Brevet FR2316966A1 — publié le 19770204

La présente invention a pour objet un nouvel antibiotique, sa préparation et son application en thérapeutique, titre de principe actif de médicament. Le nouvel antibiotique qui sera désigné par la suite S 31794/F-1 possède les caractéristiques indiquées ci-après. Il se présente sous forme d'une poudre amorphe, qui peut être cristallisée comme indique à l'exemple 3, Lorsqu'aucune précision n'est donnée, les caractéristiques indiquées ci-dessous se rapportent aussi bien a la forme amorphe qu'à la forme cristalline. Point de fusion: forme amorphe: 178-180 - (avec décomposition); forme cristalline: 181-183 (avec décomposition). Pouvoir rotatoire spécifique: [&alpha;]20 = -240- (c = 0,5 dans le méthanol) D [&alpha;]D20 = +37 (c = 0,5 dans la pyridine) (forme cristalline) Spectre ultraviolet (dans le méthanol): voir figure 1. Maxim'ms d'absorption à: 194 nin, E = 807 lcm 1 225 nm (épaulement), ElCm = 132 1% 276 nm, E1cm = 12,8 284 nm (épaulement), E1% = 10,5 1cm Spectre infrarouge: dans le bromure de potassium (forme amorphe) voir figure 2. Dans le nujol (forme cristalline): voir figure 3. Spectre de RMN: sur protons dans le diméthylsulfoxyde: voir figure 4 (100 MHz; substance de référence: tétraméthylsilane) 13 sur C dans le méthanol D4 (forme cristalline); voir tableau I ci-après. TABLEAU I Spectre de RMN sur C de l'antibiotique S 31794/F-1 (forme cristalline; 190 mg dans 1,5 ml de méthanol 24). Appareil Bruker HX-90E; 22,63 MHz, domaine spectral: 6000 Hz; tétraméthylsilane = û ppm. ppm ' ppm ppm 176,2 75,5- 51,2 175,0 74,0 39,7 173,7 71,0 38,8 172,6 70,5 36,6 172,0 69,7 34,8 171,8 68,0 32,8 171,7 62,2 30,6 168,6 58,3 26,7 157,7 57,0 23,5 132,5 56,2 19,7 129,0 55,4 14,3 115,9 52,9 11,1 76,6 Analyse élémentaire: - Après séchage de la substance amorphe sous vide poussé a 200 on a obtenu: C = 53,9% H = 7,5% N = 10,1% 0 = 27,3% - Après séchage de la substance cristalline sous vide poussé, pendant 2 heures 1000, on a obtenu:: C = 55,5-56,5% H = 7,5 - 7,7% N = 10,5-10,8% 0 =25,5 - 26,0% Le nouvel antibiotique se dissout bien dans le méthanol, l',ethanol, la pyridine et le diméthylsulfoxyde. I1 est peu soluble dans l'eau, le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'éther, le benzène et l'hexane. L'antibiotique S 31794/F-1 est stable dans le méthanol aqueux à pH 3-7,5. En dehors de ces limites, il y a décomposition avec perte de l'activité fongicide. Par hydrolyse en milieu acide (HC1 6N; 1100), on a obtenu comme produit de décomposition l'acide myristique, qui a été identifié sous forme de myristate de méthyle. La chromatographie en couche mince sur plaques de gel de silice Merck d'épaisseur 0,25 mm a fourni les résultats rassemblés dans le tableau II suivant. TABLEAU II Gluants Valeurs Rf Chloroforme-méthanol-eau * (71 : 25 : 4) 0,17 (0,4 Chloroforme-méthanol-acide acétique glacial t (70 : 29 : 1) 0,19 (0,6 Chloroforme-méthanol (2 : 1) 0,27 (0,5*) *) Se rapporte la substance de référence commercialisée sous la dénomination Uracil. ta substance peut être révélée au moyen d'iode ou par vaporisation d'un révélateur approprié. On opère de préférence de la manière suivante: Apres avoir entièrement éliminé le solvant de la plaque, on vaporise sur celle-ci un méla-ng parts égales d'acétone et d'une solution éthanolique d'acide acétique glacial à 0,5%. On place ensuite la plaque pendant environ 7 minutes dans une atmosphere de chlore, puis on chasse le chlore en exces au moyen d'un fort courant d'air. Sur la plaque ainsi préparée, on vaporise une solution composée d'une partie d'une solution aqueuse O,05M d'iodure de potassium et de 4 parties d'une solution à 0,5% de benzidine dans de l'acide acétique à 20%.L'antibiotique S 31794/F-1 apparaît alors sous forme d'une tache bleue. L'essai