Brevet FR2283902A1 — publié le 19760402

la présente invention concerne un procédé de dégradation enzymatique d'une matière riche en-protéine et contenant des liquides. Des résidus riches en protéine s'accumulent fréquemment dans la production d'huiles végétales et animales. Ces résidus sont de nature hétérogène très complexe et contiennent, outre diverses quantités de protéine, de nombreux autres composants de haut et bas poids moléculaIre, tels o,ue des graisses, de l'amidon, de la cellulose, des matières pectiques, des hem celluloses, des colorants et des sels. Les résidus de la production dthuiles ont été utilisés jusqutà présent pour l'alimentation du bétail, en raison de leur forte teneur en protéine et en glucides. leur utilisa tion comme source de protéine dans l'alimentation humaine nécessite en général des opérations particulières de préparation et d'isolement. Un exposé sommaire sur les procédés de ce type est donné par R. oyes dans "Protein Food Supplements", Noges Data Corp., 1969. Le but de ces procédés de préparation est d-téliminer les impuretés telles que l'amidon, la cellulose, les graisses, les substances minérales ou les substances sapides indésirables, par exemple les principes amers de la fève de soja, sans altérer la qualité de la protéine. Tandis qu'un groupe de procédés connus a pour but de concentrer, de purifier ete parfois même de fractionner ou de scinder la protéine par sa dissolution par exemple avec de l'eau, des solutions aqueuses de sels ou de bases alcalines ou des sol tions alcooliques, ou par l'action dtenzymes protéolytiques, les impuretés indésirables ou perturbatrices sont éliminées par un second groupe de procédés.De m8me que la dissolution de la protéine pe-l-t entre effectuée par voie enzymatiqueS des procédés de ce groupe utilisent la dégradation enzymatique des composants indésirables, par exemple de l'amidon par des amylases, ou de la cellulose et des substances pectiques par des cellulases et respectivement des pectinases. Dans tous ces procédés de traitement, la teneur en huiles ou en matières grasses de ces matières premières riches en protéine est particulièrement gtnante, meme lorsqu'il s'agît alors de la teneur en huile résiduelle, relativement faible, du tourteau de presse ou d'extraction obtenu après la séparation de l'huile. Cette teneur en huile résIduelle réduit considérablement le caractère hydrophile du tourteau de presse ou d'extraction. Une imprégnation avec de l'eau, des solutions aqueu-ses contenant des sels ou des bases alcalines, ou des solvants hydrophiles que l'on utilise habituellement pour dissoudre la protéine ou les impuretés, est si difficile qu'elle ne permet quine séparation incomplète. L'extraction par épuisement avec des solvants organiques, ltaddition d'agents mouillants ou l'attaque à la vapeur d'eau à températures élevées, avec extraction par liquéfaction et séparation de l'huile, permet d'accéder plus aisément à-la protéine ainsi qu'aux impuretés qui l'accompagnent et facilite leur séparation. Lorsqu'on conduit un traitement avec des solvants pour éliminer les lipides, il peut toutefois y avoir une- altéra- tion,par exemple,du pouvoir gonflant ou de l'aptitude à la dégradation enzymatique, en raison de la dénaturation occasionnée par les solvants utilisés. De plus, on ne peut pas toujours compter sur une élimination quantitative des lipides. Les composants lipidiques contenus dans les résidus de production des huiles sont en effet généralement constitués non seulement par de lthmile ou de la graisse incomplètement séparée, mais dans une mesure importante, notamment dans le cas des céréales, par des lipoprotéines (environ 2 à 10 % sur la base de la protéine totale) etlou des lipopolysaccharides à liaisons complexes.Dans ces complexes, les lipides sont, par leur structure, si solidement attachés au composant protéinique ou glucidique, qu'ils ne peuvent pas etre éliminés, par exemple par des solvants. De piLle, du fait dela formation de complexes entre protéines et lipoprotéines, la solubilité des-protéines est à ce point réduite que ces substances, par exemple les protéines du gluten de blé,. ne sont plus solubles, pas même dans une solution d'urée les procédés de traitement prcposés jusqu'à présent pour améliorer les propriétés hydrophiles et la solubilité ne permettent toujours qu'une amélioration graduelle, par exemple de l'aptitude à la dégradation enzymatique, notamment dans le cas de protéines de céréales telles que les protéines de maSs et le gluten de blé. On vient de découvrir