Brevet FR2214887A1 — publié le 19740819

L'invention, due à Erich BERNT, Werner BOLLACKER, Wolfgang GRUBER, Hans Ulrich BERGMEYER, a pour objet un procédé perfectionné de dosage de la créatinekinase et un réactif approprié à la réalisation de ce procédé. Certaines maladies entraînent des modifications caractéris tiques de l'activité de la créatinekinase (CK) dans les humeurs de l'organisme, par exemple dans le sérum. Le dosage de la CK présente donc un grand intérêt pour le diagnostic de ces maladies. Par ailleurs le dosage de la CK est également d'une grande importance pour la recherche pure. La créatinekinase sert de catalyseur dans la réaction (1): (1) créatinephosphate + ADP # créatine + ATP. On connaît plusieurs procédés de dosage de la CK selon l'é- quation (1), fondés sur la mesure des variations quantitatives d'un des produits intervenant dans la réaction dans l'équation cidessus. Parmi ceux-ci, ce sont surtout les procédés utilisant la réaction inverse, et dosant la créatine (Rotthauwe et collaborateurs,Klin. Wochenschrift 39, 1269 (1961)) ou l'ATP (I.T.Oliver, J.biol. Chemistry 61, 116 (1955)) qui ont pris de l'importance. La méthode préférée consiste à mesurer l'activité de l'enzyme par dosage de l'ATP, formé de façon continue. On effectue ce dosage de façon connue (I.T.Oliver,J.biol. Chem. 61,116 (1955)) par réaction avec du glucose en présence d'hexokinase comme catalyseur: (2) ATP + glucose ADP + glucose-6-phosphate. Le glucose -6-phosphate est facilement convertible, au moyen de NADP et de G-6-P-DH, en gluconate-6-phosphate. Dans cette réaction, le NADP se transforme en NADPH qui adsorbe fortement la lumière de longueur d'onde 340 nm: (3) NADP + G-6-P NADPH + 6-PG + H+. I1 est donc très facile de déterminer l'activité de la CK par mesure de la vitesse de formation du WADPH. On sait depuis longtemps que le procédé de dosage de la créatinekinase nésessite l'addition d'un agent d'activation, qui consiste en un composé renfermant li moins un groupe -SH. On a déjà utilisé à cet effet les composés sulfures les plus divers, comme la cystine, le glutathion (GSH), 1 mercaptoéthanol, le mercaptoacétate, le dithiothréitol, le dithioérythritol etc... Les composés contenant des groupes -oH, proposés jusqu'd présent comme activateurs, présentent cependant les inconvénients les plus divers. Ainsi, les solutions de cystine ont une forte tendance à cristalliser, alors que des préparations lyophilisées, conservées durant un certain laps de temps, ne permettent plus d'obtenir des solutions limpides. L'utilisation de mercaptoéthanol, de mercaptopropanol, de mercaptoacétate, de thioglycolate etc... se heurte à leur odeur très désagréable. Le dithiothréitol, le dithioérythritol,l'ester méthylique de la cystéine etc... s'oxydent facilement sous l'influence de l'oxygène atmosphérique et perdent alors leur propriété activante.Le bromure d'aminoéthyliso- thio-uronium présente l'inconvénient de dénaturer considérablement les protéines, ce qui interdit de le lyophiliser conjointement avec des protéines, par exemple avec de l'albumine, de l'hexoki- nase, du G-6-P-DH etc... D'autres substances, comme la guanylcystéine ou la carlsamoylcystéine, sont très peu solubles. Jusqu'à présent, l'agentdbctivation choisi était donc le GSH. En 1970 et 1972, la revue Deutsche Gesellschaft für Klinische Chemise (Z.klin.Ohem.u.klin.Biochem.8, 658-659 (1970) et 10, 185186 (1972)) a publié des recommandations concernant la normalisation de la méthode de détermination de l'activité de la CK. Dans ces publications, on recommande, comme activateur de la CK, le GSH. Celui-ci est relativement stable presque inodore et son produit d'oxydation, le GSSG est très soluble et dépourvu de propriétés de dénaturation des protéines. L'expérience a cependant montré que, lorsqu'on utilise des solutions de GSH ou des lyophilisats de GSH conservés depuis un certain laps de temps, on observe dans une partie des échantillons de sérum étudiés une activité de la CK trop faible. L'activité trouvée ne correspond plus au tableau clinique. Il est cependant nécessaire, en particulier dans le cas d'un infarctus du myocarde, de déterminer le plus rapidement possible, dès sa manifestation, l'activité exacte de la CK. De l'accroissement de l'ac- tivité au-dessus de la valeur normale de 50 U/litre, on peut déduire l'importance de l'infarctus et le médecin peut alors prendre les dispositions nécessaires. L'invention a donc pour but la réalisation d'un procédé et d'un réactif appropriés au dosage de la créatinekinase, utilisant un activateur dépourvu des inconvénients des activateurs antérieurement connus. On résout ce problème selon l'invention au moyen d'un procédé de dosage de la créatinekinase consistant à faire réagir, en présence d'un agent d'activation renfermant des groupes -SH,le créatinephosphate et 1'ADP pour former de la créatine et de l'ATP et à mesurer les modifications quantitatives d'un des produits intervenant dans la réaction, lequel procédé est caractérisé par le fait qu'on effectue la réaction en utilisant, comme agent d'activation, la N-acétylcystéine. Avec l'agent d'activation selon l'invention, la CK conserve son activité durant de très longues périodes et, même lorsqu'elle est sous forme de solution, son activité reste inchangée apres un stockage de plusieurs semaines. La supériorité de la N-acétylcystéine (NAC)utilisée conformément à l'invention sur le GSH, utilisé jusqu'à présent de façon préférentielle, ressort du tableau I ci-dessous qui donne les résultats de dosages d'activité de la CK dans 15 sérums différents, obtenus respectivement avec des solutions de GSH ou de NAC fraîche- ment préparées et avec des solutions de GSH ou de NAC conservées durant 6 semaines à la température de 40C, -TABLEAU I Sérum Activité en Ullitre trouvée au moyen d'une solution avec du GSH avec du GSH avec de la NAC avec de la NAC fraîchement conservée 6 fraîchement conservée Ç préparée semaines à4'C préparée semaines à 4'C 1 30 19 32 30 2 58 44 60 60 3 107 95 105 104 4 124 109 130 125 5 230 219 235 230 - 6 33 10 35 30 7 75 55 80 78 8 132 115 130 t28 9 190 170 185 180 10 239 220 245 240 11 20 0 24 20 12 49 2 52 47 13 115 70 110 110 14 180 140 185 179 15 231 190 235 225 Les résultats de ces essais, et en particulier la comparaison des sérums NOs 1, 6, 7,11, 12, 13 et 14, font apparaître que les solutions au GSH, conservées durant un certain laps de temps, conduisent à des valeurs fortement erronnées, tandis que les valeurs, trouvées selon l'invention, ne présentent que de très faibles déviations, qui se situent le plus souvent dans les limites de la précision de la méthode de dosage. La supériorité de l'agent d'activation selon l'invention résulte probablement de sa stabilité supérieure à celle du GSH. Cette amélioration de la stabilité, en