de coloration à la ninhydrine est négatif avec le nouvel antibiotique. Selon le procédé de l'invention,pour préparer le nouvel antibiotique S 31794/F-1 on cultive sur ou dans un milieu nutritif une souche d'Acrophialophora limonispora nov.spec. Dreyfuss & Müller susceptible de produire l'antibiotique S 31794/F-1. On opère selon les méthodes connues pour la préparation d'antibiotiqueS par fermentation. Une culture d'une souche ainsi définie a été déposée sous le nO NRRL 8095 au "United States Department of Agriculture" (Northern Utilization Research and Development Division), Peoria, Illinois (USA). On peut utiliser une souche de base d'Acrophialophora limonispora nov.spec. Dreyfuss & Müller ou une souche obtenue å partir de cette souche de base, par exemple par sélection, irradiation ou traitement par des substances mutagènes. On utilise de préférence la souche NRRL 8095. Caractéristiques de la souche NRRL 8095 La nouvelle souche NRRL 8095 a été isolée d'un prélèvement de terre provenant de la Colombie Britannique (Canada). En raison de ses caractéristiques morphologiques, elle a été classée dans le genre Acrophialophora Edward de 11 ordre des Hyphomycétals, mais elle ne concorde pas avec les trois espèces déjà décrites de cet ordre LSamson et Tariq Mahmood, 1970: The Genus Acrophialophora, Acta bot.Neerl. 19 (6), 804-808] et sera par conséquent désignée par la suite comme une nouvelle espèce, Acrophialophora limonispora nov.spec. Les conidiophores brun clair à brun foncé de la nouvelle souche NRRL 8095 ont généralement de 700 à 1800 de long et de 4 à 8 p d'épaisseur. Ils sont septés, droits ou légèrement incurvés, et ne présentent géneralement pas de ramifications sauf un petit nombre dans la partie inférieure et moyenne; ils peuvent être verruqueux sur toute la longueur. A l'extrémité des conidiophores se développe un système ramifié defaçon pénicillée, symétrique ou asymétrique, généralement compact, formé par des hyphes latéraux primaires constitués d'une seule ou de quelques cellules, qui apparaissent de façon verticillée en général sur les dernières cellules de l'hyphe principal des conidiophores, en quinconce ou, le plus souvent, par paires dont les éléments se font face, ou encore à trois, plus rarement à quatre. Ces hyphes latéraux portent eux-mêmes latéralement et à leurs extrémités plusieurs ramifications secondaires qui peuvent à leur tour porter des hyphes tertiaires.Aux extrémités de ces ramifications secondaires et tertiaires, on observe un groupe compact de deux à six phialides effilés, dont les dimensions sont de 7 à 11 x 2,5 a 4 p Dans les vieilles cultures surtout, on trouve de petits pinceaux présentant des éléments de ramification fortement allongés. Les conidies hyalines sont disposées en chaînes à développement basipétal qui se désagrègent aisément. Vues de profil, elles sont larges et citriformes et présentent des apicules plus foncés. Leurs dimensions sont de 3,2 à 4,2 x 3,0 à 3,5 ju et leur surface est lisse à faiblement verruqueuse. La souche NRRL 8095 possède un optimum de température de croissance entre 20 et 270; après 7 jours1 on obtient sur un milieu gélosé à 2% d'extraits de malt, une colonie d'environ 35 à 40 mm. La limite inférieure de croissance se situe aux environs de 4 -, la limite supérieure entre 33 et 340 Les colonies développées sur milieu gélosé à 2% d'extraits de malt sont d'abord d'un blanc verdâtre et recouvertes d'un mycélium aérien blanc, très peu dense. En vieillissant, le mycélium de substrat devient brun foncé, Le mycélium aérien initialement formé se recouvre progressivement- en l'espace de 5 à 10 jours d'un tapis compact de conidiophores tout d'abord de couleur jaune d'or à vert jaunâtre, ensuite dvun brun clair, puis sombre à gris. La nouvelle souche NRRL 8095 peut