Brevet FR2315944A1 — publié le 19770128

Les stimulations immunitaires sont bien connues depuis longtemps et employées en thérapeutique de différentes façons. Les produits d'origine microbienne sont ceux qui ont suscité le plus d'intérêt. Les préférences vont pour l'instant aux substances du type protidique extraites des germes microbiens, à l'exclusion des autres constituants, lipidiques par exemple. Le but de la présente invention est d'utiliser l'ensemble des constituants des germes microbiens, mais en les maniant séparément, de façon à administrer par exemple d'abord les composés protidiques puis, ensuite, les composés lipidiques. Les germes utilisés comme matière première sont des saprophytes banals des muqueuses de l'homme , appartenant par exemple aux genres suivants : Neisseria, flemophilus, Klebsiella, Pseudomonas, Proteus, Streptococcus, Staphylococcus. L'invention a donc pour objet une préparation pharmaceutique ayant une action de stimulation immunitaire non spécifique de ltorga- nisme et comprenant, conditionnés séparément, un extrait contenant les constituants protidiques et un extrait contenant les constituants lipidiques d'un ensemble de germes microbiens choisis parmi les saprophytes courants des muqueuses humaines Les extraits constituant la préparation pharmaceutique selon l'invention sont obtenus de la façon suivante : chaque germe est traité séparément après avoir été cultivé selon les procédés classiques, en récipients ou en fermenteurs.On centrifuge les cultures pour recueillir les germes que l'on met en suspension et lyse par un moyen approprié, tel que action d'un agent tensioactif, congélation suivie d'une décongélation, action des ultrasons ou encore airtolyse prolongée. On mélange alors les lysats provenant des divers germes choisis comme matière première et appartenant aux genres suivants : Neisseria, Hemophilus, Klebsiella, Pseudomonas, Proteus, Streptococcus, Staphylococcus. On ajoute un peu de formol au mélange et on concentre à basse température. 1 ml de ce mélange concentré de base correspond environ à 2 mg de corps bactériens de départ, mélangés. On prépare ensuite, à partir de ce mélange de base les extraits appelés ci-après "composés protéiniques" et'composes lipidiques a) Composés protéiniques Le mélange de base précédent est délipidé par une association dite "solvant des lipides", par exemple méthylal-méthanol. Par décantation, on sépare la phase surnageante contenant les lipides. La phase aqueuse restante est lavée à plusieurs reprises par le solvant des lipides, puis concentrée doucement à basse température (T inférieure à + 5O0C), enfin lyophilisée. On obtient ainsi la fraction dite "composés protéiniques" délipidée qui contient essentiellement un mélange de divers glucoprotéines b) Composés lipidiques. La phase surnageante et les liqueurs de rinçage par le solvant des lipides provenant de l'opération précédente sont soigneusement recueillies et évaporées à basse température (T inférieure à + 50 C). La masse obtenue constitue la fraction dite "composés lipidiques" des extraits microbiens Elle contient les différentes fractions lipidiques bactériennes. Les études expérimentales sur l'animal révèlent les faits suivants, relatifs à la réponse immunitaire sous l'effet de l'administration distincte de ces deux catégories de composés bactériens, les méthodes employées étant a) Etude de la réaction cellulaire par l'épreuve du ganglion para-thymique de la souris, dans le but de déceler les réactionsprécoces de celui-ci aux injections desdits extraits bactériens, ceux-ci étant injec tés, séparément ou mélangés, par voie intrapéritonéale. b) Etude de la réponse des anticorps de la souris à l'agression de toxine tétanique suivant la méthode dite de "TOXIN CHALLENGE METHOD", pour laquelle la réponse immunologique est plus complète que celle concernant les seuls anticorps antitétaniques, parce qu'avec cette technique, toutes les cellules de l'organisme répondent à l'agression de la toxine. Au cours de ces-essais, les extraits constituant la préparation pharmaceutique selon l'invention ont été employés de la façon suivante a) injection dlun mélange des deux extraits; b) administration séparée, d'abord de la fraction lipidique, puis secondaire- ment de la substance protidique, avec quelques jours d'intervalle entre les deux injections; c) méme expérience, mais en injectant d'abord les substances protéiniques puis, secondairement, les