Brevet FR2327794A1 — publié le 19770513

La présente invention concerne la production d'antibiotiques, et plus précisément un procédé d'isolement de 11 antibiotique mycoheptine. La mycoheptine est active vis-à-vis des germes causaux des mycoses profondes et systémiques et des champignons levuriformes et trouve des applications dans le traitement de la coccidioSdose, l'histoplasmose, la cryptococcose, la chromomyeose, la blastomycose, l'aspergillose, la sporotrichose et la candidose. On connais des procédés d'isolement de la mycoheptine, consistant à 11 extraire à partir de streptoverticillium mycoheptinicum au moyen, par exemple, d'alcools inférieurs, de méthanol, d'isopropanol, avec précipitation de l'antibiotique après une évaporation préalable des extraits. On purifie alors l'antibiotique obtenu et l'on reprécipite dans une solution de diméthylformamide.Un des procédés connus d'isolement de la mycoheptine consiste en ce qu'on extrait la mycoheptine à partir du mycélium par le methanol, on concentre sous vide l'extrait méthanolique et on sépare sous refroidissement le précipité, qu'on lave à l'éthanol chaud à une temperatute de 600C, on dissout dans le diméthylformamide, on précipite de nouveau l'antibiotique avec de l'acétone, on lave à l'acétone et ltéther et on sèche sous vide le produit visé. Le rendement en antibiotique par rapport à sa teneur dans le mycélium constitue 20 à 25 % selon l'activité. Les inconvénients des procédés indiqués sont un bas degré d'extraction de la mycoheptine à partir du mycélium à cause de sa faible solubilité dans les solvants organiques tels que les alcools inférieurs, ainsi qu'un bas rendement et une qualité altérée du produit visé. a présente invention a pour but de supprimer les inconvénients précités. Conformément : cet objectif l'invention vise, par modification de la technologie d'isolement de l'antibiotique mycoheptine, à élever l'efficacité de l'extraction de la mycoheptine à partir du mycélium, à améliorer sa qualité et le rendement. La solution consiste en un procédé d'isolement de l'antibiotique mycoheptine à action antifongique par son extraction à partir du mycélium par un solvant organique, précipitation de l'antibiotique et purification subséquente de celui-ci, procédé dans lequel, conformément à l'invention on conduit l'extraction de l'antibiotique à partir du mycélium par l'isopropanol aqueux à 65-80 , contenant du chlorure de calcium à raison de 1 à 10 ffi en poids, du chlorure de méthylène à raison de 10 à 15 % en poids, et on effectue la purification par lavage de l'antibiotique précipité à l'isopropanol aqueux, avec sa réprécipitation ultérieure à partir du diméthylformamide par l'eau, et avec traitement par le n - propanol aqueux à 2O-5, contenant de 0,2 à 0,5 w en poids d'hexamétaphosphate de sodium. I1 est avantageux de conduire l'extraction par l'isopropanol à 65O% contenant 2 en poids de chlorure de calcium et 10o en poids de chlorure de méthylène et d'effectuer la reprécipitation de l'antibiotique par le n - propanol aqueux à 404, contenant 0,5% en poids d'hexamétaphosphate de sodium. Le procédé d'isolement de l'antibiotique mycoheptine gction antifongique est mis en oeuvre de la manière suivante. On soumét le mycélium du producteur Streptoverticillium mycoheptinicum à l'extraction par l'isopropanol aqueux à 65-80%, contenant de 1 à lOgo en poids de chlorure de calcium et de 10 à 15 %0 en poids de chlorure de méthylène. I1 est rationnel d'utiliser un agent d'extraction contenant 2% en poids de chlorure de calcium et 10 % en poids de chlorure de méthylène. On effectue de 1 à 3 extractions pour extraire entièrement l'antibiotique à partir du mycélium. Le nombre d'extractions est déterminé par la teneur en antibiotique du mycélium. Les extraits réunis sont évaporés sous vide et refroidis, l'antibiotique étant précipité par l'eau à partir du concentré.Le précipité formé d'antibiotique est séparé. On conduit la purification de l'antibiotique obtenu par l'isopropanol aqueux. On sépare