Brevet FR2235136A1 — publié le 19750124

Cette invention se rapporte à un procédé de préparation de la 3-(méthylmercapto)-propylaminobléomycine (dénommée ci-après "déméthylbléomycine A211) et plus particulièrement à un procédé de préparation de la déméthylbléomycine A2, où, la 3-(S,S-diméthylmercapto) propylaminobléomycine (dénommée ci-après "bléomycine A2") est aécomposée dans un solvant renfermant une base. La déméthylbléomycine A2 qui peut outre ohtenue conformément àla présente invention est un composé représenté par la formule développée indiquée ci-après dans laquelle R représente -NH-(CH2)3-S-CE3 et qui possède une activité antibiotique extr8mement grande.Par exemple, vis-à-vis du "Mycobalderium smegmatis 607,elle a un titre de 2458 mcg/mg, tandis que la bléomycine A2 a un titre de 1000 mcg/mgO En outre, en ce qui concerne la DL50, avec 10 jours successifs d'administration intrapéritonéale à des souris porteuses de tumeurs malignes ICR, la bléomycine A2 a la valeur de 12,5 mg/kg, tandis que la déméthylbléomycine A2 a la valeur de 22,5 mg/kg, ce qui montre que la toxicité est réduite à approximativement la moitié de la toxicité de la bléomycine A2 Ainsi, la déméthylbléomycine A2 est une substance utile en tant qu'antibiotique ayant une activité anti-cancéreuse. - voir structure page 2 Bes substances anti-cancéreuses telles que les bléomycines sont obtenues en cultivant une souche productrice de bléomycine appartenant au streptomyces verticillus dans un milieu nutritif (c.f. par exemple le brevet japonais n 465.525). En outre, si l'on effectue la culture de la manière exposée précédemment, on ajoute dans le milieu en tant que progéniteur un composé aminé ayant à la fois un groupe basique et un groupe amino primaire, il est possible d'obte nir sélectivement des bléomycines connues ou nouvelles dont les chaînes latérales comprennent le reste du composé aminé (c,f. par exemple, brevet belge n 745.926). Structure de la bléomycine R = NH - (CH2)3 - S - OH, (déméthylbléomycine A2) (Bléomycine A2) Cependant, la 3-(méthylmercapto)propylamine correspondant au fragment amino dans la channe latérale de la déméthylbléomycine A2 n'a pas d'autres groupes basiques que le groupe amino primaire de sorte que si l'on cultive ùne souche productrice de bléomycine dans un milieu de culture où l'amine a été ajoutée comme progéniteur, la fixation de l'amine dans la molécule de bléomycine ne se produit que dans une faible mesure, et l'on ne peut extraire et isoler de la culture qu'une petite quantité de déméthylbléomycine A2 Fujii, l'un des inventeurs de la présente invention, ainsi que d'autres chercheurs, ont découvert antérieurement un procédé de préparation de la déméthylbléomycine A2 par une réaction de déméthylation par décomposition thermique de la bléomycine A2 solide (coke brevet anglais nO 10310ç218) mais ce procédé ntest pas nécessairement un procédé idéal et aussi du point de vue du rendement, car du fait qu'il s'agit d'une réaction en phase hétérogène ou pour d"au- tres raisons, les matières de départ et des impuretés.différente s du produit désiré sont présentes dans le produit de la réaction. La demanderesse a découvert au cours drêtu des approfondies en ce qui concerne la réaction de déméthylation que tandis que la réaction de déméthylation se développe peu si l'on dissout la bléomycine A2 dans un solvant neutre tel que le méthanol ou l'eau en chauffant après. elle steffec- tue très efficacement si l'on ajoute à la solution une base organique telle que la pyridine, la pipéridine ou la morpholine et si l'on abandonne la solution à la température ambiante ou si on la chauffe, on obtient la déméthylbléomycine A2 désirée avec un