Brevet FR2242111A1 — publié le 19750328

La présente invention a pour objet un produit enzymatique insoluble exerçant une activité thrombinique et défibrinogénante. Ce produit est utilisable comme réactif défibrinogénant dans des examens sanguins, en particulier dans le dosage des facteurs intervenant dans la coagulation sanguine, et dans la préparation ou l'isolement desdits facteurs à partir de sang humain ou mammifère. L'invention a également pour objet un procédé pour l'obtention dudit produit enzymatique. Lt élimination du fibrinogène du sang humain ou mammifère, du plasma sanguin ou de fractions de celui-ci est une mesure préalablé nécessaire non seulement dans l'isolement préparatif mais également dans le dosage des facteurs de la coagulation sanguine. Le fibrinogène affecte la solubilité et la stabilité des concentrats de facteurs de coagulation injectables utilisés en médecine humaine et constitue une impureté difficile à éliminer et qui provoque des difficultés dans la prépara,tion ou l'isolement de facteur VIII, facteur XIII, prothrombine, plasminogènei etc., à l'état pur [voir p.ex. E. MAMMEN dans "Thrombosis and Bleeding Disorders", N. BANG et al., page 140, Stuttgart/New York/London (1971)]. La fibrine qui se forme à partir du fibrinogène adsorbe et inhibe la thrombine.Par con séquent, l'élimination du fibrinogène à partir de plasma sanguin est indispensable dans les cas où, pour le dosage quantitatif des facteurs de la coagulation sanguine, la mesure de leur activité s'effectue sur la base de l'activation de la prothrombine ou de l'inhibition de la thrombine. L. FREDERICQ [Annales Soc. méd. Gand, 55, 93 (1877)] fut le premier à décrire la séparation du fibrinogène à partir d'échantillons de plasma sanguin par chauffage de ceuxci à 560C. Cette méthode,présente le désavantage que l'antithrombine III et la prothrombine sont partiellement détruites par le chauffage [voir p.ex. B. BLOMBACK, M. BLOMBACK et P. OLSSON, Thromb. Diath. Haem. 9, 368 (1963)]. Aussi, l'application analytique de cette méthode aboutit à des résultats erronés. Etant donné que la durée du chauffage à 560C ne doit pas excéder 3 à 5-minutes, cette-méthode ne saurait être utilisée dans l'i- solement préparatif des facteurs de coagulation sanguine où lton est obligé de chauffer et de refroidir des quantités importantes de plasma pendant des temps prolongés.Une autre méthode courante de défibrinogénation, laquelle consiste à ajouter de petites quantités de thrombine, n'est également pas satisfaisante du point de vue analytique étant donné que l'excès de thrombine, d'une part, affecte le dosage de la prothrombine dans le sens qu'une activité trop élevée est mesurée et, d'autre part, consomme de l'antithrombine dans le dosage de l'antithrombine, de sorte que les valeurs mesurées pour l'antithrombine sont trop faibles [J.M. GREEP et al., Thromb. Diath. Haem. 5, 256 (1960)]. En outre, la thrombine provoque des modifications moléculaires des facteurs de coagulation V, VIII et XIII [voir S.P. COLOWICK et N.O. KAPLAN, "Methods in Enzymology", vol. XIX, Proteolytic Enzymes, Academic Press, New York et Londres, p. 181 (1970)]. Par conséquent, elle ne saurait être utilisée dans la défibrinogénation préparative du plasma sanguin et de ses fractions. L'élimination du fibrinogène du plasma par adsorption à de la bentonite est désavantageuse dans le sens que les facteurs V et X sont également adsorbés [voir M.P. ESNOUF & BR K. LECHNER in: N. BANG F. BELLER, E. DEUTSCH & E. MAMMEN, "Thrombosis and Bleeding Disorders', Stuttgart/New York/London, p. 176 (1971)]. P.W. HOWIE et al. [Brit. Journ. of Haematology, 25, 101 (1973)] ont effectué la défibrinogénation du plasma à l'aide d"'Ancrod", une enzyme à activité thrombinique dérivée du venin d'Agkistrodon rhodostoma, pour le dosage de l'antithrombine III. Contrairement