Brevet FR2349335A1 — publié le 19771125

La présente invention qui est due à Monsieur André TROUET, 17 Wijngaardlaan à Heverlee (Belgique) est relative à des complexes d'alcaloides bis-indoliques du type vinblastine avec la tubuline. Les alcaloides bis-indoliques du type vinblastine sont bien connus. Comme exemples non limitatifs de tels alcaloides, on peut citer la vincaleukoblastine ou vinblastine, la vincristine ou leurocristine, la vinleurosine, le vinrosidine, la néoleurocristine, la néoleurosidine et la catherine. On les prépare par extraction à partir de feuilles de Catharanthus (dans le cas de la vincaleukoblastine et de la vincristine par exemple). Les alcaloides bis-indoliques considérés dans la présente invention peuvent aussi être obtenus par modification chimique de produits naturels. Comme exemples non limitatifs, on peut citer le sulfate de désacétylvinblastine, le sulfate de l'amide de la désacétylvinblastine et la vinglycinate. Les alcaloïdes bis-indoliques considéres dans la présente invention comprennent aussi les produits o3.Rentls par couplage d'un composé de type vindoline de formule s dans laquelle R1 désigne un radical alkyle ou alkoxy, de préférence méthyle ou méthoxy et R2 désigne de l'hydrogène, un radical alkoxy, de préférence méthoxy, avec la 16-carbométhoxycléavamine de formule t La dihydro-2,16 méthoxytabersonine peut remplacer la vindoline et être couplée à la catharantine ou à la coronaridine et leurs dérivés. Ces alcaloïdes bis-indoliques connus répondent à la formule générale : ou R1 et R2 ont les significations données plus haut. Ils sont décrits dans les référence de littérature sui- vantes : brevets américains 3.097.137, 3.225.030 ; Neuss et al., J. Am. Soc. 86 : 1440 (1964). P. Potier et al., J.C,S, Cnem. Comm. 1975, 670-671. Comme on le voit, ces composés se prêtent à un certain nombre de substitutions et les dérivés d'alcaloïdes bis-indoliques ainsi obtenus entrent également en ligne de compte comme produits de départ des complexes selon l'invention. Parmi lesdits alcaloides, la vincaleuklobastine et la vincristine sont des produits antitumoraux bien connus, utilisés dans la thérapeutique de la leucémie et des tumeurs solides. Toutefois, ces produits provoquent des effets secondaires notamment une très forte toxicité sur les cellules du système nerveux et sur les tissus hématopoétiques, caest-à-dire les tissus formant les éléments du sanq tels que globules rouges, globules blancs et plaquettes sanquines. La tubuline, qui constitue l'autre produit de départ des complexes selon l'invention, est une protéine également connue. Cette protéine est présente dans toutes les cellules où elle constitue l'élément de base des microtubules. Le poids moléculaire de la tubuline est d'environ 120.000 ; elle est constituée de 2 sous-unités différentes mais très semblables. Les propriétés des microtubules, de même que la purification et les propriétés physicochimiques des tubulines ont été décrites en détail dans Ann., N.Y. Acad. Sci. 253, pp. 5-711 du 30 juin 1975 sous le titre *The biology of cytoplasmic microtubules". On a constaté que les complexes formés par association des alcaloïdes bis-indoliques décrits ci-dessus avec la tubuline de préférence en rapport molaire de 1 : 1, répondent aux critères d'une drogue lysosomotrope antitumorale, c'est-à-dire qu'ils constituent l'association stable d'une drogue antimitotique résistant aux hydrolases lysosomiales en l'occurrence l'alcaloi- des bis-indolique et d'une macromolécule de tubuline endocytable et dégradable par les enzymes lysosomiaux. Par les termes "droque lysosomotrope", on désigne une substance qui possède un tropisme particulier pour les lysosomes. Les termes drogue antimitotique" désignent une drogue dont l'action la plus caractéristique est d'arrêter la division cellulaire en métaphase, phénomène d'abord observé avec la colchicine par Lits, 1934. (C.R. Soc. Biol. (Saris), 115, 1421-1423). Ce phénomène est aussi observé avec les alcaloïdes bis-indoliques. Le terme endocytable est un terme général qui désigne les phénomènes de pinocytose et de phagocytose. On a constaté -et l'invention est basée sur cette constatation- que la digestion de la macromolécule de tubuline, formant les complexes décrits ci-dessus, entrain la libération de la drogue antitumorale sous sa forme active. On a constaté en outre -et l'invention est aussi basée sur cette