Brevet FR2279419A1 — publié le 19760220

La présente invention a trait à un procédé de préparation d'immunoglobulines (Ig) purifiées de préférence humaines mais pouvant également être animales. Elle a également trait aux nouvelles préparations contenant de telles immunoglobulines purifiées ainsi qu'au nouveau médicament contenant de telles immunoglobulines purifiées. On connait actuellement un certain nombre de procédés de préparation et de purification d'immunoglobulines humaines ou animales mais au cours des fractionnements qui ont lieu dans ces procédés les immunoglobulines ont tendance a former des agrégats et les globulines, modifiées dans ces agrégats, acquièrent des propriétés biologiques particulières et deviennent notamment capables d'activer le complément. Cette propriété des agrégats est appelée "activité anticomplementaire". I1 en résulte que la présence d'agrégats dans les préparations d'immunoglobulines présente des inconvénients importants, notamment en ce qui concerne le choix du mode d'administration. En effet, les immunoglobulines peuvent être injectées par voie intramusculaire ou intraveineuse. Théoriquement la voie intraveineuse est plus avantageuse car elle a un effet thérapeutique immédiat et un rendement nettement supérieur a celui de la voie intramusculaire dans laquelle 40 % seulement des immunoglobulines injectées atteignent la circulation sanguine, le reste étant détruit. Toutefois on hésite a utiliser la voie intraveineuse car la présence des agrégats entraine un risque important de choc anaphylactique par activation du complément. Même l'injection intramusculaire n'est pas sans danger car les agrégats peuvent causer des réactions locales douloureuses. On a déja essayé d'éliminer les agrégats dans les préparations d'immunoglobulines par des fractionnements chimiques mais ceux-ci sont longs et compliqués et entrainent en plus des pertes importantes en immunoglobulines-normales. I1 en résulte que l'on préfère actuellement traiter les immunoglobulines par des enzymes protéolytiques qui enlèvent aux immunoglobulines le fragment moléculaire Fc responsable de l'activation du complément. Cependant les molécules normales non agrégées peuvent également être atteintes par l'action protéolytique et, perdant des fragments Fc, elles perdent la faculté de déclencher les réactions qui conduisent à la destruction ou l'élimination de l'antigène et les globulines ainsi traitées perdent de leur efficacité. L'invention se propose de fournir un procédé de préparation d'immunoglobulines humaines ou non qui permet d'éliminer de façon sûre et totale les agrégats formés lors des étapes de la purification sans altérer les qualités fonctionnelles des globulines normales restantes ni provoquer de pertes en globulines normales. L'invention a également pour but de fournir des préparations d'immunoglobulines et des médicaments comprenant de telles immunoglobulines dépourvus de réactions inflammatoires et notamment de réactions du complément et comprenant une concentration élevée d'immunoglobulines normales non altérées. L'invention a tout d'abord pour objet un procédé de préparation d'immunoglobulines (Ig), notamment d'immunoglobulines humaines, dans lequel on purifie des immunoglobulines obtenues à partir d'une source d'immunoglobulines, telles que par exemple du sérum, du sang hémolysé ou non, ou du placenta hémolysé ou non, par des mesures conduisant à la formation d'agrégats d'immunoglobulines, ledit procédé étant caractérisé par le fait que l'on élimine lesdits agrégats en faisant agir sur la préparation qui les contient, une quantité suffisante de l'un au moins des facteurs suivants : facteur CIq du complément et facteur rhumatoide (FR). Les immunoglobulines contenant des agrégats, qui sont utilisées comme produit de départ dans le procédé indiqué ci-dessus, sont obtenues au départ de sérum ou d'extraits placentaires, notamment par les procédés connus de fractionnement à l'alcool. Les procédés de préparation d'immunoglobulines à partir de sérum par fractionnement à l'alcool ont été décrits par E.J. COHN et Coll. J.Am. Chem. Soc., 68, 459-475 (1946) et par J.L. ONCLEY et Coll., J.Am Chem. Soc, 71, 541-550 (1949). Le procédé de préparation d'immunoglobulines à partir d'extraits placentaires a été décrit par H.L. TAYLOR, F.C. BLOOM, K.B. Mc