Brevet FR2323699A1 — publié le 19770408

La présente invention concerne un nowel antibiotique appelé antibiotique A-3459A, un acétate correspondant et un procédé de preparation de l'antibiotique et de l'acétate. On sait que de nombreuses souches du genre Streptomyces sont capables de produire divers antibiotiques. Parmi ces souches du genre Streptomyces, on a signalé que Streptomyces californicus était capable de produire des antibiotiques à activité antimicrobienne contre les mycobactéries et les bactéries à gram positif et à gram négatif, comme décrit dans Chem. Ber. 98 > 24 (1965) et Chemical Abstracts, volume 63, 11249 (1965). Cependant, la souche de Streptomyces californicus de l'invention et l'antibiotique A-3459A qui en dérive, comme décrit ci-après, sont nouveaux. L'invention a pour objet - un nouvel antibiotique appelé antibiotique A-3459A et un acétate correspondant ayant une activité antimicrobienne puissante contre les micro-organismes à gram positif, y compris les souches résistant aux divers antibiotiques utilisés en médecine ; et - un procédé pour préparer l'antibiotique A-3459A et un acétate correspondant. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre et en se référant aux dessins annexés dans lesquels - la figure 1 représente le spectre d'absorption dans l'ultraviolet de l'antibiotique A-3459A, le trait continu correspondant au spectre d'absorption déterminé dans L'méthanol et le trait en pointillé au spectre d'absorption déterminé dans un mélange 1/1 en volume d'hydroxyde de sodium OlN;' et d'éthanol - la figure 2 représente le spectre d'absorption dans l'infrarouge de l'antibiotique A-3459A déterminé selon la technique au disque de bromure de potassium ; et - la figure 3 représente le spectre d'absorption infrarouge de l'acétate de l'antibiotique A-3459A déterminé selon la technique au disque de bromure de potassium. Après des recherches poussées concernant de nouveaux antibiotiques utiles isolés de bouillons de culture de micro-organismes, la demanderesse a découvert qu'une souche de Streptomyces isolée d'un échantillon de sol recueilli à Yokkaichi-shi, Mie-ken, Japon, est capable de produire un nouvel antibiotique appelé antibiotique A-3459A lorsqu'on la cultive dans un milieu de culture renfermant des substances nutritives assimilables classiques. Le micro-organisme produisant l'antibiotique A-3459A qu'on utilise dans l'invention a été identifié, comme décrit ci-après plus en détail, comme constituant une nouvelle souche du genre Streptomyces et appelé Streptomyces californicus var. rivalis nov. var. et a été déposé à l'institut de Recherches sur les Fermentations, Ministère des Sciences et Techniques Industrielles, Japon, sous le n" FEDI-P 2492 et à l'American Type Culture Collection des Etats-Unis d'Amérique, sous le nO ATCC 31173. Les caractéristiques microbiologiques du microorganisme utilisé dans l'invention sont décrites ci-après en détail. Ces études ont été réalisées selon la méthode décrite dans International Journal of Systematic Bacteriology, volume 16, page 313 (1966). I. Caractéristiques en culture sur divers milieux. Les caractéristiques en culture ont été déterminées par culture du micro-organisme sur un milieu de culture, à la température de 27 à 28 C, à la pression atmosphérique pendant 14 jours, sauf dans le cas du milieu à la gélatine pour lequel les caractéristiques ont été observées dans les conditions précisées dans le tableau I ci-après. On a effectué la détermination des couleurs selon le "Color Standard" (1954) publié par Nihon Shikisai Kenkyu-jo, Japon. Les résultats obtenus figurent dans le tableau I ci-après. Les