Brevet FR2307870A1 — publié le 19761112

La présente invention a pour objet un procédé permettant d'obtenir, par fermentation, une association naturelle à parts égales des alcaloïdes ergocornine, ergokryptine et ergocristine, comprenant leurs isomères ergocorninine, ergokryptinine et ergocristinine. On connaît déjà des procédés de fabrication de l'ergocornine et de l'ergokryptine par fermentation, ainsi que des procédés de fabrication de l'ergocristine par fermentation. On sait par ailleurs qu'une association à parts égales d'ergocornine, d'ergokryptine et d'ergocristine, comprenant les isomères correspondants, peut être utilisée comme produit de départ pour la préparation de spécialités pharmaceutiques. Pour obtenir une telle association d'alcaloides, on a utilisé jusqu'à présent une drogue qu'on obtient en inoculant, dans les cultures en plein champ, des souches appropriées de claviceps purpurea à des épis de seigle. Cette drogue est équilibrée de façon à obtenir, par extraction subséquente, des parts égales des alcaloses ergocristine, ergocornine et ergokryptine comprenant leurs isomères. Selon un autre procédé connu, on cultive par fermentation une souche produisant l'ergocristine et, séparément, une souche produisant l'ergocornine et l'ergokryptine. On réunit ensuite dans le rapport correspondant les bouillons de culture ainsi obtenus et on poursuit l'isolement selon les méthodes habituelles. Quoique les avantages qu'apporterait un procède pour obtenir une association naturelle des alcaloïdes cités en une phase de fermentation unique apparaissent clairement,un tel procédé n'a jamais été mis au point pour les raisons suivantes: La mise en oeuvre d'une fermentation combinée, c'est-à dire d'une culture simultanée de plusieurs souches a l'aide du même milieu nutritif, a toujours soulevé de très grandes difficultés, et on ne connait jusqu'à présent aucun procédé de ce genre qui soit réellement d'un intérêt pratique. En effet, l'expérience accumulée dans le domaine de la production microbiologique à l'échelle industrielle de métabolites secondaires a montré que, outre les conditions physiques sous lesquelles on effectue la culture, la composition du milieu nutritif est d'une importance primordiale.Il faut trouver pour chaque souche le milieu de culture lui convenant et, d'une façon générale, on ne peut pas trouver un mélange nutritif susceptible de permettre une production optimale de métabolites avec deux souches différentes. La demanderesse a maintenant trouvé de façon surprenante un procédé permettant d'obtenir, par fermentation combinée et avec un haut degré de pureté, une association naturelle à parts égales des alcaloïdes de l'ergot de seigle cités. L'invention concerne donc plus particulièrement un procédé de fabrication d'une association a parts égales d'ergecor- nine, d'ergokryptine et d'ergocristine, comprenant les isomères ergocorninine, ergokryptinine et ergocristinine, par culture saprophytique de souches de l'ergot de seigle de l'espèce Claviceps purpurea, procédé selon lequel on combine la fermentation d'une souche produisant ltergocornine, l'erySuptine et leurs isomères, avec celle produisant l'ergocristine et son isomère, en une phase de fermentation unique. Avant de réaliser la culture par fermentation combinée des deux souches mentionnées, et conformément aux techniques habituellement utilisées pour la fabrication des alcaloldes de l'ergot de seigle, on effectue avantageusement une préculture. Le milieu utilisé pour cette étape préliminaire doit permettre une rapide germination des spores ensemencées, provenant d'une culture sur milieu gélosé, et par la suite une bonne croissance du mycélium. Les cultures obtenues dans le milieu de préculture servent ensuite à ensemencer le milieu de culture principal dont la composition doit être telle que l'on obtienne en peu