Brevet FR2338992A1 — publié le 19770819

'la présente invention concerneun procédé de production de cellules microbiennes par cultures de mlcroorganismes et plus particulièrement de bactéries en présence de méthanol comme source de carbone. Ces cellules bactériennes, riches en protéine, après avoir été séparées du milieu puis séchées, peuvent être utilisées comme appoint protéinique à la nourriture humaine et animale. Il est déjà connuquecertains microorganismes sont susceptibles de se développer sur des milieux de culture contenant du méthanol comme source unique de carbone. Les auteurs de la présente invention ont isolé des souches de bactéries capables d'assimiler le méthanol, qui sont des bactéries gram négatives. Au cours d'un travail d'adaptation en chemostat d'une souche bactérienne qui visait à la suppression de tout appoint vitaminique dans le milieu de culture - mélange de vitamines pures ou extrait de levure -, puis à l'adaptation de la culture à des températures élevées comprises entre 350C et 450 C, on a. trouvé qu'un mélange de plusieurs micro organismes, dont certains n'utilisent pas le méthanol, s'adapte plus facilement qu'une souche pure à ces changements variés des conditions de culture. Ces cultures mélangées peuvent être constituées d'une ou plusieurs souches de microorganismes utilisant le méthanol associées à une ou plusieurs souches de microorganismes n'utilisant pas le méthanol. On a trouvé, ce qui constitue une caractèristique de l'invention, que la culture mixte ainsi obtenue et isolée, référencée MS1 était constituée de deux nouveaux organismes utilisant le méthanol, organismes methylotrophes non décrits antérieurement, une espèce du genre Xanthomonas, urne espèce mé- thylotrophe stricte que nous désignerons sous la référence M 114. et de deuxmicroorganismes n'utilisant pas le méthanol, une espèce du genre Flavobacterium et une espèce du genre Pseudomonas, les proportions relatives de chacune de ces quatre souches étant bien établies. L'isolement et la purification des différentes souches ont été réalises par étalement sur milieux gélosés solides à partir de dilutions convenables d'un échantillon prélevé au cours d'une culture en fermenteur. On a utilisé deux formules de milieu de culture différentes, l'une comprenant du méthanol (milieu M > pour la croissance des souches méthylotrophes, autre sans méthanol (milieu Luria) pour la croissance des souches non methylotrophes. Les compositions respectives de ces deux milieux sont les suivantes Milieu Luria Milieu M Bacto tryptone 10 g.l- Méthanol 5 ml Bacto yeast extract 5 g.l H3 P04 concentré (d20/4=l,7) 0,75 ml Glucose 1 g.l H2 S04 concentré (d20/4=1,84) 0,63 ml Na Cl 5 g.l- NH4 OH concentré (d20/4=O,92) 1,00 ml Agar 20 g.l- Mg SO4, 7 H2O 1 g Eau distillée 1 1 KOH 0,62 g Fe SO4, 7H2O 0,06 g Cu SO4, 5H2O 1,5.10-5 g H3 BO3 1.10-4 g Mn SO4, H2O 1.10-4 g Zn SO4, 7H2O 1.10- g Co (NO3)2 1.10-4 g (NH4)6 Mo7 O24 1,5.10- g Agar 20 . g Eau du robinet 1 1 Des deux nouveaux organismes utilisant le méthanol, celui appartenant au genre Xanthomonas est capable d'utiliser des sources de carbone autres que le méthanol qu'il emploie toutefois préférentiellement aux autres, tandis que le deuxième est une bactérie méthylotrophe stricte qui n'assimile que le méthanol comme source de carbone. Les caractéristiques microbiologiques des differentes souches sont décri- tes ci-après. Sur la base des résultats obtenus, et en se référant à l'ouvrage classique "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" 