Brevet FR2356724A1 — publié le 19780127

L'invention est relative à un procédé d'identification et de détection de bactéries dans l'urine et autres liquides physiologiques, dans les produits à base de lait ou de viande et autres produits alimentaires et dans l'eau. L'invention concerne également un procédé pour déterminer la sensibilité de bactéries aux différents antibiotiques. La détermination des types et des espèces de bactéries dans des échantillons est basée sur la combinaison des sensibilités et des résistances, ainsi que sur llaptitude des bactéries de se multiplier dans des milieux de culture sélectifs, et leur comportement chimiotactique vis-à-vis de certains produits chimiques. Les procédés connus pour la détermination de la sensibilité des bactéries dans les cas de bactériurie et autres infections bactériennes dans les liquides et tissus physiologiques, peuvent être divisés en deux groupes 1 -incubation pendant une période de 18 à 72 heures avec des cultures pures de bactéries, isolées des échantillons. D'autres procédés d'incubation pour cette détermination sont celui par dilution d'agar-agar WHO/ICS et ceux par diffusion sur disques selon Bauer, Kirby, Sherris et Turck, et procédés similaires; 2 - procédés basés sur les propriétés de diffusion de la lumière par les colonies de bactéries en développement. Selon les procédés du groupe 1, on conduit les essais en général par inoculation d'une culture pure à un milieu bactériologique solide ou liquide dans lequel on a incorporé différentes quantités d'antibiotiques. Après une période d'incubation comprise entre 18 et 72 h, on détermine la concentration nécessaire, soit pour inhiber le développement des bactéries, soit pour les tuer. Habituellement on utilise pour ce faire le procédé par diffusion sur disques, appelé technique de Kirby-Bauer, selon laquelle on place des disques en papierfiltre contenant des quantités mesurées d'antibiotiques sur un milieu de culture solide inoculé. Après une incubation pendant une période de 18 à 72 h, on évalue le diamètre d'une zone claire autour du disque en papier filtre. Plus la zone claire est large, plus ltorganisme soumis à ltépreuve est considéré etre sensible à l'antibiotique choisi. Ces procédés antérieurs présentent plusieurs inconvénients. Ils requièrent des cultures pures et des temps d'incubation longs, de plus le procédé par diffusion sur disques est sujet à des erreurs cau sées par des facteurs physiques et chimiques. Les procédés du groupe 2 sont basés sur les propriétés de cellules bactériennes de diffuser la lumière lorsqu'on les cultive en milieu limpide, tel celui connu sous le nom "Eugonic Broth" ; des bactéries qui ne se dévelop pent pas ne troublent pas le milieu nutritif pendant la période d'incubation et sont ainsi considérées comme étant sensibles à la substance antibiotique présente dans le milieu. Des instruments automatiques basés sur ce phénomène sont ca pables de déterminer la sensibilité dans des cultures pures des bactéries sou mises à l'essai aux antibiotiques en 3 ou 5 heures. L'inconvénient de ces instruments est cependant qu'ils requièrent également une culture pure de l'organisme soumis à l'essai et ainsi de 21 à 23 heures sont nécessaires pour conduire l'analyse complète d'un échantillon. Dans le cas de l'analyse d'un échantillon provenant d'un malade pour connaitre sa sensibilité aux antibiotiques, le délai ainsi imposé pour commencer un trai tement efficace, peut être fatal dans des cas graves d'infections bactériennes. Pour l'identification de groupes et d'expères de bactéries selon les procédés habituels, on utilise des milieux sélectifs, des tests biochimiques, la coloration, les produits de métabolisme, la microscopie ou encore d'autres pro cédés connus. Toutes ces techniques demandent des temps de travail assez longs. I1 existe des analyses biochimiques pour l'identification d'espèces bactériennes basées sur l'aptitude de certaines espèces d'utilser des substrats spécifiques en tant que substance nutritive. Le nombre de substrats spécifi ques utilisé dans des telles analyses peut varier de 3 à 20 environ. Selon les procédés conventionnels on utilise une suspension des bactéries isolées qui doi vent