Brevet FR2300074A1 — publié le 19760903

L'invention concerne un procédé de récupération du glucagon à partir de la liqueur surnageante de cristallisation alcaline dan le procédé de préparation de l'insuline. L'invention concerne un procédé de récupération du glucagon par A. séparation des protéines contenant du glucagon de la liqueur surnageante de cristallisation alcaline du procédé de préparation de l'insuline; B. séparation du glucagon des autres protéines;et C. purification du glucagon obtenu dans l'étape B. Peu après la découverte de l'insuline en 1921 par Banting et Best, plusieurs chercheurs ZMurlin et al., J. Biol. Chem., 56, 252 (1953) et Kimball et .'4urlin~J. Biol. Chem., 58, 337 ( 1924) notaient que l'on obtenait une réaction hyperglycémique avec certains extraits pancréatiques d'insuline. Le facteur responsable de la réaction hyperglycémique a été appelé glucagon. A l'heure actuelle, l'usage le plus important du glucagon est le traitement de l'hyperglycémie induiLe par l'insuline. Comme la population diabétique mondiale augmente,la demande en glucagon doit augmenter. En outre, on fait à l'heure actuelle des recherches sur l'utilisation de glucagon dans les troubles cardiaques. En consèquence, ces deux applications augmentent beaucoup les demandes de production de glucagon, demandes qui sont le mieux satisfaites en améliorant le rendement en glucagon à partir de sources naturelles. La première préparation du glucagon cristallise a été indiquée en 1953Staub, et al., Science, 117, 628 !1953); voir également, Staub, et al., J.Biol.Chem.,214, 619 (1955)1. La substance de départ est une fraction amorphe obtenue pendant la fabrication industrielle de l'insuline qui implique une extraction acide-alcool du tissu pancréatique, une concentration de l'extrait, une précipitation par le chlorure de sodium, une précipitation au point isoélectrique, plusieurs fractionnements par l'alcool, une décoloration, une cristallisation avec le zinc dans un tampon acétate, un lavage pour éliminer la fraction amorphe, et le séchage de l'insuline-zinc ainsi obtenue. La fraction amorphe contient environ 4 % en poids de glucagon et environ 7 % en poids d'insuline. Généralement, le rendement en matériau amorphe est compris entre environ 11 et environ 22 mg par kilogramme de pancréas.La préparation du glucagon implique à son tour, facultativement, un fractionnement à pH 6,7, un fractionnement par l'acétone, une précipitation fractionnée à pH 4,3, deux précipitations fractionnées à pH 2,5, et deux cristallisations dans un tampon urée-glycine à pH 8,6. Le rendement en glucagon cristallisé est environ 20% du poids du glucagon contenu dans le matériau amorphe sec, ce qui correspond à un rendement d'environ 0,088 à environ 0,176 mg de glucagon par kilogramme de pancréas. L'introduction d'une cristallisation intermédiaire de l'insuline-zinc dans le tampon citrate, comme indiqué dans le brevet des E.U.A NO 2 626 228, entraine une réduction globale du nombre total d'étapes nécessaires dans le procédé de fabrication de l'insuline à partir de pancréas de boeuf. Bien que l'on obtienne pratiquement la même quantité de fraction amorphe pendant l'étape de lavage que dans le procédé plus ancien, la teneur en glucagon de la fraction amorphe diminue à seulement environ 0,2%. On a découvert que le glucagon est retenu dans le tampon citrate pendant la cristallisation intermédiaire. La récupération du glucagon dans le tampon citrate nécessite une précipitation par un excès de zinc, suivie d'une précipitation par le sel et de deux précipitations à pH 5,1 et 5,6 respectivement pour éliminer le zinc. Le rendement en glucagon brut à partir du tampon citrate correspond à environ 1,75 - 2,0 mg par kilogramme de pancréas, d'après quoi le rendement du glucagon purifié correspond à environ 0,22 - 0,66 mg par kilogramme de pancréas. L'utilisation du zinc comme agent de précipitation rend l'élimination totale du zinc difficile et augmente la quantité d'insuline introduite dans le glucagon purifié final. Des études sur les extractions du pancréas ont montré que les divers extraits acide-alcool généralement utilisés dans les procédés de fabrication de l'insuline contiennent 8,8-13,2 mg de glucagon par kilogramme de pancréas. Après concentration et dégraissage de l'extrait, la teneur en glucagon diminue à 3,34,4 mg par kilogramme. Cependant, comme décrit précèdemment, seulement environ 25 à 50 % en poids de cette quantité sont utilisables pour la purification, selon la substance de départ. Le dessin est un diagramme schématique d'un mode de réalisation préféré de la présente invention. Le dessin illustre également la relation du procédé de la présente invention avec l'étape de cristallisation alcaline du procédé de préparation de 1' insuline. La source de glucagon pour le procédé est la liqueur surnageante provenant de l'étape de cristallisation alcaline du procédé de préparation de l'insuline, décrite dans le brevet des E.U.A No 3 719 655. Cette liqueur surnageante est une solution aqueuse ayant un pH de 7,2 à 10,0 et une concentration en cations 0,2 - 1,0 M et contient en solution des protéines qui sont environ 1 à 10 % d'insuline et environ 0,2 à 1,5 % de glucagon, selon la source de pancréas utilisée dans le procédé de préparation de l'insuline.Par