Brevet FR2233044A1 — publié le 19750110

présente invention concerne l'acide I-trans 2-amino- 4-(2-aminoéthoxy)-3-butéoique de formule générale et ses sels- d'addition d'acides, une méthode pour la préparation de cet acide par fermentation et son utllisation comme agent antibiotique. Ires composés de formule générale I sont produits par une nouvelle espèce de Streptomyces ; Streptomyces sp. X-11085. Le procédé cqmprend la culture de Streptomyces sp. X-11085 dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables d'hy drates de carbone, d'azote et de sels inorganiques sous immersion aérobique jusqu ce qu'une activité antibiotique soit impartie au milieu par la production d'acide I-trans-2-amino- 4-(2-aminoéthoxy)-3-buténoïque, puis on récupère l'antibiotique ainsi produit du milieu aqueux et le cas échéant, ccnvertit cet acide en un sel d'addition d'acides. te nouveau Streptomycas a été isole d'un échantillon de terre provenant d'Arlington, Californie. Tjne culture viable de l'organisme intitulé Streptomyces sp. X-11085 a été déposée à la Northern Utilization Research and Development Division, Agriculture Research Service, United States Department of Agriculture à Peoria, Illinois, où cette culture a été ajoutée à la collection NRRL sous le No. NRRL 5331. l'espèce de Streptomyces décrite ici et identifiée comme Streptomyces ap. X-11085, contient des souches de Streptomyces produisent le composé de formule générale I et qui ne peuvent être différenciées définitivement de la souche NRRL 5331 et de ses sous-cul- tures, y compris les mutants et les variants sous le terme "mutants", comme il es-t employé ici, on entend des mutants produits de l'organisme décrit par différents moyens, tels que les agents mutagéniques chimiques, les radiations ultra-violettes, les rayons X, exposition au phage, etc. tes propriétés du composé de formule générale I sont décrites ici; et en connaissant ces propriétés, il est aisé de différencier la souche produisant ce composé d'autres souches, Ce qui suit est une description générale de l'organisme Streptomyces sp. X-11085, NRR1 5331, basée sur des caractéristiques telles que croissance, pigment, morphologie, etc. tes couleurs descriptives et les désignations de fragments de couleurs sont généralement celles recommandées par International StreptomycesProject (ISP): Shirling E.B. et D. Gottlieb, 1966, "Methods for Characterization of Streptomyces Species", Intl. J. Systeinatic Bct. ; 16; 313-340. Les moyens employés pour l'obtention des caractéristiques diagnostiques et la description morphologique dont' il est question ci-dessous sont celles qui ont été préparées par Difco taboratories for the ISP; l'identification et le contenu des moyens sont exposés dans le tableau 1. Description générale de l'organisme Streptomyces sp. X-11085 Croissance: la culture produit un substrat de mycélium ramifié, bien développé et un mycélium caractéristique de tissus lâche, poudreux, abondant, sur de nombreux milieux. tes colonies croissent avec des bords ondulés. En général, la croissance est de finement granuleuse à rugueuse, occasionnellement lisse au centre (agar de Bennett). couleur des spores et du mycélium végétatif Après 2 jours de croissance sur ISP-2, l'asparagine et en milieu Amidex, les spores sont d'une couleur chamois-sable et ivoire, et conservent leur couleur chamois même après 10 jours. Mycélium végétatif jaune à jaune-orange à brun clair. Morphologie: Mycélium long filamenteux, sporophores, longs et courts, ayant jusqu'à 50 spores par chaîne, avec un mélange de droits et flexueux (groupe RF-?ridham). Aucune spirale. Sporophores se ramifiant irrégulièrement, souvent emmêlés et aux extrémités fourchues, ou se présentant ou se dressant sous forme de grappes. Comme on l'a observé au microscope électronique à un agrandissement jusqu'à 50.000 fois, les spores sont élongés, cylin driques, lisses, voire légèrement rugueux, entourés d'une gaine et mesurent de 0,6 X 0,4 à 1,0 X 0,5 microns. Physiologis Pigment soluble Des quantités modérées de pigment sont produites après 4 jours sur certains milieux, tels qu'asparagine, Bennett, Emerson, extrait de levure-extrait de malt (ISP-2), lait et gélatine, mais pas sur 15? 