Brevet FR2238759A1 — publié le 19750221

La présente invention concerne la culture des organismes amorceurs de fromage ; elle se rapporte plus particulierement a un procédé dans'lequel la concentration des cellules de micro-organismes peut être augmentée sensiblement en excès de la concentration obtenable par le procédé conventionnel de fermentation. Une des étapes préliminaires dans la fabrication des fromages consiste a inoculer de grands volumes de lait avec ce que l'on appelle des "organismes amorceurs de fromages" ou des "ferments". Ce sont généralement des acides lactiques produisant des micro-organismes tels que le streptococcus crémoris, le streptococcus lactis et le streptococcus diacetylactis, qui convertissent le lactose du lait en acide lactique. Le nombre de cellules amorceurs de fromages viables susceptibles d'etre produites par le procédé conventionnel de fermentation est limité, car l'acide lactique est produit rapidement par les organismes durant la phase exponentielle de croissance, et cet acide lactique inhibe la croissance ultérieure des micro-organismes. La conséquence de ceci est qu'il n'est pas possible, dans la production. normale, de produire des concentrations de cellules supérieures a IO9 par millilitre ; cela signifie que dans la fabrication commerciale du fromage, le volume d'amorceurs à employer doit être de 45-90 litres d'amorceurs pour 4 500 litres de lait. Idéalement, il serait souhaitable d'utiliser un petit volume d'inoculeur non seulement pour faciliter la manipulation durant l'inoculation de chaque bain de lait, mais également pour rendre utilisable l'emploi d'un organisme amorceur de caractéristiques constantes de sorte que les bains dtinoculeur puissent être enanagasinés pour un usage ultérieur et transportés à travers le pays. Pour surmonter le problème d'un grand volume d'inoculeur et l'impuissance des techniques de fermentation conventionnelle a produire un inoculeur de concentration suffisante, on a proposé de concentrer les produits de la fermentation conventionnelle par centrifugation, ce qui peut conduire a des densités de cellw- les d'environ 10 Imillilitre, mais des centrifugeuses et des techniques 8p-ecia- les sont nécessaires pour éviter la contamination du produit concentré. On a trouvé, et c'est ce qui fait l'objet de l'invention, que l'utilisation de techniques connues comme la dialyse ou la diffusion de culture (ci-après appeléediffusion de culture) pour la culture d'organismes amorceurs de fromages, pour produire des concentrations de cellules supérieures à IOII/milLilitre par fermentation directe éliminant la centrifugation et manipulation prolongées de s or- te que l'inoculeur résultant est de concentration identique h celui produit par centrifugation, et tel que 200 à 500 millilitres d'amorceur concentré sont suffisants pour l'inoculation directe de 4 500 litres de lait à fromages.Alternativement, 2 à 5 grammes d'amorceur peuvent être utilisés pour inoculer un amorceur conventionnel saturé de 45 litres éliminant la propagation normale depuis les ampoules séchées å froid. La présente invention se rapporte à un procédé pour la production d'une eulture concentrée de micro-organismes susceptible de transformer le lactose en acide lactique qui se caractérise en ce qu'elle consiste è à cultiver le micro-organisme dans un milieu nutritif dans une zone de fermentation et à faire circuler le milieu nutritif contenant le micro-organisme cultivé, l'acide lactique et les sels de ce dernier depuis la zone de fermentation jusqu'à la première chambre d'un dialyseur a à introduire une solution régénérante dans la seconde chambre du dialyseur qui est séparée de- la première par une membrane de dialyse ou de diffusion, sensiblement imperméable aux micro-organismes mais perméable aux subs-tances nutritives, à l'acide lactique et aux sels de celui-ci, la solution régénérée ayant une concentration d'éléments nutritifs suffisamment élevée et une concentration d'acide lactique et des sels de celui-ci suffisamment basse de sorte que - les éléments nutritifs traversent la membrane depuis la solution régénéraate au milieu nutritif contenant le micro-organisme cultivé, l'acide lactique, et les sels de ce dernier ; - l'acide lactique et les sels de ce dernier passent à travers la membrane du milieu nutritif contenant les micro-organismes cultivés, l'acide lactique et les sels de ce dernier à la solution régérérante ; è à faire recirculer à la zone de fermentation une solution nutritive con- tenant des micro-organismes cultivés qui est enrichie en éléments nutritifs et épuisée en acide lactique ou sels de ce dernier enfin à continuer la culture des micro-organismes. L'acide lactique est ainsi produit rapidement pendant