Brevet FR2236539A1 — publié le 19750207

La présente invention a trait a un procédé de fabrication de membranes d'origine biologique et aux produits ainsi obtenus. Les membranes d'origine biologique rencontrent de plus en plus d'applications dans les domaines les plus#divers. Elles peuvent servir pour des opérations purement physiques (filtrage, osmose, etc...), pour des opérations chimiques (comme catalyseurs ou supports de catalyseurs) et pour de ncinbreuses autres applications dans le domaine de l'industrie du textile, du papier, ainsi que dans le domaine de la pharmacie, de la médecine et de la chirurgie. La présente invention a, entre autres buts, la fabrication d'un copolymère d'origine biologique contenant de l'élastine et du collagène présentant des propriétés mécaniques nouvelles et inté- ressantes qui seront explicitées ci-dessous et notamment une bonne élasticité et qui présentent par ailleurs une bonne compatibilité avec un grand no:ubre de milieux, et en particulier avec des milieux aqueux, organiques ou plus généralement biologiques (notamment lipides et protides) et avec des fibres naturelles et synthétiques ou tout autre support ou renforcement (notamment métallique ou plastique). Le procédé consiste essentiellement en une dépolymérisa- tion des macromolécules de la substance biologique de départ et l'utilisation sélective de certaines de ces macromolécules pour obtenir ensuite un copolymère d'origine biologique. La première phase du procédé consiste donc essentiellement en une préparation de macromolécules par dépolymérisation, ces macromolécules étant destinées au cours d'une seconde phase a autre copolymérisées pour Outre ensuite dans une troisième phase traitées de façon à leur con gérer la neutralité, la stabilité, la non-toxicité et toutes autres propriétés recherchées en fonction de l'usage prévu. Il est d'ailleurs évident que, sans sortir du cadre de l'invention, certaines des phases du procédé peuvent Entre, dans certains cas, effectuées simultanément. Le procédé est basé sur le fait que les peptides macromoléculaires obtenus par dégradation' contrôlée de l'élastine peuvent outre copolymérisés avec du collagbne, de la gélatine ou d'antres macromolécules en utilisant des procédés appropriés et les copolymères biologiques ainsi obtenus possèdent des propriétés mécaniques que l'on ne trouve pas en l'absence de l'élastine copo lymérisée. En plus de son élasticité l'élastine est un polymère hydrophobe et hydrophile et elle présente ainsi le double avantage d'être compatible avec des milieux lipidiques et aqueux, propriétés que l'on ne trouve pas dans les autres polymères d'origine biolopique utilisés jusqu'ici pour des préparations analogues. Le copo lymèré ainsi obtenu présente les avantages des propriétés#rhéolo- giques des deux principaux constituants macromoléculaires de la su substance du tissu conjonctif, la résistance du collagène et l'é- lasticité de l'éiastine. De plus, ces copolymères présentent une antigénicité très faible, ce qui permet leur utilisation pour la préparation de pansements biologiques ou de greffes tectoniques, en particulier dans la couverture des grands brdlés ou des plaies difficilement cicatrisables, des ulcères notamment de la jambe ou d'autres surfaces exigeant des soins prolongés. En ce qui concerne la préparation des macromolécules selon un mode de réalisation préféré de l'invention, on procédera comme suit. L'élastine est préparée de préférence a partir de ligament large de boeuf ou de l'aorte de porc ou de bovidé par extraction saline, pour éliminer les macromolécules diffusibles. Suit un traitement, par exemple par la soude diluée a chaud ou par la col lagénase pour enlever le collagène. L'élastine réticulée résiduelle est lavée a l'eau et a l'acétone, séchée puis réduite en poudre par broyage dans un moulin a marteau. A partir de cette élastine purifiée, on prépare des peptides solubles par dégradation organoalcaline.La concentration de potasse peut varier notamment entre 0,1 et 1 M selon la rapidité