Brevet FR2300131A1 — publié le 19760903

La présente invention a pour objet un procédé de production d'alcalotdes par cultures "in vitre réalisées en milieu liquide, de cellules de Vinca minor L. (Apocynacées). Il est connu que des cellules de végétaux supérieurs peuvent vivre et se multiplier "in vitro" sous une forme dédifférenciée de façon indéfinie. Ces cellules, en se divisant, donnent naissance soit à des éléments isolés, soit à de petits amas cellulaires (de 2 à 100 cellules), soit encore à des formes plus importantes couramment nommées cals, qui présentent des aspects morphologiques variables t(GAUTHERET, R.J., "La culture des tissus végétaux", Masson, Paris (19593. I1 est également connu que des cellules de végétaux supérieurs cultivées "in vitro" peuvent, sous certaines conditions, biosynthétiser des composés secondaires analogues à, ou différents de ceux qu'elles produisent au sein d'une plante entière en croissance "in situ". Parmi ces composés secondaires, des alcalotdes ont té cités kcf. SUPNIEWSKA, P1.J., Herba Polonica, Suppl.B-19 (1973 En particulier, on a pu mettre en évidence, dans des cals de Vinca minor L et dans les milieux nutritifs semi solides ayant servi à leur prolifération, des alcalotdes, notamment du type de la vincaminePETIARD, V. et DEMARLY, Y. Ami. Amélior. Plantes 22, nO 4, 361-374 (1972)). On doit d'ailleurs noter que, de Vinca minor L. croissant "in situ", il est possible d'extraire une grande variété d'alcalotdes (au moins une trentaine) qui existent dans des proportions relatives variables selon l'écotype analysé et le stade de végétation de la plante. Ces composés peuvent avoir des intérêts divers, en particulier thérapeutiques. D'une façon générale, des cellules végétales cultivées "in vitre conservent l'ensemble de l'information génétique de la plante dont elles sont issues. Ce fait est fréquemment confirmé par l'observation de régénération d'organes ou de plantules à partir d'une ou d'un petit nombre de cellules indifférenciées. Par contre, si l'information concernant une biosynthèse donnée doit être pratiquement toujours conservée, il n'est pas évident qu'elle soit toujours déréprimée, ou encore qu'elle soit dans une situation de régulation quantitative favorable à l'obtention du ou des composés concernés avec un rendement élevé. Du fait des remarques précédentes, on a jugé nécessaire de ne pas se contenter de l'obtention d'une seule souche de cellules de Vinca minor L., mais, au contraire, on a créé, multiplié et entretenu une population variée d'environ quarante souches différentes de cellules de cette espèce, provenant de divers écotypes naturels. On a ainsi augmenté notablement la probabilité de la mise en évidence - d'une part, de souches biosynthétisant des alcalotdes - d'autre part, d'une souche, au moins, les biosynthétisant avec un rendement élevé. La présente invention peut donc autre réalisée par l'adaptation d'une ou de plusieurs de ces souches biosynthétisant activement les alcalotdes à des conditions de culture compatibles avec leur utilisation pour une production industrielle d'alcalofdes. Cette adaptation comporte 1") le passage des cultures croissant en milieu semi-solide gélosé à des cultures croissant en milieu liquide 2 ) l'utilisation de biomasses de taille de plus en plus grande. Le milieu de culture est un élément important de l'environnement cellulaire ; ce dernier conditionne l'état global de régulation génétique de la souche et, entre autres, celui de l'information génétique concernant la biosynthèse des composés recherchés. On donnera ci-après un choix d'exemples non limitatifs illustrant la réalisation de l'invention. Toutes les cultures qu'ils décrivent sont effectuées dans des milieux de culture dont l'originalité consiste dans les types d'association des divers composés utilisés couramment - une solution de macro-éléments minéraux, telle que la solution de HELLER ou celle de MURASHIGUE et SKOOG - une solution d'oligo-éléments minéraux, telle que celle de HELLER, ou celle de MURASHIGUE et SKOOG ;; - une source de fer, par exemple du chlorure ferrique, ou le complexe ferrique d'éthylène-diamine-tétraacétate de sodium - une source principale de carbone organique, par exemple du glucose, du saccharose ou un autre hydrate de carbone - un complexe vitaminique, par exemple la solution référencée B1 (voir exemple 1) - des hormones végétales, c'est-a-dire des modificateurs de croissance, par exemple des auxines et/ou des kinétines - facultativement, des inducteurs de croissance, comme l'albumen liquide de Cocos nucifera L, immature, l'hydrolysat de caséine ou un extrait de levure. On s'est généralement attaché à utiliser des conditions de culture identiques à celles de la souche croissant sur milieu semi-solide, sélectionnée pour sa richesse en alcalotdes, à l'exception des conditions incompatibles avec une adaptation à l'utilisation industrielle de la souche (gélification du milieu, substances coûteuses, cultures en récipients de petite taille). On cherche en effet à conserver au maximum l'état de régulation génétique de la souche retenue par sélection à cause de son potentiel productif. Exemple 1. Obtention de cultures dissociées de cellules de Vinca minor L. en milieu liquide. Parmi la population de souches de cellules de petite pervenche, on en a retenu une, par criblage analytique, à cause de son haut niveau de biosynthèse des alcaloses ; on a mis ceux-ci en évidence et dans les cals et dans le milieu nutritif semi-solide où ils ont diffusé pendant le cycle de culture. Cette souche, référencée 13, a les caractéristiques suivantes 1) Elle est en croissance dans des tubes contenant le milieu nutritif référencé V O1 composé comme suit : - Solution de macro-éléments dite de HELLER Composant Concentration en mg/1 de milieu de milieu Chlorure de potassium : :. 750 Nitrate de sodium.................................. 600 Sulfate de magnésium heptahydraté .................. 250 Phosphate monosodique monohydraté 125 Chlorure de calcium dihydraté 75 - Solution d'oligo-éléments dite de HELLER Composant Concentration en mg/l de milieu de milieu Sulfate de zinc heptabydraté 1 Acide borique................................. 1 Sulfate de manganèse tétrahydraté 0,1 Sulfate de cuivre pentahydraté 0,03 Chlorure d'aluminium hexahydraté 0,05 Iodure de potassium............................... 0,01 Chlorure de nickel hexahydraté 0,03 - Source de fer Chlorure ferrique hexahydraté 1 mg/l de milieu - Source de carbone Glucose 30.000 mg/l de milieu - Solution de vitamines référencée B1 Concentration ea sg/l Composant de milieu Pantothénate de calcium................................. 1 Pyridoxine 1 Acide nicotinique 1 Thiamine 1 Meso-inositol ..................... 