Brevet FR2307872A1 — publié le 19761112

L'invention a pour objet un procédé o d'obtention milieu propre à la production de toxine, ainsi qu'un protéolysat pouvant servir de milieu propre à la production de toxine. La protéolyse à l'aide de la papaine est connue : on l'utilise de façon classique dans la fabrication des peptones ou autres extraits, dans les limites du degré de son-titre pro téolytique (ex : une papaine, de titre- 500 selon le Codex Fran çais, est utilisée dans la proportion 1/500 environ par rapport au poids du substrat protélque à hydrolyser), au pH et à la température optimale d'activité qui sont respectivement pH 6,5 à 7,0 et 650 C pour une durée de digestion totale variant de 6 à 14 heures selon les substrats : les protéolysats obtenus par le pro cédé classique avec les mimes matières premières que celles qututilisent l'invention ne possèdent aucune activité taxinogéné tique. Le but de l'invention est de proposer un nouveau milieu propre à la production de toxine et son procédé dtobtention Ce but est atteint, de façon surprenante, par les moyens de l'in vention qui diffèrent substantiellement des procédés de protéolyse à la papaïne rappelés ci-dessus. Selon l'invention, ce but est atteint par le fait qu'on procede à une protéolyse ménagée de muscle de squelette de che val à une température de l'ordre de 48 à 500C,'à l'aide de la papaïne utilisée à un taux au moins sensiblement double du taux qui serait nécessaire pour assurer à 650C la digestion totale des protéines présentes, par introductions intermittentes de la papaine en quantités ajustées pour régler son activité protéoly tique en fonction de la variation controlée du taux d'acides aminés libérés dans le substrat, de manière à maintenir une hydro lyse constante et sensiblement linéaire, et on arrQtela protéo lyse lorsque le taux d'acides aminés libérés atteint environ 3 %. Il est avantageux oue les introductions intermittentes de papaine soient périodiques et que le taux de papaine introduite au total soit de l'ordre de cinq fois le-taux qui serait néces-sai re pour assurer à 650C la-digestion totale des protéines. Conformément à l'invention, la température du milieu de réaction est maintenue à -OC près, et le pHà + 0,1 près entre 6,8 et 7,0 avant la première introduction et après chaque introduction de papaine. Le procédé selon l'invention diffère donc substantiellement des leçons connues, par le fait qu'il utilise la papaine à haute dose et à une température relativement basse. D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description qui sera donnée ci-après, uniquement à titre d'exemple, d'un mode de réalisation de l'inventionSdécrit en regard de la figure unique annexée qui représente la droite théorique et un exemple de courbe pratique de la variation du taux d'acide aminé en fonction du temps pendant la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Dans la suite des opérations qui vont entre décrites, on utilise exclusivement comme matière première du muscle de cheval frais, et soigneusement dégraissé. Le muscle rouge ainsi récolté est finement haché dans un broyeur à couteaux et introduit dans une cuve en acier inoxydable, à double enveloppe permettant un chauffage précis par circulation dieau, contenant de l'eau déminéralisée dans la proportion d'une partie de viande pour quatre parties d'eau. On porte la température du mélange à 50 C, on le maintient continuellement sous agitation à l'aide d'un agitateur à hélice et on ajuste son pH à 7,0 à 11 aide d'une solution de soude diluée au cinquième On prépare, par ailleurs, une solution de papaine dosée à 54 grammes de papaine purifiée titrant 1 000 Unités NF XIII et 4,8 grammes de chlorhydrate de cystéine par litre, comme activateur usuel.Pour 100 parties de muscle rouge contenues dans le mélange décrit précédemment, on ajoute, au temps T=O, 0,500 litre de la solution de papaine et on contrôle a) le pH : Il doit rester à 7,0, sinon rectifier avec de la soude diluée. b) la température : elle devra Btre maintenue à 500 + 100 c/ la libération d'acides aminés : elle devra entre contrlée selon la méthode de SORENSEN, après chaque addition d'enzyme protéolytique L'addition de solution de pepsine est faite ensuite toutes les demi-heures à raison de - 1 litre au temps T + 30 minutes - 1 litre au temps T + 60 minutes - t litre au temps T + 90 minutes - 1,5 litre au temps T + 120 minutes - 2 litres au temps T + 150 minutes La quantité d'acides aminés libérés devra Qtre comprise à ce Moment- là entre 1,20 gramme et 1,30 gramme par litre. Sur la figure nnexée on a représenté en abscisse le temps repéré par les