Brevet FR2206084A1 — publié le 19740607

La présente invention se rapporte à une nouvelle substance antibiotique appelée "Jolipeptine" et à son procédé de production. On sait que le bouillon de culture obtenu par la fermentation de Bacillus polymyxa sous-espèce colistinus KOYAMA contient une colistine qui présente une excellente activité antibiotique contre les bactéries Gram négatives. D'autre part, la Demanderesse a trouvé que le bouillon de culture ci-dessus contient de la gatavaline, substance qui a un spectre antimicrnbien différent de celui de la colistine ci-dessus et qui a fait l'objet d'un brevet. D'autres recherches ont permis à la Demanderesse de constater que Bacillus polymyxa sous-espèce colistinus KOYAMA produit un nouvel antibiotique qui a un spectre antimicrobien différent de ceux de la colistine et de la gatavaline mentionnées. On a baptisé cette 'nouvelle substance antibiotique "jolipeptine". En conséquense, l'un des buts de la présente invention est de fournir une nouvelle substance antibiotique. Un autre but de l'invention est de faire connaître un procédé pour isoler et récupérer la jolipeptine. Ces buts et d'autres sont atteints en faisant fermenter Bacillus polymyxa sous-espèce colistinus KOYAMA AICC N" 21830 et en isolant la jolipeptine. Bacillus polymyxa sous-espèce colistinus KOYAMA utilisé dans la présente invention a les propriétés suivantes Batônnets : 0,9 à 1,1 x 4,5 à 4,6la, motilité, gram-positif Spores : 1 à 1,2 x 1,2 à 1,5 ellipsoldes, centraux. Ensemencement sur gélatine : liquéfaction Culture en tube incliné sur glucose-agar : Bonne croissance, haute, brillante, visqueuse, avec production de gaz, translucide, marge lobée. Culture sur glucose nitrate agar : Bonne croissance, visqueuse. Bouillon de culture : turbidité uniforme, sédiment visqueux. Bouillon salé (NaCI) : aucune croissance avec 5% de Na C1. Lait : coagulé avec production de gaz, caséine hydrolysée. Pomme de terre : croissance abondante, gluante, brun jaunâtre, pomme de terre dé composée avec production de gaz. Indole : négatif. Sources de carbone utilisées Arabinose + Cellobiose + Fructose + Galactose + Inuline - Lactose + Maltose + Mannose + Rhamnose - Sorbose - Sucrose + Salicine Xylose + Adonitol - Dulcitol - Erythritol In stol - Mannitol ' + Sorbitol - Citrate Acetate - Succinate - Tartrate Amidon : hydrolysé De l'acétylméthylcarbinol est produit. Des nitrites sont produits à partir des nitrates. De la biotine est nécessaire pour la croissance. Antibiotiques produits Colistine, gatavaline, jolipeptine. On prépare le bouillon de culture utilisé dans la présente invention selon les procédés habituellement utilisés pour produire la colistine. Diverses substances peuvent être utilisées comme source de nourriture dans le milieu de culture, les matières préférées contenant une source d'azote comme les peptones, le son de blé, la farine de blé, le liquide de macération de mais, l'extrait de viande, les hydrolates de protéine, les nitrates inorganiques, les sels d'ammonium, etc. Une source de carbone peut aussi être présente sous la forme de dextose, lactose maltose, amidon, glycérine, de mélasses, etc., et doit être utilisée en quantités relativement grandes. Divers sels inorganiques et d'autres additifs peuvent aussi être ajoutés, au besoin. Pour produire la jolipeptine sur une grande échelle, il est avantageux d'utiliser une culture immergée.La température de culture doit être d'environ 28 à 35"C. Le pH initial du milieu de culture doit se situer autour de pH 7. Le bouillon de culture ainsi obtenu contient de la colistine, de la gatavaline et de la jolipeptine. Etant donné que cette dernière existe à la fois dans le liquide de culture et dans les cellules, on l'isole par le procédé suivant (1) On filtre le bouillon de culture pour en séparer les cellules et les matières solides. On ajoute au filtrat un agent de précipitation, tel que le benzaldéhyde, ou le sulfate d'ammonium, de sorte que le mélange de colistine, de gatavaline et de jolipeptine forme un précipité. En dissolvant ce précipité, dans une solution de butanol saturée d'eau acidulée, dont le pH est inférieur à 5, et en le lavant avec de l'eau acidulée, la colistine est transférée dans cette eau acidulée et est ainsi séparée.En suite, on ajoute à la liqueur mère une substance ne dissolvant pas la jolipeptine, telle que l'éther, ce qui a pour effet de précipiter la gatavaline et la