Brevet FR2257089A1 — publié le 19750801

La présente invention concerne un procédé et un dispositif pour détecter l'apparition d'une réaction immunologique entre une particule biologique et son anticorps marqué par un élément radioactif et, en particulier, un procédé et un dispositif pour la dé- tection de la réaction immunologique dans un modèle particulier sur un substrat approprié. Les réactions immunologiques sont des réactions biochimiques hautement spécifiques, dans lesquelles une première protéine, connue comme étant l'antigène , se combine (se lie) avec une seconde protéine spécifique de l'antigène et connue comme étant l'anticorps, pour former une protéine complexée immunologiquement. Les réactions immunologiques se déroulant dans un système biologique, par exemple un animal ou un être humain, sont d'une importance vitale dans la lutte contre la maladie. Lorsqu'une protéine étrangère, c'est-àdire l'antigène, pénètre dans un système biologique, celui-ci produit l'anticorps spécifique de l'antigène dans un processus non encore complètement élucidé.Les molécules d'anticorps possèdent des centres due combinaison ou de liaison chimique, qui sont les compléments de ceux de la molécule d'-antigène, de sorte que l'antigène et l'anticorps se combinent ou se lient chimiquement pour former une protéine complexée immunologiquement. La plupart des antigènes sont des protéines ou contiennent des protéines en tant que constituants essentiels, alors que tous les anticorps sont des protéines. Les protéines sont des grosses molécules de masse- moléculaire élevée,c'est-à-dire ce sont des polymères constitués de chaines avec un nombre variable d'aminoacides. On sait qu'une protéine quelconque adhère à un substrat en une couche monomoléculaire uniquement, et qu'aucune autre protéine choisie au hasard n'adhère à cette couche de protéine.Par ailleurs, la protéine réagissant spécifiquementà la première protéine adsorbée sur le substrat s'y lie immunologiquement On a -exploité, cette découverte pour réaliser un dispositif de diagnostic médical dans lequel une lame, sur laquelle une protéine est adsorbée en une couche monomoléculaire, est utilisée pour tester des solutions suspectes afin d'y détecter la protéine réagissant spécifiquement à la première protéine adsorbée. Si la protéine réagissant spécifiquement est présente dans la solution, la lame, après avoir été exposée à la solution, a à sa surface une couche de protéine bimoléculaire. Si la protéine réagissant spécifiquement est absente de la solution, la lame, après avoir été exposée àla solution, n'a à sa surface que la couche de protéine monomoléculaire initiale.On connaît des moyens optiques, électriques et chimiques pour faire la distinction entre des couches de protéines bimoléculaires et monomoléculaires ; ces procédés présentent dif férents degrés de sensibilité et d'économie. Du fait que les anticorps sont produits par des systèmes biologiques en réponse à des invasions de ces systèmes par des protéines étrangères, la détection des anticorps dans un système biologique a une valeur diagnostique médicale en ce qu'elle détermine les antigènes auxquels le système a été exposé. Un exemple typique de détection diagnostique d'anticorps est la détection des anticorps de la syphilis ou de la blennorragie dans le sérum sanguin. Inversement, la détection de certains antigènes dans un système biologique a également une valeur en tant que diagnostic médical ; comme exemples de détection diagnostique d'antigènes, on peut citer la détection de molécules de protéine HCG dans l'urine en tant que test de la grossesse, et la détection de molécules d'antigène associé à l'hépatite (HAA) dans le sang de donneurs de sang possibles. Afin de réaliser ces tests diagnostiques, il faut obtenir la protéine appropriée de la paire réagissant immunologiquement. La seule source connue de protéine d'anticorps est un système biologique vivant. Plus spécialement, seuls les vertébrés sont connus actuellement pour avoir des réactions immunologiques à l'introauc- tion d'une protéine étrangère. Par exemple, de nombreux anticorps sont décelés dans le sérum sanguin d'animaux ou d'êtres humains ayant été exposés aux antigènes correspondants. De nombreux antigènes, toutefois, peuvent être produits de façon déterminée en cultures de laboratoire. Mais certains antigènes, par exemple les antigènes associés à l'hépatite, ne peuvent être obtenus actuellement, comme les anticorps, qu'à partir de systèmes biologiques vivants supérieurs. En immunologie, c'est un fait connu que des molécules d'anticorps fonctionnent comme des antigènes lorsqu'elles sont introduites dans le système d'un vertébré pour lequel ce sont des pro téinfs étrangères. C'est'pourquoi, des anticorps réagissant speci- fiquement à un anticorps donné peuvent se former facilement dans un tel système de vertébré. Finalement, on sait également, en immunologie, qu'une première particule biologique, un antigène (ou un anticorps) peut être fixée sur une surface solide, puis être exposée à une solution supposée contenir une seconde particule biologique, à l'égard de laquelle la première psrikulz- est spécifique, le système étant finalement exposé à un anticorps- anti-seconde particule, et marqué par un élément radioactif. La technique ci-dessus est utilisée actuellement pour la détection de l'hépatite ; on recouvre tout d'abord la surface intérieure du fond d'un premier tube à essai par des anticorps anti-HAA, on ajoute ensuite un échantillon de sang que l'on soupçonne contenir HAA, et on ajoute, finalement, un anticorps marqué anti-HAA.Un compteur de radiations est ensuite utilisé pour tester la surface totale du premier tube à essai pour y déceler la radioactivité, On sait que dans ces tests il se produit généralement une certaine adhérence non-spécifique de particules biologiques, on obtient donc la valeur de l'adherence non-spécifique (impulsions de fond) en répétant le test dans plusieurs tubes à essai témoins, c'-est-à-dire avecun échantillon de sang que