Brevet FR2235133A1 — publié le 19750124

La présente invention a pour objet un support de protéines actives greffées. Depuis quelques années les protéines et plus particulièrement les enzymes occupent une place importante dans le domaine de la biochimie. Les enzymes que l'on sait maintenant isoler, pour un grand nombre d'entre eux, sont d'un emploi intéressant, car permettant de catalyser, à la température des etres vivants, c'est-à-dire environ 20-40 C des réactions qui avec d'autres catalyseurs nécessiteraient une température réactionnelle de 3000 ou 4000 C, par exemple. Les enzymes en raison de leur activité et de leur spécificité sont utilisés avantageusement dans les hopitaux ou laboratoires médicaux comme catalyseurs dans des dosages effectués dans les fluides biologiques. Une première possibilité consiste à ajoutes au fluide à doser une solution enzymatique. Cette possibilité n'est pas sans inconvénients : effectivement, après le dosage, il n'est pas possible de récupérer la solution enzymatique quoique l'enzyme soit encore actif. Or les enzymes sont des protéines particulièrement couteuses, et le fait de ne pouvoir les utiliser qu'une seule fois augmente sensiblement le prix d'une analyse.En outre, l'enzyme étant placé dans le milieu réactionnel et étant un catalyseur très actif, une fois que la réaction est démarrée, il est impossible de l'arrêter sans détruire l'enzyme Or, particulièrement en recherche fondamentale, il est intéressant de pouvoir suivre la réaction catalysée par plusieurs enzymes, puis d'étudier l'influence du retrait dlun ou plusieurs enzymes du milieu réactionnel. Pour remédier à ces inconvénients il a été imaginé de fixer un ou plusieurs enzymes sur un support solide et insoluble dans le milieu réactionnel, permettant ainsi en plaçant le support enzymatiquement actif dans le milieu réactionnel de catalyser la réaction et d'arrêter celle-ci en retirant le support de ce même milieu; après rinçage du support, celui-ci peut être stocké en vue d'utilisations postérieures, l'activité de l'enzyme n'étant diminuée qu'après un grand nombre de réactions. Plusieurs techniques ont déåà été mises en oeuvre pour essayer de parvenir à ce résultat. La première de ces techniques, qui est la plus utilisée industriellement est l'adsorption Elle consiste à adsorber un ou des enzymes sur un support pouvant etre, par exemple, du charbon actif ou une résine échangeuse d'ions. L'adsorption est généralement réalisée par mélange du support à 1'état pulvérulent et d'une solution enzymatiqueo Généralement le support enzymatiquement actif est placé dans une colonne du type de celles utilisées en chromatographie, que l'on fait traverser par le milieu réactionnel0 Cette technique présente un certain nombre d'inconvénients Elle nécessite tout d'abord une quantité importante d'enzymes. En outre, les liaisons créées entre enzyme et le support sont des liaisons labiles, si bien que la désorption du support est réalisée relativement facilement, l'enzyme passant en solution dans le milieu réactionnel. C'est ainsi par exemple qu'une variation du pi peut entraSner la désorption. Pour remédier à ces inconvénients, il est apparu nécessaire d'ajouter un agent réticulant en surface l'enzyme adsorbé, bien que cette réticulation porte-atteinte à l'activité catalytique de l'enzyme. Une seconde technique utilisée est l'inclusion. Cette opération consiste à effectuer une polymérisation permettant d'obtenir un gel, les enzymes étant introduits au cours de la réaction et répartis régulièrement dans la masse du gel, Outre qu'elle nécessite une quantité importante d'enzymes et correspond donc à un prix de revient élevé, l'activité enzymatique est mauvaise en raison de la répartition régulière des enzymes dans le support, les substrats pénétrant difficilement à l'intérieur du support. D'autres supports enzymatiquement actifs ont été obtenus par réticulation et coréticulation. La réticulation consiste à réaliser un pontage entre un support inactif et une protéine active à l'aide d'un agent pontant tel que du Glutaraldéhyde, permettant d'obtenir un support enzymatiquement actif0 La coréticulation consiste à réaliser un pontage entre une protéine anaetive formant support et une protéine active à l'aide d'un agent pontant, permettant