Brevet FR2352299A1 — publié le 19771216

Les appareils d'électrophorèse préparative se composent en général d'un compartiment supérieur avec une électrode, un endroit de séparation où un gel peut être mis, une chambre d d'élution ou un réceptacle et un compartiment inférieur avec une électrode.Les différents composants du matériel à traiter (à purifier ou à séparer) migrent à travers le gel sous l'influence du champ électrique appliqué à des vitesses différen- tes, afin qu'ils sortent du gel l'un après l'autre et entrent dans la chambre d'élution. Une solution de tamDon passe à travers la chambre d'élution-et transporte les composants hors de la chambre d'élution, par exemple vers un collecteur de fraction, duquel ils peuvent être sortis pour un examen approfondi. Une grande variété de construction d'appareils d'éleetro- phorèse préparative existe, et beaucoup d'attention a été con sacrée au dessin de la chambre d'élution. Cependant, dans les appareils faits suivant l'état de la technique, l'solution n'est pas satisfaisante dans beaucoup de cas. Dans la plupart des appareils qui existent déJà, le fond de la chambre d'élution est perméable au courant électrique d'électrophorèse. La raison principale d'une mauvaise élution dans les systèmes précédents est que les composants, après la sortie du gel, ne restent pas à l'endroit où le transport hydrodynamique par le tampon d'élution est le plus efficace, ceci parce qu'ils sont soumis aux effets de ltélectrophorèse libre, des phénomènes de convection et de la migration causée par la gravité. Quant à l'lectrophorèse libre, il est nécessaire pour une bonne élution que les composants, après leur sortie du gel, migrent hors de la proximité du fond du gel sous l'influence d'une rapide électrophorèse libre parceque la vitesse d'écoule ment du tampon est basse à proximité du gel (S. Hjerten et coau teurs, Anal. Biochem. 27 (1969) 108-129), et par conséquent l'évolution est inefficace près du fond du gel. La migration rapi de de l'électrophorès libre oeut être obtenue en faisant passer un tampon d'une faible force ionique frôlant le fond du gel (J.W. Nelson et coauteurs, ISCO Applications Research Bulietin 19 (1975) > . Les appareils selon l'état de la technique dans lesquels un disque solide et poreux est entre le gel et la chambre d'élu- tion et qui soutient le gel, ne donnent pas une bonne élution. Ceci est dû au fait que les composants, après être sortis du gel, doivent migrer sur une longue distance avant le ddbut de leur solution, et durant cette migration la diffusion n'est slus limi tée par la matrice du gel, cette diffusion donnant un élargisse ment des bandes, alors que la migration ne peut être accélérée en passant un tampon d'une faible force ionique le long de la surface inférieure du gel (J.W. Nelson et coauteurs, loc. cit.). Dans les appareils selon ltétat de la technique, seulement une vitesse d'écoulement élevée du tampon d'élution peut empêcher les composants de migrer vers la proximité du fond de la chambre d'élution sous l'influence de la migration rapide d'électropho- rèse libre nécessaire pour les raisons déjà mentionnées, sous l'influence du phénomène de convection ou sous celui de gravité. Cependant, une vitesse d'écoulement élevée du tampon d'élution entraîne inévitablement une dilution importante des composants, ce qui est désastreux pour beaucoup d'app)ications. I1 est égale- ment désavantageux d'agrandir les dimensions de la chambre d'élu- tion pour empêcher la migration vers le fond, parce que ceci diminue la vitesse d'coulement du tampon dlélution. Suivant l'étatde la technique, la perte par électrophorèse à travers le fond de la chambre d'élution des composants qui sont à la proximité du fond de la chambre d'élution est dite en mettant une membrane de dialyse (par exemple, U.S. patent 5,773745)* ou m filtre en. verre fritté semi-perméable (U.S. patent 3,539,493), ou un gel fait dans un tampon d'une force ionique élevez (Offenlegungsschrift allemand 2,221,242) sous la chambre d'élution, ou en passant un tampon à contre-courant de l'électrophorèse à travers le fond de la chambre d'élution (P.H. Duesberg et coauteurs, Anal. Biochem. 