de temps un poids important en mycélium. Comme milieu de préculture approprié, on utilise un milieu nutritif contenant du saccharose comme source de carbone, des sels d'ammonium comme source d'azote, du fer et du zinc comme oligo-éléments, et par ailleurs des sels minéraux. Il est particulièrement important d'ajouter en outre un mélange d'amino-acides et de vitamines. Au lieu de préparer le mélange décrit ci-dessus, on utilise avantageusement un extrait de graines de coton dégraissé, disponible dans le commerce sous la dénomination "Proflo". On a constaté de façon inattendue qu'un milieu nutritif tel que décrit ci-dessus convient aussi bien pour la culture d'une souche produisant l'ergocristine que pour la culture d'une souche produisant l'ergocornine et l'ergokryptine. Comme milieu approprié pour la culture principale, on utilise un milieu nutritif contenant du saccharose comme source de carbone, des sels d'ammonium comme source d'azote, du fer et du zinc comme oligo-éléments, et des sels minéraux. Ce milieu ne doit cependant pas contenir d'importantes quantités de composés complexes riches en amino-acides et en substances favorisant la croissance, comme par exemple des extraits de levure ou des peptones hydrolysées. Tout comme pour le milieu de préculture, on a constaté qu'un tel milieu convient aussi bien pour la culture d'une souche produisant l'ergocornine et l'ergokryptine que pour la culture d'une souche produisant l'ergocristine. La souche produisant l'ergocornine et l'ergokryptine fournit ces deux alcaloides, ainsi que les isomères correspondants, en quantités égales. Selon le procédé de l'invention, on peut déjà effectuer la fermentation combinée au niveau de la culture sur milieu gélosé dont les spores servent à ensemencer la préculture. Dans ce cas, ce milieu de culture gélosé est ensemencé avec des suspensioIs de spores provenent de deux cultures primitives effectuées séparément. Par ailleurs, il est également possible de commencer la fermentation anbinée au niveau de la préculture, celle-ci étant alors ensemencée avec des suspens ions de spores provenent de deux cultures sur milieu gélosé obtenues séparément. Selon une troisième possibilité, on peut effectuer la fermentation combinée uniquement au niveau de la culture principale, après avoir effectué deux précultures séparées. On ensemence alors le milieu de culture principal avec ces deux Précultures. ,Etant donné que la croissance de la souche produisant l'ergocristine est plus rapide et plus forte que celle produisant l'ergocornine et l'ergokryptine, que ce soit dans la culture sur milieu gélosé servant à ensemencer la préculture, dans la préculture ou dans la culture principale, il en résulte que dans une culture unique préparée à partir de quantités égales de spores des deux souches, la croissance de la souche produisant l'ergocristine domine à tel point qu'on n'obtient pratiquement que de l'ergocristine. Or, pour obtenir les trois alcaloldes en quantités égales il faut que, à la fin de la culture, la souche produisant l'ergocornine et l'ergokryptine ait fourni deux fois plus de mycélium que la souche produisant l'ergocristine.Pour parvenir à ce résultat, la quantité de spores mise en jeu initialement conduisant à ltergocornine et à l'ergokryptine doit être nettement plus importante que la quantité de spores conduisant à l'ergocristine, le rapport exact de ces deux quantités étant déterminé par des essais préliminaires. C'est ainsi par exemple que, conformément à la première variante du procédé de l'invention mentionnée plus haut, on effectue une culture combwe sur milieu gélosé incliné de la souche produisant l'ergocristine et de la souche produisant l'ergocornine et l'ergokryptine, en ensemençant cette culture avec une suspension contenant de 1.108 à 5.108 spores/ml, le rapport des quantités de spores de