Brevet FR2215944A1 — publié le 19740830

Les manifestations allergiques sont consécutives à la libération dans l'organisme de médiateurs, à la suite de la sollicitation par les antigenes sensibilisants. Parmi les médiateurs connus, les plus importants sont : l'Histamine, les Kinines, les Anaphylatoxines, la "Slow Reacting Substance" et la Sérotonine. Les substances chimiques connues comme antiallergiques agissent en général en empechant la fixation de l'histamine sur les récepteurs cellulaires ou en bloquant la libération de l'histamine. Dans l'organisme, ces médiateurs sont détruits par des processus enzymatiques. Ainsi, l'histamine est dégradée par une diamine-oxydase et par l1imidazole-N-méthyl-transférase. Les kinines sont dégradées par des kininases et particulièrement par la carboxypeptidase N. I1 a été démontré récemment que cette meme carboxypeptidase dégradait l'anaphylatoxine (Bokisch J. Clin. Invest. 49,24 (1970). La sérotonine est dégradée par l'intermédiaire d'une monoamine-oxydase. Il est donc avantageux d'utiliser un complexe enzymatique comportant un maximum d'activités histaminasique, kininasique et monoamine-oxydasique, afin de dégrader l'excédent de médiateurs que l'on remarque dans les manifestations aUergiques. La voie orale ne semblant pas entre satisfaisante pour l'administration de ce genre d'enzymes, il est préférable de retenir la voie parentérale, ce qui conduit à envisager exclusivement une origine homologue, afin d'éviter tout risque de sensibilisation par les protéines étrangères. I1 est bien connu que le placenta humain contient une quantité très élevée d'histaminase, ce qui explique que, lors de la gestation, l'activité diamine-oxydasique du sang maternel se trouve augmentée. Plusieurs auteurs ont décrit l'extraction et la purification de l'histamtaoeplacentaire (Smith J.x., Biochem. J. 103, 110 (1967) ; Paolucci E., Biochimie, 53, 735 (1971. On a maintenant con-stagdque que le tissu placentaire contenait une activité kininasique importante ; ce fait a été confirmé récemment par Uszynski M.tBiochem. Pharmacol. 20, 3211, (1971)). On v ' dés ouvert que le tissu placentaire renferme également une quantité importante d'enzyme monoamine-oxydase capable de dégrader la sérotonine. On a , d'autre part, démontré que,dans le placenta5 une grande partie de ces activités enzymatiques était liée à une protéine de transport l'a2-macroglobuline placentaire. De plus, le placenta humain, tel qu'il est récolté, contient des immunoglobulines qu'il est avantageux de récupérer pour la préparation d'unmédicament, dont les applications sont bien connues et différentes de celles du complexe enzymatique décrit plus haut. L'invention concerne une nouvelle composition, utile notamment pour le traitement des maladies allergiques, constituée essentiellement par des a2-macroglobulines placentaires humaines et caractériséeen ce que ces a2-macroglobulines constituent le support d'activités histaminasique, kininasique, mono-amineoxydasique, m a is s o n t dépourvues d'activité protéasique vraie. L'invention a égalementpour objet un procédé de préparation de cette nouvelle composition à partir du placenta humain, procédé qui comprend essentiellement le passage d'un extrait dialysé du placenta sur un échangeur de cations qui retient les protéines contaminantes, le complexe enzymatique supporté par les a2-macroglobulines restant dans l'effluent. Ce procédé permet ainsi non seulement d'obtenir la composition selon l'invention, mais aussi de récupérer à partir des protéines retenues sur la résine échangeuse d'ions, les immunoglobulines présentant des applications thérapeutiques intéressantes. Le procédé de préparation selon l'invention comprend leaétapes caractéristiques suivantes Le placenta humain frais ou congelé, est broyé dans une solution d'extraction des protéines classique, c'est-à-dire un tampon, de préférence un tampon borate, à pH 6-8. Après centrifugation, la teneur saline du liquide surnageant est abaissée, par dialyse