Brevet FR2237905A1 — publié le 19750214

l'a présente invention concerne un procédé de vre- paration de galactose et de boissons à base de galactose, à partir de solutions contenant du lactose. Ce procédé est plus particulièrement utilisable dans l'industrie laitière et notamment pour le traitement du lac- tosérum, en utilisant ce dernier comme solution de lactose L'industrie laitière produit des qu-antites-crois- santes de lactosérum qui est une phase liquide obtenue après précipitation à partir du lait (par addition de presure ou d'acide de) de la caséine servant à la fabrication du fromage. La composition moyenne du lactosérum est la suivante Bau .................... 960 g Lactose................. 35 g Cendres 4 g Potassium * 1 g -Sodium 0,50 g R}boflavine * 1,4 mg Niacine.................. 1 mg Thiamine................. 0,3 mg Calcium ....... 0,25 mg Phosphore................ 0,20 mg Vitamine A............... 100 UI Protéines................ traces. Bien que les produits de départ du présent procédé ne soient pas limités aux lactosérums, l'utilisation de ces -derniers comme matières de départ présente de nombreux avantages. En effet, le lactosérum est actuellement une source de pollution non négligeable des cours d'eau, voisins des laiteries, dans lesquels il est déversé. Ceci car jusqu'à maintenant il ne constituait qu'un sous-produit non valorisable, La présente invention permet de préparer à partir du lactosérum des produits intéressants et directement commercialisables et d'éliminer les rejets de lactosérum, ee qui est doublement avantageux. La présente invention propose un procédé de traitement du lactosérum à l'aide de micro-organismes qui fournit d'une part, une masse de micro-organismes utilisable dans l'alimentation animale, et, d'autre part, une solution de galactose pouvant servir directement après clarification a la préparation de boissons. Ce procédé permet également, si on le désire, de préparer du galactose par extraction de ce dernier à partir de sa solution. le brevet français 71 27592 decrit un procédé de préparation du galactose à partir d'une solution de lactose telle que le lactosérum. Dans ce procédé, il est d'abord nécessaire d'amener le lactosérum à une concentration de 5 à 15 ffi en lactose, de pratiquer ensuite l'hydrolyse acide de la solution obtenue, puis de ramener le pli de la solution entre 3 et 6. La solution, contenant alors du glucose et du galactose provenant de l'hydrolyse du lactose, est fermentée par une souche de levure fermentant et assimilant le glucose, mais pas le galactose. Les levures sont ensuite séparées du milieu renfermant le galactose par centrifugation. Ce procédé nécessite de multiples opérations. L'hydrolyse chimique permet de traiter des solutions de lactose dont la concentration est comprise entre 5 et 15 % alors que le lactosérum brut ne contient que 3,5 % environ- de lactose. Par la suite, l'épuisement total en glucose dans les tours de fermentation est difficile à obtenir. De plus, l'opération s'effectuant sans croissance, elle exige des conditions particulières de stérilité. Le procédé selon la présente invention, outre le fait qu évite la majorité des opérations précédemment décrites, présente également des avantages qui apparaitront dans la suite de la description. Selon l'invention, on prépare du galactose ou une boisson contenant du galactose à partir d'une solution contenant du lactose, en particulier du lactosérum, en traitant-la solution contenant du lactose par un micro-organisme mutant, non-pathogène, prototrophe, possèdant une ss-galactosidase et un caractere gale, ciest-à-dire incapable de fermenter le galactose, puis en séparant, après fermentation, les micro-organismes d'avec la solution contenant le galactose et en extrayant, si'ongle désire-, le galactose de cette solution. Selon un des modes de réalisation préférés de ltinvention, le micro-organisme utilisé est une bactérie obtenue par mutation et sélection