Brevet FR2221122A1 — publié le 19741011

La présente invention concerne la préparation o de liposomes ayant un diamètre maximal.oe 1000 A , de o préférence de 200 à 500 A. Bes parois de ces liposomes sont constituées par des couches mono-, bi- ou multi-moléculaires, mais de préférence par des couches bimoléculaires ayant une épais o seur approximative de 30 à 100 A.Les substances oui sont utilisées pour la préparation des liposomes, répondent à la formule générale : x dans laquelle X est un groupe hydrophile polaire et Y estun groupe hydrophobe non polaire.Par exemple,X désigne un reste phosphate, carboxyle, sulfate, amino, hydroxyle ou choline et Y désigne un reste d'hydrocarbure saturé ou insaturé, par exemple un groupe alkyle, alcényle ou alcynyle, qui peut Rtre substitué le cas échéant,par exemple, par un reste aromatique ou cycloaliphatique. Toutefois, ceci ne représente que quelques exemples de définitions très avantageuses de X et Y. Pour encapsuler des médicaments et des substances analogues, il convient d'utiliser entre autres des phospc1i- poides tels que la lécithine, la phosphatidyléthanoîamine, la phosphatidylsérine, l'acide phosphatidique, etc. Pour préparer des liposomes, il convient itutiliser principalement deux procédés simples. Dans le premier procédé, on ajoute un lipide à une phase aqueuse et on chauffe légèrement le mélange, puis on l'agite énergiquement par secousses, après quoi on le traite aux ultra-sons jusqu'à ce que les liposomes aient été formés. Le.ur formation se manifeste par une clarification partielle et l'apparition d'une légère opalescence bleu âtre. Dans le second procédé, on prépare un système en dis-persion,de préférence un colloTde linéaire, que i'on obtient de la façon la plus simple en transformant en minces pellicules, par évaporation du solvant, une phase dispersée dissoute dans ce solvant, et en faisarXt ensuite entrer ces pellicules en contact avec une phase continue aqueuse ou non aqueuse, sous agitation énergique. te système ainsi produit est ensuite traité aux ultra-sons pendant une péric e prolongée de temps ; les molécules de la phase dispersée s'orientent alors dans un ordre tout à fait déterminé, dont la structure est reproduite sur le schéma suivant.Ces édifices représentent un état particulièrement favorable du point de vue thermodynamique, en sorte qu'ils ont une grande stabilité et qu'ils peuvent entre canservés pendant des mois. Schéma X et Y ont les définitions données ci-dessus. Dans les deux procédés décrits ci-dessus, les liposomes formés peuvent entre séparés du mélange réactionnel, par exemple par ultra-centrifugation, chromatographie, etc. L'application des procédés décrits offre un intérêt particulier pour ltencapsv.lage de médicaments ou de substances o actives cosmétiques, la dimension diamétrale maximale de 1000 A des liposomes obtenus représentant un progrès important par rapport aux micro-capsules usuelles. On mentionne ci-après trois propriétés de ces liposomes, en tant que nouvelles formes dtapplication d'un intél8t particulier pour des substances actives pharmaceutiques ou cosmé- tiques. 1. Les liposomes formés sont extrEmement stables et peuvent donc protéger les solutions de substances chimiques qu'ils renferment (par exemple des médicaments, des protides, des enzymes, des hormones, des vitamines. etc.) de conditions ambiantes extrêmes ou nuisibles (par exemple pendant le passage dans les voies gastro-bftestinales) et ils permettent donc éga lement l'administraticn par voie orale de médica.ments sensibles. 2. l'os liposomes individuels sont si petits que leur pouvoir de pénétration est ex.-t-remement grand, ce qui permet de leur faire traverser sans difficulté des memoranes biologiques. 3. Par le choix approprie des substances utilisées pour la préparation des parois des liposones, on peut influencer les charges exercées à la surface des liposomes et,par conséquent, diriger ces derniers, avec la substance active qu'ils renferment, préférentiellement dans un organe-déterminé. Ainsi, par exemple, dans le cas de liposones renfermant une lécithine et la stéa-ryl- amine, le potentiel de surface est positif, tandis que dans le cas de liposomes formés par exemple à partir de phosphatidyl inositol, le potentiel de surface est négatif. L'application thérapeutique de nombreux médicaments, principalement de protéc-hormones,telles quel'irsulnne, l2oc-yto- cine, la vasopressine, l'hormone adrénocorticotrope, la calcitonine, la sécrétine, la kallicréine, l2irtnibfteur de kalli- créine, les relaxine-quinines, le glucagon, ainsi