Brevet FR2252085A1 — publié le 19750620

La présente invention concerne un procédé de préparation d'un complexe enzymatique stable, par extraction à partir du duodénum dtanimaux tels que le porc et le boeuf. L'invention vise d'autre part les applications thérapeutiques du complexe enzymatique précité. On sait que dans le duodénum des animaux précités se trouvent certains pro-enzymes ou enzymes qui permettent respectivement d'activer les enzymes du pancréas et d'opérer directement une action enzymatique. On note dans les enzymes trouvés dans le duodénum des disaccharidases, parmi lesquelles la lactase, qui libèrent du glucose à partir des disaccharides, des dipeptidases qui coupent les dipeptides et parmi lesquelles se trouve la leucylprolinase qui libère de la leucine, et tout particulièrement de l'entérokinase qui est 11 enzyme capable d'activer le trypsinogène et le chymotrypsinogène du pancréas. I1 est donc intéressant de mettre au point une technique permettant d' extraire ces enzymes et pro-enzymes du duodénum sans les dénaturer pour leur permettre de garder leur activité totale (ce qui exclut en particulier tout chauffage), en vue de les conditionner sous la forme de médicament. En effet, il est connu tue, si l'on prend du duodénum et si on le broie, une partie importante de l'activité enzymatique disparait. D'autre part, si on récolte simplement le liquide du duodénum, on St aperçoit qu'une grande partie des enzymes et pro-enzymes n'y est pas contenue. On a d'ailleurs pu mettre en évidence que l'entérokinase se trouve notamment en grande partie dans la muqueuse du duodénum. Si, partant du duodénum lui-meme, on fait une simple extraction à l'eau, du fait des graisses ou des liaisons internes, ltextraction est très faible. Par ailleurs, si on emploie des solvants concentrés, on risque de précipiter une partie des protéines, donc de perdre des enzymes ou de les dénaturer. Le but de la présente invention est donc de permettre d'obtenir un complexe enzymatique contenant la presque totalité des enzymes du duodénum avec leur activité initiale, en vue notamment de son utilisation entant que médicament pour le traitement des affections dues à une carence enzymatique du duodénum et plus généralement de l'intestin. Suivant l'invention, le procédé de préparation d'un complexe enzymatique stable à partir du duodénum, est caractérisé en ce qu'on met en présence du duodénum, un mélange d'eau et d'un solvant miscible à l'eau et susceptible à l'état pur de précipiter les enzymes, la proportion de duodénum et du mélange précité et la proportion d'eau et de solvant dans ce mélange étant telles que cette mise en présence n'entraine pas de précipitation des enzymes, puis on sépare le duodénum et le mélange dans lequel les enzymes sont passés en solution. On obtient ainsi une mise en solution et par conséquent une extraction pratiquement totales des enzymes. On peut utiliser la solution telle quelle ou lui faire subir un traitement ultérieur, mais, de préférence, après avoir séparé le duodénum et le mélange dans lequel les enzymes sont passés en solution, on ajoute à ce mélange un produit susceptible de précipiter les enzymes et on sépare du mélange obtenu les enzymes précipités. On peut ainsi obtenir un complexe enzymatique sous forme d'une poudre particulièrement pratique à utiliser. Le solvant du mélange eau-solvant initial et le produit qui permet de précipiter les enzymes sont soit des produits différents, soit de préférence le mme produit. son outre, dans un mode d'exécution particulièrement avantageux de l'invention, le solvant miscible à l'eau et susceptible à l'état pur de précipiter les enzymes est l'acétone qui sert ainsi dans le mélange eau-solvant initial et éventuellement pour la précipitation ultérieure des enzymes. On peut également utiliser tout autre solvant miscible à l'eau et susceptible à l'état pur de précipiter les enzymes, par exemple un alcool de faible masse moléculaire tel que le méthanol ou l'éthanol. Le mélange eau-acétone peut contenir de préférence environ 25 à 40% en volume d'acétone et la proportion de mélange utilisée est de préférence environ 1 à 2,5 volumes par rapport au poids de duodénum, en litre/kg. C'est ainsi que, dans le mode d'exécution particulier ci-dessus, le mélange eau-acétone contient de préférence environ 33% en volume d'acétone et la proportion de mélange utilisée est de préférence environ 1,8 volume par rapport au poids de duodénum, en litre/kg. Bien que les valeurs puissent varier dans les intervalles indiqués, les deux valeurs ci-dessus constituent des valeurs