la phase exponentielle de croissance des micro-organismes et cela empêche la croissance de ces derniers è des taux exponentiels, notamment lorsque leur concentration est supérieure à 2 % dans le milieu nutritif. Dans certaines circonstances, le taux de production d'acide lactique peut être si élevé qu'il n'est pas possible d'enlever l'acide lactique à travers la membrane aussi rapidement qu'il est produit, de sorte que l'acide lactique à tendance à s' accumuler dans la zone de fermentation et à inhiber une nouvelle fermentation.C'est la que le contrôle du pH est d'importance puisqu'il y a été trouvé que les sels de l'acide lactique ne sont pas inhibiteurs d'une nouveile fermentation comme l'est l'acide lactique lui-même, et en contrôlant un agent neutralisant, par exemple la soude ou de préférence l'ammoniaquesil est possible de transformer partiellement l'acide lactique en sel de lactate qui pourra éventuellement être retiré à travers la membrane mais, pendant qu'il reste dans le milieu de fermentation, ne pourra pas inhiber la croissance comme le ferait les acides libres. Le pH optimum est en pratique 6-7. L'amorceur concentré produit conformément à l'invention, peut être glacé, dans l'azote liquide, et peut être formulé en bain de volume constant, par exem ple en seringue, ou en granulés ce qui permet l'emploi dtinoculeurs de volume précis. L'emploi dans la fabrication du fromage de suspensions de cellules concentrées selon l'invention, lequel emploi constitue un aspect supplémentaire de l'invention, permet une uniformité souhaitable dans la mise en oeuvre, 'et de réaliser des produits de qualité. Le dialyseur utilisé dans le procédé selon l'invention peut être d'un type en soi connu dans lequel deux chambres sont séparées l'une de l'autre, par une membrane. La membrane peut être du type de dialyse véritable ou du type de diffusion poreuse. Elle devra être sensiblement imperméable aux micro-organismes, mais devra permettre la diffusion à travers elle, des éléments micro-organismes nutritifs, de l'acide lactique et de ses sels.IL est préférable utiliser des membranes ayant des pores inférieurs à 0,5 micron, un haut taux de diffusion dtélement nutritif, une résistance mécanique appropriée, et qui peut être stérilisée, de préférencea l'autoclave Des membranes, telles que celles qui sont fabriquées en cellulose régénerée (dénomination commerciale "Visking") et en ma tériau filtrant (dénomination commerciale " Acropor") sont appropriées. Une chambre du dialyseur peut astre en communication liquide avec la zone de fermentation où le micro-organisme est cultivé dans un milieu nutritif équi- pant les sources nécessaires de carbone assimilable , d'azote et autres éléments. Cette fermentation peut être effectuée sous des conditions normales d'aseptise et également sous contrôle du pH et de la température, sous aération de manière à å ce que la fermentation puisse être optimisée pour les conditions de diffusion de culture employées. Cette première chambre du dialyseur peut également être en communication liquide avec la zone de fermentation è travers un conduit de recirculation et le milieu nutritif contenant le micro-organisme cultivé cirar lant continuellement dans le circuit fermé, encore qu'une circulation intermit- tente soit également possible. La seconde chambre du dialyseur est équipée avec une solution régénérante, conventionellement depuis un réservoir. La solution régénérante est également conventionellement mise zen circulation de manière intermittente ou de preferemm ce en continu, dans un circuit fermé depuis le réservoir, à travers le dialyseur et retour au réservoir, mais il faut prendre soin, si l'on opère ainsi, que cide lactique et ses sels peuvent s'accumuler dans le réservoir, ce qui peut progressivement affecter négativement le passage de l'acide lactique ou des ses a travers la membrane dans la solution nutritive à partir du milieu nutritif. En conséquence, pendant qu'il est utile en pratique de faire recirculer la solution nutritive au réservoir, la concentration en acide lactique ou en lactate sera contrôlée et l'accumulation de concentrations excessives évitée. I1 est souhaitable que le rapport du volume total de solution régénérante utilisée de cette manière au volume total de solution nutritive contenant les micro-orga nismes cultivés, soit d'au moins IO/I.La concentration d'éléments nutritifs d'une part et celle d'acide lactique et de sels d'autre part, dans la solution régénérante, doit être a la fois suffisamment haute et basse de sorte que, lorsqu'on l'introduit dans la seconde chambre du dialyseur, les éléments nutritifs passent a travers la membrane depuis la solution régénérante jusqu'au milieu nutritif contenant les