Brevet FR2315251A1 — publié le 19770121

L'invention est relative à des moyens, plus particulièrement un procédé et une composition pour réaliser une numération des leucocytes, et plus particulièrement des basophiles, tels que des basophiles sanguins chez l'homme ou l'animal, et elle concerne également un procédé de diagnostic in vitro des causes de certains désordres anaphylactiques, plus particulièrement des allergies, mettant en oeuvre les moyens sus-indiqués. On sait que les méthodes de diagnostic des allergies utilisées le plus souvent jusqu'à ce jour impliquent en général des injections nombreuses des différents allergènes à tester. Outre le désagrément que présente ce mode d'administration, il se révèle parfois extrêmement dangereux pour les patients et donne lieu souvent à- des réactions non spécifiques, difficilement interprétables. il existe depuis quelques années, des méthodes de mise en évidence d'anticorps anaphylactiques dans le sérum. Mais, d'une part, elles sont extrêmement coûteuses, car mettant en oeuvre une technologie très complexe de purification, de marquage par l'iode radioactif, de fixation sur supportsinsolubles, d'allergènes purifiés et d'anticorps obtenus par immunisation d'un animal et purifiés. Elles nécessitent un appareillage spécialisé (centrifugeuse, appareil à comptage d'éléments ràdioactifs), ce qui les rend extrêmement coûteuses et inapplicables en dehors des grands centres urbains des pays développés.De plus, on sait maintenant que l'existence d'anticorps sériques ne suffit pas à déclencher une allergie. I1 faut prouver la dégranulation des basophiles, soit in vivo (test de provocation), soit in vitro (test de dégranulation). On sait en effet depuis quelque temps que les basophiles du sang jouent un rôle important dans le développement des symp tômes de l'allergie. En particulier, des auteurs ont écrit que les phénomènes allergiques peuvent en grande partie être attribués à la dégranulation des basophiles du sang circulant, sous l'action de l'agent allergène, dégranulation qui s'accompagne entre autres d'une libération de quantités importantes de produits toxiques, notamment d'histamine, que contenaient ces basophiles. Certains auteurs ont donc déjà été amenés à proposer des méthodes de diagnostic des allergies reposant sur l'étude, in vitro, de modifications cellulaires, en fait très difficiles à interpréter, des basophiles dans des échantillons sanguins préalablement sou mis à l'action de divers agents allergènes à tester. On avait en effet constaté que la réaction allergique in vitro se traduisait par des altérations diverses des basophiles de l'échantillon testé, altérations qui n'étaient pas observées chez les échantillons témoins ou préalablement mis au contact d'agents allergènes indiscutablement inactifs à l'égard de ces échantillons. Les méthodes d'étude des basophiles qui ont. été proposes jusqu'à ce jour sont difficiles à mettre en oeuvre, notamment en raison de la relative rareté des basophiles dans les échantillons sanguins. Il en est naturellement de même de la numération des basophiles, problème auquel s'étaient déjà attaqués plusieurs auteurs, dans le but d'étudier ce paramètre dans diverses situations physiologiques et pathologiques. Les techniques qui ont été décrites - et qui présentent un certain degré d'efficacité sont extrêmement difficiles à mettre en oeuvre.Elles impliquent en général la séparation préalable soignée de certains des constituants des échantillons sanguins traités avant la mise en contact des constituants restants, notamment des leucocytes, avec un agent métachromatique relativement spécifique des basophiles, tel que le colorant bien connu appelé "bleu de toluidine". Il est enfin nécessaire de préparer, avant chaque série d'essais, les réactifs qui seront nécessaires à cet effet. Outre leur caractère long et fastidieux, ces méthodes ne peuvent être mises en oeuvre avec un succès relatif que dans des laboratoires spécialisés par un personnel très entrainé. Toutes ces raisons font que les laboratoiresd'hématolo- gie courants ne font pas en général appel à de -telles méthodes