Brevet FR2285894A1 — publié le 19760423

La présente invention a trait à de nouveaux médicaments destinés à la stimulation des réponses immunitaires des organismes récepteurs On sait que les mécanismes de défense de l'organisme, brièvement résumés en immunité humorale et en immunité cellulaire, interviennent pour éliminer les corps étrangers qui pourraient être nuisibles, tels que notamment les micro-organismes (bactéries, rickettsies, virus, champignons, protozoaires ou métazoaires) et les cellules anormales, y compris les cellules néoformées poten tiellement ou effectivement aptes à devenir une "tumeur". La notion de surveillance immunologique qui a été main tenant établie montre notamment qu'il existe des liens entre la diminution naturelle ou provoquée de la réactivité immunologique et l'accroissement du risque de cancer. Par ailleurs, un certain nombre de maladies sont dates, de façon bien connue , à des modi fications du fonctionnement du système immunologique ou accompa gnent de telles modifications, notamment les maladies auto-immunes, maladies par immun-complexes, intoxications, septicémies, etc... On a déjà expérimenté ou utilisé un assez grand nombre de substances susceptibles d'augmenter la réactivité immunologi que des sujets récepteurs, cette stimulation de l'immunité cor respondant à une importante gamme d' antigènes. A titre d' exemple on peut citer le B.C.G. utilisé dans le cas des leucémies lympho ides ou des lymphomes, des extraits de M. tuberculosis, de C-par vum, de Brucella, etc ... Ces substances présentent cependant divers inconvénients. En particulier elles sont souvent Fxiques. Elles provoquent à divers degrés l'effet "producteur de granulome local" et, d'une façon générale, 1'ignorance de leur nature exacte et les conditions difficiles de leur préparation rendent compliquées une expérimentation systématique et une bonne reproductibilité des résultats cliniques. Les nouveaux médicaments selon l'invention remédient à ces inconvénients et possèdent une toxicité très faible et dans certains cas nulle. Certains au moins des médicaments ont une action antitoxique sur l'organisme. Ils sont dénués dol'effet "producteur de granulome local". L'administration des médicaments seon l'invention a pour effet une stimulation de la réponse immunologique spécifique de l'organisme en cas d'introduction d'un antigène. Ces médicaments agissent selon le cas sur la production d'anticorps et sur l'immunité cellulaire et, de façon générale sur ces deux aspects de l'immunité. Ils permettent de rétablir une réactivité immunologique normale chez des patients dont l'activité immunitaire a été diminuée de façon naturelle ou provoquée. Lorsque le médicament selon l'invention est associé à un vaccin il provoque un accroissement de l'effet immunoprotecteur du vaccin. Les nouveaux vaccins selon l'invention sont susceptibles d'un assez grand nombre d'applications thérapeutiques. Ils sont notamment utilisables dans l'immunothérapie des cancers pour rétablir une réactivité immunologique normale, associées à des "antigènes" (cellules tumorales, extrait de ces cellules, virus oncogènes). Ils sont également utilisables dans la prévention des cancers par immunothérapie des sujets immunologiquement déficients, notamment les personnes agées et les personnes qui ont été soumises à des thérapeutiques immunodépressives telles que rayons ionisants, antimétaboliques, antimitodiques. Les médicaments selon l'invention sont également applicables à la restauration de l'immunité amoindrie par l'âge (immunosenescence), par un déficit naturel ou par une modification grave de l'état général. Les nouveaux médicaments. selon l'invention peuvent également être utilisés pour l'immunothérapie des brûlures. Les nouveaux médicaments immunostimulants sont caractérisés par le fait qu'ils comprennent un ou plusieurs thiols minéraux absents en tant que constituants normaux des êtres vivants, comprenant environ entre 16 et 40 % de soufre dans la molécule, ladite molécule présentant une cyclisation ou étant cyclisable. Lesdites molécules possèdent un poids moléculaire faible dont le domaine sera défini par l'indication, à titre d'exemple, de certains thiols minéraux constituant ou faisant partie des médicaments selon l'invention. Dans un mode de mise en oeuvre préféré un médicament selon l'invention, dosé pour son administration, par exemple chez l'homme, comprend une quantité de thiol minéral, expriméeen mg par Kg d'organisme receveur, suffisante pour que l'index de stimulation, ramené à la souris