Brevet FR2310760A1 — publié le 19761210

La présente invention se rapporte à un nouvel antibiotique appelé dihydromocimycine, à un procédé pour le produire et à des composi tju: tP. contenant. L'antibiotique est spécialement utile contre la maladic du- porc appelée dysenterie à tréponèmes ou vibrion de Doyle, etc. L'invention se rapporte en outre à un procédé pour produire de la mocimycine au départ de dihydromocimycine. La dihydromocimycine répond à la formule : La dihydromocimycine s'obtient par fermentation de Streptomyces ramocissimus ou d'un mutant approprié, qui donne également de la mocimycine. Streptomyces ramocissimus est un micro-organisme décrit dans le brevet anglais n 1.325.200 et est déposé à la collection de cultures du Centraal Bureau voor Schimmelcultures à Baarn, aux Pays-Bas sous le n CBS 190.69 où il est disponible pour le public. Le brevet anglais n 1.325.200 décrit uti procédé pour produire de la mocimycine (appelée MYC 8003) au moyen du micro-organisme précité. La structure de la mocimycine est donnée par Vos et Verwiel dans Tetrahedron Letters 52 (1973), pages 5173-5176. La demanderesse a découvert à présent que Streptomyces ramocissimus de meme que des mutants appropriés produisent la dihydromocimycine en plus de la mocimycine. La dihydromocimycine est un solide jaune pâle faiblement acide qui est de plus caractérisé par les propriétés physico-chimiques ci-après. Solubilité Ce composé a une bonne solubilité dans le chloroforme, la méthylisobutylcétone, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, l'acétone, le dioxanne, le méthanol, méthanol, le tétrahydrofuranne et les solutions aqueuses faiblement alcalines. Sa solubilité est modérée dans le tétrachlo- rure de carbone et le benzène, le composé étant insoluble dans l'éther diéthylique, l'eau, les solutions aqueuses faiblement acides, le cyclohexane et l'éther de pétrole Pouvoir rotatoire. 20 Le composé a un [&alpha;]D@ de -85 en solution méthanolique à 1 %. Point de fusion. Le composé ne fond pas, mais commence à se décomposer à 123 C. Analyse élémentaire Le composé présente llanalyse élémentaire ci-apris Trouvé : Calculé pour C43H62N2 2 12 2 C : 61,8 % 61,8 % H : 7,5 % 8,0 % N : 3,4 % 3,3 % 0 : 27,2 % (par différence) 26,8 % Spectre ultraviolet. Le spectre ultraviolet de la dihydromocimycine dans un mélange 1 : 1 d'eau et de méthanol pour différentes valeurs du pH est illustré à la figure I des dessins annexés. La concentration des soluticns étudiées est de 18,3 g/ml. Le spectre ultraviolet est dépendant du pH. On relève les maxima ci-après (les extinctions molaires étant indiquées entre parenthèses) méthanol - eau : 233,5 nm (# = 63.000); 267 nm (# = 23.000); 291 nm (s. = 19.000) et 333 nm ( courbe 1; méthanol - NaOH 0,5 N : 235 nm (C= 62.000); 277 nm (# = 25.000) et 308 nm (# = 29.000); courbe 2; méthanol - HCl 0,5 N : 233?5 nm (# = 65.000); 268 nm (# = 25.000) et 338 nm (# = 14.000); courbe 3. Spectre infrarouge Les figures 2 et 3 donnent le spectre infrarouge de la dihydromocimycine dans le chloroforme et dans le bromure de potassium, respectivement. On relève les absorptions principales suivantes chloroforme (# en cm ) : + 3.445 (épaulement); 3.430; 2.979; 2.941; 2.886; 1.662-1-.653; 1.458; 1.100; 1.080; 1.040; 998; 944; 893; 870 et 840; bromure de potassium (# en cm ) : + 3.400-3.320; 2.972; 2.935; 2880; 1.650; 1.535; 1,455; 1.099; 1.040; 990; 943; 860; 840 et 790. Spectre de résonance magnétique des protons La figure 4 donne le spectre de résonance magnétique des protons de la dihydromocimycine en solution dans le deutérochloroforme avec le tétraméthylsilane comme étalon interne (60 MHz). Chromatographie en couche mince On releva des chromatogrammes en couche mince de la dihydromocimycine sur des plaques de Kiesalgel F 254 de la Société Merck (plaques prêtes à l'usage) et, après séchage, on décèle les taches par extinction, par fluorescence ou par carbonisation après pulvérisation d'un mélange d'éther diéthylique et d'acide sulfurique. L'étude a montré que la tache attribuée à la dihydromocimycine, même avec les préparations les plus pures, s'accompagne toujours d'une petite tache suppld:.cntaire. L'existence des deux taches résulte d'un équilibre tautomère, comme il est possible de le mettre en évidence avec un chromatogramme à deux dimensions. On mesure ies valeurs de Rf ci-après pour la dihydromocimycine dans divers éluants (la valeur de Rf pour la tache supplémentaire est donnée entre parenthèses) mélange 50 : 45 : 5 de méthylisobutylcétone, d'acétone et d'eau : C,44 (environ 0,44); mélange 70 : 20 : 1C : 0,5 d'acétate d'éthyle, de méthanol, d'eau et d'ammoniaque à 25 % : 0,29 (0,36); mélange 65 : 40 : 9 de benzène, d'éthanol à 100 % et d'ammoniaque à 33 % : 0,16 (0,22); mélange.60 : 42 : 10 de chloroforme, d'éthanol à 96 7 et d'ammoniauqe à 25 % : 0,4. La structure de la dihydromocimycine est confirmée par le spectre de résonance magnétique des protons (220 MHz) de la mocimycine (voir Tetrahedron Letters 52 (1973), pages 5.173 à 5.176 pour la formule ou structure), ainsi que par celu- de la dihydromocimycine oui montre que les deux composés sont semblables, Si ce n' est que deux doublets à . = 5,9 et 7,3 ppm (avec le tétraméthylsilane comme étalon interne). qui apparaissent dans le spectre de la mocimycine, n'apparaissent pas