Brevet FR2335198A1 — publié le 19770715

On sait déjà qu'il est connu de préparer des prothèses greffées vasculaires à partir de matériaux collagènes De telles prothèses sont actuellement commercialisées par la firme américaine Johnson & Johnson de New Brunswick, New Jersey. Outre les publications qui seront énumérées dans la suite de la description, on trouvera des informations intéressantes sur la question dans les références suivantes Wesolowski S.A. : la cicatrisation des prothèses vasculaires Surgery 57:319, 1965 Wesolowski S.A. ,Fries , C.C.Domingo , R.T. Fow L.M. & Sawyer P.N. : comportement des prothèses artérielles simples et composées: observations expérimentales et cliniques dans : Fundamentals of Vascular Grafting Mc Graw-Hill New York 1963 pp 252-268. Wesolowski, S.A. , Hennigar , G.R. ,Fox, L.M., Fries , C.C. & Sauvage, L.R. : les facteurs responsables de l'échec à long terme des greffes vasculaires humaines, présenté au Symposium sur les résultats les plus récents de. la reconstruction artérielle, International Cardiovascular Society Meeting , Rome,September 1963, J.Cardiov. Surg. 5:44, 1964 Sawyer P.N. & Pate - J.W. : étude des différences de potentiel électrique entre l'aorte normale et l'aorte greffée chez le chien Research ReportNM 007081, 10.06.Naval medical Hesearch Institute BethesdaM:d, 1953. Sawyer , P.N. & Pater J.W. :Phénomènesbioélectrique5comme facteurs étiologiques dans la thrombose intravasculaire .Amer, J.Physiol. 175:103, 1953. Williams , R.D. & Carey L.C.: études dans la production des thromboses veineuses standard. Ann.surg. 149:381, 1959. Schwartz, S.I. & Robinson J.W.: prevention de la thrombose par l'application d'un courant électrique négatif. Surg. Forum 12:46, 1961. Sadd. J.R. Koepke, D.E. Daggett, R.L. Zarndorff , W.C. Young W.P. & Gott-V.L.: aptitude relative des différences surfaces conductrices pour le rejet de la formation de caillots sur des prothèses intravasculaires. Surg. Forum 12:5252, 1961 Means , G.E. & Feeney, R.E. : modification. chimique des protéines, HOlden Day Inc. San francisco,Calif. 1971 pp.144-148 La présente invention a pour but un procédé perfectionné pour la préparation de prothèses vasculaires greffées à base de matière collagénique. D'autres buts de l'invention sont les suivants - un dispositif prothétique greffé vasculaire perfectionné qui soit moins sensible à la thrombose et aux affections semblables. - une greffe vasculaire tubulaire perfectionnée dont la surface intime ne peut pas être prise comme based'accumulation par las plaquettes sanguines. D'autres buts de l'invention visent un procédé consis tant à modifier la surface intime d'une prothèse vasculaire greffée par accroissement de la charge superficielle négative nette de cette surface intime. De préférence, la prothèse est en matière collagénique et sa surface intime est traitée par une réaction de succinyla tion- dans le but de couvrir la surface collagénique par les groupes amino libres. De préférence la matière de départ de la greffe est un collagène préparé à partir d'un matériau artériel carotide bovin digéré par la ficine, matériau connu également sous le nom de collagène tanné à amidon dialdéhydique. Comme on rie verra, la greffe est généralement fournie sous forme d'un tube collagènique dont une extrémité est fermée et insérée dans un fluide tel que I'éthanol, un réactif chimique liquide étant introduit dans l'orifine du tube de manière à accroître la charge superficielle négative de sa surface intime. Le réactif est de préférence, comme on le verra ci-après, de l'anhydride succinique en solution basique. Plus particulièrement on introduit dans:l'orifice du tube une solution tampon au carbonate d'acide de sodium par additionsuccessives d'environ 10 ml chacune, auquel on ajoute respectivement environ 0,lg de cristaux d'anhydride succinique. D'autres buts dé l'invention appraitront dans le description détaillée-- qui suit. Avant cependant de présenter la description détaillée de l'invention, on va donner ci-après un breftésume des études ayant conduit à la mise au point de cette invention. On a obtenu des prothèses vasculaires collageniques préparées par digestion enzymatique de matériau carotide bovin artériel au moyen de cine . On a modifié chimiquement des segments de ces prothèses vasculaires dans le but de modifier la configuration electro-chimique de leur surfaceinintime eet plus particulièrement de produire une charge superficielle positive, une charge r auperficielle négative ou une charge superficielle neutre. Ces greffes sasculaires modifiées, ainsi que des segments de prothesesvasculaires collagèniques non modifiées ont été implantées dans l'artère carotide, les veines jugulaires externes, l'artère fémorale et la veine fémorale de chiens bâtards perdant des périodes de 1,15,30 let 120 mn.On prélève ensuite les greffes et on les soumet à un examen macroscopique pour déterminer la présence et le degré d'occlusion thrombotique. On soumet encore ces prothèses à une autre analyse en utilisant un microscope électronique à balayage dans le but de determiner la nature précise des occlusions thrombiques. On a découvert qu'en accroissant la densité de la charge supefficielle négative nette sur la surface intime des prothèses vasculaires, on peut notablement reduire I 'occlusion thrombotique tout en créant un potentiel interfaciel sang-prothèse plus positif, ce qui accélère largement le déroulement du processus thrombotique. Des segments de ces prothèses vasculaires ont été à nouveau implantés dans le système vasculaire de chiens bâtards et in vivo on a réalisé des mesures de potentiel du courant artériel et veineux. La polarité despotentiel de l'écoulement reflete le potentiel inter-facialentre la prothèse vasculaire et le sang s'écalant à travers la greffe , un potentiel d'écoulement positif dans l'électrode en aval indiquant une densité-de charge uperficielle négative nette sur la surface intime de la greffe par rapport aux éléments sanguins. Les potentiels d'écoule- ment artériels et veineux in vivo obtenus à partir