Brevet FR2277593A1 — publié le 19760206

La présente invention se rapporte à un antibiotique de la série des polypeptides, produit par une souche de Bacillus circulans. Comme antibiotiques qui sont fortement efficaces contre les bactéries Gram-négatives et qui ont une faible toxicité, les substances suivantes ont été préalablement mises au point ou utilisées en pratique la colistine : J. Biochem., 54, 25 (1963), la polymyxine : Antibiotics, 2, 255 (1967), la circuline : Experientia, 24, 656 (1968), la polypeptine : J. Biol. Chem., -198 405 (1952) le produit dit BN-7 le produit dit EM-49 : J. Antibiotios, 26, 444 (1973). Ces antibiotiques sont des substances de la série des polypeptides et, plus particulièresent, certains de ces antibiotiques sont appelés antibiotiques du type polymyxine, en se basant eur leurs constituants d'aminoacides et d'acides gras. Ces antibiotiques possèdent la thréonine en tant qu'un de leurs constituants d'aminoacides, sauf le produit dit EM-49 qui est produit par une souche de Bacillus oirculans. Le présent antibiotique, le TM-743, est également produit par un microorganisme du groupe des Bacillus circulans et il lui manque la thréonine. En outre, le TM-743 a les mêmes constituants d'aminoacides que le EM-49, ctest-à-dire qu'il contient de l'acide 2,4-diaminobutyrique, de la leucine et de la phénylalanine suivant un rapport moléculaire de 5 : 2 : 1. Cependant, leurs constituants d'acides gras diffèrent. Ainsi le TM-743 contient des acides gras en C8 et C9, alors que 1'EM-49 contient des acides gras en C10 et C11 respectivement. En conséquence, on peut dire que le présent antibiotique, le TM-743, est une nouvelle substance. La présente invention se rapporte à un nouvel antibiotique et au procédé pour sa production, ainsi qu'au procédé pour sa purification. Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à un nouvel antibiotique, désigné par "TM-747", dérivé d'une novelle souche de microorganismes appartenant aux Bacillus circulans, en tant que nouveau produit utile, avec un procédé pour la préparation de ce nouvel antibiotique et, en outre, un procédé pour sa purification. L'objet principal de la présente invention est de prévoir un produit possédant une activité antibiotique contre des microorganismes pathogènes. C'est encore un autre objet de la présente invention d'obtenir facilement le nouvel antibiotique, désigné par "TEM-743", avec une grande pureté. Le nouvel antibiotique mentionné ci-dessus, le TM-743, peut être produit par culture d'une nouvelle souche de microorganismes appartenant aux Bacillus circulans, et son chlorhydrate peut être obtenu sous forme de poudre blanche selon le procédé de la présente invention. Le TM-743 est un genre d'antibiotique de la série des polypeptides; plus spécifiquement, il peut être appelé antibiotique du type polymyxine et il est utile pour combattre des microorganismes pathogènes, particulièrement des bactéries Gram-négatives. Cette couche de microorganismes appartenant au Bacillus circulans et produisant l'antibiotique TM-743, a été isolée à partir d'un échantillon de sol et a été désignée par Bacillus circulans TM-743 (ATCC nO 31154) par la demanderesse. La présente invention sera maintenant décrite en relation avec les dessins ci-joints dans lesquels La figure 1 représente le spectre d'absorption dans l'ultraviolet du chlorhydrate de TM-743 dans le méthanol. La figure 2 représente le spectre d'absorption dans l'in fraroage du chlorhydrate de TM-743 avec une tablette de KBr; et La figure 3 représente le spectre de résonance magnétique nucléaire du chorhydrate de TM-743 dans le diméthylsulfoxydec-d. Le nouvel antibiotique, le TM-743, de la présente invention, est préparé par culture, dans des conditions contrôlées, d'une nouvelle souche de Bacillus circulans qui a été identifiée selon le Manual of Determinative Bacteriology de Bergey, 7ème édition, et Handbook of Microbiology, volume 1 (publié par A.I. Laskin et H.A. Lechevalier). Les propriétés microbiologiques de la nouvelle souche, le Bacillus circulans TM-743 (ATCC nO 31154), sont les suivantes 1. Caractldristiques au microscope 1) Cellules végétales : tiges à extrémités rondes, 0,8-1,0 sur 3-7 microns (en moyenne 0,9 sur 4,5 microns); motilité active : une channe n'est pas formée ; aérobies, de manière facul tative anaorobies ; Gram-négatives ; non résistantes vis-à-vis des acides. 