Brevet FR2332025A1 — publié le 19770617

L'invention concerne un procédé d'extraction d'un facteur hyperglycémiant, à partir de la moelle osseuse rouge et/ou d'organes physiologiquement analogues ; elle comprend également le nouvel extrait obtenu par ce procédé, ainsi que son application dans le domaine thérapeutique. La moelle osseuse rouge provient des os plats, par exemple des animaux de boucherie. Ces os convenablement préparés sont entreposés au froid pendant un temps court, ou stockés apres con gélation à basse température. Ils sont sciés en morceaux, et leurs parois osseuses externe dures sont éliminées. La moelle rouge avec sa matrice osseuse spongieuse est alors découpée en fragments, puis concassée. La pâte ainsi préparée est soumise aux opérations de broyage et d'extraction. Le procédé selon l'invention consiste a soumettre au broyage la pâte constituée par la moelle osseuse rouge et la matrice osseuse spongieuse en présence d'eau distillée froide, à éliminer les particules osseuses par filtration, a soumettre le filtrat une extraction en milieu tamponné acide, a des températures comprises entre 600 et 1000C, puis a effectuer une nouvelle filtration, une concentration, une précipitation et diverses purifications. On peut ainsi extraire de la moelle osseuse rouge une fraction contenant un facteur hyperglycémiant, provoquant une glycogénolyse générale, notamment musculaire et aboutissant a une chasse glycosurique. Le traitement à l'eau , effectué au cours du broyage, permet d'éliminer de l'extraction les substances indésirables pour le but poursuivi, et qui sont contenues dans la matrice osseuse spongieuse dans laquelle se trouvent les cellules de la moelle rouge. Ces substances sont des sels, des corps organiques tels que gélatine, osséomucorde, osséoalbumine et autres. Pour ce traitement, la moelle osseuse concassée, débarrassée des parties dures, est traitée par l'eau distillée froide qui lyse les cellules. Le broyage est pratiqué dans cette eau distillée ; il est très poussé avec un broyeur à grande vitesse par exemple du type polytron. On filtre le liquide de façon retenir toutes les particules osseuses en suspension.Ce traitement par l'eau distillée peut se faire selon deux variantes : ou bien dans un premier temps, on ajoute la moitié de l'eau distillée selon la dilution finale choisie prévue, on broie ce mélange, on élimine les particules osseuses en suspension, puis on ajoute un volume égal à celui du filtrat d'un tampon à double concentration ; ou bien, on ajoute au début la totalité de l'eau distillée prévue, et après broyage et filtration1, on ajoute les éléments qui établissent le système tampnn acide prévu. Au cours de l'extraction du filtrat, conformément à l'invention, on travaille à des PH compris entre 4 et 7 et de préférence à des pH voisins de 4,5. On peut recourir à des tampons à partir des acides soit forts, soit organiques, ou à tout autre tampon acide connu en biologie. Ce pH acide permet d'obtenir des milieux exempts de sels comme c'est le cas quand on effectue l'extraction en milieu basique. Pour parfaire l'extraction on peut ajouter au mélange, de l'alcool à faible concentration par exemple à 50 alcooliques en final. Le filtratl ainsi préparé est soumis au chauffage entre 600 et 1000C pendant un temps proportionnel à la masse traitée,ge- néralement compris entre 30 minutes et 2 heures. Après refroidissement, ce broyat est filtré (filtrat2). I1 reste sur le filtre un résidu pateux brun foncé, fin, sans particules osseuses ; le filtrat2 est jaune pâle, presque limpide, il ne contient que les substances thermorésistantes et éventuellement acidorésistantes de la moelle osseuse rouge. Ce filtrat2 est alors fortement concentré par exemple avec un concentrateur rotatif sous vide ou tout autre dispositif convenable. La concentration peut être poussée entre 5 et 20 fois. On obtient ainsi l'extrait brut concentré. A ce stade, l'extrait brut concentré peut être dialysé, contre de l'eau déminéralisée ou soumis à une ultrafiltration,ou a une électrodialyse ; en fait, l'extraction ayant eu lieu en PH acide, cet extrait est