Brevet FR2229397A1 — publié le 19741213

I1 est connu que l'on peut immuniser les lapins contre la myxomatose en produisant une réaction inflammatoire spécifique ou fibrome d Shope, par injection du virus de Shope (ou virus du myxome) par voie intradermique. Cependant, pour obtenir une bonne immunisation, il convient d'effectuer des injections intra-dermiques en plusieurs points, ce qui est irréalisable dans la pratique. D'autre part, l'injection de virus par voie sous-cutanée qui constitue la vaccination classique ne provoque la formation de fibrome de Shope que de façon très incertaine, et l'immunité qui s'ensuit est très aléatoire. C'est ainsi que la demanderesse a contrôlé llefficacité déterminée par l'épreuve expérimentale par le virus virulent de la myxomatose, de 2 vaccins expérimentaux classiques préparés par elle et 2 vaccins commerciaux classiques. VACCIN EXPERIMENTAL n 1 , nombre de lapins protégés : 0/4 n0 2 , " " " : 0/4 VACCIN COMMERCIAL n 1 , nombre de lapins protégés : 1/4 n0 2-, 2 " " : : 1/4 Témoins li " " : 0/4 I1 est donc normal que les utilisateurs ne soient que peu satisfaits des résultats pratiques d'immunisation à la suite de l'utilisation de tels vaccins. Divers auteurs ont préconisé l'emploi de souches atténuées ou modifiées du virus du myxome de façon à lui faire perdre son pouvoir pathogène. Malheureusement, on ne peut pas etre sûr du non-retour à la virulence de ces souches modifiées, d'autant plus que, dans la nature, elles peuvent subir un nombre de passages indéterminés, à la suite de leur transfert par les vecteurs. On a maintenant trouvé que l'on peut communiquer au lapin une bonne immunité contre la myxomatose par une seule injection sous-cutanée de virus de Shope et d'une substance insoluble non résorbable (qui sera ci-dessous désignée sous le nom "d'adjuvant") inoculés simultanément. La présente invention a donc pour objet un vaccin contre la myxomatose, destiné à être administré par voie sous-cutanée comprenant du virus de Shope et un adjuvant non résorbable. La demanderesse a d'abord montré que la formation d'une tumeur (ou fibrome) de Shope était nécessaire au développement d'une immunité antimyxomatose. Ainsi 4 lapins pesant 3 kg recevant, par injections intra-dermiques reparties en 12 points, 1,2 ml de virus de Shope titrant 100.000 unités infectieuses par ml, développaient tous 12 petits fibromes aux 12 points d'injection ; ces animaux étaient tous protégés, 21 jours après, contre une épreuve virulente consistant à injecter aux lapins 2 fois 0,2 cm3 par voie intra-dermique d'un virus du myxome titrant 105 UI/ml. D'autre part, sur 4 lapins recevant également 1,2 ml de virus de Shope, mais par voie Sous- cutanée, aucun ne présentait de fibrome de Shope post-vaccinal, et aucun n'était protégé contre l'épreuve virulente par le virus du myxome. De nombreux titrages effectués sur des fibromes de Shope ont montré, de plus, que le titre infectieux en virus de Shope est fonction du développe9ent du fibrome. L'administration sous-cutanée séparée de deux constituants, à savoir, d'une part le virus de Shope, d'autre part une substance insoluble non résorbable ne provoque pas de tumeur 4e Shope, ni de nodule inflammatoire appréciable. Par contre, la demanderesse a trouvé que l'inoculation simultanée des 2 constituants par voie sous-cutanée provoque un nodule inflammatoire et un fibrome de Shope important. L'importance de ce fibrome varie avec la nature de l'adjuvant et avec la quantité administrée. Des déterminations volumétriques ont été effectuées à la suite de l'injection sous-cutanée des deux constituants seuls ou associés. Les figures ci-jointes illustrent l'évolution de la taille des nodules, en fonction du temps, après injection