et obtenu en divisant le nombre de plaques compté pour 108 cellules de la rate de souris après stimulation et injection d'hématies de mouton, par le nombre de plaques obtenues après injection des hématies de mouton, seules, soit supérieur ou égal à 1,6. D'une façon générale ladite dose est égale de préférence à au moins 1 mg/Kg. Les médicaments ainsi constitués selon l'invention comprennent de préférence l'un au moins des composés suivants - le diéthyldithiocarbamate de soude de préférence a des doses de 10 à 25 mg/Kg - le thiomalate de soude de préférence à des doses de 0,6 à 10 mg/Kg - le thiosulfate de soude - le métabisulfate de sonde - la méthimazole (mercaptométhylmidazole) - le thiaphase - la thioguanine - le thiosericarbazine - la phénothiazine - le thiouracile Les nouveaux médicaments selon l'invention peuvent avantageusement etre administrés en méme temps qu'un vaccin, notamment un vaccin dans lequel les antigènes proviennent de cellules tumorales, d'extraits de ces cellules ou de virus oncogènes, dans le but d'augmenter le pouvoir immunisant du vaccin. L'adjonction peut s'effectuer simultanénent au vaccin, ou avant ou après, de façon particulièrement avantageuse moins de deux jours avant ou après l'administration du vaccin. L'invention a pour objet, à titre de nouveaux médicaments immanostitulants, les dicaroents contenant une préparation d'antigènes agissant comme un vaccin et au moins un thiol minéral comprenant de 16 à 40 % de soufre environ dans la molécule, ladite molécule présentant une cyclisation ou étant susceptible d'étre cyclisée, ladite molécule étant absente en tant que constituant normal des entres vivants. Un tel médicament peut avantageusement comporter des antigènes provenant de cellules tumorales ou de leurs extraits ou encore des antigènes viro-oncogbnes. Parmi les thiols minéraux précités, ledit médicament présente de préférence un thiol choisi dans le groupe précisé ci-dessus. De tels médicaments se caractérisent par un effet de combinaison dans lequel le thiol minéral, agissant a la manière d'un adjuvant, potentialise l'action antigénique des antigènes du vaccin, permettant ainsi de provoquer une réponse immunitaire accrue, même dans un organisme dont la réactivité immunologique a été abaissée. La quantité de thiol minéral dans le médicament dosé est telle que l'index de stimulation est au moins égal à 1,6. La dose de diéthyldithiocarbamate de soude ainsi que celle de thiomalate de soude est de préférence comprise entre 1,25 et 25 mg/Kg. On va maintenant, à titre d'exemple, décrire l'action desdits médicaments sur la réponse irmauritaire ae la souris. Les expériences permettant la détermination de l'index de stimulation (IS) ont été établies par le comptage des plaques d'hemolyse de rate de souris, localisées en gel selon une techni- que dérivée de la méthode originale de JERKE. Cette méthode en soi classique permet de relever l'activité des lymphocytes B (production d'anticorps) comme des lymphocytes T (immunité cellulaire et. induction de la production d'anticorps). L'inaex IS est obtenu en divisant le nombre de plaques comptées pour 108 cellules nucléées de la rate après une administration de globules rouges de mouton et du médicament selon l'invention, par le nombre de plaques obtenues après injection des hématies de mouton seules, toujours pour 108 cellules nucléées. On consiaère, par l'analyse statistique des résultats, au'une valeur de IS#1,6 correpsond à une stimmulation affective de l'immunité alors qu'une valeur de IS#0,60 correspond à une inhibition. EXEMPLE I On utilise des groupes de cinq souris femelles de laboratoire CI-1 (Rivers) pesant 20+1 g et on incole lesdites souris par voie intraveineuse avec 108 hématies de mouton. Certains groupes de souris sont alors conservés comme contrôle de l'activité de l'antigène. D'autre groupes reçoivent simultanément, mais séparément par voie sous cutanée, des doses différentes par groupe, de thiols minéraux, les doses s'échelonnant de 0,625 mg/Kg à 25 mg/Kg. Deux jours après les injections d'antgènes et de thiol les souris sont sacrifiées et les rates examinées. A cet effet on mélange dans une boite de Petri de 100 mm de diamètre, 2ml de milieu de Eagle gélosé à 0,8% contenant 3,5 x 108 hématies de mouton et 0,2 ml de milieu de Eagle non gélosé contenant en suspension homogène et bien dispersée le cinquième de la pulpe splénique d'une souris. Après solidification du milieu et incubation de 1 h à 370C, on répartit à la surface de chaque boite 1,5 ml de C' de cobaye dilué au 