Brevet FR2306448A1 — publié le 19761029

La présente invention concerne le titrage radioactif de foliates dans des liquides et des tissus corporels par exemple dans le sérum. lies méthodes de titrage des foliates du type général auquel ltinvention stadresse sont conçues pour déterminer la teneur, dans le sérum ou autre liquide à titrer, en acide folique et en ses métabolites qui existent normalement et qui, en fait, coexistent dans des sytèmes biologiques, en particulier dans ltor- ganisme humain.L'organisme est alimenté en foliates par la nourriture absorbée et par sa propre flore bactérienne normale, et les flfoliates?? sont sensiblement en totalité sous la forme diacide folique, également appelé acide ptéroylglutamique (PGA > . Toutefois, les formes biologiquement actives contenues dans le sérum, les érythrocytes, etc., consistent en divers métabolites, particulièrement l'acide 5-méthyltétrahydrofolique. Un résumé intéressant en est donné dans l'ouvrage intitulé "The Red Gell de John W. Harris, Harvard University Press 1965, pages 186-191, que l2on pourra consulter. L'acide folique et ses divers métabolites sont désignés dans la pratique et dans le présent mémoire par le terme collectif foliates. Un dosage rapide et précis des foliates dans les liquides corporels tels que le sérum serait très avantageux, mais les méthodes disponibles laissent considérablement à désirer. L'une de ces méthodes implique la culture dtune bactérie particulière, c'est-à-dire un procédé qui ne convient pas très bien pour des titrages rapides. Une autre méthode plus récente implique l'utilisation d'acide ptéroylglutamique tritié dans un titrage radioactif basé sur la liaison en compétition avec une protéine. Cette méthode requiert ltutilisation d'un scintillomètre pour déterminer les taux de tritium et, en outre, elle est sujette à la même imprécision que la plupart des modes opératoires qui utilisent l'acide PGA comme coordinat, du fait que les métabolites de l'acide folique qui constituent la cible du titrage peuvent ou non avoir des affinités comparables de liaison avec le PGA tritié. On connatt dans leur principe des titrages radioactifs dans lesquels l'élément de marquage est l'iode 125I, crest-à-dire l'iode radioactif, et ces titrages offrent l'avan tage général de ne pas nécessiter l'utilisation d'un scintio- mètre, mais simplement dtun détecteur de rayons gamma. Toutefois, en ce qui concerne l'application de cet indicateur radioactif à des titrages de foliates, la difficulté rencontrée jusqu'à présent et qui est résolue par la présente invention est que l'iodation du PGA modifie la molécule de telle manière quelle n'est plus reconnue comme un foliate par la protéine de liaison, et le titrage radioactif se traduit par un échec. Conformément à l'invention, le tyramide de l'acide folique est préparé par condensation de tyramine avec l'acide folique. lie produit de condensation est ensuite marqué à 12 iode radioactif et il est ainsi formé un dérivé marqué de l'acide folique qui a les mêmes caractéristiques de liaison vis-à-vis de la protéine du lait que l'acide folique lui-même, et, en fait, les mêmes caractéristiques de liaison que les métabolites de l'acide folique mentionnés ci-dessus, à condition qu'un pH convenable ait été choisi pour la liaison. On présume que l'iode radioactif s'attache au groupe phényle du radical tyramine du dérivé nouveau d'acide folique qui vient d'être décrit, sous la forme du mono-iodure ou du di-iodure ou d2un mélange des deux, selon le: degré d'iodation. Conformément à ltinvention, on prépare le nouveau tyramide d'acide folique, de préférence par combinaison de la tyramine avec acide PGA en utilisant comme agent de couplage un carbodiimide convenable. Il est particulièrement avantageux d'utiliser le chlorhydrate du 1-éthyl-3-(diméthylaminopropyl)- carbodiimide. On peut utiliser d'autres carbodiimides, comme l'en- seignent par exemple