Brevet FR2356723A1 — publié le 19780127

La présente invention concerne le domaine de l'identification des bactéries, notamment des entérobactéries, et a pour objet une micro-méthode destinée à cet effet. Actuellement, l'identification des enterobactéries est pratiquée quotidiennement dans les iaboratoires de biologie médicale et vétérinaire, ou dans les laboratoires de bactériologie alimentaire. Généralement, cette identification est réalisée en mettant en évidence un ensemble de propriétés biochimiques de la bactérie à l'aide de milieux de cultures spéciaux appelés milieux d'identification. Par le passé, ces milieux étaient des milieux glosés complexes contenus dans des tubes en verre à fermeture au moyen d'une vis de grande dimension. Pour ensemencer les tubes, il était alors nécessaire de disposer d'une souche en culture pure obtenue en 24 heures par repiquage de la colonie isolée sur milieu d'isolement. Ces milieux d'identification présentent, cependant, entre autres, l'inconvénient d'etre encombrants, pet pratiques pour le travail en série et onéreux. Il existe également d'autres dispositifs d'identification des entérobactéries qui permettent d'identifier la bactérie à partir du milieu d'isolement, et ayant pour corollaire un gain de temps et de matériel. Un tel dispositif d'identification peut être constitué par un cylindre compartimenté contenant différents milieux gélosés, une tige pointue traversant le tube dans sa longueur, et permettant par contact de sa pointe avec la colonie à identifier, et par traction sur la tige, d'ensemencer chaque milieu au passage. Un autre dispositif se présente sous la forme d'un ensemble de petites cupules de formes particulières placées sur un support en matière synthétique, et contenant les milieux d'identification sous formes desséchées. Ces eupules sont alors remplies à l'aide d'une suspension dans l'eau de la bactérie à identifier. Il existe encore d'autres procédés et dispositifs d'identification, mais tous nécessitent l'emploi d'un contenant spécial et sont d'un prix de revient élevé. la présente invention a pour but de pallier ces inconvénients. Elle a, en effet, pour objet une micro-méthode dtidentifi- cation des bactéries, applicable notamment à l'identi-lication des entérobactéries, qui se pratique en tube à hémolyse ou sur plaque pour microtitration et utilise les colonies bactériennes obtenues sur milieu dtisolement. Ce procédé a l'avantage de n'utiliser que des récipients ordinaires en laboratoires d'analyses, et est. en outre, d'une plus grande rapidité que les procédés classiques, du fait que l'on utilise les colonies bactériennes obtenues sur milieu d'isolement. les propriétés biochimiques des bactéries étudiées peuvent etre réparties en deux groupes, à savoir, d'une part, les propriétés biochimiques essentielles qui permettent sûrement l'identification du genre de l'entérobactérie, c'est-à-dire - la recherche de la fermentation du glucose, - la recherche de la béta-galactosidase, - la recherche de la réduction des nitrates, - la production d'acétoine, - l'utilisation du citrate, - l'utilisation du malonate, - la recherche de la lysine décarboxylase, - la recherche de l'ornithine décarboxylase, - la recherche de la tryptophane désaminase, - la production d'indole, - la recherche de l'uréase, - la production d'acide sulfhydrique, - la recherche de la gélatinase, et, d'autre part, les propriétés biochimiques complémentaires qui permettent dans certains cas l'identification de l'espèce, par l'étude de l'utilisation par voie fermentative des sucres suivants - mannitol, - inositol, - sorbitol, - rhamnose, - saccharose, - raffinose, - arabinose, - adonitol, - salicine. La méthode peut également être étendue à d'autres fermentations sucrées telles que fructose, galactose, maltose, xylose, amygdaline ou dulcitol. Pour la mise en oeuvre en tube à hémolyse de la microméthode décrite ci-dessus, l'invention a pour objet des réactifs énumérés ci-après dans leur composition préférentielle 1. Solution de Koser modifiée concentrée, conservée à 4 C et constituée par une solution aqueuse de : 430 mmol/l de chlorure de sodium, 4 mmol/l de sulfate de magnésium, 18 mmol/l de chlorure de potassium, 43 mmol/l de chlorure d'ammonium. 