10 Biotine 0,1 - Modificateur de croissance Acide (dichloro-2,4 phénoxy)-2 acétique 0,1 mg/l de milieu - Agent de solidification Gélose 7.000 mg/l de milieu Le milieu est ajusté à pH 5,6, si nécessaire,, et il est stérilisé à l'autoclave sous une pression de vapeur de 0,7 bar pendant 20 minutes. Après implantation sur ce milieu du cal inocuîum, les tubes sont placés, dans des conditions parfaitement homogènes, à une température de 230 environ et sous un éclairement ainsi défini - spectre lumineux type lampe Sylvania Gro -Lux, - intensité lumineuse de l'ordre de 5.000 lux, - photopériode de l'ordre de 16 heures par jour. 2) Morphologiquement, les cals ont les caractères ci-dessous - ils sont d'un vert très intense, et donc ils sont fortement chlorophylliens ; - ils ne sont pas morphogènes - ils sont strictement non dissociés - ils possèdent une friabilité variable selon la zone considérée : la partie inférieure, en contact avec le milieu semi-solide et s'y enfonçant partiellement, est beaucoup plus friable que le sommet du cal. 3) La vitesse de croissance de cette souche est telle que, repiquée toutes les six semaines, elle présente une augmentation de biomasse de l'ordre de 200% de celle de l'implant par cycle de culture. A partir de cette souche 13, telle que définie ci-dessus, on a obtenu une culture, croissant en milieu liquide, et dissociée en cellules et petits groupements celulaires. Pour réaliser cette adaptation, on a prélevé aseptiquement la biomasse friable constituant la partie inférieure d'un ou de plusieurs cals. On l'a inoculée dans une fiole d'Erlenmeyer stérile de 250 ml renfermant 50 mî d'un milieu liquide similaire au milieu V 1 à l'exception, bien entendu, de la gélose. Eventuellement, pour faciliter le conditionnement du milieu par les cellules, on peut augmenter la taille de l'inocuîum en introduisant également un ou des fragments de la partie peu friable des cals ; ces fragments jouent alors un r81e communément dit de "nourrice". Les fioles d'Erlenmeyer ainsi inoculées sont placées dans les conditions suivantes - agitation circulaire, horizontale et permanente de 120 rotations par minute, environ - température ambiante de 23 , environ - éclairement ambiant résiduel d'une intensité de 250 à 500 lux et de 16 heures par 24 heures. Dès les premières vingt-quatre heures de culture, on observe une dissociation mécanique des masses de tissu inoculées en éléments de taille réduite et d'aspect cotonneux. Huit à dix jours environ après la date d'inoculation, on peut déceler macroscopiquement un début d'augmentation de la densité de la culture, donc de la biomasse. Quatre à six jours plus tard, soit sensiblement deux semaines après l'inoculation, la culture est suffisamment importante pour permettre un repiquage dans un milieu nutritif neuf. Mis à part les cals éventuellement introduits comme "nourrices et les fragments de cals non dissociés, on est en présence d'une culture dont la taille maximale des amas cellulaires est de l'ordre de 1,0 à 1,5 mm de diamètre et dont le niveau chlorophyllien est, bien que notable, nettement inférieur à celui de la souche 13 de départ. L'aspect microscopique de la culture est présen té dans la figure 1 ) et où d l'on peut voir que les cellules croissent sous a) b) > forme de courts filaments ; ceux-ci sont parfois réunis en masses sphériques plus importantes, observables macroscopiquement. Exemple 2. Cultures définies en fioles d'Erlenmeyer de cellules de Vinca minor L. On repique les cultures dissociées, obtenues selon exemple 1, dans le même milieu nutritif, et l'on place les fioles d'Erlenmeyer inoculées dans les mêmes conditions que celles décrites dans cet exemple. Pour cela, on sépare aseptiquement par filtration sur toile à bluter (Blutex Superset NO 50, taille des pores 48 ) le milieu nutritif liquide de la biomasse en dissociation. Après avoir enlevé de cette dernière les cals en fragments de cals non dissociés, on l'inocule, en partie ou totalement selon son importance, dans un milieu nutritif neuf V 01 sans gélose. Généralement, la densité de la culture dissociée obtenue ne permet pas de la fragmenter en plusieurs inoculums, et cela pour deux raisons principales 1) Afin d'avoir un minimum d'hétérogénéité, on a seulement utilisé, pour la dissociation telle que décrite dans l'exemple 1, les parties inférieures de 3 ou 4 cals, ce qui représente une masse végétale relativement restreinte. Lors du premier passage en milieu liquide, on observe rarement une croissance notable de la culture. La biomasse 'obtenue en fin de la phase de dissociation n'est donc que légèrement supérieure à l'implant d'origine. 2) La suppression des éléments non dissociés de la culture diminue encore notablement sa taille. Le conditionnement du milieu nutritif neuf utilisé nécessitant un implant minimum, on est donc généralement amené à réinoculer toute la biomasse obtenue selon l'exemple 1. L'élimination des groupements non dissociés et de la "nourrice" éventuelle compense sensiblement la faible augmentation de matière végétale due à la croissance des éléments dissociés. Ainsi, ce second cycle de culture en milieu liquide part d'inoculums de taille à peu près identique à celle des implants mis en dissociation. Comme dans l'exemple 1, la durée de ce deuxième cycle de culture en milieu liquide est variable (de 7 à 15 jours) en fonction de la croissance observée. Si nécessaire, on peut la prolonger jusqu'à obtention d'une culture de densité suffisante pour qu'elle soit repiquable. Cette méthodologie de repiquage et de sélection des éléments dissociés est répétée (en général 4 ou 5 fois) tant que le rythme de croissance de la culture ne permet pas de diviser la biomasse obtenue en plusieurs inoculums différents, Généralement, on observe une diminution progressive de la durée nécessaire à l'obtention d'une culture repiquable au fur et à mesure que le nombre de cycles déjà effectués en milieu liquide augmente. Après cette période d'adaptation et de stabilisation, on obtient donc ainsi, à partir de la souche 13 cultivée en milieu semi-solide, une culture stable en milieu liquide, repiquée par filtration et divisée en deux ou trois implants égaux tous les sept jours. Cette souche, référencée 13L a les caractéristiques morphologiques suivantes - la biomasse en est vert clair et donc nettement moins chlorophyilienne que celle de la souche 13 initiale - elle est toujours strictement non morphogène ; - elle est composée d'éléments dont la taille varie d'environ 50 ss (cellule isolée) à 0,5 - 1,5 mm (diamètre des groupements sphériques les plus importants) - son niveau de dissociation est stable, c'est-à-dire que la distribution des différents éléments selon leur taille est sensiblement constante au cours des différents repiquages - son aspect cytologique est encore tel que représenté dans la figure I. Physiologiquement, la croissance de la souche 13L est ainsi caractérisée : - la culture est réalisée dans des fioles d'Erlenmeyer de 250 ml, 500 ml ou 1.000 ml, contenant, respectivement, 50 ou 100 ml, 200 ml ou 400 ml de milieu nutritif V 1 sans gélose défini dans l'exemple 1 - ces fioles sont placées dans les conditions précédemment décrites dans le même exemple - la cinétique de croissance et la densité de la culture sont telles que représentées dans les figures 2 et 3. La définition de ces courbes a été réalisée