Brevet FR2313076A1 — publié le 19761231

T a présente invention concerne des préparations contre les cari@s et leur fabrication. Des recherches récentes ont montré que les décompositions ps dents sont la suite naturelle de processus dus à des hacté- ies bucales (treptococcus mutans). On sait en articulier T,Je Streptococcus autans se fixe 8 la surface ae l'email de la dent et que dans des conditions correspondantes de température d'acidité d'aliment bactérien disponible, il s'ensuit une colonisation de sorte elle la colonie bactérienne provoque la formation d'une carie particulière d'abors de 'étrail de la dent et ensuite de la structure d enta ire. On sait mettre les bactéries en contact avc des anti-corps qui arrêtent la croissance des colonies bactériennes. mais il importe principalement que l'on puisse utiliser des anticorps régulièrement de préférence quotidiennement, de façon à constituer un moyen efficace contre la multiplication de Streptococcus mutans. L'obtention de Streptococcus mutans ne pose pas de problème du fait que ce genre de bactéries est présent dans la bouche de la plupart des êtres humains, et ce sont seulement l'ampleur ou le degré d'aptitude à la résistance naturelle contre les bactéries qui se différentient d'un individu à l'autre. Dans des conditions de milieu appropriées, la formation des colonies est plus rapide. On sait qu'on peut obtenir des anticorps contre Streptococcus mutans sous la forme de sérum à partir de la plupart des animaux. Pour obtenir un anticorps en sérum on le prépare fréquemment à partir de lapins ou de chevaux. On sait également que les vaches constituent un système efficace pour la préparation d'anticorps à partir d'antigènes qu'on peut administrer à ces animaux par injections. En particulier, pour la vache, il se trouve que, non seulement le sérum, mais également le lait peuvent être engendrés avec des anticorps, qui contiennent les mêmes anticorps que le sérum. Normalement, le Sérum animal n'est pas réputé être un aliment, tandis que par contre le lait de vache représente un aliment. La présente invention repose sur la reconnaissance du fait que les vaches peuvent engendrer de grandes quantités d'anti corps spécifiques contre Streptococcus mutans -sous la forme d'un aliment que l'on absorbe volontiers, que l'on peut consommer sans domptage et qui inhibe la formation de caries. La présente invention offre un procédé pour la préparation d'un produit laitier, qui contient des anti-corps contre Streptococcus mutans et qu'on peut utiliser sur les dents pour inhiber la carie dentaire. Comme produit on peut obtenir un agent alimentaire totalement naturel, qui contient les anti-corps qui arrêtent la formation de caries. La Demanderesse a découvert que par immunisation des vaches avec un antigène de Streptococcus mutans, en particulier pendant des époques déterminées du cycle gestatif de la vache, les vaches engendrent dans leur lait des anti-corps contre l'antigène. Le fait que les anti-corps sont contenus dans un agent alimentaire naturel, fait de cette forme de préparation qu'on peut obtenir selon la présente invention, un produit particulièrement efficace correspondant. La technique précise de l'immunisation des vaches par fabrication d'anti-corps spécifiques est connue de l'art vétérinaire. De façon générale, on immunise les vaches en deux étapes. Lors Je la remire étape on administre quatre injections intramusculaires principalement, à intervalles d'une semaine. Lors de la seconde étape d'immunisation, on administre les injections intramusculaires à intervalles de 15 jours. Les particularités de la technique de l'imuunisation sont des mesures connues du spécialiste. Four le procédé selon la présente invention, ont peut utiliser des souches de Streptococcus mutans qui ont été cultivées selon des procédés habituels de travail.En pratique, on peut porter des cultures de Streptococcus mutans AHT (groupe sérologique a), BHT (groupe b), 10449, (groupe c) et 6715 (groupe d) dans un milieu de tryptose dialysé pour la culture, les cellules sont ensuite rassemblées par centrifugation à 4000 g t lavées cinq fois avec une solution saline 0,1 m tanponnée au phosphate, pH 7,0. On peut inactiver ensuite les cellules par chauffage pendant 30 minutes à C0C et on remet en suspension pour une concentration finale en Streptococcus mutans ATiT, 10449 et 6715 de 5. 