à la thrombine, cette enzyme présente l'avantage de ne pas consommer d'antithrombine et, en outre, de ne pas activer les facteurs VIII et XIII. Toutefois, cette enzyme dégrade protéolytiquement la chaîne alpha de la fibrine [P. MATTOCK & M.P. ESNOUF, Nature New Biologyy 233, 277 (1971)] et peut, par conséquent, provoquer une inhibition de la thrombine par l'intervention des produits de dégradation de la fibrine. En outre, il est nécessaire de neutraliser l'excès d"'Ancrod" subsistant dans le plasma par l'action d'un antisérum spécifique, lequel contient également de l'antithrombine; d'autre part, l'utilisation de cet antisérum augmente considérablement les coûts de cette méthode de défibrinogénation. S. LOPACIUE [VIII Congr. World Fed. of Haemophilia, July 24, 27, Buenos Aires (1972)] décrit un procédé pour 11 élimination du fibrinogène à partir d'un concentré de facteur VIII par incubation de ce concentré avec de la batroxobine > une enzyme à activité thrombinique dérivée du venin de Bothrops atrox.Cette enzyme présente les mêmes avantages que l"'Ancrod't par rapport-à la thrombine puis, en outre, elle a l'avantage par rapport à l"'Ancrodfl de ne pas provoquer de dégradation protéolytique de la chaise alpha de la fibrine. Toutefois, l'inconvenient qui résulte de l'utilisation de la batroxobine réside dans le fait qu'un excès d'enzyme subsiste, lequel ne peut être neutralisé par un antisérum étant donne que cette neutralisation provoquerait une contamination du produit par des protéines antigènes et rendrait ainsi impossible l'administration parentérale du produit en médecine humaine. On a découvert qu'il était possible d'obvier aux désavantages et dangers des méthodes connues de défibrinogénation en utilisant des enzymes présentant une activité analogue à celle de la thrombine, préparées partir de venins de certaines espèces de serpents et insolubilisées par liaison avec des supports insolubles. Ainsi, l'invention a pour objet un produit enzymatique insoluble présentant une activité thrombinique et défibrinogénante, ledit produit comprenant une substance support insoluble à laquelle est liée une enzyme défibrinogénante présentant une activité analogue à celle de la thrombine et oh- tenue à partir de venin de serpent. Par "insoluble" on veut dire insolubilité dans l'eau, dans des solutions aqueuses de sels, dans des acides minéraux dilués, dans des bases aqueuses diluées, dans des solvants organiques, dans le plasma sanguin et des fractions de celui-ci, dans le sérum sanguin, etc. Conformément à 11 invention, le produit enzymatique insoluble est obtenu en faisant réagir une enzyme défibri nogénante > présentant une activité analogue à celle de la thrombine et dérivée d'un venin de serpent, avec une substance support comportant des groupes réactifs aptes à réagir avec des groupes fonctionnels de 1' enzyme pour former un produit réactionnel insoluble. A titre de supports qui se prêtent aux fins définies ci-dessus, on peut utiliser des substances insolubles qui, le cas échéant, sont activées préalablement à leur usage et qui sont aptes à lier des protéines, plus particulièrement des protéases sériniques [voir K.A. WALSH & P.E. WILCOX gans "Methods of Enzymology", vol. XIX, p. 31, S.P. COLOWICK & N.O. KAPLAN, Academic Press, New York et Londres (1970)], de manière que lesdites protéines deviennent insolubles sans que leur activité biologique ne soit sensiblement affectée ou réduite. Des méthodes de ce type pour insolubiliser des protéines sont, en principe, connues. Cependant, l'application de ces méthodes à l'insolubilisation d'enzymes dérivées de venins de serpents n'a pas été décrite jusqu'à présent. A titre de substances support, on peut utiliser, des substances polymères insolubles, le cas échéant activées par l'introduction de groupes réactifs ou par catalyse. On