sur une période de 21 jours, par établissement régulier (tous les 2 ou 3 jours) de la moyenne du poids frais des cultures et de celle des volumes de milieu nutritif correspondant, après que l'on ait séparé par filtration ces deux éléments quantifiés. On a vérifié que la "teneur en sec" de la matière végétale représentant le rapport poids seclpoids frais est sensiblement constante au cours d'un cycle de croissance. Le poids sec moyen de la culture par fiole d'Erlenmeyer évolue donc parallèlement à son poids frais. La figure 3 montre nettement que la cinétique d'augmentation du poids frais en fonction du temps d'une culture de la souche 13L comporte deux phases a) de O à 8 jours, on observe une croissance exponentielle représentée par une graphe linéaire en coordonnées semi-logarithmiques. I1 est à noter que le temps de latence existant parfois au début d'une culture de cellules de végétaux supérieurs est ici pratiquement négligeable. Durant cette phase exponentielle, la durée nécessaire au doublement du poids frais de la biomasse est de l'ordre de 3 jours à 3 jours et demi. b) de 8 à 21 jours, il y a croissance constamment amortie, représentée dans le même système de coordonnées, par un graphe courbe tendant vers une parallèle à l'axe des abscisses. La densité de la culture augmente de façon similaire à celle de son poids frais, mais plus rapidement et plus fortement. En fait, cette évolution est le résultat de deux phénomènes : l'augmentation de la biomasse, d'une part, et la concentration du milieu nutritif par évaporation, d'autre part. Cette augmentation de la densité de la culture est légèrement plus rapide et plus forte que celle de son poids frais, parce que la quantité de matière végétale croit dans un volume de milieu qui diminue. En plus de l'aspect pratique (programmation aisée des manipulations), cette ohservations justifie le choix d'une périodicité de repiquage de 7 jours pour cette souche 13L En effet, après ce temps de culture, l'augmentation de la biomasse est de l'ordre de 200 % à 300 % du poids de l'implant, on peut donc diviser la masse végétale obtenue en 3 ou 4 inocu2ums égaux tout en maintenant la culture en situation de croissance exponentielle. Selon cet exemple 2, on obtient donc une souche de cellules de Vinca minor L., référencée 13L, cultivée en milieu liquide, et dont un certain nombre de caractéristiques sont bien connues. Cette souche est stable et entretenue de façon indéfinie par repiquages successifs. Elle peut servir de référence et de base de départ à des études sur des volumes de culture beaucoup plus importants. Exemple 3. Culture en réacteur d'une souche de Vinca minor L. référencée 13L Avec la souche 13L obtenue selon les exemples 1 et 2, on réalise des cultures en milieu liquide dans des réacteurs de 4 litres de volume total et de 2,6 litres de volume utile. I1 s'agit là d'un stade intermédiaire entre la culture en fiole d'Erlenmeyer et celle en fermenteur, nécessité par le besoin d'un inoculum de taille suffisante pour implanter ce dernier. Le réacteur, conçu d'après l'appareil mis au point par WILSON, S.B., KING, P.J. et STREET, H.E. ( Exp. Botany, 22, na 70, 177-207 (Février 1971) ) a été perfectionné par addition d'un moyen antimousse mécanique entraîné par l'axe d'agitation et d'un condenseur placé à la sortie d'air, évitant une diminution du volume de culture par simple évaporation du milieu nutritif. Il n'a jamais été utilisé en continu dans le cadre de cet exemple. La stérilisation de l'appareil contenant 1,5 1 de milieu V Ol sans gélose est effectuée à l'autoclave sous une pression de vapeur de 1 bar pendant 30 minutes, en prenant la précaution de laisser la vapeur circuler dans l'appareil. Après refroidissement, on inocule le réacteur par surpression. Pour cela, on utilise un flacon intermédiaire, nommé "appareil à inoculer", comportant quatre possibilités de raccordement (deux pour l'entrée et la sortie d'air stérile et deux pour l'apport et la sortie de l'inoculum). Ce flacon est préalablement stérilisé par passage à l'autoclave pendant 30 minutes sous pression de vapeur de 1 bar. On place dans cet appareil - d'une part, 200 ml d'une culture de la souche 13L réalisée en fiole d'Erlenmeyer de 500 ml et âgée de 7 jours, donc encore en phase exponentielle de croissance. La masse végétale de cette culture a un poids frais de l'ordre de 20 g à 40 g. - d'autre part, environ 900 ml de milieu V 1 stérile sans gélose. L'ensemble est ensuite poussé par surpression d'air stérile dans le réacteur, apportant ainsi l'inoculum et complétant le volumetotal de l'ensemble à 2,6 1 (1,5 1 + 0,2 1 + 0,9 1). Les conditions de culture utilisées sont les suivantes - éclairement résiduel : environ 250 lux - température de culture : 30"C (appareil thermiquement auto-régulé) - aération t 0,2 à 0,3 litres d'air stérile par minute, soit sensiblement de 0,08 111/min. à 0,12 1/1/min. ss - agitation par barreau magnétique suspendu, tournant à une vitesse de 60 à 80 rotations par minute ; - bris partiel de mousse pouvant se former par rotation de l'organe antimousse à la même vitesse que l'agitateur. Le suivi de l'évolution de la culture est réalisé par un contrôle journalier des différents paramètres énumérés ci-dessus et, éventuellement, par prélèvements réguliers, effectués stérilement et par surpression, d'échantillons de la culture. Sur un échantillon, on mesure le poids frais et le poids sec de la biomasse et on en déduit sa "teneur en sec". On peut aussi, Si cela est jugé nécessaire, effectuer un contrôle bactériologique de la culture afin d'en vérifier la stérilité. S'il se forme des dépôts cellulaires sur les parois du réacteur ou sur les éléments plongeant dans le milieu nutritif, on peut agiter manuellement l'ensemble de l'appareil, afin de les remettre en suspension. On évite ainsi une nécrose possible de ces amas cellulaires risquant d'entrainer celle de l'ensemble de la culture. Après 10 à 12 jours de croissance dans ces conditions, on obtient une biomasse dont le poids frais est de l'ordre de 120 à 240 g, ce qui représente une augmentation de 500 % environ par rapport à l'implant d'origine, soit une croissance similaire à celle que l'on obtiendrait après deux cycles et demi de division cellulaire en phase exponentielle. Globalement, on aurait donc un temps de doublement apparent de la biomasse de l'ordre de 4 à 6 jours, soit légèrement supérieur à celui de la même souche cultivée en fiole d'Erlenmeyer. En réalité, le rythme reste sensiblement inchangé, que la culture soit réalisée en réacteur ou en fiole. La diminution du taux global de croissance est simplement due au fait que cette dernière n'est pas continuellement en phase exponentielle. Tout d'abord, dans certains cas, il y a un temps de latence de l'ordre de 1 à 2 jours, vraisemblablement provoqué par une implantation beaucoup plus faible en réacteur ( de l'ordre de 7 à 15 g par litre ) qu'en fiole d'Erlenmeyer (environ 30 g). De plus, la croissance exponentielle ne dure que 7 à 8 jours et, rapide ment,la vitesse