Brevet FR2282113A1 — publié le 19760312

L'invention a pour objet un nouveau réactif pour la détermination Quantitative des hydrates de carbone ,tels que des aldohexo ses. La détermination quantitative du glucose dans un milieu biologique est fondamentale pour le diagnostic du diabète et en clinique médicale en général. Par suite, cette détermina- tion constitue l'une des analyses cliniques les plus fréqiuemment prescrites par les médecins à leurs malades. Cette détermination offre également un grand intérêt pour la recherche et l'industrie. Durant les décennies comprises entre 1920 et 1960, les méthodes de détermlnation quantitative les plus utilisées ont été les méthodes réductimétriques. lesdites méthodes sont fondées sur l'action réductrice exercée par le glucose, dans certaines circonstances, sur les sels cuivriques, l'acide picrique, les ferricyanures et analogues. Doutes les méthodes précitées ne sont pas spécifiques et elles nécessitent la dénrotéinisation préalable du sérum, du plasma et des autres substances biologiques sur lesquelles on désire effectuer la détermination quantitative. Dans une méthode analytique, un progrès est constitué chaque fois que l'on obtient une sensibilité et une spécificité plus grandes, en particulier si elles sont obtenues par une simplification du protocole opératoire. En ce Qui concerne la détermination quantitative du glucose et d'autres aldohexoses, on a obtenu une grande amélioration avec l'introduction par llultman en 199, du réactif à base d'amines aromatiques dans des milieux acides chauds. E.M. Dubowski (1962),. Hyvarinen et E.A. Nikkila (1962), et d'autres chercheurs insistent sur cette nouvelle technologie en l'améliorant par l'incorporation de thiourée à leurs réactifs. La composition desdits réactifs est la suivante Ortho-toluidine (amine aromatique) 6 ml Acide acétique glacial (donneur de protons) 9 4 ml Thlourée (stabilisant) O,15 g En conséquence, pendant la première décennie de leur application, lesdits réactifs présentaient les caractéristiques suivantes 1) Une bonne spécificité vis-à-vis des aldohexoses en général et, en narticulier vis-à-vis du glucose dans les milieux biologiques. 2.)Un pouvoir hautement aggressif, dd à leur causticité et à leurs vapeurs irritantes, vis-à-vis de la peau, des membranes muqueuses et des voies respiratoires de ltopérateur, de m8me que vis-à-vis des tuyaux en matières plastiques usuellement utilisés dans certains appareils d'analyse automatiques, tels que les appareils mis dans le commerce sous le nom de l'2echnicon". (On doit prendre en considération le fait que lesdits réactifs contiennent plus de 90 d'acide acétique). 3) Une sensibilité raisonnable pour les travaux de routine en analyse clinique, mais une inadaptation dans tous les cas dans lesquels on ne dispose que d'une quantité limitée dtéchantillons et/ou dans lesquels on n'est en présence que d'une faible concentration en glucose (échantillons en pédiatrie, liquide céphalo-rachidien, détermination quantitative du glucose dans l'urine pour le contrôle des infections des voies urinaires, par exemple). Un autre chercheur, Shibata, a utilisé l'ortho-aminobiphényle comme amine aromatique au lieu de l'ortho-toluidine, et a essayé l'anion borate comme activateur de la réaction colorée. En vue de diminuer le pouvoir agressif précité desdits réactifs, plusieurs chercheurs proposent d'autres réactifs à concentration plus faible en acide acétique glacial. Il en est ainsi pour Moorehead et Sasse en 1970 et pour Jenest et Bowles en 1971, qu ont publié des travaux dans lesquels ils décrivent des réactifs à base d'ortho-toluidine, à 5055o/o d'acide acétique (ils remplacent une partie de l'acide acétique par de l'eau distillée). L'incorporation d'eau afin de remplacer l'acide acétique entraSne deux résultats indésirables a) une forte chute de la sensibilité et, b) un aspect trouble ou la formation d'un précipité lorsque les échantillons soumis à la détermination contiennent des protéines (comme dans le cas des échantillons de substances biologiques telles que le sérum ou le plasma sanguin). 