Brevet FR2346446A1 — publié le 19771028

La demande croissante en protéines comme nourriture pour lthomme et pour les animaux rend nécessaire le développement de nouveaux procédés de préparation de protéines à bas prir et de valeur nutritive élevée. Pendant ces dernières années on a consacré beaucoup de recherches à la préparation de protéines à l'aide de micro-organismes capables d'utiliser des hydrocarbures gazeux comme le méthane ou des hydrocarbures liquides provenant des fractions du pétrole comme source de carbone et d'énergie. Mais les hydrocarbures gazeux ont l'inconvénient d'une faible solubilité dans les milieux aqueux et de provoquer des explosions dans des conditions de culture aérobie.Les hydrocarbures liquides ont l'inconvénient d'une médiocre solubilité dans l'eau eux aussi, ce qui nécessite de dépenser davantage d'énergie pour disperser ce substrat dans ns le milieu en petites gouttes. En outre il est nécessaire de raffiner la masse cellulaire produite sur des hydrocarbures fluides par un traitement à l'aide d'un solvant organique. Ces dernières années on a témoigné beaucoup d'intérêt au méthanol comme source de carbone et d'énergie convenant particulièrement bien au développement de procédés de culture de micro-organismes à grande échelle. Ce substrat a l'avantage de pouvoir être préparé facilement et à bon marché sous une forme chimiquement définie à partir du gaz de synthèse que l'on peut obtenir à partir de sources naturelles très diverses telles que le gaz naturel, le pétrole et le charbon. Dans la demande de brevet allemand publié en République Fédérale Allemande sous le numéro 2 040 358, on décrit un procédé de préparation d'une protéine mono-cellulaire à l'aide d'alcools, d'aldehydes, de cétones, d'acides carboxyliques et de leurs dérivés servant de sources d'hydrocarbure formés par oxydation d'alcanes liquides. Â la demande de brevet allemand mise à l'inspection publique sous le numéro 2 152 039, on décrit la préparation d'une masse cellulaire bactérienne dans un milieu de culture contenant du méthanol utilisant les sourcesbactériennes suivantes : Protaminobacter ruber var. machidanus ÂTCC 21 611, ÂTCC 21 612, ÂTCC 21 613 ou ATCC 21 614. Â la demande de brevet allemand publiée sous le numéro 2 311 006, on décrit un procédé pour la préparation de protéines mono-cellulaires sur le quel on cultive le micro-organisme Hethylomonas-methanolica HRRL-B-5458 aérobie sur du méthanol qui est la seule source d'hydrocarbure. Â la demande de brevet en République Fédérale Allemande publiée sous le numéro 2 059 277, on décrit un procédé micro-biologique pour pré parer une protéine utilisant les souches bactériennes suivantes dans des conditions aérobie et avec du méthanol comme principale source de carbone Pseudomonas methanica, Pseudomonas sp. ATCC 21438, Pseudomonas sp. ÀTTC 21439, Pseudomonas sp. PRL-W 4, Corynebacterium sp. ATCC 21232, Corynebacterium sp. ATCC 21235 et Corynebacterium sp. ATCC 21236. À la demande de brevet publiée en République Fédérale Allemande sous le numéro 2 407 740, on décrit un procédé pour la culture de micro-organismes qui consiste à faire appel à un milieu de culture mixte consistant en une bactérie assimilant facultativement du méthanol et en plusieurs bactéries ne l'assimilant pas. La bactérie qui assimile le méthanol n'est pas mobile et croit sur le méthanol aussi bien que sur d'autres composés organiques, par exemple sur le glucose ou la glycérine. A la demande de brevet publiée en République Fédérale Allemande sous le numéro 2 418 385, on décrit un procédé pour la préparation d'un produit riche en protéine en utilisant une couche baotérienne pigmentée qui n'est pas rose, qui est un dérivé du micro-organisme Pseudomonas extorquens (NCIB No. 9399). Jusqu'à maintenant on n'a pas utilisé pour la préparation de protéine à partir duméthanol, une bactérie assimilant nécessairement du méthanol, mais simplement des micro-organismes facultativement méthylotropes. L'invention vise un procédé de préparation d'une protéine mono-cellulaire qui met en oeuvre une bactérie méthylotrope. D'un échantillon de sol recueilli à Ludwigshafen aux bords du Rhin, on a isolé une bactérie assimilant d'une manière obligatoire le méthanol