Brevet FR2215952A1 — publié le 19740830

La présente invention se rapporte à un procédé de fabrication d'un désinfectant intestinal composé, principalement, de Clostridium butyricum miyairi et de ses spores. Les propriétés bactériennes et les phénomènes vitaux des espèces destinées à etre utilisées dans la présente invention sont les suivants (1) Propriétés Genre, espèces et nom des bactéries Clostridium butyricum miyairi Les bactéries de ces espèces sont relativement faciles à trouver dans les instestins des animaux et dans le sol. Elles sont également connues sous le nom de lactobacilles comme bactéries à acide lactique antiputrescentes. Morphologie Les cellules bactériennes ont généralement une forme fuselée, pointue aux deux bouts et légèrement dilatée au milieu. Parfois, la cellule est légèrement incurvée, ou bien elle est rectiligne et obtuse et arrondie aux deux extrémités. Chaque cellule a une longueur de 3 à 6 microns et une largeur de 1 à 1,21u. Les cellules ne forment pas de channe ni de hyphe. Coloration Les bactéries se colorent bien avec les couleurs d'aniline, se révèlent Gram-positives et, très souvent, on observe des granules au centre de chaque cellule bactérienne. Une culture prolongée rend les bactéries facilement Gram - . Après une culture d'une semaine, on n'observe que peu de bactéries Gram positives. Spores et capsules Des spores se forment facilement dans les bouillons de culture à base de foie haché, ou contenant des cubes de pomme de terre, sur des plaquettes d'agar, etc. Après 18 heures de culture, un grand nombre de spores ont été produites. Après 48 heures, on observe une prépondérance de spores. Chaque spore a une forme ovale et est soit centrée, soit dilatée vers chaque extrémité. Aucune capsule ne se forme. Flagelles et motilité La plupart des cellules ont jusqu' à dix flagelles le long de leur périphérie, certaines en possédant même aux extrémités. Leur motilité est très faible Besoin d'oxygène Les bacteries ne se développent pas dans un bouillon ou dans une plaquette placée.dans un environnement aérobie. Ces espèces exigent un milieu anaérobie. Résultats des essais de culture (a) Les bacteries forment des colonies blanches-ou grisâtres opaques, ou parfois translucides, de forme irregulière sur des plaquettes foie-agar et contenant du sucre. Avec des surfaces lisses, les colonies sont parfois visqueuses. Sur une plaquette comportant de multiples colonies, celles ci ont-une forme irrégulière ou bien, plus géneralement, une forme circulaire0 Lorsque le nombre des colonies est petit, celles-ci ont des dimensions considirables, sont plates et ramifiées et présentent un contour irrégulier, soit légèrement dilaté vers le haut, soit plat au centre, (b) Les bactéries ne provoquent pas dthéolyses mais produi sent un certain nombre d'hémolysoides sur une plaquette Z. (c) Quand on ensemence avec une aiguille la couche supérieure d'une plaquette d'agar, les bactéries croissent activement en formant un flocon le long de la ligne d'ensemencement et les gaz résultants forment une multitude de bulles dans le milieu de culture. On n'observe aucune croissance bac térienne au voisinage de la couche superficielle0 (d) Dans un bouillon de foie haché, les bactéries croissent, avec une vigoureuse production de gaz. Ensuite, le milieu de culture devient progressivement trouble. Après environ 24 heures, il atteint son maximum de turbidité et est acidifié. Après environ 48 heures, les cellules bactérien nes se déposent en formant des dépôts filiformes sur le fond du tube de culture et autour des fragments de foie, permettant ainsi au liquide de devenir progressivement transparent. (e) I1 en est exactement de meme en ce qui concerne la crois sance bactérienne dans un bouillon contenant des cubes de pomme de terre0 Quand on ensemence un bouillon contenant 20 % de cubes de pomme de terre et dont le pH a été réglé à 