2) Spores : ellipsoldales ; 0,7 à 1,0 sur 1,2 à 1,5 micron (en moyenne 0,8 sur 1,3 micron); placées centralement ou paracentralement. 3) Sporanges : gonflés et en forme de fuseau. 2. Caractéristiques de colonies Croissance sur de l'agar-agar nutritif contenant un extrait de viande, de la peptone et NaCl : une lente expansion est observée. La colonie isolée est de dimension petite ou moyenne et non ronde (rebord non entier) ; colonie mince, translucide ou trans pa-rente, lustrée et fortement visqueuse. 3. Croissance sur certains milieux typiques 1) Agar-agar nutritif avec du glucose : plus importante que sur de l'agar-agar nutritif normal. 2) Bouillon nutritif : sauvais aspect trouble, mais une pellicule épaisse et visqueuse se forme. Riche sporulation dans la pellicule. 3) Agar-agar-soJa-produit dit Trypto, contenant de la tryptone, de la peptone de soja et du NaCl, agar-agar-jus de tomate contenant du Jus de tomate, de la peptone et du lait peptonisé, ou agar-agar-dextrose-pomme de terre : ordinairement pas de croissance. 4. Propriétés physiologiques 1) Hydrolyse de l'amidon + 2) Utilisation de Caséine + Citrate Azote minéral 3) Formation de Catalase + Uréase + Oxydase + Indole + Dihydroxyacétone Pigment U2S Acétone (test de Voges Proskauer) 4) Liquéfaction de la galatine + 5) Réduction de nitrates + 6) Coagulation de la caséine + 7) Rougissement de Lait de tournesol + Rouge méthyle 8) Acide à partir de Amidon + Lactose + Glucose + Galactose + Mannitol Arabinose Xylose Fructose Saccharose Inositol Glycérol 9) Gaz à partir d'hydrates de carbone 10) Température de croissance 20-370C 11) Croissance dans NaCl à 7 % à pH 5,7 Ces caractéristiques de la présente souche sont semblables à celles du Bacillus polymixa, du Bacillus circulans, du Bacillus alvei, du Bacillus macerance et du Bacillus stearothermophilus selon Manual of Determinative Bacteriology de Bergey, 7ème édition, et Handbook of Microbiology, volume 1 (par A.I. Laskin et collaborateurs) Spécialement, elle ressemble intimement au Bacillus circulans par diverses propriétés morphologiques et physiologiques. I1 y a cependant, une légère différence entre les deux microorganismes, c'està-dire que le Bacillus circulans produit de l'acide à partir d'arabinose et de xylose. D'après ces caractéristiques, on en conclut que la souche de la présente invention appartient à l'espèce Bacillus circulans et, ainsi, cette souche a été désignée par Bacillus circulans TM-7 43. Cette souche a été déposée à l'Institute for Microbiological Industry and Technology, Japon, sous la désignation FERM-P n" 2633 et à l'American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Etats-Unis d'Amérique, sous la désignation ATCC nO 31154. L'antibiotique TM-743 peut Etre ordinairement obtenu en inoculant la souche de Bacillus circulans TM-743 dans un bouillon nutritif, en cultivant cette souche par le procédé de culture par secouage et en séparant l'antibiotique TM-743 ainsi produit du bouillon de culture. Le bouillon nutritif pour cultiver la souche TM-743 contient des sources d'azote et de carbone assimilables et certains éléments peu importants. L'amidon, le glycérol et divers genres de saccharides peuvent être utilisés comme sources de carbone. Surtout, le glucose et le saccharose sont ordinairement utilisés. La peptone, des aminoacides, la caséine, de la farine de poisson et de la farine de soja peuvent être utilisés comme sources d'azote. Un extrait de viande, un extrait de levure, de la liqueur de mats macéré, et d'autres extraits d'origines végétale et animale peuvent être utilisés comme éléments peu importants. Des lipides, des graisses, des huiles et divers composés d'azote minéral peuvent être aussi utilisés de manière subsidiaire. Dans certains cas, on peut également employer des sels minéraux tels que le chlorure de sodium et le carbonate de calcium.Une résine de silicone peut Autre ajoutée, si cela est nécessaire, comme agent stopposant à la formation de mousse. La solution de milieu est neutrariséeavant la stérilisation par passage à l'autoclave à 120"C pendant 15 minutes. La culture est réalisée à 30-350C avec aération. Le développement de cellules bactériennes