l'on sait ne pas contenir HAA. La différence entre les nombres d'impulsions du premier tube à essai et la moyenne des tubes à essais témoins est alors proportionnelle à la concentration de HAA dans l'échantillon de sang suspect.Toutefois, les impulsions de fond représentent généralement 25 * des impulsions "virus présent" et ainsi les résultats du test peuvent souvent conduire à une confu sion et le test n'est pas très sensible. Un autre facteur contribuant à réduire la sensibilité du test utilisé actuellement est dû aux caractéristiques généralement différentes des tubes à essais, ce qui résulte du lavage de ces tubes. Le processus de lavage effectué en particulier après l'addition de l'échantillon de sang n'est en général pas identique pour les divers tubes à essais, et il reste dans les tubes une adhérence spécifique de différents degrés, ce qui modifie le nombre d'impulsions de fond. Ainsi, le test de radioimmunodosage utilisé actuellement n'est pas unifor mément satisfaisant et présente l'inconvénient d'une faible sensiblité. La présente invention a donc pour but-de proposer un procédé et un dispositif améliorés pour les tests de radioimmunodosage pour la détection de particules biologiques immunologiquement réactives. L'invention a également pour but d'assurer au test de radioimmunodosage une meilleure sensibilité en comparaison des tests de radioimmunodosage classiques. L'invention a encore pour but d'assurer au test de radioimmunodosage un nombre réduit d'impulsions de fond. L'invention a aussi pour but de fournir un procédé et un dispositif pour le test de radioimmunodosage plus simples et plus économiques que les tests de radioimmunodosage classiques. L'invention a enfin pour but d'assurer la réalisation du test de radioimmunodosage sur une lame de diagnostic immunologique. En résumé, l'invention concerne un procédé et un dispositif pour la détection de particules biologiques immunologiquement réactives, telles que virus, antigènes, anticorps, bactéries et autres cellules, par la détection sur un substrat de la présence d'une réaction immunologique entre la particule devant être détecté-e et son anticorps marqué par un élément radioactif. Une première particule biologique immunologiquement réactive est adsorbée sur la surface du substrat en une couche monomoléculaire d'un modèle particulier. Le substrat avec la première particule à sa surface est ensuite exposé à une-solution supposée contenir les (secondes) particules à détecter, et qui sont spécifiques des premières particules.Finalement, le substrat recouvert est exposé à un anticorps marqué anti-seconde particule et, dans une réalisation de l'invention d'un test direct, la radioactivité de la surface du substrat est contrôlée en recherchant le niveau relàtivement élevé des radiations émises par la couche trimoléculaire qui est présente si la solution contiént les secondes particules. Dans une-autre réalisation de l'invention (test indirect ou d'inhibition), la première particule biologique est une forme purifiée de la particule devant être détectée, et les anticorps anti-première particule sont mélangés dans la seconde solution devant être testée pour la seconde particule, qui est de même nature que la première particule.La phase finale consiste à exposer le substrat recouvert a uretroi- sième particule marquée, cette particule étant en général un anticorps anticorps contenus dans la seconde solution. Les tests direct et d'inhibition donnent pour la radioactivité des résultats inverses dans le test direct, un nombre d'impulsions supérieur aux impulsions de fond indique la présence de la particule que l'on supposait contenue dans la solution testée, et la présence uniquement des impulsions de fond indique l'absence d'une telle particule, alors que, inversement, dans le test d'inhibition, un nombre d'impulsions plus élevé indique l'absence de la particule.L'adsorption des premières particules biologiques en un modèle particulier sur un substrat assure une sensibilité nettement améliorée par rapport au procédé classique, dans lequel toute la surface d'un tube à essai est contrôlée quant aux rayonnements émis et est soumise de ce fait à un bruit de fond considérable qui fausse les résultats. En comparaison du test de radioimmunodosage traditionnel, le procédé et le dispositif de détection selon l'invention sont beaucoup plus économiques à la fois en ce qui concerne le temps et le prix, étant donné qu'ils ne nécessitent qu'une seule lame par test. La suite de la description se réfère aux figures annexées représentant respectivement Figure 1 - une vue de dessus et une coupe en élévation d'un substrat après qu'une première particule biologique ait été adsorbée à sa surface en une couche monomoléculaire particulière J Figure 2 - une vue de dessus et une coupe en élévation du substrat après qu'il ait été exposé à une solution supposée contenir la seconde particule biologique ; et Figure 3 - une vue de dessus et une coupe en élévation du substrat après qu'il ait été exposé à l'anticorps marqué antiseconde particule, et le modèle étant testé quant à sa radioacti vité. La vue de dessus de la figure l,a et la coupe en élévation de la figure l,b représentent un substrat 10 ayant une surface pratiquement plane et fabriqué en un matériau adéquat, qui peut être du métal, du verre, du plastique ou un matériau similaire et, de préférence, sous la forme d'une lame de métal ou de verre métallisé. Après le choix d'un substrat approprié convenant au test immunologique particulier à effectuer, l'étape suivante dans le procédé de radioimmunodosage pour la détection immunologique en surface de particules biologiques immunologiquement réactives consiste à déposer une première particule biologique immunologiquement réactive sur la surface supérieure du substrat 10, en un modèle particulier. La première-particule biologique est choisie en fonction de sa spécificité à lvégard de la particule biologique particulière étudiée. Suivant la nature de cette particule particulière, la première