être cultivée sur ou dans des milieux nutritifs appropriés, en culture de surface ou en culture immergée et agitée. On effectue de préférence des cultures immergées, par exemple comme décrit ci-après: On ensemence avec une suspension de conidies ou de mycélium de la nouvelle souche NRRL 8095 un milieu nutritif approprié tel que ceux décrits aux exemples 1 et 2. On incube ensuite pendant 48 à 360 heures, de préférence pendant 120 à 288 heures, à un pH de 3 à 8, de préférence de 5 à 7, et à une température comprise entre 15 et 300, de préférence entre 18 et 270, tout en agitant, en secouant et/ou en aérant On désagrège éventuellement le mycélium dans le bouillon de culture et on isole l'antibiotique S 31794/F-1 par extraction et/ou par adsorption, selon les methodes connues.On peut également séparer d'abord le mycélium du bouillon de culture par centrifugation, extraire separément le filtrat et le mycélium après avoir désagrégé ce dernier, et poursuivre le traitement des extraits séparément ou après les avoir reunis. La présente invention comprend également les bouillons de culture obtenus par fermentation d'une souche d'Acrophiaophora limonispora nov.spec. Dreyfuss & Müller susceptibles de produire l'antibiotique S 31794/F-1. Le nouvel antibiotique S 31794/F-1 se signale par d'intéressantes propriétés pharmacodynamiques. I1 exerce notamment une action antimicrobienne, en particulier contre les levures et les champignons inférieurs. Alors que sous les conditions habituelles, le nouvel antibiotique s'avere être sans effet contre les bactéries Gram positives et Gram negatives, il présente une remarquable action contre différentes souches de l'espèce Candida, pathogènes pour l'homme. Le tableau III suivant indique les concentrations inhibitrices minimales contre différents champignons et levures. Les essais de dilution en série utilises pour ces déterminations ont été effectués selon les méthodes habituelles, avec les souches indiquées. Dans ces essais, l'incubation est pratiquée dans un milieu à 2% d'extraits de malt de pH 5,2-5,4, à une temperature de 27. On évalue les résultats après 48 à 72 heures d'incubation. TABLEAU III Organisme Concentration inhibitrice minimale en ,uq/ml Candida albicans 0,3 Candida krusei 1 Candida tropicalis 0,3 Candida albicans 5897 0,3 Candida albicans H 12 0,3 Candida albicans Blast.res. 0,03 TABLEAU III (suite) Organisme Concentration inhibitrice minimale en jigimi Candida tropicalis CK 4 0,01 Candida albicans 439 0,03 Trichophyton mentagrophytes 32 Trichophyton quinckeanurn = > 100 Blastomyces dermatitidis 100 Sporotrichum schenkii > 100 Aspergillus niger 100 Aspergillus fumigatus 32 Microsporum canis 100 Curvularia lunata > 100 Neurospora crassa > ioo L'efficacité de l'antibiotique S 31794/F-1 contre Candida albicans a également été mise en évidence in vivo dans l'essai de l'infection expérimentale de L'intestin chez la souris femelle. Dans cette méthode, on déplace par traitement aux antibiotiques l'équilibre de la flore intestinale normale en faveur de Candida albicans administré par voie orale (voir à ce sujet H.B.R. Seeliger, Handbuch der experimentellen Pharmakologie XVI/ll/A, page 27 et suivantes). Après administration par voie sous-cutanée de l'antibiotique S 31794/F-1 a des doses partant de 25 mg/kg, on a constaté la guérison de la totalité des animaux soumis a l'essai. Grâce à ces propriétés, l'antibiotique S 31794/F-1 peut être utilisé en thérapeutique comme amtimycotique, en particulier pour combattre Candida albicans. I1 sera prescrit à des doses quotidiennes comprises entre 1 et 3 g de substance active pour l'administration par voie orale et entre 20 et 150 mg de substance active pour l'administration par voie parentérale. Ces quantités peuvent etre administrées en une seule fois