Brevet FR2260109A1 — publié le 19750829

La présente invention se rapporte à la détérmination dtactivités biologiques en milieu gélifié, notamment à la détermination d'activités d'enzymes et d'inhibiteurs dtenzymes. Dans la demande de brevet déposée ce meme jour par les Demandeurs on expose que certains enzymes peuvent entre dosés à l'aide de substrats gélifiés. Les substrats gélifiés contiennent un réactif enzymatique qui peut entre "digéré" par ces enzymes. Les gels sont coulés en couches minces dans lesquelles on découpe de petits trous et on introduit dans ces trous la solution d'enzymes dont on veut déterminer l'activité. Après des traitements appropriés, l'activité enzymatique qui s'est exercée se traduit par I'apparition, sur le gel, autour des trous, de plages rondes dont la mesure permet de doser les enzymes en question. La présente invention a pour but de fournir un appareillage pour la détermination d'activités biologiques en milieu gélifié, notamment d'aetivités d'enzymes ou d'inhibiteurs d'enzymes, appareillage qui permet deeffectuer toutes les opérations nécessaires pour le dosage de ces activités, depuis la préparation des milieux gélifiés jusqu'à la lecture finale des résultats. Cet appareillage est caractérisé par un support mobile sur lequel on peut déposer une couche de gel contenant un réactif convenable, un dispositif de perforation permettant de découper au moins un trou dans la couche de gel et un dispositif de lecture permettant d'observer la couche de gel après déport, dans le trou, de la solution à étudier et traitement approprié de l'ensemble, afin d'apprécier ltétendue de la plage qui entoure le trou et correspond à l'activité à mesurer. Le support mobile est constitué de préférence par une cuve de réaction pouvant recevoir au moins une plaque sur laquelle sont coulés les couches de gel. Le dispositif de perforation comprend préférablement une matrice interchangeable munie d'au moins un emporte-pièce destiné à découper des trous dans les gels. Les emporte-pièces sont avantageusement reliés à une source de vide, par exemple une trompe à eau ou bien une pompe à palettes, ce qui assure ltenlèvement de la pastille de gel découpée. Le dispositif de lecture peut comprendre une loupe de faible grossissement (par exemple de 3 à 5 fois) et éventuellement un dispositif d'éclairage. I1 est aussi possible d'adjoindre des plaques transparentes portant des graduations en unités d'activité biologique, par exemple en unités d'activités enzymatiques ou encore en degrés d'activité inhibitrice, etc.. La description qui va suivre en regard du dessin annexé, donné à titre d'exemple non limitatif, fera bien comprendre comment l'invention peut autre réalisée. La figure 1 représente l'appareillage en plan. La figure 2 est une coupe selon Il-Il de la figure 1. La figure 3 est une coupe partielle selon III-III de la figure 1 montrant le dispositif de lecture. La figure 4 est une coupe partielle, selon IV-IV de la figure 1 montrant le dispositif de perforation. L'appareillage donné en exemple sur ces figures comporte un bSti métallique 1 muni de 4 pieds, dont deux sont fixes 2 et deux autres de hauteur ajustable 3, de façon à permettre le réglage de l'horizontalité de l'appareil à l'aide d'un niveau à bulles 4 incorporé à celui-ci. Le bSti 1 reçoit un support mobile constitué par une cuve 5 dans laquelle on dispose des plaques 6 recouvertes de gel. La cuve a un fond transparent et est réalisée en matière plastique ou en verre par exemple. Deux côtés de la cuve s'adaptent dans des rails 7 de l'appareil, ce qui peut se faire au moyen de bandes-guides portant à distance régulière, égale exactement à la longueur d'une plaque 6, des encoches destinées à recevoir des butoirs à ressort montés sur les rails de l'appareil. Les butoirs et les encoches sont alors disposés de façon à immobiliser la cuve dans son déplacement latéral de manière à présenter les plaques convenablement centrées soit en dessous du dispositif de perforation, soit devant le dispositif de lecture. On peut utiliser plusieurs cuves pour le meme appareil pour un grand nombre de dosages. Les cuves ont de préférence une largeur suffisante pour recevoir deux rangées parallèles de plaques, et leurs longueurs peuvent entre différentes et correspondre par exemple à la longueur de deux, trois ou quatre plaques. Le fond transparent des cuves est cloisonné en alvéoles 8. Les cloisons 9 déterminent la place de chaque plaque 6 avec une précision telle que celle-ci se trouve bien centrée. Chaque cuve est munie d'un couvercle 10 étanche à double paroi. La paroi inférieure est percée de trous 11, et entre les deux parois se trouve du coton, du papier filtre ou une éponge > imbibées d'une solution nécessaire pour assurer la saturation de l'intérieur de la cuve de vapeurs de solvants. Les plaques 6 sont de préférence en verre et ont toutes les mêmes dimensions, par exemple 8 x 12 cm. On peut prévoir la production en série de plaques recouvertes de gel, qui seraient commercialisées toutes prêtes. hn outre, on peut prévoir des plaques de verre comportant une grille de lecture, millimétrique ou en unités empiriques d'activités quelconques (enzymatiqWe, inhibitrice, etc.). Il est à noter que le gel comporte un des réactifs, substrat ou enzyme ou autre, nécessaire pour un travail donné. ta nature de chaque réactif incorporé dans le gel est précisée à propos de chaque type d'application. Un support 12 est prévu d'un capté du bSti 1 pour la fixation de la tête d'un dispositif de perforation 13. Ce dispositif comprend une matrice 14 interchangeable portant des emporte-pièces 15 qui percent dans le gel des mini-godets (trous). Les trous peuvent avoir par exemple 1 mm de diamètre. Pour chaque