7,5 avec les bactéries conformes à l'invention, à un taux de 0,1 mg/cm de boillon et qu'on les maintient dans un incubateur-à 37 C, il se produit une croissance aéro génique et le milieu commence à devenir -trouble au bout de 4 à 5 heures. La croissance atteint un naximum après 18 à 24 heures, puis, la production de gaz devient telle que les cubes de pomme de terre flottent à la surface du liquide. La production concomitante d'acide augmente l'a cidité du milieu de culture à pH 5,5-6. Après environ 48 heures, le pH se situe entre 4,8 et 5.La croissance bac térienne s'arrête alors, la plupart des cellules étant remplacées par leurs spores0 La clarté du liquide augmente de plus en plus. (f) Sur un milieu lacté aussi, les bactéries croissent dans des conditions aérogéniques selon ce qu'il est convenu d'appeler une "fermentation tuaultueuse". Après .coagulation du milieu de culture, les bactéries forment de grossiers caillots, tandis que le milieu devient acide (g) Sur un milieu de culture cérébral, les bactéries croissent en dégageant des gaz et avec un léger degré de turbidité. Le produit résultant est inodore et n'est pas noirci. (h) Les bactéries ne digèrent pas le serum coagulé. Elles ne sont pas pathogènes; des injections par voie abdominale et hypodermiques dans les souris et les cobayes et l'ad ministration par voie orale de grandes doses à l'homme ne provoquent pas d'irrégularité, Action antagoniste à l'égard des germes pathogènes En culture.de contact sur des plaquettes et en culture mixte dans des milieux liquides, les bactéries conformes à l'invention forment des zones bactériostatiques et exterminent du milieu les oeufs et analogues de B. putrificus verrucosus, Shigella dysenteriae, ShiOflexneri, Salmonella typhi, S. paratyphi A, S. paratyphi B, S. pullorum, Staphylococcus aureus, B. thiaminolyticus, Myco- bacteria tuberculosis, B. orodigiosus, Escherichia colivar, Streptococcen, Bact.diphtheriae, Neisseria gonorxhoeae, Proteus vulgaris, B. pyocyaneus, Candida albicans, Trichophyton, Aspergillus, Ascaris lumbricoides, etc, On va expliquer maintenant le procédé utilisé à cette fin. Pour la culture de contact, on ensemence une plaquette uniformément revetue de Clostridium M. tamisés avec une très petite quantite d'une souche pathogène de B. putrificus, en formant des sillons ou des stries. Puis on place la plaquette dans une cloche anaérobie. Après 48 heures de culture à 370C, on enlève la plaquette. On constate que Clostridium M. a formé des zones bactériostatiques de 2 à 3 mm de largeur en inhibant la croissance de la souche pathogène. On ensemence Clostridium M. conjointement avec B. putrificus dans un bouillon de foie haché aux fins de culture mixte. On appli-que ce mélange sur une plaquette et on procède à une culture anaérobie. Au bout de 7 jours, B. putrificus a disparu du milieu de culture. Symbiose avec d1autres bactéries Les bactéries de l'invention sont capables de vivre en-symbiose avec d'autres groupes de bactéries acidogènesO Ce phénomène est particulièrement notable entre les bactéries de l'invention et les bactéries à acide lactique, plus particulièrement les streptocoques et les lacto-bacilles, les bactéries ramifiées, les levures, les colibacilles intestinaux, etc. Aptitude de synthèse des vitamines Les bactéries de l'invention peuvent synthétiser diverses vitamines. Jusqu'ici, on a trouvé quelles produisent dans le filtrat, après 48 heures de culture Vitamine B1 2,3 - 3 q/cc Vitamine B2 4-5,9 Vitamine B12 1 - 4 lr/cc Acide nicotinique 200 - 250 Qr/cc Acide folique 7-15 #/cc Vitamine K: traces Acide sulfhydrique Les bactéries n'en produisent pas Test K.C.N. Les bactéries se révèlent négatives Réaction M.R. Positive Réaction VOP Négative Test P.R.A. Négatif Test au citrate Négatif Uréolyse Négative Indole N1en produisent pas Liquéfaction de la gélatine Ne liquéfient pas Test. K.I.Positif Test S.M. Positif