Brevet FR2307779A1 — publié le 19761112

La présente invention se rapporte à la séparation de polyphénols d'origine végétale et plus particulièrement celle des tannins, des catéchines, des leucocyanidines et de leurs dérivés à partir d'extraits végétaux bruts. Les polyphénols d'origine végétale possèdent des propriétés qui rendent leur application intéressante dans plusieurs domaines industriels. Du fait de leur grand pouvoir réducteur, ils sont utilisés fréquemment comme antioxydants dans l'industrie alimentaire. Les catéchines et les leucoanthocyanidols possèdent également des propriétés intéressant l'industrie pharmaceutique, car ils améliorent la perméabilité des vaisseaux capillaires (Voir MBSQUELLIER et TAYEAU, Bull. Trav. Soc. Pharm. Bordeaux 88, 168, 1950) et présentent ne activité antiinflammatoire (Voir BONNAMEAUX et LECOMPTE, Comput R. Soc. Biol. 149, 1062, 1955). En outre, les leucoanthocyanidols ainsi que leurs oligo- et polymères peuvent être utilisés en tant que médicaments pour le traitement préventif des tumeurs (Voir BUCHATTER et COLT, J. Pharm. Sci., 56, 1033, 1967). Les sources végétales des polyphénols précités sont constituées notamment par l'écorce de pin maritime, les grains de Colophyllum, le fruit de Sapoto, les fougères, les gymnospermes, les monocotylédons, les grains de cacao et le résidu du traitement des arachides, (Voir NAIRET et Coll., Current Sci., India, n , 336, 1964 ; BATE- SMITHS, Biochem. J., 58, 122, 1954 ; FORSYTH, Biochem J., 51, 511, 1952 et MASQUELLIER et TAYEAU, Bull. Trav. Soc. Pharm. Bordeaux, 88, 168, 1950). Les extraits polyphénoliques de ces végétaux s'obtiennent le plus souvent par extraction à l'acétone, à l'éthanol ou à l'acide chlorhydrique dilué. On connatt des procédés de séparation des catéchines et de leurs oligomères, des hydroxycatéchines et des anthocyanidines qui consistent par exemple, à soumettre les extraits végétaux à une extraction fractionnée basée sur le principe de la distribution à contre-courant, puis à purifier les fractions recueillies par chromatographie sur une colonne de cellulose en poudre (Voir FORSYTH., Biochem. J. 60, 108, 1955).Une autre méthode de séparation consiste à recueillir, par exemple, le leucocyanidol dans la phase aqueuse au cours de l'extraction à contre-courant en utilisant en tant que solvant un mélange comprenant une partie en volume d'alcool amylique, une partie en volume de benzène et une solution d'acide chlorhydrique 0,1 N. Le leucocyanidol ainsi recueilli est dissous dans l'acétone, puis précipité par l'éther éthylique. Les procédés de séparation précités présentent les inconvénient s suivants : - les leucocyanidines et les catéchines ont tendance à se décomposer aux Ph alcalins ou légèrement acides des milieux de séparation utilisés. De plus, les leucoanthocyanidols entrent facilement en réaction de condensation avec d'autres polyphénols et ils sont sujets également à l'autocondensation. Les conditions opératoires décrites dans les procédés précités n'évitent pas la réaction de polycondensation. Par ailleurs, la purification par chromatographie ainsi que l'extraction fractionnée basée sur le principe de la distribution à contre-courant sont des méthodes coûteuses et peuadaptées à la production industrielle. Le but de la présente invention est de fournir un procédé de séparation de polyphénols ne présentant pas les inconvénients précités. Suivant l'invention, le procédé de séparation de polyphénols tels que monomères ou oligomères de catéchines, de leucocyanidols et de leurs dérivés à partir d'un extrait végétal, est caractérisé en ce qu'on traite l'extrait végétal par de la bétavne base, en milieu alcoolique pour obtenir des bétainates de polyphénols et en ce qu'on sépare ces bétainates de polyphénols par précipitation fractionnée. Le procédé selon l'invention présente de nombreux avantages par rapport aux techniques antérieures. Il ne fait pas appel en particulier aux techniques conteuses de séparation chromatographique et d'extraction selon la distribution à contre-courant. Ires bétainates formés présentent une grande stabilité due à l'action stabilisante de la bétaine. En outre, la solubilité dans l'eau des bétainates de polyphénols est plus élevée que celle des polyphénols seuls, ce qui facilite la séparation et le conditionne sent des polyphénols sous forme de solutions aqueuses en vue de leur application industrielle ou pharmaceutique. On a constaté d'autre part que les complexes qui se forment par réaction de la bétoine base sur les polyphénols présentent des solubilités différentes dans les solvants organiques, en fonction de la nature chimique du composé polyphénolique. Grâce aux différences de solubilités, on peut effectuer aisément la séparation des différents polyphénols, par précipitation fractionnée. Selon une version avantageuse du procédé selon l'invention, l'extrait végétal est traité par une quantité de bétoine base correspondant sensiblement à