Brevet FR2299343A1 — publié le 19760827

invention concerne un procédé d'immobilisation d'une enzyme, utilisant la réactivité chimique spécifique du groupe N-halogénoamide. Les avantages de l'utilisation d'une enzyme après immobilisatlon sont les suivants. Tout d'abord, il est possible de réutiliser l'enzyme0 Deusièmement, il est possible d'effectuer une réaction enzymatique continue dans une colonne Troi- sièmement, il est possible de régler la réaction avec précision car il est facile de séparer de l'enzyme les produits de réaction0 ire quatrième avantage est que l'on peut éviter divers ennuis techniques dûs à la contamination des produits finals par l'enzyme ou par des impuretés. En outre, la stabilité de l'enzyme est accrue et par conséquent l'enzyme est facile à utiliser.Enfin, il est possible de conduire automatiquement la réaction enzymatique et par conséquent, de réduire le coft de la fabrication0 Ainsi, l'immobilisation d'une enzyme a divers avantages. On a fait jusqu'ici de nombreuses tentatives pour utiliser les enzymes après immobilisation et les procédés dtim- mobilisation peuvent entre classés principalement en procédés d'adsorption, d'inclusion et de liaison chimique. Le procédé d'adsorption consiste à adsorber des enzymes sur la surface d'un solide insoluble et à les immobiliser Son fonctionnement est simple mais ltaptitude- à l'adsorption est si faible que les enzymes adsorbées risquent de se désorber lorsqu'il y a des sels ou des substrats à de fortes concentra tisons. Aussi, le procédé d'adsorption 'est pas satisfaisant quant au but essentiel de l'immobilisation. Autrement dit, le procédé d'adsorption n'est applicable que lorsque des supports ont une affinité spécialement forte pour les molécules d'enzyme0 Actuellement, on utilise comme support la diméthyl-cellulose. Dans le procédé d'inclusion, les enzymes sont contenus dans des gels polymères. Actuellement, on utilise des gels de copolymères dlacrylamide et de N,N'-méthylène-bis-acrylamideO Etant donné que les enzymes elles-memes ne se lient pas chimiquement aux polymères qui forment les gels, les enzymes risquent de s'écouler si le réseau des gels est trop large. Toutefois, Si l'on adopte un réseau plus petit, la vitesse de la réaction enzymatique devient moindre. Donc, il est important de régler la grandeur du réseau. Dans le procédé de liaison chimique on immobilise des molécules d'enzyme à la surface d'un support par des liaisons chimiques covalentes en utilisant les groupes fonctionnels des molécules d'enzyme0 te degré d'activité des enzymes est légèrement diminué par suite de la réaction chimique concomitante mais leur stabilité est excellente et la perte par entrainement est faible. Donc, le procédé de liaison chimique est le plus efficace pour l'immobilisation des enzymes. Toutefois, il reste de nombreux problèmes à résoudre. Il faut des étapes compliquées et des réactifs coûteux pour lier chimiquement les molécules d'enzyme à la surface d'un support et il faut souvent aussi des conditions de réaction strictes.Du point de vue des formes de réaction, les procédés actuellement employés peuvent être classés principalement dans les quatre catégories suivantes : À) - procédé de formation de liaisons peptide, B) - procédé d'alcoylation, O)- procédé de copulation diazoRque et D) - procédé de formation de base de Schiff. Comme procédé A, on peut mentionner un procédé qui consiste à convertir le support en azide, en isocyanate, en carbodiimide ou en iminocarbonate, puis à faire réagir le dérivé obtenu sur des groupes amine des enzymes. Coeur procédé B, on peut mentionner un procédé dans lequel on active des groupes