Brevet FR2328768A1 — publié le 19770520

L'invention se rapporte au domaine de la synthèse microbiologique des substances protéino-vitaminiques et plus exactement à un procédé de fabrication d'une masse biologique ou matière cellulaire ou masse cellulaire. On connatt des procédés de fabrication de matière cellulaire par croissance de cultures mixtes de microorganismes dans des eonditionsaérobies, avec utilisation en qualité de sources de carbone, d'hydrocarbures gazeux, par exemple e méthane, de gaz naturel, et avec emploi de milieux nutritifs standards, par exemple ceux de Buschnell-aas Kaserer, Rider, etc., ainsi que de bouillons nutritifs aqueux connus, dont la composition comprend les sources de nutrition azote, phosphore, magnésium, potassium et micro-éléments sous forme de composés inorganiques et organiques.Dans ce cas, dans le procédé périodique, durant 38 heures de croissance d'une culture mixte composée de Pseudomonas, de Mycabactérium Bacillus, on a obtenu 1,2 ggl de masse biologique sèche ; dans les conditions de croissance continue d'une culture mixte composée de Pseudomonas methanica et de Mycobacterium methanica Èt une vitesse d'écoulement de 0,05 heures , une concentration de 3,3 g/l de masse cellulaire sèche a été obtenue. Ainsi, les cultures mixtes connues croissent lentement en atmosphère de méthane et elles n'assurent pas une concentration suffisamment élevée ae-la masse biologique. le but de la présente invention est de remédier aux inconvénients indiqués. On s'est donc proposé de rechercher une culture de micro-organismes qui permettrait, dans les conditions aérobies sur des milieux nutritifs connus, d'augmenter la production de matière celllaire, Lâ solution consiste en un procédé de fabrication de masse biologique par croissance d'une culture mixte de microorganismes dans des conditions aérobies sur un milieu nutritif aqueux minéral contenant une source de carbone consistant en des hydrocarbures gazeux, des sources d'azote, de phosphore, de potassium, de magnésium, et des micro éléments sous forme de sels correspondants, procédé qui, selon l'invention, est caractérisé en ce qu'en qualité de culture mixte de micro-organismes, on utilise de bactéries 1-70 se présentant sous forme d'un mélange symbiotique de quatre micro-organismes :Methylococcus capsulatus, Methylosinus sporium variante, incoloratus Methylosinus trichosporium variant rosaceus, Flavobacterium gasotypicun, le rapport entre la concentration de la masse cellulaire et celle des sels précités étant maintenu, pendant le processus entre 1:1 et 1: 4. La présente invention permet, en régime périodique de croissance durant 30 à 40 heures, d'obtenir une concentration de matière cellulaire sèche dans les limites de 35 à 40 g/l, et, en régime continu, d'augmenter la vitesse dtécoulement jusqu'à 0,16 heure -1 avec une concentration de matière cellulaire sèche dans les limites de 9 à 11 g/l. le proc-édé proposé assure un render.;nt élevé stable en matière cellulaire, ainsi qu'une haute qualité de la matière cellulaire, à teneur en protéine brute allant jusqu'à 75 % y compris tous les amino-acides irremplaçables, par exemple jusqu'à 3 % de méthionine, 7 % de lysine, par rapport à la protéine brute, et jusqu'à 12 mg/kg de vitamine B jusqu'à 40 mg/kg de vitamine 31 et jusqu'à 75 mg/kg de vitamine 32 (calculés en substance absolument sèche, SAS). Les avantages précités du procédé proposé ne peuvent pas être obtenus si l'on ne respecte pas le rapport indiqué des concentrations de matière cellulaire et de sels contenus dans le milieu nutritif. Une concentration quadruple des sels entraine une inhibition du processus et une réduction de la concentration de la matière cellulaire. la variation du rendement en matière cellulaire en fonction du rapport des concentrations de matière cellulaire et de sels dans le milieu nutritif est représentée sur le tableau suivant. TABLEAU Rapport de la ooncen- Rendement en matière cellutration de la matière laire, en g/ l de SAS* cellulaire à la con- -~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ centration des sels Durée de la croissance dans le milieu O h 10h 15h 20h 30h 40h 65h nutritif 1:1 5,0 10,5 1:2 5,0 ll?O 15,6 15,8 1:3 5,0 14,0 16,0 20,0- 20,5 1:4 5,0 7,0 9,0 12,0 18,0 25,0 24,0 1:5 5,0 5,0 5,5 6,0 8,5 12,0 12,0 1:6 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 * SAS : substance absolument sèche. le tableau montre que pour la croissance de la culture 1-70 sur des milieux avec un rapport de 1:1 à 1:4 entre la concentration en matière cellulaire et la concentration en sels dans la solution nutritive, on atteint une