Production d'acides et de gaz Les acides que les bactéries selon l'invention produisent sont, en majeure partie, de l'acide butyrique, le reste étant de l'acide propionique et de l'acide formique. Après 48 heures de culture, le filtrat présente une acidité total-e de 5 à 9. Les gaz engendrés sont l'acide carbonique et l'hydrogène. Saccharolyse Glycérine (+), glycose (+), galactose (+), levulose (+), saccharose (+), lactose (+), maltose (+), salicine (+), mannite (+), dulcite (-), isodulcite (-), inuline sorbite (-), et la mannose (+). Zymogénèse Les enzymes dont on a, jusqu'à présent, pu s'assurer qutel- les sont produites par les bactéries selon l'invention, sont I'amylase, la lactase, l'invertase, la maltase, la lipase et la protéase. Le pouvoir de liquéfaction (de l'amylase) a été déterminé de la manière suivante. Après 48 heures de culture, on verse le filtrat dans une coupelle d'essai supportée sur une plaquette d'agar contenant 0,1 % de dextrine et on le laisse reposer à 370C pendant 15 heures. Ensuite, après addition d'une solution diode dans l'iodure de potassium, on procède à une réaction iode-amidon. Un anneau transparent ayant un diamètre extérieur d'environ 20 mm apparaît. Ceci est équivalent au pouvoir d'une solution de 0,5 à 1 % de diastase, selon la pharmacopée japonaise. Résistance et durabilité à la chaleur Les bactéries survivent à un chauffage à 800C pendant 30 minutes et à 900C pendant 10 minutes. Lorsqu'on chauffe les bactéries à 900C pendant 20 minutes, 5 % d'entre elles meurent. A 100 C pendant 5 minutes, la mortalité s1 élève à 70 A. Elles vi vent pendant 197 jours dans l'eau distillée ou pendant 8 à 17 ans protégées dans le mélange avec de l'amidon à la température am brante. Jusqu'à présent, pour la culture en milieu liquide d'es puces obligatoirement anaérobies, il était nécessaire d'ajouter au milieu de culture (qualifié ci-après, plus simplement, de "milieu") des substances de démarrage de la croissance bactérienne, telles que : des morceaux de tissu biologiques, par exemple, des pommes de terre (qualifiées ci-après de "cubes de pomme de terre"), du soja dégraissé, de ltextrait de foie, des fragments de foie et du sang; des substances réductrices, par exemple, des vitamines C, du thioglycolate, du sulfite et de la cystine; et des substances poreuses, par exemple, du coton ou de la ponce. Ces substances ont pour effet de réduire le potentiel d'oxydoréduction de la culture à un niveau suffisamment bas pour permettre la croissance d'une souche anaérobie.- Les expériences de culture de clostridium butyricum miyairi indiquent que les milieux mentionnés ci-dessus sont appropriés en ce que les cubes de pomme de terre servent de promoteurs S la formation des spores. Ceci est déjà connu dans. la technique par les brevets japonais NO 270 356 et 303 854. Plus récemment, toutefois, on a constaté qu'â l'utilisation de cubes de pomme de terre pour promouvoir. la croissance bactérienne, sont liés les inconvénients suivants (1) On rencontre de grandes difficultés pour préserver les pommes de terre de façon à maintenir leur fraîcheur et leur qualité après la récolte. En conséquence, il est pratiquement impossi ble de maintenir un rendement bactérien constant pendant toute l'année. (2) Le fait d'introduire des pommes de terre dans les récipients en vue d'une culture industrielle est une opération fastidieuse et qui a des répercussions défavorables sur l'environnement de travail du personnel. (3) Les pommes de terre ont une influence nuisible sur la couleur et longueur de la poudre bactérienne déshydratée qui est obte nue par l'addition d'un excipient aux spores et aux cellules des bactéries. Ceci a, de son coté, pour résultat de détériorer la qualité de la préparation médicinale finale. (4) L'élimination des résidus de pomme de terre (qualifiés ci-après "résidus grossiers") par filtration des liquides de