Brevet FR2297912A1 — publié le 19760813

La présente invention se rapporte aux procédés d'obtention des substances biologiquement actives et a plus précisément pour objet un procédé d'obtention simultanée de l'ergostérol et de l'ubiquinone-9. Les produits eités se synthétisent lors de la croissance de levure, par exemple, de ltespèce Candida, Torula, etc. L'ergostérol est un alcool stéroide à haut poids moléculaire. Isolé sous forme cristalline, l'ergostérol sert de matière première pour la production, à l'échelle industrielle, des vitamines du groupe D, y compris ses métabolites actifs, et dans l'industrie chimico-pharmaceutique pour la fabrication d'hormones stéroidiennes. Les ubiquinones appartiennent à la classe des 2,3 diméthoxy-5-méthylbenzoquinones, ayant en position 6 une channe latérale composée d'un nombre différent de charnons isoprénoides, et désignées d'après leur nombre Q1 à Q0. Les représentants de cette classe possèdent une activité coenzymatique dans des systèmes électrotransporteurs et prennent part à des métabolismes aussi bien énergétique que constructif de la cellule vivante. Pour les cellules animales, la présence dtubiquinones-10 et 9 est caractéristique, tandis que dans les plantes et les cellules microbiennes, la synthèse des ubiquinones à chaine isoprénofde plus courte est possible. Actuellement, il y a des données démontrant l'efficacité des préparations d'ubiquinone lors de la cure de l'insuffisance cardio-vasculaire, leur action curative sur la distrophie alimentaire et génétique des animaux. Un certain effet a été obtenu par administration de l'ubiauinone lors de l'anémie due à la perturbation du métabolisme protéique chez l'homme. Ou connaft un procédé d'obtention industriel de l'ergostérol, à partir de levures de boulangerie du genre Saccharomyces, utilisé dans la production de la vitamine D2 et qui consiste en ce qui suit. La levure de boulangerie pressée est traitée avec de l'alcool éthylique et l'extrait alcoolique est filtré. Le coagulat de levure, après la filtration, est soumis à l'hydrolyse alcaline sous chauffage et mélange continu, à une filtration ultérieure du résidu insoluble, à l'évoporation de la solution alcoolique et à l'épuration de l'esgostérol brut l'épuration s'effectue par un affinage triple et par recristallisation du produit affiné. On connatt un procédé prévoyant l'hydrolyse de toute la masse biologique de levure de boulangerie dans un mélange butanolalcalin, effectuée dans un autoclave à la température de 1200C. Les inconvénients essentiels des procédés indiqués sontles suivants 1. La matière première de départ est la levure de boulangerie conteuse du genre Saccharomyces, cultivée sur des milieux de carbohydrates. 2. lies deux procédés prévoient des conditions rigoureuses 'hydrolyse, dans lesquelles l'extraction du second produit désiré à savoir, I'ubiquulone, devient impossible. 3. 'ezgostérol brut se forme à une faible teneur (de 27 à 345') ; la purification subséquente, afin d'obtenir de l' ergostérol à une teneur de 90 à 95% en produit visé, comprend un double ou triple affinage exigeant beaucoup de main d'oeuvrs et la recristallisation du produit affiné. On connatt la production de 1' ubiquinone-9 à partir de Candida tropicalis i -233 cultivé sur des milieux complexes, p contenant des sels minéraux, une fraction de n-alcanes (en C10-- C13), un précurseur du noyau aromatique (acide p-oxybenzoi- que), des biostimulants (l'acide malique et l'extrait de mats), un détergent. Cependant, le problème des études des auteurs japonais comprenait la réalisation de la supersynthèse de l'ubiquinone-9, mais non ltélaboration du procédé de Sa production. Malgré les résultats obtenus sur la biosynthèse de l'ubiquinone-9, le processus décrit de biosynthèse a les inconvénients suivants. 1. Pour la reproduction du procédé, on met en oeuvre un producteur spécialement sélectionné apte à la supersynthèse de l'ubiquinone-9, mais possédant une faible vitesse de croissance. 2. Pour la supersynthèse de l'ubiquinone-9 à partir de Candida tropicalis K -233 cultivé, on utilise un milieu coûteux p contenant le précurseur du noyau aromatique, des biostimulants, un détergent et une fraction restreinte de n-alcanes (en C10 - C13). 