Brevet FR2215200A1 — publié le 19740823

La présente invention concerne un produit médicamenteux exerçant ur.e action dilatatrice sur les vaisseaux coronaires et In procédé d'isolement d'une neurohormone à partir de lthypothalamus des gros bovidés. On saint que l'hypothalamus du gros bétail à cornes contient des substances biologiquement actives de nature hormonale, telles que l'oxytocine, la vasopressine, des hormones dites hypophysotropes, ainsi que des neurohormones constitufss par deux composés thermostables à faible masse moléculaire, secrétées par les noyaux neurose@étoires de l'hypothalamus et transférées de l'hypothalamus à la cir culation gçnérale en évitant l'adénobypophyse, c'est-à-dire par voie parahypophysaire. L'ur. de ces composés, appelé conventionnellement la neurohormone "K", contient des acides aminés : la glycine, la sérine, les acides aspartique et glutamique et un corps ultra-violet de caractère nucléotide, possède un spectre caractéristique dans le domaine ultra-violet et, présente des propriétés acides. Il migre vers l'anode lors de l'électrophorèse sur papier sous 3000 volts au sein d'une solution tampon de citrate (pH= ),8l. Il est dialysable à travers une membrane semi-perméable.Il perd de son activité biologique à la suite d'un traitement à l'alcali et de l'hydrolyse pendant 24 kau sein de HC1 6N à la température de 1050 G. Il subit une perte considérable de son activité biologique à la suite d'un traitement à la pepsine et à la trypsine. Pendant la filtration de gels sur céfadex G- 10 et G -O5 (dénominations commerciales de composés syntllétiques permettant, d'après le principe du "tamis moléculaire", de séparer différents comtés suivant leur poids moléculaire), ledit composé sort plus tard que tous les composés à faible mase moléculaire connus.Le coefficient de distribution Rf pour la chromatographie sur papier est de 0,)5 dans un système de solvants butanol-acide acétique - eau, engagés dans un rapport de 4 : t : 5. 'autre composé, appelé conventionnellement la neurohormone "C", est ui corps hydrosoluble thermostable, susceptible de franchir une membrane semi-perméable. il présente des propriétés acides. Il migre vers l'anode pendant l'élec- trophorèse sur papier sous 3000 volts au sein d'une solution tampon de citrate dont le pH est ajusté à 3,8, mais cette migration s'effectue dans une mesure moindre que pour le composé précédent; Rf pour la chromatographie sur papier est de 0,15 dans un système de solvants butanol - acide acétique - eau, engagés dans un rapport de 4 : 1 : 5. Il ne perd pas son activité biologique à la suite d'une hydrolyse pendant 24 h au sein de HC1 6N à la température de 1050 C.Il ne perd pas non plus son activité biologique à la suite d'un traitement à la pepsine et à la trypsine. Lors de la filtration de gels sur céfadex 010et G-25 le composé en question sort après le composé précédent. Il ne possède pas de spectre caractéristique. Lesdites neurohormones exercent une action dilatatrice sur les vaisseaux coronaires et trouvent des applications en médecue humaine en tant que produits médicamenteux. Selon l'invention, le produit médicamenteux exerçant une action dilatatrice sur les vaisseaux coronaires contient en tant que principe actif, une neurohormone sécrétée par l'hypothalamus du gros bétail à cornes, se présentant sous forme d'un composé hydrosoluble thermostable à faible masse moléculaire, susceptible de franchir une membrane semi-perméable, possédant des propriétés acides, migrant vers l'anode lors de l'électrophorèse sur papier sous 5000 volts au sein d'une solution tampon de citrate dont le pK est ajusté à 3,8, ayant un coefficient de distribution Rf égal à 0,15 dans un système de solvants bdanol -acide ascétique - eau, engagés dans un rapport de 4 : 1 : 5, conservant son activité biologique à la suite d'une hydrolyse pendant 24 H au sein de HGA 6N à la température de 105 C, conservant son activité biologique à la suite d'un traitement à la pepsine et à la trypsine, sortant le dernier lors de la filtration à travers des tamis moléculaires de 200 à 400 mailles/2,54 cm ne présentant pas de