Brevet FR2269964A1 — publié le 19751205

La présente invention concerne un procédé pour l'obtention d'extraits hydrosolubles-acétylés de faibles poids moléculaires provenant de cellules d'Escheriohia coli, les extraits hydrosolubles ainsi obtenus et les compositions pharmaceutiques les contenant. L'invention a également pour objet l'application des extraits hydrosolubles comme adjuvants -immunologiques. Selon la présente invention, les extraits hydrosolubles ont un poids moléculaire compris entre 1 000 + 200 et 8 000 + 200 et, contiennent de l'acide diaminopimélique (DAP). Le procédé selon la présente invention consiste à soumettre à une acétylation les résidus bactériens délipidés de cellules d'Escheriehia Coli et à isoler les extraits hydrosolubles par des moyens physico-ehimiques classiques connus ; les extraits hydrosolubles ainsi obtenus sont avantageusement purifiés par mise en oeuvre de moyens physico-chimiques classiques. On effectue également l'acétylation dans un mélange d1anhy- dride acétique et de pyridine, contenant de préférence 2 volumes d'anhydride acétique pour 3 volumes de pyridine à une température comprise entre 20 et 350C. La réaction est complète après agitation pendant une durée variant entre 50 et 75 heures. Les cellules d'Eseherflchia Coli mises en oeuvre dans le procédé selon l'invention sont au préalable soumises à une délipidation en utilisant par exemple la méthode décrite par A. Aebi et alull.Soc.Chim.3iol., D5, 66i (I953.Toutes les variétés atES- cherichia Coli peuvent être utilisées dans le procédé de l'inven- tion, toutefois on préfère utiliser des cellules d'Escherichia Coli B (variété non virulente). On isole ensuite les extraits hydrosolubles par extraction à l'alcool suivie d'une extraction à l'eau. Selon une variante préférée de l'invention, les extraits hy drosolubles sont isolés de la manière suivante - traitement du milieu réactionnsl, obtenu après acétylation par de l'alcool - séparation de l'insoluble par centrifugation - concentration de la solution alcoolique - traitement du résidu ainsi obtenu par de lilu distillée - séparation de la fraction insoluble dans liteau par centrifugation et - lyophilisation de la couche aqueuse surnageante qui contient les extraits hydrosolubles acétylés, qui sont donc à la fois solubles dans le mélange alcool-pyridine et dans l'eau. De façon préférée, on utilise alors un mélange alcoolpyridine dans des proportions relatives voisines de 10:1 en volume. Dans le présent procédé, toutes les étapes de centrifugations sont réalisées avantageusement à basse tempéfature, de préférence å une température comprise entre 0 et 60C environ. Selon une variante particulièrement préférée de l'invention, les extraits hydrosolubles sont purifiés et séparés en leurs constituants par des méthodes physico-chimiques appropriées, notamment par chromatographie sur des absorbants, tels que b cellulose, le produit connu sous la dénomination commerciale "DEAE-Biogel A", ou par filtration sur un gel de polyacrylamide en utilisant par exemple les produits connus sous les dénominations commerciales Biogel P10", "Biogel P6"-ou "Biogel P4". Les extraits hydroselubles ainsi obtenus, qui sont un autre objet de la présente invention, sont constitués essentiellement d'un mélange en proportions variables de fragments hydrosolubles acétylés de la paroi cellulaire éventuellement associés à des suores réducteurs non aminés acétylés. La quantité de fragments hydrosolubles de la paroi cellulaire contenus dans les extraits hydrosolubles selon l'invention varie en fonction des conditions particulières de mise en oeuvre du procédé selon l'invention et notamment de l'étape de purification. Les fragments hydrosolubles de la paroi cellulaire sont cons titués essentiellement par un disaccharide-tétrapeptide, par un tétrasaccharide-heptapeptide et les dimère, trimère et tétramère de ce dernier. Le disaccharide-tétrapeptide a la composition moléculaire suivante : N-acétylglucosamine (1), acide N-acétYlmuramique (1), alanine (2), acide glutamique (1), acide diaminopimélique ( et son squelette peut Autre représenté par le schéma suivant dans lequel NAG = N-acétylglucosamine NAM = acide N-acétylmuramique Ala = alanine Glu = acide glutamique DAP = acide diaminopimélique Le tétrasaccharide-heptapeptide a la composition moléculaire suivante :N-acétylglucosamine (2), acide N-acétylmuramique (2), alanine ( acide glutamique (2), acide diaminopimélique (2)et son squelette peut être représenté par le schéma suivant Les sucres réducteurs non aminés sont constitués essentiellement par le glucose,et éventuellement par le mannose et le galactose. La constitution des extraits hydrosolubles acétylés ainsi obtenus peut être mise en évidence par les méthodes habituelles de détermination des teneurs en aminoacides > en sucres aminés et en sucres non réducteurs non aminés. L'activité des extraits hydrosolubles selon la présente invention étant liée à la présence d'acide diaminopimelique, il est particulièrement intéressant d'isoler, à partir du mélange brut, des substances qui sont présentes enqlantités suffisamment importantes et qui ont une forte teneur en acide diaminopimélique. On peut ainsi isoler,en mettant en oeuvre des procédés de purification tels que définis ci-dessus, des extraits hydrosolubles contenant principalement du tétrasaccharide-heptapeptide acétylé associé ou non à des sucres réducteurs non aminés acétylés. Les extraits hydrosolubles obtenus selon la présente invention ou leurs constituants possèdent des activités biologiques intéressantes. Ce sont des adjuvants immunologiques et des immunostimulants qui ne manifestent pas d'activité arthrogène. Le pouvoir adjuvant est détermine chez le cobayeysouche Hartleyt selon le principe de la méthode de R.G. White et roll. Immunology, 