérieur compris entre 1,3et 1,4 mm. On prélève par capillarité d'abord le réactif antigénique jusqu'au 2/3 d'un tube capillaire puis le sérum à étudier jusqu'à ce que le tube soit plein. On maintient ensuite le tube verticalement, par exemple en le plantant dans un cordon de pâte à modeler, et on effectue la lecture 24 heures plus tard, à la température du Laboratoire. En cas de réaction positive, on constate l'apparition de précipités blancs révélateurs de l'existence d'anticorps antistaphylococciques dans le sérum. Selon le processus indiqué précédemment, 2000 essais ont été effectués chez I'homme, dont 1200 chez des nouveau-nés (sur le sang du cordon ombilical). Pour 2 s de ces nouveau-nés, on a obtenu un résultat négatif indiquant que ces nouveau-nés étaient plus sensibles aux infections que les autres et qu'il y avait donc lieu de les isoler de toute source d'infections. Les essais effectués sur .le sérum d'adultes normaux ont donné environ 1 eh de réactions négatives. 700 essais ont été effectués chez des sujets adultes malades et ont donné des taux variables suivant chaque type de maladie. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'endooantigenes extraits de Staphylococcus aureus, caractérisé par le fait quil comprend les étapes consistant à cultiver une souche bactérienne de Staphylococcus aureus sur un milieu liquide contenant de la peptone, du chlorure de sodium, de l'extrait de levure et du glucose, 4 à centrifuger le milieu de culture et å recueillir le culot contenant les bactéries, à mettre le culot en suspension dans une solution de glyco colle additionné de polyvinylpyrrolidone et à le maintenir à 370C pendant le temps nécessaire à la lyse des bactéries, à centrifuger le lysat et à recueillir le surnageant, et à traiter le surnageant par une solution de mercurothiolate de soude pour détoxifier les endo-antigènes. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le milieu liquide de culture est ensemencé à partir d'un milieu solide constitué par une gélose trypticase soja. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que la souche de Staphylococcus aureus est telle que décrite page 3 de la description. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que la souche est une souche de Staphylococcus aureus déposée sous le numéro L AI D 76.3 auprès du stLaboratory for Nicrobiology of the Technical University of Delft". 5. Les endo-antigènes de Staphylococcus aureus obtenus par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 4. 6. Application des endo-antigènes selon la revendication 5 comme réactifs pour la recherche sérologique d'anticorps antistaphylococciques.