Brevet FR2223000A1 — publié le 19741025

La présente invention concerne l'obtention de l'enzyme suc cinylthiokinase. Elle concerne plus particulièrement un procédé pour l'obtention et la purification de succinylthiokinase, ainsi que l'application de cette dernière au traitement préventif ou curatif de perturbations du métabolisme musculaire et en particulier myocardique. Cette enzyme est connue comme ayant la propriété de transformer le sEccinyl coenzyme A selon l'équation de réaction suivante, en catalysant l'équilibre succinyl coenzyme A + diphosphonucléotide + phosphate succinate + triphosphonucléotide + coenzyme A réduit. Dans le cycle métabolique, dit cycle tricarboxylique, cette réaction se situe en intermédiaire de passage du cétoglutarate au fumarate. On a déjà décrit des procédés pour l'extraction et le dosage de l'enzyme succinylthiokinase à partir de diverses matières premières. C'est ainsi que S. Kaufman a décrit dans un article intitulé "a-Eetoglutaric Dehydrogenase System and Phosphorylating Enzyme from Heart Muscle", J. Biol. Chem. 203,869 (1953) un procédé selon lequel on traite des coeurs de porcs prélevés inmédiatement après l'abattage des animaux et conservés dans la glace.On prépare la matière première et on la hache, puis on la soumet à un premier fractionnement au sulfate d'ammonium, comprenant en outre une dialyse précédée elle-même d'une addition d'iodoacétate, et ensuite à un second fractionnement au sulfate d'ammonium, suivi de préférence d'un fractionnement à l'éthanol, d'une adsorption sur gel de phosphate de calcium et d'une élution fractionnée. Chacune de ces étapes opératoires est en réalité complexe et requiert un nombre important d'opérations, toutes effectuées au voisinage de OOC et m8me pour certaines d'entre elles à des températures inférieures. De plus, l'étape d'adsorption doit 8tre répétée deux ou méme trois fois. Dans un article intitulé "Purification and Properties of Hog Kidney Succinic rChiokinase" et publié dans "T he Journal of Biological Chemistr9', vol. 235, N 9, Septembre 1960, R. Mazumder a décrit 1' extraction de succinylthiokinase à partir de rein de porc, par fractionnement au sulfate d'ammonium d'une poudre de matière première préparée à l'acétone, à - 5 C et séchée à température ambiante,. et ensuite fractionnement à 1 'méthanol à une tem pérature décroissant jusqu'à - 160 C, puis adsorption sur gel d'alumine et élution subséquente, fractionnement à l'acétone et nouveau fractionnement au sulfate d' ammonium. La fraction finale obtenue devait entre entreposée à -200C, et il est précisé dans cet article que des congélations et décongélations répétées au cours du procédé ou ultérieurement faisaient perdre à l'enzyme jusqu'à la moitié de son activité. L'auteur de cet article a également indiqué que l'activité spécifique de la fraction finale obtenue dépendait de celle de l'extrait pulvérulent dans l'avec tone, très variable dans la pratique et ce pour des raisons inconnues.Il s'agit donc là d'un procédé peu reproductible et dont il faut noter qu'il ne saurait s'appliquer aisément industriellement sur d'importantes quantités de matière première, puisque plusieurs de ses étapes opératoires mettent en oeuvre de l'acétone utilisée à de très basses températures. On a décrit également un procédé pour la purification de succinylthiokinase à partir de coeur de porc (article de Sungman Cha intitulé "Succinic Thiokinase", dans The Journal of Biological Chemistry, vol. 239, N0 6, Juin 1964), consistant à traiter des coeurs de porc entreposés dans de la glace, quelques heures seulement après l'abattage des animaux. Il est précisé par l'au- teur de cet article qu'une série d'études a révélé que enzyme recherchée peut être extraite en plus grandes quantités du coeur frais que du coeur congelé, la congélation et la décongélation provoquant, selon Sungman Cha, une considérable perte d'activité. A aucun moment donc cet auteur n' a opéré à une température inférieure à OOC. Ires coeurs de porcs frais, préparés et hachés, sont lavés à liteau distillée et soumis à diverses opérations et la préparation obtenue est ensuite traitée à l'acide acétique 0,1 N en vue de l'abaissement de son pH ; on adsorbe ensuite la succy- nylthiokinase sur un gel de phosphate de calcium et on soumet à un fractionnement au sulfate d'ammonium.On dialyse la fraction recueillie contre un tampon phosphate de potassium 0,05 i et on porte brusquement la te4mpérature de la solution à 520C par immersion de cette dernière dans un bain d'eau à 90 C. Après 9 minutes à 520 C, on ajoute à la solution enzymatique un volume égal d'une solution à 100* de sulfate d'ammonium refroidie dans de la glace. Autre autres opérations ultérieures, on réalise encore ensuite un second fractionnement au sulfate d'ammonium et une chromatographie sur colonne de DBAB-Celluloser ainsi qu'une chromatogra phie sur colonne de carboxyméthyl cellulose. Ce m8me auteur a décrit dans The Journal of Biological Chemistry 242, 2577 (1967) un procédé pour purifier l'enzyme succinylthiokinase à partir de coeur de porc frais, non congelé. Ce procédé est un procédé en deux