Brevet FR2276859A1 — publié le 19760130

L'Invention, due à Kar BUCHTA, Mohamed ABDOU et Harald WOLTERSDORF, a pour objet un assemblage en filtres à base de membranes ou filtre-membranes désignés ci-après par l'expression "membranes filtrantes" et de matériau poreux, le procédé pour la fabrication de cet assemblage et son utilisation en tant que support de milieux nutritifs pour des recherches microbiologiques. On sait fabriquer des membranes filtrantes de perméabilité graduée selon différentes méthodes et à partir de différents matériaux. Elles sont constituées par exemple d'une mince pellicule de solutions collo#dales, comme par exemple la gélatine, le collodium, l'acide silicique, des esters cellulosiques ou la cellulose, qui forment, lors de l'évaporation et de la coagulation, une charpente dont les cavités présentent une structure spongieuse. Suivant le mode de fabrication. on peut faire varier les sections des pores dans un large domaine, de sorte qu'on peut séparer par tamisage par exemple des bactéries et même des particules jusqu'aux dimensions moléculaires. Normalement, les membranes filtrantes ont besoin d'être soutenues lors de la mise en oeuvre par un support, dans le cas de dimensions relativement grandes le plus souvent par des plaques perforées ou frittées, puisque, par elles-##mes, elles ne présentent pas la résistance mécanique nécessaire. Pour de nombreuses utilisations, il serait souhaitable de pouvoir disposer d'un assemblage solide, constitué d'une membrane filtrante et d'un support poreux, dans lequel seraient conservées intégralement et sans modification les propriétés de la membrane filtrante d'une part, et celles du support poreux d'autre part. Un procédé connu consiste à coller à l'aide d'un produit adhésif la membrane filtrante sur un support poreux, mais ce procédé présente l'inconvénient que l'adhésif peut modifier de façon inpré- visible les propriétés du système membrane filtrante/support poreux. On sait également imprégner un support poreux d'une solution, à partir de laquelle une membrane filtrante se forme lors du séchage, de sorte que la couche membraneuse se forme au moins par tellement au sein du matériau poreux. Les propriétés du produit ainsi formé sont cependant différentes de celles des composants séparés ; la surface en particulier ne présente plus l'aspect lisse d'une membrane filtrante, indispensable pour de nombreuses opérations, mais elle reflète la structure du support poreux. Dans le cas d'un support poreux imprégné d'une solution nutritive et séché, par exemple un disque en carton, destiné à être utilisé dans des essais d'inhibition bactériologiques dif férentiels, il est nécessaire d'accoler au support poreux une membrane filtrante. On ne peut former cet assemblage ni par col langez ni en imprégnant le matériau poreux avec la matière génératrice de la membrane filtrante puisque, d'une part, la couche adhésive agit de façon imprévisible sur 13 diffusion des éléments nutritifs entre le support poreux et la membrane filtrante et, d'autre part, l'absence de surface lisse et propre de la membrane empêche par exemple la formation de plaies d'inhibition concentriques dans l'essai d'antibiotiques. On se propose donc selon l'invention de réaliser un assemblage membrane filtrante/support poreux, dans lequel seraient conservées intégralement les propriétés des deux composants et évités les inconvénients de l'état actuel de la technique. Conformément à l'invention, le problème est résolu par un assemblage, exempt de produits adhésifs, constitué de membranes filtrantes et de matériau poreux sous forme de deux couches nettement distinctes conservant inaltérées leurs propriétés respectives, lequel assemblage est caractérisé par le fait qu'on met en contact avec le matériau poreux une membrane filtrante à base de substances polymères, pendant que le générateur polymère de membrane se trouve à l'état de gel, et qu'on effectue ensuite la solidification. On forme ainsi l'assemblage défini plus haut de membrane filtrante et de support poreux. A l'aide d'un tel assemblage on peut, par exemple dans des essais d'inhibition bactériologiques, faire des observations non seulement qualitatives, mais aussi quantitatives. Conformément à un mode de réalisation particulier, on peut fabriquer un tel assemblage de la façon