Brevet FR2305161A1 — publié le 19761022

La présente invention concerne une méthode et un produit pour déterminer par colorimétrie les périodes de fécondité ou l'état de grossesse' chez la femme. Il y a un très grand intérêt à pouvoir déterminer la période de fécondité chez la femme, ainsi qu'à examiner si une femme est erceinte,.ceci dans les premiers stades de la grossesse. L'intérêt de ia détermination de la période de fécondité est important pour les femmes qui désirent avoir un enfant ainsi que pour celles qui veulent éviter d'en avoir un, et l'ints- ret d'un examen de grosesse est-important pour les femmes dési rant recevoir des soins médicaux'et vue de la protection de leur santé et de celle de l'enfant, ainsi que pour l'interruption éventuelle d'une grossesse non désirée. Des produits et des méthodes d'essai pour déterminer par colorimétrie si une feime est féconde ont été décrits dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique Nos 3.406.016 et 3.699.005, ans lesquels les produits utilisés sont des bandes de papier. Dans le brevet No 3.406.016, la bande de papier est imprégnée d'une peroxydase et d'essence de gaïac et elle change dê couleur lorsqu'elle est humectée par la salive d'une femme se trouvant dans sa période de fécondité, changement de couleur qui est dfl à la présence de peroxyde dans la salive. Dans le brevet N 3.699.005 , la bande de papier est imprégnée de phosphate d'indoxyle ou de 5-bromo-indoxyle et d'un tampon non toxique maintenant un pH de 10 à 10,3 et cette bande change de couleur lorsqu'elle est humectée par la salive d'une femme dans sa période de fécondité, changement qui est d à I 'augmentation du taux de phosphatase alcaline dans la salive au cours de cette période. Par ailleurs, des dosages colorimétriques de phosphatasesacides dans des liquides biologiques sont connus par-le brevet des Etats-Unis d'Amérique No 3.595.756.- La présente invention est'fandde'9ur la découverte que la quantité de N-acétyl-ss-glacosaiinidase dans des liquides biologiques d'une femme est un signe de fécondité ou de grossesse, ou de leur absence, Plus précisément; la Demanderesse a trouvé qu'il se produit une brusque élévation de la quantité de N-acétyl ss-glucosaminidase dans de tels liquides au cours de la période de fécondité du cycle aenstru'el es que-par ailleurs, l'état de grossesse est lié à une diminution de N-acétyl-ss-glucosaminidase au cours d'une période particulière du cycle menstruel normal. ainsi, la présente invention a pour objet un produit d'essai pour le dosage colorimétrique de la quantité d'une certaine enzyme présente dans un milieu biologique d'une femme, cette quantité étant un indice de fécondité ou de grossesse , produit qui comprend une matière absorbant contenant un agent de tamponnage et un composé qui réagit en présence de cette enzyme au pH maintenu par le tampon, en formant une substance qui a une coloration nette à un pH déterminé j ce produit d'essai étant caractérisé en ce que l'agent de tamponnage est un tampon qui maintient un pH acide, de préférence compris entre 4 et 5 et en ce que le composé mentionné est un N-acétyl-P-d-glucosa minime. Cette invention comprend aussi une méthode d'examen pour le dosage colorimétrique de la quantité d'une certaine enzyme présente dans un milieu biologique d'une femme, cette quantité étant un indice de fécondité ou de grossesse, méthode consistant à mettre le milieu en contact avec un composé qui réagit en présence de cette enzyme à un pH particulier en formant Uk produit qui a une coloration nette à un pH déterminé, et après la formation de ce produit, à établir ce pH déterminé, cette méthode étant caractérisée en ce que le composé est un N-acétyl ss-d-glucossaxinide et le pH particulier est un pH acide, de pré térence compris entre 4 et 5. En ce qui concerne les dessins