particule biologique peut être produite en cultures de laboratoire ou obtenue à partir de systèmes biologiques vivants supérieurs. Un modèle commode de la première particule biologique. sur le substrat 10 est la forme généralement circulaire obtenue en déposant à la surface du substrat 10 une seule goutte d'une première solution contenant la première particule biologique. La solution peut être une solution saline d'eau ou d'un autre liquide convenant aux premières particules particulières, et ne réagissant pas avec ces dernières qui sont de préférence sous une forme hautement purifiée. La goutte de la première solution est maintenue à la surface du substrat pendant un temps suffisant pour que les premières particules biologiques soient adsorbées a la surface du substrat 10 en une couche monomoléculaire pratiquement complète, dans la forme circulaire particulière de la goutte. Le temps nécessaire pour la formation de la couche monomoléculaire sur le substrat 10 est inversement proportionnel à la concentration des premières particules dans la solution.Un modèle circulaire typique de la couche monomoléculaire 11 est représenté sur la figure l,a et en image très grossie sur la figure I,b. Le reste de la surface du substrat 10 reste propre après que la couche monomoléculaire de forme circulaire 11 se soit formée. La taille de la couche monomoléculaire 11 est de préférence aussi petite que possible, et elle est généralement de l'ordre d'un millimètre carré à un centimètre carré, afin d'économiser la quantité de substance biologique utilisée dans les trois couches monomoléculaires, conformément à-la méthode décrite plus loin. L'utilisation d'un petit modèle pour la couche monomoléculaire 11 découle de la considération que le processus d'obtention des premières (et troisièmes) particules biologiques peut être long et couteux, et il est donc très souhaitable de les employer économiquement. Suivant la solution des premières particules biologiques, un lavage de la surface du substrat 10, en particulier dans la zone de la couche monomo séculaire 11, peut être utilisé après la formation de la couche monomoléculaire particulière sur la surface du substrat. Après la formation de la couche monomoléculaire 11 sur le substrat 10, la surface du substrat est séchée, de préférence en plaçant le substrat dans un courant d'air à la température ambiante, afin d'accélérer le séchage. Le substrat 10, recouvert de la couche monomoméculaire, est ensuite exposé à une seconde solution supposee contenir des particules immunologiquement réactives du second type, qui constituent l'objet du test particulier réalisé. L'exposition se fait généralement en immergeant le substrat recouvert dans la seconde solution, et la durée de l'immersion est de nouveau inversement proportionnelle à la concentration des secondes particules biologiques dans la deuxième solution. Etant donné que la concentration des secondes particules est généralement bien inférieure à celle des premières particules dans la première solution1 la phase de l'immersion dans la seconde solution est généralement beaucoup plus longue que le temps nécessaire pour la formation de la première couche monomolêculaire 11.Les premières particules biologiques sont spécifiques à l'égard des secondes particules, de sorte qu'en présence de ces dernières dans la deuxième solution, il se-forme sur la-première couche monomoléculaire 11, fixée sur le substrat 10, une autre couche monomoléculaire 12a pratiquement complète, comme résultat de la réaction immunologique dans laquelle des secondes particules se lient aux premières particules. Etant donné que tout le dessus du substrat 10 est exposé à la deuxième solution, la deuxième couche monomoleulaire se formesur le dessus de cette surface et s'étend sur la zone recouverte par le modèle ; la couche s'étendant sur la zone non recouverte par le modèle est designée par 12 surlafigure 2,B.La couche monomoléculaire 12 en contact direct avec la surface du substrat 10 résulte de l'adhérence non-spécifique, aléatoire, à cette surface, d'autres protéines (ctest-a-dìre non-spécifiques) présentes dans la deuxième solution, alors que la portion de la deuxième couche monomoléculaire, qui adhère à la première couche monomoléculaire 11, et désignée par 12a, forme une couche bimoléculaire avec la couche 11, ainsi que cela est illustré sur la figure 2,b. L'adhérence aléatoire, non-spécifique, illustrée plus clairement par les points distribués au hasard sur4 la figure 2,a, est un phénomène indésirable, mais inévitable qui, après une étape ulté rieure d'exposition du substrat à des particules biologiques mar queues, provoque-des impulsions de fond indésirables. Toutefois, ainsi que cela est illustré sur la figure 2,a, il faut remarquer que les molécules de protéine fixées à la surface du substrat 10 à la suite de l'adhèrence non-spécifique, sont en bien plus petit nombre et plus largement espacées que les molécules des secondes particules formant la couche monomoléculaire 12a, pratiquement complète. Après avoir exposé suffisamment le substrat IO aux secondes particules biologiques, on le retire de la deuxieme solution supposée contenir ces particules et on le lave avec une solution appropriée qui, dans de nombreux cas, peut être de l'eau ou une solution saline aqueuse, afin d'éliminer une grande partie des particules non-spécifiques qui se sont fixées sur le substrat. Le substrat est ensuite exposé à une troisième particule biologique qui est marquée par un élément radioactif et qui est, en géneral, un anticorps anti-seconde particule biologique.En tout cas, la troisième particule biologique marquée est spécifique de la seconde particule biologique, de sorte que la présence de cette dernière sur le substrat 10 provoque la complexation entre les troisièmes et secondes particules et la formation d'une troisième couche monomoléculaire 13a sur le substrat 10, suivant le-modèle particulier de la couche monomoléculaire 11, comme illustré sur la figure 3 et en particulier sur la figure 