et la taille des peptides que l'on désire préparer et le milieu dans lequel l'élastine est suspendue contient de l'eau, environ 20% en volume, et un mélange de solvant organique pouvant contenir de l'éthanol, du propanol, du butanol tertiaire ou tout autre alcool susceptible d'accélérer ou de ralentir la dépolymérisa#ion de l'élastine. On peut également utiliser d'autres méthodes de dégradation par exemple en faisant appel à des hydrolysants enzymatiques d'origine végétale, bactérienne ou animale tels que l'élastose, la pa pain, la pronose etc..., ou a l'hydrolyse chimique, par exemple pour certains usages aux acides minéraux ou organiques, ou encore à d'autres procédés physico-chimiques La solution ainsi obtenue, (kappa-élastine) est ensuite dialysée contre un tampon approprié (chlorure de sodium 0,1 M, phosphate 0,05 M, pH 7,4) et sa concentration protidique est déter- minée par le réactif de bîuret. La kappa-élastine peut. #tre aussi dialysée et lyophilisée et gardée a froid pendant des temps prolongés. Pour la préparation de collagène ou de gélatine, on procb- de comme suit. Le tissu conjonctif utilisé (ligament large, peau, fascia, tendon, etc...) est débarrassé des macromolécules solubles par exemple par extraction saline (chlorure de calcium 1M à pH 7,5) puis lavé et soumis a une extraction par exemple avec la soude di luée avec l'acide trichloracétique dilué (0,1 a 0,25M) a des tem pératures entre 37 et 900 selon la taille moléculaire que l'on souhaite donner a la gélatine ainsi préparée. La solution peptidique est dialysée et lyophilisée en vue de la conservation. D'autres macromolécules, comme dps protéoglycannes peuvent être également préparées en utilisant des protéases pour dégrader les protéines présentes dans l'extrait calcique ci-dessus obtenu et en précipitant les mucopolysaccharides par le cétyl-pyridinium a faible force ionique. Après lavage, des protéoglycannes (mucopo lysaccharides liés a des peptides) sont obtenus qui peuvent étre éventuellement également ajoutés aux polymères ci-dessus mentionnés. Pour certains usages, des gélatines industriellement préparées ou des mucopolysaccharides protéines industriellement préparées peuvent Entre également utilisées, De telles substances. peu- vent Etre trouvées sur le marché.Dans ce cas, seule l'élastine doit etre préparée par la méthode ci-dessus décrite ainsi qu'even- tuellement les autres polymères tels que les protéoglycannes. En ce qui concerne le copolymère et selon l'usage qu'on veut en faire, on peut faire varier la proportion relative de l'élastine et des autres macromolécules a copolymériser. Pour des usages tels que greffes tectoniques ou pansements biologiques, il est recommandé- d'utiliser un rapport collagène-élastine de l'ordre 50/50 a 99/1 et plus particulièrement de 60/40 a 95/5. Pour la préparation des copolymères, le collagène ou la gélatine sont dissous dans l'eau chaude de préférence de 50 a 1000 C. L'élastine kappa est ajoutée de préférence entre 40 et 600 C et le mélange est agité. Une pellicule d'épaisseur variable et prédéterminée peut btre préparés! de ce mélange après refroidissement par coulage dans des moules ou sur des surfaces appropriées. La Concentration de gélatine, ou de collagène est de l'ordre de 5 a 20% dans le gel formé et celle de l'élastine de l'ordre de 1 a 20%. L'agent de réticulation peut être le formaldéhyde ou tout autre aldéhyde comme le glutaraldéhyde. Pour la procédure à dérre, le formaldéhyde sera utilisé surtout a cause de son pouvoir bactéricide élevé, ce qui confère tout de suite une stérilité a la membrane préparée. Mais le glutaraldehyde ou tout autre aIdEhyde ou di-aldéhyde avec deux à six atomes de carbone peuvent être utilisés pour cette procénure, ainsi que d'autres substances classiques de pontage. Pour le pontage, les pellicules prépares sont immergées dans une solution aqueuse de l'aldéhyde dont la concentration varie de préférence entre 1 à 40z, selon la vitesse et le degré de réticulation que l'on souhaite obtenir. Le temps de traitement