Brevet FR2258448A1 — publié le 19750818

La présente invention concerne un procédé de préparation de composés 7-amino-cephem. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de production microbiologique de composés 7-amino cephem, présentant la formule dans laquelle I représente un atome d'hydrogène, un groupe hydroxyle, acétoxy ou un groupe résiduel nucléophile, à partir des analogues de la céphalosporine. La Demanderesse a découvert que le micro-organisme appartenant au genre Comamonas, souche SY-77-1, séparé d1 échan- tillons de sols, présente une activité qui lui permet de produire des composés 7-amino-cephem à partir d'un composé de formule dans laquelle R représente un groupe -COOH ou -COCOOH, et X la même signification que ci-dessus, par scission d'une liaison amide. Le micro-organisme décrit ci-dessus présente les propriétés taxOnOmiques suivantes A. Morphologie On effectue les observations au microscope optique ou électronique sur un bouillon de culture inclinée gélose à 30 C. 1) Forme et dimension : bâtonnet court, extrémité arrondie, 0,1-0,3 x 0,3-0,5# , 2) Métamorphose : unique ou courte chaîne, pas de capsule, 3) Mobilité s positive, flagellé, 4) Spore : pan de sporulation 5) Teinture de Gram : négative, 6) acido-résistance :negative. B. Conditions de culture sur divers milieux 1) Culture, plaque de gélose (300C, 24 heures) colonie circulaire ; poussée convexe, surface lisse, bord ondulé, blanc à blanc légèrement jaunâtre, légèrement collante, translucide à opaque, pas de dispersion. 2) Culture inclinée de gélose (30 C, 24 heures) : bonne croissance, croissance linéaire, surface lisse, lustrée, bnmide, surface opalescente à blanc faiblement jau nâtre, translucide à opaque, le milieu ne change pas de couleur. 3) Bouillon (300C, 1 à 3 jours : trouble homogène, trace de précipitation, suspension filamenteuse en secouant, pas de pellicule ni d'anneaux. 4) Culture sur bâton de gélatine (300 C, 24 heures) Croissance linéaire le long du bâton en particulier du milieu au fond. 5) Culture inclinée de gélose soPa (300C, 24 heures) Bonne croissance, identique au bouillon de gélose, surface lisse lustrée. 6) Culture inclinée pomme de terre gélose Bonne croissance, colonie à surface blanche, surfa- ce lisse, légèrement collante, translucide à opaque, humide, lustrée, pas de formation de pigment. 7) Lait au tournesol (3000, 25 jours) Presque aucune liquéfaction. 8) Culture inclinée de gélose, bouillon de glucose (300C, 24 heures) Meilleure croissance comparativement au bouillon sur plaque de gélose inclinée, légerement collante. 9) Culture inclinée de gélose au nitrate et glucose (30 G, 1 à 3 jours) Presque aucune croissance. 10) Culture inclinée de gélose à la tyrosine (30 C, 48 heures) Croissance, le milieu vire légèrement au brun. 11) Plaque de gélose avec extrait de levure et nnite (3000, 48 heures) Bonne croissance, blanc à jaune pâle, surface lisse, ide, convexe, milieu sans changement de coloration a 12) Bouillon, plaque de gélose avec addition de 7 de NaCl (30 C, 10 jours) : presque pas de croissance. 13) Plaque de gélose, glycérine-peptone (3000, 3 jours). Bonne croissance, surface lisse, lustrée, convexe, le milieu vire au brun. 14) Plaque de gélose, lait (30 C, 5 jours) s Pas d'hydrolyse de la caséine. 15) Plaque de gélose, taurochiate (300C, 15 jours) Aucune croissance. C. Propriétés physiologiques 1) Réduction des nitrates 2) Dénitrification : 3) Essai au Rouge de méthyle : - (jaune) 4) Réaction de Voges-Proskauer : + 5) Formation d'indol 6) Formation de sulfate acide 7) Hydrolyse de l'amidon 8) Utilisation du citrate 9) Utilisation d'une source d'azote inorganique: pas d'uti lisation de nitrate. 