dan le spectre de la dihydromocimycine. Ces signaux résultent de la présence de protons sur les atomes de carbone en 5 et en 6 du noyau de pyridone. Cependant, deux triplets apparaissent dans le spectre de la dihydromocimycine à # = 2,5 et 3,4 ppm. Ceci indique que la liaison entre les atomes de carbone en 5 et 6 du.noyau de pyridone de la dihydromocimycine est saturée. Cette interprétation est confirmée lors de l'ozonisation d'une solution aqueuse de dihydromocimycine à pH 12 pendant 5 minutes à OOC. Après réduction du mélange de réaction résultant au moyen d'hydrogène avec de l'oxyde de platine comme catalyseur, puis hydrolyse au moyen d'acide chlorhydrique concentré, on décèle la présence de p-alanine ce qui montre ;ue la liaison entre les atomes de carbone en 5 et en 6 du noyau de pyridone est saturée dans la dihydromocimycine. Beaucoup des propriétés de la dihydromocimycine sont semblables à celle de la mocimycine. Cependant, il axis te une différence importante, à savoir que l'addition en une faible concentration de la mocimycine à l'alimentation d'animaux en cours d'engraissement, comme des volailles ou des porcs, améliore beaucoup la croisssance et l'assimilation des aliments. Au contraire, la dihydromocimycine n'améliore aucunement la croissance ou la similation des aliments par les animaux ce qui est inattendu du fait qu'in vitro, cette dernière manifeste de l'activité à l'égard des mêmes micro-organismes et même, dans de nombreux cas, une meilleure activité que celle de la mocimycine. Une comparaison des activités antimicorbiennes de ces deux antibiotiques est faite dans le tableau ci-après. Essais avec dilution sur gélose Concentration inhibitrice minimale en g/ml en culture anaérobie Organisme essayé mocimycine dihydromocimycine Staphylococcus aureus A2000 > 100 > 100 Staphylococcus aureus A2001 > 100 > 100 Diplococcus pneumoniae L54 1,5 Salmonella typhimurium R172 > 100 100 Escherichia coli U20 > 100 1,5 Listeria monocytogenes A2130 6 1,5 Listeria monocytogenes A2131 6 6 Listeria monocytogenes A2132 6 6 Clostridium perfringens A738 > 100 > 100 Clostridium septicum A2152 10 10 Streptococcus zooepidemicus A2144 6 6 R-Streptococcen A2148 6 3 Brucella suis (lisse) A2126 0,75 0,4 Pasteurella haemolytica A2136 3 1,5 Treponema spec. A2275 30 10 Essais avec dilution en milieu liquida -Ooncentration inhibitrice minimale an a an culture anaérobie Organisme essayé mocimycine dihydromocimycine Bacillus subtilis ATCC6633 100 50 Bacillus subtilis ATCC6051 100 50 Bacillus subtilis 6346 D167 1,2 0,9 Bacillus subtilis 220 D178 . 75 75 Bacillus subtilis TH10 | 100 50 Bacillus cereus D166 0,6 0,6 Bacillus cereus D261 0,9 0,6 Bacillus cereus D220 1,2 0,9 Bacillus cereus B569 2,5 1,2 Bacillus cereus THl 1,8 1,2 Bacillus thuringiensis W11 1,2 0,9 Bacillus mesenterium D169 100 50 Bacillus cereus var. mycoides 1,2 0,45 Streptococcus haemolyticus A266 0,45 0,45 Streptococcus haemolyticus A2182 0,25 0,12 Mycoplasma hyorhinus A2230 t 1 Streptomyces viridochromogenes 2,5 0,9 Streptomyces ramocissimus dans les conditions appropriées produit de la dihydromocimycine en plus de la mocimycine et donc, suivant une caractéristique de l'invention, on prépare la dihydromocimycine par un procédé suivant lequel on cultive en milieu aérobie la souche C3S 190.69 de Streptomyces ramocissimus ou un de ses mutants produisant la dihydromocimycine dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone, d'azote et de substances inorganiques, puis on sépare la dihydromocimycine formée pendant la culture. I1 est possible d'exécuter la fermen ration du micro-organisme avec des milieux liquides contenant les sources habituelles de carbone, d'azote, de phosphore, de calcium, de fer, de soufre, de magnésium, de potassium, de vitamines et d'oligo-éléments, comme les milieux contenant de la mélasse de betterave, de la pâte maltée, de la farine d'arachide, du lactose, de l'amidon de pomme de terre, de la liqueur de macération du mais et de l'extrait de levure. La température du milieu de fermentation doit être de 20 à 40"C et est de préférence de 26 à 34"C, cependant que le pH est de 5 à 9 et de préférence de 6,5 à 8. I1 convient de noter que le procédé ci-dessus est semblable au procédé de production de la mocimycine et la demanderesse a constaté que la dihydromocimycine est formée dans les conditions appropriées en plus de la mocimycine lors de la fermentation de Streptomyces razocissicus ou d'un de ses mutants produisant de la mocimycine (et de la dihydromocimycine. La demanderesse a découvert avec surprise qu'il est possible d'obtenir une production plus élevée de dihydromocimycine par rapport à la mocimycine en augmentant la pression de l'oxygène dans le milieu de culture. On pourrait s'attendre, d'après la structure de la dihydromocimycine, à ce qutune plus haute pression en oxygène dans le milieu de culture diminue la production de la dihydromocimycine par rapport à la mocimycine.Cependant, la dihydromocimycine s' est révélée être obtenue en quantité plus importante que la mocimycine lors d'une meilleure aération du liquide de culture qui peut être assurée par des techniques classiques, par exemple au moyen d'un débit d'aération plus élevé, c'est-à-dire plus grand volume d'air par volume de milieu de culture et par unité de temps, ou par une vitesse d'agitation