Brevet FR2265285A1 — publié le 19751024

La présente invention concerne un procédé pour l'obten- tion de levures a usage alimentaire pratiquement exemptes d'acides nucléiques, par mise en oeuvre de réactions chimiques touchant à la structure de ces~acides. Ceci est atteint facilement si on ne provoque pas l'appauvrissement contenu protéique dela levure en question. En effet, ona établi, dans chaque cellule, la présence de nucléoprotéines qui sont des substances constituées de protéines combinées avec des polymères naturels d'un autre type: les-acides nucléiques.Bien que chimiquement très différents, ces acides ont, en commun avec les protéines, la caractéristique de présenter une longue channe (ou squelette) égale, différente par la longueur, dans tous les acides nucléiques; divers groupes, dont la nature et la succession caractérisent les acides nucléiques particuliers, sont liés à ce squelette commun.Alors que le squelette des protéines est une channe polyamidique (ou polypeptidique), le squelette des acides nucléiques est une channe polyester (ou polynucléotidique), dont 11 ester dérive de l'acide phosphorique et d'un sucre suivant la formule ci après : L'utilisation des levures comme alimentation pour l'entre humain trouve une application limitée en raison de leur teneur élevée en acides nucléiques (environ 1,8 % du poids sec). Cette limitation est déterminée par le chimisme particulier des bases --hétérocycliques présentes.Ces bases ont une structure purique et sont liées au C-I de chaque sucre par l'intermédiaire d'une liaison beta. Le métabolisme de ces composés les transforme en acide urique peu soluble, qui ne peut pas être dégradé en l'allantolne, et qui,dès lors, par l'accumulation résultante, provoque des insuffisances dues à la formation de calculs rénaux ou d'affections, telles que la goutte. L'intérêt de trouver un procédé qui tend à isoler les acides nucléiques de la levure en question, en laissant inaltéré presque totalement le contenu protéique, est par conséquent bien justifié. On connaît de nombreux procédés qui réduisent la concentration en acides nucléiques des cellules des micro-organismes: on peut citer notamment les procédés faisant intervenir 1) la limitation de la vitesse de croissance la réduction de la concentration en acides nucléiques peut être réalisée en abaissant la concentration en phosphates et en carbone du milieu : au point de vue économique, cé procédé contraste avec l'optimisation des rendements de la biomasse et doit dès lors être écarté; 2) l'extraction des acides ribonucléiques (ARN) elle est fondée sur l'extraction avec du NaCl à 10 % à 800 C et à un pH de 9,5 de cellules brisées; la récupération des protéines est de l'ordre de 70 %. Au-=point de vue économique, du te et de l'instrumentation, elle doit être écartée, du fait qu'elle prévoit le brisement des cellules; en outre, la teneur élevée en NaCl du précipité rend nécessaire un traitement extractif subséquent. 3) la dégradation des ARN au moyen d'enzymes endogènes Il s'agit d'un procédé complexe qui est fondé sur une série de passages à des températures suroptimales, alternées avec des températures presque optimales pendant des temps prolongés; il se produit un abaissement de la teneur en ÂRN de 7-8 % à 1-1,5 %. Parallèlement, on enregistre un abaissement, provoqué par les enzymes hydrolytiques, de la teneur en azote protéique. 4) la dégradation exogène des ÂRN Celle-ci est fondée sur l'utilisation d'enzymes hydrolytiques provenant d'autres organismes; ce procédé est peu économique en raison de la grande quantité de facteurs actifs indispensables ou 5) Hydrolyses alcalines des ÂRN Conformément à-la présente invention, on a déterminé, à partir des essais effectués sur la quantité préférée de levure, en appliquant une hydrolyse acide, que le procédé mis en oeuvre obéit aux nécessités industrielles présentant les caractéristiques d'économie et de rapidité d'exécution requises.Une caractéristi- que de ce procédé est l'élimination des acides désoxyribonucléiques (âne) et des ARN, avec un effet hydrolytique minimal sur les protéines, contrairement à l'M.ydrolyse basique qui agit exclusivement sur les ARN. Dans le procédé d'extraction des acides nucléiques conforme à la présente invention, on réalise les opérations suivantes: 1) Hydrolyse alcaline; 2) Hydrolyse acide, et ensuite on détermine les acides nucléiques extraits par réaction avec l'orcinol et on détermine l'azote total. Le procédé de l'invention est illustré ci-lessous à l'aide d'un exemple qui représente un mode de mise en oeuvre préféré. Hydrolyse alcaline Les échantillons traités étaient constitués de 10 g de cellules de