10) Formation de pigment : selon le milieu 11) Uréase 12) Oxydase 13) Catalase 14) Liquéfaction de la gélatine 15) Hydrolyse d'arginine : 16) Oxydation du gluconate : 17) Gamme de croissance croissance : pH 5-12, 5-420C. croissance optimale :pH 7,0-8,5 ; 28-35 C. 18) Aérobie ou anaérobie : aérobie 19) Essai 0-F. : pas de modification par essai du type 0 et du type F 20) Fermentation des hydrates de carbone : Formation d'acide formation de gaz 1-arabino se D-xylose D-glucose D-mannose D-fractose D-galactose Maltose Saccharose Lactose Tréharo se Sorbite Mann ite Inositol Amidon Lorsque la situation taxonomique de la souche du microorganisme SY-77-1 présentant les propriétés mycologiques signalées précédemment ont été examinées en référence au Eanual for the Identification of Medical Bacteria", par Cowan & Steel (Ed. de 1965) et le "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" (70 édition, 1961), en comparant avec la culture type de la souche apparentée, on l'identifie comme étant une souche apparte nant au genre Comanonas. En conséquence, la Demanderesse a compa- ré la souche SY-77-1 avec la culture type obtenue auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC), pour reconnaître que la souche était similaire à Comamonas terrigena, mais en était différente sur le point que la souche SY-77-1 a une forte activi té sur la scission d'une liaison amide du composé (II):: D'après ce qui précède, on peut reconnaitre que la souche SY-77-1 est une souche nouvelle appartenant au genre Comamonas et désignée Comamonas pp SY-?7-1. Cette souche a été déposée sous le numéro "FERM-P 2410" au nkesearch Institute for Microbiological Industry and Technology, Agence of Industrial Science and Technology, au Japono La Demanderesse a aussi découvert que Pseudomonas ovalis ATCC 950 présentait la même activité. En conséquence, la présente invention concerne un procédé de préparation de composés 7-amino-cephem de formule (I) (ci-après désigné sous le nom de composé amino (I)), comprenant la désacylation d'un composé (II) par traitement en présence d'un milieu aqueux avec une culture microbienne ou une de ses préparations, présentant une activité de désacylation du compo sé (II) pour former le composé (I) provenant de la culture de la souche microbienne produisant l'enzyme de désacylation. D'un des objets de la présente invention est constitué par un procédé nouveau de production de composés 7-amino- cephem à partir de composés analogues de la céphalosporine C, par voie microbiologique. Un autre objet de la présente invention est constitué par les intermédiaires importants pour la production de dérivés de céphalosporine pharmac eutiquement précieux. On peut utiliser, lors de la réaction de désacylation selon la présente invention, des micro-organismes appartenant au genre Comamonas ou au genre Pseudomonas, présentant une activité de désacylation pour former le composé (I) à partir du composé (II). Pour pouvoir obtenir l'activité la plus élevée pour former le composé amino (I) à partir du composé (II) (ci-après, on désigne cette activité comme étant 11 activité de N-désacylation, on peut avantageusement appliquer des procédés connus de mutation par traitement des bactéries par exemple le traitement sélectif des souches par l'ultra-violet, les rayons X ou un agent mutagène, et le choix du milieu et de la condition de fermentation Des exemples de micro-organismes qui présentent l'ac- tivité de N-désacylation précédente sont Comamonas sp. SY-77~1 BERM-P 2410 et Pseudomonas ovalis AUCC 950. On peut parvenir à la production du composé amino (I) en utilisant les micro-organismes qui présentent 1 'activité de N-désacylation par culture de ces micro-organismes et traitement du composé (II) avec la culture microbienne ou l'une de ses préparations. On peut avantageusement conduire la culture des microorganismes en condition aérobie, mais de préférence par culture submergée avec aération. Le milieu nutritif peut comporter une source de carbone assimilable, une source d'azote assimilable et des sels. La température de la culture est de préférence de 25 à 370C et la durée de la culture est généralement de 2 à 10 jours et, à l'époque à laquelle l'activité de