Brevet FR2223384A1 — publié le 19741025

La présente invention concerne un procédé d'isolement de la phosphatase acide à partir du mycélium d'aspergillus, cette phosphatase trouvant des applications en tant que réactif dans les recherches scientifiques en biologie moléculaire et biochimie clinique, ainsi que dans le diagnostic oncologique, étant donné qu'elle participe au métabolisme des hydrates de carbone, des phospholipides, des phosphoporotéides et des acides nucléiques. L'activité de la phosphatase peut servir d'indice d'intensité de divers processus biochimiques cellulaires. On connait déjà différents procédés de préparation de la phosphatase acide à partir de matières premières d'origine animale (le foie, les érythrocytes, l'encéphale, etc.) et végétale (les céréales, la pomme de terre, etc.), ainsi qu'un procédé de préparation de la phosphatase acide à partir d'Aspergillus oryzae, Aspergillus awomori, Aspergillus nidulans, qui consiste à broyer le mycélium d'aspergillus et on le soumet à une extraction à l'eau dans un rapport de 1:5, pendant 5 heures. On précipite l'enzyme à partir de l'extrait en le saturant deux fois avec du sulfate d'ammonium, jusqu'à 20% la première fois et jusqu'à 60% la seconde. On dialyse le précipité obtenu par rapport à l'eau distillée pendant 3 jours et on lyophilise. L'inconvénient des procédés connus de préparation de la phosphatase acide est la faible activité de l'enzyme obtenu à partir des matières premières d'origine animale et végétale. Le procédé de préparation de la phosphatase acide par voie microbiologique n'a pas été réalisé à l'échelle industrielle L'objet de l'invention est de supprimer l'inconvénient précité. Conformément à cet objectif, l'invention vise, par un choix judicieux du nouveau type de matière première et des conditions technologiques appropriées, à obtenir un enzyme de haute activité, ainsi qu'à utiliser comme matière première les rebuts de fabrication de l'acide itaconique, ce qui rend le procédé économiquement avantageux. La solution consiste en ce que dans le procédé d'isolement de la phosphatase acide à partir du mycélium d'Aspergillus par extraction, précipitation de l'enzyme à partir de l'extrait obtenu, dialyse et séchage, suivant l'invention on effectue l'isolement de la phosphatase acide à partir du mycélium d'Aspergillus appartenant à l'espèce d'Aspergillus terreus. I1 est rationnel de réaliser le processus d'isolement par broyage du mycélium d'Aspergillus terreus, extraction avec de l'eau distillée ou de l'eau distillée acidulée à un pH de 2 à 6, ou avec un tampon phosphate à un pH de 7 à 7,5 pendant une heure, par précipitation de l'enzyme à partir de l'extrait obtenu, par sa double saturation avec le sulfate d'ammonium, jusqu'à 50% la première fois et jusqu'à 804 la seconde fois, par séparation du précipité et dialyse subséquente contre l'eau distillée jusqu'à l'élimination complète du sulfate d'ammonium, et par lyophilisation avec obtention du produit visé. I1 est avantageux d'effectuer l'extraction du mycélium, la précipitati-on de l'enzyme, la dialyse et le séchage à une température de 4 C. On peut également conduire l'isolement de la façon suivante. On soumet le mycélium broyé d'Aspergillus terreus à ltextraction avec de l'eau distillée ou de l'eau distillée acidulée à un pH de 2 à 6, ou avec un tampon phosphate jusqu'à un pH de 7 à 7,5 pendant une heure, on précipite l'enzyme à partir de l'extrait obtenu par traitement de l'extrait avec un alcool inférieur dans un rapport de 1;2, le résidu d'enzyme étant séparé et lyophilisé. I1 est avantageux de réaliser l'extraction. du mycélium, la précipitation de l'enzyme, la dialyse et le séchage à une température ne dépassant pas 4 C. Le procédé en question est mis en oeuvre de la manière suivante. On broie le mycélium d'Aspergillus terreus. On utilise un mycélium d'âge quelconque, de préférence dès le 10èmè jour. On conduit l'extraction à l'eau distillée refroidie jusqu'à 4 C, pendant une heure, à une température de 4 C, dans un rapport mycélium - agent d'extraction de 1:4, sous agitation. Après l'extraction on sépare les cellules de mycélium et on les rejette. Dans l'extrait obtenu on précipite l'enzyme, par saturation avec du sulfate d'ammonium jusqu'à 50 806. On sépare le précipité formé, on le dissout dans une quantité minimale d'eau distillée et on le soumet à la dialyse contre l'eau distillée à une température ne dépassant pas 4 C sous agitation jusqu'à l'élimination complète du sulfate d'ammonium. Après dialyse on lyophilise le produit à une température ne dépassant pas 40C. On peut précipiter l'enzyme par traitement de l'extrait obtenu avec un alcool inférieur pris dans un rapport de 1:2 à une température ne dépassant pas 4 C. On lyophilise le précipité formé. On obtient 0,2 g de phosphatase acide par kilogramme de mycélium ayant une activité de 2,0 à 3,0 unités/mg. Le procédé d'isolement de la phosphatase acide à partir du mycélium d'Aspergillus terreus permet