Brevet FR2290219A1 — publié le 19760604

Pseudomonas aeruqinosa, ou bacille pyocyanique, autrefois considéré en pathologie humaine presque comme une curiosité, est devenu, depuis quelques années, un des principaux agents des infections gravissimes en milieu hospitalier. Sa résistance extrême à la plupart des antibiotiques et le développement des techniques de réanimation sont les principaux facteurs écologiques responsables de la sélection si fréquente de ces bactéries, en particulier de leurs variétés virulentes. Il en résulte que la solution de ce grave problème infectieux, sur le plan épidémique, n'est plus dans le traitement, souvent très difficile, des cas individuels d'infection, mais dans la prévention de ces infections par des méthodes d'hygiène et surtout de vaccination. De nombreux auteurs ont décrit les propriétés vaccinantes d'antigènes obtenus à partir de cultures de P. aeruainosa à l'égard d'infections expérimentales créées chez des souris. Plus particulièrement, ils se sont adressés aux produits d'excrétion de ces bactéries, souvent désignés sous le terme anglais de "lime, et qui, comme il est bien connu des spécialistes, rendent les cultures liquides de P. aeruqinosa rapidement visqueuses. On pensait en effet que ces produits d'excrétion visqueux contenant divers enzymes extra-cellulaires, protéines, acides nucléiques, devaient également comporter des antigènes vaccinants à l'égard des infections créées par le bacille du genre en question. C'est bien ce que confirment les nombreuses expériences qui ont été décrites jusqu'à ce jour.C'est pourquoi de nombreux auteurs ont décrit des méthodes d'extraction du "slime" ayant, pour la plupart, en commun une étape de séparation du "slime" à partir de cultures bactériennes, par simple agitation à température ambiante et sans lavage préalable des bactéries. I1 a en particulier été proposé d'extraire un principe actif, d'ailleurs riche en enzymes extra-cellulaires et protéines, à partir du surnageant visqueux obtenu par précipitation directe, habituellement en une seule étape, par l'éthanol. Certains des extraits ainsi obtenus se sont révélés posséder effectivement un pouvoir vaccinant che- la souris, à l'égard des infections causées par les bactéries dont ils étaient originaires. Malheureusement, leur toxicité relativement importante rend difficile leur utilisation en clinique humaine ou vétérinaire. L'invention a pour but de remédier à ces difficultés, plus particulièrement de fournir des principes actifs, utilisables pour la constitution de vaccins ou sérums, qui soient à la fois au moins aussi actif s, sinon plus actifs, que les préparations vaccinantes connues et, en même temps, dépourvus de toxicité. L'invention repose sur la découverte que l'on pouvait obtenir un tel extrait vaccinant non toxique à partir de bactéries, préalablement débarrassées par lavage, des produits d'excrétion labiles et des impuretés du milieu de culture, dons 3:5S t ndition n3 Le principe actif selon l'invention est notamment obtenu par la mise en oeuvre d'un procédé caractérisé en ce que l'on cultive, de préférence à l'abri des impuretés du milieu de culture, une souche de la bactérie sus-indiquée choisie parmi les P. aeruqinosa qui sont virulentes et qui appartiennent au type morphologique "la", que l'on recueille cette culture, que l'on sépare, si besoin, les bactéries recueillies des impuretés du milieu de culture, que l'on lave les bactéries avec un liquide à faible force ionique, tel que l'eau distillée, pour séparer les produits labiles d'excrétion des bactéries, que l'on met en suspension les bactéries préalablement lavées au sein d'un milieu liquide et que l'on chauffe la suspension formée à une température comprise entre environ 37 et environ 800C, ce milieu liquide ayant, à ladite température, une force ionique suffisante pour extraire les constituants de la capsule entourant les bactéries (substances péribacillaires), que l'on sépare la partie solide et que l'on recueille la solution contenant le susdit principe actif. La mise en oeuvre de ce procédé permet d'obtenir des préparations ayant une activité vaccinante très importante et sensiblement dépourvue de toxicité. I1 importe de noter que la température à laquelle est effectuée l'opération d'extraction proprement dite de l'agent actif, à partir des bactéries préalablement