Brevet FR2300566A1 — publié le 19760910

La présente invention concerne un agent qui inhibe l'agrégation des plaquettes du sang et un procédé pour sa préparation. L'inhibiteur est un picolyl-amide de l'acide 4-méthoxyisophtalique et plus précisément un composé dont la dénomination chimique est le N,N'-bis(3-picolyl)-4-méthoxy-isophtalamide. Le composé correspond à la formule suivante Formule empirique : C21H20N4O3 Poids moléculaire : 376,4 Le composé se présente sous la forme d'une poudre cristalline stable qui est facilement cristallisable dans le benzène. Son point de fusion est de 1240C, On décrira dans ce qui va suivre, à titre purement illustratif et nullement limitatif, deux exemples de préparation des Nr,N'-bis-(3-picolyl)-4-méthoxy-isophtalamide, à partir de l'acide 4-méthoxy-isophtalique. Dans ces exemples, on peut opérer sur les quantités suivantes de réactifs Dichlorure d'acide 4-méthoxy-isophtalique 0,02 mole 4,7 g (poids moléculaire 233,061) 3-amino-méthyl-pyridine U mole 4,75 g (poids moléculaire 108, 146) Triéthylamine 0,044 mole 4,44 g (poids moléculaire 101,19) Procédé à On place dans un ballon tricol de 250 ml muni d'un agitateur, d'un réfrigérant à reflux avec un tube de protection on gel de silice et d'rm entonnoir de séparation, 4,7 g (0,02 mole) de dichlorure d'acide 4-méthoxy-isophtalique dissous dans 50 ml de tétrahydrofuranne, et on ajoute ensuite 4,75 g (0,044 mole) de 3-aminométhyl-pyridine (3-picolylamine) dissous dans 50 ml de tétrahydrofuranne ; il y a donc un léger excès de la base par rapport au chlorure d'acide. On ajoute goutte à goutte à la suspension qui stest formée dans le ballon, au moyen de l'entonnoir de séparation, 4,44 g (0,044 mole) de triéthylamine dissous dans 50 ml de tétrahydrofuranne. Après achèvement de cette addition, on porte le mélange au reflux pendant 20 heures en agitant continuellement. On chasse l'excès de tétrahydrofuranne par distillation sous vide. On reprend le résidu avec un excès d'une solution aqueuse saturée de NaHC03, on le filtre, on lave le résidu solide à l'eau, on le cristallise dans l'éthanol puis on le recristallise dans le benzène. Son point de fusion est de 12400. Procédé B On place dans un ballon tricol de 250 ml, muni d'un agitateur, d'un réfrigérant à reflux avec un tube de protection en gel de silice et d'un entonnoir de séparation, 19 g de 3-picolylamine dissous dans 50 ml de tétrahydrofuranne. On ajoute goutte à goutte à cette solution 4,7 g (0,02 mole) de dichlorure d'acide 4-méthoxy-isophtalique, dissous dans 50 ml de tétrahydrofuranne, par l'entonnoir de séparation. Après que cette addition est achevée, on porte le mélange au reflux pendant 16 heures en agitant continuellement.A la fin de la réaction, on verse le contenu du ballon dans un excès d'une solution aqueuse saturée de NaHC03. Après un certain délai, il sgpare un produit cristallin que l'on filtre et quton cristallise ensuite dans le benzène. Son point de fusion est de 12400. Analyse : Pour C21H20N403 Trouvée : C 6?,19 ; H 6,14 ; N 14,68 % Calculée : C 67,01 ; H 5,36 ; N 14,88 96 On a trouvé que le N,N'-bis-(3-picolyl)-4-méthoxyisophtalamide présente une activité marquée contre l'agrégation des plaquettes sanguines, et qu'il est donc utile dans le domaine pharmacologique et thérapeutique. Cette activité a été étudiée in vitro et in vivo à l'aide de l'agrégomètre de Born, appareil qui permet de déterminer le degré d'inhibition exercé sur la tendance de l'agrégation des plaquettes de sang. 1) Activité inhibitrice de l'agrégation in vitro On anesthésie les lapins, qu'on a laissé jeûner pendant 12 heures avec de l'eau ad lIÙitJn, avec de l'éthyl-uréthane à 20 % que l'on injecte par voie intra-péritonéale en dose de 0,6 ml/100 g de poids corporel. On prélève leur sang par la carotide, on le reprend dans du citrate de sodium à 3,8 %, en proportion de 9:1, on le centrifuge ensuite pendant 15 minutes à 1000 tours/minute et on obtient ainsi un plasma riche en plaquettes sanguines (que l'on désignera par PRP dans ce qui va suivre). On centrifuge une partie de ce plasma pendant 10 minutes supplémentaires à 8000 tours minute ce qui donne un plasma pauvre en plaquettes (que l'on désignera par PPP dans ce qui va suivre). On ajoute au PRP le N,N'-bis-(3-picolyl)-4-méthoxy isophtalamide dissous dans une solution lN de HCl (ou dans une solution stoechiométrique d'acide fumarique) et tamponné aux phosphates à un pH de 7,4, à des concentrations diverses, dans la proportion de 0,1 pour 1,0 de plasma, et on laisse incuber en bain d'eau à 37 C pendant 30 minutes. On place 1,0 ml de PRP ainsi trait dans la coupelle de l'agrégomètre de Born (avec réglage au zéro sur le PPP), et on effectue l'aggrégation des plaquettes sanguines avec une concentration en sel disodique de ADP de 10-2 m. On calcule l'activité comme étant l'inhibition de la courbe d'aggrégation obtenue avec le même témoin de plasma (incubé dans un bain d'eau à 37 C pendant 30 minutes, après addition de 0,1 ml d'une solution de sel physiologique par ml de plasma). La valeur du témoin est prise conme étant égale à 100. 