Brevet FR2270860A1 — publié le 19751212

La présente invention a pour objet un nouveau composé doué de propriétés curatives, son procédé de préparation et son application en thérapeutique . Depuis la découverte des propriétEs des alcanols a chaine halogénophénoxylée - en particulier du (p-chlorophénoxy) - 2 méthyl - 2 propanol - sur le taux de triglycérides et dtr cholestérol dans le sérum sanguin, les chercheurs se sont efforcés d'accroitre l'intensité de l'effet de ces atcanols en greffant sur leur molécule des radicaux connus pour leur activité dans le meme domaine thérapeutique.Ainsi, il a été proposé d'estérifier la fonction a Icool du (p - chlorophénoxy) - 2 méthyl - 2 propanol - par l'acide N - oxyde pyridyl - 3 carboxylique (brevet français nO 2 004 661 au nom de AKTIEBOLAGET ASTRA), et - par l'acide thiazol - 5 carboxylique (brevet spécial de médicament français nO 7796 M au nom de ROUSSEL-UCLAF)7 acides qui, l'un et l'autre, exercent des propriétés antihyperI ipémiantes, Ce phénomène est encore plus manifeste dans le cas du brevet français n 2 100 774au nom de BOEHR1NGER MANNHEIM GmbH, selon lequel on tente de renforcer l'activité du (p-chlorophénoxy) - 2 méthyl - 2 propanol en l'estérifiant à l'aide de l'acide (p-chlorophénoxy)- 2 isobutyrique, ctest-à- dire en formant une molécule syméfrique autour de la fonction ester. Rompant avec cette tendance générale, la Demanderesse s'est proposée, non pas d'intensifier les propriétés connues du (p-chlorophénoxy) - 2 méthyl - 2 propanol, mais de réunir dans un même produit ces propriétés et d'autres qu'on ne lui connaissai t pas. Plus précisément, sachant, d'une part, que l'hyperlipémie est un des principaux facteurs de la thrombose artérielle et, d'autre part, d'après KERR et Colt. (Lancet, 1965,11, 1296), que certains lipides constituant la plaque athéromateuse (hypolécithine, sphi ngomyél ine et acides gras saturés) possèdent un pouvoir agrégeant in vitro sur les plaquettes sanguines, la Demanderesse s'est fixé pour but de créer un nouveau produit présentant à la fois des propriétés antihyperlipémiantes et des propriétés anti-agrégantes plaquettaires pour le traitement des maladies provoquées par des ischémies vasculaires. A cette fin, elle a réalisé le composé de formule qui est l'ester acétylsalicylique du (p-chlorophénoxy) - 2 méthyl - 2 propanol. Le radical acétylsalicylique ne confère pas d'activité anti-hyperlipé miante aux composés qui en sont pourvus. Par contre, si l'on s'en réfère à l'acide acétylsalicylique, il est notamment à l'origine d'intéressantes propriétés antiagrégantes plaquettaires connues depuis plusieurs années, par exemple d'après ZUCKER et Coll., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1968, 127, 547, O'BRIEN, Lancet, 1968 - 1,779, etc... Le composé selon l'invention est préparé par action d'un halogénure, tel que le chlorure, d'acétylsalicyloyle de formule ou Hal représente un halogène, sur le (p-chlorophénoxy) - 2 méthyl - 2 propanol de formule Les composés de formule (11) et (ici) sont, I'un et l'autre, connus et leur préparation est décrite dans la littérature de spécialité. A titre d'exemple, le composé selon l'invention peut etre préparé d'après le mode opératoire suivant Exemple Dans un tricol de 250 ml muni d'un agitateur mécanique, d'un réfrigérant et d'une ampoule à brome, on introduit 28,1 g (0,14 mole) de (p-chlorophénoxy) - 2 méthyl - 2 propanol et 50 ml de pyridine. On refroidit par un bain de glace en agitant, puis on ajoute, goutte à goutte, 27,5 g (0,14 mole) de chlorure d'acétylsalicyloyle. On agite pendant 1/2 heure dans le bain de glace, puis pendant 3 heures à la température ambiante. On verse ensuite lentement le mélange réactionnel dans 150 ml d'HCI à 10 % et sépare la couche organique. On extrait la couche aqueuse à l'aide de deux fois 100 ml d'éther, puis réunit la couche organique à la solution éthérée.On lave l'ensemble successivement par une solution dlHCl à 10 % , par de l'eau, par une solution saturée de bicarbonate de sodium, puis par de l'eau. On sèche ensuite ia solution éthérée sur du sulfate de sodium anhydre, évapore