Brevet FR2266518A1 — publié le 19751031

La presente invention concerne un procédé pou7-l'obtention d'antigènes HL-A à partir d'urine de sujets atteints de protéinurie et les antigènes HL-A obtenus par ledit procédé. Il est connu que les antigènes contrôlés par le système principal d'histocompatibilité (HL-A) sont présents à la surface des cellules nucléées et des plaquettes. On sait cependant peu de choses sur leur métabolisme, si ce n'est qu'ils sont synthétisés et rejetés vers le milieu extracellulaire de façon continue. On peut en effet les détecter à l'état de traces dans le plasma ou le sérum. D'autre part, on peut détecter à la surface de tous les lymphocytes, en association avec l'antigène HL-A, de ia bêta-2microglobuline (b2m), qui est une protéine de poids moléculaire ll.8OO, isolée pour la première fois par Berggard (Berggard I. et Bearn A.G., J. Biol. Chez.,245, pp. 4095-410D, 1968) à partir de protéinurie tubulaire, et qui présente une homologie significative avec des parties d'immunoglobuline Ig-Gi. On sait en outre que les antigènes HL-A solubilisés préparés à partir de lymphoblastes se purifient concurremment avec la p2m. En ce qui concerne la protéinurie et notamment la protéinurie de type tubulaire, on peut préciser que les protéines plasmatiques de plus faible taille que l'albumine, c'est-à-dire par exemple des dimères de channes légères d'immunoglobulines, passent à travers la membrane basale glomérulaire et sont ensuite réabsorbées et catabolisées par les cellules épithéliales des tubules proximaux du rein. Lorsque la réabsorption tubulaire est insuffisante, on retrouve ces protéines de faible taille dans l'urine et c'est ce que l'on nomme une "protéinurie tubulaire. On a maintenant trouvé de façon inattendue que lton peut extraire de l'urine de patients atteints de néphropathie avec pro téinurie, notamment de protéinurie de type tubulaire des antigènes HL-A, auxquels est en outre associée une partie de la beta-2-microglobuline (p2m). Un objet de la présente invention est donc de fournir des antigènes HL-A extraits de urine de patients atteints de néphropathie avec protéinurie, notamment de protéinurie de type tubulaire. Un autre objet de l'invention est un procédé pour ltobten- tion d'antigènes HL-A, selon lequel on soumet à une ultrafiltration des urines de patients atteints de néphropathie avec protéinurie, notamment de protéinurie de type tubulaire, l'ultraflltrat étant ensuite soumis à une ou plusieurs chromatographies préparatives au terme desquelles on recueille les fractions renfermant des antigènes HL-A, ainsi qu'il peut être déterminé par un test de lymphocytotoxicité. De façon pratique, les urines collectées sont récoltées .sur de l'azide de sodium et stockées de préférence en chambre froide, avant d'strie concentrées, par ultrafiltration dans un concentreur de type classique. On concentre ainsi les urines jusqu'à ce que le taux de protéines atteigne 50 g/l environ, et on dialyse ensuite contre une solution saline tamponnée à pH 7,2. Toujours en vue de préparer les urines pour la mise en oeuvre de la suite du procédé de l'invention, on peut ensuite centrifuger les urines pendant 1 ou 2 heures sous 48.000 a, et on congèle à environ - 70"C dans l'attente d'une utilisation ultérieure. Après décongélation, on dialyse les urines ainsi préparées, contre un grand volume de tampon phosphate 0,05 M pH 6,o, et on soumet à une ou plusieurs chromatographies préparatives, qui peuvent être par exemple des chromatographies successives sur des gels de dextran et notamment sur les résines connues sous les dénominations de CM - Sephadex, DEAE - Sephadex et/ou Sephadex G 100 ou G 200. Selon une forme de mise en oeuvre préférée du procédé de l'invention, on dialyse les urines préparées comme indiqué plus haut après décoagetation, contre un grand volume de tampon phosphate 0,05 M pH 6,o et on fait passer à travers un gel de earboxyméthyl- Sephadex (CM-Sephadex) en présence du meme tampon. Dans les préparations ainsi traitées, il est possible de détecter l'activité HL-A en decelant 1'activité 2m qui lui est