Brevet FR2281569A1 — publié le 19760305

L'invention a pour objet un procédé de destruction d'une molé- cule de protéine de sérum ou de plasma afin de libérer des points de liaison de la protéine, une molécule ou un constituant ou un fragment de molécule d'une matière à analyser ultérieurement, laquelle est fortement liée normalement et ne pourrait pas être détectée sans extraction par les techniques analytiques usuelles. En outre, le procédé selon l'invention permet de détruire pratiquement tous les points de liaison de la molécule d pro téine et de supprimer ainsi la nécessité d'éliminer du mélange réactionnel le constituant libéré, avant l'analyse.Le procédé selon l'invention permet notamment le dosage de la teneur en hormone thyroïdBnne d'un échantillon de sérum sanguin Les protéines du sérum et du plasma, principalement l'albumine, les globulines alpha, beta et gamma, le fibrinogène etc., ont la propriété de se lier à des substances contenues dans le courant sanguin comme les hormones thyroidiennes. Selon la technique antérieure un échantillon de sérum sanguin esttraité de diverses façons pour éliminer ces constituants de la protéine sérique et ordinairement, ces techniques d'élimination ne sont que partiellement complètes et nécessitent l'application d'un facteur de pourcentage aux données analytiques obtenues, si l'on veut approcher d'une analyse complète. Par exemple, les hormones thyroldiennes, la thyroxine ou la triiodothionine sont normalement présentes dans le sérum du sang humain à l'ôtant lié à une protéine thyro-fixatrice telle qu'une alpha-globuline appelée globuline fixatrice de thyroxine (TBG). Pour séparer les hormones thyroïdiennes de la protéine qui les fixe, il est usuel d'utiliser un alcool, tel que le méthanol l'méthanol ou le butanol, ou encore le tétrahydrofuranne ou similaire. D'autres techniques comportent l'utilisation d'acides tels que l'acide chlorhydrique aqueux à un pH d'environ 1,5. Lorsque ces procédés ont permis d'extraire l'hormone thyroi- dienne, habituellement à raison d'environ 65 à 75,' seulement, il faut séparer soigneusement l'hormone extraite du reste de l'échantillon afin d'éviter quelle ne se fixe à nouveau ensuite à d'autres points de liaison de la protéine. Les techniques antérieurement utilisées comprennent la séparation par ultracentrifugation, l'absorption sur une matière absorbante minérale, ltextraction en colonne de "Sephadex" etc. Avec le procédé selon l'invention, il est possible de séparer complètement les constituants ci -des sus des protéines qui les fixent en utilisant un enzyme protéolytique, la pepsine. Non seulement cette technique permet de séparer complètement la matière analysable de la protéine qui la fixe, mais encore elle détruit pratiquement les points de liaison résiduels de la pro téine et supprime ainsi, dans la plupart des cas et pour la plupart des méthodes d'analyse, la nécessité d'éliminer du mélange réactionnel la substance spécifique séparée.En outre, on peut très facilement détruire toute activité enzymatique résiduelle, si elle risque d'avoir ensuite un effet sur I'opération d'analyse, en modifiant les conditions du mélange réactionnel, par exemple le pH, la température etc. pour obtenir des conditions où l'enzyme est inactivée ou en ajoutant simplement au mélange un inhibiteur spécifique de l'enzyme protéolytique. Pour la technique du radiotitrage de la fixation protéinique compétitive (CPB) ou dans la méthode de titrage radio-immunologique (RIA) des hormones thyroïdiennes, il est préférable d'utiliser la pepsine, enzyme protéolytique. Voici un exemple d'un tel procédé. On ajuste à un pH de 1,0 au moyen d'acide chlorhydrique aqueux, des quantités égales d'un échantillon de sérum sanguin où il s'agit de doser les hormones thyroïdiennes et d'une solution de pepsine contenant environ 10 000 à 80 000 unités/ml de pepsine. Après incubation à la température ambiante - 22 à 27 C - pendant 30 minutes, ou entre 37 et 45" C pendant dix minutes, toutes les hormones thyroïdiennes sont libérées des protéines fixatrices et