Brevet FR2271288A1 — publié le 19751212

La présente invention concerne un procédé de préparation de protéines par fermentation. On connaît des methodes biosynthétiques, dans lesquelles des microorganismes, par exemple certaines souches de bactéries, se développent par fermentation dans un milieu nutritif synthétique contenant du méthanol comme source unique de carbone. De telles méthodes peuvent être mises en oeuvre aussi bien en discontinu qu'en continu. Les cellules bactériennes ainsi obtenues contiennent, dans la protéine brute" (calculée par multiplication de la valeur pour l'azote, trouvée par analyse élémentaire, avec le facteur empirique 6,25), en général, de 40 à 75 % en poids d'acides aminés et de 8 à 16 % en poids d1 acides nucléiques.Une proportion tellement élevée d'acides nucléiques n'est toutefois pas désirable, car il se forme à partir de ceux-ci, en particulier dans ltorganisme humain, de l'acide urique qui provoque de l'arthrite. De plus, ils ont une influence défavorable sur la flore microbienne dans le tube digestif. Or la Demanderesse a trouvé un procédé de préparation de bactéries avec du méthanol comme source de carbone et une source d'azote dans des conditions aérobies à un pH allant de 4,0 à 9,0, procédé qui est caractérisé en ce qu'on développe par fermentation des souches de bactéries de l'espèce Bacillus, Pseudomonas et Flavobacterium, leurs mutants ou variants, de façon que la concentration de méthanol, dans la phase de croissance logarithmique des cellules bactériennes, soit comprise entre 5 et 200 ppm, par rapport à la suspension de culture. On préfère utiliser une concentration de méthanol comprise entre 10 et 150 ppm. Le procédé conforme à l'invention est réalisé avantageusement dans des récipients de fermentation qui contiennent un milieu nutritif renfermant, en plus du méthanol mentionne, comme source d'azote, des sels, tels que le nitrate de potassium, le sulfate d'ammonium, le phosphate d'ammonium ou l'ammoniac, l'urée ourla farine de soja. I1 contient aussi des phosphates, tels que le dihydrogéno-phosphate de potassium ou l1hydrogéno-phosphate disodique ainsi que des sels de magnésium et de potassium et des oligo-éléments, tels qu'ils sont contenus aussi, par exemple dans l'eau courante. Ainsi, par exemple, sont présentes des traces de sels de fer, de cuivre, et de molbvdene. I1 peut être avantageux d'ajouter, en particulier aux cultures préliminaires, des éléments nutritifs, tels que l'extrait de levure, de l'extrait de viande, de l'extrait de foie, du glucose ou d'autres substances. Le procédé est mis en oeuvre avantageusement à des températures comprises entre 20 et 45 OC, de préférence entre 30 et 37 OC. Comme souches bactériennes, on peut utiliser des souches de l'espèce Bacillus, en particulier les souches bien connues, telles que B. substilis ou -B.polymixa, de plus des souches de l'espèce Pseudomonas, telles que Pseudomonas aeruginosa. On peut aussi utiliser des flavobactéries. La suspension de culture qui se trouve dans le récipient de fermentation est aérée avec 0,1 à 1,5 1 d'air par litre de solution de culture et par minute (vvm), de préférence avec 0,3 à 0,6 vvm. Pour garantir une bonne absorption de l'oxygène par les cellules, il est bon d'agiter fortement, on peut aussi ajouter des émulsionnants. Dans les systèmes de réaction autres que les récipients à agitation, il faut veiller à ce qu'il y ait une quantité d'air suffisante, un recyclage de l'air étant avantageux étant donné la volatibilité du méthanol. Dans des systèmes conventionnels, il s'est avéré avantageux d'utiliser un, ou mieux encore, deux ou plusieurs agitateurs dans un récipient de fermentation. I1 y a avantage aussi à disposer deux agitateurs, en particulier des agitateurs à plaque perforée, dans le récipient de sorte que les distances entre les agitateurs correspondent à peu près à un diamètre d'agitateur. Le rapport du diamètre d'agitateur au diamètre du récipient est avantageusement situé entre 0,35 et 0,65, de préférence entre 0,45 et 0,55. La vitesse de circulation de la suspension de culture est avantageusement supérieure à 7 mètres/sec. S'il se forme des mousses, il est recommandé de les réduire à l'aide de moyens chimiques ou mécaniques, par exemple en ajoutant de 0,01 à 0,1 % en poids d'un agent anti-mousse, tel que l'octanol, l'ester de l'acide oléique et de l'acide laurique avec le glycol, le glycérol ou le sorbitol, une solution alcoolique de cholestérol ou des silicones, tels que le polydiméthyl-siloxanne. La concentration en méthanol