Brevet FR2341592A1 — publié le 19770916

La presente invention est relative à un procédé permettant d'obtenir à l'état très pur une enzyme appelée glucuromoglycosamino glycane hyaluronate lyase, désignée dans la suite par l'abré- viation GL. Dans le brevet des Etats-Unis NO 3 708 575 est décrit un procédé pour le traitement des arythmies cardiaques, du thrombus, de l'athérosclérose, de l'infartus cérébral, des thromboses cérébrales ou coronaires, et des infarctus cardiaques chez les êtres humains, consistant à administrer une quantité efficace d'une solution stérile isotonique de GL, par injection intraveineuse, intraartérielle ou intrathécale chez des êtres humains nécessitant un tel traitement. Beaucoup de préparations d'hyaluronidase antérieurement disponibles ont renfermé de très grandes proportions d'autres produits ayant une activité enzymatique en plus de l'enzyme réellement responsable de la catalyse de l'hydrolyse de l'acide hyaluronique. La nature hétérogène de l'hyaluronidase est discutée dans un article de Greiling et al. (Z. physioi.Chem. 340; 243/1965). Les préparations d'hyaluronidase disponibles sur le marché jusqu' ce jour ont été fréquemment contaminées par des proportions importantes et variables d'autres enzymes comme la -glucu- ronidase, la N-acétyl-P-hexosaminidase, l'aryi sulfatase A et l'aryl sulfatase B. Des procédés de préparation de GL de haute activité et très pure ont été décrits, par exemple dans le brevet anglais de la Demanderesse NO 1 060 513, ainsi que par Borders et Raftery (J.Biol. Chem. 243, 3756-3762/1968). Toutefois, ces procédés connus sont trop longs et compliqués pour avoir une utilité économique dans la fabrication de GL à grande échelle et, par conséquent, il existe un besoin d'un procédé plus économique pour la préparation de GL de haute activité et tres pure. L'invention a précisément pour but de fournir un procédé de préparation de GL très pure et de haute activité, caractérisé en ce qu'on part d'une solution d'enzyme brute qu'on met d'abord en contact avec une résine de divinyl benzène polyacrylique réticulée, contenant comme groupes actifs des groupes carboxyliques (par exemple la résine fournie dans le commerce sous la marque "Amber- lite CG-5O'), on élue de la résine l'enzyme adsorbée, on dialyse les fractions éluées riches en enzyme désirée contre une solution aqueuse saturée de sulfate d'ammonium, on met le concentrat d'enzyme obtenu au contact d'un gel de dextrane réticulé contenant des groupes carboxyméthyle actifs (par exemple le gel fourni sous la marque "CM-Sephadex"), et on procède à l'solution du gel pour recueillir une solution GL très pure et de haute activité. A titre de variante, le concentrat d'enzyme de l'étape de dialyse contre le sulfate d'ammonium peut être mis au contact d'un gel de dextrane réticulé ne contenant pas de groupes carboxyméthyle actifs (en utilisant par exemple les gels du commerce "Sephadex G-75" et G-100), en procédant ensuite à l'élution du gel. Si on le désire, on peut encore purifier la solution de GL très active obtenue, en la mettant en contact avec un gel de dextrane réticulé contenant des groupes carboxyméthyle actifs (du type CM-Sephadex, par exemple) et en éluant finalement le gel. La solution d'enzyme brute servant de produit de départ peut être préparée d'une manière connue à partir d'une source quelconque riche en l'enzyme désirée. Pour la préparation de la solution d'enzyme il est préférable d'utiliser des testicules d'animaux, de bovidés par exemple, du fait que I'on peut se les procurer facilement, mais on peut aussi partir d'autres produits tels que les lysozomes de foie. La résine contenant des groupes carboxyle utilisée dans la première étape de purification est de préférence équilibrée à la température ambiante avec un tampon au phosphate 0,1 M (pH 6,0) et l'enzyme brute est de préférence dissoute