des prothèses vasculaires collagéniques modifiées négative " sont de polarité uniformément positives tandis que les potentiels d'écoulement obtenus à partir des greffes modifiées "positives" sont uniformE- ment négatives. Les potentiels d'écoulement obtenus à partir des greffes modifiées chimiquement manière à neutraliser les charges superficielles intimes au pH physiologique sont également trouvés positifs en polarité mais d'un ordres de grandeur moins êlevé qc ei greffes altérées négativement.Les artères carotides bovines digérées à la ficine et non modifiées présentent un potentiel d'écoulement ayant une polarité légèrement négative. Ces mesures de potentiel dtécoulement servent à contrdler les processus de modification chimique et à assurer la modification électrique de la densité de charge superficielle qui se de roule comme on s'y attend. La figure 1 du dessin annexé illustre schématiquement un appareillage pour la mise en oeuvre de 1'invention. La figure 2 illustre schématiquement une technique pour la mesure du potenttST d'écoulement conformhment à l'invention et la figure 3 illustre schéiquement une portion de la figure 2 à plus grande échelle. Des preuves ont été fournies de la formation d'un complexe entre des channes d'hydratesde carbone incomplètes dans le collagène et la glucosyltransférase présente sur la surface externe des plaquettes comme étape primaire déterminant la reconnaissance des plaquettes vis-a-vis du collagène et leur adhésion ultérieure. (Jamieson, G.A. Turban E.C and Barber, A.J.: base enzymatique pour les plaquettes : adhérence du collagène comme étape primaire dans l'hémostase. Nature New Biology 234:5(1971); Barber A.J. and Jamieson G.A. caractérisation de l'adhésion du collagène et desplaquettes par rapport à la glucosyltransférase des membranes plasmatiques des plaquettes du sang humain. Biochim. Biophys.Acta 252:533 (1971). La réaction fait intervenir l'accouplement enzymatique du glucose aux restes galactosyle fixés aux channes latérales dhydroxylysine présentes dans les peptides du collagène. Le glucose est fourni par des plaquettes sous forme d'uridinediphosphoglucose (UDPG) conformément au schéma suivant n groupeg -amino de l'hyAroxylysine 'IT2Ct --o É}i .4 t Ga1 Oli -N( Il U1)i'u Giucosyl.transferase UDP CH20H - S ' R= aollaEsent R\ il Glucoc' Glucosc ' 61I L'activité aggrégative des plaquettes da collagène in vitro a été démontrée exiger l'intégrité structurale du groupe 6-hydroxyméthyl du galactose et des groupes t-amino de la lysine et de l'hydroxylysine sur la molécule de collagène. On a pose que en principe/la spécificité substratique de la glucosyltransférase des plaquettes est à l'origine de ce phénomène dépendant de l'aggrégation des plaquettes (Chesney, C. arper, E. et Coleman, R.W. :rôle critique des chaînes latérales carbohydratées du collagène dans l'aggrégation des plaquettes. HIEG 72-43(1972); Wilner G.D.Nossel HL.et Leroy E.C. : aggrégation des plaquettes par le collagène J.Clin.Invest. 47:2616 (1968). L'utilisation des hétérogreffes artérielles bovines modifiées comme prothèses vasculaires a déjà été décrite et leur comportement et leurs caractéristiques physiques sous forme de greffes artérielles ont été discutées en détail. Dans les présentes études, on a trouvé que l'accroissement de l'électronégativité de la surface interne des prothèses contribue grandement à un comportement favorable de la greffe. Le sujet a été particulièrement décrit dans les publications suivantes Bothwell, J.W,Lord G.J.,RosenbergsN.ssurrowes, C.D.,Wesolowski,S.A. > et Sawyer P.N.: hétérogreffes artérielles modifiées : relation des techniques de trament vis à vis des aaractéristiques d'interface dans : Biophysical Mechanisms in Vascular Hemeostasis and Intravascular Thrombosis , P.N. Sawyer,Ed. Appleton-Century- Crofts NEW YORK 1965 G.H. pp 306-313; Rosenberg, N. Henderson, J., Douglas,J.F., Lord qH and Gaughran/:utilisation des implants. artériels préparés par modification enzymatique des hétérogreffes artérielles . II.Physical properties of the elastica and collagen components of the arterial wall. Arch. Surg. 74:89(1957); Rosenberg,N. Henderson ,J .,Lord,G.H. and Bothwe utilisation des hétérogreffes traitées aux enzymes comme substitut de segment artériels. V.Influence of processing factors on strength and invasion by host. Arch. Surg. 85:192 (1962); Rosenberg, N.penderson,J.,Lord,G.H. et Bothwell, J. W. :une,prothèse artérielle d'origine vasculaire hétérologue. JAMA 187:741(1964); Rosenberg, N,Henderson,J.,Lord, G.H. et Bot-hwell,J.W. : prothèse artérielle collagènique d'origine vasculaire hétérologue :propriétés physiques et comportement comme greffe artérielle. Dans BIqphysical Mechanisms in Vascular Homeostasis and INtravascular Thrombosif,P.N.,Sawyer, Ed,Appleton Century Crofts , New york, 1965,pp,314-321. On a démontré que la succinylation d'un collagène solubilisé entraine une conversion d'approximativement 95% des groupes -amino en groupes carboxyle libres(Gustavson,KH.Akiv. For Kemi 17: 541 (1961). Au surplus, on a démontré que le blocage des groupes amino libres du collagène par désamination, N-acétylation ou traitement par le dinitrofluorobenzène entraine une réduction de plus de 90% de l'activité aggrégative des plaquettes in vitro. On a conduit maintenant des recherches pour élucider l'activité anti-plaquette et anti-thrombogène du collagène modifié chimiquement par l'évaluation in vivo des prothèses vasculaires hétérogreffées artérielles bovines digérées a la ficine implantée dans le système vasculaire des chiens bâtards. Pour la modification chimique des artères carotides bovines digérées à la ficine, I'appareil mis au point pour la modification chimique des artères carotides bovines digérées a la ficine a l'aspect illustré àla figure 1. Il se compose d'un réceptacle 10 présentant un orifice 12 que traverse l'arbre 14 d' un agita teur électrique 16.Un bouchon en verre 18 est placé à l'extrémité inférieure d'une artère carotide bovine digérée a la ficine immergée par exemple dans de l'éthanol à 40% Dans le