Brevet FR2347334A1 — publié le 19771104

ta présente inyention concerne de nouveaux dérivés du L-leucyl-p-amtnoanilide, un procédé pour les préparer et l'uti lisation de dérives du L-leucyl-p-aminoanilide comme substrat pour la mesure de l'activité de la leucyl-aminopeptidase. La-leucyl-aminopeptidase, désignée ci-après sous le nom de LAP est une enzyme qui libère la leucine des peptides contenant de la leucine comme amino-acide N-terminal. Elle est largement répandue dans tous les tissus des organismes vivants et est également présente dans le sérum sanguin, et il est connu que son activité augmente dans certains états pathologiques, notamment en cas de lésion du parenchyme hépatique, de blocage de la cholér ragie du canal biliaire dans le foie, de diabète sucré, de gastrite, de cancer et de grossesse. La mesure de l'activité de la LAP est donc un examen biochimique clinique indispensable dans les cas ci-dessus, non seulement pour le diagnostic d'une évolution vers un état morbide, mais encore comme élément du pronostic. On a proposé jusqu a présent diverses méthodes de mesure de l'activité de la LAP. Ces méthodes ont de nombreux avantages, mais -aussi de nombreux inconvénients. Une méthode qui a été jusqu' présent d'un usage très général est le dosage colorimétrique d'une amine formée par la LAP à partir d'un substrat synthétique. Dans ce dosage colorimétrique, si on utilise le L-leucyl-p-nitranilide comme substrat synthétique et que l'on mesure par colorimétrie la coloration jaune de la p-nitraniline formée, il est impossible d'éliminer l'influence de certains constituants du sérum.Si on utilise comme substrat synthétique le L-leucyEss-naphtylamide, qui est largement-utilise à l'heure actuelle, on peut former une matière colorante par copulation de la ss-naphtylamine formée avec un sel de diazonium ou diazotation de la ss-naphtylamine formée puis copulation avec un composé pouvant devenir un chromogène, ou condensation avec le p-diméthylaminobenzaldéhyde, le p-diméthylaminocinna- maldéhyde, etc... Dans ce dosage colorimétrique, I'activité de la LAP peut être mesurée d'une manière simple et avec une grande pré cistron, mais l'utilisation de la B-naphtylamine comme substance étalon pose un problème.En effet la ss-naphtylamine est connue pour etre cancérigène (sa production est interdite par la loi au Japon) et elle doit etre manipulée avec grand soin en utilisant un système de protection. La demAndeFesse a procédé a une étude approfondie en yue d'éliminer les inconvénients des méthodes classiques de mesure de l'activité de la LAP indiquées ci-dessus, et elle a trouvé que de nouveaux dérivés du L-leucyl-p-aminoanilide peuvent être utilisés comme substrat pour la mesure de l'activité de la LAP. La présente invention concerne de nouveaux dérivés du L-leucyl-p-aminoanilide répondant à la formule dans laquelle R1 et R2 désignent indépendamment un atome d'hydrogène ou un groupe allyle inférieur pouvant être substitué par un groupe hydroxyle ou un groupe méthanesulfonamide, et R3 désigne un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle inférieur. Dans la formule ci-dessus, l'expression "groupe alkyle inférieur" désigne un groupe alkyle en Cl à C4, par exemple un groupe méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, t-butyle etc... Les dérivés du L-leucyl-p-aminoanilide répondant à la formule (I) comprennent par exemple les composés suivants L-leucyl-4-dimethylamiloanilide, L-leucyl-4-diéthylaminoanilide, L-leucyl-4-dipropylaminoanilide, L-leucyl-2 -méthyl-4-diéthylaminoanilide, L-leucyl-2-méthyl-4-(N-éthyl-N-ss-methane-sulfonamide-ethyl) -aminoanilide, L-leucyl-2-methyl-4-(N-ethyl-N-ss-hydroxy-ethyl)-aminOanilide. Les dérivés du L-leucyl-p-aminoanilide de formule I peuvent se préparer en faisant réagir un dérivé de la'p-phénylène-diamine répondant à la formule