Brevet FR2273870A1 — publié le 19760102

La présente invention a pour objet un nouveau microorgaosme, pouvant seprésenter sous forme de diverses souches et plus particulièrement sous forme de la souche dite 1VJPi ayant fait l'objet d'un dépôt à l'institut Pasteur le 18 Avril 1974 sous la dénomination1-004 (échantillon lyophilisé).L'invention concerne en outre un procédé de préparation de ce nouveau microorganisme ainsi qu'un procédé d'obtention de protéines par fermentation d1un substrat approprié, en utilisant le microorganisme précité ; plus particulièrement ce procédé consiste en 11 obtention d'une biomasse riche en protéines, à partir de laquelle onpeut extraire les protéines par application de méthodes en soi connues, cette biomasse pouvant également être utilisée directement comme source de protéines, notamment pour l'alimentation de toutes espèces animales. Le nouveau microorganisme selon la présente invention est caractérisé en ce qu'il est constitué par une bactérie appartenant au genre Methylomonas et en ce qu'il est obtenu par sélection à la suite de fumures successives dans un milieu minéral contenant une source d'azote, en présence d'au moins un hydrocarbure gazeux et d'air, et en ce qu'il est susceptible de produire des protéines par fermentation d'un substrat approprié. Le microorganisme de la présente invention est~nouveau en ce sens qu'il n'existe pas tel quel à l'état naturel et qu'il a été isolé, à partir du milieu naturel, par sélection naturelle et/ ou artificielle, étant donné que son procédé d'obtention implique nécessairement une succession de cultures avec repiquage de la ou des souches obtenues dans un milieu de culture donné sur le milieu de culture suivant, dont la composition peut d'ailleurs-être la même, et en ce qu > il implique éventuellement un traitement aux ultra-sons; en effet la demanderesse a pu mettre en évidence que la mise en oeuvre d'ultra-sons, dans la préparation du nouveau microorganisme de l'inventioW effectuait une séparation entre des cellules susceptibles d'oxyder le méthane, qui seules font partie de la présente invention,parmi d'autres qui n'oxydent pas le méthane et/ ou d'autres éventuellement susceptibles de l'oxyder, ces ultra- --sons ayant vraisemblablement pour effet de détruire l'association entre ces deux types de cellules , en mettant à profit l'action sélective des ultra-sons sur les cellules du point de vue de la résistance de leurs membranes cytoplasmiques et de leur taille. le traitement aux ultra-sons s'effectue de préférence , selon l'invention, dans un milieu minéral liquide fortement dilué . La source initiale de bactéries soumise au traitement de la présente invention est de préférence constituée par un prélèvement de fumier contenant notamment les Methylomonas, qui sont susceptibles d'oxyder le méthane. Selon une autre caractéristique du procédé de préparation du nouveau microorganisme, on effectue plusieurs étapes de culture en milieu liquide minéral contenant une source d'azote, en présence d'hydrocarbure gazeux et d'air une étape de culture en milieu minéral solide et gélosé , contenant de l'azote , cette culture étant effectuée également en présence d'hydrocarbue gazeux et d'air, et une étape de sélection des colonies jaune pâle ainsi obtenues; lorsqu'on effectue le traitement précité aux ultra-sons, celui-ci porte de préférence sur une culture provenant du repiquage desdites colonies jaune pale en milieu minéral liquide, cette culture étant effectuée dans les mêmes conditions que ci-dessus Conformément à une autre caractéristique de ce procédé, on effectue , après le traitement aux ultra-sons,une nouvelle culture sur milieu minéral solide gélosé, dans les mêmes conditions que ci-dessus, c'est-à-dire en présence d'au moins un hydrocarbure et d'air et d'une source d'azote dans ledit milieu minéral, on sépare une colonie pure parmi-les .différentes colonies ainsi obtenues et on la cultive à nouveau sur le milieu minéral précité. les différentes cultures sont habituellement effectuées à une température de l'ordre de 25 à 350 C, de préférence voisine de 30 C. le même milieu minéral peut être employé pour les différentes cultures mises en oeuvre en vue de l'isolement du nouveau microorganisme , ce-milieu minéral contenant , en sus de l'azote, des éléments choisis parmi les suivants : sodium, potassium, phosphore, magnésium et calcium , ainsi que un ou plusieurs oligo-éléments