3,b . L'exposition du substrat 10 aux troisièmes particules biologiques peut se faire par immersion dans une troisième solution contenant ces particules, ou en le recouvrant de là troisième solution si la concentration est suffisamment élevée.De nouveau, la durée d'exposition du substrat à la troisième solution, afin d'obtenir une couche 13a pratiquement c-omplète, est en premier lieu fonction de la concentration de ces particules dans la troisième solution. La concentration des troisièmes particules peut de nouveau être contrôlée, comme dans le cas des premieres particules, étant donné que ces particules sont produites en cultures de laboratoire ou dans des systèmes biologiques vivants supérieurs et, ainsi, la concentration est généralement beaucoup plus élevée que celle des secondes particules dans la deuxième solution, de sorte que la durée d'exposition aux. troisièmes particules est généralement beaucoup plus courte que l'immersion dans la deuxième solution.Certaines des particules non-spécifiques, provenant de la-deuxième solution-, et qui restent fixées au substrat 10, se complexent également avec les troisièmes particules marquées, ainsi que cela est illustré sur les figures 3,a et 3,b par les petits cercles 13 dispersés au hasard et très espacés ; ces troisièmes particules marquées donnent les impulsions de fond lors de la détermination subséquente des rayonnement émis Après la formation sur le substrat 10 du modèle sou haité de couche trimoléculaire, constituée des couches monomoléculaires 11, 12a et 13a (en admettant que la deuxième.solution contenait les secondes particules immunologiquement réactives), le substrat est retiré de la source des troisièmes particules biologiques marquées et un compteur de radiations approprié 14 est placé tout près de la surface recouverte du substrat 10, dont la radioactivité est contrôlée. La phase de contrôle implique la recherche à la surface du substrat 10 du niveau relativement élevé de rayonnements émis par la couche trimoléculaire si les secondes particules sont présentes dans la deuxième solution.Au cours de ce processus de recherche, on mesure le niveau relativement bas de rayonnements correspondant aux impulsions de fond, et la présence de la couche trimoléculaire est facilement décelable du fait de l'augmentation brusque du niveau de rayonnements émis associée à la présence de cette couche. L'ouverture du compteur est réglée de telle façon qu'il réagisse uniquement à une surface correspondant approximativement à celle de couche trimoléculaire. Le réglage de l'ouverture peut se faire, par exemple, en utilisant un écran de plomb 15 à l'entrée du compteur 14 et cet écran a une ouverture correspondant à celle souhaitée pour le compteur.Dans le cas de troisièmes particules biologiques marquées émettant essentiellement des rayons gamma, le compteur de radiations 14 peut être un compteur classique de rayons gamma, comprenant un tube avec un cristal à scintillation 14a à son extrémité ouverte et une cathode photo-électrique 14b à l'extrémité de sortie. Les connexions de tension de polarisation dans le compteur 14 ne sont pas représentées pour des raisons de simplification. Le cristal à scintillation 14a peut être de l'iodure de sodium, par exemple ; il réagit aux rayons gamma qui viennent le frapper et émet des photons lumineux qui sont détectés par la cathode photo-électrique 14b et sont transformés en impulsions de tension correspondant-au nombre de coups détectés. La sortie de la cathode photo-électrique 14b est reliée à un amplificateur électroniqueconvenabe pour amplifier les impulsions de tension, et la sortie de l'amplificateur est injectée à l'entrée du dispositif de lecture en temps réel 20, qui peut fournir un affichage visuel (oscilloscope), ou un son (haut-parleur), ou bien ce peut être un dispositif de mémori,sation, tel qu'une bande magnétique, permettant une lecture ultérieure. Dans le cas où le marquage radioactif est tel que les troisièmes particules biologiques émettent des rayons bêta, le compteur 14 peut être un compteur classique de rayons bêta comprenant un tube scellé rempli de gaz et contenant une électrode reliée à une source de tension relativement élevée, de sorte que le gaz est ionisé par les rayons bêta et chaque ionisation est détectée par l'amplificateur électronique et l'appareil d'enregistrement. Ou encore, les rayonnements émis peuvent être détectés par la technique autoradiographique, dans laquelle une pellicule photographique spéciale, sensible aux rayons gamma, est placée directement sur la surface du substrat recouvert 10. La présence de la couche trimoléculaire est facilement décelable sur une telle pellicule, sous forme d'un niveau d'exposition bien plus élevé que le niveau d'exposition du fond. Comme exemple spécifique de l'application de l'invention on examinera en premier lieu le test direct pour l'hépatite. Dans ce test, la première particule biologique est l'anticorps anti-HAA, qui est généralement dans une solution d'eau salée ou de sérum inactif. La goutte de la première solution (et toutes les gouttes supplémentaires qui peuvent être nécessaires suivant la concentration de l'anticorps) est maintenue à la surface de la lame de diagnostic (substrat 10) pendant environ une heure pour une concentra 3 tion de 10 microgrammes/cm3 de solution, et pendant dix minutes 3 pour une concentration de 100 microgrammes/cm3, afin que se déve- loppe la couche monomoléculaire 11-, complète ou pratiquement complète.La seconde particule biologique est l'antigène associé à l'hépatite (HAA) contenu dans un échantillon de sérum sanguin provenant d'un malade que l'on pense être atteint d'hépatite. Cette 3 concentration peut être de l'ordre de 1 nanogramme/cm3 de sérum, si le malade est réellement atteint d'hépatite, et la lame reste immergée dans cet échantillon de sérum sanguin pendant 24 heures environ. La troisième particule biologique est un anticorps marqué anti-HAA, qui peut être le même anticorps que la première particule biologique et a été