Brevet FR2250822A1 — publié le 19750606

La présente invention concerne un procédé pour cultiver des levures. Plus particulièrement, I1 invention concerne un procédé de fabrication efficace de levures, de leurs composants et de leurs produits, par culture de levures appartenant au genre Saccharomyces, Fichia Saccharomycopsis, Rhodotorula, Candida, Torulopsis ou Trichosporon dans un milieu nutritif, dans lequel on ajoute de la carnitine, définie ci-après, un de ses précurseurs, ou un de ses dérivées, comme facteur de croissance pour favoriser la croissance des cellules L'accroissement de la vitesse de croissance en culture des micro-organismes permet de façon efficace de réduire le cout de la culture, car il réduit la durée de culture, accroît le rendement des cellules, et diminue le risque de contamination par divers germes. Il est classique d'ajouter de l'infusion de mais, des extraits de levure, etc. > au milieu de culture, comme substance renfermant un facteur de croissance, lorsqu'on cultive une levure avec du glucose, de l'éthanol, de l'acide acétique, des hydrocarbures, etc., comme source de carbone, bien que cela ne soit pas le cas dans les procédés où on utilise un milieu de culture riche en sources nutritives organiques tel que les mélasses ou le mout de bières un tel procédé n'est jamais souhai table, car il augmente la demande chimique en oxygène et la demande bio- logique en oxygène et risque d'entralner une contamination par des germes. Par conséquent, la demanderesse a étudié de nombreux composés pour trouver des substances actives à de faibles concentrations. La demanderesse a découvert que la carnitine et ses dérivés; lorsqu'on les utilise à très faibles concentrations, favorisent nettement la croissance et l'invention repose sur cette découverte. La carnitine est une substance naturelle présente dans les muscles et le foie des animaux et on sait qu'elle joue un rôle -important dans le métabolisme des acides gras. On ignorait cependant qu'elle favorisait la croissance des levures. On entend ici par "carnitine" les isomères optiquement inactifs ou actifs. On peut citer commeexemples de précurseurs de la carnitine, la crotonbéta'ine -et -la butyrobéta'ine. Les sels de carnitine et de ses précurseurs sont par exemple des sels organiques et minéraux (tels qu'un chlorhydrate ou un aurochlorate), les sels de métal alcalin (tels que les sels de sodium'ou de potassium) et les sels de métaux alcalino terreux. On peut citer comme exemples de dérivés de carnitine utiles dans l'invention ceux qui se décomposent en carnitine sous l'effet d'une enzyme ou d'un micro-organisme, tels que l'acétylcarnitine, les acylcarnitines à chaine courte et à channe longue (telles que la propionylcarnitine, la butyrylcarnitine, la palmitoylcarnitine et la stéaroylcarnitine), et les esters alkyliques (tels que les esters niéthyliqueset éthyliques) de la carnitine. On peut citer comme exemples de dérivés de la crotonbéta9ne et de la butyrobetaine, les esters alkyliques (tels que les esters méthyliques et éthyliques). On peut utiliser dans l'invention tout micro-organisme appartenant au genre Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Saceharomycopsis, Pichia, Rhodotorula, Candida, Torulopsis ou Trichosporone. Le procédé de l'invention s'applique particulierement à la culture de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces rouxii IFO 0476, Saccharomycopsis lipolytica 6124, Pichia farinosa IFO 0193, Pichia membranaefaciens IAM 4744, Rhodotorula rubra IFO 0383 > Rhodotorula glutinis IFO 0559, Candida novellus ATCC 20275, Candida tropîcalis IFO 0006, Candida arborea IAM 4147, Candida guilliermondii IFO 0566, Candida rugosa IFO 0591, Torulopsis xylinus-IFO 0454, Torulopsis ragnoliae IFO 0705, Trichosporon cutaneum OUT 6259 et Trichosporon pullulans OUT 626D, soit seuls, soit en combinaisons. Dans llinvention,on peut