chaque souche, exactement determiné par des essais préliminaires, étant compris entre 1:2 et 1:20. Selon la deuxième variante du procédé de l'invention, on ensemence la préculture avec des suspensions de spores des deux souches. On utilise à cet effet, par litre de milieu de préculture,de 1.108 à 5.109 spores, le rapport des quantités de spores de chaque souche, exactement déterminé par des essais préliminaires, étant compris entre 1:20 et 1:200. Selon la troisième variante du procédé de l'invention, après avoir effectué séparément la préculture de chaque souche, on ensemence la culture principale en utilisant les précultures dans un rapport en volume préalablement déterminé et compris entre 1:3 et 1:20. Lorsque la culture est terminée, on extrait les alcaloldes de la bouillie de culture selon les méthodes habituelles. On peut par exemple isoler préalablement le mycélium, qui contient la majeure parties des alcaloldes, au moyen de solvants organiques, selon les méthodes connues. Comme souche produisant l'ergocornine et l'ergokryptine, on utilise de préférence la souche désignée par Exy 20. Cette souche a été déposée dans la collection de la société Sandoz S.A. a Bâle (Suisse). La souche Exy 20 a été obtenue après divers traitements mutagéniques, à l'aide de la lumière ultra-violette ou avec des agents alkylants, d'une souche parentale produisant de l'ergocornine et de l'ergokryptine et isolée d'un sclérote trouvé sur Festuca pratensis à Martigny, dans la vallée du Rhône (Suisse). La souche Exy 20 présente les caractéristiques morphologiques suivantes Lorsqu'on dépose un fragment de mycélium de la souche Exy 20 au centre d'une boîte de Pétri contenant un milieu à pH 5,2 qui comprend, par litre, 70 g d'extraits de levure, 30 g de flocons de pommes de terre, 10 g de gélose et pour le reste de l'eau distillée, le mycélium se développe rapidement sur toute la surface. A une température de 240, on obtient une colonie d'environ 3 cm de diamètre après 7 jours, d'environ 4,5 cm de diamètre après 14 jours et d'environ 8,5 cm de diamètre après 20 jours. Le centre de la colonie est circonvolué et de ce centre partent des filaments radiaux. Le mycélium forme une pellicule incolore d'aspect brillant à la surface du milieu gélosé. Rarement, et seulement au centre, il se forme un mycélium aérien pauvre. De nombreuses conidies se forment dans une telle culture.Après 20 jours, par exemple, le mycélium contient environ 2.108 conidies par cm2. Celles-ci sont de dimensions assez inégales (4-13 x 2-4p, en général cependant 6-9 x 3 jeu). Le mycélium ne contient pas d'alcaloides. Comme souche produisant l'ergocristine, on utilise de préférence la souche désignée par Ech k 420. Cette souche a été déposée dans la collection de la société Sandoz S.A. à Bâle. La souche Ech k 420 r été obtenue après divers traitements mutagéniques, à l'aide de la lumière ultra-violette ou avec des agents alkylants, d'une souche parentale produisant de l'ergocristine et isolée d'un sclérote trouvé sur du seigle à Black River, Wisconsin (USA). La souche Ech k 420 présente les caractéristiques morphologiques suivantes Lorsqu'on dépose un fragment de mycélium de la souche Ech k 420 sur un milieu à pH 5,2 contenant, par litre, 70 g d'extraits de malt, 30 g de flocons de pommes de terre, 10 g de gélose et pour le reste de l'eau distillée, on obtient, à une température de 240, une colonie d'environ 4 cm de diamètre après 7 jours et d'environ 5 cm de diamètre après 14 jours. La colonie est légèrement convexe et son mycélium aérien est blanc et d'aspect ouaté. Au centre de la colonie, on distingue une partie surélevée et cratériforme d'environ 1 cm de diamètre, d'où sont issus des plissements radiaux. Le mycélium est de couleur violette et on y distingue des zones concentriques plus ou moins pigmentées; le bord en est diffus. Au bout