hydroxyle de la cellulose en utilisant le chlorure de cyanuryle. Comme procédé D, on peut mentionner un procédé qui consiste à leir un sminoalcoylsilane aux surfaces de granules de verre poreux, puis à former le sel de Schiff en utilisant le glutaraldvhydeO Toutefois, étant donné que la formation du sel de Schiff est une réaction d'équilibre, un inconvénient est que les enzymes se libèrent graduellement comme dans le procédé d'adsorption. Dans les procédés classiques, en tout cas, il faut des étapes compliquées, des réactifs coûteux et des conditions de réaction strictes pour activer le support, tes inventeurs ont étudié un procédé a im!-obilisation d'enzyme qui consiste à traiter l'enzyme par un composé N-halo- génoamide. Il est bien connu qu'un composé N-halogénoamide se forme comme intermédiaire dans la décomposition des amides par réarrangement de Hofmann. Autrement dit, quand on fait réagir une amide sur un ion d'oxyacide hypohalógéné (OX-) en milieu fortement alcalin, il se forme une amine, en passant par une N-halogénoamide, comme l'indique le schéma suivant : En ce qui concerne la décomposition de Hofmann, on a fait de nombreuses recherches sur la relation entre la structure chimique des amides et les rendements d'amines.Toutefois, aucune recherche n'a encore été signalée en ce qui concerne la réactivité chimique d'un composé N-halogénoamide intermédiaire, en solution aqueuse0 Bes inventeurs ont fait des études sur la réaction d'halogénation de diverses amines sur l'azote et ont trouvé qu'un groupe N-halogénoamide a un faible taux de conversion en grouse amine en milieu faiblement alcalin et réagit plutôt sur des groupes d'atomes contenant de lthydrogène actif, par exemple -NE2, -OH, C0NIt2 etc.. en formant respectivement un uréide, un uréthanne et une acylurée. On a trouvé que le groupe N-halogénoamide est spécialement actif sur le groupe amine et très actif meme dans des conditions de réaction modérés, par exemple à un pE de 8 à 9 et à une température de réaction de 30 à 4000. Selon l'invention, pour obtenir une enzyme immobilisée stable, on fait réagir une enzyme sur une substance contenant un groupe N-halogéncamide en solution aqueuse alcaline faible. Comme substance contenant un groupe N-halogénoamide, on utilise dans l1inventin des composés halogénoamides polyfonctionnels hydrosolubles à bas poids moléculaire (appelés ci-après substance A), des composés halogénoamides pölyfonc- tionnels hydrosolubles à poids moléculaire élevé (appelés ciaprès substance B) et des supports solides contenant un groupe N-halogénoamide (appelés ci-après substance C). On prépare respectivement les substances A, B et C par les procédés suivants :: Pr aration de la substance A On prépare la substance A en halogénant sur l'azote des amides polyfonctionnels tels que des amides d'acide polycarboxylique, par exemple l'adipamide et le succinsmide, des polyalcools carbamoylés, des sucres carbamoylés, etc... Comme polyalcool à carbamoyler, on peut utiliser le glycérol, le polyéthylèneglycol, le polypropyleneglycol etc00 Comme sucre à carbamoyler, on peut utiliser le glycose, le fructose, le sucrose, le pentaérythritol, le sorbitol, le mannitol, etc.. On peut conduire la réaction d'halogénation par tout procédé connu0 Par exemple, on prépare le composé N-halogénoami- de en faisant réagir un amide sur un hypohalogénite tel que l'hypochlorite de sodium à une température comprxe ente -10 et 5oC. On peut conduire la réaction de carbamoylation selon tout procédé connu Par exemple, pour préparer les polyalcools ou sucres carbamoylés, on fait réagir des polyalcools ou des sucres sur l'acrylonitrile puis on