Brevet FR2300804A1 — publié le 19760910

La présente invention concerne un procédé de fabrication de masse biologique qui peut trouver des applications dans la production de concentrats de fourrage protéino-vitaminique utilisé dans l'élevage, dans la fabrication de lipides, de vitamines et d'autres constituants de masse biologique, ainsi que pour effectuer le déparaffinage microbiologique des distillats pétroliers et d'autres coupes de pétrole. On connaît un procédé de fabrication de masse biologique à l'aide d'une culture bactéreienne des espèces Pseudomonas alruginosa, Pseudomonas fluorescens, Nocardia opaca, Nocardia coralina, Nocardia rubra, Pseudomonås methanica, Pseudomonas desmolyticium, mycobactérium phleie, MicrocQu cerificans. On utilise, de préférence, la culture Micrococcus cerificans isolée et identifiée par R.E. Kallio et autres. les bactéries sont cultivées sur un milieu de composition suivante : en poids pour la croissance de 1% en poids de masse biologique H3P04 de 0,01 à 1,0 ; Na2S04 de 0,01 à 0,5 ; KCl de 0,01 à 0,5 MgS04 de 0,005 à 0,5 ; Ca Cl2 de 0,005 à 0,5 ; Peso4 de 0,001 à 0,1 ; MnS04 de 0,001 à 0,1. En qualité de source d'azote on utilise l'ammoniac, et en qualité de source de carbone on utilise des hydrocarbures. On introduit additionnellement dans le milieu 0,08 à 0,20 g d'azote par gramme de masse biologique sèche à obtenir. la concentration initiale des hydrocarbures dans le milieu est inférieure à 2% en poids en cas d'aération à l'air, et de 1 à 10% en poids, de préférence de 1 à 5g en poids, en cas d'aération à l'air contenant 90 d'oxygène pur. Le processus de culture se déroule à une température de 20 à 45OC, à un pH de 5,5 à 7,5. Le temps de séjour des bactéries dans le fermentateur est compris entre 1 et 10 heures, la durée optimale étant de 1,5 à 2,5 heures. l'inconvénient du procédé précité est le faible rendement du processus qui est déterminé par la concentration des hydrocarbures dans le milieu, celle-ci ne dépassant pas 10o en poids (aération à l'air contenant 90% de e2), la concentration initiale étant de 2ç0 en poids. Plusieurs espèces de bactéries précitées ont une croissance lente et exigent, pour leur culture, des conditions stériles, ce qui complique la technologie du procédé. Les espèces à croissance lente se distinguent par une faible teneur en protéines qui détermine la principale valeur nutritive de la masse biologique obtenue. L'utilisation de icrococcus cerificans ne permet pas d'obtenir un rendement élevé en masse biologique, parce que cette souche, dans le processus de croissance sur des hydrocarbures, transforme la majeure partie du substrat carboné en esométabolites (éthers cireux). Le but de la présente invention est de remédier aux inconvénients indiqués. Il s'agissait donc, en modifiant le producteur, d'aug enter la productivité du procédé et de simplifier le schéma technologique du procédé. la solution consiste en un procédé de fabrication de masse biologique par culture de bactéries de l'espèce ts.icrococcus dans un milieu nutritif contenant, en qualité de source de carbone, des hydrocarbures de pétrole, des sources d'azote et des sels minéraux, avec isolement ultérieur de la masse biologique, ledit procédé étant caractérisé, selon l'invention, en ce qu'on utilise la souche de bactéries Micrococcus freudenreichii K-219, isolée de la rhisosphère du mais et sélectionnée suivant un procédé continu dans des milieux nutritifs contenant, en qualité de source de carbone, des hydrocarbures, ladite souche ayant les particularités morphologiques et les propriétés physiologiques suivantes cellules arrondies, isolées, par paires ou par groupes, de 1 à 1,5 de diamètre, G. positives ; les colonies sur agar peptonique de viande sont menues? blanches, lisses, brillantes à bords réguliers ; elles fermentent le glucose en aérobie ; parmi les hydrocarbones, elles assimilent le glucose, le saccharose, le mannose, le maltose, le xylose, l'arabinose, le lactose, le tréhalose ; parmi les alcools, elles assimilent la mannite, la glycérine ; à partir des nitrates, elles froment des nitrites ; elles ne liquéfient pas la