Brevet FR2236472A1 — publié le 19750207

L'invention a trait au comptage différentiel des cellules ou autres particules sanguines, et notamment des globules blancs du sang en vue de déterminer sa formule leucocitaire. Le comptage divers types de globules blancs se pratique couramment dans les là boratoires d'hématologie clinique du monde entier et présente discutablement un très grand intérét pour le diagnosticien, par exemple dans le cas de la mononucléose ou de la leucémie. I1 s'agit cependant là, jusqu'à ce jour, d'une analyse assez subjective nécessitant un temps important et présentant une pertinence quantitative restreinte. Ces inconvénients sont inhérents aux techniques actuellement utilisées pour effectuer le comptage, lesquelles consistent généralement â faire une préparation micros copique forme d'une tache de sang talée sur une plaaue, séchée et colorée, a examiner à l'aide d'un microscope optique des parties de la préparation choisies au hasard et a classer les globules blancs présents en termes du nombre de globules de chaque type exprimé en pourcentage du nombre total des globules.Vu le carac tère très subjectif de cet examen et-de cette classification, et de la variation des résultats selon la technique de coloration choisie, il est fort possible que deux techniciens compétents puissent être en désaccord quant à l'identité d'un type particulier de cellule et arrivent à des chiffres qui peuvent différer de - 20%. On a proposé divers appareils destinés à permettre le comptage différentiel des globules blancs de façon automatique et avec plus de précision. Ces appareils de comptage automatique sont cependant également basés sur le comptage des cellules dans une préparation microscopique sanguine sechée et colorée. Le manque général de succès de tels appareils peut s'expliquer par la complexité des moyens nécessaires pour permettre la reconnaissance de la structure morphologique des cellules. La présente invention a pour but de permettre un comptage dif- férentiel des particules sanguines, notamment des globules blancs, et cela dtune manière précise et rapide, permettant d'obvier aux inconvénients susmentionnés. A cet effet, on se propose d'effectuer le comptage différentiel des cellules sanguines en exploitant les différentes mobilités des divers types de cellules lorsqu'ils sont soumis à une électropho rèse. L'invention a pour objet un procédé de comptage différentiel des particules sanguines, notamment des globules blancs. Ce procédé est caractérisé par le fait que l'on soumet un échantillon des particules à compter, en suspension dans un liquide, à l'action dtun champ électrique unidirectionnel de manière à soumettre ces particules à une migration dans la direction de ce champ, que l'on détermine la vitesse des particules en les observant. sur une portion déterminée de leur trajectoire lors de cette migration, et que l'on détermine, en fonction des vitesses mesurées, le nombre de particules dont les vitesses sont. comprises dans des gammes déterminées. I1 devient ainsi possible, grâce à l'emploi de l'électrophorê- se selon ce procédé, d'obtenir d'une manière efficace et rapide le comptage différentiel automatique des cellules sanguines, par exemple des globules blancs, en vue d'obtenir la formule leucocitaire. Ce comptage differentiel, obtenu à l'aide de l'électropho- ruse, peut cependant être appliqué à diverses autres analyses du sang. En effet, les cellules et autres particules sanguines de divers types ont différentes densités de charge superficielle et, par conséquent, elles possèdent des mobilités électrocinétiques différentes. Grâce à l'électrophorèse, ces différences permettent donc de distinguer entre les différents types de cellules. Ces dernières sont alors identifiées par une propriété physico-chimique et non plus d'après leur affinité à différents colorants et leur structure morphologique. De plus, la mise en oeuvre de ce procédé de comptage différen- tiel peut être obtenue par une combinaison particulière d'une cellule d'électrophorèse avec. des moyens optiques et électroniques connus qui permettent d'assurer un