Brevet FR2257601A1 — publié le 19750808

Le présent concerne un groupe de techni ques nouvelles permettant d'obtenir par élution à partir de complexes anti gènes-anticorps, d'une part les antigènes et d'autre part les anticorps correspondants. Ces techniques s'appliquant notamment à L'éluvion des anticorps dits bloquants à partir de broyats de tumeurs ou de placentas humains. À l'heure actuelle ce sont les seules qui réalisent l'élution des anticorps de la classe des immunoglobulines D dans des conditions telles quelles permettent leur utilisation en thérapeutique humaine. Les techniques actuelles d'élution des anticorps dits facili tants ou bloquants à partir de broyats de tumeurs ou de placentas humains sont essentiellement des techniques d'élution à pH acide. Ces techniques permettent d'extraire des anticorps facilitants appartenant aux classes immunoglobuliniques Ig G et Ig A. Elles ne permettent pas l'élution des immunoglobulines D qu'elles détruisent on qu'elles abiment: les ismunoglo- burines n sont en effet réputées pour leur fragilité et ces techniques sont trop agressives pour que l'on puisse grâce à elles obtenir des immuno globulines D intactes, condition sine qua non de leur efficacité thérapeuti que. Les techniques selon le présent certificat d'addition évitent les inconvénients de des techniques d'élution à PR acide Grace à elles en effet il est possible d'extraire les immunoglobulines D intaotes à partir de broyats tumoraux et placentaires humains. Les techniques, objet du présent certificat d'addition, sont des techniques d'élution particulières et originales du fait quelles uti lisent les propriétés éluantes inconnues jusqu'alors des solutions salines aqueuses présentant les radicaux chromate, bichromate, chlorate et per chlorate, et que le pH utilisé pour l'élution est indifférent: l'elution pouvant se faire à des pH acides, neutres ou basiques. Nous donnerons à titre indicatif deux exemples d'élution des anticorps à partir de broyats tumoraux et placentaires humains: le premier concerne l'élution d'anticorps facilitants à partir de broyats tumoraux humains par le bichromate de sodium, le deuxième concerne l'élution d'an anticorps facilitants à partir de broyats placentaires humains par te per chlorate de sodium. EXEMPLE I Ce premier exemple expose une technique d'élution des anticorps facilitants présents dans les tumeurs à partir d'un broyat tumoral en pré- sence de bichromate de sodium. Le tissu tumoral est broyé mécaniquement pendant 3 minutes dans un volume égal de sérum physiologique, puis soumis à une ultracentrifuga-. tion de 3000 G pendant 10 minutes; le surnageant est ensuite recueilli et le culot de centrifugation est resuspendu dans un volume égal de sérum physiologique; la suspension est recentrifugée à 3000 G pendant 10 minutes, le surnageant recueilli, le culot resuspendu dans un volume égal de sérum physiologique puis recentrifugé à 3000 G, 10 minutes, et le surnageant recueilli. Après ces trois lavages le culot de la derniere centrifugation est resuspendu dans une solution aqueuse de bichromate de sodium 0,05 M sous le rapport de 1 volume de culot pour 4 volumes de bichromate de sodium 0,05 M1. L'élution se fait à une température optima de 320C pendant 45 minutes avec agitation constante. La suspension est ensuite centrifugée à 2000 G pendant 10 minutes. Le surnageant est recueilli et dialysé contre du sérum physiologique pendant 24 heures à 270C sous le rapport de 1 volume de surnageant pour 15 volumes de sérum physiologique. La concentration en différents types d'immunoglobulines est donnée par immunodiffusion radiale en gélose selon la méthode de Mancinio À titre indicatif, la technique ci-dessus décrite permet d'obtenir à partir de 100 grammes de tissu tumoral humain environ 50 à 100 mg d'Ig G, 80 à 120 mg d'lg À, 10 à 30 mg d'Ig X et 60 à 1-30 mg d'Ig D. EXEMPLE II Ge deuxième exemple expose la technique d'élution des anticorps facilitants présents dans le tissu placentaire humain à partir d'un broyat de placenta en présence de perchlorate de sodium. Le tissu placentaire est broyé mécaniquement pendant 3 minutes dans un volume égal. de sérum physiologique, puis soumis à une ultracentri- fugation de 3000 G pendant 10 minutes; le surnageant est ensuite recueilli et le culot de centrifugation est resuspendu dans un volume égal de sérum physiologique; la suspension est recentrifugée à 3000 G 10 minutes, le surnageant recueilli, le culot resuspendu dans un volume égal de sérum physiogique puis recentrifugé à 3000 G 10 minutes et le surnageant recueilli. Après ces trois lavages le culot de la dernière centrifugation est resuspendu dans une solution aqueuse de perchlorate de sodium 0O4 M sous le rapport de l volume de culot pour 4 volumes de perchlorate de sodium 0,04 M. L'élution se fait à unë température optima de 280C pendant 45 minutes aveo agitation constante. La suspension est ensuite centrifugée à 2000 G pendant 10 minutes. Le surnageant est recueilli et dialysé contre du sérum physiologique pendant 24 heures à 27 