obtenu par le même procédé ou un procédé différent. L'élément de marquage radioactif est spécifiquement un isotope d'iode.De façon spécifique, pour-obtenir l'anticorps anti-HAA, on Injecte HAA à une chèvre, un lapin ou un autre animal approprié, on laisse s'écouler une période d'incubation convenable, par exemple deux semaines, puis on soutire le sang contenant l'anticorps spécifique et on sépare l'anticorps des autres protéines du sang. Le temps d'exposition de la lame à l'anticorps marqué est 3 d'environ une heure pour une concentration de 10 microgrammes/cm3 d'eau salée ou d'un autre sérum inactif, et de 10 minutes pour une 3 concentration de 100 microgrammes/cm3.La lame de diagnostic est ensuite testée quant à sa radioactivité, et la détection d'une petite région ayant un niveau de rayonnements émis considerablement plus élevé que les impulsions de fond-présentes sur le reste de la surface de la lame indique que le malade est atteint d'hépatite. L'absence de région avec un nombre d'impulsions plus élevé indique l'absence de HAA dans l'échantillon de sérum sanguin. Dans un test indirect ou d'inhibition pour l'hepatite, la première particule biologique est l'~-antígbne associéà l'hépatite, qui forme la couche monomoléculaire particulière 11 sur le substrat 10, la seconde particule biologique est l'anticorps anti-HAA, et la troisième particule biologique est un anticorps marqué anti anticorps-HAA. Ce dernier est obtenu en général chez les animaux, comme décrit plus haut, deux semaines environ après leur avoir injecté les anticorps purs provenant de sérum humain.Dans le test d'inhibition, l'échantillon de sang devant être testé pour l'hepa- tite est mélangé avec les anticorps anti-EAA, de sorte qu'une com plexation se produit entre tout HAA présent dans l'échantillon de sang et les anticorps ajoutés dans la seconde phase et silà un tel mélange, on expose ensuite le substrat recouvert de la couche monomoléculaire, l'effet est inverse à celui obtenu dans le test direct, c'est-à-dire que la présence de HAA dans le sérum sanguin ne provoque pas la formation d'une seconde couche monomoléculaire 12a. Dans le cas d'test direct pour la syphilis ou la blennorragie, le but est de rechercher les anticorps spécifiques de ces maladies chez le patient examiné. Dans le test de la syphilis, la première particule biologique est le site antigénique provenant des spirochètes de la syphilis (par exemple, antigène de Reiter), qui fonctionne comme un antigène pour former la couche monomoléculaire particulière 11 sur le substrat 10, la seconde particule biologique est l'anticorps anti-syphilis, qui peut être présent dans l'échantillon de sérum sanguin prélevé chez le malade, et la troisième particule biologique est l'anticorps marque anti-anticorps de la syphilis qui de nouveau peut être obtenu chez un animal approprié. D'après- la description qui précede, on peut constater que l'invention fournit une nouvelle méthode et un nouveau dispositif pour la détection immunologique en surface de particules biologiques par radioimmunodosage, dans lequel, lorsque la surface du substrat est testée pour la radioactivité, il s'agit de rechercher un modèle particulier, plutôt que de déterminer la somme de la radioactivité pour la surface entière, obtenant ainsi un test beaucoup plus sensible grâce au contraste considérable dans les niveaux de rayonnements émis lorsque le modèle particulier est présent, en comparaison des rayonnements de fond.Le test immunologique peut être réalisé pratiquement avec n'importe quelle protéine susceptible de se complexer immunologiquement avec une autre protéine et il englobe donc les antigènes, les anticorps, les virus, les bactéries, les hormones, les enzymes et d'autres cellules qui peuvent être facilement cultivées ou isolées et recueillies. Etant donné que le test peut être réalisé sur un substrat unique, il est évident que la méthode est nettement améliorée par rapport à la méthode antérieure dans laquelle on utlise un tube à essai pour l'échantillon à tester et-une multitude de tubes témoins pour déterminer un nombre d'impulsions moyen, et cette technique antérieure implique le comptage de la somme de la radioactivité pour le tube à essai entier. La méthode de l'invention est donc bien plus économique en ce qui concerne l'appareillage nécessaire et la réalisation des tests est par conséquent considérablement simplifiée. Mais la caractéristique la plus importante de l'-invention est le fait que la sensibilité du test est de près de 100 fois plus élevée que celle du test de radioimmunodosage utilise antérieurement et qu'elle évite par conséquent le problème souvent difficile d'avoir à déterminer si un nombre d'impulsions relativement faible est dû simplement au bruit de fond qu à la présence d'une faible concentration des particules biologiques particulières pour lesquelles le test est effectué. Etant donné que le test, conformément à l'invention, est réalisé sur un substrat unique, on évite aussi l'effet résultant du changement des caracteristiques dû aux lavages différents de la multitude des tubes à essais nécessaires dans le test de radioimmunodosage traditionnel.La méthode de détection immunologique conformément à l'invention est particulièrement importante pour la détection des hormones, étant donné que les taux des hormones présentes sont généralement très bas. Le test immunologique (inhibition) pour la détection d'une hormone utilise une forme pure de l'hormone en tant que première particule biologique qui, du fait du petit modèle de la couche monomoléculaire particu lière adsorbée sur le substrat, ne nécessite pas de quantité importante de l'hormone. L'échantillon de sang testé est mélangé avec des anticorps spécifiques de cette hormone, les anticorps étant obtenus à partir de sérum sanguin provenant d'une personne dont on sait que l'organisme contient cette hormone.Finalement, les anticorps anti-anticorps spécifiques de l'hormone sont obtenus chez un animal du type mentionné plus haut, auquel on a injecté auparavant