Brevet FR2268811A1 — publié le 19751121

La présente invention est relative à un procédé de fixation d' > -galactosidase in situ au sein de cellules de microorganismes dans lesquelles cette enzyme est produite I1 est connu que lO(-galactosidase est une enzyme capable d'hydrolyser le raffinose, substance qui freine la cristallisation du saccharose, pour donner du saccharose et du galactose. L'&alpha;-galactosidase est produite par des microorganismes en majours partie par voie intracellulaire quand les microorganismes sont cultivés dans des conditions spécifiques (voir brevets américains n 3 047 625 et 3 832 284). Dans l'industrie de production du sucre de betterave, les cellules de microorganismes contenant l'&alpha;-galactosidase en question sont ajoutées à la solution de sucre de betterave en vue d'hydrolyser le raffinose contenu dans la solution de sucre et d'augmenter de ce fait le rendement en saccharose (voir brevets américains n 3 836 432 et 3 767 526). Etant donné que l'&alpha;-galactosidase est contenue de façon intracellulaire par les microorganismes, on peut l'utiliser de façon répétée dans une certaine mesure.Néanmoins, elle ne peut pas être conservée dans les cellules pendant une période prolongée d'utilisation répétée, en raison de facteurs tels que la solubilité dans l'eau de la-galactosidase elle-même et de l'autolyse des cellules des microorganismes qui entra ment invariablement la décharge graduelle de l'd-galactosidase contenue dans les cellules et sa dissolution dans la solution de sucre. La présente invention a pour objet un procédé permettant de fixer facilement l'&alpha;-galactosidase produite de façon intracellulaire par un microorganisme, en particulier une moisissure, au sein des cellules du microorganisme, grâce à quoi les cellules contenant l' -galactosidase peuvent retenir cette enzyme intacte quand on l'utilise de façon répétée pendant une période de temps prolongée pour lthydrolyse du raffinose dans la solution de sucre de betterave. Pour réaliser les buts décrits ci-dessus, la présente invention vise un procédé qui consiste à ajouter du glutaraldéhyde à une solution tampon dans une proportion de 0,2 à 10,0 > en poids sur la base de la solution tampon, à ajuster le pH de la solution résultante à une valeur comprise entre 5,2 et 8,0, à ajouter des moisissures contenant de l' -galactosidase dans une proportion de 10 à 30 g (sur une base sèche) pour 100 ml de la solution résultante, à agiter le mélange à une température de 10 à 500C et à séparer les cellules du mélange agité. Grâce à ce traitement, la majeure partie de l' -galactosidase contenue dans les cellules peut se fixer in situ dans les cellules.Quand les cellules contenant l'o(-galactosidase ainsi fixée sont utilisées pour l'hydrolyse du raffinose que contient une solution de sucre de betterave, elles permettent à l'&alpha;-galactosidase de conserver son activité sensiblement intacte pendant une période de temps prolongée d'utilisation répétée. On peut donc de cette manière utiliser ces cellules de façon stable dans l'hydrolyse du raffinose. Sur le dessin annexé la fig. l est un graphique montrant la variation avec le temps (en jours, en abscisse) du pourcentage d'activité d' -galactosidase perdu par dissolution (en ordonnée) les fig. 2 à 5 sont des graphiques montrant chacun la relation entre le taux d'hydrolyse du raffinose (en ordonnée, en %) et le temps de réaction (en abscisse, en jours). Sur ces figures, la courbe A correspond aux cellules non traitées et la courbe B aux cellules traitées par un aldéhyde. Quand on cultive des moisissures de Mortierella vinacea var. raffinose-utilizer (ATCC 20034) dans un milieu contenant du lactose comme agent inducteur 7 il se forme de l'c(-galactosidase dont la plus grande partie est produite intracellulairement. Quand les cellules de microorganismes résultantes sont utilisées pour traiter de façon répétée