Brevet FR2272683A1 — publié le 19751226

La présente invention a pour objet un médicament à effet anti-inflammatoire, et son procédé d'isolement. On a découvert de façon surprenante quel'extrait hépatique préparé selon la tFarmacopea Ufficiale della Republica Italiana" 7ème édition (appelée F.U.VII dans la suite) a chez le rat, aux doses de 7 ml/kg, un effet anti-inflammatoire net. L'extrait total utilisable par application parentérale est, toujours selon la source précitée, un "liquide limpide dépourvu de sédiments après conservation prolongée dans les conditions ambiantes normales, d'une couleur variant du jaune ambré au marron, stérile, dépourvu de protéines, de substances pyrogènes et d'additifs colorants. En outre, la teneur en résidu sec à 100*C ne doit pas entre inférieure à 8 %. L'effet pharmacologique de extrait a été apprécié par les tests classiques des substances à effet anti-inflammatoire, après avoir administré, par voie intrapéritonéale, l'extrait hépatique précité lyophilisé, à la dose de 5.omg/kg, à des rats tWistar" pesant de 200 à 250 g, à jeun depuis 18 heures. Les tests utilisés sont les suivants: -Oedème dû au carragtuoen selon le mode opératoire de Winter. -Oedème dû au dextranne,selon le mode opératoire de Stucki. -Oedème dû à la sérotonine,selon le mode opératoire de Benditt et Rowley. -Oedème dû à la formaline. -Oedème dû à l'albumine. -Oedème dû au kaolin. -Granulome dû à des boulettes de coton,selon le mode opératoire de Meyer. -Erythème produit par des rayons ultra-violets,selon le mode opératoire de Winder. L'invention a pour objet un procédé d'isolement d'une fraction fortement active, telle qu'un médicament à effet anti-inflammatoire, de l'extrait hépatique total utilisable par application parentérale, en particulier de l'extrait hépatique total utilisable par application parentérale de la F.U.VII (produit précité), mais également d'un extrait hépatique total quelconque. Le procédé de préparation de la fraction à activité anti-inflammatoire de l'extrait hépatique selon l'invention est caractérisé pàr les phases suivantes: 1) Elimination de toutes les substances à réaction alcaline présentes dans l'extrait hépatique. On peut effectuer cette élimination par chromatographie sur une résine échangeuse d'ions appropriée (li"'Amberlite I.R. 120" est particulièrement appropriée). Cette opération peut être précédée par une précipitation partielle de l'extrait hépatique amené de façon appropriée à siccité avec de l'alcool éthylique; en effet, le résidu solide obtenu par évaporation de l'extrait hépatique est soluble dans de l'alcool à 70 %, mais précipite partiellement par addition de S volumes d'alcool absolu. La fraction pharmacologiquement active se trouve dans le précipité. 2) Chromatographie sur une résine qui retient les fractions pharmacologiquement actives, à réaction acide, de l'extrait hépatique. Cette résine peut être, par exemple, "Sephadex A 25 DEAE". Par élution de la colonne avec de l'eau distillée,puis avec une solution alcaline (par exemple des solutions d'ammoniaque à 0,1 à 10% > , on élimine les fractions faiblement acides (pH = 3 à 5). Les fractions nettement acides (pH - 1 à 3) retenues par la résine ne peuvent être éluées qu'avec des solutions d'acides minéraux forts (solutions décinormales à normales d'acide chlorhydrique, sulfurique,etc.) ou des solutions d'acides organiques à des concentrations de 1 à 10%, par exemple d'acide formique, acétique, etc. On peut faire précéder la chromatographie décrite plus haut par une purification par précipitation partielle par l'alcool éthylique, en dissolvant le résidu provenant de la colonne de "Amberlite I.R. 120", amené de façon appropriée à siccité, dans 10 volumes d'alcool à 60%, et en ajoutant à la solution obtenue 19 volumes d'alcool absolu (degré d'alcool de la solution obtenue 98%). La fraction active reste dissoute dans l'alcool et l'on élimine le précipité. Si l'on n'effectue pas cette purification préalable on mène à son terme la préparation de la fraction polypeptidique à activité anti-inflammatoire en faisant subir la chromato; graphie à l'éluat acide à pH = 1 à 3 provenant de la colonne de "Sephadex A 25 DEAEn, sur une colonne de "Sephadex G 25". I1 se dessine nettement 3 bandes dont la bande inférieure brun-gris contient les principes actifs.Par dessication sous vide ou lyophilisation de l'éluat provenant directement de la colonne de Sephadex G 25 DEAE, si la purification préalable à l'alcool a été effectuée, ou de la colonne de 'Sephadex G 25", si l'on nta pas effectué cette purification préalable, on obtient une poudre brune, constituée par une fraction polypeptidique acide. Rendement 0,3 % de l'extrait hépatique injectable selon F.U.VII. On a contrôlé 1' activité anti-inflammatoire de cette substance en utilisant les tests décrits précédemment, sur le rat de souche "Wistar" pesant 200 à 250 g, à jeun depuis 18 heures. Les doses utilisées ont été de 100,50, 25 mg/kg par voie intrapéritonéale. Les résultats obtenus à ces doses sont comparables à ceux obtenus à partir de doses égales de phénylbutazone. L'analyse élémentaire, chromatographique, et la chromatographie sur colonne de nSephadex", montrent qu'il s'agit probablement d'une fraction de polypeptides de poids moléculaire moyen, à caractère acide. Les exemples non limitatifs qui suivent illustrent le procédé selon l'invention. EXEMPLE 1. On amène à siccité sous vide 7 litres d'extrait hépatique F.U.VII à une température inférieure à 5O0C. On dissout le résidu, poudre marron clair, de poids moyen d'environ 600 g, dans 6 litres d'alcool à 7QX; après filtration dans un filtre à plis, on ajoute à cette solution 30 litres d'alcool absolu, en agitant énergiquement. Il précipite une substance de couleur brun foncé, d'aspect légèrement poisseux, que l'on recueille par centrifugation ét que l'on amène à siccité à l'étuve sous vide à 400C. On dissout alors la poudre marron ainsi obtenue, ex trêmement soluble dans l'eau, pesant environ 300 g, dans 1 litre d'eau désionisée; on fait subir à la solution obtenue une chromatpgraphie sur colonne d'"Amberlite I.R.120" (hauteur= 150 cm; diamètre = 10 cm), avec pour éluant de l'eau désionisée. L'"Am berline" de la colonne retient toutes les substances à pH alcalin. On amène I'éluantà pH = 3 à siccité sous vide à une température inférieure à 500C, et l'on obtient 140 g d'une poudre brune. On dissout cette poudre dans 1,4 litre d'alcool à 60% et l'on ajoute à la solution obtenue 4,2 litres d'alcool absolu. Il précipite une substance de couleur marron foncé, poisseuse, que l'on élimine par filtration; on ajoute au filtrat limpide 22,4 litres d'alcool absolu. Par filtration sur filtre à plis, on élimine une petite quantité d'une substance pulvérulente de couleur noisette très claire. Le filtrat alcoolique limpide fournit, par évaporation à siccité, une poudre marron pesant environ 60 g. On dissout les 60 g de poudre ainsi obtenue dans 150 ml d'eau désionisée, et l'on traite la solution de couleur brun foncé ainsi obtenue par chromatographie sur "Sephadex DEAE A 25", dans une colonne de 12 cm de diamètre et de 25 cm de hauteur. Par élution à l'eau désionisée , il se détache une bande jaune clair. Par élution subséquente avec de l'ammoniaque à 0,5 %, il se détache une autre bande jaune intense. Après lavage soigné, avec de l'eau désionisée, de la colonne de "Sephadex", jusqu'à obtention d'éluats à pH neutre, on effectue une élution par HCl 0,1 N. La bande de couleur marron foncé, très nette, demeurée dans la colonne, descend rapidement et est recueillie. Par lyophilisation de la solution constituée par cette bande,on obtient une poudre marron foncé brillante. On élimine les bandes jaunes recueillies à pH neutre et alcalin. La poudre ci-dessus pèse 20 g environ et est constituée par un mélange de substances à structure probablement polypeptidique, caractérisé par un net effet anti-inflammatoire. EXEMPLE 2. Dans une colonne de chromatographie ( hauteur = 5 cm; diamètre = 5 cm)remplie de résine "Amberlite I.R.120", on élue 100 ml d'extrait hépatique F.U.VII. li'"Amberlite" retient toutes les