but deaccroitre la densité de la charge superficielle positive sur la surface intime des prothèses vasculaires collagèniques, on emploie une réaction de formation d'amides déclanchée a la carbodiimide pour convertir la source principale de charges négatives (groupes carboxyle libres des acides aspartique et glutamique)en portions amides. Le processus fait intervenir le traitement de la protéine par un excès de EDC (1-éthyl-3,3'-diméthylaminopropylcarbodiimide, HC@@ et une amine (NH4Cl) en présence d'une concentration élevée d'un dénaturant (urée). Cette réaction (Means,G.E. and Feeney,RE.:Chemical Modi fication of Proteins eHoldeh-Day, Inc, San Francisco,Calif., 1971,pp. 144-148) a été utilisée pour la conversion pratiquement quantitative des groupesccarboxyle protéiniques en amides pour déterminer le nombre de groupes carboxyle dans les protéines (Hoare, D.G. and Koshland, D.E. : J.Biol.Chem. 242:2447j1967). A température ambiante, la réactionchimique se déroule de la manière suivante O o it Protéine - C - O + NH3.BC1 R-N=C=N-R' Protéine-C-NH2 pHr5 urée dans laquelle : On prépare 100 ml d'une solution réactionnelle contenant à température ambiante 0,5 M EDC ( 7,75 g /100 ml), 7,5 M urée (45g/ 100 ml) et 5,0 M NH4C1 (26,75 g /100 ml) dans de l'eau tri-distillée (ajustée à pH 5) et on les ajoute dans 1 'orifice de prothèse vasculaire par portions 10 ml, en meme temps que l'implant en suspension dans de l'éthanol à 40% comme illustré à la figure 1.On change la solution réactionnelle chaque heure avec la dernière portion demeurant dans l'orifice pendant une nuit. A l'achèvement de la période de réaction de 24h,on retire la prothèse vasculaire de l'appareillage de modification et on la place dans un plateau rempli d'une solution saline stérile dans laquelle de longs tubes sont découpés en segments de 3,5cm pour des études d'implantation ou de 10,0 cm pour des mesures de potentiel d'écoulement. Dans le but d'accroitre la densité de charge superficielle négative sur la surface intime des prothèses vasculaires collagéniques, an réalise P'acylation des groupes amino libres (en particulier ceux de la lysine et de lhydroxylysine) de la protéine par l'anhydride succinique dans une solution plus basique qae le pH 7,0. Cette réaction ne couvre pas seulement la source principale de charges positives libres mais les convertit également en restes anioniques (Means, i.E. and Feeney,R.E.:Chemical Modification of Proteins. Holden-day,Inc.,San FRANCISCO, Calif.,I971 pp. 74,75). La réaction chimique s'déroule de la manière suivante o O o Protéine - NH3 + + PH > 7k Protéine-NH-C-CH2CH2-C-O On prépare une solution basique de 75 ml d'éthanol à 100% de 25 ml d'une solution tampon 1 M de NaHCO3 et on l!introduit dans l'orifice de la prothèse vasculaire par portions de 10 ml Sur une période de 5 heures ,l'implant étant en suspension dans de l'éthanol à 40% comme illustré à la figure 1. A chacune des portions de 10 ml de la solution basique, sont ajoutés des cristaux d'anhydride succinique. La quantité totale de 1,gramme d'anhydride succinique est répartie également entre les dix potinas aliquotes. A l'achèyement de la péridde, de réaction, on retire la prothèse vasculaire de l'appareillage de modification et la place dans un plateau de solution saline stérile dans laquelle de longs tubes sont découpés en segments de 3,5cm pour les études d'implantation ou de 10,0 cm pour les mesures de potentiel a'écoulement. Dans le but de neutraliser les charges su2erficielles électriques sur les surfaces intimes desprothèses vasculaires collagéniques, on emploieune réaction de formation d'amide interne déclenchée par carbodiimide pour lier les groupes carboxyle libres et amino des chaines peptiques voisines. Une telle réaction élimine les sources principales d'électropéga tivité (groupes carboxyles) et d'électropositivité (groupes amino libres). La réaction chimique te déroule de la manière suivante O O Protéine--O + H3N-Proteine r 5M EDC,Protéine-C-NH Protéine On prépare une solution de 100 ml de EDC.0,5 M(7,75g/ 100 ml) dans de l'eau tri-distillée et on l'ajoute dans l'orifice de la prothèse vasculaire par portions de 10 ml avec l'implant en suspension dans de l'éthanol à 40% comme illustré à la figure 1. On change la solution réactionnelle chaque heure, la dernière portion aliquot demeurant dans l'orifice pendant 1 nuit. A l'achèvement de la période de réaction de 24h , on retire la prothèse vasculaire de l'appareillage de modification et on la place dans unt plateau de solution saline stérile dans laquelle on découpe de longs tubes en segments de 3,5cm pour les études d'implantation ou de '10,0cm pour les mesures de potentiel d'écoulement. Comme matériau de départ dans ce qui précède, on emploie par exemple des prothèses vasculaires en collagène. tanné à l'amidon dialdéhydique, ces composants d'hétérogreffes vasculaires coblagè- niques bovines tannées à l'amidon dialdéhydique étant mis dans le commarce par la firme américain Johnson - & Jbhnson , New Brunswick New Jersey - USA. Les implantations chirurgicales de prothèses vasculaires collagèniques modifiées sont les implAntations d'artères carotides et de veines jugulaires. On anesthésie des chiens bâtards pesant entre 10 et 28kg(moyenne 18,6kg) au Nembutal (pentabarbital sodique) à saison de 0,5cc/kgpar injection intraveineuse. Les animaux sont placés sur la table d'opération en position couchée sur le dos et on procède à une incision cervicale oblique parallèle au bord antérieur du muscle sternocleidomastoidien. On incise la couche musculaire platismatique en même temps que la couche antérieure du faisceau cervical profond et après hémostase, on rétracte ces structures postérieurement de manière ss réviser la veine jugulaire externe.Angulairement aux mandibules, on identifie la veine auriculaire postérieure, la face faciale commune et la veine rétromandibulaire et on cercle un segment mobilisé de chacune au moyen d'une ligature liche de ruban ombilical. On ligature la veine jugulaire externe postérieure avec de la soie 3-O et on la divise