est plutAot lent et la substance active, la TM-743, apparatt à l'extérieur des cellules après environ 50 heures à partir de l'inoculation. La production maxima de la substance dite TM-743 est ordinairement obtenue après 72-120 heures dans le milieu de culture. Après la culture, les cellules bactériennesvsont retirées par centrifugation et la partie surnageante est chargée sur des résines échangeuses de cation, telles que celles dites Amberlite IRC-50 et éluées avec un acide minéral tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique ou un mélange d'un solvant organique soluble dans l'eau et d'un acide minéral. L'éluat contenant la substance active est décoloré par du charbon activé et concentré sous vide. La substance active peut être aussi extraite de la partie surnageante du bouillon ou de l'éluat avec un alcool inférieur non miscible avec l'eau, tel que le n-butanol. L'extrait est alors concentré sous vide et additionné d'un solvant organique tel que l'acétone pour obtenir le précipité de la substance recherchée.Le séchage du précipité sous vide donne une poudre brute de la substance recherchée. La poudre brute peut être en outre purifiée par une combinaison efficace de filtration par du gel sur le produit dit Sephadex, la chromatographie avec échange d'ions sur la carboxyméthylcellulose, la chromatographie sur colone du gel de silice et par un procédé de distribution à contre-courant. Par exemple, l'éluat actif passant à travers le produit dit Sephadex LH-20 avec de l'eau est concentré, réglé à un pH de 2 avec de l'acide chlorhydrique et additionné d'acétone. Le précipité résultant est rassemblé par centrifugation et séché sous vide pour donner le chlorhydrate de TM-743 sous forme de poudre blanche. La poudre obtenue, le chlorhydrate de TM-743, présente les propriétés physicochimiques suivantes 1) Valeurs d'analyse élémentaire C : 49,31, H : 8,19, N : 14,57, Cl : 12,10 (%) 2) Point de fusion 200-220 C (coloration brunâtre) 3) Pouvoir rotatoire optique 23 []D = -520 (C = 1%, eau) 4) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet (figure 1) La solution méthanolique de l'antibiotique présente les maxima d'absorption suivants (El%m) : 251 mu -1,69, 257 m > s -1,85, 263 mrL -1,46 et 266 m W 0,94 (épaulement) 5) Spectre d'absorption dans l'infrarouge ligure 2) Le spectre d'absorption dans l'infrarouge, doterminé avec une tablette de KBr présente des bandes caractéristiques à 3400, 3220, 3030, 2960, 1640 -1650, 1520-1540 > 1465, 1440, 1385, 1370, 1330, 1280, 1240, 1170, 1080, 1030, 920, 865, 745 et 700 cm-l 6) Spectre de résonance magnétique nucléaire (figure 3) Le spectre de résonance magnétique nucléaire, à 60 MHz, du chorhydrate de TM-743 dans une solution de diméthysulfoxyded6 présente les signaux caractéristiques suivants à J 4,0-4,9 (8H, -NCHC, 728(5H, -C6H5)et 7,5-9,2 (-NH3+ et -CONH-). 7) Solubilité Soluble dans 1 1eau, dans le méthanol, dans méthanol, dans le n-butanol contenant de l'eau et dans le diméthysulfoxyde, mais insoluble dans l'acétone, dans l'acétone d'éthyle, dans le chloroforme, dans l'éther éthylique, dans le benzène et dans ltéther de pétrole. 8) Réaction colorée Réactions positives avec la ninhydrine et le biuret 9) Composition Une comparaison par chromatographie sur papier et une analyse quantitative des aminoacides de lthydrolysat de chlorhydrate de TM-743 avec de 1'acide chlorhydrique 6N, à 1050C, pendant 6 heures avec certains échantillons authentiques indiquent l'exis- tence d'acide 2,4-diaminobutyrfque, de leucine et de phénylalanine suivant le rapport moléculaire 5 : 2 : 1. L'hydrolyse du chlrhydratede TM-743 avec de l'acide chlorhydrique 6N à 900C pendant 30 minutes fournit, en plus d'un mélange d'aminoacides, une fraction huileuse non miscible, qui peut être séparée de la solution hydrolysée par extraction avec de l'éther. La solution Othérée est traitée par un excès de diazométhane à la température ambiante. Le mélange résultant est examiné par chromatographie en phase gazeuse sur une colonne d'acier inoxydable (1.000 mm x 3 mm) remplie de 15 ffi du produit dit PEGS (traité par le produit dit Chromosorb W-AW passant au tamis dont l'ouverture de maille est 0,177 à 0,149 mm soit 80 à 100 mesh), He gazeux étant utilisé comme gaz porteur à 1 kg/cm2. . Deux