dans le même tampon. On peut mettre en oeuvre la résine dans une colonne ou on peut effectuer cette étape en opérant en discontinu, en mettant la résine en contact avec la solution d'enzyme dans un récipient équipé d'un moyen d'agitation. Après lavage de la résine avec un tampon au phosphate 0,1 M (pH 6,0), on l'élue avec un tampon au phosphate 0,3 M (pH 7,7) et on recueille les fractions riches en enzyme que l'on réunit. Toute cette étape du procédé peut être conduite de façon convenable à la température ambiante. La solution enrichie en enzyme ainsi obtenue est ensuite concentrée par dialyse contre une solution aqueuse concentrée de sulfate d'ammonium jusqu'à ce que le volume de la solution ait diminué par exemple des deux tiers cnviron. ne préférence, on effec tue cette dialyse à une température inférieure à l'ambiante, par exemple vers 4 OC. Le précipité actif en enzyme obtenu dans le sac de dialyse peut alors être isolé, par exemple par centrifugation à la température ambiante. On dissout ensuite ce précipité dans une solution aqueuse 0,1 M de chlorure de sodium, qu'on applique sur une colonne du gel de dextrane réticulé ne contenant pas de groupes carboxyméthyle, préalablement équilibré avec une solution aqueuse 0,1 M de chlorure de sodium, la température étant, dans cette opération, de l'ordre de 4 OC. On élue ensuite le gel avec une solution aqueuse 0,1 M de chlorure de sodium et on collecte les fractions riches en enzyme que l'on réunit. On peut dissoudre dans un tampon à l'acétate 0,1 M (pH 5,0) le précipité provenant de l'étape de dialyse, ou les fractions riches en enzyme recueillies lors du traitement avec le gel de dextrane réticulé dépourvu de groupes carboxyméthyle actifs, et appliquer la solution à une colonne de gel de dextrane réticulé contenant des groupes carboxyméthyle actifs, vers 4 OC, en équilibrant préalablement le gel avec un tampon à l'acétate 0,1 M (pH 5,0). On élue ensuite le gel-avec un tampon à l'acétate 1,0 M (pH 5,0) et on collecte les fractions riches en enzyme qu'on réunit. De façon similaire, on peut dissoudre le concentrat de dialyse dans un tampon à l'acétate 0,1 M (pH 5,0), appliquer la solution vers 4 OC à un gel de dextrane réticulé contenant des groupes carboxyméthyl actifs, préalablement équilibré par du tampon å l'acétate 0,1 M (pH 5,0), puis éluer le gel avec un tampon à l'acétate 1,0 M (pH 5,0). Grâce au procédé selon l'invention, il est possible d'obtenir une purification 90 fois supérieure en ce qui concerne l'activité enzymatique et le rendement total de récupération de 1' enzyme peut dépasser 40 %. Les exemples non limitatifs ci-après illustrent l'invention. Exemple 1. Etape 1 : chromatographie sur résine échangeuse d'ions. a) On équilibre à la température ambiante une colonne d Amberlite CG-50 (2,2 x 13 cm) avec un tampon au phosphate 0,1 M (pH 6,0). On applique sur la colonne 421 ml d'une solution d'enzyme brute dans le même tempon (contenant 7,46 g de protéine et 255 u.i. d'enzyme par mg de protéine, soit au total 1 902 300 u.i. d'enzyme) et on lave la colonne avec 1 litre de tampon au phosphate 0,1 M (pH 6,0). Ensuite, on élue la colonne à la température ambiante avec du tampon au phosphate 0,3 M (pH 7,7) sous un débit d'environ 180 ml/ heure, en collectant les fractions d'éluat. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau suivant. TABLEAU I rac- vol. Concentration Protéine | Act.spéc. Activité Rendement ion (ml) en protéine récupérée (u.i/mg de totale en (mg/ml) (%) protéine) (u.i.) enzyme % A 38 1,12 4,2 580 24685 8,23 B 36 2,0 7,2 2250 162000 54 C 13 1,01 1,3 356 4674 1,56 b) On répète le traitement décrit en a) mais avec une colonne o' "Amberlite CU-5A' oe plus grande dimension (4,2 x 30 cm). On trouve que le rendement en enzyme est supérieur à ce qu'on obtient avec une plus petite colonne. Les résultats enregistrés sont portés dans le tableau 2 ci-après. TABLEAU II Frac- Vol. Concentration Protéine Act.spéc. Activité Rendement en protéine récupérée (u.i/mg de totale en (mg/ml) (%) protéine) (u.i.) enzyme % A 132 1,48 2,62 797 155733 8,2 B 206 2,57 7,09 2529 1338903 70,4 c 194 1,02 2,65 343 67873 3,6 Etape 2 : Dialyse. La fraction active B de l'étape 1 est concentrée par dialyse de la solution contre une solution aqueuse saturée de sulfate d'ammonium à 4 OC jusqu'à ce que le volume de la fraction active ait diminué des deux tiers (ce qui équivaut à une solution de sulfate d'ammonium saturée à environ 60-70 % dans le sac de dialyse). On isole le précipité actif en enzyme obtenu dans le sac de dialyse par centrifugation à la température ambiante pendant 3 minutes à 4 000 tours/minute. Etape 3 : filtration sur gel. On équilibre à 4 OC une colonne "de Sephadex G-75" (4,2 x 75 cm) avec une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,1 M. On dissout le produit enzymatique isolé dans l'étape 2 dans 15 ml d'une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,1 M et on l'applique directement à la colonne de gel. On élue la colonne de gel avec une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,1 M, à un débit de 50 ml/ heure; on collecte les fractions d'éluat, en réunissant celles qui sont riches en enzyme Ces dernières contiennent au total 40,3 % de l'activité enzymatique initiale, et leur activité enzymatique fait ressortir un degré de purification de 92,5 fois. L'ensemble des résultats de la purification en trois étapes figurent dans le tableau 3 ci-après. TABLEAU III Etapes volu Concentration Protéines Récupération Activité Activité Activité Rendement me en protéine totales protéine spécifi- totale relative en activi (ml) (mg/ml) (mg) % que (u.i.) té enzyma (u.i/mg tique (%) de protéine Enzyme brute 421 17,72 7460 255 1.902.300 1,0 100 "Amberlite CG-50" 206 2,57 529,4 7,09 2529 1.338.903 9,9 70,4 Dialyse contre sulfate d'ammonium 19,3 19,0 366,7 4,92 4000 1.466.800 15,7 77,1 "Sephadex G-75" 36,5 0,89 32,5 0,44 23596 766.516 92,5 40,3 Exemple 2. Etape 1 : chromatographie sur résine échangeuse d'ions. On équilibre à la température ambiante une colonne d' "Amberlite CG-50" (4,4 x 60 cm) avec un tampon au phosphate 0,1 M (pH 6,0). On verse sur la colonne 550 ml d'une solution d'enzyme brute dans le même tampon (contenant 5,98 g de protéine et 340 u.i. d'enzyme par mg de protéine, soit 2,03 x 106 u.i. d'enzyme), puis on lave la colonne avec 2,5 litres de tampon au phosphate 0, 1 M (pH 6,0). On élue ensuite à la température ambiante avec du tampon au phosphate 0,3 M (pH 7,7) sous un débit de 30 ml/heure; on collecte ltéluat par fractions en réunissant celles qui sont riches en enzyme. Etape 2 : Dialyse On concentre la fraction active de l'étape précédente par dialyse de la solution contre une solution aqueuse saturée de sulfate d'amsonium, à 4 OC, de la manière décrite à l'exemple 1. Etape 3 : Filtration sur gel. On équilibre à 4 OC une colonne de "Sephadex G-75" (4,4 x 72 cm) avec une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,1 M. On dissout le produit enzymatique isolé à l'étape 2 dans 18,5 ml de solution aqueuse de chlorure de sodium 0,1 M et on verse la solution directement sur la colonne de gel. On élue la colonne avec une solution aqueuse de chlorure de sodium O,l M sous un débit de 20 ml/ heure; on collecte l'éluat par fractions en réunissant celles qui sont riches en enzyme. Etape 4 : chromatographie sur résine échangeuse d'ions On équilibre à 4 OC une colonne de "CM-Sephadex" (13x 1,5 cm) avec un tampon à l'acétate 0,14 M (pH 5,0). On applique sur la colonne les fractions riches en enzyme de l'étape 3, puis on lave la colonne avec du tampon à l'acétate 0,42 M (pH 5,0). On élue à 4 OC avec du tampon à l'acétate 0,85 M (pH 5) et on collecte lté- luat par fractions. Les fractions riches en enzyme