au voisinage de son entrée. La veine jugulaire externe est alors disséquée de ses attaches fasciales jusqu'au point dans le bas où elle disparaît derrière la bordure postérieure du muscle sternocleidomastoidien ou on réalise une autre ligature lâche de ruban ombilical. Toutes les petites ramifications perforantes de la veine jugulaire externe sont ligaturées avec de la eoie 3-0 au voisinage deleur entrée. Le bord antérieur du muscle sternocleidomastoidien est rétracté postérieurement pour exposer la dissection des faisceaux et des couches de tissus fibroaérolaires qui recouvrent l'enveloppe de la carotide.Od incise l'enveloppe de la carotide et après identification du nerf vague, on réalise une ligature souple de ruban ombilical pour cercle l'artère carotide au niveau du troisième anneau trachéal . L'incision de l'enveloppe carotide est poursuivie jusqu'à la bifurcation de l'artère carotide commune (ou de l'artère thyroide supérieure) ou on opère une autre ligature lâche au ruban ombilical. L'implAatation des prothèses vasculaires collagèniques modifiées fespectives est réalisée de manière suiva-nte : des embouts sont constitués par des segments de 2cm de tubes de caoutchouc épais disposés autour des extrémités libres des ligatures de ruban ombilical. Ces embouts sont ensuite étendus jusqu'aux ligatures de manière a empêcher 1 'écoulement des vaisseaux respectifs et maintenus en place par des pinces de Kelly. On pratique deux incisions transversales.séparées d'environ 2,5cm dans les vaisseaux respectifs avec une paire de ciseaux de Metzenbaum arrondis. Les prothèses vasculaires (de 3,5cm de longueur pour les études macroscopiques et l'évaluation SEM et de 10,0 cm de longueur pour les mesures de potentiel d'écoulement) montées sur des canules en acier inoxydable nettoyées à l'acide chlorhydrique (de 1,5cm delongueur) par une double ligature de la soie 3-0 ,sont implantées avec leurs extrémités canulées libres dans les orifices du vaisseau etmaintenues en place par deux ligatures de soie 3-0.Les deux anastomoses ainsi préparées, la pièce de connection du vaisseau sanguin est séparée ce qui permet ainsi à la greffe de reposer à plat dans son lit "fascial". On retire alors les pinces de Relly pour supprimer la tension sur les embouts montés sur les rubans ombilicaux (le distal du courant sanguin est enlevé le premier) et on laisse le sang s'écouler par la prothèse vasculaire. Les greffes vasculaires sont laissées en place pendant des périodes de temps spécifiées, la blessure etant recouverue de tampons de gaze imbibés de solution saline. Les diamètres internes des vaisseaux sanguins et des prothèses sont calculés en mesurant les diamètres externes des vaisseaux et des implants au moment où le sang s'écoule à travers le système avec un micromètre et en soustrayant deux fois l'épaisseur de la paroi de ces diametres;Les différencesentre les diamètres internes du récipient et des vaisseaux sanguins prothétiques sont indiquées autableau I ci-après. TABLEAU I DIFFERENCES ENTRE LE DIAMETRE INTERNE DU RECIPIENT ET DES VAISSEAUX SANGUINS PROTHETIQUES Vaisseau D.I.du-lvaisseau D.I. du vaisseau Différence de diamètre réel(mm) prothétique(mm) interne Artère carotide 4 10 6 5 9 4 5 10: 5 5 8 3 4 10 6 x =4,6 x=9,4 x= 4,8 Veine jugulaire 8 10 2 7 9 2 8 10 2 8 10 2 8 10 2 x= 7,8 x=9,8 x=2,0 Artère 4 10 6 fémorale 5 9 4 4 10 6 5 8 3 4 10 6 x= 4,4 x= 9,4 x= 5,0 Veine 7 10 3 fémorale 7 8 1 7 9 2 8 10 2 7 10 3 x= 7,2 x= 9,4 x = 2,2 -D.I. =diamètre interne Pour l'implantation de l'artère fémorale et de la veine fémorale, on pratique une incision recouvrant le triangle fémoral vers l'arrière jusque dans la zone médiane de la cuisse au niveau de la jointure du genau. Le faisceau fémoral superficiel est disséqué pour être libéré de ses liens avec l'enveloppe fémorale sousjacente ce qui révèle l'artère fémorale et la veine reposant dans l'enveloppe à l'emplacement de la fossa ovalis.Les vaisseaux fémoraux sont disséqués pour être séparés de leur enveloppe et les ramifications de l'artère fémorale(artère iliaque circonflexe superficielle, artère pudendale externe, artère fémorale circonflexe médiane et artère fémorale circonflexe latérale) sont identifiées, ligaturées avec de la soie 3-0 et divisées au voisinage de leur origine.On cercle de ruban ombilical l'origine de l'artère fémorale par une ligature lâche. Les branches rostrales de la veinefémorale sont de même identifiées, ligaturées avec de la soie 3-0 et divisées au voisinage de leur entrée et la veine fémorale est également cerclée par une ligature lâche de ruban ombilical.Le muscle sartorius est rétracté latéralement et le muscle adducteur est rétracté médinnement au moyen d'une paire de rétracteurs exposant ainsi l'artère géniculaire descendante et la veine. ON poursuit avec soin la dissection vers le bas jusqu'au vaisseau géniculaire descéndant de manière à exposer la continuation caudale de l'artère et de la veine fémorales. Les 1petits vaisseaux perforant et leurs ramifications vasculaires sont ligaturés avec de la soie 3-0 et divises au voisinage de leur origine ou entrée. Des ligatures lâches de ruban ombilical sont pratiquées autour des vaisseau fémoraux respectifs et -leurs ramifications géniculaires descendantes .L'implantation des prothèses vasculaires collagèniques respectives est pratiquée comme décrit précédemment. Pour les mesures de potentiel d'écoulement ,on place une paire d'électrodes au chlorure d'argent-argent 22 et 24(figures 2 et 3) dans l'orifice 26 de la prothèse vasculaire 27 en passant par le centre de 2 "cordons de bourse" 28 et 30 en Dacron 5-0 cousus dans la surface superficielle et séparés par une distance équivalente à au moins 10 rayons. Les électrodes sont fixées par des fils à écrans classiques à un électromètre de Kiethley 32 (Sawyer, RKHimrthel,Et Lustrin,I., and Ziskind,H: mesure de potentiels dtecoulement dans les vaisseaux sanguins de mammiferes, l'aorte et la veine cave, in vivo .Biophys.J.6. 