partir d'une souche sauvage. Cette bacterie est choisie de préférence parmi les Enterobacteriaceae ou les Lactobacteriaceae, en particulier Escherichia coli, de façon encore préférable, la souche d'Escherichia coli est la souche CBS 6501 B déposée a Delft ( voir exemple 1). Selon un autre mode de réalisation préféré de l'inven tionr le micro-organisme utilise est une levure. Cette levure étant obtenue par mutation-et sélection, de préférence a partir d'une souche haploïde, la souche sauvage étant choisie de préférence parmi Les Ascomycètes Débaryomyces cantarellii -- Débaryomyces castellii Débaryomyces hansenii Débaryomyces morana Dêbaryomyces tamarii Hansenula capsulata Kluyveromyces aestuarii Kluyveromyces bulgaricus kluyvercomyces cicérisporus Klayveromyces fragilis Rluyveromyces lactis Rluyveromyces wikerhamii Lipomyces lipofer Lipomyces starkeyi Pichia farinosa Pichia polymorpha Pichia pseudopolymorpha Pichia scolyti Pichia stipitis Schwanniomyces castelli Wingea robertsii, en particulier les Rluyveromyces fragilis ou Rluyveromyces lactis, ou parmi : Les Basidiomycètes Leucosporium frigidum Leucosporidium scottii Bullera alba Bullera strigea Sporobolomyces singularis. Dans un mode de réalisation encore préféré de l'invention, le micro-organisme utilisé est l'une des levures mutantes de Kluyveromyces fragilis déposées au Centraal Bureau voor Schimmelcultures à Delft sous les nos Cs 6498 et CS 6499 Une variante du procédé selon l'invention consiste à déprotéiner le lactosérum avant la fermentation, par Itun des procédés actuellement bien connus tels que la précipitation des protéines à chaud en milieu acide ou par ultrafiltration sur membrane sélective. La séparation des corps microbiens, après la fermentation, peut ttre réalisée par tout moyen connu, en particulier par centrifugation. Dans le cas des levures, l'utilisation de ces micro-organismes dans l'alimentation ne pose pas de problème il s'agit bien d'un sous-produit présentant un intérêt économique certain. Dans-le cas des bactéries, celles-ci peuvent éventuellement servir dans l'alimentation des volailles. Dans le cas óW lton utilise des levures, et à condition d'aérer fortement le milieu de fermentation, il ne reste pas de sous-produit dans la solution et celle-ci peut être directement utilisée dans la préparation de boissons contenant du galactose, il est possible également d'arrêter la fermentation avant que tout le lactose soit consommé afin d'obtenir une solution de lactose et de galactose, si besoin est. Lorsque l'on utilise des bactéries, en particulier des bactéries coliformes, le processus de fermentation est plus rapide et nécessite une aération moins importante que pour les levures, ce qui .Constitue un avantage, mais d'unautre coté, il reste dans le milieu de fermentation des sous-produits peu favorables pour la préparation de boissons, il est donc, en général, préférable dans ce cas d'extraire le galactose de la solution, par exemple en concentrant la solution obtenue jusqu'à obtention d'un extrait sec à 50 % et cristallisation par refroidissement aux environs de 200C, après lavage, essorage et décantation ; on peut procéder à un séchage par atomisation ou, pour attendre un plus grand degré de pureté, on peut procéder à une dissolution dans l'eau chaude puis à un passage sur charbon actif suivi des opérations de cristallisation, lavage, essorage, décantation etséchage par atomisation ou sur un lit fluidisé, suivi d'un broyage. En variante, le galactose pur peut etre obtenu par extraction à laide d'une solution d'alcool éthylique selon un procédé bien connu. Bien quelle ne désire pas etre tenue par des considérations théoriques, la Demanderesse désire préciser, ci-après, le schéma du métabolisme du galactose chez les micro-organismes et ses relations avec l'invention. Chez certaines levures et certaines bactéries, le lactose est hydrolysé par une ss-galacto- sidase mais les micro-organismes qui possèdent cette ss-galactosidase possèdent aussi, en général, l'équipement enzymatique leur permettant de métaboliser le galactose. Le schéma du métabolisme du galactose chez les micro-organismes est le suivant 1ère étape Pénétration du galactose par une perméase. 