Brevet FR2215945A1 — publié le 19740830

La présente invention concerne des fractions antigéniques utilisables en particulier, comme vaccins, et leur préparation. La caractéristique d'une telle fraction est d'être la portion d'une culture de germes pathogènes qui donne le premier pic sur le diagramme d'absorption dans 1lultra- violet à 280 nm et qui, opposée à un immunsérum produit chez un animal à partir de la même culture, donne la bande de précipitation (ou le couple de bandes) la plus proche du puits d'antigène dans l'épreuve de diffusion en milieu gélose et dans l'épreuve d'analyse immuno-électrophorétique. I1 s'agit plus spécialement de la fraction sortant la première d'une colonne de chromatographie faite de dextrane en grains de 40 à 120 microns, lors de la chromatographie d'une culture de germes qui ont été lysés pour la mise en liberté de leur production endocellulafre L'invention s'applique, en particulier, à l'obtention d'une fraction antigénique à partir du Salmonella typhi murium; elle s'applique aussi, sans que cette liste ait un caractère limitatif, à la préparation de fractions utiles à partir du bacille de la morve (Malleomyces mallei), du bacille de Whitmore (Pseudomonas mallei) et du vibrion cholérique (Vibrio cholerae). Pour préparer la fraction en cause, on opère, de préférence, de la façon suivante : on cultive le germe pathogène, on lyse le produit de la culture dans des conditions stériles de façon à obtenir une suspension de germes lysés, on chromatographie cette suspension et on recueille la première fraction protéinique qui passe. Si, en particulier, on a utilisé du gel de dextrane en grains de 40 à 120 microns (Sephadex G 200) pour constituer la colonne et si on élue avec un tampon au phosphate 0,15M (pH 7,2), on recueille la portion de liquide dont le volume est égal à celui du gel divisé par 8,5 après avoir initialement laissé s'écouler une quantité d'eau tamponnée égale au volume du gel divisé par 3,7. Pour obtenir le sérum hyperimmun utilisable dans l'épreuve de diffusion en milieu gélosé, on opère de préférence de la façon suivante : on opère initialement comme pour l'obtention de la fraction et on administre la suspension de germes lysés, sans la filtrer à un animal, on saigne celui-ci apres le temps d'action requis et on sépare des hématies le sérum ainsi rendu hypérimmun. L'invention comprend en tant que produit industriel nouveau le sérum qu'on obtient en administrant non la culture entière mais la fraction considérée, ainsi que l'application de ce sérum particulier comme moyen de diagnostic in vitro de la maladie causée par le germe en cause, en particulier le vibrion cholérique. On conduit, de préférence, la culture dans des bottes de Roux sur de la gélose associée à du boùillon de coeur de boeuf à un pH de 7fui2, pendant 24 heures, lorsqu'il s'agit de S. typhi murium; la gélose peut Autre associée à de la peptone trypsinée de veau à un pH de 7,4 lorsqu'il s'agi de Pseudomonas malle ou de Malleomyces malles, les durées étant alors respectivement d'environ 18 heures et 4 jours. Le pH de la gélose au coeur de boeuf pour la culture de V. cholerae doit être de 8,2 et la durée de culture de 18 heures. Pour recueillir les germes qui se sont ainsi multipliés on peut laver les bottes avec de l'eau physiologique (solution aqueuse de NaCl) tamponnée à pH 7,2, en s'aidant de billes de verre et on centrifuge la suspension obtenue à 3000 tours/minute pendant environ 20 minutes. Pour lyser les germes sans porter atteinte aux produits antigéniques engendrés, on procède, de préférence, par congélation et décongélation brutales ou au moyen d'ultrasons. Dans le premier cas on peut faire passer successivement chacun des tubes venant de la centrifugeuse