rendement extrêmement satisfaisant. En outre, il est également remarquable qu'avec l'invention on peut obtenir quantitativement de la déméthylbléomycine d'une grande pureté. On considère que ce haut rendement doit provenir du fait que la déméthylation est accélérée au cours de la réaction en phase homogène dans le solvant renfermant une base en s'achevant ainsi à des températures relativement basses en une période de temps courte. Dans le procédé de la présente invention , la bléomycine A2 obtenue par culture (qui renferme du cuivre et figure sous forme de chlorhydrate) peut être utilisée telle quelle, bien que la bléomycine A2 puisse renfermer un quelconque anion car la nature de l'anion dans la bléomycine A2 nla pas un effet important sur la déméthylation. I1 est aussi possible d'utiliser comme matière de départ dans le présent procédé de la bléomycine A2 exempte de cuivre, par exemple au moyen d'un traitement par l'hydrogène sulfuré. Pour préparer la déméthylbléomycine A2 selon la présente invention par déméthylation de la bléomycine A2, on peut dissoudre la bléomycine A2 dans un solvant approprié ou dans un mélange de solvants convenables et ajouter une quantité adéquate d'une base à la solution puis abandonner le mélange à la température ambiante ou le chauffer à 20 100 C pendant 0,5 à 100 heures. Ces solvants sont par exemple l'eau ou des solvants miscibles à l'eau tels que les alcools inférieurs, par exemple le méthanol ou l'éthanol, des cétones inférieures, le dioxane ou le tétrahydrofurane, bien que les solvants différents de l'eau et du méthanol qui ne sont pas miscibles avec ces deux solvants ne conviennent pas, car la matière de départ et le produit désiré sont insolubles dans des solvants différents de l'eau et du méthanol En outre, au point de vue du rendement élevé et de la facilité de manipulation, le méthanol serait le solvant le plus adéquate La base qui est ajoutée dans le procédé de l'invention est choisie, par exemple, parmi les amines aliphatiques telles que la méthylminA1,1éhylamine, la dimé la triéthylamine thylamine, la triméthylamine,/l'éthylènediamine, la triméthylènediamine, la méthanolamine et 1'éthanol-amine ; les amines alicycliques telles que la pipéridine, la pyrrolidi he, la morpholine et la cyclohexylamine ; les amines aromatiques telles que la pyridine, la collidine, la picoline, la pyrimidine, la quinoline,l'isoquinoline, la benzylamine et l'aniline ; et les bases minérales telles que l'ammoniaqie, le bicarbonate de sodium, le carbonate de sodium et le carbonate de potassium.En ce qui concerne le endement, les bases organiques ayant une valeur de pEb de l'ordre de 1 x 10 2 à 1 x 10 9 , telles que la pyridine, la morpholine, et la pipéridine-, seraient les plus adéquates. La quantité de la base qui est ajoutée au solvant de la réaction, la température de la réaction et la durée de la réaction dépendent de la nature de la base qui est utilisée Ainsi, par exemple, si l'on utilise de la mor pholine ayant une valeur de pKb de 1 x 10 -3 pour un rapport volumétrique du méthanol à la morpholine de 5 : 1 , une réaction de cinq heures à une température de 70 à 730C fournira le produit désiré presque quantitativement, bien que la format ion de sous-produits ait tendance à augmenter en fonction de la durée de la réaction, de la température de la réaction et de la concentration de la morpholine dans le mélange réactionnel en diminuant ainsi le rendement.Si l'on utilise de la py ridine ayant une valeur de pgb de 2,3 x 10 -9 pour un rapport volumétrique méthanol-pyridine de 5 : 2, on obtient le produit désiré quantitativement avec une réaction de 30 à 40 heures à 76 - 7900 (en chauffant au reflux). De