Brevet FR2324311A1 — publié le 19770415

L'invention est relative à des agents solubles, efficaces comme adjuvants immunologiques, pour stimuler chez un hôte les réponses immunitaires à des antigènes de différentes sortes. L'invention concerne en particulier des agents adjuvants servant à renforcer et à exalter l'action des immunogènes faibles. L'invention concerne plus particulièrement des agents solubles, efficaces comme adjuvants, utilisables pour l'immunisation de l'homme et des animaux à sang chaud contre des infections bactériennes, virales et parasittires, et contre différents antigènes tissulaires, dZorigine normale ou pathologique, notamment contre les tumeurs. On a déjà décrit dans la demande de brevet.principal un procédé pour obtenir de tels agents, ce procédé consistant es sentielîlement à cultiver une souche de mycobactéries, de cellules de Nocardia ou de micro-organismes apparentés, à recueillir les cellules de la souche cultivée, à produire leur rupture, à récupérer les parois cellulaires rompues, par exemple par centrifugation différentielle, à séparer et éliminer les cires, les lipides libres, les protéines et les acides nucléiques, à produire la digestion de la matière délipidée provenant des parois cellulaires avec unie enzyme murolytique, telle que le lysozyme, à éliminer le résidu solide et à recueillir la fraction aqueuse contenant les susdits agents so lubles, On procède à une purification et, au moins dans certains cas, selon. la nature de la souche initiale traitée, à un fractionnement supplvémentaire des agents obtenus, par exemple en soumettant la susdite fraction aqueuse à une filtration sur tamis moléculaire, par exemple sur une colonne de gel de polydextrane ou d'un matériau analogue, tel que le gel connu sous la marque "SEPHADEX G 75" ou "SEPHADEX G 50". On a en outre déjà indiqué dans la deuxième demande de certificat d'addition au brevet principal, déposée le 23 octobre 1973 sous le n" 73 37206, que l'activité adjuvante des préparations obtenues par la.mise en oeuvre du procédé selon le brevet principal était due,en particulier, à la presence dans ces préparations de fragmentes solubles des peptidoglycanes intervenant dans la constitution des parois celgulaires des bactéries traitées par le susdit procédé. Comme on l'a indiqué dans cette deuxièmedemande de certificat d'addition, il a été constaté que, d'une façon géné rale, les fragments solubles de peptidoglycanes intervenant dans la constitution des parois cellulaires des procaryotes avaient une activité adjuvante, que ces procaryotes soient constituées par des mycobactéries, des Nocardiae ou analogues, ou par des bactéries appartenant à d'autres groupes, par exem ple celui des entéro-bactéries dont le E.coli est représentatif. On a fait plus particulièrement, mais non exclusivement, référence dans la deuxième demande de certificat d'addition à des fragments de peptidoglycanes constitués par des polysaccharides-polypeptides, de faible masse moléculaire, comprenant dans leur formule - en ce qui concerne la partie polysaccharide, des unités de - N-acétylglucosamine (N-AcM c), - acide N-acyl-muramique (N-acyl-Mur), dans lequel le groupe acyle est de préférence du type glycolyle ou acétyle, - en ce qui concerne la partie polypeptide, des unités de -L-alanine (L-Ala), et éventuellement D-alanine(D-Ala) (ou de sérine ou de glycine pour les peptidoglycanes de certains micro-organismes) - acide D-glutamique (D-Glu), dont le groupe carboxyle en 0( est soit libre, soit substitué, cas dans lequel il forme de préférence un groupe amide, - acide éso-yC- -diaminopimélique (méso-DAP), dont l'un des groupes -carboxyliques est soit libre, soit engagé dans une liaison peptidique et dont l'autre groupe carboxyle est soit libre, soit substitué, cas dans lequel il forme de préférence un groupe amide. L'invention a pour but de fournir des exemples supplémentaires de fragments de peptidoglycanes ayant une activité adjuvante. Elle a également pour but de décrire des fragments de peptidoglycanes ayant une masse moléculaire encore plus faible que les polysaccharides-polypeptides décrits ci-dessus. Elle a enfin pour but de fournir un procédé de synthèse pour la fabrication de ces nouveaux fragments de peptidoglycane. L'invention est en particulier relative à des polysaccha rides-polypeptides du genre sus-indiqué mais dans lesquels l'acide méso-&alpha;-#- diaminopimélique (méso-DAP) est remplacé par d'autres groupements peptidiques, par exemple des groupe ments constitués par la lysine ou des fragments polypeptidiques contenant de la lysine. Les fragments de peptidoglycanes de masse moléculaire encore plus faibles que-ceux qui ont été décrits ci-dessus sont formés d'acide N-acyl-muramique (N-acyl-Mur) auquel est liée une courte chaine peptidique contenant au moins deux amino-aides, notamment formée de deux à cinq groupes amino-acides et dans laquelle le premier amino-acide est -------------------------------- - celui qui est fixé sur l'acide N-acyl-muramique, est