solution aussi bien qu'à l'état lyophilisé, ressort du tableau II ci-dessous. -TABLEAU II- NAC GSH Durée de Solution à Lyophilisat à Solution à Lyophilisatà stockage 40C 33"C 4"C 33"C semaines mgZml mg/flacon mg/ml mg/flacon 0 102 102 100 105 1 99 102,5 88 100 2 98 101 80 95 3 87 98,7 68 92 4 81 97,0 55 85 5 77 97,5 45 77 On attribue la différence de stabilité à une différence des sensibilités à l'oxydation du groupe SH. Les différences de stabilité trouvées dans les essais, n'étaient pas prévisibles. On réalise de préférence le procédé selon l'invention en utilisant la méthode illustrée par les équations (2) et (3). Compte-tenu de la grande importance que revêt le dosage de l'activité de la CK dans le sérum, notamment pour le diagnostic de différentes maladies, l'industrie offre des compositions de réactifs pour un nombre déterminé d'essais. Ces compositions contiennent les réactifs nécessaires pour l'essai en quantités pesées ou mesurées à l'avance et se présentent sous une forme qui permet un dosage exact de l'activité de la CK. Le rassemblement des différents composants compatibles, nécessaires pour le dosage, dans un petit nombre de flacons, la préparation de mélanges réactionnels et les modes de préparation spéciaux sont destinés à permettre une exécution simple et rapide du dosage. Pour répondre à ces impératifs, l'invention a aussi pour objectif un réactif pour le dosage de la créatinekinase contenant soit du créatinephosphate, de l'ADP et un système pour le dosage de l'ATP ou de la créatine, soit de la créatine, de l'ATP et un système pour le dosage de l'ATP ou du créatinephosphate et qi est caractérisé par ie fait qu'il contient de la N-acéthylcystéire- Dans le mode de réalisation préféré, le réactif selon l'invention est constitué par 1. 3,5 à 15 mmoles d'imidazole 0,8 à 3,5 mmoles de glucose 0,3 à 1,5 mmole d'acétate de magnésium 0,5 à 2,5 mmoles d'un azide alcalin C,1 à 0,4 mmoles d'EDTA (acide éthylènediaminotètracétique) dissous dans 60 ml d'eau pour former une solution de pH 6,5 à 7,0. 2. G,04 à 2,0 mmoles d'ADP 0,02 à 1 mmole de NADP-Na 0,3 à 1 mmole d'AMP-Na2 sous forme de solution dans 3 ml d'eau ou sous forme de lyophilisat. 3. 0,5 à 3 mmoles de créatinephosphate dans 5 ml d'eau ou sous forme de lyophilisat. 4. 30 à 350 U d'hexokinase 3C à 350 U de glucose-6-phosphate-déshydrogénase (G-6-P-DH) dans 1 ml du mélange glycérine/eau = 1:1. 5. 0,3 à 3,0 mmole de N-acétylcystéine dans 2 ml d'eau ou sous forme de lyophilisat ou de parties aliquotes de ces mélanges. Les constituants 1 à 5 de ce réactif préféré se présentent avantageusement sous forme de produits secs sous forme de solutions ccntenues dans cinq récipients séparés, par exemple des flacons; pour l'exécution du dosage, on les mélange de la façon indiquée ci-dessous. Suivant un mode de réalisation particulièrement préféré, le réactif selon l'invention n'est constitue, que de deux mélanges différenté, à savoir: mélange i, constitué de: 3,5 à 15 mmoles d'imidazole 0,8 à 3,5 mmoles de glucose 0,3 à 1,5 mmole d'acétate ce magnésium G,. à 2,5 mmoies d'un azide alcalin, dissous dans 60 ml d'eau pour former une solution qu'on arre;; a un pH de 6,5 à 7,0 et mélange 2, constitué de ,a à 0,6 mmole d'ADP 1,0 à 5,0 mmoles d'AMP C,G5 à 0,5 mmole de NADP 5,0 à 20,0 mmoles de créatinephosphate 2,0 à 5,0 mmoles de N-acétylcystéine 100 à 300 U dthexokinase 100 à 1500 U de G-P-DH 100 