Brevet FR2348703A1 — publié le 19771118

La présente invention concerne une préparation d'hémoglobine appropriée pour l'injection intraveineuse, présentant un pouvoir de libération d'oxygène élevé par rapport aux erythrocytes et aux solutions d'hémoglobine. La pression de demi-saturation de oxygène en hémoglobine (Hb), désignée entant que valeur P50, s'élève d'une manière connue à 27 mm de Hg dans des érythrocytes intacts. Outre la valeur du pH intra-érythrocytaire de 7,25, c'est essentiellement la teneur en 2,3-diphosphoglycérate (DPG) qui est responsable de cette grandeur du pouvoir de libération de l'oxygène. Pour toutes les préparations par infusion à base d'hémoglobine libre ou de ses dérivés, la valeur du plasma sanguin d'environ 7,4 est essentielle, car lesdites préparations doivent nécessairement transporter l'oxygène dans ces conditions. Ce fait conduit déjà à un déplacement vers la gauche de la courbe de fixation de l'oxygène conformément à un abaissement de la valeur P50 à environ 24 mm de Hg dans le cas favorable.Dès qu'une telle solution d'hémoglobine se trouve infusée le'2,3-diphosphoglycérate non lié dans l'équilibre de dissociation se trouve alors immédiatement séparé par les reins par suite de sa faible grosseur de molécule. Le DPG est lié à la façon d'un sel au Hb et se trouve par suite rapidement dissocié de sorte qu 'en une courte durée, tout le Hb libéré dans le circuit sanguin se trouve dépourvu de DPG. La valeur P50 tombe par suite à 15-17 mm de Hg. Une valeur P50 plus elevée indique un pouvoir de libération d'oxygène accru pour une préparation. Jusqu'alors on n'avait pas trouvé de préparation d'hémoglobine qui puisse libérer aisément de l'oxygène pour l'alimentation des tissus en oxygène. On sait que le pyridoxal-5-phosphate (PP) (figure 1) se trouve également lié préférentiellement aux mêmes emplacements de la molécule de Hb que le DPG, mais qu'il est toutefois, d'une manière surprenante, considérablement plus solidement lié à l'hémoglobine que le diphosphoglycérate. La préparation modèle à base d'hémoglobine et de phosphate de pyridoxal décrite par R.E. BENESCH, R. BENESCH, A. BENK, R.RENTHAL et B.A. BRAY dans Proc. I. Intermaer. Symp. Haemoglobins, Caracas (1969), "Genetical functional and physical studies of hemoglobins, p 134-142 (Karger, Bâle, 1971) ne peut pas être utilisée en solution pour infusion car elle provoque des réactions pyrogènes. Conformément à l'invention, on a maintenant trouvé d'une façon surprenante qu'il est possible de réaliser une préparation d'hémoglobine appropriée à l'injection intraveineuse, présentant un pouvoir de libération d'oxygène accru par rapport aux érythrocytes, ladite préparation étant constituée par un produit de condensation d'hémoglobine et de phosphate de pyridoxal et n'entraInant aucune réaction pyrogène. Ladite préparation peut être appliquée thérapeutiquement par voie intraveineuse par suite de son affinité favorable vis-à-vis de l'oxygène. Dans ledit produit de condensation, se trouve présent un tétramère d'hémoglobine dans lequel le phosphate de pyridoxal est distribué statistiquement sur l'hémoglobine. Ladite préparation possède ellemême une valeur P50 de 32 mm de Hg pour une valeur de pH de 7,4. La durée de séjour de ladite préparation dans le circuit sanguin s'élève à environ 2 heures. On obtient lesdites solutions pour infusion (Hb/PP) exemptes de réactions pyrogènes et actives dans le circuit sanguin comme donneurs exceptionnels d'oxygène en adoptant une modification du procédé de préparation de l'hémoglobine selon R.E. BENESCH, et R. BENESCH, (Proc. of the National Academy of Science USA 59, 526532 (1968) et en opérant comme suit on traite des érythrocytes humains à 10-150C pendant 5-15 minutes avec des solutions diluées de B-propiolactone, la proportion de ss-propiolactone (B-P1) s'élevant à 4-12 g/l de sédiment d'érythrocytes, on les soumet consécutivement à un lavage au moyen d'une solution faiblement alcaline pour éliminer le ss-Pl en excès et ses produits de réaction et on les soumet à une hémolyse en les introduisant sous agitation dans 1 à 2 litres d'eau pour injections par litre de sédiment