constitué par 1'alanine, la sérine ou la glycine, et le second amino-acide de ladite chaine est constitué par l'acide glutamique ou l'acide aspartique, les fonctions carboxyles de ce second amino-acide étant individuellement soit libres, soit amidées (dans le cas des chaînes ne comportant que deux amino-acides), soit engagées dans une liaison avec un autre acide aminé dans le cas d'une chaîne peptidique plus longue. De préférence, le premier amino-acide est la L-alanine, et le second l'acide D-glutamique. Lorsque ce dernier est amidé, il l'est de préférence sur le carboxyle 6. I1 peut se trouver sous sa forme L ou sous sa forme D. il peut aussi être remplacé par l'acide aspartique, dont la structure chimique est très voisine de celle de l'acide glutamique. La substitution éventuelle par un acide aminé supplémentaire s'effectue de préférence sur le carboxyle y de l'acide glutamique (ou de l'acide aspartique). L'acide aminé supplémentaire peut être quelconque. Des acides aminés supplémentaires préférés sont l'acide méso---diaminopimélique, la lysine, l'acide &gamma; -aminobutyrique et l'acide 6-hydroxy-diaminopimelique. Avantageusement, le groupe acyle de l'acide N-acyl-Mur est constitué par un groupe acétyle. il peut cependant aussi être différent, par exemple former un groupe glycolyle. L'invention concerne également un procédé de fabrication des fragments de peptidoglycane du genre en question, procédé qui consiste à faire réagir l'acide N-acyl-muramique, dont les fonctions -OH libres, à l'exception de celles du groupe propionyle de l'acide muramique, ont été préalablement protégées, avec le peptide correspondant dont les fonctions OH libres ont également été préalablement protégées. Dans qui suit, on décrit l'obtention de certains fragments de peptidoglycane, aussi bien par vie biochimique, que par synthèse directe. Les essais pharmacologiques dont il sera fait état ensuite visent àdémontrer a) que l'absence de la partie N-acétyl-glucosamine dans la partie osidique des fragments de peptidoglycane.considérés ne nuit pas à l'activité adjuvante de ces fragments b) que la présence d'un groupe méso-DAP- dans le groupe peptidique lié à la partie osidique de l'acide N-acyl-muramique, que celui-ci soit seul ou qu'il fasse partie d'un glycane plus long, n'est pas essentielle pour la conservation de l'activité adjuvante des fragments de peptidoglycane considérés. EXEMPLE I - Obtention des parois de Micrococcus roseus. Les cellules de M.roseus (souche nO 5693)de l'institut Pasteur de Paris)-sont cultivées sur Nutrient broth (Difco) en erlens de 2 litres contenant 800 ml de milieu placés sur une table d'agitation Biolafitte (Maisons-Lafitte) à 25 , et récoltées aux 2/3 de la phase exponentielle de croissance. Les bactéries sont cassées par agitation en présence de petites billes de verre : dans une expérience type, 30 g de bactéries poids frais, sont mises en suspension dans 150 ml d'eau distillée-; on ajoute 150 ml de petites billes de verre 0,17-0,18 mm de diamètre et l'on place le mélange dans le bol de 400 ml d'un Omni-mixer (Sorvall) refroidi; par immersion dans un bain d'eau glacée. Le mixer est mis à fonctionner à pleine vitesse pendant 30 minutes. Après décantation des billes de verre, le surnageant est conservé : on lui adjoint le surnageant provenant du lavage de ces billes par deux fois 100 ml d'eau distillée. Les surnageants réunis sont centrifugés trois fois 10 minutes à 800 g dans une centrifugeuse réfrigérée pour éliminer les débris de billes de verre et les bactéries non cassées.Le surnageant résultant est centrifugé une heure-à 27.500 g dans une centrifugeuse refroidie : le culot constitué de parois est mis en suspen sion à l'aide d'un broyeur de Potter à piston en téflon dans 150 ml de tampon phosphate 0,066 M, pH 7,8, additionné de 30 mg de trypsine et de 30 mg de chymotrypsine, puis incubé une nuit à la température du laboratoire en présence de quelques gouttes de toluène destinées à prévenir les contaminations.Après centrifugation de une heure à 27.500 g, le culot de parois déprotéinisées est lavé par remise en suspension à l'aide d'un broyeur de Potter à piston en téf ion et centrifugation de une heure à 27.500 g à +4 , trois fois avec 150 ml de tampon phosphate 0,066 M, pH 7,8 et trois fois avec 150 ml d'eau distillée. Les parois sont ensuite lyophilisées ; elles sont adjuvantes comme le montre le tableau II plus loin. On sait, par les publications faites par, respectivement (1) 3.F. PETIT, E. MUNOZ et J.M. GHUYSEN, BIOCHEMISTRY, 5, 2764-2776 (1966) , (2) E. MUNOZ, J.M. GHUYSEN, M. LEYH-BOUILLE, J.F. PETIT, H. HEYMANN, E. BRICAS et P. LEFRANCIER, Biochemistry, 5, 3748-3764 (1966) que le peptidoglycane de M. roseus est constitué d'unités répétitives N-acéthylglucosaminyl- p -1 ,4-N-acétylmuramyl-L-alanyl-D- isoglutaminyl-L-lysyl-D-alanine dont le groupement # -aminé de la lysine est substitué par un peptide (L-Ala)3-L-Thr ; les liaisons interpeptidiques se font par une liaison entre la D-Ala terminale d'un tétrapeptide et la L-Ala terminale du peptide (L-Ala)3-L-Thr substituant la lysine d'un autre tétrapeptide (1).Pour prouver que l'adjuvanticité de la paroi de M.roseus était liée à son peptidoglycane, un disaccharide pentapeptide en a été isolé par dégradation enzymatique. EXEMPLE II - Isolement d'un disaccharide pentapeptide à partir du peptidc- glycane de la paroi de M.roseus. 