7th Edition, Williams and Wiikins (1959) utilisé pour l'identification des bactéries, trois des quatre microorganismes sont classés comme suit : Xanthomonas 114, Flavobacterium 114 et Pseudomonas alcaligenes 114. Le quatrième microorganisme qui n'utilise que le méthanol comme source de carbone, n'a pas pu, d'après ses caractéristiques microbiologiques être classé dans l'un quelconque des genres connus jusqu'à présent. Nous le dénommons M 114. A/ - Souche de Xanthomonas 114 1) - Morphologie microscopique Bacilles assez grêles de 0,5 M de largeur et 3 à 5 de longueur, non sporulés, mobiles , présentant un cil polaire ; ne fixent pas le gram (bactéries gram-négatives). 2) - Morphologie des colonies sur milieu gélosé complet (milieu de Luria) - Colonies bombées, de forme circulaire, jaunes avec un centre orangé, diamètre moyen = 4 à 5 mm après 2 jours de croissance à 370C 3) - Propriétés physiologiques Croissance satisfaisante à 370C et 420C Relation avec l'oxygène libre = aérobie stricte en gélose viande levure Catalase : positivé Oxydase : positive (Méthode de Kovacs(Nadi réaction)) Réduction des nitrates : négative Pouvoir oxydatif sur milieu H--gh et Leifson avec glucose Pouvoir fermentatif sur milieu Hugh et Leifson avec lactose Utilisation du lactose : négative sur milieu de Hajna Utilisation du mannitol : positive sur milieu mannitol-mobilité Utilisation des citrates : négative sur milieu citrate de Simmons Hydrolyse de l'esculine : positive sur gélose à ltesculine Production de H.2S : négative à Fartir de thiosulfate Production d'indole : négative Uréase : négative Gélatinase : négative Essai Voges-Proskauer : négatif Tyrosinase : positive en milieu contenant 0,1% de L (-)Tyrosine Le méthanol ainsi que le glucose peuvent etre utilisés commue source de carbone pour la croissance. B/ - Souche M 114 1) - Morphologie microscopique : Bacilles petits de 0,5 - 0,6 de largeur et de 2 - 4 p de longueur, non sporulés, mobiles - ne fixent pas le gram (bactéries gram-négatives) 2) - Morphologie des colonies sur milieu gélosé M Colonies plates d'aspect bleuté sur leur pourtour Diamètre moyen = 2 mm après 2 jours de croissance à 370C Aspect butyreux à mucoide après 4 jours de croissance à 370C 3) - Propriétés physiologiques Oxydase : positive (Test de Mac Leod par pulvérisation) Catalase :- positive Uréase : positive Croissance satisfaisante à 37 C Utilisation des sources de carbone :Le méthanol est assimilé, mais la monométhylamine, méthanol, le formiate d'ammonium, le formamideA'urée, le n-propanol, la n-propylamine le chlorhydrate de guanidine, les acétates, les citrates, l'asparagine,le ribose, le glucose, le cyanamide, la méthylhydrazine, le N;méthylhydroxylamine chlorhydrate, le méthylène diamine dichlorhydrate,l'acide méthane sulfonique. Utilisation des sources d'azote : les sels d'ammonium tels que le sulfate d'ammonium et les nitrates tels que le nitrate de sodium peuvent être employés comme source d'azote. la compositIon du milieu utilisé pour l'assimilation des différentes sources de carbone est, par exemple,-celle donnée précédemment pour le milieu M, en faisant seulement varier la source de carbone C/ - Souche de Flavobacterium 114 1) - Morphologie microscopique Bacilles moyens,assez trapus de 0,6 y de largeur et de 3 à 4 y de longueur,à coloration bipolaire, non sporulés, non ciliés, ne fixent pas le gram (bactéries gram-négatives). 