Brevet FR2345517A1 — publié le 19771021

La présente invention est relative à un nouveau milieu sélectif de culture pour le Bacille de Whitmore (Pseudomonas Pseudomallei) ainsi qu a son procédé de préparation, et à un agent de diagnostic de la mélioidose par séroagglutination, obtenu à partir de ce milieu sélectif. Le Bacille de Whitmore qui est apparenté au Bacille de la morve (Pseudomonas Mallei) est l'agent causal de la mélioidose appelée encore maladie de Whitmore ou pseudomorve, maladie infectieuse épizootique grave. Elle peut revêtir des formes diverses ressemblant tantôt à la peste, tantt au choléra, tantôt à la tularémie ou à la morve. Ces diverses formes sont des manifestations très polymorphes et leurs localisations sont multiples, la localisation pulmonaire étant toutefois la plus fréquente. Son incidence humaine est très importante (surtout dans le Sud-Est Asiatique). La maladie a particulièrement sévi parmi les troupes étrangères qui combattaient au Viet-Nam, la mélioldose pouvant même se déclarer 3 ou même 5 ans après le rapatriement de la zone d'endémie. D'autre part, I' introduc- tion d'animaux neufs dans des zones où sévit la mélioldose est pratiquement toujours suivie d'un échec et la maladie décime régulièrement les troupeaux de moutons, chèvres, chevaux et même chameaux. Les animaux sauvages sont également sensibles au Bacille de Whitmore. On a pu isoler à partir des cultures de Bacille de Whitmore, une substance appelée Whitmorine (LEGROUX) ou mélioidine (OLDS & LEWIS) qui constitue l'antigène allergisant et qui permet de dépister et d'isoler les animaux contaminés, exactement comme pour la mailéine, substance présente dans les cultures du Bacille de la morve et qui est utilisée pour le diagnostic de la morve à cause de sa réaction de sensibilisation spécifique. Si la malléine est un excellent antigène, les diagnostics réalisés à l'aide de la whitmorine obtenue à partir des milieux de culture classiques, présentent certains inconvénients : les antigènes extraits sont toxiques (dermotoxiques) à des degrés différents et conduisent par conséquent à des résultats faussement positifs et ne décèlent l'allergie qu'à un stade relativement tardif de la maladie. I1 en est de même pour le sérodiagnostic qui est décevant, avec des nombreux résultats faussement positifs ou faussement négatifs. Un milieu de culture sélectif a été proposé conformément à l'Art antérieur pour isoler le bacille de Whitmore. Ce milieu de culture, connu sous le nom de milieu de Lévine, contient du phosphate acide de potassium (K2HP0417,5 g/l), du sulfate de magnésium (MgS04, 7H20 ; 125 mg/l), du sulfate de fer (FeSO4, 7 O, solution aqueuse 0,1 % ; 0,7 ml/l) et de l'acide lactique (5,4 g/l), et son pH est de 6,5 (ajusté à l'aide d'ammoniaque) ; il s'est toutefois avéré dans la pratique que la sélectivité du milieu de Lévine est très insuffisante en effet, d'autres germes cultivent en même temps que le bacille de Whitmore, ce qui gêne et complique considérablement l'isoler ment rapide de ce dernier. L'on connaît par ailleurs un milieu de culture, connu sous le nom de milieu SMB, dont la composition est la suivante - tampon phosphate pH7 (P04 K - PO4Na2H) 0,02 M - solution de S04Mg, 7H20 0,2 g/l - CaCl2 0,01 g/l - Versénate de fer 0,1 ml/l - traces de métaux (As) 1 ml/l qui, lorsqu'il est ensemencé avec des quantités croissantes de Pseudomonas pseudomallei, ne permet pas la culture du bacille de Whitmore. La Demanderesse a cependant pu établir qu'en modifiant de manière appropriée ce milieu de base SMB, elle obtient un milieu sélectif de culture du bacille de Whitmore, qui permet une culture sélective de ce dernier et son isolement rapide. La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à un nouveau milieu de culture du Bacille de Whitmore, qui répond mieux aux nécessités de la pratique que les moyens visant au même but antérieurement connus, notamment en ce que ce milieu est parfaitement sélectif et permet de fournir un