comprise entre 5 et 200 ppm, de préférence entre 10 et 150 ppm, peut être réglée continuellement par diverses mesures, par exemple par détermination de la con sommation d'azote et de la proportion de la masse cellulaire ou, de préférence par détermination de la libération de gaz carbonique. On obtient ainsi un dosage exact de l'addition de méthanol, qui a un effet rapide sur la libération de gaz carbonique, qui s'abaisse par défaut de carbone. De préférence, ce réglage s'effectue par mesure du méthanol gazeux à l'aide d'un détecteur à ionisation de flamme. Lorsque le pH de la suspension de culture s'abaisse au dessous de la valeur indiquée, il est ramené à la valeur indiquée par addition d'alcali, par exemple~de lessive de soude ou de potasse. On corrige également un pH trop élevé par addition d'acide, par exemple d'acide chlorhydrique ou acide sulfurique. Pour suivre 1 t opération, on prélève des échantillons dans la suspension de culture afin de déterminer le poids sec et la teneur en azote dans la masse de bactéries, ce qui permet de déterminer le taux de croissance et le temps de doublement de la masse cellulaire. Si le poids sec des cellules, après prélèvement successif des échantillons, n'augmente plus de manière logarithmique, la fermentation est terminée. Dans l'opération en-continu, la production de la masse biologique est contrôlée dans le réacteur par l'inter- médiaire du taux de dilution. La séparation de la masse des bactéries se fait comme dtha- bitude par centrifugation avec lavage répété à l'eau. Il y a aussi avantage à concentrer la masse de cellule par floculation avec des acides à pH 2 à 6, ou aussi de rendre la suspension de culture d'abord alcaline, avantageusement à pH 8 à 11, de préférence 8 à 9, puis à la chauffer pendant peu de temps à 60 - 95 OC et à I1acidi- fier après refroidissement, comme il a été décrit ci-dessus. La floculation peut aussi être facilitée par addition de sels du fer ou d'aluminium ou d'agents auxiliaires de fluculation d'origine na turelle, par exemple, I'amidon ou la colle ou d'origine synthétique, par exemple les polyacrylamides, les - polyacrylates, les polyéthylène-imines ou les polyoxyéthylène . On obtient ainsi une masse pâteuse de cellules bactériennes qui contient encore 75 à 90 % en poids d'eau. On la sèche de diverses manières, par exemple à l'aide de cylindres, d'un lit tourbillonnaire ou par atomisation. Le produit ainsi séché ne contient que 2 à 5 % en poids d'eau et 60 à 80% en poids de protéine brute.Dans cette protéine brute, la teneur en acides aminés est de 90 à 95 1 en poids. Il est remarquable que non seulement la teneur en acides aminés en général mais aussi celle en acides aminés essentiels et semi-essentiels est plus élevée que celle des produits comparables connus De plus, la teneur en cendres brutes de la masse cellulaire séchée et obtenue conformément à l'invention est beaucoup plus réduite que celle des produits connus. La protéine brute obtenue conformément à l'invention contient de plus seulement 5 à 10 % en poids d'acides nucléiques, tandis que des produits connus contiennent de 8 à 16 A en poids ou plus d'acides nucléiques. La masse bactérienne séchée, obtenue suivant le procédé conforme à l'invention, convient particulièrement bien comme source de protéine dans des denrées et fourrages pour animaux. Les exemples qui suivent illustrent la présente invention. EXEMPLE 1 On met en suspension la souche Pseudomonas sp. ATCC 31061 (FH-B-5163), qui est maintenue sur des tubes inclinés de gélose ayant une composition suivante 2,5 % d'extrait de viande 1,0 % de méthanol 5,0 % d'extrait de levure 0,2 % de NaN03 10 % de peptone de viande 0,02 % de MgS04. 7H20 10 % 10 % de glucose + 90 % 0,02 s de Na2HP04 10 % de NaC1 et 0,009 s de NaH2Po4 2,5 % de gélose 0,004 % de KC1 0,00015 % de CaCl2 0,0001 % de FeSO4. 0 traces de CuS04 . 5H20 traces de H3B03 traces de MnSO4 . 5H20 traces de ZnSO4. 7H2 0 traces de Na2Mo4 . 2H20 (pH 6,6) avec 4 ml d'eau distillée ou une solution physiologique de chlorure de sodium et on ensemence la suspension dans des conditions stériles dans un Erlenmayer à 2 1 qui contient 250 ml d'une solution nutritive de pré-culture et ayant la composition suivante 0,53 % de (NH4)2S04 0,4 % de KH2P04 0,2 % de Na2HPO . 12H20 0,02 % de MgS04 . 7H20 1,5 % de méthanol et 0,1% d'oligo-éléments (pH 6,8) L'opération est réalisée dans un récipient de fermentation ayant une capacité de 14 litres, qui est rempli de 10 litres de la solution nutritive suivante 1 95 de (NH4)2S04 0,4 % de KH2PO4 0,2 % de Na2HP04 . .,H20 0,2 % de Na2HP04 . 