Brevet FR2352828A1 — publié le 19771223

Le mélange antibiotique A-35512 comprenant des facteurs apparentés A, B, C, E, F, G et H microbiologiquement actifs, est produit par fermentation aérobie en immersion d'une nouvelle souche Streptomyces candidus NRRL 8156. Les facteurs individuels de A-35512 sont séparés et isolés par chromatographie. Une hydrolyse acide modérée du facteur B de A-35512 enlève plusieurs sucres pour former l'aglycone du facteur B de A-35512. Les antibiotiques A-35512 sont des agents antibactériens et promoteurs de la croissance et augmentent l'efficacité de l'utilisation des aliments chez les ruminants et la volaille. En outre, le facteur B de A-35512 est utile dans le traitement des caries dentaires et de l'acné. Les antibiotioues A-35512 sont des antibiotiques olycopepti- diques très proches les uns des autres. Le facteur B de l'antibiotique A-35512, qui est l'élément gui a été le plus complètement caractérisé du complexe antibiotique A-35512, semble être un nouvel élément du groupe des antibiotiques contenant des peptides, qui comprend la vancomycine (Brevet des E.U.A. N03.067.099), A-4596 A, B et C (Brevet des E.U.A. N03.952.095), l'avoparcine (Brevet des E.U.A. N03.855.410), la ristomycine A (Lomakina, N., 7th International Symposium of Chemisty of National Products, Riga, Latvia page 625, 1970) et la ristocétine A (Brevet des E.U.A. N02.990.329). Les antibiotiques A-35512 diffèrent de ces antibiotiques connus, par exemple, par leur mobilité dans divers systèmes chromatographiques et par la teneur en amino-acides et en sucres. Bien que l'on connaisse à l'heure actuelle de très nombreux agents antibactériens, la nécessité de trouver de nouveaux antibiotiques améliorés existe toujours. Un problème dans la thérapeutique antibiotique courante est le fait que les antibiotiques diffèrent par leur efficacité vis-à-vis des organismes pathogènes. Un autre problème est le fait qu'il se crée continuellement des souches d'organisme qui résistent aux antibiotiques couramment utilisés. Encore un autre problème est le fait que certains patients souffrent souvent de réactions importantes à des antibiotiques spécifiques, en raison d'une hypersensibilité et/ou d'effets toxiques. En raison de ces problèmes dans la thérapeutique courante, un but de cette invention est de fournir de nouveaux antibiotiques que l'on utilise contre les maladies provoquées par des microorganismes. Un autre but de cette invention est de fournir des outils supplémentaires permettant d'augmenter l'efficacité alimentaire des animaux ruminants et de la volaille. Comme le besoin de nourriture augmente, l'efficacité de l'utilisation des aliments devient de plus grande importance. Le diéthylstilboestrol et d'autres oestrogènes permettent d'augmenter l'efficacité alimentaire chez un certain nombre d'animaux et la volaille. L'attention a été attirée sur les risques de consommation de résidus de ces additifs alimentaires restant dans la viande au moment de la consommation. I1 existe un besoin économique très réel de trouver de nouvelles façons d'augmenter l'efficacité des ressources limitées en aliments disponibles dans la production de la viande à partir d'animaux ruminants et de volaille.Le mélange antibiotique A-35512, ces facteurs et leurs dérivés sont des étapes dans cette voie. Cette invention fournit un mélange antibiotique A-35512 comprenant les facteurs A, B, C, E, F, G et H ; le facteur A de A-35512, le facteur B de A-35512, le facteur C de A-35512, le facteur E de A-35512, le facteur F de A-35512, le facteur G de A-35512 et le facteur H de A-35512 ; et le dérivé aglycone du facteur B. Cette invention fournit salement un procédé de production du mélange antibiotique A-35512 comprenant les facteurs A, B, C, E, F, G et H ; le facteur A de A-35512, le facteur B de A-35512, le facteur C de A-35512, le facteur E de A-35512, le facteur F de A-35512, le facteur G de A-35512 et le facteur H de A-35512 ; et le dérivé aglycone du facteur B, procédé consistant : a) à cultiver Streptomyces candidus NRRL 8156 ou un de ses mutants producteurs de A-35512, dans un milieu de culture contenant des sources assimilables'de glucide, d'azote et des sels minéraux dans des conditions de fermentation aérobie en immersion juqu'à production d'une quantité substantielle d'activité antibiotique; r b) à séparer éventuellement le mélange antibiotique A-35512 du milieu de culture c) à isoler éventuellement les facteurs A, B, C, E, F, G et H de A-35512 du mélange antibiotique A-35512 ; et d) à préparer éventuellement l'aglycone du facteur B de l'antibiotique A-35512 à partir du facteur B de l'antibiotique A-35512. Cette invention fournit également une composition alimentaire convenant à la nutrition des ruminants ayant une fonction du rumen développée, comprenant un aliment et une concentration permettant d'augmenter les propionates d'un élément choisi dans le groupe comprenant le mélange antibiotique A-35512, le facteur A de A-35512, le facteur B de A-35512, le facteur C de A-35512, le facteur E de A-35512, le facteur F de A-35512, le facteur G de A-35512, le facteur H de A-35512 et l'aglycone du facteur B de A-35512 et les sels pharmaceutiquement acceptables des facteurs A, B, C, E, F, G et H de A-35512 et de l'aglycone du facteur B de A-35512. Cette invention fournit également une composition alimentaire que l'on peut utiliser pour la nutrition de la volaille, compre- nant un aliment et une concentration augmentant l'efficacité alimentaire d'un élément choisi dans le groupe comprenant le mélange antibiotique A-35512, le facteur A de A-35512, le facteur B de A-35512, le facteur C de A-35512, le facteur E de A-35512, le facteur F de A-35512, le facteur G de A-35512, le facteur H,de A-35512 et l'aglvcone du facteur B de A-35512 et les sels pharmaceutiquement acceptables des facteurs A, B, C, E, F, G et H de A-35512 et de l'aglycone du facteur B de A-35512. Cette invention fournit également un procédé d'augmentation de l'efficacité de l'utilisation des aliments chez les animaux ruminants ayant une fonction du rumen développée, qui consiste à administrer par voie orale à ces animaux une quantité efficace pour l'augmentation de la quantité de propionates, d'un élément choisi dans un groupe comprenant le mélange antibiotique A-35512, le facteur A de A-35512, le facteur B de A-35512, le facteur C de A-35512, le facteur E de A-35512, le facteur F de A-35512, le facteur G de A-35512, le facteur H de A-35512 et l'aglycone du facteur B de A-35512 et les sels pharmaceutiquement acceptables des facteurs A, B, C, E, F, G et H de A-35512 et de l'aglycone du facteur B de A-35512. Cette invention fournit également un procédé d'augmentation de l'efficacité de l'utilisation des aliments chez la volaille, qui consiste à administrer par voie orale à ces animaux une quantité efficace d'un élément choisi dans un groupe comprenant le mélange antibiotique A-35512, le facteur A de A-35512, le facteur B de A-35512, le facteur C de A-35512, le facteur E de A-35512, le facteur F de A-35512, le facteur G de A-35512, le facteur H de A-35512 et l'aglycone du facteur B de A-35512 et les sels pharmaceutiquement acceptables du facteur A, B, C, E, F, G et H de A-35512 et de llaglvcone du facteur B de A-35512. Le nombre et les auantités relatives de facteurs individuels produits simultanément dans ce mélange antibiotique varieront selon les conditions de fermentation utilisées. Les substances antibiotiques de cette invention sont désignées ici arbitrairement sous le nom d'antibiotiques A-35512. Le facteur B est le facteur prépondérant dans le mélange A-35512. Les facteurs de A-35512 se trouvent dans le mélange A-35512 et en sont recueillis individuellement sous forme de chlorhydrates. Chaque facteur individuel peut être transformé en sa base libre (exempte de chlore ionique) par chromatographie sur résine échangeuse d'ions faiblement basique, par exemple. En plus des formes base libre et chlorhydrate, d'autres sels pharmaceutiquement acceptables des facteurs A-35512 sont également utilisables.Dans les discussions d'utilité, l'expression "composé A-35512" sera utilisée pour des raisons de brièveté pour désigner un composé choisi dans le groupe comprenant les facteurs A, B, C, E et H de A-35512 et leurs sels pharmaceutiquement acceptables. Les spectres d'absorption infrarouge (en pastille de KBr) des facteurs de A-35512 suivants sont donnés dans les dessins comme suits Figure 1 - dichlorhydrate du facteur A de A-35512 Figure 2 - dichlorhydrate du facteur B de A-35512 Figure 3 - chlorhydrate du facteur Il de A-35512 Figure 4 - dichlorhydrate du facteur C de A-35512 Figure 5 - dichlorhydrate du facteur E de A-35512 Le spectre infrarouge de l'aglycone du facteur B de A-35512 (dans le Nujol) est donné sur la figure 6. Les facteurs A-35512 de cette invention sont des composés très proches. On a recueilli jusqu'à sept facteurs antibiotiques dans la fermentation sous forme du mélange antibiotique A-35512. On sépare les uns des autres les facteurs individuels et l'on isole les facteurs A, B, E et H sous forme de copposésindividuels comme décrit ci-après. Le mélange A-35512 est soluble dans l'eau est partiellement soluble dans les alcools comme le méthanol et l'méthanol ; mais est insoluble dans d'autres solvants organiques comme le benzène, le chloroforme, l'acétone, l'éther diéthylique, l'acétate d'éthyle, le toluène, l'hexane, l'acétonitrile et le dioxane. Facteur A de A-35512 Le facteur A de A-35512 est un composé basique amorphe blanc. Le facteur A de A-35512 a la composition élémentaire approximative suivante, en pourcentage Carbone, 54, 29 % ; hydrogène, 5,19 % ; azote, 5,58 % oxygène, 33, 76 % ; chlore, 1,69 t Le dichlorhydrate du facteur A de A-35512 est un composé hygroscopique amorphe et blanc. Le dichlorhydrate du facteur A de A-35512 a la composition élémentaire moyenne suivante, en pourcentage Carbone, 51,03 ; hydrogène, 5,10 % ; azote, 4,75 % oxygène, 34,20 % ; chlore, 4,80 %. Le spectre d'absorption infrarouge du dichlorhydrate du facteur A de A-35512, en pastille de Kbr, est représenté sur la figure 1 des dessins annexés. Les maxima d'absorption les plus significatifs se trouvent aux fréquences suivantes (cm 1) : 3405 (fort), 3300 (épaulement) , 2950 (faible), 1750 (faible), 1670 (fort), 1625 (épaulement), 1602 (fort), 1520 (fort), 1470 (faible), 1440 (faible), 1405 (faible), 1345 (épaulement), 1312 (moyen), 1225 (moyen), 1180 (faible), 1130 (faible), 1080 (fort), et 1020 (épaulement). Le spectre d'absorption ultraviolet (uv) du dichlorhydrate du facteur A de A-35512 présente, dans le méthanol acide et neutre,un maximum d'absorption à 282 nm ( 11.700) etc; dans le méthanol basique, un maximum d'absorption a 292 nm (E 14.000), calculé en utilisant un poids moléculaire de 2.000. Le spectre uvdu dichlorhydrate du facteur A de A-35512 présente également une absorption finale à 225 nm. Un spectre de résonance magnétique nucléaire du carbone C13 du dichlorhydrate du facteur A de A-35512 dans D2O a les caractéristiques suivantes No. PPM Hauteur (%) 3 175,3 0,8 4 173,0 2,1 5 172,1 2,0 6 171,4 1,5 7 . 170t 9 2,7 8 170,5 2,3 No. PPM Hauteur (%) 9 169,5 1,6 10 159,0 1,3 ll 157,9 2,3 12 156,2 2,6 13 155,6 2,3 14 155,3 2,4 15 154,4 1,1 16 136,3 1,4 17 136,0 1,0 18 135,1 1,4 19 133,5 1,2 20 129,6 1,6 21 129,1 1,7 22 128,7 1,8 23 127,5 1,0 24 126,0 1,4 25 124,3 2,8 26 122,1 1,6 27 109,9 1,3 28 107,4 1,6 29 101,7 0,9 30 77,6 3,8 31 76,3 4,6 32 75,5 2,6 33 74,8 2,5 34 74,5 2,4 35 73,4 3,7 36 72,8 6,0 37 72,0 4,4 38 70,9 7,0 No.PPM Hauteur (%) 39 69,6 2,8 40 67,4 90,9* 41 65,4 1,7 42 61r7 3,1 43 56r 1,7 44 55,5 1,3 45 54,7 0,8 46 24,6 0,9 47 19,1 1,7 48 17,9 2,0 49 17,2 1,9 50 16,7 3,2 51 16,2 3,0 référence dioxanne Le dichlorhydrate du facteur A de A-35512 a les pouvoirs rotatoires suivants :[&alpha;] D25 -100 (c 1, H2O) [&alpha;]36525 -400 (c 1, H2O) Le titrage électrométrique du dichlorhydrate du facteur A de A-35512 dans du diméthylformamide aqueux à 66 % indique la présence de quatre groupements titrables avec des a d'environ 7,35, 9,09, 10,49 et 12,44 (pH initial 6,2). Le poids moléculaire apparent du dichlorhydrate du facteur A de A-35512, déterminé par titrage, est environ 2106. Le dichlorhydrate du facteur A de A-35512 est soluble dans l'eau, partiellement soluble dans les alcools comme le méthanol et I'éthanol, mais généralement insoluble dans d'autres solvants organiques comme le benzène, le chloroforme, l'acétone, l1éther diéthylique, l'acétate d'éthyle, le toluène, l'hexane, l'aceto- nitrile et le dioxanne. Le dichlorhydrate du facteur A de A-35512 est stable pendant 72 heures dans des solutions aqueuses ayant un pH d'environ 3 à environ 10. L'analyse des amino-acides du dichlorhydrate du facteur A de A-35512 hydrolysé par voie acide indique que le facteur A de A-35512 contient au moins cinq restes amino-acides dont l'un est la glycine. Facteur B de A-35512 Le facteur B de A-35512 est un composé basique amorphe blanc. La composition empirique approximative pour le facteur B de A-35512 est C97-99H101-105N8-9O46-48Cl. Le facteur B de A-35512 a la composition élémentaire moyenne suivante, en pourcentage Carbone, 53,97 % ; hydrogène, 4,75 2 ; azote, 5,25 oxygène, 34,29 % ; chlore, 1,59 %. Cette composition élémentaire correspond particulièrement à une formule empirique préférée de C98H104N9O 47Cl (Valeur