Brevet FR2220275A1 — publié le 19741004

ta présente invention, à la réalisation de laquelle ont participé Madame Nicole LANGLOIS et Messieurs Pierre POTIER et Philippe RASOANAIVO, concerne un nouvel alcaloide appelé "calongine", sa préparation par extraction des parties aériennes d'une pervenche de ++adagascar (Catharanthus longifolius Pich.) et les compositions qui le contiennent. Les parties aériennes de Catharanthus longifotius Pich. extraites et fractionnées selon la méthode de C.H. Svoboda et coll., J. Amer. Phar. Ass., Sci. Ed., 48 , 659 (1959), fournissent un certain nombre d'alcaloïdes monoindoliques qui représentent les principaux types connus de squelettes d'alcaloldes indoliques et des alcaloides bis-indoliques connus tels que la leurosine; la vincaleucoblastine, la vindolicine, la catharine et la catharicine. I1 a maintenant été trouvé, et c'est ce qui fait l'objet de la présente invention, que l'on peut isoler un nouvel alcaloïde bis-indolique, qui a été appelé "calongine", par traitement approprié des extraits des parties aériennes de Catharanthus longifolius Pich.. La "calongine" selon l'invention présente les caractéristiques physicochimiques suivantes - poids moléculaire = 776 - formule brute (déterminée-par spectrographie de masse à haute résolution), correspondant à I'une des trois formules suivantes : C4SH5208N4, C47H55010N4, C48Hs8010N4. - spectre ultra-violet (éthanol): épaulement à 225 nm ; X max. nm ( 256 (12500) ; 284 (8450) ; 292 (8100) ; inflexion à 308nm. - spectre infrarouge(dans pastille de KBr) représenté sur la figure 1. - les fragmentations observées en spectrographie de masse montrent que la calongine est constituée dtune molécule de vindoline et d'une molécule de nature indolique dont la formule brute correspond à l'une des 3 formules suivantes : C20H2202N2, C22H2604N2, C23H2804N2. - le spectre de résonance magnétique nucléaire montre que la vindoline est liée à la partie indolique par le carbone en position 10. - la calongine donne une coloration violette caractéristique avec le réactif cérique N.R. Farnsworth et coll., Lloydia, 27 , 302 (1964) J . Selon l'invetion, la calongine est obtenue en utilisant une méthode analogue à celle de Svoboda et coll. basée sur la différence de solubilité des tartrates des différents alcaloïdes dans les solvants organiques et sur la différence de comportement des alcaloïdes en chromatographie de partage. Le principe de l'extraction est le suivant Les parties aériennes de la plante, débarrassées de leurs constituants solubles dans l'éther de pétrole, sont traitées par une solution aqueuse d'acide tartrique (20 gîl) puis la suspension obtenue est extraite au benzène. Les extraits organiques, après concentration sous pression réduite b un volume égal au dixième environ de leur volume initial3 sont traités par un volume à peu près égal d'une solution aqueuse d'acide tartrique (20 g/l) puis le benzène est éliminé totalement par distillation sous pression réduite. La solution aqueuse tartrique est ensuite alcalinisée au moyen d'une solution aqueuse dtammoniaque puis les alcaloïdes totaux sont extraits par du benzène. Les alcaloïdes totaux ainsi obtenus sont chromatographiés sur un gel de Sephadex pour séparer les alcaloTdes bis-indoliques des alcaloses monoindoliques, Les alcaloïdes bis-indoliques sont séparés selon une technique d'extraction par gradient de pB voisine de celle de G,110 Svoboct, Lloydia, 27, 299 (1964). Les alcaloïdes extraits à pH 4,5 sont chromatographiés sur alumine désactivée. La calongine est éluée par du chloroforme et est purifiée par chromatographie sur couches épaisses de gel de silice, La calongine présente un intérêt tout particulier par suite de son activité antitumorale prononcée qui a été démontrée au laboratoire sur les tumeurs greffables de la souris telles que la forme solide du sarcome 180 > la tumeur ascitique d'Ehrlich, la leucémie L 1 2102 la leucémie A.K.R, > le réticulosarcome, la leucosarcomatose et les carcinomes mammaires, utérins ou pulmonaires à des doses comprises entre 5 et 25 mg/kg par voie intra-péritonéale ou sous-cutanée. La présente invention comprend également les compositions médicinales contenant la calongine en association avec tout autre produit compatible, qu'il soit inerte ou lui-même physiologiquement actif, Ces compositions peuvent être présentées sous toute forme pharmaceutique appropriée à