l'anticorps anti-hormone. Ayant décrit I'invention en faisant mention des réalisations et des exemples particuliers, il semble évident qu'il est possible de la modifier et de la varier à la lumière des données ci-dessus. Ainsi, un échantillon de sérum sanguin peut être soumis à un test d'inhibition quantitatif pour une particule biologique particulière dans une variation simple de l'invention de la façon suivante. On utilise un certain nombre de récipients de même taille, chacun pouvant contenir une des lames de diagnostic, un nombre de quatre récipients étant commode. Chaque lame est exposée de la même façon à une première particulebiologique particulière sous une forme purifiée, par exemple une hormone, pour laquelle le test quantitatif est à effectuer, afin d'obtenir pratiquement la même taille de couche monomoléculaire (de la première particule biologique), correspondant à la couche 11.L'échantillon de sérum sanguin à tester pour la présence de l'hormone est divisé en quatre parties égales et différentes concentrations (crest-à-dire a, 2a, 4a, 8a) de l'anticorps mar qué anti-hormone sont ajoutées respectivement aux quatre échantillons de sang pour une complexation avec l'hormone dans la proportion de la concentration de celle-ci. Les quatre mélanges sont ensuite placés respectivement dans les quatre récipients et après un intervalle de temps convenable, les quatre lames sont sorties des récipients et testées pour la radioactivité. La concentration de l'hormone est ensuite déterminée quantitativement comme étant entre les deux concentrations (a, 2a, 4a, 8a) des deux lames qui encadrent le point où une radiation notable a été détectée en premier lieu. I1 est évident que les mélanges peuvent être faits dans les récipients et les lames avec la couche monomoléculaire à leur surface peuvent être immergées dans les récipients. Par conséquent, ce test utilise seulement une double couche, contrairement à la triple couche des tests mentionnés plus haut. Il faut donc considérer que les tests précédents permettent aussi une détermination quantitative de la concentration de la particule suspecte d'après le niveau des rayonnements détectés dans le modèle. REVENDICATIONS I. Méthode de test de radioimmunodosage direct pour là détection immunologique en surface de particules biologiques immunologiquement réactives, caractérisée en ce qu'elle comprenant les étapes suivantes le choix d'un substrat approprié, ~l'exposition d'une partie de la surface principale-du substrat à des premières particules biologiquement réactives pour provoquer l'adsorption, sur le substrat, d'une couche monomoléculaire des premières particules biologiques en un modèle particulier, l'exposition du substrat recouvert de la couche monomoléculaire à une solution supposée contenir des secondes particules biologiques-immunologiquement réactives, spécifiques des premières particules, de sorte que la présence des secondes particules dans la solution::provoque une réaction immunologique des secondes particules avec les-premièresparticules pour former une couche bimv- léculaire du modèle particulier sur le substrat alors qu'en l'absence des secondes particules, il ne se forme pas de couche bimoléculaire, ~l'exposition du substrat recouvert à des troisièmes -particules biologiques immunologiquement réactives, marquées par un élément radioactif et spécifiques à l'égard des secondes particules, de sorte que la présence des secondes particules dans la solution provoque une réaction immunologique entre les troisièmes particules marquées et les secondes particules pour former une couche trimo léculaire du modèle particulier sur le substrat, et l'examen de la surface du substrat recouvert en recherchant la présence de la couche trimoléculaire radioactive, qui se trouve en constraste marqué avec un bruit de fond dû à une adhérence non-spécifique, ce qui assure une sensibilité plus élevée que celle obtenue dans le test de radioimmunodosage traditionnel. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'étape du choix d'un substrat approprié consiste choisir une lame de verre métallisé. 3. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'étape du choix d'un substrat approprié consiste à choisir une lame deverre. 4. Méthode selon la revendication 1, caractérisee en ce que l'étape de l'exposition d'une partie de la surface principale du substrat à des premières particules immunologiquement réactives comprend - la préparation d'une première solution-des premières particules biologiques immunologiquement réactives, - l'orientation du substrat de façon que sa surface principale soit horizontale et dirigée vers le haut, et -- le dépôt d'une goutte de la première solution sur la partie de la surface principale du substrat, afin de provoquer l'adsorption de la couche monomoléculaire sous forme d'une couche pratiquement complète. 5. Méthode selon la revendication 4 caractérisée en ce qu'elle comprend de plus, une étape de séchage du substrat avec la couche monomoléculaire à sa surface. 6. Méthode selon la revendication 4 caractérisée en ce qu'elle comprend en plus les étapes suivantes -le lavage du substrat recouvert de la couche monomoléculaire pour éliminer les particules non-spécifiques provenant de la pre mière solution et qui ont pu se déposer sur la principale surface du substrat, et -le séchage du substrat lavé et -ayant à sa surface la couche monomoléculaire. 7. Méthode selon la revendication l,-caractérisée en ce que l'étape de l'exposition du substrat recouvert de la couche monomoléculaire à une solution supposée contenir des secondes particules biologiques immunologiquement réactives, spécifiques à l'égard des premières particules, comprend - La collecte d'une seconde solution supposée contenir les secondes particules biologiques immunologiquement réactives, - l'immersion du substrat recouvert de la couche monomoléculaire dans la seconde solution, et - le maintien du substrat immergé pendant une durée dépendant de la concentration des secondes particules biologiques suspectes dans la deuxième solution, afin de provoquer la formation de la couche bimoléculaire sous forme d'une couche pratiquement complète, en présence des secondes particules dans la deuxième solution. 