Brevet FR2299313A1 — publié le 19760827

L'invention concerne un procédé de purification de l'insuline-métal alcalin ou de l'insuline-ammonium, en utilisant la fil ration sur gel à un pH de 2,0 à 3,5. L'invention fournit un procédé de purification de l'insuline-métal alcalin ou de l'insuline-ammonium, qui consiste à faire gonfler un gel ayant à l'état sec un taux de récupération d'eau d'au moins environ 4% en poids et de diamètres de particule infé- rieurs à environ 100 microns ; à garnir une colonne avec le gel gonflé ; à ajouter à la colonne garnie une solution aqueuse d'une insuline-métal alcalin ou d'insuline-ammonium ayant une pureté d'au moins environ 80%, dans laquelle la concentration en insuline est comprise entre environ 1 et environ 8%, poids/volume, la quantité totale d'insuline est suffisante pour fournir une charge dans la colonne comprise entre environ Q,8 et environ 6,7 grammes par lite de lit, et le p9 de la solution est dans la gamme d'environ 2,0 à environ 3,5 ; et à éluer l'insuline de la colonne, à une tempérSture comprise entre environ 5 et environ 300C, à l'aide d'un éludant aqueux ayant un pH dans la même gamme que celle de la solution d'insuline. Le dessin est un diagramme d'élution pour l'exemple 1. Le diagramme est la courbe de la densité optique à 280 m de cer taines fractions de la solution d'insuline au cours de la filtra tion sur gel. Depuis sa découverte en 1921 comme composant du pancréas, l'insuline a pris une importance mondiale dans le traitement du diabète sucré. Comme les modes opératoires d'extraction utilisés pour enlever l'insuline du tissu pancréatique enlèvent également des quantités importantes de protéines autres que l'insuline, des efforts considérables ont été dépensés pour créer des procédés de purification de l'insuline ; c'est-3-dire des procédés permettant de séparer l'insuline des protéines autres que l'insuline. Plusieurs des procédés créés pour purifier l'insuline ont une ippor- tance industrielle. Parmi ces procédes industriellement importants, l'un des premiers utilise le phénomène général qu'une protéine a une solu bilité minimale au point isoélectrique, les autres facteurs étant par ailleurs constants Banting et al. décrivent dans le brevet des E.U.A. N0 1.469.994 un procédé de purification qui consiste à faire précipiter à leur point isoélectrique les protéines autres que l'insuline contenues dans un-extrait aqueux de pancréas. La précipitation isoélectrique de l'insuline à partir d'un extrait pancréatique aqueux d'un pH d'environ 4 à environ 7 a été ensuite décrite par Walden dans le brevet des E.U.A. NO 1.520.673. Dans un autre procédé ancien, on effectue la précipitation de l'insuline par l'addition d'une quantité suffisante d'un sel minéral. Murlin dans le brevet des E.U.A. NO 1.547.515 décrit le premier procédé de relargage de l'insuline d'un solvant d'extraction par addition de chlorure de sodium. Un procédé de relargage différentiel est décrit par Lautenschlager et al dans le brevet des E.U.A. NO 2.449.076, procéde qui comprend le relargage de l'insuline d'un extrait neutralisé par addition de chlorure de sodium, filtration, redissolution du résidu et nouveau relargage de l'insuline, mais avec une concentration en sel inférieure à celle utilisée dans la première étape de relargage. Un troisième procédé industriellement important de purification de l'insuline comprend la précipitation ou la cristallisation de l'insuline de la solution sous forme d'un complexe insuline ne-zinc. En général, l'insuline-zinc précipite à partir d'une solution aqueuse tamponnée contenant des ions zinc. Divers tampons ont été utilisés; par exemple Petersen dans le brevet des E.U.A. NO 2.626.228 utilise un tampon acide citrique-citrate. A l'heure actuelle les procédés industriels de purification de l'insuline utilisent typiquement les. trois procédés