Brevet FR2250823A1 — publié le 19750606

La présente invention se rapporte à un procédé industriel d'obtention d'un concentré fourrager de riboflavine par voie de biosynthèse à l'aide du champignon Ashbya gossypii. On connaît la place importante, occupée par les concentrés fourragers de riboflavine dans le groupe des concentrés vitaminés employés comme additifs aux substances fourragéres concentrées utilisées pour la nourriture des animaux; dans la production de ces concentrés, les efforts sont dirigés vers l'obtention d'une haute concentration de riboflavine par rapport aux autres parties composants tel que de nicotinique, l'acide pantothénique, l'acide folique, la vitanine B12, en utilisant des milieux pas coûteux et accessibles, Dans le pratique industrielle on emploie, dans ce but les souches d'Eremothécium ashbyii et celle d'Ashbya gossypii. Par raport à l'Eremothécium ashybii, le champignon Ashbya gossypii, bien que possédant une variabilité naturelle très prononcée, présente l'avantage d'une plus grande stabilité et de la possibilité de conservation sous forme liophylisée. L'entretien de la souche Ashbya gossypil se fait par passages successifs sur milieux solides et liquides avec sélection permanente des meilleures colonies, avec la conservation sous forme de culture en milieux liquides, à 17 C-18 C. Les procédés connas d'obtention de la riboflavine utilisent des mi- lieux de culture contenant de l'extrait de levure, de la levure fourragère, des peptones, de l'extrait de viande, des sels minéraux, des phospholipides végétales, de l'albumine animale, du jus de pomles de terre, du sen de blé, des huiles végétales non raffinées et des matières qui se gélifient telles que le collagène, le "caragheer" etc. Certaiss des procédés connus utilisent des techniques de préparation assez laborieuses avec de nombreuses étapes, des mo- des opératoires qui n'assurent pas les meilleures conditions, des milieux qui s'assimilent difficilement ce qui réduit la possibilité d'utilisation intégrale de la capacité productive de la souche. La présente invention élimine les inconvénients énumérés, par l'utilisation de souches conservées par liephylisation et cultivées sur des milieux contenant conne source de lipides une nixture de graisse de porc I p. et d'huile d'hélianthe non raffinée 2,3 2,5 p., c'est-'a-dire en proportion de 100 g pour un litre de milieu; conne source d'azote, le collagène fourni par une colle d'origine animale à 3 - 5%, partiellement hydrolysé en présence du corn steep liquor, à 132 - 153 C. Pour prévenir les contaminations secondaires, on emploie la tétracycline à une concentration de 20-40 &gamma;/ml milieu ou 0,2 - 0,3% de chloroforme. Le produit intégral obtenu, milieu et microoorganismes sont soumis ensuite à la dessication par atomisation. Exemple 1: -On prépare un milieu d'inoculum I1 contenant les ingrédiants suivants: glucose purifiée 1 g, lactose 0,3 g, levure fourragère 2 g autolysé de levure 1 ,, et de l'eau ordinaire peur obtenir 100 ml. Stériliser 2 fois à 110 C, pendant 30 minutes chaque fois, à intervalle de 24 heures. Ajuster le pH, stérilement, avec KCH à 6,5 - 6,7. Ensemencer des portions de 50 ml de milieu, contenues dans des flacons Erlenmeyer de 500 cc, avec des colonies d'Ashbya gessypii âgées de 4 - 5 jours. Incuber avec agitation rotative à 240 tr/minute, à 26-28 C pendant 24 heures. La deuxième étape d'inoculum (I2) utilise le même milieu et les mêmes conditions que la première (I1). La troisième étape d'inoculum (I3) emploie un milieu ayant la composition suivants: corn steep liquor 3 g, leuvre fourragère 3 g, graisse de porc 1 g, huile d'hélianthe non raffinée 0,5 ml et l'eau ordinaire pour obtenir 100 ml. Ajuster le pH à 8,4 et stériliser deux fois & 110 C, pendant 30 minutes chaque fois, b intervalle de 24 heures.Le nilien, partagé en portions de 50 ni par flacon de 500 cc, est ensemencé avec I2 âgé de 24 heures, en proportion de 2% et incubé dans les nénies conditions que li et 120 Le milieu de fermentation a été préparé dans des vaisseaux d'acier inoxydable d'une capacité de 50 l et contenant 20-30 litres de milieu avec la composition suivante t collagène 5 9 (réduit à sec), corn steep liquor 3 g (réduit A sec), glycocolle 0,075g K2HPO4, 0,15g, CoSO4.7H2O 0,0095 g, ZaSO4.7H2O 0,044 g, MnSO4.7H2O 0,0101 g et de l'eau ordinaire pour faire 100 ml. Le collagène mélangé à l'extrait de maïs et à la moitié de la quantité totale d'eau est maintenu pendant une heure et demi i 132-137 C avec agitation permanente. Ajouter ensuite le reste des ingrédients, ajuster le pH à 7 - 7,2 avec KCH 6 N et ajouter, fina- lement les substances lipidiques (graisse de porc 3 9, huile d'hé- lianthe 2 ml pour 100 ml de milieu). Stériliser 30 minutes à 125 C et ensemencer avec I3 i 3% après avoir ajouté, pour prévenir les contaminations secondaires, une solution stérile de tétracycline HCl pour obtenir une concentration finale de 40 &gamma;/ml milieu. Il existe la possibilité d'ajouter la tétracycline en trois portions, le premier, le troisième et le cinquième jour de fermentation selon les conditions de travail. Les paramètres de la fermentation ont été les suivants : T = 26-280C P = 0,5 atm Air = 1 litre/1/min. Agitation = continue, à 320 tr/minute. Le troisième et le cinquième jours de fermentation, on ajoute de l'huile d'hélianthe non raffiné à 2,5 %, chaque fois, par rapport au volume du milieu. L'huile est stérilisée deux fois à 1100C, pendant 30 minutes à intervalle de 24 heures, en présence d'une quantité d'eau pour augmenter l'efficacité de la stérilisation. La fermentation est poursuivie pendant 8 jours en observant la concentration de la riboflavine, le pH et l'aspect microscopique. L'augmentation de la concentration de la riboflavine pendant la fermentation est illustrée par le tableau I. Les rendements obtenus ont atteint des valeurs allant jusqu'à 7 360 &gamma;/ml milieu. TABLEAU I N de la Age Activité fermentation (jours) pH Aspect microscopique vit B2 &gamma;/ml milieu O 1 2 3 4 1 3 6,2 apparition de la ribo 20 l de milieau flavine dans les fila ments 4 7,5 apparition de cristaux 2880 de riboflavine en de hors des filaments 5 7,7 nombreux cristaux de 4000 riboflavine dans et en dehors des filaments 6 7,7 " " " 5360 7 7,7 " " " 5600 0 1 2 3 4 2 # 2 2 6,6 Filaments jeunes sans - 15 1 de Milieu asques 3 6,4 Apparition d'asques et de riboflavine dans les filaments 5 6,4 Présence de riboflavine cristallisée en dehors des filaments. 6 6,4 Nombreux cristaux de riboflavine dans et en dehors des filaments 4320 7 6,5 4800-5120 8 6,7 7360 Exemple 2 Pour réaliser des fermentations industrielles on procè- de de la façon suivante Pour les trois étapes d'inoculum on utilise les mêmes milieux que dans l'exemple n 1. La première étape d'inoculum a été effectuée dans des flacons Erlenmeyer de 500 cc contenant, chacun, 150 ml de Milieu, ensemencés avec des cultures sur milieux gélosés, âgées de 4-6 jours. Les flacons ont été incubés à 26-280C avec agitation rotative. La deuxième étape d'inoculum est effectuée en vaisseau d'acier inoxydable de 25 1, contenant 15 1 de milieu. Le Milieu a