antigène d'excellente qualité aussi bien pour la préparation des vaccins (cf. le Brevet Français nO 73 03734 "FRACTIONS ANTIGENIQUES UTILISABLES POUR LA VACCINATION ET LEUR PREPARATION") que pour les tests de séroagglutination. La présente invention a pour objet un nouveau milieu sélectif du Bacille de Whitmore (Pseudomonas pseudomallei) qui contient du tampon phosphate pH7, du sulfate de magnésium, du versénate de fer et des traces de métaux, et qui est caractéri sé par le fait qu'il contient de la L-thréonine, et des tra ces de métaux non arséniés. La Demanderesse a en effet constaté qu'alors que le Bacille de Whitmore ne pousse pas du tout sur le milieu SMB, l'introduction dans un tel milieu de la L-thréonine non seule ment permet la culture du Bacille de Whitmore, mais permet d'isoler, et même d'identifier ledit Bacille, en raison du rôle sélectif qu'exerce la L-thréonine vis-à-vis des autres bactéries. Selon un mode de réalisation avantageux du milieu sélec tif de culture objet de la présente invention, les métaux pré sents dans le milieu sont choisis dans le groupe qui comprend le bore, le manganèse, le zinc, le molybdène, le cuivre. le cobalt et ventuellement le fer. Selon un autre mode de réalisation 'avantageux du milieu sélectif de culture objet de la présente invention, la L-thréonine est présente dans le milieu à une concentration comprise entre $1.10-M et 5.10-M. Conformément a l'invention, les traces de métaux pré sentes dans le milieu, sont introduites dans ce dernier sous la forme de leurs sels, et notamment sous forme de chlorure ou de sulfate de manganèse, de sulfate de zinc, de molybdate de sodium, de sulfate de cuivre, de nitrate de cobalt, le bore étant prisent sous la forme de l'acide borique, ainsi qu'éven tuellement des traces de fer présentes sous forme de sulfate de fer. Selon un mode de réalisation avantageux du milieu de culture objet de la présente invention, les métaux à l'état de traces sont présents dans ledit milieu, sensiblement dans les proportions quantitatives suivantes BB03 0,062 - 2,86 g/l MnS04 ou MnCl2, E 0,223 - 1,81 g/1 znSO4,7H20 0,222 - 0,297 g/l NaMoO4,2H2O 0,030 - 0,39 g/l CuSO4,50 0,025 - 0,079 g/l Co(NO3)2, 6H2O 0,030 - 0,0494 g/l Conformément à l'invention, lorsque le milieu contient également des traces de fer, celui-ci y est présent sous forme de sulfate de fer, sensiblement. à raison de 0,501 - 0,611 g/l. Suivant une variante de l'invention, le milieu sélectif de culture du Bacille de Whitmore est dépourvu de versénate de fer. Selon un mode de réalisation avantageux du milieu de culture du Bacille de Whitmore conforme à la présente invention, ledit milieu est liquide. Selon un autre mode de réalisation avantageux du milieu de culture du Bacille de Whitmore conforme à la présente invention, celui-ci est gélosé. Il s'est en effet avéré que la sélectivité du milieu vis à-vis du Bacille de Whitmore est encore améliorée, lorsqu'il est gélosé. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation du milieu sélectif pour la production du Bacille de Whitmore, conforme à l'invention, caractérisé en ce que - l'on prépare au cours d'une première étape, le tampon phos phate pH 7 que l'on autoclave, puis les solutions de MgS04 et CaCl2 que l'on stérilise, puis la solution du versénate de fer que l'on stérilise, - puis au cours d'une deuxième étape, la solution de sels métalliques-est préparée en procédant à la dissolution sépa rée de chaque sel de métal et à la stérilisation séparée de chacune des solutions de sels métalliques, après quoi ces solutions sont mélangées pour obtenir le milieu de base con forme à l'invention, - puis au cours de la troisième étape, on prépare une solution molaire de L-thréonine que l'on stérilise sur filtre milli pore (0,4 - 0,5 )z) et que l'on ajoute ensuite au milieu de base. Selon une variante particulièrement avantageuse de ce procédé, le milieu sélectif pour la production du Bacille de Whitmore est préparé en dissolvant conjointement