C sous le rapport de 1 volume de surnageant pour 15 volumes de sérum physiologique. La concentration en différents types d'immunoglobulines est donnée par immunodiffusion radiale en gélèse selon la méthode de Eancini. a titre indicatif, la technique ci-dessus décrite permet d'obtenir à partir de 100 grammes de tissu placentaire humain environ 30 à 60 mg d'Ig G, 100 à 160 mg d'Ig A, 10 à 20 mg d'Ig M et 70 à 160 mg d'Ig n. Ces deux exemples sont donnés à titre indicatif et aucun- de leurs paramètres ne peut être considéré comme restrictif. In effet, de nombreuses solutions salines, de molarités variées comprises entre 0,01 M et 0,08 M, peuvent être employées. Leur originalité est de posséder en commun un des radicaux suivants: chromate, bichromate, chlorate et perchlorate. Cette caractéristique distingue très nettement ces techniques des autres techniques d'élution actuellement connues: les oro- priétés éluantes des radicaux cités sont jusqu'alors inconnues.Il est à noter que ces techniques ne peuvent être confondues avec les techniques dites d'élution à pH acide où l'acidité de la solution éluante est la propriété nécessaire à son activité éluante et impose l'utilisation d'un tampon; en effet les techniques faisant l'objet du présent certificat d' addition peuvent être pratiquées à des pH aussi bien acides que basiques ou neutres, dans un intervalle compris entre pE 4,- et pH S;2 et elles-ne nécessitent pas l'usage d'un tamron. En conséquence, les techniques ici décrites sont caractérisées par le fait qu'elles utilisent des solutions salines d'une molarité conprise entre 0,01 E et 0,08 ti, présentant l'un des radicaux suivants: chlorate, perchlorate, chromate et bichromate, afin d'éluer les anticorps facilitants à partir de broyats tumoraux et placentaires humains. En outre, ces techniques possèdent la propriété d'éluer les anticorps facilitants appartenant à la classe des immunoglobulines D sans les léser, ce oui également les différencie des techniques d'elution actu- tellement connues qui n'ont pas cette faculté. Les techniques, objets du présent certificat d'addi- tion, peuvent être utilisées dans tous les cas où l'on veut séparer un anticorps de leantigène correspondant ou'il sature afin d'obtenir soit l'antigène isolé soit l'anticorps spécifique correspondant. Par conséquent, ces techniques possèdent de nombreuses applications pratiques dans le domains médical et pharmaceutique. Les présentes techniques permettent de libérer les sites antigéniques saturés par les anticorps bloquants, présents à la surface des cellules tumorales, de telle sorte que ces antigènes néoplasiques, ainsi disponibles, peuvent être utilisés à des fins d'immunothérapie spécifique active chez l'homme ou de vaccinations, chez l'animal, de façon à obtenir des antisérums spécifiques. Ces techniques permettent d'extraire, in vitro, les anticorps bloquants responsables de la tolérance de l'organisme humain vis-à-vis des néoplasies malignes, à partir de tumeurs prélevées chirugicalement, et par suite de préparer des antisérums animaux actifs contre ces anticorps blo cuants. Ces techniques permettent d'extraire à partir du placenta humain les anticorps facilitants responsables de la tolérance de la greffe-placen- taire; la spécificité de ces anticorps étant dirigée contre les antigènes de transplantation du placenta, cette spécificité peut être facilement determinée et par conséquent permettre l'utilisation de la spécificité de ces anticorps à des fins de facilitation immunologique passive lors des greffes chez l'homme; cette facilitation rassive peut être réalisée en perfusant le greffon avant la transplantation par une solution contenant les anticorps bloquants purifiés dirigés contre ses antigènes de transplantation et en les administrant par voie générale au receveur. Ces techniques permettent d'extraire à partir de broyats pla centaires humains les immunoglobulines de te D afin de les utiliser en thérapeutique humaine comme cela a été décrit dans le brevet principal ou de les employer à la fabrication d'antisérum animal spécifique. REVENDICATIONS 1. Techniques permettant d'éluer des anticorps à partir de complexes antigènes-anticorps caractérisées par le fait qu'elles utilisent les propriétés éluantes de solutions contenant au moins l'un des sels suivants: chromate, bichromate, chlorate et perchlorate, dans des limites de molarité comprises entre 0,01 M et 0,1 M. 2. Techniques-selon la revendication 1 permettant de libérer in vitro des antigènes presents sur les cellules tumorales des anticorps facilitants qui les saturent. 3. Techniques selon la revendication 1 permettant obtenir des anticorps facilitants à partir de tumeurs et de placentas. 4. Techniques selon la revendication 1 permettant d'obtenir des anticorps facilitants de spécificités connues et dirigées contre des antigènes d 'histocompatibilité , à partir de placentas. 5. Techniques selon la revendication 1 permettant l'obtention d'im- munoglobulines D complètes et fragmentées à partir de tumeurs et de placentas humains.