Brevet FR2336684A1 — publié le 19770722

La présente invention est relative à des mélanges de réactifs utilisables pour déceler et doser l'urée. Le dosage de l'urée est important dans l'industrie alimentaire, l'industrie des engrais et en chimie clinique. En chimie clinique, le dosage du taux d'urée est un moyen de diagnostic courant pour évaluer les affections rénales et autres affections ne touchant pasprin- cipalement les reins. De façon idéale, le mode de dosage du taux d' urée, en chimie clinique, devrait permettre de doser des taux d'urée de l'ordre du microgramme (du fait du faible taux d'urée dans le sérum) avec rapidité, facilité, et précision. Toutefois, les modes d' analyse du taux d'urée normalement utilisés dans les industries alimentaires et des engrais sont bien loin d'être suffisamment sensibles en chimie clinique. Les trois modés de dosage de l'urée les plus utilisés en chimie clinique sont les procédés uréase-Nessler, uréase-Berthelot et le procédé monoximev Dans le procédé uréase-Nessler, l'urée de l'échantillon inconnu est hydrolysée en anhydride carbonique et ammoniac On fait réagir l'ammoniac libéré sur l'iodure mercurique (réactif de Nessler), afin d'obtenir une forte réaction colorée qu'on soumet à une analyse quantitative colorimétrique. Le procédé uréase-Berthelot est similaire au procédé uréase-Nessler à cette exception près qu'on fait réagir l'ammoniac libéré avec du phénol, du nitroprussiate et un hypochlorite alcalin (réactif de Berthelot) pour obtenir la réaction colorée.Dans le procédé au monoxime, on fait réagir l'urée de 1' échantillon inconnu avec du monoxime afin d'obtenir un complexe fortement coloré en présence de chaleur et d'acide Tous ces modes opératoires présentent des inconvénients, entre autres:une déprotéinisation, l'élimination de l'ammoniac, descourbes d'étalonnage non linéaires dans les limites cliniquement utilisables, des temps de réaction longs et des conditions réactionnelles élevées. Les procédés enzymatiques ont l'avantage d'être hautement spécifiques du fait de la spécificité de l'enzyme, 1 'uréase, vis-à-vis de l'urée. Toutefois, ils ont pour inconvénient de prendre du temps, d'être compliqués à effectuer, d'utiliser des réactifs toxiques et d'être très sensibles à la contamination par l'ammoniac0 Le procédé au monoxime a pour inconvénient d'utiliser des composés chimiques toxiques et de nécessiter des températures de réaction élevées, pouvant atteindre 1000C, pour obtenir le complexe coloré, outre qu'il est moins spécifi que que les procédés à l'uréase. Un autre mode de dosage de l'urée consiste à utiliser de l'uréa- se, un tampon et un indicateur coloré du plI. Dans un tel système réactionnel, comme il se forme deux moles de hb par mole de C02 lors de l'hydrolyse de l'urée, le mélange de réaction net devient alcalin. L'accroissement net d'alcalinité est déterminé visuellement à l'aide d'un indicateur coloré du pH soit 1) par titrimétrie soit 2) par comparaison visuelle avec des tableaux d'étalons colorés. Le premier mode de détermination a pour inconvénient d'etre long et compliqué. Le second mode de détermination a pour inconvénient d'être, au mieux, semi-quantitatif. On a maintenant deoouvert un nouveau mode de pesage de l'urée dans les fluides biologiques qui pallie les inconvénients des procédés précités. C'est-à-dire qu'il est plus simple et plus rapide à réaliser que les procédés à l'uréase précités, qu'il ne nécessite pas une température de réaction élevée, qu'il utilise des composés chimiques sans danger et qu'il est quantitatif. On opère de façon appropriée à température ambiante et la réaction est entièrement menée à bonne fin en cinq minutes. Dans le mélange réactionnel l'uréase catalyse la réaction: Urée + 2H20 3 2NH3 + C02 Seul le NH3 libéré est décelé d'une manière remarquable et nou voile0 La présente invention est relative à un nouvean mélange'de réactifs comprenant de l'uréase, un mélange de tampons, comme décrit ciaprès, ainsi qu'un indicateur coloré du pH en solution aqueuse, ou sous forme de poudre qu'on reconstitue à l'eau distillée avant utilisation. Des agents stabilisants peuvent également être présents. Le fluide biologique contenant de l'urée, l'urine