pré cédents. Comme l'insuline-zinc est la forme la plus importante industriellement de l'insuline, la dernière étape de la purification de l'insuline est normalement une étape de cristallisation par le zinc. Cependant, on sait depuis quelques années que les protéines autres que l'insuline parmi lesquelles la pro-insuline et les protéines du type pro-insuline sont les plus importantes sont des composants mineurs des insulines-zinc industrielles. Bien que ces composés constituent généralement moins d'environ 8% en poids des insulines-zinc industrielles, on pense que certains de ces composés ont une nature antigène ou immunogène. Voir par exemple, Chance et al., Science, 161, 165 (1968) ; Steiner et al., Diabetes, 18, 725 (1968) ; Bromer, Bioscience, 20, 701 (1970) ; et Rubenstein, et al., Ann. Rev. Med., 22, 1 (1971). Donc à. l'heure actuelle il existe encore le problème de l'élimination à une échelle industrielle des protéines autres que l'insuline à partir de l'insuline. Le terme insuline" tel qu'utilisé ici comprend non seulement l'insuline en elle-même, mais également toutes les protéines du type insuline, comme la désamido-insuline Comme l'insuline les protéines du type insuline ont des activités hypoglycémiantes similaires, il n'est généralement pas nécessaire de séparer l'insuline de toutes les autres protéines pancréatiques, c'est-à-dire qu'une insuline homogène n'est normalement pas nécessaire. On sait que des techniques de séparation de substances biologiques à une échelle analytique, comme l'électrophorèse et la chromatographie d'échange d'ion, permettent de séparer les composants non insuline du composant insuline des préparations industrielles (ou même brutes) d'insuline. Ces techniques permettent même de séparer le composant insuline en insuline et en insuline désamidée. Cependant ces modes opératoires ont une utilité à grande échelle qui est aléatoire. Un mode opératoire que l'on peut plus facilement adapter à une grande échelle est la filtration sur gel (expression synonyme à chromatographie d'exclusion sur gel ou chromatographie par filtration sur gel). Dans ce procédé, on sépare les protéines sur une colonne contenant un gel qui a été réticulé d'une manière telle que des pores sont formés dans chaque particule de gel. Ces pores ont un volume mesurable fini qui est directement proportionnel au degré de gonflement du gel et inversement proportionnel au degré de réticulation. Comme les plus petites molécules ont un accès plus total à ces pores que les molécules plus grosses, le déplacement des plus petites molécules dans la colonne est gêné par rapport à celui des plus grosses molécules qui ont seulement un accès partiel ou nul aux pores. On a utilisé dans le passé la filtration sur gel pour purifier l'insuline. Dans la séparation de l'insuline à partir d'un pancréas de chat, onobtient l'insuline brute par extraction acidealcool suivie d'une précipitation alcaline pour eliminer les matières inactives, concentration, précipitation au point isoélectrique, et finalement précipitation par relargage par le chlorure de sodium. On introduit alors l'insuline brute dans une colonne de gel de dextrane réticulé et on l'élue avec de l'acide acétique 1,0 M. Davoren, Biochim. Biophys. Acta, 63, 150 (1962). Dans la séparation de l'insuline à partir de poisson, on homogénéise les glandes dans l'eau et on fait précipiter les pro téines par une solution d'acide trichloro-acétique. On extrait le précipité avec un mélange acide-éthanol et on traite les extraits par le chlorure de méthylène pour éliminer les lipides. On sépare les solides restants et on les reprend dans de l'acide acétique à 5,0 M et on les filtre sur une colonne de gel de dextrane reticulé avec de l'acide acétique 5,0 M comme solvant d'élution. Humbel, Biochem. Biophys, Res. Commun., 12, 333 (1963).Des rendements d'environ 