150 mg de parois de M.roseus sont mises en suspension dans 30 ml de tampon véronal 0,05 X, pH 8,6 et additionnées de 20 ml d'une préparation de S.a.endopeptidase de Streptomyces albus G obtenue selon la méthode de GHUYSEN (J.M. GHUYSEN, L. DIERICKX, J. COYETTE, M. LEYH-BOUILLE, M. GUINAND et J.N. CAMPBELL, Biochemistry, 8, 213-222 (1969) ), puis incubées une nuit à 37C en présence de quelques gouttes de toluène. Le mélange d'incubation est ensuite additionné d'acétate d'ammonium 0,2 M final et le pH est ajusté à 6,2 avec de l'acide acétique. On ajoute alors 3 mg de lysozyme de blanc d'oeuf de poule (Sigma) et on incube le m- lange vingt-quatre heures à 37 .On ajoute ensuite 2 % de pronase et de l'acétate de calcium 0,01 M final et on maintient la solution à 37 pendant quarante-huit heures. Après concentration à 15 ml dans un évaporateur rotatif, le lysat est filtré sur une colonne de SEPHADEX G 25 (h= 80 cm, diamètre = 2,5 cm) équilibrée avec de l'acide acétique 0,1 M.L'enregistrement de la densité optique de l'effluent à 206 nm permet de le diviser en quatre fractions ; les analyses effectuées ont montré que la deuxième fraction était constituée de glucosamine, d'acide muramique, d'alanine, d'acide glutamique, de lysine et de thréonine dans les rapports molaires (1:1:2:1:1:1). La réaction de Origan Elson ayant montré que les sucres aminés étaient présents sous forme de disaccharides, la formule du composé, étant donné son mode d'obtention,est la suivante N-acéthylglucosaminyl ss 1,4-N-acéthylmuramyl L-Ala D-Glu-#-NH2 L-Thr L-Lys D-Ala Ce disaccharide pentapeptide est adjuvant comme le montre le tableau Il. EXEMPLE III - Obtention de N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamyl-méso-DAP. Des cellules de Bacillus cereus T ont été cultivées sur Antibiotic Médium 3 (Difco) en erlens de 2 litres contenant 800 ml de'milieu et agités sur une table d'agitation Biolafitte. Aux deux tiers de la phase exponentielle de croissance, la cul- ture a été additionnée de 50 g/ml de D-cyclosérine (Roche) après une demi-heure à 37 dans les mêmes conditions d'agitation, la culture, dont la densité optique a cessé d'augmenter après l'addition de la D-cyclosêrine, a été centrifugée. Le culot de cellules a été extrait par l'acide trichloracétique à 4 % à froid : typiquement pour 15 g de cellules poids frais, 100 ml d'acide trichloracétique (TCA) ont été employés. La suspension de cellules dans le TCA a été homogénéisée dans un broyeur de Potter à piston en téflon, puis centrifugée une heure à 27.500 g à +40 ; le surnageant a été extrait par l'éther plusieurs fois de façon à éliminer l'acide trichloracétique et neutralisé par NH40H, puis concentré à 10 ml dans un évaporateur rotatif. L'UDP-N-acétylmuramyl-tripeptide, dont la D-cyclosérine provuque l'accumulation dans la cellule (selon K. IZAKI, M. MATSUHASHI et J.L.STROMINGER, J. Biol. Chem., 243, 3180-319-2 (1968) se trouve-dans cet extrait concentré qui a été filtré sur une colonne de SEPHADEX G 25 (h = 80 cm, : diamètre = 2,5 cm) équilibrée avec de l'acétate d'ammonium 0,02 M. L'earegistrement de la densité optique de l'effluent à 260 nm permet de le diviser en quatre fractions. La troisième qui contient le produit cherché a été purifié par chromatographie sur papier WHATMAN 3 MM pendant trois jours dans le solvant éthanolacétate d'ammonium M, pH 7,5 (5:2) ; la bande principale absorbante dans l'ultraviolet a été éluée, puis hydrolysée dans HCl 0,02 N à 100 pendant vingt minutes pour hydrolyser la liaison entre le nucléotide et le muramyl-tripeptide recherché.Après lyophilisation, lthydrolysat a été soumis à une électrophorèse de deux heures à pH 4, à 40 v/cm sur papier WHATMAN 3 MM, sous varsol (White spirit) dans un appareil GILSON (GILSON MEDICAL ELECTRONICS, VILLIERS-LE-BEL). Après révélation à la ninhydrine-collidine, la bande principale a été éluée, lyophilisée et analysée : elle cor- respond bien au produit cherché. 1 mg a été obtenu à partir de 8 litres de culture de B.cereus empoisonné par la D-cyclosérlne ce produit est adjuvant comme le montre le tableau II-. EXEMPLE IV On décrit dans ce qui suit la synthèse chimique de substances adjuvantes selon l'invention, plus particulièrement des molécules d'acide N-acetyl-muramique sur lesquelles sont respectivement fixées des chaines di-, tri- et tétra-peptidiques. On décrira cependant d'abord la synthèse des di-, tri- et tetra-peptides du genre en question, avant leurs couplages respectifs sur l'acide N-acetyl-muramique. A : Synthèse des chaInes peptidiques On décrit ci-après les synthèses - du chlorhydrate de l'ester benzylique de la L-alanyl-D-isogluta- mine : -L-Ala-D-Glu-t -NH2, HCl. aîanyï--isogîu - du chlorhydrate de l'ester benzylique de taminyl]. (L), Z-(D)meso-diaminopimelyl-(L).