Brevet FR2273067A1 — publié le 19751226

La présente invention concerne le traitement des bactéries en vue d'en extraire les peptidoglycanes contenus dans leurs parois. I1 est connu que l'on peut extraire, des parois des bactéries et notamment des bactéries à gram négatif, des peptidoglycanes carite- nant des sucres aminés et des acides aminés, ces acides étant notamment l'acide glutamique, llalanine et l'acide diaminopimélique. I1 est également connu que ces peptidoglyeanes constituent un agent à activité pharmacologique susceptible d'être utilisé comme adjuvant d 'immunité. En d'autres termes, cet agent est capable de stimuler les réponses immunitaires de l'homme et des animaux à l'égard d'antigènes à caractère pathogène.Dans ses applications pharmaceutiques, un tel agent est donc avantageusement administré en association avec des vaccins contenant des antigènes déterminés, dans le but d'améliorer l'immunité conférée par les vaccins en augmentant la production des anticorps correspondants. Pour extraire les peptidoglycanes des bactéries à gram négatif il convient d'éliminer le matériel cytoplasmique, puis les couches superficielles lipoprotéiques et lipopolysaccharidiques des parois, ainsi qu'une lipoprotéine normalement liée au peptidoglyeane. Les procédés d'extraction du peptidoglycane que lton connaît actuellement sont dans ces conditions particulièrement complexes. On connaît des procédés qui comportent un traitement de solubilisation des matières à éliminer par des enzymes protéolytiques. Toutefois, il est nécessaire de procéder à une désintégration préalable des bactéries, suivie de centrifugations différentielles et de nombreux lavages. Ges opérations entraînent une perte de matière importante. les bactéries désintégrées doivent ensuite subir plusieurs traitements enzymatiques, combinés rades traitements par du dodécylsulfate de sodium, qui ont pour but d'éliminer tant le matériel cytoplasmique que les autres couches pariétales des bactéries. Généralement, on procède à des traitements par des nucléases (DNAses et RNAses) pour enlever le matériel cytoplasmique, puis à des traitements par des protéases telles la trypsine, deux traitements successifs par les protéases étant nécessaires pour enlever, d'une part, la couche lipoprotéique externe et, d'autre part, la lipoprotéine liée au peptidoglycane. Malgré leur complexité, ces techniques sont encore peu efficaces. les peptidoglycanes séparés sont obtenus en quantité relativement faible par rapport aux peptidoglycanes initialement contenus dans les bactéries traitées. De plus, ils sont très impurs et contiennent encore notamment des acides aminés étrangers à ceux des peptidoglycanes. L'invention a pour objet un procédé qui, vis-a-vis des prov- dés connus, permet d'améliorer à la fois le rendement d'extraction des peptidoglycanes et la pureté de ces derniers, et qui, cependant, est plus simple dans sa mise en oeuvre. Dans ce but, l'invention fait appel à une autolyse des bactéries, réalisée en l'absence d'enzymes. Ainsi, l'invention a pour objet un procédé de traitement de bactéries, et notamment de bactéries à gram négatif, qui comporte au moins une étape d'autolyse consistant à mettre en contact les bactéries avec un milieu à un pli propre à provoquer la lyse des bactéries en l'absence d'enzymes. De préférence, l'autolyse est as surée en soumettant les bactéries, alors qu'elles sont en phase logarithmique de croissance, à un pH nettement acide ou basique. Par phase logarithmique de croissance, on entend ici que les bactéries sont traitées à partir d'une culture où elles se développent en respectant une loi logarithmique de variation de la densité des bactéries dans le milieu de culture en fonction du temps. Si, d'une manière générale, on considère l'évolution de la densité des bactéries dans un milieu de culture, on constate que la croissance se produit selon les courbes analogues à celles qui sont tracées sur la figure . Sur cette figure, on a pOrté, en foncticri du telmps(en heures), les variations de la densité optique (Des ) dtun milieu de culture sur une échelle logarithmique des ordonnées, cette densité optique