Brevet FR2312964A1 — publié le 19761231

La présente invention concerne un procédé d'obtention d'une préparation enzymatique lacto-coagulante utilisée en tant que produit de substitution de la rennine - préparation enzymatique d'origine animale, dans la production de fromages ainsi que d'autres produits laitiers - fromage frais, fromage blanc en pâte molle, caséine. On connait déjà des procédés d'obtention d'une préparation enzymatique lacto-coagulante à partir de microorganismes producteurs qui sont les basidiomycètes.On utilise les cultures suivantes de basidiomycètes : Tomitopsis pinicola, Irpex lacteus, Coriolus hirsutus, C.consorus, Benzines sepåaria, qu'on cultive sur un milieu minéral contenant comme sources de carbone l'amidon, la dextrine, le saccharose, le lactose, le maltose ou le glucose, et comme sources d'azote, les sels minéraux d'ammonium, les extraits de mais, de viande, de poisson ou de levure, à un pH de 2 à 7, à une température de 25 à 350C pendant 2 à 10 jours. L'activité lacto-coagulante maximale de la liqueur culturale est comprise entre les limites de 450 et 600 unités/ml. On effectue la précipitation de la préparation enzymatique à partir de la liqueur culturale par saturation avec le sulfate d'ammonium jusqu a 70 ffi en poids. les préparations enzymatiques obtenues sont utilisées dans la production du fromage de "Cheddar" et également pour améliorer la saveur des produits laitiers, à savoir : le fromage vert, le beurre, les produits laitiers acides, le lait sec et le lait condensé. les inconvénients des procédés connus sont l'activité protéolytique globale élevée des producteurs utilisés, par suite de laquelle l'enzyme obtenu confère une saveur amère aux produits laitiers, et l'activité lacto-coagulante insuffisamment élevée. En outre, l'utilisation des enzymes indiqués dans la production du fromage appauvrit le grain de fromage par suite du passage de la graisse dans le sérum. La présente invention se propose de supprimer les inconvénients précités. Conformément à cet objectif, l'invention vise, par modification du producteur, à améliorer la qualité de l'enzyme à obtenir et à augmenter son activité lacto-coagulante. La solution consiste en ce que dans le procédé d'obtention de la préparation enzymatique lacto-coagulante par culture des producteurs - les basidiomycètes - sur un milieu nutritif liquide contenant des sources d'azote, de carbone et des sels minéraux, avec séparation ultérieure du mycélium et isolement du produit visé à partir de la liqueur culturale, suivant l'invention on utilise comme producteur une culture de basidiomycètes, du genre Russula decolorans. On utilise de préférence, en tant que microorganisme producteur, la souche Russula decolorans N 2, sélectionnée parmi les cultures isolées dans des sporophores de Russula decolorans, souche qui se caractérise par les aspects morphologiques et des propriétes physiologiques suivantes.Sur un milieu de moût de bière agar les colonies sont lisses, blanches constituées de mycélium végétatif, l'envers n'est pas coloré ; les hyphes du mycélium aérien et du substrat sont minces, de 2,7 à 3 4 de diamètre, courbés avec des cloisons rares on trouve parmi les hyphes des cellules sphéroidales jusqu'à 10-17 k de diamètre ; pendant toute la période de croissance le basidiomycète se trouve en phase de végétation et ne forme aucun appareil sporifère ; il croit bien sur les milieux contenant comme source de carbone le glucose, le maltose, le cellobiose, la dextrine, le xylose, et comme source d'azote, la peptone, l'asparagine ; le basidiomycète est cultivé à une température de 25 à 260C, à un pH égal à 5-5,5 ; l'activité lacto-coagulante maximale est de 970 unités/ml. La souche indiquée de Russula decolorans N02 est déposée dans la collection du Musée de l'institut Botanique (V.L.) Komarov près de l'Académie des