Brevet FR2300130A1 — publié le 19760903

,a présEnte invention se rapporte à un dispositif dZa- agitation de suspensions de cellules vivantes permettant de cultiver Ces cellules dans des conditions favorables à leur developpement D'une manière générale, les cellules que l'on cultive sont fragiles et sédimentent rapidement, il est donc impératif de les agiter si l'on veut éviter qu'elles s'agglutinent et meurent par anoxie, et leur agitation doit etre menée avec beaucoup de précautions de façon à ne pas les blesser ou à ne pas les tuer On sait que l'on effectue des cultures de cellules vivantes, que celles-ci soient d'origine animale ou végétale, à la fois dans un but de recherche fondamentale, par exemple lorsnue l'on veut connaître l'action d'une substance, d'un rayonnement ou de tout autre facteur sur le développement de ces cellules, ou dans un but industriel, lorsque l'on veut recueillir les produits de sécrétion de ces cellules en vue d'en extraire certaines substances E'est ainsi que l'on extrait des alcaloïdes à partir d'une plante connue sous le nom de Ruta graveolens et de la nicotine à partir de Nicotina tabacum On traite de ces questions en détail dans les trois documents suivants - dans la revue Physiologie Végétale, tome 4, pages 365 à 378, de 1966 où se trouve un article de LescurE intitulé "Etudes quanti statives de la croissance d 'une culture d'Acer pseudo platanus (L)". - das la revue intitulée Annales de l'institut Pasteur. Paris, tome 9, pages 090 à 410, 1950 se trouve un article de sacques Monod intitulé "La technique de culture continue, beorie eT. application", - dans un livre intitulé In plant tissue on cell culture" par HoE Street, Editeur Elackwell Scientific Publications, ondon, 1973, pages 292 à 297. Parmi les procédés connus d'agitation des cellules an suspension, on peut citer celui qui consiste à entraîner, dans un mouvement de rotation ou de va-et-vient, le récipient de culture tout entier il est bien évident qu'un tel procédé ne peut s'appliquer qu' de petits volumes de l'ordre de 1 ou 2 litres, car pour des volumes plus importants, le brassage est de moins en moins efficace On peut également brasser les cultures au moyen d'agitateurs à ailettes ou au moyen de barreaux magnétiques en appui sur le fond des récipients de culture et entraînés par la rotation d'un aimant tournant au fond des récipients à l'extérieur de ceux-ci.Il se trouve que la plupart des cellules vivantes, et notamment celles des animaux et des végétaux supérieurs sont fragiles et risquent de ce fait d'être détruites soit par le contact des ailettes, soit par l'abrasion des barreaux magnétiques sur le fond des récipients. On peut encore brasser les cellules au moyen d'une tige à ailettes commandée de l'extérieur et plongeant dans la suspension. Dans ce cas, l'étanchéité des récipients est problématique et la stérilité du milieu n'est pas garantie. L'invention a pour objet un dispositif d'agitation de suspensions des cellules vivantes dans un flacon, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement un agitateur suspendu par sa tête au sommet du flacon, et équipé d'une masse magnétique généralement située à sa base, et un aimant déplaçable à l'extérieur du flacon de façon à conférer à l'agitateur un mouvement pouvant être au choix un mouvement de balancement pendulaire, un mouvement de révolution autour de la verticale passant par le sommet de l'agitateur et un mouvement de rotation sur lui-même. Suivant un premier mode de réalisation du dispositif, l'agitateur est constitué d'une tige dont la base est équipée d'une pince porteuse d'un barreau magnétique. Cet agitateur est recouvert de téflon ou d'une matière analogue ne présentant pas d'arete vive susteptible de blesser les cellules et r,e réagissant pas chimiquement avec la solution. La tête de l'agitateur est constituée d'une double chape inversée,comportant une chape supérieure,dont les deux joues sont reliées par un axe et une chape inférieure,dont les deux joues com portent chacune une vis à pointeau sur lesquelles s'articule la tige de l'agitateur La tige de l'agitateur comporte à son sommet une bague qui repose sur une butée à billes dont le plateau inférieur est solidaire d'une hape circulaire articulée autour des vis à poin tesu e La tige de l'agitateur comporte à sa base une pince porteuse d'un barreau magnétique. Le flacon repose sur un coffret équipé intérieurement d'une piste à crémaillère sur laquelle peut se déplacer entre deux positions extrêmes un chariot porteur d'un aimant. Suivant une variante du dispositif, ie flacon repose sur un coffret dans lequel est logé un aimant entraîné en rotation autour d'un axe excentré par rapport à la verticale passant par 1E sommet de l'agitateur. Un tel dispositif permet d'éviter les inconvénients présentés par les dispositifs connus, puisqu'il permet le déplace- ment de l'agitateur en souplesse à vitesse contrôlée, sans que cElui-ci touche le fond des récipients et sans qu'il blesse les cellules. En outre, il est bien adapté à la culture en -émos- tat, ctest-3-dire en présence de quantités constants de certains réactifs, et en turbidostat, c'Est-à-dire en vitesse. d'agitation constante dans les conditions définies dans l'article cité ci-dessus de Jacques OOD. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront encore de la description qui suit de quelques exemples de réalisation d'un dispositif conforme à l'invention donnés en référence aux dessins annexés dans lesquels La figure l représente un premier mode de réalisation du dispositif La figure 2 représente en détail la tête de l'agitas tueur La figure 3 est une vue de côté du haut de la figure 2 ; et la figure 4 est un diagramme comparatif des résultats obtenus au moyen de trois agitateurs de types différents. Sur la figure 1 , on observe un flacon I en verre du type généralement utilisé pour effectuer des réactions chimiques. Ce flacon, qui repose sur un coffret 2, est équipé d'un couvercle 3 qui comporte un col central 4 et quatre cols périphériques ré gulièrement répartis tels que 5 et 6, par lesquels on Introduit de l'air, des solutions nutritives et des réactifs ou extrait de l'air et effectue des prélèvements de solutions. Le bouchon 7 du col 4-est conçu de façon à supporter par sa base 6 la tête 9 d'un agitateur 10 qui plonge dans le flacon 1, sans toutefois en toucher le fond. L'agitateur 10 est constitué d'une tige 11 en verre enrobée de téflon, dont la base est équipée d'une pince 12 entre les mâchoires de laquelle est maintenu un barreau magnétique 13, l'ensemble étant enrobé de téflon pour éviter le plus possible de blesser les cellules Le coffret 2 est équipé intérieurement d'une piste à crémaillère 14 sur-laquelle peut se déplacer un chariot 15. Un moteur 16 d'entraînement du chariot entraîne un pignon 17 qui engrena avec les dents 18 de la crémaillère. Le chariot 15 entraîne un aimant 19 de forme généralement parallélépipédique qui repose sur une roue 20 en appui sur un axe 21 prévu sur le chariot. Un moteur 22 d'entraînement de l'aimant en rotation est monté dans une console 23 et fait tourner un pignon 24 qui engrène avec les dents 25 de la roue 20. Deux inverseurs de fin de course 26 et 26' sont fixés au sommet du coffret 2, ils ont pour ralle de changer le sens de marche du chariot dès qu'ils entrent en contact avEc l'aimant On voit sur les figures 2 et 3 que la tête 9 de l'ag tateur est constituée d'une double chape inversée qui comprend une chape supérieure 27 dont les deux joues 28 et 28' sont reliées par un axe 29 qui coopère avec un logement 30 prévu à la base 8 du bouchon 7, et dont l'ouverture peut être obturée par abaissement d'une douille de verrouillage 31, et une chape inférieure 32, dont les joues 33 et 33' sont porteuses de deux vis à pointeau 35 et 35' qui se font face Le sommet 37 de la tige 11 est entouré d'une bague 38 qui repose sur une butée à billes 39 dont le plateau inférieur 4 est solidaire d'une chape circulaire 41 comportant une lumièrE cE- traie 42. Les deux joues 43 et 43' de la chape 41 sont percées extérieurement de deux trous coniques diamétralement opposés, qui coopèrent avec les vis à pointeau 35 et 35'. On comprend que grâce à l'agencement de sa tête, l'agitateur puisse tourner sur lui-même autour des billes, et avoir un mouvement de balancement pendulaire autour des vis à pointeau. Le fonctionnement du dispositif se déduit de la description donnée ci-dessus, il ne sera donc donné ci-après que brièvement Le chariot 15, qui est entrainé par le moteur 16, se déplace sur la piste 14 en conduisant l'aimant 19 vers l'inverseur 26 jusqu'à ce qu'il vienne au contact de ce dernier qui commande la rotation en sens inverse du moteur 16 jusqu'à ce que l'aimant 19 vienne au contact de l'inverseur 26'. il en résulte que le barreau magnétique 13 suit l'aimant en décrivant un mouvement pendulaire, et qu'il tourne sur lui-même en suivant la rotation de l'aimant 19. Parmi les variantes de ce dispositif, on peut citer celle qui consiste à ne pas déplacer le chariot, mais à seulement faire tourner l'aimant, sur lui-même, par rotation du moteur 22. Le barreau n'est donc plus animé que d'un mouvement rotatif sur lui-même, et il est plus long que dans le cas de la figure 1 afin d'assurer un brassage convenable de la solution. On peut également fixer le chariot 15 sur la piste 14 