Brevet FR2254309A1 — publié le 19750711

La présente invention concerne un nouvel enzyme-à action hydrolytique, une préparation enzymatique, et un procédé de préparation et d'utilisation de ceux-ci. Cet enzyme à action hydrolytique faisant l'objet de l'invention est une protéase neutre, à poids moléculaire d'environ 37000, ayant son point isoélectrique à pH = 8,8 sa température optimale d'action est de 40 à 45 C, sa zone de stabilité dans les solutions aqueuses se situe dans les limites de pH = 6,0 à pH = 8,0, et est sujet à une inactivation rapide dans ces solutions à une température de plus de- 50 C. L'enzyme de l'invention se présente sous forme d'une poudre blanche, inodore, légèrement soluble dans l'eau, dans les solutions isotoniques de chlorure de sodium~et les solutions hypertoniques de chlorure de sodium, dans les solutions à 0,25 %-2% de novoeaine ; il est insoluble dans les alcools inférieurs, dans l'acétone ; il possède le spectre ultraviolet spécifique des protéines. Les ions calcium stabilisent l'activité enzymatique de l'enzyme de l'invention. Les ions magnésium exercent une action similaire, mais moins marquée. L'acide éthylènediaminetétra-acétique et d'autres composés, liant les ions calcium, conduisent à une perte d'activité enzymatique. L'enzyme de l'invention est apte à la salification en présence des polyélectrolytes solubles et réticulés portant des groupements carboxyle, ainsi qu'à la sorption avec eertains polymères et sorbants. La structure dudit enzyme n'est pas établie. L'activité caséinolytique spécifique-de l'enzyme de l'invention est de 2 à 3 fois supérieure à celle des enzymes connus d'origine animale, tels que la trypsine et 1' -chymotrypsine. L'enzyme de l'invention est susceptible d'hydrolyser les protéines natives telles que l'élastine, le collage ne, la gélatine, la fibrine, l'albumine, l'hémoglobine ; elle manifeste aussi une aptitude à la thrombolyse et à la prévention de la formation de thrombus, ainsi qu'une activité favorisant la lac to-coagulation. Cet enzyme peut être employé dans diverses branches où l'hydrolyse des substrats protidiques est nécessaire, notamment en agriculture pour l'hydrolyse des constituants protidiques des fourrages pour une meilleure assimilation de ceux-ci ; dans l'industrie alimentaire : panification, industrie de la brasserie, industrie de la viande (pour le ramollissement de la viande), industrie poissonière ; dans l'industrie mierobiologique, pour l'hydrolyse des constituants protidiques (notamment des levures) au cours de l'obtention de milieux nutritifs ; dans l'industrie des matériels cinématographiques ( pour l'extraction complémentaire, à partir des déchets, de l'argent lié à la-gélatine ; dans l'industrie du cuir (pour le délainage et l'adoucissage de la matière première brute de cuir).L'enzyme de l'invention présente une activité protéolytique et peut être utilisée pour la liquéfaction des exsudats purulents, denses et visqueux au cours du traitement des maladies des voies respiratoires, -des plaies purulentes et des bi7ures , pour le traitement et la prophylaxie des pleurésies purulentes (empyèmes). On peut également utiliser l'enzyme de l'invention, en combinaison avec des anticoagulants, en tant que médicament thrombolytique et préventif de la thrombose. L'emploi de cet enzyme est avantageux grâce à sa préparation peu coûteuse, étant donné qu'on I1 obtient simultanément avec l'antibiotique hygromycine B. Ia préparation enzymatique, sous forme de produit brut, faisant l'objet de l'invention, contient ledit enzyme à action hydrolytique à raison de 50 à 500 UP/g (unités protéolytiques d'après Kunitz), et des produits de métabolisme des souches Streptomyces hygroscopicus produisant ledit enzyme. Ladite préparation enzymatique se présente sous forme d'une poudre de couleur brune; te procédé d'obtention de l'enzyme à action hygwolytique, selon l'invention, consiste en ce qu'on cultive les souches Streptomyces hygroscopicus, produisant cet enzyme, sur un milieu nutritif comprenant des sources dé carbone et d'azote assimilables, des sels inorganiques, dans des conditions d'aérobie submergée, en accumulant l'enzyme de l'invention dans la liqueur culturale de pair avec les produits de métabolisme des souches indiquées, après quoi on isole l'enzyme. Au cours de la fermentation il peut également se former deux protéases ou plus, constituant l'enzyme actif de l'invention. En tant que milieu de fermentation on peut utiliser un milieu contenant (* en poids) : farine de soja - 1-1,5 extrait de mais - 0,2-0,3 ; graisse de cachalot - 1-2,5 glucose --0,8-1,5 ; sulfate d'ammonium - 0,2-0,8 ; chlorure de sodium Jusqutà 0,5 ; carbonate de calcium - 0,3-O,B ; levures seches alimentaires (complexe protido-vitaminique) - 0,8-1,6. Il est avantageux d'effectuer ltisolement du produit visé par séparation, å