optimales en ce qui concerne la mise en solution et donc 1' extraction des enzymes. Dans le cas où on procède à une précipitation-des enzymes et oW on utilise l'acétone comme corps commun pour la mise en solution, puis pour la précipitation, la quantité totale d'acétone utilisée aussi bien dans le mélange eau-solvant initial que pour la précipitation des enzymes est de préférence comprise entre 60 et 80% en volume par rapport au volume total de la solution. On constate en effet qu'avec des valeurs supérieures à 80%, on précipite en plus des enzymes d'autres protéines ou qu'onobtient des enzymes dénaturés, et qu'avec des valeurs inférieures à 60%, on ne précipite pas assez d'enzymes.Une valeur très avantageuse est 66%, ce qui se traduit, dans le cas où on utilise 1,8 volume de mélange à 33% d'acétone, par le fait que la proportion d'acétone utilisée pour précipiter les enzymes est de I volume par rapport au volume du mélange eau-solvant initial. De préférence, avant de mettre le duodénum en présence du mélange eau-solvant, on le coupe en morceaux pour faciliter l'extraction des enzymes, mais sans broyage ultérieur car ce dernier ferait disparaltre une partie importante de l'activité enzymatique. De préférence également, après avoir mis le duodénum en présence du mélange eau-solvant, et notamment dans le cas où on utilise 1,8 volume de mélange à 33% d'acétone, on règle le pH du mélange obtenu à une valeur comprise entre 6 et 7. En effet, on a pu vérifier qu'en dessous de pH 6 (par exemple à partir de pH 5), on inactivait 1' entérokinase ; Si on acidifie plus, on remet en solution, mais avec une destruction rapide. De même, au-dessus de pH 7, on a des risques d'autodigestion des protéines et en particulier de dégradation des enzymes. Bien que ce ne soit pas fondamentalement nécessaire, on peut par ailleurs, avant de précipiter les enzymes, centrifuger la solution ; cette opération est relativement importante, car elle permet d'éliminer les déchets de protéines. L'invention a également pour objet un complexe enzymatique préparé à partir du duodénum à l'aide d'un procédé du genre ci-dessus. L'invention concerne encore l'application en thérapeutique du complexe enzymatique-obtenu selon le procédé précité, pour le traitement des affections telles que les diarrhées dues à une carence enzymatique du duodénum. L'invention vise en outre l'application en thérapeutique, d'un complexe stable obtenu à partir du duodénum et contenant entre environ 8 et 11 unités/mg d'entérokinase, environ 150 unités/g de disaccharidases et environ 300 unités/g de dipeptidases. La description de l'exemple qui va suivre à titre non limitatif a uniquement pour but de bien faire comprendre comment l'invention peut être mise en pratique. Dans cet exemple, on récolte 20 kg de duodénum de porc et on les congèle à -20 C immédiatement. On les stocke avant le travail à la même température pendant un mois ou plus sans que l'extraction ultérieure montre de différence avec les extractions effectuées sur du duodénum congelé, mais non stocké. On porte ces 20 kg de duodénum congelé au réfrigérateur à OOC et on laisse dégeler lentement pendant une nuit pour les réchauffer légèrement en ramenant la température sensiblement entre 0 et -5 e. On coupe ensuite ces duodénums au couteau électrique, chacun sensiblement en trois morceaux, ce qui donne des morceaux de 15 à 20 cm. On prépare d'avance 24 litres d'un mélange eau-acétone à 2 volumes d'eau pour 1 volume d'acétone (33% d'acétone), ce qui représente 1,2 volume de mélange par rapport au poids de duodénum. On plonge les duodénums coupés dans ce mélange eauacétone, on agite légèrement les duodénums dans la solution acétonique de façon à ne parles dégrader et on vérifie si le pH est compris entre 6 et 7, sinon on le ramène dans cet intervalle. On porte ensuite au réfrigérateur entre O et -5 C pendant 24 heures pour que la diffusion soit aussi complète que possible. On ressort alors du réfrigérateur et on agite ensuite ensuite assez rapidement et assez violemment pendant 1/2 heure. On filtre sur un Bucbner à toile grossière pour séparer les morceaux de duodénum et on comprime ensuite ces morceaux à l'aide d'un filtre-presse. On reprend les morceaux par 12 litres du même mélange eau-acétone que précédemment, ce qui représente 0,6 volume de mélange par rapport au poids de duodénum. On agite à nouveau 1/2 heure et on flltre à nouveau sur BuchnerO Les deux filtrats sont mélangés et on vérifie le pH qui doit Btre compris entre 6 et 7. On remarque que la quantité totale de mélange eauacétone utilisée