12 H20 0,02 % de MgS04 . 7 H20 et 0,02 % de KC1 Le pH de la solution nutritive est 6,8. Elle est stérilisée pendant 45 minutes à 121 OC. On stérilise, de plus, 50 g (0,5 s en poids) de méthanol avant ensemencement de la culture principale de la solution nutritive. Pour ensemencer la solution nutritive on utilise, dans des conditions stériles, deux fois 250 ml de la pré-culture qui a été agitée pendant 24 - 48 heures à 30 OC. On agite la solution nutritive ainsi ensemencée à l'aide d'un agitateur à turbines pendant 24 - 36 heures à 30 OC avec aération de O, 6 vvm. Le cas échéant, le pH est rajusté par addition de HC1 2N stérile. Au cours de la phase logarithmique de la fermentation discontinue et continue, une concentration en méthanol comprise entre 5 et 150 ppm est maintenue. De plus, lorsque la libération de C02 des cellules diminue, on ajoute automatiquement d'autres portions de méthanol jusqu'à ce que la libération de C02 remonte de nouveau. Cette opération peut aussi être effectuée par mesure de la portion méthanolique gazeuse dans l'air usé à l'aide d'un détecteur à ionisation de flamme. Le déroulement de ltopération est vérifié par prélèvement des échantillons pour déterminer le poids sec et la teneur en azote de la masse cellulaire des bactéries. Lorsque la phase de croissance logarithmique est terminée, le traitement complémentaire est effectué de manière usuelle, par centrifugation ou par floculation, lavage des cellules à l'eau et séchage ultérieur par atomisation. Le produit ainsi obtenu a une teneur en protéine brute de 71,87 % en poids une teneur en acides aminés de 66,55 % en poids et une teneur en acides nucléiques de 9,8 % en poids. Les acides aminés essentiels et semi-essentiels seuls représentent un pourcentage de 46,47 % en poids (la glycine comprise). Des indications plus détaillées se trouvent dans le tableau suivant. TABLEAU I Produit Bactéries FH-B-5163 Protéine brute (Nx 6,25) % 71,87 Teneur en eau % 4, Cendres brutes 46 5, Matières grasses brutes % 9, Fibres brutes 96 3,6 Teneur en acide aminé % 66,55 Acides aminés g/16 g N Asp 9,50 Thr 4,63 Ser 3,08 Glu 11,57 Pro 4,15 Gly 6,05 Ala 8,41 Cys n.dét. Val 6,19 Met 3,85 Ile 3,92 Leu 7,45 Tyr 2,09 Phe 3,55 His 1,89 Lys 5,90 Arg 7,33 Try n.dét. teneur en acide nucléique % J 9,8 EXEMPLE 2 La souche Pseudomonas aeruginosa ATCC 21996 (FH-N-845) est cultivee comme à l'exemple 1. De plus, on introduit dans un récipient de fermentation d'une capacité de 14 1, 9 1 d'une solution nutritive comme à l'exemple I, et 0,5 % en poids de méthanol. La solution nutritive est ensemencée comme à l'exemple 1 et agite à 3 OC à l'aide d'un agitateur à turbines à 210 t/m. avec 0,6 vvm d'air. Le pH est maintenu à 8,0, éventuellement par l'addition de HC1 stérile. Au cours de la phase logarithmique de la fermentation, une concentration en méthanol comprise entre 50 et 100 ppm est maintenue. Le réglage de cette concentration, la surveillance de ltopération ainsi que la séparation et le traitement complémentaire de la masse cellulaire obtenue s'effectuent comme à l'exemple 1. Après séchage par atomisation on obtient un produit dont la teneur en protéine brute est 75,8 s en poids, en acides aminés de 67,0 % en poids et en acides nucléiques de 8,5 % en poids. EXEMPLE 3 La souche Flavobacterium sp. ATCC 31062 (FH-B-5108) est cultivée d'abord comme à l'exemple 1 dans un récipient de fermentation ayant une capacité de 10 litres. La suspension de culture ainsi obtenue est ensuite transvasée dans un récipient de fermentation ayant une capacité de 200 1, qui contient 150 1 de la solution nutritive suivante l % de (NH4)2So4 0,4 % de KH2P04 0,2 % de K2HP04 0,2 % de Na2HPO . 12H20 0,02 % de NaCi 0,02 % de MgS04 . 7H20 0,5 % de méthanol Le pH de la solution nutritive est ajusté à 6,5 à l'aide diacide phosphorique semi-concentré. On stérilise ensuite à 120 OC et sous une pression relative de 1,4 atmosphère pendant 20 minutes, Après la stérilisation, le pH est de 6,7.On ajoute le méthanol-sé- parément. On développe ensuite la culture par fermentation pendant 24 à 36 heures à 35 OC avec aération de 1,1 vvm sous une pression relative de 0,3 atmosphère et avec agitation à laide de deux agitateurs à 250 t/m. Au cours de la phase logarithmique de la fermentation, une concentration en méthanol comprise entre 50 et 120 ppm est maintenue par addition - lors-d'une réduction de la libération de gaz carbonique d'autres fractions de méthanol jusqu'à une remontée de la libération de C02. Le pH est maintenu entre 7,9 et 