partir de la liqueur culturale, de la masse cellulaire des souches productrices de l'enzyme de l'invention, avec précipitation subséquente de l'enzyme dans la solution obtenue par le sulfate d'ammonium pris à raison de 50 à 60 ffi du volume de la solution, reprécipitation du précipité obtenu dans l'acétone, dissolution du précipité nouvellement obtenu dans une solution de chlorure de calcium, dépigmentation (clarification) de la solution à l'aide de charbon activé, stérilisation et séchage lyophile de la solution indiquée, et obtention de la préparation médicinale faisant l'objet de l'invention. Pour obtenir un enzyme pur à action hydrolytique on dissout la poudre lyophilisée dans une solution 0,001 M de chlorure de calcium, on fait passer la solution obtenue à travers des colonnes à sorbants de gel et on la sèche d'une manière lyophile. On peut également isoler le produit visé par concentration de la liqueur culturale et par séchage subséquent de la préparation enzymatique obtenue. On peut également effectuer l'isolement du produit visé par séparation, à partir de la liqueur culturale, de la masse cellulaire des souches productrices de l'enzyme, suivie d'une concentration du produit. obtenu et d'un séchage. En tant que souche productrice de cet enzyme on peut employer la souche n 1913 consignée dans la collection de cultures productrices d'antibiotiques de Vsesojouzny nauclino- issledovatelsky institut antibioticov (Moscou) sous-le n 997, Streptomyces hygroscopicus (Jensen 1931), qui, de pair avec l'enzyme, produit aussi l'antibiotique hygromycine B s'accumulant dans la liqueur culturale ; on isole alors l'antibiotique hygromicine B avant d'isoler le produit visé à partir de la liqueur culturale, en utilisant des résines échangeuses de cations. On peut aussi, avant isoler lthygromycine B de la liqueur culturale, séparer la masse cellulaire de la souche n 1913 Streptomyces hygroscopicus. La souche n 1913 Streptomyces hygroscopicus (Jensen 19t3), sur un milieu synthétique de Czapek contenant K2HP04 - 1 g NaN03 -3g Kol - 0,5 g MgS04 - 0,5 g FeSO4 0,015 g amidon - 20 g agar-agar - -25 g eau - i 1 (stérilisation 30 minutes sous 0,8 atmosphère ; pH après stérilisation 7,0 à 7,1), forme des sporophores bien reserrées et ayant 1 à 3 spires dans leur spirale. Les spores sont en forme de segments avec des formations verruqueuses.Le mycélium aérien est développé aussi bien sur les milieux synthétiques que sur les milieux organiques. Le mycélium n'est pas fragmentaire, les sclérotes sont absents. La teinte du mycélium aérien sporulent sur un milieu-minéral de Czapek avec glucose va du gris-blanc au gris. Sur un milieu synthétique de Krassilnikov- constitué de C1HPO, -3g 'LgC03 - 0,3 g NaCl - 0,2 g KN03 t,O g FeSO4 0,001 g CaCO3 0,5 g saccharose 20 g agar-agar 15 g eau 1 l (stérilisation 20 minute8 à 110 C; pH après stérilisation - 7,0), la souche se développe bien, en formant des colonies bombées d'un diamètre de 4 à 6 mm ; le mycélium aérien est faiblement sporulent, de couleur gris-blanc. Le mycélium de substrat est de couleur brun-jaunâtre. Sur le milieu de Czapek avec amidon, les colonies sont blanches, plates, asporogènes, d'un diamètre de 4 à 6 mm le mycélium de substrat est de couleur jaune pâle de sable. Sur un milieu contenant de l' amidon et de l'ammoniac, constitué de amidon (soluble) 10 g K2HPO4 (anhydre) I g MgSO4.7H2O I g NaCl Ig (NH4)2S 4 2g CaCO3 2g eau Il agar-agar 20 g (stérilisation 30 minutes sous 0,5 atmosphère ; pH après stérilisation 7,0 à 7,2), les colonies sont grandes, plates, avec mycélium aérien développé au bord de la colonie, et leur couleur va du gris-blanc au gris foncé. Le mycélium de substrat n'est pas coloré. Sur le milieu organique n 2 de Hause Bouillon de Hottinger 21 mg % d'azote aminé peptone 0,5 % NaCl 0,5 % glucose 1% agar-agar 2,2 % (stérilisation 30 minutes sous 0,5 atmosphère ; pH après stérilisation 7,2), les colonies sont petites, bombées, avec mycélium aérien blanc, farineux ; le mycélium de substrat est jaune-brun. Sur un milieu n0 21/12 avec amidon et extrait de mais : extrait de mais 5 g (NH4) 2HP04 4g EHeP04 2 g MgSO4 0,25 g CaCO3 i g amidon 20 g agar-agar 20 g eau il (stérilisation 30 minutes sous 0,8 atmosphères ; pH après stérilisation 7,0-7,2), la croissance est abondante, la couleur du mycélium aérien va du blanc au gris foncé. Sur des tranches de pores de terre la croissance est abondante, sans sporulation, le mycélium aérien est blanc. Sur le milieu de Pridham - Gottlieb (Pridham T.C., Gottlieb D.J., Bac., 1948, v. 56, 107-114) constitué de glucose, rhamnose, i-fructose, 6(-mannitol -xylose, raffinose, la souche N0 1913 croit bien, mais sur le milieu de même composition avec l-arabinose, elle croit mal. Sur un milieu contenant du saccharose et l-inositol il n'y a pas de croissance. Sur le milieu de Van-Yterson