substances à pH alcalin présentes dans l'extrait hépatique initial. L'éluat présente un pH d'environ 5 et, après concentration sous vide et à basse température appropriée, jusqu'à obtention d'un volume final d'environ 50 ml, on effectue la chromatographie sur une colonne (hauteur = 20 cm; diamètre = 10 cm) de wSephadex A 25 DEAE". On élue à l'eau distillée jusqu'à obtention d'un éluat incolore, puis avec une solution d'ammoniaque à 15 %,toujours jusqu'à obtention d'un éluat incolore. On lave par élution à l'eau distillée la colonne chromatographique, jusqu'à obtention d'un pH neutre de l'éluat. A ce moment, il se dessine très nettement dans la colonne chromatographique une bande marron foncé unique. Par élution par une solution décinormale d'acide chlorhydrique, on obtient une solution brune que l'on concentre à un volume final de 50 ml, par lyophilisation ou concentration sous vide poussé et à une température inférieure à 300C. Dans une colonne de "Sephadex G 25 (hauteur =80 cm; diamètre = 4 cm), on effectue la chromatographie de ladite solution, par élution à l'eau distillée. Dans la colonne, il se sépare 3 bandes apparaissant très clairement: une bande inférieure gris-brun, une bande intermédiaire marron foncé et une bande supérieure rosâtre. On recueille l'éluat correspondant à la bande inférieure, et on l'amène de façon appropriée à siccité. Rendement : 0,3 à 0,4 g d'une poudre brune. L'activité anti-inflammatoire du produit a été mise en évidence par le test classique du carragheen, en utilisant le mode opératoire de Winter, qui consiste à administrer, dans la zone plantaire de la patte droite du rat, 0,20 ml d'une solution de carragheen à 1 X, en solution physiologique. On provoque ainsi un oedème de la patte qui atteint son maximum au bout de 3 à 4 heures. Pour cette expérience, on a utilise des rats de souche "Wistar" pesant de 200 à 250 g, à jeun depuis la veille au soir, et groupés aléatoirement par groupes de 20 animaux chacun. Les substances examinées ont été administrées par voie intrapéritonéale aux rats, 30 minutes avant injection du carragheen. On a noté le volume de l'oedème par mesure pletismométrique, avec un appareil à mercure, 3 heures après l'administration du carragheen. L'appareil permet d'évaluer avec précision, par différence, l'augmentation du volume de la patte dû au carragheen, et, par suite, l'activité anti-oedémique des substances essayées. Le médicament selon l'invention s'est avéré posséder une activité anti-inflammatoire, à doses égales, identique à celle de la phényl-butazone. lia substance selon l'invention est avantageusement présentée sous des formes pharmaceutiques adéquates en vue de son administration à différents animaux, y compris des êtres humains. Sous un autre de ses aspects, l'invention prévoit donc des compositions pharmaceutiques contenant la substance en question associée à des excipients non toxiques, pharmaceutiquement acceptables. Ces compositions sont avantageusement administrables par voie parentérale ou rectale. Plus particulièrement, les compositions en question peuvent être présentées sous la forme de suppositoires, de fioles, flacons ou ampoules contenant des doses injectables. Le choix de l'excipient dépend de la forme de présentation pharmaceutique, de la solubilité de la substance, et de la pratique pharmaceutique courante et normale. Les exemples suivants, bien entendu non limitatifs,illustrent diverses compositions établies conformément à l'invention. EXEMPLE A: Ingrédient contenu mg/ampoule Substance X 25 eau q.s.p.f. 2 ml EXEMPLE B: Ingrédient contenu mg/ampoule Substance X 100 glycine 40 eau q.s.p.f. 2 ml EXEMPLE C: Ingrédient contenu mg/suppositoire Substance X 200 spermacéti 175 "Myghiol 812" 25 "Tween 61" 2200 EXEMPLE D: Ingrédient contenu mg/suppositoire Substance X 100 tMyghiol8l2" 35 "Crocklaan" 750 On peut préparer une grande variété de compositions contenant d'autres excipients sans s'écarter pour autant de la portée de l'invention. En outre, les compositions'pharma- ceutiques en question peuvent contenir, pour accompagner