Brevet FR2347050A1 — publié le 19771104

la présente Invention concerne un agent anti-inflammatoire et un nroeedé pour le préparer. On sait que la bradykinine est un corps qui provoque des inflammations et qui est engendré par le corps humain. La bradykinine parait jouer un rûle particulier dans les inflammations rhu matismales. Il a maintenant dtd trouvé que la bradykinine, que lton peut synthétiser, exerce un effet immunologique si on la combine à la gamma-globuline humaine ou à ltalbumine humaine. Si lton injecte de la bradykinine sous cette forme, il se forme des anti-corps qui fixent la bradykinine promot-rice d'inflammation et la rendent inoffensive. La bradykinine combine à la gamma-globuline ou à l'albumine agit donc comme antigène vis-à-vis de la bradykinine. En conséquence, l'agent anti-inflammatoire selon l'invention est donc caractérisé par le fait qu'il contient de la bradykinine combinée à de la gamma-globuline humaine ou à de l'albumine humaine Une possibilité avantageuse consiste à combiner la bradyki- nine à la gamma-globuline ou à l'albumine au moyen d'un corps in termediaire qui forme une liaison par ponts azotiques avec la gamma-globuline ou l'albumine. Des corps intermédiaires susceptibles d'être utilisés à cette fin sont des amino-acides aromatiques diazotables ou des amines. tes amino-acides peuvent être adjoints par leur groupe amine au groupe carboxyle terminal de la bradykinine ou,rar leur groupe carboxyle, au groupe amine terminal de la bradykinine par réaction de condensation, tandis que les amines peuvent être adjointes par leur groupe amine au groupe carboxyle terminal de la bradyki- nine. ta diazotation est effectuée de façon connue avec de l'acide nitreux sur le groupe amine aromatique de l'amino-acide ou de l'amine, ce groupe étant soit préalablement formé par réduction d'un groupe nitro, par exemple au moyen diacide zincique ou d'acide chlorhydrique, soit, dans le cas d'une diamine, déjà formé, cette diazotation s'accompagnant de la formation d'un sel diazonium qui réagit avec des composants dé la gamma-globuline ou de l'albumine susceptibles de copulation, avec formation d'un pont azoïque. En résumé, le procédé selon l'invention consiste à décomposez la bradykinine per un amino-acide diazotable ou une amine diazotable, ou à synthétiser un dérivé de bradykinine contenant un amino-acide diazotable ou une amine diazotable, à diazoter le drivé de bradykinine obtenu, de façon connue en soi, par traitement à l'acide nitreux et à le transformer en un sel diazonium que l'on décompose, à des valeurs de pH entre 8 et 9, avec de la gammaglobuline humaine ou de l'albumine humaine, ajoutée de préférence en excédent. L'addition d'un excès de gamme-globuline ou a 'albumine exclut qu'il y ait des résidus de composé azoïque non consommé dans le produit obtenu et n'est pas nuisihle,étant donné que la gemmaglobuline ne provoque pas de réactions hypersensibles, même en inhjection intramusculaire. La solution obtenue est lavée par dialyse en eau distillée puis dans du sérum physiologique, après ouoi elle est prête à 1' emploi, éventuellement après dilution. Exemples de préparation Exemple 1: Préparation de l'antigène de la bradykinine avec un amino -acide-: De façon connue, N-tert.-butyloxycarbonyle-L-p-nitro-phényl- alanine obtenue par aécomposition de L-p-nitro-phénylalanine avec du t ert ,-butyl-azidof ormat e fut déposé sur la résine de réaction chiorométhylée, le groupe protecteur tert.-butyloxycarbonyl fut séparé et le nonapeptide fut lié progressivement selon le procédé de Merrifield.Après séparation du décapeptide nitro-t-argy nyle-L-prolyle-L-prolyle-glycyle-L-phénylalanyle-L-séryle-L-prolyle-L-phénylalanyle-nitro-L-arginyle-p-nitro-L-phénylalanine, diazotation et copulation à la gamma-globuline, on obtint une ao- lution azoprotéique qui, dans du sérum physiologique, présenta un meximum d'ebsorption à 290 mm. Préparation de la p-nitro-L-phénylalanine: 50g de iphénylalanine furent dissous à 30-40 G dans 150m1 d'acide sulfurique an brassant, puis refroidis avec de l'eau glacée. 23g d'acide nitrique fumant (densité 1,51) furent ajoutés goutte à goutte avec refroidissement à la glace. On agita pendant 20mn à la température ambiante puis on déversa sur 240g de glace. L Le précipité fut filtré, dissous dans peu d'eau distillée, alcalisé et recristallisé hors de l'eau. Parfois la substance ne se sépara de la solution aqueuse acide qutaprès addition d'une solution d'ammoniaque. Rendement: 43g de p-nitro-t-phénylalanine; point d'écoule- ment 236 C (non corrigé). Préparation de la N-tert.