les ouvrages intitulés ??Methods in Immunology and Immunochemistry1,, de C.A. Williams et Collaborateurs, Editeurs, New York 1967, volume I, pages 150-167 et "Advances in Protein Chemistry" 12, pages 488-490 (1957), que l'on pourra consulter. Il est pratique de dissoudre 140 mg de PGA, 61 mg de chlorhydrate de tyramine et 79 mg du carbodiimide qui vient dtttre mentionné, dans un volume minimal de diméthylformamide anhydre. On agite cette solution pendant 20 heures à la température ambiante, puis on la verse dans de l'eau distillée. lie précipité floculant de tyramide d'acide folique est recueilli par centrifugation et lavé avec un mélange de deux parties d'eau distillée, deux parties d'éthanol et une partie d'éther. Le cas échéant, le produit peut dtre purifié par les opérations classiques de chromatographie, comme mentionné dans le paragraphe qui suit. Le 125iodure de tyramide d'acide folique peut ensuite être préparé en mélangeant les ingrédients suivants, dans l'ordre indiqué, en une période totale n'excédant pas 30 secondes : 20 microlitres d'une solution de 5 microgrammes de tyramide d'acide folique dans 5 ml de diméthylformamide ; un millicurie de 25iodure de sodium, 10 pl d'une solution de 50 mg de chloramine-T dans 10 ml de solution tampon au phosphate de sdrensen 0,2 M (pH 7,4) ; 10 Fl d'une solution de 120 mg de métabisulfite de sodium dans 10 ml de solution tampon au phosphate de Sgrensen 0,05 M (pH 7,4) ; et 10 pl d'une solution de 200 mg d'iodure de potassium dans 10 ml de la même solution tampon. La préparation peut autre purifiée le cas échéant par chromatographie, de la manière usuelle en utilisant du dextrane réticulé ("Sephadex G-25) comme garniture de la colonne. Voir, par exemple "Advances in Protein Chemistry", 17, 209-226, "Cross Linked Dextrans as Molecular Sieves" (1962). Be produit marqué à l'iode radioactif que l'on obtient peut recevoir différents noms. On peut l'appeler par exemple Tyramide acide folique 125iodé Mono- 25ioSure de tyramide d'acide folique Di-125iodure de tyramide d'acide folique Be degré dtiodation n'est naturellement pas déterminant, attendu que le produit est utilisé en fonction de sa radioactivité, exprimée en microcuries par unité de poids. Lorsqu'on désire effectuer la purification chromatographique du tyramide et du tyramide iodé, on opère selon des techniques usuelles bien connues. 'les composés peuvent être commodément dissous dans un mélange de volumes égaux de C2H5SH 0,2 M et de tampon au phosphate de S#rensen 0,02 M (pH 7,4) et élués avec la même solution. La fraction de protéine du lait que lton utilise pour fixer les foliates peut consister en du lait entier ou en du lait écrémé, attendu que ces formes de lait contiennent naturellement la fraction protéinique qui fixe les foliates. A titre de variante, la fraction de b8ta-lactoglobuline qui est en général considérée comme étant le liant des foliates contenus dans le lait ou comme étant associée avec ce liant, peut être isolée à tout degré désiré par des opérations connues. Des procédés sont décrits, par exemple, dans le chapitre intitulé "Milk Proteins", pages 201-228 de l'ouvrage "Advances in Protein Chemistrytt 5 (1949), que l'on pourra consulter. Le mode opératoire impliqué dans l'exécution du titrage radioactif des foliates peut suivre les grandes lignes des titrages décrits dans la littérature, selon un protocole bien connu des spécialistes en ce domaine. Toutefois, il peut être utile de citer l'article de Waxman et Collaborateurs intitulé "Blood", 42, pages 281-290 ; et les articles de revues de Skelley et Collaborateurs, "Radioimmunoassay"; Clinical Chemistry 19, pages 146-186 (1973) ; et Hawker, Analytical Chemistry 45, pages 878A-890A (1973), que l'on pourra consulter. Néanmoins, afin de donner un exemple pratique complet, on indique ciprès un protocole détaillé de mise en oeuvre du titrage radioactif utilisant les particularités de la présente invention. On prépare une série de solutions comme indiqué ci-après 1. Tampon : 150 mg de gélatine, 750 mg de trométhamine, 100 mg d'azoture de sodium et 150 mg d'acide ascorbique sont dissous avec 150 ml dteau distillée et le pH de la solution est ajusté à 9,3. 