Brevet FR2288781A1 — publié le 19760521

Cette invention concerne un procédé de traitement de matériau cellviXire contenant de la glucose-isomérase. Plus particulièrement, cette invention concerne un procédé de traitement, par une enzyme protéôlytique, d'un matériau cellulaire contenant de la glucoseisomérase. La glucose-isomérase est une enzyme qui transforme le glucose en fructose. On connatt dans la technique divers micro-organismes qui produisent de la glucose-isomérase. Par exemple, le brevet britannique n 1.103.394 et le brevet japonais n 7.428 (1966) délivré d Takasaki et al., décrivent que les micro-organismes classés dans la catégorie appartenant au genre Streptomyces, tels que Streptomyces flavovirens, Streptomyces achromogenes, Streptomyces echinatus, et Streptomyces albus produisent de la glucose-isomérase. I1 existe de nombreux autres micro-organismes qui sont décrits dans la technique comme produisant de la glucoseisomérase. Ceux-ci comprennent Aerobacter cloacal, Bacillus megaterium -Acetobacter melanogenus, Acetobacter roseus, Acetobacter oxydans et Lactobacillus fermenti. I1 existe de nombreuses méthodes pour multipliser les micro organismes qui produisent de la glucose-isomérase. Les conditions exactes de multiplication, dépendent généralement des micro organismes particuliers que l'on doit multiplier Cependant, fréquemment, dans la pratique industrielle de multiplication des micro-organismes on désire procéder par étapes. Ces étapes peuvent entre nombreuses ou peu nombreuses, selon la nature du procédé et des caractéristiques des micro-organismes Ordinairement, on démarre la multiplication en ensemençant des spores provenant d'une culture inclinée, dans un milieu nutritif préalablement stérilisé contenu dans un flacon secoué. Dans le flacon, on favorise le développement des micro-organismes par divers moyens, par exemple en secouant pour faire une aération. et en mainteaant une température convenable. On peut répéter cette étape une ou plusieurs fois dans des flacons ou des récipients contenant le mêne volume ou des volumes plus grands de milieu nutritif. On peut, de manière commode désigner ces étapes sous le nom d'étapes de développement de la culture. On introduit ou bien on ensemence les micro-organismes provenant du dernier stade de développement, avec ou sans milieu de culture, dans un fermenteur à grande échelle pour produire des quantités industrielles de micro organismes ou de sous-produits de ceux-ci. On peut traiter le matériau cellulaire contenant la glucoseisornérase par la chaleur pour y fixer ou stabiliser la glucoseisomérase, par exemple, selon lea indications du brevet ja nais 19.030 (1972), pendant qu'il est dans le fluide ou le milieu de culture ou bien on peut effectuer ce traitement après avoir séparé le matériau cellulaire du fluide ou du milieu deculture. Après le traitement par la chaleur, les caractéristiques de filtration du matériau eellulaire ont relativement médiocres. Il se pose pratiquement le meme problème lorsqu'on utilise le matériau cellulaire traité par la chaleur dans une colonne ou un lit-pour isomériser en continu le glucose en fructose comme il est indiqué, par exemple dansle brevet E.U.A. N 3.694.399 de Lloyd-et al. Le substrat glucose ne traverse pas le matériau cellulaire traité aussi facilement qu'on le désire. Par conséquent, il est nécessaire d'avoir un procédé de traitement de matériau cellulaire contenant de la glucose-isomérase qui a été chauffé pour y fixer ou y stabiliser la glucose-isomérase de manière a ce qu'un liquide puisse passer relativement facilement a travers un lit ou une colonne du matériau cellulaire. --Selon la présente invention il est fourni un procédé d'amélioration du débit d'un liquide a travers un lit ou une colonne de