contenant NH4N 3 0,05 g KH2P04 0'05 g eau 100 ml (papier filtre ; stérilsation 30 minutes sous 0,5 atmosphère) en présence de cellulose, la croissance est médiocre, la souche liquéfie totalement la gélatine, réduit les nitrates, peptonise le lait, n'inverse pas le saccharose, ne forme pas de l'hydrogène sulfuré, hydrolyse d'une manière intense l'amidon. Elle ne croit pas à 50 C et en l'absence d'oxygène. L'activité antibiotique moyenne selon l'hygromyoine B de la souche NO 1913 dans les conditions de laboratoire sur le milieu décrit est de 2600 + 200 unités/ml, l'activité protéolytique est de 37 + 8 UP/ml. Comme il a été indiqué plus haut, l'enzyme à action hydrolytique, doué d'une activité protéolytique, constitue la substance active d'un médicament pour le traitement des affections des organes respiratoires, des plaies purulentes et des brûlures, le traitement et la prophylaxie des empyèmes, ledit médicament contenant l'enzyme à raison de 1 à 50 UP/ng et, comme excipient, une protéine inactive et des sels inorganiques. On peut utiliser le médicament sous forme d'une poudre pour saupoudrage local. Pour l'administration par inhalation, endotrachéale, endobranchiale, endopleurale, ainsi qu'en cas d'emploi local sous forme d'applications, on utilise un médicament contenant la substance active en question, associée à un solvant pharmaceutique, tel que 11 eau stérilisée, les solutions isotonique et hypertonique de Naél ou une solution aqueuse à 0,25-tg de novocaine. La concentration de ces solvants en enzyme faisant l'objet de l'invention est de 5 à 50 UP/ml. Pour le saupoudrage, en cas d'application locale, on utilise le médicament contenant l'enzyme de l'invention associé à un excipient constitué par l'amidon en proportion de 500 UP par gramme d'excipient. Dans les essais "in vivat ont été établies les doges toxiques et tolérables du médicament contenant l'enzyme de l'invention. la dose léthale 50 pour la souris blanche par voie endoveineuse est de 260 à 300 Up/kg. On a établi expérimentalement qu'une concentration de 50 à 100 UP/ml est inoffensive pour l'inhalation (chez le rat) et l'administration sous forme d'application (chez le lapin). L'action locale du médicament contenant l'enzyme de-l'invention sur les escarres de plaiés par brûlures, a été étudiée-chez le rat et le lapin, en l'administrant sous forme de saupoudrage avec application subséquente d'un pansement imbibé d'une solution de NaCl, sous forme d'un pansement imbibé d'une solution de médicament et d'une solution à 0,25% de novocaRne, ou bien en l'introduisant sous l'escarre à l'aide de piqûres. Les doses du médicament dans les deux premiers cas étaient de 50 à 100 UP/ml, pour les piqEres elles étaient de 5 à 70 UP/ml. On a noté dans tous les cas un ramoILssement superficiel des couches d'escarre et leur rejet. L'aptitude de l'enzyme de l'invention à dissoudre les tissus nécrosiques a été étudiée "in vitro" sur un tissu pulmonaire dévitalisé, nécrosé, excisé lors d'opérations effectuées sur des patient-s. On a demontré que l'enzyme de l'invention hydrolysait activement les tissus dévitalisés, etqu'il n'exerçait pas une telle action sur les tissus sains. Dans les études "in vitre'l on a également démontré l'aptitude du médicament contenant l'enzyme de l'invention à liquéfier les crachats visqueux prélevés chez les patients. L'étude clinique du médicament contenant l'enzyme de l'invention a été faite sur 267 malades. Dans le cas des affections des organes respiratoires, le médicament a été employé sous forme d'aérosol pour inhalations, en utilisant une solution d'enzyme de l'invention renfermant 25 UP/ml d'eau ou d'une solution isotonique de NaCl, en dose unique de 75 à 125 UP. Les inhalations ont été effectuées 1-2 fois par jour, pendant 5 à 7 jours. Pour l'introduction endotrachéale on a employé une solution de médicament contenant de 8 à 10 UP/ml de solution isotonique de NaCl d'un volume non supérieur -à 5 ml, qu'on a introduite dans la trachée à l'aide d'un cathéter. Dans un but de prophylaxie des - empyèmes après la pneumectomie, on a introduit dans la cavité pleurale, à la fin de l'opération, une solution de médicament contenant 250 UP dans 50 ml d'un solvant stérile, après- quoi la cavité a été suturée sans drainage. les jours suivants on a fait 5 à 7 ponctions envue d'éliminer ltexsudat, en introduisant 250 UP du médicament contenant l'enzyme de l'invention dans 50 ml de solution stérile en association avec un antibiotique approprié. Pour l'administration locale on a utilisé une solution de médicament contenant.l'enzyme de l'invention (25-50 UP/ml) dans l'eau, une solution isotonique de NaCl, une solution hypertonique de NaCl, ou dans une solution -aqueuse -de novocaïne. Une serviette imbibée de cette solution a été appliquée sur la plaie, au-dessus de la serviette on a appliqué un