lavées, constitue un paramètre essentiel du procédé selon l'invention. En particulier, on constate qu'à une température d'environ 37"C, la mise en oeuvre du même procédé, toutes les autres conditions étant par ailleurs les mêmes, ne permet tout au plus d'extraire que des quantités négligeables, sinon inexistantes, de produit actif. Du côté des hautes températures, on observe une diminution de l'activité du principe actif obtenu,lorsque la température d'extraction dépasse 80-C. De préférence, on opère à une température comprise entre 500C et 70"C environ. Un rendement optimal est obtenu à une température de l'ordre de 60 C. Comme on l'a indiqué plus haut, le procédé selon ltinven- tion est appliqué à des souches de P.aeruqinosaX qui sont virulentes. I1 faut entendre par virulentes toutes souches qui ont provoqué ou qui sont susceptibles de provoquer des accidents graves, sinon mortels, pour les malades atteints de septicémie. I1 s'agit donc en général de souches qui ont été isolées chez de tels malades. On sait cependant aussi que les souches de P. aeruqinosa de collection peuvent, si besoin, être rendues virulentes, notamment par passages répétés chez l'animal, par exemple les souris - L'accroissement de virulence des souches traitées peut s'apprécier par l'accroissementdupomotr %-'t d ces bactéries à l'égard d'animaux d'expériences, notamment de souris. Un autre paramètre,dont on tiendra compte avec avantage pour sélectionner les bactéries virulentes mises en oeuvre dans le procédé selon l'invention,réside également dans la quantité et l'activité des principes vaccinants obtenus par la mise en oeuvre de ce procédé,à partir d'échantillons bactériens présé -lectionnés présentant les~caractéristiques qui ont été définies ci-dessus à partir d'échantillons bactériens. L'activité des principes vaccinants obtenus peut s'apprécier rapidement, par exemple par des essais de séroneutralisation tels que décrits plus loin. Un autre paramètre important du procédé selon l'invention réside dans la mise en oeuvre de bactéries préalablement débarrassées, aussi bien des impuretés du milieu dans lequel elles ont été cultivées, que des produits labiles, notamment les enzymes extra-cellulaires, qu'elles ont elles-mêmes excrétées. L'élimination des impuretés du milieu de culture peut naturellement être réalisée par tout procédé en soi connu, par exemple par centrifugation. Cependant, dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon l'invention, on réalise la culture des bactéries sur un milieu, de préférence solide, à travers des feuilles ou pellicules cellulosiques du type CELLOPHANE, ce qui évite toute contamination des bactéries au cours de leur croissance par les impuretés du milieu de culture. Le lavage des bactéries par un liquide à faible force ionique, et notamment de l'eau distillée, constitue un autre paramètre important du procédé selon l'invention. Ce lavage permet l'élimination en particulier des enzymes extra-cellulaires, dont le pouvoir vaccinant est faible. En outre, elles sont également toxiques. L'extraction du principe actif selon l'invention à partir des cellules préalablement lavées et mises en suspension au sein d'un milieu ayant une force ionique suffisante pour extraire ces principes actifs hors de la capsule entourant les bactéries (substance peribacillaire) dans les conditions de tepé- rature sus-définies, peut être mise en oeuvre, notamment avec tout milieu aqueux salin ayant à cet effet une concentration suffisante en sel. Avantageusement, on a recours à des solutions de NaCl dont la concentration molaire est comprise environ entre 0,1 M et 1 M, de préférence de l'ordre de 0,15 N. On sépare alors les parties solides et on recueille le surnageant.Celuici est alors traité en vue d'éliminer les sels minéraux, plus particulièrement le chlorure de sodium, notamment par dialyse. La solution obtenue après dialyse est alors concentrée, notamment par évaporation sous pression réduite à une température ne dépassant de préférence pas 80ex, cependant sans dépasser le seuil de saturation de la solution en les produits dissous qu'elle contient. La solution obtenue du principe actif ei-après, dite "solution d'extraction" contient encore des protéines, des acides nucléiques et autre produits du métabolisme bactérien, de même que des traces de mucopeptide Ces solutions peuvent être utilisées