Brevet FR2302540A1 — publié le 19760924

L'invention concerne un procédé de préparation de cellules destinées à un examen microscopique. La préparation d'échantillons physiologiques pour l'examen visuel, par exemple au microscope, pose des problèmes importants eessentiellement due à la difficulte d'obtention d'une répartition uniforme des cellule sur la surface à exa- miner Souvent, les problèmes posés par cette répartition résultent d'une agglomération excessive des cellules qui se déposent à partir des milieux liquides. En raison de ces problèmes de répartition, un observateur au microscope doit travailler avec un soin exceptionnel afin d'être sûr qu'il a observé toutes les zones où des cellules sont déposées, une discontinuité dans la couche des cellules déposées sur une lame n'indiquant pas obligatoirement qu'il n'y a plus d'échantillons a examiner dang le champ. En outre, les cellules n'étant pas réparties uniformément à la surface de l'échantillon, une surface relativement importante doit être examinée lorsqu'on veut etre sûr qu'une cellule malade n'a a pas été isolée au sein de cellules agglutinées dans un coin de la lame à examiner. Enfin, en dehors de ces problèmes liés à la réparties tion elle-même, l'orientation ou la disposition naturelle des cellules non sphériques est souhaitable afin que celles-ci soient facilement observées dans les trois dimensions. Les préparations de cellules déposées sur des lames selon les procédés ronnus ne concernent jamais une orientation de ce type Un procédé connu de préparation des cellules desti- nées à J'examen compiend le prélèvement manuel de l'échantil- lon, le dépôt de celui-ci. pas balayage sur une lame de verre, avec une autre lame de verre, l'immersion dune des lames de verre dans de l'alcool et la fixation du frottis, l'expéditio du frottis ainsi fixé au laboratoire où il est coloré avec les colorants appropriés, le recouvrement par une la.ael le du frot- tis coloré, au laboratoire pour la première fois puis l'expédition de la lame à un autre point du laboratoire pour l'examon visuel au microscope. L'observateur doit examiner au microscope tout l'échan- tillon dans lequel les cellules sont réparties très médiocrement et forment des agglomérats sur toute la surface. L'ensemble du procédé comporte de nombreux risques de contamination et en conséquence, le risque qu'une cellule très caractéristique de la population soit cachée ; de plus ce procédé demande un temps considérable à l'examinateur travaillant au microscope. Ce procédé a été progressivement remplacé par les améliorations suivantes. Le médecin prélève un échantillon et au lieu d'en faire un frottis, il l'introduit dans un tube à essai et llen- voie au laboratoire. Le laboratoire centrifuge l'échantillon, élimine le liquide surnageant et ajoute une quantité donnée d'alcool absolu à la suspension de cellules. La suspension de cellules est analysée. Elle peut être analysée par remise en suspension et dépot sur une lame, l'alcool s'évaporant et laissant les cellules sur la lame. Ce procédé est très supérieur au premier procédé décrit, essentiellement du fait de la répartition améliorée des cellules sur la lame et du risque moindre de contamination. Selon un troisième procédé, on utilise un filtre ce procédé a été très utilisé ces dix dernières années. Ce troisième procédé est devenu essentiel en raison de la nécessité de la concentration d'un petit nombre de cellules qui doivent etre étudiées. Un exemple de problème rencontré récemment par les laboratoires est celui que pose la récepticn fréquente d'échantillons provenant de prélèvementspar ponction lombaire qui comprennent si peu de cellules que le personnel du laboratoire ne peut pas les observer visuellement. Fréquemment, une ponction lombaire ne peut etre répétée qu'au bout d'un certain temps et en conséquence il est très important que tou- tes les cellules contenues dans l'échantillon provenant de la ponction lombaire aient une concentration suffisante pour être observées au microscope.Dans ce procédé du type à filtre, la matière est placée dans l'alcool absolu après centrifugation comme dans le deuxième procédé décrit. Mais, dans ce procédé, la matière est déposée sur un filtre