peut citer, par exemple: les celluloses, [D.H. CAMPBELL et al., Proc. nat. Acad. Sci. USA, 37, 575 (1951); A.E. GURVIC et al., Biokhimiya, 24 > 144 (1959); A.E-. TUMANOVA, Biokhimiya, 26, 803 (1961); N. GRUBHOFER, Hoppe Seylers Z. physiol. Chem., 297, 108 (1954); MA. MITZ et- al., Nature, 189, 576 (1961); C.J. EPSTEIN et al., J. biol. Chem., 237, 2175 (1962)], les polydextranes [J. PARATH, Nature, 183, 1657 (1959); J. PARATH, Nature, 218, 834 (1968)], l'agarose [J-. PARATH, Nature, 218, 834 (1468); R. AXEN et al., Nature, 214, 1302 (1967); P. CUATRECASAS et al., Biochem., 11, 2291 (1972); P. CUATRECASAS et al;, J. biol. Chem. 245, 3059 (1970)], les polypeptides [A.BAR-ELI et-al., Nature, 188, 856 (1960); E. RISEZ et al., J. biol. Chem., 239, 1521 (1964); D. GIVOL et al., Biochem., 3, 444 (1964)], les polystyrènes [G. MANECKE et al., Makromol. Chem., 39, 13 (1960); G. MANECKE et al., Makromol. Chem., 51, 199 (1962); G. MANECKE et al., Makromol. Chem., 91, 136 (1966)], les acides polyacryliques [J.P. CORNAZ et al., Helv. chiot. Aéta, 40, 2015 (1957); K. MOSBACH, Acta chem. Scand., 24, 2084 (1970)], les polyacrylamides [K. MOSBACH, Acta chem. Scand., 24, 2084 11970)] et des copolymérisats. [K. MOSBACH, Acta chem. Scand., 24, 2084 (i970); S.A. BARKER et al., Carbohyd. Research, 14, 287 (1970); G. MANECKE et al., J. Polymer Sci. Part C, 30, 607 (1970)]. Les groupes réactifs introduits, le cas échéant, dans les substances mentionnées ci-dessus peuvent être, par exemple, des groupes diazonium [D.H. GAMPBELL.et al., Proc. nat. Acad. Sci. USA, 37, 575 (1951); A.E. GURVIC et al., Biokhimiya, 24, 144 (1959)i J.I. CEBRA et al., J. biol. Chem., 236, 1720 (1961)1, isocyanate [H. BHANDENBERGER, Helv. chim. Acta, 40, 61 (1957r; R. AXEN et al., Nature, 210, 367 (1966)], chlorure d'acide [H.C. ISLIKER, Advanc. Protein Chem., 12, 387 (1957)], acide [M.A. MITZ et ai., Nature 189, 576 (1961); C.J. EPSTEIN et al., J. biol. Chem. 237, 2175 (1962)], anhydride d'acide [Y. LEWIN et al., Biochem., 3, 1905 t1964)], sulfochlorure [H.C. ISLIKER, Advanc. Protein Chem., 12, 387 (1957)}, dinitrofluorophényle [G. MANECKE et al. Makromol. Chem., 39, 13 (1960); G. MANECKE, Naturwissenschaften, 51, 25 (1964)], isothiocyanate [R. AXEN et al., Nature, 210, 367 (1966); G. MANECKE et al., Naturwissenschaften, 54, 531 (1967)], halogénotriazine [G. KAY et al., Nature, 216, 514 (1967)3, hydroxy [R. AXEN et al., Nature, 214, 1302 (1967); P. CUATRECASAS et al., J. Biol.Chem., 245, 3059 (1970)], amino [D.H. CAMPBE1L et ai., Proc. nat. Acad. Sci. USA, 37, 575 (1951); A.s. GURVIC et ai., Biokhimiya, 24, 144 (1-959); P. CUATRECASAS et al., J. Biol. Chem., 245, 3059 (1970)], ester de N-hydroxyimide d'acide succinique [P. CUATRECASAS et al., Biochem., 11, 2291 (1972)] ou hydrazino [F. MICHAEL et al., Makromol. Chem., 3, 200 (1949)]. I1 est recommandable d'utiliser des supports dont la réactivité est suffisamment élevée pour permettre de lier enzyme défibrinogénante dans des conditions aussi ménageantes que possible. A titre d'enzyme défibrinogénantes, présentant une activité analogue à celle de la thrombine, on peut utiliser, par exemple, les enzymes obtenues par le. procédé décrit ci-après à partir du venin de serpents appartenant aux familles, genres et espèces suivantes: CROTALIDAE: Genre Agkistrodon, p.ex. les espèces acutus, rhodostoma, et autres; Genre Bothrops, p.ex. les espèces atrox, jararaca, moojeni, marajoensis, asper, pradoi, et autres; Genre Crotalus, p.ex. les espèces adamanteus, atrox, durrissus terrificus, et autres.; Genre Trimeresurus, p.ex. l'espèce flavoviridis; VIPERIDAE: Genre Vipera, p.ex les espèces aspis, berus, et autres; ELAPIDAE:: p.ex. les espèces Denisonia superba, Notechis scutatus, Pseudechis porphyriacus. On obtient des résultats particulièrement intéressants en utilisant l'enzyme dite