Brevet FR2277097A1 — publié le 19760130

La présente invention concerne un procédé pour la préparation d'un polymère présentant une activité enzymatique. L'utilisation sans cesse croissante des enzymes provenant de micro-organismes dans l'industrie chimique et l'industrie pharmaceutique, à titre de catalyseurs industriels, constitue peut-être l'un des phénomènes les plus marquants de la chimie actuelle. Malheureusement, sauf dans des cas particuliers, l'utilisation de ces enzymes est soit malcommode, soit onéreuse malcommode dans le cas où l'on doit cultiver le micro-organisme contenant l'enzyme sur le milieu de réaction, par exemple dans le cas de l'épuration des effluents, onéreuse dans le cas où l'on doit isoler l'enzyme à partir du micro-organisme la contenant avant son utilisation.Dans le cas où l'on doit avoir recours à la culture du micro-organisme, il est pratiquemment impossible de travailler en continu, ce qui constitue assez souvent un désavantage dans les procédés industriels et, de plus, il est nécessaire de maintenir des conditions de culture adéquates (telles que l'aération) qui constituent à la fois une sujétion et qui rendent le procédé onéreux. Dans le cas où il est nécessaire de séparer l'enzyme du micro-organisme, cette séparation est le plus souvent délicate et le produit obtenu, souvent en assez faible quantité, n'est pas toujours très commode à mettre en oeuvre au stade industriel, en particulier dans des procédés en continu. I1 était donc intéressant de pouvoir disposer d'un produit assez bon marché présentant une activité enzymatique du méme ordre de grandeur que celle des micro-organismes, mais se présentant sous forme très maniable comme des grains de polymère,qui puisse facilement servir de garnissage à des colonnes de réaction pour la mise en oeuvre de procédés en continu. Pour ce faire, la présente invention propose un procédé pour la préparation d'un polymère présentant une activité enzymatique, caractérisé a) en ce qu'on immobilise un micro-organisme doué d'une activité enzymatique dans la matrice d'un polymère en effectuant la polymérisation dudit polymère en présence du micro-organisme b) et en ce qu'on traite ensuite le polymère ainsi obtenu par un solvant ou un mélange de solvants choisis parmi les alcanes inférieurs et leurs dérivés chlorés, le benzène et ses dérivés alcoylés, les éthers inférieurs, les cétones inférieures et les alcools inférieurs. Parmi ces solvants il faut citer tout particulièrement l'éther de pétrole, le chloroforme, le benzène, le toluène, l'éther diéthylique, l'acétone, l'éthanol, le butanol et le propanol.Dans le mode de réalisation preféré du procédé selon la présente invention, le solvant utilisé dans l'étape b est le toluène. L'étape "b" permet notamment de tuer les microorganismes et de perméabiliser les membranes, ce qui permet de restituer au polymère obtenu pratiquement 100 ffi de l'activité enzymatique du micro-organisme utilisé. Néanmoins, la présente invention concerne également un procédé dans lequel le micro-organisme est tué, avant son immobilisation, par tous moyens chimiques ou physiques tels que l'action de solvants organiques polaires ou non polaires, de protéines, de peptides basiques (polymyxine, histones, protamines) ou de rayonnements. Mais il s'agit d'un mode de réalisation beaucoup moins intéressant sauf dans certains cas particuliers. Les polymères qui peuvent être utilisés-dans le procédé selon la présente invention sont très variés et sont de préférence des polymères synthétiques mais peuvent être des polymères naturels. Il est préférable d'utiliser des polymères dont les formes monomères ou dimères sont liquides, ceci afin de faciliter la mise en oeuvre de l'étape "a" du procédé selon la présente invention. En effet, dans cette étape "a" on réalise, de préférence, une dispersion du micro-organisme dans le monomère ou le dimère du produit à polymériser, ce qui n'est évidemment pas possible avec des monomères gazeux. Toutefois, dans ce cas, il est possible, si on le désire, d'avoir recours à des