Brevet FR2310748A1 — publié le 19761210

La présente invention a pour objet un procédé m de marquage de protéines à l'aide du 99 technétium comprenant la réduction de pertechnétate et la mise en contact du pertechnétate réduit avec au moins une des protéines choisies dans le groupe comprenant le fibrinogène et les immunoglobines, pour pro voquer le marquage de cette protéine. Différentes techniques de marquage du fibrinogène ont été publiées dans la littérature. Ces données se réfèrent notamment au marquage du fibrinogène, soit à l'iode 1131, soit à llIl25. Parmi ces procédés de marquage, existent la méthode électrolytique, la méthode enzymatique, la méthode à la chloramine-T et la méthode au monochlorure d'iode. Ces techniques présentent un certain nombre d'inconvénients qui, d'une part, sont dus à l'utilisation soit de radioisotopes à demi-vie trop longue, soit de radioisotopes à demi-vie qui ne convient pas pour le marquage des protéines et, d'autre part, soit à une énergie non compatible avec les moyens de visualisation existant actuellement sur le marché et à un degré d'irradiation trop important- soit à un bruit de fond trop important qui empoche la mise en évidence de thromboses situées dans la région pelvienne, C4 est principalement pour ces raisons que l'on utilise plus volontiers actuellement des procédés de marquage m m au 99 technétium, le 99 technétium présentant les avantages majeurs suivants : la facilité d'obtention, une demi-vie courte, un émetteur gamma pur dont le rayonnement a une énergie qui permet la visualisation avec les appareils courants et enfin un degré d'irradiation minimal. Toutefois les procédés de marquage utilisés jus qu'à présent sont essentiellement basés sur des techniques de marquage électrolytique. Bien que la littérature fasse mention m de l'utilisation de procédés de marquage au 99 technétium par voie chimique, en présence d'agents réducteurs tels que le chlorure stanneux ou l'acide ironascorbique, il ressort de celle-ci que les résultats qui ont été obtenus n'ont jamais été très satisfaisants étant donné que ces agents provoquent généralement une diminution de la solubilité du pertechnétate réduit, qui peut entraver le marquage de la protéine.En ce qui m concerne les méthodes de marquage au 99 technétium utilisant la réduction du pertechnétate par voie électrolytique, bien que ne présentant pas d'après la littérature les inconvénients précités des procédés de marquage chimique connus jusqu'à présent et permettant souvent d'obtenir un marquage assez sélectif de la protéine, elles imposent l'utilisation d'un matériel compliqué et coûteux, l'électrolyse se faisant généralement au moyen d'électrodes de zirconium Or, on a constaté, suivant l'invention, d'une facon totalement surprenante, que sous certaines conditions les procédés de marquage par voie chimique de protéines au 99m technétium en présence d'agents réducteurs peuvent se révéler extr8- mement intéressants par rapport aux procédés de marquage connus, plus particulièrement par rapport aux procédés de marquage par électrolyse, tant sur le plan de la sélectivité du marquage que du rendement et de la stabilité de celui-ci. Le but de la présente invention est de présenter un procédé économique qui permet d'obtenir une solution injectable d'une protéine du groupe susdit marquée à l'aide du 99m technétium permettant à la fois de profiter pleinement des propriétés très intéressantes du technétium en tant que traceur isotopique et d'obtenir une sélectivité et une stabilité du marquage ainsi qu'une efficacité de liaison du technétium à la protéine supérieures à celles obtenues avec les procédés de marquage connus jusqu'à présent. A cet effet, suivant l'invention, on réalise la réduction du pertechnétate en présence d'un agent réducteur à un pE compris entre 11 et 12 et on soumet le mélange contenant la protéine précitée marquée à l'aide de technétium obtenu par la mise en contact du technétium réduit et de la protéine en cause, à une purification permettant l'élimination de produits de dégradation éventuels de cette protéine ainsi que de technétium non fixé. Avantageusement, la purification consiste à éliminer de cette protéine les substances ayant un poids mo-lécu- laire inférieur à 100 000. Suivant une forme de réalisation particulièrement avantageuse, on réalise la réduction du pertechnétate à un pH de l'ordre de 11,6. Suivant une forme de réalisation préférée, du pertechnétate, contenu dans du sérum physiologique, est réduit par l'addition d'une solution d'acide acétique et de chlorure stanneux comme agent réducteur suivie de l'addition d'une base pour amener le pH à la valeur voulue. L'invention