pansement hydrofuge. Le changement des pansements avec élimination des secteurs détachés de nécrose a été effectué tous les deux jours. Dans le cas du traitement de plaies, d'ulcères trophiques et de décubitus -à nombreux tissus nécrosiques, ainsi que des brtlures du IIIème degré, jusqu'à exfoliation de l'escarre, on a employé le-médicament contenant l'enzyme de l'invention sous forme de saupoudrage ou en association avec l'amidon jusqu'à 500 UP par gramme d'excipient, en saupoudrant la surface affectée. Au-dessus on a appliqué une serviette stérile, légèrement imprégnée par une solution isotonique de NaCl ou par une solution aqueuse à 0,25% de novocaïne, puis un pansement hydrofuge. Le changement du pansement a été effectué une fois par jour. Les essais cliniques ont montré que le médicament contenant l'enzyme de l'invention liquéfie efficacement les crachats épais, visqueux et les masses nécrosiques, et favorise l'évacuation des mucosités et des masses purulentes, nécrosiques. Il en résulte le rétablissement de la fonction de l'épithélium à cils vibratiles et des glandes muqueuses des voies respiratoires, et la ventilation pulmonaire s'améliore. L'activité prononcée, thrombolytique et préventive de la thrombose, du médicament a permis de l'employer efficacement pour la prophylaxie des empyèmes. Dans les cas d'administration locale, le médicament renfermant l'enzyme de l'invention a été efficace lors du traitement des plaies purulentes et par brsslures, en lès débarrassant des masses purulentes, nécrosiques et des formations fibrineuses, en clivant et exfoliant l'escarre, tout cela accélérant la formation de granulations nouvelles et améliorant les conditions pour la cicatrisation des plaies. De cette maniere, le médicament contenant l'enzyme de l'invention peut être indiqué pour le traitement des trachéites, bronchites, bronchotrachéites, pneumonies, bronchectasies, abcès pulmonaires et autres affections des voies respiratoires, s'accompagnant d'aceumulations d'exsudat visqueux, ainsi que pour le traitement et la prophylaxie des empyèmes, et également par voie locale dans le cas de plaies puruXentes, de décubitus, d'ulcères trophiques, de brûlures du 111ème degré, et en stomatologie. Lors de l'administration du médicament il peut se produire une sensation d'irritation du larynx et un reflexe de toux, une réaction locale douloureuse et allergique. tes contre-indications du médicament contenant l'enzyme de l'invention sont les suivantes : intolérance individuelle du médicament, insuffisance cardiaque aux stades IIa, IIb, et III avec décompensation, formes graves caverneuses de tuberculose pulmonaire, compliquées par l'amyloEdose, la cachexie, les crachements de sang, une prédisposition à lthémorragie, plaies et ulcères saignantes et, é-galement, ulcération de tumeurs malignes. Le médicament doit être employé avec précaution chez des malades souffrant d'insuffisance respiratoire au IIIème stade et d'asthme bronchique, ainsi que chéz les malades présentant des plaies par-lesquelles passe un vaisseau magistral. Le médicament sous la forme d'une poudre dans des flacons stériles peut être conservé à l'abri de la lumière à une température de 4 C pendant une année. La préparation enzymatique, en tant que produit brut, peut être utilisée dans l'industrie du cuir pour le délainage et la mise en confit des matières premières de cuir, dans l'agriculture pour l'hydrolyse des constituants protidiques des fourrages afin d'améliorer l'assimilation de ces derniers, et dans d'autres buts où l'hydrolyse de substrats protidiques est nécessaire. Le délainage et le déchaulage des matières premières de cuir à l'aide de la préparation enzymatique de l'invention permettent d'améliorer d'une façon importante les indices technico-économiques et hygiénico-sanitaires du procédé (amélioration de la qualité et accroissement du rendement en poil, élimination du procédé de pelanage alcalin). L'action spécifique de ladite préparation enzymatique consiste non seulement en ce quwelle dissout les structures cellulaires et les mucopoly saccharides retenant le tégument de poil, mais provoque aussi une hydratation importante qui permet de conduire les stades suivants du procédé sur une installation existante (machines de délainage et arrachage de poils sans reconstruction spéciale), parce que la matière première gonflée, traitée par une solution de préparation enzymatique conforme à l'invention a une0 élasticité suffisante. L'hydratation de la matière première ameublit le tissu grâce à l'humidité admise dans le derme au cours du traitement. il en résulte des conditions permettant d'exclure le procédé de pelanage étant donné que simultanément avec l'hydratation se produit une hydrolyse enzymatique des protéines interfibrillaires, dont l'absence est généralement liée à la nécessité de réaliser le procédé