Brevet FR2225441A1 — publié le 19741108

L'invention est relative à un inhibiteur de trypsine lié à une trame insoluble et à un procédé pour réaliser cette liaison. On sait l'intérêt que présente la fixation des enzymes sur une trame insoluble, dans la mesure où cette fixation n'entraîne pas une perte de l'activité de l'enzyme considérée. Cette fixation autorise en particulier une uti?isation plus aisée de l'enzyme, notamment au niveau de sa récupération à partir du milieu de réaction dans lequel elle peut être amenée à exercer son action spécifique. Dans le cas d'un inhibiteur de la trypsine, sa fixation sur une trame insoluble pourrait lui ouvrir un champ d'application particulièrement intéressant, celui de la séparation sélective de la trypsine à partir d'un mélange d'enzymes la contenant ou de la purification de la trypsine, notamment par chromatographie d'affinité. On a déjà proposé de réaliser la fixation de certains inhibiteurs polypeptidiques de la trypsine sur un support insoluble. Par exemple, l'ovomucoide a été fixé sur SEPHAROSE (Robinson, Tye, Neurath et Walsh, Biochemistry 10 (1971) 2743), l'inhibiteur du soja dit de Bowmann-Birk a été fixé sur cellulose (Fink, Schiessler, Arnhold et Fritz, Hoppe Seller's Z. Physiol. Chem. 353 (1972) 1633). L'utilisation de ces inhibiteurs immobilisés pour purifier des enzymes du type trypsine est cependant peu satisfaisante, compte tenu de ce que ces inhibiteurs tendent à être scindés par la trypsine, avec comme conséquences que, d'une part, les fragments scindés peuvent contaminer les enzymes à purifier et, d'autre part, l'inhibiteur immobilisé mais dégradé, ne peut plus être réutilise. Un autre inhibiteur de la trypsine est constitué par un polypeptide connu sous le nom de "inhibiteur de Kunitz", lequel fut primitivement isolé par Kunitz du pancréas de boeuf. La structure de cet inhibiteur, qui peut en fait être extrait de la plupart des tissus du boeuf, a maintenant été complètement élucidée. On peut à cet égard se référer au chapitre "Structure and Mechanism of ction of a Pancreatic Trypsin Inhibitor" de R. Acher et J. Chauvet dans l'ouvrage intitulé "Structure -- Function Relationships of Proteolytic Enzymes" de P. Desnuelle, H. Neurath, and M. Ottesen, édité en 1970 par Munksgaard, Copenhague, Danemark. On a également montré que la séquence cystine--4-lysine-15- alanine-6, et plus particulièrement le groupe aminé de la lysine-15, jouent un rôle particulier dans l'interaction avec la trypsine, dans le processus d'inhibition de celle-ci. On a certes déjà proposé également de réaliser la fixation de l'inhibiteur de Kunitz sur une trame insoluble synthétique comportant des groupes ionisables (Fritz, Brey, Schmal et Werle Hoppe Seyler's Z Physiol. Chem. 350 (1969) 617). L'utilisation de l'inhibiteur ainsi fixé, notamment pour purifier la trypsine, ne donne cependant pas satisfaction, compte tenu de ce que des protéines autres que la trypsine peuvent être fixées par attraction ionique sur cette trame à groupes ionisables. L'invention a pour but de remédier à ces difficultes, notamment de fournir un inhibiteur de trypsine fixé sur une trame insoluble, qui puisse être utilisée de façon répétitive, notamment dans des opérations de purification de la trypsine ou de séparation de cette dernière enzyme à partir de melanges d'enzymes, en l'absence de tout danger de dégradation de l'inhibiteur fixé par la trypsine. Le produit selon l'invention résulte de la fixation de l'inhibiteur de Kunitz sur le polysaccharide insoluble connu sous la désignation de SEPHAROSE. Le procédé selon l'invention pour obtenir ce produit est caractérisé en ce que l'on procède à l'activation du susdit polysaccharide, notamment par traitement de celui-ci au moyen de bromure de cyanogène, et en ce que l'on met ensuite en contact le polysaccharide activé avec l'inhibiteur de Kunitz à l'égard de la trypsine, notamment en milieu alcalin. Contre toute attente, l'inhibiteur de Kunitz ainsi fixé s'est révélé rester extrêmement actif à l'égard de la trypsine. On pouvait en effet penser que la mise en jeu nécessaire de groupes aminés de l'inhibiteur de Kunitz, notamment de celui de la lysine-15, pour réaliser la susdite fixation, entrainerait l'inactivation de l'inhibiteur de Kunitz fixé à l'égard de la trypsine. Le résultat inattendu s'explique peut-etre par le fait que cette fixation s'opère de préférence au niveau d'un autre groupe aminé plus réactif que celui de la lysine-15 à l'égard du SEPHAROSE. L'inhibiteur de Kunitz fixé sur le SEPHAROSE peut également retenir la chymotrypsine. L'inhibiteur de Kunitz lié au SEPHAROSE permet la fixa tionde la trypsine ou de la chymotrypsine, notamment en milieu neutre (pH 7,Q), l'enzyme fixée pouvant être récupérée par élution au moyen d'une solution à pH acide. L'inhibiteur de Kunitz ainsi fixé est parfaitement stable. Il peut être reutilise de nombreuses fois, en l'absence de tout danger de dégradation, dans des opérations de purification de la trypsine ou de la chymotrypsine, ou d'extraction de l'une ou l'autre de ces enzymes à partir de mélanges d'enzymes qui les contiennent. L'extrême sélectivité de l'inhibiteur de Kunitz fixé est mise en évidence par le fait qu'une