constituant une expression de la densité des bactéries. les courbes (a), (b), (c) de la figure 1 sont relatives, respectivement, à des bactéries du type Proteus, Mo axella et Neisseria.Dans chaque cas, on observe un début de croissance relativement lent, suivi d'une partie des courbes ascendantes sensiblement linéaire, avant un ralentissement, les courbes tendant finalement vers une asymptote horizontale. les bactéries sont dites en phase logarithmique de croissance dans l'intervalle de temps correspondant à la partie ascendante sensiblement linéaire de la courbe. Elles sont dites, au contraire, en phase stationnaire lorsque la densité optique ne varie pratiquement plus avec le temps. La mise en oeuvre de l'autolyse conformément au procédé selon l'invention s'effectue avantageusement sur des bactéries en phase logarithmique de croissance et, de préférence, sur des bactéries se trouvant dans la première moitié de la phase logarit mloue de croissance, c'est-à-dire après un temps de culture qui correspond à la première moitié de la partie ascendante sensiblement linéaire des courbes ci-dessus. les bactéries peuvent être séparées du milieu dans lequel s'effectue la croissance, et introduites ensuite, le plus rapidement possible après leur prélèvement, dans un milieu au pli approprié pour assurer l'autolyse. On peut également provoquer l'autolyse directement dans le milieu de culture, en amenant celui-ci au pH approprié par addition d'une solution acide ou Dasique. L'invention a également pour objet un procédé d'extraction des peptidoglycanes à partir de bactéries, et notamment à partir de bactéries à gram négatif, qui se caractérise en ce que l'on fait subir une autolyse aux bactéries avant de les soumettre à un traitement par une enzyme protéolytique. L'autolyse est avantageusement réalisée dans les conditions qui ont été précisées ci-dessus. Ainsi, selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon l'invention, on cultive les bactéries, on leur fait subir une autolyse en les soumettant, alors qu'elles sont en phase logarithmique de croissance, à un pli nettement acide ou basique, notamment à un pi inférieur à 5 ou, de préférence, à un pH supérieur à 9, on sépare le résidu solide et on le soumet à un traitement par une enzyme protéolytique pour le débarrasser des matières lipoprotéiques liées aux peptidoglycanes. Ce procédé s'applique autraitenent de toutes bactéries à gram négatif ou à gram positif, quilles soient pathogènes ou non pathogènes. Il s'applique d'une manière particulièrement avantageuse su traitement des bactéries à gram nti di type des Proteus, Moraxella, Bacillus megaterium et Escherichia coli, ou des bactéries apparentées. Dans le procédé objet de l'invention, l'extraction des peptidoglycanes est considérablement simplifiée Par rapport aux procédés antérieurement connus. En effet, l'autolyse rend inutiles les opérations préalables de désintégration mécanique des bactéries et les centrifugations différentielles. Tout traitement par des nucléases peut également entre supprimé et, en outre, un tritement unique par une enzyme protéolytique telle que la trypsine et sfisant. De plus, le procédé selon l'invention perme-t d'obtenir des peptidoglycanes d'une très grande pureté avec un excellent rendement. Il a été observé en particulier que, contrairement aux procédés antérieurement connus, le procédé selon l'invention permet dans l'étape d'autolyse, de détruire sélectivement le matériel cytoplasmique, le peptidoglycane restant intact. Dans la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, il est avantageux de soumettre à l'autolyse des bactéries prélevées pendait la première moitié de la phase de croissance logarithmique, soit notamment après un temps de culture de l'ordre de 5 à heures en milieu nutritif du type "Standard I" de Merck, à 37 C. C'est dans ces conditions que l'autolyse subséquente est aparue la plus rapide et la plus efficace, et, bien que la concentration de la culture soit alors nettement fr-êrieure à ce qu'elle serait si l'on attendit d'atteindre la phase stationnaire, le procédé selon l'invention pernet finalement, et contrairement à ce que