d'érythrocytes. Ledit pré-traitement n'est toutefois pas absolument nécessaire pour la réalisation de la préparation désirée, car il suffit également de procéder à un simple traitement de lavage en plusieurs fois. On traite ensuite l'hémolysat obtenu au moyen d'un échangeur de cations sous la forme H+ jusqu'à ce que la valeur du pH soit abaissée à 5,0-5,5 et, à pH 5,5-5,7, éventuellement après ajustement de cette valeur au moyen d'une lessive de soude 1N on le libère de la résine et de la masse de stroma précipitée par centrifugation sous refroidissement. Par dilution avec de l'eau pure par injections, on amène l'hémolysat à une concentration en hémoglobine'de 5-9% et on amène la valeur de son pH entre 7 et'9 avec une lessive de soude iN. On complète les électrolytes à des concentrations analogues à celles du plasma sanguin par des additions correspondantes de sels, on ajoute 22 g de. monohydrate de glucose par litre, on clarifie éventuellement encore une fois la solution par centrifugation sous refroidissement et consécutivement, on l'agite dans un récipient fermé sous un vide de 20 mm de Hg pendant 10 minutes, on place ensuite la masse réactionnelle sous une atmosphère gazeuse d'azote pur que l'on fait passer pendant 30-60 secondes, on l'additionne de 0,25 - 1,25 g de pyridoxal-5-phosphate monohydraté par litre de solution d'hémoglobine à 5-9% et on poursuit l'agitation sous l'atmosphère d'azote pendant une heure à la température ambiante. On ajoute ensuite goutte à goutte de la lessive de soude 1N jusqu'à ce que l'on atteigne une valeur de pH de 7,6 à 200C. On filtre enfin la solution dans des conditions stériles dans des unités d'infusion de 300 ml ou 500 ml. Dans la figure 2 des dessins annexés, on a représenté le chromatogramme sur colonne desdites préparations (Sephadex G-150, 90 x 1,5 cm, volumes déposés 0,3 ml). Les valeurs P50 de la préparation conforme à l'invention se situent pour une valeur de pH de 7,45 entre 30 et 40 mm de Hg et surpassent ainsi considérablement la valeur P50 de l'hémoglo- bine dans les érythrocytes. On a en outre trouve dans le cadre de 1 'invention que par une autre modification du procédé de préparation, on pouvait obtenir, par fixation du phosphate de pyridoxal sur l'hémoglobine, des molécules aptes à libérer l'oxygène de façon améliorée dans les tissus, dont la durée de séjour dans le sang s'élève à environ 2 heures, et telles que lesdites molécules demeurent entièrement actives dans le circuit sanguin en conservant au moins leur fonction thérapeutique deux fois plus longtemps. A cet effet, le procédé de l'invention est mis en oeuvre comme suit on traite des érythrocytes humains plusieurs fois, en particulier au moins quatre fois, avec des solutions de lavage faiblement alcalines, puis on les hémolyse et on les traite avec un échangeur de cations sous la forme H+ jusqu'à ce que la valeur du pH soit abaissée à 5,0-5,5, puis on les libère de la résine et de la masse de stroma précipitée par centrifugation sous refroidissement, on les dilue avec de l'eau a une concentration en hémoglobine désirée de 5-9%, on ajuste la valeur du pH à 7-9 avec une lessive de soude 1N, puis on agite sous un vide de 20 mm de Hg pendant 10 minutes, et ensuite sous introduction d'azote, jusqu'à ce que l'oxygène soit remplacé par de l'azote pur dans le récipient, on ajoute 0,25-1,25 g de pyridoxal-5phosphate par litre de solution d'hémoglobine à 5-9% et on poursuit l'agitation sous azote pendant une heure à la température ambiante tandis que consécutivement, en ajoutant la quantité 5 à 10 fois molaire de borohydrure de sodium par rapport au phosphate de pyridoxal, on poursuit l'agitation pendant 20 minutes supplémentaires à température ambiante, on met ensuite de nouveau le mélange réactionnel sous vide, on y ajoute un dialdéhyde en quantité 9 fois molaire par rapport à l'hémoglobine, on agite pendant 45 minutes sous azote, on sépare ensuite l'hémoglobine non réticulée par relargage ou ultrafiltration, on amène la préparation réticulée enrichie à une valeur de pH de 7,6 à 20 0C avec de la lessive de soude 1N, on complète les concentrations aux valeurs analogues à