Brevet FR2276381A1 — publié le 19760123

La présente invention se rapporte à un procédé de préparation de -galactosidase, également appelée lactase. Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à un procédé pour la préparation de P-galactosidase stable aux acides, à activité acide, consistant à cultiver une nouvelle souche appartenant à l'Aspergillus oryzae dans un milieu nutritif et à récupérer cette enzyme à partir de la matière cultivée. La ss-galactosidase est une enzyme qui catalyse l'hydrolyse d'aryl -D-galactopyranosides, tels que le lactose, pour fournir du galactose, du glucose et analogues. Ce lactose est un des composants principaux du lait et des produits dérivés du lait, qui sont utilisés depuis longtemps comme produits nutritifs importants pour les êtres humains et les animaux.Alors que le lactose peut être généralement digéré dans l'organisme vivant après avoir été hydrolysé pour former du glucose et du galactose par la ss-galactosidase qui existe normalement dans les sucs intestinaux et dans les muqueuses, des études récentes ont montré qu'une partie importante de la population humaine souffre de déficience en ss-galactosidase ou d'intolérance vis-à-vis du lactose, et, de ce fait, des vomissements ou des diarrhées se produiront dans le cas où l'on prendra des alimentations contenant du lactose. La préparation de la ss -galactosidase est utile pour la guérison ou la prévention de ces vomissements ou de ces diarrhées dus à cette déficience en enzyme ou à l'intolérance vis-à-vis du lactose. En conséquence, il est nécessaire que la préparation d'enzyme soit si stable aux acides que son activité ne soit pas réduite par l'acidité du suc gastrique, dans le cas de l'administration orale de cette préparation. La ss-galactosidase mentionnéeci-dessus est connue depuis longtemps et de nombreuses études ont été indiquées sur sa préparation à partir des matières cultivées constituées de bactéries, de levures et de champignons ainsi qu'à partir de plantes ou de corps d'animaux, et aussi sur ses caractéristiques. Cependant, les caractéristiques physico-chimiques et enzymologiques de cette ss-galacto- sidase diffèrent les unes des autres selon la différence des origines à partir desquelles les -galactosidases ont été préparées, cela étant vrai pour tous les genres de préparation d'enzymes. Plus particulièrement, selon ces articles de littérature, on décrit divers genres de microorganismes, tels que le Saccharomyces fragilis, le Torulopsis spherica, le Zygosaccharomyces lactis, le Torulopsis lactis, le Torula utilise le Candida pseudotropicalis, le Lactobacillus bulgaricus, l'Aspergillus oryzae, l'Aspergillus ni ger, l'Aspergillus flavus, le Penicillium notatum et analogues, comme étant les origines d'où l'on peut obtenir les ss-galactosidases;; cependant, la majeure partie des ss-galactosidases préparées de cette manière dont des pH optima du caté alcalin ou dans la gamme faible- ment acide et, en outre, la plupart de ces préparations de ss-galac- tosidase classiques contiennent d'autres enzymes mélangées avec la ss-galactosidase, par exemple des protéases et des amylases, qui sont plutôt les composants prédominants dans le mélange. On a récemment découvert que la ss-galactosidase stable aux acides a été préparée à partir de la matière cultivée d'Aspergillus niger > cette -galactosidase ayant un pH optimum du côté acide (voir brevet américain nO 3.629.073). Cependant, il n'y a pas de description quant à la quantité d'enzyme qui s'accumule dans la matière cultivée d'Aspergillus niger dans cette publication et, en outre, on a reconnu par des expériences portant sur des traces, réalisées par la demanderesse, que cette quantité de -galactosidase qui s 'accu- mule est p2utst faible. Contrairement à ce qu'on a mentionné précédemment, la présente invention prévoit un procédé pour fournir une préparation de -galactosidase stable aux acides, avec des rendements fortement supérieurs, en employant une nouvelle souche d'Aspergillus oryzae, cette nouvelle souche d'Aspergillus oryzae étant choisie parmi un grand nombre de levures, de bactéries et de champignons, tous étant déjà connus comme cultures types ou nouvellement isolés par la demanderesse, par examen de la production