Brevet FR2314497A1 — publié le 19770107

L'invention a pour objet un procédé de dosage du glycérol à l'aide dtau moins une enzyme et qui peut servir, entre autres, au dosage des triglycérides du sérum sanguin. On utilise déjà des méthodes enzymatiques de dosage du glycérol impliquant la réduction du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) par le glycérol et faisant intervenir soit une seule enzyme, la-glycérol-déshydrogénase (GDH), soit deux enzymes la glycérol-kinase (GK) et la glycérol-3-phosphate déshydrogénase (GPDH). Dans l'un et l'autre cas, la réaction produit du nicotinamide adénine dinucléotide réduit (NADH2) dont la quantité est proportionnelle à celle du glycérol. Toutefois, la quantité produite de WADH2 ne peut être évaluée autrement que par spectrophotométrie en ultra-violet ou, pour arriver à une plus grande sensibilité, par fluorimétrie. L'obligation de faire cette détermination en lumière non visible est un inconvénient gênant qui impose le recours à un appareillage complexe et coûteux. L'invention a pour but principal d'apporter un procédé de dosage du glycérol qui permette d'en faire la détermination quantitative en lumière visible. Un autre but de l'invention-est de parvenir à un procédé de dosage du glycérol en lumière visible à l'aide d'un appareillage simplifié et avec une sensibilité accrue par rapport aux méthodes connues qui comportent une mesure en ultra-violet. Selon le procédé de l'invention, on soumet le glycérol à doser à l'action d'une enzyme au moins, appropriée, dans un milieu réactionnel convenable, en présence de chlorure de (p-iodophényî)-2-p-nitrophényl)-3 phényl-5 tétrazolium (INT), ou d'un autre sel de tétrazolium conduisant au même résultat. L'action de l'enzyme ou des enzymes produit du NADH2 qui réagit, au fur et à mesure de sa formation, avec INT pour donner du INT réduit ayant une coloration rouge typique dont on peut mesurer l'intensité par photocolorimétrie vers 500 nm. Quand on maintient la- réaction dans des conditions déterminées, que lson précisera plus loin, la densité optique mesurée est proportionnelle à la quantité de glycérol présent au début de la réaction. On ajoute encore au milieu réactionnel du méthyl-sulfate de méthyl-5-phénazinium (PMS) qui joue un rôle de catalyseur de la reaction de réduction des sels de tétrazolium incolores en formazans colorés par le NADH2. Selon un mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention, on fait intervenir une seule enzyme, la GDH ; selon un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, on fait intervenir deux enzymes, la GK et la GPDH. Dans le premier cas, le schéma réactionnel du procédé de l'invention est le suivant glycérol + NAD + INT ; GDH dihydroxyacétone + NADH2 NADH2 + INT PMS INT réduit + NAD Dans le second cas, ce schéma devient glycérol + ATP + INT # GK glycérol-3-phosphate + ADP glycérol-3-phosphate + NAD QPDH phosphate de dihydroxyacétone + NADH2 NADH2 + INT # PMS INT réduit + NAD Pour mieux faire comprendre l'invention, on donnera maintenant, uniquement à titre d'illustration, trois exemples de mise en oeuvre du procédé de l'invention. Exemple I Dosage de glycérol à l'aide de ODIl. A une quantité de 0,05 ml d'une solution de glycérol à doser, on ajoute 0,02 ml d'une solution aqueuse d'albumine bovine à 50g/l dans NaCl à 9g/1, puis 0,2 ml d'une solution tampon aqueuse appropriée à l'enzyme employée afin de maintenir dans le milieu réactionnel final une valeur du pH proche de 9sans dépasser ce chiffre, puis 0,1 ml d'une solution aqueuse de réactif colorant ayant la composition suivante - pour 1 ml - NAD = 5 mg. - INT = 0,8 mg. - PMS = 0,img. Puis on ajoute encore 0,1 ml d'une solution de GDH à 2 UI/ml au moins dans du tampon phosphate de potassium 0,01 M ph 7,5 contenant 4g/l d'albumine bovine. Après mélange homogène, on chauffe à 3700, de préférence au bain-marie. Comme le réactif colorant est sensible à la lumière, il est préférable de se servir d'un bain-marie