Brevet FR2213289A1 — publié le 19740802

La présente invention est relative à un nouveau procédé de préparation d'une trypsine pure d'origine porcine. La trypsine est une enzyme connue depuis longtemps, puisqu'elle a été découverte et individualisée par KÜHNE en 1848 à partir de pancréas de boeuf. Les principaux travaux sur la trypsine et ses précurseurs ont été effectués sur de la trypsine de boeuf, et c'est ainsi que dans le cadre des travaux tendant à obtenir une trypsine aussi pure que possible, NORTHROP et KUNITZ ont obtenu pour la première fois en 1948, une-trypsine cristallisée, à partir de pancréas de boeuf, et les progrès réalisés dans le domaine des techniques de purification ont permis d'obtenir, toujours à partir du pancréas de boeuf, une trypsine considérée comme présentant un degré de pureté de l'ordre de 100 %. C'est alors qu'en 1968, SCHROEDER et SHAW gDuane D. SCHROEDER & ELLIOTT SHAW, Journal of Biological Chemistry, Vol. 243 , NO 11, p. 2943-2949 (1968) J ont démontré que cette trypsi ne que l'on considérait comme pure était en réalise é constituée par un mélange de composants difficilement séparables, à savoir par plusieurs formes de trypsine douées d'activités enzymatiques, à des degrés différents. Les travaux de SCHROEDER et SHAW ont montré que la trypsine cristallisée connue est constituée par un mélange comprenant essentiellement : - une forme non dégradée douée dune activité enzymatique élevée, que SCHROEDER et SHAW ont identifiée sous le nom dess-trypsine, et qui est une forme à une seule chaîne; - une $ > -trypsine, présente en quantités moindres dans le mélange, constituant une forme dégradée de la A-trypsine, et étant une structure à deux channes liées l'une à l'autre par des ponts disulfure , qui résulte d'une couyede la forme - au niveau de la lysine 131-; d'autres formes de la trypsine, plus dégradées encore par rapport à la,J-trypsine,que l' -trypsine, en particulier une pseudo-trypsine;- et enfin un mélange de produits inactifs. SCHROEDER et SHAW sont parvenus à séparer les composants du mélange connu sous le nom de trypsine, par chromatographie d'une solution de trypsine bovine, à 10 mg/ml, dans un tampon constitué par du chlorure de trio(hydroxyméthyl) aminométaae (0,100,15 M), du chlorure de calcium (0,02 M) et du chlorhydrate de benzamidine (1 mM), à un pH voisin de la neutralité, de 7,1, sur une colonne de sulfoéthyl-SEPHADEX C-50 équilibrée par le tampon ci-dessus. La trypsine de porc a également fait l'objet de travaux, qui ont fait apparaître qu'elle est plus stable que la trypsine d'origine bovine et que sa composition en acides aminés diffère de celle de la trypsine de boeuf. Des travaux tendant à obtenir de la trypsine de porc à l'état aussi pulque possible compte tenu des connaissances en la matière au moment de ces travaux, ont utilisé la chromatographie sur carboxyméthylcellulose. Deux méthodes ont été décrites, la première rM. CHARLES, M.ROVERY, A.GUIDONI et P.DESNUELLE, Biochim. Biophys.Acta, 69 (1963), p. 115.129 réalisant cette chromatographie à pH 5 avec un tampon citrate (0,06 M) + CaC12(0,01 M), tandis que la seconde ÈJ.TRAV et I.E.LIERER, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 240, N 5, pages 1962-1966 (1965D fait précéder la chromatographie à pH 5,5 d'une double cristallisation. Le produit obtenu par ces techniques était néanmoins constitué, ainsi que nous le savons maintenant, par un mélange des différentes formes de trypsine. Par ailleurs, l'application à la trypsine de porc de la méthode de séparation des différentes formes de la trypsine de boeuf, mise au point par SCHROEDER et SHAW, n'a pas permis de séparer la g -trypsine de porc de ses formes dégradées, ainsi que cela ressort de la publication d'Y. JACQUOT-ARNAND et M.HILL dans FEBS LETTERS, Vol.ll, N 4, Décembre 1970. ROBINSON, TYE, NEURSTH et WALSH, dans une Contribution parue dans "BIOCHEMISTRY", Vol. 10, N 14, 1971, pages 2743-2747, décrivent une méthode de séparation de 1'( Cette cnntribution mentionne l'application de la méthode préconisée à la trypsine de porc, mais le produit ainsi obtenu est toujours constitué par le mélange des formes actives. La présente invention a pour but de pourvoir à un procédé de préparation de la forme non dégradée de la trypsine, à l'état pur, à savoir de la ss-trypsine pure, à partir de trypsine de porc du commerce. La présente invention a pour objet un procédé de préparation de la -trypsine pure de porc, caractérisé en ce que l'on réalise la purification d'une trypsine de porc cristallisée du commerce, par chromatographie sur des échangeurs d'ions sulfonés, d'une solution de ladite trypsine dans un tampon dont le coefficient d'élution est équivalent à celui du tampon tris(hydroxyméthyl)aminométhane lorsque celui-ci présente une résistance supérieure à 0,21 x 103 ohms et de préférence comprise entre 0,23 