peu chargé en sels et ces dernières opérations ne sont pas indispensables dans la mesure où l'on procède à des opérations ultérieures de purification. L'extrait subit alors une purification préalable par précipitation ; si la concentration a été poussée jusqu'à précipitation à chaud, on laisse achever cette précipitation à +40C, puis on centrifuge. Le surnageant ainsi obtenu, ou l'extrait brut qui n'a pas été concentré si fortement et qui n'a pas encore précipité de lui-même, sont précipités, soit par de l'alcool par exemple vers 350 alcooliques en final, mais pendant un temps de 1 à 2 heures à 40C avant la centrifugation, ou même simplement par ébullition de quelques minutes. En effet, bien que l'extraction initiale ait été faite à chaud, le concentrat peut encore précipiter vers 98 ou 1000C par exemple au bain-maris bouillant. Dans tous les cas, on refroidit et centrifuge. Ce sont en effet les surnageants obtenus après centrifugation ou précipitation alcoolique ou thermique qui sont l'objet des opérations de fractionnement. Les surnageants sont limpides, jaunes et ont tous une fluorescence jaune-vert en lumière ultra violette. Ils sont chromatographiés et fractionnés par gel-filtration. -.Celui-ci est pratiqué selon les techniques connues, mais dans le cas de l'extraction de la moelle osseuse rouge à PH acide, après équilibration des gels choisis, par un tampon acétate 0,02M à pH 4,3-4,5. Les courbes de % de transmission du fractionnement montrent des pics initiaux que l'on sépare et qui ne contiennent pratiquement pas les matières fluorescentes. Par contre, ils sont suivis par un très grand pic formé par les fractions contenant les substances intensément fluorescentes. Or les fractions physiologiquement actives, dans le cas de l'invention sont contenues dans les pics de tête non fluorescent64 Les fractions actives sont reconcentrées et repurifiées par fractionnements successifs. Elles sont utilisées en solution, ou desséchées et mises en poudre par les moyens connus. Les extraits et produits obtenus selon l'invention sont utilisés en tant qu'agents thérapeutiques administrables par voie intraveineuse ou parentéarale. Ils ont des propriétés physiologiques qui les caractérisent. Ils contiennent un facteur qui provoque, par injection intrasanguine, une élévation extraordinairement forte, pendant quelques heures, du taux du glucose dans le sang circulant et corrélativement une chasse urinaire de ce glucose, qui s'accumule ainsi dans la vessie. Les chiffres, par exemple chez le lapin, peuvent correspondre à une glycémie progressive atteignant en 5 heures 8 g par litre de sérum sanguin, ou dépassant ce chiffre. De plus, la chasse urinaire du glucose porte la glycosurie jusqu'à des taux expérimentaux de plus de 50 g par litre d'urine ; dans certains cas, cette glycosurie peut monter jusqu'à 90 g par litre. Or, l'étude biochimique minutieuse montre que, contrairement à des hormones hyperglycémiantes connues, ce glucose, li béré aussi massivement, provient non seulement d'une dégradation du glycogène ou glycogénolyse dans certains organes, comme le foie principalement mais est d'ordre général. Par exemple, contrairement au glucagon qui est sans action sur la glycogénolyse dans les muscles, le facteur découvert réduit le taux de glycogène dans les muscles et dans les principaux organes, jusqu'à l'annuler complètement. Cette glycogénolyse générale et cette libération dans le sang de glucose à partir d'autres sources encore, provoque progressivement la chasse glycosurique considérable dont il a été parlé. Le facteur hyperglycémiant, séparé par le procédé selon l'invention, n'altère pas les fonctions sanguines et cardiaques, comme le montrent les mesures et les électrocardiogrammes. Au contraire, à dose physiologique, il agit sur ces fonctions de façon bénéfique. Les organes ne sont pas altérés et le taux du glucose sanguin revient ultérieurement à la normale. Ce facteur est thermostable et de nature protéique ; il donne une vive réaction avec la p.diméthylaminobenzaldéhyde selon Ehrlich, indicatrice des glycoprotéines. Ce test est confirmé par la réaction