Brevet FR2343484A1 — publié le 19771007

L'invention est relative è un nouvel agent soluble dans l'eau, efficace comme adjuvant immunologique pour stimuler, chez un hutte, les réponses immunitaires. L'agent adjuvant selon l'invention est le 2-(2-acétamido-2 déoxy-3-O-D-glucopyranosyl)-D-propionyl-L-alanyl-D-(&alpha;-méthylami glutamique répeindant à la formule Nos le désignerons ci-après par l'abréviation Mur-NAc-L-Ala-D Glu(NHCH3)' L'invention concerne aussi des compositions médicamenteusee contenant ledit agent et servant notamment à renforcer l'action des immunogènea faibles. Plus particulièrement, l'invention concerne des compositions contenant ledit agent et utilisables pour l'im- munisation de l'homme et des animaux à sang chaud contre des infec tions bactériennes, virales et parasitaires, et~contre différents antigènes tissulaires d'origine normale ou pathologique. L'intérêt tout particulier du produit selon l'invention réside dans le fait qu'il n'est pas nécessaire d'avoir recours à des milieux particuliers d'administration, dont dépendrait la manifes- tation de l'action adjuvante, et les excipients auxquels on est conduit à 11 associer n'ont pour but que de faciliter l'utilisation du produit. En particulier, il n1 est pas nécessaire, lorsque le produit est inject, d'utiliser à cet effet une composition contenant une phase huileuse. En outre, l'agent adjuvant selon l'invention peut être administré par voie orale ou parentérale, notamment par injection, scarification, ou par application sur des muqueuses. L'invention concerne en particulier des compositions médicamenteuses contenant le Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(NHCH3) en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Des compositions de ce type particulièrement préférées sont constituées par des solutions injectables contenant une dose efficace du produit selon l'invention. On utilise avantageusement, à cet effet, des solutions stériles dans une phase aqueuse de préférence isotonique, telles que des solutions isotoniquea salines ou glucosées. Ceci n'est bien entendu pas limitatif ; on peut également utiliser une simple solution dans de l'eau distillée. I1 est également possible d'utiliser des milieux d'injection contenant une phase huileuse, et notamment des émulsions eau dans l'huile.De telles émulsions sont obtenues en particulier avec des huiles végétales métabolisables, telles que décrites dans la demande de brevet français no 75 04003. Les compositions médicamenteuses selon l'invention peuvent être présentées encore sous des formes variées, en utilisant à cet effet des excipients appropriés au mode d'administration choisi. On utilisera par exemple des compositions sous forme de cachets, comprimés ou gélules, pour l'administration orale, des aérosols ou des gels pour l'application sur les muqueuses. L'agent adjuvant selon l'invention peut encore être sous forme lyophilisée pour permettre la préparation extemporanée de solutions injectables, ou pour scarification. Une forme pharmaceutique avantageuse pour la préparation extemporanée de solutions injectables comprend une dose d'environ 2 mg du produit adjuvant selon l'invention, à l'état lyophilisé, en association avec environ 10 mg de lactose comme excipient. L'invention vise aussi les compositions médicamenteuses dans lesquelles le Mur-NAc-L-Bla-D-Glu(NHCH, ) est associé à un agent immunogène, notamment à un antigène vaccinant faible. L'invention concerne encore un procédé de préparation du Mur NAc-L-Ala-D-Glu(NRCH3), caractérisé en ce que l'on fixe à un dérivé adéquat de l'acide N-acétyl-maramique la channe peptidique L- Ala-D-Glu(NECH3) dont sont bloqués les groupements réactifs, à l'exception du groupe amine devant réagir. Après la fixation, on libère les fonctions protégées. D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront; au cours de la description d'un exemple de préparation du produit selon l'invention, ainsi que des essais mettant en évidence les propriétés pharmacologiques de ce produit. Exemple de synthèse du Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(NHCH3) Ce composé est préparé en plusieurs étapes. Dans un premier temps, la channe peptidique est synthétisée, puis, dans un second temps, cette channe est fixée au résidu