stades, dont le premier comprend la préparation de l'extrait brut de coeur de porc frais, une chromatographie sur colonne de gel de phosphate de calcium et de cellulose, un fractionnement au sulfate-d'ammonium, une chromatographie sur colonne de DEAE-cellulose (diéthylaminoéthyl cellulose sous forme acétate) et une seconde chromatographie sur colonne de gel de phosphate de calcium et de cellulose ; le second stade opératoire comprend une filtration sur gel de Sepha dex G-100, une seconde chromatographie sur colonne de DEAE-cel- lulose, une troisième chromatographie sur colonne de gel de phosphate de calcium et de cellulose, et une seconde filtration sur gel de Sephadex G-100. Sungman Cha remarque en outre dans cet article que l'enzyme ainsi préparée perdait jusqu'à 5OYD de son activité à chaque congélation ou chaque décongélation et était instable en milieu tampon dilué. D'autre part, dans un article intitulé "Succinyl Coenzyme A Synthetase from Escherichia Coli" publié-dans J. Biol. Chem. U.S.A. 1967 tome 242 n 19 p. 4287, w. Bridger, R.P. Ramaley et P.D. Boyer ont décrit un procédé pour l'extraction de Succinyl Coenzyme A synthetase, qui est une autre appellation de la succinylthiokinase, à partir de cellules d'Escherichia Coli.Ce procédé comprend le traitement de cultures de cellules bactériennes d'Escherichia Coli, obtenues en fermenteur, par une extraction sonique, un fractionnement à l'acétone à -209C, un fractionnement au sulfate d'ammonium, avec élimination subséquente du sulfate d'ammonium par passage sur colonne de gel de Sephadex Gc50 et traitement thermique à 520C, puis refroidissement-brusque à O C environ, et ensuite une chromatographie sur diéthylamincéthyl Sephadex (DEAE-ss), et une chromatographie sur gel de phosphate de calcium. Selon un autre procédé décrit par J. Gibson, C.D0 Upper et I.C. Gunsalus dans The Journal of Biological Chemistry, vol. 242, N 10, pp.2474-2477, 1967, on obtient de la succinyl Coenzyme A synthetase ou succinylthiokinase à partir de cellules d'Escherichia coli en soumettant un extrait brut de cellules, préparé à 15-200C et ramené ensuite brutalement à OOC, à un fractionnement dans l'acétone à une température de - 200 C, puis (à une tempéra- ture légèrement supérieure à OOC) à une précipitation au sulfate d'ammonium, à un traitement thermique à 520C suivi d'un brusque refroidissement à OOC et à une chromatographie sur diéthylaminoéthyl Sephadex. Outre ces conditions opératoires particulières pour son extraction, il faut signaler que l'enzyme extraite d'Escherichia Coli exerce une action sur les nucléosides adényliques tandis qutil s'est avéré que c'est vis-à-vis des nucléosides guanyliques qu'est efficace l'enzyme succinylthiokinase extraite de coeurs de mammifères selon l'invention. Dans un article de la revue Soviétique DOKI,. AKAD. NAUK. SSSR, tome 191, N0 6, pp.1413-16 (1970), Mechkova et Matweeba ont décrit un procédé pour l'extraction et la purification de succinyl Coenzyme A synthetase à partir du muscle pectoral de pigeon, sensiblement suivant la méthode de S. Kaufman décrite plus haut, avec cependant au 2ème stade de la purification de la matière première une acidification à pH 5,4 à l'aide d'acide acétique 0,1 N. Aucun de ces procédés de l'art antérieur ne peut cependant autre mis en oeuvre à l'échelle industrielle et selon des modes opératoires applicables industriellement sur des tonnages importants de matière première, qui seuls permettraient de réaliser une production notable de l'enzyme purifiée recherché dans des conditions économiques convenables et ouvrant la voie à une utilisation effective de la succinylthiokinase pour de nombreuses applications. Or, on a maintenant trouvé un procédé pour l'obtention et la purification de succinylthiokinase à partir de coeurs de mammifères, notamment de coeur de porc, frais ou congelé ou conservé à + 4 C, procédé selon lequel (1) on émince les coeurs et on les hache, (2) on prépare une solution aqueuse saline d'extraction, le pE de cette solution étant ajusté à 7,4 environ et son volume en litres étant au moins égal à 3 fois le poids en kilogrammes de la matière première hachée et on sépare cette solution en deux fractions sensiblement égales (a) et (b). (3) on ajoute à la matière première hachée la fraction (a) portée à une température ajpropriée pour que le mélange obtenu soit à une température voisine de + 40C, et on agite vigoureusesent et l'on maintient la température au-dessous de + 15 C, (4) on ajoute la fraction (b) dont la température a au préalable été ajustée à environ + 4-OC, on brasse vigoureusement et on laisse reposer, (5) on centrifuge et on élimine le gâteau formé, (6) on réalise une précipitation fractionnée en 3 couches du liquide de centrifugation au moyen de sels neutres, (7) on réunit la couche supérieure constituée principalement de mousse et la couche inférieure formée d'un précipité, on centrifuge et on élimine le liquide obtenu, (8) on dissout le précipitédans une solution saline préparée à partir d'eau distillée à + 4-OC et dont on ajuste le pH à-7,4 environ, le rapport du volume en litres de solution finale au poids