Brevet FR2244542A1 — publié le 19750418

La présente invention concerne la possibilité d'utiliser la lignée cellulaire dite IB-RS-2 pour la production de virus destinés à la préparation de vaccins. La cellule IB-RS-2 a été isolés à l'Institut de Biologie de Sao Paulo et présentée par Mme M'aria PÈREIRA de CASTRO au 14e Congrès annuel de la "Tissus Culture Association" å Boston les 28, 29 et 30 mai 1963. Elle a été dècrite par l'auteur dans: - la revue ARQ. INST. BIOL. SAO PAULO (37 (2), 103-127, 1970; 34, 223-241, 1967; 285-294, -; 295-299, -; 31 (3), 63-78, 1964; 31 (4) 155-166, 1964). Cette lignée cellulaire est issue dtune culture primaire présentant un karyotype normal de femelle (karyotype O) constitué de 38 chromosomes groupés comme suit: 2 G I, 2 G II, 2 G III-1, 2 G III-2, 14 G IV (chromosome de sexe inclus) 4-G V, 2 G VI, 4 G VII, 2 G VIII-1, 4 G VIII-2. L'auteur a décrit dans le détail (ARQ. INST. BIOL SAO PAULO 37 (2) 103-127, 1970) les diverses possibilites de réarrangements chromosomiques qui ont pu se produire au cours de l'évolution de la lignés cellulaire IB-RS-2. Il est à notar que tous les clones cellulaires étudiés et décrits jusqu'à maintenant par l'auteur se caractérisent par le respect des groupes 2 G I, 2 G II, 4 G V, 4 G VII, 4 G VIII-2 alors que tons présentent une modification dans le groupe 2 G III-2 qui devient 1 G III-2. Par divers réarrangements le nombre total de chromosomes peut varier, suivant les clones cellulaires étudiées, entre 37 et 38 chromosomes. Ces caractéristiques chromosomiques correspondent aux clones deja décrits et actuellement utilisés, mais niest pas exclus pour autant la possibilité d'utiliser d'autres clones issus de la ligne IB-RS-2 et comportant des réarrangements chromosomiques différents. Cette lignée cellulaire dite IB-RS-2 peut être multiplée dans les divers milieux utilisés pour la culture cellulaire: milieu synthé- tique typ-e 199 ou milieux à base d'extraits de levure et hydrolysats de caséine ou de lactalbumine. Son taux de multiplication est'élevé et peut atteindre- un facteur de 10 entr chaque -subeulture et nionocouche, La demanderesse a trouvé que la cellule IB-RS-2 peut être cultivée en suspension. Cette culture peut être réalisée dans tout fermenteur utilisé pour la culture cellulaire et équipé de systèmes d'agitation et d'aération. Divers milieux peuvent être utilisés, qui sont å base d'acides aminés et de vitamines, à base d'hydrolysats de protéines et d'extraits de levure. Dans les deux cas, on ajoute un sucre et un milieu physiologique tamponné. Pour les cultures en monocouches ou en Suspension, on ajoute aux milieux de cultures classiques 5 è 10 % de sérum de veau ou de porc, La deianderesse a de plus montre que la cellule IB-RS-2 multipliée en monocouche ou adaptée è la culture en suspension est démunie de pouvoir tumorigène pour le hamster Des hamsters ont été inoculés dans la poche jugale avec respectivement 10 x 106, 2 x 106, 1 x 106 et 1 x 105 cellules vivantes. Un petit nodule se développe dbs le 5ème jour après inoculation de 10 x 106 cellules et disparatt progressivement è partir du 10ème jour. Ce nodule est imperceptible après 1 mois et a disparu complètement après 2 mois.Avec les concentrations inférieures : Z x 106 et en-deesous, il n'y a aucun nodule même à 5 jours. D'autre part, on a rapporté (S.S. Breese ; Archiv. fur die Cassante Virusforschung 30, 401-404, 1970) que la cellule IB-RS-2, de mime que la lignée cellulaire porcine PK 15, contiennent des particules ressemblant b des virus, ayant un diamètre moyen extérieur de 90 m. et un noyau central de 60 m Ces particules ressemaient: a celles/décrites pour la lignée cellulaire BHK 21. L'invention a principalement pour objet l'emploi de la cellule IB-RS-2 pour la multiplication de divers virus et la préparation de suspensions virales utilisées soit a des fins de diagnostic, soit pour la préparation de vaccins. Les chercheurs de l'institut de Biologie de Sao Paulo qui ont isolé la lignée cellulaire 'IB-RS-2 ont déjà