Brevet FR2254638A1 — publié le 19750711

La présente invention concerne un procédé pour la produc tion de L-lysine extracellulaire à partir de levures convenablement sélec tionnées On connaît des procédés de préparation de L-lysine par culture de levures, plus spécialement de levures du genre Candida et plus partieulière7nent de levures de I'espèce Candida lipolytica, dans lesquels on cultive lesdites levures sur des milieux contenant des dérivés hydro carbonés. Nais dans tous les cas la L-lysine produite était intracellulaire, c'est-à-dire qu'elle nécessitait une extraction spécifique, par destruction de la levure, pour pouvoir être récupérée. La présente invention concerne un procédé de fabrication de L-lysine par culture de levures dans lequel, grâce à une sélection convenable desdites levures, on ne cultive que des mutants qui possèdent la propriété de produire des quantités notables de L-lysine extracellulaire, cette dernière étant par conséquent directement récuperable à partir du milieu de culture. -La présente invention a ainsi pour brnt 1) de fournir un procédé de production d'un acide aminé indispensable à haute valeur nutritionnelle : la L-lysine 2) d'utiliser à cet effet un substrat hydrocarboné peu coûteux tel qu'une paraffine normale, une coupe n-paraffinique, un acide organique à chaîne droite tel que l'acide acétique, l'acide propionique, l'acide butyrique, un acide gras, ou un sucre tel que le glucose , 3) de réaliser- cette production de L-lysine à l'aide d'une levure du genre Candida présentant l'avantage d'utiliser les substrats. désirés. A cet effet, des microorganismes appartenant à ltespbce Candida lipolytica ont été sélectionnés d'une part pour leur capacité à accumuler la L-lysine dans leurs cellules, et d'autre part pour leur faculté (acquise secondairement) à excréter cet acide aminé dans le milieu de culture. Sans que l'on entende se lier à une interprétation particuliere des phénomènes moléculaires qui se développent, on peut tenter d'expliquer la présente invention par les remarques suivantes: 1) l'accumulation intracellulaire de L-lysine est liée *-1me modification de structure de la première enzyme de la chaîne de biosynthèse de la lysine : l'homocitrate synthétase, à la suite drune première mutation, celle-ci entraînant la suppression ou la diminution du rétro-contrôle de l'enzyme par la L-lysine 2) la faculté d'excréter la lysine dans le milieu de culture était liée à une altération du système contrôlant le maintien d'un pool d'amino-acides dans le cytoplasme des cellules, à la suite d'une seconde mutation. La présente invention concerne donc essentiellement un procédé pour la préparation de L-lysine extracellulaire par culture d'une levure caractérisé en ce que - on utilise une levure d'un type connu comme produisant de la lysine intracellulaire, - on soumet ladite levure à un traitement mutagène, - on sélectionne les levures obtenues en les cultivant sur un milieu solide exempt de L-lysine et contenant une souche indicatrice lysine-moins et en ne retenant que les levures pour lesquelles apparaît un halo de croissance de ladite souche indicatrice,et on cultive les levures sélectionnées dans un milieu contenant un substrat hydrocarboné. Bienqie les.levures utilisables comme produits de départ puissent être, par définition, toutes celles qui sont connues comme susceptibles de produire de la L-lysine intracellulaire, il est préférable d'utiliser des levures présentant l'une des caractéristiques suivantes - levure se développant sur un milieu minimal et résistant, lors de ce développement, à des concentrations considérées comme normalement toxiques d'un analogue de la L-lysine connu pour agir sur l'homocitrate synthétase, - ou levure ne se développant pas sur un milieu minimal et qui, pour se développer, a besoin d'un apport de Lysine. Les levures de départ sont soumises à des traitements mutagènes connus par exemple au moyen de rayons ultraviolets ou de rayons X ou d'additifs chimiques. Ensuite les levures obtenues doivent être sélectionnées afin de déterminer celles qui sont aptes å fournir de la L-lysine extracellulaire. Cette sélection consiste à cultiver la levure sur un milieu minimal solide comportant des souches "L-lysine-moins" ; par définition les souches "L-lysine-moins" sont celles qui, cultivées sur un milieu minimal, ne peuvent se développer que si l'on ajoute audit milieu de la "L-lysine". Ainsi, en effectuant la culture des levures ayant subi la mutation sur un milieu minimal comportant une souche "L-lysine-moins", on verra apparaître sur certaines cultures un halo de croissance provenant du développement de la "L-lysine-moins" utilisée.On ne retiendra pour le procédé selon l'invention