plus grande du milieu de culture dans le fermenteur. Des. débits d'aération convenables pour le milieu de culture représentant, par exemple, environ 2 litres sont de 1 à 3 litres d'air et de préférence de 1,5 à 2,5 litres d'air par minuta. On améliore davantage la production de dihydromocimycine an ajoutant en faibles concentrations certains ions métalliques, comme des ions fer, cobalt et nickel, au milieu de culture. La séparation de la dihydromocimycine du milieu de culture se fait pour partie comme la séparation de la mocimycine. Au dernier stade, au cours duquel les composés sont précipités à partir d'un solvant organique, on exploite la différence entre les solubilités de la mocimycine et de la dihydromocimycine. La mocimycine précipita d'abord lors d'un barbotage d'ammoniac gazeux dans la solution et la séparation peut être assurée par introduction d'ammoniac dans la solution sensiblement jusqu'au terme de la précipitation de la mocimycine, cependant que la dihydromocimycine subsiste en substance totalement dans la solution. Ceci peut être vérifié, par exemple, par chromatographie en couche mince.Après la séparation, par exemple par filtration, du précipité de mocimycine de la solution, on poursuit le barbotage d'ajnmoniac jusqu'à précipitation de sensiblement toute la dihydromocimycine qui peut ensuite être isolée, par exemple, Far filtra tien. L'ammoniac est, par exemple, amené à traverser la solution a raison d'environ 150 litres par litre de solution et par heure pendant environ 1 à 4 minutes (c'est-à-dire à raison d'environ 2,5 à le litres d'ammoniac par litre de solution) à une température d'environ -12 C a 4 15 C et de préférence de -50C a +8 C.Durat la barbotage contre d'ammoniac gazeux dans la solution, la concentra Lion en ions hydrogène diminue suffisamment pour rendre la dihydromocimycinè insoluble durant le le barbot:-ge dans les conditions indiquées ci-desssus pendant environ 10 A 15 minutes (soit à raison d'environ 25 à 40 litres) dans les mêmes circonstances. I1 est possible de prendre non seulement l'ammoniac, mais de manière générale tout composé alcalin pour séparer la mocimycine et la dihydromocimycine, comme il en est du méthylate de sodium et de la triéthylamine. La dihydromocimycine brute ainsi séparée du milieu de culture est davantage purifiée par élimination de la mocimycine en conséquence d'une dissolution du précipité dans une solution ammoniacala fortement diluée (pH 9) et de l'extraction de cette solution au moyen d'un solvant comme le chloroforme ou le chlorure de méthylène. La mocimycine est médiocrement soluble dans un tel solvant et, en versant l'extrait obtenu dans un excès d'un solvant apolaire comme l'éther dc pétrole, le cyclohexane ou le pentane, il se forme un précipité de dihydromocimycine contenant moins de 5% de mocimycine. On peut obtenir de la dihydromocimycine fortement purifiée par passage du produit obtenu comme ci-dessus sur une colonne de LH 20 dans laquelle on exploite la différence d'adsorption de la mocimycine et la dihydromocimycine. On met le SEPHADEN an suspension dans du méthanol à 100 %, puis on verse soigneusement la suspension dans la colonne. Après avoir déplacé le méthanol par du chloroforme. on introduit dans la colonne le précipité de dihydromocimycine précité. On prend ie chloroforme comme éluant. Après un certain délai, on obtient d'abord de la dihydromocimycine, puis la mocimycine. I1 est possible de déceler la présence de es deux composés dans l'éluat puisqu'ils absorbent dans l'ultraviolet à 350 nm.On peut isoler les composés purs du chloroforme par précipitation au moyen d'un solvant apolaire comme le cyclohexane ou le pentane. La nature des composés peut être confirmée par c@romato- graphie en coucha mince. A cette fin, on utilise des plaques de Kieselgel F 254 de 20 cm x 5 cm de la société Merck. Comme éludant, on choisit @ un mélange 60 : 42 : 10 de chloroforme, méthanol et d'ammoniaque à 25 c. La durée d'dilution est de 2 heures. La mocimycine présente un Rf de 0,3 (tautomère principal), cependant que la dihydromocimycine présente un Rf de 0,4 (tautomère principal). A un stade précoce des recherches, on avait supposé que la mocimycine dont le spectre antimicorbien est semblable à celui de la tylosine (voir Merck Inde, 8ème édition, page 1.089) pourrait être efficace contre Treponema hyodysenteriae qui provoque la dysenterie å tréponèmes ou vibrion de Doyle qui est l'une des maladies les plus courantes du porc. A ce moment, des expériences ont montré que la mocimycine est active contre cette maladie mais pas autant que ia tyrosine. Pour cette raison, on n'a paspoursuivi les recherches. Comme on l'a déjà indiqué, la dihydromocimycine s'est révélée être plus active que la mocimycine à l'égard de nombreux microorganismes et, par conséquent, on a étudié l'effet de cette substance sur le micro-organisme responsable de la dysenterie à tréponèmes. Il en est ressorti que la dihydromocimycine possède une activité nettement supérieure à celle de la tylosine à l'égard de ce micro-organisme et de plus qu'elle est activa à l'égard des souches résistantes à la tylosine. Ainsi, la dihydromocimycine peut être considérée comme un antibiotique supérieur à la tylosine ainsi qu'à la mocimycine pour le traitement de la dysenterie à tréponèmes. Suivant un autre