Brevet FR2278346A1 — publié le 19760213

La présente invention concerne la lutte immunologique et immunothérapeutique contre la bilharziose ou schistosomiase, la croissance des tumeurs et la fascioliase, par induction de propriétés pharmacologiques dans des systèmes biologiques et au moyen de compositions originales. Plus particulièrement, on obtient ces propriétés pharmacologiques en traitant le système biologique par un compose de formule dans laquelle R1 représente le groupe -NHCH2CH2N(C2H5)2 et R2 représente un reste cyclohexyle condensé sur la molécule de thia xanthone. On préfère tout particulièrement les composés suivants : 4-C -diéthylamiho éthylamino)-1,2-cyclohexenothiaxanthone 2-( a -diéthylamino éthylamino )-3 ,4-cycl ohexenothiaxanthone et 1-(ss-diéthylaminoéthylamino)-3,4-cyclohexenothiaxanthone Pour une description de la préparation de ces composés, on peut se référer utilement au brevet US 3 767 674. L'invention a également pour objet les sels appropriés des composés de formule I. On peut utiliser divers systèmes biologiques en vue de leur traitetient par les composés de formule I. L'application de ces composés à divers systèmes biologiques est décrite ci-après, séparément pour chaque système biologique, et on étudie dans chaque cas les problèmes qui se posent avec chaque système biologique particulier. A. Application du composé de formule I aux cercaires Les cercaires constituent un stade infectieux du cycle de développement de la bi-harxiose ou schistosomiase. Ils se développent sur un hôte intermédiaire particulier, qui est une espèce spéciale d'escargot vivant dans l'eau douce, et ils sont répandus par cet escargot. Une fois que les cercaires pénètrent par un processus infectieux dans le corps d'un second hôte, par exemple de l'homme, ils se développent jusqu'à devenir des vers adultes, à savoir les schistosomes. Ils vivent dans le sang qui circule dans la veine-porte et dans les veinules mésentériques la formant. Oes vers, bien qu'ils vivent dans un environnement de sang dans un tel système, échappent aux défenses naturelles de l'hôte.Il existe des théories différentes et des interprétations variées pour expliquer la façon dont les vers échappent au système immunologique de l'hôte; par exemple, on peut supposer qu'ils se recouvrent eux-mêmes avec les antigènes de l'hôte, ce qui leur permet de ne pas être identifiés par les composants de la défense immunologique de l'hôte. A ce propos, c'est-à-dire au sujet de la façon dont les composants réussissent à échapper aux défenses naturelles de l'hôte, on est obligé de constater une certaine similitude avec la façon dont les cellules des tumeurs échappent elles aussi au système d'immunisation, car ces cellules ne sont pas reconnues ou identifiées par les éléments de défense de l'hôte. La présente invention décrit et démontre un moyen nouveau pour la provocation du système d'immunisation et un moyen pour combattre l'infection par les schistosomes, ainsi que le développement des tumeurs par voie immunologique et par voie immunothérapeutique. On peut obtenir les deux effets avec de bons résultats en utilisant des cercaires chimiquement prétraités. Les composés chimiques qu on doit utiliser pour ce traitement des cercaires sont ceux qui répondent à la formule générale I. On a traité les cercaires par ces agents in vitro pendant 24 heures dans une suspension de 2000 cercaires dans 40 ml d'eau renfermant 0,2 mg d'un composé de formule I, par exemple de la a C3 diéthylaminoéthylamino)-3,4-cyclohexénothiaxanthone (provenant d'une solution de 2 mg/ml). bu bout de 10 minutes, les cercaires ont commencé à être paralysés et ne pouvaient plus avoir de mouvements dynamiques, Après 24 heures, les cercaires étaient morts et la substance de la solution était en majeure partie absorbée par les cercaires (des calculs spectraux ont montré que chaque cercaire a absorbé environ 0,25 microgramme de la matière ajoutée). A l'examen microscopique, les cercaires avaient la couleur de la matière dans