de 8 jours, le mycélium contient environ 2 1.108 conidies par cm . Celles-ci sont de dimensions assez inégales (5-12 x 3-7 , en général cependant 5-6 x-3p). Le mycélium ne contient pas d'alcaloides. Les exemples suivants illustrent la présente invention sans aucunement en limiter la portée; les températures y sont indiquées en degrés centigrades. Exemple 1 On prépare séparément une suspension dans de l'eau distillée de spores provenant d'une culture sur milieu gélosé incliné de la souche Ech k 420 et d'une culture sur milieu gélosé incliné de la souche Exy 20, et on combine les deux suspensions de manière que 1 ml contienne 1,05.106 spores de la souche Ech k 420 et 1.108 spores de la souche Exy 20. Avec 10 ml de cette suspension on ensemence, dans un erlenmeyer de 2 litres, 500 ml d'un milieu désigné par la suite milieu 1 et contenant, par litre, 100 g de saccharose, 3 g d'oxalate d'ammonium, 10 g de Proflo, 0,25 g de KH2P04, 0,25 g de Mg SOd, 0,12 g de KC1, 16,6 mg de FeS04.7 H20, 6,8 mg de ZnS04.7 H20 et pour le reste de l'eau distillée. On incube cette culture sur un agitateur à mouvement rotatif (180 t/min) pendant 5 jours à 240. On utilise la préculture ainsi obtenue pour ensemencer le milieu de culture principal. On ensemence des erlenmeyer contenant chacun 50 ml d'un milieu stérile à pH 6,2, désigné par la suite milieu 2 et contenant, par litre, 240 g de saccharose, 9,6 g d'oxalate d'ammonium, 1,7 g d'urée, 0,625 g de KH2P04, 0,625 g de MgSO4, 0,31 g de KC1 25 mg de FeS04.7 H20 10 mg de ZnS04.7 H20 et pour le reste de l'eau distillée, avec chaque fois 10 ml de la preculture obtenue ci-dessus, et on incube pendant 14 jours à 240 sur un agitateur à mouvement rotatif (180 t/min.). Un litre de cette culture contient 850 mg d'ergotoxines, avec des quantités égales, à - 5% près, d'ergocristine, d'ergocornine et d'ergokryptine, comprenant leurs isomères ergocristinine, ergocorninine et ergokryptinine. On peut isoler ces alcalotdes selon des méthodes connues, par extraction avec des solvants organiques, à partir du bouillon de culture ou à partir du mycélium séparé par filtration ou centrifugation, dans lequel la majeure partie des alcaloldes se trouve concentrée. Pour préparer la culture sur milieu gélosé incliné des souches Ech k 420 et Exy 20, on procède comme suit. 1. Culture sur milieu gélosé incliné de la souche Ech k 420 a) Gendalogie de la souche Ech k 420 On prépare un milieu nutritif à pH 5,2 désigné par la suite milieu 3 et contenant, par litre, 70 g d'extrait de malt, 30 g de flocons de pommes de terre, 10 g de gélose, et pour le reste de l'eau distillée. Sur ce milieu, on cultive une souche provenant d'un sclérote contenant l'ergocristine et trouvé sur du seigle, dans le Wisconsin (USA). Les conidies ainsi obtenues sont mises en suspension dans de l'eau distillée, à une concentration de 10.000 spores/ml. A 100 ml de la suspen sion ainsi obtenue,on ajoute 1 ml d'une solution d'éthy lèneimine à 10% et on laisse reposer le mélange ainsi obtenu pendant 110 minutes (ce qui correspond à un taux de létalité de 99%). On sépare les conidies de la solution par filtration, on les lave sur le filtre et on les remet en suspension dans 100 ml d'eau distillée. Avec chaque fois 0,2 ml de la suspension ainsi obtenue, on ensemence uniformément des boites de Pétri contenant un milieu désigné par la suite milieu 4 et contenant, par litre, 150 g de saccharose 4 g d'oxalate d'ammonium 0,25 g de KH2PO4 0,25 g de MgS04 0,12 g de KC1 1 g de Ca (NO3)2 0,1 mg d'aneurine 10 mg de cystéine 8,3 mg de Fez04.7 H20 3,4 mg de ZnS04.7H20 15 g de gélose et pour le reste de l'eau distillée. On incube les boîtes de Pétri pendant 3 semaines à 240, on isole les différentes colonies, on les transfère sur un milieu gélosé incliné 3 et on détermine la formation d'alcaloides après culture en milieu submergé