aspect, l'invention a pour objet des aliments pour porc qui ont été additionnés d'ure proportion sensible de dihydromocimycine, éventuellement à l'état de sel par exemple de sel de sodium, L'antibiotique ou son sel de métal alcalin, d'ammonium ou d'amine peut de plus être dispersé ou mélangé dans tout véhicule ou diluant inerte approprié, physiologiquement inoffensif qui peut s'administrer par voie orale à un porc, qui ne réagit pas avec l'antibiotique et qui n'est pas nuisible au porc lors de l'administration par voie orale.Pour la prévention ou le traitement de la dysenterie à tréponèmes, une quantité efficace de dihydromocimycine dans un aliment pour porc est d'environ 10 à 220 ppa et de préférence 20 à 40 ppn sur base du poids de l'aliment. La dihydromocimycine obtenue par le mode opératoire décrit précédemment est une poudre fine donnant aisément de la poussière. Ceci peut poser des difficultés pour l'incorporation à l'aliment et il est donc préférable de former un mélange maître avec un ou plusieurs des constituants de l'aliment pour porc contenant, par exemple, 9 à 99 fois la quantité de dihydromocimycine requise, Des constituants appropriés pour la préparation du mélange maitre sont, par exemple, la farina de mais, la farine de pomme de terre et la farina de soya. Les expériences ont montré que la dihydromocimycine a une bonne stabilité à l'égard de la granulation (à savoir sous haute pression à une température élevée au moyen de vapeur d'eau). Le mélange maître peut être ajouté à l'aliment en vue de la prophylaxie ou bien pour le traitement de porcs qui ne souffrent que légèrement de la dysenterie à tréponèmas. Lorsque les porcs souffrent de la dysenterie à tréponames au point de perdra l'appétit ou bien que les porcs maiades sont empêchés de manger par les porcs bien portants la dihydromocimycine est de préférence administrée au moyen de l'eau de boisson, le plus avantageusement en présence d'un agent corrigeant la saveur, A cette fin, la dihydromocimycne est utili sée sous forme hydrosoluble, par exemple sous forme d'un sel, comme un sel de potassium, de sodium ou d'amine Les porcs souffrant d'unie dysenterie grave peuvent être traités par injection de dihydromocimycine ou d'un de ses se] hydroso lubies en suspension ou en solution dans Lr. liquide à injecter convenable, comme de la solution physiologique satine: du propylèneglycol, un mélange de glycérol et d'eau etc. La mocimycina, au contraire de ia dihydromccimycine, offre l'avantage de favoriser la croissance lors de son administration à un élevage de poulets ou d'autres animaux domestiques. On a donc également cherché à convertir la dihydromocimycine en la mocimycine qui est plus utile pour cette application. La demanderesse a ainsi découvert que la déshydrogénation de la dihydromocimycine peut être réalisée au moyen d'une substance et d'un mode opératoire pour la déshydrogénation de types particuliers. Les quinones, comme la 2,3-dicyano-5,6-dichloro-1,4-quinone, le p-chloranile ou l'o-chloranile, ne sont pas satisfaisants pour la déshydrogénation de la dihydromocimycine du fait qu'il se forme d'autres produits.L'halogénation au moyen de bromure cuivrique, de brome, d'iode ou de N-bromosuccinimide avec ensuite déshydrohalogénation ne donne pas non plus le résultat recherché, même en présence de catalyseurs, comme le peroxyde de benzoyle du 1'a,a-azo-isobutyronitrile. Les essais visant à déshydrogéner la dihydromocimycine par voie catalytique impliquent l'usage de températures trop élevées qui conduiraient à la décomposition de la dihydromocimycine. Un seul agent de déshydrogénation, à savoir le dioxyde de sélénium, s'est révélé utile pour sa déshydrogénation de la dihydromocimycine. La présente invention a donc également pour objet un procédé de déshydrogénation de la dihydromocimycine en mocimycine, suivant lequel on fait réagir la dihydromocimycine avec du dioxyde de sélénium. Ce procédé peut être appliqué avec avantage aux mélanges de dihydromocimycine et de mocimycine s'obtenant, par exemple, lors de l'isolement de la mocimycine des liquides de fermentation dans lesquels elle est formée. La déshydrogénation de la dihydromocimycine au moyen du dioxyde de sélénium peut être réalisée à la température ambiante, mais est de préférence exécutée à une température élevée, par exemple d'environ 65 à llO"C et de préférence de 80 à 95"C. La durée de réaction est d'environ 10 heures à 20 minutes dans l'intervalle de températures d'environ 65"C à llO"C, mais est de préférence d'environ 3 heures à 1 heure pour l'intervalle de températures préféré. A la température ambiante, la réaction demande environ 1 semaine. La réaction est de préférence exécutée dans un solvant. Des solvants appropriés sont, par exemple, lthexaméthylphosphoramide, le diméthylsulfoxyde, le t-butanol, l'alcool t-amylique, le s-butanol, l'hexylèneglycol, le n-butanol, l'isopropanol, l'éther monométhylique d'éthylèneglycol, le diméthylformamide, l'eau, le phénylméthylcarbinol et le propanol, de même que les mélanges de deux de ces solvants ou davantage. Les solvants préférés sont l'hexaméthylphosphoramide, le diméthylsulfoxyde et le t-butanol. La demanderesse préfère tout sépcîalement l'hexa- méthylphosphoramide. Pour la déshydrogénation, il est préférable de prendre le dioxyde de sélénium en quantité