par une culture d'enrichissement. On a mis en suspension 1 g de l'échantillon de sol dans 100 ml d'un milieu de sels minéraux de la composition suivante KH2PO4 3,75 g ; Na2 HPO4 2,5 g ; (NH4)2 SO4 4,0 g ; MgSO4, 7H2O 0,5 g Ca (NO3)2, 4H2O 0,025 g ; FeSO4, 7 H2O 0,005 g ; ZnSO4, H2O 0,005 g dans 1000 ml d'eau distillée , pH7,0 avec 1% (en volume par volume) de méthanol et on a fait incuber dans des Erlenmeyer de 500 ml sur un agitateur rotatif tournant à loo tours par minute à 30 C.On a cultivé le milieu inoculé pendant cinq jours puis on en a étendu 0,1 ml sur de la gélose nutritive en boite de Petri contenant le même milieu, en sorte qu'il y est ajouté 2% de gélose. Après avoir sélectionné d'une manière répétée des colonies des boîtes de Petri et avoir cultivé dans des cultures liquides, on a obtenu une bactérie pure désignée Methylomonas sp. avec le numéro DSM 580. L'invention vise un procédé pour la préparation d'une protéine mono-cellulaire à base de méthanol. Le procédé suivant l'invention consiste à inoculer à un milieu stérile une culture de la bactérie Methylomonas sp. DSM 580 assimilant le méthanol d'une manière obligée, contenant des sources assimilables d'azote, du méthanol comme seule source de carbone et d'énergie,des sels minéraux essentiels et, si nécessaire, des agents favorisant la croissance. On effectue la fermentation dans des conditions aérobie en fournissant de l'air ou de l'air enrichi par de l'oxygène, la température de culture allant de 20 à 45 C.Après avoir effectué la culture, on enlève les cellules microbiennes du système à trois phases et on les sèche jusqu'à obtention d'une masse bio logique cellulaire ayant une teneur en protéine brute de 60 à 7 Y (poids par poids), une teneur en acide nucléique de 2 à 17% (poids par poids), une teneur en cendres de 3 à 6% (poids par poids) et une teneur en liquide de 3 à 8% (poids par poids). On peut recycler le fluide de culture enlevé au stade de séparation. te micro-organisme qui convient pour l'invention est la bactérie Methylomonas sp. DSM 580 assimilant le méthanol qui a les caractéristiques morphologiques et de culture suivantes 1. Morphologie de la cellule Fatonnet ne formant pas de spore mesurant environ 0.3 à 0.6 x 1. à 0.8 micron, très mobile avec un seul flagelle polaire. Dans la culture liquide les cellules sont légèrement roses (mais après centrifugation le culot cellulaire est intensément rose). 2. Caractéristiques des colonies Transparente, blanche, ronde et lisse, diamètre d'environ 1 à 2 mm après deux à trois jours d'incubation. 3. Prise du gram : gram - negative, masse cellulaire sèche légèrement rose. 4. Physiologie Très aérobie, catalase positive, méthanol deshydrogénase positive, hexose-phosphate-synthétase positive, hydroxy-prruvate-réductase négative. 5. Propriétés de croissance min opt. max. Température (OC) 20 33-36 45 pH ( C) 4,5 6,5-7,5 9,5 concentration en méthanol ffi (volume par volume) 0,5-1,5 5,0 La bactérie Methylomonas sp. est déposée à la collection de micro organismes de Göttingen sous le numéro DSM 580 Methylomonas sp. DSM 580 est une bactérie méthylotrope obligée; seul le méthanol contribue à sa croissance. On n'observe pas de croissance quand on essaie des composés C1 autres que le méthanol ou quelques autres substrats (Tableau i). Tableau i : Croissance de Methylomonas sp. DSM 580 sur diverses sources de carbone dans un milieu de sel minéral dans des conditions aérobie. Substrat Croissance i) Méthane Méthanol + Néthylamine Formaldéhyde Formiate Ethanol Ethanol Propanol-(1) Propanol- (2) Acétate Lactate Pyruvate Succinate Citrate Glucose Fructose Sérine i) + croissance; - pas de croissance On a en outre trouvé que l'on obtient Methylomonas sp. DSM 580 dans une culture en discontinu avec une concentration initiale en méthanol de 0,5 à 5% (volume par volume) et de 2 à 3% et que l'on peut cultiver Methylomonas sp.DSM 580 dans une culture en discontinu quand on maintient la concentration en méthanol de 0,01 et 2,0 (volume par volume) par un dispositif de réglage automatique, 25% (volume par volume) du méthanol étant consommés. On peut également cultiver Methylomonas sp.DSM 580 en continu à un taux de dilution allant de 0,1 à 0,5 volume par volume