Brevet FR2240232A1 — publié le 19750307

La présente invention concerne un procédé permettant de fabriquer industriellement la méthylcobalamine à partir de la cyanocobalamine. On connatt la méthylcobalamine et on sait que ce produit dérive de la cyanocobalamine par remplacement du groupe cyano (CN) par un groupe méthyl (O). La méthylcobalamine comme la cyanocobalamine sont utilisées en thérapeutique pour les traitements justiciables de l'administration de - vitamine B12. Le conditionnement de la méthylcobalamine, sous la forme d'ampoules injectables est cependant plus aisé que celui de la cyanocobalamine,- en raison de la plus grande solubilité dans l'eau de la méthylcobalamine. On connatt d'autre part, un procédé de fabrication de la méthylcobalamime. Dans ce procédé connu, on réduit la cyanocobalamine (vitamine B12) pour obtenir la cobalamine réduite (B12s) Oette réduction est effectuée par- l'hydrure double de bore et de sodium (NnRR4) dans une atmosphère privée d'ogggène, puis on fait réagir sur cette cobalamine réduite (B12S), a'oxalate de méthyle ou l'iodure de méthyle pour fixer le groupe méthyl sur le cobalt de la cobalamine réduite (B12s). Toutefois, en raison de la faible stabilité de la cobalamine réduite B12S, cette dernière a tendance, pendant la réaction de réduction et surtout avant la fixation du groupe méthyl, à se transformer partiellement en cobalamine Bi2r qui est une cobalamine moins réduite que la cobalamine 312s et qui n'est plus susceptible de fixer un groupe méthyl. Pour éviter cet important inconvénient qui affecte le rendement final en méthylcobalamine, on est obligé d'utiliser des quantités en excès de -réducteurs. On se heurte alors à un autre inconvénient car on risque d'attaquer de façon irréversible la molécule de cobalamine en formant des produits-de dégradation préjudiciables à la pureté et au rendement en méthylcobalamine. Le procédé suivant la présente invention vise à remédier aux inconvénients du procédé précité en permettant de réaliser la transformation de la cyanocobalamine en méthylcobalamine dans des conditions telles qu'on limite considérablement le risque de formation de cobalamines réduites non susceptibles de fixer un groupe méthyl ou de produits de dégradation de la cobalamine. Suivant l'invention, le procédé de fabrication de la méthylcobalamine à partir de la cyanocobalamine est caractérisé en ce qu'on réalise une solution contenant au moins 40 g par litre de cyanocobalamine dans un mélange de méthanol et d'eau, en ce qu'on ajoute à cette solution de l'oxalate acide de méthyle et une poudre métallique capable de libérer de l'hydrogène par action sur l'oxalate acide de méthyle en des quantités telles qu'on libère au moins cinq atome-grammes d'hydrogène naissant par molécule-gramme de cyanocobalamine. Dans ce procédé, la réduction et la méthylation de la cyanocobalamine sont effectuées simultanément au moyen de l'oxalate acide de méthyle. Ce procédé limite considérablement la durée d'existence de la cobalamine réduite (312s) obtenue par action de l'hydrogène naissant produit par réaction entre l'oxalate acide de méthyle sur la poudre métallique, car la cobalamine réduite est méthylée au fur et à mesure de sa formation. Les réactions de réduction et de méthylation peuvent être représentées par le schéma suivant où (I) représente la cyanocobalamine, (2) l'hydrogène naissant produit par action de la fonction acide libre de l'oxalate acide de méthyle sur la poudremétallique(,3) la cobalamine réduite (B12ss) qui est aussitôt méthylée par le groupe OH3(4) provenant de l'oxalate acide de méthyle, pour former la méthylcobalamine (5). En même temps que les réactions précitées le groupement CN provenant de la cyanocobalamine (1) est hydrogéné en méthylamine suivant la réaction On voit d'après le schéma de cette réaction, qutil suffit théoriquement de ne libérer par réaction entre l'oxalate acide de méthyle et la poudre métallique que