exemple, avec du pancréas de boeuf, cette protéine de la liqueur surnageante de la cristallisation alcaline contient généralement environ 5 à 10 % d'insuline et 1,0 à 1,5 % de glucagon; avec le pancréas de porc, les protéines de la liqueur surnageante contiennent habituellement environ 1 à 2 % d'insuline et environ 0,2 à 0,3 % de glucagon. I1 faut noter cependant que les rendements réels en glucagon par rapport à la matière première de départ peuvent varier sur une large gamme en raison de la sensibilité du glucagon à la dégradation enzymatique. La séparation des protéines contenant le glucagon de la liqueur surnageante de cristallisation alcaline constitue la première étape du procédé. En général, une telle séparation peut être effectuée par un quelconque procédé connu. Par exemple, on peut ajuster le pH de la liqueur surnageante à environ 3,2 et on peut ajouter 20 % poids/volume de chlorure de sodium pour faire précipiter le glucagon et les autres protéines. Ou bien, on peut effectuer la précipitation par addition d'un excès de chlorure de zinc à un pH d'environ 6,0. Un troisième mode opératoire comprend l'utilisation de la précipitation au point isoélectrique. Encore un autre mode opératoire consiste à utiliser une chromatographie d'échange d'ion. La deuxième étape du procédé consiste à séparer le glucagon des autres protéines. Cette opération en général peut être effectuée par un quelconqfle procédé connu, comme la filtration sur gel, la chromatographie d'échange d'ion, la focalisation isoélectrique, et la formation de fibrilles de glucagon, méthodes parmi lesquelles on préfère la formation de fibrilles de glucagon. La troisième et dernière étape du procédé consiste à purifier le glucagon obtenu dans la deuxième étape.En général, on peut effectuer cette purification par l'un quelconque des procédés connu de l'homme de l'Art, comme la cristallisation, la chromatographie d'échange d'ion, etc. La cristallisation est le procédé préféré. On préfère l'utilisation de la précipitation isoélectrique ou de la chromatographie d'échange d'ion, ou d'une certaine combinaison des deux, pour séparer les protéines contenant du glucagon de la liqueur surnageante de cristallisation alcaline. En général, la précipitation isoélectrique nécessite que le pH de la liqueur surnageante soit compris entre environ 4,2 et environ 6,6. La gamme de pH préférée va d'environ 4,6 à environ 5,2, bien que la gamme nettement préférée aille d'environ 4,7 à environ 5,0. Comme la liqueur surnageante de cristallisation alcaline est un pH d'environ 7,2 à environ 10, il est nécessaire d'acidifier la liqueur surnageante au pH désiré. On peut normalement effectuer cette acidification en ajoutant simplement une solution diluée d'un acide minéral ou organique qui ne dégrade pas et ne réagit pas avec le glucagon. Des exemples des acides appropriés sont l'acide chlorhydrique,l'acide phosphorique, l'acide formique, l'acide acétique, l'acide propionique, etc... On préfère l'acide chlorhydrique. Facultativement mais de préfèrence, on peut ajouter jusqu'à environ 20% en volume d'un alcool pour réduire la solubilité des protéines contenant le glucagon dans la liqueur surnageante de cristallisation alcaline.Par le terme "alcool", on désigne un monoalcool aliphatique saturé ayant moins d'environ 6 atomes de carbonne. De préférence, l'alcool aura moins d'environ 4 atomes de carbonne, comme l'alcool méthylique, l'alcool éthylique, l'alcool propylique, et l'alcool isopropylique. L'alcool nettement préféré est l'alcool éthylique. Quand on en utilise un, on ajoute normalement l'alcool à la liqueur surnageante avant acidification. Après acidification de la liqueur surnageante au pH désiré, la précipitation des protéines contenant le glucagon désiré commence rapidement, généralement, après quelques minutes. Pour assurer une précipitation totale, on laisse reposer la solution, généralement à une température qui n'est pas supérieure à la température ambiante. De préférence, on refroidit la solution à une température d'environ 30C à environ 100C. Bien que la précipitation soit généralement terminée après environ 24 heures, on peut laisser le mélange reposer indéfiniment sans effet nuisible. Quand la précipitation est terminée, le précipité appelé ci-après précipité isoélectrique, est séparé par un quelconque procédé connu commode, comme la centrifugation ou la filtration; on préfère souvent la filtration.Il n'est pas nécessaire de laver ou de sécher le précipité isoélectrique ainsi obtenu, bien que l'on puisse utiliser ces modes opératoires si on le désire. Un autre mode opératoire convenant bien à la séparation des protéines contenant du glucagon de la liqueur surnageante de cristallisation alcaline est la chromatographie par échange d'ion. Parmi les modes opératoires connus d'échange d'ion, le procèdé du brevet des E.U.A. nO 3 715 345 est particulièrement efficace et est préféré. En bref, le procédé de chromatographie par échange d'ion consiste à faire passer la solution contenant le glucagon sur une résine d'un copolymère styrene-divinylbenzene sulfoné macroréticulé, sous forme métal alcalin à pH 7-8. Le glucagon est adsorbé sur la résine. Puis on élue le glucagon à l'aide d'une base diluée comme l'hydroxyde d'ammonium 0,1 N. On ajuste à 2,5 le pH