Brevet FR2280387A1 — publié le 19760227

La présente invention, à la réalisation de laquelle ont participé messieurs Guy BOURAT et Rodolphe MARGRAF, concerne de nouveaux copolymères solubles de la L-lysine et du L-tryptophane leur préparation et les compo- sitions qui les contiennent, Dans le brevet belge 798 994 ont été décrits des poly L-lysine modifiées constituées de n motifs de forsule (I) et de in sotifs de formule (IT) t formant un enchaînement polypeptidique de nature statistique avec n + m superieur à 30 de préférence supérieur à 2000, m pouvant être nul et R pouvant représenter ltun des groupements suivants : -NHS03H 8 -NH(CH2)pSO3H dans lequel p est supérieur ou égal à i ; -NH2(CH2)2COOH; -NHCOCH2CH2OH; -NHCO(CH2)3SO3H; -NHCONH2; -NHC(=NH)NH2; OH; N(CH3)2 dqui présentent des propriétés anticoagulantes particulièrement intéressantes. Les nouveaux produits selon la présente invention sont des copolymères statistiques qui peuvent être représentés par la formule générale : dans laquelle x et y représentent respectivement le nombre des motifs de L-lyaine sulfonée et de L-tryptopnane. De préférence, les produits solubles en milieu aqueux dans les conditions de force ionique et dtacidité propres aux autres vivants sont ceux pour lesquels le rapport y est compris entre 2 et 20, la somme x + y y étant supérieure à 1000 et de préférence voisine de 1500. Les nouveaux copolymercs de formule générale (In) peuvent exister sous forne d'un sel alcalin, tel que le sel de sodium ou de potassium, ou alcalino-terreux, ou sous forme d'un sel d'addition avec une base azotée. Selon la présente invention les nouveaux produits de formule générale (III) peuvent autre obtenus par copolymérisation du N-carboxyanhydride une L-lysine de formule générale t dans laquelle Z représente un groupe protecteur de la fonction amine libre facilement éliminable sans toucher au reste de la molécule, tel que le radical benzyloxycarbonyle, avec le N-carboxyanhydride du L-tryptophane, suivie de l'élimination du groupe protecteur de la fonction amine et de son remplacement par le radical -S03H. Généralement la copolymérisation s'effectue dans un solvant organique inerte tel que le dioxanne anhydre en présence d'un initiateur de polymérisation. Comme initiateurs peuvent titre utilisés l'eau, une base minérale telle que la soude ou la potasse, une amine primaire, secondaire ou tertiaire ou un alcoolate alcalin. Les meilleurs résultats sont obtenus en employant le méthylate de potassium. La copolymérisation peut s'effectuer dans des conditions de température variées mais il est préférable d'opérer à une température voisine de 20in. Dans ces conditions la copolymérisation est complète après 10 å 14 jours. L'élimination du groupement protecteur Z steffectue selon les méthodes habituelles utilisées en chimie peptidique. De préférence, lorsque Z représente le radical bensyloxycarbonyle, le remplacenent de ce radical par un atome d'hydrogène est réalisé en milieu acide. Généralement on fait barboter un acide, tel que l'acide chlorhydrique ou 11 acide bromhydrique anhydre, dans une solution du copolymère dans un solvant organique, tel que le chloroforme, à une températur voisine de 20 C. Il est particulièrement avantageux d'opérer en présence d'un antioxydant tel que l'acide thio glycolique. La transformation des radicaux amino libres du copolynère ainsi obtenu en radicaux sulfoamino peut etre effectuée selon les méthodes habituelles utilisées en chimie organique qui permettent cette réaction sans toucher au reste de la molécule. De préférence, on utilise le complexe pyridine-anhydride sulfurique, préparé selon Inorganic Synthesis, II, 173, en opérant à une température comprise entre -5 et 10 C sur une solution aqueuse alcaline du copolymére intermédiaire, Le copolymere de formule générale ('n) obtenu selon le procédé de la présente invention peut être purifié selon les méthodes physico chimiques habituelles et plus particulièrement par ultra-filtration sur une membrane appropriée. Les copolymères obtenus selon le procédé de la présente invention présentent une activité anticoagulante particulièrement intéressante qui est d'un type nouveau vis-a-vis de produits de structure connue tels que les héparinoïdes et les hirudinodes. Ils manifestent une activité nettement supérieure à celle des polymères qui font l'objet de brevet belge 798 994. Ils provoquent un allongement très important du temps de coagulation par exemple sur le plasma citraté du