d'obtenir un support actif0 Un des inconvénients de la coréticulation est llobtention d'un support relativement mou. L'inconvénient majeur de la réticulation et de la coréticulation, outre les quantités importantes de la solution enzymatique qu'elles nécessitent, est, comme dans la méthode précédente, la mauvaise activité enzymatique en raison de la répartition régulière des enzymes dans le support et de la mauvaise accessibilité des substrats. La dernière des méthodes connues est la fixation par covalence d'enzymes sur un support activé Cette méthode est intéressante car la liaison chimique ainsi réalisée est très stable et que par conséquent il n'y a pas de passage en solution des enzymes dans le milieu réactionnel Ces fixations peuvent etre réalisées sur des supports synthétiques tels des films de polystyrène, de polyamide, ou de copolymères divers, mais un grand nombre de ceuxci ont une action dénaturante sur l'enzyme. Ces fixations nécessitent une quantité importante de solution enzymatique.De plus dans certains cas, il est nécessaire d'envisager une étape intermédiaire pour la fixation de groupements réactifs sur le support, si celui-ci n'en présente pas Dans d'autres cas, lorsque l'activation du support est difficile à réaliser, il est procédé simultanément à l'activation du support et à l'addition d'enzymes; cette opération tend à dénaturer l'enzyme à fixer sur le support La présente invention vise pallier les inconvénients précites en proposant un support enzymatiquement actif sur lequel ne sont fixées que de faibles quantités d'enzymes A cet effet, l'invention pour objet un support de protéines actives greffées, constitué par un produit collagènique sur lequel les protéines actives sont greffes en surface de façon covalence, Cette solution présente de nombreux avantages La nature protéique du support est tout-à-fait favorable à la consservation du ou des enzymes. En outre, le greffage de surface évite tous les inconvénients des couches limites de diffusion : les substrats accèdent facilement à l'enzyme, permettant une activité élevée de celui-ci. La méthode de fixation en surface ne dénature pas les enzymes alors que les enzymes réticulés ou coréticulés,inclus ou dans la masse du support perdent toujours une grande partie de leur activité. Iei, en raison de l'activation de surface, il suffit de quelques microgrammes d'enzyme fixé pour obtenir une activité enzymatique efficace et comparable à celle obtenue par fixation, par des techniques habituelles, de plusieurs milligrammes d'enzyme sur un support. D'un point de vue pratique les produits collagèniques sont intéressants, car leur haut degré de polymérisation et leur technique de réalisation permettent l'obtention de fils, fibres, mousses ou avantageusement de films fins dont les propriétés mécaniques sont excellentes. D'un point de vue économique les produits collagèniques employés étant des produits industriels sont d'un coat raisonnable. Les préparations collagèniques utilisées sont décrites dans trois brevets français du Centre Technique du Cuir - brevet français nQ 4.568.829 du 1er décembre 1967 "Procédé de préparation et de conditionnement des pâtes de dispersion et de gelsprotéiniques d'origine animale". - brevet français nO 1.596.789 du 27 novembre 1968 "Procédé et appareil pour la préparation de dispersions de collagène en vue de leurs applications't - brevet français nO 1.596.790 du 27 novembre 1968 Procédé et installation pour l'obtention et le traitement en continu des matériaux collagèniques sous formes de films". Deux des caractéristiques des produits collagèniques mentionnées dans les trois brevets ci-dessus montrent l'intérêt du greffage d'enzymes sur de tels supports - La préparation du produit collagènique en milieu acide permet la libération de carboxyles nécessaires dans la phase d'activation du support puis pour le greffage. - La présence d'un polyol tel le glycérol dans le produit collagènique augmente son hydrophilie et protège l'activité et la stabilité des enzymes fixés en repoussant les couches hydrophobes. Dans une forme d'exécution préférée de l'invention le support collagènique utilisé est constitué par un film de collagène, ceci uniquement pour des raisons pratiques, un support en forme de film étant