11 (1965)342-361). Cependant une bonne élution n'est pas possible si les composants peuvent s'approcher du fond de la chambre d'élution, parce que la vitesse d'écoulement du tampon d'élution vers la sortie est plus basse au voisinage du-fond de la chambre d'élution qu'au centre de la chambre d'élution, par exemple. De plus, il y a un danger de dénaturation, d'absorption et d'adsorption des composants si le fond de la chambre d'solution est formé d'une membrane de dialyse(S. Hjerten et coauteurs, loc. cit.). Les appareils selon le modèle décrit par I Schenkein et coauteurs (Anal. Biochem 25 (1968) 387-595) ont le désavantage que la migration par électrophorèse libre des composants est dans le sens opposé du courant du tampon d'élution. Dans ce cas, une chambre d'un petit volume (voir demande de brevet hollandaise 7115364) crée un gradient de potentiel élevé dans la chambre d'élution et la direction du gradient de potentiel est telle que les composants ont tendance à migrer dans le sens contraire du courant du tampon d'élution; ce dernier phénomène fait que les bons effets d'une chambre d'élution ayant un petit volume seront perdus. La-prdsente invention a pour but de fournir un appareil d'électrophorèse simple qui peut être utilisé facilement, et qui n'a pas les inconvénients mentionnés plus haut et qui permet une bonne élution à la fois avec des gels mous ou durs, et avec des composants ayant une mobilité d'électropborèse libre aussi bien haute que basse. Suivant le premier aspect de la présente invention, il est fourni un appareil d'électrophorèse, comprenant une pièce tubulaire ayant deux extrémités pour recevoir une colonne de gel, un dispositif définissant une chambre d'élution à une première extrémité de la pièce tubulaire, une entrée primaire-permettant le passage de la solution de tampon dans la chambre d'élution, et une sortie pour l'évacuation de la solution de tampon de la chambre d'élution et disposée de telle manière vis à vis de l'entrée primaire vue la solution de tampon passe de l'entre primaire a la sortie substantiellement perpendiculaire à l'axe centrai de la pièce tubulaire, le dispositif définissant la chambre d'élution comprenant une pièce en forme de plaque en materiel solide et poreux ayant deux surfaces principales étendues d'une manière substantielle perpendiculaire à l'axe central de la dite pièce tubulaire, et l'appareil comprenant une entre auxiliaire pour le passage d'un courant secondaire de solution de tampon dans la chambre 1'élution à travers cette surface principale de pièce en forme de plaque qui est la plus éloi- gnée de la première extrémité de la pièce tubulaire. Suivant le second aspect de la présente invention, il est fourni un appareil d'électrophorèse, comprenant une pièce tubulaire ayant deux extrémités pour recevoir une colonne de gel, et un dispositif définissant une chambre d'élution à une première extrémité de la pièce tubulaire, le dispositif définissant la chambre comprenant une pièce en forme de plaque de matériel solide mais poreux, la face de la plaque la plus éloignée de la 4tanV ' -. piece suoulalre exposee a un reservoir ae liquide a une telle manière que ce dernier puisse pénétrer la plaque. Suivant le troisième aspect de la présente invention, il est fourni une méthode de construction des appareils d'électrophorèse, dans laquelle on applique une couche de caoutchouc de silicone non polymdrisd (Rhdne Poulenc, Rodorsil CAF 4) sur une pièce en forme de plaque d'un matériel solide mais poreux, on laisse le caoutchouc de silicone se polymériser, et la pièce en forme de plaque est mise en contact avec un coté de la pièce tubulaire et avec les autres pièces qui entourent la pièce en forme de plaque, le caoutchouc de silicone assurant ltétanchéité entre la pièce en forme de plaque et les pièces qui l'entourent. Pour une meilleure compréhension de l'invention et pour montrer comment celui-ci peut entre mis en action, référence sera faite, à titre d'exemple, aux figures