Sciences de l'Union Soviétique. il est préférable de conduire le processus de culture à une température de 25 à 260C pendant 7 à 20 jours, le pH étant de 5 à 3,2. Il est rationnel d'utiliser un milieu nutritif de composition suivante (en poids) maltose ou dextrine 1,0 % peptone 0,3 % SH2P04 0,06 % K2HPO4 0,04 4 MgS04 .7H20 0,05 % ZnS04 .7H20 0,0001 % FeSO4 .7I0 eau de robinet, complément pour 100 % pH du milieu 5-5,5 le procédé en question est mis en oeuvre de la manière suivante. On fait crottre la semence de la culture de Russula decolorans destinée à la culture par fermentation en surface, dans des tubes à essai avec le moflt de bière-agar incliné (2 g d'agar pour 100 ml de mott de bière dilué dans un rapport de 1:3) à une température de 25 à 260C pendant 12-15 jours. On utilise 1/4 de partie de la culture inclinée, couverte du mycélium pour ensemencer 100-200 ml de milieu nutritif destiné à la culture. La semence pour culture submergée est obtenue par ensemencement du mycélium à partir du moft de bière-agar incliné dans des fioles coniques à 500 cm3 de capacité contenant 100 cm3 (dilué 1:3) de mott de bière et de perles de porcelaine. le mycélium développé est frappé par les perles de porcelaine sous agitation des fioles en masse homogène, qui est utilisée à titre d'inoculant pour la culture submergée sur une secoueuse et des fermenteurs dans un rapport de 1:10. On réalise la culture par fermentation en surface sur un milieu nutritif, par exemple, de composition suivante, (% en poids), glucose - 1, peptone - 0,3; KH2PO4 - 0,06; K2HP04 - 0,04; MgS04 .7H20 - 0,05; ZnS04 .7H2O - 0,0001; FeSO4 .7H20 - 0,00005; eau du robinet- complément pour 100; pH du milieu avant la stérilisation - 5 - 5,5. Il est avantageux d'utiliser à titre de source de carbone le maltose ou la dextrine au lieu du glucose. La température de culture est de 25 à 26oC. L'activité lacto-coagulante maximale de la liqueur culturale se situe entre le 9ème et le 20ème jour de la croissance à un pH de 5 à 3,2 et constitue 800 à 970 unités/ml conventionnelles (en tant qu'unité conventionnelle d'activité on prend la quantité d'enzyme nécessaire pour coaguler 100 cm3 de lait par cm de liqueur culturale ou par cm de solution aqueuse à 0,1 Xo de préparation à la température de 350C et à un pH de 6,0 en présence de 1 cm3 de solution à 15 % de CaC b pendant 40 minutes). On effectue la culture submergée sur le même milieu nutritif à une température comprise entre 25 et 260C. l'activité maximale se situe entre le 7ème et le 9ème jour de la croissance et constitue 600 à 750 unités/ml. Une fois atteinte l'activité maximale, la liqueur culturale est séparée du mycélium, le filtrat est refroidi jusqu'à OOC et la précipitation de protéines est effectuée avec de l'éthanol à 960 refroidi à 15-200C dans un rapport de 1:3. On laisse reposer le mélange pendant vingt-quatre heures à une température de -15 à -200C, après quoi on décante le liquide surnageant. La liqueur restante est séparée à l'aide d'une centrifugeuse à 4000 à 4500 tr/mn à la température de OOC pendant 5 à 8 minutes.L'humidité et l'alcool résiduels contenus dans le précipité sont éliminés par congélation à la température de -50C pendant 24 à 48 heures, après quoi l'enzyme est extrait du précipité à plusieurs reprises avec de l'eau distillée jusqu'à disparition de l'activité lacto coagulante dans l'eau d'extraction. les extraits aqueux sont réunis et sont desséchés par lyophilisation, et le précipité insoluble est rejeté. La préparation enzymatique se présente sous la forme d'une poudre de couleur crème, soluble dans l'eau, possédant une activité moyenne de 500000 unités/g (activité maximun allant jusqu'à 970.000 unités/g) et appartient aux protéases acides. Le rendement en préparation est en moyenne de 0,5 à 0,6 g/l ou 76 à 80 % par rapport à l'activité initiale. La préparation