Brevet FR2269576A1 — publié le 19751128

La présente invention concerne un procédé de production de cellules microbiennes par culture de microorganismes et plus particulièrement de bacté ries en présence de méthanol comme source de carbone. Un premier objet de la présente invention est un procédé pour la culture d'un nouveau microorganisme de façon à obtenir un taux élevé de protéi de la masse cellulaires dont la composition en acides aminés et plus partisulière ment en lysine et méthionine permette l'utilisation en alimentation humaine ou animale. D'autres objets de la présente invention, relatifs aux conditions de culture du microorganisme, apparattront au cours de la description. Il est déja connu que certains microorganismes sont susceptibles de se développer sur des milieu de culture contenant du méthanol comme unique source de carbone. Les auteurs de la présente invention ont isolé des souches de bacté- ries capables d'assimiler le méthanol, qui sont des bactéries gram-négatives. Le présent procédé de production de biomasse utilise une nouvelle souche baetérienne inconnue Jusqu'ici. Aucune mention de bactéries présentant des caractères semblables n'a été trouvée dans la littérature, particulièrement dans le "Bergey's Manual" dans lequel on n'a trouvé aucune espece présentant les caractères indiqués ci-dessous. Cependant, certaines caractéristiques microbiologiques peuvent situer cette nouvelle souche dans le genre Protaminobacter, et on la dénommera donc, paur 11 instant, Protaminopacter B22P. Avec ce nouveau microorganisme on a obte ru un rendement et une production plus élevés que ceux déjà trouvés avec des souches connues. Les caraotéristiques microbiologiques de la souche sont les suivantes : Provchance = sols. 1/Morophologie microseppique : Bâtonnets rectilignes de 0,4-0,6 de largeur et 1-1,5 de logueur les cellules apparaissent isolément et parfois par paires ; elles se mauvent éventuellement : elles ne fixent pas le gram (bactéries gram-négatives) ; pas de formation de spores ; légère production de mueilage extra-cellulaire. 2/Morphologie des colonies sur gélose (gélose synthétique contenant du métha nol, 30 C) : forme circulaire (dimetre moyen : 1 mm apres- 2 jours de eroissance, 2 ms après 4 jours de croissance). : surface lisse, à bord entier, te couleur blanc-grisâtre, luisante, aspect butyreux à mucoide. . colonies légèrement bombées. 3/Propriétés physiologiques ; # Température = croissance satisfaisante de 25 C à 35 C. | pH = pousse bien à un pH de 6,5 à 7,5, capable de se développer à un pH de 6 à 9. Relation avec 11 oxygène libre = aérobie. Réduction des nitrates = négative. Catalase = positive. Milieu citraté de Simmons = pas de croissance. Production d'indole = négative. Uréase = positive. Test à l'oxydase = négatif. lait au tournesol = dégradation de la caséine avec alcalinisation. Production d'hydrogène sulfuré = négative. Production de pyocyanine (milieu A de King) = négative. Production de fluorescéine (milieu B de King) = négative. Utilisation des sources de carbone = Le méthanol, la méthylamine, lléthylamine, la propylamine, le glucosse, le fructose sont assimilés, mais les succinates, citrates, acétates, oxa lates, pyruvates, glutamates, lXacétaldéhyde, méthanol, le propanol, le buta nol, le glycérol, le sorbitol, le mannitol,l'heptane, lthexadécane, le tréha lose, le rhamnose, le sorbose, le sucrose, le galactose, le xylose ne sont pas assimilés. La composition du milieu utilisé pour l'assimilation des différen tes sources de carbone est, par exemple, la suivante = (NH4)2HP04 2g KH2P04 2g MgSO4, 7 H2O............. 0,5 g FeSO4, 7 H2O............. 0,01 g Extrait de levure ........... 