Brevet FR2277889A1 — publié le 19760206

la présente invention concerne un procédé de préparation de Vitamine B 12 par fermentation. lus particulièrement elle concerne un procédé qui consiste à cultiver des microorganismes du type de: Bacillus Megaterium, Propionebacterium Shermanii, Propionibacterium Freudeureichii, streptomyces griseus, strep. olivaceus, strep. Rimosus dans des conditions spécifiques de fermentation en présence de matière première spécifique qui est le moût de manioc. La présente invention concerne la mise au point d'un procédé Cie fermentation utilisant une matière première spécifique, abondante, bon marché et économiquement rentable, l'utilisation du moût de manioc est facile et sa mise en oeuvre ne nécessite pas d1 installations spéciales. La demanderesse a mis au point un procédé de production de Vitamine B 12, par fermentation de moût de manioc. La présente invention fournit désormais une biosynthèse de Vitamine B 12 par utilisation d'une matière première spécifique et à l'échelle industrielle. En utilisant comme agents d'inoculation des souches originales ou mutantes de : bacilles Megaterium, rropionibacterium Shermanii, Propionibacterium Freudeureichii, Streptomyces grissus, streptomyces olivaceus, streptomyces rimosus qui sont capables de produire la Vitamine B 12, le procédé de la présente invention permet de biosynthétiser par fermentation de moût de manioc une quantité importante de Vitamine B 12. Dans la présente invention la source principale de carbone est le moût de manioc. D'autres sources de carbone peuvent être glucose, saccharose1 dextrine, amidon, mélesse....etc. la source de carbone n'est pas limitée à une seule substance mais elle peut comprendre un mélange de deux ou de plus de deux substances. Toutefois la source principale et parois unique de carbone est le moût de manioc. Comme source d'azote on peut utiliser divers types de sels ou composée minéraux ou organiques tels par exemple : urée, sels d'ammonium, chlorures, sulfates, nitrate, acétates, phosphates etc... ou des substances naturelles contenant l'azote telles que liqueur de macération de mats, extrait de viande, une peptone, de la farine de poisson, les matières solubles de poisson, un hydrolysat de caséine, un amino-acide...etc. le milieu de culture comportera des sels minéraux et autres produits nutritifs usuels. De plus dans le cas où l'on utilise des souches ayant des exigences particulières de nutrition, des substances qui peuvent satisfaire à ces exigences de nutrition doivent être ajoutées au milieu de culture. Ces substances comprennent des amino-acides, des vitamines etc.. es précurseurs, morceaux de nucléotides aident à la biosynthèse de la B 12. Ces précurseurs sont : 1 amino 2 propanol ; 0. phenylènediamine, 1.2 dimethyl, 4.5 diaminobenzène, 5.6 diethylbenzimidazole, 5. aminobenzimidazole, 5. oxymethylbenzimidazole. La dose de l'additif efficace à ajouter ne doit pas nuire la quantité du produit recherché ni détruire le microorganisme. Il doit être tenu compte du microorganisme, ce la composition du milieu, des conditions d'incubation. L'activité vitaminique B 12 sera mesurés de façon biologique par les procédés classiques. (activité vis-à-vis de 3. Coli, lactobacillus Leichmanii, L. Lactis onchromonas malhamensis, onchromonas sp. etc..). Après la culture, la Vitamine B 12 est récupérée du milieu de fermentation, filtrat de culture ou mase cellulaire selon le cas, par les procédés physico-chimiques habituels : précipitation, adsoption, extraction par solvants organiques etc.. Il sera possible de récupérér également les sous produits de farmentation et qui peuvent être selon le ca la streptomycine, l'oxy- tétracycline. La méthode selon l'invention est en outre illustrée par les exemples qui suivent qui ne doivent en aucun cas limiter la portée de l'invention. Préparation du moût de manioc triage des tubercules puis lavage. pluchez les tubercules puis les soumettre à un blanchiment (cuisson durant 8 à 10 minutes). Broyez ensuite les tubercules én présence d'un peu d'eau de manière à obtenir une puré. Soumettes à une hydrolyse acide sous pression 3 à 4 kg. Le traitement par l'acide sulfurique donne un pH final de 1,5 . Neutralisez par exemple par traitement par un lait de chaux jusqu'à pd 6.8. Filtrez pour éliminer le sulfate de calcium précipité. Clarifiez par filtration (filtre presse), centrifugation ou décantation puis soutirage du jus. Le jus soutiré sera soumis å la fermentation et constitue la source de carbone. Le schéma du protocole opératoire est le suivant:: PREPARATION DU MOUT DE MANIOC Triage des tubercules Lavage Epluchage Blanchiment des tubercules durant 8 à 10 minutes Broyage en présence d'un peu d'eau (10 %) de manière à obtenir une purée hydrolyse acide sous pression 9 - 4 kg (pH final 1,5 environ) Clarifier par filtration, centrifugation etc... La pus obtenu (îu à 0 % du poids des tubercules) Neutralisation (alcali) Fil ration # Filtrat = liqueur neutre Stérilisation (Pasteurisation) v Fermentation dans de onditions spécifiques en utilisant les microorganismes du type de Bacillus Megaterium, propionibacte rium shermanii, propionibacterium freudeureichii, streptomyces griseus, streptomyces clivaceus, streptomyces rimosus. Recupérer la vitamine B 12 par les procédés pgysico-chi3iques habituels. REVENDICATIONS 1 - Procédé de biosynthése de la vitamine B 12 par tementation de -moOt par utilisation comme inoculum d'un des microorganismes du type: Bacillus mégaterium. Propionibacterium shermanii, P. Freudenreichii, streptomyces grises, streptomyces olivaceus, S. Rimosus, caractérisés en ce que l'on prépare un moOt a partir de tubercules de manioc épluchés, blanchis, (cuisson 8 à 10 minutes), broyés et soumis à une hydrolyse acide sous pression 3 à 4 ; le jus obtenu étant ensuite neutralisé après filtration, centrifugation, ou décantation et soutirage. 2 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le tait qu'il est réalisé en continu ou discontinu. 3 - Procédé selon la revendication 2 caractérisé par le fait que le moOt de manioc est utilisé comme source principale de carbone assimilable, l'utilisation comme inoculum de fermentation d'une des cultures en phase de croissance active de bacillus Megaterium, Propionibacterium shermanii, propionibactérium treudenreichii, streptomyces griseus, streptomyces olivaceus, streptomyces rimosus. 4 - la vitamine B 12 obtenue par un procédé selon les revendications 1 a 3. 5 - manière première pour la biosynthése de la vitamine B 12 obtenue selon les revendications 1 à 2.