Brevet FR2273280A1 — publié le 19751226

La présente invention, qui est le fruit des travaux effectuées par l'institut Pasteur, concerne le domaine de la dé termination des quantités d'antigènes ou d'anticorps présents dans certains milieux biologiques. L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé pour la mesure de faibles concentrations d'an tigènes ou d'anticorps par une technique quantitative d'immunodif- fusion en gel, faisant appel à des enzymes, ainsi que les produits spécialement destinés à la mise en oeuvre dudit procédé. L'homme de l'art connait déjà la technique dtim- munodiffusion radiale simple. Cette méthode a notamment été décrite par Mancini G., Carbonara A.O. et Heremans J.H. (1965) Immunochemistry 2, 235, ainsi que par Fahey J.L. et McKelvey E.M. (1965), J. Immun., 94, 84. Une telle technique est couramment utilisée pour des mesures immunochimiques quantitatives drun grand nombre d'antigènes dans les fluides physiologiques. Cependant, cette méthode usuelle en biologie chimique n'est pas suffisamment sensible pour do ser-certaines protéines dont les-concentrations sont trop faibles. En vue d'accroître la sensibilité de ce procédé, on a déjà proposé d'utiliser des anticorps radiomarqués : voir par exemple Rowe D.S. (1969), Bull. Wld. Hlth. Org., 40, 613, ainsi que Jalanti R. et Henney C.S. (1972) J. Immun. Meth., 1, 123. Pour mesurer l'antigène on incorporait directement l'anticorps marqué dans un gel d'agarose (méthode directe) ou bien, en variante, on faisant d'abord réagir l'antigène et un antisérum non marqué et ensuite on incubait les plaquettes avec un anticorps marqué dirigé contre les immunoglobu- lines de l'antisérum (méthode indirecte). Pour rendre visible la radioactivité associée avec les précipités immuns spécifiques, on exposait les plaquettes à une pellicule photographique ou bien on découpait par poinçonnage les zones entourant les puits et on mesurait la radioactivité.En variante, pour augmenter la sensibilité d'une diffusion radiale simple ou d'une électro-immunodiffusion, on a u utilisé des protéines marquées à la fluorescéine ou à la peroxydase. A titre de référence bibliographique pertinente, on citera par exemple les articles de Centifanti Y.M. et Kaufman H.E. (1971), J. Immun., 107,608, ou de Stanislawski M. (1970) C.R. Acad. Sc. Paris Série D, 271, 1452. A titre de méthode quantitative d'immunodiffu- sion en gel, on connaît également une technique utilisant l'électrophorèse, qui est décrite par C.B. Laurell sous le titre "Electro- immuno Assay" dans Scandinavian J. Clin. Lab. Invest. Vol. 29 Suppl. 124 (1972). Selon cette méthode, on prépare une plaquette de gel d'agarose dans lequel on introduit l'anticorps. On place ensuite l'antigène dans des puits separés de la plaquette puis on soumet la plaquette à une électrophorèse en appliquant une différence de potentiel de part et d'autre de la plaquette. La présence dtun précipité est mise en évidence par un pic, dont la hauteur est une mesure de la réaction antigène-anticorps, et par conséquent de la concentration d'antigène. La présente invention a pour objet un procédé général pour la mesure de faibles concentrations d'antigènes, qui utilise des anticorps marqués par des enzymes. L'invention concerne donc un tel procédé, qui fait appel à une technique connue quantitative d'immunodiffusion en gel, avec marquage d'anticorps, ou d'antisérum contenant ces derniers, et mise en évidence de la réaction anticorps-antigène pat immunodiffusion, ce qui fournit un moyen d'évaluation de la quantité d'antigènes présents dans le milieu réactionnel;; ledit procédé étant caractérisé en ce que, à titre de substance pour le marquage des anticorps, on utilise au moins une enzyme à haute activité spécifique, stable à la température ambiante, conservant la plus grande partie de son activité après couplage avec l'anticorps, capable d'être mise en évidence consécutivement par une méthode histochilique ou biologique, telle que la glucose oxydase ou la phosphatase alcaline, on ce qu'on couple/ladite enzyme et le ou les anticorps avec un agent de pontage, de préférence bifonctionnel, tel que le glutaraldéhyde, et en ce qu'on effectue