Brevet FR2207693A1 — publié le 19740621

Cette demande de brevet est orientée vers desnnouvelles protéines ou des nouveaux polypeptides de poids moléculaires intermédiaires entre ceux de l'insuline et du glucagon, ainsi que vers leur procédé de préparation. La protéine actuelle, extraite habituellement du pancréas de bovins,est représentée (en utilisant les abréviations de nomenclature normales pour les polypeptides : voir 67 JACS 1524, 1530) par la formule ifflH2-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Gln-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asp-Ala 6 12 Thr-Pro-G lu-G ln-Mé t-A la-Gln-Tyr-A la-A la-G lu-Leu 18 24 Comme il est entendu dans la technique des polypeptides naturels, toutes les parties amino-acides sont de la forme isomère optique lévogyre. Le polypeptide correspondant provenant du pancréas de porcins est identique à celui qui est représenté ci-dessus, si ce ntest que en position 6 là où le polypeptide de bovins présente une glutamine, le polypeptide de porcins présente une valine. De même, le polypeptide d'origine ovine diffère de celui d'origine bovine en ce qu'il présente unesérineen position 2 là où le polypeptide d'origine bovine présente une proline ; et le polypeptide d'origine humaine diffère du polypeptide d'origine bovine en ce qu'il présente une asparagine en un point que l'on pense être en position 23 mais qui est peut étre la position 15, là où le polypeptide d'origine bovine présente une glutamine, en plus d'une différence représentée par le remplacement d'une glutamine par une valine en position 6 comme dans la substance d'origine porcine. Ces différences spécifiques mineures sont bien connues dans la technique des extraits glandulaires : les substances présentent des comportements chimiques et pharmacologiques similaires, et à l'utilisation, on peut substituer l'une à l'autre, ou bien on peut utiliser un mélange. Ainsi, sous une forme de représentation, la présente protéine a la constitution suivante NH2-Ala-X-Leu-Glu-Pro-Y-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asp-Ala-Thr-Pro 6 12 13 Z-Gln-Mét-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Zl-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile- 24 25 où, dans les modes de réalisation particuliers, X, Y, Z et Z' ont ces significations Protéine X Y Z Z' Bovine Pro Gln Glu Glu Porcine Pro Val Glu Glu Ovine Sér Gln Glu Glu Humaine Pro Val Glu Asn ou Pro Val Asn Glu En outre, on décrit également ici un procédé de production de ladite protéine qui consiste à broyer la glande pancréatique d'un animal jusqu'à obtention d'un état d'émulsion approximatif dans un solvant non miscible à l'eau ; à mettre ladite glande en contact d'alcool aqueux acidifié jusqu' à un pH d'environ 2,8 ; à séparer les substances titsulaires insolubles par filtration ; à ajuster la solution à un pH de 8à 8,5 en ajoutant un hydroxyde de métal alcalin ; à séparer, à ce pH, de la préparation concentrée résultante une partie des graisses et le phosphate d'ammonium par précipita tion à a ajuster jusqu'à un pH d'environ 5,2 à l'aide d'un acide à diluer cette solution par un mélange de diéthyléther et d'éthanol; puis à laisser ce mélange au repos pendant 12 heures ou plus pour faire précipiter et recueillir lesdits polypeptides. Le produit de cette invention est présent à des concentrations faibles dans 1 insuline cristallisée du commerce ; il est présent à des concentrations plus élevées dans l'extrait pancréatique brut obtenu dans la séparation de l'insuline, et connu dans la technique sous le nom de "gâteau salin". Le produit est présent dans la liqueur mère du procédé de cristallisation alcaline de l'insuline, et en a été extrait. Il peut également étre extrait du pancréas lui-meme, et d'extraits liquides bruts de pancréas. Pour préparer le produit de cette