2ème étape Galacto-Kinase Galactose + ATP # Galactose-1-phosphate + ADP ATP = Adénosine triphosphate ADP = Adénosine diphosphate. 3ème étape Uridyl-tran-sférase Galactose-1-phosphate # Glucose-1-phosphate + Uridine diphosphate glucose + Uridine diphosphate galactose 4ème étape Epimérase Uridine diphosphate # Uridine triphosphate Galactose Glucose 5ème étape Pyrophosphorylase Uridine diphosphate # Uridine triphosphate Glucose + Glucose--i -phosphate Des études génétiques ont montré que ces différentes étapes sont contrôlées par un seul enzyme et donc par un seul gène, une mutation au niveau du gène controlant l'un des enzymes suivants : perméase, galacto-Kinase, uridyl-transférase ou épimérase, bloque donc l'utilisation du galactose. Il est alors possible de produire une souche possédant une ss galacto- sidase et ayant perdu par mutation un enzyme indispensable pour l'utilisation du galactose libéré dans la cellule. Toutefois, la mutation bloquant l'utilisation de la perméase n'est pas utilisable dans le procédé selon l'invention En effet, le micro-organisme reste capable de métaboliser le galactose lorsque celui-ci se trouve déjà à l'intérieur de la cellule, ce qui se produit lors de l'hydrolyse du lactose.La mutation la plus intéressante pour l'utilisation de la souche dans le procédé selon l'invention est la perte de l'uridyl-transférase. Pour l'obtention de souches bactériennes utilisables dans le procédé selon l'invention, on peut avoir recours à deux types différents de mutation et sélection. La premiere consiste, à partir alune souche de collection présentant le caractère gal et une -galactosidase, cette souche étant non-pathogène mais auxotrophe pour certaines substances, à traiter cette souche de façon à la reverser pour ses différentes auxotrophies jusqu'à obtenir une souche prototrophe -et ayant conservé ses autres caractéristiques. En effet, sur le plan industriel, une souche prototrophe présente l'avantage de ne pas exiger l'ajout de facteurs de croissance qui sont nécessaires au développement dune souche auxotrophe. A titre exemple de procédé permettant de reverser une souche auxotròphe, on peut utiliser la technique suivante A partir d'une culture de la souche auxotrophe, réalisee naturellement sur un milieu renfermant les facteurs de croissance, on étale 108 à io9 cellules à la surface d'un milieu minimum (il est rappelé que la caractéristique d'une souche prototrophe est de pouvoir synthétiser tous ses constituants dans un milieu synthétique exclusivement minéral appelé milieu minimum) dans lequel manque un facteur de croissance X nécessaire à la croissance de la souche de départ. Le mutant reversé devenu prototrophe pour le facteur X va pousser. On étale alors les cultures à la surface d'un milieu coulé en Boîte de Pétri. Bes colonies apparaissant sont isolees et prélevées, elles sont devenues prototrophes pour le facteur X et peuvent être utilisées dans une autre étape du procédé dans laquelle elles seront reversées pour une autre des-auxo- trophiesde la souche initiale. C'est par ce procédé que la Demanderesse a préparé le mutant qui fait ltobjet de Itexemple 1 décrit ci-après. Il est également possible en partant d'une souche sauvage d'obtenir une souche bactérienne utilisable dans le procédé selon l'invention par un autre procédé de mutation-sélection. La-description de ce procéda qui sera faite ci-après en se réfe- rant à Escherlchia coli peut être utilisée évidemment pour dtautres souches sauvages, en particulier des souches d'Entero- bacteriaceae ou de Lactobacteriaceae. Escherichia coli appartient à la famile des En*ero- bacteriaceae-et à la tribu des Escherichiaceae, ce sont des bactéries gram négatif de formes