concentration de SAS allant jusqu'à 25 g/î en 40 heures. lors de la croissance des microorganismes sur des milieux dans lesquels la concentration en sels est de 5 à 6 fois supérieure à la concentration en matière cellulaire, on ntobtient, pour la méme durée de culture que 5 à 12 g/l de matière cellulaire sèche. Ladite culture mixte de bactéries 1-70 est déposée dans la collection de l'institut de recherches pour la synthèse biologique des substances protéiques de l'URSS de Moscou, et, corme il a ét indiqué plus haut, se présente sous forme d'un mélange symb@otique de quatre micro-organismes :- Methylococcus copsulatus, Methylosinus sporium var incoloratus, Methylosinus trichosporium variant rosaces, Flavobacterium gasotypicum Les cultures de micro-organismes ont les propriétés morphologiques et culturales suivantes. Methylococcus capsulatus Coques de 1,4 à 2 de diamètre, diplocoques. Ils ne forment pas de rosettes. La culture forme un stade en repos du type des cystes immaturés de l'azotobacter. les cystes sont enclin à réfracter. les cellules sont immobiles, gram-négstives, non pathogènes. Ils ne forment pas de pigment. La nécessité en méthane est obligatoire, ils croissent bien sur un milieu liquide minéral dans une atmosphère de méthane. Ne se développent pas sur l'agar peptonique de viande et sur les autres milieux organiques riches. Ils ne croissent pas sur un milieu à 1 % de méthanol. Comme source d'azote, ils préferent la forme ammonique de l'azote. La température de croissance est de 30 à 420C. Methylosimus sporium variant incoloratus Bacilles vibrioniques de 1,2 à 0,7 i de dimension, bourgeonnants. Au stade de repos ce sont des exospores sous forme de bulle sur le pôle opposé au p8-le à flagelle. Le stade initial de sporulation est vibrioTde. Les cellules gram-négatives forment des rosettes, des capsules, sont mobiles en jeune âge. La couleur des colonies est blanche, il ne forme pas de pigment soluble dans l'eau. Les colonies sont denses, bombées, lisses à bord régulier, de dimension allant jusqu'à 2 mm. La culture est non pathogène. Les bactéries croissent obligatoirement sur un milieu de méthane, ne se développent pas sur un milieu à 0,1 % de méthanol et sur les milieux organiques riches 2 en agar de viande peptonique (AVP), et en agar de moult (AX). La culture utilise plus aisément la forme ammonique d'azote, ne croit pas sur les milieux exempts d'azote. La température de croissance est de 33 c. Methylosinus trichosporium variant rosaceus Bacilles de 2 à 3,5 xlde de dimensions forment des rosettes. Au stade de repos ce sont des exospores. Le stade initial de sporulation est piriforme. En jeune âge, les cellules sont mobiles, gram-négatives, la culture n'est pas pathogène. Le pigment des colonies est rose pâle, elles ne forment pas de pigment soluble dans l'eau. La culture survit en l'absence de méthane, ne nécessite pas d'ensemencements fréquents. La nécessité en méthane est obligatoire, il n'y a pas de croissance sur les milieux organiques riches, ne se développe pas sur un milieu à 0,1 % de méthanol. Il utilise la forme ammonique commisource d'azote, ne se développe pas sur un milieu exempt d'azote. Il croit bien à une tempérâture de 30 à 320C. Flovabacterium asoticum La culture de 2 à 6 jours, croissant sur un milieu minéral Buschnell-Haas en présence de méthane, forme des bacilles isolés immobiles de 1,5 à 3 x 0,6/ de dimensions sans ramification. Sur un milieu de fécule de pommes de terre, la culture d'un jour a des cellules plus longues, légèrement courbées, de 3 à 4 x 0,6yO de dimensions atteignant rarement une longueur de 7 T . Dans une culture de cinq jours sur le même milieu, les cellules deviennent plus courtes et plus grosses, se disposant par paire ou, rarement, en chainons ; sont gram-négatives, instables à l'acide. Les colonies -sur un milieu agarisé minéral en présence de méthane sont arrondies, à bord régulier, bombées, lisses, de 0,5 mm de diamètre denses, d'abord de couleur crême, deviennent ensuite jaune clair.Elle croît sur un milieu contenant de 1' éthanol et sur des milieux organiques riches, ne se développe pas sur un milieu contenant 0,1 à 1 % de méthanol ; elle assimile les homologues supérieurs du méthane, éthane, fraction propane-butane. Elle croît bien sur un milieu contenant de la glucose et sur l'agar de chou. Sur l'agar de viande peptonique, de levure et de sol, elle se développe faiblement au septième jour, et au bout de 20 heures sur l'agar de fécule de pommes de terre. Sa consistance sur le milieu de glucose est muqueuse et elle est dateuse dans les autres milieux. Sur tous les milieux, le pigment