Brevet FR2235698A1 — publié le 19750131

La présente invention concerne de nouveaux composés et leur procédé de préparation, elle se rapporte notamment à l'acide N6-monobutyryl-8-thioadénosine-3',5'-cyclique-phosphorique et à l'acide 2' 0-monobutyryl-8-thioadénosine-3',5'- cyclique-phosphorique ainsi qu'à leurs sels et leur procédé de préparation. Il est connu que l'acide adénosine-3',5'-cyclique- phosphorique (cAMP) joue un rôle biologique extremement important en tant que "porteur hormonal secondaire". Certaines hormones activent une enzyme appelée adényl-cyclase localisée dans les membranes cellulaires du tissu visé. L'adényl-cyclase catalyse la formation de cANP à partir de A P par perte d'acide pyrophosphorique. De cette façon, le cAMP à l'intérieur des cellules du tissu visé, modère l'effet d'une hormone spécifique. On connaît également une phosphodiestérase spécifique qui, par hydrolyse, transforme le cAMP en acide adénosine-5'-phosphorique Cette enzyme et l'adényl-cyclase régulent la concentration intracellulaire du nucléotide cyclique. Divers drivés du uAMP sont connus comme le dérivé 8-thio, le dérivé , 2'0-dituty- ryle, le dérivé 6-monobutyryle et le dérivé 210-monobutyryle. Certains de ces dérivés sont bien plus actifs que le composé proche, à savoir, l'acide adénosine-3',5'-cyclique-phosphorique (cAMP). Le composé N6 2'0-dibutyryl-8-thio-cAMP est décrit dans le brevet français n 2 112 084. Ce composé est décrit comme étant préparé en faisant réagir du 8-thio-cVMP avec de l'anhydride bityrique en présence de pyridine anhydre pendant trois heures à la température ambiante. Le produit est isolé par précipitation de son sel de baryum selon un rendement de 30%. La présente invention a trait à un procédé pour la préparation de dérivés N6- et 2'O-monobutyryle de l'acide 8-thio-adénosine-3', 5'-cyclique-phosphorique et ses sels. La présente invention concerne également les nouveaux composés N6-monobutyryl-8-thio-cAMP et 2'O-monobutyryl-8-thio cAMP et leurs sels. La préparation du 2'Q -monobutyryl-8-thio-cAMP consiste à faire réagir du 8-thio-cAMP avec un agent butyrylant à la température ambiante pendant une période de temps relativement brève de l'ordre d'une heure et à isoler le 2'0-monobutyryl-8cAMP substitué par chromatographie sur colonne sur de la terre de diatomées. La préparation du N6-monobutyry1-8-thio-cAMP utilise le N6, 2'0-dibutyryl-8-thio-cAMP comme matière de départ et consiste en une hydrolyse sélective du groupe 2'O-butyryle par une base comme lthydroxyde de sodium. Après l'extraction de l'acide butyrique, le N6-monoTutylal-8-thio-cAMP est isolé par précipitation de son sel de sodium. Le procédé de butyrylation pour le 2'0-monobutyryl-8- thio-cAMP est mis en oeuvre a' la température ambiante ou en dessous de la température ambiante pendant environ 30 minutes à environ 1 heure 30 minutes, de préférence pendant une heure. Comme agent butyrylant, on peut utiliser l'anhydride butyrique ou le chlorure de butyryle en présence de pyridine ou d'autres amines tertiaires. Le produit résultant est isolé par chromatographie sur colonne sur de la terre de diatomées, par exemple de la célite en utilisant comme éluants successifs des mélanges de solvants ou un solvant à polarité accrue comme, par exemple, l'heptane, 1 'heptane-acétone et 1 'éthanol-acétone-eau. Le 2'0-dibutyryl-8-thio-cAMP est obtenu sous la forme d'un sel-, par exemple le sel de pyridinium qui peut être transformé en sel alcalin ou en acide libre par passage sur une résine échangeuse d'ions