Brevet FR2275220A1 — publié le 19760116

La présente invention a trait à un procédé d'obtention de sels organiques de la S.adénosyl-L-méthionine (S.A.M.), ainsi qu'à ces nouveaux sels organiques de la S.adénosyl-L-méthionine. L'invention a également trait aux médicaments comprenant de tels nouveaux sels. On sait que la S.adenosyl-L-méthionine est un composé biologique très important susceptible de jouer le rible, soit de donneur de méthyle dans de nombreuses réactions de transméthylations enzymatiques soit de donneur de groupe amino-propyle après décarboxylation enzymatique. I1 existe actuellement trois procédés principaux de préparation de la S.adénosyl-L-méthionine Le premier consiste à en faire la synthèse chimique (J.BADDYLEY, G.A. JAMIESON J. chem. Soc 1955 1085). Cette synthèse s'effectue par méthylation de la S.adénosyl-L-homocystéine par l'iodure de méthyle. Cette technique nécessite la préparation préalable de la S.adénosyl-L-homocystéine qui est un composé difficile à obtenir et ce procédé ne présente donc pas un intérêt industriel. Le deuxième prédé consiste à effectuer la synthèse enzymatique correspondant à l'activation de la L-méthionine par l'adeno- sine triphosphate en présence d'un enzyme purifié contenu dans le foie (G-L CANTONI Methodes in Enzymology 1957. 3. 600). Ce procédé nécessite la préparation d'un enzyme difficile à obtenir en grande quantité et de plus, comme le procédé précédent, il conduit à un mélange racémique des deux formes L et D difficilement séparables alors que seule la forme L est utilisable comme cofacteur de la Catechol-O-méthyle transférase nécessaire pour les réactions de transméthylations. Le troisième procédé consiste à effectuer une extraction suivie d'une purification à partir de levures (SCHLENK et Coll Enzymologia 1965 29 283). Un tel procédé a également déjà été décrit dans la demande de brevet allemand publiée DOS 1.803.978 dans lequel il consiste à préparer du bisulfate de S.adénosyl-L-méthionine par extraction de levures à l'aide d'une résine cationique suivie d'une élution à l'acide sulfurique et d'une précipitation par l'acide picrique et/ou une addition d'acide borique suivie d'une chromatographie. Le procédé général consistant à extraire le produit recherché à partir des levures parait être actuellement le plus intéressant et la présente invention se propose de fournir un nouveau procédé de préparation à partir de levures permettant d'obtenir, par des moyens simples des sels organiques intéressants de la S. adénosyl-L-méthionine sous forme particulièrement pure. L'invention a pour objet un procédé de préparation de S. adé nosyl-L-méthionine (S.A.M.), dans lequel on lyse une levure contenant de la S.A.M., on fixe la S.A.M. sur un échangeur cationique, on élue la S.A.M. fixée par un acide et on effectue une concentration de la S.A.M. éluée, caractérisée par le fait qu'on effectue l'élution à l'aide d'un acide organique approprié, à la suite de quoi on précipite le sel organique formé par un solvant organique. Les acides intéressants sont des acides organiques possédant les caractéristiques suivantes : ce sont des acides dicarboxyliques ou bien ils ont un pk al compris entre 2 et 4 ou bien un pH en solution 0,1 M inférieur à 2,4, lesdits acides étant solubles dans un au moins des solvants tels que l'alcool, l'acétone, le méthanol ou généralement les solvants polaires, leurs sels étant par contre insolubles. Parmi les acides organiques utilisables on obtient des résultats particulièrement avantageux avec les acides tricarboxyliques tels que l'acide citrique, dicarboxyliquestels que les acides tartrique, malique, et les acides non carboxyliques tels que l'acide ascorbique. Conformément à l'invention la molarité de la solution d'acide organique est avantageusement comprise entre 1 M et 2 M,le pH lors de l'élution étant compris entre 1 et 3. L'invention a également pour objet les nouveaux sels organiques de la S.adénosyl-L-méthionine obtenus par le procédé selon l'invention, et notamment les citrates, tartrates, malates et ascorbates. Les sels sont obtenus avec une très grande pureté de plus de 90 %. L'invention a également pour objet de nouveaux médicaments caractérisés par le fait qu'ils contiennent un sel organique de la S.adénosyl-L-méthionine, de préférence sous forme de citrate, malte tartrate ou ascorbate. Les sels sont solubles dans l'eau et insolubies dans l'alcool et la plupart des solvants organiques. Dans une première forme de réalisation le médicament ne comporte en tant que principe actif, que le sel organique de la S.A.M., accompagné éventuellement d'un corps inactif. Dans une deuxième forme de réalisation, ce médicament se présente