Brevet FR2355505A1 — publié le 19780120

L'invention est relative à un nouvel agent soluble dans l'eau, efficace comme adjuvant immunologique pour stimuler, chez un hôte, les réponses immunitaires. L1invention est aussi relative au procédé de préparation de cet agent ainsi qu'aux compositions médicamenteuses qui le renferment. L'agent adjuvant selon l'invention est le 2-(2-acétamido-2- déoxy-3-D-D-glucopyranosyl)-acétyl-L-alanyl-D-isoglutemine répondant à la formule On le ddsignera ci-après par l'abréviation nor-Mur-NAc-L-Ala-D- iso-Gln. Pour préparer le composé (I), on procède selon l'invention, dans un premier temps, à la synthèse du fragment correspondant à la channe peptidique L-Âla-D-iso-Gln, et à celle du fragment désigné par l'abréviation nor-Mur-NAc, les groupes fonctionnels ne devant pas réagir étant protégés au préalable, puis, dans.un deuxième temps, on effectue le couplage de ces deux fragments. Le couplage effectue', les groupes fonctionnels sont libérés. I1 est également possible d'effectuer la synthbse du composé (I) en réalisant le couplage séparé d'un dérivé du nor-Mur-NAo avec un dérivé de la 1-alanine, puis de coupler le produit résultant avec la D-glutamine, suivant les procédés traditionnellement utilisés pour les synthèses peptidiques. Pour former le nor-Mur-NAo, c'est-à-dire, suivant la nomenclature officielle. le 2-acétamido-3-O-carboxvméthyl-2-déoxy-D glucopyranoside de formule on fait réagir, selon-l'invention, l'acide chloracétique sur le 2 acétamido-2-déoxy-D-glucopyranoside dont les hydroxyles sont blo qués, à l'exception de celui en position 3, et on libère ensuite les hydroxyles bloqués. L'invention vise aussi, à titre de produit intermédiaire de synthèse nouveau le produit (il), et ce même produit lorsque les groupes hydroxyles sont protégés par des groupes de blocage et que seul le carboxyle reste libre de réagir, notamment pour former une liaison amide0 Contrairement à l'acide muramique, le composé (il) ne présente pas de carbone asymétrique sur la channe latérale fixée en position 3. L'obtention du produit pur ne se heurte donc pas à des problèmes de stéréo-isomerie au niveau de cette channe latérale. La synthèse en est donc simplifiée d'autant. Par suite, il en est de même de la synthèse de l'adjuvant (I) complet. L'invention concerne aussi des compositions médicamenteuses contenant ledit agent et servant notamment à renforcer l'action des immunogènes faibles. Plus particulièrement, l'invention concerne des compositions contenant ledit agent et utilisables pour l'immunisation de l'homme et des animaux à sang chaud contre des infections bactériennes, virales et parasitaires, et contre différents antigènes tissulaires d'origine normale ou pathologique. Le produit selon l'invention peut être administré de différentes façons, mais, de préférence, il est injecté ou administré par scarification locale ou par voie orale A cet effet, on utilise des compositions médicamenteuses constituées par des émulsions ou des solutions aqueuses de doses efficaces du produit selon l'invention dans un milieu pharmaceutiquement acceptable. On utilise avantageusement des milieux contenant une phase huileuse, et notamment des émulsions eau dans l'huile. Pour réaliser ces émulsions, on peut utiliser des huiles de paraffine ou des huiles analogues, mais, de préférence, on choisit des huiles végétales métabolisables celles que celles décrites dans la demande de brevet français n 75 04003, ou toute autre composition à base d-'huile végétale permettant l'ob- tention de résultats équivalents. Pour permettre la préparation extemporanée des solutions ou émulsions, l'agent adjuvant peut être encore sous forme lyophilisée. L'invention vise aussi les compositions médicamenteuses dans lesquelles le norS ur-NAc-I-Ala-D-iso-Gln est associé à un agent immunogène, notamment à un antigène