muramyle. Pendant cette synthèse, les fonctions ne devant pas entrer en réaction sont protégées par des groupes de protection ou de blocage qui sont ensuite éliminés. Dans la suite de cet exposé, les abréviations utilisées ont les significations suivantes : Mur-NAc : 2-acétamido-2-déoxy-3-O-(D-2-propionyl)-D glucopyranose Ala : alanine Glu : acide glutamique iso-Gln : isoglutamine 4,6-O-bzi : 4,6-O-benzylidène ss-bz. : ss-benzyl BOC : t-butyloxycarbonyl OBzl : ester benzylique OSu : ester succinimidique Bzl : éther benzylique BOC-D-Glu(NHCH3)-OBzl (A) 3,36 g (10 mmoles) du #-ester benzylique BOC-D-Glu [E. Schröder, E. Klieger, Justus Liebig's Ann. Chem. 673 (1964) 196] sont dissous dans 50 ml de tétrahydrofuranne. A la solution refroidie à -150C, on ajoute sous agitation 1,1 ml (10 mmoles) de N-méthylmorpholine et 1,3 ml (10 mmoles) de chloroformate d'isobutyle. Après 10 minutes et à OOC, on fait passer dans la suspension un courant de méthylamine sec. Après 60 minutes, le mélange réactionnel est étendu à 150 il avec de l'acétate d'éthyle, et la phase organique est lavée à 11 eau jusqu'à pH neutre, puis séchée sur MgS04. Après filtration, la phase acétate d'éthyle est concentrée à sec et le produit précipité à l'éther. On obtient 2,8 g de produit, soit un rendement de 80 %. Les constantes de ce produit sont : PF 124-126 C 25 D = + 1,40 (méthanol absolu) L'analyse élémentaire du produit est C18H26O5N2 (350,42) c % R % calculé : 61,69 7,48 7,99 trouvé : 62 7,6 8,2 Chlorhydrate de D-Glu(NHCH3)-OBzl (B) 1,4 g (4 mmoles) de (A) sot traités par 12 ml d'une solution environ N d'acide chlorhydrique dans l'acide acétique, pendant 30 minutes. Le mélange réactionnel est concentré à sec. Le produit est obtenu sous forme d'huile. Il est homogène en chromatographie sur couche mince de gel de silice dans n-butanol-pyridine-acide acétique-eau (30/20/6/24, v/v). BOC-L-Ala-D-Glu(NHCH3)-OBzl (C) 1 g (3,5 mmoles) de l'ester succinimidique de BOC-Ala [G.W. Anderson, J.E. Zimmerman, F.M. Callahan, J. Am. Chem. Soc. 86 (1964) 1839] est ajouté à une solution, dans le diméthylformamide (10 ml), refroidie à 0 O, de 3,7 mmoles de (B) et 0,4 ml (3,7 mmoles) de N-méthylmorpholine. Après une nuit à température ambiante, le mélange réactionnel est concentré à sec et repris avec 100 ml d'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée successivement avec une solution d'acide citrique 10 %, à liteau, avec une solution N de C03HNa, puis à l'eau jusquwà pH neutre. La phase acétate d'éthyle est séchée 30 minutes sur MgS04, puis filtrée et concentrée à sec. le produit est cristallisé dans le mélange méthanol-éther de pétrole.On en obtient 1,04 g, soit un rendement de 71 %. les constantes de ce produit sont Pf 145-147 C &alpha;25 = = + 6,40 (acide acétique glacial) L'analyse élémentaire du produit est 021H3106N3 (421,50) 0% H% O fo N % calculé : 59,84 7,41 22,77 9,97 trouvé : 60,2 7,4 22,82 10,01 Chlorhydrate de L'Ala-D-Glu(NHCH3)-OBzl (D) 843 mg (2 mmoles) de (C) sont traités pendant 30 minutes par 5 ml d'une solution environ N d'acide chlorhydrique dans l'acide acétique. te mélange réactionnel est concentré à sec et le résidu purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (35 g) (CHCl3-MeOR, 5/5, v/v). Les fractions obtenues pures sont réunies et concentrées. On obtient 614 mg de produit sous forme d'huile, soit un rendement de 86 %. Mur-NAc (ss-bzl-4,6-bzi)-L-Ala-D-Glu(NHCH3)OBzl (E) 377 mg (0,8 mmole) de Mur-NAc (ss-bzl-4,6-bzi) sont ajoutés à une solution dans 10 ml de diméthylformamide de 0,86 mmole de (D) et 0,1 ml (0,86 mmole) de N-méthylmorpholine. On ajoute 108 mg (0,8 mmole) d'hydroxybenzotriazole et 165 mg (0,8 mmole) de dicyclohexylcarbodiimide. Après une nuit à température ambiante, le produit et la dicyclohexylurée formée sont précipités à l'eau, filtrés et desséchés. On obtient ainsi 767 mg de précipité, soit un rendement de 96 %. 