levure de bière et ont été mis en suspension dans 20 ml d'eau; à chaque échantillon, on a ajouté 20 ml de NaOH à concentration double par rapport à la concentration finale. Les échantillons ont été maintenus pendant des temps voulus aux températures de 37 et 20 C. A la fin du traitement, la solution a été neutralisée par l'addition de 5 ml de HCl concentré 12 fois par rapport au NaOH. Après 15 minutes, on a ajouté 40 ml d'eau et la suspension cellulaire a été centrifugée. Le précipité a été remis en suspension dans 80 ml de HCl 0,1 N; après centrifugation, le résidu a été conservé à -20 C jusqu'à l'analyse. Le tableau 1 ci-aprbs donne les pourcentages des ARN restant après l'hydrolyse alcaline avec du NaOH. TABLEAU 1 0,15 N 0,35 s 0,75 N 1,5 N 6 h 56 % 62,5 % 42,4 % 31,3 % 9 h 48,8 % 27,9 % 20,3 % 36,6 % 37 C 12 H 52,3 % 75,5 % 23,7 % 33,7 % 24 H 54 % 19,1 % 57,5 % 13,3 % 6 h 53,4 % 54,6 % 54 % 29 % 9 H 90,6 % 43 % 54,6 % 36 % 20 C 12 H 70,3 % 35,4 % 53,4 % 16,8 % 24 h 33,7 % 40,1 % 9,8 % 30,2 % D'après le tableau 1 on constate que les meilleurs rendements de l'hydrolyse des ARN ont été obtenus avec du NaOH 0,15 N pendant 12 à 24 heures. Les résultats sont exprimés en pourcent par rapport au t6- moin non traité et il y a lieu de retenir qu'il s'agit de valeurs en excès. Les valeurs comprises entre 10 et 15 pourcent représentent les ADN non hydrolysés par le traitement, étant donné que l'hydrolyse alcaline ne dégrade pas les ÂDN. Hydrolyse acide Aux échantillons d'une composition identique à celle du traitement précédent, on a ajouté 20 ml de solution de HCl à une concentration double de la concentration finale et on a mis les échantillons au bain-marie à 1000 C; les échantillons ont été préle- vés aux temps voulus, refroidis par addition de 40 ml d'eau froide et ont été centrifugés. Le précipité a été remis en suspension dans 80 ml de HC1 0,1 N froid, centrifugé et maintenu à -20 C åus- qu'à l'analyse. Le tableau 2 ci-après donne les pourcentages des ARE restant après l'hydrolyse acide avec du HCl à 100 C. TABEAU 2 0,3 N 0,6 N 3 N 6 N 10 mn 39,5 % 32,5 % 0 % O % 20 mn 1,7 % 1,1696 0 % 1,16 96 30 mn 1,74% 0 % 0 % 0,58 % 40 mn 1,16% 0,58 % 0 % 0,58 % D'après les résultats consignés dans le tableau 2, on peut constater que l'hydrolyse acide à 1000C était beaucoup plus efficace que l'hydrolyse alcaline des acides nuléiques. Les concentrations en HC1 de 3 N et 6 N ont hydrolysé presque complètement les protéines et dégradé les radicaux de tryptophane; la mise en évidence de ce phénomène est donnée par la couleur violette que les suspensions cellulaires prennent à la fin du traitement.Dans les traitements avec du HC1 0,6 N, on a constaté nettement l'apparition d'une faible couleur violette qui n'est pas décelable dans les traitements avec du HCl 0,3 N. Détermination des ARN avec l'orcinol Suspension d'orcinol : 1 g d'orcinol purifié a été dissous, aussitôt avant usage, dans 100 ml de HCl concentré (37 %) contenant 0,5 g de FeCl3. a) Elimination des composés acides solubles : 1 ml d'une suspen- sion à 20 % a été mélangé avec 2,5 ml de cyanurate de triallyle (CTA) froid à 10 % et a été centrifugé. Le précipité- a été la vé une fois avec 2,5 ml de CTA froid à 10 %. b) Elimination des composés lipidiques : le précipité final, res tant après élimination des composés acides solubles, a été ex trait deux fois avec 10 ml d'éthanol à 99 % et a été récupéré par centrifugation. Ce Procédé est généralement suffisant pour écarter les lipides contenant du phosphore. c) Elimination des acides nucléiques : le résidu précédent a été mis en suspension dans 1,5 ml d'eau et 1,5- ml de OTA à 10 %; le mélange a été chauffé à 90 C pendant 15 minutes. On a sépa ré de façon quantitative les ADN et ARN des protéines et on- a laissé subsister ces derniers sous la forme d-'un résidu inso luble qui a été centrifugé et lavé avec 2,5 ml de CTA à 5 %. La combinaison des extraits constituait la fraction des acides nucléiques. d) 0,5 ml d'extrait d'acide nucléique a été dilué jusqu'à 2,5 ml et chauffé avec 1,5 ml de suspension d'orcinol pendant 25 minu tes dans de l'eau bouillante; l'absorption a été lue à 660 nm. e) les valeurs d'absorption, comparables en ce qui concerne tous les échantillons, sont déterminées dans les mêmes conditions et on ajoute, à tous ces échantillons, les mêmes volumes de réactifs; ces valeurs d'absorption sont mentionnées en pourcent par rapport à l'absorption enregistrée avec un échantillon témoin non traité. Détermination de l'azote total La détermination a été effectuée au moyen de la méthode de Rjeldahl en soumettant à l'analyse,pour la détermination de l'azote total, seuls les échantillons