ci-jointes dans lesquelles La Figure 1 montre une vue sectionnée et verticale d'un appareil d'électrophorèse préparative; lies Figures 2, 3 et 4 montrent des graphes; La Figure 5 montre une vue démontée et en perspective d'une partie de l'appareil; La Figure 6 montre une vue sectionnée et agrandie de l'app - reil avec l'illustration des lignes dlécoulement. L'appareil montré dans la Figure 1 comprend un compartiment supérieur 1 avec une électrode 13, et un compartiment inférieur 2 avec une dlectrode 14. lies électrodes 13 et 14 sont en platine et sont introduites dans des rainures circulaires dans les parties isolantes respectives, ce qui Protège les électrodes des dommages. Des nièces cylindriques isolantes avec une sortie tour les gaz dégagés entourent les électrodes pour éviter un contact inopportun. Entre les récipients I et 2, il y a un tube cylindrique 3 (de diamètre intérieur de 10 mm) pour le gel, un logement 4 pour la chambre d'solution 5 (le dernier ayant un diamètre de 15 mm et une épaisseur de 1,5 mm), et une pièce tubulaire 6. La chambre d'élution 5 qui a une couche poreuse lu à sa face inférieure, est fixée en la poussant grâce à la pièce 6 dans la pièce 4 jus qu a son immobilisation. Les joints toriques en Viton 7 et 8 assurent une bonne étanchéïté et une position fixe du tube de gel 3 et de la pièce 6 dans leur logement 4. te tampon d'solution entre par trois tubes en acier inoxydable 9 (un seul est montré dans la Figure 1) qui font entre chaque pair de tubes adjacents un angle de 45 degrés.Un courant de tampon d'élution auxiliaire est obtenu en forçant à travers le tube 10 un tampon contre la face inférieure de la couche poreuse 11. te courant venant du aussi J tube 10, qui circule à haute vitesse, sert aussi à refroidir la chambre d'élution et le gel. Le surplus de tampon, fourni à travers le tube 10 revient au compartiment avec électrode 2 par un petit espace entre le tube 10 et la pièce 6 et est mis à nouveau en circulation. Les lignes de courant du tampon d'élution dans la chambre d'élution sont montrées dans la Figure 6. Le courant électrique pour l'électrophorèse passe par le petit espace déjà mentionna. Soit en changeant le courant du tampon passant à travers le tube 10, ou soit en changeant l'espace entre le tube 10 et la pièce 6, la pression du courant auxiliaire du tampon d'solution peut entre ajustez à volonté, et par conséquent le courant du tam- pon d'élution passant par la couche poreuse dans la chambre d'eIn- tion est aussi ajusté. Les tampons d'élution sont libérés de la chambre d'élution à travers un tube en acier inoxydable 12 vers une pompe précise et réglable (non montrée) et passant de là à un collecteur de fraction e.g. via un spectrophotomètre. La chambre d'solution 5 est faite d'un matériel solide mais poreux comme le verre fritté, de préférence du Pyrex P2; dans l'appareil montré, le volume en liquide de la chambre d'solution est de l'ordre de 0,13 ml. La couche poreuse 11 en dessous de la chambre d'solution peut être une membrane de dialYses dns ce cas, par/ le courant auxiliaire ou tamDon d'évolution est maintens une res- sion élevé sous la membrane.Cependant, la couche poreuse 11 est par préférence une couche de verre fritté de porosité différente de la chambre 5, d'épaisseur de 0,5 mm, qui peut avantageusement étre frittée contre la chambre d'élution. ta couche poreuse Il est de préférence en Pyrex P5. L'étanchéité entre la chambre d'élution 5, ou si vous préférez la chambre d'élution 5 avec la couche poreuxe 11, et les trois pièces respectives, le tube de gel 3, l'enveloppe 4 et la pièce 6, est obtenue en formant une couche de forme adaptée en matériel élastique, de préférence du caoutchouc silicone polymérisé.Four ce but, du caoutchouc sili (Rhône Poulenc Rhodorsil CAF 4 par exemple) cone non polymérisé est appliqué sur les endroits importants de la chambre d'élution 5, ou de la chambre d'élution 5 et de la couche poreuse 11 combinées, et ensuite l'ensemble est de préférence placé dans un moule, en Teflon par exemple, pour la polymérisa- tion du caoutchouc silicone