[D-alanine], (D)-amide : [L-Ala-D-Glu-&alpha;-NH2] - (L)-, Z-(D)-m-DAP-(L) (O-Ala-OBzl), (D)-NH2, HC1. - du chlorhydrate de l'ester benzylique de la [L-alanyl-D-isoglu- tominyl]-(L), Z-(D)-meso-diaminopimelyl-(O) amide : -[L-ala-D-glu-&alpha;-NH2]- (L), Z-(O)-m-DAP-(L) - [OBzl], (D)-NH2, HCl Les abréviations utilisées : - Z pour benzyloxycarbonyl - BOC pour t-butyloxycarbonyl - m DAP pour acice meso-&alpha;&alpha;,-diaminopimélique - OSu pour ester succinimidique. Les points de fusion ont été déterminés en tubes capillaires avec l'appareil du Dr. TOTTOLI (Ets BUCHI FLAWIL - SUISSE) et n'ont pas été corrigés. Les mesures de constantes physiques et les analyses élémentaires ont été effectuées sur des produits sé- chés sous vide (10- mm Hg) généralement pendant vingt heures à 780. Les analyses élémentaires ont été effectuées avec un appareil de micro-analyse CHN automatique PERKIN-ELMER. Les pouvoirs rotatoires ont été déterminés à l'aide du polarimetre électronique ROUSSEL-JOUAN. Les chromatographies ont été faites sur plaques fines de gel de silice (MERCK) dans le mélange de solvants (A) n-butanol-pyridine-acide acétique-eau (30-20-6-24 v/v) ou (B) : chloroforme-méthanol-ammoniaque (2-2-1 v/v). a) Diamide de l'acide BOC, Z-meso-diaminopimélique [BOC, Z-m-DAP-(NH2)2] 6,12 g (7,80 mmoles) du sel de dicyclohexylammonium de l'acide BOC, Z-meso-diaminopimélique (préparé selon les méthodes de DEZSLEE, P. et BRICAS, E. Biochem. 1970, 9, (823) et de DEZELEE, P. et BRICAS E. dans "Peptides 1969 : Proceedings of the Tenth European Peptide Symposium" (E. SCOFFONC, Ed) p. 347-355 North Holland, Amsterdam) sont dessalifiés par une solution d'HCl 4 N dans le tétrahydrofurane.Le résidu huileux obtenu est repris dans 25 ml de tétrahydrofurane et la solution refroidie a - 10 . 4,05 ml (15,6mmoles) de chlorocarbonate-d'isobutyle, puis 2,2 ml (15,6 mmoles de triéthylamine sont ajoutes.-Après dix :ninutes, un courant d'ammoniac sec barbote dans la solution pendant trente minutes à température ordinaire. Un précipité blanc très abondant se forme et est repris, après distillation du tétrahydrofurane, dans un mélange d'acétate d'éthyle (60 ml) et d'eau (20 ml). La solution organique est alors lavée deux fois avec une solutionde C03HNa 1 M (20 ml chaque fois), puis à l'eau distillée jusqu'à neutralité.Elle est ensuite séché sur MgS04, et finalement concentrée à sec. Le résidu solide obtenu est cris tallisé dans le mélange acétate d'éthyle-hexane : 2,06 (Rdt 63 %). Fc 169-172 . Analyse élémentaire (C20H30O6N4, 422,49). Calculé C % 56,9. H % 7,2. N % 13,3. Trouvé C % 56,8. H % 7,5. N % 13,5. b) Chlorhydrate du diamide de l'acide Z-meso-diaminopimélique [Z-m-DAP-(NH2)2, HCl] 1,86 g (4,4 mmoles) du diamide de l'acide BOC, Z-mesodiamino-pimélique sont dissous dans 14 ml d'une solution HCl 1 N dans l'acide acétique. Après trente minutes à 250, la solutïon est concentrée à sec et le résidu séché dans un dessicateur, en présence de solide. Le produit est finalement cristallisé dans le mélange méthanol-éther : 1,5 g (Rdt 90,5 %). Fc 138-1400.Rf (A 0,7). c) Chlorhydrate de l'acide Z-(D)-meso-diaminopimélique-(D)- monoamlde Z-(D)-m-DAP-(D)-NH2, HCl Ce produit a été préparé selon la méthode mise au point par DEZELEE et BRICAS (LEFRANCIER, P. t BRICAS, E; Bull. Soc. Chim. Biol., 1967, 49, 1257) pour l'obtention de l'acide BOC-(D)meso-diaminopimélique-(D)-monobutyloxycarbonylhydrazide BOC-(D)m-DAP-(D)-NH-NYH-BOC Une solution de 1,144 g du chlorhydrate du diamide de l'acide Z-meso-diaminopimélique (3,2 mmoles), dans 100 ml d'eau distillée est ajustée à pH 8,6 avec une solution de KOH N, et maintenue à 37 .Sont ajoutés 3 ml d'une solution de leucine aminopeptidase préalablement activée (0,8 ml d'une solution de LAP contenant 2 mg de protéine par ml, 0,7 ml d'eau distillée, 1,5 ml de tampon TRIS pH 8,5, 0,5 M, 3 ml d'une solution 0,025 M NgS04. 90 mn à 370). Le pH de la solution est maintenu à 8,6 par addition d'une solution 0,1 N d'H2S04 à l'aide d'un pH-Stat. Après environ une nuit, un léger précipité est filtré, et le filtrat acidifié avec une solution 2 N d'HCl, puis concentré à un petit volume. Le précipité obtenu est filtré après une nuit à : : 400 mg (Rdt 70 %). Le filtrat est concentré jusqu 4 mi et passé sur une colonne SE-SEPHADEX (NB@+), (2 x 20 cm) pré-équilibré avec une solution d'acide acétique i M. Le Z-(D)-m-DAP-(D)- NH2 est élué avec une solution 0,1 M d'acétate d'ammonium dans l'acide acétique 1 M. Par lyophilisation, on obtient 100 mg. Les deux lots sont recristallisés dans le mélange éthanol-éther 480 mg (Rdt 84 %). Fc 245-250 . [&alpha;]25D = 5 (c = 0,5 HCl N). Rf (A) 0,65. - d) Ester succinimidique de la BOC-L-alanyl-D-isoglutamine (BOC-L-Ala-D-Glu(OSu)-NH2) A une solution dans 30 ml de diméthylformamide de 4,05 g (10 mmoles) de BOC-L-alanyl-O-isoglutamine (2), sont ajoutés 1,15 g de