préférence, la température de la réaction est-de l'ordre de 60 à 800C, bien qu'il soit favorable de régler convenablement la température d'après la basicité de la base utilisée. En effectuant la réaction selon le procédé de l'invention, le mélange réactionnel ne contient presque pas de matières de départ ou d'impuretés. Ainsi, par exemple1 quand on utilise du méthanol comme solvant pour la réaction on peut ajouter directement 2 à 5 volumes d'un éther dans le mélange réactionnel pour précipiter la déméthylbléomycine A2, et ensuite séparer le précipité par filtration et le faire sécher pour obtenir de la déméthylbléomycine A2 presque pure. Pour obtenir de la déméthylbléomycine A2 roduit purifiée davantage, on peut inåecter une solution aqueuse du/ précipité par l'éther susmentionné, ou bien le mélange réactionnel dilué d' eau, dans une colonne garnie de O C - 25', pour adsorber la déméthylbléomycine A2, et en- suite l'éluer et la séparer en utilisant une solution aqueuse de chlorure d'ammonium. Après cela, on ajoute du-charbon actif aux fractions d'éluat, ou bien l'on fait passer les fractions dans une colonne garnie d'une résine échangeuse d'ions, Amberlite # CG - 50", en effectuant ainsi dans chaque cas, l'adsorption du produit désiré. Ensuite, dans chacun de ces cas, on lave le produit désiré, adsorbé, avec de l'eau ou bien successivement avec de l' u , lt solution S se d'acide acétique à 0,5 % et de l'eau, puis on l'élue avec un mélange d'acétone et d'acide chlorhydrique 0,02 n (1 : 1 en volume), puis on le concentre et on le fait sécher pour obtenir du chlorhydrate de déméthylbléomycine A2 dessalé et d'une grande pureté. La déméthylbléomycine qui peut entre préparée par le procédé de l'invention est tout à fait identique, en ce qui doncerne ses propriétés physicochimiques, à la déméthylbléomycine A2 témoin obtenue par le procédé de décomposition bien connu. La présente invention sera exposée d'une manière plus détaillée dans les exemples explicatifs et non limitatifs suivants. Exemple suivants. Exemole 1 On dissout 500 mg de bléomycine A2 (renfermant du cuivre et sous forme de chlorhydrate) dans un mélange de 25 ml de méthanol et 10 m1 de pyridine, et on fait bouillir la solution au reflux pendant 40 heures. Lorsque le mélange réactionnel est refroidi, on y ajoute 70 ml d'éther et on sépare par filtration le précipité qui s'est formé, on le lave à l'éther et on le fait sécher sous pression réduite dissout le produit sec dans 50 ml d'eau et on l'injecte dans une colonne garnie de 100 ml de 11Cfl-Sephadex &commat; 0-25" en suspension dans une solution aqueuse de chlorure d'ammonium (0,02 M) pour adsorber le produit désiré, puis on l'élue avec 400 ml d'une solution aqueuse de chlorure d'ammonium (0,1 M).On fait passer la dernière portion de 100 ml de l'cffluent renfermant la déméthylbléomycine A2, dans une colonne garnie de 75 ml"d'Amberlite # CG-50 (forme H)" en suspension dans l'eau pour adsorber le produit désiré, que l'on lave ensuite avec successivement 380 ml d'eau, une solution aqueuse d'acide acétique à 0,5 % et de l'eau, puis on l'élue avec un mélange d'acide chlorhydrique (0,02 n, et de méthanol (1 : 1 en volume) On évapore à sec l'élut sous pression réduite pour obtenir 400 mg de déméthylbléomycine A2 (renfermant du cuivre) sous forme de chlorhydrate ayant un titre de 2420 mcg/mg et dont la couleur est bleue. Le produit se décompose lentement à des températures de l'ordre de 201 à 21200. Exemple 2 -On dissout 500 mg de chlorhydrate de bléomycine A2 renfermant du cuivre dans un mélange de 5 mi de métha nol et I mi de morpholine et on le chauffe â 720C pendant 5 heures. On ajoute au mélange réactionnel 15 ml d'éther pour