calculée C, 53,60 ; H, 4,75 ; N, 5,74 ; O, 34,30 ; Cl, 1,61). Une autre formule empirique préférée est C98H103N8047Cl (Calculée : C, 54,00; H, 4,75 ; N, 5,15 ; O, 34,50 ; C1, 1,60). Le spectre d'absorption ultraviolet (uv) du facteur B de A-35512 indique, dans le méthanol acide et neutre, un maximum d'absorption à 282 nm (E 15000) et, dans le méthanol basique, un maximum d'absorption à 292 nm ( 16000), calculé en utilisant un poids moléculaire de 2000. Le spectre uv du facteur B de A-35512 présente également une absorption finale à 225 nm. Le facteur B de A-35512 a les pouvoirs rotatoires suivants 25 - 1230 (c 1, H20) 25 Ci3365 -4460 (c 1, H2O) Le titrage électrométrique du facteur B de A-35512 dans du diméthylformamide aqueux à 66 % indique la présence de quatre groupements titrables avec des pK d'environ 7,15, 8,81, 10,20, 12,00, et la présence possible d'un autre groupement avec un PKa supérieur à 13,50. Le poids moléculaire apparent du facteur B de A-35512, déterminé par titrage, est environ 2143. Le dichlorhydrate du facteur B de A-35512 est un composé cristallin blanc (dans le méthanol aqueux à 50 %). Bien que le dichlorhydrate du facteur B de A-35512 soit hygroscopique et ne présente pas de point de fusion distinct, un thermogramme montre que la perte de poids commence à 250C, en donnant une perte de poids de 7,4 % à 1210C ; à 1350C une autre perte se produit, entraînant la décomposition. Le dichlorhydrate du facteur B de A-35512 a la composition élémentaire approximative suivante en pourcentage (moyenne) Carbone, 52,57 % ; hydrogène, 4,80 % ; azote, 5,66 % oxygène, 32,86t ; chlore, 4,51 t. Cette composition élémentaire correspond particulièrement à une autre formule empirique possible C98H103N9O47Cl.2HCl (Calculée C, 51,93 ; H, 4,65 ; N, 5,57 ; O, 33,20 ; C1, 4,65). Le spectre uv du dichlorhydrate du facteur B de A-35512 présente, dans le méthanol acide et neutre, un maximum d'absorption à 282 nm (E 12.000) et, dans le méthanol basique, un maximum d'absorption à 292 nm (14.000), calculé en utilisant un poids moléculaire de 2000. Le spectre uv du dichlorhydrate du facteur B de A-35512 présente également une absorption finale à 225 nm. Le dichlorhydrate du facteur B de A-35512 présente les pouvoirs rotatoires suivants : [&alpha;]D25 -1280 (c 1, H2O) 25 [&alpha;]365 @@@ (c 1, H2O) Le titrage électrométrique du dichlorhydrate du facteur B de A-35512 dans le diméthylformamide aqueux à 66 % indique la présence de quatre groupements titrables avec des pKa d'environ 7,15, 8,87, 10,30 et 12,10 et la présence possible d'un autre groupement avec un pKa supérieur à 13,1. Le poids moléculaire apparent du dichlorhydrate du facteur B de A-35512, déterminé par titrage, est environ 2027. Un spectre de résonance magnétique nucléaire du carbone C13 du dichlorhydrate du facteur B de A-35512 dans D2O a les caractéristiques suivantes No. PPM Hauteur (t-) 2 173,0 4,1 3 171,9 3Z7 4 171Z6 3,3 5 171,0 5,8 6 170,8 5t0 7 169,6 3,6 8 159,0 9 157,9 4,4 10 157,5 3,7 11 156,6 4,8 No. PPM Hauteur (%) 12 155,6 6,1 13 155,3 4,2 14 154,9 15 154,3 4,2 16 151,7 3,3 17 144,3 3,1 18 136,7 3,5 19 136,2 4,9 20 135,4 4,0 21 135,2 4,4 22 133,6 4,2 23 133,3 4,1 24 129,8 1,7 25 129,3 3,0 26 128,8 2,6 27 127,6 1,5 28 126,1 3,9 29 124,2 5,6 30 122,4 1,4 31 122,0 4,4 32 120,7 3,3 33 116,5 2,7 34 109,5 0,8 35 108,2 1,1 36 107,7 2,7 37 104t5 z 1,7 38 101,8 2,9 39 100,9 1,6 40 98,2 1,0 41 76,9 1,2 No.PPM Hauteur (%) 42 76,1 1,8 43 74,1 2,0 44 73,5 2,7 45 72,7 2,4 46 72,3 4,0 47 71,0 7,1 48 70,3 2,5 49 69,7 2,5 50 67,4 74,7* 51 64,6 1,2 52 62,0 1,5 53 58,0 1,3 54 56,8 1,7 55 55,4 3,9 56 54, 3 - 2, 5 57 24,5 2,0 58 17,9 3,0 59 17,2 2,0 60 16,3 2,5 Le dichlorhydrate du facteur B de A-35512, cristallisé dans un mélange de méthanol et d'eau, a le schéma de diffraction sur poudre de rayons X caractéristique suivant (radiation 1,50405 #, filtre de nickel, d = espacement interplanaire en angströms) :: Intensité d relative 17,15 100 12,90 80 10,85 70 9,25 70 8,87 60 Intensité d relative 8,22 50 7,86 50 6X93 40 6,20 40 5,62 40 5,04 05 4,02 02 3754 02 Le spectre d'absorption infrarouge du dichlorhydrate du facteur B de A-35512 en pastille de KBr est représenté sur la figure 2 des dessins annexés. Les maxima d'absorption les plus significatifs se trouvent aux fréquences suivantes (cm ) : 3420 (fort), 3300 (épaulement), 2950 (faible), 1752 (faible), 1675 (fort), 1630 (épaulement), 1605 (fort), 1520 (fort), 1470 (faible) 1440 (faible), 1410 (faible), 1345 (épaulement), 1312 (moyen), 1225 (moyen),1180 (faible), 1135 (faible), 1080 (fort), et 1020 (faible). L'analyse des amino-acides du dichlorhydrate du facteur B de A-35512 hydrolysé par voie acide indique que le facteur B de A-35512 contient au moins cinq restes amino-acides dont l'un est la glycine. Les quatre autres restes amino-acides du facteur B A-35512 sont complexes et semblent être identiques à ceux que l'on trouve dans le facteur A de A-35512. I1 semble que la structure de l'un de ces restes amino-acides soit L'analyse de ses produits d'hydrolyse acide indique que le dichlorhydrate du facteur B de A-35512 contient les sucres suivants: glucose, fucose, mannose, rhamnose et 3-amino-2,3,6-tridésoxy-3-C mEthyl-L-xylo-hexopyranose. L'analyse acide modérée du dichlorhydrate du facteur B de A-35512 enlève lesgroupementsglucose, fucose, mannose et rhamnose en donnant un dérivé aglycone caractéristique. Le dichlorhydrate du facteur B de A-35512 comporte au moins un groupement hydroxyle susceptible d'estérification. Le dichlorhydrate du facteur B de A-35512 est soluble dans l'eau, partiellement soluble dans les alcools comme le méthanol et l'éthanol, mais insoluble dans d'autres solvants organiques moins polaires, comme le benzène, le chloroforme, l'acétone, l'éther diéthylique, l'acétate d'éthyle, le toluène, l'hexane, l'aceto- nitrile et le dioxanne. Le dichlorhydrate du facteur B de A-35512 est stable pendant un temps allant jusquà 72 heures dans des solutions aqueuses ayant un pH d'environ 3 à environ 10. Facteur C de A-35512 Le facteur C de A-35512 est un composé basique amorphe blanc. Le facteur C de A-35512 a la composition approximative suivante en pourcentage Carbone, 53,93 % ; hydrogène, 5,15 % ; azote, 5,80 % oxygène, 32,35 % ; chlore, 1,90 %. Cette composition élémentaire est en agrément avec une formule empirique préférée C84HggN8038Cl. Le facteur C de A-35512 a un poids moléculaire approximatif de 1862. Le dichlorhvdrate du facteur C de A-35512 est un composé amorphe blanc. Le dichlorhydrate du facteur C de A-35512 a la composition élémentaire approximative suivante en pourcentage Carbone, 51,76 % ; hydrogène, 5,07 % ; azote, 5,61 % oxygène, 30,29 % ; chlore, 4,88 %. La formule empirique du dichlorhydrate du facteur C de A-35512 est environ C83~85H97-101N8037,39C13 La composition élémentaire est en accord particulier avec une autre formule empirique préférée de C84H97N8038Cl . 2HC1 (Calculé C, 52,2 % ; H, 5,1 % ; N, 5,8 % ; O, 31,5 % ; C1, 5,4 t). Le spectre d'absorption infrarouge du dichlorhydrate du facteur C de A-35512, en pastille de KBr, est représenté sur la figure 4 des dessins annexés. Les maxima d'absorption les plus significatifs se trouvent aux fréquences suivantes (cm-1) : 3370 (fort), 3280 (épaulement), 3040 (épaulement), 2980 (épaulement), 2920 (faible), 1740 (faible), 1658 (fort), 1620 (fort), 1589 (moyen) , 1503 (fort), 1460 (fort), 1428 (moyen), 1385 (faible), 1330 (faible) , 1295 (moyen)., 1210 (fort), 1162 (moven), 1120 (faible), 1060 (fort), et 1005 (moyen). Les spectres d'absorption ultraviolette du dichlorhydrate du facteur C de A-35512 présentent, dans le méthanol acide et neutre, un maximumd'absorption à 282 nm (E 14.600) et, dans le méthanol basique, un maximum d'absorption à 292 nm (E 16.400), calculé en utilisant un poids moléculaire de 2.000. Un spectre de résonance magnétique nucléaire du carbone C du dichlorhydrate du facteur C de A-35512 dans D2O a les caractéristiques suivantes No. PPM Hauteur (t) 1 172,9 2,5 2 172,2 2,0 3 171,5 2Z2 4 171,0 3,9 5 169,6 2,0 6 158,6 1,8 7 157,8 3,0 8 156,5 2,1 9 156,1 2,8 10 155,6 4,2 11 154,6 3,9 12 151,1 1,5 13 143,3 1,4 14 136,0 3,2 15 135,4 2,7 16 133,2 3,7 17 128,7 2,3 18 126,5 3,1 19 124,6 2,1 20 129,3 2,7 21 121,5 2,2 22 120,1 1,2 23 118,0 1,7 No.PPM Hauteur (%) 24 116,5 1,2 25 107,8 2,7 26 104t5 1,9 27 101,7 1,9 28 94,5 1,0 29 75,9 3,0 30 74,3 2,0 31 73,4 2,3 32 72,1 3,5 33 70Z9 4,3 34 68t7 2,9 35 67,4 71,7* 36 6493 1,3 37 62,2 1,6 38 56,1 1,4 39 55,2 3,5 40 54,2 2,1 41 24,3 1,9 42 17,9 2,2 43 17,1 2,0 44 16,2 2,0 Référence dioxanne Le dichlorhydrate du facteur C de A-35512 a les pouvoirs rotatoires suivants : [&alpha;]D25 -161 (c 1,05, H2O) [&alpha;]36525 -614 (c 1,05, H2O) Le titrage électrométrique du dichlorhydrate du facteur C de A-35512 dans le diméthylformamide aqueux à 66 % indique la présence de trois groupements titrables avec des PKa d'environ 7,30, 8,92 et 10,99, et la présence possible de deux groupements ou plus avec des PKa supérieurs à 11,5. Le poids moléculaire apparent du dichlorhydrate du facteur C de A-35512, déterminé par titrage, est environ 1982. L'analyse des amino-acides du dichlorhydrate du facteur C de A-35512 hydrolysé par voie acide indique qu'il contient au moins cinq restes amino-acides dont l'un semble être la glycine. Les quatre restes amino-acides restants n'ont pas encore été identifiés. Le dichlorhydrate du facteur C de A-35512 est soluble dans l'eau, le diméthylsulfoxyde et le diméthylformamide aqueux et partiellement soluble dans les alcools comme le méthanol et l'éthanol, mais insoluble dans d'autres solvants organiques moins polaires comme le benzène, le chloroforme, l'acétone, l'éther diéthylique, l'acétate d'éthyle, le toluène, l'hexane, l'aceto- nitrile et le dioxanne. Le dichlorhvdrate du facteur C de A-35512 est stable dans des solutions aqueuses ayant un pH d'environ 3 à environ 10, pendant des temps allant jusqu'à 146 heures. Facteur E de A-35512 Le facteur E de A-35512 est un composé basique amorphe et blanc. Le facteur E de A-35512 a la composition élémentaire approximative suivante en pourcentage : Carbone, 54,84 % ; hydrogène, 4,73 % ; azote, 5,26 % ; oxygène, 32,67 % ; chlore, 1,72 % Le chlorhydrate du facteur E de A-35512 est un composé amorphe blanc. I1 a la composition élémentaire approximative suivante en pourcentage Carbone, 52,67 % ; hydrogène, 4,59 % ; azote, 5,55 % oxygène, 33,51 % ; chlore1 3,62 % Le spectre d'absorption infrarouge du chlorhydrate du facteur E de A-35512 en pastille de KBrest représenté sur la figure 5 des dessins annexés.Les maxima d'absorption les plus significatifs se trouvent aux fréquences suivantes (cm 1) : 3360 (fort), 3220 (épaulement), 2900 (faible), 1725 (faible), 1650 (fort), 1580 (moyen), 1498 (fort), 1450 (faible), 1419 (faible),1295 (moyen), 1205 (moyen), 1172 (moyen), 1110 (faible), 1060 (fort) et 1000 (faible). Les spectres d'absorption ultraviolette du chlorhydrate du facteur E de A-35512 présentent les maxima d'absorption suivants dans le méthanol neutre, 270 nm (épaulement) et 359 (# 16.216) ; dans le méthanol acide, 286 nm ( 18.018) et 310 nm (épaulement) ; dans le méthanol basique, 270 nm (épaulement), 300 nm (E 16.216) et 354 nm (t 17.568) calculés en utilisant un poids moléculaire de 2.000. Le chlorhydrate du facteur E de A-35512 a le pouvoir rotatoire 25 suivant JD -108,3 (c 1, H2O) Le titrage électrométrique du chlorhydrate du facteur E de A-35512 dans le diméthylformamide aqueux à 66 - indique la présence de trois groupements titrables avec des PXa d'environ 6,30, 9,09 et 11,62, et la présence possible d'un ou deux groupements avec des PKa d'environ 12,5 ou plus (pH initial 5,45). Le poids moléculaire apparent du chlorhydrate du facteur E de A-35512, déterminé par titrage, est environ 2018. L'analyse des amino-acides du chlorhydrate du facteur E de A-35512 hydrolysé par voie acide indique que le facteur E de A-35512 contient six restes amino-acides non encore identifiés. Le chlorhydrate du facteur E de A-35512 est soluble dans l'eau, est partiellement soluble dans les alcools comme le méthanol et le butanol mais est insoluble dans la plupart des solvants organiques comme le benzène, le chloroforme, l'acétone, l'éther diéthylique, l'acétate d'éthyle, le toluène, l'hexane, l'aceto- nitrile et le dioxanne. Facteur H de A-35512 Le facteur H de A-35512 est un composé basique amorphe blanc. Le facteur H de A-35512 a la composition élémentaire approximative suivante, en pourcentage Carbone, 53,76 % ; hydrogène, 5,32 tO, azote, 5,53 %, oxygène, 33,48 % ; chlore, 1,59 % Le facteur H de A-35512 a une formule empirique de C85 87H103 107N8038 40C1, une formule empirique preférée de C86H104N8O39Cl, et un poids moléculaire approximatif de 1908. Le chlorhydrate du facteur H de A-35512 est un compose hygroscopique amorphe blanc. Le chlorhydrate du facteur H de A-35512 a la composition élémentaire moyenne suivante, en pourcentage Carbone, 53,10 % ; hydrogène, 5,37 % ; azote, 5,35 % ; oxygène, 30,12 % ; chlore, 3,78 % Le spectre d'absorption infrarouge du chlorhydrate du facteur H de A-35512, en pastille de KBr, est représenté sur la figure 3 des dessins annexés.Les maxima d'absorption les plus significatifs se trouvent aux fréquences suivantes (cm-1) : 3410 (fort), 3240 (épaulement), 2940 (faible), 1670 (fort)., 1630 (épaulement), 1605 (fort), 1520 (fort), 1470 (faible), 1442 (faible), 1400 (faible) 1345 (épaulement), 1310 (moyen), 1225 (moyen), 1180 (faible), 1135 (faible), 1080 (fort), et 1020 (épaulement). Les spectres d'absorption ultraviolette du chlorhydrate du facteur H de A-35512 présentent, dans le méthanol acide et neutre, un maximum d'absorption à 282 nm (# 12.500) et, dans le méthanol basique, un maximum d'absorption à 292 nm (E 14.000), calculés en utilisant un poids moléculaire de 2.000. Les spectres uv du chlorhydrate du facteur H de A-35512 présentent également une absorption finale à 225 nm. Un spectre deresonance magnétique nucléaire du carbone C13 du chlorhydrate du facteur H de A-35512 dans D2O présente les caractéristiques suivantes No. PPM Hauteur (%) 2 177,2 2,7 3 17176 5,2 4 170,9 5,8 5 169,6 4t7 6 158,9 3,1 7 157,6 4,3 8 15616 3,8 9 155,6 4,1 10 155,4 3,8 11 154,3 2,4 12 151,3 1,6 13 137,7 2,0 14 136,7 2,2 15 136t0 4,0 16 135,3 1,9 17 133,5 5,0 18 129,4 3,7 19 127,3 1,3 20 126,1 3,2 21 124,2 6, 9 No.PPM Hauteur (%) 22 122,6 4,1 23 107,6 2,7 24 101,8 1,8 25 76,2 2,8 26 73,5 4,4 27 72,3 7,4 28 71t0 12,2 29 69,7 4,6 30 67,4 73,1* 31 61,6 3,5 32 56,8 1,8 33 55Z4 2,8 34 55,0 1,5 35 24,5 2,6 36 17,9 4,6 37 17,2 2,6 38 16,3 316 Référence dioxanne Le chlorhydrate du facteur H de A-35512 présente le pouvoir rotatoire suivant : [&alpha;]D25 -123,50 (c 1, H2O). Le titrage électrométrique du chlorhydrate du facteur H de A-35512 dans le diméthylformamide aqueux à 66 % indique la présence de cinq groupements titrables avec des pKa d'environ 5,0, 7,46, 9,80, 11,43 et 13,02 (pH initial 5,93). Le poids moléculaire apparent du chlorhydrate du facteur H de A-35512, déterminé par titrage, est environ 1660. L'analyse des amino-acides du chlorhydrate du facteur H de A-35512 hydrolysé par voie acide indique que le facteur H de A-35512 contient au moins cinq restes amino-acides dont l'un est la glycine. Les quatre restes amino-acides restants du facteur H de A-35512 semblent être identiques à ceux que l'on trouve dans les facteurs A et B de A-35512. Le chlorhydrate du facteur H de A-35512 est soluble dans l'eau, partiellement soluble dans les alcools comme le méthanol et l'éthanol, mais insoluble dans la plupart des solvants organiques comme le benzène, le chloroforme, l'acétone, l'éther diéthylique, l'acétate d'éthyle, le toluène, l'hexane, l'acétonitrile et le dioxanne Le chlorhydrate du facteur H de A-35512 est stable pendant une durée allant jusqu'à 72 heures dans des solutions aqueuses ayant un pH d'environ 3 à environ 10. On sépare commodément les facteurs A, B, C, E et H et les facteurs mineurs F et G de A-35512, par chromatographie sur papier en utilisant un système solvant l-butanol:pyridine:acide acétique: eau (15:10:3:12). La bioautographie, en utilisant Sarcina lutea, est une méthode de détection préférée. On donne dans le tableau 1 les Rf approximatifs des facteurs de A-35512 dans ce système. Tableau I Facteur de A-35512 R f Facteur A.2HC1 0,21 Facteur B.2HC1 0,34 Facteur C.2HCl 0,46 Facteur .HIC1 0,64 Facteur F 0,81 Facteur G 0,93 Facteur H.HC1 0,15 Dans divers système, le facteur H de A-35512 a un profil chromatographique très similaire à celui de l'antibiotique AM374 (Brevet des E.U.A. N03.700.768). On peut distinguer le facteur H de l'antibiotique A-35512 et l'antibiotique AM374 dans au moins deux systèmes de chromatographie sur papier. Le tableau 2 donne les Rf du dichlorhydrate du facteur H de A-35512 et de AM374 dans ces deux systèmes. Tableau II R f Système solvant A35512H AM374 CH30H:HC1. 0,1N (3:1) 0,47 0,58 l-propanol:NH40H:H2O (6:3:1) 0,11 0,20 On peut séparer plusieurs des facteurs A-35512 par chromatographie liquide de performance élevée (HPLC), en utilisant du polyamide (ALPAX, Dupont) comme phase stationnaire et une solution aqueuse 1,33 M de phosphate monopotassique comme phase mobile, et en détectant par UV (250 nm).Dans le tableau III, on donne les durée de rétention des facteurs A-35512 dans une séparation type par HPLC, en utilisant les conditions suivantes Dimensions de la colonne : 3,2 mm x 152 mm Garnissage : polyamide (ALPAX, DuPont) Solvant : KH2PO4(327 g)/H2O (1800 ml) Débit : 0,5 ml/mn Vitesse du papier : 5 cm/h Pression : 105 kg/cm2 Tableau III Durée de rétention Facteur de A-35512 (minutes) A 9,375 B 13,125 C 26,25 E 5,625 F 7,5 G 7,5 H 7,5 Aglycone du facteur B de A-35512 Le chlorhydrate de l'aglycone du facteur B de A-35512 est un composé amorphe blanc ayant la composition élémentaire approximative suivante, en pourcentage Carbone, 54,29 % , hydrogène, 4,34 % ; azote, 7,40 % chlore, 5,02 % ; oxygène, 28,95 % (par différence) Le spectre d'absorption infrarouge du chlorhydrate de l'aglycone du facteur B de A-35512, dans le Nujol, est représenté sur la figure 6 des dessins annexés.Les bandes d'absorption les plus significatives se trouvent aux fréquences suivantes (cm-1) : 3440 (épaulement), 3340 (épaulement), 3215 (fort), 2950 (épaulement), 2910 (fort) , 2840 (fort) , 2640 (épaulement), 1735 (faible), 1655 (fort), 1590 (moyen), 1500 (fort), 1460 (fort), 1378 (moyen), 1365 (épaulement), 1298 (moyen), 1215 (moyen), 1155 (moyen), 1120 (épaulement), 1105 (faible), 1060 (faible), 1040 (faible) , 1008 (moyen), 925 (faible), 875 (faible), 765 (épaulement) et 718 (faible). Le titrage électrométrique du chlorhydrate de l'aglycone du facteur B de A-35512 dans le diméthylformamide aqueux a 66 % indique la présence de trois groupements titrables avec des PKa d'environ 7,5, 9,25 et 11,0 et la présence possible de deux groupements supplémentaires avec des PKa supérieurs à 11,0. Le chlorhydrate de l'aglycone du facteur B de A-35512 a un poids moléculaire d'environ 1782, déterminé par titrage. Le chlorhydrate de l'aglycone du facteur B de A-35512 a les pouvoirs rotatoires suivants [&alpha;]D25 -178 (c 5, CH3OH) [&alpha;]36525 -716,8 (c 5, CH3OH) Les spectres d'absorption ultraviolette du chlorhydrate de l'aglycone dufacteur B de A-35512 présentent, dans le méthanol acide et neutre, un maximum d'absorption à 282 nm (E@@@1% 102,62) et, dans le méthanol basique, un maximum d'absorption à 302 nm (E1c1% 182,09). 1cm Un spectre de résonance magnétique nucléaire du carbone C13 de l'aglycone du facteur B de A-35512 dans le DMSO-d6 à 900C a les caractéristiques suivantes : No. PPM Hauteur (%) 1 187,8 37,2 2 172,0 40,9 3 170,7 45,2 4 17071 46,9 5 169,6 47,7 6 168,4 57,6 7 166,7 52,5 8 15774 49,9 9 156,6 45,5 10 155,7 55,8 11 155,6 71Z5 12 155,4 56,7 13 154,5 50,5 14 149,3 43,0 15 138,8 38,8 16 136,9 54,3 17 136,3 40,2 18 135,2 31/7 19 134,7 28,4 20 133,8 40,9 21 128,2 102,9 No. PPM hauteur (%) 22 126,2 77,2 23 123,0 57,5 24 121,3 38,1 25 117,7 44,4 26 117,0 31y5 27 108,6 31,0 28 106,7 47,9 29 105,7 81,2 30 103,2 26,5 31 93,6 33,4 32 74,9 39,8 33 71,8 33,9 34 68,9 40,2 35 63,2 43,1 36 60,4 33,6 37 57,1 57,8 38 55,2 33,1 39 53,2 30t1 40 518 36,0 41 40,7 43,4* 42 39,9 60,9* 43 39,1 43,9* 44 23,8 55,7 45 17,1 47,8 46 0,0 43,7 #DMSO-d6 13 Le spectre RMN du carbone C indique que 1 'aglycone du facteur B A-35512 contient toujours la partie 3-amino-2,3,6-tridésoxy-3-C-méthyl-L-xylo-hexopyranose (l'un des sucres présent dans le facteur B de A-35512). L'analyse des amino-acides du chlorhydrate de l'aglycone du facteur B de A-35512 ayant subi une hydrolyse acide plus poussée indique que l'aglycone du facteur B e A-35512 contient de la glycine et au moins trois restes amino-acides complexes. I1 semble que la structure de l'un de ces restes amino-acides soit Le chlorhydrate de l'aglycone du facteur B de A-35512 porte au moins un groupement hydroxyle susceptible d'estérification. Le chlorhydrate de l'aglycone du facteur B de A-35512 est soluble dans l'eau et le méthanol, mais est insoluble dans les solvants organiques moins polaires comme le benzène, le chloroforme, l'acétone, l'éther diéthylique, l'acétate d'éthyle, le toluène, l'hexane, l'acétonitrile et le dioxanne. Le chlorhydrate de 1 olycone du facteur B de A-35512 a un Rf voisin de 0,80 par chromatographie sur couche mince de cellulose (support d'aluminium), en utilisant un système solvant l-butanol:pyridine:acide acétique:eau (15:10:3:12). La bioautographie en utilisant Sarcina lutea est une méthode de détection préférée. Le chlorhydratede l'aqlycone du facteur B de A-35512 a un Rf Voisin de 0,26 par chromatographie sur couche mince de gel de silice en utilisant un système solvant méthanol:chloroforme:NH40H concentré (3:2:1). L'aglycone du facteur B de A-35512 (base libre) est un composé amorphe blanc ayant la composition élémentaire approximative suivante en pourcentage (moyenne) Carbone, 52,65 % ; Hydrogène, 4,57 % ; Azote, 6,91 % Chlore, 2,94 % ; Oxygène, 27,04 % ; Cendres, 4,70 %. Le spectre d'absorption infrarouge de l'aglycone du facteur B de A-35512 (base libre), en pastille de KBr, présente des pics d'absorption significatifs aux fréquences suivantes (cl 1) : 3360 3360 (fort), 3260 (épaulement), 2940 (épaulement), 1735 (épaulement), 1660 (fort), 1598 (moyen), 1510 (fort), 1440 (moyen), 1295 (faible) 1215 (moyen), 1165 (moyen), 1122 (faible), 1070 (faible), 1018 (fort), 940 (faible), et 920 (faible). Le titrage électrométriaue de l'aglycone du facteur B de A-35512 (base libre) dans le dimethylrormamide aqueux à 66 % indique la présence de cinq groupements titrables avec des PK.a d'environ 6,2, 8,2, 10,1, 11,4 et 12,4 et la présence possible de un ou deux groupements supplémentaires ayant des PKa supérieurs à 12,5. L'aglycone du facteur B de A-35512 (base libre) a le pouvoir rotatoire suivant Les spectres d'absorption ultraviolette de l'aglycone du facteur B de A-35512 (base libre) présentent, dans le méthanol neutre et acide, un maximum d'absorption à 282 nm (ElCm 43,65) et dans le méthanol basique, un maximum d'absorption à 301 nm (ElCm 67,46). L'aglycone du facteur B de A-35512 (base libre) a les mêmes valeurs Rf approximatives que celles décrites ci-dessus pour le chlorhydrate de 1 glycone du facteur B de A-35512. En plus des formes base libre et chlorhydrate des différents facteurs de A-35512 et de 1 glycone du facteur B de A-35512, d'autres sels d'addition d'acide pharmaceutiquement acceptables des facteurs A, B, C, E, H et de 1 glycone du facteur B de l'antibiotique A-35512 font également partie de cette invention. Les sels pharmaceutiquement acceptables sont des sels dans lesquels la toxicité du composé comme un tout vis-à-vis des animaux à sang chaud n1 est pas accrue par rapport à la forme non-sel.Des exemples des sels appropriés des facteurs A, B, C, E et H et de l'aglycone du facteur B de A-35512 comprennent les sels formés par des réactions classiques avec les acides tant organiques que minéraux comme, par exemple, les acides sulfurique, phosphorique, acétique, succinique, citrique, lactique, maléiaue, fumarique, palmitique, cholique, pamolque, mucique, D-glutamique, d-camphorique, glutarique, glycolique, phtalique, tartrique, aurique, stéarique, salicylique, méthanesulfonique, benzènesulfonique, sorbique, picrique, benzoïque, cinnamique, etc... On produit les nouveaux antibiotiques de cette invention en cultivant une souche productrice de A-35512 de Streptomyces candidus NRRL 8156 dans des conditions aérobies en immersion dans un milieu de culture approprié jusqu production d'une activité antibiotique substantielle. On recueille les antibiotiques en utilisant divers modes opératoires d'isolement et de purification utilisés dans la technique de la fermentation. Le nouvel organisme utilisable pour la préparation des antibiotiques A-35512 a été isolé d'un échantillon de sol recueilli sur L'atoll Eniwetok. Cet organisme a été classé comme étant une nouvelle souche de Streptomyces candidus (Krassilnikov) Waksman, comme décrit par E.B. Shirling et D. Gottlieb dans "Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces. II. Species Descriptions from Second Study," Intern. J. Systematic Bacteriol. 18 (4):279-392 (1968) ; et S.A. Waksman, "The Actinomycetes. Vo1.2. Classification, Identification, and Descriptions of Genera and Species," Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1961. Cette classification est basée sur les méthodes recommandées par International Streptomyces Project (E.B. Shirling and D. Gottlieb, "Methods for Characterization of Streptomyces Species," Intern. Bull. Systematic Bacteriol. 16:313-340 (1966)) accompagnées de certains essais supplémentaires. Les noms de couleur ont été attribués selon la méthode ISCC-NBS (K.L. Xelly et D.B. Judd, "The ISCC-NBS Method of Determining Colors and a Dictionary of Color Names," U.S. Department of Commerce Cir. 553, Washlngton, D.C., 1955). Les chiffres entre parenthèses se réfèrent aux séries de couleurs de Tresner et Backus (H.D. Tresner et S.J. Backus, "System of Color Wheels for Streptomycete Taxonomy," Appl. Hicrobiol. 