N-hydroxy-succinimide (10 mmoles) et 2,26 g de dicyclohexylcarbodiimide (11 moles). Après une nuit à température ordinaire, la dicyclohexylurée est filtrée et le filtrat concentré à sec. Le produit est cristallisé dans le mélange alcool isopropy- lique-diisopropyléther : 4 g (Rdt 100 %). Fc 69-70 (avec décomposition. [&alpha;]25D = 12,2 (c = 1 dioxane). Ce produit semble se décomposer assez rapidement. Il est gardé au dessicateur en présence de P205, ou mieux préparé juste avant l'emploi. e) Chlorhydrate de l'ester benzylioue de la L-alanyl-D-isoqlutamine 1 g (2,5 mmoles) de l'ester benzylique de la BOC-L alanyl-D-isogiutamine (2), sont dissous dans 30 ml d'une solution d'HCl N dans l'acide acétique. Après 30 mn, la solution est concentrée à sec et le résidu est repris dans un minimum de méthanol. Le produit est précipité à éther : 800 mg (Rdt 94 %). Fc 153 157 . [&alpha;]25D = + 8,1 (c = 1 Méthanol). Analyse élémentaire (C15H22O4N3Cl, 342,87. Calculé C % 52,5. h % 6,5. N % 12,3: Trouvé C % 52,5. H % 6,4. N % 1212. f) [BOC-L-alanyl-D-isoglutaminyl]-(L), Z-(D)-meso-DAP-(D)-NH2 1,18 g (3,3 mmoles) du chlorhydrate du monoamide (D) de l'acide Z-(D)-meso-diaminopimélique sont dissous dans 5 ml d'eau distillée. On ajoute, à 00, 0,72 ml (6,6 mmoles) de N-méthylmorpholine, puis une solution dans 15 ml de diméthylformamide de 1,2 g (3 mmoles) de lester succinimique de la BOC-L-alanyl-Disoglutamine. Le précipité observé au début de la réaction se solubilise après deux heures. Après quarante-huit heures, le mélange réactionnel est concentré à sec et repris dans 50 ml d'alcool n-butylique, préalablement équilibré avec une solution d'acide acétique 1 M, et 20 ml d'une solution d'acide acétique 1 M, préalablement équilibrée avec de l'alcool n-butylique.La phase n-butanolique est extraite cinq fois avec de petites quantités de la solution d'acide acétique. Les phases aqueuses réunies sont lavées trois fois avec 10 ml d'alcool n-butylique. Les phases organiques sont finalement réunies et concentrées pres qu' sec. Par addition d'éther, un précipité est obtenu (1,8 g) ; il est repris dans de l'éthanol absolu, L'insoluble observé est filtré, et le filtrat concentré au minimum. Par précipitation à l'éther, on obtient 1,6 g (Rdt 80 %). Fc ramollissement 10 -110 , fusion 115 . pal 25 = - 50 (c = 1 Méthanol). Analyse élémentaire (C28H42010N6, 623,09). Calculé C % 54,0. H % 6,8. N % 13,5. Trouvé C S 54,1. H % 6,7. N% 13,5. g) [BOC-L-Ala-D-Glu-&alpha;-NH2]-(L), Z-(D)-meso-DAP-(L)- D-Ala-OBzl, (D) NH2 570 mg (0,92 mmoles) de [BOC-Ala-D-Glu-&alpha;-NH2]-(L), Z-(D)meso-DAP-(D)-NH2 sont dissous dans 30 ml de tétrahydrofurane. A - 15 sont ajoutées 0,26 ml (1 mmole) d'isobutyl chlorocarbonate et 0,11 ml (1 mmole) de N-méthylmorpholine. Après 10 mn, on ajoute en solution dans 10 ml de tétrahydrofurane 352 mg (1 mmole) du p-toluène sulfonate de l'ester benzylique de la D-alanine et 0,11 ml (1 mmole) de N-méthyl-morpholine. A température ordinaire, au bout d'une heure, on obtient un précipité solvaté. La réaction est poursuivie pendant vingt-quatre heures.Après concentration à sec, le résidu est repris dans 25 ml d'acétate d'éthyle et 10 ml d'eau distillée. La phase organique est lavée successivement avec une solution d'acide citrique 10 %, à lteau distillée avec une solu tiQn C03HNa 1 M, puis à l'eau distillée jusqu'à pH neutre. La phase acétate d'éthyle est concentrée et le résidu obtenu sèche dans un dessicateur en présence de P205. Le produit est cristallisé dans le mélange acétate d'éthyle-éther de pétrole : 400 mg (Rdt 55 X). Fc ramollissement 1800, fusion 2150. (Le pouvoir rotatoire d'une solution méthanolique (c = 1) est trop faible pour être pris en considération). Analyse élémentaire (C38H53O11N7, 783,89). Calculé C % 58,2. H % 6,8. N % 12,5. Trouvé C % 58,0. H % 6,7. N % 12,55. h) Chlorhydrate de [L-Ala-D-Glu-&alpha;-NH2) (L), Z-(D)-meso-DAP-(L) [L-Ala-OBzl], (D)-NH2 850 mg (1,1 mmoles) de BOC-L-Ala-D-Glu-&alpha;-NH2 (L), Z (D)-DAP-(L)- L-Ala-OBzl, (D)-NH2, sont dissous dans 5 ml d'une solution d'HCl N dans l'acide acétique. Après 30mn à 25 la solution est concentrée à sec, et le résidu cristallisé dans le mélange méthanol-éther : 750 mg (Rdt 95 %). Fc 90-100 (peu net). [&alpha;]25D = +3,5 (c = 0,5 méthanol). Analyse élémentaire (C33H4609N7Cl, HCL 0,25 H20). Calculé C %52,2. H % 6,3. N % 12,9. Trouvé C % 52,26. H % 6,14. N % 12,69. L'analyse en acides aminés d'un hydrolysat total (effectué en tube scellé sous vide, à 110 pendant 24 heures, en présence d'HCl 6 N) de 0,5 mg du dérivé donne Ala 1,9 ; Glu 1 ; DAP 1. i) Chlorhydrate de l'ester benzylique du Z-(D)-meso-diaminopimelyl- (D)-monoamide Z-(D)-m-DAP-(L)-OBzl, (D)-NH2, HCl Le di-Z-meso-diaminopimelyl-(D)-monoamide a été préparé selon la méthode décrite par Van Heijenhoort J., Bricas E., Nicot C. (Bull. Soc. Chim. 1969 8 2743). 