Brevet FR2234900A1 — publié le 19750124

Ta présente invention concerne une substance ayant une activité anti-hépatotoxique et anti-phlogistique ainsi qu'un procédé pour l'isolement de bouillons de protéines. Des nombreuses études ont été effectuées dans le but dtisoler des extraits de foie, une fraction ayant une activité anti-hépatotoxique. On a cru attribuer parfois à des fractions phospholipidiques, nucleosidiques, polypeptidiques l'activité des extraits de foie. Au cours des recherches effectuées par la déposante pour l'iso- lement du facteur anti-hepatotoxique du foie présumé, on a obtenu une fraction capable d'inhiber dans le rat et dans les mammifères les lésions hépatiques produites par quelques agents hépatotoxiques. Ces études ont permis de conclure que la dite substance devait être obtenue non seulement par des bouillons de foie, mais également par d'autres bouillons protéiques et elles ont conduit également à la mise au point d'un procédé pour sa préparation. lies activités biologiques de la substance sivant l'invention, consistent principalement dans une capacité élevée d'inhiber la nécrose du tissu hépatique en le protégeant contre différents types d'agents qui le le sent, et de posséder en-même temps une activité antilipémique et antiphogistique. lies dites activités biologiques sont identifiées au moyen des tests (essais) suivants 1) Méthode de l'intoxication par CO14 lit administration de CC14 produit dans le rat des lésions nécrotiques contre-lobules s'accompagnant de l'apparitiondns le torrent circulatoire, de transaminases, telles que GOI, GPP, GLD et une fonctionalité altérée de clearance de la bromo-sulfon-phtaléine (BSF) injectée par voie intraveineuse. L'administration de la substance, suivant les modalités et les temps selon le tableau 1, détermine une inhibition des dommages hépatiques produits par le CU14 sur tous les paramètres examinés. lia dite inhibition se développe par une cinétique d'effets, laquelle est toute différente de celle produite par d'autres substances, et se rapproche de celle-ci de l'induction pharmaco-métabilique. TABLEAU 1 Animaux traités : Rats Wister femelle de 190 + 10 grammes Groupe ler traitement 2ème traitement 3ème traitement après 18 heures après 24 heures et à jeun du 2ème traitement C s.f. - s.C; s.f. - i.p. BSF - i.v. I s.f. - s.c. OC14 - i.p. BSF - i.v. F + I F - s.c. C014 - i.p. BSF - i.v. lies rats ont été sacrifiés après 30 minutes du 3ème traitement. C = rats de contrôle s.f. = solution physiologique I = rats intoxiqués par du CC14 s.c. = sous-cutané F + I = rats intoxiqués par du CC14 et traités avec la médicine en examen i.p. = intra-péritoine i.v. = intraveineuse CC14 = solution en huile CC14 Merck à la concentration du 15% dose administrée 8 ml/kg = 1200 mg / kg i.p. BSF = Bromosulfonphtaléine Merck, phioles de 0,5 g en 10 ml dilué avec s.f. à 10 mg/ml ; dose administrée : 5 ml/kg. F = médicine sous examen. Basée sur le test ci-dessus est l'unité de mesure arbitraire laquelle est définie ici par UNITE ANTIHEFATOTOXIQUE (UAET). . 1 UART est le titre de la quantité de substance laquelle, injectée souscutanée suivant les modalités du test précité, est apte à réduire de 50 % la concentration hématique de la Bromosulfonphtaléine. Te test aiguë de l'intoxication due au CC14 est fondamentalement employé pour le dosage dupuit, suivant la présente invention soit pour les préparations grèges que pour les produits purifiés ; étant donné qu'en tous les cas on obtient une courbe dose réponse, soit alors que la substance est administrée par voie subcutanée ou par d'autres voies d'absorption. 