etre analysées pour inoculer ces milieux spéciaux, contenant chacun un substrat spécifique. A ces milieux sont incorporés des colorants indiquant le changement du pH provoqué par la destruction du substrat, due à l'activité métabolique des bactéries. On relève les résultats à l'oeil nu après un ou plu sieurs jours d'incubation. Le temps d'incubation est choisi long afin que les résultats soient visibles à l'oeil nu.Le développement des bactéries à analyser est jugé positif en- cas de changement de couleur du colorant, et négatif lorsque l'on n'observe aucun changement. Par combinaison des résultats négatifs et positifs on détermine l'espèce en utilisant des tables standards éditées sous forme de livres, tel le Manuel de Bergey, ou des programmes d'ordinateur spécialement conçus pour la détermination des espèces bactériennes, tel que celui mis au point par API (International S.A. Meyrin Suisse). L'invention a par conséquent pour objet de proposer un procédé pour la détection accélérée et donc pour l'identification accélérée de bactéries. Un autre objet de l'invention est de créer la possibilité de raccourcir le délai dans lequel on peut commercer un traitement effectif des malades souffrant d'une infection bactérienne. Ces objets et d'autres seront décrits plus en détail dans la description ci-après. L'invention est relative à un procédé amélioré pour identifier et/ou combattre les bactéries se trouvant dans un milieu, à partir d'un ou plusieurs échantillons contenant ces bactéries, selon lequel on combine les échantillons avec une ou plusieurs matières affectant les propriétés de développement des bactéries, on fait incuber les mélanges obtenus en observait l'effet de développement et ensuite, au moyen de cet effet de développement, on identifie les bactéries ou on choisit la substance appropriée pour combattre les bactéries, caractérisé en ce que l'on observe le développement des bactéries en déterminant le. nombre de bactéries dans les mélanges par extraction de triphosphate d'adénosine (TPA) que l'on dose ensuite de façon connue au moyen du procédé de biolumine scence. Plus particulièrement pour combattre les bactéries se trouvant dans un milieu, on conduit le procédé directement dans des échantillons de ce milieu constitué en particulier par un liquide physiologique d'un malade, par exemple l'urine. La réaction par bioluminescence pour détecter la présence de bactéries par l'intermédiaire du TPA extrait des cellules bactériennes est un procédé connu, décrit par exemple dans lesbrevetsaméricainsnos 3, 359, 973, 3, 423, 290 et 3, 690, 832 et dans de nombreuses autres publications: (Seliger, HH et W. D. Mc Elroy, 1965. Light: Physical an Biological Action. Acad. Press. New-York and London, 417 p. ; McElroy, W.D. etM. de Luca 1973 "Chemical and enzymatic mechanism of firefly luminescence", p. 285-311, dans "Chemiluminescence and Bioluminescence" (M. J. Cormier, D. M. Hercules et J. Lee, Eds) Plenum Press, New-York et London, 515 p), comme c'est le cas de ce meme procédé par bioluminescence pour la détection du nombre de bactéries dans l'urine (Hamilton, R. D. et 01 Holm-Hansen. Limn.ol. & BR Ocenog. 12:319 1967 ; Sharpe, A.N., M.N. Woodrow etA.K. Jackson. J. Appl. Bact. 33:758, 1970 ; Those, A., S. Ansehn, A. Lundin et S. Bergman, K. Clin. Microb. 1:1, 1975). Cependant il n'est connu ni de combiner le procédé de bio-luminescence avec un comptage rapide des cellules bactériennes, plus particulièrement d'appliquer un comptage rapide des cellules bactériennes par le procédé de bioluminescence, à la détermination de la sensibilité, spécialement en les effectuant directement dans des échantillons d'urine ou dans d'autres liquides physiologiques, ni d'appliquer ce procédé de bioluminescence en utilisant des milieux de culture sélectifs pour l'identification d'espèces bactériennes. Une réalisation préférée de l'invention est particulièrement appropriée à la détermination de la sensibilité de bactéries à des antibiotiques dans des cas de bactériurée (une injection bactérienne dans laquelle l'urine présente plus de 100. 