2. Bouillon galerie stérilisé en autoclave à 110 X pendant 10 minutes, puis conservé à température ambiante, et constitué par 200 mi de solution de Koser modifiée concentrée, 7 g d'extrait de levure connue sous la déno mination commerciale DISCO, eau distillée q.s.p. 1 000 ml. 3. Milieu de base pour fermentations sucrées, stérilisé en autoclave pendant 10 minutes à 110OC, et constitué par 50 mmol de trihydroxyméthylaminométhane, 46 ml d'acide chlorhydrique N, 100 mmol de chlorure de sodium, 1 ml de solution de pourpre de bromocrésol à 16 g/l dans l'éthanol à 95O. Le pu de ce milieu est ajusté à 7,2. 4. Solutions aqueuses concentrées de sucre, stérilisées par filtration, et diluées lors de leur emploi dans le milieu de base pour fermentations sucrées dans un rapport de 1/10. Ainsi les solutions de glucose, mannitol, méso-inositol, sorbitol, rhamnose, saccharose, arabinose, adonitol, fructose, galactose, maltose, tréhalose et xylose sont des solutions à 0,5 mole/litre, tandis que la solution de lactose est à 0,3 môle/litre, celles de raffinose et d'amygdaline à 0,25 môle/litre et celles de salicine et de dulcitol à 0,15 môle/litre. 5. Milieu pour la recherche de l'acétolne, stérilisé par filtration, conservé à 4-C et constitué par 80 umol de Glucose, 80 mmol de pyravate de sodium, 5 g d'extrait de levure connue sous la dénomina tion commerciale DIFCO, 50 mmol de trihydroxymathylaminométhane, 46 mi d'acide chlorhydrique N, eau distillée q.s.p. 1 000 mi. le pli de ce milieu est ajusté à 7,2. 6. Milieu pour la recherche de la béta-galactosidase et de la nitrate réductase, stérilisé par filtration, conservé à 4 C à l'abri de la lumière et constitué par 3,5 mmol de nitro 2 phényl béta I) galactopyranoside, 14 mmol de nitrate de sodium, 100 mmol de trihydroxyméthylaminométhane, 78 ml d'acide chlorhydrique N, eau distillée q.s.p. 1 000 ml. Le pH de ce milieu est ajusté à 7,5. 7. Milieu pour la recherche de l'uréase, stérilisé par filtration et conservé à 4 C, constitué par 25 mmol d'urée, 16 mmol de chlorure de potassium, 6 mmol de chlorure de magnésium, - 5 mmol de D-glueose, 1 ml de solution de pourpre de bromocrésol à 16 g/l dans l'éthanol à 950, eau distillée q.s.p. 1 OOO ml. 8. Milieu pour la recherche de la tryptophane désaminase et la production d'indole, stérilisé en autoclave à 110 C pendant 10 minutes, et constitué par 80 mmol de di-chlorure de piperazine, 60 ml de soude N, 20 mmol de B-tryptophane, eau distillée q.s.p. 1 000 ml. Le pH de ce milieu est ajusté à 6,5. 9. Milieu pour la- recherché de la gélatinase, stérilisé en autoclave-à 110 C pendant 10 minutes, et constitué par 2 g d'extrait de levure connue sous la dénomination commerciale DISCO, 50 mmol de chlorure de sodium, 10 mmol de chlorure de calcium, eau distillée q.s.p. 1 000 ml. 10. Milieu pour la recherche de la lysine décarboxylase, stérilisé en autoclave à 110 C pendant 10 minutes, et constitué par 25 mmol de L + lysine, 5 mmol de D - glucose, 1 ml de solution de pourpre de bromocrésol à 16 g/l dans l'méthanol à 95g, eau distillée q.s.p. 1 000 ml. 11. Milieu pour la recherche de l'ornithine décarboxylase, stérilisé en autoclave à 110 C pendant 10 minutes, et constitué par 25 mmol de X + ornithine, 5 mmol de D - glucose, 1 mi de solution de pourpre de bromocrésol à 16 g/l dans l'éthanol à 950, eau distillée q.sOp. 1 000 ml. 12. Milieu pour la vérification de l'utilisation du citrate, stérilisé en autoclave à 110OC pendant 10 minutes, et constitué par 29 > mmol de citrate tri-sodique, 4 mmol d'acide citrique, 100 mg de bleu de bromothymol, eau distillée q.s.p. 1 000 ml. le pH de ce milieu est compris entre 6 et 6,1. 