Brevet FR2280082A1 — publié le 19760220

La présente invention concerne un procédé pour le dosage de la bilirubine dans les liquides biologiques. La bilirubine se présente sous forme de cristaux prismatiques ou de lamelles de couleur orange à marron. Elle peut exister dans le sérum (ou le plasma) sous deux formes I) bilirubine non conjuguée, appelée aussi bilirubine "indirecte" ou libre. C'est un métabolite de l'hémoglobine des globules rouges. 2) bilirubine glyCurono-conjuguée, appelée aussi bilirubine directe. La bilirubine est conjuguée à l'acide glycuronique par les cellules hépatiques et excrétée dans la bile. D'une façon schématique, la concentration en bilirubine non conjuguée (bilirubine indirecte ou libre) s'élève lors d'une destruction ou d'une atteinte des cellules hépatiques. Ces dernières sont alors incapables de conjuguer la bilirubine. En revanche, la concentration sérique (ou plasmatique) en bilirubine directe, glycurono-conjuguée, s > élève lors de l'obstruction des canaux hépatiques, comme dans le cas de lithiase, compression, tumeurs, etc. La détermination spécifique et exacte de l'un et l'autre type est donc importante pour le diagnostic étiologique. Le titrage guide le pronostic et les mesures thérapeutiques (en particulier, d'une façon décisive lors de maladie hémolytique du nouveau-né par incompatibilité Rh). La détermination des deux types de bilirubine est effectuée d?une manière générale par dosage de la bilirubine directe et dosage de la bilirubine totale. La bilirubine indirecte est déterminée par différence ~ Bil - bilirubine Bilirubine totale - bilirubine directe - indirecte EHRLICH (P., Zentr - Klin - Med. 4, 721, 1883) fut un des premiers à proposer la copulation du cation p-sulfophényldiazonium à la bilirubine pour obtenir un dérivé coloré. La coloration est bleu-vert en milieu alcalin. Cette dernière propriété est particulièrement intéressante pour le dosage, car les interférences dues aux pigments colorés du sérum : orange (carotène) rouge (hémoglobine) sont de ce fait éliminées. Afin de déterminer la bilirubine totale, il est nécessaire de rompre les liaisons bilirubine-protéines sériques (sérum albumine). Divers procédés ont été décrits - Addition d'alcool méthylique (MALLOY et EVELYN, J. 3101. Chem., 119, 481, 1937) - Addition d'alcool éthylique (HIJFIANS VAN DEN BERG, A.A.H., MULLER P., Biochem. Z., 77, 90J 1916) - (HIJMANS VAN DEN BERG A.A.H., SNAPPER, I., Dent. Arch. Klin, Med., 110, 540, 1913) - Addition du réactir antipyrine-urée-acétate de sodium (BRUCHNER cité par LECOQ) - Addition d'une solution de caféine (JENDRASSIK, L., GROF, P., Biochem. Z., 297, 81, 1938). L'utilisation du réactif à la caféine présente l'avan- tage de ne former ni louche, ni précipité. Les solutions restent limpides au cours du dosage. Une difficulté réside dans le fait qu'il faut prévoir un mode opératoire permettant de doser, d'une part, la bilirubine totale dans des conditions de précision satisfaisantes, en particulier, stabilité de la coloration, etc., d'autre part, exclusivement la bilirubine directe (sans interférence de la bilirubine indirecte). En effet, lors de l'addition du réactif azoique, ce dernier réagit (en milieu acide) rapidement avec la bilirubine directe. I1 faut alors s'assurer que, dans la succession des conditions opératoires choisies, la bilirubine indirecte ne réagit pratiquement pas, alors que la totalité de la bilirubine directe a effectivement réagi. Certains auteurs ont préconisé l'utilisation d'acide ascorbique pour empêcher la réaction de la bilirubine indirecte une fois que la bilirubine directe a totalement réagi. Toutefois, cette méthode présente un inconvénient majeur : l'acide ascorbique est en effet un réactif instable, facilement oxydable, surtout en solution. On a aussi préconisé l'utilisation de l'hydroxylamine, du glutathion et divers produits chimiques. La présente invention a pour objet un procédé de titrage de la bilirubine contenue dans un liquide biologique par copulation de la bilirubine avec un diazotque et dosage colorimétrique du produit de copulation en milieu alcalin, caractérisé en ce que, après