000 cellules bactériennes par ml). Selon le présent procédé on peut effectuer la détermination de la sensibilité directement dans l'échantillon d'urine, sans l'isolation préalable de cultures pures. I1 est de cette façon possible de déterminer le nombre de bactéries et partant une éventuelle infection bactérienne, ainsi que la sensibilité de la bactérie aux antibiotiques , en 3 à 5 jours, tandis que selon les procédés antérieurs ces tests nécessitent de 24 à 72 heures. Il est rare qu'une infection soit causée par plus d'une espèce de bactéries. Mais même dans ce cas, le procédé de l'invention procure une information correcte en ce qui concerne la sensibilité de cette espèce, étant donné que l'essai est effectué dans le liquide physiologique et non dans un milieu de culture artificiel. Dans les tests conventionnels une rivalité entre les espèces dans un milieu de culture peut donner des résultats erronés et c'est la raison pour laquelle on doit utiliser dans ces tests des cultures pures isolées. Comme il a été indiqué ci-dessus, un des avantages de la présente invention est que les essais pour la détermination de la sensibilité peuvent etreeffectués dans le liquide physiologique meme, c'est-à-dire dans le milieu physique et chimique dans lequel les bactéries vivent dans le malade. Ces conditions se rapprochent davantage de celles dans lesquelles les bactéries infectieuses doivent etre combattues par des substances antimicrobiennes. Il est toutefois également possible d'inoculer des milieux bactériologiques liquides dans lesquels sont incorporés des antibiotiques, avec une faible quantité de l'échantillon et de déterminer ultérieurement la sensibilité de la bactérie à partir de l'aptitude de l'organisme soumis à l'essai de se développer dans le milieu qui contient certaines substances antibiotiques. La procédure pour la détermination de la sensibilité est conduite de la façon suivante On fait d'abord une analyse dans une urine ou un autre échantillon liquide pour rechercher une éventuelle infection par bactéries pathogènes à l'aide par exemple du procédé par bioluminescence. Dans des échantillons dans lesquels on trouve un nombre excessif de bactéries, c'est-à-dire un nom bre plus élevé que celui que pourrait provoquer une contamination de l'échan tillon, on détermine la sensibilité des bactéries à des antibiotiques normalement utilisés. On introduit de faibles portions, de 1 ml par exemple, d'un échantillon d'urine dans des tubes d'essai, des fioles ou récipients similaires.Dans ces portions on introduit des disques de diffusion en papier antibiotique conventionnels, ou bien un faible volume, par exemple 0, 1 ml, d'une solution antibio tique ayant le même pouvoir que les disques de diffusion. On fait incuber ces portions pendant 2 à 5 h (un intervalle corres pondant approximativement à trois générations bactériennes), à une tempéra ture de 37"C. Si l'on essaie 12 antibiotiques différents, on fait 13 portions de l'échantillon. Le treizième ne reçoit pas d'antibiotique mais seulement un dis que en papier ou de l'eau distillée, en fonction de la façon que l'on a choisie pour introduire les antibiotiques. Cette portion sert de témoin (fig. 1). Après la période d'incubation, on détermine le nombre de bactéries (ou la concentra tion de TPA) dans chaque portion au moyen du procédé par bioluminescence. Cela est fait par extraction du TPA d'une façon appropriée, par exemple avec un réactif libérant un nu cléotide pour bactéries en chauffant la portion rapide ment jusqu'au point d'ébullition de l'eau et en le faisant bouillir pendant 2 mn dans un tampon de tris-EDTA, ou bien selon un autre procédé d'extraction uti lisé pour le TPA. Après l'extraction on dose le TPA dans les portions par voie pho tométrique après avoir ajouté les réactifs luciférine-luciférase appropriés. Etant donné que l'urine et d'autres liquides physiologiques contien nent toujours des cellules d'épithélium, de sang et d'autres natures non micro- b iennes, on doit soumettre les échantillons à un traitement préalable pour éli miner le TPA qui n'est pas d'origine bactérienne avant d'entreprendre l'extrac tion du TPA bactérien. On effectue ce traitement préalable par introduction du réactif détergent TPA-ase dans les échantillons, suivie d'une incubation pendant 10 mn. L'ébullition des échantillons inactive la