'les chercheurs ont essayé de compenser cette diminution de sensibilité au moyen des techniques suivantes.: 1) Ils incorporent avec l'anion borate à leurs formules, à une concentration de dix parties pour mille, des substances qui rendent plus brillante la coloration produite par la réaction. 2) Ils augmentent fortement la concentration de 1 'aiin aromatique en utilisant 15 à 16* d' ortho-toluidine, ce qui élève le coût du réactif. 3) Ils modifient le pH du réactif par incorporation d'acide citrique. De cette manière, lesdits chercheurs ne résolvent seulement que partiellement le problème posé, puisqu'ils obtiennent en effet un réactif relativement sensible et moins agressif, mais toutefois beaucoup plus codteux, MElheureusement, ils introduisent simultanément une très sérieuse difficulté. En effet, leurs réactifs ne sont pas capables de dissoudre les faibles quantités de protéines contenues dans de nombreux échantillons de substances biologiques d'usage courant. En conséquence,on ne peut pas utiliser les réactifs précités sans déprotéiniser au préalable lesdits échantillons, ce qui complique fortement l'opération manuelle. C'est dire que l'utilisation desdits réactifs implique le recours à des réactifs additionnels (déprotéiniseurs), -et une plus grande consommation d'échantillon, de temps et de travail. Par suite, il est devenu nécessaire de disposer, comte c'est précisément le but de l'invention, d'un nouveau réactif d'application plus souple, doté des avantages améliorés suivants a) le réactif de l'invention a une bonne sensibilité. b) il est moins agressif pour la peau et le tractus respiratoire de l'opérateur, par suite de sa faible causticité et de la diminution de l'odeur irritante. c) il ne nécessite pas de déprotéinisation préalable des échantillons soumis 4t'analyse, tels que le sérum et le plasma sanguin. le réactif de 1 'invention, qui présente lesdits avantages sur les réactifs déjà connus, constitue un nouveau produit industriel dont le champ d'application et la souplesse d'emploi le rendent extrtmement utile pour la détermination quantitative d'hydrates de carbone divers, en particulier du glucose. Les buts de l'invention sont atteints par le fait que la composition générale du réactif de l'invention comprend les produits suivants a) AMINE : une amine choisie dans le groupe des amines aromatiques, telles que ltnmnnobenzène, les ortho-, méta-, et para-toluidines, 1 'ortho-aiino-bîphényle et analogue s. b) DONNEURS DE PROTONS s une ou plusieurs substances de nature acide, du groupe des acides mono- et polycarboxyliques, tels que les acides acétique, propionique et analogues. c) SOLVANT DE l'AMINE AROMATIQUE : parmi d'autres, les situations suivantes peuvent survenir 1) le solvant est exclusivement constitué par la substance ou les substances de nature acide qui confèrent le pH convenable au réactif. C'est le cas des réactifs de Dubowski (1962), Nikkila et Hyvarinen (1962), précités, et d'autres réactifs, dans lesquels l'acide acétique~est le seul solvant. 2) le solvant n'est que partiellement constitué par un ou plusieurs acides, le restant tant complété par de l'eau et/ou un ou plusieurs solvants organiques. 3) le solvant n'est que partiellement constitué par un ou plusieurs acides, le restant étant complété par de l'eau et/ou un ou plusieurs solvants organiques, dont l'un est le solvant proposé selon l'invention, 11 alcool butylique normal. d) AGENTS DE CONSERVATION ET/OU STABILISANTS: leur incorporation n'est pas indispensable, mais très souhaitable pour éviter l'interférence due aux matières étrangères que les produits utilisés peuvent contenir et pour prolonger la durée de vie utile du réactif. On peut utiliser à cet effet la thiourée; des agents complexants et chélatants du tgpe de l'acide Othyline- diamine-tétraacétique et ses sels, et analogues. e) ACTIVATEURS DE LA REACTION COLOREE : pour former une base de Schiff entre les aldohexoses du type glucose et un réactif, les conditions minimales suivantes doivent être satisfaites : 10) Le réactif doit comprendre au moins uné amine aromatique et doit avoir un pli convenable (cette