ou filtration moléculaire, jusqu'à ce que la force ionique du liquide dialysé soit égale ou inférieure à 0,1. Ce liquide est alors mis en contact avec un échangeur de cations, tel que la carboxyméthylcellulose, équilibré à un pH de 6 à 8, et, de prdfé- rence, 6,8, avec un tampon (de préférence un tampon borate), dont la molarité est comprise entre 0,001 et 0,01 et, de préférence, 0,005. Dans ces conditions, la plus grande partie des protéines contaminantes, c'est-à-dire l'hémoglobine et les immunoglobulines, est retenue par la résine échangeuse de cations, alorssque le complexe enzymatique recherché, supporté par les &alpha;2-macroglobulines, reste dans l'effluent. Les fl'rnnogobulines, ou y-globulines, peuvent être récupérées en les éluant de l'échangeur de cations au moyen d'un tampon de force ionique égale ou supérieure à 0,3 et, de préférence, égale à 0,4. Elles sont ensuite précipitées de l'éluat, (par exemple, après avoir ajusté le pH à 6,9), par addition d'éthanol jusqu'à une concentration de 30 %) et purifiées par les procédés classiques. L'effluent contenant le complexe enzymatique, supporté par les a2-macroglobulines, est traité par la B-propiolactone pour éliminer les virus contaminants et spécialement le virus de l'hépatite. I1 est ensuite soumis à une précipitation fractionnée par le polyéthylèneglycol ou par le sulfate d'ammonium. Dans le premier cas, on ne conserve que la fraction précipitant entre 8 et 18 % de polyéthylèneglycol. Dans le second cas, on ne conserve que la fraction précipitant entre 35 et 65 % de saturation en sulfate d'ammonium. Le précipité contenant le complexe enzymatique selon l'invention est repris dans une solution isot ique, ds faK à obtenir les concentrations enzymatiques désirées. On peut obtenir des produits purifiés en sr1umettant le produit obtenu précédemment, soit à un tamisage moléculaire, sur Séphadex G2OO par exemple, soit à une chromatographie d'affinité sur un analogue de substrat de l'histaminase, fixé sur un support solide tel que. l'agarose ou Sépharose 4B. La composition selon l'invention a fait l'objet d'une étude analytique comportant la détermination des diverses activités enzymatiques et le dosage des 2-macroglobulines qui servent de support au complexe enzymatique. L'activité histaminasique est dosée par une méthode spectrophotométrique basée sur l'action de la diamine-oxydase sur la putrescine ou par une méthode fluorométrique mesurant la dégradation de l'histamine par la même diamine-oxydase. L'activité histaminasique peut. également être déterminée par sa capacité de détruire l'histamine, celle-ci étant dosée d'après la contraction qu'elle provoque sur l'iléon de cobaye organe isolé. L'activité histaminasique est exprimée en unités elles-memes définies comme étant le nombre de nanomoles de substrat transformées par heure et par millilitre du produit à tester. L'activité de carboxypeptidase N (kininase) est déterminée in vitro par la mesure de la vitesse de dégradation de l'hippuryl-lysine sous l'action de l'enzyme. Elle peut également être déterminée par la vitesse de dégradation de la bradykinine,. celle-ci étant dosée d'après les contractions qu'elle provoque sur l'utérus de rate en organe isolé. L'activité kininasique est exprimée en nombre d'unités correspondant au nombre de nanomcaes de substrat détruites par heure et par millilitre de produit à tester. L'activité monoamine-oxydasique sur la sérotonine est déterminée in vitro par la vitesse d'oxydation de la sérotonine. Elle peut également entre déterminée par la vitesse de dégradation de la sérotonine, celle-ci étant dosée d'après les contractions qu'elle provoque sur l'iléon de cobaye en organe isolé. Cette activité est exprimée en nombre d'unités correspondant au nombre de nanomoles de substrat détruites par heure et par millilitre de produit à tester. La composition selon l'invention, d'après les essais ainsi' effectués5 présente5 pour une teneur totale en protéines allant de 30 à 50 mg/ml, les