à la température ambiante jusqu'à 370 peut varier entre une à vingt-quatre heures. Cette température de 370 correspond à la température limite pour éviter la modification de phase de la gélatine. Elle est évidemment donnée à titre d'exemple, puisque pour chaque produit utilisé, il faudra tenir compte de ses propres propriétés physico-chimiques. Ensuite, on laisse sécher la pellicule à une humidité contrôle de préférence de 20 a 508 sans rinçage préalable. Ce traitement provoque la densification de la texture du produit final. D'autres méthodes de stérilisation peuvent être utilisées, par exemple, la bombe au cobalt. Une autre variante de cette méthode consiste a exposer les pellicules contenant environ entre 95 et 50% d'eau à des vapeurs d'aldéhyde pendant des temps variables de préférence entre deux et soixante heures. Une fois ce traitement effectué, l'excès de réactif est éliminé en lavant le gel à l'eau distillée. Ensuite on procède #u blocage des résidus aldéhydiques présents et pour ceci les gels pontés par les aldéhydes sont traités par toute méthode adéquate, par exemple,par une solution d'aminoacides basiques, lysines ou arginines, a une concentration de l'ordre de 0,5 a 18 selon un procédé de décrit (brevet français n0 2.048.152). Les membranes ainsi traitées présentent un maximum de solidité compatible avec leur utilisation biologique et un minimum d'anti génicité. Leur tolérance biologique est très bonne et elles ne possèdent pas de propriétés irritantes. Néanmoins on peut encore diminuer la présence de portions peptidiques non pontées en les traitant avec des protéases comme la trypsine, la chymotrypsine, la papaïne, la pronase ou d'autres enzymes, de préférence pendant cinq à vingt heures à un pH optimum de l'enzyme, par exemple 7,4 à 6 dans-un tampon approprié, à une température de l'ordre de O à 500C.L'excès de l'enzyme est ensuite éliminé par lavage à l'eau physiologique (NaCI à 0,98). Les membranes ainsi préparées peuvent etre-conservEes soit a l'état humide, en présence d'un antiseptique approprié (détergent a faible concentration par exemple) ou encore a l'état lyophilisé ne contenant que de 2 à 5% d'humidité. Dans ce cas, les membranes doivent être rehydratées par un bref trempage dans l'eau physiologique stérile avant leur utilisation. L'avantage des membranes ainsi préparées est leur plus grande élasticité et leur charge de rupture également beaucoup plus élevée aux gels préparés sans élastine (de deux à cinq fois supérieur à des polymères ne contenant pas de kappa-Elastine). D'autre part, l'élastine étant une protéine peu- attaquée par les enzymes protéolytiques elle confère une plus grande résistance aux agents dégradants libérés au cours des phénomènes inflammatoires qui ont lieu par exemple sur les surfaces brtldes ou dans les réactions inflammatoires comme les ulcères de la jambe. D'autre part, l'antigSnicitE des membranes ainsi traitées est réduite à un minimum, 1'8latine étant une substance extrémement peu antigénique, moins encore que la gélatine. On peut préparer selon l'invention un copolymère comme il est dit ci-dessus et comprenant des protéglycannes à pouvoir anticoagulant et empêchant l'adhésion des plaquettes du sang (action anti-thrombique). Pour ce faire, on agira comme il est dit cidessous à l'exemple 2. On peut également fixer ou greffer sur ces polymères ou copolymères de nombreux autres produits (enzymes, oxydoréducteurs, catalyseurs, antiseptiques...) Ces membranes conformes à l'invention ont de plus des propriétés électrostatiques et des propriétés de perméabilité sélective nouvelle intéressantes pour de nombreuses applications industrielles, biologiques, médicales par exemple, comme membranes permo-sélectives, par exemple pour les appareils de dialyse extraccrporelle ou la préparation de greffes vasculaires.Sans sortir du cadre de la présente invention, tout autre polymère naturel, artificiel ou synthétique peut être, par greffage, ajouté au copolymère collagène-élastine qui sert de support afin de donner une compatibilité organo-lipo-aqueuse à ces membranes et rendant par ticulièrement apte à tout usage biologique, médical ou industriel. Pour mieux faire comprendre les caractéristiques techniques et les avantages de la présente invention, on va en décrire des exemples de réalisation, étant bien entendu que ceux-ci ne sont pas limitatifs quant à leur mode de mise en oeuvre et aux applications qu'on peut en faire. Exemple 1.