sorte de travail à effectuer, on peut prévoir une matrice avec le nombre d'emporte-pièces nécessaires. Les matrices s adaptent d'une manière étanche dans la texte de perforation reliée à une source de vide par l'intermédiaire d'une conduite fermée par une soupape à ressort. Le vide peut entre obtenu soit par raccordement du dispositif à une trompe à eau, soit par incorporation dans l'appareil d'un moteur à palettes. Un casier 16 est prévu pour le logement d'un tel moteur. La tête de perforation est suspendue à des ressorts 17 dont l'élongation permet la mise en contact des emporte-pièces de la matrice avec la surface du gel. Lorsqu'on abaisse la tette, un contacteur par exemple déclanche le moteur pour faire le vide et les parties de gel découpées par les emporte-pièces se trouvent éliminées par succion. Le dispositif de lecture comprend essentiellement une loupe 18 maintenue par un support 19. La loupe possède des dimensions telles qu'elle permette d'observer avec un faible grossissement (3 à 5 fois) tout ou une partie d'une plaque 6 sur laquelle une détermination a été effectuée. Le bâti 1 de l'appareil, juste en dessous de la loupe, est muni d'une fenêtre 20, éclairée par en dessous au moyen dsune source lumineuse 21. L'intensité de ltéclairage fournie par la source peut entre réglée à l'aide d'un rhéostat ou d'un potentiomètre 22 .Entre la source et la fenêtre de lecture se trouve un tiroir 23 dans lequel peuvent être introduites des plaques transparentes portant des graduations appropriées à chaque type de détermination, par exemple des graduations en unité d'activité biologique, enzymatique, ou encore en degré d'activité inhibitrice. Enfin, deux supports 24 sont destinés à recevoir des pipettes permettant d'aspirer des quantités déterminées de liquide (sérum sanguin, réactifs, etc.), les mélanger, les incuber au besoin (par exemple dans le cas de réactions enzyme-inhibiteur), puis de déposer le mélange réactionnel én quantité déterminée dans un mini-godet. L'appareillage qui vient d'etre décrit peut entre utilisé comme suit On coule le substrat gélifié sur les plaques de verre 6 quand celles-ci sont en place dans les-alvéol-es 8 de la cuve 5. Après solidification du gel, on perfore celui-ci à l'aide de la matrice . On introduit dans les mini-godets ainsi formés la solution biologique dont on veut déterminer l'activité. Ensuite on enlève la cuve du plateau de l'appareil et on la recouvre d'un couvercle étanche à double paroi 10. Dans le cas d'une réaction enzymatique courante, la cuve ainsi fermée est placée dans une étuve réglée à la température désirée pour l'incubation, par exemple 37"CI pour une durée déterminée. Ensuite on ouvre la cuve et on traite les plaques de verre ensemble avec les solutions appropriées (fixateurs, colorants, décolorants, rinçages etc...). pendant toutes ces manipulations les plaques de verre restent à leur place fixe dans la cuve, et c'est toujours dans la même position que la cuve et les plaques qu'elle contient, repasse dans l'appareil. La cuve se déplace dans ses rails et fait défiler devant la loupe de lecture les plaques de verre, sur lesquelles les résultats des réactions sont visibles. On mesure, au moyen d'une plaque transparente étalonnée disposée dans le tiroir 21, les dimensions des plages entourant les mini-godets. L'appareillage selon la présente invention permet de réaliser rapidement et commodément des mesures quantitatives d'activités biologiques en milieu gélifié, notamment d'acti- vités d'enzymes et dtinhibiteurs d'enzymes tels que des élastases et d'inhibiteurs dtélastases. REVENDICATIONS 1.- Appareillage pour la détermination d'activités biologiques en milieu gélifié, notamment d'activités d'en- zymes ou d'inhibiteurs d'enzymes, caractérisé par un support mobile sur lequel on peut déposer une couche de gel contenant un réactif convenable, un dispositif de perforation permettant de découper au moins un trou dans la couche de gel et un dispositif de lecture permettant d'observer la couche de gel après dép8t,dans le trou,de la solution à étudier et traitement approprié de l'ensemble, afin d'apprécier l'étendue de la plage qui entoure le trou et correspond à l'activité à mesurer. 2.- Appareillage selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le support mobile comporte une plaque sur laquelle est déposée la couche de gel et une cuve pouvant recevoir au moins une telle plaque. 3.- Appareillage selon la revendication 2, caractérisé par le fait que la cuve est amovible et est munie d'un couvercle étanche à double paroi. 4.- Appareillage selon la revendication 2 ou la revendication 3, caractérisé par le fait que la cuve peut se déplacer sur des rails permettant d'amener les plaques devant le dispositif de perforation et le dispositif de lecture. 5.- Appareillage selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que le dispositif de perforation comprend une matrice munie d'au moins un emportepièce montéeélastiquement. 6.- Appareillage selon la revendication 5, caractérisé par le fait que la matrice est reliée à une source de vide destinée à aspirer la pastille de gel découpée. 7.- Appareillage selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que le dispositif de lecture comprend une loupe de faible grossissement et un dispositif d'éclairage. 8.- Appareillage selon la revendication 7, caractérisé par le fait que le support mobile est transparent et que le dispositif d'éclairage est du cSté opposé à la loupe par rapport au plan du support. 9.- Appareillage selon l'une quelconque des revendications 1 a 8, caractérisé par le fait que l'appareillage comporte un bâti muni de pieds de hauteur réglable et un niveau 9 bulles afin d'assurer L'horizontalité de l'appareillage.