tous les points de liaison des pro téines thyro-fixatrices sont détruits. Ce procédé est démontré par les exemples expérimentaux suivants On enrichit par des quantités connues de L-thyroxine une réserve de sérum humain contenant 2,4 microgrammes (t g) de thyroxine par 100 ml.Les échantillons ainsi enrichis sont traités par des volumes égaux d'une solution de pepsine contenant environ 10 000 à 80 000 unités /ml d'activité pepsine et ajustée à un pH 1,0 au moyen de HCl aqueux. Les échantillons sont ensuite laissés en incubation à la température ambiante pendant trente minutes. Puis on ajoute aux échantillons un tampon barbital à un pH de 8,6 et on dose alors la thyroxine dans les solutions tamponnées par la technique de radiotitrage de la fixation protéinique compétitive.Les résultats sont indiqués au tableau I ci-après Tableau I Thyroxine Thyroxine récupération % calculée dosée (fi gilOomi) (#g/100 ml) ~~~~~~~~~~~~~ 2,4 2,5 104 7,4 7,3 99 12,4 12,6 101 17,4 17,2 99 Les résultats ci-dessus démontrent clairement que la digestion par la pepsine détruit tous les points thyro-fixateurs de la protéine et libère toute la thyroxine fixée. Dans l'opération suivante, on utilise des tubes à essais étiquetés A, B, C, D pour démontrer, respectivement, l'effet de l'addition d'eau distillée sur la liaison de la thyroxine 125I à une protéine sérique, l'effet d'une solution d'acide chlorhydrique à pH 1,0 sur la liaison de la thyroxine 125I à la protéine sérique, l'effet d'une solution acide de pepsine sur la liaison de la thyroxine 125i a la protôine sôrique et l'effet d'une solution acide de pepsine sur la liaison de la thyroxine 125i à l'eau. Le contenu des tubes est indiqué au tableau II ci-dessous Tableau II TUBE A TUBE B TUBE C TUBE D sérums humains 0,3 mi 0,3 mi 0,3 ml 0,3 ml normaux thyroxine 125I 0,005 mi 0,005 mi 0,005 mi 0,005 mi eau distillée 0,3 mi --- 0,3 ml solution de HCl --- 0,3 m1 -- (pH 1,0) pepsine (3000 uni- --- - 0,3 mi 0,3 mi tés par 0,3 ml, dans solution de HCl,pH 1,0) Les quatres tubes sont laissés en incubation à la température ambiante pendant trente minutes. A la fin de l'incubation, on ajoute 4,0 mi de tampon barbital sodium (0,075M, pH 8,6) que l'on mélange au contenu de chaque tube. La radioactivité de chaque tube est mesurée au moyen d'un compteur gamma. Cette mesure montre que tous les tubes ont la même radioactivité de 64 600 coups/mn. Chacun des tubes est alors transféré dans un cône d'ultrafiltration du type "Amicon" muni d'un tube de centrifugeuse. Les tubes sont ensuite centrifugés pendant 45 minutes à 2200 g à la température ambiante. Tout l'ultrafiltrat est alors recueilli et la radioactivité est comptée. Les résultats sont indiqués au tableau III ci-après Tableau III Radioactivité avant Radioactivité après Thyroxine ultrafiltration, ultrafiltration, liée coups/mn coups/mn ~~~~~~~~~~~~ Tube A 64 600 490 99,95 Tube B 64 600 29 245 54,60 Tube C 64 600 63 555 1,62 Tube D 64 600 63 365 1,91 Les résultats démontrent clairement que les points de fixation de thyroxine des protéines sériques sont complètement détruits par incubation de la-protéine sérique pendant trente minutes à pH 1,0 avec 3000 unités de pepsine.Cela est basé sur 1' observation que la radioactivité de l'eau utilisée comme témoin et des ultrafiltrats de sérum traité par la pepsine est pratiquement la meme. Les résultats démontrent aussi que la solution de HCl à pH 1,0 sans addition de pepsine peut seulement détruire partiellement les points de fixation de thyroxine. On calcule la thyroxine liée à la protéine par l'équation a = radioactivité avant ultrafiltration b = radioactivité de l'ultrafiltrat ,' de thyroxine fixée = 100 x a-b a Il est également possible selon l'invention d'utiliser une solution de réserve de l'enzyme protéolytique acide. On peut préparer cette solution de la manière suivante On dissout 80 g. de pepsine USP dans environ 1200 ml d'eau distillée et on ajuste à un pH de 1,0 en ajoutant du HC1 6. On peut aussi utiliser le chlorhydrate de glycine, le chlorhydrate d'acide glutamique, le