de pelanage. Le procédé de traitement de toutes les espèces de matière première de cuir à l'aide de la préparation enzymatique au cours de ses essais dans les conditions industrielles a permis d'obtenir un cuir et une laine de bonne qualité sur les appareillages existants. La consommation de préparation enzymatique conforme à l'invention, avec une activité de 80 UP/g dans le cas d'utilisation des' méthodes de bains (cuves) et d'enduits à constitué de 1 à 7 ffi du poids de la matière première, avec une durée de 6-24 heures. Les procédés d'obtention de l'enzyme à action hydrolytique, de la préparation enzymatique et du médicament est mis en oeuvre, de préférence, de la manière suivante. On introduit dans un fermenteur un milieu nutritif stérile- contenant (* en poids) 1,5,' de farine de soja, 0,2% d'extrait de mars, 1,5-2% de graisse de cachalot, 0,8-1,2 de levures fourragères (complexe protido-vitaminique), 0,2 ffi de sulfate d'ammonium, 0,5% de chlorure de sodium, 0,3% de carbonate de calcium, 1,0-1,5 de glucose.On ensemence la culture de la souche n0 1913 de Streptomyces hygroscopicus, obtenue par culture sur un milieu de composition suivante en en poids) : 1 % de farine de soja, 0,2% d'extrait de mars, 1% de graisse de cachalot, 1% de levures fourragères sèches, 0,2% de sulfate d'ammonium, 0,5% de chlorure de sodium, 0,3g de carbonate de calcium et 1% de glucose, à une température de 280C pendant 54 heures. On effectue la fermentation sous une pression de 0,3 atmosphère et;l'aération avec t volume d'air par volume du milieu par minute, à une température de 280C pendant 168-192 heures. La fermentation terminée, on transfère la liqueur culturale dans un récepteur, on traite par une solution d'oxalate de sodium pour précipiter les ions calcium à un pH voisin d'un pH neutre, et on sépare la masse cellulaire et un précipité de sels de calcium de la solution native. On admet la solution native dans une batterie de colonnes fichangeuses d'ions, contenant un cationite carboxylique, pour éliminer l'antibiotique hygromycine B. Le filtrat, contenant 10-50 unités/ml d'antibiotique hygromycine B issu des colonnes échangeuses d'ions, est admis sous brassage dans un appareil où l'on fait précipiter l'enzyme de l'invention par le sulfate d'ammonium, pris à raison de 50 à 60%o du volume de la solution. Après 6-10 heures de salaison à froid, on sépare par centrifugeage le précipité de salaison et on le dissout dans une solution O,OO1M de CaC12; On ajoute à froid à la solution obtenue un volume égal d'acétone refroidie, on maintient pendant 30 minutes et l'on sépare par par.centrifugeage. On dissout le précipité obtenu dans une solution à 30 % d'acétone, on sépare par centrifugeage la partie insoluble et on la rejette. Au liquide surnageant on ajoute à froid 10 volumes d'acétone refroidie. On sépare le précipité formé, on le lave 2 fois à l'acétone refroidie et on le sèche seus vide. On dissout le précipité sec dans une solution à 0,001M de CaCl2, on ajoute du charbon activé, on agite pendant 1,5 heures et on sépare par filtration. Ensuite on sépare par filtration-la solution sur un filtre stérilisant, on verse dans des flacons et on sèche d'une manière lyophile. On peut effectuer la clarification de la solution également à l'aide d'une résine échangeuse d'ions, par exemple une anionite à coefficient de gonflement de plus de 3,0. Pour obtenir à l'ëtat pur l'enzyme à action hydrolytique, on dissout.la poudre lyophilisée obtenue dans une solution O,OOtM de CaCl2 et l'on sépare par chromatographie sur des colonnes contenant un filtre moléculaire connu sous la dénomination commerciale 'tSéphadex" ou un autre sorbant à effet de tamis analogue. Ce processus, avec l'alternance indiquée des stades, est répété trois fois. La solution débarrassée des substances concomitantes et des sels est séchée d'une manière lyophile avec obtention de l'enzyme. On obtient la préparation enzymatique par concentration de la solution en réduisant son volume par évaporation sous vide à une température ne dépassant pas 400C du filtrat de solution native issue des colonnes échangeuses d'ions, adsorbant l'antibiotique hygromycine B, avec séchage subséquent du concentré dans un séchoir par dispersion, la température de l'air admis étant de 110 à 130 C. On peut également obtenir la préparation enzymatique à partir de la liqueur culturale (sans séparation de la masse cellulaire) par autolyse préalable sous chauffage à une température de 400C pendant 30 minutes, par sorption de l'antibiotique hygromycine B sur un lit fluidisé de cationite et en réduisant son volume par évaporation sous vide et son séchage. On peut réaliser l'isolement et la purification de l'enzyme. par sorption de cet enzyme partir du filtrat de solution native à l'aide d'une échangeuse d'ions, le cationite carboxylique par exemple, avec désorption subséquente avec une solution tampon et séchage de ladite solution. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparattront à la lecture de la description, qui va suivre, de plusieurs exemples de réalisation non limitatifs. EXEMPIE 1 Dans 10 ballons de 750 ml on introduit 50 ml de milieu nutritif, contenant f,5% en poids de farine de soja, 0,2% en poids d'extrait de mars, 0,2% en poids de graisse de cachalot 1% en poids de levures fourragères sèches (complexe protidovitaminique), 0,2% en poids de sulfate d'ammonium, 0,5% en poids de chlorure de sodium, 0,3% en poids de carbonate de calcium et 1% en poids de glucose. On ensemence le milieu avec une culture-inoculum d'ensemencement à 48 heures de Streptomyces hygroscopicus nO 1913, variante nO 149, en quantité de 10 % en volume.Cette variante est obtenue à partir d'une culture de Streptomyces hygroscopicus (souche nO 1913) sous l'action -de rayons-X en dose de 200 000 roentgen. La variante nO 149 croît bien sur le milieu n0 21/12, en donnant des colonies bombées, parfois plicates, d'un diamètre de 6-8mm ; le mycélium aérien, développé modérément est de couleur blanc-grisâtre, faiblement sporulent. Le mycélium de substrat est de couleur brun-åaunâtre. Cette espèce de la souche nO 1913 ne donne pas l'antibiotique hygromycine B au cours de la fermentation) et ne produit que l'enzyme à action hydrolytique jusqu'à 22,0 UP/ml. La durée de la fermentation à la température de 280C est de 148 heures. On obtient 500 ml de liqueur culturale à activité protéolytique de 20 UP/ml. On sépare par filtration la liqueur culturale obtenue sur une ampoule à décantation de Buchner et on obtient 420 ml de solution native que l'on lyophilise. On obtient 16,4 g de préparation enzymatique à activité de 500 UP/g. EXEMPLE 2. On introduit dans un fermenteur (d'une capacité de 300 1) 200 1 de milieu nutritif de composition décrite dans l'exemple 1, l'on ensemence avec une culture d'ensemencement obtenue par culture sur un milieu nutritif de composition suivante : 1% de farine de soja, 0,2% d'extrait de mars, 1% de graisse de cachalot, 1% de levures fourragères sèches (complexe protido-vitaminique), 0,2 de sulfate d'ammonium, 0,5% de chlorure de sodium, 0,3% de carbonate de calcium et 1% de glucose, à la température de 280C pendant 54 heures.On effectue ensuite la fermentation sous une pression de 0,3 atmosphère et aération avec 1 volume d'air par volume de milieu par minute à la température de 280G pendant 180 heures. On obtient 200 1 de liqueur culturale contenant 2420 unités/ml d'antibiotique hygromycine B et 36 UP/ml d'enzyme conforme à l'invention. Pour précipiter les ions calcium on ajoute à la liqueur culturale obtenue 1 kg d'oxalate de sodium à un pH égal à 7,0, on agite pendant 30 minutes, puis on sépare la masse cellulaire et l'oxalate de calcium sur un filtre-presse. A partir de la solution native obtenue on sorbe l'antibiotique hygromycine -B sur un lit fixe de cationite carboxylique. On ajoute à 200 1 du filtrat issu des colonnes échangeusffl d'ions 25 g de.CaCl2, on mélange et l'on réduit le volume jusqu'à 50 litres dans un évaporateur à vide à la température de 300C, On ajoute sous brassage 1,5 kg de NaCl à 50 litres de concentrat obtenu, et l'on sèche dans un séchoir à dispersion, la température de l'air admis étant de 11000. On obtient 5 kg de préparation enzymatique conforme à l'invention, dont l'activité est dé 240 UP/g. EXEMPLE 3. On chauffe à la température de 400C pendant 30 minutes 200 litres de liqueur culturale obtenue dans des conditions identiques à celles décrites dans l'exemple 2, contenant 2600 unités/ml d'antibiotique hygromycine B et 38 UP/ml d'enzyme, puis on refroidit jusqu'à 100C, on ajoute 5 kg d'oxalate de sodium à pH = 7,0, et on agite pendant 30 minutes. On sorbe ensuite l'antibiotique hygromycine B sur un lit fluidisé de cationite carboxylique et on obtient la préparation enzymatique de l'invention conformément à l'exemple 2. Le rendement. en préparation enzymatique à activité de 200 UP/g est de 5,4 kg. EXEMPLE 4. On ajoute sous agitation à 20 litres de filtrat de solution native, obtenu conformément à l'exemple 2 et issu de colonnes échangeuses d'ions avec un pH 6,8 et d'une activité protéolytique de 33 UP/ml, 10 kg de sulfate d'ammonium. On abandonne le précipité de salaison jusqu'au lendemain dans un réfrigérant à la température de +4 C. On sépare par centrifugeage le liquide de salaison décanté et on dissout le dépôt dans 1,0 litre d'une solution 0,001M de chlorure de calcium. On ajoute à froid à la solution 1 litre d'acétone refroidie jusqu'à 0 et l'on abandonne pendant 0,5 heure dans le réfrigérant. On sépare par centrifugeage le dépôt, on dissout dans 300 ml d'acétone à 30% refroidie et on isole une partie insoluble. On verse 3 litres d'acétone refroidie dans le liquide