Brevet FR2345157A1 — publié le 19771021

La présente invention concerne généralement la préparation d'échantillons de sérum sanguin, pour des analyses biochimiques accomplies par des méthodes photométriques. Quand on accomplit des analyses biochimiques sur du sérum sanguin ou autres fluides du corps, on rencontre des difficultés de temps en temps, dues à la présence de substances anormalement présentes dans le sérum, ces substances produisant une absorption directe de la lumière dans une mesure colorimétrique, qui s'additionne aux facteurs de l'intensité de couleur de la réaction chimique spécifique qui est observée. Be sérum contient non seulement des triglycérides maintenus en solution conjugués avec la protéine comme la lipoprotéine, principalement la beta-lipoprotéine. Tandis que la proportion de protéines dans les molécules de lipoprotéine diminue, la solubilité de la molécule diminue. Quand la teneur en protéine atteint environ 5%, la lipoprotéine existe sous forme de gouttelettes finement émulsifiées, ayant un diamètre supérieur à 0,5k et appelées chylomicrons.Elles sont visibles et responsables d'une turbidite du sérum appelée lipémie.La lipémie apparaît habituellement au-dessus d'un niveau total de lipides dans le sérum de 500 à 1.000 milligrammes par décilitre, mais le sérum peut rester optiquement clair à un niveau de zip pouvant atteindre 4.400 milligrammes par. décilitre. Même un sérum clair ou un plasma clair peut produire une turbidité en restant au repos , probablement par suite de l'aggrégation des molécules de lipoprotéine. L'apparition de lipémie se produit normalement après un repas contenant de la graisse. La turbidité de l'échantillon due auxohylomicrons , est courante, et etest une source d'erreurs duesà une diffusion de la lumière ou une absorption de la lumière, par les particules de graisse présentes dans l'échantillon.On a trouvé que ce type de turbidité était extrêmement difficile à enlever, sans soumettre l'échantillon à un procédé d'extraction dffl graissesproduisant une modification ou endommageant d'autres constituants biochimiques pouvant être intéressants. On a observé que quand un sang non lipémique éA soumisà à un champ centrifuge, une zone blanche apparaissait à l'interface air-plasma, et quand le champ centrifuge est supprimé, la zone blanche disparaît. On a trouvé que la résistance du champ sur laquelle ce phénomène se produisait était de 500 à 1000 RCF (force centrifuge relative). En observant du sang lipémique dans les mêmes conditions, la zone blanche est très prononcée. Par ailleurs, le plasma entre lui et la couche de cellules rouges devint tout à fait clair.. Quand le champ centrifuge était enlevé, il y avait une redistribution sensible de la zone blanche dans le plasma, bien que, dans le cas du sang lipémique, il reste une concentration résiduelle dans la zone blanche.En conséquence on a trouvé qu'il était considérablement difficile, sinon impossible, d'enlever les chylomicrons d'un sang lipémique. Une autre suggestion pour la zzlarification consisterait à utiliser des solvants spécifiques ajoutés à l'échantillon pour extraire les particules grasses microscopiques d'une façon connue. Un solvant typique serait de l'éther mélangé au sérum puis on les laisserait se séparer par gravité. Comme on l'a indiqué ci-dessus, toutes les molécules polaires dans le sérum, ainsi que les chylomicrons seraierfixposés à l'action solvante de l'éther, par conséquent des molécules polaires telles que les stérols, c'est à dire le cholestérol, seraient affectées Ainsi, il y aurait une perturbation sensible de la concentration relative des composants solubles dans les lipides, avec des résultats néfastes sur l'échantillon pour les essais ultérieurs. En conséquenhe,la présente invention procure un procédé de clarification d'échantillons de sérum sanguin lipmique, et il comprend les étapes de former une interface entre un corps de sérum lipémique et un solvant spécifique de la graisse, et de soumettre cesliquidesavec l'interface, à un champ centrifuge ayant une force minimum de 100 RCF, pendant un temps prédéterminé, tout en maintenant l'intégrité de l'interface pour forcer le solvant à se déplacer de façon centripète par rapport au corps de sérum lipémique, puis à enlever lesliquides formant uneinter- face,de ce champ, et à retirer l'une des couches résultantes de solvant et de sérum clair , sans perturber l'autre. Une partie de sérum lipémique e centrifugée avec une couche de solvant spécifique de la graisse se déplaçant de façon centripète. lies chylomicrons dans le sérum lipémique, qui sont responsables de la turbidité, ayant un poids spécifique plus faible que le sérum, seront entraSnés vers le haut dans et au delà de l'interface sérum/solvant, où ils seront capturés par le solvant. Quand le champ centrifuge est enlevé, il ntest pas possible que les chylomicrons se redispersent dans le sérum, car pour le faire, ils devraient reprendre leur configuration particulaire qui est en contraste avec leur configuration en solution. lies forces intermoléculaires opérant dans tout système solvant sont suffisamment importantes pour empêcher une inversion de la solution sous une forme de dispersion. On peut utiliser une grande