stoechiométrique ou en léger excès, sur base de la dihydromocimycine. Comme l'isolement des deux produits ensemble du milieu de fermentation est simple, alors que la séparation de la dihydromocimycine et de la mocimycine est beaucoup plus difficile, la découverte de la demanderesse que la dihydromocimycine peut être convertie par voie chimique en la mocimycine (en raison de la propriété intéressante de cette dernière à favoriser la croissance), même dans un mélange des deux composés, la mocimycine restant sensiblement Inchangée durant les opérations est très importante. I1 n'est donc pas nécessaire d'isoler les composés en vue de la déshydrogénation de la dihydromocimycine dans des mélanges contenant de la dihydromocimycine et de la mocimycine. L'invention est Illustrée par les e: Exemple 1 Préparation de la dihydromocimycine On met à fermenter Streptomyces ramocissimus CBS 190.69 dans 2.000 litres d'un milieu contenant 20 g de pâte maltée, 10 g d'extrait de levure et 5 g de solides de la liqueur de macération du mais par litre à un pH d'environ 7 sous agitation et avec aération. Au terme de la fermentation, on mélange le milieu de culture avec environ 2 7 de Dicalite qui est une perlite expansée, à savoir un silicate d'aluminium contenant du potassium, du sodium et des oligo-éléments, et qui sert d'auxiliaire de filtration, puis on filtre le mélange.On acidifie le filtrat au moyen d'acide sulfurique 8N jusqu'à pH 6,0 et on l'extrait alors à deux reprises avec 1/5 de son volume Qa méthylisobutylcécone en rompant les émulsions formées au moyen de la terre de diatomées vendue sous le nom de Hyflo Supercel comme auxiliaire de filtration. On mélange les liquides organiques et on concentre le mélange jusqu'à environ 1 litre par évaporation sous pression réduite à l'évaporateur rotatif. On isole un produit brut an ajoutant le concentré résultant à 5 fois son volume d'éther de pétrole bouillant dans l'intervalle de 40 à 600C et on isole par filtration le précipité formé au moyen d'un filtre en verre G 3.On lave le précipité avec de l'éther de pétrole frais et on le sèche pour obtenir une poudre de coulenr jaune contenant de la mocimycine et de la dihydromocimycine. On obtient de la manière suivante la dihydromocimycine sous une forme purifiée ne contenant pas plus de 5 %de mocimycine. On fait barboter de l'ammoniac gazeux dans le concentré à raison (1.0 150 litres par litre de concentré et par heure pendant 1 minute à 2 C. Il se forme un précipité qui contient la mocimycine. On sépare ce précipité par filtration et on traite encore une fois le filtrat avec de l'ammoniac gazeux pendant 10 à 15 minutas. On isole alors par filtration le précipité résultant qu'on dissout dans l'ammoniaque diluée à pH 9,0. On extrait cette solution avec un égal volume de chlorure de méthylène et on verse l'extrait dans 3 à 5 fois son propre volume de cyclohexane. On isole par filtration le précipité ainsi obtenu qu'on sèche et qu'on amène à l'état de poudre. On obtient le sel de sodium de la dihydromocir.lycine par dissolution de la dihydromocimycine dans de l'eau avec addition d'hydroxyde de sodium 0,1N jusqu'à pH 9 pour la formation d'une solution saturée. On filtre la solution et on évapore le filtrat par voie azéotropique avec addition de butanol (sous vide à environ 450C) en collectant le résidu butanolique dans une petite quantité de butanol anhydre. On ajoute de ltéther de pétrole goutte à goutte à la solution agitée jusqu'à pré cipitation de tout le sel. On sépare le précipité par filtation, ongle lave et on le sèche pour obtenir le sel de sodium de la dihydromocimycine. On prépare d'une manière semblable d'autres sels de la dihydromocimycine. Exemple 2 Préparation de la dihvdromocimycine avec des rendements plus élevés Pour augmenter le rendement en dihydromocimycine, on ensemence le contenu d'un erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml d'un milieu stérilisé qui comprend 20 g de pâte maltée, 10 g d'extrait de levure et 5 g de solides de la liqueur de macération du mais par litre d'eau de distribution à pH 7,0, au moyen d'une culture lyophilisée de Streptomyces ramocissimus CBS 190.69 ou d'une culture sur gélose bien sporulée de ce micro-organisme. Après incubation pendant 3 jours à 30 C sur une secoueuse rotative fonctionnant à 300 tours par minute avec une course de 2,5 cm, on utilise la culture résultante pour ensemencer de petits fermenteurs contenant 2 litres du milieu ci-dessus additionné de 20 mg de dichiorure de cobalt hexahydraté par litre. On réalise cette croissance également à 30 C avec une très bonne aération pour simuler ia production de dihydromocimycine. A cette fin, on fait barboter de l'air stérile dans le milieu de culture à raison de plus de 2 litres Far minute et on alite le milieu A une vitesse pouvant atteindre 1;000 tours par minute. a dihydromocimycine commence à être formée après environ 12 heures de fermentation, la production etant maximale après environ 120 heures. La fermentation à plies grande échelle est possible par utilisation d'un milieu de culture de 48 heures s'obtenant dans de petits fermenteurs comme inoculum pour les gros fermenteurs. On isole la dihydromocimycine résultante du milieu de culture de la manière suivante. Après addition de 2 % de terre de diatomées comme auxiliaire de filtration, on