cocoides ou légèrement allongées; les cellules sont isolées en paires ou en courtes chaînes, en général dépourvues de capsule et le plus souvent mobiles, ce sont des anaérobies facultatives -présentant une fermentation des glucides de type acide mixte, sans formation d'acétoine, et ayant un test au rouge-de méthyle positif.Ces bactéries utili- sent les glucides, en particulier le lactose, le galactose, le glucose et le manitol, elles possèdent la lysine décarboxylase mais ne donnent pas l'acide phénylpyruvique à partir de la phenylalanine ; elles n'hydrolysent pas non plus l'urée et-ne dégagent pas H2S La souche sauvage d'Escherichia coli est traitée à l'aide d'un agent mutagène physique ou chimique-de façon à augmenter la fréquence des mutations pour les gènes intervenant dans le métabolisme du galactose. Comme agent mutagène physique on peut citer les rayons ultraviolets, les rayons X et les rayons gamma par exemple, et, comme agent mutagène chimique on peut citer l'éthylméthanesulfonate, l'acide nitreux, les agents alkylant, la nitrosoguanidinef l1acryfîavine ou d'autres composés biens connus comme agent mutagène. Après ce traitement, on pratique un- enrichissement en bactéries mutantes possédant le caractère gal pour ce faire, on transfère la population ayant subi la mutation dans un autre milieu permettant la croissance et dans lequel la seule sourie de carbone est le galactose et qui contient en outre un antibiotique tel que la pénicilline. L'antibiotique tue les cellules en multiplication végétative mais reste sans action sur les mutants incapables de se multiplier puisque ne pouvant métaboliser le galactose.Au bout d'un certain temps, seules survivent les bactéries possédant un caractère gal . Parmi les souches isolées, il est nécessaire de procéder à une nouvelle sélection puisque certaines des souches obtenues, bien qu'incapables d'utiliser le galactose comme source de carbone, ne sont pas utilisables dåns le procédé selon l'invention. il s'agit par exemple de souches qui ne possèdent pas la perméase. Pour éliminer ces souches indésirables, on cultive les souches obtenues à l'étape précédente sur boîte de Pétri contenant un milieu complet à base de glucose comme source de carbone. Il convient d'étaler 100 cellules vivantes environ par boite. les colonies apparues sont repliquées par "replicá- plating" (ou culture par replique) sur un milieu à base de galactose. Les mutants recherchés gal donnent des colonies sur le premier milieu à base de glucose mais pas sur le milieu à base de galactose. Parmi les clones mutants gal lactose+ il convient de choisir à l'aide de tests appropriés ceux qui ont la possitilité dthydrolyser le lactose en rejetant le galactose dans le milieu. Dans toules cas il est possible d'effectuer des préparations acellulaires et de doser les activités enzymatiques afin de déterminer quel est pour chaque clone ltenzyme manquant; Lorsque l'on désire utiliser comme micro-organisme selon la-présente invention une levure, le procédé de mutation et de sélection de la levure est le suivant, la description qui suit sera faite-en se référant à la souche Kluyveromyces fragilis mais est également applicable à d'autres souches de levures, en particulier celles qui appartiennent aux ascomycètes et qui sont diplobiontiques hétérothaliques, notamment celles citées pré- cédemment ; il est possible d'utiliser également certains basidiomycètes, en particulier les souches citées précédemment. Enfin, il est possible d'utiliser des levures appartenant aux fongi-imperfi bien que l'obtention de mutants défectifs pour le galactose et utilisant le lactose soit plus délicate dans le cas de ces levures car leur cycle biologique est inconnu et on ne sait pas s'ils sont haploïdes ou diploïdes. Les levures de ce type particulièrement utilisables dans le procédé selon l'invention sont les suivantes Bréttanomyces anomalus Bréttanomyces claussenii Bréttanomyces curtersil Candida aaseri