Brevet FR2303552A1 — publié le 19761008

La présente invention, à la réalisation de laquelle ont participe Messieurs Jean FLORENT, Jcan LUNEL et Jacques RENAUT, concerne un nouveau dérivé du naphtacène de formule ses sels, sa préparation et les compositions qui le contiennent. Le produit de formule (I), qui sera désigné par le numéro 32.999 RP,présente un intéret tout particulier par suite de son activité anti tumorale. Le 32.999 RP est un composé basique de couleur rouge foncé formant des sels avec les acides. Le chlorhydrate du 32.999 RP est soluble à raison d'environ 100 mg/cm3 dans le méthanol, la pyridine le diméthylformamide et l'eau, environ 10 mg/cm3 dans le n.butanol saturé d'eau à 20 C, environ 5 mg/cm3 dans méthanol, et pratiquement insoluble (moins de O,i mg/cm3) dans l'acétone, le chloroforme, le chlorure de méthylene, l'acétate d'éthyle, le benzène, la méthylisobutylcétone, le dioxanne et l'hexane. Le chlorhydrate du 32.999 R? contient du carbone, de l'hydrogène, de l'oxygène, de l'azote et du chlore. Sa composition élémentaire est voisine de C % = 56,6 H % = 5,7 0 % = 29,41 N % = 2,39 C1 % = 6,0 Il est en outre caractérisé par les propriétés physico-chimiques suivantes : - aspect : poudre microcristalline, rouge orangé - point de fusion.: vers 2000c (avec décomposition) - pouvoir rotatoire : (déterminé en solution à 0,09 % dans méthanol à 0,1 % de HCl IN) [&alpha;]D20 = +208 #32 - spectre ultra-violet : détermination à partir d'une solution à 10,65 mg/l dans l'éthanol à 0,1 % de HCl IN. 1 % Maximum d'absorption à: E 233 nm 620 254 nm 495 292 nm 140 Ce spectre est représenté par la figure 1. - spectre visible : détermination à partir d'une solution à 10,65 mg/l dans méthanol à 0,1 % de HC1 UN. 1 % Maximum d'absorption à: E 493 nm 272 512 nm 189 527 nm - 190 Ce spectre est représenté par la figure 2. - spectre infra-rouge : (détermination à partir de comprimés en mélange avec KBr) Ce spectre est représenté par la figure 3 sur laquelle on a porté en abscisses, d'une part les longueurs ondes exprimées en microns (échelle supérieure) et d'autre part les nombres d'ondes en cm-1 (échelle inférieure) et en ordonnées les densités optiques. Dans le tableau I on indique les principales bandes d.'absorption infra-rouge pour ce produit exprimées en nombre d'ondes (cm ) 3410 F 2680 ép. 1580 ép. 1195 F 915 ép. 725 m 530 f 3250 ép. 2600 ép. 1510 ép. 1165 F 885 m 708 m 485 m 3220 ép. 1980 tf 1460 F 1115 F 875 m 695 ép. 475 ép. 3050 ép. 1930 ép. 1440 F 1062 F 845 ép. 665 ép. 465 f 2970 F 1900 tf 1405 F 1050 ép. 840 ép. 640 ép. 450 ép. 2930 F 1800 tf 1370 ép. 1030 ép. 820 F 625 ép. 438 m 2900 ép. 1735 ép. 1315 ép. 1010 F 810 ép. 600 m -415 tf 2860 ép. 1690 ép. 1285 F 985 F 780 m 580 f 390 2820 ép. 1635 ép. 1255 m 960 ép. 762 m 565 f 320 f 1600 tF 1235 F 930 m 750 m 540 f tF = très forte f = faible F = forte tf = très faible M = moyenne ép.= épaulement Le 32.999 RP peut etre caractérisé par chromatographie sur couche mince de gel de silice en utilisant comme solvant de développement le mélange chlorure de méthylène - acide formique - méthanol (80-17-3 en volume) à une température de 240C. Dans ce système le chlorhydrate du 32 999 RP a un Rf voisin. de 0,2. L'hydrolyse acide du 32.999 RP ou d'un de ses sels permet d'obtenir le produit de formule qui est l'aglycone du 32.999 RP. - L'aglycone du 32.999 RP est soluble à raison de 20 mg/cm3 dans la pyridine, 5 mg/cm3 dans le méthanol, le dioxanne, le chloroforme et le chlorure de méthylène et à moins de 0,1 mg/cm3 dans l'acétone, l'acétate d'éthyle, l'hexane et l'eau. Ce produit présente en outre les propriétés physico-chimiques suivantes : - aspect : poudre microcristalline rouge orangé - point de fusion : vers 1850C (avec décomposition) - analyse élémentaire : elle est voisine de : C % = 61,57 H 7. = 5,31 0 % = 30,16 - pouvoir rotatoire : (déterminé en solution à 0, 1 % dans le dioxanne) [&alpha;]D20 = + 249 #32 - spectre ultra-violet : détermination à partir de solutions à 50 et 5 mg/l dans méthanol à 0,1 % de HCl IN 1 % Maximum d'absorption à: E 1 cm 234 nm 770 254 nm 640 293 nm 190 Ce spectre est représenté par la figure 4 sur laquelle les courbes I et II correspondent respectivement à des solutions à 50 et 5 mg/l. spectre visible : déterminé à partir d'une solution à 10 mg/l dans l'éthanol à 0,1 % de HCl 1N 1 % Maximum d'absorption à: E 493 nm 370 515 nm 255 528 nm 270 Ce spectre est représenté par la figure 5. - spectre infra-rouge: (détermination à partir de comprimés en mélange avec KBr) Ce spectre est représenté par la figure 6 sur laquelle on a porté en abscisses, d'une part les longueurs d'ondes exprimées en microns (échelle supérieure) et, d'autre part, les nombres d'ondes exprimés en cm-1 1 (échelle inférieure) et en ordonnées les densités optiques. Dans le tableau II on indique les principales bandes d'absorption infra-rouge pour ce produit exprimées en nombres d'ondes (cm-1). 3500 ép. 2680 ép. 1412 F 1095 f 910 m 740 m 530 tf 3420 F 1980 tf 1370 F 1070 ép. 885 m 710 m 505 ép. 3360 ép. 1705 f 1345 ép. 1062 F 875 m 700 ép. 485 m 3080 ép. 1640 ép. 1285 tF 1050 ép. 865 f 680 tf 465 2975 m 1600 tF 1255 tF 1030 m 840 m 665 tf 450 2925 m 1580 ép. 1240 ép. 1020 m 815 F 625 ép. 435 m 2910 ép. 1540 ép. 1196 F 1005 m 805 ép. 595 f 385 tf 2890 ép. 1458 F 1165 F 975 m 785 ép. 585 f 360 tf 2860 ep. 1448 F 1130 m 950 m 775 ép. 570 f 320 tf 925 m 765 m 545 f tF = très forte F = forte m = moyenne f = faible tf = très faible ép. = épaulement L'aglycone du 32.999 RP peut être caractérisé par chromatographie sur couche mince de gel de silice en utilisant comme solvant de développemellt le mélange chlorure de méthylène - acide formique - méthanol (80-17-3 en volume) à une température de 240C. Dans ce système l'aglycone a un Rf voisin de 0,7. L'aglycone du 32.999 RP constitue un autre objet de la présente invention. Selon la présente invention,'le 32.999 RP peut être obtenu par réduction microbiologique de l'antibiotique 30.449 RP. L'antibiotique 30.449 RP, qui répond à la formule peut etre obtenu à partir des milieux de culture appropriés d'un microorganisme appartenant au genre streptomycète et désigné par l'appelation Streptomyces calamistratus DS 14.135 (NRRL 8059). La réduction microbiologique de l'antibiotique 30.449 RP s'effectue généralement en milieu aqueux au moyen soit de cultures de microorganismes arrivées à un stade convenable de développement, soit de cellules isolées de ces cultures, soit des extraits enzymatiques obtenus à partir de ces microorganismes. Les microorganismes qui peuvent être utilisés selon le procédé de la présente invention peuvent appartenir à la catégorie des streptomycètes ou des bactéries. Parmi les microorganismes qui conviennent particulièrement bien peuvent être cités Streptomyces lavendulae (ATCC 8664), Streptomyces roseochromogenes (ATCC 13.400), Corynebacterium simplex (ATCC 6946) ou. Bacterium cyclooxydans (ATCC 12.673). Les meilleursrésultats sont obtenus à partir de Corynebacterium simplex (ATCC 6946). La culture du microorganisme produisant le système enzymatique capable de réduire l'antibiotique 30.449 RP en 32.999 RP peut être effectuée par toute méthode de culture aérobie en surface ou en profondeur mais cette derniere est à préférer pour des raisons de commodité. On utilise à cette fin les techniques d'ensemencement et de fermentation et les différents types d'appareils qui sont d'un usage courant dans l'industrie des fermentations. Le milieu de culture du microorganisme doit contenir essentiellement des sources de carbone et d'azote assimilables, des éléments minéraux et des facteurs de croissance, tous ces éléments pouvant etre apportés sous forme de produits bien d finis ou par des mélanges complexes tels qu'on en rencontre dans des produits bioïogiqt\es d'origines diverses. Comme sources de carbone assimilable on peut utiliser des hydrates de carbone tels que glucose ou d'autres substances hydrocarbonées comme des sucres alcools ou comme certains acides organiques. Certaines huiles animales ou végétales comme lthuile de lard ou lthuile de soja peuvent avantageusement remplacer ces sources hydrocarbonées ou leur être adjointes. Les sources d'azote assimilable sont extrêmement varlets. Elles peuvent être des substances chimiques très simples comme les sels minéraux ou organiques d'ammonium, l'urée, certains acides aminés. Elles peuvent être aussi apportées par des substances complexes contenant principalement l'azote sous forme protidique : caséine, lactalbumine, gluten et leurs hydrolysats, farines de soja, d'arachi-de, de de poissons, peptone, extraits de viande, de levure, distillers' solubles, corn-steep. Parmi les éléments minéraux ajoutés, certains peuvent avoir un effet tampon ou neutralisant comme les phosphates alcalins ou alcalino-terreux. D'autres apportent l'équilibre ionique nécessaire au développement du microorganisme comme les chlorures et les sulfates de métaux alcalins ou alcalinoterreux. Les facteurs de croissance.sont des produits de nature vitaminique, tels que la riboflavine, l'acide folique, l'acide pantothénique. Le pH du milieu de fermentation au début de la culture doit être compris entre 6,0 et'7,8 et de préférence entre 6,5 et 7,5. La température optimale pour la culture du microorganisme est 29-310C mais un développement satisfaisant est obtenu à des températures comprises entre 26 et370C. L'aération. du milieu de culture peut varier entre des valeurs assez larges. On a cependant trouvé que des aérations de 0,3 à 3 litres d'air par litre de bouillon et par minute conviennent particulièrement bien. De plus, pour obtenir une culture possédant une bonne activité rédùc-.