gélatine ; elles acidifient légèrement le lait tourné ; la souche n'est ni pathogène nu toxique pour les animaux de laboratoires, tels que les rats et les lapins en cas d'injections intraveineuses et intra-abdominales, la culture se reproduit d'une façon stable à une température de 28 b 45 C, elle est morphologiquement stable, elle se reproduit en un processus continu avec un facteur D de dilution du milieu allant de 0,4 à 0,7 heure la culture est effêctuee dans des conditions non stériles à > ttempérature de 38 à 44OC, à un pH de 6,8 à 7,0, avec séparation ultdrieure de la masse biologique. Le procédé proposé est réalisé de la manière suivante. Ta culture Micrococcus freudenreichii E-219 est çultivée pendant 24 heures sur un milieu Rider minéral agar incliné avec les hydrocarbures. On effectue l'ensemencement de ballons contenant 50 à 500 ml de milieu Rider, avec une suspension bactérienne obtenue par lavage de colonies. On additionne au bouillon 2 à 25% en poids dthydrocarbur*8.Les ballons sont incubés sous aération à une température de 38 à 440C pendant 6 à 18 heures. Avec la matière de semence contenue dans les ballons, on inocule un appareil de faible capacité (volume 10 à 20 fois supérieur par rapport à la quantité de matière de semence). On utilise un milieu de composition suivante (par litre) acide phosphorique titré à 70% 36 ml sulfate de magnésium 5,8 g chlorure de potassium 11,5 g sulfate de zinc 0,16 g sulfate ferrique 0,08 g sulfate de manganèse 0,16 g sulfate cuivreux 0,16 g eau de robinet jusqu'à 1 litre. On additionne au milieu de 2 à 25% en poids d'hydrocarbures. La culture se fait pendant 2 à 4 heures à un pH de 6,8 à 7 et à une température de 38 à 440C. Les opérations suivantes prévoient une augmentation progressive du volume utile du fermentateur (de préférence de 2 à 20 fois) jusqu'à ce qu'on atteigne la capacité requise de l'appareil. La culture continue est réalisée avec un facteur de dilution D allant de -1 0,4 à 0,7 heure , à un pH de 6,8 à 7,0 et à une température de 38 à 44OC, dans des fermentateurs aérés pourvus d'un réglage automatique du pH, de la température, de l'alimentation en air, en constituants nutritifs, avec prélèvement de la suspension bactérienne. Le degré d'aération est déterminé d'après la concentration du substrat hydrocarburé amené et d'après la densité de la suspension bactérienne (dans les limites de 0,5 à 4 volumes par volume et par minute). Les bactéries peuvent être cultivées suivant un procédé à étape unique ou à étapes multiples (en batteries), en utilisant des concentrations élevées d'hydrocarbures. Lors de la culture à de faible concentrations en paraffines liquides purifiées ou en matière première pétrolière non purifiée, il faut prévoir un stade de condensation de la masse biologique avec isolement ultérieur de celle-ci. Le produit peut etre obtenu sec. la productivité spécifique des fermentateurs, exprimé en masse biologique absolument sèche, peut atteindre jusqu'à 12 kg/t par heure pour le procadé à étape unique et jusqu'à 26 kg/t par heure pour le procédé à étapes multiples. Le procédé proposé de fabrication de masse biologique à l'aide de la souche Micrococcus freudenreichii K-219 assure une productivité spécifique élevée des fermentateurs en ce qui concerne la masse biologique. La concentration des hydrocarbures utilisés (jusqu'à 25% en poids) assure une haute densité de la population bactérienne (jusqu'à 50 à 70 g/l,) ce qui facilite les stades technologiques d'isolement subséquents de la masse biologique (par exemple élimination du stade de condensation). 'a masse biologique fabriquée par le procédé de l'invention a une composition hautement nutritive. La teneur en protéine brute est comprise entre 60 et 75% en poids, la teneur en protéine réelle est de 48 à 61% en poids, les vitamines du groupe B, substances vitales essentielles pour unehlimentation de valeur de l'organisme animal, y sont contenues en quantités notables (en matière sèche, tX g/g) thiamine 15 riboflavine 124 acide nicotinique 670 pyridoxine 4 biotine 7 vitamine B72 6. Ta composition qualitative de la masse biologique permet d'obtenir d'une manière orientée diverses substances biologiquement actives. La souche utilisée dans le procédé de l'invention n'est ni pathogène ni toxique. La culture se développe dans des conditions non-stériles et, gr ce à sa croissance intense, elle n'est ni incommodée ni infectée. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description, qui va suivre, d'exemples de réalisation concrets mais non limitatifs. EXEAIPIE 1. Les bactéries de l'espèce Micrococcus freudenreichii K-219 sont cultivées dans des éprouvettes sur un milieu Rider agar incliné, contenant, en qualité d'unique source de carbone, des hydrocarbures IAroliers . La culture s'effectue pendant 24 heures à la température de 40cl. Ensuite, par lavage de la suspension bactérienne de 15 éprouvettes, on ensemence 15 ballons contenant chacun 100 ml de milieu Rider avec 10% en poids de distillat de pétrole ayant une température d'ébullition allant de 185 à 3350C et contenant 33% en poids de complexant dthydrocarbures et à température de figement de - 100C. Les ballons contenant la matière d'ensemencement sont mis en incubation pendant 6 heures sur un secoueur (280 tr/mn) à un pH de 7,0 et une température de 400C. Avec la matière de semence des ballons, on ensemence un fermentateur de 30 1 de capacité pourvu d'une alimentation automatique en constituants minéraux du milieu nutritif et en distillat pétrolier, et d'un prélèveçent automatique. le fermentateur est muni d'un réglage automatique du pH, de la température et de l'alimentation en air. Les bactéries sont cultivées dans les conditions suivantes : pH = 7,0 ; température de travail 390C ; alimentation en air 3 1/1 mn ; teneur en distillat pétrolier 25/d en poids par rapport à I'écouleent. Dans l'expérience on utilise un milieu nutritif de composition suivante acide phosphorique titré à 70% 36 ml sulfate de magnésium 5,8 g chlorure de potassium 11,5 g sulfate de zinc 0,16 g sulfate ferrique 0,08 g sulfate de manganèse 0,16 g sulfate cuivreux 0,016 g eau de robinet jusqu'à 1 1. La solution saline est amenée dans le fermentateur selon les besoins en phosphore. Pour assurer l'alimentation en azote et pour maintenir le pH du milieu, on utilise une solution d'ammoniac. Après une accumulation de courte durée de la masse biologique (de 2 à 4 heures), on passe au processus continu de culture. Le processus se déroule en une seule étape avec un facteur de dilution du milieu de 0,5 heure 1. Le distillat pétrolier après déparaffinage microbiologique et la masse biologique bactérienne sont isolés du liquide de culture, acidulé avec H3P04 jusqu'à un pH de 3,0, par séparation avec addition de 0,2 en poids de substance tensioactive, par exemple de sulfo-uréide technique. La masse biologique isolée sur un séparateur passe au séchage. La liqueur de culture contenant de l'acide phosphorique est recyclée au stade de fermentation. Dans 1 kg de suspension on a, alors, 22,0 g de masse biologique sèche, ce qui correspond à un rendement spécifique en masse biologique de 1t kg/t heure. La masse biologique a une teneur de 714* en poids de protéine, 14,7% en lipides, 3,0 g/g en vitamine B2, 4,1 g/g en vitamines B6, 633,8/g/g en vitamines Bs, 3,09 g/g en vitamines B7, , 12,5 /Ug/g en vitamines B1 et 82,15 /g/g en vitamines B2. La teneur en amino-acides (en g par 100 g de protéine) est la suivante lysine, 5,36 ; thréonine, 4,17 ; valine, 3,57 ; méthionine, 0,92; leucine, 5,13 ; isoleucine, 2,32 ; tyrosine, 2,19 phénylalonine, 2,74 ; tryptophanne, 0,81 ; arginine, 4,71 acide aspartique, 8,88, sérine, 3,14 ; acide glutanique, 10,86 proline, 4,17 ; alamine, 5,57 ; glycine, 3,0. EXEMPLE 2. Les conditions de la culture de Micrococcus freudenreichii K-219 sont analogues à celles décrites dans l'exemple 1, mais avec un facteur de dilution D = 0,7 heure (# = 1,4 heures). Le distillat pétrolier (fraction passant entre 240 et 360OC, contenant 4T,5 en poids de complexants d'hydrocarbures et une température de figement de +30C) est admis en proportion de 25% en poids par rapport à l'écoulement. Dans ces conditions de culture, la concentration de la masse biologique est de 14,9 g de