d'employer en tant que matière première les rebuts de fabrication de l'acide itaconique (mycélium d'Aspergillus terreus), ce qui rend le procédé économiquement avantageux, et également d'obtenir un enzyme de haute activité (2,0-3,0 unités/mg). L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples non limitatifs suivants de mise en oeuvre du procédé d'isolement de la phosphatase acide à partir du mycélium d'aspergillus. EXEMPTE 1. On broie 0,5 kg de mycélium d'Aspergillus terreus âgé de 10 jours, on le soumet à l'extraction avec de l'eau distillée à un pH de 6,0 et à une température de 40C pendant une heure. Après extraction on porte le pli jusqu'à 5,0. On précipite la protéine par saturation avec du sulfate d'ammonium jusqu'à 50%, ensuite jusqu'à 80fui. On sépare le premier précipité et on le rejette, on dialyse le second précipité contenant l'enzyme contre l'eau distillée sous agitation pendant 24 heures à la température de 4 C, et on lyophilise. Rendement : 0,15 g d'enzyme à activité 2,4 unités/mg. EXEMPIF 2. On sépare du milieu de culture 0,4 kg de mycélium d'Aspergillus terreus âgé de 12 jours et on broie. On conduit l'extraction avec du tampon phosphate à un pH de 7,5 dans un rapport mycélium - tampon de 1:3, à une température de 40C pendant une heure. On sépare la phase solide et on précipite la protéine par saturation avec du sulfate d'ammonium jusqu'à 50o, ensuite jusqu'à 80fox On rejette le premier précipité et on soumet à la dialyse le second précipité contenant l'enzyme, contre l'eau distillée à une température de 40C. On conduit la dialyse sous agitation jusqu'à réaction négative sur l'ion d'ammonium. On lyophilise le précipité à la température de 4 C. Rendement : 0,1 g dtenzXmeà activité de 2,6 unités/mg. EXEMPLE 3. On sépare du milieu de culture 0,6 kg de mycélium d'Aspergillus terreus âgé de 14 jours et on broie. On conduit l'extraction avec de l'eau distillée acidulée à un pH de 2,5 pendant une heure. On précipite la protéine à partir de l'extrait obtenu par sa saturation avec du sulfate d'ammonium jusqu'à 50, ensuite jusqu'à 80%. On sépare et rejette le premier précipité et on dialyse le second précipité contenant l'enzyme contre l'eau distillée sous agitation à une température de 40C pendant 24 heures, et ensuite on lyophilise. Rendement : 0,12 g d'enzyeà activité de 2,0 unités/mg. EXEMPI;E 4. On sépare 0,5 kg de mycélium d'Aspergillus terreus âgé de 13 jours, on broie, on soumet à l'extraction avec un tampon phsophate à un pH de 7,5 refroidi jusqu'à 4 C, dans un rapport mycélium - tampon de 1:3, à une température de 40C pendant une heure. On sépare la phase solide. On précipite l'enzyme dans l'alcool éthylique dans un rapport de 1:2. On sépare le précipité formé par centrifugation et on lyophilise . Rendement : 0,1 g d'enzyme à activité de 1,9 unités/mg. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits et représentés qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre des revendications qui suivent. REVENDICATIONS 1. Procédé d'isolement de la phesphatase acide à partir du mycélium d'Aspergillus par extraction, précipitation de l'enzyme à partir de l'extrait obtenu et séchage subséquent de l'enzyme, caractérisé en ce que l'isolement delta phosphatase acide s'effectue à partir du mycélium d'aspergillus appartenant à l'espèce d'Aspergillus terreus. 2. Procédé suivant la revendication 1, U ractérisé en ce qu'on broie le mycélium d'Aspergillus terreus, on le soumet à l'extraction avec de l'eau distillée ou de l'eau distillée acidulée à un pH de 2 à 6, ou avec un tampon phosphate à un pH de 7 à 7,5, pendant une heure, on précipite l'enzyme à partir de l'extrait obtenu par sa double saturation avec du sulfate d'ammonium, jusqu'à 50% la première fois et jusqu'à 80% la seconde fois, on sépare ensuite le précipité, on le soumet à une dialyse contre l'eau distillée jusqu'à l'élimination complète du sulfate d'ammonium, on lyophilise la partie restante du précipité en obtenant ainsi le produit visé. 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que l'extraction du mycélium, la précipitation de l'enzyme, la dialyse et le séchage sont réalisés à une température ne dépassant pas 40C. 4. Procédé suivant la révendication 1, caractérisé en ce qu'on broie le mycélium d'Aspergillus terreus, on le soumet à l'extraction avec de l'eau distillée ou de l'eau distillée acidulée jusqu'à un pH de 2 à 6, ou avec un tampon phosphate à un pH de 7 à 7,5, pendant une heure, on précipite l'enzyme à partir de l'extrait obtenu par traitement de l'extrait avec un alcool inférieur dans un rapport de t:2, on sépare le précipité d'-enzymeet on lyophilise. 5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que l'extraction du mycélium, la précipitation de l'enzyme, la dialyse et le sachage sont réalisés à une température ne dépassant pas 4 C. 6. Phosphatase acide, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par le procédé faisant l'objet de l'une des revendications i à 5.