en kilogrammes du précipité à dissoudre étant au moins égal à trois, (9) on dialyse la solution obtenue tout en maintenant son pH à 7,4 environ, on centrifuge et on élimine le gâteau formé, (10-15) on réalise une succession de six opérations consistant en des précipitations fractionnées (10), (12) et (14) au moyen de sels neutres, à des concentrations différentes selon le stade de ltopération, et en des centrifugations (11), (13) et (15), respectivement à la suite des 3 précipitations susdites, pour finalement isoler un précipité, (16) on dissout ce précipité dans environ 10 fois son poids d'une solution aqueuse de tampon phosphate 0,033 M depH 7,4 environ, (17) on dialyse contre le précédent tampon phosphate la solution obtenue, et (18) on clarifie par centrifugation ou filtration la solution dialysée. On effectue avantageusement la suite des opérations (10) à (15) ci-dessus de la manière suivante (10) on réalise une précipitation fractionnée du liquide de centrifugation au moyen de sels neutres, (11) on centrifuge et on élimine le précipité, (12) on réalise une précipitation fractionnée du liquide recueilli, (13) on centrifuge et on élimine le précipité, (14) on réalise une précipitation fractionnée du liquide recueilli, (15) on centrifuge et on élimine le surnageant liquide. Dans le procédé selon l'invention, l'ensemble des étapes (4) à (18) inclusivement est mis en oeuvre à une température de + 40C environ. Si la matière première utilisée est du coeur congelé de mammifères, ce dernier est émincé et haché à une température de - 200C environ, dès sa sortie des chambres de stockage. Dans le cas où il s'agit en revanche de coeurs de mammifères frais ou conservés à + 40C environ, ces coeurs sont émincés et hachés directement. Lorsque l'on traite une grosse quantité de coeur, il est cependant préférable de laisser la température du coeur haché remonter vers OOC avant de passer aux étapes suivantes du procédé. I1 faut en outre noter que, dans le cas où la matière pre- mière est du coeur de mammifères, cette matière doit être au préalable, et cela de préférence avant meme sa mise en conservation, débarrassée de la graisse et des vaisseaux qui l'entourent et chaque coeur est fendu longitudinalement afin qu'en soient extraits les caillots sanguins. La solution aqueuse saline utilisée pour l'extraction dans les étapes (3) et (4) ci-dessus est de préférence une solution aqueuse de chlorure de potassium 0,20 M, de phosphate monopotassique 0,005 M et de phosphate dipotassique 0,05 M et le pH de ladite solution est ajusté à 7,4. Toute autre solution saline d'extraction appropriée connue de l'homme de l'art peut également convenir. n faut noter que l'eau du robinet convient parfaitement pour la préparation de cette solution saline, et qu'en tous cas il n'est pas nécessaire d'utiliser de l'eaudistillée. La quantité de solution saline requise pour l'extraction est telle que le rapport de son volume en litres au poids en kilogrammes de la matière préparée à traiter avec ladite solution soit d'au moins 3 environ. Cette quantité est variable dans la pratique et dépendue la matière première, mais surtout du matériel et des conditions opératoires mis en oeuvre dans les étapes suivantes du procédé. En ce qui concerne l'étape (4) du procédé selon lwinven- tion, il est avantageux que la matière à laquelle on incorpore la fraction (a) de solution saline ne soit pas à trop basse tem pérature, afin d'éviter une éventuelle prise en masse préjudiciable à la bonne extraction. Après avoir ajouté également la fraction (b) qu'on avait au préalable portée à la température de + 40C, on brasse vigoureusement pour réaliser un bon mélange et on laisse reposer longuement à + 40C. On homogénéise alors à nouveau l'ensemble, au moyen d'une agitation douce, et on centrifuge ensuite dans une essoreuse refrigérée capable de-soumettre les particules en suspension à une accélération d'environ 2000 g. On obtient alors un liquide trouble fortement coloré et un gåteau, ce dernier étant essentiellement composé de particules fibreuses et de lipides. On élimine ce gâteau et on réalise une précipitation fractionnée au moyen de sels neutres dudit liquide trouble fortement coloré. Cette précipitation fractionnée qui constitue l'étape (6) du procédé selon l'invention est réalisée au moyen de sels neutres en solution aqueuse, et de préférence au moyen de sulfate d'ammonium ajouté en une quantité telle que 11 extrait soit ainsi amené à une concentration finale de 50% environ de saturation à + 400. On peut toutefois remplacer le sulfate d'ammonium par tout autre sel approprié, tel que par exemple du chlorure de potassium, du chlorure de magnésium, du sulfate de magnésium ou autre, et la quantité dudit autre sel est alors une quantité équivalente et appropriée pour qu'elle amène l'extrait àla concentration finale requise. Pour réaliser dans la pratique l'addition de sels neutres, il y a lieu de mesurer le volume de la solution extractive issue de l'étape (5) du procédé selon l'invention ; on ajoute sous agitation lente une quantité appropriée du sel neutre choisi, on maintient l'agitation jusqu