spectre caractéristique. Le produit médicamenteux faisant l'objet de l'invention est indiqué en cas d'infarctus aigu du myocarde, de sténocardie, d'insuffisance coronarienne chronique. La neurohormone faisant office de principe actif du produit médicamenteux de l'invention est élaborée dans les noyaux neurosecrétoires de l'hypothalamus pour être transportée vers le coeur par la circulation sanguine, en se liant par des liaisons lâches avec les albumines et les globulines gamma du sérum sanguin. La neurohormone exerce une action directe sur les vaisseaux coronaires. En cas d'injection aux animaux par voie intra-veineuse en doses de 1 à 2 Ypar -Kg de poids vif, la neurohormone dilate les vaisseaux coronaires au bout de 7 à 5 mn. Au bout d'une heure, la quantité de sang qui s'est écoulée des vaisseaux veineux du coeur par unité de temps se chiffre par 200 à 70 % par rapport au niveau initial. Cet effet dure 3 à 6 h. Après hypophysectomie, le produit conserve pleinement son pouvoir de dilatation des vaisseaux coronaires. Ceci témoigne du fait que, dans ce phénomène, l'hypophyse ne joue aucun rôle. Après surrénalectomie, l'effet exercé par le produit médicamenteux disparaît. Ceci témoigne du fait que dans les conditions de l'organisme entier la glande surrénale joue un rôle important dans la réalisation de l'effet dû au produit. A l'état physiologique tant normal que pathologique, la neurohormone est sécrétée par l'hypothalamus dans le sang sous l'influence des facteurs chimiques du duodénum et du coeur. Sécrétées dans le sang, ces substances chimiques excitent les chémorécepteurs de sinus carotiens", ce qui provoque, par l'intermédiaire des systèmes cholinoréactifs de l'encéphale la sécrétion de la neurohormone dans le sang par l'hypothalamus. On a donc découvert les mécanismes de régulation chimique de la circulation sanguine cardiaque - par l'intermédiaire des neurohormones de l'hypothalamus. Les produits médicamenteux synthétiques employés en clinique en tant que remèdes dilatant les vaisseaux coronaires sont sous tous les rapports inférieurs à la neurohormone de l'invention. La neurohormone n'est pas toxique, même si on l'injecte aux souris en quantités de 100 à 700 ( et même davantage) de doses biologiquement actives. Elle ne produit aucun effet sur la pression artérielle. La dose minimale produisant un effet dilatateur sur les vaisseaux coronaires est de 1 à 2 g /Kg. Les produits médicamenteux connus utilisés pour la dilatation des vaisseaux coronaires sont employés en doses cent ou mille fois plus grandes. La neurohormone influe d'une façon spécifique sur la circulation artérielle coronarienne, elle est un régulateur chimique naturel de la circulation artérielle coronarienne. La neurohormone dilate assez rapidement les vaisseaux coronaires, contribue à l'ouverture de toutes les anastomoses du coeur et est extrêmement efficace dans la lutte contre l'infarctus du myocarde et d'autres maladies des vaisseaux cardiaques. Le produit médicamenteux exerçant une action dilatatrice sur les vaisseaux coronaires a été essayé en clinique sur 60 sujets souffrant de l'infarctus du myocarde, de la sténocardie et de l'insuffisance coronarienne chronique. Le produit médicamenteux a été administré aux malades par injection intra-veineuse. On a injecté aux malades 50 à 40 g de substance sous forme d'une solution stérile dans un mélange d'eau bidistillée et d'eau physiologique. Au bout d'une heure, on a observé la disparifon des douleurs ayant pour siège la région du coeur, la stabilisation de la pression artérielle, la normalisation de la fréquence des battements cardiaques et une amélioration de l'électrocar- diogramme. Le produit médicamenteux faisant l'objet de l'invention peut être employé sous forme d'une poudre, de comprimés et de solutés injectables. Le produit médicamenteux selon l'invention contient le principe actif en association avec un solvant pharmaceutique, en qualité duquel il est avantageux d'utiliser un mélange d'eau bidistillée avec de l'eau physiologique ou avec une solution de glucose. La teneur en principe actif de la solution est de 0,00012 