3,4 ou 5, ou Amidex, Pablum, agar-tomates, tomates farine d'avoine, tomates-farine de soja ou espèce 5 (ATCC 45). Cependant, après 11 jours, il y a sécrétion de pigment , brun-noir sur l'espèce 5, Amidex, tomates-farine d'avoine, Pablum agars. Couleurs inversées Celles-ci varient selon le milieu employé pour la croissance, allant de blanc à chamois sans noir (comme dans Pablum, ISP-3, ISP-5, et agar-tomates) à gris cendré à noir (comme l'espèce 5, Amidex, asparagine, Bennett, tomates-farine d'avoine et agars-d'Emerson) après 11 jours à 280. différentes réactions physiologioues: La culture est hautement chromogénique (production de mélanine) sur un milieu de fer et de peptone, mais l'est moins sur agar-tyrosine. L'amidon ést hydrolysé et la gélatine en partie liquéfiée après seulement 4 jours. ta croissance est bonne sur le lait, avec une peptonisation modérée. ta culture se développe bien à 280, produisant un exsudat incolore après 11 jours sur de nombreux milieux (par-exemple Esp. 5, Amide, asparagine, Eennett, Emerson, Pablum, tomates, tomates-soja). La culture se développe bien à 280 et à 350, mais ne se développe pe pas à 45, 47 et 500. En se référant à l'ornementation et à la morphologie générale des spores, ainsi qu'à l'embranchement des sporophores, les couleurs sur différents milieux et certaines réactions biochimiques et physiologiques, on conclut que l'espèce Streptomyces X-11085 est différente ds cultures du groupe RF décrites dans la littérature. ta culture de l'organisme Streptomyces X-11085 pour produire le composé désiré de formule générale I peut être mise en oeuvre au moyen de différentes techniques de fermentation. En général, on peut employer les techniques de base suivantes dans la méthode en flacon et en réservoir. Dans la fermentation en flacon, on inocule une cuillerée de spores d'une culture d'agar incliné à 100 ml du milieu nutritif dans un Erlen-meyer de 500 ml et on incube à environ 280 sur un agitateur rotatif pendant une période allant jusqu'à 3 jours. Le milieu nutritif inoculé contient une source d'azote, choisie de préférence parmi les suivantes : source de protéines hydrolysées par un acide ou des enzymes, tels que des produits laitiers hydrolysés avec des enzymes, des produits de farine de pois hydrolysés avec des enzymes, etc; une source d'hydrates de carbone telle que le glucose; et des sels inorganiques tels les phosphates, le chlorure de sodium, etc. "Trypticase soy broth" préparé par Baltimore Biological taboratories est le milieu d'inoculation préféré. Après incubation dans le milieu d'inoculation jusqu'd 3 jours, on introduit de petits écantil- lons du bouillon dans le milieu de culture, où ils sont incubés à environ 280 sur un agitateur rotatif pendant 1 h-5 jours On prélève régulièrement et aseptiquement des échantillons de bouillon de culture pour des essais in vitro, habituellement un jour sur deux. Pour préparer des volumes de bouillon de culture plus importants, on commence par préparer l'inoculum dans des erlenmeyer de 6 litres ou dans des bouteilles en pyrex de 2,2= litres, équipéés pour l'aération, la prise d'échantillons etc. On introduit ensuite ce bouillon de culture dans les réservoirs de fermentation. L'aération des bouteilles et des réservoirs est mise en oeuvre en injectant de l'air stérile à travers le milieu de fermentation. Dans les réservoirs l'agitation se fait au moyen de roues à palettes mécaniques. On ajoute si né-cessaire des agents anti-mousse, tels que l'huile de saindoux, l'huile de soja, des produits de mouillage de silicone etc., pour limiter la quantité de mousse. Streptomvces sp. X-11085 peut être cultivé dans de nombreux milieux de culture liquides. tes milieux spécialement utiles à la production du nouvel antibiotique comprennent une source de carbone Fassimilable, telle que l'amidon, le glucose, les mélasses, ete., une source d'azote assimilable, telle que les protéines, l'hydrolysat Fe protéines, les polypeptides, les amino-acides, la liqueur de macération de,mais, les sels d'ammonium, et les cations et anions inorganiques, tels que z potassium, sodium, calcium, magnésium, sulfate, phosphate, chlorure, etc.Des oligo-éléments tels que : cobalt, cuivre, fer, molybdène, bore, etc., sont fournis en tant qu'impuretés provenant d'autres-cons- tituants du milieu l'activité du composé-de formule générale I peut être mesurée in vitro par sa zone d'inhibition contre le microorganisme Streptomyces cellulosae 097.Dans cette méthode d'essai, on utilise une méthode de diffusion biologique sur agar en employant des disques de papier pour détecter le composé de formule générale I et le mesurer quantitativement. l'inoculum est préparé å partir de Streptomyces cellulosae 097, cultivés pendant environ 5 Jours 'a 280 sur agitateur rotatif dans des erlenmeyer contenant de 60 à'80 ml de milieu composé de (en g/litre): 2,0 g de glucose; 7,0 g de K2 HPO4; 3,0 g de KH2 PO4 0,5 g de citrate de sodium . 