11: 335-338 (1963)) et les désignations de couleurs sont soulignées. Les valeurs de couleurs de Maerz et Paul (A. Maerz and M.R. Paul, "Dictionary of Color", McGraw-Hill, New York, N.Y., 1950) sont mises entre crochets. Les cultures sont faites à 300C pendant 14 jours à moins d'indication contraire. CARACTERISATION DE LA SOUCHE PRODUCTRICE DE A-35512 Morphologie Il se forme des sporophores onduleux et longs. Les spores qui se forment en chaînes de 10 à 50 sont cylindriques et mesurent de 0,7 à. 1,O5 x 1,4 à 3,5 . I1 se produit sur certains milieux des structures du type sclérotie. On observe également parfois des hyphes en forme de balais ou de faisceaux. La surface des spores lorsqu'on l'observe au microscope électronique est lisse. Caractéristiques de culture sur divers milieux Milieu Caractéristiques ISP N02 (gélose d'extrait de levure et d'extrait de malt) Croissance abondante ; envers gris jaunâtre [11J5] ; mycélium aérien et sporulation abondante, blanc a a ; pas de pigment soluble. ISP N03 (gélose de farine d'avoine) Croissance modérée ; envers vert jaune-pâle [10Bl] ; mycélium aérien et sporulation faible, blanc (w) 13ba ; pas de pigment soluble ; on observe des masses du type sclérotie. ISP N04 (gélose d'amidon et de sels minéraux) Bonne croissance ; envers blanc ambré [10Cl] ; mycélium aérien et sporulation bons, gris jaunâtre (GY) 2dc ; pigment soluble brun clair ; on observe des masses du type sclérotie. ISP N05 (gélose de glycérol et d'asparagine) Bonne croissance ; envers vert jaune pâle 1OB23 ; mycélium aérien et sporulation bons, blanc (w) a ; pas de pigment soluble le mycélium semble être en faisceau. Gélose d'Emerson Bonne croissance ; envers olive clair C14L6g; pas de mycélium aérien ni de sporulation ; pigment soluble brun clair. Gélose modifiée de Bennett Croissance abondante ; envers jaune moyen CllJ6] ; mycélium aérien et sporulation abondants, blanc (w) a ; pas de pigment soluble. Gélose de solution de Czapek Bonne croissance ; envers vert jaune pâle ìOBi) ; mycélium aérien et sporulation bons, blanc (w) b ; pas de pigment soluble ; le mycélium apparalt en faisceaux. Gélose de farine d'avoine et de pâte de tomate Croissance abondante ; envers jaune grisatre [11I5] ; mycélium aérien et sporulation abondants blanc, (w) a le mycélium "s'enroule vers le haut" en s'écartant de la surface de la gélose ; pas de pigment soluble. Gélose nutritive Croissance médiocre à bonne ; envers vert jaune pâle [18D2] mycélium aérien et sporulation bons, blanc (w) a ; pigment soluble brun clair. Gélose de glucose et d'asparagine Croissance bonne, envers vert jaune pâle t17E13 ; mycélium aérien et sporulation bons, blanc (w) 13ba ; pas de pigment soluble. Gélose de tryptone et d'extrait de levure Croissance passable ; envers blanc [10Al] ; mycélium aérien et sporulation passables, blanc (w) b pas de pigment soluble. Gélose de tyrosine Croissance bonne ; envers blanc p1OB2 ; mycélium aérien et sporulation bons, blanc (w) a pigment soluble brun ; on observe des masses du type sclérotie. Gélose de glycérol et de glycine Croissance bonne ; envers blanc t1OB2 ; mycélium aérien et sporulation bons, blanc (w) d pigment soluble brun clair. Gélose de malate de calcium Croissance bonne ; envers blanc COBI ; mycélium aérien et sporulation bons, blanc (w) a pas de pigment soluble ; le milieu s'éclaircit autour de la zone de l'inoculum. L'organisme a été étudié au point de vue de certainespropriétés physiologiques choisies selon des modes opératoires classiques. Les propriétés observées et les caractéristiques trouvées sont les suivantes Propriété observée Caractéristiques Action sur le lait Coagulation avec un certain éclaircissement au bout de 14 jours. Réduction des nitrates Positive Production de pigment de mélanine sur Géloses inclinées de peptone Négative et de fer Gélose inclinée de tyrosine Faiblement positive (pigment après 7 jours) Bouillon d'extrait de levure Négative de tryptone Liquéfaction de la gélatine Exigence de température (Milieu ISP N02 : culture inclinée d'extrait de levure et d'extrait de malt) Complète au bout de 14 jours 26-300C : bonne croissance et sporulation 37"C : croissance rare ; pas de mycélium aérien ni de spores 40"C : croissance légèrement végétative seulement 450C : pas de croissance. Les résultats d'essais d'utilisation de carbone effectués avec l'organisme NRRL 8156 sont donnés ci-dessous. Les symboles utilisés pour indiquer la croissance sont les suivants + = bonne croissance, utilisation positive (+) = croissance faible à passable (-) = croissance faible, vraisemblablement pas d'utilisation - = pas de croissance, pas d'utilisation Source de carbone Aucune (témoin négatif) (-) D-glucose (témoin positif) + L-arabinose (-) saccharose (-) i-inositol + D-mannitol + D-fructose + rhamnose (-) raffinose (-) D-xylose (+) Certaines caractéristiqu(s de la souche S. candidus NRRL 8156 productrice de A-35512 diffèrent des caractéristiques de l'organisme décrit par Shirling et Gottlieb (Elwood B Shirling et David Gottlieb, "Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces III. Additional Species Descriptions from First and Second Studies," Intern. J. Systematic Bacteriol. 18(2), 69-189 (1968)) et par Waksnan (S.A. Waksman, "The Actinomycetes. Classification, Identification and Descriptions of Genera and Species," Vol. 2, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Md., 1961).Ces différences sont résumées dans le tableau IV Tableau IV NRRL 8156 Description publiée Utilisation du carbone L-arabinose - + rhamnose - + i-inositol + Liquéfaction de la Complète en Lente gélatine 14 jours Action sur le lait Coagulation ; Pas de coagulation un certain bonne peptonisation éclaircisse ment au bout de 14 jours La culture de candidus Streptomyces utilisée pour la production des antibiotiques A-35512 a été déposée et fait partie de la collection de cultures de Northern Regional Resarch Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, 61604, USA, où elle est accessible au public sous le NONRRL 8156. Comme c'est le cas avec d'autres organismes, les caractéristiques de la culture productrice de A-35512, Streptomyces candidus NRRL 8156, sont sujettes à variation. Par exemple, on peut obtenir des variants et des mutants artificiels de la souche NRRL 8156 par traitement par divers mutagènes connus comme les rayons ultraviolets, les rayons X, les ondes de haute fréquence, les rayons radio-actifs et les produits chimiques. Tous les variants et mutants naturels et artificiels qui appartiennent à Streptomyces candidus et produisent les antibiotiques A-35512 peuvent être utilisés dans cette invention. Le milieu de culture utilisé pour cultiver Streptomyces candidus NRRL 8156 peut être l'un quelconque d'un certain nombre de milieux. Pour des raisons d'économie de production, de rendement optimal et de facilité d'isolement du produit, on préfère cependant certains milieux de culture. Ainsi, par exemple, une source de glucide préférée dans une fermentation à grande échelle est le saccharose, bien que l'on puisse également utiliser le glucose, la dextrine de tapioca, le fructose, le mannitol, le maltose, le lactose, etc.... Une source d'azote préférée est la peptone de viande soluble, bien que la farine de soja, la farine de sang de porc, les amino-acides comme l'acide glutamique, etc..., soient également utilisables.Parmi les sels minéraux nutritifs que l'on peut incorporer dans le milieu de culture, citons les sels solubles courants pouvant fournir des ions zinc, sodium, magnésium, calcium, ammonium, chlorure, carbonate, sulfate, nitrate, etc...' Des oligo-éléments nécessaires à la croissance et au développement de l'organisme doivent également inclus dans les milieux de culture. Ces oligo-éléments se trouvent souvent sous forme d'impuretés dans d'autres constituants du milieu, en quantités suffisantes pour satisfaire les exigences de croissance de l'organisme I1 peut être nécessaire d'ajouter de petites quantités (c'està-dire 0,2 ml/l) d'un agent anti-moussant, comme le propylèneglycol, dans les milieux de fermentation à grande échelle si la formation de mousse pose des problèmes. Pour la production de quantités importantes des antibiotiques A-35512, on préfère la fermentation aérobie en immersion dans des cuves. On peut obtenir des petites quantites des antibiotiques A-35512 par des cultures sur flacons agités. En raison de la perte de temps dans la production antibiotique qui se produit couramment lorsque l'on inocule de grandes cuves avec la forme spore de l'organisme, on préfère utiliser un inoculum végétatif. On prépare l'inoculum végétatif en inoculant un petit volume de milieu de culture avec la forme spore ou des fragments-mycéliens de l'organisme pour obtenir une culture fraîche en cours de croissance active de l'organisme. On transfère ensuite l'inoculum végétatif dans une plus grande cuve. L'organisme producteur de A-35512 peut être cultivé à des températures comprises entre environ 20C et environ 400C. I1 semble que la production optimale de A-35512 se produise à des températures d'environ 30"-340C. Comme il est courant dans les- procédés de culture en immersion aérobie, on insuffle de l'air stérile dans le milieu de culture. Pour une croissance efficace de l'organisme, le volume d'air utilisé dans la production en cuve est de préférence supérieur à 0,1 volume d'air par volume de milieu de culture par minute (V/V/mn). Pour la production efficace des-antibiotiques A-35512, le volume d'air utilisé dans la production en cuve est de préférence environ 0,25 V/V/mn. On peut suivre pendant la fermentation la production des antibiotiques A-35512 en-testant des échantillons du bouillon ou d'extraits des solides myceliens pour déterminer l'activité -anti- biotique vis-à-vis des organismes dont on sait qu'ils sont sensibles aux antibiotiques. Un organisme d'essai utilisable pour tester ces antibiotiques est Bacillus subtilis ATCC 6633. On effectue de préférence le bioessai par un essai sur disque de papier sur des plaques de gélose contenant un milieu limité au point de vue nutritionnel. Après leur production dans des conditions de fermentation aérobie en immersion, on peut recueillir les antibiotiques A-35512 du milieu de fermentation pardesprocédés utilisés dans la technique de la fermentation. L'activité antibiotique produite pendant la fermentation d'un organisme producteur de A-35512 se trouve généralement dans le bouillon filtré. On effectue donc une récupération maximale des antibiotiques A-35512 par une filtration initiale pour éliminer la masse mycélienne. Le bouillon filtré peut être purifié pour obtenir le mélange A-35512, selon diverses techniques. Une technique préféree comprend l'adsorption du bouillon filtré sur une colonne de polyamide et l'élution de la colonne avec des mélanges d'eau et d'alcool aqueux.Les fractions éluées qui présentent une activité antibiotique peuvent être réunies pour donner le mélange A-35512. Ou bien, en utilisant cette technique, on peut réunir les fractions éluées sur la base de leur comportement chromatographie sur couche mince, pour obtenir le facteur B de A-35512 purifié et des mélanges enrichis des autres facteurs de A-35512. Une purification supplémentaire des différents facteurs de A-35512 comprend des modes opératoires supplémentaires d'adsorption et d'extraction. On peut utiliser avantageusement des matériaux adsorbants comme l'alumine, le gel de silice, les résines échangeuses d'ion, etc... Lesfacteursde A-35512 se trouvent dans le bouillon de fermentation sous forme de chlorhydrates. Le procédé de séparation préféré sur polyamide fournit le facteur B de A-35512 et la portion restante du mélange de A-35512 sous forme de chlorhydrates. Chaque facteur séparé peut être transformé en sa base libre (exempte de chlore ionique) par des modes opératoires connus, comme par exemple la chromatographie sur une résine échangeuse d'ion faiblement basique. Ou bien, les solides de la culture, comprenant les constituants du milieu et le mycélium, peuvent être utilisés sans extraction ou séparation, mais de préférence après élimination de l'eau, comme source des antibiotiques A-35512. Par exemple, après production de l'activité antibiotique de A-35512, le milieu de culture peut être séché par lyophilisation et mélange directement dans le prémélange pour aliments. L'aglycone du facteur B de A-35512 est préparé par hydrolyse acide modérée du facteur B de A-35512. Le facteur B de A-35512 est le plus facilement disponible sous sa forme dichlorhydrate. Le dichlorhydrate du facteur B de A-35512 est donc une substance de départ préférée pour la préparation de l'aglycone du facteur B de A-35512. On peut également utiliser le facteur B de A-35512 ou d'autres sels d'addition d'acide du facteur B de A-35512. On effectue l'hydrolyse acide selon des modes opératoires classiques. Bien que l'on puisse utiliser un certain nombre d'acides, on préfère l'acide chlorhydrique pour la préparation de l'aglycone du facteur B de A-35512. Quand on utilise l'acide chlorhydrique, on recueillera l'aglycone du facteur B de A-35512 sous forme du chlorhydrate. On effectue de préférence l'hydrolyse dans l'eau à reflux pendant un temps d'environ 1 à environ 2 heures. Des durées de réaction plus longues entrainent une dégradation de l'aglycone en donnant des produits moins actifs et enfin des produits inactifs. Les durées de réaction optimale pour des conditions de réaction spécifique peuvent être déterminées en vérifiant la bioactivité de parties aliquotes du milieu réactionnel. Le mélange antibiotique A-35512, les facteurs antibiotiques A, B, C, E et H de A-35512 et l'aglycone du facteur B de A-35512 inhibent la croissance de certains organismes pathogènes, en particulier des bactéries gram-positives. Les concentrations inhibitrices minimales (CIM) auxquelles les facteurs A, B, C et H de A-35512 inhibent certaines bactéries, comme déterminé par des essais sur dilution sur gélose classique, sont résumées