Brevet FR2307038A1 — publié le 19761105

La présente invention se rapporte à un procédé de préparation d'une nouvelle substance anticarcanome à partir d'un liquide surnageant obtenu en retirant le mycélium d'un bouillon de culture résultant de la culture de streptomyces hachijoensis, qui est un steptomyces découvert en 1951 par Hosoya, Komatsu, Soeda, Yamaguchi et Sonoda. Les propriétés microbiologiques du streptomyces hachijoensis ont été exposées par Hosoya, Komatsu, Soeda, Yamaguchi et Sonoda : "Trichomycine, nouvelle substance antibiotique présentant des activités d'acide trichomonique et fongicides" /Journal of Antibiotics, Vol 10, page 564 (1952)7 en ce qui concerne la souche H-2609 de Streptomyces hachijoensis. Ces propriétés ont également été exposées par Yamaguchi : "Etudes sur les souches produisant une substance antibiotique H-2075, H-2609 (S. hachijoensis, Nov. Sp.) et H-3030" /The Journal of Antibiotics, Series A, Vol. VII, No 1, pages 10 à 14 (195417 en ce qui concerne les souches H-2609 et H-2075 de Streptomyces hachijoensis. On connais des procédés de préparation de médicaments en utilisant le Streptomyces hachijoensis. De façon plus précise, on peut mentionner un procédé dans lequel on extrait le mycélium de la souche H-2609 de Streptomyces hachijoensis avec de l'acétone contenant de l'eau ou du méthanol contenant de l'eau. On peut également mentionner un procédé dans lequel on prépare un bouillon de culture contenant le mycélium de ladite souche, légèrement acide, on ajoute une faible quantité d'argile activée au bouillon de culture, on agite le mélange et on extrait la substance absorbée sur l'argile activée avec de l'acétone contenant de liteau et/ou du méthanol contenant de l'eau. Conformément à ces procédés, on prépare de la trichomycine ayant des propriétés acides trichomoniques, fongicides et anti-levure. On a récemment mis au point un procédé pour préparer une nouvelle substance anti-carcinome, dans lequel on utilise la même souche que celle utilisée dans les procédés de préparation de trichomycine mentionnés ci-dessus. Mais le produit final, son utilisation et ltétape d'extraction du composant efficace sont tout à fait différents de ceux des procédés de préparation de trichomycine. Cette nouvelle substance anticarcinome est obtenue suivant un procédé dans lequel on retire le mycélium d'un bouillon de culture de streptoces hachijoensis, on ajoute une solution de chlorure de sinc au liquide qui surnage pour provoquer un précipité, on recueille le precipité, on ajoute une solution de phosphate secondaire de sodium all précipité recueilli pour régler le pH entre 7,0 ee 9,4, on extrait ainsi le précipité, on ajoute à 11 extrait au moins un produit choisi parmi le méthanols l'éthanol et lfflacétone pour provoquer un précipité, on dissout le précipité résultant dans de l'eau distillée et on filtre la solution de façon stérile. La présente invention a pour but d'obtenir une nouvelle substance anticarcinome améliorée par rapport à la substance anticarcinome ci-dessus. L'invention concerne à cet effet un procédé du type ci-dessus dans lequel on retire le mycélium d'un bouillon de culture de streptomyces hachijoensis, procédé caractérisé en ce qu'on ajoute un solvant organique au liquide qui surnage, on recueille le précipité ainsi formé, on ajoute au précipité un produit choisi parmi l'eau, une solution saline, le phosphate secondaire de sodium et le glucose, on extrait ainsi le précipité et on filtre cet extrait de façon stérile. La substance obtenue à l'aide du procédé conforme à la présente invention a une activité bien supérieure à celle de la substance obtenue à l'aide du procédé mentionné précédemment et conforme au brevet japonais nO 42 560/74. Lorsque des substances anticarcinome connues sont administrées, l'hypoleucocytose et des phénomènes similaires se produisent comme résultats d'effets secondaires défavorables. En conséquence, il n'est pas admissible d'administrer ces substances anticarcinome de façon continue sur une longue période; on interrompt habituellement le traitement. La substance anticarcinome obtenue conformément à la présente invention ne provoque pas d'hypoleucocytose, ni d'autres troubles des organes hématopoiétiques, de mauvais fonctionnement du foie, de mauvais fonctionnement des reins, de fibrothorax ou de manifestations similaires,même lorsqu'elle est administrée pendant une longue période. Les propriétés physico-chimiques de la nouvelle substance anticarcinome conforme à la présente invention sont indiquées ci-apres 1) Apparence poudre de couleur blanche à légèrement jaune. 