est de couleur jaune clair, à part 1' agar de levure dans lequel il ne se forme pas. Il ne change pas la couleur du milieu. Il ne liquifie pas la gélatine, n'altère pas le lait, il réduit les nitrates en nitrites. Il ne forme pas d'hydrogène sulfuré, d'ammoniac et d'indole. Elle croit sur le galactose, le saccharose, la dextrine sans formation d'acide ; elle forme de l'acide en croissant sur la glucose, l'arabinose, le maltose et faiblement sur le mannitol ; ne croit pas sur le lactose. Elle croit bien sur l'4thanol et elle ne croît pas sur le méthanol, assimile mal les sels des acides acétique, propionique, oxalacétique, citrique, diméthyloxy-succinique, oxalique et valérianique, elle ne se développe pas sur les milieux des sels d'acide formique. La culture mixte de bactéries 1-70 est isolée lors de la croissance continue dans un mélange de quatre cultures d'accumulation les plus actives obtenues auparavant à partir d'échantillons naturels. L'isolement a été réalisé avec augmentation graduelle de la vitesse d'écoulement de 0,025 heure l jusqu'au régime d'élution. On 8 obtenu une culture 1-70 physiologiquement active, stable d'après sa composition spécifique et vis-à-vis d'une modification des conditions extérieures de culture ; apte à crottre et à se développer dans des conditions non stériles à une vitesse assez élevée, et à assurer un rendement d'au moins 1,6 ç l par heure. La culture mixte précitée des bactéries 1-70 est stable vis-à-vis des infections dans des conditions non stériles de croissance, a une vitesse de croissance dépassant de plusieurs fois celle de certaines souches isolées dans celle-ci sous forme de cultures pures. Pratiquement, le procédé est réalisé de la manière suivante. La culture symbiotique mixte 1-70 précitée est cultivée dans des conditions aérobies sur un milieu nutritif contenant, en qualité de source de carbone, des hydrocarbures gazeux, par exemple le méthane, le gaz naturel, et aussi une source d'azote (ammoniac, sulfate d'ammonium), une source de phosphore (acide phosphorique, extrait de superphosphate, monophosphate ét diphosphate de potassium, phosphate d'ammonium).En qualité de composés inorganiques, le milieu nutritif peut contenir des additions de sulfate de magnésium, de sulfate de potassium, de chlorure de potassium, de sulfate de cuivre, de sulfate de manganbse, de sulfate de zinc et d'autres sels de métaux nécessaires au développement des cellules des micro-organismes, ainsi que de l'acide borique, Durant la culture, les rapports de la concentration de la masse biologique formée à celle des sels indiqués sont maintenus respectivement entre 1:1 et 1:4. La croissance des cultures précitées est réalisée à une température de 30 à 380C et à un pH de 5 à 7,0. Comme source de carbone on peut utiliser des hydrocarbures gazeux, par exemple le méthane, le gaz naturel, qui sont introduits dans le milieu nutritif en mélange avec l'air dans un rapport de 1:1 à 1:8. La masse cellulaire est extraite du milieu culturel par un procédé connu quelconque. Le procédé de croissance de la culture indiquée peut être conduit aussi bien en régime périodique qu'en régime continu. Le produit final est une matière cellulaire nontoxique, contenant .jusqu'à 75 ffi de protéine, comprenant tous les amino-acides irremplaçables, tels que la méthionine, à concurrence de 3 k, la lysine à concurrence de 7,0 %, par rapport à la protéine brute, jusqu'à 12 m vg de vitamine B122 40 mg/kg de vitamine B, 75 mg/kg de vitamine B2 rapportées à la substance absolument sèche. Le produit final peut Btre largement appliqué en agriculture comme addition aux fourrages, dans l'industrie de d'alimentation pour la production d'amino-acides, d'enzymes, dans l'industrie minière pour introductions dans les couches afin de réduire la teneur en CH4 dans les mines, dans l'industrie textile comme addition à des matériaux appropriés afin d'améliorer la qualité des articles de consommation courante, et dans d'autres branches de l'économie nationale D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture des exemples de réalisation concrets mais non limitatifs suivants. Exemple 1 Dans un fermentateur de 10 litres, pourvu d'un système d'aération par éjection, on introduit 6 1 de milieu nutritif contenant par litre d'eau (en grammes) s (NH4)2SO4 8,4 ZnSO1. b 7H20 0,0048 H3PO4 1,4 In SO4. 