les connaissances acquises à ce jour laissaient prévoir, d'obtenir un meilleur rendement en peptidoglycanes que les procédés antérieurs. lorsque les bactéries sont prélevées e séparées de leur milieu de culture, il est souhaitable d'assurer l'autolyse des bactéries le plus rapidement possible après leur prélèvement. En général, on préfère ajouter directement dans le milieu de culture contenant les bactéries en phase de croissance logarithmique, une solution acide ou basique appropriée. Des résultats particulièrement satisfaisants peuvent être obtenus en utilisant une solution tampon carbonate-bicarbonate concentrée, que l'on ajoute au milieu nutritif initial jusqu'à ce que la concentration saline 3ans celuici atteigne une valeur suffisante, qui peut être notamment de l'ordre de 0,1 N. Dans un premier mode de mise en oeuvre du procédé objet de l'invention, où l'autolyse s'effectue en lieu acide, ii est avantageux de laisser les bactéries incuber dans ce milieu, de préférence à un pli infrieur à-5, pendant au moins un temps de l'ordre de 2 heures. Un second norme de mise en oeuvre du procédé, où l'autolyse s'effectue en milieu basique, est généralement plus avantageux que le précédent, car la lyse est alors plus rapide t plus complète. Dans ce cas, le pH étant de préférence supérieur à 10, un temps d'incubation de l'ordre de 5 à 30 minutes peut être sufQi- ant. Ce temps peut cependant être prolongé sans inconvénient aaeur. Après le traitement d'autolyse, le procédé selon l'invention comporte, ainsi qr'on l'a déjà indiqué, un traitement enzymatique qui est cependant considérablement simplifié par rapport aux procédés antérieurs. Ce traitement, portant sur le résidu séparé par centrifugation après l'autolyse, peut être réalisé selon toute technique en elle-même classique. Une enzyme préférée est constituée par la trypsine, et le traitement s'effectue généralement en 7aissant le résidu incuber, en présence de cette enzyme, pendant au moins 1 heure dans un milieu à pH sensiblement neutre.Ce traitement est avantageusement précédé par un traitement au moyen de dodécylsulfate de sodium, mis en oeuvre à une concentration de ltor- dre de 4 % et à l'ébullition, un tel traitement étant également en lui-même classique. Vautres particularités de l'invention apparaftront au cours de la description suivante concernant des modes opératoires prefé- rés du procédé d'extraction de peptidoglycanes selon l'invention, et en particulier de l'étape d'autolyse. Il doit être entendu toutefois que ces modes opératoires ne sont donnés qu'à titre d'exemples non limitatifs de mise en oeuvre de l'invention. Exemple 1 Des bactéries de la souche Proteus vulgaris P18 sont cultivées en bouillon nutritif du type "Standard I" de Nerck, à 370C sous agitation. La croissance est suivie par la mesure de la densité optique à 690 nm. Les bactéries sont récoltées durant la phase logarithmique de croissance, après 2 heures de culture, la concentration des bactéries étant de l'ordre de 108 par millilitre (au lieu de 109 par millilitre en phase stationnaire). les culots sont lavés rapidement et remis en suspension dans différentes solutions tampons de pli 4,4 à 10,6. Les solutions tam- pons utilisées sont les suivantes : tampon acétate aux pli 4,4 à 5, tampon phosphate aux pli 5 à 8, tampon carbonate-bicarbonate aux pH 9,5 à 10,6. Pour chaque suspension, la lyse est suivie au cours du temps, par mesure de la densité optique toutes les 10 minutes, à 690 nm. La figure 2 représente les courbes de variations de la turbidité, exprimée en pourcentage de lyse par rapport à la lyse complète, en fonction du temps exprimé en minutes-(jusqutà 2 heures) pour les pi 4,4 - 9,7 - 10,3 et 10,6. On considère que la lyse est complète lorsque la courbe est horizontale. Au pH acide de 4,4 par exemple, on constate une lyse de 50 0 au bout de 2 heures. Aux pH basiques au-dessus de 10, la lyse est pratiquement complète après 15 minutes de contact. Après un temps constant de 30 minutes de contact par exemple, les lyses observées avec différentes solutions tampons sont notamment de 70 $ environ pour pH 9,7, et de plus de 90 % pour pH 10,3 et pli 10,6. Des