de diagnostic in vitro, pour faire des opérations de diagnostic d'allergies. Même la simple numération directe des basophiles n'est pas pratiquée, du fait de l'absence de techniques commodes. L'invention a pour but de fournir des moyens, notamment des procédés de numération in vitro des leucocytes, et plus particulièrement des polynucléaires basophiles contenus dans des échantillons sanguins, applicables à des échantillons de sang, en une étape unique, en l'absence de toute séparation préalable nécessaire de certains des constituants de ces échantillons, qui soient d'une mise en oeuvre extrêmement aisée, à la portée de tout manipulateur non spécialement entraîné. Elle a également pour but de fournir un réactif permettant, après sa mise en contact avec les échantillons de sang à tester, une numération rapide, directe, par l'intermédiaire des appareils de numération, notamment des hémocytomètres classiques.Elle a aussi pour but la réalisation de tels réactifs qui soient d'une très grande stabilité dans le temps, de sorte qu'il ne soit plus nécessaire de préparer extemporanément les réactifs appropriés pour chaque série d'essais. L'invention a enfin pour but la mise au point d'une méthode de diagnostic in vitro de sensibilités anaphylactiques, plus particulièrement d'allergies, dont peuvent être affectés des patients. Le procédé selon l'invention de numération des basophiles et, le cas échant, des autres leucocytes contenus dans un milieu biologique, notamment un échantillon sanguin, est caractérisé par le mélange direct de cet échantillon, de préférence en une seule étape, avec un réactif liquide contenant des agents capables de réaliser en même temps la destruction des érythrocytes de l'échantillon sanguin, la fixation des leucocytes et la stabilisation des basophiles, et enfin la coloration sélective des granules cytoplasmiques des basophiles. Ce réactif liquide est notamment constitué par une solution d'un agent métachromatique des basophiles au sein d'un mélange eau-alcool contenant une faible proportion d'un acide,notamment telle que le pH du mélange échantillon-réactif soit tel qu'il permette à l'agent métachromatique d'exercer son effet de coloration spécifique des granules contenus dans le cytoplasme des basophiles. Avantageusement, le pH du mélange est compris entre environ 3 et environ 5. L'alcool est constitué par tout alcool miscible à l'eau et apte à réaliser une fixation des leucocytes et une stabilisation des basophiles, l'eau agissant à la fois comme diluant del'alcool et comme agent lytique des érythrocytes. L'acide est choisi parmi ceux qui sont compatibles avec les leucocytes, plus particulièrement les basophiles. De préférence, on a recours à ceux qui sont en même temps aptes à contribuer à la lyse des érythrocytes. Le réactif mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention et qui fait lui-même partie de l'invention, contient par exemple, pour un volume de 100 ml de liquide - d'environ 20 à environ 50 ml d'alcool, - d'environ 80 à environ 50 ml d'eau, de préférence de l'eau distillée, voire bidistillée, - moins de I ml d'un acide et - la quantité nécessaire de l'agent métachromatique. Un agent métachromatique préféré est constitué par un bleu de toluidine. D'autres colorants métachromatiques peuvent naturellement être utilisés, par exemple ceux dérSts~aans l'ouvrage "Mast-cells and basophils", Annals of the New York Academy of Sciences, Vol. 103, 1963. L'alcool et l'acide préférés sont respectivement constitués par l'éthanol et l'acide acétique. On a constaté qu'il est ainsi possible de réaliser en une seule étape, à l'aide du réactif selon l'invention, à la fois la destruction. des érythrocytes de l'échantillon sanguin, la fixation des leucocytes et la stabilisation des basophiles, et enfin et surtout la coloration sélective des granules cytoplasmiques des basophiles, en rouge lorsque le colorant métachromatique utilisé est constitué par un bleu de toluidine. Cette coloration est immédiate et lorsque le mélange est transféré dans la chambre d'un hémocytomètre, il est possible de rapidement dénombrer, par des