Brevet FR2233623A1 — publié le 19750110

La présente invention concerne un densitomètre destiné à la mesure et à la détermination des vitesses relativesde migration de fractions de protéines séparées les unes des autres par électrophorèse ou par des procédés analogues. Le domaine d'application de l'invention est la médecine et la biologie. Il existe différents procédés pour la séparation d'un mélange de fractions de protéines en différents éléments. La séparation peut être réalisée dans diverses matières ayant des propriétés optiques- et une épaisseur qui varient. Dans les procédés existants de séparation, on obtient un dessin de lignes ayant une largeur et une distance interne allant de 25 microns à plusieurs millimètres, sur les diverses lignes. Le problème est la réalisation d'un densitomètre ayant une résolution suffisante pour la détermination des plus petits détails sans sensibilité aux va- riationsd'épaisseur ou de dispersion lumineuse de la matière. AInsi, l'invention concerne un appareil quipeut zetre utilisé pour le plus grand nonbre possible de procédés. Le prin cipe habituel de tels appareils est le passage d'un objet dans un faisceau lumineux et la mesure de l'absorption lumineuse dans le dessin de lignes ou raies à laide dtun transducteur photoélectrique. L'absorption de la lumière visible peut entre mesurée dans les bandes colorées ou ltabsorption de la lumière ultraviolette peut être mesurée dans les bandes non colorées. Le problème le plus important et l'enregistrement de détails inférieur à 100 microns environ. Lors de l'utilisation d'une optique de microscope, on peut obtenir une résolution d'objets ayant l'épaisseur d'un film. Lorsque 11 épaisseur de l'objet augmente, la profondeur de champ pose des problèmes étant donné la déformation des courbes enregistrées d'absorption. On a aussi utilisé la solution suivante. L'objet est éclairé par une image proåetée de la source lumineuse; Une lentille détectrice forme une image agrandie de l'objet sur une fente. Les possibilités de l'optique à faire la différence entre deux bandes adjacentes dépendent du rapport de la fente au grossissement de l'appareil. La figure 1 du dessin est une couve d'un tel appareil. La lumière provient d'une lentille convergente et passe dans le gel entre deux bandes colorées.Lorsque l'objet se déplace dans le faisceau lumineux, le signal parvient au transducteur photoélectrique et comprend deux pics avec un creux entre eux, la profondeur du creux dépendant de l'étaisseur de l'objet t, de la distance d entre les bandes et de l'angle d . La relation entre ces paramètres est donnée par l'équation d = t.tg 6 j2 La plus courte distance d qui peut entre notée est une mesure de la résolution de l'instrument. Il est clair que la résolution d'un tel appareil dépend beaucoup de l'épaisseur t de l'objet. De plus, il ne peut Qtre utilisé que pour les mat ères créant une faible dispersion de la lumière. Les considérations qui précèdent mon-trent que de nombreux avantages découleraient de la suppression de l'image agrandie de l'objet, pourvu que la résolution ne soit pas réduite. L'invention -concerne la possibilité d'obtention d'une résolution suffisante avé-c de la lumière parallèle, sans grandissement de ltobået. D'abord, on a utilisé un laser mais sans succès. Il semble que la lumière cohérente donne un grandissement étant donné le facteur de diffraction5 avec un niveau accru de bruit dans les courbes d'absorption. Ensuite, on aemis au-point l'appareil-de l'invention représenté la la figure 2. Ainsi, cet appareil est tel que l'objet est déplace perpendiculairement au faisceau lumineux et, derrière l'objet, une fente est placée perpendiculairement à 12 direction de déplacement, la lumière provenant de la fenteparvenant à un photomultiplicateur. L'appareil est caractérisé par la lumière parallèle qui est utilisée en combinaison avec une fente particulière disposée aussi près que possIble derrière l'objet sur le trajet de la 1unJère ctest-à-dire sans grandissement de ltim2ge de l'objet. D'autres caractéristiques et avantages de l'inven- tion ressortiront mieux de la description qui va suivre, faite en référence au dessin annexé sur lequel, la figure 1 ayant déjà été décrite, la figure 2 représen-te schématiquement un mode de réalisation de l'invention. Pour que l'angle 0 (figure 1) soit aussi faible que possible, la source lumineuse 1 doit être aussi petite que possible et; placée aussi loin de l'objet que possible. La limi tct donnée par la dimension de l'appareil ainsi que par la quantité de lumière nécessaire à la détection. Une source lumineuse de forte intensité est utilisée étant donné l'étro- teste de la fente qui est nécessaire dans l'appareil. Lors de 'analyse de bandes non colorées par de la lumière ultraviolette, une source lumineuse toit donner une quantité relativement grande de lumière dans la plage de longueurs d'onde utilisée en réalité.La lampe est alimentée par une source de tension bien régulée. La lumière passe dans une lentille cylindrique 3 qui a une distance focale relativement importante, la source lun1ireuse étant placée au foyer de la lentille. Lorsqu' on utilise de la lumière ultraviolette, la lentille doit entre en quartz. Une fente large 4 est placée entre la lentille et l'objet de manière quelle réduise la lumière trop abondante et les élargissements par réfraction dans la matière. L'objet est monté entre de mincas lames fixes de verre ou de quartz dans le cas de la lumière ultraviolette et il est placé sur la platine non représentée sur la figure 2. I1. s'agit d'une platine qui peut entre déplacée par un moteur réglable. Un mouvement régulier est nécessaire. La fente détectrice 7 est placée derrière l'objet sur le trajet de la lumière. On a