micro-organismes, l'acide lactique ou les sels et, a ce moment, les métabolites des micro-organismes sont retirés du milieu nutritif et passés a travers la membrane dans la solution régénérante.Le passage des e léménts nutritifs, de l'acide lactique, des sels, à travers la membrane, est très important, d'autant qu'il previent l'inhibition de la croissance des micro-organismes par affermissement de l'acide lactique et des sels ou par épuisement des éléments nutritifs. Toutefois, l'excès d'élement nutritif peut être lui-même un inhibiteur à la croissance des cellules. Ainsi, alors que la croissance des cellules est inhibée par insuffisance ou excès d'élément nutritif, aussi bien que par l'acide lactique, il est possible, par la technique de diffusion de culture, d'apporter des éléments nutritifs additionnels, de manière continue ou intermittente, au taux désiré comme l'élément nutritif est utilisé par la croissance du micro-organisme. Ainsi, il a été observé qu'un équilibre soigné doit être maintenu entre la concentration en elements nutritifs et la concentration en acide lactique et en lactates dans le liquide de fermentation et dans le liquide régénérant pour obtenir des quantités optimas d'éléments nutritifs et d'acide lactique et de sels pour réaliser la population désirée de cellules à la fin de la fermentation. Comme indiqué ci-dessus, la nature de la membrane, la concentration en é léménts nutritifs, en acide lactique et en lactates le pH et le rapport des volumes de la solution totale régénérante au volume du milieu des éléments nutritifs contenant les micro-organismes sont tous des facteurs qui influencent la fermentation et peuvent être optimisés pour obtenir des populations de cellules au moins 5 x 1010 millilitre. Toutefois, il est reconnu que le paramètre le plus important de ce point de vue, est le rapport surface de membrane au volume du milieu des éléments nutritifs contenant les micro-organismes.On a trouvé que pour la croissance des micro-organismes du type, selon l'invention, pour donner les populations de cellules les plus importantes de l'ordre de I0IO à IOII cellules/millilitres, il est important d'utiliser plus de surface de membrane par rapport au volume d'éléments nutritifs contenant les micro-organismes que cela était utilisé dans la culture de diffusion. Pour obtenir les meilleurs résultats avec les organismes amorceurs de fromage, on préfère utiliser au moins 2 2 3 cm et plus, voir 5 cm de membrane par millilitre de milieu nutritif conte- nant les micro-organismes.La limite supérieure des membranes n'est pas criti que et est régie essentiellement par des problèmes pratiques associés à la mise en oeuvre des dialyseurs ayant de tres grandes membranes, mais on a trouve qu'il était possible de travailler avec des surfaces de membranes de l'ordre de I2-I5 2 cm par millilitre de milieu nutritif contenant le micro-organisme. Un paramètre supplémentaire qui influence la réaction de fermentation est le taux avec lequel l'élément nutritif contenant le micro-organisme est mis en circulation à travers le dialyseur. Dans cette voie, il est préférable de le faire circuler à la vitesse d'au moins I litre par minute, de manière à obtenir la turbulence maximum à la surface de la membrane. Les organismes amorceurs de fromage qui peuvent être mis en-oeuvre dans l'invention sont du type de ceux qui sont connus pour la conversion du lactose en acide lactique et compronnant le streptococcus crémonis, le streptococcus lactis et le streptococcus diacetylactis. La culture de diffusion selon I'invention, peut être réalisée au moyen d'un appareil illustré dans le dessin unique ci-joint. L'appareil comporte généralement un fermentateur I, un réservoir 2, un dialyseur 3 et un bac de récupération IO. Le fermentateur I et le réservoir 2 sont équipés respectivement avec un agitateur à pales 4 et magnétique 5 et le fermentateur I est équipé avec une sonde à pH 6 immergé en dessous de la surface du liquide de fermentation 7 et, envoie un signal à l'appareil de contrôle du pH 8. Cet appareil 8 contrôle un réservoir d'alcali 9 qui peut envoyer de l'alcali dans le fermentateur I à travers l'ouverture Il pour maintenir le pH au niveau désiré. Le fermentateur à une fente 28 préservée par un filtre a air 29 et une ouverture de transfert du milieu I2. Le réservoir 2 contient la solution régénérante 24 et a une ouverture d'air 30 préservée par un filtre 31. Le réservoir 2 est immerge dans un bain d'eau I4 dont la température est contrôlée par un refroidisseur I5. Le dialyseur 3 a des compartiments de culture I6, I7 et des compartiments de dialyse 25, 23 séparés les uns des autres par des membranes de dialyse ou de diffusion respectivement I8 et 27.L'inducteur de