Brevet FR2247471A1 — publié le 19750509

La présente invention concerne les procédés de fractionnement des protéines, et plus précisément un procédé d'isolement d'une albumine de sérum pure à partir de liquides biologiques-. L'albumine sous forme de solutions à 5-TO ffi trouve de larges applications en médecine en tant que milieu de transfusion en cas de pertes de sang-massiques, de chocs dus aux traumatismes, aux brûlures, aux intertions chirurgicales, de collapsus, de troubles hémodynamiques, ainsi que comme produit médicinal pour l'alimentation parentérale. On utilise l'albumine aussi en laboratoire. L'albumine du sérum des animaux s'emploie dans diverses branches de l'industrie. On connaSt des procédés de séparation de l'albumine à partir de liquides biologiques, par exemple à partir du sérum sanguin de donneurs et du plasma-, par fractionnement des protéines au moyen de -l'alcool éthylique. Ce procédé permet d'isoler l'albumine avec un rendement élevé et un degré de pureté de 98 ffi déterminé par électrophorèse. Le procédé permet également d'obtenir, de pair avec l'albumine, une série d'autres protéines de valeur. Ce procédé -s'effectue saune température au-dessous de 0 C. En modifiant à plusieurs reprises la teneur de la solution en alcool, le pH du milieu et la force ionique de la solution, on arrive à précipiter successivement des fractions protéiques et à les séparer de la solution. L'inconvénient de ce :procédé est qu'il demande beaucoup de travail et qu'il s'effectue en plusieurs stades. I1 est possible d'isoler l'albumine a' partir du plasma de sang et du sérum à l'aide d'éther diéthylique. Ce procédé ne présente pas d'avantages sur le procédé utilisant l'alcool, son application étant limitée par suite des risques d'explosion et due la toxieité de l'éther. On connaît aussi des procédés de séparation de l'albumine au moyen de sels minéraux neutres. Le procédé consiste à précipiter des fractions protéiques et à les isoler dans la solution sous l'effet de différentes concentrations du sel. L'inconvénient majeur de ce procédé est l'élimination difficile d'une grande quantité de sel à partir des solutions protéiques. I1 existe un procédé d'isolement de l'albumine dans du plasma de sang à l'aide de rivanol. Le rivanol se combine d'une façon spécifique avec les protéines et précipite l'albumine et une partie des d; - et A -globulines. L'obtention de l'albumine pure à l'aide du rivanol se heurte à des difficultés importantes ; en outre, la précipitation au moyen d'une solution de rivanol exige un accroissement injustifié des volumes de travail; Les procédés indiqués ne permettent d'obtenir une albumine pure qu'à partir du plasma et du sérum de bonne qualité de donneurs.En même temps il existe des sources de matières premières dépassant considérablement le volume du plasma de donneur, telles que les sérums de placenta et d'avortement, l'extrait de placenta, à partir desquels on ne peut pas obtenir une albumine pure par les procédés connus par suite de la pollution -abondante de la matière première par les protéines de tissu, ainsi que par des impuretés de nature non protéique : hormones stéroïdes, h mopigments, etc. Pour le traitement de ces matières premières on a proposé un procédé d'élimination des hémopigments dans la solution d'albumine au moyen de sels de zinc. Toutefois ce procédé n'a pas trouvé de larges applications par suite de l'élimination difficile des ions zinc toxiques de la solution, du bas rendement en albumine, aussi ce procédé s'effectuant en plusieurs stades exige-t-il un appareillage compliqué. On connaît un procédé d'isolement de l'albumine à partir de plasma et de sérum et de purification visant à la débarrasser des hémopigments, qui consiste à les éliminer à l'aide de l'alcool éthylique et en présence, dans la solution, de sels des acides citrique, sulfurique, et chlorhydrique, à une tempfirature au-dessous de OO (cf. le brevet autrichien nO 275038, cl. 3011/out). Ce procédé ne donne des résultats satisfaisants que dans le cas dune faible teneur en hémopigments de la matière première de départ. L'inconvénient de ce procédé tient à ce qu'il est nécessaire d'effectuer une dialyse pour la séparation des sels de la solution d'albumine. I1 est difficile de débarrasser l'albumine des impuretés de nature non protéique, telles que les hémopigments, les pigments bilieux, les hormones stéroïaes, par site de la formation de combinaisons complexes de ces corps avec l'albllmine. La présence de ces complexes rend peu efficaces les procédés d'épuration généralement connus qu'on utilise pour le fractionnement des mélanges de protéines. Le but de l'invention est de remarier aux inconvénients indiqués.