réunies contiennent 23 % de l'activité enzymatique initiale, et l'activité enzymatique atteinte indique un degré de purification de 88,3 fois. L'ensemble des résultats de la purification en 4 étapes figurent sur le tableau ci-après TABLEAU 4 Etape Protéines Activité Activité Activité Rendement en totales spécifique totale relative activité en (mg) (u.ifmg de (u.i*) zymatique rotéine Enzyme brute 5.980 340 2,03x106 1 100 "Sephadex G-75" 57 15.000 8,55x105 44 42 "CM-Sephadex" 16 30.000 4,8 xlS 88,3 23 Exemple 3. Etape 1 : Chromatographie sur résine échangeuse d'ions. On équilibre à la température ambiante une colonne d' "Amberlite CG-50" (3,5 x 32 cm) avec un tampon au phosphate 0,1 M (pH 6,0). On verse sur la colonne 110 ml d'une solution d'enzyme brute dans le même tampon (contenant 585 mg de protéine et 300 u.i. d'enzyme par mg de protéine, soit 175.500 u.i.d'enzyme) et on lave la colonne avec 700 ml de de tampon au phosphate 0,1 M (pH 6,0). On élue ensuite, à la température ambiante, avec un tampon au phosphate 0,3 M Etape 2 : Dialyse. On concentre la fraction active de l'étape 1 par dialyse de la solution contre une solution aqueuse saturée du sulfate d'ammonium, à 4 OC, comme il a été décrit à l'exemple 1. Etape 3 : Filtration sur gel. On équilibre à 4 OC une colonne de "Sephadex G-100" (3,2 x 55 cm) avec une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,1 M. On dissout le produit enzymatique isolé à l'étape 2 dans 10 ml de solution aqueuse de chlorure de sodium 0,1 M et on verse la solution obtenue directement sur la colonne de gel qu'on élue avec une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,1 M sous un débit de 25 ml/heure. On collecte l'éluat par fractions en réunissant celles qui sont riches en enzymes. Etape 4 : Chromatographie sur résine échangeuse d'ions. On équilibre à 4 C une colonne de "CM-Sephadex" (1,6 x 11 cm) avec un tampon à l'acétate 0,14 M (pH 5,0). On verse sur la colonne les fractions riches en enzyme de l'étape 3, puis on lave avec un tampon à l'acétate 0,42 M (pH 5,0). On élue ensuite la colonne avec un tampon à l'acétate 0,85 M (pH 5,0) et on collecte l'éluat par fractions. Les fractions riches en enzyme réunies contiennent 32,8 % de l'activité enzymatique initiale, et l'activité enzymatique atteinte représente un degré de purification de 38,3 fois. L'ensemble des résultats de la purification en 4 étapes figurent sur le tableau 5 ci-après. TABLEAU 5 Etape Protéines | Activité Activité Activité Rendement en totales spécifique | totale relative activité en (mg) (u.i/mg de (u.i.) zymatique protéine) (%) Enzyme brut 585 300 1.75x105 1 100 Amberlite CG-50 70 2.020 1.41x105 6,74 80,5. Sephadex 4 G-100 19 5.000 9.5xlO 16,7 54 CM -Sephadex 5 11.500 5,75x104 38,3 32,8 L'activité de la GL en u.i. a été déterminée par la methode d'essai normalisée internationale, acceptée par l'Órganisation Mondiale de la Santé (cf.J.H. Humphrey, Bull. W.H.O., 16, 291/1957) pour les tests d'hyaluromidase (cf. également Pharmacopée des Etats Unis, 15è révision, p.329/1955), en remplaçant toutefois le tampon phosphate 0,1 M - NaCl 0,15 M, pH 7,0, par le tampon acétate de sodium 0,1 M - Nacl 0,15 M, pH 6,0, est en utilisant du sérum de boeuf au lieu de sérum humain, toutes les autres conditions étant identiques. La GL obtenue par le procédé selon l'invention est immunochimiquement pure et stérile, et pratiquement exempte de protéine bovine, de produits pyrogés et de constituants antigéniques. La GL obtenue par le procédé selon l'invention peut être utilisée pour le traitement des troubles circulatoires chez les êtres humains, tels que l'arythmie cardiaque, le thrombus, les thromboses coronaires, les infarctus cardiaques, les arrêts du coeur, les attaques, le blocage cardiaque, l'athérosclérose, les thromboses cérébrales, ainsi que pour le traitement des troubles anto-immunologiF ques