culture exige des traitements compliqués. Compte tenu de ce qui précede, la Demanderesse a étendu ses recherches de diverses substances réductrices, diverses sources d'hydrates carbonés et de protéines, en vue de trouver un moyen pour préparer des milieux de culture pour les bactéries de l'invention, sans utiliser de cubes de pomme de terre0 Le résultat de ses recherches est un procédé qui permet de faire croitre des souches de bactéries obligatoirement sporogènes et anaérobie et de réaliser la formation des spores facilement et à peu de frais, sans avoir recours a' des cubes de pomme de terre. Le procédé de l'invention est caractérisé en ce qu'on inocule Clostridium butyricum miyairi dans un milieu de culture contenant de l'amidon de mais, une solution d'acide aminé et du carbonate de calcium, en vue de la croissance bactérienne et de la formation de spores. L'amidon à utiliser dans le procédé de l'invention est obtenu à partir de mas et la solution d'acide aminé est obtenue à partir du filtrat résultant de l'hydrolyse de gluten de blé. Une solution d'acide aminé, qui est essentielle pour le procédé de l'invention, coopère avec amidon de mais pour élever le taux de formation des spores et pour augmenter le rendement en cellules bactériennes sporifères (comme l'illustre l'exemple de référence ultérieur). Une formule avantageuse pour ce milieu de culture est, par exemple, la suivante Amidon de mais ................... 2 - 3 % Solution d'acide aminé .............. 2 - 3 % Carbonate de calcium ................ 1 - 2 % Rau ................................. q.s.p. 100 % Sur ce milieu, on cultive Clostridium butyricum miyairi de la manière habituelle. Comparativement à un milieu de culture ordinaire contenant de la pomme de terre, le milieu conforme à l'invention n'est pas très diffrent en ce qui concerne le temps nécessaire pour amorcer la croissance bactérienne. Ceci est probablement dû à l'action additive de la solution acide aminé et de l'amidon de mais. De plus, dans le présent procédé il n'est pas nécessaire de maintenir le pH du milieu entre 5 et 6 pour promouvoir la sporulation. Selon l'invention, la production d'acides a lieu de façon relativement lente, tandis que l'utilisation de pommes de terre provoque une fermentation tumultueuse et une formation relativement rapide d'acide, avec une diminution correspondante du pH du milieu. I1 est probable que dans le procédé de l'invention, la production relativement lente d'acides est due au fait que, à la différence des pommes de terre, l'amidon de mais contient certaines protéines et que ces protéinessegerées et décomposées par les bactéries en produisant une solution-tampon avec la solution d'acide aminé pour ralentir la formation des acides. Les acides qui se forment ainsi, de façon relativement lente, sont avantageusement neutralisés par le carbonate de calcium présent dans le milieu ets naturellement, il n'est plus nécessaire d'ajuster le pH du mélange de l'extérieur. Le procédé de l'invention est aussi supérieur aux procédés classiques tant en ce qui concerne le taux de formation des spores que le rendement en cellules bactériennes sporifères. Ce procédé a, en outre, sur les procédés de la technique antérieure, l'avantage de simplifier considérablement le procédé ou d'économiser un certain nombre d'étapes opératoires, d'heures de travail et dsappa- reillages, tout en améliorant la qualité du produit et en supprimant le problème de l'élimination des résidus. Aux fins de comparaison, un procédé de culture classique peut être décrit comme comprenant les étapes successives suivantes: 1. Délivrance et transport des (environ 500 kg de pommes de matières des magasins terre et d'autres produits) 2. Lavage des pommes de terre (Désachage des pommes de ; terre et introduction de celles-ci dans un appareil de lavage). 3. Découpage.