fait réagir le mélange obtenu sur l'eau oxygénée Préparation de la substance B Pour préparer la substance B utilisée dans l'inventions on carbamoyle des polyalcools ydrosolubles puis on les halogène selon le procédé de la réaction d'halogénation décrit cidessus. Comme polyalcools, on peut utiliser la cellulose, l'amidon, l'agar-agar, l'acide alginique, le "Eonåak", les alcools polyvinyliques etc... En outre, des bomopolymères et polymères greffés d'acrylnmide ou de méthacrylamide ou les copolymères de ceux-ci et d'autres monomères vinyliques copoly me ri sables sont utiles comme composés pouvant être carbamoylés0 - Préparation de la substance C Pour préparer le support solide contenant un groupe halogénoamide, on carbamoyle et on halogène une matière solide appropriée0 On peut utiliser toute matière pouvant être carbamoy- idée, qu'elle soit d'origine naturelle ou synthétique.Par exemple, on peut utiliser la cellulose, des produits de bois tels que la pate de bois etc.., la laine, la soie, le coton, des matières polymères telles que le "selon", l'alcool polyvinylique, une résine échangeuse d'anions faiblement basique telle que le "Dlaion GR-20 (fabriqué par Mitsubishi chemical Industries Ltd.) On peut utiliser la matière solide sous toute forme désirée, par exemple sous forme de poudre, de grains, de fibres, d'étoffe, de menbranes, de papier, de plaques etc..Un support spécialement praféralbe est hydrophile et poreux mais non rigide parce que la réaction enzymatique s'effectue généralement dans une solution aqueuse de l'enzyme et que le support hydrophile ne nuit pas à la diffusion du substrat ni à l'interaction entre le substrat et le support. On peut obtenir une plus grande stabilité de l'enzyme immobilisée avec un support plus hydro- phile. En outre, en utilisant un support poreux, on augmente la surface spécifique du support et la quantité d'enzymes qui peut etre liées En outre, en ce qui concerne la rigidité du support, un support souple comme la cellulose est préférable à un support rigide comme le verre, afin d'éviter la déformation des molécules d'enzyme et aussi d'obtenir une grande stabilité de 1'enzyme. La réaction d'immobilisation des enzymes, avec la substance contenant un groupe N-halogénoamide, s'effectue à une température de -10 à 5O0C, de préférence de 15 à 4O0C et à un pH de 8 à 11, dans une solution aqueuse de l'enzyme. ire groupe N-halogénoamide des substances subig une réaction de réticulation avec le grolle amine de l'enzyme, immobilisant ainsi l'enzyme. Quand on utilise la substance B, le groupe N-halogénoamide réagit sur les groupes amine partiellement formés comme sous-produit par la décomposition de Hofmann et subit une réaction de réticulation entre les molécules, comme indiqué cidessous, ce qui cause une autocondensation et une gélification du composé N-halogénoamide : En même temps, le groupe N-halogénoamide réagit sur un groupe amine d'une enzymes Donc, dans ce cas, l'enzyme est immobilisée physiquement et chimiquement. On peut faire varier la solidité du gel et la grandeur du réseau en réglant la nature de l'halogénoamide polyfonction- nel polymère, sa concentration et la densité des groupes halo génosmide. tes enzymes qui peuvent Etre immobilisees dans le procédé de l'invention comprennent des enzymes purifiées ou brutes, des mélanges d'enzymes et des systèmes enzymatiques présents dans les tissus animaux, végétaux ou microbiens, ou isolés de ceux-ci. On les utilise sous la forme de cellules entières, de particules intracellulaires intactes et d'extraits bruts de ces tissus Par exemple, on peut utiliser des enzymes protéolytiques comme la trypsine, la