8. Méthode selon la revendication 7 caractérisée en ce qu'elle comprend en plus les étapes suivantes -l'enlevement du substrat recouvert de la deuxième solution, et -le lavage du substrat pour éliminer les particules non-spécifiques provenant de la deuxième solution et qui ont-pu se déposer sur la principale surface du substrat. 9. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'étape de l'obtention de la deuxième solution supposée contenir les secondes particules biologiques consiste a - prélever un échantillon de sériait sanguin chez un malade chez lequel on soupçonne la présence des secondes particules biologiques dans le courant sanguin. 10. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que I'étape de l'exposition du substrat recouvert aux troisièmes particules biologiques, immunologiquement réactives, marquées par un élément radioactif et spécifiques à l'égard des secondes particules, comprend - la préparation d'une troisième solution contenant les troi sièmes particules biologiques, immunologiquement réactives, marquées, - 1'immersion du-substrat recouvert dans la troisième solution, et - le maintien du substrat immergé pendant une durée dépendant de la concentration des troisièmes particules biologiques dans la troisième solution, pour provoquer la formation de la couche trimo léculaire en tant que couche pratiquement complète, en présence des secondes particules dans la deuxième solution. 11. Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce quel'étape de l'obtention de la troisième solution contenant les 'troisièmes particules biologiques comprend - l'injection à un animal (vertébré) approprié des secondes particules biologiques, - une période d'incubation au cours de laquelle l'animal produit les anticorps anti-secondes particules biologiques, - le prélèvement dX'un échantillon du sérum sanguin de l'animal, - la séparation des anticorps dans l'échantillon de sérum sanguin de l'animal des protéines restantes, et - la préparation d'une solution saline aqueuse des anticorps marqués, qui sont les troisièmes particules biologiques. 12. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce.que les premières particules biologiques sont une protéine. 13. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les premières particules biologiques sont un antigène. 14. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les premières particules biologiques sont un anticorps antisecondes particules biologiques. 15. Méthode selon la revendication 1, caracterisee en ce que les secondes particules biologiques sont une protéine. 16. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les secondes particules biologiques sont un antigène. 17. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les secondes particules biologiques sont un anticorps anti-premières particules biologiques. 18. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les secondes particules biologiques sont un virus. 19. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les secondes particules biologiques sont une bactérie. 20. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les secondes particules biologiques sont une hormone. 21. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les secondes particules biologiques sont ure enzyme. 22. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les troisièmes particules biologiques sont une protéine. 23. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les troisièmes particules biologiques sont un anticorps anti-secondes particules biologiques. 24. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'étape de l'examen de la surface recouverte du substrat pour la recherche de la présence de la couche trimoléculaire radioactive consiste : - contrôler le niveau des rayonnements émis le long de la surface du substrat à l'aide d'un compteur de rayonnements convenant à la radioactivité ayant servi au marquage des troisièmes particules radioactives, afin de détecter la présence éventuelle de la couche trimoléculaire qui produit un nombre d'impulsions notablement plus élevé que le nombre des impulsions de fond. 25. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'étape de l'examen de la surface recouverte du substrat pour rechercher la présence de la couche trimoléculaire radioactive consiste à - contrôler le niveau des rayonnements émis le long de la surface du substrat en exposant à la surface recouverte une pelli- cule photographique sensible à la radioactivité, de sorte que la couche trimoléculaire entraîne une plus forte exposition de la pellicule que le fond. 26. Méthode de test par inhibition pour la détection immunologique en surface de particules biologiques immunologiquement réactives, caractérisée en ce qu'elle comporte les étapes suivantes: -le choix d'un substrat approprié, -I'exposition d'une partie de la surface principale du substrat aux premières particules biologiques immunologiquement réactives, afin de provoquer l'adsorption d'une couche monomoléculaire des premières particules biologiques en un modèle particulier, -1lexposition du substrat recouvert de la couche monomoléculaire à une première solution supposée contenir les premières particules et dont on sait qu'elle contient les secondes particules biologiques immunologiquement réactives, spécifiques des premières particules, de sorte que la présence des premières particules dans la première solution provoque une réaction immunologique avec les secondes particules dans la première solution et ainsi il ne se forme pas de couche bimoléculaire du modèle particulier sur le substrat, alors qu'en l'absence des premières particules dans la première solution, il se forme une couche bim9léculaire comme conséquence d'une réaction immunologique entre les secondes particules et les premières particules adsorbées à la surface du substrat, ~l'exposition du substrat recouvert aux troisièmes particules biologiques immunologiquement réactives et marquées, spécifiques à l'égard des secondes particules, de sorte qu'en l'absence des pre mières-particules dans la première solution, il se produit une réaction immunologique entre les particules marquées et les secondes particules poUr former une couche trimoléculaire du modèle particulier sur le substrat, et l'examen de la surface recouverte du substrat en recherchant la présence de la couche trimoléculaire radioactive qui se trouve en contraste net avec le bruit de fond dû à l'adhérence non-spé cifique, ce qui assure une sensibilité-plus élevée que celle.obtenue dans le test de radioimmunodosage classique. 