-Conformément au but de l'invention, on s'est proposé d'élaborer un procédé d'isolement de l'albumine qui permettrait d'éliminer les protéines concomitantes et de détruire simultanément les complexes d'albumine et d'impuretés de nature non protéique empêchant l'utilisation de l'albumine en clinique. La solution consiste en un procédé d'isolement de l'albumine de sérum à partir de liquides biologiques, ledit procédé comprenant un traitement desdits liquides par un alcool aliphatique inférieur et un sel d'acide carbonique, dans lequel, suivant l'invention, on effectue le traitement par l'alcool en concentration de 15 à 35 / en volume, en présence de 0,1 à 0,6 '% de sel d'acide carbonique aliphatique avec un cation non toxique et un anion en C6 12 à une température de à 3OOC et à un pH de 2 à 5 du milieu ; en fonction de la valeur choisie du pH, les protéines concomitantes de l'albumine sont partiellement ou complètement dénaturées ; les protéines dénaturées et des protéines natives concomitantes se précipitent à un pH de 4 à 5 et à une température de 5 à 300(3, les impuretés de nature non protéique formant un complexe avec l'albumine se clivent et sont adsorbées par le précipité form la solution obtenue, contenant l'albumine de sérum turne, est séparée du précipité à une température de 1 à 300(3 et à un pH de 4 à 5. I1 est préférable d'utiliser l'alcool éthylique à raison e -5 o en volume ; parmi les sels d'acides gras il est préférable 'ut liser le catwjlate e sodium en concentration de 0,3-,0 en volume ; le pH du milieu -te traitement est choisi de préférence entre 3,3 et 4,6, et la température, de 15 à 22- C. lorsqu'on utilise une concentration de l'alcool inférieure à 15 20 en volume, le degré de pureté de l'albumine séparée diminue t si l'alcool est en concentration supérieure à 35 pD en volume, des modifications irréversibles liées à la conformation de la molécule de l'albumine peuvent se produire. L'invention prévoit l'emploi obligatoire d'un sel d'acide gras en concentration de 0,1 à 0,6 . Le degré de pureté de l'albumine de sérum isole est insuffisante lorsqu'on prend le sel en concentration inférieure à la concentration limite indiquée. L'utilisation d'une concentration en sel d'acide gras suprrieure à la concentration limite indiquée n'est pas rationnelle, étant donne qu'elle peut provoquer une augmentation injustifiée des pertes d'albumine. Lorsqu'on effectue la réaction dans un milieu dont le pH est inférieur à 2, le degré de pureté de l'albumine isole ne croît pas, mais, par contre, le danger de sa dénaturation augmente. Si le pH du milieu est supérieur à 5, le degré de pureté de l'albumine sera insuffisant. I1 est indispensable d'effectuer la réaction à une température non supérieure à 300C, étant donne qu'une température de plus de 300 peut entraîner l'apparition, dans l'albumine, de modifications de dénaturation irréversibles ; lorsqu'on baisse la température du mélange réactionnel, c'est-à-dire au fur et à mesure qu'on se rapproche de 00, la précipitation de l'albumine augmente. La baisse de la température au-dessous de 1 C provoque des pertes extrêmement grandes d'albumine, jusqu'à sa précipitation complète et son élimination de pair avec les impuretés. Le procédé proposé consiste à combiner l'effet de l'alcool et de l'anion d'un acide gras dans les conditions d'une réaction acide du milieu et d'une température positive. L'effet des quatre facteurs indiqué s est une condition indispensable pour l'isolement d'une albumine suffisament pure. L'effet de la réaction acide du milieu et de l'alcool conduit à la dissociation des complexes de l'albumine et des impuretés de nature non protéique substitues par l'anion d'acide gras et à leur séparation. Les impuretés séparées de l'albumine sont sorbées par le précipité constitué de protéines accompagnantes et sont éliminées avec celui-ci. L'-élimination des protéines accompagnantes s'effectue par suite d'une dénaturation-acido-alcoolique sélective, suivie de leur précipitation à une température positive, et d'une élimination simultande des impureté s de nature non protéique adsorbées