chypotrypsine et la papafne, des hydrolases comme l'a-amylase, la P-galactosidase, la ribonucléase, la phosphatase alcaline, l'amyloglucosidase et la dextranase, des déshydrogénases comme la créatine-phosphokinase et la pyru vatvkinase, des oxydases comme la glucose-oxydase et des amidases comme l'amidase et les pénicilline-amidasesO La concentration de la solution enzyme utilisée dans le procédé n'est pas limitée mais on utilise de préférence une solution d'enzyme à 0,01 à 10%. Quand on immobilise une enzyme par le procédé de l'invention, la perte d'enzyme est très faible car on conduit la réaction d'immobilisation dans une solution aqueuse de l'enzyme, dans des conditions très modérées. L'enzyme immobilisée obtenue selon le procédé de l'invention est très stable au lavage. Par exemple, l'a-amyla- se immobilisée par liaison covalente avec la pâte de bois modifiée que l'on obtient par carbamoyléthylation de la pâte puis, par chloration sur l'azote du produit obtenu présente une excellente stabilité au lavage comme le montrent le Tableau 1 et l'Exemple 3o A titre de comparaison, la stabilité de l'o-amylase immobilisée par adsorption sur la patte cationioue tirée de la même matière est aussi indiquée au Tableau 1. On décrira l'invention en détail ci-après, à propos des exemples mais elle nty est pas limitée. - EXEMPLE i À 21 g (0,1 mole) d'hydroxyéthylcellulose (HEC) commerciale, on ajoute 140 ml de solution aqueuse de soude à 1,0% et 5,3 g (0,1 mole) d1acrylonitrile (AN) et on laisse réagir le mélange à 500C pendant 60 minutes en agitant. Puis on ajoute 23 g (0,2 mole) d'une solution d'eau oxygénée à 30%, en deux ou trois portions et on laisse réagir la solution à 200C pendant 90 minutes0 Les étapes de réaction sont illustrées par le schéma suivant : On dilue à 2 fois son volume avec de l'eau la solution aqueuse de carbamoyléthyl-EEC obtenue.A 10,0 g (0,0027 mole de groupe carbamoyle) de solution diluée de carbamoyléthyl-IIEC, on ajoute 2,7 nil (0,0027 mole) de solution aqueuse 1M dthypochlo- rite de sodium. On soumet le mélange à la chloration sur N, entre 0 et 20C, pendant 60 minutes puis on neutralise à pli 9 environ au moyen d'acide acétique IN. A la solution obtenue, on ajoute 2,0 ml de solution aqueuse d'a-amylase à 250 mg/100 nil. Puis on agite suffisamment le mélange, on le chauffe lentement à 300C et on le laisse reposer 20 minutes pour obtenir une aamylase immobilisée dans le gel de carba moyléthyl-XECO L'enzyme immobilisée dans le gel est liée aux chines HEC non seulement physiquement mais aussi chimiquement et par suite, elle ne s'écoule jamais même au lavage répété. - EXEMPLE 2 A 10,0 g (opo7 mole) de solution aqueuse à 5% > de po lyacrylnmide, on ajoute 2,8 ml (0,0056 mole) de solution aqueuse d'hypochlorite de sodium 2M. On soumet le mélange à la chloration sur l'azote, entre -5 et 0 C pendant 30 minutes puis on le neutralise à pH 9 environ au moyen d'acide acétique 1N. Puis on ajoute 2,0 ml de solution aqueuse d'a-amylase à 250 mg/100 ml. Après avoir agité suffisamment, on chauffe lentement le mélange à 300C et on le laisse reposer 20 minutes pour obtenir une a-amylase immobilisée dans le gel de polyacrylamide. L'enzyme est immobilisée dans le gel non seulement par liaison physique mais aussi par liaison chimique avec les chines de polyacrylamide et donc, elle ne s'écoule jamais même au lavage répété, On dissout 5,0 g d'acrylonitrile dans 250 ml de solution aqueuse de soude et on plonge dans la solution 16,2 g (0,1 mole) de pâte. On laisse réagir le mélange à 500C pendant 2 heures. Puis on filtre le mélange, on lave le résidu à l'eau et on le plonge dans 200 ml de