Brevet FR2335238A1 — publié le 19770715

L'invention est relative à un vaccin contre hépatite virale de type B et à un procédé de préparation de ce vaccin. L'hépatite B, ou hépatite sérique, est connue pour se transmettre accidentellement à l'occasion de transfusions de sang contaminé ou par l'usage de seringues contaminées. I1 semble que ces modes ne sont pas les seuls possibles et quten fait la transmission puisse avoir lieu de façon beaucoup plus générale. Il est donc important de disposer, pour lutter contre l'hépatite, d'un vaccin efficace, facile à mettre en oeuvre et d'une parfaite innocuité. On a déjà proposé de préparer un vaccin contre hépatite 3 à partir du virus correspondant, provenant de sérum d'individus chez lesquels la présence du virus est décelée. A cet effet, le sérum recueilli est porté à une température d'environ 100oC pour détruire les composants infectieux présents dans le sérum. Ce traitement particulièrement énergique s'explique par la volonté d'obtenir un produit parfaitement stérile, ce qui ne va pas sans dommage pour l'activité immunogène du produit. 9 l'inverse, un traitement à température plus faible, pour préserver les qualité inmLnogènes, ne présente pas toute la sécurité nécessaire quant à ''irinocuité du produit.En outre, on remarquera que le vaccin obtenu par simple stérilisation contient , en plus de l'agent immunogène, tous les constituants initiaux du sérum. On a également déjà proposé d'isoler des agents immunogènes spécifiques de l'hépatite B à partir de sérum. Pour obtenir ces agents, le sérum qui les contient est soumis, entre autres, à une opération de digestion enzymatique. En fait, un tel traitement, s'il permet bien d'éliminer les protéines sériques, agit également sur les composants du virus, de telle sorte que inactivité mmunogéni- que du produit final est, dans ce cas encore, affectée par e trai- tement de purification. le but de l'invention est de fournir un procédé d'obtention d'un agent immunogène contre l'hépatite B, très pur, qui, lorsqu'il fait partie d'une composition de vaccin, présente toutes les garanties d'innocuité et d'efficacité. L'invention a encore pour but de fournir, contre l'hépatite 3, des vaccins contenant l'agent immunogène obtenu par ledit procédé. Grâce à l'invention, on a maintenant montré qu'il était possible d'isoler un antigène à l'état pratiquement pur et sans risque d'altération de celui-ci au cours des opérations conduisant à son obtention, et que cet antigène, lorsqu'il est administré à un hôte dans une composition vaccinale, développe des réponses immunitaires vis-à-vis de lshepatite B, et présente une parfaite innocuité. Des études antérieures avaient révélé, chez les individus atteints d'hépatite B, la présence de plusieurs types d'antigènes identifiés comme étant respectivement le virus complet (particule de Dane), l'antigène constitué par la nucléocapside du virus et l'antigène d'enveloppe, ces deux derniers étant respectivement désignés par les initiales HBC et KB le procédé selon l'invention vise à séparer et à purifier l'antigène d'enveloppe par des techniques qui ne modifient ni n'altèrent ses propriétés physico-chimiques, ni surtout immunologiquesO le procédé d'obtention de l'antigène HBS selon l'invention est caractérisé en ce outil comprend au moins une opération dans laquelle du sérum contenant ledit antigène est mis en contact avec un hydrocarbure aliphatique fluoré liquide, non miscible avec le sérum, que l'on sépare les deux phases, que l'on récupère la phase sérique qui est ensuite mise au contact d'un adsorbant moléculaire solide, et que, après ce contact, l'adsorbant est séparé de la phase liquide, et que l'on produit la désorption de l'antigène qui est récupéré. On trouve l'antigène B s notamment dans le sérum des personnes atteintes par l'hépatite aiguë ou chronique, mais aussi chez certains porteurs "sains", c'est-à-dire qui n'ont jamais présenté de manifestations pathologiques de l'infection. On le trouve également chez certains animaux tels que les chimpanzés. La présence de cet antigène dans le sérum d'une personne ou d'un animal peut être décelée par les techniques habituelles d'immunologie telles que l'immunodiffusion, ltélectro-immunodiffusion, lthémagglutination passive, la radio-immunologie. Selon l'invention, on utilise avantageusement un sérum contenant l'antigène HB,, pratiquement dépourvu de virus complet et d'antigène KB . Un tel sérum provient par exemple de porteurs sains ou d'animaux porteurs