Brevet FR2221464A1 — publié le 19741011

L'amidon, polysaccharide de formule empirique (C6H1005)n, est un produit polymere qui se compose essentiellement d'une fraction d'amylose de formule et d'une fraction d'amylopectine de formule Les amylases sont des enzymes qui catalysent l'hydrolyse de l'amidon.Elles sont de deux types, 1 -amylase qui peut hydrolyser à la fois les liaisons -1,4 et -1,6 de l'amylose et de l'amylopectine, respectivement, et peut donc hydrolyser com plètement l'amidon, et la -anylase, cui ne peut hydrolyser que la liaison -1,4 de 'amylose, laissant inchangée la liaison A-1,6 de larylopectine. L'action de l' Ll4-amylase est activée par les ions chlore et a une activité optimale à un pH d'environ 7. Les amylases d'origine animale sont du type amylase. Leur présence a été démontrée dans de nombreux tissus, mais elles sont principalement produites par le pancréas et les glandes salivaires. La fonction de l'amylase présente dans les sécrétions de ces tissus glandulaires est d'aider à la digestion de l'amidon en hydrolysant ou en coupant l'amidon en molécules plus petites qui peuvent ensuite être absorbées et assimilées. Bien que l'on connaisse depuis plus de 100 ans l'existence de l'amylase dans le courant sanguin, on n'a pas établi la source corporelle exacte de cet enzyme dans le sérum normal. Cette source n' est apparemment pas dans le pancréas ni dans les glandes salivaires, car l'ablation de ces glandes n'a qu'un effet négligeable sur les teneurs en amylase du sérum normal. La détermination de l'activité de l'amylase dans les fluides du sang devient de plus en plus importante. On a observé des teneurs élevées en amylase dans le serum sanguin dans un certain nombre d'états pathologiques, mais l'augmentation la plus spectaculaire des teneurs en amylase du sérum a été constatée dans la pancréatite aigüe, où des augmentations à 30 ou 40 fois la teneur normale ne sont pas rares. Dans la pancréatite chronique les augmentations sont modérées, et un nombre notable de malades peuvent en fait présenter des teneurs normales.On a également observé des élévations modérées de l'amylase du sérum chez les malades souffrant d'ulcères peptiques perforés et dans les occlusions intestinales, où l'augmentation de l'amylase est probablement causée par la perte des enzymes à partir du tractus intestinal dans la cavité péritonéale et la réabsorption à partir de cette cavité dans la circulation générale. On voit aussi des augmentations modérées dans les oreillons, dans l'insuffisance rénale et le cancer du pancréas. Les affections hépatobiliaires sont caractérisées par de faibles teneurs en amylase du sérum. Les méthodes classiques de détermination de l'amylase comprennent la méthode amyloclastique, où la diminution de viscosité ou de turbidité d'une suspension d'amidon liquéfiée par un échantillon d'essai contenant de l'amylase est lue comme activité de l'amylase ; et une version modifiée de la méthode saccharogé' nique où on fait incuber un échantillon contenant de l'amylase avec de l'amidon, et où on détermine les sucres réducteurs formés et les enregistre sous forme d'unités Somogyi. Bien que la méthode saccharogénique modifiée de détermination de l'amylase soit considérée comme beaucoup plus précise que. la méthode amyloclastique, cette méthode saccharogénique est fondamentalement très lente, complexe, et oblige à doser un témoin important et variable de sucre réducteur préformé.De plus, l'amidon non hydrolysé crée souvent une turbidité et interfère avec la détermination des sucres réducteurs. Ainsi, il apparaît qu'il existe un réel et sérieux besoin dlun procédé simple, rapide et précis de détermination de l'activité de l'amylase. Un tel procédé perfectionné d'essai de l'activité de l'amylase a récemment été trouvé et est décrit dans la demande de brevet aux Etats-Unis NO 771 354, déposée le 28 octobre 1968.Dans cet essai de l'amylase perfectionné, on fait incuber un produit ou substrat hydrosoluble coloré avec un échantillon relativement petit de fluide contenant une concentration inconnue d'amylase, dans des conditions réglées de temps et de température ; au bout d'un certain temps, on fait précipiter le substrat coloré non digéré et les matières protéiniques éventuellement présentes dans l'échantillon de fluide par addition d'un agent de précipitation à l'acide tannique, alcoolique, à un pH et à une température réglee ; et on mesure la densité optique du liquide surnageant restant