concerne également une solution injectable contenant au moins une protéine choisie dans le groupe formé par le fibrinogène et les immunoglobulines, marquée à l'aide du 99m technétium, obtenue suivant le-procédé décrit ci-dessus. D'autres détails et particularités de l'invention ressortiront de la description donnée ci-après, à titre d'exemple non limitatif, de quelques formes de réalisation avantages ses du procédé suivant l'invention. La figure 1 représente un graphique obtenu par wchromatographie montrant en abscisse les différentes fractions d'une solution contenant du fibrinogène marqué au 99m technétium et en ordonnée la radioactivité desdites fractions. La figure 2 représente un graphique obtenu par chromatographie montrant en abscisse les différentes fractions obtenues d'une solution contenant du fibrinogène marqué au 99m technétium et en ordonnée la densité optique desdites fractions. La figure 3 représente l'image aggrandie sortie d'une imprimante électro-statique montrant les zones de radioactivité correspondant à la fixation du 99m technétium-pertechnétate sur les zones atteintes d'arthrite rhumatoïde de la queue et de la patte d'un rat, 19 jours après l'injection de l'adjuvant de Freund et de 500 Ci de 99m Tc 04 La figure 4 représente l'image aggrandie sortie d'une imprimante électro-statique montrant les zones de radioactivité correspondant à la fixation du 99m technétium-fibrinogène sur les zones atteintes d'arthrite rhumatoide de la queue et de la patte d'un rat, 19 jours après l'injection de la même dose d'adjuvant de Freund que celle utilisée pour l'obten- tion de l'image représentée à la figure 3, et de 500 Ci de 99m Tc - fibrinogène. Le procédé, suivant l'invention, vise la préparation d'une solution injectable de fibrinogène ou d'immunoglobulines marqués à l'aide du 99m technétium,comme traceur isotopique. Ce complexe radioisotopique est particulièrement utile dans le radiodiagnostic spécifique et précoce d'affections inflammatoires du tissu conjonctif telles que la polyarthrite rhumatoide entre autres, les thromboses vasculaires et les tumeurs malignes, en particulier celles du foie et du cerveau. On utilise avantageusement du fibrinogène lyophilisé d'origine humaine injectable aux humains et dont la fraction coagulable s'élève à 90% environ. De.plus, ce fibrinogène est stérile et est libreXd'antigène australien et de pyrogène. I1 est conservé sous une forme lyophilisée en présence de sels sodiques. Le traceur isotopique utilisé est de préférence le 99m Tc pertechnétate (NaTc04) stérile et apyrogène. Avant d'entre mis en contact avec la protéine à marquer, en l'occurence le fibrinogène, le pertechnétate est m réduit. Il est, en effet, généralement établi que le 99 Tc m obtenu sous forme de 99 Tc04-, doit entre préalablement réduit au stade + 4 ou + 5 avant de se fixer sur une molécule quelconque. Le-choix du pH est très important à cet égard et, suivant l'invention, on travaille à un pli de l'ordre de 11 à 12, de préférenca de 11,6. Il est absolument indispensable de maintenir le pH dans cette gamme. En effet, si l'on s'en écarte, on a constaté, d'une façon surprenante, que l'efficacité de Liaison du technétium réduit à la protéine diminue sensiblement. On utilise comme agent réducteur de préférence le chlorure stanneux. Le technétium réduit se fixerait alors, lorsqu'vil est mis en contact avec le fibrinogène, sur les groupements tyrosyles de la molécule de celui-ci, Le fibrinogène lyophilisé est dissous dans de l'eau stérile et apyrogène et est ensuite soumis à une dialyse pour séparer les sels sodiques susdits. Dans un stade suivant, le pertechnétate réduit est mis en contact intense, par exemple par agitation, avec le fibrinogène en solution de manière à provoquer le marquage de celui-ci. Le mélange comprenant le fibrinogène en solution et le pertechnétate réduit ainsi obtenu est ensuite amené à un pH compris entre 7 et 8, de préférence par l'addition d'une solution aqueuse de citrate de sodium et d'acide citrique. Un pH de l'ordre de 7,4 convient parfaitement. Il est également possible de procéder au marquage du fibrinogène lyophilisé sans passer par la dialyse susdite. On procède ensuite comme ci-dessus, en amenant le mélange comprenant le fibrinogène en solution et le pertechnétate réduit à un pH compris entre 7 et 8, de préférence à pH 7,4, par exemple également par l'addition d'une solution aqueuse de citrate de sodium et d'acide citrique. A cet effet, suivant l'invention, on notera que la réduction du pertechnétate, la mise en contact du pertechnétate réduit avec le fibrinogène en solution et l'abaissement du pH du mélange entre 7 et 8 se font de préférence