les tissus.Après 24 heu res, les cercaires traités ont été laissés en vue d'une sédimentation à une temperature de +4 G. On a enlevé le liquide surnageant et on a recueilli les cercaires sédimentés, puis on les a remis en suspension dans une solution physiologique, par exemple une solution saline tamponnée et équilibrée rappelée "BSS" qui sont les initiales de son appellation anglaise, à savoir "balancez salt buffered solution1. On les a comptés de manière à réaliser une valeur correspondant à un comptage normalisé par ml de la suspension. Par exemple,dans les tests décrits ci-après, on a utilisé de 200 à 300 cercaires prétraités. Oontre la bilharziose ou schistosomiase Ca) Lutte immunologique Â 16 souris de souche GOBA, on a administré par injection i.p. (intrapéritonéale) 1 ml de la suspension décrite ci-dessus de cercaires chimiquement prétraités, trois fois, un jour sur deux. Au bout de deux semaines, on a exposé 8 souris de ce groupe à une infection par des cercaires vivants frais virulents, en même temps qu'un autre groupe de 4 souris n' ayant pas été immunisées. Âu bout de 8 semaines après l'infection, on a commencé à examiner et à surveiller le développement de l'infection, aussi bien chez les souris immunisées que chez les souris non immuni- sées.Les comptages d'oeufs, ainsi que l'examen des excrétions et ensuite une autopsie, ont montré le développement de l'infection chez les souris-témoins (non immunisées) et l'absence d'un tel développement chez les souris immunisées. (b) Lutte immunothérapeutique On a effectué des injections i.p. (on aurait pu d'ailleurs faire également des injections sous-cutanées) à raison de trois injections, un jour sur deux, à 6 souris de souche ACA atteintes déjà d'une infection établie par Schistosoma mansoni et faisant preuve de fortes excrétions d'oeufs dans leurs selles, chaque in jection comportant 1 ml l'une suspension contenant les cercaires prétraités. Six semaines après le traitement, on a examiné les souris par comptage des oeufs et on les a ensuite autopsiées. Dans les tissus des souris, on n'a trouvé que des vers morts détruits et des oeufs noirs morts. Ces découvertes démontrent que le traitement d'une infection établie peut amener une guérison à l'aide de cercaires chimiquement prétraités. Contre les tumeurs : Lutte irmmunothérapeutique 1DCPIaE On a administré par voie i.p. ou sous-cutanée 1 ml de la suspension décrite contenant 300 cercaires chimiquement prétraités, trois fois un jour sur deux, à des groupes de souris (6 animaux par groupe) chaque animal étant atteint d'une tumeur déjà établie de Ehrlich ascites carcinoma (ELD) dans un premier groupe et de T3 (carcinome mammaire) ou El4 (leucémie des sou ris), après inoculation de 10 cellules virulentes franches provoquant les tumeurs.On a procédé à des contrôles du développement due la grosseur de chaque tumeur, du comptage des cellules et du poids de chaque animal et on a constaté une régression certaine de la grosseur des tumeurs et meAme une guérison complète dans certains cas. On voit donc que cet exemple met en évidence une nouvelle thérapeutique de traitement des tumeurs. B. Application de composés de formule I aux escargots de la variété Lynnae et aux meta-cercaires. La fascioliase est une maladie à parasites provoquée par l'infection par Basciola hepatica (douve du foie) qui vit normalement dans le foie des brebis, du bétail et de l'homme. Les vers adultes vivent dans les voies biliaires où ils pondent des oeufs et sont évacués par les selles. Les miracidia s'échappent des oeufs et envahissent l'hôte intermédiaire spécifique, en l'occurrence les escargots de la variété Lymnae, où se développe la forme infectieuse (les méta-cercaires) et d'où ils sont libérés pour infecter l'hôte définitif (bétail ou homme). Le traitement de la maladie par des moyens chimiques est complexe et ne donne que rarement de bons résultats, par suite de la toxicité des agents utilisés pour l1hôte. La maladie occasionne des pertes phénoménales à 11 