dans laquelle R1, R2 et R3 sont tels que définis ci-dessus, avec une L-leucine dans laquelle le groupe amino est protégé par un groupe protecteur et en éliminant le groupe protecteur de l'atome d'azote. La réaction de condensation du dérivé de la p-phénylene-diamine de formule (-II) avec la L-leucine protégée peut être effectuée à une température de O à 200C, de préférence de 5 à 100C. Si nécessaire, la réaction peut être effectuée dans un solvant choisi parmi les hydrocarbures aliphatiques, les les éthers, hydrocarbures aromatiques, les esters,ftes cétones, les alcools ou l'eau, par exemple le dichlorométhane , le toluène, le n- hexane, le cyclohexane, l'acétone, l'acétate d'éthyle, l'éther éthylique, l'alcool éthylique etc... et un agent déshydratant tel que le N', N'-dicyclohexylcarbodiimide, le N',N'-di-p-toluoylcarbodiimide, le pyrophosphite de tétraéthyle, le chlorhydrate de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl )carbodiimide, le l-cyclohexyl3- (2 morpholino) carbodiimide, le meso-p-toluène sulfonate etc.. Si nécessaire, le produit de la réaction peut etre traité par une méthode classique telle que filtration, lavage à l'eau, condensa tion etc... pour éliminer les réactifs n'ayant pas réagi, les impuretés, le solvant etc... L'élimination du groupe protecteur de l'atome d'azote du produit de la réaction peut s'effectuer par une méthode classique telle que l'addition du produit de la réaction à un solvant comme de l'acétate d'éthyle contenant de l'acide chlorhydrique. On peut utiliser dans le présent procédé n'importe quel groupe protecteur classique pour la L-leucine. Le dérivé du L-leucyl-p-aminoanilide de formule (I) peut être utilisé avec succès comme substrat pour la mesure de l'activité de la LAP. Le dérivé du L-leucyl-p-aminoanilide de formule (I) est hydrolysé en dérivé de la p-phénylènediamine et en L-leucine par la LAP.Pour connaître l'activité de la LAP, on peut mesurer la baisse de la quantité de substrat ou les quantités de dérivé de la p-phénylènediamine ou de L-leucine formées ; la meilleure méthode consiste à mesurer la quantité de dérivé de la p-phénylènediamine formée. La plupart des dérivés du L-leucyl-p-aminoanilide de l'invention présentent la même réactivité, comme substrat de la LAP, que le L-leucyl-B -naphtylamide, ou une réactivité supérieure, comme le montre le tableau 1. Même, lorsque leur réactivité comme substrat de la LAP n'est pas aussi élevée, comme le montre le tableau 1, les dérivés du L-leucyl-p-aminoanilide de l'invention peuvent être utilisés pour mesurer l'activité de la LAP. Tableau I Substrat quantité rapport ayant réagi 4(*) (%) (mole x 10 ) L-leucyl-4-diméthylaminoanilide 1090 100 L-leucyl-4-diéthylaminoanilide 1145 105 L-leucyl-4-diPrOpylaminoanilide 1090 100 L-leucyl-2-méthyl-4 diéthylaminoanilide 1070 98 L-leucyl-2-méthyl-4- (N-éthyl- N-ss-méthanesulfonamide-éthylF 271 25 aminoanilide L-leucyl-2-méthyl-4- (N-éth'7l - N-ss-hydroxy-éthyl)-aminoanilide 243 22 (Témoin) L-leucyl-B-naphthylamide 1090 100 +)quantité de substrat décomposée par 0,05 ml (environ 600 unités GR) de sérum à 370C pendant 15 minutes. La réaction d'un substrat avec la LAP s'effectue de préférence à un pH de 6,5 à 8,0 a une température de 10 à 450C, de préférence de 35 à 400C. Pour maintenir le pH dans la gamme préférée, on peut utiliser un tampon tel qu'un tampon au phosphate, un tampon au tris (hydroxyméthyl) aminométhane, un tampon au barbital, un tampon au borate, un tampon à l'aminométhylpropanol etc.... Pour le dosage du dérivé de la p-phénylènediamine formé, on peut oxyder le dérivé de la p-phénylènediamine en milieu alcalin, ce qui conduit à un composé de coloration rouge, ou de préférence ajouter un agent de copulation tel qu'un phénol ou un naph-tol au dérivé de la p-phénylènediamine, ce qui produit une matière colorante par