Brevet FR2343483A1 — publié le 19771007

L'invention est relative à de nouveaux agents solubles dans 1'eau, efficaces comme adjuvants immunologiques pour stimuler, chez un h8te, les réponse immunitaires. Bes agents adjuvants selon l'invention sont l'ester méthylique de la 2-(2-acétamido-2-déoxy-3-O-D-glucopyranosyl)-D-propionyl-L alanyl-D-isoglutamine, et le diester méthylique de acide 2-(2acétamido-2-déoxy-3-O-D-glucopyranosyl)-D-propionyl-L-alanyl-d-glutamique, répondant aux formules Nous les désignerons ci-après Par les abréviations Mur-NAc-L-Ala-P- iso-gln(OMe), et Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(OMe)2' L'invention concerne aussi des compositions médicamenteuses contenant lesdits agents et servant notamment à renforcer l'action des immunogènes faibles.Plus particulièrement, l'invention concerne des compositions contenant lesdits agents et utilisables pour l'immunisation de l'homme et des animaux à sang chaud contre des infections bactériennes, virales et parasitaires, et contre différents antigènes tissulaires d'origine normale ou Pathologique. L'intérêt tout particulier des produits selon l'invention réside dans le fait qu'il n'est pas nécessaire d'avoir recours à des milieux particuliers d'administration, dont dépendrait la manifestation de l'action adjuvante, et les excipients auxquels on est conduit à l'associer n'ont pour but que de faciliter l'utilisation du produit. En particulier, il n'est pas nécessaire, lorsque le produit est injecté, d'utiliser à cet effet une composition contenant une phase huileuse. En outre, les agents adjuvants selon l'invention peuvent être administrés par voie orale ou parentérale, notamment par injection, scarification, ou par application sur des muqueuses. L'invention concerne en particulier des compositions médicamen- teuses contenant le Mur-EAc-L-Ala-D-iso-Gln(OMe) et/ou le Mur-NAc B-Ala-D-Glu(OMe)2 en association avec un véhicule pharmaceutiquemert acceptable. Des compositions de ce type particulièrement préférées sont constituées par des solutions injectables contenant une dose efficace d'au moins un produit selon l'invention. On utilise avantageusement, à cet effet, des solutions stériles dans une phase arquez se de préférence isotonique, telles que des solutions isotoniques salines ou glucosées. Ceci n'est bien entendu pas limitatif ; on peut également utiliser une simple solution dans de l'eau distillée. Il est également possible d'utiliser des milieux d'injection contenant une phase huileuse, et notamment des émulsions eau dans l'hui- le. De telles émulsions sont obtenues en particulier avec des huiles végétales métabolisables, telles que décrites dans la demande de brevet français n 75 04003. les compositions médicamenteuses selon l'invention peuvent être présentées encore sous des formes variées, en utilisant à cet effet des excipients appropriés au mode d'administration choisi. On utilisera par exemple des compositions sous forme de cachets, comprimés ou gélules, pour l'administration orale, des aérosols ou des gels pour l'application sur les muqueuses. l'es agents adjuvants selon l'invention peuvent encore être sous forme lyophilisée -pour permettre la préparation extemporanée de solutions injectables, ou pour scarification. Une forme pharmaceutique avantageuse pour la préparation extemporanée de solutions injectables comprend une dose d'environ 2 mg d'un des produits adjuvants selon l'invention, à l'étant lyophilisé, en association avec environ 10 mg de lactose oamme excipient L'invention vise aussi les compositions médicamenteuses dans lesquelles le Mur-NAc-L-Ala-D-iso-Gln(OMe) ou le Mur-NAc-I-Ala-D- Glu(OMe)2 sont associés à un agent immunogène, notamment à un antigène vaccinant faible. 