Brevet FR2208980A1 — publié le 19740628

La présente invention concerne un procédé de production d'acide citrique par fermentation. On sait que l'acide citrique est l'un des acides organiques les plus utilisés dans les industries alimentaires et pharmaceutiques grâce à sa facilité d'assimilation et à sa faible toxicité. On sait que la lus grande partie de l'acide citrique est fabriquée dans le monde par des procédés dc fermentation. Les microoganismes les plus utilisés dans ces procédés sont des souches d'Aspergillus Niger, qui utilisent comme principale sourcer de carbone des glucides tels que mélasses et dextrose. Cependanc de tels procédés présentent de nombreuses difficultés licées notamment à une instabilité des souches ainsi qu'à à des durées de fermentation particulièrement longues En outre des difficultés importantes sont liées à la variabilité de composition des glucides utilisés, ce qui esL le cas général pour les produits d'origine agricole. Il a t signale depuis longtemps que la production de levures ainsi que de métabolites divers et notamment d'acide citrique pouvait être obtentie par fermentation sur nydrocarbures, de tels procédés écant a priori beaucoup plus avantageux que des procédés à partir de substrats d'origine agricole (voir par exemple F. JUET, W. SCHNABEL et S. ULMAN, Die Brauerei, Wissnaschaftliche Beilage, 1951, 4(8), 57-60 et (9-) 71-75). L'objet de la présente invention consiste en un procédé perfectionné d'obtention d'acide citrique utilisant une levure capable d'assimiler des paraffines normales dans lequel une telle levure est cultivée dans un milieu qui comprend au moint une paraffine normale et une phase nutritive aqueuse de composition classique, milieu caractérisé en ce qu'il contient au moins -an composé organique hétérocyclique azoté. Les auteurs de l'invention cnt en effet découvert que les souches. de levures Candida acquièrent une capacité accrue d'accomulation d'acide citrique lorsque l'on ajoute aux milieux de fermentation des composés organiques possédant au moins un groupement amino inclus dans un cycle, c'est-à-dire des compo- sés organiques azotés hétérocycliques.Parmi ces composés, ceux. qui possèdent au moins un groupement carbonylique en &alpha; de l'azote hétérocyclique, tels que # l'acide pyridine 2 carboxylique (acide picolinique) # l'acide pyridine 2,6 dicarboxylique (acide. 2,6-dipicolinique) l'acide quinaldique se révèlent particulièrement efficaces. Ces acides peuvent entre utilisés sous forme de -nls non toxiques, par exemple des sels de métaux alcalins. Mais on peut utiliser avec succès d'autres composés hétérocycliques azotés tels que l'orthophénantroline le bi-pyridyle 1 'hydroxy-5-quinoxaline 1 'hydroxy-8-quinoléine. La mise en oeuvre du procédé consiste donc, par exemple, à préparer un inoculum d'une culture de levure capable d'assimiler les n-paraffines, par exemple Candida, puis à effectuer la fermentation en présence d'au moins une paraffine de C10 à C24. L'inoculum peut être préparé en mettant en suspension des cellules de levure, de préférence Candida, dans des conditions aérobies dans un milieu aqueux contenant une source de carbone assimilable, généralement une coupe industrielle d'hydrocarbures n-paraffiniques de C10-C24, et une source d'azote assimilable. Les composés hétérocycliques azotés peuvent être ajoutés à l'inoculum ou être introduits ulterieurement. Le milieu est agité à une température de 25-300C pendant, par exemple, 36 heures. Après avoir obtenu une densité suffisante de cellules de Candida ou autre levure dans la culture de l'inoculum, une partie de celui-ci est ajoutée au milieu de fermentation qui contient une source carbonée n-paraffinique, une source d'azote assimilable ainsi que différents cations, anions et vitamines connus comme favorisant la croissance. Le composé hétérocyclique azoté, utilisé dans le procédé de la présente invention, est ajouté soit au début de la fermentation, soit de préférence lorsque la croissance de la levure aura été suffisante (fin de la phase exponentielie), soit en partie à chacun de ces moments. Comme source d'azote, utilisée