courant I9 fait circuler le milieu nutritif contenant les micro-organismes cultivés depuis le fermentateur I, à travers la valve 32, le conduit 20 au dialyseur 3 et retour au fermentateur I a travers le conduit 21 et la valve 33 et la solution d'éléments nutritifs depuis le réservoir 2 à travers le conduit 22 au dialyseur 3 et ensuite retour au réservoir 2 à travers le conduit 23. Un bac de récupération refroidi IO, communique avec le fermentateur I à travers un inducteur de courant 34 et un conduit 35. Le bac de récupération IO est équipé avec un agitateur a pales 36 et une sonde à pH 37, immergée en dessous de la surface du liquide récupéré 38, envoie un signal au pli mètre 39. Le pli mètre 39 contrôle un réservoir d'alcali 40 qui peut envoyer de l'alcali dans le bac de récupération IO à travers l'ouverture 41, comme cela est nécessaire pour maintenir le pH a un taux désiré. Le bac IO a une fente 42 préservée par un filtre à air 43. Un conduit 44 amène depuis la base du bac IO à travers la valve 45 et l'inducteur 46 à un collecteur à aiguilles 47 qui est positionné sur un bain d'azote liquide 48 pour réfrigérer le concentrat de culture. En marche, le milieu de culture et un inoculeur du micro-organisme à cultiver peuvent être introduit dans le fermentateur I a travers l'orifice de transfert 12. Le pH est ajusté à la valeur désirée au commencement de la fermentation et la fermentation est démarrée. En cours d'opération, le pli tend à tomber au fur et à mesure de la production d'acide lactique et une chute excessive du pH est évitée en introduisant de l'alcali pour neutraliser l'acide lactique, l'introduction de l'alcali étant déclenchée par la sonde à pH 6 et le pH mètre 8.Le milieu nutritif contenant les micro-organismes et les métabolites, est mis en circulation à travers la valve 32 et le conduit 20 au moyen de l'inducteur I9 dans les compartiments I6 et I7 du dialyseur 3 et retour a traversle conduit 21 et la valve 33 au fermentateur I. Pendant le même temps, la solution nutritive est pompée du réservoir 2 à travers le conduit 22 et l'inducteur I9 dans les compartiments 25 et 26 du dialyseur 3 et retour à travers le conduit 23 au réservoir 2. Durant ce temps, l'échange d'éléments nutritifs et de métabolites apparaît à travers les membranes I8 et 27.La fermentation s'effectue en continu en utilisant les éléments nutritifs récemment introduits et en maintenant le le contrôle du pH jusqu 'à ce que la concentration désirée en cellules soit obtenue. La suspension concentrée de micro-organismes est ensuite enlevée du fermentateur à travers le conduit 35, à travers l'inducteur 34 (ou si celà est plus pratique, depuis un autre point du système fermé du milieu de culture) dans un bac à récupération refroidi IO. Le pH de la culture concentrée stockée est contrôlé dans le fermentateur I par une sonde à pH 7 et si une addition supplémentaire d'alcali est nécessaire, celle-ci est introduite par le pH mètre 39 depuis le réservoir 40 à travers l'aiguille 41. La suspension de micro-organismes concentréé collectée peut être refroidie en l'enlevant du bac IO à travers la valve 45, la conduite 44 et l'inducteur 46 et passage à travers le collecteur à aiguilles 47 dans le bac d'azote liquide 48. La description ci-dessus se réfère à la circulation continue du fluide de culture et du fluide nutritif, mais il est également possible d'opérer selon l'invention, en utilisant une circulation intermittente de l'un ou des deux milieux de culture et d'éléments nutritifs. La manière dont l'invention peut être mise en oeuvre et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation qui suivent, donnés à titre indicatif. Exemple I Cet exemple de réalisation est éxécuté avec un dispositif conforme à celui qui est schématisé dans le dessin. Les matériaux suivants sont utilisés ; L'organisme cultivé est le Streptococcus crémoris P2 (NCDO 1995, National Institute for Research in Dairying, Shinfield, Reading, Grande-Bretagne). L'organisme est reproduit dans de la crème de lait reconstituée à IO Z depuis une am- poule séchée au froid, ensuite sous-cultivée trois fois (O,I X, 200C pendant 18 heures) dans le milieu expérimental. La troisieme sous-culture est ajustée à pli 6,6, emballée dans une seringue hypodermique de I millilitre et réfrigérée dans de l'azote liquide.Une culture de travail est produite pour chaque fermentation en inoculant I millilitre de culture dégelée dans IO millilitres du milieu expérimental et. en incubant 4 à 5 heures à 250C. Milieu : a) milieu de culture : Constituants (gramme/litre) : pâte concentrée de lait écrémé 25,0 petit lait non neutralisé pulvérisé 50,0 à sec pâte extrait levure (froid) I,O. Le milieu est préparé dans un bac de 15 litres en