de cet antigène. Ces derniers peuvent etre des porteurs naturels ou des animaux chez lesquels la formation d'antigène B s est provoquée consécutivement à une innoculation expérimentale. Dans ce cas, pour favoriser au maximum la fornation des antigènes, il est avantageux de soumettre les animaux à un traitement immunodépresseur. le sérum utilisé peut présenter une teneur en antigène KB très variable. De pré2érerce, on utilise des smuns dont la teneur est relativement élevée, par exemple ceux dont le titre en électro- immunodiffusion est au moins égal à 1/16. L'innocuité des sérums utilisés, ctest-a-dire l'absence totale de particules de Dane ou d'antigène HBc est vérifiée avant leur i̇tement. Ce contre peut être effectué par toutes les méthodes permettant de mettre en évidence la présence ou, dans le cas présent, l'absence de ces particules. On montrera, par exemple, l'absence d'agrégats contenant le virus complet (particules de Dane), ou encore l'absence de l'antigène HBC, en microscopie électronique. On pourra également utiliser une méthode permettant de montrer l'absence d'activité ADN polymérasique, pour mettre en évidence l'absence d'acides nucléiques. le contact entre le sérum et l'hydrocarbure aliphatique fluoré liquide permet d'éliminer du sérum une partie des protéines sériques qui passent préférentiellement dans l'hydrocarbure. Pour effectuer cette opération de partage liquide-liquide, le rapport des volumes de la phase hydrocarbure à la phase sérique est de préférence compris entre 0,1 et 1. Des hydrocarbures préférés pour la mise en oeuvre de cette opération sont du type de ceux commercialisés sous le nom de "Fréon". Parmi ceux-ci, on utilise avantageusement le trifluorotrichloréthane (Fréon 113"). Avec ce dernier, le rapport des volumes hydrocarbure/sérum est de préférence d'environ 1/4. On maintient le mélange des liquides de préférence sous agitation pendant un temps suffisant pour qu'un équilibre s'établisse. De préférence, le mélange est maintenu au moins environ 70 minutes. On sépare les deux phases liquides par exemple par simple décantation, et l'on récupère la phase sérique qui est mise au contact de l'adsorbant solide, du type adsorbant moléculaire. Comme adsorbant moléculaire solide, on utilise avantageusement des composés à forte surface spécifique, capables de fixer des composés lipoprotéinés tels que les poudres de silice, d'alumine, de silico-aluminates ou de composés analogues. On utilise cet adsorbant en quantité telle qu'il adsorbe la quasi-totalité de l'antigène présent dans la phase sérique traitée. De préférence, on utilise 1 à 10 ?io en poids d'adsorbant par rapport au sérum traité. La phase sérique est maintenue au contact de l'adsorbant pendant un temps suffisant pour que l'adsorption de l'antigène HBS soit pratiquement totale. De préférence, le contact est maintenu entre 1 et 10 heures, et ce temps dépend de la nature et de la quantité du matériau adsorbant utilisé. Des adsorbants préférés sont les produits du type de ceux commercialisés sous le nom T?AérosilI, et, parmi ceux-ci, un produit particulièrement préféré est l1,,Aérosil 380". Ces aérosils sont constitués de très fines particules de silice amorphe. On utilise avantageusement environ 2 % d'Aérosil 380, et on maintient le contact avec la phase sérique pendant environ 2 à 6 heures, et de préférence 4 heures. L'adsorption est conduite de préférence à une température comprise entre 20 et 450C, et de façon préférée à 370C. Après adsorption, on sépare l'adsorbant solide, qui contient l'antigène KOBS, de la phase sérique liquide, et on récupère la phase solide. Cette séparation est effectuée avantageusement par centrifugation. On lave la phase solide récupérée pour éliminer les traces de sérum. Ce lavage est fait de préférence à l'aide d'une solution isotonique saline. Pour éluer l'antigène HBS fixé sur l'adsorbant, on lave de préférence ce dernier à l'aide d'une solution tampon alcaline. le pH de la solution tampon est avantageusement compris entre environ 8 et environ 11. Comme pour l'adsorption, on opère de préférence à température de l'ordre de 20 à 450C. le contact de l'adsorbant avec la solution de lavage est maintenu un temps suffisant pour que ltélution de l'antigène s'effectue pratiquement en totalité. Pour faciliter ltélution, on effectue des lavages répétés. De façon préférée, on utilise une solution de borax environ 0,01 N à pH de l'ordre de 9,3, à température voisine de 370C, et pendant un temps d'au moins 30 