invention, on peut partir de préférence de pancréas entier soigneusement disséqué du corps d'un animal fraîchement tué, par exemple, en vue de la production de viande. La glande est rincée et immédiatement mise au réfrigérateur. Si elle doit être conservée plus longtemps qu'une durée minimale elle doit autre maintenue à l'état congelé. La quantité de glande utilisée n'est pas essentielle mais pour obtenir un rendement convenable de 30-50 milligrammes de produit, il est nécessaire d'en avoir environ 10 kilogrammes. Toutes les opérations subséquentes décrites ci-après sont effectuées avec élégance, dans les conditions d'hygiène, et avec l'asepsie nécessaire, à 40C t 0,50. Les solvants et substances similaires sont introduits à la température indiquée. On broie finement la glande jusqu'à un état d'émulsion approximatif, et on met la glande broyée en contact avec de l'alcool aqueux acidifié jusqu'à un pH d'environ 2,8. On agite la suspension résultante et ensuite on éliminé les substances tissulaires insolubles par filtration. La fraction intéressante est dans la solution. Pour obtenir le pH nécessaire, on peut utiliser l'acide phosphorique, l'acide chlorhydrique ou l'acide sulfurique ainsi que d'autres acides. De même, bien que l'éthanol soit le solvant de choix, on peut utiliser d'autres solvants organiques miscibles à l'eau, parmi lesquels l'acétone, d'autres cétones solubles dans l'eau, ltacétaldéhyde, d'autres aldéhydes solubles dans l'eau, etc. On ajuste la solution acide, exempte de tissu, à pH 8 - 8,5 en ajouttant judicieusement l'hydroxyde de métal alcalin ou, de préférence, de l'ammoniaque aqueux. A ce pH, il précipite de la préparation concentrée résultante certainscorpsgras et duphosphete d'ammonium. On sépare la solution soit par décantation soit par filtration, soit par les deux procédés. On ajuste ensuite le pH de la solution résultante à une valeur d'environ 5,2 avec par exemple l'acide acétique. Ensuite on dilue cette solution avec un mélange de quatre volumes de diéthyléther et de deux volumes d'éthanol. On laisse reposer le mélange pendant une nuit ou bien une durée équivalente ou plus longue, et après ce temps presque toutes les protéines, y compris le présent produit, précipitent. On centrifuge la suspension partielle résultante et on récupère le précipité. On élimine l'eau du précipité sous vide, on le lave à l'éther pour éliminer les corps gras résiduaires s 'il y en a, et ensuite on chasse l'éther résiduaire sous vide. A ce moment là on reprend ie produit séché par l'acide acétique molaire. Diverses protéines se dissolvent dans le milieu acide on chromatographie alors la solution sur une colonne de Sephadex G50 (Fine), la séparation se faisant approximativement selon la masse moléculaire. Le glucagon a une masse moléculaire d'approximativement 3500. La nouvelle protéine a une masse moléculaire d'approximativement 4200 -- 4231 dans une détermination de la forme bovine -- tandis que l'insuline a une masse moléculaire d'approximativement 5800. En outre, le glucagon contient un fragment tryptophane, qui confère à la molécule la capacité d'être sorbéequelque peu sur Sephadex. Pour cette raison, la séparation sur Sephadex du glucagon et de la nouvelle protéine est un peu meilleure que ce qu'on attendrait en fonction de la masse moléculaire seule. C'est pourquoi on préfère la présente séparation sur Sephadex Par ce procédé, la présente protéine et quelques autres se séparent dune matière d'aucun interet ici. On peut étudier l'éluat par absorption ultraviolette, tout pic d'élution de protéine étant mis en évidence par une forte absorption à 276-280 millimicrons. Remarquant l'existence d'un tel maximum d'absorption, on change le moyen utilisé pour recueillir des substances, et, facultativement on change après avoir observé le début d'un autre