Brevet FR2303077A1 — publié le 19761001

La présente invention est relative à des perfectionnements dans ou concernant un procédé de séparation de la biomasse à partir d'un bouillon de fermentation cultivé contenant la biomasse, un milieu nutritif aqueux et un hydrocarbure, par centrifugation en présence d'un agent de surface anionique. L'invention concerne plus particulièrement un procédé consistant à séparer le bouillon en biomasse d'une part et en hydrocarbure d'autre part. Les procédés de fermentation qui utilisent les hydrocarbures à titre de source de carbone pour uniquement la production de biomasse ou pour la production simultanée de biomasse et d'un hydrocarbure amélioré sont connus. Ces procédés consistent à cultiver un hydrocarbure utilisant des microorganismes dans un bouillon comprenant un hydrocarbure à titre de substrat carboné, un milieu nutritif aqueux et un gaz contenant de l'oxygène libre. Des procédés sont connus pour séparer la biomasse ou la biomasse et les hydrocarbures du bouillon cultivé.Ces procédés comprénnent la centrifugation du bouillon ou d'une fraction de celui-ci en présence d'un agent de surface pour donner d'une part une crème comprenant le milieu aqueux nutritif contenant l'agent de surface et jusqu'à environ 20 % en poids de biomasse (poids sec) et d'autre part une émulsion comprenant essentiellement les hyr drocarbures, un peu du milieu nutritif aqueux, la biomasse et l'agent de surface. On a décrit des agents de surface anioniques, cationiques/ non ioniques appropriés pour leur utilisation dans de tels procédés. On a cité des températures de centrifugation comprises entre 30 et 99 C et des pH compris entre 4 et 9 .La crème a été traitée ultérieurement pour séparer la biomasse de la phase aqueuse et la phase aqueuse est recyclée soit vers le fermenteur ou l'étape de centrifugation. De façon similaire, l'émulsion comprenant l'hydrocarbure, un peu de milieu nutritif aqueux, la biomasse et l'agent de surface a été traitée pour séparer l'hydrocarbure de la phase aqueuse contenant la biomasse et l'agent de surface. Cependant en pratique on déchargeait cette phase aqueuse du système sous forme de résidu. Dans des opérations à plus grande dimension, la récupération maximum de la biomasse et l'utilisation de l'eau et des agents de surface est souhaitable afin de conserver l'eau, de minimiser la consommation en agent de surface et la production d'effluents non désirés et d'avoir une production optimum de biomasse. La demanderesse a développé maintenant un procédé amélioré consistant à procéder à la centrifugation en présence d'un agent de surface anionique en vue de séparer la biomasse du bouillon de culture de fermentation contenant la biomasse, le milieu nutritif aqueux et l'hydrocarbure. Dans ce procédé la quantité d'eau et d'agent de surface rejetée comme résidu est réduite et m9me éliminée et la quantité de biomasse récupérée est améliorée. Selon la présente invention, la demanderesse a mis au point un procédé consistant à séparer la biomasse à partir du bouillon de culture contenant la biomasse, le milieu nutritif aqueux et l'hydrocarbure. Ledit procédé consiste dans une première étape de centrifugation à centrifuger le bouillon ou une fraction de celui-ci en présence d'un agent de surface anionique à un pH supérieur à celui auquel l'agent de surface est ionisé mais qui est inférieur à 8 et à une température comprise entre 20 et 400C pour donner d'une part une crème comprenant la biomasse1 le milieu nutritif aqueux et l'agent de surface et d'autre part une émulsion comprenant essentiellement l'hydrocarbure et un peu du milieu nutritif aqueux, la biomasse et 1' agent de surface et dans une seconde étape de centrifugation, à centrifuger l'émulsion à un pli de 4 ou inférieur et à une température comprise entre 65 C et le point d'ébullition de la phase aqueuse de l'émulsion pour donner une fraction comprenant essentiellement l'hydrocarbure et une fraction comprenant essentiellement le milieu nutritif aqueux, la biomasse et l'agent de surface et puis à recycler la fraction comprenant essentiellement le milieu nutritif aqueux, la biomasse et l'agent de surface dans'la première étape de