'invention concerne encore un procédé de préparation des agents adjuvants selon l'invention, caractérisé en ce que l'on fixe à un dérivé adéquat de l'acide N~acétyl-muramique, respectivement la ohaîne peptidique tAla-D-iso-Gln ou la channe B-Ala-D-Glu dont sont bloqués les groupements réactifs, à l'exception du groupe amine devant réagir. Après la fixation, on libère les fonctions protégées, puis, sur chacun des produits obtenus, l'estérification méthylique est effectuée au moyen d'une solution éthérée de diazométhane. D'sutures caractéristiques de l'invention apparaitront au cours de la description d'un exemple de préparation des produits selon l'invention, ainsi que des essais mettant en évidence les propriétés pharmacologiques de ces produits. Exemple de sybnthèse du Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(OMe)2 et du Mur-NAc-L Ala-D-iso-Gln(OMe) Ces composés sont préparés en plusieurs étapes. Dans un premier temps, la channe peptidique est synthétisée, puis, dans un second temps, cette chaîne est fixée au résidu muramyle. Pendant cette synthèse, les fonctions ne devant pas entrer en réaction sont protégées par des groupes de protection ou de blocage qui sont ensuite éliminés. Dans la suite de cet exposé, les abréviations utilisées ont les significations suivantes : Mur-NAc : 2-acétamido-2-déoxy-3-O-(D-2-propionyl)-D glucopyranose Ala : alanine Glu : : acide glutamique iso-Gln : isoglutamine OMe : ester méthylique 4,6-0-bzi : 4,6-0-benzylidène ss-bzl : ss -benzyl BOC : t-butyloxycarbonyl OSzl : ester benzylique OSu : ester succinimidique Bzl : éther benzylique a) Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(OMe)2 Dans un premier temps, on prépare le Mur-NAc-L-Ala-D-Glu de la façon suivante Préàparation du diester benzylique de l'acide BOC-L-alanyl-D-glutamique (A) 2,3 g (8 mmoles) d'ester succinimidique de la t-butyloxycarbo- nyl-I,alanine, dont la fonction amine est protégée par le groupe t-butyloxyearbonyle (BOC-L-Ala-OSu), sont ajoutés sous agitation à une solution dans le diméthylformamide de 4,5 g (9 mmoles) du p. toluène-sulfonate du diester benzylique de l'acide D-glutamique et 1 ml (9 mmoles) de N-méthylmorpholine. Le mélange réactionnel est laissé à la température ambiante pendant 12 heures. Il est ensuite concentré jusqu'6 siccité. Le composé sec est repris dans 50 ml d'acétate d'éthyle et lavé successivement avec une solution d'acide citrique à 10 %, à l'eau, avec une solution de bicarbonate de sodium 1N, enfin à l'eau. La phase acétate d'éthyle est séchée sur MgSO4' filtrée et concentrée.En cristallisant dans un mélange acétate d'éthyle-hexane, on obtient 2,50 g (67,5 %) du produit recherché dont les constantes physiques sont PF 105-1060C 25 = + bCD L'analyse élémentaire de ce produit est C27H3407N2 (498,5) C % H % N % calculé : 65 6,9 5,6 trouvé ; 64,85 7,0 5,5 Préparation du diester benzylique de l'acide 2-(benzyl-2 acétamido4,6 benzylidène-2-déoxy-3-O-D-glucopyranosyl)-D-propionyl-(O-benzyl)-L-alanyl-D-glutamique (B) 500 mg (1 mmole) de composé (A) sont traités par 5 ml d'une solution d'acide chlorhydrique 1N dans l'acide acétique glacial. Après 30 minutes, le mélange réactionnel est concentré jusqu'd sic cité.- l'huile obtenue est reprise dans 25 ml d'un mélange acétonitrile-diméthylformamide (2/1, v/v). Le mélange est refroidi à 0 C et on ajoute 0,141 ml (1 mmole) de triéthylamine.Sa solution préparée est versée sous agitation à 0 C dans une suspension préparée depuis 1,5 heure et formée de 472 mg (1 mmole) de benzyl-2 acétamido-4,6 O-benzylidène-3-O-(D-1 carboxyéthyl)-2-déoxy-ss-D-glucopyranoside et de 0,141 ml (1 mmole) de triéthylamine dans 25 ml du mélange acétointrile-diméthylformamide (2/1, v/v) le mélange est laissé 12 heures à température ambiante ; il est ensuite concentré et le résidu est précipité dans une solution d'acide citrique à 10 %. le précipité est filtré, lavé abondamment à l'eau et séché. On obtient 800 mg (94 %) du produit recherché dont les constantes sont PF 198-1990C &alpha;25D = 4.92 (diméjthylformamide) Après recristallisation dans l'éthanol, le point de fusion s'établit à 220 