5.108 cellules par ml. Cette préparation est utilisée par exemple pour imnniser deux vaches comme suit. Chaque vache est immunisée en deux traitements particuliers avec des antigènes -récents provenant des quatre groupes de Streptococcus mutans (groupe a, b, c, d). Ensuite une vache est immunisée selon les procédés habituels pour la fabrication d'un produit laitier. Après l'immunL- sation on prélève des échantillons de sang de vache, jusqu'à ce que le titre en anti-corps de sérum ait atteint a plus haute valeur, et on rassemble alors le lait. On sèche et pulvérise le lait selon les procédés habituels pour obtenir de la poudre de lait qui, dans ce cas, contient des anti-corps contre Streptococcus mutans. En fait, il s'est formé une immunoglobuline du lait de vache.Ce produit peut ensuite être utilisé par exemple comme composant de base pour l'un des produits de consommation suivants a) les lait séché lui-même peut entre dilué avec 1 à 5 parties d'eau pour former un agent de rinçage de la bouche. L'agent de rinçage de la bouche agit simplement par le fait qu'on se rince quotidiennement la bouche avec et de ce fait, ceci inhibe la for Ilxation des colonies de Streptococcus mutans à la surface de l'émail des dents. b) le produit peut être un produit édulcorant sans sucre, par exemple incorporé dans une gomme à macher, des bonbons ou une-crème glacée ou une autre forme d'agent alimentaire dans lequel on introduit une quantité importante en pourcentage d'immunoglobuline, par exemple 25 % ou plus. c) l'immunoglobuline peut être introduite dans un agent de nettoyage des dents, par exemple poudre ou pate déntifrice tels que les utilisent les dentistes au qu'on achète sur le marché. Il est recommandé que la proportion en pourcentage d'immunoglobuline du lait soit d'au moins 25 Xu en addition aux produits industriels connus, ce qui améliore son efficacité de façon importante. d) Effectivement le lait reconstitué est efficace en luimême pour inhiber la formation de colonies. de Streptococcus mutans, par exemple simplement en boisson, le lait arrive en contact suffisant entre les dents et l'immunoglobuline pour un traitement efficace. La présente invention est dirigée en premier lieu sur la fabrication de l'immunoglobuline du lait et l'utilisation de 1'immunoglobuline du lait sur les surfaces dentaires. Mais l'immu- noglobuline du lait peut aussi Outre absorbée par le système di gestf, à partir du sang et ensuite par le circuit sanguin, arriver dans la cavité bucale. Ceci encore est une possibilité pour utiliser les anticorps du lait absorbé, efficaces contre la formation des caries. En-résumé on peut dire, sur la base des données permises jusqu'ici que l'immunoglobine de lait préparée selon la présente in Invention contient des anti-corps contre Streptococcus mutans, que ces anticorps, lorsqu'ils sont mis en contact' avec les dents, inhibent la croissance de Streptococcus mutans et de ce fait aussi la décomposition dentaire. Pour effectuer des recherches correspondantes sur les animaux on procède comme suit On se procure des rats femelles grosses(Souches COBS/CD auprès de Chartes River Laboratories (wilmington, Mass.). On garde-chaque femelle en cage stérile et on lui fournit de l'eau stérile. On ap- plique une diète définie qui contient des antitiotiques choisis précisément, pour supprimer la flore bactérienne. Après la naissance, on ramène chaque portée à neuf jeunes par mère. Pour correspondre aux prescriptions de travail, toutes les portées sont réparties en trois groupes (A, B, C). Chaque groupe contient cinq portées de neuf jeunes par portée ou ensemble 45 jeunes animaux par groupe.Après le sevrage (19 jours après la naissance) les jeunes animaux sont alimentés avec un aliment complètement défini, favorisant la- carie (voir tableau I). Les rats du groupe A reçoivent l'aliment avec du lait immunisé tandis que ceux du groupe B et du groupe C reçoivent un aliment correspondant avec du lait séché "Carnation1,. Teneur en ati-corps de lait : la teneur en anti-corps anti Streptococcus mutans dans du lait de vache séché et écrémé (1222) est évaluée à chaque fois comme suit : on dissout 50 mg de lait séché dans 1 ml d'eau distillée et préparé en quatre lots de double dilution successive avec une solution saline. Chaque tube de dilution-de lot est additionné de Streptococcusmutans AHT, BHT, 10449 ou 6715, tués à la formaline, en concentration de 2.108 cellules par ml. On secoue les tubes pour le mélange et on laisse incuber pendant 4 heures à 370C. La valeur de titrage point finalement l'a@@lutination est enregistré et on laisse encore incuber pendant 24 heures à 4 C, et on enregsitre à nouveau la valeur le filtrage. Evaluation de la carie: A la fin