Candida aquatica Candida blankii Candida curvata Candida glaebosa Candida humicola Candida intermédia Candida kefyr Candida macédoniensis Candida muscorum Candida pseudotropicalis Candida salmanticensis Candida shehatae Candida tenuis Cryptococcus albidus Cryptococcus ater Cryptococcus dimennae Cryptococcus flavus Cryptococcus gastricus Cryptococcus hungaricus Cryptococcus infirmo-miniatus Cryptococcus laurentii Cryptococcus macerans Cryptoccocus mélibiosum Cryptococcus terreus Rhodotorula aurantiaea Rhodotorula lactosa Rhodotorula marina Rhodoturula minuta Sterigmatomyces halophilus Torulopsis candida Torulopsis ingéniosa Torulopsis versatilis Trichosporum cutaneum Trichosporum inkins Trichosporum pullulans. La souche Kluyveromyces fragilis se trouve dans la nature à l'état diploïde, or la recherche de mutants pour un gène donné ne peut se faire avec de bonnes chances de succès qu'à partir d'un individu haploïde. Le procédé d'obtention d'une souche utilisable selon la présente invention comprend donc deux parties principales. La première est la recherche d'individus haploïdes et la seconde la mutation et la sélection des souches haploïdes obtenues. On donne ci-après la description de l'espèce selon J. Lodder Assimilation des substrats carbonés Glucose + Mélézitose - Ribitol # Galactose + Inulin + Galactitol L.sorbose + D-xylose + D-manitol + Sucrose + L-arabinose + D-glucitol + Maltose - D-arabinpse - &alpha;;-méthyl-D-glucceide Cellobiose + D-ribose + Salicin + Thréhalose - B-rhamnose - Acide lactique DL + Lactose + \Ethanol + Acide succinique + Mélibiose - Glycérol + Acide citrique t Raffinose + Erythritol - Inositol Fermentation des composés carbonés Glucose + Mélibiose - Mélézitose Raffinose + Saccharose + Cellobiose Maltose - Inuline + -méthyl-D-glucoside Lactose + Galactose + Tréhalose Autres tests Hydrolyse l'arbutine, Assimile les nitrates de potassium et le chlorhydrate d'éthylamine comme source d'azote, Croissance négative en absence de vitamines, Croissance à 370C, Résiste à la cycloheximine. Croissance sur extrait de malt Après 3 jours à 280C, les cellules sont ellipsoïdes ou cylindriques (2,0 - 6,0) x )3,5 - 10,0) . Elles sont seules, -en paires ou en chaîne Les pseudomycéliums se forment en plus ou moins grande quantité. Un culot apparaît et occasionnelle ment un anneau. Après un mois à la température ambiante, un important culot s'est formé. Un anneau est habituellement présent. Croissance sur extrait de malt gélosé : Après 3 jours, les cellules sont cylindriques ou ellipsoïdes ; le plus souvent seules, en paires ou en courtes channes Un pseudomycélîum se forme fréquemment. La culture est de couleur crème, brillante. Les colonies sont lisses ou parfois plissées. Formation des ascospores Les cellules diploïdes se transforment directement en asques. Il-peut y avoir conjugaison entre cellules isolées. La somatogamie peut précéder la formation de l'asque. Une à quatre spores sont formées par asque. Les ascospores sont rapidement libérées danse milieu et s'agglutinent. Les asco spores sont réniformes ou allonges. Formation des pseudomycéliums : Il y a formation dtun pseudomycélium sur les milieux spéciaux. Celui-ci se développe mieux en anaérobiose. il peut etre rudimentaire ou ramifié. Afin d'obtenir- des clones haploïdes, la souche est mise a pousser sur un milieu riche (extrait de levure, glucose, pe,p- tone). La culture en phase exponentielle de croissance est ---transférée sur un milieu de sporulation dont la composition est décrite par B. Veqinhet : c'est un mélange en partie égale d'une solution d'acétate de potassium 0,4 N et de tampons phosphate Sorensen M/15 : pH = 7. Après 48 à 72 heures, 80 % des cellules ont sporulé. Les asques éclatent très rapidement et libèrent dans le milieu les spores haploïdes. La technique habituelle au micro-manipu lateur de Fontbrune n'est pas utilisable dans ce cas car les spores sont léthalesà 99 %.