CALL, L.A. HYNDMAN et M.D. ANDERSON, J.Am. Chem. Soc., 78, 1356-1358 (1956). A titre d'exemple, on rappelle que ce dernier procédé consiste à traiter le filtrat d'une solution saline de placenta broyé de façon à obtenir une concentration d'éthanol égale à 25 % en volume. On recueille le précipité obtenu et le traite par l'éthanol à 8% à pH 4,8. On élimine le précipité restant et recueille le surnageant. Par addition d'alcool à ce surnageant jusqu'à obtention d'une concentration de 25 % en volume ôn obtient la précipitation d'une fraction riche en gammaglobulines. Le précipité est traité par I'éthanol à 17 % à pH 5,1. On élimine le précipité restant et recueille le surnageant.Par addition d'éthanol au surnageant jusqu' obtention d'une concentration de 25 % en volume, on obtient un précipité de gammaglobulines utilisables comme produit de départ dans le procédé de la présente demande. Les facteurs C1q et Fr peuvent être d'origine humaine ou animale, étant entendu qu'on utilise les facteurs présentant une affinité avec les immunoglobulines à traiter. Ainsi, à titre d'exemple, pour des immunoglobulines humaines on peut utiliser le Clq humain, de lapin, de chèvre ou de boeuf, ainsi que les FR humain ou de lapin. Ces différents réactifs peuvent éventuellement être combinés. Comme indiqué ci-dessus on utilise une quantité suffisante du facteur C1q et/ou du facteur FR, c'est-à-dire une quantité suffisante pour éliminer complètement les agrégats. Cette quantité de facteur Cîq ou FR dépend évidemment de la teneur en agrégats de la préparation d'immunoglobulines à traiter. La quantité suffisante de C1q t/ou FR peut, si nécessaire, être déterminée de façon simple par un essai préliminaire sur un échantillon. On estime que les agrégats ont été complètement éliminés lorsque la préparation d'Ig est dépourvue de pouvoir anticomplémentaire (déterminé selon le test indiqué ci-après à l'exemple 1). En pratique on utilisera de préférence un excès de facteur C1q ou FR, cet excès étant ensuite éliminé, après séparation des agrégats, comme il sera indiqué ci-après. Bien entendu, il est également possible d'effectuer la séparation des agrégats en plusieurs étapes en utilisant à chaque étape un défaut de facteur C1q et/ou FR, et en répétant l'opération autant de fois que nécessaire pour obtenir une élimination complète des agrégats, c'est-à-dire une disparition du pouvoir anti complémentaire. Dans un premier mode de mise en oeuvre on effectue la séparation des agrégats par adjonction à la préparation qui les contient des facteurs Cîq et/ou FR sous forme soluble de façon à provoquer la précipitation des immunoglobulines agrégées. Ces immunoglobulines agrégées sont ensuite éliminées de préférence par centrifugation. De préférence on élimine ensuite l'excès de Cîq ou de FR restant dans le surnageant. Cette élimination peut être effectuée par exemple par passage du surnageant sur une colonne d'anticorps insolubilisés dirigés contre le Cîq ou le FR. Dans un second mode de mise en oeuvre on effectue la séparation des agrégats en utilisant les facteurs Cîq et/ou FR insolubilisés, ce qui permet de recueillir facilement la totalité des facteurs et offre en outre l'avantage de n'introduire aucune protéine etrangère dans la préparation d'immunoglobulines. L'insolubilisation des facteurs Cîq ou FR peut être effectuée par toute technique habituelle, par exemple en liant les facteurs à des particules, par exemple d'agarose porteur de groupements aminés, à l'aide d'un agent couplant. La préparation d'immunoglobulines peut alors être passée à travers une colonne contenant le ou les facteurs insolubilisés ou être mélangée à une suspension de l'un ou des deux facteurs, la séparation steffectuant alors par centrifugation ou filtration. En outre il est ainsi plus facile de récupérer les facteurs Cîq ou FR après élimination des agrégats retenus qui peuvent être détachés au moyen de diverses solutions de concentration ionique ou de pH adéquats tels que par exemple une solution de thiocyanate d'ammonium 1 M. Les conditions de réaction entre le Cîq ou le FR et les immunoglobulines à traiter sont de préférence les suivantes - on opère entre 4 et 370C environ; si les incubations sont prolongées au-del de 30 minutes, on opère de préférence aux températures les plus basses de cette gamme, par exemple à 