Brevet FR2302336A1 — publié le 19760924

La présente invention se rapporte à la production d'enzymes et concerne plus particulièrement un procédé permettant d'obtenir directement une composition comprenant un mélange en proportions déterminées de pectinase, de cellulase et/ou d'hémicellulase. Les enzymes sont des composés produits par des microorganismes, en particulier par des champignons. Les enzymes ont les propriété de catalyser certaines réactions spécifiques à chaque enzyme. C'est ainsi que la cellulase provoque la dégrada- tion de la cellulose en cellobiose. L'hémicellulase amène la dépolymérisation des glucides tels que par exemple le galactomannane. La pectinase transforme la pectine en acides galacturoniques. Bien que ces réactions soient utilisées industriellement pour diverses applications, on a constaté qu'il était possible, enutilisant non pas une enzyme déterminée mais bien un mélange en proportions déterminées de certains enzymes d'obtenir soit des résultats plus avantageux que ceux obtenus avec une seule enzyme, soit des résultats tout à fait différents et susceptibles d'applications nouvelles. C'est ainsi que le mélange des trois enzymes considérées peut être utilisé pour le traitement de produits et de résidus d'origine végétale ainsi que des végétaux eux-mêmes dans le but d'en accroitre la digestibilité par les êtres humains et les animaux. Dans ces applications et selon la nature et la composition du produit traité, il est nécessaire d'ajuster les proportions relatives des trois enzymes afin de parvenir à un résultat optimum. Les procédés connus de préparation des enzymes permettent d'obtenir chacune des enzymes séparément par culture d'un microorganisme déterminé dans un milieu approprié suivie d'une séparation et d'une purification de l'enzyme après la fin de la fer mentation. En règle générale le temps de fermentation est très long, plusieurs dizaines d'heures sinon plusieurs jours. chaque enzyme doit être extraite et purifiée séparément ce qui accroit notablement les colts des opérations. L'objet de la présente invention est donc de fournir un procédé de préparation d'un mélange d'enzymes, en particulier de cellulase, d'hémicellulase et de pectinase, comprenant des proportions prédéterminées de chaque enzyme, dans lequel le mélange des trois enzymes est obtenu directement après une fermentation pendant un temps relativement court suivie d'opérations d'extraction et de purification communes pour le mélange d'enzymes ainsi obtenu. Le procédé de l'invention consiste essentiellement A, après avoir sélectionné le micro-organisme et le milieu de fermentation appropriés, controler constamment les conditions de fermentation et en particulier la concentration en matière fermentable, 1' aé- ration etjou l'agitation du milieu de fermentation, de manière à obtenir finalement un mélange comprenant des proportions relatives des enzymes déterminées. La demanderesse a en effet constaté que certains microorganismes sont susceptibles de produire, dans des conditions de fermentation déterminées, plusieurs enzymes simultanément et qu'en outre, lorsqu'on fait varier les conditions de fermentation, les proportions relatives des enzymes dans le produit final varient. C'est ainsi que des souches déterminees du genre Aspergillus produisent directement dans des conditions favorables un mélange de cellulase, d'hémicellulase et de pectinase en proportions telles que le mélange purifié est directement utilisable pour des applications industrielles telles que le traitement de produits et résidus végétaux pour en accroitre la digestibilité ou le traitement des fruits et légumes en particulier lorsque ceux-ci sont destinés à la préparation d'aliments pour enfants tels que les "Babyfoods". Les Aspergillus ont été décrits de façon très complète dans le "manuel of the Aspergilli" de C. Thom and K. Raper édité par "The Williams and Wilkins Company". I1 n'apparaît pas que tous les micro-organismes de ce genre soient pratiquement utilisables pour produire des mélanges d'enzymes ayant un intérêt industriel et la demanderesse a établi que les micro-organismes utilisables pour produire un complexe enzymatique cellulase, hémicellulase, pectinase appartsennent généralement au groupe aspergillus Niger. Des micrQ-ganismes pouvant etre utilisés avec des rendements plus ou mains favorables suivant les cas peuvent être obtenus de l'American Type Culture Collection sous les numéros ATCC 1004ê 101S, 1027, 1040, 6273, 6275, 6276, 6277, 7797, 8740, 9029, 9lA2, 9642, 10249, 10254, 10535, 10549, 10553, 10575, 10577,10581, 10864, 11394, 1141, 12846, 