Brevet FR2287912A1 — publié le 19760514

L'invention est relative à de nouveaux dérivés de polysaccharide portant des groupements aminés, à un procédé de préparation de ces nouveaux dérivés, à leur application en tant qu'agents adjuvants de l'immunité non spécifique, notamment pour la constitution de vaccins. Le dérivé selon l'invention est constitué par un polysaccharide du type de celui qui est connu sous la désignation commerciale "SEPHAROSE" portant des groupes -NH-(CH2)n-COOH, dans lesquels "n" est un nombre entier égal à 1 , 2 ou 3. Le dérivé selon l'invention-est en particulier formé d'un polysaccharide comportant des groupes B-D-galactopyrannose, et des groupes 3,6-anhydro-a-L-galactopyrannose, les groupes ss-D- galactopyrannose étant, dans les paires correspondantes, liés entre eux en et les groupes 3,6-anhydro-a-L-galactopyran- nose étant, également dans les paires correspondantes, liés entre eux en les channes de ce polysaccharide portant des groupes -NH-(CH)n-COOH, dans lesquels "n" est un nombre égal à 1, 2 ou 3. On notera que la structure des polysaccharides type SE PHAROSE a été décrite par AHRGREN, L., KAGEDAL, L., at Ackers tram1 S., Acta-Chem. Scand., 26, 285-288 (1972). Avantageusement, les chaines du susdit polysaccharide sont réticulées entre elles par des liaisons transversales, notamment par des liaisons imidocarbonate En ce qui concerne particulièrement les groupes -NH (CH)n-COOH, "n" est de préférence égal à 1, le groupement acide aminé correspondant étant alors dérivé de la glycine. Les dérivés selon l'invention présentent une activité adjuvante importante, comme il ressort des tests pharmacologiques qui seront décrits plus loin. Cette activité reste importante dans les dérivés polysaccharide-acide aminé du genre défini cidessus, dans lesquels "n" est égal à 2 ou 3. On observe que pour des valeurs de "n" supérieures à 3, l'activité adjuvante décroit considérablement, voire même disparaît, peut-être en raison de l'encombrement stérique qui rend moins accessible les charges négatives apportées par les groupes carboxyle des acides aminés correspondants. L'invention concerne également un procédé de préparation des nouveaux dérivés selon l'invention, procédé qui est caracté risé en ce que l'on fait réagir le polysaccharide type SEPHAROSE ou tel que chimiquement défini ci-dessus, avec un halogénure, notamment le bromure, de cyanogène, le polysaccharide activé obtenu étant ensuite mis à réagir avec l'acide aminé H2N-(CH2)n-COOH correspondant. Avantageusement, la première étape de ce procédé est réalisée à pH alcalin sensiblement constant, de préférence de l'ordre de 11, et à température suffisamment basse, par exemple à 40C, pour éviter la décomposition du bromure de cyanogène. La deuxième étape (réaction du polysaccharide activé avec l'amino-acide) est également de préférence réalisée en milieu alcalin, par exemple à pH 10, également à une température suffisamment basse pour éviter la décomposition du polysaccharide activé, avant la réaction de celui-ci avec l'acide aminé. Dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon l'invention, le polysaccharide et l'halogénure, plus particulièrement le bromure, de cyanogène, sont maintenus en contact durant la première étape susdite, pour obtenir la création d'un nombre aussi grand que possible de liaisons imidocarbonate réticulant les chaînes du polysaccharide entre elles (par l'intermédiaire de groupes hydroxyles portés par les chaînes voisines). On décrit dans ce qui suit un exémple de préparation d'une SEPHAROSE portant des groupements glycine, étant entendu que le procédé peut être mis en oeuvre d'une manière sensiblement analogue en remplaçant la glycine par les acides aminés H2N-(CH2),- COOH, dans lesquels "n" serait égal à 2 ou 3. La SEPHAROSE, par exemple celle mise dans le commerce sous la désignation "SEPHAROSE 4B", est mise en suspension dans de l'eau. La SEPHAROSE ainsi mise en suspension est essorée. La SEPHAROSE est alors remise en suspension dans sensiblement trois fois son volume d'eau. On introduit dans la suspension ainsi formée du bromure de cyanogène, notamment à raison de 1 g pour 50 3 cm3 de suspension. On amène le pH à 11 avec de la soude 4N, ce pH étant maintenu à cette valeur par addition continue de soude pendant quinze minutes. L'ensemble de ces opérations est effectué à une température de l'ordre de 4"C. On filtre ensuite la suspension sur verre fritté, et on lave abondamment le résidu solide à l'eau glacée, puis avec un tampon à pH 10 ou avec du bicarbonate de sodium. Le produit obtenu est constitué par la SEPHAROSE activée. On. ajoute alors à celle-ci unè solution de l'amino-acide dans le même tampon (ou dans une solution de bicarbonate de sodium) et l'on maintient l'ensemble à la chambre froide, notamment à 4"C, sous agitation pendant vingt-quatre heures. On essore sur verre fritté le produit obtenu, on le lave avec le tampon à pH 10, puis à l'eau, et on lyophilise le produit obtenez Le dérivé de SEPHAROSE obtenu contient 5,8 % d'azote, ce qui correspond à une molécule de glycine pour trois sucres. L'activité adjuvante des dérivés selon l'invention a été mise en évidence sur les souris selon la technique décrite par JEUNE, N.K., et NORDIN, A.A., Science, 140, 405 (1960), notamment dans les conditions qui peuvent être résumées comme suit. Les souris, pesant chacune environ 20 g, sont réparties par groupes de six et reçoivent toutes au jour 0 (J = 0) 109 glotules rouges de mouton par injection intrapéritonéale. Les six souris du premier groupe ont reçu 4 jours auparavant (J-4) 1 mg de SEPHAROSE-glycine par voie intrapéritonéale. Les souris d'un second grnupe reçoivent la même dose de SEPHAROSE-glïcine 1 jour après l'injection des globules rouges de mouton (J + 1). Trois semaines plus tard, les souris sont tuées. On prélève et l'on broie les rates, et on dilue les rates broyées dans un volume de liquide physiologique. Une partie aliquote des rates de chacune des souris est coulée sur des tapis de gélose contenant des hématies de mouton dans des bnîtes de Pétri.On ajoute du complément et l'on incube les cultures à 37"C et pendant vingt-quatre heures. On compte alors le nombre de plages (ou plaques) formées, comme suite de l'hémolyse des hématies. Les comptages fournissent une indication du degré d'activité adjuvante des substances testées. Des groupes de souris témoins ont été traitées dans les mêmes conditions. D'autres groupes ont reçu de la SEPHAROSE activée, au lieu de la SEPHAROSE-glycine. Les résultats sont rapportés dans le tableau ci-dessous dans lequel sont indiqués la teneur en % d'azote des produits testés (N %), le nombre moyen de plages par rate (avec indication des valeurs extrêmes), d'une part, avant l'injection de l'antigène (au jour J - 4) et, d'autre part, après l'injection de l'antigène (au jour J + 1). Les résultats sont exprimés en valeurs statistiques selon le test de Student. Les signes t S signifient que les résultats sont significatifs et les signes NS signifient qu'ils ne sont pas significatifs. TABLEAU N % Témoins Nombre de plages formées (J = O) avant injection après injectio de l'antigène de l'antigène (J- 4) (J + 1) SEPHAROSE 4B 0,00 (50 - 24)1ou (66 in28) 103 NS (51-8)10 NS N-(SEPHAROSE 4 B)-glycine 5,83 (73-30)10 (91+ 30) 103 NS (176+68)10 tS (P = 0,02) Les résultats montrent que la SEPHAROSE seule est totalement dépourvue d'activité adjuvante; au contraire, la SEPHAROSEglycine présente une activité adjuvante hautement significative (P = 0,02). L'action adjuvante des dérivés selon l'invention, couplée aux avantages exposés dans ce qui suit, font desdits dérivés des agents adjuvants particulièrement intéressants, applicables