Brevet FR2258863A1 — publié le 19750822

la présente invention a pour objet de nouveaux lipopolysaccharides et leur procédé de préparation. Bes lipopolysaccharides (LPS) sont des constituants à haut poids moléculaire des parois cellulaires de bactéries à Gram négatif. Tous les lipopolysaccharides connus présentent, essentiellement, le même type de structure, une molécule du lipopolysaccliaride comprenant 3 régions : les chaines de sucre O-spécifiques, le polysaccharide nucléaire et le lipide dit lipide A (voir: O. Lüderitz; Angewandte Chemie 82, 708-722, 1970). Selon leur origine, les lipopolysaccharides se distinguent, cependant, par la nature et la quantité de leurs constituants individuels. Déjà avec des quantités relativement faibles, les lipopolysaccharides développent des activités biologiques multiples et intenses, en premier lieu une antigénité prononcée. On sait aussi que les lipopolysaccharides ont une activité pyrogène forte et peuvent produire un titre d'interféron élevé chez les animaux à sang chaud. Une induction d'interféron provoquée par IFS ne peut, cependant, pas être utilisée pour le traitement de maladies à virus, parce qu'il serait nécessaire d'administrer des quantités de LISPS qui provoquent déja des effets nettement toxiques. La présente invention concerne de nouveaux lipopolysaccharides constitués par des chaînes de sucre O-spécifiques, le polysaccharide nucléaire et le lipide A, qui sont caractérisés par la teneur relative suivante acide gras : 8 -13 % d'acide dodécanolque, 31-39 % d'acide dodécanoïque 2-OH, 22-29% d'acide décanoïque 3-OH, 23-27% d'acide dodécanoique 3-OH et 0-7 % d'autres acides gras tes lipopolysaccharides selon l'invention qui ont la teneur relative suivante en acides gras: 9-11 % d'acide dodécanoique, 33-37 % d'acide dodécanoique 2-OH, 23-27 % d'acide décanolque 3-OH, 24-26 % d'acide dodécanoique 3-OH et de 4-6 % d'autres acides gras, possédent des propriétés thérapeutiques particulièrement intéressantes. Comme il ressort du Tableau I suivant, les lipopolysaccharides de l'invention ont une teneur en acides gras parfois très différente de celle de lipopolysaccharides connus qui ont été obtenus à partir d'autres souches bactériennes à Gram négatif. On entend par teneur relative en acides gras la relation des pourcentages indiqués à la teneur totale en acides gras dans le lipopolysaccharide en question. La proportion totale d'acides gras dans les lipopolysaccharides de l'invention est dans le cadre usuel, à savoir entre environ 10 et 18%. TABLEAU I Teneur relative en acides gras dans différents LPS LPS obtenu à acide acide dodéca- acide déca- acide dodéca- d'autres partir de dodécanoïque noïque 2-OH noïque 3-OH noïque 3-OH acides gras FH-N-845 ATCC-Nr. 21 996 8-13% 31-39% 22-29% 23-27% 0,7% Ps. syncyanea 26,2% 13,0% 18,2% 29,3% 13,3% Ps. alcaligenes 10,5% 0,0% 20,3% 34,2% 35,0% Ps. aeruginosa 8,4% 22,8% 14,0% 40,2% 15,6% Abstraction faite de peu d'exceptions (voir LPS obtenu à partir de Ps. aeruginosa, A.H. Fenson, G.W. Grey, Biochem, J. 114,185 (1969) et K. Ikeda, F. Egami, J. Gen.Appl. Microbial,- 19, 115 (1973); LISPS obtenu à partir de Ps. alcaligenes, B.A. Key, G.W. Grey, S.G. Wilkinson, Biochem. J. 120, 559 (1970) et LPS à partir de Ps. syncyanea, S.G. Wilkinson, 1. Galbraith, G.A. Lightfoot, Eur. J. Biochem, 33, 158 (1973))les lipopolysaccharides contiennent dans la partie du lipide A comme acides gras typiques, entre autres, l'acide tétradécanoïque (acide myristique) et l'acide tétradécanoique 3-OH (acide ss -hydroxymyristique) sous forme du dérivé N-acyle de la glucosamine (voir: Microbial Toxins, Vol. IV, Edit. G. Weinbaum, S. Kadis, S.J. Ajl. Acad. Press, New-York, London, 1971, page 115 et 218). Les lipopolysaccharides de l'invention se distinguent également en ce qu'ils ne contiennent pas ou que très peu d'acides de ce genre.Si jamais ils contiennent d'autres acides gras que ceux indiqués dans le Tableau I, la faible teneur et surtout la faible teneur en acide hexadécanoique (acide palmitique d'environ 