utiliser toute source de carbone pouvant etre assimilée par la levure. On peut citer comme exemples de sources de carbone des sucres tels que le glucose, le saccharose et l'amidon, des alcools rels que le méthanol et l'ethanol, des acides organiques tels que l'acide acétique ou l'acide fumarique, des acides gras supérieurs tels que l'acide palmitique, l'acide stéarique ou l'acide oléique, leurs esters, des huiles et graisses telles que lthuile de soja ou l'huile de baleine qui renferment ces acides gras, et des hydrocarbures tels que les paraffines normales, le kérosène en renfermant ou le gasoil. On utilise comme source nutritive des sels d'ammonium tels que le sulfate d'ammonium ou le chlorure d'ammonium ou l'urée. On-peut également utiliser d'autres sels minéraux, par exemple les sels de potassium, les sels de magnésium, les sels d'acide phosphorique, les sels de zinc et'les sels de manganèse, tels que le chlorure de potassium, le sulfate de magnésium, le phosphate de potassium, le sulfate de zinc ou le sulfate de manganèse. On peut incorporer au milieu de culture des traces de vitamines telles que la biotine ou la vitamine B1 ou des extraits de levure, des mélasses, et de l'infusion de mais renfermant ces vitamines. Pour des raisons relatives à la liqueur résiduelle, il est souhaitable de n'incorporer qu'une seule vitamine nécessaire au micro-organisme utilisé. On peut effectuer la culture selon des techniques utilisant un milieu solide ou un milieu liquide avec une cuve de culture à barbotage d'air, une cuve de culture & agitation et similaires. On peut effectuer la culture à une température quelconque permettant le développe- ment de la levure. Cependant, sauf pour certains micro-organismes, on préfère particulièrement des températures de 25 à 400 c. Le pH du milieu de culture est de préférence de 6 à 8 dans le cas où lton utilise des acides organiques ou des acides gras supérieurs, et de 4 à 7 dans le cas des autres sources de carbone.En particulier, lorsqu'on utilise des hydrocarbures ou des huiles et des graisses comme substrats, on peut ajouter un agent tensioactif tel qu'un dérivé d'acide gras pour favoriser la dispersion du substrat dans les conditions de culture Selon l'état de la culture; on peut ajouter un antimousse tel qu'une résine de silicone, un dérivé d'acide gras ou un ester mono ou dialkylique d'un polyoxyalkylène- glycol. On peut utiliser la carnitine ou son dérivé qu'on ajoute au milieu de culture à des concentrations quelconques correspondant au moins à lOIugll exprimées en chlorure de carnitine, car, même à des concentrations élevées, il n'y a pas d'inhibition du développement des levures. Cependant, des concentrations trop élevées peuvent accroitre le coût de production et,par conséquent, la gamme de concentrations préférée est comprise entre 100 g/l et 100 mg/l. Cependant, la concentration de la crotonbétaine, qui est un précurseur de la carnitine, est de préférence de 100 g/l à 10-mJlJ car à des concentrations plus élevées on observe une inhibition du développement des levures. L'invention est illustrée par les exemples nullement limitatifs suivants, dans lesquels les pourcentages sont exprimés en poids. Exemple 1. À un milieu de base (ajusté à pH 7,0) constitué de 13 g de paraffines normales (pureté 98 70, c1021), 4 g de phosphate monopotassique, 5 g de sulfate d'ammonius, 0,6 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 30 mg de sulfate de zinc heptahydraté, 50 mg de sulfate ferreux- heptahydraté > 1 ml d'un bouillon de culture de Candida novellus ÂTCC 20275 qu'on a préalablement cultive dans un flacon renfermant le même milieu de base, et on cultive à 330C en agitant. Les résultats obtenus figurent dans le tableau I, ci-après. Ezemple 2. On cultive comme décrit dans l'exemple 1, respectivement Candida tropicalis IFO 0006, Candica lipolytica IFO 0746 et Candida rugosa IFO 