l'éther et distille le produit attendu sous vide poussé. On obtient 43,8 g (rendement: 86 %) d'ester acétylsalicylique du (p - chlorophénoxy) - 2 méthyl - 2 propanol se présentant sous la forme d'une huile jaune pale. Le produit est insoluble dans l'eau, soluble dans l'huile et dans les solvants organiques. Point d'ébullition : 228 - 230 OC / 1,5 mm Hg Formule brute : C19 H19 Cl Os Masse molaire : 362,5 La micro-analyse, les spectres d'absorption des ultra-violets et des infra-rouges, et de résonance magnétique nucléaire confirment que la structure du produit obtenu est conforme à la formule avancée. Llexistence des propriétés pharmacologiques attendues du composé selon l'invention, que l'on désignera ci-après par son numéro de code CBS 10 A, a été vérifiée par l'accomplissement des essais suivants 1 - Activité antihypercholestérolémiante, antihypertriglycéridémiante et antihyperi ipémiante. Mode opératoire: On administre, par voie intrapéritonéale; à des rats pesant de 250 à 300 g, et à jeun de 6 heures, 300 mg/kg d'une solution aqueuse de tyloxapol d'une concentration de 50 mg /ml, en vue d'introduire une hypercholestérolémie, une hypertriglycéridémie et une hyperlipémie chez les animaux traités. Immédiatement après, on administre le CBS 10 A par voie orale, en solution dans l'huile d'olive, à la dose de 400 mg/kg. Les animaux sont alors iaissés à jeun, avec eau de boisson ad libitum'l, pendant 18 heures. A l'issue de cette période, on effectue un prélèvement sanguin par ponction dans l'aorte abdominale sous anesthésie légère à l'éther. On dose alors le cholestérol total, les triglycérides et les lipides totaux dans les sérums. Les animaux sont répartis en quatre lots de six animaux chacun - un premier lot témoin ne recevant que l'huile d'olive, - un deuxième lot témoin recevant l'huile d'olive et le tyloxapol, - le lot traité recevant, outre l'huile d'olive et le tyloxapol, 400 mg/kg (O, 11 mol e/kg) de CBS 10 A, et - à des fins de comparaison, un lot traité recevant outre l'huile d'olive et le tyloxapol, 220 mg/kg ( 0,11mole/kg) de (p-chlorophénoxy) - 2 méthyl - 2 propanol. Un pool de six sérums de chaque lot est réalisé pour permettre d'effectuer un lipidogramme représentatif de chaque lot. Résultats Les résultats sont exprimés dans le tableau I suivant: Cholestérol total Triglycérides Lipides totaux taux moy % abais faux moy % abatis taux moy % abatis g/i sement g/l sement g/l sement Lot témoin 1,00 0,62 5,3 (huile d'olive) Lot témoin Huile d'olive + 1,97 13,1 32,1 tyl oxapol Tableau I (suite) Cholertérol total Triglycérides Lipides totaux Taux moy. % abais- Taux moy. % abais- Taux moy. % abais- g/l sement g/l sement g/l sement Lot traité (CBS 10A : 400mg/kg) 1,35 - 31 8,5 - 35,1 18,8 - 41 Lot traité (p-chlorophénoxy) 1,65 - 16 9,8 - 25,1 23,7 - 26,1 - 2 methyl - 2 propanol 220 mg/kg Il ressort du tableau ci-dessus que, pour une meme concentration molaire, le CBS 10 A provoque un abaissement du taux de cholestérol total, des triglyce- rides et des lipides totaux beaucoup plus marqué que le (p - chlorophénoxy) - 2 méthyl - 2 propanol, et ce, bien que l'acide acétyl-salicylique à partir duquel a été obtenu le CBS 10 A ne présente aucune activité dans ce domaine. 2 - Activité sur l'agrégation plaquettaire Deux essais différents ont été accomplis. a) Le premier essai porte sur l'agrégation plaquettaire proprement dite du plasma de lapin à l'aide de l'agrégomètre BRYSTON. Comme agent agrégont, on utilise l'adénosine di-phosphate (ADP) à la dose de 5 microgrammes pour 0,3 mi. Le sang est prélevé par ponction dans la veine marginale de l'oreille du lapin où l'on peut recueillir assez facilement 5 ml de sang. Le sang est prélevé sur tube citraté (citrate de soude à 3,8 %, à raison de 1 volume de citrate pour 9 volumes de sang). On utilise une aiguille siliconée neuve pour chaque prélèvement. A l'aide de ces échantillons de sang, on établit les courbes d'agrégation témoins des lapins. Quarante huit heures après ce prélèvement, on administre, per os, à un premier lot d'animaux 200 mg/kg (0,055 mole / kg) de CBS 10 A et à un second lot 110 