-des pommes de (par une machine) terre en morceaux 4. Cuisson des tommes de terre (Les pommes de terre sont $ transportées dans une cuve de cuisson où d'autres matières et de l'eau sont également in troduites,et elles sont cuites à la vapeur). 5. Stérilisation (Le milieu de culture est # transféré de la cuve de cuis son dans une cuve de culture et est stérilisé indirectement à la vapeur) 6. Refroidissement (Refroidissement à l'eau). 7. Ensemencement (Une souche cultivée pendant # 24 heures dans une cuve spé Culture de ciale est ensemencée dans le la souche # milieu résultant de façon stérile). 8. Culture (24 h) 4f 9. Sporulation (Après 24 h de culture, on # transfère le milieu dans une cuve de sporulation préalable ment stérilisée et on l'y main tient pendant 24 h) 10. Elimination des résidus (On pompe le liquide résultant grossiers de la cuve de sporulation dans un tamis où les résidus de pom me de terre sont séparés, puis le reste est transféré dans une cuve de sédimentation). 11. Sédimentation des (On laisse se déposer les ré résidus fins sidus fins et le carbonate de calcium) 12. Séparation centrifuge (On sépare les bactéries par centrifugation du liquide sur nageant à une vitesse de (dénombrement des 15 000 tours/minute. On pompe bactéries) le précipité et on élimine les résidus fins dans une centri fugeuse séparée tournant à 3 000 - 4 000 tours/minute. On soumet le filtrat à une nouvelle centrifugation à 15.000 tours/minute 13. Pétrissage (On mélange lapate bactérienne et un excipient dans un pétrin). 14. Granulation (On forme des granules du mélange ainsi pétri dans un granulateur) 15. Séchage (au moyen d'un sécheur) 4f 16. Pesage, vérification et stockage 17. Elimination des résidus (Les résidus grossiers sont tami grossiers sés tout en les lavant avec de l'eau, sont soigneusement déshy dratés, puis brûlés dans la terre). 18. Elimination des résidus (Ils sont pétris, granulés et fins séchés pour être utilisés comme aliments). Selon la présente invention, les étapes numérotées 1 a 4 sont supprimées et, à leur place, un liquide formé en mélangeant de l'amidon de mais, une solution d'acide aminé, du carbonate de calcium et de l'eau est pompée dans une cuve de culture et y est stérilisée. Les étapes 10, 11, 17 et 18 sont également supprimées. A l'étape 12, le liquide de culture est simplement centrifugé à 15 000 tours/minute. Parmi les principaux appareils qui sont ainsi supprimés, on peut citer : la machine à laver les pommes deterre, la machine à couper les pommes de terre, le magasin à pommes de terre, le convoyeur, la cuve de cuisson, le séparateur de résidus, la centrifugeuse à panier, etc. Le nombre des heures de travail nécessaires est réduit en conséquence (à environ 0,5 homme/jour). En ce qui concerne la qualité du produit, il ne se produit aucune perte de bactéries dans le procédé conforme à l'invention, alors qu'on constate une certaine perte avec les résidus grossiers et fins dans les procédés classiques. La préparation granulaire, quand elle est complètement sèche, présente une couleur et une odeur sensiblement améliorées, comparativement aux produits ordinaires. Le procédé de l'invention est supérieur aux procédés de la technique antérieure tant dans le taux de formation des spores que dans le rendement en cellules bac atériennes sporifères, comme l'illustre l'exemple ci-après. EXEMPLE On utilise des milieux de culture ayant des compositions indiquées dans le tableau 1, pour des expériences de fermentation avec une cuve de 7000 litres0 Tableau 1 Constituante et pH Composition du milieu de culture I II III IV Amidon de mais 2.0% 2.0% - Solution d'acide aminé 2,0% - 2.0% Peptone - 1.0% - 1.0% Extrait de viande - 0.5% - 0.5% Sel ordinaire - 0.3% - 0.3% Carbonate de calcium 1.5% 1.5% 1.5% 1.5% Amidon de pommes de terre - - 2.0% 2.0% pH 7.0 7.0 7.0 7.0 On cultive une souche de Clostridium butyricum miyairi sur ces milieux de la manière habituelle et on obtient