et dans lesquels on a laissé le culot dans un bain réfrigérant, par exemple d'alcool éthylique et de neige carbonique abaissant la température vrrs -60 , puis dans un bain-marie à +370 et cela 10 à 20 fois selon les germes, la durée de séjour dans ehaque bain étant d'environ 20 minutes. Au lieu de cela, on peut placer le contenu des tubes dans le vase d'un appareil de traitement par ultrasons et le soumettre, par exemple, à 250 Hz pendant 2 heures, 500 KHz pendant 2 autres heures et 1000 KHz pendant 2 heures tout en refroidissant ccntinuellement. On dilue alors la suspension de germes lysés avec de l'eau physiologique jusqu'à abaisser à 8 g/litre sa teneur en azote. Un animal auquel il est commode de faire appel pour la production d'anticorps et l'obtention d'un sérum hyperimmun est le lapin. On parvient à lui conférer une immunisation au moyen-de 5 injections, chacune d'un ml de suspension diluée, additionnée de 1 ml d'adjuvant de Freund, en 10 administrations intradermiques, à raison de 0,20 ml de chaque côté de l'épine dorsale puis, tous les 5 jours, une injection intramusculaire d'un ml sans adjuvant, après cela une, souscutanée, d'un ml également et enfin une autre, intrapéritonéale, elle aussi sans adjuvant . Les animaux sont sacrifiés 14 jours après la dernière injection, leur sang recueilli et le serum séparé. On peut aussi utiliser l'ante et l'on obtient alors un sérum très riche en anticorps précipitants. Pour produire le vaccin on procède comme il vient d'trie décrit jusqu'au stade de l'obtention de la suspension de germes lysés. En- vue de la chromatographie on peut, par exemple, constituer une colonne de 2,5 cm de diamètre et 45 cm de hauteur avec 205 ml de gel de Sephadex G 200, l'éluant étant comme indiqué ci-dessus une solution aqueuse de phosphate 0,15 M à pH 7,2, et recueillir le liquide sortant, à 200, par portions successives de 3 ml, par exemple dans une batterie de tubes groupés en spirale (miniescargot de Gilson) et que l'on amène tour à tour sous la colonne. On numérote les tubes dans leur ordre de présentation et, pour chaque tube, on recherche le pouvoir de précipitation par application de la "microméthode" de diffusion en milieu gélosé sur lame. Après 48 heures de maintien en chambre humide, on regroupe les fractions suivant leur appar tenance antigénique, la pureté antigénique traduite par l'unicité de bande de précipitation, étant vérifiée par deux réactions de précipitation, la diffusion en milieu gélosé selon la technique d'Ouchterlony et Oudin et la méthode d'analyse immuno électrophorétique (méthode de Grabar-Williams, modifiée par Scheiddeger).Ainsi est-on conduit à grouper ensemble, comme correspondant à deux bandes osculatrices nommées 1 et 2 (le compte se faisant à partir du puits d'antigène), les contenus des tubes numéros 19 à 27 lorsqu'on opère avec la colonne de Séphadex définie ci-dessus, à partir d'une culture de Styphi murium. La fraction antigénique I + 2 ainsi recueillie peut ensuite être placée dans un sac de collodion, dialysée pendant 24 heures contre de l'eau distillée et enfin lyophilisée, ce qui donne finalement une poudre sèche. Les exemples suivants,non limitatifs, illustrent l'invention. EXEMPLE 1 a) On ensemence de l'eau peptonée répartie dans 20 tubes avec de la souche C 5 de Salmonella typhi murium et l'on maintient les tubes pendant 12 heures à l'étuve à 37". Dans 20 boites de Roux contenant de la gélose à la pepsine trypsinée de veau, à un pH de.7,4, on ensemence avec le contenu des tubes et on cultive pendant 18 heures à 37". On lave ensuite le contenu des boites avec de l'eau physiologique tamponnée, à raison de 20 ml par boite, en s'aidant de billes de verre puis on centrifuge à 3000 tours/minute, pendant 20 minutes