caractéristiques en culture du tableau I ci-après montrent que la plupart des pigments solubles produits ont une couleur rouge pourpre clair à rouge foncé, ces pigments présentant une assez mauvaise dispersibilité et étant présents dans la portion marginale du mycé1iun leur servant de substrat sous forme de fins granules. Egalement, la couleur des pigments solubles produits varie avec le pH du milieu de culture, une couleur pourpre bleuâtre foncé à un pH alcalin et une couleur rouge foncé à un pH acide. D'autre part, la couleur du revers est généralement rouge pourpre à rouge foncé et varie également selon le pH du milieu de culture, une couleur pourpre bleuâtre foncé à un pH alcalin et une couleur rouge foncé à un pH acide. 11. Caractéristiques physiologiques. (1) Température et pH de culture (déterminés sur un milieu à l'amidon et aux sels minéraux, milieu n 4 de 1'ISP) : - culture optimale : entre 25 et 300C entre pH 6,0 et 8,0 - conditions permettant la culture : entre 15 et 400C entre pH 5,0 et 12, Ô. (2) Réactivité vis-à-vis des protéines et des aminoacides - liquéfaction de la gélatine : la gélatine est liquéfiée relative ment fortement en couche - coagulation du lait et peptonisation du lait : le lait est coagulé après 3 à 4 jours et peptonisé aprés 7 à 8 jours - liquéfaction du sérum coagulé de Löffler : le milieu est liquéfié à partir du 2e ou du 3e jour et la liquéfaction est complète entre le 10e et le 14e jour - réaction à la tyrosinase : négative -formation d'H2S : positive. (3) Hydrolyse de l'amidon : positive. (4) Décomposition de la cellulose : négative. (5) Réduction des nitrates : positive. (6) Formation de NH4 : positive. (7) Utilisation des sources de carbone : on a étudié l'utilisation de diverses sources de carbone en obtenant les résultats figurant dans le tableau II ci-après. III. Propriétés morphologiques. L'examen microscopique du micro-organisme utilisé dans l'invention montre que le mycélium aérien présente des ramifications de type monopode et que les channes des spores forment un dispositif ondulé distinct. Selon la nature du milieu de culture, les chaines de spores ont une forme non mairie en crochet ou une forme en spirale primitive. Les spores forment généralement des chaînes constituées de 10 à 30 spores et ont une surface lisse et une forme ovale allongée et mesurent chacune environ 0,85 - 1,2 pm x 0,65 - 0,80 /um. Les diverses propriétés du micro-organisme utilisé dans l'invention qui viennent d'être décrites et des études complémentaires réalisées sur des micro-organismes étroitement apparentés du genre Streptomyces décrits par S.A. Waksman dans The Actinomycetes, volume 2 (1961) et The Journal of Antibiotics, volume 1 (1948) à volume 26 (1973), etc., montrent que Streptomyces californicus (Waksman et Cutis, 1916) décrit par Waksman et Henrici dans The Actinomycetes, volume 2, page 186, est étroitement apparenté au micro-organisme utilisé dans l'invention. Cependant, la comparaison sur divers milieux du micro-organisme utilisé dans l'invention (Streptomyces A-3459A) et de Streptomyces californicus ISP 5058 montre des différences nettes entre ces micro-organismes. Les résultats obtenus figurent dans le tableau III ci-après. Les différences ci-dessus montrent nettement que le micro-organisme utilisé dans l'invention n'est pas identique à Streptomyces californicus ISP 5058 décrit par Waksman et Curtis et la demanderesse a appelé le nouveau micro-organisme Streptomyces californicus var. rivalis nov. var. Dans la mise en oeuvre du procédé de l'invention, on peut cultiver le micro-organisme producteur de l'antibiotique A-3459A > c'est-a-dire Streptomyces