sur ces protéines. I1 est indispensable de mettre le procédé en oeuvre à une température de plus de OC, pour prévenir la précipitation de l'albumine sous l'effet de 1'alcool. Le rôle de la temperature positive consiste également à augmenter l'effet de dénaturation de l'alcool et l'effet de la réaction acide du milieu sur les protéines devant être éliminées de la solution. Si lton veut conserver la protéine à l'état natif au cours de son élimination, en vue de son emploi ultérieur, il est possible d'isoler au préalable la masse principale de protéines en présence de l'alcool et de l'anion d'acide gras dans des conditions suffisamment douces pour conserver la nativité. Le procédé proposé est mis en oeuvre comme suit. On utilise, en tant que matière première initiale, un plasma de sang de donneur, un sérum de placenta ou un sérum d'avortement, un extrait de placenta du sang de mammifères, à partir desquels peuvent être préalablement isolées par des procédés connus, d'autres fractions telles que le fibrinogène et la gamma-globuline. On introduit, dans la solution à une température de 1 à 300C et à un pH compris entre 2 et 5, un alcool aliphatique inférieur, de préférence l'alcool éthylique en concentration de 15 à 35 ffi en volume, et le sel d'un acide aliphatique à 0,1 à 0,6, En fonction de la valeur de pHcisie, les protéines concomitantes de l'albumine sont dénaturées en partie ou en masse. On établit ensuite le pH du milieu à 4 ou 5, en maintenant la température entre 1 et 300(3. Les protéines dénaturées et natives, dans ces conditions, se séparent de l'albumine et précipitent avec les impuretés de nature non protéique. On sépare la solution obtenue, contenant l'albumine de sérum pure, du précipité à un pH de 4 à 5 et à une température de 1 à 300C. Le procédé proposé permet d'isoler une albumine apte à être utilisée en médecine et en laboratoire, avec un degré de pureté de 100 ffi calculé par rapport à la protéine (déterminé par la méthode d'électrophorèse) et dont la teneur en impuretés nocives et en hnmopigments se trouve dans des limites n'empêchant pas l'emploi de l'albumine en clinique. D'autres caractéristiques et avantagew de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description, qui va suivre, de plusieurs exemples non limitatifs de mise en oeuvre du procédé proposé d'isolement de l'albumine de sérum pure. EXEMPIE 1. On prend 50 cm3 d'un mélange de sérum de placenta et de sérum d'avortement. Après élimination de la gamma-globuline du mélange par un procédé quelconque connu, la solution contient 25 %, en volume, d'alcool éthylique. La température est égale à 20 C. On ajoute, sous brassage continu, le caprylate de sodium jusqu'à une concentration de 0,3 ffi . Ensuite, à la température indiquée, on porte le pH à 3,3 en ajoutant de l'acide chlorhydrique 1N et on maintient cette valeur du pH pendant 30 minutes pour la dénaturation la plus complète possible des protéines concomitantes de l'albumine. On porte le pH du milieu jusqu'd 4,5, les protéines dénaturées de pair avec les impuretés de nature non protéique se clivent de l'albumine et précipitent. On sépare par centrifugeage la solution contenant l'albumine pure du précipité formé à une température de 200C et au pH de 4,5 (on ajuste le pu par une solution SN de soude caustique). Le produit de centrifugeage est complémentairement purifié par filtration. L'albumine peut hêtre concentrée dans le produit de centrifugeage par un procédé quelconque connu, par exemple en la précipitant avec l'alcool éthylique à 20-40% en volume et à une temperature de 6 à 80C, avec dissolution du précipité formé dans de l'eau et sa lyophilisation. L'albumine isole, selon les données de l'électrophorèse, ne contient pratiquement pas d'autres protéines1 ce qui constitue un degré de pureté de OOdo. Le rendement en albumine est de 18 à 29 grammes par litre de sérum. EXETsPLE 2. La matière première de départ est un plasma de donneur. On élimine, par un procédé quelconque connu, à partirde501 de plasma le fibrogène, la prothrombine, le fibrinolysine et la gamma-globuline ; la teneur en alcool étant de 20 %, on introduit le caprylate de sodium jusqu'à une concentration de 0,3 %, on ajuste le pH a 4,5 et on maintient pendant 20 minutes à 10 C. On sépare le précipité formé par centrifugeage. Ce précipité peut être utilisé pour l'isolement des alphaglobulines et des beta-globulines et pour