2) - Morphologie des colonies sur milieu gélosé complet (milieu de Luria) Colonies jaunes orangées, bombées Aspect butyreux à mucoSde Diamètre moyen = 3 mm après 3 jours de croissance à 370C 3) - Propriétés physiologiques Croissance satisfaisante à 370C Relation avec l'oxygène libre : aérobie stricte en gélose viande levure Catalase : positive Oxydase : positive (méthode de Kovacs(Nadi réaction)) Réduction des nitrates : négative Pouvoir oxydatif sur milieu Hugh et Leifson avec glucose Utilisation du lactose : négative sur milieu de Hajna Utilisation du mannitol : positive (après 7 jours) sur milieu mannitol-mobilité Utilisation des citrates : négative sur milieu citraté de Sommons Hydrolyse de l'esculine : positive sur milieu gélosé à l'esculine Tyrosinase : négative en milieu contenant0,î% de L (-) tyrosine Gélatinase : positive Uréase : négative Production d'indole : positive Essai Voges - Proskauer : négatif Le glucose peut etre utilisé comme source de carbone pour la croissance, mais non le méthanol. D/ - Souche de Pseudomonas alcaligenes 114 ouPseudo alcaligenes 114 1) - Morphologie microscopique Bacilles assez gros de 0,5 de largeur, et de 2 à 5 y de longueur, aux extrémités arrondies, se rencontrant souvent par paires, mobiles-ne fixent pas le gram (bactéries gram négatives ) 2) - Morphologie des colonies sur milieu gélosé complet (milieu de Luria) Colonies plutôt blanches,avec un centre teinté jaune-crème aux pourtours non nets. Diamètre moyen : 3 mm après 3 jours de croissance à 370C 3) - Propriétés physiologiques Croissance satisfaisante à 370C et 42 C Relation avec l'oxygène libre : aérobie strict en gélose viande levure. Calalase : positive Oxydase : positive (méthode de Kovacs -(Nadi réaction)) Réduction des nitrates : positive Alcalinisation du milieu de Hugh et Leifson avec glucose Utilisation du lactose : négative sur milieu de Hajna Utilisation du mannitol : négative sur milieu mannitol - mobilité Utilisation des citrates : positive sur milieu citraté de Simmons Hydrolyse de l'esculine: négative sur milieu gélosé à l'esculine Uréase : positive en miliéu urée-indole Tyrosinase : négative en milieu contenant 0,1% de L (-) tyrosine Gélatinase : négative Production d'indole : négative Essai Voges - Proskauer : positif ile méthanol ne peut pas être utilisé comme source de carbone pour la croissance de cette souche Une autre propriété de ce nouveau mélange de souche que l'on référencera MS1 est sa parfaite stabilité au cours du temps, tant du point de vue microbiologique que du point de vue des performances de -croissance, à savoir productivité, biomasse et rendement substrat. On a trouvé, d'autre part, que la culture de ce mélange de souches peut être conduite de façon noneseptique aussi bien en ce qui concerne la prépe- ration et l'injection du milieu minéral que l'injection de l'air,opérations qui jusqu'ici, étaient connues pour être toujours effectuées stérilement, et qui, dans ces conditions, sont très couteuses. En cultivant ce m8me mélange de souches sur méthanol, on a encore obtenu une plus grande vitesse de croissance, des biomasses plus importantes ainsi que des rendements substrats (définis comme le rapport du poids de cellules seches récupérés sur le poids de substrat consommé) plus élevés que ceux trouvés lorsque l'on cultive une seule des souches méthylotrophes. Une autre propriété de cette culture mixte de bactéries, qui constitue une particularité de la présente invention , concerne sa résistance particulièrement bonne à des concentrations élevées de méthanol. A des concentrations comprises entre 0,01% et 