le fait surprenant quten traitant avec des lipases une telle matière riche en Protéine et contenant des lipides, on peut obtenir non seulement une dégradation totale de la graisse ou de l'huile libre, mais aussi une dégradation de la fraction lipidique complexée avec des protéines ou des glucides. le procédé de l'invention, destiné à la dégrada- tion enzymatique d'une matière riche en protéine et contenant des lipides, consiste à traiter la matière en suspension aqueuse avec des lipases, pour mieux mobiliser ainsi la protéine par exemple en vue d'une dégradation protéolytique. En principe, on peut utiliser des lipases de toute origine dans le procédé de l'invention. toutefois, on recommande d'utiliser des lipases produites par des micmo-organismes des genres Candida, Aspergillus, Rhizopus, Pseudomonas et Geotrichum, notamment des lipases dérivées de Candida cylindracea est d'Aspergillus oryzae. lors du traitement- avec des lipases en suspension laqueuse, la concentration de la matière riche en protéine et contenant des lipides dépend de l'absorption d'eau (aptitude au gonflement), ctest-à-dire de la consistance de la matière en question, en ce qui concerne la manutention (agitation, aptitude au pompage, etc.). Dans le cas des protéines de mais, cette concentration est comprise entre 1 et 30 % et se situe avantageusement vers 10 %. la concentration optimale en lipase est proportionnelle à la teneur en lipides -de la matière à traiter. Dans le cas des protéines de masse elle se situe par exemple entre 0,002 et 1 %, notamment entre 0,005 et 0,01 fo. les lipases agissent sur la suspension aqueuse de la matière riche en protéine et contenant des lipides, dans la gamme de températures d'environ 20 à 65 C, notamment de 35 à 45 c, et dans la gamme de pH d'environ 3 à9, notamment de 6,0 à 8,5. les périodes d'incubation peuvent atteindre jusqu'à 16 heures et se situent avantageusement entre I et 6 heures, selon la concentration en lipides et l'activité de la lipase. L'utilisation d'enzymes protéolytiques pour la dissolution et la dégradation de la protéine a é-té décrite principalement pour des tourteaux de presse ou autres résidus d'ex- traction de fèves de soja ou pour des fractions de protéine extraites par épuisement de ces résidus. La dégradation enzymati- que par des protéases est bien moins complète dans le cas de protéines de céréales (gluten) que dans le cas de protéines du soja, à cause de la forte teneur en lipoprotéines des premières. Cela est valable en particulier dans le cas des protéines du maïs, qu n'ont qu'un faible pouvoir de gonflement contrairement au gluten de blé et qui ne peuvent pas être utilisées comme ce dernier, par exemple pour la production de pâtes alimentaires mais que l'on utilise principalement comme aliment pour le bétail ou additif pour de tels aliments. Une dégradation enzyma- tique des protéines du maSs en peptides et amino-acides entièreS ment solubles n2a pu être obtenue jusquXà présent avec aucune des protéases connues. le procédé de l'invention, pour la fragmentation enzymatique tant des lipides libres que des lipides complexés est caractérisé par le fait qu2il accroft non seulement l'apti- tude au gonflement de la matière ainsi traitée, mais qu'il ané- liore notablement 11 aptitude à la dégradation enzymatique de ces matières contenant des lipides avec des protéases ou enzymes protéolytiques. Le traitement ïjréliminaire avec des lipases, conformément à l'invention, permet pour la première fois une liquéfaction totale des protéines du maSs en peptides, de préférence de faible poids moléculaire. Après un traitement préalable correspondant, l'hydrolyse totale est produite tant dans le cas des protéines obtenues par broyage du mais par voie humide, que dans le cas de protéines du mats Qui ont déjà été séchées. Après un séchage convenable (par exemple sous vide, par pulvérisation, par lyophilisation,etc.), l'hydrolyzat donne un produit qui se dissout dans lçeau en formant une solution limpide. Bien que lramélioration de la dégradation protéolytique par traitement préalable avec une lipase soit valable pour tous les enzymes protéolytiques, il convient le mieux,pour obtenir une dégradation totale, d'utiliser des protéases alca lines, notamment des protéases dérivées de Bacillus subtilis (par exemple "Bioprase A1 15", "Optimase 300", "Alkalase AP-10"). Avec une protéase neutre telle que la trypsine, on obtient malgré un traitement préalable avec une lipase, une dégradation des protéines du mais d2environ 30 % seulement, ce qui, toutefois, signifie