C. L'analyse élémentaire de ce produit est C47H53O12N3 (851,96) C% calculé : 66,26 6,27 4,93 trouvé : 66,34 6,45 4,92 Préparation de l'acide-2-(2-acétamido-2-déoxy-3-O-Dj-glucopyranosyl)-D-propionyl-L-alanyl-D-glutamique (C) ou Mur-NAc-L-Ala-D Glu 700 mg (0,8 mmole) du composé (B) sont traités par 40 ml d'une solution d'acide acétique à 60 % au bain-marie bouillant pendant 1 heure.Le mélange réactionnel est ensuite concentré jusqutà siccité (puis séché sur MgSO4) le résidu est repris dans 1 ml d'un mélange chloroforme-méthanol (3/5, v/v) et placé sur une colonne de silice (35 g) préalablement équilibrée avec le même mélange de solvant. les fractions contenant le produit sont recueillies et concentrées jusqu'à siccité (leur homogénéité est testée par chromatographie sur couche mince de gel de silice dans le même mélange de solvants). On obtient 185 mg (30 %) de dérivé. 76 mg de ce dérivé sont dissous dans 15 ml d'acide acétique glacial, puis soumis à une hydrogénation en présence de palladium 5 % sur charbon. Après filtration, le mélange est concentré jusqu'à siccité et précipité dans un mélange méthanol-acétone-éther. On obtient ainsi 45 mg (92 %) du produit recherché dont les constantes sont: PF 150-155 C &alpha;25D = + 330 (acide acétique glacial) I? L'analyse élémentaire de ce produit est C19H31O12N31H2O (511,48) C% H% N% calculé : 44,6 8,2 6,5 trouvé : 44,7 8,1 6,4 Dans un second temps, on estérifie le Mur-NAc-l-Ala-D-Giu préalablement préparé. 100 mg (0,2 mmole) de Mur-NAc-l-Ala-D-Glu sont dissous dans 10 ml de méthanol absolu. En 15 minutes, on ajoute 10 ml d'une solution éthérée de diazométhane (environ 0,7 mmole par ml). Après 90 minutes, on ajoute une goutte d'acide acétique et on concentre à sec le mélange réactionnel. le résidu obtenu est purifié sur colonne de gel de silice (f x 16 cm), avec pour solvant le mélange chloroforme-méthanol (6/2, v/v). les fractions pures sont réunies et concentrées. le produit est précipité dans le mélange méthanolacétone-éther.On obtient 83 mg de produit (rendement 80 %) dont les constantes sont PF 137-142 C &alpha;25D= + 31,6 (acide acétique glacial) L'analyse élémentaire est la suivante C21H35O12N3 (521,53) C% calculé : 48,36 6,76 8,57 trouvé : 48,0 7,0 8,2 b) Mur-NAc-L-Ala-D-iso-Gln(OMe) Pour la préparation de ce produit, on utilise le Mur-NAc-l- Ala-D-iso-Gln obtenu de la façon décrite dans la demande de brevet français portant le n 74 22909. 100 mg (0,2 mmole) de Mur-NAc-I-Ala-D-iso-Gln sont traités de la façon décrite précédemment pour l'estérification du Mur-NAc-I-Ala- D-Glu. La purification est effectuée à l'aide du mélange chloroforme-méthanol (5/5, v/v). On obtient 80 mg de produit (80 r de rendement) dont les constantes sont PF 201 C 25 L'analyse élémentaire de ce produit est : C20H34O11N4 (506,52) C % H % N % calculé : 47,52 6,76 11,06 trouvé : 47 6,5 10,3 Propriétés Pharmaeologiques des Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(OMe)2 et Mur-NAc L-A1a-D-isoln( OMe) 10) Détermination de l'innocuité L'innocuité, ou au contraire la toxicité du produit selon l'in, vention, est étudiée par injection intraveineuse sur des souris âgées de deux mois. En augmentant progressivement les doses administrées, on détermine celle pour laquelle la mortalité des souris d'un même lot s'établit à 50 % (DL50). Pour le produit étudié, on a montré que la DL50 est supérieure à 1 g par kg d'animal, ce qui est de beaucoup supérieur aux doses pour lesquelles le produit manifeste ses propriétés adjuvantes. 