méthodes bien connues dans cette technique, le nombre de basophiles contenus dans une unité de volume de l'échantillon sanguin. Lorsque le pH du mélange est de l'ordre de 4,5, on observe une coloration du cytoplasme des seuls basophiles. On constate également une très légère coloration en bleu des noyaux des autres leucocytes, mais le cytoplasme des autres cellules que les basophiles n'est jamais coloré, si bien que les seules cellules qui apparaissent colorées dans leur masse, en rouge, sont les basophiles. On rappelle en effet que les granules contenus dans le cytoplasme des basophiles, et colorés par les susdits colorants métachromatiques, sont spécifiques des basophiles, raison pour laquelle les cytoplasmes des autres polynucléaires et des leucocytes ne sont pas colorés également, d'où la possibilité de dénombrer les polynucléaires basophiles, d'une part, les autres polynucléaires et les lymphocytes, d'autre part. Le pH choisi résulte du mélange direct de proportions de réactif et de sang, ajustées en fonction de la valeur de pH désirée. Eventuellement, le pH du mélange peut également être ajusté en modifiant le pH du réactif avant mélange, par exemple à l'aide d'acide acétique ou chlorhydrique ou d'une base constituée, par exemple, par de la soude, selon que l'on veut diminuer ou au contraire augmenter la valeur du pH du mélange. I1 est naturellement particulièrement simple de régler au préalable la teneur en acide du réactif, en fonction du pH finalement désiré dans le mélange. Le procédé est d'une mise en oeuvre extrêmement simple. Il est applicable à du sang total, en l'absence de toute nécessité de séparation préalable de certains de ses constituants. Il peut être appliqué à du sang natif ou préalablement lavé avec un tampon isotonique, par exemple celui connu sous ltex- pression "tampon de Tyrode". I1 peut être misenoeuvre directement sur du sang frais ou sur du sang contenant un anticoagulant, tel que lthéparine,dans le cas d'un sang qui aura été conservé quelque temps. Les proportions de sang et de réactif qui sont mélangés dépendent entre autres du pH initial du réactif et du pH désiré dans le mélange. Dans le cas préféré évoqué plus loin, avec le réactif "optimum", le mélange de 1 volume de sang avec 9 volumes de réactif conduit directement à un pH de l'ordre de 4,5, permettant la coloration sélective pratiquement des seuls basophiles. La simplicité de la méthode, complétée par l'excellente l'lisibilité" des plaques (les basophiles rouges se détachent aisément sur le fond clair de l'échantillon traité), la mettent a' la portée rapide de tout manipulateur non entraîné. Le réactif est enfin peu coûteux, compte tenu du caractère courant de ses constituants. Enfin, le choix judicieux des proportions des constituants du réactif conduit à un mélange parfaitement stable, pendant des durées qui peuvent atteindre plusieurs mois à la température ambiante, bien que l'on ait intérêt à conserver de tels réactifs à une température de l'ordre de 4" Ct dans le but de réduire les risques d'évaporation de l'alcool. A cet égard, des réactifs préférés sont ceux qui comprennent les proportions volumiques - ou pondérales en ce qui concerne l'agent métachromatique - suivantes des susdits constituants préférés, pour un volume de 100 ml de liquide : - 20 à 50 ml d'éthanol, - 80 à 50 ml d'eau, - une quantité comprise entre 150 et 600 microlitres d'acide acétique glacial, telle que le pH du mélange final soit com pris entre environ 3 et environ 5, - 30 à 250 mg de bleu de toluidine. On a constaté la compatibilité des constituants de ce mélange, la grande stabilité de ce dernier ainsi que son effi cacité de coloration métachromatique des basophiles dans les conditions indiquées. Les proportions encore plus préférées des divers constituants dans le réactif selon l'invention sont les suivantes - 25 à 40 ml d'éthanol, - 75 à 60 ml d'eau, - une quantité comprise entre 150 et 600 microlitres d'acide acétique glacial, telle que le pH du mélange final soit com pris entre environ 3 et environ 5, - 30 à 100 mg de bleu de toluidine, pour un volume total de 100 ml de