résultats analogues aux précédents sont obtenus en rempla çant Proteus vulgaris par l'une ou l'autre des bactéries suivantes Moraxella glucidolZtica ou Bacillus megaterium. Exemple 2 Sur les mêmes cultures de bactéries que dans l'exemple 1, des aliquotes de 5 ml de la culture sont prélevées à des intervalles de temps réguliers durant toute la croissance logarithmique. Après lecture de la densité optique à 690 nm (fig. 2), les cellules sont centrifugées, lavées rapidement, et remises en suspension dans du tampon carbonate-bicarbonate à pH 9,7. La densité optique est déterminée après 20 minutes de contact. On remarque que les cellules autolysent plus rapidement durant la première moitié de leur phase logarithmique de croissance que vers la fin de cette phase. Avec Proteus par exemple, le maximum d'autolyse est observé à la densité optique de 0,400, chez Moraxel- la à la densité optique de 0,550, et chez Neisseria à la densité optique de 0,250. Exemple 5 les mêmes souches de bactéries que dans l'exemple 1 sont cultivées, prélevées et soumises à une autolyse à différents pli dans les mimes conditions que dans l'exemple 1, l'autolyse étant conduite pendant 2 heures à 370 C. les produits d'autolyse sont ensuite séparés par centrifugation à 22000 g pendant 40 minutes, puis l'on analyse la composition du surnageant et celle du résidu par des techniques classiques. L'estimation quantitative des acides aminés (après hydrolyse de 16 heures à iosoa dans XCl 6N) et des sucres aminés (après hydrolyse de 4 heures à 950C dans IICl 3N) est effectuée sur un analyseur d'amino-acides Unichrom (Beckman) dans les conditions décrites dans EuroS J.Biochem. - 38, 301-306 (1973). les sucres réducteurs, les sucres aminés et les acides aminés N terminaux sont mesurés selon les techniques décrites par Ghuysen (J.k. Tipper, D.J. 3tromin- ger, J.L. (1966) Methods in Enzymology). le tétrapeptide est rechen ché par électrophorèse effectuée sur du papier Whatman n 3 tWI dans un appareil Pleuger à pli 4 en milieu acide acétique - pyridine eau dans la proportion 9/2/1000 en volume. le KDO (acide 2 céto 3 désoxy octonique) est recherché selon la technique de Waravdekar et al (V.S., Saslaw, l.D. 1959) J. Biol. Chem., 234, 1945-). Dans le surnageant, on trouve exclusivement du matériel nucléique et protéique. Il ne contient aucune trace ni d'acide diaminopimélique ni d'acide muramique. la recherche de sucres réducteurs, des disaccharides, du tétrapeptide et d'acides aminés N terminaux s'est également révélée négative. Le résidu, par contre, contient du matériel lipopolysaccharidique et glycopeptidique. En effet, on note la présence de KDO et l'étude des amino-acides à l'analyseur Unichrom montre la présence d'alanine, d'acide glutamique, d'acide diaminopimélique, d'acide muramique et de glucosamine. Ces résultats démontrent que, dans l'autolyse des bactéries entières, seul le matériel cytoplasmique est détruit le peptido glycane reste intact, dans une fraction qui contient également la couche lipopolysaccharidique antigénique. Exemple 4 les souches utilisées sont respectivement Proteus vularis, Moraxella glucidolytica, E.coli et Bacillus megaterium. Pour chaque souche bactérienne, deux cuves contenant chacune 12 litres de bouillon ("Standard I" Merck) sont ensemencées avec 50 ml d'inoculux en phase de croissance logarithmique. les cultures sont incubées à 370C dans un fermenteur sous agitation et barbotage d'air comprimé. La cuve n 1 sert pour l'extraction du peptidoglycane par le procédé selon l'invention, avec autolyse, et la cuve n 2 pour l'extraction du peptidoglycane selon la technique classique. Au bout de 2 heures de culture, un litre de tampon carbonatebicarbonate pli 10,6 concentré (1,3 M) est ajouté à la cuve n 1. La concentration saline finale du milieu est ainsi de 0,1 M environ. Après une nuit de contact, le résidu d'autolyse est récolté dans un rotor en continu Beckman tournant à 18 000 tr/mn, avec un débit de 140 ml/mn. Ce résidu est trotté par du dodécylsulfate de sodium (SDS) à 4 % à ébullition selon une technique qui est en ellemême classique, telle que celle décrite par Braun, V.,Rehu, K., Europ. J. Biochem., 