et agité en utilisant les milieux 1 et 2. La meilleure souche parmi 8.000 souches ainsi traitées montre une production en alcaloTdes de 2302 supérieure à celle de la souche parentale. A partir de cette meilleure souche, on prépare 500 ml d'une suspension de conidies à environ 2.000 conidies par ml contenant, outre 5 ml d'eau distillée, 450 ml d'un tampon de Mc Ilvaine à pH 4,5. On ajoute à cette suspension la même quantité d'une solution de nitrite de sodium contenant 2,5 g de nitrite de sodium par litre, stérilisée pendant 20 minutes à 1200. On laisse reposer le tout pendant 50 minutes à la température ambiante (ce qui correspond à un taux de létalité de 99%). On sépare les conidies de la solution par filtration et on procède comme décrit plus haut. La meilleure souche parmi 10.000 souches ainsi traitées montre une production en alcaloVdes de 100% supérieure à celle de la souche parentale. A partir de la meilleure souche obtenue à l'étape précédente, on prépare 400 ml d'une suspension de conidies à environ 1.000 conidies/ml dans un mélange à pH 6 d'un tampon au tris-maléate et d'une solution d'hydroxyde de sodium, et on y ajoute 40 ml d'une solution aqueuse contenant 10 ml de N-méthyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine. On laisse reposer le mélange à la température ambiante pendant 30 minutes (ce qui correspond à un taux de létalité d'environ 97%), puis on sépare les conidies de la solution par filtration et on procède comme décrit à la première étape de traitement. La meilleure souche parmi 10.000 souches ainsi traitées montre une production en alcaloides de 125% supérieure a celle de la souche parentale. A partir de la meilleure souche obtenue ci-dessus, on prépare une suspension de conidies dans de l'eau distillée contenant environ 100 conidies/ml et on ense mence 1.000 boites de Pétri contenant chacune 17,5 ml du milieu 3 avec chaque fois 1 ml de cette suspension de spores. On soumet les boites de Pétri pendant 40 minutes à un rayonnement ultra-violet d'une longueur d'onde de 254 mp, de manière que 90% des spores soient détruites. Après 3 semaines, on détermine la formation d'alcaloldes sur un total de 10.000 souches, comme décrit plus haut. La meilleure souche,désignée par la suite Ech k 420,montre une production enalcalofdes de 95% supé rieure à celle de la souche parentale. b) Obtention et conservation des conidies de la souche Ech k 420 On met en suspension dans de l'eau distillée les conidies formées à partir des colonies des boîtes de Pétri ayant résisté au traitement mutagénique,et à l'aide de cette suspension on ensemence des tubes de milieu gélosé incliné. Après 8 jours, une telle culture sur milieu gélosé incliné (12 ml du milieu 3 dans un tube à essaisde 18 mm de diamètre et de 20 cm de long) contient environ 1.103 à 2.109 conidies. Par propagation supplémentaire sur milieu gélosé incliné, on peut obtenir d'importantes quantités de spores qui peuvent être conservées pendant un temps très long soit par surgélation, soit par lyophilisation. 2. Culture sur milieu gélosé incliné de la souche Exy 20 a) Genealogie de la souche Exy 20 Sur un milieu gélosé incliné 3, on cultive une souche provenant d'un sclérote contenant l'ergocornine et l'ergokryptine et trouvé sur Festuca pratensis dans la vallée du Phone. les conidies ainsi obtenues sont mises en suspension dans de l'eau distillée, à une concen tration d'environ 100 conidies/ml. On ensemence uniformé ment des boîtes de Pétri contenant le milieu 4 avec chaque fois 1 ml de la suspension ainsi obtenue, puis on les soumet à un rayonnement ultra-violet jusqu'à ce que 90 à 95% des conidies soient détruites.On incube pendant 3 semaines à 240, on isole les différentes colonies, on les transfère sur un milieu gélosé incliné 3 et on détermine la production en alcaloides après culture en milieu agité et