une coloration sur plaquette de l'enzyme ainsi couplée, lesdites plaquettes convenant pour la mesure de la concen- tration d'antigènes correspondant aux anticorps marqués, par une technique quantitative d'immunodiffusion en gel directe ou indirecte. Grâce au procédé de l'invention, qui utilise des anticorps marqués avec une enzyme, on augmente très largement la sensibilité de la technique connue d'immunodiffusion quantitative et éventuellement qualitative. I1 devient ainsi possible de doser les protéines présentes en faibles concentrations dans les li quides biologiques, par exemple le liquide céphalorachidien, la salive, l'urine, le liquide intestinal, le sérum, entre autres. A titre illustratif, le procédé de l'invention est spécialement approprié pour la quantification des IgE, des IgD de lta-foetopro- téine, de l'antigène carcino-embryonnaire, de la protéine C réactive (CRP), notamment.On notera que les abréviations IgE, IgD, etc... sont utilisées dans le présent mémoire, ainsi qu'il est recommandé par les règlements internationaux et l'O.M.S. Le procédé de 1' invention peut également trouver des applications pour le dosage précoce des IgA et des IgM du nouveau né (diagnostic des infections intra-utérines), ainsi que pour l'évaluation des immunoglobulines dans les cas d'hypogamma-globulinémies. Bien entendu, le procédé de l'invention, tel qu'il vient d'être défini, peut également être appliqué au dosage quantitatif des anticorps présents dans un liquide biologique tel qu'un sérum. Dans ce cas, on marque ou couple ltantigbne avec l'une des enzymes décrites précédemment, on effectue la coloration sur plaquette de l'enzyme et on utilise ladite plaquette par une technique quantitative dtimmunodiffusion en gel pour la mesure de la concentration d'anticorps correspondant à l'antigène marqué. A titre d'enzymes convenant pour le couplage avec les anticorps ou les antigènes, on utilise avec avantage la glucose oxydase (1.1.3.4.; Aspergillus niger) et la phosphatase alcaline (3.1.3.1.; Escherichia coli). De telles enzymes sont aisèment disponibles à partir de sources diverses. Des sources convenables de glucose oxydase sont les microorganismes Aspergillus Niger, Penioillium aaagasakienses ou Penicillium notatum, ainsi que le miel. La glucose-oxydase est actuellement une enzyme disponible dans le commerce. La phosphatase alcaline peut être obtenue à partir du lait, du foie et des intestins des bovins, ainsi que des microorganismes E. Coli ou Neurospora crasse. Elle est également disponible dans le commerce. Pour le couplage des anticorps, des antisérums ou des antigènes avec les enzymes, on utilise selon l'invention des moyens connus, à savoir une réaction de pontage ou de réticulation avec, de préférence, un agent bifonctionnel, tel que le gluta- raldéhyde. Un exemple d'une telle technique de couplage ou de conjugaison est décrite par Avrameas S. - et Ternynck T. (1969) Immunochemistry, 6, 53. Des agents de réticulation autres que le glutaraldéhyde, notamment les carbodilmides hydrosolubles, le tolylène diiso thiocyanate, la difluorodinitro phénylsulfone, conviennent également. Selon l'invention, une fois qu'on a obtenu les anticorps ou antigènes marqués par une enzyme, on les utilise pour mettre en évidence les précipités spécifiques antigène-anticorps formés soit par une méthode directe, soit par une méthode indirecte. Cette technique est réalisée selon des moyens connus, auxquels il a été fait allusion dans l'introduction du présent mémoire et qui seront illustrés plus en ddtails dans la suite de la description, en référence aux exemples de mise en oeuvre du procédé de l'inten- tion. Selon l'invention, on utilise ensuite une technique eonnue de coloration des enzymes sur des plaquettes humides ou séchées, le plus avantageusement par coloration histochimique. De telles techniques sont notamment décrites par Pearse A.G.S. (1961) Histochemistry Thoorical and Applied (Churchill, London). Après coloration des plaquettes, celles-ci sont lavées et séchées. On obtient ainsi des plaquettes porteuses d'enzymes coloréoi qui peuvent être mises en oeuvre pour la quantification d'antigènes et de protéines ou