de l'éluat contenant le glucagon, puis on fait précipiter le glucagon par un procédé classique de précipitation par relargage par un sel. Le précipité résultant contenant du glucagon est pratiquement dépourvu de protéines du type insuline mais le précipité contient encore d'autres substances qui ne sont pas du glucagon. Si l'on soumet la liqueur surnageante de la cristallisation alcaline au procédé du brevet des E.U.A. nO 3 715 345, on obtient un éluat contenant de l'insuline et un gâteau de sel contenant le glucagon. On peut renvoyer si on le désire l'éluat contenant l'insuline au procédé de préparation de l'insuline Le gâteau de sel contenant du glucacon est dissous de nouveau pour un traitement ultérieur; pour des raisons de commodité,le pH de la solution et la concentration en protéine sont en général rendus approximativement équivalents à ceux de la liqueur surnageante de cristallisation alcaline. I1 peut souvent être avantageux d'effectuer la première étape du procédé, c'est-à-dire la séparation des protéines contenant du glucagon de la liqueur surnageante de cristallisation alcaline, en utilisant successivement la précipitation isoélectrique et la chromatographie d'échange d'ion. Par exemple, on peut soumettre la liqueur surnageante de la cristallisation alcaline au procédé de chromatographie par échange d'ion. Le gâteau de sel contenant du glucagon ainsi obtenu est dissous à nouveau et soumis à une précipitation isoélectrique comme décrit ci-avant. Ou bien, on soumet la liqueur surnageante de cristallisation alcaline à une précipitation isoélectrique ; on peut dissoudre le précipité ainsi obtenu dans un milieu aqueux légèrement alcalin et le soumettre au procédé de chromatographie par échange d'ion. Dans chaque cas, l'éluatcontenant de l'insuline provenant de la chromatographie par échange d'ion peut être renvoyé si on le désire au procédé de préparation de l'insuline. Comme indiqué ci-avant, le procédé préféré pour la séparation du glucagon des autres protéines est la formation de fibrilles de glucagon. En général, la formation des fibrilles de glucagon est effectuée en solution aqueuse acide. Normalement, on dissout les protéines contenant le glucagon dans un milieu aqueux acide ayant un pH inférieur à environ 2,7. Bien que le pH puisse généralement être compris entre environ 1,5 et environ 2,7, la gamme préférée de pH va environ 2,0 à environ 2,5. Bien que l'on puisse -utiliser l'un quelconque des acides qui permettent d'acidifier une liqueur surnageante de cristallisation alcaline avant une précipitation isoélectrique,on préfère encore l'acide chlorhydrique . Avec l'acide chlorhydrique cependant, il faut utiliser un agent de conservation comme le phénol, généralement une concentration d'environ 0,2 % poids/volume. Typiquement, on dissout les protéines contenant le glucagon dans de l'acide chlorhydrique 0,01 N contenant 0,2% de phénol, poids/volume. La concentration en protéines contenant du glucagon dans la solution peut en général être comprise entre environ 2,5 et environ 30 mg/ml, La gamme préférée est d'environ 5 à environ 20mg/ml, et la gamme nettement préférée est d'environ 5 à 10 mg/ml. Facultativement, on peut ajouter un sel minéral soluble dans l'eau à la solution acide de protéines contenant du glucagon pour amorcer la formation des fibrilles. Le terme " soluble dans l'eau " désigne les sels minéraux qui sont solubles dans l'eau aux concentrations utilisées comme décrit ci-après. Comme on pense que le sel organique a essentiellement un effet de relargage vis-à-vis de l'armorçage de la formation des fibrilles, le choix du sel minéral n'est pas déterminant. En pratique cependant, l'utilisation de sels radio-actifs,toxiques ou colorés, ou de sels qui sont des agents oxydants, des agents réducteurs ou qui sont fortement acides ou basiques, n'est pas indiquée pour des raisons évidentes. Ainsi, les sels minéraux appropriés comprennent de manière générale les selsd'ammonium solubles dans l'eau, les sels solubles dans l'eau des métaux alcalins jusqu'à et y compris la période 6 de la classification périodique des éléments g Robert C.Weast, Ed.-in-Chief, "Handbook of Chemistry and Physics", 53rd Edition, The Chemical Rubber Co., Cleveland, Ohio, 1972,p.B3)g,et et les sels solubles dans l'eau des métaux alcalino- terreux allant jusqu'à et comprenant la pédiode 6 de la classification périodique des éléments.Des exemples de ces sels comprennent, entre autres, le bromure d'ammonium, le chlorure d'ammonium, le fluorure d'ammonium, l'iodure d'ammonium, le sulfate d'ammonium et de magnésium, le sulfate d'ammonium et de manganèse, le nitrate d'ammonium, le sulfate d'ammonium, le bromure de lithium, le chlorure de lithium, le fluosilicate de lithium, le fluosulfonate de lithium, l'iodure de lithium, le molybdate de lithium, le nitrate de lithium, le sulfate de lithium et de potassium, le phosphate de sodium et d'ammonium, le sulfate d'ammonium et de sodium, le bromure de sodium, le chlorure de sodium, l'iodure de sodium, l'hexafluoropnospnate de sodium, le fluosulfonate de sodium, le sulfate de sodium et de magnésium, le nitrate de sodium, lshexamétaphosphate de sodium,l'orthophcsphate monosodique,l'orthophosphate disodique, le sulfate de sodium, le sulfate acide de sodium, le bromure de