0,1 g Eau distillée .................. 1 litre Substrat carboné ........... 0,1 %-0,5 5 (poids/volume) Le pH est de 6,9. Dans le cas d'-un milieu gélosé, on doit ajouter la gélose en une quantité telle que sa concentration soit de 10 g/l. Une autre propriété de cette nouvelle souche - qui constitue une par ticularité de la présente invention - concerne sa résistance particulièrement bonne à des concentrations élevées de méthanol. A des concentrations comprises entre 0,01 % et 6 % en volume de méthanol, la croissance de la souche ntest pas inhibée, et entre 0,01 % et 3,0 % en volume on ne constate aucune diminution du taux de croissance maximal. Ceci constitue un point particulièrement nouveau, la plupart des souches décrites dans la littérature étant inhibées à partir d'une concentration de méthanol de l'ordre de 1 % en volume. la La culture de la souche est effectuée dans des conditions aérobies à une température de 200C à 400C et de préférence entre 300C et 370 C, le pH étant maintenu entre 6 et 9 par exemple à environ 7,0. On peut utiliser la soude caus tique, l'ammoniac sous forme gazeuse ou en solution pour le réglage du pH, lorsqu'on emploie comme source d'azote des sels d'ammonium, la consommation d'ammoniaque contribuant à abaisser le pH. On a, d'autre part, remarqué - ce qui constitue une autre particula rité de ltinvention - que la culture de cette souche peut être conduite de façon non aseptique, aussi bien en ce qui concerne la préparation du milieu que | l'injection d'air, opérations qui jusqu'ici étaient connues être toujours effec tuées stérilement afin d'obtenir une culture pure de bactéries. Dans le cas pré sent, avec la souche de Protaminobacter P,22P, on a réussi à éliminer toutes ces étapes de stérilisation sans que la culture soit contaminée. Les milieux utilisables pour la culture de cette souche sont des milieux aqueux renfermant des composants usuellement utilisés pour la culture des microorganismes c'est-à-dire, renfermant une source d'azote, des composés minéraux et de petites quantités de substances organiques favorisant le dévelop pement comme les vitamines et produits analogues. i Les sources d'azote sont les sources classiques et comprennent les t sels d'ammonium tels que le chlorure, le sulfate, le carbonate ou le phosphate dibasique, les nitrates solubles tels que le nitrate de potassium, de sodium ou d'ammonium, , l'urée et l'ammoniaque soit en solution aqueuse, soit à l'état gazeux. Le milieu minéral renferme du phosphore, par exemple sous forme de sels de l'acide phosphorique, des ions essentiels tels que les ions magnésium, 'fer et potassium, et des oligo-éléments généralement à l'état de traces, tels que le cuivre, le zinc, le molybdène. Ce milieu pourra renfermer certains facteurs de croissance, par exemple de svitamines et des produits naturels contenant ces mêmes substances telles ;que les extraits de levure. On a d'autre part remarqué - ce qui constitue également une caracté ristique de l'invention - que l'on a intérêt à ajuster la composition du milieu de façon à ce que les ions qui interviennent, soit à l'état d'ions essentiels, soit à l'état d'oligo-éléments,sient à des concentrations adaptées, c'est-à dire ni limitantes ni en excès, par exemple L'élément fer et l'élément zinc dans le milieu minéral seront ajoutes dans les concentrations respectives = PeSO4, 7 H20 = 5 mg/l à 50 mg/l, ZnS04, 7 H20 = 0,05 mg/l à 1 mg/l. La culture de la souche étant conduite comme il vient d'entre indiqué, la récupération du produit protéinique consistant en cellules séchées de bacté ries peut être mise en oeuvre de toute manière