avec le verre fritté. L'exès de caoutchouc silicone est arraché automatiquement en sortant du moule la chambre d'élution ou l'ensemble de la chambre d'élution et de la couche poreuse, ou peut être ôté avec une lame de rasoir et une fraise en carbure de tungstène là où sont les conduits de tampon. En dehors des tubes en acier inoxydable 9 et 12, des joints toriques en Viton 7 et 8, de la chambre d'solution en verre frittd 5 avec ses joints en caoutchouc silicone et de la couche poreuse 11, tous les éléments composant l'appareil sont faits en Perspex (Polymethacry'late). La colonne de gel reste directement sur la chambre d'élution 5, ou sur une feuille en papier de fibre de verre au dessus de la chambre d'élution et n'est pas nécessairement supporte par une pression hydrostatique du tampon d'élution. La présente invention peut aussi être utilisée avec avan tasF dans d'autres appareils comme des appareils pour électro- phrèse préparative à grande échelle avec refroidissement du gel, et avec une élution centrale ou avec une chambre d'élution rectan plaire associée à un gel en forme de plaque. Dans une telle réa lisation, la fabrication et le contrôle sont également simples. Dans l'appareil décrit d'électrophorèse Dréparative, le tampon passe dans la chambre poreuse d'solution d'une manière homogène pour empecher les composants d'atteindre le fond de la chambre d'élution, que ce soit par un phénomène de convection, ou par une haute mobilité d'électrophorèse libre, ou rar la migration due à la gravité, dans cela, il est possible d'adapter la force ionique du tampon passant juste sous le gel pour que les composants émigrent rapidement loin de la proximité, dans cela, lreffet ralentissant sur la migration de ltélectrophorèse par le tampon auxiliaire, passant dans la direction oppose de la migration, peut être accru en sélectionnant par exemple la force ionique, le pH, la viscositd et la densité du tampon.Ceci se traduit par une haute efficacité de ltélution et évite les ddsavantages des composants allant au fond de la chambre d'élution. La chambre d'élution poreuse prévirent les phénomènes de convection, de migration des composants causée par la gravité et des flux préférés des tampons dilution dans la chambre d'élution. Les courants du tampon d'élution ayant les caractéristiques ci-dessus, sont obtenus par le passage de deux tampons d'élution dans la chambre d'élution, un tampon réparti de manière homogène sur la surface de la chambre d'élution dans la direction opposée à celle de ltélectrophorèse dans la chambre d'élution, et un tampon perpendiculaire à la direction de ltélectrophorèse et réparti de manière homogène. Une répartition homogène du courant du tampon d'élution sur la surface de la chambre d'élution est obtenue en pompant ou en aspirant le tampon en question à travers une couche poreuse appliquée contre la face inférieure de la chambre d'élution, la résistance du courant pour le tampon d'élution étant principalement déterminée par la couche poreuse. Les constructions décrites ci-dessus de la chambre itélution et des pièces correspondantes simplifient considérablement la fabrication et la manutention des appareils d'électrophorèse préparative. Les appareils sont flexibles et peuvent être adaptés d'une manière simple à un procédé de purification spécifique, par exemple en choisissant une autre chambre d'élution ou une autre enveloppe pour le gel. Refroidir le gel est simple. L'appareil peut être aisémment et parfaitement nettoyé à cause de sa construction simple. Les exemples suivants décrivent des utilisations de l'appareil Exemple 1 : Des échantillons d'un mélange de molécules de poly(uridine) tritiées de tailles voisines étaient chargés sur des gels de 9 * de polyacrylamide hauts de 3 mm. XupareXra--t, il avait été déterminé que toute la radioactivité sous les conditions appliquées sortirait du gel en moins de 8,5 minutes. La totalité des flux Ses deux t-wnpons d'élution était variée entre 2 et lOml par heurte. lie flux du tampon d'élution auxiliaire, à contrecourant de la direction de l'électrophorèse, était