2 Solubilité aisément soluble dans l'eau, insoluble dans le méthanol, l'ethanol, le chloroforme, la pyria ne, e chlorure d'éthylène, le dioxane et l'aride a étique. 3) Rotation optique + 7,10 (eau) 4) Réactions colorées positive à la réaction de Feeling, à la réaction du miroir argenté et à la réaction de Molisch, négative à la réaction de ninhydrine et de l'acide xanthoprotéique. 5) Valeurs de l'analyse élémentaire C : 33,8 %. H : 6,33 % 0 : 59,86 i Cendres : 15,2 S0 6) masse moléculaire Si lton ne tient pas compte des cendres, la masse moléculaire est égale à 1200 (mesurée suivant le procédé par différence de pression de vapeur en utilisant un dispositif de mesure de masse moléculaire du type Hitachi 115). 7) Formule moléculaire A partir des valeurs d'analyse élémentaire ci-dessus et du résultat de mesure de la masse moléculaire, on peut admettre que la substance, sans les cendres, peut être représentée par la formule suivante C34 H76 045 8) Absorption dans l'ultra-violet : Dans le cas d'une solution aqueuse, on observe une absorption maximale pour 277 my. 9) Absorption dans l'infra-rouge Des pointes nettes pour 1030, 1655, 2920 et 3450 cm-1. Le test anti-carcinome a été effectué sur la nouvelle substance carcinostatique conforme à la présente invention. Pour l'expérience, on a fait appel à une tumeur ascitique de Ehrlich en injectant 0,1 ml d'une solution contenant 10-5 ml de mycélium de tumeur ascitique de Ehrlich à des souris de la série DD-S. Dans une période de trois heures, on a injecté la nouvelle substance dans le péritoine (quantité 6,25; 12,5; 25; 50 ou 100 &gamma;). Le résultat constaté est que la tumeur pouvait être - itqe chez les souris refevan- une injectlcn de la nouvelle substance suivant une quantité de 12,5 &gamma; l2;5 ou davantage. ConIormément au test in-vitro effectué par l'inventeur, il a été constate que a nouvelle substance présentait une activité anticarcinome élevée dans le procédé d'épreuve de désactivation par réduction colorée en utilisant le 2,6-dichlorophénol-indopnénol. La nouvelle substance anticarcinome a également manifeste une activité anticarcinome élevée conformément au test de réaction catalytique (variante du procédé Nüke). Une solution de 1 à 2 mg de la nouvelle subs- tance anticarcinome sous forme de solution saline physiologique de 0,5 à 1,0 cm3 a été injectée en injections sous-cutanées une fois par jour à des patients ayant subi une résection de ltestomac. I1 ne s'est produit aucun effet secondaire défavorable. L'invention sera mieux comprise en regard de la description ci-aprus et des dessins annexés se rapportant à des exemples de réalisation de l'invention, dessins dans lesquels - La figure 1 est un diagramme représentant le spectre d'absorption dans l'ultra-violet de la nouvelle substance anticarcinome; - La figure 2 est un diagramme représentant le spectre d'absorption dans l'infra-rouge de la nouvelle substance anticarcinome. Exemple n 1 a) La souche H-2609 de streptomyces hachijoensis a été cultivée dans un bouillon de culture contenant 0,5 % de polypeptone, 1,0 Uo de protéose peptone (nom commercial du produit de Difco Co.), 0,3 % d'extrait de viande (nom commercial du produit de Difco Co.), 0,75 % de chlorure de sodium, 0,5 % de glucose et 2,0 % d'amidon. La culture agitée a été conduite pendant 4 à 5 jours à une température de 27 à 300C. Le mycélium a été séparé du bouillon de culture par