variété de solvants à condition d'abord, qu'ils soient spécifiques de la graisse. Ils peuvent comprendre de nombreux types aliphatiques, aromatiques, halogénés ou non halogénés connus, la limite étant qu'ils soient solvants des lipides, immisdibles avec lteau et qutils aient un poids spécifique inférieur à celui du sérum sanguin. lie sérum sanguin a un poids spécifique qui est de façon type de 1 ,030. En conséquence, éther éthylique, l'éther de pétrole et le chloroforme sont des solvants appropriés à utiliser dans la mise en pratique du procédé selon la présente invention. Comme exemple du procédé selon la présente invention, on place quelques millilitres de sérum sanguin lipémique dans une éprouvette, et on dépose, au dessus du sérum, un volume égal d?un solvant tel que de l'éther éthylique. En déposant par dessus en formant une couche, on applique le solvant au sérum de façon à ne pas mélanger les deux, mais à définir l'interface entre les deux couches. Il est essentielle qu'aucune tentative ne soit fait pour mélanger le solvant et le sérum sanguin. L'éprouvette contenant les deux couches, l'unede sérum lipémique et l'autre du solvant, est placée dans un centrifugeur , soit du type à angle fixe ou oscillant. lies tubes ne sont pas bouchés.Si cela est nécessaire, on peut prévoir un tube d'équilibrage dans le centrifugeur., contenant de l'eau, couvert d'une couche de solvant, pour obtenir une perte constante par évaporation à chaque extrémité du bras du centrifugeur. L'éprouvette et son contenu sont alors centrifugés à un champ centrifuge relatif de l'ordre de 1.500, pendant au moins cinq minutes. Bien entendu, la quantité minimum de temps requis pour la centrifugation dépend de l'étendue de lipémie qui est traitée. Un temps de cinq minutes est plus que suffisant pour traiter même un échantillon fortement turbide. Tandis qu'unie centrifugation plus longue peut ne pas produire d'avantages importants, on ne,pense pas qu'une telle centrifugation plus longue nuira au matériau ou auxréskltatsobten par observation du matériau. lie champ centrifuge relatif pourra être utilisé à une force minimum de 1.000, l'extrémité supérieure de l'étendue applicable n'étant limitée que par le centrifugeur particulier utilisé. lie tube ou éprouvette est enlevé du centrifugeur, et les deux couches d'éther et de sérum sont visuellement claires. lie solvant peut être ajouté au sérum, ou bien le sérum au solvant selon ce qui est le plus pratique. Cependant, il ne faut pas secouer le sérum et le solvant ensemble. lie sérum et le solvant peuvent être séparés par toute méthode:' classique, selon que l'on souhaite ou non réutiliser le solvant. Habituellement, le solvant peut être aspiré au dessus du sérum, en utilisant une sonde fine en verre reliée à une source de dépression avec un siphon. flans l'exemple concerné, le solvant a été aspiré au dessus du sérum en utilisant une sonde en verre fine reliée à une source de dépression par l'intermédiaire d'un siphon. Il est également possible de décanter un liquide de l'autre. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée au mode de réalisation décrit et représenté qui n'a été donné qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituai des équivalents techniques des moyens décrits, ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre des revendications qui sMSvent RE VE NB I C AT IONS 1. Procédé de clarification d'un sérum sanguin lipémique, caractérisé par les étapes de former une interface entre un corps de sérum lipémique et un solvant spécifique de la graisse, et de soumettre lesdits liquides avec une interface, à un champ centrifuge ayant une force minimum de 100 RGF, pendant une durée prédéterminée, tout en maintenant l'intégrité de ladite interface pour forcer ledit; solvant à se déplacer de façon centripète par rapport audit corps de sérum lipémique, puis d'enlever ensuite lesdits liquides avec une interface entre eux, dudit champ et de retirer ltune desdites couches résultantes de solvant et de sérum clair ., sans perturber 11 autre. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape précitée de retirer est effectuée par décantation ou à 11 aide d'une sonde. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le solvant précité a un poids spécifique inférieur au sérum précité. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la durée de la centrifugation précitée n'est pas de moins de cinq minutes. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en c e que le solvant précité est spécifique des lipides. 6. Procédé selon l'une quelconques des revendications précédentes, caractérisé en ce que le solvant précité est spécifique des lipides et est choisi dans le groupe consistant en solvants aliphatiques, aromatiques,halogénés et non halogénés, tous étant capables de recevoir des lipides en solution. 70 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le solvant précité est choisi dans le groupe consistant en éther éthylique, éther de pétrole et chloroforme 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le champ centrifuge précité est de 10500 ROF. 9. Sérum sanguin lipémique, caractérisé en ce qu' il est clari- geintRsar le procédé selon l'une quelconque des revendications précé