associée, par le mode opdratoire qui sera décrit plus loin. En vue d'augmenter l'activité spécifique des fractions antigéniques on fractionne les protéines non fixes sur CM-Sephadex, en fonction de leur poids moléculaire, par passage sur une colonne de Sephadex G 100 ou G 200, équilibrée avec un tampon "Tris" (phosphate trisodique), HC1 0,03 M, NaCl 0,17 M à pH 7,8. On effectue l'é- lution avec le même tampon et on mesure la densité optique du pro duit d'élution à 280 nm.On sépare le produit d'élution, ci-après dénommé "éluat",en plusieurs fractions, qui sont fonction de l'étalonnage de la colonne, et on teste ces fractions, comme décrit plus loin, pour y déterminer la présence des antigènes HL-A et de 2m , après avoir concentré lesdites fractions jusqu'à un volume correspondant au volume inclus. Afin de réaliser un fractionnement supplémentaire des fractions antigéniques ainsi individualisées, on peut inclure lesdites fractions sur une colonne de DEAE-Sephadex, équilibrée par un tampon "Tris", HC1 0,0) M pH 7,8, puis les éluer à l'aide de solutions de NaCl, dissous dans le même tampon et à des concentrations croissantes, par paliers successifs. Selon ce procédé, on n'augmente la molarité du tampon NaCl que si, d'une part, la densité optique de l'éluat mesurée à 206, 280 et 254 nm est revenue à la ligne de base et si, d'autre part, la résistivité de ltéluat, mesurée à l'aide d'un pont de conductivité,a atteint la valeur de celle du tampon introduit dans la colonne. Sur les fractions ainsi enrichies en antigènes HL-A,on peut pratiquer une purification supplémentaire au moyen d'une chez. matographie sur colonnes immunoadsorbantes. Cette méthode ntest cependant utilisable qu'avec quelques antisérums HL-A monospécifiques de très forte avidité. On prépare 1'immunoadsorbant en couplant 1'anticorps sur de la "Sepharose" activée par du bromure de cyanogène CNBr en présence de tampon citrate 0,02M pH 6,o. On met la fraction issue de la colonne de Sephadex, riche en antigènes HL-A,à incuber avec l'immunoadsorbant ramené à pH 8,0 en présence de Tris-HCl O,lM, pendant 1 heure. L'- antigène qui s'est lié spécifiquement à l'anticorps anti-HL-A monospécifique est ensuite élué par du tampon Tris-ECl 0,lM, puis NaCl 2M, Tris 0,lM, Tris-Acétate 0,2M pH 3,9. Dans le cas où, selon une variante particulièrement avantageuse du procédé de l'invention, on a mis en oeuvre ces quatre fractionnements successifs, on parvient à un accroissement de ltac tivité antigénique spécifique d'un facteur d'au moins 200, pour une urine de patient atteint de protéinurie tubulaire. Pour déterminer l'activité HL-A, on opère par inhibition de lymphocytotoxicité, selon l'une des deux méthodes décrites ciaprès, qui sont dénommées respectivement "macrométhode" et tmicro- méthode11. a) Macrométhode On met à incuber 20 mm3 de la fraction à tester suscepti-ble de contenir des antigènes HL-A, avec 10 mm3 d'antisérum monospécifique pur, pendant 4 heures à 370C, puis on ajoute 5 mm3 d'une suspension de lymphocytes à la concentration de 107 par cm3 (les lymphocytes ayant été séparés par passage sur fibres de Nylon et centrifugés sur une couche d'un mélange connu sous la dénomination commerciale de "ìcoll-metrizoate" ayant une densité de 1,077).Après 1 heure d'incubation à 25"C, on lave les cellules deux fois avec 1,2 cm3 de milieu tamponné physiologique et on les met à nouveau en suspension dans 30 mm3 de complément de lapin sélectionné, pendant 1 heure à 370C. On ajoute enfin 5 mm3 d'éosine Y (à 5% dans l'eau). L'intensité de lyse est exprimée par le pourcentage de cellules ayant incorporé le colorant. Le pourcentage d'inhibition de lymphocytotoxicité est égal à : 100-rapport du pourcentage de lyse en présence de la fraction à tester au pourcentage de lyse en présence de sérum de veau foetal. b) Microméthode On fait incuber 1 mm3 de la fraction à tester susceptible de contenir des antigènes HL-A et non diluée, avec un volume égal d'antisérum monospécifique à différentes dilutions (pur, au 1/2, au 1/4, au 1/8 et au 1/16ème), pendant 2 heures à 370C.On fait incuber avec