telles quelles dans le cas où les divers constituants mentionnés sont pratiquement dépourvus de toxicité, comme ce peut être lue cas pour les solutions obtenues à partir de certaines souches de P. aeruqinosa. Avantageusement cependant, on aura recours à une séparation sélective de la plus grande partie de ces constituants étrangers, en mettant en oeuvre des agents utilisés dans des conditions telles qu' ils soient susceptibles de précipiter les protéines, sans cependant préci pi0erles constituants gluddiques. Acet eft, on peut utilIser des solutions salines ou des alcools, notamment l'éthanol, en proportions volumiques suffisamment faibles vis à vis de la "solution d'ex traction généralement aqueuse obtenue par la mise en oeuvre du procédé, tel qu'il a été défini plus haut, pour ne pas précipiter les polyosides. Une purification supplémentaire peut encore être obtenue, cette fois-ci par précipitation de' la fraction contenant les polyosides, le précipité contenant alors l'agent vaccinant actif .On peut à cet effet avoir recours à tout agent connu de précipitation des polyosides, par exemple un alcool, notamment 1'ethanol, en proportions volumiques suffisamment élevées à cet effet vis à vis de la solution d'extraction" aqueuse contenant ces polyosides à l'état dissous, ou l'acétone etc... Un mode de purification avantageux met en oeuvre l'alcool dans les deux cas: précipitation de protéines par mise en contact, par exemple pendant 24 heures, de la'bolution d'extraction aqueuse contenant le principe actif selon l'invention avec de l'alcool, jusqu'à obtenir une proportion de 1 volume d'alcool pour 1 volume de solution aqueuse, de préférence à basse température, par exemple 4"C, puis précipitation des polyosides par mise en contact, dans les mêmes conditions, de la solution aqueuse obtenue avec une proportion d'alcool plus élevée, notamment de 5 volumes d'alcool pour 1 volume de solution aqueuse. Le précipité obtenu,contenant l'agent actif, est dénommé dans ce qui suit :"antigène protecteur brut. Cet antigène protecteur peut être lyophilisé. Il est exempt de cellules bactériennes visibles au microcospe ou capables d'entre cultivées. Si besoin, l'antigène protecteur brut peut être soumis à des traitements de purification supplémentaires, notamment par précipitation des acides nucléiques par un agent dénaturant des acides nucléiques, tel que le sulfate de streptomycine ou une DNase ou une RNase, de lyse des protéines accompagnant encore l'antigène sous l'action d'enzymes proselytiquestels que la trypsine. L'antigène protecteur peut également etre purifié de façon en soi connue, par exemple par filtration sur tamis moléculaire, par exemple celui connu sous la désignation commerciale SEPHADEX, ou par échange d'ions, par exemple sur résine échangeuse d'ions du type DEAE Cellulose. On obtient donc un procédé à la fois simple et efficace pour extraire de celles des cultures de P.aeruqinosa qui possèdent les caractéristiques sus-indiquées, des principes actifs qui ne sont pas extractibles, sinon en quantités négligeables, en tous les cas pas sous la forme de préparation non toxique, par la mise en oeuvre des procédés anterieurss en général à la température ambiante et à partir de matières premières du type "slime". L'importance de disposer d'un procédé qui permette l'obtention,dans des conditions simples,d'extraits suffisamment purifiés et dépourvus de toxicité pour être utilisables en tant que principes actifs de vaccins, ou pour servir à la production de serums, prend un relief tout particulier, si l'on prend en considération le grand nombre de sérotypes connus de P.Aeruainosa, par conséquent len6mb: important de principes actifs dont il faut pouvoir disposer pour la constitution de vaccins ou pour la production de sérums actifs à l'égard de tous ces sérotypes. D'autres caractéristiques de l'invention apparattront encore au cours de la description d'exemples d'extractions de tels principes actifs et de leurs propriétés pharmacologiques. A. EXEMPLE DE PREPARATION D'UN PRINCIPE ACTIF SELON L'INVENTION 1. La souche bactérienne étudiée La souche désignée 72V de Pseúdomonas aeruqinosa, utilisée dans cette étude, a été isolée en 1972 à l'hôpital Necker. Elle fut responsable d'une septicémie mortelle en 24h chez un malade. Elle a été déposée sous ne n I-005 dans la collection ne l'Institut skieur de Paris. Cette souche donne sur gélose trypticase-so;a des colonies "la" pigmentées typiques de cette espèce bactérienne et fait partie du groupe sérologique 06 de la classification de HABS (1957). 