-butyloxycarbonyle-p-nitro-L-phénylala nine: On brassa pendant 20 h 27,3g de p-nitro-L-phénylalanine à 40-45 C dans 450 ml de dioxane et 225 ml d'eau distillée, en pré- sence de 12 g d'oxyde de magnésium, avec. 45,4 g de tert.-butyl azidoformate. On filtra, on ajuste le filtrat à un pH de 5 à 6 dans un bain glacé, avec de l'acide citrique solide, puis le pro dudit de réaction fut séparé par de l'éthylester d'acide citrique. Après évaporation de l'ester la substance fut recristallisée à partir d'éthylester d'acide acétique/éther de pétrole (60 C). Rendement : 25g de N-tert.-butyloxycarbonyl-p-nitro-L-phénylala- nine, point d'écoulement 11300 (non corrigé). Synthèse de peptide (dérivé de bradykinine): On lia la N-tert.-butyloxycarbonyl-p-nitro-L-phénylalanine par un procédé connu, sous forme d'ester, à une résine de polystyrène chlorométhylée et, après séparation du reste tert.-butyloxycarbonyle (BOC) par HCl en acide acétique glacial, plusiears rinçages et libération- du groupe amine protoné par de la triéthylamine avec l'amino-acide 300 le plus proche, on la condensa avec la dicvclohexylcarbodiimide (DCC). Après élimination par levage des produits de réaction solubles, le reste de BOC fut séparé du peptide lié à la résine, après la première étape, et on répéta chaque étape intermédiaire pour allonger la chaîne peptide. On lia au polystyrène chlorométhylé, réticulé au divinyl benzène sot la P-nitro-L-phénylalanine, soit la nitro-t-arginine, en tant que composés 300, en faisant chauffer à reflux- pendant 48h ces comosés dans de l'méthanol absolu en présence de triéthylamine Âpr ès séparation du nitro-L-arg-L-pro-L-pro-gly-L-ser-L-pro-L -phe-nitro-L-arg-p-nitro-L-phe de la résine de réaction et hydrogénation catalytique il se forma la bradykinyl-p-anino-I-phényl- alanine que l'on épura aux échangeurs d'ions à l'aide de. la chromatographie en colonne. Rendement : 74% de la théorie. Diazotation et copulation à la gamma-globuline On dissout 80 mg de brad-p-amino-t-phe dans 1,5 ml de IN HCl et-on ajouta goutte h goutte, en refroidissant, 40 mg de NaNO2 dans 0,5 ml-d'eau distillée. La solution fut versée dans une solution de 300 mg de gammaglobuline dans 10 ml de tampon phosphate pH 8,6; on dyalisa la solution azoprotéique pendant 24 h en eau distillée puis 24 h en sérum physiologique. Maximum d'absorption 290 tmn. -Exemple 2: Préparation de l'antigène de la bradykinine à partir d'un dérivé de la bradykinine avec une diamine aromatique-: Le nonapeptide protégé, obtenu de façon connue selon Merri- field (R.B.Merrifield: J.Amer. Soc. 86, 304(1964)) ou BOissonnas ( R.A. Eoissonnas, St. Guttman et P.-t Jaquenoud: Helv. Chim. Acta. 43. 1349 ( 1960)):- fut, après séparation du groupe protecteur Z avec N-tert.-butyloxy carbonyl-L-p-nitro-phénylalanine, condensé par la dicycloheryl- carbodiimide (DCC) : le groupe protecteur fut séparé par traitement avec HBr en CF3COOH et par hydrog#nation : p-amino-phe-arg-pro-pro-gly-phe-ser-pro-phe-arg-OH Après diazotation de ce décapeptide on effectua la copulation à la gamma-globuline comme dans l'exemple 1. Exemple 3: Préparation de l'antigène de la bradykinine à partir d'un dérivé de la bradykinine avec une amine aromatique contenant un deuxième groupe fonctionnel (N02) s Le nonapeptide protégé, obtenu de façon connue selon Merrifield ou Boissonnas fut, après séparation du groupe protecteur X avec p-nitro-aniline, condensé par la dicyclohexylcarbodiimide (DCC) : Le groupe protecteur fut sépagé par treitement avec HCl et on hydrogéna cetelvtiquement les groupes nit0s qui se trouvèrent ainei partiellement séparés Après diazotation du nonapeptide substitué on effectua la copulation à la gamma-globuline comme dans l'exemple 1. Détermination des propriétés de l'antigène de la bradykinine préparés selon l'exemple 1, par des essais sur des animaux. Essai I: On sait que la bradykinine, trZs fortement vaso-active, conduit à l'augmentation de la perméabilité capillaire, et qu'après injection de solution bleue d'dans on voit apparaître, a l'en- droit de l'application de la bradykinine, une coloration intensé- ment bleue de la peau. tes cobayes furent immunisés 3 fois avec un intervalle de 3 joure entre deux injections successives, avec la solution d'antigème de la bradykinine. 