Brevet FR2277814A1 — publié le 19760206

A ce jour, on extrait l'insuline du pancréas d'animaux et on ne trouve pas de texte, dans la littérature, décrivant son isolement à partir de vdgétaux. L'isolement de l'insuline à partir du pancréas d'animaux présente des inconvénients, pour les raisons suivantes: (1) il faut sacrifier 10.000 animaux pour n'obtenir que 500 g environ d'insuline pure; (2) si le pancréas est infecté par une maladie, par exemple par un cancer, etc.. cette maladie risque d'hêtre transmise (s'il s'agit d' une maladie virale) par l'insuline: (3) la culture de végétaux permet d'obtenir toute la quantité d'insuline voulue et représente ainsi une économie. La présente invention a posr but d'isoler l'insuline à partir de végétaux, afin d'éviter les inconvénients précités. La Demanderesse a découvert: (1) que les fruits ainsi que les cultures de Memordica charantia, lorsqu'on les extrait à ltéthanol, fournissent de l'insuline; (2) qu'elle a pu extraire de l'insuline à partir de cultures in vitro sur milieu MS modifié ainsi qutà partir des fruits du végétal; (3) que les points de fusion de l'insuline isolée, le point de fusion en mélange de l'insuline isolée et de ltéchan- tillon de référence, les analyses par chromatographie sur papier et par chromatographie en couche mince des hydrolysats des échantillons isolés et des échantillons de référence, l'analyse infrarouge du composé isolé et de l'échantillon de référence confirment la présence d'insuline dans Nemordica charantia. La présente invention a pour objet un procédé d'isolement de 1' insuline suivant lequel on extrait une substance organique par un mélange d'éthanol, d'eau et d'acide sulfurique, on ajuste le pH de 1' extrait à une valeur de 1,5 à 2,0, par exemple par addition d'ammoniaque ou d'acide chlorhydrique, on précipite l'insuline par addition d'éthanol et d'éther diéthylique, on cristallise à l'aide de traces de zinc, on purifie par chromatographie en couche mince éventuellement suivie d'analyse, caractérisé en ce que la substance organique utilisée pour l'extraction est constituée par des cultures obtenues à partir de graines et/ou par les fruits de Nemordica char anis Linn. Il est préférable d'utiliser des fruits de M. charantia recueillis dans les champs pendant les mois d'avril, mai et juin. Les cultures obtenues sur milieu (RT) modifié (Khanna, P. et Staba, E.J., Lloydia, 1968, 31, 180) de Murashige et Skoog (Murashige, T. et Skoog, F., Physiol. Plantarum, 1962, 15, 470) additionné d'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique et 1% de gélose sont transférées dans un milieu RT liquides et récoltées aux fins d'extraction de l'insuline. Les cultures qu'on fait pousser sur milieu modifié (RT: Vanna, P. et Staba E.J., Lloydia, 1968 31,180) de Murashige et Skoog (tIu- rashige, T. et Skoog, F. Physiol. Plantarum, 1962, 15, 470) additionné de 1 ppm (partie pour un million) d'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique '2,4-D) et de 1 de gélose sont des cultures organisées qu'on fait pousser dans des ballons de 100 ml contenant 30 ml de milieu, pendant un laps de temps de 36 mois, puis qu'on transfère dans un milieu liquide additionné de 0,1 ppm de 2,4-D sans gélose; les cultures liquides sont effectuées sur des dispositifs à secousses horizontales fonctionnant à 60 secousses/minute.0n effectue toutes ces cultures à 26+10C sous une lumière incandescente de 1500 à 1800 lux après avoir fait pousser les cultures dans le milieu RT liquide pendant 4 à 6 mois et avec fréquentes sous-cultures dans du milieu RT frais, on récolte afin d'extraire l'insuline. On extrait séparé- ment les fruits et les cultures par ltéthanol, puis on mélange avec de l'éthanol froid et de l'éther diéthylique et on obtient des cristaux en aiguilles après addition de traces de zinc, au bout de 18 heures.On broie séparément les fruits et les cultures, on homogénéise dans de l'eau, de l'éthanol et de l'acide sulfurique concentré, on ajuste le pH à une valeur de 1,5 à 2,0, on filtre, on ajuste le pH du filtrat à 3,0 à l'aide d'ammoniaque, on mélange avec de l'éthanol froid et de l'éther diéthylique, on maintient à 0,50C