chlorhydrate d'acide aspartique etc. On ajuste alors le volume de la solution à 1500 ml au moyen d'eau distillée et on fait un ajustement final du pH si nécessaire. On peut alors revêtir de la solution de réserve un tube à essais ordinaire pour titrage radio-immunologique, ajouter 0,1 ml d'un sérum à essayer, procéder au mélange, faire incuber trente minutes à la température ambiante, neutraliser puis doser la thyroxine par des techniques connues. On envisage aussi de préparer des comprimés contenant l'acide enzymatique et les charges inertes usuelles telles que le lactose etc. Voici une composition de ce genre: pepsine USP 1,0 mg chlorhydrate d'acide glutamique 20,0 mg lactose 14,0 mg Par des techniques usuelles, on prépare des comprimés; On laisse alors tomber un comprimé dans un tube à essais, on ajoute un échantillon de sérum, on mélange, on neutralise puis on titre. Pour illustrer le fait que l'invention permet d'obtenir le même niveau d'exactitude que les techniques antérieures lorsqu' on applique les méthodes de radiotitrage de la fixation proté- inique compétitive pour les L-thyroxines, les expériences suivantes sont effectuées On soumet à la méthode classique antérieure et au procédé selon l'invention, plusieurs échantillons hypothyroidiques, euthyroïdiques et hyperthyroidiques de sérum sanguin .La mé thode classique est la suivante 1) on mélange dans un tube à essais pour radiotitrage 1 ml de méthanol et 0, 5 ml du sérum à essayer, 2) on mélange alors ltéchantillon à la vitesse maximale dans un mélangeur à tourbillon pendant trente secondes, 3) dans une centrifugeuse, on fait tourner les tubes pendant dix minutes à 1500 g, 4) on transfère 0,3 ml du liquide qui surnage dans une fiole de radiotitrage contenant 4,0 ml du mélange suivant a) O, 1 ml de L-thyroxine 125i b) tampon barbital sodium (0,075M, pH 8,6) c) sérum humain 1::350 5) à chaque fiole, on ajoute un bande de membrane anionique, 6) on bouche les fioles et on les fait tourner à 33 tours/mn pendant trente minutes exactement à la température ambiante, 7) on retire les bandes, on rebouche les fioles et on compte la radioactivité, on compare le compte à des étalons de ré férence. En appliquant le procédé selon l'invention, on traite comme suit des échantillons en double de ce qui précède 1) à un tube à essais pour radiotitrage, on ajoute 0,1 ml des sérums et 0, i ml d'une solution de pepsine dans HC1 aqueux à pH 1,0 contenant environ 3000 unités pepsine, 2) on laisse reposer trente minutes les tubes à essais à la température ambiante, 3) on ajoute alors directement au tube 4,0 ml du mélange indi qué en 4 ci-dessus, 4) comme 5 ci-dessus, 5) comme 6 ci-dessus, 6) comme 7 ci-dessus, Les résultats de ces essais comparatifs sont indiqués au tableau IV ci-dessous Tableau IV Etat thyroidique nombre Thyroxine dans le sérum ( g/100 ml d'échan- + SD) tillons Extraction par le Digestion par ~~~~~~~~ méthanol * la pepsine Sérum hypothyroï- 18 2,4 + 1,1 2,0 + 0,8 dique(moins de pas 5 g/1OO mi) pas de différences significatives ** euthyroïdique (5 à 13? g/100 ml) 139 8,6 + 2,0 8,5 + 1,7 pas ae différences significatives** hyperthyroîdique Il 17,8 + 3,9 16,9 + 3,0 (plus de 13 g/100 pas de différence significatives ** mi) (*) corrigé pour le rendement de l'extraction (**) essai "t" du chercheur Ces essais démontrent clairement que lorsqu'on effectue l'analyse de la thyroxine sur les mêmes échantillons par extraction au méthanol avec correction pour la récupération et par digestion à la pepsine, on obtient pratiquement les mêmes résultats. REVENDICATION Procédé de dosage de la teneur en hormone thyroïdienne d'un échantillon de sérum sanguin, caractérisé en ce qu'il consiste à -mélanger à l'échantillon une quantité efficace de pepsine à un pH d'environ 1,0 -a faire incuber 1'échantillon pendant un temps suffisant et à une température suffisante pour permettre à la pepsine de digerer la protéine fixatrice d'hormone thyroidienne, -a ajuster le mélange à un pH où la pepsine est inactive -et enfin à doser dans le mélange l'hormone thyroidienne libérée.