maximum d'absorption. Dans un autre mode opératoire, on change le moyen utilisé pour recueillir les substances en fonction de la durée, et l'observation visuelle ou un graphique par rapport à la durée indiquent quels sont les divers échantillons recueillis qui ont un intérêt. La fraction contenant la présente protéine contient habituellement aussi de l'insuline-et du glucagon. Dans un mode de réalisation préféré, on lyophilise ensuite le mélange pour obtenir une substance sèche. On reprend alors cette substance sèche dans un tampon de tris(hydroxyméthyl)aminométhane 0,01 M, d'éthylènediaminetétraacétate tétrasodique 0,001 M et d'urée 7 M, le pH (initialement égal à environ 11) de la solution résultante étant ajusté à environ 9,0 à l'aide de HC1. Lorsque la substance sèche a été totalement dissoute dans une quantité minimale suffisante de tampon, on chromatographie la solution résultante sur une colonne de diéthylaminoéthyl cellulose, en utilisant d'autres portions de la même solution tampon comme éluant. Dans cette élution, des traces de substances indésirables sans intérêt ici sont tout d'abord éluées, puis le glucagon. Après le glucagon, la protéine de cette invention est nettement éluée. Dans le mode de réalisation préféré décrit ici, l'insuline demeure fixée dans la colonne chromatographique. Si on le désire, on peut l'éluer à l'aide de solutions salines plus concentrées, mais ceci ne fait pas partie de l'invention. Ensuite on chromatographie l'éluat dans la solution tampon sur une colonne de Sephadex G-25 (grossier), avec une solution aqueuse d'acide acétique à2 pour cent comme éluant. Dans cette étape on sépare presque complètement les constituants des tampons non aqueux. On lyophilise de nouveau la solution résultante le produit séché restant à la fin de la lyophilisation est la protéine de l'invention. L'exécution élégante des différentes étapes détaillées ici conduit avec certitude au produit. Cependant, on peut ultérieurement le caractériser rapidement si on le désire, de la manière suivante. Une première étape de caractérisation préférée est l'analyse de l'aminoacide terminal en N. On fait réagir une partie du produit d'une manière connue avec le chlorure de l-diméthylaminonaphtalène5-sulfonyle : ce composé forme un produit d'addition terminale en N. On hydrolyse le produit d'addition, ce qui sépare l'aminoacide terminal sous forme dudit produit d'addition. On partage ensuite celui-ci par chromatographie en couche mince et on recherche en lumière ultraviolette une tache fluorescente unique du produit d'addition du chlorure de l-diméthylaminonaphtalène5-sulfonyle et de l'alanine. Lorsque les résultats de cette expérience sont satisfaisants, on examine le produit par électrophorèse sur gel et disque de polyacrylamide dans un tampon de tris-borate en partant d'une concentration en produit égal à 0,1 pour cent. Après deux heures sous un courant d'électrophorèse constant de 2 milliampères, on colore le gel avec du Bleu Brillant Coomassie à une concentration d'environ 0,025 pour cent dans une solution aqueuse d'acide trichloracétique à 10 pour cent. Cette expérience devrait avoir pour résultat une zone bleue unique d'intensité importante, représentant la seule présente protéine. Si cette expérience donne des résultats satisfaisants, on peut, si on le désire, soumettre l'échantillon à une analyse partielle ou totale de la séquence d'aminoacides. Le prcduit isolé, sec, est une substance cristalline blanche qui se décompose à la chaleur avant que l'on puisse déterminer sa température de fusion nette. L'analyse a une série d'étapes souevractives (Edman) conduit à la formule développée attribuée ci-dessus. Le produit a divers effets biologiques. I1 augmente la mobilité de l'intestin, provoque la constriction du canal cholédoque et le relachement de la