Brevet FR2282114A1 — publié le 19760312

La présente invention concerne un procédé et un dispositif pour l'analyse enzymatique d'un substrat chimique ou biologique, notamment au sein d'une solution. L'utilisation des enzymes pour réaliser des dosages de substancoechimiquoeou biologiquoeest de plus en plus répandue. En effet, la très grande spécificité de leur action permet de déterminer la quantité ou la concentration d'une substance donnée contenue dans un mélange pouvant être très complexe. La détection des produits formés à partir de ces substances, par suite de l'action enzymatique,se fait le plus souvent par des méthodes colorimétriques. Plus récemment, l'utilisation d'électrodes spécifiques mesurant la concentration des ions formés par suite de l'activité enzymatique sur les substances à doser a été envisagée Cependant, la spécificité de ces électrodes s'est avérée, dans certains cas, loin d'entre satisfaisante. L'un des inconvénients majeurs présenté par les méthodes de dosage décrites dans l'art antérieur et mettant en oeuvre certains enzymesRréside dans la faible durée de conservation de ces enzymes. Par ailleurs, l'utilisation de ces enzymes sous forme de solutions lescontenant ne permet pas leur récupération en fin de dosage. Afin de pallier ces inconvénients, la présente invention a pour objet un procédé pour l'analyse enzymatique d'un substrat chimique ou biologique, du type consistant: - à mettre en contact une solution contenant ledit substrat avec au moins un enzyme ayant une activité vis-à-vis de ce substrat, les produits résultant de cette mise en contact présentant une conductivité différente de celle dudit substrat; - à.immerger deux électrodes dans ladite solution, et - à réaliser ainsi le dosage dudit substrat par la mesure de la variation de conductivité de ladite solution; - ledit procédé étant caractérisé en ce que, avant d'analyser ledit substrat dans la solution, on incorpore ledit enzyme à une matière insoluble dans ladite solution, telle qu'or gel ou un support insoluble analogue. Selon une autre caractéristique de l'invention, l'enzyme est associé, au sein de la matière insoluble précitée, à au moins une substance modifiant l'activité ou la durée de vie de cet enzyme. Le fait d'emprisonner l'enzyme à l'intérieur d'un gel ou de le fixer sur un support insoluble dans la solution permet d'augmenter notablement la durée de conservation de I1 enzyme et facilite également de façon appréciable sa récupération. Selon encore une autre caractéristique de l'invention, la mesure de la variation de conductivité de la solution à doser est réalisée par rapport à une solution de référence,quin'ffit pssencntsct avec l'enzyme précité et dont la conductivité est égale à la conductivité initiale de la solution à doser. I1 s'agit alors, dans ce cas, d'une mesure relative et non pas d'une mesure absolue; il en résulte donc une meilleure précision de la mesure. L'invention a également pour objet un dispositif pour l'exécution du procédé pour l'analyse enzymatique d'un substrat chimique ou biologique, et du type comprenant - une cellule de mesure pourvue d'une paire d'électrodes et contenant la solution à doser; - une source de tension reliée auxdites électrodes; et - un premier dispositif pour le traitement du signal de sortie de ladite cellule de mesure; - ledit dispositif étant caractérisé en ce qu'il comporte une cellule de référence comprenant une paire d'électrodes reliées à ladite source de tension, ladite cellule de référence contenant une solution n'étant pas en contact avec l'enzyme précité et dnt B conductivité est égale à la conductivité initiale de la solution à doser, le signal de sortie de cette cellule de référence attaquant un second dispositif de traitement de signal, associé, avec ledit premier dispositif de traitement du signal, à un appareil de mesure formant éventuellement appareil de zéro. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention ressortiront plus clairement de la description explicative qui va suivre , faite en référence à la figure unique annexée, donnée uniquement à titre d'exemple, et représentant le schéma de principe du circuit électrique du dispositif conforme à 1' invention. Ce dispositif comporte, en premier lieu, deux cellules 1 et 2 dont l'une constitue la cellule de mesure (1) tandis que l'autre constitue la celle de référence (2). La cellule de mesure 1 comprend une paiie d'électrodes (3a et > respectivement) qui sont isolées l'une de l'autre. De même, la cellule de référence 2 comprend deux électrodes 4a et 4b . Chacune de ces cellules est alimentée par une source de tension 5 régulée à travers un dispositif de traitement de signal (respectivement 6 et 7). Ces dispositifs 6 et 7, à gain réglable, délivrent à leur sortie une tension proportionnelle au courant traversant les deux cellules.Par ailleurs, ies dispositifs 6 et 7 , qui sont par exemple des amplificateurs, sont associés à un appareil de mesure 8 formant éventullement appareil de zéro. Le fonctionnement du dispositif selon l'invention est le suivant. La solution contenant le substrat à doser est introduite dans la cellule de mesure 1 ainsi que dans la cellule de référence 2 . Préalablementàl'introduction de l'enzyme dans la cellule de mesure 1, les gains des amplificateurs 6 et -7 sont réglés de telle façon qu'ils présentent la même tension de sortie lorsque les deux cellules 1 et 2 contiennent-chacune une solution présentant la même conductrvité . Ce dispositif permet notamment de corriger les différences de géométrie que pourraient présenter les cellules l'une par rapport à I'autre. On introduit alors , dans la solution à doser contenue dans la cellule 1, l'enzyme, au sein d'un gel ou fixé sur un support et associé, le cas échéant, à au moins une substance modifiant l'activité ou la durée de vxe de cet enzyme. Ainsi, l'enzyme , agissant sur le composé que l'on désire doser, est mis en contact avec le liquide à analyser qui se trouve dans la cellule de mesure. On observe alors une apparition ou une disparition de certains constituants résultant., de l'action de l'enzyme sur le composé à doser. Ceci a pour effet de modifier la conductibilité de la solution étudiée . Il en résulte une augmentation ou une diminution, selon les cas, de