0-5 %) est caractéristique pour les produits de l'invention. Comme il ressort du Tableau II, les lipopolysaccharides de 1' invention se distinguent aussi de tous les autres lipopolysaccharides connus du point de vue de la compositlon en sucres. Ainsi, les lipopolysaccharides obtenus à partir de Ps. synsyanea contiennent des quantités importantes de ribose, alors que les lipopolysaccharides de l'invention ne contiennent pas ou, en tous cas, que très peu de ce sucre. Cela vaut également pour la fucosamine, sucre qui est un constituant essentiel dans les lipopolysaccharides obtenus à partir de Ps. aeruginosa. le LPS obtenu à partir de Ps. alcaligenes, par contre, ne contient pas de quinovosamine, alors quelle est un constituant typique dans les lipopolysaccharides de l'inven- tion. TABLEAU II Proportions d'hydrates de carbone dans les lipopolysaccharides (valeurs absolues) LPS obtenu à partir de Glucosamine Galactosamine Quinosamine Glucose Rhamnose Autres sucres FH-N-845 ATCC-Nr. 21 996 2,0-3,5% 0,5-1,5% 2,0-3,5% 6-9% 10-18% Cétodésoxyoctanate 2,8-3,7% Ribose Fucosamine Ps. syncyanea 4,96% 1,98% 0,41% 8,2% 18% Ribose 8,7% Ps. alkaligenes 4-5,32% 2,5-3,6% - ++ ++ pas d'indications Ps. aeruginosa 2,5-4,4% 5,8-11,8% 2,4-5,3% 3-6,3% 1,2-2,8% Fucosamine (Ikeda) 2,2-4,5% Ps. aeruginosa (Wilkinson, Grey) 3,3-3,7% 2,1-2,6% - + + Fucosamine tes pourcentages indiqués se réfèrent à la teneur en sucres dans l'ensemble du lipopolysaccharide. En outre, les lipopolysaccharides de l'invention contiennent encore d'autres constituants en petites quantités, qui se trouvent aussi dans les Iipopolysaccharides connus, par exemple, l'alanine (%r 1 %) et l'éthanolamine. Les lipopolysaccharides de l'invention sont des substances uniformément incolores qui contiennent moins d'environ 0,05 ffi d'acides nucléiques. Si l'on examine les lipopolysaccharides de l'invention à l'état dissous dans une solution de dodécylsulfate de sodium à 0,25 % par analyse avec une ultra-centrifugeuse, on constate que la substance est uniforme et que le poids moléculaire est compris entre 15 000 et 25 000. te poids moléculaire apparent de solutions aqueuses pures, par contre, est de plusieurs millions.On obtient les nouveaux lipopolysaccharides en cultivant Ps. aeruginosa FE-N845 (-ATCC No 21 996), ses variants et mutants dans un milieu de culture d'une manière connue et en récupérant les lipopolysaccharides à partir des cellules de bactéries d'une manière connue. Une culture de cet organisme a été déposée à l'American Type Culture Collection avec le numéro ATCC-21 996. La souche bactérienne est cultivée dans un milieu de culture ayant la composition usuelle (source de carbone et d'azote assimilable ainsi que des oligo-éléments), après quoi on inocule avec cette pré-culture un milieu de fermentation ayant la même composition. La fermentation est effectuée à une température allant d'environ 25 à 350 C, de préférence à environ 28-30 C. Après une croissance suffisante on récupère la masse des cellules, ce qui se fait par filtration en présence d'un auxiliaire de filtration ou, de préférence, par centrifugation. Puis, avantageusement on ajoute à la masse des cellules un solvant miscible à l'eau, de préférence un mélange de chloroforme et de méthanol, et on centrifuge à nouveau. Par ce traitement, les bactéries sont pour la plus grande partie tuées, dégraissées et séchées. tes lipopolysaccharides sont obtenus à partir de la masse de cellules sèche selon des procédés connus dans la littérature (voir : O. Westphal, O. Büderitz, Angew. Chem. 66, 407 (1-954); O. Lüderitz, Anges. Chem 82,708 (1970); Z. Naturforsch. 7b, 148 (1952); Wilkinson, et al. Fur. J.Biochem. 