annexés la figure 1 est un graphique représentant la variation de l'activité (quantité) de N-acétyl-ss-gluósatinidase dans la salive d'une femme au cours d'une partie du cycle menstruel; les figures 2 et 3 sont des graphiques montrant les variations des activités (quantités) de phosphatase alcaline et de phosphatase acide, respectivement, dans la salive d'une femme au cours d'une partie du cycle menstruel, les variations de phosphatase alcaline constituant la base du brevet des Etats- Unis d'Âmérique No. 3.699.005 ; et la figure 4 illustre la corrélation qui existe entre les quantités de N-acétyl-P-glucosaminidase dans la salive d'une femme si celle-ci n'est pas enceinte et les quantités de cette même substance en état de grossesse, au cours d'une partie parti culière du cycle menstruel normal. Dans chacune des figures 1 à 3, les résultats ont été normalisés par l'attribution d'une valeur 100 à la plus forte activité enzymatique au cours du cycle menstruel et la flèche qui est représentée à l'abscisse zéro indique le début de la menstruation. La méthode selon l'invention comprend l'examen par colorimétrie d'un liquide biologique tel que la salive, le liquide vaginal ou le liquide cervical, pour doser la N-acétyl -glucosaminidase avec un N-acétyl-I3-d-glucosaminide qui réagit en présence de cette enzyme, à un pH acide, en formant un produit ayant une coloration nette à un pH déterminé, normalement un pH basique. Ces glucosaminides sont des dérivés de la N-acéty d- glucosamine ayant un substituant qui s'élimine au cours de la réaction en formant le produit mentionné.De préférence, le glucosaminide est un dérivé phénolique incolore ou pratiquement incolore de la N-acétyl-ss-d-glucosamine, qui réagit en présence de la glucosaminidase, à un pH acide, en formant un phénol qui a une coloration nette à un pH basique. Dans la plupart des cas, la réaction se produit à un pH de 4 à 5 et la coloration nette apparat à un pH basique compris entre 8 et 11 en général entre 9 et 11.Le terme "phénol" désigne ici dea composés aryliques hydroxyles en général plutôt que l'hydroxybenzène lui-mSme. Des oxomples de tels dérivés phénoliques sont le p-nitrophényl-N acétyl-X-d-glucosaminide, le 1-(p-nitrocatéchol)-N-acétyl-ss-d- glucosaminide, le 2-(p-nitrocatéchol)-N-acétyl-ss-d-glucosaminide, le 3,3-bis(p-hydroxyphényl)phtalide-N-acétyl-ss-d-glucosaminide, le 3-amino-4-nitrophényl-N-acétyl-ss-d-glucosaminide, le 2-méthyl4-nitrophényl-N-acétyl-ss-d-glucosaminide, le 3-méthyl-4-nitro- phényl-N-acétyl-B-d-glucosaminide, le 3-nitro-2 ,4 ,6-triméthyl phényl-N-acétyl-ss-d-glucosaminide, le 2-ac étylamino-4-nitrophényl- N-acétyl--d-gluco s aminide, le 3-nitro-4-méthoxyphényl-N-acétyl-ss- d-glucosaminide, le 3-nitro-4-acétylphényl-N-acétyl-ss-d-glucosaminide, le 3-nitro-4-méthylphényl-N-acétyl-ss-d-glucosaminide, le 2-méthoxy-4-nitrophényl-N-acétyl-ss-d-glucosaminide, le m-nitro phényl-N-acétyl-P-l~glucos aminide, le 2,4-dinitrophényl-N-acétyl- P-d-glucos aminide, le 2,6-dinitrophényl-N-acétyl-ss-d-glucosaminide, le 2,5-dinitrophényl-N-acétyl-ss-d-glucosaminide, 1 'ortho-nitro- phényl-N-acétyl-ss-d-glucosaminide et le 2-amino-4-nitrophényl- N-acétyl-ss-d-glucosaminide. La quantité de glucosaminide utilisée dans la méthode et dans le produit selon l'invention doit être suffisante pour permettre la formation de la quantité maximale du produit de réaction qui soit possible avec la quantité de glucosaminidase présente dans l'échantillon examiné, au cours de la période d'incubation (réaction) donnée, afin de produire une réaction colorée maximale avec la quantité de glucosaminidase de l'échantillon, l'intensité de la coloration constituant une mesure de cette quantité. On peut exécuter la méthode en solution, en mélangeant d'abord un échantillon d'un liquide de la femme1 par exemple 0,1 ml de salive, avec 