Brevet FR2327796A1 — publié le 19770513

la présente invention concerne un procédé de préparation de l'antibiotique antifongique - la mycoheptine. L'antibiotique mycoheptine est actif contre les germes causaux des mycoses profondes et systémiques et contre les champignons levuriformes, et trouve des applications dans la traitement de la coccidioidose, la histoplasmose, la cryptococcose, la chromomycose, la blastomycose, ltaspergillose, la sporotrichose, la candidose On connaît déjà un procédé de préparation de l'antibiotique mycoheptine, dans lequel on utilise en tant que producteur la souche de Streptoverticillium mycoheptinicum 443 a culture du producteur Streptoverticillium mycoheptinicum 443/I est réalisée sur un milieu nutritif contenant des sources d'azote, de carbone et des sels mineaui2 avec séparation ultérieure du mycélium à partir de la liqueur culturale et 1' isolement du produit visé la souche de Streptoverticillium mycoheptinicum 44B/I forme des sporophores droits et faiblement spiralés rassemblés en verticilles monofiles et bifiles. les spores ont un aspect de bâtonnets avec une enveloppe lisse le caractère de la croissance des colonies de la souche indiquée sur des milieux à l'agar est représenté sur le tableau ci-dessous Caractère de .Pigmentation Milieu la croissance : des colonies du mycé- lium lium de du milieu aérien substrat Czapek à Colonies fai- Blanch- Brune- Absente l'amidon blement convexes âtre, grisâtre de 5 à 10 mm de celle du diamètre, le cen mycélium tre des colonies âgé est étant plissé. grise Mycélium aérien rosâtre velouté Amidon- Colonies fai- 3lanch- Olive Papale ammonacé blement convexes-âtre foncée brunâtre ou lisses ou planes, de 6 à 10 mm de diamètre. Myc é lium aérien bien développé Glycérine- Colonies de 6 à Blanch- Jaune- Jaune asparagine 11 mm de diamè- âtre doré tre, centre ridé bord faiblement plissé. Mycélium aérien faiblement développé Agar à Colonies planes, Incarnate Isabelle Absente l'avoine lisses.Mycélium foncée aérien bien développé propriétés physiologiques de cette souche ; elle pepterise le lait, hydrolyse l'amidon liquéfie la gélatine ne se développe pas sur la cellulose, n'invertit pas le saccharoses réduit des nitrates, ne forme pas H2S. Sur le milieu de Pridham-Gottlieb avec source i 1 % de carbone elle pousse bien en présence de glucose, de fructose, dtinositol, ne croît pas en présence d'arabinose, de saccharose, de rhamnose, de mannitol, de raffinose, de xylose. La souche Streptoverticillium mycoheptinicum 44B/I se développe bien et produit la mycoheptine dans des conditions de croissance submergée sur un milieu de fermentation de composition suivante (% en poids). Glucose - 2 farine de soja - - 2 extrait de mais en poids sec - 0,25 graisse de cachalot - 0,5 CaC03 - 0,2 pH avant stérilisation - 8,0 du milieu pH après stérilisation - 7,0-7,2 du milieu, La stérilisation est réalisée à ll5ll60C pendant 30 minutes. La durée dtincubation sur une secoueuse à 230 tours/ minute est de 120 heures à la température de 28)C, L'activité de la liqueur culturale après 120 heures de fermentation est de 300 à 400 ssg/ml. Une fois le processus de fermentation terminé, on sépare le mycélium et on isole le produit visé à partir de ce dernier. Un inconvénient du procédé connu est la faible activité de la souche utilisée. La présente invention a pour but de supprimer l'inconvénient indiqué. Conformément à cet objectif, l'invention vise, par modification du producteur, à élever le rendement du procédé en antibiotique mycoheptine. Ce problème est résolu en ce que dans le procédé de préparation de l'antibiotique mycoheptine par culture du producteur Streptoverticillium mycoheptinicum sur un milieu nutritif contenant des sources d'azote, de carbone et des sels minéraux, avec séparation ultérieure du mycélium de la liqueur