Brevet FR2266517A1 — publié le 19751031

La présente invention a trait à un médicament facilitant le transfert de groupes méthyl, ainsi qu'à un procédé de préparation de ce médicament On a déjà utilisé comme médicament donneur de groupes méthyl, des préparations contenant de la méthionine. En raison de la faible activité de tels médicaments on a ensuite envisagé d'utiliser comme source, pour le transfert de groupes méthyl, la S-adénosyl- l-méthionine (SAM) et différents procédés ont déjà été décrits pour purifier ce composé, par exemple dans la demande de brevet allemand DOS 1.803.978. On connait par l'étude du métabolisme des catécholamines, le rôle des processus de désamination et de I'O-méthylation. Ce dernier processus métabolique est réalisé par une enzyme, la S-adénosylméthionine : catéchol O-méthyltransférase ou COMT (E.C. 2.1.1.6.). Cette enzyme de transméthylation catalyse le transfert d'un groupement méthyle du donneur : la S-adénosylméthionine (SAM) sur un oxygène phénolique. La SAM co-facteur de 11 enzyme est la forme activée de la méthionine par 1'ATP. La COMT est une enzyme soluble, d'un poids moléculaire de l'ordre de 50 000 daltons, dont la présence est détectée dans de nombreux tissus, en particulier dans le foie et le placenta qui d'après LISALO et coll. (1), transforme la noradrénaline dangereuse pour le foetus lorsqu'elle est en excès. Par ailleurs, on sait que l'hypertension chez une femelle gestante provoque une sévère asphyxie du foetus par une vasoconstriction utérine (2). La purification de la CoMT a été réalisée essentiellement a partir du foie de rat (3-4-5) et une seule tentative a été effectuée à partir du placenta humain (6). Les auteurs, après une ultracentrifugation de deux heures à 150 000 g, réalisent une précipitation au sulfate d'ammonium, suivie de deux filtrations sur gel Séphadex G. 100. Le taux de purification obtenu était de 66 fois avec un rendement de 40%. Littérature (1) E. LISALO - O. CASTREN, Ann. Med. Exp. Biol. Fenn. 1967, 45 (2), 253. (2) K. ADAMSONS - M.E. MUELER --R.E. MYERS, Amer. J. Obstet. Gynecol. 1971 - 109 (2), 248. (3) P.J. ANDERSON - A. D'IORIO, Biochem. Pharmacol. 1968, 17, 1943. (4) L. FLOHE - K.P. SCHWABE, Biochim. Biophysica. acta 1970, 220, 469. (5) M. ASSICOT - C. BOHUON, Europ. J. Biochem. 1970, 12, (3), 490. (6) R. GUGLER - R. KNUPPEN - H. BREUER. Biochim. Biophysica. Acta 1970, 220, 10. La présente invention se propose de fournir un médicament facilitant le transfert de groupes methyl, soit à partir de donneurs de groupes méthyl déjà pré-existants dans l'organisme, soit à partir de donneurs administrés simultanément ou conjointement. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet une composition thérapeutique, notamment pour le traitement des affections provoquées par une teneur anormalement élevée en derivés présentant une structure O-diphénolique ou autres fonctions qui s'en rapprochent comme les ène-diols, ainsi que des procédés de préparation de cette composition. Le médicament selon l'invention est susceptible de nombreuses applications, notamment en ce qui concerne le dismétabolisme hépatique des dérivés O-diphénols ou apparentés, mais peut aussi constituer une thérapeutique dans le cas d'hypertension essentielle de phéochromocytoma, ou de perturbation du fonctionnement cérébral lié à un "release" ou une production exagérée de dopamine, noradrénaline ou d'un métabolite de neurotransmetteur. L'invention a pour objet un médicament caractérisé par le fait qu'il contient une quantité d'enzyme catéchol-ortho-méthyl- transférase (COMT) purifié, issu du placenta humain frais ou congelé, ayant un poids moléculaire de l'ordre de 50.000 ledit enzyme étant contenu dans un véhicule approprié. Dans une variante particulière de l'invention la composition peut renfermer des ions Mg 2+ De préférence le véhicule est choisi pour permettre l'injection du médicament. De façon avantageuse la dose thérapeutique peut être comprise entre 1 milli-unite et 50 milli-unités par jour. Le médicament selon l'invention peut, de plus, contenir un donneur de méthyl tel qu'une dose de S-adenosyl-l-méthionine, de préférence telle que l'administration régulière du médicament en amène environ 10 à 20 milligrammes par jour. De plus, il est possible de réaliser, dans une variante de l'invention, une association albumine-COMD, l'albumine humaine étant employée pour son action stabilisante et pour l'excellent support de lyophilisation qu'elle constitue. D'une façon