2% ou 3% en poids de méthanol, on ne constate aucune inhibition, ainsi qu'aucune diminution de la productivité représentant le poids de cellules séches récupérées par unité de volume et par heure. La culture de ce mélange de souches est effectueeen fermenteur dans des conditions aérobies à une température d'environ 20 à environ 450C et de préférence entre 340C et 42 OC, le pH étant maintenu entre environ 6 et 9, par exemple à environ 7,0. On peut utiliser la soude caustique, l'ammoniac sous forme gazeuse ou en solution pour le réglage du pH, lorsqu'on emploie comme source d'azote des sels d'ammonium, la consommation d'ammoniaque contribuant à abaisser le pH. Les milieux utilisables pour cette culture mixte de bactéries sont des milieux aqueux renfermant des composants usuellement utilisés pour la culture des microorganismes, c'est-à-dire renferment une source d'azote, des composés minéraux. Les sources d'azote sont les sources classiques et comprennent les sels d'ammonium tels que le chlorure, le carbonate, le phosphate dibasique le'sulfate, les nitrates solubles tels que le nitrate de potassium, de sodium ou d'ammonium, l'urée et l'ammoniaque soit en solutions aqueuse, soit à l'état gazeux Le milieu minéral renferme du phosphore, par exemple sous forme d'acide phosphorique ou de sels de ce même acide, des ions essentiels tels que les ions magnésium, fer et potassium, et des oligacéléments généralement à l'état de traces, tels que le cuivre, le zinc, le molybdène, le cobalt. Ce milieu, contrairement aux autres milieux déjà délits dans la littérature et utilisés pour la croissance de microorganismes sur méthanol, ne renferme aucun facteur de croissance pouvant être par exemple des vitamines et des produits naturels contenant ces mêmes substances tels que les extraits de levures, les liqueurs de macération du maTs, ceci constituant une nouvelle particularité de l'invention. Chacune des quatre souches pures décrites précédemment et le mélenge MS1 de ces quatre mêmes souches sont conservés sous.forme lyophilisée ou sous forme congelée. Dans ce dernier cas, la température de-congé'ation est de - 200C environ. Pour ensemencer une culture avec le mélange de souches ES1 par exemple, on utilise les cellules congelées du mélange MS1 que lton laisse revenir à la température ambiante et que l'on introduit ensuite directement dans l'appareil de fermentation. la culture de ce mélange de souches étant conduite comme il vient d'être indiqué, la récupération des cellules bactériennes riches en protéines peut être mise en oeuvre de toute manière connue. Généralement, on sépare, par exemple, par décantation, floculation, filtration ou centrifugation, le milieu minéral aqueuxdes cellules de microorganismes qui sont ensuite séchées. 'les exemples suivants qui illustrent l'invention ne sont pas limitatifs. Exemple 1 Cultures en discontinu de M114 et du mélange de souches MSI On cultive le microorganisme méthylotrophe M 114 dans un appareil de fermentation cylindrique ayant un volume de travail de 2 litres. L'appareil de fermentation comporte un système d'aération, un système d'agitation et un système de contrôle automatique de la température et du pH. Le taux d'aération est de 1,5 volume d'air par volume de milieu et par minute, la vitesse d'agitation est de 1500 t/mn. La température est maintenue constante à 380C, et on régle le pH à 6,8 par addition d'hydroxyde d'ammonium. Le milieu minéral a la composition suivante H3 PO4 concentré(d20/4=1,7) = 0,75 ml H2 SO4 concentré (d2O/4= 1,84) = 0,63 ml NH4 OH concentré (d20/4= 0,92) = 2,45 ml Mg S04 , 7 H20 = 1 g KOH = 0,62 g Fe SO ,7 H2O = 0,06 g Cia SO4 , 5H2 0 = 1 5.10-5 g H3 BO3 = 1. 