de l'expérience (après 42 jours rt pèse les rats et on les tue en les décapitant à l'ai de d'une guillotine. On traîte les toues pendait 5 minutes en autoclaves pour relâcher les tissus mous. On extrait les canines, on nettoye et on teinte avec 0,4 ; de murexide dans l'alcool à 70%. Après la teinture, on découpe les molaires avec une preceuse eniaire, en deux moitiés en on évalue les lieux d'attaques par caries selon le procédé de travail de Keyes (9).Jusqutà pré- sent, on a analysé dans cette recherche un ensemble de quinze rats par groupe. Les résultats de l'évaluation pour chaque groupe de rats sont réduits statistiquement par calcul, écarts types et erreurs types. Les différences de la valeur moyenne sont éva- luées par analyse de variance et comparaison du multiple de la valeur de titrage selon l'expérience de Duncan. Cours de l'expérience jours-21 0 19 25 45 sevrage provocation sacrifice Méres Grossesse alaitement Aliment: Aliment purifié n 425 Groupes de Streptococcus mutans AHT, BHT, jeunes 6715 A Alimentation avec aliment purifié n 305 avec lait immunisé Streptococcus mutans AHT, BHT, 6715 B Alimentation avec aliment purifié n 305 avec lait "carnation" Néant C Alimentation avec aliment purifié n 305 avec lait "carnation" Résultats ::'Valeurs du titre d'anticorps du lait. En suite de divers titrages en double, on obtient les résultats suivants Antigène utilisé Titre du lait immunisé (vache 1222) Streptococcus mutans AHT 64 Streptococcus mutans BHT 1 024 Streptococcus mutans 10 449 Streptococcus mutans 6 715 256 Streptococcus sanguis 0 Comme on le voit, trois des quatre souches indiquent un titre d'agglutine important, pourtant, on n'a pu trouver aucun anticorps contre Streptococcus mutans 10 449 (groupe C). Sur cette base, on provoque l'infection chez de jeunes rats avec les-souches virulentes de Streptococcus mutans AHT, BHT et 6 715 (voir déroulement de ltexpérience). titre de comparaison, on n"a pu établir aucun anticorps reconnaissable contre une souche de bactérie de la bouche, Streptococcus sanguis. Composition de.l'aliment des jeunes rats : comme indiqué au Tableau I, l'aliment utilisé sauf le lait qui est prévu à la place de protéine est complètement défini. L'analyse du lait immunisé comme aussi celle du lait séché "Carnation" montrent qu ils contiennent environ 29 % de protéine et qui est introduit dans l'aliment favorisant la carie n 305, dans cette proportion comme lactalbumine. Les jeunes rats sont sevrés 19 jours après la naissance et portée en cages stériles, où ils sont alimentés avec l'aliment correspondant jus.qu'au 45e jour (sacrifice). TABLEAU Composition de l'aliment n 305 purifié, favorisant la carie, et aliment n 305 avec substitut du lait. Composants Aliment purifié Aliment n 305 avec n 305 (%) $substituant de lait (%) Saccharose (6 x pulvérisé 5,0 5,0 Lactalbumine (Protéine du lait) 20,0 20,0(69,0)* Mélange de sel ("!IIT") 3,0 3,0 mélangé de vitamines 1,0 1,0 TABLEAU I (suite) Composants Aliments purifié Aliment n 305 avec n" 305 (%) substitut de lait(0A) Huiles de graines de coton 3,0 3,0 Cellulose 6,0 6,0 Amidon de mais 62,0 62,0 * Le lait immunisé et le lait séché "Carnation contiennent environ 29 % de protéine, ce qui demande 690=/kg pour donner 200 g/kg de protéine. Provocation avec Streptococcus mutans cariogène : on utilise des cultures de 18 heures de Streptococcus mutans AHT, BHT et 6 715 préparées comme dans le cours de l'expérience. On introduit dans la cavité bucale de chaque rat des groupes A et B au 25e jour des frottis de chaque culture. Le groupe C sert de groupe de com paraison non infecté. Les 26e et 27e jours on prélève des frottis oraux de trois à quatre rats par portée dans les groupes A et B et on cultive sur plaaues alimentaires d'agar avec du sang et Mitis salivarius pour déterminer la formation de la colonie. Dans chaque cas, on peut à nouveau isoler Streptococcus mutans AHT, BHT et 6 715.On prélève des frottis supplémentaires sur des animaux sa crifiés déterminésC45e jour), qui montrent de même des cultures positives de ces trois souches, ce qui indique une formation perpétuée de- colonies de Streptococcus mutans. Détermination des caries et poids des animaux. Les résultats des évaluations de caries pour 15 rats de chaque groupe sont ras- semblés au Tableau II suivant TABLEAU Il Valeur moyenne des caries et poids corporels de jeunes rats qui ont été infectés avec S. mutans AHT, BHT et 6715 virulents et alimentés avec un aliment purifié favorisant la car-ie N0 305 qui contient soit un lait immunisé soit un