générale le médicament permet le traitement des affections provoquées par une teneur anormalement élevée de dérivés présentant un groupement catéchol, la COMT réalisant dans le cas particulier des catécholamines la transformation de l'adre- naline en 3 O-m"thyladrénaline et de la noradrénaline en 3 O-méthyl noradrénaline dont les effets hypertenseurs sont nettement amoindris. Par ailleurs, le médicamentselon l'invention est dépourvu d'action toxique dangereuse et ne présente aucune activité antigénique. L'invention a egalement pour objet un procédé de prepara- tion du médicament permettant d'extraire la catéchol-ortho-méthyl- transférase (COMT) à partir du placenta humain. Le procédé selon l'invention est caractérisé par le fait que l'on effectue une extraction du placenta à l'aide d'un milieu liquide saccharosé, additionné avantageusement d'un conservateur, que l'on effectue une précipitation des protéines insolubles à l'aide d'un agent tel que le sulfate d'ammonium, que le précipité, remis en solution, est passé sur un échangeur cationique faible de préférence à un pH voisin ou égal à 6,2, et que l'on effectue ensuite une ou plusieurs chromatographies d'exclusion-diffusion de façon à concentrer les protéines dont le poids moléculaire correspond à celui de la CONT. Parmi les conservateurs intéressants, on peut citer notamment le mercaptoéthanol, de préférence à une concentration de l'ordre de 10 3M. De façon avantageuse, le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre à l'aide des étapes suivantes Placenta Extraction de la COMT en milieu saccharosé Précipitation au sulfate d'ammonium (40 - 55%) ( Filtration sur gel Dessalage par -( ou dialyse Passage sur échangeur cationique faible équilibré à pH 6,2 Concentration ou lyophilisation Chromatographie d'exclusion-diffusion limite de fractionnement 104 à 5.105 daltons Concentration ou lyophilisation de la fraction de l'éluat riche en COMT Chromatographie d'exclusion-diffusion limite de fractionnement 4.10 à 1,5.10 daltons Lyophilisation de la fraction enrichie en COMT D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif Purification de la catéchol-o-méthyltransférase Exemple I Extraction de l'enzyme : Le placenta frais dépourvu de membranes et de cordons ombilicaux est broye dans une solution de saccharose 0,25 M additionnée de mercaptoéthanol 10 3M (70 ml pour 30 g de poids frais d'organe). La centrifugation permet d'obtenir un surnageant limpide "S". Précipitation au sulfate d'ammonium : Sur une portion aliquote d'extrait "S", 500 ml par exemple, on effectue une double précipitation au sulfate d'ammonium qui laisse sédimenter les pro téines insolubles dans les limites de 40 - 50 % de saturation en sel. Filtration sur Sephadex CM-C 50 : Le culot protéique repris est amené à 50 ml avec du tampon phosphate, doit être au préalable dessalé avant d'être soumis à la filtration sur échangeur d'ions. Cette opération a été réalisée par filtration sur gel Sephadex G 25. Le filtrat obtenu, extrait "G 25" (4 fois le volume initial) est acidifié à pH = 6,2 , puis traité en bain avec 2 g de Sephadex CM-C 50, précédemment gonflé et équilibré à ce même pH. L'opération peut être améliorée par un passage sur colonne. On obtient ainsi, sans grande dilution, un extrait "CM-C 50" renfermant une faible teneur en hémoglobine. Chromatographie d'exclusion-diffusion sur Biogel A 0,5 m C gel a l'avantage de donner une bonne vitesse d'écoulement et des résultats très reproductibles d'une manipulation à l'autre. Dans la réalisation de cette étape, 100 ml d'extrait "CM-C 50" sont concentrés dans des boudins de dialyse par action du polyéthy lène-glycol 20.000, concentré 10 fois il est déposé sur une colonne remplie de Biogel A 0,5 m, dont les caractéristiques sont les suivantes - limite d'exclusion : 0,5 x 106 daltons - domaine de fractionnement : 104 à 5.105 daltons - granulométrie : 50 - 100 mesh L'éluat est collecté par fraction de 8 ml. Les fractions riches en enzyme sont groupées et concentrées de la même façon que précédemment. Chromatographie d'exclusion-diffusion sur Biogel P 100 Dans le procédé décrit, les 5/8èmes de la fraction de filtrat riche en COMT (fractions nd 35 à 44 incluse), soit 50 ml sont concentrés 10 fois en 8 heures environ et déposes sur une colonne présentant les caractéristiques suivantes - limite d'exclusion: 105 daltons - domaine de fractionnement : 5.10 à 105 daltons - granulométrie : 50 - 100 mesh L'éluat est récupéré par fractions de 8 ml