chien dans les techniques suivantes t - temps de thrombine, selon R. M. Biggs et Ro G. Mac parlane (Blood coagulation and its disorders - Blackwell Scientific Publications - Oxford 1962), - temps de Quick, selon A. J. Quick, J. Biol. Chem., 109, 73 (1935) 1 - temps de céphaline-kaolin, selon H. J. Larrien et C. Weilland, Rev. Hemat., 12, 2 (1957). Dans le tableau suivant sont rassemblés les résultats qui ont été obtenus dans ces techniques avec s 87 a) un produit de formule générale (III) dans laquelle x/y= et la somme 13 x + y est supérieure ou égale à 1600, et b) l'héparine. Temps de coagulation mesuré (secondes) Milieu réactionnel étudié Temps de Temps de Teqs de thrombine Quick céphtalin -kolin Plasma citraté tel quel 12 7,6 24 Plasma citraté + Poly(L-tryptophane, L-lysine N-c sulfo) 0,42 mg/1 31 0,84 mg/l 13,9 35 2,1 mgl 17,3 43 3,4 mg/l 57 4,2 mg/l 27,9 8,4 mg/l 12,7 14,7 mg/l 15,3 21 mg/l 16,4 42 mg/l 22,6 84 mg/l 26,6 Plasma citraté + héparine 0,5 mg/l 13,7 0,75 mg/l 25,6 35 1 mg/l 29 43 1,5 mg/l 55 5 mg/l 9,8 10 sel. 13,1 20 mg/l 20,7 25 mg/l 27,8 Quelle que soit la technique utilisée, le poly(L-tryptophane, L-ly- sine N-c sulfol provoque un allongement très net du temps de coagulation et cette action anti-coagulante est du même type que l'action de l'héparine. De plus, l'activité anti-coagulante des produits selon l'inven- tion se manifeste à des doses tres inférieures à celles qui sont necessaires pour les produits du brevet belge 798 994. Ainsi, selon la présente invention, un allongement du temps de thrombine de 16 X environ est obtenu avec une concentration de 0 > 84 mg/l alors qu'avec le produit de l'exemple 10 du brevet belge 798 994 il est nécessaire d'utiliser une concentration de 15 mg/l pour obtenir un allongement équivalent du temps de thrombine. Lut exemple suivant, donné à titre non limitatif, illustre la présente invention : EXEMPLE a) On dissout 6,6 millimoles du N-carboxyanhydre du L-tryptophane et 60 millimoles du N-carboxyanhydride de la N-e benzyloxycarbonyl L-lysine dans 660 cm3 de dioxanne anhydre. On ajoute 1,66 cm3 d'une solution de méthylate de potassium dans le méthanol (0,1 M) puis agite pendant 12 jours à une température voisine de 20 C et à l'abri de l'humidité. On obtient alors une solution incolore, limpide et visqueuse qui est désignée ci-après par "solution polymérisée". La "solution polymérisée" est versée dans 2,6 litres d'éthanol anhydre. Le polymère qui précipite est filtré puis est dissous dans 200 cm3 de chloroforme puis est reprécipité par addition d'un litre d'éther de pétrole. Après filtration et séchage sous pression réduite (0,1 mn de mercure) à 40 C, on obtient 11 g d'un solide filandreux dont la viscosité intrinsèque dans le diméthylformamide à 250C est t =2,7 d'où l'on déduit la somme x + y qui est supérieure ou égale à 1600. b) A 330 cm3 de "solution polymérisée" obtenue dans les conditions décrites ci-dessus, on ajoute 660 cm de dioxanne anhydre, 2500 cm3 de chloroforme anhydre et 35 cm3 d'acide thioglycolique. Dans cette solution, on fait passer successivement, à 20 C, un courant de gaz chlorhydrique anhydre pendant 30 minutes puis un courant de gaz bromhydrique anhydre et exempt de brome libre pendant 45 minutes. Le copolymère qui précipite est isolé par décantation puis lavé par de l'éther éthylique et enfin rapidement séché. Le solide est repris par 500 cm3 dteau et la solution est soumise à une ultrafiltration sur membrane AMICON XM 100 en rinçant à l'eau distillée jusqu'à disparition des ions bromure dans le filtrat. Le retentat est alors lyophilisé. On obtient ainsi 5,5 g d'un solide fibreux blanc contenant 5 % d'eau, qui est soluble dans l'eau et insoluble dans les solvants organiques usuels. Par dosage spectrophotométrique en solution aqueuse diluée à 280 nm, on détermine le pourcentage moléculaire des restes tryptophane qui 87 est de 13 % ce qui correspond à un rapport x/y = 13 c) 3,8 g du copolymère obtenu précédement sont dissous dans 380 cm d'eau distillée. On ajoute 19 g de tétraborate de sodium (Na2B407, 10H2O), refroidit à 0 C et ajuste le pH à 8,8 par addition dtune solution normale de soude. On ajoute alors en une seule fois 3,8 g du complexe pyridineanhydride sulfurique (préparé selon Inorganic Synthesis, II, 173), agite énergiquement en maintenant la température entre 0 et 50C et en maintenant le pH à 9,8 par addition d'une solution normale de soude. Au bout de 2 heures, on ajoute à nouveau 3,8.g de complexe pyridine-anhydride