comptage différentiel rapide et précis et qui se prêtent bien au fonctionnement automatique. L'invention a également pour objet un appareil. pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Cet appareil est caractérisé par le fait qutil comprend au moins un dispositif d'électrophorèse agencé de manière à permettre l'introduction de l'échantillon liquide et l'observation des particules sanguines y contenues en suspension, un dispositif d'aggrandissement agencé de manière à for mer une image agrandie desdites particules, un dispositif convertisseur opto-electronique agencé de manière à délivrer continuellement des signaux électriques correspondant à la densité optique de chaque point de l'image observée, et des moyens permettant le calcul des vitesses des particules observées, à partir desdits signaux, et le classement des particules en fonction de leur vitesses. I1 est cependant évident qu'un tel appareil peut, en outre, comprendre divers perfectionnements, tels que décrits par la suite, Pour mesurer les mobilités des cellules, une solution contenant ces dernières est introduite dans une cellule d'électrophorèse comprenant, par exemple, un petit tube cylindrique (diamètre interne 2 mm, longueur 16 cm), disposé horizontalement, muni à chacune de ses extrémités d'une -électrode platinée. La cellule d'électrophorèse est thermo-stabilisée a 250C. On peut ainsi examiner le déplacement des cellules sous l'action d'un champ électri que appliqué entre lesdites électrodes à l'aide a d'une source de tension continue.Cet examen peut etre effectué à l'aide d'un microscope optique monté perpendiculairement a l'axe du tube ì d'élec trophorèse. On prendra cependant de préférence certaines précautions afin de mieux distinguer les différents types de cellules à observer et a compter. A cette fin, on peut mettre les cellules en suspension dans une solution dont on règle différents paramètres tels que le pH et la force ionique, par exemple. De plus, on peut soumettre les cellules a divers traitements préliminaires, par exemple avec des anticorps, des enzymes, des substrats enzymatiques, des protéines très basiques ou tres acides, des colorants, des ions multivalents etc. La vitesse de chacune des cellules observables dans le champ du microscope peut etre mesurée par un dispositif automatique opérant selon le principe décrit ci-après. Le dessin annexé montre schématiquement et à titre d'exemple, un appareil pour la mise en oeuvre du procédé de comptage différentiel selon l'invention. La fig. 1 est un schéma bloc de l'appareil. La fig. 2 est un schéma bloc d'un dispositif de traitement d'information, faisant partie de l'appareil dela fig. 1 La fig. 3 est un diagramme explicatif de la méthode utilisée pour suivre les trajectoires des cellules. Avant de décrire les schémas bloc de l'appareil selon les fig.l et 2, il convient de préciser, en se référant à la fig. 3, les méthodes utilisées pour l'identification de la trajectoire-des cellules et pour le calcul de leur vitesse. La position instantanée d'une cellule i peut être définie par un couple de coordonnées (pi, qi), par exemple, son centre. La mesure de la vitesse de déplacement v@ d'une cellule i nécessite de déterminer la position de la cellule à deux instants différents (tl, tn) séparés par un intervalle tel que la distance parcourue par la cellule durant cet intervalle de temps permet une évaluation précise de la vitesse. Pour que ces deux positions (pli, q.i, tl) et (pni, qni, tn), correspondent effectivement à deux positions de la même cellule, il est nécessaire que le système de traitement des informations provenant de l'image soit -capable d'identifier la trajectoire de chaque cellule. Pour ce faire, le système opere de la façon suivante (voir fig.3): - les coordonnées de la cellule (pli, qli, tl) sont d'abord extraites d'un premier balayage de l'image et sont mémorisées; - les nouvelles coordonnées (P2, q2' t2) sont ensuite recherchées lors d'un second balayage de l'image dans un certain voisinage des coordonnées (pli, qli, tl). Si l'on trouve ces coordonnées (p2, q2, t2), celles-ci sont alors