Brevet FR2260108A1 — publié le 19750829

La présente invention concerne un substrat gélifié permettant le dosage des enzymes à activité élastolytique et celui des inhibiteurs des élastases ainsi que la préparation de ce substrat. Les enzymes élastolytiques ou élastases jouent un grand rôle en pathologie et sont entre autres responsables de la dégradation du tissu élastique dans l'aorte la peau, le cartilage. Ce processus est impliqué dans la génèse de l'athérosclérose. I1 est donc d'une grande importance de pouvoir déterminer avec précision et rapidité l'activité élastolytique d'extraits tissulaires ainsi que de détecter la présence d'inhibiteurs des élastases dans les milieux biologiques (sérum sanguin par exemple) ou dans des extraits obtenus de différents tissus, ou encore dans des préparations pharmaceutiques destinées à inhiber l'activité des élastases. Le dosage de l'activité élastolytique pouvait se faire jusqu'à présent, par exemple, selon des méthodes colorimétriques (L.A. SACHER et Coll. Proc. Sos. EXPTL.BIOL, New York, Vol. 90, 1955, p. 323)ou selon des méthodes gravimétriques (I. BANGA, ACTA, PHYSIOL. ACAD. SCI. HUGa tome 3, p. 317, 1952). La première de ces méthodes présente l'inoon- vénient de nécessiter la préparation d'un substrat chromogène qui est d'un maniement délicat. La seconde méthode n'est pas assez sensible et nécessite de fortes activités enzymatiques. La présente invention concerne un substrat gélifié qui est constitué par un "élastinosde" et une substance gélifiante dissous dans une solution tampon appropriée et qui permet de doser soit l'activité élastolytique d'extraits tissulaires soit la concentration d'inhibiteurs d'élastases dans des milieux biologiques. Ce substrat peut être présenté par exemple sous la forme de couches minces gélatineuses. L'élastinoide est une substance obtenue par dépolymérisation contrôlée de 1'élastine fibreuse, selon l'une des méthodes décrites ci-après. C'est un mélange de peptides de poids moléculaire de 10.000 à 50.000 environ et est riche en amino-acides aliphatiques. Ces peptides sont hy drosolubles, mais précipitent en présence d'acide trichloracétique à 10%. Leur composition en acides aminés est déterminée génétiquement et dépend essentiellement de l'espèce dont l'élastine est extraite. Elle est de composition constante pour une espèce choisie. TABLEAU I Par exemple, la composition en amino-acides d'un élastinoide extrait d'élastine provenant d'aorte de boeuf est la suivante: Amino acides élastincide (pour 1C00 résidus totaux Desmosine (@) .................................... 4,0 Lysine , 8,9 Histidine ................................. 0,7 Arginine ................................... 6,6 3-hydroxy-proline .......................... 15,6 Acide aspartique ........................... 1,7 Thre'onine 3,5 Sérine ................................... 4,3 Proline .................................... 134,9 Acide glutamique ........................... 20,0 Glycine .................................... 243,3 Alanine .................................... 299,9 Valine ..................................... 154,2 Cystéine ,. 1,5 Méthionine ................................. 4,2 Isoleucine 16,5 Leucine .................................... 45,8 Tyrosine ................................... 5,9 Phénylalanine .............................. 