Brevet FR2350356A1 — publié le 19771202

L'invention concerne un procédé pour purifier un extrait aqueux contenant de la kallidinogénase, obtenu à partir du pancréas de mammifère, en vue d'obtenir de la kallidinogénase purifiée. Le procédé selon l'invention doit permettre en particulier d'éliminer très facilement et de façon pratiquement complète la kininase indésirable. Différentes suggestions ont été faites en ce qui concerne la purification d'un extrait aqueux contenant de la kallidinogénase, obtenu à partir du pancréas de mammifère, par les techniques d'adsorption-élution. On a suggéré par exemple deux types de procédés de purification. L'un d'eux, qui utilise des matières non résineuses du type polysaccharide, comprend, par exemple, un procédé consistant à provoquer l'adsorption de la kallidinogénase brute sur une cellulose échangeuse d'anions faiblement basique, et à la séparer (brevet japonais 11 697/62), et un procédé consistant à ajouter un sel de plomb ou de zinc à une solution aqueuse contenant de la kallidinogénase, à provoquer l'adsorption du précipité de Xallidinogénase obtenu sur une cellulose échangeuse d'anions faiblement basique ou un dextrane réticulé (marque commerciale Sephadex) et à la séparer (brevet japonais 56 889/73). L'autre type de procédés, qui utilise des résines échangeuses d'ions, comprend par exemple un procédé consistant à ajouter un précipitant de protéines à un extrait de tissu glandulaire du pancréas, à provoquer l'adsorption de la kallidinogénase obtenue sur une résine échangeuse d'anions macropore fortement basique, et à la séparer (brevet japonais 103 715/73). Les procédés utilisant comme adsorbant une matière non résineuse du type polysaccharide ont l'inconvénient que la résistance physique de la matière échangeuse d'ions n'est pas suffisante, et qu'une contamination par des microorganismes risque de se produire, ce qui rend le procédé impraticable à I'échelle industrielle. Les procédés de l'autre type ont l'avantage d'éviter ces inconvénients, mais ne donnent pas satisfaction en ce qui concerne, par exemple, l'élution du produit désiré et l'élimination de la kininase indé sirable. Des recherches approfondies ont été faites pour éliminer les inconvénients des procédés classiques pour purifier l'extrait de kallidinogénase. On a trouvé que si l'on utilise une résine échangeuse d'anions faiblement basique du type gel, une partie plus importante de la kininase indésirable peut être éliminée par une opération de lavage après l'adsorption, et que la kallidinogénase adsorbée peut être éluée et recueillie avec une bonne efficacité et de bons taux de récupération par une opération d'élution subséquente qui demande moins de temps que dans les procédés connus. On a trouvé également que cet effet supérieur de purification ne peut être obtenu avec une résine échangeuse d'anions fortement basique du type gel ou une résine échangeuse d'anions faiblement basique macropore, mais uniquement avec la résine échangeuse d'anions faiblement basique du type gel. L'invention a pour objet un procédé pour purifier la kallidinogénase, qui consiste à soumettre un extrait aqueux contenant de la kallidinogénase, obtenu en partant de pancréas de mammifère, à un traitement d'adsorption-élution utilisant une résine échangeuse d'anions, dans lequel on met en contact le dit extrait aqueux avec une résine échangeuse d'anions faiblement basique du type gel pour provoquer l'adsorption de la fraction de kallidinogénase sur la résine, et on élue la kallidinogénase avec une solution aqueuse d'un sel d'ammonium d'un acide faible de manière à recueillir la kallidinogénase. On a constaté que lorsqu'on utilise une résine échangeuse d'anions fortement basique, ou faiblement basique macroporeuse, l'élution de la kallidinogénase adsorbée sur ces résines est lente, et pour obtenir une élution et une séparation complète, une grande quantité de solvant et une longue durée sont nécessaires; en outre, des impuretés ont tendance à accompagner la kallidinogénase séparée. En revanche, lorsqu'on utilise la résine échangeuse d'anions faiblement