été ensemencé avec I1, âgé de 24 heures, à une concentration de 2%. Avant l'ensemencement, l'appareil contenant le milieu I2 a été stérilisé deux fois à 110 C, pendant 30 minutes, à intervalle de 24 heures; le pH a été ajusté apres stérilisation à 6,4 - 6,5 avec NaOH à 40% stérile. Les paramètres de la fermentation ont été les suivants T = 28 C P = 0,5 atm Air : 1,5 1/#/min Agitation = continue à 400 tr/minute. Après 24 heures de développement 12 a été ensemencé, toujours à 2% dans un appareil intermédiaire d'une capacité de 100 1, contenant 60 1 de Milieu pour I , le pH du milieu ayant été ajusté 3 avant la stérilisation i 7,2 avec NaOH i 40%. Le Milieu a été stérilisé b 1300C, pendant 30 Minutes. Les paramètres pour le dé veloppement de 13 ent été les mêmes que pour I2. Après 24 heures de développement, le contenu du vaisseau a été transvasé dans un autre vaisseau d'acier inoxydable d'une capacité de 5 tonnes et contenant 2 tonnes de milieu de fernentation avec la même colposi- tion que celui de l'exemple 1. Les paramètres de la fermentation ont été les suivants T = 26-280C P = 0,5 atm. Air = 1,5 - 1,7 1/1/min. Agitation = continue à 200 tr/minuts. L'évolution de la fernentation a été poursuivie pendant 8-9 jours. Les résultats sont illustrés dans le tableau II. TABLEAU II N de la Age pH Aspect microscopique Activité fersentation (jours) @ Aspect microscopique vit. B2 &gamma;/ml 1 1 6,7 2ème stage sans asques 2000 Développement modéré du mycélium milieu 2 6,4 2ème et 3ème stage. Apparition d'asques, mycélium bien développé. 3 6,6 2ème et 3ème stage. Apparition de cristaux de riboflavine en dehors du mycélium. 4 6,6 3ème stage. Présence de riboflavine dans la majorité des filaments et en dehors des fila ments sous forme de cristaux. 5 6,7 Noibreux cristaux de riboflavine dans et en 3300 dehors des filaments 7 7,1 - " - 4640 8 7,2 - " - 4800 9 7,3 - " - 5100 La concentration de la riboflavine a été déterminée par le procédé d'extraction avec l'acide acétique et l'oxydation avec KMnO4 et H2O2 en lisant les extinctions (#) sur un fluouomètre type HILGER WATIS et, parallèlement au Pulfrich. Le liquide de culture, contenant la riboflavine et d' nitres vitamines À des concentrations plus basses, a été atomisé. Le produit résultant avait un contenu en riboflavine de 40.000 &gamma;/ml (réduit à sec). L'invention présente l'avantage de permettre d'obtenir des rendements asser élevés, allant jusqu'à 7 300 &gamma;/ml milieu. R E V E N D I C A T I O N S 1. Procédé d'obtention d'un concentré fourrager de riboflavine par voie de biosynthèse avec des souches d'Ashbya gossypii, caractérisé par l'emploi de souches liophylisées, cultivées sur des milieux contenant conne source de lipides un mélange de graisse et d'huile d'hélianthe à 1:2 et en quantité de 75-100 g pour un litre de milieu; conne source d'azote le collagène partiellement hydrolysé en présence du corn stoep liquor, i 132 -1350C pendant 90 minutes; comme agent de prévention vis À vis des contamina- tions secondaires, la tétracycline À 20 - 40 &gamma;/ml milieu ou 0,2 0,3 % de chloroforme, le produit final contenant lé milieu et les microorganismes étant soumis À la dessication par les procédés connus. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la liophylisation du champignon Ashbya gossypii est réalisée à partir d'une colonie typique, productive, âgée de 5 jours Mis en suspension dans un milieu de protection forme de gélatine, de sucrose et d'eau distillée, congelée rapidement b -70 C et soumise à la dessication dans le vide pendant six heures.