choisis parmi le manganèse, le cobalt , le cuivre, le zinc , le fer et le bore. Selon un mode de réalisation préféré du procédé précité, l'hydrocarbure gazeux utilisé est le méthane et l'on conduit chaque culture en présence d'un mélange gazeux essentiellement constitué de méthane et d'air, de préférence dans un rapport volumique air/méthane compris entre 5,5 et 1, et de préférence voisin de 4. On peut aussi, sans sortir du cadre de l'invention, utiliser, en tant qu'hydrocarbure gazeux, un mélange de méthane et d'éthane contenant éventuellement d'autres hydrocarbures gazeux saturés (propane et butane). Tqute souche obtenue dans les conditions définies plus haut peut constituer le microorganisme nouveau de la présente invention, chaque souche pouvant présenter des caractères de stabilité qui lui sont spécifiques ; d'autre part, certaines de ces souches peuvent ne pas résister à l'absence de méthane, qui constitue alors un besoin nutritionnel impératif, tandis que d'autres peuvent supporter une absence temporaire de méthane, comme c'est le cas pour la souche 1VJPi. On donne ci-dessous les caractéristiques de la souche 1VJPi 1 ) gram : négatif 20) catalase : positive 70) oxydase : positive 40) aspect des cellules - bâtonnets courts et trapus souvent par deux ou en - chaînette lorsque la culture vieillit - cellules mobiles grâce à un flagelle polaire; - pigmentation rose des culots de centrifugation n'apparaissant pas dans les suspensions. 50) aspect des colonies - colonies opaques de coloration blanc crême aux contours nets - colonies apparaissant après 3 à 5 jours sur milieu minéral, grossissant pour atteindre un diamètre maximal de 2 à3 mm après. 2 semaines de culture. 60) temps de génération : 3 à 4 heures dans les conditions de culture correspondant au milieu minéral et au mélange gazeux avec 4 remplissages par jour. 70) influence de l'extrait de levures ajouté à raison de 1 gil au milieu de culture : néant. 80) influence de l'acétate de sodium ajouté à raison de 1 g/l au milieu de culture : néant-. 90) influence du malate de sodium ajouté à raison de 1 g/l au milieu de culture : nuant 100) influence du succinate de sodium ajouté à raison de 1 g/l au milieu de culture : néant. 11-0) influence de la température : le microorganisme 1VJPi se cultive saune température de 25 à 750 C et ne se reproduit pas à 370 C. 120) le microorganisme 1VJPi croît avec du méthanol comme substrat. 130) le microorganisme 1VJPi résiste au moins 2 semaines à l'absence de méthane s'il est conservé sur milieu minéral gélosé dans un réfrigérateur. 140) résistance à la chaleur ; nulle pour un traitement de 15 minutes à 850 -C. 150) conservation au réfrigérateur à 40 C sous atmosphère de gaz (air : 77,5 % ; méthane : 19,5 % ; gaz carbonique : 3 ) : au moins 3 mois pour les cultures âgées. 160) conservation par lyophilisation : au moins 11 mois. 170) stoechiométrie de la réaction d'oxydation du méthane : CH4 + 1,3 2-d 0,5 CC2 + cellules produites. le milieu de culture mis en oeuvre pour la caractérisation selon les paragraphes 40 à 11 , 13-0 à 150 et 170 est par exemple celui dont la composition est donnée plus loin dans la deseription d'un mode de réalisation de l'invention. Le procédé d'obtention de protéines selon l'invention , par fermentation, est caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver le nouveau microorganisme de l'invention dans un milieu minéral contena-nt une source d'azote, en présence d'air et d' au moins un hydrocarbure gazeux, pendant une durée de l'ordre de 48 heures à une dizaine de jours, de préférence de l'ordre de 2 à 4 jours ; ce milieu minéral peut notamment avoir la même composition que le milieu de culture ayant servi à la sélection du microorganisme . les conditions opératoires sont notamment les mêmes que celles relatives au procédé d'obtention du nouveau microorganisme, en ce qui concerne la température et la nature de l'hydrocarbure utilise. De préférence, afin de pouvoir maintenir les conditions optimales de composition de l'atmosphère gazeuse en contact avec le milieu de fermentation , on opère en cnntinu, notamment par circulation continue de l'atmosphère gazeuse en présence d'une quantité donnée du milieu de fermentation ou par circulation continue, à contre-courant, de l'atmo.sphère gazeuse et du milieu de fermentation. L'extrait sec du milieu de fermentation , à la fin du procédé de production, peut contenir environ 