pendant 12 heures, on recueille le précipité floconneux blanc, on ajoute des traces de zinc et on laisse reposer pendant 18 heures, obtenant ainsi des cristaux bruts blancs. On dissout les cristaux bruts dans un mélange d'éthanol et d'ammoniaque (1:2) et on isole l'insuline sous forme pure par chromatographie en couche mince (CCM). On active à 1000C de minces plaques de 20 x 20 cm reveAtues de gel de silice "silica gel G" sur une épaisseur de 0S4 à 0,5 mm, on applique la solution d'insuline, on développe les plaques dans un système n-butanol/eau/acide acétique (12/5/2), on fait sécher, onrend visible la tache unique correspondant à l'insuline étalon en pulvérisant à la ninhydrine (à 0,25 dans l'acétone), on isole en même temps que le gel de silice G à partir de plaques non pulvérisées, on extrait à l'éthanol et à l'ammoniaque (1/2), on filtre, on sèche le filtrat, obtenant ainsi des cristaux purs, sous forme d'aiguilles blanches. Les fruits contiennent 1 g d'insuline pour 100 g de poids frais, les cultures contiennent 1,90 g d'insuline pour 100 g de poids frais. On analyse. On hydrolyse la substance isolée en même temps que l'insuline étalon, on applique sur des chromatogrammes sur papier, on développe et on obtient les mêmes acides aminés. On hydrolyse séparément la substance isolée et l'insuline étalon, à l'aide d'HCl 6N pendant 20 heures, on sèche, on reconstitue dans de l'éthanol à 50%, on applique sur des bandes de papier filtre Whatman No.1, on développe dans un système n-butanol/acide acétique/ eau (60/20/20), après développement on pulvérise les bandes avec de la ninhydrine à 0,25% dans l'acetone: les acides aminés sont les mê- mes que ceux de l'hydrolysat étalon. On effectue l'analyse: on extrait les fruits et les cultures dans de ltéthanol, obtenant ainsi un produit qui a le même point de fusion (2340C) , le même spectre infrarouge et le même nombre d'acides aminés que l'insuline étalon, ainsi qu'on peut-le constater. Les exemples non limitatif s suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention. Exemple 1 On cueille les fruits de M. charantia dans les champs, pendant les mois d'avril, mai et juin. On broie les fruits frais dans un mortier et on extrait l'insuline qu'ils contiennent. On homogénéise 100 g de fruits broyés dans un malaxeur Yaring avec 10 mol d'eau distillée, 45 ml d'éthanol à 95% et 3,6 ml d'acide sulfurique concentré pendant 10 à 15 minutes, à faible vitesse et à une température de 25 à 280C. On ajoute à ce mélange 60 ml d'eau distillée et 250 ml d'éthanol à 95%, puis on homogénéise pendant 15 à 20 minutes à faible vitesse. On ajuste le pH à une valeur de 1,5 à 2,0 et on filtre le mélange sous vide. On ajuste le pH du filtrat à une valeur de 8,0 à l'aide d'hy- droxyde d'ammonium à 28%, on mélange avec 1,5 litre d'éthanol absolu froid et 2 litres d'éther diéthylique et on maintient à 0,50 pendant 12 heures. On obtient un précipité floconneux blanc après avoir séparé le liquide surnageant. On lave le précipité brut, tout d'abord avec 90 ml d'acétone, puis avec 30 ml d'éther anhydre, et on dissout dans l'éthanol absolu et lthydroxyde d'ammonium (1/21. On ajoute des traces de zinc à cette solution qu'on maintient ensuite à température ambiante pendant 18 heures. On obtient des cristaux incolores en aiguilles, ainsi que des traces de zinc et autres impuretés. On dissout les cristaux bruts dans un mélange d'éthanol absolu et d'hydroxyde d' ammonium (1/2) aux fins d'analyse par CCM. On active à 1000C, pendant une demi-heure, de minces plaques de verre de 20 x 20 cm revêtues d'une épaisseur de 0,4 à 0,5 mm de gel de silice (Kie'sel G fourni par la Société Merck). On applique la solution contenant la substance isolée à 1 cm au-dessus du bord des plaques, en même temps que l'insuline étalon, et on traite les plaques par un mélange de solvants organique s (n-butanol/eau/acide acétique 12/5/2). On sèche les plaques développées à température ambiante et on pulvérise avec 0,25% de ninhydrine dans de l'acétone. On isole les taches positives à la ninhydrine (RF = 0,19) , correspondant à l'insuline, d'environ 200 plaques non pulvérisées, en même temps due le