-- trice, il est préférable d'agiter le milieu de culture par exemple au moyen d'un agitateur dont la vitesse de rotation peut varier entre 100 et 250 tours/minute. Géné-ralement la culture du microorganisme atteint un degré de développement satisfaisant après une période de 24 à 48 heures. L'activité réductrice dépend essentiellement de la quantité de cellules formées au cours de la culture. Avec des cellules isolées, par exemple après centrifugation du milieu de culture, la quantité de 32.999 RP forme à partir de l'antibiotiquc 30 449 RP est en relation directe avec la co > centra- tion en cellules du milieu réactionnel ; les milieux riches en cellules possèdent un pouvoir réducteur supérieur. La réduction de l'antibiotique 30.449 RP en 32.999 RP s'effectue en mettant en contact une solution aqueuse de l'antibiotique 30.449 RP ou d'un de ses sels avec la culture du microorganisme ayant atteint un degré de développement et un pouvoir réducteur suffisants, ou avec les cellules isolées de ces cultures, ou avec des extraits enzymatiques obtenus à partir de ces cellules. Les extraits enzymatiques des cellules peuvent être obtenus après destruction des parois cellulaires soit par des méthodes chimiques ou biochimiques soit par des méthodes physiques. De préférence, la destruction des parois cellulaires est effectuée à partir de la culture du microorganisme ou des cellules isolées de cette culture en suspension en milieu aqueux soit en les traitant par une enzyme capable de lyser la paroi cellulaire, telle que le lysozyme, soit en les soumettant à l'action des ultra-sons. Les extraits enzy matiques sont en solution dans le liquide surnageant qui est obtenu après centrifugation du milieu. Généralement la solution des extraits enzymatiques est utilisée sans autre traitement ultérieur dans la phase de réduction. Généralement la réduction s'effectue en milieu agité à une température comprise entre 23 et 37 C, de préférence entre 26 et 30 C et elle est complète après 1 à 4 jours de contact. La réduction peut avoir lieu à un pH compris entre 5 et 10 mais il est préférable d'opérer à un pH compris entre 7 et 8. Le milieu réactionnel peut être agité, par exemple par un agitateur dont la vitesse de rotation peut varier- entre 100. et 250 tours/minute. La réduction peut être effectuée soit sur l'antibiotique 30.449 RP ou l'un de ses sels purs, soit sur un produit impur, soit sur le filtrat acide d'une culture ayant produit del1antibiotique 30,449 RP. Pour obtenir de bons rendements, la concentration de l'antibiotique 30.449 RP, dans le milieu réducteur est avantageusement comprise entre 0,1 et 1 g/l au début de la réduction. Le 32.999 RP peut'être séparé du milieu de réduction selon les méthodes habituelles d'isolement des antibiotiques appartenant à cette famille. Par exempte le 32.999 RP peut être extrait du milieu de réduction à un pH voisin de 9 au moyen d'un solvant organique tel que le chloroforme, le chlorure de méthylene, le n.butanol ou un mélange de ces solvant Le 32.999 RP peut cotre isolé des extraits organiques, après lavages et extractions successifs, par précipitation après concentration des extraits sots un faible volume ou par addition dTun solvant miscible dans lequel le 32.999 r9 est pratiquement insoluble, tel que l'hexane, après transformation éventuelle de l'antibiotique en un sel d'addition avec un acide tel que le chlorhydrate. Le 32.999 RP peut être éventuellement purifié par les diverses - opérations classiques de purification telles que la cristallisation ou la chromatographie. Le 32.999 RP et ses sels se sont montrés particulièrement actifs sur les tumeurs greffables de la souris à des doses comprises entre 0, 125 et 0,250 mgZkg i.p. sur la leucémie L 1210, la leucémie P 388 et la leucosarcomaltose. - toxicité du chlorhydrate de 32.999 RP a été étudiée