d'augmentation de la biomasse diminue. En dehors de cette différence, uniquement provoquée par ces changements dans les conditions expérimentales (densité d'implantation et temps de culture), les caractères morphologiques et physiologiques de la souche 13L cultivée en réacteur restent pratiquement identiques à ceux de la même souche cultivée en fiole d'Erlenmeyer (voir exemple 2). Selon cet exemple 3, on obtient la biomasse minimale de cellules de Vinca minor L. (souche 13L ) suffisante pour inoculer un volume de culture de l'ordre de 12 litres. Exemple 4. Culture en réacteur d'une souche de cellules de Vinca minor L. référencée 3L On a obtenu une souche, référencée 3Lss de cellules de Vinca minor L., cultivée en milieu liquide dans des fioles d'Erlenmeyer, issue de la souche 3 sélectionnée pour sa richesse en alcaloïdes et entretenue sur milieu semi-solide. Cetre souche 3L possède les caractéristiques morphologiques suivantes - la biomasse en est blanche et donc absolument non chlorophyllienne - elle est strictement non morphogène - elle est composée d'éléments dont la taille varie de 50 CI environ (cellule isolée) à 1,5 mm de diamètre (pour les groupements cellulaires sphériques les plus importants) - son niveau de dissociation est stable - son aspect cytologique est sensiblement identique à celui de la souche 13L, excepté, bien sûr, la présence de chlorophylle dans cette dernière. Physiologiquement, la croissance de la souche 3L est ainsi caractérisée - La culture est réalisée dans les mêmes conditions de milieu et d'environnement que celles utilisées pour l'entretien de la souche 13L, le volume de milieu nutritif placé dans une fiole de 250 ml pouvant être de 50 ou de 100 ml; - la cinétique de croissance et l'évolution de la densité de la culture sont telles que représentées dans les figures 4 et 5. Les courbes ont été définies comme il a été indiqué dans l'exemple 2. Dans ce cas aussi, le poids sec évolue de façon sensiblement parallèle au poids frais. Pour cette souche 3Lss le déroulement de la croissance n'est pas identique à celui de la souche 13L précédemment décrit ; il comprend 3 phases et n'est absolument pas classique, c'est-à-dire semblable à ceux couramment observés sur les cultures de cellules de végétaux supérieurs. Ces trois phases sont les suivantes a) De O à 6 jours, la croissance présente un amortissement constant rapide. Elle est figurée par un graphe courbe tendant vers une parallèle à l'axe des abscisses en coordonnées semi-logarithmiques. Contrairement à cela, pour d'autres souches, durant cette période de début de culture, il existe souvent un temps de latence caractérisé par une accélération plus ou moins forte de la vitesse d'augmentation de la biomasse. Pour la souche 3Lss ce type d'évolution initial peut être ainsi interprété : il n'y a pratiquement pas de temps de latence et la phase exponentielle interrompue lors du repiquage se poursuit. Celle-ci se limite à 1 ou 2 jours. Après cette courte période, on observe, de 2 à 6 jours environ, un amortissement constant de l'augmentation de poids frais. Biologiquement, ce phénomène est caractéristique de l'apparition rapide d'une situation où la croissance de la culture est de plus en plus nettement limitée par un facteur physique ou chimique de l'environnement cellulaire. b) De 6 à 15 jours, on observe une croissance exponentielle de la culture, caractérisée par un graphe linéaire en coordonnées semi-logarithmiques. c) De 15 à 21 jours, l'augmentation de la biomasse est de nouveau dans une période d'amortissement constant. Comme précédemment, elle est caractéri sée par un graphe courbe tendant vers une parallèle à l'axe des abscisses dans le système de représentation choisi. Ces deux dernières phases sont similaires à celles habituellement observées sur des cultures de cellules de végétaux supérieurs, y compris celles de la souche 13L (exemple 2). Comme pour cette dernière, la densité de la culture évolue selon une allure similaire à celle de son poids frais, mais plus rapidement et plus fortement. - - La fréquence des repiquages nécessités par l'entretien de la souche 3L est de 7 jours. Après ce temps, l'augmentation de la biomasse est de l'ordre de 100 % par rapport à l'implant, ce qui correspond globalement à 1 cycle de division cellulaire. On peut donc entretenir cette souche en scindant, tous les 7 jours, la masse végétale obtenue en 2 inoculums égaux. La culture est ainsi repiquée en limite des phases a) et b). La culture en réacteur de cette souche 3L est effectuée dans l'appareil et dans les conditions d'inoculation et de développement décrits dans l'exemple 3, à l'exception de l'éclairement ; effectivement, elle peut être réalisée in différemment dans une obscurité totale et permanente ou en présence d'une faible lumière résiduelle. En partant d'un inoculum dont le poids frais est de 30 g environ, après 15 jours de croissance dans ces conditions, on obtient une biomasse dont le poids frais est de l'ordre de 120 g, ce qui représente une augmentation de 300 Z environ par rapport à l'implant d'origine. Le développement de la souche 3L a donc une cinétique et un résultat global sensiblement identiques, qu'elle soit placée en fiole d'Erlenmeyer ou en réacteur. Ses caractères morphologiques et physiologiques précédemment définis restent également inchangés. Exemple 5. Culture en fermenteur d'une souche de cellules de Vinca minor L. référencée 3L La production d'alcalordes par culture de cellules de Vinca minor L. ne peut être mise au point, en vue d'une utilisation industrielle, qu'avec des appareils de taille suffisante, du type fermenteur ; en effet, les rendements fournis par la biosynthèse de ces composés sont relativement bas, que ce soit "in situ" ou "in vitro", même pour une souche sélectionnée. Pourtant, dans certains cas, le taux des alcaloïdes synthétisés par des cultures de tissus est supérieur à celui généralement observé dans les plantes dont elles sont issues. L'ensemble des exemples précédents rapporte les différentes étapes pratiquement indispensables pour adapter les souches et atteindre le stade de la présente réalisation. Le terme de fermenteur qui sera repris tout au long des descriptions à venir est propre à l'appareil employé, mais n'implique pas qu'il s'agisse de fermentations au sens bactériologique du terme. Le fermenteur utilisé pour les travaux décrits dans cet exemple 5 est un appareil de 15 litres de volume total et de 12 litres de volume utile, de type "Magnaferm" commercialisé par la Société New Brunswick. On lui a adjoint un moyen permettant de prélever stérilement à tout moment un échantillon de la culture. Ce système comprend une ampoule de 150 ml raccordée à une canne plongeant dans la culture et une réserve d'eau pour le rinçage des circuits de pré lèvement. D'autre part, des moyens destinés à la mesure, l'enregistrement et la régulation du pH et de la tension d'oxygène dissous dans le milieu de culture sont également adjoints à l'appareil principal. On introduit dans le fermenteur 10 1 de milieu V 01 sans