Brevet FR2222334A1 — publié le 19741018

La présente invention a pour objet un radical nitroxyde oxazolidinique utilisé pour le marquage de spins en biologie et son procédé de préparation. Elle concerne également un aminoalcool stéroïdique utilisé comme précurseur pour la prépara- tion au radical précédent ainsi que le procédé de préparation de cet amino-alcool. L'amino-alcool stéroïdique objet de l'invention, et utilisé comme précurseur pour le marquage de spins en biologie est l'amino-3-a hydroxyméthyl-3-ss cholestane-5-a de formule: Son procédé de préparation utilise comme point de départ un composé connu, à savoir l'amino-3-a carboxylic acide-3-ss cholestane-5-a dont la formule est: que l'on obtient par hydrolyse de l'hydantoine correspondante, elle-même obtenue à partir de la cholestane-5-a one-3. (Réf. MAKI, TAKAFUMI, Japan, 6822,095 (1968)). La préparation de l'amino-alcool stéroïdique selon l'invention, s'effectue en soumettant successivement le composé connu précédent à un traitement d'estérification, ce qui conduit à l'amino-3-a carboxylate d'éthyle-3-8 cholestane-5-a, puis à un traitement d'hydrogénation ce qui conduit à l'amino-3-a hydroxyméthyl-3-ss cholestane-5-a, qui est l'amino-alcool stéroïdique objet de l'invention. On va décrire ci-après plus en détail un exemple particulier de mise en oeuvre de la suite des opérations précédentes d'estérification et d'hydrogénation qui permettent de parvenir à cet amino-alcool. Dans cet exemple, on commence par placer 0,410 g d'amino-3-a carboxylic acide-3-ss cholestane-5-a dans l'éthanol en présence d'acide chlorhydrique anhydre. On laisse la réaction s'effectuer pendant 24 heures environ à température ordinaire, puis on évapore, par distillation sous vide, l'éthanol et l'acide chlorhydrique en excès. Le résidu est alors séché sous vide en présence de soude.Ce résidu est constitué de 0,450 g de chlorhydrate d'amino-3-a carboxylate d'éthyl-3-ss cholestane-5-a de formule Le rendement de la réaction précédente est de l'ordre de 95% et les caractéristiques du produit sont vérifiées par analyse à l'aide de tests faits par résonance. magnétique nucléaire sur la solution du produit dans du chloroforme deutéré CDCl3, ce qui donne les résultats suivants: Ch3 : 1 triplet à 1,3 ppm (protons méthyliques de COO-CH2-CH3) Ch2 : 1 quadruplet à 4,2 ppm (protons méthyléniques de COO-Ch2-Ch3) Ch3 : 0,7 ppm, 0,9 et 0,95 ppm, 1,5 ppm (protons méthyliques du stéroïde). On soumet enfin le chlorhydrate précédent à une extraction par l'éther en milieu basique, ce qui conduit à l'amino-3-a carboxylate d'ethyle-3-ss cholestane-5-a de formule: La phase d'esterification étant terminée, on s'y prend alors comme suit pour réaliser l'hydrogénation. A 0,250 g d'hydrure de lithium et d'aluminium en suspension dans l'éther anhydre, on ajoute 0,120 d'amino-3-a carboxylate d'éthyl-3-ss cholestane-5-a. On porte à reflux pendant 24 heures, puis on 3 détruit l'excès d'hydrure par 0,25 cm3 d'eau, 0,25 cm de 3 soude a 15 % et 3 fois 0,25 cm d'eau. On agite avec de l'éther plusieurs fois, on évapore le solvant, et on obtient 0,100 g d'un produit cristallisé blanc, avec un rendement de réaction égal a 92%.Ce produit cristallisé blanc est L'amino-3-a hydroxyméthyl-3-ss cholestane-5-a de formule: On voit que l'hydrogénation a porté sur le groupement carboxylate d'éthyle en position 3ss de l'amino-3-a carboxylate d'éthyle-3-ss cholestane-5-a selon la réaction. L'amino-alcool obtenu a un point de fusion de 158 C; ces caractéristiques analytiques telles qu'elles résultent d'une résonance magnétique nucléaire effectuée en solution dans du chloroforme deutéré CDC13 sont les suivantes: CH2 : 3,2 ppm (protons méthyléniques de CH2OH) CH3 : 0,7 ppm, 0,8 et 0,85 ppm, 0,95 ppm, 1,4 ppm (protons méthyliques du stéroïde). L'amino-alcool ainsi obtenu selon l'invention, est utilisé comme précurseur pour le marquage de spins en biologie. I1 faut entendre par lâ qu'il est capable, en