surnageant au-dessus du dép8t, on sépare le précipité par centrifugation, on lave avec l'acétone, on sèche sous vide. On obtient 30 g de substance brute d'une activité de 7,4 UP/ml et d'une activité spécifique de 19,5 UP/g de protéine. On dissout la substance brute dans 3,8 litres d'une solution 0,001M de CaCl2, on ajoute 50 g de charbon activé, lavé jusqu'au pH de 8,5. On agite pendant t,5 heures, on sépare par filtration à travers un entonnoir avec un coussinet en diatomite, et on fait passer à travers un filtre stérilisant. On verse la solution stérile dans des flacons à 150 ml et on sèche d'une manière lyophile. On-obtient t8 g de médicament stérile d'une activité de 8,8 UP/mg et dune activité spécifique de 23,8 UP/mg de protéine. EXEMPLE 5. On dissout 18 g de médicament lyophilisé, obtenu conformément à l'exemple 4, dans 80 ml de solution 0,001M 'de CaCl? et on le fait passer avec une vitesse de 140 ml/h à travers 2 colonnes remplies de-"Séphadex ? - 75" ;-chaque colonne a un diamètre a = 6,0 cm, et la hauteur h de la couche de "Séphadex" est de 50 cm. On obtient 1,8 g de médicament d'une activité de 38 UP/mg et une activité spécifique de 42 UP/mg de protéine. On dissout 1,8 g du médicament obtenu dans 10 ml d'une solution 0,001 M de CaCl2 et on introduit la solution dans une colonne remplie de "Séphadex DEAE A - 50" en tris ampon et ayant un diamètre d = 3,5 cm, la hauteur h de la couche de "Séphadex" est de 50 cm. On- effectue l'solution à l'aide de tris-tampon au pH - 7,0. On effectue la séparation à la température de +40C. On isole la fraction active et on sèche d'une manière lyophile. On obtient 800 mg de médicament à activité de 25 UP/mg et à activité spécifique de 65 UP/mg de protéine on dissout 800 mg du médicament obtenu dans 8 ml d'une solution 0,001 M de CaCl2 et on effectue le dessalage de la solution, en la faisant -passer à travers une colonne remplie de "Séphadex 5 - 15", de diamètre d = 2,5 cm, la hauteur h de la couche de "Séphadex" étant de 42 cm. On recueille la fraction active et on sèche d'une manière lyophile. On obtient t20 mg d'enzyme à action hydrolytique d'une activité de 56 UP/mg et une activité spécifique de 60 UP/mg de protéine. EXEMPLE 6. On traite des peaux de bovines, après lavage et trempage dans de l'eau sans addition d'agents d'affQtage, par une solution aqueuse de préparation conforme à l'invention contenant au moins 900 UP par litre, pendant 24 heures et à une température de 20 à 250C. On effectue le délainage sur une machine à délainer. EXEMPLE 7. Les peaux de bovins, après lavage et trempage, sont essorées ; on applique sur le grain chagrin une solution aqueuse de préparation conforme à l'invention à raison de 55 - 70 UP par dom2. La matière première brute est stockée, en petites piles, grain chagrin sur grain chagrin, et abandonnée pour 24 heures. On élimine ensuite le poil sur une machine à délainer. EXEMPLE 8 Les cuirs de veau, de bouc, de mouton, après lavage et trempage dans l'eau, sont contractés de la fleur ; on applique ensuite sur la cote contractée une solution aqueuse de préparation enzymatique à raison de 55 - 70 UP/dm2. La-matière première brute est ensuite emplilée, côte chair du cuir sur côte chair du cuir, et abandonnée pendant 16 à 24 h, ou bien elle est suspendue dans une chambre pour cette même durée. On effectue ensuite le délainage. EXEMPLE 9. Les cuirs de veau, après les procédés et opérations habituels de trempage et de pelanage, sont lavés avec l'eau courante dans un appareillage mobile pendant 40-60 minutes en élevant graduellement la température jusqu'à 3'40C vers la fin du lavage. Le coefficient de liquide est de 1 - 1,5 å 2,5 3,5. On effectue le déchaulage et la mise en confit dans un meAflie appareillage. 10-20 minutes après avoir ajouté du sulfate d'ammonium on admet dans le bain de déchaulage la préparation enzymatique conforme à l'invention. On effectue le déehaulage et la mise én confit dans un appareil à rotation continue à une température de 32 à 340C. Caractéristiques du procédé 1) Déchaulage : durée - 15-20 minutes, consommation de sulfate d'ammonium par rapport au poids de la peau en tripe - 1,5-à 2% en poids. 2) Mise en durée - 10-15 minutes, consommation de confit : préparation enzymatique conforme à l'invention par rapport au poids de la peau en tripe à une activité de 80 UP - Q,05 à 0,1% en poids. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits et représentés -qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituants des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées suivant son esprit' eut mises en oeuvre dans le cadre des revendications qui suivent. REVENDICATIONS 1. Enzyme à action hydrolytique, caractérisé en ce qu'il est une protéase neutre de poids moléculaire égal à environ 37 000, ayant son point isoélectrique à pH=8,8, dont la température optimale d'action est de 40 à 450C, dont la zone de stabilité dans des solutions aqueuses se situe dans les limites de pH = 6,8 et pH = 8,0, et qui subit une inactivation rapide dans lesdites solutions à une température de plus de 500G. 2. Préparation enzymatique, caractérisée en ce qu'elle contient l'enzyme à action hydrolytique selon la revendication t, à raison de 50 à 500 UP/g, et des produits de métabolisme des souches Streptomyces hygroscopicus produisant ledit enzyme. 