2H20 ; 0,1 g de MgS04 71120 1,0 g de (EH4)2S04 et 15,0 g d'agar.On lave les cellules trois fois avec de l'eau pour éliminer les substances rutri- tives en excès et régler à une densité optique de 1,2 (longueur d'onde, 500 nm; longueur de chemin 15,5 mm); on ajoute 30 ml de suspension de cellules lavées à 1 litre d agar-minimum fondu de Davis et MIngioli (3. of Bacterioligy. Vol. 16 pages 17-28, 1950) juste avant la répartition. On introduit à l'aide d'une pipette des portions du milieu inoculé dans des coupelles de Pétri (100 x 15 mm). Après solidification de l'agar, les coupelles sont conservées à 4 et employées dans la semaine suivante. Les échantillons d'essai sont déposés sur des disques de papier qui sont ensuite posés sur l'agar.Après incubation pendant une nuit à 280, on mesure les diamètres des zones d'in- hibition : on constate que les diamètres de zones sont proportionnels au log de la concentration entre 10 et 1000 mcg par ml de composé de formule générale I. En doublant la concentration du composé:de formule générale I, on augmente le diamètre de la zone de 3,5 mm. le tableau 2 illustré les types de milieux que l'on utilise de préférence et leur rendement en antibiotiques dans. la fermentation en flacons agités. Un examen des données de ce tableau démontre qu'une substance azotée complexe provenant de diverses sources supporte une production d'antibiotiques, par exemple : des substances végétales, telles que la farine de soja; des substances animales, telles que la farine de viande, et des substances microbiennes, telles que la levure. Un nombre de sources de carbones permettent une bonne croissance et une production d'antibiotiques, par exemple le glucose, le glycérol, le dextrose et l'amidon de mais. En plus des sels inorganiques déjà présents dans les milieux naturels, l'addition de sels, tels que le phosphate de potassium, le carbonate de calcium, le sulfate de magnésium et des oligo-éléments augmenteront parfois la croissance et le rondement, en antiblo- tiques selon les constituants déjà présents dans le milieu de base.Un des milieux préférés pour la production du composé de formule générale I dans de grands fermentateurs contient en g/litre : 10,0 g de glucose, 5,0 g de protéines hydrolysées par un enzyme telles que le peptone de Dacto (préparé par Difco); 3,0 g d'extraits de levure tels que les extraits de levure de Bacto préparé par Disco et 0,031 g de Fe(NH4)2(S04)2 . 61120. Une fois la fermentation terminée, on peut utilise une quantité de procédés pour isoler et purifier le composé de formule générale I. Des méthodes d'isolation et de purification adéquates comprennent la chromatographie échangeuse d'ions, de séparation et d'adsorption. Dans une méthode préférée, on récupère le composé de formule générale I de la culture en séparant le mycélium et tout solide non dissous du bouillon de fermentation par des moyens conventionnels tels que le filtrage ou la centrifugation. On sépare ensuite le composé de formule générale I du bouillon de culture, filtré ou centrifugé, en appliquant la chromatographie échangeuse d'ions ou d'adsorption. La procédure de chromatographie d'adsorption est effectuée de préférence par adsorption des impuretés à du charbon animal, tel que le Norite A. La chromatographie échangeuse d'ions peut etre mise en oeuvre en utilisant soit une forme hydrogène, soit une forme d'ions de métal alcalin, par exemple la forme sodium, d'une résine échangeuse d'ions.La chromatographie de répartition est effectuée de préférence en employant un support de gel de silice et un solvant d'alcool, d'eau ou d'ammoniac. I1 est évident que l'isolattnn et la purification du composé de formule générale I peuvent être mises en oeuvre en utilisant une combinaison de l'une des techniques décrites ci-dessus. Après filtration et centrifugation du milieu de fermentation on peut employer des techniques de chromatographie à couche mince ou sur papier pour analyser le composé de formule générale I De par les caractéristiques chimiques dudit composé, on peut visualiser les taches à l'aide de ninhydrine vaporisée ; on peut en outre employer avantageusement la bioautographie. On pelt exécuter la chromatographie sur papier, mais il est préférable de la faire sur plaques de verre couvertes de gel de silice ou sur des plaques de cellulose.Le système solvant utilisé pour les ahromatogrammes à couche mince est à base d'éthanol / H2O / NH3' 49/49/2 quand on utilise des plaques de gel de silice et un mélange phénol/1120 80/20 quand on emploie des plaques de cellulose. Dans la cristallisation finale, du composé de formule générale I, on peut obtenir ce composé comme ion amphotère ou comme sel mono- ou diacide, par exemple comme son mono- ou di-chlorhydrate. Le composé de-formule générale I démontre une activité antimicrobienne, antiprotozoaire et antihelmintique. Le spectre antimiorobien dans le tableau 3 a été déterminé par les essais de diffusion sur plaques d t agar, comme décrit cidessus. Pour le traitement des infections microbiennes, protozoaires ethelmintiques, on peut administrer le composé de formule générale I sous forme de ses sels d'addition thé rapeutiquement compatibles avec de-s acides organiques ou inor paniques. Comme acides appropriés à cet usage, on peut citer les acides halogbnehydriques, tels que les acides chlorhydrique et bromhydrique, d'autres acides minéraux tels que les acides sulfurique, phosphorique, nitrique etc., d'aci acides organiques, tels que les acides tartrique, citrique, acétique, formique, maléique, succinique, etc. On peut employer ces sels dans les même buts biologiques que la forme amphotère.Puisque les solutions salées du composé