attribuées à la cellule i.Les coordonnées (p2, q2, t2) deviennent donc (p2i q2i, t2); - lors d'un troisième balayage des coordpnnées (p@. q3, t3) sont recherchées dans un certain voisinage des coordonnées (p2i, q2i, t2). Si ces coordonnées existent, elles sont alors mémorisées dans un des registres associés é la cellule i et (p3i, q3i, t3). Ces nouvelles coordonnées remplacent les coordonnées (p2i, q2i, t2) qui sont éliminées; - a partir de (p3i, q3, t3), on détermine (p3i, q41 t4), comme décrit, et l'on répète cette opération jusqu'à l'instant t . De n cette manière, on observe la trajectoire de la cellule par pas successifs. Cette méthode, illustrée sur a fig.3 permet ainsi d'obtenir dans les registres associés à chaque cellule i, deux positions (p1i, q1i, t1) et (pni, qni, tn) correspondant effectivement à la même cellule. C'est à partir de ces données que l'on peut calculer les vitesses. On a: où: pni, qni sont les coordonnées de la cellule i au temps tn et i i n pl, ql, les coordonnées au temps tl. Dans le système servant a la mesure de la vitesse de déplacement par électrophorèse, l'axe X sera considéré dans la direction du champ électrique et l'axe Y dans la direction du champ de gravité et c'est la composante de vitesse vx qui serait alors à mesurer. x On peut cependant également envisager de mesurer la composante vy Afin de permettre une mesure continue pouvant s'étendre sur un grand champ d'observation, et cela plus rapidement que lors d'un déplacement séquentiel du champ d'observation, on peut envisager de déplacer la cellule d'électrophorèse dans la direction de la composante vxi des cellules sanguines, et cela avec une vitesse constante V, et à mesurer le temps nécessaire pour que la projection de chaque cellule parcourt une distance déterminée dans un système de coordonnées fixe.Par rapport à ce système référentiel, une cellule de sang a donc une vitesse vxi selon l'axe X composée de la vitesse de translation constante V et de la vitesse de déplacement ou mobilité due au champ électrique, que l'on désignera par Mi, et l'on a donc: Vi = V + Mi x La vitesse V étant connue, on peut donc déterminer la mobilité Mi de chaque cellule à partir de la mesure de vx. A cette fin, on détecte les positions d'une même cellule aux instants (tli, tni). La mobilité sera donnée par: L'appareil représente sur la fig. 1 permet de mesurer le spectre des vitesses des cellules sanguines et d'établir automatique-ment un histogramme représentant le nombre de cellules groupées selon leur vitesse de déplacement. Le bloc 1 (voir fig.l) représente un dispositif d'électrophorese, par exemple celui décrit précédemment, agencé de manière à permettre l'introduction et l'observation des échantillons liquides contenant les particules sanguines. Le bloc 2 représente un système optique comprenant essentiellement un microscope qui forme une image agrandie des cellules sanguines en mouvement dans le dispositif d'électrophorèse du bloc 1. Ce microscope est couplé au tube-image d'un convertisseur optoélectronique 3 qui explore par balayage l'image optique et délivre continuellement le signal vidéo correspondant SV Dans ce convertisseur 3, on utilise de préférence une illumination "champ clair". Toutefois, compte tenu du faible contraste des cellules et des ombres créées dans l'image par les cellules proches du plan focal du microscope, il convient d'améliorer la qualité de l'image et cela comme décrit ci-après par-rapport au bloc-6 de la fig. 2. On a utilisé une caméra de télévision modifiée de façon à effectuer un balayage sans entrelaçage. La synchronisation de la caméra est obtenue par l'intermédiaire d'un signal périodique Sus délivré par un circuit dé synchronisation 13. Cette caméra comprend un tube "vidicon" conventionnel > pour des raisons économiques. Cependant, un tube à écran composé de diodes silicium ("silicon target tube") présente une plus haute sensibilité et une gamme spectrale plus large. I1 permet ainsi de réduire l'illumination et, par conséquent, aussi les effets de convection thermique dans la cellule d'électrophorèse. Ce signe vidéo su est introduit