batroxobine, obtenue à partir du venin de Bothrops atrox ou d'autres serpents dont le venin donne une réaction immunologique croisée avec le venin de Bothrops atrox. Le terme réaction immunologique croisée est définie, par exemple, dans "Expenmental Immunochemistry", par KABAT et MAYERS, 2e édition, pages 405 à 442 (1971). Le nom batroxobine est utilisé couramment dans la littérature pour désigner l'enzyme thrombinique défibrinogénante dérivée du venin de Bothrops atrox. Ce nom a été adopté officiellement par l'Organisation Mondiale de la Santé (voir Chronique OMS, vol. 27, No. 10, 1973). Les propriétés de la batroxobine ainsi que sa préparation sont décrites, par exemple, dans la demande de brevet français NO 72 01 658 (publiée). La batroxobine peut être préparée, par exemple, en faisant agir le phénol ou un dérivé phénolique sur une solution aqueuse du venin de Bothrops atrox, ou de tout autre serpent dont le venin donne une réaction immunologique croisée avec le venin de Bothrops atrox, pour obtenir un produit réactionnel insoluble entre la fraction enzymatique thrombinique défibrinogênante du venin et le phénol ou le dérivé phénolique, en isolant et décomposant le produit réactionnel insoluble pour libérer ladite fraction enzymatique et en soumettant celle-ci à une purification supplémentaire. A titre d'exemples de serpents dont le venin donne une réaction immunologique croisée avec le venin de Bothrops atrox, on peut citer Bothrops jararaca, moojeni, marajoensis} asper, pradoi, etc. Le même procédé peut être appliqué à la pré paration d' enzymes défibrinogénantes à partir du venin des autres espèces de serpents énumérées ci-dessus. La batroxobine présente les propriétés suivantes: a) elle exerce une activité semblable à celle de la thrombine, b) elle comprend un constituant peptidique et un constituant hydrate de carbone, le constituant peptidique comprenant un ou plusieurs polypetides d'un poids moléculaire- n1 ex- cédant pas 55000 (détermine par la méthode d'ultracentrifugation équilibrée), c) elle est soluble dans de la solution physiologique de chlorure de sodium, d) elle forme avec des composés phénoliques des complexes peu soluble ou insolubles dans l'eau, e) elle provoque la coagulation du fibrinogène par ltélimination sélective de fibrinopeptide A du fibrinogène sans détachement de fibrinopeptide B, f) elle dégrade l'ester méthylique de tosylarginine et la gélatine, mais non pas l'ester méthylique de lysine, l'ester éthylique de phénylalanine, la N-acétylméthionine, la N-acétyltyrosine, la leucylglycine et la caséine7 -g) elle n'est pas inhibée par l'héparine, les héparinoides, lthirudine, les antithrombines et l'inhibiteur de peptidase polyvalent selon KUNITZ, et hj elle n1 est pas fixée et, par conséquent, n'est pas inactivée par la fibrine. La réaction entre l'enzyme et la substance support est effectuée, de préférence, dans un milieu aqueux, par exemple dans un tampon aqueux dilué tel que le bicarbonate de sodium, le phosphate de sodium aqueux ou le borate de sodium aqueux, à un pH neutre ou faiblement alcalin et à de8 températures plutôt basses comprises; p.ex., entre 0 C et la temperature ambiante, de préférence entre 0 et 5 C. L'enzyme résiduelle non fixée chimiquement peut être séparée du produit insoluble par lavage avec des tampons aqueux ou des solutions aqueuses de sels. I1 est utile d'inactiver les groupes réactifs libres qui pourrait subsister sur la substance support dans le produit enzymatique insoluble obtenu. Cette inactivation peut se faire par un traitement avec des-substances inactivantes telles que le B-naphtol, les acides aminés, les alcalis faibles ou les acides faibles. Lorsque le produit enzymatique conforme à l'invention est ajouté à du sang humain ou mammifère, à du plasma ou à des fractions de celui-ci, une défibrinogénation du