0591. les résultats obtenus figurent dans le tableau II, ci-après. Exemple 3. On cultive Pichia farinosa en opérant comme décrit dans l'exemple 1, avec un milieu de culture qu'on a obtenu en ajoutant du chlorure de carnitine au même milieu de. culture de base que dans l'exemple 1, en quantité telle que le milieu de culture obtenu présente les diverses concentrations en chlorure de carnitine figurant dans le tableau III, ci apures. Les résultats obtenus figurent également dans le tableau III, ci-après. Exemple 4. On cultive Saccharomyces rouxii de la même façon que dans l'ezemple"l. Les résultats obtenus figurent dans le tableau IV, ci-après. Exemple 5. On cultive Saccharomycopsis lipolytica CBS 6124 en opérant conte dans l'exemple 1 Les résultats obtenus figurent dans le tableau V, ci-après. Exemple 6. On cultive Torulopsis xylinus IFO 0454 en opérant comme décrit dans lexemple 1. Les résultats obtenus figurent dans le tableau VI, ci-après. Exemple 7. On cultive Saccharomyces cerevisiae (levure de bière) en opérant comme décrit dans l'exemple 1, si ce n'est qu'ou utilise 20 g d'éthanol comme~soúrce de carbone au lieu de paraffines normales ; on ajoute comme vitamines, en plus de la biotine et du chlorhydrate de thiamine, 2 mg de pantothénate de potassium, 10 mg de chlorhydrate de pyridoxine et 10 mg diinositol et on cultive à 300 c. Les résultats obtenus figurent dans le tableau VII, ci-après. Exemple 8. On cultive Pichia membranaefaciens TAM 4744 en opérant comme décrit dans l'exemple I, si ce n'est qu'on utilise un milieu de base (ajusté à pH 6,0) constitué de 10 g d'acide acétique, 15 g de phosphate monopotassique, 15 g de phosphate disodique, 13 g de phosphate mono-acide d'ammonium, 2 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 30 mg de sulfate de zinc heptahydraté, 10 mg de sulfate ferreux heptahydraté, 10lug de biotine et 1 1 d'eau du robinet. Les résultats figurent dans le tableau VIII, ci-après. Exemple 9. On cultive Rhodotorula rubra IFO 0383 en opérant comme décrit dans l'exemple 1, si ce n' est qu'on utilise 20 g de glucose comme source de carbone, au lieu des paraffines normales. Les résultats figurent dans le tableau IX ci-après. Exemple 10. On reprend l'exemple 1, si ce n'est qu'on ajoute respectivement du chlorhydrate de crotonbétaine et du chlorhydrate de butyro bétoine. Les résultats figurent dans le tableau X ci-après. Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de 1'art aux dispositifs ou procédés qui viennent prêtre décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. TABLEAU I Concentration du Concentration des cellules (g/l) chlorure de carnitine Durée de culture (mg/i) 16 heures 18 heures 20 heures 0 6,4 9,4 10,5 0,01 7,1 10,7 12,3 0,1 8,3 12,0 13,0 i --9,0 12,2 13,8 10 10,2 13,0 13,8 100 10,5 13,3 13,8 TABLEAU Il Concentration des cellules (g/l) Sans addition Chlorure de carnitine (1 mg/i) Souche Durée de culture (h) 16 20 24 16 20 24 Candida lipolytica 1,5 5,6 8,7 3,4 9,6 9,3 IFO 0746 Candida tropicalis 1,9 6,7 9,4 4,2 10,3 10,4 IFO 0006 Candida rugosa 0,9 4,4 7,5 3,1 8,5 9,9 IFO 0591 TABLEAU III Concentration du Concentration des cellules (g/l) chlorure de carnitine (mg!l) Durée de culture 16 heures 18 heures 20 heures 0 5,4 8,0 10,2 0,1 8,6 11,5 12,8 1 9,4 12,7 13,3 TABLEAU IV Concentration du Concentration des cellules (g/l) chlorure de carnitine ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ (mg/l) Durée de culture 16 heures 20 heures 24 heures 0 2,2 7,3 9,0 0,1 3,8 9,1 10,1 1 4,2 10,5 11 > 6 TABLEAU V Concentration du Concentration des cellules (g/l) chlorure de carnitine ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ (mg/l) Durée de culture 16 heures 20 heures 24 heures o 1,5 5,6 8,7 0,1 3,0 8,8 9,5 1 3,4 9,6 9,8 TABLEAU VI Concentration du Concentration des cellules (g/l) chlorure de carnitine I (mg/l) Durée de culture 20 heures 26 heures 32 heures O 