3. L'extraction de l'ubiquinone-9 prévoit l'hydrolyse de toute la masse biologique ; ceci exclut l'utilisation de sa partie protéique en qualité de préparation pour l'élevage. Ledit procédé est un procédé de laboratoire et il n'y a pas de données concernant sa réalisation industrielle. D'après les références, on ne connaît pas de procédé prévoyant la production simultanée de l'ergostérol et de l'ubiquinone. Le but de la présente invention est de remédier aux inconvénients indiqués. Pour atteindre ce but, on s'est proposé d'élaborer un procédé de production de l'ergostérol et de l'ubiquinone-9, à partir de produits de biosynthèse des levures, permettant d'obtenir les produits précités simultanément, en un cycle technologique unique. La solution consiste en un procédé de fabrication de l'ergostérol et de l'ubiquinone-9 qui, selon l'invention, comprend : l'hydrolyse de la fraction biolipidique, extraite de la masse biologique de la levure, produisant l'ergostérol et l'ubiquinone-9, par un alcali alcoolique en présence d'un anti-oxydant préservant l'ergostérol et l'ubiquinone-9 contre l'oxydation ; l'extraction des constituants insaponifiables du mélange hydrolysé ; l'évaporation de l'extrait jusqu'à formation de cristaux de l'ergostérol ; la séparation de ltergostérol précipité de la solution-mère lors de l'évaporation l'élimination des résidus de l'agent extractif à partir de la solution-mère ; la chromatographie d'adsorption du produit huileux restant après l'élimination de l'agent extractif ; et l'isolement de l'ubiquinone-9. Sous le terme "fraction biolipidique", on entend la fraction extraite de la masse biologique de différentes levures aptes à produire l'ergostérol et l'ubiquinone-9, contenant des constituants de cellule solubles dans la graisse. Pour hydrolyser la fraction biolipidique, on peut utiliser des alcools gras inférieurs ; il est préférable d'employer l'alcool méthylique afin d'éviter la substitution nucléophyle éventuelle du groupemellt méthoxy dans la molécule de l'ubiquinone-9 en groupement alcoxy. Parmi les hydrates de ltoxyde des métaux alcalins, utilisés dans l'hydrolyse alcalinoalcoolique, il est préférable d'utiliser la potasse caustique qui assure des conditions plus douces d'hydrolyse. La concentration en potasse caustique peut être comprise dans les limites de 8 à 12. L'augmentation de la concentration en potasse caustique au-dessus de la limite indiquée entrain la réduction de la quantitéde produits désirés. Selon l'invention, en qualité d'antioxydant dudit procédé d'hydrolyse, on peut utiliser n'importe quelle substance préservant ltergostérol et l'ubiquinone-9 contre l'oxydation, telle que le pyrogallol, la santoquine, le butyloxytoluol et d'autres antioxydants convenables. La quantité d'antioxydant peut être différente et elle est déterminée par la nature de l'antioxydant. Par exemple, pour le pyrogallol sa quantité est comprise entre 1 et 3% en poids par rapport à la fraction biolipidique. Il est recommandé d'effectuer l'hydrolyse sous ébullition du mélange réactionnel pendant 30 - 45 mn. tette durée est suffisante pour obtenir des rendements maximaux en produits désirés. Selon l'invention, le mélange hydrolysé est soumis à l'extraction pour isoler les constituants insaponifiables. En qualité d'agents extractifs, on peut utiliser des solvants organiques, connus et facilement disponibles, inertes vis-à-vis de l'ergostérol et de l'ubiquinone-9, tels que le n-hexane, l'éther de pétrole, l'éther diéthylique, le benzène, etc. Il est préférable d'utiliser l'éther didhylique, étant donné qu'il forme à un moindre degré des émulsions persistantes lors de l'extraction. D'après l'invention, l'extrait obtenu est soumis à l'évaporation jusqu'à l'apparition de cristaux d'ergostériol, qui sont séparés de la solution-mère. Après l'élimination des résidus d'agent extractif de la solution-mère, on obtient un produit huileux qui est séparé par chromatographie d'adsorption sur une colonne garnie d'un adsorbant, par exemple d'oxyde d'aluminium. Cidessous est donnée une description détaillée d'un mode non limitatif de réalisation du procédé de l'invention. Comme il a été indiqué plus haut, en qualité de matière de départ pour la fabrication de l'ergostérol et de l'ubiquinone9, on propose l'utilisation d'une fraction biolipidique. Pour le procédé considéré, on peut utiliser n'importe quelle fraction biolipidique extraite de levures productrices de l'ergostérol et de l'ubiquinone-9, par exemple de levure de l'espèce Candida, indépendamment du procédé de culture du producteur. On charge dans un réacteur, pourvu d'un mélangeur, d'un réfrigérant à reflux et d'un élément chauffant, la fraction biolipidique, une solution alcoolique d'alcali et l'antioxydant indiqué. Le mélange est malaxé et porté à l'ébullition. Le mélange hydrolysé est refroidi, dilué