principalement chez la souris. Sa dose létale 50 7. (DL50) a été déterminée (traitement pendant 4 jours consécutifs) par voie intra-péritonéale et elle est voisine de 0,4 mg/kg. Les exemples suivants, donnés à titre non' limitatif, montrent comment l'invention peut être mise en pratique. Dans ce qui suit a) l'identification du 32.999 RP est effectuée par chromatographie sur couche mince de gel de'silice en comparant les Rf des produits obtenus à celui de ltantibiotique 30.449 RP ou du 32.999 RP dans le même système de solvant, b) la production du 32.999 RP est déterminée à partir des chromatogrammes sur couche mince, soit d'après les intensités comparées des taches correspon dantes de l'extrait et de-celle du 32.999 RP pur pris comme référence, soit par comparaison des surfaces des pics enregistrés au lecteur de plaque "Chromoscan" soit enfin en dosant colorimétriquement le 32.999 RP élué du support chromatographique au niveau de la tache du produit recherché. Exemple 1 On prépare un milieu de culture A dont la composition en g/l est la suivante Autolysat de levure de brasserie en poudre ... 15 Phosphate monopotassiqué ... 2,5 Phosphate dipotassique ... 2,5 Glucose anhydre ... 15 Une solution des 3 premiers constituants dans 1000 cm3 d'eau distillée est ajustée à pH 6,9 par addition de soude normale et est répartie en fioles dc 300 cm3 à raison de 50 cm3 par fiole. Ces fioles sont stérilises à 1220C pendant 20 minutes puis refroidies. On complète le milieu en ajoutant stérilement dans chaque fiole 1,5 cm3 d'une solution stérile de glucose à 500 g/l. Ix pH du milieu est alors de 7,05. On ensemence 80 de ces fioles en ajoutant dans chaque fiole 2,5cm3 d'une culture inoculum de la souche Corynebacterium simplex (ATCC 6946). La culture est développée sur table agitée à 220.tr/mn dans une enceinte à 30 CC. Après 48 heures la culture est bien développée et son pH est de 7,70. On ajoute alors une solution aqueuse à-10.mg/cm3 de chlorhydrate de 30.449 RP à raison de 2,5 cm3 par fiole. La phase de réduction est poursuivie sur table agitée à 220 tr/mn dans une enceinte à 260C. Après 48 heures la réductionest terminée et le pH de la culture est de 8,5. Le contenu des 80 fioles est réuni. On prélève de fanon homogène 50 cm3 de la culture qui est traitée par 25 cm3 d'un tampon borate de fanon à amener le pH à 9,0. On extrait alors par 2 fois 50 cm3 d'un mélange chlorure de méthylène - butanol normal (70-30 en volume). Les extraits organiques.sont séchés- sur sulfate de sodium anhydre. La production de 32.999 RP est déterminée par chromatographie des extraits organiques sur couche mince de silicagel. Les volumes d'extraits déposés sont de 10 à 20 A1. Les plaques sont développées avec le mélange suivant chlorure de méthylène - acide formique - méthanol (80-17-3 en volume) afin d'obtenir une bonne séparation de lrantibiotique 30.449 RP et du 32.999 RP. Les Ff des produits obtenus sont comparés à ceux des produits de référence chromatographiés dans les mêmes conditions L'évaluation quantitative de la production de 32.999 RP montre que la culture de Corynebacterium simplex (ATCC 6946) réduit le 30.449 RP en 32.999 RP avec un rendement de 80 % sur le 30.449 RP mis en oeuvre. Exemple 2 On prépare et on répartit en fioles de 300 cm3 un milieu de culture A préparé comme dans l'exemple 1. On prépare et on répartit également en fioles de 300 cm3 un milieu de culture B dont la composition est la suivante Peptone ... 10 g Extrait de viande ... 5 g Glucose - ... 10 g - eau distilée q.s.p. ... 1000 cm3 Le ph est aju:,Lé à 7,2 par addition de soude normale milieu est stérilisé à 122 C pendant 20 minutes. On ensemence une fiole contenant 50 cm3 de milieu A dont le pil e de 7,05 et une fiole contenant 50 cm3 de milieu B dont le pli est de 5,5 avec, par fiole, 2,5 cm3 d'une culture inoculum de la souche Corynebacterium simplex (ATCC 6946). Les cultures sont développées sur une table agitée à 220 tr/mn dans une enceinte à 300C. Après un temps de culture approprié (48 heures pour le milieu A et. 72 heures pour le milieu Bj, une solution aqueuse à 10 mg/cm3 de chlorhydrate de 30.449 RP est alors ajoutée' à raison de 2,5 cm3 par fiole pour obtenir une concentration de 0,5 gil de 30.449 RP. Après ces additions les cultures A et B sont incubées pendant 2 et 4 jours, respectivement, sur une table agitée à 220 tr/mn dans une enceinte à 26 C. Les fioles sont traitées dans les conditions décrites à l'exemple 1. Les rendements en 32.999 RP, par-rapport au 30.449 