réactif. Des résultats optima sont obtenus avec un réactif à pH 3,4-3,6, contenant, par exemple, les susdits constituants dans les susdites proportions - environ 30 ml d'éthanol absolu, - environ 70 ml d'eau distillée, - environ 70 mg de bleu de toluidine, - environ 400 microlitres d'acide acétique glacial. L'invention concerne également un procédé de diagnostic des sensibilités anaphylactiques, plus particulièrement d'allergies,' lequel procédé consiste essentiellement à produire l'incubation de fractions différentes d'un même échantillon sanguis, respectivement en présence d'au moins un antigène, notamment allergène, suggéré par l'interrogatoire du malade à étudier, et d'un antigène témoin dont on n'a pas de raison clinique de suspecter une action allergisante chez le malade étudié, et, après le temps nécessaire à la réalisation de la dégranulation au moins partielle des basophiles en présence de l'allergène à éprouver, dans la mesure où l'échantillon sanguin testé serait sensible à ce dernier allergène, à mélanger les diverses fractions avec un réactif tel que défini plus haut, dans les conditions également indiquées plus haut, à effectuer ensuite les numérations des basophiles dans chacune des fractions et à comparer les numérations obtenues, l'obtention éventuelle d'une différence significative entre les numérations effectuées sur la fraction de l'échantillon initialement incubé en présence de l'antigène inactif et celles réalisées sur la fraction initialement incubée en présence de l'antigène, notamment de l'allergène à éprouver, traduisant alors la sensibilité anaphylactique du patient dont est provenu l'échantillon sanguin testé, à l'égard de l'antigène éprouvé. Il est entendu que l'invention s'applique au diagnostic de la sensibilité du patient à tout antigène ou agent chimique susceptible de causer une dégranulation des basophiles, même si dans les cas les plus fréquents ces agents ou antigènes sont constitués par des allergènes. Le grand avantage de la technique de diagnostic selon 1 'in- vention réside dans sa simplicité. Elle est basée sur des techniques de numération uniquement, sans qu'il soit nécessaire de se préoccuper des transformations morphologiques subies par les basophiles en présence d'antigènes dégranulants. En effet la technique de coloration selon l'invention ne révèle que les granules des basophiles non dégranulés. Les basophiles présents dans la solution, mais ayant subi une dégranulation, ne sont pas colorés. Les numérations sont de préférence réalisées sur des échantillons sanguins tout de suite après l'opération d'incubation, en présence de l'allergène à tester. Elles peuvent également être remises à plus tard. Il convient cependant alors de bloquer les réactions et d'éviter l'agrégation ultérieure des cellules, par exemple par addition d'un agent antiagrégant, tel que I'éthylènediamineté- tracétique (EDTA) sodique. L'invention concerne enfin une présentation en une trousse dans laquelle sont rassemblés tous les réactifs nécessaires au diagnostic des allergies ou analogues. Dans l'une de ces formes préférées, la présentation pharmacologique comporte un réactif liquide conforme à l'invention, d'une part, et les allergènes de base nécessaires au diagnostic de l'allergie, dans des récipients respectivement distincts, d'autre part. Eventuellement, les constituants essentiels du réactif iiquide peuvent également être contenus dans des récipients distincts, le cas échéant sous des volumes correspondant aux proportions requises dans le réactif, de sorte que le manipulateur n'aura plus qu'à les mélanger pour constituer ce réactif qui peut ensuite être cnnservé pendant un temps prolongé en raison de sa stabilité surtout si les susdites proportions correspondent aux cas préférés qui ont été évoqués plus haut. Dans une forme préférée de présentation des allergènes de base, on a recours a des petits tubes ou à des plaques à cuvettes, ces tubes ou cuvettes étant revêtus de quantités predeterminees de ces différents allergènes, à l'état sec. Le dépôt de ces allergènes dans ces tubes ou cuvettes peut être réalisé de toute façon en