ou en plusieurs doses unitaires de 250 à 1500 mg de substance active pour l'administration par voie orale et de 5 à 75 mg de substance active pour l'administration par voie parentérale, a raison de 2 à 4 fois par jour. Le nouvel antibiotique peut être utilisé comme médicament, soit seul, soit mis sous forme de compositions pharmaceutiques appropriées pour l'administration par la voie orale, parentérale ou rectale, tels que des comprimés, des capsules, des solutions, des suppositoires ou des pommades. Pour préparer des compositions pharmaceutiques appropriées, on travaille la substance active avec des excipients minéraux ou organiques, inertes du point de vue pharmacologique. On peut par exemple incorporer les nouveaux antibiotiques a une pommade à raison d'environ 5 à 50 mg de substance active par gramme de pommade. Comme excipients, on pourra utiliser par exemple: pour des comprimés et des dragées: le lactose, l'amidon, le talc, l'acide stéarique etc..; pour des sirops: l'eau, le saccharose, le sucre inverti, le glucose, etc..; pour des préparations injectables: l'eau, des alcools, le glycérol, des huiles végétales etc.. pour des suppositoires: des huiles naturelles ou durcies, des cires, des graisses etc. Les compositions pharmaceutiques peuvent en outre contenir des agents de conservation, de dissolution, des stabilisants, des mouillants, des édulcorants, des colorants, des aromatisants etc.., appropriés. ExemEle de comEosition Eharmaceutigue- comprimés Antibiotique S 31794/F-1 0,0300 g Stéarate de magnésium 0,0010 g Polyvinylpyrrolidone 0,0040 g Talc 0,0050 g Amidon de mais 0,0100 g Lactose 0,1480 g Huile de diméthylsilicone 0,0005 g Poîyéthylèneglycol 6000 0,0015 g Pour un comprimé pesant 0,200 g On mélange à sec la substance active, le stéarate de magnésium, le polyéthylèneglycol 6000, la polyvinylpyrrolidone, le talc, l'amidon et le lactose. On granule le mélange ainsi obtenu avec de l'huile de diméthylsilicone en suspension dans de l'eau, on seche et on comprime le granulé broyé pour en faire des comprimés. Avec 100 g du mélange décrit ci-dessus, on peut fabriquer théoriquement 500 comprimés pesant chacun 0,200 g et contenant chacun 30 mg de substance active. Les exemples suivants illustrent la présente invention sans aucunement en limiter la portée. Les températures sont toutes indiquées en degrés centigrades et sont données non corrigées. Exemple 1 Culture de la souche NRRL 8095 On ensemence avec un litre d'une~preculture de la souche NRRL 8095 10 litres d'une solution nutritive contentant, par litre d'eau déminéralisée, 20 g de glucose 5 g de peptone de caseine 3 g de NaN03 1 g de K2HPO4 o,5 g de KC1 0,5 g de MgS04.7H20, et 10 mg de FeS04.7H20. On laisse ensuite incuber pendant 4 jours à 180 dans un fermenteur en verre de 10 litres, tout en agitant (150 tours par minute) et en aérant (1 litre d'air par minute et par litre de solution nutritive). La préculture utilisée ci-dessus peut etre préparée comme décrit ci-après: On cultive pendant 10 ours a 27 lasouche NRRL 8095 sur un milieu gélosé contenant, par litre d'eau déminéra lisée, 20 g d'extraits de malt, 20 g d'agar-agar et 4 g d'extraits de levure. Les spores et le mycélium de cette culture sont ensuite mis en suspension dans une solution physiologique de chlorure de sodium. Avec cette suspension, on ensemence un litre d'un milieu nutritif contenant, par litre d'eau déminéralisée, 20 g d'extraits de malt et 4 g d'extraits de levure et on laisse incuber pendant 2 jours à 27 dans un erlenmeyer de 2 litres, sur un agitateur à mouvement rotatif (180 tours par minute).Avec le bouillon de culture ainsi obtenu, on ensemence le fermenteur de 10 litres, Exemple 2 Culture de l-a souche NRRL 8095 ~(variante) On ensemence un fermenteur en acier renfermant 50 litres