Brevet FR2214888A1 — publié le 19740819

La présente invention concerne un procédé pour déterminer l'aptitude d'agents chimiques à mettre en liberté la bi bilirubine et un procédé pour déterminer les rapports de la bilirubine à la protéine dans une prise de plasma I1 est connu que la bilirubine est fixée solidement par les protéines du plasma. Le rapport de la bilirubine à la protéine dépend de l'affinité entre la bilirubine et les protéines du plasma, du nombre des groupes de liaison dans les molécules de protéine, de la concentration de la bilirubine et de la présence de substances qui empêchent de façon compétitive la fixation de la bilirubine à un groupe de liaison de la protéine.On sait en outre que divers agents chimiques, en particulier des produits médicamenteux, mettent en liberté la bilirubine provenant des protéines du plasma, la bilirubine passant alors dans la circulaticn sanguine. L'aptitude de ces agents chimiques à mettre la bilirubine en liberté est toutefois différente. De grandes quantités de bilirubine dans la circulation sanguine provoquent une maladie appelée hyperbilirubiné- mie, qu'on rencontre principalement chez les enfants prématurés et chez les enfants nés à termes lia libération de la bilirubine peut provoquer une maladie du cerveau appelée ictère nucléaire. Gomme les enfants doivent souvent être traités par des remèdes, il est nécessaire de disposer d'un procédé rapide pour déterminer l'aptitude des agents chimiques individuels à mettre la bilirubine en liberté. se cette façon, on peut choisir l'agent chimique approprié pour le traitenent. I1 est en outre désirable de pouvoir rechercher, pour chaque patient individuel, la possibilité supplémentaire de fixation de la bilirubine sur les protéines du plasma de façon que le traitement par les remèdes soit fait en meilleure connaissance de cause, sans coutil se produise de mise en liberté dam le sang de quantités dangereu- ses de bilirubine0 melon l'invention, on développe des procédés qui tiennent compte des besoins ci-dessus mentionnés. Gour être plus précis, la présente invention concerne un procédé pour déterminer l'aptitude relative d'agents chimi aues à mettre en liberté de la bilirubine li est fixe sur une protéine. Ce procédé est CarRCtnriS en ce cue (a) - on mesure les maxima d'absorptiow de 1 biliru- bine qui est fixée sur une protéine et/o- de la bilirubine dans un échantillon de plasma qui contient la bilirubine et la protéine dans un certain rapport quantitatif connu. (b) - on ajoute différentes quantités connues de chaque agent chimique aux échantillons de plasma décrits en (a) d'importance et de dilution aliquotes (c) - on mesure la diminution ;tu maximum d'absorption de la bilirubine qui est fixée sur la protéine et/ou l'sugmen- tation du maximum d'absorption de la bilirubine libre apyres chacune des additions0 (d) - on trace la courbe de l'inverse de l'augmentation ou de la diminution du maximum d'absorption mesurée en (c) en fonction de l'inverse de la concentration molaire pour chaque agent chimique ou la courbe de l'augmentation ou de la diminution du maximum d'absorption mesurée en (c) en fonction de la concentration molaire pour chaque agent chimique, et (e) - on compare les courbes obtenues pour chaque agent chimique. L'invention concerne encore un procédé pour déterminer les rapports de la bilirubine à la protéine dans un échantillon de plasma, caractérisé en ce que (a') - à chaque échantillon d'une série d'échantillons de plasma d'importances et de dilutions aliquotes et avec différents rapports de la bilirubine à la protéine, on ajoute une quantité déterminée d'un agent de libération qui empêche de façon compétitive la fixation de la bilirubine sur la protéine du plasma (b') - on mesure la diminution du maximum d'absorption de la bilirubine qui est liée à la protéine et/ou la diminution du maximum d'absorption de la bilirubine libre après chacune de ces additions (c') - pour l'établissement d'une échelle de comparaison, on trace la courbe du rapport de l'augmentation ou de la diminution du maximum d'absorption mesurée selon (b') en fonction du rapport de la bilirubine à la protéine pour chaque agent chimique ajouté (d') - à des échantillons de plasma à examiner de même importance et de même dilution que dans l'opération (au), on ajoute la même quantité calculée d'agent de libération que selon (a') et on mesure la diminution correspondante du maximum d'absorption ae la bilirubine liée à la protéine et/ou l'augmentation du maximum d'absorption de la bilirubine libre ; et (e') - on détermine le rapport de la bilirubine à la protéine dans l'échantillon à examiner en comparant l'augmentation ou la diminution du maximum