Brevet FR2299635A1 — publié le 19760827

Ta présente invention se rapporte à une bande expérimentale pour déterminer un sucre dans les fluides de 11 organisme. Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à une bande expérimentale pour la détection de glucose ou de galactose dans les fluides de l'organisme, particulièrement dans l'urine, comprenant une matière absorbante imprégnée par une solution de sucre oxyda- se, de peroxydase, de chromogène et d'acétate-phtalate de cellulose. Jusqu'à présent, pour le diagnostic du diabète, on a employé dans le domaine clinique un certain nombre de bandes expérimentales utilisant un système enzymatique, comprenant une glucose oxydase, une peroxydase et un chromogène. Cependant, certains inconvénients dans ces bandes expérimentales ont éte indiqués, du fait que la sensibilité de la bande expérimentale ntest pas suffisante par suite de l'instabilité des enzymes qui y sont contenues ou de la présence d'inhibiteurs tels qu'unie substance réductrice (par exemple l'acide ascorbique, la créatinine, l'acide urique, acide glucronique) dans un échantillon expérimental.Actuellement, la vitamine C (c'est-à-dire l'acide ascorbique; est souvent administrée sous la forme de médicaments ou de boissons rafratchissantes dans certains buts thérapeutiques ou de santé, et,en conséquence, l'acide ascorbique est présent dans l'urine ou dans le sang en grande quantité. Par suite, il est nécessaire de trouver un procédé simple pour retirer ces substances réductrices ou pour minimiser l'effet indésirable de ces composés dans la réaction de coloration. Puisque l'acide ascorbique est facilement oxydé et que ceci affecte de manière indésirable la réaction de coloration basée sur la réaction dloxydo-réduction pour la détection de glucose ou de galactose, des résultats expérimentaux fiables ne peuvent pas entre obtenus quand de l'acide ascorbique est présent dans un échantillon expérimental. Ainsi, il est souhaitable de retirer ces inhibiteurs avant la réaction de coloration, ou de minimiser 11 effet d'inhibition.Une bande expérimentale disponible dans le commerce pour le glucose des urines est d'un type tel que l'extrémité de la bande expérimentale est plongée dans un échantillon expérimental pendant quelques minutes et l'échantillon expérimental est imprégné par voie chromatographique dans la bande expérimentale, après quoi la réaction de coloration est déterminée en observant la ligne colorée entre la partie imprégnée et la partie résiduelle qui n t a pas absorbé l'échantillon expérimental . Dans ce type de bandes expérimentales, toute la partie qui a été imprégnée par l'échantillon expérimental ne donne pas une réaction de coloration, mais seule une partie de la bande expérimentale, c'est-à-dire la ligne de limite, donne une réaction de coloration positive.En conséquence, dans ce type de bandes expérimentales, il est plutôt difficile de déterminer distinctement la réaction de coloration. En outre, ce procédé prend un temps plutôt long pour obtenir les résultats du test, parce qu'un echantillon expérimental doit être amené à s'élever par voie chromatographique sur la bande. Ainsi, il y a des inconvénients à utiliser ces bandes expérimentales connues en combinaison avec d'autres bandes expérimentales pour le diagnostic de diverses maladies. La bande expérimentale de la présente invention donne des résultats expérimentaux fiables-, msme en présence d'-un niveau élevé d'acide ascorbique, et, contrairement aux bandes expérimentales connues mentionnées précédemment, la bande expérimentale de la présente invention peut être utilisée en plongeant la totalité de la bande contenant des agents réactifs, en donnant ainsi une réaction de colo- ration distincte et homogène, en un bref instant Lorsqu'un échantillon d'urine ne contient pas une grande quantité d'acide ascorbique, la bande expérimentale