RP mis en jeu, sont les suivants Milieu Rendement A 80 % B 60% Exemple 3 On prépare en:fiole de 300 cm3 dans les conditions décrites à ltexemple 1 des cultures sur le milieu A de la souche Corynebacterium simplex (ATCC 6946). Les cultures sont développées sur.une.table agitée à 220 trlmn dans une enceinte à 30 C. Après 30. heures d'incubation, 5 fioles sont réunies (250 cm3 de moût) et les cellules présentes sont récoltées par centrifugation. La récolte cellulaire dans sa totalité est ensuite remise è suspension dans une fiole de 300 cm3 contenant 50 cm3 d'un tampon phosphate M/15 à pH 8,0. On prépare également de la même manière une autre suspension cellulaire en utilisant pour la reprise des cellules, 50 cm3 d'un tampon phosphate M/15 à pH 5,0. On ajoute ensuite dans chaque fiole 2,5 cm3 d'une solution aqueuse à 4 mg/cm3 de chlorhydrate de 30.449 RP pour obtenir une concentration de 0,2 g/l de 30.449 RP. Les fioles sont mises à incuber pendant 48 heures dans les conditions décrites à l'exemple 1 et sont traitées comme dans ltexemple 1. Les rendements en antibiotique 32.999 RP par rapport au 30.449 RP mis en jeu, sont les suivants pH Rendement 8,0 90 % 5,0 60 7. Exemple 4 On prépare et on répartit en fioles de 300 cm3 un milieu de culture A dont le pH est 6,8 et qui est préparé comme décrit à l'exemple 1, à raison de 50 cm3 pàr fiole. On ensemence plusieurs fioles dont le pH est de 6,8 en ajoutant dans chacune d'elles 2,5 cm3 d'une culture incoculum de la souche Bacillus -cYclooxydans (ATCC 12.673). La culture est développée pendant 48 heures sur une table agitée à 220 tr/mn dans une enceinte à 30 C. La réduction du 30.449 RP est effectuée en utilisant -soit la culture entière dont le pH est de 7,65 - soit une suspension cellulaire dans un tampon de- pH 8,0 préparée dans les conditions décrites à l'exemple 3. On ajoute dans chaque fiole 1 cm3 d'une solution aqueuse à 10 mglcm3 de 30.449 RP pour obtenir une concentration de 0,2 g/l. La phase de réduction est poursuivie durant 4 jours sur une table agitée à 220 tr/mn dans une enceinte à 260C. Les fioles sont traitées.dans les conditions décrites à l'exemple 1. Les rendements en 32.999 RP par rapport au 30.449 RP mis en jeu sont les suivants milieu réducteur Rendement Culture entière - 94 X Cellules isolées ~ 75 X Exemple 5 On prépare dans les conditions décrites à ltexemple 4 des cultures sur le milieu A de la souche Bacillus cyclooxydans (ATCC 12.673).Aux cultures entières incubées pendant 48 heures et dont le pH est de 7,65, on ajoute le 30.449 RP sous forme a) d'une solution aqueuse à 10 mg/cm3 du produit pur, a raison de 1 cm3 par fiole (0,2 g/L de 30.449 RP) b) d'une solution aqueuse à 10 mg/cm3 d'un produit brut qui renferme 10 % de 30.449 RP, à raison de 4 cm3 par fiole (0,13 g/l de 30.449 RP). Les fioles sont ensuite incubées pendant 4 jours. dans les conditions décrites .s l'exemple 1 et traitées de la même manière. Les rendements en 32.999 RP, par rapport au 30.449 YçP mis en jeu sont les suivants Produit Rendement 30.449 RPpur 94 % 30.449R?brut 92 % Exemple 6 On prépare un milieu de culture C dont la composition en g/l est la suivante :: Farine de soja ... 30 Huile de soja (d = 0,92) ... 4,6 Phosphate monopotassique ... 1 Carbonate de calcium ... 2,5 Glucose anhydre ... 50 Les constituants du.milieu à l'exception du glucose sont dissous ou mis en suspension dans 900 cm3 d'eau distillée. La préparation, ajustée à un pH de 7,20 par'addition de soude N, est répartie en fioles de 300 cm3 à raison de 45 cm3 par- fiole. Ces fioles sont stérilisées à 122 C pendant 20 minutes et refroidies. On complète le milieu en ajoutant stérilement dans chaque fiole 5 cm3 d'une solution stérile de glucose à 500 gll. Le pH du milieu prêt pour l'ensemencement est de 7,0. On ensemence une fiole de 300 cm3 contenant 50 cm3 du milieu précédent dont le pH est de 7,0 avec 2,5 cm3 d'une culture inoculum de la souche Streptomyces roseochromogenes (ATCC 13.400). La culture est développée pendant 48 heures sur une table agitée à 220 tr/mn dans une enceinte à 30 C. On récolte alors les cellules produites par cette culture. La réduction du 30.449 RP en antibiotique 32.999 RP est effectuée en utilisant une suspension des cellules dans 50 cm3 d'un tampon phosphate M/15 à pH 8,0 contenant 1 cm3 d'une solution aqueuse à 10 mg/cm3 de chlorhydrate de 30.449 RP pour obtenir une concentration de 0,2 gjl. La phase de réduction est poursuivie pendant 48 heures sur une table agitée à 220 tr/mn dans une enceinte à 260C.La suspension cellulaire est traitée dans les conditions décrites à l'exemple 1. Le rendement en 32.999 RP par rapport au 30.449 RP mis en jeu est de 57 % Exemple 7 On prépare et on répartit en fioles de 300 cm3 un milieu de culture C préparé dans les conditions décrites à l'exemple 6. On ensemence des fioles contenant 50 cm3 de ce milieu, dorut le pH est de 6,90, avec 2,5 cm3 d'une culture inoculum de la souche Streptomyces lavendulae (ATCC t3664). La culture est développée pendant 40 heures sur table agitée à 220 tr/mn dans une enceinte à 26 C. On ajoute alors dans claque fiole contenant la culture entière, dont le pH est de 7,50, 1 cm3 d'une solution aqueuse à 10 mg/cm3 de chlorhydrate de 30.449 RP pour. obtenir une concentration de 0,2 g/l. La phase de réduction est poursuivie pendant 4 jours dans les mêmes conditions d'agitation et de température. Les fioles sont traitées dans les conditions décrites à l'exemple 1.Le rendement en 32.999 RP, par rapport au 30.449 RP mis en jeu,. est de 61 % Exemple 8 A - Fermentation On charge dans unfarmenteur de 170-litres Peptone ... 600 g Extrait de viande ... 600 g Extrait de levure ... 600 g Glucose monohydraté ... 600 g Eau de ville q.s.p. ... 110 litres Après avoir ajusté le pH à 6,8 avec 40 cm3 de soude 10 N on ajoute Cabonate de calcium ... 300 g Le pH du milieu est alors voisin de 6,8; on stérilise le milieu par barbotage de vapeur à 1220C pendant 40 minutes ; après refroidissement, du fait de la condensation de vapeur au cours de la stérilisation, le volume de bouillon est de 120 litres et lé pH de 8,3. Le pH est ajusté à 7,0 par addition de 90 cm3 d'acide chlorhydrique 12 N. On ensemence avec 290 cm3 d'une culture inoculum en fiole erlenmeyer agitée de la souche Corynebacterium simplex (ATCC 6946). La culture est développée à 30 C pendant 32 heures en agitant et en aérant avec de l'air. stérile ; elle est alors convenable pour l'ensemencement de la culture productrice. La culture productrice est effectuée dans un fermenteur de 800 litres chargé avec les substances suivantes: Autolysat de levure de brasserie en poudre ... 6 kg Phosphate monopotassique ... 1 kg Phosphate dipotassique ... 1 kg Eau de ville q.s.p. ... 355 litres Après avoir ajusté le pH à 7,0 par addition de 460 cm3 de soude 10 N, on stérilise le milieu par barbotage de vapeur à 1220C pendant 41 minutes. Après refroidissement, du fait de la condensation de vapeur au cours de la stéri- lisation, le volume du bouillon est de 385 litres; il est complété à 400 litre par addition de 15 litres d'une solution aqueuse stérile contenant: Glucose monohydraté ... 6 kg Le pH du milieu est de 6,8; On ensemence avec 40 litres de la culture inoculum en fermenteur de 170 litres décrite ci-dessus. La culture est développe à 30 C en agitant avec une turbine tournant à 160 tr/mn et en aérant avec un volume d'air stérile de 20 m3/h. Après 30 heures, la culture est convenable pour effectuer la transformation biochimique de l'antibiotique 30.449 RP en-32.999 RP. On introduit dans la culture 4 litres d'une solution aqueuse. conte-- nant Chlorhydrate de 30.449 RP ... 40 Lez g L'incubation est poursuivie pendant 17 heures à 26 C, en agitant et en aérant dans les conditions décrites ci-dessus. L'antibiotique 30.449 RP est réduit en 32.999 RP avec un rendement voisin de 100 % B - Extraction A 420 litres de moût obtenu comme décrit à ltexemple -8 A, on ajoute 42 litres de n.butanol et 2,9 litres de souae 6 N. Le principe actif est extrait à contre-courant par du n.butanol (60 % en volume) sur deux.centrifugeuses. L'extrait, dont le volume est de 330 litres, est concentré sous pression réduite (5 à 10 mm de mercure) à 40 C jusqu'à un volume de 20 litres. A l'extrait concentré on ajoute 20 litres de chlorure de méthylène et on lave ce mélange par 10 litres d'eau amenés à pH 10 par addition de soude. L'eau de lavage, qui contient du 32.999 RP, est extraite 2 fois par 10 litres du mélange chlorure de méthylène - n.butanol (80-20 en volume). Les trois extraits organiques.sont réunis puis concentrés sous pression réduite (5 à 10 mm de mercure) jusqu'à un volume de 15 litres. On ajoute alors en agitant 0,2 litre du mélange n.butanol - acide chlorhydrique il N (90-10 en volume) puis on.concentre sous pression réduite (5 à 10 mm de mercure) jusqu'à un volume de 5 litres. L'antibiotique 32.999 RP sous.forme de chlorhydrate est précipité par addition du concentrat dans 35 litres d'hexane. Le précipité est essoré, lavé et séché. On