facile à manipuler et présentant une surface-active importante pour un faible encombrement. Le procédé de fabrication du support selon l'invention consiste à immerger le produit collagènique dans un mélange méthanol-acide pendant plusieurs heures à température ambiante, à rincer le produit à l'eau, puis à le plonger dans un bain d'hydrazine pendant plusieurs heures, à traiter le produit ainsi obtenu par un mélange nitrite de sodium-acide pendant quelques minutes, puis à le laver au chlorure de sodium, le produit collagènique ainsi activé étant immergé dans une solution enzymatique à pli 9 pendant environ deux heures, pour former un support collagènique enzymatiquement actif. De toute façon, l'invention sera bien comprise grâce à la description d'un exemple de fixation d'un enzyme réalisé conformément à l'invention. L'enzyme à greffer est de l'Asparçate Amino Transférase (A A ) et le support un film de collagène de 2,5 cm de long, 1,5 cm de large et environ 100 microns d'épaisseur. La première opération consiste en l'activation en surface du film de collagène. A cet effet celui-ci est immergé pendant 72 heures dans une solution de méthanol et d'acide chlorhydrique (0,2 N)à la température ambiante. Le film est ensuite rincé avec de l'eau à 200 C. Le film est alors plongé dans un bain d'hydrazine à 1% en milieu aqueux à la température ordinaire pendant 12 à 15 heures. Le film est enfin traité à 0 C par un mélange nitrite de sodium - acide chlorhydrique pendant 5 minutes avant d'entre lavé par une solution de chlorure de sodium 0,1 M. Le support collagènique ainsi activé, il est procédé à la fixation covalente de l'Aspartate Amino Transférase. Le film de collagène activé est plongé dans la solution enzymatique à 1,3 mg/ml, à 0 C et pli 9 pendant environ 2 heures. Le film est rincé abondamment et stocké dans une solution tampon à pH 8 à 40 C. Un certain nombre d'analyses ont été effectuées pour prouver l'activité enzymatique du film. L'étude détaillée comparative d'Aspartate Amino Transférase en solution et greffé sur un film de collagène montre que les paramètres sont sensiblement les mêmes (énergie d'activation et pli optimum}. Ces résultats prouvent que l'enzyme est greffé à la surface du film puisqu'il se comporte comme s'il était en solution; effectivement Si l'enzyme était fixé à l'intérieur de la masse collagènique les paramètres varieraient. En comparant l'activité enzymatique du film et de solutions enzymatiques d'Aspartate Amino Transférase, il a été évalué que 1 cm2 de film à la même activité que 0,5j'g d'Aspartate Amino Transférase. Il est donc possible de conclure à la fixation de 0,5.J" aienzyme par cm2. Il est bien évident que la solution enzymatique dans laquelle le film est immergé pour la fixation de l'enzyme peut être utilisés un grand nombre de fois. D'autres essais ont été effectués pour vérifier la bonne fixation de l'enzyme sur le film de collagène. Ces essais sont illustrés par les enregistrements figurant sur la figure ciannexée. L'Aspartate Amino Transférase a été choisi comme catalyseur de la réaction L - Glutamate + Oxalacétate A A T &alpha;- Cétoglutarate + Il-Aspartate On suit la réaction en mesurant la disparition de l'Oxalacé- tate dans le milieu réactionnel dans l'UV à 257 nanomètres. Les conditions opératoires sont les suivantes - Solution tampon Tris - HCl 0,05 N pli : 8,1 ml - L Glutamate 1 N : 0,45 ml - Oxalacétate 1-0-2 M : 0,45 ml Sur l'enregistrement effectué, l'axe des abscisses correspond au temps (1 mn = 1cm) et l'axe des ordonnées à la densité optique (8010-3 unité de densité optique = 1 cm) de l'Oxalacétate Les deux expériences suivantes ont été réalisées La première correspond à la catalyse de la réaction par un support collagènique enzymatiquement actif selon l'invention0 La courbe I montre la disparition de l'Oxalacétate dans le milieu réactionnel0 La solution de départ correspond à 0,59 unités de densité optique0 Au temps 2, le film de collagène enzymatiquement actif est immergé dans le milieu réactionnel0 ta réaction démarre aussitôt, comme le montre la diminution de la densité optique due à la disparition de l'Oxalacétate dans le milieu réactionnel.Au temps 3, le film est retiré de la solution et la densité optique devient pratiquement constante prouvant