ensuite la pâte d'antibiotique formée, on lave à l'acétone et on sèche sous vide. On reprécipite l'antibiotique séché dans la solution de diméthylformamide avec l'eau, on lave la pâte d'antibiotique obtenue par le n-propanol aqueux à 20-50% contenant de 0,2 à 0,5 % en poids d'hexamétaphosphate de sodium. I1 est préférable d'utiliser le n - propanol aqueux à 40 % avec teneur en hexamétaphosphate de sodium de 0,5 ffi en poids. On sépare ensuite la pâte d'antibiotique, on la lave à l'eau, à l'acétone et on sèche sous vide; Le rendement moyen en produit visé par rapport à la teneur en antibiotique du mycélium est de 33% suivant l'activité. La modification, dans le procédé proposé, de la technologie d'extraction et de reprécipitation par voie d'utilisation de nouveaux réactifs permet d'augmenter de 1,5 fois le degré d'extraction de la mycoheptine à partir du mycélium, ainsi que d'améliorer la qualité du produit visé. La présente invention sera mieux comprise à l'aide des exemples non-limitatifs suivants de mise en oeuvre du procédé d'isolement de l'antibiotique mycoheptine à action antifongique conformément à l'invention. Exemple 1 1 kg de mycélium de la souche Streptoverticillium mycoheptinicum 44 3/I à activité de 5 000 g est extrait à l'isopropanol aqueux à 80 ffi contenant 2 % en poids de chlorure de calcium et 10 % en poids de chlorure de méthylène. Le rapport entre l'agent d'extraction et le mycélium est de 5:1 (volume:poids). On réunit les extraits et on réduit le volume par évaporation jusqu'à la concentration de 1,5 1 sans dépasser la température de 6000 sous vide de 10 à 20 mm de Hg. On refroidit le concentrat jusqu'à une température de +50C et on ajoute 2 volumes d'eau. Le précipité formé est séparé et lavé à l'isopropanol aqueux à 50 % et ensuite à l'acétone après quoi il est séché sous vide. On dissout l'antibiotique séché dans le diméthylformamide pris en quantité de 20 volumes par partie pondérale de poudre séchée ; on sépare les impuretés insolubles et on précipite l'antibiotique par un volume d'eau par rapport au volume de diméthylformamide.Or lave la pSte d'antibiotique obtenue avec le n - propanol aqueux à 40 % contenant 0,5 en poids de hexamétaphosphate de sodium, ensuite à l'eau, à l'acétone et on sèche sous vide. On obtient 2,33 g de produit visé avec teneur en substance active de 750 jlg/mg. Le rendement en mycoheptine par rapport à sa teneur dans le mycélium constitue 35 % selon l'activité. Exemple 2 1,08 kg de mycélium de la souche Streptoverticillium mycoheptinicum 44 B/I à activité de 4860 r/mg est lavé par 6 litres de chlorure de méthylène. On extrait trois fois l'antibiotique dans la masse de lavage. On utilise pour la première extraction l'isopropanol aqueux à 80 % contenant 2 % en poids de chlorure de calcium, on conduit la seconde et la troisième extraction par l'isopropanol aqueux à 65 ffi contenant 10 % en poids de chlorure de méthylène et 2 % en poids de chlorure de calcium. Le rapport entre l'agent d'extraction et le mycélium est de 5:1 (volume:poids). On réunit les extraits et on réduit leur volume par évaporation jusqu'à la concentration de 1,5 1 sans dépasser la température de 600 C, sous vide de 10 à 20 mm de Hg.On refrodit le concentrat jusqu'à une température de SOC et on ajoute 2 volumes d'eau. On sépare le précipité formé, on lave à l'acétone et on sèche sous vide de 10 mm de Ng. Le précipité d'antibiotique obtenu en quantité de 25,8 g à teneur en substance active de 165 pg/mg est lavé à l'isopropanol aqueux à 50 ffi à raison de 50 volumes par partie pondérale. Qn lave ensuite la pate à l'acétone et on sèche sous vide. On obtient 10,19 g de poudre contenant 289 /Ag/mg de substance active. On dissout la poudre dans 200 ml de diméthylformamide, on sépare les impuretés insolubles et on précipite l'antibiotique par un volume d'eau par rapport au volume de diméthylformamide.On sépare le précipité formé, on lave à l'acétone et on sèche sous un vide de 10 mm de Hg. On obtient 4,22 g de poudre à teneur en substance