d'un milieu nutritif contenant, par litre, 200 g de saccharose 10 g d'albumine de soja 10 g d'extraits de levure 10 g d'extraits de malt 2 g de KH2P04 2 g de MgS04.7H20 et, pour le reste, de l'eau déminéralisée, avec 10 litres d'une préculture secondaire de la souche NRRL 8095. On laisse incuber pendant 12-jours à 240, à un pH compris entre 5 et 7, tout en aérant (0,8 à 1,0 litre d'air par minute et par litre de milieu nutritif) et en agitant à une vitesse de rotation passant progressivement de 150 à 400 tours par minute. Pour préparer la préculture secondaire utilisée cidessus on procède comme décrit ci-après: Afin d'obtenir des conidies servant à ensemencer le milieu de préculture, on cultive pendant 19 jours à 270 la souche NRRL 8095 sur un milieu gélosé incliné contenant, par litre, 100 g de sorbitol 10 g de tryptone (peptone préparée à partir de caséine) 250 mg de KH2P04 250 mg de MgS04.7H20 250 mg de Ca(N03)2*4H20 125 mg de KC1 16 mg de FeS04.7H20 7 mg de ZnS04.7H20 15 g d'agar-agar et, pour le reste, de l'eau déminéralisée. Pour préparer une préculture primaire, on ensemence dans un erlenmeyer de 2 litres, un litre de milieU de préculture contenant, par litre, 20 g d'extraits de malt et 4 g d'extraits de levure et, pour le reste, de l'eau déminéralisée, avec 8 - 9 . 10 conidies dans 10 ml d'une solution à 0,9% de chlorure de sodium, et on laisse incuber pendant 4 jours à 240 sur un agitateur à mouvement rotatif, à 180 tours par minute. Pour préparer la préculture secondaire, on ensemence dans un fermenteur en verre 10 litres du milieu de préculture décrit ci-dessus avec 2 litres de préculture primaire ainsi obtenue, et on laisse incuber pendant 4 jours à 240, tout en agitant (150 tours par minute) et en aérant (0,5 litre d'air par minute et-par litre de milieu nutritif). Exemple 3 Obtention de l'antibiotique S 31794/F-1 A 90 litres du bouillon de culture obtenu à l'exemple 1 ou 2, on ajoute 90 litres d'un mélange d'acétate d'éthyle et d'isopropanol dans le rapport 4:1, et on homogenéise ce mélange dans un appareil Ultraturrax pendant 30 minutes à la température ambiante. On sépare la phase organique, on l'évapore sous pression réduite à une température maximale de 400 et on chromatographie le résidu d'évaporation sur 10 fois sa quantité de gel de silice Merck (dimension des grains: 0,06 à 0,2 mm) en procédant comme suit: Le résidu brut est d'abord adsorbé sur 1 à 2 fois sa quantité de gel de silice Merck (dimension des grains: 0,2 à 0,5 mm); à cet effet, on le dissout dans du méthanol ou un mélange de méthanol et d'eau en utilisant le moins de solvant possible, on ajoute le gel de silice et on évapore à nouveau le solvant sous pression réduite. On met en suite le gel de silice ainsi imprégné en suspens ion dans un mélange de chloroforme et de méthanol dans le rapport 95:5 et on place cette suspension sur la colonne de chromatographie. On commence l'élution avec un mélange de chloroforme et de méthanol dans le rapport 95:5 et on la poursuit en doublant à chaque fois la part de méthanol jusqu'à 40%. On réunit les fractions actives contre Candida albicans et où la chromatographie en couche mince a mis en évidence la présence de métabolites dans la zone de l'antibiotique S 31794/F-1. On chromatographie ces fractions sur 100 fois leur quantité de Séphadex LH-20 en éluant avec du méthanol et on réunit à nouveau les fractions à activité antifongique contenant des métabolites de l'antibiotique S 31794/F-1. On chromatographie le produit ainsi fortement concentré en antibiotique S 31794/F-1 sur 100 fois sa quantité de gel de silice Merck (dimension des grains: 0,05 à 0,2 mm) en utilisant, comme éluant, un mélange de chloroforme, de méthanol~et d'eau dans le rapport 71:25:4. Les fractions où la chromatographie en couche mince