constatation- que les complexes possèdent une toxicité plus faible que celle des alcaloïdes bis-indoliques libres et une activité chimiothérapeutique plus grande. L'invention concerne donc également des compositions pharmaceutiques pour le traitement de la leucémie et des tumeurs solides comprenant un complexe tubuline/alcaloide bis-indolique du type vinblastine. On peut traiter avec succès des leucémies du type L1210 ou P388, des tumeurs solides comme le Ridgeway osteogenic sarcoma et des tumeurs ascitiques comme les ascites dsEhrlich et de Freund. La composition peut être constituée par le complexe sous forme lyophilisée ou bien en solution dans un diluant thérapeutiquement acceptable, tel que l'eau physiologique (NaCl 0,9%) ou d'autres solutions salines tamponnées avec du phosphate, du trishydroxyméthyl-aminométhane ou toute autre solution acceptable, La concentration des solutions peut être par exemple, de 12 mg de tubuline/ml et de 0,04 mq de vinblastine ou de vincristine/ml. L'administration a lieu en solution par voie parentérale à doses journalières ou hebdomadaires d'alcaloide dans le complexe allant de 0,1 mg/kg à 2 mg/kg. L'invention concerne, en outre, la préparation des complexes précités par incubation de la tubuline et de l'alcaloide bis-indolique. Cette opération se fait généralement par incubation de 30 minutes à des températures allant de 200C à 370C dans un milieu tamponné à des pH compris entre pH 6,6 et pH 7,6. Le complexe peut être employé seul ou en combinaison avec 1 ou plusieurs autres agents earcinostatiques incluant par exemple les agents alkylants, les antimétabolites tels que le méthotrexate, le 5-fluorouracile, la 6-mercaptopurine, la 6-thioguanine, les arabinosides de la cytosine, et les antibiotiques tels que l'actinomycine D, la daunorubicine et l'adriamycine. EXEMPLE. 12 mg de tubuline et 40 ya de vincaleukoblastine sont incubées pendant 30 minutes à 37 C dans 1 ml d'un tampon phosphate loC2M, pH 6,8 contenant du MgCl2, du GTP (guanosine triphosphate) 10- M et du NaCl 0,15 M, le chlorure sodique étant ajouté uniquement afin d'éviter les chocs osmotiques lors de l'expérien- ce in vivo décrite ci-après. Le GTP est ajouté pour stabiliser la tubuline. La formation du complexe est contrôlée par dialyse et son achèvement est mis en évidence par l'arrêt de la dialyse et/ou par la perte d'activité antimitotique du produit. L'activité antimitotique peut être déterminée au moyen d'une culture d'organismes sensibles aux alcaloïdes bis-indoliques. L'activité est déterminée dans le cas présent par l'inhibition de la croissance d'une culture de Tetrahymena pyrifor- mis. Les propriétés de dialyse et l'activité antimitotique peuvent cependant être restaurées par une incubation en milieu acide (pH de 4,5 à 5,0 ou pH régnant à l'intérieur des lysosomes) en présence d'extraits lysosomiaux purifiés. Pour obtenir des complexes à partir de tubuline et d'alcaloïdes bis-indoliques autres que la vincaleukoblastine on procède de manière semblable à celle décrite ci-dessus. L'activité chimiothérapique de ce genre de complexe a été testée sur des souris DBA2 inoculées par voie intraveineuse ( IV.) avec des cellules leucémiques L1210. Les résultats de cet essai sont repris au tableau I ci-apres où la vincristine (VCR) est l'alcaloïde bis-indolique mis en oeuvre. I1 en ressort que le complexe VCR/tubuline possède une activité antimitotique supérieure à celle de la vincristine libre, se traduisant par une augmentation du temps moyen de survie. Ces résultats ont été confirmés par une étude de l'ac tivité cnimiothérapique du complexe VCR/tubuline sur des souris DBA2 inoculées par des cellales leucémiques P388 (tableau II). Les animaux sont inoculés avec des cellules leucémiques au jour j0. Ils reçoivent une ou plusieurs injections de complexe suivant les schémas de traitement (tableaux I et Il). Si les animaux reçoivent les injections 1 jour, 2 jours, i jours après les cellules, ces injections sont notées respec tivement par jl, j2 .... ji dans les schémas. Comme on l'a dit plus haut, les alcaloïdes bis-indoliques sont résistants aux hydrolases lysosomiales, ils forment des complexes stables avec la tubuline et les complexes ainsi formés peuvent être dissociés par une incubation en milieu acide en présence d'enzymes lysosomiaux qui libèrent l'alcaloïde. Les complexes répondent aux critères qui définissent une drogue lysosomotrope. Ces critères