pics substantiels, avec un temps de rétention de 3,6 et 5,2 minutes, respectivement, sont détectés. La spectrométrie de masse révèle des pics de masses maxima (M±H20) pour m/e = 156 pour le premier pic de chromatographie en phase gazeuse et m/e = 170 pour le dernier pic. Les pics d'ions fragmentaires des deux composants m/e = 82 et 96 sont considérés comme étant M±(H20 + CH2=C (OH)OCH ). En conséquence, on peut éventuellement dire que les deux composants sont des esters méthyliques d'acides gras -hydroxylés. Ultérieurement, l'analyse couplée par chromatographie en phase gazeuse et une spectrométrie de masse des esters méthyliques triméthylsilylés révèlent les pics de masse maximum m/e = 231 et 254.De plus, un pic d'ion fragmentaire commun pour les deux composants de chromatographie en phase gazeuse est détecté pour m/e = 175 et on estime que c'est le fragment à terminaison carboxylique dérivé de la scission entre le carbone ss et le carbone X de ces composants. En outre, deux pics d'ions fragmentaires sont également détectés pour m/e = 173 et 187, respectivement, dont on estime que ce sont les fragments W -terminaux dérivés de la coupure entre le carbone a,et le carbone p. D'après ces faits, on peu t en conclure que les acides gras contenus dans le TM-743 sont C5HllCH(OH)CH2COOH et C6Hl iCH(OH) CH2COOH. Le rapport des teneurs de. ces acides gras diffère pour chaque lot dtéchantillonsde TM-743, alors que la teneur en acides gras totale conserve une bonne valeur constante par rapport à la teneur en aminoacides. Ceci peut suggérer que l'antibiotique TM-443 est constitué de deux composants, qui sont identiques au point de vue constituants d'aminoacides mais qui diffèrent légèrement au point de vue des constituants d'acides gras. L'antibiotique constitué par le chlorhydrate de TM-743 présente une bonne activité antibactérienne contre des microorganismes pathogènes, spécialement contre les bactéries gram-négatives. Ainsi, ordinairement,le chlorhydrate de TM-743 présente une activité suffisante contre diverses souches P.seudomonas, comprenant des souches isolées par voie clinique, à une concentration de 1,6 à 6,25,wg/ml. De plus, son activité élevée contre l'Escherichia coli résistant à la polymyxine B est le point le plus remarquable. De nombreuses bactéries Gram-positives, de nombreuses levures et de nombreux champignons sont également fortement sensibles à cet antibiotique. L'activité antibactérienne a été déterminée par le procédé suivant : divers microorganismes ont été inoculés dans des plaques d'agar-agar-infusion de coeur (ou, partiellement, milieu de Sabouraud) contenant l'antibiotique formé par le chlorhydrate de TM-743 suivant des concentrations graduelles et la concentration minima pour laquelle la croissance des microbes a été totalement inhibée a été déterminée. Le spectre antibactérien de l'antibiotique TM-743 ainsi obtenu est présenté dans le tableau suivant. La toxicité aiguë (DL50) du chlorhydrate de TM-743 visà-vis des souris, par injection intraveineuse, était 16 mg/kg. TARTi4AU Spectre antibactérien du TM-743 Microorganismes testés Concentration minima d'inhi bition ( / gXml) Escherichia coli 055 6,25 E. coli B 1,6 E. coli SC 8600 (résistant à la polymmxine B) 3,2 Klebsiella pneumoniae 6,25 Proteus vulgaris HX-l9 100 pseudomonas aeruginosa 171-3 1,6 Ps. aeruginosa ONB 1-1 1,6 Ps. aeruginosa GNB 1-2 3,2 Ps. aeruginosa GNB 1-3 6,25 Ps. aeruginosa GNB 1-4 6,25 Ps. aeruginosa KB-1 3,2 Ps. aeruginosa P-52 6,25 Ps. fluorescens ATCC 27 6,25 Ps. ovalis IAM 1236 12,5 Salmonella enteritidis 6,25 Shigella sonnei 6,25 Staphylococcus aureus 209P 25 St. aureus Smith 12,5 Bacillus subtilis PCI 219 12,5 Micrococcus lysodeikticus 0,8 Candida albicans 25 Les exemples suivants présentent des procédés pratiques pour réaliser la présente invention, sans aucune limitation. EXEMPLE 1 Le Bacillus circulans TM-743, conservé sur une partie inclinée dlagar-agar-infusion de coeur, a été inoculé dans un bouillon d'infusion de coeur traité à l'autoclave, en quantité de 100 ml, dans un ballon de Sakaguchi de 500 ml bouché par du coton. Après 24 heures de culture sur un agitateur à mouvement de va-et-vient à 300C, 5 ml de la culture ont été retirés et placés dans un ballon de Sakaguchi de 2 litres, bouché par du