3. Procédé d'obtention de l'enzyme à action hydrolytique selon'la revendication 1, caractérisé en ce qu'on cultive les souches Streptomyces hygroscopicus, productrices dudit enzyme, sur des milieux nutritifs contenant des sources assimilables de carbone et d'azote, des sels inorganiques, dans des conditions d'aérobie submergée, en accumulant dans la liqueur culturale ledit enzyme à action hydrolytique de pair avec les produits de métabolisme des souches indiquées, après quoi on isole l'enzyme. 4, Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on effectue la culture des souches productrices dudit enzyme à action hydrolytique sur un milieu de fermentation constitué de 1 à 1,5% en poids de farine de soja, de 0,2 à 0,3% en poids d'extrait de mais, de 1 à 2,5% en poids de graisse de cachalot, de 0,8 à 1,5% en poids de glucose, de 0,2 à 0,8 en poids de sulfate d'ammonium, jusqu'à 0,5% en poids de chlorure de sodium, de 0,3 à o,8y en poids de carbonate de calcium, de 0,8 à 1,6% en poids de levures fourragères sèches (complexe protidovitaminique). 5. Procédé selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisé en ce qu'on isole le produit visé en séparant de la liqueur culturale la masse cellulaire de- souches productrices dudit enzyme à action hydrolytique, avec précipitation subséquente, dans la solution native obtenue, de l'enzyme par du sulfate d'ammonium introduit à raison de 50 à 60% du volume de la solution, reprécipitation du résidu obtenu dans l'acétone, dissolution du nouveau précipité obtenu dans une solution de Cas1,, clarification dé la solution à l'aide de charbon active', stérilisation de la solution et séchage lyophile de ladite solution avec obtention d'un médicament'. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on dissout la poudre lyophilisée dans une solution 0,001M de CaCl2, on fait passer la solution obtenue à travers des colonnes à sorbants de gel, et on sèche d'une manière lyophile avec obtention dudit enzyme à action hydrolytique. 7. Procédé selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisé en ce qu'on isole le produit visé par concentration de la liqueur culturale et séchage subséquent de la préparation enzymatique obtenue. 8. Procédé selon l'une des revendication 3 et 4, caractérisé en ce qu'on effectue l'isolement du produit visé en séparant de la liqueur culturale la masse cellulaire des souches-productriees dudit enzyme à action hydrolytique, en concentrant ensuite la solution native obtenue, et en séchant la préparation enzymatique obtenue. 9. Procédé selon l'une des revendications 3 à 8, caractérisé en ce qu'en qualité de souche productrice dudit enzyme on utilise la souche nO 1913 Streptomyces hygroscopicus qui, de pair avec ledit enzyme à action hygrolytique, produit aussi l'antibiotique hygromycine B, qui s'accumule dans la liqueur culturale, et en ce qu'avant. de séparer le produit visé on isole l'antibiotique hygromycine B de la liqueur culturale en utilisant des résines échangeuses de cations. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'avant l'isolement de l'antibiotique hygromycine B dans la liqueur culturale, on sépare de cette dernière la masse cellulaire dé la souche nO 1913 Streptomyces hygroscopicus. 11. Médicament pour le traitement des affections. des voies respiratoires, des plaies purulentes et par brsslures, pour le traitement et la prophylaxie des empyèmes, caractérisé en ce qu'il contient, en tant que principe actif, l'enzyme à action hydrolytique selon la revendication 1, à raison de 1 à 50 UP/mg, une protéine inactive et des sels inorganiques. t2. Médicament selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il contient ledit principe actif en association avec un solvant pharmaceutique constitué par de l'eau stérile, une solution isotonique de NaCl, une solution hypertonique de NaCl ou une solution aqueuse à 0,25* - 2% de novocaïne. 13- Médicament selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il contient ledit principe actif en concentration de 5 à 50 UP/ml. 14. Médicament selon la revendication 11, caractérisé en ce qutil contient ledit-principe actif en association avec un excipient pour saupoudrage, constitué par l'amidon. 15. Médicament selon la revendication 14, caractérisé en ce que ledit principe actif et l'amidon sont introduits dans un rapport allant jusqu'à soe UP par gramme d'excipient.