Brevet FR2356429A1 — publié le 19780127

La présente invention concerne des endo-antigènes de Bordetella pertussis et Bordetella parapertussis, leur prépa- ration et leur application tant en médecine humaine quten médecine vétérinaire. La coqueluche constitue une maladie infantile parti culiérement grave et contagieuse qui est provoquée par Bordetella pertussis et Bordetella parapertussis. On connaît déjà différents vaccins anticoquelucheux qui sont certes efficaces mais qui présentent toutefois certains inconvénients du fait des effets secondaires qu'ils peuvent entrainer. En conséquence, la présente invention a pour obJet un nouveau procédé de préparation dtendo-antigènes de Bordetella pertussis et Bordetella parapertussis utiles notamment à la préparation de vaccins anticoquelucheux. L'invention a également pour objet l'utilisation de ces endo-antigènes à la préparation des antis4rums correspondants, à la stimulation lymphocytaire et leur utilisation comme réactif pour recherches sérologiques. Le but du procédé de l'invention est d'obtenir des endo-antigènes de Bordetella pertussis et Bordetella parapertussis d8pourvus de paroi par une méthode d'altération déterminée par autolyse enzymatique. Dans sa forme la plus générale, le procédé de l'invent ion est caractérisé par les étapes consistant à cultiver séparément deux souches bactériennes de Bordetella pertussis et une souche bactérienne de Bordetella para pertussis chacune sur un milieu de culture différent, à extraire les bactéries du milieu de culture, à effectuer la lyse des bactéries extraites, à centrifuger le lysat et à recueillir le surnageant, à constituer un mélange en parties égales des trois surnageant obtenus, et à détoxifier les endo-antigènes du mélange de surnageants. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, le milieu de culture utilisé pour chacune des souches est un milieu liquide contenant de la L cystine et du DL tryptophane, ensemenc à partir du milieu solide de Bordet-Gengou. Ce milieu liquide a pour avantages principaux de donner un meilleur rendement, de favoriser la croissance de germes non modifiés et de favoriser l'action du glycocolle qui est l'agent de lyse préféré et qui n'agit bien qu'en milieu liquide. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparattront à la lecture de l'exemple illustratif suivant. Dans cet exemple, les milieux de culture utilisés sont préparés comme indiqué ci-dessous. I) PREPARATION DU MILIEU SOLIDE DE BORDET-GENGOU A) PREPARATION DE LA GELOSE DE BASE Formule . Pommes de terre pilées et émincées 50 g Glycérol 4 ml . Chlorure de sodium 2,015 g . Gélose 12 g . Eau distillée 400 ml Mode de Préparation : . Utiliser des récipients de verre, d'acier inoxydable ou d'émail. . Mettre les pommes de terre dans un noué de gaze fine, les plonger dans un mélange formé du volume de glycérol et de la moitié de l'eau. . Faire bouillir jusqu'à ce que les pommes de terre soient molles. . Laisser refroidir, puis compléter dans une éprouvette jusqu'a 400 mi. . Ajouter le chlorure de sodium, agiter pour dissoudre. . Ajouter la gélose, chauffer jusqu'à ébullition. . Répartir 100 ml en erlen meyer de 250 ml. . Mettre à l'autoclave 30 minutes à 12O0C. . Le pH final doit être compris entre 5,9 et 6,2. B) PREPARATION DU MILIEU FINAL Formule . Gélose de base Bordet-Gengou 100 ml . Sang de mouton défibriné stérile 30 ml Mode de prarati.n . Faire fondre la gélese de base et laisser refroidir k 45-C. . Mettre le flacon de sang de mouton dans un bain-marie amené progressivement à 45 C. . Couler aseptiquement le sang dans l'erlen meyer, mélanger soigneusement et répartir stérilement en tubes de 16 mm de diamètre. . Laisser le contenu des tubes se solidifier en position inclinée. . Le pH final doit être compris entre 7,3 et 7,6. . Mettre quelques tubes à l'étuve pendant-48 h à 37 C pour vérifier la stérilité. 