potassium, le chlorure de potassium et de calcium, le chlorure de potassium, le fluorure de potassium, l'iodure de potassium, le chlorure-sulfate de potassium et de magnésium, le sulfate de potassium et de magnésium, le chlorure de potassium et de magnésium, le molybdate de potassium, l'orthophosphate de magnésium, le sulfate de potassium et de sodium, le bromure de rubidium, le chlorure de rubidium, le fluorure de rubidium, l'iodure de rubidium, le nitrate de rubidium, le bromure de césium, le chlorure de césium, le fluorure de césium, l'iodure de césium, le nitrate de césium, le sulfate de césium, le bromure de béryllium, le chlorure de béryllium, le fluorure de béryllium, le nitrate de béryllium, l'orthophosphate de béryllium, le bromure de magnésium, le chlorure de magnésium, l'iodure de magnésium, le nitrate de magnésium, le silicofluorure de magnésium, le bromure de calcium, le chlorure de calcium, l'iodure de calcium, le nitrate de calcium, le bromure de strontium,le chlorure de strontium, l'iodure de strontium, le bromure de baryum, l'iodure de baryum, leurs hydrates solubles dans l'eau etc... On préfère les sels d'ammonium, le sulfate d'ammonium étant nettement préféré. Les sels minéraux appropriés peuvent de manière générale être utilisés à des concentrations jusqu'à environ 0,5 M. De préférence, ces sels seront présents à des concentrations d'environ 0,01 M à environ 0,05 M. La gamme de température dans laquelle la formation des fibrilles de glucagon a lieu est normalement d'environ 20 à environ 300C. La gamme de température préférée est d'environ 24 à environ 260C. La température nettement préférée est 250C. La formation des fibrilles, qui est aidée par une agitation, commence généralement dans les 3 à 4 heures qui suivent le moment où a été terminee la préparation de la solution aqueuse acide de glucagon, et est terminée en environ 48 heures. Des dures de formation en excès d'environ 48 heures ne sont généralement pas nécessaires. Quand la formation des fibrilles est terminée, on peut recueillir les fibrilles de glucagon par un quelconque procédé connu, comme par filtration ou centrifugation, ce dernier procédé étant préféré. Si on le désire, on peut laver les fibrilles de glucagon en les mettant en suspens ion dans un milieu acide aqueux qui peut ou non contenir un sel minéral. La température du milieu de lavage peut être comprise entre environ 20 à environ 300C, une température de 250 étant préférée. On recueille ensuite les fibrilles comme précèdemment et on les garde au froid, généralement à une température inférieure à environ 10 C, sil'onn'effectue pas immédiatement l'étape suivante. Si on le désire,on peut introduire dans le milieu de formation de fibrilles un agent de chélation comme l'acide éthylène diaminetétracétique. La concentration de l'agent de délation normalement sera inférieure à environ à 0,01 M, la concentration préférée étant de 0,004 M. Cependant, l'utilisation d'un agent de chélation n'est pas indiquée à moins que l'on sache que des ions zinc ou d'autres ions métalliques bivalents soient présents. Comme indiqué ci-avant, la cristallisation est le procédé préféré de purification du glucagon obtenu dans la deuxième étape. En général, on effectue la cristallisation du glucagon en dissolvant le glucagon dans un milieu aqueux alcalin et en acidifiant à un pH légèrement alcalin ou acide pour amorcer la cristallisation, c'est-à-dire à un pH compris entre environ 4,5 et environ 8,5. On peut effectuer la dissolution du glucagon par l'une ou l'autre de deux méthodes. D'abord, on peut dissoudre le glucagon directement dans un milieu aqueux alcalin. Ou bien on peut mettre le glucagon en suspension dans de l'eau distillee et ajuster le pH par addition d'une base aqueuse. Les bases appropriées sont de manière générale les hydroxydes de métal alcalin et d'ammonium, parmi lesquels on préfère l'hydroxyde de potassium. En général, la solution résultante de glucagon peut avoir un pH compris entre environ 9,0 et environ 11,5, la gamme préférée étant environ 9,5 à environ 10,5. La concentration en glucagon de la solution alcaline peut être comprise entre environ 2 et environ 10 mg/ml. La concentration préférée est comprise entre environ 4 et environ 8 mg/ml, la concentration nettement préférée ctant d'environ 5 mg/ml. Comme l'acidification entraine fréquemment la précipitation immédiate d'une petite quantité de protéines autres que le glucagon, on préfère le mode opératoire d'acidification suivant bien qu'il ne soit pas essentiel. On chauffe la solution alcaline de glucagon à une température d'environ 55 à environ 650C. On acidifie ensuite la solution à un pH d'environ 4 à environ 6 avec de l'acide phosphorique à 10%. Bien que l'on puisse utiliser un quelconque des acides que l'on peut utiliser dans les étapes précèdentes, on préfère utiliser l'acide phosphorique. On filtre ensuite la solution résultante pendant qu'elle est encore à la température élevée initiale. En général, l'étape de filtration est facultative et peut souvent être omise quand la quantité de précipité résultant de l'acidification est minimale. En outre, on peut utiliser si on le désire des modes opératoires autres que la filtration, par exemple la centrifugation. Si la solution de glucagon est colorée, on peut ajouter