sulfurique et encore 2 heures après 3,8 g de complexe pyridine-anhydride sulfurique, en opérant dans les mêmes conditions. Le tétraborate de sodium en excès est filtré et la solution limpide obtenue est soumise à une ultra-filtration sur membrane AMICON XM 100 Les sels minéraux dissous sont éliminés par lavage à 11 eau distillée puis on ajuste le pH à 13 par addition d'une solution de soude et enfin lave à l'eau distillée jusqu'à neutralité du filtrat. Le retentat, après lyophilisation, fournit 3,8 g de solide fibreux blanc contenant 9 X d'eau dont l'analyse élémentaire est la suivante Z N X = calculé t 12,5 I trouvé (sur sec) : 12,3 1 S % = calculé 12,4 ; trouvé (sur sec) t 12,05 ; et qui est le sel de sodium d'un produit de formule générale (III) dans 87 laquelle x/y = et la somme x + y est supérieure ou égale à 1600. 13 Le N-carboxyanhydride de la N-# benzyloxycarbonyl L-lysine peut être préparé selon la méthode de N. BERGMANN et L. ZARVAS, J. Biol, Chem. 111, 245, 1935. Le N-carboxylanhydride du L-tryptophane peut être préparé selon la méthode de E. KATCHALSKI et coll., J. Amer. Chem. Soc. 76, 299 (1954) ou selon celle de A. C. FARTHING, J. Chem. Soc., 3213 (1957). La présente invention concerne les compositions pharmaceutiques qui contiennent au moins un produit de formule générale (III) en association avec -un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et pharmaceutiquement acceptables. Ces compositions sont administrées par voie parentérale et plus particulièrement par voie intra-veineuse. Les compositions selon l'invention pour administration parenté rale peuvent autre des solutions stériles aqueuses ou non aqueuses, des suspensions ou des émulsions. Comme solvant ou véhicule on peut employer le propylène-glycol, le polythyline-glycol, les viles végétales, en particulier l'huile d'olive et les esters organiques injectables, par exemple l'oléate dtéthyle. Ces compositions peuvent également contenir des adjuvants en particulier des agents mouillants, émulsifiants et dispersants, La stérilisation peut se faire de plusieurs façons par exemple à l'aide d'un filtre bactériologique, en incorporant à la composition des agents stérilisants, par irradiation ou par chauffage.Elles peuvent également Qtre préparées sous forme de compositions solides stériles qui peuvent atre dissoutes au moment de l'emploi dans de l'eau stérile ou tout autre milieu stérile injectable. Les compositions selon l'invention sont utilisables dans le traitement des accidents trombo-emboliques médicaux, chirurgicaux ou obstétricaux. En thérapeutique humaine, les doses dépendent de l'effet recherché et de la durée du traitement : elles peuvent autre comprises entre 50 et 250 mg par jour pour un adulte par vote intraveineuse. L'exemple suivant, donné à titre non limitatif, illustre une composition selon l'invention : EXEMPLE On prépare la solution ayant la composition suivante - Poly(L-tryptophane, L-lysine N-e sulfo) ..... 25 g -Soluté injectable ..... 1000 cm Cette solution est stérilisée par filtration sur un filtre bactériologique puis est répartie en ampoules à raison de 10 cm3 par ampoule. Les ampoules sont scellées. On obtient ainsi des ampoules contenant 0,25 g de principe actif. REVENDICATIONS 1 - Un nouveau copolymère statistique caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale s dans laquelle x et y représentent respectivement le nombre des motifs de L-lysine sulfonée et de L-tryptophane, et ses sels. 2 - Un nouveau copolymère statistique selon la revendication 1 x pour lequel le rapport y est compris entre 2 et 20, et la somme x + y est y supérieure ou égale à 1000. 3 - Un nouveau-copolymère statistique selon la revendication t 87 caractérisé en ce que le rapport x/y est égal à et la somme x + y est 13 supérieure ou égale à 1600. 4 - Un procédé de préparation d'un copolymère selon la revendication t caractérisé en ce que l'on copolymérise le N-carboxyanhydride dtune L-lysine de formule générale t dans laquelle Z est un groupe protecteur de la fonction amine facilement éliminable sans toucner au reste de la molécule, avec le N-carboxyanhydride du L-tryptophano puis élimine le groupe protecteur Z et le remplace par le radical -S03H. 5 - Un procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que Z représente le radical benzyloxycarbonyie. 6 - Composition pharmaceutique caractérisée en ce quelle contient un copolynère selon la revendication 1 en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles.