Brevet FR2259836A1 — publié le 19750829

La présente invention concerne un procédé de préparation d'un support polymère hydrophile anhydre, activé par le bromurede cyanogène, qui convient extraordinairement bien pour la fixation de composés dont la molécule contient un ou plusieurs groupes amino primaires. La réaction avec le bromure de cyanogène appartient aux procédés favoris d'activation des supports usuels pour des compo gés biologiquement actifs qui sont utilisés dans la chromatographie d'affinité ou comme catalyseurs. Ce procédé élaboré par Axén et collaborateurs (Nature 214 (1967), 1)G2 ; 215 (lu67), 1591) a donné de très bons résultats en particulier dans le cas de supports constitués par des polysaccharides. Selon ce procédé, on fait réagir du bromure de cyanogène avec du gel d'agarose en milieu alcalin. La réaction achevée, on doit laver rapidement la suspension du gel activé et la délayer ensuite immédiatement dans la solution du composé biologiquement actif (à fixer par le gel). L'opération de lavage et le délayage dans la solution du composé à fixer ne doivent pas durer plus de 90 secondes. Cette nécessité soumet évidemment l'expérience et l'habilité technique des spécialistes effectuant la réaction à des exigences rigoureuses. Les complications dues à la nécessité d'activer le gel immédiatement avant la fixation de la substance biologiquement active sont supprimées par la préparation d'un gel d'agarose activé anhydre qui rend l'opération plus commode. Les inconvénients des polysaccharides utilisés comme supports dans la chromatographie d'affinité, à savoir la faible résistance mécanique et la faible stabilité hydrolytique, la facilité d'une atteinte par des micro-organismes, la porosité insuffisante pour certaines utilisations, la-sorption non spécifique qui se produit dans certains cas et finalement le prix élevé, peuvent entre surmontés par le procédé de préparation d'un gel macroporeux qui forme l'objet de la présente invention. La comparaison des stabilités mécaniques des gels homogène et macroporeux au contact avec un solvant parle sans équivoque en faveur du matériau macroporeux à structure interne rigide. Cette propriété acquiert en particulier une importance énorme lors de l'utilisation technologique avec mise en oeuvre d'une quantité élevée de matière dans un appareil de grandes dimensions. La stabilité chimique du matériau activé peut entre, comme on le sait, considérablement accrue par fixation de groupes réactifs à la surface solide. Il n'est donc pas surprenant que le gel macroporeux activé par le bromure de cyanogène reste actif même après des temps très prolongés, et ceci sans utilisation d'addi- tions stabilisantes qui sont indispensables lors de l'activation et du stockage des matériaux homogènes. 'élimination-du stabilisant par lavage, de nécessité absolue dans le cas des gels homogènes avant la fixation de la substance biologiquement active, devient également superflue. Ui lion exige une stabilité particulièrement grande au stockage, on peut obtenir une suppression presque totale des réactions de désactivation par stabilisation du gel macroporeux. l'ors de la préparation du gel actif anhydre pour la fixation de composés actifs, les dépenses occasionnées par son séchage jouent également un rtle considérable. La facilité du séchage de la structure polymère rigide du gel macroporeux qui ne gonfle pas en comparaison avec le matériau homogène fortement gonflé est évidente, aussi bien en ce qui concerne la durée du séchage que quant à la quantité d'eau à éliminer. En égard à la faible stabilité thermique des groupes fonctionnels actifs du gel, on doit avoir recours lors du séchage à une technologie très délicate avec application d'une basse température. veules des technologiesde séchage considérablement dispendieuses, telles que par exemple la lyophilisation ou la déshydratation à l'aide de solvants, entrent alors en ligne de comptes. A c8té de la structure macroporeuse, le gel utilisé pour l'activation doit comporter une quantité suffisante de groupes hydroxyle libres qui sont susceptibles de réagir avec le bromure de cyanogène. C'est pourquoi on a choisi les gels préparés selon la demande de brevet français N 71 42005 du 24-11.1171 au nom de la présente Demanderesse, par copolymérisation d'acrylates ou de méthacrylates dthydroxyalkyl-, d'oligo- ou de polyglycols avec des comonomères réticulants dont la molécule contient deux ou plusieurs restes acryle ou méthacryle ou avec du divinylben zène. L'activité biologique des substances préparées par fixation des composés biologiquement actifs a été déterminée de la manière usuelle. Les exemples ci-après illustrent avec plus de détails l'in- vention dont l'objet n'est cependant pas limité à ces exemples. Exemple 1 On fait gonfler dans de l'eau distillée jusqu'à l'équilibre 5 parties en poids d'un gel macroporeux hydrophile, de la limite d'exclusion du poids moléculaire de 300 OúG, préparé par copolymérisation par précipitation en suspension de méthacrylate d'hy droy-2-éthyle et de diméthacrylate d'éthylène (3 : 2) en présence d'un mélange 9 : I des-solvants cyclohexanol et alcool dodécylique. On délaie ensuite le gel gonflé dans un