la tension de sortie du dispo sitif 6 ; cette variation est proportionnelle à la quantité de substrat contenue dans la solution introduite dans la cellule 1. Au contraire, la tension de sortie de l'amplificateur 7 reste constante étant donné que la cellule de référence 2 ne contient pas d'enzyme La différence entre ces valeurs respectives de tension de sortie est appréciée au moyen de l'appareil de mesure 8 formant éventuellement appareil de zéro. La mesure de cette différence permet d'en déduire la variation de la conductivité de la solution à doser qui est elle-même proportionnelle à la quantité de substrat contenue dans cette solution.La mesure de la variation de conductivité peut intervenir avant la transformation totale du substrat. Il s'agit alors de déterminer la vitesse de la réaction de l'enzyme sur le substrat ; ceci permet d'effectuer le dosage dans un temps relativement court même si la réaction elle-même continue pendant un temps nettement plus long. La mesure de la variation de condutivité peut bien sûr être faîte aphs transformation totale du substrat. La méthode de conductimétrie employée selon l'invention,parallèlement à l'utilisation d'un enzyme insolubilis > , permet une mesure très sensible des modifications du milieu réactionnel que constituent la solution à doser et l'enzyme. Il est par ailleurs à noter que la précision de la mesure telle qu'obtenue, selon l'invention, dans le cas d'une mesure relative faisant intervenir à la fois une cellule de mesure et une cellule de référence est meilleure que dans le cas d'une mesure absolue ne faisant intervenir que la cellule de mesure. De plus, l'invention s'applique au dosage d'échantillons dont les conductivités initiales respectives peuvent varier dans une très large mesure. La tension appliquée aux électrodes 3a, 3b et 4a, 4b, au moyen dé la source de tension 5, peut être alternative ou continue ; dans ce dernier cas, le temps d'application de cette tension est Me courte durée, de façon à éviter notamment les phénomènes de polarisation des électrodes. En outre, la récupération , en fin de mesure, de l'en- zyme mis en oeuvre selon l'invention est très facile. Ainsi, le procédé selon l'invention permet de disposer d'une quantité d'enzyme pouvant être utilisée pour un grand nombre de dosages consécutifs. De plus, l'appareil selon l'invention est particulièrement bien adapté au fonctionnement automatique. Par exemple, on peut disposer un grand nombre de cellules ou de récipients d'analyse, contenant des échantillons à analyser, sur un plateau tournant, de façon que chacun de ces récipients soit amené successivement au regard d'électndes 3a , 3b d'une part et 4a, 4b d'autre part . Au moment de la mesure, les électrodes sont alors abaissées avant d'être remontées du vase pour lequel la mesure a été réalisée. Après lavage de ces électrodes, elles peuvent être utilisées pour une autre mesure, réalisée pour le récipient suivant Les résultats successifs de dosage peuvent être donnés en lecture directe ou sur une imprimante. Enfin, le procédé selon l'invention peut être employé pour doser toute substance , chimique ou biologique, capable de subir une transformation au contact d'un enzyme fixé sur un support insoluble dans la solution à doser. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits et représentés qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemples En particulier, elle comprend tous les moyens constituant les équivalents techniques des moyensdécrits ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre des revendications qui suivent. R B V S N D I C A C I O N S REVENJ)ICÂTI0NS 1 Procédé pour linalyte enzymatique d'un substrat chimique ou biologique, du type consistant - à mettre en contact une solution contenant ledit substrat avec au moins un enzyme ayant une activité vis-à-vis de ce substrat, les produits résultant de cette mise en contact présentant une conductivité différente de celle dudit substrat; - à immerger deux électrodes dans ladite solution; et - à réaliser ainsi le dosage dudit substrat par la mesure de la variation de conductvité de ladite solution; caractérisé en ce que, avant d'analyser ledit substrat dans la solution, on incorpore ledit enzyme à une matière insoluble dans ladite solution, tel qu'un gel ou support insoluble analogue. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme précité est associé, au sein de la matière insoluble précitée,à au moins une substance modifiant-lFactivité ou la durée de vie dudit enzyme 3 Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la mesure de la variation de conductivité de la solution à doser précitée est réalisée par rapport à une solution de référence, n'étant pas en contact avrZenzyme précité et dont la conductivité est égale à la conductivité initiale de la solution à doser 4 Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que 3a mesure de la variation de conductivité est réalisée avant ou après la transformation totale du substrat. 5. Dispositif pour l'exécution du procédé selon l'une des revendications 1 à 4, du type comprenant - une cellule de mesure pourvue d'une paire d'électrodes et contenant la solution à doser; - une source de tension reliée auxdites électrodes; et - un premier dispositif pour le traitement du signal de sortie de ladite cellule de mesure; caractérisé en ce qu'il comporte une cellule de référence comprenant une pairea'électrodes reliées à ladite source de tension, ladite cellule de référence contenant une solution n'étant pas en contactaRe l'enzyme précité et dont la conductivité est égale à la conductivité initiale de ladite solution à doser, le signal de sortie de cette cellule de référence attaquant un second dispositif de traitement de signal, associé, avec ledit premier dispositif de traitement de signal, à un appareil de mesure formant éventuellement appareil de zéro 6. Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce que la tension appliquée aux cellules précitées est alternative ou continue, le temps d'application de ladite tension continue étant de courte durée. 7 Dispositif selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que l'un au moins des dispositifs de traitement de signal précité est un dispositif à gain réglable tel qu'un amplificateur.