Brevet FR2346719A1 — publié le 19771028

Pour la détermination radio-immunologique de substances biologiquement actives, il faut que deux composants ou plus réagissent ltun avec l'autre et avec des substances tierces ajoutées, par exemple un échantillon de plasma ou de sérum, uniquement au moment de l'utilisation. La réaction menant à la saturation ou à liétablissement d'un équilibre entre un anticorps spécifique et la forme radio-active de la substance à déterminer, ajoutée en excès, est indépendante de la quantité de substance se trouvant dans 11 échantillon a' déterminer (principes de l'analyse de fixation compétitive de protéines et de l'analyse de dilution d'isotopes). Pour éviter une réaction partiellement irréversible, qui aurait lieu prématurément et qui rendrait imprécise la détermination, on conserve d'habitude les composants réactionnels séparément â l'étant solide, liquide ou lyophilisé dans des ampoules ou des petits flacons. Leur contenu est dissous selon une méthode prescrite directement avant l'utilisation et on mélange des quantités définies de ces solutions. I1 est connu selon la DT-OS 2 123 210 d'introduire les deux composants dans un récipient et de les soumettre å une lyophilisation. Il est connu selon la DT-OS 2 261 544 d'introduire successivement les deux composants, de les congéler et de les soumettre ensuite ensemble à la lyophilisation. Or, la Demanderesse a trouvé un procédé de préparation d'un réactif prêt à l'emploi pour des déterminations radio-immunolo- giques, caractérisé en ce quton introduit en même temps (ou sous la forme d'un mélange) la solution de la forme marquée radio-activement de la substance biologiquement active & déterminer et la solution de l'antisérum spécifique dans un récipient, par exemple un tube à essai, et on congèle immédiatement après ou bien qu'on introduit les deux solutions successivement dans le récipient et les congèle immédiatement après le remplissage.Il est avantageux de refroidir les solutions à une température comprise entre Oo et 4 OC (avec de l'eau glacée) avant l'introduction. La congélation est effectuée de préférence å l'aide d'azote liquidez Après cela, les solutions congélées sont lyophilisées sans dégeler. La lyophilisation est effectuée avantageusement à une température entre -5 et -400 et à une pression entre 0,5 et 0,001 Torr, pendant environ 24 heures. Bien que les deux composants puissent réagir l'un avec l'autre à un degré minime, fonction de la concentration nécessaire, la réaction entre ces composants peut être réduite à moins de 1 % et ne joue aucun rôle dans l'exécution de la détermination, si l'on congèle rapidement le mélange prérefroidi. Pour l'exécution de la détermination d'une substance biologiquement active, on introduit l'échantillon à déterminer d'un liquide biologique, de préférence en une quantité de 20 à 200 microlitres, en fonction de la concentration de la substance active, dans le tube à essai contenant le réactif pret à l'emploi. Dans un autre tube à essai, on introduit la solution standard ayant une teneur connue de la substance biologiquement active. Pour remplacer l'eau prélevée par la lyophilisation, on ajoute une quantité d'eau égale à la quantité d'eau utilisée au début pour la préparation du réactif, soit séparément soit en mélange avec le liquide biologique. La détermination ultérieure est effectuée de manière connue (voir G. Pincus, K.V. Thimann et E.B. Aswood "The Hormones, Physiology, Chemistry and Applications", Academic Press New York, London 1964, pages 557 et suivantes). De cette manière on peut préparer des tubes à essai contenant des réactifs prêts à l'emploi pour des déterminations radio-immunologiques et immuno-radiométriques pour des substances biologiquement actives suivantes Thyréotropine (TSH) Thyroxine (T4) Triiodothyronine (T3) Alphafétoprotéine (AFP) Insuline Glucagone Hormone de croissance (GH) Hormone folliculo-stimulante(FSH) Hormone de lutéinisation (LH) Lactogène du placenta (PL) Choriongonadotropine (CG) Oestrogènes Gest agènes Androgènes Prostaglandines Vitamines Médicaments, par exemple digoxine/digitoxine. Les récipients contenant le réactif, tels que préparés par ces deux modes de remplissage ainsi que par congélation et lyophilisation, réduisent considérablement le travail qui doit être fourni par l'utilisateur relativement à celui nécessaire avec les autres réactifs du marché. A côté du gain de temps et de l'élimina- tion de sources d'erreurs par suite de l'omission de nombre de stades de dissolution, de dilution et de pipetage, on réduit aussi (à un minimum) la manipulation ouverte avec la-substance marquée radio-activement L t. En plus de ces avantages l'utilisateur ne