basique du type gel, la kallidinogénase recher cliée adsorbée sur la résine peut être éluée très rapidement au moyen d'une solution aqueuse d'un sel d'ammonium d'acide faible en tant que solvant d'élution, et peut être facilement séparée des impuretés. Selon le procédé de purification de l'invention, on fait passer l'extrait aqueux contenant de la kallidinogénase à travers une colonne de résine échangeuse d'anions faiblement basique du type gel pour assurer le contact entre l'extrait aqueux et la résine, de manière à adsorber la fraction de kallidinogénase sur la résine. De préférence, l'opération d'adsorption est effectuée à un p11 compris entre environ 4 et environ 8, de préférence entre 5 et 7, et plus particulièrement de l'ordre de 6 + 0,5. Aux valeurs de pH extérieures à la plage indiquée, la kallidinogénase est désactivée, et à un pH supérieur à 8, la quantité de kallidinogénase non adsorbée augmente. Par conséquent, cela provoque une diminution de la production et de la pureté de la kallidinogénase. On élue la kallidinogénase adsorbée sur la résine échangeuse d'anions en utilisant une solution aqueuse d'un sel d'ammonium d'acide faible à un pH compris entre environ 6 et environ 7. La température à laquelle on effectue l'adsorption et l'élution est quelconque pourvu qu'elle ne provoque pas la décomposition de la kallidinogénase. Habituellement on effectue ces opérations à la température ambiante. Le sel peut être éliminé de l'éluat par des moyens tels que la dialyse ou l'ultrafiltration, et le produit obtenu peut être séché à une température inférieure à la température de décomposition de la kallidinogénase, habituellement à moins de 600C. Le séchage peut être exécuté par exemple par lyophilisation ou séchage par pulvérisation. La résine échangeuse d'anions faiblement basique du type gel utilisée dans le procédé de purification selon l'invention comporte de préférence une amine secondaire ou tertiaire comme groupe d'échange. I1 peut s'agir par exemple de résines du type divinylbenzène/acrylate (Diaion WA 10 et Diaion WA 11, marques commerciales pour des produits de la firme Mitsubishi Chemical Industries Ltd, Japon) ou de résines du type divinylbenzèneZstyrène (Amberlite IR 45, Amberlite IRA 47, Amberlite IRX 68, marques commerciales pour des produits de la firme Rohm & Haas Co., E.U.A.) Afin de démontrer l'effet de la résine échangeuse d'anions faiblement basique du type gel, on a réalisé l'expérience suivante en utilisant comme résine, selon l'invention, le Diaion WA 10, et comme résines de comparaison, une résine échangeuse d'anions faiblement basique macroporeuse (Diaion WA 30, marque commerciale pour un produit de Mitsubishi Chemical Industries Ltd), une résine échangeuse d'anions fortement basique du type gel (Diaion SA 21 A, marque commerciale pour un produit de Mitsubishi Chemical Industries Ltd), et une résine échangeuse d'anions fortement basique macroporeuse (Diaion HPA 10, marque commerciale pour un produit de Mitsubishi Chemical Industries Ltd). L'expérience consiste à faire passer 300 ml d'un extrait de pancréas brut de porc (3 unités de BAEE/ml comme kallidinogénase) à travers une colonne (3 x 25 cm) de chacune des résines échangeuses durions citées ci-dessus, à laver la résine avec une solution e,2 d'acétate d'ammonium (pH 6,0) et à éluer l'extrait au moyen d'une solution G,4 LI d'acétate d'ammonium (pH 6,0) à un débit de 50 ml/b tout en recueillant l'éluat par fractions de 19 ml chacune dans des tubes à essai. Les résultats sont indiqués au tableau (page 7). Dans le tableau la kallidinogénase est exprimée en unités de BAEE. La carboxypeptidase (CPase) est exprimée par l'activité de décomposition du HPLA (lactate d'hippuryl-L--phényle). Une unité HPLA est la quantité de CPase nécessaire pour décomposer lu mol de EPLA par minute lorsqu'on fait agir la CPase sur le HPLA. La mesure de l'activité de décomposition du HPLA est utilisée dans l'invention comme procédé pour détecter une fraction de kininase en chromatographie. L'activité biologique de la kallidinogénase dans les fractions éluées ayant une activité