que les levures qui ont provoqué cette croissance de la "L-lysine-moins" utilisée. Les levures ainsi sélectionnées seront ensuite cultivées dans das milieux cannes contenant des composés hydrocarbonés comme par exemple des hydrocarbures (coupes paraffiniques). Une telle culture est connue et a été décrite par ailleurs. Dans le milieu de culture on a trouvé l'existence de quantités notables de L-lysine extracellulaire que l'on peut récupérer par des moyens connus. Parmi les levures de départ utilisables selon l'invention on emploie de préférence des levures du genre Candida et pos spécialement des levures appartenant à l'espèce Candida lipolytica. Les mutants sélection nés de cette espèce présentent l'avantage de ne pas avoir de besoins nutri tionnels atrés que le besoin en vitamine B1 (thiamine). Les exemples non limitatifs suivants illustrent l'invention. EXEMPLE 1.- Obtention de mutants excréteurs de L-lysine à partir d'une souche sauvage de Candida lipolytica. a) Obtention des mutants simples non excréteurs résistant à la trans-déshydro- lysique. La souche sauvage W 29 a été d'abord cultivée pendant une nuit sur un milieu solide gélosé contenant de l'extrait de levure et du glucoses Les cellules ont été mises en suspension dans de Liteau distillée stérile à une densité de 107 cellules/ml. Puis 5 ml de cette suspension ont été placés dans une boîte de Pétri (diamètre = 5 cm) et soumis A une irradiation ultraviolette pendant 1 minute (2000 ergs/mm2). Les fractions de 0,1 ml de la suspension cellulaire ont été ensuite étalées sur des boîtes de Pétri renfermant un milieu minimal gélosé supplémenté avec 5.10-4M de 4-5 déshydrolysirie dichlorhydrate (TDL). Ce milieu minimal a la composition suivante Sels A2 : 100 ml Glucose : 10 g Na2HIO4 : 3,95 g Agar : 20 g pour 1000 ml d'eau distillée. Composition des sels A2 : 10 g KH2P04 5 g MgSO4, 7 H2O NaCl : 1 g 0,75 g CaCl2 (anhydride) 50 g (NH4)2SO4 10 ml de A1 oligoéléments pour 1000 ml d'eau distillée Sels A1 : H3B03 (500 mg) CuSO4, 5 H20 (40 mg) KI (100 mg) FeCl3, 6 H20 (200 mg) MnS04, 4 H20 (530 mg) H2MoO4, 2 H20 (160 mg) ZnSO4, 7 H20 (400 mg) pour 1000 ml d'eau distillée. Après 5 jours d'incubation à 280C un certain nombre de colonies résistantes furent isolées. Elles croissaient sans difficulté sur TDL 5.10-M, alors que la souche sauvage W 29 est complètement bloquée à TDL 5.10 5M. Sur les 34 souches isolées (dénommées mg-l à mg-34), 25 poussaient aussi bien que W 29 sur glucose et n-hexadécane et furent conservées pour des études ultérieures. Ces souches ont été cultivées sur milieu minimal liquide (le même que ci-dessus, mais sans agar). Après 1 jour à 280C, les cellules furent récoltées en phase exponentielle (5-7. 7 cellules/ml), séparées du milieu de culture, leur pool extrait au bain-marie, le poids sec étant déterminé par ailleurs. La concentration de lysine dans le pool a été déterminée par la méthode de Shimura et Vogel (BBA, 1966, 118, 396). Les meilleurs résultats ont été obtenus avec le mutant mg-5, dont le pool contenait 189 umieslysine par gramme de poids sec, alors que W 29 en contient 80. Certaines des 25 souches furent testées pour l'activité homocitrate synthétase et la susceptibilité de cette enzym; à l'inhibition par la L-lysine. Pour la mesure de l'activité enzymatique on a utilisé une méthode décrite par P. Maldonado et al. (P. Maldonado, L. Poirier and H. Heslot - A study of homocitrate synthetase in the yeast Candida lipolytica -4 th Intern. Ferment. Sympos. Kyoto 1972, abstract G9-2). L'inhibition par la L-lysine a été mesurée en présence de 10 M L-lysine. Dans ces conditions, l'enzyme de la souche sauvage W 29 est inhibée à 70 %,alors que l'enzyme de mg-5 ntest inhibée qu'à 10 %. b) Obtention de mutants doubles résistants à la transdéshydroîysine et par- méables à la lysine intracellulaire : Le mutant mg-5 a été soumis à un nouveau traitement mutagène par l'ultraviolet (mêmes conditions que ci-dessus ) puis étalé sur un milieu minimal contenant la souche indicatrice lys 9. On s'arrange pour avoir entre 50-100 colonies par boîte. Une fraction des colonies excrète de la L-lysine ce qui se manifeste par la formation d'un halo résultant de la croissance des cellules lys 9. Certaines de ces colonies excrétrices ont été isolées et purifiées par plusieurs transferts, jusqu ta stabilisation du caractère excréteur. L'un de ces doubles mutants, dérivé de mg-5, a reçu la dénomination mg-5 ex-l. Son pool de lysine intracellulaire est de 10 moles/g de poids sec On a ainsi obtenu une souche mg-5 ex-l qui a été identifiée selon les méthodes décrites par Lodder et qui présente les caractères suivants Forme des cellules : ovales, allongées, bourgeonnantes. Forme des colonies : rondes, bombées, granulées, brillantes, jaunes pâles. Assimilation des substrats Glucose + Lactose Mannitol + Soluble starch DL Lactic acid + Galactose Ethanol + L sorbose Succinic acid + Maltose Glycerol + D xylose Citrate + D ribose C 16 + Inositol Salicine +/- D arabinose Tréhalose +/- Saccharose Raffinose - L rhamnose Température optimale de croissance : 280C pH optimal de croissance : voisin de 5. EXEMPLE 2. Production de Lysine à l'aide des mutants obtenus La souche mg-5 esl est mise en croissance dans un milieu de préculture ayant la composition suivante n-paraffines C9-C22.... 