la solution de sucre de betterave , l'activité d'-galactosidase dans les cellules diminue graduellement. il -s'ensuit que le taux d'hydrolyse du raffinose se trouve également diminué. Compte tenu de ce qui précède, la demanderesse a cherché la cause d'une telle diminution de l'activité dl -galactosidase dans les cellules de microorganismes. Elle a ainsi constaté que cette diminution se produit non pas parce que l'o(-galactosidase est utilisée pour l'hydrolyse du raffinose mais parce que les cellules se désintègrent en raison de l'autolyse et de l' -galactosidase est exsu dée sous des influences telles que la force ionique de la solution de sucre de betterave et la pression osmotique de la solution de sucre, de sorte que l'd-galactosidase est déchargée hors des cellules et se trouve ensuite dissoute dans la solution de sucre. Dans l'industrie de la production du sucre de betterave, l'hydrolyse du raffinose est ordinairement exécutée dans une solution de sucre de betterave (principalement de la mélasse) ayant un degré Brix de 10 à 60, à un pH de 5,0 à 6,0 et à une température de 45 à 550C. Quand on exécute l'hydrolyse du raffinose dans de telles conditions, l'o Au cours de ses recherches pour résoudre ce problème, la demanderesse a émis la théorie que si un composé organique pos sédant deux groupes fonctionnels était utilisé pour le couplage des groupes amino libres des protéines formant les cellules des microorganismes (y compris l1enzyme) avec les groupes fonctionnels dudit composé, l' -galactosidase serait susceptible de se fixer si rapidement dans les cellules des microorganismes qu'elle pourrait résister à une décharge dans la solution de réaction malgré la force ionique ou la pression osmotique de la solution de sucre.La demanderesse a effectué diverses études en se basant sur cette hypothèse et elle a ainsi pu acquérir la certitude que lorsque les cellules des microorganismes contenant l' & galactosidase sont traitées avec du glutaraldéhyde, la majeure partie de l-galactosidase est retenue et fortement fixée dans les cellules, tandis qu'une partie seulement de l' -galactosidase s'échappe des cellules et subit une inactivation. La présente invention est basée sur cette constatation. Les microorganismes qui peuvent être utilisés dans la présente invention ne sont pas particulièrement limités. On peut citer comme exemples les microorganismes producteurs d'o(-galactosidase couramnent connus comne les moisissures du genre Mortierella, du genre Absidia et du genre Circinella. Les cellules contenant de l'a(galac- tosidase qui doivent subir le traitement de fixation de l'enzyme selon le procédé de la présente invention peuvent être sous forme de cellules vivantes obtenues immédiatement après achèvement de la culture ou sous forme de cellules congelées ou même de cellules sèches, selon ce qui convient le mieux. La présente invention permet d'obtenir la fixation intracellulaire de ltt-galactosidase par traitement avec du glutaraldéhyde des cellules contenant de l'-galactosidase qui sont o4- tenues par culture des microorganismes précités par un procédé connu. De façon spécifique, on dissout le glutaraldéhyde dans une solution tampon au phosphate, par exemple dans une proportion de 0,2 à 10 % en poids sur la base de ladite solution tampon, on ajuste le pH de la solution résultante à une valeur comprise entre 5,2 et 8,0, on ajoute ensuite des cellules de microorganismes contenant de l'CC-galactasidase à cette solution et on agite le mélange à 10 - 500C pendant une demi-heure à 2 h 1/2. A la fin du traitement , on sépare les cellules de la solution , par exemple par filtration , puis on les lave soigneusement à l'eau. En vue du traitement selon la présente invention, on peut utiliser n'importe quel composé organique possédant deux groupes fonctionnels. Toutefois, pour des raisons d'économie et de facilité de manipulation, l'utilisation