suivante Sur un ruban sans fin à degré de polissage élevé. on applique de façon connue une solution apte à la formation d'une membrane. Comme substances génératrices de membrane, on utilise en particulier le nitrate de cellulose, l'acétate de cellulose, la gélatine, le chlorure de polyvinyle, l'acétate de polyvinyle, un polyamide ou un alginate. Du fait de l'avancement du ruban, la solution appliquée traverse des zones climatiques déterminées, par exemple de la façon décrite dans le brevet DT 1.017.596. Durant ce processus, les solvants s'évaporent et on obtient finalement sous forme de substance solide un produit poreux, superficiels à savoir la membrane filtrante. Entre la phase de solution et le stade d'obtention du filtre solide. la substance polymère génératrice de membrane traverse une étape où elle se trouve à l'état de gel. Lorsqu'on met en contacts avec précaution, au cours de cette étape un support poreux, par exemple un ruban en carton, avec ce gel, le filtre en voie de formation adhère solidement à ce matériau poreux et s'y solidifie. On met de préférence la membrane filtrante en voie de formation en contact avec le matériau poreux entre le commencement de la synérèse et le début de la solidification définitive qui s'annonce par un aspect en fleurs de givre de la pellicule étalée. Quand le processus de formation est terminé, la membrane filtrante aussi bien que le support poreux constituent bien un assemblage, tout en conservant cependant inchangée et nettement perceptible leur forme antérieure. Ce résultat se manifeste surtout par l'état superficiel impeccable de la membrane. D'une façon analogue, on peut appliquer une seconde membrane sur l'autre côté du matériau poreux. L'adhérence entre les deux composants est très bonne et, sans action extérieure, il ne se produit pas de séparation du support poreux etde la membrane filtrantet. On peut réaliser, à volonté, une adhérence plus ou moins forte en mettant en contact le matériau poreux avec la membrane à l'état de gel plus au début ou plus vers la fin de l'état gélifié de la substance génératrice de la membrane. L'assemblage selon l'invention. constitué de la membrane filtrante et d'un matériau poreux, en particulier du carton d'une épaisseur d'environ 1 à 2 mm, convient surtout aux essais microbiologiques, dans lesquels la formation de plages d'inhibition circulaires, nettement délimitées. est souhaitable sinon indispensable. Dans ces essais, l'assemblage a, après imprégnation avec une solution nutritive habituelle pour microorganismes, la même fonction que des produits tels que l'agar-agar ou la gélatine, utilisés habituellement à la solidification de milieux nutritifs. L'assemblage imprégné ("carton nutritif") peut être. après stérilisation, immédiatement utilisable à des fins microbiologi ques. Il est cependant également possible de sécher l'assemblage imprégné, de le couper en morceaux de contours déterminés, par exemple des disques circulaires, et de conserver ceux-ci, après stérilisation, à l'état stérile. Au moment voulu, on peut, en les mouillant avec de l'eau stérile, préparer rapidement un milieu de culture utilisable de la façon habituelle. Après développement et, le cas échéant, après coloration des cultures, on peut sécher les "cartons nutritifs" et, après les avoir recouverts d'une pellicule, on peut les conserver comme documents permanents. Les avantages de l'assemblage selon l'invention apparaissent surtout dans les essais microbiologiques qui, du fait des propriétés reproductibles du milieu de culture, permettent une standardisation des essais. Cette possibilité s'offre surtout, lorsqu'on utilise des milieux nutritifs synthétiques i c'est-à-dire des milieux nutritifs qui ne sont pas constitués de mélanges de substances généralement utilisées (peptones, extraits de viande, extraits de levure) et d'autres additifs, mais de composés bien définis. Un milieu nutritif synthétique de ce genre peut présenter la composition suivante Solution I g/litre Composants L-arginine 0,523 acide L-aspartique 1,065 L-cystéine 0,485 acide L-glutamique 2,207 Glycocolle 0,15 L-histidine 0,31 L-leucine 0,787 L-isoleuc ine 0,525 L-lysine 0,585 L-méthionine 0,298 L-phénylalanine 0,33 L-proline 0,345 L-thréonine 0,357 L-triptophane 0,102 L-tyrosine 0,362 L-valine 1,17 NaCl 2,92 KCl 0,298 Acétate de Na anhydre 0,984 Pyruvate de Na 1,1 Glycérophosphate de Na . 