a dissolution complète de ce sel, en prenant soin d'éviter tout brassage d'air, ainsi que la formation de mousse, et on laisse ensuite reposer. Pour que la précipitation fractionnée s'effectue alors dans de bonnes conditions, il est avantageux que le diamètre de la cuve où elle s'opère soit inférieur à environ 3 fois sa hauteur, et m8me de préférence plus faible encore. I1 se produit dans la cuve une séparation en 3 couches, la couche supérieure étant pour sa plus grande part constituée de mousse ; la couche inférieure est constituée par un précipité volumineux et la couche médiane, que l'on rejette, de préférence en la siphonnant, est un liquide limpide. On réunit ensuite les couches inférieure et supérieure, a vantageusement après les avoir débarrassées de la couche liquide médiane, et on centrifuge sous une accélération de '0G à 5000g de préférence. Selon un mode de nise en oeuvre particulièrenent avanta gueux du procédé selon l'invention, on retire le liquide surnageant tout en poursuivant la centrifugation, c'est-à-dire sous accélération, évitant ainsi une éventuelle remise en suspension du précipité dès ltarrSt de la centrifugation. Dans l'étape (8) du procédé selon l'invention, on dissout à nouveau ledit précipité dans une solution aqueuse saline à + 4 C. Cette solution saline peut titre par exemple une solution aqueuse de phosphate dipotassique 0,033 k et de phosphate monopotassique 0,033 M et on en ajuste le pH à 7,4 environ par tout moyen connu approprié. Dans cette étape du procédé, la quantité de ladite solution saline utilisée est telle que le rapport entre le volume en litres de solution finale obtenue après redissolution du précipité de étape (7) dans ladite solution saline et le poids en kilogrammes du précipité à dissoudre soit d'au moins 7. On soumet ensuite la solution obtenue à une dialyse, en vue d'en retirer le sulfate d'ammonium ou autre sel neutre ajouté dans l'étape (6) restant, selon tout mode opératoire approprié connu de 1'homme de 1' art, contre une solution saline maintenue à + 40C et ayant la même composition que celle utilisée à l'étape (8), et l'on maintient le pH de la solution soumise à la dialyse à 7,4. En variante, on peut utiliser en lieu et place de la dialyse décrite ci-dessus tout autre procédé connu permettant d'élimine ner le sulfate d'ammonium de la solution de étape (8), tout en conservant à cette solution un pH de 7,4, ainsi que sa concentration protéique initiale. On centrifuge ensuite la solution dialysée, de préférence en la soumettant à une accélération de 10 000 g, et on conserve la solution clarifiée. L'étape (10) consiste en une nouvelle précipitation fractionnée au moyen de sels neutres en solution aqueuse, et de préférence au moyen de sulfate d'ammonium ajouté en une quantité telle que l'extrait soit ainsi amené à une concentration finale e t environ de saturation à + 4 C. On peut cependant renplacer le sulfate d'ammonium par tout autre sel approprié, tel que par exemple du chlorure de potassium, du chlorure de magnésium, du sulfate de magnésium ou autre, et la quantité dudit autre sel est alors une quantité équivalente et appropriée pour qu'elle amène l'extrait à la concentration finale requise. Pour réaliser pratiquement cette addition de sels neutres, on opère comme indiqué plus haut en référence à l'étape (6). Après un certain temps de repos à + 4oC, on centrifuge le mélange recueilli (étape 11), de préférence en le souméttant à une accélération de 10 000 g et on élimine le précipité formé. L'étape (12) consiste à réaliser, sur la solution recueillie, une nouvelle précipitation fractionnée semblable à celle de l'étape (10), à cette différence près que l'on ajoute le sulfate d'ammonium, ou un sel équivalent, en une quantité telle que 11 ex- con trait soit ainsi amené à une/centration finale de 43fi environ de saturation à + 4oC. On centrifuge ensuite le mélange recueilli, de préférence sous une accélération d'environ 10 000 g (étape 13), et on élimine le précipité formé. Sur la solution recueillie, on réalise une précipitation fractionnée aux sels neutres (étape 14), du type de celles décrites plus haut en référence aux étapes (10) et (12), avec cette différence que l'on ajoute le sulfate d'ammonium, ou un sel équivalent, en une quantité telle que l'extrait soit ainsi amené à une concentration finale de ?0% environ de saturation à + 4 C. Après un certain temps de contact et de repos, à + 4 C, on centrifuge (étape 15), de préférence sous une accélération de l00OOgenviron, et on élimine le surnageant limpide. On redissout ensuite le précipité (étape 16) dans 10 fois environ son poids d'une solution aqueuse de tampon phosphate 0,033M de pH 7,4 environ. Une fois effectuée cette mise en solution, on dialyse cette dernière (étape 17),en vue de retirer le sulfate d'ammonium ou autre sel neutre ajouté dans les étapes (10), (12), et (14) restant, selon tout mode opératoire approprié connu de l'homme de l'art, contre une solution saline maintenue à + 40C et ayant la même composition que celle utilisée à 11 étape (16). Durant cette opération, on prend soin de maintenir le pH de la solution