activités suivantes Diamine-oxydase : 500 à 2000 unités/ml,déterminée in vitro ou 15.000 unités/ml, déterminée sur iléon de cobaye. Carboxypeptidase : 20.000 à 40.000 unités/ml, déterminée in vitro ou 30 unités/ml,determinée sur l'utérus de rate. Monoamine-oxydase : 10 à 200 unités/ml, déterminée in vitro par la vitesse de dégradation d'une monoamine,(séroYnine ou benzylaminX La recherche de l'activité protéasique a été effectuée par les méthodes classiques, dosage d'enzymes protéolytiques en utilisant la caséine comme substrat : le produit selon l'invention ne présente pas d'activité protéasique. Le dosage des a2-macroglobulines a été effectué au moyen de la méthode d'immunodiffusion radiale ou d'électroimmunodiffusion utilisant un sérum de lapin anti-a2-macroglobuline humaine. Les.valeurs habituellement trouvées se situent entre 300 et 600 mg d'a2-macroglobulines par 100 ml de préparation. L'association a2-macroglobuline-activités histaminasique et kininasique est démontrée par les méthodes suivantes a) Tamisage moléculaire sur Séphadex G-200 Le premier pic d'élution correspondant aux protéines de haut poids moléculaire contient à la fois les activités histaminasique et kininasique et les a2-macroglobulines, tandis que le deuxième pic d'élution ne contient ni les activités enzymatiques citées, ni l'a2-macroglobuline. b) Electrofocalisation Cette technique permet d'isoler un complexe protéique de pu14,7 à 4,9 contenant les deux activités enzymatiques en même temps que l'a2-macroglobuline. I1 est à noter que le pHide l'a2- macroglobuline libre est de 5,4 et que celui de l'histaminase libre est de 6,15. c) Chromatographie d'affinité Un substrat insolubilisé sur Sépharose 4B et fixant spécifiquement l'histaminase permet de séparer un complexe protéique contenant l'histaminase mais aussi la kininase. L'analyse immunoéleetrophorétique de ce complexe démontre en outre la présence d'a2-macroglobu1îne. d) Méthode dé purification des a-macroglobulines Le produit décrit, soumis à une purification des a2-macroglobulines, suivant une méthode analogue à celle de SAVNDERS R.. et al (J. Clin. Invest. 50, 2376 (1971) et comportant une chromatographie sur Séphadex G-200 suivie d'une chromatographie sur Sépharose 4B, conduit à la séparation d'un premier pic de protéines contaminantes et d'un deuxième pic d'a2-macroglobulines accompagnées des activités histaminasique et kininasique. Ce produit se caractérise en outre par l'absence ou la teneur très faible en immunoglobulines, en albumine et en lipoprotéines. L'activité thérapeutique du produit ne peut donc être rapportée à- la présence d'îmmuno- globulines. L es exemples suivants sont destinés à illustrer le procéda de préparation selon l'invention. EXEMPLE 1 Préparation de la composition à activité8 enzymatiques selon l'invention 5 kg de placenta humain sont finement broyés à + 4 C dans 7,5 1 de tampon borate 5 mM, contenant de l'EDTA 1 mM, de pH 6,8. Après une heure de contact à +40C, on filtre sur gaze pour éliminer la plus grosse partie du sédiment. On centrifuge ensuite à 40C à 5.000 tr/mn pendant 15 mn et on abandonne le surnageant une nuit à +44C pour insolubiliser les lipoprotéines. Après centrifugation à 11.000 tr/mn pendant 30 mn, on dialyse le nouveau surnageant contre du t a mpon b or a t e 5 mM, de pH 6,8 > jusqu'à ce que la force ionique del'extraitdialysd soit inférieure ou égale à 0,1. On obtient ainsi une solution A. On met alors en contact cette solution maintenue à 40C avec 800 g de CM-cellulose préalablement équilibrée à 'p' H avec a v e c d u tampon b o r a t e 5 mM, et disposée dans une colonne. Lorsque tout le liquide est passé sur la colonne, on rince cdle-ci avec le mOme tampon jusqu'à ce que I'effluent ne contienne plus de protéines. (Les effluents réunis constituent la solution B). La solution A peut aussi être mise en contact avec la CM- cellulose, préparée comme précédemment, dans un récipient quelconque. Après 30 mn de contact à 4 C, le liquide est séparé de la