11) PREPARATION DU MILIEU LIQUIDE Formule - Acide casamino 7g - Chlorure de potassium 100 mg - Phosphate monopotassique 250 mg - Chlorure de magnésium 50 mg - Vitamine PP 15 mg - L cystine 20 mg - DL tryptophane 20 mg - Amidon îg - Autolysat levure 3 g - Eau distillée qsp 500 ml Mode de préparation Le milieu obtenu dont le pH est de 7,6 est chauffé dans un autoclave à 1150C pendant 30 minutes. EXEMPLE On utilise deux souches de Bordetella pertussis et une souche de Bordetella parapertussis que l'on cultive chacune séparément selon le même processus opératoire. A cet effet, on fait croitre, sur un milieu solide de Bordet-Gengou préparé corme indiqué précédemment, des bactéries de Bordetella pertussis ou de Bordetella parapertussis isolées de malades humains. A partir de-la culture ainsi obtenue, on ensemence au moins un fermenteur contenant un milieu liquide de culture à base de L cystine et de DL tryptophane préparé comme indiqué précédemment. Cette culture est agitée et aérée à 370C pendant environ 30 heures. On soumet ensuite cette culture à une centrifugation à 4500 tr/min. (environ 2250 g) dans une centrifugeuse refroidie jusqu'à l'obtention d'un surnageant clair. La suspension du culot de germes est additionnée, pour 500 ml du culot de germes, de 40 ml d'une solution de glycocolle en eau bidistillée, à froid, à 10 *, stérilisée par filtration sur membrane avec essai de stérilité. Après addition de la solution de glycocolle, la suspension du culot de germes est maintenue à 370C pendant environ 20 jours pour assurer la lyse des cellules. On effectue ensuite une seconde centrifugation à 4500 tr/min. (environ 2250 g) pendant environ 40 minutes au moyen d'une centrifugeuse refroidie et on ne conserve que le surnageant. On constitue un mélange en parties égales des trois surnageants obtenus séparément, on traite ce mélange par une solution de mercurothiolate de soude et la détoxification est obtenue au bout d'environ 8 jours à 200C. La solution de mercurothiolate de soude employée est une solution au 1/250e faite en eau bidistillée à froid et filtrée sur membrane. L'addition de la solution de mercurothiolate de soude est effectuée à raison de 1 ml de la solution pour 39 ml du mélange de surnageant. Le produit antigénique obtenu peut être utilisé pour la fabrication de vaccins en le titrant par une méthode de dilutions successives caractérisée par les points suivants 1) Dilution du produit antigénique en sérum physiologique non tamponné au 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 et 1/32. 2) Utilisation d'un antisérum antibactérien et d'un antisérum préparé avec l'antigène, concentrés et purifiés. 3) Essai avec deux méthodes A) Immunodiffusion en gélose clarifiée sur lame. Cupules à l'emporte-pièce de 23 mm de diamètre, distantes de 0,5 cm. Observation des traits de précipitation. B) Précipitation et floculation en mi cro tubes capillaires de 10 cm de longueur et de 1,3 à 1,4 mm de diamètre. On pipette par capillarité 2/3 d'antigène, puis 1/3 de sérum. Lectures faites 48 heures après. La solution antigénique ainsi titrée peut entre ajustée à la force voulue par des méthodes classiques de dilution et peut être mise dans des ampoules scellées après addition éventuelle d'agents de conservation. SOUCHES EMPLOYEES Les souches qui ont donné les meilleurs résultats répondent aux caractéristiques suivantes A) BORDETELLA PERTUSSIS (Institut Pasteur de Lyon, N 3776) . Pousse en 48 h à 360 en atmosphère humide à 70 p sur milieu de Bordet-Gengou - à la pomme de terre glycérinée, - sang de mouton défibriné à 30 *. . Colonies en gouttes de mercure. . Hémolyse - noire en lumière réfléchie, - transparente en lumière transmise. . Ne cultive pas sur milieu ordinaire, solide ou liquide. . Pas d'activité enzymatique, sauf catalase + Morphologie . Petit bacille (1 à 2 ), Gram négatif, immobile. . Capsulation moyenne. Agglutination : au 1/1600 en sérum antipertussis (même taux qu'avec le germe témoin standard selon la méthode de KENDRICK > . Nécrose intradermique du lapin : importante B) BORDETELLA PERTUSSIS (Institut Pasteur de Lyon, N 5566) Mêmes caractéristiques, sauf . Capsulation plus marquée. . Nécrose intradermique plus importante. C) BORDETELLA PARAPERTUSSIS (Institut Pasteur de Lyon, N 756) r . Petit bacille (1 - 2 p), Gram négatif, immobile. . Capsulation très importante. . Pousse en 24 h sur gélose sang de mouton . Pousse en 24 h sur gélose ordinaire avec brunissement du milieu. Caractères biochimieues : . Citrate Simmons . Uréase Positives . Catalase . Réduction Nitrates en Nitrite Agglutiné par antisérum à 11320e Nécrose intradermique du lapin : nette mais peu importante. Ces trois souches ont été déposés auprès du "Laboratoryfor Microbiology of the Technical University of Delft" à Delft aux Pays-Bas. Elles ont été enregistrées sous les numéros de dépôt indiqués ci-dessous L M D 76.4 (Bordetella pertussis IPL 3776) L M D 76.5 (Bordetella pertussis IPL 5566) L M D 76.6 (Bordetella parapertussis IPL 756) Propriétés pharmacologiques du produit antigènique In vitro Le produit antigénique terminé présente un profil immuno-électrophorétique constant. En gélose molle clarifiée par la méthode d'Ouchterlony-Elek, on obtient en immuno-diffusion une zone de précipitation caractéristique et spécifique comportant un seul trait de précipitation avec des serums antiportussis standard et des antisérums préparés avec l'antigène. On peut donc en déduire, selon les principes connus en immunologie, l'activité spécifique du produit antigénique obtenu. In vivo Le produit antigénique terminé s'avère être très bien toléré par les espèces animales expérimentées, comme le démontrent les résultats des études toxicologiques qui ont été entreprises. La toxicité aiguë a été étudiée chez la souris Swiss Charles River CF par voie sous-cutanée et par voie intraveineuse. Les doses de 0,5 ml par voie sous-cutanée et de 0,5 ml par voie intraveineuse ne se sont pas révélées toxiques pour la souris. La toxicité chronique a été étudiée chez le lapin blanc de Vendée. On a administré le produit antigénique par voie sous-cutanée à chaque animal pendant 8 jours consécutifs, à une dose de 0,5 ml/kg. On n'a constaté aucune toxicité que ce soit au niveau général ou au niveau local. Le produit antigénique terminé est protecteur par voie sous-cutanée contre la maladie expérimentale de la souris inoculée par voie intracérébrale avec une souche test de Bordetella pertussis. Des essais de vaccination préventive contre l'inoculation expérimentale de H. Pertussis par voie intracérébralo ont été effectués sur un lot de 500 souris. On a vacciné chaque souris à raison d'une injection par semaine de 0,1 ml du produit antigénique pendant quatre semaines. Une semaine plus tard, on a inoculé par voie intracérébrale à chaque souris 40 000 germes d'une souche test de H. Pertussis suivant la méthode de Kendrick. Un taux de protection de 98 à 100 X a été obtenu chez les souris vaccinées, alors que les souris témoins mourraient en moins de 15 jours. Après une nouvelle inoculation intracérébrale de H. Pertussis chez les souris protégées, on a obtenu une survie totale. On a constaté par ailleurs que le produit antigénique terminé faisait apparaitre un pouvoir précipitant, agglutinant et opsono-cytophagique dans le sérum de souris, de lapin et de mouton et qu'il stimulait la prolifération lymphocytaire chez le lapin. Le produit antigénique terminé s'est avéré efficace dans les cancers expérimentaux de la souris (ascite d'Ehrlich), avec une action thérapeutique à la phase d'inoculation et un effet préventif de type vaccination protégeant contre une inoculation secondaire. Une étude expérimentale a été effectuée sur 360 souris de souche Swiss Rockfeller dépourvues d'encéphalite spontanée. On a d'abord effectué une inoculation avec l'ascite infectante non diluée (0,5 ml par voie i.p.). Toutes les souris mourraient en 10 jours qu'elles aient ou non été soumises à un traitement par le produit antigénique de l'invention. On a par ailleurs effeetué une inoculation avec l'ascite infectante diluée, à raison de 160 cellules/ml et de 80 cellules/ml et on a obtenu les résultats suivants Animal témoin : mort en trois semaines avec ascite apparaissant au dixième jour. Souris traitées Pour les souris traitées le même Jour que l'inoculation de 1'ascite d'Ehrlich, en commençant un traitement