Brevet FR2291212A1 — publié le 19760611

L'invention concerne un nouveau composé de la famille des acides nucléiques et plus particulièrement un nouveau dérivé de la guanosine, désigné sous le nom de (2'-amino-2'-déoxypento- furanosyl)-guanine. Selon l'invention, on a découvert que certains microorganismes, de l'espèce Aerobacter sont capables de produire une nouvelle substance, qui présente des caractéristiques semblables à celles de la guanosine, telles que déterminées par la chromatographie sur papier, le spectre d'absorption en W etc... Après son isolation et identification, on a pu confirmer que la substance produite est un nouveau dérivé de la guanosine, utilisable de façon analogue aux autres dérivés de la guanosine. L'invention concerne également le procédé de fabrication par fermentation du nouveau dérivé de la guanosine. Le nouveau composé de l'invention a pour formule générale (désignée ci-après sous l'abréviation de 2'-APG) que l'on peut aisément isoler sous forme de cristaux, en forme de plaques, blancs et de nature alcaline, par concentration sous pression réduite de sa solution dans un solvant convenable tel que, par exemple, l'eau. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la descrip tion suivante et à l'examen des exemples et dessins annexés. Sur ces dessins, la figure 1 représente le spectre de résonance magnétique nucléaire de la 2'-APG ; la figure 2 représente son spectre d'absorption W, et la figure 3 représente son spectre d'absorption IR. Le nouveau dérivé de guanosine de l'invention présente les valeurs maximales suivantes d'absoption en W, comme représenté à la figure 2 à(mv) dans 253 solution aqueuse neutre 256 solution 0,lN HC1 258 et 266 solution O,lN NaOH Les valeurs de Rf du dérivé de guanosine de l'invention, dans une chromatographie sur papier (en utilisant le papier filtre nO 50 vendu par la société dite Toyo Roshi Kabushiki Kaisha, Japon) sont les suivantes Rf développé par 0,22 n-butanol : acide acétique : eau (4:1:2) 0,35 isopropanol : HC1 (65:16,7) avec addition d'eau en q.s. pour 100 0,51 éthanol : acétate d'ammonium 1N (75:30) En ce qui concerne la couleur, les essais à l'orcinol et à la diphénylamine sont négatifs. L'analyse élémentaire, la formule empirique et le poids moléculaire fournissent les données suivantes Analyse : C : 42,60 H : 4,95 N : 29,81 Formule : C10 H14 6 04 Poids moléculaire : 282,26 quand on hydrolyse le composé de l'invention par 1N, HC1 pendant 1 heure dans un bain d'eau bouillante, on observe, par chromatographie sur papier, la formation suivante d'aminopentose développé par position de Rf n-butanol : pyridine : eau (6:4:3) à 0,28 n-butanol:acétate d'éthyle:eau (7:1:2) 0,42 n-butanol:acide acétique:eau (4:1:2) 0,31 Les réactions colorées de l'aminopentose sont les suivantes, qui confirment l'existence du 2'-aminopentose. Couleur par rose réactif p-anisidine pourpre réactif ninhydrine rose procédé Elson-Morgan bleu réaction de Teuji-Kinoshita D e plus, les données du spectre IR et de résonance magnétique nucléaire permettent aussi d'identifier le nouveau composé de l'invention. Le composé de l'invention est donc d'une excellente activité physiologique et ne présente aucun pouvoir toxique, lorsqu'administré par exemple dans la cavité abdominale de souris du type DD, à la dose de 800 mg par kg de souris. I1 présente une activité anticancéreuse par administration intraveineuse, continue pendant 8 jours, à la dose de 120 mg/kg/jour, à une souris à laquelle on a innoculé un cancer du type solide Salcoma 180 ; à la dose de lOmcg/ml, il inhibe la croissance in vitro de cellules cancéreuses HeLa 83. On hydrolyse 400mg de 2' -APG cristallin, par 'N, HCl, à 1000C pendant 1 heure, on fait passer sur une résine échangeuse d'ions, du type H+ (vendue sous la dénomination commerciale de Dowex 50w par la société dite Dowex Chemical Inc.USA) et on isole la fraction sucre du 2'-APG sous forme d'hydrochlorure, qui est ensuite cristallisé dans une solution