formes faiblement polymérisées liquides dudit monomère gazeux. Dans un mode de réalisation particulièrement intéressant du procédé on utilise des résines acrylamides obtenues de préférence par polymérisation de monoacrylamide et de N,N'-méthylène-bis-acrylamide à l'aide d'un agent de condensation connu tel que, par exemple, un mélange de persulfate d'ammonium et de N,N,N',N'-tétraméthyléthylène-diamine. Il est bien entendu possible d'ajouter au polymère des additifs connus tels que des colorants, dans des buts d'identification par exemple, sous réserve que ces additifs ne nuisent ni à la polymérisation ni à l'activité enzymatique du produit obtenu. Dans le mode préféré de réalisation du procédé selon la présente invention, avant d'effectuer l'étape de traitement b du procédé, le polymère est granulé, ceci permet tout d'abord d'obtenir une forme très maniable du polymère et, d'autre part, d'augmenter la surface de contact entre le polymère et le solvant. Il est possible d'immobiliser, par le procédé selon la présente invention, un grand nombre de micro-organismes qu'ils soient du type bactérie ou micro-fungi. Des essais réalisés sur des spécimens d'un grand nombre de familles d'eubactéries unicellulaires ou mycéliennes et sur des microfungis variés ont permis, dans tous les cas, de se rendre compte que le produit obtenu conserve pratiquemment l'activité enzymatique du micro-organisme immobilisé. Les essais ont été menés plus particulièrement sur des micro-organismes appartenant aux familles suivantes - Enterobacteriaceae, - Bacillaceae, - Pseudomonadaceae, - Micrococcaceae, - Actynomycetes, et sur des micro-fungis. Evidemment la concentration en micro-organisme dans le polymère peut dépendre, en particulier, à la fois du microorganisme utilisé, du polymère utilisé et du but poursuivi. Le produit obtenu se présente de préférence sous forme de granulats mais peut évidemment être mis sous une forme quelconque dans le cas d'utilisation particulière, il est meme possible d'envisager la réalisation d'objetsprésentant une activité enzymatique. La présente invention concerne également un objet en polymère présentant une activité enzymatique tel que granulé, fibre, feuille, etc. Il est évidemment nécessaire de réaliser le façonnage de l'objet, que ce soit avant l'étape "b" du procédé ou après, à des températures qui ne conduisent pas à la destruction de l'enzyme. Les exemples suivants sont donnés afin d'illustrer le procédé selon la présente invention mais ne doivent pas être considérés comme une limitation de celui-ci. Exemple 1 On cultive,dans un milieu minimum contenant du lactose comme source de carbone, une souche d'Escherichia coli de façon à induire la synthèse de la -galactosidase. Les cellules de la souche ainsi induite sont ensuite centrifugées et lavées par un tampon phosphate à pH 7,3. A 0,2 g de ces cellules (poids sec) on ajoute ensuite 0,8 ml d'une solution tampon phosphate à pH 7,3 contenant le monoacrylamide et le N,N'-méthylène-bis-acrylamide pour obtenir des concentrations finales des produits de, respectivement, 24 % et 0,5 % puis on ajoute 0,1 ml d'une solution de N,N,N',N'-tétraméthyléthylène-diamine à 5 % et 0,1 ml d'une solution de persulfate d'ammonium à 0,5 . Le volume final du mélange est ajusté à 2,5 ml puis on effectue la polymérisation entre 0 et 40C pendant une heure. Le gel ainsi formé est passé à travers un tamis de mailles de 0,1 cm puis les grains de polymère sont traités par le toluène. les résultats obtenus avec le produit ainsi préparé sont les suivants - la constante d'hydrolyse Km mesurée à l'aide d'un substrat synthétique, 1 'orthonitrophényl--galactoside, est égale à 1,8.10 2 mole/litre, aussi bien pour les bactéries en suspension que pour le polymère obtenu - on prépare une colonne contenant le polymère afin de réaliser l'hydrolyse en continu d'un effluent présentant une concentration en lactose voisine de celle du lait le taux d'hydrolyse du lactose après passage sur la colonne est pratiquement de 100 . On constate donc bien que le polymère obtenu