dans le tableau V. Tableau V CIM ( g/ml) A-35512 A-35512 A-35512 A-35512 Organisme d'essai facteur A.2HCl facteur B.2HCl facteur C.2HCl facteur H.HCl Staphylococcus aureus 3055 6,25 3,12 6,25 25,0 Staphylococcus aureus 3074 25,0 6,25 6,25 25,0 Streptococcus faecalis 6,25 3,12 3,12 12,5 Selon un aspect important, les antibiotiques A-35512 inhibent la croissance d'organismes qui sont résistants d'autres antibiotiques. Dans le tableau VI est résumée l'activité selon l'essai sur plaques et disques classiques des facteurs A, B, C, E et H de A-35512 (30 Ug/disque) vis-à-vis d'organismes types. L'activité est mesurée comme étant le diamètre en mm des zones d'inhibition observées. Tableau VI Diamètres des zones (mm) A-35512 A-35512 A-35512 A-35512 A-35512 Organisme d'essai Facteur A.2HCl Facteur B.2HCl Facteur C.2HCl Facteur E.HCl Facteur H.HCl Staphylococcus aureus 3055 (sensible à la pénicilline G) 13,4 18,4 0 14,4 11,9 Staphylococcus aureus 3074 (résistant à la pénicilline G) 13,2 16,8 0 14,5 11,6 Staphylococcus aureus 3130 (résistant à la méthicilline) 14,4 18,4 0 15,4 12,6 Streptococcus pyogenes (Groupe A) 17,0 19,6 10,5 17,0 16,0 Streptococcus sp. 9960 (Groupe D) 15,5 19,4 0 16,4 13,8 Diplococcus pneumoniae Park I - - 11,0 20,0 - Le tableau VII donne des résultats supplementaires de l'essai de dilution sur gélose pour le dichlorhydrate du facteur B de A-35512, donnant les concentrations inhibitrices minimales vis-àvis de plusieurs Streptocoques du Groupe A et Diplococcus pneumonia. Tableau VII CIM ( g/ml) Organisme d'essai Facteur B de A-35512 Streptococcus pyogenes C203 1 " " 10389 1 " " 12344 8 " " 12961 1 " " 663-72 0,5 " " 664-72 0,5 " " 665-72 1 " " 13234 0,5 " " 19035 0,5 " " M6517 0,5 " " D27781 1 Diplococcus pneumoniae Park I 2 " " Type 14 2 Le tableau VIII donne des résultats supplémentaires des essais de dilution sur gélose pour le dichlorhydrate du facteur B de A-35512 vis-à-vis de plusieurs Streptocoques du Groupe D. Tableau VIII CIM ( g/ml) Organisme d'essai Facteur B de A-35512 Streptococcus sp. D282 2 " " 9901 2 " " 9913 4 " " 9933 4 " " 9960 4 " " 12253F 4 " " Shrigley 4 " " Mitis 4 " " 238 2 " " SS992 4 Le tableau IX donne des résultats supplémentaires de l'essai de dilution sur gélose pour le dichlorhydrate du facteur B de A-35512 vis-à-vis d'autres organismes gram-positifs. Tableau IX CIM (pg/ml) Organisme d'essai Facteur B de A-35512 Staphylococcus aureus 3123* 4 " " H43** 4 " " 3124** 4 " 3126** 2 " " 3127** 4 " " H57** 2 't " 3074** 4 " 3130*** 4 'I " 3131**** 4 " " 3133*** 2 " " 3136*** 2 " " 3125*** 4 Staphylococcus epidermis 3064** 2 " @ 3078* 2 Bacillus subtilis ATCC 6633 2 Sarcina lutea PCI-1001-FDA 1 # sensible à la pénicilline G ex résistant à-la pénicilline G ### résistant à la pénicilline G et à la méthicilline #### résistant à la pénicilline G, à la méthicilline et à la clindamycine. Les antibiotiques A-35512 inhibent également la croissance de certaines bactéries anaerobies. Le tableau X résume l'activité du chlorhydrate du facteur B de A-35512 vis-à-vis de diverses bactéries anaérobies, en utilisant l'essai classique de dilution sur gélose. Tableau X CIM ( > g/ml) Organisme d'essai Facteur B de A-35512 Actinomyces israeîii 0,5 Clostridium perfringens 2,0 Clostridium septicum 4,0 Eubacterium aerofaciens 20 Peptococcus asaccharolyticus 1X0 Peptococcus prevoti 2X0 Peptostreptococcus anaerobius 1,0 Peptostreptococcus intermedius 470 Propionibacterium acnes 0,5 Bacteroides fragilis ssp. fragiles 111 64,0 Fusobacterium necrophorum 8ss0 Le dichlorhydrate du facteur B de l'antibiotique A-35512 présente une activité antimicrobienne in vivo vis-à-vis d'infections bactériennes expérimentales. Quand on administre deux doses souscutanées du facteur B de A-35512 à des souris dans des infections types, l'activité observée est mesurée sous forme de la valeur DE50 [dose efficace en mg/kg pour protéger 50 % des animaux d'essais ; voir Warren Wick et al , J. Bacteriol. 81, 233-235 (1961)3. Les DE50 observées pour le dichlorhydrate du facteur B de A-35512 sont données dans le tableau XI. Tableau XI Organisme d'essai DE50 Dose infectante Streptococcus pyogenes C203 1,75 260 x DL50 (ip) Diplococcus pneumoniae Park I 4,3 60,8 x DL50 (ip) Staphylococcus aureus 3055 6,9 206 x DL50 (ip) Le dichlorhydrate du facteur B de A-35512 fournit également une protection à des cobayes qui ont été infects par Clostridium chauvoei anaérobies (agent responsable du charbon symptomatique chez les bovins). Ces essais sont effectués selon la méthode d'essai définie par U.S.D.A. Supplemental Assay Method for Potency Testing Clostridium chauvoei-containing Products (SAM 200, U.S. Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Veterinary Services Laboratories, Ames, Iowa 50010, April 7, 1975, under 9 C.F.R. 113.91). Les résultats des essais sont donnés dans le Tableau XII. Tableau XII Traitement Témoins infectés % de protégés Morts/total Facteur B de A-35512 10 mg/kga 0/10 100 Facteur B de A-35512 1 mg/kgi 3/10 o Témoins infectés 10/10 o a Administration intramusculaire. L'activité de l'aglycone du facteur B de A-35512, mesurée par des essais classiques de diffusion sur disque (tampons de 6 mm plongés dans des solutions contenant 1 mg de composé d'essai par ml de solution et placés sur des plaques de gélose ensemencées avec l'organisme d'essai) est résumée dans le tableau XIII. Tableau XIII Zone d'inhibition (mm) de l'aglycone du facteur B de A-35512 Organisme d'essai (base libre) Staphylococcus aureus 19 Bacillus subtilis 13 Sarcina lutea 14 Bacillus subtilis* 22 avec gélose limitée sur le plan nutritionnel. Le tableau XIV résume les concentrations inhibitrices minimales (CIM) auxquelles le chlorhydrate de l'aglycone du facteur B de A-35512 est actif vis-à-vis de souches choisies de Staphylococcus aureus, déterminées par des essais classiques de dilution sur gélose. TABLEAU XIV Organisme d'essai CIM ( g/ml) Staphylococcus aureus 3055* 0,5 Staphylococcus aureus H290* 05 Staphylococcus aureus V92* 0Z5 Staphylococcus aureus V104* 0,25 Staphylococcus aureus 3074** 0,25 Staphylococcus aureus H43** 0t5 Staphylococcus aureus V57** 0,5 Staphylococcus aureus H356** 1,0 Staphylococcus aureus 3130*** 0t5 Staphylococcus aureus 3131**** 0t5 # sensible à la pénicilline G ## résistant à la pénicilline G ### résistant à la pénicilline G et à la méthicilline #### résistant à la pénicilline G, à la méthicilline et à la clindamycine. Le tableau XV donne des résultats supplémentaires d'essais de dilution sur gélose pour le chlorhydrate de l'aglycone du facteur B de A-35512 vis-à-vis de plusieurs streptocoques du Groupe D. TABLEAU XV Organisme d'essai CIM ( g/ml) Streptococcus sp. Shrigley 1t0 Streptococcus sp. Mitis 1,0 Streptococcus sp. 12253F 1,0 Streptococcus sp. SS992 1,0 Streptococcus Sp. 9933 1,0 Streptococcus sp. 9913 1,0 Streptococcus sp. 282 1,0 Streptococcus sp. 238 1,0 L'aglycone du facteur B de A-35512 a révélé une activité antibactérienne in vivo vis-à-vis d'infections bactériennes expérimentales. Quand on administre deux doses souscutanées du chlorhydrate d'aglycone de facteur B de A-35512 à des souris dans des infections types, l'activité observée est mesurée par la valeur DE50.Les DE50 observées pour le chlorhydrate de l'aglycone du facteur B de A-35512 sont données dans le tableau XVI. TABLEAU XVI Organisme d'essai DE50 Dose infectante Streptococcus pyogenes C203 5,8 2570 x DL50# (ip) Streptococcus pneumoniae 7,0 374 x DL50 (ip) Staphylococcus aureus 3055 1,04 370 x DL50 (ip) DL50 = dose létale à 50 % Les antibiotiques A-35512 sont relativement non toxiques. Par exemple, la Dodu chlorhydrate du facteur A de A-35512, administre par voie souscutanée à des souris femelles ICR Cox et Harlan ayant jaune, est supérieure à 8000 mg/kg. La DL50 du chlorhydrate du facteur B de A-35512 chez les souris, administré par voie intrapéritonéale, est environ 1356 mg/kg et, administré par voie intraveineuse,est supérieure à 1000 et inférieure à 1250 mg/kg. Le dichlorhydrate du facteur C de A-35512 et le chlorhydrate du facteur E de A-35512 ont tous deux une toxicité aiguë, quand on les administre par voie intrapéritonéale à des souris, qui est supérieure à 300 mg/kg. Une autre propriété importante du mélange et des composés A-35512 est leur aptitude à améliorer l'efficacité de l'utilisation des aliments chez les animaux. Cette aptitude a été démontrée chez les ruminants qui possèdent une fonction du rumen développee. On sait que l'efficacité de l'utilisation des glucides chez les ruminants est augmentée par des traitements qui stimulent la flore du rumen des animaux en donnant des propionates plutôt que des acétates ou des butyrates (pour une discussion plus complète, voir Church et al.in "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants," Vol. 2, 1971, pp. 622 et 625). L'efficacité de l'utilisation des aliments peut être mesurée par des essais in vivo chez du bétail muni d'une fistule, en utilisant la méthode décrite par Arthur P. Raun dans le brevet des E.U.A. N03.794.732 (voir en particulier l'Exemple 8). Le tableau -XVII résume les résultats d'un tel essai avec le dichlorhydrate du facteur B de A-35512, où les concentrations en acide propionique -dans le rumen, en pourcentage molaire, sont la moyenne de cinq analyses pendant une. période de traitement de 21 jours. Tableau XVII Traitement Nombre % molaire moyen % molaire d'aug d'animaux d'acide propionique mentation par rapport au témoin Témoin 5 19,3 Facteur B de A-35512 50 g/tonne 5 26,0 6,7 Le mélange et les composés A-35512 sont typiquement efficaces dans l'augmentation des'propionates, et donc dans l'efficacité de l'utilisation alimentaire, quand on les administre aux ruminants par voie orale à des doses d'environ 0,15 à environ 10,0 mg/kg et par jour. On obtient les résultats les plus intéressants à des doses d'environ 1,0 à environ 2,0 mg/kg et par jour. Une méthode préférée d'administration du mélange ou des composés A-35512 consiste à les mélanger à la nourriture des animaux ; cependant, on peut les administrer d'autres manières, par exemple sous forme de comprimés, de potions, de bols ou de capsules.La formulation de ces diverses formes posologiaues peut être effectuée par des procédés bien connus en pharmacie vétérinaire. Chaque unité posologique séparée doit contenir une quantité de mélange ou de composé A-35512 directement reliée à la dose quotidienne appropriée de l'animal à traiter. Le mélange et les composés A-35512 sont également utiles comme agents promoteurs de la croissance chez les animaux. Dans des essais utilisant des poulets à une taille de consommation, le dichlorhydrate du facteur B de A-35512 ajouté à la nourriture à une dose de 20 g par tonne améliore les gains de poids et augmente l'efficacité des aliments. Le tableau XVIII résume les résultats de ces essais dans une étude en batterie en utilisant quatre lots de huit poulets pour chacun des essais refaits deux fois. Tableau XVIII Traitement Conc. Gain de % d'amélioration Efficacité des % d'amélioration (g/tonne) poids (g) par rapport au aliments par rapport au témoin témoin Témoin -- 380 --- 1,850 --- Facteur B de A-35512 20 394 3,68 1,776 4,00 Le Tableau XIX résume les résultats de ces essais dans une étude en poulailler utilisant douze groupes de quatre vingt volailles chacun. Tableau XIX % d'amélioration % d'amélioration Conc. Gain de par rapport au Efficacité des par rapport au Traitement (g/tonne) poids (g) témoin aliments témoin Témoin -- 1898 ---- 2,250 --- Facteur B de A-35512 20 1956* 3,06 2,177* 2,81 * p # 0,05 Le mélange et les composés A-35512 sont typiquement efficaces en ce qui concerne la promotion de la croissance chez la volaille, quand ils sont administrés avec la nourriture des animaux à des doses d'environ 1 à environ 100 g de mélange ou de composé A-35512 par tonne d'aliment pour animaux. Pour illustrer plus complètement la mise en oeuvre de cette invention, on donne les exemples suivants. EXEMPLE 1 A. Fermentation en flacon agité de A-35512 On dissout une pastille lyophilisée de Streptomyces candidus NRRL 8156 dans 1-2 ml d'eau distillée. On utilise cette solution pour inoculer une culture inclinée sur gélose d'extrait de malt et de levure Bacto (ISP N02, Difco Laboratories, Detroit, Michigan USA). La culture sur gélose inclinée inoculée est incubée à 30"C pendant environ 7 jours. On recouvre la culture inclinée mûre avec 2 ml d'eau et on gratte avec une pipette stérile pour détacher les spores. On utilise une portion de 0,1 ml de cette suspension aqueuse de spores pour inoculer une autre culture inclinée sur gélose de ISP N 2. On fait incuber cette culture inclinée inoculée à 300C pendant environ 7 jours. On recouvre la culture inclinée mure avec 5 ml d'eau et on gratte avec une pipette stérile pour libérer les spores. On utilise 2,5 ml de la suspension résultante de spores pour inoculer 50 ml d'un milieu végétatif ayant la composition suivante : Ingrédient Quantité Bouillon de soja et trypticase 30 g (Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville, Md, USA) Eau (désionisée) q.s. 1 litre On fait incuber le milieu végétatif incoculé dans un flacon d'Erlenmeyer de 250 ml, à 300C pendant 48 heures sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 t/mn. On utilise 0,5 ml de ce milieu végétatif incubé pour inoculer 50 ml d'un milieu de production ayant la composition