réagissant sur une molécule contenant une fonction cétonique, de conduire à une amine cyclique, laquelle, après oxydation par un peracide, fournit un radical nitroxyde utilisable directement comme marqueur de spins dans les molécules biologiques. Ce radical nitroxyde oxazolidinique, objet de l'invention, a pour formule générale: formule dans laquelle R et R' sont des radicaux alkyles. On va décrire maintenant plus en détail un exemple de mise en oeuvre du procédé qui permet, à partir. de l'aminoalcool obtenu précédemment, de synthétiser un radical nitroxyde oxazol;diniJueparticulier dans lequel les radicaux R et R' sont constitués par le groupement CH3. Dans cet exemple particulier, la réaction de l'amine alcool sur une fonction cétonique est réalisée par cyclisation avec l'acétone et l'oxydation de l'amine cyclique intermédiaire ainsi formée est réalisée à l'aide de l'acide métachloroperben azoïque. On part d'une solution benzénique contenant 0,100 g d'amino-3 ydroxyméthyl-3-S cholestane-5-a, un excès d'acétone et des traces d'acide paratoluène sulfonique. La solution est portée à reflux pendant 240 heures puis on extrait à l'éther et on évapore le solvant.On obtient ainsi 0,105 g d'un produit blanc cristallisant difficilement (rendement de la réaction 95%) qui est le spiro cholestane-5-a -3,4' dimethyl-2', 2' oxazolidine de formule: Les caractéristiques de cette amine cyclique sont vérifiées par une analyse par résonance magnétique nucléaire dans du chloroforme deutéré CDCl3 qui a donné les résultats suivants: CH3 : 1,4 ppm (protons méthyliques de l'oxazolidine > CH2 : 3,6 ppm (protons méthyléniques de l'oxazolidine) CH3 : 0,7, ,8, 0,85, 0,95 et 1,45 ppm (protons méthyliques du stéroïde). On effectue alors la deuxième partie du traitement qui consiste en une oxydation de l'amine cyclique ainsi formée. A cet effet, dans une solution éthérée de 0,105 g de spiro cholestane-5-a -3,4' diméthyl-2' 2' oxazolidine, on ajoute goutte à goutte 0,062 g d'acide métachloroperbenzoïque. On agite la solution à la température ordinaire pendant 6 heures. On lave par une solution de bicarbonate de soude à 5% puis on sèche sur du sulfate de sodium et on évapore le solvant. Après chromatographie sur plaques de silice avec pour éluant un mélange contenant 90% de pentane et 10% d'éther, on obtient 0,044 g d'un produit cristallisé jaune (rendement de la réaction 40%) qui est le spiro cholestane-5-a-3, 4' diméthyl-2', 2' oxazolidine oxyle-3' répondant à la formule: Ce composé est un radical nitroxyde oxazolidinique selon l'invention qui peut être utilisé pour le marquage de spins en biologie. Sa température de fusion est de 1800C. Par résonance paramagnétique électronique en solution dans le chloroforme, on constate que ce corps présente trois raies de résonance de même intensité et dont l'écart hyperfin est a = 15,3 Oe. REVENDICATIONS 1. Radical nitroxyde oxazolidinique utilise pour le marquage de spins en biologie, de formule formule dans laquelle R et R' sont des radicaux alkyles. 2. Radical nitroxyde oxazolidinique selon la revendication 1, caractérisé ence quile,t constitué par le spiro-cholestane-5 n-3,4'- diméthyl-2',2' oxazolidine oxyle-3'. 3. Procédé de préparation du radical selon l'une quelconque des revendications 1 ou2, caractérisé en ce que l'on procède successivement , à partir d'un amino-alcool stéroidique précurseur de formule - à une cyclisation par une fonction cétonique suivie d'une extraction de l'amine cyclique ainsi formée - à une oxydation par un- peracide de l'amine cyclique extraite. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la cyclisation par la fonction cétonique a lieu dans un excès d'acétone en présence de traces d'acide paratoluène sulfonique et en ce que l'extraction de l'amine cyclique formée se fait à l'éther. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le peracide employé pour l'oxydation de l'amine cyclique est l'acide métachloroperbenzoique.