5H2O 5,2 Mg SO4 . 7 H2O 0,049 Adénine 0,009 Guanine 0,009 Uracile 0,011 eau distillée 950,0 mi Solution II g/litre Composants 1198 Inositol 0,011 chlorure de choline 0,014 nicotinamide 0,011 chlorhydrate de thiamine 0,01 riboflavine 0,001 chlorhydrate de pyridoxine 0,006 pantothénate de Ca 0,01 acide folique 0t009 biotine 0,0002 Glycérophosphate de Na . 5 H20 1,04 p-Nitrophénylpropanetriol 0,005 pimaricine 0,30 eau distillée 50,0 ml Solution III Lessive de soude aqueuse à 10%. *) Les indications se rapportent à la quantité d'eau distillée totale utilisée pour la préparation des solutions I et II, à savoir, dans l'exemple présent : 950 ml + 50 ml. La préparation s'effectue de la façon suivante 1. On dissout les ingrédients, indiqués sous I, dans 950 ml d'eau distillée et on stérilise la solution durant 20 minutes dans l'autoclave à la température de 1210C. 2. On dissout le glucose, les vitamines et les substances de croissance, indiquées sous Il, dans 50 ml d'eau distillée et on stérilise la solution par filtration stérilisante à travers une membrane filtrante presentant des dimensions de pores de 0,22 micron. 3. On stérilise la lessive de soude a 10% par chauffage durant 20 minutes dans l'autoclave la température de 121 C. 4. On chauffe chacune des solutions I et Il à la température de 55 C, puis on les réunit et on établit dans la solution ainsi formée, à l'aide de la solution III, un pH de 7,2 à la température de 470C. On peut choisir pour les ingrédients dans les solutions I et Il aussi d'autres quantités. On peut les réduire par exemple de moitié ou on peut les doubler. En général, il n'est cependant pas indiqué d'omettre complètement l'un des ingrédients, par exemple un acide aminé, ou de modifier sensiblement le pH du mélange. L'utilisation des milieux dans un pesai étalonné n'est possible qu'à condition que les modifications n'exercent pas d'influence essentielle sur la croissance des micro-organismes et, de ce fait, sur la grandeur des plages d'inhibition formées au cours de l'essai. On peut réaliser l'essai de la façon suivante On dispose l'assemblage selon l'invention (disque circulaire de diamètre correspondant), imprégné de la solution nutritive, dans une boîte de Pétri, la couche formée par la membrane tournée vers le haut, et on l'ensemence avec une quantité déterminée de l'échantillon (le cas échéant après diiution) à examiner. On répartit ensuite sur la membrane de petits disques de papier filtre d'environ 4 mm de diamètre, chargés de quantités déterminées de substances actives antimicrobiennes (antibiotiques, sulfonamides) et on incube la boite de Pétri durant environ 15 à 24 heures à une température déterminée (par exemple 36 + 1 C). Pour une charge en substance active déterminée sur les petits disques de papier réactif, il existe (à une densité de microorganismes donnée, déterminée de façon habituelle) un rapport entre le diamètre de la plage d'inhibition et la concentration inhibitrice minimale de la substance active qui est en jeu. D'un autre côté, on connaît, pour les substances actives courantes, le taux sanguin maximal à atteindre, c'est-à-dire thérapeutiquement admissible. Il est par conséquent possible d'évaluer à l'aide du diamètre de la plage d'inhibition la possibilité d'utilisation d'une substance active antimicrobienne. Lorsqu'on effectue l'essai avec une solution nutritive étalonnée dans des conditions standardisées, on obtient avec l'assea- blage selon l'invention des résultats reproductibles. Ceci n'est pas possible avec des moyens connus comparables, par exemple des cartons recouverts d'une membrane selon la demande de brevet DT 2.320.946. Un autre essai expérimental, dans lequel on utilise des "cartons nutritifs" selon l'invention avec un avantage tout particulier est décrit dans la demande de brevet DT n0 P 23 01 211, ou encore dans la demande de brevet NL 74 00336. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire, toutes les variantes. REVENDICATIONS 1. Assemblage, exempt de produits adhésifs, constitué de membranes filtrantes et de matériau poreux sous forme de deux couches nettement distinctes conservant inaltérées leurs pro priétés respectives, lequel assemblage est caractérisé par le fait qu'on met en contact avec le matériau poreux une membrane filtrante à base de substances polymères, pendant que le généra teur polymère de membrane se trouve à l'état de gel, et qu'on effectue ensuite la solidification. 