vaccinant faible. Outre son utilisation comme adjuvant dans les compositions de vaccins, le composé (I) est utile comme réactif de laboratoire. Il est par exemple applicable à l'amplification des réponses immuno gazes d'antigènes. dont l'immunogénicité est étudiée plus particulièrement lorsque celle-ci est faible, ou en tant qu'antagoniste de l'action immunosuppressive éventuelle de produits supposés posséder une telle action, dans les tests biologiques couramment utilisés. D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront au cours de la description d'un exemple de préparation du produit selon l'invention, ainsi que des essais mettant en évidence les propriétés pharmacologiques de ce produit. Exemple de synthèse de 2- ( 2-acétamido-2-déoxy-3-0-D-glucopyranosyl) -acétyl- L-alanyl-D-isoglutamine On prépare ce composé en deux temps. Dans un premier temps, on carboxyméthyle le 2-acétamido-2-déoxy-glucopyranoside en position 3 du cycle, et, dans un deuxième temps, on fixe la channe peptidique. Pendant ces opérations, les fonctions qui ne doivent pas réagir sont protégées par des groupes de blocage qui sont ensuite éliminés. a) Benzyl-2-acétamido-4,6-O-benzylidène-3-O-carboxyméthyl-2-déoxy ss-D-glucopyranoside (I) 1 g (2,5 m moles) de benzyl-2-acétamido-4,6-O-benzylidène-2 déoxy- -D-glueopyranoside (P.H. Gross et R.W. Jeanloz, J. Org. Chem. 1967, 52, 2761) est dissous dans 112,5 ml de dioxane anhydre et déperoxydé à 90 C. Après addition de 350 mg (7,37 m moles) d'une suspension à 50 % d'hydrure de sodium dans l'huile, le mélange est agité pendant 2 heures à 900C, et 4,4 m moles d'acide chloroacétique sont ensuite ajoutés. Après i heure à 85 C, une seconde addition de 700 mg de la suspension d'hydrure de sodium est faite. Le mélange est ensuite laissé une nuit à très exactement 650C, sous agitation. Après refroidissement dans un bain de glace, l'excès d'hydrure de sodium est détruit par addition de 25 ml d'eau. Deux phases se forment. La phase supérieure est séparée, filtrée, puis concentrée. Le résidu obtenu est dissous dans l'eau. La solution aqueuse est extraite plusieurs fois avec du chloroforme, puis, à 0 C, elle est acidifiée avec de l'acide chlorhydrique 2,5 M jusqu'à pH 3. Le précipité obtenu est immédiatement essoré et lavé à l'eau, puis séché. Il est recristallisé dans du méthanol entre chaud et froid. On ob -tient 1,2 g (67,2 % de rendement) du produit (I) dont le point de fusion est P.F. 237,5-238 C et le pouvoir rotatoire [&alpha;] D25 = - 800 (c = 0,4 dans la pyridine). L'analyse élémentaire du produit est : C24H2708N (457,48) a H N % calculé : 63,01 5,95 3,06 % trouvé : 63,36 5,80 2,96 b) 2(benzyl-2-acétamido-4,6-O-benzylidène-2-déoxy-3-O-ss-D-g ranosyl)-acétyl-L-alanyl-D-isoglutamine benzyl ester (II) 407,46 mg (1 m mole) d'ester benzylique de la L-t.butyloxycar- bonyl-alanyl-D-isoglutemine (BOC-L-Ala-D-Gln(OBzl)-NH2), préparé suivant la méthode décrite par P. Lefrancier et E.Bricas dans Bull. Soc. Chim. Biol. 1967, 49, 1257, sont traités par 3 ml d'une solution normale d'acide chlorhydrique dans l'acide acétique glacial. Après 30 minutes, le mélange réactionnel est concentré à sec et desséché. L'huile obtenue est reprise dans 25 ml d'un mélange acétonitrile-diméthylformamide (2/1 volume à volume). Le mélange refroidit à 0 C et l'on ajoute 0,141 ml (1 m mole) de triéthylamine. La solution ainsi obtenue est versée, sous agitation, dans une sus- pension à OOC, préparée depuis 1,5'heure, de 475,5 mg (1 m mole) de (I), de 0,141 ml (1 m mole) de triéthylamine,-et de 253,28 mg (1 m mole) de réactif de Woodward (N-éthyl-5-phényl-isoxazolium-3'sul- fonate) dans 25 ml du mélange acétonitrile-diméthylformamide précédent. Après une nuit à température ordinaire, le mélange réactionnel est concentré au minimum et le produit est précipité-par une solution d'acide citrique à 10 %. Il est filtré, lavé abondamment à l'eau et desséché.On obtient 665 mg de produit, soit un rendement de 89. 