suivante Ingrédient Quantité (g/l) Dextrine de tapioca 25,0 Glucose 10,0 NH4NO3 2,5 Ingrédient Quantité KC1 1,5 MgSO4 1,1 FeCi2 .4H2O 0,03 ZnCl2 0,03 gH2Po4 0,1 Acide L-glutamique 1,0 DL-citrulline 0,1 CaCO3 5,0 Eau désionisée q.s. 1 litre On fait incuber le milieu de production inoculé, dans un flacon d'Erlenmeyer de 250 ml, à 320C pendant 8 à 10 jours sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 t/mn. B. Fermentation en cuve de A-35512 Pour obtenir un plus grand volume d'inoculum, on utilise 20 ml du milieu végétatif incubé préparé comme décrit précédemment, pour inoculer 400 ml d'un milieu de culture végétatif de second stade ayant la même composition que le milieu végétatif. Ce milieu de second stade est incubé dans un flacon de 2 litres pendant 24 heures à 320C sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 t/mn. On utilise 800 ml du milieu végétatif de second stade incubé ainsi obtenu pour inoculer 100 litres de milieu de production stérile. On laisse fermenter le milieu de production inculé dans une cuve de fermentation de 165 litres pendant environ 8 à 10 jours - @ une température de 32 C. On aère le milieu de fermentation avec de l'air stérile à un débit de 0,5 V/V/mn et on agite avec des agitateurs classiques à 200 t/mn. EXEMPLE 2 On peut également conserver le milieu végétatif incubé préparé comme décrit dans l'Exemple 1, A, pour l'utiliser par la suite, en le maintenant dans la phase vapeur de 1'azote liquide, selon le mode opératoire suivant dans un petit (13 x 100 mm) tube à bouchon à vis stérilisé, on place 2 ml d'un agent de mise en suspension ayant la composition suivante Ingrédient Quantité Glycérol 20 % Lactose 10 % Eau (desionisée) 70 % A cet agent de mise en suspension, on ajoute 2 ml d'un milieu végétatif incubé 48 heures préparé comme décrit précédemment. On congèle la solution et on la conserve dans la phase gazeuse d'une cuve à azote liquide. On décongèle le milieu végétatif ainsi conservé, pour l'utiliser dans une fermentation en agitateur ou en cuve, en plaçant l'ampoule dans un bain-marie à 430C. On utilise une portion de la solution décongelée (1 ml) dans l'ampoule, pour inoculer 50 ml d'un milieu végétatif ayant la même composition que celle donnée dans l'Exemple 1, A, on utilise le milieu végétatif inoculé, comme décrit dans l'Exemple 1, soit pour une fermentation en flacon agité soit pour obtenir un inoculum plus grand pour une fermentation en cuve. EXEMPLE 3 On effectue la fermentation selon la méthode de l'Exemple 1, mais en utilisant un milieu de production flacon agité/cuve, ayant la composition suivante Ingrédient Quantité (g/li Dextrine de tapioca 75,0 Mélasse 40,0 Peptone de viande soluble 15,0 MgSO4.7H2O 0,5 CaCO3 2,0 Eau q.s. 1 litre EXEMPLE 4 Séparation du mélange antibiotique A-35512 On filtre le bouillon de fermentation entier (945 litres), obtenu comme décrit dans l'Exemple 1, en utilisant un adjuvant de filtration (Hyflo Super-cel, terre de diatomées, Johns-Manville Products Corp.) au pH du milieu (pH 6,8-7,2). On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu sur une colonne contenant 10 ml d'adsorbant polymère (Amberlite XAD-4, Rohm and Haas Co.) pour 100 ml de filtrat de bouillon, à un débit de 150 ml/mn.On détermine l'activité biologique des fractions ainsi obtenues en utilisant un essai classique sur disque vis-à-vis de Sarcina lutea. On rejette l'effluent inactif sur le plan biologique. On lave la colonne à l'eau (1/8 du volume de bouillon) à un débit de 150 ml par minute. On rejette les eaux de lavage inactives. Puis on élue la colonne avec une solution méthanolique aqueuse à 50 % (600 litres) à un debit de 200 ml/mn. On concentre sous vide l'éluat contenant le mélange antibiotique A-35512, jusqu'à un volume de 15 litres contenant environ 200 g de mélange antibiotique 1-35512 par litre. EXEMPLE 5 Séparation des facteurs du mélange antibiotique A-35512 On chromatographie sur une colonne de polyamide (Woelm, 100 1) le mélange antibiotique A-35512 (environ 3000 g dissous dans 15 1 de méthanol), obtenu comme décrit dans l'Exemple 4. On élue la colonne avec de l'eau désionisée à un débit d'environ 80 à 120 ml par minute. On contrôle les fractions en utilisant la chromatographie sur couche mince de cellulose ou la chromatographie sur papier, un système de solvant n-butanol:pyridine:acide acétique:eau (15:10:3: 12) et une bioautographie par Sarcina lutea. On rejette les 100 premiers litres d'éluat. Puis on fait passer le débit à environ 160-200 ml par minute et l'on recueille des fractions de 12 litres. On recueille de cette manière 20 fractions. A ce moment, on change le solvant d'éluant pour un gradient d'eau et de méthanol en utilisant le mode opératoire suivant On siphone un conteneur contenant 360 litres de méthanol dans un conteneur retenant 120 litres d'eau. Dans le conteneur d'eau, on agite la solution de mélange et on l'introduit dans la colonne. On recueille 24 fractions de 24 litres chaque à un débit de 200 à 300 ml/mn. En se basant sur les résultats de la bioautographie, on réunit des groupes de fractions et on les évapore à siccité sous vide, pour obtenir le dichlorhydrate du facteur B de A-35512 et les mélanges enrichis suivants de facteurs Fractions Vol. (litres) Facteur(s) Poids 1-10 120 A+H i 192 g 11-24 216 B 269 g 25-31 168 B+C 590 g 32-44 312 C,E,F,G 224 g EXEMPLE 6 Purification du facteur B de A-35512 On dissout 400 g du dichlorhydrate du facteur B de A-35512 partiellement purifié, obtenu comme décrit dans l'Exemple 5, dans 1,2 1 de méthanol aqueux à 50 % et on chromatographie sur une colonne d'alumine préparée comme suit On agite 10 kg d'oxyde d'aluminium acide (M. Woelm) dans une solution de méthanol aqueux à 50 %. Après avoir laissé le mélange reposer, on décante et on rejette la liqueur surnageante.On agite de nouveau l'alumine avec du méthanol aqueux à 50 % et on l'introduit dans une colonne ayant un diamètre de 13,5 cm. On lave la colonne d'alumine avec du méthanol aqueux à 50 % jusqu'à obtention d'un effluent limpide. On élue la colonne avec du méthanol aqueux à 50 % à un débit d'environ 8 à 10 ml/mn, en recueillant des fractions ayant un volume d'environ 240 à 300 mi. On contrôle les fractions par bioautographie sur couche mince comme décrit dans l'Exemple 5. En se basant sur ces résultats, on réunit les fractions et on obtient le dichlorhydrate du facteur B de A-35512 purifié, comme suit Fractions Poids 17-21 9,6 g 22-29 72,0 g 30-37 117,0 g On cristallise chacune de ces récoltes dans une solution de méthanol dans l'eau à 50 %, à 40C. Le dichlorhydrate du facteur B de A-35512 ainsi purifié contient environ 4,6 % de chlore. Une solution du dichlorhydrate du facteur B de A-35512 dans du diméthylformamide aqueux à 66 % a un pH d'environ 6,5. EXEMPLE 7 Préparation du facteur B de A-35512 exempt de chlore libre On fait passer 1 g de dichlorhydrate de facteur B de A-35512 purifié, obtenu comme décrit dans l'Exemple 6 et dissous dans 40 ml d'eau, sur une colonne échangeuse d'ion 2,5 x 18 cm (Bio-Rad AG3-4X, dans le cycle OH ) à un débit de 0,5 ml/mn, en éluant avec de l'eau désionisée. On rejette les 5 premiers ml d'éluat. On évapore les 50 ml suivants d'éluat à siccité sous vide, ce qui donne 0,76 g du facteur B de A-35512 exempt de chlore libre, sous forme de poudre blanche, contenant environ 1,59 % de chlore. Une solution de ce facteur B de A-35512 exempt de chlore ionique, dans le diméthylformamide aqueux à 66 %, a un pH de 9,13. EXEMPLE 8 Purification du facteur A de A-35512 On dissout dans 5 ml de méthanol aqueux à 50 % 1 g du dichlorhydrate du facteur A de A-35512 partiellement purifié, obtenu comme décrit dans l'Exemple 5 (fraction 1-10). On chromatographie cette solution sur une colonne d'alumine acide 3 x 16 cm (M. Woelm), préparée comme décrit dans l'Exemple 5. On élue la colonne avec du méthanol aqueux à 50 % à un débit de 0,5 ml/mn. On recueille des fractions ayant un volume de 5 ml. On analyse toutes les fractions par bioautographie sur couche mince comme décrit dans l'Exemple 5. En se basant sur ces essais, on réunit les fractions 7 à 15, on les concentre sous pression réduite jusqu'à un petit volume et on les lyophilise, ce qui donne 0,3 g du dichlorhydrate du facteur A de A-35512 (4,71 % de chlore). EXEMPLE 9 Préparation du facteur A de A-35512 exempt de chlore ionique On dissout dans 10 ml d'eau 200 mg de dichlorhydrate du facteur A de A-35512 préparé comme décrit dans i'Exemple 8 ; on fait passer cette solution dans une colonne échangeuse d'ion de 1,5 x 10 cm (Bio-Rad AG3-4X, dans le cycle OH ) à un débit de 0,5 ml/mn, en éluant avec de l'eau désionisée. On rejette les 10 ml d'éluat initial. On concentre les 20 ml d'éluat suivants jusqu'à un petit volume sous pression réduite puis on lyophilise, ce qui donne 115 mg du facteur A de A-35512 exempt de chlore ionique. EXEMPLE 10 Purification du facteur C de A-35512 On dissout dans 40 ml d'eau désionisée 15 g du-dichlorhydrate du facteur C de A-35512 partiellement purifié, obtenu comme décrit dans l'exemple 5 (fractions25-31). On applique cette solution sur une colonne de polyamide de 4 x 115 cm (MN, inférieur à 0,07 mm, Brinkman Instruments, Inc. ; préparée dans l'eau et lavée pendant une nuit à l'eau}. On élue la colonne avec de l'eau désionisée à un débit d'environ 3 ml/mn. On rejette les 250 premiers ml d'éluant; puis on recueille des fractions ayant un volume de 24 ml. On contrôle les fractions par bioautographie par chromatographie sur couche mince. On utilise des plaques de chromatographie sur couche mince de cellulose (sur feuilles d'aluminium ; E. Merck, République Fédérale d'Allemagne), un système de solvant de s-butanol: pyridine:acide acétique:eau (10:10:3:8) et Bacillus subtilis comme organisme de détection. En se basant sur les résultats de la CCM, on réunit les fractions 1 à 33, on les concentre sous vide jusqu'à un volume de 150 ml et on les lyophilise. On chromatographie deux lots supplémentaires de dichlorhydrate du facteur C de A-35512 partiellement purifiés, en utilisant les mêmes conditions. On réunit chaque fois les fractions 1 à 33, on les concentre sous vide à 150 ml et on les lyophilise. On réunit les 3 échantillons lyophilisés des trois colonnes, ce qui donne 12,3 g de dichlorhydrate du facteur C de A-35512 partiellement purifie. On purifie ensuite ce dichlorhydrate du facteur C de A-35512 par chromatographie sur une autre colonne de polyamide comme décrit précédemment, mais en recueillant des fractions ayant un volume de 15 mi, à un débit de 1 ml/mn. On contrôle de nouveau les effluents par bioautographie sur couche mince. On réunit les fractions 36 à 58, on les concentre sous vide jusqu un volume de 150 ml et on les lyophilise, ce qui donne 5,3 g de dichlorhydrate du facteur C de A-35512 encore plus purifié. La purification finale du dichlorhydrate du facteur C de A-35512 se fait par chromatographie sur une colonne d'oxyde d'aluminium acide (Woelm) 5 x 41 cm. On garnit la colonne et on la lave avec du méthanol aqueux à 50 %. Quand l'effluent de lavage est limpide, on dépose sur la colonne le facteur C de A-35512 (5,3 g dissous dans 30 ml de méthanol aqueux à 50 t). On élue la colonne avec du méthanol aqueux à 50 % à un débit de 1 ml/mn. On recueille des fractions ayant un volume de 12 ml et on les contrôle par bioautographie sur CCM comme décrit précédemment. On réunit les fractions 22 à 74, on les concentre sous vide jusqu'à un volurrede 250 ml et on les lyophilise, ce qui donne 3,86 g du dichlorhydrate du facteur C de A-35512. EXEMPLE 11 Préparation du facteur C de A-35512 exempt de chlore ionique On chromatographie 200 mg de dichlorhydrate du facteur C de A-35512, préparé comme décrit dans l'Exemple 10, sur une résine échangeuse d'ion faiblement basique, en utilisant le mode opératoire donné dans l'Exemple 9, ce qui donne 156 mg du facteur C de A-35512 exempt de chlore ionique. Ce facteur C de A-35512 exempt de chlore ionique contient environ 1,90 % de chlore. EXEMPLE 12 Purification du facteur E de A-35512 On dissout dans 40 ml d'eau désionisée 8,1 g du chlorhydrate du facteur E de A-35512 partiellement purifié, obtenu comme décrit dans l'Exemple 5 (fractions 32-44). On applique cette solution sur une colonne de polyamide de 5 x 110 cm (MN, Instruments, Inc.), préparée dans l'eau et lavée à l'eau pendant une nuit. On élue la colonne avec de l'eau désionisée à un débit de 20 ml toutes les 15 minutes, en recueillant des fractions ayant un volume de 20 ml. A la fraction 118, on change le solvant d'élution et l'on utilise du méthanol aqueux à 50 %. On contrôle les fractions par bioautographie sur CCM comme décrit dans l'Exemple 10. Les fractions 148 à 195 contiennent le facteur E de A-35512. On réunit ces fractions, on les concentre sous pression réduite jusqu'à un volume de 150 ml et on les lyophilise, ce qui donne 2,7 g du chlorhydrate du facteur E de A-35512. On dissout 615 mg de ce chlorhydrate du facteur E de A-35512 partiellement purifié, dans 5 ml de méthanol aqueux à 50 % et on l'applique sur une colonne d'oxyde d'aluminium acide (Woelm) de 1,5 x 50 cm, qui a été préparéedans l'eau et lavceavec du méthanol aqueux à 50 % jusqu'à ce que l'effluent soit limpide. On élue la colonne avec du méthanol aqueux à 50 % à un débit de 1 ml/mn, en recueillant des fractions ayant un volume de 10 ml. On contrôle de nouveau les fractions par