de t3-galactosidase avec ces cultures. La souche d'Aspergillus oryzae a été nouvellement isolée dans le sol à Chiba-Ken, Japon, et la préparation de P-galactosidase produite avec cette souche présente la plus forte activité à un pH d'environ 4,5, tout en étant stable dans la large gamme de pH allant de 3,5 à 9.Cette souche a été déposée à la collection américaine de cultures types à Rockville, Maryland, Etats-Unis d'Amérique, sous le numéro d'identification ATCC 20423 et à l'Agency of Industrial Science & Technology de Chiba-shi, Chiba-ken, Japon, sous le numéro d'identification FERM-P 1680. En conséquence, c'est un objet de la présente invention de prévoir un procédé de préparation d'une -galactosidase stable aux acides, avec un rendement élevé, en utilisant une nouvelle souche d'Aspergillus oryzae. C'est un autre objet de la présente invention de prévoir un procédé pour préparer, de manière peu coateuse, une ss-galactosidase stable aux acides, C'est encore un autre objet de la présente invention de prévoir un procédé pour préparer une ss-galactosidase stable durant la période d'emmagasinage. D'autres objets et avantages de la présente invention apparattront d'après la description ci-après, en relation avec les dessins ci-joints dans lesquels ta figure 1 présente le spectre d'absorption dans l'ultraviolet de la -galactosidase produite dans le présent procédé, enregistré en utilisant un spectrophotomètre à enregistrement (Hitachi, Type EPS-3T); et La figure 2 représente le spectre d'absorption dans l'infrarouge de la ss-galactosidase produite dans le présent procédé, avec une tablette de KBr, enregistré en utilisant un spectrophotomètre à infrarouge à réseau (Hitachi, Type EPI-G2). Les caractéristiques microbiologiques de l'Aspergillus oryzae ATCC 20423, utilisé dans le procédé selon la présente invention, sont les suivantes (z) Caractéristiques morphologiques: Les mycéliums de longueur 1-2 mm croissent de manière dense. La pointe du conidiophore est subglobeuse pour former une vési cule ayant une largeur de 20-40 P . La vésicule porte un certain nom- bre de stérigmates ayant une dimension de 15-25 x 6-8 X , et des conidies ayant une dimension de 6-8 f sont produites sur les pointes des stérigmates. La surface des conidies est lisse, alors que la surface du conidiophore est rugueuse, spécialement dans la partie prochede la vésicule. I1 ne se forme pas de périthécium. (il) Caractéristiques de culture (après 10 Jours de culture à 300C, sauf indication contraire) (1) Milieu de malt-extrait d'agar-agar : le microorganisme crott bien, la colonie étant de couleur marron verdâtre et portant des mycéliums aériens veloutés, de manière abondante. Aucune produc tion de pigment soluble. (2) Milieu d'agar-agar de Czapek : le microorganisme croft normalement, la colonie étant marron et portant des mycéliums aériens veloutés, de manière abondante. Aucune production de pigment soluble. (3) Milieu de pomme de terre-dextrose-agar-agar : le microorganisme croit bien, la colonie étant marron verdâtre et portant des mycéliums aériens veloutés, de manière abondante. Aucune production de pigment soluble. (4) Milieu de gélatine (culture à 250C) : le microorganisme croit normalement ou faiblement, la colonie étant marron foncé. Lente liquéfaction. (III) Caractéristiques physiologiques (1) Gamme de températures pour la croissance : 40-450C (2) Température optima pour la croissance : 30-350C (3) pH optimum pour la croissance : pH 4-6 (4) Liquéfaction de gélatine : lente (5) Aptitude à l'utilisation d'éthanol : lente (6) Décomposition de pectine : lente (7) Décomposition de tanin : lente (8) Aptitude à l'utilisation de sources carbonées : le microorganisme utilise l'arabinose, le xylose, le glucose, le mannose, le galactose, le fructose, le maltose, le saccharose, le mélibiose, le tréhalose, le raffinose, l'inuline, la dextrine, et l'amidon, mais n'utilise pas la céllulose. Les caractéristiques microbiologiques décrites ci-dessus sont comparées à celles décrites dans l'article de K. B. Raper et D.I. Fennell : "The Gens Aspergillus" pages 370 (1965) et dans l'article de Kin-ichiro Sakaguchi et Koichi Yamada : Nippon Nogeikagaku Kaishi, Japon, 20, pages 65 et 141 (1944); de ce fait, on a identifié la