obtient ainsi 52 g de chlorhydrate brut de 32.999 RP. C - Purification a) A une suspension de 50 g de chlorhydrate brut de 32.999 RP, obtenu comme indiqué à l'exemple 8 B, dans 130 cm3 d'eau, on ajoute 520 cm3 de dioxanne. La solution obtenue est filtrée. Le chlorhydrate de 32.999 RP est cristallisé par addition de 4 litres de dioxanne, à uc température voisine de 200C dans le filtrat. Les cristaux sont essorés, lavés par du dioxanne et séchés. On obtient ainsi 27 g de chlorhydrate de 32.999 RP semi purifié. b) 4,2 g de chlorhydrate brut obtenus comme à l'exemple 8 B sont mis en solution dans 0,2 litre d'eau. Le pH est ajusté à 4,5 par addition de soude N 10. L'antibiotique contenu dans cette solution est fixé sur une colonne contenant 0,4 litre d'Amberlite IRC 50 sous forme acide. La colonne estlavée par I litre d'eau, 2 litres de méthanol aqueux à 50 7 , 2 litres de méthanol aqueux à 90 7 et enfin par 3 litres de méthanol aqueux à 90 % contenant 1 % de chlorure de sodium. L'éluat est concentré sous pression réduite (5 à 10 mm de mercure 40 C jusqu'à un volume de 0,5 litre. Le concentrat, dont le pH est ajusté à 10 par addition de soude 11 N, est extrait par 2 fois 0,5 litre de chloroforme et- 2 fois 0,5 litre du mélange chloroforme - n.butanol (80-20 en volume).Les extraits organiques réunis sont concentrés sous pression réduite (5 à 10 mm de mercure) à 40 C. Pendant la concentration on ajoute 10 cm3 de n.butanol contenant 1 7. (en volume) d'acide chlorhydrique 11 N et 5 : (en volume) d'eau. Le concentrat, dont le volume est amené à 30 cm3, est ajouté lentement à 500 cm3 d'hexane. Le précipité obtenu est essoré, lavé et séché. On obtient ainsi 1,26 g de chlorhydrate de 32.999 RP semi-purifié. Le produit semi-purifié (27 g) obtenu selon a) est mis en solution dans 300 cm3 dieau. La solution obtenue est filtrée. Le chlorhydrate de 32.999 RP est cristallisé par addition dans le filtrat de 2,7 litres d'acétone, à une température voisine de 20 C. Les cristaux sont essorés, lavés et séchés. On obtient ainsi 17 g de chlorhydrate de 32.999-RP pur. Exemple 9 On centrifuge stérilement à une température voisine de OOC, 50 cm3 dune culture de Corynebacterium simplex (ATCC 6946) développée pendant 30 heures dans les conditions décrites dans l'exemple 8 A. Après centrifugation les cellules sont remises en suspension dans 50 cm3 de tampon phosphate M/15 à pH 7,5. Les cellules sont alors soumises à l'action des ultra-sons (25 kHz) pendant 15 minutes à une température voisine de OOC. Après centrifugation on ajoute au liquide surnageant 10 mg de chlorhydrate de 30.449 RP. La solution ainsi obtenue est mise Xi incuber dans les conditions décrites dans l'exemple 1. Après 40 heures, Itantîbiotique 30.449 RP est réduit en 32.999 RP avec un rendement voisin de 60 e/o s Exemple 10 On centrifuge stérilement à une température voisine de 0 C 50 cm3 d'une culture. de Corynebacterium simplex (ATCC 6946).développée pendant 30 heures dans les conditions qui sont décrites dans l'exemple 8 A.Après centrifugation, les cellules sont remises en. suspension dans 50 cm3 de tampon tris(hydroxyméthyl) aminométhane/HCl M/Sa' pH 8,1 et transférées dans une fiole erlenmeyer de 300 cm3 ; on ajoute alors 25 mg de EDTA (acide éthylène diamine tétraacétique), 25 mg de CTAB (bromure de cétyltriméthylammonium) et 200 mg de lysozyme, puis la fiole est placée à 370C pendant 1 heure, sur une table tournant à 220 trhnn. Après centrifugation, on ajoute au liquide surnageant 5 mg de chlorhydrate de 30*449 RP. La solution ainsi obtenue est mise à incuber dans les conditions qui sont. décrites dans l'exemple t. Après 40 heures, l'antibiotique 30.449 RP est réduit. en 32.999 RP avec un rendement voisin de 30 7. Exemple 11 0,5 g de chlorhydrate de 32.999 RP pur sont hydrolysés par mise en solution. dans 50 cm3 d'eau additionnée de 10 cm3 d'acide chlorhydrique 1I N et chauffage à l'ébullition pendant 2 heures. Un précipité cristallin d'aglycone se forme en cours d'hydrolyse. Le précipité est essoré, lavé et séché. On obtient ainsi 0,3 g d'aglycone pur. La présente invention comprend également les compositions médicinales contenant au moins le 32.999 RP sous forme de base libre ou de sel d'addition avec un acide, en association avec tout autre produit. Ces compositions peuvent etre présentées sous toute forme appropriée à la voie d'administration prévue. La voie parentérale est la voie d'administration préférentielle, notamment la voie intra-veineuse. Les compositions