1, 158 (1964t, et les pouvoirs arthrogene et protecteur selon les méthodes décrites par F. Bonhomme, C.R. Acad.Sci., série D, 263, 1422 (1966) et C.R.Acd. Sei., Série D, 26t, 2115 (1967). Chez le cobaye, les extraits hydrosolubles selon l'invention provoquent une augmentation du taux dtanticorps à des doses supérieures ou égales à 0,1 mg par voie intradermique. Chez la souris, à la dose de 25 mg/kg par voie intra-veineuse, les extraits hydrosolubles augmentent de façon significative le nombre des cellules spléniques formant des plages d'hémolyse selon la technique de N.K. Jerne et A,A. Nardin, Science; 140, 4 5, (I965). Les produits selon l'invention sont utilisables en thérapeutique humaine ou vétérinaire pour favoriser la résistance aux infections d'origine virale ou bactérienne. Ils provoquent une augmentation de la formation d'anticorps utiles contre les organismes pathogènes et ils peuvent être adjoints à l'administration de vaccins pour assurer le maximum de réaction d'anticorps. La présente invention concerne également les compositions pharmaceutiques qui contiennent les extraits hydrosolubles selon l'invention en association avec un ou plusieurs diluants ou ad jusants compatibles et éventuellement avec d'autres médicaments tels que des antibiotiques, des décongestifs ét des vaccins. Dans ces compositions la teneur en produit selon l'invention est généralement supérieure à 0,1 %. Ces compositions-peuvent être utilisées par voie orale, rectale, parentérale ou en aérosols. En thérapeutique humaine, les doses dépendent de l'effet recherché. Elles peuvent être comprises entre 10 et 50 mg par jour pour un adulte. L'exemple suivants donné à titre non limitatif, illustre la présente invention. EXEMPLE 20 g de résidus bactériens délipidés, obtenus a' partir de cellules d'Escherichia Coli B selon la méthode de A Aebi et roll., Bull.Soc.Chim.Biol., )5, 661 (I953), sont agités pendant 66 heures à 280C dans 50Ocm3 d'un mélange anhydride acétiquepyridine (2-3 en volume). On ajoute alors 5000 cm3 d'éthanol puis agite pendant encore 5 heures. La partie insoluble est séparée par centrifugation (4000 tours/mn). La couche surnageanteaest concentrée jusqu a siccité sous pression réduite. Le résidu est repris par 100 cm3 d'eau. La partie insoluble dans l'eau est séparée par centrifugation (4000 tours/mn). Après lyophilisation de la couche surnageante, on obtent 2 g d'extrait hydrosoluble acétylé brut. REVENDICATIONS 1. Procédé pour l'obtention d'extraits hydrosolubles acétylés de faibles poids moléculaires et contenant de l'acide diaminopimélique, à partir de cellules d'Escherichia Coli, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre à une aeétylation les résidus bactériens délipidés de cellules d'Escherichia Coli et à isoler les extraits hydrosolubles par mise en oeuvre de moyens physicochimiques. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits extraits hydrosolubles obtenus sont en outre soumis à une étape de purification. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2 > caractéri- sé en ce que l'acétylation est effectuée à l'aide d'un mélange d'anhydride acétique et de pyridine. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'acétylation est effectuée à l'aide d'un mélange anydride acéti- que-pyridine constitué de 2 volumes d'anhydride acétique pour 9 volumes de pyridine à une température eomprise entre environ 20 et 35 C pendant entre environ 50 et 75 heures. 5. Procédé selon ltune quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les extraits hydrosolubles sont isolés par extraction à l'alcool, suivie d'une extraction à leau et d'une lyophilisatlon. 6. Procédé selon la revendication 5 > caractérisé en ce que l'alcool est de l'éthanol. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les extraits hydrosolubles sont isoléspar traitement à l'aide d'éthanol, élimination de l'insoluble, dessication du surnageant éthanolique, qui est repris par de l'eau distillées élimination de la fraction insoluble dans l'eau et lyophilisation de la couche aqueuse surnageante ainsi obtenue. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que les extraits hydrosolubles sont purifiés par filtration et/ou par chromatographie sur adsorbant. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la chromatographie est effectuée sur DEAE-cellulose ou sur le produit connu sous la dénomination eommerciale "DEAE-Biogel An. 10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé entre que la filtration est réalisée sur du gel de polyacrylamide, tel que par exemple sur les produits connus sous les ddnominations com mereiales nBiogel P10", WBiogel p6n ou tBiogel P4". 11. Extraits hydrosolubles acétylés de faible poids moléculaire et contenant de l'acide diaminopimélique caractérisi en ce qu'ils sont obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10. 12. A titre de nouveaux produits, les extraits hydrosolubles acétylés de faible poids moléculaire et contenant de l'acide diaminopimélique, caractérisés en ce que leur poids zolé-culaire est compris entre 1000 + 200 et 8 000 + 200 et en ce qu'ils sont constitués par des fragments hydrosolubles de la paroi cellulaire d'Escherichia Coli éventuellement associés à des sucres réducteurs non aminés acétylés. 13. Extraits selon la revendication 12, caractérisés en ce que lesdits extraits hydrosolubles sont constitués d'un mélange d'un disaccharide-tétrapeptide acétylé et d'un tétrasaccharide- heptapeptide acétylé, associés ou non à des sucres réducteurs non aminés acétylés. 14. Compositions pharmaeeutiques, caractérisées en ce qu'elles contiennent une quantité efficace d1au moins un extrait hydrosoluble acétylé défini à l'une quelconque des revendications 11 i 13 en association avec un diluant ou un adjuvant compatible et pharmaceutiquement acceptable.