soi connue, par exemple à partir de suspensions ou so- lutions de ces allergènes préalablement placés dans ces tubes ou cuvettes, par lyophilisation ou évaporation du solvant. En ayant recours à cette dernière forme de présentation, on peut donc réaliser très rapidement des diagnostics d'allergies. Il suffit en effet d'introduire dans chacun de ces tubes ou cuvettes une quantité prédéterminée de sang, par exemple à l'aide d'une micropipette, de réaliser l'incubation du sang au contact de ces allergènes à une température et pendant une durée appropriées à la réalisation, dans l'un ou l'autre de ces tubes ou cuvettes, de la dégranulation des basophiles sanguins, dans la mesure où ceux-ci donneraient lieu à une telle réaction en présence de l'allergène correspondant, d'ajouter ensuite, dans chacun de ces tubes ou cuvettes, un volume également prédéterminé du réactif selon l'invention, et de réaliser ensuite la numération des basophiles dans chacune de ces cuvettes, dans les conditions qui ont été évoquées plus haut. D'autres caractéristiques de l'invention apparaitront encore au cours de la description qui suit de modes de mise en oeuvre du procédé et du réactif selon l'invention. On notera que le sang utilisé dans les essais décrits ci-après a été recueilli sur l'héparine pure (10 unités héparine par millilitre de sang dans des tubes en plastique siliconé). Dans l'attente de la réalisation des essais, le sang est maintenu, soit dans la glace, soit sous agitation, pour éviter l'agrégation non spécifique des leucocytes. EXEMPLE 1 : Préparation du réactif colorant selon l'invention. On mélange 70 ml d'éthanol à 95 % avec 30 ml d'eau distillée, puis on ajoute 75 mg de bleu de toluidine, tel que celui commercialisé par K and K, Lab. Plainview, NY, USA. On soumet ce mélange à une agitation jusqu'à dissolution complète. Tout en poursuivant cette agitation, on ajoute 400 microlitres d'acide acétique glacial, ce qui amène le pH de la solution à 3,4-3,6. Cette solution est filtrée quarante-huit heures plus tard. Le filtrat peut être conservé pendant plusieurs mois à la température ambiante. Toutefois, pour réduire l'évaporation de l'éthanol, il est préférable de le conserver à 4" C. I1 y a intérêt aussi de filtrer la solution environ tous les deux mois. EXEMPLE 2 : Coloration métachromatique et numération des basophiles sanguins. On verse 0,50 à I ml de sang (d'homme ou de lapin) dans un tube renfermant 10 unités par ml d'héparine ou 25 microlitres d'EDTA sodique, 0,2 M de pH 7,4. On dilue ensuite cet échantillon de sang dans neuf fois son volume du réactif colorant de l'exemple 1, ce qui conduit à un pH de l'ordre de 4,5. Le mélange est agité doucement et l'on procède, après 4-5 minutes, à la numération des basophiles, de façon en soi connue, dans la chambre d'un hémocytomètre. De la même façon, on peut opérer sur des volumes plus petits, par exemple sur iOpl de sang (prélevé au doigt chez l'homme). A 90vu de réactif contenu au fond d'un microtube type "rhésus", on ajoute 10/ul de sang et l'on dénombre les taches rouges, résultant de la coloration métachromatique des basophiles, comme dans le cas précédent. Les résultats obtenus avec du sang prélevé chez lthomme sain et le lapin ont été les suivants chez l'homme 23 à 70 basophiles par mm3 de sang (12 échantillons) ce qui correspond à une moyenne + une déviation standard de 44 + 8 chez le laEin sain : 3 298 + 23 basophiles par mm de sang (38 échantillons). La technique décrite ci-dessus permet également de dénombrer les autres leucocytes, lorsque l'on opère à un pH plus élevé. En particulier, on constate, lorsque l'on accroît progressivement le pH, que, successivement, les noyaux des petits lymphocytes, puis les lymphocytes plus grands, les monocytes et enfin les leucocytes polynucléaires se teignent progressivement en bleu. On obtient les pH les plus élevés, soit en opérant avec un réactif contenant moins d'acide acétique, soit en ajoutant de la soude au réactif avant le mélange du réactif avec ltéchan- tillon de sang à étudier. EXEMPLE 3 : Etude de l'action d'allergènes. On introduit dans deux séries de