33, t58 (t973). On peut obtenir le tPS par extraction avec de l'eau chaude, des mélanges de diéthylène-glycol ou de pyridine avec de l'eau ou avec de l'acide trichloroacétique aqueux. les lipopolysaccharides bruts sont obtenus, de la manière la plus avantageuse par extraction avec un mélange de phénol et d'eau à une température élevée (environ 60 - 700 C). Les lipopolysaccharides bruts ainsi obtenus sont séparés, alors, des impuretés à bas poids moléculaire, par exemple par précipitation avec des solvants organiques hydrosolubles, par dialyse ou par ultrafiltration. Il est aussi avantageux d'éliminer les acides nucléiques contenus dans les lipopolysaccharides comme impuretés, par dégradation enzymatique avec des ribo-nucléases ou des désoxy-ribonucléases. Il est aussi avantageux de chauffer les solutions aqueuses de LISPS brièvement à ébullition, ce qui facilite la stérilisation et la centrifugation de beaucoup d'impuretés. Puis, on peut centrifuger les fractions à l'aide d'une ultra-centrifugeuse. Une très bonne purification est obtenue aussi par chromatographie sur gel, par exeni- R ple, avec du Sépharose .On peut sédimenter les lipopolysaccharides de l'invention dans l'ultra-centrifugeuse à 180 000 g. Ear rapport aux lipopolysaccharides connus, les nouveaux lipopolysaccharides se distinguent par le fait que l'administration de très petites doses qui sont 100 fois plus petites que celles nécessaires pour l'augmentation du taux d'interféron, peut conduire à un effet protecteur très intense contre un grand nombre de maladies à virus (provoquées par infection avec, par exemple, influenza Ao, A2 ou B/Lee, Columbia SE; Encephalomyocarditis, Visicular stomatitis, Herpes Simplex 1, Vaccinia p71). A côté de la prophylaxie, les lipopolysaccharides de l'invention peuvent aussi être utilisés pour la thérapie, bien que dans ce cas leur activité soit plus faible. L'indice thérapeutique des lipopolysaccharides nouveaux est, donc, considérablement plus grande par rapport aux substances connues. On utilise les lipopolysaccharides de l'invention avec des véhicules pharmaceutiques usuels, par exemple sous forme d'atomiseurs pour l'administration par voie nasale ou sous forme de solutions aqueuses pour injection. La dose est en générale comprise entre 10 et 100 mcg/kg de poids de corps. Les Exemples suivants illustrent la présente invention: Exemple 1 On inocule, sur un tube de gélose incliné, la souche Pseudomo nase aeruginosa FH-N-845 avec un milieu de culture ayant la composition suivante 1 % de glucose 0,4 % de caséine-peptone 0,4-96 d'extrait de viande 0,1 % d'extrait de levure 0,24 % de NaCl 0,1 ffi d'extrait de foie 1,8 % de gélose pH 7,0 - 7,2. Le tube inoculé est mis à incuber à 300 C pendant 24 heures et, puis, maintenu à la température ambiante. Pour enlever par rinçage les cellules végétatives du tube de gélose incliné on utilise de lteau distillée stérile ou une solution NaCl physiologique (environ 10 ml). 0,5 ml du liquide recueille contenant des cellules sert à inoculer plusieurs erlenmeyer de 300 ml qui contiennent 50 ml de solution nutritive stérilisée qui a la composition suivante : 1,0 % de glucose 0,4 çfo de caséine-peptone 0,4 % d'extrait de viande 0,1 % d'extrait de levure 0,25% de NaCl 0,1 % d'extrait de foie le restant étant de l'eau, pH 7,0. te pH de la solution nutritive doit être de 6,8 à 7,2 après la stérilisation, de préférence, 7,0. On l'ajuste de façon correspondante, si nécessaire. On fait incuber les erlenmeyers à 30 C et 240 tpm pendant 18 heures sur une machine à vibration tournante et on obtient, après ce temps, le vaccin végétatif pour la fermentation suivante. Un appareil de fermentation qui a un volume total de 30 1 et qui contient 20 l d'une solution nutritive ayant la même composition - à l'exception du glucose - que la culture préalable, est stérilisé à 1210 C pendant 20 minutes et sous atmosphère relative. Après refroidissement on ajoute à l'appareil la partie de glucose qui a été stérilisée séparément et on ajuste le pH à la valeur initiale préférée de -7 avec du NaOH 2 N stérile. L'inoculation s'effectue avec 100 ml de la culture préparée comme il a été décrit ci-dessus, c'est-à-dire 0,5 %, par rapport au volume de fermentation. On fait fermenter à 280 C pendant 18 à 24 heures, le degré d'aération étant de 0,55 vvm et on agite à 400 tpm. Par prélèvement d'échantillons on