afin de rassembler les germes dans un culot; on rejette le liquide surnageant, Pour faire éclater les germes et libérer ainsi la production endocellulaire,on soumet les culots à l'action d'ultra-sons pendant 2 heures à 250 KHz puis 2 heures à 500 KHz et enfin 2 heures à 1000 KHz tout en maintenant la température à +4 par refroidissement. Par application des techniques ordinaires de culture sur gélose, on peut vérifier la stérilité des suspensions obtenues. On dilue le produit du traitement aux ultra-sons avec de l'eau physiologique jusqu'à abaisser la teneur en azote à environ 8 g par litre. A ce stade, la suspension de germes lysés ainsi diluée est utilisable pour la préparation de serums hyperimmuns. b) Pour séparer de ces suspensions les antigènes produits par les germes, on opère comme il va maintenant - Aetre décrit. On fait passer la suspension de germes lysés à travers 205 ml de gel de dextrane (Sephadex G 200) en grains de 40 à 120H dans une colonne de 2,55 cm de diamètre et 45 cm de hauteur en utilisant comme éluant une solution aqueuse de phosphate 0,15 M (pH 7,2). On laisse s'écouler les 54 premiers ml (18 tubes de 3 ml) puis on recueille les 24 ml qui suivent (tubes 19 827) et qui renferment la fraction recherchée Tm 1 + 2. On dialyse le liquide obtenu pendant 24 heures contre de l'eau distillée puis on le lyophilise. Les cultures récoltées sur les 20 boites de Roux ont procuré 350 mg de substanee lyophilisée. La fraction obtenue à partir de S. typhi murium que l'on nommera fraction Ttn 1 + 2, a un poids moléculaire de l'ordre de 180 à 200 000. Elle présente un aspect monomorphe vésiculaire au microscope électronique (grossissement 60 000), passe à travers les filtres Millipore de 0,45E de diamètre de pore mais est retenue par les filtres de 0,22 EXEMPLE 2 Une fraction similaire Ch 1 + 2 a été obtenue à partir de V. cholerae. L'une et l'autre de ces fractions Tm 1 + 2 et Ch 1 + 2 ont été soumises à une expérimentation pharmacologique dont les résultats sont exposés ci-après. Etant do que, Jusqu'à présent il n'était pas possible de déterminer lfactivité vaccinante de la fraction ah 1 + 2 chez la souris, car le choléra est une maladie propre à l'homme, on a tout d'abord déterminé l'activité vaccinante de la fraction Tm 1+2 obtenue à partir de Salmonella typhi murium, germe voisin de Vibrio choléra, qui provoque chez la souris une diarrhée voisine du choléra avec septicémie. En effet, la sourie infectée par Salmonella typhi murium présente les memes sy tomes (diarrhée, etc.) que l'homme ayant contracté le choléra. Toutefois il a été montré récemment par l'inventeur qu'il était possible de reproduire expérimentalement le choléra chez la souris : voir C.R. Acad. Sc. Paris t. 275. p 2049 - 2051. L'activité vaccinante de la fraction Ch 1+2 a pu être déterminée sur quelques souris infectées par Vibrio cholerae. Les résultats de ces deux expérimentations sont rapportés ci-dessous. 1) Vaccination anti-Salmonella typhi murium. a) par voie orale. - La fraction Tm 1+2 extraite de la souche Salmonelle typhi murium, de la manière indiquée ci-dessus, est utilisée à une concentration de 1000 y/tnî. On utilise des souris "Swiss" C3H,"pathogen free" (libre de -tous germes), ayant 4 semaines et pesant de 12 à 15 g. On administre la solution vaccinante par voie orale, au moyen d'une sonde à raison de 0,20 ml (soit environ 200 r de produit actif) par souris. Après 21 jours, on inocule les souris traitées, par voie intrapéritonéale, avec 2000 germes vivants virulents de la souche C d'une culture de 24 heures sur gélose. 