de formule générale I; et spécialement le monochlorhydrate, sont beaucoup plus stables que les solutions d'amphotères, il est préférable 'acidifier légèrement pour purifier. L'activité antiprotozoaire du composé dé formule générale I est démontrée par exemple contre Trichomonas vaginalis. Dans ce test, on se sert de 8 souris dans chaque groupe, et d'un groupe de contrôle dont les animaux furent infectés mais non traités. On pratique une Injection sous cutanée d'environ 500 000 cellules sur la surface abdominale des animaux, Puis on traite les animux par voie sous cutanée avec différentes quantités du médicament à tester dans 1 ml de solution à ltendroit de l'infection, le jour meme de l'Infection, On examine les souris 2 jours après l'infection pour voir s'il y a des lésions à l'endroit de l'infection. On enregistre le nombre d'animaux sujets à des lésions et sans lésions pour chaque dose d'essai. On calcule la DC50 (dose curative) en se servant de la méthode de Reed et Munch (American Journal of Hygiene, Vol. 27, page 493, 1958), et on l'exprime en mcg/ml.Dans cet essai, le composé de formule générale I montre une DC50 de 10 mcg par ml indiquant ainsi son activité en tant qu'agent anti-protozoaire. ' L'activité antihelmintique du composé de formule générale I est démontrée par son activité contre Ascaris suum dans la souris. Pour cet essai, on se sert de 4 souris par groupe, 4 souris sont utilisées comme témoins non infectés et non traités, et-4 souris comme témoins infectés non traités. Le médicament est administré 24 heures avant l'infection. On mélange 100 à 200 mg du médicament à tester avec 100 g de nourriture de souris, L'infection est pratiquée par administration orale d'environ 2000 à 4000 oeufs d'ascaris embryonnés à chaque souris.On continue le traitement pendant 7 jours supplémentaires après l'infection. 7 jours après l'infection, on sacrifie les animaux, enlève les poumons, les compresse à laide de deux plaques de verre et compte les larves au microscope. On calcule en % l'abaissement du taux d'infection des larves dans les poumons des souris infectées et traitées, par rapport aux souris non infectées et non traitées. Dans cet essai, le composé de formule générale I indique un abaissement de 71%, montrant ainsi que ledit composé a une activité contre Ascaris suum. le nouveau composé de formule générale I démontre une tasse toxicité orale et parentérale. Chez les souris, l'antibiotique montre des valeurs LD50 de 50C mg quand il est admiris- tré oralement ou par injection sous cutanée. Le composé de formule générale I démontre également des propriétés herbicides, et plus spécialement post-levées et sont par conséquent utiles pour la préparation de compositions herbicides de post-levée contenant l'acide L-trans-2-amino- 4-(2-aminoéthoxy)-3-buténoique en tant qu'ingrédient actif, en combinaison avec des véhicules cu additifs usuellement utilises dans les compositions herbicides Ces agents comprennent des modifiants, des diluants, ou des agents de conditionnement pour faciliter la formulation de solutions, d'émulsions, de dispersions, de poussières ou de poudres mouillables. Des formulations liquides diacide L-trans-2-amino-4-(2- aminoéthoxy)-3-buténoîque ou de l'un de ses sels pour vaporisation directe peuvent être préparées, par exemple avec de l'eau, des fractions de pétrole, des esters, glycols, cétones ou alcools aliphatiques ou aromatiques liquides etc, Ces formulations liquides peuvent être des solutions, des dispersions, des émulsions ou des dispersions de poudres mouillables et si nécessaire peuvent c-ontenir des agents tensioactifs, par exemple des agents de mouillage, dispersion et d'émulsification etc., en quantité suffisante pour donner les propriétés désires à la formulation Les formulations aqueuses par exemple, peuvent être préparées en formant des solutions de sels non-toxiques du composé de formule générale I, solubles dans l'eau, ou par addition d'eau aux concentrés de l'émulsion, aux pâtes ou aux poudres à pulvériser mouillables de l'émulsion. Les agents mouillants, émulsifiants ou dispersants peuvent être soit anioniques, cationiques, non ioniques, ou des mélanges de ceux-ci. Comme agents mouillants appropriés, on peut citer, les composés organIques capables de diminuer la tension de la surface de l'eau, et comprennent les savons conventionnels tels que les sels d'acides carboxylique a longue chaîne hydrosolubles et les savons aminés, tels que les sels d'amines d'acides carboxyliques à longane chaîne, les huiles suif ontques animales, végétales et minérales, les sels quaternaires d'acides à haut poids moléculaire ; les savons de colophane tels que les sels dé l'acide abiétique, les sels d'acide sulfurique de composés orgies à hau sodas moléculaire - les savons d'algine ; et les compositions simples et polymétiques ayant des fonctions hydrophobes et hydrophiles. On peut préparer des poussières en mélangeant ou en moulant