2) Test de l'hyperlipémie par Triton lie dit test est basé sur l'augmentation des Triglycérides Cholestérol et béta-Tipoprotéine dans le sangle des rats traités par voie veineuse par un tensio-actif non ionique d tVpe connu dans le commerce sous le nom enregistré TRITON WR 1339 (Octyl phénopolyéthylèneglycoléther). L'hyperlipémie est bien évidente après 8 heures. a substance administrée suivant les modalités et les temps in dilués au tableau 2 inhibite le dit-type d'hyperlipémie suivant la même cinétique d'effets mentionnés ci-dessus, laquelle rappelle le mécanisme d'induction pharmaco-méthabolique. TABLEAU 2 Animaux traités : Rats Wistar Wistar mâle de 320+ 10 grammes. Groupe 1er traitement 2ème traitement après 18 heures C s.f. - i.p. s.f. - i.v. I s.f. - i.p. T - i.v. F C F - i.p. T - i.v. lies rats ont été sacrifiés après 8 heures à jeun du 2ème traitement. O = rats de contrôle i.p = intrapéritoné I = rats intoxiqués par du Triton i.v. = intraveineux F + I rats intoxiqués par du Triton et traités avec la mé dicine sous examen s.f. solution physiologique T = Triton (octylphénolpolyéthylène gIycolétier) F = le farmacon en examen 3) est d'oedème plantaire de carragénine dans le rat Dans ce test l'injection sous-aponèvrotique dans la patte du rat d'une suspension de lambda-carrageenano détermine un oedéma d'une intensité remarquable. lia substance, selon les modalités et les temps indiqués au tableau 3 produit l'inhibition de l'oedème analogue à celle induite par- des stéroïdes non cortisoniques. TABLEAU 3 Animaux traités : Rats WISTAR mâles de 180 + 10 grammes à jeun depuis 12 heures 1er traitement 2ème traitement après 30' 3ème traitement après 60' 30 ml/kg de H20 s.f. - i.p. Or. - s.p. par voie orale à la dose 5 mlZkg et mesùre après 3 heures du 3ème traitement on effectue la mesure de i'aug- mentation du volume de la patte. Cr = carragénine (lambda carragénane) suspension à 1% en solution physiologique stérile. Appareils : Pletismomètre 3ASILE i.p. = intrapéritonée s.p. = sous-aponévrotique sof. = solution physiologique lia substance suivant la présente invention est caractérisée outre que sur la base de ses activités biologiques, sur la base des caractéristiques chimiques-physiques. L'électrophorèse sur papier WHATMANN 3 MM en tampon alcalin à pH 8,6 indique que le principe actif émigre au pole négatif en se séparant d'une fraction protéique, laquelle reste-ferme au départ. La reconnaissance de la fraction active est effectuée sur les éluées centimètre par centimètre du ruban électrophorétique sur laquelle a été déposée la substance au moyen du test d'intoxication par Cl14. Un exemple de la dite électrophorèse exécuté en tampon borate de pH8,6 avec une différence de potentiel 150 V et qu'on laisse développer pendant 3 heures aveo la déposition à l'endroit du pôle positif de la fraction numérotée 3, est re-éré à la figure 1 annexée. lia figure montre en abscisse les centimètres de longueur du ruban, et en ordonnée la protection en pourcentage sur le test de l'intoxication par Cl14. Normalement la substance est reconnue également au moyen de chromatographie sur colonne. Un exemple du comportement ehromatographique de la substance sur un échangeur ionique constitué par des dextranes croisés avec des groupes fonctionnels diéthylaminoéthiliques connus en commerce sous le nom enregistré DEAE SEPHADEX A 25 comte support, est montré à la figure 2. L'éluition a été effectuée par des solutions ayant une molarité croissante de NaCl ; la substance biologiquement active est individuée dans l'éluate au moyen de dosage sur le test de l'intoxication par du Cl14. Les fractions actives sont comprises dans l'intervalle de molarité entre 0,35 et 0,60 et dans les fractions comprises entre 275 et 350 ml d'éluant. Le graphique à la figure 2 montre un exemple de la