5 On inocule dans les mêmes conditions un lot de souris témoins. Sur les 40 souris vaccinées, trois sont mortes et les autres étaient vivantes après 45 jours. Sur les 10 souris témoins la durée moyenne de survie a été de 5, 6 jours.. b) par voie intradermique. La fraction Tm 1 + 2 adminsitrée à des souris à raison de deux injections de 0 > 05 mg à 5 jours d'intervalle, par voie intradermique, a assuré une protection à 80% contre l'inSection. 2) Vaccination anticholérique. - La fraction Ch 1 + 2 extraite pour partie égale des souches HK 1 Ogawa et 9292 Inaba, toutes deux du biotype eltor de là manière décrite ci-dessus, est utilisée à une concentration de 1000t /ml. Les souris "Swiss" utilisées pesaient 15 g et avaient 4 semaines. On administre la solution vaccinante par voie orale, au moyen d'une sonde, à raison de 0;20 ml (soit environ 200 r de produit actif) par souris. Après 21 jours, on inocule les souris traitées,par voie intrapéritonéale, avec 10 000 germes de Vibrio cholerae de la souche HK 1 Ogawa biotype eltor d'une culture de 6 heures, additionnée de 50 ffi de mucine à 5%. On inocule dans les mêmes conditions un lot témoin d'gel identique. Sur les 40 souris vaccinées par voie orale, 5 sont mortes dans les 12 heures, les autres ont survécu. Les 10 souris témoins sont toutes mortes entre 12 et 18 heures. Toxicité. L'injection à la souris, d'un mg de fraction pure lyophilisée, par voie intradermique ou sous-cutanée, ne provoque aucune réaction toxique ni aucune mortalité. L'injection de 5 mg de fraction pure à des souris provoque une diarrhée jaune d'or et parfois la mort par hémolyse. Ces quantités représentent environ 1000 fois les doses utiles chez l'homme. Les fractions Tm 1 + 2 et Ch 1 +.2 provoquent une augmentation du péristaltisme intestinal de l'anse intestinale isolée de lapin avec exsudation importante d'un liquide jaune citron dans la lumière intestinale. L'injection aux souris de ces fractions entratne l'apparition d'anticorps agglutinants, précipitants, vibiocides et protecteurs. Les résultats des expérimentations relatés ci-dessus montrent que les fractions Tm 1 + 2 et Ch t + 2 protègent les animaux par voie orale ou par voie intrapéritonéale. I1 est donc possible d'administrer à l'homme le vaccin anticholérique, obtenu à partir de la fraction Ch 1- + 2, par voie orale, ce qui facilite l'application. De plus l'antigène purifié limite les risques d'allergisation. La répétition biannuelle de la vaccination serait ainsi facilitée. Par ailleurs, la vaccination par l'antigène de Salmonella typhi-murium peut eAtre appliquée aux élevages industriels de poules pondeuses, de poulets industriels, etc... La fraction Tm 1 + 2 est utilisable comme principe actif de vaccin contre Salmonella typhi murium et la fract-ion Ch 1 + 2 comme principe actif de vaccin contre le Vibrio cholerae. Pour faire d'une telle fraction un vaccin, il suffit de filtrer la solution dialysée sur filtre millipores (3 microns), de la répartir en flacons stériles, de peser le poids sec de fraction obtenue et de d iluer avec de l'eau physiologique stérile à la concentration voulue en mg. De plus, soit sous la forme de la fraction non encore dialysée, soit- sous celle du produit dialysé mais non encore desséché, soit enfin à l'état sec, la fraction Ch 1 + 2 peut être utilisée pour le diagnostic d'urgence du choléra ; son emploi permet alors, en particulier, d'écourter considérablement le délai minimum de 48 heures, aetuellement nécessaire pour un diagnostic. El-suffit à cet effet d'administrer à un animal ladite fraction, sous l'une quelconque de ses formes dans les conditions qui ont été définies plus haut pour la production de sérum hyperimmun à partir de la suspension totale ; on dispose ainsi En opérant avec du bacille de Whitmore comme avec le vibricncholerique. on peut obtenir une fraction comparable à la fraction Tm 1 + 2, savoir celle que l'on nommera