sous une atmosphère d'azote. En effet, l'azote prend la place de l'oxygène atmosphérique et empoche toute oxydation ou réoxydation des constituants en présence, notamment du pertechnétate réduit. Suivant l'invention, on soumet le mélange ainsi obtenu, contenant la protéine marquée à l'aide de technétium, à une purification pour éliminer des produits de dégradation éventuels de cette protéine ainsi que du technétium non fixé sur cette dernière. Cette purification consiste de préférence à séparer de cette protéine marquée les substances ayant un poids moléculaire inférieur à 100.000 et éventuellement inférieur à 300.000 en faisant passer ledit mélange sur une membrane appropriée retenant les substances ayant un poids moléculaire supérieur à ceux donnés ci-dessus, Par exemple, pour n*enir les substances à poids moléculaire supérieur à 100.000 on utilise avantageusement une cellule Amicon modèle 12 avec une membrane du type XM 100 A. Avantageusement, par une première purification, on élimine le technétium libre et le technétium lié aux molédu- les dont le poids moléculaire est inférieur à 100.000 et, par une deuxième purification subséquente, on élimine toutes les molécules dont le poids moléculaire est inférieur à 300.000. Dans certains cas, par exemple lorsqu'on procède au marquage du fibrinogène lyophilisé sans passer par la dialyse, il y a lieu, avant la purification proprement dite, de séparer les particules colloidales et/ou précipitées, telles que, par exemple, les particules d'étain précipitées, apparaissant au cours de l'abaissement du pH du mélange contenant le fibrinogène en solution et le pertechnétate réduit.' On utilisera, par exemple, pour retenir ces particules, un filtre Millipore de 0,22 mp (diamètre des pores). Les différentes techniques de contr1e, comme la chromatographie sur colonne et l'immunoélectrophorèse ont permis d'établir que la méthode de purification garantit une élimination de la majorité des produits de dégradation et du technétium libre. Dans la solution finale, il a été constaté, sui m vant l'invention, que le 99 technétium est fixé à environ 90% sur une molécule de fibrinogène et ceci d'une manière très reproductible, alors que les deux purifications successives permettent, pour certains cas particuliers, d'obtenir une solution de fibrinogène marquée à l'aide de technétium dans laquelle la quantité de technétium fixée sur une molécule de fibrinogène est au moins de 98%. On notera, à cet égard, qu'avec les procédés de marquage connus jusqu'à présent, ainsi qu'on l'a déjà mentionné précédemment, on ne peut obtenir de marquage avec un rendement aussi élevé, les rendements obtenus se situant aux alentours de 55 à 70%. Les deux graphiques susdits permettent d'apprécier l'efficacité du procédé de purification suivant l'invention et de constater que le produit marqué est.bien le fibrinogène et ceci d'une manière très sélective. Les deux exemples concrets donnés ci-après permettent d'illustrer davantage le procédé suivant l'invention. Exemple 1. - réduction du pertechnétat-. 10 mCi de pertechnétate contenus dans 2ml de sérum physiolo gique sont réduits grace à l'addition, d'une part, d'un ml d'une solution aqueuse de 100ml contenant 20 lamdas d'acide acétique à 96% et lomg de SnC12.2H20 et, d'autre part, de 2 2 0,3ml de NaOH 0,1 N pour amener le pH à 11,6. - conditionnement du fibrinogène On dissout îg de fibrinogène lyophilisé dans loeml d'eau stérile et apyrogène. On dialyse le fibrinogène en solution pendant 18 heures à 40C dans des sacs à dialyse du type Visking 1-8/32" contre une solution de NaCI 0,6%. On divise le fibrinogène en solution en parties aliquotes de 2ml qu'on conserve en flacons à -200C. marquage proprement dit. 2ml de fibrinogène sont agités pendant 15 minutes et à température ambiante avec la solution contenant le technétium réduit. On abaisse ensuite le pH du mélange ainsi obtenu jusqu'à 7,4, par addition de la quantité nécessaire d'une solution tampnn contenant lOml de citrate de sodium 0,1 M et 0,5 ml d'acide citrique 0,1 M. - Purification du fibrinogène. Le technétium non fixé et les produits éventuels de dégrada tion sont élimina par passage sur cellule Amicon modèle 12 avec une membrane du type XM 100 A. - Contr6le final de la solution de fibrinogène marqué. Avant l'injection, le produit final obtenu est testé pour vérifier la stérilité et l'absence de pyrogène. Exemple 2. Réduction du pertechnétate. On procède comme dans l'exemple 1, en travaillant sous une atmosphère d'azote. - Conditionnement du fibrinogène. On dissout îg de fibrinogène lyophilisé en présence de sels sodiques dans lOOml d'eau stérile et apyrogène. On divise le