centrifugation. En plus du fait que l'on réduit et élimine la perte en eau et biomasse, le présent procédé présente d'autres avantages car il permet d'obtenir un produit hydrocarboné qui est essentiellement libre de tout milieu nutritif aqueux , biomasse et agent de surface contaminant. Ce procédé est plus particulièrement approprié pour son utilisation dans la séparation des microorganismes iono- cellulaires utilisant les hydrocarbures tels que par exemple une levure ou une bactérie, du bouillon qui a été obtenu en cultivant des aiicroorganismes en présence d'un hydrocarbure à titre de substrat carboné, un milieu nutritif aqueux et un gaz contenant de l'oxygène libre. Tout bouillon contenant la biomasse, un milieu nutritif aqueux et un hydrocarbure résultant des procédés connus de production de biomasse utilisant des hydrocarbures à titre de substrat carboné est approprié pour autre utilisé dans le présent procédé.Un exemple d'un tel procédé est un procédé de production d'une biomasse de levure utilisant une fraction pétrolière consistant ou contenant des hydrocarbures à channe linéaire ayant au moins 10 atomes de carbone par molécule, à titre de source de carbone. En particulier la fraction pétrolière peut 8tre un gasoil contenant Jusqu'à 45 % en poids d'hydrocarbure à channe linéaire. Lorsqu'on utilise un gasoil à titre de source de carbone le produit du procédé est d'une part une biomasse de levure et d'autre part du gasoil déparaffiné c'est-à-dire un gasoil ayant une teneur en hydrocarbure à channe linéaire réduite ou qui est débarrassé des hydrocarbures à channe linéaire.Le procédé de culture met en oeuvre habituellement une levure utilisant l'hydrocarbure comme par exemple une levure utilisant un hydrocarbure du genre Candida . Les exemples de levures appropriées sont des souches utilisant les hydrocarbures de l'espèce Candida lipolytica ou tropicales . Quelques exemples de fraction pétrolières appropriées sont des gasoils ayant un point d'abullition compris entre 200 et rCOOOC ou des coupes de n-paraffine comprenant des hydrocarbures ayant 10 à 25 atomes de carbone par molécule. Tout agent de surface anionique qui a été considéré comme étant efficace dans les procédés de centrifugation connus pour la séparation de la biomasse à partir d'un bouillon de fermentation cultivé contenant la biomasse, le milieu nutritif aqueux et un hydrocarbure peut être utilisé dans le procédé selon l'invention.Quelques exemples d'agents de surface anioniques qui ont été considérés comme appropriés pour l'utilisation dans ce but sont : (a) les alkylsulfates de sodium tels que par exemple le Teepol (qui est une marque enregistrée) (b) l'a-oléfine sulfonate de sodium ou (c) des composés représentés par la formule générale CH3 (GH2) - O - CH2 - (CH2 - O - CH2)m - C2-O-S03X dans laquelle n est un nombre entier compris entre 11 et 14 et m est un nombre entier compris entre 4 et 12 et x est un métal alcalin tel que par exemple le sodium, le potassium ou un ion ammoniuî. Les exemples de composés représentés par cette formule générale sont des sels de métaux alcalins de condensats sulfatés de polyalkylène oxydes et d'alcools gras tels que par exemple les sulfates d'alcool laurique polyoxyéthylènés et en particulier des sels de métaux alcalins de sulfate a'alcool laurique polyoxyéthylénés ayant en moyenne 7 groupements d'oxydes d'éthylène par molécule, une teneur en soufre d'environ 14 % en poids. Les agents de surface de ce type sont vendus par Marchon de Brance sous la marque Empimin . Un exemple d'agent de surface du type alkylsulfonates est vendu par la Société Hoeschst sous la marque Eaulsogen.Un exemple d'agent de surface du type a-oléfine sulfonate est vendu par AKZO-CHEMIE sous la Marque ÂOS.H6. Dans l'opération du présent procédé la quantité d'agent de surface anionique qui peut être présent dans la première étape de centrifugation est au moins de 50 parties par million par rapport au poids total du bouillon ou la fraction du bouillon et elle est de préférence de 200 à 500 p.p.m. De préférence, l'agent de surface est dilué avec de l'eau avant d'être additionné au bouillon ou à la fraction de bouillon. De préférence, le bouillon est traité au