mg/kg(0,055 mole/kg) de (p - chlorophénoxy) - 2 méthyl - 2 propanol , en solution dans l'huilé d'olive. Deux heures plus tard, on effectue un nouveau prélèvement et établit une nouvelle courbe. La comparaison des deux courbes fait ressortir un abaissement de la faculté d'agrégation des plaquettes, égal en moyenne à 34,1 % pour le CBS 10 A et de 14 % pour le (p-chlorophénoxy)-2 méthyl-2 propanol. b) Le deuxième essai a porté sur l'étude des variations du temps de saignement d'une veine mesentérique de la souris, par une micromanipulation, selon la méthode de R. G. HERRMANN et coll(Proc.Soc. Exp. Biol. Med. 1968, 128, 960-964). Les animaux soumis au test étaient des souris mâles d'un poids moyen de 20 grammes On a administré, per os, les produits à étudier, en solution dans l'huile d'o!ive, à l'aide d'une sonde oesophagienne, une heure avant la mesure des temps de saignement. Le test a été accompli sur quatre lots d'animaux - un lot témoin ne recevant que l'huile d'olive, - un lot traité recevant 22mg/kg (0,0135 mole/kg) d'acide acétylsalicylique en solution dans l'huile d'olive, à titre de comparaison, - un lot traité recevant 27 mg/kg (0,0135 mole/kg de (p-chlorophénoxy)-2 méthyl-2 propanol en solution dans l'huile d'olive à t itre de comparaison,et - un lot traité recevant 49 mgXkg (0,0135 mole/kg) de CBS 10 A en solution dans l'huile d'olive. Les résultats sont exprimés dans le tableau suivant TABLEAU Il Nombre Temps de saignement % d'augmentation d'animaux moyen en seconde Témoins 10 32, 14 (huile d'olive) Aspirine (p.o.22mg/kg > 5 61,10 90,1 (p-chl orophénoxy)-2 méthyi-2propanol (p.o.27mg/kg) 5 40,1 62,5 CBS 10 A (p.o.49mg/kg) 5 79,9 148,59 Cet essai a révélé, d'une part, que le (p-chlorophénoxy) - 2 méthyl - 2 propanol exerçait une activité antiagrégante plaquettaire, ce que l'on ignorait jusqu'ici, et montré que l'on retrouve pratiquement la somme de l'activité de l'acide et de l'alcool de départ dans le CBS 10 A. On pourrait en conclure que ce résultat va de soi. Une telle appréciation est cependant erronée en ce sens que l'on n'est jamais assuré de trouver dans un composé chimique les propriétés que l'on pouvait attendre de lui, connaissant les propriétés des composés de départ à partir desquels il a été synthétisé. La preuve en est que l'on ne retrouve pas, dans le CBS 10 A, les propriétés antiinflammatoires et analgésiques qui ont fait la réputation de l'acide acétyl - salicylique, ou tout au moins que, dans le CBS 10 A, ces propriétés sont fortement amoindries. 3 - Activité anti-inflammatoire .Principe d'essai L'injection, sous la face plantaire de la patte du rat, de 0,05 ml d'une solution de carragéenine à I % d'eau distillée provoque l'apparition d'un oedème mesurable avec un plbthismométre. Le composé à étudier est administré, par voie orale, en solution dans l'huile d'olive, une heure avant l'injection de ta carragéenine, à titre préventif. La mesure du volume de la patte initialement, puis toutes les heures après l'injection de l'agent inflammatoire, permet d'apprécier l'oedème. On opère comparativement: - sur un lot témoin ne recevant l'huile d'olive, - sur Un lot traité recevant 200 mg/kg (0, 1 îmole/kg) d'acide acétyl salicylique en solution dans l'huile olive, et - sur un lot traité recevant 400 mg/kg (O, il moletkg) de CBS 10 A en -solution dans l'huile d'olive. Dans chaque groupe et pour chaque animal, on calcule aux différents temps l'oedème et l'exprime en pourcentage du volume initial de la patte. Résultats Les résultats obtenus sont exposés dans le tableau suivant: Tableau III Moyenne du pourcentage d'augmentation du volume initial de la patte. lère h. thème h. | 3ème h. | 4ème h. t 5ème h. 6èmeh. Témoin (huile d'olive) 30,16 63,33 51,83 49 41,33 49 Acide acétyl-salicy- lique (p.o. 200 mg/kg 19,85 35,71 26,28 22,14 23,42 12,57 CBS 10A (p.o.400mg/kg 30 47,75 45,85 38,57 37,57 28 II ressort de ce tableau que la protection conférée par l'acide acétyl salicylique est nettement plus intense que celle résultant de l'administration du CBS 10 A. II apparaît donc que l'estérification dudit acide par le (p-chlorophénoxy) - 2 méthyl-2 propanol lui a fait perdre de son activité dans ce domaine. 