traités avec du HOl, qui parais- saient, par une estimation colorimétrique superficielle, ne pas avoir subi une dégradation des radicaux de tryptophane, ainsi que les échantillons traités avec du NaOH qui présentaient des teneurs considérablement faibles en ARN. Les résultats obtenus sont donnés au tableau 3 ci-après TABEAU 3 Echantillon Durée/température Humidité 96 Azote total du résidu % HG1 0,3 N 40 min./10000 89,79 0,83 0,3 N 20 min./100 C 87,52 1,13 NaOH 1,5 N 12 h. / 200C 82,04 1,12 NaOH 0,75N 9 h. / 370C 80,81 1,17 NaOH 0,75N 24 h. / 200C 79,53 1,34 NaOH 0,15N 24 h./ 20 C 71,78 1,45 Témoin 59,24 3,14 Le tableau 4 ci-après donne une comparaison des résultats obtenus au-moyen des traitements d'hydrolyse alcaline et d'hydro- lyse acide. -TABLEAU 4 Température Durée NaOH HCl % des ARS res- % d'azote tant s total (3E) 1000C 20 min. - 0,3 N 1,7 % 35,98 % 100 C 40 min. - 0,3 N 1,16 % 26,43% 37 C 9 h. 0,75N - 20,3 % 37,26 % 200C 12 h. 1,5 N - 16,8 % 35,66 % 20 C 24 h. 0,15 N - 33,7 % 46,17 % 200C 24 h. 0,75N - 9,8 % 42,67 % (z) en % par rapport à l'échantillon. En observant les résultats du tableau, on peut conclure que tous les traitements avec NaOH, dans les conditions examinées, n'ont pas altéré dtune manière considérablement différente la teneur en azote total du résidu. Les traitements avec HCl 0,3 N n'étaient pas considérablement différents de ceux avec NaOE pendant des durées allant jusqu'à 20 minutes, en ce qui concerne l'azote total du résidu; celui-ci est réduit de 50 % avec des traitements d'une durée de 40 minutes. les valeurs des pourcentages de l'azote total par rapport au témoin sont un indice d'un manque de teneur protéique en ce qui concerne un échantillon de cellules telles quelles, non lavées. Manmoins, la teneur en azote total du témoin comprend l'azote protéique, l'azote des acides nucléiques et l'azote des composés solubles du type amino-acide, les nucléotides éliminés par lavage des échantillons traités. D'après les résultats obtenus, on peut conclure que le traitement offrant le meilleur rendement en ce qui concerne lthy- drolyse des acides nucléiques et la moindre perte en azote total, est celui avec HCl 0,3 N à 1000C pendant 20 minutes. L'hydrolyse alcaline s'est révélée efficace uniquement pour l'hydrolyse des ÂRN et la teneur en acides nucléiques du résidu était de l'ordre de 10 %, par rapport au témoin (4 à 5 fois supérieur par rapport au meilleur rendement avec l'hydrolyse acide). On peut ainsi bien comprendre que,grce au procédé de la présente invention, on réalise itélimination presque totale des acides nucléiques, en maintenant presque intact le contenu protéique de la levure, Bien que prune des formes de réalisation préférée de l'invention ait été décrite ci-dessus, il est bien évident que des modifications de réalisation peuvent hre apportées en pratique, sans s'écarter du cadre de la présente invention0 REVENDICATIONS -1. Procédé d'extraction des acides nucléiques de cellules de levure à usage alimentaire, caractérisé en ce que la séparation hydrolytique des acides nucléiques est réalisée dans un milieu basique et ensuite dans un milieu acide. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu basique est réalisé par de l'hydroxyde de sodium et le milieu acide par de l'acide chlorhydrique. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les concentrations en hydroxyde de sodium et en acide chlorhydrique sont respectivement de l'ordre de 0,15 N à 1,5 N et de 0,3 N à 6 N. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 3, caractérisé en ce qu'il est réalisé à une température de l'ordre de 20 à 10000 pendant 10 minutes à 24 heures0 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que les hydrolyses réalisées dans un milieu basique et acide sont suivies d'une élimination des composés acides solubles, des composés lipidiques et des acides nucléiques. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'élimination des composés acides solubles est effectuée par mélange et lavage subséquent avec du cyanurate de triallyle à 10 %. 7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ltélimination des composés lipidiques est effectuée par extraction avec de l'éthanol à 99 O/o. 8. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en cé que l'élimination des acides nucléiques est réalisée par une mise en suspension dans de l'eau et du cyanurate de triallyle à 10 %, par chauffage subséquent jusqu'à 900C, par centrifugation et lavage à l'aide de cyanurate de triallyle à 5 %. 9. Cellules de levures à usage alimentaire, pratiquement exemptes d'acides nucléiques, obtenues par le procédé selon l'une quelconque- des revendications 1 à 8.