vésicule biliaire. I1 est utile comme laxatif vétérinaire ne nécessitant pas d'ingestion orale. Utilisé dans ce but, il est administré de toute manière connue par laquelle le polypeptide non dénaturé entre dans la circulation sanguine. L'administration de la substance entraîne l'expulsion involontaire du contenu du côlon. Lorsqu'on désire obtenir des effets rapides, on administre le composé par voie intraveineuse. Lorsqu'on désire un effet plus prolongé, à démarrage plus lent, on l'administre par voie sous-cutanée dans une région bien alimentée à circulation périphérique et sous forme d'un composé retard d'où il est lentement mobilisé par la circulation sanguine. On ajuste les doses posologiques en fonction des espèces animales, de l'importance de la réponse désirée et d'autres facteurs qu'on a l'habitude de prendre en considération dans la détermination des doses posologiques. A titre d'indication, on peut dire que les propriétés du produit de cette invention se sont bien manifestées chez des chiens auxquels on a fait des injections intraveineuses de 5 à 50 microgrammes par kilogramme de poids corporel. Des doses aussi faibles que 0,5 microgramme par kilogramme sont également efficaces. REVENDICATIONS 1. Polypeptide caractérisé par la formule -A la-X-Leu-Glu-Pro-Y-Tyr -Pro-G ly-Asp-Asp-A la 1 6 12 Thr-Pro-Z-Gln-Mét-Ala-Gln-Tyr -A la-A la-Z' -Leu- 13 18 24 qui satisfait au moins a'l'une des définitions suivantes X 2 Pro, Y = Gln, Z = Glu, Z' = Glu, ou X = Pro, Y = Val, Z = Glu, Z' = Glu, ou X = Sér, Y = Gln, Z = Glu, Z' = Glu, ou X = Pro, Y = Val, Z = Glu, Z' = Asn, ou X = Pro, Y = Val, Z = Asn, Z' = Glu. 2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il a la formule NH -A la-Pro-Leu-Glu-Pr o-G ln-Tyr-Pro-Gîy-Asp-Asp-A la- 2 1 6 12 Thr-Pro-Glu-G ln-Mét-Ala-Gln-Tyr-A la-A la-G lu-Leu 13 18 24 3. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il a la formule -A la-Pro-Leu-Glu-Pr o-Va l-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asp-Ala- 1 12 Thr-Pro-G lu-G ln-Mét-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Glu-Leu- 13 lo 24 4. Composition thérapeutiquement active caractérisée en ce qu'elle comporte comme ingrédient actif un polypeptide selon la revendication 1. 5. Procédé de production de polypeptides de formule NH2-Ala-X-Leu-Glu-Pro-Y-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asp-Ala- 1 6 12 qui satisfait à au moins l'une des définitions suivantes X = Pro7 Y = Gln, Z = Glu, Z' = Glu, ou X = Pro, Y = Val, Z = Glu, Z' = Glu, ou X = Ser, Y = Gln, Z = Glu, Z' = Glu, ou X = Pro, Y = Val, Z = Glu, Z' = Asn, ou X = Pro, Y = Val, Z = Asn, Z' = Glu caractérisé en ce qu'il consiste à broyer la glande pancréatique d'un animal jusqu'à ce qu'elle soit à l'état presque émulsionné dans un solvant non miscible à l'eau, à mettre ladite glande en contact avec une solution aqueuse d'alcool acidifié à un pH d'environ 2,8, à séparer les substances tissulaires insolubles par filtration, à ajuster le pH de la solution à une valeur de 8 à 8,5 en ajoutant un hydroxyde de métal alcalin, à séparer à ce pH, de la prbparation concentrée résultante, certains corps gras et le phosphate d'ammonium par précipitatitn, à ajuster à un pH d'environ 5,2 par un acide, à diluer cette solution avec un mélange de diéthyléther et d'éthanol, enfin à laisser ce mélange reposer pendant une durée de 12 heures ou plus pour faire précipiter et récupérer lesdits polypeptides. 6. Procédé de production de polypeptides selon la revendication 4, caractérisé en ce que le polypeptide a la formule NH2 -A la-Pro-Leu-Glu-Pro-Gln-Tyr-Pro-G ly-Asp-Asp-A la 1 1 6 12 7. Procédé de production de polypeptide selon la revendication 4, caractérisé en ce que le polypeptide a la formule NH2-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Vaî-Tyr-Pro-G îy-Asp-Asp-A la- 1 6 12