caractéristique est essentiellement obtenue par l'incorporation d'une ou plusieurs substances de nature acide convenables ), et 20) le mélange de glucose et de réactif doit recevoir un apport d'énergie (par exemple par chauffage dans un bain-marie à 100oC). Une fois les conditions minimales et indispensables remplies, on doit considérer que certaines substances tendent à inhiber la production ae la coloration, tandis que d'autres tendent à l'activer. En général, parmi ces dernières substances, on peut différencier les deux types suivants A) Des activateurs non spécifiques : parmi ceux-ci figurent toutes les substances qui tendent à conférer au réactif le pH idéal. De ce point de vue, ce groupe comprend les donneurs de protons mentionnés ci-dessus. Dans le cadre de l'invention, on propose 1'alcool butylique normal comme activateur non spécifique, qui améliore la formation d'une coloration lorsqu'il est incorcoré au réactif, en remplaçant totalement ou partiellement l'eau préconisée par certains chercheurs. B) des activateurs spécifiques : ceux-ci rendent la coloration plus intense et/ou permettent de l'obtenir plus rapidement. On décrit à cet effet la thiourée (dans certaines conditions) et l'acide borique. On propose selon l'invention l'anhydride arsénieux et ses dérivés. Parmi d'autre cas, les suivants peuvent se produire 1) le réactif peut comprendre ou non des activateurs spécifiques, mais il contient l'alcool butylique normal comme activateur non spécifique. 2) le réactif comprend un ou plusieurs activateurs spécifiques, dont l'un est l'anhydride arsénieux ou ses dérivés. Le réactif contient ou non l'alcool butylique normal comme activateur non spécifique. Be mode opératoire avec le réactif de l'invention est le suivant, dans le cas d'un échantillon de sérum ou de plasma sanguin On produit la réaction fondamentale entre le glucose et lamine aromatique, dans un intervalle de pli convenable obtenu par des substances de nature acide, par chauffage pendant plusieurs minutes, dans un bain-marie à 1000C. Il se forme alors de la glucosamine et la base de chiff correspondante. L'intensité de la coloration obtenue, dans les conditions opératoires, est directement proRortionnelle à la concentration en glucose dans l'échantillon. L'incorporation d'anhydride arsénieux ou de ses dérivés, au réactif, augmente la vitesse de réaction et permet a1 obtenir une coloration beaucoup plus intense que celle obtenue dans un réactif totalement similaire, mais toutefois exempt de l'activa- teur spécifique proposé selon l'invention. L'explication probable de ladite action de sensibilisation est fondée sur le fait que l'anhydride arsénieux se combine avec les deux hydro-Xyles alcooliques du glucose en formant des esters et en clivant ainsi la structur-e cyclique du sucre. La réactivité de la fonction adéhyde du glucose, dans sa forne acyclique, est très potentialisée. 'l'incorporation d'alcopl butylique normal au réactif permet dlobteniz plusieul-sSrésultats importants contribue à diminuer la causticité du réactif. 20) Il agit comme un activateur non spécifique de la réaction, car il contribue à maintenir le pli convenable du réactif. De cette manière, son incorporation au réactif est compatible avec le maintien d'une bonne sensibilité. Par ailleurs, si ledit activateur non spécifique est remplacé par un volume égal d'eau, la sensibilité du réactif diminue ostensiblement. 30) incorporé à une concentration et en mélange convenable, dans de nombreux cas il confère au réactif la propriété très imortante de maintenir dissoutes les faibles quantités de protéines contenues dans les échantillons de substances biologiques, telles que le sérum et le plasma sanguin. De cette manière, on peut éviter l'obligation d'effectuer une déprotéinisation préalable des échantillons soumis à la dé termination quantitative, avec en conséquence, une économie de temps, de travail, de réactifs additionnels et de volume d'échantillons à utiliser. On doit prendre en considération le fait que l'opération manuelle nécessaire pour effectuer la déprotéini sation de l'échantillon, est aussi complexe sinon davantage que l1opération nécessaire pour effectuer la détermination quantitative elle-même. Par suite, le réactif de l'invention doit remplir l'une des trois conditions suivantes 10) Il contient l'activateur spécifique proposé : l'anhydride arsénieux ou les dérivés de l'anion arsénite. 