N-désacylation atteint un maximum, on doit naturellement arrêter la culture. la culture microbienne ainsi obtenue, ou sa préparation, peuvent être utilisées pour la réaction de N-désacylation du composé (II). La préparation de culture microbienne désigne la masse cultivée traitée pour augmenter l'activité de N-désacylation en vue de la production préférée du composé amino (I), et comprend par exemple, en raison d'une propriété endo-enzymatique de l'activité de N-désacylation, des cellules microbiennes lavées, recueillies à partir de 1a masse de culture, un extrait exempt des cellules tel que des cellules broyées ou traitées aux ultra-sons, un lysat de cellules traité par une solution tampon ou du chlorure de cétyl-pyridium, l'enzyme de N-désacylation purifiée ou partiellement purifiée, obtenue à partir d'un extrait exempt de cellules, par des procédés connus comme la précipitation par addition d'un sel, la chromatographie ou analogues, une préparation d'enzyme immobilisée ou une microcapsule contenant des cellules microbiennes ou l'une de ses préparations présentant une activité de N-désacylation. La microcapsule doit avoir de préférence une structure tridimensionnelle (structure de gel) constituée par une paroi de membrane semi-perméable, en un polymère, qui n'inactive pas activité de N-désacylation, recouvrant la substance du coeur de la préparation active de N-désacylation. Des exemples de procédés d'encapsulation sont par exemple le procédé de l'orifice dans lequel on dissout la substance du coeur ou on la disperse dans un solvant miscible dans l'eau, qui dissout le polymère de la paroi formant la membrane semi-perméable, en milieu aqueux (Brevet japonais N 49-25128), un procédé d'éimilsion complexe en véhicule aqueux, procédé selon lequel on dissout le polymère de la paroi dans un solvant non miscible avec liteau, dont le point d'ébullition est inférieur à celui de l'eau et dont la tension de vapeur est supérieure à celle de l'eau, qui 'inactive pas l'activité de N-désacylation après quoi on y disperse une substance de coeur et on fait arriver goutte-à-goutte cette solution dispersée pour la mettre en suspension dans une solution aqueuse contenant un agent tensioactif ou un colloïde protecteur, puis on chasse le solvant pour former une microcapsule (Brevet japonais N 47-43803 ;Brevet japonais N 49-49679) ; la micro-encapsulation par élimination de solvant par une émulsion non solvante, par exemple la dispersion ou la dissolution d'une substance de coeur dans un solvant organique qui contient en dissolution le polymère de paroi, la mise en émulsion de cette solution dans un véhicule qui est médiocrement miscible avec le solvant de la solution du polymère de la paroi, pour préparer une émulsion, l'addition à l'émulsion l'un non-solvant du polymère de la paroi, le non-solvant du polymère de la paroi, le non-solvant étant miscible avec le solvant du polymère de la paroi mais immiscible ou médiocrement miscible avec le véhicule et inactif vis-à-vis de l'activité de N-désacy lation ce qui forme les microcapsules (Brevet français N0 2 166 062) et le procédé de l'émulsion complexe dans un véhicule lipophile, par exemple la dissolution du polymère de la paroi pour former un solvant, ce solvant étant médiocrement miscible avec le véhicule, miscible avec l'eau, dont le point d'ébullition est inférieur à celul de l'eau et qui est inactif vis-à-vis de l'activité de N-désacylation, la dissolution ou la dispersion d'une substance de coeur dans la solution, mise en émulsion par dispersion de cette solution résultante dans un véhicule composé tant de la paraffine liquide ou une huile de silicone et élimi- nation du solvant organique pour former une microcapsule (brevet des Etats-Unis d'Amerique N0 3 714 065). La réaction de N-désacylation du composé (II) est géneralement effectuée en milieu aqueux, de préférence à pH de 6 à 8. En variante, on utilise des cellules microbiennes insolubles