de deux injections par semaine de 0,4 ml de produit antigénique à dilution 1/2, on a obtenu les résultats suivants : survie inconstante de quelques souris et mort de tous les témoins. On a par ailleurs soumis à un traitement préventif d'autres souris en leur faisant une injection sous-cutanée unique de 0,5 ml de produit antigénique à dilution 1/2. Un mois après, on inocule l'ascite d'Ehrlich à chaque souris par voie IP. Les souris survivent pendant deux mois puis meurent lentement. En revanche si on fait une injection de rappel au bout de deux mois, les souris continuent à survivre. Dans les mêmes conditions d'injection d'ascite d'Ehrlich, les témoins meurent. Applications thérapeutiques Le produit antigénique de l'invention peut être utilisé pour la prévention et le traitement do la coqueluche. Pour cela, on dose la solution antigénique comme indiqué ci-dessus et on prépare des ampoules stériles pour injection. Par ailleurs, le produit antigénique de l'invention peut être utilisé dans la stimulation non spécifique de l'immunité, spécialement dans les cancers humains, soit en traitement initial, soit pour éviter ou traiter une rechute isolément ou en association avec une autre thérapeutique. Exemples d'applications thérapeutiques - Prévention de la coqueluche chez l'enfant 3 injections de 0,5 ml à 1 mois d'intervalle (par analogie avec la protection de la souris). - Traitement de la maladie cancéreuse résiduelle 2 injections sous-cutanées profondes par semaine, pendant 1 mois, de 1 ml chacune, puis 1 semaine sur 2, pendant 2 mois, puis 1 semaine chaque mois pendant 3 mois. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'endo-antigènes extraits de Bordetella pertussis et Bordetella parapertussis, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant à cultiver séparément deux souches bactériennes de Bordetella pertussis et une souche bactérienne de Bordetella para pertussis chacune sur un milieu de culture différent, à extraire les bactéries du milieu de culture, x à effectuer la lyse des bactéries extraites, à centrifuger le lysat et à recueillir le surnageant, à constituer un mélange en parties égales des trois surnageants obtenus, et à détoxifior les endo-antigènes du mélange de surnageants. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant à cultiver chaque souche sur un milieu liquide contenant de la L. cystine et du DL tryptophane, à centrifuger le milieu de culture et à recueillir le culot contenant les bactéries, à additionner d'une solution de glycocolle la-suspension du culot et à la maintenir à 370C pendant le temps nécessaire à la lyse des bactéries à centrifuger le lysat et à recueillir le surnageant, à constituer un mélange en parties égales des trois surnageants obtenus, et à détoxifier les endo-antigènes du mélange de surnageants au moyen d'une solution de mercurothiolate de soude. 3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé par le fait que le milieu liquide de culture contient en outre de l'acide casamino,au chlorure de potassium, du phosphate monopotassique, du chlorure de magnésium, de la vitamine PP, de l'amidon et un autolysat do levure. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que le milieu liquide de culture est ensemencé à partir du milieu solide de Bordet-Gengou. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que les souches de Bordetella pertussis et Bordetella parapertussis sont telles que décrites pages5 et 6 de la description. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que les souches utilisées sont Bordetella pertussis L M D 76.4 , Bordetella pertussis L M D 76.5 , et Bordetella parapertussis L M D 76.6, déposées auprès du wLaboratory for Microbiologv of Technical University of Delft". 7. LeS enào-antigènes obtenus par la mise on oeuvre du procédé selon ltuno des revendications 1 à 6. 8. A titre de médicaments nouveaux, les endo-antigènes selon la revendication 7. 9. Les préparations-pharmaceutiques contenant à titre de principe actif des endo-antigènes selon la revendication 7, ainsi qu'un support pharmaceutiquement acceptable.