à l'état congelé conserve son activité plus d'une année ; à l'état hermétique à la température ambiante - pendant 6 mois et plus. lors du chauffage de la solution aqueuse de la préparation jusqu'à une température de 400C pendant 12 à 24 heures, l'activité de départ est conservée, mais pendant le chauffage jusqu'à 50 C elle diminue de 10 fois et davantage. La température optimale de l'action de la préparation sur le lait est de 40 à 450C, le pH optimal pour coaguler le lait est de 5,0, le pH de l'action sur l'hémoglobine et la caséine étant de 2,0. le point isoélectrique de la préparation enzymatique est à pH 5,7. les ions Mg, Fe n'exercent aucune influence sur l'activité de la préparation et les ions Ca augmentent celle-ci. Quand on laisse la préparation passer dans une colonne remplie de Céphadex G-100 on obtient un chromatogramme à 3 pics protéiques. L'activité principale (800000 unités/ml) lacto -coagulante est mise en évidence dans les fractions du premier pic à poids moléculaire de protéine de 121000. le poids moléculaire des protéines du second pic constitue 36000 et ces protéines sont faiblement actives (2000 unités/ml). le poids moléculaire des protéines du troisième pic constitue 30000, elles ne montrent aucune activité.On a découvert dans la préparation 15 acides aminés (la histidine, l'arginine, la lysine, l'acide aspartique, la thréonine, la sérine, l'acide glutamique, la proline, la glycine, l'alamine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la tyrosine, la phénylalanine), le tryptophane n'est pas déterminé, la méthionine et la cystine manquent. Le procédé proposé permet d'obtenir une préparation enzymatique à haute activité lacto-coagulante, allant jusqu'à 976000 unités/gramme, avec une activité protéolytique globale diminuée, de sorte que les fromages obtenus au moyen de cette préparation enzymatique sont stables au stockage, ne deviennent pas amers, présentent une teneur en graisse normale et se caractérisent par une qualité élevée. les épreuves pilotes (semi-industrielles) de la préparation obtenue dans la production de fromage ont montré que la préparation peut servir comme produit de substitution de la présure. Des fromages expérimentaux du type de "Hollande" ont été évalués comme étant de première qualité et de qualité supérieure. Pour une meilleure compréhension de l'invention, deux exemples concrets mais non limitatifs, de mise en oeuvre du procédé proposé d'obtention de la préparation enzymatique lacto-coagulante sont décrits dans ce qui suit. Exemple 1 On fait croître la semence de la souche de Russula decolorans N02 dans des tubes à essai sur le moat de bière -agar incliné (2 g d'agar sur 100 cm3 de moat de bière, dilué dans un rapport de 1:3), à une température de 25 à 260C pendant 12 à 15 jours. On introduit alors la semence dans un milieu nutritif pour culture (en quantité égale à 1/4 de partie de moat de bière incliné couvert de mycélium par 100 à 200 cm3 de milieu nutritif).On effectue la culture par fermentation superficielle dans des fioles à 750 cm3 de capacité contenant 100 cm3 de milieu nutritif de composition suivante (% en poids) maltose 1, peptone - 0,3; KH2P04 - 0,06; K2HP04 - 0,04; MgS04 7H20 0,05; ZnS04.7H20 - 0,0001; FeS04.7H20 - 0,00005; eau du robinet complément pour 100; pH du milieu avant la stérilisation - 5 à 5,5. On réalise la culture jusqu'à l'activité lacto-coagulante maximale de la liqueur culturale (970 unités/ml) qui a lieu au 11ème jour de la croissance lors de la diminution du pH de départ jusqu'à 4,0.On sépare ensuite le mycélium, on refroidit le filtrat jusqu'à la température de OOC, on effectue la précipitation avec de l'éthanol à 960 refroidi jusqu'à une température de -15 à -200, dans un rapport de 1:3, pendant 24 à 48 heures, à la température de -200C, après quoi on élimine le liquide surnageant par siphonnement. On