active de 572 ,fwg/mg qu'on lave avec 400 ml de n - propanol aqueux à 40 ffi contenant 0,5 % en poids d'hexamétaphosphate de sodium, on sépare la pâte, on lave par 400 ml d'eau, ensuite à l'acétone et on sèche sous un vide de 10 mm de Hg. On obtient 2,31 g de produit visé à teneur en substance active de 760g/mg. Le rendement en mycoheptine par rapport à sa teneur dans le mycélium constitue 32,9 % selon l'activité. Exemple 3 1 kg de mycélium de la souche Streptoverticiîlium mycoheptinicum 44 B/1 à activité de 5000 fig/mg est soumis à l'extraction par l'isopropanol aqueux à 70 ffi contenant 8 % en poids de chlorure de Calcium et 15 % en poids de chlorure de méthylène. On effectue trois extractions, dans un rapport de l'agent d'extraction au mycélium et 5:1 respectivement. On effectue l'opération suivante d'une façon analogue à celle décrite dans l'exemple 1. On obtient 2,03 g de produit visé à teneur en substance active de 740 + Xmg. Te rendement en mycoheptine par rapport à sa teneur dans le mycélium constitue 30 % selon l'activité. Exemple 4 L'extraction, la précipitation et la reprécipitation de l'antibiotique mycoheptine à partir du diméthylformamide est conduite d'une façon analogue à celle décrite dans l'exemple 1. La pâte d'antibiotique obtenue après la reprécipitation à partir du diméthylformamide est lavée avec le n-propanol aqueux à 20 % contenant 0,5 ffi en poids d'hexamétaphosphate de sodium, puis à l'eau, à l'acétone et est séchée sous un vide de 10 mm de Hg. On obtient 2,3 g de produit visé contenant 740 2 > g/mg de substance active. Le rendement en mycoheptine par rapport à sa teneur dans le mycélium constitue 34 % selon l'activité. Exemple 5 L'extraction, la précipitation et la reprécipitation de l'antibiotique mycoheptine à partir du diméthylformamide est conduite d'une manière analogue à celle décrite dans l'exemple 1. La pate d'antibiotique obtenue apros la reprécipitation avec le diméthylformamide est lavée avec une solution aqueuse à 50 % de n - propanol contenant 0,2 % en poids d'bexamétaphosphate de sodium, puis à liteau, à l'acétone, et est échée sous un vide de 10 mm de Hg. On obtient i,94 g de produit visé à teneur en substance active de 800 /v mg . Le rendement en mycoheptine par rapport à sa teneur dans le mycélium constitue 31 % selon l'activité Bien entendu l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits et représentés qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemple, en particulier elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci sont exécutés suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre des revendications qui suivent. REVENDICATIONS 1. Procédé a'isolement d'un antibiotique antifongique, la mycoheptine, par son extraction à partir du mycélium de Streptoverticillium mycoheptinicum à l'aide d'un solvant organique, suivie d'une précipitation de l'antibiotique et de sa purification subséquente caractérisé en ce qu'on effectue l'extraction de l'antibiotique à partir dudit mycélium à l'aide d'isopropanol aqueux à 65-80 % contenant de 1 à 10 g en poids de chlorure de calcium et de 10 à 15 % en poids de chlorure de méthylène, et on effectue ladite purification par lavage de l'antibiotique précipité avec de l'isopropanol aqueux, suivi de sa reprécipitation à partir de diméthylformamide avec de l'eau et de son traitement avec du n-propanol aqueux à 20-50 % contenant de 0,2 à 0,5 % en poids d'hexamétaphosphate de sodium. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue ladite extraction à l'aide d'isopropanol à 65-80 ffi contenant 2 ffi en poids de chlorure de calcium et 10% en poids de chlorure de méthylène. 3. Procédé suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le traitement précité de l'antibiotique reprécipité est réalisé avec du n - propanol aqueux à 40 % contenant 0,5 % en poids d'hexamétaphosphate de sodium. 4. L'antibiotique antifongique mycoheptine, caractérisé en ce qu'il iobtenu conformément au procédé faisant l'objet de l'une des revendications 1 à 3.