d'absorption mesurée selon Cd') avec l'échelle de comparaison établie selon (c'). Bes procédés selon l'invention sont fondés sur la constatation que la bilirubine qui est liée à une protéine, présente un spectre d'absorption possédant un maximum entre 455 et 460 nm, tandis que pour la bilirubine libre le maximum se trouve entre 420 et 440 nm. Ce déplacement de la longueur d'onde du maximum d'absorption est causé par la mise en liberté de la bilirubine qui est liée à la protéine du plasma. Bien que dans la présente description pour la bilirubine qui est liée à une protéine et pour la bilirubine libre on ait cité exclusivement un maximum d'absorption entre 455 et 460 nm et un maximum d'absorption entre 420 et 440 nm, il y a lieu de remarquer que ces valeurs correspondent à la température ambiante et à une valeur de pH de 7 à 8, en général 7,lu5, -et peuvent varier par des modifications de la température et/ou de la valeur du pH, dans une certaine mesure. Selon l'invention on peut aussi mesurer avec une grande précision de petites variations dans la libération de la bilirubine qui est liée à une protéine, par spectrométrie différentielle. On admet qu'une molécule de protéine du plasma (albumine) possède au maximum deux groupes de liaison pour la bilirubine. De ce fait, les groupes de liaison sont saturés quand le rapport de la bilirubine à l'albumine est voisin de 2,0. Il s'ensuit que l'addition d'un agent de libération qui empêche de façon compétitive la fixation de la bilirubine sur l'albumine a pour résultat, dans le cas où le rapport de la bilirubine à 1albumine est élevé, une libération plus importante que dans le cas où ce rapport est bas. Be nombre des- groupes de liaison libres que possède la protéine - quton exprime souvent comme le rapport de la bilirubine à la protéine - est souvent appelé par le technicien, aptitude supplémentaire de fixation.L'importance de la libération qui est provoquée par un agent de libération, par exemple un médicament, dépend aussi bien de l'aptitude de mise en liberté de l'agent individuel que de l'aptitude supplémentaire de fixation. .de la protéine du plasma de tel ou tel patient. Pour déterminer l'aptitude relative d'un certain agent chimique à mettre la bilirubine en liberté, on procède selon l'invention comme suit : à des é-chantillOns de plasma à teneur en protéine (albumine) connue, on ajoute différentes quantités connues de bilirubine. On mesure ensuite l'absorption des échantillons obtenus qui contiennent la bilirubine et l'albumine dans un rapport molaire connu. La bilirubine qui estliée à la protéine est déterminée par un maximum d'absorption entre 455 et 460 nm, tandis que la bilirubine libre est indi- quée par un maximum d'absorption entre 420 et 440 nm. A ces échantillons on ajoute des quantités connùes d'agents chimiques divers, comme par exemple des médicaments, et on mesure à nouveau l'absorption. La diminution du maximum diabsorption dans le domaine de 455-460 nm ou l'augmentation du maximum d'absorption dans le domaine 420-440 nm dépend directement de la bilirubine mise en liberté.La diminution abso lue du maximum d'absorption (t A) à 455-460 nm ou 1 'augmenta- tion absolue du maximum d'absorption à 420-440 nm peut être traduite en courbe en -fonction de la concentration molaire pour chaque agent chimique et on obtient une droite Toutefois, dans un mode de réalisation préféré, on trace la courbe de l'inverse de l'augmentation ou de la diminution du maximum d'absorption en fonction de l'inverse de la concentration molaire pour chaque agent chimique. Dans ce dernier cas, les droites qui ont les plus petits angles d'inclinaison correspondent aux agents qui ont une grande aptitude de libération et inversement. Par l'emploi de la spectrométrie différentielle, on peut obtenir des résultats plus précis. Dans ce cas, on esgloie un spectromètre à double rayonnement, on compare 1'absorption de l'échantillon initial avant l'addition d'un agent de libération à celle de l'échantillon après addition de ces agents et on mesure la différence des maxima d'absorption dans les domaines d'absorption indiqués. Par comparaison avec le premier procédé décrit, on peut mesurer avec une plus grande précision des modifications qui sont causées par addition de quantités beaucoup moindres des agents de libération, par exemple 100 à 1000 fois moindres. L'un des avantages du procédé selon l'invention est qu'on peut mesurer avec précision la libération, provoquée par un agent de libération, de la bilirubine, dans des échantillons de plasma avec un rapport de la bilirubine à la protéine aussi bien supérieur qu'inférieur à 1,0. Dans les procédés connus, par exemple le procédé de filtration avec