élimine le résidu du liquide surnageant par centrifugation à une température de OOC sous 4000 à 4500 tr/mn pendant 5 à 8 minutes. L'humidité et l'alcool résiduels sont éliminés par congélation à la température de -5 C pendant 24 à 48 heures, après quoi la préparation enzymatique est extraite à partir du précipité par l'eau à plusieurs reprises jusqu'à son extraction complète (l'extraction est déterminée d'après l'activité). les extraits aqueux réunis congelés préalablement à la température de -470C pendant 10 heures sont desséchés par lyophilisation. Le rendement en préparation est de 0,6 g/l de milieu nutritif. La préparation enzymatique obtenue est douée d'une activité lacto-coagulante de 976000 unités/gramme. Exemple 2 On conduit la culture de la semence de la souche de Russula decolorans N02 d'une manière analogue à celle décrite dans l'exemple 1. Qn réalise la culture par fermentation submergée sur une secoueuse à 160 tr/mn, dans des fioles de 750 cm3 de capacité, sur un milieu et dans des conditions analogues à ceux de l'exemple 1. On conduit la culture jusqu'à l'obtention de l'activité lacto-coagulante maximale, qui a lieu au 7ème jour de la croissance après la baisse du pH jusqu'à 4,0. L'isolement de la préparation enzymatique s'effectue d'une façon analogue à celle décrite dans l'exemple 1. le rendement en préparation enzymatique est de 0,5 g/l de milieu nutritif, l'activité lacto-coagulante étant de 600000 unités/gramme. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits et représentés qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre des revendications qui suivent. REVENDICATIONS 1. Procédé de production d'une préparation enzymatique lacto-coagulante, par culture de basidiomycètes en tant que producteurs sur un milieu liquide nutritif contenant des sources d'azote, de carbone et des sels minéraux, avec séparation ultérieure du mycélium et isolement du produit visé à partir de la liqueur culturale, c a r a c t é r i s é en ce qu'on utilise comme producteur une culture de basidiomycètes du genre Russula decolorans. 2. Procédé suivant la revendication 1, c a r a c t é r i s é en ce qu'on utilise comme producteur la souche Russula decolorans N02, selectionnée parmi les cultures isolées dans les sporophores de Russula decolorans, souche qui se caractérise par des aspects morphologiques et les propriétés physiologiques suivantes : sur un milieu de mott de bière agar les colonies sont lisses, blanches, constituées de mycélium végétatif, l'envers n'est pas coloré; les hyphes du mycélium aérien et du substrat sont minces, de 2,7 à 7k > de diamètre, spiralées avec des cloisons rares; on trouve parmi les hyphes des cellules sphérordales jusqu'à 10 à 17k de diamètre; pendant toute la période de la croissance les basidiomycètes se trouvent en phase de végétation et ne forment aucun appareil sporifère; ils croissent bien sur les milieux contenant comme source de carbone le glucose, le maltose, le cellobiose, la dextrine, le xylose, et comme source d'azote, la peptone, l'asparagine; les basidiomycètes sont cultivés à une température de 25 à 260C, à un pH de 5 à 5,5; l'activité lacto-coagulante maximale est de 970 unités/ml. 3. Procédé suivant l'une des revendications 1 et 2, c a r a c t é r i s é en ce qu'on conduit la culture à une température de 25 à 260C pendant 7 à 20 jours, le pH étant de 5,0 à 3,2. 4. Procédé suivant l'une des revendications 1 à 3, c a r a c t é r i s é en ce qu'on utilise un milieu nutritif contenant (en poids) maltose ou dextrine 1,0 % peptone 0,3 % KH2PO4 0,06 % K2HPO4 0,04 % flgS04 7H20 0,05 % ZnSO4 7H20 0,0001 % FeS04 7H20 0,00005 % eau de robinet complément pour 100 % pH du milieu 5 à 5,5. St Préparation enzymatique lacto-coagulante, caractérisée en ce qu'elle est obtenue suivant le procédé faisant l'objet de l'une des revendications 1 à 4.