fibrinogène en solution en parties aliquotes de 2ml qu'on conserve en flacons à -200C. marquage proprement dit. 2ml de fibrinogène sont agités sous azote pendant 15 minutes et à température ambiante avec la solution contenant le tech nétium réduit. On abaisse ensuite le pH du, mélange ainsi formé d'une valeur initiale de 9,6 jusqu'à 7,4, par addition de la quantité né cessaire d'une solution contenant 10 ml de citrate de sodium 0,1 M et 0,5ml d'acide citrique 0,1 M, toujours sous une atmosphère d'azote - Séparation des particules colloîdales et/ou précipitées, ap paraissant au cours de l'abaissement du pH du mélange. Les colloides éventuels et l'étain précipité sont séparés par passage du mélange sur un filtre Millipore de 0,22 mp. - Purification proprement dite du fibrinogène. On procède comme dans l'exemple 1. - Contrdle final de la solution de fibrinogène marquée. Avant l'injection, on teste également le produit final pour vérifier la stérilité et l'absence de pyrogène. De la même façon, le procédé suivant l'invention est applicable pour marquer les immunoglobulines (IgG, IgA, IgM) à laide de technétium. Comme déjà signalé ci-dessus, le marquage du fibrinogène et des immunoglobines a été conçu dans le but du diagnostic spécifique et précoce d'un certain nombre d'affections comme la polyarthrite rhumatoide, les thromboses vasculaires et les tumeurs malignes, en particulier les tumeurs du foie et du cerveau. Cette technique permet la mise en évidence des lésions au niveau des organes par la visualisation à l'aide de la gamma-caméra à scintillation. On trouvera, ci-après, une étude comparative mettant en évidence les avantages du procédé de la présente in m vention (99 Tc-fibrinogène), par rapport au procédé utilisant le 99m Tc 04-, traceur classiquement utilisé dans le diagnostic des affections articulaires inflammatoires, dans l'arthrite rhumatoïde à l'adjuvant de Freund chez le rat. I1 est connu, à cet effet, que le tableau histologique de l'arthrite rhumatoide est caractérisé par un dépit précoce de fibrine sur la membrane synoviale autour duquel s'accumulent des éléments cellulaires conduisant à la forma tion du pannus. A divers stade d'évolution de l'arthrite après injection de l'adjuvant, une même quantité de l'un ou l'autre de ces deux traceurs a été injectée à 2 groupes de rats. Le développement des investigations est présenté dans le tableau ci-après TABLEAU 1. Lots de 3 rats + adjuvant de Freund 500H Ci , , , , , , jours. 0 3 6 9 12 15 17 21 500\iCi fiTc99m 2. Enregistrement en continu de la radio-activité pendant 30 ou 60 minutes 3. Choix des zones d'intérêt. 4. Calcul des rapports d'activité a. patte entière / corps entier b. zone active / patte entière c. zone active / zone inactive 5. Comparaison de ces rapports après 5 minutes et 30 minutes 6. Méthode statistique : "t par paires". L'analyse des résultats, ainsi qu'on peut le voir plus particulièrement aux figures 3 et 4 des dessins annexés a permis de tirer les conclusions suivantes a) la répartition de 99m Tc 04- et du 99m Tc-fibrinogène au niveau des articulations malades est tout-à-fait différente m homogène pour le 99 Tc 04-, ainsi qu'on peut le voir à la figure 3 des dessins annexés, où l'on constate une seule m zone d'hyperfixation du 99 technétium au niveau de la patte et de la queue-du rat, et hétérogène pour le 99 Tc-fibrino- gène, ainsi qu'on peut le voir à la figure 4, où l'on cons tate deux zones d'hyperfixation bien distinctes au niveau de la patte, et une intense fixation au niveau de la queue. Cette différence est due principalement au comportement différent de ces 2 traceurs. L'accumulation du 99 Tc04- au niveau d'une articulation malade est le résultat conjugué de deux mécanismes - Dans une première phase, l'accumulation est proportionnelle au degré d'inflammation (méca nisme intravasculaire) - Dans une seconde phase, le traceur fixé sur des protéines sanguines diffuse dans les tis sus environnants (mécanisme extravasculaire), m Le Tc 99 -fibrinogène ne diffuse pas dans'les tissus environnants. Son degré de fixation est proportionnel à la quantité de fibrine déposée sur la membrane synoviale atteinte. b) La comparaison du rapport -zone malade après 5 minutes zone non malade et 30 ou 60 minutes montre pour le 99m Tc 04- une diminution de ce rapport au cours du temps et, par contre, une augmenta tion de ce rapport pour le 99 Tc-fibrinogène. La méthode statistique "t par paires" est hautement signifi cative # R* à t = 5 minutes et 30 minutes 99m Tc 04- 99m Tc-fibrinogène p de vasodilatation dans le cadre d'une inflammation non spé cifique, tandis que le 99"Tc-fibrinogène a une spécificité de fixation