302 mg de ce produit ont été purifiés sur colonne de silice, par élution avec le mélange chloroforme-méthanol (6/1 volume à volume), puis cristallisés dans le mélange méthanolacétone-éther. On récupère ainsi 225 mg du produit -(Il) dont le point de fusion est P.F. 240-2430C et le pouvoir rotatoire toci 25 = - 560 (c = 0,55 acide acétique).L'analyse élémentaire de ce produit est la suivant: C39H46O11N4 (746,83) C H N % calculé : 62,72 6,21 - 7,5 % trouvé : 62,75 6,24 7,48 c) 2(benzyl-2-acétamido-2-déoxy-3-O-D-glucopyranosyl)-acétyl I-alanyl-D-isoglutamine benzyl ester (III) 360 mg de (II) sont traités par 30 ml d'une solution d'acide acétique à 60 46, au bain-marie bouillant, pendant 1 heure. Le mélange réactionnel est ensuite concentré à sec et desséché. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de -silice -par élution avec le mélange chloroforme-méthanol (5/1 volume à volume). On récupère 135 mg, soit un rendement de 42,5 %, du produit (III) dont le point de fusion est P.F. 230-2310C. d) 2(2-acétamido-2-déoxy-3-O-D-glucopyranosyl)-acétyl-L-alanyl-D isoglutamine (IV) 130 mg (0,19 m mole) de (III) sont hydrogénés, pendant 3 heures, en présence de Pd sur charbon (5 %), dans l'acide acétique glacial. Après filtration, le mélange réactionnel est concentré à sec. Le produit est précipité dans le mélange-méthanol-éther. On obtient ainsi 94,4 mg du produit (IV) présentant un point de fusion P.F. 160-i650C et dont l'analyse élémentaire est la suivante C18H30O11N4 (478,47) C H N %calculé : 45,18 6,32 11,71 % trouvé 45,0 6,5 11,8 Le procédé ainsi décrit ne constitue qu'un des modes d'obtention possibles. De nombreuses variantes peuvent être apportées à ce mode de synthèse.En particulier, pour améliorer le rendement et rendre les opérations plus faciles, il est intéressant 1 ) de partir de benzyl-2-acétamido-4,6-0-benzylidène-3-0-carboxy méthyl-2-déoxy-&alpha;-D-glucopyranoside ; 20) d'effectuer le couplage décrit en b) par la méthode tradition nélle des anhydrides mixtes au lieu de celle du réactif de Woodward ; 30) d'hydrogéner directement le produit (II) pendant une durée prolongée, ce qui permet d' éviter la chromatographie préparative sur silice conduisant au produit intermédiaire (III) dont l'isolement n'est pas nécessaire. PROPRIETES PHARMACOLOGIQUES Caractère adjuvant en présence d'une phase huileuse Dans ces essais, on suit l'accroissement du taux d'anticorps spécifique d'un antigène donné lorsque ce dernier est injecté, avec ou sans le composé adjuvant selon l'invention, au sein d'une émulsion eau dans l'huile. Les essais sont effectués sur des cobayes Hartley femelles de 350 g. L'administration est faite par injection intradermique dans chacune des pattes postérieures. L'ovalbumine (constituant l'antigène) à raison de 2,5 mg est préparée dans 0,1 ml de solution isotonique saline, elle-m8me en émulsion dans 0,1 ml d'une phase huileuse constituée soit par l'adjuvant incomplet de Freund (FIA), soit par l'adjuvant complet (FCA). Le composé selon l'invention est administré à raison de 0,025 mg.additionné dans l'émulsion contenant le FIA. Trois semaines après l'injection, on pratique un prélèvement sanguin par ponction cardiaque. Sur le sérum recueilli, on mesure la teneur en anticorps spécifiques de ltovalbumine par précipitation du complexe anticorps-antigène dans la zone d'équivalence suivant la-méthode de Folin. Les valeurs moyennes des teneurs en anticorps sont indiquées dans le tableau de résultats. Quatre semaines après l'injection, on effectue des essais pour mettre en évidence des réactions cutanées d'hypersensibilité retardée. A cet effet, on injecte de façon intradermique 0,05 mg d'ovalbumine sur le flanc des animaux, et l'on observe, 48 heures après, la