du glutaraldéhyde se révèle la plus avantageuse et produit un effet évident. On ajoute le glutaraldéhyde à un solvant approprié dans une proportion de 0,2 à 10,0 % en poids. La limite supérieure concernant cette proportion est d'environ 10 % en poids. Quand la proportion de glutaraldéhyde ajouté dépasse la limite supérieure de 10,0 Sr le taux résiduel d'activité d' -galactosidase diminue comme on le verra plus loin;'A titre de solvant auquel on ajoute le glutaraldéhyde, même l'eau peut être utilisée efficacement.Toutefois, compte tenu de l'ajustement du pH qui est exécuté après l'incorporation du glutaraldéhyde, l'utilisation d'une solution de phosphate, d'acétate ou de tampon similaire se révèle avantageuse en ce sens que cet ajustement du pH peut être accompli simultanément. Ceci ne signifie pas nécessairement que l'a-- justement du pH doit être effectué avec une solution tampon. L'ajustement du pH peut être efficacement obtenu en utilisant une solution d'hydroxyde de so dium ou d'un autre alcali quelconque. La quantité de cellules de microorganismes devant être ajoutée à la solution doit uniquement être comprise dans l'intervalle dans lequel les cellules peuvent être uniformément agitées dans la solution. Normalement, cette quantité est comprise entre 10 et 30 g (sur une base sèche par îoe ml de la solution. Dans une expérience, des prélèvements de cellules contenantde l' -galactosidase (ayant une activité d' -galactosidase de 383,39 x unités/gramme, sur une base sèche) obtenues à partir des -moisissures de Mortierella vinacea var. raffinose-utilizer (ATCC 20034) sont mis en suspension dans des solutions tampon au phosphate contenant du glutaraldéhyde en concentrations variables, puis elles sont soumises à un traitement en utilisant une température de réaction, un temps de reaction et une valeur de pH variables. On détermine les taux résiduels d'activité dt -galactosidase dans les cellules immédiatement après le traitement de fixation- et dans les mêmes cellules après 21 jours de traitement continu d'une solution de sucre -de betterave. Les ré sultats sont donnés dans le tableau ci-dessous. Les valeurs numériques de l'activité d'&alpha;-galactosidase qui sont données dans l'ensemble de la description sont déterminées par la méthode PNPG. Le terme "taux résiduel activité dWgalactosidase" concerne le rapport de l'activité résiduelle à l'activité totale sauf mention contraire. T a b l e a u Taux résiduel Concentra- Tempé- Temps de d'activité Taux résiduel d'activité d'&alpha;-galactosidase après tion de rature traite- pH d'&alpha;;-galacto- traitement d'une solution de sucre (%) Essai n glutaral- ment sidase après déhyde (% ( C) (heures) traitement par Sur la base de l'activité Sur la base de l'activité en poids) un aldéhyde (%) après traitement par un avant traitement par un aldéhyde aldéhyde 1 0,5 20 1,5 7,0 77,0 30,0 29,3 2 0,5 50 1,0 7,0 37,2 85,0 31,5 3 1,0 20 1,5 7,0 54,1 72,1 39,0 4 1,0 10 2,5 5,2 73,0 45,2 33,0 5 1,0 20 1,0 7,0 65,2 56,1 36,6 6 1,0 20 1,0 8,0 61,2 55,5 34,0 7 10,0 30 1,5 8,2 36,0 98,0 35,3 (cellules non - - - - 100,0 4,9 4,9 traitées) Ensuite, en utilisant les cellules de microorganismes obtenues par le traitement exécuté dans les conditions de l'essai n 3, on traite en continu une solution de sucre de betterave pendant Zl jours. Au cours de ce traitement, on soumet les cellules à des essais par intervalles pour déterminer l'activité d'd-galactosidase perdue par dissolution. Séparément, on traite la même solution de sucre de betterave dans les mêmes conditions en utilisant les cellules de microorganismes qui n'ont pas subi le traitement par le glutaraldéhyde.On soumet les cellules à des essais similaires pour connaître l'activité d' -galactosidase perdue par dissolution. Les variations en fonction du temps de l'activité d -galactosidase qu'on peut ainsi déterminer sont portées sur la figure 1. Ainsi qu'il