de décomposition du BAEE est déterminée par la méthode de l'augmentation de la circulation sanguine, et l'activité biologique de la kininase dans les fractions éluées ayant une activité de décomposition du HPLA est déterminée par la méthode de contraction du muscle utérin du rat (cf. fliroshi Moriya, "Basic Lectures in the Development of Medicines", vol. 5, Pharmacological Test Methods, page 974, ouvrage en langue japonaise édité par Chijin Shokan Company, Tokyo, en 1971). Les résultats du tableau montrent qu'avec le procédé de purification selon l'invention utilisant la résine échangeuse d' anions faiblement basique du type gel, 99 % de la kallidinogénase sont élués et recueillis dans la première fraction de 304 ml, et le rendement d'élution et de récupération est nettement supérieur à celui qu'on obtient avec les autres résines.Ces résultats font également apparaître que la quantité de Crase, qui est une impureté indésirable, est beaucoup plus faible dans l'invention que dans les essais comparatifs; qu'au moment du lavage de la résine avant élution, une partie plus importante (98 %) de la CPase adsorbée peut être éliminée; que la quasi-totalité (99 %) de la kallidinogénase peut être éluée et récupérée des le stade de l'élution; et que la quantité de CPase est très faible (0,6 SO) et la qualité de la kallidinogénase purifiée obtenue par un cycle du processus d'adsorption-élution est excellente. Les exemples suivants illustrent la présente invention plus en détail. Dans ces exemples, la teneur en pancréas essentiel est d'environ 50 % en poids par rapport au pancréas utilisé. Le pancréas est utilisé sans éliminer la graisse. L'activité de la kininase est exprimée en unités de kininase. Une unité de kininase est la quantité de kininase nécessaire pour décomposer I ng de bradykinine par minute. - EXEMPLE 1 - On hache 300 g de pancréas de porc brut et on ajoute 900 ml d'eau, puis on règle le pH du mélange à 6. On ajoute 6,25 g d'acétate de magnésium (concentration 0,03 M) et on mélange bien l'ensemble. On laisse reposer le mélange à environ 500C pendant 1,5 heure. On le laisse ensuite reposer à la température ambiante pour éliminer la couche supérieure contenant la graisse. On soumet la couche de fond à une séparation par centrifugation, et on obtient 800 ml d'extrait. On fait passer l'extrait à travers une colonne (3 x 25 cm) d'une résine échangeuse d'anions faiblement basique du type gel (Diaion WA 10) tamponnée avec une solution 0,15 M d'acétate d'ammonium (pH 6,0) et après avoir lavé la résine avec une solution 0,2 M d'acétate d'ammonium (pH 6,0), on élue l'extrait avec une solution 0,4 M d'acétate d'ammonium (pH 6,0). On élimine le sel de l'éluat, et on lyophilise la fraction de kallidinogénase obtenue. On obtient 148 mg (117,7 KU/mg) de kallidinogénase. La quantité de kininase de ce produit est de 0,5 unité par unité de kallidinogénase (KLJ). - EXEMPLE 2 - On mélange soigneusement 30 g d'une poudre de pancréas séchée à l'acétone avec 20 fois sa quantité d'eau et on règle le pi du mélange à 6. On ajoute 3,2 g de sulfate de magnésium (concentration 0,05 M) et on mélange l'ensemble soigneusement. On laisse reposer le mélange à environ 450C pendant 2 heures. On laisse ensuite reposer le mélange à la température ambiante, et on élimine la couche supérieure contenant des matières solides telles que des protéines insolubles. On soumet la couche de fond à une séparation par centrifugation, et on obtient 550 ml d'extrait. On fait passer l'extrait à travers une colonne (3 x 25 cm) d'une résine échangeuse d'anions faiblement basique du type gel (Amberlite IRX 68) tamponnée avec une solution 0,15 M d'acétate d'ammonium (pH 6,0) et après avoir lavé la résine avec 600 ml d'une solution 0,2 M d'acétate d'ammonium (pH 6,0), on élue l'extrait avec une solution 0,4 M d'acétate d'ammonium (pH 6,0). On élimine le sel de l'éluat, et on lyophilise la fraction de kallidinogénase obtenue. On obtient 156 mg (142,3 KU/ng) de kallidinogénase. La quantité de kininase est seulement de 1 unité par unité de kallidinogénase (Kil) - EXEMPLE n - On prépare