16019, i6404, 16888, 20057, 20117, 26036. On peut facilement déterminer si une variété particulière d'un micro-organisme est susceptible d'être utilisée dans le procédé de l'invention en utilisant le test suivant La sélection est effectuée par un test sur liquéfaction de la pectine de pomme. Le milieu de culture est à base de phosphate de potassium, de phosphate d'ammonium et de sulfate de magnésium et d'un gel de pectine. Le test s'effectue en tube à hemolyse. Quelques jours après ensemencement on mesure soit la hauteur de zone liquéfiée, soit la viscosité du milieu. C'est ainsi que la demanderesse a découvert une variété nouvelle d'Aspergillus Niger particulièrement adaptée pour le procédé de l'invention et susceptible de donner dans des conditions appropriées des rendements en enzymes particulièrement favorables. Cette variété se distingue par les caractéristiques suivantes La souche sélectionnée se caractérise par le développement de caractères microscopiques bien définis au genre Aspergillus tel que conidiophore, vésicule, conidie. Les caractéristiques morphologiques sur milieu Sabouraud glucosé à 2% (couleur de la colonie évoluant du jaune brun au noir) permettent de la classér comme étant proche du groupe Aspergillus Niger. La première souche a été isolée de prélèvements effectués sur des fruits avariés (citron et pomme). Une souche de cette variété d'Aspergillus Niger a été déposée auprès de l'American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Etats-Unis d'Amérique, sous le numéro 20452 et des échantillons peuvent en être obtenus sur demande auprès de cet Organisme. Comme matériau organique fermentable on peut utiliser une grande variété de produits et de résidus végétaux tels que des fécules, du son de blé, du mais, etc... On a cependant constaté que des résultats particulièrement favorables étaient obtenus en utilisant de la pulpe de betterave. Conformément à l'invention on contrôle la composition du mélange enzymatique final en agissant sur les conditions de fer mentation et sur la composition du milieu. En effet comme le montrent les courbes représentées sur les figures 1 à 4 ci-jointes, les quantités des différentes enzymes dans le mélange final varient en fonction de la concentration en matière végétale. Sur ces courbes on a représenté en abscisse la concentration en pulpe de betterave dans le jus de fermentation pendant la période de secrétion de l'enzyme et en ordonnée les activités enzymatiques, la courbe I représentant l'activité en pectinase, la courbe II celle en hémicellulase et la courbe III celle en cellulase. Les courbes de la figure 2 correspondent à des opérations effectuées dans les mêmes conditions que dans la figure 1 mais en réduisant de moitié l'aération. Quant à la figure 3 elle représente les courbes obtenues en réduisant dans les mêmes conditions que dans la figure 1 la vitesse d'agitation de 800 tours/minute à 600 tours/minute. La figure 4 enfin correspond à des opérations effectuées en réduisant l'aération de moitié par rapport à la figure 1 et en réduisant la vitesse d'agitation à 600 tours/minute. On signalera que la géométrie du fermenteur a une influence non négligeable sur l'allure des courbes, en particulier le rapport hauteur/diamètre du fermenteur. I1 est donc nécessaire lorsqu'on change de réacteur d'établir un nouvel ensemble de courbes correspondant au nouveau réacteur. Un fois le jeu de courbes correspondant à un réacteur donné établi il est aisé de déterminer grâce à ces courbes les conditions optima permettant d'obtenir un mélange d'enzymes de composition donnée. Afin d'obtenir les meilleurs rendements possibles, on aura toujours avantage entre plusieurs solutions possibles à choisir celle comportant l'utilisation d'un milieu de fermentation ayant une concentration en matière végétale fermentable aussi élevée que possible. La demanderesse a en outre constaté que pour obtenir des rendements élevés et réduire parallèlement le temps de fermentation, on a avantage à ne pas introduire dans le fermenteur dès le départ toute la matière végétale. On a constaté en effet que l'opération se déroule en deux phases : d'abord une phase de croissance des micro-organismes pendant laquelle il n'y a pratiquement pas formation d'enzymes, puis, lorsque cette phase est terminée, une seconde phase au cours de laquelle les enzymes se forment très rapidement, ces deux phases étant séparées par une période d'induction et d'adaptation. Si on ajoute le complément de matière végétale lors de la phase d'induction, on constate que le rendement en fin d'opération est nettement plus élevé, de deux à