dans le milieu de fermentation, on peut utiliser par exemple des sels d'ammonium minéraux parmi lesquels seront choisis de préférence le nitrate d'ammonium, le sulfate d'ammonium, et le carbonate d'ammonium. Les cations et anions suivants sont également favorables à la croissance des levures du genre-Candida : potassium, sodium, zinc, magnésium, manganèse, fer, phosphate, carbonate. Il est également bien connu que l'addition dans les cultures de levures du genre Candida de traces de vitamines telles que la thiamine et la biotine joue un rôle favorable à la croissance des cellules. Après l'ensemencement, la fermentation a lieu dans un milieu agité et fortement aéré 9 une température habituellement comprise entre 25 et 35 C, et de préférence autour de 300C. De l'air comprimé stérile est diffusé dans le milieu de fermentation à raison d'environ 1 à 2 litres d'air/mn/litre de milieu. Dans les premières heures de la fermentation, c'est-h-dire pendant la phase de croissance, le pH est de préférence réglé de façon à ce que la vitesse de multiplication des cellules de levure soit optimale, c'est-à-dire à une valeur de préférence comprise entre 4,5 et 5,5. Cette régulation du pH pourra etre effectuée par exemple par addition d'une solution aqueuse basique telle qulune solution d'ammoniaque, de soude, de potasse, de carbonate de sodium ou de potassium. Cependant on préfère maintenir le pH à la valeur désirée par addition de carbonate de sodium ou de potassium à cause, non seulement de l'effet activateur des ions sodium et potassium pour la croissance Trais aussi-de celui des ions carbonate qui semblent entrer dans le métabolisme des cellules de levure et activer leur croissance. Après une croissance suffisante des levures (fin de la phase exponentielle de croissance) on ajoute les composés organiques hétérocycliques azotés à une concentration habituellement comprise entre 0,5 et 10 g/litre et de préférence entre 1 et 5 g/litre, et on laisse la fermentation se poursuivre sans qu'il soit nécessaire de réguler le pH pour addition d'une solution basique, le pH diminuant alors progressivement pour se maintenir aux environs de 3-3,5 en fin de fermentation. Quand des quantités intéressantes d'acide citrique se seront accumulées, ce composé peut etre isolé par des méthodes classiques par exemple sous forme de sel de calcium. Après l'élimination des cellules, on peut par exemple rendre le milieu basique par addition de la quantité stoechiométrique de chaux, puis précipiter le citrate de calcium par chauffage du surnageant. Il est entendu que le procédé de la présente invention englobe l'utilisation de mutants de levures, notamment des mutants de Candida, ou de variants, obtenus par des techniques physiques telles que les rayons X ou les rayons tV, ou par des techniques chimiques telles que l'utilisation de nitrosométhyluréthane ou nitrosoguanidine, bien connues pour leur action mutagène. EXEMPLE 1 (exemple comparatif) - On ensemence, à partir d'un tube contenant des cellules de Candida lipolytica IFP 29 sur gélose, une fiole de 100 ml contenant 20 ml d'un milieu liquide de préculture ayant la composition suivante KH2P04 .......... 3,4 g/litre Na2HP04, 12 H20 ... 1,5 g/litre # MgSO4, 7 H2O .......... 0,7 g/litre (NH4)2S04 ............ 4 g/litre CaCl2 0,1 gllitre - # FeSO4, 7 H20 ;;. 2 mg/litre # CuSO4, 5 H2O ........ 5 g/litre # H3BO3 ............... 10 g/litre MnSO4, H20 ............ 10 rg/litre ZnSO4, 7 H20 10 g/litre # (NH4)6M7O24, 4 H2O .... 100 g/litre # Co (NO3)2, 6 H2O ...... 10 g/litre Extrait de levure ..... 100 mg/litre Eau de ville ......... ajustée à 1 litre Coupe n-paraffinique 15 g/litre C12-C19 La coupe n-paraffinique à la composition suivante Hydrocyrbure % poids relatif C12 0,07 Cl3 2,05 C14 15,71 C15 32,00 Cl6 30,83 C17 17,90 C18 1,38 C19 0,06 Les cellules de Candida sont incubées à 30 C après fixation de la fiole contenant l'inoculum surune table d'agitation tournant à la vitesse de 140 t/mn.Après 36 heures d'incubation, 10 ml de cet inoculum sont utilisés pour ensemencer une fiole de Fernbach de 1,5 litre contenant 200 ml du milieu nutritif stérile A ayant la composition suivante KE2P04 ............ 