cours d'une étape de séparation pour éliminer une partie du milieu nutritif aqueux avant de le faire passer à la première étape de centrifugation, ce qui permet de réduire le volume de liquide qui doit être centrifugé. Par exemple le bouillon peut être passé à travers un décanteur où sous l'influence de la gravité la fraction aqueuse du liquide la plus dense se sépare de la fraction supérieure gazéifiez moins dense contenant l'hydrocarbure, la biomasse et un peu du milieu nutritif aqueux. La fraction supérieure uniquement peut ensuite titre transérée dans un ré cipient mélangeur où 1 'agent de surface peut être additionné ou peut autre transféré directement à la centrifugeuse. De préférence, l'agent de surface est additionné au bouillon ou à la fraction de bouillon avant que ce dernier soit traité dans la première étape de centrifugation. Ceci est effectué habituellement dans un récipient de mélange ou dans une conduite dans le courant du bouillon. Si nécessaire le pH et la température du bouillon ou de la fraction du bouillon doivent hêtre ajustés dans la gamme requise c'est-à-dire à un pH supérieur au pH auquel l'agent de surface est ionisé, mais qui est inférieur à 8 . Normalement le pH est ajusté à une valeur comprise entre 4,5 et 7,5 et la température est ajustée à une valeur comprise entre 20 et 400C. En particulier, lorsque le bouillon ou la fraction du bouillon est obtenu en cultivant une levure utilisant des hydrocarbures sur une fraction pétrolière tel qu'un gasoil ayant un point d'ébullitíon compris entre 300 et 3800C ou un mélange de n-paraffine ayant un point d'ébullition de 300 à 3500C le pH du bouillon est normalement compris entre 4,0 et 4,5 En conséquence, l'ajustement du pH est habituellement nécessaire. Ceci peut être effectué soit dans le récipient mélangeur, soit dans la conduite dans le courant de bouillon. De façon appropriée la gamme du pH dans la première étape de centrifugation est de 5,5 à 6,5 et le pH préféré est d'environ de 6. La température préf-érée est d'environ 25 à 300C.Le pH du bouillon est normalement ajusté par addition d'un alcali - comme par exemple l'ammoniaque ou un hydroxyde de métal alcalin. Le bouillon ou la fraction de bouillon est séparé dans la première étape de centrifugation d'une part en une crème contenant la biomasse et le milieu nutritif aqueux et l'agent de surface et d'autre part en une émulsion comprenant essentiellement les hydrocarbures et un peu du milieu nutritif aqueux, la biomasse et l'agent de surface. Lorsque l'émulsion est séparée du bouillon obtenu par la culture de la levure sur un hydrocarbure à base de gasoil à titre de substrat carboné , elle comporte habituellement environ 80 % en poids de gasoil déparaffiné, enviror 20 % en poids d'eau, 1 à 2 % en poids de levure (poids sec) et 100 à 200 ppm d'agent de surface. Le pH de l'émulsion doit autre abaissé jusqu'à une valeur égale ou inférieure à 4 qui est le pH requis dans la seconde étape de centrifugation. Il est souhaitable d'effectuer ceci avant que l'émulsion soit amenée à passer à la centrifugeuse. Le pH peut être abaissé par addition à l'émulsion d'un acide tel que par exemple l'acide phosphorique,sulfurique ou chlorhydrique. Le pH préféré dans la seconde étape de centrifugation est d'environ 3. La température de l'émulsion dans la seconde étape de centrifugation est comprise entre 650C et le point d'ébullition de la phase aqueuse de l'émulsion qui est d'environ 980 C. La limite supérieure de la gamme de températures est habituellement d'environ 85C. Avantageusement la température de l'émulsion est élevée avant que l'émulsion soit amenée à passer à la seconde étape de centrifugation en la faisant passer à travers un échangeur de chaleur. La température et le pH peuvent être ajustés simultanément. De façon plus appropriée le pH est ajusté après que l'ajustement de la température ait été effectué. L'acidification et le traitement à la chaleur permet d'éliminer l'agent de surface de la phase liquide présente dans l'émulsion par le fait qu'il est adsorbé sur la biomasse solide .L'élimination de l'agent de surface à partir de la phase liquide en mtme temps que l'acidification et le traitement par la chaleur