dans un système 4 de traitement représenté d'une façon plus détaillée dans le schéma bloc de la fig. 2, ainsi qu'à un poste 5--de télévision servant à l'affi- chage de l'image soumise à l'analyse. Comme on le voit sur la fig. 2, le système de traitement 4 comprend des moyens 6 servant à l'amélioration du signal vidéo Sv . Ces moyens 6 comprennent un dispositif de filtrage, servant à ameliorer le rapport signal/bruit, et un dispositif de quantification du-signal Su de manière à donner au signal la valeur 1 pour les points de 11 image correspondant a la projection des cellules et 0 pour tous les autres points. Le signal quantifié Sv (0,1) est délivré à un circuit 7 de détection des coordonnées des cellules projetées sur l'image. Ce circuit de détection 7 comprend une série de registres à décalage qui reçoivent le signal vidéo quantifié SV (0,1) ainsi qu'un circuit logique.Ladite série de registres est composée de n groupes de registres, dont chaque groupe est destiné a stocker les données correspondant à une ligne de balayage, soit M points ou colonnes de la matrice principale (MxN) correspondant à l'image du champ observé, N étant le nombre de lignes de cette matrice. Chaque groupe de registres présente m sorties correspondant à m colonnes successives de la matrice principale MxN. Ainsi, ces groupes de registres sont agencés de ma nière que l'on obtienne une très petite matrice (mxn) dont les dimensions correspondent à peu près à celles de l'image projetée d'une cellule.Un signal SH d'horloge est délivré par le circuit 13 auxdits registres de manière à produire un mouvement de balayage de ladite petite matrice (mxn) et à couvrir ainsi successivement la matrice principale (MxN > entière. L'image se trouve ainsi en quelque sorte analysée par une petite fenêtre qui la balaye entièrement. Cette disposition des registres permet d'établir des corrélations entre des points voisins de la matrice principale, dt cela avec une capacité de mémoire très limitée. Ledit circuit logique est agencé de manière à détecter, à partir d'un certain nombre de données qui correspondent à la petite matrice (mxn),l'instant où cette dernière vient en regard de la projection d'une cellule.Ce circuit logique est en outre associé a une mémoire tampon à laquelle il délivre un signal logique (0,1) de détection servant a commander la restitution, à un circuit 8 de mémorisation (voir fig.2), des coordonnées instantanées (p, q) du point de détection. Outre ledit signal d'horloge SH, le circuit de synchronisation 13 délivre continuellement à ladite mémoire tampon, les coordonnées instantanées (x, y} de la position du point de balayage de ladite matrice principale (MxNl par la caméra de télévision. Les coordonnées (p, q) des points de détection des cellules sont délivrées par ladite mémoire tampon du circuit de détection 7 à un circuit 8 de mémorisation des positions successives des points détectés. Un circuit de calcul 9, relié au circuit 8, sert à calculer la vitesse ou mobilité Mi des cellules détectées, et cela comme déjà expliqué en détail. Ces vitesses Mi sont mémorisées dans une mémoire 10, et ensuite classées en plusieurs gammes de vitesse dans un circuit 11 et délivrées â un dispositif d'affichage 12, par exemple une imprimante servant à traçer 1'histogramme des vitesses des cellules de l'échantillon. La mémoire représentée par le bloc 10 mémorise simplement toutes les valeurs des vitesses calculées pour toutes les cellules observees. Cette mémoire peut être associée à un compteur permettant de compter le nombre de valeurs mémorisées et de déterminer la fin de la mesure de vitesse lorsque ce nombre de valeurs atteint un nombre prédéterminé. C'est alors qu'intervient la sortie de l'information au circuit 11. L'information de sortie relative aux vitesses mesurées peut être facilement organisée de façon à traçer un graphique de la distribution des mobilités des cellules sanguines. On paut cependant également envisager de fournir cette information directement sous forme des pourcentages des différents types de cellules. Or, une telle organisation (bloc 11) de l'information