et les cellules se concentrent dans la matière du filtre. Le filtre est ensuite coloré et déposé sur une lame. On utilise ensuite de la formaline pour la dissolution du filtre, les cellules colorées restant en place sous forme concentrée. Ce procédé est avantageux et a un succès commercial considérable. I1 existe actuellement une autre variante de ce procédé qui eorrespond à l'utilisation d'un filtre amélioré ne laissant pas un fond gris sous l'action de la formaline,ce fond représentant un inconvénient majeur du filtre utilisé antérieurement.Cependant, dans le cas des deux procédés comportant des filtres, on observe encore des agglomérations et des empilements de cellules. En outre, ces procédés demandent un temps important de traitement en laboratoire. L'invention concerne un procédé de préparation d'échantillons physiologiques et en particulier d'échantillons contenant des cellules entières. Elle concerne en outre un dispositif qui convient particulièrement à la mise en oeuvre de ce procédé. Le procédé et le dispositif de l'invention permettent la répartition et l'orientation des cellules sur une surface à laquelle elles adhèrent, ces cellules étant avantageusement étalées et conservées. Le procédé et le dispositif de l'invention permettent la préparation des cellules en un temps très réduit et améliorent nettement la définition des cellules au microscope. L'invension concerne en outre un dispositif qui facilite le traitement identique de différents échantillons de cellules et en conséquence la comparaison de ces échantillons, ainsi qu'un dispositif de concentration d'échantillons dilués de cellules qui permet l'observation optique de ces échantillons. Le procédé de l'invention met en oeuvre l'agitation thermique d'une suspension de cellules pendant la période qui précède immédiatement l'élinination du milieu de suspension et un phénomène de flottaison qui aboutit au dépôt des cellules avec une bonne orientation et une bonne répartition à la surface sur laquelle elles se déposent. Le procédé de l'invention comprend de façon générale la dispersion d'un échantillon de cellules dans un liquide volatil à la température d'essai entre 25 et 35OC. Avantageusement, le nombre de cellules contenues dans la suspension ne doit pas être excessif afin que le mélange soit satisfaisant et que l'agglomération et l'empilement des cellules sur le substrat soient évités. Le nombre excessif de cellules par unité de volume dépend de l'épaisseur de la suspension déposée sur le support et de la dimension des cellules. On utilise avantageusement un modèle empirique qui correspond à des cellules de 56 microns de diamètre, et une épaisseur de la suspension de cellules de 3,15 mm, pour la définition d'une limite de ce type. Dans ce cas, le nombre de cellu 3 les ne doit pas castre supérieur à environ 125 OOO par cm de suspension.Dans le cas de cellules dont les dimensions sont supérieures à celles du modèle, le nombre maximal de cellules doit être inférieur à celui indiqué tandis que dans le cas de cellules dont les dimensions sont inférieures à celles du modèle, ce nombre peut augmenter légèrement. Normalement, le nombre total de cellules doit être compris entre 100 et 140 000 3 par cm On verse la suspension décrite dans une chambre dont le fond est constitué par une lame de verre ou un autre dispositif formant une surface de manipulation. Les parois de la chambre sont avantageusement constituées par une bague placée sur la lame et en contact intime avec celle-ci, l'ensemble étant étanche. L'étanchéité peut etre assurée de plusieurs fa çons, par exemple par les dispositifs habituels tels que des pinces, des ressorts et des pattes de fixation. Une surface d'acier usiné convient particulièrement bien car elle a une certaine porosité au niveau de l'interface entre la lame et la bague. Une petite quantité de liquide peut s'infiltrer dans les interstices au niveau de cette interface et fixe effica cement la bague en position sur la lame si bien que tout déplacement de la bague par inadvertance est évité pendant la manipulation, m'eme en l'absence d'autres dispositifs mécaniques de blocage ou d'étanchéité. Selon l'invention, deux échantillons de cellules peuvent