de la présente invention peut détecter de manière semi-quantitative du glucose des urines en quantité de 25-2.000 mg/ 100 ml.En outre, dans le cas où des médicaments ou des boissons ra fraîchissantes sont administrés et quten conséquence une grande quantité d'acide ascorbique (20-100 mg/100 ml) est excrétée, la bande expérimentale de la présente invention donne une réaction de coloration positive vis-à-vis du glucose de l'urine en quantité supérieure à 100 mg/100 ml. En utilisant un acétate-phtalate de cellulose, on prévoit une bande expérimentale améliorée pour la détection du glucose ou du galactose, particulièrement du glucose des urines. En conséquence, c'est un objet de la présente invention de prévoir une bande expérimentale perfectionnée pour la détection dtun sucre dans les fluides de l'organisme, qui indique de manière fiable et distincte, la présence de glucose ou du galactose, sans entre affectée par une substance réductrice telle que l'acide ascorbique. la bande expérimentale de la présente invention peut entre préparée à la manière suivante. Une matière absorbante est d'abord imprégnée par une solution de sucre oxydase et de peroxydase à la température ambiante, et puis séchée dans l'air ou sous pression rédutte. les enzymes sont ordinairement dissoutes dans un tambour à pH d'environ 5,0-8,0 et, si cela est nécessaire, de l'alcool polyvinylique peut etre ajouté.L'alcool polyvinylique peut revêtir la sucre oxydase et la peroxydase, en stabilisant ainsi efficacement ces enzy mes a matière absorbante ainsi obtenue est plongée dans la seconde solution de chromogène et d'acétate-phtalate de cellulose,après quoi, la matière absorbante imprégnée est séchée pour fournir la bande expérimentale désirée. L'acétate-phtalate de cellulose est ordinairement utilisé à une concentration de 1-10 ss (en poids/volume), de préférence environ 5 H (en poids/volume) et il peut recouvrir les enzymes et les chromogènes; de ce fait,on évitera efficacement un effet indésirable avec des substances réductrices telles que l'acide ascorbique. Des exemples de matières absorbantes à plonger dans la solution d'imprégnation peuvent être une feuille de papier, un mor ceau d'étoffe ou un boston de bois poreux. Des exemples typiques de genres de papiers sont du papier filtre, du papier buvard, du papier adsorbant (par exemple du papier à la phosphométhylcellulose, du papier à la sulfoéthylcellulose, du papier à l'aminoéthylcellulose, du papier à la polyéthylèneimirecellulose) et du papier à résine échangeuse d'ions dite Sephadex. D'autres matières absorbantes ayant des propriétés équivalentes peuvent entre aussi utilisées.Parmi ces matières absorbantes, des papiers à la cellulose échangeuse d'ions, spécialement du papier à la diéthylaminoéthylcellulose, peuvent être de préférence employés. Une solution d'imprégnation peut être préparée en dissolvant chaque composant dans l'eau ou dans un solvant organique (par exemple un solvant ayant un faible point d'ébullition, tel que le méthanol, l'éthanol ou l'acétone; ou dans un mélange de ces solvants. Cette solution est ordinairement réglée à un pH d'environ 5-ô avec un tampon. Des exemples de tampons sont des phosphates, des citrates, des carbonates, des borates et d'autres tampons convenables. Dans la préparation de la solution d'imprégnation, on préfère régler la solution à un pH de 5-7, lorsque la glucose oxydase est employée. Dans le cas où la galactose oxydase est employée, il est souhaitable d'utiliser un tampon en quantité suffisante pour maintenir le pH à 6-8, de préférence aux alentours de 7,0. Lorsqu'un solvant organique ou une solution aqueuse de ce solvant est employé, le produit réagissant est absorbé de manière homogène dans une matière absorbante, en donnant ainsi une couleur homogène quand on la teste dans une réaction de coloration. En outre, 11 étape de séchage pour la