que d'autres médicaments facilement inactivables tels que l'adrénaline, la tubocurarine ou des dogues de résorption difficile telles que la digitaline, notamment la strophantine ou des stéroSdes tels que des oestrogènes ou la testostérone, a été jusqu'à présent limitée aux voies sous-cutanée ou intraveineuse, parce que ces composés sont décomposés dans l'estomac ou dans l'intestin en produits inactifs, ou parce qu'ils ne sont que difficilement résorbés dans llinitestin. Dans tous les cas dans lesquels un tel médicament doit être utilisé en thérapeutique régulièrement pendant des années, une administration par voie orale signifie lin grand progrès. La présente invention permet de préparer une forme d'adminis-tration des médicaments mentionnés ci-dessus, notamment de l'insuline, que lton peut faire absorber de façon illimitée par voie orale les substances actives encapsulées n'étant alors libérées quota l'endroit désiré. Dans des tests effectués sur des souris blanches, il a été possible d'engendrer par exemple un choc hypoglycémique par administration orale d 'une préparation d'insuline sous la forme de liposome, avec le doublé de la dose qui était nécessaire pour engendrer le choc par voie sous-cuzal1ée. oeez des animaux témoins, même avec une dose 20 fois supérieure à la dose habituel- le d'insuline,administrée par voie orale, il n'a pas été possible de faire apparaître les -sympt8mes d'une action de ltinsuline. Dans un autre test d'activité des nouvelles préparations, on a administré à des souris blanches par voie sous-cutanée la dose usuelle de tubocurarine et par voie orale une dose 3000 fois plus forte. Toutes les souris traitées par voie sous-cutanée sont mortes, tandis que les grandes quantités administrées par voie orale n'ont engendré aucun sympt8re. Mais dès que la tubocura- rine a été administrée sous la forme incluse dans des liposomes de lécithine, les souris on pu entre tuées avec la quantité sous-cutanée de tubocurarine administrée par voie orale. On a constaté que la quantité utilisée de composé X - Y (lipides) est déterminante pour la. préparation de ces liposomes administrables par voie orale et que suivant le type du lipide, elle est optimale dans la gamme de 0,01 à 50 mg par millilitre de solution du médicament. Les liposomes conformes à l'invention conviennent, non seulement comme forme optimale pour des substances actives administrées par voie orale, mais aussi pour denombreuses autres applications. Ainsi, par exemple, l'excellent pouvoir de pénétration des liposomes permet une application extrmement efficace de médicaments et de cosmétiques par application sur la peau. Bes liposomes pénètrent sans difficulté dans la peau et les tissus, si bien que des substances hydrosolubles peuvent agir à l'endroit désiré, alors que dthabitude, elles ne peuvent pas pénétrer dans la peau. De même, la présente invention permet d'obtenir des préparations de liposomes admlnistrables par inhalation, agissant de façon excellente, et à l'entroit désiré. Exemple Pour encapsuler 300 mg de théophilline, on dissout 9 mg de lécithine dans 10 mu de chloroforme et on concentre par évaporation dans un ballon à fond rond, de manière que la lécithine résiduelle soit repartie aussi uniformément que possible sur la paroi du ballon. Ensuite, la solution de théophilline (300 mg de théophilline dans 3 ml de tampon tris 0,1 N, pH 8,5) est introduite dans le ballon et agitée énergiquement par secousses pendant quelques minutes.Après la formation d'une émulsion blanche, on traite cette émulsion aux ultra-sons pendant une demi-heure. Be systèmeendispersion se clarifie et la suspension des liposomes formés se présente comme un liquide pratiquement transparent. 'tes vésicules formées,qui contiennent à présent la solution de théophilline, peuvent être séparées de la lécithine non mobilisée dans la formation de la structure, par ultra-centrifugation pendant une heure à 100 000 g. Pour séparer les liposomes de la solution de théophilline non incluse dans la structure, on procède à une chromatographie sur 'tSepharose't. F,xemple 2 Pour encapsuler 100 mg d'insuline, on dissout 3 mg de phosphatidylinositol dans 10 ml de chloroforme et on concentre la solution par évaporation dans un ballon à fond rond, de manière à former sur toute la paroi intérieure une pellicule uniforme de phosphatidylinositol. Ensuite, on introduit dans le ballon une solution d'insuline (100 mg d'insuline dans 3 ml de tampon de phtalate 0,1 M, pH 4,0) et on effectue ensuite le même traitement que dans ltexemple 1. Exemple 3 On