encore une augmentation du degré de décomposition de 50 % par rapport aux protéines non traitées (dégradation d'environ 20 %). l'amélioration de la dégradation enzymatique peut entre constatée dans le cas de toutes les matières contenant des lipides, mais pour les protéines de céréales riches en lipoprotéines (protéines de maïs, gluten de blé), elle est plus forte que dans le cas drun résidu drextraction-de soja et d'arachide. le traitement préalable avec des lipases convient donc notamment pour des matières dont le composant lipidique est très solidement lié, comme dans les protéines de céréales. le fait que la solution contenant la lipase peut être séparée de la matière ou de la protéine en suspension après le traitement et peut etre réutilisée pour traiter une matière riche en protéine et contenant des lipides, est en faveur de la rentabilité du traitement de ladite matière avec des lipases, outre la liquéfaction complète des composants protéiniques. Il est également possible de traiter la matière contenant des lipides, simultanément avec des lipases et avec des protéases ou enzymes protéolytiques. Enfin, il est également possible de conduire pendant ou après le traitement avec des lipases, un traitement avec d'autres^enzymes tels que les amylases et/ou des cellulases. En résumé, le traitement préalables avec des lipases de matières riches en protéines et contenant des lipides, offre les avantages suivants, par rapport à d'autres procédés connus 1. Un traitement avec une lipase permet de dégrader aussi des lipoprotéines ou d'autres lipides à liaisons complexes qui ne peuvent pas être éliminés par exemple par des solvants. Le trait en mant préalable est donc très efticace,en particulier dans le cas de protéines de céréales. 2. Le traitement avec une lipase permet pour la première fois une hydrolyse enzymatique totale et très modérée des protéines du maTs, comparativement à d'autres procédés d'hydrolyse, par exemple une hydrolyse acide. On peut ainsi obtenir des produits hydrosolubles de couleur très claire, destinés aux applications bien connues des hydrolysats de gluten et protéines analogues, sans qu'unie séparation des matières humiques, par exemple après l'hydrolyse acide, soit nécessaire. 3. On peut faire agir les lipases d'une façon simple dans une suspension aqueuse de la matière contenant la protéine. Attendu que la gamme de pH assurant l'action optimale de la lipase est de 6 à 8,clest-à-dire la gamme de quassi-neutralité, il n'est pas nécessaire d'ajouter des tampons ni d'autres substancas auxiliaires. 4. Les conditions du traitement lipolytique sont très douces, en sorte qu'il nry a pas d'altération de la protéine, par exem- ple pas de dénaturation par un solvant ni de dégradation de certains amino-acides intéressants par des substances auxiliaires ajoutées, par exemple une base alcaline en suspension aqueuse. De plus, il n'y a pas à éliminer de résidus de solvants ou de substances auxiliaires souvent très solidement liés à la protéine et exigeant un traitement ulterie-ar coûteux. 5. La dégradation des lipides évite la formation d'émulsions stables de lipides et proteine que l'on voit souvent apparattre lors du traitement ultérieur. 6. Lorsque la protéine en suspension a été séparée par exemple par centrifugation, la solution aqueuse de lipase peut être réutilisée sans autre opération de traitement ou de préparation. 7. Le traitement lipolytique peut être combiné de façon simple avec d'autres opérations connues de dégradation enzymatique, par exemple avec des protéases, des amylases ou des cellulases. Cela est possible du fait de la très large gamme efficace de pH, en sorte que même au-delà de la gamme optimale d'efficacité des lipases, par exemple lorsquton utilise des protéases alcalines à un pH égal à 9, on peut encore améliorer notablement la dégradation protéolytique. On peut ainsi obtenir en un procédé à une seule phase des solutions qui contiennent aussi,par exemple,des glucides et des composés azotés solubles, et que lton peut donc utiliser comme produits très digestes destinés à ltalimentation des êtres humains et/ou des animaux. 