celles du plasma sanguin par des additions de sels correspondantes, on ajoute 22 g de monohydrate de glucose par litre et on filtre la masse réactionnelle dans des conditions stériles. Pour l'appauvrissement en hémoglobine non réticulée, on dispose à cet effet de deux possibilités 1. On introduit peu à peu en agitant, dans une solution de sulfate d'ammonium 4M, la préparation d'hémoglobine de volume 0,8 à 1,0 fois celui de ladite solution afin d'effectuer le relargage de l'hémoglobine réticulée. On dissout dans de l'eau le dépot séparé par centrifugation et on le soumet à une dialyse par rapport à une solution de chlorure de sodium à 0,5% pour éliminer le sulfate d'ammonium et tous les adjuvants chimiques en excès. On élimine les dernières traces par un échangeur sous forme de lit mixte. 2. On laisse s'écouler la préparation d'hémoglobine à travers une cartouche en fibre creuse mise sur le marché sous le nom de Hollow Fiber H1 P 100, par la firme : Amicon Corporation, 21 Hostwell Avenue. Lexington, Massachusetts, USA). On exprime de préférence l'hémoglobine non réticulée par ultrafiltration en épuisant ainsi celle-ci pour la recueillir dans le résidu de filtration. Dans ce mode de mise en oeuvre du procédé, on fait tout d'abord réagir le phosphate de pyridoxal sur l'hémoglobine et par l'hydrogène naissant produit à partir de borohydrure de sodium on reduit consécutivement les liaisons azométhine (bases de Schiff) formées en liaisons amine secondaire. (Hb)-N = CH - (Pyr) NaBH4 (Hb) - NH - CH2 - (Pyr) Consecutivement, on fait réagir un dialdéhvde de formule générale O = CH - (CH2)n - CH = 0 , n = 1-6 sur les molécules. On obtient ainsi,un enchaînement des molécules d'hémoglobine modifiée avec formation de structures plus grandes. Les dialdéhydes pour le traitement conforme à l'invention sont en particulier ceux à chalnes carbonées linéaires à 3-8 atomes de C, tels que le malonodialdêhyde, le succinodialdéhyde, le glutarodialdéhyde, I'adipodialdéhyde, le subérodialdéhyde, qui correspondent à la formule générale OCH-(CH) n - CHO dans laquelle n représente une valeur de 1-6. Ledit produit obtenu suivant ce procédé (Hb/PP) m suivant la figure 3 des dessins annexés comprend A = une hémoglobine pyridoxalée fortement réticulée (m > 3) B = une hémoglobine pyridoxalée réticulée sous forme d'oligo mère (m = 2 - 3) C = une hémoglobine pyridoxalée non réticulée ( m = 1) On peut également utiliser comme substance de départ pour les deux variantes du procédé, des érythrocytes déjà vieillis dans une banque de sang. On a soumis la préparation pour infusion à base de Hb/PP conforme à l'invention non seulement à un essai de vérification de l'absence de réactions pyrogènes mais encore à une épreuve de toxicité aiguë chez le rat et la souris. A cet effet, une quantité s' élevant jusqu'à 50 ml d'une solution à 8% par kg de poids du corps s est avérée supportable par voie intraveineuse chez le rat sans comportement anormal et sans symptômes notables D'après le fait que les souris survivent après l'administration d'une dose intraveineuse de 100 ml/kg de poids du corps, on a pu déterminer d'après THAER ;; "Grundlagen der experimentellen Arzneimittelforschung" (1965) que la DL50 de la préparation de l'invention est supérieure à 50 ml/kg de poids du corps et que la substance de l'invention peut être classée dans la catégorie des preparations "relativement inoffensives". Contrairement au cas du produit de R.E. et R. BENESCH, dans le cas de la préparation de l'invention, on a pu démontrer en raison d'une valeur P50 constante que la liaison du type base de Schiff du phosphate de pyridoxal sur le groupe amino de la valine N-terminale de la chaîne p- de l'hémoglobine est résistante in vitro vis-à-vis du traitement par dialyse. On a effectué àcet effet une dialyse totale par rapport à une solution de chlorure de sodium à 0,98 à 100C. Résultat Préparation P50 (mm de Hg) avant dialyse après dialyse Hb/PP 731017 32 33 Hb/PP 731013 39 37 Par comparaison avec la référence de la littérature précitée R.E BENESCH et al. 1971. La préparation de Hb/PP montre également une activité supérieure dans les conditions physiologiques