à 0,00016 % en masse. C'est la forme c@rat@@e préférable du produit médicamenteux proposé.Le produit est commercialisé e flacons contenant chacun 5 ml d'une solution stérile du produit dans de l'eau bidistillée. Cette solution est melangée extemporanément avec de l'eau physiologique ou une solution de glucose, puis introduite par voie intra-veineuse. Le produit ne donne lieu à aucun phéno- mne secondaire. Le produit médicamenteux n'a pas de contre-indications. L'invertion a également pour objet un procédé d'isolement, à partir de l'hypothalamus du gros bétail à cornes, de la neurohormone faisant office de principe actif du produit médicamenteux , faisant l'objet de l'invention. Aucun procédé d t isolement des neurohormones de l'invention n'est décrit dans la littérature. Selon l'invention, le procédé d'isolement delta neurohormone à partir de l'hypothalamus du gros bétail à cornes consiste à épuiser l'hypothalamus du gros bétail à cornes perdant 20 à 50 mn avec une solution 0,25 à 0,5 % d'acide acétique, à soumettre l'extrait à une centrifugation, à précipiter ensuite les composés à masse moléculaire élevée du moyen de solvants organiques, à lyophiliser le mélange restant de composés à faible masse moléculaire, à les dissoudre ensuite dans l'eau distillée, à séparer ces composés ers filtrant leur solution à travers des tamil moléculaires de 200 à 400 mailles / 2,54 cm, à éluer avec de l'eau distillée c une solution 0,25 à 0,5 % d'acide acétique les deux fractions obtenues de composés à faible masse moléculaire et - les sécher par voie lyophilise pour obtenir, à partir de la dernier fraction le produit désiré, l t extraction avec la solution d'acide acétique étant de préférence effectue à une température de 80 à 85 sC. IL y et intérêt à opérer la centrifugation à 8000 à 10000 g. Er, tant que solvants organiques il est préférable-d'utiliser l'éthanol et le chloroforme. est avantageux d'utiliser en tant que tamis moléculaires le céfadex G-10 ou G-25. - s met en oeuvre le procédé de l'invention de la manire suivante. L'hypothalamus du gros bétail à cornes est épuisé avec une solution 0,25 à 0,5 % d'acide acétique. L'opération peut être réalisée à la température ambiante, mais de préférence en chauffant jusqu'à une température de 80 à 850 C. On opère l'extraction pendant 20 à 50 mn, puis on soumet l'extrait à la centrifugation à 8.000 à 10.000 g. On élimine à partir du mélange obtenu les composés à masse moléculaire élevée en les précipitant au moyen de solvants organiques, par exemple d'méthanol puis de chloroforme. On lyophilise le mélange restant de composés à faible masse moléculaire, puis on le dissout dans de l'eau distillée et on le fait passer à travers un- tamis moléculaire, par exemple le ckfadex G-10 ou G-25, en vue d'isoler deux fractions de composés à faible masse moléculaire, avec élution subséquente avec de l'eau ou une solution 0,25 à 0,5 Va d'acide acétique. Les fractions ainsi obtenues de composés à faible masse moléculaire sont séchées par voie lyophile. On obtient le produit désiré à partir de la dernière fraction. La présente invention sera mieux comprise à la lecture de ltexemple non limitatif suivant de mise en oeuvre du procédé proposé d'isolement de la neurohormone à partir de lthypothalamus du gros bétail à cornes. Exemple. - Dans un homogénéisateur en verre on charge 1 kg d'hypothalamus et 5 litres d'une solution à 0,25 % d'acide acétique et on homogénéise pendant 20 à 50 mn. On procède ensuite à la centrifugation en vue de l'élimination des débris cellulaires, noyaux, etc. Au liquide surnageant on ajoute de l'alcool à 960 dans un rapport de 1:3. On secoue pendant 2 h et on abandonne au repos pendant une nuit au frigorifique. Ensuite on centrifuge, on élimine les composés à masse moléculaire élevée et on ajoute au liquide surnageant du chloroforme dans un rapport de 1 : 5. On malaxe pendant 60 mn, puis on abandonne au repos pendant une nuit au frigorifique. A l'interface entre le chloroforme et l'eau il se forme une pellicule. On décante la couche supérieure, on sèche par voie lyophile et on obtient 1,5 à 2 g d'une poudre de