condensation oxydante.Comme agents de copulation, on peut utiliser le phénol, lta-naphtol, le -ss naphtol et leurs dérivés, par exemple des dérivés monosulfonés tels que llacide-l-naphtol-2-sulEonique, l'acide l-naphtol-4sulfonique, l'acide 2-naphtol-7-sulfonique, l'acide 2-naphtol-8sulfonique etc.. , des dérivés disulfonés tels que l'acide 2-naphtol3,6-disulfonique, l'acide 2-naphtol-6,8- disulfonique etc... des dérivés carboxylés tels que l'acide l-naphtol-2-carboxylique, l'acide salicylique etc.. et des polyphénols comme le catéchol, le pyrojallol etc. la coloration rouge qui se forme peut être mesurée par une méthode classique à 510 nm. Une méthode de mesure bien préférable consiste à utiliser une matière colorante donnant par développement une coloration bleue.Etant donné que toutes les matières colorantes produites par condensation oxydante du dérivé de la p-phénylènediamine et de l'agent de copulation ont une coloration bleue présentant un maximum d'absorption aux environs de 660 nm, et que la coloration est remarquablement stable, la mesure de l'activité de la LAP dans des échantillons provenant d'organismes vivants peut avantageusement être effectuée en l'absence presque complète d'influence d'autres constituants de ces échantillons. Le développement de la coloration par oxydation s'effectue en utilisant un agent oxydant et en ajustant le pH à 9-12 au moyen d'un agent alcalin classique tel que l'hydroxyde de sodium, l'hydroxyde de potassium, le carbonate de sodium etc.. - Comme agents oxydants, on peut utiliser des agents oxydants classiques tels que le métapériodate de sodium, le persulfate d'ammonium, le peroxyde d'hydrogène, l'hypochlorite de sodium, le ferricyanure de potassium etc.... Plus concrètement, on mesure l'activité de la LAP de la façon suivante . A 1,0 ml d'une solution 0,1 M de tampon phosphate contenant 1,0 mmole de L-leucyl-4-N,N-diéthylamino- anilide, par exemple, et ayant un pH de 7,0 , on ajoute 0,05 ml de sérum sanguin et on chauffe le mélange dans un thermostat à 370C pendant 15 minutes.On ajoute à la solution réactionnelle l,O ml d'une solution de phénol à 0,2 % et 1,0 ml d'une solution de métapériodate de sodium à 0,5 % dans l'hydroxyde de potassium 0,15 N La solution réactionnelle prend immédiatement une couleur bleue ayant un maximum d'absorption à 660 nu. L'absorbance à 660 nm est mesurée pour la solution d'échantillon obtenue contenant le sérum et pour une solution pour l'essai à blanc des réactifs contenant de l'eau à la place du sérum et préparée de la même manière que ci-dessus. Par ailleurs, on prépare de la même manière que ci-dessus une solution témoin contenant un sérum dans lequel l'activité de la LAP est connue, et on mesure également son absorbance.L'activité de la LAP dans l'échantillon de sérum se calcule par une règle de trois à partir des résultats obtenus. Les résultats obtenus par la méthode ci-dessus sont en très bon accord avec ceux obtenus par la méthode de Takenaka-Takahashi utilisant comme substrat le L-leucyl-ss-naph- tylamide, cette dernière méthode étant largement utilisée aujourd'hui et décrite dans Igaku to Seibutsugaku 65, 74-78 (1962), comme le montre le tableau 2. Tableau 2 Unités GR Echantillon Méthode de l'invention Méthode Méthode-Takenaka- EjO Takahashi 1 450 479 2 520 510 3 124 114 4 480 470 5 234 220 6 371 378 7 365 360 8 873 880 9 161 159 10 137 138 Note : les échantillons utilisés sont des échantillons de sérum humain. Etant donné que le substrat de l'invention est très stable, comme le montre le tableau 3, on peut l'utiliser sous forme de solution. Si un stockage prolongé est nécessaire, on-peut le mélanger à un excipient et le transformer en comprimé, ou le mélanger à un agent tampon et le lyophiliser pour former des solides que l'on dissout dans i'eau juste avant de les utiliser. Tableau 3 Temps