Brevet FR2343250A1 — publié le 19770930

L'invention a pour objet des moyens pour l'étude des cellules responsables d'une réponse immunitaire, notamment de la population cellulaire faisant partie du système lympholde et, parmi celle-ci, des lymphocytes, notamment des lymphocytes T ou cellules T. On sait que les cellules T jouent un rôle important, notamment au niveau des phénomènes de rejet des greffes chez des malades ayant subi une transplantation d'organe. Une variation du taux normal de cellules T du sang du malade constitue une indication précieuse d'un début de rejet de greffe. Le contrôle de ce taux et du rapport du nombre de cellules T au nombre de cellules B s'avère alors très important chez ces malades. En outre, les cellules T sont notamment impliquées dans 11 immunité humorale et coopèrent avec d'autres lymphocytes ou cellules B pour la production d'anticorps. L'importance du rôle joué par les cellules T chez l'être vivant met en évidence la nécessité de disposer de méthodes permettant d'étudier aisément ces cellules, notamment de les mettre en évidence dans un milieu biologique, et de les dénombrer Or les méthodes ou techniques connues jusqu'à ce jour sont d'une mise en oeuvre complexe, longue et fastidieuse. Dans ce but, la demanderesse a eu l'idée de mettre en jeu la réaction des antigènes spécifiques de ces cellules T, ou les antigènes qui les caractérisent, ci-après appelés "antigènes T", X avec des anticorps euxmemes spécifiques vis-à- vis de ces antigènes. On rappelle à ce propos que dans des travaux antérieurs, la demanderesse a montré que l'antigène T existe, notamment chez le rat et la souris, à la surface des cellules T et que ce même antigène se retrouve dans le cerveau et le cervelet. Par inoculation à un animal par exemple de l'antigène T du rat, on obtient un immun sérum renfermant des anticorps spécifiques à l'égard de l'antigène T du rat, lesquels sont donc cytotoxiques vis-à-vis des cellules T du rat qui portent cet antigène. L'invention découle de la découverte que l'immunsérum en question est non seulement cytotoxique pour les cellules T de l'animal dont provient l'antigène utilisé pour l'im- munisation mais également pour des cellules T d'espèces animales différentes et même de l'homme. En d'autres termes, elle repose sur la découverte de l'identité antigénique dans diverses es pèces animales et chez l'homme de l'antigène T, constituant spécifique des cellules T. L'invention fournit ainsi des moyens, notamment un procédé pour mettre en évidence l'antigène T et plus particulièrement les cellules T portant cet antigène dans un milieu biologique d'un être vivant différent de celui utilisé pour l'obtention d'antigène T, et ce par mise en jeu de la réaction sus-indiquée.Elle fournit également un procédé de mise en oeuvre extrêmement aisée permettant de déceler in vitro et de compter rapidement et directement à l'aide d'appareils appropriés, tels que microscopes, les cellules T ou les antigènes T d'un échantillon d'un milieu biologique à étudier. L'invention vise également à fournir des présentations du type "kit" destinées à rendre encore plus aisée la mise en oeuvre du procédé susindiqué. Le procédé selon l'invention pour mettre en évidence des antigènes T, plus particulièrement les cellules T portant ces antigènes, dans un milieu biologique à étudier provenant d'un être vivant donné, par la mise en jeu d'une réaction de ces antigènes T avec des anticorps spécifiques à leur égard, est caractérisé en ce que les anticorps proviennent d'un immunsérum, ou d'une fraction de cet immunsérum, d'un animal immunisé aupa rayant par une ou plusieurs inoculations avec une composition antigénique contenant l'antigène T et obtenue à partir d'un être vivant, et plus particulièrement d'un animal, d'une espèce différente de celle de l'être vivant dont on désire étudier le milieu biologique. Sous l'action de la composition antigénique inoculée à l'animal, celui-ci élabore des anticorps spécifiques de l'antigène T mais non spécifiques de l'espèce. il est ainsi possible d'étudier l'antigène T d'une espèce donnée en utilisant le sérum d'un animal immunisé avec l'antigène T d'une espèce différente de celle à étudier. Cette disposition présente un grand avantage, notamment lorsqu'on désire étudier l'antigène T et plus particulièrement les cellules T chez l'homme. Cette étude est en effet extrêmement facilitée puisqu'elle peut être effectuée à partir d'un substrat animal aisé à se procurer, et relativement peu coûteux. En particulier, on a avantageusement recours au cervelet de veau dont la teneur