un isolement supplémentaire de l'albumine.Etant donné que le produit de centrifugeage contient une albumine insuffisamment pure, on répète la procédure en abaissant le pH du produit de centrifugation à 3,3, et on conduit les opérations comme décrit dans l'exemple 1. ExEMPL 3. la matière premiere de départ est un extrait de placenta contenant 2,5 i0 de protéine. On conduit la procédure d'une façon analogue à celle de l'exemple 1, sauf pour la quantité de caprylate de sodium, qu'on ajoute jusqu'à une concentration de 0,2 . EXEMPLE 4. La matière première de départ est un sérum sanguin de boeuf. On ajoute à 50 1 de sérum un alcool éthylique à 96 % jusqu'à sa concentration de 25 ss en volume dans la solution. On introduit ln caprylate de sodium à raison 0,3 %0. Après dissolution du caprylate de sodium, on ajoute une solution t N d'acide chlorhydrique et on porte le pH de la solution à 3,3. On maintient dans ces conditions la solution à une température de 20 C pendant 40 minutes, ensuite on porte son pH à 4,5 en ajoutant une solution 1N de soude caustique. On sépare par centrifugation le résidu formé à la température et au pH indiqués. Après séparation du précipité, on baisse la température du produit de centrifugation à E-o et on maintient la solution durant 48 heures pour la formation du résidu. Le résidu séparé contient de l'albumine pure et des traces de globulines. ZXIPLT: 5. On Trend 1 1 de sérum de placenta, on y intrpduit de l'alcool méthylique jusqu'à une concentration de 30 ?/o., et le caprylate de sodium jusqu a une concentration de 0,3 %, le pH étant de 2,5, et on maintient le mélange à cette valeur du pH pendant 20 minutes. En élevant le pH à 4,6 on précipite les protéines concomitantes de l'albumine et les impuretés de nature non protéique. On sépare par centrifugation la solution contenant de l'albumine pure. EXEMPLE 6. On prend i 1 de sérum de placenta, on y introduit de l'alcool éthylique à une concentration de 20 % et le capronate de sodium à raison de 45 % - ; le pH est de 3,3. On conduit la procédure d'une façon analogue à celle de l'exemple 1. EXEMPLE 7. On prend 1 1 de sérum de placenta et on y ajoute- de l'alcool éthylique à raison de 25 jo et le caprynate de sodium à raison de 0,3 %. Le pH du mélange est égal à 3,3. La suite des opérations s'effectue comme dans l'exemple 1. Bien entendu, l'invention n'est nullement limité aux modes de réalisation décrits et représentés qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemple.~En particulier, elle comprend tous les moyens constituants des equivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre des revendications qui suivent. EZEVENDICATIONS 1. Procédé d'isolement de l'albumine de sérum pure à partir de liquides biologiques, par traitement de ces derniers avec un alcool aliphatique inférieur et un sel d'acide carbonique; caractérisa en ce qu'on effectue ledit traitement avec de l'alcool en concentration de 15 à 35 ffi en volume, en présence de 0,1 à 0,6 % de sel d'acide carbonique aliphatique avec un cation non toxique et un anion en C6-12, à une température de t à 300C et un pH de 2 à 5, les protéines concomitantes à l'albumine se dénaturant alors en partie ou en masse en fonction de la valeur de pH choisie, on précipite les protéines dénaturées et natives concomitantes à un pH de 4 à 5 et à une température de 1 à 300(3, les impuretés de nature non protéique formant des complexes.avec l'albumine se clivant alors de celle-ci et étant adsorbées par le précipité, et on sépare de ce dernier la solution contenant l'albumine pure-à une température de t à 300(3 et un pH de 4 à 5. 2. Procédé selon la revendication 1, caracterisé en ce-quton utilise en tant que sel d'acide carbonique aliphatique le caprylate de sodium, le capronate de sodium ou le caprynate de sodium. 3. Procédé selon l'une des revendicaions 1, ?, caractérisé en ce que les opérations précitées s'effectuent à une température de 15 à 220G, 4. Procédé suivant l'une des revendications i à 3, caractérisé en ce que le traitement des liquides biologiques avec l'alcool et le sel précités s'effectue à un pH de 3,3 à 3,5-. 5. Procédé suivant l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce-que la séparation de l'albumine du précipité s'effectue par centrifugation. 6. Albumine de sérum pure, caractérisé en ce qu'elle est obtenue par le procédé faisant l'objet de l'une des revendications 1 à 5.