californicus var. rivalis nov. var., ATCC 31173, selon un procédé de culture classique couramment utilisé pour cultiver les micro-organismes, tel que celui décrit dans la demande de brevet de la République Fédérale d'Allemagne publiée sous le nO DOS 1.954.047, ou une modification correspondante, et pour la production à l'échelle industrielle de l'antibiotique A-3459A, on a avantage à utiliser un mode de culture submergée en aérobiose en agitant dans un fermenteur. On peut obtenir ces conditions en utilisant une aération aseptique bien connue de l'homme de l'art. On peut effectuer la culture dans un milieu de culture aqueux renfermant des sources assimilables de carbone et d'azote, des sels minéraux et, éventuellement, divers additifs couramment utilisés pour cultiver les micro-organismes. On peut citer comme exemples caractéristiques de sources de carbone qu'on peut utiliser dans le procédé de l'invention le glucose, l'amidon, les mélasses, la glycérine et d'autres matières carbonées qu'on utilise généralement à raison d'environ 0,5 à 2,5 Z du poids du milieu de culture. On peut citer comme exemples caractéristiques de sources d'azote qu'on peut utiliser dans l'invention le sulfate d'ammonium, la farine de soja, les peptones, l'extrait de viande, les levures, l'infusion de mats, le nitrate d'ammonium, le phosphate d'ammonium, le carbonate d'ammonium, l'ammoniac et d'autres matières azotées qu'on utilise généralement à raison d'environ 0,05 à 0,5 % du poids du milieu de culture. On peut citer comme exemples caractéristiques de sels minéraux qu'on peut utiliser dans l'invention le chlorure de sodium, le phosphate de sodium, le chlorure de potassium, le phosphate de calcium, le phosphate de potassium, l'hydroxyde de potassium, le sulfate de magnésium et similaires qu'on peut généralement utiliser à raison d'environ 0,05 à 0,5 % du poids du milieu de culture. D'autres additifs qu'on peut éventuellement utiliser dans le milieu de culture sont divers facteurs de croissance, tels que les vitamines, qu'on peut généralement utiliser à raison d'environ 0,001 à 0,01 % du poids du milieu de culture et des agents antimousses, tels que l'huile de lard. On peut effectuer la culture à une température d'environ 200C à environ 380C, de préférence de 25 à 350C, à un pH d'environ 5,0 à 8,5 et, de préférence, de 6,5 à 7,0, sous une pression comprise entre la pression atmosphérique et environ 0,5 bar. Généralement, la concentration de l'antibiotique A-3459A accumulé dans le bouillon de culture atteint un maximum en 2 à 5 jours. L'antibiotique A-3459A s'accumule dans le mycélium et ie bouillon de culture et on peut l'isoler et le récupérer selon des techniques bien connues d'isolement des antibiotiques ou une combinaison de ces techniques. Dans un mode de réalisation préféré, on extrait du bouillon de culture l'antibiotique A-3459A qui est de nature acide et soluble dans divers solvants organiques, comme décrit ci-après en détail, en acidifiant le bouillon de culture par l'acide chlorhydrique, enséparant l'antibiotique A-3459A ainsi précipité avec le mycélium par filtration ou centrifugation et en extrayant le gâteau de filtre obtenu avec un solvant, tel que le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde, la pyridine, l'acétone, l'acétate d'éthyle, le chloroforme, le benzène, l'éther éthylique, l'acide acétique, le méthanol, l'éthanol, le butanol ou un de leurs mélanges, de préférence de l'acétone hydratée (mélange 20-50 %/80-50 en volume d'eau et d'acétone) ou le méthanol, en obtenant une préparation brute renfermant l'antibiotique A-3459A. Sinon, on peut isoler l'antibiotique A-3459A