du charbon décolorant soit avant soit après acidification, et de préférence avant. Après acidification (et filtration si on en utilise une), on laisse reposer la solution de glucagon à une température comprise entre environ 2 et environ 100C et pour une durée de cristallisation d'environ 24 heures à environ 120 heures. La température préférée est 40C. De préférence, la durée de cristallisation sera comprise entre environ 72 et environ 120 heures, la durée de cristallisation nettement préférée étant de 72 heures. On décante la plus grande partie de la liqueur surnageante des cristaux résultants de glucagon, généralement en utilisant un filtre. On enlève la liqueur surnageante restante des cristaux de glucagon, généralement par centrifugation. Puis on lave le glucagon purifie successivement avec une solution saline diluée (généralement 0,001%) et avec de l'eau. Puis on lyophilise le glucagon et on le garde au froid. Selon la pureté du glucagon obtenue dans la seconde étape et la pureté désirée pour le glucagon purifié final, on peut utiliser une ou plusieurs cristallisations supplémentaires. On a cependant trouvé qu'un total de deux-cristallisations est généralement suffisant pour donner un glucagon ayant une pureté d'au moins 80%, déterminée par un essai biologique sur des chats. Quand on utilise deux cristallisations, on préfère le mode opératoire suivant : on effectue la première cristallisation comme décrit ci-avant et on dissout les cristaux dans une solution alcaline. La seconde cristallisation utilise une acidification à un pH d'environ 7,0 à environ 8,5, de préfèrence d'environ 7,3 à environ 7,5, et mieux encore à environ 7,4. La dissolution et le mode opératoire de filtration, si on en utilise un, sont de préférence effectués à une température d'environ 35 à environ 450C de préférence à une température d'environ 400C. La concentration en glucagon est de préférence environ 10mg/ml. Si on le désire, on peut recycler la liqueur surnageante de l'une quelconque ou de toutes les opérations de cristallisation. Par exemple, on peut faire précipiter toutes les protéines dissoutes contenues dans une quelconque liqueur surnageante en ajustant le pH à 2,5 - 3,0 par de l'acide chlorhytlrlqtle dilue et en ajoutant 20% de chlorure de sodium poids/volume. On peut soumettre le précipité ainsi obtenu à la première étape du procédé de la présente invention séparément ou dissous dans la liqueur surnageante de cristallisation alcaline. Comme indiqué ci-avant,la liqueur surnageante de cristallisation alcaline contient normalement en solution nettement plus d'insuline que de glucagon. Cette insuline est un composant des protéines contenant le glucagon obtenues par précipitation isoélectrique. Bien que la seconde étape du procédé, c'est-à-dire la séparation du glucagon et des autres protéines, sépare effectivement le glucagon de l'insuline, l'opération de séparation peut être nuisible au composant insuline du mélange de protéines. En consèquence, il est souvent indiqué d'effectuer la première étape du procédé à l'aide d'un mode opératoire,comme une chromatographie par échange d'ion, qui permet également la séparation de l'insuline du glucagon. Il faut cependant noter que la chromatographie par échange d'ion n'est pas le seul moyen de séparer l'insuline du glucagon avant de séparer le glucagon des autres protéines. Par exemple, le précipité provenant d'une précipitation isoélectrique peut être soumis à ce que l'on appelle dans la technique un fractionnement du facteur hyperglycémique. En bref, une telle opération consite à relarguer le glucagon d'un milieu aqueux phénolique légèrement alcalin. Le fractionnement du facteur hyperglycémique a été décrit par Staub et al, voir ci-dessus. La liqueur surnageante contenant l'insuline est recyclée au procédé de préparation de l'insuline, alors que le glucagon brut précipité est utilisé dans la deuxième étape du présent procédé. Bien que ce ne soit pas essentiel au procédé de la présente invention, on préfère que la liqueur surnageante provenant de l'étape de formation de fibrilles soit recyclée au procédé de préparation d'insuline, généralement au début de l'étape de la cristallisation alcaline décrite dans le brevet des E.U.A nO 3 719 655. Evidemment un tel recyclage n'est pas nécessaire si l'insuline a été séparée du glucagon, comme décrit ci-avant, avant la formation des fibrilles. Dans un tel cas cependant l'insuline ainsi séparée serait recyclée au procédé de préparation d'insuline. Le procédé de la présente invention et sa relation avec le procédé de préparation de l'insuline seront peut être mieux compris en se référant au dessin qui illustre sous forme schématique un mode de réalisation de la présente invention. Pour des-raisons de simplicité, on a représenté comme étant rejetées les liqueurs surnageantes obtenues après la première et la troisième étape du présent procédé, étant entendu que ces liqueurs surnageantes peuvent être recyclées comme décrit ci-avant. L'opération de cristallisation alcaline du brevet des E.U.A.n03 719 655 est indiquée à la partie supérieure du dessin. L'opération de cristallisation alcaline donne l'insuline-metal alcalin ou l'insuline-ammonium et une liqueur surnageante, comme indiqué. Comme l'opération de cristallisation alcaline et