doit plus préparer un tampon et ajuster son pH.En outre, la précision des procédés est améliorée, car le fabricant travaillant avec des installations opérant automatiquement peut remplir les solutions avec une limite d'erreur de moins de 1 %. Un autre avantage des tubes à essai avec réactif décrits ici est l'utilisation optimal du nécessaire radio-immunologique. Tandis qu'avec les nécessaires usuels, la matière non utilisée en raison du nombre trop petit d'echantillons à mesurer est en bien des cas non stable sous forme dissoute et doit donc être projetée, les composants séparés et lyophilisés dans les tubes à essai sont stables et peuvent aussi etre utilisés plus tard. L'introduction simultanée des composants dans les tubes â essai est particulièrement avantageuse, puisqutelle ne demande qu' une seule étape de travail. Cependant, l'introduction consécutive des composants est également avantageuse, car le refroidissement est effectué, comme avec le remplissage simultané, après le remplissage. De ce fait, on évite des dépôts des composants sur la paroi intérieure du tube. En plus, il n'y a pas de risque que la pointe de la pipette de remplissage gèle, ce qu'on doit craindre lorsqu'on remplit tout en refroidissant en même temps. Pour l'utilisation ultérieures on dispose donc d'un mé- lange homogène, que l'on peut convertir rapidement et sans problème en une solution homogène par addition d'eau ou d'un liquide biologique. Les exemples suivants illustrent l'invention. EXEMPLE 1 Préparation de tubes à essai pour la détermination de triiodo-thyronine (T3) On introduit dans des tubes à essai faits de polystyrène et ayant une capacité de 3 à 4 ml, en même temps 200 Zul microlitres d'une solution tampon de barbital, refroidie avec de l'eau glacée, ayant un pH de 8,6 et contenant environ 30 picogrammes de T3 marquée avec de l'iode 125, avec environ 20.000 impulsions par minute, dans de l'albumine de sérum bovin, et 200 rl de solution également refroidie de l'antisérum avec le tampon barbital dans un rapport de 1 : 20 000. Dès que les deux solutions froides coulent l'une dans l'autre, on congèle le mélange avec de l'azote liquide pour éviter toute réaction.On lyophilise ensuite les tubes à essai à une température de-20 OC et à une pression de 0,2 à 0,1 Tors, sans que le contenu puisse dégeler entre temps. Aucune réaction ne se produit entre les deux composants dans les lyophilisats ainsi obtenus. Les lyophilisats sont fermés avec des bouchons et peuvent être utilisés pendant une période de plus de 6 semaines. Exécution de la détermination Au moment de la détermination de T3 on ajoute dans des tubes A essai contenant le réactif prêt à l'emploi de préférence Â l'aide d'un dilueur, dans une seule étape ou consécutivement a l'aide de pipettes d'Eppendorf exactement 100 1 de sérum du malade et 400 pl d'eau bidistillée. Il est aussi possible de diluer le sérum du malade avec de l'eau bidistillée dans un rapport de 1 : 5 et d' en introduire 500 F1 dans le tube a essai. Pour la préparation de la courbe d'étalonnage, on introduit de la meme manière, à l'aide de pipettes, les diverses solutions standard d'hormones dans les tubes. Pour dissoudre complètement les lyophilisats et bien ho mogénéiser le mélange dOincubation, on mélange intensivement le contenu de chaque tube à essai immédiatement après l'addition des solutions (Whirl mix). Avantageusement, on prépare trois charges d'essai, avec un minimum toutefois de deux. Pour la réaction, on laisse séjourner les tubes à essai à l'état bouché pendant 4 heures â la température ambiante (20-30 OC), puis on ajoute chaque fois 1 ml d'une solution à 24 % de polyéthy lène-glycol (degré de polymérisation 6 000), on mélange intensivement (Whirl mix) et on sépare le précipité formé par centrifugation pendant 10 minutes à au moins 1 500 g (g = accélération de la pesanteur). On décante avec précaution le surnageant, et, pour assurer l'écoulement, on place les tubes avec leur ouverture sur un support de cellulose et on mesure ensuite la radio-activité des résidus pendant 1 minute avec un compteur d'impulsions gamma. Pour chaque ensemble de trois déterminations, on fait la moyenne arithmétique des impulsions par minute et on la porte en regard de la concentration étalon correspondante. Cependant, il est également possible d'exprimer en pourcentage la partie de l'hormone liée à l'anticorps, si l'on mesure au début la radio-activité totale d'un nombre représentatif de tubes à essai (environ 3 à 5 unités). De cette courbe, on peut lire la teneur en T3 d'un échantillon de sérum directement en nanogrammes/ml à l'aide du nombre d'impulsions trouvé. EXEMPLE 2 Préparation de tubes à essai pour l'hormone