spécifique de Elson-Morgan. Les principes de préparation décrits peuvent être appliqués, sans sortir du cadre de l'invention à tout organe physiologiquement équivalent à la moelle osseuse rouge. Les exemples qui suivent sont donnés à titre non limitatif. EXEMPLE 1 Préparation de l'extrait de moelle osseuse rouge Des ceintures osseuses pelviennes de bassin de veau sont prélevées aussitôt après l'abattage ; elles sont débarassées de leurs muscles et mises au froid, ou mieux congelées. Les os sont sciés en morceaux et leurs parois osseuses dures externes grossiè- rement éliminées. La moelle osseuse rouge est débitée en petits fragments puis traitée soit immédiatement soit après stockage à -800C pendant plusieurs mois. Ces fragments sont concassés et la pâte obtenue mise dans de l'eau distillée froide. Si la proportion finale est de 1 kg de pâte de moelle rouge pour 10 litres, on peut ajouter, selon la procédure choisie, 5 litres d'eau distillée, c'est-à-dire la moitié du volume final choisi, ou bien recourir å la variante d'ajouter d'emblée la totalité du volume d'eau soit 10 litres. La suspension est broyée fortement au broyeur à grande vitesse, par exemple du type polytron, pendant un temps suffisant, soit 4 fois 5 minutes. Ce broyat est filtré sur une épaisse couche de gaze, ou sur tout autre tamis capable de retenir toutes les particules osseuses de la matrice osseuse de la moelle rouge et qui sont en suspension dans le broyat. Si l'on choisit la première technique, on double le volume du filtrat obtenu par un tampon acétate 0,2M à pH 4,3, pouvant ou non contenir de l'alcool à 100 alcooliques. L'ensemble correspond donc alors, à 1 kg de broyat dans 10 litres environ de tampon 0,1M ps 4,3, pouvant ou non comprendre de l'alcool à 50 alcooliques. Si l'on a utilisé d'emblée la quantité totale d'eau distillée pour effectuer la suspension et le broyage de la moelle rouge, après broyage et élimination des fragments osseux, on ajoute les éléments du tampon acide, soit l'acide acétique, jusqu'à stabilisation au PH 4,3. La préparation est alors chauffée au bain-marie, à 600C pendant 30 minutes, ou au bain-marie bouillant pendant 30 minutes. On laisse refroidir, puis on filtre. Le filtrat est limpide et jaune pâle. I1 est concentré dans un concentrateur rotatif sous vide. Si la concentration est suffisamment poussée, de 20 fois ou plus, le concentrat commence à précipiter à chaud ; on laisse alors cette précipitation s'achever à +40C et on filtre, ou on centrifuge. La précipitation des substances non désirables pour le but poursuivi est complétée par une précipitation par l'alcool, en ajoutant de l'alcool à 700, volume à volume, ce qui amène le titre alcoolique à environ 350, pendant 1 ou 2 heures, à +40C, et on centrifuge. On peut également effectuer un court chauffage de 5 minutes du filtrat, au bain-marie bouillant, et centrifuger après refroidissement. Ces préparations sont soumises au fractionnement par gelfiltration au Séphadex G 50 Fine, équilibré par du tampon acétate 0,02M à pH 4,3. Seuls les pics 1, 2, 3 de tête sont prélevés, puis concentrés 5 fois, et leur teneur en protéines dosée ; la purification de cet extrait est poursuivie par fractionnements successifs. I1 est porté à l'état sec et réduit en poudre. Celle-ci est soluble dans l'eau distillée ; par légère acidification, la solution, même concentrée, est parfaitement limpide et incolore. Elle peut être restérilisée. L'extrait peut aussi être traité par d'autres méthodes de concentration, ultrafiltration, électrodialyse. EXEMPLE 2 Propriétés pharmacologiques On injecte dans le sang de plusieurs lapins mâles ou femelles non gestantes, pesant 4 kg environ, 1 à 5 ml d'une solution contenant le facteur hyperglycémiant, tel que préparé et décrit ci-dessus, et correspondant à la dose de 1 mg de protéines. Les lapins avant traitement avaient des taux de glycémie normaux variant de 1 g à 1,20 g & Des ponctions de sang artériel effectuées toutes les 30 minutes montrent que le taux de glycémie croit pendant 5 heures pour atteindre suivant les lapins, des taux de 5 à 9 g %. On effectue simultanément le