le chlorure de calcium, le sulfate de magnésium, les phosphates de potassium mono et dipotassiques,du chlorure de sodium et de l'acide nitrilo triacétique (TS dans de l'eau distillée, puis en ajoutant à cette solution une solution de sels métalliques comprenant le sulfate de zinc, le chlorure ou le sulfate de magnésium, le sulfate de cuivre, le nitrate de cobalt et le molybdate de sodium, ladite solution de sels métalliques contenant en outre de l'acide borique et de l'acide phosphorique, ainsi que du sulfate de fer. après quoi l'on ajuste le pH de la solution obtenue à pH 7,4 et on lui ajoute la L-thréonine, puis l'on proçède, en fin de préparation, a un autoclavage unique du milieu de culture obtenu. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, lorsque le milieu contient du versénate de fer, ce dernier est préparé au préalable en dissolvant séparément l'EDTA et la potasse d'une part, et le sulfate de fer d'autre part, puis en les mélangeant et stérilisant, puis en les gardant à l'obscurité. Selon un mode de réalisation préféré du procédé objet de la présente invention, l'opération ou les opérations d'autoclavage et de stérilisation sont réalisées a une température comprise entre 105 et 1200C. Selon encore un autre mode de réalisation préféré du procédé objet de l'invention, le milieu de culture est gélosé par mélange, de préférence par fusion, avec un gel d'agaragar éventuellement additionné de mono-oléate de polyoxy éthylene-sorbitol. La présente invention a de plus pour objet un procédé d'identification et d'isolement du Bacille de Whitmore contenu dans des produits souillés tels que pus, terre de zone d'endémie, en particulier. à l'aide du milieu sélectif de culture conforme à l'invention, caractérisé en ce que le dit milieu est-ensemencé des produits souillés susdits, et la culture est poursuivie à une température de l'ordre de 370C, pendant 24 à 48 heures environ, au bout desquelles les colonies de bacille de Whitmore qui apparaissent, sont identifiées par immunofluorescence a l'aide d'un sérum anti-Whitmore, tel, en parti culiez que le sérum spécifique antifraction W1 + 2 selon le Brevet Français nO 73 03734 du 2 Février 1973, déposé au nom de l'AGENCE NATIONALE DE VALORISATION DE LA RECHERCHE pour "FRACTIONS ANTIGENIQUES UTILISABLES POUR LA VACCINATION ET LEUR PREPARATICN", ou par séroagglutination au moyen d'un sérum antiagglutinant spécifique anti-Whitmore, tel en particulier, que le sérum agglutinant spécifique anti W1 + 2 selon le Brevet Français susdit. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. La présente invention vise plus particulièrement un nouveau milieu sélectif pour le Bacille de Whitmore, son procédé de préparation et un agent de diagnostic de la mélioîdose par séroagglutination, obtenu à partir de ce milieu sélectif, conformes aux dispositions qui viennent d'être énoncées, ainsi que les moyens propres à la mise en oeuvre et à la réalisation de ces milieu, procédé et agent de diagnostic. L'invention sera décrite de façon plus détaillée dans le complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation du nouveau milieu conforme à l'invention, et à des exemples de réalisation de tests de diagnostic à l'aide de ce milieu. Il doit litre bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLES Exemple 1 10) On mélange une solution de 39 ml de KN2PO4 0,4 M et de 61 ml de Na2HPO4 0,4 M. On autoclave pendant 20 minutes à 120 C. Pour un litre de milieu on met 50 ml de ce mélange. 20) On stérilise 20 minutes à 1200C une solution de MgSO4, 7H2O à 1 g/1 et une solution de CaCl2 à 0,5 g/1. On pré lève 20 ml du mélange de ces solutions pour 1 litre de milieu. 3 ) On idssout 17,9 g d'acide éthylène-diamine-tétraacétique (EDTA) et 3,23 g de potasse dans 186 ml d'eau distillée. On dissout d'autre part 13,7 g de FeSO4, 7H2O dans 364 ml d'eau distillée. On mélange ces deux solutions en agitant sur agitateur magnétique pendant 15 à 20 heures. On garde à l'obscurité et l'on stérilise cette solution pendant 20 minutes à 1200C. On prélève 0,1 ml de cette solution pour I litre de milieu. 