centrifugation et on a récupéré le liquide surnageant. b) On a ajouté du méthanol refroidi au liquide surnageant dans une proportion de quatre fois la quantité de ce liquide. Le précipité formé a été recueilli et on lui a ajouté une soiution diluée de phosphate secondaire de sodium pour régler le pH dans une zone faiblement alcaline de 7,0 à 9,0 et pour effectuer l'extraction. L'extrait résultant a été filtré de façon stérile, refroidi et congelé pour obtenir la nouvelle substance anticarcinome. On peut faire usage dléthancw or dvacetone & lieu du méthanol utilisé dans lexpéiience ci-dessus. On peut aussi faire usage d'une solution saline, d'eau distillée ou de glucose au lieu du phosphate secondaire de sodium utilisé dans l'expérience ci-dessus. Exemple n 2 Une solution saturée de sulfate d'ammonium a été ajoutée au liquide surnageant obtenu conformément au paragraphe a) de ltexemple nO 1 pour obtenir 1/3 de saturation après que ce liquide surnageant ait été concentré sous une pression réduite et à une température inférieure à 300C nusqutà ce que le volume du liquide surnageant ait été réduit de 1/5 à 1/10 vtel qu'il était). Le précipité formé a été retiré. Une solution saturée de sulfate d'ammonium a été en outre ajoutée au liquide surnageant résultant jusqu'à 2/3 de saturation. Le précipité formé a été recueilli et de liteau distillée (ou une solution salines a été ajoutée au précipité pour le dissoudre.La solution a été dialysée à travers un tube de cellophane (ou une membrane intestinale de bovin). Après la dialyse, le dialysat a été filtré de façon stérile, refroidi et congelé pour obtenir la nouvelle substance anticarcinome recherchée. Exemple nO 3 Une solution de chlorure de zinc à 50 % a été ajoutée au liquide surnageant obtenu conformément au paragraphe a) de l'exemple nO 1 et le précipité formé a été recueilli. Une solution de phosphate secondaire de sodium à 10 % a été ajoutée au précipité pour régler le pH dans une zone faiblement basique de 7,0 à 9,0 et pour effectuer l'extraction. Une solution saturée de sulfate d'ammonium a été ajoutée à l'extrait pour obtenir 1/3 de saturation. Le précipité formé a été retiré. Une solution saturée de sulfate d'ammonium a été en outre ajoutée au liquide surnageant pour obtenir 2/3 de saturation. Le précipité formé a été recueilli et de l'eau distillée (ou une solution saline) a été ajoutée au précipité pour le dissoudre.La solution a été dialysée à travers un ruban de cellophane (ou une membrane intestinale de bovin). Après la dialyse, le dialysat a été filtré de façon stérile, refroidi et congelé pour obtenir la nouvelle substance anticarcinome recherchée. Exemple nO 4 Une solution de chlorure de zinc à 50 % a été ajoutée au liquide surnageant obtenu conformément au paragraphe a: de l'exemple no 1 et le précipité formé a été recueilli. Une solution à 10 % de phosphate secondaire de sodium a été ajoutée au précipité pour régler 10 pH dans une zone faiblement alcaline de 7,0 à 9,0 et pour effectuer l'extraction. Une solution saturée de sulfate d'ammonium a été ajoutée à l'extrait suivant une saturation de 1/3 et le précipité formé a été retiré. Une solution saturée de sulfate d'ammonium a été en outre ajoutée au liquide surnageant résultant pour obtenir 2/3 de saturation.Le précipité formé a été recueilli et de liteau distillée (ou une solution saline) a été ajoutée au précipité pour le dissoudre. La solution a été dialysée à travers un tube de cellophane (ou une membrane intestinale de bovin). Après la dialyse, le dialysat a été concentré à une température inférieure à 300C sous une pression réduite, jusqu'à ce que le volume soit réduit de 1/5 à 1/10. De méthanol froid a été ajouté au dialysat concentré suivant une quantité égale à quatre fois celle de ce dialysat. Le précipité formé a été recueilli et dissous dans de l'eau distillée (ou une solution saline). La solution a été filtrée de façon stérile, refroidie et congelée, pour obtenir la nouvelle substance anticarcinome recherchée. Dans chacun