minutes. la solution contenant l'antigène HBS, qui provient de l'élu- tion décrite ci-dessus, contient encore des traces de constituants sériques et notamment certaines immunoglobulines. Pour obtenir un antigène parfaitement pur, une séparation antigène HBs/immunoglo- bulines sériques doit donc Qtre effectuée. Pour réaliser cette séparation, on utilise avantageusement au moins une technique dite de chromatographie d'affinité. Ces techniques consistent à faire passer un mélange de constituants sur un matériau qui fixe sélectivement un ou plusieurs d'entre eux et laisse passer les autres. Dans le cas présent, il s'agit donc de faire passer le mélange antigène HB5-immunoglobulines sur un matériau qui fixe - soit HB soit les immunoglobulines sériques. De préférence, ce matériau est constitué par un support sur lequel sont fixées, par l'intermédiaire d'un agent de soupxage et de façon irréversible, des immunoglobulines spécifiques soit de 11antigène HBS, soit des immunoglobulines sériques que l'on veut retenir. De préférence, le support est du type gel d'agarose ou gel de dextrane modifié, tels que ceux commercialisés sous le nom "Sé- phadex" ou "Sépharose" par la Société PHARMACIA UpSAi. la fixation des immunoglobulines sur le support est faite de telle sorte quelle soit pratiquement irréversible, c1est-à-dire qu'elle reste inaffectée par la répétition d'opérations d'adsorp- tion et d'élution dans les conditions précisées ci-dessous. Or utilise avantageusement à cet effet le bromure de cyanogène Icur activer le support qui doit fixer les immunoglobulines. Pour fixer sélectivement les immunoglobulines sériques, on utilise de préférence un support sur lequel sont fixées des immunoglobulines d'un sérum hétérologue. Par exemple, -z la source d'antigène HBs est un sérum humain, on utilise avantageusement des immunoglobulines de sérum de cheval. Ces derrières sont obtenues de façon connue en soi, par exemple par relargage au moyen de sul- fate d ' ammonium. La fixation des immunoglobulines sur le support activé est réalisée de préférence à un pH compris entre 6 et 7. Pour réaliser le contact de la phase sérique avec le matériau d'adsorption sélective, ce dernier est de préférence disposé dans une colonne sur laquelle on fait passer la phase serique, et qu'on le lave avec une solution dont le pH est de préférence compris entre environ 7 et environ 8. Au cours du passage sur le matériau adsorbant contenant les tsmunoglobulines antisérum total, les immunoglobulin-es encore contenues dans la phase sérique sont retenues sélectivement, et l'on recueille une solution d'antigène ESs pratiquement exempte de protéines sériques. Il est aussi possible de fixer sélectivement l'antigène HBs au lieu des immunoglobulines sériques. Dans ce cas, on utilisera avantageusement un matériau constitué, comme précédemment, par un support activé mais sur lequel sont fixées, cette fois, des inumi- noglobulines spécifiques de l'antigène HBs. les immunoglobulines anti-HBs sont extraites de sérums qui les contiennent, par exemple, par précipitation au moyen de sulfate d'ammonium, suivie d'une purification par chromatographie d'échange d'ions. Pour faciliter les mécanismes de fixation et d'élution de l'antigène HB, sur le matériau considéré, il est préférable que la concentration des immunoglobulines anti-HB8 dans ce matériau soit limitée. Pour cela, on utilisera de préférence un sérum dont la concentration initiale en immunoglobulines anti-HBs est exprimée par une positivité comprise entre 1 et 1/16 en électro- immunodiffusion. la phase sérique est avantageusement passée sur une colonne remplie de ce matériau qui fixe sélectivement l'antigène et laisse passer, cette fois, la phase sérique. la colonne est lavée avec une solution dont le pH est de préférence compris entre environ 7 et environ 8, c'est-à-dire voisin de celui du sérum initial qui se situe à environ 7,4.On utilisera avantageusement, à cet effet, une solution de Tris 0,02 M (hydroxyméthylsmnnométhane). Pour éliminer certaines protéines sériques qui peuvent se fixer sur la colonne en meme temps que l'antigène HBs, on lave avantageusement la colonne à l'a de d'ne solution d'un thiocyanate métallique dont la concentration est au pas molaire et à un pH de l'ordre de 7 à 8. Avantageusement, on utilise une solution de thiooyanate de sodium 0,5M à pH de l'ordre de 7,4. Pour éluer l'antigène, on utilise de préférence soit une soluion concentrée d'un thiocyanate métallique, dont la molarité n'est