matériau cellulaire contenant de la glucose-isomérase qui a été chauffé pour que la glucose-isomérase soit fixée ou stabilisée a l'intérieur du matériau cellulaire ou sur celui-ci, procédé qui consiste à traiter ledit matériau cellulaire dans les conditions convenables et avec une quantité suffisante d'enzyme protéolytique pour qu'un liquide passe plus facilement a travers un lit ou une colonne dudit matériau cellulaire qu'il ne passe a travers un lit ou une colonne de matériau cellulaire n'ayant pat êté traité ainsi, Lorsqu'un matériau cellulaire contenant de la glucose-isomérase qui n'a pas été chauffé pour que la glucose-isomérase y soit fixée ou stabilisée, est traité par des enzymes protéolytiques, on ne voit aucune amélioration dans les caractéristiques de filtration du matériau cellulaire.Bien que les inventeurs ne souhaitent s'en tenir à aucune théorie particulière, on pense qu'il se trouve rtaines substances, vraisemblablement des substances protéinées, présentes dans le matériau cellulaire qui au moment du chauffage, ainsi au moment où est effectuée la fixation de la glucose-isomérase par la chaleur, coagulent pour former un gel qui zalentitJ le passage d'un liquide à travers le matériau cellulaire. Les enzymes protéolytiques peuvent dissoudre ce gel.L'amélioration de la vitesse de filtration par traitement par des enzymes protéolytiques ne semble pas commune a tous les matériaux cellulaires qui contiennent des enzymes Par exemple, lorsqu'on traite par des enzymes protéolytiques des matériaux cellulaires provenant de levure, de fermentations par Bacillus subtilis et Asnerqillus niqer, on n'observe aucune amélioration de leurs caractéristiques de filtration. Les conditions dans lesquelles le matériau cellulaire contenant la glucose-isomérase est traité par les enzymes protéolytiques peuvent varier largement, mais naturellement ne doivent pas etre telles qu'elles aient un effet nocif sur la glucose-isomérase. Les températures atteignant environ 700C donnent des résultats satisfaisants bien qu'il soit préférable que le traitement soit effectué a une témpérature d'environ 250 a environ 450C. Le pH de la suspension aqueuse de matériau cellulaire pendant le traitement peut également varier largement, par exemple, d'environ 4 a environ 10, bien qu'un pH situé dans l'intervalle d'environ 5,5 a environ 7,5 soit préférable. La durée pendant laquelle le tz4ite- ment est effectué dépend des autres conditions de traitement,par exemple pH, température, etc., et de la quantité d'enzymes protéolytiques utilisée. Généralement, dans les conditions préférées, le traitement peut entre réalisé en environ 10 minutes à environ 3 heures. Les exemples d'enzymes protéolytiques qui peuvent entre utilisées dans le présent procédé sont la ficine, la bromelavne, la papaïne, une protéase alcaline et leurs mélanges. D'enzyme protéolytique préférée est la papaSne. Le matériau cellulaire préféré contenant la glucose-isomérase provient de micro-organismes du genre Streptomyces.çwn matériau cellulaire particulièrement préféré est celui qui provient de Streptomyces sp. ATCC 21175 et de Streptomyces sp. ATCC 21176. Afin de décrire plus clairement la nature de. la présente invention on va décrire ci-après des exemples spécifiques. Toutefois, il est bien entendu que ceci n'est fait qu'a titre d'exemple et n'est destiné ni a délimiter le champ de 11 invention ni a limiter le cadre des revendications annexées. EXEMPLE I Cet exemple illustre l'utilisation de la papaïne pour traiter le matériau cellulaire contenant la glucose-isomérase que l'on a chauffée pour y fixer on stabiliser la glucose-isomérase. On cultive Streptomyces Sp. ATCC 21175 dans des conditions dgadrobiose et d'immersion. On ajuste le pH du bouillon contenant le matériau cellulaire