entrassent la rupture de l'émulsion. Ceci facilite la séparation de l'émulsion lors de la seconde étape de centrifugation en une fraction consistant essentiellement en hydrocarbure et une fraction consistant essentiellement en phase aqueuse, traces d'hydrocarbure et de biomasse avec l'agent de surface adhérant à celle-ci. La fraction de phase aqueuse peut être recyclée directement à la première étape de centrifugation où le pH et la température peuvent être ajustés . -De préférence, la fraction est refroidie dans les limites utilisées pour la première étape de centrifugation, puis additionnée au bouillon ou la fraction du bouil- lon dans l'étape de mélange où le pH est ajusté avant le passage à la première étape de centrifugation . L'ajustement de la température et du pH de la fraction aqueuse récupérée de la seconde étape de centrifugation permet de libérer l'agent de surface et la biomasse de telle sorte qu'il est à nouveau efficace dans la première étape de centrifugation . I1 est habitue,- lement nécessaire d'additionner un peu d'agent de surface frais au bouilloa ou à la fraction de bouillon avant la première étape de centrifugation pour en avoir assez pour permettre d'avoir l'agent de surface se trouvant dans la crème séparée par l'étape de centrifugation. La présente invention est illustrée par les exemples suivants donnés à titre non limitatif. Exemple Un bouillon contenant une biomasse de levure, du gasoil déparaffiné et un milieu nutritif aqueux a été obtenu en cultivant en continu un hydrocarbure à channe droite utilisant une souche de levure Candida tropicalis (souche C.B.S. 6373) sur du gasoil ayant un point d'ébullition compris entre 300 et 380 C T.B.P (True Boiling Point) à titre de source de carbone unique, et un milieu nutritif aqueux ayant la çom- position suivante : H3P04 1,84 g/l KCl 1,16 " ng (OH)2 0,078 Mn S04,A20 0,024 Pe SO4, 7H20 0,080 Zn S04, 7H2O 0,158 " Cu SO4, 5H2O 0,004 " Extrait de levure 0,015 Eau du robinet 1 000 ml La température de la fermentation est maintenue à 320C ,le pH du bouillon est contré à 4,0 par addition d'hydroxyde d'ammonium qui sert également de source d'azote. Le bouillon est amené à passer à travers un décanteur où ' il se sépare sous l'influence de la gravité en une fraction moins dense supérieure et une fraction plus dense inférieure dans une proportion d'environ 40 à 60 % en poids respectivement. La fraction supérieure consistant essentiellement en environ 25 % en poids de gasoil déparaffiné, 2,1 % en poids de biomasse de levure (poids sec) et 72,9 % en poids du milieu nutritif aqueux. La fraction inférieure comprend essentiellement le milieu nutritif aqueux.La fraction supérieure est amenée à passer à travers un récipient de mélange comportant un moyen d'agitation, des moyens d'additionner l'agent de surface, des moyens d'additionner la phase aqueuse, la biomasse et l'agent de surface précité à partir de la seconde étape de centrifugation et des moyens pour ajuster le po du contenu des récipients. Un poids total de 0,24 g d'agent de surface Empimin a été additionné à chaque kilogramme de fraction du bouillon amené à passer à travers le récipient. L1Empimin est une marque de Marchon de France pour le sulfate d'alcool laurique polyoxyéthylèné sodique contenant environ 7 groupements oxyde d'éthylène par molécule.Le pH de la fraction de bouillon est ajusté à 6,5 par addition d'ammoniaque. La fraction du bouillon traitée ayant une tetpérature de 30 ± 5C est amenée à passer à artir du récipient mélangeur dans une, centrifugeuse du type à injection Alpha Laval HYBX à une vitesse de circulation d'environ 1400 litres par heure. Le mélange est séparé en (a) une crème consistant en milieu nutritif aqueux, biomasse de levure et agent de surface et (b) une émulsion consistant essentiellement en gasoil déparaffiné, milieu nutritif aqueux, biomasse de levure et agent de surface. La proportion de crème (aJ à l'émulsion (b) est d'environ 30 à 70 * en volume respectivement. L'émulsion (b) consiste essentiellement en environ 80 * en poids de gasoil déparaffiné, environ 20 % en volume du milieu nutritif aqueux et environ 0,5 % en poids (poids sec) de biomasse de levure et 0,40 g par kilo