pas inférieure à 2 et présentant un pH compris entre 6 et 8, et, de préfé-rence, une solution environ 3 M de thiocyanate d'un métal al calcin à un pH d'environ 7,4, soit une solution dont le pH est inférieur à 6. Ces conditions sont déterminées dans tous les cas par deux impératifs, à savoir : permettre une élution suffisamment ra pide de l'antigène, et ne pas endommager la capacité de fixation de la colonne, de telle sorte que celle-ci puisse être réutilisée. Eventuellement, il est également possible, après l'étape d'adsorption moléculaire, d'effectuer successivement la fixation sélective de l'antigène comme on vient de le décrire, puis, après élution de celui-ci, de passer la solution d'antigène recueillie sur un matériau adsorbant sélectivement d'éventuelles traces de protéines sériques. Cette façon d'opérer permet d'obtenir un produit d'une grande pureté. La solution d'antigène issue de la purification est avantageusement concentrée et ramenée à des conditions de pH et de concentration saline propres à l'administration en tant que solution vaccinante. Avantageusement, on effectue une dialyse de cette solution d'antigène HBS contre une solution saline isotonique. Pour concentrer la solution, on peut notamment effectuer une ultra-filtration suivant des techniques connues en soi. De préférence, on établit le pH de la solution servant à la préparation du vaccin à une valeur voisine du pH physiologique, c'est-à-dire voisin de 7,4. La solution d'antigène est ensuite avantageusement amenée à un titre standardisé pour faciliter le dosage du vaccin. Avantageusement, on prépare une solution dont le titre d'antigène HBB est exprimé par une positivité d'environ 1/2 en électro-immunodiffusion. Ceci correspond à un titre d'environ 1/512 en agglutination passive, ou encore d'environ au moins 1/lQOO en radio-immunologie. Sur la solution ainsi préparée, on effectue une série de con trôles pour vérifier sa pureté. Par des méthodes immunologiques telles que ltélectro-immunodiffusion vis-à-vis d'immunosérums spécifiques ou l'immuno-électrophorèse, on vérifie l'absence de protéines sériques. Dans le cas où, au cours des opérations de purification, on est conduit à utiliser une solution de thiocyanate, on vérifie également que celui-ci a été totalement éliminé de la solution utilisée pour la préparation des vaccins, par exemple par une méthode argentimétrique. lia stérilité de la préparation est vérifiée par culture. On utilise, par exemple, un milieu liquide thioglycolate et une gélose nutritive ordinaire. les tubes ensemencés sont maintenus 15 jours à une température de 20 à 370C et ne montrent l'apparition d'aucune culture. Eventuellement, par mesure supplémentaire de sécurité, la solution d'antigène peut être en outre inactivée. Pour ce faire, on utilise les moyens usuels d'inactivation. Par exemple, on traite la solution par du formol, de telle sorte que la concentration du mélange ne soit pas supérieure à 1/1000 en formol. Après l'inactivatien, l'excès de formol est avantageusement éliminé, par exemple par dialyse. Pour constituer la composition de vaccin, on peut utiliser, outre la solution d'antigène HB,, des excipients ou adjuvants traditionnels. Avantageusement, on ajoute à cette solution de l'hydre- xyde d'aluminium tel que sa concentration dans la solution s'établisse entre environ 1 et 3/1000. Des doses préférées de vaccin selon l'invention contiennent 1 ml diune solution d'antigène HBS dont le titre est exprimé en électro-immunodiffusion par une positivité d'environ 1/2. Ces doses sont réparties dans des ampoules et maintenues dans des conditions stériles. le vaccin préparé selon l'invention est administré par voie sous-cutanée. L'injection d'une dose de rappel est normalement nécessaire pour obtenir une réponse immunitaire suffisante, ce que l'on peut déceler par l'apparition d'anticorps anti-HBs chez la personne vaccinée. Ce rappel est effectué dans les mêmes conditions que la première injection, et environ un mois après cette dernière. Le cas échéant, un second rappel peut être également pratiqué. L'invention sera expliquée de façon plus détaillée dans l'exem- ple qui est donné ci-après d'un mode d'obtention des antigènes HBS et de préparation du vaccin correspondant. Exemple 1 ) Source d'antigène On utilise le sérum d'un donneur de sang porteur sain de lian- tigène HEs. Ce sérum est exempt de particules de Dane,d'antigènes HB et d'anticorps anti-HB5. Le titre de ce sérum en électro-immunodiffusion est 1/16. 