80% sont obtenus. I1 faut noter que Humbel indique que pour une bonne séparation de l'insuline et des autres protéines, les conditions d'élution doivent favoriser la dissociation des molécules d'insuline. I1 suggère en outre que l'acide acétique 1,0 M n'est pas un solvant satisfaisant car, selon Yphantis et Waugh (Biochim. Biophys. Acta, 26, 218 (1957) ), l'insuline n'y est pas totalement dissociée. On filtre un extrait brut de pancréas de boeuf sur un gel de dextrane réticulé, selon Epstein, et al., Biochemistry, 2, 461 (1963). Le solvant d'élution est le bicarbonate d'ammonium 0,2 M, solvant qui a également été condamné par Humbel, voir ci-dessus. Epstein et al., indiquent un rendement d'environ 60%. L'insuline a même été séparée à partir de pancréas humain. Les glandes sont d'abord homogénéisées et extraites. Un fractionnement par le sulfate d'ammonium élimine une certaine quantité de matériaux inactifs. Puis on fait précipiter l'insuline, d'abord avec du chlorure de sodium puis en utilisant une technique de précipitation au point isoélectrique. On dissout l'insuline résultante dans de l'acide acétique 0,5 N et on la filtre sur un gel de dextrane réticulé. On transforme ensuite l'insuline filtrée en insuline-zinc. Jackson, et al., Diabetes, 18, 206 (1969). Le rendement en insuline après filtration sur gel est environ 60%. Enfin, la filtration sur gel et la chromatographie d'échange d'ion ont été combinées par Schlichtkrull et al., dans le brevet Sud-Africain NO 69/5280 (pour un brevet équivalent voir le brevet Belge NO 737.257). Dans l'exemple comportant seulement une filtration sur gel (Exemple 1), l'insuline-zinc est filtrée sur une colonne de gel de dextrane réticulé avec un rendement de 80%. Le solvant d'élution est l'acide acétique 1,0 M. I1 faut noter que Schlichtkrull et al. trouvent nécessaire, après filtration, d'effectuer un relargage, une précipitation au point isoélectrique et une cristallisation par le zinc de manière à obtenir l'insulinezinc. Chacune des applications de la technique antérieure de la filtration sur gel à la purification de l'insuline a entrainé une perte importante d'insuline. En outre, d'après la technique antérieure, il n'y a aucune indication fiable qu'on n'obtienne que de l'insuline (y compris les protéines du type insuline comme décrit ci-avant) comme résultat de l'utilisation de la filtration sur gel. En général, on peut utiliser dans le procédé de la présente invention un quelconque gel gonflable à l'eau qui convient à l'utilisation avec les solutés de protéine Cependant, un tel gel doit avoir à l'état sec ou non gonflé un taux de récupération d'eau d'au moins environ 4% en poids, par rapport au poids du gel sec, etdesdiamètres de particule inférieurs à environ 100 microns. De préférence, le taux de récupération d'eau du gel doit être compris entre environ 4 et environ 98%, et de préférence entre environ 5 et 20%. De préférence, les diamètres des particules du gel sec doivent être inférieurs à environ 80 microns ; une gamme particulièrement utile de diamètres de particule va d'environ 20 à environ 80 microns. Des exemples des gels appropriés comprennent, entre autres, l'amidon (y compris l'amidon de mais), le galactomannane réticulé, le dextrane réticulé, l'agar-agar ou gélose, les polyacylamides, les copolymères d'acylamide et de méthylène bis-acrylamide, les copolymères de méthylène bis-acrylamide avec le vinylethylcarbitol et avec la vinylpyrrolidone, etc... Les gels préférés sont les dextranes réticulées, comme la série Sephadex fabriquée et vendue par Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, N.J., Tf,S.A. Le type de colonne utilisé dans le procédé n'est pas déter minant. Le choix de la hauteur, du diamètre,de de la configuration de la colonne dépend des paramètres de fonctionnement utilisés. Evidemment, lorsque la hauteur de la colonne