introductions de papaine de 30 en 3U minutes et en ordonnée le nombre de ml de réactif Na OH à N/10 de dosage de l1azo- te aminé, 1 ml Na OH à N/10, correspondant à 0,24 d'azote aminé en pourcentage du poids sec (formoltitration de Sorensen) dans les conditions expérimentales suivantes :-pH = 6,9 + ,1 et température = 50 + 1 C. La variation du taux d'acides aminés en fonction du temps devra obligatoirement donner une droite (ou un tracé très proche de la droite théorique) présentant une forme bien définie. La droite en trait interrompu est ladite droite théorique de variation du taux d'azote aminé et la courbe en trait continu donne la courbe pratique dans les conditions précédentes. Au temps T = 180 minutes, on ajuste alors le pH du mélange à 5,0 à l'aide de l'acide chlorhydrique pur et l'on porte à ébullition0 On arrête l'agitation et l'on filtre sur toiles le liquide encore chaud. On laisse repose 24 heures à + 40C, on filtre sur plaques clarifiantes, on concentre et on filtre sur plaques stérilisantes, puis on atomise dans une tour d'atomisation. Sur la poudre ainsi obtenue on procède au test suivant : on fait dissoudre 4 grammes de protéolysat dans 100 ml d'eau distillée. On ajuste le pH à4,1 avec de l'acide acétique pur. Puis on ramène le pH à 7,8 avec de la soude, on laisse précipiter et on filtre. On dose sur le filtrat l'azote total selon la méthode de KJELDAHL et l'azote aminé selon la méthode de SGRENSEN. Le rapport d'azote aminé azote total doit etre 1/5. Par ailleurs le protéolysat doit présenter les caractères suivants CARACTERES PHYSIQUES - poudre blanc cassé à crème, fine et légère; - odeur très légère de bouillon de viande - entièrement soluble dans l'eau - Le pH de la colution aqueuse est de 5,0 + 0,1 - ao-s acidification par l'acide acétique et alcalinisa ti.cn (pH 7,8) 12 la soude, la solution filtrée ne doit présenter aucun truble à l'autoclave à 120 C pendant 30 minutes CARACTERES CHIMIQUES :: - ne doit pas contenir de protéines non digérées (recher che selon la méthode de l'USP XVIII), ni d'indole, ni sucres réducteurs, ni hydrates de carbone fermentiscibles - doit contenir des protéoses précipitables par le sulfate de zinc - azote total : 14,0 + 1,5 sur sec - azote aminé : 2,7 + 0,3 sur sec - chlorures (en ClNa) : 3,0 à 4, po 100 - production d'indole (présence de tryptophane): positive. - production d'hydrogène sulfuré (présence d'acides aminés soufrés) : positive - fer : inférieur à 10 ppm CARACTERES MICROBIOLOGIQUES : Le pouvoir toxinogénétique de ce protéolysat au taux d'utilisation de 3 à 4 p. 100, est de 200 + 10 % Lf. Ce pouvoir toxinogénétique est élevé, particulièrement sur le bacille diph stérique. Son activité toxinogénétique pourra éventuellement trouver des applications avec d'autres germes que le bacille diphtérique, notamment aérobies. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'un milieu propre à la production de toxine, caractérisé en ce qu'on procède à une protéolyse ménagée de muscle de squelette de cheval à une température de l'ordre de 480 à 500C, à l'aide de la papaine utilisée à un taux au moins sensiblement double du taux qui serait nécessaire pour assurer à 650C la digestion totale des protéines présentes, par introductions intermittentes de la papaïne en quantités aJustées pour régler son activité protéolytique en fonction de la variation contrôlée du taux d'acides aminés libérés dans le substrat, de manière à maintenir une hydrolyse constante et sensiblement linéaire et on arrête la protéolyse lorsque le taux d'acides aminés libérés atteint environ 3%. 2. Procédé selon la revendication l, caractérisé en ce que les introductions intermittentes de papaine sont périodiques. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications l et 2, caractérisé en ce que le taux de papaine introduite au total est de l'ordre de cinq fois le taux qui serait nécessaire pour assurer à 650C la digestion totale des protéines présentes. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications l à 3, caractérisé en ce que la température du milieu de réaction est maintenue à + 100 près. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le pH est rajusté à + 0,1 près entre 6,8 et 7,0 avant la première introduction et apres chaque introduction de papaïne. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le protéolysat obtenu est précipité, puis atomisé en poudre. 7. Protéolysat, caractérisé en ce qu'il est obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications i à 6. 8. Milieu propre à la production de toxine, caractérisé en ce qutil est obtenu à partir du protéolysat selon la revendication 7.