20) 4 volumes de sérum sont traités par 1 volume de "Fréon 113" (trifluorotrichloréthane). le mélange est maintenu sous agitation à la température ambiante pendant une demi-heure. On laisse ensuite décanter le mélange, on sépare et on récupère la phase sérique dans laquelle on introduit 2 %0 en poids de poudre d'"Aérosil 380". le mélange est laissé pendant 4 heures à 370C, puis l'on récupère la phase solide par centrifugation. A ce stade, on ne décèle plus d'antigène Bs dans le liquide sérique. La totalité de l'antigène a donc été adsorbée sur l'"Aérosil". L"'Aérosil" récupéré est lavé quatre fois à l'aide d'une solution saline isotonique pour éliminer les traces de liquide sérique. On sépare chaque fois l'"Aérosil" de la solution par centrifugation. L"'Aérosil" est ensuite traité par une solution tampon de bo rax 0,01 N à pH 9,3, en plusieurs fois, pendant 70 minutes, et à 370 C. On récupère les solutions d'élution qui contiennent l'antigène HB . 50) Le pH de la solution est ramené à 7,4. La solution est passée sur une colonne contenant ie matériau fixant sélectivement les protéines sériques obtenues comme décrit ci-après. On utilise pour support le gel d'agarose, commercialisé sous le nom "Sépharose 4B" par la Société PHMiAClA UPSALA. La taille des billes d'agarose est de 40 à 190/u. On active 400 ml de gel par une solution dans de l'eau d-stil- lée de bromure de cyanogène, à raison de 25 mg de r par millilitre de gel. L'activation est faite sous agitation. L'activation, qui se traduit par la formation de fonctions imidocarbonates réactives sur les mailles du gel, s'accompagne d'une importante chute de pH. Pendant toute l'opération, on compense cette chute en introduisant goutte à goutte une solution de soude 3N, de manière à maintenir le pH à environ 11. La fin de la réaction est marquée par la stabilisation du pH. le gel est immédiatement transféré sur un filtre de verre fritté, de porosité 90 à 150/u, et lavé successivement avec deux litres des tampons suivants : bicarbonate 0,;07 M, pH 6,5, et carbonate 0,15 M, pH 6,5, pour éliminer les déchets de l'activation et ramener le gel au pH optimum pour le couplage des immunoglobulines. les immunoglobulines de sérum de cheval sont obtenues par précipitation au sulfate d'ammonium. On les mélange au gel dès la fin du lavage, à raison de 25 mg d1immunoglobulines par millilitre de gel activé. le support est ensuite stocké 16 heures à + 4 C pour permettre l'hydrolyse totale des sites non couplés. le support est placé dans une colonne de dimensions 25 x 1000 mm, et équilibré au moyen d'un tampon Tris 0,02 M à pH 7,4. Après avoir introduit la solution d'antigène sur la colonne, on lave cette dernière avec une solution tampon. On récupère la solution contenant l'antigène HBS débarrassé des protéines sériques. Pour concentrer la solution, on effectue une dialyse-filtration contre une solution saline isotonique, aa moyen dtune membrane pour ultra-filtration, commercialisée sous le nom "Diaflo XM 300" par la société AMICON. 40) Préparation du vaccin la solution d'antigène est ajustée à une concentration correspondant à la positivité 1/2 en électro-immunodiffusion (soit 1/512 en agglutination passive, et 1/1000 en radio-immunologie). le pH de la solution-est aussi ajusté à 7,4. On a vérifié l'absence de protéine sérique vis-à-vis d'une série dtimmunosérums spécifiques par électro-immunodiffusion et im muno-éle ctrophorè se. On a contrôlé la stérilité par ensemencement avec l'antigène de milleux thioglycolate et gélose nutritive, et incubation pendant 15 jours. La solution d'antigène est ensuite inactivée par 1/1000 de formol pendant 48 heures à 370C, et une semaine à 40C. La solution est additionnée de 2/1000 d'hydroxyde d'aluminium et répartie dans des ampoules, à raison d'un millilitre par ampoule. Essais pharmacologiques On a contrôlé l'innocuité et l'efficacité des vaccins préparés comme décrit à l'exemple précédent sur un groupe de chimpanz6a. les chimpanzés utilisés pour ces essais sont indemnes d'hepa tite B. Leur sérum ne présente ni antigène HB s, ni anticorps anti- HBS, ni anti-HBc, et présente un taux de transaminase normal. Chaque chimpanzé reçoit deux injections sous-cutanées de 1 ml de vaccin à un mois d'intervalle. les chimpanzés sont mis en observation pendant quatre mois pour déceler l'apparition éventuelle d'hépatite B. On constate qu'aucun d'entre eux ne manifeste de signe clinique ou biologique de l'hépatite B. On constate, par contre, l'apparition des anticorps