selon l'invention pour administration parentérale peuvent e"tre des solutions stériles aqueuses ou non aqueuses, des suspensions ou des émulsions. Comme solvant ou véhicule, on peut employer le propylèneglycol, le polyéthylène-glycol, les huiles végétales, en particulier l'huile d'olive, et les esters organiques injectables par exemple l'oléate d'éthyle. Ces compositions peuvent également contenir des adjuvants en particulier des agents mouillants, émulsifiants et dispersants. La stérilisation peut se faire de plusieurs façons, par exemple à l'aide d'un filtre bacteriologiquc, en incorporaIt à la composition des agents stérilisants, par irradiation Oc par chauffage. Elles peuvent également cotre prépares sous forme de compositions solides stériles qui peuvent être dissoutes ou dispersÉs au moment de l'emploi dans de l'eau stérile ou tout autre milieu stérile injectable. Le 32.999 RP et ses sels sont actifs contre les tucurs solides et liquides et plus particulièrement utilisés dans le traitement des cancers humains à des doses journalières généralement comprises entre O, 1 et 2 mg/kg par voie intraveineuse pour un adulte. L'exemple suivant illustre une composition selon l-'invention Exemple 12 On prépare une solution contenant 10 mg/cm3 de matière active en dissolvant 1,07 g de chlorhydrate de 32.999 RP dans 100 cm3 de soluté physiologique apyrogène. La solution obtenue est-répartie aseptiquement en ampoules de 2 cm3, à raison de 1 cm3 par ampoule. Les ampoules sont scellées et contiennent chacune 10 mg de principe actif. R E V E N D I C A T I O.N S 1. Nouvelle substance antitumorale basique caracterisée en ce que - son chlorhydrate est une poudre microcristalline rouge orangé soluble à raison d'environ 100 mg/cm3 dans le méthanol, la pyridine, le diméthyl- formamide et leau, 10 mg/cm3 dans le butanol saturé dieau à 20 C, 5 mg/cm3 dans l'éthanol et moins de 0,1 mg/cm3 dans l'acétone, le chloro forme, le chlorure de méthylène, l'acétate d'éthyle, le benzène, le méthyl isobutylcétone, le dioxanne et l'hexane - sa composition élémentaire est voisine de C % = 56,6 H % = 5,7 0 % = 29,41 N % = 2,39 Cl % = 6,0 - son pouvoir rotatoire déterminé en solution à 0,09 % dans méthanol à 0,1 % de-HCl 1 N est [&alpha;;]D20 = + 208 #32 - son spectre ultra-violet et son spectre visible déterminé à partir d'une solution à 10,65 mg/l dans méthanol à 0,1 % de HCl 1 N présente des maxima d'absorption à 233 nm, 254 nm, 292 nmj 493 nm, 512 nm et 527 nm - son spectre infra-rouge présente des bandes d'absorption à 3410, 3250, 3220, 3050, 2970, 2930, 2900, 2860, 2820, 2680, 2600, 1980?, 1930, 1900, 1800, 1735, 1690, 1635, 1600, 1580,-1510, 1460, 1440, 1405, 1370, 1315, 1285, 1255, 1235, 1195, 1165, 1115, 1062, 1050, 1030, 1010, 985, 960,. 930, 915, 885, 875, 845, 840, 820, 810, 780, 762, 750, 725, 708, 695, 665, 640, 625, 600, 580, 565, 540, 530, 485, 475, 465, 450, 438, 415, 390 et 320 cm - en chromatographie ascendante sur couche mince de gel de silice avec comme solvant de développement le mélange chlorure de méthylène - acide formique méthanol (80-17-3 en.volume),.il a un Rf de.O,2 - il est actif sur la leucémie L 1210,- la leucémie P 388 et la leucosarco matose à des doses comprises entre 0,125 et 0,250 mgZkg i.p. chez la souris, la dite substance étant prise sous forme de base libre ou de sel d'addition avec un acide. 2. Le produit selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il répond à la formule sous forme de. base libre ou de sel d'addition avec un acide. 3. Le chlorhydrate du produit selon l'une des revendication 1 ou 2. 4. Un procédé de préparation d'un produit selon les revendications 1, 2 ou 3 caractérisé en ce que l'on réduit par voie microbiologique l'antibiotique 30.449 SP de formule O OH CO -CH3 K -OH i 1, 1' II- I' J HO O OH 0 - CH - CH2 - CH - CH - CH - CH3 -I ou L'un bye. sués sels. NH2- OH 5. Procédé selon. la revendication 4 caractérisé en ce que la réduction est effectuee au moyen d'une culture d'un microorganisme choisi parmi Strepto myces lavendulae (ATCC 8664), Streptomyces roseochromogenes (ATCC 13.400), Corynebacterium simplex (ATCC 6946) ou Bacterium cyclooxydans (ATCC 12.673), ou des cellules isolées de cette culture ou des extraits enzymatiques obtenus à partir de cellules de ces microorganismes. 6. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient comme produit actif le produit selon l'une des-revendications 1, 2 ou 3 en asso- ciation avec un produit compatible inerte ou pharmaceutiquement actif..