augmente le débit diminue ; en d'autres termes, la contre-pression de la colonne est directement proportionnelle à la hauteur de la colonne. Pour cette raison, on préfère une configuration de colonne empilée, comme la colonne à sections Pharmacia Sectional Column KS-370. Dans un but de production normale, un empilement de six sections convient parfaitement. Pour l'approximation, on peut effectuer une purification satisfaisante de l'insuline à des charges de colonne d'environ 4,5 grammes d'insuline-métal alcalin ou d'insuline-ammonium par litre de lit, charge qui est nettement préférée. Cependant, la charge de la colonne peut de manière générale être comprise entre environ 0,8 et environ 6,7 grammes par litre de lit, bien que la gamme préférée soit d'environ 3,5 à environ 5,0 grammes par litre de lit. Evidemment, les conditions optimales seront déterminées facilement pour une quelconque colonne donnée. Le gel peut être gonflé et la colonne garnie à l'aide du gel gonflé selon l'un quelconque des divers procédés connus de l'homme de l'art. En général, le gel sera gonflé dans le milieu d'élution. Ou bien, on peut gonfler le gel dans de I'éthanol aqueux à 30%, décanter les fines et remplacer le milieu de gonflement par le milieu d'élution. On peut préparer d'une quelconque manière appropriée la solution d'insuline-métal alcalin ou d'insuline-ammonium. Par exemple, on peut dissoudre l'insuline dans une quantité appropriée du milieu d'élution. Ou bien on peut dissoudre l'insuline dans un milieu aqueux qui est quelque peu plus acide (mais encore dans la gamme de pH du milieu d'élution) que le milieu d'élution. Par exemple, si le milieu d'élution est de l'acide acétique 0,5 N avec un pH de 2,5, on pourrait dissoudre l'insuline dans un milieu aqueux ayant un pH d'environ 2,3 ; c'est-à-dire dans de l'acide acétique 1,0 N. L'insuline-métal alcalin ou l'insuline-ammonium a normalement une nature alcaline ou basique. En conséquence, lorsqu'on dissout l'insuline dans un milieu aqueux neutre ou acide, le pH de la solution résultante augmentera. Ainsi, si on dissout l'in-: suline dans de l'acide acétique 1,0 N, le pH de la solution résultante augmentera à environ 2,7. Cependant, selon la concentration d'insuline utilisée, la solution d'insuline peut avoir un pH aussi élevé que 3,2. Cette augmentation de pH est normale et'ne provoque aucun problème, pourvu que le pH de la solution d'insuline ne dépasse pas environ 3,5. Ou bien, on peut dissoudre l'insuline dans de l'acide acétique 0,5 N et ajuster le pH à moins d'environ 3,2 avec de l'acide chlorhydrique dilué. En général, on peut préparer par l'un quelconque des procédés connus l'insuline-métal alcalin ou llinsuline-ammonium. On préfère cependant que l'insuline-métal alcalin ou l'insuline-ammonium soit préparée par le procédé du brevet des E.U.A. NO 3.719.655. Comme indiqué ci-avant, cependant ladite insuline doit avoir une portée d'au moins environ 80%. C'est-à-dire que la teneur en insu line, comprenant les protéines du type insuline ayant une activité hypoglycémiante, doit être au moins environ 80% des protéines totales présentes. La concentration en insuline-métal alcalin ou en insulineammonium de la solution d'insuline introduite dans la colonne doit être, comme indiqué ci-avant, d'environ 1 a environ 8% poids/volume. La concentration préférée est d'environ 4 à environ 6%. Pour des résultats satisfaisants, l'insuline-métal alcalin ou l'insuline-ammonium doit être dissoute dans un volume de solvant qui est inférieur au volume de séparation, décrit ci-dessous. En chromatographie, le coefficient de distribution Kd est défini comme le rapport de la concentration en soluté dans la phase mobile à la concentration en soluté dans la phase stationnaire. En filtration sur gel, la phase mobile est le solvant se déplaçant dans l'espace vide entre les particules