la-voie d'administration prévue, La proportion de produit actif dans ces compositions peut varier selon lteffet thérapeutique recherché; En thérapeutique humaine, la calongine est active en particulier sur les leucémies aiguës lymphoblastiques ou myéloblastiques, par voie intraveineuse à des doses journalières comprises entre O5 et 1 mg/kg pour un adulte : une composition pour injection consiste par exemple en une solution à 0 > 1 mg/cm3 de calongine dans du sérum physiologique0 L'exemple suivant, donné à titre non limitatif, montre comment l'invention peut être mise en pratique. Exemple 35 kg de parties aériennes de Catharanthus longifolius sont séchées et broyées puis traitées, dans un turbo-extracteur, par 155 litres puis 140 litres d'éther de pétrole. Après essorage et séchage, la poudre végétale est additionnée de 22s7 litres d'une solution aqueuse d'acide tartrique à 2 % puis la suspension obtenue est agitée pendant 1/2 heure. La suspens ion est extraite par 245 litres puis 4 fois 140 litres de benzène en agitant pendant 1 heure pendant chaque extraction. Les extraits organiques sont filtrés sur laine de verre puis le benzène est évaporé sous pression réduite à une température inférieure à 500 C jusqutà l'obtention d'un volume de 87 litres. On ajoute alors 87 litres d'une solution aqueuse diacide tartrique à 2 % puis élimine le benzène par distillation sous pression réduite. La solution aqueuse dont le pH est voisin de 2,3 est filtrée sur Célite puis alcalinisée à pH 9 par addition d'une solution aqueuse dtammoniaque à 30 % et enfin extraite,jusqutà réaction de layer négative par 4 fois 15 litres de benzène.Après séchage des couches organiques sur sulfate de sodium, on obtient 57 g d'alcaloïdes totaux0 Les alcalotdes- totaux sont chromatographiés sur une colonne de Sephadex LH 20 ( 1 800 g) en éluant avec un mélange chloroforme-méthanol (3-7 en volumes), en faisant des fractions de 80 cm3 et en étudiant le comportement de chaque fraction en chromatographie sur cpuche mince de silice neutre et en éluant avec un mélange ckloroforme-méthanol (5-95 en volumes). Les alcaloses bis-indoliques sont élués d'abord et peuvent être facilement séparés des alcaloïdes mono-indoliques en repérant sur la plaque la vindoline qui donne une tache rouge facilement reconnaissable en présence de réactif sérique; Les fractions contenant les alcaloïdes bis-indoliques sont réunies puis concentrées à sec à une température inférieure à 500 C; On obtient ainsi 12,5 g d'alcaîoTdes bis-indoliques qui sont dissous dans 600 cm3 de benzène. A la solution obtenue on ajoute 600 cm3 d'une solution aqueuse d'acide citrique 0,1 M (19a2 g/l) puis le benzène est totalement éliminé par distillation sous pression réduite Le précipité est filtré puis lavé 2 fois avec environ 75 cm3 de solution aqueuse d'acide tartrique. La solution obtenue dont le pH est égal à 2,9-3 est extraite par trois fois 500 cm3 de benzène. La solution aqueuse est amenée à pH 4,5 par addition dlune solution aqueuse d'ammoniaque à 30 Z puis est extraite trois fois par pay59m? de benzène0 Les extraits benzéniques sont séchés sur sulfate de sodium anhydre puis concen trés à sec. On obtient ainsi 3,38 g d'une fraction contenant la calongine Cette fraction est chroniatographiée sur 40 fois son poids d'alumine désactivée par 10 Z diacide acétique. L'solution au chloroforme fournit une fraction très enrichie en calongine. Par chromatographie sur couche épaisse de gel de silice en éluant par un mélange acétate dtéthyle-éthanol absolu (3-1 en volumes)} on obtient 120 mg de calongine pure. REVENDICATIONS 1- Nouvel alcaloïde extrait de Catharanthus longifolius Pich., appelé calongine, caractérisé en ce que son poids moléculaire est 776, son spectre ultra-violet présente des maximums d'absorption à 256 nm, 284 nm et 292 nm , son spectre infra-rouge est-représenté figure 1, et qu'il est constitué d'une molécule de vindoline attachée par sa position 10 à une molécule de nature indolique. 2--Procédé de préparation de la calongine selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on extrait cet alcaloïde par traitement approprié des parties aériennes de Catharanthus longifolius Pich.. 3- Composition médicinale caractérisée en ce qu'elle contient comme principe actif l'alcaloïde selon la revendication I en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants pharmaceutiquement acceptables.