ressort du tableau qui précède, quand des cellules contenant de l'o(-galactosidase sont traitées par l'aldéhyde, l'activité d' - galactosidase au sein des cellules diminue dans une mesure plus ou moins importante. Superficiellement, il peut sembler que le traitement par l'aldéhyde soit désavantageux parce qutil provoque une inactivation d'une partie de l'- galactosidase. Toutefois, l'intérêt du traitement par l'aldéhyde devient évident quand on exécute l'hydrolyse du raffinose pendant une longue période de temps. En effet, après une période prolongée d'utilisation des cellules, on constate que la quantité cumulative d'&alpha;-galactosidase dissoute est remarquablement faible par comparaison avec la quantité dissoute lors de l'utilisation de cellules qui n'auraient pas été traitées par l'aldéhyde. Après 21 jours d'utilisation continue dans l'hydrolyse du raffinose, par exemple, on constate que les cellules traitées par l'aldéhyde conservent encore plus d'environ 30 de l'activité d'O(galactosidase qui existait avant le traitement par l'aldéhyde.Il ressort du tableau que lorsqu'on traite les cellules avec du glutaraldéhyde dans les conditions de l'essai nd 3, le taux résiduel d'activité d't-galacto- sidase dans les cellules tombe à environ 54 % et qu'il ne diminue que d'environ 15 A pendant 21 jours d'hydrolyse continue du raffinose. Ceci montre que, à la fin du 2lème jour d'hydrolyse continue, les cellules conservent encore environ 39 % de l'activité d'&alpha;-galactosidase qui existait avant le traitement par l'aldéhyde. Quand on exécute l'hydrolyse du raffinose pendant 21 jours dans les mêmes conditions en utilisant des cellules qui n'ont pas subi le traitement par l'aldéhyde, l'-galactosidase commence à exsuder hors des cellules après un certain laps de temps. On constate que la quantité d'o(-galac- tosidase qui exsude de cette manière des cellules atteint environ 50 4bile 11sème jour et environ 95 % le 2lème jour respectivement, selon la fig. 1. A mesure que l'&alpha;-galactosidase se trouve ainsi exsudée hors des cellules, le taux d'hydrolyse du raffinose est proportionnellement diminué, ce qui rend impossible d'exécuter une telle hydrolyse de façon stable pendant une longue période de temps. La fixation forte de l'-galactosidase au sein des cellules des microorganismes, obtenue comme décrit ci-dessus, peut éventuellement être expliquée de façon logique en supposant que la fixation a lieu par une réaction -chimique entre les protéines (comprenant celles qui constituent les cellules des microorganismes et celles qui constituent l'enzyme) et l'aldéhyde.Plus spécifiquement, l'exsudation de l'enzyme à travers les cellules est éventuellement empêchée parce que les protéines enzymatiques se trouvent mutuellement liées chimiquement par des liaisons transversales et se trouvent ainsi convertie en molécules d'un poids moléculaire plus élevé, qui est suffisant pour empêcher une évacuation facile de ltenzyme hors des cellules, parce que les protéines enzymatiques et les protéines formant les cellules sont liées par des liaisons transversales qui fixent l'enzyme sur les cellules et également parce que les protéines formant les cellules sont liées les unes aux autres par des liaisons transversales par l'intermédiaire de l'aldéhyde et se trouvent ainsi converties en molécules ayant un poids moléculaire assez élevé pour gener une autolyse qui serait sans cela possible et pour augmenter physiquement la résistance des cellules elles-memes. En ce qui concerne la fixation par liaisons transversales mentionnée ci-dessus, il peut être déduit encore que, dans le cas du glutaraldéhyde, il se produit éventuellement une réaction produisant une base de Schiff (aboutissant à la formation d'imines, etc.) entre le groupe aldéhyde du glutaraldéhyde et le groupe amino des protéines. En outre, il existe une forte possibilité que le glutaraldéhyde induise un