en antigène T est très importante. Enfin, l'animal destiné à fournir le sérum est avantageusement constitué par la brebis ou le lapin. L'immunsérum mis en oeuvre dans le procédé de l'invention est prélevé chez un animal auquel a été inoculée, à une ou plusieurs reprises, une composition antigénique provenant d'extraits d'organes d'animaux tels que le veau ou le ra renfermant de l'antigène T, tels que les organes lymphoides, notamment -le thymus, ou bien d'autres organes, tels que le cerveau ou le cervelet. Ces extraits sont avantageusement purifiés notamment par fractionnement sur tamis moléculaire. La fraction renfermant des constituants de poids moléculaire 30.oxo à 35.000 constitue une fraction active avantageusement utilisée, selon l'invention, pour l'immunisation. Après le temps nécessaire à 1'élaboration dS anti- corps désirés, l'immunsérum est prélevé de l'animal et mis en contact avec le milieu biologique à étudier, et ce, pendant le temps nécessaire pour la réalisation de la réaction anticorpsantigène désirée. Avantageusement, on utilise la fraction globulinique de cet immunsérum qui est enrichie en anticorps antiantigène T, ou anti-T. On observera que l'utilisation selon l'invention comme source d'antigène T d'un extrait biologique d'un être vi vant appartenant à une espèce différente de celui dont on étudie plus particulièrement les cellules T permet d'éviter toute interférence éventuelle entre des anticorps éventuellenent induits par des antigènes originaires de l'être vivant ayant fourni 1 'antigène T initial et les constituants non spécifiques des cellules T de l'extrait biologique étudié, d'où une remar tuable spécificité du procédé selon 1'invention. L'élimination d'anticorps indésirables est encore améliorée en soumettant l'immunsérum ou la fraction globulinique de celui-ci, préalablement à la susdite mise en contact, à un ou plusieurs épuisements avec un milieu biologique pauvre en antigène T, ou qui de préférence en est même pratiquement dépourvu. A cette fin, on a recours à un milieu provenant de l'être vivant utilisé pour l'obtention de la composition antigénique, et/ou de l'être vivant dont provient le milieu biologique à étudier. On élimine ainsi les anticorps éventuellement présents dans l'immunsérum et susceptibles de réagir avec des antigènes différents de l'antigène T. Ainsi, le sérum Cou sa fraction globulinique) est avantageusement soumis à au moins un épuisement avec du foie et du sérum préalablement "polymérisés" de façon en soi connue, par exemple en présence de glutaraldéhyde, pour les rendre insolubles, ainsi qu'éventuellement avec des extraits de moelle osseuse également polymérisés, cet épuisement consistant à mettre en contact le sérum à épuiser avec ces milieux insolubilisés pendant un temps suffisantparpermettre la fixation sélective d'une grande partie au moins des anticorps, accom saunant éventuellement les anticorDs-anti-T et. ensuite. à séqui continent les anticorps anti-T parer et recueillir le sérum purifié liquie/. On peut effectuer également au moins un épuisement avec des érythrocytes en suspension dans une solution physiologique,pour obvier à des effets parasites éventuels de leurs hémagglutinines. Selon une autre disposition de l'invention, le procédé évoqué ci-dessus est réalisé in vitro et comporte l'incu- bation d'un échantillon du milieu biologique à étudier en présence d'une quantité suffisante de l'immunsérum évoqué cidessus, ou d'une fraction de celui-ci, et pendant un temps suf fisant, pour la réalisation de la réaction anticorps-antigène désirée. Pour visualiser les produits de cette réaction, les anticorps de l'immunsérum sont avantageusement marqués, préala bîcient à l'incubation, notamment par des marqueurs fluorescents ou enzymatiques. Il est également possible de mettre en évidence cette réaction, en ayant recours à un "marquage indirect post incubation" par exemple à l'aide d'un immunsérum marqué, -antiimmunoglobuline vis-à-vis de l'animal dont provient 1'iamun- sérum. Cet immunsérum anti-immunoglobuline réagit avec les au microscope anticorps fixés sur les antigènes T, les rendant ainsi visibles / et permettant de ce fait de déceler les cellules T portant ces antigènes. On notera la remarquable simplicité de mise en oeuvrecBce procédé basé sur la spécificité de la réaction anticorps-antigène susindiquée. La seule observation au microscope du milieu biologique étudié, par exemple d'une coupe de tissus ou d'un frottis d'éléments cellulaires, permet de déceler instantanément les antigènes T et par là les cellules T portant cet antigène. Ce