dite chromatographie effectuée avec un éluant tampon phosphate pH 7,2 en NaCl ayant une molarité comprise entre O et 1, avec la déposition de 100 ml de substance. Tes absisses reportent respectivement dans l' échelle supérieure le nombre des volumes''singles", chacun de 5 ml, recueillis et dans ltechelle inférieure les ml d'éluant recueilli. lies ordonnées reportent respectivement dans l'échelle plus intérieure la protection en pourcentage sur le texte de l'intoxication par COl4 et celle plus extérieure la molarité en NaCl, laquelle est exprimée sur le graphique par les petits triangles. nti-hépatqtqx,clu,e et anti-hétatotoxiqet I1 est possible de surveiller la superposition des aetivitesSan- ti-phlogistiques en dosant en comparaison les fractions diverses de rubans électrophorétiques sur les tests d'intoxication par CO14 et de ltoedème de carragénine ; un exemple du dit comportement est montré à la figure 3. La figure 3 montre les dosages d'une électrophorèse en continu sur du papier Whatran 3 MM avec la déposition sur le pôle positif. lie dosage sur le test du CC14 est repéré sur le graphique par la ligne continue, tandis que le dosage concernant le test de carragénine est reporté en pointillés. Sur la figure les abcisses reportent les centimètres du ruban électrophorétique duquel est éluée la substance servant pour le dosage ; les ordonnées reportent les valeurs de la protection en pour centrage sur les 2 tests. lia présente invention en outre a pour objet un procédé pour obtenir la dite substance, comprenant les phases suivantes - on broie et on homogénéise en eau de la viande animale - on porte en ébullition et on fait bouillir pendant 1/2 heures à 3 heures et demie et on filtre pour séparer les parties solides - on porte le liquide limpide ainsi obtenu au pH compris entre 6 et 8 - on stérilise et on fait refroidir à 20-37 C en obtenant un bouillon stérile prêt pour la fermentation - on prépare séparément un inoculum de cultures de micro-organismes de souche bactérienne "pseudomonas" et on laisse couver pendant 2 à 6 jours à 30-37 C sous agitation en aérobiose -on introduit 1' inoculum ainsi préparé dans le rapport I : 50 - 1 - 100 dans un fermentomètre contenant le bouillon stérile précédemment préparé - on laisse fermenter à 20-37 C pendant une période de 2 à 6 jours en aérobiose sous agitation - on introduit à la fin de la fermentation un alcali volatilisable jusqu'à pH9-12 - on agit et on filtre - le bouillon stérile alcalin est concentré selon le rapport 4 : 1 à 12 : 1 et on fait précipiter avec du solvant organique polaire en recueillant la précipitation - on fait dissoudre à nouveau la précipitation sensiblement de. mê- me volume de H20 du produit concentré - on porte à pH4-5 avec de l'acide acétique et on fait précipiter avec de l'alcool à nombre d'atomes de C inférieur à 4 - la précipitation est lavée à plusieurs reprises avec du métha et éther, en obtenant la substance grége (activité 0,5 UAS?/mg). Pour obtenir la substance purifiée ayant le titre 4-8 UAElmg, le produit grège est soumis aux traitements suivants - on reprend la substance grège en eau rendue alcaline à pH9-II,5 au moyen d'alcali volatile -on filtre jusqu'à obtenir le liquide limpide et on porte le li- quide ainsi obtenu à pH 6-8 avec de l'acide acétique - on traite par une solution d'acide trichloroacétique pour en lever/éloigner les protéines et on filtre - on précipite avec un solvant organique polaire - on centrifuge en obtenant une précipitation blanche - on fait redissoudre la dite précipitation en eau à pH 6,5 - 8 et on ajoute de l'acétate de zinc et on centrifuge - la précipitation est lavée avec du méthanol et éther jusqu'à essuyage On obtient ainsi une substance