la quantité stoechiométrique de polyphénols contenus dans l'extrait végétal. b. préférence, la quantité d'alcool ajoutée à l'extrait vAg4- tal est telle que la solution alcoolique contienne entre 2 et 10% en poida de polyphénols, cet alcool étant avantageusement un alcool aliphatique ayant entre 2 et 4 atones de carbone tel que l'éthanol, l'isoprcpanol et le n- butanol. Selon une version préférée du procédé selon l'invention, la séparation par précipitation fractionnée des différents bétaïnates de polyphénols est réalisée selon les étapes successives suivantes - Dans une première étape, on réalise la précipitation des bétanates les moins solubles dans l'alcool utilisé, c'eat-à-dire les bétannates de tannins et les bétaSnRtes d'oligomères de cat4- chines en diluant la solution obtenue apyres addition de la bétatne base par 0,5 à 1,5 volume d'alcool aliphatique ayant 3 à 5 atomes de carbone et on sépare le précipité obtenu. - Dans une seconde étape du procédé, le filtrat recueilli après séparation du précipité de bétaïnates de tannins et de bétaï- nates de catéchines est de nouveau dilué par 2 à 3 volumes d'alcool aliphatique ayant 3 à 5 atomes de carbone afin de précipiter le bétaïnate du dimère de leucocyanidol. - Dans une troisième étape du procédé, le filtrat recueilli après séparation du bétaïnate du digère de leucocyanidol est dilué par 1 à 3 volumes d'alcool aliphatique ayant de 4 à 5 atomes de carbone pour précipiter le bétaïnate de leucoanthocyanidol. - Dans une quatrième étape du procédé, on ajoute au filtrat obtenu à l'issue de la troisième étape, 0,5 à 4 volumes d'éther éthylique d'une cétone aliphatique ou d'un ester aliphatique ayant entre 3 et 5 atomes de carbone et on précipite ainsi le bétaïnate de catéchine. Selon une variante du procédé selon l'invention, on peut réduire la quantité d'alcools utilisés pour la précipitation en procédant comme suit - Dans une première étape, le filtrat obtenu après séparation des bdtaSnates de tannins et des oligomères de catéchines est éva poré sous vide et les bUtaRnates de polyphénols monomères sont extraits du résidu d'évaporation au moyen d'un alcool ayant entre 2 et 3 atomes de carbone ou d'un mélange de ces alcools renfermant au moins 50% d'éthanol. - Dans une seconde étape, on précipite le bétatnate de leucoanthocyanidol en ajoutant 0,1 à 1 volume d'alcool aliphatique ayant 3 ou 4 atomes de carbone au filtrat obtenu après séparation des oligomères supérieurs à digère de polyphénol. - Dans une troisième étape, on précipite le bétainate de catéchine en ajoutant 0,1 à 1 volume d'ester aliphatique ayant de 3 à 5 atomes de carbone au filtrat obtenu après précipitation du bdtaInate de leucoanthocyanidol. Le bétaïnate de catéchine obtenu est cristallisé à partir de sa solution et il est identifié par son point de fusion compris entre 200 et 205C et par sa raie d'absorption à 280 millimicrons. Les différents bUtainatea de polyphénols peuvent Otre transformés en polyphénols purs selon les méthodes suivantes : - On fait passer une solution aqueuse de bdtainate de polyphénol sur une colonne échangeuse de cations appropriée et on recueille le polyphénol dans l'éluat. En variante, on peut hydrolyser la solution aqueuse de bétaflate de polyphénol en chauffant à une température comprise entre 30 et 80 C pour faire précipiter le polyphénol pur. À titre d'exemple non limitatif, on décrit ci-après un mode de réalisation du procédé selon l'invention appliqué à l'extrait de pin maritime. L'écorce de pin est tout d'abord traitée de façon connue (Voir TAYEAU et MASQUELLIER, Bull. Soc. Chim. 15, 1167, 1948) pour préparer un extrait riche en polyphénols. L'écorce de pin maritime est dégraissée par l'éther éthylique ou par l'éther de pétrole. Selon cette méthode, on soumet ensuite 11 écorce dégraissée à une extraction alcoolique pour en séparer la fraction riche en polyphénols et en flavonoîdes. L'extrait alcoolique est alors évaporé à sec et les flavonordes sont éliminés par extraction au chloroforme, puis 30g de résidu sec provenant de cette extraction au chloroforme sont dissous dans 400ml d'éthanol. On y ajoute ensuite conformément à l'invention, 15g de bétal- ne base dissoute dans un mélange comprenant 400ml d'éthanol et 20ml d'isopropanol. On laisse le mélange au repos pendant vingt quatre heures, puis on essore le précipité obtenu. On obtient ainsi 20g de bétaînates de tannins et d'oligomères de catéchines. Le filtrat recueilli est additionné de 600gaz d'alcool isopropylique et le mélange est laissé au repos pendant vingt quatre heures. Le précipité filtré et essoré contient du bétainate de dimère de leucocyanidol et une faible quantité de bétannates de tannins.Le filtrat est évaporé à sec puis traité par 300ml d'éthanol absolu pendant une heure à tempPPature ambiante. Le précipité est constitué de 6g de bétaînate du dimère de leucocyanidol. En répétant l'évaporation à sec du filtrat et en traitant le résidu par 150ml d'éthanol