de diverses préparations. Les adjuvants testés, à titre d'exemple, étaient : le gel d'hydroxyde d'alumine, l'oxyde d'alumine (gel lyophilisé), le kaolin et la silice collotdale. Dans la figure 1 sont représentées les courbes illustrant l'évolution des nodules après injection simultanée de virus et d'un adjuvant courbe 1 : virus + hydroxyde d'aluminium 4% Poids/Volume (P/V.) courbe 2 : virus + silice 2 X (P/V.) courbe 3 : virus + kaolin 4 X (P/V.) courbe 5 : virus + kaolin lyophilisé 4 % (P/V.) Dans la figure 2 sont représentées les courbes illustrant l'évolution des nodules après injection de virus seul (courbe 1) ou d'un adjuvant seul courbe 2 : silice 2 % + kaolin 4 7. courbe 3 : silice 8 X (P/V.) courbe 4 : kaolin 8 70 (P/V.) Dans tous les cas le volume inoculé était de 1 ml. La demanderesse a ensuite montre que les "nodules inflammatoires" obtenus à la suite de l'injection sous-cutanée de virus de Shope et d'adjuvant non résorbable étaient bien de nature virale et correspondaient bien à un fibrome de Shope Les "nodules" ont été prélevés, pesés, broyés, dans un tampon physiologique et après clarification, titrés sur peaux de dr lapins. Le tableau ci-dessous donne le titre infectieux obtenu en fonction du poids de la tumeur. Nature de l'adjuvant Poids Titre infectieux Gel d'hydroxyde d'aluminium 4% . 0,97 g Oxyde d'aluminium (gel lyophilisé) 25% ..... 1,38 g 5,5.105 Silice 1% ................................. 0,40 g 2.105 Kaolin 4% ......... 1,36 g 6,5.105 Kaolin 4% lyophilisé - 4,00 g 2.106 La demanderesse a également montré que la qualité "irrésorbable" de l'adjuvant additionné au virus de Shope était essentielle pour obtenir une bonne réponse en fibrome et par suite une bonne immunité. C'est ainsi que des adjuvants d'immunité résorbables ne donnent pas de résultats satisfaisants, comme le montrent les essais suivants On a utilisé comme adjuvants d'immunité résorbables, des émulsions huile-dans-eau ou des émulsions mixtes de type eau-dans-huile dans eau et une résine polycationique soluble. Fibromes Nombres d'animaux protèges Virus de Shope sans adjuvant (48.000 unités infectieuses) 0 1/4 Virus de Shope émulsionné dans huile, dans eau O 0/5 Virus de Shope avec 0,5% de résine polycationique soluble 0 0/4 Virus de Shope avec 4% de gel d'hydroxyde d'aluminium (P/V) - ler essai 4 5/10 2ème essai 3 3/4 Virus de Shope avec kaolin 1% (P/V) 2 2/4 Enfin la demanderesse a confirmé, par des essais avec des préparations vaccinales selon l'invention contenant comme adjuvant des substances non résorbables, qu'il y a une relation directe entre la formation de fibrome de Shope et l'acquisition de l'immunité. Titre infectieux Fibrome Nombre par dose vaccinale d'animaux protégés Virus de Shope lyophilisé repris avec 0,5 ml d'eau distillée 50.000 D.I. 50% 2/5 1/5 Virus de Shope lyophilisé repris avec 0,5 ml d'une suspension de gel d'alumine à 25% " " 3/5 2/5 Virus de Shope lyophilisé avec 25% de gel d'hydroxyde d'aluminium repris avec 1 mi d'eau distillée " " 2/3 3/3 Virus de Shope lyophilisé avec 20 mg de silice repris avec 1 ml d'eau distillée !l " 4/5 4/5 Virus de Shope lyophilisé avec 40 mg de kaolin repris avec 1 ml d'eau distillée '.. " 5/5 5/5 * D.I. 50% : dose infectieuse 50% On donne ci-dessous un exemple de prbparation d'un vaccin selon l'invention La souche vaccinale est conservée de préférence à -80oC ou à -1800C. Elle est ensuite activée par 3 passages successifs sur lapine. Après 3 passages d'activation, le virus est multiplié sur lapins, 130 ml de suspension virale étant inoculés par la voie intra-dermique. Après 4 jours d'incubation, on récolte stérilement environ 150 à 200g de "fibrome" qui sont broyés dans 500 ml à 1000 ml de tampon physiologique. Le titre