40) On prépare des solutions séparées de - HBO3 2,86 g/1 - MnCl2,H2O 1,81 g/1 - ZnSO4,7H2O 0,222 g/1 - Na2MoO4,2H2O 0,39 g/1 - CuSO4,5H2O 0,079 g/1 - Co(NO3)2,6H2O 0,0494 g/1 On les autoclave séparément 20 minutes à 12O0C puis on les mélange. On prélève 1 mi de la solution de sels obtenue par mélange, pour un litre du milieu. 5 ) On pèse 119,12 g de L-thréonine et l'on dissout dans un litre d'eau distillée. On filtre sur filtre millipore 0,45 On prélève 10 ml de cette solution pour I litre du milieu. 6 ) On prépare une gélose à 30 o/oo avec de 1' "Agar Noble Difco" dans le milieu de base. On fait prendre au bainmarie. On coule 20 ml de milieu de base gélosé par boite de Pétri, ainsi que 5 ml d'une solution de thréonine à une concentration de 5.10-M préalablement filtrée. On ajoute encore 0,2 ml de "Tween SO" (Marque déposée). Exemple 2 On dissout conjointement, à froid, sur un agitateur mécanique : - CaCl2 0,0147 g - NTA 2 0,200 g - SO4Mg,7H2O 0,123 g I - KH2PO4 0,451 g - K2HPO4 1,730 g - NaCi 10 g dans - H2O distillée 980 ml On ajoute a la solution obtenue, 20 ml de solution de sels métalliques dont la composition quantitative, pour I litre, est la suivante s - H3PO4 1,960 g/1 - FeSO4,7H2O 0,556 g/1 - ZnSO4,7H2O 0,297 g/1 - MnSO4,H2O 0,223 g/1 - CuSO4,5H2O 0,025 g/1 - Co(NO3),6h2O 0,030 g/1 - Na2MoO4, 2H2O 0,030 g/1 - H3BO3 0,062 g/1 L'on ajuste ensuite le pli de la solution à 7,4 à l'aide de KOH N. L'on ajoute alors la L-thréonine à raison de 5.10-M, soit 5,956 g pour 1 litre de milieu. L'on autoclave le milieu de culture obtenu, pendant 20 minutes à 105-110 C. Le milieu obtenu est gélosé en procédant comme indiqué à l'Exemple 1. Exemple 3 - Réalisation d'un test de diagnostic à l'aide du milieu de culture selon la présente invention. Des produits souillés (tels que pus, terre de zone d'endémie, etc...) sont, par exemple, ensemencés à raison de 2 à 3 g, dans des tubes de milieu liquide, placés à l'étuve à 370C pendant 24 à 48 heures. Après ce temps, le voile de surface est ensemencé sur le milieu gélosé t les colonies de Bacille de Whitmore apparaissent petites, rondes et bleutées et elles peuvent être agglutinées sur lames par des sérums anti-Whitmore, par exemple du type de ceux obtenus conformément au Brevet Français ne 73 03734 précité. Si les colonies sur le milieu synthétique conforme à l'invention sont difficilement agglutinablee, il est nécessaire de faire un diagnostic soit par la méthode d'immunofluorescence, soit en effectuant un nouveau passage sur gélose ordinaire, ce qui améliore la croissance du microorganisme. La mélioîdose évoluant en zone d'endémie sous une forme chronique, les tests de séroagglutination permettent de dépis- ter les animaux ou les hommes malades, dans une telle zone. Dans ce but, l'on prépare l'antigène pour séroagglutination, en procédant comme suit 1 - Préparation de l'antigène formolé (recherche de l'anti gène flagellaire) La souche 6068 Whitmore type I de référence est mise en culture pendant 18 heures sur gélose ordinaire,puis la culture est reprise par 10 ml de solution formolée à 0,5 %,après quoi l'on agite,l'on attend 30 minutes,l'on décante,l'on récupère le surnageant et l'on ajuste la DO de façon à obtenir 5.108 germes/ml. 2 - Préparation de l'antigène chauffé (recherche de l'auti gène 0) La souche 6068 Whitmore type I est mise en culture pendant 18 heures, puis on récupère la culture par 10 à 15 mi de solution physiologique, on agite, on laisse reposer 10 à 15 minutes, on décante, on agite et l'on chauffe pendant 2 heures à 100 C, après quoi l'on ajuste la DO pour obtenir i09 germes/ml. 3 - Réaction On fait les dilutions du sérum suspect à 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320. L'on fait un témoin avec de la solution physiologique. L'on ajoute à 0, ml de chaque dilution du sérum, 0,5 ml de la suspension antigénique chauifée. L'on ajoute