écoulé immédiatement :1 semaine: 1 mois : 2 mois: 3 mois après Essai à blanc 0,020 : 0,020 : 0,020 :0,022 : 0,025: activité de la : :LAP dans le sé-: :rum (23 (unités GR) : 137 : 138 : 137: 136 : 137: rétention de substrat (%} : 100 : 100 : 100: 99,9 : 99,9 : Note : (1) le L-leucyl-4-N,N-diéthylaminoanilide en solution dans un tampon phosphate 0,1 M, est stocké à pH 7,0 et à 2-100C. (2) l'activité de la LAP du même sérum est mesurée après des durées variables~par la méthode indiquée ci-dessus. La mesure de l'activité de la LAP par le procédé de l'invention est caractérisée en ce que les impuretés habituellement présentes dans les échantillons provenant d'organismes vivants n'ont presque aucune influence sur la mesure. Si on utilise le I,-leucyl-ss-naphtylemide ou le L-leucyl-p-nitranilide comme substrat, on utilise respectivement pour la mesure les longueurs d'onde de 450 nm ou 410 nm, de sorte qu'il se produit des erreurs par excès du fait de l'absorption des impuretés de l'échantillon à 400-500 nm. I1 est donc nécessaire d'effectuer un essai à blanc des réactifs et un essai à blanc de l'échantillon, ce qui complique la mesure.Au contraire, étant donné qu'on utilise dans le procédé de l'invention une longueur d'onde atteignant 660 nm, les matières colorantes de l'échantillon d'organisme vivant n'ont presqu'aucune influence sur la mesure. En outre, si cet échantillon contient des substances réductrices comme l'acide urique, l'acide ascorbique etc,.. celles-ci sont décomposées par l'agent oxydant en excès et n'ont pas d'influence sur la mesure. Comme le montre bien le tableau 4, on peut obtenir des résultats précis par le procédé de l'invention même si l'échantillon contient des substances réductrices. TABLEAU 4 Additif concentration activité de la L; (mg/dl) (unités GR) Aucun 160 acide ascorbique 7s5 160 créatinine 25 160 glucose 500 159 acide urique 10 158 bilirubine . 5 160 hémoglobine 500 156 Comme il a été indique ci-dessus, le procédé de l'ln- Invention pour la mesure de l'activité de la LAP dans des échan- tillons d'organismes vivants permet d'obtenir rapidement et simplement des résultats précis, et il est en outre plus sur du point de vue sanitaire. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention. EXEMPLE 1 On prépare une suspension de 15,0 g d'hydrate de tertbutoxycarbonyl-L-leucine et de 9,9 g de N,N-diéthyl-p-phénylène diamine dans du dichlorométhane, et on y ajoute goutte à goutte une solution de 14,9 g de NtNl-dicyclohexyl-carbodiimide dans du dichlorométhane en agitant, à 5 - 100C, sur une période de 1 à 2 heures, puis on élimine le solvant par distillation. On ajoute au xésidu de l'acétate d'éthyle contenant 22 g d'acide chlorhy- dorique gazeux, ce qui donne des cristaux. Par recristallisation dans le méthanol, on obtient 14,8 g (rendement 70,2 %) de dichlo rhydrate de L-leucyl-4-diéthylaminoanilide,sous forme de prismes incolores fondant à 258-260 C (déc.). Composition élémentaire : C (*) H (%) N(%) Calculé pour C16H27N30. 2HCl 54,86 8,34 11,99 Trouvé : 54,76 8,39 11,96 IR (Nujol) cm61 : 1690, 1620 (-CO-NH-) HO X 2 243 nm max EXEMPLE 2 En utilisant le même mode opératoire qu'à 11 exemple 1, mais en remplaçant la N,N-diéthylrp-phenylènedlamine par 3,6g de 2-méthyl-4-diéthylaminoaniline, on obtient 3,1 g (rendement 42,5% de dichlorhydrate de L-leucyl-2-mêthyl-4-diéthylaminoanilide, sous la forme d'une poudre blanche fondant à 184-1860C. Composition élémentaire : C (%) H (%) N(%) Calculé pour C17H29N30 2HCl : 56,04 8,58 11,53 Trouvé : 55,74 8,41 11,27 IR (XBr) cm 1 : 1685, 152C (--CO-NH-) HO # H20 230 nm max EXEMPLE 3 En utilisant le même mode opératoire qu'à l'exemple 1, mais en remplaçant la N,N-diéthyl-p-phénylènediamine par 5,4 g de 2 méthyl-4- (N-éthyl-N-8-méthanesulfonamide-éthyl) aminoaniline, on obtient 5,0 g (rendement 54,6 % de dichlorhydrate