submergé en utilisant les milieux 1 et 2. La meilleure souche parmi 3.000 souches ainsi traitées montre une pro duction en alcaloldes de 120% supérieure à celle de la souche parentale. A partir de cette meilleure souche, on prépare une suspension de conidies contenant environ 1000 spores/ml. A 1000 ml de la suspension ainsi obtenue, on ajoute 10 ml d'une solution d'éthylèneimine à 10%. On laisse reposer pendant 100 minutes (ce qui correspond à un taux de létalité d'environ 99%), puis on sépare les conidies de la solution par filtration, on les lave sur le filtre et on les remet en suspension dans 1000 ml d'eau distillée. On traite la suspension ainsi obtenue comme décrit ci-dessus. La meilleure souche parmi 9.000 souches ainsi traitées montre une production en alcaloldes de 100% supérieure à celle de la souche parentale.Au cours d'une troisième étape, on traite les conidies de la meilleure souche comme décrit plus haut, avec une solution 10-2 molaire de méthyl- bis (chloroéthyl) amine. La meilleure souche parmi 12.000 souches de cette série, désignée par la suite Exy 20, montre une productionen alcaloides de 758 supérieure à celle de la souche parentale. b) Obtention et conservation des conidies de la souche Exy 20 On met en suspension dans de l'eau distillée les conidies formées à partir des colonies ayant résisté au traitement mutagenique,et à l'aide de cette suspension, on ensemence des tubes de milieu gélosé incliné. Après 18 jours, une telle culture sur milieu gélosé incline (12 ml du milieu 3 dans un tube à essai de 18 mm de diamètre et de 20 cm de long) contient environ 2.109 à 3.109 conidies. Par propagation supplémentaire sur milieu gélosé incliné, on peut obtenir d'importantes quantités de spores qui peuvent être conservées pendant un temps très long soit par surgélation, soit par lyo philisation. Exemple 2 On ensemence un erlenmeyer de 2 1 contenant 500 ml 8 de milieu 1 avec 1. 108 spores de la souche Ech k 420 et un 8 autre erlenmeyer de 2 1 avec 1.108 spores de la souche Exy 20 et on incube les cultures pendant 5 jours à 240 sur un agitateur à mouvement rotatif à 180 tours/minute . On combine les précultures ainsi obtenues dans le rapport 1:4, c'est-à- dire que l'on ajoute 40 ml de la préculture de la souche Ech k 420 à 160 ml de la préculture de la souche Exy 20 et on homogénéise. On ensemence un milieu de culture principale 2 avec cette culture ocobinée enajoutant 10 ml de la culture caibinée à50ml de milieu stérile 2. On procède ensuite comme décrit à l'exemple 1. Après 14 jours, 1 litre de culture contient 950 mg d'ergotoxines avec des quantités égales, à - 5% près, d'ergocristine, d'ergocornine et d'ergokryptine, comprenant leurs isomères ergocristinine, ergocorninine et egokryptinine. On peut extraire ces alcaloldes du bouillon de culture selon les méthodes habituelles, par exemple au moyen de solvants organiques. On peut aussi séparer le mycélium contenant la majeure partie des alcaloldes avant l'extraction, par filtration ou centrifugation. Exemple 3 A partir de cultures sur milieu gélosé incliné des souches Ech k 420 et Exy 20, on prépare des suspensions de conidies dans de l'eau distillée, de manière qu'un ml de suspension contienne 9.107 conidies de la souche Ech k 420 et 2,7.108 conidies de la souche Exy 20. Avec cette combinaison de spores on prépare, dans des tubes à essais, des cultures sur un milieu gélosé incliné 3. Après 14 à 18 jours, de nombreuses conidies se sont formées dans ces cultures; cellesci peuvent être conservées par surgélation à -400, ou par lyophilisation. On utilise les conidies de 10 de ces cultures oombineesenmilieu gélosé incliné pour ensemencer un fermenteur contenant 10 litres du milieu 1.Après une durée d'incubation de 60 heures à 250, à un taux d'aération de 0,6 et à une vitesse d'agitation de 200 tours/minute , on obtient une