phénomène de condensation du type aldolisation qui donnerait naissance à des dimères et trimères (y compris ceux qui ont une forme cyclique). Par conséquent, la possibilité qu'une réaction du type addition de Michael se produise pour donner une liaison transversale au sein de la région insaturée des atomes de carbone qui s'est formée lors de la réaction de condensation sus-mentionnée ne peut pas être entièrement rejetée. Ainsi qu'il ressort de la description qui précède, le procédé de la présente invention consiste à traiter les cellules de microorganismes contenant de l'1-galactosidase avec l'aldéhyde spécifié. En réalité, ce traitement semble désavantageux en ce sens qu'il diminue l'activité d'd-galactosi- dase à un certain degré. Toutefois, en réalité, il se révèle éçonomiquement avantageux étant donné que les cellules obtenues permettent de conserver l'activité d' -galactosidase sensiblement intacte et de renforcer ainsi la stabilité du taux d'hydrolyse du raffinose quand on les utilise lors de l'hydrolyse du raffinose pendant un laps de temps prolongé.En outre, le nombre de réapprovisionnements en cellules contenan+ de li CG-galactosidase dans le récipient de réaction, pendant un laps de temps donné, se trouve diminué. On peut obtenir des résultats particulièrement satisfaisants en utilisaht des cellules obtenues sous forme de granules étant donné que leur plus grande dureté diminue les risques d'agglomération, ce qui augmente la perméabilité des cellules se trouvant dans le récipient vis-à-vis dela solution de sucre et ce qui augmente la valeur industrielle du procédé selon la présente invention. On va maintenant décrire la présente invention en se référant à des modes de réalisation préférés, étant bien entendu que les exemples qui vont suivre ont un caractère uniquement illustratif. ExemPle 1 Dans 3 litres d'une solution préparée en dissolvant du glutaraldéhyde dans une proportion de 1 X dans une solution tampon au phosphate 0,2M et en ajustant le pH de la solution résultante à 7,0, on met en suspension 350 g de cellules contenant de l'&alpha;-galactosidase (ayant une activité d'&alpha;-galactosidase de 383,39 x 194 unités/g sur une base sèche) obtenues en cultivant les moisissures de Mortierella vinacea var. raffinose,utilizer et on agite ensuite à 20 C pèndant 1 h 1/2. Lorsque l'agitation est terminée, on lave parfaitement les cellules à liteau distillée et on les récupère par filtration à la trompe.On mesure l'activité d'o(-galactosidase des cellules ainsi obtenues, qui est de 198,83 x 104 unités/g, ce qui indique que le rapport de l'activité résiduelle à 11 activité initiale totale est de 54,1 %. Dans un récipient comportant intérieurement une toile métallique cylindrique, on introduit 2,5 litres d'une solution de sucre de betterave ayant un degré Brix de 30 (ayant une teneur en raffinose de !,245 %) et les cellules traitées par un aldéhyde en une quantité correspondant à 50 x104 unités d'activité d' galactosidase par gramme de raffinose présent. On agite le mélange résultant à 50 C pendant 2 heures pour effectuer l'hydrolyse du raffinose. A la fin de la réaction, on soulève la toile métallique du sécipient pour séparer les cellules de la solution réactionnelle. On prélève une quantité appropriée ae la solution réactionnelle et on l'analyse.On immerge de nouveau les cellules retenues par la toile métallique dans le récipient contenant 2,5 litres d'une solution franche de sucre de betterave et on exécute la réaction dans les mêmes conditions que décrit ci-dessus pour effectuer l'hydrolyse du raffinose contenu dans la solution. En répétant le procédé décrit ci-dessus, on utilise les memqs cellules pendant 252 cycles au total (répartis sur 3 semaines de traitement), la solution de sucre de betterave étant remplacée pour chaque cycle à des intervalles déterminés de 2 heures pour effectuer l'hydrolyse du raffinose. A titre