à l'eau et soumis à l'extraction par l'extractif précité par une méthode quelconque, par exemple par extraction à contre-courant à l'aide de mélangeurs-décanteurs. Lors de l'extraction, les constituants insaponifiables passent dans l'agent extractif, les constituants saponifiés hydrosolubles se séparent d'avec la phase aqueuse et sont évacués. L'extrait séparé est lavé à l'eau jusqu'à réaction neutre et est soumis à l'évaporation dans un évaporateur jusqu'à apparition des cristaux d'ergostérol dans le culot. Le résidu de distillation est déchargé de l'appareil et refroidi, après quoi on sépare l'ergostérol par une méthode quelconque, par exemple par filtration, par centrifugation, etc. L'ergostérol séparé est lavé à l'éther de pétrole et est recristallisé dans le mélange alcool éthylique - bensène ; Le degré de pureté de l'ergostérol obtenu est compris entre 95 et 98%. la solution-mère restant après la séparation de l'ergostérol est utilisée pour obtenir l'ubiquinone-9. Dans ce but, on évacue de la solution-ère les restes de l'extractif. On obtient alors un résidu huileux qui est soumis à la chromatographie d'adsorption sur une colonne garnie d'un sorbant, par exemple d'oxyde d'aluminium, d'acide silicique, de silicagel, etc. La couche jaune contenant l'ubiquinone-9 est éluée à partir de la colonne à l'aide d'un mélange d'éther diéthylique et de pétrole. Après l'évacuation du solvant de l'éluat, le reste est recristallisé dans l'alcool éthylique ou dans l'acétone. Le degré de pureté de l'ubiquinone obtenue est compris entre 95 à 100%. Dans le cas où l'on utilise une fraction biolipidique extraite de la levure cultivée sur des bouillons contenant des n-alcanes, on introduit des opérations supplémentaires afin de les éliminer avant la chromatographie en dissolvant le résidu huileux dans de l'acétone et en le congélant. L'invention proposée possède plusieurs avantages. 1. L'invention permet d'obtenir simultanément, en un cycle techrolagique unique, deux substances : ltergostérol et l'ubiquinone-9 à un haut degré de pureté atteignant 100%. Le rendement en ergostérol est compris entre 10 et 15 g/kg de fraction biolipidique, le rendement en ubiquinone-9 est de 1,2 à 1,7 g/kg de fraction biolipidique. 2. Le procédé de production des substances désirées à base de fraction biolipidique permet d'utiliser en qualité de producteurs les souches industrielles de la levure, utilisées dans la production des protéines alimentaires et fourragères, par exemple l'espèce Candida, tandis que d'après le procédé connu, la production de l'ubiquinone-9 exige une souche spécialement sélectionnée de la même espèce. 3. D'après l'invention, on utilise la fraction biolipidique obtenue à partir de la levure, indépendamment du procédé de sa culture. Dans certaines branches, la fraction biolipidique peut entre un résidu, par exemple lors de la production des concentrats protéino-vitaminiques à partir de la levure de l'espèce Candida cultivée sur des milieux de n-alcanes. La séparation de la fraction de la masse biologique augmente la qualité de la partie protéique des concentrats de fourrage, ce qui augmente la durée de sa conservation. De cette façon, le procédé de séparation et d'utilisation de la fraction biolipidique permet d'intensifier les procédés microbiologiques de production des concentrats protéino-vitaminiques. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparattront à la lecture de la description, qui va suivre, de deux exemples concrets mais non limitatifs de réalisation du procédé proposé. EXEIP~ZE 1 La fraction biolipidique est obtenue de la manière suivante. La levure Candida guîlliermondii NP-4 est cultivée dans des conditions aérobies sur un milieu nutritif contenant des sources d'azote, de phosphore, de micro-éléments et, en qualité de source de carbone, un mélange purifié de n-alcanes (C11 - C23). La masse biologique est séparée du milieu de culture et est séchée. Pour extraire la fraction biolipidique, 70 kg de masse biologique sèche sont soumis à l'extraction avec 280 1 d'éther de pétrole. L'extraction s'effectue pendant 6 à 8 heures L'extrait est séparé du concentrat protéique et est soumis à l'évaporation sous vide à la température de 400C. Après élimination complète du solvant, on obtient 7 kg de fraction biolipidique (poids spécifique 0,96) ayant la composition suivante (% en poids) hydrocarbures 7,2 acides aliphatiques libres 15 phospholipides 30 ubiquinone 0,18 glycérides 43 reste stérol 1,5 impuretés non identifiées. La quantité obvenue de fraction