Brevet FR2269963A1 — publié le 19751205

La présente invention concerne un procédé pour l'obtention d'extraits hydrosolubles de faibles poids mol écu- laires provenant de cellules d'Escherichia coli, les extraits hydrosolubles ainsi obtenus et les compositions pharmaceutiques les contenant. L'invention a également pour objet l'application des extraits hydrosolubles comme adjuvants immunologiques. Bes extraits hydrosolubles selon la présente invention contiennent de l'acide diaminopimélique (DAP) et présentent un poids moléculaire compris entre 1000 ± 200 et 8000 + 200. Be procédé selon la présente invention consiste à soumettre les résidus bactériens délipidés des cellules d'Escherichia Coli à une extraction douce et à isoler les extraits hydrosolubles ainsi obtenus. Les extraits hydrosolubles sont ensuite de préférence purifiés par mise en oeuvre de procédés de purification connus. Bes extraitshydrosolubles selon 1 'inven- tion sont avantageusement manipulés et conservés à l'état pulvérulent. Dans la présente description l'expression il extrait tion douce" designe une homogénéisation en milieu aqueux faisant appel à l'autolyse des cellules bactériennes et non a' des modi- fications ou extractions chimiques. -L'extraction douce des cellules est effectuée par broyage et homogénéisation en milieu aqueux en présence ou non d'un détergent non-ionique tel que par exemple le produit connu sous la dénomination commerciale nNP-40". Selon l'invention on réalise avantageusement l'extrac- tion à une-température voisine de 3?0 a, qui est une température physiologique. Le temps d'extraction selon le procédé de l'invention n'est pas critique, il doit être suffisant pour extraire le maximum de substances hydrosolubles et obtenir ainsi les extraits hydrosolubles avec de bons rendements, l'extraction pouvant être réalisée en une seule étape ou en plusieurs étapes successives. Les cellules d'Escherichia Goli mises en oeuvre dans le procédé selon l'invention sont au préalable soumises à une délipidation en utilisant par exemple la méthode décrite par A. Aebi et al. Bull. Soc. Chim. Biol, 35, 661 (1953). Toutes les variétés d'Escherichia Coli peuvent etre utilisées da-ns le procédé de l'invention ; toutefois, on préfère utiliser les cellules d'Escherichia Goli B (variété non virulente). Be détergent non-ionique qui peut éventuellement être utilisé dans le procédé selon l'invention permet de dissocier les substances lipidiques liées aux cellules, qui n'ont pas été extraites par délipidation ; l'utilisation du détergent permet donc d'améliorer le rendement de l'extraction. Après 1 'extraction':douce ,les extraits hydrosolubles sont isolés par centrifugations, relargages, dialyses et lyophilisation. Bes relargages sont effectués sur la couche surnageante obtenue après centrifugation.du mélange résultant de 11 extraction douce, au moyen de solutions d'un sel minéral, tel que le sulfate d'ammoniumà différentes concentrations. Pour effectuer les relargages on élève de préférence la température du mélange réactionnel à une température suf fi- sante pour permettre la dissociation rapide du sel minéral utilisé et obtenir la saturation voulue; ensuite, on maintient le mélange à-une température relativement basse, de préférence à une température comprise entre 0 et 60C environ pendant 6 à 24 heures. L'élimination des parties insolubles est réalisée selon le procédé de l'invention de préférence par centrifugation à une température également comprise entre 0 et 60C environ. Bes extraits hydrosolubles selon l'invention sont ensuite obtenus à l'étant sec,par exemple par lyophilisation, à partir des solutions résultant des étapes précédemment décrites qui ne dialysent pas à travers une membrane retenant les substances de poids moléculaire supérieur à 1000 ;- on utilise par exemple une membrane du type "Diaflo UM 2 (Amicon)". Selon une variante particulièrement préférée de l'invention, les extraits hydrosolubles sont ensuite purifiés et séparés en leurs constituank par des méthodes physico-chimiques appropriées, notamment par chromatographie sur des adsorbants, tels que DEAE-cellulose, le produit connu sous la dénomination commerciale "DEAE-Biogel À, ou par filtration sur un gel de polyacrylamide en utilisant par exemple les produits connus sous les dénominations commerciales "Biogel P10", "Biogel P6" ou "Biogel p4n. Bes extraits hydrosolubles ainsi obtenus, qui sont un autre objet de la présente invention, sont constitués essentiellement d'un mélange en proportions variables de fragments hydro solubles de la paroi cellulaire éventuellement associés à des sucres réducteurs non aminés; la quantité des fragments hydrosolubles de la paroi cellulaire contenus dans les extraits selon l'invention varie en fonction desconditions particulières de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, notamment du