Brevet FR2227862A1 — publié le 19741129

La présente invention, à la réalisation de laquelle ont participé Monsieur Pierre JOLLES et Madame MIGLIORE-SAMOUR Danièle, concerne des extraits hydrosolubles de mycobactéries de faible poids moléculaire, leur préparation et leur emploi comme adjuvant immunologique. Ces extraits hydrosolubles, qui sont définis plus complètement ci-après, peuvent être obtenus à partir de résidus bactériens délipidés de mycobactéries préparés selon la méthode de A.Aebi et coll., Bull.Soc.Chim.Biol.,35, 661 ( 1953). Les mycobactéries qui peuvent être utilisees pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention sont celles d'origine humaine ou non-humaine, virulentes ou non-virulentes chez lesquelles l'existence d'une " cire D" a pu être mise en évidence. Parmi les mycobactéries qui peuvent être employees peuvent être citées : Mycobacterium tuberculosis, var. hominis, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium tuberculosis, var. bovis, souches LA et BB, etc. Les résidus bactériens délipidés traités par l'anhydride acétique dans la pyridine fournissent après traitement par l'acool éthylique, reprise par~l'eau de la fraction soluble dans l'alcool, et après purification par chromatographie une substance hydrosoluble qui est désignée par " substance A". La substance A possède les caractéristiques suivantes - aspect : poudre jaune pulvérulente ( après lyophilisation) - composition : a) en acides aminés ( rapport moléculaire) : alanine (3), acide glutamique (2), acide ,K' -diaminopimélique (2), b) en sucres aminés ( rapport moléculaire): N-acétylglucosamine (2), acide N-acetylmuramique (2), c) en sucres réducteurs non aminés: mannose, glucose; pre- sence d'arabinose; absence de galactose, d) absence de lipides. - poids moléculaire ( calculé sur la base de trois résidus alanine par molécule): 4 000 + 200 - constante de sédimentation S20 ( déterminée avec un appareil de Beckman) : 0,7. Les résidus bactériens délipidés traités par la pyridine seule fournissent après traitement par l'alcool éthylique une fraction insoluble dans l'alcool qui, par extraction douce (homogénéisation en milieu aqueux) suivie de relargages au moyen d'un sel tel que le sulfate d'ammonium, de centrifugations, de dialyses et de chromatographies successives, conduit à deux substances hydrosolubles : l'une de poids moléculaire élevé (26 500 + 500) qui est désignée par " substance B",l'autre de faible poids moléculaire qui est désignée par " substance C". La substance C possède les caractéristiques suivantes: - aspect : poudre blanche après lyophilisation, - composition a) en acides aminés ( rapport moléculaire): alanine (3), acide glutamique (2), acide i,w'-diaminopimélique (2), d) en sucres aminés ( rapport moléculaire) :N-acétylgluco- samine (2), acide N-glycolylmuramique (2), c) en sucres réducteurs non aminés: arabinose, galactose, mannose. - poids moléculaire ( calculé sur la base de trois résidus alanine par molécule): 6 000 + 500. Les substances hydrosolubles obtenues selon la présente invention possèdent une activité adjuvante et non arthrogène. Le pouvoir adjuvant est déterminé chez le cobaye, souche Hartley, selon le principe de la méthode de R.G.White et coll., Immunology,7, 158 ( 1964) et les pouvoirs arthrogène et protecteur selon les méthodes décrites par F.Bonhomme, C.R. Acad.Sci., série D, 263, 1 422 ( 1966) et C.R. Acad. Sci., série D,265, 2 115 (1967). Chez le cobaye, les substances hydrosolubles selon l'invention provoquent une augmentation du:taux d'anticorps à des doses supérieures ou égales à 0,1 mg par voie intradermique. Les nouveaux produits selon l'invention sont utilisables en thérapeutique humaine ou vétérinaire pour favoriser la résistance aux infections d'origine virale ou bactérienne. Ils provoquent une augmentation de la formation d'anticorps utiles contre les organismes pathogènes et ils peuvent être adjoints à l'administration de vaccins pour assurer le maximum de réaction d'anticorps. La