40C; - le pH du milieu est compris entre 6,5 et 8,5 environ; - la durée de la réaction est au moins égale à 30 minutes. Bien que la durée de réaction puisse être prolongée pendant des temps très importants, le temps maximum de réaction est généralement pour des raisons pratiques, de l'ordre de 24 heures. La préparation du facteur Cîq peut être effectuée par tous moyens connus. De préférence on le prépare dans la technique de précipitation des euglobulines décrites par KUNIO YONEMASU et R.M. STROUD, dans J. Immunol., 106 : 304-313 (1971). Ce procédé consiste à précipiter les euglobulines du sérum par dialyse contre un tampon de faible force ionique et contenant un agent chélateur du calcium (EDTA). La préparation du facteur FR peut également être effectuée par les moyens actuellement connus, tels que ceux décrits par exemple dans J.Exp. Med.115, 253-273,1962. Ainsi le FR peut, à titre d'exemple être induit chez le lapin par inoculation intradermique de ses propres immunoglobulines agrégées par la chaleur et mélangé à de l'adjuvant de Freund. L'animal est saigné deux semaines après la dernière injection et le FR est isolé par passage du sérum sur une colonne d'IgG humaines agrégées et inso lubilisées. L'élution du facteur FR retenu s'effectue par les concentrations croissantes de thiocyanate d'ammonium. L'invention a également pour objet les préparations d'immunoglobulines obtenues par le procédé selon l'invention et qui se caractérisent par une teneur quasi nulle en agrégat et une concentration élevée en immunoglobulines normales. L'invention a également pour objet des médicaments consistant en de telles préparations ou comprenant de telles préparations. Ces médicaments possèdent l'activité anticorps des immunoglobulines, et leurs applications thérapeutiques sont les applications thérapeutiques habituelles des immunoglobulines, c'est-à-dire notamment le traitement ou la prévention des affections d'origine virale ou bactérienne, ou encore des affections dues à l'action de certaines toxines, en particulier dans le cas des malades souffrant de carences immunitaires. Ils sont administrés par voie parentérale, de préférence par voie intraveineuse. Ces médicaments peuvent être notamment utilisés pour la prévention du tétanos sur des sujets immunisés contre les protéines sériques d'origine animale. Les médicaments agissent in vivo par l'action des anticorps qu'ils contiennent. Ils ne présentent pas de risques -de choc anaphylactique et se trouvent appropriés à l'injection intraveineuse. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaltront à la lecture de la description suivante faite à titre d'exemple non limitatif. EXEMPLE 1 On prépare une solution de gammaglobulines humaines à usage intramusculaire par précipitation alcoolique à partir de sang placentaire selon la méthode de H.L. TAYLOR et Coll. mentionnée ci-dessus. On prépare du facteur Clq isolé à partir d'un litre de sérum frais humain par la méthode décrite par KUNIO YONEMASU et ROBERT M.STROUD dans J. Immunol., 106 : 304-313 (1971). Le facteur Cîq obtenu est repris dans une solution tampon de Tris 0,1 M EDTA 0,01 M, pH compris entre 8,0 et 8,5, puis est couplé sur des particules d'agarose porteur de groupements aminés, par exemple le Sepharose aminé AH, l'agent coupleur consiS- tant en glutaraldéhyde. Dans ce but le Sepharose aminé AH est lavé avec le tampon Carbonate-bicarbonate de sodium, pH 8,5 à concentration entre 0,1 M et 0,2 M. On reprend 20 ml de Sepharose lavé et essoré que l'on traite avec une solution récente de glutaraldéhyde à 2,5 % à raison de 1 volume de Sepharose aminé sédimenté avec 1 volume de glutaraldéhyde à 2,5 %. On agite 15 mn à température du laboratoire, puis on lave avec un large volume de tampon Carbonate-bicarbonate de sodium à raison de 10 volumes au moins. Au Sepharose ainsi activé sous forme essorée on ajoute la solution de Clq en excès ; 1 ml fixe en gros 15 à 25 mg de protéines totales. On agite en bain pendant au moins 30 mn à temperature ordinaire, on essore sur un filtre Büchner sous vide et on lave l'excédent de protéines par une solution physiologique de Cana. On prend ensuite 100 ml de la solution d'immunoglobulines à traiter et l'on met le Cîq ainsi insolubilisé en suspension dans ces 100 ml. On agite 30 mn à température ordinaire puis on sépare les