par exemple, provoque un accroissement du pH proportionnel à la quantité d'urée hydrolysée en ammoniac sous l'action de l'uréase.L'accroissement de pH provoque une modification proportionnelle dans l'absorption de l'indicateur coloré du pH dont la modification est analysée quantitativement à 1' aide d'un spectrophotomètre ou colorimètre approprié. Bien que les spécialistes de la technique puissent comprendre l'intéret de ce système dans son ensemble, le fait qu'il est précis, reproductible, répétable et insensible aux facteurs d perturbation habituels est loin d'être évident, comme en témoigne le fait qu'untel système n'a jamais été utilisé pour doser l'urée dans les humeurs et fluides biologiques. Les paramètres qui ont été soigneusement ajustés pour que le système suivant l'invention fonctionne sont: la proportionnalité linéaire de la variation de l'absorbance (dans un photomètre) de l'indicateur coloré en fonction de l'urée contenue dans l'échantillon à analyser et l'insensibilité relative du système aux perturbations dues à des facteurs tels que la température, la concentration ionique et les constituants moléculaires normalement rencontrées lorsqu'on effectue des dosages d'urée de routine en laboratoire. Le caractère linéaire de la variation de l'absorbance en fonction de la concentration en urée est obtenu en assortissant de façon appropriée le pKa de l'indicateur coloré avec le tampon afin que le pKa de l'indicateur coloré soit voisin de l'un au moins des pKa du tampon. L'une des variables sur lesquelles il est le plus difficile d' agir dans la plupart des laboratoires effectuant des analyses de rou- tine est constitue par les petites fluctations de rature du mélange acticar- nel.L'absorbance d'un indicateur coloré du pH varie avec la température pour les raisons suivantes: 1) la dilution de la concentration en colorant due à une variation de volume du fluide réactif avec la température, 2) la réduction de pNa de l'indicateur coloré lorsque la température croît, 3) la variation de pKa des tampons lorsque la température varie, 4) la variation de la concentration ionique du système réactif due à des variations des coefficients d'activité des éléments ionique; Afin de minimaliser les effets ci-dessus, on a découvert qu'il convient: t) d'accroStre la concentration ionique du réactif à l'aide de sels neutres comme Nace, Kce, etc. 2 > d'ajouter un tampon ou des tampons dont le pHeroet lorsque la température croît (+ dpH/dT), par exemple des pyraphosphates, leurs sels et leurs acides., 3) enfin, d'ajouter un ou plusieurs tampons dont le pH baisse lorsque la température crott (-dpH/dT), par exemple des tampons à base d'amines substituées et à base de phénols substitués. D'une façon générale, les mélanges de tampons et les indicateurs colorés du pH utilisés suivant l'invention ont à peu près le même pKa. D'une façon générale, la composition de la solution ajoutée au fluide biologique dans lequel on veut doser l'urée est la suivante: - concentration en tampon: de 1 à 100 millimoles/litre - concentration en indicateur coloré: de 0,05 à 2,0 millimoles/iitre - concentration en stabilisant: de O à 100 millimoles/litre - concentration en enzyme: de 0,1 à 10 unités internationales (UI)ji On utilise habituellement 3 ml de cette solution pour de 0,1 à 1,0 ml de sérum ou autre fluide biologique. D'une façon générale, l'invention a pour buts: - de fournir un nouveau mélange réactif, - de fournir un mode de dosage de l'urée en solution aqueuse, y compris les fluides et tissus de l'organisme, - de fournir un article constitué par un nouveau mélange réactif sous forme conditionnée. D'autres buts, avantages et caractéristiques de l'invention qpparaîtront dans la description qui va suivre. Le matériau tampon utilisé dans tout matériau de dosage particulier dépend de la réaction de dosage à effectuer et des autres constituants du matériau de dosage. Toutefois, il appartient à une classe de tampons à dpH/dT positif. Comme exemples, on peut citer 11 acide pyrophosphorique (H2P207) ainsi que ses sels à ions positifs comme le pyrophosphate de sodium, le pyrophosphate de potassium et leurs mélanges. Afin d'empêcher én outre que le système soit perturbé