la substance active avec un véhicule solide tel que le talc, la terre d'infusoires, le kaolin, la bentonite, le carbonate de calcium, l'acide borique, le phosphate de calcium, le bois, le fluor, la poussière de liège, le carbone, etc. On peut obtenir des granulés dispersables, par exemple, en employant le sulfate d'ammonium comme véhicule. Dans une autre variante, des-véhicules peuvent être impré- gnés de solutions contenant les substances actives dans des solvants liquides. On peut obtenir des préparations poudreuses ou des pâtes qui peuvent être mises en suspension dans de l'eau et utilisées comme substances pulvérisées par addition de mouillants et de colloides protecteurs. Différentes formes d'ap plication peuvent etre mleux adaptées aux différents buts auxquels sont destinées les substances actives par addition de substance qui améliorent la dispersion, l'adhésIon, la rcsiDtarc~ la pluie et la force de pénétration, telles que les acides gras, les résines, les agents mouillants, émulsifiants, la colle etc. D'une manière analogue, le spectre biologique peut etre élargi par addition de substances ayant une action bactéricide, fungicide et des propriétés régularisant la croissance des plantes, ainsi que par combinaison avec des engrais. La quantité de substance active dans les compositions herbicides de cette invention varie selon le taux et le type d'application, et l'activité requise. Généralement, les compositions contiennent moins de 50% en poids de substance active. Afin d'obtenir la plus grande activité herbicide de post-levée, on applique une quantité suffisante de composition de l'invention correspondant d'environ 125 g à environ 2 kg, de préférence d'environ 500 g à environ 1 kg, de produit actif wour environ 40 ares . La quantité de composé de formule générale I employée devra dépendre du type des plantes nuisibles b traiter, car son efficacité varie d'espèce à espèce. Exemple 1 Fermentation de Streptomyces sp. X-11085 On inocule une suspension de spores de Streptomycos sp. X-11085 d'une culture d'agar à 2 litres de bouillon de culture de tryptocase de soja (Baltimore Biological Laboratories) dans un erlenmeyer de 6 litres. On fait incuber le flacon-à 280 pendant 72 heures sur un agitateur rotatif (240 tours/minute, course de 5 cm). On verse ensuite 4 litres de cet inoculum à 227 litres du milieu de fermentation contenant en g/litre Cerelose (Corn Products) 10,0 g Bacto-Peptone (Difco) 5,0 g extrait de Bactolevure 3,0 g hexahydrate de sulfate d'ammonium ferreux 0,03g Le pH de ce milieu est réglé à 6,8 avec de l'hydroxyde de sodium avant stérilisation.On fait incuber la culture à 280 dans un fermentateur de 380 litres, injecte de l'air à 85 l/minutr et agite à 200~tours/minute. Si nécessaire, on ajoute un agent antimoussant de silicone, (Dow Corning AF) pour réduire la mousse. Après 41 heures, le contenu du fermentateur est filtré par centrifugation à travers de la terre à infusion. Exemple 2 Purification de l'acide I-trans-2-amino-4-(2-amino- éthoxy)-3-buténoïque 426 1 de bouillon de culture fermenté et filtré, obtenu comme décrit à l'exemple 1, contenant 3,1 kg de solides, sont passés à travers une colonne de 30 cm de diamètre contenant 50 litres de résine Dowex 50WX4 (50-100 mailles de forme 11+). On lave la colonne successivement avec 1) 50 litres d'iau 2) 200 litres d'une solution aqueuse de pyridine à 5%. 3) 50 litres d'cau. On élue ensuite la substance active avec 200 litres d'ammoniac 1,0 M dans une solution aqueuse. Ires 80 premiers litres d'éluat obtenus après élévation du pH à 9,0 contiennent la majeure partie de la substance active. On fait évaporer les fractions actives à pression réduite jusqu'à obtention de 2 litres de concentré contenant 64 g de solides. On règle le pH du concentré à 3,3 avec une solution 5N d'acide chlorhydrique tandis que 340 g de charbon animal Norme A sont mis en suspension dans le concentré. On filtre ensuite la suspension à travers un entonnoir de verre frité contenant un tampon de cellite Hyflo, sur lequel est placé une couche de 70 g de charbon animal Norite A.Un volume combiné de 5 litres de filtrat et d'eau de lavage contient la presque totalité de la substance active (42 g). Après évaporation sous pression réduite, on dilue une portion de 31 mi du concentré contenant 18 g de solides dans 65 ml de solvant (mélange éthanol / H2O/ NH4 OH : 80/15/5) et on verse cette solution sur une colonne de 90 cm x 8 cm contenant 4,7 litres de gel de silice, 0,05 à 0,2 mm précédemment mis en pâte dans un solvant (éthanol/ H2O/NH4 OH/ : 80/15/5). On développe ensuite la colonne avec le même solvant et recueille la substance active dans une fraction de 4,8 litres qui apparait après que 12 litres de solvant aient passé à travers la colonne.La fraction active est concentrée à 200 ml et on passe le concentré dans 50 ml de ré- sine AG50WX4 (50-100 mailles de forme H+). Après avoir lavé la colonne avec de l'eau et une solution aqueuse de pyridine à 10%, l'activité est éluée avec une solution 1,5M de NH4OH. Cet éluat est concentré à 80 ml et on ajuste le pH à 3,3 avec 7,4 ml d'une solution IN de HC1. On concentre à nouveau la solution à un sirop et on cristallise à partir d'un mélange de 20 ml de méthanol et d'eau (19:1) pour obtenir le chlorhydrate de l'acide L-transo-2-amino-4-(2-aminoéthoxy)-3-buténiïque. $Une seconde récolte est oristallisée à partIr de 20 mi d'un mélange méthanol/H2O (49:1) ; p. f. 185-186; [a] 25 D = +85, 8 (c, 1%, H2O) Exemple 3 Purification de l'acide L'trans-2-amino-4-(2-aminoéthoxy)3-buténoïque. 