de sortie peut etre obtenue facilement par programmation d'un ordinateur, couplé à une imprimante (bloc 12). De même, la mémorisation (bloc 8) des coordonnées des cellules sanguines, le calcul (bloc 9) et la mémorisation (bloc 10) de leurs vitesses. peuvent également être obtenus facilement dans ce même ordinateur. Ledit ordinateur peut également être programmé pour commander, à l'aide d'interfaces appropriées, différentes fonctions de l'appareil décrit. Ainsi, grâce à 11 appareil décrit, le comptage différentiel des particules sanguines, et notamment des globules blancs, de divers types s' obtientautc,îatqunt d'une façon rapide et précise et cela à l'aide d'un appareillage composé d'éléments conventionnels agencés d'une manière particulière permettant d'établir, par exemple, la formule leucocitaire du sang soumis à l'examen. Vu qu'il s'agit de la mise en oeuvre d'une technique nouvelle de comptage différentiel des cellules sanguines, il convient d'examiner préalablement les résultats obtenus dans différents cas pratiques afin de pouvoir obtenir les informations pertinentes désirées. Or, il n'est pas indispensable d'utiliser un appareil automa tique pour la mesure de la mobilité des cellules. I1 suffit, en fait, d'un microscope optique et d'une cellule d'électrophorèse pour permettre à une personne qualifiée de suivre le mouvement des cellules et d'en déterminer la vitesse. Pour permettre la mesure de la vitesse électrophorétique, on a préparé des échantillons pour le comptage différentiel des globules blancs à partir du sang obtenu de donneurs en bonne santé, de différents groupes sanguins, et cela en utilisant, comme anticoagulant, l'héparine (Liquemine Roche), 500 U par 20 ml de sang. On a isolé les lymphocytes et granulocytes par la technique de Boyum, et cela en utilisant un gradient de densité Ficoll-Isopaque. Après sédimentation au Dextran (T 500 Ph.F.Chemic), on a enlevé les erythrocytes contaminants par lyse hypotonique. On a obtenu les plaquettes à partir d'un surnatant riche en plaquettes leucocitaires, après sédimentation du sang au Dextran et sa centrifugation à 100 g pendant 12 minutes. On a utilisé la phase plasmatique comme source de plaquettes. Après lavage repété avec une solution saline, on a suspendu les de divers types/cellules ainsi obtenus dans un tampon isotonique Michaelis à 1/10, de force ionique constante et de bas pH (environ pH 2) pour obtenir les échantillons pour la mesure de la mobilité électrophorétique. On a pu établir expérimentalement que l'on peut distinguer correctement différents types de globules blancs de manière à permettre d'effectuer le comptage différentiel conformément à l'invention. En effet, il est possible de bien distinguer les uns des autres différents types de globules blancs et même ceux présentant des mobilités très voisines (par exemple lymphocytes et granulocy tes), et cela en les soumettant à un traitement préliminaire approprié, avec des antilymphocytes (A.L.S.) par exemple. Or, on a pu constater que la mobilité electrophorétique des cellules varie en fonction du pH et de la force ionique de l'é- chantillon. I1 convient donc d'ajuster ces paramètres à des valeurs déterminées empiriquement au préalable, qui permettent de distinguer de la meilleure façonwles uns des autres, les différents types de cellules considérées. Ainsi, par exemple, on a pu obtenir un comptage différentiel satisfaisant des globules blancs avec des échantillons d'une valeur pH inférieure à 5 et de préfé rence 2 environ. I1 est également à remarquer que le procédé décrit présente de nombreux avantages par rapport aux systèmes de comptage différentiel basés sur l'affinité sélective aux colorants et sur ltob- servation de la morphologie. Parmi ces avantages, on peut citer: - l'utilisation de cellules vivantes; - l'automatisation aisée du changement d'échantillons; - la simplicité des moyens nécessaires à la mise en oeuvre du procédé; - la rapidité; - l'utilisation d'une propriété physico-chimique. L'appareil pour la mise en oeuvre de l'invention peut cependant être muni facilement de moyens permettant de mesurer