dans l'eau ou une de leurs préparations sous la forme d'une suspension, ou sous la forme d'une colonne dans laquelle le composé (II) est W-désacylé lorsque l'on fait passer la solution aqueuse du composé (II) dans cette colonne.La durée de la réaction est généralement de 3 à 30 heures et elle doit s'achever lorsque la production du composé amino (I) a atteint un maximum. La température réaction nelle peut etre de 20 à 45 C, de préférence de 30 à 37 C. La concentration du support dépend de l'activité de N-désacylation et peut être généralement de 0,1 à 5%. Les composés (Il), matières de départ selon la présente invention, peuvent entre préparés conformément à des procédés connus. Par exemple le composé (II) pour lequel R représente un groupe -COOH peut se préparer à partir du composé de formule dans laquelle I a la même signification que ci-dessus, ou l'un de ses sels, par action de D-amino acide oxydase provenant des micro-organismes Trigonopsis variabiris, etc.., en conditions aérobie (brevet britannique N 1 272 769 ; on traite le composé (III) ou l'un de ses sels avec des cellules activées de Trigonopsis variabiris ou Fusarium sp. (brevet japonais N 47-39595 et brevet japonais, demande N 49-117205). Le composé (II) pour lequel R représente un groupe -COCOOH peut se préparer à partir du composé (III) en présence d'une activité de catalane et d'une activité de D-amino acide oxydase. Le substituant X dans la formule (II) représente un atome d'hydrogène, un groupe hydroxyle, un groupe acétoy ou un groupe résiduel nucléophile, ce groupe peut être formé à partir de céphalosporine C par un procédé connu. Par exemple, un composé (III) dont le groupe X représente un atome d'hydrogène se prépare par réduction catalytique en présence de palladium sur charbon (brevet des Etats-Unis d'Amerique N 3 124 576) ; un composé (III) qui présente un groupe hydroxyle pour le groupe X se prépare par action d'une estérase (brevet japonais N 42-7553) ; un composé dont le groupe x représente un groupe résiduel nucléophile se prépare par traitement avec une amine tertiaire hétérocyclique faiblement basique, comme la pyridine (brevet japonais N 38-26?19) ou bien par les autres procédés (voir brevets japonais Nos 39-17926 41-4714, 43-5010, 42-1305, 46-147355 46-13025, 46-15951 et 40-9155). On peut utiliser le composé (II) sous la forme d'un sel hydrosoluble, comme un sel de sodium, de potassium ou d'ammonium. On peut isoler le composé amino (I) ainsi formé et le purifier par des procédés connus, tels que la chromatographie sur colonne, l'échange d'ions, la précipitation et analogues. Les exemples suivants illustrent la présente invention, sans pour autant la limiter. Procédé de dosage du composé amino (I) : On règle une portion aliquot du mélange réactionnel à pH 2,5 avec HCl 1 N, et après avoir lavé cette solution trois fois avec la moitié d'acétate de butyle, on règle la solution à pH 7,5 avec NaoH 1 N. On fait en outre réagir une portion aliquot avec du chlorure de phényl-acétyle et on dose sur Bacillus subtilis PCI 211 pendant 16 heures à 37 C. Chromatographie en couche mince (TIC) : Véhicule : gel de silice pré-enduit. Révélateur I : n-BuOH:acide acétique:eau (3:1:1) II : n-BuOH:acide acétique:pyridineteau (15:3:10:12) III : b-BuOH:acide acétique:formaldehyde:eau (3:1:5:1) -EXEMPLES 1 à 5 On introduit dans un ballon Erlenmeyer de 500 mI, 100 ml d'un milieu aqueux (pH 10,0) constitué par un extrait de viande à 0,5%, 1% de peptone, 0,1% d'extrait de levure, 0,05% d'acide glutatio et 0,5% de NaCl, on stérilise à 120 C pendant 15 minutes, on inocule avec Aomamonas sp. SY-?7-1 FERM-P 2410 et on effectue la culture en secouant par rotation à 300C pendant 8 jours.Après la culture, on centrifuge le bouillon de culture à 12 000 tours/minute pendant 10 minutes en refroidissant, pour recueillir les cellules bactériennes. On met la masse en suspension dans 50 ml d'une solution tampon au phosphate 0,1 mole (pH 7,0). On y ajoute 50 ml d'un tampon au phosphate 0,1 mole (pH 7,0) contenant 3% d'acide 3-acétoxyméthyl-?