sous forme d'une composition pharmaceutique contenant une quantité dosée de sel organique de S.A.M. et d'un ou plusieurs autres produits actifs. Parmi ces derniers on peut notamment associer la S.A.M, l'enzyme catechol-O-méthyle-transférase (C.O.M.T.), le rapport des quantités de S.A.M. par rapport à cet enzyme étant de préférence de 10 à 20 mg de sel organique de S.A.M. pour 0,1 1 milli Unité Internationale de C.O.M.T. La dose journalière comporte de préférence une quantité de sel de la S.A.M. comprise entre 10 et 20 mg. La voie d'administration est orale ou par injection. L'administration du médicament selon l'invention entraine un effet sédatif, le médicament intervenant comme donneur de méthyle. Aux doses habituelles le médicament n'entraîne pas de signe de toxicité. Les sels selon l'invention sont supportés pratiquement sans signe de toxicité par la souris à des doses de 100 mg/kg et la dose léthale est située au dessus de 1600 mg/kg. Les médicaments selon l'invention peuvent être notamment utilisés pour traiter les affections telles que 1) Insuffisances hépatiques, notamment cirrhoses, ictères, hépatites toxiques ou infectieuses. Etats de dénutrition, convalescence. Etats post-infectieux, athéromanoses, anémies de carence. 2) au niveau cérébral : maladie de Parkinson, correction des troubles secondaires apportés par le traitement chronique à la L.DOPA. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention appa raieront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif. Le produit de départ est une levure saccharomyces cerevisiae ou torulopsis enrichie préalablement en S.A.M. selon la méthode de SCHLENK (Enzymologia 1965 29 283). Les levures sont ensuite lyses soit par des méthodes chimiques faisant appel à des acides minéraux ou organiques (SCHLENK et De-PALMA J. Biol chem 1957 229 1051), soit par des méthodes physiques telles que les ultra-sons, soit enfin par autolyse résultant d'une congélation rapide à basse température (de l'ordre -700C) suivie d'une décongélation lente. L'extrait aqueux obtenu après lyse est passé sur un échangeur cationique du type DOWEX ou Amberlite (SHAPIRO et EHNIGNER Analytical Biochemistry 1966 15 323.333 SCHLENK et de PALMA J. Biol chem 1957 229 1051) La S.A.M. qui est ainsi fixée sur l'échangeur est ensuite éluée par une solution d'acide organique au moins molaire. EXEMPLE N01 Obtention du Citrate de S.adénosyl-L-méthionine 100 g de levure de boulangerie (Saccharomyces cerevisiae) enrichie en S.A.M. suivant le procédé de SCHLENK sont décongelés puis lysés selon un des procédés précités, par exemple par ultrasons à 20 Kc pendant 30 minutes. Après centrifugation à 12.000 t/mn pendant 20 minutes + 40C le surnageant est tamponné à un pH compris entre 6,5 et 6,7 par un tampon acétate d'ammonium - ammoniaque pH 6. On ajoute au surnageant 80 ml d'une résine amberlite cationique équilibrée à pH 6, sous forme ammonium et on maintient le tout sous agitation lente pendant 12 heures à +10C. La résine est ensuite séparée par filtration et rincée par de l'eau acidulée. L'élution de la S.A.M. se fait en bain par 200 ml d'une solution d'acide citrique 2 M et de pH compris entre 1,06 et 1,12. On agite à 200 t/mn pendant 2 heures à + 10C. Le surnageant acide est isolé par filtration et ajouté sous agitation modérée à 1200 ml d'alcool éthylique préalablement refroidi à +10C. Le précipité qui se forme se décante pendant unenuit à cette température. On sépare ensuite le précipité par filtration sur verre fritté, on le rince par quelques millilitres d'acétone anhydre et on le sèche sous pression réduite en présence d'anhydride phosphorique. On obtient ainsi 600 mg d'une poudre blanche. La chromatographie sur couche mince, la chromatographie sur colonne G 25, l'étude du spectre d'absorption U.V. et le dosage spectrophotométrique à 256 nanomètre permettent d'identifier cette poudre comme étant du citrate de S.adénosyl-L-méthionine pur à 95 %. EXEMPLE II Obtention du tartrate de S.adénosyl-L-méthionine Dans cet exemple la levure est lyse par l'acide perchlorique ce dernier étant éliminé du lysat avant passage sous régime cationique par précipitation sous forme de perchlorate de potassium. L'adjonction de la résine s'effectue dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1. On effectue l'élution par une solution d'acide tartrique molaire à pH 1,35. Le précipité formé après addition d'alcool est redissous par la quantité minimale d'une solution acétique molaire. Le filtrant est ensuite ajouté à 6 fois son volume d'alcool éthylique et l'on obtient après filtrage et séchage 590 mg d'une poudre blanche qui se révèle être du tartrate de S.adénosyl-L-méthionine pur à 