produits lipidiques, en observant quelques jours d'intervalle entre les deux administrations. Le tableau suivant résume l'essentiel des résultats obtenus. Mode d'adminis- Temps en jours s'écou- Protection de la souris vacci tration lant entre la seconde née par 2UI d'anatoxines injection et les pre- contre la meme dose de toxine mières réactions d'un tétanique après injection des Injection parathymique de l'en- mort des composés 5 jours mort dès le quatrième jour semble des composes jours protection jour soit : composés protéiniques + com posés lipidiques Prémière injection : pas de mort en 10 jours composés protéini 3 jours ques protection a 100 % Deuxième injection: Première injection: composés lipidiques mort dès le quatrième jour Deuxième injection : 5 jours protection à 20% composés prptéini- i ques On voit que les résultats obtenus avec les ganglions parathymiques et ceux relatifs à la réponse toxine tétanique sont semblables. Ils peuvent etre résumés comme suit a) la protection antitoxine était faible et la réponse ganglionnaire était lente et fugace quand on utilisait un mélange des deux composants; b) la protection antitoxine ainsi que la réponse du ganglion étaient médiocres quand on injectait d'abord les composés lipidiques et,secondairement, les composés protéiniques; c) la protection antitoxine de même que la réponse du ganglion étaient notablement plus élevées quand on injectait en premier lieu les composés pro- téiniques et, secondairement, les composés lipidiques. En médecine humaine, la préparation pharmaceutique selon l'invention est utilisée comme-stimulant immunitaire non spécifique. On l'administre de la façon suivante - L'extrait dit "protéinique", présenté sous forme lyophilisée est dissous dans un solvant approprié stérile (sérum physiologique ou eau apyrogène) à raison de 5 à 20 mg pour 5 ml de solvant. Il est injecté par voie parentérale. - L'extrait dit"lipidîque " est dissous dans un excipient huileux stérile (huile d'olive neutralisée ou huile de vaseline) à raison de 1 à 5 mg pour 5 ml de solvant. Il est injecté par voie parentérale entre 3 et 10 jours après l'injection protéinique précédente. En résumé, la préparation pharmaceutique selon l'invention (qui comprend deux extraits quel'on injecte successivement : extrait protéinique d'abord, extrait lipidique ensuite) est proposée comme médicament à action immunisante non spécifique renforçant les défenses de l'organisme contre les agressions bactériennes, virales, fongiques, parasitaires ou néoplasiques. REVENDICATIONS 1. Préparation pharmaceutique présentant une action de stimulation immunitaire non spécifique de l'organisme, caractérisée en ce qu'elle comprend, conditionnés séparément, un extrait dit "protéinique" et un extrait dit "lipidique", d'un mélange de plusieurs germes microbiens choisis parmi les saprophytes banals des muqueuses humaines et appartenant aux genres Neisseria, Hemophilus, Klebsellia, Pseudomonas, Proteus, Streptococcus et Staphylococcus. 2. Préparation pharmaceutique selon la revendication 1, présentée sous une forme convenant pour l'administration parentérale successive des deux extraits, l'extrait "protéinique', sous forme de poudre lyophilisée devant être injecté apres dissolution dans du sérum physioLo- gique ou de l'eau apyrogène, à la dose unitaire de 5 à 20 mg pour 5 ml de solvant, l'extrait "lipidique" devant être injecté après dissolution dans un excipient huileux stérile, à la dose unitaire de 1 à 5 mg pour 5 ml de solvant. 3. Procédé d'obtention de la préparation selon revendication 1, caractérisé en ce que, après lyse par un procédé connu soi des cultures des différents germes développés séparément, on mélange les lysats et les concentre de façon à obtenir 1 ml de mélange de base concentré à partir de 2 g de germes microbiens mélangés; puis on extrait ce mélange de base par un solvant des lipides tel que l'association méthylal-méthanol, on sépare par décantation la phase surnageante contelar. les lipides de la phase aqueuse contenant les protéines, la phase aqueuse après avoir été lavée à plusieurs reprises par le solvant des lipides, et concentrée à température inférieure à 500C et lyophilisée, la poudre obtenue constituant l'extrait dit "protéinique"; la phase surnageante, additionnée des liqueurs de lavage par le solvant des lipides, est évaporée à sec à température inférieure à 50 C, la masse obtenue constituant l'extrait dit "lipidique".