0,1 ml d'une solution de p-nitro phényl-N-acétyl-ss-d-glucosaminide 0,1 M dans un tampon 0,1 M de citrate de sodium et d'acide citrique et 0,2 ml d'un tampon au citrate de sodium 0,1 M (pH 4,5), puis, après avoir secoué jusqu'à ce que les réactifs soient bien mélangés, on les laisse réagir pendant 30 minutes à la température ordinaire pour que la N-acétyl-ss-glucosaminidase de la salive hydrolyse le p-nitro phényl-N-acétyl--d-glucosaminide en en éliminant le radical p-nitrophényle , avec formation de p-nitrophénol. Â la fin de la période de réaction, on ajoute au mélange 1,0 ml d'un second tampon de glycinate de sodium 1,0 M (PH 10,3) pour arrenter l'hydrolyse et faire apparaître la coloration jaune caractéristique du p-nitrophénol aux pH basiques. L'absorbance du mélange de réaction est alors déterminée à 400 nm et elle est comparée à une courbe d'absorbance étalonnée qui a été établie avec des solutions de p-nitrophénol de concentrations connues, à pH 10,3. Dans la présente méthode, on peut utiliser d'une manière semblable d'autres dérivés phénoliques de la N-acétyl-ss-d-glucosamine. On peut par exemple remplacer, dans l'exemple que l'on vient de décrire, le p-nitrophényl-N-acétyl-P-d-glucosaminide par le 3,3 bis-(p-hydroxyphényl)phtalide-N-acétyl-ss-d-glucosaminide 0,1 M, la phénolphtaléine étant dans ce cas le produit de réaction formé. La méthode peut aussi être exécutée avec le produit d'essai selon l'invention, qui comprend une matière absorbante contenant un N-acétyl-P-d-glucosamFnide tel que décrit ci-dessus avec un agent de tamponnage maintenant un pH acide. Les matières absorbantes pouvant etre utilisées à cette fin sont celles qui , par une action de capillarité ou par toute autre action ou technique physique ou chimique, peuvent retenir des liquides. Ces matières comprennent par exemple le papier d'essai, par exemple du papier filtre, des bandes de cellulose, de bois, de feutre, de matières céramiques poreuses, de velours ou autres étoffes mais il est préférable de prendre du papier du fait qu'il est peu coûteux.On peut préparer un produit d'essai typique en imprégnant une bande d'un papier poreux avec 0X1 à 0,5 ml d'une solution d.'un substrat tamponné consistant en p-nitrophényl-N acétyl-ss-d-glucosaminide 0,1 X,disaous-dins un tampon au citrate de sodium 0X1 M (pH 4-5), puis en séchant la bande à une texpé- rature pouvant être comprise entre la température ambiante et 1000C (sans carbonisation) pour évaporer le solvant aqueux et laisser le glucosaminide et le tampon sur le papier. La bande de papier ainsi préparée peut servir a' déterminer la période de fécondité de la marnière suivante. La femme met sa langue en contact avec le papier ou bien elle le mouille de toute autre manière avec sa salive puis attend environ 20 à 40 minutes, en général 30 minutes, à la température ambiante, pour que se forme sur la partie humectée du papier le produit de réaction phénolique, et on peut ensuite faire apparaître la coloration du phénol en mouillant la bande avec une petite quantité d'un tampon au glycinate de sodium 0,1 M (pH 9-11).La coloration obtenue est alors comparée avec une échelle de couleurs étalonnée comprenant une série de taches colorées qui ont été formés d'une manière semblable pour des concentrations connues de p-nitrophénol à pH 9-11. Le papier fait apparaître une coloration maximale au cours de la période d'ovulation et de fécondité de la femme, alors qu'aux autres périodes il ne subit aucune modification de couleur ou qu'une modification minimale D'après la figure 1 du dessin annexé, le produit d'essai (papier par exemple) présenterait une modification de couleur nette dans la période allant d'environ 18 à Il jours avant le début de la menstruation} en réponse à la brusque élévation de la quantité de lucosaminidase au cours de cette période