CM-cellulose par centrifugation ou par filtration, ces opérations étant effectuées à 40C. (Filtrat ou surnageant : solution B). La solution B obtenue par un des procédés décrits est amenée à pH 8,6 au moyen drune solution diluée d'hydroxyde de sodium. On ajoute alors la ss-propiolactone à raison de 1 mg pour 20 mg de protéines. On laxse une nuit à 4 C. A la fin du traitement, le pH est environ 7. On a ainsi obtenu la solution C. A la solution C, on ajoute du NaC1 en quantité suffisante pour que sa concentration finale soit de 0,9 %, on ajuste le pH à 6,5 au moyen d'acide chlorhydrique dilué et-on ajoute une solution de polyéthyleneglycol (poids moléculaire moyen 6.000) à 50 % dans de l'eau contenant du Na1(0,9 % t), jusqu'à ce que la concentration finale en polyéthylèneglycol soit de 8 %. de On laisse en contact sous agitation pendant 30 mn à la température ambiante et on centrifuge 30 mn à 11.000 tr/mn à 40C. Le surnageant constitue la solution D. On amène la concentration en polyéthylàneglycol de la solution D à 18 % au moyen de la solution de polyéthylèneglycol A 50 70. On laisse de nouveau en contact 30 mn sous agitation à la température ambiante, puis on centrifuge 30 mn à 11.000 tr/mn à 40C. On reprend le précipité par une solution de NaCI 0,9 % ou de glycocolle 0,2 NL On obtient ainsi une solution E qui est la composition selon l'invention. EXEMPLE 2 Préparation de y-globulines placentaires Après obtention de la solution B suivant l'exemple 1, on élue les protéines fixées sur la Cwcellulose et principalement constituées d'hémoglobine et de &gamma;-globulines,au moyen de tampon borate 5 mM contenant du NaCl 0,4 M. On obtient un éluat que l'on désigne solution F. On ajuste le pH de la solution F à 6,9, on abaisse la température à 0 C et on ajoute une quantité d'alcool éthylique à 95 , de façon à obtenir une concentration finale de 30 %. L'addition d'éthanol s'effectue en 1 h tout en abaissant progressivement la température à -10 C. On laisse sous agitation 2 h à -100C et on centrifuge à 11.000 tr/mn pendant 30 mn à -100C. Le précipité obtenu est constitué presque entièrement de t-globulines. I1 est repris par une solution aqueuse de NaCl 0,9 % ou de glycocolle 0,2 M de volume choisi pour obtenir la concentration en protéines désirée. On obtient ainsi une solution G de y-globulines. EXEMPLE 3 Précipitation des a,-macroglobulines selon l'invention à partir de la solution C, par le sulfate d'ammonium La solution C, préparée selon l'exemple 1, est soumise à un fractionnement au sulfate d'ammonium. Le précipité obtenu entre 35 et 65 % de saturation est repris dans l'eau, dialysé contre NaCl 0,9 % ou glycocolle 0,2 M. On obtient une solution E, identique à celle obtenue dans l'exemple 1. La solution E préparée selon l'un des exemples 1 ou 3, est filtrée stérilement et conditionnée en ampoules stériles. La solution E préparée selon l'un des exemples 1 ou 3 peut également être additionnée de polyéthylèneglycol 6000 de façon à obtenir une concentration finale entre 2 et 10 j, filtrée sterilement, puis lyophilisée. EXEMPLE 4 Purification de la solution E par tamisage moléculaire La solution E, préparée selon l'un des exemples 1 ou 3, est passée sur une colonne Séphadex G-200. On ne retient que la première fraction protéique. Cette fraction est traitée comme la solution C préparée selon l'un des exemples 1 ou 3. La solution obtenue, éventuellement additbnnée de polyéthylèneglycol 6000, est filtrée stérilement, puis lyophilisée. EXEMPLE 5 Purification de la solution E par chromatographie d'affinité La solution E, preparée suivant l'un des exemples 1 ou 3, est purifiée par chromatographie d'affinité en utilisant un analogue de substrat de !'histaminase fixé sur un support solide. A titre d'exemple, on trouvera ci-après la description de la fixation d'un analogue de substrat : on fixe sur Sépharose de l'éthyîènediamine et l'on coupe le produit obtenu à de la L-arginine. La solution E peut également être purifiée par chromatographie