faire précipiter le produit désiré, ensuite, on le sépare par filtration, on le lave avec de l'éther, et on le fait sécher sous pression réduite. On dissout le produit sec dans 60 ml d'eau et on l'injecte dans une colonne garnie de 100 ml de"CM-Sephadex O # C - 25" en suspension dans une solution aqueuse de chlorure d'ammonium (0,02 M) pour adsorber le produit désiré, que l'on élue ensuite avec 400 ml de solution aqueuse de chlorure d'ammonium (0,1 N).On fait passer la dernière portion de 00 ml de l'effluent, renfermant la déméthylbléomycine A2 dans une co lonne garnie de 75 ml d'Amberlite co # - 50- (forme Hr en sus- pension dans l'eau pour adsorber le produit désiré, que l'on lave ensuite avec successivement 380 ml d'eau, une solution aqueuse d'acide acétique à 0,5 % , et de l'eau et qu'on élue avec un mélange d'acide chlorhydrique (0,O2n ) et du méthanol ( 1 : 1 en volume). Ensuite, on évapore à sec l'éluat pour obtenir 370 mg de chlorhydrate de déméthylbléomycine A2 renfermant du cuivre et ayant un titre 2400 mcg/mg , et dont la couleur est bleue. exemple 3 On dissout 100 mg de chlorhydrate de bléomycine A2, exempte de cuivre, dans un mélange de 1 ml de méthanol et 0,2 ml de morpholine et on effectue la réaction à 700C pendant 3 heures. On ajoute 3 ml d'éther au mélange réactionnel pour faire précipiter le produit désiré, ensuite, on le sépare par filtration, on le lave avec de l'éther et on le fait sécher pour obtenir 96 mg de chlorhydrate de déméthylbléomycine A2 - exempte de cuivre et ayant un titre de 2000 mcg/mg , et dont la couleur est bleue et la pureté de 90 * . ExemPle 4 On dissout 20 mg de chlorhydrate de bléomycine A2 renfermant du cuivre dans 0,5 ml de chacun des systèmes de solvants énumérés au tableau 1, et on chauffe à 720C pendant 5 heures0 On sépare les produits de la réaction par chromatographie en couche mince (adsorbant ; gel de silice, agent de développement : acétate d'ammonium à 10 % - ammoniaque à 10 % - méthanol, 9 : 1 : 10 en volume), et on les analyse pour connaître la teneur en déméthylbléomycine A2 avec -un densitomètre pour obtenir les résultats indiqués au tableau 1. TABLEAU 1 Système de solvants Composition Rendement % en rapport en déméthyl volume tri que bléomycine A2 Pyridine-méthanol 1 : 1 31 Pyridine-tétrahydrofurane aqueux 60 ffi Pyridine-dioxane aqueux à 60 * n 15 Gamma-collidine-méthanol " 25 Alpha-picoline-méthanol 23 Quinoline-méthanol 1 7 Morpholine-méthanol 1 : 5 96 Pip éridine-méthanol n 90 Pyrrolidine-méthanol n 92 Ethanolamine-méthanol " 88 Triméthylènediamine-méthanol " 86 Triéthylamine-méthanol 0,5 : 5 79 Cyclohexylamine-méthanol 1 : 5 62 REVENDICATIONS 1 - Procédé de préparation de la 3-(méthylmercapto- propylamino-bléomycine, dans lequel on décompose la 3-(S,S diméthylmercapto)propylaminobléomycine dans un solvant renfermant une base. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la décomposition est effectuée à une température de 20 à 1000C pendant 0,5 à 100 heures. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le solvant est : l1eau, le méthanol et leurs mélanges avec l'éthanol, une cétone inférieure, le dioxane ou le tétrahydrofurane. 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la base est une amine aliphatique, une amine alicyclique, une amine aromatique, ammoniaque ou un carbonate de métal alcalin. 5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'amine alicyclique est la pipéridine, la pyrrolidine ou la morpholine. 6 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'amine aromatique est la pyridine. 7 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'amine aliphatique est : l'éthanolamine, la triéthylènediamine ou la triéthylamine.