préparation de-trypsine inactivée sélectivement par le diisopropylfîuorophosphate contenant 0,75S d'activité trypsine résiduelle, n'est pas fixée, alors que les 0,75 d'activité résiduelle se trouvent entièrement retenus. L'inhibiteur de Kunitz fixé sur SEPHAROSE est tout à fait inactif à l'égard d'autres enzymes du pancréas qui pourraient accompagner la trypsine, notamment ltélastase et la ribonucléase. L'absence de fixation de la ribonucléase, laquelle a sensiblement la même charge que la trypsine, démontre que la fixation de l'4- nhibiteur de Kunitz sur le SEPHAROSE -met en jeu un mécanisme plus spécifique que l'attraction ionique. Les exémples qui suivent concernent la description de conditions opératoires préférées pour réaliser la fixation de l'inhibiteur de Kunitz sur SEPHAROSE et les conditions préférées d'utilisation de l'inhibiteur de Kunitz fixé, pour réaliser les purifications de la trypsine et de la chymotrypsine. Exemple 1 : La fixation de l'inhibiteur de Kunitz sur le SEPHAROSE 50 ml du polysaccharide insoluble commercialisé par la Société Pharmacia sous la désignation SEPHAROSE 4B sont lavés à liteau, décantés et mis en suspension dans 80 ml d'eau. Le pH est ajusté à 10,5 et 2 g de bromure de cyanogène sont ajoutés ; le pH est maintenu à sa valeur primitive pendant 10 minutes à la température de 40C par addition de soude N. Le SEPHAROSE activé est ensuite lavé à l'eau sur verre fritté, remis en suspension dans 80 ml de bicarbonate de soude 0,1 M, PH 9 et 100 mg d'inhibiteur de Kunitz dissous dans 5 ml du même tampon sont ajoutés. Le mélange est laissé 18 h sous agitation à 40C. 1'inhibiteur- SEPHAROSE est lavé jusqu'à absorbance nulle à 280 nm avec du Tampon Tris 0,1 M pH 7,0 contenant Ca Cl2 0,05 M. On obtient ainsi 45 ml 'inhibiteur-SEPHAROSE décanté contenant environ 70 mg d'inhibiteur fixé. Exemple 2 : Fixation de la trypsine par l'inhibiteur de Kunitz lui-meme fixé sur SEPHAROSE 5 ml de l'inhibiteur-SEPHAROSE de l'exemple 1 sont mis en contact avec de la trypsine en solution aqueuse à pH 7,0 pendant environ 30 minutes. La trypsine fixée sur l'inhibiteur-SEPHAROSE est ensuite éluée par une solution d'acide chlorhydrique 0,1 M contenant du chlorure de sodium en concentration 0,5 M et du chlorure de calcium en concentration 0,05 M. On constate qu'un ml de l'inhibiteur-SEPHAROSE décanté de ltexemple 1 peut fixer jusqu'à 6 mg de trypsine bovine à pH 7,0. Exemple 3 : Fixation de la chymotrypsine par l'inhibiteur de Kunitz lui-même fixé sur SEPHAROSE 1 ml de l'inhibiteur-SEPHAROSE de l'exemple 1 est mis en contact pendant environ 30 minutes avec une solution contenant 1 mg de chymotrypsine en solution aqueuse à pH 7,0. On constate que la totalité de la chymotrypsine mise en jeu est fixée sur l'inhibiteur-SEPHAROSE. L'élution ultérieure de la chymotrypsine fixée est effectuée par une solution d'acide chlorhydrique 0,1 M contenant du chlorure de sodium en concentration 0,5 M et du chlorure de calcium en concentration 0,05 M. On obtient donc un inhibiteur fixé sur,une trame insoluble fixant sélectivement la trypsine et la chymotrypsine dans des conditions de pH déterminées, ces enzymes pouvant être ensuite récupérées par modification du pH du milieu au contact de l'inhibiteur fixé sur SEPHAROSE. La possibilité de réutiliser de nombreuses fois l'inhibiteur de Kunitz ainsi fixé, en l'absence de tout risque de dégradation, en fait donc un matériau de choix pour la séparation de la trypsine et de la chymotrypsine, notamment par chromatographie d'affinité, à partir de xné1angesdnzymes. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes, notamment les produits résultant de la fixation de fragments actifs à l'égard de la trypsine de l'inhibiteur de Kunitz et leur application à la purification de la trypsine ou de la chymotrypsine ou de leur séparation à partir de milieux qui les contiennent. Ces variantes sont incluses dans la portée des revendica tions qui suivent. REVENDICATIONS Inhibiteur de Kunitz fixé sur le polysaccharide insoluble connu sous la désignation SEPHAROSE. 2. Application de l'inhibiteur de Kunitz fixé sur le polysaccharide insoluble connu sous la désignation SEPHAROSE, à la purification de la trypsine ou à la séparation de cette enzyme à partir d'un milieu qui la contient, par fixation de la trypsine, notamment en milieu neutre, et par élution de la trypsine fixée par une solution acide. 3. Application de l'inhibiteur de Kunitz fixé sur le polysaccharide insoluble connu sous la désignation SEPHAROSE,à la purification de la chymotrypsine ou à la séparation de cette enzyme à partir d'un milieu qui la contient, par fixation de la chymotrypsine, notamment en milieu neutre, et par élution de la chymotrypsine fixée par une solution acide. 4. Procédé pour obtenir un inhibiteur de Kunitz fixé sur une trame insoluble, caractérisé en ce que lton procède à l'activation du polysaccharide connu sous la désignation SEPHAROSE, en ce que l'on met celui-ci en contact avec l'inhibiteur de Kunitz à l'égard de la trypsine, notamment en milieu alcalin. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l1ac- tivation du susdit polysaccharide est réalisée par traitement de celui-ci avec du bromure de cyanogène.