souche comme appartenant à l'espèce "Aspergillus oryzae". Cependant la différence importante par rapport aux souches classiques appartenant à l'espèce "Aspergillus oryzae",réside dans le fait que la présente souche accumule une quantité remarquable de -galactosidase stable aux acides dans ses matières cultivées. La culture de l'Aspergillus oryzae ATCC 20423 mentionné ci-dessus dans le procédé de la présente invention est réalisée à la manière d'une culture avec immersion en utilisant des milieux liquides, ou d'une culture en surface en utilisant des milieux solides, dans l'état aérobie, à une température de 25-300C. Comme sources de carbone dans le cas où l'on emploie des milieux liquides, on utilise de manière souhaitable le glucose, la dextrine, le saccharose et analogues et, comme sources d'azote on utilise avantageusement des matières organiques ou minérales telles que des extraits de levure, la peptone, des extraits de viande, la liqueur de mats macérée, la farine de soja, le produit dit bacto soytone, un extrait de pomne de terre, un extrait de malt, la caséine, le citrate d'ammonium, le tartrate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le nitrate de sodium et analogues. En outre, au milieu, on peut ajouter des matières minérales appropriées telles que des sels de sodium, des sels de potassium, des sels de calcium, des sels de magnésium, des sels phosphoriques et analogues. D'autre part,comme milieux solides, on peut utiliser des matières comme celles ayant généralement été utilisées jusqu a présent, c'est-à-dire du son de blé, de la farine de soja, du son de riz et analogues, et, si cela est nécessaire, les sources d'azote et/ ou les matières minérales mentionnées dans le cas de l'emploi des milieux liquides peuvent être ajoutées aux milieux solides. La culture en surface en utilisant les milieux solides peut entre mise en pratique au moyen de dispositif de culture sur milieux solides du type à aération ou de dispositif de culture sur milieux solides du type à tambour rotatif. Cette culture sur milieux solides du microorganisme dans la présente invention est achevée en 3-7 jours à partir du commencement de la culture.Dans la présente invention, la culture sur milieux solides est meilleure que la culture sur milieux liquides au point de vue de la croissance de l'organisme et de la production de ss-galactosidase. Par exemple, lorsque du sonde riz est inoculé avec le microorganisme, suivi d'incubation du microorganisme à 300C pendant 5 jours, une bonne croissance de l'organisme et une accumulation maxima de ss-galactosidase dans la matière cultivée seront obtenues. La ss-galactosidase ainsi accumulée dans la matière cultivée peut être récupérée, dans le cas de la culture sur milieux li quides, en soumettant le filtrat du bouillon de culture aux modes opératoires de routine pour la séparation et la purification de l'en- zyme. Dans le cas de culture sur milieux solides, à la matière cultivée, on ajoute de l'eau en quantité égale à 5-10 fois plus que celle de la matière cultivée, et, après agitation pendant 1-5 heures,le liquide mélangé résultant est filtré ou centrifugé, et le filtrat ainsi obtenu est soumis aux modes opératoires par routine comme dans le cas de la culture sur milieux liquides.La ss-galactosidase de la présente souche d'Aspergillus oryzae ATCC 20423 est une enzyme extracellulaire, sibien que plus de 95 % d'enzyme peuvent être facilement extraits par liteau, sans aucune destruction de la cellule du microorganisme. Ceci constitue un des grands avantages de la présente invention. En ce qui concerne les modes opératoires de routine pour séparer et purifier l'enzyme, mentionnés dans ce qui précède, en tout premier lieu, on se réfère à la précipitation de la ss-galactosidase à partir de la solution aqueuse en ajoutant un solvant organique hydrophile, tel que I'éthanol, l'isopropanolss l'acétone et analogues ou au relargage de l'enzyme à partir de la solution aqueuse, en y ajoutant un sel minéral tel que le sulfate d'ammonium, le sulfate de sodium, le sulfate de potassium ou analogues. Ces modes opératoires peuvent être aussi réalisés de manière telle que la solution aqueuse de l'enzyme soit concentrée sous pression réduite et ensuite le concentré