x 103 ohms et 0,35 x 103 ohms. La résistance du tampon est mesurée à 200 C, dans des cellules de type usuel. Suivant une disposition préférée du procédé objet de la présente invention, l'on opère dans des conditions de pH comprises entre 7 et 7,2, et de préférence, à pH 7,1. Suivant une autre disposition préférée du procédé objet de la présente invention, l'on opère à une température comprise entre 10C et 40C. Suivant un mode de réalisation avantageux du procédé qui fait l'objet de la présente invention, la trypsine de porc cristallisée dont on réalise la purification,est mise en solution dans un tampon contenant du tris (hydroxyméthyl)aminométhane (0,05 M), de préférence sous la forme de son chlorure, du chlorure de calcium (0,012 M - 0,02 M) et de la benzamidine (1 mM). Suivant un autre mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, la purification de la trypsine de porc cristallisée du commerce utilisée comme matière de départ, est effectuée sur un échangeur d'ions constitué de préférence par du sulfoéthyl-"SEPHADEX" ou par du sulfopropyl- "SEP;HA- DEX" ("SEPHADEX" est une dénomination commerciale appartenant à la Société PHARMACIA FINES CHEMICALS A B, UPSALA, Suède, qui désigne des gels de dextrane sous forme de particules généralement sphériques), et notamment par du:"SE-SEPHADEX" C-50 ou par du "SP-SE PHADEX" C- 50. Le procédé qui fait l'objet de la présente invention permet d'obtenir pour la première fois la séparation des différentes formes actives de la trypsine de porc, et en particulier la séparation de la forme non-dégradée, à savoir la 8trypsine de porc. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortent de la descriptlon qui va suivre; la présente invention vise particulièrement les procédés de préparation d'une '-trypsine de porc pure confor mes aux dispositions qui précèdent,ainsi que les moyens propres à la mise en oeuvre de ces procédés et les produits obtenus en mettant ces procédés en oeuvre. L'invention pourra être mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à un exemple de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention, qui est donné uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, sans aucun caractère limitatif. EXEMPLE La colonne de chromatographie est constituée par une colonne de SE-SEPH & EX C-50 de 70 cm de hauteur et 2 cm de diamètre intérieur, équilibrée par un tampon à pH 7,1, contenant du chlorure de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (0,05 M),du chlorure de calcif (0,012 M) et de la benzamidine (1 mM). L'on part de trypsine de porc cristallisée du commerce (CHOAY) dont le titrage des sites actifs a été effectué par la méthode de CHASE et SHAW BIOCHEM. BIOPHYS.RES.COMMUN.29,pages 508-514 (1967V, à l'aide de p-nitrophényl-p'-guanidinobenzoate.HC1 ; ce dosage spécifique fait apparature pour la trypsine mise en oeuvre, 50 % de sites actifs. L'on dissout cette trypsine dans le tampon ci-dessus (50 mg/ml de tampon) et on fait passer la solution ainsi formée sur la colonne de chromatographie, à un débit de 10 ml/heure,en veillant à ce que la température de la solution ne dépasse pas 400. Les fractions ont été collectées toutes les 30 minutes : les produits inactifs sont sortis avec le volume mort de la colonne, c'est-à-dire avec les premiers 150 à 300 ml, suivis de différentes formes dégradées mais présentant cependant une activité enzymatique,qui sortent entre 300 et 600 ml.Entre 600 et 700 ml commence à sortir l'44-trypsine, suivie, entre 800 et 950 ml, par la ss-trypsine. Â partir de cette fraction (800-950 ml) la -trypsine pure est isolée à l'état sec par les méthodes usuelles. le produit obtenu en mettant en oeuvre le procédé ci-dessus, objet de la présente invention, dosé par la méthode de CHBSE et SHAW mentionnée plus haut, par le p-nitro-p'-guanidinobenzoate, a fait apparattre un titre en sites actifs d'au moins 90 %,et généralement de l'ordre de 90 à 95 %. La chromatographie de la trypsine de porc cristallisée du commerce définie plus haut, effectuée dans les conditions qui viennent d'entre décrites,donne lieu,comme le montre le dessin annexé, à la séparation de quatre pics qui contiennent une acti vité trypsique, tandis qu'aucune activité chymotrypsique n'a été détectée. Si l'on se réfère à la figure annexée, qui représente le diagramme d'élution de la trypsine de porc cristallisée du com merce traitée ainsi qu'il vient d'être décrit, l'on a porté en abscisse le volume des fractions collectées, exprimé en ml, et en ordonnée l'absorbance des fractions collectées, mesurée par spec trophotométrie à 280 nm. Le pic 1, entre 150 et 300 ml, correspond aux pro duits inactifs qui sortent avec ces fractions; le pic 2 et le pic 3 correspondent à des formes dégradées de la -trypsine, qui pré sentent cependant une activité trypsique, et qui sortent entre 300 et 600 ml; le pic 4 correspond