20) Il convient l'alcool butylique normal, proposé comme solvant supplémentaire et comme activateur non spécifique selon l'invention. 30) Il contient l'activateur spécifique proposé dans le cadre de l'invention: anhydride arsénieux ou l'un quelconque des dérivés de l1anion arsénite, ainsi que la substance proposée également selon l'invention comme activateur non spécifique et comme solvant supplémentaire, à savoir l'alcool butylique normal. Pour la composition finale du réactif de l'invention, on doit utiliser des produits de la meilleure qualité. Dans certains cas, comme pour l'ortho-toluidine, il est souhaitable d'utiliser des produits purs pour synthèse. les exemples suivants illustrent quelques-unes des formules du réactif de l'invention, sans nullement limiter le cadre de celle-ci. lesdites formules répondent aux caractéristiques précitées du nouveau réactif ainsi proposé. Exemple 1 Acide acétique glacial 94 ml Ehiourée 0,15 g Ortho-toluidine 6 ml Acétate de sodium, 3H2O 0,10 g Anhydride arsénieux 0,01 g Exemple 2 Acide acétique glacial 25 ml Eau distillée 25 ml Alcool butylique normal 40 ml Ethylènediamine-tétraacétate disodique 0,01 g Ortho-toluidine 10 ml Acétate de sodium, 3E20 I g Anhydride arsénieux 0,1 g Exemple 3 Acide acétique glacial 60 ml Eau distillée 10 ml Alcool butylique normal 26 ml rt;;ourée 0,10 ml Ethylènediamine-tétraacétate disodique 0,01 g Ortho-toluidine 5 ml Acétate de sodium, 3H2O 0,25g Anhydride arsénieux 0,025 g Exemple * Acide acétique glacial 15 ml Acide propionique 15 ml Eau distillée 17 ml Alcool butylique normal 42 ml Alcool propylique normal 3 ml Ortho-toluidine 8 ml Acétate de sodium, 3E20 0,50 g Anhydride arsénieux 0,05 g Exemple 5 Acide acétique glacial 25 ml Eau distillée 25 ml Alcool butylique normal 40 ml Ethylènediamine-tétraacétate disodique 0,01 g Ortho-toluidine 10 ml Exemple 6 Acide acétique glacial 60 ml Eau distillée 10 ml Alcool bulique normal 26 ml Thiourée 0,10 g Etylènediamine-tétraacétate disodique 0,01 g Ortho-tolui dine 5 ml Exemple 7 Acide acétique glacial 15 ml Acide propionique 15 ml Eau distillée 17 mi Alcool butylique normal 42 ml Alcool pIopylique normal 3 ml Ortho-toluidine 8 ml La formule de l'exemple 1 illustre l'efficacité du sensibilisateur spécifique selon l'invention.Contenu dans ladite formule à la concentration de une partie pour dix mille, il confère au réactif résultant une sensibilité supérieure, d'environ 200 à 300% de celle d'un réactif exempt dudit sensi bilisateur spécifique, par ailleurs similaire, Un mode de mise en oeuvre du réactif dont la formule correspond à i 'exenple 1, avec le sérum, le plasma et analogues, est le suivant : Sérum 0,05 ml Réactif 5 mol On mélange le sérum et le réactif dans les proportions précitées.On chauffe le mélange obtenu pendant trois à qlwatre minutes dans un bain-marie à 1000C. On laisse refroidir et on effectue la lecture par l'intermédiaire d'un filtre rouge (6200 à 6300 t) les formules correspondant aux exemples 2, 3 et 4, à concentrations en acide beaucoup plus faibles montrent égale- ment la nette action activante sur la réaction du sensibilisateur spécifique de l'invention. En effet, lesdits réactifs ont une sensibilité beaucoup plus élevée que celle des réactifs préparés de manière identique, toutefois exempts du sensibilisateur spécifique de l'invention. La sensibilité accrue obtenue par introduction dudit sensibilisateur spécifique peut varier entre 7o et 250',c', suivant le réactif considéré. La mise en oeuvre desdits réactifs est similaire a celle décrite au sujet de la formule de l'exemple 1, en dehors d'une modification du temps de chauffage précnnisé (entre cinq et huit minutes) Par ailleurs, les réactifs qui correspondent aux formules des exemples 5, 6 et 7 illustrent l'action du solvant et activateur non spécifique proposé selon