a mis en évidence la présence de l'antibiotique S 31794/F-1 à l'état pur sont ensuite réunies et évaporées. On dissout le résidu d'évaporation dans un peu de méthanol et on ajoute de l'éther. L'antibiotique S 31794/P-1 précipite alors sous forme d'une poudre amorphe blanche. Après séchage sous vide poussé à 25-30 , l'antibiotique S 31794/F-1 à l'état amorphe fond a 178-180 (avec décomposition). On fait cristalliser ce produit dans 10 fois sa quantité a d'un mélange d'acétate d'éthyle, de méthanol et d'eau dans le rapport 80:12:8, ce qui donne l'antibiotique S 31794/F-1 sous forme de cristaux filiformes fondant à 181-183 (avec décomposition) après séchage sous vide poussé à 200.. REVENDICATIONS 1. Le nouvel antibiotique S 31794/F-1, caractérisé en ce qu'il présente, sous forme amorphe et cristalline (sauf si la forme est précisée)-, les propriétés suivantes: Point de fusion: forme amorphe: 178-180 (avec décomposition); forme cristalline: 181-183 (avec décomposition). Pouvoir rotatoire spécifique: [&alpha;]20 = -240 (c = 0,5 dans le méthanol) D [&alpha;]D20 = +37 (c = 0,5 dans la pyridine) (forme cristalline} Spectre ultraviolet (dans le méthanoi): voir figure 1. Maximums d'absorption à: 194 nm, E1% = 807 1cm 225 nm (épaulement), E1% = 132 1% 1cm 276 nm, E1cm = 12,8 284 nm (épaulement), E1% = 10,5 1cm Spectre infrarouge: dans le bromure de potassium (forme amorphe): voir figure 2. Dans le nujol (forme cristalline): voir figure 3. Spectre de RMN: sur protons dans le diméthylsulfoxyde: voir figure 4 (100 MHz; substance de référence: tétraméthylsilane) 13 sur C dans le méthanol D4 (forme cristalline): voir tableau I. Analyse élémentaire: - Après séchage de la substance amorphe sous vide poussé à 200 on a obtenu: C = 53,9t H = 7,5% N = 10,1% 0 = 27,3% - Après séchage de la substance cristalline sous vide poussé, pendant 2 heures à 1000, on a obtenu: C = 55,5-56,5% H = 7,5 - 7r7* N = 10,5-10,8% o =25,5 - 26,0% 2.- Le nouvel antibiotique S 3l794/F-l spécifié à la revendication 1, caractérisé en ce qu'il se trouve sous forme amorphe. 3.- Le nouvel antibiotique S 31794/F-1 spécifié à la revendication 1, caractérisé en ce qu'il se trouve sous forme cristalline. 4.- Un procédé de préparation du nouvel antibiotique S 31794/F-1 spécifié à l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on cultive sur ou dans un milieu nutritif une souche d'Acrophialophora limonispora nov.spec. Dreyfuss & Müller susceptible de produire l'antibiotique S 31794/F-1, et on isole sous forme amorphe ou cristalline l'antibiotique ainsi obtenu. 5.- Un procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on utilise une souche de base dtAcrophialophora limonispora nov. spec. Dreyfuss & Müller, ou une souche obtenue par sélection, traitement par des substances mutagènes ou irradiation de cette souche de base. 6.- Un procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on utilise, comme souche d'Acrophialophora limonispora nov.spec. Dreyfuss & Müller, la souche NRRL 8095. 7.- Les bouillons de culture obtenus par fermentation d'une souche d'Acrophialophora limonispora nov.spec. Dreyfuss & Buller susceptible de produire l'antibiotique S 31794/F-1 spécifié à l'une quelconque des revendications 1 à 3. 8.- L'application en thérapeutique du nouvel antibiotique S 31794/F-1 spécifié à l'une quelconque des revendications 1 à 3, à titre de principe actif de médicament. 9.- Un médicament caractérisé en ce qu'il contient, à titre de principe actif, l'antibiotique S 31794/F-1 spécifié à l'une quelconque des revendications 1 a 3. 10.- Une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient l'antibiotique S 31794/F-1 spécifié à l'une quelconque des revendications 1 à 3, en association avec des excipients et véhicules acceptables du point de vue pharmaceutique.