a 7,5, et on eh2uffe le bouillon pendant une 1/2 heure jusqu'S obtention d'une température de 750C. On maintient le bouillon a cette température pendant 5 minutes pour fixer l'isomérase aux cellules. On incorpore au bouillon 3% en poids d'adjuvant de filtration et ensuite on filtre le bouillon sur un filtre sous vide a tembour rotatif préalablement garni de terre a diatomées.On lave la matériau cellulaire sur le filtre et on sèche le gateau de filtration résultant dans un dessicateur où l'on fait passer de l'air a une température de 490C pendant environ 3 h 1/2 pour obtenir un matériau cellulaire séché contenant la glucose-isomérase fixée ou stabilisée. La teneur en humidité du matériau cellulaire est d'environ 15%. On ajoute des quantités suffisantes d'eau aux échantillons de matériau cellulaire pour obtenir un poids total de 100 grammes dans chaque échantillon. On traite les échantillons par de la papaïne dans les conditions indiquées dans le Tableau I, tout en agitant constamment ces échantillons. On détermine les durées de filtration indiquées dans le Tableau Il pour chaque échantillon traité de matériau cellulaire et son témoin non traité correspondant, sur un matériau cellulaire provenant d'une fermentation séparée. TABLEAU I Conditions dans lesquelles le matériau cellulaire contenant la glucose-isomérase fixée ou stabilisée, est traité par la papaîne Matériau cellu laire (%) durée du Unités Echantillons Ph Température ( C) poids (q)*100 traitement de poids total (q) papaîne * 1. Traité par la papaîne 7,2 27 5 10 (mn) 240 2. Témoin (pas de traitement 7,2 27 5 10 (mn) zéro par la papaîne) 3. Traité par la papaîne 7,3 63 10 3 (heures) 240 4. Témoin (pas de traitement 7,3 63 10 3 " zéro par la papaîne) 5. Traité par la papaîne 7,3 63 10 3 " 480 6. Témoin (pas de traitement 7,3 63 10 3 " zéro par la papaîne) * Sigma Chemical Co., Poudre brute Type II (2,4 unités/mg). Après avoir traité les échantillons dans les conditions indiquées dans le Tableau I, on les filtre sur un papier filtre Whatman de porosité n 3, de 7 cm de diamètre, placé-dans un entonnoir de nuchner sous un vide de 56 cm de mercure. On détermine le temps mis par la phase liquide pour traverser le papier filtre et l'activité de glucose-isomérase d'un groupe des échantillons. Les résultats sont indiqués dans le Tableau II ci-après TABLEAU II Durée de Activité de filtration glucose-isomérase (UIGI/g)* Echantillon (mn : s.) matériau cellulaire 1. Traité par la papa une 5*46 1141 114 2. Témoin (pas de traitement par la papaine) 10:05 1369 116 3. Traité par la papaîne 2:00 non déterminés non dé terminée 4. Témoin( pas de traite ment par la papaîne) 15:00 a d 5. Traité par la papagne 7:00 i 6.Témoin (pas de traite ment par la papaîne) 22:00 r 3 * UXGI est l'abréviation de unité International de Glucose Isomérase et est la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation du D-glucose en D-fructose a la vitesse de 1 mole par minute. Il ressort du Tableau précédent que le traitement par la papaîne du matériau cellulaire contenant de la glucose-isomérase a pour résultat une meilleure capacité de filtration du matériau cellulaire par rapport aux échantillons témoins qui-- n' ont pas été ainsi traités. En outre, on-voit que la papatne n'a pratiquement pas d'effet nocif sur la glucose-isomérase. EXEMPLE II Cet exemple illustre le traitement d'un matériau cellulaire contenant de la glucose-isomérase que l'on a chauffé pour y fixer ou stabiliser la glucose-isomerase par la ficine et une protéase alcaline. de On prépare un matériau cellulaire contenant/la glucose-isomérase selon le mode opératoire expose dans l'Exemple I. On ajoute des quantités suffisantes d'eau aux échantillons du matériau cellulaire pour obtenir un poids total dans chaque échantillon