-(4- carboxybutane-amide)-ceph-3-em-4-carboxylique et on laisse incuber à 37 C pendant 10 heures pour obtenir le composé amino (I). La culture de la bactérie de la même façon est répétée et on laisse inculper chacune des substances suivantes, respectivement à 3% à chaque fois. Acide 3-méthyl-?- (4-c arboxybutane-amide) -c eph-3-en -4-c arboxyl i- que, acide 3-hydroxyméthy1-7-(4-carboxy-butane-amide)-ceph-3-em-4- carboxylique ; 4-carboxylate de N-[7-(4-carboxy-butane-amide)-ceph-3-em-3-ylméthyl]-pyridinium, et acide 7-(4-carboxy-butane-amide)-3-(5-méthyl-1,3,4-thiadiazol2-yl)-thiométhyl-ceph-3-em-4-carboxylique. Les résultats sont présentés au Tableau ci-dessous Composé amino (I) ( - COOL3 f EkeEple I Proportioa de forira tion ffi = Rf stêie solvant I i E 72 0,32 I 2 oe00H3 53 0,15 I 3 ~cE 64 0E33 n 4 ~ 58 0,23 III 5 H-B 50 0,'17 I -S 5 4 I On identifie les composés lino par chromatographie en couche mince (TLC) avec un révélateur à la ninhydrine, l'ul traviolet et dosage biologique. -EXEMPLES 6 à 9 Dans les Exemples 1 à 5, l'acide 3-acétoxyméthyl-7- (4-carboxy-butane-amide)-ceph-3-em-4-carboxylique et les autres sont remplacés par les composés suivants et on obtient les résultats ci-après t acide 3-méthyl-?-( 5-c arboxy-5-oxopentan e-amido ) -ceph-3-em-4- carboxylique, acide 3-acétoxyméthyl-7-(5-carboxy-oxopentane-amido)-ceph-3em-4-carboxylique, acide 3-hydroxyméthyl-7-(5-carboxy-oxo-pentane-amido)-ceph-3em-4-carboxylique, et 4-carboxylate de N-[7-(5-carboxy-5-oxo-pentane-amido)-ceph-3em-3-yl-méthyl]-pyridinium. C1DnrpoBé isino (a P -CX)K) 7 C0tP08e amino (I) (R = -COC30E) Propor- ~ItLC: '" I tion de I ysfe forraai;iosolvant 6 H 65 0,32 I 7 -OOOGH) 50 0,15 I 8 -GH 58 0,34 II 9 ~ O 52 0,23 III l - EXEMPLES 10 a 13 On introduit dans un ballon Erlenmeyer de 500 ral, 100 ml d'un milieu aqueux (pH 7,0) constitué par 0,5% d'extrait de viande, 1% de peptone, 0,1% d'extrait de levure, 0,05% d'acide glutamique et 0,5% de NaCl, on stérilise à 1200C pendant 15 minutes, on inocule avec Pseudomonas ovalis ATCC 950, et on cultive en secouant par rotation à 300C pendant 8 jours. Après la culture, on centrifuge le bouillon de culture à 12 000 tours/ minutes pendant 10 minutes en refroidissant pour recueillir les cellules bactériennes. On met en suspension les cellules cultivées dans 50 ml d'un tampon au phosphate 0,1 mole (pH 7,0). On repère la culture de la même façon et on prépare une suspension de cellules. On laisse incuber les suspensions de cellules à 37 C pendant 10 heures avec chacune des substances (2% dans une solution tampon au phosphate 0,1 mole) indiquées au Tableau cidessous. Les résultats sont indiqués au Tableau. 4-carboxylate de 3-méthyl-7-(4-carboxy-butane-amido)-ceph-3-em, 4-carboxylate de 3-hydroxyméthyl-7-(4-carboxy-butane-amido)ceph-3-em, 4-carboxylate de 3-ac étoxyméthyl-7-(4*carboxybutan e-amido ) ceph-3-em, et 4-carboxylate de N-[7-(4-carboxy-butane-amido)-ceph-3-em-3-ylméthyl](pyridinium. Composé amino (I) emple I 1 emple I Rf ar WLC 10 H 0s33 (système solvant I) il -OH 0,33 ( n 11) 12 -OCOCH3 0,15 ( n * I) 13 - 0,22 " w e' 'n) - EXEMPLE 14 On cultive Comamonas sp. SY-77-1 FERM-P 2410 de la même façon qu'à l'Exemple 4 pour obtenir 6 litres de bouillon -de culture. On recueille les cellules par centrifugation à 12 000 tours/minute, pendant 10 minutes et on lave. On met en suspension les cellules ainsi obtenues dans un tampon au phospha- te 0,1 mole (pH 7,0) pour préparer 300 ml de suspension.On y ajoute 15 ml d'un agent tensio-actif cationique, on agite à la température ambiante pendant 30 minutes, puis on centrifuge à 10 000 tours/minute pendant 10 minutes pour obtenir 288 ml d'une couche qui surnage. On dialyse la couche qui surnage dans une solution tampon au phosphate 0,1 mole (pH 7,0) en utilisant un tube de cellophane à 40C pendant 48 heures. On