filtre la culture et on acidifie le filtrat avec de l'acide sulfurique 8N jusqu'a un pH de 5 à 6, puis on l'extrait à deux reprises avec 1/5 de son volume de méthylisobutylcétone. S'il se forme une émulsion, on rompt cette dernière par filtration du mélange après addition d'un peu de terre de diatomées. Cn collecte les phases organiques qu'on concentre sous vide jusqu'à environ le 1/10 du volume initial. On fait barboter de l'ammoniac gazeux dans la concentré à raison de 150 litres par litre de concentré et par heure pendant 1 minute. I1 se forme ainsi un précipité qu'on sépare par Filtration.On traite à nouveau le filtrat avec de l'ammoniac gazeux pendant 10 à 15 minutes. On dissout le précipité résultant dans l'ammoniaque diluée à pH 9,0 et on obtient la dihydromocimycine purifiée ne contenant pas plus de 5 20 de mocimycine par extraction de la solution dans l'ammoniaque avec un égal volume de chlorure de méthylène.On verse extrait dans 3 à 5 fois son propre volume de cyclohexane et on isole par filtration le précipité résultant qu'on sèche et qu'onamène à l'état de poudre. @ EXEMPLE 3 Utilisation de la dihydromocimycine contre la dysenterie à tréponèmes On infecte vingt porcs de 3 mois avec le micro-organisme provoquant la dysenterie à tréponèmes en leur administrant de la nourriture à laquelle est incorporé un mélange homogène du contenu de l'intestin et des muqueuses intestinales de deux animaux souffrant de la maladie. On répartit les porcs infectés en quatre groupes de cinq animaux chacun et on les nourrit avec l'aliment à l'état de suspension diluée dans la rapport 1 : 1 avec de l'eau pendant semaine.La quantité totale de nourriture par animal esc de 1,2 kg par jour se donnant en deux fois. Après 5 jours, on nbsere les premiers symptômes de la maladie, à savoir des selles molles, et on confirme la diagnostic par examen microhiologique des selles Après 1 semaine. on traite les animaux de la-manière suivante groupe 1 : on ne mélange pas d'antibiotique à la nourrIture; groupe 2 : on mélange 100 ppm de tylosine à la nourriture; groupe 3 : on mélange 25 ppm de dihydromocimycine à la nourriture; groupe 4 : on mélange 50 ppm de dihydromocimycine à la nourriture. On administre pendant l semaine, la nourriture enrichie en antibiotique. Au terme de cette semaine, on donne à nouveau la. nourriture exempte d'antibiotique. observe la convalescence par mesure du poids de l'animal et par examen de prélèvement des selles macroscopiquement (consistance) et microscopiquement (au moyen d'une technique d'immuno- fluorescence spécifique). Au cours de l'essai un un animal de chacun des groupes 1, 3 et 4 meurt. Les résultats sont repris au tableau ci-après dans lequel les poids sont la moyenne des poids des animaux encore vivants au moment de la détermination. La consistance des selles est indiquée de la manière suivante + : selles liquides molles; + : selles liquides épaisses; - : selles normales. Les résultats de la technique d'immunofluorescence sont donnés quantitativement par indication du nombre de tréponèmes dans le champ examiné : 5 = très abondants ; 4 = nombreux; 3 = environ 10 tréponèmes; 2 = 1 ou 2 tréponèmes; 1 = plusieurs champs à regarder pour trouver 1 tréponème; - = pas de tréponème. groupe 1 groupe 2 groupe 3 - groupe. 4 Poids en kg juste avant l'infection 24,6 24,4 24,2 23,4 après 1 semaine (1) 23,7 22,2 21,3 21,6 après 2 semaines 20,9 21,4 20,2 21,2 après 3 semaines 19,8 23,2 24,0 23,0 Consistance des selles après 1 semaine + + + + + + + + + - + + + + * + + + + + après 2 semaines + + + + + + + + + + + + ~ + + + + * + + après 3 semaines + + + + * + + + + + - - + + - - + Immunofluorescence après 1 semaine 4 4 4 4 5 4 4 3 4 - 5 4 5 5 * 5 - 5 3 3 après 2 semaines 4 4 4 - 4 4 4 2 2 - 4 4 3 1 2 - * 4 1 après 3 semaines 2 2 2 2 * 3 - - 2 - - - - 1 - - - moment auquel l'antibiotique commence à être administré * un animal meurt la consistance des selles, de même que les résultats de l'immunofluorescence montrent que les animaux traités par la dihydromocimycine guérissent nettement plus vite que ceux traités par la tylosine. Il ressort des doses.adminisrées que la dihydromocimycine est au moins 4 fois aussi active que la tylosine. Exemple 4 Utilisation de la dihydromocimycine contre la dysenterie a tréponèmes On traite des porcs provenant d'une ferme dans laquelle des difficultés pour l'élevage étaient apparues depuis quelque temps, sous le contrôle du vétérinaire de la région et de l'inspecteur du service de santé. On répartît les porcs en groupes qu'on traite pendant 4 jours de la manière suivante groupe 1 : à 66 porcs, on donne de la nourriture contenant 100 ppm de tylosine groupe 2 : à 34 porcs, on donne de la nourriture contenant 25 ppm de dihydr mocimycine groupe 3 : à 40 porcs, on donne de la nourriture contenant 50 ppm de dihydro mocimycine groupe 4 : à 40 porcs, on donne de la nourriture contenant 100 ppm de dihydromocimycine. Avant le traitement, tous les animaux ont des selles molles à très molles. On examine des échantillons de ces selles qui se révèlent concenir des tréponèmes, mais être exempts de Salmonella. Parfois, on décèle la présence d'oeufs de vers. Un jour après le début du traitement, les selles des porcs du groupe 4 sont normales. Les porcs du groupe i guérissent seulement après 3 à 4 jours. Les animaux