sang, du plasma ou des fractions de celui-ci se produit par formation et pricipitation de fibrine. La fibrine ainsi précipitée peut se déposer sur le produit enzymatique insoluble. On peut facilement séparer la fibrine précipitée et le produit enzymatique insoluble ou le produit enzymatique insoluble sur lequel la fibrine est déposée d'avec le sang ou le plasma par des moyens conventionnels, par exemple par pressuration ou centrifugation. Le produit enzymatique insoluble mélangé à ou portant de la fibrine, peut être régénéré par un traitement avec une solution aqueuse 5 m d'urée, traitement qui provoque la dissolution de la fibrine coagulée. I1 est recommandable de soumettre le produit enzymatique insoluble débarrassé de la fibrine à un lavage avec une solution aqueuse de NaCl (p.ex. à 0,9%). Le produit enzymatique est alors prêt à être réutilisé. Le rapport pondéral entre l'enzyme et la substance support dans le produit de l'invention peut varier dans une gamme étendue. On obtient de bons résultats avec un rapport pondéral d'environ 1 à 20. Dans les exemples de mise en oeuvre de 1'in- vention qui suivent, les températures sont données en degrés centigrades. Exemple 1 On a mis en suspension 100 mg de p-aminobenzylcellulose dans 2 à 10 ml de HC1 2 n, tout en agitant et en refroidissant dans un bain de glace. On a ajouté une solution aqueuse à 4% de NaNO2 à la suspension et on a laissé réagir le mélange pendant 15 minutes. Ensuite, on a isolé par essorage le chlorhydrate de cellulosebenzyldiazonium obtenu, on a éliminé l'excès de HC1 par lavage à l'eau froide et on a mis en suspension le résidu dans 2 à 4 ml de tampon phosphaté 0,1 m présentant un pH de 7,5. On a dissout 5 mg de batroxobine dans 1 ml du meme tampon et ajouté la solution obtenue à la suspension.On a agité le mélange pendant 24 heures à 0-5 . On a séparé le produit réactionnel par essorage, on l'a lavé à l'eau et on l'a traité pendant 12 heures avec une solution saturée de P-naphtol dans de l'acétate de sodium aqueux à une température de 0-5 . On a finalement lavé le produit enzymatique plusieurs fois avec du tampon phosphaté 0 > 1 m à pH 7,5, avec du NaCl aqueux 0,5 m et avec du NaCl aqueux à 0,9% afin d'éliminer toute trace d'enzyme libre non liée. La formation du produit enzymatique insoluble conformément à l'exemple 1 peut être illustrée par le schéma réactionnel suivant: Exemple 2 On a porté- le pH d'une solution de 300 mg de BrCN dans 4 ml d'eau à 11,5 en y ajoutant du NaOH 2 n, tout en agitant. A cette solution, on a ajouté une solution de 100 mg de polydextrane (produit SEPHADEX, marque déposée) dans 4 m1 d'eau et on a de nouveau porté le pH du mélange à 11,5 à l'aide de NaOH 2 n. Après 10 minutes, on a séparé le produit réactionnel par essorage et on l'a lavé à l'eau froide. On a dissous 5 mg de batroxobine dans 1 ml de solution aqueuse de bicarbonate de sodium 0,5 n et on a ajouté la solution obtenue au polydextrane activé. On a agité le mélange réactionnel pendant 12 heures à 0-5 . On a lavé le produit enzymatique insoluble obtenu avec du bicarbonate de sodium aqueux, avec du HC1 aqueux dilué, avec du NaCl aqueux 1 m et avec de l'eau pour éliminer toute trace d'enzyme libre non liée. La formation du produit enzymatique insoluble conformément à l'exemple 2 peut être illustrée par le schéma réactionnel suivant: polydextrane-OH + NaOH + CNBr - > [polydextrane-CN produit intermédiaire] + NH2 NH2 H2N - enzyme -COOH # polydextrane-O-CH=N- enzyme COOH Exemple 3 On a mis en suspension 100 mg de résine hydrazino-polyacrylamide (produit ENZACRYL AH, marque déposée) dans 10 ml de HC1 2 n et on a agité la suspension dans un bain de glace. On a ajouté à la suspension une solution aqueuse à 4% de nitrite de sodium et on a laissé réagir le mélange pendant 15 minutes. On a ensuite isolé par centrifugation la résine