être traités exactement de la même façon sur le plan physique et chimique c'est-à-dire dans deux zones différentes de la même lame sans danger de contamination croisée. En général, un ensemble lame et bague limitant une chambre d'environ 12,7 mm de diamètre et 3,15 mm de profondeur convient très bien. Dans tous les cas, selon l'invention, lorsque l'al- cool s'évapore d'une suspension contenue dans une chambre de ce type, le refroidissement dû à l'évaporation ainsi que l'effet de stabilisation de la température dû à la matière de la bague au niveau du bord du liquide qui s 'évapore provoquent une agitation thermique notable des cellules suivant des courants tourbillonnaires circulaires pendant pratiquement toute l'évaporation. Cette agitation provoque, lorsqu'elle dure comme on l'a observé jusqu'à ce que le liquide soit pratiquement évaporé, une dispersion très efficace des cellules. En outre, des cellules qui ont une forme d'aiguille ou au moins celles qui diffèrent beaucoup d'une forme sphérique ont tendance à flotter de sorte que les cellules de ce type se déposent en-dernier. Ainsi, les cellules de formes différentes sont plus faciles à identifier en raison de l'effet tridimensionnel de ce procédé. La matière de la lame, c'est-à-dire du fond de la chambre, doit être du verre (ou un équivalent optique évidemment). Les bagues ou parois des chambres peuvent etre en toute substance convenable. Bien que des bagues d'acier conviennent particulièrement à la manipulation, les matières qui, en raison de leur propriété de mouillabilité, provoquent la formation de ménisques relativement petits (l1expression "relativement petits" signifie de concavité faible) sont avantageuses, car la formation de ménisques relativement importants a tendance à provoquer le dépot d'une certaine quantité de cellules qui s'agglomèrent ou s'empilent au pourtour de la chambre.Ainsi, par exemple, les matières polymères telles que les polyoléfines, le polyméthacrylate de méthyle et d'autres matières telles que les polymères organique s synthétiques sont avantageuses dans le cas des parois de la chambre. Cependant, comme indiqué, des métaux tels que l'acier, le nickel, le plomb, l'or, l'argent, l'aluminium et analogues conviennent également de même que certaines matières céramiques telles que la porcelaine, la silice, le verre, le quartz et analogues. Des combinaisons de matières conviennent à la fabrication des parois, par exemple une bague d'acier inoxydable revetue de polytétrafluoréthylène est très avantageuse. En général, l'effet de refroidissement décrit est tel que la température à la surface, près du centre de la chambre, est inférieure à la température près des parois. Bien entendu, on peut concevoir l'inversion des conditions thermiques. On peut refroidir artificiellement les parois du tube et favoriser un effet différent de circulation. Ce procédé est pratiquement équivalent au procédé décrit selon lequel la zone la plus froide de la suspension en cours d'évaporation se trouve au centre de la bague. En pratique, la différence de températures entre le liquide au centre de la bague et le long des parois est de l'ordre de 0,55OC au moins. Il est surprenant que des variations très faibles de la répartition de la chaleur permettent l'obtention d'une disposition préférentielle des cellules sur le support. Le temps nécessaire à l'obtention de cette disposition préférentielle devant etre court avant l'évaporation totale du milieu, un dispositif de chauffage sélectif par radiations est avantageusement placé à proximité du fond de la chambre. En outre, étant donné qu'il est avantageux que le fond de la chambre ait une surface qui soit une lame transparente sur laquelle on puisse travailler, une structure réceptrice des radiations thermiques est avantageusement placée de façon amovible sur la face de la lame transparente opposée à celle sur laquelle les cellules sont déposées. Dans les conditions d'éclairage naturel existant généralement dans de nombreux laboratoires, une répartition préférentielle effective des cellules est obtenue par mise en place d'une surface absorbant bien les radiations thermiques (noire ou sombre) sous la lame de verre. En général, une surface encrée