d'essai témoin, les cellules des moisissures qui n'ont pas subi le traitement par le glutaraldéhyde sont utilisées pour l'hydrolyse du raffinose de la même manière que les cellules traitées par le glutaraldéhyde. A la fin du dernier cycle d'hydrolyse, le rapport de 11 activité résiduelle d'O(galactosidase à l'activité initiale totale est de 7Z,1 jo pour les cellules traitées et de 4,9 > pour les cellules non traitées. La figure 2 montre la relation entre le taux d'hydrolyse du raffinose et la durée de la réaction déterminée pour les cellules traitées et les cellules non traitées. Ainsi qu'il ressort de la fig. 2, le taux d'hydrolyse du raffinose dans le cas des cellules traitées reste voisin de 7G A pendant la période entière de la réaction, tandis que dans le cas des cellules non traitées, ce rapport reste voisin de o0 % pendant la première semaine mais diminue ensuite graduellement de sorte que l'hydrolyse du raffinose est virtuellement nulle après 15 jours de traitement. Le taux d'hydrolyse du raffinose est déterminé par chromatographie en phase gazeuse. Exemple 2 Dans 3 litres d'une solution preparée en dissolvant du glutaraldéhyde dans une proportion de 1,0 dans une solution tampon au phosphate 0,2M, la solution résultante ayant été ajustée à pH 7,0, on met en suspension 350 g de cellules congelées (ayant une activité d'&alpha;-galactosidase de 85L,43 x 104 unités/g sur une base sèche) de moisissures d'Absiaia reflexa van tiaem (IFO 5874).et on agite ensuite à 200C pendant 1 h 1/2. On peut. déterminer que les cellules ainsi traitées possèdent une activité d'&alpha;;-galactosidase de 507,15 x 104 unités/g, ce qui indique un rapport de l'activité résiduelle à 11 activité initiale totale de 56,2 % Dans un récipient comportant intérieurement une toile métallique cylindrique comme dans le cas de l'exemple 1, on introduit 2,5 litres d'une solution de sucre de betterave ayant un degré Brix de 30 et les cellules traitées en une quantité telle que l'activité d'&alpha;-galactosidase soit de 500 x 104 unités/g de raffinose présent. On agite le mélange à 500C pendant z heures pour effectuer l'hydrolyse du raffinose.On répète le procédé décrit ci-dessus jusqu'à un total de 144 cycles (répartis sur une période de 12 jours) dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1. A titre d'essai témoin, on tented'ef- fectuer l'hydrolyse dans les memes conditions en utilisant des cellules qui n'ont pas subi de traitement par le glutaraldehyde. A la fin du dernier cycle d'hydrolyse, le rapport de l'activité d'&alpha;-galactosidase résiduelle à l'activité initiale totale est de 15,38 5b dans le cas des cellules traitées et de 1,73 % dans le cas des cellules non traitées. La fig. 3 montre la relation entre le taux d'hydrolyse du raffinose et la durée de la réaction aussi bien dans le cas des cellules traitées que dans le cas des cellules non traitées. Il ressort de la fig. 3 qu'après 12 jours d'utilisation dans l'hydrolyse du raffinose, le taux d'hydrolyse du raffinose est virtuellement nul dans le cas des cellules non traitées, tandis qu'il est voisin de 30 % dans le cas des cellules traitées par l'aldéhyde. Exemple 3 Dans 3 litres d'une solution préparée en dissolvant du glutaraldéhyde à raison de 1,0 % dans une solution tampon au phosphate 0,2M et après avoir ajusté le pH de la solution résultante à 7,0, on met en suspension 350 g de cellules congelées (ayant une activité d' -galactosidase de 1810 x 104 unités/g sur une base sèche) obtenues en cultivant les moisissures dtAbsidia sri- sella var.iauchii (ATCC N 30431) et on agite ensuite à 200C pendant 1 h 1/2. On mesure l'activité d'd-galactosidase des cellules ainsi obtenues, qui est de 1033,21 x 10 unités, ce qui montre que le rapport de l'activité résiduelle à l'activité initiale totale est de 53,8 %. Dans un récipient dans lequel on a placé une toile métallique cylindrique comme dans le