purifiée ayant le titre 4-8 UAEX/mg. Pour rendre plus claire la coulpréhension de la conduite du pro cédé, on en décrit ci-après deux exemples simplement à titre li mitatif. EXEMPLE I 25 kg de foie bouse franche ou gelée sont broyés et homogénéisés dans I50 Litres de H20. On porte à l'ébullition et on fait bouillir pendant 60 minutes; on centrifuge -à 3000 t.p.m et on filtre en obtenant d'une part une couche de déchets et d'autre part un filtrate limpide jaune ambre, lequel est porté à pH 7. Ensuite on stérilise à l'atmo- sphère pendant 30' et on fait refroidir à 25 C en obtenant un bouillon stérile prêt pour la fermentation. Une partie de la souche de manutention de pseudomonas syringae conservée sur du terrain solide est portée sterilenent dans une petite partie de bouillon et on la laisse couver pendant 5 jours à 25 C sous agitation en aérobiose. L'inoculum ainsi préparé est introduit selon un rapport I : 60 dans lefermentateur contenant le bouillon stérile précédemment préparé. On laisse fermenter pendant 5 jours en aérobiase et sous agi tation atvec l'addition d'un produit anti-mousse au silicone. Une fois terminée la fermentation, on porte à pH : IO avec de l'ammoniac, on agite et on filtre stérilement. le filtré est concentré selon le rapport IO : I et précipité avec IO volumes d'acétone. On recueille la précipitation et on fait dissoudre encore dans l'eau jusqu'à obtention d'un volume égal à celui au bouillon concentré ; on porte à pH avec de l'acide acétique et on précipite avec 3 volumes de méthanol. La précipitation est lavee à plusieurs reprises avec du méthanol et de éther en obtenant de 50 à I50 gr d'un produit ayant une a ctivité 0, 5 UAET/mg;. On reprend le produit en eau portée à pE II au moyen d'ammoniac, on filtre åusqu'å l'obtention d'un liquide limpide, on porte à pH 7 avec de l'acide acétique. La solution est traitée avec I volume d'une solution à ?0 % acide trichloroacétique et on éloigne la précipitation, tandis que le liquide est traité avec 3 volumes de méthanol pour donner une précipitation exempte d'acide trichleroacétique. On centrifu- ge et on obtient une précipitation blanche (environ 50 0 de matière du départ ayant une activité 2 UALT/mg). On dissout la précipitation dans 50 volumes d'eau à pH 7,5 et on ajoute de l'acétate de zinc jusqu'à la concentration de 3 % et ensuite on centrifuge. La précipitation ainsi obtenue est lavée et précipitée à nouveau avec du solvant méthanol jusqu'à l'essuyage pour donner un produit à environ 5 UAET/mg. EXEMPLE 2 25 kg de viande sont broyés, honogénéísés dans I50 1 d'eau, portés à ébullition pendant 3 heures et refroidis à 5 C. On élimine ensuite la partie grasse par flottaison, on centrifuge le bouillon dégraissé, on porte à pE 6,5 et on stérilise en autoclave pendant 30' à l'atmosphère ; on fait refroidir ensuite à 300C en obtenant ainsi un bouillon stérile. On prépare séparément un ihoculum de pseudomonas fragi, en prélevant de la souche de maintenance le micro-organisme et en portant celle-ci dans une petite quantité de bouillon enlevée du bouillon stérile. Ongait couver le dit inoculum pendant 3 jours à 280G sous agitation et aérobiase. On introduit le dit inoculum dans un rapport I : 70 dans le bouillon stérile et on laisse fermenter pendant 3 jours a 2800 en aérobiase et sous agitation. On porte à pH II avec de l'ammoniac, on agite et on liltre. On concentre le filtrate 5 : I et on fait précipiter avec 7 volumes de méthanol et on xentriMuge. On fait dissoudre à nouveau la précipitation en eau pour redoin- dre le même volume du bouillon concentré. On porte à-pH 4,8 avec de l'acide acétique et on précipite avec de méthanol. On lave la précipitation avec du méthanol et de 