4 - Activité analgésique Principe de l'essai Sur des souris d'un poids voisin de 20 grammes, l'injection intrapéritonéale de 0,25 ml d'une solution à 0,02 % de phénylbenzoquinone dans l'alcool à 5 % provoque, dans les minutes qui suivent, l'apparition d'un syndrome caractéristique (torsion et creusement des flancs, étirements des pattes postérieures) pouvant persister pendant une heure. La suppression ou l'atténuation du syndrome peut etre obtenue par administration préventive de substances analgésiques. On opère sur trois lots de quatorze animaux chacun, répartis par tirage au sort comme suit - un lot témoin ne recevant que de l'huile d'olive, - un lot traité recevant 100 mg/kg(0,055 mole/kg) d'acide acétyl salicylique, per os, en solution dans l'huile d'olive, et - un lot traité recevant 200 mg/kg (0, 055 mole/kg) de CBS 10 A, per os, en solution dans l'huile d'olive. On compte le nombre de torsions apparaissant chez les animaux, au cours des 30 minutes qui suivent i'injection de phényî-benzoquinone. Résultats Les résultats obtenus sont exprimés dans le tableau suivant Tableau IV Lots Nombre de contractions moyen par animal Témoins (huile d'olive) 67,7 Acide acétal salicylique (p.o. 100mg/kg) 49,50 BS 10 A (p.o. 200 mg/kg) 56,36 On voit que le CBS 10 A ne protège pas les animaux autant que l'acide acétyl-salicylique. Cet affaiblissement des propriétés analgésiques est lié à l'estérification de la molécule. A partir de ces résultats, on aurait donc pu s'attendre à ce que les propriétés anti -agrégantes p laquettaires de l'acide acétyl-salicylique aient également pâti de l'estérification. Comme il ressort des essais accomplis par la Demanderesse, tel n'est pas le cas. Ces propriétes restent entières et s'a joutent à celles - jusqu'alors inconnues - du (p-chlorophénoxy) - 2 méthyl - 2 propanol. L'examen des propriétés du CBS 10 A a été complété par une étude toxicologique. 5 - Etude toxicologique a) Détermination de la toxicité aiguë du CBS 10 A, par voie orale, chez la souris. On utilise des souris mâle (Swiss) d'un poids moyen de }5i g que l'on maintien à une température voisine de 21 0C. Les animaux sont à jeun de 18 h et sont répartis en 5 lots de 10 animaux chacun. On administre le CBS 10 A en solution à 10% (10 g/100 ml) dans l'huile d'olive en gavant lessouris à laide d'une canule et d'une seringue de taille convenable. On établit ainsi la DL 50 par la méthode de BEHRENS et KARBER et la chiffre à ;2450 + 470 mg/kg (intervalle de confiance = 0,05). Remarque La mort des animaux est toujours survenue au delà d'un délai de 4 heures après l'administration du CBS 10 A. b) Détermination de la toxicité aiguë du CBS 10 A par voie orale chez le rat. On utilise des rats mâles de souche Wistar d'un poids moyen de 19 g auxquels on a fait préalablement subir un jeûne non hydrique de 18 h. L'étude de la toxicité aiguë a lieu dans une pièce où la température est maintenue à 210C. Les animaux sont répartis en 5 lots de 10 animaux chacun. On administre le CBS 10 A en solution à 40 % (40g/100 ml) dans l'huile d'olive en gavant les rats à l'aide d'une sonde gastrique et d'une seringue de taille appropriée. Le calcul de la DL 50 a été effectué selon la méthode de BEHRENS et KARBER. DL 50 = 2700 + 502 mg/kg (intervalle de confiance = 0,05). Remarque Comme dans le cas des souris, la mort des animaux est toujours survenue au delà d'un délai de 4 heures après l'administrationdu CBS 10 A. II ressort de l'ensemble des résultats qui précèdent que l'écart entre les doses pharmacologiquement actives et les doses léthales est suffisamment grand pour permettre l'accomplissement d'essais cliniques. 