noire réduit préférentiellement le dépôt des cellules sur la surface de la lame qui se trouve juste au-dessus d'elle.Ainsi, par exemple, la mise en place d'un pourtour encré noir sur une carte, juste en dessous de la zone circonférentielle intérieure et adjacente aux parois de la chambre provoque non seulement la diminution ou la suppression de toute agglomération de cellules due à la formation du ménisque, mais réduit aussi nettement le nombre de cellules placées dans la zone, à une valeur inférieure au nombre qui peut être obtenu avec la combinaison d'une paroi et d'un milieu de suspension ne provoquant pas la formation d'un ménisque. Ainsi, l'invention concerne un dispositif permettant l'obtention de dispersions uniformes de cellules selon des dessins géométriques prédéterminés correspondant à des surfaces encrées noires (qui absorbent les radiations thermiques). Le procédé de lsinvention peut être accéléré par utilisation de dispositifs accélérant l'évaporation. Par exemple, un milieu deCsuspension de cellules qui stévapore en 26 minutes à l'air relativement peu mobile-, peut s'évaporer avec des résultats favorables en une petite fraction de ce temps, c'est-à-dire environ 5 minutes lorsqu'un courant dlair circule dans la chambre. Plus l'évaporation est rapide, plus la différence de températures dans la suspension de cellules en cours de concentration est importante et, en conséquence, plus le mélange thermique est important et facilite ainsi la bonne répartition de certains échantillons de cellules. Dans la description précédente, l'expression "bague" conterne une chambre circulaire, mais bien entendu~ des cham bresde forme rectangulaire elliptique triangulaire ou autres conviennent également. D'autres caractéristiques et avantages de i l'inven- tion apparaltront dans la description de l'exemple d'un mode de réalisation particulier, faite en référence au dessin annexé sur lequel la figure 1 est une perspective d'un dispositif selon l'invention la figure 2 est une coupe du dispositif de la figure 1 représentant un ménisque concave ; les figures 3 et 3A sont analogues à la figure 2 mais représentent les modes de réalisation sans ménisque et à ménisque convexe la figure 4 est analogue à la figure 2 mais représente une surface formant un corps noir, placée en dessous de la lame ; la figure 5 représente des exemples de dessins de surfaces noires la figure 6 représente des exemples de dessins de répartition des cellules sur une lame de verre préparée avec les dessins noirs de la figure 5 ;; la figure 7 représente un dispositif qui convient à l'accélération du procédé de pA dépôt des cellules ; et la figure 8 est un schéma très exagéré de la répartition des cellules qui représente comment les cellules ont tendance à se déplacer sur la lame selon un schéma tridimensionnel. La figure 1 représente une chambre 20 délimitée par une bague 22 d'acier et une lame transparente 24 de verre. Une surface inférieure 26 usinée de la bague 22 permet l'infiltratien d'une petite quantité de liquide de la dispersion 28 de cellules à la surface 30 lisse du verre et favorise le collage des surfaces 30 et 26, ce collage facilitant la mani pulation du dispositif. La figure 2 représente le dispositif de la figure 1 mais montre comment un ménisque concave ou position 32 donne des différences d'épaisseurs de suspension de cellules au-des sus de différend s parties de la lame de verre lorsque le liquide de suspension Les figures 3 et 3A représentent l'utilisation des différents milieux permettant l'obtention de ménisques de différentes formes La figure 3 représente l'utilisation d'une bague 34 revêtue d'une matière plastique 36 qui évite la formation de ménisque. La figure 3A représente une bague 38 de po- lyéthylène et la formation résultante d'un ménisque convexe 40. La figure 4 représente le dispositif de la figure 1, une surface 42 portant des dessins noirs étant placée juste en dessous de la lame de verre. La surface 42 est avantageusement celIe d'une carte 44 de matière plastique. La figure 5 montre deux configurations possibles dans le cas d'une surface de ce type. L'anneau 46 est particulièrement avantageux lorsqu'on veut éviter tout empilement de cellules