13. Milieu pour vérifier l'utilisation du malonate, stérilisé en autoclave à il 00C pendant 10 minutes, et constitué par : 29,7 mmol de malonate de sodium, 3,3 mmol d'acide malonique, 100 mg de bleu de bromothymol, eau distillée q.s.p. 1 000 ml. le pH de ce milieu est compris entre 5,9 et 6. D'autres réactifs connus sont encore utilisés par la méthode selon l'invention, à savoir : - un milieu pour vérifier la production d'acide sulfhydrique, stérilisé en autoclave à 110OC pendant 10 minutes, et constitué par : 40 g de peptone trypsique de caséine, 6 mmol de thiosulfate de sodium, Q4 mmol d'alun de fer, eau distillée q.s.p. 1 000 ml. le pH de ce milieu est ajusté à 7,4 avec de la soude. - des réactifs annexes, notamment de l'huile de vaseline fluide, stérile, des réactifs des nitrites tels que 20 mmol/l d'acide sulfanilique dans l'acide acétique 0,44 M et 35 mmol/l d'alpha naphthylamine dans l'acide acétique 0,44 M, des réactifs de l'acétone tels que 7 môle/l de potasse dans Ilfau distillée et 0,4 mole/l d'alpha naphtol dans l'éthanol à 900, un réactif révélateur de la tryptophane désaminase, tel que le perchlorure de fer dans l'eau distillée à raison de 20 mmol/l, un réactif pour la mise en évidence de l'indole, ou réactif dit "de Sowacks", constitué par :: 300 mmol de paradiméthylaminobenzaldehyde, 750 ml d'alcool amylique, 250 ml d'acide chlorhydrique 10 N, et des bandelettes de pellicule photographique noir et blanc, de format 24 x 36 mm, connues sous la dénomination commerciale Gilford Sp 4. La micro-méthode conforme à l'invention est mise en oeuvre de la manière suivante Une suspension d'une colonie d'entérobactérie à identifier est préparée dans 2 ml de bouillon galerie et est mise à l'étuve à 37 C pendant deux heures. Punis, à l'aide de cette suspension, on ensemence les bouillons d'ldentification préalablement répartis à raison de 0,5 ml dans des tubes à hémolyse en polystyrène cristal. A chaque caractère biochimique recherché correspond un tube, sauf en ce qui concerne la réduction des nitrates qui sont recherchés sur le même tube que la recherche de la béta-galactosidase. 0,25 ml d'huile de vaseline est ajouté aux tubes destinés à la recherche de la production d'acide sulfhydrique, de la lysine décarboxylase, de l'ornithine décarboxylase, d'uréase et de fermentation du glucose, tandis que dans le tube contenant le bouillon pour la recherche de la gélatinase, est introduite une bandelette de pellicule photographique. Si tous les caractères du premier groupe et les fermentations sucrées sont à étudier simultanément, il est nécessaire d'utiliser 2,5 à 3 ml de bouillon galerie. Après passage des différents milieux pendant une durée d'environ 14 à 18 heures à l'étuve à 35-0C, les réactions peuvent être interprétées, à titre d'exemple, de la manière suivante Réaction positive Réaction négative 1. Fermentation du glucose ..... jaune bleu 2. Recherche de la béta galactosidase ............. jaune incolore 3. Réduction des nitrates en nitrites Ajouter au tube pour la recherche de la béta-galactosidase, une goutte d'une solution d'acide sulfanilique et une goutte d'une solution d'alpha naphtylamine. Mélanger ............... rouge groseille jaune pâle 4. Production d'acétone : ajouter au milieu deux gouttes d'une solution de potasse et deux gouttes d'une solution d'alpha naphtol. Bien mélanger9 Après 15 minutes ............ coloration rose incolore ou lé gèrement jaune 5. Utilisation du citrate ...... bleu intense vert 6. Utilisation du malonate .... bleu intense vert 7. Recherche de la lysine décarboxylase ............... bleu jaune 8. Recherche de l'ornithine décarboxylase ............. bleu jaune 9. Recherche de la tryptophane désaminase : ajouter au milieu une goutte d'une solution de perchlorure de fer ............................. brun foncé jaune clair 10.Production d'indole : ajouter au milieu deux gouttes de réactif de Kowacks ................ anneau rouge anneau incolore ou légèrement verdâtre 11. Recherche de l'uréase bleu jaune 12. Production d'acide sulfhydrique ............................. noircissement incolore du milieu 1-3. Recherche de la gélatinose ................. bandelette bandelette transparente inchangée 14. Fermentations sucrées quelque soit le sucre étudié ,....... jaune bleu. Conformément à une autre caractéristique de l'invention, pour la mise en oeuvre de la micro-méthode sur plaque à microtitration, le bouillon galerie est stérilisé en autoclave à 110 C pendant 10 minutes, et présente de préférence la composition suivante : 200 ml de solution de Koser modifiée concentrée, 4,5g d'extrait de levure connue sous la dénomina tion commerciale DLFCO, eau distillée q.s.p. 1 000 ml. Dans ce cas d'emploi, les bouillons d'identification sont les mêmes que pour la pratique en tube à hémolyse, et sont conservés dans des flacons compte-goutte débitant 50 l/goutte. Pour ce dernier cas d'emploi, la micro-méthode est mise en oeuvre de la manière suivante : Une colonie de la bactérie à identifier, prélevée sur milieu d'isolement est mise en suspension dans 1 ml de bouillon galerie. Après deux heures d'étuve, on répartit SOAl de cette suspension dans i OOAl de bouillon d1 identification préalablement répartis dans les godets de la plaque à microtitration. A chaque godet correspond un caractère biochimique, sauf au godet contenant le milieu pour la recherche de la béta-galactosidase et de la nitrate réductase. Aux godets contenant les milieux glucose, urée, lysine, ornithine, production d'acide sulfhydrique, on ajoute trois gouttes d'huile de vaseline fluide. Dans le godet contenant le milieu pour la recherche de la gélatinase, on ajoute un petit morceau de pellicule photographique, et enfin, on couvre les godets avec un adhésif auto-collant. Si, en plus des treize caractères du premier groupe, on veut également étudier les fermentations sucrées, on procède à l'ensemen- cement de 1,5 ml de bouillon galerie. Après passage des milieux en étuve à 35 C pendant une durée d'environ 14 à 18 heures, on enlève le couvercle adhésif et on ajoute les réactifs révélateurs de la manière suivante - Pour la recherche des nitrates, on ajoute au milieu pour la recherche de la béta-galactosidase et de la nitrate réductase une goutte d'acide sulfanilique et une goutte d'alpha-naphtylamine0 - Pour la recherche de lracétolne, on ajoute au milieu pour la recherche de l'acétoîne, une goutte de potasse à 40 fo et une goutte d'alpha-naphtol, la lecture s'effectuant 15 à 30 minutes après addition des révélateurs0 - Pour la recherche de la tryptophane désaminose, on ajoute au milieu correspondant une goutte de perchlorure de fer. - Pour la recherche de la production d'indole, on ajoute au milieu correspondant une goutte de réactif dit de "Kowacks" La lecture des résultats des réactions est effectuée comme dans le cas des tubes à hémolyse. Grâce à l'invention, il est possible, en mettant en oeuvre des moyens connus, de réaliser rapidement, et à un prix de revient très bas, une identification de bactéries. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée au procédé décrit. Des modifications restent possibles, sans sortir pour autant du domaine de protection de l'invention0 -REVENDICATIONS- 1. Micro-méthode d'identification des bactéries, caractérisée en ce qu'elle se pratique en tube à hémolyse ou sur plaque pour microtitration, et utilise les colonies bactériennes obtenues sur milieu d'isolement en relation avec des réactifs tels qu'une solution de Roser modifiée concentrée, un bouillon galerie, un milieu de base pour Sermentatiom sucrées, des solutions aqueuses concentrées de sucre, un milieu pour la recherche de l'acétorne, un milieu pour la recherche de la béta-galactosidase et de la nitrate réductase, un milieu pour la recherche de l'uréase, un milieu pour la recherche de la tryptophane désaminase et la production d'indole, un milieu pour la recherche de la gélatinase, un milieu pour la recherche de la lysine décarboxylase, un milieu pour la recherche de l'ornithine décarboxylase, un milieu pour la vérification de l'utilisation du citrate et un milieu pour vérifier l'utilisation du malonate. 2. Réactif pour la mise en oeuvre de la micro-méthode, suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en une solution de Koser modifiée concentrée, conservée à 40 C, et constituée de préférence par une solution aqueuse de 430 mmol de chlorure de sodium, 4 mmol de sulfate de magnésium, 18 mmol de chlorure de potassium, 43 mmol de chlorure d' ammonium. 3. Réactif pour la mise en oeuvre de la micro-méthode, suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en un bouillon galerie stérilisé en autoclave à 110OC! pendant 10 minutes, puis conservé à température ambiante, et constitué, pour 11 emploi en tube à hémolyse, de préférence par 200 ml de solution de Koser modifiée concentrée, 7 g d'extrait de levure connue sous la dénomina tion commerciale DIFCO, eau distillée q.s.p. 1 000 mi. 4e Réactif pour la mise en oeuvre de la micro-méthode, suivant la revendication 1, caractérisé en ce qutil consiste en un bouillon galerie, stérilisé en autoclave à 110-C pendant 10 minutes, et constitué, pour l'emploi sur plaque à microtitration, de préfé rence par : 200 mi de solution de Koser modifiée concentrée, 4,5 g d'extrait de levure connue sous la déno mination commerciale DIFC0, eau distillée qOs.p. 1 000 mi 5.Réactif pour la mise en oeuvre de la micro-méthode, suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en un milieu de base pour fermentations sucrées stérilisé en autoclave pendant 10 minutes à 110OC, et constitué de préférence par 50 mmol de trihydroxyméthylaminométhane, 46 ml d'acide chlorhydrique N, 100 mmol de chlorure de potassium, 1 ml de solution de pourpre de bromocrésol à 16 g/l dans l'éthanol à 95o, le pH de ce milieu étant ajusté à 7,2. 6. Réactif pour la mise en oeuvre de la micro-méthode, suivant la revendieation 1, caractérisé en ce qu'il consiste en des solutions aqueuses concentrées de sucre stériiisées par filtration, et diluées lors de leur emploi dans le milieu de base pour fermen- - tations sucrées dans un rapport de 1/10, les solutions de glucose, mannitol, méso-inositol, sorbitol, rhamnose, saccharose, arabinose, adonitol, fructose, galactose, maltose, tréhalose et xylose étant des solutions à 0,5 môle/litre, tandis que la solution de lactose est à 0,3 m8le/litre, celles de raffinose et d'amygdaline à 0,25 môle/litre, et celles de salicine et de dulcitol à 0,15 môle/ litre. 