tubes une quantité fixe de sang (250 à 500 microlitres). On ajoute des quantités crois santes de l'antigène à tester dans les tubes de la première sé rie et des quantités croissantes de l'antigène témoin, auquel le patient n'est pas sensible. Après agitation douce, on fait incuber le contenu des tubes à 370 C pendant 10 minutes. On ajoute ensuite une quantité d'EDTA sodique pour obtenir une dilution finale de 2 x 10 M. L'EDTA arrête la réaction et évite l'agrégation ultérieure des cellules. Les colorations peuvent être effectuées dans les 6'heures qui suivent, par exemple par prélèvement dans chacun des tubes de 10 microlitres de sang et par mélange de chacun de ces prélèvements avec 90 microlitres du réactif colorant. On effectue ensuite la numération des basophiles comme indiqué plus haut. A titre d'exemple, on donne, dans le tableau ci-après, les numérations moyennes de basophiles obtenues sur le sang de deux patients A et B, après incubation en présence de pollen, d'une part,et de pénicilline, d'autre part. Les numérations en présence de pollen sont données dans la première rangée horizontale et celles en présence de pénicilline dans la seconde rangée horizontale du tableau. Ces résultats mettent en évidence le fait que le patient A présente une allergie à l'égard du pollen, tandis que le patient B présente une allergie à l'égard de la pénicilline. Tableau A B 7 Pollen ................ 7 50 Pénicilline ............. 50 12 EXEMPLE 4 : Utilisation de microplaques pour l'étude de lac- tion d'allergènes. Des dilutions croissantes de l'antigène à tester dans de l'eau distillée enrichie en protéines, par exemple 0,01 à 0,1 % de sérumalbumine humaine, sont placées dans les cuvettes de microplaques du type Térasaki. On évapore le solvant liquide. Ces microplaques sont prêtes à l'utilisation. On ajoute 10 microlitres de sang dans chacune des cuvettes de la plaque, on agite et on place la microplaque en étuve humide à 37 C pendant 10 minutes. Le sang est ensuite introduit dans des tubes capillaires contenant de 1'EDTA sec et rejeté rapidement dans les cuvettes. On ajoute ensuite 90 microlitres du réactif colorant dans chacune des cuvettes et on effectue la numération des basophiles comme décrit plus haut. Les lectures peuvent être effectuées dans les cellules connues sous la désignation de "cellules Fuchs Rosenthal". Au lieu et place d'allergène n'importe quel agent dégranulant peut être ainsi testé. On peut ainsi évaluer la dégranulation des basophiles en présence d'un antisérum anti-IgE, ce qui fournit un autre paramètre de la réactivité allergique du malade. L'ensemble de laréaction peut être faite sur du sang "total" ou du sang lavé deux fois avec du tampon de Tyrode ou autre tampon isotonique. En inCorporant les taux d'allergène nécessaires pour la dégranulation en sang total et lavé, on peut mettre en évidence l'existence dans le plasma de facteurs blo- quants", c'est-d-dire consommant de antigène, dont l'importance est très grande en pathologie allergique. REVENDICATIONS 1 - Procédé de numération des basophiles et, le cas échéant, des leucocytes contenus dans un échantillon d'un milieu biologique, notamment un étantillon sanguin, caractérisé par le mélange direct de cet échantillon, de préférence en une seule étape, avec un réactif liquide contenant des agents capables de réaliser en même temps la destruction des érythrocytes de l'échantillon sanguin, la fixation des leucocytes et la stabilisation des basophiles, et enfin la coloration sélective des granules cytoplasmiques des basophiles. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le réactif est constitué par une solution d'un agent métachromatique des basophiles au sein d'un mélange eau-alcool contenant une faible proportion d'un acide, notamment telle que le pH du mélange échantillon-réactif soit tel qu'il permette à l'agent métachromatique d'exercer son effet de coloration spécifique des basophiles, lorsque ce réactif est mélangé avec le susdit milieu biologique. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que dans le susdit réactif l'alcool est constitué par un a-lcool miscible à liteau, apte à réaliser une fixation des leucocytes et une stabilisation des basophiles, l'eau agissant à la fois comme diluant de l'alcool et comme agent lytique des érythrocytes, et. l'acide est choisi parmi ceux qui sont compatibles avec les leucocytes, plus particulièrement les basophiles et, de préférence, aptes aussi à contribuer en même temps à la lyse des érythrocytes. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que le réactif contient, pour un volume de 100 ml de liquide : - d'environ 20 à environ 50 ml d'alcool, - d'environ 80 à environ 50 ml d'eau, de préférence de l'eau distillée, voire bidistillée, - moins de 1 ml d'un acide et - la quantité nécessaire de l'agent métachromatique. 5 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que le pH du réactif est compris entre environ 3 et environ 5. 6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que l'agent métachromatique est consti tué par un bleu de toluidine, l'alcool par de l'méthanol et l'acide par acide acétique. 7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le réactif contient pour un volume de 100 ml de liquide - 80 à 50 ml d'eau distillée, -- une quantité comprise entre 150 et 600 microlitres d'acide acétique glacial, telle que le pH du mélange final soit compris entre environ 3 et environ 5, - 30 à 250 mg de bleu de toluidine, - 20 à 50 ml d'éthanol. 8 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il contient, pour un volume de 100 ml de liquide : - 75 à 60 ml d'eau distillée, - une quantité comprise entre 150 et 600 microlitres d'acide acé tique glacial, telle que le pH du mélange final soit compris entre environ 3 et environ 5, - 30 à 100 mg de bleu de toluidine, - 25 à 40 ml d'éthanol. 9 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il contient, pour un volume de 100 mi de liquide : - environ 70 ml d'eau distillée, - environ 30 ml d'éthanol absolu, - environ 70 mg de bleu de toluidine, - environ 400 microlitres d'acide acétique glacial, le pH de cette solution étant de l'ordre de 3,4 - 3,6. 10 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'échantillon sanguin est constitué par du sang total. Il - Procédé selon lune quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'échantillon sanguin est constitué par du sang lavé. 12 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que le pH du mélange sang-réactif est réglé à une valeur de l'ordre de 4,5 ou à une valeur de pH un peu supérieure, selon que l'on veut dénombrer les basophiles seulement ou les basophiles et d'autres leucocytes contenus dans l'échantillon sanguin, ce pH résultant, soit du simple mélange du réactif avec l'échantillon sanguin, dans des proportions appropriées à cette valeur de pH, soit par ajustement au moyen d'un réactif basique ou acide. 13 - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le réactif a sensiblement la composition indiquée dans la revendication 9 et que le sang total est dilué par neuf fois son volume du réactif liquide. 14 - Réactif, notamment pour la numération des basophiles, et le cas échéant des autres leucocytes contenus dans un milieu biologique, notamment un échantillon sanguin, caractérisé en ce qu'il est constitué par une solution d'un agent métachromatique des basophiles au sein d'un mélangeesu-alcool contenant une faible proportion d'un acide, notamment telle que le pH du mélange échantillon-réactif soit tel qu'il 'permette à l'agent métachromatique d'exercer son effet de coloration spécifique des basophiles, lorsque ce réactif est mélangé avec le susdit milieu biologique. 15 - Réactif- selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'alcool est constitué par un alcool miscible à l'eau, apte à réaliser une fixation des leucocytes et une stabilisation des basophiles, l'eau agissant à la fois comme diluant de l'alcool et comme agent lytique des érythrocytes, l'acide étant choisi parmi ceux qui sont compatibles avec les leucocytes, plus particulièrement les basophiles et, de préférence, aptes aussi à contribuer en même temps à la lyse des érythrocytes. 