temps d'extraction, du nombre de relargages-, de la purification. Les fragments hydrosolubles de la paroi cellulaire sont constitués essentiellement par un disaccharide-tétrapeptide, par un tétrasaccharide-heptapeptide et les dimère, trimère et tétra- mère de ce dernier. Le disaccharide-tétrapeptide a la composition moléculaire suivante : N-acétylglucosamine (1), acide N-acétylmuramique (1), alanine (2), acide glutamique (1), acide diaminopimélique (1), et son squelette peut etre représenté par le schéma suivant dans lequel NAG = N-acétylglucosamine NAm = acide N-acétylmuramique Ala = alanine Glu = acide glutamique = = acide diaminopimélique Le tétrasaccharide-heptapeptide a la composition moléculaire suivante : : N-acétylglucosamine (2), acide N-ac-étyl- muramique (2), alanine (3), acide glutamique (2), acide diaminopimélique (2),et son squelette peut être représenté par le schéma suivant Les sucres réducteurs non aminés sont constitués essentiellement par le glucose, et éventuellement par le mannose et le galactose. La constitution des extraits hydrosolubles ainsi obtenus peut être mise en évidence par lès. méthodes habituelles de détermination en aminoacides, en sucres aminés et en sucres réducteurs non aminés. Par mise en oeuvre de l'étape de purification définie précédemment, on peut obtenir selon l'invention de-s extraits hydrosolubles contenant principalement le tétrasaccharide- heptapeptide éventuellement associé å-des sucres réducteurs non aminés. Ainsi, par exemple, l'extrait hydrosoluble brut obtenu après l'extraction douce et l'étape d'isolement fournit, après chromatographie sur J)EAE-éèllulôse au moyen d'éluants convena- blement choisis, une famille de substances comprenant le disaccharide-tétrapeptide, le tétrasaccharide-heptapepbide, ainsi que ses dimère, triiaère et tétramère, éventuellement associés à des sucres réducteurs non aminés.Au cours de la chromatographie, les substances hydrosolubles sont isolées par ordre de poids moléculaires décroissants. L'activité des extraits hydroC;olubles selonla présente invention étant liée à la présence d'acide diaminopimélique, il est particulièrement intéressant d'isoler, à partir du mélange brut, des substances qui. sont présentes en quantités suffisament importantes et qui ont une forte teneur en acide diaminopimélique. Selon uno variante de l'inventionon réalise avantageusement la chromatographie en équilibrant la DEAE-celluldse avec une solution tampon de pH de l'ordre de 7 et en éluant avec un tampon acide, ayant pnr exemple un pli de l'ordre de 3. On peut donc isoler par chromatographie des -extraits hydrosolubles qui contiennent principalement le tétrasaccharide-heptapeptide éventuellement associé à des sucres réducteurs non aminés. Les extraits hydrosolubles obtenus selon la présente invention possèdent une activité intéressante comme adjuvants immunologiques sans manifester d'activité arthrogene. Le pouvoir adjuvant est déterminé chez le cobaye, souche Hartley, selon le principe de la méthode de R.G. Nhite et coll., Immunology, 7, 158 (1964) et les pouvoirs arthrogène et protecteur selon les méthodes décrites par F. Bonhomme, C.R. .cad Sci., série D 263, 1422 (1966) et C.R. Acad, Sci., série D, 265, 2115 (1367). Chez le cobaye, les extraits hydrosolubles selon l'in- vehtion provoquent une augmentation du taux a'anticorps à des doses supér.eures ou égales à 0,1 mg par voie intradermique. Les produits selon l'invention sont utilisables en thérapeutique humaine ou vétérinaire pour favoriser la résistance aux infections d'origine virale ou bactérienne. Ils provoquent une augmentatioz de la formation d'anticorps utiles contre les organismes pathogènes et ils peuvent être adjoints à l'adminas- tration de vaccins pour assurer le maximum de réaction d'anticorps. La présente invention concerne également les compositions pharmaceutiques qui contiennent les extraits hydroso- lubles selon la présente invention en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et pharmaceutiquement acceptables, et éventuellement en association avec d'autres médicaments tels que des antibiotiques, des décongestifs et des vaccins. Dans ces compositions la teneur en extraits hydrosolubles selon l'invention est généralement supérieure à 0,1%. Ces compositions peuvent être utilisées par voie orale, rectale, parentérale ou en aérosols. En térapeutique humaine, les doses dépendeat de l'effet recherché. Elles peuvent être comprises entre 10 et 50mg par jour pour un adulte. Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, montrent comment l'invention peut être mise en pratique. EXEMPLE 1 1 50 g de résidus bactériens délipidés, obtenus à partir de cellules d'Escherichia coli B selon la méthode de 4. Aebi et collez Bull. Soc. Chim. Biol., 35, 661 (1953) sont broyez et homogénéisés dans 250 cm3 d'eau contenant 0,1 cm3 de détergent llNP40N au moyen-d'un broyeur du type UUltra-Turrax". Après avoir agité pendant 48 heures à 400C et centrifugé pendant 30 minutes à 40C -(4000 tours/mn), la couche surnageante est chauffée à 80 C. On ajoute alors du sulfate dlam- monium de façon à obtenir une solution à 40% de la saturation. Après 12 heures à 40C et centrifugation pendant 30 minutes, on obtient un précipité P40; A la couche surnageante, on ajoute du sulfate d'ammonium de façon à obtenir une -solution à 70% de la saturation. Aprs 12 heures o 400 et ce:itr-f.agati-t pendant 3a minutes dans les mêmes conditions on obtient un précipité P70. Les précipités P40, P70 et là couche surnageante S70 sont ensuite dialysés séparément contre de l'eau distillée. Les diverses.solutions qui ne dialysent paa.sont lyophilisées. Qn obtient ainsi 9 g de la fraction P40, 0,180 g de la fraction P70 et 2,200 g de la fraction S70 qui contient l'extrait seluble brut. EXEMPLE 2 Purification - Obtention d'un tétrasaccharide-heptapeptide associé à des sucres réducteurs non aminés. La fraction S70 obtenue dans l'exemple 1 est purifiée par chromatographie sur une colonne de DEAE-cellulose (hauteur 92 cm ; diamètre 2,5 cm) équilibrée avec un tampon véronal 0,05 M à pli 7 en éluant avec un tampon au citrate de sodium 0,05 M à pH 3 en recueillant des fractions de 2cm3, auxquelles on attribue un numéro de 1 à 50Q1'éîution étant suivie par lecture optique au spectrophotomètre à 280 et 220 m . Les fractions N 180 à 220 contiennent l'extrait actif. Après dialyse contre de l'eau disti'lée pour éliminer les sels puis lyophilisation, on obtient 37 mg d'extrait hydrosoluble dont les caractéristi-ques sont les suivantes - aspect : poudre blanche pulvérulente. - composition : a) en.acides aminés (rapport moléculaire) : alanine (3), acide glutamique (2), acide diaminopimélique (2). b) en sucres aminés (rapport moléculaire) . N-acétylglucosamine (2), acide N-aeétylmuramique (2) - poids moléculaire calculé sur la base de 3 résidus alanine par molécule) : 5600 + 200. - la teneur en aminoacides est de 15 + 2%;en aminosucres de 17,5 + 2% ; le reste/tnasWttué par des sucres réducteurs non aminés (essentiellement du glucose). REVENDICATIONS 1. Procédé pour l'obtention d'extraits hydrosolubles de faibles poids moléculaires et contenant de l'acide diaminopimélique à partir de cellules d'Eseherichia Coli, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre les résidus bactériens délipidés des cellules d'Escherichia Coli à une extraction douce et à isoler les extraits hydrosolubles à l'aide de moyens physico-chimiques. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ceque lesdits extraits hydrosolubles sont souris à une étape de purification. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'extraction douce est effectuée par broyage et homogénéisation en milieu aqueux desdits résidus bactériens délipidés. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'extraction est réalisée en présence d'un détergent. - 5. Procédé selon l1une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les extraits hydrosolubles sont isolés par centrifugations, relargages, dialyses et lyophilisation à partir de la solution résultant de l'étape d'extraction douce. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la purification des extraits hydrosolubles est effectuée par chromatographie sur adsorbants ou par filtration. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la chromatographie est effectuée-sur DESE-cellulose ou sur le produit connu sous la dénomination commerciale "DEAE-Biogel A" 8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la filtration est effectuée sur un gel de polyacrylamide, tel que sur les produits connus sous les dénoninations comeerciales "Biogel P10", "Biogel P6" ou "Biogel 24".. 9. Procédé selon la revandication 1, caractérisé en ce que l'on effectue après homogénéisation en milieu aqueux et eentrifugation, deux relargages au moyen de sulfate d'ammonium suivis chacun d'une centrifugation, puis on dialyse contre de 1 eau olstillée le surnageant obtenu, on chromatographie sur colonne et on isole l'extrait hydrosoluble actif. 10. Extraits hydrosolubles de faiblcs poids moléculaires Ct contenant de 1'acide diaminopimélique, caractérisés en cc qu' ls sont obtenus par le procédé selon l'une quelconque des rel,endi- cations 1 à 9, le poids moléculaire desdits extraits étant compris entre 1000 + 200 et 8000 + 200, lesdits extraits étant constitués essentielletent par les fragments hydrosolubles de la paroi ce'lu- laire d'Escherichia Coli éventuellement associés à des sucres réducteurs non aminés. 11. Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles contiennent une quantité efficace d'au moins un extrait hydrosoluble défini à la revendication 10 en association avec un diluant ou adjuvant compatible et pharmaceutiquement acceptable.