Sephadex G25 /J. Am. Chem. Soc. 71, 1230 (1949)7 la libération de la bilirubine ne pouvait être mesurée que pour des rapports de bilirubine à protéine inférieurs à 1,0. En conséquence, le procédé selon l'invention, a l'avantage de pouvoir être employé, sans tenir compte du rapport de la bilirubine à la protéine, directement pour examiner le plasma d'un patient. Le principe utilisé dans le procédé selon l'invention, peut trouver un emploi pour déterminer rapidement l'aptitude supplémentaire de fixation. Dans cette détermination on emploie une- série d'échantillons de plasma avec des rapports connus la bilirubine à la protéine et un agent de libération qui empêche de façon compétitive la fixation de la bilirubine sur la protéine correspondante. Le salicylate de sodium convient particulièrement bien comme agent de libération. De cette façon on peut établir une échelle qui traduit les modifications des maxima d'absorption qui sont occasionnés par les additions de quantités déterminées des agents de libération utilisés comme standard, en fonction du rapport de la bilirubine à la protéine (aptitude supplémentaire de fixation). Les modifications des maxima d'absorption qui sont occasionnées par l'addition dans un échantillon quelconque de plasma de l'agent de libération utilisé comme standard peuvent être ensuite cQtparees avec l'échelle citée plus haut et le rapport de la bilirubine à la protéine (aptitude supplémentaire de fixation) peut être déterminé directement par interpolation L'avantage d'un procédé de ce genre pour déterminer l'aptitude suppli entaire de fixation d'un plasma réside en ce qu'il rend possible la mesure directe de cette aptitude, sans présenter les erreurs et complications inhérentes aux procédés indirects connus. Les exemples qui suivent illustrent l'invention avec les dessins. - EXEMPLE I Détermination de l'aptitude des médicaments à libérer la bilirubine sui est fixée sur l'albumine humaine. La concentration en albumine d'échantillons de plasma humain est déterminée par électrophorèse. On prépare d'autre part une solution de bilirubine à 2 mg/ml dans l'hydroxyde de sodium 0,1N. Cette solution est ajoutée aux échantillons de plasma dans des quantités qui donnent des rapports molaires de la bilirubine à lt-albumine de 0,25, 0,5, 1,0 et 1,5 et les mé- langes obtenus sont dilués à 1::100 avec un tampon au phosphate 0,1 de valeur de pH de 7,45. Trois millilitres d'échantillons de chaque mélange sont amenés dans des cuvettes à mesure (échantillon et standard) et dans un spectrophotomètre d'Aminco-Chance à double rayonnement, on établit une ligne de base. 9 x 10-8 mole d'agent de mise en liberté dans 10 microlitres sont ajoutés à la cuvette qui contient l'échantillon, ce qui amène finalement la concentration en agent de libération à 3-10-5 mole. Dans la cuvette de référence, on ajoute un égal volume d'eau. On mélange à fond, on mesure l'absorption des échantillons à une longueur d'onde entre 350 et 540 nm et on enregistre la modification de l'absorption par rapport à la ligne de base. Le procédé est utilisé avec le salicylate de sodium, le benzoate de sodium et le sel de diéthanolamine du sulfisoxazol comme agent de libération. Pour chaque addition de médicament on me sure la diminution absolue du maximum d'absorption (#A) à 455-460 nm et la valeur inverse de #A en fonction de la valeur inverse de la concentration molaire du médicament. Les courbes d'absorption représentées figure 1 représentent la libération de la bilirubine qui est fixée sur la protéine de plasma humain, par le salicylate de sodium à des rapports de la bilirubine à l'albumine de 1,0 (courbes A) et 2,0 (courbes B). La mesure directe des modifications d'absorption occasionnées par les médicaments est effectuée comme suit. Un échantillon de bilirubine-albumine-plasma ayant un rapport de la bilirubine à l'albumine de 1,0 est dilué à 1:150 avec un tampon au phosphate 0,15M ayant une valeur de pH de 7s45. On ajoute diverses quantités molaires de 9,0 x 10-6 à S x 10-6 d'agent de mise en liberté, chaque fois dans desxvo- lumes aliquotes de 3,0 ml des échantillons dilués. Les mélanges obtenus sont amenés dans des cuvettes à mesure et pour chacun de ces mélanges on enregistre la modification de l'absorption. Les modifications d'absorption, qui sont occasionnées par la libération de la bilirubine qui est fixée sur la protéine du plasma humain, au moyen de salicylate de sodium pour des rapports de la bilirubine à l'albumine de 1,0 et 2,0 sont représentées figure 2. Dans la figure 3 sont comparées les aptitudes du salicylate de sodium, du benzoate de sodium et du sel de diéthanolamine du sulfisoxazol à libérer la bilirubine qui est fixée sur une