substance sèche par kilogramme de milieu, le rendement spécifique du fermentateur en masse biologique est de 10,4 kg/t. heure. La masse biologique a une teneur de 73% en poids en protéines et de 9,8* en poids en lipides, 2,84 / g/g en vitamines B12, 3,85 g/g en vitamines B6, de 594, 0 9 g/g en vitamines Bs, de 2,88y de 11,65 t g/g en vitamines Bî et de 77 g/g en vitamines EXEMPLE 3. Dans un fermentateur de 30 1 de capacité, on cultive des bactéries suivant le procédé à étape unique, avec un facteur de dilution du milieu de 0,5 heure 1. Les bactéries Micrococcus freudenreichii K-219 sont cultivées sur un milieu minéral d'une composition identique à celle de l'exemple 1. Comme source de carbone, on utilise la paraffine liquide purifiée. La paraffine est admise en quantité de 4% en poids par rapport à l'écoulement. La température de la culture est de 41 C, le pH = 7,0. Dans ces mimes conditions de culture, la concentration de la triasse biologique est égale à 23 g de substance sèche par kilogramme de milieu, le rendement du fermentateur est de 11,5 kg/t. heure. La masse biologique a une teneur de 69,7 en poids en protéines, 11w2ajo en poids en lipides, 3,01 / g/g en vitamines B 2, 13,9 g/g en pyridoxine, 687,3 /g/g en acide nicotinique, 4,0 g/g en biotine, 8,8 / g/g en thiamine et 146,9 t g/g en riboflavine. EXEMPLE 4. La culture des bactéries Micrococcus freudenreichii K-219 est effectuée dans une batterie composée de trois fermentateurs de 1 1 de capacité, dans des conditions analogues à celles de l'exemple 1, avec une vitesse de dilution D = 0,5 heure 1. les paraffines purifiées, à une concentration de 6% en poids par rapport à l'affluent, sont admises séparément : 4,0%. en poids dans le premier appareil et 2% en poids dans le second. Dans ces conditions, la concentration de la masse biologique dans le dernier appareil est de 55 g/l en substance absolument sèche. La masse biologique obtenue a une teneur de 56% en poids en protéines réelles, la teneur en vitamines du groupe B étant analogue à celle décrite dans l'exemple 2. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits et représentés qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre des revendications qui suivent. REVENDICATTONS 1. Procédé de fabrication d'une masse biologique à l'aide d'une culture de bactéries de l'espèce Micrococcus sur un milieu nutritif contenant des hydrocarbures de pétrole en tant que source de carbone, des sources d'azote et des sels minéraux, avec isolement subséquent de la masse biologique visée, caractérisé en ce qu'on utilise la souche de bactéries Micrococcus freudenreichii - 2t9 isolée de la rhisosphère du maïs et sélectionnée suivant un procédé continu dans des milieux nutritifs contenant des hydrocarbures en qualité de source de carbone, ladite souche présentant les particularités morphologiques et les propriétés physiologiques suivantes cellules arrondies, isolées ou en paires ou en groupes, de 1 à 1,Sjlde diamètre, G. positives ; les colonies sur agar peptonique de viande sont menues, blanches, lisses, brillantes à bords réguliers ; elles fermentent le glucose en aérobie parmi les hydrocarbures, elles assimilent le glucose, le saccharose, le mannose, le maltose, le xylose, l'arabinose, le lactose, le tréhalose ; parmi les alcools, elles assimilent la mannite, la glycérine ; à partir des nitrates elles forment des nitrites ; elles ne liquéfient pas la gélatine ; elles acidifient légèrement le lait tourné ; la souche n'est ni pathogène ni toxique pour les animaux de laboratoire tels que les rats et les lapins en cas d'injections intraveineuses et intra-abdominales ; la culture se reproduit d'une façon stable à une température de 28 à 45 OC, elle est morphologiquement stable ; elle se reproduit en un processus continu avec un facteur de dilution D du milieu allant de 0,4 à 0,7 heure la culture est effectuée dans des conditions non stériles à une température de 38 à 44OC, à un pH de 6,8 à 7,0, avec séparation subséquente de la masse biologique visée. 2. Masse biologique caractérisée en ce qu'elle est obtenue suivant le procédé faisant l'objet de la revendication 1.