réaction au point d'injection. On mesure le diamètre en mm de l'érythène (E), de l'induration (I) ou de la nécrose (N) ainsi provoqués. Les résultats de ces essais sont reportés dans le tableau suivant. Composition de l'émulsion Anticorps sériques Test outané contenant l'antigène ( g/ml) diamètre en mm FIA 1,503 # 468 5 E à 4 I FCA (50 g) 3,705 # 981 15 I, 2 N à 5 N FiA + nor-Mur-NAc-L Ala-D-iso-Gln (25 g) 4,336 # 1849 10 à 12 I, 5 N Ces résultats montrent que le nor-Nur-NAc-L-Ala-D-iso-Gln, administré dans une émulsion huileuse, favorise nettement l'accroissement du taux d'anticorps, et qu'il induit une réaction dthyper sensibilité du type retardé vis-à-vJs du même antigène. Toxicité On a étudié la toxicité du produit selon llinvention par in jection intraveineuse à des, souris âgées de 2 mois. En accroissant progressivement les doses administrées, on a montré que la dose léthale (DL50), , c eest-à-dire la dose pour laquelle la mortalité des animaux, à la suite de l'injection, est de 50 %, est d'un ordre de grandeur très supérieur à celui des doses auxquelles le produit manifeste ses propriétés adjuvantes. On obtient donc des compositions adjuvantes dépourvues de tolicité et qui peuvent être utilisées pour accroître l'efficacité de vaccins d'origine bactérienne ou virale, notamment quand ceuxci sont faiblement immunogènes. Elles peuvent être utilisées notamment pour favoriser l'immunisation de l'hôte (patients humains ou animaux) à l'égard des in fections d'origine bactérienne ou virale, des antigènes des tumeurs, etc. Elles sont également efficaces pour la fabrication de sérums contenant des anticorps actifs à l'égard de ces antigènes. REVENDICATIONS 1 - 2-t2-acétamido-2-déo:ry-3-o-D-glucopyranosyl)-acéty alanyl-D-isoglutamine, composé répondant à la formule 2 2 - Procédé de préparation du composé (I), caractérisé en ce que l'on carboxyméthyle le 2-acétamido-2-déoxy-glucopyranoside en position 3 du cycle, les autres hydroxyles étant bloqués pour obtenir le produit (II), puis que l'on effectue le couplage de ce dernier par l'intermédiaire du groupe carboxyle avec la chaine peptidique L-Ala-D-iso-Gln préparée au préalable, et dont les groupes réactifs, à l'exception de l'amine portée par l'alanine, sont également bloqués, et que l'on élimine les groupes de blocage. 3 - Procédé de préparation du composé (I), caractérisé en ce que l'on couple le dérivé carboxyméthylé en position 3 du cycle du 2-acétamido-2-déoxy-3-O-D-glucopyranoside, dont les hydroxyles sont bloqués, avec la L-alanine, puis que l'on couple le composé formé avec la D-glutamine. 4 - 2-acétamido-3-0-carboxyméthyl-2-déoxy-D-glucopyranoside pouvant servir à la préparation du composé (I), de formule 5 - Le composé (II) dont les groupes hydroxyle sont bloqués, seul le groupement carboxylique étant libre et pouvant entrer en réaction, notamment pour former des liaisons peptidiques du type de celles conduisant à la formation du composé (I). 6 - Composition médicamenteuse contenant le produit- (i). 7 - Composition médicamenteuse selon la revendication 5, constituée par une solution aqueuse ou une émulsion injectable contenant une dose efficace du produit (I). 8 - Composition selon la revendication 7, constituée par une émulsion eau dans l'huile contenant une dose efficace du produit (I). 9 - Composition selon larevendication 7, caractérisée en ce que la phase huileuse est constituée par une huile métabolisable. 10 - Composition selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisée en ce que le produit (i) y est associé-à un agent immunogène. il - Composition de vaccin à usage humain, caractérisée en ce qu'elle contient, outre l'agent immunogène, une dose efficace du produit (I). 12 - Composition de vaccin à usage vétérinaire, caractérisée en ce qu'elle contient, outre l'age-nt immunogene, une dose efficace du produit (I).