solution aqueuse de soude à 0,5% additionnée de 5,0 ml de solution d'eau oxygénée à 30%. On laisse réagir le mélange à 200C pendant 60 minutes. On filtre alors le mélange et on lave le résidu à l'eau pour obtenir une patte carbamoyléthylée. On disperse 1,0 g de cette pite dans 100 mI d'eau0 On ajoute 2,0 nil de solution aqueuse 1M d'hypo- chlorite de sodium et on soumet le mélange à la réaction de chloration sur-N, entre 0 et 20C, pendant 30 minutes. Une fois que la réaction est achevée, on lave suffisamment la pâte à l'eau glacée puis on la plonge dans 100 ml de solution tampon d'acétate de calcium 0,1M (pli 8,10) contenant 100 mg d'o-amy- lase.On laisse réagir le mélange à 400C pendant 3 heures pour immobiliser l'enzyme Le Tableau 1 montre les résultats obtenus lorsqu'on détermine la résistance au lavage de l'activité de l'enzyme ainsi immobilisée (essai 1). L'activité d'enzyme est exprimée par le poids (mg) d'amylase, c'est-à-dire le volume (mol) d'amylase à 0,1% qui diminue de 10% en 30 minutes à 300C une coloration bleue par l'iode (indice de bleu). On effectue le lavage en agitant vigoureusement 100 mg de enzyme immobilisée dans 15C ml. de solution tampon d'acétate de calcium 0,1E à 300C pendant 30 minutes. A titre de comparaison, le Tableau 1 (essai 2) indique aussi la résistance de l'enzyme immobilisée par un processus d'adsorption utilisant une pe cationique0 Pour préparer la pâte cationique, on chlore sur l'azote la pâte carbamoyléthylée de la façon décrite plus haut puis on lie chimiquement à celleci une polyéthylène-imine (degré de polymérisation 100). L'activité de l'enzyme immobilisée par le procédé de l'invention n'est pas diminuée même par des lavages répétés. TABLEAU 1 Activité enzymatique, mg Nombre de lavages Essai 1 Essai 2 0 300 470 1 260 390 2 255 330 3 255 280 4 255 240 10 255 148 - EX22SLE 4 A 1,44 g (10 millimoles) d'adipamide, on ajoute 50 ml d'eau et 10 ml (20 millimoles) de solution aqueuse 2M d' > ypo- chlorite de sodium0 On soumet le mélange à la réaction de chloration sur N pendant 60 minutes avec refroidissement à la glace. Au mélange, on ajoute 1,2 g (20 millimoles) d'acétone, puis on ajuste la solution à un pH d'environ 9,0 au moyen d'acide acétique. A la solution obtenue, on ajoute 30 mi de solution à 1% d'enzyme (a-amylase, papaïne, trypsine ou invertase). On maintient la solution à 180C pendant 50 minutes pour précipiter l'enzyme immobilisée0 L'activité de l'enzyme ainsi immobilisée n'est pas diminuée même par des lavages répétés, - EXEMPLE 5 - A 7,0 mi d'eau, on ajoute 6,8 g (0,05 mole) de penta érythritol, 10,6 g (2 moles) d'acrylonitrile et 0,4 g de soude. On maintien le mélange à 500C pendant 60 minutes et on le transvase dans un entonnoir séparé pour obtenir une matière huileuse dans la couche inférieure. On hydrolyse la matière huileuse à 200C pendant 3 heures au moyen de 100 g (0,88 mole) de solution à 30% d'eau oxygénée dans une solution de soude à O,AN. En ajoutant de l'acétone au mélange, on obtient 16,8 g de tétrakis-carbamoyléthyl-pentaérythritol (rendement 80%), A 4,2 g (10 millimoles) du produit obtenu, on ajoute 50 ml d'eau et 10 mi de solution aqueuse 2M d'hypochlorite de sodium. On soumet le mélange à la chloration sur l'azote pendant 60 minutes avec refroidissement à la galce, puis on y ajoute 1,2 g (20 millimoles) d'acétone.Puis on ajuste le mélange à un pli de 9,0 environ au moyen d'acide acétique et on l'ajoute à 100 ml de solution tampon d'acétate de calcium 0,1 M (pE 8,10) contenant 100 mg d'a-amylase. On laisse réagir le mélange à 250C pendant 50 minutes pour obtenir l'a-amylase immobilisée sous forme de précipité blanc, L'activité