d'anticorps. L'invention concerne donc également, à titre de nouveaux produits, les produits destinés à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, lesdits produits étant notaiment sous forez de plaquettes et carac/térisés en ce que lesdites plaquettes contiennent des enzymes telles que la glucose oxydase et la phosphate tase alcaline, couplées à des anticorps ou à des antisérums entiers, par des agents de pontage ou de réticulation, tels que le glutaraldéhyde. Les plaquettes qui viennent titre définies conviennent pour une mesure par la méthode directe d'immunodiffusion en gel. Il suffit de prévoir complémentairement un colorant, qui servira de révélateur lors de l'analyse. Bien entendu de telles plaquettes peuvent être livrés séparément ou sous forme d'un ensemble avec leur colorant spécifique, en vue des analyses conformes au procédé de l'invention. Pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention par la méthode indirecte d'immunodiffusion en gel, il convient de disposer (1) de plaques-support, en général des plaques de verre, sur lesquelles a été coulé un gel d'agar ou d'agarose et qui contiennent l'antieorps ou l'antisérum dans des puits individuels,(2) (2) d'échantillons d'antigènes normalisés, par exemple sous forme liquide ou lyophilisée, (3) d'anticorps marqués par une enzyme conformé- ment à 1 enseignement de la présente invention, qui peuvent notamment titre présentés sous forme liquide dans des ampoules scellées et (4) d'un colorant spécifique enzymatique. Bien entendu, slil s'agit d'effectuer des mesures de la concentration d'anticorps, tels que ceux contenus dans un antisérum, les produits destinés à la mise en oeuvre du procédé de l'invention seront adaptés en conséquence. Pour la méthode directe d'immunodiffusion en gel, les plaquettes contiennent des enzymes couplées à des antigènes. Pour la méthode indirecte, il conviendra de disposer de plaques-support avec gel contenant l'antigène dans des puits individuels, d'anticorps normalisés, ainsi que d'antigènes marqués par une enzyme. La glucose oxydase esssspécialement satisfaisante, car, lors de 1 'analyse par immunodiffusion, elle donne une coloration plus intenses avec un bruit de fond plus faible que la phosphatase alcaline. Conformément à l'enseignement de la présente in vention1des fractions de gamma-globulines d'antisérum ou des anticorps spéeifiquement isolés ont été marqués par la glucose oxydase, la phosphatase alcaline ou, à titre de comparaison, la peroxydase, et les compositions obtenues ont été comparées pour en déterminer l'aptitude à augmenter la visibilité des précipités immuns dans la technique de diffusion radiale simple. On a trouvé que la glucose oxydase et la phosphatase alcaline étaient pareillement sensibles, bien qu'on ait obtenu des résultats plus satisfaisants avec lten- zyme citée en premier lieu, alors que la peroxydase fournissait des résultats beaucoup moins satisfaisants.En effet, dans ce dernier cas, il n1 était pas possible de mesurer des concentrations faibles d'antigène. En vue de la révélation de l'activité enzymatique (coloration histochimique des plaquettes), on peut utiliser des réactifs connus. Pour la mise en évidence de la glucose-oxydase, on fera par exemple appel à un sel de tdtrazolium, ou à la 3,3'diaminobenzidine associée à la peroxydase. Dans le cas de la phosphatase alcaline, on peut utiliser un ester phosphorique de naphtol, tel que le naphtol - AS-MX-phosphate, en présence d'un sel de diazonium La description qui suit est relative à des modes de réalisation illustratifs du procédé de l'invention et des produits susceptibles d'entre mis en oeuvre en vue de l'analyse en biologie clinique. Dans les essais ci-après on a utilisé, à titre d'antigènes, un sérum humain de référence contenant des quantités connues de IgG, IgA et IgM. On a isolé l'IgG de souris sur la cellulose DEAE selon la méthode de Levy et Sober [ Levy H.B. et Sober H.A. (1960), Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 103, 250j, et on a déterminé sa concentration par la réaction au bluret. On a purifié la ribonucléase pancréatique bovine par chromatographie.L'a- foeto-protéine de rat a été purifiée