est traité par addition de solvant organique ou de sel minéral, tel que mentionné précédemment. Le précipité ainsi formé est rassemblé par centrifugation et lyophilisé immédiatement ou après avoir été soumis encore à d'autres traitements de purification. Par exemple, le précipité est dissous dans une solution tampon tris-HCl 0,05 M ou dans une solution de tampon phosphaté 0,05 M, et les impuretés contenues sont dialysées et retirées dans le même genre de solution tampon par une membrane de dialyse. Le dialysat (ou solution tampon restante) peut être, en outre, soumis à une chromatographie sur colonne échangeuse d'ions en utilisant une résine échangeuse d'ions, de la cellulose échangeuse d'ions ou le produit dit Sephadex échangeur d'ions, ou à une filtration sur gel en utilisant le produit dit Sephadex ou le produit dit Biogel. En combinant les modes opératoires de purification appropriés, choisis parmi ceux tels que mentionnés ci-dessus, on peut obtenir des préparations de ss-galactosidase ayant diverses qualités d'activité. Dans la présente description, l'activité de la ss-galactosi- dase est estimée par l'activité d'hydrolyse de cette enzyme dans les cas respectifs où l'on utilise l'o-nitrophényl ss-D-galactopyranoside, le p-nitrophényl ss-D-galactopyranoside (ces termes sont représentés pour plus de brièveté par ONPG et PNPG, respectivement ci-après dans la description) et le lactose en tant que substrats.Les modes opératoires respectifs sont les suivants (a) Activité d'hydrolyse de l'enzyme pour l'ONPG ou le PNPG : à 3,5 ml d'une solution tampon au phosphate-citrate 0,1M (pH 4,5) contenant 6 mg d'ONPG, on ajoute 0,5 ml de solution d'enzyme, et après l'incubation à 30 C pendant 10 minutes, on ajoute 0,5 ml de solution d'enzyme; après incubation à 300C pendant 10 minutes, on ajoute 1 ml de solution de carbonate de sodium 1M au mélange de liquides, afin d'arrêter la réaction enzymatique.La quantité d'onitrophénol formée dans la solution ayant réagi est estimée par comparaison de la capacité d'absorption à la longueur d'onde de 420 mesurée en utilisant un spectrophotomètre (Hitachi, type 101), la courbe standard étant préparée à l'avance en utilisant de l'o-nitro- phénol purifié. Ainsi, l'unité de -galactosidase pour l'ONPG est définie comme étant la quantité d'enzyme qui produira 10 6 mole d'o-nitrophénol par minute à 300C (cette unité a été prescrite par l'Union International de Biochimie, Comité des enzymes).L'unité de -galactosidase pour le PNPG est définie de manière semblable à celle de 1'ONPG, sauf qu'on emploie du PNPG comme substrat et que la longueur d'onde est de 410 mX au lieu de 420 my pour 1'ONPG. (b) Activité d'hydrolyse de l'enzyme pour le lactose à 4,5 ml d'une solution tampon au citrate-phosphate 0,1 M (pH 4,8) contenant 272 mg de lactose, on ajoute 0,5 ml de solution d'enzyme, et, après~incubation à 300C pendant 10 minutes, le mélange de liquides est chauffé au bain-marie bouillant pendant 2 minutes afin d'arroter la réaction enzymatique. On retire 0,5 ml de la solution ayant réagi et on l'ajoute à 3,0 ml du produit réagissant dit Glucostat (se composant d'oxydase et de peroxydase de glucose); après que le liquide mélangé a été soumis à l'incubation à 370C pendant 60 minutes, on y ajoute 0,5 ml de HCl 5N afin de terminer la réaction enzymatique.La quantité de glucose formée dans la solution ayant réagi est estimée en comparant la capacité d'absorption à la longueur d'onde de 400 mu , mesurée en utilisant un spectrophotomètre, la courbe standard étant préparée à l'avance. Ainsi, l'unité de -galactosidase pour le lactose est définie comme étant la quantité d'enzyme qui produira 10 6 mole de D-glucose par minute, à 300C. Les caractéristiques physico-chimiques de la ss-galactosi- dase préparée dans le procédé selon la présente invention sont les suivantes (1) Spécificité du substrat et catalyse : cette enzyme hydrolyse spécifiquement les composés de ss-D-galactopyranosyle. Ainsi, le lactose (ou le ss-D-galactopyranosyl-D-glucoside), ltONPG, le PNPG, le phényl ss-D-galactopyranoside, et analogues sont hydrolysés pour fournir du galactose, en même temps qu'un membre choisi dans le groupe se composant de glucose, d'o-nitrophénol, de p-nitrophénol et de