- On dissout 10g de gélatine (peau de boeuf) dans 100mol d'eau distillée au bain-marie bouillant. On ajoute à 40-50 sous agitation continue, 2g de la fraction adialysable (poids moléculaire 15.000) de la kappa-#lastine prFparde à partir du ligament large de boeuf comme décrit ci-dessus. On laisse couler ce mélange sur une plaque de verre de façon à ce qu'une pellicule de 2mm d'épaisseur soit formée. an laisse refroidir et on enlève la pellicule de gel de la plaque en la découpant pour faire des carrés d'environ 4cm x 4cm. On trempe les tissus dans 200m1 d'une solution de formol à 10%. On laisse reposer le mélange pendant vingt heures à 200 en agitant doucement de temps en temps.Le tissu est ensuite lavé plusieurs fois par l'eau distillée en décantant chaque fois liteau de lavage usée. Les carrés de tissus sont ensuite trempés dans une solution aqueuse de lysine et d'artinine de 0,58 respectivement, pendant six heures à 200. Le gel est de nouveau lavé à l'eau distillée, traité ensuite par une solution de trypsine a 0,1% dans le NaHCo3 aqueux à 0,2% pendant trois heures à 200C. Les tissus sont ensuite lavés à l'eau physiolotique et lyophilisée. Exemple 2.- On prépare un copolymère contenant du prctéo- glicanne en procédant comme à l'exemple 1, mais on y introduit entre 0,1 et 10% de mucopolysaccharides convenablement choisis (héparine-protéine, héparan-sulfate protéine, dermatan-sulfate protéine ou chondroitine-sulfate protéine)* La copolymérisation, le pontage et la neutralisation de l'excès d'aldéhyde se poursuivent comme dans l'exemple 1, et on obtient ainsi une membrane qui possède des propriétés d'hémocompatibilité remarquables. Exemple 3.- On procède exactement comme décrit dans 1'ex- emple 1, mais on utilise pour le pontage du glutaraldéhyde à l08 à la place du'formaldéhyde. Le traitement par la trypsine est raccourci dans ce cas à une heure et demie. Exemple 4.- On ajoute une suspension de 0,8g de fibres élastiques (voir préparation ci-dessus) dans 2m1 d'eau, obtenus par la digestion trypsique de ligament large de veau, à 20ml d'une solution aqueuse de gélatine à 15% et de kappa-61astine (ligament large-de veau) à 5%, à 40-50- sous agitation. On coule une pellicule de 2mm d'épaisseur, comme décrit dans l'exemple 1, on la coupe en carrés de 4cm x 4cm, on trempe les tissus dans 50ml de formaldéhyde à 10% pendant six heures à 200. On étale les membranes sur la gaze chirurgicale stérile étalée sur une plaque de verre, et on laisse sécher jusqu' a ce que la teneur en eau descende à 60%. Ensuite on expose le tissu aux vapeurs de formaldéhyde à 20% pen dant six heures. Les membranes sont ensuite lavées, traitées par la lysine et l'arginine selon le processus indique dans l'exemple 1. La digestion par la trypsine est prolongée à dix heures sous les conditions décrites dans l'exemple 1. Les membranes sont ensuite gardées à 4e dans l'eau physiologique en présence de merseptyl a 1* jusqu'à l'utilisation. REVENDICATIONS 1.- Procédé de fabrication de membranes a partir de polymères biologiques caractérisé par le fait que l'on prépare des macromolécules par dépolymérisation et qu'on copolymérise ces macro molécules. 2.- Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait qu'au moins l'un des polymères a copolymériser est obtenu par dégradation de protéines. 3.- Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2 caracté- risé par le fait qu'au moins l'un des polymères à copolymériser est obtenu par dégradation d'élastine. 4.- Procédé selon l'une des revendications 2 ou 3 caracté- risé par le fait que la protéine est soumise à une dégradation organo-alkalyne. 