dissout 1 g de trypsine dans 30 ml de tampon au phosphate 0,1 M (pu 7) et on introduit la solution dans un ballon à fond rond de 500 ml, puis on superpose une couche de 15 ml de chloroforme contenant en solution 15 ml de lécithine. Ensuite, on raccorde le ballon à un évaporateur à couche mince et on le fait tourner très rapidement à 300C pour chasser le chloroforme par évaporation sous pression de 0,1 bar. L'émulsion qui se forme est traitée aux ultra-sons comme dans l'exemple 1, et les liposomes sont ensuite séparés du résidu, également par chromatographie. Exemple 4 On ajoute 4 mg de lécithine par raillilitre à une solution de tubocurarine à 0,1 mg/ml et on maintient la solu tion à 30 C sous agitation permanente par secousses pendant vn certain temps (10 à 20 mn). Ensuite, on traite l'émulsion formée aux ultra-sons pendant 15 à 30 mn, jusqu'à formation d'ur colloS- de présentant une opalescence bleuâtre, ce qui est un indice de la formation des liposomes. Après ultra-centrifugation pendent 10 mn, au cours de laquelle la matière lipidique non utilisée dans la formation des liposomes se sédimente, on peut séparer les liposomes de la solution non utilisée dans leur formation, par chromatographie sur colonne de "Sephadex" ou de "Sepharose". La suspension de liposomes ainsi obtenue peut être administrée directement par voie orale. Exemple 5 En procédant comme indiqué dans l:exemple 4, on traite de l'insuline avec de la lécithine très pure pour former une préparation de liposomes pouvant être administrée par voie orale. REVENDICATI0NS 1. Liposomes contenant des composés chimiques, caractérisés par le fait que ces composés sont enveloppés de couches de préférence bimoléculaires, qui sont conformées en liposomes o extrmement petits, de diamètre maximal égal à 1000 A , ces couches étant formées de substances de formule générale X ---- Y dans laquelle X désigne un groupe hydrophile polaire et Y désigne un groupe hydrophobe non polaire. 2. Procédé de préparation de liposomes, caractérisé par le fait que les liposomes sont produits par traitement aux. ultra-sons , d'un système en dispersion, la phase continue du système contenant à ltétat dissous le composé à encapsuler, tandis que la phase dispersée contiens la substance formant les liposomes. 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé pal le fait que le système traité en dispersion est un système colloSdal linéaire que l'on obtient par mise en contact de couches minces de la phase dispersée, sous agitation énergique, avec là phase continue. 4. Procédé suivant ltune des revendications 2 et 3, caractérisé par le fait qu'on utilise des lipides ou, (les lipoS- des pour former la phase dispersée. 5. Procédé suivant l'une des revendications 2 et 3, caractérisé par le fait qu'on utilise des phospholipides comme phase dispersée. 6. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé par le fai tulil est appliqué à ltencapsulage de médicaments, d'enzymes ou d'insuline. 7. Procédé de préparation d'insuline , administrable par voie orale, caractérisé par le fait qu'on inclut l'insuline dans des liposomes qui ont un diamètre maximal de 800 A, et de o préférence de 200 à 500 A et la matière utilisée pour la réali sation des liposomes consiste en substances de formule générale : X --- Y dans laquelle X est un groupe hydrophile polaire et Y est un groupe hydrophobe non polaire0 8. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé par le fait que les liposomes sont produits par traitement aux ultra-sons dtun système en dispersion, la phase con-tinue du système contenant de l'insuline dissoute, tandis ue la phase dispersée contient la matière qui forme les liposomes. 9. Procédé suivant l'une des revendicajions 7 et 8, caractérisé par le fait que le système traité en dispersion est un colloïde linéaire que lton obtient par mise en contact de couches minces de la phase dispersée avec la phase continue, sous agitation énergique. 10. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé par le fait qu'on utilise des lipides ou des lipoïdes pour la phase dispersée, c'est-à-dire connue matière engendrant les liposomes. 11. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé par le fait qu'on utilise des lécithines pour former la phase dispersée. 12. A titre de produits industriels nouveaux, des liposomes obtenus notamment au moyen d'un procédé suivant l'une quelconque des revendications 2 à 11. 13. Liposomes à base d'insuline, administrables par voie orale, obtenus notamment au moyen d'un procéda suivant l'une quelconque des revendications 7 à 11.