Brevet FR2248851A1 — publié le 19750523

La présente invention concerne des substances douées d'activité anti-inflamatoire , destinées à etre utilises dans le traitement de troubles rhumatismaux et d'autres troubles inflammatoires. Des travaux de recherche conduits depuis de nombreuses années dans le domaine des médicaments anti-rhumatismaux ont abouti à la découverte de diverses substances offrant un intérêt clinique. Tous les médicaments anti-rhumatismaux usuels sont îles aux protéines du plasma dans le système circulatoire de l'organisme, mais aucune relation chimique entre les substances intéressar,tes ne laisse entrevoir un mode d'action basé sur la structure chimique.On a donc émis lthypothèse générale que lorsque ces médicaments entrent dans le système circulaloire et s'attachent aux protéines du plasma, ils déplacent une molécule liée aux protéines existantes et faisant partie d'un système naturel de défense contre l'inflammation chronique caractérisant les troubles rhumatismaux. Des expériences sont venues étayer dans une certaine mesure cette hypothèse, du fait que tous les médicaments à effet anti-rhumatismal, à l'exclusion des autres, déplacent le L-tryptophane de sa liaison aux protéines du sérum humain, tant in vitro lutin vivo. vue d'obtenir On a poursuivi les recherches en une molécAS déplaçable à fonction défensive naturelle, comme, défini ci-dessus, mais jusqu'à présent, aucun résultat convaincant nta été obteml et rien de précis n'a été découvert sur la nature d'une telle molécule. On vient de découvrir qu'il est possible d'obtenir une fraction de sérum et de plasma qui déploie une activité antiinflammatoire dans le test de l'oedème de la patte provoqué par la carraghénine chez le rat. On obtient cette matière par ultrafiltration du plasma ou du sérum ou d'une fraction convenable de l'un ou L'autre, suivie d'une filtration sur gel et d'une élution avec un milieu aqueux non tamponné ou tout au plus très faiblement tamponné par des sels dont la molarité totale ne dépasse pas, par exemple, 0,02 M. L'ultra-filtration de la matière première est des tinée- à éliminer les très grandes molécules et à permettre le pasagge du principe actif qui a vraisemblement un poids moléculaire relativement faible. Pour éliminer au maximum les ma tières indésirables au stade de l' l'ultra-filtration, on peut uti-- liser des filtres, par exemple des membranes, dont le point de fractionnement moléculaire s'abaisse à un poids moléculaire d'environ 500.Toutefois, avec de telles membranes, le débit est plu- t8t lent et, en pratique, il est désirable d'utiliser des mm- branles qui permettent d'obtenir un plus grand débit, parce qu'il est possible de tolérer, à ce stade, le passage d'une certaine proportion d'impuretés dont le poids moléculaire est à peu près égal ou peut meme dépasser 2000. On améliore les résultats en effectuant l'ultra-filtration sur des fibres creusses. L'utilisa tion d?un faisceau de fibres creuses facilite la séparation des macromolécules et accélère la filtration.Ces fibres offrent également l'avantage d'être plus robustes que des membranes et de faciliter l:épuration au moyen de détergents contenant des enzymes, qui dispersent spontanément la matière macromoléculaire qui tend à ralentir périodiquement la filtration. Avant la filtration sur gel, il est préférable de concentrer le produit d'ultra-filtration. La filtration sur gel peut être conduite avec diverses matières, mais de très bons résultats ont été obtenus en utilisant des dextranes réticulés tels que ceux aui sont vendus sous la marque "Sephadex". L'élution de la matière retenue sur la colonne de gel, dans des conditions réglées, est un critère très important du procédé de la présente invention. Au lieu d'utiliser des éluants qui renferment les taux usuels de sels tampons, on a trouvé possible d'atteindre un degré important de purification en maintenant la quantité de sels tampons dans ltéluant à une faible concentration ou en supprimant ces sels. Une élution à l'eau distillée est très avantageuse.Lorsque la substance active est éluée du gel dans ces conditions, elle tend à se séparer an deux bandes de part et d'autre de la bande renfermant la maJeure partie des substances toxiques et autres substances indésirables qui sont présentes et qui sont responsables des principaux pics d'absorption dans le spectre ultiolet. La substance active apparaissant dans la première bande est vraisemblablement éluée en raison de la nature acide de la substance active, parce que des colonnes de "Sephadex" con tiennent normalement une matière chargée négativement, qui em pêche la retenue de la