connue . Généralement, on sépare, par exemple, par décantation, filtration ou centrifugation, le milieu minéral aqueux des cellules de microorganismes qui sont ensuite séchées. Les exemples suivants qui illustrent l'invention ne sont pas limita tifs. EXEMPLE .1 : Culture en discontinu On cultive le nouveau microorganisme Protaminobacter B22P dans un ap pareil de fermentation cylindrique ayant un volume de travail de 1,5 litre. L'unité de fermentation comporte un système de contrôle automatique de la tempé rature et du pH, et un système d'agitation. La vitesse d'agitation est de 1200 t/mn, le taux d'aération est de 0,8 volume d'air par volume de milieu et par minute, et on règle le pH à 6,8 par addition d'hydroxyde d'ammonium. La température est maintenue constante à 310C. Le milieu a la composition suivante KH2P04 * 2 g/l (NH4)2HP04 .................... 2 g/l FeSO4, 7 H2O ............................ 0,01 g/1 MgS04, 7 HO ............. 0,5 g/l Extrait de levure ....... 0,3 g/l Eau distillée .................... 1 litre la concentration de méthanol initiale est de 2,5 % en volume. Le métha nol est ensuite ajouté en discontinu au milieu de façon à maintenir sa concen tration dans le milieu comprise entre 0,01 %--et 3 %. la croissance est suivie par des mesures de poids sec et de la den sité optique de la culture. Le méthanol résiduel est dosé par-chromatographie en phase gazeuse. On fait démarrer la fermentation en ajoutant 0,3 gg1 dtune culture de bactéries Protaminobacter B22P qui s'est développée sur méthanol. Après une phase d'accélération de 1 heure, la phase de croissance logarithmique a duré 5 heures et représente un accroissement de la biomasse de 6 g par litre. On a arrêté la fermentation après 11 h 30. Les résultats sont indiqués dans le ta tableau 1. TABLEAU 1 Accroissement de la biomasse pendant la phase exponentielle (g/l) = 6 Productivité (g/I/h) pendant la phase exponentielle = 1,05 Temps de génération (h) = 1,33 Taux de croissance spécifique maximum (h-) = 0,515 Biomasse obtenue après 11 heures 30 de culture (g/l) =- 18,5 Les résultats démontrent que cette nouvelle souche présente des performances intéressantes pour la production de biomasse à partir du méthanol. EXEMPLE 2 : Culture en continu On cultive le nouveau microorganisme Protaminobacter B22P dans un appareil de fermentation déjà décrit. La vitesse d'agitation est de 1200 t/mn, la température de 34 C, l'aération de 0,6 litre d'air par litre de milieu et par minute. Le pH est régulé à 6,8 par addition d'ammoniaque. Le milieu minéral a la composition suivante KH2PO4 ................ 2 g CuSO4 ................. 5 g (NH4)2SO4 ............. 2 g H3BO3................... 50 g MgSO4, 7 H2O .......... 0,5 g MnSO4, H2O .............. 50 g FeSO4, 7 H2O ......... 0,01 g ZnSO4, 7 H2O .......... 50 g Extrait de levure 0,1 g (NH4)6Mo7o24, 4 H2O 500 g Eau distillée ..... 1 lite Co(NO3)2, 6H2O .... 50 g 3 2' 5OJ & BR Les résultats sont donnés dans le tableau 2. TABLEAU 2 Taux de dilution (h-)= 0,31 Poids sec de cellules (g/l) = 6,5 Productivité (g/l/h) = 2,0 Rendement (g.cellules séehées/g.CH30H consommé) = 34,5 Le temps de fermentation est de 900 heures, sans qu'aucune contamination par d'autres microorganismes apparaisse. Le taux de croissance de cette nouvelle souche de bactéries est une des caractéristiques qui contribue à sa fiabilité dans la fermentation en continu. EXEMPLE 3 : Culture en continu On cultive le microorganisme Protaminobacter B22P dans les memes conditions que dans l'exemple 2, excepté la concentration en fer qui est multipliée par 3, et on opère toujours de façon non aseptique. Les résultats sont donnés dans le