20 g H2KP04 ................ 10 g MgSO47H2O .............. 5 g NaCl ......................... 1 g CaCl26H2O .................... 1,5 g (NH4)2SO4 ..................... 50 g H3BO3 ..........................50 /ug MnSO4, H2O ......................... 50 /ug ZnSO4, 7 H2O .......... 50 /ug (N114) 6Mo7024, 4 H20 500 1ug Co(N03)2, 6 H2O ........ 50 g Thiamine ................. 200 /ug Eau distillée ............ qsp 1 litre Apres une incubation de 48 heures suffisante à l'obtention d'une bonne croissance, 400 ml de ce milieu servent à ensemencer un fermenteur à agitation mécanique de 5 1 contenant 2,5 1 d'un milieu de culture ayant la composition suivante K2HPO4 ................... 0,3 g/l MgS04, 7 H20 ............. 0,2 g/l NaCl ..................... 0,1 g/l CaC12 .................... 0,1 g/l FeS04, 7 H2O.............. 0,015 g/l ZnSO4, 7 H2O ............. 0,01 g/l Urée ..................... 6 g/l Thiamine îod i;;g/l Le substrat utilisé est une coupe n-paraffinique C9-C22 ajoutée progressivement dans le fermenteur à la vitesse de 5 ml/h à un pH compris entre 2,5 et 6,5 et à une température comprise entre 240C et 320C. Le milieu est aéré stérilement à un v. v. m. compris entre 0,1 et 0,5 1 d'air par litre de milieu et par minute. Le dosage de la lysine excrétée par les cellules est effectué au moyen d'un analyseur d'amino-acides au cours de la culture, sur le milieu débarrassé des cellules par centrifugation. Il apparaît que dans ces conditions la concentration en L-lysine au bout de 10 jours de culture atteint 1 g/l dans le clarifiat. EXEMPLE 3. On a recommencé les essals dans des conditions identiques à celles de l'exemple 2 mais enremplaçant les n-paraffines par du glucose à la concentration de 70 g/l. La concentration en L-lysine au bout de 10 jours de culture atteint 825 mg/l dans le clarifiat. En ce qui concerne la récupération de la lysine à partir du milieu de culture, on peut. éliminer les cellules par centrifugation et extraire la lysine du clarifiat, en la fixant d'abord sur une résine échangeuse d'ions sous forme acide, puis en l'éluant de la résine par une solution diluée d'ammoniaque. Le chlorhydrate de lysine est ensuite précipité en amenant la solution concentrée à un pH compris entre 5 et 6 à l'aide d'acide chlorhydrique. REVEND I CÂT IONS 1. Procédé pour la préparation de L-lysine extra cellulaire par culture d'une levure caractérisé en ce que - on utilise une levure d'un type connu comme produisant de la lysine intra cellulaire, - on soumet ladite levure àun traitement mutagène, - on sélectionne les levures obtenues en les cultivant sur un milieu solide exémpt de L-lysine et contenant une souche indicatrice lysine-moins et en ne retenant que les levures pour lesquelles apparaît un halo de croissance de ladite souche indicatrice, et - on cultive les levures sélectionnées dans un milieu contenant un substrat hydrocarboné. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la levure d'un type connu comme produisant de la lysine est une levure qui pousse dans milieu minimal et qui est résistante à des concentrations toxiques d'un analogue de la lysine connu pour agir sur l'homocitrate synthétase. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la levure d'ua type connu comme produisant de la lysine est une levure qui ne pousse pss dans ns un milieu minimal et qui- a besbin de lysine pour se développer. 4. Procédé selon l'une des revendications 1, 2 et 3, caractérisé en ce que la levure de départ est du genre Candida et plus spécialement de l'espèce Candida lipolytica ayant éventuellement subi une première mutagénese. 5. Procédé selon l'une des revendications 1, 2, 3 et 4, caractérisé en ce que la mutagénèse est effectuée par traitement de la levure à l'aide de rayons ultraviolets. 6. Procédé selon l'une des revendications -1, 2, 3 et 5, caractérisé en ce que, après culture des levures sélectionnées dans un milieu hydrocarboné, on récupère la L-lysine en éliminant les levures par centrifugation puis en fixant lå L-lysine contenue dans le clarifiat à l'aide dlune résine échangeuse d'ions puis en extrayant la L-lysine par élution.