phénol. (2) Effet du pH sur l'activité : l'activité de l'enzyme pour diverses valeurs de pH est étudiée respectivement avec le lactose, l'ONPG et le PNPG comme substrats, dans des conditions d'incubation telles que la température soit 30 C et la période 10 minutes. La valeur de l'activité relative est calculée à partir du rapport entre l'activité correspondante et celle existant à pH 4,8 (en ce qui concerne le lactose) ou 4,5 (en ce qui concerne 1'ONPG et le PNPG). Les résultats sont présentés dans le tableau 1, d'où l'on reconnatt que les valeurs du pH optimum se trouvent du côté acide. TABLEAU 1 Activité relative (%) pH Lactose ONPG PNPG 2 16 4 2 3 47 73 72 4 86 97 99 4,5 95 100 100 4,8 100 93 99 5 > 0 99 84 97 6,0 66 26 49 0 2 29 3 12 (3) Effet de la température sur l'activité : le tableau 2 présente l'effet de la température d'incubation sur l'activité d'enzyme en utilisant l'ONPG comme substrat, dans des conditions d'incubation telles qu'on ait un pH de 4,5 et une période de 10 minutes.La valeur de l'activité relative est calculée à partir du rapport entre l'activité correspondante et celle existant à la température de 500C. On comprend que l'activité maximum se présente à 500C. TABLEAU 2 Température (OC) Activité relative (%) 10 11 20 25 30 48 40 79 50 100 60 32 70 3 (4) Effet du pH sur la stabilité : pour examiner l'effet des valeurs de pH sur la stabilité de enzyme, les solutions d'enzyme ayant diverses valeurs de pH comprises entre 3,0 et 9,5 sont laissées au repos à 300C pendant 1 heure, respectivement, et l'ac tivité de '3-galactosidase demeurant dans chaque solution est alors estimée en utilisant 1'ONPG comme substrat.La valeur de l'activité relative conservée est calculée à partir du rapport entre l'activité correspondante observée et celle examinée à un pH 6. Les résultats sont présentés dans le tableau 3, d'où l'on reconnatt que l'enzyme est raisonnablement stable dans la gamme de pH allant de 3,5 à 9 > 0. TABLEAU 3 pH Activité relative conservée (%) 3 12 3,5 69 4 92 5 100 6 100 7 100 8 100 9 92 9,5 18 (5) Effet de la température sur la stabilité : pour examiner l'effet de la température sur la stabilité de l'enzyme, les solutions d'enzyme ayant un pH de 6,0 sont soumises à l'incubation à des températures de 300C à 60"C, pendant 10 minutes. L'activité enzymatique restante est déterminée en utilisant 1'ONPG comme substrat, et l'activité relative conservée est calculée à partir du rapport entre l'activité correspondante conservée et celle examinée à la température de 300C. Les résultats sont tels que présentés dans le tableau 4, et l'enzyme est raisonnablement stable à 500C pendant 10 minutes. TABLEAU 4 Température (OC) Activité relative conservée 30 100 40 100 50 88 60 15 (6) Inhibiteur, activeur et stabilisant : la réaction d'hydrolyse par la présente enzyme est inhibée soit par une concentration 10 2M de Cu++ ou d'Ag++, soit par une concentration de 10 4M de Hg+, tout en étant ni inhibée ni activée par une concentration 10 à .0-4M de divers autres ions métalliques.De plus, l'activité -4 d'enzyme est complètement perdue soit par une concentration 10 M de N-bromosuccinimide, soit par une concentration de 10 2M de laurylsulfate de sodium. Cependant, une concentration 10 2M du produit dit EDTA, du mercaptoéthanol, de l'eau oxygénée du thiosulfate de sodium, de la cystéine, de l'acide ascorbique ou analogues ne révèle aucun effet sur l'activité de l'enzyme. En outre, dans le cas de la lyophilisation du précipité ou de la liqueur purifiée, obtenu à partir des matières cultivées dans le présent procédé, la stabilité de l'enzyme durant cette étape de lyophilisation est améliorée par l'addition préalable de maltose et de glucose, en quantité correspondant à 10-30 % de la matière solide du précipité ou de la liqueur purifiée. (7) Analyse élémentaire : C : 46,42 ffi H : 6,76 ffi N : 12,21 % (8) Poids moléculaire : le poids moléculaire apparent de l'enzyme est estimé par application du procédé de filtration sur gel dit Sephadex G-200 et du procédé de centrifugation à gradient de densité de saccharose, respectivement, et conduit à une valeur approximativement égale à 105.000 dans les deux cas. (9) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet : la figure 1 