gel de silice G et on extrait par un mélange d'éthanol absolu et d'ammoniaque (1/2). On filtre l'extrait et on sèche sous vide.On obtient ainsi des cristaux purs, incolores, qu'on pèse (1 g/ 100 g de poids frais de fruits). On détermine le point de fusion du composé purifié (232-235 ) ainsi que le point de fusion en mélange (2540). Le point de fusion de l'insuline étalon est de 233 . Séparément, on hydrolyse l'insuline étalon ainsi que le composé isolé, au reflux dans l'HCI 6N, pendant 20 heures. On filtre les hy drolysats, on les reconstitue séparément dans l'éthanol à 50% et on les applique sur des bandes de papier Whatman No.1. On traite les bandes de papier par un mélange de solvants organique s (n-butanol/ eau/acide acétique (60/20/20). On applique, également séparément, les hydrolysats de l'insuline isolée et de l'insuline étalon, en même temps que les aminoacides connus (hydroxylysine, hydroxyproline, méthionine et tryptophane). On pulvérise les divers chromatogrammes dé veloppés, à l'aide de ninhydrine à 0,25% dans l'acétone.Les aminoacides de l'hydrolysat de l'étalon coïncident exactement avec ceux de 1' hydrolysat du composé isolé. L'hydroxylysine, l'hydroxyproline, la méthionine et le tryptophane sont absents à la fois de l'hydrolysat du composé isolé ainsi que de l'hydrolysat de l'étalon, ce qui indique que le composé isolé est identique à l'insuline. Le spectre IR (Spectrophotomètre Perkin-Elmer 337 Grating; effectué avec CCl4) du-composé isolé est superposable àecelui de 1' étalon. On dissout l'insuline isolée (5 mg/ml dans de l'eau distillée stérile) dans des fioles d'injection stériles (2 ml) qu'on scelle. On secoue bien la suspension ainsi obtenue avant de l'administrer à des lapins. On prélève des échantillons de sang normal de lapins (pesant chacun de 120 à 130 g) qu'on place dans des fioles de fluorure afin de doser la glycémie. On injecte l'insuline isolée (1 ml) par voie intramusculaire aux animaux d'essai et on prélève 1 ml de sang, toutes les heures, pendant 3 heures. La baisse de la glycémie est de 20 à 25% au cours de la première heure et de 30 à 35% au cours des deuxième et troisième heures, par comparaison avec la glycémie normale des animaux d'essai. Ces résultats ont Qté obtenus à partir de 50 cas dont on a pris la moyenne. Exemple 2 On entaille des graines de M. charantia à l'aide d'un scalpel, à l'extrémité où est situé le micropyle, on stérilise à l'aide d'une solution d'hypochlorite de sodium à 5,25% dans l'eau distillée stérile, on secoue pendant 5 à 10 minutes, puis on rince trois fois à 1' eau stérile. On inocule, avec les graines stériles, des ballons de 100 ml contenant 30 ml de milieu modifié (mut; Khanna, 0. et Staba, E.J., Lloydia, 1968, 31, 180) de Murashige et Skoog (Murashigé, T. et Skoog F., Physiol. Plantarum, 1962, 15, 470) additionné de 1 ppm d'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D) et 1% de gélose. On maintient les ballons inoculés à 26 +1 C sous une lumière incandescente de 1500 à 1800 lux. La germination des graines s'effectue en 4 à 6 jours. On transfère ensuite les plants dans du milieu RT frais: ils se forme des racines épaisses munies de nombreux poils.On entretient cette culture organisée pendant 36 mois, après sous-cultures fréquentes dam -du milieu RT frais, puis on transfère dans du milieu liquide RT additionné de 0,1 ppm de 2,4-I), sans gélose. On fait pousser les cultures liquides sur des dispositifs leur faisant subir des secousses par un mouvement de va-et-vient, à raison de 60 secousses par minute, et on cultive pendant 6 mois après avoir effectué des sous-cultures fréquentes de 4 à 6 semaines. Puis on récolte les cultures organisées aux fins d'extraction de l'insuline. On homogénéise 100 g de tissus broyés, dans un malaxeur Wading, avec 10 ml d 'eau distillée, 45 ml d'éthanol à 95% et 3,6 ml d'acide sulfurique concentré pendant 10 à 15 minutes, à faible vitesse et à une température de 25 à 280C. On additionne ce mélange de 60 ml d'eau distillée et 250 ml d'éthanol à 95%, puis on homogénéise pendant 15 à 20 minutes, à faible vitesse. On ajuste le pH à une valeur de 1,5 à 2,0 et on filtre le mélange sous