de gel et la phase stationnaire est le solvant imbibé dans les particules de gel, c'està-dire emprisonné dans les pores que contient chaque particule de gel. Ainsi, Kd désigne la fraction de solvant imbibé dans laquelle un soluté peut pénétrer. On peut exprimer le volume d'élution Ve d'un soluté en fonction de Kd selon l'équation Ve = VO + Kd * Vi où VO est le volume de vide de la colonne et V. est le volume de solvant imbibé. Si l'on sort Kd, l'équation devient Si l'on suppose que la densité de liteau est l'unité, V. = a.Wr, où a est le poids du gel sec et Wr est le taux de récupération d'eau. Ainsi, Kd devient que l'homme de l'art peut déterminer de manière expérimentale. En supposant qu'une solution contient deux solutés, le volume d'élution pour chaque soluté est exprimé comme suit V ' = V + K 'V. e o d i Ve" = VO + Kd "V. Le volume de séparation Vs est la différence entre les volumes d'élution des deux solutés V = Ve" - Ve' Vs = Ve - Ve Vs = (Kd K Vi D'après ce qui précède, on voit que le degré de séparation de deux ou plusieurs solutés dépend en partie de la charge de la colonne. Lorsque la quantité de soluté de poids moléculaire inférieur approche la limite des pores accessible, la séparation entre les deux solutés doit nécessairement diminuer. Dans les limites de charge indiquées comme faisant partie de la présente invention, le degré de séparation peut varier. Dans certains cas une charge de colonne plus élevée peut être choisie pour équilibrer la séparation et la productivité. Comme indiqué ci-avant, le milieu d'élution peut avoir un pH compris entre environ 2,0 et environ 3,5. En général, le milieu d'élution peut être une solution aqueuse d'un quelconque acide organique ou minéral vis-à-vis duquel les protéines sont stables. Des exemples de ces acides comprennent, entre autres, l'acide chlorhydrique, l'acide phosphorique, l'acide formique, l'acide acétique, l'acide propionique, l'acide n-butyrique, l'acide isobutyrique, l'acide pentanoique, etc... On préfère l'acide acétique. Si on utilise l'acide chlorhydrique, un agent de conservation comme le phénol doit être incorporé dans le milieu d'élution. On peut noter que l'acide acétique agit comme agent de conservation. Le pH préféré est environ 2,5. En conséquence, le milieu d'élution nettement préféré consistera en une solution 0,5 N d'acide acétique. Si on le désire, le solvant d'élution peut contenir jusqu'à environ 0,02 mole par litre de sel minéral, comme le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le chlorure d'ammonium, etc.. La concentration préférée est 0,01 M et le sel préféré est le chlorure de sodium L'utilisation d'un tel sel est préférée pour améliorer la séparation et pour empêcher les substances basiques d'être absorbées par le gel. L'élution de la colonne peut être effectuée à des températures comprises entre environ 5 et environ 300C. De préférence, la température de traitement sera la température ambiante ou une température inférieure. On suit le cours de 1'élution par un quelconque moyen ap proprié. Un procédé particulièrement utile consiste cependant à mesurer l'absorption ultra-violette à 280 my de chaque fraction. On réunit les fractions représentant le composant insuline purifiée désiré et on les transforme généralement en insuline-zinc. Comme indiqué précédemment, l'insuline-zinc est la forme la plus importante de l'insuline. En conséquence, l'insuline-me- tal alcalin ou 1'insuline-ammenium de pureté élevée obtenue par le procédé sera généralement transformée en insuline-zinc. La transformation en insuline-zinc est de préférence effectuée à pH 6,0 en présence d'un tampon acétate d'ammonium. il n'est pas nécessaire de séparer du milieu d'élution l'insuline-metal alcalin ou l'insuline-ammonium, ou de concentrer la solution d'insuline purifiée avant de la cristalliser à l'aide de zinc.Un avantage