l'invention. En effet, si dans lesdites formules l'alcool butylique normal est remplacé par un volume égal d'eau, les réactifs résultants ne peuvent pas être utilisés directement avec le plasma ou le sérums qui tendent à devenir troubles et empêchent la lecture de la coloration obtenue. Ce n'est pas le cas avec les réactifs de l'invention qui répondent aux formules desdits exemples 5, 6 et 7, car ils sont tous capables de maintenir en solution les faibles quantités de protéines présentes dans les échantillons de sérum et de plasma. En outre, les colorations obtenues avec les réactifs correspondant aux dernières formules précitées sont plus intenses que celles qui sont obtenues avec les réactifs similaires dans lesquels l'alcool butylique normal est remplacé par un volume éal d'eau. La mise en oeuvre des derniers trois réactifs mentionnés ci-dessus est similaire à celle décrite plus haut pour les réactifs correspondant aux formules des exemples 2, 3 et 4. Pour permettre une compreShension meilleure et plus ample de la description precitée, il convient d'expliquer le concept précis et le ciiaflp couvert par l'expression naShydride arsénieux et ses dérivés, utilisée dans le cadre de l'invention. A cet effet, on doit prendre en considération les faits suivants : 10) Sous l'effet d'une mise en solution, l'anhydride arsénieux libère l'anion arsénite. 20) Par acidification du milieu, les dérivés alcalins de l'anhydride arsénieux libèrent l'acide arsénieux (cless-à- dire l'anion arsénite). 30) Avec un degré de facilité plus ou moins grand, de nombreux dérivés de l'arsenic sont capables de libérer de i 'anhydride arsénieux, cette libération dépendant de la composition du restant du réactif. Ainsi, plusieurs arséniates peuvent produire des a##éni##s et, par suite, l'anhydride arsénieux et l'anion arsénite, dans un milieu réducteur convenable. Des résultats similaires sont obtenus par traitement des arséniates par des halogénures alcalins. Par hydrolyse, les halogénures d'arsenic produisent l'anhydride arsénieux. Par suite, dans le cadre dé l'invention, il est entendu que les '1dérivés de l'anhydride arsénieux" sont tous les composés qui, dans les conditions dans lesquelles tressai du réactif qui les contient est effectué, libèrent l'anhydride arsénieux ou ltanion arsénite. A titre de démonstration et de confirmation de la description précédente, on décrit en détails ci-après une formule représentant un autre exemple du réactif de l'invention. Exemple 8 Acide acétique glacial 94 ml Thiourée 0,15 g Ortho-toluidine 6 mi Acétate de sodium, 3E2 0,10 g Méta-arsénite de sodium 0,01 g Cette dernière formule correspond aux caractéristi quels précitées du réactif de l'invention. REVENDICATIONS 1. Réactif pour la détermination quantitative des hydrates de carbone, en particulier des aldohexoses, tel que constitué par une amine aromatique dissoute dans un milieu solvant acidifié, avec ou sans addition d'un ou plusieurs agents de conservation et de stabilisants, tels que la thiourée, et d'agents complexants du type de l'acide éthylènediamine-tétra- acétique, avec ou sans addition de solvants supplémentaires tels que l'eau, des alcools, des esters et des éthers, et leurs dérivés, ledit réactif étant caractérisé en ce qu'il renferme au moins l'un des composés suivants a) au moins l'un des deux d'un composé d'arsenic trivalent du groupe de l'anhydride arsénieux et d'un composé arsenical capable, dans la solution réactive de détermination quantitative et dans les conditions de mise en oeuvre de Lissai analytique, de libérer des composés d'arsenic trivalent du groupe de 1'anhydrlde arsénieux; et b) l'alcool butylique normal. 2. Réactif pour la détermination quantitative des hydrates de carbone selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé d'anhydride arsénieux y est renfermé en une concentration finale s'élevant au maximum à 2% en poids/volume. 3. Réactif nour la détermination quantitative des hydrates de carbone, selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il contient l'alcool butylique à une concentration finale d'au maximum 79% en volume.