4,57 g (10 mmoles) de ce dérivé sont mis en suspension dans 50 ml d'éther anhydre. On ajoute en 30 mn, à 00, et sous agi ition, 10 m moles de pentachlorure de phosphore finement pulvérisé. Après complète dissolution du pentachlorure de phosphore, le mélange réactionnel est filtré et le filtrat est concentré à sec sous vide à 40 . On répète plusieurs fois la concentration après addition de solvant frais. Le résidu est alors repris dans 10 ml d'alcool benzylique et la solution versée à 0 dans un ballon contenant 50 mi d'éther préalablement saturé en HCl. On laisse la température atteindre 25 , la solution étant agitée ; le gaz carboni- que s'chape, tandis qu'un précipité se forme. On laisse une nuit, puis on filtre le précipité qui est lavé à l'éther. On obtient ainsi le produit i) identifié ci-dessus. j) [BOC-L-Ala-D-Glu-&alpha;-NH2]- (L), Z-(D)-m-DAP-(L)-OBzl, -(D)-NH2 500 mg (2 mmoles) du chlorhydrate de l'ester benzylique du Z-(D)-meso-diaminopimelyl-(D)-monamide sont dissous dans 10 ml de diméthyl-formamide. On ajoute à 0 , 0,22 ml (2 mmoles) de Nméthylmorpholine, puis une solution dans 10 ml de diméthylforma midc de 0-00 mg (2 m moles) de l'ester succinimidique de la Boc-L alanyl-D-isoglutamine. Après quarante-huit heures, le mélange réactionnel est concentré a' sec et repris dans 50 ml d'alcool n-butylique, pré valablement équilibré avec une solution d'acide acétique 1 M, et 20 ml d'une production d'acide acétique 1 M, préalablement équi libré avec de l'alcool n-butyl. La phase n-butanolique est ex traite cinq fois avec de petites quantités de la solution d'aicde acétique. Les phases aqueuses réunies sont lavées trois fois avec 10 ml d'alcool butylique. Les phases organiques sont finale ment réunies et concentrées jusqu'à sec. On obtient le produit i) identifié ci-dessus par préci pitation à l'éther. k) Chlorhydrate de [L-Ala-D-Glu-&alpha;-NH2] (L), Z-(D)-meso DAP-(L) OBzl, (D)-NH2 712 mg (1 m mole) de Boc-L-Ala-D-Glu-&alpha;-NH2(L), Z-(D)-m DAP-(L) OBzl, (D)-NH sont dissous dans 5 ml d'une solution d'HCl - dans l'acide acétique . Après 30 mn à 25 la solution est concen tre à sec et le résidu repris dans le méthanol et précipité à l'éther : 600 mg (98 %). L'analyse an acides aminés d'un hydrolysat acide total (effectué en tube scellé sous vide à 110 pendant 24 heures en présence d'HCl 6 N), de 0,5 mg du dérivé donne Ala 0,95 - Glu 1 DAP 0,90. B : Synthèse totale du glycopeptide 2-(2-acétamido-2-disoxy-3-O- D-glucopyranosyl)-D-propionyl-L-Ala- (&gamma;-OH)-n-&alpha;-Glu NH2. Les réactions mises en oeuvre sont indiquées dans le tableau I ci-après. On a utilisé,dans le tableau I, les abréviations "Ph" pour les groupes phényle et "Ac" pour les groupes acétyle. Tableau 1 a) Préparation du benzyl-2-acétamide-4,6-O-benzylidène-2- désoxy-ss-D-glucopyranoside (composé (A) du tableau I) Il est préparé à partir du benzyl-2-acétamido-3,4, 6, tri-O-acéthyl-2-désoxy-ss-D-glucopyranoside, quiest désacétylé par le méthanolate de sodium, puis protégé par un 4,6-O-benzylidène selon la méthode de P.H. GROSS et R.W. JEANLOZ, J. Org. Chem. 32 (1967), 2759. b) Prépåration du benzyl-2-acétamido-4,6-o-benzylidène-3-o- (D-1-carboxyéthyl)-2-désoxy-ss-D-glucopyranoside (I) 4 g de benzyl-2-acétamido-1,6-o-benzylidène-2désoxy-ss-D-glucopyranoside A sont dissous à 90 dans du dioxanne anhydre et dépéroxydés (450 ml). Après addition d'une suspension à 50 % d'hydrure de sodium dans de l'huile (2,80 g de suspension), l'ensemble est agité pendant 2.h à 90 . De l'acide L-g -chloropropionique (1,840 g) est alors ajouté. Une seconde addition d'hydrure de sodium (2,80 g de suspension) est faite 3 h après l'addition de l'acide. Le mélange est ensuite laissé une nuit à 65-67 , sous agitation mécanique. Après refroidissement dans un bain glacé, l'excès d'hydrure de sodium est détruit avec prudence par addition d'eau (110 ml). Le mélange se sépare endeux phases. La phase inférieure est éliminée ; la phase supérieure est séparée, filtrée èt évaporée sous vide. Le résidu est dilué avec de l'eau (250 ml), la solution aqueuse obtenue étant lavée avec du chloroforme. Cette solution aqueuse est ensuite refroidie à 0 C et de l'acide chlo- rhydrique 2,5 M est ajouté, jusqu'à un pH de 3. Le composé (I) précipite et est immédiatement essoré et lavé soigneusement à l'eau froide.Après cristallisation dans le méthanol, on obtient (I) à l'état pur (3,64 g, 76 %), p.f. 264-265 [&alpha;]20D-52 (c 0,41, éthanol) ; spectre i.r. :# Mujol 3.320 (NH), 3.080 (Ph), 1,760 (COOH), 1.660 (Amide I), 1.565 (Amide II), 740 et v 695 cm - (Ph). .1 c) Préparation du glycopeptide 2-(2-acetamido-2-désoxy-3-o-D- glucopyranosyl)-D-propionyl-@-Ala-(&gamma;-OH)-D-&alpha;-GluNH2. Le principe général de la préparation est le suivant : Le benzyl-2-acétamido-4,6-o-benzylidène-3-O-(D-1carboxyéthyl)-2-désoxy-ss-D-glucopyranoside 4 (I) est condensé avec le chlorhydrate de L-Ala-@@-O-benzyl)-D-Glu NH2 selon Woodward et al (Tétrahedrod, Suppl. 