utilisant de l'eau du robinets bouillie pendant 3 heures avec brassage occasionnel et est placée dans une chair bre froide (50C) la veille pour permettre aux matières insolubles de se precipi- ter.Des aliquates de IO millilitres d'un milieu clarifié sont dispersés dans des bouteilles universelles de 28,35 grammes et placés à l'autoclave 15 minutes à 121 C. b) milieu de diffusion Les constituants et la préparation initiale à la chambre froide sont exactement les mornes que pour (a) Le milieu clarifié est ensuite transféré dans un bac ste- rile et est place à la vapeur pendant 3 heures,avec une agitation occasionnelle. I,5 litre du milieu initial clarifié est transféré dans un flacon stérile conique de 2 litres ajusté avec un transfert aseptique et traité à la vapeur pendant I,5 heure. Membrane La membrane de diffusion est en "Acropor" AN 200,un copolymère acrylonitrile, chlorure de polyvinyle renforcé nylon, avec des pores de 0,2 micron. Cette membrane est choisie pour ses propriétés de diffusion rapide, sa résistance et sa longévité. Appareillage : a) bac fermentateur Le fermentateur est un bac à réaction thermostatique de un litre équipé avec un couvercle à cinq orifices et un orifice du fond. Le bac est ajusté avec quatre chicanes de polyearbonates. Le couvercle à orifices comporte au centre un agitateur avec des pales de 70 millimètres, un courant stérilisable, une sonde démontable à pH, un orifice pour introduire le milieu, un orifice de sortie pour la culture, une sortie de circulation, une aiguilledlinjection d'alcali pour le contrôle du pH et un filtre à air. Le contrôle de la température du contenu du fermentateur est réalisé en utilisant un thermo-circulateur CRurchill LTCK re lier au manchon d'eau du fermentateur. b) bac réservoir Le réservoir est un bac à réaction Quickfit (FR 20 LF) de 20 litres ajusté avec un couvercle Quickfit MA F3/52, comportant des entrée tamponnées et bouchées et des conduites de sortie et un filtre a air. Le contenu du bac est agité au moyen d'un agitateur magnétique avec un plateau magnétique. La croissance des contaminents est empêchée en tenant le bac dans un bain d'eau équipé d'un systeme de contrôle de la température, maintenue à I5 OC. L'emballage extérieur en bois du bac d'eau a été enlevé pour obtenir un meilleur couplage de l'agita- teur et du plateau magnétique. c) dialyseur (type KIIL) Un normal KIIL hemodialyseur est modifier pour recevoir deux simples feuil les de membrane équipant une surface de membrane de 5,500 cm2. La modification en parallèle produit deux unités, consistant en deux chambras, chacune couplée et serrée sur un chassis. La contenance de chaque chambre est d'environ I75 millilitres. d) pompe de circulation : La circulation du contenu du réservoir et du fermentateur à travers les unités de diffusion a été réalisée en utilisant un inducteur a deux canaux. Un garnissage de tube de caoutchouc de silicone d'alésage 9,5 millimètres est employé avec les unités prototypes donnant l'écoulement maximum de 3 litres par minute par canal. Des tubes d'alésage 7 millimètres en caoutchouc de silicone sont employés avec l'unité de diffusion KIIL donnant l'écoulement maximum de I,5 litre par minute. e) pH métre : un pH mètre enregistreur couplé la sonde à pH et une pompe delta, contrôlent le pH du contenu du fermentateur utilisant IO N d'ammoniaque f) système de rammassage du concentré : Le bac de récupération du concentré est identique a celui du fermentateur équipé avec un pH mètre, un thermomètre, un conduit directe depuis le fermentateur de culture de diffusion, à travers un inducteur à courant H R, et un agitateur a pales de 70 millimètres.Un manchon refroidit le bac à 0 C par circulation d'une solution d'eau-glacée. L'orifice de sortie depuis le fond du bac est couplé a un collecteur comportant sept aiguilles hypodermiques I9 G x 2 en caoutchouc de silicone de 20 centimètres de long. Les tubes sont reliés a une pompe péristaltique. Un bac de Dewar de 4,5 litres contenant de l'azote liquide et réglé avec un sac de mousseline est placésous le collecteur pour récupérer les goutelettes de concentré. La distance entre les orifices du collecteur et la surface de l'azote liquide est maintenuede 6 a 7 centimètres. Les unités de diffusion sont stérilisées avec une solution aqueuse à 250 ppm de soude et lavéesa l'eau stérile. le fermentateur est stérilisé et l'unité de diffusion, le fermentateur et le réservoir sont reliés ensemble dans des conditions stériles. Le fermentateur est ensuite rempli aseptiquement, la valve 33 étant fermée. Les valves 32 et 33 sont alors ouvertes et la pompe I9 est démarrée pour ne pas pomper plus de 250 millilitres par minute pour éviter l'aération initiale du milieu tant que