641(1966). Pour l'extraction,la fixation et l'observation macrosco pique à la fin des1.périodes de temps respectifs, les vaisseaux sanguins ascendants et descendants provenant à la fois des implants artériels et veineux sont doublement pincés transversale ment par des pinces de Kelly droites et divisés entre les deux pinces. Les deux prothèses (artérielles et veineuses) emplies de sang et fer-mées aux deux extrémités par les pinces de Kelly sont immédiatement prélevées et placées dans une solution de formaline à 10%.Tout en restant sous le niveau de formaline, les pinces de Kelly sont retirées en même temps que les canules d'acier inoxydables et les ligatures de soie 3-O et les implants vasculaires sont placés dans des tubes portant des étiquettes appropriées et contenant de la formaline à 10%. Le degré d'occlusion thrombotique est évalué numériquement sur une échelle allant de 0 à 4+ par trois obsdrvateurs indépendants, en double aveugle. Les valeurs moyennes des-trois évaluations pour chaque vaisseau et chaque période de temps sont réunies au tableau 2 ci-après TABLEAU 2 OBSERVATIONS MACROSCOPTQUE DES IMPLANTATIONS* PROTHETIQUES VASCULAIRES EN COLLAGENE MODIFIE TEMPS VAISSEAU NON MODIFIE POSITIVE NEGATIVE NEUTRE AMIDON Sanguin TANNE AU DIALDEHYDE Omn LFA 0 2+ 0 0 0 Omn LFV 0 4+ 0 0 0 15mn LCA 1+ 4+ 0 1+ 0 15mn LJV 2+ 4+ 0 1+ 1+ 30mn RFA 1+ 4+ 1+ 2+ 1+ 30mn RFV 4+ 4+ 1+ 2+ 2+ 2hrs RCA 3+ 4+ 1+ 3+ 2+ 2hrs RJV 3+ 4+ 1+ 3+ 3+ Le degré d'occlusion tkhombotique est évalue numériquement sur une échelle allant de 0 à 4+ par trois observateurs inde pendants. Les valeurs auront les significations suivantes 3 = surface intime prosthétique macroscopiquement propre 1+= thrombi jonctionnels à l'interface entre la canule d'acier inoxydable et la prothèse 2+= thrombi jonctionnel9plus thrombi visible macroscopiquement sur les parois adhérant à la paroi prothétique 3+=thrombi 3OnctionneZ plus thrombi sur paroi macroscopiquement évident suffisament important pour provoquer une sténose marquée de l'orifice greffé. 4+= occlusion thrombotique totale del'orifice vasculaire prothétique Toutes les observations sont pratiquées double aveugle" Signification des codes de la colonne 2 LFA : artère fémorale gauche LFV : veine fémorale gauche LCA : artère carotide gauche LJV : veine jugulaire gauche RFA : artère fémorale droite RFV : veine fémorale droite RCA : artère carotide droite RJV : veine jugulaire droite Le degré d'occlusion thrombotique des diverses heterogreffes vasculaires bovines axant subi une digestion à la ficine à divers degrés apparat au tableau 2 précédent. Les hétérogreffes artérielles et veineuses non modifiées ne provoquaient initiale ment aucune thrombose quand elles étaient exposées aux éIaments du sang.A mesure que la durée d' implantation augmente cepen dant,on peutnoter qu'aussi bien les prothèses artérielles et à un plus grand degré les prothèses vasculaires veineuses devienne occluses thrombotiquement. On constate une succession semblable d'évènements avec les prothèses au collagène modifié neutre et avec les vaisseaux tannés à l'amidon dialdéhydique Dans ce dernier cas, les évènements thrombotiques se deroulentM plaa lentement. Le processus chimique réalisé dans le but de provoquer l'accrois- sement de la densité de la charge superficielle positive sur la surface intime des hétérogreffes vasculaires entraine une accélérationdes événements thrombotiques. On peut voir d'après le tableau 2 que le simple contact des éléments du sang avec la surface vasculaire prothétique entraîne une occlusion importante de l'orifice du vaisseau (plùs marquéedans l'implant veneuM écoulement plus lent). Une occlusion thrombotique totale se produit dans l'implant veineux immédiatement et est constatée dans les 15 mn suivant les greffes artérielles. La réaction de xodification négative réalisée sur les tubes collagèniques entraine une comportement plus favorable de ces implants.On peut voir d'après le tableau 2 que les événements thrombotiques se produisant sur la surface intime des prothèses vasculaires sont notablement prolongés. ON obtient une surface intime macroscopiquement propre aussi bien sur les greffes artérielles que veineuses pendant 15 mn de l'écoulement sanguin. Après 2 h de contact avec les éléments de l'écoulement sanguin, on ne note que des thrombi jonctionnels à l'interface entre la canule d'acier inoxydable et la prothèse. Les résultats des mesures de potentiel d'écoulement veineux et artériels in vivo sur implantations de prothèses vasculaires collagène modifiées apparaissent au tablé au 3 ci-après Mesures de potentiel d'écoulement in vivo sur les prothèses vasculaires en collagène modifié PROTHESE POTENTIEL D'ECOULEMENT POTENTIEL D'ECOULE VASCULAIRE ARTERIEL (mv) MENT VEINEUX(mv) Tannéea + 0,1 - 0,1 l'amidon + 0,2 - 0,1 dialdéhydique + 0,1 + 0,1 x= + 0,13 x= - 0,03 Digérée -,8 - 0,4 à la ficine - 0,5 - 0,4 positive - 0,8 - 0,4 x= - 0,7 x= - 0,4 Digérée a laficine + 0,7 + 0,3 négative + 0,4 + 0,3 + 0,7 + 0,6 x= + 0,6 x= + 0,4 Digérée + 0,3 + 0,1 à la ficine + 0,2 + 0,2 neutre + 0,2 + 0,1 x= + 0,23 x= + 0,13 Digérée - 0,2 - 0,1 a la ficine non modifiée La polarité du potentiel d'écoulement reflète le potentiel interfacial entre laprothèse vasculaire et l'écoulement sanguin à travers la greffe, un potentiel d'écoulement positif enregistré a l'électrode aval indiquant une densité de charge superficielle négative surla surface intime de 1+ greffe par rapport aux éléments du sang. 1 polarité des mesures de potentiel d'écoulement artériel et artériel in vivo obtenu a partir de l'implantationdes hétérogreffes vasculaires bovines en ficine digérée non modifiée Get de l'ordre de -0,2 et -0,1 mv, respectivement Ces valeurs indiquent qu'un potentiel interfacial légèrement positif existe entre la surface interne de la greffe vasculaire et les éléments du sang en écoulement". Un ordre de grandeur encore plus élevé du potentiel d'écoulement négatif (potentiel interfacial positif) est noté avec les hétérogreffes veineuses et artérielles chimiquement modifiées jusqutà une augmentation de la densité de charge superficielle positive (-0,7 mv artériel -0,4 mv veineux). Les