infectieux de la préparation virale est détérminé sur lapins par la méthode classique: ce titre est compris entre 104 et 106 D.I: 50% par ml. La suspension virale doit Titre lyophilisée immédiatement sur un substrat de lyophilisatiox (La dégradation de la suspension virale conservée à +40C est en effet très rapide). Parmi les substrats de lyophilisation on peut utiliser le sulfate de dextrane(5 %); ; le mélange sulfate de dextrane 5% + glutamate de sodium 1% + glucose 7%; un mélange de dextrane 5% + lactobionate de sodium (Bactocasitone Difco réf. : 0259) 2%; un mélange de gélatine 0,5% 4 lactobionate 30%; ou du lait écrémé à 10%. Cette liste est non limitative. L'adjuvant non résorbable (hydroxyde ou oxyde d'alumine, kaolin lyophilisé ou non, silice collordale lyophilisée ou non) est ajouté à la préparation virale avant ou après lyophilisation. Quelques formules de vaccins belon l l'invention sont données ci-dessous à titre d!exemple. EXEMPLE 1 Virus de Shope 50.000 doses infectieuses 50% ..................... 0,10 ml Lait écrémé ...................................................... 0,20 ml Hydroxyde d'aluminium titrant 2% d'Al2O3 ......................... 0,20 ml Lyophilisation. Pour l'emploi, reprendre par eau distillée stérile ................... imi EXEMPLE 2 Virus de Shope 50.000 doses infectieuses 50% ..................... 0,10 ml Lait écrémé ...................................................... 0,20 ml Kaolin Codex ..................................................... 40 mg Lyophilisation. Pour l'emploi, reprendre par eau distillée stérile . 1 ml EXEMPLE 3 Virus de Shope 50.000 doses infectieuses 50% ..................... 0,10 ml Lait écrémé ...................................................... 0,20 ml Lyophilisation. Pour l'emploi, reprendre par - eau distilée stérile .................... 1 ml - kaolin .................................. 40 mg EXEMPLE 4 Virus de Shope 50.000 doses infectieuses 50% ..................... 0,10 ml Lait écrémé ...................................................... 0,20 ml Silice gel selon Stahl (Marck HF 254) ............................ 20 mg Lyophilisation. Pour l'emploi reprendre par eau distilée stérile ................ 1 ml EXEMPLE 5 Virus de Shope 50.000 doses infectieuses 50% ...................... 0,10 ml Glutamate de sodium . .. . ... 10 mg Sulfate de dextrane ............................................... 50 mg Glucose ........................................................... 70 mg Kaolin ............................................................ 40 mg Lyophilisation. Pour l'emploi reprendre par eau distilée stérile ................. 1 ml EXEMPLE 6 Virus de Shope 5.000 doses infectieuses 50% ...................... 0,10 ml Lait écrémé ...................................................... 0,20 ml Kaolin ........................................................... 40 mg Lyophilisation. Pour l'emploi reprendre par eau distilée stérile ................ 1 ml REVENDICATIONS 1. Vaccin contre la myxomatose des lapins destiné à être administré par voie sous-cutanée, caractérisé en ce qu'il contient du virus de Shope et un adjuvant insoluble non résorbable. 2. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'adju vant non résorbable est de l'hydroxyde ou de l'oxyde d'aluminium. 3. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'adjuvant non résorbable est du kaolin, éventuellement lyophilisé. 4. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'adjuvant non résorbable ést de la silice coîlotdale, éventuellement lyophilisée. 5. Vaccin selon l'une des revendication 1 à 4, caractérisé en ce que le titre infectieux du virus de Shope est compris entre 1000 et 100.000 doses infectieuses 50% par dose vaccinale unitaire,