notamment à la constitution de vaccins dans lesquels ils viennent renforcer 1'action immunitaire des antigènes vaccinants, notamment de ceux qui, pris seuls, ne possèdent qu'une capacité immunogène faible. Ils peuvent également être injectés séparément, notamment après l'injection de l'antigène vaccinant lui-même. En effet, les dérivés selon l'invention sont suffisamment hydrodispersibles pour être utilisables dans des solutés injectables. Ils sont stérilisables à 1200C. Ils sont extrêmement bon marché. Enfin, ils sont dépourvus de toute toxicité : sous l'action des peptidases présentes dans l'organisme, ils sont décomposés dans les sucres et les acides aminés correspondants dont l'inocuité a été reconnue. L'invention concerne donc tout particulièrement des compositions injectables de vaccins contenant en association avec un antigène vaccinant, l'agent adjuvant tel qu'il a été défini plus haut. A titre indicatif et non limitatif, l'agent adjuvant selon l'invention peut être dosé à raison de 50 à 5000 mg, de préférence 500 à 1000 mg par dose unitaire de vaccin. L'agent adjuvant selon l'invention peut être utilisé pour la constitution des vaccins couramment utilisés pour la prévention des maladies bactériennes et virales. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés; elle en embrasse au contraire toutes les variantes. REVENDICATIONS 1. Produit formé d'un polysaccharide du type SEPHAROSE portant des groupes -NH- (CH2)nCOOH, dans lesquels "n" est un nombre entier égal à 1 ,2 ou 3. 2. Produit formé d'un polysaccharide du type SEPHAROSE portant des groupes ?-D-galactopyrannose, et des groupes 3,6-anhydro a-L-galactopyrannose, les groupes B-D-galactopyrannose étant, dans les paires correspondantes, liés entre eux en (1 A3) et les groupes 3,6-anhydro-a-L-galactopyrannose étant, également dans les paires correspondantes, liés entre eux en (1- b4), les chaînes de ce polysaccharide portant des groupes -NH-(CH2)n-COOH, dans lesquels "n" est un nombre égal à 1, 2 ou 3. 3. Produit selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les groupes -NH-(CH2)n-COOH sont dérivés de la glycine. 4. Produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les chaines du susdit polysaccharide sont réticulées entre elles par des liaisons transversales. 5. Produit selon la revendication 4, caractérisé en ce que les susdites chaînes sont réticulées entre elles par des liaisons imidocarbonate 6. Procédé de préparation du produit selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'on fait réagir le susdit polysaccharide avec un halogénure, notamment le bromure de cyanogène, puis le polysaccharide activé obtenu avec un acide aminé de formule HN-(CH2)n-COOH dans laquelle "n" est un nombre entier égal à 1 ,2 ou 3. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le susdit acide aminé est la glycine. 8. Application du produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 en tant qu'adjuvant à la constitution de vaccins. 9. Composition de vaccin injectable, caractérisée en ce qu' elle contient, en association avec un antigène vaccinant, un agent adjuvant constitué par le produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 10. Composition de vaccin selon la revendication 9, constituée par une solution ou une suspension de l'antigène vaccinant au sein d'un soluté physiologique, caractérisée en ce que l'agent adjuvant est à l'état hydrodispersé au sein du soluté. 11. Composition de vaccin selon l'une quelconque des revendications 9 et 10, caractérisée en ce qu'elle est dosée à raison de 50 à 5000 mg, de préférence de 500 à 1000 mg de l'agent adjuvant, par dose unitaire de vaccin. 12. Composition contenant à titre d'agent adjuvant le produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, à l'état hydrodispersé au sein d'un milieu aqueux, notamment d'un soluté physiologique.