culture bien homogène que l'on introduit dans un fermenteur contenant 100 litres de milieu stérile 1. Après avoir incubé pendant 120 heures sous les mêmes conditions que précédemment, on obtient une préculture secondaire grumeleuse. Avec la préculture secondaire ainsi obtenue, on ensemence un fermenteur contenant 500 litres de milieu stérile 2. On incube pendant 18 jours à 240, à un taux d'aération initial de 0,5 que l'on augmente progressivement à 1,2 et à une vitesse initiale de 75 tours/minute que l'on augmente progressivement à 150 tours/minute. On obtient 75,1 g de mycélium sec par litre de bouillon de culture, ayant une teneur totale en alcaloïdes de 1,037%, calculée sur la base d'un poids moléculaire de 600. Ceci correspond à une quantité totale d'alcaloldes de 779 mg par litre. L'analyse préparative des alcaloldes donne les valeurs suivantes ergocristine + ergocristinine 206 mg ergocornine + ergocorninine 200 mg ergokryptine + ergokryptinine 203 mg autres alcaloïdes 170 mg On sépare le mycélium de laesolution par filtration, puis on l'extrait selon les méthodes connues avec des solvants organiques. REVENDICATIONS 1.- Procédé de fabrication d'uneassoeiationnaturelle à parts égales d'ergocornns,d'ergokryptine et d'ergocristine, comprenant les isomères ergocorninine, ergokryptinine et ergocristinine, par culture saprophytique de souches de 11 ergot de seigle de l'espèce Claviceps purpurea, caractérisé en ce qu'on combine la culture d'une souche produisant l'ergocornine 1'ergokryptine et leurs isomères, avec celle produisant ltergocristine et son isomère, en une phase de fermentation unique. 2.- Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue une fermentatation combinée des deux souches au niveau de la culture sur milieu gélosé dont les spores servent à ensemencer la préculture. 3.- Un procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on ensemence la culture sur milieu gélosé avec une suspension contenant de 1.108 à 5.108 spores/ml, le rapport du nombre de spores de la souche produisant l'ergocristine et son isomère au nombre de spores de la souche produisant l'ergocornine, l'ergokryptine et leurs isomères, étant compris entre 1:2 et 1:20. 4.- Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue une fermentation combinée des deux souches au niveau de la préculture. 5.- Un procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on ensemence la préculture avec une suspension de spores des deux souches contenant de 1.108 à 5.10 spores/litre, le rapport du nombre de spores de la souche produisant l'ergocristine et son isomère au nombre de spores de la souche produisant l'ergocornine, l'ergokryptine et leurs isomères, étant compris entre 1:20 et 1:200. 6.- Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue une fermentation combinée des deux souches au niveau de la culture principale. 7.- Un procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on ensemence la culture principale encombinant une préculture de la souche produisant l'ergocristine et son isomère avec unepréculture de la souche produisant l'ergocornine, l'ergokryptine et leurs isomères dans un rapport en volume compris entre 1:3 et 1:20. 8.- Un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'on utilise, comme souche produisant 1'ergocornine, l'ergokryptine et leurs isomères, la souche Exy 20. 9.- Un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'on utilise, comme souche produisant l'ergocristine et son isomère, la souche Ech k 420. 10.- Une association naturelle à parts égales d'ergocornine, d'ergokryntine et d'ergocristine, comprenant les isomères ergocorninine,ergokrvptinine et ergocristinine, caractérisée en ce qu'elle a été fabriquée par culture saprophytique de souches de l'ergot de seigle de l'espèce Claviceps purpurea, selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 9.