par les variations de température, on peut "fortifier" ou renforcer les tampons appartenant à la classe précitée avec d'autres tampons qui présentent une variation négative de pII lorsque la température varie positivement. A titre d'exemples, on peut citer des amines substituées et des phénols substitués.Comme exemples de ces tampons, on citera ltéthylènediamine, le 1,3-diamino-2-hydroxypropane, le 1,3-diaminopropane, la glycylglycine, la tricyne, l'acide 5,5-diéthylbarbiturique, la triéthanolamine, le tris(hydroxyméthyl)aminométhane et leurs mélanges. Comme exemples de phénols substitués on citera le crésol, le chlorophénol, le bromophénol, le phénylphénol et le méthoxyphénol. L'indicateur coloré peut être tout composé dont les propriétés d absorption varient avec le pH, en particulier dans la gamme des pH neutres. A titre d'exemples, la phénolsulfonephtaléine, la 2-méthyl- 3-amino-6-diméthylaminophénazine, lto-crésolsulfonephtaléine, la cyanine, le 5, 8-quinoléinequinone-8-hydroxy-5-quinolyl-5-imide et la dibromothymolsulfonephtaléine sont utilisables suivant l'invention. Les stabilisants ont pour effet de stabiliser et d'intensifier la couleur drSvelon2ée et éaieeent doser des variations importantes -de concentration ironique dans le système réactif lors de l'addition de l'échantillon. En outre, les stabilisants empêchent la précipita- tion des protéines lorsqu'on ajoute des échantillons de substances contenant des protéines comme le sérum et l'urine. On a découvert que des agents séquestrants comme l'acide éthylène diamine tétracétique (ENTA) et des sels neutres comme le chlorure de sodium et le chlorure de potassium sont particulièrement efficaces à cet égard.On peut utiliser tout colorimètre ou spectrophotomètre qui transmet la lumière au voisinage de 500 à 600 nEI. On peut doser l'azote de l'urée dans le plasma, le sérum, l'urine et autres fluides biologiques par le procédé suivant la présente invention, sans déprotéinisation ou élimination d'ammoniac. Bien que la présente invention convienne particulièrement au dosage du taux d' urée dans les fluides biologiques, elle est utilisable d'une façon générale pour le dosage du taux d'urée dans tout fluide contenant de l'urée. Du fait de la spécificité de l'uréase vis-à-vis de l'urée, on ne connaît à l'heure actuelle aucune substance pouvant fausser le dosage du taux de l'azote de l'urée, hormis les réactifs qui dénaturent l'enzyme, I'uréase. Comte il peut y avoir perte d'urée du fait d'une action bactérienne, en particulièrement dans les échantillons d'urine, les échantillons doivent être conservés de façon appropriée en utilisant des agents antibactériens ou en les réfrigérant. D'une façon générale, le procédé suivant l'invention est mis en oeuvre comme suit: 1. On prépare des solutions à 10, 20, 50 et 100 mgeSë d'azote de l'urée (contenant respectivement 21,43 mg; 42,87 mg; 107,2 mg et 214,3 mg d'urée sèche, A.R., pour 100 ml d'eau distillée). 2. On utilise ces solutions dans le protocole d'essai décrit ci-après. 3. Lorsqu'on porte les résultats obtenus en fonction de l'azote de l'urée, on obtient une ligne droite dans la plupart des spectrophotomètres jusqu'à 200 mgeXé d'azote de l'urée, comme représenté à la figure unique du dessin annexé. 4. Sans accrottre ou réduire le volume de l'échantillon, il est possible, dans la plupart des spectrophotomètres, de facilement doser de 5 à 200 mgS d'azote de l'urée. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention. Dans les exemples suivants, on peut utiliser une cupule ayant n'importe quelle dimension et, en conséquence, on peut utiliser des volumes d'échantillons différents avec des cupules de dimensions différentes. On utilise ici une cupule de 3 ml. EXEABLE I 1. Une solution constituée par environ 10 mmoles/litre de triéthanolamine, 10 mmoles/litre de pyrophosphate, 10 mmoles/litre d' EDTA, 200 mmoles/litre de chlorure de sodium et 0,3 mmole/litre de phénolsulfonephtaléine dans l'eau distillée est amenée à un p11 de 6 W 8 à l'aide d'hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique. On peut également dissoudre dans l'eau distillée un mélange solide contenant les ingrédients ci-dessus en proportions appropriées afin d'obtenir la même solution finale. 