lait séché "Carnation", Valeura moyennes des caries (a) Grcu r E: il Ivoire poids corporel moyen (g) A .,L # 0y5 0,5 + 0,2 116 (Lait séché immunisé, infecté) (47%) (b) (8%) B 10,P#0,7 6,2#0,8 110 (Lait séché "Carnation", infecté) (100%) (100%) C 0,9 + 0,5 0,1 + 0,1 114 (Lait séché "Carnation", sans infection) (8 chez (2%) (a) évalué selon le procédé de Keyes (9). Valeur ± erreur nornalisée. Les groupes A et C nettement différents du groupe B (p Les groupes A et C ne se différencient pas de façon significative. (b) Valeurs de caries des groupes A et C exprimées en % de la valeur de carie du groupe B. D'après cés donnés, il-est facile de reconnattre que la protection immunologique se produit chez les rats qui ont reçu l'a- liment qui contient du lait de vaches immunisées. En ceci apparaissent encore deux points importants : (1) d'abord dans cette expérience, les lésions se produisent en majeure partie dans les capillaires dentaires et les sillons, de quoi ont neut déduire que les lésions de caries sont évitées avec un aliment compact avec des cariogènes ; (2) les rats utilisés comte témoins et qui n'ont pas reçu de provocation ne présentent pratiquement aucune carie, ce qui représente une ligne de base, nui de façon normale ne peut s'obtenir que chez des rats non infectés, exempts de germes.Déjà, sur la base des résultats présentement indiqués, il est permis de dire que les animaux alimentés avec du lait immunisé présentent nettement moins de lésions par caries que les rats dont l'aliment comporte comme portion lactée dans l'alimentation uniquement du "Carnation" et qui ont été provoqués par Streptococcus mutans. l'alimentation n'est en général pas concernée par ce résultat, du fait que le poids moyen des rats des trois groupes ne se différen cie pas de façon significative. Les recherches sur les animaux indiquent en résumé que 1. - La poudre de lait séchée- neut être utilisée à la place de protéine dans l'aliment n 305 déà pleinement défini, favori sat la carie. En présence de Streptococcus mutans virulant, les # e caries se développent en particulier dans les sillons. 2.- - Après injections des vaches avec l'antigène Streptococcus -utans, on peut établir une proportion importante d'anticorps agglutinogènes dans le lait de vache. 3. - Lorsque l'on utilise le lait de vaches immunisées dans-l'aliment défini en général, favorisant la carie, ceci conduit à une protection contre la carie, en particulier dans les régions des sillons dentaires. La présente invention offre de façon générale entre autre une immunoglobuline du lait de vache qui contient des anticorps qui sont spécifiques contre le ou les antigènes de Streptococcus mutans, et que l'on peut utiliser dans un véhicule correspondant, par exemple pharmaceutiquement administrable pour lutter contre' la carie, par exemple sous forme de pâte dentifrice qui contient comme adjuvant l'immunoglobuline de lait de vache ci-dessus, ou comme agent de rinçage de la. bouche composé de façon correspondante. On peut adjoindre à des produits édulcorants sans sucre-de préférence au moins 25 % de l'anticorps décrit ci-dessus, de sorte que le produit édulcorant serve de véhicule pharmaceutiquement administrable. De plus-, des produits alimentaires naturels sanssucre peuvent être additionnés d'au moins 25 Oic' de l'îmmunoglobuline cidessus décrite, de sorte que le produit alimentaire soit le véhicule pharmaceutiquement administrable. On peut en outre aussi additionner une poudre dentifrice du marché d'au moins 25 % de l'immunoglobuline ci-dessus décrite de sorte que-la portion restante de la poudre dentifrice serve de véhicule pharmaceutiquement administrable. REVENDICATIONS 1) Procédé de fabrication de préparations agissant contre les caries, caractérisé en ce qu'on immunise des vaches avec Streptococcus mutans pour engendrer des anticorps correspondants et qu'on obtient une préparation contenant une immunoglobuline à partir du lait des ces vaches. 2) Procédé selon la revendication 1-, caractérisé en ce qu'on utilise comme Streptococcus mutans l'une des souches AHT, 3HT, 10 449 ou 6 715. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'on. obtient pratiquement le lait de vaches immunisées contre Streptococcus mutans lorsque le titre des anticorps dans le sérum a atteint une valeur maximale. 4) Procédé selon l'une des revendications I à 3, caractérisé en ce que l'on obtient la préparation sous forme d'un agent alimentaire ou d'adjuvant à un agent alimentaire. 5) Préparation obtenue selon le procédé d'une des revendications 1 à 4.