1' éther et on reprend avec de liteau rendue alcaline avec de l'ammo- niac à pH 9,5. On filtre et on porte le pH à 7,5 avec de l'acide acétique. On traite la solution avec de l'acide trichloroacétique et on filtre. le filtrage est précipité avec 3 volumes d'éthanol et centrifugé. On fait dissoudre à nouveau la précipitation en eau à pH 7, on traite avec de l'acétate de zinc jusqu'à concentration de 3% et on centrifuge. On lave la précipitation ainsi obtenue avec du méthanol et de l'éther éthilique jusqu'à 11 essuyage. REVENDICATIONS - I - Substance caractérisée en ce qu'elle possède simultanément de ltactivité anti-hépatotoxique, anti-phlogistique et antilipémique, d'émigrer par électrophorèse en tampon alcalin au p81e négatif, d'être mise en élution sur support échangeur ionique constitué de dextrames croisés ayant des groupes fonctionnels dié thylaminoacétyliques dans les fractions comprises entre les molarités 0,35 et 0,60 et comprises entre 275 et 350 ml d'éluant. - 2 - Procédé pour la préparation de la substance suivant la revendication I, caractérisé en ce qu'il comprend les phases suivantes X - on broie et homogénéise de la viande animale en eau - on porte à l'ébullition et on la maintient pendant 30 à 240 minutes - on filtre en laissant à part les parties solides - on porte le filtrat à pE compris entre 6 et 8 - on stérilise et on fait refroidir à 20-3700 - on prépare séparément un inoculum de culture de micro-organismes de la souche pseudomonas et on laisse couver pendant 2 à 6 jours de 20 à 370 C, sous agitation et en aérobiase - on introduit le dit inoculum dans le rapport de I : 50 - I : 100 dans le bouillon-stérile précédemment préparé - on laisse fermenter à 2O370C pendant 2 à 6 jours en aérobiase sous agitation - On introduit à la fin de la fermentation un alcali volatilisable portant le pH entre 9 et I2 - on agite et on filtre en séparant les parties solides - on concentre le bouillon dans un rapport de 4 : I - I2 :I et on precipite avec un solvant organique polaire et on recueille la précipitation - on fait dissoudre à nouveau la précipitation en eneau jusqu'à re- moindre sensiblement le même volume du bouillon concentré - on porte à pE compris entre 4 et 5 avec de l'acide acétique et on précipite avec un alcool ayant un nombre itatomes de carbo nium inférieur à 4 - la précipitation est lavée à plusieurs reprises avec du nétha- nol et de ltéther pour donner la substance grège. - 3 - Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la dite substance grège est soumisse aux +raitezents suivants - on fait dissoudre la substance grège en eau portée à pK 9-II,5 au moyen d'alcali volatilisable - on filtre jusqu obtenir le liquide limpide et on porte le liquide à pH compris entre 6 et 8 avec de l'acide acétique - on traite avec une solution d'acide trichloroacétique jusqu'à la coagulation de la fraction protéique et on éloigne la précipitation par filtration - on précipite avec un solvant organique polaire et on sépare la la précipitation - à la précipitation ainsi obtenue dissoute en eau à pH 6,5-8, on ajoute de l'acétate de zinc et on ntrîfuge - la précipitation est lavée avec du méthanol et de 11 éther éthylique jusqu'à l'essuyage - 4 - Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que l'acétate de zinc est en concentration d'environ 3 % - 5 - Procédé suivant les revendications 2 à 4, caractérisé en ce que l'alcali volatilisable est de lsammoniac - 6 - Procédé suivant les revendica+lons 2 à 5, caractérisé en ce que la viande est constituée de foie de mammifères - 7 - Procédé suivant les revendications 2 à 6, caractérisé en ce que le micro-organisme de la souche des pseudomonas est choisi parmi les types syringae, fluorescens, frai.