8. Dans le cas d'une matière renfermant des protéines, qui nécessite de fortes concentrations en protéase en raison de sa teneur en lipoprotéines ou lîpopolysacobarides à liaisons complexes, le traitement lipolytique préliminaire permet de réduire à moins de 2/20 la concentration nécessaire en protéase,par exemple dans le cas du gluten de blé, ce qui représente un abaissement consi- dérable du coût des enzymes pour la dégradation protéolytique. La dégradation enzymatique de lipides tant libres que liés dans des matières premières riches en protéine telles que des céréales, du gluten, de la farine de soja, de la farine d'arachide, des graines de lin, de cotonier, de colza, des haricots de Lima, etc., au moyen de lipases, constitue donc un traitement préliminaire simple qui mobilise mieus les composants de ladite matière, c'est-à-dire tant la protéine que les autres composants, pour les opérations bien connues d'isolement, de liquéfaction, etc. L'invention est illustrée par les exemples suivants : le Une suspension de 2 kg de protéines de maïs, à l'état humide,à teneur en matières sèches d'environ 50 %, dans 10 1 d'eau,est mélangée avec 0,01 % de lipase, sur la base des matières sèches des protéines de maïs, on ajuste son pH à 7,0 au moyen d'hydroxyde de sodium et on agite à 400C.La lipase utilisée dans ce procédé est extraite de Candida cylindracea du type "MY", de la firme japonaise Meito Sangyo Co. Ltd. (Activité/kg d'environ 50 Unités Internationales x 106]). Environ 6 heures plus tard, on sépare les protéines par centrifugation, on les met en suspension dans l'eau (teneur finale en matières sèches d'environ 5 %), et on les hydrolyse pendant 6 heures à 470C par addition de 1,0% de protéase (sur la base des matières sèches des protéines de mals). La protéase utilisée dans ce procédé consiste en "Bioprase AL 15" de Bacillus subtilis, de la firme Japonaise Nagase & Co. (activité de 75 000 unités "Nagase" de protéase par gramme).Le pH est ajusté à 9,2 au début de l'hydrolyse par addition d'hydroxyde de sodium et il est maintenu à cette valeur pendant l'hydrolyse, par addition d'une quantité supplémentaire de less:ive. On obtient une dégradation totale à 100 % des produits hydrosolubles (valeur déterminée par la méthod-e Kjedahl, après centrifvgation). A titre comparatif, des protéines de maïs non traitées avec une ligase donnent dans les mêmes conditions un résidu insoluble dans l'eau qui contient encore environ 27 % de l'azote initial. Exemple 2 On soumet une suspension de 1 kg de protéines sèches de mals (teneur en matières sèches d'environ 90 %) comme dans exemple 1, tout d'abord à un traitement avec une lipase, puis à la dégradation protéolytique. Comparativement à un échantillon identique non traité préalablement avec une lipase, et pour lequel on ne peut obtenir qu'une dégradation a 73 % en produits totalement solubles, on parvient, par le traitement préliminaire, à une liquéfaction à 100 % des protéines du maTs. Exemple 3 Une suspension de 1 kg de protéines de maïs dont la teneur en matiéres séches est d'environ 92%, la teneur en protéine est d'environ 86% sur base sèche et la teneur en lipides est d'environ 1,7 % sur la même base, est soumise d'abord à un traitement avec une lipase, puis à une dégration protéolytique pendant 16 heures, dans les conditions indiquées dans l'exemple 1. Le tableau suivant fait apparaître l'amélioration de l'aptitude à la dégradation comparativement à des échantillons ntayant pas subi de traitement préliminaire. traitement Azote soluble préliminaire (pourcentage par rapport à l'azote total Néant 75 lipase 100 Exemple 4 En suivant le mode opératoire de l'exemple 1, on soumet tout d'abord à un traitement avec une lipase puis à une dégradation protéolytique durant 16 heures, des suspensions contenant chacune 1 kg de résidu en poudre drextraction du soja (89 0 de matières sèches, 54 % de protéine sur base sèche, 0,1 % de lipides sur base sèche) et de poudre d'extraction drarachide (93 % de matières sèches, 57 % de protéine sur base sèche, 0,01 % de lipides sur base sèche).L'amélioration de l'aptitude à la dégradation est indiquée sur le tableau suivant, comparativement à des échantillons n'ayant pas subi de traitement préliminaire. Traitement Poudre de Poudre préliminaire soja d'arach-ide L Néant 89 83 100 100 Lipase I l'aptitude à la dégradation est nettement élevée dans le cas des deux produits, mais l'amélioration que l'on peut obtenir est plus faible que pour des protéines de céréales riches en lipoprotéines (exemples 1 à 3). Exemple 5 Une suspension de protéines de mals, à l'état humide, est traitée conformément à l'exemple 1; les protéines sont séparées par centrifugation après le traitement avec une lipase, et elles sont soumises : a) à U12 séchage par circulation d'air b) à un séchage par lyophilisation. L'aptitude au gonflement des produits secs (90 % de matières solides) est nettement meilleure après ces deux modes de