36 g de solides, partiellement purifiés au moyen de n'im- porte quelle technique de purification, y compris la chromatographie d'adsorption, de séparation et par échange d'ions, sont dissous dans 250 ml d'eau et le pH de la solution est réglé à 3,6 avec HCI 5N. On verse la solution sur une colonne de 60 cm x 7 cm, contenant 2,5 1 de résine d'échange de cations AG5OWX4 (100-200 mailles, forme Na+). On élue la colonne avec un tampon 0,2M de citrate-phosphate de sodium, de pH 5,5, jusqu'à ce qu'un volume de substance active compris entre -6,2 et 9,1 litres apparaisse dans l'éluat. On élimine les sels de la fraction active en passant la solution à travers 1,2 litre de résine d'échange de cations AG50WX4 (50-100 mailles, forme H). On élue la substance active de la colonne avec une solution 1,5N de NH40H, et après évaporation sous pression réduite, on cristallise le chlorhydrate de l'acide L-trans-2-amino-4-(2- aminoéthoxy)-3-buténoïque selon la description de l'exemple 2. Exemple 4 On prépare une formulation parentérale contenant par cc: chlorhydrate de l'acide L-trans-2-amino-4-(2 aminoéthoxy )-3-buténoique 5,1 mg alcool benzylique 0,1 cc eau pour injection, U.S.P. q.s. ad 1,0 cc Procédé (pour 100.000 cc): 1. On chauffe 8 litres d'eau d'injection à 900 dans un récipient en verre. On refroidit ensuite à 50-60 , ajoute l'al- cool benzylique et dissout en agitant. On laisse la solution se refroidir à la température ambiante. On règle le pH de la solution entre 5 et 7 par addition de HCl. 2. On ajoute les 51,0 g de chlorhydrate de l'acide L-trans2-amino-4-(2-minoéthxy)-3-buténoïque sous azote et agite jusqu'à dissolution complète. 3. On ajoute ensuite suffisamment d'eau d'injection pour obtenir un volume total de 10 litres. 4. On filtre ensuite cette solution à travers une bougie 02 Selas, et la met en ampoules de taille adéquate qui sont scellées sous azote. Exemple 5 On prépare une crème à 5,0% contenant: acide L-trans-2-amino-4-(2-aminoéthoxy)-3buténoique 50,00 alcool stéarique 100,00 alcool cétylique 15,00 vaseline blanche 70,CO p-hydroxybenzoate de méthyle, U.S.P. 2,00 p-hydroxybenzpate de propyle, U S P. 0,50 palmitate dtisopropyle 60,00 polyoxyl 40 stéarate U.S.P. 40,00 propylèneglycol 120,00 versenate de disodium 0,10 eau distillée 548,16 Procédé I. On fait fondre à 75C les acools stéarique et cétylique, la vaseline, le p-hydroxybenzoate de propyle, le palmitate d'isopropyle et le polypxyl 40 stéarate, puis refroidit le mélange à 700 et le maintient à cette température. 2. On dissout le versenate de disodium et le p-hydroxybenzoate de méthyle dans de l'eau distillée très chaude, à laquelle on ajoute le propylèneglycol. On mélange la solution à 750 et on la verse lentement dans le solution huileuse préparée Antérieu- rement, en agitant lentement. On refroidit progressivement l'é- mulsion en agitant lentement. 3. Lorsque la température de l'onguent atteint 550, on ajoute une solution d'acide L-trans-2-amino-4-(2-aminoéthoxy)-3-buté noïque et mélange. 4. Lorsque la température de l'onguent atteint 500, on fait circuler de l'eau froide dans le manteau de la bouilloire ct on refroidit à 300 en agitant. On place alors l'onguent dans des récipients d'emmagasinnage. Exemple 6 On prépare des comprimés contenant par comprimé acide L-trans- 2-amino-4-(2-amino-éthoxy)-3buténoique 100 mg lactose U.S.P. 202 mg amidon de mais, U. S. P. 80 mg amidon de mais préhydrolysé 20 mg stéarate de calcium 8 mg poids total 401 m Procédé L'acide L-trans-2-amino-4-(2-amino-éthoxy)-3-buténoïque, le lactose, l'amidon de mais, et l'amidon de mais préhydrolysé sont mélangés dans un mélangeur approprié. 2. lie mélange est granulé en une pâte épaisse avec de lteau et on fait passer la masse humide par un tamis No. 12. On fait ensuite sécher pendant une nuit à environ 380. 3. On fait passer le granulat sec à travers un tamis No. 16 et l'introduit dans un mélangeur approprié. On ajoute le stéarate de calcium et mélange jusqu'à uniformisation. 4. On presse le mélange en comprimés de 410 mg en employant des poinçons à comprimés d'un diamètre d'environ 10 mm. Ires comprimés peuvent etre plats ou biconvexes, et peuvent avoir une entaille. Exemple 7 On prépare des capsules contenant par capsule acide L-trans-2-amino-4-(2-aminoéthoxy)-3 buténoque 10 mg lactose, U.S.P. 165 mg amidon de mais, U.S.P. 30 mg talc, U.S.P. 5 mg poids total 210 mg Procédé: 1. On mélange l'acide L-trans-2-amino-4-(2-aminoéthoxy)-3- buténolque, le lactose, et l'amidon de mais dans un mélangeur approprié. Le Le mélange est mélangé davantage dans une comminutrice de Fitzpatrick (tamis No 1A, couteaux en avant). 