enzy matique à environ 7,4. Enfin, on recueille la solution dialysée et on la clarifie au moyen d'une simple filtration, ou mieux d'une centrifugation. La solution d'enzyme succinylthiokinase obtenue peut être conservée soit à l'état congelé, soit à l'état lyophilisé. En variante, et en particulier Si l'on désire une enzyme d'une plus grande pureté, ladite solution de succinylthiokinase peut être soumise, bien que cela ne soit pas indispensable, à d'autres traitements de purification connus de 11homme de l'art, tels que par exemple une adsorption sur gel d'agarose ou sur gel de phosphate de calcium ou une chromatographie de partage. Ire procédé selon l'invention conduit couramment à la production d'une solution de succinylthiokinase hautement purifiée, avec extraction de 25 000 à 30 OoO unités enzymatiques par kilogramme de matière première et obtention d'une activité spécifique de 100 à 150 unités par milligramme d'azote protéique. In'unité enzymatique est définie par la quantité enzymatique catalysant l'oxydation de 1,0 micromole de substrat par minute, dans les conditions standards. Ea pratique, cette unité est définie comme étant la quantité d1 enzyme donnant au spectrophotomètre d'absorption un accroissement de l'absorption de 1000 par minute à 235 mu dans les conditions de l'essai standard (voir pour référence l'article de Sungman Cha, page 1962 de la revue The Journal of Biological Chemistry, vol. 259, nO 6, Juin 1964). Cet accroissement d'absorption est dA à la formation, par le système enzyme-succinyl Coenzyme A, de succinate et de Coenzyme A (accompagnés de triphosphonucléotide).En fait, c'est le chiffre obtenu multiplié par 100 qui représente l'acti vité de l'enzyme à la dilution considérée. Il faut noter que les valeurs indiquées plus haut ont été obtenues selon l'invention avec une simple matière première de qualité alimentaire (c'est-à-dire très courante et tout juste prépafée par séparation de la graisse, des vaisseaux et des caillots sanguins l'encombrant), et cela sur des quantités qui peuvent autre de plusieurs tonnes. Or, lorsqu'on a soumis cette mAeme matière première respectivement à plusieurs des procédés de l'art antérieur, on n'a chaque fois obtenu, dans les meilleurs des cas, que des rendements d'extraction d'au plus 2200 unités enzymatiques par kilo gramme de matière première et une activité spécifique ne dépassant pas 21 unités par milligramme d-'azote protéique. Ire procédé selon l'invention permet donc d'extraire à l'échelle industrielle Be l'enzyme succinylthiokinase avec des rendements considérablement accrus par rapport à la technique antérieure, 1 enzyme ainsi obtenue ayant de surcroSt une pureté d'environ 5 à 7 fois supérieure à celle ae la succinylthiokinase extraite jusqu'à maintenant des mimes sources. I1 faut d'autre part noter que le procédé selon la présente invention peut également être mis en oeuvre sur toute autre matière première connue comme renfermant de 1 1enzyme succinylthiokinase, telle que par exemple du coeur -de veau, du rein de porc, du muscle pectoral de pigeon, des épinards, du soja, de l'Escherichia Coli et autres, des modifications à la portée de l'homme de 1 t art pouvant alors être apportées aux conditions et techniques opératoires en fonction de la matière première traitée. L'activité physiologique de enzyme dépend toutefois, ainsi qu'on l'a indiqué plus haut, de la source dont on extrait lten- zyme succinylthiokinase. On a également trouvé selon l'invention que l'enzyme extraite et purifiée par ledit procédé peut entre utilisée pagexem- ple pour le traitement préventif ou curatif de perturbations du métabolisme musculaire et en particulier myocardique. La succinylthiokinase fait partie d'un complexe enzymatique qui transforme, au niveau de la fibre musculaire, l'énergie brute apportée par-la circulation artérielle en une énergie directement utilisable pour la contraction de cette fibre musculaire, sans recours à une phosphorylation oxydative, c'est-à-dire sans apport dtoxygvne. Dans la circulation veineuse une grande partie de cette énergie brute se trouve non utilisée et c'est à ce niveau que se situe l'action de l'enzyme, qui augmente le potentiel de transformation de cette énergie brute. On a alors montré que cette enzyme peut entre utilisée en thérapeutique pour son action préventive ou curative sur - un muscle dont la nutrition se fait mal ou un débit san guin diminué, par exemple à la suite d'une lésion arté rielle, - un muscle surmené à la suite en particulier de contrac tions violentes et/ou répétées, et - une lésion musculaire. On a montré selon l'invention que l'action ae cette enzyme se prolonge sur une longue durée. Afin d'établir ia preuve de l'activité pharmacologique de la succinylthiokinase obtenue par le procédé selon l'invention, on a mis au point le protocole d'essai suivant, dans lequel se trouvent réunies la baisse des réserves consommables (test de fatigue) et celle de l'oxygène disponible pour ce faire (test de l'hypoxie et de l'anoxie), ce protocole d'essai représentant un modèle d'affection cardiaque : il consiste à réduire le débit des coronaires