1/5ème de tampon veronal de Mayer et l'on porte à nouveau pour 1 h à 370C. La fixation sur l'antigène (hématies de mouton) des anticorps diffusés autour des cellules formatrices et l'effet cytotoxique subséquent de C' créent des plaques d'hémolyse. Ces plaques sont repérées, comptées et leur nombre apporté à 108 cellules spléniques nucléées, en même temps qu'est calculé l'ecart-type. Les résultats obtenus sont visibles sur le tableau N01 ci-dessous. INDEX DE STIMULATION PAR INJECTION SOUS CUTANEE DU PRODUIT EN MEME TEMPS (SIMULTANE) QUE L'ANTIGENE INTRAVEINEUX TABLEAU 1 Thiols Doses 0,625 1,25 2,5 5 12,5 25 diéthyldithiocarbamate de soude 0,9 2,5 2,5 2 3,5 Thiomalate de soude 2,6 3,1 3,9 Cystine 0,98 Cystéine 0,98 Méthionine 1,1 Thiamine 0,98 0,98 0,98 1,2 Thiosulfate de soude : : :3,5 : :2,5 Metahisulfate de soude 3,4 2,5 22,9 Thiophène 3,2 1,1 0,55 Methimazole 5,6 7,3 2,6 Thioguanine 0,9 1,7 5,1 Thioracile 1,8 2,6 1,1 Phenothiazine 3,5 0,3 Thiosemicarbazine 1,67 1,65 4,2 1,9 On voit sur le tableau 11 aue pour 1 dose pour de 0,625 mg/Kg une action immunostimmulante est déjà présente pour le métybisulfi te de soude, Le methimazole, le thiouracile et le thiosemicarba- zine. Pour 1 dose de 1 mg/Kg l'action immunostimulante est pour la quasi-totalité des thiols. A partir de doses de 2,5 mg/Kg certains thiols devien nent moins actifs, toutefois le diéthyldithiocarbamate de soude, le thionalate de soude, le thiosulfate de soude, notamment, sont actifs a des doses supérieures pouvant aller jusqu'à 25 mg/Kg pour le diéthyldithiocarbamate de soude qui n'est d'ailleurs pas toxique à cette dose. On a également étudié, a tire de comparaison, 1'index de stimulation de thiol organique tel que la cystine, la cystéine, la methionine et la thiamine. Aux différentes doses envisagées ces composés ne sont pas actifs. EXEMPLE 2 Dans cet exemple des souris ont été traitées de façon analogue à celle de l'exemple 1, à la seule différence que les souris ont subi l'inoculation du diéthyldithiocarbamate de soude 18 heures avant l'inoculation de l'antigène. Les résultats sont les suivants INDEX DE STIMULATION LE PRODUIT ETANT INJECTE 18 HEURES AVANT L'ANTIGENE TABLEAU 2 Produit Doses (mg/Kg) s0,625 : 2,50 : 5,0 : 14,5 : 25 léthydithiocarbamate a soude 4,4 2,45 1,2 3,8 4,7 EXEMPLE 3 Les memes essais que dans l'exemple 1 ont été effectués sur des souris a l'exception du fait que les thiols ont été injectés 6 heures après l'inoculation de l'antigène (tableau 3), et dans une seconde série d'essais, 24 heures après l'inoculation de l'antigène (tableau 4). Toutes les doses employées sont efficaces pour le thiogalate de soude de même que pour le diéthyldithiocarbamate de soude. INDEX DE STIMULATION PAR INJECTION SOUS CUTANEE DU PRODUIT 6 HEURES APRES L'ANTIGENE TABLEAU 3 Produit Doses (mg/Kg) :0,625 :1,25 : 2,5 : 5 : 12,5 : 25 hiomalate de soude 5,8 4,2 3,6 3,0 22,7 diéthyldithiocarbamate de soude : 0,45: 2,10: 3,8: 6,2: 3,1 Thiosulfate de soude : : :3,5 : : 2,5 etabisulfite de soude 2,0 Cystine : : 1 : : Cystéine : : 1 : : : hiamine . : 1,2 : . INDEX DE STIMULATION PAR INJECTION SOUS CUTANEE DU PRODUIT 24 HEURES APRES L'ANTIGENE TABLEAU 4 Produit Doses (mg/Kg) :0,625 : 1,25: 2,5 : 5 : 12,5 : 25 iéthyldithiocarbamate e soude : 3,2 : : 1,4 1,6 3,1 : 4,0 EXEMPLE 4 Dans cet exemple on a étudié l'action du diéthyldithiocarbamate de soude sur la réponse immunologique des souris agées. Des souris CD-1 femelles, hors d'âge (agées de plus de 9 mois et pesant de 49 à 54 grammes) sont inoculées par la voie veineuse par 108 globules rouges de mouton. Les souris traitées par le diéthyldithiocarbamate de soude reçoivent 6 heures après l'antigène les unes 2,5 mg/Kg, les autres 12,5 mg/Kg de ce composé. Deux jours après l'injection d'antigène (hématies de mouton) les souris sont sacrifiées et leur rate examinée. Les résultats sont résumés au tableau 5. TABLEAU 5 Action sur les souris âgées CD-1 femelles, plus de 9 mois, 49 à 54 g. (10 souris par lot) Traitement PFC/1 8 + SE aucun 39 + 21 108 hématies 98 + 37 108 hématies + 2,5 mg/Kg DEDTC 284 + 79 10 hématies + 12,5 mg/Kg 316 + 58 Ces résultats montrent que l'administration de diéthyldithiocarbamate de soude à des souris très âgées est capable d'augmenter selon la dose du traitement, de 2,9 à 3,2 fois plus leur potentiel immunitaire pratiquement aboli par l'immunisenescence. L'inoculation de ces souris âgées élève leur réponse immunitaire à un niveau (316 plaques) voisin de celui des souris jeunes adultes qui, injectées par la même quantité du même antigène