anti-HB. l'efficacité a également été vérifiée, par innoculation par injection de sérum riche en particules de Dane, deux mois après la vaccination. Chez aucun des animaux, l'infection ne s'est développée. REYESTDICATIONS 1 - Procédé d'obtention d'antigène d'enveloppe du virus de l'hépatite B (eus), caractérisé en ce qu'il comprend au moins une opération dans laquelle du sérum contenant ledit antigène est mis en contact avec un hydrocarbure aliphatique fluoré liquide, non miscible avec le sérum, que l'on sépare les phases et que l'on récupère la phase sérique, que ladite phase sérique est ensuite mise au contact d'un adsorbant moléculaire solide, qu'après ce contact l'adsorbant est séparé de la phase liquide, et que l'on produit la désorption de l'antigène, ledit procédé comprenant, en outre, de préférence au moins une opération de purification ou de concentration ultérieure du type adsorption sélective. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise un sérum dont l'analyse immunologique par des méthodes usuelles montre qu'il ne contient sensiblement ni virus complet, ni antigène HBe, et dont le titre en antigène H3s par électro-immunodiffusion est au moins égal à environ 1/16. 3 - Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que le solvant fluoré est du type de ceux commercialisés sous les désignations "Fréon", et que le rapport des volumes de la phase organique à la phase sérique respectivement mises en contact est compris entre 0,1 et 1. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le "Préon" utilisé est constitué par le trifluorotrichloréthane. 5 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'adsorbant moléculaire est choisi parmi le groupe des composés pulvérulents de silice, d'alumine, des silicoaluminates et des composés analogues, et que cet adsorbant est introduit dans le sérum à raison de 1 à 10 % en poids de ce dernier. 6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'adsorbant est constitué par le produit commercialisé sous le nom "Aérosil 380", que celui-ci est introduit dans le sérum à raison d'environ 2 % en poids, et qutil est maintenu entre 2 et 6 heures au contact de la phase sérique. 7 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'antigène est désorbé par lavage au moyen d'une solution tamponnée de pH compris entre 8 et 11. 8 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'adsorbant, après avoir été mis en contact avec le sérum, est lavé avec une solution isotonique, puis que l'antigène est désorbé par des lavages successifs avec une solution tampon de borax à pH voisin de 9,3 9 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la solution contenant l'antigène KBB et provenant de la désorption est mis en contact avec un matériau fixant sélectivement les protéines sériques et laissant passer l'antigène0 10 - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le matériau fixant sélectivement les protéines sériques est constitué par un support solide sur lequel sont fixées des immunoglobulines antisérum humain total. 11 - Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le support est du type agarose ou dextrane modifié, et que les immunoglobulines sont fixées sur ledit support à l'aide d'un agent de couplage. 12 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la solution d'antigène KBs provenant de la désorption est mise en contact avec un matériau fixant sélectivement l'antigène Ho,,. lequel, après lavage pour éliminer les résidus éventuels des constituants sériques, est élué et récupéré. 13 - Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le matériau fixant sélectivement le HB est constitué par un support solide sur lequel sont fixes des immunoglobulines spécifiques de l'antigène HBS. 14 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la solution d'antigène HBB obtenue est concentrée par dialyse ou ultra-filtration. 15 - Vaccin contenant l'antigène KBs tel qu'obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14. 16 - Vaccin selon la revendication 15, dosé à un millimètre de solution de l'antigène KOBS, dont le titre est établi pour correspondre à une positivité 1/2 en électro-immunodiffusion, ce qui équivaut à un titre d'environ 1/512 en agglutination passive, ou encore de 1/1000 par les techniques radio-immunologiquesO 17 - Vaccin selon l'une quelconque des revendications 15 ou 16, caractérisé en ce que l'antigène est inactivé au moyen d'une solution de formol dont la concentration n'est pas supérieure à 1/1000