8,4 par addition de HC1 stérile. Le déroulement de 11 opération et sa fin sont menés comme à l'exemple 1. La suspension de culture ainsi obtenue est utilisée comme matière d'ensemencement pour un récipient de fermentation ayant une capacité de 2000 1. La solution nutritive a la même composition et le même pH que décrit ci-dessus pour la précédente fermentation. Le récipient de fermentation est stérilisé pendant 20 minutes à 120 C sous une pression relative de 1,4 atmosphère avec agitation à 210 t/m. Après stérilisation le pH est de 6,8. La fermentation subséquente est effectuée à 35 OC, sous une pression relative de 0,3 atmosphère avec aération de 0,6 vvm et à l'aide de deux agitateurs à 210 t/m. Le pH est maintenu entre 7,9 et 8,4 au cours de la fermentation au moyen de HC1 stérile. Le déroulement de 11 opération est vérifié par prélèvement d'échantillons pour déterminer la stérilité, le pH, le poids sec et la teneur en azote dans la masse cellulaire des bactéries. La concentration de méthanol est maintenue au cours de la phase de croissance logarithmique entre 10 et 150 ppm et réajustée comme décrit ci-dessus-selon la libération de gaz carbonique. La phase de croissance logarithmique une fois terminée, la suspension de culture est chauffée pendant peu de temps à 55 OC puis refroidie de 18 OC. Le pH est compris entre 8,0 et 8,5. 2000 litres de la suspension de culture ainsi obtenue, ayant une teneur de 20 g par litre en masse sèche, sont centrifugés à 15 000 g dans une centrifugeuse tubulaire avec un débit de 400 litres/h. Les cellules bactériennes humides, ainsi séparées, sont mises en suspension dans de l'eau déminéralisée pour obtenir une suspension ayant une teneur de 10 à 15 % en poids de masse sèche, suspension que l'on agite vigoureusement dans un récipient approprié à 15-18 OC. Au cours de cette opération, des substances secondaires et les constituants de la solution nutritive sont séparés par lavage au bout d'une heure environ. Après une nouvelle centrifugation, on prépare une suspension de bactéries à 20-25 % en poids avec de l'eau déminéralisée, on l'agite dans les mêmes conditions et on la centrifuge de nouveau. Les cellules bactériennes ainsi lavées sont mises sous forme d'une suspension de 40-50 ffi en poids et séchées par ato misation. On obtient ainsi 37 kg d'un produit de cellules clair sans odeur, qui contient 73,7 % en poids de protéine brute, 61,0 % en poids d'acides aminés - dont 49,0 s en poids d'acides aminés essentiels - et 10,5 % en poids d'acides nucléiques. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de protéine à partir de bactéries avec du méthanol comme source de carbone et une source d'azote,dans des conditions aérobies, à un pH de 4,0 à 9 > 0 ce procédé étant caractérisé en ce qu'on développe par fermentation des souches de bactéries de l'espèce Bacillus, Pseudomonas et Flavobacterium, leurs mutants ou variants, de façon que la concentration en méthanol dans la phase de croissance logarithmique des cellules bactériennes soit comprise entre 10 et 150 ppm, par rapport à la suspension de culture. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration en méthanol est comprise entre 50 et 100 ppm par rapport à la suspension de culture. 3. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'on aère la suspension de culture avec 0,3 à 0,6 volume d'air par volume de suspension et par minute. 4. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la suspension de culture est agitée à une vitesse de 5Q à 210 tours par minute 5. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on réalise la fermencation dans un récipient muni d'au moins deux agitateurs à plaque perforée, où le rapport du diamètre d'agitateur au diamètre du récipient est compris entre 0,35 et 0,65 et la distance entre deux agitateurs correspond à un diamètre d'agitateur. 6. Procédé suivant l'une quelconque des revendications I à 5, caractérisé en ce qu'on réalise la fermentation dans des récipients qui peuvent être agités mécaniquement, hydrodynamiquement et pneumatiquement. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on utilise Pseudomonas species, ses mutants ou variants. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 6, caractérisé en ce que l'on utilise Bacillus species, ses mutants ou variants. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on utilise Flavobacterium species, ses mutants ou variants. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la concentration en méthanol est controlée par mesure de la libération de gaz carbonique.