2 ) Caractère adjuvant en phase aqueuse Dans la série d'essais dont les résultats sont indiqués ciaprès, on a étudié l'influence des principes actifs selon l'invention sur le taux des anticorps anti-albumine dans les conditions suivantes. Des groupes de 8 souris Swiss gagées de deux mois reçoivent, par injection sous-cutanée, 0,5 mg d'antigène constitué par de l'albumine de sérum bovin (BA) et 0,1 mg de la substance essayée dans une solution saline isotonique. Cette dose élevée d'antigène, parce qu'elle se situe à la limite de la dose paralysante vis-àvis de la réponse immunitaire, entraîne, de ce fait, une réponse faible ou nulle à l'antigène seul chez les témoins ; elle constitue donc un critère sévère pour mettre en évidence l'activité d'une substance adjuvante. Trente jours plus tard, les souris reçoivent un rappel contenant 0,1 mg du même antigène. le taux d'anticorps est déterminé par hémagglutination passive en utilisant des hématies de mouton traitées à la formaline et reeouvertes de l'antigène étudié selon la méthode décrite par A.A. Pirata et M.W. Brandiss (J. Immunol., 100, 641-648, 1968). Les prélèvements ont lieu 14, 28, 34 et 36 jours après la première injection. A titre de comparaison, des souris reçoivent, à la plaee du Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(OMe)2 ou du Mur-NAc-L-Ala-D-iso-Gln(OMe), soit des lipopolysaccharides (LPS) (extrait de S.Enteritidis par la méthode eau-phénol), soit l'adjuvant désigné sous le nom "WSA" et décrit par Adam et coll. Infect. Immun. (1973) 7, 855-86 . les souris témoins ne reçoivent que l'antigène. les résultats de ces essais sont donnés dans le tableau suivante Tableau I Titre r --itre ; 14e t 28e | 34e r 36e jour , jour jour , jour , jour j il Témoin - BSA ! 3 ! 3 ! 3 ! 3 1 1 r 3! r A + LPS (10Q/ag) ! 3 ! 6 ! 50 ! 1310 I ! 6! 50 ! 1710 ! I BSA + WSÂ (300/ut) ! 3 ! 3 ! 3 ! 6 t t 3SÂ + Mur-NAc-L-Ala-D-isoln(e) BZe) ! 12 ! 12 ! 100 t 800 ! ' ,,,,,,,,,--,,-,,-,,,,,, (1OOgu) ! ! i ! I ! ! ! ESA + Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(OMe)2 ! 50 ! 50 ! 400 I 1800 I (IOO/ug) ! ! Ces résultats montrent que le Mur-NAc-L-Ala-D-iso-G1n(0Me) et le Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(OMe)2' administrés en solution saline isotonique, provoquent un important accroissement des taux d'anticorps formés, alors que, dans les mêmes conditions, le "WSA" est pratiquement inactif. les principes actifs selon l'invention engendrent des réponses qui peuvent être considérées, de façon générale, comme comparables à celles que l'on obtient avec le "LPS", mais il faut remarquer que, contrairement à ce dernier, ils sont dépourvus de toxicité. 3 ) Caractère adjuvant en présence d'une phase huileuse Comme pour les essais précédents, on mesure l'accroissement du taux d'anticorps provoqué par I1 injection d'antigène et du composé selon l'invention, mais, dans le cas présent, I1 injection contient une phase huileuse constituée par l'adjuvant incomplet de Freund (en émulsion eau dans l'huile). Pour ces essais, on a utilisé des cobayes Hartley de 35Q g. Les animaux témoins reçoivent, dans chacune des pattes postérieures, 0,1 ml d'émulsion, soit de FIA, soit de FCA (adjuvant complet de Freund) contenant 500 g d'ovalbumine (antigène). Le produit essayé est administré à raison de 100 g dans une émulsion de FIA. On détermine, 21 jours après l'injection, le taux d'anticorps par hémagglutination passive (PHA), comme précédemment, et par précipitation suivant la méthode de Folin. les mêmes cobayes subissent, 18 jours après l'injection, un test d'hypersensibilité cutanée. A cet effet, ils reçoivent, par injection intradermique, 5 g d'ovalbumine. 48 heures après cette injection, on mesure le diamètre de l'induration au point dtinjec- tion. les résultats sont donnés dans le tableau suivant. Tableau 2 ---------------------------------------------------------------------------------------- Titre d'anticorps Injection Précipi- Aggluti- Test cutané tation nation (diamètre en mm) ---------------------------------------------------------------------------------------- ovalbumine + FIA # 500 900 0, 0, 0, 0, 0, 0, ---------------------------------------------------------------------------------------- ovalbumine + FCA 2100 3600 12, 13, 12, 14, 11, 19 ---------------------------------------------------------------------------------------- ovalbumine + FIA 2100 3000 14,8, 13,12, 14,11 + Mur-NAc-L-Ala-D-iso-Glu(OMe) ---------------------------------------------------------------------------------------- ovalbumine + FIA + Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(OMe)2 950 2600 5, 7, 0, 8, 10, 7 ---------------------------------------------------------------------------------------- Ces résultats montrent que le Mur-NAc-L-Ala-D-iso-Gln(OMe) et le Mur-NAC-L-Ala-D-Glu(OMe)2' administrés en présence d'une phase huileuse, favorisent l'accroissement du taux d'anticorps formés, et qu'ils induisent une réaction d'hypersensibilitd retardée vis-à-vis du même antigène. On obtient donc des compositions adjuvantes dépourvues de to xicité et qui peuvent être utilisées pour accroître l'efficacité de vaccins d'origine bactérienne ou virale, notamment quand ceux-ci sont faiblement immunogènes. Elles peuvnet être utilisées notamment pour fa voirser l'immunisation de l'hôte (patients humains ou animaux) à l'égard des infections d'origine bactérienne ou virale, des antigènes des tumeurs, etc. Elles sont également efficaces pour la fabrication de sérums contenant des anticorps actifs à l'égard de ces antigènes. REVENDICATIONS 1 - Ester méthylique de la 2-(2-acétamido-2-déoxy-3-0-D-gluco pyranosyl) -D-propionyl-l-alanyl-D-isoglutamine, composé répondant à la formule 2 - Diester méthylique de l'acide 2-(2-acétamido-2-déoy-3-0- D-glucopyranosyl)-D-propionyl-I-alanyl-D-glutamique, composé répondant à la formule 3 - Procédé de préparation du produit selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on fixe à l'acide N-acétyl-muramique la chaîne peptidique l-Ala-D-iso-Gln(OMe) dont on a au préalable bloqué les groupements réactifs, à l'exception du groupe amine devant réagir avec l'acide N-acétyl-muramique, puis on libère les fonctions protégées. 4 - Procédé de préparation du produit selon la revendication 2, caractérisé en ce que lton fixe à l'acide N-acétyl-muramique la channe peptidique L-Ala-D-Glu(OMe)2 dont on a au préalable bloqué les groupements réactifs, à 11 exception du groupe amine devant réagir avec I1 acide B-acétyl-muramique, puis on libère les fonctions protégées. 5 - Composition médicamenteuse contenant au moins l'un des produits (I) et (II) 6 - Composition médicamenteuse selon la revendication 5, constituée par une solution injectable d'au moins un des produits (I) et (II). 7 - Composition selon la revendication 5, constituée par une solution aqueuse isotonique saline dans laquelle au moins un des produits (I) et (II) est dissous0 8 - Composition selon la revendication 5, constituée par une émulsion eau-huile dans laquelle au moins un des produits (I) et (II) est dissous. 9 - Composition selon la revendication 5, dans laquelle au moins un des produits (I) et (II) est associé à des excipients destinés à faciliter son administration par voie orale, ou à des excipients propres à faciliter son application sur des muqueuses. 10 - Composition selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisée en ce que au moins un des produits (I) et (II) y est associé à un agent immunogène. il - Composition médicamenteuse contenant au moins un des produits (I) et (II) sous forme lyophilisée, éventuellement associé à un agent immunogène. 12 - Composition adjuvante de l'activité immunitaire, caractérisée en ce qu'elle contient une dose efficace d'un des produits (î) ou (Iî). 13 - Composition de vaccin à usage humain, caractérisée en ce qu'elle contient, outre l'agent immunogène, une dose efficace d'un des produits (I) ou (Il). 14 - Composition de vaccin à usage vétérinaire, caractérisée en ce qu'elle contient, outre l'agent immunogène, une dose efficace d'un des produits (I) ou (II). 15 - Présentation pharmaceutique pour la préparation extemporanée de solutions comprenant une dose d'environ 2 mg du produit (I) ou du produit (II) lyophilisé en association avec environ 10 mg de lactose.