l'insuline-metal alcalin ou l'insuline-ammonium que l'on en obtient font partie du procédé de préparation de l'insuline, les rectangles représentant l'opération et l'insuline sont entourés d'un trait pointillé et comportent la mention " procédé depréparatioh d'insuline". Tout ce qui ne comporte pas ce trait pointillé fait donc partie du présent procédé et comporte la mention " procédé de préparation du glucagon". Le traitement commence, comme indiqué, avec la liqueur surnageante de cristallisation alcaline. On effectue les étapes préférées constituant le présent procédé, donnant le précipité isoélectrique, les fibrilles de glucagon et le glucagon cristallisé respectivement comme indiquée dessin indique également le renvoi de la liqueur surnageante de l'étape de formation fibrilles au procédé de préparation de l'insuline. A moins d'indication contraire, toutes les températures sont en degrés celsius. Exemple 1 On dilue avec 1,45 litre d'éthanol absolu 14,75 litres de liqueur surnageante de cristallisation alcaline provenant du traitement de 5 912 kg de pancréas de boeuf et de porc, ayant une teneur en solides de 40,7 mg/ml, On ajuste à 5,2 le pH de la solution résultante avec de l'acide chlorhydrique 3 N. On refroidit la solution à 50C pendant une nuit.On recueille par filtration le précipité qui s'est formé, on le dissout dans 11,28 litres d'acide chlorhydrique 0,01 N contenant 0,2% de phénol, poids/volu (désigné ci-après sous le nom de solution aqueuse d'acide et de phénol ) et on analyse la solution résultante solides totaux : 512,6 g ( 45,4 mg/ml) insuline : 87,43 unités/ml ( 1,93 Unité/mg de solides) glucagon :463,7il g/ml (1,02% des solides totaux) On prélève pour des essais 870 ml de solution, en laissant 10,4 litres contenant environ 473 g de solides. Pour effectuer un fractionnement du facteur hyperglycémique,.on dilue la solution précèdente avec 111,8 litres de la solution aqueuse d'acide et de phénol, en laissant un volume total de 122,2 litres avec une teneur en solides de 0,387 %. A la solution diluée, on ajoute 245,8 ml de phénol liquéfié, 941 g de chlorure de sodium et suffisamment d'hydroxyde de sodium aqueux à 40% pour ajuster le pH à 9,0 de manière à aider la dissolution de tous les solides. On ajuste ensuite le pH à 7,5 avec de l'acide chlorhydrique 3 N. On refroidit la solution résultante à 50 pendant 1 à 2 jours, période pendant laquelle se forme un précipité. On décante la liqueur surnageante et on la filtre sous aspiration. On recueille le précipité parcentrifugatiôn. On réunit les solides obtenus par filtration et centrifugation et on les dissout dans 10 litres de la solution aqueuse d'acide et de phénol; la solution résultante a l'analyse suivante solides totaux : 75,0 g ( 7,5 mg/ml insuline : 6,33 Unités/ml glucagon : 275 lr g/ml ( 5,01 t des solides totaux) On dilue la solution à une concentration en solides de 5,0 mg/ml en ajoutant 5 litres supplémentaires de la solution aqueuse de phénol. On prélève pour des essais une portion de 5,0 litres de la solution résultante, ce qui laisse 10,0 litres de solution contenant environ 50 g. de solides. A la solution restante on ajoute en agitant 8,0 ml d'acide éthylènediaminetétracétiqueaqueux 0,5M ( sous forme du sel tetrasodique ) et 60 ml d'une solution aqueuse à 50% de sulfate d'ammonium. On continu à ayiter pendant 16 heures à la température ambiante. On recueille par centrifugation les fibrilles de glucagon qui se sont formées et on les lave deux fois avec la solution aqueuse d'acide et de phénol qui contient de l'acide thylènediaminetétracétique et du sulfate d'ammonium comme précédemment. On met les fibrilles de glucagon en suspension dans 10 litres d'eau contenant 0,2% de phénol, poids/volume. On chauffe le mélange à 400 et on ajuste le pH à 10,5 en ajoutant 150 ml d'une solution aqueuse à 10% d'hydroxyde de potassium. On chauffe ensuite la solution à600 tout en ajustant le pH à 7,8 par addition de 68 ml d'acide phosphorique à 10%.Une fois que la température de la solution atteint 60 , on ajuste encore le pH à 5,0 en ajoutant 68 ml supplémentaires d'acide phosphorique à 10t Puis on filtre par gravité la solution pendant qu'elle est encore chaude et on refroidit le filtre avec agitation à 50 pendant 72 heures. On sépare par filtration le glucagon qui a précipité. On dissout le solide ainsi obtenu comme décrit précèdemment pour les fibrilles de glucagon ; cependant lorsqu'on ajuste le pH à 10,5, le volume total est 870 ml. Puis on chauffe la solution à 600,on ajuste le pH à 5,0 avec de l'acide phosphorique à 10% et on filtre la solution résultante par gravité pendant qu'elle est chaude. On refroidit le filtrat et on l'agite comme précèdemment. On recueille par filtration le glucagon précipité puis on le lyophilise, ce qui donne l,84gde glucagon purifié. Ceci correspond à 74 % du glucagon disponible avant la formation des fibrilles, et à 39 % du glucagon disponible après précipitation des protéines de la liqueur surnageante de cristallisation alcaline ( exception faite des prélèvement d'échantillons ). Exemple 2 On sépare par centrifugation les cristaux d'insuline des liqueurs mères de cristallisation alcaline de 3 cristallisations d'insuline provenant de 29 627 kg, 37 230 kg, et 49 212 kg d'un mélange 2 : 1 de pancréas de boeuf