présente le spectre d'absorption dans l'ultraviolet de l'enzyme, d'où l'on reconnatt qu'il y a une capacité d'absorption maxima pour la longueur d'onde de 280 m . (10) Spectre d'absorption dans l'infrarouge : le spectre d'absorption dans l'infrarouge avec KBr est présenté sur la figure 2. (11) Couleur et état : poudre blanche. La ss-galactosidase préparée dans le présent procédé a des caractéristiques physico-chimiques décrites ci-dessus, ces caractéristiques étant reconnues comme étant différentes de celles des ss-galactosidases ayant été préparées en utilisant l'espèce classique appartenant au "Genre Aspergillus". Ainsi, la présente enzyme diffère de la plupart des ss-galactosidasesclassiques du fait que le pH optimum de cette dernière se trouve proche de la neutralité, et, en outre, elle diffère de l'enzyme préparée en utilisant 1'Aspergillus niger et ayant le pH optimum du cEté acide du point de vue de l'espèce de microorganismes employés, de la gamme de pH pour la stabilité, du pH optimum et analogues.De plus, le rendement d'enzyme accumulée dans la présente invention est fortement supérieur, par comparaison avec ceux obtenus dans la préparation des enzymes classiques et, ainsi, cette caractéristique unique de la présente enzyme (ou microorganisme) par incorporation avec une a utre caractéristique de cette enzyme qui est sa stabilité aux acides, rend facile l'application industrielle du procédé de la présente invention. Les exemples suivants sont donnés à titre d'illustration de la présente invention, sans aucune limitation. EXEMPLE 1 20 g de son de blé et 20 ml d'eau du robinet sont placés dans un ballon d'Erlenmeyer de 500 ml et stérilisés. Après refroidissement, le milieu est inoculé avec le contenu d'une boucle de platine de spores d'Aspergillus oryzae ATCC 20423 ayant été cultivées sur un milieu de pomme de terre-dextrose-agar-agar, et les microorganismes sont soumis à l'incubation à environ 30"C pendant 5 jours. Cette culture de microorganismes, telle que décrite ci-dessus, est réalisée en utilisant 10 ballons et les matières cultivées sont rassemblées (environ 232 g). A cette matière, on ajoute 2 litres d'eau du robinet, et, après agitation pendant 2 heures, le liquide mélangé est filtré pour donner 1.914 ml de filtrat, dont l'activité de ss-galactosidase est 57,4 unités d'ONPG/ml ou 43,3 unités de lactose/ml. Ce filtrat est décoloré avec du charbon actif et le filtrat résultant est refroidi jusqu a 150C. Dans le filtrait, on ajoute de l'isopropanol refroidi jusqu'à 100C, tout en agitant, et le précipité formé est centrifugé. On ajoute à ce précipité 20 ml d'eau du robinet et le liquide mélangé résultant est lyophilisé à des températu res de -30 C à +20 C,sous des pressions de 0,1-0,2 mm Hg; de ce fait, on obtient 4,3 g de poudre d'enzyme blanche dont l'activité de ss- galactosidase est 16.300 unités d'ONPG/g ou 12.400 unités de lactose/ g. EXEMPLE 2 20 g de son de blé et 12 ml d'eau du robinet sont placés dans un ballon d'Erlenmeyer de 500 ml et stérilisés. Après refroidissement, le milieu est inoculé avec le contenu d'une boucle de platine de spores de microorganismes ayant été cultivées sur un milieu de pomme de terre-dextrose-agar-agar et les microorganismes sont incubés à 30"C pendant 7 jours. Cette culture du microorganisme,telle que décrite ci-dessus, est réalisée en utilisant 10 ballons et les matières cultivées sont rassemblées de manière aseptique, suivi de leur addition au milieu stérilisé se composant de 61 kg de son de blé et de 84 litres d'eau du robinet, ce milieu étant maintenu dans un dispositif de culture sur milieux solides du type à aération. Le milieu inoculé est maintenu à environ 300C pendant 3 jours, tout en faisant passer de l'air humide.Dans la matière cultivée, on ajoute 500 litres d'eau du robinet, et le liquide mélangé est filtré après agitation pendant 3 heures pour obtenir 469 litres de filtrat. L'activité de -galactosidase du filtrat est 48,6 unités d'ONPG/ml ou 36,7 unités de lactose/ml. 20 litres du filtrat sont décolorés avec du charbon actif et le filtrat résultant est concentré sous pression réduite jus qu a environ 4 litres. Le concentré est refroidi jusqu'à 15"C et on y ajoute 4 litres d'isopropanol froid (100C), tout en