2. Etalon : PGA, 3 nanogrammes par millilitre dans le tampon au phosphate 0,2 M de S/rensen. de pH égal à 7,4. 3. Foliote radioactif : 1,2 microcurie du tyramide d'acide folique 125iodé décrit ci-dessus, dans 2,5 ml de diméthylformamide aqueux à 10 %, avec 0,1 ffi de 1 ,4-dimercapto -2,3-dihy- droxybutane. 4. Liant du foliate : 20 mg de beta-lactoglobuline (de boeuf dans cet exemple) et 100 mg de gélatine dans 100 ml d'eau. 5. Charbon adsorbant : 1,5 g de charbon de bois activé ("NORIT-A") et 38 mg de dextrane hydrolysé de poids moléculaire égal à 80 000, plus 100 mg d'azoture de sodium dans 150 ml d'eau distillée. Le mode opératoire est le suivant 1. On introduit à la pipette dans 9 tubes 500 Rl de tampon (réactif N 1). On ajoute les quantités suivantes d'étalon (réactif N 2 : 0, 0, 5, 10, 20, 30 et 50 l correspondant à 0, 0, 1,5, 3,0, 6,0, 9,0 et 15,0 ng/ml, comme valeur finale. On introduit à la pipette 500 l de tampon (réactif N 1) dans deux autres tubes, sans ajouter d'étalon ; on peut ainsi construire la courbe d'étalonnage "témoin sans liant (TSL). 2. On introduit à la pipette 500 l de tampon (réactif N 1) dans trois tubes à essai pour chaque échantillon de sérum. 5. On ajoute 10 pl de sérum à chaque tube (le troi sième tube ne reçoit pas de liant et constitue ainsi le tube "TSL"). 4. On ajoute 10 l d'acide folique marque à l'iode 125I (réactif N 3) à tous les tubes et on agite modérément. 5. On ajoute 50 l de liant des foliates (réactif NO 4) à tous les tubes, excepté ceux qui sont marqués "TSL" et on agite modérément. 6. On fait incuber à la température ambiante pendant 45 minutes. 7. On ajoute 500 l de suspension de charbon (réactif N 5) tout en agitant à l'agitateur magnétique. 8. On laisse reposer pendant 5 minutes. On centrifuge à 3500 tr/mn pendant cinq minutes. 9. On décante la liqueur surnageante dans un autre tube propre. 10. On effectue un comptage sur les deux tubes pendant une minute pour chacun d'eux. Calculs 1. On calcule le pourcentage lié CPM* du liquide Pourcentage lié = CPM du charbon + CPM du liquide CPM du charbon + CPM du liquide CPM = chocs par minute 2. On trace la variation du pourcentage lié en fonction du nombre de nanogrammes par millilitre pour les étalons et on tire de cette courbe les valeurs inconnues. 3. On effectue éventuellement des corrections pour tenir compte du 'tTSL" (témoin sans liant). Il ressort de ce qui précède qu'on utilise acide folique proprement dit, c'est-à-dire PGA, comme étalon pour établir la courbe d'étalonnage. Cela semble dtre la meilleure façon d'opérer. Mais une variante pratique consiste à utiliser comme étalon l'acide 5-méthyl-tétrahydrofolique, à condition qu'il soit protégé par un agent réducteur convenable, le 1 ,4-dimercapto- 2,3-dihydroxybutane étant remarquablement efficace à cet effet. Ce composé existe sous trois formes stéréoisomères (tout comme dans le cas de l'acide tartrique), toutes ces formes étant efficaces. Deux des isomères, que l'on peut appeler dithiothréitol et dithioérythritol, sont disponibles dans le commerce, le premier étant également appelé réactif de Cleland. Cet agent réducteur est utilisé à une concentration qui peut s'abaisser à 0,01 % sur la base de l'acide 5-méthyltétrahydrofolique ; une quantité allant jusqu'à environ 0,2 ffi est tout aussi efficace, mais il est superflu de dépasser cette limite.Lorsqu'on utilise cet autre étalon possible, le "réactif étalon NO 2" devient l'acide 5-méthyltétrahydrofolique que l'on utilise à raison de 3 nanogrammes par millilitre d'eau avec, en solution, 0,) à 6 (à titre d'exemple non limitatif) picogrammes de 1,4-dimercapto-2,3-dihydroxybutane. On