accumulé dans le bouillon de culture en séparant le mycélium du bouillon de culture par filtration ou centrifugation, en acidifiant le gâteau de filtre et le filtrat par l'acide chlorhydrique et en extrayant respectivement le gateau de filtre et le filtrat avec un solvant, comme précédemment décrit, de préférence l'acétate d'éthyle, le chloroforme, le butanol ou un de leurs mélanges. On peut éliminer les impuretés demeurant dans la préparation brute ainsi obtenue en tirant parti de la solubilité élevée de l'antibiotique A-3459A dans les solutions alcalines aqueuses, c'est-à-dire en redis solvant la préparation brute dans une solution alcaline aqueuse, telle qu'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium. On peut de plus purifier la préparation brute en tirant parti des différences d'affinité vis-à-vis des absorbants, tels que le gel de silice, l'alumine et similaires, et des différences de solubilité dans divers solvants, par exemple en opérant par chromatographie sur colonne avec du gel de silice, de façon à isoler l'antibiotique A-3459A qu'on recristallise ensuite dans un ou plusieurs solvants en obtenant un produit pratiquement pur. Comme précédemment décrit, l'invention concerne également un acétate de l'antibiotique A-3459A présentant d'excellentes propriétés antimicrobiennes semblables a celles de l'antibiotique A-3459A. Onpeut de façon pratique préparer l'acétate de l'antibiotique A-3459A en faisant réagir l'antibiotique A-3459h avec un grand excès d'anhydride acétique dans une quantité appropriée de pyridine, à une température d'environ -200C à environ +600C, de préférence de 15 à 250C, pendant une durée d'environ 1 à 60 mn. On peut isoler par filtration l'acétate obtenu qui, de façon générale, précipite lorsqu'on verse le mélange réactionnel dans de l'eau glacée, et le purifier par chromatographie, par exemple par chromatographie en couche mince sur gel de silice, puis le recristalliser dans un solvant, par exemple un mélange 1/1 en volume d'hexane normal et de benzène. L'antibiotique A-3459A de l'invention présente les caractéristiques physiques et chimiques suivantes (1) Analyse élémentaire C = 56,25 ; H 3,64 ; O = 32,07 ; C1 = 6,63 ; N = O %. (2) Poids moléculaire 614 (déterminé par osmométrie de tension de vapeur dans le diméthyl formamide comme solvant, à une température de 400C, en utilisant un appareil Perkin-Elmer, modèle 115, fourni par Hitachi, Ltd. Japon). (3) Point de fusion L'antibiotique A-3459A se décompose lentement à 228-238"C avec brunis sement. (4) Pouvoir rotatoire spécifique [&alpha;]n20 = + 15 (c = 0,01 ; chloroforme). (5) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet L'antibiotique A-3459A présente le spectre d'absorption illustré par la figure 1. Les absorptions caractéristiques dans méthanol et dans un mélange 111 en volume d'hydroxyde de sodium 0,1N et d'éthanol, dans l'ultraviolet et dans le visible, figurent respectivement dans le tableau IV ci-après. (6) Spectre d'absorption dans l'infrarouge L'antibiotique A-3459A présente le spectre d'absorption illustré par la figure 2. (7) Réactions colorées [déterminées selon la méthode décrite dans "Spot Test In Organic Analysis (1960)] L'antibiotique A-3459A donne une réaction colorée bleu pourpre avec l'acétate de nickel dans lrethanol, une réaction positive avec le chlorure ferrique, décolore le permanganate de potassium en solution aqueuse, donne une réaction de Molisch négative et une réaction de Fehling négative. (8) Solubilité L'antibiotique A-3459A est très soluble dans le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde, la pyridine et l'hydroxyde de sodium aqueux, soluble