essayé une fente formée sur un négatif photogra- phique, mais rne telle fente n'est pas suffisamment opaque étant do.mé la source lumineuse intense. On utilise une lame de quartz sur laquelle une couche de métal a été formée par évaporation, une fente ayant été attaquée chimiquement dans la couche métallique. La largeur de cette fente doit être inférieure au plus faible détail du dessin linéaire qui doit être détecté. En pratique, la fente doit avoir une largeur de 10 microns pour l'enregistrement des plus petits détails. La longueur de la fente est égale à 2 min. Lorsque la fente est plus courte, l'instrument est sensible aux varias ions de l'épaisseur de la matière. Une fente trop longue rend l'instrument sensible au manque de parallélisme entre les lignes formées et la fente. Il est essentiel que l'objet soit placé aussi près de la felle 7 que possible car l'élargissement par réfraction-dans la matière réduit alors la résolution. Il est possible que cette distance soit réduite à 1,5 mm comme décrit dans la suite.L'axe longitudinal de la fente est marqué sur la platine de manière que le dessin linéaire de l'objet puisse tire disposé parallèlement à la fente. Un filtre optique e est disposé-derrière la fente et limite la lumière à la partie du spectre dans laquelle le dessin a l'ab sorption la plus grande. Un photomultiplicateur 9 de sensibilité élevée pour la longueur d'onde utilisé est disposé dans un cylindre étanche. La lame de quartz et la fente détectrice sont fixées à l'extrémité de ce cylindre. De cette manière, il n'est pas nécessaire que l'appareil ait un couvercle étanche à la lumière, comme dans le cas de l'utili- sation de la lumière ordinaire.Le signal provenant du photomultiplicateur est amplifié et transformé logarivhmiquement. On considère maintenant les avantages de l'appa- reil de la figure 2. Cet appareil a d'abord une résolution de l'ordre de 25 microns dans un gel de polyacrylamide de 8 mm d'épaisseur. Ensuite, il est relativement insensible aux va- riations d'épaisseur de la matière. Un gel de polyacrylamide ayant une épaisseur-variant entre Q,9 et 8 mm peut titre analysé sans distorsion visible des pics Ensuite, des matières peuvent être analysées avec des propriétés optiques différentes et on a essayé par exemple un gel de polyacrylamide, un gel transparent d'amidon, un gel d'agarose et un gel d'agar. Enfin, la réalisation est simple et comprend un petit nombre d'éléments simples.Le montage est simple et l'optique conteuse est réduite au minimum. Cette caractéristique est particuliere- ment importante-lors d'une analyse avec de la lumière ultraviolette car le prix d'une optique coûteuse en quartz est considérablement réduit. Un couvercle étanche à la lumière n1 est pas nécessaire. On considère maintenant un mode de réalisation particulier. La source lumineuse I est une lampe à halogène de 12 V, 50 W, ayant un filament de 2 min de largeur. La lampe est alimentéé par une source de tension ayant une précision meilleure que 1 % et qui peut entre régulée entre 1 et 12 V. Elle est placée de man-ère qu'elle forme une source lumineuse avec une fente de I mm de largeur portant la référence 2 et associée à une lentille 3 de 25 min de diamètre et de 500 min de distance focale. Une fente relativement large 4 est réalisée par exemple avec une lame de rasoir, et a une largeur de 1 mm; est placée juste après la lampe. L'objet 5 est montré entre les deux lames de verre et il est disposé dans une gorge profonde d'un chassis en "Perspex". Ce châssis comporte deux fentes à sa partie inférieure, entourant deux courroies de transport. De cette manière, ltobJet est placé à 1,5 mm de la fente détectrice.Les courroies de transporteur comprennent deux joints toriques tendus sur deux axes montés sur des roulements à billes et entraînés par un moteur pas à pas reglable. Les joints toriques sont portés par une couche métallique La fente 7 de détection a une largeur de 10 microns et une longueur de 2 min et elle est formée par attaque d'un métal appliqué par vaporisation sur une lame de quartz. Les défauts de la couche métallique sont réparés par utilisation de peinture noire.La lame de quartz est collée sur une plaque métal ligue circulaire qui est montée dans 11 embout d'un cylindre métallique. Un filtre optique, ayant une longueur d'onde centrale de 626 -nm une largeur de bande passante de 14,5 nm et une transmission maximale de 41 % est fixé de manière correspondante sous la fente détectrice. Un photomultiplicateur 9 de tyW,e "EMI 9558" est fixé derrière le fil te et il est refroidi par de la neige carborsiquee Le signal du photomuntiplicateur gst amplifié et transforme logarithmiquement puis enregistré sur un enregistreur linéalre. il est bien entendu que l'invention n'a été décrite et représente qu'à titre d'exemple préférentiel et qu'on pourra apporter tout équivalence technique dans ses éléments constitutifs sans pour autant sortir du cadre de l'invention, qui est défini dans les revendications annexées, REVENDICATIONS 1. Densitomètre destiné à déterminer la concentration d'éléments répartis géométriquement dans un substrat, à laide d'un faisceau lumineux dans lequel se déplace le substrat, une fente perpendiculaire à la direction de déplacement du substrat et destinée à transmettre la lumière à un photomultiplicateur étant placée derrière le substrat par rapport au trajet de la lumière, ledit densitomètre étant caractérisé en ce que le substrat est traversé par de la lumière parallèle qui passe sans grandissement vers la fente qui est placé juste derrière le substrat. 2. Densitomètre selon la revendication 1, caractérisé en ce que la fente est formée par attaque chimique d'une couche métallique formée par évaporation sur une lame transparente.