chez les êtres humains chez lesquels il est souhaitable d'ap porter des antigènes au système lymphatique afin de créer des anticorps, par exemple dans la colite ulcérative et la maladie de Crohn (c'est-à-dire l'iléite régionale). La GL est administrée par voie systémique, par exemple par voie intraveineuse, intra artérielle, intrathécale, sous-cutanée ou intramusculaire, sous forme d'une solution stérile isotonique. La quantité de GL adsinistrée dépend de la gravité de la maladie à traiter; elle peut être comprise entre 5 000 et 106 u.i. et, de préférence, entre 20 000 et 106 u.i. REVENDICATIONS 1.- Procédé de préparation de glucuronoglycosaminoglycane hyaluronate lyase très pure et d'un haut degré d'activité, caractérisé en ce qu'on met d'abord en contact une solution de lyase brute avec une résine de type divinyl-benzène polyacrylique réticulée contenant comme groupes actifs des groupes carboxyles, on élue ensuite de la résine la lyase adsorbée, on dialyse les fractions d'éluat riches en la lyase désirée contre une solution aqueuse saturée de sulfate d'ammonium et on purifie encore le concentrat d'enzyme ainsi obtenu soit en mettant ce concentrat au contact d'un gel de dextrine reticu- lé contenant des groupes carboxyméthyle actifs puis en éluant le gel pour recueillir une solution de la lyase cherchée, soit en mettant le concentrat en contact avec un gel de dextrane réticulé ne contenant pas de groupes carboxyméthyle actifs puis en éluant le gel pour recueillir une solution de la lyase désirée. 2. - Procédé melon la revendication I, caractérisé en ce que l'éluat provenant du gel de dextrane réticulé ne contenant pas de groupe carboxyméthyle actifs est mis ensuite au contact d'un gel de dextrane réticulé contenant des groupes carboxyméthyle actifs, l'éluvion de ce gel donnant facilement une solution de la lyase dé sirée. 3. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la résine de type divinylbenzène polyacrylique réticulée est e-- quilibrée à la température ambiante avec un tampon au phosphate 0,1 M (pH 6,0). 4.-Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme brute est mise au contact de la résine dans un tampon au phosphate 0,1 M (pH 6,0). 5.-Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la résine est lavée avec un tampon au phosphate 0,1 M (pH 6,0) et la lyase est ensuite éluée avec un tampon au phosphate 0,3 M (pH 7,7). 6.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la dialyse est conduite à une température d'environ 4 OC. 7.- Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce que le concentrat de dialyse est dissous dans une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,1 M et mis en contact, vers 4 OC avec le gel de dextrane réticulé ne contenant pas de groupes carboxyméthyle actifs, préalablement équilibré avec une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,1 M. 8.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le gel de dextrane réticulé est élué avec une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,1 M. 9.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les fractions provenant du traitement par le gel de dextrane réticulé dépourvu de groupes carboxyméthyle actifs, sont dissoutes dans un tampon à l'acétate 0,1 M (pH 5,0) et mises en contact, vers 4 OC, avec un gel de dextrane réticulé contenant des groupes carboxyméthyle actifs, préalablement équilibré avec un tampon à l'acétate 0,1 M (pH 5,0), puis le gel est élué avec un tampon à l'acétate 1,0 M (pH 5,0). 10.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le concentrat de dialyse est dissous dans un tampon à l'acétate 0,1 M (pH 5,0) mis en contact, vers 4 bC, avec un gel de dextrane réticulé contenant des groupes carboxyméthyle actifs, préalablement équilibré avec un tampon à l'acétate 0,1 M (pH 5,0), puis le gel est élué avec un tampon à l'acétate l,O M (pH 5,0).