jolipeptine, lesquelles sont ensuite dissoutes dans le méthanol, etc, avant d'être précipitées à nouveau par addition d'éther, etc. Quand on fait subir au précipité une extraction au moyen d'une solution aqueuse faiblement alcaline contenant une base organique, telle que la triéthylamine, la triméthylamine, etc., la jolipeptine se dissout dans cette solution aqueuse, tandis que la gatavaline reste dans le précipité. On acidifie la solution aqueuse contenant la jolipeptine et on la soumet à une extraction par le butanol, après quoi, on précipite la jolipeptine par l'addition d'éther, etc. (2) On soumet les cellules séparées du bouillon de culture à une extraction, tout en les agitant avec un alcool inférieur, tel que le méthanol, méthanol, le butanol, etc., et on ajoute de l'éther à l'extrait pour précipiter la jolipeptine. On dissout le précipité dans une solution de butanol saturée d'eau acidulée, puis on procède comme indiqué dans l'alinéa (1) ci-dessus. En variante, on brise les cellules par un broyage à l'alumine, et on procède à une extraction avec une solution-tampon ayant un pH d'enviion 7 ou avec de l'eau, puis on poursuit le traitement comme indiqué sous 1. (3) Le filtrat du bouillon de culture ou l'extrait de cellules broyé est adsorbé sur une résine acide telle que l'Amberlite IRC-50, IR-120 (marque déposée de la société Rohm Haas Co.) sur la carboxyméthylcellulose, etc., et on sépare la jolipeptine par élution avec de l'acide chlorhydrique 0,5 N, de l'ammoniac, etc. (4) Le bouillon de culture contenant les cellules est soumis directement à une extraction par un alcool inférieur tel que le butanol, etc., puis est traité comme indiqué sous 1. On dissout la jolipeptine ainsi obtenue dans le méthanol, etc., et elle peut encore être raffinée sur du Sephadex LH-20 (marque déposée de la société Pharmacia Co.) etc. Propriétés de la jolipeptine 1. Poids moléculaire : inférieur à 3 000 2. Stabilité : une solution aqueuse de jolipeptine se conserve plus d'une semaine au frais. 3. Absorption des rayons ultraviolets t absorption terminale. 4. Solubilités : soluble dans l'eau; le méthanol, méthanol, le n-butanol et l'isopropanol ; insoluble dans l'acétate de méthyle, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, l'éther éthylique, l'éther de pé trole, l'acétone, le chloroforme et le benzène. 5. Réaction à la ninhydrine : positive 6. Chromatographie sur papier : n-butanol : acide acétique : eau (4 : 1 : 2) - Rf = 0,65Y0,70 7. Point de fusion : le point de décomposition est situé au-dessus de 300"C. 8. Analyse élémentaire : & 49,66%, H 7,22X, N 13,10% 9. Acides aminés acidecx Fdiaminobutyrique 2 moles Sérine 2 Alanine 2 Valine 2 Acide glutamique 1 Glycine 1 10. Rotation spécifique 22 () + 14,00 (C=l, éthylèneglycol) D Spectre antimicrobien Organisme Concentration minimale d'inhibition (mcg/ml) Escherichia coli NIJH 0,312 " B 0,312 Peudomonas desmolytica IFO 12570 10 " fluorescens IFO 3081 10 11 IFO 3903 2,5 " aeruginosa IFO 3924 5,0 IFO 3901 20 Proteus mirabilis IFO 3849 40 vulgaris IFO 3045 20 IFO -3167 20 Staphylococcus aureus 209 P 1,25 Bacillus subtilis PC 1219 0,625 Sarcina lutea 2,5 Micrococcus lysodeikticus 0,625 Mycobacterium tuberculosis 607 10 Candida albicans 40 " krusei 40 Saccharomyces cereviciae 40 rosei 40 12. Toxité aiguë Pour la souris, en injection intraveineuse DL50 = 5,21 mglkg Les exemples qui suivent, qui n'ont bien entendu aucun caractere limitatif, feront mieux comprendre les particularités de l'invention. Production de jolipeptine Exemple 1 On ensemence une cuve de fermentation de 500 1 contenant 200 1 de milieu de culture avec deux litres d'une culture de 24 h de Bacillus polymyxa sous-espèce colistinus KOYAMA. qu'on avait fait croître à 300C dans un récipient animé d'un mouvement alternatif, puis on poursuit la culture à 30"C pendant 24 heures en veillant à une aération convenable. Le milieu de culture utilisé contient 10g d'amidon, 5 g (NH4)2S04, 0,5g MgS04 . 