l'addition du diazotque, on ajoute au milieu réactionnel de l'hydrazine comme stabilisant en une concentration au moins 400 fois supérieure à celle du diazoïque et de préférence 600 fois supérieure. Comme hydrazine, on peut utiliser de l'hydrate dthydra- zine ou de l'hydrazine anhydre ou un sel d'hydrazine avec un acide minéral ou organique. L'hydrazine est avantageusement ajoutée au milieu réactionnel sous forme d'une solution aqueuse acide, ayant de préférence un pH inférieur à 2. L'hydrazine est ajoutée avantageusement au bout de 2 à 3 minutes. L'utilisation d'hydrazine présente entre autres, les avantages suivants a) le réactif est stable et peut être conservé à température ambiante pendant plusieurs mois, b) il stabilise la coloration obtenue, évitant un minutage précis aussi bien dans le dosage de la bilirubine totale que de la bilirubine directe, c) il inhibe le sel de diazonium en excès après que la réaction avec la bilirubine directe ait eu lieu; il permet un dosage précis et exact de la bilirubine indirecte, évitant en particulier les erreurs par excès, d) il est incolore et n'interfère en aucune façon avec la réaction, ni par inhibition, ni par déplacement spectral, ni par absorption spectrale. I1 ne développe aucune coloration parasite. L'hydrazine stabilise la coloration et arrête donc la réaction au stade voulu et recherché. On peut en faire la démonstration suivante Dans deux tubes à essais, marqués A et B, on introduit les réactifs, comme indiqué au tableau ci-dessous Réactif Tube A Tute 3 Phénol 200 mg 200 mg Eau distillée 2,8 ml 3 ml Na OH O,I N 0,5 ml 0,5 ml On agite pour dissoudre. Réactif hydrazine 0,2 ml Réactif diazoïque 0,2 ml 0,2 ml. Dans le tube B : il se forme une coloration orangée immédiate due à la opulation du réactif diazorque sur le phénol. Cette coloration est stable. Dans le tube A : il ne se forme aucune coloration. La solution demeure limpide et incolore. De même, la diazocopulation sur une amine aromatique n'a pas lieu en présence d'hydrazine. Dans deux tubes à essais chargés A et B, on introduit les réactifs comme indiqué ci-dessous Réactif Tube A | Tube B Aniline 0,05 ml 0,05 ml HCl 0,05 N 2,5 ml 2,5 ml Agiter énergiquement jusqu'à dissolution. Eau distillée - 1 ml Réactif hydrazine 1 ml Réactif diazoIque 0,5 ml 0,5 ml Dans le tube B : il se forme une coloration jaune immédiate. Cette coloration est stable. On n'observe aucune coloration dans le tube A. La solution demeure limpide et incolore. Des phénomènes du mème genre se produisent lors de la détermination de la concentration en bilirubine directe dans les sérums, (en particulier selon le mode opératoire de type Jendrassik décrit ci-après). La présence d'hydrazine empêche en effet la réaction de la bilirubine non conjuguée avec le diazoïque, alors qu'en l'absence d'hydrazine, il y a au moins partiellement réaction de la bilirubine non conjuguée, de sorte qu'on obtient des taux de bilirubine directe beaucoup plus élevés que les taux réels, si l'on opère en l'absence d'hydrazine. Bien entendu, l'hydrazine peut être utilisée dans toutes les variantes des méthodes de dosage de la bilirubine : avec d'autres promoteurs de la réaction de la bilirubine non conjuguée avec un composé azoNque et avec d'autres composés azoïques; le mode opératoire ci-après ntest qu'une illustration. La formule des réactifs proposés pour illustrer la présente invention est comme suit. La méthode est du type Jendrassik. I - REACTIFS a) Réactif stabilisant : hydrazine 2,5 M. Dans une fiole jaugée de 100 ml, on pèse 12,5 g d'hydrazine hydratée, on ajoute 50 ml d'acide chlorhydrique 5 N puis on complète au volume avec de l'eau distillée. Le pH de cette solution est inférieur à 2. Cette solution est stable plusieurs mois à la température ambiante. b) Solution de nitrite de sodium 0,385 M. Dans une fiole jaugée de 100 ml, on pèse 2,660 g de nitrite de sodium et on dissout dans q.s.p. 100 ml d'eau distillée. A l'abri de la lumière, cette solution est stable plusieurs mois, à la température ambiante. c) Solution de caféine 0,26 M. et benzoate de sodium 0,52 M. Dans une fiole jaugée d'un litre, on