gélose et l'ensemble, y compris le moyen de prélèvement, est stérilisé à l'autoclave sous une pression de vapeur de 1 bar pendant 40 minutes. Une précaution nécessaire consiste à laisser circuler la vapeur dans l'appareil et les divers canalisations et filtres adjoints. Après refroidissement, on étalonne les appareils de mesure de pH et de densité d'oxygène dissous aux conditions physiques (T,, agitation et aération) qui seront maintenues par la suite. On inocule le fermenteur de façon à obtenir la densité cellulaire de début de culture préalablement souhaitée (en principe, de l'ordre de 5 à 15 g/l). Pour cela, après avoir raccordé stérilement une canalisation d'un réacteur à une autre du fermenteur, on pousse, par surpression d'air stérile, l'ensemble du milieu et des cellules d'une partie des 2,5 litres environ contenus dans le réacteur et agités pour en maintenir l'homogénéité. L'importance du volume inoculé est défini en fonction de deux critères, la densité de la culture en fin de cycle en réacteur, d'une part, et celle souhaitée en début de cycle en fermenteur, d'autre part. Par conséquent, si l'on a un inoculum total d'un poids frais de 120 g, soit d'une densité de 48,0 g/l (120/2,5) et que l'on veuille débuter la culture en 2,5 fermenteur à la densité de 6 g/l environ, on inoculera 1,5 litres. Dans ce cas, le volume total en début de cycle est donc de 11,5 litres (10 1 + 1,5 1). La partie restante de l'inoculum est en général utilisée pour préciser certaines de ses caractéristiques, comme sa densité et sa "teneur en sec" exactes et pour contrôler la stérilité et le taux d'alcalotdes totaux du milieu nutritif et de la biomasse inoculés. Les conditions utilisées pour la culture en fermenteur sont les suivantes - obscurité totale et permanente - température :- 300 + 0,20 au sein du milieu nutritif - aération : 1,5 1 d'air stérile par minute, soit 0,121 1/1/minutie - agitation avec un axe portant des pales à deux niveaux et tournant à une vitesse de 100 rotations par minute - si nécessaire, rotation du moyen antimousse à des vitesses variant entre 300 et 1.500 rotations par minute, selon l'importance de la mousse pouvant se former à la surface du milieu nutritif. Tous les paramètres définis ci-dessus sont régulièrement contrôlés (2 fois par jour) et éventuellement réajustés. De même, si besoin est, on remet journellement en suspension tout ou partie des dépôts cellulaires pouvant s 'a- masser sur les parois ou sur les éléments internes du fermenteur et risquant de se nécroser. Dans ce but, on accélère fortement et très brièvement la vitesse d'agitation, ce qui provoque des remous entrainant ces départs. Régulièrement, aussi, selon la phase de croissance et les contrales envi sagés, on prélève stérilement un échantillon représentatif de la culture, d'un volume de 100 ml environ. On en détermine le poids frais, le poids sec, donc la "teneur en sec" et, éventuellement, le taux d1alcalotdes totaux diffusés dans le milieu nutritif. On peut, bien sûr, ramener toutes les valeurs ainsi déterminées au litre, ctest-a-dire définir les diverses caractéristiques concernant la densité de la culture. A l'occasion, on peut effectuer un contrôle bactériologique sur le prélèvement, pour vérifier la stérilité de la culture. Le pH du milieu et sa tension en oxygène dissous sont continuellement mesurés et enregistrés ; le pH varie entre 5,2-5,4 et 6,0-6,5 ; la tension d'oxygène dissous diminue, du début à la fin du cycle de croissance, de 20 Z environ de son niveau mesuré dans les possibilités maximales d'aération (15 I/min.) et d'agitation (700 rotations par minute) de l'appareil ; en général, avant indcu- lation sous les conditions normales de culture, elle est à 80 % environ de ce niveau maximum, alors qu'en fin de cycle elle n'est plus qu'à sensiblement 60 %. Vingt et un jours après l'inoculation, on arrête l'appareil et l'on récupère le milieu nutritif, d'une part, et la biomasse, d'autre part, en les séparant par filtration sur toile à bluter (Blutex Superset n 50). Le volume de milieu obtenu est de l'ordre de 10 litres ; il correspond à celui de début du cycle de croissance, moins celui des divers prélèvements (de 10 à 15) réalisés au cours de ces 21 jours. La diminution par évaporation est très réduite, grâce au condenseur placé en sortie d'air sur l'appareil d'origine et au faible niveau d'aération utilisé. La biomasse ainsi séparée du milieu nutritif a un poids frais de l'ordre de 540 g, ce qui correspond à une densité de 54 g/l environ. Les figures 6, 7 et 8 montrent l'évolution de divers paramètres au cours d'un cycle de culture de 21 jours, débutant avec un inoculum de 70 g dans un stade de différenciation connu. Le développement de la cinétique de croissance comprend 3 phases (voir figure 8). a) de O a 2 jours et demi, on observe une phase de latence classique caractérisée par une augmentation progressive de la vitesse de croissance. Cette phase est habituellement rencontrée dans les cinétiques de culture de cellules de végétaux supérieurs. Dans le càs de cellules de la souche 3 elle peut avoir lieu ou non, ou encore être remplacée par une période d'amortissement constant de l'augmentation de la biomasse (voir exemple 4). Ces différents types d'évolution de la croissance au cours des premiers jours d'une culture de cellules de la souche 3L se sont tous présentés au niveau d'études en fermenteur. Leur déterminisme est lié, entre autres facteurs, à ltétat de différenciation cellulaire de l'inoculum, à sa taille et, en conséquence, à la densité du début de cycle. b) de 2 jours et demi à 14 jours5 l'augmentation de la biomasse est exponentielle et donc caractérisée par un graphe linéaire dans un système de coordonnées semi-logarithmiques. c) de 14 à 21 jours5 on observe une phase dite d"'entrée en plateau" au cours de laquelle la croissance est en amortissement constant ; elle est représentée par un graphe courbe tendant vers une parallèle à l'axe des abscisses dans le même système de représentation. Sur les figures 7 et 8, on peut noter que, dans l'ensemble, l'évolution de la densité de la culture exprimée en poids sec par litre est sensiblement identique à celle exprimée en poids frais. La seule différence notable porte sur la phase c) qui s'engage moins nettement et moins rapidement pour la croissance en poids sec que pour celle en poids frais. Ce fait est corrélé à une augmentation notable de la "teneur en sec" à partir de 13 ou 14 jours et il exprime une importante différenciation cellulaire comportant vraisemblablement une accumulation de substances dans le cytoplasme. La croissance en poids sec est en effet le résultat de la division cellulaire, mais également celui de l'évolution de la quantité de matière sèche par cellule, c'est-8-dire d'un élément de la différenciation. Les densités de début et de fin de cycle d'une culture en fermenteur de la souche 31sont fort variables (respectivement de 5 à 15 g/l et de 40 à 120 g/ 1). De même, bien que le type d'évolution des divers paramètres décrit ci-dessus soit classique, il