380 mg du précipité sont purifiés sur colonne de gel de silice (30 g). la colonne est éluée d'abord avec du chloroforme, puis avec un mélange chloroforme-méthanol (5/5, v/v). les fractions pures sont réunies et concentrées. On obtient ainsi 250 mg de produit (rendement 80 %) dont le pouvoir rotatoire est 25 - @@ (diméthylfomm@@@@) D l'analyse élémentaire du produit est la suivante C41H50011N4 0,75 H20 (792,88) O % H% N% calculé : 62,46 6,65 7,10 trouvé : 62,7 6,69 6.92 Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(NHCH3) (F) 198,22 mg (0,25 mmole) de (E), dissous dans 15 ml d'acide acétique glacial, sont hydrogénés pendant 10 heures en présence de palladium sur charbon.Après filtration du catalyseur et concentration à sec du mélange réactionnel, le produit est obtenu par précipitation dans le mélange éthanol-acétone-éther. On obtient 108 mg de produit (rendement 85 %) dont les constantes sont PF 157-161 O &alpha;D25 = + 49 (acide acétique glacial) Le produit est chromatographiquement homogène sur plaques de gel de silice dans les mélanges n-butanol-pyridine-acide acétique-eau (30/ 20/6/24, v/v) et n-butanol-acide acétique-eau (4/t/5, v/v - phase supérieure). l'analyse élémentaire est la suivante : C20H34O11N4 (506,52) C% calculé : 47,42 6,76 11,06 trouvé : 47,5 6,8 11,0 Propriétés pharmacologiques du Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(NHCH3) L'innocuité, ou au contraire la toxicité du produit selon l'invention, est étudiée par injection intraveineuse sur des souris âgées de deux mois.En augmentant progressivement les doses admi nistrées, on détermine celle pour laquelle la mortalité des souris d'un même lot s'établit à 50 % (DL50). Pour le produit étudié, on a montré que la DL50 est supérieure à 1 g par kg d'animal, ce qui est de beaucoup supérieur aux doses pour lesquelles le produit manifeste ses propriétés adjuvantes. Caractère adjuvant en solution aoueuse Dans les séries d'essais dont les résultats sont indiqués ci après, on a étudié l'influence du principe actif selon l'invention sur le taux des anticorps anti-albumine dans les conditions suivantes. Des groupes de 8 souris Swiss agrées de deux mois reçoivent, par injection sous-cutande, 0,5 mg d'antigène constitué par de l'albumine de sérum bovin (BSA) et 0,1 mg de la substance essayée dans une solution saline isotonique. Cette dose élevée d'antigène, parce qu'elle se situe à la limite de la dose paralysante vis-àvis de la réponse immunitaire, entratne, de ce fait, une réponse faible ou nulle à l'antigène seul chez les témoins ; elle constitue donc un critère sévère pour mettre en évidence l'activité d'une substance adjuvante. Trente jours plus tard, les souris reçoivent un rappel contenant 0,1 mg du même antigène. Le taux d'anticorps est déterminé par hémagglutination passive en utilisant des hématies de mouton traitées à la formaline et recouvertes de l'antigène étudié selon la méthode décrite par A.A. Pirata et M.W. Brandiss (J. Immunol., 100, 641-648, 1968). Les prélèvements ont lieu 14, 28, 34 et 36 jours après la première in jection. A titre de comparaison, des souris reçoivent, à la place du Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(NHCH3), soit des lipopolysaccharides (TPS) (extrait de S.Enteritidis par la méthode eau-phénol), soit l'adjuvant désigné sous le nom "WSA" et décrit par Adam et colt. [Infect. Immun. (1973) 7, 855-86j7. Les souris témoins ne reçoivent que l'antigène. Les résultats de ces essais sont donnés dans le tableau suivant. Tableau 1 t d'anticorps ; 14e t 2 & ; 34e ; 36e 28e ; 34e jour ~~----~~~~~~~~ ; jour jour jour jour , jour ; jour ; ! Témoin - BSA I 1 1 1 ! i i 3SA + LPS (100/ug) ! 3 ! 6 1 50 i 1310 1 !------ ! ! ! ! --! i BSA + WSA (300/ug) ! 3 ! 3 ! 3 ! 6 1 I ! ! ! I ! ! BSA + Mur-NAc-1-Ala-D-Glu( NHCH) ) i 6 ! 12 t 1600 i 1600 (100/us) i ! ! Ces résultats montrent que le Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(NHCH3), ad ministré en solution saline isotonique, provoque un important accroissement du taux d'anticorps formés, alors que, dans les mêmes conditions, le "WSA" est pratiquement inactif. Les réponses obtenues avec le Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(NHCH3) peuvent e être considérées, de façon générale, comme comparables à celles que l'on constate avec le "LPS", mais il faut remarquer que, contrairement à ce dernier, il est dépourvu de toxicité. Caractère adjuvant en présence d'une phase huileuse Comme pour les essais précédents, on suit l'accroissement du taux d'anticorps provoqué par l'injection d'antigène et du composé selon l'invention, mais, dans le cas présent, l'injection contient une