Brevet FR2274230A1 — publié le 19760109

La présente invention se rapporte a un procédé pour traiter des liquides contenant des substances sanguines, et concerne plus particulièrement un procédé pour séparer de ces liquides la globine qu'ils contiennent de la protoporphyrine de fer ou de ses dérivés et/ou produits de clivage. I1 existe déjà des procédés pour préparer, à l'échelle du laboratoire, le composant à base de fer et la globine du sang par voie chromatographique ou par une extraction, en utilisant des solvants tels que le méthyl-éthylcétone, l'acétone ou le diméthylformamide. Le procédé chromatographique ne se prête pas bien aux applications industrielles, tandis que l'extraction par des solvants donne des produits impropres à la consommation. La présente invention rend possible l'utilisation d'un procédé technique relativement simple en utilisant un solvant organique ayant des propriétés de déshydratation et en ajoutant un milieu ayant un effet d'augmentation de la proportion d'ions et/ou de l'action de déshydratation, tel que le chlorure de sodium, le sulfate de sodium ou le sulfate d'ammonium, le benzoate de sodium ou le polyglycol, en ajoutant éventuellement un régulateur de pH, tel qu'un acide inorganique, par exemple l'acide chlorhydrique ou sulfurique, ou un acide organique, tel que l'acide acétique ou citrique. En conséquence, l'invention apporte un procédé pratique et économique pour séparer le composant fer de la globine,de façon à permettre d'utiliser cette dernière dans l'alimentation. Dans une forme d'exécution particulière de l'invention, on sépare d'abord le composant fer qui existe, par exemple, sous la forme d'un agrégat,dans une solution concentrée ou qui est adsorbée sur une matière protéinique, de préférence par centrifugation. L'agglomération peut être effectuée, par exemple, par une addition de chlorure de sodium. De la fraction surnageante ainsi obtenue, on sépare la globine en la précipitant par une addition d'une substance augmentant la proportion d'ions et/ou une substance déshydratante, tandis que le composant fer est retenu dans la phase liquide d'un fluide et/ou sous une forme finement dispersée. Les conditions créées par la forte teneur en solvant, par exemple en éthanol, et la faible teneur en eau, jointe à une certaine concentration d'ions et à un pH relativement faible, conviennent évidemment pour retenir dans le liquide, sous une forme finement divisée et sous une forme fluide, le composant fer et les éventuels dérivés et produits de décomposition de celui-ci, tandis que la globine est séparée par la centrifugation. Les exemples qui suivent, qui n'ont bien entendu aucun caractère limitatif, feront mieux comprendre les particularités de l'invention. EXEMPLE 1 A 5g d'une solution d'hémoglobine ayant une teneur en ma trière sèche de 15% et contenant approximativement 33% d'éthanol, on ajoute goutte à goutte, à -80C et en agitant, un mélange refroidi de 1,1 ml d'acide chlorhydrique à 1 M et 5 ml d'eau. Après l'addition, la température a été -70C et le pH 2,5. On ajoute ensuite, goutte à goutte, en refroidissant à -100C, 80 ml d'éthanol à 94%. On précipite la globine par une addition de 0,3 ml de sulfate d'ammonium dans une solution aqueuse à 20%, et on la sépare par une centrifugation à 8000 g pendant 10 minutes. La surface du liquide a été brun vif, la pâte étant grise. On a lavé cette pâte dans de l'éthanol à 85%, à une température de -100C et à un pH de 3,1, puis on l'a centrifugée pour obtenir approximativement 2,4 g d'une pâte ayant une teneur en ma tières sèches de 23%. EXEMPLE 2 A 36 ml d'une solution d'éthanol à 94%, de 6 ml d'eau et de 0,55 ml d'acide chlorhydrique 1 M, on