12 jours après la dernière injectiou, on leur injecta, sous la neau abdominale presée, de la solution de bradykinine pure et, 10 mn plus tard, on leur injecta intracardialement de la solution bleue d'Evans. Au bout d'l heure on mesura la coloration bleue de la peau à l'endroit de l'inJection de bradykinine. Des cobayes servant de témoins ne furent pas immunisés et re çurent, comme les cobayes immunisés, tout d'abord de la solution de bradykinine dans la peau abdominale rasée puis,10 mn après, on leur injecta intracardialement de la solution bleue d'Evans. Résultate de l'essai Nombre de cobayes Intensité de la coloration bleue de la peau ++ +++ ++++ +++++ immunisés : 20 5 6 6 2 1 O non traités :30 l 2 3 7 9 8. (témoina) Essai 2: On sait que la bradykinine provoque, après injection intraveineusc ou intraoardiale, une broncho-constriction ou la dyspnée asthmatique chez le cobaye. Des cobayes furent immupisés avec des injection s sous-cutanées d'antigène de bradykinine en solution, 3fois avec un intervalle de 4 jours entredeux injections successives. Dix jours après la dernière injection on fit à chaque cobaye une injection intracardialede solution de bradykinine. On fit à des cobayes servant de ptémoins, et qui n'avaient pas été immunisés par l'antigène de la bradykinine, des injections intracardiales de bradykinine. Résultat de l'essai Intensitéde l'apparition Nombre de cobayes o + immunisés : 21 6 7 4 3 1 non traités : 20 1 1 6 7 5 (témoins) Essai W: L'effet immunisant de l'antigène de la bradykinine fut examiné sur des latins selon l'essai 1 (effet de la bradykinine qui accroît la perméabilité capillaire). On immunise les lanins avec la solution d'antigène de la bradykinine, le ler, le 5e et le 10e jour. Dix jours plus tard on leur injecta de la solution de bradykinine dans la peau abdominale renée, puis, 10 mn plus tard, de la solution bleue d'Evans dans la veine auriculaire. tes lapins servant de témoins ne furent pas immunisés. En même temps qu'aux animaux immunisés on leur fit d'abord une iniec- tion -intradermique- de solution de bradykinine, dans la peau abdominale rasée, puis, 10 mn plus tard, une injection de solution bleue d'Evans dans la veine auriculaire. Résultat de l'essai Intensité de la coloration bleue de lanêau Nombre de lapins . + ++ +++ +++ immunisés: 5 1 3 1 - - non traités : 5 - - - 3 1 l (témoins) On peut constater ce qui suit L'administration de l'azo-protéine de bradykinine selon l'invention conduit à un affaiblissement sensible de 11 effet d'augmentation de la perméabilité capillaire exercé par la substance bradykinine pure administrée queiaues jours après achèvement de l'im- munisation. L'administration de l'azo-protéine de bradykinine opère une atténuation sensible de 11 action broncho-sonstrictive de la bradykinine aaministrée ensuite. l'efficacité de ltazo-protdine de bradykinine réside selon toute vraisemblance dans via synthèse d'anticorps antibradykinine spécifiques dirigée contre la bradykinine et aui neutralisent celle-ci par voie immunochimique. REVENDICATIONS 1. Agent anti-inflammatoire, remarquable en ce qu'il contient de la bradykinine liée à de la gamma-globuline humaine ouà de 1' albumine humaine. 2. Agent selon la revendication 1, remarquable en ce que la bradykinine est liée à la gamma-globuline ou à l'albumine au moyen d'un corps intermédiaire qui forme une liaison par pont azoiaue avec la gamme-globuline ou l'albumine. 3. Agent selon la reveidication 2, remarouable en ce que le corps intermédiaire est un amino-acide, diazoté, de préférence aromatique. 4. Axent selon le revendication 2,-remarquable en ce que le corps intermdiaire est une amine diazotée, de préférence aromatique. 5. Agent selon la revendication 3, remarquable en ce que 1' amino-acide est préparé à partir de para-nitro-phénylalenine. 6. Procédé sde préparation d'un agent anti-inflammatoire selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, remarquable en ce qu'il consiste à décomposer la bradykinine par un amino-acide diazotable ou une amine diazotable, ou à synthétiser un dérivé de bradykinine contenant un amino-acide diazotable ou une amine diazotable, à diazoter le dérivé de bradykinine obtenu, de façon connue en soi, par traitement à l'acide nitreux et à le transformer en un sel diazonium que l'on décompose, à des valeurs de pH entre 8 et 9, avec de la gamma-globuline humaine ou de l'albumine-humaine, ajoutée de préférence en excédent.