par chromatographie dehangeu- se et par immunoadsorption selon la technique de Aussel C., Uriel J. et Mercier-Bodard C. (1973) Biochimie, 2, 1431. On a obtenu par la technique d'immunisation classique les antisérums de lapins aux IgG, IgM et IgA huins. On a déterminé la spéciricité par double diffusion et immuno-électro- phorèse en utilisant du sérum humain normal. L'antisérum de lapin à l'a-foeto-protéine de rat a également été préparé de manière usuelle. On a obtenu tous les autres antisérums utilisés pour la présente étude en injectant aux lapins ou aux brebis les antigènes correspondants, en se conformant aux procédés d'immunisation déjà décrits, par exemple par Avrameas S (1969), Immunochemistry, 6, 43. On a préparé les fractions de gamma-globuline à partir des antisérums par précipitation dans une solution à 40% de sulfate d'ammonium. On a isolé les anticorps à partir des antisérums entiers en utilisant les immunoadsorbants correspondants préparés avec du glutaraldéhyde voir Avrameas S/ et Ternnnck T. (1969), Immunochemis- try, 6, 53; et Ternynck T. et Avrameas S (1972), F.E.B.S. Letters 23, 24]. On a conjugué les anticorps isolés et les frac- tions de gamma-globuline provenant des antisérums aveo la glucose oxydase d'Aspergillus Niger (Boehringer-Mannheim, Allemagne Fédéra- le, qualité I; 210 unités/mg), avec la phosphatase alcaline de E. Coli. tWorthington, New Jersey, 10 unités/mg) et avec la peroxydase de raifort (Boehringer-Mannheim, qualité I; RZ = 3) en utilisant du glutaraldéhyde en qualité d'agent de réticulation. Le couplage a été réalisé selon la technique décrite par Avrameas S. (1969) Immunochemistry, 6, 43. Après le couplage, on a filtré les préparations à travers des filtres "Millipore" stériles de 0,22 micron et on a emmagasiné à 4 C. On a effectué une coloration histochimique des enzymes sur des plaquettes séchées pendant 2 heures à la température ambiante, par des moyens déjà connus J Pearse A.G.E. (1961), Histochemistry Theorieal and Applied (Churchill, London)j. On a utilisé un sel de tétrazolium réactif pour la coloration de la glucose oxydase [Avrameas S. (1969) Immunochemistry, 6, 43] ; un naphtol-AS-phosphate réactif pour la phosphatase alcaline [Avra- meas S., Taudou B., et Ternvnck T. (1971) Int. Arch. Allergy, 40 l6lJet la 3,3 -diamino-benzidine pour la peroxydase [Graham R. et Karnovsky M.S. (1966) J. Cytochem, X, 291]. Après coloration des plaquettes, on les a lavées dans plusieurs quantités d'eau distillée et on a séché. Dans des essais complémentaires, on a egale- ment utilisé la 3,3' -diamino-benzidine associée à la peroxydase pour révéler l'activité de la glucose oxydase. Les essais ont fait appel à la technique d'analyse par diffusion radiale simple soit par voie directe soit par voie indirecte. 1) Voie directe On a dilué la préparation conjuguée (anticorps ou fraction de gamma-globulines avec marquage à l'enzyme) dans une solution saline tamponnée au phosphate à concentration double 0,30 M de NaCl, 0,02 M de tampon de phosphate de potassium à pH 7,4, 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) et du merthiolate en qualité d'agent de conservation à raison de 1/2500). On a mélangé une partie aliquote de cette solution avec un volume égal d'une solution i-2% d'agarose fondue dans l'eau distillée. On a mélangé le contenu du tube par inversion et on a laissé aurepos pendant quelques minutes à 48 C dans un bain-marie. On a versé ensuite le mélange entre deux plaques de verre (8,5 x 10 cm) séparées d'une distance de 1,5 mm à l'aide d'une armature.Avant utilisation, on a revêtu l'une des plaques avec la solution à 2% d'agarose et on a séché à 1000C. On a laissé le gel se solidifier et on a enlevé doucement la plaque non revêtue en la faisant glisser. On a découpé des puits de 2,3 mm de diamètre dans le gel d'agarose à l'aide d'un tire-bouchon et on les a remplis avec 5 microlitres d'une dilution appropriée de l'antigène dans la solution saline tamponnée au phosphate contenant 0,5 de BSA. On a laissé la diffusion se poursuivre pendant 48 heures à température ambiante dans une chambre humide. On a lavé les plaquettes à 40C pendant 30 à 35 heures avec des quantités importantes de solution tampon phosphate (PBS) en changeant la liqueur de lavage plusieurs fois. Après lavage, on a séché par souf- flage et on a révélé l'activité enzymatique par incubation dans un milieu approprié. 