cinq atome-grammes d'hydrogène naissant par molécule-gramme de cyanocobalamine. Cependant, il est préférable, d'utiliser des excès d'oxalate acide de méthyle et de poudre métallique. La méthylamine formée lors de la réduction reste présente dans le milieu réactionnel et son groupe méthyl ne gene nullement la réaction de methylation. Parmi les poudres métalliques capables de libérer de l'hydrogène par action sur 1' oxalate acide de méthyle, il est préférable d'utiliser la poudre de zinc. On a constaté que pour que la réduction et la méthylation de la cyanocobalamine s'effectuent dans de bonnes conditions, il était avantageux que la concentration de la cyanocobalamine dans le milieu réactionnel soit supérieure à 40 g/l. thie telle concentration èst -impossible à obtenir dane le méthanol et l'eau purs, la solubilité de~la cyanocobalamine dans ces deux solvants étant égale respectivement à 20 g/l et 13 g/l seulement.On a toutefois constaté cet effet- surprenant que la solubilité de la cyanocobalamine. augmentait dans un mélange de méthanol et d1 eau et passait par un maximum lorsque la proportion a'eau dans le méthanol était égale à 8% en volume et atteignait 160 g/l pour cette proportion. Il est cependant inutile d'opérer avec une telle concentration de cyanocobalamine, les conditions favorables de solubilité, de réduction et de méthylation étant remplies. lorsque le mélange de méthanol et d'eau utilisé contient entre 7 et 15% d'eau. Selon une version préférée de l'invention, le milieu réactionnel est maintenu à une température comprise entre 28 et 320C, Il est en effet préférable de maintenir le milieu réactionnel entre les deux limites de température précitées. Si la température du milieu est supérieure à 3200, la réaction de réduction a teno dance à être trop rapide, de sorte qu'on risque de dégrader la molécule de cobalamine. D'autre part Si la température est inférieure à 280C les réactions de réduction et de méthylation sont trop lentes et incomplètes, ce qui est préjudiciable au rendement du produit final. Selon une autre version préférée de l'invention, on ajoute au milieu réactionnel, des sels de cobalts. Ces sels de cobalt, pouvant autre par exemple, du chlorure de cobalt, du nitrate de cobalt ou de l'oxalate de cobalt, catalysent la réaction de réduction et régularisent en particulier, le Rh du milieu réactionnel. En opérant dans les conditions précitées, on peut transformer presque quantitativement la cyanocobalamine en méthylcobalamine. On peut suivre visuellement ou au moyen d'un spectrophotomètre, l'évolution de la réaction. La solution de cyanocobalamine qui, au départ est rouge devient violacée puis marron lorsque la cyanocobalamine est transformée en méthylcobalamine. La coloration bleu-vert annoncée dans la littérature, attribuée à la formation de la cobalamine réduite 312e n'apparaît pas, ce qui constitue bien la preuve que ce composé a dans le présent procédé une durée de vie très courte du fait qu'il est méthylé au fur et à mesure de sa formation. Une fois la réaction terminée, on filtre le milieu réactionnel pour éliminer le zinc en excès et les sels de zinc insolubles formés. On précipite ensuite la méthylcobalamine dans le filtrat par quatre volumes.d'acétone, on filtre, et on redissout le précipité de méthylcobalamine dans un mélange en quantités- égales d'acétone et d'eau. La solution~obtenue peut ensuite etre laissée à cristalliser directement, mais est de préférence purifiée au préalable, par passage sur des colonnes chromatographiques appropriées. On donne ci-après, un exemple de mode opératoire non limitatif, illustrant le procédé de fabrication de la méthylcobalamine conforme à l'invention. Exemple : On met en solution 100g de cyanocobalamine dans deux litres de méthanol et 200 cm3 eau. La solution est parfaitement limpide et a une eoloration rouge caractéristique. On ajoute à cette solution 200g d'oxalate acide de méthyle, 50g de chlorure