2. La culture des bactéries. La culture est faite en boites de Pétri (diamètre 20cm), à travers des membranes de cellophane selon la technique de LIU (1957). Le milieu de culture choisi est celui qui a été défini par LIU et al. (1961) : Tryptone 0,5 %; glu cose 1 %; NaCl 0,3 %; Na2H P04 0,5 X; agar 1,2 %. L'ense mencement est effectué par inondation, avec un inoculum bactérien de l'rdre de 108 bactéries par ml. Après une in, cubation de 24 heures à 30 C, les bactéries sont récoltées et lavées deux fois en eau distillée. Les microorganismes sont alors remis en suspension épaisse, avec des billes de verre, dans une solution de NaCl 0,-15 M ou 0,50 M. 3. Obtention d'antigènes Protecteurs bruts Des échantillons distincts de la suspension bactérienne obtenue sont chauffés à 60 C ou à 1000C, pendant des temps respectivement variables (15, 30, 60 ou 90 min), et soumis à une agitation douce à intervalles réguliers. Chacun des échantillons est ensuite traité comme suit Les bactéries sont ensuite centrifugées pendant 30 min. à 10.000 g et à + 40C, et ---------------------------- le surnageant est dialysé contre de l'eau distillée pendant 48h à la chambre froide, puis concentré sous vide partiel à une température à 37 - 400C, jusqu'à un volume d'environ 20 mi. On ajoute alors 1 volume d'éthanol abso lu. Après 24h à + 4"C, le précipité fourni (contenant des protéines) est écarté par centrifugation (20 minutes à 5.000 g et à +40C). On recueille le surnageant auquel on ajoute 5 volumes d'ethanol. Le précipité obtenu après 24h à +4 C est récolté par centrifugation (20 minutes à 5.000g et à +40C ). Ce précipité est redissous dans l'eau distillée, puis lyophilisé et il constitue antigène protecteur brut" qui a fait l'objet de tests pharmacologiques dont les résultats sont exposés plus loin. 4. Obtention d'extraits vaccinants davantage purifiés Les antigènes protecteurs bruts sont purifiés davan tagepar le double traitement suivant a) traitement par le sulfate de streptomycine Une première purification est faite par addition à l'antigène protecteur préalablement redissous dans de l'eau distillée, de sulfate de streptomycine à une concentration finale de 1,5 p cent. Après 90 min.de contact et agitation douce à 25"C, le précipité formé, contenant surtout des acides nucléiques est éliminé par centrifugation pendant 15 min à 15.000 g et à + 40C. Le surnageant est alors dialysé pendant 48 h contre de l'eau distillée, puis concentré et lyophi- lisé. b) trǐtmentpar la trypsine L'extrait bactérien obtenu est remis en solution dans du tampon phosphate (0,05 M, pH 7,9) et purifié par la trypsine (soluble) à une concentration finale de 1 %. Après une agitation douce pendant 12 h à 37 C, en présence de quelques-gouttes de toluène (pour éviter une éventuelle contamination bactérienne) ou centrifuge pendant 15 min. (5000 g + 40 C), on recueille le sur nageant qui est dialysé et lyophilisé comme précédem ment. Il constitue "l'antigène protecteur purifié" utilisé dans les expérimentations pharmacologiques décrites ci-après. 5. Composition et rendement La composition des antigènes protecteurs bruts obtenus à partir de l'échantillon de suspension bactérienne qui a été chauffé à 600 C est indiquée dans le tableau I ci-dessous. Les sucres identifiés sont le glucose, le rhamnose, un heptose, l'acide 3-céto-2-déoxyoctonique et en plus, dans le cas de l'antigène brut, le ribose provenant des acides nucléiques. Les sucres aminés sont la glucosamine et la galactosamine. L'antigène brut contient 27 p. 100 de lipides libres. Le rendement de production de l'antigène est de 1 à 2 p 100. On obtient de 70 à 80 mg d'antigène protecteur purifié à partir de 100 mg d'antigène protecteur brut. Tableau I : Composition de l'antigène protecteur brut et purifié : résultats en mg par rapport à 100 mg d1anti- gène en poids sec. Antigène protecteur Antigène prptecteur brut purifié Sucres réducteurs 21 27,6 Sucres aminés 4,72 6,32 Acides uroniques 4,56 6,25 Radicaux O acétyle 0 O Radicaux N acétyle 0 0 Protéines 1 25 Il Phosphore 5,5 O Acide 3-céto-2 dé- 1,2 2,5 oxyoctonique On a préparé dans des conditions tout à fait analogues des "antigènes