7. Réactif pour la mise en oeuvre de la micro-méthode, suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en un milieu pour la recherche de llacétolne, stérilisé par filtration, conservé à 4-0C, et constitué de préférence par 80 mmol de D - glucose, 80 mmol de pyruvate de sodium, 5 g d'extrait de levure connue sous la dénomi nation commerciale DIFC0, 50 mmol de trihydroxyméthylaminométhane, 46 ml d'acide chlorhydrique N eau distillée q.s.p. 1 000 ml, le pH de ce milieu étant ajusté à 7,2. 80 Réactif pour la mise en oeuvre de la micro-méthode, suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en un milieu pour la recherche de la béta-galactosidase et de la nitrate réductase, stérilisé par filtration, conservé à 4oC à l'abri de la lumière, et constitué de préférence par 3,5 mmol de nitro 2 phényl béta D galactopyranoside, 14 mmol de nitrate de sodium, 100 mmol de trihydroxyméthylaminométhane, 78 ml d'acide chlorhydrique N, eau distillée q.s.pO 1 000 ml, le pH de ce milieu étant ajusté à 7,5. 9. Réactif pour la mise en oeuvre de la micro-méthode, suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en un milieu pour la recherche de l'uréase, stérilisé par filtration, conservé à 4oC, et constitué de préférence par : 25 mmol durée, 16 mmol de chlorure de potassium, 6 mmol de chlorure de magnésium, 5 mmol de D - glucose, î ml de solution de pourpre de bromocrésol à 16g/l dans ltéthanol à 950, eau distillée q.s.p. 1 000 ml. 10. Réactif pour la mise en oeuvre de la micro-méthode, suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en un milieu pour la recherche de la tryptophane désaminase et la production d'indole, stérilisé en autoclave à 120OC pendant 10 minutes, et constitué de préférence par 80 mmol de di-chlorure de piperazine, 60 ml de soude N, 20 mmol de 1 - tryptophane, eau distillée q.s.p. 1 000 ml, le pH de ce milieu étant ajusté à 6,5. 11. Réactif pour la mise en oeuvre de la micro-méthode, suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en un milieu pour la recherchide la gélatinase, stérilisé en autoclave à 110OC pendant 10 minutes, et constitué de préférence par 2 g d'extrait de levure connue sous la dénomina tion commerciale DIFC0, 50 mmol de chlorure de sodium, 10 mmol de chlorure de calcium, eau distillée q.sOp. 1 000 ml. 12. Réactif pour la mise en oeuvre de la micro-méthode, suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en un milieu pour la recherche de la lysine décarboxylase, stérilisé en autoclave à 110OC pendant 10 minutes, et constitué de préférence par 25 mmol de B + lysine, 5 mmol de D - glucose, 1 ml de solution de pourpre de bromocrésol à 16 g/l dans l'éthanol à 950, eau distillée q.s.p. 1 000 mi. 13. Réactif pour la mise en oeuvre de la micro-méthode, suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en un milieu pour la recherche de l'ornithine décarboxylase, stérilisé en autoclave à 110OC pendant 10 minutes, et constitué de préférence par 25 mmol de L + ornithine, 5 mmol de D - glucose, 1 ml de solution de pourpre de bromocrésol à 16 g/l dans l'éthanol à 95 , eau distillée q.s.p. 1 000-ni. 14. Réactif pour la mise en oeuvre de la micro-méthode, suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en un milieu pour la vérification de l'utilisation du citrate, stérilisé en autoclave pendant 10 minutes à 110OC, et constitué de préférence par 29 mmol de citrate tri-sodique, 4 mmol d'acide citrique, 100 mg de bleu de bromothymol eau distillée qos,p. 1 000 mi, le pH de ce milieu étant compris entre 6 et 6,1. 15. Réactif pour la mise en oeuvre de la micro-méthode, suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en un milieu pour vérifier l'utilisation du malonate, stérilisé en autoclave à 110OC pendant 10 minutes, et constitué de préférence par : 29,7 mmol de malonate de sodium, 3,3 mmol d'acide malonique, 100 mg de bleu de bromothymol, eau distillée q.s.p. 1 000 ni, le pH de ce milieu étant compris entre 5,9 et 6.