introduit 50,490 g de caféine 74,940 g de benzoate de sodium 123 g d'acétate de sodium anhydre ou 203 > 9 g d'acétate de sodium 3 H20. On dissout l'ensemble dans q.s.p. 1 litre d'eau distillée. Cette solution est stable plusieurs mois à température ambiante. d) Solution alcaline de Fehling Dans une fiole jaugée de 200 ml, on dissout 12,04 g d'hydroxyde de sodium 37 > 36 g de tartrate double de sodium et potassium à 2 H20 dans q.s.p., 200 ml d'eau distillée. Cette solution est stable plusieurs mois à température ambiante. e) Solution d'acide sulfanilique Dans une fiole jaugée d'un litre, on introduit 4,5 g d'acide para amino phényl sulfonique, puis q.s.p. 1 litre d'acide chlorhydrique 0,137 N. Cette solution est stable plusieurs fltois à température ambiante. f) Acide chlorhydrique 0,05 N. Préparation du réactif diazoique Cette solution est à préparer juste avant de procéder aux dosages. Elle est stable au moins 3 heures après sa préparation. On mélange 0,1 ml de solution de nitrite de sodium et 10 ml de solution d'acide sulfanilique, ou encore 0,05 ml de solution de nitrite de sodium et 5 ml de solution d'acide sulfanilique. II - MODE OPERATOIRE Dosage de la bilirubine directe Dans un tube à essais, introduire Acide chlorhydrique 0,05 N 2,4 ml Sérum ou plasma 0,3 ml Mélanger, puis ajouter : Réactif diazoïque 0,2 ml Attendre 2 à 3 minutes, puis ajouter Solution stabilisante d'hydrazine 0,2 ml Solution de Fehling 1,5 ml Mélanger et lire la densité optique à 600 nm en utilisant de l'eau comme témoin. Dosage de la bilirubine totale Dans un tube à essais on introduit Solution de caféine et benzoate de sodium 2,4 ml Sérum (ou plasma) G,3 ml Mélanger soigneusement, puis ajouter Réactif diazoïque 0,2 ml Attendre 2 à 3 minutes; ajouter Solution stabilisante d'hydrazine 0,2 ml Solution de Fehling 1,5 ml Mélanger et lire la D.O. à 600 nm en utilisant de l'eau comme témoin. Microdosage de la bilirubine directe Dans un tube à essais, introduire Acide chlorhydrique 0,05 N 1,2 ml Sérum (ou plasma) 0,05 ml Mélanger, puis ajouter Réactif diazoïque 0,1 ml Attendre 2 à 3 minutes, puis ajouter Solution stabilisante d'hydrazine 0,1 ml Solution de Fehling 0,8 ml Mélanger et lire la D.O. à 600 nm en utilisant de l'eau comme témoin. Microdosage de la bilirubine totale Dans un tube à essais, on introduit Solution de caféine et benzoate de sodium 1,2 ml Sérum (ou plasma) 0 > 05 ml Mélanger, puis ajouter Réactif diazolque 0,1 ml Attendre 2 à 3 minutes; ajouter Solution stabilisante d'hydrazine 0,1 ml Solution de Fehling 0,8 ml Mélanger et lire la D.O. à 600 nm en utilisant de l'eau comme témoin. Les réactifs peuvent être présentés dans un coffret. Un tel coffret peut contenir - une solution aqueuse acide d'hydrazine - une solution aqueuse de nitrite de sodium - une solution aqueuse acide d'acide sulfanilîque - une solution aqueuse d'acide fort, tel que l'acide chlorhydrique - une solution de caféine et de benzoate de sodium, et - une solution alcaline de Fehling. REVENDICATIONS 1. Procédé de titrage de la bilirubine contenue dans un liquide biologique par copulation de la bilirubine avec un dia torque et dosage colorimétrique du produit de copulation en milieu alcalin, caractérisé en ce que, après l'addition du diazoSque, on ajoute au milieu réactionnel de l'hydrazine comme stabilisant, en une concentration au moins 400 fois supérieure à celle du dia osque et de préférence 600 fois supérieure. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hydrazlne est constituée par de l'hydrate d'hydrazine de l'hydrazine anhydre ou un sel d'hydrazine avec un acide minéral ou organique. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que l'hydrazine est ajoutée au milieu réactionnel sous forme d'une solution aqueuse acide. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la solution a un pH inférieur à 2. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précCdentes, u,rtrisé en ce que l'hydrazine est ajoutée 2 à 3 minutes après l'addition du diazoïque. 6. Un coffret contenant les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'un procédé selon lune quelconque des revendications 1 à 5.