10 ffi d'azote, ce qui représente environ 60 %0 de protéines lesquelles contiennent divers acides aminés qui ont pu être dosés ; les poids d'extrait sec obtenus jusqu'ici sont de l'ordre de 0,4 à 2 g/l, ce qui représente donc des rendements de l'ordre de 0,25 à 1,2 gramme de protéines. par litre du milieu de fermentation, mais on peut espérer, en améliorant les conditions opératoires, obtenir des rendements plus élevés. On attire l'attention sur le fait, que dans le procédé de l'invention, la présence de traces d'oligoéléments est en général suffisante ; cependant, pour assurer une bonne prolifération , le cuivre doit être présent en quantité suffisante , généralement de l'ordre d'au moins 0,1 mg/l. Par contre , le magnésium et le calcium doivent être présents en quantités plus élevées , en général de l'ordre d'au moins 20 mg/l et 5 mg/l, respectivement, pour assurer de bonnes conditions de prolifération. D'autres caractéristiques de l'invention apparaitront au cours des exemples de réalisation décrits ci-après, à titre nnn limitatif. EXEMPLE 1. Préparation du nouveau microorganisme On prélève un échantillon de fumier et- on procède à une succession de cultures en milieu liquide minéral, ledit milieu étant contenu dans des fioles recevant un courant continu d'un mélange gazeux, le processus étant conduit à une température d'environ 300 C. La composition dudit milieu liquide minéral est la suivante NaNO3 2 g E2HPO4 1,3 g xH2rO4 1 g MgS04, 7H20 0,2 g CaCl2, 21120 20 mg FeSO4, 71120 3 mg CuSO4, 5H20 0,4 mg H3BO5 0,4 mg ZnSO4, 7H2O 0,2 mg MnSO4,H2O 0,2 mg CoCl2, 6H20 0,2 mg Eau distillée Q.S.P. 1 litre pH : 6,5 ajusté avec HCl La composition du mélange gazeux est la suivante (en volume) air : 77,5 %;méthane : 19,5 % (rapport volumique air/méthane voisin de 4) ; gaz carbonique : 3 fo. On distingue dans les cellules formées au cours de la culture - celles qui se déposent sur les parois (cellules âgées) de la fiole, celles qui se déposent au fond de la fiole et celles qui surnagent ; le prélèvement à l'anse ou à la pipette du surnageant d'une culture donnée est repiqué à la pipette dans le milieu liquide minéral suivant , de même composition. Après plusieurs repiquages successifs , on prélève un échantillon qui s'est déposé sur le vere de la fiole au cours de la dernière culture en milieu liquide. On repique cet échantillon sur un milieu solide minéral , de même composition que le milieu minéral liquide, mais contenant en plus de la gélose ; on effectue la culture sur ce milieu gélosé dans les mêmes conditions que précédemment, c'est-à-dire à 300 C et en présence du même mélange gazeux. On voit ainsi se développer des colonies de formes et de pigmentations différentes. On prélève des colonies jaune pâle et on les repique dans le milieu liquide minéral précité, en effectuant la culture en présence de l' atmosphère gazeuse précitée, à 300 C. Alors que cette culture est encore jeune, on la dilue à 1/1000 et on soumet la suspension de cellules ainsi obtenue à un traitement aux ultra-sons, pendant 15 minutes, ce qui a pour effet de séparer, d'une manière stérile, des cellules oxydant le méthane parmi d'autres ne l'oxydant pas toutes nécessairement, en détruisant l'association entre ces deux types de cellules. Après repiquage de la suspension traitée aux ultra-sons et nouvelle culture en présence du mélange gazeux précité, à 300 C, sur milieu gélosé (identique à celui mentionné précédemment), on obtient différentes colonies à partir desquelles on sépare lesdites colonies que l'on repique et cultive, en présence du mélange gazeux précité, à 300 C ; on sépare ainsi une colonie susceptible de donner des colonies semblables de cellules morphologiquement identiques ne se développant pas sur gélose nutritive ; la souche ainsi isolée qui présente des caractères tables , est celle dénommée 1VJPi qui a été mentionnée précédemment et qui a fait l'objet du dépôt I-004 à l'Institut Pasteur. les caractéristiques de cette souche ont été données plus haut. EXEMPLE 2 Préparation d'une biomasse riche en protéines, en utilisant la souche 1VJPi Dans une fiole de 1l, placée sur une table soumise à une agitation, sous une tente thermostatée à 300C, on effectue une culture, pendant 3 jours, de la souche 1VJPi; on utilise 0,251 du même milieu liquide minéral que celui utilisé dans l'exemple 1 pour l'isolement du microorganisme, le volume résiduel de ladite fiole étant rempli du même mélange gazeux que dans l'exemple 1; l'atmosphère gazeuse est purgée chaque jour et remplacée par une quantité franche du mélange gazeux de l'exemple 1. En fin de culture on obtient une biomasse riche en protéines. Les caracteristiques de cette biomasse ainsi que les conditions opératoires sont données dans le tableau cidessous. Dans l'expérience NO 1, on a utilisé le meme mélange gazeux que dans l'expérience NO 1, tandis que dans l'expérience N02, on a utilisé un mélange d'air et de gaz naturel provenant d'Arzew (Algérie), la composition de ce gaz naturel étant la suivante; en volume : CH4 = 89,7% C2H6 = 77% C3H8 = 1 ,-6% C4H10 = 0,5% N2 = 0,5% le rapport air/gaz d'Arzew étant le même que le rapport air/ méthane de l'expérience NO 1. TABLEAU Expérience N 1 Expérience N 2 Atmosphère gazeuse nature des hydrocarbures CH4 gaz d'Arzew rapport air/hydrocarbures 4 4 % de C02 (en volume) 3 % 3% Quantité d'extrait sec dans milieu de culture en fin d'expérimentation 0,55 g/l 0,46 g/l Composition de l'extrait sec en en poids) Elément fondamentaux C 45,4 % 45,0 % H 6,9 % 6,8 % N 10,2 % 10,4 % Nature et quantité d'acides aminés pour 16 g d'azote (en g) -glycocolle 6,3 6,2 -alanine 7,7 7,9 -valine 6,6 6,6 -leucine 9,0 9,0 -isoleucine 5,4 5,1 -sérine 4,0 4,0 -thréonine 5,9 5,9 -tyrosine 3,3 3,7 -phénylalanine 5,4 5,8 - tryptophane 1,9 1,8 -proline 4,1 3,6 -métHonine au moins 1,5 au moins 2,0 -cystéine ainrans 0,5 sumos 0,4 -lysine 5,5 6,0 TABLEAU (suite) Expérience NO 1 Expérience N02 -histidine 2,3 2,3 -arginine 5,0 5,6 -acide aspartique + asparagine 12,5 11,8 -acide glutamique ; + glutamine 12,8 12,3 Bien entendu, la présente invention n'est nullement limitée aux modes d'exécution décrits qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre des revendications qui suivent. R E V E N D i C A T i O N S 1. Nouveau microorganisme, utilisable notamment pour la production de protéines par fermentation, caractérisé en ce qu'il appartient au genre Methylomonas, en ce qu'il est obtenu par sélection à la suite de cultures successives dans un milieu minéral contenant une source d'azote, en présence d'au moins un hydrocarbure gazeux et d'air, et en ce qu'il est susceptible de produire des protéines par fermentation. 2. Nouveau microorganisme selon la revendication 1, caractérisé en ce que la cuivre initiale est ensemencée par un prélèvement de fumier. 3. Nouveau microorganisme selon la revendication 1 ou 2, caractérisé entre qu'il a fait l'objet d'un dépot, sous forme lyophilisée, à l'institut Pasteur, le 18 Avril 1974, sous la référence I-004. 4. Nouveau microorganisme selon la revendication 3 , carac térisé en ce qu'il présente les caractères suivants 10) gram : négatif 26) catalase : positive 30) oxydase : positive 40) aspect des cellules - bâtonnets courts et trapus souvent par deux ou en chainette lorsque la culture vieillit - cellules mobiles grâce à uneflagelle polaire - pigmentation rose des culots de centrifugation n'appa ravissant pas dansés suspensions 50) aspect des colonies - colonies opaques de coloration blanc crême aux contours nets - colonies apparaissant après 3 à 5 jours sur milieu minéral gélosé, grossissant pour atteindre un diamètre maximal de 2 à 7 mm après 2 semaines de culture. 60) temps de génération : 3 à 4 heures dans des conditions de culture correspondant au milieu minéral et au mélange gazeux hydrocarbure -air avec 4 remplissages par jour. 70) influence de ltextrait de levures ajouté à raison de 1 -g/l au milieu de culture : néant. 80) influence de l'acétate de sodium ajouté à raison de 1 g/l au milieu de culture : néant. 90) influence du malate de sodium ajouté à raison de 1 g/l au milieu de culture : néant. 100) influence du succincte de sodium ajouté à raison de 1 g/l au milieu de culture : néant. 110) influence de la température : le microorganisme se cultive à une température de 25 à 350C et ne se reproduit pas à 370C 120) le microorganisme croit avec du méthanol comme substrat. 130) le microorganisme résiste au moins 5 semaines à l'absence de méthane s'il est conservé sur milieu minéral gélosé dans un réfrigérateur. 140) résistance à la chaleur : nulle pour un traitement de 15 minutes à 850C. 150) cnnservation au réfrigérateur à 40C sous atmosphère de gaz (air : 77,5%; méthane : 19,5%; gaz carbonique 3%) : au moins 3 mois pour les cultures âgées. 160-) conservation par lyophilisation : au moins. 