2,3 6,5 8,5 0,1 4,6 8,7 9,3 1 5,9 10,1 10,9 TABLEAU VII Concentration du Concentration des cellules (g/l) Glutathion (mg %) chlorure de carnitine ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ (mg/l) Durée de culture Durée de culture 16 heures 20 heures 24 heures 24 heures 0 3,5 6,1 10,0 63,5 0,1 5,2 7,9 10,5 72,0 1 5,5 8,4 10,9 75,0 10 5,8 8,6 11,0 74,0 TABLEAU VIII Concentration du Concentration descellules (g/l) chlorure de carnitine ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ (mg/l) Durée de culture 16 heures 20 heures 24 heures 0 1,8 2,6 3,4 0,1 2,5 3,1 3,9 1 2,8 3,5 4,1 TABLEAU IX Concentration du Concentration des cellules (g/l) ARN chlorure de carnitine ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ (7) (mgll) Durée de culture 12 heures 14 heures 16 heures 14 heures 0 4,6 7,7 11,5 5,8 0,1 6,9 10,8 12,0 6,8 1 7,3 11,1 12,2 6,9 TABLEAU X Concentration des cellules (g/l) Additif Durée de culture 16 heures 18 heures 20 heures Néant 6,5 9,4 10,7 Chlorhydrate de crotonbétaïne 0,1 mg/l 8,5 12,1 13,4 1 mg/l 8,7 12,3 13,5 Chlorhydrate de butyrobetaine 0,1 mg/l 8,0 11,7 12,9 l mg/l 8,5 12,0 13,1 REVENDICATIONS I. Procédé pour cultiver une levure1 caractérisé en ce qu'il consiste & cultiver en aérobiose une levure appartenant au genre Saccharomyces, Pichia, Saccharomycopsis, Rhodotorula, Candida, Torulopsis ou Trichosporon dans un milieu nutritif pouvant être assimilé par cette levure, en ajoutant au milieu nutritif de la carnitine, un de ses précurseurs ou un de leurs dérivés. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la levure appartenant au genre Saccharomyces est Saccharosyces cerevisiae ou Sacchardmyces rouxii. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la levure appartenant au genre Pichia est Pichia farinosa ou Pichia membransefaciens. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la levure appartenant au genre Saccharomyeopsis est Saccharomycopsis lipolytica. 5 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la levure appartenant au genre Rhodotorula est Rhodotorula rubra 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la levure appartenant au genre Candida est Candida novellus, Candida tropicalis, Candida lipolytica, Candida arborea, Candida guilliermondii ou Candida rugosa. 7. Procédé selon la revendication 1,-caractérisé en ce que la levure appartenant au genre Torulopsis est Torulopsis sylinus ou Torulopsis magnolise. 8. Procédé selon la revendication 1,caractérisé en ce que la levure appartenant au genre Trichosporon est Trichosporon cutaneum ou Trichosporon pullulans. 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu nutritif renferme une source de carbone choisie parmi les sucres, les huiles et graisses, les alcools, les acides organiques et les hydrocarbures. 10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le précurseur de la carnitine est la crotonhétaine ou la butyrobétaine. 11. Procédé selonsla revendication 1, caractérisé en ce que le dérivé de carnitine est llacylcarnitine ou une alkylcarnitine. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'acylcarnitine est choisie parmi l'acétylcarnitine, la propionylcarnitine, la butyrylcarnitine, la palmitoylcarnitine et la stéaroylcarnitine. 13. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'alkylcarnitine est la méthylcarnitine ou l'éthylcarnitine. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 10, caractérisé en ce que le dérivé de crotonbétaine est une alkylcrotonbéta'ine. 15. Procédé-selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'alkylcrotonbétaïne est la méthylcrotonbétalne ou l'éthylcrotonbétaine. 16. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 10, carac térisé en ce que le dérivé de butyrobétaine est une alkylbutyrobétaine. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'alkylbutyrobétaine est la méthylbutyrobétaîne ou l'éthylbutyro bétasne.