donnent 380 plaques. EXEMPLE 5 Dans cette expérience on a étudié l'action sur la souris d'un médicament selon lDinvention à base de diéthyldithiocarbamate de soude lors d'une attaque toxique de la souris. Des souris femelles CD-1 de 20 + 1 g reçoivent une inoculation de 2,5 mg de toxine brucellique correspondant à la fraction "phénol" de brucella melitensis. On sait qu'une telle inoculation amène un net amaigrissement toxique des souris, (voir Renoux et Renoux, J.Inf.Diseases, 1973, 127, 139). Un premier lot de souris inoculées est maintenu comme témoin de l'activité de la toxine. Un deuxième lot est traité par 2,5 mg/Kg de diéthyldithiocarbamate de soude, 12 heures après l'inoculation de la toxine.Un autre lot est traité par 5 injections de la mme quantité (2,5 mg/Kg de diéthyldithiocarbamate de soude) aux jours +2,+3,+4,+6,+7, après inoculation de la toxine. Le lot n 1 consiste aux souris témoins n'ayant reçu qu'une ino culation. Un autre lot 5 est un témoin de l'action du diéthyldi- thiocarbamate de soude sur les souris sans inoculation de toxine, chaque souris recevant cinq injections dans les mêmes conditions, aux mémes jours et heures que les souris du lot 4. Ces souris sont entretenues dans un air conditionné a 240C et nourries d'aliments spéciaux sans antibiotiques. Le résultat est représenté sur la figure 1 qui montre en abscisse le temps en jours et en ordonnée l'évolution en poids a partir du poids normal. On voit que les souris qui ont reçu 1'endotoxine seule maigrissent de 4 g en moyenne par rapport aux témoins, soit une perte de poids d'environ 20 %. Les souris traitées par le thiol 12 heures après 1'in- jection d'endotoxine ne maigrissent pas et dès le 20ème jour ont une courbe de poids très nettemment supérieure à celle des témoins. Les souris traitées au thiol -i jours 2, 3, 4, 6, 7 après l'injec- tion de la toxine ne magrissment pas et ont dès le 20ème jour rme courbe de poids très fortement supérieure a celle des témoins. On voit ainsi que le diéthyldithiocarbamate de soude possède une activité anti-toxique associée à un effet anabolisant chez les souris. L'administration à des sujets humains des médicaments selon l'invention peut par exemple être efectuée par voie orale soit sous forme d'une solution du thiol a la dose inscrite, soit sous forte solide a l'aide d'un excipient de type classique. Dn variante l'administration peut s'effectuer par voie sous cutanée le thiol étant de préférence dissous dans de l'eau physiologique. De façon préférée, l'admministration du médicament dans le but de provoquer un relèvement de 1' immunité s'effectue en administrant au moins une dose par jour et ceci de préférence durant des périodes de plusieurs jours ou plusieurs semaines. REVENDICATIONS 1. Vaccin caractérisé par le fait qu'il comprend une préparation d'antigènes agissant comme un vaccin et au moins un "thiol minéral" comprenant de 16 a 40 % de soufre dans la molécule, ladite molécule présentant une cyclisation ou étant susceptible d'être cyclisée, ladite molécule étant absente en tant que constituant normal des êtres vivants. 2. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les antigènes proviennent de cellules tumorales ou de leurs extraits. 3. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les antigènes sont des antigènes viro-oncogènes. 4. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait qu'il comprend 1'un au moins des composés du groupe constitue par le diéthyldithiocarbamate de soude, le thiomalate de soude, le thiosulfate de soude, le métabisulfite de soude, la méthimazole (mercaptométhylimidazole) , le thiophéne, la thioguanine, le thiosemicarbazine, la phénothiazine, le thiouracile. 5. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'il comprend une quantité de thiol minéral, exprimée en mg/Kg d'organisme receveur suffisante pour que l'index de stimulation, ramené à la souris et obtenu en divisant le nombre de plaques comptées pour 108 cellules nucléées de la rate de souris aes stimulation et injection d'hématies de mouton, par le nombre de plaques obtenues après injection des hématies de mouton seules, soit supérieur ou égal a 1,6. 6. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 a 5, caractérisé par le fait qu'il contient du diéthyldithiocarbamate de soude en des quantités dosées entre 1,25 et 25 mg/Kg d'organisme receveur. 7. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 a 5, caractérisé par le fait qu'il contient du thiomalate de soude en des quantités dosées entre 1,25 et 25 mg/kg d'organisme receveur.