d'Empimin. Le pH de l'émulsion est abaissé à 3,5 par addition d'acide phosphorique commercial et l'émulsion est ensuite amenée à passer à travers un échangeur de chaleur où la température est élevée jusqu'à 800C. L'émulsion est ensuite amenée à passer à travers un centrifugeur du type à bol ouvert séparateur Alpha Laval Px opérant de façon continue à une vitesse d'environ 400 à 420 litres par heure. L'émulsion est séparée de façon continue d'une part en un gasoil déparaffiné clair et d'autre part en un milieu nutritif aqueux.La biomasse de levure comportant l'Empimin adsorbé sur celle-ci et des traces de gasoil déparaffiné accumulées dans le bol du centrifugeur est évacué périodiquement. Le courant de milieu nutritif aqueux à partir de la centrifugeuse et de biomasse de levure comportant l'Empimin adsorbé et les traces d'huile récupérées à partir du bol sont mélanges w Le mélange est amené à passer à travers un récipient de retroidissement où la température s'abaisse naturellement jusqu'à 30 ± 50C . Le mélange refroidi comprenant essentiellement le milieu nutritif aqueux, la biomasse de levure, l'Empimin adsorbé et des traces de gasoil déparaffiné est amené à passer dans le récipient mélangeur décrit préalablement. La quantité dtEmpimin amenée à passer dans le récipient mélangeur par ce moyen est d'environ de 0,12 g par kilo de fraction de bouillon. On additionne de l'Empimin frais dans un rapport de 0,12 g par kilo à la frac- tion de bouillon et le pH du mélange total est ajusté comme décrit précédemment. La quantité totale d'Empimin additionnée est de 0,24 g par kilo de fraction du bouillon amené à passer à travers le mélangeur. On peut constater qu'en opérant comme décrit ci-dessus on peut récupérer une quantité considérable d'eau et d'agent de surface, et d'avoir une réduction correspondante en effluent, un gasoil déparaffiné de pureté élevée et une production améliorée de levure. REVENDICTIONS 1. Procédé pour séparer la biomasse d'un bouillon de culture contenant la biomasse, un milieu nutritif aqueux et un hydrocarbure, caractérisé par le fait qu'il consiste dans une première étape de centrifugation, à centrifuger le bouillon ou une fraction de celui-ci en présence d'un agent de surface anionique à un pH supérieur à celui auquel l'agent de surface est ionisé mais qui est inférieur à 8 et à une température comprise entre 20 et 400C pour donner d'une part une crème comprenant la biomasse, le milieu nutritif aqueux et l'agent de surface et d'autre part une émulsion comprenant essentiellement l'hydrocarbure, un peu de milieu nutritif aqueux, la biomasse etc'agent de surface et puis dans une seconde étape de centrifugation à centrifuger l'émulsion à un pli de 4 ou moins et à une température comprise entre 65 C et la température d'ébullition de la phase aqueuse de l'émulsion pour obtenir une fraction comprenant essentiellement l'hydro- carbure, une fraction comprenant essentiellement le milieu nutritif aqueux, la biomasse et l'agent de surface , et puis à recycler la fraction comprenant essentiellement le milieu nutritif aqueux, la biomasse et l'agent de surface dans la première étape de centrifugation. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'agent de surface est un composé représenté par la formule générale : CH3 - (CE2) - O - CH2 - (CE2 - O - CH2)m 2 CH2 - O - S031 dans laquelle n est un nombre entier compris entre 11 et 14 et m est un nombre entier de 4 à 12 et X est un métal alcalin tel que par exemple le sodium , le potassium ou un ion ammonium. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que l'agent de surface anionique est un sulfate de l'alcool laurique polyoxyéthyléné ayant une moyenne de 7 groupements d'oxyde d'éthylène par molécule et une teneur en soufre d'environ 14 % en poids. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'agent de surface anionique est un alkylsulfate de sodium. 5. Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que 1' agent de sulface anionique est un &alpha;-oléfine sulfate de sodium. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que la quantité d'agent de Furface-présent dans la première étape de centrifugation est at MOw1ZLS. de 50 ppm par rapport au poids total du bouillon ou la fraction de bouillon. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que la quantité d'agent de surface présent à la première étape de centrifugation est conprise entre 200 et 500 ppm par rapport au poids total de bouillon ou fraction de bouillon. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé par le fait que le bouillon est traité dans une étape de séparation pour éliminer une partie du milieu nutritif aqueux avant qu'il passe à la première étape de centrifugation. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'étape de séparation est effectuée dans un décanteur. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait que l'agent de surface anionique est additionné au bouillon ou & la fraction de bouillon avant d'8tre traité dans la première étape de cen trifugation. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 , caractérisé par le fait que le pH du bouillon ou de la fraction du bouillon de la première étape de centrifugation a une valeur comprise entre 4,5 et 7,5. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé par le fait que le pH du bouillon ou de la fraction du bouillon lors de la première étape de centrifugation a une valeur comprise entre 5,5 et 6,5. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé par le fait que le pH du bouillon ou de la fraction de bouillon est aJusté avant d'etre traité dans la première étape de centrifugation. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé par le fait que la température du bouillon ou de la fraction de bouillon de la première étape de centrifugation est comprise entre 25 et 30in. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé par le fait que la température du bouillon ou de la fraction de bouillon est ajustée avant qu'il soit traité dans la première étape de centrifugation. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé par le fait que le pH de l'émulsion est abaissé à un p11 ayant une valeur de 4 cu moins avant que l'émulsion soit amenée à passer dans la seconde étape de centrifugation. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé par le fait que le pH de l'émulsion dans la seconde étape de centrifugation a une valeur d'environ 3 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisé par le fait que la température de l'émulsion dans la seconde étape de centrifugation est com- prise entre 65 et 85-C, 19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé par le fait que la température de l'émul sion est ajustée avant que l'émulsion soit amenée à passer dans la seconde étape de centrifugation par passage & travers un échangeur de chaleur. 20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, caractérisé par le fait que la température de la fraction comprenant essentiellement le milieu nutritif aqueux, la biomasse et l'agent de surface résultant de la seconde étape de centrifugation est ajustée & une température comprise entre 20 et 40 C , puis additionné au bouillon ou à la fraction de bouillon dans une étape de mélange au cours de laquelle le pH est ajusté à une valeur supérieure à la valeur à laquelle l'agent de surface est ionisé mais qui est inférieure à 8 et que le mélange est amené à passer dans la première étape de centrifugation. 21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisé par le fait que la biomasse est une levure utilisant un hydrocarbure. 22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé par le fait que la levure est une souche Candida li w lytica ou Candida tropicalis 23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, caractérisé par le fait que l'hydrocarbure dans la fraction comprenant essentiellement lthydrocarbure résultant de la seconde étape de centrifugation est un gasoil ayant une teneur en hydrocarbure à chatne droite réduite ou qui est débarrassé d'hydrocarbure à channe droite. 24. Biomasse caractérisée par le fait qu'elle a été séparée à partir du bouillon de culture suivant le procédé décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 13. 25. Hydrocarbure caractérisé par le fait qu'il est séparé à partir du bouillon de culture suivant le procédé qui a été revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1 à 23.