d'affinité en utilisant un analogue de substrat de la kininase, par exemple le dipeptide D-alanine-L-arginine fixé sur Sépharose. La solution obtenue dans l'un et l'autre cas, contenant le complexe enzymatique selon l'invention, est traitée comme une solution C. On a étudié la composition obtenue selon l'invention du point de vue pharmacologique et therapeutique. Toxicité Injecté à des souris par voie intraveineuse et intrapéritonéale, le médicament est dénué de toute toxicité 8 la dose de 1 ml par souris de 20 g, soit 50 ml par kg. Action vis-à-vis de la réaction anaphylactique in vitro Des cobayes ont eté sensibilisés par injection intrapéritonéale de 0,5 ml de sérum équin 15 jours avant l'essai. La réaction anaphylactique est obtenue par introduction de 0,2 ml de sérum équin dans une cuve à organe de 20 ml, contenant une portion d'iléon.de cobaye sensibilisé. Dans les essais de protection, 0,2 ml de produit a été introduit dans la cuve 15 mn avant le sérum de cheval. Le tableau suivant montre que le produit inhibe la réaction anaphylactique in vitro. Dilution du produit Nombre d'essais Protection contre la réaction ana phylactique Nulle Partielle Totale 1/10e 16 7 4 5 pur 9 2 1 6 Action sur le choc anaphylactique in vivo Des cobayes sensibilisés par une injection intrapéritonéale de 0,1 ml de sérum équin 15 jours avant l'essai ont été soumis au choc déclenché par injection intraveineuse de 0,1 ml du même sérum équin dilué au 1/10e. La protection était obtenue par injection intrapéritonéale de 0,5 ml de produit 15-mn avant le déclenchement du choc. Le tableau suivant montre -les résultats obtenus. Symptômes Mortalité Etat des survivants Violents Atténués à 20 mn Déprimés Normaux Témoins 9 1 5 5 0 Traités 4 6 3 2 5 Action sur les manifestations allergiques chez l'homme L'expérimentation a porté sur des patients souffrant des affections suivantes - rhinite allergique, avec ou sans polypose - asthme - toux asthmatiforme - pharyngite allergique - eczéma - manife~-ations allergiques diverses Les patients ont reçu de 7 à 11 injections intramusculaires, s'étalant sur 8 à 20 jours, de produit selon l'invention. Les doses injectées étaient de 1 à 2 ml pour les cinq premières injections et, en généraI, plus fortes, de 3 à 5 ml, pour les dernières. La dose totale moyenne variait de 15 à 20 ml pour un traitement commet. Les résultats ont été les suivants. Affection Nombre Très Bon Moyen Nul Non supporté Non inter de cas bon prétable Rhinite allergique 6 3 1 1 Allergies diverses (froid, alimentaire) 2 2 Rhinopharyngite allergique Z 2 Allergie intestinale 1 1 Eczéma 1 1 Pharyngite allergique 4 1 1 1 1 Asthme 3 1 1 1 Laryngo-tracheite allergique 2 2 Total 21 11 5 2 1 1 Le produit selon l'invention peut etre avantageusement utilisé pour lutter contre les manifestations allergiques et le choc. Dans ce but, on l'utilisera seul ou en association avec des produits activant l'action enzymatique, tels que l'héparine ou le pyridoxaîphosphate. En outre, il peut être associé à des produits doués d'activité histaminopextque ou immunologique, tels que certaines préparations de globulines humaines. REV E' MDICATIDNS 1. Composition obtenue à partir du placenta humain, caractérisée en ce quelle comprend des a2-macroglobulines constituant le support d'activités histaminasique, kininasique et monoamine-oxydasique et qu'elle est dépourvue d'activité protéasique vraie. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle présente, pour une teneur totale en protéines de 30 à 70 mg/ml, une activité histaminasique (ou activité de diamine-oxydase) de 500 à 2000 UliiS/Ul déterminé in vitro par la vitesse de dégradation de la putrescine ou de l'histamine, une activité kininasique (ou activité de carboxypeptidase N) de 15.000 à 50.000 unitEs/ml déterminée in vitro par la mesure de vitesse de dégraddtioh de l'hippuryl-lysine ou de la bradykinine et une activité de monoamine-oxydase de 10 à 200: unités/ml déterminee in vitro par la vitesse de dégradation d' une monoamine (sérotonine ou benzylamine). 