28,5 (X) Desmosine + iso-desmosine exprimée en équivalent de lysine. La substance gélifiante peut être choisie par exemple parmi les composés suivants : agarose, agar-agar, acide alginique et alginates, carboxyméthyl-cellulose et ses sels, polyacrylates, etc. La solution tampon appropriée peut être une solution "Trisn,HCl,encore appelé "Tham" (ces noms de marque correspondant au tris-(hydroxy-méthylamino)-méthane), une solution de phosphate ,une solution à base de véronal, un mélange de citrates et phosphates, etc. La solution tampon peut avoir un pH de 2,5 à 9,6 et son choix dépend essentiellement de l'enzyme dont on cherche à déterminer l'activité. Pour les élastases on utilise de préférence un tampon de pH 8 environ. Les concentrations de l'élastinolde dans le tampon peuvent aller en général de 0,5 à 5 g, tandis que les concentrations de gélifiant vont de 9,5 à 10 g pour 100 ml de solution tampon. On utilise en général des solutions contenant environ 2 g d'élastinoide et 1 g d'agarose pour 100 ml de solution tampon. Les mélanges d'élastinolde et de substance gélifiante peuvent être traités par des agents de pontage afin de donner un plus grand degré de réticulation à ltélastinotde et de le rendre ainsi plus résistant à l'action des protéases non spécifiques. Les agents de pontage peuvent être les agents de réticulation habituellement utilisés pour les protéines, tels que le formaldéhyde ou d'autres aldéhydes comme le glutaraldéhyde. ou encore des carbodiimides hydrosolubles. Les exemples suivants illustrent l'invention. Les exemples 1 à 7 illustrent la préparation de l'élastinoTde et les exemples 8 à 10 la préparation du substrat conforme à l'invention. La préparation de l'élastinoide s'effectue comme suit : Une élastine purifiée est obtenue à partir soit de ligament large de boeuf, soit d 'aorte de porc ou d'autre vertébré supérieur, par une des méthodes suivantes Après dégraissage es organes mentionnés cidessus au moyen d'acétoneet de n-butanol, on extrait toutes les protéines solubles par chauffage dans une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium 0,1 N pendant 45 minutes à 100"C, ou enecre par agitation dans de 1 'acide trichloracétique à 70 à 40G pendant 48 heures.Le résidu insoluble est lavé abondamment avee de l'eau distillée puis de l'acétone et séehé à 37 C sous vide La poudre ainsi obtenue est ltélastine polymère. Celle-ci est ensuite dépolymérisée par l'action d'une base, d'un acide ou d'un enzyme approprié. EXEMPLE 1 On introduit dans de la potasse éthanolique (KOH 1 M dans de l'éthanol à 80%) à 370C, tout en agitant jus qu'à solubilisation totale, l'élastine polymère. On introduit 100 mg d'élastine polymère par 10 ml de solvant. Après solubilisation on neutralise au moyen d'acide acétique et on dialyse pour éliminer les sels. La solution d'élastinorde ainsi obtenue est lyophilisée. EXEMPLE 2 On met en suspension de la poudre d'élastine polymère dans une solution aqueuse à 50% en volume de dioxanne. Tout en agitant on ajoute à cette suspension des pastilles de potasse en quantité telle que la concentration finale soit de 0,5 M, On chauffe la suspension agitée à 45"C jusqu'à dissolution complète de l'élastine. On neutralise avec de l'acide acétique concentré puis on dialyse contre de l'eau courante et on lyophilise. EXEMPLE 3 On procède comme dans l'exemple 2 en utilisant de l'acétone au lieu du dioxanne. EXEMPLE 4 On procède comme dans l'exemple 3 mais on remplace la potasse par de l'hydroxyde de tétraméthylammonium 1M. On chauffe alors e vase clos pendant un temps plus long. EXEMPLE 5 On met de l'élastine polymère en suspension dans une solution tampon Tris-HCl 0,1 M à pH 8,6 puis on ajoute de l'élastase pancréatique ou une autre protéase d'origine végétale (papaïne, ficine), bactérienne ou fongique (collagénase brute de Cl. perfr-ingens) ou animale (pepsine, pancréatine) en quantité suffisante pour obtenir une hydrolyse ("dissolution") lente de l'élastine. Après dialyse on concentre par lyophilisatioh. EXEMPLE 6 On met 10 g d'élastine polymérique en suspension dans 200 ml d'un tampon citrate-phosphate à pH 3, sous forte agitation à 370cl On ajoute 100 mg de pepsine. Après solubilisation de la suspension, on