appropriée comme la résine "DOWEX-50- X-8" (forme H+ ou Na+ respectivement). Le procédé de préparation du 0 -monobutyryl-8-thio- cAMP selon l'invention est caractérisé par le traitement du N6,2'0-dibutyryl-8-thio-cAMP avec une base en solution alcoolique. On peut utiliser toute base convenable et notamment l'hydro- xyde de sodium ou l'hydroxyde de potassium. De préférence, la réaction est mise en oeuvre à la température ambiante pendant environ 20 minutes en utilisant une concentration d'hydroxyde de sodium d'environ 0,2 M. Il est évident pour un spécialiste des synthèses de chimie que les conditions précitées peuvent être modifiées raisonnablement. Ainsi, si la température est abaissée, la durée de réaction peut être accrue et si la durée de réaction est réduite, la concentration de la base peut entre augmentée. En général, la température varie entre environ O et 250C, la concentration de la base étant de l'ordre de 0,1 à 0,3 N et la durée de réaction d'environ 10 à 30 minutes. L'acide butyrique formé dans la réaction est éliminé du mélange réactionnel par acidification suivie par une extraction au solvant organique. L'acidification est, de préférence, réalisée avec de l'acide chlorhydrique 1 à 3 M. L'acide butyrique est extrait avec n'importe lequel des solvants organiques convenables et, en particulier, avec de l'éther. La phase aqueuse restante est neutralisée avec toute base convenable et, notamment, de lthydroxyde de sodium ou de l'hydroxyde de potassium à la température ambiante ou à une température inférieure et est evaporée jusqu'à siccité sous vide. Le sel de sodium du dérivé monobutyrylé est séparé des sels inorganiques, par exemple, du chlorure de sodium par trituration du résidu avec de l'éthanol. Après filtration, la solution alcoolique du dérivé monobutyrylé est concentrée selon un petit volume et le sel de sodium du N6-monobutyryl-8-thio-cANP est précipité par addition d'éther. Le sel de sodium ainsi obtenu peut être transformé sous la forme d'acide libre ou en d'autres sels par traitement classique, par exemple, par neutralisation avec une base convenable y compris les sels acceptables du point de vue pharmaceutique classiquement employés dans la technique des nucléotides comme les sels de sodium, potassium, ammonium, triéthylammonium, triméthylammonium. Les composés résultant du procédé de l'invention sont d'un intérêt considérable en recherche biochimique et thérapeu tique et ils peuvent être utilisés de façon spécifique-pour stimuler la synthèse et/ou le dégagement de certaines hormones par les glandes endocrines. Les exemples suivants donnés de façon non limitative illustrent la présente invention. EXEMPLE 1 Préparation du sel de sodium de l'acide 0 -monobutyryl-8-thio- adénosine-3' g 5'-cyclique-phos6horiaue (sel de sodium du monobutyryl-8-thio-cAMP). 300 mg d'acide N6, 2'0-dibutyryl-8-thio-adénosine- 3',5'-cyclique-phophorique sont traités avec une solution d'hydroxyde de sodium 0,2 N dans de l'alcool à 60% pendant 20 minutes à la température ambiante. Le mélange réactionnel est acidifié à pE2 avec de l'acide chlorhydrique et l'acide butyrique est extrait avec de l'éther, la solution ainsi obtenue est neutralisée à pH7 avec de l'hydroxyde de sodium et est évaporée jusqu'à siccite,-la trituration du résidu avec de l'éthanol absolu dissout le-- produit et permet une séparation du chlorure de sodium présent.La solution alcoolique est concentrée et le produit est précipité par addition d' éther fratchement distillé pour obtenir 170 à 200 mg du sel de