séchage, comparativement à des échantillons qui n'ont pas été soumis à un traitement préliminaire. Traitement Gonflement (gain, %, par rapport au volume initial) Séchage par circu- lyophilisation lation d'air Néant 50 75 Lipase 100 150 Exemple 6 On soumet une suspension de 2 kg de protéines de maïs à l'état humide à un traitement avec une lipase conformément à l'exemple 1. Les protéines séparées sont hydrolysées en suspension aqueuse à 2,5 % à un pH de 7,5 et à 350C pendant 16 heures, en présence de 1 % de trypsine (sur base sèche). Comparativement à un échantillon non traité, pour lequel on peut obtenir une dégradation maximale de 20 %, l'apti- tude à la dégradation est portée à 30 % par le traitement préliminaire. Exemple 7 On soumet des échantillons-de 1 kg de protéines de mais à i'état sec (teneur en matières solides égale ou supérieure à 90 0 à une extraction par épuisement (Soxhlet) avec de l'hexane et avec du trichloréthylène, puis à une hydrolyse protéolytique pendant 6 heures par le mode opératoire décrit dans ltexemple 1 On n'obtient pas d'amélioration de l'aptitude à la dégradation comparativement à des protéines de maSs qui n'ont pas été traitées, Traitement - Protéine soluble Néant 73 Extraction à l'hexane 74 Extraction au trichloréthy- lène 70 Traitement pré liminaire à la lipase 100 Exemple 8 Une suspension de 2 kg de protéines de maTs, à ltétat humide, dans 20 1 d'eau est agitée pendant 6 heures à 470C en présence de 0,01 % de lipase et de 1,0 % de protéase (dans chaque cas sur la base de l'extrait sec des protéines), en maintenant le pR à une valeur constante de 9,-2 par addition dthydroxyde de sodium du début à la fin de l'hydrolyse. Traitement Protéolyse Azote soluble, % par préliminaire rapport à l'azote total Néant protéase 73 Néant protéase + 97 lipase Lipase protéase 100 Bien que l'optimum de pH de la lipase ait été. dépassé dans 11 action directe simultanée de cette dernière et de la protéase, on a pu obtenir une amélioration iinportante de la dégradation enzymatique et une transformation à 97 % en produits solubles. Exemple 9 On fait incuber pendant 16 heures du gluten de blé avec et sans traitement préliminaire au moyen d'une lipase (o, sur base sèche) avec diverses quantités de "Biophase", par le mode opératoire de exemple 1. Le tableau suivant démontre que le traitement préliminaire avec mie lipase permet de réaliser une économie considé rable (égale ou supérieure à 1/25) sur la quantité de protéase qui est nécessaire pour obtenir une liquéfaction à 100 % des protéines lu gluten. Concentration en Pourcentage d'azote dans la "Bioprase" (d,o sur -solution base sèche) Traitement préliminaire ras de traitement avec une lipase préliminaire avec ~ ure lipase 0,05 96 64 0,2 100 75 0,5 100 83 1,0 100 87 125 100 96 2,5 100 98 5,0 100 99 REVENDICATIONS 1. Procédé de dégradation enzymatique d'une matière riche en protéine contenant des lipides, caractérisé par le fait quril consiste à traiter la matière en suspension aqueuse avec des lipases avant de faire agir des enzymes protéolytiques. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il consiste à utiliser des lipases d'origine microbienne, par exemple des genres Candida, Aspergillus, 'Rhizopus, Pseudomonas et Geotrichun. 3. Procédé suivant lune des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il consiste à faire agir les lipases sur la suspension aqueuse de la matière riche en protéine contenant des lipides, dans une gamme de températures dtenvi- ron 20 à 650C,nctamment de 35 à 45 C, et dans une gamme de pH d'environ 3 à 9, notamment de 6,0 à 8,5. 4. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la matière riche en protéine débarrassée des lipides est soumise,en suspension aqueuse, à la dégradation enzymatique avec des enzymes protéolytiques, notamment des protéases alcalines. 5. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la solution contenant la lipase est séparée mécaniquement de la matière riche en protéine après le traitement et,le le cas échéant ,réutilisée pour le traitement de la matière riche en protéine contenant des lipides. 6. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il consiste à conduire simultanément le traitement de la matière riche en protéine et contenant des lipides avec des lipases et des enzymes pro tevolytiques. 7. Procédé suivant ltune quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qutun traitement avec d'autres enzymes tels que des amylases ou des cellulases oules deux est conduit avant, pendant ou après le traitement avec des lipases.