économie d'un pays et à la main d'oeuvre. Dans certains pays, l'infection des animaux de ferme atteint 25 à 30 %. La présente demande décrit des moyens efficaces aussi bien de protection contre l'infection que de traitement d'une infection déjà établie. La spécificité biologique entre la forme infectieuse d'un parasite et l1hôte intermédiaire chez lequel l'infection se développe avant d'etre transférée à lthôte définitif est régie habituellement par des rapports génétiques et antigènes. Ce facteur,suggère la possibilité d'exploiter ce rapport d'une façon rationnelle pour lutter contre la maladie. ii raison de toutes ces considérations, on a suggéré aussi bien le traitement chimique de l'hôte intermédiaire (escargots BIymnae") que celui du stade intermédiaire (ctest-à-dire du stade infectieux), étant donné que tous deux possèdent des antigènes communs. Le traitement chimique doit se faire par des systèmes chimiques particuliers capables d'induire et d'amorcer des modifications chimiques de la nature des antigènes natifs. Ainsi, par une modification chimique des antigènes et par l'établissement ultérieur de l'immunité par l'entremise des cellules, on réussit à retarder l'hypersensibilité autrement dit la réponse immunolo tiques qui est habituellement la principale responsable du rejet des greffes ou des infections. Le type de- système chimique qu'on utilise dans la présente étude est constitué par les composés de formule I ci-dessus. Les structures de ce genre, qui possèdent l'affinité voulue pour résider sur un support de DWL en raison du squelette de thiaxanthone et de la réactivité du système de tétralîne incorporé par voie moléculaire, tendent à interférer avec la synthèse des protéines qui dépend du rapport DNA/REA, d'où modification des propriétés antigènes. Dans ces essais, on a administré les extraits des escargots chimiquement prétraités ou des méta-cercaires chimiquement prétraités à des groupes d'animaux non infectés qu'on a exposés ultérieurement à une infection par les parasites. Un examen ultérieur du développement de l'infection des animaux préimmunisés et des témoins a montré l'absence d'infection chez les animaux i unisés et au contraire son développement chez les témoins. Dans d'autres tests, comportant l'utilisation d'animaux déja infectés qu'on a examinés pour déterminer les effets théra peptiques des antigènes nouveaux, les extraits provenant des escargots chimiquement prétraités et des méta-cercaires prétraités, aussi bien par voie sous-cutanée que par voie i.p., ont montre' l'efficacité de la suppmession de l'infection chez les animaux traités, comme on a pu le constater par l'arrêt des excrétions d'oeufs et par la destruction des vers (examen à l'autopsie). EXE2 z E On a laissé quatre escargots de la variété Lymnae réagir avec la 4-( L -diéthylaminoéthylamino)-1 , 2-cyclohexénothiaxantho ne en solutIon en une concentration de 4 mg par escargot. Après 24 heures, le substrat du composé avait été à peu près entièrement absorbé par les escargots. La petite partie résiduelle du composé a changé de couleur en passant du jaune au rouge rostre. On a enlevé les coquilles des escargots et on a extrait les tissus doux dans une solution de 5,8 % de chlorure de sodiun en un volume de 0,75 ml par escargot. On a soumis le produit homogène à une centrifugation et on a dilué le liquide surnageant pour le faire correspondre à 1,5 mi par escargot dans une solution à 2 % de NaCl (solution I). On a utilisé cette solution pour les tests décrits. On a effectué le traitement chimique des méta-cercaires en mettant en suspension de 200 à 250 méta-cercaires;dans 10 ml d'une solution de i-C n -diéthylaminoéthylamino )-3,4-cyclohexéno- thiaxanthone (dilution 1 mgzml) pendant une période de 24 heures. L'analyse a montré l'absorption de la substance par les cercaires à raison d'environ 50 microgrammes par cercaire. On a ensuite isolé les cercaires prétraités et on les a remis en suspension dans une solution à 0,9 % de Nazi. Essais d'immunisation