ce, mélange, pendant 45 minutes et à la température ambiante, 2 mm3 d'une suspension de lymphocytes à la concentration de 106 par cm3. On effectue un lavage en ajoutant 10 mm3 de tampon véronal ; après 12 minutes de sédimentation, on élimine le surnageant par aspiration. On procède à une nouvelle incubation d'une durée de 1 heure à 370C, en présence de 4 mm3 de complément de lapin, après quoi on ajoute 2 mm3 d'une solution d'éosine à 5fui. On exprime le pourcentage d'inhibition comme indiqué sous a). On a trouvé de la b8ta-2-microglobuline dans la plupart des fractions d'solution sur DEAE-Sephadex contenant des quantités définies d'antigènes HL-A,et cette association entre les antigènes HL-A et la ss2m permet d'utiliser cette dernière pour repérer la présence d'antigènes HL-A dans les fractions éluées par chromatographie. Les antigènes HL-A de l'invention, comme tout autre allo antigène de membrane préparé de façon connue, peuvent être utilisés - pour des études de structure chimiques - pour la preparation de molécules hautement purifiées permettant le dosage radio-immunologique de ces antigènes dans les liquides biologiques, - pour la préparation d'antisérums par immunisation de diverses espèces animales,antisérums utilisables dans des r- actions sérologiques et susceptibles d1Aetre administrés à des malades. - pour l'administrationss en association avec des immuno- suppresseurs, à des malades candidats à une transplantation d'organe, afin de faciliter la tolérance du greffon, par la production d'anticorps bloquants ou facilitants. L'invention est décrite plus en détail dans l'exemple suivant , qui ne la limite aucunement. EXEMPLE On a collecté les urines d'un patient atteint de protéinurie tubulaire , on les a récoltées sur azide de sodium et on les a stockées en chambre froide ; après décongélation, on les a ensuite concentrées jusqu'à 50 g/l environ par ultrafiltration à l'aide d'un concentreur Amicon type DC 2, équipé d'une cartouche H 1 DP 10, et on a dialysé contre une solution saline tamponnée à pH 7,2 à l'aide du même appareil. On a ensuite centrifugé pendant 2 heures à 48.000 G, sur une centrifugeuse Sorvall RC2 équipée d'un rotor SS 34, et on a congelé à - 700C. Pour unerörotéinurie de type tubulaire qui était à 1,5 g/î, on a pu récupérer ainsi en 5 Jours 6 litres d'urine permettant d'obtenir, par ces concentrations, environ 9g de protéines sous un volume de 180 ml. On a dialysé l'urine concentrée ainsi préparée, pendant 2 fois 12 heures contre un grand volume (rapport urine : tampon de 1 : 1000) de tampon phosphate 0,05 M pH 6,0, puis on l'a fait passer à travers un gel de carboxyméthyl-Sephadex, en présence du même tampon. On a ainsi éliminé les gamma globulines et certaines bêta globulines, et en particulier la totalité de la ss2m libre ; dans les préparations fraîches ainsi traitées, on a pu déterminer ltexis- tence d'une activité HL-A comme indiqué sous a > ou b) plus hauts en décelant l'activité P2m qui lui est associée. En vue de préparer des fractions -tige'nioues actives, on a fractionné les protéines non fixées sur CM-Sephadex, en fonction de leur poids moléculaire, par passage sur une colonne de Sephadex G 100, équilibrée par un tampon "Tris" HCl 0,()3 M, NaCl 0,17 M à pH 7,8. Ce même mélange tampon a servi pour ltélution et on a mesuré la densité optique de l'éluat à 280 m . Sur une colonne de Sephadex ou G 100 de 1 m de long et de 5 cm de diamètre, on a inclus 250 mg de protéines sous un volume de 5 cm5. On a séparé l'éluat en plusieurs fractions, en fonction de 1'étalonnage de la colonne et on a testé ces fractions pour y déterminer les antigènes KL-A présents,après les avoir concentrées Jusqu'à un volume correspondant au volume inclus (5cm3). Les antigènes HL-A ont été trouvés dans la fraction correspondant aux poids moléculaires de l'ordre de 50.000. Pour réaliser un fractionnement supplémentaire, on a inclus cette fraction sur une colonne de DEAE-Sephadex, équilibrée par un tampon "Tris", HCl 0,03 M pH 7,8, et on a élué par du NaCl dans le même tampon et à des concentrations croissantes (variant