bioautographie sur CCM. On réunit les fractions 5-8 et on les concentre sous pression réduite jusqu'à un volume d'environ 10 ml. On ajoute environ 50 ml d'eau désionisée et on lyophilise la solution résultante, ce qui donne 480 mg du chlorhydrate du facteur E de A-35512. EXEMPLE 13 Préparation du facteur E de A-35512 exempt de chlore ionique On chromatographie 200 mg du chlorhydrate du facteur E de A-35512, préparé comme décrit dans l'Exemple 12, sur une résine échangeuse d'ion faiblement basique, en utilisant le mode opératoire donné dans l'Exemple 9, ce qui donne 170 mg du facteur E de A-35512 exempt de chlore ionique. Ce facteur E de A-35512 exempt de chlore ionique contient environ 1,72 % de chlore. EXEMPLE 14 Purification du facteur H de A-35512 On dissout 30 g du chlorhydrate du facteur H de A-35512 partiellement purifié, obtenu comme décrit dans l'Exemple 5 (fractions 1-10), dans une quantité minimale d'une solution 7:3 de méthanol et d'eau. On adsorbe la solution résultante sur une colonne d'oxyde d'aluminium acide (3 x 60 cm ; Woelm ; garniedans le méthanol et diluée avec du méthanol jusqu'à ce que l'effluent soit limpide). Puis on élue la colonne avec du méthanol à un débit de 4 ml/mn. On recueille des fractions ayant un volume de 24 ml. On change le solvant d'élution à la fraction 39 pour un mélange 1:1 de méthanol et d'eau. On contrôle les fractions par chromatographie sur couche mince en utilisant un système de solvant de chloroforme:méthanol: hydroxyde d'ammonium (2:3:1) et une bioautographie par Bacillus subtilis à un pH alcalin. On réunit les fractions 51 à 118 et on les évapore sous vide, ce qui donne 6,4 g du chlrohydrate du facteur H de A-35512 purifié. EXEMPLE 15 Préparation du facteur H de A-35512 exempt de chlore ionique On chromatographie 200 mg du chlorhydrate du facteur H de A-35512, préparé comme décrit dans l'Exemple 14, sur une résine échangeuse d'ion faiblement basique, en utilisant le mode opératoire donné dans l'Exemple 9, ce qui donne 143 mg du facteur H de A-35512 exempt de chlore ionique. Le facteur H de A-35512 exempt de chlore ionique contient environ 1,59 % de chlore. EXEMPLE 16 Préparation de l'aglycone du facteur B de A-35512 On dissout dans 200 ml d'eau 5,0 g du dichlorhydrate du facteur B de A-35512, obtenu comme décrit dans l'Exemple 6. On acidifie cette solution avec 14 ml d'acide chlorhydrique 4N. On chauffe la solution résultante à reflux pendant 2 heures. Puis on refroidit la solution et on l'évapore sous vide jusqu a environ les 3/4 de son volume initial. On ajoute goutte à goutte à cette solution de l'acide chlorhydrique 6N jusqu'à ce que la précipitation soit complète. On sépare par filtration le précipité résultant et on le sèche, ce qui donne 3,56 g du chlorhydrate de l'aglycone du facteur B de A-35512 brut. On concentre le filtrat et on l'analyse. Le filtrat contient du glucose, du fucose, du mannose et du rhamnose. On purifie l'aglycone du facteur B de A-35512 brut par chromatographie sur alumine lavé à l'acide (Woelm, Qualité I), en utilisant un système solvant eau:méthanol (1:9). On contrôle l'élution de la colonne par chromatographie sur couche mince de cellulose. On réunit les fractions éluées contenant l'aglycone du facteur B de A-35512 et on les évapore sous vide, ce qui donne 398 mg de produit partiellement purifié. Les résultats d'une chromatographie comparative sur couche mince, en utilisant pour la détection une pulvérisation de ninhydrine, confirment que des impuretés non biolooiquement actives sont encore présentes. On purifie encore une portion de cet aglycone du facteur B de A-35512 partiellement purifié (100 mg) par chromatographie sur polyamide (4 g ; Machery, Nagel & Co.MN-SC-6, distribué par Brinkmann Instruments Co. ; On contrôle également cette colonne par chromatographie sur couche mince de cellulose comme décrit précédemment. On réunit les fractions éluées contenant l'aglycone du facteur B de A-35512 et on les lyophilise, ce qui-donne 64 mg du chlorhydrate de l'aglycone du facteur B de A-3SS12 purifié (rendement total de 5,08 % par rapport au facteur B de A-35512 de départ). EXEMPLE 17 Préparation de la base libre de l'aglycone du facteur B de A-35512 On dissout dans 30 ml d'un mélange 1:1 de méthanol et d'eau 90 mg du chlorhydrate de l'aglycone du facteur B de A-35512, obtenu comme décrit dans l'Exemple 16. On neutralise cette solution avec une résine échangeuse d'ion C3t5 ml, Bio-Rad AG-3-4X (OH-)]. On agite la solution résultante pendant 15 minutes à la température ambiante. Puis on enlève la résine par filtration. On concentre le filtrat sous vide, en maintenant la température à une valeur inférieure à 600C, jusqu'à environ mi-volume, puis on lyophilise, ce qui donne 68 mg de la base libre de l'aglycone du facteur B de A-35512. REVENDICATIONS 1. Mélange antibiotique A-35512 comprenant Le facteur A de l'antibiotique A-35512 quiest un ocOposé basique amorphe et blanc, ayant une composition élémentaire approximative de 54,29% de carbone, 5,19% d'hydrogène, 5,58t d'azote, 33,768 d'oxygène et 1,69% de chlore ; et qui sous sa forme dichlorhydrate est un composé amorphe blanc qui a les caractéristiques suivantes a) une composition élémentaire approximative de51,01% de carbone, 5,10% d'hydrogène, 4,75% d'azote, 34,20% d'oxy gène et 4,80% de chlore b) un spectre d'absorption infrarouge, en pastilles de XBr, avec des maxima d'absorption significatifs aux fréquences suivantes (cm 1) : 3405 (fort), 3300 (épaulement), 2950 (faible), 1750 (faible), 1670 (fort), 1625 (épaulement); 1602 (fort), 1520 (fort), 1470 (faible), 1440 (faible), 1405 (faible), 1345 (épaulement), 1312 (moyen), 1225 (moyen), 1180 (faible), 1130 (faible), 1080 (fort), et 1020 (épaulement) ; c) des spectres d'absorption ultraviolettes, dans le méthanol acide et neutre, avec un maximum d'absorption à 280 nm (# 11700) et dans le méthanol basique, un maximum d'absor tion à 292 nm (# 14000) et avec une absorption finale à 225 nm d) un poids moléculaire, détermine par titrage, d'environ 2106 ;; e) quatre groupements titrables dans le diméthylformamide aqueux à 66% avec des pKa d'environ 7,35, 9,09, 10,49 et 12,44 f) les pouvoirs rotatoires suivants 25 - 100 (c 1, H20) D [&alpha;]36525 - 400 (c 1, H2O) g) il est soluble dans l'eau, partiellement soluble dans le méthanol et l'éthanol et insoluble dans le benzène, le chloroforme, l'acétone, l'éther diéthylique, l'acétate d'éthyle, le toluène, l'hexane, l'acétonitrile et le dioxanne h) une analyse des amino-acides indiquant la présence d'au moins cinq restes amino-acides dont l'un est la glycine ; i) un R f d'environ 0,21 par chromatographie sur papier dans un système solvant l-butanol : pyridine : acide acétique eau (15:10:3:12), en utilisant Sarcina lutea comme organis me de détection j) un spectre de résonance magnétique nucléaire du carbone C dans D20 ayant les caractéristiques suivantes N PPP Hauteur (%) 3 17513 018 4 173,0 2,1 5 172,1 2,0 6 171,4 1,5 7 170,9 2,7 8 170,5 2,3 9 169,5 1,6 10 159,0 1,3 11 157,9 2,3 12 156,2 2,6 13 155,6 2,3 14 155,3 2,4 15 154,4 1,1 16 136î3 1,4 17 136,0 1,0 18 135,1 1,4 19 133,5 1t2 20 129,6 1,6 21 129,1 1,7 22 128f7 1,8 23 127X5 110 24 126,0 1,4 25 124,3 2,8 26 122,1 1,6 27 109,9 1,3 28 107,4 1,6 29 101,7 0,9 30 77,6 3,8 31 7613 4,6 32 7575 2t6 33 74,8 2,5 34 74,5 2,4 35 73,4 3,7 36 7218 6f0 37 72,0 4,4 38 7019 7,0 39 69,6 2,8 40 6714 90,9* q 41 65,4 1,7 42 61 7 3,1 43 56,7 117 44 55,5 1,3 45 54,7 0,8 46 24,6 0r9 47 19,1 1,7 48 17,9 2,0 49 17r 2 1,9 5-0 16,7 3,2 51 16,2 3,0 k) est stable pendant 72 heures dans des solutions aqueuses ayant un pH d'environ 3 à environ 10 ; le facteur B de l'antibiotique A-35512 qui est un composé basique amorphe blanc ayant a) une composition élémentaire approximative de 53,97% de carbone, 4,75% d'hydrogène 5,25% d'azote ; 34,29% d'oxy gène et 1,59 de chlore b) des spectres d'absorption ultraviolette dans le méthanol acide et neutre, avec un maximum d'absorption à 282 nm (E 15000) et, dans le méthanol basique, un maximum d'absorp tion à 292 nm ( #16000) ; c) un poids moléculaire d'environ 2143, déterminé par titrage d) quatre groupements titrables dans le diméthylformamide aqueux à 66% avec despKa d'environ 7,15, 8,81, 10,20 et 12,0 e) les pouvoirs rotatoires suivants 25 D5 - 1230 (c 1, H20) La] 23565 4460 (c 1, H20) f) une formule empirique dans l'intervalle de C97-99H101-105N8-9O46-48Cl ; et qui, sous sa forme dichlorhydrate, est un composé cristallin hygroscopique blanc (cristallisé dans le méthanol aqueux à 50%) qui a les caractéristiques suivantes a') une composition élémentaire approximative de 52,57% de carbone, 4,80% d'hydrogène, 5,66% d'azote, 32,86% d'oxy gène et 4,51% de chlorure b') un spectre d'absorption infrarouge, en pastilles de KBr, avec des maxima d'absorption significatifs aux fréquences suivantes (cm-1) 3420 (fort), 3300 (épaulement), 2950 .(faible), 1752 (faible), 1675 (fort), 1630 (épaulement), 1605 (fort), 1520 (fort), 1470 (faible) 1440 (faible), 1410 (faible), 1345 (épaulement), 1312 (moyen), 1225 (moyen), 1180 (faible), 1135 (faible), 1080 (fort) et 1020 (faible) ;; c') des spectres d'absorptiqn ultraviolette, dans le méthanol acide et neutre, avec un maxima d'absorption à 282 nm ( # 12000) et dans le méthanol basique, un maximum d'ab sorption à 292 nm (E14000), et avec une absorption finale à 225 nm d') un poids moléculaire, déterminé par titrage, d'environ 2027 e') quatre groupements titrables dans le diméthylformamide aqueux à 70% avec des pKa d'environ 7,15, 8,87, 10,30 et 12,10 f') les pouvoirs rotatoires suivants [&alpha;]D@@ - 128 (c 1, H2O) [&alpha;;] 365 - 4750 (c 1, H20) g') il est soluble dans l'eau, partiellement soluble dans le méthanol et l'éthanol, et insoluble dans le benzène, le chloroforme, l'acétone, l'éther diéthylique, l'acétate d'éthyle le toluène,l'hexane, l'acétonitrile et le dioxanne; h') une analyse des amino-acides indiquant la présence d'au moins 5 restes amino-acides dont l'un est la glycine i') un Rf d'environ 0,34 par chromatographie sur papier dans un système solvant l-butanol : pyridine : acide acétique eau (15:10:3:12), en utilisant Sarcina lutea comme orga nisme de détection ; j') un spectre de résonance magnétique nucléaire du carbone C1@ dans D2 O avec les caractéristiques suivantes N PPM hauteur (%) 2 17310 4,1 3 171,9 3,7 4 171r6 3,3 5 171,0 5,8 6 170,8 5,0 7 169,6 3,6 8 15970 4,1 9 157,9 4,4 10 157,5 3,7 11 156,6 4,8 12 155,6 6,1 13 155,3 4,2 14 154,9 3,3 15 154,3 4,2 16 151,7 313 17 144,3 3,1 18 136,7 3,5 19 136,2 4,9 20 13514 4,0 21 135,2 4,4 22 133,6 4,2 23 133,3 4,1 24 129t8 1,7 25 129,3 3,0 26 128,8 2,6 27 127,6 1,5 28 126,1 3,9 29 12412 516 30 122ss4 1,4 31 12210 4,4 32 120,7 3,3 33 11615 2t7 34 109,5 0,8 35 108,2 1,1 36 10717 217 37 104,5 1,7 38 101,8 2,9 39 100,9 1,6 40 98,3 1,0 41 76,9 1,2 42 76,1 1,8 43 74,1 270 44 73,5 2r7 45 72r7 214 46 72,3 4,0 47 71,0 7,1 48 70,3 2,5 49 69,7 2,5 51 64,6 1,2 52 62,0 1,5 53 58r0 113 54 56,8 1,7 55 55r4 3r9 56 54,3 2,5 57 24,5 2,0 58 17t9 3,0 59 17,2 2,0 60 16,3 2;5 k') est stable pendant un temps allant jusqu'à 72 heures dans des solutions aqueuses ayant un pH d'environ 3 à environ 10 1') un diagramme de diffraction des rayons X sur poudre (rayonnement Cu++, 1,5405 #, filtre de nickel) ayant les espacements interplanaires (d) suivants en angströms :: d Intensité relative 17,15 100 12,90 80 10185 70 9,25 70 8,87 60 8,22 50 7r86 50 6193 40 6,20 40 5,62 40 5,04 05 4,02 02 3t54 02 m') il contient les sucres suivants : glucose, fucose, mannose, rhamnose, et 3-amino-2,3,6-tridésoxy-3-C-méthyl-L-xylo hexopyranose n') il a au moins un groupement hydroxy, susceptible d'esté rification le facteur C de l'antibiotique A-35512, qui est un composé basique amorphe blanc ayant a) une composition élémentaire approximative de 53,13% de carbone, 5,15% d'hydrogène, 5,80% d'azote, 32,35% d'oxygène, et 1,86% de chlore b) une formule empirique d'environ C84HggN8038Cl, en se basant sur la composition élémentaire c) un poids moléculaire d'environ 1862 ; et qui sous sa forme dichlorhydrate, est un composé amorphe blanc qui a les caractéristiques suivantes a') une composition élémentaire approximative de 51,768 de carbone, 5,07% d'hydrogène, 5,61% d'azote, 30,29% d'oxy gène et 4,88% de chlore b) un spectre d'absorption infrarouge, en pastilles de KBr, avec des maxima d'absorption significatifs aux fréquences suivantes (cm 1) : 3370 (fort), 3280 (épaulement), 3040 (épaulement), 2980 (épaulement), 2920 (faible), 1740 (fai ble), 1658 (fort), 1620 (faible), 1589 (moyen), 1503 (fort), 1460 (faible), 1428 (moyen), 1385 (faible), 1330 (faible) , 1295 (moyen), 1210 (fort), 1162 (moyen), 1120 (faible), 1060 (fort) et 1005 (moyen) ; c') des spectres d'absorption ultraviolette avec un maximum d'absorption dans le méthanol acide et neutre, à 282 nm ( # 14600) et dans le méthanol basique, à 292 nm ( & 6400) ;; d') un poids moléculaire déterminé par titrage, d'environ 1982 e') trois groupements titrables dans le diméthylformamide à 66% avec des pKa d'environ 7,30, 8,92 et 10,99 f') les pouvoirs rotatoires suivants [&alpha;] 25 - 1610 (c 1,05, H2O) 25 23565 - 6140 (c 1,05, H20) g') il est soluble dans l'eau, le diméthylsulfoxyde, et le le diméthylformamide aqueux, partiellement soluble dans le méthanol et l'éthanol, et insoluble dans le benzène, le chloroforme, 11 acétone, l'éther diéthylique, l'acétate