par injection d'extrait de post-hypophysev On assiste alors à un déréglement total du rythme cardiaque, que l'on peut consigner en courbes éventuellement simplifiées, en mesurant l'intensité et la durée de ce dérèglement afin de mieux mettre en évidence le phénomène. Lorsque, avant cette administration de l'extrait de posthypophyse, on injecte par toute voie appropriée une quantité thérapeutiquement efficace de l'enzyme obtenue selon l'invention, on assiste à une réduction considérable de la perturbation du rythme cardiaque ; cette dernière peut même devenir nulle, comme le rée le graphique établi qui ne présente alors le plus souvent/de plage d'arythmie. Pour établir l'efficacité thérapeutique de 11 enzyme extraite et purifiée selon la présente invention, on a-opéré sur 2 groupes d'animaux dont l'un constituait- le groupe témoin et dont l'autre recevait au préalable une injection d'une quantité efficace de l'enzyme susdite.On a ensuite injecté par voie intraveineuse de l'hormone post-hypophysaire et on a enregistré les variations du rythme cardiaque respectivement sur chaque animal de chacun des 2 groupes. L'invention est décrite plus en détail dans les exemples ci-après qui ne la limitent aucunement dans dans ces exemples, la température est toujours, sauf indication contraire, de + 4 C Exemple 1 On a pris des coeurs de porc prélevés immédiatement après l'abattage et on les a débarrassés de la graisse et des vaisseaux qui les entouraient. On a fendu les coeurslongitudinalement pour en extraire les caillots sanguins. Cas coeurs ont été congelés. On a émincé et haché les coeurs de porc à une température d'environ - OOC, dès leur sortie des chambres de stockage des congélateurss. On a effectué ce hachage sur des grilles ayant des ouvertures d'un diamètre de 6 mm, puis de 2 au. On a préparé une solution saline d'extraction comprenant du chlorure de potassium 0,20M, du phosphate monopotassique 0,05M et du phosphate dipotassique O,05M, le pH de cette solution étant a ajusté å 7,4. Le volume de solution préparé était dans un rapport de 3 vis-à-vis du poids de coeur traité (rapport en litres par kilogramme). On a séparé cette solution en 2 fractions égales (a) et (b). On a ajouté la fraction (a) à la matière première hachée. La température de cette solution (a) était ajustée de telle sorte que la température du mélange final fut de +40C, en veillant toutefois à ce que la température de la fraction (a) ntexcédat pas +300C et en prenant garde que le mélange restât fluide.On a ensuite procédé à une dispersion violente de la matière dans la solution grande à une turbine tournant à grande vitesse, afin d'obtenir un produit aussi homogène que possible, sans pour autant que la température dépassSt +15 C. On a d'autre part porté la fraction (b) à a température de +40C et cela ajontée,à cette température,à lthomogénéisat précédemment réalisé ; on a brassé vigoureusement pour obtenir un bon mélange et on a laissé reposer pendant environ 16 heures à + 40C. On a réhomogéndisé lentement la suspension de coeur en l'agi- tant doucement, puis on a centrifugé au moyen d 1une essoreuse réfrigérée à + 40C environ, qui a soumis les particules en suspension à une accélération de 2000 g pendant 15 minutes. On a ainsi obtenu un liquide trouble fortement coloré et un gSteau composé de particules fibreuses et de lipides.On a éliminé ce gazteau et on a réalisé au moyen de sels neutres une précipitation fractionnée de la solution recueillie, Pour ce faire, on a opéré dans une cuve dont le diamètre était inférieur à 3 fois la hau- teur et on a utilisé du sulfate d'ammonium, que lton a ajouté en une quantité telle que l'extrait fût ainsi amené à une concentration finale de 50% environ de saturation à + 40C. De façon pratique, on déterminait cette quantité en mesurant le volume de solution extractive à traiter et on a ajouté lentement et sous agitation le sulfate d'ammonium, à raison de 350 g/l.On a ;mainte- nu l'agitation jusqu'à dissolution complète du sel, c'est-à-dire pendant environ 30 minutes, en évitant un brassage d'air et en pr & ant soin d'éviter que se~forme une mousse trop importante ; on a ensuite laissé reposer au moins 16 heures. I1 se produisait dans la cuve une séparation en 3 couches, la couche supérieure étant constituée principalement de mousse et la couche inférieure étant un précipité volumineux. La couche centrale quant à elle était la plus importante et consistait en un liquide limpide. On a siphonné ce dernier et on a réuni le précipité et la mousse. On les a centrifugés de telle sorte que le liquide épais que l'ensemble représentait fût soumis à une accélération de 2000 à 5000 g pendant 1 heure. On a retiré le liquide surnageant en continu pendant la centrifugation, afin d'éviter que se reforme une suspension. On a alors éliminé en totalité le liquide surnageant. On a dissous à nouveau le précipité dans une solution aqueuse de phosphate dipotassique 0,033 M et de phosphate monopotassique 0,033 M dont on avait ajusté le pH à 7,4 environ. La quantité de solution utilisée était telle que le rapport du volume final de matière, après redis solution du