-Il est nécessaire d'avoir recours à un traitement thermique pour obtenir des clones haploïdes. En effet, les cellules végétatives sont moins résistantes à la chaleur que les spores et un traitement de 2 minutes à 600C permet de détruire 99 % des formes végétatives diploïdes. A la suite de ce traitement, on étale à la surface d'un milieu riche coulé en Boite de Pétri 100 à 200 colonies par boite. On observe les boîtes après 48 à 72 heures dtincubation à l'étuve à 26 C et l'on prélève les clones cellulaires qui apparaissent. Chaque clone est mis en culture sur un milieu riche puis testé sur unmilieu de sporulation, chaque clone qui sporule peut être éliminé puisqu'il est diploïde. Les clones qui ne sporulent pas sont supposés haploïdes.Afin de confirmer le caractère haploïde de chaque clone, il est nécessaire d'essayer de les marquer par- des mutations auxotrophes. Un moyen simple et rapide consist-e à rechercher les clones conduisant à des mutants auxotrophes pour un acide aminé ou une base lors d'une mutagénè-se. La technique consiste à faire-agir sur une population en phase stationnaire un agent mutagène physique ou chimique tel que ceux décrits pour la mutation des bactéries par exemple. Dans le cas présent, on utilise de préférance l'éthylméthanesulfonate puis on transfère la culture sur un milieu tel que seuls les prototrophes poussent et sur lequel on fait agir après une à deux générations un antifongique.La mycostatine tue les cellules en phase de croissance qui correspondent aux clones prototrophes n'ayant pas subi de"mutation.Apr's dilution-on étale 100 cellules par Boîte sur un milieu complet où les auxotrophes pourront se développer puis on incube les boites pendant 48 à 72 heures. La technique de "replicaplating" permet ensuite de déterminer les-clones qui se sont développés sur un milieu complet et n'ont pas donné de colonies sur le milieu minimum où seuls les prototrophes se développent. Après 48 heures d'incubation il est possible de repérer les auxotrophes. Cette technique permet d'obtenir des clones haploïdes. Dé telles souches obtenues et marquées vont servir 'à la recherche, dans l'étape suivante, de mutants pour l'un des gènes bloquant 11utilisation du galactose. La technique de mutation et de sélection destinée à obtenir des mutante gal est la même que celle décrite précédemment pour l'obtention de mutants auxotrophes, seuls les milieux de culture vont changer. Le milieu "complet" permettant la croissance sera un milieu contenant du glucose alors que le milieu "minimum" contiendra du galactose. Lorsqu'après "replicaplating" un certain nombre de clones ne se développent pas sur milieu minimum, ceux-ci sont pré7evés et testés en milieu liquide sur les milieux suivants : extrait de levure + galactose, et lactosérum. En effet, parmi tous les clones ne poussant pas sur galactose, certains ne sont pas utilisables dans le procédé selon l'invention. Par exemple, une souche ayant muté pour la perméase ne se développera 'pas sur galactose car celui-ci ne peut pénétrer que par osmose. Cette souche consommera néanmoins le galactose après hydrolyse du lactose puisque celle-ci se produit à l'intérieur de la cellule Il est possible de déterminer l'enzyme perdu par une étude enzymatique. De méme que pour les bactéries, lorsqu'un mutant gal est marqué pour une auxotrophie, il est alors nécessaire de rechercher la reversion par une technique telle qu'e celle indiquée précédemment.Les souches de levure ainsi obtenues peuvent être utilisées dans le procédé selon l'invention mais il est en général préférable de rechercher la diploïdisation de ces souches. En effet, les souches diploïdes ont une meilleure croissance que les haploïdes. Un, certain nombre de techniques sont actuellement connues pour diploïdiser des souches haploides. On peut croiser cellule à cellule, au micromanipulateur, ou croiser deux clones auxo troches à besoin complémentaire en criblant les prototrophes. Naturellement, il faut croiser des