27. Méthode selon la revendication 26, caractérisée en ce que l'étape de l'exposition du substrat recouvert de la couche monomo léculaire à une première solution supposée contenir les premières particules comprend - la collecte d'urne première solution supposée contenir les premières particules biologiques immunologiuement réactives, - l'addition des secondes particules à la solution en quantité suffisante pour provoquer une réaction immunologique avec pratiquement toutes les premières particules contenues dans la solution, - l'immersion du substrat recouvert de la couche monomoléculaire dans la première solution, et - maintien du substrat immergé pendant une durée dépendant de la concentration des premières particules bio-logiques supposées contenue dans la première solution, afån de provoquer la formation de la couche bimoléculaireen tant que couche pratiquement complète, en'l'absence des premières particules dans la première solution. 28. Méthode selon la revendication 26, caractérisée en ce que l'étape de l'exposition du substrat recouvert aux troisièmes particules biologiques, immunologiquement réactives, marquées et spécifiques à l'égard des secondes particules comprend - la préparation d'une deuxième solution contenant -les troisièmes particules biologiques, immunologiquement réactives et marquées, - l'immersion du substrat recouvert dans la deuxième solution, et - le maintien du substrat immergé pendant une durée dépendant de la concentration des troisièmes particules biologiques dans la deuxième solution, afin de provoquer la formation de la couche trimoléculaire en tant que couche pratiquement complète, en l'absence des premières particules dans la première solution. 29. Méthode selon la revendication 26, caractérisée en ce que l'étape de l'examen de la surface recouverte du substrat en recherchant la présence de la couche trimoléculaire radioactive consiste a: - contrôler le niveau des rayonnements émis le long de la surface recouverte du substrat à l'aide d'un compteur de rayonnements convenant à la radioactivité ayant servi au marquage des troisièmes particules biologiques, afin de détecter la présence éventuelle de la couche trimoléculaire qui produit un nombre d'impulsions nettement supérieur aux impulsions de fond, ce qui indique l'absence des premières particules dans la première solution. 30. Méthode pour un test de radioimmunodosage quantitatif pour la détection immunologique en surface de particules biologiques immunologiquement réactives, caractérisée en ce qu'elle comporte les étapes suivantes -le choix d'un certain nombre de récipients, -l'addition dans les récipients d'un mélange constitué, d'une part, d'un échantillon de sang à tester pour la présence de la particule biologique particulière et, d'autre part, les anticorps anti-particule recherchée, en différentes concentrations connues, - l'exposition d'un même nombre de lames de diagnostic à une première particule biologique, qui est la même que la particule particulière testée , mais sous une forme purifiée, afin de former sur ces lames des couches monomoléculaires pratiquement complètes de modèle particulier, -l'immersion des lames dans les mélanges contenus dans les récipients, -I'écoulement d'un temps suffisant pour permettre la complexa tion entrer d'une part tous les anticorps marqués qui restent non complexés dans les mélanges de sang et d'anticbrps marqués, et, d'autre part, les premières particules biologiques sur les lames, afin qu'il se forme une seconde couche monomoléculaire du modèle de la couche monomoléculaire des premières particules, ~l'enlèvement des lames desrécipients, ,le contrôle des lames pour la radioactivité, et -la détermination de la concentration de la particule biologique particulière en notant les deux lames qui encadrent le point où un niveau de rayonnements notable a été détecté en premier lieu. 31. Dispositif pour la détection immunologique en surface de particules biologiques immunologiquement réactives, par radioimmunodosage, caractérisé en ce qu'il comprend - un substrat ayant une surface supérieure, - une première particule biologique immunologiquement réactive, adsorbée en une couche monomoléculaire pratiquement complète et en un petit modèle particulier à la surface supérieure, - une seconde particule biologique immunologiquement réactive, la première particule étant spécifique- à l'égard de la seconde particule, de sorte qu'en présence de la seconde particule il se forme une couche bimoléculaire du petit modèle particulier à la surface supérieure du substrat, - une troisième particule biologique, immunologiquement réactive, marquée par un élément radioactif et spécifique à l'égard de la seconde particule, de sorte qu'en présence de la seconde particule il se forme une couche trimoléculaire radioactive du petit modèle particulier à la surface supérieure du substrat, et - des moyens pour contrôler le niveau des rayonnements émis le long de la surface supérieure du substrat recouvert afin de détecter la présence de la couche trimoléculaire. 32. Dispositif selon la revendication 31, caractérisé en ce que le petit modèle particulier a une surface de l'ordre de un millimètre carré à un centimètre carré, afin d'économiser le matériau biologique utilisé pour les trois couches moléculaires.