On a utilisé deux groupes comportant chacun 6 souris; on a administré à chaque animal du premier groupe 0,4 mi de la solution I par voie sous-cutanée ou i.p. à trois reprises (une fois par jour). Aux souris de l'autre groupe, on a administré également par l'une ou par l'autre vole 10 à 12 cercaires prétraités. Au bout de deux semainas, on a soumis les animaux des deux groupes - une infection, à l'aide d'un tube d'alimentation directe de l'estomac, en introduisant de 6 à 8 méta-cercaires par souris aux animaux des deux groupes, ainsi qu'aux animaux d'un groupe témoin. L1examen des groupes immunisés, ainsi que du groupe témoin, par une surveillance des excrétions d'oeufs et par un examen à l'autopsie, a montré le développement de l'infection chez les animaux. témoins et l'absence d'infection chez les animaux préimmunisés. Essais d'immunothérapie Aux souris appartenant à deux groupes (souche ACA) déjà infectées avec la fascioliase et dont les selles contenaient des excrétions d'oeufs, on a administré (dans le cas du premier groupe) 0,4 ul de Solution I par voie sous-cutanée ou i.p., à trois reprises un jour sur deux. En ce qui concerne les animaux de l'autre groupe, on leur a administré également par l'une des deux voies de 10 à 12 cercaires prétraités. On a réalisé les examens trois semaines après le traitement, en surveillant les ex crétions d'oeufs ou la destruction des vers à l'autopsie des souris traitées. Dans les souris des deux groupes, l'excrétion des oeufs a cessé et, après autopsie, on a trouvé des vers morts. Chez les témoins, on a constaté la poursuite de l'infection, ac cospagnée d'excrétion d'oeufs. Cette façon d'aborder le problème et ce principe de mise en oeuvre, à savoir le prélèvement des antigènes du stade d'infection intermédiaire du parasite ou chez l'hôte intermédiaire du parasite, chez lequel le stade intermédiaire se développe et possède un antigène commun avec celui de lthôte, sont valables tant par exemple pour le cas des escargots de la variété Lymnae lors d'une fascioliase que pour celui des Eetrophyes auquel cas les antigènes pourraient provenir des hôtes intermédiaires qui sont des escargots de la variété Perinella conica. On pourrait donc appliquer ce principe de façon universelle pour protéger l'hôte définitif ou pour le traiter dans le cas d'une infection. On pourrait également utiliser les extraits provenant de l'hôte intermédiaire non traité (par exemple des escargots Lymnae dans le cas de la fascioliase) ou du stade intermédiaire non traité de l'infection (par exemple des méta-cercaires) pour provoquer les réponses imnunologiques et immunothérapeutiques désirées, mais avec une efficacité moindre qutavec les extraits prétraités. i'rElqI?lCATIONS 1. Composition pour lutter par voie immunologique et par voie immunothérapeutique contre (a) la bilharziose ou schistosomiase et la croissance des tumeurs ou (b) la fascioliase, caractérisée en ce qu'elle comprend respectivement (a) des cercaires ou (b) des méta-cercaires ou un extrait d'escargots de la variété Lymnae , prétraités dans chaque cas par un composé de formule: dans laquelle R1 représente le groupe -NHCH2CH2N(C2H5)2 et R2 est un reste cyclohexylique condensé sur la molécule de thiaxan thon. 2. Application du composé de formule I selon la revendication 1 au traitement (a) de cercaires ou (b) méta-cercaires ou escargots Lymnae 3. Application du composé de formule I selon la revendication 1 au traitement de (a) la bilharziose ou schistosomiase et la croissance des tumeurs ou (b) la fascioliase, caractériséeen ce qu'elle comprend l'administration à un hôte justifiable d'un tel traitement d'une dose pharmaceutiquement acceptable() de cercaires ou (b)2méta-cercaires ou d'un extrait d'escargots Lymnae prétraités par un composé selon la revendication 1. 4. Procédé pour l'obtention d'une composition selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on traite (a) les cercaires ou (b) les méta-cercaires ou les escargots Lymnae par un composé de formule I.