6 - Esais cliniques Les essais ont été effectués sur quatre malades chez lesquels le test d'agrégation plaquettaire à l'adénosine-diphosphate (A DP) a montré une hyperagrégabilité souvent majeure, et qui présentaient, en outre, une hypercholes térolémie, une hypertriglycéridêmie et une hyperlipidémie. c.) Action sur l'agrégation des plaquettes Matériel et méthode L'étude de l'agrégation plaquettaire est effectuée à l'aide d'un agré gomètre BRYSTON relié à un enregistreur sur papier. Après réglage de la transmìon des rayons lumineux, de 0 à 100%, suivant le procédé classique, on enregistre la courbe d'agrégation de chaque plasma de malade en utilisant l'A DP comme agent agrégant, à deux doses diffé":ntoe: 0,625 et 1,25 microgrammes. On établit une première courbe d'agrégation avant le traitement au CBS 10 A. Traitement Tous les jours, pendant deux semaines, les malades ont absorbés, per os, 6 gélules renfermant chacune 0,Q83g de CBS 10 A, soit 0,498g par jour et par malade. Le quinzième jour, une nouvelle courbe d'agrégation, suivant la meme méthode que précédemment, a été établie. Les courbes avant traitement(en pointillés) et après traitement (en trait plein), pour une dose d'ADP de 1,25 microgrammes, sont représentéesschéma- tiquement à la figure unique du dessin annexé, où le pourcentage de densité optique (% DO) est donné en fonction du temps en minute. Ces courbes révèlent, en pratique, la vitesse d'agrégation et de désagrégation, avant et arpès traitement. Les valeurs qui ont permis de tracer ces courbes sont des valeurs moyennes. Les moyennes des différences entre les valeurs avant et après traitement sont rapportées dans le tableau suivant Tableau V ADP dose dose 0,625.10-6g t 1,25.10-6g t Vitesse d'agrégation -3 # 1 5,9* -3,23 # 1,5 3,75* en %DO,{mn Maximum d'agrégation en % DO -2,56 # 2,4 1,85 -3,86 # 2 3,35 * Vitesse de désagrégation +3,3 # 2,3 2,48 +2,2 # 1,1 3,46* en %# DO/mn Le test det a été appliqué à toutes ces moyennes (méthode des couples) ; l'astérique indique les moyennes qui sont significativement différentes de 0 à un risque inférieur à 0,05. En conclusion A partir des résultats obtenus avec une dose d'agent agrégant égale à 1,25 microgrammes, on peut voir que la vitesse d'agrégation et le maximum d'agrégation ont été significativement diminués (valeurs précédées du signe -), alors que, au contraire - et ceci est important dans des cas de diabètes - la vitesse de désagrégation est significativement augmentée (valeurs précédées du signe +) après le traitement par le CBS 10 A. b) Action sur les lipides du sang Le sérum des malades sur lesquels ont été réalisés les essais d'agrégation ploquettaires, a été utilisé pour la détermination, avant et après traitement (0,498 g/jour/malade pendant 15 jours), des diverses fractions lipidiques du sérum. On a ainsi dosé le cholestérol total, les triglycérides et les lipides totaux. Les résultats, exprimés en gramme/litre de sérum, sont exposés dans le tableau suivant. Tableou VI Avant traitement Après traitement Malades Malades 1 2 3 4 1 2 3 4 Cholestérol total 2,9 2,7 3,4 2,9 2,1 2,2 2,5 2,1 Triglycérides 2,5 2,3 2,1 1,8 2,0 2,1 1,8 1,8 Lipides totaux 8 8,5 7,5 11,0 6,3 7,6 5,6 10,5 Les résultats obtenus sur l'homme confirment donc ceux observés chez l'animal, I'administration du CBS 10 A provoquant une diminution dJ taux de certaines fractions lipidiques du sérum. Compte-tenu de l'ensemble de ces résultats, on peut envisager d'utiliser le CBS 10 A pour le traitement des maladies ischémiques (ischémies vasculairs cardiaques, cérébrales ou rétiniennes). II pourra êfre administré par voie orale (capsule, comprimé, gélule. ou p-ar voie rectale (suppositoires} aux doses journalières de 0,5 g à 3 g en cure continue ou discontinue. L'invention ayant maintenant été exposée et son intéret justifié sur des exemples détaillés, la Demanderesse s'en réserve l'exclusivité, pendant toute la durée du brevet, sans limitation autre que celle des termes des revendications ci-après. REVENDICATIONS A A titre de produit industriel nouveau, l'ester acétylsolicylique du (p-chlorophénsxy) - 2 méthyl - 2 propanol de formule 2. Procédé de préparation du composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à faire agir un haiogénure, tel que le chlorure, d'acétylsalicyloyle de formule: où Hal représente un haIogane,sur le (p-chlorophénoxy) - 2 méthyl - 2 propanol de formule 3. A titre de médicament, utilisable en particulier pour le traitement des maladies ischémiques, le composé selon la revendication 1.