opaque muni d'un couvercle. On tient le mélange à cette température pendant 20 minutes puis on bloque la réaction enzymatique en ajoutant 1,5 ml d'acide chlorhydrique 0,1 N. Ceci a pour effet de donner au pH du mélange réactionnel une valeur de 2 à 3 à laquelle le mélange n'est plus photo-sensible et la coloration est stabilisée. Plus exactement, la coloration est stable à la lumière pendant plusieurs heures, à condition que l'on évite la lumière solaire directe. Ainsi qu'il est connu, on prépare dans un tube témoin T un mélange identique à celui indiqué ci-dessus sauS qu'on s'abstient d'y ajouter l'enzyme. On mesure la densité optique du premier tube par rapport au tube témoin T, à 500 nm, et, à partir de cette densité optique, on évalue la concentration du glycérol dans la solution initiale en se reportant à une courbe d'étalon nage établié préalabllement à l'aide de dilutions à diverses valeurs d'une solution étalon de glycérol. On a remarqué que, selon l'invention, la densité optique est proportionnelle à la quantité de glycérol, jusqu'à une valeur de 6,5 microgrammes, contenue dans la prise d'essai de la solution à doser, valeur à laquelle correspond une densité optique de 0,7 environ. La sensibilité de la réaction de l'invention telle qu'on vient de la décrire est la suivante : 81 microgramme de glycérol contenu dans la prise d'essai de la solution à doser correspond une densite~optique de 0,i05 (toujours à 500 nm) dans un volume réactionnel final de 2 ml. On notera que l'emploi d'une solution de GDH plus concentrée permet de diminuer le temps de réaction et d'aug- menter la zone dans laquelle la densité optique est proportionnelle à la concentration du glycérol. Exemple 2 Dosage du glycérol à l'aid4 de GK et de -GPDH. A une quantité de 0,05 ml d'une solution de glycérol à doser, on ajoute 0,02 ml d'une solution aqueuse d'albumine bovine identique à celle de l'exemple 1, puis 0,3 ml d'une solution tampon aqueuse appropriée aux enzymes employées afin de maintenir une valeur de pH de 8,7 à 8,75 puis 0,1 mol d'une solution aqueuse de réactif colorant ayant la composition suivante - pour 1 ml : - NAD = 20 mg - INT = 2 mg - PMS = 0,2 mg - ATP = 14 mg à un pH de 6, à 6,5 obtenu à l'aide de la quantité voulue de tampon approprié. L'abréviation ATP désigne 1 'adénosine-5 '-triphos- phate dont la présence est nécessaire aux enzymes. Ensuite, on ajoute 0,01 ml du réactif enzymatique sous forme d'une suspension dans le sulfate d'ammonium 3,2 M des quantités minimales suivantes GK 20 UI/ml GPDH 50 UI/ml Après mélange homogène, on chauffe à 370 C, en prenant les précautions indiquées à l'exemple 1, pendant la même durée et on bloque la réaction en ajoutant 1,5 mi de HC1 0,1 N. On prépare un tube témoin T sans adjonction d'enzymes, on mesure la densité optique par comparaison et on obtient la concentration en glycérol en se reportant à une courbe d'étalonnage, en procédant comme à l'exemple 1. La sensibilité est telle qu'une quantité de 1 microgramme de glycérol dans une prise d'essai de la solution à doser donne une densité optique de 0,085, à 500 nm, dans un volume réactionnel final de 2 ml Exemple 3 Dosage des triglycérides du sérum sanguin. On procède comme décrit aux exemples précédents. On prend 0,02 .ml de sérum à doser, on ajoute 0,02 ml d'une solution d'albumine à 50g/l identique à celle des exemples 1, 2 ; puis on ajoute une solution tampon aqueuse appropriée pour obtenir un pH de 7,3, mais, à la différence des exemples précédents, on ajoute un réactif d'hydrolyse de façon à libérer le glycérol des triglycérides du sérum. Le .dosage du glycérol-permet. de. connaître la concentration du sérum en triglycérides. Comme réactif d'hydrolyse, on peut utiliser une solution, dans un tampon acétate 0,01 M à pH 4,5, de lipase de rhizopus Delemar à raison de 22.Q0 U/ml au moins et de a-chymotrypsine 100 U/ml. I1 est possible aussi d'employer une suspension enzymatique dans du sulfate d'ammonium 2,5 M contenant