agitant. Le précipité formé est centrifugé, et, au précipité, on ajoute 12 g de maltose et 250 ml d'eau du robinet. Le liquide mélangé résultant est lyophilisé pour fournir 47,7 g de poudre d'enzyme blancbe, dont l'activité de -galactosidase est 17.200 unités d'ONPG/g ou 13.000 unités de lactose/g. EXEMPLE 3 20 g de la poudre d'enzyme brute obtenue dans l'exemple 2 sont dissous dans 1 litre d'eau du robinet et la solution est décolorée avec du charbon actif. Le filtrat est refroidi jusqu'à 150C et on y ajoute 500 ml d'isopropanol froid (100C) tout en agitant. Le précipité formé est retiré par centrifugation et, dans la liqueur surnageante, on ajoute en outre 700 ml d'isopropanol froid, suivi de centrifugation du précipité formé à nouveau.Dans ce dernier précipité on ajoute 2,5 g de maltose et 50 ml d'eau du robinet, et le liquide mélangé résultant est lyophilisé pour donner 10,6 g de poudre d'enzyme blanche, dont l'activité de ss-galactosidase est 25.300 unités d'ONPG/g ou 19.200 unités de lactose/g. EXEMPLE 4 5 g de la poudre d'enzyme obtenue dans l'exemple 3 sont dissous dans 100 ml de la solution tampon tris-HCl 0,05 M (pH 7,5) et, après enlèvement de la matière insoluble par centrifugation, la liqueur surnageante est soumise à la dialyse pour dialyser les impuretés qui y sont contenues, en utilisant le mebme genre de solution tamponnée sans l'enzyme. Le dialysat est appliqué à une colonne (4,8 x 90 cm) de diéthylaminoéthylcellulose dite Sephadex A-50, cette colonne ayant été équilibrée à l'avance avec le même genre de solution tampon. Après que la colonne a été lavée avec le mme genre de solution tampon, l'enzyme absorbée dans la colonne est éluée avec le même genre de solution tampon, mais ayant une concentration de NaCl croissant graduellement dans la gamme de 0-0,5 M. Les fractions d'éluat présentant l'activité de ss-galactosidase sont rassemblées et soumises à nouveau à la dialyse, en utilisant le même genre de solution tampon. La solution d'enzyme purifiée ainsi obtenue est lyophilisée pour donner 1,6 g de poudre blanche dont l'activité de ss-galacto- sidase est 68.400 unités d'ONPG/g ou 51.800 unités de lactose/g. La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'trie décrits, elle est au contraire susceptible de variantes et de modifications qui apparaîtront à l'hom- me de l'art. REVENDICATIONS 1 - Procédé de préparation de ss-galactosidase, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver l'Aspergillus oryzae ATCC 29423 dans un milieu nutritif, dans un état aérobie, à une température de 20-450C, pour accumuler une ss-galactosidase stable aux acides, à activité acide, dans la matière cultivée, à récupérer la ss-galae- tosidase à partir de cette matière et à la purifier. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'un milieu solide choisi dans le groupe se composant de son de blé, de farine de soja et de son de riz est utilisé comme milieu nutritif. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la culture du microorganisme est réalisée en utilisant un dispositif de culture sur milieux solides du type à aération ou du type à tambour rotatif. 4 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la ss-galactosidase accumulée dans la matière cultivée est extraite d'abord avec de l'eau, sans aucun mode opératoire destructif de la cellule du microorganisme. 5 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'un milieu liquide est utilisé comme milieu nutrifif, et le filtrat du bouillon cultivé est soumis à l'étape de récupération de l'enzyme, sans aucun mode opératoire destructif de la cellule du microorganisme. 6 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins un mode opératoire & purification, choisi dans le groupe se composant de chromatographie sur colonne échangeuse d'ions, de filtration sur gel et de lyophilisation, est réalisés afin de purifier l'enzyme. 7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que, dans le mode opératoire de lyophilisation de la matière contenant enzyme, on ajoute à l'avance du maltose ou du glucose, en quantité correspondant à 10-30 % du contenu en solide de cette matière. 8 - A titre de produit industriel nouveau, ss-galactosidase obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.