2) Activité insibitrice de l'agrégation in vivo On anesthésie les lapins qu'on a laissé jeûner pendant 12 heures avec de l'eau ad libitum, avec de l'éthyl-ure'thane à 20 % qu'on injecte par voie intre-péritonéale en dose de 0,6 ml/ 100 q de poids corporel. On prélève le sang de la carotide avant (témoin) et après l heure 30 minutes suivant l'injection intrapéritonéale de N,N'-bis(3-picolyl)-4-méthoxy-isophtalamide en doses de 25, 50, 100 et 200 mg,/kg de Doids corporel. On reprend les échantillons de sang dans du citrate de sodium à 3,8 % en proportion de 0:1 et on les centrifuge à 1000 tours/minute pendant 15 minutes. On détermine l'activité inhibitrice de l'agrégation par le procédé déjà écrit pour l'expérience in vitro, directement sur les divers plasma traités, après leur centrifugation. La confirmation de l'activité inhibitrice in vivo du composé sur l'agrégation des plaquettes sanguines a été obtenue par injection intra-musculaire du composé à des Cobayes en doses de 20 mg/kg de poids corporel aussi bien que par traitement par os de volontaires humains en dose de 12 mg/kg de poids corporel, en appliquant la même technique de détermination. Résultats Sur la base des expériences effectuées sur 11 effet inhibiteur in vitro du N,N'-bis(3-picolyl)-4-méthoxy-isophtalamide sur le plasma de Lapin, on a calculé par analyse probatoire la concentration fournissant une inhibition à 50 % de l'agrégation des plaquettes du sang (CI50) . On a trouvé que la concentration molaire du composé capable d'inhiber à 50 % l'aggrégation des plaquettes du sang correspond à 5,2.10-4 M (CI50 in vitro). Pour la détermination de l'effet inhibiteur de lagré- gation in vivo chez des lapins traités par voie intrapéritonéale on a trouvé que la dose capable d'inhiber à 50 % l'agrégation des plaquettes du sang correspond à 108,2 mg/kg (CI50 in vivo). Chez le cobaye, l'activité du composé atteint un maximum de 64,50 %, au cours de la 4ème heure après son injection, alors que la limite du délai au bout duquel l'effet du composé disparait est de 72 heures. Chez litre humain, on trouve un effet maximum de 70,11 % au cours de la 8ème heure après administration, alors que la limite de délai au bout duquel l'effet disparait est également de 72 heures dans ce cas. On a déterminé la toxicité aiguë du composé par administration intrapéritonéale chez des souris blanches suisses mâles. Les expériences sur la DL50 (Fl 95 qb) se font conformément au procédé de Lichtfield et Wilcoxon (I. Pharm. exp. Ther. 96, 99/1949). On donne ci-dessous un tableau rapportant les résultatW es essais comparatifs, dans lequel le composé selon la présente invention est désigné par le terme G-137. G-137 Aspirine Héparine Acide Fluphénamique Inhibition de 5,2 10-4M 9,04 10-3M - 3,2 l'agrégation des plaquettes in vitro Activité anticoagulante (délai de recal- 4,8 10-3 M - 0,389 U.I./ml cification) Activité fibrinolytique in 8,7 10-3M - - 5,7 10-3 M vitro Activité anti- inflammatoire (cedème dû à inactif 74,5 mg/kg - 10,8 mg/kg la carragénine). DL50 1205 mg/kg 495 mg/kg - 235 mg/kg Sur la base de ces résultats, et en considérant sa très faible toxicité, on s'attend a ce que ce composé trouve son domaine d'application en thérapeutique, sous la forre de préparations orales ou parentérales, pour tous les états pour lesquels, il est préconisé de diminuer la tendance à l'agrégation spontanée des plaquettes du sang, comme ceux en relation avec la thrombophilie et la fibrinophilie. REVENDICATIONS 1 - Le N,N'-bis(3-picolyl)-4-méthoxy-isophtalamide de formule à titre de médicament pour le traitement inhibiteur de l'agré- gation des plaquettes sanguines. 2 - Composé selon la revendication 1, sous la forme de capsules de comprimés, de pastilles ou de granulés. 3 - Composé selon la revendication 1, dissous dans un véhicule liquide sous forme d'injections. 4 - Composé selon la revendication 1, dissous dans HCl IN et tamponné par des phosphates à un pH de 7,4.