2) Voie indirecte On a incorporé l'antisérum entier ou les anticorps isolés mais non arqués dans le gel d'agarose fondu et on a préparé les plaquettes de la façon décrite plus haut. Le temp-s nécessaire à la diffusion dépend de la nature de l'antigène utilisé et ce temps varie entre 24 et 72 heures. Après diffusion, on a lavé les plaquettes pendant 3 heures à température ambiante dans PES et on a incubé dans une position inversée au sein d'une composition d ' anticorps diluée de façon appropriée et marquée à l'enzyme (5 à 20 microgrammes d'anticorps par ml). On a dirigé cet anticorps marqué contre l'espèce d'Ig initialement incorporée dans le gel.Deux heures après, on a enlevd le milieu d'incubation et on a soumis les plaquettes à une post-incubation pendant 16 heures à températu- re ambiante dans une chambre humide. On a lavé les plaquettes pen- dant 20 heures à 4 C avec plusieurs quantités de PBS, on a séché et on a coloré pour révéler l'activité enzymatique. Résultats Pour comparer l'efficacité des diverses préparations d'anticorps en vue d'une détermination quantitative d'antigène par la méthode directe ou la méthode indirecte, on a utilisé un système de IgG de souris et IgG d'anticorps de brebis. On a marqué avec enzyme choisie des dilutions variées d'anticorps isolés de brebis à IgG de souris et on a incorporé chaque dilution dans des'gels d'agarose. Les puits reçoivent des concentrations différentes de IgG de souris sous forme d'aliquotesde 5 microlitres.Après avoir laissé la diffusion se poursuivre à température ambiante pendant 48 heures, on a lavé les pla quartes, on a séché et on a coloré pour les protéines avec le bleu brillant de Coomassie, on a révélé également par l'activité enzymatique en utilisant des substrats appropriés} et on a mesuré ensuite les aires des précipités immuns spécifiques ainsi colorés La concentration minimale des anticorps nécessaire pour obtenir la coloration des protéines d'un type visible et mesurable était de 4,5 microgrammes par ml de gel, alors que pour la coloration enzymati- que, il suffisait de 0,25 microgramme d'anticorps marqués à la glucose oxydase ou à la phosphatase alcaline par ml de gel (voir tableau I).La plus petite concentration de IgG de souris qu'on pouvait déterminer par coloration protéinique était de 3 microgrammes/ ml alors que la coloration à la glucose oxydase ou à la phosphotase alcaline permettait la détermination de 0,15 microgramme/ml (tableau I). Ainsi, l'utilisation d'anticorps marqués à la glucose oxydase ou à la phosphatase alcaline a permis d'augmenter la sensibilité du système de vingt fois. Dans les conditions mises en oeuvre (concentration d'anticorps 0,25 microgramme/mI, 48 heures de diffusion), quand on porte sur un graphiquele diamètre de l'vanneau de précipitation ramené à un carré en fonction de la concentration d'IgG de souris, le rapport obtenu est linéaire entre 0,15 et 1,5 microgramme/ml.Des estimations répétées de la concentration d'antigène faites à des jours différents font ressortir des variations inférieures à 15% Bien que les anticorps marqués à la glucose oxydase ou a la phosphatase alcaline soient dtune sensibilité étale, le premier couple s'est révélé plus satisfaisant. Les aires des précipités immuns, colorées en bleu par la glucose oxydase, sont plus nettement définies et donc plus faciles à mesurer que les aires colorées en rouge avec la phosphatase alcaline. De plus, avec enzyme mentionnée en premier lieu, la coloration de fond sur les plaquettes était moins prononcée qu'avec la seconde enzyme. Les anticorps marqués à la peroxydase étaient moins efficaces que ceux marqués la glucose oxydase ou à la phosphatase alcaline, étant donné qu'avec cette préparation, on ne pouvait détecter que 0,6 mi crogramme/ml de IgG (Tableau I). Les résultats obtenus avec utilisa tion de fractions de gamma-globuline marquées à l'enzyme provenant de l'antisérum de brebis à l'IgG de souris, au lieu d'anticorps