polyacrylamide activée obtenue et l'a lavée avec du tampon phosphaté 0,1 m jusqu'à neutralité. On a dissous 5 mg de batroxobine dans 1 ml de tampon phosphaté et refroidi la solution. On a ajouté la solution refroidie à la résine polyacrylamide activée, tout en agitant. On a laissé réagir le mélange pendant 24 heures à 0-5 . On a enusite isolé par essorage le produit enzymatique insoluble obtenu et on l'a lavé plusieurs fois avec du tampon phosphaté, du NaCl aqueux 0,5 m, avec de l'eau et avec une solution aqueuse à 0,9% de NaCl pour éliminer toUte trace d'enzyme libre non liée. La formation du produit enzymatique insoluble conformément à l'exemple 3 peut être illustrée par le schéma réactionnel Comme il est évident pour l'homme du métier, on peut activer les substances support mentionnées dan-s les exemples 1 à 3 par l'introduction d'autres groupes réactifs tels que ceux énumérés ci-dessus. En outre, les substances support mentionnées dans les exemples 1 à 3 peuvent être remplacées par d'autres supports tels que ceux énumérés ci-dessus. Les exemples qui suivent montrent comment on peut utiliser le produit enzymatique de l'invention dans la défibrinogénation de plasma sanguin. Exemple 4 On a mélangé O 0,2 ml de plasma sanguin humain citraté avec 0,1 ml d'une suspension du produit enzymatique préparé conformément à l'exemple 3 dans une solution aqueuse à 0,9% de NaCl (100 mg de prodùit enzymatique pour 1 mlr. On a constamment agité le mélange. Après 5 à 10 minutés, on a observé des fibres de fibrine qui s t étaient déposées sur les particules du produit enzymatique insoluble. Après 10 à 15 minutes, la fibrine s'était condensée sous forme due flocons. Au bout de 1/2 à 1 heure, on a pressuré le caillot et on a recueilli le plasma par centrifugation.Le plasma défibrinogéné ne ùoagulait plus lors de l'adjonction d'une quantité supplémentaire du produit enzymatique insoluble ou de thrombine. Le plasma était prêt à être utilisé pour des examens hématologiques, p.ex. le dosage de l'antithrombine et de la prothrombine. Exemple 5 A partir de 10 litres de plasma sanguin bovin citraté, on a isolé le facteur VIII par précipitation à OC à +2 et centrifugation selon la méthode de J.G. POOL [Nature, 203, 312 (1964)1..Le cryo-précipitat qui présentait une teneur en fibrinogène de 60% environ a été dissous dans 200 ml de solution aqueuse 0,05 m de bicarbonate de sodium à 20-25 . On a ajouté à la solution 2 g du produit enzymatique insoluble préparé conformément à l'exemple 3. On a agité le mélange pendant 1 heure à 20-25 . On a éliminé le précipitat de fibrine et le produit enzymatique insoluble par centrifugation de la suspension (à 3000 tours par minute pendant 15 minutes). Ensuite, on a refroidi le centrifugat à -30 à 0 et on y a ajouté 35 ml d'méthanol refroidi (00) et 15 g de glycocoll. On a agité le mélange pendant 1 à 3 heures à -30 à 0 et ensuite on a séparé par centrifugation le facteur VIII précipité. On a dissous le sédiment dans une solution aqueuse 0,055 m de citrate trisodique. La solution a été centrifugée et stérilisée par filtration à travers un filtre à membrane. On a ainsi obtenu environ 6000 à 8000 unités de facteur VIII exempt de fibrinogène et facilement dissoluble. REVENDICATIONS 1. Produit enzymatique insoluble destiné à être utilisé comme réactif défibrinogénant dans des examens sanguins, en particulier dans le dosage des facteurs de la coagulation sanguine dans le sang humain ou mammifère, et dans la préparation ou l'isolement des facteurs de coagulation à l'état pratiquement pur à partir de sang humain ou mammifère, de plasma sanguin ou de fractions de celui-ci, caractérisé en ce qu'il comprend une enzyme obtenue å partir d'un venin de serpent et dont l'activité est défibrinogénante et analogue à celle de la thrombine, et une substance support insoluble, l'enzyme étant liée à la substance support. 