de loo grammes. On traite les échantillons par la ficine et une protéase alcaline dans les conditions indiquées dans le Tableau III tout en les agitant constamment. On détermine les durées de filtration indiquées dans le Tableau IV pour chaque échantillon traité de matériau cellulaire et pour son témoin non traité correspondant, sur un matériau cellulaire provenant d'une fermentation sérarde. TABLEAU III Conditions dans lesquelles le matériau cellulaires contenant la glucose-isomérase fixée ou stabilisée est traité par la ficine ou une protésse alcaline Matériau cellulaire (%) Durée Unités Unités Echantillon pH Température ( C) poids (g) x 100 du de fi- de pro poids total (g) trai- cines téase tement alca line ** 1. Traité par la ficine 7,2 27 5 10 58 2. Témoin (pas de trai- 7,2 27 5 10 zéro tement enzymatique) 3. Traité par une pro- 7,2 27 5 10 1000 tésse alcaline 4.Témoin (pas de trai- 7,2 27 5 10 zéro tement enzymatique) * Sigma Co., qualité brute (0,58 unité/mg) ** 1000 unités pour 0,1 g (Unités de protéase déterminées par une variante de la méthode de Kunitz M.J., Journal of General Physiology (30) p.291, 1947) Après avoir traité les échantillons dans les conditions indiquées dans le-Tableau III, on les-filtre sur un papier filtre Whatman de porosité n 3, de 7 cm de diamètre, placé dans un entonnoir de Buchner sous un vide de 56 cm de mercure. On détermine pour chaque échantillon la durée nécessaire à la phase liquide pour traverser le papier filtre et l'activité de glucose-isomérase séparément du matériau cellulaire et des-filtrats. Les résultats sont donnés dans le Tableau IV ci-après: TABLEAU IV Durée de filtra- Activité de glucose-isomérase Echantillon tion (mn:s.) UIGI/g) * Matériau cellulaire Filtrat 1.Traité par 3:47 1324 110 la ficine 2. Témoin(pas de traitement en zymatique) 4:50 1200 106 3. Traité par une protéase alca line 4:33 1200 123 4. Témoin (pas de traitement en zymatique) 6:01 1342 112 * UlGI est l'abréviation de Unité International de Glucose Isomerase et est la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation du Glucose en D-fructose d la vitesse de I mole par minute. Il ressort du tableau précédent que le traitement d'un matériau cellulaire contenant de la glucose-isomérase par une protéase alcaline ou par la ficine a pour résultat une meilleure capacité de filtration du matériau cellulaire comparativement aux échantillons témoins qui sont pas été traités ainsi. En outre, on voit que le traitement enzymatique n'a pratiquement pas d'effet nocif sur l'activité d'isomérase du matériau cellulaire. EXEMPLE III Cet exemple illustre le traitement d'un matériau cellulaire provenant de divers micro-organismes par diverses protéases. On traite dans les conditions indiquées dans le Tableau V, et tout en les agitant, des échantillons de 100 ml de bouillons de fermentation de Bacillus Subtilis et Aspergillus niger, à 8,8 et 12% de substance sèche respectivement, et des échantillons aqueux de 100 ml de lavure contenant 1,5% de substance sèche de levure. TABLEAU V Conditions dans lesquelles le matériau cellulaire provenant de divers micro-organismes a été traité par des protéases Micro-organisme Type de protéase pH Température ( C) Durée du Unités de dont provient traitement protéase le matériau (minutes) utilisées Echantillon cellulaire 1. Levure Bromelane * 7,0 45 60 200 2. Levure Ficine ** 4,5 45 60 58 3. Levure Papaine *** 7,0 45 60 240 4. Levure Protéase alcaline 7,0 45 60 1000 **** 5. Levure Absente 7,0 45 60 6.Bacillus subtilis Bromelaine 7,0 45 60 200 7. " Ficine* 4,5 45 60 58 8. " Papaine 7,0 45 60 240 9. " Protéase **** 7,0 45 60 1000 alcaline 10. " Absente 7,0 45 60 11. Aspergillus niger Bromelaine 4,5 45 60 200 12. " Ficine** 7,0 45 60 58 13. " Papaine *** 7,0 45 60 58 