hétérogreffes vasculaires en collagène chimiquement modifié pour neutraliser les charges superficielles électriques sur la paroi intime prothétique produisent des potentiels d'écoulement artériel et veineux de l'ordre de + 0 ,23 et + 0,13 mv,respectivement. Ces implants vasculaires en collagène chimiquement altéré de manière à accroître la densité de charge supefficielle négative donnenGdes mesures de potentiel d'écoulament positif de plus grandaordre de grandeur (+0,6 mv artériel ; +0,4 mv veineux). Ces dernières valeurs indiquent qu'un potentiel inteffacial négatif important est en fait produit sur la surface intime des greffes vasculaires par le processus de modification chimique. Une prothèse vasculaire idéale devrait possèder les caractéristiques de détente d'une matière élastique intacte plus la résistance de l'armature en collagène. La solidité de cette armature en collagène lui permettant de résister pendant de nombreux mois aux pressions artérielles à pulsations répétées et permettant de fonctionner comme hétérogreffes vasculairesprothétiques a fait l'objet de nouveaux articles :tRosenbergN, Henderson, J. & rd, GWH.,and BothwelloJ.W. : prothèse artérielle en collagène d'origine vasculaire hétérologue : propriétés physiques et comportement comme greffe artérielle:dans Biophysical Mechanisms in Vascular Homeostasis and INtravascular Thrombosis. P.N. > awyer, Appleton-Century.Crofts, New York,1965 pp.3-14-321. De plus de nombreuses caractéristiques désirables d'une prothèse vasculaire (Wesolowski, S.A., Fries,C.C. and Sawyer,P.N.: quelques caractéristiques physiques désirables des greffes vasculaires prothetiques dans Biophysical Mechanism in Vascular Homeostasis and Intravascular Thrombosis, PN. Sawyer, Ed.Appleton-Century-Crofts, New York,1965, pages 322-336) sont présentes dans les préparations artérielles carotides bovines digérées la ficine.Le traitement enzymatique élimine les éléments parenchymiques. sujets à la necrose et empêche ainsi la réaction inflammatoire qui en résulte et qui affecte l'intégrité de la paroi greffée et prédispose à la thrombose intime. Elle produit au surplus un degré de porosité de la paroi vasculaire prothétique qui favorise 1 invasion par les tissus connectifs de l'hte et en raison de l'absence relative de réaction inflammatoire favorise aussi bien l'endotheliali- sation précoce.La thrombose précoce après insersion de ces greffes peut être inhibée en augmentant la charge de densité négative sur les surfaces intimes.Les résultats précédents démontrent l'importance de la densité de charge superficielle intime négative pour la prévention de l'occlusion thrombotique précoce des prothèses vasculaires hétérogreffées en collagène.La modification chimique prévue pour augmenter la charge superficielle négative sur la paroi interne des hétérogreffes artérielles bovines en ficine traitée a été trouvée empêcher l'occlusion de l'orifice par la thrombose parentérale de manière notable. La modification chimique par une réaction de formation d'amide déclenchée par carbodiimide,prévue pour augmenter la densité de charge auperficielle positive sur la surface intime, a été trouvée accélérer largement les évènements thrombotiques La polarité des potentiels d'écoulement artériel et veineux mesuré à travers les prothéses vasculaires a servi à contrôler les processus de modification chimique et a s'assurer que l'alteratison électrique de la densité de charge superficielle se produise- avec la polarité prévue. On peut voir du tableau 3 queles potentiels d'écoulement artériel et veineux mesurés par les greffes modifiés de manière à accroître leur électronégativité superficielle intime ont été uniforméent positives en polarité tandis que les greffes prévues pour présenter une surface chargée positivement aux éléments de sang en écoulement produisent des potentiels d'écoulement à polarité négative.Ainsi, les processus de modificatinn chimique sont efficaces sur la modulation de la polarité du potentiel inter-facial entre la surface de la prothèse vasculaire et - les éléments sanguins qui s'y écoulent. Les hétérogreffes vasculaires artériellesde carotide boirine digérée à la ficine ont également été ipIantes les systèmes vasculaires de chiens bâtards dans leur état non modifié et dans les états chimiquement modifiés de manière à neutra liser les charges supefficielles sur les greffes. Comme il ressort du tableau 2, les deux implants ne sont inférieurs dans leur comportement que quand ils sont comparés à des greffes à surface modifiée négativement, mais supérieurs aux greffes à surface chargée positivement. Les mesures de potentiel d'écoulement obtenues à partir des greffes en collagène digérées à la ficine non modifiée indiquent que leur polarité inter-faciale est légèrementpostive tandis que celle des implants modifiés neutres est légèrement négative (tableau 3). On peut voir d'après ces résultats que le processus chimique prévu pour neutraliser la -charge supefficielle légèrement positiVe sur les surfaces digérées à la ficine (non modifiée' ) dépasseen fait la neutralité électrique et produit une surface à charge légèrement négative bien que ces excès de charge surles surfaces de ces deux prothèses vasculaires soient de polarité opposée, leur fonctionnement en temps que matériau de greffes vasculaires , évalué macroscopiquement, est comparahle. Cette apparence d'absence de différence dans le comportement entre les deux doit probablement etre mise sur le compte de leur relativement faible densité de charge superficielle par rapport aux prothèses modifiées positivement et négativement (voir tableau 3). Un autre type d'hétérogreffes vasculaires bovines digérées à la ficine a été évalué. Cette prothèse tannée à l'amidon dialdéhydique a été déjà décrite pour se comporter de façon convenable pendant des périodes prolongées (3 ans) (Bothwell,J.W., Lord , GH.,Rosenberg,N., Burrowes, C, Wesolowski,S.A. and Sawyer P.N. :: hétérogreffes artérielles modifiées =relation des techniques de traitement avec les caractéristiques interfaciales,dans Biophysical