prélèvement des urines de ces lapins, on en dose le glucose contenu ; il atteint des concentrations variant de 60 g à 98 g par litre d'urine. Les lapins ainsi traités, et mis au repos retrouvent après quelques heures un taux de glycémie normal. Certains lapins, après 5 heurs, sont saignés, et leurs organes immédiatement prélevés. Une partie de ces organes servent à des analyses histologiques, histochimiques, ultrastructurales par microscopie électronique ; l'autre partie est congelée à -800C pour effectuer des dosages biochimiques. Ces dosages révèlent que le taux de glycogène dans le foie qui normalement est de 35 à 55 g/kg d'organe frais, tombe à 1 à 3 g et même 0,5 g/kg ; ce taux de glycogène tombe à zéro dans les muscles, les reins, le myocarde, le tissu adipeux. On constate que corrélativement, le taux de glucose augmente dans ces organes, et c'est cet excès de glucose, libéré par glycogénolyse générale, qui est chassé dans les urines ot il s'accumule. Les examens morphologiques et histochimiques confirment la très grande diminution du glycogène notamment dans le foie. REVENDICATIONS 1. Procédé d'extraction d'un facteur hyperglycémiant provoquant une glycogénolyse générale, et une chasse glycosurique, carac térisé en ce qu'on traite la moelle osseuse rouge provenant des os plats, par de l'eau froide distillée, en ce qu'on ex trait le filtrat dans un milieu tamponné acide dont le PH est compris entre 4 et 7, à des températures comprises entre 600 et 1100C, en ce qu'on concentre, et purifie cet extrait. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'avant le traitement les os sont sciés et leurs parois osseuses dures sont éliminées. 3. Procédé suivant une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que avant l'extraction, on traite la pate constituée par la moelle rouge et sa matrice par de l'eau distillée froide, on broie dans cette suspension la matrice osseuse, on filtre. 4. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce qu'on n'ajoute que la moitié de l'eau distillée mécessaire, la deu xième moitié étant ajoutée dans la phase d'extraction. 5. Procédé suivant une des revendication 1 à 4, caractérisé en ce que l'on transforme auprès le traitement à l'eau froide, le filtrat en un système tampon à un pH compris entre 4 et 7 et de préférence voisin de 4,5. 6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que le tampon est un acétate. 7. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce qu'on ajoute à la solution tampon de l'alcool au titre final de 50 alcooliques. 8. Procédé suivant une des revendications 1, 2, 3, 5 et 7, carac térisé en ce que le filtrat concentré, est soumis à une ultra filtration. 9. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que l'ultra filtration est précédée d'une purification préalable par purification par l'alcool au titre final de 350 alcooli ques, pendant quelques heures, à +40C, suivi d'une centrifu gation et élimination de l'alcool du surnageant par distilla tion et concentration. 10. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que l-'ultra filtration est précédée d'une purification préalable par chauffage de l'extrait brut à 1000C pendant quelques minu tes et centrifugation. 11. Procédé suivant une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les extraits sont chromatographiés, puis fractionnés par gel-filtration. 12. Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que les fractions de tête sont reconcentrées, et repurifiées par frac tionnements successifs. 13. Produit obtenu suivant le procédé défini dans l'une des reven dications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il est constitué par un extrait de moelle rouge osseuse provenant des os plats et/ou de tout organe physiologiquement équivalent. 14. Composition pharmaceutique hyperglycémiante, provoquant une glycogénolyse générale, notamment musculaire, et une chasse glycosurique, caractérisée en ce qu'elle contient un extrait de moelle osseuse rouge obtenue par traitement de la moelle osseuse rouge, et/ou de tout organe physiologiquement équiva lent suivant'une des revendications précédentes.