16 - Réactif selon l'une quelconque des revendications 14 et 15, caractérisé en ce que le réactif contient, pour un volume de 100 ml de liquide : - d'environ 20 à environ 50 ml d'alcool, - environ 80 à environ 50 ml d'eau, de préférence de l'eau distillée, voire bidistillée, - moins de 1 ml d'un acide et - la quantité nécessaire de l'agent métachromatique. 17 - Réactif selon l'une quelconque des revendications 14 à 14 caractérisé en ce que son pH est ccmpris entre environ 3 et environ 5. 18 - Réactif selon l'une quelconque des revendications 14 et 15, caractérisé en ce que l'agent métachromatique est constitué par un bleu de toluidine, l'alcool par de l'éthanol et l'acide par l'acide acétique. 19 - Réactif selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il contient, pour un volume de 100 ml de liquide : - 80 à 50 ml d'eau distillée, - une quantité comprise entre 150 et 600 microlitres d'acide acétique glacial, telle que le pH du mélange final soit com pris entre environ 3 et environ 5, - 30 à 250 mg de bleu de toluidine, - 20 à 50 ml d'éthanol. 20 - Réactif selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il contient, pour un volume de 100 ml de liquide - 75 à 60 ml d'eau distillée, - une quantité comprise entre 150 et 600 microlitres d'acide acétique glacial, telle que le pH du mélange final soit compris entre environ 3 et environ 5, - 30 à 100 mg de bleu de toluidine, - 25 à 40 ml d'éthanol. 21 - Réactif selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il contient, pour un volume de 100 ml de liquide : - environ 70 ml d'eau distillée, - environ 30 ml d'éthanol absolu, - environ 70 mg de bleu de toluidine, - environ 400 microlitres d'acide acétique glacial, le pH de cette solution étant de l'ordre de 3,4 - 3,6. 22 - Application du procédé de numération des basophiles, selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, au diagnostic de sensibilités anaphylactiques, plus particulièrement d'allergies, caractérisé en ce que l'on produit l'incubation de fractions différentes d'un même échantillon sanguin, respectivement en présence d'au moins un agent dont doit être éprouvée l'action dégranulante des basophiles, de préférence un antigène, notamment allergène, et d'un antigène témoin, et, après le temps nécessaire à la réalisation de la dégranulation, au moins partielle, des basophiles en présence de l'allergène à éprouver dans la mesure où l'échantillon sanguin testé serait sensible à ce dernier allergène, on mélange les diverses fractions avec un réactif tel que défini dans l'une quelconque des revendications 14 à 21, dans les conditions définies dans l'une quelconque des revendications 1 à 13, on effectue ensuite les numérations des basophiles dans chacune des fractions et on compare les numérations obtenues, l'obtention éventuelle d'une différence significative entre les numérations effectuées sur la fraction de l'échantillon initialement incubé en présence de l'antigène inactif et celles réalisées sur la fraction initialement incubée en présence de l'agent à éprouver, traduisant alors la sensibilité anaphylactique du pa tient dont est provenu l'échantillon sanguin testé, à l'égard de l'agent à éprouver. 23 - Présentation pharmaceutique en une trousse, dans laquelle sont rassemblés tous les réactifs nécessaires au diagnostic des allergies ou analogues, ces réactifs comportant notamment un réactif liquide conforme à l'une quelconque des revendications 14 à 21, d'une part, et les allergènes de base nécessaires à la mise en oeuvre d'un diagnostic des eensibilités anaphylactiques, notamment de l'allergie, dans des récipients distincts, d'autre part. 24 - Présentation pharmaceutique en une trousse, selon la revendication 23, caractérisée en ce que les constituants essentiels du réactif liquide sont également présentés sous forme séparée dans des récipients distincts, de préférence sous des volumes correspondant aux proportions requises dans le réactif, selon l'une quelconque des revendications 17, 18, 19, 20 et 21. 25 - Présentation en une trousse, selon l'une quelconque des revendications 23 et 24, caractérisée en ce que les allergènes sont contenus dans les cuvettes d'une microplaque.