n'a pas été le seul observé au cours de ces réalisations. Les différences notables entre les diverses cinétiques des croissances réalisées portent essentiellement sur les caractéristiques de la phase a) et sur les durées respectives des phases a), b) et c). Les variations de pH et de la tension en oxygène dissous du milieu nutritif étant directement ou indirectement corrélées à celles de la croissance, le type d'évolution de ces paramètres est variable, lui aussi, selon la réalisation considérée. En dehors des différences éventuelles que l'on vient de citer, les cultures en fermenteur de cellules (souche 3L) de Vinca minor L. conservent des caractéristiques morphologiques et physiologiques identiques à celles décrites dans l'exemple 4 à propos de la définition de cette souche. Selon cet exemple 5, on obtient donc, d'une part, environ 540 g (poids frais) de cellules de Vinca minor L., souche 3La et d'autre part, 10 litres de milieu de culture ayant servi à leur prolifération. Sur ces deux éléments d'une culture on pourra effectuer des recherches de composés secondaires, tels des alcalotdes. Exemple 6. Culture en fermenteur d'une souche de cellules de Vinca minor L. référencée 13L Selon l'exemple 3, on a réalisé une culture en réacteur de cellules de la souche 13L et on a ainsi obtenu une biomasse suffisante pour inoculer un volume de 12 litres. Dans des conditions strictement similaires à celles décrites dans l'exemple 5, à l'exception de l'éclairement qui est ici maintenu à un niveau résiduel de 250-lux, on cultive cette souche 13L dans un fermenteur. Après 21 jours, la culture aboutit à une biomasse dont les caractéristiques physiologiques et morphologiques sont semblables à celles décrites dans l'exemple 2 à propos de la même souche cultivée en fiole d'Erlenmeyer. Ainsi, selon cet exemple 6, on obtient des échantilons de matériel végétal de Vinca minor L. (souche 13L) et de milieu nutritif ayant servi à sa proli fération,en quantité suffisante pour effectuer des recherches de composés secondaires, tels des alcalotdes. Exemple 7. Extraction des aîcaîotdes de la biomasse et du milieu nutritif d'une culture en fermenteur de cellules de Vinca minor L (souche Selon exemple 5, on a obtenu une biomasse de cellules de Vinca minor L. (souche 3L) dont le poids frais est de sensiblement 540 g. Simultanément, on a conservé les 10 litres environ de milieu nutritif ayant servi à la prolifération de ces cellules. On extrait les alcaloses totaux de ces échantillons et, éventullement, si nécessaire pour la production souhaitée, on sépare les divers composés qu'ils contiennent afin de les identifier. Pour cela, à la fin d'un cycle de croissance de 21 jours, on récupère, non aseptiquement et par surpression, l'ensemble du milieu nutritif et des cellules contenu dans la cuve. On sépare ces deux éléments de la culture par filtration sur toile à bhi ter dont la taille des pores est de 48 > . La distinction entre le milieu nutritif et la masse végétale est ainsi réalisée de façon reproductible. I1 reste cependant des débris végétaux en suspension dans le filtrat et, de même, les groupements cellulaires contiennent encore du milieu. La limite de séparation est donc arbitrairement fixée à l'élément de taille égale à celle de la cellule isolée, mais ceci permet une comparaison aisée des résultats. La biomasse obtenue a un poids frais de 540 g (voir exemple 5). Si on ne peut pas la traiter immédiatement, on la conserve par congélation ou par lyophilisation. La phase liquide doit être extraite dans un délai très court après sa sortie du fermenteur. Ainsi, une contamination n'aura ni le temps de se développer ni celui de modifier la composition chimique de l'échantillon étudié. Les techniques utilisées pour l'extraction des alcaloses totaux sont les suivantes I) A partir du milieu nutritif concentration à 60 sous pression réduite jusqu'à diminution du volume des 9/10 de sa valeur initiale, soit, à partir de 10 litres, jusqu'à résidu de 1 litre environ ; - acidification à pH 1 par de l'acide sulfurique à 5 % - alcalinisation à pH 9-10 par de l'ammoniaque concentré - addition d'un volume de chloroforme pur pour analyse double de celui de la phase aqueuse - longue et forte agitation de l'ensemble - filtration sur filtre en verre fritté nO 3 - décantation - séparation des deux phases par filtration sur filtre hydrophobe. Cette étape de la manipulation facilite l'élimination des émulsions dues à la présence de fortes concentrations de glucose dans le milieu nutritif (voir exemple 1) .; - séchage de la phase chloroformique par addition de sulfate de sodium anhydre ; - concentration à 400 et sous pression réduite jusqu'à obtention d'un résidu sec - récupération de ce résidu - contrôle par le réactif de Meyer de la nature alcaloidique des composés ainsi obtenus - quantification par gravimétrie de l'extrait sec. Le choix de cette méthodologie simplifiée, qui n'est donc pas strictement classique, est Justifié par la nature du produit à traiter. En effet, un milieu nutritif ayant servi à la prolifération en fermenteur de cellules de végétaux supérieurs contient bien moins de composés pouvant interférer avec ou sur des alcaloïdes que des plantes sèches de la même espèce, du fait de l'insolubilité en milieu aqueux de ces composés ou de leur stricte localisation à certains niveaux cellulaires. D'autre part, les produits initialement introduits dans le milieu nutritif sont bien connus et la limite maximale de leur interférence éventuelle est facilement évaluée quantitativement. Selon la production en cours, divers tests séparatifs et analytiques sont choisis et effectués sur 1 extrait alcaloSdique obtenu - réactions spécifiques - chromatographies en couche mince, en présence de témoins, et mesures de Rf - chromatographies en couche épaisse - chromatographies liquides sous haute pression - révélations spécifiques - études des spectres d'absorption de la lumière ultra-violette et infra rouge par les composés séparés - analyse élémentaire, etc... Le milieu nutritif obtenu selon l'exemple 5 a ainsi fourni un extrait sec d'alcalotdes totaux dont les caractéristiques sont les suivantes - quantitativement, il a un poids sec d'environ 450 mg, ce qui correspond à une teneur du milieu nutritif en alcaloïdes de 45 mg/l, soit à or045 = 2,5 % du poids sec de la matière végétale ayant diffusé ces composés, 1,8 puisque la densité de la culture, au bout de 21 jours, est de 1,8 g/l. (poids sec). Il est à noter que la teneur en alcaîotdes totaux de Vinca minor L dépas se rarement 1 % du poids sec, chez la plante cultivée "in situ". - quaiitativement, l'extrait sec comprend environ vingt composés diffé rents, tous de nature alcalordique. Certains parmi ceux-ci sont typiquement vincaminiques. II) A partir de la biomasse séparée du milieu - séchage ou non, selon le type de conservation, par dessiccation dans une "poire à solides", sur un évaporateur rotatif à une température de 50 à 60 et sous pression réduite.On obtient ainsi environ 18 g de matiere sèche - broyage jusqu'a