protéine du plasma humain. Les mesures correspon dantes ont été effectuées par spectrométrie différentielle à un rapport de la bilirubine à l'albumine de 1,0. - EXEMPLE 2 Détermination de la mise en liberté de la bilirubine par des médicaments à des niveaux de plasma usuels en clinique Des échantillons de plasma, qui contiennent de la bilirubine et due l'albumine dans des rapports de 0,25, 1,0 et 1,5 sont dilués, avec du tampon au phosphate 0s15M de valeur de pH de 7,45, à 1:20, 1:30, 1:50, 1:60, 1:80, 1:90 et 1:100. La mesure de la mise en liberté de la bilirubine est effectuée comme dans l'Exemple 1. La quantité de médicaments (sulfisoxasol ou sulfadiméthoxine), qui est ajoutée aux dilutions de plasma, correspond au taux de plasma, usuel en clinique, atteint avec une quantité thérapeutique de ce médicamento Comme illustré dans la figure 5 et la figure 4, on au porté la valeur inverse de la modification du maximum d'absorption obtenue par addition du médicament en fonction de la dilution du plasma. REVE@DICATIONS 1) Procédé pour déterminer llaptitude relative d'agents chimioues à mettre en liberté la bilirubine qui est fixée sur une protéine, caractérisé par (a) - la mesure du maximum d'absorption de la bilirubine qui est fixée sur une protéine et/ou de li bilirubine libre dans un échantillon de plasma qui contient de la bilirubi- ne et de la protéine dans un certain rapport quantitatif connu, (b) - l'addition de diverses quantités connues de cha@ue a@ent chimi@ue aux échantillons de plasma décrits en (a) d'import@nce et de dilution aliquotes, (c) - la mesure de la diminution du maximum d'absorp- tior de 1 bilirubine qui est fixée sur la protine ou l'aug- mentstion du maximum d'absorption de la bilirubine libre après chacune de ces additions, (d) - le tracé d'une courbe de l'inverse de l'augmen- tation ou de la diminution du maximum d'absorption mesuré selon (c) en fonction de l'inverse de la concentration molaire pour chaque a-ent chimique ou la courbe de l'augmentation ou de la diminution au maximum d'absorption mesurée en (c) en fonction de la concentration molaire pour chaque agent chimique, et (e) - la comparaison des courbes obtenués pour chaque a@ent chimique. 2) Procédé selon la reven@ication 1, caractérisé en ce que l'au@mentation ou la diminution des maxima d'absorption est mesur@e par spectrométrie différentielle. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractéris@ en ce que, dans les étapes (a), (b) et (c) la valeur du pH est de 7 à @. 4) Procédé selo@ l'une des reve@dications 1 à @, caractérisé en ce que les a ents chimi@ues sont @es mécicaments. 5) Procédé selo@ la revendication @, caractérisé en ce que le m@@icament est le salicylate @e sodium. 6) Procédé pour déter iner les rap orts de la bili ru@ine la prot@ine dans un échantillon de plasma, caractérisé en ce oue (a') - à chaque échanti@@on d'une série d'échantillons de plasma d'importances et de dilutions con@ues et ayant des rap@orts différents de la bilirubine à la pro@éine, on ajoute une @uantité déterminée d'un agent de libération qui e@pêche de façon compétitive la fixation de la biliru@ine la protéine du plasma ;; (b') - on mesure la diminution du maxi@um d'absorptior de la bilirubine qui est fixée sur la protéine et/ou l'aug- mentation du maximum d'absorption de la bilirubine libre après chacune de ces additions (c') - pour l'établissement d'une échelle de comparaison, on trace la courbe du rapport de l'augmentation ou de la diminution du maximum d'absorption mesurée seion (b') en fonction du rapport de la bilirubine à la protéine pour chaque agent chimique ajouté (d') - à des échantillons de plasma à examiner de meme importance et de même dilution que selon (a') on ajoute la même quantité calculée d'agent de libération que selon (a') et on mesure la diminution correspondante du maximum d'absorption de la bilirubine liée à la protéine et/ou l'augmentation du maximum d'absorption de la bilirubine libre ; et (e') - on détermine le rapport de la bilirubine à la protéine dans l'échantillon à examiner en comparent l'augmenta- tion ou la diminution du maximum dlabsorption mesurée selon (d') avec l'échelle de comparaison établie selon (c)O 7) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'auçmentation ou la diminution des maxima d'absorption est mesure par spectrométrie différentielle. 8) procédé selon l'une des revendications 6 et 7, caractérisé en ce que l'a@ent de libération est un médicament. 9) procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le médicament est le salicylate de sodium0 10) procédé selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que, dans les étapes (a'), (b'); et (c') la valeur du pH est de Y à 8.