mg d'albumine du sérum, dans 100 ml d'eau pour former un mélange qu'on amène à un pH de 6,5 à 7,0 ou sous forme de lyophilisat ou de parties aliquotes de ces mélanges. Dans le cas de ce mode de réalisation du réactif, on utilise une certaine quantité du mélange 1, qui se présente sous forme d'une solution pour dissoudre une partie déterminée du mélange 2 présent sous forme d'un produit solide ou on la mélange avec une proportion correspondante de la solution du mélange 2. L'invention permet une amélioration notable de la fiabilité du dosage de la créatinekinase grâce à l'utilisation d'un stabilisant plus efficace. Ce stabilisant, le NAC, ne dénature pas les protéines, il est pratiquement inodore, très hydrosoluble et ne coûte qu'environ le dixième de l'activateur GSH, préféré jusqu'à présent. Les exemples suivants, non limitatifs, décriront des modes de réalisation préférentiels du procédé selon l'invention et le réactif selon l'invention. EXEMPLE 1. Solution 1. On dissout dans 50 ml d'eau bidistillée 7,0 mmoles d'imidazole 1,6 mmole de glucose 0,73 mmole d'acétate de magnésium 1,07 mmole d'azide de sodium 0,22 mmole d'EDTA, on amène, avec de l'acide acétique 2 N, le pH de la solution à 6,8 et on ajuste à 60 ml avec de l'eau. Solution 2. On dissout dans 3 ml d'eau C,06 mmole d'ADP 0,037 mmole de NADP-NaZ 0,46 mmole d'AMP-Na2, et on lyophilise la solution dans un flacon approprie. Solution 3: On dissout dans 5 ml d'eau 2,10 mmoles de créatinephosphate et on lyophilise la solution dans un flacon approprié. Solution 4: On dissout dans 1 ml de glycérine à 50% 175 U d'hexokinase et 175 U de G-6-P-DH Solution 5: On dissout dans 2 ml d'eau 0,7 mmole de N-acétylcystéine et on lyophilise la solution dans un flacon approprié. Sous cette forme, les mélanges de réactifs se conservent au moins 1 an à la température de 40C et au moins 4 semaines à la tempéra ture de 33 C. Pour préparer un mélange réactionnel, on dissout le contenu des flacons 2,3 et 5 dans la solution 1; on obtient ainsi une solution qui se conserve au moins 6 semaines à la températuv re de + 40C. Pour effectuer le dosage de l'activité de la CK, on opère de la façon suivante: On transfère à la pipette, dans une cuve, on mélange et on fait incuber durant 5 minutes à 25 C, 2,50 ml de mélange réactionnel et 0,10 ml de sérum. Après addition de 0,02 ml de solution 4, on mesure la densité optique dans un photomètre approprié, qui permet d'isoler avec précision les longueurs d'onde 340 nm,334 nm ou 366 nm, et on suit, durant 5 minutes, l'augmentation de la densité optique à des intervalles d'exactement 1 minute Les différences de densité optique par minute, multipliées par un facteur, donnent l'-activité de CK contenue dans le sérum. EXEMPLE 2. Solution 1: On dissout dans 50 ml d'eau bidistillée 7,0 mmoles dtimidazole 1,6 mmole de glucose 0,73 mmole d'acétate de magnésium 1,07 mmole d'azide de sodium 0,23 mmole d'EDTA on amène, avec de l'acide acétique 2 N, le pH de la solution à 6,8 et on ajuste à 60 ml avec de l'eau. Solution 2: On dissout dans 80-ml d'eaubidistillée 0,25 mmole d'ADP 2,50 mmolesd'AMP 0,15 mmole de NADP 8,75 mmoles de créatinephosphate 2,5 mmoles de N-acétylcystéine 700 U d'hexokinase 350 U de G-6-P-DH 100 mg d'albumine du sérum. On amène, suivant le cas avec une solution diluée de NaOH ou avec de l'acide acétique dilué le pH de la solution a 6,8, on ajuste à 100 ml avec de l'eau