vide. On ajuste le pH du filtrat à 3,0, à l'aide d'hydroxyde d'ammonium à 28fus on mélange avec 1,5 litre d'éthanol absolu froid et 2 litres d'éther diéthylique, et on maintient à 0,50 pendant 12 heures. Après avoir décanté le liquide surnageant, on obtient un précipité floconneux blanc.On lave le précipité brut, tout d'abord avec 90 ml d'acétone, puis avec 30 ml d'éther anhydre et on dissout dans un mélange d'éthanol absolu et d'hydroxyde d'ammonium 1/2. On ajoute des traces de zinc à cette solution qu'on maintient à température ambiante pendant 18 heures. On btient des cristaux incolores en aiguilles ainsi que des traces de zinc et autres impuretés. On dissout les cristaux bruts dans un mélange d'éthanol absolu et d'hydroxyde d'ammonium (1/2) pour les analyser par CON. On active à 100 C, pendant une demi-heure, de minces plaques de verre de 20 x 20 cm revêtues d'une couche de 0,4 à 0,5 mm de gel de silice G (Kieselgel G fourni par la Société Merck). On applique la solution contenant la substance activée 1 cm au-dessus du bord des plaques en même temps que ltéthanol (insuline) et on traite les plaques par un mélange de solvants organique s (n-butanol/eau/acide acétique 12/5/2). On sèche les plaques développées à température ambiante et on les pulvérise avec de la ninhydrine à 0,25 dans l'acétone. On isole les taches positives à la ninhydrine (RF = 0,19),correspondant à l'insuline, d'environ 200 plaques non pulvérisées, en même temps que le gel de silice G et on extrait par un mélange d'éthanol absolu et d'ammoniaque 1/2. On filtre extrait et on sèche sous vide. On obtient ainsi 1,90 g de cristaux incolores purs pour 100 g de tissus frais. On détermine le point de fusion du composé purifié (232-2350) ainsi que le point de fusion en mélange (2340). Le point e fusion de l'insuline étalon est de 2330. On hydrolyse séparément l'insuline étalon ainsi que le composé isolé, au reflux, avec de l'HCl 6N, pendant 20 heures. On filtre les hydrolysats, on sèche, on reconstitue séparément dans l'éthanol à 50yó et on applique sur des bandes de papier Whatman No.1. On traite les bandes de papier dans un mélange de solvants organiques (n-butanol/ eau/acide acétique 60/20/20. On isole les hydrolysats de l'insuline isolée et de l'insuline étalon, et on les applique également séparément, en même temps que les aminoacides connus (hydroxylysine, hydro xyproline, méthionine et tryptophane). On pulvérise à la ninhydrine à 25% dans l'acétone les divers chromatogrammes développés. Les amino acides de l'hydrolysat de l'étalon cofncident exactement avec ceux de l'hydrolysat du composé isolé.L'hydroxylysine, l'hydroxyproline, la méthionine et le tryptophane sont absents à la fois de l'hydrolyse sat du composé isolé et de l'hydrolysat de l'étalon, ce qui indique que le composé isolé est identique à l'insuline. Le spectre IR (spectrophotomètre Perkin Elmer 337 Grating) du composé isolé est superposable à celui de l'étalon. En résumé, il découle de ce qui précède que l'invention présente les avantages suivants: (1) Elle évite d'abattre des animaux0 (2) Elle évite les risques de transmission à l'homme de virus contenus dans l'insuline. (3) On peut obtenir toute quantité souhaitée d'insuline en cultivant des végétaux ou en effectuant des cultures in vitro, ce qui permet d'obtenir de l'insuline à meilleur prix. (4) L'administration d'insuline végétale à l'homme, même à des doses élevées, ne provoquera pas la formation d'anticorps. REVENDICATIONS 1. Procédé d'isolement de l'insuline suivant lequel on extrait une substance organique par un mélange d'éthanol, d'eau et d'acide sulfurique, on ajuste le pH de l'extrait à une valeur de 1,5 à 2,0, par exemple en ajoutant de l'ammoniaque ou de l'acide chlorhydrique, on précipite l'insuline par addition d'éthanol froid et d'éther diéthylique, on cristallise à l'aide de traces de zinc, on purifie par chromatographie en couche mince et on analyse éventuellement, caractérisé en ce que la substance organique mise en oeuvre pour 1' extraction est constituée par les cultures obtenues à partir de graines et/ou par les fruits de Memordica charantia Linon. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est préférable d'utiliser des fruits de M. charantia récoltés dans les champs pendant les mois d'avril, mai et juin. 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue les cultures en milieu modifié RT de rashige et Skoog add- tionné d'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique et de 1% de gélose, on les transfère en milieu RT liquide et on les récolte aux fins d' extraction de l'insuline. 4. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce qu'on effectue les cultures en milieu modifié RT de Murashige et Skoog additionné de 1 ppm d'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique et de 1% de gélose dans des ballons de 100 ml contenant 30 ml de milieu, pendant un laps de temps de 36 mois, et on les transfère ensuite en milieu RT liquide additionné de 0,1 ppm d'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique, sans gélose, et on cultive lesdites cultures liquides sur des dispositifs à secousses horizontales suivant un mouvement de va-et-vient, à raison de 60 secousses par minute, toutes les cultures étant effectuées à 26+1 C sous une lumière incandescente de 1500 à 1800 lux et, après culture en milieu RT liquide pendant 4 à 6 mois en effectuant des sous-cultures fréquentes en milieu RT frais, on récolte afin d' extraire l'insuline. 5. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on extrait les fruits et les cultures à l'éthanol, on les mélange ensuite avec de ltéthanol froid et de l'éther diéthylique et on obtient des cristaux en aiguilles en ajoutant des traces de zinc. 6. Procédé suivant la revendication 1 ou 5 caractérisé en ce qu'on traite séparément les fruits etcultures'quion broie, homogé néise dans de l'eau, de ltéthanol et de l'acide sulfurique concentré, après quoi on ajuste le pH à une valeur de 1,5 à 2,0, on filtre, on ajuste le pH du filtrat à 3,0 à l'aide d'ammoniaque, on mélange avec de l'éthanol froid et de l'éther diéthylique et on maintient à 0,5 C pendant 12 heures, on recueille le précipité floconneux formé, on ajoute des traces de zinc, obtenant ainsi des cristaux blancs bruts. 7. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1, 5 et 6, caractérisé en ce qu'on dissout les cristaux bruts dans un mélange d'éthanol et d'ammoniaque 1/2, et on isole l'insuline par chromatographie en couche mince. 8. Procédé suivant la revendication 1 ou 7, caractérisé en ce qu'on active de minces plaques de verre de 20 x 20 cm revêtues d'une couche de 0,4 mm à 0,5 mm d'épaisseur de gel de silice G, on applique la solution d'insuline, on développe les plaques dans un système n-butanol/eau/acide acétique 12/5/2, on sèche, on isole en même temps que le gel de silice la tache unique correspondant à l'insuline étalon, on extrait dans un mélange d'éthanol et d'ammoniaque 1/2, on filtre, on sèche le fltrat obtenant, ainsi, des cristaux purs, blancs, en forme d'aiguilles. 9. Procédé suivant la revendication 1 ou 8, caractérisé en ce que les fruits fournissent 1 g d'insuline pour 100 g de poids de fruits frais et que les cultures fournissent 1,90 g d'insuline pour 100 g de cultures fraîches. 10. Procédé suivant la revendication 8 , caractérisé en ce qu'on analyse le produit en hydrolysant simultanément la substance isolée et l'étalon, en appliquant sur des chromatogrammes sur papier et en développant, obtenant ainsi les mêmes aminoacides. 11. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce qu'on effectue l'analyse, on hydrolyse séparément la substance isolée et l'insuline étalon, par l'HCl 6N, pendant heures, on sèche, on reconstitue à l'éthanol à 50%, on applique sur bandes de papier filtre Whatman No.1, on développe dans un mélange n-butanol/eau/acide acétique 60/20/20, on développe les bandes, on sèche, on pulvérise à la ninhydrine à 0,25% dans l'acétone, obtenant ainsi les mêmes aminoacides que ceux de l'hydrolysat de l'étalon. 12. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on effectue l'analyse, on extrait les fruits et les cultures dans l'éthanol, obtenant ainsi un produit qui a le même point de fusion de 2340C, le même spectre infrarouge et le même nombre d'aminoacides que l'insuline étalon.