4 H20 0,02 MgSO4 0,3 Cu S04, 5 H20 0,008 KCl 0,75 H3B43 0,0o43 Le pH du milieu nutritif est maintenu automatiquement à 6,7 par addition continue d'une solution titrée à 10 % de NAOS. Le procédé est mené à la température de 330C. On admet en continu un mélange de gaz naturel et d'air pris dans un rapport de 1:3, à raison de 1,0 min, dans le fermentateur, tandis qu'on en évacue le mélange gazeux inutilisé. Le milieu nutritif du fermentateur ensemencé par la culture mixte 1-70 en quantité de 5 g/l, constituant un mélange symbiotique de quatre micro-organismes Methylococcus capsulatus, Methylosinus sporium variant incoloratus, Methylosinus trichosporium variant rosaceu@., Flavabseterium gazotypicum. L'inoculat est la matière cellulaire produite dans les expériences précédentes. Le rapport en poids de la masse biologique à la concentration des sels indiqués est de 1:3. La concentration initiale de la matière cellulaire dans le fermentateur est de 5 gaz g/l. Après 20 heures de culture périodique, on obtient 20 g/l de matière cellulaire sèche à teneur en protéine de 70 %. Exemple 2 Dans le fermentateur de 10 1 cité dans exemple 1, on introduit 6 1 de milieu nutritif contenant par litre d'eau (en grammes). (NH4)2S04 5,66 n 4e 7H20 0,0029 H3PO4 0,87 XnSO4. 4H2O 0,014 MgS04 0,2 Cu S04* 5H20 0,0054 KCl 0,5 H3B03 0,0029 Lors du processus de fermentation, on admet en continu un mélange de gaz naturel et d'air en quantité de 1,0 l/l.min, pris dans le rapport de 1:3, on évacue le mélange gazeux non utilisé, on admet les sels nutritifs et on évacue à partir du fermentateur la suspension bactérienne. Dans le fermentateur on maintient le pH au niveau de 6,7 en additionnant en continu une solution à 10 % de Na0H, la température de culture étant de 33 C.La concentration initiale de la masse biologique de la culture précitée 1-70 est de 10 g/l de poids sec. Le rapport entre la concentration de la matière cellulaire et celle des sels indiqués est de 1:1. Après 1 ou 2 heures de croissance en régime périodique, on commence la culture en continu à une vitesse d'écoulement de 0,13 heure l du milieu, à une concentration de 11 g/l en matière cellulaire sèche à teneur en protéine de 75 %. Exemple 3 Dans un fermentateur de 200 l, pourvu d'un système à éjection d'aération, on introduit 100 1 de milieu nutritif d'une composition analogue à l'exemple 2 et on ensemence avec la culture mixte 1-70 indiquée en quantité correspondant, dans le fermentateur, à la concentration initiale de matière cellulaire de 5 g/l. On admet dans le fermentateur, à la vitesse de 1,0 1/1 min, un mélange gazeux composé de 25 % de gaz naturel et de 75 % d'air. La température de fermentation est de 330C, le pH est maintenu au niveau de 6,7 en additionnant une solution à 10 % de NaOH. Le rapport pondéral de la concentration de la matière cellulaire et de celle des sels est de 1:2. Dans leprocédé périodique durant 5 heures, la concentration de la matière cellulaire atteint 10 g/l. On commence ensuite, la culture en continu, d'abord à une vitesse d'écoulement de 0,05 heures, en l'augmentant ensuite jusqu'à 0,13 heures, la concentration de la matière cellulaire étant comprise entre l1 et 12 g/l. La composition de la matière cellulaire produite est la suivante. Teneur en acides aminés en ffi par rapport à la protéine brute. lysine 7,3 thréonine 3,9 histidine 1,5 sérine 3,3 arginine 5,0 acide glutamique 10,0 acide aspartique 7,6 proline 5,8 alanine 6,0 glycine 5,4 acide cystéique 0,7 isoleucine 4,2 valine 5,3 leucine 7,8 méthionine 2,5 phénylalanine 3,5 tryptophane 2,4 Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux modes de rdalisation décrits et représentés qui n'ont été donnes qu'à titre d'exemple, en particulier elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre des revendications qui suivent. REVEND I OT IONS 1. Procédé de fabrication d'une masse biologique ou matière cellulaire par croissance de cultures mixtes de micro-organismes dans des conditions aérobies sur un milieu nutritif minéral aqueux contenant une source de carbone consistant en des hydrocarbures gazeux, des sources d'azote, de phosphore, de potassium, de magné- sium et des micro-éléments sous forme de sels correspondants, caractérisé en ce qu'en qualité de culture mixte de micro-organiEnes on utilise une culture mixte de bactéries 1-71) constituée par un mélange de symbiose de quatre micro-organismes : Methylococcus capsulatus, Methylosinus sporium variant incoloratus, Methylosinus trichosporium variant rosaceus, Flavohacterium gasotypicum, et en ce que, au cours de la croissance, on maintient dans les limites de 1:1 à 1:4, respectivement, le rapport entre la concentration de ladite masse biologique ou matière cellulaire et celle des sels précités. 2.Masse biologique ou matière cellulaire, caractérisée en ce qu'elle est obtenue conformément au procédé faisant l'objet de la revendicaticn 1.