phase huileuse constituée par l'adjuvant incomplet de Freund (en émulsion eau dans l'huile). Pour ces essais, on a utilisé des cobayes Hartley de 350 g. Les animaux témoins reçoivent, dans chacune des pattes postérieures, 0,1 ml d1émulsion, soit de FIA, soit de FCA (adjuvant complet de Freund) contenant 500/ug d'ovalbumine (antigène). Le produit essayé est administré, à raison de 100 g, dans une émulsion de FIA. On détermine, 21 jours après l'injection, le taux d'anticorps par hémagglutination passive (PHA), comme précédemment, et par précipitation suivant la méthode de Folin. les mêmes cobayes subissent, 18 jours après l'injection, un test d'hypersensibilité cutanée. A cet effet, ils reçoivent, par injection intradermique, 5 g d'ovalbumine. 48 heures après cette injection, on mesure le diamètre de l'induration au point d'inJec- tion. les résultats sont donnés dans le tableau suivant. Tableau 2 Titre d'anticorps Injection Test cutané Précipi- Aggluti (diamètre en mm) tation nation ---------------------------------------------------------------------- ovalbumine + FIA # 500 900 0, 0, 0, 0, 0, 0 ---------------------------------------------------------------------- : ovalbumine t FCA ! 2100 : 3600 !12,13,12,14,11,19 ---------------------------------------------------------------------- ovalbumie + FIA + Mur-NAc L-Ala-D-Glu(NHCH3) 5500 6100 8, 9, 14, 15, 15 ---------------------------------------------------------------------- Ces résultats montrent que le Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(NHCH), administré en présence d'une phase huileuse, favorise de façon très importante 1'accroissement du taux d'anticorps, et qu'il induit une réaction d'hypersensibilité du type retardé vis-à-vis du m4me antigène. On obtient donc des compositions adjuvantes dépourvues de toxicité et qui peuvent être utilisées pour accrottre l'efficacité de vaccins d'origine bactérienne ou virale, notamment quand ceux-oi sont faiblement immunogènes. Elles peuvent Entre utilisées notamment pour favoriser l'immu- nisation de l'hôte (patients humains ou animaux) à l'égard des infections d'origine bactérienne ou virale, des antigènes des tumeurs, etc. Elles sont également efficaces pour la fabrication de sérums contenant des anticorps actifs à l'égard de ces antigènes. REVENDICATIONS 1 - 2-(2-acétamido-2-deoxy-3-0-D-glucopyranosyl)-D-propionyl- L-alanyl-D-(&alpha;-méthylamide)-glutamique, composé répondant à la formule 2 - Procédé de préparation du produit selon la revendication1, caractérisé en ce que l'on fixe à un dérivé adéquat de acide N-acétyl-muramique la channe peptidique L-Ala-D-Glu(NHCH3) dont sont bloqués les groupements réactifs, à l'exception du groupe amine devant réagir, puis on libère les fonctions protégées. 3 - Composition médicamenteuse contenant le produit (I). 4 - Composition médicamenteuse selon la revendication 3, constituée par une solution injectable du produit (I). 5 - Composition selon la revendication 3, constituée par une solution aqueuse isotonique saline dans laquelle le produit (I) est dissous. 6 - Composition selon la revendication 3, constituée par une émulsion eau-huile dans laquelle le produit (I) est dissous. 7 - Composition selon la revendication 3 dans laquelle le produit (I) est associé à des excipients destinés à faciliter son administration par voie orale, ou à des excipients propres à faciliter son application sur des muqueuses. 8 - Composition selon l'une quelconque des revendications 3 à 7, caractérisée en ce que le produit (I) y est associé à un agent immunogène. 9 - Composition médicamenteuse contenant le produit (I) sous forme lyophilisée, éventuellement associé à un agent immunogène. 10 - Composition adjuvante de l'activité immunitaire, caractérisée en ce qu'elle contient une dose efficace du produit (I). Il - Composition de vaccin à usage humain, caractérisée en ce qu'elle contient, outre l'agent immunogène, une dose efficace du produit (I). 12 - Composition de vaccin à usage vétérinaire, caractérisée en ce qu'elle contient, outre l'agent immunogène, une dose efficace du produit (I). 13 - Présentation pharmaceutique pour la préparation extemporanée de solutions, comprenant une dose d'environ 2 mg du produit (I) lyophilisé en association avec environ 10 mg de lactose