protecteurs bruts" à partir de P. aeruginosa appartenant aux serotypes définis plus loin. B. PROPRIETES PHARMACOLOGIQUES DES PRINCIPES ACTIFS SELON L'INVENTION 1. Etude du pouvoir vaccinant des extraits bactériens Le pouvoir vaccinant est défini par l'effet protecteur (exprimé en pourcentage de survivants) conféré aux souris après vaccination par les extraits bactériens et injection de 10 ou 20 DL50 de la souche 72 V homologue. On a donc d'abord déterminé la DL50 de la souche 72 V, puis on a établi un protocole de vaccination, conférant un effet protecteur puissant et rapide. L'expérimentation a été faite sur des lots de souris mâles et femelles de 22-25 g environ, de lignée pure (lignée ML fournie par l'élevage du B.C.G. - Institut Pasteur, Paris) Les lots utilisés pour chaque dose d'essai, sont de 10 souris tirées au hasard. a) Détermination de la DL : La dose létale 50 (DL50) de la souche 72 V a été déter minée de la façon suivante : la souche est mise en cul ture pendant 24 h dans 200 ml de bouillon trypticase soja. Après centrifugation à 10.000 g pendant 30 min. à +4"C, le culot est remis en suspension avec des bil les de verre dans 40 ml de NaCl 0,15 M. Cette suspen sion bactérienne est titrée par numération sur boites et mesure photométrique à 660 nm. Les souris reçoivent alors par injection intrapéritonéale , 0,5 ml des sus pensions bactériennes à différentes dilutions, et on compte les survivants après un délai de 48 h, car la presque totalité des animaux meurent en 1 à 2 jours. La DL50 est ensuite calculée par la méthode des probits selon la technique classique (log dose/probit du pour centage cumulé de mortalité). b) Essais de vaccination Les vaccinations sur souris ont été pratiquées par voie sous-cutanée en injectant les extraits bactériens bruts ou purifiés à étudier aux souris. Chaque souris reçoit une dose de 50 si d'extrait le ler, le 3eme et le 6eme jour. Elles reçoivent par injection intrapé ritonéale 20 DL 50, des bactéries correspondantes, au lOeme jour après la lere~vaccination. Des souris témoins ont été inoculées avec de l'eau phy siologique, en lieu et place de vaccin. Les résultats sont rassemblés dans le tableau II. Tableau II:Vaccination par les différénts extraits bactériens de la souche 72 V N de NATURE DE L'EXTRAIT (a) Dose Effet l'expérience injectée tteciEt + # F.I. Ethanol (b) 1 60 min 60'C NaCI 0,15 M 5 vol 150 g 90 % 2 15 min 60 C NaCl 0,50M 5 vol 150 g 85 % 3 30 min 600C NaCl 0,50 M 5 vol 150 g 70 % 5 60 min 60 C NaCl 0,15 M 1 vol 150 g 40 X 6 90 nazi 100 C NaCl 0,15 M 5 vol 159,ug 30 % 9 T é m o i n s eau 0% physiologique Dans ce tableau on indique successivement a) la nature de l'extrait bactérien, en prenant en considération le temps d'extraction t, la température d'extraction 0, la force ionique F.I. de la solution de NaCl utilisée pendant l'extraction; les proportions d'éthanol (en volumes) respec tivement utilisés pour obtenir le précipité testé; b) la dose totale inoculée à l'animal (souris) en trois injec tions rapprochées; c) L'effet protecteur exprimé en pourcentage de survivants obtenu après injection de 20 DL50, le lOeme jour après la lere injection vaccinante. Comme le montre le tableau II, les extraits les plus effica ces sont obtenus par chauffage de la suspension bactérienne en NaCl 0,15 M ( ou 0,50 M) à 600C et précipitation du sur nageant après addition de 5 volumes d'éthanol. Dans ces conditions, on a obtenu 85 à 90 p cent d'effet protecteur, ce qui est nettement supérieur en moyenne à l'effet obtenu avec les précipités avec 1 volume d'éthanol. Le pouvoir vaccinant diminue nettement lorsque l'extraction est faite à 100 C. Des essais semblables avec l'antigène purifié, mélangé à l'hydroxyde d'alumine utilisé comme adjuvant, ont conduit à un taux de protection de 100 p. 100 contre 10 DL50 de bacté ries 72 V au 10ème jour après la première injection vacci nante. Ces résultats montrent aussi la rapidité de l'action immunisante des extraits bactériens testés sur les animaux d'expérience. On a constaté que l'immunité est maximale le lOème jour et encore très importante au 35ème jour chez la souris. Par exemple, on obtient encore 95 p. 100 de protection contre 10 DL50 au 35ème jour après la vaccination avec l'antigène protecteur brut. L'expérience a montré de même que la dose efficace 50 ou effet dose 50 (ED 50) contre 10 DL50 est obtenue avec environ 0,60 g d'antigène protecteur purifié (en 3 injections de 0,20/ut). 