obtient 300 ml de dialysat une activité de N-désacylation. Le dialysat ainsi obtenu entre dans le cadre de la préparation de la culture microbienne selon la présente invention, zt on peut la préparer, comme préparation de micPo-encapsulation, comme préparation pulvérulente par séchage, lyophilisa'ion ou précipitation par le sulfate d'ammonium. On peut aussi traiter Pseudomonas ovalis de la même façon. - EXEMPLE 15 On dissout 9 g d'acétate de cellulose (sous forme de triacétate) dans 100 ml de chlorure de méthylène, on met en suspension 3 g de cellules de culture de Comamonas sp. SY-77-1 FlXP 2410, obtenue de la meAme façon qu'à l'Exemple 1, dans de l'eau distillée, et on émulsionne de façon dispersée. On agite l'émulsion ainsi obtenue, on disperse dans 800 ml d'une solution aqueuse de gélatine à 2% à la température ambiante et on agite encore jusqu'à évaporation du chlorure de méthylène, pour obtenir la micro-capsule (diamètre 0,1-0,3 mm) contenant Coeato- nas sp. SY-??-1 FERM-P 2410.Cette micro-capsule peut être utilisée pour la production du composé amino (I) ainsi qu'il est donné en exemple ci-dessous. - EXEMPLE 16 On répète l'Exemple 15 à ceci près qu'on utilise 2 g d'acétate de cellulose, 70 mi de chlorure de méthylène et 2 g de Pseudomonas ovalis ATCC 950. On obtient des mlero-capsules contenant la bactérie. - EXEMPLE 17 On répète l'Exemple 15 à ceci près qu'on utilise 20 ml du liquide qui surnage présentant l'activité de N-désacylation, obtenue à l'Exemple 14 au lieu de 3 g de cellules de Comamonas en suspension dans 20 ml d'eau pour obtenir la micro-capsule de même dimension. - EXEMPLE 18 On tasse 21,9 g (poids humide) de micro-capsules obte nues à l'Exemple 15 dans la colonne chemisée (2 x 9,6 cm, V 5 30 ml) et on lave avec un tampon au phosphate 0,1 mole (pH 7,0). On charge avec une vitesse spatiale dtenviron 0,4, une solution de 840 ml d'acide 3-acétoxy-méthyl-7-(4-carboxybutane-amide)-3-cephem-4-carboxylique dan s un tampon au pho spha- te 0,1 mole (9,92 mg/ml). On obtient 865 ml d'éluat contenant le 7-ACA (proportion de formation 84,5%) et on concentre jusqu'à 80 ml après réglage du pH à 3,2. On laisse reposer le concentré pendant une nuit à 40C pour précipiter le 7-ACA. (Rendement 4,6 g, pureté 86,2%). -EXEMPLE 19 On répète l'Exemple 18, à ceci près qu'on remplace les micro-capsules contenant Camamonas sp. SY-??-1 FERM-P 2410 par les micro-capsules contenant Pseudomonas ovalis ATCC 950 obtenues à l'Exemple 16, et 1% de la solin des substances indiquées ci-dessous au lieu du support de l'#Exemple 18, pour obtenir les composés amino (I) ci-après. Substance Rendement en com posé (I) 4-carboxylate de 3-méthyl-7-(4-carboxybutaneamide)-3-cephem 84,2% 4-carboxylate de 3-hydroxyméthyl-7-(4-carboxybutane-amide)-3-cephem 83,1% 4-carboxylate de N-[7-(4-carboxybutane-amide)3-cephem-3-yl-méthyl]-pyridinium 79,2% -EXEMPLE 20 On remplace les microcapsules de l'Exemple 18 contenant Comamonas sp SZ-77-1 FERM-P 2410 par le liquide surnageant qui contient les microcapsules présentant l'activité de N-désacylation obtenue à l'Exemple 17, et on remplace le support par une solution à 1% de 4-carboxylate de 3-acétoxy-méthyl-7-(4-carboxy butane-amide)-3-cephem par le 4-carboxylate de 3-méthyl-7-(5carboxy-5-oxo-pentane-amide)-3-cephem et le 4-carboxylate de 3-hydroxyméthyl-7-(5-carboxy-5-oxo-pentane-amide)-3-cephem, pour obtenir le composé amino (I), avec un rendement de 87,ss, de 78,8% et de 79,5%, respectivement. REVENDICATIONS Procédé de production de composés 7-amino-cephem de formule : dans laquelle I représente un atome d'hydrogène, un groupe hydroxyle, un groupe acétoxy ou un groupe résiduel nucléophile, caractérisé en ce qu'on traite une solution aqueuse de composés de formule dans laquelle R représente un groupe -COOH ou -OOCO, avec une culture microbienne ou une de ses préparations provenant de Comamonas sp. SZ-77-1 FERM-P 2410 ou de Pseudomonas ovalis ATCC 950 en milieu aqueux.