10, 426-438. le dodécylsulfate de sodium est ensuite élimines par une centrifugation à 65 000 g pendant 70 minutes, uivie de 5 à 6 lavages. Puis le culot est remis en suspension dans une solution e trypsine de façon à obtenir une concentration de 5 mg/ml, le rapport enzyme/ substrat étant de 1/25. Au bout de 4 heures d'incubation à 37 C, l'addition de dodécylsulfate de sodium à une concentration finale de 1 % permet l'ar rêt de la réaction et une meilleure solubilisation des lipoprotéines. Le peptidoglycane est alors séparé per une centrifugation à 65 000 g suivie de 3 lavages. les bactéries de la cuve n 2 sont cultivées eÉ traitées selon la technique utilisée jusqu'à présent. Files sont laissées en culture pendant une nuit et se trouvent alors dans la phase de croissance stationnaire. Elles sont récoltées sur une centrifugeuse Sharplas et soumises ensuite à un traitement de désintegration aux ultra-sons pendant 15 à 20 minutes, ou à la presse de ex Hugues. Tes bactéries non désintégrées sont éliminées par plusieurs centrifuga- tions à 3 000 g pendant 5 minutes. Les parois es bactéries sont ecueillies après une centrifugation à 22 000 g pendant 30 minutes. Le résidu obtenue est ensuite traité par du ClNa, par de la ribonucléase pendant 16 heures à 37 C, puis par du dodécylsulfate de sodium à 4 % à l'ébullition pendant 16 heures. Ce dernier trai- tement est suivi de plusieurs lavages et d'une centrifugation à 65 000 g pendant 30 minutes. Le résidu est alors traité par de la trypsine pendant 1 heure a 370C, et le peptidoglycane est séparé Par centrifugation à 65 000, g pendant 30 minutes. les peptidoglycanes obtenus selon les deux techniques Ont lyophilisés et pesés. le tableau ci-anres indique les quantités de peptidoglycanes obtenues par litre de milieu de culture. ' ' ' Procédé Technique avec classique autolyse Proteus 0,45 mg 0,9 mg E.coli 3,8 mg 4,5 mg Moraxella 1,5 mg 7 mg B.megaterium 52 mg 110 mg On constate que p-r le procédé avec autolyse, bien que les bactéries utilisées soient en début oe la phase de croissance (108 par ml), on obtient nettement plus et, dans trois cas au moins, une quantité de peptidoglycane double de celle obtenue avec le procédé classique appliqué à une culture de bactéries en phase stationnaire (109 par ml). Par ailleurs, les acides aminés et les sucres aminés sont o- sés dans les produits obtenus par les deux procédés, par analyse après hydrolyse à l'acide chlorhydrique, sur un analyseur d'amino- acides Unichrom. Des produits obtenus sont dans les deux cas essentiellement constitués par un peptidoglycane orme de trois acides aminés, qui sont respectivement l'alamine, acide glutemique et l'acide diami- nopimélique, et de deux sucrs aminés, la glucosamine et l'acide muramique. Ces constituants s'y trouvent dans les proportions relatives, pour 1 mole d'acide diaminopimélique (DAP), de 1,75 à 2,3 moles d'alanine, 1 mole d'acide glutamique, 2 moles de sucres aminés. Toutefois, les produits diffèrent par leurs degrés de pureté. Ainsi par exemple, dans le cas de Proteus, le peptidoglycane obtenu par la technique classique ne représente que 50 % du matériel extrait. les 50 j non glycopeptidiques sont de nature lipidique. Par ailleurs, le produit contient également, en quantité non négligeable, des acides aminés étrangers au peptidoglycane tels Que l'acide aspartique (0,1 mole pour 1 mole de DAP), de la lysine et de la glycine. Par contre, le peptidoglycane obtenu par autolyse représente 90 - 100 % du matériel extrait et aucun acide amine contaminant n'est détecté à l'analyse. Ainsi que le font ressortir les exemples ci-dessus, le procédé selon 1 t invention permet d'extraire efficacement les peptidoglyca- nes des parois des bactéries à gram négatif. Dans ce cadre, il présente, par rapport aux techniques antérieurement appliquées, une série d'avantages parmi lesquels on peut souligner en particulier la rapidité, la simplicité, un meilleur rendement et ume plus grande pureté. Comme il va de soi et conme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l t invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envi sagés; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. REVENDICATIONS 1 - Procédé de traitement des bactéries, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une étape d'autolyse consistant à mettre en contact les bactéries avec un milieu à un pH propre à provoquer la lyse des bactéries en l'absence d'enzymes. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on assure l'autolyse des bactéries à partir d'un milieu de culture où elles sont en phase logarithmique de croissance. 3 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que autolyse des bactéries est assurée en les soumettant à un pH nettement acide ou basique, et notamment à un pH inférieur à 5 ou, de préférence, supérieur à a. 4 - Procédé d'extraction des peptidoglycanes de bactéries, notamment de bactéries à gram négatif, caractérisé en ce Q l'on fait subir aux bactéries une autolyse en l'absence d'enzymes, et qu'on les soumet ensuite à un traitement par une enzyme protéolytique. 5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on cultive ces bactéries, on leur fait subir une autolyse en les soumettant, alors qu'elles sont en phase logarithmique de croissance, à un pli nettement acide ou basique, on sépare le résidu solide et on le soumet à un traitement par une enzyme protéolytique pour le débarrasser des matières lipoprotéiques. 6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que l'autolyse est effectuée à un pH inférieur à 5. 7 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que l'autolyse est effectuée à un pH supérieur à 9, et de préférence supérieur à 10. 8 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce que l'on soumet à l'autolyse des bactéries préle- vées pendant la première moitié de leur phase logarithmique de croissance. - Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, caractérisé en ce que l'on soumet le résidu séparé après autolyse à un traitement par du dodécylsulfate de sodium préalablement au traitement par une enzyme, notemment par la trypsine. 10 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 9, caractérisé en ce que " on cultive les bactéries dans un milieu nutritif du type du bouillon "Standard I" de Merck, on les prélève après un temps de culture de l'ordre de 1 à 3 heures, alors qu'elles sont en phase logarithmique de croissance, on les lave rapidement et on les remet en suspension dans un milieu tampon au pH choisi pour l'autolyse, notamment un milieu tampon carbonate-bicarbonate. 11 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 10, caractérisé en ce que l'on cultive les bactéries dans un milieu nutritif du type du bouillon "Standard I" de Merck, puis après un temps de culture de l'ordre de 1 à 3 heures, alors que les bactéries sont en phase logarithmique de croissance, on y ajoute une solution tampon concentrée, notamment un tampon carbonate-bicarbonate, jusqu'à ce que le milieu soit au pH choisi pour l'autolyse. 12 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à Il, caractérisé en ce que l'autolyse est effectuée par incubation des bactéries en milieu acide à pH inférieur à 5 pendant un temps minimum de l'ordre de 2 heures. 13 - Procédé selon 'une quelconque des revendications 4 à 12, caractérisé en ce que autolyse est effectuée par incubation des bactéries en milieu basique à pli supérieur à 10 pendant un temps minimum de Itordre de 5 minutes à 30 minutes. 14 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 13, caractérisé en ce que l'on sépare le résidu de l'autolyse par centrifugation, on l'ajoute dans du dodécylsulfate de sodium à 4 % à l'ébullition, on élimine le surnageant par centrifugation, on remet le culot obtenu en suspension dans une solution de trypsine, puis, après incubation, on ajoute du dodécylsulfate de sodium à une concentration finale de ltordre de I %, et on sépare le peptidoglycane par centrifugation. 15 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 14, caractérisé en ce que les bactéries traitées sont es bactéries du type Proteus, Moraxella, Bacillus megaterium T'scherichia coli, ou des bactéries apparentées. 16 - Peptidoglycanes tels qu'obtenus par le procédé selon l'u- ne quelconque des revendications 4 à 15.