amène la température à 800 pendant 10 minutes pour inactiver l'enzyme. Ensuite on dialyse contre de l'eau distillée jusqu'à élimination des sels et petits peptides et on lyophilise. EXEMPLE 7 On peut "solubiliser" l'élastine polymère à l'aide d'un acide minéral (chlorhydrique) ou organique (acétique) en milieu aqueux-organique (éthanol aqueux à 80% par exemple) à une température de 40 a.800C, tout en agitant. On évapore ensuite l'acide sous vide, on lave la poudre obtenue avec de l'acétone et on sèche. EXEMPLE 8 On prépare à partir de la poudre lyophilisée d'élastinoide une solution à 1 à 2 g dans 100 ml de tampon Tris-HCl 0,1 M de pH 8,0. On ajoute à cette solution de ltagarose, à raison de 2 g pour 100 ml, on chauffe à 400C jusqu a dissolution totale. La solution ainsi obtenue est maintenue à 40"C et coulée sur des lames ou plaques appropriées de façon à obtenir une couche uniforme de l-mm environ d'épaisseur. EXEMPLE 9 On prépare une solution de 1 g d'elastinoide et 2 g d'agarose dans 100 ml d'un tampon Tris-HCl 0,1 M de pH 8,0. On ajoute 5 ml d'une solution de glutaraldéhyde à 10fui. On agite pendant 12 heures à 200 C, on traite pour éliminer l'excès d'aldéhyde soit par dialyse contre le tampon Tris, soit par addition d'un excès (par rapport à l'aldéhyde) d'aminoacide dibasique, par exemple la lysine. La solution d'élastine repontée et d'agarose ainsi obtenue donne un gel très stable à 370cl EXEMPLE 10 On dissout dans 100 ml de tampon acétate de sodium-0;1 M de pH 4,5, 2 g d'élastinoide et 2 g d'alginate de sodium sous agitation constante et on ajoute 100 ml d'éthyl-l (dimEthylamino-3 propyl)-3 carbodiimide, HCl. On agite une heure à 37oC. On élimine l'excès de carbodiimide soit par dialyse à 37 pendant 24 heures contre le meme tampon (acétate) soit on ajoute un excès d'aminoacide basique Comme la lysine. On obtient un gel stable à 31". Les substrats gels obtenus sont placés en couches minces (0,1 à 2 mm) sur des lames ou plaques appropriées et peuvent être utilisés pour le dosage,de l'activité élastolytique (élastasique) d'extraits tissulaires ou bien pour le dosage de l'activité anti-élastolytique des inhibiteurs d'élastases. A cet effet on prépare, sur les couches uniformes de substrat gélifié, de petits trous (mini-godets) de 1 mm de diamètre environ avec un emporte-pièce approprié. Dans ces trous on dépose la solution dont on veut déterminer l'activité élastolytique ou un mélange d'élastase "standardisée" et de l'inhibiteur à tester dont onveut déterminer l'activité ante~ élastolytique. Les plaques ou lames sont alors placées dans une chambre humide à 37C pendant un temps déterminé (par exemple 2 heures). Dans le deuxième cas, on mélange une quantité déterminée d'élastase standardisée (par exemple de ltélastase pancréatique cristallisée d'origine industrielle ou une élastase tissulaire purifiée) avec l'inhibiteur : à titre d'exemple on peut mélanger 5 Aitres d'eau contenant 10 pg d'élastase avec 1 volume égal d'inhibiteur. On dépose le mélange dans. les trous de la plaque ou de la lame après avoir laissé incuber 30 mn à 37 C. A titre de comparaison, on dépose également dans ces trous une solution d'élastase ne contenant pas d'inhibiteur. On plonge ensuite les plaques ou lames dans une solution qui fixe le résultat de la réaction, par exemple dans une solution à 10 d'acide trichloracétique qui précipite les protéines non digérées. On lave ensuite les plaques ou lames dans une solution à 1% d'acide acétique. Là ou l'activité élastolytique s'est exercée on obtient des plages rondes, transparentes qui se situent au milieu d'un gel uniformément opaque. Le contraste entre les-plages transparentes (zonesde lyse où les protéines sont digérées) et les plages opaques (protéines non digérées) peut etre augmenté