par heure dans des conditions chémostatiques ou turbistatiques. En outre on règle le pH à une valeur constante ae 4,5 à 9 en ajou tant des alcalis ou des acides pendant toute la fermentation. Il vaut mieux cultiver Methylomonas sp. DSM entre 20 et 45 C, et mieux entre 33 et 36 C. Il est recommandé d'envoyer pendant la fermentation de l'air ou de l'air enrichi en oxygène à une vitesse de 0,5 à 1,5 volume par volume par minute. Avantageusement le mélange gazeux a une teneur en oxygène de 20 à 60% (volume par volume). En outre il est bon que le milieu de culture aqueux contienne des sels d'ammonium et/ou des nitrates d'ammonium et/ou de l'urée ainsi que les cations sodium, potassium, magnesium, calcium, fer, zinc, manganèse et les anions phosphate, sulfate, nitrate et chlorure ainsi que des agents favorisant la croissance. Les exemples suivants illustrent l'invention Example 1 On charge un fermenteur de 80 1 de capacité de 50 1 d'un milieu de sels minéraux (composition : 200 g (SH4)2S04 ; 150 g KH2P04 , 125 g Na2HP04 25 g MgSO4, 7 H2O, 1,25 g Ca (NO3)2, 4 H2O, 0.25 g FeSO4 , 7 H2O, 0.25 g ZnS04 , H20 , 0.25 g EC1 dans 50 ml d'eau) et on stérilise à 121 C pendant 10 minutes puis on refroidit à 150C , on mélange aseptiquement à 1000 ml de méthanol, et on inocule par 500 ml de Methylonomas sp. DS! 580 et on fait incuber à 350C pendant 28 heures sous agitation dans un turbo-agitateur (300 tours par minute) et avec une vitesse d'aération de 0,7 volume/volume/ minute.Pendant la fermentation, on maintient antomatiquement le pH à 6,4 par l'addition de solution d'hydroxyde d'ammonium à 6%. Après avoir fait fermenter pendant 22 heures, on refroidit le milieu à 1500 et on ajuste le pH à 3 par de l'acide sulfurique puis on recueille la masse cellulaire précipitée par filtration, on lave à l'eau et on sèche pour obtenir 324 grammes de poids de cellule sèche. La composition cellulaire de la masse cellulaire séchée est : 71% de protéine brute, 9% d'acides nucléiques, 4% de cendres et 7% de lipide. Example 2 : Dans un fermenteur de 340 litres muni d'un"intenseur" fabriqué par Biologische Verfahrenstechnik ÂG, Bâle, on charge avec un milieu de sels minéraux (composition : 500 g (NH4)2 SO4 , 500 g NH4NO3. 600 g KH2PO4 500 g Na2 HPO4 , 140 g MgSO4, 140 g MgSO4, 7 H2O, 15 g Ca(NO3)2, 4 H2O 6 g FeSO4 , 7 H20 , 2 g KCl 1 n 200 1 d'eau du robinet), on règle le p11 à 6,8, on stérilise pendant 15 minutes à 121 C, on refroidit à 33 C, on ajoute aseptiquement 2000 ml de méthanol, on inocule 4000 ml de culture de Methylomonas sp.DSM 580 qui a eu une croissance pendant 18 heures dans le même milieu et on fait incuber à 330C avec une vitesse d'aération de 0,5% (volume par volume) dans le milieu de culture, cette vitesse étant maintenue constante en mesurant en continu la concentration de vapeur du méthanol qui est en relation avec la concentration du méthanol dans le milieu, le p11 étant en outre maintenu à 6,8 par addition automatique d'une solution d'ammoniaque à 12% en volume. Après une incubation de 25 heures, la concentration en cellule est de 14 g. en poids sec par litre. On aère alors le fermenteur par de l'air enrichi en oxygène ayant une teneur en oxygène de 4 (volume par volume) tandis que la vitesse d'aération est la même que ci-dessus.Après 60 heures, on refroidit le fermenteur à 15 C, on récolte les cellules par une centrifugation continue à vitesse élevée à 10 000 g et on sèche. Dans ces conditions, on obtient 0,44 g. en poids sec de masse cellulaire séchée par g. de méthanol ayant une teneur en protéine brute de 76%, en acides nucléiques de 6,5%,. en cendres de 5% et en lipide de 4,5% Exemple 3 On charge un fermenteur de 80 litres muni d'un intenseur comme décrit à l'exemple 2 de 50 litres de milieu de culture identique à l'exemple 1, inoculé par 1000 ml d'une culture de Methylomonas sp. I)SM 580 qui a été cultivée pendant 15 heures à 35 C, à une vitesse d'aération de 0,5 volume par volume par minute, la vitesse de l'agitateur étant de 1200 tours parminute le p11 étant constant à 7,0. on commence la culture en continu après 18 heures à un taux de dilution de 0,05 que l'on augmente après 48 heures à 0,1, puis en 120 heures et graduellement à 0,35. Dans ces conditions, un