11 mois. 5. Nouveau microorganisme selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est préparé par un procédé comportant un traitement de sélection au moyen d'ultra-sons. 6. Procédé de préparation du nouveau microorganisme selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer plusieurs cultures successives de bactéries du genre Methvlomonss, dans un milieu minéral, liquide ou solide (gélose) contenant une source d'azote, en présence d'au moins un hydrocarbure gazeux et d'air. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la première culture est ensemencée par un prélèvement de fumier.. 8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que l'une des cultures précitées est soumise à un traitement aux ultra-sons, de préférence en milieu--minéral liquide fortement dilué, pendant une durée de, par exemple, environ 15 minutes. 9. Procédé selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend plusieurs étapes de culture dans lemilieu liquide minéral précité, une étape de culture dans le milieu minéral solide gélosé précité et une étape de sélection des colonies jaune pâle ainsi obtenues. 10. Procédé selon l'ensemble des revendications 8 et 9, caractérisé en ce que le traitement précité aux ultra-sons porte sur une culture provenant du repiquage des colonies jaune pâle précitées dans le milieu minéral liquide précité. 11. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que, après traitement aux ultra-sons, on effectue une nouvelle culture sur milieu minéral solide gélosé, on sépare une colonie pure parmi les différentes colonies -ainsi- obtenues et on la cultive à nouveau sur le milieu minéral précité. 12. Procédé selon l'une des revendications 6 à 11, caractérisé en ce que lesdites cultures sont effectuées à une température de l'ordre de 25 à 350C, de préférence environ 3O0C. 13. Procédé selon l'une des revendications 6 à 12, caractérisé en ce que le milieu minéral précité contient les éléments suivants : N, Na, K, P, MgCa, ainsi que un ou plusieurs oligo-éléments choisis parmi Mn, Co, Cu, Zn, Fe et B 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le milieu minéral précité a la composition suivante NaNO3 2 g t2HP04 1,3 g EH2PO4 1 g MgS04,7H20 0,2 g CaCl2,2112O 20 mg FeSO4,7112O 3 mg CuSO4,5H2O 0,4 mg H3BO3 0,4 mg ZnSO4,7H2O 0,2 mg Mr1S04,H20 0,2 mg CoO-i2,6H20 0,2 mg Eau distillée Q.S.P. 1 litre pH : ajusté à 6,5 15.Procédé selon l'une des revendications 6 à 14, caractérisé en ce que l'hydrocarbure gazeux précité est choisi parmi les hydrocarbures saturés, notamment le méthane et le mélange méthane-éthane et, de préférence, le méthane. 16. Procédé selon la revendication 15,- caractiérisé en ce qu'on utilise un mélange d'air et de méthane, présentant un rapport volumique air/méthane compris entre 5,5 et 1, de préférence voisin de 4. 17. Procédé d'obtention de protéines, comportant application du nouveau microorganisme selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver ledit microorganisme en milieu minéral contenant une source d'azote et en présence d'air et d'au moins un hydrocarbure gazeux, pendant une durée de l'ordre de 48 heures à une dizaine de jours, de préférence de l'ordre de 2 à 4 jours, le produit obtenu se présentant sous la forme d'une biomasse riche en protéines. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'on opère à une température de l'ordre de 25 à 350C, de préférence voisine à 3O0C. 19. Procédé selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce que l'hydrocarbure précité est le méthane. 20. Procédé selon l'une des revendications 17 à 19, caractérisé en ce que l'hydrocarbure gazeux précité est un mélange de méthane et d'éthane, contenant éventuellement d'autres hydrocarbures gazeux saturés (propane et butane). 21. Procédé selon l'une des revendications 17 à 20, caractérisé en ce que le milieu de culture précité contient les éléments suivants : N, Na, K, P, Mg ainsi que un ou plusieurs oligoéléments choisis parmi Mn, Co, Cu, Zn, Fe et B. 22. Procédé selon l'une des revendications 17 à 21, caractérisé en ce que le milieu de culture précité à la composition suivante NaNO3 2 g K2HPO4 1,3g KH2PO4 îg MgSO4,7H2O 0,2 g CaCl2,2H2O 20 mg FeSO4,7H2O 3 mg CuSO ,5H O 0,4 mg 42 H3BO3 0,4 mg ZnSO4 ,7H O 0,2 mg 4 2 MnSO4, H2O 0,2 mg CoCl2,6H2O 0,2 mg Eau distillée Q.S.P. 1 litre pH : ajusté à 6,5 -23. Biomasses riches en protéines, obtenues par le procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 22.