dans le cas d'un ménisque concave. Les anneaux concentriques 48, 48a et 48b provoquent le dépôt préférentiel des cellules en anneaux concentriques sur la lame microscopique? ces anneaux correspondant aux zones claires limitées par les anneaux sombres.La figure 6 montre ces effets, les zones 56, 58 et 57 couvertes de cellules correspondant aux zones claires 47, 49 et 50 de la figure 5. tes zones 60; 61, 62 et 67 relativement peu peuplées, de la lame, correspondent aux surfaces sombres 46, 48, 48a et 48b. La figure 7 représente un dispositif dans lequel les suspensions de cellules préparées selon le procédé de l'in vention sont enfermées dans un bottier 72. De l'air est introduit sous pression dans le boîtier et est réparti au-dessus des suspensions par un ventilateur 74 qui provoque l'évapora- tion, l'agitation et le dépot des cellules. L'air sort par un tuyau 76 et pénètre dans un piège 78 de refroidissement avant d'être libéré. L'air pulsé par le ventilateur 74 traverse avantageusement un filtre 80 ou un autre dispositif de traitement qui évite la contamination de l'échantillon-de cellules. Les échantillons qui s'évaporent sont rangés sur des plateaux 82 dans le bottier. La figure 8 représente une lame 84 terminée qui convient à une conservation longue et qui comprend, fixée à sa surface, une population de cellules parmi lesquelles certaines cellules 86 allongées ou en forme d'aiguilles ont tendance à se déposer en position verticale, cette position facilitant énormément l'examen microscopique de la population de cellules. Le mécanisme de la fixation des cellules n'est pas totalement connu. Néanmoins, cette fixation est très avantageuse pour la préparation et la manipulation des lames. L'exemple suivant illustre un mode de réalisation très important de l'invention selon lequel des cellules provenant d'un lavage vaginal sont préparées pour l'examen microscopique. On aspire l'échantillon de cellules et on le place dans un tube qui contient un mélange d'alcool et de solution saline, puis on l'envoie à un laboratoire qui le centrifuge. On élimine le liquide surnageant et on remet en suspension les cellules résiduelles dans l'éthanoi. Ce procédé est actuellement utilisé. La suspension dans l'éthanol est diluée jusqulà ce que la concentration en cellules soit de l'ordre de 70 000/cm3. On place environ 0,4 cm3 dans une chambre limitée par une bague d'acier de 12,7 mm de diamètre et 3,15 mm de hauteur. La bague d'acier repose sur une lame de verre. La température de la pièce est de 24oC. Elle provoque l'évaporation du liquide contenant l'éthanol et dans lequel les cellules sont en sus- pension. Le résidu déposé sur la lame est collé sur celle-ci mais la répartition des cellules dans ce résidu est excellente et leur orientation est également excellente, comme mis en évidence lorsque la lame est colorée et examinée au microscope. L'invention concerne en outre un objet très avantageux de présentation de cellules formé selon le procédé de l'invention, les cellules étant fixées sur la lame, mme lorsqu'elles sont de forme aciculaire, et ayant tendance, peut-être en raison de leur flottement dans le liquide et de l'agitation qui les empêche de s'agglomérer, à s'orienter en position verticale. On ne connatt pas le phénomène selon lequel ces cellules se fixent si bien sur la lame, mais il est avantageux pour la manipulation et la-conservation des cellules. L'expression '1réservoir11 utilisée dans le présent mémoire désigne une quantité de liquide dont la profondeur est suffisante pour Permettre l'agitation thermique décrite. Habituellement une profondeur minimale de l'ordre de 1,58 rmn est nécessaire dans la zone au-dessus de laquelle les cellules doivent être réparties et le rapport largeur/épaisseur doit être au moins égal à 1. L'expression "surface absorbant les radiations thermiques" s'applique à une surface sombre ou d'un autre type qui absorbe les radiations lumineuses dont la longueur d'onde correspond aux radiations thermiques. Cependant, cette expression ntest pas utilisée avec son sens fonctionnel précis. On n'a pas déterminé si cette surface absorbe ou émet des radiations thermiques Ces surfaces sont connues à la fois comme émetteurs et