immunoglobulines Sepharose par filtration sur verre frité. La gammaglobuline ainsi traitée est dépourvue de pouvoir anticomplémentaire, le Cîq s'étant complexé aux immunoglobulines altérées par agrégation. Pour tester le pouvoir anticomplémentaire on utilise de préférence la technique décrite dans Public Health Monograph NO 74, 1965 (USA) : Standardized Diagnostic Complement Fixation Method and Adaptation to Microtest, et l'on considère une gammaglobuline comme dépourvue de pouvoir anticomplémentaire quand la concentration de protéines nécessaires pour inhiber 2 C'H 50 % est égale ou supérieure à 50 mg par ml. Au cas où un certain pouvoir anticomplémentaire est encore présent dans la solution de gammaglobulines, on recommence une opération avec une nouvelle quantité de facteur Cîq sur Sepharose. EXEMPLE 2 A 100 ml d'une solution d'immunoglobulines à 16 % obtenues comme dans l'exemple 1 on ajoute une solution de Cîq en tampon EDTA Tris préparé selon l'exemple 1 dans la proportion de 300 mg en protéines de la fraction riche en Clq. --On incube le mélange 12 heures à 40C puis on centrifuge et on filtre sur filtre bactériologique. On obtient ainsi une préparation d'immunoglobulines dépourvue de pouvoir anticomplémentaire d'après le test décrit dans l'exemple 1, et prête à l'emploi pour usage intraveineux chez l'homme. On peut cependant encore éliminer l'excès de Clq soluble dans la solution de la façon suivante : On prépare un antisérum de chèvre contre le Cîq de lapin. A partir de l'antisérum on isole les anticorps et on les couple de manière covalente à un support solide tel que l'agarose. La solution d'immunoglobulines est ensuite mise en contact avec les anticorps insolubilisés qui retiennent sélectivement le Clq. L'ac traite des anticorps insolubilisés peut être régénérée en détachant le Cîq à l'aide, par exemple, d'une solution de thiocyanate d'ammonium 3 M. On pourra réutiliser les anticorps insolubilisés après les avoir rééquilibrés avec un tampon de pH et de force icniqu physiologiques. EXEMPLE 3 On utilise la meme préparation de gammaglobulines humaines séparées par précipitation alcoolique à partir du sang placentaire que dans l'exemple 1. Le Cîq est préparé à partir de sérum de lapin par la méthode décrite dans J. Immunol. 106: 304-313 (1971). Le Cîq est couplé au Sepharose aminé activé par la glutaraldéhyde dans les memoe conditions que dans l'exemple 1. On effectue un lavage extrêmement soigné du Cîq fixé sur le support insoluble, non seulement par un lavage intense par une solution physiologique de CiNa 900 mais également par une solution contenant un agent chaotropique tel que le thiocyanate d'ammonium qui élimine les traces de protéines animales non fixées par covalence. Le support est relavé avant l'emploi et rééquilibré par la solution tampon physiologique. On traite la préparation d'Ig par le Cîq insolubilisé, comme dans l'exemple 1. On obtient ainsi une préparation d'immunoglobulines humaines dépourvue de pouvoir anticomplémentaire et de plus ne piésentant pas de protéines d'origine animale. EXEMPLE 4 Les conditions de l'exemple sont identiques à celles de l'exemple 3 à l'exception du fait que le facteur Cîq est tiré du sérum de boeuf au lieu de sérum de lapin. On obtient également une préparation d'immunoglobulines humaines dépourvues de pouvoir anticmplémentaire et ne contenant pas de protéines d'origine bovine. EXEMPLE 5 On prépare le facteur rhumatoïde FR par induction chez le lapin par inoculation intradermique au lapin, de ses propres immunoglobulines agrégées par la chaleur et mélangées à de l'adjuvant de Freund dans des conditions suivantes On injecte au lapin 1 mg de ces immunoglobulines agrégées. Le FR apparat dès la seconde injection et sa production est entretenue par une injection mensuelle des immunoglobulines agrégées. L'animal est saigné deux semaines après la dernière injection et le facteur rhumatoïde est isolé par passage du sérum recueilli sur une colonne d 'immunoglobulines humaines agrégées et insolubilisées par couplage de manière covalente à un support solide tel que l'agarose. Le FR spécifiquement retenu est ensuite élué par des concentrations croissantes de thiocyanate d'ammonium, la concentration la plus faible étant de l'ordre de 1 M, la concentration terminale la plus forte étant de l'ordre de 3 M. La solution