sodium du N6-monobutyryl8-thio-cAMP. Composition: C10H11N5O6PSNa Rf (sur papier Whatman n 1) dans le système éthanol-acétate d'ammonium 0,5 M ( 5:2-vXv) = 0,61 Résultats à l'ultraviolet : dans l'eau à pH 6,0 max = 242 et 308 m # max = 17 430 et 19 100 EXEMPLE 2 Préparation du sel de sodium de l'acide 2'O-monobutyryl- 8-thio-adénosine-3',5'-cyclique-phosphorique (sel de sodium du 2,0-monobutyryl-8-thio-cAMP). On traite 1, 1 g du 8-thio-cANP avec 33,3 g d'un mélange d'un volume d'anhydride butyrique et de deux volumes de pyridine anhydre à la température ambiante pendant 75 minutes. Le mélange obtenu est séparé par chromatographie sur une colonne de célite d'une longueur de 50-cm et d'un diamètre de 3 cm. La colonne est tout d'abord lavée avec de ltheptane puis avec un mélange d'heptane-acétone (3:1 v/v) et le dérivé, 2'0-monobutyryl8-thio-cAMP est élué avec un mélange d' acétone-éthanol-eau (16:1:3 v/v). Les fractions contenant le produit sont refroidies et évaporées. Le 2'0-monobutgryl-8-thio-cAMP est traité avec du bicarbonate de sodium, la solution aqueuse obtenue est ensuite concentrée et le sel de sodium est précipité avec de l'éthanol et de l'acétone. Le rendement est de 0,8 g de sel de sodium. Composition: C10H11N5O6PSNa Rf (sur du papier Whatman n 1) dans le système éthanol-acétate d'ammonium 0,5 M (5:2 v/v).-= 0,63. Résultats à l'ultraviolet : dans l'eau à pli 6,0 #max = 246 et 297 m # max = 16 960 et 22 900 EXEMPLE 3 Les dérivés N6 - et 2'0-monobutyryl-8-thio du cAMP sont étudiés pour leur effet sur le dégagement de l'hormone de croissance (HC) de glandes pituitaires de rats mâles et femelles in-vitro. La mesure du dégagement de l'hormone de croissance (EG) de la glande pituitaire est effectuée par le procédé classique impliquant l'incubation de glandes pituitaires suivie par une électrophorèse sur gel. Lors de la mise en oeuvre du procédé, un amino-acide margué avec c14(C14 -L-leucine) est ajouté au milieu d'incubation et est incorporé dans la synthèse de l'hormone de croissance (HC) pendant l'incubation.Les resultats du comptage (compteur à scintillation Nuclear Chicago) sont exprimés en coups par minute par ml (cpm/sl)par milligramme de glande pituitaire ayant incubé. Les concentrations des nucleo- tides sont exprimeesen mM et les quantités de l'hormone de croissance de glande pituitaire libérées dans les milieux d'incubation sont exprimées en g/mg de glande pituitaire et en pourcentage d'augmentation par rapport aux témoins. Les nouveaux dérives de cAMP décrits dans l'invention sont particulièrement intéressants en raison de leur grande activité biologique. Ils sont non seulement utiles dans les études du mécanisme d'action du porteur hormonal secondaire mais également dans les applications thérapeutiques. L'activité biologique importante chez les rats femelles des dérivés 2'0 et N6-monobutyryl-8-thio-cAMP est d'un intérêt particulier dans toutes les applications relatives aux fonctions dépendantes du sexe. On utilise le code de désignation suivant aux tableaux 1 et 2 ci-après: cANP = acide adénosine-3' ,5'-cyclique-monophosphorique. DBT-cAMP = N , 2'0-dibutyryl-8-thio-cAMP N6-cAMP = N6-monobutyryl-8-thio-cAMP 2' 0-MBT-cAMP - 2'O-monobutyryl-8-thio-cMP. = N6, 2'0-dibutyryl-cAMP. TABLEAU I Libération de l'hormone de croissance (EC) de glandes pituitaires de rats mâles in-vitro. Concen- g HC g HC cpm/ tration /ml /mg % de cpm/ mg % de (mM) Pit. témoin ml Pit. témoin 1.Témoin - 69,60 3,68 - 3 107 164 - 2.cAMP 2,0 64,90 3,75 102 3 213 # 186 113 3.cAMP 6,0 99,90 