peut rappeler que l'acide 5-méthyl-tétrahydrofolique peut aussi être nommé 5-méthyltétrahydro-PGA. Dans l'exemple décrit ci-dessus, la protéine de lait que l'on utilise est une protéine de lait de vache, pour laquelle le pH optimal pour la mme fixation des foliates est d'environ 9,2 à environ 9,4 et de préférence d'environ 9,3. Pour la protéine de lait d'une autre origine, la gamme optimale et le pH préféré varient, comme indiqué ci-après Type Gamme optimale approximative pH approximatif préféré Caprin 9,3-9,5 9,4 Humain 9,4-9,6 9,5 Lorsqu'on utilise uneprotéine de fixation dérivée de lait de chèvre ou de lait de femme, le pH du tampon (réactif NO 1) est ajusté à environ 9,4 ou environ 9,5,suivant le cas et conformément au tableau donné ci-dessus. Le liant des foliates que constitue la protéine du lait peut dtre d'origines diverses, comme on lta déjà mentionné. C,1 peut utiliser la bêta-lacto-globuline du lait de vache disponible dans le commerce Fn général, les autres constituants du lait ne sont pas gênants, en sorte qu'on peut avantageusement utiliser du lait en poudre déshydraté par pulvérisation, que l'on trouve dans le commerce sous forme de lait de vache ou de lait de chèvre. Le terme "Trométhamine" désignant l'un des ingrédients du tampon (réactif NO 1) est le terme que l'on préfère utiliser pour désigner le tris(hydroxyméthyl)-aminométhane (voir "The Merck Index, 8ème édition, page 1083). Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre indicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées, sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Méthode de titrage radioactif des foliates, dans laquelle on détermine la fixation sur une fraction de protéine du lait fixant les foliates par compétition entre le ou les foliates à titrer et un dérivé d'acide folique marqué par un isotope radioactif, méthode caractérisée par le fait qu'elle consiste à utiliser comme dérivé marqué le tyramide d'acide folique 125iodé. 2. Méthode suivant la revendication 1, caractérisée par le fait que la fraction de protéine du lait provient du lait de vache,et que la fixation est effectuée à un pH de préférence compris entre environ 9,2 et environ 9,4 et notamment égal à 9,3 environ. 3. Méthode suivant la revendication 1, caractérisée par le fait que la fraction de protéine du lait provient du lait de chèvre et que la fixation est -effectuée à un pli- de préférence compris entre environ 9,3 et environ 9,5 et notamment égal à 9,4 environ. 4. Méthode suivant la revendication 1, caractérisée par le fait que la fraction de protéine du lait provient du lait de femme et que la fixation est effectuée à un pH compris entre environ:9,4 et environ 9,6 et notamment égal à 9,5. 5. le tyramide de l'acide folique, sa forme marquée à l'iode 125 son mono-125iodure ou son I, di-125iodure. 6. Méthode suivant la revendication 1, caractérisée par le fait quelle consiste à tracer une courbe d'étalonnage en utilisant l'acide ptéroylglutamique comme foliate étalon. 7. Méthode suivant la revendication 1, caractérisée par le fait quelle consiste à tracer une courbe d'étalonnage en utilisant l'acide 5-méthyl-tétrahydroptéroylglutamique avec, comme foliate étalon, une quantité d'environ 0,01 à environ 0,2 % de 1 ,4-dimercapto-2,3dihydroxybutane 8. Procédé de préparation d'un dérivé marqué à l'125Iode du tyramide de l'acide folique, caractérisé par la condensation de la tyramine avec l'acide folique suivie du marquage du produit de condensation par de l'1251ode radioactif. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la réaction de condensation de la tyramine avec l'acide fo lique s'effectue en présence d'un agent de couplage et notamment d'un carbodiimide. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce que le marquage du produit de condensation par de l'125Iode radioactif s'effectue à l'aide de l'125Iodure d'un métal alcalin et notamment le 125Iodure de sodium.