2. On dissout un échantillon d'uréase dans une portion aliquote de la solution finale du stade 1 de façon à obtenir une solution contenant environ 100 unités internationales d'activité d'uréase par ml à 250C. 3. On prépare des solutions d'urée, de qualité pour analyses, contenant 10, 50 et 100 mg d'azote de l'urée pour 100 ml, à l'aide d' eau distillée. 4. On introduit à la pipette des portions aliquotes de 2,8 ml de la solution finale du stade 1 de l'exemple I dans une cupule témoin et des cupules contenant les échantillons , marquées a, b, c et témoin. 5. On ajoute des portions aliquotes de 0,1 ml des solutions d' urée à 10, 50 et 100 mg pour 100 ml du stade 3 de l'exemple I dans les cupules marquées respectivement a, b et c et on mélange doucement, mais soigneusement. 6. On note l'absorbance initiale des cupules a, b et c , par comparaison avec la cupule témoin à 560 nM. 7. On ajoute des portions aliquotes de 0,1 ml de la solution d7 uréase du stade 2 de l'exemple I dans les cupules témoin et d' échantillon, on mélange doucement mais soigneusement et on laisse reposer à température ambiante pendant au moins une minute mais pas plus de cinq heures. 8. On note l'absorbance finale de chaque tube d'échantillon par comparaison avec la cupule témoin à 560 nM. On soustrait 1' absorbance initiale de chaque cupule d'échantillon de sa valeur d'absorbance finale pour obtenir la variation d'absorbance. 9. Lorsqu'on porte, sur un graphique, la concentration en urée des échantillons en fonction des variations de l'absorbance on obtient une droite, comme illustré au dessin. 10. On peut obtenir la concentration en urée d' échantillons inconnus de fluide biologique en soumettant les échantillons inconnus aux opérations décrites aux stades 1 à 8 ci-dessus et en comparant les résultats obtenus avec ceux obtenus avec les solutions à concentration en urée connue. Il est courant, dans la plupart des laboratoires, d'exprimer l' urée en azote de l'urée. Cela est dû au fait qu'on souhaite comparer la quantité d'azote dans l'urée avec celle d'autres constituants entrant dans la catégorie des substances non protéiniques. Comme la masse moléculaire de l'urée est de 60 et qu'elle contient 2 atomes d'azote présentant un poids global de 28, on peut convertir un taux d'azote de l'urée en taux d'urée en multipliant par 60/28 ou 2,14. Calcul: 1. On soustrait l'absorbance initiale de l'absorbance finale pour obtenir le A de 11 échantillon et de l'étalon à 50 mg% d'azote de l'urée. #A mg% d'azote de l'urée = 50 x dB de l'échantillon 2. mg d'azote de l'urée = 50 x #A de l'étalon 3. mg% d'urée = mg'% d'azote de l'urée x 2,14 Exemple de calcul: étalon à 50 * mg% d'azote de l'urée - Absorbance initiale = -0,04 Absorbance finale = 0,46 = A = 0,50 Echantillon: - Absorbance initiale - 0,10 Absorbance finale = 0,20 - A = 0,10 10 Azote de l'urée = 5a x !y- = 10 Limites normales (1)s Plasma ou sérum : de 7 à 18 mg% d'azote de 1' urée (de 15 à 38 mg% d'urée) Urine: de 12 à 20 g d'azote de l'urée/24 heures (de 12 à 43 g d'urée/24 heures) EXEMPLE II 1.On mélange 1 partie de la solution finale du stade 2 de 1' exemple I avec 29 parties de la solution finale du stade 1 de l'exem- ple I. 2. On introduit à la pipette 2,9 ml de solution du stade 1 dans les cupules marquées a, b, c et témoin. 3. On ajoute des portions aliquotes des solutions à 10, 50 et 100 mg d'azote de l'urée pour 100 ml du stade 3 de l'exemple I respectivement dans les cupules marquées a, b et c et on mélange doucement mais soigneusement. On laisse les solutions reposer à température ambiante (au-dessus de 20eC) pendant au moins une minute mais pas plus de cinq heures environ. 4. On note l'absorbance finale des cupules a, b et c par comparaison avec la cupule témoin. 5. Lorsqu'on porte, sur un graphique, l'absorbance de chaque échantillon en fonction de la concentration en urée des échantillons on obtient une droite, comme illustré au dessin. 