Brevet FR2298109A1 — publié le 19760813

L'invention est relative à un procédé de dosage des complexes solubles et insolubles de la thyroglobuline avec les anticorps antithyroglobuline dans le sérum humain. Un tel procédé de dosage est utile pour le diagnostic de la thyrofdite auto-immunitaire, une maladie de la thyroide pendant laquelle l'organisme produit des anticorps antithyroglobuline, c'est-à-dire contre la thyroglobuline. On connaît déjà des méthodes de dosage d'anticorps antithyroglobu line par la méthode des globules rouges tannés, par immunofluorescence ou par résultat immunoprécipitation. Les deux premières méthodes donnent seulement des semiquantitatifs. L'immunoprécipitation donne un résultat quantitatif, mais seulement les complexes insolubles de la thyroglobuline avec les anticorps antithyroglobuline sont dosés, et non les complexes solubles. De plus, de faibles quantités d'anticorps ne peuvent pas etre mesurées. On connaît également un dosage radio-immunologique, selon lequel on marque les anticorps antithy roglobuline avec de l'iode 125, mais les résultats sont exprimés en unités arbitraires et cette méthode ne fournit pas de réponse quantitative. C'est en 1953 que la- capacité de fixation a été déterminée pour la première fois au moyen des anticorps anti-albumine. Selon cette méthode cependant on ne mesure que 33 % de la capacité de fixation, ce qui ne permet pas d'obtenir un résultat quantitatif. On a maintenant trouvé un nouveau procédé de dosage de l'ensemble des complexes solubles et insolubles de la thyroglobuline avec les anticorps antithyroglobuline dans le sérum humain, caractérisé en ce que l'on effectue consécutivement les opérations suivantes a) on purifie un extrait de thyroglobuline humaine au moyen d'un gradient de saccharose de façon à obtenir une thyroglobuline S19; b) on marque la thyroglobuline obtenue au moyen d'iode 125 en utilisant du lactoperoxydase c) on purifie de nouveau à l'aide d'un gradient de saccharose pour obtenir une thyroglobuline marquée S19;; d) on aJoute ensuite de la thyroglobuline contenant de la thyroglobuline marquée au sérum à doser,en quantités croissantes à chaque fois la meme quantité de sérum à doser, afin de déterminer le niveau de saturation indiquant la capacité de fixation de la thyroglobuline, et après cette addition on laisse chaque échantillon pendant 30 minutes à 37"C, puis pendant 24 heures à 4"C ensuite on traite chaque échantillon de la manière suivante e) on ajoute après ce repos dru sérum antigammaglobuline humaine provenant de la chèvre ou du lièvre et on maintient pendant 30 minutes à 37"C puis pendant 24 heures à 4"C;; 0 on mesure la radio-activité totale g) on sépare le précipité formé h) on mesure la radio-activité du précipité et on calcule la quantité de thyroglobuline fixée par les anticorps, et on établit la courbe de saturation avec les résultats obtenus. Selon l'invention on effectue en premier lieu la purification d'un extrait de thyroglobuline obtenu de la manière habituelle. Crache à cette purification on obtient uniquement des complexes avec les anticorps antithyroglobuline et il ne se produit aucune interférence. On effectue la purification au moyen d'un gradient de saccharose, technique connue, selon laquelle on fait traverser de haut en bas et par ultracentrifugation, une colonne de solution de saccharose dont la concentration diminue de bas en haut, par 1' échantillon de thyroglobuline que l'on veut purifier. On recueille ensuite les divers composants retenus dans la solution par fractionnement de celle-ci (cf. Salvatore G. et coll. Biol. Chem. 239 , 3267, 1964). On marque la fraction thyroglobuline S 19 avec de l'iode 125 en utilisant du lactoperoxydase (cf. Pommier J. et coll. Biochimie 54, 483 1972). Après le marquage on purifie de nouveau pour éliminer les thyroglobulines à plus basse constante de sédimentation qui ont pu se trouver pendant l'opération de marquage. La thyroglobuline marquée possède une activité spécifique moyenne de 0, 5/uC//ug, ce qui