par ml = lipase 22 000 U, a-chymotrisine 1000 U, dont on se sert en quantité: dix fois moindre ou en même quantité après dilution au 1/10. Après mélange homogène, on chauffe à 370C pendant 10 mn. Ensuite, on ajoute 0,2 ml de la mèm? solution tampon donnant un pH de 8,7 à 8,75 puis 0,1 mI de la même solution de réactif colorant, puis 0,01 ml du même réactif enzymatique, qu'à l'exemple 2. Après mélange homogène et maintien à 370C pendant 10 mn avec les mêmes précautions qusaux exemples let 2 on -bloque la réacti-on par acidification comme a l'exemSe 2. Parallelement, à partir d'une solution étalon de glycérol (remplaçant le sérum) dosée par une méthode chimique connue appropriée, on applique, avec les mêmes quantités, le même processus. opératoire. On peut partir aussi d'un sérum étalon dont la concentration en triglycéride a été déterminée. Comme dans les. exemples précédents, on mesure la densité optique par comparaison avec un tube témoin T, ne contenant pas- les enzymes qui agissent sur le glycérol. Quand les densités optiques trouvées sont : S pour le sérum initial, E pour l'étalon ayant une con centration C en glycérol mais exprimée en triglycérides, B pour le tube témoin qui sert à éliminer les réactions parasites, on connais la concentration des triglycérides en g/l dans le sérum par la relation S- B x C. E - B L'étalon de glycérol peut avoir une concentration exprimée soit en trioléate soit en triglycéride moyen. Avee le procédé de 11 invention, la densité optique visible à l'oeil est proportionnelle à la concentration des triglycérides sériques jusqu'à une valeur d'environ 4g/l ce qui correspond à une densité optique de 0,7 La sensibilité du procédé de l'invention est telle qu'un sérum contenant 1 g/l de triglycéride donne une densité optique de 0,18 environ. Aux valeurs faibles, on peut augmenter la quantité de sérum pour améliorer la précision du dosage Dans les exemples décrits, on a prévu l'adjonc- tion d'une solution d'albumine. Celle-ci est nécessaire parce que les formazans colorés qui se forment sont insolubles dans l'eau mais se fixent sur les protéines. Cependant, on peut se dispenser de cette adjonction quand on pense que la solution à doser contient suffisamment d'albumine. On n'a pas précisé la nature des solutions tampon employées parce qu'elles sont connues en soi en association avec les enzymes mises en oeuvre. On rappellera cependant que pour la GDH, la solution tampon convenable est la suivante, par litre de solution aqueuse HKC03 25 g HK2PO4 : 41n5 g (NH4)2S04 : 6,5 g avec une quantité de potasse suffisante pour avoir un pH 9. Pour les enzymes GK et GPDH, on emploie une solution tampon tris 0,25 M-MgC12 2,5 mM -8,7-. Les ions Mg sont nécessaires. On remarquera que, avec le procédé de l'invention, le glycérol libre est dose en même temps que celui des triglycérides libéré par hydrolyse du sérum. On peut éliminer l'influence du glycérol libre sur le résultat en pratiquant la même réaction avec la même quantité de sérum de la meme façon mais en remplaçant le réactif d'hydrolyse par de l'eau distillée et en omettant le premier temps de chauffage. La densité optique résultat de cette réaction est à déduire de la valeur S trouvée à l'exemple 3. En plus du procédé décrit ci-dessus, l'invention couvre aussi les réactifs qui peuvent être préparés spécialement et mis en vente pour sa mise en oeuvre, notamment le réactif colorant et le réactif enzymatique. Pour la mise en oeuvre du procédé comme décrit à l'exemple 1,. les produits de l'invention qui peuvent être fournis aux utilisateurs, prêts à l'emploi, sont a) pour le réactif colorant, - une solution aqueuse contenant, par ml : NAD 5 mg INT 0,8 mg - PMS O,l mg à un pH compris entre 6 et 6,5. Ce réactif doit être conservé à l'abri de la lumière et à une température de O à +4 C. Les proportions relatives des composants doivent être observées. de façon assez stricte mais la concentration indi quéep3ut être modifiée de # 20 %. b) pour le- réactif enzymatique - une solution de GDH a 2 UI/ml au moins dans du tampon phosphate de potassium 0,01 M pH -7-,3 contenant 4 g/i d'albumine bovine. Pour la mise en oeuvre du procédé comme décrit aux exemples. 