qui est illustrée par cette figure. Une femme peut ainsi désirer ou non avoir une activité sexuelle au cours de cette période, suivant son désir de grossesse. La sensibilité de la méthode selon l'invention par rapport aux méthodes fondées sur l'augmentation du taux de phosphatase est montrée par une comparaison entre la figure 1 d'une part et les figures 2 et 3, d'autre part, les résultats qui sont représentés sur les figures 2 et 3 ayant été déterminés de la manière suivante.Pour réaliser l'essai de la phosphatase alcaline, on commence par préparer un tampon au glycinate de sodium ou de potassium 0,1 M ajusté à pH 9,6 et un substrat tamponné comprenant du phosphate de p-nitrophényle 0,1 X en solution dans un tampon de glycocolle 0,1 M (pH 9,6). On exécute l'essai en ajoutant 1,0 ml du mélange de substrat tamponné à 0J2 il de salive, on secoue et on laisse réagir (incubation) pendant 45 minutes à la température de 370 C. On détermine alors â 400 ni la coloration produite et on la compare avec une courbe d'étalonnage de couleurs de p-nitrophénol.Pour réaliser l'essai do phosphatase acide, on prépare un tampon 0,1 X d'acide acétique et d'acétate de sodium ajusté à pH 427 , un substrat tamponné coloprenant le sel disodique du phosphate de p-nitrophényle 0,1 M, on solution dans un tampon d'acétate de sodium 0,1 M ajusté à pH 4,7, et enfin un tampon au glycinate de sodium alcalin 1,0 K ajusté à pH 10,3. L'essai consiste à ajouter 0,1 mi du substrat tamponné et 0,2 mi du tampon d'acide et d'acétate à 0,1 il de salive puis à aecouer et à laisser réagir pendant 30 minutes à la température ambiante.On ajoute ensuite au mélange de réaction 1,0 mi du tampon de glycine, on détermine 1'absorbance du mélange à 400 nm et on la compare à une courbe d'étalonnage de couleurs de p-nitrophénol0 Comme le montrent les figures 1 à 3, le taux de base de glucosaminidase est en général bien inférieur à 50 * tandis que les taux de base de phosphatase acide et de phosphatase alcaline sont généralement supérieurs à 50 %, ce qui signifie que ces augmentations des taux de phosphatases, qui sont liées à la fécondité, ne sont pas en général aussi importantes que l'aug tentation correspondante du taux de glucosaminidase et qu'ainsi dans le cas des phosphatases, la modification de couleur peut ne pas être aussi nette que dans le cas de la glucosaminidase. De plus, dans l'essai de la phosphatase alcaline, l'augmentation d'activité s'étend sur un intervalle de temps plus long que dans l'essai de la glucosaminidase, c'est-à-dire que le premier essai peut ne pas etre aussi précis que le second. On peut voir sur la figure 1 qu'il se produit une seconde élévation, plus faible, du taux de glucosaminidase dans les quelques jours qui précèdent le début de la menstruation. La figure 4 cst une représentation agrandie de cette seconde élévation et de l'effet qu'a sur elle la grossesse, déterminée conformément à la présente invention, sur 40 femmes non enceintes et sur 8 femmes enceintes.Les quantités de glucosa minidase sont reportées en densités optiques normalisées de solutions d'essai, déterminées par les absorbances de ces solutions à 400 nmO La flèche qui est représentée à l'abscisse zéro indique le premier jour de la menstruation pour les femmes non enceintes et, dans le cas des femmes enceintes le jour où l'on devrait normalement 8 s'attendre à voir débuter les règles en l'absence de grossesse. La zone hachurée en lignes verticales represente le domaine des densités optiques pour les femmes non enceintes et la zone hachurée en lignes horizontales le domaine des densités optiques pour les femmes enceintes. On voit que l'état de grossesse supprime pratiquement la seconde élévation du taux de glucosaminidase et il est généralement lié à une diminution d'activité au cours de la période examinée. Il en résulte