d'autres paramètres des cellules observées et en particulier: - la vitesse de sédimentation lorsque celle-ci est perpendiculaire à la direction du champ électrique, ou en l'absence de ce champ; - la dimension des cellules; - la surface des cellules projetées sur l'image; - les propriétés d'absorption lumineuse pour différentes longueurs d'onde; - l'absorption sélective'des cellules renforcée par colora tion. La mesure de ces différents paramètres peut permettre des classifications plus détaillées des cellules et par là fournir de plus amples informations utiles à l'élaboration d'un diagnostique. L'appareil selon l'invention peut également être utilisé dans un grand nombre d'applications où l'on désire, soit mesurer les vitesses de diverses cellules ou particules, soit simplement les compter. Ainsi, par exemple, on peut utiliser ce même appareil pour: - la mesure de la vitesse de migration ou de diffusion, cette dernière étant mesurée en l'absence du champ électrique; - le comptage des cellules rouges ou des plaquettes de sang; - le comptage de cellules ou de particules présentant-des dimen sions ou des propriétés d'absorption définies. REVENDICATIONS 1. Procède de comptage différentiel des particules sanguines, notamment des globules blancs, caractérisé par le fait que l'on soumet un échantillon des particules à compter, en suspension dans un liquide, à l'action d'un champ électrique unidirectionnel de manière à soumettre ces particules à une migration dans la direction de ce champ, que l'on détermine la vitesse des particules en les observant sur une portion déterminée de leur trajectoire lors de cette migration, et que l'on détermine, en fonction des vitesses mesurées, le nombre de particules dont les vitesses sont comprises dans des gammes déterminées. 2. Appareil pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il comprend au moins un dispositif d'électrophorèse (1) agencé de manière à permettre l'introduction de l'échantillon liquide et l'observation des particules sanguines y contenues en suspension, un dispositif d'agrandissement (2) agencé de manière à former une image agrandie desdites particules, un dispositif convertisseur opto-électronique (3) agencé de manière à délivrer continuelSlement des signaux électri- ques (SVj correspondant a la densité optique de chaque point de l'image observée, et des moyens (4) permettant le calcul des vitesses des particules observées, à partir desdits signaux, et le classement des particules en fonction de leur vitesse. 3. Appareil selon la revendication 2, caractérisé par le fait que ledit dispositif convertisseur (3) est formé d'une caméra de télévision. 4. Appareil selon la revendication 2, caractérisé par le fait que lesdits moyens (4) comprennent un circuit (6-) de filtrage et de quantification desdits signaux (Sv). 5. Appareil selon la revendication 4, caractérisé par le fait que lesdits moyens (4) comprennent un circuit (7) de détection qui reçoit les signaux quantifiés SV (0,1) et délivre les coordonnées instantanées (p, q) de chaque particule détectée sur ladite image. 6. Appareil selon la revendication 5, caractérisé par le fait que ledit circuit de détection (7 > comprend une série de registres à décalage qui reçoivent lesdits signaux quantifiés et sont ciés à des moyens permettant de détecter lesdites coordonnées de chaque particule. 7. Appareil selon la revendication 5 ou 6, caractérisé par le fait que ledit circuit (7) de détection est relié à un circuit (8) de mémorisation desdites coordonnées d'une façon prédéterminée. 8. Appareil selon la revendication 7, caractérisé par le fait que ledit circuit (8) de mémorisation des coordonnées est relié à un circuit (9) de calcul desdites vitesses des particules et à un circuit (10) de mémorisation des vitesses calculées, lequel circuit (11) est relié à un circuit (11) de classement desdites particules en fonction de leurs vitesses. 9. Appareil selon la revendication 2, caractérisé par le fait qu'il comprend un dispositif d'affichage (12) dudit nombre de particules dont les vitesses sont comprises dans des gammes de vitesses prédéterminées.