Mechanisms in Vascular Homeostasis and INtravascular Thrombosis, PN.Sawyer,Ed Appleton-Century-Crofts,New York,1965, pp, 306-313) . I1 ressort du tableau 2 que cette matière de greffe est notablement inférieure aux prothèses en collagène modifié négativement mais comparable au collagène non modifié et modifié neutre. Les mesures de potentiel d'écoulement obtenues à partir de ces implants sont très ambigus. Les potentiels d'écoulement artériels sont uniformément de polarité positive ce qui indique que la prothèse présente une surface légèrement négative par rapport à l'écoulement aanguin .Par contre les potentiels d'écoulement veineux, ne sont pas concordants, deux des trois mesures indiquant que la greffe présente en fait une surface légèrement positive. par rapport à l'écoulement sanguin Le rôle critique deS plaquettes dans la thrombose intra vasculaire a été décrit de manière définitive dans les publications suivantes - Mitchell, JRA:Chapter XVI Platelets and Thrombosis ,Sci.Basis Med.Ann Rev. 266-288(1968) Hampton,J.R.: étude du comportement des plaquettes et de leur relation vis à vis de la thrombose:J.Artheroscler.Res.7:729 (1967). Mustard,JF.,Packham,MA.Rowsell,HC. and Jorgensen,L: le rôle des plaquettes dans la thrombose et l'artérosclérose Thromb. Diath. Haemorrh.Suppl.23:261(1967). Certains pensent que l'évènement initial conduisent à la formation d'un thrombus parentéral intravasculaire est le démasquage du collagène sub-intime et sa reconnaissance ultérieure pal les raquettes en circulation avec l'adhérence qui résulte de ces dernières et leur aggE6qation, (bien que cette vue ne soit pas universellement acceptée). On sait cependant que le collagène est susceptible de provoquer l'adhérence des plaquettes à lui même et que cette adhérence peut entraîner l'aggrégation des plaquettes. Le mécanisme biochimique par lequel les plaquettes reconnaissent le collagène et y adhèrent ultérieurement d été remontre impliquer la formation d'un complexe 'z'2t.re les chaînes latérales carbohydratés complètes du collagène et la glucose transférase présente sur la surface externe des plaquettes (voir figure 1). La réaction fait intervenir l'accouplement enzymatique du glucose (apporté par les plaquettes sous forme d'uridine-diphosphoglucose) aux restes galactosyle fixés aux channes latérales d'hydroxylysine présentes dans les peptides collagèniques. La réaction employee pour accroître la densité de charge Kuperficielle négative sur la surface intime des prothèses vasculaires en collagène est une réaction de succinylation prévue pour couvrir ltensemble des groupes amines libres de la protéine. On a démontré que la succin9lation du collagène solubilisé entraine uee conversion d'environ 95% des groupes (-amino en groupes carboxyle libres Kemi 17:541(1961). On a observé que cette réaction entraine la production d'une prothèse vasculaire qui, quand elle est implantée dans le système vasculaire des chiens entraîne un moindre degré de dépôt des plaquettes et d'occlusion thrombotique ultérieur.On voit d'après les résultats biochimiques précédents que cette réaction de succinylation qui couvre les groupes -amino de la protéine altère suffisament le substrat de la glucosyltrans férase des plaquettes pour que la spécificité de cet enzyme ne soit plus suffisante pour qu'elle reconnaisse le collagène hétérogreffé comme tel. Sans la reconnaissance des plaquettes, il n'y peut ç avoir adhérence à la surface prothétique intime et ainsi par d'occlusion thrombotique. Au surplus,on a dXmontré que le blocage des groupes carboxyle libres du collagène entraîne une activité d'aggrégation des plaquettes in vitro augmentée. On a évoqué l'hypothèse que cela résulte de la potentialisation des effets des groupes amino libres (Wilner, G.D.,Nossel,HL. and Leroy,E.C. : aggfégation des plaquettes par le collagène;J.Clin.Invest. 47:2616(1968). Les résultas obtenus dans cette étude avec la réaction prévue pour accroître la densité de charge superficielle positive sur la surface intime de la prothèse vasculaire collagénique par amidation des groupes carboxyle libres concordent entièrement avec ces études in vitro. La réaction de modification positive.entraîne l'occlusion thrombotique rapide et totale de ces hétérogreffes vasvulaires quand elles sont implantées dans le système vasculaire de chiens bâtards. Une densité de charge superficielle intime négative entraîne un comportement de l'hétérogreffe vasculaire favorable en ce qu'elle empêche l'occlusion thrombotique précoce de l'orifice de la prothèse. Un processus chimique simple est donné par lequel la surface intime de l'artère carotide bovine digérée à la ficine peut êtreprépareen présentant cette électro-négativité. En plus de ce qui précède, l'invention apporte un nouveau type de prothèse consistant en une artère digérée a la ficine modifiée par un amidon dialdéhydique anionique. Cette prothèse peut être tannée et présenter des charges négatives incorporées en une seule étape. Le produit ainsi résultant peutêtre renforcé par tannage à L'amidon dialdéhydique et présenter une excès de charge négative de manière a présenter une surface non thrombogène meilleure. Le dérivé d'amidon dialdéhydique nécessaire est le dérivé 5-carboxy-méthyl de formule cette matière peut se trouver dans le commerce ou peut être préparée.On en dispose sous forme du produit appelé "Dialde-hyde polymérisé anionique scluble dans l'eau" sous la marque DASOL A commercialisée par lo firme Miles Lab. Inc. qui est intéressante à la foisscomme matière tannante et véhicule. Comme variante des prothèses existantes pour introduire une charge négative, une artère modifiée 1 amidon dialdéhydique digéré à la ficine peut etre encore modifiée par 1' anhydride succinique pour 1 rîntroduction de charges négatives. La réaction de 17 amidon dialdéhydique peut se présenter principalement avec les troupes -amino de la lysine dans les conditions de tannage (pH 8,8). Une certaine réaction se produit avec les groupes guanidine de l'arginine car on sait que ces groupes réagissent avec les