8 (1966) 321). Le solvant util lisé est un mélange de N-N-diméthylformamide et d'acétonitrile 1 : 2 (v/v). Le 2-(benzyl-2-acétamido-4,6-o-benzylidène-2-désoxy 3-O-ss-D-glucopyranoayl)-D-propionyl-L-Ala-(&gamma;-O-benzyl)-D-&gamma;- Glu NH2 (III) est ainsi obtenu à l'état cristallin avec un rendement de plus de 80 %.Le réactif K de Woodward (N-éthyl-5phénylisoxazolium-3'-sulfonate) a été choisi car il ne donne pratiquement pas lieu à une racémisation et donne de très bons résultats avec les amides type glutamine, y compris dans le N-N-diméthylformamide ; le seul inconvénient de ce dernier solvant est qu'il conduit à un rendement plus faible, ce qui n'est pas le cas ici par emploi du mélange acétonitrile-N-N-diméthylformamide. Un traitement du glycopeptide protégé CIII) à l'acides acétique à 60 5 donne le 2-(benzyl-2-acétamido-2-désoxy-3-O-ss D-glucopyranosyl)-D-propionyl-L-Ala-(&gamma;-O-benzyl)-D-&alpha;-Glu NH2 (IV, à ltétat cristallin, avec un rendement de l'ordre de 70 %.Le glycopeptide cherché (V) est obtenu par hydrogénation catalytique du composé (IV) dans l'acide acétique glacial, en présence de charbon palladié. Il n'a pu être obtenu à l'état cristallin et sa très forte hygroscopicité n'a pu conduire à une analyse élémentaire satisfaisante. Il est homogène lors de chromatographie sur couche mince de gel de silice Cpropanol-eau, 7 : 3,v/v), ainsi que sur papier (n-butanol-acide acétique-eau, 5 : 1 : 2,v/v/v). Ces opérations ont été réalisées dans les conditions expérimentales décrives ci-dessous. Conditions générales. Les points de:fusion sont mesurés dans un tube capillaire au moyen d'un appareil Büchi et ne sont pays corrigés. Les pouvoirs rotatoires sont déterminés au moyen d'un polarimètre Perkin Elmer (Modèle 141). Les spectres infrarouge sont enregistrés sur un spectrophotomètre Jouan Jasco IRA-1. L1homQgénéité des composés préparés est contrôlée par chromatographie sur des plaques de verre -recouvertes de gel de silice Merci HF 254 (épaisseur 0,25 mm) et révélées par vaporisation d'une solution alcoolique à 50 % d'acide sulfurique concentré et chauffage au moyen d'un épiradiateur. Les chromatographies sur colonne sont effectuéesau moyen de gel de silice Merck (0,063-0,200 mm). Les chromato- graphies sur papier sont descendantes et effectuées sur du pa- pier Whatmann n 1. Les analyses élémentaires ont été effectuées par le Service Central de Micro-Analyse du Centre National de la Recherche Scientifique (Thiais). 2-tbenzYl-2-acétamido-4,6-0-benzvl.dène-2-désoxsr-3-0-a- D-glucopyranosyl)-D-propionyl-L-Ala-(&gamma;-O-benzyl)-D-&alpha;-Glu NH2 (III). Une solution de 157 mg benzyl-2-acétamido-4,6-o-benzy- lidène-3-0-tD-l-carboxyéthyl)-2-désoxy- $D-glucopyranoside (I), (0.,33 mmole) dans le mélange acétonitrile-N-N-diméthylformamide (2 : 1, v/v, 5 ml) contenant un équivalent (0,33 mmole) de triéthylamine est versée dans une suspension, maintenue à 0 , de N-éthyl-5-phénylisoxazolium-3'-sulfonate t84,3 mg) Aldrich (réctif K de Woodward) dans de l'acétonitrile (5 mi). Le mélange est agité à 0 C jusqu'à l'obtentiond'une solution limpide (1 h.30 environ).Une solution de chlorhydrate de L-Ala-(&gamma;-O- benzyl)-D-&alpha;-Glu NH2 (II) (114,4 mg, 0,33 mmole) dans le mélange acétonitrile-N-N-diméthylformamide (2 : 1, v/v, 5 ml) contenant un équivalent (0,33 mmole)de triéthylamine est alors ajoutée. Après une nuit d'agitation-à la température ambiante les solvants sont évaporés sous vide, le résidu solide obtenu étant soigneusement extrait avec de l'eau chaude, afin d'éliminer les produits secondaires. Le solide est essoré, séché et cristallisé dans de l'éthanol, donnant III (208 mg 82 %), p.f. 243-245 , 200 20 -20 (-c 0,5, N-N-diméthylformamide), spectre i.r. # Nujol 3.440, 3.320 (NH), 3.080, 3.060 (Ph), 1.740 (ester), 1.645 (Amide I), 1.540 (Amide II), 740 et 690 cm (Ph). Anal.Calc. pour C40H48N4011 : C, 63, 15 ; H, 6,36; N, 7,36. Trouvé : C, 62,96 ; H, 6,22 ; N, 7,49. 2-(benzyl-2-acétamido-2-désoxy-3-O-ss-D-glucopyranosyl) p-propionyl-L-Ala-(&gamma;-o-benzyl)-D-&alpha;-Glu NH2 (IKV). Le composé (III) (200 mg) est mis en suspension dans de acide acétique à 60 % (15 ml) et chauffé pendant 1 h à 100 . Après refroidissement de la solution, l'acide acétique est évapo- ré sous vide, les dernières traces d'acide étant éliminées par des additions d'eau suivies d'évaporations, les traces d'eau étant finalement éliminées par des co-distillations en présence de toluène, Le résidu obtenu est chromatographié sur une colonne de gel de silice (15 g) (chloroforme-méthanol, 85 : 15, v/v). Les fractions pures sont jointes, évaporées sous vide, donnant un résidu chromatographiquement pur du composé (IV) (129 mg, 73 ), qui est cristallisé dans le mélange tétrahydrofurane- éthe@ de pétrole (115 mg, 65 %), p.f. 217-219 , [&alpha;]20D-1 (c 0,45, N-N-diméthylformamide) ; spectre i.r. : # NuJol 3.450- 3.230 (OH,NH), 1.740 (ester), 1.645 (Amide I, bande large), 1.545 (Amide II), 720 et 690 cm- (Ph) Anal. Calc. pour C33H44N4011 : C, 58,92 ; H, 6,59 ; N, 8,32. Trouvé : C, 58,78 ; H, 6,50 ; N, 8,25. 