2 et 3, les produits de l'invention qui peuvent être fournis aux utilisateurs, prêts -à l'emploi, sont a) pour le- réactif colorant - une solution aqueuse contenant, par ml . NAD 20 mg . INT 2 mg . PMS 0,2mg # 20 % . ATP 14 mg et une quantité suffisante de tampon-tris pour avoir un pH de 6 à 6,5. Ce réactif doit être conservé à l'abri de la lumière et à une température de O à 40C. b) pour le réactif enzymatique - une suspension dans le sulfate d'ammonium 3,2 M en quantités minimales suivantes : de GK 2Q UI/ml, de GPDH 50 UI/ml, devant être conservée entre 0 et + 4 C. Au lieu d'une solution aqueuse, le réactif colorant peut être une poudre des mêmes composants dans les mêmes proportions relatives, livrée prête à être dissoute dans un volume d'eau convenable. -REVENDTCATlONS 1. Procédé de dosage enzymatique du glycérol selon lequel on soumet le glycérol à doser à l'action d'une enzyme au moins. dans un milieu convenable pour obtenir du NADH2, caractérisé en ce qu'on incorpore au milieu réactionnel du INT pour provoquer sa réaction avec du NADH2 au fur et à mesure de la formation de ce dernier et obtenir du INT réduit à coloration rouge mesurable dans le spectre visible, puis on acidifie le milieu pour stabiliser la coloration. 2. Procédé de dosage selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'on ajoute au milieu réactionnel du PMS à titre de catalyseur. 3. Procédé de dosage selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on ajoute au milieu réactionnel une solution d'albumine. 4. Procédé de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 et 2,. Caractérisé en ce qu'on utilise comme enzyme de la GDH avec une solution tampon maintenant le pH du milieu à une valeur proche de 9 sans la dépasser. 5. Procédé de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 caractérisé en ce qu'on utilise comme enzyme de la GK et de la GPDH avec une solution tampon maintenant le pH du milieu à une valeur de 8,7 à 8,75. 6. Procédé de dosage selon l'une quelconque des revendications 4, 5, caractérisé en ce qu'on ajoute au milieu, après l'avoir tenu à une température de 370c pendant une durée suffisante, un acide dilué convenable pour ramener le pH à une valeur de 2 à 3 environ et bloquer la réaction. 7. Procédé de dosage des triglycerides du sérum sanguin, caractérisé en ce qu'on soumet d'abord le sérum à une réaction de libération du glycérol des triglycérides avant d'appliquer le procédé selon l'une quelconque. des revendications 1 à 6. 8. Produit préparé pour servir de réactif colorant dans la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications I à 7 caractérisé en ce qu'il a l'une des compositions suivantes a) pour enzyme GDH Solution aqueuse contenant, par ml NAD 5 mg INT 0,8 mg PMS 0,1 mg à un pH ne dépassant pas 9. b) pour les enzymes GK et GPDH réunis Solution aqueuse contenant, par ml NAD 20 mg INT 2 mg PMS 0,2 mg ATP 14 mg à un pH de 6 & 6,5. les quantités indiquées pouvant varier de t 20 % sans changement important des proportions relatives. 9. Produit préparé pour servir de réactif enzymatique dans la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 6, 7, caractérisé en ce qu'il a l'une quelconque des deux compositions suivantes a) Solution de GDH à 2 UI/ml au moins dans du tampon phosphate de potassium û,01 M pH 7,3 contenant Vg/l d'albumine bovine. b) Suspension dans le sulfate d'ammonium 3,2 M de GK ; 20 UI/ml au moins et de GPDH 50 UI/ml au moins. 10. Produit préparé pour servir de réactif colorant dans la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce qu'il est constitué par une poudre comprenant les composants en proportions relatives voulues pour donner par dissolution dans un volume d'eau convenable la solution a) ou b) de la revendication 8.