du circuit sanguin lors d'essais sur animaux. Sous une pression partielle d'oxygène veineuse normale de 40 mm de Hg, la préparation de l'invention délivre déjà aux tissus des quantités d'oxygène qui ne se trouvent seulement atteintes par l'hémoglobine normale que dans des proportions pathologiques, c'est-à-dire lorsque la PO2 veineuse s'est abaissée à environ 20 mm de Hg (K. MESSMER et coll., en préparation). Dans les exemples suivants, on décrit avec plus de détails la préparation de l'invention et son procédé d'obtention. EXEMPLE 1 On délaye le sédiment érythrocytaire d'une conserve de sang stockée pendant 4 semaines (environ 270 ml), pendant 10 minutes avec.l/3 de son volume d'une solution de chlorure de sodium à 1,6% et à teneur en p-propiolactone de 1,2%. On sépare les érythrocytes à OOC par centrifugation, et après filtration à la trompe du surnageant et de la pellicule de thrombocytes formée, on lave encore quatre fois avec 1 à 2 fois son volume des solutions suivantes sur la centrifugeuse a réfrigération 1. 3,8% de bicarbonate de sodium/eau 2. Il 3. Mélange 1:1 d'une solution de chlorure de sodium à 1,6%/bicar bonate de sodium à 3,8% 4.Solution de chlorure de sodium à 1,6% Pour l'hémolyse, on introduit en agitant les érythrocytes lavés dans la quantité d'eau pour injection qui correspond au volume d'érythrocy tes de départ et on leur additionne une suspension d'échangeurs de cations sous la forme H+ par exemple une résine mise sur le marché sous le nom de DOWEX 50 WX 8, jusqu'à ce que la valeur du pH soit abaissée à 5. On fait suivre par un traitement destiné à ramener la valeur du pH à 5,5-5,7 avec de la lessive de soude 1N et par une séparation du stroma et de la résine par centrifugation sous refroidissement et décantation.On dilue le surnageant avec de l'eau pure pour injection jusqu'à une concentration de 8,6% en hémoglobine, on amène le pH à 7,5 avec de la lessive de soude 1N et on effectue par litre de solution une addition de 3,6 g de chlorure de sodium, 22 g de glucose monohydraté, 0,29 g de chlorure de potassium, 0,23 g de chlorure de calcium dihydraté et 0,25 g de sulfate de magnésium heptahy draté Après une nouvelle centrifugation sous refroidissement, on procède à une décantation et on agite la masse réactionnelle en récipient fermé pendant 10 minutes sous un vide de 20 mm de Hg. Par passage d'azote gazeux pur, on chasse les dernières traces d'oxygène, de sorte que l'hémoglobine se trouve consécutivement sous la forme prépondérante désoxy. On fait alors réagir celle-ci avec 1,1 g de pyridoxal-5-phosphate monohydraté par litre de solution (ce qui correspond à environ 3,5 moles de phosphate de pyridoxal pour immole de tétramère de Hb), en agitant pendant I heure à 200C sous azote après avoir toutefois ajouté au préalable 2,12 g de bicarbonate de sodium par litre. On fait suivre par l'ajustement final de la valeur du pH de 7,6 (à 20"C) au moyen de lessive de soude 1N et par une filtration dans des conditions stériles. Rendement : environ 400 ml de solution, à 8% de Hb. valeur P50 à pH 7,45 : 32 mm de Hg EXEMPLE 2 On traite les sédiments érythrocytaires réunis provenant de six conserves de sang frais (environ 1,5 1) suivant l'exemple 1, en traitant toutefois pendant 5 minutes avec une solution à 2,0% de p-propiolactone/1,68 de chlorure de sodium. On procède à l'hémolyse avec le double du volume érythrocytaire par rapport à environ 3 litres d'eau pour injection. En variante del'exemple 1, on effectue le réglage du pH à 9,0 avec de la lessive de soude 1N avant l'addition, appropriée à la dilution, de 0,82 g de phosphate de pyridoxal monohydraté par litre de solution tandis que la durée d'agitation sous azote s'élève à 2 heures. Après un traitement complémentaire analogue à celui dudit exemple précédent, on obtient 4 litres d'une solution de Hb/PP,à 6% en Hb valeur P50 : 32 mm de Hg EXEMPLE 3 On soumet le sédiment érythrocytaire d'une conserve de sang de 10 jours sans traitement préalable à la p-propiolactone, aux quatre processus de lavage analogues à ceux de l'exemple 1. On procéde toutefois à l'hémolyse des érythrocytes lavés dans 450 ml d'eau pour injection (dilution plus forte). Pour la réaction avec 1,1 g de pyridoxal-5-phosphate monohydraté par litre de solution (correspondant à 5 moles de phosphate de pyridoxal pour 1 mole de tétramère de Hb) on règle toutefois le pH à la valeur de 7,3 et on agite consécutivement pendant 2 heures sous azote à la température ambiante. Après l'ajustement final courant en électrolytes, on obtient environ 700 ml de solution de Hb/PP à teneur de 5,5% en Hb. Valeur P50 : 39 mm de Hg EXEMPLE 4 On agite, toutefois seulement pendant 5 minutes, des sédiments érythrocytaires réunis provenant de 25 conserves de sang vieilli (environ 6 litres) suivant l'exemple 1 avec la quantité indiquée de solution de p-propiolactone/chlorure de sodium. D'une façon différente de celle de l'exemple 1, on effectue en outre le réglage du pH à une valeur de 7,0 avant l'addition du phosphate de pyridoxal A la fin du traitement complémentaire effectué d'une manière analogue à celle de l'exemple 1, on recueille 10,5 litres d'une préparation de Hb/PP à teneur en Hb de 8%, qui présente une valeur P50 de 34 mm de Hg. EXEMPLE 5 On convertit sous sa forme désoxy 100 ml d'une solution d'hémoglobine à 108 par mise sous un videde 20 mm de Hg et balayage consécutif avec de l'azote. On y ajoute 47 mg de phosphate de pyridoxal en agitant et on poursuit l'agitation pendant 15 minutes. Puis on ajoute 56 mg de borohydrure de sodium et on poursuit l'agitation pendant 20 minutes (température ambiante). Après une nouvelle mise sous vide, on ajoute 0,8 ml de glutarodialdéhyde à 10% et on agite pendant 45 minutes sous azote. Pour séparer l'hémoglobine non réticulée, on ajoute 90 ml d'une solution de sulfate d'ammonium 4M dans l'intervalle de 7 minutes, et on poursuit encore l'agitation pendant 10 minutes. On sépare par centrifugation le dépôt formé et on écarte le surnageant. On dissout le dépôt dans 20 ml d'eau. On fait suivre par une dialyse pendant 3 heures avec un tube de dialyse mis sur le marché sous le nom de Visking type 10/32 par rapport à 50 fois son volume d'une solution de chlorure de sodium à 0,5%, en échangeant trois fois la solution extérieure. Pour l'élimination totale du sulfate d'ammonium, on fait passer la solution d'hémoglobine dialysée sur un échangeur sous forme de lit mixte, constitué par un échangeur de cations fortement acide, par exemple un échangeur de cations mis sur le marché sous le nom de DOWEX WX 8 sous la forme Na+ et par un échangeur d anions mis sur le marché sous le nom de DOWEX 21 K sous la forme C1 par la firme DOW CHEMICAL Company, Midland, Michigan, USA. Après le réglage à un pH de 7,5 avec NaOH 1N et à une concentration isotonique en électrolytes et en glucose (addition de 2 g de glucose et 0,21 g de bicarbonate de sodium), on soumet la préparation à une filtration dans des conditions stériles et on la conserve à l'armoire réfrigérante (50C). La préparation présente une valeur P50 de 16 mm de Hg et montre le diagramme d'élution sur colonne sur le produit mis sur le marché sous le nom de Sepharose 6 B par la firme Pharmacia Fine Chemicals AB, suivant la figure 4. EXEMPLE 6 On opère comme à l'exemple 5 en utilisant toutefois des charges triples jusqu'à l'addition du glutarodialdéhyde. Après l'agitation, on fait passer la préparation par pompage à travers une cartouche d'ultrafiltration- Hollow-Fiber H1 P 100 préalablement remplie à l'aide d'une solution à 0,9% de NaCl avec une pression d'entrée de 500 mm de Hg. On remplace de façon continue le volume exprimé par ultrafiltration dans l'eau stérile. La durée de pompage s'élève à environ 5 heures. Dans cet intervalle, il se produit simultanément un relargage complet. On amène la prépa ration dalls des conditions finales telles que dans l'exemple 5 et elle présente une valeur P50 de 19 mm de Hg, son chromatogramme sur gel étant celui de la figure 5. EXEMPLE 7 On procède comme dans l'exemple 5 en utilisant toutefois une addition de 71 mg de phosphate de pyridoxal. Le produit final préparé d'une façon correspondante présente une valeur P50 de 18 mm de Hg, son chromatogramme sur gel étant celui de la figure 6. REVENDICATIONS 1 Préparation d'hémoglobine