est de 1,2 + 0,6 = 1,8 volume par rapport au poids de duodénum. La double série d'opérations ci-dessus constitue une extraction méthodique : une seule série suffirait, mais les résultats sont bien meilleurs avec deux ; par contre l'augmentation de rendement ne justifie en général pas d'aller au-delà de deux. Le réglage du pli peut se faire par exemple à l'aide de soude si la solution est trop acide ou à l'aide d'acide chlorhydrique si elle est trop basique. Le liquide obtenu est ensuite centrifugé à la centrifugeuse à -ZOoC, ce qui permet d'avoir un liquide nettement plus limpide que le liquide initial. La partie lourde séparée ne contient pratiquement pas d'unités d'entérokinase, mais uniquement des graisses ou protéines autres que les enzymes. Du fait d'une part de l'évaporation d'acétone et d'autre part du liquide qui demeure dans les déchets, on retire environ 30 à 32 litres de filtrat ou solution acétonique. On effectue alors sur ce filtrat les dosages de contrôle pour vérifier que l'extraction a été correcte. On titre les unités d'entérokinase d'après la méthode de Eunitz (Methods in Enzymology, Colowick-Kaplan, n0 2, page 32) qui consiste en une activation du trypsinogène en trypsine par l'entérokinase, une unité d'entérokinase étant définie comme la quantité de kinase qui active 0,065 mg de trypsinogène à pli 5,8 à 50C et pendant 1 heure. On retrouve alors dans le filtrat au total environ 2.500.000 à 2.600.000 unités, ce qui est très voisin des unités dosées en partant directement du duodénum. On reprend le liquide par 32 litres d'acétone pur et on laisse le tout 24 heures au froid entre O et -5 C. On obtient alors la précipitation des protéines parmi lesquelles les enzymes. On remarque que la quantité totale d'acétone utilisée est de en volume par rapport au volume total de la solution. On filtre sur Buchner avec papier dur après avoir décanté au maximum pour filtrer dans le minimum de temps, ce qui évite notamment les risques d'infection microbienne et de variation du pli. Le précipité obtenu est alors lavé trois fois à l'acétone pur pour le déshydrater le plus possible et la poudre obtenue est alors séchée 24 heures à l'air libre. On obtient environ 500 g de poudre titrant en entérokinase environ 8 à 10 unités/mg. Bien qu'elle puisse déjà être utilisée, cette poudre est longue à mettre en solution et donne des solutions troubles. C'est pourquoi on peut, après essorage, la reprendre par 6 litres d'eau froide environ (20 volumes par rapport à son poids), on agite une heure, ox laisse reposer 24 heures au froid, on agite à nouveau, puis on passe à la centrifugeuse à -100C. Le liquide obtenu est lyophilisé et on obtient de cette façon 220 g de poudre lyophilisée qui se met bien en solution, donne une solution pratiquement limpide et claire et est un complexe enzymatique donnant les résultats suivants à 11 analyse - entérokinase (dosage effectué par la méthode de Unités mentionnée plus haut) = 11 unités/mg environ, - disacoharidases, essentiellement constitués par du lactase (dosage effectué par la méthode de Dahlquist (Anal. Biochem., 22, 99, 1968 etEnzymoîogy n 8, page 589) = 150 unités/g environ, - dipeptidases, essentiellement constitués par de la leucylprolinase (dosage par la méthode de Grassmaan et Heyde : Snzymology n 2, pages 97-100) = 300 unités/g environ. Le complexe enzymatique comporte en outre - de la phosphatase alcaline, à une teneur voisine de 5 mi11imole/g, le dosage ayant eté effectué selon la méthode de 0.A. BESSEY, H. LOWRY et M.J. BROIE ("Division of Nutrition and Physiology, Public Health Research Institute of New-York") publiée le 28 mars 1946 - de ltornithine carbamyl transférase, à une teneur voisine de 200 unités/g, le dosage ayant été effectué selon la méthode décrite dans "Enzymology, volume 17 Dy page 885"; - de ltsminopeptidase et de la glutamyl transférase à des teneurs appréciables. Les taux en entérokinase, disaccharisases, dipeptidases, phosphatase alcaline et ornithine carbamyl-transférase sont très voisins des taux trouvés dans la muqueuse intestinale in vivo. L'augmentation constatée du taux en entérokinase (8 à 10 unités/mg jusqu'à il unités/mg) est due à la centrifugation et à la lyophilisation du complexe enzymatique. L'expérience a montré que le complexe enzymatique, sous forme de poudre lyophilisée, stocké même à la température ambiante, ne présente aucune baisse d'activité enzymatique, après plusieurs mois de stockage. Un complexe enzymatique sensiblement identique peut également être obtenu par extraction à partir de duodénums dlsnimaux autres que