précipité, au poids du précipité était égal à 3 en litrespar kilogramme. On a dialysé cette solution afin d'en retirer le sulfate d'ammonium restant. On a effectué cette dialyse contre une solution ayant la même composition que celle utilisée ci-dessus (solution aqueuse de phosphate dipotassique 0,033 et de phosphate monopotassique 0,033M) et maintenue à + 40C. On a clarifié la solution dialysée en la soumettant à une centrifugation sous une accélération de 10 000 g. On a soumis le liquide recueilli à une seconde précipitation fractionnée au moyen de sels neutres ; le sel utilisé était du sulfate d'ammonium en une quantité telle que l'extrait de coeur fAt ainsi amené à une concentration finale d'environ 30% de saturation à + 4 C. Dans la pratique on ajoutait ce sel sous agitation et à raison de 210 g/l de solution. On a maintenu les matières en contact pendant 3 heures à + 4 C. On a centrifugé la solution sous une accélération de 10 000 g et on a éliminé le précipité formé. On a ajouté à la solution et sous agitation 80 g/l de sulfate d'ammonium en poudre, afin de réaliser une nouvelle précipitation fractionnée pour laquelle on amenait la concentration finale en extrait à environ 42C/o de saturation à + 40C. On a laissé les constituants en contact pendant 3 heures et on a centrifugé la solution en la soumettant à une accélération de 10 000 g. On a éliminé le précipité et on a soumis la solution à une précipitation fractionnée au sulfate d'ammonium pour laquelle on a amené l'extrait à une concentration finale de 70% environ de satu ration à + 40C par addition sous agitation de sulfate d'aimonium en poudre à raison de 196 g/1 de solution.On a laissé l'ensem- ble des matières en contact pendant 16 heures et on a centriu- gé la solution sous 10 000 g. Après avoir elinlo le liquide surnageant, on a redissous le précipité dans 10 fois son poids d'une solution saline tamponnée de phosphate 0,033Mde pH 7,4. On a dialysé cette solution d'enzyme contre une solution tamponnée identique de phosphate 0,033 x de pH 7,4 à + 4-OC, afin d'éliminer le sulfate d' ammonium restant. On a clarifié par centrifugation la solution dialysée et on a conservé la solution recueillie à l'état congelé. Cette solution présentait une activité spécifique de 100 à 150 unités par milligramme d'azote protéique. Ire rendement de l'extraction était de 25000 à 30000 unités par kilogramme de coeur mis en oeuvre. exemple 2 On a utilisé l'enzyme succinylthiokinase préparée selon exemple 1 pour le traitement de perturbations du métabolisme musculaire, en particulier du métabolisme myocardique. On a opéré sur 20 cobayes mt:les adultes pesant chacun 500 g environ. On a injecté à 10 d'entre eux une quantité de succinylthiokinase de l'exemple 1 de 200 unités. On a ensuite administré 0,24 unité internationale (UI) de post-hypophyse à chacun des vingt cobayes, les dix cobayes n'ayant pas au préalable reçu d'injection d'enzyme constituant le groupe d'animaux témoins. Chez ces derniers, l'injection par voie intraveineuse de l'hormone post-hypophysaire se traduisait immédiatement par une baisse brutale du rythme cardiaque, suivie un instant. plus tard par des battements très irréguliers du coeur, qui atteignaient pendant quelques secondes un rythme élevé, rythme qui se ralentissait et s'accélérait de nouveau et ainsi de suite, et ce chaque fois sur une période de temps très courte. L'enregistrement de l'électrocardiogrsmme a permis de déterminer avec précision la durée de la crise ainsi provoquée et qui était de 12 à 15 minutes. Au Dout de ce temps, l'arythmie avait disparu, et le rythme cardiaque revenait très lentement vers la normale. Une seconde injection de m & e type à quelque 35 minutes de la pre mière à provoqué à nouveau pratiquement le .E8me phénomène. Sur les animaux qui en revanche avaient reçu au préalable une Injection de 200 unités de succinylthiokinase préparée selon l'exemple 1, on a seulement constaté immédiatement après une première injection d'hormone post-hypophysaire une baisse modérée du rythme cardiaque. La remontée de ce rythme cardiaque s'o- pérait plus rapidement et la crise apparente pendant laquelle le rythme cardiaque a subi une succession de ralentissements et d'accélérations rapides n1 était plus que de 1 à 2 minutes et de très faible intensité. Ensuite, le rythme cardi-aque revenait plus rapidement à la normale et une seconde injection par voie intraveineuse d'hormone post-hypophysaire faite quelque 30 minutes après la première n'a là encore provoque qu'une crise mineure du même type que lapremière/qui ne durait que 2 minutes environ0 Certains animaux ne manifestaient même aucune arythmie, mais simplement une légère diminution du rythme cardiaque. REVEtTD1CATIGNS 1. Procédé pour l'obtention et la purification de succinylthiokinase à partir de coeur de mammifères, notamment de coeur de porc, frais ou congelé ou conservé à + 40C, caractérisé er ce que (1) on émince les coeurs et on les hache, (2) on prépare une solution aqueuse saline d'extraction, le pH de cette solution étant ajusté à 7s4 environ et son volume en litres étant au moins égal à 3 fois le