présente invention concerne également les compositions pharmaceutiques qui contiennent au moins une substance hydrosoluble selon l'invention en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et éventuellement avec d'autres médicaments tels que des antibiotiques, des décongestifs et des vaccins. Dans ces compositions la teneur en produit selon l'invention est généralement supérieure à 0,1%. Ces compositions peuvent être utilisées par voie orale, rectale, parentérale ou en aérosols. En thérapesutique humaine, les doses dépendent de l'effet recherché. Elles peuvent être comprise entre 10 et 50 mg par jour pour un adulte. Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, illus trent la préparation des substances hydrosolubles selon l'invention. Exemple 1 20 g de résidus bactériens obtenus à partir de Mycobacterium tuberculosis var, hominis, souche H37Ra dans 250 cm3 d'un mélange pyridine-anhydride acétique (3 - 2 en volumes) sont agités pendant 36 Heures à 280C. On ajoute ensuite 2500 cm3 d'alcool éthylique puis agite encore pendant une nuit. La partie insoluble est séparée par centrifugation ( 4 000 tours/min.). La couche surnageante est concentrée jusqu'à siccité sous pression réduite. Le résidu est repris par 200 cm3 d'eau. La partie insoluble dans l'eau est séparée par centrifugation ( 4 000 tours/min). La couche surnageante est filtrée sur une colonne de Biogel p 10. On obtient, après lyophilisation, 0,1 g de substance hydrosoluble A. La composition de la substance A est déterminée de la manière suivante : - la composition en aminoacides et en aminosucres est déterminée au moyen d'un autoanalyseur ( type Technicon) après hydrolyse totAle par l'acide chlorhydrique 6 N à 1100C respectivement pendant 18 heures et 6 heures, - la composition en sucres non aminés est déterminée, après hydro lyse par l'acide chlorhydrique 2 N pendant 2 heures à 1100C, qualitativement par chromatographie sur papier g Whatman NO 1; solvant : butanol - pyridine - eau ( 6 - 4 - 3 en volumesiet quantitativement par chromatographie en phase gazeuse apres méthylation et silylation en utilisant un chromatographe Hewlett-Packard, - la recherche des lipides est effectuée par chromatographie sur couche mince de gel de silice après hydrolyse totale et extraction t l'éther. La substance hydrosoluble A obtenue précédemment possède les caractéristiques suivantes - aspect : poudre jaune pulvérulente - composition a) en acides aminés ( rapport moléculaire) = alanine (3), acide glutamique ( 2), acide - , b) en sucres aminés ( rapport moléculaire): N-acétylglucosamine (2), acide N-acétylmuramique (2), c) en sucres réducteurs non aminés: mannose, glucose;présence d'arabinose, absence de galactose, d) absence de lipides. - la teneur en aminoacides est de 31 + 5%, en aminosucres de 25 + 5% et le reste est constitué par les sucres réducteurs non aminés ( 11%) et par les fonctions acétyles fixées par acétylation sur les sucres réducteurs aminés ou non. - poids moléculaire ( calculé sur la base de 3 résidus alanine par molécule): 4 000 + 200 - constante de sédimentation : 0,7 . Exemple 2 20 g de résidus bactériens obtenus partir de Mycobacterium tuberculosis var. hominis, souche Test dans 250 cm3 de pyridine sont agités pendant 36 heures à 280C. On ajoute ensuite 2 500 cm3 d'alcool éthylique puis agite encore pendant une nuit. La partie insoluble, qui est séparée par centrifugation, est ho moiénéisée dans 100 cm3 d'eau au moyen d'un broyeur ( Ultra-Tur rax) Après avoir agité pendant 48 heures à 400C et centrifugé pendant 30 minutes à 40C ( 4 000 tours/min), la couche surnageante est chauffée à 800C. On ajoute alors du sulfate d'ammonium de façon à obtenir une solution à 40% de la saturation. Après 12 heures à 40C et centrifugation pendant 30 minutes, on obtient un précité ( P40). A la couche surnageante on ajoute du sulfate d'ammonium de façon à obtenir une solution à 70 % de la saturation. Après 12 heures à 4"C etcentrifugation pendant 30 minutes dans les mêmes conditions, on