2. Etude de l'immunité Passive : séro-protection Les antigènes protecteurs bruts et purifiés respective mentsont injectés au lapin par voie sous-cutanée, puis intra veineuee, à raison d'une injection tous les 3 jours (7 injec tions au total). La dose totale est de 3 mg. Les lapins sont saignés et les sérums recueillis 7 jours après la dernière in jection. On a indiqué dans le tableau III ci-après les résultats de la séroprotection contre 1Q DL50 de la souche 72 V, par injection intrapéritonéale à la souris de 0,2 ml de sérum de lapin immunisé (pur ou dilué) suivie de I1 inoculation in trapéritonéale de 10 DL50 de la souche 72 V. Les souris té moins reçoivent du sérum de lapin frais décomplémenté ou non. TABLEAU III: S é r u m i m m u ni s a n t Effet protecteur Nature Dilution utilisée (b) antigène 1/1 100 X protecteur. brut antigène. protecteur. 1/1 95 % à 100 % purifié. antigene protecteur 1/2 100 % brut. 1/4 100 1/8 60 % lSi6 20 % 1/32 20 X 1/64 O X S. témoin 1/1 o % On a indiqué dans ce tableau a) La nature de l'antigène qui a servi à la préparation du sérum de lapin hyperimmunisé utilisé dans l'expériences et b) l'effet protecteur observé exprimé en pourcentage de survivants compté 48 h après l'épreuve de 10 DL50 Ce tableau III met clairement en évidence l'action séroprotectrice des sérums de lapins préalablement immunisés avec les antigènes protecteursaussi bien bruts que purifiés. Des essais semblables ont été réalisés avec des antigènes protecteurs bruts obtenus partir de souches P. aeruginosa appartenant à 16 sérotypes différents de la classification de HABS. Il s'agit des souches plus particulièrement identifiées ci-dessous par leur n de collection à l'Institut Pasteur. 0:1 (CIP'5933), 0:2 (CIP 5934), 0:3 (CIP 5935), 0:4 (CIP 5936), 0:5 (CIP 5937), 0:6 (CIP 5939), 0:7 (CIP 5938), 0:8 (CIP 5940), 0:9 (CIP 5941), 0:10 (CIP 5943), 0:11 (CIP 5944), 0:12 (CIP 5945), 0:13 (CIP 6092), 0:14 (CIP 7212), 0:15 (CIP 7213), 0:16 (CIP 7421). Toutes ces souches, sauf la souche 0:7, étaient virulentes. Elles appartenaient au type morphologique "la" . Tous les sérums obtenus avec les antigènes protecteurs bruts correspondants, sauf celui obtenu avec le type 0:7, se sont révélés avoir un effet protecteur à l'égard de souris inoculées avec 10DL50 bactéries correspondantes. Les mêmes constatations ont été faites avec les sérums fabriqués dans les mêmes conditions avec les antigènes protecteurs bruts obtenus par l'intermédiaire du procédé selon l'invention, à partir de 19 souches pathogènes récentes isolées chez des malades atteints de septicémie. Il convient enfin de souligner que ces antigènes protecteurs sont pratiquement dépourvus de toxicité. Des injections de 500 tu d'antigène protecteurbrut extrait de la souche 72 V à la souris par différentes voies (intraveineuses, sous-cutanées, intrapéritonéale) ont été très bien supportées. On utilise avec avantage les antigènes protecteurs ainsi obtenus pour la constitution de vacciN ou pour la production de sérums pour respectivement prévenir ou combattre des infections dues au bacille pyocyanique, aussi bienchez lthomme que chez l'animal. Si besoin, on constitue le médicament, plus particulièrement le vaccin, avec plusieurs principes actif s respectivement obtenus à partir de souches de P. aeruqinosa appartenant à des sérotypes différents, dans la mesure où le principe actif obtenu à partir d'un sérotype donné peut n'entre pas-suffisamment actif à l'égard de souches de P. aeruainosa appartenant à d'autres sérotypes. En combinant dans un même vaccin les extraits obtenus à partir d'un nombre suffisant de bactéries de différents sérotypes, il est possible de produire un vaccin capable d'immuniser l'h8te de façon polyvalente à l'égard de la majeure partie des bacilles pyocyaniques rencontrés chez les malades. Ceci s'applique également aux sérums. Le procédé selon l'invention permet par conséquent laproduction de sérums ayant un très grand spectre d'activité , dont l'utilisation pourra par conséquent être envisagée avec une chance raisonnable de succès, sans qu'il soit nécessaire de déterminer par hémoculture préalable le sérotype auquel appartient le germe responsable de l'infection dont le patient est atteint, ce qui représente indiscutablement un avantage