préparation de la bande expérimentale est simplifiée. La sucre oxydase peut être une substance qui peut oxyder un sucre spécifiquement et qui produit ainsi de l'eau oxygénée. Cette sucre oxydase peut être la glucose oxydase et la galactose oxy- dase. Dans la détection de glucose et de galactose, on utilise respectivement la glucose oxydase et la galactose oxydase. Comme peroxydase, on peut employer toute substance qui peut catalyser 11 oxydation du chromogène par l'eau oxygénée provenant de l'oxydation du glucose ou du galactose. Des exemples typiques de peroxydases sont celles dérivées d'animaux, de plantes, de micro-organismes et de leucocytes. I1 est préférable d'utiliser une peroxydase de raifort. Le chromogène est une substance qui change de couleur par oxydation avec l'eau oxygénée produite par oxydation du glucose ou du galactose et qui n1 inhibe pas la réaction enzymatique. Des exemples de ces chromogènes sont lto-tolidine, la m-tolidine, le gaïac, I'o-dianisidine, la benzidine, lto-méthylbenzidine, le 4,4'-diaminodiphényles l'o-phénylènediamine, la m-phénylènediamine, la p-phénylè ne diamine, la 2ss3-toluylènedikamines la 2,4-toluylènediamine, la 2,5-toluylènediamine, la 2,6-toluylènediamine, l'acide gallique, l'acide pyrogallique, lthydroquinone les benzidines dont le ou les groupes amino sont aryles par un groupe alkyle inférieur ayant 1-4 atomes de carbone (demande de brevet japonais nO 27.298/1974 déposée le 8 mai 1974 au nom de la demanderesse, sous le titre : "Un instru ment de diagnostic et sa production"),ek et leurs sels (par exemple le chlorhydrate, le bromhydrates le fluorhydrate, le sulfate, le nitrate).Parmi ces produits, on préfère de beaucoup une utilisation combinée d'o-tolidine et de gaïac. Llo-tolidine est de préférence contenue dans la première solution d'imprégnation et on préfère uti liser le gaïac, en combinaison avec l'acétae-phtalate de de cellulose, comme composant de la seconde solution d'imprégnation. Cette combinaison donne un changement de couleur distinct dans la réaction de coloration désirée. Quand le gatacol est utilisé, on préfère employer une fraction soluble dans le chloroforme. La sucre oxydase et la peroxydase sont ordinairement utilisées en quantité en excès. I1 n'y a pas de limitation particulière dans la quantité de sucre oxydase et de peroxydase, et elles peuvent être employées à une concentration de plus de 0,1 ss (en poids/ volume) et de 0,01 % (en poids/volume) par rapport à la totalité de la première solution d'imprégnation, respectivement. Une quantité en excès de chromogène est également employée dans la préparation de la bande expérimentale désirée. La bande expérimentale de la présente invention convient à la détection de sucres dans l'urine ou dans le sang, particulièrement du glucose dans les urines. me lorsqu'une grande quantité d'inhibiteurs de réduction, tels que de l'acide ascorbique, est présente dans un échantillon expérimental, la bande expérimentale donne une bonne sensibilité sans être affectée de manière importante- par ces inhibiteurs et donne un résultat de diagnostic correct pour les diabétiques. ta bande expérimentale selon la présente invention est utilisée en la plongeant dans un échantillon expérimental, et, de ce fait, un changement de couleur détectable se produit en 30 secondes. La bande expérimentale peut être employée sous une forme très convenable, telle que, par exemple, en étant maintenue sur une feuille de matière plastique. les exemples suivants ne seront donnés qu'à titre d'illustration d'exemples de réalisation particuliers de la présente invention, et'non pas de limitation. EXEMPlE 1 Un petit morceau (5 x 10 cm) de papier à la diéthylamino éthylcellulose (produit dit DE-81, Whatman) est plongé dans la solution suivante à la température ambiante. Glucose oxydase (Sigma, type II) 200 mg Peroxydase (Sigma, type II) 20 