dans une position telle que l'axe 21 de la roue 20 ne soit pas vertical, et ainsi faire tourner l'agitateur sur lui-même. On peut éventuellement entraîner le chariot sur une piste circulaire dans un mouvement de révolution autour de la verticale passant par le sommet de l'agitateur, celui-ci tournant oc non sur lui-meme Pour mettre en évidence la supériorité du dispositif conforme à l'invention, par rapport aux dispositifs déjà connus, on a fait simultanément trois séries d'essais identiques dans des flacons semblables en utilisant toutefois des dispositifs d'agita tio différents. ,es trois courbes de la figure 4 représentent pour cnaque série la variation du nombre de cellules par ml de solution indiqué enlogaritnmes en ordonnées en fonction de la durée de l'essai exprimée en jours. La série 1 a été effectuée en utilisant un agitateur magnétique posé sur le fond d'un récipient, et entraîné par un aimant mobile tournant à l'intérieur d'un plateau servant de suppurt au récipient. La série 2 a été effectuée en utilisant un dispositif d'agitation du récipient suivant un mouvement de va et vient. La série 3 a été effectuée en utilisant un dispositif conforme à l'invention du type décrit ci-dessus. Ces trois séries d'essais ont été effectuées dans des flacons de 30 litres dans lesquels on a placé 20 iitres d'une solution contenant 80 000 cellules par ml d'érable Acer pseudoplatanus (L) dans un milieu de culture stérile bien connu des spécialistes sous le nom de milieu de LAMPORT modifié par LESCURE. Pendant toute la durée des essais, c'est-à-dire pendant 16 jours, la température a été maintenue à 250C et un débit d'air de 100 1/heurte a été maintenu à l'intérieur des flacons pour assurer l'oxygénation des cellules. Au bout de 10 jours, on a observé dans la série 1 (courbe I), que le nombre des cellules au ml est passé de 80 000 à 100 000 et dans la série 2 (courbe II), de 80 D00 à 700 000, alors que dans la série 3 (courbe III), ce nombre est passé de 80 000 à 2,6 millions Une aussi grande différence dans les résultats s 'ex- plique par le fait que dans le cas de la série 1, beaucoup de cellules ont été tuées par abrasion entre l'agitateur et le fond du récipient, et dans la série 2, une mauvaise oxygénation due à une agitation insuffisante a entraîné la mort des cellules par anoxie. Par contre, dans la série 3, toutes les conditions favorables à un bon développement ont été réunies.. Il est bien entendu que les modes de réalisation qui ont été décrits ci-dessus n'ont aucun caractère limitatif, et que de nombreuses variations et modifications pourront y être apportées sans se départir pour autant ni du cadre ni de l'esprit de liinvention. REVENDIzATIONS 1. Dispositif d'agitation de suspensionsdes cellules vivantes dans un flacon, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement un agitateur suspendu par sa tête au sommet du flacon, et équipé d'une masse magnétique généralement située à sa base, et un aimant déplaçable à l'extérieur du flacon de façon à conférer à l'agitateur un mouvement pouvant être au choix un mouvement de balancement pendulaire, un mouvement de révolution autour de la verticale passant par le sommet de l'agitateur et un mouvement de rotation sur lui-même. 2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agitateur est constitué d'une tige dont la base est équipée d'une pince porteuse d'un barreau magnétique 3. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agitateur est recouvert de téflon ou d'une matière analogue ne présentant pas d'arête vive susceptible de blesser les cellules et ne réagissant pas chimiquement avec la solution 4. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que la tête de l'agitateur est constituée d'une double chape inversée comportant une chape supérieure dont les deux joues sont reliées par un axe et une chape inférieure dont les deux joues comportent chacune une vis à pointeau sur lesquelles s'artile la tige de l'agitateur, 5.Dispositif selon la revendication 4, caractérisé en ce que la tige de l'agitateur comporte à son sommet une bague qui repose sur une nuitée à billes dont le plateau inférieur est solidaire d'une chape circulaire articulée autour des vis à pointeau, 6 Dispositif selon la revendication i , caractérisé en ce que le flacon repose sur un coffret équipé intérieurement d'une piste à crémaillère sur laquelle peu se dplacer ,er -r deux positions extrêmes un chariot porteur d'un aimant 7. Dispositif selon la revendication 6, cara-térise en ce que le flacon repose sur un coffret dans lequel est logé un aimant entraîné en rotation autour d'un axe excentré par rapport à la verticale passant par le sommet de l'agitateur