du présent procédé est que l'insuline en solution telle qu'éluée est suffisamment concentrée pour qu'une précipitation au point isoélectrique ou une précipitation par un sel ne soit pas néces- saire, bien que l'on puisse utiliser ces modes opératoires si on le désire. L'insuline-zinc ainsi obtenue a une pureté améliorée par suite du procédé. On peut montrer par plusieurs méthodes cette pureté améliorée. On peut analyser l'insuline-zinc directement pour déterminer les composants du type protéine non insuline, comme me la pro-insuline et le glucagon. La présence de protéines de poids moléculaire élevé, qui comprennent typiquement la protaminase qui est une enzyme protéolytique, peut être déterminée en mesurant la stabilité d'une suspension d'insuline-protamine a tem -pérature élevée ; si de la protaminase est présente, le complexe insuline-protamine se dissociera en raison de la dégradation de la protamine. On peut mesurer les propriétés physiques, comme la so lubilité de llinsuline-zinc à un pH neutre et la coloration de la solution résultante. Enfin, on peut mesurer l'activité spécifique de l'insuline par des effets biologiques et immunologiques. En raison de sa pureté accrue, l'insuline-zinc obtenue après mise en oeuvre du procédé, est un matériau indiqué pour la formulation de diverses formes pharmaceutiques de l'insuline, par exemple l'insuline normale, l'isophane-insuline, la protamine-insuline-zinc, la suspension d'insuline-zinc, la globine-insuline, etc... En outre, l'insuline-zinc plus pure permet la préparation d'une insuline neutre qui est plus stable que l'insuline acide les impuretés qui jusqu'à présent étaient présentes dans 1'insu- line-zinc précipitent souvent partiellement à un pH neutre. Ces impuretés comprennent souvent des enzymes qui dégradent l'insuline, comme la trypsine et la chymotrypsine, ce qui diminue la puissance de la préparation d'insuline.L'insuline-ztnc plus pure permet également la formulation de préparations d'insuline de porc et de boeuf à action étendue, sans la purification supplémentaire qui était nécessaire jusqu'à présent. Enfin, la préparation de l'isophane-insuline à partir de l'insuline-zinc plus pure demande moins de protamine car l'absence des impuretés protéinées acides permet l'utilisation de la seule quantité de protamine nécessaire pour faire précipiter l'insuline. On peut combiner le procédé comme on le désire avec d'autres modes opératoires de purification. Par exemple, on peut soumettre la solution d'insuline-métal alcalin ou d'insuline-ammonium à une ou plusieurs opérations de filtration avant d'effectuer la filtration sur gel. On peut également soumettre l'insuline éluée à une ou plusieurs opérations de filtration avant la transformation en insuline-zinc. Exemple 1 On équilibre dans de l'acide acétique 0,5 N un gel de dextrane réticulé ayant un taux de récupération d'eau de 5% et des tailles de particules de 20 à 80 my. On garnit une colonne de laboratoire K100/100 (Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) ayant un diamètre de 10 cm et une longueur de 100 cm avec le gel gonflé jusqu'à un volume de lit de 7 litres (hauteur du lit, 89 cm). On dissout dans 400 ml d'acide acétique 0,5 N 17,5 g d'insuline-sodium (provenant-de pancréas de boeuf) préparée par le procédé du brevet des E.U.A. NO 3.719.655 et ayant une puissance de 23,8 unités par mg et une teneur en pro-insuline de 4,218 en poids.On applique la solution d'insuline à la colonne et on l'élue avec de l'acide acétique 0,5 N sous une pression de 0,35 kg par cm2 effectif , ce qui donne un débit de 900 ml par heure (débit linEai- re, 0,19 ml/cm2/mn). Après élution du volume de vide (1725 ml), on recueille des fractions d'environ 23,5 ml chaque ; on estime la teneur en protéines en mesurant l'absorption ultra-violette à 280 my. On détermine également les concentrations