90 %. EXEMPLE III Obtention du malate de S.adénosyl-L-méthionine Cet exemple diffère de l'exemple 1 par le fait que l'élution s'effectue avec une solution d'acide malique 2 M à pH 1,40. Le surnageant acide est ajouté sous agitation modérée à 1000 ml d'acétone préalablement refroidie à +10C. I1 se forme un trouble qu'on laisse décanter 24 heures à 48 heures à + 10C. Le précipité formé, peu abondant et incolore, adhère au fond et le surnageant est siphoné et écarté. Le précipité est ensuite dissous dans 25 ml d'eau distillée et cette solution est alors ajoutée à 6 fois son volume d'alcool éthylique. I1 se forme un précipité blanc et floconneux qui décan te lentement et on obtient, après filtration et séchage, 620 mg d'une poudre blanche qui s'avère être du malate de S.adénosyl-Lméthionine. EXEMPLE IV Obtention de l'ascorbate de S.adénosyl-L-méthionine Après préparation et adjonction de résine selon l'exemple 1 on effectue l'élution par une solution d'acide ascorbique 1,08 M à pH 2,06. Le surnageant acide est ajouté sous agitation modérée à 100 ml d'acétone préalablement refroidie à + 1 C. On obtient un trouble qu'on laisse décanter 24 à 48 heures à + 10C Le précipité forme un film au fond du récipient et l'on écarte le surnageant tandis que le précipité est dissous dans 25 ml d'eau distillée. A cette solution aqueuse on ajoute 6 fois son volume d'alcool éthylique et on obtient un précipité floconneux, légèrement brun qui décante rapidement. On obtient 350 mg d'une poudre brunâtre qui est constituée par de l'ascorbate de S.adénosyl-L-méthionine. EXEMPLE D'UNE COMPOSITION PHARMACEUTIQUE A BASE DE CITRATE DE S.ADENOSYL-L-METHIONINE On remplit des ampoules avec 20 mg par ampoule de citrate de S.adénosyl-L-méthionine sec, stérile. Les ampoules sont avantageusement accompagnées d'un solvant séparé tel.que 2 ml de soluté injectable de bicarbonate de sodium à 4,2 %. Le citrate peut également être préparé sous forme de comprimes, gélules ou autres formes galéniques avec des excipients habituels, assurant la libération au niveau de l'intestin. Bien que l'invention ait été décrite à propos d'un mode de mise en oeuvre particulier il est bien entendu qu'elle n'y est nullement limitée et qu'on peut lui apporter diverses modifications sans pour cela s'éloigner ni de son cadre ni de son esprit. REVEND I CAT IONS 1. Citrate de S-adénosyl-L-méthionine. 2. Tartrate de S-adénosyl-L-méthionine. 3. Malate de S-adénosyl-L-méthionine. 4. Ascorbate de S-adénosyl-L-méthionine. 5. Procédé de préparation des composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que l'on lyse une levure contenant de la S-adénosyl-L-méthionine, que l'on fixe la S-adénosyl-L-méthionine sur un échangeur cationique, que l'on élue par/acide organique correspondant ou sel recherché, ledit acide étant l'acide citrique, l'acide tartrique, l'acide malique ou l'acide ascorbique et qu'enfin l'on précipite de l'élut le sel organique formé par un solvant organique. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que la levure est une levure saccharomyces cerevisiae ou torulopsis enrichie. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 et 6, caractérisé par le fait que la lyse est réalisée soit par la méthode chimique à l'aide d'acides minéraux ou organiques, soit par ultra-sons soit encore par autolyse résultant d'une congélatison rapide à une température d'environ - 700C suivie d'une congélation lente. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé par le fait que la molarité de la solution d'acide organique d'élution est avantageusement comprise entre 1 M et 2 M. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé par le fait que la solution de l'acide organique d'élution a un pH compris entre 1 et 3. 1O.Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisé par le fait que la précipitation du sel organique formé est effectuée à l'aide d'un solvant choisi dans le grou peformé par l'alcool éthylique, l'acétone et le méthanol. 11.Composés obtenus par le procédé revendiqué selon l'une quelconque des revendications 5 à 10. 12.Médicament comportant en tant que principe actif au moins un composé tel que revendiqué selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 13.Médicament selon la revendication 12, caractérisé par le fait que le composé actif est en association avec un véhicule inactif. 14.MEdicament selon l'une quelconque des revendications 12 et 13, caractérisé par le fait qu'il comprend en outre de l'enzyme cathéchol-O-méthyle transférase. 15.Médicament selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, Qsé selon une quantité journalière d'au moins un sel selon les revendications 1 à 4 comprise entre 10 et 20 g.