de méthanolacétone, pour donner 100 mg de cristaux. Leur température de décomposition est de 143-1500C et l'angle de rotation optique est [&alpha;]D 27 = + 13 4 (initial, extrapolé) -F-3,5 (C=0,75, H20). Par comparaison de ces résultats avec les valeurs standard de la 2-aminopentose synthétique, on trouve que la fraction sucre du 2'-APGest le D2-amino-2-déoxyribose. L'angle de rotation optique du 2'-APG de l'invention est [&alpha;]D26 = - 56,6 (C = 0,5, H2O). D'autre part, l'angle de rotation optique de la guanosine (9b-ribofuranosyl-guanine) est [&alpha;]D26 = - 72 (C = 1,4 0,1N NaOH). Les angles de rotation optique des adénosines, qui sont des composés analogues du 2'-APG sont les suivants i) 9-B-adénosine [&alpha;]D11 = - 61,7 (C = 0,706, H2O) D - ii) 9- -2'-amino-2'-déoxyadénosine [&alpha;]D23 = + 90 2 (C = 0,635, méthanol) iii) 9--2'-amino-2'-déoxyadénosine 22 = -66 t 20 (C = 0,98, méthanol) D Les données ci-dessus confirment que le 2'-APG de l'invention présente une configuration . On peut utiliser l'un quelconque des micro-organismes de l'espèce Aerobacter (Enterobacter) dans le procédé de fermentation de l'invention, les espèces préférables étant Aerobacter cloacae (Enterobacter cloacae) (FERM-P n 1893). Les sources de carbone convenant au milieu de culture comprennent des carbohydrates comme le glucose, le sucrose, l'amidon, le sorbitol, etc... des alcools et des acides organiques comme l'acide acétique, etc... Les sources d'azote comprennent, par exemple, des dérivés azotés minéraux, comme le sulfate d'ammonium, et organiques, comme des extraits de viande ou de levure, la peptone, etc... Dans le procédé de l'invention, on stérilise le milieu de culture contenant les sources de carbone et d'azote précitées, des composés minéraux comme desphophates, sulfates, chlorhydes se s métalliques de fer, manganese, magnésium, potasslum, drayes sodium, etc... et des agents promoteurs de croissance on innocule ensuite ce milieu avec le micro-organisme, dans des conditions de culture aérobie. On peut augmenter le rendement du procédé en ajoutant au milieu des nucléotides puriques comme les acides inosinique, xanthylique, guanylique, etc... ou leurs précurseurs. On peut effectuer la culture à une température de 20 à 400C et un pH de 5 à 8, de préférence 6 à 7, ajusté par addition d'une solution d'urée, une solution aqueuse d'ammoniaque ou de carbonate d'ammonium. La culture est terminée lorsque-la quantité de 2'-APG produit atteint un maximum, généralement atteint en une durée de 1 à 7 jours. Pour isoler le 2'-APG, on sépare les cellules du milieu de culture par centrifugation ou filtration, puis on récupère le 2'APG dans la liqueur de culture en faisant passer ceBe-ci à travers une résine échangeuse d'ions acide pour absorber sélectivement le 2'-APG. Si nécessaire, on peut utiliser des agents absorbants. On élue de 2'-APG à l'aide d'eau ou d'ammoniaque, par exemple, puis on concentre l'éluat sous pression réduite pour obtenir le 2'-APG purifié et cristallin. Les micro-organismes désignés ici sont disponibles au "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial and Technology, Japon". L'invention est encore illustrée par les exemples non limitatifs suivants de plusieurs modes de réalisation de l'invention. EXEMPLE 1 On inocule Aerobacter cloacae (Enterobacter cloacae) (FERM-P nO 1893) pour ensemencer un milieu de culture composé d'extrait de viande (1,0 %), de peptone (1,0 %), d'extrait de levure (0,3 %), de sel de table (0,3 %) et de sorbitol (2,0 %). On ajuste le pH du milieu de culture à 7,3 avant sa stérilisation, et on effectue la culture à 300C pendant 24 heures, tout en secouant. On place la semence obtenue dans un flacon de 2 litres, dit de Florence, contenant un milieu de fermentation de composition suivante sucrose 10,0 % extrait de levure 0, 1 % sulfate d'ammonium 1,0 % KCl 0,8 % MgSO4 0,1 K2 % HPO4 0,02 % FeS04 40mg/l ZnS04 3mg/l On ajuste le pH du milieu de fermentation à 7,0 avant stérilisation