de cobalt, on porte le mélange obtenu à 280G et maintient ce dernier à cette température. On ajoute alors 300g de zinc en poudre. Les réactions de réduction et de méthylation démarrent. Ces réactions étant exothermiques, on refroidit le milieu réactionnel pour maintenir ce dernier à une température inférieure à 320 O. On laisse les réactions se poursuivre pendant une heure, en maintenant le milieu réactionnel sous agitation. Ce milieu prend en fin d'opération une coloration marron. On filtre le mélange résultant pour éliminer le zinc ou les sels de onc formés, insolubles dans le milieu réacsionnel. On ajoute au filtrat 4 volumes d'acétone, pour précipiter la méthylcobalamine. Qn filtre et on remet en solution le précipité de méthylcobalamine recueilli dans un mélange en quantités égales doleau et d'acétone. La solution résultante est ensuite passée sur une colonne contenant une résine composée de perles polymères sphériques contenant des sites échangeurs de cations et d'anions, telle que la résine dénommée 'tRetardion ÂG 11 A8" fournie par Bio-Rad pour éliminer les ions zinc, cobalt, etc.. en solution;;,puis sur une colonne à lit mélangés constitués par 3 volumes d'une résine fortement basique (N (CH3) 3+) échangeuse d'anions, telle que la résine IRA 400 de Robm & Haas, pour un volume drune résine sulfonique acide, échangeuse de cations, telle que l'amberlite IRG 120 de Rohm & Haas pour éliminer la cyanocobalamine non transformée, ou les cobalaminos trop réduites Après purification, la solution est laissée à cristalliser après addition d'acétone. On obtient ainsi 65g de méthylcobalamine. Le spectre d'absorption d'une solution diluée contenant la méthylcobalamine ainsi obtenue, présente des maxima à 267, 343 et 520 millimicrons, correspondant à ceux obtenus pour la me'thyl cobalamine pure. La résistivité d'une solution d'eau déminéralisée dosée à 5 microgrammes par cm3 de métbylcobalamine obtenue selon ltexemple précité est supérieure à 10.000 ohms/cm, ce qui montre que la méthylcobalamine obtenue ne renferme pas d'ions pouvant provenir notamment du zinc ou du cobalt que l'on a introduits dans le milieu réactionnel. Comme le montre l'exemple précité, le procédé de fabrication de la méthylcobalamine conforme à l'invention est de mise en oeuvre particulièrement aisée. On obtient une méthylcobalamine parfaitement pure grâce à une réduction contrôlée de la cyanocobalamine au moyen d'un composé, l'oxalate acide de méthyle jouant un double rôle, étant à la fois l'acide capable de libérer I'hydrogène naissant par réaction sur la poudre de zinc et l'agent capable d'assurer la méthylation de la cobalamine réduite. L'excellent rendement en méthylcobalamine s'explique d'autre part par le fait que la solution contienne au départ, une importante concentration de cyanocobalamine ce qui a été rendu possible grâce aux choix judicieux d'un solvant constitué par un mélange de méthanol et d'eau. REVENDICATIONS t. Procédé de fabrication de la méthylcobalamine à partir de la cyanocobalamine, caraetérisé en ce qu'on réalise une solution contenant au moins 40 g par litre de cyanocobalamine dans un mélange de méthanol et d'eau, en ce qu'on ajoute à cette solution de l'oxalate acide de méthyle et une poudre métallique capable de libérer de l'hydrogène par action sur I'oxalate acide de méthyle en des quantités telles qu'on-libère au moins cinq atome-grammes d'hydrogène -naissant par molécule-gramme de cyanocobalamine. 2. Procédé conformé à la revendication 1, caractérisé en ce que le mélange de méthanol et d'eau utilisé contient entre 7 et 15% d'eau. 3. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu réactionnel est maintenu à une température comprise entre 28 et 32 C. 4. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce qu'on ajoute au milieu réactionnel des sels de cobalt 5. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que la poudre métallique utilisée est de la poudre de zinc.