procédé permet aussi d'obtenir des renseignements précieux notamment sur la localisation de ces antigènes dans les tissus ou autres milieux biologiques d'êtres vivants. De plus, ce procédé facilitant l'examen des cellules T permet en particulier d'étudier leur devenir. On observera en outre qu'il est extrêmement aisé de déceler sur le même milieu biologique, outre les cellules T, par exemple les cellules B, ce qui permet, au cours d'une même manipulation ou d'une même série de manipulations, de connaitre le taux de ces deux populations cellulaires dans l'échantillon étudié et d'obtenir ainsi des indications importantes notamment dans le cas de transplantation d'organes. La mise en évidence des cellules B est effectuée selon des techniques courantes, notamment en visualisant ces cellules à l'aide d'un immunserum marqué, anticellule B à l'égard de l'être vivant dont provient l'échantillon à étudier. L'invention vise enfin une présentation du type "kit" comportant les éléments nécessaires à la mise en évidence de l'antigène T, et plus particulièrement des cellules T portant cet antigène, dans un milieu biologique provenant d'un être vivant donné. Selon une forme préférée, cette présentation comprend, dans des flacons ou recipients distincts, au moins un immunsérum tel qu'évoque ci-dessus, et/ou une fraction de celui-ci, ainsi que des réactifs et/ou milieux nécessaires à la réalisation de la réaction antigène-anticorps désirée, et à sa mise en évidence, notamment des solutions physiologiques, de 1'eau distillée stérile, et des marqueurs. Ces marqueurs sont constitués par-exemple par des marqueurs fluorescents ou enzymatiques, destinés à êtrefixésster l'immunsérum préalablement à l'étape d'incubationavec l'échantillon/ Il peut s'agir également d'un immunsérum marqué antiimmunoglobuline vis-à-vis de l'animal, notamment la brebis ou le animaux lapin, se fixant sur I'immunsérum anti-T provenant de ces / Cet immunsérum anti-immunoglobuline est utilisé après l'incubation pour révèler les anticorps anti-T fixes sur les an tigènes T, ce qui permet, par conséquent, de déceler le complexe formé. Avantageusement, une présentation préférée comporte en outre un immunsérum anti-B de l'être vivant, pr exemple de l'homme, dont provient le milieu biologique à étudier, ou dans le cas de "kits" destinés à des études en laboratoire, de plusieurs im- munsérums anti-B, spécifiques chacun d'une espèce donnée, prélevés chez un animal préalablement immunisé par exemple par inoculation de moelle osseuse de l'être vivant de l'espèce en question. Les divers immunskrums sont déposés au fond des réci peuvent être pients et/avantageusement/lyophylisés pour assurer une bonne conservation. Ces présentations permettent de déceler très rapidement l'antigène T dans un échantillon d'un milieu biologique donné. I1 suffit en effet d'ajouter quelques gouttes de l'immunsérum anti-T d'un des flacons de la présentation au milieu biologique constitué par exemple par une coupe de tissus ou un frottis de sang étalé sur une lame. Lorsque l'immunsérum est lyophylisé, on introduit auparavant de l'eau distillée stérile dans le flacon pour obtenir une solution ou suspension. Après incubation dans les conditions nécessaires à la réaction antigène-anticorps désirée, et lorsqu'on utilise un immunsérum préalablement marqué, il est possible de déceler immédiatement, par exemple sous un microscope, le complexe antigène-anticorps renfermant 1'anticorps marqué. Lorsque 1' immunsérum anti-T utilisé pour l'incubation n'est pas marqué, il est également possible de mettre en évidence la réaction antigène-anticorps en curant recours à un 'triarquage indirect" comme décrit plus haut. D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront au cours de la description qui suit des modes de mise en oeuvre du procédé de l'invention. Exemple 1. Préparation d'une composition antigènique à partir de cervelet de veau. On broie légèrement, à l'aide d'un mixeur, du cervelet -de veau en présence d'une solution physiologique puis on soumet le broyat aux ultrasons pendant cinq minutes environ, à basse fréquence. On réalise ces opérations en prenant les precautions habituelles, notamment en opérant à basse température, de prefé ronce à une température voisine de 4 C, et, pour éviter toute oxydation, en présence d'hydrogène. La suspension résultante est soumise à une zentrifugation pour éliminer les débris cellulaires. On réalise tette centrifugation pendant environ 5 à 10 minutes à faible vitesse, notamment avec une centrifugeuse du type connu sous le nom de centrifugeuse