de facteur rhumatoïde ainsi obtenue est ensuite dialysée de manière très lente contre un tampon physiologique afin d'éliminer le thiocyanate d'ammonium. On traite ensuite 100 ml de la préparation d'immunoglobulines, obtenue par précipitation alcoolique à partir de sang placentaire, soit de façon analogue à celle écrite à l'exemple 1 (le FR étant sous forme insoluble), soit de façon analogue à celle décrite à l'exemple 2 (le FR étant alors sous forme soluble). Lorsqu'il est utilisé sous forme soluble, l'excès de FR de lapin peut être éliminé à l'aide d'un antisérum de chèvre dirige contre les immunoglobulines du lapin, de la même manière que l'on élimine le Cîq en recourant à un antisérum de chèvre dirigé contre le Cîq (voir ci-dessus, exemple 2). REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'immunoglobulines (Ig) purifiées par élimination des agrégats d'immunoglobulines, caractérisé par le fait que l'on élimine lesdits agrégats en faisant agir sur la préparation d'immunoglobulines qui les contient, une quantité suffisante de l'un au moins des facteurs suivants : facteur Cîq du complément et facteur rhumatoide (FR). 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la quantité suffisante de facteur Cîq et/ou FR est une quantité qui permet d'obtenir une disparition du pouvoir anticomplémentaire de la préparation. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, pour la préparation d'immunoglobulines humaines, caractérisé par le fait que l'on utilise le facteur Cîq choisi dans le groupe constitué par Cîq humain, Cîq de lapin, Cîq de bovins et Cîq de chèvre. 4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que l'on utilise le facteur rhumatoïde FR choisi dans le groupe formé par le facteur FR humain et le FR de lapin. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que l'on mélange le facteur sous forme soluble à la préparation d'immunoglobulines, à traiter, de façon à provoquer la précipitation des Ig agrégées, et qu'on élimine ensuite le précipité forme. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que l'on élimine le précipité par centrifugation. 7. Procédé selon la revendication 5 ou 6, caractérisé par le fait que l'on élimine ensuite l'excès de facteur restant dans le surnageant en le faisant passer sur des anti-corps insolubili sés dirigés contre le facteur. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que l'on effectue la séparation des agrégats en utilisant un facteur insolubilisé. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'on insolubilise le facteur en le liant à des particules porteuses de groupements aminés, avec un agent couplant. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait que l'on utilise des particules d'agarose. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 et 10, caractérisé par le fait que l'agent couplant est le glutaraldéhyde. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisé par le fait que la préparation d'immuno-globulines est passée à travers une colonne contenant le facteur insolu bilisé. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisé par le fait que l'on mélange la préparation d'immunoglobulines avec une suspension du facteur insolubilisé et que l'on effectue ensuite la séparation du facteur sur lequel sont fixés les agrégats. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé par le fait que la séparation est effectuée par centrifugation ou par filtration. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 14, caractérisé par le fait que l'on récupère ensuite le facteur en détachant les agrégats au moyen de solutions de concentration ionique ou de pH adéquats. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé par le fait que l'on détache les agrégats au moyen d'une solution de thiocyanate d'ammonium 1 M. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'action du facteur Cîq et/ou FR sur la préparation d'immunoglobulines est effectuée à température comprise entre 4 et 370C environ, à pH compris entre 6,5 et 8,5 environ, pendant un temps compris entre 30 minutes et 24 heures. 18. Préparation d'immunoglobulines obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, et comprenant une teneur quasi-nulle en agrégats. 19. Médicament comportant une préparation d'immunoglobulines selon la revendication 18, conditionnée pour l'injection.