maintenu à 1,5 ml par heure. Ce flux était déterminé en mesurant le transport d'eau tritiée pendant l'électrophorèse.Le flux du tampon d'élution auxiliaire entraine une migration de tampon dans la chambre d'élution avec la même rapidité que l'électrophorèse des ARN mais dans la direction opposée (contre-courant). Le gradient de potentiel dans le gel était environ de 6 V par cm pour un courant de 10 mA.La concentration des tampons d'élution était 3 fois supérieure à la concentration du tampon du gel sauf pour la concentration de sodium dodecyl-sulfate qui était partout de o,2 %. lies résultats : En déterminant pour tous les flux testés la radioactivité dans des fractions collectées, il est apparu qu'avec 0,6 ml de tampon d'élution une élution de plus de 99 % de la radioactivité était obtenue, si une correction était faite pour la largeur de la bande de l'échantillon. Cette valeur n'est pas corrigée pour l'influence négative de la diffusion dans le gel ni pour la diffusion dans les tubes vers le collecteur, et est donc une estimation supérieure. Le chiffre de 0,6 ml veut dire que la chambre d'élution est rincée par une quantité de tampon qui est environ cinq fois la contenance de la chambre d'élution, ou neuf fois la contenance de la chambre d'élution sous le gel. Par conséquent, ltélution est hautement efficace. La récupération de radioactivité était toujours plus importante que 96 %.La Figure 3 montre la variation de radioactivité dans le tampon d'élution au flux total des tampons d'élution de 2 ml par heure. I1 apparait de la forme de la courbe que l'élution se fait trèsbien malgré la haute mobilité de 1'ARN en électrophorèse libre. Exemple Il : Des échantillons de ARN de faible poids moléculaire sont utilisés dans des gels analytiques et des gels préparatifs, et sont soumis à une électroDhorèse de gel préparative. Le gradient de potentiel dans les gels préparatifs était environ de 4 V par cm. Le flux du tampon d'élution auxiliaire, à contrecourant de la direction de l'électrophorèse,était de 1,5 ml par heure. La totalité des deux flux des tampons d'élution était de 6 ml par heure Environ 50 Fg de ARN étaient posés sur le gel analytique et 150 pg de ARN sur le gel préparatif. Le graphe supérieur de la Figure 3 montre les variations de l'extinction dans le gel analytique, et le graDhe inférieur de la Figure 3 montre les variations de l'extinction dans le tampon deélution. lie pouvoir de résolution n'est pas notablement détérioré par ltélution, et les pics dans les graphes sont symétriques. Exemple Iii : Des échantillons de ARN nucléolaire de haut poids moléculaire sont posés sur des gels extrêmement mous de 2,20 % de polyacrylamide. Tes gels sont polymérisés sur des disques en papier de fibre de verre (Whatman GF/C). Environ 6 > ig de ARN sont mis sur le gel analytique, et 24 pg de ARN sur le gel préparatif,qui a une hauteur de 3 cm. Dans le graphe supérieur de la Figure 4, est montrée la variation de l'extinction dans le gel analytique, et dans le graphe inférieur de la Figure 4, la variation de l'extinction dans le tampon d'élution. Le support des gels par la chambre d'élution et par le papier en fibre de verre parait convenir pour produire une bonne élution avec un gel très mou. I1 faut remarquer que la hauteur relativement importante de la ligne de base entre les pics sur le graphe préparatif n'est pas due à une mauvaise résolution mais aux matières contenues dans le gel même qui causent également des phénomènes d'extinction. REVENDICATIONS : 1. Appareil d'électrophorbse, caractérisé par le fait qu'il comprend une pièce ayant deux extrémités pour recevoir la colonne de gel, un dispositif définissant une chambre d'élution 9 une extrémité de la pièce pour recevoir le gel, une entrée primaire permettant le passage de la solution de tampon dans la chambre d'élution, et une sortie pour l'évacuation de la solution de tampon et disposée de telle manière vis à vis de l'entrée primaire que la solution de tampon passe de ltentri primaire à la sortie substantiellement perpendiculaire à l'axe central de la pièce