obtient un précipité (P70). Les précipités P40,P70 et la derniere couche surnageante obtenue ( S70) sont ensuite dialysés séparément contre de l'eau distillée. Les diverses solutions qui ne dialysent pas sont lyophilisées. On obtient ainsi une fraction P40, une frac-tion P70 et 0,8 g de fraction S70 qui contient la majeure partie des substances biologiquement actives. Cette dernière fraction est purifiée par chromatographie sur DEAE-cellulose équilibrée avec un tampon phosphate 0,05 M à pH 7 en éluant avec un tampon au citrate de sodium 0,05 M à pH3". On obtient ainsi après dialyse et lyophilisation des fractions correspondantes, 0,15 g de substance hydrosoluble B et 0,1 g de substance hydrosoluble C. La composition de la substance C est déterminée selon les méthodes décrites dans l'exemple 1. La substance C obtenue précédemment possède les caractéris tiques suivantes : - aspect : poudre blanche après lyophilisation - composition a) en acides aminés ( rapport moléculaire): alanine (3), acide glutamique (2), acide ,' -diaminopimélique C2), b) en sucres aminés ( rapport moléculaire): N-acetylglucosamine ( 2), acide N-glycolylmuramique (2), c) en sucres réducteurs non aminés: arabinose, galactose, mannose, d) absence de lipides. - la teneur en aminoacides est de 16 + 3 %, en aminosucres de 16 + 3%, le reste est constitue par des sucres réducteurs non aminés, - poids moléculaire ( calculé sur la base de 3 résidus alanine par molécule): 6 000 + 500. REVENDICATIONS 1 - Extrait hydrosoluble de mycobactéries d'origine humaine ou non humaine, virulentes ou non virulentes chez lesquelles l'existence d'une " cire D" peut être mise en évidence, carac térisé en ce que - il contient de l'alanine, de l'acide glutamique et de l'aci de,o-diaminopimélique dans le rapport moléculaire 3-2-2, de la N-acétylglucosamine et de l'acide N-acétylmuramique dans le rapport moléculaire 2-2, du mannose, du glucose et de 1 'arabinose, - son poids moléculaire ( calculé sur la base de 3 résidus alanine par molécule) est 4 000 + 200, - sa constante de sédimentation S est 0,7, - il est doué d'une activité adjuvante immunologique et n'est pas arthrogène. 2 - Extrait hydrosoluble de mycobactéries d'origine humaine ou non humaine, virulentes ou non virulentes chez lesquelles l'existence d'une " cire D" peut être mise en évidence, caractérisé en ce que - il contient de l'alanine, de l'acide glutamique et de l'a cide ,z'-diaminopimelique dans le rapport moléculaire 3-2-2, de la N-acétylglucosamine et de l'acide N-glycolylmuramique dans le rapport moléculaire 2-2, du galactose, du mannose et de l'arabinose, - son poids moléculaire ( calculé sur la base de 3 résidus alanine par molécule) est de 6 000 + 500, - il est doué d'une activité adjuvante immunologique et n'est pas arthrogène. 3 - Procédé de préparation de l'extrait hydrosoluble selon la re vendication 1 caractérise en ce que l'on traite par un mélan ge pyridine-anhydride acétique des résidus bactériens délipi dés de mycobactéries, ajoute de l'alcool éthylique,reprend par l'eau la fraction soluble dans l'acool puis isole et puri fie l'extrait hydrosoluble selon la revendication 1 ainsi obtenu. 4 - Procédé de préparation de l'extrait hydrosoluble selon la revendication 2 caractérisé en ce quel'on traite par la pyridine des résidus bactériens délipidés de mycobactéries, ajoute de l'alcool éthylique, extrait par homogénéisation en milieu aqueux la fraction insoluble dans l'alcool, puis, après relargages, centrifugations, dialyses et chromatogra phies successives, isole, sépare et purifie l'extrait hydeo- soluble selon la revendication 2. 4 - Procedé selon les revendications 3 et 4 caractérisés en ce que les mycobactéries utilisées sont Mycobacterium tuberculo sis, var.hominis, souche H37Ra ou Mycobacterium tuberculosis, var.hominis, souche Test. 6 - Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle con tient au moins un extrait selon les revendications 1 ou 2 en présence de tout diluant ou adjuvant compatible.