bidistillée, on homogénéise la solution et on l'introduit par portions de 1,0 ml dans des flacons appropries de 1,0 ml chacun dans lesquels on la lyophilise. Pour l'exécution de l'essai, on dissout le contenu d'un flacon dans 2,50 ml de la solution 1, on ajoute 0,1 ml i sérum et on effectue le dosage de l'activité de CK de la façon décrite dans l'exemple 1. Dans ce qui précède on a décrit l'invention sur la base de son mode de réalisation préféré, le dosage de 1'ATP, produit conformément à la réaction (1). On peut cependant l'appliquer de la même façon et avec les mêmes avantages, lorsqu'on utilise, pour le dosage de la créatinekinase, l'une des autres méthodes connues, puisque, dans chaque cas, et en particulier quand il s'agit de doser l'enzyme dans dés humeurs de l'organisme, comme le sérum, l'activation de la créatinekinase revêt la même importance. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés; elle en embrasse au contraire, toutes les variantes. REVENDICATIONS 1.- Procédé de dosage de la créstinerinase consistant à faire réquir, en fréquence d'un ment d'activation rensermant des groupes @@@, e er atinephosphate et l'ADP pour forrer de la créatine et de l'ATP et à mesurer les modifications quantitives d'un des produits intervenant dans la réaction, lequel procédé est caractérisé par le fait qu'on effectue la reaction en utilisant, comme agent d'activation, la N-acéthylcystéine. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on dose l'ATP forme par réaction avec du glucose et de l'hexokinase, oxydation, au moyen de NADP en présence de glucose-6phosphate-déhydrogénase, du glucose-o-phosphate formé en acide phosphogluconique et mesure du NADP réduit. 3.- Réactif pour le dosage de créatinekinase, contenant, soit du créatinephosphate, de l'ADP et un système pour le dosage de l'ATP ou de la créatine, soit de la créatine, de l'ATP et un systèrne pour le dosage de l'ADP ou du créatinephosphate, lequel réactif est caractérisé en ce qu'il contient de la N-acétylcysté- ine. 4.- Réactif selon la revendication 3,constitué par 1. 3,5 à 15 mmoles d'imidazole 0,8 à 3,5 mmoles de glucose 0,3 à 1,5 mmoles d'acétate de magnésium 0,5 à 2,5 mmoles d'un azide alcalin C, 1 à C,4 mmole d'ED Te acide éthylènediaminotétracétique) dissous dans 7C mi d'eau pour former une solution qu'on amène à un pri de 8,5 à 7,5 2. 0,04 à 2,5 mmoles d'ADP 0,02 à 1 mmole de NADP-Na2 0,3 1 mmole d'ANP-Na2 sous forme de solution dans 3 ml d'eau ou sons forme de lyophilisat 0,5 à 3 mmoles de créatine phosphate dans a ml d 'eau ou sous forme de lyophilisat 4. 30 à 350 U d'nexokinase 30 à 350 U de glucose-phosphate-déshydrogénase (G-6-P DH) dans 1 ml du mélange glycérine/eau = 2: :1 5. 0,3 3,0 mmole de n-acéthylcystéine dans ml d'eau ou sous forme de lyophinisat ou de partien eliquotes de ces mélanges. 3,2 Réactif selon la revendication 6. 3,5 à 15 mmoles d'imidazole 0,3 3,5 mmoles de glucose 0,3 1,5 mmoles d'acétate de l 0,5 2,2 mmoles d'un azi@@ dissous dans 70 ml d'eau pour former in pre de 1,5 7,0, et de 0,2 à 0,8 mmoles d'ADP 1,0 à 2,0 mmoles d'ATP 0,05 à 0,2 mmole de NADP 5,0 à 20,0 mmoles de créatinephosphate 2,0 à 5,0 mmoles de N-acéthylcystene ô à 300 U d'hexokinase 100 à 1500 U de G-6-P-DH lOb mg d'albumine du sérum, pour former un mélange qu'on amène dans 100 ml d'eau à un pH de 6,5 à 7,0 ou sous forme de lyophilisat ou de parties aliquotes de ces mélanges.