volume égal d'eau distillée, on munit le récipient contenant la suspension d'un agitateur magnétique et l'on immerge une électrode de verre dans la suspension.Puis la suspension est additionnée de 20 parties en poids de solution aqueuse-de bromure de cyanogène à îO. La solution de bromure de cyanogène est toujours fraichement préparée quelques minutes avant l'exécution de la réaction. Immédiatement après l'addition du bromure de cyanogène, on ajuste le pH de la suspension à Il à l'aide de NatH 4 H et on le maintient pendant 12 minutes à cette valeur, en agitant constamment, par addition goutte à goutte de NaOH 4 N. Puis la suspension est lavée sur un filtre de verre fritté avec vingt fois son volume par rapport au volume du gel gonflé primitif - de NaH0O30,l M de pH 9. L'opération de lavage dure au maximum deux minutes.Après le lavage et essorage par aspiration, le gel activé est divisé en deux moitiés appelées fractions A et B. À. La première moitié - la fraction A - est délayéeimmédia- tement dans 10 ml de NaH0030,l N de pH 9 et la suspension additionnée de I g de chymotrypsine. Puis la suspension est agitée pendant 24 heures à 40 C à l'aide d'un agitateur magnétique. Le gel est ensuite lave successivement avec les tampons suivants borate de sodium 0,1 M et NaCl 0,1 M (pH 8,5) ; acétate de sodium 0,1 M et Wacl 1 M (pH 4,1) ; acétate de sodium 0,01 M (pE 4,1). Lors de l'activation de plus de 10 ml de gel, on effectue les opérations de lavage dans une colonne de dimensions correspondantes, en réglant le débit à 8 ml/h. On lave la colonne de gel pendant 40 heures avec le premier tampon et chaque fois 24 heures avec les deux autres tampons. Lors de l'activation de moins de 10 ml de gel gonflé, on effectue les opérations de lavage sur un filtre de verre fritté. Le volume du premier tampon correspond à quarante fois et le volume de chacun des deux autres tampons à trente fois le volume du gel à l'état gonflé. Le gel préparé de cette manière est utilisé pour la chromatographie d1 affinité et ses activités protéolytique et d'estérase déterminées par analyse. La capacité est de 12,Amg de chymotrypsine/ml de gel gonflé. B. La deuxième moitié du gel activé par le bromure de cyanogène - la fraction B - est délayée à température ordinaire dans de l'méthanol aqueux de concentration croissante (50%, 60%, 70%, 80% et 90%) et la solution aqueuse l'méthanol éliminée cha- que fois par centrifugation du gel. Au dernier stade de déshydratation, le gel est balayé dans de l'éthanol absolu, puis séparé par centrifugation et séché à température ordinaire dans le dessiccateur à vide (le séchage dure à peu près 24 heures). L'activité du gel ainsi séché est de 7(ko de l'activité de la fraction A. Après 6 semaines de stockage à 4 O, on fait gonfler le gel dans NafiCO3 0,1 N, puis on effectue la fixation de la chymotrypsine selon le même procédé que pour la fraction A. La capacité du gel est de 6,5 mg de chymotrypsine/ml de gel gonflé. L'activité protéolytique, exprimée en A280 par mg de chymotrypsine fixée, est la même pour les deux fractions, à savoir de 0,038/min.mg- Exemple 2 Le gel macroporeux hydrophile est activé de la même manière que dans l'exemple 1. Après lavage et essorage par aspiration, le gel est délayé dans une solution de 5 parties en poids de dextrane d'un poids moléculaire de 40 0b0 et de 5 parties en poids de lactose dans 100 parties en poids d'eàu, séparé par centrifugation et lyophilisé. Le gel lyophilisé anhydre a après la réaction avec de la chymotrypsine une capacité de 11,8 mg de chymotrypsine/ml de gel, un lavage avec 50 parties en poids de NaHCO, 0,1 M ayant précédé la réaction décrite dans l'exemple 1 du gel activé avec la chymotrypsine. REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation d'un support polymere hydrophile anhydre, activé par le bromure de cyanogène, de composés biologiquement actifs, caractérisé par le fait que l'on active par le bromure de cyanogène un gel macroporeux hydrophile contenant des groupes hydroxyle préparé par copolymérisation en suspension de méthacrylates ou d'acrylates d'hydroxyaikyle avec des comonomères réticulants aptes à la copolymérisation avec ces esters hydroxyalkyliques tels que par exemple les acrylates ou méthacrylates de diols ou de polyols dont la molécule contient deux ou plusieurs groupes acryle ou méthacryle ou avec des bisacrylamides, des méthacrylamides ou du divinylbenzène et l'on débarrasse le gel activé de 11 eau par déshydratation à l'aide de solvants organiques et évaporation consécutive de ces solvants. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que lton effectue le séchage du gel activé par le bromure de cya nogene par évaporation de l'eau dans le vide à une température inférieure à son point de fusion, c'est-à-dire par lyophilisation. 3) Erocédé selon la revendication 2, caractérise par le fait que l'on ajoute en vue de la stabilisation du gel activé par le bromure de cyanogène lors de la lyophilisation un polysaccharide et un sucre, par exemple du dextrane et du lactose. 4) Support polymère hydrophile anhydre de composés biologiquement actifs, activé par bromure de cyanogène, préparé par procédé suivant la revendication 1, 2 ou 3.