quand on sait la nécessité d'intervenir rapidement contre les infections dues aux pyocyaniques. Les principes actifs du vaccin selon l'invention ou les sérums qui peuvent être produits à partir de ces principes actifs peuvent naturellement être associés dans les préparations vaccinantes ou dans celles contenant les parties actives de ces sérums, à tous véhicules pharmaceutiquement acceptables, notamment liquides,stériles, lorsqu'il s'agit de préparations injectables ou administrables par perfusion. Comme il va de-soi, et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'un principe actif de vaccin ou de sérum contre Pseudomonas aeruginosa, caractérisé en ce que l'on cultive, de préférence à l'abri des impuretés du milieu de culture, une souche de la bactérie sus-indiquée choisie parmi les Pseudomonas aeruqînosa qui sont virulentes et qui appartiennent au type morphologique "la", que l'on recueille cette culture, que l'on sépare, si besoin, les bactéries recueillies des impuretés du milieu de culture, que l'on lave les bactéries avec un liquide à faible force ionique, tel que l'eau distillée, pour séparer les produits labiles d'excrétion des bactéries, que l'on met en suspension les bactéries préalablement lavées au sein d'un milieu liquide et que l'on chauffe la suspension formée à une température comprise entre environ 37 et environ 80"C, ce milieu liquide ayant, à ladite température, une force ionique suffisante pour extraire les constituants de la capsule entourant les bactéries (substances péribacillaîres), que lton sépare la partie solide et que 1 'on recueille la solution contenant le susdit principe actif. 2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que 1' on réalise la culture sur un milieu solide à travers des pellicules cellulosiques, notamment du type "Cellophane". 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la susdite suspension est chauffée à une température comprise entre environ 50 eL environ 700C, de préférence de l'ordre de 600C. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le milieu liquide utilisé pour la réalisation de la susdite suspension est constitué par une solution saline. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que cette solution-saline est constituée par une solution de chlorure de sodium dont la concentration molaire est comprise entre environ 0,1 M et 1 M, de préférence de l'ordre de 0,15 M. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la solution contenant le susdit principe actif est traitée avec un agent apte à précipiter sélectivement des protéines, sans précipiter en même temps des polyosides, que lton sépare le précipité formé et que l'on recueille la solution contenant le susdit principe actif. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'agent de précipitation des protéines, sans précipiter en même temps des polyosides, est constitué par de l'alcool utilisé en concentration limitée pour obtenir la susdite sélectivité. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 et 7, caractérisé en ce que la nouvelle solution obtenue et contenant le susdit principe actif est traitée à nouveau avec un agent de précipitation des polyosides et que l'on recueille le précipité contenant le susdit principe actif. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'agent de précipitation des polyosides est constitué par l'al- cool utilisé à concentration suffisante pour provoquer la précipitation des polyosides-dans le milieu initialement aqueux de la nouvelle solution susdite. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la souche cultivée est celle désignée tel72 V" appartenant au sérotype 06 de la classification de HABS. 11. Produit tel que celui obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10. 12. Médicament, notamment vaccin, contenant le principe actif tel qu'obtenu par la mise en oeuvre de l'une quelconque des revendications 1 à 11. 13. Médicament, notamment vaccin, contenant un mélange des principes actifs tels qu'obtenus par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, appliqué à. des Pseudomonas aeruginosa appartenant à des sérotypes distincts. 14. Sérum obtenu à partir d'un animal inoculé avec des préparations contenant des produits selon la revendication 11, obtenus à partir d'une ou plusieurs souches de Pseudomonas aeruginosa appartenant à des sérotypes distincts.