matière acide sur la colonne.Il est vrai semblable que la portion de la substance active retenue à ce stade sur la colonne soit retenue par adsorption et cette portion, comme indiqué ci-dessus, demeure jusqu'à la fin de l'élution des composants principaux et composants indésirables de la fraction de sérum ou de plasma Dans la mise en oeuvre du procédé de séparation conforme à l'invention, il est nécessaire de soigner particu lièrement l'opération d'ultra-filtration, parce que le comportement de la substance active semble varier en fonction des dimensions de la membrane, par exemple son diamètre et son épaisseur, d'une manière qui n2est pas encore entièrement élucidée, et, en conséquence, des essais préliminaires sont nécessaires Si on envisage toutes modifications des dimensions de la membrane. Par exemple, dans le cas d'une cellule de deux litres de la firme Amicon Ltd., une membrane "PSi-10" de diamètre égal à 150 mm donne d'excellents résultats. L'utilisation d'autres membranes, par exemple "UM-10", "UM-2" ou "tJM-05", exige la détermination des dimensions optimales des divers paramètres. Pour l'opération de filtration sur gel, il est très avantageux d'utiliser des membranes de "Sephadex" de qualité G25, G15 ou S10. L'utilisation de gels d'acrylamide et d'autres types de substrats entre également dans le cadre de la présente invention. On a également trouvé possible de parfaire à un très haut degré la purification du produit obtenu dans le procédé mentionné ci-dessus, en conduisant une opération d'échange ionique. La substance active contenue dans la fraction intéressante du sérum ou du plasma est acide et, en conséquence, on utilise des matières d'échange anionique pour améliorer la purification. Des exemples convenables de matières d'échange anionique comprennent des matières faiblement basiques telles que DEAE-"Sephadex" ou DEA-cellulose. Il est préférable d'utiliser deux de ces colonnes, ctest-à-dire d'effectuer un échange anionique puis une filtration sur gel ou vice versa. Bien que l'or- dre dans lequel les colonnes sont utilisées puisse ne pas être déterminant, il est avantageux de conduire tout d'abord la fil tration sur gel, parce que cela permet de rs'diir les volumes traités sur la colonne d'échange anionique. Il en résulte que la concentration finale de l'éluat acide sortant de la colonne d'échange anionique exerce un moindre effet sur la substance active (la matière beaucoup plus pure obtenue sur la colonne d'échange anionique est un peu moins stable à l'acide que ne l'est le produit obtenu par filtration sur gel).Lorsqu'une chromatographie par échange ionique est conduite avant ou après la filtration sur gel, la matière désirée est présente dans une fraction recueillie après l'élution des pics principaux absorbant la lumière ultraviolette. Les phases subséquentes du procédé, c'est-à-dire la chromatographie par échange ionique et la chromatographie sur des gels convenables, permettent une meilleure purification de la substance active qu'en l'absence d'un échange ionique, et le produit résultant présente une plus large gamme d'activite'. Ainsi, la fraction active obtenue fait preuve d'activité dans le test à la carraghénine chez la souris et le cobaye. Elle déploie une grande activité dans le test de l'arthrite provoquée chez le rat et elle/est également active dans le test de l'érythème aux rayons ultraviolets chez le cobaye. La substance désirée est inactive dans le test anaphylactique d'Arthus. La substance active déploie également son activité dans les tests de pleurosie sous l'effet de la térébenthine et de la carraghénine chez le rat, ainsi que sur l'accumulation d'exsudat et l'infiltration cellulaire dans des éponges non susceptibles de résorption, implantées sous lsépiderme du rat. La substance active de la présente invention ne déploie pas d'activité analgésique ou antipyrétique. L'invention est illustrée par les exemples suivants, qui décrivent le traitement de fractions de sérum humain et d'une fraction de sérum de boeuf. Les mêmes opérations peuvent être appliquées à des sérums ou plasma d'autres mammifères d'intérêt économique, par exemple des sérums de porcs, moutons et chevaux. Exemple 1 Un litre de plasma humain additionné de citrate ("Blood Transfusion Centre", Tooting, Lonares, S.W.17) est cen trifugé à 2000 g pendant 30 minutes à 4 dans une centrifugeuse "MSE Mistral 4L" et la liqueur surnageante est filtrée sans retard à 20O dans une cellule "Amicon" de deux litres en atmosphère d'azote gazeux sous pression de 3,5 bars, en utilisant une membrane "Diaflo PM 10", jusqu'à ce qu'un volume d'ultra-filtrat de 500 mi ait