des exemples nO 1 à 4 précédents, la production de nouvelle substance anticarcinome a été de 500 mg environ. Etant donné que la nouvelle substance anticarcinome est passée par l'étape de stérilisation et mise sous forme de poudre > cette nouvelle substance doit être administrée aux êtres vivants sous forme de solution dans l'eau distillée, de solution saline physiologique ou de solution de glucose. On a obtenu des résultats nettement satisfaisants lorsqu'on a administré la nouvelle substance anticarcinome suivant la présente invention à des patients atteints de cancer de l'estomac, de cancer de l'oesophage, de cancer du larynx, de cancer des poumons de cancer des ovaires et de cancer de l'utérus. ela a été le cas en particulier pour des patients atteints de cancers de l'estomac et ayant subi une résection de l'estomac pour éviter la récurrence. Cela a également été vrai lorsque la nouvelle substance anticarcinome a été administrée à des patients pour lesquels l'opération était impossible. L'invention s'étend à la substance conforme à celle obtenue à l'aide du procédé ci-dessus. Bien entendu l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation ci-dessus décrits et representés, à partir desquels on pourra prévoir d autres formes et d'autres modes de réalisation, sans pour cela sortir du cadre de i-invention. REVENDICATIONS 13) Procédé pour préparer une nouvelle substance anticarcinomes dans lequel on retire le mycélium d'un bouillon de culture de streptomyces hachijoensis, procédé caractérisé en ce qu'on ajoute un solvant organique au liquide résultant qui surnage pour produire un précipité, on recueille le précipité, on extrait le précipité recueilli en ajoutant un produit choisi parmi l'eau, une solution saline, le phosphate secondaire de sodium et le glucose, et on filtre l'extrait de façon stérile. 20) Procédé pour préparer une nouvelle substance anticarcinome, dans lequel on retire le mycélium d'un bouillon de culture de streptomyces hachijoensis, procédé caractérisé en ce qu'on soumet le liquide surnageant tel qu'il est à une concentration sous pression réduite, on soumet le concentrat à un fractionnement par le sulfate d'ammonium, on recueille le précipité formé par le fractionnement par le sulfate d'ammonium, on dissout le précipité recueilli dans l'eau ou une solution saline, et on soumet la solution à une dialyse. 30) Procédé pour préparer une nouvelle substance anticarcinome, dans lequel on retire le mycélium d'un bouillon de culture de streptomyces hachijoensis, procédé caractérisé en ce qu'on ajoute une solution de chlorure de zinc au liquide résultant qui surnage pour produire un précipité, on recueille le précipité, on ajoute du phosphate secondaire de sodium au précipité recueilli pour régler le pH de 7,0 à 9,0, on extrait ainsi le précipité, on soumet l'extrait à un fractionnement par le sulfate d'ammonium, on recueille le précipité formé par ce fractionnement, on dissout le précipité recueilli dans de l'eau ou une solution saline, on soumet la solution à une dialyse et on filtre le dialysat de façon stérile. 40) Procédé pour préparer une nouvelle substance anticarcinome, dans lequel on retire le mycélium d'un bouillon de culture de streptomyces hachijoensis, procédé caractérisé en ce qu'on ajoute une solution de chlorure de zinc au liquide résultant qui surnage pour produire un précipité, on recueille le préciput, on ajoute du phosphate secondaire de sodium au précipité recueilli pour régler le pH de 7,0 à 9,0, on extrait ainsi le précipité, on soumet l'extrait à un fractionnement par le sulfate d'ammonium, on effectue une dialyse et une concentration sous pression réduite; on ajoute un solvant organique au concentrat résultant pour produire un précipité, on dissout le précipité cars de l'eau ou une solution saline et on filtre la solution ee façon stérile. 50) Substance anticarcinome, caractérisée en ce quelle est conforme à celle obtenue à l'aide d'un procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4.