liée-à la présence d'undép8t de fibrine sur la' membrane synoviale. d) Le 99 Tc-fibrinogène en tant que traceur isotopique permet le diagnostic précoce et spécifique de l'arthrite rhumatoVde. e) Le 99 Tc-fibrinogène permet d'autre part une appréciation objective de la tendance évolutive de la maladie. I1 est bien entendu que l'invention n'est pas limitée aux formes de réalisation décrites et que bien des variantes pourraient être envisagées sans sortir du cadre du présent brevet. REVEND ICAT TONS 1. Procédé de marquage de protéines à l'aide du 99m technétium, comprenant la réduction de pertechnétate et la mise en contact du pertechnétate réduit avec au moins une des protéines choisies dans le groupe comprenant le fibrinogène et les immunoglobulines, pour provoquer le marquage de cette protéine, ce procédé étant caractérisé en ce qu'on réalise la réduction du pertechnétate en présence d'un agent réducteur à un pH compris entre Il et 12 et en ce qu'on soumet le mélange ainsi obtenu contenant cette protéine marquée à l'aide de technétium à une purification permettant l'élimination de produits de dégradation éventuels de cette protéine ainsi que le technétium non fixé. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on réalise la réduction du pertechnétate à un pH de l'ordre de 11,6. 3. Procédé suivant l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la purification consiste à séparer de cette protéine les substances ayant un poids moléculaire inférieur à 100.000. 4. Procédé suivant l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la purification susdite consiste à séparer du mélangexsusdit les substances à poids moléculaire inférieur à 300.000. 5. Procédé suivant l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la purification consiste à éliminer d'abord le technétium libre et le technétium lié aux molécules dont le poids moléculaire est inférieur à 100.000 et à éliminer ensuite les molécules dont le poids moléculaire est inférieur à 300.000. 6. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce qu'on fait passer le mélange sur une membrane appropriée permettant le passage des substances à séparer du mélange. 7. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que du pertechnétate contenu dans du sérum physiologique est réduit par l'addition d'une solution d'acide acétique et de chlorure stanneux comme agent réducteur. suivie par l'addition d'une base alcaline pour amener le pH à la valeur voulue. 8. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé entre qu'on utilise un fibrinogène d'origine humaine injectable. 9. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'on utilise du fibrinogène lyophilisé associé à des sels alcalins, on dissout ce fibrinogène dans de l'eau, on dialyse cette solution de fibrinogène pour éliminer lesdits sels alcalins et on amène le mélange comprenant le fibrinogène et le pertechnétate réduit à un pH compris entre 7 et 8. 10. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé en ce qu'on amène le mélange à un pH de l'ordre de 7,4. 11. Procédé suivant l'une ou l'autre des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce que le pH du mélange susdit est amené à la vaLeur voulue par l'addition d'une solution aqueuse de citrate de sodium et d'acide citrique. 12. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'on ut-ilise du fibrinogène lyophilisé associé à des sels alcalins, on dissout ce fibrinogène dans de l'eau et on amène le mélange comprenant le fibrinogène et le pertechnétate réduit à un pH compris entre 7 et 8. 13. Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce qu'on amène le mélange à un pH de l'ordre de 7,4. 14. Procédé suivant l'une ou l'autre des revendications 12 et 13, caractérisé en ce que le pH du mélange susdit est amené à la valeur voulue par l'addition d'une solution aqueuse de citrate de sodium et d'acide citrique. 15. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'avant la purification précitée, on sépare les substances colloidales et/ou précipitées éventuelles çparaissant au cours de l'abaissement du pH dudit mélange. 16. Procédé suivant la revendication 15, carac térisé en ce qu'on fait passer le mélange sur un filtre approprié retenant les substances à séparer du mélange. 17. Procédé suivant l'une quelconque des reven dications 12 à 16, caractérisé en ce qu'on effectue le marquage du fibrinogène sous une atmosphère d'azote. 18.- Une solution injectable, caractérisée en ce qu'elle contient au moins une protéine, choisie dans le groupe formé par le fibrinogène et les immunoglobulines, parquée à l'aide du 99mtechn6- tium et obtenue suivant un procédé selon l'une des revendications 1 i 17.