cas de l'exemple 1, on introduit 2,5 litres d'une solution de sucre de betterave ayant un degré Brix de 30 et les cellules traitées en une quantité telle que 11 activité d' -galactosidase soit de 500 x unités/g de raffinose présent. On agite le mélange à 500C pendant 2 heures pour effectuer l'hydrolyse du raffinose. On répète le procédé décrit ci-dessus jusqu'à 180 cycles au total (répartis sur une période de 15 jours) dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1. A titre d'essai témoin, on tente d'exécuter l'hydrolyse dans les memes conditions en utilisant les cellules qui n'ont pas subi le traitement par le glutaraldéhyde. A la fin du dernier cycle d'hydrolyse, le rapport de l'activité résiduelle d' -galactosidase à l'activité initiale totale est de 16,90 % dans le cas des cellules traitées et de 1,85 % dans le cas des cellules non traitées. La figure 4 montre la relation entre le taux d'hydrolyse du raffinose et la durée de la réaction aussi bien pour les cellules traitées que pour les cellules non traitées. Il ressort de la fig. 4 qu'après 15 jours d'utilisation dans l'hydrolyse du raffinose, le taux d'hydrolyse du raffinose est virtuellement nul dans le cas des cellules non traitées tandis qu'il est voisin de 37,5 dans le cas des cellules traitées par l'aldéhyde. Exemple 4 Dans la solution tampon ajustée à pH 7,0 de l'exemple 3, on met en suspension 350 g de cellules congelées (ayant una acitivité d'&alpha;-galacto- sidase de 1450 x 104 unités/g sur une base sèche) obtenues par culture des moisissures d'Absidia qrizeo'a (ATCc N 30430) et on agite ensuite à 200C pendant 1 h 1/2. On détermine que les cellules ainsi obtenues possèdent une activité d' > -galactosidase de 792,15 x 104 unités/g et le rapport de l'activité résiduelle à l'activité initiale totale est de 51,9 . Ensuite, on répète l'hydrolyse du raffinose jusqu'à 180 cycles au total dans les memes conditions que dans l'exemple 3, en utilisant les cellules traitées par un aldéhyde ci-dessus et les cellules non traitées, respectivement. A la fin du dernier cycle d'hydrolyse, le rapport de l'acti- vité résiduelle d'&alpha;-galactosidase à 1'- activité initiale totale est de 16,75 X dans le premier cas et de 1,82 % dans le second cas. La fig. 5 montre la relation entre le taux d'hydrolyse du raffinose et la durée de la réaction dans le cas de cellules traitées et de cellules non traitées. I1 ressort de la fig. 5, après 15 jours d'utilisation dans l'hydrolyse du raffinose, que le taux d'hydrolyse du raffinose est virtuellement nul dans le cas des cellules non traitées tandis qu1iî est voisin de 37 % dans le cas des cellules traitées. R E V E N D I C A T I O N S 1. Procédé de fixation d W-galactosidase dans des cellules, selon lequel un microorganisme producteur d'&alpha;-galactosidase est cultivé au sein d'un milieu et l' > -galaactosidase produite dans les cellules est fixée dans celles-ci à l'aide d'un composé organique, ce procédé étant caractérisé par le fait qu'on traite un microorganisme contenant de l'&alpha;-galactosidase avec une solution contenant 0,2 à 10 % en poids de glutaraldéhyde. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la solution contenant du glutaraldéhyde est formée par addition de glutaraldéhyde à une solution tampon. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le microorganisme producteur d' -galactosidase est une moisissure. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le microorganisme contenant de l'&alpha;-galactosidase est ajouté à la solution dans une proportion de 10 à 30 g (sur une base sèche) pour 100 ml de ladite solution. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le pH de la solution possède une valeur comprise entre 5,2 et 8,. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la solution contenant le microorganisme producteur d' -galactosidase est agitée à 10-500C pendant 1/2h à 2 heures 1/2.