2- ( 2-acétamido-2-désoxy-3-0-D-qlucoyranosyl ) -D=-proiô- nyl-L-Ala-(&gamma;-OH)-D-&alpha;-Glu NH2 (V) Le composé (IV) (69 mg) est hydrogéné catalytiquement dans l'acide acétique glacial (10 ml), en présence.de palladium sur charbon (25 mg). Au bout de 3 h, le catalyseur est essoré et le filtrat évaporé sous vide. Le composé (V) est alors obtenu sous forme d'un verre très hygroscopique qu'il n'a pas été possible de cristalliser. Ce composé est homogène lors d'une chromatographie sur couche mince de gel de silice (n-propanol-eau, 7 : 3, v/v), ainsi que lors d'une chromatographie sur papier (n-butanol-acide acétique-eau, 5 : 1 : 2, v/v/v) : Rf = 0,30, la révélation étant faite à l'aide du ractif de Sharon (J. Biol. Chem., 239 (1964) PC 2398) et à l'aide du nitrate d'argent selon TREVELYAN et al. (Nature, 166 (1950) 444). Ceci confirme l'hydrogénolyse de la fonction glycosioique. Un test effectué sur une très petite quantité montre la réactivité totale et immédiate avec une solution éthérée de diazométhane, indiquant la présence d'un acide carboxylique libre. Après hydrolyse, les seuls constituants dosables dans un analyseur d'acides aminés sont l'alanine, llaclde glutamique et l'acide muramique. Le composé finalement obtenu (Nur-N-Ac-Ala-GluNH2 ) a été testé pour son activité adjuvante Le meme mode opératoire permet, à partir du composé I, de préparer des dérivés N-acétyl muramique dipeptides et tripeptides, en mettant en oeuvre, au lieu du chlorhydrate de lester benzylique de la L-alanyl-D-isoglutamine (composé II du tableau I, également référencé plus haut sous e), respectivement le chlorhydrate de l'ester benzylique de la [L-Alanyl-Oisoglutaminyl]-(L), Z-(D)-méso-diamino-pimélyl-(D) amide (composé k) et le chlorhydrate de l'ester benzylique de [L-alanyl-D isogletaminyl]. (L), Z-(D)-meso-diminopimelyl-(L). [D-Alanine], (D)-amide composé h. Les propriétés des dérivés selon l'invention ont été mises en évidence dans les conditions suivantes. Démonstration des propriétés adjuvantes des agents selon l'in- vention. Des cobayes Hartley femelles de 300-350 g ont reçu, danse coussinet plantaire de chacune des deux pattes arrière, une émulsion composée de parties égales d'adjuvant de Freund incomplet et-d'une solution physiologique contenant de l'ovalbumine (5 mg/cobaye) et la préparation de fragments de peptidoglycane à tester. L'adjuvant incomplet de Freund (AIP) et l'ad- juvant complet (ACF) commercialisés par la société DIFCO ont été employés comme témoins. Le taux des anticorps antiovalbumine a été déterminé trois semaines après injection, dans les conditions indiquées dans la demande de brevet principal ; il est exprimé en g/ml de sérum du précipité antigène-anticorps au point d'équivalence. L'hypersensibilité.retardée à l'ovalbumine a été mesurée par réaction cutanée quatre semaines après l'injection ; elle est exprimée par le diamètre en millimètres de ltérythème (@), de l'induration (I) ou de la nécrose (N), quarante-huit heures après l'injection sous-cutanée de 10 ou 100 g d'ovalbumine. Les résultats, qui figurent dans le tableau II ci- dessous, témoignent de la rexarquable activité adjuvante des préparations selon l'invention. Tableau II Dose/ Anticorps/antiovalbumine ( g/ml) animal n dans animaux Hypersensibilité ratardéeé 1 2 3 4 5 Moyenne g ovalbumine in jectée ------ ----- ------- ------ ------- ------ 10 100 Adjuvant incomplet de Frzund 0 600 660 440 700 600 10 E * 51 Adjuvant complet M.butyricum 4800 6160 3200 4480 5040 4736 10 E 13 E 7 N* (50 g) Parois de M.roseus 25 g 3200 2400 2000 2440 3200 2648 8 I 15 E 4 N Disaccharide pentapeptide de M.roseus 25 g 2480 3360 3620 4640 7360 4292 7 E 14 E 7 N N-acetylmuramyl L-Ala-D-Glu-meso DAP 25 g 4880 2560 5440 1920 3840 3728 7 E 13 E 5 N N-acetylmuramyl-L Ala-D-Glu-NH2 25 g 5280 6000 2960 6880 4960 5210 9 E 17 E 5 N * I = induration, E = érythème, N = nécrose. REVENDICATIONS 1 - Polysaccharide-polypeptide contenant - pour la partie polysaccharide des unités N-acétyl-glucosamine (N-Ac-Glc) ou N-glycolyl-glucosamine acide N-acétyl-muramique (n-acyl-Mur) ou N-glycolyl-muramique pour la partie polypeptide des unités L-alanine (B-Ala) de D-alanine, de glycine ou de sérine , acide D-glutamique (D-Glu), dont le groupe carboxyle en OCest soit libre, soit amidé, ou l'acide aspartique lysine ou d'acide &gamma;-aminobutyrique, ou encore d'acide ss-hy droxy-diaminopimélique. 2 - Polysaccharide-polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué d'unités de N-acé- tyl-glucosamine, d'acide N-acétyl-muramique, de 1-alanine, d'acide D-glutamique et de L-lysine. 3 - Disaccharide-pentapeptide formé de N-acétyl-glucosamine, d'acide N-acétyl-muramique, de L-alanine, d'acide D-glutamique, de $L-lysine et de thréonine dans la séquence suivante N-acétgl-glucosaminyf-B- 1,4 N-acétyl-muramyl L-Ala D-iso-Glu 1-Thr-#-L-lys D-Ala 4 - Agent adjuvant soluble pour stimuler, chez un hôte, les réponses immunitaires à des antigènes, constitué par un polysaccharide-polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 5 - Médicament pour usage en médecine humaine ou vétérinaire contenant un agent adjuvant immunologique selon la revendication 4.