comme absorbeurs des radiations thermiques. En outre, il est évident que les zones noires soit peuvent être placées à la surface de la lame transparente et en conséquence, peuvent être solidaires de celle-ci (c'est-à-dire fixées ou peintes sur cette surface), soit peuvent être isolées de cette surface. Il va de soi que de nombreuses modifications peuvent être apportées au procédé décrit et représenté sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de cellules pour un examen microscopique, caractérisé en ce qu'il comprend la préparation d'une suspension des cellules dans un liquide, la préparation d'un réservoir de cette suspension, limité par une surface et des parois et ayant une profondeur qui suffit à l'établissement de courants de convection thermique, l'évaporation du liquide à une vitesse qui suffit à la formation de courants thermiques dans le réservoir pendant l'évaporation, ces courants entraînant les cellules et les répartissant pratiquement uniformément dans une zone limitée par les parois et, par évaporation du liquide, le dépôt des cellules ainsi dispersées sur la surface. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le réservoir a une profondeur au moins égale à 1,58 mm et la suspension de cellules a un volume ne depassant pas celui qui contient 125 000 cellules de diamètre moyen égal à 56 microns par centimètre cube. 3. Procédé selon l'u-ne des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'une surface absorbant les radiations ther minus est placée près d'au moins une des faces d'une lame transparente et modifie i'évaporation de façon que les cellules se répartissent préférentiellement dans les zones de la lame qui ne correspondent pas aux zones absorbant les radiations thermiques. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le réservoir est formé par mise en place d'une bague constituant les parois, ouverte à sa partie supérieure et dont le fond est placé sur une lame transparente, et introduction de la suspension dans la bague. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 et 4, caractérisé en ce que la bague et la lame sont fixées de fa çon amovible l'une à l'autre par la tension superficielle du liquide qui se trouve entre la partie inférieure de la bague et la partie supérieure de la lame. 6 Procédé selon 1lune des revendications 1 et 49 caractérisé en ce que la surface de la bague n'est pas mouillable par ia suspension de cellules. 7. Objet comprenant une présentation de cellules dérivant d'un échantillon physiologique, caractérisé en ce qu1il comprend une lame transparente de verre, une population de cellules réparties uniformément sur cette lame et, fixées sur une zone prédéterminée de la lame, des cellules aciculaires fixées préférentiellement en position verticale sur la lame. 8. Objet selon la revendication 7, caractérisé en ce que la zone prédéterminée de la lame comprend des parties distinctes formant un dessin circulaire et concentrique. 9. Dispositif destiné à répartir sur un support une suspension dans un liquide de cellules dérivées d'un échantillon physiologique, ce dispositif étant caractérisé en ce qu'il comprend une lame transparente qui forme le fond d'une chambre et une bague dont les extrémités supérieure et.infé- rieure sont ouvertes et qui forme les parois de la chambre. 10. Dispositif selon la revendication 9, caractérisé en ce que la chambre a des parois dont la hauteur minimale est de l'ordre de 1,58 mm. 11. Dispositif selon la revendication 9, caractérisé en ce que ses éléments sont maintenus solidaires par la tension superficielle du liquide placé entre la partie inférieure de la bague et la partie supérieure de la lame. 12. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 9, 10 et 11, caractérisé en ce que les surfaces formant les parois de la chambre et la surface de la lame sont en une matière difiicilement mouillable par les liquides polaires. 13. Procédé selon ltune des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que ltévaporation est mise en oeuvre avec formation d'un ménisque convexe entre les parois et la suspension. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que ltévaporation est réalisée avec un dispositif accélérant l'évaporation.