et on effectue la culture à 300C pendant 24heures, en utilisant la méthode de secousses rotatives, pour obtenir 205 mg de 2'-APG par litre de liqueur fermentée, que l'on centrifuge pour séparer la solution surnageante.On fait passer cette solution (3 litres) à travers une colonne de résine échangeuse d'ions, faiblement acide, sous la forme H, (vendue sous la dénomination commerciale d'Amberlite IRC-50 par la société dite Rohm & Haas, U.S.A.), puis on élue avec de l'ammoniaque 0, 5N, on fait passer à travers une colonne de résine échangeuse d'ions, fortement acide, sous forme NH4 (vendue sous la dénomination commerciale Diaion SK 1S par la société dite Mitsubishi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha, Japon), Après concentration, la solution est reprise par de l'ammoniaque (10mM) et on élue avec de l'ammoniaque(lOmM)S qu'on fait passer à travers une colonne remplie d'un agent synthétique absorbant (vendu sous la dénomination commerciale de Diaion HP par la société dite Mitsubishi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha, Japon). On recueille la fraction éluée contenant le 2'-APG, on la concentre et on ajoute une quantité 10 fois supérieure d'acétone. On concentre le liquide surnageant pour obtenir des cristaux de 2'-APG (440 mg) ayant un point de fusion à 252-2540C (décomposition). EXEMPLE 2. On effectue la culture en répétant le processus de l'exemple 1, sauf que l'on ajoute de l'inosinate de sodium (0,5 g/ litre) au milieu de fermentation. On obtient 660 mg de 2'-APG par litre de liqueur fermentée. EXEMPLE 3. On prépare le milieu d'ensemencement comme dans l'exemple 1, sauf que l'on cultive la semence pendant 15 heures avant de la transvaser dans une jarre de fermentation de 30 litres, contenant 18 litres d'un milieu de fermentation, de meme composition que celui décrit dans l'exemple 1. Le rapport d'inoculation est de 5 %, par rapport à la quantité du milieu de fermentation. Au cours de la fermentation, effectuée à 30 C pendant 24 heures, tout en secouant (350 tours-minute) et sous aération (1 litre d'air stérilisé par litre du milieu), on règle le pH du milieu à 6,5 - 7,0 par l'ammoniaque. Après la fin de la culture, la liqueur fermentée contient 300 mg/litre de 2'-APG. En traitant la liqueur fermentée comme décrit dans 1'exemple 1, on obtient des cristaux de 2'-APG (2,9 g). EXEMPLE 4/ On effectue la culture comme décrit dans 1' exemple 3, excepté que l'on ajoute de l'acide xanthylique, sous forme de son sel de sodium, au milieu de fermentation, à la concentra tion de lg/litre. Après la fin de la fermentation, on obtient 80q mg de 2'-APG par litre de liqueur fermentée, que l'on traite ensuite comme dans l'exemple 1, pour obtenir 9,2 g de cristaux de 2'-APG. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples donnés ci-dessus, elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans s'écarter pour cela de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1.- Composé (2'-amino-2'-déoxypentofuranosyl)-guanine corres pondant à la formule générale : HO NEZ HHÂH 2.- Composé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est préparé par fermentation. 3.- Procédé pour la fabrication de(2'-amino-2'-déoxypentofuranosyl)-guanine, caractérisé en ce qu'on cultive un microorganisme capable de produire la (2'-amino-2'-déoxypentofuranosyl)-guanine, appartenant à l'espèce Aerobacter, dans un milieu de culture et que l'on sépare le produit obtenu accumulé dans la liqueur fermentée. 4.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le micro-organisme appartient à la famille Aerobacter cloacae. 5.- Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le micro-organisme est Aerobacter cloacae (FERM-P nO 1893). 6.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on effectue la culture entre 20 et 400C et à un pH de 5 à 8. 7.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le milieu de culture contient une source de carbone, une source d'azote et des composés minéraux.