clones de signes sexuels opposés; La méthodologie décrite est utilisable pour toute les cellules capables de métaboliser le lactose et le galactose, pourvu qu'elles soient dîplobiontiques et hétérothaliques. Pour les levures haplobiontiques, la mutagénèse peut s'-appliquer directement sur les cellules de collection ou isolées dans la nature. Pour les levures diplobiontiques homothyliques, certaines difficultés peuvent se présenter, c'est le cas rencontré avec Kluyveromyces marginus. Après sporulation, il est possible d'extraire les spores. Chaque spore se développe en donnant un clone haploïde. Celui-ci va se diploidiser par la suite sans qu'il y ait eu de crcisement; dès lors la recherche de mutants est très délicate, en effet les chances, d'obtenir un mutant avec les diploïdes sont très faibles, de l'ordre de 10-14 à 10-16. Dans ce cas précis, on ignore si l'on a un diploïde ou un haploïde. Certaines -caractéristiques de l'invention seront mieux comprises à la lecture des exemples suivants, qui ne limitent évidemment aucunement l'invention. EXEMPLE 1 On utilise pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention une bactérie du type Escherichia coli. La souche utilisée, déposée à Delft sous le n0 CBS 6501 P, -est obtenue par mutation de la souche B 112.21 déposée à l'institut Pasteur et répertoriée sous. le n 115.15. Cette souche a le génotype suivant : Thi gal (transférase), Hfr P O.. 00. Après avoir obtenu la mutation de souche et la reversion de l'auxotrophie pour la thymine par le procédé décrit précédemment, la croissance sur lactosérum a été étudiée. Les précultures sont effectuées sur un milieu minéral complémenté en thiamine dont la composition est la suivante H PO4 ............... 7 g/l K H2 P04 , 3 g/l (NH4)2SO4............. 1 g/l MgSO4,7H2O............ 0,10 g/l Citrate de sodium à 2 H2O ................ 0,5 g/l Citrate de fer ....... 0,3 mg/l MnSO4H2O ............. 0,17 mg/l Glucose ou lactose ... 5 g/l Thiamine ........... 1 mg/l La culture proprement-dite est effectuée sur lactosérum complémenté en thiamine à raison de 1 microgramme/ml à une température de 340C + 0,50C sur agitateur de manière à aerer le milieu et a maintenir les cellules en suspension (80 oscillatisons par minute d'amplitude 7 cm}.La culture est ensemencée a l'aide de la préculture en milieu minéral Dans ces conditions, on obtient une population donnant de l'ordre de 1,5 à 3,5 mg de matière sèche par ml de lactosérum. Le dosage des sucres restants est effectué par chromatographie sur papier Whatman n I selon la méthode de Partridge. Toutes les chromatographies révèlent la présence de galactose dans le milieu en fin de croissance. Aucune trace de glucose n'a- pu être mise en évidence Après 48 heures de croissance sur lactosérum 35 g/l de lactose, la totalité de ce dernier a pratiquement disparu. Cette souche effectue donc l'opération recherchée et hydrolyse quantitativement le lactose du lactosérum en galactose qui s'accumule dans le milieu et en glucose qui est consommé; EXEMPLE 2 Dans cet exemple, on 'utilise -pour la mise en oeuvre du procédé une levure Kluyvermyces fragilis SG i 1 enregistrée a Delft sous le n CBS 6498 et obtenue à partir d'une souebe Kluyvermyces fragilis appelée SG I a laquelle on a p@pliqué le traitement de mutation et de sélection décrit précédemment Lesccultures sont effectuées en erlenmeyer de 5 litres remplis au l/10ème de leur volume de lactosérum brut sans facteur de croissance.La température est maintenue à 26 C#-0#5 C. On maintient une agitation à l'aide d'un dispositif agitateur (80 oscillations par minute d'amplitude cm). Sur ce milieu la souche donne d'es populations de l'ordre de 300 x 106 cellules par mi après 120 heures de croissance Cette souche consomme la totalité du lactose d'un lactosérum a, 35 g/l de lactose. La disparition- du lactose et la présence de galactose ont été déterminées dans le milieu par la méthode chromatographique décrite précédemment-po,ur