tableau 3. TABLEAU 3 Taux de dilution (h ) = ,3 Poids sec de cellules (g/l) = 9,5 Productivité (g/i/h) = 2,85 Rendement (g. cellules séchées/g. CH3OH consommé ) = 42 Les résultats démontrent l'amélioration obtenue sur la productivité et sur le rendement par l'augmentation de la concentration en fer dans le milieu. EXEMPLE 4 : Culture en continu iOn cultive le microorganisme Protaminobacter B22P dans les mêmes conditions que dans l'exemple 3, excepté la concentration en zinc qui est multipliée par 10, et on opère toujours de façon non aseptique. les résultats sont donnés dans le tableau 4. TABLEAU 4 Taux de dilution (h ) = 0,3 Poids sec de cellules (g/l) = 11,5 Productivité (gXl/h) = 3,45 Rendement (g.cellules séchées/g.CH30H consommé) = 44,2 L'augmentation de la concentration en zinc dans le milieu minéral améliore les performances citées dans exemple 3. EXEMPLE 5 : Culture en continu On cultive le microorganisme Protaminobacter B22P dans les memes conditions que dans l'exemple 2. On opère à différents taux de dilution, et toujours dans les mêmes conditions de non stérilité. On détermine pour chaque taux de dilution, le taux protéinique brut (N x 6,25) des cellules ainsi que le pourcentage des différents acides aminés par rapport à leur somme. Comme on peut le voir à la lecture des résultats donnés dans le tableau 5, le taux protéinique brut n'est jamais inférieur à 80 % et la distribution des différents acides aminés est convenable, en particulier pour la lysine et la méthionine dont les pourcentages respectifs par rapport à la somme des acides aminés sont en moyenne de 7,2 % et 2,6 . TABLEAU 5 Taux de dilution D (hl) 0,15 0,30 0,4 % N intracellulaire (Kjeldahl) 13,9 12,9 13,3 Taux protéinique brut (% en poids (N x 6,25)) 87 80,5 83 Total des acides aminés anhydres (% en poids) 72 68 54 Acides aminés anhydres ( en poids) par rapport au total des aminoacides anhydres Lysine 6,7 7,3 7,5 Histidine 2,1 2,6 2,2 Arginine 5,7 5,4 6,3 Acide aspartique 10,4 11,1 10,7 Thréonine 5,7 5,2 5,1 Sérine 5,0 4,3 4,3 Acide glutamique 12,8 13,1 13,2 Proline 4,3 3,7 4,4 Glycine 6,2 6,2 6,3 Alanine 8,5 9,3 9,0 Cystéine non déterminé non déterminé non déterminé Valine 5,8 8,7 6,9 Méthionine 3,5 2,6 1,9 Isoleucine 4,6 5,0 5,4 Leucine 9,8 8,3 8,7 Tyrosine 4,3 3,1 3,6 Phénylalanine 4,6 4,1 4,5 Tryptophane non déterminé non déterminé REVENDICATIONS 1/ Procédé de culture de microorganismes pour la production maximale de matiè res protéiques, caractérisé par le fait qu'il consiste à cultiver une nou virile souche de bactérie Protamlnobacter B22P en présence de méthanol comme source unique de carbone, en présence d'oxygène et d'un milieu minéral aqueux 2/ Procédé selon la revendication 1, dans lequel la quantité de méthanol pré sente dans la solution nutritive est comprise entre 0,01 et 6 % (v/v) 3/ Procédé selon la revendication 2, dans lequel la quantité de méthanol pré sente dans la solution nutritive est comprise entre 0,01 et 3 % (v/v). 4/ Procédé selon la revendication 1, dans lequel on opère en continu et de façon non aseptique. 5/ Procédé selon la revendication 4, dans lequel l'air d'entrée, le milieu, ainsi que ltappareil de fermentation ne sont pas stérilIsés. 6/ Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'élément fer et l'élément zinc, dans le milieu minéral, interviennent dans les concentrations respec tives : FeSO4, 7 H20 = de 5 à 50 mg/l, ZnSO4, 7 H20 = 0,05 à 1,0 mg/î. 7/ Protéine destinée à l'alimentation humaine et animale, caractérisée en ce qu'elle est un produit de culture provenant d'une culture aérobie d'un nou veau microorganisme dénommé Protaminobacter B22P assimilant le méthanol