d'éthyle, le toluène, l'hexane, l'acétonitrile et le di oxanne h') une analyse des amino-acides indiquant la présence de cinq restes amino-acides dont l'un semble être la glycine i') un R f d'environ 0,46 sur chromatographie sur papier dans un système solvant l-butaanol:pyridine:acide acétique: eau (15:10:3::12), en utilisant Sarcina lutea comme organisme de détection j') un spectre de résonance magnétique nucléaire du carbone C13 dans D2 O avec les caractéristiques suivants N PPM Hauteur (%) 1 172,9 2,5 2 172,2 2,0 3 171,5 2r2 4 171rO 3,9 5 169,6 2,0 6 158î6 1,8 7 157,8 3,0 8 156,5 2,1 9 156,1 2,8 10 155,6 4t2 11 154,6 3,9 12 151,1 1,5 13 143,3 1,4 14 136,0 3,2 15 135,4 2,7 16 133r 2 3t7 17 128,7 2,3 18 126,5 3,1 19 124,6 2,1 20 129,3 2,7 21 121,5 2,2 22 120,1 1,2 23 118,0 117 24 116,5 1,2 25 107,8 2,7 26 104,5 1,9 27 101,7 119 28 94,5 1,0 29 75,9 3,0 30 74,3 2,0 31 73,4 273 32 72,1 315 33 70,9 4t3 34 68,7 2,9 36 64,3 1,3 37 6212 1,6 38 5611 1,4 39 55,2 3,5 40 54,2 2,1 41 24,3 1,9 42 17,9 2,2 43 17,1 2,0 44 1672 2,0 k') est stable dans des solutions aqueuses ayant un pH d'en viron 3 à environ 10, pendant une période aussi longue que 146 heures ; 1') une formule empirique dans l'intervalle de C83-85H97-101 N8O37-39Cl3 et une formule empirique approximative C84H97N8O38Cl.2HCl, en se basant sur la composition élémentaire le facteur E de l'antibiotique de A-35512, qui est un composé basique amorphe blanc ayant une composition élémentaire approximative de 54,848 de carbone, 4,73% d'hydrogène, 5,28% d'azote, 32,67 d'oxygène, et 1,72% de chlore ; et qui sous sa forme chlorhydrate, est un composé amorphe blanc qui a les caractéristiques suivantes : a) une composition élémentaire approximative de 52,67% de car bone, 4,59% d'hydrogène, 5,55% d'azote, 33,51% d'oxygène, et 3,62% de chlore b) un spectre d'absorption infrarouge, en pastilles de KBr, avec des maxima d'absorption significatifs aux fréquences suivantes (cm 1) : 3360 (fort), 3220 (épaulement), 2900 (faible) , 1725 (faible), 1650 (fort), 1580 (moyen), 1498 (fort), 1450 (faible) , 1419 (faible) , 1295 (moyen) , 1205 (moyen), 1172 (moyen), 1110 (faible), 1060 (fort) et 1000 (faible) ; c) des spectres d'absorption ultraviolette avec les maxima d'absorption suivants : dans le méthanol neutre, 270 nm (épaulement) et 359 nm (616216) ; dans le méthanol acide 286 nm (E 18018) et 310 nm (épaulement) ; dans le mé thanol basique 270 nm (épaulement), 300 nm ( & 6216) et 354 nm ( # 17568) ; d) un poids moléculaire déterminé par titrage, d'environ 2018 e) trois groupements titrables dans le diméthylformamide aqueux à 66% avec des PKa d'environ 6,30, 9,09 et 11,62 f) le pouvoir rotatoire suivant (. D D 108,3 (c 1, H20) ; g) il est soluble dans l'eau, partiellement soluble dans le méthanol, et l'éthanol, et insoluble dans le benzène, le chloroforme, l'acétone, l'éther diéthylique, l'acétate d'éthyle, le toluène, l'hexane, l'acétonitrile et le dioxanne; h) une analyse des amino-acides indiquant la présence de six restes amino-acides i) un R f d'environ 0,64 sur chromatographie sur papier dans un système solvant 1-butanol:pyridine:acide acétique:eau (15:10:3: :12), en utilisant Sarcina lutea comme organisme de détection le facteur F de l'antibiotique A-35512 ayant un R f de 0,81 dans un système de chromatographie sur papier, en utilisant Sarcina lutea comme organisme de détection dans un système solvant 1-butanol: pyridine:acide acétique:eau (15:10:3:12); le facteur G de l'antibiotique A-35512 ayant un R f de 0,93 dans un système de chromatographie sur papier utilisant Sarcina lutea comme organisme de détection dans unsystème solvant l-butanolpyridine:acide acétique:eau (15:10:3::12) le facteur H de l'antibiotique A-35512, qui est un composé basique amorphe blanc ayant a) une composition élémentaire approximative de 53,76% de car bone, 5,32% d'hydrogène, 5,53% d'azote, 33,488 d'oxygène et 1,59% de chlore b) une formule empirique dans l'intervalle de C85. 87H103-107N8038-40C1 c) un poids moléculaire d'environ 1908, en se basant sur la composition élémentaire et qui, sous sa forme chlorhydrate, est un composé amorphe blanc qui a les caractéristiques suivantes a') une composition élémentaire approximative de 53,10% de carbone, 5,37% d'hydrogène, 5,35% d'azote, 30,12% d'oxy gène et 3,78% de chlore b') un spectre d'absorption infrarouge, en pastilles de KBr, avec des maxima d'absorption significatifs aux fréquences suivantes (cm 1) : 3410 (fort), 3240 (épaulement), 2940 (faible), 1670 (fort), 1630 (épaulement), 1605 (fort), 1520 (fort), 1470 (faible) 1442 (faible), 1400 (faible), 1345 (épaulement), 1310 (moyen), 1225 (moyen), 1180 (faible), 1135 (faible), 1080 (fort) et 1020 (épaulement) ; c') des spectres d'absorption ultraviolette qui présentent, dans le méthanol acide et neutre, un maximum d'absorption à 282 nm (E 12500), et dans le méthanol basique, un maxi mum d'absorption à 292 nm ( & 4000), et une absorption finale à 225 nm d') un poids moléculaire déterminé par titrage, d'environ 1660; e') cinq groupements titrables dans le diméthylformamide aqueux à 66% avec des PKa d'environ 5,0, 7,46, 9,80, 11,43 et 13,02 f') le pouvoir rotatoire suivant 3D25 - 123,50 (c 1, H2O) ;; g') il est soluble dans l'eau, partiellement soluble dans le méthanol et l'éthanol et insoluble dans le benzène, le chloroforme, l'acétone, l'éther diéthylique, l'acétate d'éthyle, le toluène , l'hexane, l'acétonitrile et le dioxanne h') une analyse des amino-acides indiquant la présence de 5 amino-acides dont un est la glycine i') des Rf approximatifs dans les systèmes de chromatographie sur papier suivants, utilisant Sarcina lutea comme organisme de détection Système solvant Rf l-butanol-pyridine:acide acétique: eau (15:10:3:12) 0,15 CH30H:HC1 0,1N (3:1) 0,47 1-propanol:NH4OH:H2O (6:3:1) 0,11 j') un spectre de résonance magnétique nucléaire du carbone C dans D20 avec les caractéristiques suivantes N PPM Hauteur (%) 2 177r2 2,7 3 171,6 5,2 4 170,9 5,8 5 169,6 417 6 158,9 3,1 7 15716 4,3 8 156,6 3,8 9 155,6 4,1 10 155,4 3,8 11 154,3 2,4 12 151,3 1,6 13 137,7 2,0 14 136,7 2,2 15 136,0 410 16 135,3 1,9 17 133,5 5,0 18 129,4 3,7 19 127,3 1,3 20 126,1 3,2 21 124,2 6,9 22 122,6 4,1 23 107,6 2,7 24 10118 1,8 25 76,2 2X8 26 73f5 4,4 27 7273 7;;4 28 71,0 12,2 29 69,7 4,6 31 6116 3,5 32 56,8 1,8 33 5514 2X8 34 55,0 1,5 35 24,5 2,6 36 17,9 4,6 37 1712 2,6 38 16,3 3,6 k') il est stable pendant un temps allant jusqu'a 72 heures dans des solutions aqueuses ayant un pH d'environ 3 à environ 10 ; l'aglycone du facteur B de A-35512, qui sous sa forme chlorhydrate est un composé amorphe et blanc ayant les caractéristiques suivantes a) une composition élémentaire approximative de 54,29% de carbone, 4,34% d'hydrogène, 7,40% d'azote, 28,95% d'oxy gène et 5,02% de chlore b) un spectre d'absorption infrarouge, en suspension dans le Nujol avec des maxima d'absorption significatifs aux fréquences suivantes (cm 1) : 3440 (épaulement); 3340 (épaulement), 3215 (fort), 2950 (épaulement), 2910 (fort), 2840 (fort), 2640 (épaulement), 1735 (faible), 1655 (fort), 1590 (moyen), 1500 (fort), 1460 (fort) , 1378 (moyen) 1365 (epaulement), 1298 (moyen), 1215 (moyen), 1155 (moyen), 1120 (épaulement), 1105 (faible), 1060 (faible) , 1040 (faible), 1008 (moyen), 925 (faible), 875 (faible), 765 (épaulement) et 718 (faible) c) des spectres d'absorption ultraviolette, dans le méthanol acide et neutre, avec un maximum d'absorption à 282 nm (E1cm1% 102,62) et dans le méthanol basique, un maximum d'absorption 302 nm (ElCm 182,09) d) un poids moléculaire déterminé par titrage, d'environ 1282 e) trois groupements titrables dans le diméthylformamide aqueux à 66% avec des PKa d'environ 7,5, 9,25 et 11,0 f) les pouvoirs rotatoires suivants [&alpha;]D25 - 178 (c 5, CH3OH) [&alpha;]36525 - 716,5 (c 5, CH3OH) g) il est soluble dans l'eau et le méthanol mais est insoluble dans le benzène, le chloroforme, l'acétone, l'éther diéthy lique, l'acétate d'éthyle, le toluène, l'hexane, l'aceto- nitrile,et le dioxanne ; h) une analyse des amino-acides indiquant la présence d'au moins quatre restes amino-acides i) un R f d'environ 0,80 par chromatographie sur couche mince de cellulose (support d'aluminium) dans un système solvant 1-butanol:pyridine:acide acétique:eau (15:10:3:12), en utilisant Sarcina lutea comme organisme de détection j) un R f d'environ 0,26 par chromatographie sur couche mince sur gel de silice, dans un système solvant méthanol:chloro forme:NH4OH concentré (3:2:1); k) un spectre de résonance magnétique nucléaire du carbone C dans DMSO-d6 avec les caractéristiques suivantes N PPM hauteur (%) 1 187,8 37,2 2 172,0 40,9 3 170,7 45,2 4 170,1 46,9 5 169,6 47,7 6 16814 57Z6 7 166,7 52Z5 8 157,4 49,9 9 156,6 45,5 NO PPM Hauteur (z) 10 155,7 55,8 11 155,6 71,5 12 155,4 56,7 13 154,5 50,5 14 14913 43,0 15 138,8 38,8 16 136,9 54,3 17 136,3 40,2 18 135,2 31,7 19 134,7 28,4 20 133,8 40,9 21 128,2 102,9 22 126,2 77,2 23 123,0 57,5 24 121,3 38,1 25 117,7 44Z4 26 117,0 31,5 27 108,6 31,0 28 106,7 47Z9 29 105,7 81,2 30 10312 26,5 31 93,6 33,4 32 74,9 39,8 33 71,8 33,9 34 68,9 4012 35 63,2 43,1 36 60,4 33,6 37 57,1 57,8 38 55,2 33,1 N PPM Hauteur (t) 39 5312 3071 40 51,8 36,0 44 23t8 55t7 45 17,1 47,8 46 0 0 43,7 1) il contient un groupement 3-amino-2,3,6-tridésoxy-3-C méthyl-l-xylo-hexopyranose ; m) il a au moins un groupement hydroxyle susceptible d'esté rification et qui, sous sa forme base libre, est un composé amorphe blanc ayant les caractéristiques suivantes a') une composition élémentaire approximative de 52,65% de carbone, 4,578 d'hydrogène, 6,91% d'azote, 27,04% d'oxygène et 2,948 de chlore ; b') un spectre d'absorption infrarouge, en pastilles de KBr, avec des maxima d'absorption significatifs aux fréquences suivantes (cm 1) : 3360 (fort), 3260 (épaulement), 2940 (epaulement), 1735 (épaulement), 1660 (fort), 1598 (moyen) 1510 (fort), 1440 (moyen), 1295 (faible), 1215 (moyen), 1-165 (moyen), 1122 (faible), 1070 (faible), 1018 (fort), 940 (faible) et 920 (faible) c') des spectres d'absorption ultraviolette avec un maximum d'absorption, dans le méthanol acide et neutre, à 282 nm E1cm1% 43,65) et, dans le méthanol basique, à 301 nm (ElCm 67,46) d') cinq groupements titrables dans le diméthylformamide aqueux à 66% avec des pKa d'environ 6,2, 8,2, 10,1, 11,4 et 12,4 e') le pouvoir rotatoire suivant [&alpha;]D25 - 64,5 (c 3, DMSO) et les sels d'addition-pharmaceutiquement acceptables des facteurs A, B, C, E, et H et du dérivé aglycone du facteur B. 2. Facteur A de A-35512 tel que décrit dans la revendication I. 3. Facteur B de A-35512 tel que décrit dans la revendication 1. 4. Facteur C de A-35512 tel que décrit dans la revendication 1. 5. Facteur E de A-35512 tel que décrit dans la revendication 1. 6. Facteur F de A-35512 tel que décrit dans la revendication i. 7. Facteur G de A-35512 tel que décrit dans la revendicationl. 8. Facteur H de A-35512 tel que décrit dans la revendication 1. 9. Aglycone du facteur B de A-35512 tel que décrit dans la revendication 1. 10. Procédé de production du mélange antibiotique A-35512 comprenant les facteurs A, B, C, E, F, G et H ; du facteur A de A-35512, du facteur B de A-35512, du facteur C de A-35512, du facteur E de A-35512, du facteur F de A-35512, du facteur G de A-35512 et du facteur H de A-35512 ; et du dérivé aglycone du facteur , procédé consistant a) à cultiver Streptomyces candidus NRRL 8156 ou un de ses mutants producteurs de A-35512, dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucide, d'azote, et de sels minéraux, dans des conditions de fermentation aérobies en immersion jusqu'à production d'une quantité substantielle d'activité antibiotique b) à séparer éventuellement du milieu de culture le mélange antibiotique A-35512 c) à séparer éventuellement du mélange antibiotique A-35512 les différents facteurs A, B, C, E, F, G et H de l'antibio tique A-35512 ; et d) à préparer éventuellement l'aglycone du facteur B de l'anti biotique A-35512 à partir du facteur B de l'antibiotique A-35512. 11. Composition alimentaire appropriée à la nutrition des animaux ruminants ayant une fonction du rumen développée, comprenant un aliment et une concentration augmentant la quantité de propionates d'un élément choisi dans le groupe comprenant le mélange antibiotique A-35512, le facteur A de A-35512, le facteur B de A-35512, le facteur C de A-35512, le facteur E de 35512, le facteur F de A-35512, le facteur G de A-35512, le facteur H de A-35512, l'aglycone du facteur B de A-35512 et les sels pharmaceutiquement acceptables des facteurs A, B, C, E, F, G et H de A-35512 et d' aglycone du facteur B de A-35512. 12. Composition alimentaire convenant à la nutrition de la volaille, comprenant un aliment et une quantité augmentant l'effi- cacité des aliments d'un élément choisi dans le groupe comprenant le mélange antibiotique A-35512, le facteur A de A-35512, le facteur B de A-35512, le facteur C de A-35512, le facteur E de A-35512, le facteur F de A-35512, le facteur G de A-35512, le facteur H de A-35512, l'aglycone du facteur B de A-35512 et les sels pharmaceutiquement acceptables des facteurs A, B, C, E, F, G et H de A-35512 et l'aglycone du facteur B de A-35512. 13. Composition antibiotique caractérisée en ce qu'elle contient comme ingrédient actif le mélange antibiotique A-35512 ou l'un de ses composants, tels que définis dans la revendication 1.