de l'a-amylase immobilisée n'est pas diminuée même par lavage répété0 - EXEMPLE 6 A 2 g de pâte de cellulose, on ajoute 70 ml d'eau, 187 mg de nitrate de cérium, 0,7 nil d'acide nitrique O,IN et 0,5 g d'acrylamide.Après congélation et désaération, on remplace à deux reprises l'air par de l'azote et on soumet le mélange à la polymérisation greffée à 350C pendant 10 minutes. En éliminant les homopolymères d'acrylamide par lavage à l'eau, on obtient une pate de cellulose présentant un taux de greffe d'acrylamide de 7,9%. A 1 g du polymère greffé obtenu, on ajoute 100 ml de solution aqueuse 0,5E d'hypochlorite de sodium0 On soumet le mélange à la chloration sur N pendant 30 minutes avec re froidîssement à la glace puis on lave à quatre reprises avec une solution aqueuse à 10% de chlorure de sodium refroidie à OOC, Puis on plonge le polymère obtenu dans 100 mi de solution tampon d'acétate de calcium O,1X (pE 8,10) contenant 100 mg d'a-amylase. On laisse réagir le mélange à 20 C pendant 60 minutes de sorte que l'on peut immobiliser l'enzyme sur la pâte de cellulose. L'activité de l'enzyme immobilisée n'est pas diminuée meme par lavage répété. - EXEMPLE 7 A 6,56 g (20 millimoles) de tDiaion CR-20" (résine échangeuse d'anions faiblement basique), on ajoute 14,0 g (200 millimoles) et 20 ml de soude 0,1N. On maintient le mélange à 400C pendant 2 heures pour carbamoyléthyler les groupes amines de la résine. En éliminant l'acrylamide inaltérée par lavage à l'eau, on obtient 8,40 g de résine échangeuse d'anions (rendement 1005 . A 1,0 g de la résine obtenue, on ajoute 10 w1 de solution aqueuse O,5M d'hypochlorite de sodium. On soumet le mélange à la chloration sur 1 'azote pendant 60 minutes avec refroidissement à la glace. Une fois que la réaction est achevée, on lave suffisamment la résine à l'eau glacée puis on la plonge dans 100 mi de solution tampon d'acétate de calcium O,11L (pH 8,10) contenant 100 mg d'&alpha;-amylase. On laisse réagir le mélange à 400C pendant 3 heures, ce qui fait que l'on peut immobiliser l'enzyme sur la résine granulaire. L'activité de l'enzyme ainsi immobilisée n' est pas diminuée même par lavage répété. REVENDICATIONS 1) Procédé d'immobilisation d'une enzyme, caractérisé par le fait que lton fait réagir l'enzyme sur une substance contenant un groupe halogénoamide, 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'enzyme est l'a-amylase, la papaïne, la trypsine ou l'invertase0 3) Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la substance est un composé contenant un groupe chloramide. 4) Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la substance est un composé halogénoamide polyfonctionnel hydrosolubleo 5) Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la substance est une matière solide contenant un groupe halogénoamide. 6) Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la substance est un composé que l'on obtient en faisnat réagir un amide polyfonotionnel hydrosoluble sur l'hy- pochlorite de sodium. 7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que 1'amide est l'adipamide, le tétrakis-carbsmoyléthyl pentaérythritol, la carbamoyléthyl-hydroxyéthylcellulose ou le polyacrylamide. 8) Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que la matière solide est une résine échangeuse d'anions faiblement basique contenant un groupe halogénoamide. 9) Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on conduit la réaction à un pli de 7 à 11. 10) Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait que l'on conduit la réaction à une température de -10 à 50 C. 11) Enzyme immobilisée obtenue par le procédé selon la revendication lo