7H2C, 0,5g KH2P04, 3g CaC03, 0,5g NaCl, 150 mcg MnS04 et 10 mcg de biotine par litre,et son pH est de 7. Procédure d'isolement de la jolipeptine Exemple 2 On filtre le bouillon de culture ainsi obtenu, et on règle le pH de 200 ml de ce bouillon entre 8 et 8,6. On y ajoute 0,5 à 1,5 % de benzaldéhyde et on laisse réagir pendant 30 minutes en remuant. On sépare le précipité ainsi obtenu, on le soumet à une extraction avec 3 litres de butanol saturé d'eau acidulée ayant un pH d'environ 2, puis on le lave avec de l'acide chlorhydrique ayant un pH de 2, pour éliminer la colistine. On ajoute de l'éther éthylique à la couche de butanol, et on sépare le précipité, qu'on dissout dans le méthanol, puis on y ajoute 2 à 3 fois son volume d'éther éthylique, ce dont résulte un précipité qu'on recueille et qu'on sèche. On traite ce précipité avec une solution aqueuse de triéthylamine afin dene dissoudre que la jolipeptine. On acidfie cette solution aqueuse et on la soumet à une axtraction par le n-butanol, puis on ajoute de l'éther d'éthyle à la couche de n-butanol pour précipiter la jolipeptine. On soumet le précipité à une extraction par le méthanol et on y ajoute de l'éther éthylique, puis on recueille le précipité et on le sèche. On obtient ainsi 3 g de jolipeptine brute. On dissout cette jolipeptine brute dans du méthanol, puis on le fait passer dans une colonne garnie de SepE a dex LH-20 et on procède à une élution avec du méthanol, après quoi, on précipite la fraction active par addition d'éther d'éthyle le et cn obtient une poudre blanche de jolipeptine. Exemple 3 On procède comme dans l'exemple 2, dans les mêmes conditions, mais en utilisant du sulfate d'ammonium au lieu de benzaldéhyde et une solution aqueuse de 1 à 2% de Tween au lieu de la solution aqueuse de triéthylamine et on obtient de la jolipeptine. Exemple 4 On filtre un bouillon de culture préparé comme dans l'exemple 1 et on absorbe le filtrat sur de l'Amberlite IRC-50 (H+) dans 1/5 de volume du filtrat,, puis on procède à une élution avec de l'acide chlorhydrique 0,5 N. On recueille une fraction active de jolipeptine et on la soumet à une extraction par le butanol. On traite l'extrait comme indiqué dans l'exemple I, et on obtient de la jolipeptine. Exemple 5 On sépare par centrifugation un bouillon de culture préparé comme dans l'exemple 1 en cellules bactériennes et en fraction surnageante, et on n'utilise que les cellules. On fait subir à 100 g de ces cellules une extraction par 500 ml de méthanol en agitant, puis on ajoute de l'éther d'éthyle à l'extrait pour obtenir un précipité. On dissout ce précipité dans du butanol saturé d'eau acidulée puis on traite la solution comme indiqué dans l'exemple 2, et on obtient de la jolipeptine. Exemple 6 On broie 100 g de cellules préparées comme spécifié dans l'exemple 5 avec 200 g d'alumine et on procède à une extraction avec 500 à 1000 ml d'une solution -tampon de phosphate à 0,1M ayant un pH de 7. On centrifuge l'extrait et on raffine la fraction surnageante comme dans l'exemple 2 et on obtient ainsi de la joli peptine. Exemple 7 On règle le bouillon de culture préparé comme dans l'exemple 1 à pH 2 et on le soumet à une extraction avec 1/5 de volume de n-butanol. On lave la couche de n-butanol avec de l'eau acidulée ayant un pH de 2 et on la traite comme dais l'exemple 2 pour obtenir de la jolipeptine. REVENDICATIONS 1. Procédé pour produire une substance antibiotique appelée "jolipeptine" qui consiste à cultiver une souche de Bacillus polymyxa sous-espèce colistinus KOYAMA, ATCC N 21830, puis à isoler et à récupérer la jolipeptine du bouillon de culture. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on isole et on récupère la jolipeptine du bouillon de culture par une extraction avec du butanol saturé d'eau acidulée, puis en lavant l'extrait avec de l'eau acidulée pour éliminer la colistine, et en précipitant un mélange de gatavaline et de jolipeptine, puis en traitant ce mélange avec une solution aqueuse d'une base organique pour séparer la gatavaline, après quoi, on précipite la jolipeptine. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la base organique utilisée est la triéthylamine, la trimfthylamine ou le Tween. 4. Jolipeptine ayant les propriétés caractéristiques suivantes Poids moléculaire : inférieur à 3 000. Point de fusion : supérieur à 3000C. Analyse élémentaire : C 49,66%, H 7,22%, N 13,10% Rotation spécifique : kX) 22 + 14,0 (C=l, éthylèneglycol) D Acides aminés : acideeb t diaminobutyrique (2 moles), sérine (2 moles), alartne (2 moles), valine (2 moles), acide glutamique (1 mole), glycine (1 mole) Réaction à la ninhydrine : positive Chromatographie sur papier : n-butanol : acide acétique : eau (4 : 1 : 2) Rf = 0,65N 0,70 5. A titre de médicament utilisable en particulier pour combattre les infections bermes Gram négatifs, la jolipeptine selon la revendication 4.