TPA-ase avant qu'elle puisse détruire le TPA bactérien. Les résultats de ces essais sont consignés dans le Tableau I ciaprès et à la figure 1 et sont exprimés par l'effect d'antibiotiques sur des populations de bactéries E. Coli (10 cellules/ml d'urine après incubation à 37"C, les résultats de la mesure par bioluminescence étant comparés à ceux de la méthode Kirby-Bauer). Dans la figure, le temps d'incubation est porté sur l'abscisse, exprimé en heures, tandis que les unités relatives de lumière sont portées sur l'ordonnée, montrant ainsi dans les échantillons la diminution des cellules donnant du TPA. La courbe I de la figure représente les résultats de l'échantillon témoin, la courbe II ceux avec la réfobacine, la courbe III ceux avec la furadantine et la courbe IV ceux avec la colistine. TABLEAU I Antibiotique zone d'inhibition sensibilité minimale Essai de bio mm mm lumine scence Colistine 4, 5 2 + Réfobacine 7 7 + Gramaxine 9 7 + Urospasmone 5 7, 5 + E u radantine 4 + Toutes les substances antibiotiques se montrent efficaces. La colistine révèle l'activité antibiotique la plus élevée à l'en- contre de cette population d'E. Coli et la furadantine est la substance la moins active. La méthode de Kirby-Bauer et le procédé par bioluminescence donnent des resultats similaires, mais le procédé par bioluminescence montre une plus grande activité pour l'utospasmone et la furadantine dans l'urine que la méthode conventionelle de Kirby-Bauer sur les milieux de culture. Les résultats de la détermination de la sensibilité selon l'invention sont interprétés de la façon suivante : Lorsque le nombre de bactéries dans une portion est égal ou même plus élevé que celui du témoin l'antibiotique n'est pas efficace, et l'organisme soumis à l'épreuve résiste à l'antibiotique. Lorsque le nombre de bactéries (la concentration du TPA) dans une portion se trouve abaissé jusqutà un taux compris entre 90 et 50 7o de celui du témoin, l'organisme soumis à l'épreuve est estimé modérément sensible à l'antibiotique en question. Lorsque le nombre de bactéries se trouve réduit à une valeur inférieure à 50 % de celui du témoin, l'espèce est estimée être très sensible à l'antibiotique en question. Les antibiotiques efficaces peuvent réduire une population bactérienne en 2 ou 3 heures. Selon une autre réalisation de l'invention, on effectue l'identification de groupes et d'espèces de bactéries par la détermination tant du développement des organismes soumis à l'épreuve sur des milieux de culture sélectifs que du compartiment chimiotactique des microbes au moyen du procédé rapide par bioluminescence. On effectue en général la culture sélective dans des milieux spécifiques qui favorisent le développement de certaines espèces et inhibent ou empechent le développement d'autres espèces. Selon le présent procédé, des milieux sélectifs tels que milieux-SS pour la mise en évidence des espèces Salmonella et Shigella sont inoculés avec l'échantillon, par exemple un produit alimentaire, et incubés à 37 "C pendant une période de 2 à 5 heures. Après l'incubation, on soumet le milieu au procédé de la bioluminescence pour déterminer le nombre de cellules bactériennes. Dans le cas où ce nombre a considérablement augmenté, c'est-à-dire s'il est supérieur au double du nombre initial, on suspecte l'échantillon de contenir l'espèce Salmonella ou Shigella. Ce test, comme c'est le cas de la méthode conventionnelle, n'est pas absolument définitif, mais donne des indications sur les possibilités. On peut utiliser selon ce procédé des températures d'incubation sélectives, par exemple celle de 44"C pour les bactéries Coliform tihermophiles dans leur milieu spécifique. Selon le procédé de l'invention, on remplace l'observation conventionnelle subjèctive à l'oeil nu par la mesure par bioluminescence du TPA dans des bactéries cultivées sur un substrat spécifique. Si la bactérie se développe sur ce substrat, on peut détecter une augmentation du TPA dans la culture après une période correspondant à environ 2 ou 3 générations, c'est-à-dire 2 à 3 heures, tandis que selon les méthodes conventionnelles il fallait un délai de 18 à 72 h. Cela signifie qu'une identification positive peut etre ffectuée en une