ajoute goutte à goutte, tout en remuant et en refroidissant, 2,5 g-d'une solution d'hémoglobine (la même que dans l'exemple 1). Après l'addition, la température a été -120C et le pH 3. On ajoute ensuite à ce mélange 45 ml d'éthanol à 94%, puis on le centrifuge à 8000 g pendant 10 minutes, ce qui permet d'obtenir moins de 0,1 g de pâte. On précipite la globine par une addition de 0,4 ml d'une solution à 20% de sulfate d'ammonium. On règle le pH à 3 avec de l'acide chlorhydrique. On procède à une centrifugation du précipite, de la même manière que dans l'exemple 1, ce qui permet d'obtenir 0,45 g d'une pâte ayant une teneur en matières sèches de 36%. De la fraction surnageante, on forme un nouveau précipité par une addition de 0,4 ml de sulfate d'ammonium, et on obtient ainsi 0,40 g d'une pâte ayant une teneur en matières sèches de 42%. Les pates obtenues sont gris clair. La fraction surnageante a une couleur marron vif et ne donne pas de précipité avec l'acide trichloracétique. EXEMPLE 3 A une solution de 20 ml d'éthanol à 94% et de 1,1 ml d'acide chlorhydrique à 1 X, on ajoute goutte à goutte, en agitant et en refroidissant, à une température de -15 0C, 5 g d'une solution d'hémoglobine (la même que dans l'exemple 1). Après l'addition, la température est -150C et le pH 2,9. On centrifuge ce mélange à 27000 g pendant 20 minutes, ce qui permet d'obtenir 0,9 g d'une pâte noire contenant 8,3% de matière sèche. A la fraction surnageante, qui a une couleur brune vive, on incorpore,en agitant et en refroidissant, 50 ml d'éthanol à 94%, à une température de -150C, puis on la précipite par une addition de 10 ml d'eau et de 1,2 ml de sulfate d'ammonium à 20%. On centrifuge le précipité résultant à 8000 g pendant 10 minutes, et on obtient ainsi une pâte qu'on dilue dans une solution à 94% d'éthanol, à une température de -150C, avant de la centrifuger comme précédemment. On obtient ainsi 1,6 g d'une pate ayant une teneur en matière sèche de 37,6%. Quand elle est sèche, cette pâte est gris clair. La fraction surnageante résultant de la précipitation ne donne aucun précipité avec l'acide trichloracétique. EXEMPLE 4 A 40 ml d'une solution à 94% d'éthanol et de 1,1 ml d'acide chlorhydrique à 1 M, on ajoute goutte à goutte, à une température de -150C, en agitant et en refroidissant, 5 g d'une solution d'hémoglobine (la même que dans l'exemple 1). Après l'addition, la température est -150C et le pH 2,9. A ce mélange, on ajoute goutte à goutte, 5 ml d'une solution à 20% de chlorure de sodium, puis on centrifuge le mélange à 27000 g pendant 20 minutes, ce qui permet d'obtenir 1,4 g d'une pâte noire ayant une teneur en matières sèches de 11%. A la fraction surnageante, on ajoute 12 ml d'eau et 1 ml d'une solution à 20% de sulfate d'ammonium, après quoi on procède à une centrifugation à 8000 g pendant 10 minutes. On obtient ainsi 3,8 g d'une pate grise ayant une teneur en matières sèches de 14,6%. EXEMPLE 5 Dans cet exemple, on procède à une extraction pour séparer le composant contenant du fer du précipité de globine. A 5g d'une solution d'hémoglobine (la même que dans l'exemple 1), on ajoute goutte à goutte, à une température de -80C, en agitant et en refroidissant, dn mélange de 11 ml d'eau, de 4 ml d'éthanol et de 1 ml d'acide chlorhydrique à 1 M à -60C. Après l'addition, la température est -40C et le pH 2,9. On règle ce pH à 3,9 avec 7 ml d'une solution à 0,1 M d'hydroxyde de sodium. On procède à la précipitation par une addition de 0,2 g de sulfate d'ammonium, et on obtient ainsi une pâte brun vif par centrifugation à environ 300 g. On dilue la pâte fluide à plusieurs reprises dans de petites quantités d'éthanol à 94%,avec un pH de' 3 et