les résultats indiqués dans le tableau 2 ci-après. Tableuau 2 M i l i e a u d e c u l t u r e Echan- I II III* IV* tillon Amidon de maifs Bouillon d'amidon de Solution d'amidon de Bouillon d'amidon de N mais pommes de terre et pommes de terre d'acide aminé Nombre de Taux de Nombre de Taux de Nombre de Taux de Nombre de Taux de spores formation spores formation spores formation spores formation /ml des /ml des /ml des /ml des spores (%) spores (%) spores (%) spores (%) 1 6.9x108 95 5.9x108 95 4.2x108 95 4.8x108 90 2 5.8 " 90 5.8 " 90 4.9 " 90 4.3 " 90 3 5.6 " 90 4.8 " 90 5.3 " 90 3.7 " 85 4 7.2 " 95 4.7 " 85 4.6 " 90 3.9 " 85 5 6.1 " 95 5.9 " 95 5.0 " 85 5.7 " 90 6 5.5 " 90 5.9 " 95 6.2 " 95 4.5 " 85 7 4.6 " 85 5.6 " 90 5.5 " 90 5.1 " 85 8 7.2 " 95 6.1 " 90 4.6 " 85 3.3 " 90 9 6.7 " 95 6.5 " 90 5.3 " 90 2.5 " 80 10 5.5 " 95 6.5 " 90 5.2 " 90 3.5 " 85 Moyenne 6.11 " 92.5 5.77 " 91.0 6.08 " 90.0 4.13 " 86.5 * Exemples de référence I1 ressort du tableau 2 que le procédé de l'invention est supérieur à la technique antérieure tant par le nombre de spores formées que par le-taux de formation de celles-ci.Plus précisément, le milieu composé d'amidon de mals et d'une solution d'acide aminé est supérieur à ces deux égards, à la solution contenant de l'amidon de pommes de terre et une solution d'acide aminé. Ceci reflète l'action additive résultant de la combinaison de l'amidon de mais et de la solution d'acide aminé. On va comparer maintenant le procédé de l'invention à un procédé de la technique antérieure pratiqué sur une échelle indus trille. Le tableau 3 montre les données se rapportant à une exploitation ir.dustrielle s'étendant sur une période de cinq années, de 1966 à 1970, et indique les rendements mensuels obtenus avec des cuves contenant chacune 6 000 litres (capacité maximale des cuves) de liquide de culture. L'unité de mesure a été définie, aux fins de l'invention comme suit. Un milligramme de poudre bactérienne finie contenant 1,5 . 108 cellules représente une unité de croissance ou une unité/milligramme. I1 en résulte qu'une unité-kilo gramme contient 1,5 . 108 x 1000 (g) x 1000 (kg) = 1,5 . -î014 cellules. L'expression milieu à base de pomme de terre" est utilisée ci-contre pour désigner le milieu de culture décrit dans le brevet japonais N 270356 qui se compose de : Pomme de terre 8 %. Produit de digestion de gâteau de soja 3 - 5 % Carbonate de calcium 0,4 % Eau q.s.p. 100 % Tableau 3 Milieu de culture M o i s Pomme de terre Amidon de mais 1966 1967 1968 1968 1969 1970 Avril 10.4 10.6 10.1 17.9 17.6 Mai 9.8 10.9 11.3 18.4 18.2 Juin 10.5 12.8 13.4 13.3 18.9 Juillet 14.5 14.6 13.6 18.6 18.2 Août 13.7 13.2 14.2 17.3 19.2 Septembre 14.0 15.2 19.4 18.6 Octobre 13.0 15.4 18.6 20.1 19.1 Novembre 13.5 14.4 19.5 19.4 17.8 Decembre 13.3 15.5 18.7 18.5 20.2 Janvier 13.9 12.9 19.2 19.0 19.2 Février 13.1 11.6 19.4 22.4 21.5 Mars 9.4 10.6 18.4 19.8 18.4 Moyenne annulle 13.1 13.7 12.7 18.8 19.4 19.0 Les bactéries et les spores de Clostridium butyricum miyairi ainsi obtenues sont utilisées comme principaux constituants d'un désinfectant intestinal conforme à la présente invention. Le procédé utilisé pour en faire des médicaments est universellement connu et, de ce fait, il serait superflu de le décrire. R E V E N D I C A T I O N S 1. Procédé de préparation d'un désinfectant intestinal qui consiste à ensemencer un milieu de culture contenant de l'amidon de mals, une solution d'acide aminé et du carbonate de calcium avec Clostridium butyricum miyairi, permettant ainsi aux bactéries de croître et de former leurs spores dans le milieu, et à préparer le désinfectant. en utilisant les spores résultants de ces bactéries comme composant principal 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de culture se compose de 2 à 3 % d'amidon de mais, de 2 à 3 % de solution d'acide aminé, de 1 à 2 % de carbonate de calcium et de 92 à 95 % d'eau.