à 0,5 ml de chaque dilution du sérum, 0,5 ml de la suspension antigénique formolée. On place les potoirs 3 heures à 37 C et 12 heures à la température ambiante. La lecture est effectuée à la loupe s l'agglutination des deux suspensions à des taux de dilution du sérum supérieurs à 1/80 a valeur d'orientation diagnostique. L'augmentation de ce taux au cours de l'évolution de la la maladie apporte une confirmation. Le test de séroagglutination réalisé en mettant an oeuvre l'antigène obtenu à partir du nouveau milieu sélectif de culture conforme à la présente invention, permet un dépistage sar et fiable des animaux ou des hommes atteints de mélioidose. La sélectivité du milieu de culture gélose réalisé conformément à l'invention,par rapport au milieu de Lévine ressort du Tableau ci-après : TABLEAU Milieu de culture Culture Germes obte mis en oeuvre tempéra- durée ture en jours Milieu SMB 37 C 4 j. néant Pseudomonas Pseudomallei Milieu de Lévine 37 C 2 j. Autres Pseudomonas, Proteus Escherichia Coli Milieu conforme Pseudomonas Pseudomallei à l'invention 37 C 2 j. seulement Il résulte de la description qui précède que, quels que soient les modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application adoptés, l'on obtient des milieux sélectifs de culture pour le Bacille de Whitmore, qui présentent, par rapport aux milieux connus, des avantages importants et notamment la possibilité de fournir d'une manière simple et répétitive un antigène d'excellente qualité et un germe à l'état pur et de permettre l'utilisation de cet antigène pour la préparation éventuelle de vaccins et pour la réalisation de tests prophylactiques donnant des résultats sûrs et fiables. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'etre décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire, toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 - Nouveau milieu de culture sélectif du Bacille de Whitmore (Pseudomonas Pseudomalléi) qui contient du tampon phosphate pH 7, du sulfate de magnésium, du versénate de fer et des traces de métaux, caractérisé par le fait qu'il contient de la L-thréonine présente à une concentration appropriée et des traces de métaux non arséniés choisis dans le groupe qui comprend le bore, le manganèse, le zinc, le molybdène, le cuivre, le cobalt et éventuellement le fer. 20- Milieu de culture selon la Revendication 1, caractérisé en ce que la L-thréonine est présente dans le milieu à une concentration comprise entre 1.10 2M et 5.10-2M. 30- Milieu de culture selon la Revendication 1, caractérisé en ce que les traces de métaux présentes dans le milieu sont introduites dans ce dernier sous la forme de leurs sels, et notamment sous forme de chlorure ou de sulfate de manganèse, de sulfate de zinc, de molybdate de sodium, de sulfate de cuivre, de nitrate de cobalt, le bore étant présent sous la forme de l'acide borique, ainsi qu'éventuellement des traces de fer présentes sous forme de sulfate de fer. 40- Milieu de culture selon la Revendication 3, caractérisé en ce que les métaux à l'état de traces sont présents dans ledit milieu, sensiblement dans les proportions quantitatives suivantes HB03 0,062 - 2,86 g/l MnSO4 ou MnC12,H20 0,223 - 1,81 g/l ZnSO4,7H2O 0,222 - 0,297 g/l Na2MoO4, 2H20 0,030 - 0,39 g/l CuSO4,5H20 0,025 - 0,079 g/l Co(NO3)2,6H2O 0,030 - 0,0494 g/l 5 - Milieu de Culture selon la Revendication 3 ou la Revendication 4, caractérisé en ce que lorsque le milieu contient également des traces de fer, celui-ci y est présent sous forme de sulfate de fer, sensiblement à raison de 0,501 - 0,611g/l. 60- Milieu de culture selon l'une quelconque des Revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il est dépourvu de versénate de fer. 70- Milieu de culture selon l'une quelconque des Revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est liquide. 80- Milieu de culture selon l'une quelconque des Reven- dications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il est gélosé. 