sont les suivants : le complexe contenant la drogue doit être endocyté par la cellule ; le complexe doit être dissocié par le lysosome, mais le constituant actif du complexe doit résister aux hydrolases lysosomiales. Après dissociation du complexe, le constituant actif de la drogue doit etre libre de diffuser dans la cellule pour atteindre le point sensible de la cellule. Les essais chimiothérapiques in vivo montrent que les complexes décrits ci-dessus possèdent une activité antitumorale supérieure à celle des droques libres tout en présentant une toxicité plus faible. Bien entendu diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux détails décrits ci-dessus à titre d'exemple non limitatif sans sortir du cadre de l'invention. TABLEAU I Dose Forme Voie d'inoculation Nombre Schéma de mg/kg/j de la des cellules d'animaux traitement MED.S.T. % ILS droque L1210 0,91 - - IV 4 j1, j2 6,5 L IV IV 7 7,5 15 C IV IV 8 8,5 31 0,75 - - IV 5 j1, j4, j7 9,2 TUB IV IV 6 9,2 L IV IV 9 10,1 9,8 C IV IV 9 11,4 23,9 Des souris DBA2 ont été inoculées avec 104 cellules leucémiques provenant d'une ascite leucémique L1210 de 8 à 10 jours. La VCR libre (L), le complexe VCR-tubuline (C) ou la tubuline seule (TUB) ont été administrés aux doses indiquées, suivant les schémas précisés. MED.S.T. = Median Survial Time = temps moyen de surive % ILS = % of Increase Life Span = % d'augmentation de la durée de survie. TABLEAU II Dose Forme Voie d'inoculation Nombre Schéma de MED.S.T. %ILS mg/kg/j de la des cellules d'animaux traitement droque L1210 0,75 - - IV 8 j1, j5 5,8 L IV IV 12 7,65 32 C IV IV 11 8,40 45 Des souris DBA2 ont été inoculées avec 106 celules leucémiques provenant d'une ascite leucémique P388 de 8 à 10 jours. La VCR libre (L) et le complexe VCR-tubuline (C) ont été administrés par voie intraveineuse à la dose de 0,75 mg/kg, aux jours indiqués. REVENDICATIONS 1. Composition pharmaceutique pour le traitement du cancer et en particulier de la leucémie, caractérisée en ce qu'elle est constituée par un complexe de tubuline et d'alcaloïde bis-indolique du type vinblastine. 2. Composition pharmaceutique suivant la revendication 1, caractérisée en ce que l'alcaloide bis-indolique répond a la formule générale dans laquelle R1 désigne un radical alkyle ou alkoxy, de préf é- rence méthyle ou méthoxy et R2 désigne de l'hydrogène, un radical alkoxy, de préférence méthoxy. 3. Composition pharmaceutique suivant la revendication 2, caractérisée en ce que le complexe est sous forme soit lyophilisée, soit en solution dans un diluant thérapeutiquement acceptable. 4. Composition pharmaceutique suivant la revendication 3, caractérisée en ce que le diluant est choisi parmi l'eau physiologique ou d'autres solutions salines tamponnées avec du phosphate, du tri?hydroxyméthylaminométhane ou toute autre solution acceptable. 5. Composition pharmaceutique suivant la revendication 4, caractérisée en ce que le complexe se trouve en concentration de 12 mg de tubuline/ml et de 0,04 mg d'alcalolde bis-indolique/ml. 6. Composition pharmaceutique suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle est administrée par voie parentérale à doses journalières ou hebdomadaires allant de 0,1 mg/kg à 2mg/kg. 7. Composition pharmaceutique suivant l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle est utilisée pour le traitement de leucémies du type L1210 ou P 388. 8. Composition pharmaceutique suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le complexe de tubuline et d'alcaloide bis-indolique est obtenu par incubation de 1 mole d'alcaloide bis-indolique et de 1 mole de tubuline à des températures de 2o0C à 37"C en milieu tamponné à un pH compris entre 6,6 et 7,6. 9. Procédé de préparation d'une composition pharmaceutique comme défini dans la revendication 8, caractérisé en ce que la formation du complexe est contrôlée par dialyse, son achèvement étant mis en évidence par l'arrêt de la dialyse et/ou la perte d'activité antimitotique > cette dernière étant déterminée de préférence en observant l'inhibition de croissance d'une culture d'organismes tels que Tetrahymena sensibles aux alcaloldes bis-indoliques. 10. A titre de produits nouveaux, les complexes d'alcaloides bis-indoliques du type vinblastine ou de dérivés de ces alcaloïdes avec la tubuline à l'exclusion de ceux choisis parmi la vincristine, la vinblastine, la colchicine, la podophyllotoxine, la griséofulvine.