les bactéries. ti croissance de cette souche est complète en l20 heures mais présente une phase de latence particulièrement longue de 48 heures. EXEMPLE 3 La souche utilisée dans cet exemple est un Kluyvercomyces fragilis SG 12 déposée a Delft sous le N" CBS 6499 et qui a été obtenue en meme temps que SG il par mutation-sélection a partir de la souche SG 1 de l'exemple 2. les oeitions de, culture sont les mêmes que dans l'exemple 2 mais la souche SG 12 donne des populations de l'ordre de 500 x 106 cellules par il après 72 heures de croissance. Elle consomme la totalité du glucose correspondant à l'hydrolyse d'un lactosérum à 35 g/l de lactose et libère quantitativement le galactose dans la solution Pour la souche SG 12 la phase de latence est seulement de 30 heures. Il est possible de supprimer la phase de latence. Dans le cas d'une technique de culture en continue, les phases de latence disparaissent mais dans ce, cas les précautions de stérilité sont plus délicates à observer. A la suite des fermentations dans les deux -as précé- dents les micro-organismes sont centrifugés, ce qui permet de récupérer d'une part les levures ou les bactéries, et d'autre part la solution de galactose. Dans le cas des le@ures cette solution peut être utilisée directement ou après concentration pour la production de boissons, les' levures est lavées et besoin est puis séchées à chaud et éclatées sur rouleau par exemple. Dans le cas des bactéries, il est un général nécessaire d'extraire le galactose afin de le séparer des résidus de fer- tentation impropres à la consommation, pour oe3a-- en concentre la solution jusqu'à obtention d'un extrait sec a 50 % et cristallisation par refroidissement aux environs de 20 C. Si l'on désire obtenir un galactose du type codex, il peut être nécessaire de répéter la cristallisation après un passage sur charbon actif ou bien en extrayant la solution par de l'alcool éthyli@ue. REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation d'une solution de galactose à partir d'une solution contenant du lactose utilisable notamment à la préparation de galactose et de boissons, caractérisé en ce que l'on traite la solution de lactose par un micro-organisme mutant, non-pathogène, prototrophe, possèdant une p-galactosidase et un caractère gal, l'on sépare après fermentation la masse des micro-organismes d'avec la solution contenant le galactose1 puis l'on extrait le galactose de la solution ainsi obtenue ou l'on prépare des boissons. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme utilisé est une bactérie obtenue par mutation et sélection à partir d'une souche sauvage 3) Procédé selon la revendication i,caractérisé en ce que le micro-organisme est une bactérie obtenue à partir d'une bactérie mutante, non-pathogène, auxotrophe, possèdant une B-galactosidase, un caractère gal , que l'on a reversée pour ses différentes auxotrophies. 4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la bactérie utilisée est choisie parmi les Enterobacteriaceae et les Lactobacteriaceae. 5) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, catarac térisé en ce que la bactérie utilisée est un Escherichia coli. 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la bactérie est une souche Escherichia coli déposée à Delft sous le n CBS 6501 B. 7) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme utilisé est une levure obtenue par mutation et sélection. 8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on opère la mutation sur une souche haploïde. 9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la souche haploïde mutante sélectionnée est diploïdisée. 10) Procédé selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé, en ce que la souche utilisée est l'une des souches haploldes de Kluyveromyces fragilis enregistrées à Delft sous les n SCBS 6498 et 6499. 11) Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la solution de lactose est déprotéinée avant fermentation.