2. Produit selon la revendication 1, caractérisé en ce qutil consiste essentiellement en le produit de réaction de 11 enzyme avec la substance support. 3. Produit selon les revendications I et 2, caractérisé en ce que le support est une substance polymère possédant des groupes réactifs liés à des groupes fonctionnels de 1'enzyme. 4. Produit selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la substance support est une cellulose, un polydextrane, l'agarose, un polypeptide, un polystyrène, un acide polyacrylique ou un copolymérisat portant comme groupes réactifs des groupes diazonium, isocyanate, chlorure d'acide, anhydride d'acide, sulfochlorure, dinitrofluorophényle, isothiocyanate, halogénotriazine, hydroxy, amino, ester d'N-hydroxyimide d'acide succinique ou hydrazino. 5. Produit selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme thrombinique défibrinogénante est dérivée du venin de serpents de la famille des Crotalidae, p.ex. le genre Agkistrodon, en particulier les espèces acutus et rhodostoma, le genre Bothrops, en particulier les espèces atrox, jararaca, moojeni, marajoensis, asper et pradoi, le genre Crotalus, en particulier les espèces adamanteus, atrox et durissus terrificus, ou le genre Trimeresurus, en particulier l'espèce flavoviridis, la famille des Viperidae, p.ex. le genre Vipera, en particulier les espèces aspis et berus, ou la famille des Elapidae, en particulier les espèces Denisonia superba, Notechis scutatus et Pseudechis porphyriacus. 6. Produit selon les revendications 1 et 5, caractérisé en ce que l'enzyme est la batroxobine. 7. Procédé pour la préparation du produit enzymatique insoluble défini par la revendication 1, caractérisé en ce qu'on fait réagir une enzyme obtenue à partir d'un venin de serpent et dont l'activité est défibrinogénante et analogue à celle de la thrombine avec une substance support insoluble afin d'obtenir un produit réactionnel dont le constituant enzymatique est insolubilisé sans que son activité défibrinogénante ne soit sensiblement affectée ou réduite. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on utilise comme substance support une substance polymère possédant des groupes réactifs aptes à réagir avec des groupes fonctionnels de 11 enzyme. 9. Procédé selon les revendications 7 et 8, caractérisé en ce qu'on utilise comme substance support une cellulose, un polydextrane, l'agarose, un polypeptide, un polystyrène, un acide polyacrylique ou un copolymérisat portant comme groupes réactifs des groupes diazonium, isocyanate, chlorure d'acide, anhydride d'acide, sulfochlorure, dinitro flubrophényle, isothiocyanate, halogénotriazine, hydroxy, amino, ester d'N-hydroxyimide d'acide succinique ou hydrazino. 10. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on utilise comme enzyme thrombinique et défibrino génante une enzyme obtenue à partir du venin de serpents de la famille des Crotalidae, p.ex. le genre Agkistrodon, en particulier les espèces acutus et rhodostoma, le genre Bothrops, en particulier les espèces atrox, jararaca, moojeni, marajoensis, asper et pradoi, le genre Crotalus, en particulier les espèces adamanteus, atrox et durissus terrificus, ou le genre Trimeresurus, en particulier l'espèce flavoviridis, la famille des Viperidae, p.ex. le genre Vipera, en particulier les espèces aspis et berus, ou la famille des Elapidae, en particulier les espèces Denisonia superba, Notechis scutatus et Pseudechis porphyriacus. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'on utilise la batroxobine. 12. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on effectue la réaction entre1'enzyme et la substance support dans un milieu aqueux à une température comprise entre 0 C et la température ambiante, de préférence entre 0 et 50C, à un pH neutre ou faiblement alcalin.