journée de travail après l'isolation des bactéries à analyser. La culture sélective, la détermination de la sensibilité et la microscopie conventionnelle après coloration, la formation de gaz ou toute autre méthode d'identification peut être combinée avec le procédé de bioluminescence pour l'identification de groupes et d'espèces de bactéries. De nombreuses bactéries sont douées de mouvement dans un milieu liquide et on sait qu'elles possèdent des capteurs chimiques (Adler, J. Sci. Amer. 234 : 40, 1976). I1 est pour cette raison possible d'attirer des bactéries spécifiques avec des produits chimiques appropriés, telle que l'Escherichia coli avec la sérine dans un capillaire à partir d'un échantillon plus grand (Adler, J. Sci. Amer. 234 : 40, 1976). I1 devient ainsi possible de concentrer des bactéries pathogènes spécifiques, telles que l'espèce Salmonella , à partir d'un échantillon d'un produit alimentaire dans un volume réduit où elles peuvent etre détectées facilement à l'aide du procédé rapide et sensible par bioluminescence. La sensibilité de ce dernier procédé permet la détection de quantités aussi faibles que de 1 à 10 bactéries par échantillon, dans des conditions optimales, et on peut donc de cette façon détecter la présence de bactéries pathogènes dans des produits alimentaires si on le combine avec un procédé de microisolement efficace, tel que par chimiotaxie. On a effectué une expérience pour montrer la détection du déve loppement de micro-organismes par mesure du TPA en un intervalle d'incubation de 6 h dans des milieux sélectifs et on a comparé les résultats de cette expérience avec ceux obtenus selon des méthodes conventionnelles. Pour ce faire on inocule à 37"C un lactose-bouillon et un lactose-agar-agar respectivement avec deux suspensions de E. coli, (1) et (2). La suspension (1) est une culture vieillie par stockage contenant (5, lO) cellules, tandis que la suspension (2) provient d'une culture fraîche, contenant 10 cellules. On évalue le développement - visuellement par observation de la formation de colonies sur le lactose agar-agar - visuellement par observation du changement de couleur du milieu lactose bouillon, dû à la formation d'acide - par mesure du TPA dans le lactose-bouillon. Les résultats sont consignés au Tableau II. TABLEAU Il Temps Valeurs de TPA Observation du développement d'incubation (unités lumineuses relative s) relatives) Lactose-bouillon Lactose agar témoin suspension de suspension de suspension de suspension de suspension de cellules cellules cellules (1) (2) (1) (2) (+) (+) (++) (++) o 0, 13 0, 11 0,11 - - - 2h 0, 13 0, 44 0, 97 3 h 30 0, 04 0, 54 1,38 - - - 5h 0, 06 1, 16 2,28 - - - 7 h 30 0,11 1,50 2,20 ± - - - 24 h + + + + Note : (+)- : pas de changement de couleur (++)-: pas de colonie Après soustraction des valeurs du témoin, les valeurs de TPA mesurées enregistrent en 2 h et 3 h 30 des augmentations significatives, qui montrent bien que l'invention peut déjà après. des intervalles aussi courts donner des résultats là où la méthode conventionnelle demande au moins 24 h avant que l'on puisse constater le développement du micro-organisme. REVENDICATIONS 1. Procédé pour identifier et/ou combattre des bactéries présentes dans un milieu, à partir d'un ou plusieurs échantillons contenant ces bactéries, selon lequel on met un tel échantillon en contact avec au moins une substance affectant les propriétés de developpement des bactéries, on effectue l'incubation des mélanges résultants, on observe le taux de développement des bactérie et, en fonction de ce taux, on identifie la bactérie ou on choisit la substance qui convient à la combattre, caractérisé en ce que l'on observe le taux de développement par détermination du nombre de bactéries dans les mélanges en effectuant une extraction de TPA et en déterminant la quantité de ce dernier de façon connue à l'aide du procédé de bioluminescence. 2. Procédé selon la revendication 1 pour combattre les bactéries dans un milieu, caractérisé en ce que l'on effectue le procédé directement dans des échantillons du milieu contenant ces bactéries. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on effectue le procédé directement dans un liquide physiologique.