de croissance (hGH) On introduit dans des tubes à essai en polystyrène ayant une capacité de 3 à 4 ml, successivement 200 pl d'un tampon phosphate, ayant un pH de 7,4 et refroidi avec de 1 t eau glacée et contenant dans de l'albumine de sérum bovin environ 50 picogrammes de hGH marque avec de l'iode 125 donnant environ 20 000 impulsions par minute, et 200 M1 d'une solution également refroidie de l'antisérum diluée avec le tampon phosphate dans le rapport de 1 : 120 000. Aussitôt que les deux solutions froides sont mélangées dans le tube à essai, on les congèle avec de l'azote liquide pour empêcher toute réaction. On lyophilise ensuite les tubes à essai contenant le mélange réactionnel, sans que le contenu puisse dégeler entretemps. Dans les lyophilisats ainsi obtenus, aucune réaction entre les deux composants ne se produit. Les tubes à essai fermés avec des bouchons et contenant les lyophilisats sont utilisables pendant une période excédant 4 semaines. Exécution de la détermination : Variante A Comme décrit à l'exemple 1, on déclenche la réaction pour la détermination de hGH par addition de 100 pl d'échantillon ou de 100pi1 de solution standard et 400pi1 d'eau bidistillée. Pour dis soudre complètement les lyophilisats et bien homogénéiser le mélange d'incubation, on mélange intensivement le contenu de chaque tube à essai immédiatement après l'addition. Avantageusement, on prépare trois charges d'essai, avec un minimum toutefois de deux charges. On laisse séjourner les charges d'essai pendant 18 à 24 heures à la température ambiante (20 - 30 OC) à l'état bouché. Pour séparer le hGH fixé du hGH libre, on ajoute a' chaque charge d'essai 0,5 ml d'une suspension, qui contient un anticorps second fixé sur de la cellulose. Après les avoir fait tourne-r verticalement pendant 3 à 5 heures avec environ 20 a' 30 révolutions par minute, on centrifuge les tubes à essai pendant 10 minutes sous au moins 1 500 g et on sépare ensuite le surnageant du sédiment par filtration par suction. On lave le résidu de cellulose avec 2,5 ml de tampon, on centrifuge de nouveau, on essore et on mesure la radio-activité. On prépare une courbe d'étalonnage avec des échantillons standard traités dans des conditions identiques et on y lit la teneur de l'échantillon inconnu. Variante B Puisque le tube à essai contient déjà les composants réac- tionnels nécessaires pour la détermination de hGH, la réaction peut aussi être déclenchée par l'addition uniquement de 100pi1 de l'échan- tillon ou de 100 pl d'une solution standard. Donc, contrairement å la variante A, l'eau prélevée par la lyophilisation n'est pas remplacée. Pour dissoudre complètement les lyophilisats avec ces 100 1 de liquide et bien homogénéiser le mélange d'incubation, il faut mé Bnger intensivement. Toutes les particules du lyophilisat doivent être complètement dissoutes. En raison du volume de réaction très petit, la réaction se déroule beaucoup plus rapidement que celle décri te sous la variante A, de sorte que la détermination décrite peut être commencée déjà après 5 heures. REVENDICATIONs 1 - Réactif prêt a' ltemploi pour des déterminations radio-immunologiques, caractérisé en ce que chacun des récipients dans lesquels il est conditionné, contient un mélange lyophilisé d'une quantité constante de la substance à déterminer marquée radio-activement et une quantité constante de l'antisérum spécifique. 2 - Procédé de préparation dtun réactif prêt å l'emploi pour des déterminations radio-immunologiques, caractérisé en ce quton introduit simultanément et sparément la solution de la forme radio-active de la substance biologiquement active à déterminer et la solution de l'anti-sérum spécifique, ou les deux solutions sous la forme d'un mélange dans un récipient et on congèle, le tout immédiatement après le remplissage, ou en ce qu'on introduit les deux solutions successivement dans un récipient et on congèle immédiatement après le remplissage. 3 - Procédé de préparation d'un réactif prêt å l'emploi selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on lyophilise le mélange sans le dégeler. 4 - Procédé de détermination de substances biologiquement actives avec le réactif selon la revendication 1 ou préparé selon les revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que la détermination est effectuée par la seule addition de l'échantillon a' déterminer, de préférence par addition de 20 pl à 200 lux d'un liquide biologique. 5 - Procédé de détermination de substances biologiquement actives selon la revendication 4, caractérisé en ce que la détermination est effectuée sous addition d'une quantité d'eau, qui correspond environ à la quantité d'eau prélevée par la lyophilisation.