3. On réin-troduit la poudre mélangée dans le mélangeur, ajoute le talc et mélange à fond. 4. On place le mélange dans des capsules de gélatlne dure No. 4. Tableau 1 Milieu 2 : Extrait de levure - extrait de malt agar ISP $extrait de bacte-levure (Difco) extrait de bacto-malt (Difco) 10,0 g bacto-dextrose (Difco) 4,0 g eau distillée 1,0 1 régler au PH 7,3 puis ajouter bacto-agar 20,0 g Liquéfier l'agar sous vapeur à 1000 pendant 15-20 minutes. Une quantité adéquate est implantée dans au moins-6 tubes pour chaque culture. On stérilise dans l'autoclave, et refroidit les tubes. Milieu D : agar farine d'orge ISP orge 20,0g agar 18,0 g On chauffe (cuisson ou vapeur) 20 g d'orge dans 1000 ml d'eau distillée pendant 2D minutes. On filtre à travers de la toile à fromage et ajoute de l'eau distillée pour porter le volume à 1000 ul. On ajoute 1,0 ml d'une solution de 0,1 g de chacun des sels sui- vants : FeSO4' 7H2O, MnCI2' 4H2O et ZnSO4' 7H2O dans distillée. On règle au pH 7,2 avec NaOH, puis ajoute 18 g d'agar; liquéfie (sous vapeur)à 1000 pendant 15-20 minutes. Milieu 4 : Sels inorganiques - agar d'amidon ISP Solution I amidon Difco soluble 10,0 g. On fait une pâte avec l'amidon et une petite quantité d'eau distillée froide, et porte le volume à 500 ml. Solution II K2HPO4 (base anhydre) 1,0 g MgSO4' 7H2O 1,0 g NaCl 1,0 g (NH4)2 SO4 2,0 g CaCO3 2,0 g eau distillée 500 ml solution d'oligo-éléments 1,0 mg (même solution que dans le milieu 3) pH doit être compris entre 7,0 et 7,4. Ne pas régler s'il est situé entre ces deux valeurs. Mélanger la suspension d'amidon et la solution salée. Ajouter l'agar Difco 20,0 g Liquéfier l'agar sous vapeur à 1000 pendant 15-20 minutes. Milieu 5 : glycérol - agar asparagine ISP I-asparagine (base anhydre) 1,0 g glycérol 10,0 g K2HPO4 (base anhydre) 1,0 g eau distillée 1,01 solution d'oligo-éléments 1,0 ml (comme dans le milieu 3) Le pH de la solution est situé entre 7,0 et 7,4. Ne pas le régler s'il est compris entre ces deux valeurs. Agar 20,0 g liquéfier l'agar sous vapeur à 100 pendant 15 à 20 minutes. Agar de Bennett [J.Bact., 57, 142 (1949)] g/litre extrait de levure 1,0 extrait de viande de boeuf 1,0 N-Z-amine A 2,0 glucose 10,0 eau distillée agar 18,0 pH 7,3 Amidex (Corn Products) g/litre Amidex 10,0 N-Z-amine A 2,0 extrait de viande de boeuf 1,0 extrait de levure 1,0 CoCL2.6H20 20,0 mg agar 20,0 eau distillée Agar d'extrait de Pablum litre pablun 60,0 agar 15,0 eau Agar d'Emerson [j. Bact., 55, 411 (1948)] eau distillée 1000 ml NaCl 2,5 g peptoene 4,0 g extrait de levure 1,0 g extrait de viande de boeuf 4,0 g régler le pH à 7,0 avec de la potasse bacto-dextrose 10,0 g agar 30,0 g Agar de tomates et de farine d'avoine g/litre farine d'avoine pour enfants 20 concentré de tomates 20 agar 20 eau 1 litre pH 6,8 - 7,3 Anar de concentré de tomates-soja g/litre glucose 10 K2HPO4 1 concentré de tomates 2n peptone deWilson 1 CaCO3 2 Agar 15 eau Bouillon de culture de spores No. 5 (ATCC) litre extrait de levure- 1,0 extrait de viande de boeuf 1,0 tryptose 2,0 FeSO4.7H2O traces glucose 10 2 agar 15 eau distillée 1 litre régler le pH à 7,2 Tableau 2 Milieu de fermentation Composition des milieux g/l potentiel anti biotique ml Bouillon BB 1,0 glucose 2,0 K2HP04 7,û 2 4 KH2PO4 3,0 Na3 citrate.2H2O 0,5 MgSO4.7H2O 0,1 (NH4)2SO4 1,0 Bouillon CB 0,1 glucose 10,0 N-Z-amino type A (Sheffield) 10,0 NgCl2.6H2O 0,2 CaCl2.2H2O 0,025 FeCl3.6H2O 0,001 ZnCl2 0,0005 CuCl2.2H2O 0,0005 MnCl2.2H2O 0,0005 Bouillon CC 0,1 glutamate de monosodium 10,0 glucose 10,0 K2HPO4 4,0 KH2PO4 2,0 MgCl2.6H2O 0,2 CaCl2.2H2O 0,025 FeCl3.6H2O 0,001 ZnCl2 0,0005 CuCl2.2H2O 0,0005 MnCl2.2H2O 0,0005 Composition des milieux g/l potentiel anti biotique &gamma;/ml Bouillon CD 10,0 soyalose (central Soya) 10,0 amidon soluble (Nutritional Biochemical) 10,0' liqueur de maceration de mais 0,5 (Corn Products) K2HPO4 0,5 CaCO3 0,5 pH réglé à 7,5 Bouillon CE 10,0 glucose (Cerelose-Corn Products) 10,0 bacto-peptone (Difco 5,0 bacto-extrait de levure (Difco) 3,0 Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O 0,031 Tableau 3 Spectre antimicrobien in vitro du composé de formule générale I Organisme testé Diamètre des zones d'inhibition 1) en mm. composé de formule générale I-lmg/ml Escherichia coli (17) Bacillus simplex (32) Staphylococcus aureus (24) Streptomyces cellulosae 097 51 Bacillus cereus 65 1) Les nombres entre parenthèses concernent des zones d'inhibition floues. Exemple 8 L'activité herbicide de post-levée des compositions de la présente invention est démontrée par les tests suivants, contre un nombre varié de plantes nuisibles. Pour ces tests les plantes croissent activement