et de porc. Les liqueurs mères respectives mesurent 460 litres, 515 litres et 680 litres, auxquels on ajoute respectivement 51 litres, 57,2 litres et 75,5 litres d'alcool absolu et on ajuste chaque liqueur à pH 5,0 avec HC1 3 N, on agite 15 minutes, et on refroidit pendant au moins 24 heures.Des analyses des liqueurs mères avant précipitation et des solutions des précipités sont : (1) 2 5308 g de glucagon et 502 unités d'insuline par kilogramme de pancréas initial (P.I.? dans la liqueur mère; 1 8468 g de glucagon et 640 unités par kilogramme de P.I., 131,3 mg de solides par kilogramme de P.I.dans la solution du précipité, 158 litres; (2) 1 619 H g de glucagon et 306 unités d'insuline /kg de P.I.dans la liqueur mère; 759 z g de glucagon et 270 unités d'insuline/kg de P.I.et 61,2 mg de solides par kg de P.I.dans la solution du précipité, 150 litres ; (3) 2 671/lg g de glucagon et 480 unités d'insulines par kg de P.I.dans la liqueur mère ; 2 081 M g et 420 unités d'insuline par kg de P.I. et 130 mg de solides par kg de P.I.dans la solution du précipité, 156 litres. On recueille les précipités par filtration et on les dissout dans la solution aqueused'acide et de phénol( préparée comme décrit dans l'exemple 1 ). On réunit les solutions des précipités à pH 5,5 et l'on obtient 464 litres ( 12 570 g de solides ), et on dilue à 630 litres avec la solution aqueuse d'acide et de phénol pour faire une solution à 2,0 % de solides dont on ajuste le pH à 2,1 avec HC1 3N supplémentaire. On traite la solution par 0,3 % de sulfate d'ammonium,que l'on ajoute sous forme d'une solution à 50 % ( 6 ml /1, 3 780 ml ),et on l'agite lentement 24 heures à 250C pendant la formation des fibrilles, puis on la laisse reposer 48 heures à 150C. On sépare les fibrilles de glucagon de la solution restante par centrifugation.On analyse la solution surnageante ( elle contient 488,4yg de glucagon et 251 unités d'insuline par kg de P.I.) et on la renvoie pour le traitement de préparation de l'insuline. On met les fibrilles de glucagon en suspension dans 450 litres d'eau froide contenant 0,2 % de phénol,on ajoute 2 700 ml d'une solution à 50 % de sulfate d'ammonium, et on agite lentement le mélange pendant 30 minutes pour laver les fibrilles ; on recueille de nouveau les fibrilles par centrifugation et on jette les eaux de lavage. On met les fibrilles de glucagon en suspension dans 275 litres d'eau contenant 0,2 % de phénol et on ajuste le pH à 3,85 en utilisant de l'acide phosphorique à 10 %, et on analyse : solides, 12,06 mg/kg de P.I. ( 0,52 % ; 1 404 g à partir de 116 069 kg de P.I.);glucagon, 466, 4 ex 9 par kg de P.I.( 54,2 g). On divise la suspens ion de fibrilles de glucagon ( 275 litres ) en deux portions de (1) 135 litres et (2) 140 litres respectivement pour la première cristallisation. On dilue la première portion à 140 litres avec une solution à 0,2% de phénol dans l'eau pour faire une concentration en solides de 0,5% ; on laisse l'autre portion à 0,52 % de solides. On réchauffe chaque suspension de fibrille à 600 C et on ajuste le pH à 9,0 - 11,0 (1) 9,9 (2) 9, 7] avec une solution à 10 % d'hydroxyde de sodium pour obtenir une solution limpide ; on ajoute 281 g de Norite A ( 0,4 g/g de solides ), et après 10 minutes d'agitation on ajuste le pH de la solution de nouveau à 5,0 en utilisant de l'acide phosphorique à 10%, et on filtre encore chaud sur des entonnoirs munis d'un filtre en papier ED N 613. On agite ensuite le filtrat ( solution de cristallisation ) lentement pendant 16-20 heures tout en refroidissant à 40C pour promouvoir une cristallisation uniforme du glucagon. On sépare le précipité par filtration à pH 5,0, 600C, on le traite de nouveau pour obtenir des cristaux supplémentaires de glucagon en mettant en suspension dans 120 litres de phénol à 0,2% dans l'eau à une concentration en solides de 0,5 % ( analyse des solides, 8,0 g ), en chauffant à 600C, en ajustant le pH à 10,0 pour dissoudre les solides, en agitant 10 minutes, et en ajustant de nouveau le pH à 5,0 avec de l'acide phosphorique à 10% et en filtrant encore chaud en utilisant la filtration par gravité. On agite lentement le filtrat pendant 16-20 heures tout en refroidissant à 40C. La cristallisation est généralement terminée après 72-120 heures.On rejetlele second précipité à pH 5,0. On décante la majeure partie des liqueurs mères de cristallisation des premiers et deuxième mélanges de cristallisation et on les filtre sous aspiration. On traite la première liqueur mère avec 20 % (poids/volume) de chlorure de sodium dans chaque cas pour précipiter tout le glucagon qui n'a pas cristallisé. On réunit ces précipités à d'autres lots et on les traite de nouveau après reprécipitation à pH 4,6 par une autre cristallisation pour obtenir un rendement supplémentaire de cristaux de glucagon.On recueille par centrifugation pendant 3 minutes les cristaux de glucagon provenant des deux parties fournissant la première récolte et les cristaux obtenus par traitement des précipités réunis à pH 5,0 provenant des premières cristallisations qui constituent la deuxième récolte, on les sépare des liqueurs mères, on les transfère à des conteneurs de lyophilisation en utilisant de l'eau froide comme milieu de suspension et on les lyophilise. On pèse les cristaux de glucagon