poids en kilogrammes de la matière premier hachée, et on sépare cette solution en deux fractions sensiblement égales (a) et (b), (3) on ajoute à la matière première hachée la fraction (a) portée à une température appropriée pour que le mélange obtenu soit à une température voisine de + 40C, et on agite vigoureusement et l'on maintient la température au-dessous de + 1500, (4) on ajoute la fraction (b) dont la température a au préalable été ajustée à environ + 4-OC, on brasse vigoureusement et on laisse reposer, (5) on centrifuge et on élimine le (6) on réalise une précipitation fractionnée en 3 couches du liquide de centrifugation au moyen de sels neutres, (7) on réunit la couche supérieure constituée principalement de mousse et la couche inférieure formée d'un précipité on centrifuge et on élimine le liquide obtenu, (8) on dissout le précipité dans une solution saline préparée à partir d'eau distillée à + 40C et dont on ajuste le pH à 7,4 environ, le rapport du volume en litres de solution finale au poids en kilogrammes du précipité à dissoudre étant au moins égal à trois, (9) on dialyse la solution obtenue tout en maintenant son pH à 7,4 environ, on centrifuge et on élimine le gatea tormé, (10-15) on réalise une succession de six opérations consistant en des précipitations fractionnées (10),(12) et (14) au moyen de sels neutres, à des concentrations différentes selon le stade de l'opération1 et en des centrifugations (11), (13) et (15), respectivement à la suite des 3 précipitations susdites, pour finalement isoler un précipité, (16) on dissout le précipité dans environ 10 fois son poids d'une solution aqueuse de tampon phosphate 0,033 M de pH 7,4 environ, (17) on dialyse contre le précédent tampon phosphate la solution obtenue, et (18) on clarifie par centrifugation ou filtration la solution dialysées l'ensemble des étapes (4) à (18) inclusivement étant mis en oeuvre à une température de + 40C environ. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que llon réalise la succession des étapes (10) à (15) comme suit (10) on réalise une précipitation fractionnée du liquide de centrifugation au moyen de sels neutres, (11) on centrifuge et on élimine le précipité, (12) on réalise une précipitation fractionnée du liquide recueilli, (13) on centrifuge et on élimine le précipité, (14) on réalise une précipitation fractionnée du liquide recueilli, (15) on centrifuge et on élimine le surnageant liquide. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que les coeurs de mammifères sont des coeurs conservés à environ - 200C ou à des températures inférieures. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite solution aqueuse saline de lé- tape (3) est une solution aqueuse de chlorure de potassium 0,2cl, de phosphate monopotassique 0,05E et de phosphate dipotassique 0,05 M et le pH de ladite solution est ajusté à 7,4. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la quantité de ladite solution saline est telle que le rapport de son volume en litres au poids en kilogrammes de la matière préparée à traiter avec ladite solution soit d'au moins 3 environ. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ladite précipitation fractionnée constituant l'étape (6) est réalisée au moyen de sulfate d'ammonium ajouté en une quantité telle que l'extrait soit ainsi amené à une concentration finale de 50% environ de saturation à+4 C. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ladite précipitation fractionnée constituant l'étape (6) est réalisée au moyen de chlorure de potassium, de chlorure de magnésium ou de sulfate de magnésium. 8 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ladite solution saline de l'étape (.8) est une solution aqueuse de phosphate dipotassique 0,053 E et de phosphate monopotassique 0,033 i: et on en ajuste le pH à 7,4 environ. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la quantité de ladite solution saline utilisée est telle que le rapport entre le volume en litres de solution finale obtenue après redissolution du précipité de l'étape (7) dans ladite solution saline et le poids en kilogrammes du précipité à dissoudre soit d'au moins 3. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications i à 9, caractérisé en ce que lesdites précipitations fractionnées constitdueanstlieasteétapes (10), (12) et (14) sont réalisées au moyen/d'ammonium ajouté en des quantités telles que l'extrait soit ainsi amené à une concentration finale de respectivement 30 %, 42 % et 70 0% de saturation à + 4-OC, 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que lesdites précipitations fractionnées constituant les étapes (10),(12) et (14) sont réalisées au moyen de chlorure de potassium, de chlorure de magnésium ou de sulfate de magnésium. 12. Application de la succinylthiokinase purifiée obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 1l au traitement préventif ou curatif de perturbations du métabolisme musculaire, notamment myocaraique. 13. Composition pharmacologique comprenant une quantité thérapeutiquenent efficace de succinylthiokinase purifiée obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.