Brevet FR2328453A1 — publié le 19770520

La présente invention concerne en tant que produit industriel nouveau, utile notamment en médecine nucléaire comme agent de diagnostic, un peptide marqué au 99mec. Elle concerne également le procédé de préparation de ce peptide marqué ainsi que les compositions thérapeutiques renfermant ledit peptide marqué en association avec un excipient physiologiquement acceptable. On sait que l'isotope 99m du technetium a été préconisé en thérapeutique comme agent de diagnostic pour visualiser la thyroïde et d'autres organes, plus précisément les os. (voir à cet effet le Merck Index, 1968, 8ème Ed. page 1016). On sait également que, en médecine nucléaire, le technetium est utilisé sous forme de pyrophosphate ou phosphonate de technetium qui sont administrés par voie injectable, et que ces deux sels présentent l'inconvénient d'exiger des durées de traitement longues. Plus précisément on sait que chez l'homme il faut trois heures au moins pour visualiser l'isotope 99m du technetium au niveau des organes après administration intraveineuse de pyrophosphate et de phosphonate de technetium. Un des buts de l'invention est de proposer un nouveau vecteur permettant une localisation plus rapide du 99mec, notamment au niveau de l'hypophyse et des autres organes de façon que l'isotope 99m du technetium parvienne au niveau des organes à visualiser en moins de 10 minutes et de façon que le temps total d'administration et d'enregistrement au moyen d'une caméra à scintillation couplée à un calculateur et une imprimante rapide soit inférieur ou égal à 20 minutes. L'invention a pu etre réalisée grace au choix d'un peptide particulier, qui se trouve dans les séquences des acides aminés d'hormones naturelles à savoir l'heptapeptide répondant à la formule NH2-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-CONH2 qui a été notamment décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique nO 3.842.064. La séquence des 7 acides aminés se retrouve notamment dans 1'ACTE, et plus précisément, ladite séquence est constituée par les amino-acides de 1'ACTH compris entre le 4eme et le lOdme amino-acide de 1'ACTH. La formule développée de l'heptapeptide peut donc etre représentie par la formule abrégée ACTE4 1oNH2 terminal La séquence des 7 amino-acides se retrouve également dans la PSH (a-NSH410 et ss-MSHll~l7) et la p-LPH (ss-LPH47-53). Dans ce qui suit l'heptapeptide selon l'invention sera désignée sous le nom de peptide ou sous la nomenclature abrégée de ACTH4-10NH2 terminal. La synthèse de 1'ACTH4 1oNH2 terminal est réalisée en phase solide selon la technique de Merrifield telle que décrite et exem lif.jée dans l'ouvrage~de J.M. Steward et J.D. Young "Solid Phase Peptide Synthesis" publié par Freeman and Company, San Francisco, 1969. La résine utilisée pour la synthèse du peptide est la benzyl-hydrylamine. Après synthèse, le peptide est séparé de la résine selon une méthode connue en soi, notamment selon la méthode décrite dans l'ouvrage mentionné cidessus. La purification du peptide est mise en oeuvre par deux passages successifs sur des colonnes de résines (Sephadex G10 puis Sephadex G15). Le marquage au 99mTc est effectué selon une méthode connue en soi. La méthode préconisée pour le marquage consiste à réduire le pertechnetate (Tc04 ) par l'étain en milieu acide puis à mélanger le produit résultant avec le peptide selon l'invention, ou de préférence à réduire le pertechnate contenu dans le mélange peptide-pertechnate au moyen de l'étain. On a résumé ci-après les essais pharmacologiques qui ont été entrepris avec le peptide selon l'invention marqué au Tc. - Au niveau de l'hypophyse Injecté à l'animal (lapin) à la dose de 100# avec une activité de 500 Ci, le peptide marqué au 99mTc conduit à une localisation au niveau de l'hypophyse très rapide. L'étude cinétique illustrée par la courbe de la figure 1 montre que la localisation hypophysaire s'effectue intensément dans la minute qui suit l'injection. Le peptide marqué selon l'invention permet donc la localisation immédiate et précise de l'hypophyse puisque l'on