l'air ntest pas retiré des unités de diffusion et des conduits. I millilitre de catalase de foiede boeuf stérile contenant 20 000 unités est injecté dans le système de circulation du fermentateur pour détruire les Per- -oxydes d'hydrogène résiduels du milieu. Lorsque le taux du milieu a été ajusté dans le fermentateur à la valeur désirée, par exemple I 000 millilitres moins la contenance des deux chambres de diffusion et des conduits, en utilisant les valves 32 et 33, le taux de pompe est augmenté approximativement a I,3 litres par minute et l'agitation démarre à 200 tours par minute. Le pH du milieu est ajusté à 6,6 pendant que le contenu du fermentateur est porté a 220C en utilisant le thermocirculateur. 20 millilitres d'une culture 45 heures de streptococcus crémris P2 est injecté dans le circuit fermentateur. Après une inoculation pendant la nuit (I6 heures environ), le contenu du fermentateur est examiné chaque heure au microscope en utilisant un Helber de profondeur 0,02 millimètre contenant une chambre sous la phase de contraste (G 500 > . Vers la fin de la phase de croissance logarithmique des échantillons sont prélevés du réservoir et du fermentateur pour analyse des concentrations de L-lactate et de lactose. Ces échantillons sont maintenus au froid dans de l'azote liquide jusqu'à l'emploi. Les estimations de L-lactate et de lactose sont effectués biochimiquement en utilisant des réactifs de Boehringer Mannheim et des méthodes classiques. Les mesures spectrophotométriques sont effectuées a 340 millimètres en utilisant un spectrophotomètre Unicem SP 500 série 2. Quand le taux optimum de cellule est obtenu, la culture concentree est récoltée. L'agitation (IOO tours par minute) est commencée dans un bac de récupération pré-refroidi et 500 millilitres de concentrat est pompé du fermentateur lorsque la circulation a été arrêtée et les valves 32 et 33 fermées. La valve 45 sur le bac de récupération est ouverte et le concentrat mesuré à 40-50 millilitres par minute a travers le collecteur 47, directement dans le sac de mousseline immergé dans l'azote liquide. La surface de l'azote est agitée manuellement pour prévenir l'agrégation du concentrat réfrigéré.Les granulés réfrigérés formés sont empaquetés dans des récipients a vis en polypropylène préstériiisés et refroidis de 300 millilitres et sont stockés dans de l'azote liquide. Les résultats obtenus sont rappelés au Tableau I. Le pourcentage moyen de cellules produites dans la culture de diffusion est de 1,55 x 1011 millilitre, le pourcentage total par litre étant de 1,55 x 1014 cellules. Ce nombre de cellules est dérivé des I7 litres du milieu, ctest-à-dire un litre dans le fermentateur et I6 litres dans le réservoir. Toutefois, dans le bain de culture conventionnel avec un pourcentage moyen de cellules de 2 x IO / millilitre, le nombre dérivé des I7 litres serait de 3,4 x IOI3 cellules. Cela est quatre fois et demi plus bas par unité de volume du milieu que celui obtenu par la culture de diffusion. Exemple 2 Le mode opératoire de exemple I est répété a une exception près c'est que le dialyseur type RIIL est remplacé par un prototype d'unité de diffusion. Les deux prototypes d'unité de diffusion (67 x I6 cm) ont été construits par moulage intégral des joints en caoutchouc silicone et des chambres en utilisant une pâte de caoutchouc silicone reticulable à froid type SR 600 (Esco Rubber Ltd. Londres). Les chambres ont des projections pyramidales pour agir comme supports de membrane. Les joints et les chambres sont reliés à des planches support en polycarbonate auxquels les orifices d'entrée et de sortie sont percés. Les mem braneg.sont placéesentre les joints et les batis bridés en acier. Les supports protubérants de membrane induisent une turbulence à basse vitesse, cela étant nécessaire pour faciliter au maximum la diffusion à travers la membrane. Les deux unités de diffusion sont couplées en parallèle en utilisant des tubes de caoutchouc silicone d'ouverture 9,5 millimètres de manière à obtenir une surface effective de membrane d'environ 1 000 cm2, La contenance est de 170 millilitres par chambre et. il y a quatre chambres en tout. Dans un but de comparaison, les bains de fermentation sont remplis en utilisant un fermentateur sensiblement identique à celui de la figure, utilisant les mêmes matériaux et les mêmes conditions de fermentation de pH, température, agitation etc., que celles utilisées dans la fermentation avec dialyse. Quand le bain de fermentation est rempli, l'inoculation est effectuée avec I millilitre de la culture 4-5 heures. Pour étudier l'influence de l'alcali sur le progrès de la fermentation, certaines fermentations de diffusion et de bain ont été réalisées en utilisant de la soude 5 N au lieu de l'ammoniaque IO N. On a obtenu les résultats rappelés au Tableau II. Exemple 3 Cet exemple illustre l'utilisation d'un concentrat en granulés réfrigérés pour inoculer un échantillon de lait pour similer les conditions d'amorceur et ainsi établir les performances d'un amorceur concentré produit par culture de diffusion. Les granulés de concentrat réfrigérés sont secoués pour assurer une corrélation étroite entre le nombre de cellules par millilitre à l'état liquide et le nombre de cellules par gramme à l'état solide réfrigéré. 