dont celles qui présentent une activité COMT constituent "l'extrait P 100", phase finale du procédé. Résultats Les grandeurs considérées sont les suivantes L'Unité d'activité COMT (U) : C'est la quantité d'enzyme qui catalyse en une minute la méthylation d'une micromole de pyrocatécholphtaléine en gaiacolphtaléine dans les conditions du dosage. Activité spécifique (As) : C'est la quantité de gaiacolphtaléine (GP) formée par minute et par mg de protéines. AS = uM de GP apparue/minute/mg de protéines As = mU/mg de protéines Ces résultats apparaissent dans le tableau suivant : : Taux de : AS : taux de : : : : Extraits : protéines : : purification : Activité : Hb : : : mg/ml : mU/mg : : mU : mg/g : : S : 35,25 : 5,0 : 1 : 88 000 : 16,30 : : G25 : 8,30 : 19,3 : 3,9 : 30 436 : 1,56 : :CM-C 50 Bain" : 4,38 : 26,3 : 5,3 : 20 598 : 0,18 : :CM-C 50 colonne" : 3,18 : 31,3 : 6,3 : 19 030 : 0,13 : :Biogel A 0,5 m : 0,29 : 265,1 : 53 : 6 257 : : :Biogel P 100 : 0,05 : 1093,0 : 218 : 3 169 : : Exemple Il Cet exemple diffère du précédent par les points suivants - On a employé pour stabiliser l'enzyme au cours de la purification le saccharose à la concentration de 0,5 M. - La zone de précipitation en sulfate d'ammonium retenue s'étend de 30 à 60% de saturation en sel. - Les résultats montrent que le rendement de certaines étapes est augmenté, par contre le taux de purification atteint dans cette deuxième expérience n'est que de 120 fois, alors qu'il est voisin de 200 fois dans le premier exemple. De façon pratique, on peut obteniràpartir de 1000 g de placentale bilan. suivant en protéines totales et activité globale 1000 g de placenta + 2 333 ml de saccharose 0,25 3 307 ml d'homogénat centrifugation : 20 000 g - 15 minutes - 40C 2 630 ml de surnageant limpide EXEMPLE I EXEMPLE II facteur protéines activité facteur protéines activité Etape de totales globale Etape de totales globale correction mg U correction mg U "Biogel 1 2,9 3,17 "Biogel 1 3,52 2,26 P 100" 1 2,9 3,17 P 100" 1 3,52 2,26 "Biogel ##=1,60 4,6 5,07 "Biogel ###=2,80 9,85 6,33 A 0,5 m" A 0,5 m" "CM-C 50" 190 8,8 10,60 220 33,75 14,63 colonne 90 9,8 10,69 "CM-C 50" 2,31 22,75 14,63 "CM-C 50" ### = 1,05 10,2 11,20 bain 170 10,2 11,20 "G 25" ###=1,05 10,8 11,82 "G 25" ###=1,07 24,41 15,70 500 ml de "S" extra- ####=5,26 56,9 62,16 Extrait"S" ####=10,52 256,8 165,15 polé à 2 630 ml La solution obtenue est ensuite stabilisée par un adjuvant de lyophilisation qui peut être, à titre d'exemple, soit un acide aminé, soit une protéine homologue, soit un composé sucré. Après ajustement de la concentration la solution est répartie en ampoules ou flacons de 1 à 50 milli-unités puis lyophilisée. Une variante consiste à associer à l'enzyme 10 à 20 mg de S-adénosyl-L-méthionine. La combinaison de l'enzyme et du substrat potentialise l'activité pharmacologique. Pour l'emploi thérapeutique le solvant est constitué par de l'eau apyrogène stérile. Les doses quotidiennes sont conçues de façon à contenir de 1 à 50 milli-unités par jour mais des doses bien supérieures peuvent être administrées du fait de l'absence de toxicité et d'antigénicité du médicament. R E V E-N D I C A T I O N S 1. Médicament facilitant le transfert de groupements méthyl, caractérisé par le fait qu'il contient une quantité d'enzyme catéchol O-méthyltransférase purifiée, ayant un poids mole- culaire de l'ordre de 50.000, contenredans un véhicule pharmaceutique approprié. 2. Médicament selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'enzyme est contenuedans un véhicule injectable. 3. Médicament selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il se présente sous la forme d'un lyophilisat. 4. Médicament selon la revendication 3, caractérisé par le fait qu'il contient en outre un adjuvant de lyophilisation. 5. Médicament selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il est présenté sous forme de doses unitaires contenant entre 1 et 50 milli-unités d'enzymes. 6. Médicament selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il contient en outre de la S-adénosyl-l-méthionine, 7. Médicament selon la revendication 6, caractérisé par le fait que pour une dose d'enzyme comprise entre 1 et 50 milliunités, il contient une dose de S-adénosyl-1-méthionine comprise entre 10 et 20 mg. 8. Médicament selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il renferme en outre des ions Mg2+ 9. Médicament selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il contient en outre de l'albumine humaine. 