présente 100 ?, de l'activité initiale des bactéries. Cette activité se conserve bien dans le temps, les études actuelles ont permis de montrer que cette stabilité est supérieure à 5 mois. Exemple 2 On traite selon le procédé de l'exemple 1 une suspension bactérienne de Proteus morganii (1964, Collection de l'institut Pasteur de Lille), le solvant utilisé dans ce cas est encore le toluène et on teste l'activité uréasique du produit obtenu. Lorsque 1 g de gel se trouve placé en colonne, il hydrolyse en continu à un taux de 100 ffi une solution d'urée de concentration égale à celle du sérum sanguin et permet un dosage automatique ultérieur en continu des produits de la réaction. Toute l'activité d'hydrolyse de l'urée de la suspension initiale de bactéries est retrouvée dans le polymère. Exemple 3 On a testé, en les préparant par le procédé décrit dans les exemples 1 et 2, des polymères contenant les microorganismes suivants - Pseudomonas fluorescens sp, pour son activité transaminasique, - Clostridium perfringens sp, pour son activité décarboxylasique des acides aminés, - Micrococcus lysodeikticus et Bacillus megaterium sp, pour leur activité catalasique, - Aspergillus niger sp, pour son activité glucose-oxydasique, - Mycobacterium phlei (689 - Collection de l'Institut Pasteur de Lille), pour son activité peptidasique. Dans tous les cas, le polymère obtenu est doué d'une activité enzymatique très importante, voisine de celle de la suspension de micro-organismes initiale. On conçoit aisément que les possibilités industrielles du produit obtenu par le procédé selon la présente invention sont très nombreuses, aussi bien dans l'industrie de synthèse que dans les procédés d'épuration. Ainsi, le polymère préparé dans l'exemple 1 peut être utilisé afin de traiter le lactosérum obtenu comme effluent des fromageries et qui pose un problème de pollution certain actuellement. Le polymère obtenu doit permettre de traiter en continu cet effluent en dégradant le lactose en glucose et galactose. Nais, il est possible également d'utiliser des polymères selon l'invention dans le domaine de la synthèse organique à titre de catalyseurs, par exemple dans la chimie des stéroïdes où ceux-ci sont nombreux ou bien dans le domaine de la chimie analytique, en particulier de l'analyse médicale. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la préparation d'un polymère présentant une activité enzymatique, caractérisé a) en ce qu'on immobilise un micro-organisme, doué d'une activité enzymatique, dans une matrice de polymère en effectuant la polymérisation en présence du micro-organisme b) et en ce qu'on traite ensuite le polymère obtenu par un solvant ou un mélange de solvants choisis parmi les alcanes inférieurs liquides, les dérivés chlorés des alcanes inférieurs, le benzène, les dérivés alcoylés du benzène, les éthers inférieurs, les cétones inférieures et les alcools inférieurs. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polymère utilisé est un polyacrylamide. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la polymérisation est effectuée à partir d'un mélange de monoacrylamide et de N,N'-méthylène-bisacrylamide. 4. Procédé selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que l'on utilise un catalyseur de polymérisation contenant du persulfate d'ammonium et de la N,N,N',N'tétraméthyléthylène-diamine. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'après la polymérisation le polymère est mis sous forme de granulé avant d'être traité par le ou les solvants. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le ou les solvants utilisés sont choisis parmi l'éther de pétrole, le chloroforme, le benzène, le toluène, l'éther ddihylique, l'acétone, l'éthanol, le propanol et le butanol. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le solvant utilisé est le toluène. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le micro-organisme que l'on immobilise est une eubactérie, une myxobactérie ou un micro-fungi. 9. Produit obtenu par le procédé de l'une des revendications 1 à 8.