à une température de -120C, puis on la centrifuge.On obtient ainsi 3,05 g de pâte grise ayant une teneur en matières sèches de 18,8%, EXEMPLE 6 On précipite 5 g de solution d'hémoglobine (la même que dans l'exemple 1) par une addition de 10 ml d'éthanol à 94%, on agitant et en remuant à une température de -60C. On centrifuge le précipité à 2000 g pendant 5 minutes, ce qui permet d'obtenir 6g de pâte rouge. Au fond du tube de la centrifugeuse, se forme un petit dépôt de pate noire. On incorpore la pate rouge à une solution de 70 ml d'éthanol à 94% et de 1,1 ml d'acide chlorhydrique à 1 M, à une tempéra- ture de -120C, en agitant et en refroidissant. Après l'addition, le pH est 2,9 et la température -120C. On centrifuge ce mélange à 27000 g pendant 10 minutes, ce qui permet d'obtenir une petite quantité de pâte noire. A la fraction surnageante, on ajoute 2 ml d'une solution à 40% de sulfate d'ammonium et 10 ml d'eau. La température a été -80C et le pH 3,4. On obtient un précipite gris qu'on centrifuge à 8000 g pendant 10 minutes, ce qui donne 1,5 g d'une pate grise ayant une teneur en matières sèches -de 93,3%. EXEMPLE 7 A une solution de 20 ml d'éthanol à 94% et de 1,1 ml d'acide chlorhydrique à 1 M, on ajoute goutte à goutte, à une température de -120C, en agitant et en refroidissant, 5g d'une solution d'hémoglobine (la même que dans l'exemple 1). Après l'addi- tion, le pH es2,9 et la température -120C. On centrifuge ce mélange, qui a une couleur brune foncée, à 27000 g pendant 10 minutes, ce qui donne 2,2 g d'une pâte noire ayant une teneur en matière sèche de 2,7%, et une fraction liquide surnageante brun clair qui, par la suite, prend une consistance gélatineuse. A la fraction surnageante, on ajoute goutte à goutte, en remuant et en refroidissant, 70 ml d'éthanol froid à 94%, puis 0,8 ml d'une solution à 40% de sulfate d'ammonium et 8 ml d'eau. Après l'addition, la température est -60C. On soumet le précipité à une centrifugation à 8000 g pendant 10 minutes, pour obtenir 1,7 g de pâte blanche ayant une teneur en matières sèches de 36%. REVENDICATIONS 1. Procédé pour séparer d'un liquide contenant des substances sanguines, la protoporphyrine de fer et ses dérivés ou produits de décomposition, c' est-à-dire ce qu'on appelle le "composant fer", de la globine, caractérisé en ce qu'on refroidit ledit liquide, de préférence à une température entre OOC et -2O0C on règle le pH du liquide au-dessous de 4,5, de préférence entre 2,5 et 4,5, puis on y ajoute un solvant organique ayant des pro priétés déshydratantes, par exemple de l'éthanol ou un mélange d'éthanol et de glycol ou de glycérol, dans une proportion correspondant au moins à 40% en volume, en se basant sur le volume total du liquide, de préférence, au moins 75% en volume, en maintenant ainsi la température indiquée ci-dessus, en ce qu'on sépare ledit composant fer dudit liquide, de préférence par une addition de sels, tels que le chlorure de potassium ou le citrate de sodium, après quoi on précipite la globine du liquide. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on ajoute le solvant organique en deux étapes, une petité quantité de solvant étant ajoutée dans la première étape, de préférence, par une addition de chlorure de sodium ou d'une autre substance qui favorise l'agglomération et/ou l'absorption des particules du composant fer sur la matière protéinique, de préférence dénaturée, après quoi on sépare l'agglomérat ainsi obtenu, par exemple par centrifugation, en ajoutant ensuite le solvant organique dans la seconde étape afin de séparer la globine de la partie restante du composant fer, lequel est alors sous une forme dissoute et/ou finement dispersée.