10. Procédé de préparation d'enzyme catéchol O-méthyltransférase purifiée à partir de placenta humain, caractérisé par le fait que l'on effectue une extraction du placenta à l'aide d'un miîieu/sliaWWcdearosé, que l'on effectue une précipitation des protéines insolubles en éliminant le surnageant, que le précipité est remis en solution et passé sur un échangeur cationique faible, et que l'on effectue ensuite au moins une chromatographie d'exclusiondiffusion pour concentrer les protéines dont le poids moléculaire est voisin de 50.000. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait que la précipitation consiste à effectuer une double précipitation au sulfate d'ammonium de façon à recueillir les protéines insolubles dans les limites de 40 à 55 % de saturation en sel d'ammonium. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 et 11, caractérisé par le fait que le précipité recueilli après traitement au sulfate d'ammonium est soumis à un dessalage par dialyse ou par filtration sur gel. 13. Procédé selon l'une-quelconque des revendications 10 a 12, caractérisé par le fait qu'une solution contenant le produit provenant de la précipitation au sulfate d'ammonium est mise en contact en bain et/ou par un passage sur colonne, avec un échangeur cationique faible équilibré à pH 6,2 environ, puis on recueille la solution ainsi traitée. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisé par le fait qu'après le contact avec l'échangeur cationique, on effectue une chromatographie d'exclusiondiffusion sur un gel ayant un domaine de fractionnement compris entre 104 et 5.105 daltons. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé par le fait que l'on effectue ensuite une seconde chromatographie d'exclusion-diffusion sur un gel ayant un domaine de fractionnement compris entre 4.103 et 1,5.105 daltons, et notamment entre et et 105 daltons. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à- 15, caractérisé par le fait qu'avant d'effectuer une chroma agraphie d'exclusion-diffusion, on effectue une concentration de la solution. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé par le fait que l'on effectue une concentration soit par lyophilisation soit par l'action d'un polyéthylèneglycol. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 17, caractérisé par le fait que le milieu liquide saccharosé est additionné d'un conservateur tel que le mercaptoéthanol. 19. Procédé selon la revendication 10, caractérisE par le fait que l'on effectue une extraction de placenta broyé à l'aide d'une solution de saccharose 0,25 M, que l'on sépare par centrifugation le surnageant, que l'on ajoute au surnageant du sulfate d'ammonium jusqu'! une concentration égale à 40 % de la saturation, que l'on élimine le précipité, que l'on ajoute au filtrat du sulfate d'ammonium jusqu'S obtention d'une concentration égale à 50 % de la saturation, que l'on recueille le précipité et le soumet à une opération de dessalage par filtration sur gel ou par dialyse, que l'on acidifie la solution obtenue à pH voisin de 6,2, que l'on met en contact la solution avec un échangeur cationique faible en bain et/ou en colonne, que l'on élimine l'échangeur cationique et recueille la solution, et que l'on soumet la solution à au moins une chromatographie d'exclusion-diffusion sur un gel permettant de concentrer les protéines dont le poids moléculaire est voisin de 50.000. 20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 19, caractérisé par le fait que pour obtenir l'extrait de placenta utilisé comme produit de départ on effectue une centrifugation à 20.000 g et recueille le surnageant. 21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 20, caractérisé par le fait que l'on effectue le dessalage par filtration sur gel Sephadex G. 25. 22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 21, caractérisé par le fait que l'échangeur cationique est le Sephadex CM-C 50. 23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 22, caractérisé par le fait que l'on effectue au moins une chromatographie d'exclusion-diffusion sur Biogel A 0,5 m. 24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 23, caractérisé par le fait que l'on effectue une chromatographie dfexclusion-diffusion sur Biogel P 100. 25. Catéchol O-méthyltransférase purifiée obtenue selon le procédé de l'une quelconque des revendications 10 à 24. 26 Médicament à base de catéchol-O-méthyltransférase obtenue selon le procédé de l'une quelconque des revendications 10 à 24.