observe le déroulemènt de la fermentation, en particulier la diminution du glucose, la valeur du pH et, ltaugmentation optique et gravimétrique de la masse biologique. te moment d'interruption de la fermentation est celui où le glucose est entièrement consommé, ou lorsque on a obtenu un titre de masse biologique de 5 mg/1 ml, ou + 5 % de cette valeur, à pH 5,5 - 5,6. Exemple 2 On prépare un mélange correspondant à celui de l'Exemple 1, mais on prend un appareil de fermentation à 75 1 (volume total) auquel on ajoute 60 1 du milieu de fermentation décrit à l'Exemple 1 et qui est additionné de 0,1 %, par rapport au volume, de désophène 3600 comme agent anti-mousse. Par rapport à l'Exemple 1 on modifie la fermentation comme suit: Température de fermentation : 300 C Degré d'aération : 0,42 vvm Agitation : 500 tpm Quantité de vaccin : 1 % 5' 0,6 1. te temps de stérilisation et de fermentation, le paramètre, le contre et les critères de la récolte restent inchangés. Exemple 3 60 1 d'une solution de fermentation obtenue selon l'Exemple 1 sont centrifugés dans une centrifugeuse à tubes de Sharples (marque déposée) et la masse de cellules de bactéries est ainsi séparée de la solution de culture. On lave les cellules dans la centrifugeuse en faisant passer de l'eau distillée. On jette l'eau de lavage et le liquide de fermentation maintenant clair. ta masse de cellules humide collectée pèse 785 g.En mélangeant les cellules humides avec un mélange de 3 1 de chloroforme et 2 1 de méthanol, puis centrifugation dans une centrifugeuse à godets, on dégraisse les cellules de bactéries et on les libère largement de i'eau. Après élimination du solvant du précipité de centrifugation sous pression réduite on obtient 76 g de poudre sèche qui consiste en cellules de bactéries pauvres en graisse On met sous forme de mousse 40 g de cellules sèches avec 2,4 1 d'eau distillée, on ajoute 2 kg de phénol, on chauffe le mélange à 650 C et on le maintien à cette température pendant 15 minutes. Puis, on refroidit à 20 C et on centrifuge à 5000 g. On prélève la phase aqueuse séparée à la surface, on agite les phases restantes avec 2 1 d'eau, on centrifuge de nouveau, on sépare encore une fois la phase aqueuse, et on la combine avec la première. Pour éliminer le phénol et les sels dissous on dialyse la phase contenant le LPS pendant 3 jours contre de l'eau distillée. On obtient le LPS brut à partir de la solution libérée des composés à bas poids moléculaire par lyophilisation sous forme de substance blanche. Le rendement est de 4,8 g. Exemple 4 Le LISPS brut obtenu selon l'exemple 3 contient encore des impuretés à haut poids moléculaire, par exemple des acides nucléiques. Pour continuer la purification, on dissout 2 g du produit brut dans 0,7 l d'eau, on ajuste le pH à 7,4 avec du NaOH 0,1 X, on ajoute 20 mg de ribonucléase commerciale et on chauffe à 370 C pendant 3 heures. Au bout de la première heure, on ajuste le pH qui avait faiblement diminué à 7,4 avec de la lessive de soude. Au bout du temps réactionnel on chauffe brièvement à ébullition, puis on refroidit à environ 100 C et on centrifuge d t abord pendant 15 minutes avec 20 000 g. Il se forme peu de sédiment brun clair, alors que le LISPS reste en solution. Puis, on centrifuge le surnageant séparé pendant 1 heure à 180 000. te LPS sédimente, et on .jette le surnageant. Par ultra-centrifugation à deux reprises, puis lyophilisation on obtient 0,9 g de IPS pur. L'analyse du produit obtenu donnait les valeurs suivantes teneur totale en acide gras : 12 %, dont 10,8 % d'acide dodécanoïque; 34,2% d'acide 2-hydroxydodécanoïque; 25,8% d'acide 3-hydroxydéca nique; 26,7 % d'acide 3-hydroxydodécanoïque; acide palmitique (acide hexadécanoique): 2,5 %. 