état stationnaire est possible. Le rendement cellulaire est de 0,46 g. en poids sec par gramme de méthanol et la production est de 10,8 gramme par litre par heure. La composition cellulaire est de 72% de protéine brute, de 4,5% d'acides nucléiques, de 3, de cendres et de 5,5% de lipide. Dans des conditions stationnaires, on recycle 50% du filtrat de culture et on diminue le milieu de culture qui est ajouté de cette quantité. L'invention a l'avantage que pour la première fois on utilise une bactérie méthylotrope obligée comme organisme pour le processus avec une productivité bien plus élevée que ce n'est le cas pour les micro-organismes lé- thylotropes facultatifs connus. En outre aucune mutation indésirable de ce micro-organisme ne peut se produire qui affecterait son attitude à croître sur du méthanol. Cette bactérie est très stable, son métabolisme est dimi- nué à un minimum et ses variations génétiques provoqueraient la mort des cellules. Un autre avantage de l'invention est que les enzymes clés de l'assi3i- lation et de la dissimilation du méthanol sont contenues dans Methylymonas sp. DSM 580. Quand on effectue le procédé suivant l'invention dans les conditions limitatives en méthanol d'une manière continue, la teneur en acide nucléique de la masse cellulaire est très faible et la perte de méthanol par évoporation est pratiquement nulle. Par substances nutritives, on entend, dans le présent mémoire, un composé chimique qui contient, outre du carbone et des sources d'énergie, des anions et cations assimilables par les micro-organismes et nécessaires à leur croissance. Une substance favorisant la croissance est un composé naturel ou synthétique nécessaire aux micro-organismes mais qui ne peuvent être synthétisés par ceux-ci en une quantité suffisante. R E V E M I 0 À T .1 O N S 1, Un procédé pour la préparation d'une cellule protéinique à partir de méthanol, caractérisé en ce que dans un réacteur soumis à un courant gazeux avec ou sans agitation mécanique, on cultive dans des conditions aérobie une culture submergée de la bactérie Methylomonas sp. DSM 580 utilisant nécessairement du méthanol, celui-ci étant la seule source de carbone et d'énergie qui est utilisée, les sels minéraux essentiels et, si nécessaire, des agents favorisant la croissance étant présents, et en outre de l'air ou de l'air enrichi en oxygène étant envoyé à une Smpé- rature de culture de 20 à 45 C, puis on enlève la masse cellulaire du système à trois phases et on sèche, obtenant ainsi une masse cellulaire ayant une teneur en protéine brute d'au moins 60 à 76 ffi en poids, une teneur en acide nucléique de 2 à 9 % en poids, une teneur en cendres de 3 à 6 % en poids, une teneur en graisse de 3 à 8 ffi en poids, le fluide de culture pouvant outre recyclé en tout ou en partie après enlèvement de la masse cellulaire, la culture de Methylomonas sp. DSM 580 s'effectuant en discontinu à une concentration initiale en méthanol de 0,5 à 5 go et mieux de 2 à 3 % en volume par volume, en discontinu à une concentration en méthanol maintenue entre 0,01 à 2 % en volume par volume par un dispositif de réglage automatique jusqu a une conversion totale de 25 % de méthanol en volume et on fournit de l'air au réacteur pendant la culture à une vitesse d'aération de 0,5 à 1,5 v/v/min. ou de 0,1 à 0,2 v/v/min. et le mélange gazeux a une teneur en oxygène de 20 à 60 % en volume, ou en continu dans une culture dans des conditions chemostatiques ou turbistatiques à un taux de dilution de 0,1 à 0,5 en volume par volume par heure. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on règle automatiquement le pH entre 4,5 et 9,0 en ajoutant des alcali ou des acides pendant la fermentation. 3. Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on cultive Menylomonas sp. 580 entre 20 et 45 C. 4. Procédé suivant l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le milieu de culture aqueux contient des sels d'ammonium et/ou des nitrates et/ou d'urée comme sources assimilables d'azote et des cations qui sont le sodium, le potassium, le magnésium, le calcium, le fer, le zinc, le manganèse et des anions qui sont le phosphate, le sulfate, nitrate, chlorure ainsi que des agents favorisant la croissance.