obtention d'une poudre fine - tamisage - alcalinisation par une solution aqueuse de carbonate de sodium à 5 Z ; - homogénéisation de l'ensemble - dessiccation à 40C dans une étuve sous pression réduite - nouveau broyage, suivi d'un tamisage - extraction à froid, pendant 30 heures, du broyat dans un extracteur double, par du benzène, lui-même réextrait par de l'acide sulfurique à 5 Z ; -soutirage des deux phases liquides ; - décantation en ampoule ; - séparation, élimination de la phase benzénique et récupération de la phase aqueuse - alcalinisation à pH 9-10 par de l'ammoniaque concentré ;; - trois extractions successives de cette phase aqueuse alcalinisée avec du chloroforme pur pour analyse - séchage des phases chloroformiques réunies sur du sulfate de sodium anhydre; - concentration à 40 sous pression réduite jusqu'a obtention d'un résidu sec; - récupération de ce résidu - contrôle par le réactif de Meyer de la nature aîcalotdique des composés ainsi obtenus - quantification par gravimétrie de l'extrait sec. Ce type d'extraction à froid a été retenu pour tenter de réduire au maximum des altérations toujours possibles des composés recherchés. Sur le résidu sec ainsi obtenu, on réalise des séparations et des tests analytiques semblables à ceux appliqués à l'extrait de milieu nutritif. Selon cette technique, on obtient donc un pool d'alcalotdes totaux dont les caractéristiques sont les suivantes - quantitativement, il a un poids sec de 35 mg environ, ce qui correspond à une teneur en alcaloïdes de la matière sèche de 0,035 , soit sensible 18 ment 0,2 %. Cette teneur est 12,5 fois plus faible que celle du milieu nutritif ramenée à la densité en poids sec de la culture (2,5 %). - qualitativement : la diversité, d'une part, et la nature, d'autre part, des divers composés de 1'extrait de la biomasse sont tout à fait sembla bles à celles de l'extrait du milieu nutritif. Ainsi, la quantité totale d'alcalotdes contenus dans une culture en fermenteur de cellules de Vinca minor L (souche 3L)' après 21 jours de croissance, est de 450 + 35 = 485 mg. Le taux global de production par rapport à la matière sèche est donc de 0,485 = 2,69 Z, ce qui est très nettement supérieur (presque 18 le triple) aux teneurs couramment rencontrées dans la plante sèche, bien que cette production soit réalisée en un temps beaucoup plus court "in vitro" (21 jours) qu"'in situ" (1 ou 2 récoltes annuelles). D'autre part, la majeure partie des produits biosynthétisés est diffusée dans le milieu nutritif (sensiblement 92,8 %), ce qui présente des avantages technologiques fort appréciables. Selon cet exemple 7, on obtient donc environ 485 mg d'alcalotdes totaux, contenant des composés de nature vincaminique, extraits d'une culture de cellu les de Vinca minor L (souche 3L ) effectuée dans un fermenteur selon la méthode décrite dans l'exemple 5. ExemPle 8. Extraction des alcalotdes de la biomasse et du milieu nutritif d'une culture en fermenteur de cellules de Vinca minor L (souche 13L) Selon l'exemple 6, on a obtenu, en 21 jours par culture en fermenteur, une biomasse de cellules de Vinca minor L (souche 13 L) et on a conservé le milieu nutritif ayant servi à leur prolifération. Par des techniques similaires à celles décrites dans l'exemple 7, on ex trait, sépare et analyse le pool d'alcalotdes totaux contenu dans ces échantil lons. On produit ainsi des composés alcalotdiques en quantité comparable et de nature similaire à ceux recueillis à partir d'une culture de souche 3L (exemple 7). En particulier, certains des alcaloïdes obtenus sont de type vincaminique, la majeure partie des substances biosynthétisées est diffusée dans le milieu nutritif et le rendement de production est très supérieur à celui d'une extraction de la plante cultivée "in situ". Les exemples non limitatifs décrits ci-dessus rapportent un mode de production d'alcalotdes totaux de Vinca minor L. Cette technique est basée sur l'utilisation du potentiel biosynthétique accumulé au cours de l'évolution dans l'information génétique des cellules de cette plante. Ce potentiel' permet la réalisation d'étapes de biosynthèse avec uff rendement élevé du fait de la spécificité des enzymes cellulaires et offre une grande variété de composés produits. En dehors de l'extraction de la plante ramassée ou cultivée dans la nature, ces possibilités ne sont pas industriellement exploitées. La présente invention permet de les utiliser sans subir pour autant les diverses contingences de la cueillette ou de la culture "in situ" nécessaires à l'obtention des matières premières. Elle couvre, en conséquence, toute production d'alcalotdes de Vinca minor L. par des cellules de cette espèce cultivées "in vitro" en milieu liquide et maintenues dans un état de dédifférenciation morphogénétique classique. Ainsi, toutes variantes des conditions de culture, d'environnement cellulaire et d'évolution de croissance restant compatibles avec une biosynthèse des composés recherchés ou favorisant celle-ci entrent dans le cadre de l'invention.On peut faire varier, par exemple, les conditions d'éclairement (de l'obscurité à la lumière solaire) de température (20 à 40 ), de circulation gazeuse (0,01 à 1,0 1. d'air, par exemple, par litre et par minute), d'agitation (50 à 150 rotations par minute), auxquelles la culture est soumise. De même, la composition du milieu nutritif peut varier dans de larges limites, tant par la nature de ses composantes que pour leurs proportions relatives : tout élément chimique ou hiologique favorisant la production d'un composé donné ou permettant la réalisation d'une biotransformation précise peut être ajouté, en continu ou non, au milieu nutritif. Dans les exemples, on a rapporté divers types observés de cinétique de croissance. Leur déterminisme est fonction de nombreux facteurs, tels la densité en début de culture, l'état de différenciation cytologique et biochimique de l'implant, l'ensemble des conditions de culture et, en limite, les produits synthétisés eux-mêmes. Toute allure de cinétique favorisant la production des composés recherchés est donc utilisable . Ainsi, la durée de la culture peut varier dans des limites très larges, de quelques jours à deux mois ; le renouvellement constant du milieu est également envisageable (culture en continu). Les résultats quantitatifs et qualitatifs obtenus par cette technique de production sont fonction de la souche de cellules cultivée et du type de sélection employé pour l'obtenir. Comme il a été partiellement indiqué dans l'introduction, l'information génétique dont on utilise le potentiel de biosynthèse peut être très diversement déréprimée. Ainsi, on peut observer selon les souches des situations de "tout ou rien" en ce qui concerne la présence d'alcaloi- des ou celle d'un alcaloïde précis dans le pool total. De plus, l'état de déré pression peut évoluer au cours de la culture et se trouver directement ou indirectement corrélé à l'état de différenciation cellulaire caractérisé, entre autres, par la cinétique de croissance. La possession d'une large