dans l'acétone, l'acétate d'éthyle, le chloroforme, le benzène, l'éther éthylique, l'acide acétique, le méthanol, méthanol et le butanol et particulièrement insoluble dans hexane normal, l'éther de pétrole et l'eau. (9) Nature L'antibiotique A-3459A est une substance acide. (10) Couleur L'antibiotique A-3459A a une couleur rouge foncé et présente une couleur pourpre dans une solution alcaline aqueuse (NaOH 0,1N) et une couleur rouge légèrement orangée dans le méthanol acide (acide chlorhydrique 0,1N dans le meKthanol). (11) Spectre d'activité antimicrobienne La concentration minimale inhibitrice de l'antibiotique A-3459A vis-8- vis de divers organismes d'étude, déterminée selon la méthode de dilution sur gélose [Chemotherapy, volume 16, pages 98-99 (1968)], figure dans le tableau V ci-après. L'acétate de l'antibiotique A-3459A de l'invention présente les caractéristiques physiques et chimiques suivantes (1) Analyse élémentaire C = 59,5 ; H = 4,25 ; N = O %. (2) Point de fusion 188-200 C. (3) Spectre d'absorption dans l'infrarouge L'acétate de l'antibiotique A-3459A présente le spectre d'absorption illustré par la figure 3 déterminé selon la technique au disque de bromure de potassium. (4) Spectre d'activité antimicrobienne La concentration minimale inhibitrice de l'acétate de l'antibiotique A-3459A vis- -vis des divers micro-organismes d'étude, déterminée par la technique de dilution sur gélose, figure dans le tableau VI ci-après. Les résultats de recherches portant sur une grande diversité d'antibiotiques connus considérés comme étant semblables ou t:rès apparentés à l'antibiotique A-3459A de l'invention, en utilisant les diverses propriétés précédemment décrites de cet antibiotique A-3459A, montrent qu'il n'existe pas d'antibiotique connu qui lui soit identique et que, par conséquent, cet antibiotique est nouveau. Ce nouvel antibiotique a été appelé par la demanderesse "Chloquinomycine". L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants dans lesquels, sauf indication contraire, les parties, pourcentages, rapports et similaires sont exprimés en poids. EXEMPLE 1 On introduit dans des flacons à agitation de 2 1 des portions de 50 ml d'un milieu de culture liquide renfermant 1 7. d'amidon, 1 % de glucose, 0,4 7. d'infusion de mats, 1 % de peptone et 0,5 70 de carbonate de calcium (pH 7,0) et on ensemence le milieu de culture avec Streptomyces californicus var. rivalis nov. var. ATCC 31173, puis on le cultive à 35"C sous la pression atmosphérique en le soumettant à une agitation par va-et-vient à raison de 120 déplacements de 8 cm/mn. On arrête la culture après environ 5 jours lorsque le bouillon de culture devient rouge pourpre foncé. On ajuste à pH 2 30 1 de bouillon de culture combiné en utilisant de l'acide chlorhydrique concentré et on filtre. On extrait 5 fois le gâteau de filtre avec 1 1 d'un mélange 80/20 en volume d'acétone et d'eau et on concentre les extraits combinés à environ 1 1 en évaporant l'acétone sous pression réduite. On extrait trois fois le concentré ainsi obtenu avec 5 1 d'acétate d'éthyle et on lave. les extraits combinés avec 5 1 d'eau, puis on extrait trois fois avec 3 1 d'hydroxyde de sodium 1 N. On ajuste le pH de la couche aqueuse à 2 avec de l'acide chlorhydrique concentré et on extrait 3 fois avec 3 1 d'acétate d'éthyle. On sèche les extraits dans l'acétate d'éthyle sur sulfate de sodium anhydre et on concentre à environ 300 ml en évaporant l'acétate d'éthyle sous pression réduite. On ajoute 3 1 d'hexane normal au concentré obtenu et on sépare par filtration le précipité formé en obtenant 1,5 g d'une substance active brute sous forme