que Si le résultat d'un ex men tombe dans la zone qui n'est hachurée qu'horizontalement, la femme considérée est probablement enceinte. Si le résultat tombe dans la zone qui est hachurée à la fois horizontalement et verticalement, on ne peut rien en conclure et s'il tombe dans la zone qui n'est hachurée que verticalement, il est probable que la femme considérée ='est pas enceinte. R R V E I; D I C A ? I O N S l- Produit d'essai pour le dosage colorimétrique de la quantité d'une certaine enzyme présente dans un milieu biologique d'une femme, cette quantité étant un indice de fécondité ou de grossesse, produit qui comprend une matière absorbante contenant un agent de tamponnage et un composé qui réagit en présence de cette enzyme au pH maintenu par le tampon, en formant une substance qui a une coloration nette à un pH déterminé, ce produit d'essai étant caractérisé en ce que l'agent de tamponnage est un tampon qui maintient un pH acide, et en ce que le composé mentionné est un I;-acétyl-ss-d-glucosa- minide. 2.- Produit selon la revendication 1, caractérisé en ce que le N-acétyl-ss-d-glucosaminide est un dérivé phénolique de la N-acétyl-t3-d-glucosamine qui forme un phénol ayant une coloration nette à un pH alcalin. 3.- Produit selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'agent de tamponnage est un tampon qui maintient le pH entre 4 et 5. 4.- Produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le composé est le p-nitro phényl-N-acétyl--d-glucosaminide ou le .3,3-bis (p-hydroxyphényl) phtalide-N-acétyl-P-d-glucosaminide, So Produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'agent de tamponnage est constitué par du citrate de sodium et de l'acide citrique. 60- Méthode d'essai pour le dosage colorimétrique de la quantité d'une certaine enzyme présente dans un milieu biologique d'une femme, cette quantité étant un indice de fécondité ou de grossesse, méthode consistant à mettre le milieu en contact avec un composé qui réagit en présence de cette enzyme à un pH particulier en formant un produit qui a une coloration nette à un pK déterminé, et après la formation de ce produit à établir ce pH déterminé, cette méthode étant caractérisée en ce que le composé est un N-acétyl-ss-d-glucosaminide et le pH particulier est un pH acide. 70- Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que le pH acide est compris entre 4 et 5. 8.- Méthode selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce que le pH déterminé est un pH alcalin. 9.- Méthode selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisée en ce que le pH déterminé est compris entre 8 et 11. 10ç- Méthode selon la revendication 8 ou 9, caractérisée en ce que le N-acéty > ss-d-glucosaminide est un dérivé phénolique de la N-acétyl-ss-d-glucosamine qui forme un phénol au pH acide spécifié, ayant une couleur nette au pH alcalin spécifié. 11.- Méthode selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisée en ce que le N-acétyl-P-d-glucosa- timide est le p-nitrophényl-N-acéyl-ss-d-glucosaminide ou le 3Z3-bis(p-hydroxyphényl)phtalide-N-acétyl-ss-d-glucosaminide. 12.- Méthode selon l'une quelconque des revendications 6 à 11, caractérisée en ce que le milieu biologique est de la salive. 13e- Méthode selon l'une quelconque des revendications 7 à 12 caractérisée en ce que le pH compris entre 4 et 5 est maintenu par tamponnage du milieu avec un tampon de citrate de sodium et d'acide citrique. 14.- Méthode selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisés en ce que le pH est élevé entre 8 et Il par tamponnage avec du glycinate de sodium. 15.- Méthode selon l'une quelconque des revendications 6 à 14, caractérisée en ce que le milieu biologique est mis en contact avec le N-acétyl-t3-d-glucosaminide, au pH acide spécifié, pendant une période d'incubation (réaction) de 20 à 40 minutes.