2- g/litre # MgSO4, 7 H2O ........ 1 g/litre NH4N03 ............. 2,5 g/litre # CaCO3 ................ 20 g/litre # FeSO4, 7 H2O ......... 0,2 g/litre # MnSO4, 7 H2O ......... 0,026 g/litre # Extrait de levure .... 100 mg/litre Eau de ville .......... ajustée à 1 litre e Coupe n-paraffinique 25 g/l C12-C19 La fiole de Fernbach est fixée sur une table d'agitation et le milieu est agité à 30 C pendant 6 jours. La concentration en acide citrique est de 10,1 g/l. EXEMPLE 2 - Quand la fermentation décrite dans l'exemple 1 est répétée après addition de 1,2 g/litre d'acide &alpha; picolinique au milieu A, la concentration en acide citrique est de 26 g/l. EXEMPLE 3 - La fermentation décrite dans l'exemple 2 est reproduite avec des résultats comparables, en utilisant à la place de la souche Candida lipolytica IFP 29, chacune des souches suivantes de levures du genre Candida Souches du N genre Candida lipolytica IFP 102 lipolytica IFP 88 lipolytica ELF 8 lipolytica ELF 19 lipolytica ElF 25 tropicalis IFP 114 lipolytica diploïde D 1805 lipolytica diploïde D 1806 lipolytica diploide D 1807 EXEMPLE 4 (exemple comparatif) - On stérilise un fermenteur d'une capacité de 2,5 litres, contenant 1,2 litre d'un milieu nutritif ayant la composition suivante # KH2PO4................ 4 g/litre MgSO4, 7 1120 . 2 litre NH4NO3 .. 5 g/litre # FeSO4, 7H2O ........... 0,4 g/litre # MnSO4, 7H2O ........... 0,052 g/litre Extrait de levure .... 200 mg/litre Chlorhydrate de thiamine 50 rg/litre # Eau de ville ............. ajustée à 1 litre Coupe n-paraffinique 100 g/litre C12-C19 Le fermenteur est ensomenté par 200 m d'un milieu de culture ayant la composition de l'exemple 1, en utilisant la souche de Candida lipolytica IFP 29. La régulation du pH est: assurée daiis une première phase à 5 par addition d'une solution de carbonate de potassium 0,5 M. Le milieu est alors agité à 2300 t/mn à 30 C pendant environ 30 heures. On laisse ensuite le milieu s'aci- difier de lui-meme et on constate que le pH se stabilise entre 3 et 3,5. Au bout de 150 heures de culture la concentration en acide citrique est de 65 g/l. EXEMPLE 5 - La fermentation décrite dans l'exemple 4 est répétée après addition de 1,2 g/litre d'acide &alpha;-picolinique dans le milieu, après 30 heures de culture. La concentration en acide citrique, au bout de 150 heures, est de 135 g/l. EXEMPLE 6 - La fermentation décrite dans l'exemple 5 est reproduite avec des résultats comparables, en utilisant, à la place de l'acide &alpha;-picolinique, l'un des hétérocycles azotés suivants Acide pyridine-2,6-décarboxyiique Acide quinaldique Bi-pyridyle Orthophénantroline Hydroxy-8-quinoléine # Hydroxy-5-quinoxaline. REVENDICATIONS 1.- Procédé de production d'acide citrique par culture aérobie de souches de levures du genre Candida dans un milieu qui comprend au moins une n-paraffi ne et une phase aqueuse nutritive, caractérisé par le fait que lton ajoute en outre au milieu, au moins un composé organique hétérocyclique azoté. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise, comme souche de levure du genre Candida, la souche C. lipolytica IFP 102, IFP 88, ELF 8, ELF 19, ELF 25, D 1805, D 1806, D 1807, ou C. tropicalis IFP 114. 3.- Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que le composé organique hétérocyclique est l'un des suivants Acide a -picolinique .Acide-2,6-dipicolinique .Acide quinaldique Bi-pyridyle Orthophénantroline Hydroxy-8-quinoléine Hydroxy-5-quinoyaline. 4.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que le composé hétérocyclique azoté est ajouté après la phase exponentielle de croissance à une concentration comprise entre 0,5 et 10 g/litre. 5.- Procédé selon l'une des revendications 1 å 3, caractérisé par le fait que le composé hétérocyclique azoté est ajouté après la phase exponentielle de croissance à une concentration comprise entre 1 et 5g/litre. 6.- Procédé selon l'une des revendications l à 5, caractérisé en ce que, pen dant la phase de croissance, le pH est contrôlé par addition de carbonate de sodium ou de potassium.