d'une poudre rouge foncé. On dissout la poudre ainsi obtenue dans l'acétate d'éthyle et on la verse sur une colonne ayant un diamètre de 4 cm et une longueur de 40 cm et garnie de gel de silice. On lave la colonne avec un mélange 3/7 en volume de benzène et de chloroforme et on élue avec un mélange 7/3 en volume de chloroforme et d'acétate d'éthyle en obtenant une fraction renfermant l'antibiotique A-3459A. On obtient également des fractions secondaires renfermant trois composants appelés A-3459B, A-3459C et A-3459D. On met en évidence la fraction renfermant l'antibiotique A-3459A désiré en effectuant une chromatographie sur papier en développant avec un système solvant constitué d'un mélange 2/1 en volume de chloroforme et de benzène et en réalisant un antibiotique avec Bacillus subtilis.On soumet la fraction renfermant l'antibiotique A-3459A b une chromatographie sur colonne complémentaire en utilisant du gel de silice, comme précédemment décrit, et on concentre sous pression réduite la fraction active sortant de la colonne et on la recristallise dans le chloroforme en obtenant 250 mg de l'antibiotique A-3459A sous forme de cristaux rouges n'ayant pas de forme cristalline définie. EXEMPLE 2 On ensemence 350 ml d'un milieu de culture liquide renfermant 2 % de glucose, 0,5 Z de sulfate d'ammonium, 0,4 %dechlorure de potassium, 0,02 Z de phosphate dipotassique, 0,25 Z de poudre d'extrait de levure et 0,5 Z de carbonate de calcium, avec Streptomyces californicus var. rivalis nov. var, ATCC 31173 dans des flacons agitation de 2 1. Séparément, on introduit dans un fermenteur en acier inoxydable de 50 1 30 1 du meme milieu de-culture liquide et on ensemence avec 3 1 de la culture obtenue dans les flacons à agitation ci-dessus, puis on cultive à 350C sous la pression atmosphérique, en aérant à raison de 30 l/mn et en agitant à la vitesse de 250 tr/mn, en maintenant le pH du milieu de culture entre 6,5 et 7,0 avec de l'acide chlorhydrique 2N. Après environ 96 h de culture, la concentration de l'antibiotique A-3459A dans le bouillon de culture atteint un maximum et on arrête la culture. On filtre la culture obtenue (pH 8,0) pour séparer le mycélium et on ajuste le pH du filtrat à 2 avec de l'acide chlorhydrique concentré puis on extrait par l'acétate d'éthyle. On lave l'extrait à l'eau, on sèche sur sulfate de sodium anhydre et on concentre. On sépare par filtration le précipité formé par addition de 2 1 d'hexane normal au concentré obtenu en obtenant 1,2 g d'une substance active brute sous forme d'une poudre rougefoncé. On purifie la poudre ainsi obtenue par chromatographie en opérant comme décrit dans l'exemple 1, en obtenant environ 200 mg de cristaux pratiquement purs de l'antibiotique A-3459A. EXEMPlE 3 On dissout 150 mg de l'antibiotique A-3459A obtenu dans les exemples 1 et 2 dans 2 ml de pyridine, puis on ajoute 1 ml d'anhydride acétique. On- laisse le mélange réagir pendant 5 mn à la température ordinaire puis on verse le mélange réactionnel dans environ 200 ml d'eau glacée. On sépare par filtration le précipité jaune obtenu et on le sèche. On soumet la poudre brute à une chromatographie en couche mince sur gel de silice en utilisant comme système solvant un mélange 85/15 en volume de chloroforme et d'acétate d'éthyle et on recueille par grattage une portion jaune à orangé jaunâtre en obtenant l'acétate brut de l'antibiotique A-3459A.On recristallise l'acétate brut ainsi obtenu dans un mélange 1/1 en volume d'hexane normal et de benzène, en obtenant 120 mg d'acétate purifié sous forme de cristaux orange. Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. TABLEAU I Caractéristiques en cultue de S. californicus var. rivalis nov. var. sur divers milieux. Milieu de culture Culture Mycélium aérien Pigment soluble Gélose au saccharose Rare, très plate, blanc à blanc grisâ- Rare, peu dense, poudreux, blanc grisâ- Rouge porpre et au nitrate tre, revers : roeuge pourpre claire tre avec une nuance pourpre pâle clair Gélose au glucose et Bonne, blanc grisâtre, revers : Poudreux blanc brunâtre Néant à l'asparagine partiellement rouge pâle Gélose au glycerol et Modérée, blanc grisâtre, revers : Bon, poudreux, blanc grisâtre mais Néant à l'asparagine partiellement rouge pâle partiellement blanc brunâtre clair Gélose à l'amidon et Bonne, gris jaunâtre, revers : Aboundant, poudreux, blanc grisâtre Rouge foncé aux sels minéraux rouge foncé avec une nuance rosâtre Gélose à la tyrosine Bonne, gris jaunâtre, revers : Bon, poudreux, blanc grisâtre avec Rouge foncé rouge foncé une nuance rose pâle Gélose de Czapeck Bonne, blanc brunâtre, revers : Blanc grisâtre à blanc brunâtre, mais Rouge foncé glucose rouge foncé partiellement gris olive clair Gélose au malate de Modérée à limitée, gris jaunâtre Poudreux, blanc grisâtre à gris Néant olive clair Gélose nutritive Bonne, élevée, lisse, blanc Veloute, blanc Néant brunâtre Gélose à l'extrait de Abondante, élevée, lisse, blanc Abondant, poudreux, gris jaunâtre Rouge foncé levure et à l'extrait brunâtre, revers : rouge foncé avec teinte rouge pourpre pâle de malt TABLEAU I (suite) Milieu de culture Culture Mycélium aerien Pigment soluble Gélose à la farine Modérée, plate, blanche, Abondant, poudreux, rose pâle Pourpre d'avoine revers : pourpre rougeâtre mais partiellement gris jaunâtre rougeâtre quelques mouchetures incolores Gélose nutritive Modérée, élevée, lisse, quelques Veloute, blanc, quelques mouche- Néant glucosee craquelures, blanc brunâtre, tures incolores revers : rouge foncé Gélose peptonée à Bonne, plate, lisse, légèrement Rare, veloute, blanc, centre : rose Néant l'extrait de levure élevée, blanc jaunâtre pâle et au fer Cube de pomme de Abondante, élevée, lisse, gris Veloute, blanc à blanc grisâtre, Brun jaunâtre terre jaunâtre quelques mouchetures incolores pâle Gélatine (à 20 C Bonne, élevée, lisse, gris Rare, blanc à blanc grisâtre Absent ou brun pendant 21 jours) jaunâtre jaunâtre pâle Lait écrémé Abondante, rapide, annulaire, Rare, blanc Brun jaunâtre gris jaunâtre pâle Sérum coagulé de Bonne, élevée, quelques craque- Veloute, blanc Brun jaunâtre Löffler lures, gris jaunâtre pâle TABLEAU II Culture Sources de carbone Bonne Glucose, xylose, mannitol, fructose, maltose, Mannose, sorbitol, amidon Assez bonne Raffinose, galactose, citrate de sodium, inuline Incertaine Arabinose, inositol, lactose Néant Saccharose, rhamnose, acétate de sodium, dulcitol TABLEAU III Caractéristique des cultures Sauche A-3459A S. Californicus ISP 5058 Gélose au saccharose et au Pigment soluble Rouge pourpre clair Pas de production ou faible nitrate production d'un pigment rouge pourpre clair Gélose au glycerol et à Mycélium aérien Blanc brunâtre Blanc grisâtre avec nuance l'asparagine rose pâle Gélose de Czapack glucosée Mycélium aérien Blanc grisâtre à blanc Gris clair brunatre mais pertiellement olive clair Cube de pomme de terre Culture Lisse, élevée, gris jaunâtre Ride, élevée, gris jaunâtre Mycélium aérien Abondant, blanc grisâtre Absent ou rare et blanc Gélose peptonée à l'extrait Mycélium aérien Bonne, veloutée, centre : Absent ou rare et blanc de levure et au fer blanc avec rose pâle Gélose au malate de calcium Mycélium aérien Blanc à gris olive clair Blanc Utilisation de l'insuline Positive Négative TABLEAU IV Dans l'ethanol (nm) 232, 258, 271, 280, 315, 351, 478, 506, 545 (E1 cm1%) 461, 421 inflexion, 279 inflexion, 231 inflexion, 145, 116, 116, 124, 82 inflexion, Dans un melange l/l en volume d'hydroxyde de sodium 0,1N et d'ethanol (nm) 232, 297, 380, 565 TABLEAU V Organismes- étudiés Concentration minimale inhibitrice (lug/ml) Staphylococcus aureus 209P 0,8 Staphylococcus aureus F 1,6 Staphylococcus aureus Y 0,8 Staphylococcus epidermidis A 0,8 Staphilococcus epidermidis I 1,6 Bacillus subtilis PCI 219 0,4 Bacillus subtilis ST-R Bacillus subtilis 17A rec Bacillus subtilis 45T rec . 0,4 Bacillus cereus IAM 1729 1,6 Micrococcus lysodeikticus IFO 3333 0,8 Brevibacterium divaricatum 0,8 Escherichia coli > 50 Escherichia coli NIHJ ?50 Escherichia coli F-1591 > 50 Pseudomonas aeruginosa I > 50 Vibrio parahaemolyticus EB-101 > 50 Alcaligenes faccalis IAM B141-1 > 50 I I M TABLEAU VI Organismes étudiés Concentration minimale inhibitrice (#g/ml) Staphylococcus aureus 209P 1,6 Staphylococcus aureus F 0,8 Staphylococcus aureus Y 6,25 Staphylococcus epidermidis A 0,8 Bacillus subtilis PCI 219 0,8 Micrococcus îysodeikticus IFO 3333 0,8 Brevibacterium divaricatum 6,25 Escherichia coli NIHJ > 100 Escherichia coli F-1591 . > 100 Pseudomonas aeruginosa I > 100 Alcaligenes faecalis IAM B 141-1 > 100 R E V E N D I C A T I O N S 1. Nouveau composé appelé antibiotique A-3459A présentant les caractéristiques suivantes analyse élémentaire C = 56,25 ; H = 3,64 ; O = 32,07 ; Cl = 6,53 ; N = O %; poids moléculaire 614 déterminé par osmométrie en tension de vapeur; point de fusion 228 - 238 C avec décomposition et brunissement; pouvoir rotatoire spécifique 20 = + 150 la concentration de 0,01 dans le chloroforme; spectre d'absorption ultraviolet dans l'éthanol : (na) 232, 258, 271, 280, 315, 351, 478, 506, 545; (E1%1cm) 461, 421 inflexion, 279 inflexion, 231 inflexion, 145, 116, 116, 124, 82 inflexion; dans un mélange 1/1 en volume d'hydroxyde de sodium O,lN et méthanol (n.m)232; 297, 380, 565 spectre d'absorption infrarouge : illustré par la figure 2; réactions colorées : - coloration bleu pourpre par réaction avec acétate de nickel dans méthanol; réaction positive avec le chlorure ferrique, décoloration du permanganate de potassium en solution aqueuse, réaction de Molisch négative et réaction de Fehling négative; Solubilité très soluble dans le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde; la pyridine et l'hydroxyde de sodium aqueux, soluble dans l'acétone, l'acétate d'6thyle, le chloroforme, le benzène, l'éther éthylique, l'acide acétique, le méthanol, l'méthanol et le butanol et particulièrement insoluble dans l'hexane normal, l'éther de pétrole et l'eau; nature : acide; couleur : couleur rouge foncé ; couleur pourpre en solution alcaline aqueuse et couleur rouge légèrement orangée dans le méthanol acide. 2. Acétate de l'antibiotique A-3459A selon la revendication 1, présentant les caractéristiques suivantes analyse élémentaire : C = 59,5 ; H = 4,25 ; N = O %; point de fusion : 188-2000C; spectre d'absorption dans l'infrarouge : illustré par la figure 3. 3. Procédé pour préparer l'antibiotique A-3459A selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer les culturesen aérobiose de Streptomyces californicus var. rivalis nov. var. ATCC 31.173 dans un milieu de culture renfermant des sources de carbone et d'azote assimilables et des sels minéraux, à une température d'environ 20 C à environ 380C et à un pH d'environ 5,0 à 8,5 jusqu'à ce qu'une quantité importante de l'antibiotique A-3459A soit accumulée dans le bouillon de culture et à isoler et à récupérer cet antibiotique A-3459A du bouillon de culture.