10-4 g Mn SO4,H2O = 1. 10-4 g Zn SO4, 7 H2O = 1. 10- g Co (NO3)2 = 1. 10-4 g (NH4)6 Mo7 O24 = 1,5.10- g Eau du robinet = 1 1 Te concentration de méthanol initiale est de 1 en volume. Le méthanol est ensuite ajouté en discontinu, mélangé à la solution d'ammoniaque utilisée pour réguler le pli à 6,8.La composition du mélange a été calculée de telle façon que la concentration du méthanol dans le milieu reste comprise entre 0,01% et 2% en volume. Cette composition est la suivante NH4 OH concentré (d20/4 = 0,92) = 19,6 ml CH3 OH pur = 63,6 ml H20 distillée = 16,8 ml Le méthanol résiduel est dosé par chromatographie en phase gazeuse. La croissance est suivie par des mesures de poids sec. On. ensemence la culture avec 0,35 g.l de la souche M 114. Ia fermentation est conduite stérilement. On répète dans les memes conditions de fermentation et de milieu, l'ex- périence décrite ci-dessus, mais en remplaçant la souche M114 par le mélange de souches MS1 composé de Xanthomonas 114, M 114, Flavobacterium 114 et Pseudoalcaligeces 114. Les résultats de ces deux cultures discontinues sont indiqués dans le tableau 1. TABLEAU 1. Souche pure Mélange de souches M 114 MS 1 f de la biomasse pendant la phase exponentielle (g.l-1) 2,3 8,4 Productivité pendant la phase exponentielle (g.l- h-) 0,25 1,5 Temps de génération (h) 2 1,25 Taux de croissance spécifique maximum (h-1) 0,345 0,55 Biomasse obtenue en fin de culture (g.l ) 8,5 16,7 Rendement substrat (%) 23 50 pendant la phase exponentielle 'les résultats indiqués dans le tableau 1 démontrent que le mélange de souches MS1 présente des performances plus intéressantes pour la production de biomasse à partir de méthanol, a' savoir une plus grande vitesse de croissance, une biomasse plus importante en fin de phase exponentielle ou en fin de culture, une meilleure productivité et un rendement substrat nettement plus élevé. Exemple 2 - Culture en continu du mélange de souches MS1 . On effectue, avec le mélange de souches NS1 , une culture en discontinu d'une manière similaire à celle décrite dans l'exemple 1. Lorsque la biomasse atteint 9g.I , on commence la culture en continu, en introduisant en continu dans le fermenteur du milieu minéral dont la composition est la m8me que celle donnée dans l'exemple 1, à l'exception de l'ammoniaque dont la concentration est seulement de 1 ml/l, et du méthanol à raison de 25 g/l de milieu frais injecté dans le fermenteur. On maintient constant le volume de liquide à l'intérieur du fermenteur, en soutirant en continu une quantité de milieu avec cellules bactériennes égale à celle de milieu frais injecté. On opère dans le récipient de fermentation de façon non aseptique et l'air ainsi que le milieu d'entrée ne sont pas stérilisés. Le taux de dilution est maintenu entre 0,32 et 0,35h 1.La vitesse d'agitation est de 1500 t/mn, la température de 380C, l'aération de 1,5 litre d'air par litre de milieu et par minute. Le pH est régulé à 6,8 par addition d'ammoniaque. 