W 1 + 2. La fraction W 1 + 2 a un poids moléculaire de 11 ordre de 180 à 200 000. Injectée au lapin elle permet d'obtenir un sérum hyperimmun de haut titre precipitant et agglutinant ; diluéau 320ème, ce sérum permet de diagnostiquer le germe avec précision dans une suppuration ou dans une apposition similaire sur lame, par la technique indirecte d'examen en fluorescence. La fraction W i + 2 elle-même permet de déceler l'allergie chez un animal malade si on lui injecte, par la voie intradermique, 0,20 ml d'eau physiologique contenant 0,20 mg de ladite fraction. REVENDICATIONS 1.- Fraction antigénique caractérisée en ce qu'elle est la portion d'une culture de germes pathogènes à laquelle correspond le premier pic sur le diagramme d'absorption dans l'ultra-violet à 280 nm, et qui, opposée à un immunsérum produit chez un animal a' partir de la même culture, donne la bande ou le couple de bandes de précipitation le plus proche du puits d'antigène dans l'épreuve de diffusion en milieu gélosé et l'épreuve d'analyse immuno-électrophorétique. 2.- Fraction selon la revendication 1, caractérisée en outre en ce qu'elle est la fraction sortant la première d'une colonne de chromatographie faite de dextrane en grains de 40 à 120 microns, lors de la chromatographie d'une culture de germes qui ont été lysés pour la mise en liberté de leur production endocellulaire. 3.- Procédé d'obtention de la fraction antigénique spécifiée sous 1 ou 2, à partir d'un germe pathogène caract6- risé en ce qu'on cultive ce germe, on lyse le produit de la culture dans des conditions stériles de façon à obtenir une suspension de germes lysés, on chromatographie cette suspension et on recueille la première fraction protéinique qui passe. 4.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on utilise une colonne faite de gel de dextrane en grains de 40 à 120 microns, on élue avec un tampon au phosphate (oui5 M ; pH 7,2), on recueille la portion de liquide dont le volume est égal à celui du gel divisé par 8,5 après avoir initialement laissé s'écouler une quantité d'eau tamponnée égale au volume du gel divisé par 3,7. 5.- Procédé selon la revendication 3 ou la revendication 4, caractérisé en ce qu'on lyse les germes par congélation et décongélation brutale du milieu de culture. 6.- Procédé selon la revendication 3 ou la revendication 4, caractérisé en ce qu'on lyse les germes en les soumettant à l'action d'ultrasons. 7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 3-à 6, caractérisé en ce qu'on dialyse la fraction obtenue contre de l'eau distillée puis on la dessèche. 8.- Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on dessèche la fraction dialysée par lyophilisation. 9.- Vaccin contenant la fraction antigénique définie dans l'une ou. l'autre des revendications 1 et 2 ou obtenue par le procédé de l'une des revendications 3 à 8. 10.- Vaccin contre le choléra contenant la fraction antigénique qui provient d'une culture de Vibrio cholerae et qui a la caractéristique définie dans l'une ou l'autre des revendications -1 et 2 ou qui a été obtenue par le procédé de l'une des revendications 3 à 8. il.- Vaccin anti-Salmonella typhi murium contenant la fraction antigénique qui provient drune culture de Salmonella typhi murium et qui a la caractéristique définie dans l'une. ou l'autre des revendications i ou 2 ou qui a été obtenue par le procédé de l'une des revendications 3 à 8. 12.- Sérum hyperimmun obtenu par administration à un animal de la fraction antigénique définie dans l'une ou l'autre des revendications i et 2 ou obtenu par le procédé de l'une des revendications 3 à 8. 13.- Application du sérum défini sous 12 comme moyen de diagnostic de la maladie engendrée par le germe ayant servi à sa production.