6. On peut obtenir la concentration en urée d'un échantillon inconnu en faisant passer un échantillon de fluide biologique ayant un taux d'urée inconnu par les stades 1 à 4 ci-dessus, à la place des solutions d'urée connues, et en comparant les résultats obtenus avec les résultats obtenus pour la solution contenant une quantité d'urée connue. On opère simplement en mesurant l'absorbance de l'échantillon inconnu et en relevant la concentration en urée correspondant à 1'absorbance mesurée sur la courbe linéaire. EXEMPLE III On peut également dissoudre dans l'eau distillée un mélange solide contenant des proportions appropriées de tampons, d'indicateurs colorés, de stabilisants et d'uréase, pour obtenir la meme solution finale qu'au stade 1 de 11 exemple II. On opère par ailleurs comme décrit à l'exemple II. EXEMPLE IV i. On introduit à la pipette une portion aliquote de 3 ml de la solution finale du stade 1 de l'exemple I dans la cupule témoin et de 2,9 ml de la solution finale du stade 1 de l'exemple I dans la cupule contenant l'échantillon 2. On ajoute 0,1 ml de la solution finale du stade 2 de ltexem- ple I dans la cupule contenant 11 échantillon. On peut également ajouter 3,0 ml de la solution finale du stade 7 de l'exemple Il dans la cupule contenant l'échantillon et 3 ml de la solution finale du stade 1 de l'exemple I dans la cupule témoin. 3. On ajoute des portions aliquotes de 0,1 ml de l'étalon à 10 mg d'azote de l'ure pour 100 ml du stade 3 de l'exemple I dans les cupules témoin et contenant l'échantillon et on mélange doucement mais soigneusement. On laisse les solutions reposer à température ambiante pendant au moins une minute mais pas plus de 5 heures. 4. On note l'absorbance de la cupule de l'échantillon par comparaison avec la cupule témoin. 5. On répète les stades 1 à 4 ci-dessus avec des étalons à 50 mg et 100 mg d'azote de l'urée pour 100 ml. 6. Lorsqu'on porte la concentration en urée des échantillons en fonction de la variation de l'absorbance, on obtient une droite. 7. On peut obtenir la concentration en urée d'échantillons inconnus de fluide biologique en faisant passer les échantillons inconnus par les stades 1 à 4 ci-dessus et en comparant les résultats obtenus avec les résultats fournis par des solutions ayant une concentration connue en urée. EXLNPLE V i. On introduit à la pipette des portions aliquotes de 3 ml de la solution finale du stade 7 de l'exemple I dans les cupules témoin et d'échantillon. 2. On ajoute 10 Ul d'uréase sèche, ou une quantité appropriée de solution d'uréase stabilisée par un concentrateur, par exemple de l'uréase dans du glycérol à 50a0 dans la cupule échantillon et on dissout en agitant doucement, Les stades 3 à 7 sont identiques à ceux décrits à exemple IV. EXEMPLE VI 1. On peut également dissoudre dans l'eau distillée un mélange solide contenant des proportions appropriées de tampons, d'ineicaieurs colorés et de stabilisants pour obtenir la mebme solution finale qu au stade 1 de l'exemple IV. 2. On peut également dissoudre dans l'eau distillée des mélanges solides contenant des proportions appropriées de tampons, d'indicateurs colorés, de stabilisants et d'uréase pour obtenir la même solu tion finale qu'au stade 2 de l'exemple IV. Les stades 3 à 7 sont identiques à ceux décrits à l'exemple IV. EXEMPLE VII 1. On peut également dissoudre dans liteau distillée un mélange solide contenant des proportions appropriées de tampons, d'indicateurs colorés et de stabilisants pour obtenir la même solution finale qu'au stade 1 de l'exemple V. Par ailleurs, on procède comme décrit à l'exemple V. Chaque fois qu'on a indiqué que l'uréase est sous forme de solution, on peut également l'utiliser sous forme pulvérulente ou sous forme d'une solution très concentrée. REVENDICATIONS l. Composition pour le dosage du taux d'urée dans les fluides biologiques, contenant de l'flréase, des tampons et un indicateur coloré, caractérisée en ce que les tampons sont des tampons mélangés comprenant au moins un tampon dont le pH croit avec la température et au moins un autre tampon dont le pH décroît lorsque la température croit. 2. Composition suivant la revendication l, caractérisée en ce qu'elle contient des stabilisants. 3. Composition suivant la revendication I ou 2, caractérisée en ce que le tampon à dpH/dT positif est un pyrophosphate. 