le porc, par exemple à partir de duodénums de mouton, de veau ou de boeuf. L'expérience a montré d'autre part qu'un complexe enzymatique stable pouvait également être obtenu en remplaçant l'acétone par de l'alcool éthylique ou méthylique pour la réalisation du mélange eau-solvant miscible à l'eau, et pour précipiter ensuite les enzymes passés en solution dans le mélange précité. On va maintenant décrire les essais pharmacologiques effectués, montrant ltintérêt thérapeutique du complexe enzymatique conforme à l'invention. Ces essais ont principalement porté sur le suc duodénal prélegs vé sur des suets atteints d1 une déficience congénitale en entérokinase et qui, de ce fait sont incapables de digérer et, par conséquent, d'assimiler les protéines. L'analyse du suc duodénal prélevé sur ces malades a montré que les zymogènes, tels que les trypsinogènes, chymotrypsinogènes et carboxypeptidases n'étaient pratiquement pas activés. Les trypsinogènes et chymotrypsinogènes, en particulier, n'étaient pas activés en trypsine et en chymotrypsine. L'addition du complexe enzymatique conforme à l'invention au suc duodénal précité a permis de réaliserxl'activation des zymogènes précités. Les courbes représentées sur la figure annexée donnée à titre d'exemple non limitatif, montrent les variations de l'activité A (en unités internationales/cm3) , en fonction du temps t (.en minutes), en trypsines (courbes T1, T2 et 5) et en carboxypeptidase (courbes C1, C2 et C) de trois prélèvements de suc duodénal effectués sur les malades précités. Les courbes montrent notamment qu'à partir de l'instant tos correspondant à l'addition au suc duodénal du complexe enzymatique conforme à l'invention à une proportion égale à 0,5% en poids des protéines contenues dans le suc duodénal, on obtient une augmentation immédiate des activités en trypsines et en carboxypeptidases. On obtient au bout de 20 mn des activités correspondant aux activités normales du suc duodénal d'un sujet sain. Les taux d'activités ont été déterminés par spectrophotométrie d'absorption, Ce résultat s'explique par l'apport au suc duodénal de l'entérokinase contenu dans le complexe enzymatique conforme à l'invention. Cette remarquable propriété du complexe enzymatique informe à l'invention destine oe dernier tout -particulièrement à son emploi en tant que médicament pour le traitement des affections dues à une carence enzymatique du duodénum, et, de façon plus générale, de l'intestin. C'est ainsi que de nombreux succès cliniques ont été obtenus dans le traitement de malades ayant une diarrhée persistante, due notamment au fait que les protéines étaient mal assimilées par l'organisme, comme l'ont montré les dosages de protéines digérées et d'azote effectués sur les fèces des malades. Des succès cliniques ont également été obtenus sur des malades ayant subi une gastrectomie ou une cholecystectomie et pour lesquels l'activation du suc duodénal ne pouvait s'effectuer correctement. D'autres succès ont également été obtenus dans le traitement des cas de déficiences hépatiques, des suites d'hépatite virale, des suites de lithiase et des cas de pancréatite alcoolique pour lesquels le métabolisme de la digestion était déréglé. Chez les malades traités au moyen du complexe enzymatique conforme à l'invention, on a constaté après analyse des fèces, une importante diminution des taux en protides, lipides et glucides non-digérés et par conséquent un rétablissement du métabolisme digestif. Pour le traitement des affections précitées,le médicament peut être présenté sous forme de comprimés ou de gélules constitués essentiellement par le complexe enzymatique conforme à l'invention et ayant un poids compris entre 10 et 200 mg, suivant les affections. Le médicament est cependant de préférence présenté sous forme de gélules revêtues par de la kératine et renfermant 20 à 50 mg de complexe enzymatique conforme à l'invention, ces gélules étant administrées à raison de 1 à 5 prises quotidinnnes. Ces gélules présentent en effet la propriété de ne libérer leur contenu en substance active qu'à leur entrée dans le duodénum, c'est-à-dire lorsque le milieu atteint un pH égal à 5,6 environ, ce qui permet aux enzymes libérées d'assurer leur fonction d'activation dans les conditions les plus favorables. On indique ci-après quelques exemples de cas cliniques, illustrant l'intérêt thérapeutique du médicament conforme à l'invention. Le tableau suivant indique, pour différents malades, la nature de l'affection traitée, la posologie, les résultats des analyses effectuées sur les fèces et les signes