culturale et isolement du produit visé à partir du mycélium, suivant l'invention,/u0ilîse en tant que producteur la souche de Streptoverticillium mycoheptinicum US5R-Li A 1514, sélectionnée à partir de la souche 44B/I par ensemencement de ses spores sur un milieu de Czapeck à base d'agar-amidon contenant du sel de sodium de mycoheptine, et présentant les particularités morphologiques et des propriétés physiologiques suivantes : elle forme des sporophores droits et faiblement spiralés rassemblés en verticilles monofiles ou bifiles ; les spores ont un aspect de bâtonnets de 0,8 à 1,0 x 1,2 à 1,5 ; l'enveloppe des spores est lisse ; elle forme sur le milieu de Czapeck à l'amidon de grosses colonies de 7 à 10 mm de diametre, convexes avec un pli au centre, mycélium aérien velouté, bien développé, blanchâtre avec une teinte rosée, à bord incarnat sombre ; mycélium de substrat brun-grisâtre ; milieu jaune- grisâtre brun 3 sur un milieu à l'amidon-smmoniac, forme des colonies faiblement convexes, presque lisses, de 6 à 11 mm de diamètre, le mycélium aérien formé est bien développé d'une coloration chair-rose à incarnate foncée, mycélium de substrat brun-marron, milieu brun-grisâtre ; sur un milieu à base de glycérine-asparagine elle forme des colonies planes de 8 à 10 mm de diamètre avec des plis rayonnés du bord au centre de la colonie et avec une cavité au centre ; le mycélium aérien formé est développé seulement le long du bord de la colonie et pigmenté en gris cendré, le mycélium de substrat est brun-grisâtre- rougeâtre, le milieu est brun-grisâtre-rougeâtre âtre ; sur un milieu à base d'agar-avoine, forme des colonies planes de 10 à 20 mm de diamètre ; le mycélium aérien formé est lilas-rosé, et celui de substrat ; tabac - brun ; le milieu est brun grisâtre ; sur un milieu organique, donne des colonies d'une forme irrégulière avec des plis rayonnes du bord au centre de la colonie et avec une craquelure au centre, de 10 mm d-12 mm de diamètre, le mycélium aérien est blanchâtre , et celui du substrat, brun-grisâtre-rougeatre, le milieu est brun-grisâtre la souche peptonise le lait, hydrolyse l'amidon, liquéfie la gélatine, croît sur la cellulose, n'invertit pas le saccharose, réduit les nitrates, ne forme pas H2S ; sur le milieu de Pridham-Gottlieb, croit en présence de glucose, de fructose, d'inositol, d'arabinose, de mannitol, de raffinose, de xylose ; ne croît pas en présence de saccharose, de rhamnose ; inhibe la croissance des bactéries gramyeitives, des levures, des champignons levuriformes et filaires : la productivité de la souche est de 950 à 1050 fg/ml. I1 est avantageux d'utiliser en tant que milieu nutritif un milieu de composition suivante (% en poids) farine de soja - 1,5 glucose - 5,0 farine de mais - 2,0 (NH4)2S04 - 0,4 graisse de cachalot - 1,0 CaCO3 - 0,25 extrait de mais - 0,25 (en poids sec) ; pH = 8,5 avant stérilisation le procédé objet de l'invention est mis en oeuvre de la manière suivante. On utilise comme producteur de la mycoheptine la souche de Streptoverticillium mycoheptinicum USSR - LiA 1514, déposée dans la collection des cultures de l'Institut de Recherches Scientifiques sur les Antibiotiques, à Moscou. On cultive préalablement le matériel d'ensemencement.A cette fin, la suspension de spores d'une culture agée de deux semaines de la souche indiquée, cultivée sur l'agar incliné de Ozapeck à l'amidon, est introduite dans un milieu nutritif liquide de composition suivante (% en poids) Glucose - 2,0 farine de soja CaO - o, PR avant stérilisation - 7,4 à 7,5 On charge le matériel d'ensemencement dans un fermenteur à raison de 10 %0 en volume par volume de milieu nutritif. I1 est avantageux d'utiliser un milieu nutritif de composition suivante en en poids) farine de soja - 1,5 glucose - 5,0 farine de maTs - 2,0 (NH4)2504 - 0,4 graisse de cachalot - 1,0 3 - 0,25 extrait de maTs - 0,25 (en poids sec) pH avant stérilisation - 8,5 On conduit la stérilisation du milieu à une température de 122 à 1240C pendant 30 minutes. On réalise la fermentation à une température de 27 à 290C pendant 100 à 130 heures avec aération (0,5 à 1 volume d'air par volume de milieu) et sous agitation intense. L'activité de la liqueur cultural à la fin de la fermentation est de 930 à 1050 g/ml. Une fois la fermentation terminée, on filtre la liqueur culturale, on sépare le mycélium et on conduit ensuite l'extraction de l'antibiotique à partir du mycélium à l'aide d'un solvant organique, par exemple l'isopropanol. L'extraction peut être réalisée deux fois. On réunit les extraits obtenus et on réduit leur volume par évaporation à une température ne dépassant pas 606C, sous un vide de 10 à 20 mm de Hg. On refroidit le concentrat obtenu et on ajoute de l'eau ; on sépare le précipité formé, on lave avec un solvant organique et on sèche sous vide. On purifie l'antibiotique séché. le rendement en mycoheptine par rapport à sa teneur dansle mycélium est de 20 à 25 % d'après l'activité. Le procédé proposé, grâce à l'utilisation d'une souche hautement active, dont l'activité est de 1,5 fois supérieure à celle de la souche connue, permet d'augmenter sa productivité. D'autres caractéristiques et avantages. de l'invention seront mieux comprises à la lecture de la description, qui va suivre, d'un exemple non limitatif de mise en peuvre du procédé proposé d'obtention de l'antibiotique mycoheptine. Exemple Dans un ballon de 750 ml de capacité contenant 100 ml d'un milieu d'ensemencement nutritif de composition suivante en en poids) glucose - 2,0 farine de soja - 2,0 CaCO3 - 0,1 pH avant stérilisation - 7,4-7,5 (stérilisation du milieu à une température de 115 à 1160C pendant 30 minutes) on introduit 100 ml d'une suspension de spores d'une culture de la souche Streptoverticillium mycoheptini cum USSR-Li A 1514 agée de deux semaines, cultivée sur l'aga incliné de Czapeck à l'amidon (pH 7-7,2). On transfère dans un fermenteur d'une capacité de 80 1 le matériel d'ensemencement à raison de 10 % en volume par volume de milieu nutritif. On utilise de préférence un milieu nutritif de composition suivante (% en poids) farine de soja - 1,5 glucose - 5,0 farine de maSs - 2,0 (NH4)2S04 - 0,4 graisse de cachalot - 1,0 CaCO3 - 0,25 extrait de mais - 0,25 (en poids sec) pH avant stérilisation - 8,5 Stérilisation : à une température de 122 à 1240C pendant 30 minutes. Volume du milieu 50 1. On effectue la fermentation à une température de 27 à 290C pendant 120 heures avec aération (0,5 à 1 volume d'air par volume de milieu) et sous agitation énergique. L'activité de la liqueur culturale est de 1050 > g/ml. Une fois le processus de fermentation terminé, on filtre la liqueur culturale. Pour isoler l'antibiotique, on utilise 5 kg de mycélium à activité de 10.000 > 4g/g. On conduit l'extraction de l'antibiotique à l'isopropanol aqueux à 65 %, trois fois, dans un rapport extrait-mycélium de 5:1 (volume/poids). On réunit les extraits et on réduit leur volume par évaporation jusqu'à 10 1 à une température ne dépassant pas 60 CF sous un vide de 10 à 20 mm de Hg. On refroidit le concentra t jusqu'à 5 C et on ajoute 2 volumes d'eau. On sépare le précipité formé et on le lave à l'isopropanol aqueux à 50 %, puis à l'acétone et on sèche sous vide. On dissout l'antibiotique séché dans le diméthylformamide pris à raison de 20 volumes par partie pondérale de poudre, on élimine les impuretés insolubles et on précipite l'antibiotique par 1 volume d'eau par rapport au volume de diméthylformamide. On lave la pâte obtenue à l'isopropanol à 50 %, puis à l'acétone et on sèche sous vide. On obtient 15,4 g de produit visé, à teneur en substance active de 650 > g/mg. Le rendement en mycoheptine par rapport à sa quantité dans le mycélium constitue 20 fo d'après l'activité. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée au mode de réalisation décrit et représenté qui n'a été donné qu'à titre d'exemple, en particulier elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci sont exécutés suivant son esprit et mises en oeuvre dans ladre des revendications qui suivent. RFWENHL CÂTION 1 - Procédé de préparation de l'antibiotique mycoheptine à action antifongique par culture du producteur Streptoverticillium mycoheptinicum sur un milieu nutritif contenant des sources d'azote, de carbone et des sels minéraux, avec séparation ultérieure du mycélium de la liqueur culturale et isolement du produit visé à partir de celui-ci, caractérisé en ce qu'on utilise en tant que producteur la souche de Streptoverticillium mycoheptinicum USSR - LiA - 1514 qui, étant sélectionné à partir de la souche Streptoverticillium mycoheptinicum 44B/I, par ensemencement de ses spores sur un milieu de Czapeck à base d'agar-amidon contenant du sel de sodium de mycoheptine, présente les particularités morphologiques et les propriétés physiologiques suivantes : elle forme des sporophores droites et faiblement courbés, rassemblés en verticilles monofiles ou bifiles, les spores étant en forme de bâtonnets de 0,8 - 1,0 x 1,2 - 1,5 , l'enveloppe des spores étant lisse ; sur un milieu de Czapeck à base d'amidon, elle forme de grosses colonies convexes, de 7 à 10 mm de diamètre, avec un pli au centre ; le mycélium aérien est velouté, bien développé, blanchâtre avec une teinte rosée à bord incarnat sombre ; le mycélium de substrat est brun-grisâtre, le milieu est jaune-brun-grisatre ; sur un milieu à base d'amidon-ammoniac elle forme des colonies faiblement convexes, presque lisses, de 6 à 11 mm de diamètre, le mycélium aérien formé est de couleur chair-rosé à incarnate sombre, le mycélium de substrat est brun-marron, le milieu est brun-grisatre ; sur un milieu à base de glycérine-asparagine elle forme des colonies plates, de 8 à 10 mm de diamètre, avec des plis rayonnés du bord au centre de la colonie et avec une cavité au centre, le mycélium aérien formé est développé seulement le long du bord de la colonie et pigmenté en gris cendré, le mycélium de substrat est brun grisâtre-rougeatre, le milieu est brun-grisâtre-rougeâtre ; sur un milieu à base d'agar-avoine elle forme des colonies plates, de 10 à 20 mm de diamètre, le mycélium aérien formé est lilasrosé, le myc lium de substrat est brun-tabac, le milieu est brun-grisâtre ; sur un milieu organique elle donne naissance à des colonies de forme irrégulière de 10 à 12 mm de diamètre, avec des plis rayonnés du bord au centre de la colonie et avec une craquelure au centre ; le mycélium aérien est blanchâtre, le mycélium de substrat est brun-grisâtre-rougeâtre, le milieu est brun-grisâtre ; la souche peptonise le lait, hydrolyse l'amidon, liquéfie la gélatine, croît sur la cellulose, n'invertit pas le saccharose, réduit les nitrates, nerforme pas de H2S ; sur le milieu de Pridham-Gottlieb elle croit en présence de glucose, de fructose, d'inositol, d'arabinose, de mannitol, de raffinose, de xylose ; elle ne croit pas en présence de saccharose, de rhamnose ; elle inhibe la croissance des bactéries gram-positives, des levures, des champignons levuriformes et filiaires ; l'activité de la souche est de 950 à 105024g/ml. 2 - Procédé suivant la revendication 1; caractérisé en ce qu'on utilise en tant que milieu nutritif un milieu de composition suivante (% en poids farine de soja - 1,5 glucose - 5,0 farine de mats - 2,0 (NH4)2O4 - 0,4 graisse de cachalot - 1,0 CaCO3 - 0,25 extrait de mas - 0,25 (en poids sec) pH - 8,5 3 - L'antibiotique mycoheptine caractérisé en ce qu'il est obtenu conformément au procédé suivant l'une des revendications 1 et 2.