provenant de la cristallisation intermédiaire et on analyse des échantillons.Cristaux intermédiaires de glucagon : rendements ( première récolte ) (1) 41,0 g ( pur à 91,7 % ) et (2) 44,0 g ( pur à 86,8% ) soit 85,0 g ( pur à 89,1 % ) soit 75,8 g de glucagon, 642,4 M g/kg de PI. soit 730,4 > g/kg (tel quel); cristaux du premier traitement supplémentaire ( deuxième récolte ) rendement, 19,0 g ( pur à 100% ) 165M/k de de P.I. ( pur et tel quel); cristaux du deuxième traitement supplémentaire ( première liqueur mère ), rendement, 22,0 g (pur à 46,0%) soit 9,9 g, 85,8 yg/kg de P.I ( pur) ou 187 yg/kg(tel quels.Rendement total 126, 0 g de solides ( 1 047 M g/kg de P.I.) à une pureté de 83,1% soit 104, 7 g de glucagon ( 900 p g/kg de P.I.). On effectue la recristallisation avec tous les autres cristaux intermédiaires accumulés. Les cristaux finals de glucagon représentent 85% du poids de glucagon présent dans les cristaux intermédiaires. On effectue la recristallisation à pH 7,5 après dissolution des cristaux intermédiaires à un pH de 8,0 - 10,0 avec de l'hydroxyde de potassium à 10 % , 40"C, à 1,0 % de solides, et en réajustant le pH à 7,5 avec de l'acide phosphorique à 10%, en filtrant et en refroidissant. On recueille les cristaux finals par centrifugation après décantation de la majeure partie de la liqueur mère ( que l'on traite de nouveau pour obtenir un certain rendement supplémentaire), on les lave deux fois avec une solution à 0,0018 de chlorure de sodium, une fois avec de l'eau distillée froide et on les lyophilise. Le rendement calculé est 89,0 g soit 765,6 pg/kg de P.I, et la récupération à partir de la liqueur mère de cristallisation alcaline est de 33,2%. REVENDICATIONS 1. Procédé de récupération de glucagon, qui consiste A. à isoler les protéines contenant le glucagon de la liqueur surnageante de cristallisation alcaline d'un procédé de préparation de l'insuline B. à séparer le glucagon des autres protéines; et C. à purifier le glucagon obtenu dans l'étape B. 2. Procédé selon la revendication 1 , où on effectue l'étape A à l'aide d'une précipitation isoélectrique à un pH d'environ 4,2 à environ 6,6. 3. Procedé selon la revendication 2, où on effectue ladite précipitation isoélectrique en présence de jusqu'à environ 20% en volume d'un monoalcool aliphatique saturé ayant moins d'environ 6 atomes de carbonne. 4. Procédé selon la revendication 3, où ledit monoalcool est l'alcool éthylique. 5. Procédé selon la revendication 1, où on effectue l'étapeAàl'aide d'une chromatographie par échange d'ion. 6. Procédé selon la revendication 1, où on effectue l'étape A à l'aide d'une précipitation isoélectrique et d'une chromatographie par échange d'ion dans un ordre quelconque. 7. Procédé selon la revendication 1, où on effectue l'étape A à l'aide d'une précipitation isoélectrique,suivie d'un fractionnement du facteur hyperglycémique. 8. Procédé selon la revendication 1, où on effectue l'étape B à l'aide de la formation de fibrilles de glucagon. 9. Procédé selon la revendication 8, où on effectue ladite formation de fibrilles à un pH compris entre environ 1,5 et environ 2,7. 10. Procédé selon la revendication 8, où on effectue ladite formation de fibrilles en présence d'un sel minéral. 11. Procédé selon la revendication 10, où ledit sel est le sulfate d'ammonium. 12. Procédé selon la revendication 11, où ledit sulfate d'ammonium est présent à une concentration d'environ 0,01 à environ 0,05 M. 13. Procédé selon la revendication 1, où on effectue l'étape C à l'aide d'une cristallisation. 14. Procédé selon la revendication 13, où on effectue ladite cristallisation à un pH compris entre environ 4,5 et environ 8,5. 15. Procédé selon la revendication 13, où on effectue ladite cristallisation avec une concentration en glucagon d'environ 2 à environ 10 mg de glucagon par ml de solution. 16. Procédé selon la revendication 14, où on effectue deux cristallisations successives. 17. Procédé selon la revendication 16, où on effectue la premiere cristallisation à un pH d'environ 4,5 à environ 5,5, et on effectue la deuxième cristallisation à un pH d'environ 7,0 à environ 8,5. 18. Procédé selon la revendication 1, où on effectue l'étape B à l'aide de la formation de fibrilles de glucagon et on effectue l'étape C à l'aide d'une cristallisation. 19. Procédé selon la revendication 18, où on effectue l'étape A à l'aide d'une précipitation isoélectrique. 20. Procédé selon la revendication 18, où on effectue l'étape A à l'aide d'une chromatographie par échange d'ion. 21. Procédé selon la revendication 18, où on effectue l'étape A à l'aide d'une précipitation isoélectrique et d'une chromatographie par échange d'ion dans un ordre quelconque. 22. Procédé de récupération du glucagon qui consiste A. à séparer les protéines contenant le glucagon de la liqueur surnageante de cristallisation alcaline d'un procédé de préparation d'insuline, par précipitation isoélectrique à pH 5,2 suivie d'un fractionnement du facteur hyperglycémique à pH 7,5 B. à séparer le glucagon des autres protéines enformant de fibrilles de glucagon dans une solution aqueuse d'acide chlorhydrique et de phénol en présence d'acide éthylènediaminetétracétique et de sulfate d'ammonium; et C. à purifier le glucagon obtenu dans l'étape B par cristallisation àpH 5,0.