0,94 % d'alanine; 3,1 % de cétodesoxy octanate; 8,2 % de glucose; 2,6 % de glucosamine; 1,2 % de galactosamine; 2,8 ffi de quinovosamine; 12 % de rhamnose. Protéine à l'exception de l'alanine et de l'acide diaminopimé lique 3 %; acide nucléique ( 0,5 %. Exemple 5 On traite 1,4 g (selon l'Exemple 3)-avec de la ribonucléase comme il a été décrit à l'Exemple 4, on centrifuge à 20 000 g, puis on sépare le surnageant aqueux et on concentre à 200 ml sous vide. On fait passer cette solution sur une colonne de séparation. Le sup- port de séparation est 4 1 de Sepharose 4 B (marque déposée), la longueur de la colonne est 80 cm. L'éluant est une solution d'acétate d'ammonium aqueuse 0,1 molaire à laquelle on a ajouté 0,02 % d'azide de sodium. On collecte l'éluat de la séparation par chromatographie sur gel en plusieurs fractions et on y recherche la présence de nucléotides et de Spis. On associe les fractions contenant le LPS, mais exemptes d'acide nucléique, on les concentre sous vide, on dialyse contre de l'eau et on lyophilise. On obtient 0,8 g de LISPS blanc pur. L'analyse dy produit obtenu donnait les valeurs suivantes teneur totale en acide gras : 13,5 %; dont 9,6 % d'acide dodécanoï- que; 36,3 % d'acide 2-hydroxydodécanoique; 25,2 % d'acide 3-hydroxy décanolque; 25,9 % d'acide 3-hydroxydodécanoique; 2,9 % d'acide palmitique (acide hexadécanolque). 0,98 % d'alanine; ),2 % de cétadesoxyoctamate; 8,1 % de glucose; 2,4 % de glucosamine; 1,0 % de galactosamine; 3,1 % de quinovosamine. Protéine à l'exception d'alanine et d'acide diaminopimélique L'effet antiviral du LPS obtenu selon l'invention se manifeste ,par un retard du déroulement de la maladie chez les animaux infectés, et, dans une augmentation du taux des animaux survivants en fonction de la dose par rapport aux animaux témoin traités seulement avec le solvant. Cet effet peut être obtenu pour différentes souches de bactéries après administration locale ou systémique du LPS une ou plusieurs fois. L'effet antiviral ainsi induit diffère nettement de la libération d'interféron des endotoxines. Exemple-A, Influenza A/PR8, infection nasale de la souris/NNRI, SPP, Hattersheim/20 DL50 Dose de LPS Temps moyen de Retard en Taux de mcg/20 g souris survie en jours jours survie I x 1 nasale 24 h avant infection 7,4 2,4 3/10 1 x 3 nasale 24 h avant 9,0 4,0 8/10 infection 9,0 4,0 1 x 10 nasale 24 h avant ~ 10/10 infection 1 x 30 nasale 24 h avant infection Animaux témoin non traités 5,0 0/5 Exemple B, virus Encéphalomyocarditis (EMC), infection intramusculaire, 15 DL50 souris NMRI/SPF Dose de LPS en Temps moyen de Retard par Taux de mcg/20 g souris survie en jours rapport témoin survie 1 x 60 i.p. 24 h avant inf. 6,0 1,8 8/10 1 x200 i.p. 24 h avant inf. 5,5 1,3 8/10 i; x 60 sc 24 h avant inf. 6,8 2,6 3/10 1 x200 sc 24 h avant inf. 5,6 1,4 4/10 Animaux témoin non traités 4,2 00/10 Exemple C, Columbia SK virus, infection intramusculaire, souris NMRI/SPE Dose de IFS en Temps moyen de survie Taux de mcg/20 g souris en jours survie 1 x 10 i.m. 6 h avant inf. 9,4 3/10 1 x 30 i.m. 6 h avant inf. 9,0 6/10 1 x 100 i.m 6 h avant inf. 8,0 8/10 Animaux témoin non traités 9,6 2/10 Revendications 1 - Lipopolysaccharides constitués par des chaises de sucres O-spécifiques, le polysacchardie nucléaire et le lipide A, caractérisés par la teneur relative suivante en acides gras : 8-13 % diacide dodécanolque, 31-39 ffi d'acide dodécanolque 2-OH, 22-29 % d'acide décanoïque 3-OH, 23-27% d'acide dodécanoïque 3-OH et 0-7% d'autres acides gras. 2 - Lipopolysaccharides selon la revendication 1, caractérisés par la teneur relative suivante en acides gras : 9-11 % d'acide dodécanoïque, 33-37 % d'acide dodécanoique 2-OH, 23-27 % d'acide décanoS- que 3-OH, 24-26 % d'acide dodécanolque 3-OH et 4-6 % d'autres acides gras. 3 - Composition thérapeutique ayant un effet antiviral, caractérisée en ce qu'elle contient à titre de principe actif un lipopolysaccharide selon la revendications 1 ou la revendication 2. 4 - Procédé de préparation de lipopolysaccharides selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qué l'on cultive Pseudomonas aeruginosa FH-N-845 (ANCC N 21 996), ses variants et mutants dans un milieu nutritif d'une manière connue et que l'on récupère à partir des cellules de bactéries les lipopolysaccharides d'une manière connue.