2. Assemblage selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la substance polymère génératrice de membrane est le nitrate de cellulose, l'acétate de cellulose, la gélatine, le chlorure de polyvinyle. l'acétate de polyvinyle. un polyamide ou un alginate. 3. Assemblage selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que le support poreux est constitué de carton. 4. Assemblage selon la revendication 3, caractérisé par le fait que le support poreux est constitué de carton en fibres de cellulose. 5. Assemblage selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que le matériau poreux est imprégné d'une solution nutritive pour micro-organismes. 6. Assemblage selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que le matériau poreux est imprégné d'une solution nutritive pour micro-organismes et séché. 7. Assemblage selon l'une quelconque des revendications 5 et 6, caractérisé par le fait que la solution nutritive contient, par litre d'eau, environ 0,25 à 1 g de L-arginine, 0.5 à 2 g d'acide L-asparatique, 0,25 à 1 g de L-cystéine, 1 à 4 g d'acide L-glutamique. 0,1 à 0,4 g de glycocolle, 0,15 à 0,6 g de L- histidine, 0,4 à 1,6 g de L-leucine, 0,25 à 1 g de L-isoleucine, 0,3 - 1,2 g de L-lysine, 0,15 à 0,6 g de L-méthionine, 0,15 - 0,6 g de L-phénylalanine, 0,2 - 0,8 g de L-proline. 0,2 à 0,8 g de L-thréonine, 0,05 à 0,2 g de tryptophanes 0,2 à 0,8 g de Ltyrosine, 0,5 à 2 g de L-valine, 1,5 à 6 g de chlorure de sodium, 0,15 à 0,6 g de chlorure de potassium, 0,5 à 2 g d'acétate de sodium anhydre, 0,5 à 2 g de pyruvate de sodium, 3 à 12 g de glycérophosphate de sodium pentahydraté, 0,025 à 0,1 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,005 à 0,02 g d'adénine, 0,005 à 0,02g de guanine, 0,005 à 0,02 g d'uracile. 1 à 4 g de D-glucose, 0,005 à 0,02 g d'inosîtol, 0,005 à 0,02 g de chlorure de choline, 0,005 à 0,02 g de nicotinamide. 0,005 à 0,02 g de chlorhydrate de thiamine, 0, 0005 à 0,002 g de riboflavine, 0,003 à 0,012 g de chlorhydrate de pyridoxine. 0,005 à 0,02 g de pantothénate de calcium, 0,005 à 0,02 g d'acide folique, 0,0001 à 0,0004 g de biotine, 0,0025 à 0,01 g de p-nitrophénylpropanetriol, 0,05 à 0,2 g de pimaricine et la quantité de solution aqueuse diluée d'hydroxyde de sodium nécessaire pour amener le pH à 7,2. 8. Procédé de fabrication de l'assemblage selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 à partir d'une solution apte à former une membrane, comprenant l'application de la solution sur unsupportr l'évaporation du solvant et la solidification de la membrane filtrante ainsi formée, caractérisé par le fait que, après la phase de solution et avant le stade d'obtention du filtre solide, pendant que la substance polymère génératrice de membrane se trouve à l'état de gel, on met en contact avec le gel, avec précaution, un matériau poreux et qu'on solidifie sur le matériau poreux le gel de la substance polymère génératrice de membrane qui y adhère. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait qu'on met la membrane filtrante en voie de formation en contact avec le matériau poreux entre le commencement de la syn~- rèse et le début de la solidification définitive qui s'annonce par un aspect en fleurs de givre de la pellicule étalée. 10. Utilisation de I'assemblage selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 à l'identification de substances actives antimicrobiennes thérapeutiquement utilisables, laquelle utilisation est caractérisée par le fait qu'on incube l'assemblage imprégné de solution nutritive, après l'avoir ensemencé avec une quantité déterminée d'un échantillon d'essai et après avoir appliqué de petits disques circulaires en papier dont chacun est chargé d'une quantité déterminée d'une substance active#antimicrobienne, durant environ 16 à 24 heures à une température d'environ 35 à 37"cet qu'on détermine ensuite à l'aide des diamètres des plages d'inhibition formées en tenant compte de la densité des germes et de la relation entre le diamètre de la plage dtinhibition et la concentration inhibitrice minimale, les thérapeutiques qui présentent un effet bactéricide à l'égard des germes à combattre.