groupes dicarboxyle voisins ce que l'on peut considérer comme une façon de considérer l'amidon dialdéhydique. Si l'on considère les choses de cette manière, on voit qu'il qpparait qu'il existe de nombreux sites disponibles pour l'attaque par l'anhydride succinique. Cela entraine l'obtention d'une prothèse tannée chargée négativement. Enfin il existe une décationisation complète d'une prothèse modifiée à l'anhydride succinique. L'anhydride succinique réagit principalement avec les groupes t-amino de la lysine pour introduire une portion carboxy propionyle à charge négative. En supposant que tous les groupes de lysine soient bloqués, des sites à charge positive existent sur les résidus d'arginine et sur les résidus d'histidine(certains des groupes imidazole de l'htstidine peuvent avoir une charge positive éliminée à pH 7,4). La modification dés restes arginine peut être effectuée par le phényl glyoxal qui réagit en conditions modérées avec les groupes guanidinium chargés positivement et conduire à un dérivé neutre.L'histidine peut être convertit en dérivé neutre par réaction avec le pyrocarbonate de diéthyle pour donner un dérivé d'éthoxyformyle sur le cycle imidazole. Les techniques précédentes impliquent le tannage du collagène chargé négativement pour sa protection pontre la thrombose intravasculaire. I1 convient pour l'applicaton de ces techniques a d'autres zones du corps où se trouvent des prothèses collagéniques et en fait a toutes les matières hétérogreffées utilisées pour les diverses. espèces d'animaux et spécialenent l'être humain. Le plus important de ces dispositifs prothétiques est les valvules homograyhiques prélevées chez l'être humain et placés chez un autre être humain et les valvules hétérogreffées qui sont classiquement prélevées sur les porcs et insérées dans la zone de la valvule aortique.Ces valvules sont connues pour présenter certains inconvénients en ce que leur élément permet- un écoulement central. Le problème de base avec divers aspects de cette application a toujours été que bien quelles fonctionnent de façon satisfaisante en position aortique, elles ont toujours présenté certains inconvénients comme valves mitrales. Letannage à charge négative de ces valvules accroît leur utilité. A. titre d'autres variantes de l'invention, on peut prélever une valvule hétérogreffée en conditions semi stériles du corps d' un. animal porcin. ON la tanne en utilisant des techniques de tannage à charge négative précitées. Le processus tannage est effectué en utilisant soit l'anhydride succinique soit le dasel pour produite une surface collagénique à charge fortement négative , qui constitue la prothèse la plus anti-coagulante de caractère que l'on ait obtenue dans ces circonstances. Les caractérisques de charge assurent non seulement I'anti-thromb8génèse additionnellemais encore accroissent la durée de vie de l'hétérogreffe implantée en raison de sa résistance au dépôt de fibrine et à la destruction. Cela s'applique également aux valvules homographiques. I1 est évident que les spécialistes de cette question pourront concevoir de nombreuses variantes de l'invention sanssortir du cadre de celles-ci qui est défini par les revendications suivantes REVENDICATIONS 1. Procédé pour l'amélioration du comportement d'une prothèse gref fée, caractérisé en ce qu'il consiste à modifier au moins la surface intime de laprothèse en accroissant la charge super ficielle négative nette de cette surface. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à constituer la prothèse en collagène et à en accroître la charge superficielle négative de sa surface intime. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il consiste à accroître la charge superficielle négative par une réaction de succinylation. 4. Procédé selon la revendication 2, du type dans lequel la prothèse contient des protéines comportant des groupes amines libres, procédé caractérisé en ce Qu'il consiste à accroître la charge superficielle négative -nette en recouvrant les groupes amines libres. 5. Procédé selon la revendication 2,caractérisé en ce que l'on prépare le collagène à partir d'un matériau artériel carotidique bovin digéré à la ficine. 6. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on accroît la charge superficielle négative grâce à la réaction chimique suivante 01, Prote I3 + t 0 KI * + n B 7 ProteinsE criCJ7?* 7. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le collagène est du collagène tanné à l'amidon dialdéhydique et qu'il est traité par l'anhydride succinique. 8. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ceque la greffe a la forme d'un tube in collagène et en ce qu' il consiste à obturer une extrémité du tube,à insérer dans cette extrémité un fluide et à introduire un réactif chimique liquide dans l'extrémité ouverte du tube pour accroître la charge superficielle négative de sa surface intime. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le réactif chimique est de l'anhydride succinique ensolution basique. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'on introduit dans l'orifice du tube une solution tampon de carbonate acide de sodium par additions successives par portions aliquotes d'environ 10 ml auxquelles on a ajouté respectivement environ 0,lg de cristaux d'anhydride succinique. 11. Prothèse greffée vasculaire caracterisée en ce qu'elle est préparée conformément au procédé de larevendication 1. 12. Procédé selon la;revendication 7,caractérisé en ce qu'il consiste à modifier ladite surface par de l'amidon dialdéhydique anionique. 13. Procédé selon la revendication 7,caractérisé en ce qu'il consiste au surplus à modifier ladite surface au moyen de phénylglyoxal. 14. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il consiste au surplus à modifier ladite surface au moyen de pyrocarbonate de diéthylé 15. Procédé selon la revendication 1,caractérisé en ce que la prothèse est ;vasculaire 16. Procédé selon la revendication 1,caractérisé en ce que la prothèse est une valvule 17. Protnèse obtenue * conformément au procédé selon la revendication 1