5.- Procédé selon l'une des revendications 2 à 4 caractérisé par le fait que la protéine est soumise à une dégradation par hydrolyse. 6.- Procédé selon la revendication 5 caractérisé par le fait que l'hydrolyse est effectuée par voie enzymatique. 7.- Procédé selon l'une des revendications 5 ou 6 caractérisé par le fait que l'hydrolyse est effectuée par voie chimique. 8.- Procédé selon l'une des revendications 2 à 7 caractéri- se par le fait que les protéines sont dégradées à l'aide de proté- ases. g.- Procédé selon l'une des revendications 1 a 8 caractérisé par le fait que l'un des polymères à copolymériser est le collagène. .10.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisé par le fait que l'un des copolymères est la gélatine. 11.- #Procédé selon l'une des revendications 8 a 10 caractérisé par le fait qu'au moins l'un des polymères est un protéogly- canne. 12.- Procédé selon l'une des revendications 1 a 11 caractérisé par le fait que l'un des polymères a copolymériser est un mucopolysaccharide protéine 13.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 12 caracté- risé par le fait qu'au moins un polymère est dialysé. 14.- Procédé selon l'une des revendications 1 a 13 caractérisé par le fait qu'au moins l'un des polymères est lyophilisé 15.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 14 caracté risé par le fait que l'un au moins des polymères est dissous, un autre au moins étant ajouté sous agitation. 16.- Procédé selon la revendication 15 caractérisé par le fait que la dissolution est effectuée entre 50 et IOOOC. 17.- Procédé selon l'une des revendications 15 ou 16 carac térisé par le fait qu'au moins l'un des polymères est ajoute sous agitation a une température comprise entre 40 et 60 C. 18.- Procédé selon l'une des revendications 1 a 17 caracté- risé par le fait que- le ou les polymères obtenus par dégradation représentent 1 à 509 en poids de l'ensemble des polymères à copoly mériser. 19.- Procédé selon la revendication 18 caractérisé par-le fait que le ou les polymères obtenus représentent 5 à 40% en poids de l'ensemble des polymères a copolymériser. 20.- Procédé selon l'une des revendications 1 a 19 caracté- risé par le fait que la copolymérisation est effectuée en présence d'au moins un agent de réticulation. 21.- Procédé selon la revendication 20 caractérisé par le fait qu'au moins l'un des agents de réttculation est un aldéhyde; 22.- Procédé selon la revendication 21 caractérisé par le fait que l'un des agents est le formaldéhyde. 23.- PRocédé selon l'une des revendications 1 à 22 caracté- risé par le fait que l'un des agents est-le glutaraldéhyde. 24.- Procédé selon l'une des revendications 15 a 23 caracté- risé par le fait que le copolymère dissous est refroidi par coulage. 25.- Procédé selon l'une des revendications 15 à 24 caracté- risé par le fait que la concentration des polymères obtenus par dégradation dans le gel formé est de 1 a 20% en poids. 26.-.Procédé selon la revendication 25 caractérisé par le fait que la concentration des autres polymères est de 5 à 20% en poids. 27.- Procédé selon l'une des revendications 20 a 26 carac térisé par le fait que la concentration de l'agent de réticulation est de 1 à 40% en poids du mélange réactionnel. 28.- Procédé selon l'une des revendications 20 a 27 carac térisé par le fait que la réticulation est effectuée a une température inférieure ou égale a 370C. 29.- Procédé selon l'une des revendications 20 à 26 caractérisé par le fait que les produits sont traités par l'agent de ré ticulation à l'état de vapeur. 30.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 29- caracté- risé par le fait que les produits obtenus sont traités avec des enzymes. 31.- Procédé selon la revendication 30 caractérisé par le fait que les produits obtenus sont traités avec au moins une protéase. 32.- Procédé selon l'une des revendications 30 ou 31 carac térisé par le fait que les produits obtenus sont lyophilisés. 33.- Produits obtenus par le procédé selon l'une des revendications 1 a 32.