à l'O(-trypsine qui sort entre 600-650 ml et 700 ml et le pic 5 correspond à la trypsine qui sort entre 800 et 950 ml. En rechromatographiant la,-trypsine recueillie, dont le titre en sites actifs est d'au moins 90 %, la Demanderesse a pu mettre en évidence, en outre, que ce produit ne contient pas d'au tres formes actives, telles, notamment que la formeO(. La Demanderesse a également pu mettre en évidence que la ss/trypsine obtenue conformément à la présente invention, compor te un seuil groupe N-terminal, à savoir l'isoleucine. Elle a égale ment pu prouver de façon très nette le fait que îa/-trypsine de porc est une structure à une seule chaîne et que l'(-trypsine de porc est une structure à deux chaînes, en procédant à une électro phorèse sur gel de polyacrylamide, en présence de dodécyl-sulfate de sodium (SDS); à l'électrophorèse, la forme ss - a donné une seule bande qui correspond à un poids moléculaire de 24 000 et la forme t- a donné deux bandes dont la migration correspond à des poids moléculaires d'environ 11 000 et 13 000, respectivement, ainsi que cela ressort du Tableau qui va suivre TABLEAU Electrophorèse de trypsine de porc sur gel de polyacrylamide en présence de trypsine de porc Protéine : Nombre de : Migration i Poids bandes (en mm) . moléculaire .A-trypsine de: 1 : 45 : 24 000 porc -trypsine de: 2 : 62 : 11 OOOenv. porc 64 . 13 000 env. Le procédé qui fait l'objet de la présente invention permet d'obtenir de la I8-trypsine de porc pure, ce que ne permettaient pas d'obtenir les procédés décrits dans l'Art antérieur. Ce résultat est atteint, conformément à l'invention, en utilisant des tampons dont la force ionique est sensiblement inférieure à celle des tampons proposés conformément à l'Art antérieur, et, par conséquent, dont la résistance est beaucoup plus élevée que celle de ces derniers. C'est ainsi, en particulier, qu'alors que la résistance des tampons préconisés par SCHROEDER et SHAW est de 0,12 x 103 ohms, la résistance du tampon décrit dans l'Exemple qui précède, est de 0,30 x 103 ohms. I1 résulte de la description qui précède que quels que soient les modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application adoptés, l'on obtient un nouveau procédé de préparation d'une trypsine de porc pure, qui présente des avantages importants par rapport à 1 'Art Antérieur, notamment en ce qu'il permet d'utiliser une source de trypsine (les extraits pancréatiques de porc) dont les procédés proposés dans l'Art antérieur n'autorisaient pas l'utilisation, et en ce qu'il permet l'obtention d'une trypsine pure dont la stabilité est sensiblement supérieure à celle de la trypsine pure issue d'extraits pancréatiques de boeuf. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre et de réalisation qui viennent d'etre décrits de façon plus explicite dans ce qui précède; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du Technicien en la matière, sans s'écarter du cadre ni de la portée de l'invention. REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation de la trypsine pure de porc, caractérisé en ce que l'on réalise la purification d'une trypsine de porc cristallisée du commerce, par chromatographie sur des échangeurs d'ions sulfonés, d'une solution de ladite trypsine dans un tampon dont le coefficient d'élution est équivalent à celui du tampon tris (hydroxyméthyl) aminométhane lorsque celui-ci présente une résistance supérieure à 0,21 x 103 ohms, et de préférence comprise entre 0,23 x 103 ohms et 0,35 x 103 ohms. 2)Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que l'on opère dans des conditions de pH comprises entre 7 et 7,2, et de préférence à pH 7,1. 3) Procédé selon 1 'une quelconque des Revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'on opère à une température comprise entre 10C et 40C. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la trypsine de porc cristallisée dont on réalise la purification, est mise en solution dans- un tampon contenant du tris (hydroxyméthyl) aminométhane (0,05 M) de préférence sous la forme de son chlorure, du chlorure de calcium (0,012 MZ 0,02 M) et de la benzamidine (1 mM). 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1à 4, caractérisé en ce que la purification de la trypsine de porc cristallisée du commerce utilisée coxnma matière de départ, est effectuée sur un échangeur d'ions constitué de préférence par du sulfoéthyl- "SEPHADEX" ou par du sulfopropyl-"SEE!IADEX" ("SEPHADES' est une dénomination commerciale appartenant à la Société PHA1RMA- CIA FINES CHEMICALS AB, UPSALA, Suède, qui désigne des gels de dextrane sous forme de particules généralement sphériques},et notamment par du "SE-SEPHADEX" C-50 ou par du"SP-SEPHADEX" C-50. 6) A titre de produit industriel nouveau, la?-trypsine de pore pure obtenue en mettant en oeuvre le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.