trois fois, et que la durée de l'opération est considérablement écourtée. On trouvera ci-après un exemple de mise en oeuvre de l'invention donné à titre non limitatif. On a utilisé un fermenteur ayant une capacité de 20 litres. La composition du milieu de fermentation était la suivante - glucose 10 g/l - (NH4)2SO4 10 g/l 2PO4 5 g/1 - NaCl 3 g/l - MnSO4 0,5 g/l - NgSO4 0,5 g/I - CaCl2 0,5 g/1 - ZuSO4 0,5 g/l - FeSO4 traces Apres stérilisation le pH du milieu était compris entre 4,00 et 6,00. On ajoute dès le début de la fermentation une quantité de pulpe de betterave suffisante pour porter la concentration du milieu en pulpe à 55 g/l. On ensemence le milieu de réaction avec une suspension de spores d'Aspergillus Niger ATCC NO 20452 obtenue sur une culture de riz avec un milieu de fermentation ayant une concentration de 106 ~ 107 spores/ml. L'aération est réglée à un vol/vol/mn et la vitesse de rotation de l'agitateur à 800 t/mn. Le pH est automatiquement maintenu entre 3,25 et 3,75 pendant toute la durée de la fermentation. La température dans le fermenteur varie entre 27 et 370C. Dans ces conditions on constate que la croissance des microorganismes s'effectue en 24 heures. On ajoute alors une quantité de pulpe suffisante pour porter la concentration en pulpe de betterave du milieu de fermentation à 70 g/l. La formation d'enzymes s'accélère et l'opération est terminée au bout de 65 heures. Le liquide de fermentation est filtré pour éliminer les résidus de matières végétales en suspension. A la fin de la fermentation le mout est dilué au 1/2. Puis les micro-organismes et les résidus végétaux sont séparés du jus de fermentation par filtration sur filtre rotatif. Après ultrafiltration le concentré enzymatique est atomisé. On obtientainsi un mélange d'enzymes comprenant 7 % de pectinase, 20 % de cellulase et 73 % d'hémicellulase. Cette composition enzymatique peut être utilisée pour traiter les carottes dans le but d'en extraire le jus. Les carottes crues sont coupées en rondelles et broyées à la machine KENWOOD ( grille fine). A 1 kg de carottes broyées on a ajouté 400 ml d'eau distillée pour obtenir une bonne division au mixer WARING. On obtient une crème qui n'est pas parfaitement lisse mais qui ne présente plus de particules grossières. La masse est portée à 850C par passage au bain-marie bouillant afin d'inactiver les oxydases. 250g de ce substrat (représentant 180g de carottes crues) sont utilisés pour chaque essai. Après 2 h 30 d'hydrolyse le substrat est centrifugé 10 minutes à 5400 t/minute. On mesure le volume de liquide obtenu dont on contrôle le pH et le Brix à 500C. ≈ Enzymes ! Volume du jus ! Brix ! pH ≈ i ≈ ! ! ! ≈ Témoin 35 ! 8 ! 5,33 ≈ ! ! ! ≈ Produit ! ! ! ≈ RAPIDASE ! 130 ! 9,30 ! 4,48 ≈ i i i Pour une composition déterminée le volume de jus récupéré est nettement supérieur à celui obtenu par le procédé usuel. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la préparation d'un mélange comprenant des proportions relatives déterminées d'enzymes déterminées, ledit procédé consistant à ensemencer un milieu de fermentation comprenant une matière végétale fermentable avec un micro-organisme capable de produire ledit mélange dans ledit milieu, à ajuster la concen tration dudit milieu en matière végétale à une valeur telle que ledit micro-organisme soit capable de produire ledit mélange et à régler les conditions de fermentation de manière à obtenir ledit mélange en fin d'opération. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'on utilise au départ un milieu de fermentation dans lequel la concentration en matière végétale est inférieure à ladite valeur et en ce qu'on ajuste cette concentration à ladite valeur une fois la phase de croissance du micro-organisme terminée et avant que commence la phase de formation rapide des enzymes. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que les conditions de fermentation sont l'aération et l'agitation du milieu de fermentation. 4. Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3 dans lequel le mélange obtenu comprend la cellulase , l'hémicellulase et le pectinase, ledit procédé étant caractérisé en ce que le micro-organisme appartient au genre Aspergillus et au groupe Niger. 5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que le micro-organisme est l'Aspergillus Niger ATCC 20452. 6. Procédé selon la revendication 4 ou 5 caractérisé en ce que la matière végétale fermentable est la pulpe de betterave. 7. L'Aspergillus Niger ATCC 20452. 8 . Le mélange de cellulase, d'hémicellulase et de pectinase obtenu directement par le procédé des revendications 4 à 6.