'le temps de fermentation est d'environ 800 heures. Au cours du temps on a mesuré la biomasse, le méthanol résiduel, le rendement substrat, et la productivité. Les résultats sont portés dans le tableau 2 Tableau 2 Temps de Taux de Biomasse Productivité CH3 OH CH3 OH CH3 OH Rendement fermentation dilution (g.l-) (g.l-. h-) injecté résiduel consommé substrat (h) (h-) (g.l-) (g.l-) (g.l-) (g. cellules par g. CH3 OH consommé) 96 0,336 10,25 3,44 25 10mg.l- 25 0,41 143 0,341 10,4 3,55 " " " 0,415 191 0,341 10,45 3,58 " " " 0,42 311 0,34 10,2 3,47 " " " 0,41 479 0,34 10,3 3,49 " " " 0,41 527 0,341 10,6 3,61 " " " 0,425 647 0,342 10,1 3,45 " " " 0,405 718 0,342 10,4 3,56 " " " 0,415 791 0,344 10,7 3,68 " " " 0,43 Les résultats démontrent une parfaite stabilité de la culture mixte MS1 en fonction du temps.La biomasse varie seulement entre 10,1 et 1C,7g.l , tandis que la productivité reste comprise en 3,44 et 3,68 g.l .h , et le rendement substrat, exprimé en gramme de cellules séches par gramme de méthanol eonsomm , est compris entre 0,405 et 0,43. Un autre point remarquable est la capacité de cette culture à épuiser le substrat carbone jusqu'à des concentrations très faibles, inférieures à 10 mg.l- Au cours de cette même expérience, cn a effectué au cours du temps des comptages de colonies pour déterminer les proportions respectives de cnacune des souches composant la culture mixte MS1.Des échantillons de la culture sont prélevés dans le fermenteur, puis après plusieurs dilutions successives approprires dans une solution de sérum physiologique stérile, on effectue de étalements en boîte de Pétri sur les deux milieux gélosés solides cités précédemment, le milieu de Luria et le milieu M. Ces boites de Pétri sont mises à incuber dans une étuve bactériologique à 370C pendant 2 jours. On effectue ensuite le comptage des différentes colonies sur les 2 sortes de milieux. Les résultats sont donnés dans le tableau 3. Tableau 3 Temps de Souche M114 Xanthomonas Flavobacterium Pseudoalcaligenes fermentation , en nombre 114 114 114 (h) (1) % en nombre % en nombre % en nombre (1) (1) (1) 215 32 32 23 13 287 | 32 32 23 13 382 | 32 32 23 13 478 37 37 16 10 550 35 35 n.d. n.d. (î) Les chiffres donnés dans ce tableau représentent le rapport du nombre de colonies de chaque souche sur le nombre total des colonies des 4 souches constituant le mélange MS1, ce rapport étant exprimé en pourcentage. Les résultats montrent que, au cours du temps, lorsque les conditions de fermentation et de milieu sont gardées constantes, les proportions relatives des 4 différentes souches restent relativement constantes. Le pourcentage d'organismes utélisant le méthanol varie entre 60 et vCX Exemple 3 - Culture en continu du mélange de souches NS1 On cultive le mélange de souches MS1 dans les mêmes conditions que dans l'exemple 2, excepté la concentration en méthanol injecté dans le fermenteur qui est augmentée progressivement. 'les résultats sont portés dans le tableau 4 Tableau 4 Taux de dilution CH3 OH injecté CH3 OH résiduel Biomasse Productivité (h-) g. l- g. l- g. l- g.l-.h- . 0,33 28 1,5 13,1 - 4,32 0,33 31 4,3 12,2 | 4,03 0,33 35 7,7 11,4 3,76 0,31 40 7,1 13,7 4,25 0,31 45 10,2 12,9 | 4,0 0,325 50 13,7 12,0 3,9 0,325 58 18,5 12,7 4,13 0,325 65 20,8 11,5 3,75 Tes résultats montrent que la biomasse et la productivité sont sensiblement constants à un taux de dilution d'environ 0,33 h 1, lorsque la concentration en méthanol résiduel dans le fermenteur passe de 1,5 g. l- à 20,8 g. î-1, soit sensiblement de 0% à 3% en volume. Exemple 4 - Culture en continu du mélange de souches MS1 On cultive en continu le mélange de souches IrIS1 dans les mêmes conditions que dans l'exemple 2. On opère à différents taux de dilution et à différentes températures et toujours dans les mêmes conditions de non stérilité. On a déterminé dans chaque cas, le taux