pour recevoir le gel, le dispositif définissant la chambre d'élution comprenant une pièce en forme de plaque en matériel solide et poreux ayant deux surfaces princitales étendues dfune manière substantiellement perpendiculaire à l'axe central de la dite pièce pour recevoir le gel, et l'appareil comprenant une deuxième entrée pour le passage d'un courant secondaire de solution de tampon dans la chambre d'élution à travers cette surface principale de pièce en forme de plaque qui est la plus éloignée de l'extrémité de la pièce pour recevoir le gel. 2. Appareil selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il comprend une couche de matériel poreux entre la chambre d'élution et l'entrée secondaire, le matériel poreux de la dite couche ayant une plus grande résistance à la solution de tampon que le matériel poreux de la nièce en forme de plaque. 3. Appareil selon la revendication 2, caractérisé par le fait que la pièce en forme de plaque est du verre fritté. 4. Appareil selon la revendication 3, caractérisé par le fait que la couche en matériel poreux est du verre fritté. 5. Appareil selon la revendication 4, caractérisé par le fait que la pièce en forme de plaque et la couche de matériel poreux sont frittées en semble. 6. Appareil selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'une couche de matériel élastique adhérant à la pièce en forme de plaque constitue l'étanchéité des contacts de la pièce en forme de plaque avec la dite pièce pour recevoir le gel. 7. Appareil selon la revendication 1, caractérisé par le faot qu'une couche de matériel élastique adhérant à la pièce en torme de plaque constitue l'étanchéité des contacts de la pièce en forme de plaque avec les canalisations des entrées et de la sortie du tampon d'élution. 8. Appareil selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'une couche de matériel élastique adhérant à la pièce en forme de plaque constitue l'étanchéité des contacts de la pièce en forme de plaque avec l'enveloppe de la chambre d'élution. 9. Appareil selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le matériel élastique adhérant à la nièce en forme de plaque est du caoutchouc silicone Dolymérisé. 10. Appareil d'électrophorèse, caractérisé par le fait qu'il comprend un pièce ayant deux extrémités pour recevoir la colonne de gel, et un dispositif définissant une chambre d'élution à une extrémité de la pièce pour recevoir le gels le dispositif définissant la chambre comprenant une pièce en forme de plaque en matériel solide mais poreux, la face de la plaque la plus éloigne de la pièce pour recevoir le gel étant exposée à un réservoir de liquide d'une telle manière que ce dernier pénètre la plaque. 11. Appareil selon la revendication 10, caractérisé par le fait que le corps de la pièce en forme de plaque est en verre fritté. 12. Appareil selon la revendication 10, caractérisé par le fait que la pièce en forme de plaque est en contact étanche avec la dite pièce pour recevoir le gel gracie à une couche de matériel élastique adhérant à la pièce en forme de plaque. 13. Appareil selon la revendication 10, caractérisé par le fait que la pièce en forme de plaque est en contact étanche avec ltenveloppe de la chambre d'élution grace à une couche de matériel élastique adhérant à la pièce en forme de plaque. 14. Appareil selon la revendication 10,caractérisé par le fait que le matériel élastique adhérant à la nièce en forme de plaque est du caoutchouc silicone polymérisé. 15. Une méthode de construction des appareils d'électrophorèse, caractérisée par le fait qu'une couche de caoutchouc silicone non polymérisé est appliquée sur une pièce en forme de plaque de matériel solide mais poreux, dans laquelle le caoutchouc silicone est laissé polymériser et dans laquelle la pièce en forme de plaque est mise en contact avec un caté d'une pièce pour recevoir le gel et avec l'enveloppe de la chambre dtélution, le caoutchouc silicone polymérisé constituant un joint étanche de la pièce en forme de plaque avec la pièce pour recevoir le gel et avec l'enveloppe de la chambre d'élution.