population de souches diversifiées a permis la réalisation de l'invention par sélection de plusieurs d'entre elles pour leur intérêt biosynthétique. Les conditions de culture, d'environnement cellulaire, de nature de l'implant et de direction de l'évolution de la croissance ont été et devront toujours être choisies en fonction de la souche afin de favoriser ltexpression des structures génétiques déréprimées dont on vérifie la stabilité de l'état de régulation au cours des diverses étapes de réalisation de l'inven- tion. Les niveaux de produits obtenus varient selon les associations des différents facteurs décrits ci-dessus. De plus, on peut envisager de cumuler les potentiels génétiques de deux ou plusieurs souches issues de variétés identiques ou non, en les cultivant dans le même fermenteur. Les stades successifs décrits dans les exemples sont pratiquement indispensables pour aboutir aisément à une culture dans un appareil de 12 litres. Similairement, l'extrapolation à des niveaux de production beaucoup plus importants est réalisable par augmentation progressive de la taille des volumes de culture. REVENDICATIONS 1) Production d'alcalotdes par culture "in vitro" en milieu liquide, de cellu les isolées ou de petits groupements cellulaires de Vinca minor L. (Apocyna cées), maintenus en état de dédifférenciation morphogénétique. 2) Production d'alcalotdes selon la revendication 1), caractérisée par le fait qu'elle est réalisée.par des cultures de cellules de souches choisies pour leur activité biosynthétique élevée, par sélection à partir d'une large popu lation de souches de cultures de tissusde Vinca minor L., provenant de divers écotypes naturels. 3) Production d'alcalotdes selon l'une quelconque des revendications 1) ou 2), caractérisée par le fait qu'elle est réalisée dans un appareil de type fer menteur. 4) Production d'alcalotdes selon l'une quelconque des revendications 1) à 3), caractérisée par les étapes suivantes ; obtention d'une large population de souches de cellules de Vinca minor L. en milieu semi-solide, sélection des souches possédant une activité biosynthétique élevée, notamment par analyses de la biomasse et du milieu nutritif, adaptation des souches choisies à la culture en milieu liquide, stabilisation des souches adaptées obtenues, aug mentation progressive des volumes de culture et des tailles d'implant, jus qu'g obtention de biomasses de taille suffisante pour être cultivées en fer menteurs de volume croissant et pour fournir des alcaloïdes en quantité susceptible d'une production industrielle. 5) Production d'alcalotdes selon l'une quelconque des revendications 1) à 4), caractérisée par le fait que les milieux de culture renferment des macro éléments minéraux et/on des micro-éléments minéraux et/ou une source de fer et/ou une source de carbone et/ou des vitamines et/ou au moins un modifica teur de croissance et/ou éventuellement au moins un inducteur de croissance. 6) Production d'alcalofdes selon la revendication 5), caractérisée par le fait que le milieu de culture est voisin de celui utilisé pour l'obtention de la souche en milieu semi-solide, à l'exception de la substance de gélification. 7) Production d'alcalotdes selon l'une quelconque des revendications 1) à 6), caractérisée par le fait que les conditions de culture sont adaptées à la souche sélectionnée. 8) Production d'alcalotdes selon l'une quelconque des revendications 1) à 7), caractérisée par le fait que la culture est effectuée à l'obscurité ou avec éclairement résiduel ou non. 9) Production d'alcalotdes selon l'une quelconque des revendications 1) à 8), caractérisée par le fait que la culture est oxygénée par passage d'air à la vitesse de 0,01 à 1,0 1/1/min. 10) Production d'alcalotdes selon la revendication 9), caractérisée par le fait que ltair passe à la vitesse de 0,08 à 0,121 1/1/min. 11) Production d'alcalotdes selon l'une quelconque des revendications 1) à 10), caractérisée par le fait que la température de la culture est comprise entre 20 et 400. 12) Production d'alcalotdes selon la revendication 11), caractérisée par le fait que la température est de 30 environ. 13) Production d'alcalotdes selon l'une quelconque des revendications 1) à 12), caractérisée par le fait que la culture est agitée à 50-150 rotations par minute. 14) Production d'alcalotdes selon la revendication 13), caractérisée par le fait que l'agitation est de 100 rotations par minute. 15) Production d'alcalotdes selon l'une quelconque des revendications 1) à 14), caractérisée par le fait que la durée de la culture est comprise entre quel ques jours et deux mois. 16) Production d'alcaloides selon la revendication 15), caractérisée par le fait que cette durée est de 21 jours environ. 17) Production d'alcalotdes selon l'une quelconque des revendications 1) à 16), caractérisée par le fait que les alcalotdes sont obtenus par extraction du milieu de culture et de la biomasse. 18) Production d'alcalotdes selon l'une quelconque des revendications 1) à 16) caractérisée par le fait que les alcalotdes sont obtenus seulement par ex traction du milieu de culture. 19) Production d'alcalordes selon l'une quelconque des revendications 17) ou 18b caractérisée par le fait que l'on extrait les alcalotdes totaux. 20) Production d'alcalotdes selon l'une quelconque des revendications 17) à 19), caractérisée par le fait que lton sépare les alcalotdes individuels du pool d'alcalotdes totaux obtenu. Légendes des planches Pl. I- Fig. 1 a - Amas de cellules de Vinca minor L. cultivées "in vitro". - Grossissement : x 125 - Observation "in vivo" par la technique du contraste de phase. P1. II Fig. 1 b - Court filament de cellules de Vinca minor L. cultivées "in vitro". - Grossissement : x 250 - Observation "in vivo" par la technique du contraste de phase. P1. III Fig. 2 - Cinétique de Croissance et évolution de la Densité d'une culture de la souche 13L en Fiole d'Erlenmeyer. - x poids frais moyen d'une culture. - o densité moyenne. P1. IV Fig. 3 - Courbe de gauche : Cinétique de Croissance d'une Culture de la souche 13L en Fiole d'Erlenmeyer. - Courbe de droite : Evolution de la Densité d'une Culture de la souche 13L en Fiole d'Erlenmeyer. P1. V Fig. 4 - Cinétique de Croissance et évolution de la Densité d'une Culture de la souche 3L en Fiole d'Erlenmeyer. - x poids frais moyen d'une culture. - o densité moyenne. P1. VI Fig. 5 - Courbe de gauche : Cinétique de Croissance d'une Culture de la souche 3L en Fiole d'Erlenmeyer. - Courbe de droite : Evolution de la Densité d'une Culture de la souche 3L en Fiole d'Erlenmeyer. P1. VII Fig. 6 - Evolution de la Densité en poids frais d'une Culture en Fermenteur de la souche P1. VIII Fig. 7 - Evolution de la Densité en poids sec, et de la teneur en sec" d'une Culture en Fermenteur de la souche - x poids sec/litre. - o "teneur en sec". P1. IX Fig. 8 - Courbe de gauche : Evolution de la Densité en poids frais d'une Culture en Fermenteur de la souche - Courbe de droite : Evolution de la Densité en poids sec d'une Culture en Fermenteur de la souche