14. " Prothéase *** alcaline 7,0 45 60 1000 15. " Absente 7,0 45 60 - * Sigma Chemical Co, qualité pratique (200 unités pour 0,1 g) ** Sigma Chemical Co., qualité brute (0,58 unités par mg) *** Sigma Chemical Co., poudre brute type II (2,4 unités par mg) **** 1000 unités pour 0,1 g (unités de protéase déterminées par une variante de la méthode de Kunitz, M.J.;Journal of General Physiology (30) p. 291, 1941 Après avoir traité les échantillons dans les conditions indiquées dans le Tableau V on les filtre sur un papier filtre de Whatman de porosité N 3, de 7 cm de diamètre, placé dans un entonnoir de Buchner sous un vide de 56 cm de mercure. On détermine la durée nécessaire a la phase liquide pour traverser le papier filtre et on donne les résultats dans le Tableau VI ci-après. TABLEAU VI Micro-organisme dont provient le matériau Durée de la Echan- cellulaire Type de-protéase filtration tillon ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~~~~~~ (mn : s.) 1. Levure Bromelaine 7:57 2. " Ficine 14:00 3. " Papaïne do:18 4. Protéase alcaline 7:29 5. Absente 5:55 6.Bacillus subtilis Bromelaine > 60:00 7. a Ficine 8. " Papaine " 9; a protéase - " alcaline 10. Absente 11. Aspergillus nicrer Bromelaine 4:21 12. " Ficine 6:46 13. J Papaïne 2034 14. " Protéase alcaline 24:18 15. S Absente 1:17 I1 ressort du Tableau précédent que le traitement d'un matériau cellulaire provenant de micro-organismes tels que levure, Bacillus subtilis et Aspergillus niger, par diverses protéases, n'améliore pas sa capacité de filtration, et en fait, semble avoir on effet nocif sur celui-ci. REVENDICATIONS 1. Procédé d'amélioration du débit d'un liquide a travers un lit ou une colonne de matériau cellulaire contenant que l'on a chauffé pour fixer ou stabiliser la glucose-isomérase dans ou sur le matériau cellulaire, lequel procédé est caractérisé en ce que l'on traite ledit matériau cellulaire dans des conditions convenables et avec une quantité suffisante d'enzyme protéolytique qui permettront a un liquide de traverser plus facilement un lit ou une colonne dudit matériau cellulaire que le meme liquide de tra verser un lit ou une colonne de matériau cellulaire qui n'a pas été traité ainsi. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en- ce que le matériau cellulaire provient de sicro-organismes du genre Streptomyces. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé- en ce que le liquide contient du glucose. 4. Procédé selon l'une des revendications 1, 2 et 3, caractérisé en ce que l'enzyme protéolytique est choisie dans le groupe formé de la ficine, de la bromelatne, de la papaine, de protéases alcalines, et de leurs mélanges. 5. Procédé selon l'une des revendications l a 4, caractérisé en ce que l'on traite une suspension aqueuse du matériau cellulaire par une enzyme protéolytique. 6. Procédé selon l'une des revendications I a 5, caractérise en ce que le traitement du matériau cellulaire par une enzyme protéolytique est effectué a une température pouvant atteindre environ 700C. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le traitement du matériau cellulaire par une enzyme protéolytique est effectué a une température de 250 a environ 450C. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 a 7, caractérisé en ce que on traite -le matériau cellulaire a un pH de 4 a lo. 9. Procédé selon la revendication B, caractérisé en ce que l'on traite le matériau cellulaire a un pH de 5,5 a 7,5. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 a 9, caractérisé en ce que le traitement est effectué pendant une durée d'environ 10 minutes a environ 3 heures. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 a lo, caractérisé en ce que le matériau cellulaire provient de Streptomvces sp. ATCC 21175 ou de strentomsces sp. ATCC 21176.