3. Composition thérapeutique, utilisée notamment pour le traitement des maladies allergiques, caractérisée en ce qu'elle comprend comme principe actif au moins l'une des compositions selon l'une des revendications 1 et 2. 4. Procédé de préparation d'une composition selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on broie du placenta humain frais-ou congelé avec une solution classique pour l'extraction des protéines, après centrifugation, on dialyse le liquide surnageant contre un tampon, dont le pH se situe entre 6 et 8 et dont la molarité est comprise entre 0,001 et 0,01 et ce, jusqu'à ce que la force ionique de l'extrait dialysé soit égale ou inférieure à 0,1, on met la solution obtenue en contact avec un échangeur de cations (tel que la carboxyméthylcellulose) préalablement équilibré avec un tampon présentant les mimes caractéristiques de pH et de molarité que le précédent, on sépare ensuite le liquide contenant les a2-macroglobulines supportant les activités enzymatiques, de l'échangeur de cations sur lequel sont retenues les immunoglobulines et 1'hémoglobineplacentaires. 5. Procédé selon la re ndication 4, caractérisé en ce que la mise en contact de la solution obtenue après dialyse, avec l'échangeur de cations, s'effectue sur une colonne et qu'on re'cueille l'effluent de cette colonne qui contient la composition selon la revendication 1. 6. Procédé selon l'une des revendications 4 et 5, caractérisé en ce que le liquide, obter après séparation de ltéchangeur de cations, est traité par la B-propiolactone, afin d'éliminer les virus contaminants, et est ensuite soumis à une précipitation fractionnée par le polyéthylèneglycol ou le sulfate d'armoniumspour récup8rer une composition selon l'une des revendica- tions l et 2. 7. Procédé de préparation selon l'une des revendications 4 et 5, permettant de récupérer les r-globulines placentaires, caractérisé en ce que l'échangeur de cations qui a été mis en contact-avec l'extrait placentaire selon l'une des revendications 4 et 5 est, après séparation du liquide contenant les a2-macroglobulines, élué au moyen d'un tampon de force ionique égale ou supérieure à 0,3, le pH de l'éluat est ajusté à 6,9 et les y-globulines sont précipitées de l'éluat par addition d'éthanol jusqu'à une concentration de 30 %. 8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu on amène le liquide séparé de 11 échangeur de cations à pH 8,6, et on le traite par la > -propiolactone à raison de 1 mg pour 20 mg de protéines contenues dans le liquide. 9. Procédé selon l'une des revendications 6 et 8, caractérisé en ce que la solution traitée par la ss-propiolactone est soumise à un fractionnement au pólyéthylèneglycol, dans lequel on ne conserve que la fraction précipitant à une concentration comprise entre 8 et 18 % de polyéthylèneglycol. 10. Procédé selon l'une des revendications 6 et 8, caractérisé en ce que la solution traitée par la -propiolactone est soumise à un fractionnement au sulfate d'ammonium, dans lequel on ne conserve que la fraction précipitant entre 35 et 65 % de saturation en sulfate d'ammonium. 11. Procédé de purification de la composition selon la revendication 1, caractérisé en ce que le précipité obtenu selon l'une des revendications 6, 8, 9 et 10, repris par l'eau et dialysé contre NaCl 0,9 % ou du glycocolle 0,2 M est passé sur une colonne de Séphadex G-200 et que la première fraction protéique est recueillie et soumise à une nouvelle précipitation par le polyéthylèneglycol ou le sulfate d'ammonium. 12. Procédé de purification de la composition selon la revendication 1, caractérisé en ce que le précipité obtenu selon l'une des revendications 6, 8, 9 et 10, repris par l'eau et dialysé contre NaCl 0,9 % ou du glycocolle 0,2 M, est traité par chromatographie d'affinité sur un analogue de substrat de l'histaminase fixé sur un support solide, tel que l'agarose. 13. Composition purifiée obtenue selon le procédé de l'une des revendications 11 et 12.