4. Composition suivant la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle est sous forme d'une solution aqueuse contenant de 1 à 100 millimoles/litre de tampon, de 0,05 à 2,0 millimoles/litre d'indicateur coloré, et de 0,1 à 10 unités internationales/ml d'uréase. 5. Composition suivant la revendication 4, caractérisée en ce que la solution contient de O à 100 millimoles/litre de stabilisant. 6. Procédé de dosage du taux d'urée dans les fluides contenant de l'urée, caractérisé en ce que : (l) on ajoute à unéchantillon dudit fluide un mélange de tampons, un indicateur coloré et de l'uréase, le mélange de tampons contenant au moins un tampon dont le pH croit avec la température et au moins un autre tampon dont le pH décroît lorsque la température croit et 2) on mesure l'absorbance de la solution juste après que l'uréase a catalysé la conversion totale en ammoniac de il urée du fluide contenant de l'urée. 7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce qu' - on ajoute également à l'échantillon du fluide, des stabilisants appropriés. 8. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce qu'on ajoute le tampon, l'indicateur coloré et l'uréase à l'échantillon et à au moins deux autres échantillons de méme volume dont l'un ou bien ne contient pas d'urée ou bien contient une quantité d'urée connue mais différente, on mesure l'absorbance des trois solutions après libération de l'ammoniac, on porte les résultats sous forme-graphique linéaire et on lit la teneur en urée de l'échantillon de fluide contenant de l'urée sur ledit graphique. 9. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce qu' - on mesure l'absorbance des échantillons avant l'addition de l'uréase et à nouveau après que l'uréase a libéré l'ammoniac, on porte la variation d'absorbance de chaque échantillon en fonction de la teneur en urée des échantillons à teneur en urée connue, et on lit sur le graphique la teneur en urée de l'échantillon de fluide contenant de 1' urée 10.Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que (1) on ajoute à un échantillon du fluide un tampon, un indicateur coloré, des stabilisants appropriés et de l'uréase et (2) on mesure l'absorbance de la solution juste après que l'uréase a catalysé la conversion totale en ammoniac de l'urée du fluide contenant de l'urée, le tampon, l'indicateur coloré, les stabilisants et l'uréase étant ajoutés audit échantillon et à au moins deux autres échantillons de même volume dont l'un ou bien ne contient pas d'urée ou bien contient une quantité d'urée connue mais différente, on mesure l'absorbance des trois solutions après la libération de l'ammoniac, on porte les résultats sous forme graphique linéaire et on lit la teneur en urée de l'échantillon de fluide contenant de l'urée sur le graphique. 11. Procédé suivant la revendication 10 , caractérisé en ce qu'on mesure l'absorbance des échantillons avant l'addition de l'uréase et à nouveau après que l'uréase a libéré l'ammoniac, on porte la variation de l'absorbance de chaque échantillon en fonction de la teneur en urée des échantillons à teneur en urée connue et on lit la teneur en urée du fluide contenant de l'urée sur le graphique. 12. Procédé suivant la revendicationlO , caractérisé en ce que le tampon est un pyrophosphate. 13. Procédé suivant la revendicationlo O caractérisé en ce que la composition utilisée pour le dosage est sous forme d'une solution aqueuse contenant de 1 à 100 millimoles/litre de tampon, de 0,05 à 2,0 millimoles/litre d'indicateur coloré, et de 0,1 à 10 unités internationales/ml d'uréase. 14. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce que la composition utilisée pour -le dosage est sous forme d'une solution aqueuse contenant de 1 à 100 millimoles/litre de tampon, de 0,05 à 2,0 millimoles/litre d'indicateur coloré, de O à 100 millimoles/litre de stabilisant et de 0,1 à 10 unités internationales/ml d'uréase. 15. Cor;rposition comprenant un mélange de tampons, utilisable dans le procédé suivant la revendication 6, caractérisée en ce que l'un au moins des tampons présente un pH qui croit avec la température et l'un au moins des autres tampons présente un pH qui décroît lorsque la température croît. 16. Composition suivant la revendication 15, caractérisée en ce que le tampon à dpH/dT positif est un pyrophosphate.