inflammatoires relevés avant et après le traitement Malade Poso Proti- L i p i d e s Diagnostic logie 1des Graisses Acides Savons N ) 4e Age (digé- neutres gras rées) 1 48 Diarrhée pos 5 comp. 65% ++ 444 ++ gastrectomie à 25 mg en 3 fois/ 85% + + O dant j;pen dant 20 j. 2 45 Diarrhée post- 72% +++ +++ + cholécystec- " 82 % + + 0 3 58 Pancréatite " 629 +++ +++ +++ alcoolique 76% + ++ + 4 38 Diarrhée n 62% ++ ++ + porte hépatite virale 79% + 0 O Malade Glucides Sels bi- Acides Signes inflam- Résultat N Age Ami- Cellu- Flore liai- Orgn. NH3 matoires don lose isso- res 1 48 ++ +++ 0 0 17 4,5 cellules épithé- guérison liales albumoses + + O O 12 3,2 disparition 2 45 ++ ++ + + 15,8 3,7 qq.hématies guérison albumoses mais rechu te après 0 0 0 + 9,2 3,5 disparition arrêt du traitement 3 58 + ++ O ++ 16,2 2,8 albumoses guérison + + O + 14,8 2,7 albumoses n 4 38 ++ + o + 15,2 3,9 albumoses guérison + + 0 0 11,8 3,8 disparition Les résultats indiqués dans le tableau précité montrent que le médicament permet d'obtenir la guérison de malades atteints des diarrhées post-gastrectomie, post-cholécystectomie, post-hépatite ou de pancréatite alcoolique. Dans l'état actuel de l'expérimentation et d'après les dosages effectués sur les fèces avant et après le traitement on constate d'autre part - une augmentation moyenne d'environ 13% du taux de protides digérées (exprimé en taux de fibres musculaires digérées), - une diminution d'environ 4 fois du taux de lipides (graisse neutre, acide gras et savon), - une diminution des glucides : 4 fois environ pour le taux d'amidon indigéré et 4 fois environ pour la cellulose, - une diminution moyenne d'environ 3,7 fois du taux d'acide organique, - et une diminution relative d'azote, exprimé en On constate par aiileurs, une disparition ou alternation très fréquente des signes inflammatoires. Le médicament conforme à l'invention permet par conséquent, dans les cas étudiés, de rétablir de façon très efficace le processus normal de la digestion. Les essais cliniques précités ont montré en outre qui la dose quotidienne de 5 comprimés (ou gélules) de 25 mg par jour, il n'a été constaté aucune intolérance clinique. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un complexe enzymatiqu stable à partir du duodénum, caractérisé en ce qu'on met en présence du duodénum frais ou concentré par le froid un mélange d'eau et d'acétone contenant entre 25 et 40 % en volume environ d'acétone, la proportion de duodénum J, % de mélange étant telle que cette mise en présence n' entralAne pas C.. ïécipitation des enzymes puis on sépare le duodénum et le mélange dans lequel les enzymes sont passés en solution. 2. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que la proportion de mélange utilisée est comprise entre 1 et 2,5 volume par rapport au poids de duodénum, en litre/kg. 3. Procédé conforme à l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'après avoir mis le duodénum en présence du mélange eau-solvant, on régle le pH du mélange obtenu alune valeur comprise entre 6 et 7. 4. Procédé conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 3., caractérisé en ce qu'après avoir séparé le duodénum et le mélange dans lequel les enzymes sont passés en solution, on ajoute à ce mélange un produit susceptible de précipiter les enzymes et on sépare du mélange obtenu les enzymes précipités. 5. Procédé conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'avant de précipiter les enzymes, la solution contenant ces derniers est centrifugée. 6. Complexe enzymatique dù duodénum, caractérisé en ce qu'il est obtenu suivant le procédé conforme 'a l'une quelconque des revendications 1 à 5. 7. Complexe enzymatique conforme à la revendication 6, caractérisé en ce qu'il contient entre environ 8 et 71 unités/mg d'entérokinase, environ 150 unités/g de disaccharidases et environ 300 unités/g de dipeptidases. 8. Complexe enzymatique du duodénum conforme à la revendication 7, caractérisé en ce qu'il contient en outre de la phosphatase alcaline à une teneur voisine de 5 millimole/g, de l'ornithine carbamyl transférase à une teneur voisine de 200 unités/g, de l'aminopeptidase et de la glutamyl transférase. 9. Médicament pour le traitement des affections dues à une carence enzymatique du duodénum, caractérisé en ce qu'il renferme en tant que substance active un complexe enzymatique conforme à l'une quelconque des revendications 6 à 8. 10. Médicament conforme à la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est dosé pour l'usage au poids médicinal à un poids de substance active compris entre 10 et 200 mg.