isolés, étaient moins satisfaisants. Avec des préparations de ce genre, même après un lavage poussé, on constate une forte colora- tion de fond, ce qui empêche de mesurer le diamètre des précipités immuns. Etant donné qu'avec la méthode directe, on obtient les meilleurs résultats quand on utilise les anticorps marqués avec la glucose oxydase, on a utilisé cette enzyme comme produit de marquage pour les tests effectués par la méthode indirec- te. On a incorporé des dilutions variées d'anticorps isolés de brebis dans les gels d'agarose et on a rempli les puits avec 5 mi crolitres de dilutions différentes d'IgG de souris. Après diPu- sion et lavage, on a incubé les plaquettes dans une solution contenant des anticorps de lapins anti-IgG de brebis marqués à la glucose oxydase.On a lavé et on a coloré.La concentration minimale d'anticorps dans le gel assurant une coloration suffisante pour permettre le mesure des aires du précipité immun était de 0,25 mierogramme/ml. Dans ce cas, la concentration minimale d'IgG de souris qu on pouvait déterminer était de 0,15 microgramme/ml (Tableau I). I1 semble donc que la méthode directe et la méthode indirecte assurent le même intervalle de sensibilité pour la déter mination des antigènes. Cependant, on a constaté que la méthode indirecte ne nécessitait pas d'incorporation d'anticorps isolés dans le gel ; on peut aussi bien utiliser des antisérmms entiers. De plus cette technique a donné des résultats satisfaisants en l'absence d'une coloration de fond si l'on utilise des fractions de gamma-globuline d'antisérums marquées à a glucose oxydase au lieu d'anticorps isolés et marqués. Etant donné que la méthode indirecte offre des avantages par rapport à la méthode indirecte, on l'a utilisée pour la détermination quantitative du nombre d'antigènes. On a incorporé des antisérums entiers de lapins ayant des spécificités différen- tesrdans le gel et on a effectué l'examen visuel des pr9eipit8s im- muns spécifiques en utilisant des anticorps de brebis anti-IgG de lapins avec marquage à la glucose oxydase. Les résultats sont ré- sumés dans le tableau II. Le tableau II indique que la coloration enzymatique permet la détermination de plus petites quantités d'antigène que ce n'est le cas avec la coloration par protéines et, selon la nature du système antigène/anticorps utilisé, on aboutit à une amélioration de la sensibilité de 8 à 20 fois. Le procédé de l'invention qui fait utilisation d'anticorps marqués par des enzymes procure la même sensibilité que les procédés décrits pour des anticorps marqués à ltiode radioactif g Rowe D.S. (1969), Bull. Wid. Hlth, Org., 40,613 ; ou Jalanti R. et Henney C.S. (1972) J. Immun. Meth., 1, 123], étant donné que par les deux procédés, on peut détecter et déterminer des quantités similaires d'IgG humain (160 à 200 ng/ml).Cependant, les anticorps marqués aux enzymes selon l'invention sont d'une manipulation plus facile et plus sQre que les anticorps marqués à l'iode radioactif et après un stockage sous forme de solutions stériles, on peut les utiliser pendant au moins une année alors que les anticorps marqués par l'iode radioactif ne peuvent pas être utilisés pendant des périodes prolongées. TABLEAU I Comparaison des sensibilités des titrages d'immuno-diffusion radiale simple pour la détermination quantitative de l'IgG de souris Préparation de Développement de Concentration Concentration l'anticorps la visibilité de d'anticorps minimale mesu : l'anneau du pré- : ( g/ml) : rable d'IgG cipité ( g/ml) :IgG de brebis an- : coloration par : 4 > 5 : 3,0 ti-souris protéine :IgG de brebis an- : coloration par : 4,5 : 3,0 :ti-souris qu'on : protéine fait suivre par IgG de lapin anti-: brebis (30 g/ml) TABLEAU I (suite) Comparaison des sensibilités des titrages d1immuno-diffusion radiale simple pour la détermination quantitative de l'IgG de souris Préparation de Développement de Concentration Concentration l'anticorps la visibilité de d'anticorps minimale mesu l'anneau du pré- ( g/ml) rable d'IgG cipité ( g/ml) IgG de brebis anti coloration 0,25 0,15 souris marqué par enzymatique glucose oxydase IgG de brebis an- coloration 0,25 0,15 ti-souris avec enzymatique