des groupes 2 et 3 guérissent en des délais qui sont intermédiaires de ceux requis-pour les groupes 1 e '. Les animaux traités par la dihydromocimycine apparaissent beaucoup plus vivants qu'avant le traitement. Les animaux ne sont pas dégoûtés par les aliments contenant la dihydromocimycine et la conclusion générale est qu'une dose de 25 ppm de dihydromoclmycine a un meilleur effet qu'une dosa de 100 ppnî de tylosine pour la guérison de la dysenterie à tréponèmes. Exemple 5 Déshydrogénation de la dihydromocimycine On dissout 1 g de dihydromocimycine dans 15 r.l d'hexamethylphosphoramide de qualité technique, séché sur un tamis moléculaire 3A, et on ajoute à la solution 139 mg (1,25 mmole) de dioxyde de sélénium. On chauffe le mélange au bain de vapeur pendant 100 minutes en ajoutant après 60 minutes un supplément de 139 mg de dioxyde de sélénium. On sépare par filtration sur un filtre en verre G4 le sélénium formé, après refroidissement, et on lave le précipité avec une petite quantité de méthanol. On verse le filtrat dans 350 ml d'eau distillée et on isole par filtration le précipité résultant qu'on lave à l'eau distillée. On conserve ce filtrait. On dissout le précipité dans du méthanol et on dilue la solution avec de la méthylisobutylcétone. On évapore la solution à 400C sous pression réduite jusqu'à élimination du'méthanol et de l'eau Il se forme un précipité qui est exempt de mocimycine, comme le montre la chromatrographie en couche mince, et qui ne contient que des impuretés polaires. On isole par filtration le précipité qu'on lave à la méthylisobutylcétone. On ajoute le filtrat goutte à goutte à un excès d'éther de pétrole bouillant de 40 à 60 C et on sépare par filtration le précipité résultant qu'on lave à l'éther de pétrole et qu'on sèche pour obtenir 500 mg de produit. On extrait le filtrat conservé précédemment au moyen de méthylisobutylcétone et on ajoute l'extrait résultant goutte à goutte à de l'éther de pétrole pour obtenir encore 100 mg de produit ayant la même qualité et qui s'obtient donc au total à raison de 600 mg. La chromatographie en couche mince montre que le produit final contient de la mocinycine avec seulement une trace de dihydromocimycine. Exemple 6 Déshydrogénation de la dihydromocimycine On réalise cette expérience en double. On dissout 2,4 g d'une composition contenant 22,8 % de mocimycine et 35,5 % de dihydromo cimycine dans 50 ml d'hexaméthylphosphoramide. On ajoute 350 mg de dioxyde de sélénium et on conserve le mélange sous agitation à 1050C pendant 45 minutes. La chromatographie en couche mince montre l'absence de dihydromocimycine. On refroidit le mélange jusqu'd la température ambiante et on le filtre dans un filtre en verre G4 pour séparer le noir de sélénium résultant ainsi qu'une petite quantité de dioxyde de sélénium inchangé. On lave le précipité à la- méthylisohutylcétone et on ajoute 350 ml d'eau, 10 g de chlorure de sodium et 5 ml d'acide chlorhydrique 4N au mélange de filtrat et de liqueur de méthylisobutylcétone de lavage. On extrait le mélange avec 3 fractions de 100 ml de méthylisobutylcétone. On mélange les extraits dans la méthylisobutylcétone et on les lave avec 100 ml d'eau, puis on sépare la phase aqueuse. On sèche la phase dans la méthylisobutylcétone sur du sulfate de magnésium anhydre qu'on lave finalement avec un peu de méthylisobutylcétone. On évapore alors la phase dans la méthylisobutylcétone sous vide a environ 200C jusqu'd obtenir un résidu de 25 ml. On ajoute ce résidu goutte à goutte à 500 ml d'éther de pétrole bouillant de 40 à 600C sous agitation et on isole par filtration le précipité résultant qu'on lave à 11 éther de pétrole bouillant de 40 à 6O0C et qu'on sèche dans une étuve sous vide à la température ambiante jusqu'au lendemain. Au cours de la première expérience, on obtient 1,64 g d'un produit contenant 41,2 i de mocimycine et, en quantité inférieure ou égale à 2 %, de la dihydromocimycine (comme le montre la chromatographie en phase liquide sous haute pression). Au cours de la seconde expérience, on obtient 1,79 g d'un produit contenant 41,6 % de mocimycine et, en quantité inférieure ou égale à 1 %, de la dihydromocimycine. Exemple 7 Déshydrogénation de la dihydromocimycine effet des solvants Dans cet exemple, on étudie divers solvants en vue de déterminer celui qui est préférable pour la déshydrogénation de la dihydromocimycine. Pour toutes les expériences, on fait réagir 50 mg d'une préparation contenant de la dihydromocimycine et de la mocimycine avec 20 mg (0,18 mmole) de dioxyde de sélenium dans 3 ml de solvant à 80 C. On prélève un échantillon 2 heures, 4 heures et 7 heures après le début de l'expérience en vue de ltexaminer par chromatographie en couche mince, si nécessaire après préparation, sur une pastille de "Kieselgel" 60 de la Société Merck, avec un mélange 50 : 45 : 5 de méthylisobutylcétone, d'acétone et d'eau comme éluant. On décèle les taches par carbonisation après pulvérisation d'un mélange d'acide sulfurique et d'éther diéthylique. On obtient ainsi une évaluation qualitative de la réaction. Les résultats sont les suivait. On obtient une décomposition ou pas de réaction dans l'alcool propargylique, le diacétonealcool, le nitrométhane, le carbonate de propylène, l'acétonitrile, la pyridine, le sulfolane, l'alcool benzylique, l'oxyde