4,56 litres de lait pasteurisé au détail sont mis à bouillir et maintenus à I000 C pendant IO minutes, refroidi à 22 C et inoculé avec 2,4 x 1010 cellules (C. 0,3 grammes de 8 x 1010 cellules/millilitre de concentré réfrigéré).Aprés 17-18 heures la pro duction d'acide est déterminée par titrage d'unéchantillon de IO millilitres à pH 8,3 avec de la soude. L'acide produit est calculé en pour cent d'acide lacti que. De la même manière, un amorceur à IO %, I Z et O,I Z dtinoculeur est incubé dans la crème de lait reconstituée à 300C pendant 6 heures pour déterminer l'ac- tivité de la culture. La production d'acide a été calculée de la même manière. Les résultats obtenus sont regroupés au Tableau III. Ces résultats montrent que les essais avec une petite quantité amorceur avec le concentrat récolté à 8 x 1010 cellules/millilitre utilisé en inoculeur comparable à ceux du commerce, atteint des acidités titrables satisfaisantes (0,6-0,7 % d'acide lactique) pour une incubation de D -I8 heures. Les mesures d'a cidité titrable à 6 heures effectuées sur l'amorceur donnent également des ré sultats satisfaisants. Exemple 4 Cet exemple est effectué sur un simple appareil sensiblement identique à celui décrit dans le dessin, mais en utilisant une simple unité de diffusion a yant une membrane et deux compartiments et en retirant le bac de récupération 10 et ses montures associées. Le réservoir a un volume de travail d'environ I,6 li- tre, le dialyseur une capacité de IO millilitres dans chaque compartiment et le fermentateur un volume de travail de 80 millilitres. Le fermentateur n'est pas agité et, tandis que le pH est contrôle, des moyens n'ont pas été prévus pour le contrôle automatique du pH par introduction d'alcali Le fermentateur, le dialy seur et le réservoir sont reliés les uns aux autres par des tubes en caoutchouc de silicone.Le dialyseur 3 est construit en matière plastique transparent et la membrane est un tube coupé et ouvert en "Visking normal" de manière à donner une. membrane de 7,5 x 28 centimètres. La surface de la membrane en contact avec le liquide est de 6,5 x I8 centimètres. Un réseau à mailles en matière plastique est installé à côté de la membrane pour provoquer une turbulence dans les liqui des. Le milieu utilisé est un extrait de bouillon (TYLE) de Tryptone/lactose/Le- vure, contenant en poids I,7 Z de tryptone, I,O Z de lactose et Q,3 Z d'extrait. de levure dans 20 mM de phosphate tamponné à pH 6,4. L'appareil est stérilisé par circulation d'eau oxygénée pendant I5 minutes suivies d'un rinçage pendant I5 minutes au moyen d'une solution stérile de Rin gers. Le milieu dans le réservoir et le fermentateur est stérilisé à l'autoclave pendant 20 minutes à 121 C. Les composants du fermentateur sont assemblés asepti- quement et le milieu du fermentateur est inoculé avec un inoculeur contenant 105 cellules viables de streptococcus crémoris (s train Nouvelle-Zélande RI) par mil lilitre.Les contenus du fermentateur et du réservoir sont maintenus à 300C et les liquides envoyés a travers le dialyseur à la vitesse de 250 Rillilitres par minute et recyclés au fermentateur et au réservoir respectivement pour une période de 30 heures. Après un temps de culture de 30 heures, on obtient un titre en cellule de 5 x 1010 millilitres et le pH est tombé de 6,4 à 4,0. TABLEAU I Concentration de L-lactate (g/1) au Max. titre/mil en temps, t (heures) temps, t (heures) Diffusion Vol. du fermentateur (ml) t Fermentateur t Réservoir t x1.09 x 1011 1,500 25.7 22.2 27.0 12.0 27.0 1.64 x 1011 1,000 23.0 32.6 24.0 10.0 24.0 +1.8 x 1011 1,000 42.5 N.E. N.E. 1.12 x 1011 1,000 24.0 N.E. N.E. +8.0 x 1010 1,000 22.5 N.E. N.E. + Présence d'air entraîné à 18 heures réduit le taux de croissance. + Les cellules sont récoltées à ce niveau, avant que le nombre maximum de cellules soit atteint, pour obtenir une grande activité pour usage dans une préparation d'amorceur de petite dimension. x L'analyse de lactose révèle 1,29 g/1 dans le fermentateur. N.E. - non effectué TABLEAU II Max. titre/ml en temps, t (heures) Concentration de L-lactate (g/1) au temps, t (haures) Bain t Diffusion t Fermetatsur t Réservoir t 2.12 x 109x 15.5 2.78 x 