obtient une véritable carte de cet organe. La localisation de l'hypophyse constitue un des avantages importants selon l'invention puisqu'elle n'avait pas pu etre réalisée jusqu'à présent. - Au niveau de l'os La visualisation de l'os est également très rapide. En effet, l'image apparaît de façon intense dans les 10 minutes qui suivent l'injection du peptide marqué au 99mTc chez l'animal (lapin). La figure 2 jointe en annexe représente une vue du train arrière du lapin 10 minutes après injection du produit. Les résultats obtenus chez l'animal sont transposables en médecine nucléaire chez l'homme. Ils permettent de déduire que l'utilisation chez l'homme du peptide marqué au 99mTc permet un examen particulièrement rapide, la durée dudit examen étant au maximum de 20 minutes, l'examen comprenant l'administration du produit, par voie injectable notamment, et l'enregistrement au moyen d'une caméra à scintillation couplée un calculateur et une imprimante rapide noire ou couleur. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de préparation nullement limitatifs mais donnés à titre d'illustration. EXEMPLE 1 Synthèse de 1'ACTH4 1oNH2 terminal La synthèse s'effectue en phase solide dans un réacteur constamment agité par rotation en utilisant comme résine la benzylhydrylamine, qui fixe 1 mM d'acide aminé par gramme. La synthèse commence par un rinçage de la résine suivant les temps d'agitation et les solvants suivants - chlorure de méthylène 10 minutes - acide trifluoroacétique 1 minute, puis 30 minutes On fait alors un test à la ninhydrine (suivant la méthode de Kaiser, Colescott, Bossinger et Cook) qui doit etre positif, et qui indique que l'on a bien des groupements N libres sur lesquels on peut ensuite greffer les autres acides aminés dont seul le groupement -COOH est libre, le protocole étant le suivant - chlorure de méthylène 1 minute (3 fois) - triéthylamine (solution à 12 Z dans CH2C12) 1 minute > puis 10 minutes CH2C12 1 1 minute - CH3 OH 1 minute CH2 1 1 minute - CH30H 1 minute CH2C12 1 minute - triéthylamine (Et3N) 1 minute, puis 10 minutes - CH2Cl2 1 minute (2 fois) - CH3OH 1 minute (2 fois) CH2C12 1 minute (2 fois) (A) - CH3OH 1 minute (2 fois) - -CH2Cl2 1 minute (2 fois) -Et3N 10 minutes - (A) Fixation du premier acide aminé : glycine - L'acide aminé est sous forme de N-(tert-butyloxylcarbonyl) (c'est-A-dire "t. boc"). On emploie 4 fois la dose minimale : soit 4 mM/g de résine. - On ajoute du N,N'-dicyclohexylcarbodiimide en quantité équimoléculaire avec l'acide aminé. - On ajoute du CH2C12 de façon que le reacteur soit plein au demi et on agite pendant au moins 3 heures. -On reprend le lavage avec (A) - Test à la ninhydrine. I1 doit etre négatif. S'il est positif on reprend l'opération au début avecfmM d'acide aminé. - Quand le test est négatif, on fait agir l'acide trifluoro acétique (T.F.A.) 1 minute à 50 % dans CH2C12, puis 20 minutes. - Puis on neutralise Lavage 3 fois avec CH2C12 1 minute . Et3N 1 minute, puis 10 minutes . (A) Et3N 10 minutes . (A) Fixation des autres acides aminés -- On fait agir alors le second acide aminé en reprenant les opérations ci-dessus, puis chacun des acides aminés suivants pour arriver au peptide désiré. I1 est à noter que l'on a ajouté dans le T.F.A. du 1 > 2- éthanedithiol pour avoir une solution à 1 % b partir du moment où l'on a une molécule de tryptophane dans le peptide. On a de meme remplacé le dichlorométhane pur par une solution à 50 7 dans le dichlorométhane de diméthylformamide à partir du tryptophane. Séparation de la résine La synthèse terminée on pratique la rupture entre la résine et le peptide par action de l'acide fluorhydrique (10 ml environ pour 1 g de résine de départ (on ajoutera 0,9 g dlindole/mole de tryptophane et quelques gouttes d'anisole). On laisse agir L heure à 0 C, puis on piège sous vide le HF et on lave le résidu avec de l'éther oxyde pour éliminer l'anisole,Rindole et autres impuretés. On élimine le filtrat. On procède alors à la dissolution du peptide par de l'eau ou une solution d'acide acétique 0,1 M. On lyophilise alors le filtrat. Ce filtrat