Brevet FR2222080A1 — publié le 19741018

La présente invention concerne un procédé de stabilisation d'enzymes. Les enzymes et en particulier la pepsine sont difficilement stockables sous des formes stables Ainsi la forme pharmaceutique l'élixir de pepsine11 inscrite à la Pharmacopée des éditions 1884 à 1937 sous la formulation pepsine 20 eau distillée 280 vin de liqueur 500 glycérine 200 est trop instable et le Codex 1949 abandonne cette formule. Les études antérieures consacrées à la stabilisation de la pepsine ont montré le caractère certes favorable mais insuffisant de molécule polyhydroxylées telles que la glycérine, les sucres en général, ou bien encore les polymères polyhydroxylés de haut poids moléculaire tels que le Carbowax ou partiellement sulfonés tels que le Sephadex. La présente invention concerne un procédé de stabilisation efficace d'enzymes et en particulier de pepsine caractérisé en ce qu'on utilise un carboxypolyméthylène. La présente invention concerne également å titre de produits industriels nouveaux les composés obtenus par réaction d'une enzyme avec uncarboxypolyméthylène et plus spécialement le produit de réaction carboxy polyméthylene-pepsine L'activité pharmacologique des enzymes est due principalement å des. sites actifs composés d'enchaînements d'acides aminés. Par conséquent, une combinaison Judicieuse, effectuée dans des conditions convenables, d'une enzyme et d'une résine acide hydrosoluble capable de donner des gels colloidaux, des sels réversibles et éventuellement lyophilisables, permet de stabiliser lesdites enzymes et de conserver intacte leur activité. Après de longues recherches la demanderesse a découvert qu'un polymère carboxyvinylique, (carboxypolyméthylène) de haut poids moléculaire, présentant des enchainements du type présentait un excellent pouvoir stabilisant. Ce produit apporte en effet une fonction salifiante liée à une molécule rigide de haut poids moléculaire. Cette fonction salifiante permet de bloquer certaines fonctions amines participant au site actif et protège la molécule enzymatique d'une auto-dégradation. La fonction salifiante du carboxypolyméthylène présente de plus la. propriété remarquable et inattendue d'être réversible et n'implique pas, par conséquent, une déformation dénaturante de la molécule enzymatique. Le poids moléculaire moyen du carboxyméthylène selon l'invention est de préférence compris entre 2 et 3 millions. Un tel produit est commercialisé sous le nom de. Carbopol par B.F. Goodrich Chemical Company. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaitront à la lecture de l'exemple suivant donné à titre illustratif et se référant au dessin annexé sur lequel la figure unique représente l'évolution de l'activité protéolytique des échantillons en fonction du temps. EXEMPLE Application du carboxypolyméthylène à la stabilisation de la pepsine. -Le procédé de stabilisation de la pepsine est le suivant on mélange une solution alcoolique et une solution aqueuse dans un rapport approximatif de 1 à 4, ladite solution alcoolique contenant de 1 à 5 % en poids de carboxypolyméthylène, ladite solution aqueuse contenant environ 1 % en poids de pepsine, le pH du mélange final obtenu étant ajusté à une valeur comprise entre 4 et 6, et de préférence 5. Selon ce procédé on a préparé les trois échantillons suivants témoin essai A essai B Alcool j en mélange 20 20 20 Carbopol t préalable 0,5 0,5 0,5 pepsine S en mélange 0 I 1 eau t préalable 80 80 80 ammoniaque quantité suffisante quantité suffisante .O pH final 5,0 5,0 3,0 aspect du mélange gel fluide gel fluide suspension opalescente On peut utiliser des produits alcalins autres que l'ammoniaque pour ajuster le pH aux valeurs désirées.Ces autres produits alcanisants peuvent être par exemple soit des bases minérales monovalentes telles que l'hydroxyde de sodium, l'hydroxyde de potassium, soit des bases organiques telles que la mono, la di-ou la triéthanolamine. L'activité protéolytique des échantillons a été déterminée selon la technique de Ans on et Mirsky décrite notamment par R. Peindaries (Ann. Pharm. Fr. 22 (1964) 293 - 300). Les résultats obtenus ont été présentés sous forme graphique sur la figure unique. Sur le graphique de la figure unique on a représenté en ordonné-e l'activité protéolytique en 7.etenabscisse le nombre de jours de conservation. Le point A représente le témoin sans pepsine dont l'activité protéolytique est nulle ; les courbes (I) et (II) indiquent respectivement l'évolution-de l'activité protéolytique des essais A et B en fonction du temps. De la figure unique il ressort clairement que l'essai B, non neutralisé par l'ammoniaque et conservant son pH initial due 3303 perd toute activité en 25 jours ; par contre l'essai A, ajusté à pH 5,0,par addition d'une quantité suffisante d'ammoniaque3 conserve encore 'totalement son activité au bout de 302 jours. Selon la méthode analytique utilisée pour déterminer l'activité protéolytique des échantillons, on opère à pH 1,9, c'est-à-dire à un pH sensiblement voisin du pH du contenu stomacal ; il apparait donc qu'd ce pH de 1,9 la pepsine est libérée de sa combinaison avec le carboxypolyméthylène. Le complexe carboxypolyméthylène-pepsine qui est stable à pH 4-6 est donc capable de régénérer la pepsine à un pR voisin de 2. Ce fait surprenant constitue un des avantages essentiels du procédé selon l'invention. La présente invention concerne également un procédé d'extraction d'enzymes à partir d'un milieu aqueux, caractérisé en ce qu'onfait réagir l'enzyme avec un carboxypolyméthylène, on sépare le produit de réaction de l'enzyme et du carboxypolyméthylène produit à partir duquel l'enzyme est libérée en solution aqueuse à un pH convenable. Cette technique d'extraction utilisant le carboxypolyméthylène a été appliquée à la pepsine. On a obtenu un gel pouvant etre lyophilisé. Le produit lyophilisé est conservé à l'état sec et peut être ultérieurement remis en solution au moment de l'utilisation. Le produit lyophilisé permet une conservation parfaite de la pepsine et des autres enzymes particulièrement fragiles. REVENDICATIONS 1. Procédé de stabilisation de pepsine caractérisé en ce mulon fait réagir la pepsine avec un carboxypçlyméthylène présentant des enchainements du type 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le carboxypolyméthylène utilisé a un poids moléculaire moyen compris entre 2 et 3 millions et est désigné sous le nom de Carbopol. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on mélange une solution alcoolique et une solution aqueuse dans un rapport approximatif de 1 à 4, ladite solution alcoolique contenant de 1 à 5 % en poids de carboxypolyméthylène, ladite solution aqueuse contenant environ 1 % en poids de pepsine, le pH du mélange final obtenu étant ajusté à une valeur comprise entre 4 et 6, et de préférence 5. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le pH du mélange final obtenu est ajusté avec de l'ammoniaque. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 et 4, caractérisé en ce que le produit de réaction obtenu sous forme de gel est lyophilisa pour donner une poudre que l'on peut conserver à ltétat sec, 6, Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que le produit de réaction formé entre le carboxypolyméthylène et la pepsine est remis en milieu aqueux ayant un pH de 1,9 à 2, et libère la pepsine. 7. Produit nouveau caractérisé en ce qu'il est obtenu par réaction de pepsine avec un carboxypolyméthylene. 8. Produit nouveau caractérisé en ce qu'il est obtenu par réaction d'un carboxypolyméthylène sur la pepsine selon le procédé décrit dans l'une des revendications 2 à 5