décrit la sensibilité des divers clones de cette lignée cellulaire au virus aphteux :(ARQ. INST. BIOL. SAO PAULO, 31 (3), 63-78, 1964 ; 31 (4) 155-166, 1964 ; 37 (2) 103-127, (1970). L'origine porcine de la cellule IB-RS-2 fait qu'elle convient particulièrement bien a la multiplication de tous les virus provoquant des maladies chez cette espece animale, les suspensions virales obtenues permettent la préparation de vaccins ne présentant pour l'espèce porcine aucun des dangers de sensibilisation consécutifs a l'emploi de cellules hétérologues. La demanderesse a maintenant trouvé que la cellule IB-RS-2 est porteuse b l'état permanent d'un virus atténué de la peste porcine, que ce virus est exempt de tout pouvoir pathogène pour le porc mais peut lui confére une immunité spécifique élevée, le protégeant complètement contre une épreuve virulente de la peste porcine. Ce virus atténue existe dans les cellules intactes (virus intra-cellulaire) et peut être récupéré par lyse cellulaire obtenue par les moyens physico-chimiques connus, Le virus existe également dans le liquide de culture de la cellule IB-RS-2. Ltinvention a donc pour objet l'emploi de ce virus comme souche vaccinale (vaccin vivant atténué). Les exemples I, 2 et 3 illustrent l'emploi du virus atténué as trouvant dans les cellules IB-RS-2, comme souche vaccinale contre la peste porcine. EXEMPLE 1: Utilisation de liquide de culture de la cellule IB-RS-2 comme vaccin vivant contre la peste porcine. Un lot de 10 porcs reçoit 5 mi de liquide de culture ayant servi 3 la multiplication de la cellule IB-RS-2 en monocouche. Pendant une durée d'observation de 25 joure, aucun animal ne présente d'élévation thermique. A la fin de cette période les porcs sont éprouvés avec i ml de sang virulent de porc prélevé lors de la virémie, et dilué d 1/10e. Après épreuve1les animaux sont conservés en observation durant 15 jours. Aucun de ces animaux n'a présenté d'élévation thermique significative, ni aucun signe de la maladie peste porcine. EXEMPLE 2 Utilisation des cellules IB-RS-2 vivantes comme vaccin vivant contre la peste porcine. 10 animaux sont vaccinés dans les mêmes conditions que dans l'exemple 4 avec 10.106 cellules IB-RS-2 vivantes par animal. La tolérance a été parfaite, aucune élévation thermique significative durant les 24 jours d'immunisation. Ia protection contre l'épreuve virulente exécutée comme à l'exemple 4 a été totale. EXEMPLE 3 Utilisation des cellules IB-RS-2 lysées comme vaccin vivant contre la peste porcine. Un lysat obtenu par congélation et décongélation de cellules IB-RS-2-,mélangéavec du liquide de culture, a été soumis à la lyophilisation. Le produit obtenu constitue un vaccin vivant contre la peste porcine. Afin de déterminer son titre protecteur et sa tolérance, ce vaccin a été inoculé, aux dilutions de 10 à 10 10-5, a -des lots de 5 porcs. Pendant la durée d'immunisation, aucun animal n'a présenté d'élévation thermique significative. Par la suite,sles animaux ont été éprouvés par 1 ml de sang virulent. On a ainsi calculé- le pouvoir protecteur qui a été trouvé égal à 10 4. Le vaccin contient donc 104 particules immunisantes. R E V E N D I C A T I O N S 1. Procédé de culture de virus de -la peste porcine, caractérisé par le fait-qu'on cultive en monocouches ou en suspension une lignée de cellules de reins de porcs, isolée et conservée à l'Institut de Biologie de Sao Paulo, désignée " cellule IB-RS-2 ", et qu'on récupère le virus de la peste porcine préexistant dans les cellules. 2. Procédé de- préparation d'un vaccin vivant atténué de la peste porcine, caractérisé par le fait qu'on cultive les cellules IB-RS-2 selon la revendication 1, qu'on recueille le liquide de culture qui contient le virus atténué de la peste porcine, et qu'on le lyophilise. 3. Procédé selon-la revendication 2 caractérisé par le fait qu'pn lyse les cellules'IB-RS-2 de la culture par congélatioff et décongélation, avant de recueillir le liquide, qui'contient le virus atténué de la peste porcine, et de la lyophiliser.