Brevet FR2222081A1 — publié le 19741018

La présente invention est relative à un procédé pour isoler et caractériser des agents antifongiques produits par le microorganisme PolNanginm cellulosum var. fulvum (BTCC No. 25532). L'invention vise également les substances antifongiques ainsi obtenues et leurs dérivés. On a décrit, dans le brevet des E.U.A. No. 3.651.216, que l'organisme précité produit des substances antifongiques lorsqu'on le fait fermenter dans un milieu de culture approprié. La présente invention a pour buts: - de fournir un nouveau procédé permettant de recueillir et de séparer les diverses substances antifongiques produites dans ledit milieu; - de caractériser les substances antifongiques séparées; - de fournir un procédé de préparation de nouveaux derivés de ces substances antifongiques; - de purifier ces substances antifongiques de façon à pouvoir les incorporer dans des formes dosées -appropriées. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparattront dans la description qui va suivre. Les conditions de culture de cet organisme ainsi que la fermentation des substances antibiotiques ont été décrites dans ive brevet des E.U.A. précité. La Demanderesse a maintenant découvert que le bouillon de fermentation, après culture de l'organisme, contient quatre constituants antifongiques chimiquement distincts. Ces constituants sont désignés "Acide F", "Acide S", "Constituant B" et "Constituant C". Les acides F et S sont les constituants principaux, qui fournissent de 70 à 90% de l'activité antibiotique, suivant les conditions de fermentation. La présente invention concerne, plus particulièrement, l'isolement et la caractérisation des acides F et SO L'invention est mise èn oeuvre comme suit; On obtient le bouillon de fermentation en cultivant l'organisme précité comme décrit dans le brevet précité. On filtre le bouillon et on l'extrait par un solvant tel que l'acétate d'éthyle, le chloroforme, le butanol, le chlorure de méthylène, etc.. D'une façon générale, on utilise une proportion d'une partie de solvant à cinq parties de bouillon pour extraire le bouillon jusqu'à séparation pratiquement complète de tous les constituants F et S. Notamment, on sépare les acides F et S après trois processus d'extraction distincts. On concentre l'extrait sous pression réduite, à une température ne dépassant pas 450C, jusqu'à environ 1% de son volume. On laisse le concentré reposer à 4t environ, pendant 24 heures, puis on le clarifie par filtration. On évapore le filtrat à sec, on ajoute de l'acide acétique à 2% jusqu'a obtention d'un pH acide, par exemple de 3 à 4, et on extrait le mélange au chloroforme. On sèche l'extrait sur Na2S04 et on concentre à faible volume. Cette dernière opération, bien qu'utile pour libérer les acides de leurs sels, est facultative et n'est pas nécessaire pour le stade suivant. On adsorbe le concentré d'antibiotique sur une colonne de Florisil, en une proportion comprise entre 1/10 et 1/20 (en poids). On développe la colonne à l'aide d'un solvant non polaire tel que l'acétate d'éthyle. On sépare ainsi la majorité des substances inactives. On recueille les constituants actifs, qui sont fermement retenus par le Florisil, en éluant à l-'aide d'un solvant polaire tel que le méthanol. On évapore les éluats méthanoliques à sec, obtenant ainsi le mélange d'antibiotiques brut contenant de 20 à 30% de substance active. On purifie ensuite par chromatographie sur colonne de gel de silice, en utilisant 1 g du mélange brut précité pour environ 100 g de gel de silice. On développe la colonne à l'aide d'un système acétate d'éthyle-isopropanol-eau en un rapport 85/10/5. On surveille les éluats par chromatographie en couche mince (gel de silice fourni par Quantum Industries) en utilisant le même système que dans la colonne. Les Rf sont les suivants: Acide F, Rf = 0,68; Acide S, Rf = 0,56. Le mode opératoire ci-dessus permet de séparer les acides F et S des constituants B et C et autres matières inactives. On peut également ne pas faire appel au stade de purification par chromatographie sur colonne de Florisil. On utilise, à la place, une proportion plus élevée de gel de silice à extrait brut dans l' acétate d'éthyle. Par exemple, une proportion de 200 parties de gel de silice pour une partie d'extrait dans l'acétate d'éthyle s'est avérée donner des- résultats de purification satisfaisants. Les