est enfin passé sur colonne GlO puis G15, puis relyophilisé. Après contrôle spectrophotométrique et chromatographie sur plaque, on obtient le peptide attendu pratiquement pur. Le spectre montre 4 pics intéressants pour 220, 263, 282 et 290 nm. Les chromatoplaques montrent après révélations par les différents réactifs de Pauly, Erlich et nin'.lydrine un Rf C0,7, le solvant employé étant un mélange constitué par alcool n-butylique 15 vol. acide acétique 3 vol. eau 12 vol. pyridine 10 vol. EXEMPLE 2 Le peptide obtenu après synthèse est pesé, puis mis en solution dans l'acide acétique 0,1 M. Des fractions correspondant à 350 microgrammes sont introduites dans des fioles de 5 ml en vue de la lyophilisation. En fin d'opération, on procède à un bouchage sous vide. Cette opération permet d'une part de conserver le produit à l'abri de dégradation possible, d'autre part d'utiliser le flacon pour la réaction de marquage. En effet, le 99mec obtenu à partir de générateurs Philip Duphar est sous forme de Tc04 (pertechnetate) et la réduction de Tc7+ en Tc4+ ne peut se faire complètement que sous vide, ou sous atmosphère de gaz inerte. La réduction de Tc7+ en Tc4+ s'obtint par action des ions Sn2+ en milieu acide chlorhydrique fumant (d = 1,19). On complète à 2 ml avec du sérum physiologique. 4) Marquage proprement dit 0,5 ml de 99mTc0 - (environ 10-7 mg), dilué avec du sérum 4 physiologique si nécessaire pour obtenir l'activité nécessaire à injecter, est introduit dans le flacon sous vide renfermant le peptide. On agite la solution 10 minutes jusqu'à dissolution complète. On ajoute alors 0,1 ml de la solution de SnC12 (précédemment préparée), ce qui correspond à 1 mg de SnC12. On agite à nouveau pendant 10 minutes et on complète avec du sérum physiologique au volume désiré (1 à 2 ml). Le pH au moment de la dilution se situe a environ 1. Dans la solution finale le pH est de 2 à 2,5. On constate que à pH 4 le "complexe" précipite, pour se redissoudre à un pH franchement basique. Ceci fait donc penser que lton a affaire à un sel plutôt qu'à un chélate. Toutes ces opérations se font à température ambiante (15-250C). Après passage sur filtre millipore de 0,22 mp la solution est prete pour injection. b) Contrôles physico-chimiques. - chromatographie sur plaque avec autoradiographie (inchangé) - spectre U.V. (inchangé). c) Contrôles biologiques Les contrôles biologiques sont les seuls qui permettent de s'assurer de la qualité du marquage. On injecte le produit au lapin. On mesure la demi-vie plasmatique du produit marqué et l'on compare à celle obtenue avec le 99mTcO4 - seul. 4 Pour le peptide on trouve 2 demi-vies biologiques . Tll/2 : 9 minutes . 1/2 : 2 heures 15 minutes. Pour le 99 C04 seul 4 . T1 : 6 minutes T2 : 4 heures 20 minutes. On contrôle enfin l'absence de radioactivité dans les glandes salivaires et l'estomac qui sont les organes de fixation privilégiés de Tc04 pur. REVENDICATIONS 1. Nouveau peptide marqué, utile notamment en médecine nucléaire comme agent de diagnostic, caractérisé en ce que le peptide comporte 7 amino-acides et répond à la formule générale NH2 Met-Glu-His-Fhe-Arg-Try-Gly-C05H2 et en ce que l'isotope radioactif est l'isotope 99m du- technetium, le peptide marqué présentant au spectromètre des pics caractéristiques pour les longueurs d'onde 220, 267, 283 et 290 nm. 2. Composition thérapeutique utile en médecine nucléaire pour visualiser les organes, notamment l'hypophyse et les os, caractérisée en ce qu'elle renferme en association avec un excipient physiologiquement acceptable une quantité active de peptide marqué selon la revendication 1. 3. Procédé de préparation du peptide marqué selon la revendication 1, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on réduit le pertechnate Tc04 par l'étain en milieu acide et mélange le produit résultant au peptide. 4. Procédé de préparation du peptide- marqué selon la revendication 1, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on réduit le pertechnate Tc04 contenu dans le mélange peptide-pertechnate, au moyen d'étain, la reduction étant effectuée en milieu acide.