composés à faible masse moléculaire.A travers une colore de 5 x 50 cm contenant du céfadex G-10 ou G-25 on fait passer 7 g de poudre obtenue, dissoute préalablement dans 10 à 20 ml d'eau distillée. La séparation se f it pendant 24 h. La vitesse d'élution est de 100 ml/h. De 50 en 50 mn on recueille 50 ml A partir de 7 g de poudre on obtient 100 à 120 microgrammes de neurohormones "K" et "C". Les endroits de sortie des deux neurohormones dilatant les vaisseaux coronaires sont déterminés par une méthode biologique : on détermine la quantité de sang s'écoulant du sinus veineux du chat par unité de temps après l'introduction intra-veineuse des éluats des fractions. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée au mode de réalisation décrit et représente qui n' a été donné qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre des revendications qui suivent. REVENDICATIONS 1.- Produit médicamenteux dilatant les vaisseaux coronaires, caractérisé en ce qu'il contient en tant que principe actif une neurohormone sécrétée par l'hypothalamus du gros bétail à cornes et se présentant sous forme d'un composé hydrosoluble thermostable à faible masse moléculaire, suscepsibfe de traverser une membrane semi-perméable, possédant des propriétés acides, migrant vers l'anode lors de l'électrophorèse sur papier sous 5000 volts au sein d'une solution tampon de citrate dont le pH est ajusté à 5,8 , ayant un coefficient de distribution Rf égal à 0,15 pour la chromatographie sur papier dans un système de solvants butanol-acide acétique -eau engagés dans un rapport de 4:1::5, conservant son activité biologique à la suite d'une hydrolyse pendant 24 h au sein de HC1 6N à la température de 1050C, conservant son activité biologique à la suite d'un traitement à la pepsine et à la trypsine, sortant le dernier lors d'une filtration à travers un tamis moléculaire de 200 à 400 mailles/2,54 cm; et ne présentant pas de spectre caractéristique. 20- Produit médicamenteux selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient ledit principe actif en association avec un solvant pharmaceutique. 7.- Produit médicamenteux selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'en tant que solvant pharmaceutique on utilise un mélange d'eau physiologique avec de l'eau bidistillée ou de glucose avec de l'eau bidistillée. 4.- Produit médicamenteux selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il contient ledit principe actif en proportion de 0,00012 à 0,00016% en masse. 50- Procédé d'isolement d'une neurohormone conforme à la revendication 1, à partir de l'hypothalamus du gros bétail à cornes, caractérisé en ce qu'on-épuise l'hypothalamus du gros bétail à cornes pendant 20 à 30 mn avec une solution 0,25 à O,5Vo d'acide acétique, on soumet l'extrait à une centrifugation, on précipite ensuite les composés à masse moléculaire élevée au moyen de solvants organiques, on lyophilise le mélange restant r composés à faible masse moléculaire, après quoi on le dissout dans de l'eau distillée, on sépare lesdites composés en filtrant leur solution å ravers des tamis moléculaires de 200 à 400 mailles/ 2,54 cm, n élue les dcx fractions obtenues de composés à faible masse moléculaire avec de l'eau distillée ou avec une siion 0,25 à 0,5,0 d'acide acétique et cn sèche par voie lyophile pour obtenir à partir de la dernière fraction le produit désiré. 6.- Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'extraction au moyen de solution d'acide acétique est opérée à une tCmpérature de 8G à 850C. 70- Procédé selon l'une des revendications 5 et 6, caractérisé en ce que la centrifugation est effectuée à 8000 à 10000 g. 8.- Procédé selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'en tant que solvants organiques on utilise l'éthanol et le chloroforme. 9.- Procédé selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé en ce qu'en tant que tamis moléculaires, on utilise des composés synthétiques connus sous les dénominations commerciales "céfadex G-10" ou "céfadex G-25" et permettant, d'après le principe du tamis moléculaire, de séparer différents composes suivant leur poids moléculaire.