5,77 157 7 477 432 263 4.DBT-cAMP 0,2 139,80 8,63 234 10 770 665 405 5.DBT-cAMP 0,6 190,30 10,46 284 17 084 939 572 1. Témoin - 110,86 4,07 - 15 100 555 2.DBT-cAMP 0,6 287,92 10,62 260 57 434 2119 382 3.2'MBT-cAMP 0,2 206,83 7,17 176 48 896 1695 305 4.2'MBT-cAMP 0,6 237,1 9,27 228 89 392 3173 572 5.N6-MBT cAMP 0,2 223,54 8,96 220 90 088 3603 649 6.N6-MBT cAMP 0,6 331,45 10,31 253 101 790 3166 570 1. Témoin - 44,37 3,13 - 6 158 435 2.DBT-cAMP 0,2 117,18 10,02 # 319 25 944 2217 509 3.DBT-cAMP 0,6 158,37 11,60 370 32 762 2400 551 4.DBT-cAMP 1,8 178,14 11,17 357 51 040 3229 742 5.N -MBT cAMP 0,2 85,30 6,91 220 23 842 1930 443 6.N -MBT cAMP 0,6 128,87 9,65 308 32 769 2454 563 7.N'-MBT GdMP 1,8 184,67 # 13,24 422 50 604 3647 833 TABLEAU II Libération de l'hormone de croissance (HC) de glandes pituitaires de rats femelles in-vitro. Concen- g HC g HC % de cpm/ cpm/ % de tration /ml /ml témoin mg (mM) /ml Pit. ml Pit. témoin 1. Témoin - 69,93 2,33 - 39 188 1308 2.DBT-cAMP 0,2 59,52 2,23 96 53 195 1988 153 3.DBT-cAMP # 0,6 102,30 3,57 153 54 619 2105 146 4.DBT-cAMP 1,8 117,97 4,58 196 54 210 2105 -161 5 cAMP # 0,2 53,94 2,29 98 56 871 2412 184 6.N6-MBT ctMP # 0,6 103,41 3,99 # 171 78 247 3021 # 231 7.N -MBT cAMP 1,8 128,34 # 5,86 251 105 231 4805 367 1.Témoin - 35,76 1,32 - 8 300 307 - 2.DBT-cAMP 2,0 62,82 2,53 190 27 960 1125 366 3.N6-MBT cAMP 2,0 77,44 2,77 210 43 840 1568 511 4.2'MBT cAMP # 2,0 54,14 1,87 141 32 900 1138 370 1.Témoin - 65,72 2,54 - 71 458 2759 - 2.cAMP 2,0 68,82 2,65 104 74 002 2851 103 3.cAMP 6,0 108,50 3,97 156 87 360 3200 216 4.DBT-cAMP 0,2 88,66 3,71 146 98 386 4116 149 1.Témoin 1,0 20,67 0,58 - 16 560 466 2.DB-cAMP 1,0 35,24 0,920 159 21 700 569 122 3.DBT-cAMP 1,0 39,48 1,168 201 35 410 1047 225 4-N6-MBT- @ @ @ @ @ @ @ cAMP 1,0 67,84 2,137 368 123 370 3830 822 5.2'0-MBT 1,0 54,85 1,798 310 72 540 2378 510 cAMP R E V E N D I C A T I O N S 1. Procédé de préparation d'acide N6-monobutyryl-8 thioadénosine-3',5'-cyclique-phosphorique et de ses sels, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir de l'acide N6.2'0- dibutyryl-8-thioadénosine-3',5'-cyclique-phosphorique avec une base et à isoler l'acide N6-monobutyryl-8-thioadénosine-3',5' cyclique-phosphorique résultant. 2. Procédé-suivant la reveudication 1, caractérisé en ce que la réaction est mise en oeuvre en solution alcoolique à 1a température ambiante. 3. Procédé de préparation d'acide 2'0-monobutyryl-8 thioadénosine-3',5'-cycliaue-phosphorique et de ses sels, carac térisé en ce qu'il consiste à faire réagir de l'acide 8-thioadénosine-3',5'-cyclique-phosphorique avec un agent butyrylant pendant environ une -heure et à isoler l'acide 2'0-monobutyryl-8- thioadénosine-3',5'-cyclique-phosphorique résultant. 4. Procédé suivant la revendication .3, caractérisé en ce que l'acide 2'0-monobutyryl-8-thioadénosine-3',5'-cyclique- phosphorique est isolé par chromatographie sur de laterre de diatomées. 5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que la terre de diatomées est de la célite. 6. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que l'agent butyrylant est un mélange d'anhydride butyrique et de pyridine anhydre. 7. Procédé suivant la revendication3, caractérisé en ce que la butyrylation est réalisée à la température ambiante. 8. L'acide N6-monobutyryl-8-thioadénosine-3',5'-cyclique-phosphorique et ses sels obtenus par le procédé suivant la revendication 1. 9. L'acide 2'0-monobutyryl-8-thioadénosine-3',5'-cyclique-phosphorique et ses sels obtenus par le procédé suivant la revendication 3.