protéinique brut (Nx 6,25), le taux des acides aminés totaux, ainsi que le pourcentage des différents acides aminés par rapport à leur somme. A la lecture des résultats donnés dans le tableau 5, on peut voir que le taux protéinique brut ainsi que la répartition des différents acides aminés, en particulier pour ia lysine dont le pourcentage moyen par rapport à la somme des acides aminés est de 7,4%, sont satisfaisants. Tableau 5 Taux de dilution (h-) 0,24 0,33 0,36 0,33 0,35 Température ( C) 38 38 38 34 41,6 %N intracellulaire 11,9 11,9 11,85 11,35 12,65 Taux protéinique brut 74,2 74,25 74,05 70,9 79,15 (N x 6,25) (% en poids) Taux des acides 61,83 59,16 54,39 56,81 67,57 aminés totaux (% en poids) Acides aminés anhydres (% en poids) per rapport au total des aminoacides anhydres. lysine 7,7 7,3 7,8 6,3 8,2 Histidine 2,3 2,2 2,4 2,1 2,3 Arginine 6,3 5,6 6,6 5,7 6,7 Acide aspartique 10,5 10,6 10,2 10,7 10,6 Thréonine 5,4 5,4 5,3 5,3 5,0 Sérine 4,9 4,0 4,1 4,4 3,8 Acide glutamique 11,7 11,9 11,6 11,7 12,4 Proline 3,3 3,3 3,7 3,9 3,8 Glycine 6,2 6,4 6,2 6,5 5,9 Alanine 8,2 8,7 8,2 8,5 8,7 Cystéine 0,8 0,8 0,9 0,9 0,7 Valine 6,6 6,5 6,5 6,5 6,4 Méthionine 1,2 2,5 1,5 2,5 1,7 Isoleucine | 5,2 | 5,4 5,2 5,4 5,3 leucine 8,8 8,7 8,7 8,6 8,7 Tyrosine | 4,4 | 4,3 4,5 4,4 3,9 Phenylalanine 4,9 4,7 4,8 4,8 4,3 Tryptophane 1,6 1,7 -1,8 1,8 1,6 REVENDICATIONS 1/ - Procédé de culture de microorganismes pour la production de matières pro téiques, caractérisé par le fait qu'il consiste à cultiver un mélange de souches bactériennes constitué de 2 souches de bactéries utilisant le mé thanol et de 2 souches de bactéries ntutilisant pas le méthanol, en présen ce de méthanol comme source unique de carbone, en présence d'oxygène et d'un milieu minéral aqueux. 2/ - Procédé selon la revendication l, dans lequells2souches de bactéries utilisant le méthanol sont respectivement l'organisme méthylotrophe strict référencé M 114 et une espèce du genre Xanthomonas référencée Xanthomonas 114 3/ - Procédé selon la revendication I, dans lequel les 2 souches de bactéries n'utilisant pas le méthanol sont respectivement une espèce du genre Flavobacterlun référencée Flavobacterium 114 et une espèce du genre Pseudomonas référencée Pseudomonas alcaligenes 514. 4/ - Procédé selon la revendication 1, dans lequel la quantité de méthanol résiduel peut Être commise entre O,Ot et g en poids 5/ - Procédé selon la revendication 1, dans lequel on opère en continu et de façon non aseptique 6/ - Procédé selon la revendication 5, dans lequel l'air d'entrée, le milieu ainsi que l'appareil de fermentation ne sont pas strilises. 7/ - Protéines destinées à l'alimentation humaine e animale, caractérisées en ce qutelles sont un produit de culture provenant d'une fermentation aérobie sur méthanol d'un nouveau mélange stable de souches de bactéries constitué d'une part de deux souches de bactéries utilisant le méthanol qui sont l'organisme méthylotrophe strict référencé M 114 et une espèce du genre Xanthomonas référencée Xanthomonas 114 et d'autre part de 2 sou ches de bactéries n'utilisant pas le méthanol qui sont une espèce du genre Flavobacterium référencée Flavobacterium 114 et une espèce du genre Pseu domonas référencée Pseudomonas alcaligeres 114. 8/ - Procédé selon la revendication 1, dans lequel les deux souches de bacté ries utilisant le méthanol sont M 114 et Xanthomonas 114 et dans lequel les 2 souches de bactéries n'utilisant pas le méthanol sont Flavobacte rium 114 et Pseudomonas alcaligenes 114.