l'ingrédient actif faisant l'objet de l'invention, au moins une autre substance thérapeutiquement active, compatible avec la première et capable d'exercer tous effets complémentaires désirables. Lorsque la substance selon l'invention est utilisée en thérapie humane, une dose quotidienne globale de 25 à 200 mg par voie parentérale ou de 100 à 600 mg par voie rectale est généralement satisfaisante. La dose à administrer peut toutefois varier selon différents facteurs: gravité des troubles à traiter, l'état et le poids des patients,etc., selon les principes ordinaires en thérapeutique. -REVENDICATIONS 1.- Fraction polypeptidique de nature acide, douée d'une forte activité anti-inflammatoire et pratiquement dépourvue de toxicité, isolée de l'extrait hépatique total. 2.- Fraction polypeptidique selon la revendication 1, isolée de l'extrait hépatique total à application parentérale de la "Farmacopea Ufficiale della Repubblica Italiana, 7ème édition". 3.- Procédé de préparation de la fraction polypeptidique selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend les phases suivantes: a) élimination à partir de l'extrait hépatique total, de toutes les substances de nature basique, par chromatographie sur résine échangeuse à caractère acide, b) chromatographie de l'éluat provenant de la phase a) sur une résine échangeuse à caractère basique, qui retient les constituants pharmacologiquement actifs; c) élimination, à partir de la résine de lå phase b), des fractions faiblement acides (pH =3à5), par élution avec de l'eau et des solutions alcalines; d) Elution, à partir de ladite résine, de la fraction polypeptidique nettement acide (pH = 1 à 3) au moyen de solutions d'acides minéraux forts ou d'acides organiques forts; e) chromatographie par filtration sur gel de ltéluat obtenu à partir de la phase d) et isolement de la bande inférieure par élution; f) dessication sous vide ou lyophilisation de l'éluat provenant de la phase e) (bande inférieure). 4.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que, pour la phase a), on utilise comme résine l'"Amberlite I.R. 120". 5.- Procédé selon les revendications 3 ou 4, caractérisé en ce que l'on utilise comme résine, pour la phase b), "Sephadex A 25 DEAEt. 6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que les solutions alcalines utilisées dans la phase c) sont constituées par des solutions aqueuses d'ammoniaque à 0,1 à 10%. 7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que les solutions acides utilisées dans la phase d) sont constituées par des solutions d'acide chlorhydrique ou sulfurique décinormales à normales, ou par des solutions aqueuses d'acide formique ou acétique à des concentrations de 1 à 10 %. 8.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 7, caractérisé en ce que lton utilise comme résine, pour la phase e),"Sephadex G 25". 9.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la phase a) est précédée par un-traitement de purification préalable consistant à évaporer à siccité l'extrait hépatique, à dissoudre le résidu dans de l'alcool éthylique à 70 % et à précipiter de la solution hydro-alcoolique, avec un volume quintuple d'alcool éthylique absolu, une fraction pharmacologiquement active envoyée à la phase a). 10.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 9, caractérisé en ce que l'on amène l'éluat provenant de la phase a) à siccité, on dissout le résidu obtenu dans de 8 à 12 volumes, de façon appropriée 10 volumes, d'alcool éthylique à 60 X, on amène la solution hydro-alcoolique, avec de l'alcool absolu, à un degré alcoolique de 96 à 99 %, de façon appropriée de 98 %, on élimine le précipité obtenu, on évapore la solution alcoolique et l'on envoie le résidu aux phases b),c) et d), on isole directement à partir de l'éluat de cette dernière phase, par dessication sous vide ou lyophilisation, la fraction pharmacologiquement active. 11.- Médicament injectable à activité anti-inflammatoire, caractérisé en ce qu'il renferme comme principe actif la fraction polypeptidique selon la revendication 1 ou 2.