ainsi que l'Oxalacétate ne disparaît plus et par conséquent que la réaction est stoppée. Au temps 4, le film est replongé dans la solution et a réaction redémarre aussitôt comme le prouve la diminution de la densité optique0 Au temps 5, le film est retiré e-t la réaction s'arrete; au temps 6, le film est replongé dans la solution et redémarre jusqu'au temps 7 où il est retiré de la solution. Cette expérience prouve que l'enzyme est fixé étroitement sur le film de collagène. Effectivement, si l'enzyme était mal fixé, une partie de celui-ci passerait en solution la réaction continuerait après que le filmait été retiré du milieu réactionnel. La seconde expérience réalisée consiste à catalyser la même réaction par un film -réalablement immergé dans une solution enzymatique d t Aspartate Amino Transférase sans activation chimique préalable du collagène La courbe Il montre la disparition d'Oxalacétate dans le milieu réactionnel. Au temps 8 le film est immergé dans le milieu réactionnel et la réaction démarre comme dans le-cas précédent, les courbes densité optique - temps étant sensiblement parallèles. Par contre, au temps 9, lorsque le film a été retiré du milieu réactionnel, la densité optique continue de diminuer, prouvant ainsi que la réaction se poursuit et par conséquent qu'une partie de l'enzyme "fixé" sur le film de collagène est passé en solution. D'autres expériences,non décrites ici, ont montré qu'en supprimant une des phases de l'activation il n'était pas possible de fixer fermement un enzyme sur un film de collagène. Il ressort donc de ce qui précède que le support collagènique ainsi réalisé et son procédé de fabrication sont particulière mentsavantageux pour la fixation des enzymes. C'est ainsi notamment que la fixation de l'enzyme est effectuée après activation du support et lavage de celui-ci, permettant d'éviter un contact entre l'enzyme et les réactifs, contact dénaturant pour l'enzyme Après utilisation, le film est rincé puis stocké dans la solution précitée à 40 C. Des essais ont été effectués montrant qu'un film actif enzzmatiquement avait une activité parfaite après 200 essais, séparés par des périodes de stockage à LCO, correspondant à peu près à 25 heures d'utilisation, effectués dans différentes solutions pendant plus de deux mois. Tous les enzymes fixés à ce joup6nt été fixés avec succès et avec une bonne activité. C'est ainsi qu'ont été fixés - Déshydrogénase Glutamique. - Aspartase Amino Transférase0 - Glutamate Pyruvate TransaminaseO - Dé shydrogénase Malique - Déshydrogénase Lactique. - Créatine Kinase. - liexokinase. - Uréase. - Trypsine. Bien que des essais de fixation n'aient été effectués qu'avec ces enzymes, il semble qu'il soit possible de fixer n'importe quel- enzyme. Comme il va de soi, l'invention ne se limite pas au seul produit et au seul procédé décrits ciAdessus à titre d'exemples non limitatifs; elle en embrasse au contraire toutes les variantes de réalisation0 I?EDl CATI ONS 1.- Support de protéines actives greffées, caractérise en ce qu1il est constitué par un produit collagènique sur lequel les protéines actives sont greffées en surface de façon covalente. 2.- Support de protéines actives greffées selon la revendcation 1, caractérisé en ce que le produit collagènique est un film de collagène industriel. 3.- Support de protéines actives greffées selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit collagènique est un fil de collagène industriel. 4.- Support de protéines actives greffées selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit collagènique est de la mousse de collagène industriel. 5.- Procédé de fabrication du support de protéines actives greffées selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il consiste a immerger le produit collagènique dans un mélange méthanol - acide pendant plusieurs heures à température ambiante, à rincer le produit à l'eau, puis à le plonger dans un bain d'hydraine pendant plusieurs heures, à traiter le produit ainsi obtenu par un mélange nitrite de sodium acide pendant quelques minutes, puis à le laver au chlorure de sodium, le produit collagènique ainsi activé étant immergé dans une solution enzymatique à pH 9 pendant environ deux heures, pour former un support collagènique enzymatiquement actif.