mg Tampon au citrate 0,5M (pH, 5,0) 10 mi Tartrazine/éthanol (1 , en poids/volume) (dissoutedans une petite quantité d'une solution de soude 0,05 N, et puis diluée avec de ltéthanol) 2 ml Solution aqueuse à 10 ffi (en poids/volume) d'alcool polyvinylique 500 4 ml Ia matière absorbante imprégnée par la solution indiquée ci-dessus est séchée dans des conditions de pression réduite, à la température ambiante, et puis plongée dans la solution suivante à la température ambiante Acétate-phtalate de cellulose-acétone (5 %, en poids/volume) 10 ml o-tolidine 250 mg Fraction de gaiac (société dite Marukawa Kagaku-Kogyo Japon) soluble dans le chloroforme, à 20 % (en poids/volu me) dans l'acétone 2 ml La bande expérimentale imprégnée par la solution indiquée ci-dessus est séchée, collée sur une feuille de chlorure de polyviny- le, et coupée à une dimension convenable, pour donner la bande expérimentale désirée. tes résultats expérimentaux sur la détection de glucose dans l'urine, en l'absence d'acide ascorbique, sont indiqués dans le tableau suivant. TABLEAU I Détection du glucose dans l'urine Concentration de glucose dans Réaction de coloration teinte l'urine 100 ml) Aspect clair Saturation O 5Y-8/10 25 7.5Y-7/8 50 2,5GY-7/6 100 7,5GY-6/8 250 7,5GY-5/8 500 10GY-4/6 1000 l0GY-4/4 Note : Y = jaune, GY = jaune verdâtre, La couleur est exprimée en fonction du copeau de couleur standard [JIS = (Japanese Industrial Standard) Z 8721]. ta réaction de coloration a été déterminée 30 secondes après que la bande expérimentale a été plongée dans un échantillon expérimental et retirée de la solution d'urine. Comme cela apparaît d'après le tableau, la bande expérimentale de la présente invention présente un changement de couleur distinct (du jaune au jaune verdâtre) pour une concentration en glucose des urines supérieure à 50 mg/100 ml. tes résultats expérimentaux pour la détection de glucose de 11 urine en présence d'acide ascorbique sont donnés dans le tableau suivant. TABLeAU II Détection du glucose de 11 urine en présence d'acide ascorbique Glucose dans Réaction de coloration l'urine Aeide 1-ascorbi ue 100 mî (mg/100 ml) O 0 20 50 100 100 7,5GY-6/8 7,5GY-6/8 2,5GY-7/8 Négative 250 7,5GY-5/8 7,5GY-5/8 7,5GY-5/8 7,5GY-5/8 500 10GY-4/6 10GY-4/6 10GY-4/6 10GY-4/6 le tableau suivant présente le temps exigé pour la réaction de coloration en utilisant une bande expérimentale de la présente invention, une bande expérimentale sans acétate-phtalate de cellulose, et une bande expérimentale préparée en revêtant tous les composants par ae l'acétate-phtalate de cellulose. TABLEAU III Temps exigé pour la réaction de coloration Glucose Acide ascorbi- Réaction de co- Préparation (mg/100 ml) que (mg/100 ml) loration n 1 n 2 n 3 (T-A/S) secondes' 100 0 10 GY - 6/10 30 30 30 250 0 10 GY - 5/8 30 30 30 2 O 50 10 GY - 5/8 30 40 60 250 100 10 GY - 5/8 50 60 70 Note : T-A/s signifie "Teinte-Aspect clair/Saturation" GY = jaune vert. Préparation n I : la bande expérimentale a été préparée à la manière décrite ci-dessus. Préparation n 2 : la bande expérimentale a été préparée à la manière décrite ci-dessus, sans utiliser d'acétate-phtalate de cellulose. Cette bande expérimentale a été employée à titre de comparaison. Préparation n 3 : la bande expérimentale a été préparée en imprégnant une matière absorbante dans une solution contenant tous les composants nécessaires, où les composants et leur concentration sont les mêmes que ceux dans la préparation 1. La bande expérimentale selon la préparation 3 a été utilisée à titre de comparaison. D'après les résultats expérimentaux, on peut voir que, même en présence de 50 mg d'acide ascorbique, la bande expérimentale de la présente invention n'est pas affectée, alors que les préparations n 2 et 3 exigent un temps plus long pour obtenir une réaction de coloration désirée. Ceci indique le fait que le retard de la