appropriée pour l'injection intraveineuse, présentant un pouvoir de libération d'oxygène élevé par rapport aux érythrocytes et aux solutions d'hémoglobine, ladite préparation étant caractérisée par le fait qu'elle est constituée par un produit de condensation d'hémoglobine et de phosphate de pyridoxal qui n'entraîne aucune réaction pyrogène et dont la durée de séjour dans l'appareil circulatoire s 'élève entre 2 et 9 heures 2.Procédé pour l'obtention d'une préparation d'hémoglobine appropriée pour l'injection intraveineuse, présentant un pouvoir de libération d'oxygène élevé par rapport aux érythrocytes et à une solution d'hémoglobine, le procédé étant caractérisé par le fait que l'on traite plusieurs fois, en particulier au moins quatre fois, des érythrocytes humains avec des solutions de lavage faiblement alcalines, puis on les hémolyse et on les traite avec un échangeur de cations sous la forme H jusqu'à ce que la valeur du pH soit abaissée à 5,0-5,5, puis on les libère de la résine et de la masse de stroma précitée par centrifugation sous refroidissement, on les dilue avec de l'eau à une concentration en hémoglobine désirée de 5-9%, on ajuste la valeur du pH à 7-9 avec une lessive de soude lN, on complète la teneur en électrolytes par addition de sels jusqu'aux concentrations analogues à celles du plasma sanguin, on ajoute 22 g de glucose monohydraté par litre, on clarifie éventuellement encore une fois la solution et on l'agite ensuite pendant 10 minutes sous un vide de 20 mm de Hg, on envoie de l'azote gazeux par-dessus la solution jusqu'à ce que l'oxygène soit rezlplace dans le récipient par de l'azote pur, on ajoute 0,25 - 1,25 g de pyridoxal-5phosphate par litre de solution d'hémoglobine à 5-9% et on poursuit l'agitation sous azote à la température ambiante et finalement on amène le mange réactionnel à une valeur de pH de 7,6 à 20"C avec de la lessive de soude 1N et on le filtre dans des conditions stériles. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que pour l'obtention de préparations à durée de séjour de 4 à 9 heures dans l'appareil circulatoire, on traite plusieurs fois, en particulier au moins quatre fois des érythrocytes humains avec des solutions de lavage faiblement alcalines, puis on les hémolyse et on les traite avec un échangeur de cations sous la forme H+jusqu'à ce que la valeur du pH soit abaissée à 5,0-5,5 puis on les libère de la résine et de la masse de stroma précipitée par centrifugation sous refroidissement, on les dilue avec de l'eau à une concentration en hémoglobine désirée de 5-98 on ajuste la valeur de pH de 7-9 avec de la lessive de soude 1N, puis on agite sous un vide de 20 mm de Hg pendant 10 minutes, on envoie par-dessus de l'azote gazeux jusqu'à ce que l'oxygène soit chassé du récipient pour être remplacé par de l'azote pur, on ajoute 0,25-1,25 g de pyridoxal-5-phosphate par litre de solution d'hémoglobine à 5-9% et on poursuit l'agitation sous azote pendant une heure à la température ambiante et consécutivement on délaye avec 5 à 10 fois la quantité molaire de borohydrure de sodium par rapport au phosphate de pyridoxal pendant 20 minutes supplémentaires à la température ambiante, on met de nouveau le mélange réactionnel sous vide, puis on y ajoute un dialdéhyde en quantité 9 fois molaire par rapport à l'hémoglobine, on agite pendant 45 minutes sous azote, on sépare ensuite l'hémoglobine non réticulée par relargage ou ultrafiltration, on ajuste le pH à une valeur de 7,6 à 20"C avec de la lessive de soude 1N, on complète la teneur en électrolytes par addition de sels en concentrations analogues à celles du plasma sanguin, on ajoute 22 g de glucose monohydraté par litre et on filtre la masse réactionnelle dans des conditions stériles. 4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé par le fait que l'on traite tout d'abord les érythrocytes à 10-150C pendant 5-15 minutes avec des solutions diluées de p-propiolactone dans la proportion de 4-12 g de P-propiolactone par litre de sédiment érythrocytaire et on élimine consécutivement par lavage avec des solutions faiblement alcalines l'adjuvant de traitement et son produit de réaction.