acides F et S ainsi obtenus ont les caractéristiques physiques suivantes: Acide F: formule brute C28H4206, masse moléculaire 474, spectre infra-rouge: 9 870, 965, 1063, 1255, 1388, 1453, 1663, t710, 2950 et 3400 cm-1, [&alpha;]D25 environ +74 (chloroforme, c = 0,8), Rf 0,68 (gel de silice; acétate dréthyle-isopropanol-eau 85/10/5). Acide S : formule brute C28H4206,- masse moléculaire 474, Spectre in frarouge: 9870, 965, 1063, 1255, 1388, 1453, 1663, 1710, 2950 et 3400 cm-, |&alpha;D25 environ +360 (chloroforme, c = 0,7), Rf 0,56 (gel de silice; acétate d'éthyle/isopropanolZeau 85/10/5). On convertit les acides F et S ci-dessus en leurs esters respectifs. On effectue notamment cette conversion en faisant appel au mode opératoire suivant: Après purification partielle sur colonne de Florisil,on traite extrait brut dans l'acétate d'éthyle par un excès de solution éthanoliqueéthérée de diazométhane à température ambiante, pendant 15 minutes. On convertit ainsi les acides F et S en leurs esters méthyliques. On - sépare les esters par chromatographie sur gel de silice, en utilisant un système acétate d'éthyle-cyclohexane (4/1) comme phase mobile. Ces esters des acides F et S ont les caractéristiques physiques suivantes: Ester F: formule brute C29H4406, masse moléculaire 488, Spectre infrarouge: s 860, 965, 1060, 1165, 1255, 1370, 1430, 1515, 1660, 1730, -1 2900 et 3350 cm , Rf 0,78 (gel de silice; acétate d'éthyle-cyclo hexane 4/1). Ester S : formule brute C29H4406, masse moléculaire 488, spectre in frarouge: 860, 965, 1060, 1200, 1250, 1370, 1440, 1518, 1658, 1725, -1 2900 et 3400 cm , Rf 0,56 (gel de silice; acétate d'éthyle-cyclo- hexane 4/1). En peut recueillir les acides F et S sous forme pure, à partir de leurs esters, en chauffant les esters au reflux pendant une heure dans NaOH 1N, Ces acides et esters présentent une activité~antifongique contre des fongi tels qu'Eistoplasma caPsulatum, Candida albicans, etc.. Pour utiliser ces produits, on utilise par exemple 0,1% en poids de l'aci- de ou de l'ester dans un véhicule dermatologiquement acceptable tel que le talc ou la vaseline, et on applique par voie topique. REVEND I C AT IONS l-Procédé d'isolement de substances biologiquement actives du bouillon de fermentation obtenu en cultivant Polyangium cellulosum var. fulvum ( ATCC N 25532), caractérisé en ce qu'on extrait le bouillon par un solvant non polaire, on adsorbe les extraits ré sultants sur une colonne de Florisil, on lave la colonne à l'aide d'un sQlvant non polaire et on élue la colonne à l'aide d'un solvant polaire. 2-Procédé suivant la revendication 1, caractérise en ce que le solvant non polaire est l'acétate d'éthyle et le solvant polaire est le méthanol. 3-Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on purifie lesdites substances en traitant,les concentrés obtenus dans le solvant polaire par un acide,on extrait le mélange résultant au chloroforme et on adsorbe les extraits chioroformiques sur gel de silice, en une proportion de 50 à 200 parties de gel de silice pour une partie d'extrait. 4-Substance antibiotique ayant les caractéristiques suivantes: formule brute C28H4206, masse moléculaire 474, spectre infrarouge: 3870,965,1063,1255, 1388,1453,1663,1710, 2950 et 3400 cm 740 (chloroforme, c = 0,8),Rf 0,68 (gel de silice; acétate d'éthyle-isoporpanol-eau 85/10/5). 5-Substance antibiotique ayant les caractéristiques suivantes: formule brute C28H4206 , masse moléculaire 474,spectre infrarouge: &gamma; 870,965,1063,1255, 1388, 1453, 1663,1710,2950 et 3400 cm-1 [&alpha;]D25 environ +360 (chloroforme,c = 0,7),Rf 0,56 (gel de silice; acétate d'éthyle-isopropanol-eau 85/10/5). 6-Substance antibiotique ayant les caractéristiques suivantes: formule brute C29H4406 ,masse moléculaire 488, spectre.infrarouge: V 860, 965, 1060, 1165, 1255, 1370, 1430, 1515 , 1660, 1730, 2900 et 3350 cm 1, Rf 0,78 (gel de silice; acétate d'éthyle-cyclohexane 4/1). 7-Substance antibiotique ayant les caractéristiques suivantes: formule brute C29H4406, masse moléculaire 488,spectre infrarouge: #860, 965, 1060 , 1200, 1250, 1370, 1440, 1518, 1658, 1725 , 2900 et 3400 cm 1, Rf 0,56 (gel de silice; acétate d'éthyle-cyclohexane 4/ 8-Medicament présentant notamment une activité antifongique caraeter-isd en ce qu'il contie-ntSa titre ae principe actif, une substance antibiotique suivant l'une queleonXue des revendicatoons 4 a 7