réaction de coloration dans la préparation n0 2 est dû à 11 effet dtinhibition de l'acide ascorbique.La réaction de coloration dans la préparation n 9 n'a pas eu lieu de manière régulière, par suite de lteffet excessif de revêtement de l'acétake-phtalate de cellulose, bien que l'acétate-phtalate de cellulose lu;-rrme ait un effet de revertement des produits réagissants à ajouter. Le temps exigé pour la réaction de coloration est important pour obtenir des résultats expérimentaux rapidement. En outre, puisque les bandes de diagnostic ) à 4 pour la détection de diverses maladies ont été récemment vendues sous une forme de combinaison maintenue sur une seule feuille, il est souhaitable d'utiliser chaque bande expérimentale ayant la même longueur de temps de réaction de coloration. Quand le temps de réaction de coloration de chaque bande expé rimentale est différent dans un tel type de combinaison de bandes ex périmentales, il est plutôt difficile de déterminer de manière fiable la réaction de coloration. le changement de couleur dans la plupart des bandes expérimentales est ordinairement observé 30 secondes après quelles ont été trempées dans un échantillon expérimental. En conséquence, la bande expérimentale de la présente invention peut eAtre appliquée sans difficulté à un type de bandes expérimentales en combinaison. La présente invention n est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de variantes et de modifications qui apparaltronk à lthomme de l'art. REVENDICATIONS I - Bande expérimentale pour la détection d'un sucre dans les fluides de l'organisme, caractérisée en ce qu'elle renferme une matière absorbante imprégnée par une solution d'une sucre oxydase, d'une peroxydase, d'un chromogène et d'un acétate-phtalate de cellulose. 2 - Bande selon la revendication 1, caractérisée en ce que la sucre oxydase est un membre choisi dans le groupe se composant de glucose oxydase et de galactose oxydase. 3 - Bande selon la revendication 1, caractérisée en ce que le chromogène est un membre choisi dans le groupe se composant d'o-tolidine, de m-tolidine, de garas, d'o-dianisidine, de benzidine, d'o-méthylbenzidine, de 4 > 4? -diaminodiphényle, d'o-phénylènediamine, de m-phénylènediamine, de 2,3-toluylènediamine, de 2,4-toluylènedia- mine, de 2,5-toluylènediamine, de 2,6-toluylènediamine, d'acide gallique, d'acide pyrogallique, d'hydroquinone, de benzidines dont le ou les groupes amino sont alkylés par un groupe alkyle inrérieur ayant 1-4 atomes de carbone, et leurs sels. 4 - Procédé de préparation d'une bande expérimentale pour la détection d'un sucre dans les fluides de ltorganisme, caractérisé en ce qutil consiste à plonger une matière absorbante dans une solution d'une sucre oxydase, d'une peroxydase et d'un tampon, à sécher la me- tière absorbante imprégnée, à plonger la matière absorbante dans une solution d'acétate-phtalate de cellulose et à sécher la matière absor bante. 5 - Procédé selon la revendication 4 > caractérisé en ce que la sucre oxydase est un membre choisi dans le groupe se composant de glucose oxydase et de galactose oxydase. 6 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le chromogène est un membre choisi dans le groupe se composant d'o-tolidine, de m-tolidine, de gaïac, d'o-dianisidine, de benzidine, d'o-méthylbenzidine, de 4,4'-diaminodiphényle, d'o-phénylènediamine. de m-phénylènediamine, de p-phénylènediamine, -de 2,3-toluylènediami- ne, de 2,4-toluylènediamine. de 2,5-toluylènediamine, de 2,6-koluylè- nediamine, d'acide pyrogallique, d'hydroquinone, de benzidines dont le ou les groupes amino ont été aikylés par un groupe alkyle inférieur ayant 1-4 atomes de carbone, et des sels de ces produits. 7 - Procédé de préparation d'une bande expérimentale selon la revendication 4, caractérisé en ce que la solution d'imprégnation contenant ltenzyme est réglée à un pH de 5,0 à 8,0.