marquage par phos phatase alcaline IgG de brebis anti coloration 2,0 0,6 souris avec mar- enzymatique quage par pero xydase IgG de brebis an- coloration 0,25 0,15 ti-souris qu'on enzymatique fait suivre d'IgG de lapin anti brebis avec mar quage par glucose oxydase (5 g/ml) TABLEAU II Détermination quantitative des antigènes parcoloration à la glucose-oxydase ou à la proté- ine lors d'une immunodiffusion radiale simple(+) Antigène Développenent de Dilution de Concentration la visibilité de l'antisérum minimale d'an l'anneau de spécifique tigène( g/ml) précipitation dans la pla quette :IgG humain : coloration par : 1/250 ; 2,0 : proteine coloration enzymatique 1/4000 0,2 TABLEAU II suite Détermination quantitative des antigènes par coloration à la glucose-oxydase ou à la protéine lors d tune immunodiffusion radiale simple (*) :Antigène Développement de Dilution de :Concentration : : :la visibilité de :l'antisérum minimale d'an-: l'anneau de pré- spécifique tigène ( g/ml) cipitation dans la pla quette :IgG humain : coloration par : 1/600 : 3,0 protéine : : coloration : 1/4000 : 0,4 : : enzymatique IgM humain : coloration par : 1/1200 : 6,0 protéine coloration 1/4000 0,7 enzymatique &alpha;-foeto-protéine coloration par 1/500 1,3 : de rat : protéine : : coloration : 1/8000 : o,080 enzymatique : RNase : coloration par : 1/5000 : 0,3 protéine : : coloration : : enzymatique : 1/60000 : 0,015 (*) la méthode indirecte a été utilisée. REtWENDICATIONS 1. Procddé pour la mesure de faibles concentrations d'antigènes par une technique connue quantitative d'immunodiffusion en gel, avec marquage d'anticorps, ou d'antisérums contenant ces derniers, et mise en évidence de la réaction anticorpsantigène par immonodiffusion, ce qui fournit un moyen d'évaluation de la quantité d'antigènes présents dans le milieu réactionnel, ledit procédé étant caractérisé en ce que, à titre de substance pour le marquage des anticorps, on utilise au moins une enzyme à haute activité spécifique stable à la température ambiante, conservant la plus grande partie de son activité après le couplage avec 1' anti- corps, capable d'être mise en évidence consécutivement par une méthode histochimique ou biologique, telle que la glucose oxydase ou la phosphatase alcaline, en ce qu'on couple ladite enzyme et le ou les anticorps avec un agent de pontage, de préférence bifonctionnel, tel que le glutaraldéhyde, et en ce quton effectue une coloration sur plaquette de l'enzyme ainsi couplée, lesdites plaquettes convenant pour la mesure de la concentration dtantigbnes, correspon- dant aux anticorps marqués, par une technique quantitative d'immonodiffusion en gel, directe ou indirecte 2.Procédé pour l'obtention de réactifs utilisables dans le procédé selon la revendication 1, selon la technique d'imnmunodiffusion en gel, directe ou indirecte, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'on utilise, pour le marquage des anticorps ou des antisérums contenant ces derniers, au moins une enzyme à haute activité spéeifique,stable à la température ambiante,conservant la plus grande partie de son activité après le couplage avec 1'anticorps, capable d'être mise en évidence consécutivement par une md- thode histochimique ou biologique, telle que la glucose oxydase ou la phosphate alcaline, en ce quton eouple ladite enzyme et le ou les anticorps avec un agent de pontage, de préférence bifonctionnel, tel que le glutaraldéhyde, en ce qu'on effectue une coloration sur plaquette de l'enzyme ainsi couplée, lesdites plaquettes convenant comme produitsréactirs a' immunodiffusion. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, en vue du dosage quantitatif d'anticorps présents dans un fluide biologique, tel qu'un sérum, caractérisé en ce qu'on marque ou couple l'antigène avec une enzyme telle que définie, on effectue la coloration sur plaquette de Enzyme et on utilise ladite plaquette par une technique quantitative d'immunodiffusion en gel, ce qui permet la mesure de la concentration des anticorps correspondant à l'antigène marqué. 