permet de détecter des anticorps antithyroglobuline fixant moins de 0, 02/ug de thyroglobuline par 10 il de sérum humain, ce qui donne une très grande sensibilité au présent procédé de dosage. Afin de déterminer la capacité de fixation des anticorps; on établit une courbe de saturation de manière connue. Pour ce faire, on ajoute des quan tités croissantes de thyroglobuline à chaque fois 10 ul de sérum à doser conte. serum nant les anticorps jusqu 'à ce qu'on né mesure plus d'augmentation du précipité. On se trouve alors dans la partie horizontale de la courbe. Les portions croissantes de thyroglobuline sont obtenues, comme il est connu de le faire, par l'addition de quantités croissantes de thyroglobuline non marquée, à chaque fois une même quantité de thyroglobuline marquée. Une partie des complexes thyroglobuline-anticorps étant soluble, on ajoute selon l'invention un sérum de lapin ou de chèvre antigammaglobuline humaine pour rendre ces complexes insolubles (cf. Salabé G. B. et coll. Hormones 3. 1, 1972). La quantité nécessaire est déterminée au moyen d'essais, par l'établissement d'une courbe de saturation. Les conditions de réaction à respecter sont les suivantes Après l'addition de la thyroglobuline au sérum à doser, on laisse le mélange d'abord pendant 30 minutes à 37"C, puis pendant 24 heures à 4"C. Après l'addition du sérum antigammaglobuline humaine0 on laisse reposer 30 minutes à 37 OC, puis encore pendant 24 heures à 4"C. Pour déterminer la quantité de thyroglobuline fixée, on mesure alors la radio-activité totale du mélange réactionnel, puis on sépare le précipité par centrifugation et on détermine la radio-activité de ce dernier. La multiplication du pourcentage de thyroglobuline radio-actif par la quantité de thyroglobuline non marquée ajouté fournit la quantité de thyroglobuline fixée par les anticorps antithyroglobuline. Au moyen d'un témoin on déduit la quantité de précipité non spécifique. Lorsque la quantité de thyroglobuline fixée reste constante malgré une augmentation de la quantité de thyroglobuline ajoutée, on a atteint la capacité de fixation. Les avantages du présent procédé ont notamment permis de diagnostiquer la thyroïdite juvénile chez des malades pour lesquels la méthode des globules rouges tannés avait donné un diagnostic négatif. Chez 49 des 5000 jeunes gens examinés, une thyroidite a été constatée par biopsie, dans 15 cas la méthodes des globules rouges tannés était négative, tandis que selon le présent procédé on a détecté des anticorps pouvant fixer de 0, 018 à 0, 4 rg de thyroglobuline par 10/ut de sérum. REVENDICATION Procédé de dosage de l'ensemble des complexes solubles et insolubles de la thyroglobuline avec les anticorps antithyroglobuline dans le sérum humain, caractérisé en ce que l'on effectue consécutivement les opérations suivantes a) on purifie un extrait de la thyroglobuline humaine au moyen d'un gradient de saccharose de façon à obtenir une thyroglobuline S19 b) on marque la thyroglobuline obtenue au moyen d'iode 125 en utilisant du lactoperoxydase c) on purifie de nouveau à l'aide d'un gradient de saccharose pour obtenir une thyroglobuline marquée S 19;; d) on ajoute ensuite de la thyroglobuline contenant de la thyroglobuline marquée au sérum à doser en quantités croissantes à chaque fois la même quantité de sérum à doser, afin de déterminer le niveau de saturation indiquant la capacité de fixation de la thyroglobuline, et après cette addition, on laisse chaque échantillon pendant 30 minutes à 37"C puis pendant 24 heures à 4"C ensuite on traite chaque échantillon de la manière suivante e) on ajoute après ce repos du sérum antigammaglobuline humaine provenant de la chèvre ou du lièvre et on maintient pendant 30 minutes à 37 C puis pendant 24 heures à 4C; ; f) on mesure la radio-activité totale g) on sépare le précipité formé h) on mesure la radio-activité du précipité et on calcule la quantité de thyroglobuline fixée par les anticorps, et on établit la courbe de saturation avec les résultats obtenus.