coton, contenant 500 ml du bouillon traité à l'autoclave à pH 7, qui se composait de 20 g de glycérol, de 5 g de farine d'avoine, de 7,5 de peptone, de 1,25 g d'extrait de levure, de 2 g de NH4C1, de 2,5 g de CaCO3 et d'eau distillée pour remplir jusqu'à 500 ml.La culture a été réalisée sur un agitateur à mouvement de va-et-vient, pendant 120 heures à 30C C. EXEMPLE 2 10 litres du bouillon cultivé obtenu dans l'exemple 1 ont été centrifugés pour retirer les cellules bactériennes. La partie surnageante à pH 7,0-7,4 a été introduite dans une colonne de 200 ml de produit dit Amberlite IRC-50, de type H+, lavée à l'eau distillée et éluée avec HCL 0,2N. Les fractions actives ont été neutralisées à travers le produit dit Amberlite IR-45 (type OH-), décolorées avec 1 ffi (en poids-volume) du produit dit Norit A, et concentrées jusqu'à 60 ml sous vide, en dessous de 500C. Par addition de 900 ml d'acétone au concentré, le précipité de la substance active a été obtenu. Le précipité a été rassemblé par centrifugation et séché sous vide. On a obtenu environ 4 g de poudre brute de TM-7543. EXEMPLE 3 1 gramme de la poudre brute du produit TM-743 obtenu dans l'exemple 2 a été dissou-s dans 10 ml d'eau distillée et soumis à une filtration sur du gel, à travers une colonne de 2 litres du produit dit Sephadex LH-20 avec de l'eau distillée. -La substance active a été éluée en plusieurs fractions au point correspondant à environ 1,3 litre. L'activité des fractions a été vérifiée par la réaction à la ninhydrine par un test microbiologique. Pour confirmer la pureté des fractions actives, la chromatographie sur couche mince a été réalisée sur du gel dit Kiesel (Merk) avec la couche supérieure du mélange de n-butanol, d'acide acétique et d'eau (4 : 1 : 3). Les fractions actives exemptes d'impuretés ont été concentrés en dessous de 500C sous vide jusqu'à 10 ml, réglées à un pH de 2 avec de l'acide chlorhydrique et additionnées de 150 ml d'acétone. Le précipité résultant a été rassemblé par centrifugation, lavé à l'acétone et à l'éther éthylique, successivement, et séché sous vide à 500C. On a obtenu environ 750 mg de poudre blanche amorphe de chlorhydrate de TM-743. La présente invention ntest pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'hêtre décrits, elle est au contraire susceptible de variantes et de modifications qui apparaetront à l'homme de l'art. REVENDICATIONS 1 - A titre de produit industriel nouveau, antibiotique dit TM-743 sous forme de son chlorhydrate, constitué par une poudre blanche ; ayant un point de fusion de 200-2200C ; contenant les éléments carbone, hydrogène, azote et chlore, suivant les valeurs d'analyse : C : 49,31, H : 8,19, N : 14,57, Cl : 12,10 ; comprenant de l'acide 2,4-diaminobutyrique, de la leucine, de la phénylalanine des acides gras en C8 et en Cg ; ayant un pouvoir rotatoire optique 11D23= -52 (C=1 %, eau) ; étant soluble dans l'eau, le méthanol, l'éthanol, le n-butanol contenant de liteau et le diméthylsulfoxyde, et insoluble dans l'acétone, l'acétate d'éthyle, le chloroforme, l'éther éthylique, le benzène et l'éther de pétrole ; donnant des réactions positives avec la ninhydrine et le biuret; présentant le spectre d'absorption dans l'ultraviolet, le spectre d'absorption dans l'infrarouge et le spectre de résonance magnétique nucléraire tels qu'indiqués respectivement sur les figures 1, 2 et 3 des dessins ci-joints. 2 - Procédé de production de l'antibiotique dit TM-743, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver la souche de microorganisme Bacillus circulans TM-743 (ATCC O 31154) dans un milieu de culture, à extraire le TM-743 ainsi produit à partir du milieu de culture, à l'aide d'un solvant organique, et à séparer le TM-743 de la solution d'extrait. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le Bacillus circulans TM-743 (ATCC nO 31154) est cultivé dans un milieu de culture aqueux contenant des sources de carbone et d'azote assimilables, à une température de 3O-350C > pendant 72-120 heures. 4 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le solvant organique est un alcool inférieur, non miscible avec l'eau. 5 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le TM-743 est séparé de la solution extraite par évaporation sous vide du solvant d'extraction.