biolipidique est chargée dans un réacteur pourvu d'un réfrigérant à reflux, d'un mélangeur et d'un dispositif de chauffage, Dans ce mdme réacteur on admet une solution contenant dans 14 1 de méthanol, 1,4 kg de potasse caustique et 0,14: kg de pyrogallol. Le mélange est malaxé sous ébullition pendant 45 an, puis ti est refroidi jusqu'à 15 - 200C et est rechargé dans un extracteur où on additionne 35 1 d'eau. On extrait trois fois la fraction insaponifiable des biolipides avec, respectivement, 28,14 et 14 1 d'éther diéthylique. lies extraits éthérés réunis sont lavés à l'eau jusqu'à réaction neutre des eaux de lavage.La solution éthérée est soumise à l'évaporation jusqu'à un volume résiduel d'environ 2 1. Le culot de distillation est purgé, refroidi jusqu'à - 50 et maintenu à cette température pendant 3 heures. Le résidu d'ergostérol est séparé, lavé à l'éther de pétrole et est séché dans une étuve à vide à 45 - 500. On obtient 98,8 g de produit à une teneur de 85% en ergostérol. Après recristallisation, on obtient à partir du mélange alcool éthylique-benzène (4/1) 79 g de produit à teneur de 98% en ergostérol. Point de fusion 156-159 ; cristaux incolores ne manifestant pas de dépression de la température de fusion avec l'échantillon d'ergostérol de la levure Saccharomyces cerevisiae. # étalon maxi : 262, 271, 282, 293 nm Après la séparation de l'ergostérol, on élimine entièrement le solvant de la solution-mère. Le résidu est congelé à -6 avec 2 1 d'acétone pour séparer les n-alcanes supérieurs. Ces derniers sont filtrés, la solution est soumise à l'évaporation à sec. Le produit huileux résiduel est soumis à la séparation par chromatographie sur l'oxyde d'aluminium. L'élution de la bande contenant l'ubiquinone s'effectue dans le mélange d'éther de pétrole et diéthylique. L'éluat, contenant l'ubiquinone-9, est soumis à l'évaporation à une température non supérieure à 350. Le résidu est cristallisé dans l'alcool éthylique absolu L'ubiquinone-9 précipitée est filtrée et séchée. On obtient 9,5 g d'ubiquinone-9 sous forme de cristaux jaunes à teneur de 97,95' en produit visé. étalon Point de fusion 43,6 - visé, # maxi (oxyd.) 272 nm, E 1 % 180 ; 1 cm étalon # maxi (réduc.) 290 nm, E 1 % 50,5 1 cm Spectrom. de masse, m/e : 794 (M+), 792 (M+2)+, 779 (M-15)+, 235, 197. EXEMPLE 2. L'isolement de la fraction biolipidique dans la levure humide Candida tropicales N-30 s'effectue par extraction à l'acétone en faisant passer ultérieurement les constituants solubles dans la graisse, en n-hexane ou l'éther de pétrole. A partir de 170 g de levure (humidité de 815'), on obtient 7,5 g de fraction biolipidique. Le traitement ultérieur des biolipides, dans le but d'extraire l'ergostérol et l'ubiquinone-9, est analogue à celui décrit dans l'exemple 1. On obtient 78 mg d'ergostérol à teneur de 97,3g en produit visé et 6,9 mg d'ubiquinone à teneur de 99,2% en produit visé. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits et représentés qui n'ont été donnés qu'à titre exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et misés en oeuvre dans le cadre des revendication qui suivent. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention simultanée de l'ergostérol et de l'ubiquinone-9 caractérisé en ce qu'il comprend l'hydrolyse de la fraction biolipidique extraite d'une masse biologique de levure productrice de l'ergostérol et l'ubiquinone-9, avec un alcali en présence d'un antioxydant préservant l'ergostérol et l'ubiquinone-9 contre l'oxydation ; l'extraction des constituants insaponifiables du mélange hydrolysé ; l'évaporation de l'extrait jusqu'à l'apparition de cristaux d'ergostérol ; la séparation des cristaux d'ergostérol précipités de la solution-mère li > rs de ladite évaporation ; l'élimination des résidus de l'agent extractif de la solution-mère ; la chromatographie d'adsorption du produit huileux restant après l'évacuation de l'agent extractif ; et l'isolement de l'ubiquinone-9. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue l'hydrolyse au moyen d'une solution méthanolique de potasse caustique. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'en qualité d'antioxydant on utilise le pyrogallol. 4. Procédé selon l'une des revendications t à 3, caractérisé en ce que l'on effectue l'extraction avec de l'éther diéthylique. 5. L'ergostérol caractérisé en ce qu'il est obtenu par le procédé suivant l'une des revendications 1 à 4. 6. L'ubiquinone-9, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par le procédé suivant l'une des revendications à å 4.