1010x 15.5 N.E. N.E. 1.2 x 109x 18.0 2.16 x 1010x 22.5 10.0 23.5 4.5 23.5 1.18 x 109x 18.0 3.88 x 1010 21.7 19.0 24.0 4.05 24.0 2.6 x 109x 19.2 3.44 x 1010 22.5 22.0 24.7 8.0 24.7 2.18 x 109 13.0 N.E. N.E. N.E. N.E. 2.24 X 1010 16.5 N.E. N.E. N.E. 3.1 X 1010 22.7 22.8 4.4 22.8 X Fermentations neutralisées avec de la soude 5 N. N.E. = non effectué Le titre moyen maximum par ml dans la culture de diffusion neutralisée avec de la soude est 2,42 x 1010 et avec l'amoniaque 3,22 x 1010. TABLEAU III Acidité titrable Acidité 6 h titrable Inoculeur en temps, t (h) avec inoculeur en % % acide lactique t 10 % 1 % 1,1 % c.2 x 1010 cellules 0.70 17.0 0.62 0.53 0.36 c.2 x 1010 cellules 0.65 18.5 N.E. N.E. N.E. c.2 x 1010 cellules 0.64 17.5 0.68 0.51 0.25 N.E. = non effectué REVENDICATIONS I. Un procédé pour la production d'une culture concentrée d'un micro-organisme capable de transformer 1e lactose en acide lactique, caractérisé en ce qu'il consiste a à cultiver le micro-organisme dans un milieu nutritif dans une zone de fermentation et à faire circuler le milieu nutritif contenant le micro-organisme cultivé et placide lactique et ses sels de la zone de fermentation A la pre mière chambre d1un dialyseur. a à introduire une solution régénérante dans une seconde chambre du dia- lyseur séparée de la première par une membrane de dialyse ou de diffusion qui est sensiblement imperméable au micro-organisme mais perméable aux éléments nutritifs, à l'acide lactique et ses sels, la solution régénérante ayant une concentration en éléments nutritifs suffisament élevée et une concentration en acide lactique et en sels suffisament basse pour que les éléments nutritifs passent à travers la membrane depuis la solution régénérante au milieu nutritif contenant le micro-organisme cultivé et l'acide lactique et ses sels et pour que l'acide lactique et ses sels passent à travers la membrane depuis le milieu nutritif contenant le micro-organisme cultivé, l'acide lactique et ses sels, a la solution régénérante. à à faire recirculer la zone de fermentation, une solution nutritive contenant des micro-organismes cultivés qui est enrichie en éléments nutritifs et appauvrie en acide lactique et en sels. e à continuer la culture du micro-organisme. 2. Un procédé selon la revendication I, caractérisé en ce que la surface de la membrane en rapport au volume total de la solution nutritive contenant le micro-organisme est suffisament élevé pour maintenir la concentration en acide lactique ou en sels en dessous d'une concentration qui est inhibitoire pour la croissance des micro-organismes. 3. Un procédé selon la revendication I, caractérisé en ce qu'il y a au moins 3 cm2 de membrane par Nillilitre de solution nutritive contenant le micro-organisme. 4. Un procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qutil y a I2 à 2 I5 cm de membrane par millilitre de solution nutritive contenant le micro-or- ganisme. 5. Procédé selon l'une des revendications I a 4, caractérisé en ce que la solution nutritive contenant le micro-organisme cultivé, l'acide lactique et ses sels,est mis en circulation en continu de la première chambre du dialyseur et la solution enrichie en éléments nutritifs et appauvrie en acide lactique et en sels, est continuellement recyclée à la zone de fermentation. 6. Un procédé selon l'une des revendications I à 5, caractérisé en ce que la solution régénérante est continuellement mise en circulation dans un circuit fermé depuis un réservoir à la seconde chambre du dialyseur. 7. Un procédé selon revendication 7, caractérisé en ce que le rapport du volume de la solution régénérante dans le circuit fermé au volume de solution nutritive contenant le micro-organisme cultivé, est d'au moins IO/I. 8. Procédé selon l'une des revendications I à 7, caractérisé en ce que la solution nutritive contenant au moins 5 x 1010 organismes par millilitre, est retirée de la zone de fermentation et est réfrigérée. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le le micro-organisme est le streptococcus crêmoris. IO. Procédé selon l'une des revendications I a 9, caractérisé en ce que le pH du milieu de fermentation est maintenu entre 6 et 7 par addition de soude ou d'am@moniaque II. Procédé selon l'une des revendications I à IO, caractérisé en ce que la vitesse du milieu nutritif contenant le micro-organisme cultivé à la première chambre du dialyseur, est au moins I litre par minute. I2. Culture concentrée de micro-organisme caractérisée en ce qu'elle est obtenue par le procédé défini a l'une des revendications I à à II. I3. Procédé pour la fabrication de fromages caractérisé en ce qu il consiste a inoculer du lait avec une culture de micro-organisme concentrée, obtenue selon revendication 12.