dans des coupelles en plastique de 10 cm x 10 cm et atteignent une hauteur d'environ 4 à 10 cm selon l'espèce. Chaque coupelle contient seulement une espèce de plante. On applique de l'acide L-trans-2-amino-4-(2-aminoéthoxy) 3-buténolque sous forme de chlorhydrate dans un véhicule aqueux contenant O,j56 en poids de monostéarate de sorbitane-polyoxyéthylène (Tween 20-Atlas Chemical Company, Wilmington, Del.). le composé actif est dissous dans le véhicule en quantités suf- fisantes pour donner des solutions contenant 225, 450, 900 et respectivement 1800 g par environ 40 a pour application sur les plantes nuisibles à une quantité pré-déterminée. les solutions d'essai sont appliquées aux plantes une seule fois avec un pul- vérisateur et les plantes sont placées en observation pendant unc période de 14 jours, après quoi le test est termine et les résultats évalués. les résultats du test se trouvent dans le tableau suivant et le taux de destruction des plantes est indiqué numériquement. Le code est le suivant : O, aucun effet visible; 1, 2, 3,légère. attaque, les plantes récupèrent en général sans ou avec une légère diminution de taille ; 4, 5, 6,attaque modérée, les plantes récupèrent en général mais subissent une diminution de taille 7, 8, 9, attaque sévère, les plantes ne récupèrent généralement pas ; 10, toutes les plantes sont tuées. Tableau 4 Activité herbicide de l'acide L-trans-2-amino-4-(2-aminoéthoxy)-3-buténoique 14 jours Concentration 1)Xanthiun 2) Cysperus 3) Sarghum 4) Datura 5) Cirsium 6) Sida kg/40 a pensylvanicum esculentus kalepense stramonium arvense acuta 1,8 9 7 9 8 5 8 0,9 8 5 8 8 4 7 0,45 8 4 8 6 1 5 0,22 6 2 7 4 1 4 Concentration 7) Cyperus 8) Daubentonia 9) Chenopodium 10) Agropyron 11) Bronius 12) Abutilon kg/40 a rotundus texana album repeus secalinus theophrasti 1,8 4 6 5 2 6 7 0,9 2 3 3 1 4 4 0,45 0 4 1 0 2 2 0,22 0 2 0 0 2 2 REVENDICATIONS 1. L'antipode L d'un composé de formule générale et ses sels d'addition d'acide. 2. le chlorhydrate de l'acide li-trans-2-amino-4-(2-amino- éthoxy )-3-buténoîque. 3. Procédé pour la préparation de l'acide L-trans-2-amino4-(2-aminoéthoxy)-3-buténoique de formule générale comprenant la culture de Streptomyces sp. X-11085 dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables dthydra- tes de carbone, d'azote et de sels inorganiques, dans des conditions aérobiques submergées, jusqu'à ce qu'une activité antibiotique importante ait été impartie au milieu par production de l'acide L-trans-2-amino-4-(2-aminoéthoxy)-3-buténoique, et la récupération de l'antibiotique ainsi produit du milieu aqueux et, le cas échéant, la conversion de cet acide en un sel d'addition d'acide. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'organisme utilisé est Streptomyces sp. X-11085, NRRL 5331. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on récupère l'acide L-trans-2-amino-4-(2-aminoéthoxy)-3 buténoique par filtration du milieu aqueux, adsorbtion de l'anti biotique sur une résine échangeuse de cations et récupération de l'antibiotique de la résine. 6. Procédé selon la revendication 1, carsetérisé en ce qu'on récupère l'acidé L-trans-2-amino-4-(2-aminoéthoxy))-3- buténoïque par filtration du milieu aqueux, séparation de 1'an- tibiotique par chromatographie de partage sur gel de silice et récupération de l'antibiotique à partir du gel de silice. 7. Les produits obtenus suivant le procédé des revendications 3 à 6. 8. A titre de médicaments nouveaux, les composés selon les revendications 1 et 2. 9. Compositiorsayant une action antibiotique, caractérisées en ce qu'elles comprennent un composé suivant les revendications 1 et- 2 ainsi qu'un véhicule ou support usuel. 10, Composition antimicrobienne selon la revendication 9. 11. Composition antiprotozoaire selon la revendication 9. 12. Composition antihelmintique selon la revendication 9. 13. Composition herbicide selon la revendication 9. 14. Composition selon l'une des revendications 9 à 13, caractériSée en ee Que le sel d'addition d'acide est le chlorhydrate. 15 Procédé pour ia fabrication de préparations ayant une action antibiotique caractérisé en ce qu'un composé selon l'une des revendications 1-2, est mélangé, entant que substance active, avec des supports solides ou liquides, non-toxiques, inerte, usuellement utilisés dans de telles préparations, et/ou des excipients. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'on fabrique une préparation antimicrobienne. 17. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'on fabrique une préparation antiprotozoaire. 18. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'on fabrique une préparation antihelmintique. 19. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'on fabrique un herbicide. 20. Une méthode de traitement ost-lev6e des plantes nuisibles,caracterisée en ce que l'on applique auxdites plantes une quantité efficacement herbicide de la composition de l'une des revendications 13 ou 14.