de mésityle, le carbonate d'éthylène, la N-méthyl-2-pyrrolidone; le N,N-diméthylacétamide, le dioxanne, la méthylisobutylcétone, l'acétate du butyle, l'acétate d'amyle, le Nméthylacétamide, l'anisole, l'éther diméthylique de diéthylèneglycol et le l,2-dichloroéthane.On obtient une conversion médiocre dans la tétraméthylurée, un tampon 0,1M de NaHCO3 /Na2CO3 à pH 9,1, le n-propanol, le phénylméthylcarbinol, l'eau et le diméthylformamide. Gn obtient une conversion quelque peu meilleure dans l'éther méthylique d'éthylèneglycol, l'isopropanol, le n-butanol, l'hyxylèneglycol, le s-butanol et l'alcool t-amylique. On obtient une conversion modérée dans le t-butamol et le diméthylsulfoxyde. Les meilleurs résultats sont obtenus avec l'hexaméthylphosphoramide. EXEMPLE 8 Déshydrogénation de la dihydromocimycine dans des mélanges de solvants. Pour cet exemple, on étudie des mélanges de solvants avec l'hexaméthylphosphoramide pour déterminer le mélange préférable pour la déshydrogénation de la dihydromocimycine. Pour chacune des expériences, on prend 2,4 g de la préparation de départ pour l'exemple 7. Après la réaction (c'est-à-dire après conversion de toute la dihydromocimycine comme le montre la chromatographie en couche mince), on traite les mélanges de la manière suivante. Après refroidissement, on filtre le mélange de réaction dans un filtre en verre C4 pour séparer le sélénium formé et on lave le filtre avec un peu de méthanol. On verse le filtrat dans un excès d'eau et on acidifie le mélange jusqu'a pH 3, puis on l'extrait à 3 reprises avec 1/4 de son volume de méthylisobutylcétone. il se forme une intercouche goudronneuse qu'on extrait à la méthylisobutylcétone, à nouveau par dissolution d'abord dans le méthanol, puis dilution avec la méthylisobutylcétone et ensuite avec de l'eau. On combine les extraits dans la méthylisobutylcétone et on les lave à 3 reprises avec 1/3 du volume d'eau, puis on concentre la phase organique sous vide à environ 400C. Dans tous les cas, il se forme un précipité qui consiste essentiellement en produits de décomposition, comme la montre la chromatographie en couche mince. On sépare le précipité par filtration et on le lave à la méthylisobutylcétone, puis on ajoute lentement le mélange des concentrés de méthylisobutylcétone sous agitation à un excès d'éther de pétrole bouillant de 40 à 60"C. On sépare par filtration le précipité résultant qu'on lave à l'éther de pétrole et qu'on sécha. Les résultats des expériences sont mentionnés au tableau ci-après. I1 ressort du tableau qu'on obtient le rendement le plus élevé, à savoir de 79 %, lors de l'utilisation d'hexaméthylphos phorami de pur comme solvant. On obtient également unrendement élevé avec un mélange d'hexaméthylphosphoramide et d'alcool t-amylique. TABLEAU Solvant Tem- Durée Quantité et moment* R SeO@/mélange nature et péra- globale quantité @ure (h) ( C) HMPT, 25 ml 90 2 0,5 début + 42 3 : H20, 35 ml 0,5 après 55 minutes HMPT, 15 ml 90 | 2 3/4 0,1 début 50 1,2 : I Tampon 0,1M 0,1 après 20 minutes NaHCO3-Na2CO3 0,1 après 85 minutes à pH 9,1, 0,1 après 130 minutes 25 ml 0,1 après 1@0 minutes t-BuOH, 20 ml 84 3 0,1 début 42 1,5 : 1 HMPT, 10 ml 0,1 après 25 minutes 0,1 après 45 minutes 0,1 après 75 minutes 0,1 après 120 minutes t-AmOH, 100 ml 96 3 0,35 début 71 3,2 : 1 HMPT, 50 ml 0,35 après 70 minutes 0,35 après 110 minutes t-AmOH, 150 ml 96 3 0,35 début 55 3,2 : l 0,35 après 75 minutes 0,35 après 15D minutes t-BuOH, 100 ml 80 2 1,0 début 42 6 : 1 1,0 après 35 minutes HMPT, 50 ml 95 arrêt 0,4 début 79 1,2 après 1 h. Notes HMPT : hexaméthylphosphoramide t-BuOH = t-butanol t-AmOH = alcool t-amylique * = SeO2, quantité ajoutée en g et moment de l'addition après le début de la réaction R = Rendement, % en poids SeO2/ mélange = SeO2, moles par mole de mélange. REVENDICATIONS 1. Nouveau composé, caractérisé en ce qu'il consiste en la dihydromocimycine de formule ou en un sel non toxique pharmaceutiquement acceptable de ce composé. 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le sel est un sel de métal alcalin, le sel d'ammonium ou un sel d'amine. 3. Procédé de préparation de la dihydromocimycine selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on cultive en milieu aérobie la souche Streptomyces ramocissimus CBS 190.69 ou un de ses mutants produisant de la dihydromocimycine, dans un milieu nutritif aqueux qui contient des sources assimilables de carbone, d'azote et de substances inorganiques et on sépare la dihydromocimycine formée durant la culture. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'aération est réalisée avec 1 à 3 litres d'air'par 2 litres de milieu culture et par minute. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'aération est réalisée avec 1,5 à 2,5 litres d'air par 2 litres de milieu de culture et par minute. 6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le milieu de culture contient en faible concentration des ions fer, des ions cobalt ou des ions nickel. 7. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la séparation d'avec la mocimycine est réalisée au moyen d'un composé alcalin, comme-l'ammoniac, le méthylate de sodium ou la triéthylamina. 8. Procédé de déshydrogénation de la dihydromocimycine en mocimycine, caractérisé en ce qu'on fait réagir la dihydromocimycine avec du dioxyde de sélénium.