9 - Procédé de préparation du milieu sélectif pour la production du Bacille de Whitmore, selon l'une quelconque des Revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'on prépare au cours d'une première étape, le tampon phosphate pH 7 que l'on autoclave, puis les solutions de MgSO4 et CaCl2 que l'on stérilise, puis la solution de versénate de fer que l'on stérilise ; - puis l'on prépare, au cours d'une deuxième étape, la solution de sels métalliques en procédant à la dissolution séparément pour chaque sel de métal et à la stérilisation séparée de chacune des solutions de sel métallique, après quoi lesdites solutions sont mélangées pour obtenir le milieu de base, - puis l'on prépare, au cours de la troisième étape, une solution molaire de L-thréonine que l'on stérilise sur filtre millipore (0,4 - 0,5 r) et que l'on ajoute ensuite au milieu de base. 10 - Procédé de préparation du milieu sélectif pour la production du Bacille de Whitmore, selon l'une quelconque des Revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ledit milieu est préparé en dissolvant conjointement, le chlorure de calcium, le sulfate de magnésium, les phosphates de potassium mono- et dipotassiques, du chlorure de sodium et de l'acide nitrilotriacétique, dans de l'eau distillée, puis en ajoutant à cette solution une solution de sels métalliques comprenant le sulfate de zinc, le chlorure ou le sulfate de magnésium, le sulfate de cuivre, le nitrate de cobalt et le molybdate de sodium, ladite solution de sels métalliques contenant en outre de l'acide borique et de l'acide phosphorique, ainsi que du sulfate de fer, après quoi l'on ajuste le pH de la solution obtenue à pH 7,4 et on lui ajoute la L-thréonine, puis l'on procède, en fin de préparation, à un autoclavage unique du milieu de culture obtenu. 11 - Procédé selon la Revendication 9 ou la Revendication 10, caractérisé en ce que lorsque le milieu contient du versénate de fer, ce dernier est préparé au préalable en dissolvant séparément l'EDTA et la potasse d'une part et le sulfate de fer d'autre part, puis en les mélangeant et stérilisant à l'obscurité. 120- Procédé selon la Revendication 9 ou la Revendication 10, caractérisé en ce que l'opération ou les opérations d'autoclavage et de stérilisation sont réalisées à une température comprise entre 105 et 120 C. 130- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 9 à 12, caractérisé en ce que le milieu de culture est gélosé par mélange, de préférence par fusion, avec un gel d'agar-agar éventuellement additionné de mono-oléate de polyoxyéthylène- sorbitol. 14 - Procédé d'identification et d'isolement du Bacille de Whitmore contenu dans des produits souillés tels que pus, terre de zone d'endemie,en particulier, à l'aide du milieu sélectif de culture selon l'une quelconque des Revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ledit milieu est ensemencé des produits souillés susdits, et la culture est poursuivie à une température de Tordre de 370C, pendant 24 à 48 heures environ au bout desquelles les colonies de Bacille de Whitmore qui apparaissent, sont identifiées par immunofluorescence à l'aide d'un sérum anti-Whitmore, ou par séro-agglutination au moyen d'un sérum anti-agglutinant spécifique anti-Whitmore. 15 - Agent de diagnostic de la mélioïdose par séroagglutination, caractérisé en ce qu'il comprend le milieu de culture selon l'une quelconque des Revendications 1 à 8, associé à un agent d'agglutination constitué par un sérum agglutinant spécifique anti-Whitmore. 16 - Agent de diagnostic de la mélioidose par immunofluorescence, caractérisé en ce qu'il comprend le milieu de culture selon l'une quelconque des Revendications 1 à 8, associé à un agent d'identification par immunofluorescence constitué par un sérum spécifique antifraction Whitmore. 17 - Agent de diagnostic de la mélioidose selon la Revendication 15 ou la Revendication 16, caractérisé en ce que les composants dudit agent de diagnostic sont associés sous la forme d'un kit de diagnostic.