on obtient une quantité supplémentaire de 6g de bétainate du dimère de leucocyanidol. De nouveau on évapore à sec sous vide, le filtrat recueilli à l'issue de cette dernière opération et on dissout le résidu d'évaporation dans 50ml d'éthanol absolu. On ajoute à cette solution 50ml de n-butanol et on laisse le mélange au repos pendant vingt quatre heures. Le précipité, séparé et essoré, est constitué par 3g de bétaSnate de leucocyanidol monomère.Le filtrat résultant est additionné de 1Oml d'acétate d'éthyle et on recueille un précipité de bétainate de catéchine. Pour transformer les différents précipités de bétanates de polyphénols, en polyphénols purs on opère comme suit : On dissout chacun des précipités dans de l'eau distillée et on fait passer la solution résultante dans une colonne échangeuse de cations capable de retenir les cations bétaine. On récupère les polyphénols dans l'éluat. On peut également chauffer la solution aqueuse de polyphénols à une température comprise entre 30 et 800C de façon à hydrolyser les bétainates de polyphénols et précipiter les polyphénols purs. Les polyphénols ainsi obtenus peuvent être utilisés de façon connue, par exemple comme antioxydants dans les produits alimentaires ou comme médicaments. REVENDICATIONS 1. Procédé de séparation de polyphdnols tels que monomères ou oligomères de catéchines, de leucocyanidines ou de leurs dérivés à partir d'un extrait végétal riche en polyphénols, caractérisé en ce qu'on traite l'extrait végétal par de la bétaSne base en milieu alcoolique pour obtenir des bétannates de polyphénols et en ce qu'on sépare ces bétaïnates de polyphénols par précipitation fractionnée. 2. Procédé de séparation selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'extrait végétal est traité par une quantité de bétaine base correspondant sensiblement à la quantité stoechiom4- trique de polyphénols. 3. Procédé de séparation selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la quantité d'alcool ajouté à l'extrait végétal est telle que la solution alcoolique contienne entre 2 et 10% en poids de polyphénols. 4. Procédé de séparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on utilise un alcool alipha- tique ayant entre 2 et 4 atomes de carbone ou un mélange de ces alcools. 5. Procédé de séparation selon la revendication 1, carac térisé en ce qu'on précipite les bdtarnstes de tannins et d'oligo- mères de catéchines en diluant la solution alcoolique de bétainates de polyphénols par 0,5 à 1 , 5 voluie d'alcool aliphatique ayant de 3 à 5 atomes de carbone. 6. Procédé de séparation selon l'une quelconque des revendications I à 5, caractérisé en ce qu'on précipite le bétnrnnte du digère de leucocysnidol en diluant le filtrat obtenu après séparation des bétaTnates de tannins et d'oligomères de catéchines par 2 à 3 volumes d'alcool aliphatique ayant entre 3 et 5 atomes de carbone. 7. Procédé de séparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on précipite le bétannate de leucccyanidol en diluant le filtrat obtenu après séparation du dimère de leucocyanidol par 1 à 3 volumes d'alcool aliphatique ayant entre 3 et 5 atomes de carbone. 8. Procédé de séparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'on précipite le bétaînate de catéchine en ajoutant au filtrat obtenu après séparation du bétai- nate de leucocyanidol 0,5 à 4 volumes d'éther éthylique, d'ester ou de cétone aliphatique ayant 4 ou 5 atomes de carbone. 9. Procédé de séparation selon l'une quelconque des revendications t à 6, caractérisé en ce que le filtrat obtenu après séparation des bétaTnates de tannins et des oligomères de catéchines est évaporé soue vide et les bétainates de polyphénols monomères sont extraits du résidu d'évaporation au moyen d'un alcool ayant 2 ou 3 atomes de carbone ou d'un mélange de ces alcools renfermant au moins 50% d'éthanol. 10. Procédé de séparation selon l'une quelconque des revendications 1 å 9, caractérisé en ce qu'on précipite le bétainate de léucoanthocyanidol en ajoutant 0,1 à 1 volume d'alcool aliphatique ayant 3 ou 4 atomes de carbone au filtrat obtenu après séparation des oligomères supérieurs à dimère de polyphénol. il. Procédé de séparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'on précipite le bétainate de catéchine en ajoutant 0,1 à 1 volume d'éther éthylique, d'ester ou de cétone aliphatique ayant de 3 à 5 atomes de carbone au filtrat obtenu après séparation du bétainate de leucoanthocyanidol. 12. Procédé de séparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'on transforme les bétatnates de polyphénols en polyphénols purs, en faisant passer les solutions aqueuses de bétainates dans une colonne échangeuse de cations. 13. Procédé de séparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'on transforme les bdtai- nates de polyphénols en polyphénols purs en chauffant les solutions aqueuses de bétainates à une température comprise entre 30 et 800C pour précipiter les polyphénols.