en solides en mg par ml. On recueille un total de 240 fractions.Les fractions sont réunies en quatre groupes, comme résumé ci-dessous Volume Volume % de Groupe ml Fractions solidesa Identification A 1405 10- 69 1,4 Protéines et enzy mes de poids molé culaire élevé B-l 1193 70-119 2,4 Essentiellement pro-insuline B-2 978 120-160 9,7 Intermédiaires entre pro-insuline et insuline C 1520 161-225 86,4 Insuline a Par rapport aux solides totaux élués Au Groupe C, on ajoute 3,0 ml d'une solution à 20% de chlorure de zinc et on dilue la solution résultante à un volume de 3025 ml avec de l'hydroxyde d'ammonium 0,5 N. On ajuste à 6,0 le pH de la solution finale à l'aide d'hydroxyde d'ammonium dilué. On sépare par centrifugation l'insuline-zinc qui précipite et on la lave successivement à l'eau, avec de l'alcool absolu et avec de l'éther, puis on la sèche sous vide.On obtient 13,9 g d'insulinezinc ; la puissance de l'insuline est 25,6 unités par mg et la teneur en pro-insuline 0,44%. Comme la teneur en solides du Groupe C est 86,4% des solides totaux élués, le rendement maximal en solides du Groupe C serait 86,4% de 17,5 g soit 15,1 g ; par rapport aux unités, l'obtention maximale serait d'environ 360.000 unités. Ainsi, le rendement en insuline-zinc du Groupe C correspond à une récupération de 91,9% en poids et à une récupération de 98,9% des unités d'insuline. Par rapport à la substance. de départ, la récupération pondérale et la récupération des unités sont respectivement de 79,4% et de 85,4%. On fait précipiter le Groupe B-2 avec un excès dotions zinc comme décrit précédemment pour le Groupe C, on redissout dans de l'acide acétique 0,5 N et on filtre de nouveau sur une plus petite colonne. On recristallise la partie insuline comme décrit précédemment pour le Groupe C, ce qui donne 1,0 g supplémentaire d'insuline-zinc ayant une puissance de 26,7 unités par mg. Ainsi, leren- dement global en insuline-zinc par rapport à la substance de départ est 85,1% en poids et 91,8% en unités d'insuline. On aura une meilleure compréhension du procédé décrit dans l'Exemple 1 en se référant au dessin. Le dessin est un diagramme d'élution pour l'Exemple 1, c'est-à-dire un graphique de la densité optique à 280 modes diverses fractions en fonction du numéro des fractions. Ainsi, le diagramme indique la teneur en protéines des fractions recueillies au cours de l'élution. Le recueil des diverses fractions dans les différents groupes décrits dans l'Exemple 1 est indiqué par les lignes verticales en pointillés. D'après le diagramme, on voit que la substance de départ comprend essentiellement de l'insuline et que le composant insuline est effectivement séparé de la pro-insuline et des protéines similaires. Exemple 2 On répète le mode opératoire de l'Exemple 1, sauf que l'on remplace l'insuline-sodium de boeuf par 30 g d'insuline-sodium de porc et que l'on augmente à 600 ml la quantité d'acide acétique 0,5 N dans laquelle on dissout l'insuline. L'insuline-sodium de porc a une puissance de 23,3 unités par mg et une teneur en proinsuline de 2,428 en poids. On obtient les résultats suivants Groupe Volume Fractions SOlide5 % de ml solides a A 1410 10- 69 1,3 B-l 1200 70-119 2,7 B-2 820 120-154 6,0 C 1920 155-235 90,0 a Par rapport aux solides totaux élués Le Groupe C fournit 26,5 g d'insuline-zinc ayant une puissance de 25,3 unités par mg et une teneur en pro-insuline de 0,57%. Ainsi, le rendement d'insuline-zinc correspond à une récupération de 98,1% en poids, ou de 95,9% par rapport aux unités insuline. De l'insuline-zinc préparée à partir du même lot de pancréas, dans le traitement duquel on remplace les procédés de cristallisation alcaline et de filtration sur gel par des précipitations classiques au point isoélectrique dans des solvants aqueux et des solvants alcooliques aqueux, est obtenue avec le même rendement par