4. Produits pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1 et/ou obtenus par le procédé selon la revendication 2, lesdits produits étant utilisables comme réactifs pour une technique analytique d ' immunodiffusion en gel, en vue de la détermination de la quantité d'antigènes contenus à de faibles concentrations dans un fluide blologique, lesdits produits étant notamment sous forme de plaquettes et caractérisés en ce que lesdites plaquettes contiennent des enzymes, telles que la glucose oxydase et la phosphatase alcaline, couplées à des anticorps ou à des antisérums entiers par des agents de pontage ou de réticulation, tels que le glutaraldéhyde. 5. Produits selon la revendication 4, caractérisés en ce qu'ils sont présentés séparément ou sous forme dtun ensemble comprenant lesdites plaquettes et, conjointement, un colorant spécifique enzymatique, en vue de l'analyse par une méthode directe d'immunodirfusion en gel. 6. Produits pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont présentés en vue de ltanalyse par une méthode indirecte dtimrunodiffusion en gel sous forme d'un ensemble comprenant (1) des plaques-supports, en général des plaques de verre, sur lesquelles a été coulé un gel d'agar ou d'garose et qui contiennent l'anticorps ou l'antisérum dans des puits individuels(2) des échantillons d'antigènes norma- lisés, (3) des anticorps marqués par une enzyme qui peuvent notam- ment être présentés sous forme liquide dans des ampoules scellées, et (4) un colorant spécifique enzymatique. 7. Produits selon l'une des revendications 4 ou 5, pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 3, caractérisésen ce que les plaquettes contiennent des enzymes couplées à des antigènes. 8. Produits selon la revendication 6,pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 3, caractérisés en ee qu'ils sont présentés sous forme d'un ensemble comprenant des plaques-support avec gel contenant l'antigène dans des puits individuels, des anti-corps normalisés, des antigènes marqués par une enzyme et un colorant enzymatique. 9. Produits selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, caractérisés en ce que les enzymes couplées avec les anticorps sont la glucose oxydase (1.1.3.4 ; Aspergillus niger) ou la phosphatase alcaline (3.1.3.1.; Escherichia coli). 10. Produits selon l'une quelconque des revendications 4 à 9, caractérisésen c3 que les enzymes sont couplées avec les anticorps ou avec les antisérums ou encore avec les antigènes par un agent de pontage ou de réticulation, de préférence bifonctionnel, tel que le glutaraldéhyde, les carbodiimides hydrosolubles, le tolylène-diisothiocyanate, la difluorodinitro phdnyl- sulfone, et de préférence le glutaraldéhyde. ll. Produits selon l'une quelconque des revendications 4 à 10, caractérisés en ce que l'enzyme est la glucose oxydase et le colorant enzymatique est un sel de tétrazolium ou la 3,3'-diaminobenzidine associée à la peroxydase. 12. Produits selon l'une quelconque des revendications 4 à 10, caractérisés en ce que l'enzyme est la phosphata- se alcaline et le colorant enzymatique est un ester phosphorique de naphtol, tel que le naphtol -AS-MX-phogphate, en présence d'un sel de diazonium. 13. Application du procédé selon la revendiea- tion 1 au dosage des protéines présentes en faibles concentrations dans les liquides biologiques, par exemple le liquide céphalo-rachi- dien, la salive, l'urine, le liquide intestinal, le srui, entre autres. 14. Application selon la revendication 13, pour la quantification des IgE, des IgD, de l'a-foetoprotéine, de l'antigène carcino-embryonnaire, de la protéine C réactive (CRP), notam- ment. 15. Application du procédé selon la revendica- tion 1 pour le dosage précoce des IgA et des IgM du nouveau-né (diagnostic des infections intra-utérines), ainsi que pour l'évaluation des immunoglobulines dans les cas d'hypogammaglobullinémies. 16. Application du procédé selon la revendication 3, pour la quantification d'anticorps présents dans un fluide biologique, tel qu'un sérum. 17. Application des produits selon l'une quelconque des revendications 4 à 12 au dosage des antigènes et des protrines, ou des anticorps contenus à de faibles concentrations dans les fluides biologiques. 18. Application selon la revendication 17 réalisée en vue du diagnostic.