Jouan. Le surnageant est ensuite sou mis à un fractionnement par filtration sur une colonne remplie d'un tamis moléculailietel que celui connu sous la désignation "Séphadex G 100t, pour séparer une fraction riche en antigène T. Pour réaliser le fractionnement d'environ 10 ml de surnageant, on utilise une colonne d'environ 1 mètre de long et 1,5 cm de diamètre. L gluant est constitué par un tampon ayant un pH d'environ 7 à 7,5,notamment par un tampon de phosphate neutre. On recueille la fraction recherchée riche en antigène qui correspond au deuxième pic d'élution contenant notamment des constituants de poids moléculaire de tordre de 30.000-35.000. Exemple 2. Préparation d'un immunsérum de brebis anti-T. On inocule à la brebis la fraction enrichie en antigène T de l'exemple . Pour éviter les pertes en antigène T, on po lymérise aupnravant cette fraction notamment à l'aide de glutaraldéhyde selon la technique décrite par Avraméas et Ternynch (C.R. Acad. Sci., 1966, no2 175 serie C). L'immunLsdtion est réalisée avantageusement selon la technique suivante. On inocule tout d'abord à l'animal 20 mg de polymère avec 20 ml d'adjuvant complet de Freund,puis le mois suivant 20 mg du polymère, sans adjuvant. A partir du deuxième mois, le tltre en a:iti=orps désirés de 1 'immunsérum est généralement suffisant, et on recueille le sérum en saignant l'animal. Dans le cas où le titre en anticorps n'est pas suffisant, on effectue une hyperimmunisation. Pour purifier le sérum, et éliminer ainsi les anticorps éventuellement présents non spécifiques de l'anti gène T, on effectue des épuisements avec du foie et du sérum "polymérisés", provenant de l'animal source de l'antigène ou de l'etre vivant dont provient le milieu-biologique à étudier.On peut en outre effectuer au mois un épuisement avec de la moelle osseuse. De plus, on peut effectuer des contrôles de l'épuisement avec des suspensions d'érythrocytes provenant des susdits êtres vivants. Exemple 3. -Jumération in vitro de cellules T d'un frottis de sang humain. Le frottis est effectue d'une manière classique, sans fixation, en étalant une goutte de sang sur une lame de verre, et est examiné rapidement. On ajoute quelques gouttes, notamment une ou deux du sérum de brebis anti-T de l'exemple 2, en particulier de la fraction globulinique de cet immunsérum. Cette fraction est auparavant soumise à un marquage selon les procédés classiques, soit par un colorant fluorescent, tel que la fluorescéine ou la rhodamine, soit par une enzyme, telle que la peroxydase de raifort. On réalise l'incubation pendant environ 40 minutes, puis on lave avec une solution physiologique tamponnée pour éliminer le réactif en excès. On effectue rapidement le comptage des cellules T rendues visibles par les anticorps marqués qui se sont fixées sur les antigènes qu'elles portent, au microscope fluorescent ou ordinaire, selon le type de marqueurs utilisés. Exemple 4. Numération in vitro sur une meme lame des cellules T et des cellules B chez le rat. On réalise, en opérant selon les conditions de l'exem- ple 3, l'incubation d'un frottis de sang de rat avec, d'une part, quelques gouttes de sérum de lapin anti-T, marqué par exemple par de la fluorescéine, et quelques gouttes de sérum de lapin anticellules B de rat, marqué par de la rhodamine. Après lavage de la lame, on procède au comptage des différents types cellulaires en utilisant un microscope à fluo rescence. Exemple 5. Numération in vitro des cellules T et des cellules B chez le rat respectivement sur des lames différentes. On opère comme dans l'exemple 4 mais en remplaçant le sérum de lapin anti-T marqué à la fluorescéine par un sérum de lapin anti-T marqué à la peroxydase. La révélation enzymatique se fait sur une lame. Pour mettre en évidence les cellules B, on procède comme décrit dans l'exemple 4, mais sur une autre lame. REVENDICATIONS 1 - Procédé pour mettre en évidence l'antigène T,et plus particulièrement, les cellules T portant cet antigène,dans un milieu biologique à étudier, provenant d'un être vivant donné, par la mise en jeu d'une réaction des antigènes T avec des anticorps spécifiques vis-à-vis de ces antigènes, caractérisé en ce que ces anticorps proviennent d'un immunsérum, ou d'une fraction de cet immunsérum d'un animal immunisé auparavant par une ou plusieurs inoculations avec une composition antigénique contenant de l'antigène T provenant d'un être vivant, et plus particulièrement d'un animal, d'une espèce différente de celle du susdit être vivant donné. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu biologique est d'origine humaine, en ce que l'immunsérum a été prélevé chez la brebis ou le lapin inoculés auparavant avec une composition antigénique contenant de l'anti- gène T provenant du rat ou, de préférence, du veau. 3 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la composition antigénique est constituée par la fraction contenant des constituants ayant un poids moléculaire de l'ordre -de 30.000-35.000, qui ont été obtenus par filtration sur tamis moléculaire d'un extrait de cervelet, notamment du veau ou du rat. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le milieu biologique à étudier est mis en contact avec la fraction globulinique, préalablement séparée, du susdit immunsérum. 5 - Procédé selon lune quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la susdite fraction de l'immunsérum est constituée par la phase liquide obtenue après un ou plusieurs épuisements de l'immunsérum, ou de ses immunoglobulines, avec un milieu biologique pauvre en antigène T, ou de- préférence qui en est pratiquement dépourvu, et provenant de l'être vivant utilisé pour l'obtention de la composition antigénique et/ou de 11 être vivant dont provient le milieu biologique à étudier. 6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'épuisement ou les épuisements ont été réalisés par mise en contact de l'immunsérum. ou des globulines de cet immunsérum avec un broyat de foie, de moelle osseuse et/ou de sérum, ces derniers milieux ayant au préalable été insolubilisés par "polymérisation', notamment en présence de glutaraldéhyde. 7 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'épuisement est réalisé par mise en contact de l'immunsérum ou de sa fraction globulinique avec des érythrocytes. 8 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, notamment pour déceler l'antigène T et dénombrer les cellules T contenues dans le susdit milieu biologique, caractérisé en ce qu'il est réalisé in vitro, par incubation d'un échantillon de milieu biologique, notamment d'un frottis de sang, de suspension de cellules de sang ou d'organes lymphoides, ou d'une coupe de tissu, en présence d'une quantité suffisante de l'immunsérum ou fraction d'immunsérum, pendant un temps suffisant pour la réalisation de la réaction antigène-anticorps. 9 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on utilise un immunsérum ou une fraction globulinique de celui-ci dont les anticorps ont au préalable été marqués, notamment par des marqueurs fluorescents ou enzymatiques. 10 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le marquage, après la susdite incubation, des anticorps fixés par un immunsérum anti-immunoglobuline de lapin ou de brebis, notamment à l'aide de marqueurs fluorescents ou enzymatiques. 11 - Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 à la surveillance des variations du nombre de cellules T dans un milieu biologique, notamment dans un frottis de sang de volume déterminé, provenant de patients, tels que ceux qui ont subi une greffe. 12 - Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 à la localisation et au devenir des cellules T présentes dans les organes. 13 - Présentation du type "kit" comportant les éléments nécessaires à la mise en évidence des cellules T d'un milieu biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend dans des flacons ou récipients distincts - un immunsérum ou une fraction d'immunsérum, tel que celui mis en oeuvre dans le procédé selon l'une quelconque des revendi cations 1 à 5, pour utilisation avec un milieu biologique pro venant d'un être vivant d'une espèce différente de celle de l'être vivant utilisé pour l'obtention de la susdite compo sition antigénlque. - et les autres réactifs, tels que marqueurs, et milieux néces saires à la réaction antigène-anticorps, notamment des solutés physiologiques ou de l'eau distillée stérile. 14 - Présentation pharmaceutique selon la revendication 13, caractérisée en ce que lesdits ixmunsérums sont prémarqués, notamment à l'aide de marqueurs fluorescents ou enzymatiques. 15 - Présentation selon la revendication 13, caractérisée en ce quelle comporte au moins un immunsérum marqué anti-immuno- globuline vis-à-vis de l'animai dont provient l'immunsérum anti T pour visualiser les anticorps fixés après la susdite incubation avec l'antigène T. 16 - Présentation selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre un immunsérua anti-B vis-à-vis de l'être vivant dont provient le milieu biologique à étudier. 17 - Présentation selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisée en ce que lesdits inmunséruxs sont sous forme lyophilisée.