kilogramme de pancréas. Cependant, la puissance est de 24,3 unités par mg et la teneur en pro-insuline est de 3,18%. REVENDICATIONS 1. Procédé de purification de l'insuline-métal alcalin ou de l'insuline-ammonium, qui consiste : a faire gonfler un gel ayant à l'état sec un taux de récupération d'eau d'au moins environ 48 en poids et des diamètres de particule inférieurs à environ 100 microns ; à garnir une colonne avec le gel gonflé ; à ajouter a la colonne garnie une solution aqueuse d'insuline-métal alcalin ou d'insuline-ammonium ayant une pureté d'au moins environ 80%, dans laquelle la concentration en insuline est comprise entre environ 1 et environ 8% poids/volume, la quantité totale d'insuline est suffisante pour donner une charge de colonne comprise entre environ 0,8 et environ 6,7 grammes par litre de lit, et le pH de la solution est dans la gamme d'environ 2,0 à environ 3,5 ; et a éluer l'insuline de la colonne a une température comprise entre environ 5 et environ 300C, a l'aide d'un éluant aqueux dont le PH est dans la mEme gamme que celle de la solution d'insuline. 2. Procédé selon la revendication 1, où ledit gel a un taux de récupération d'eau compris entre environ 4 et environ 98%. 3. Procédé selon la revendication 2, où ledit gel a un taux de récupération d'eau compris entre environ 5 et environ 20%. 4. Procédé selon la revendication 3, où ledit gel est un dextrane réticulé. 5. Procédé selon la revendication 4, où ledit gel a un taux de récupération d'eau d'environ 58. 6. Procédé selon la revendication 5, où les diamètres de particule dudit gel sont compris entre environ 20 et environ 80 microns. 7. Procédé selon la revendication 1, où la charge de la colonne est comprise entre environ 3,5 et environ 5,0 grammes par litre de lit. 8. Procédé selon la revendication 7, où la charge de la Cc- lonne est environ 4,5 grammes par litre de lit. 9. Procédé selon la revendication 1, où l'insuline est dissoute dans de l'acide acétique 1,0 N. 10. Procédé selon la revendication 1, où l'insuline est dissoute dans de l'acide acétique 0,5 N et le pH est ajusté avec de l'acide chlorhydrique dilué. 11. Procédé selon la revendication 1, où l'agent d'élution consiste en acide acétique 0,5 N. 12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent d'élution contient un sel minéral à une concentration allant jusqu'à environ 0,02 M. 13. Procédé selon la revendication 12, où le sel minéral est présent à une concentration d'environ 0,01 M. 14. Procédé selon la revendication 13; où ledit selRmine- ral est le chlorure de sodium. 15. Procédé selon la revendication 1, où l'solution est effectuée à la température ambiante. 16. Procédé selon la revendication 1, où l'élution est effectuée à 50C. 17. Procédé de purification d'insuline-sodium de boeuf qui consiste : faire gonfler un gel de dextrane réticulé ayant un taux de récuperation d'eau de 5% et des diamètres de particule compris entre 20 et 80 microns ; à garnir une colonne de 10 cm x 100 cm ayant un volume de lit de 7 litres à l'aide du gel gonflé à ajouter à la colonne garnie une solution d'insuline-sodium de boeuf dans de 1'acide acétique 0,5 N ayant une concentration en insuline de 4,4% ; et à éluer l'insuline de la colonne a la température ambiante avec une solution 0,5 N d'acide acétique. 18. Procédé de purification d'insuline-sodium de porc, qui consiste : a faire gonfler un gel de dextrane réticulé ayant un taux de récupération d'eau de 5% et des diamètres de particule compris entre 20 et 80 microns ; à garnir une colonne de 10 cm x 100 cm ayant un volume de lit de 7 litres à l'aide du gel gonflé à ajouter à la colonne garnie une solution d'insuline-sodium de porc dans de l'acide acétique 0,5 N et ayant une concentration en insuline de 5t ; et a éluer l'insuline de la colonne à la tempéra- ture ambiante avec une solution 0,5 N d'acide acétique.