de L-leucyl-2 méthyl-4- (N-méthyl-N--méthanesulfonamide-éthyl-aminoanilide sous la forme d'une poudre blanche (recristallisée dans l'éthanol-éther éthylique) fondant à 144-1460C. Composition élémentaire : C (*) H (%) N (e) Calculé pour CH32N403s.2HCl : 47,26 7,49 12,25 Trouvé : 46,98 7,51 12,36 -1 IR (kir) cm : 1685, 1620 (-C0-NH-), 1315, 1145 (SO2) 1120 X 263 nm max EXEMPLE 4 Détermination de l'activité-de la LAP Réactifs : Solution tamponnée de substrat : solution tampon au phosphate 0,1 M, pH 7,0, contenant 1,0 mmole de L-leucyl-4-N,Ndiméthylaminoanilide. Solution oxydante : solution d'hydroxyde de potassium 0,1 N contenant 0,2 % de métapériodate de sodium. Mode opératoire A 2,0 ml de la solution tampon de substrat, on ajoute 0,05 ml d'un échantillon de sérum humain sous une agitation suffisante, puis on chauffe le mélange dans un thermostat à 370C pendant 15 minutes. On ajoute alors 1,0 mI de la solution oxydante au mélange obtenu pour développer la coloration. Par ailleurs, on répète le même mode opératoire, excepté que l'on utilise 0,05 ml d'eau à la place de l'échantillon de sérum, la solution obtenue étant destinée à l'essai à blanc des réactifs. On mesure l'absorbance sous 510 nm pour ces échantillons d'essai. En même temps, on prépare de la même manière que ci-dessus une solution témpin contenant un sérum dont on connait l'activité de la LAP, et on mesure également son absorbance. L'activité de la LAP dans l'échantillon de sérum se calcule à partir des résultats obtenus par une règle de trois. EXEMPLE 5 Détermination de l'activité de la LAP Réactifs Solution tamponnée d'un substrat : solution de tampon phosphate 0,1 M, à pH 7,0, contenant 1,0 mmole de L-leucyl-4 N,N-diéthylaminoanilide et 0,1 % de phénol. Solution oxydante Solution d'hydroxyde de potassium 0,1 N contenant 0,5 % de métapériodate de sodium. Mode opératoire A 2,0 ml de la solution tamponnée de substrat, on ajoute 0,05 ml d'un échantillon de sérum humain en agitant suffisamment, puis on chauffe le mélange dans un thermostat à 37"C pendant 15 minutes. On ajoute alors 1,0 ml de la solution oxydante au mélange obtenu pour developper la coloration. Par ailleurs, on répète le même mode operatoire, excepté que l'on utilise 0,05 ml d'eau à la place de I'échantillon de sérum, la solution obtenue étant destinée à servir à l'essai à blanc des réactifs. On mesure l'absorbance à 660 nm pour ces échantillons d'essai. En même temps, on prépare une solution témoin contenant un sérum, dont on connait l'activité de la LAP, de la même manière que ci-dessus et on mesure~egalement son absorbance. L'activité de la LAP dans l'échantillon de sérum se calcule par une règle de trois à partir des résultats obtenus. REVENCICATIONS 1. Dérivé du L-leucyl-p-aminoanilide répondant à la formule dans laquelle R1 et R2 désignent indépendamment un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle inférieur pouvant être substitué par un groupe hydroxyle ou par un groupe methanesulfonamide, et R3 désigne un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle inférieur. 2. Dérivé du L-leucyl-p-aminoanilide suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est le L-leucyl-4 dimethylaminoanilide, le L-leucyl-4--diéthylaminoanilide, le L-leucyl-4-dipropylaniinoanilide ou le L-leucyl-2-méthyl-4- diéthylaminoanilide. 3. Procédé de preparation d'un L-leucyl-p-aminoanilide suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on fait réagir un dérivé de la p-phénylènediamine répondant à la formule dans laquelle R1, R2 et R3 sont tels que définis ci-dessus avec une Lleucine dans laquelle le groupe amine est protégé par un groupe protecteur, et en ce qu'on élimine le groupe protecteur 4. Utilisation d'un dérivé du L-leucyl-paminoanilide suivant la revendication 1 pour mesurer l'activité de la leucyl-aminopeptidase. SR 331-Ja-NdT