par des méthodes de coloration appropriées. On mesure les diamètres des plages transparentes, diamètres qui sont proportionnels à l'activité élastolytique. On peut obtenir directement une mesure de l'activité élastolytique si l'on a étalonné au préalable 1 'appa- reil qui permet de faire les mesures à 1'aide de solutions dont on connatt 11 activité élastasique ou de mélanges d'élastase et d'inhibiteurs dont on connaet la concentration. Un appareil particulièrement approprié aux utilisations du nouveau substrat est décrit dans la demande de brevet qui est déposée ce même jour par les mêmes Demandeurs. Par exemple on peut définir l'unité d'élastase comme le diamètre de la zone de lyse obtenue avec 5 p1 d'une solution tampon contenant 1 ug d'élastase pancréatique cristallisée de porc (obtenue chez Whatman Biochemicals, Angleterre). De même, l'unité dtinhibiteur-d'élastase peut être considérée comme la quantité d'inhibiteur (contenue dans un mélange contenant une unité d'élastase) qui réduit de moitié le diamètre de la plage de lyse obtenue avec une unité délastase sans inhibiteur. Les substrats gels de l'invention permettent un dosage rapide et facile de l'activité élastolytique d'extraits tissulaires ou d'inhibiteurs d'élastases et peuvent donc entre utilisés en pharmacologie et pour des études cliniques et expérimentales. EiEVENDICATIONS 1.- Substrat gélifié permettant le dosage des enzymes à activité élastolytique et celui des inhibiteurs des élastases, substrat caractérisé par le fait qu'il comprend un élastinoIde et une substance gélifiante dissous dans une solution tampon. 2.- Substrat selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il se présente sous la forme de couches minces gélatineuses. ).- Substrat selon la revendication 2, caractérisé par le fait que les couches gélatineuses ont de 0,1 à 2 mm d'épaisseur. 4.- Substrat selon l'une quelconque des-revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que I'élastinorde est obtenu par dépolymérisation de l'élastine par l'action d'une base, d'un acide ou d'un enzyme approprié. 5.- Substrat selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que 1'élastinolde est présent à une concentration allant de 0,5 à 5 g pour 100 mi de solution tampon. 6.- Substrat selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que l'élastinolde est présent à une concentration environ 1 à 3 g pour 100 ml de solution tampon. 7.- Substrat selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que la substance gélifiante est présente à une concentration allant de ,5 à 10 g pour 100 ml de solution tampon. 8.- Substrat selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que la substance gélifiante est présente à une concentration allant de 1 à 2 g pour 100 ml de solution tampon. 9.- Substrat selon l'une quelconque des revendications 5 à.8 > caractérisé par le fait que la substance gélifiante est l'agarose. 10.- Substrat selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait que la solution tampon à un pH de 7 à 9. 11.- Substrat selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait qu'il est traité par un agent de pontage des protéines. 12.- Substrat selon la revendication 11, caractérisé par le fait que l'agent de pontage est le glutaraldéhyde. 13. - Procédé de préparation du substrat spécifié dans l'une quelconque des revendications 1 à 12, procédé caractérisé en ce qu'on dissout l'élastinolde et la substance gélifiante dans une solution tampon et, si l'on désire, on traite le mélange par un agent de pontage afin de donner un plus grand degré de réticulation à l'élastinolde. 14.- Utilisation du substrat spécifié dans l'une quelconque des revendications 1 à 12, pour le dosage des enzymes à activité élastolytique et celui des inhibiteurs des élastases.