de O à 0,1 (M) par paliers successifs de 0,05 et de 0,1 à 0,5 par paliers de 0,2. A l'issue de ces fractionnements successifs, on avait accru d'un facteur multiplicatif 50 à 200 l'activité antigénique spécifique, dans le cas d'une protéinurie tubulaire. Le tableau suivant rapporte les résultats de ces expériences qui ont permis de situer les specificités HL-A 3, W 10, W 15 et W 28 après fractionnement sur DEAE-Sephadex. TABLEAU Fraction M/NaCl HL-A3 W10 W15 W28 B2m 1 0-0,05 - - - - + 2 0,075 - - - - ++ 3 0,102 - - - + 4 0, 115 - - - ++ ++ 5 0,135 + ++ - +++ - 6 0,167 ++ ++ - ++ + 7 0,190 - - - + 8 0,210 - - - + + 9 0,230 - 10 0,265 - - - - + 11 0,285 TABLEAU SUITE Fraction M/NaCl HL-A3 W10 W15 W28 p2m 12 0,330 - - - - 13 0,360 - - - - 14 0 > 375 - + - - 15 0,400 - - - - 16 0,430 - - + - + 17 1,000 - - - - Dans ce tableau, les signes + indiquent la présence de l'antigène correspondant dans la fraction visée, le nombre de ces signes + étant d'autant plus grand que la quantité d 'antigène est importante. Un enrichissement supplémentaire des fractions 5 et 6 en antigène HL-A3 a été réalisé par passage de ces fractions concentrées (volume : 5 cm3) sur colonne immunoadsorbante préparée avec de la"Sepharose 4311 couplée à des gamma globulines hyperimmunes anti HL-A3 à 1 'aide de bromure de cyanogène CNBr. REVENDICATIONS 1. Procédé pour l'obtention d'antigènes HL-A, caractérisé en ce qu'on soumet à une ultrafiltration des urines de patients atteints de néphropathie avec protéinurie, notamment de protéinurie de type tubulaire, l'ultrafiltrat étant ensuite soumis à une ou plusieurs chromatographies préparatives, au terme desquelles on recueille les fractions renfermant des antigènes KL-A, ainsi qu'il peut 8tre-déterminé par un test de lymphocytotoxicité. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les urines collectées sont récoltées sur de l'avide de sodium et stockées en chambre froide, de préférence à environ - 700C. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on poursuit ladite ultrafiltration jusqu'à ce que le taux de protéines dans les urines atteigne 50g/1 environ. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que lesdites chromatographies préparatives sont réalisées par passages de fractions concentrées d'urine successivement et dans un ordre quelconque, sur des co-lonnes de gels de dextran, notamment de résines connues sous les dénominations de carboxyméthyl-Sephadex, de Sephadex G 100 ou G 200 et/ou de DEAE Sephadex. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1à 4, caractérisé en ce qu'on réalise une purification supplémentaire par passage des fractions ainsi éluées sur des colonnes immunoadsorbantes anti-S2 ou anti-H1-A, les protéinesretenues par les antisé- rums couplés sur de la "Sepharose" étant secondairement éluées par un tampon acide. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on soumet les urines à une ultrafiltration, on centrifuge, on dialyse et on soumet à une ou plusieurs chromatographies préparatives sur colonnes de résines connues sous les dénominations de carboxyméthyl-Sephadex, Sephadex G 100 ou-G 200, et/ou DEAE-Sephadex, calibrées et tamponnées, et on récupère les fractions renfermant lesdits antigènes, la détermination de l'activité antigénique desdites fractions se faisant au moyen d'un test de lymphocytotoxi- cité. 7. Antigènes HL-A, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 8. Application des antigènes selon la revendication 7, après purification éventuelle, au dosage immunologique desdits an tigènes dans les liquides biologiques. 9. Application des antigènes selon la revendication 7 à l'obtention d'antisérums spécifiques, préparés chez lthomme ou dans diverses espèces animales par immunisation au moyen desdits antigènes, à titre de réactifs sérologiques ou d'agents thérapeutiqúes. 10. Application des antigènes selon la revendication 7 en association avec des immunosuppresseurs à la facilitation de la tolérance vis-à-vis du greffon, par la production d'anticorps bloquants ou facilitants, chez des malades candidats à une transplantation d'organe.