un extrait (a) de la façon suivante - On hache 500 g de pancréas de proc brut, et on ajoute 2 000 ml d'eau. On règle le pH du mélange à 6,0. On ajoute 12 g de sulfate de magnésium (coneentration 0,05 M) au mélange ci-dessus, et on mélange bien l'ensemble. On laisse reposer le mélange à environ 500C pendant 1,5 heure. On retirel'extrait qui s'est séparé sous forme de couche de fond, et on obtient de la kallidinogénase en quantité correspondant à 36 000 unités (KU). On prépare un autre extrait (b) de la façon suivante : - On hache 500 g de pancréas de proc brut, et on ajoute 2 000 ml d'eau. On règle le pH du mélange à 6,0. On ajoute 13 g d'acétate de magnésium (concentration 0,03 M) au mélange, et on mélange bien l'ensemble. On laisse reposer le mélange à 55 C pendant 1 heure. On retire l'extrait qui s'est séparé en tant que couche de fond, et on obtient de la kallidinogénase en quantité correspondant à 37 000 unités (KU). On élue et on sèche chacun des extraits (a) et (b) de la mdme manière qu'à l'exemple 1. On obtient respectivement 257 mg et 241 mg de kallidinogénase. Les activités de kallidinogénase sont respectivement 108,3 Kl/mg et 126,2 KU/mg. - EXEMPLE 4 - On mélange 100 g d'une poudre de pancréas de proc séchée à l'acétone avec 3 000 ml d'eau, et on règle le pH de la solution à 6+ On ajoute 16 g d'acétate de magnésium (concentration 0,025 M) au mélange, et on mélange bien l'ensemble. On laisse reposer le mélange à environ 500C pendant 1 ,5 heure. On retire l'extrait séparé comme couche de fond, et on obtient de la kallidinogénase en quantité correspondant à 75 000 unités (Kil). On élue et on sèche l'extrait obtenu de la mdme manière qu'à l'exemple 2. On obtient 355 mg de kallidinogénase. L'activité de kallidinogénase de ce produit est 98,5 KU/mg. TABLEAU selon l'invention Comparaison 1 Comparaison 2 Comparaison 3 Résine échangeuse d'ions DIAION WA 10 DIAION WA 30 DIAION SA 21A DIAION HPA 10 Caractéristiques de la faiblement basique, faiblement ba- fortement ba- fortement basique, résine du type gel sique, macro- sique, du macroporeuse poreuse type qel Quantité de l'estrait de pancréas de porc 300 ml 300 ml 300 ml 300 ml Enzymes KA CPase KA CPase KA CPase KA CPase Quantité adsorbée 800 39 000 900 107 000 800 50 000 900 88 000 Quantité des enzymes 0 38 400 0 31 200 0 15 000 0 80 000 éluées au coure du lavage (0) (98) (0) (29) (0) (30) (0) (91) 1ère fraction tubes à essai n 1-16 790 250 190 61 360 92 890 420 3 000 (0 - 304 ml) (99) (0,6) (21) (57) (11) (2) (47) (3) 2ème frantion tubes à essai n 17-46 0 0 405 14 250 0 0 380 2 000 (305 - 874 ml) (0) (0) (45) (13) (0) (0) (42) (2) 3ème fraction tubes à essai n 47-96 0 0 300 144 0 0 50 0 (875 - i 824 ml) (0) (0) (33) (0,1) (0) (0) (6) (0) *KA signifie kallidinogénase Les valeurs entre parenthèses représentent les pourcentages de la quantité d'enzyme éluée rapportée à la quantité d'enzyme adsorbée sur la résine échcngeuse d'ions. REVENDICATIONS 1 - Procédé pour purifier la kallidinogénase, caractérisé par le fait qu'on soumet la phase aqueuse d'un extrait aqueux contenant de la kallidinogénase et obtenu à partir du pancréas d'un mammifère à un traitement d'adsorption-élution utilisant une résine échangeuse d'anions, dans lequel on met en contact la pna- se aqueuse du dit extrait aqueux avec une résine échangeuse d'anions faiblement basique du type gel pour provoquer l'adsorption de la fraction de kallidinogénase sur la dite résine, et on élue la kallidinogénase avec une solution aqueuse d'un sel d'ammonium d'un acide faible de manière à recueillir la kallidinogénase. 2 - Procédé selon la revendication 1, dans lequel le sel d'ammonium d'un acide faible est choisi parmi les sels d'ammonium d'acides minéraux faibles et les sels d'ammonium d'acides gras en C1 àC5 3 - Procédé selon la revendication 2, dans lequel le sel d'ammonium est choisi parmi le carbonate, l'hydrogénocarbonate, le borate, le phosphate mono- ou dibasique, le phosphite, l'hypophosphite, le formate, l'acétate, le bimalate, le citrate, le lactate, l'oxalate, le succinate, le tartrate et le valérate d'ammo- nium.