été recueilli.Une fraction de 200 ml de cet ultra- filtrat est réduite à un volume de 20 ml à 370 sous pression réduite, et le concentré obtenu est chargé sur une colonne (55 x 5 cm) de ItSephadex G25" en fines particules, et élué à l'eau distillée à 20g. L'éluat obtenu (débit de 2 ml/mn) est soumis à un essai de contrôle à 254 nm sur "Uvicord I"(LKB Instruments, Croydon). On recueille des portions de 20 ml et on les rassemble en fractions désignées par les chiffres I, II, III, IV et V, correspondant à la figure 1 des dessins annexés (volune élué en abscisses ; pourcentage de transmission à 254 nm, en ordonnées). Les fractions II et IV contiennent la substance active. Ges fractions rassemblées totalisent un volume d'environ 500 ml ; on les concentre ensuite à sec par évaporation sous vide. Da substance purifiée ainsi obtenue est utilisée dans des tests anti-inflammatoires par administration parentérale d'une solution saline de cette substance, de préférence par voie in traveineuse. On peut parfaire la purification de la substance ainsi obtenue par des opérations dtextraction au solvant, par exemple une extraction liquide/liquide, éventuellement suivie d'une réextraction dans un solvant aqueux. La substance active obtenue dans l'opération décrite ci-dessus déploie son activité contre de nombreux oedèmes de la patte du rat, dus notamment à la carraghénine. Elle n'antagonise pas l'histamine, la 5-hydroxy-tryptamine ou les kinines. Son poids moléculaire apparent est inférieur à 1000 et elle résiste remarquablement aux enzymes protéolytiques. L'opération de cette substance à une protéase non spécifique, à la trypsine ou la papaïne pendant 24 heures à 360C n'entraîne pratiquement pas de baisse d'activité. Exemple 2 Quatre litres de plasma humain additionné de citrate (collecté par le "Blood Transfusion Centre", Tooting, Londres, S.W. 17) sont centrifugés à 2000 g pendant 45 minutes à 4 dans une centrifugeuse "M.S.E. Mistral 4L" et la liqueur surnageante est filtrée à 200 dans une cellule d'ultra-filtration à fibres creuses "Amicon DC2", à limite de fractionnement moléculaire de 10 000. Lorsque deux litres de filtrat ont été recueillis, ce volume est chargé sur une colonne de 5 x 10 cm de résine d'échange anionique "Sephadex A25. La colonne est ensuite éluée avec 400 mi d'eau, 400 mi d'acide acétique à 5 % et finalement de acide acétique à 5 % en solution saline à 0,45 %.L'éluat (débit de 5 ml/mn) est soumis à un essai de contrôle à 254 nm sur un appareil "Uvicord il (L.X.E. Instruments, Croydon). On recueille des portions de 15 mi que l'on rassemble en frac- tions A, B, C, D et E correspondant à la figure 2 des dessins annexés (volume d'éluat en millilitres en abscisses ; pourcentage de transmission à 254 nm en ordonnées). La fraction 2, représentant un volume de 450 mi, est ensuite concentrée à sec sous vide, dissoute dans 5 ml d'eau et l'acide résiduel est neutralisé à l'hydroxyde de sodium. Cette fraction est ensuite chargée sur une colonne (55 x 5 cm) de "Sephadex G25" en fines particules et elle est éluée à l'eau distillée à 20 . L'éluat (débit de 2 ml/mn) est soumis à un essai de contrôle à 224 nm sur un appareil "Uvicord I (L.Y.B. Instruments, Croydon). On recueille des portions de 20 ml que l'on rassemble en fractions désignées par les lettres F, G, H et J correspondant à la figure 3 des dessins annexés (volume d'éluat en millilitres en abscisses et pourcentage de transmission à 254 nm en ordonnées). La fraction G contient la substance active. Ces fractions sont rassemblées et totalisent un volume de 200 ml qui est ensuite réduit par concentration à sec sous vide. La substance active de l'invention est détruite par chauffage avec des réactifs alcalins tels qutune solution diluée d'ammoniac, et par agitation par secousses énergiques avec des solvants orgatliques non purifiés tels que l'éther diéthylique contenant des traces de peroxyde. Elle n'est pas détruite par agitation par secousses avec des solvants organiques purifiés Exemple 3 On fait coaguler du sang de boeuf fraîchement recueilli (4 litres) à 37 pendant deux heures. On centrifuge le sang à 2000 g pendant 60 minutes à quatre degrés dans une centrifugeuse "MSE Mistral 4L" et on filtre la liqueur surnageante à 200 dans une cellule d'ultra-filtration à fibres creuses "Amicon DC2" dont la limite de fractionnement moléculaire est égale à 10 000.Deux cents millilitres de cet ultra-filtrat sont réduits à un volume de 5 ml à 37 sous pression réduite, le concentré est chargé sur une colonne (55 x 5 cm) de "Sephadex G25" en fines particules et l'élution est effectuée à l'eau distillée à 20 . l'éluat (débit de 2 ml/mn) est soumis à un essai de contrôle à 254 nm à l'aide d'un appareil "Uvicord 1" (LKB Instruments, Croydon). On recueille des portions de 20 mi que l'on rassemble en fractions appelées I, II, III, IV et V qui ne correspondent qu'au diagramme de la figure 1. Les fractions II et IV sont rassemblées et concentrées sous pression réduite. Le résidu est dissous dans 6 ml de solution saline à 0,9 % en poids/volume. Lorsqu'on injecte des portions aliquotes d'un millilitre de cette solution dans la veine caudale d'un rat, on note une nette réduction de l'oedème de la patte du rat dans le test à la carraghénine, quatre heures après l'injection de la substance irritante. Exemple 4 Deux litres de plasma humain additionné de e citrate, recueilli par le "Blood Transfusion Centre, Tooting, Londres, S.W. 17, sont centrifugés à 2000 g pendant 45 minutes à 40 dans une centrifugeuse '1MSE Mistral 4L" et la liqueur surnageante est filtrée à 200 dans une cellule d1ultra-filtration à fibres creuses "Amicon DC2", dont la limite de fractionnement moléculaire est égale à 10 000. Après avoir recueilli un litre dtultra-filtrat, on concentre ce dernier sous vide à 100 ml et on charge le concentré sur une colonne de 90 x 300 mm contenant de fines particules de "Sephadex G25".On élue la colonne à l'eau distillée à 200 et on soumet l'éluat (débit de 15 ml/mn) à un essai de contrôle à 254 nm sur un app-crcil "Uvicord I" (LKB Instruments, Croydon). On recueille des portions de-50 mi et la fraction correspondant à celle qui est numérotée II sur la figure 1 des dessins mnexés est concentrée par évaporation à sec sous vide à 37 . Le résidu est repris dans 25 mi d'eau distillée et chargé sur une colonne de 12 x 80 mm de résine d'échange ionique "Sephadex A25". La coloime est ensuite éluée avec 10 ml d'eau distillée, 40 ml d'acide acétique à 5 % et finalement 100 ml diacide acétique à 5 % dans une solution de sel à 0,45 %. L'éluat (débit de 0,25 ml/mn) est soumis à un essai de contrôle de 254 nm sur un appareil "Uvicord 2" (LKB Instruments, Croydon). On recueille des portions de 15 ml que l'on rassemble en fractions A, B, C, D et E correspondant au diagramme de la figure 2 des dessins annexes. La fraction E, totalisant un volume de 40 mi, peut être neutralisée directement à l'hydroxyde de sodium et conservée ou additionnée de 200 ml d'eau distillée. La solution résultante est concentrée à sec sous vide, le résidu est dissous dans 25 ml d'eau distillée et l'acidité résiduelle de la solution est neutralisée à l'hydroxyde de sodium. REVENDICATIONS 1. Procédé de production dpune substance anti-inflammatoire, caroctér sé par le fait qu'il consiste à soumettre du sérum, du plasma ou une fraction convenables de l'un ou l'autre à une ultra-filtration puis à une filtration sur gel et à éluer du gel une fraction qui déploie une activité anti-inflammatoire dans le test de l'oedème de la patte du rat provoqué par la carraghénine. 2. Procédé suivant la revendication i, caractérisé par le fait que la fraction active est éluée du gel avec une solution aqueuse de faible force ionique. 3. Procédé suivant la revendica-tion 2, caractérisé par le fait que l'élution est effectuée à l'eau distillée 4. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé par le fait que l'élution est effectuée avec un milieu dont la force ionique est inférieure à 0,02 mole 5. Procédé suivant ltune quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que la filtration sur gel est effectuée au moyen d'un dextrane réticulé. 6. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que ltultra-filtrat est concentré avant la filtration sur gel. 7. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il comporte une opération supplémentaire de purification par chromatographie par échange anionique. 8. Procédé suivant la revendications 7, caractérisé par le fait que la purification par échange anionique est effectuée après la filtration sur gel. 9. Procédé suivant ltune quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'ultra-filtration est effectuée avec une membrane appropriée. 10. Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions 1 à 8, caractérisé par le fait que l'ultra-filtration est effectuée avec un faisceau de fibres creuses. 11. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la matière pre mière dérive de sang humain ou de sang de boeuf. 12. Une fraction de sérum ou de plasma douée d'activité anti-inflammatoire,sensiblement exempte de composants de poids moléculaire supérieur N 1000 et excerçant notamment une activité dans le test de l'oedème de la patte du rat, provoqué par la carraghénine.