qui est transparent, mais à présent coloré, pour déterminer l'activité de l'amylase.La sensibilité améliorée de cette nouvelle méthode de détermination de l'activité de l'amylase provient principalement de l'utilisation d'un substrat hydrosoluble teint, qui est plus facilement hydrolysé par de petites quantités d'amylase. Le substrat hydrosoluble coloré utilisé pour 1' ssai est préparé par couplage, dans une solution alcaline aqueuse, d'un colorant réactif approprié avec un amidon ou une fraction d'amidon appropriés, ce qui donne un produit~d'amidon hydrosoluble coloré. On soumet ensuite le produit obtenu à une filtration sur gel et à un traitement de dialyse pour éliminer tout le colo rant n'ayant pas réagi ; la présence éventuelle de colorant libre dans le substrat interfère sérieusement avec les résultats de l'essai, car la mesure de l'activité de l'amylase dans cet essai s'effectue au moyen de la densité optique. Pour s'assurer que tout le colorant libre est complètement éliminé du substrat coloré au cours de l'opération de purification, on ajoute un agent de précipitation sélectif du substrat coloré aux échantillons de fractions successives de solutions purifiées.On a trouvé qu'un agent de précipitation à l'acide tannique alcoolique, utilisé à un pH et à une température réglés, précipitait tout le substrat hydrosoluble teint : la présence de la couleur due au colorant dans le fluide surnageant restant indique qu'il reste du colorant libre, et que la purification est incomplète. Les propriétés de cet agent de précipitation à l'acide tannique alcoolique sont déterminantes : on peut utiliser des solutions contenant de 0,5% à 2% d'acide tannique dans l'alcool à 50%, tamponnées à un pH de 5,0 à 5,5, et portées à une température re de 200C à 300C. On préfère de beaucoup tamponner une solution alcoolique d'acide tannique constituée de méthanol à 50% contenant 1% d'acide tannique à un pH de 5,35 avec un tampon acide benzoi- que/benzoate de sodium 0,yin et la porter à une température de 250C. Les détails de la préparation et de la purification du substrat hydrolosuble coloré utilisé dans l'essai de l'amylase amélioré sont donnés dans la demande de brevet aux Etats-Unis d'Amérique NO 100 373, déposée le 21 décembre 1970. Bien que la méthode de purification du substrat coloré et de contrôle du procédé de purification décrit dans cette demande se soit révélée efficace, elle comporte certains inconvénients. Par exemple, l'opération de purification par dialyse demande environ une semaine avant que l'on obtienne une solution purifiée du substrat coloré. Dans le procédé de purification par filtration sur gel, l'éluant doit être recueilli par fractions successives et on doit essayer un échantillon de chaque fraction pour être sûr qu'il ne reste pas de colorant libre. I1 est évident que ces opérations sont lentes et coûteuses. Dans la présente invention, on élimine complètement le colorant n'ayant pas réagi des substrats hydrosolubles colorés par un procédé de précipitation multiple, effectué à une température réglée, dans lequel on ajoute à un mélange réactionnel d'un substrat hydrosoluble colore, contenant de 0,14% à 4,5% de sel provenant de la neutralisation, une solution aqueuse d'alcool donnant une concentration finale de 10,5% à 34 d'alcool dans le mélange réactionnel total pour précipiter le substrat coloré ; on élimine le fluide surnageant contenant du sel et du colorant libre, ce qui fournit un précipité de substrat coloré partiellement purifié ; on redissout ce précipité dans une des solutions suivantes : une solution aqueuse, une solution aqueuse de sel donnant jusqu'à 4,5% de sel dans le volume total de la solution de substrat coloré, une solution aqueuse d'alcool donnant jusqu'à 34t d'alcool dans le volume total de la solution de substrat coloré, ou une solution aqueuse contenant moins de 0,14% de sel et moins de 10,5% d'alcool ; et on reprécipite le substrat d'amidon coloré en ajustant la concentration finale de sel à 0,14%- 4,5%, et la concentration finale de l'alcool à 10,5 - 34, Le processus de purification par précipitation/redissolution, que l'on effectue de préférence à 40C, est poursuivi jusqu'à ce que tout le colorant libre ait été éliminé du substrat coloré hydrosoluble. On a trouvé à présent que l'on peut obtenir des substrats hydrosolubles colorés, complètement exempts de colorant n'ayant pas réagi, pour un procédé perfectionné dans lequel on élimine le colorant nf yant pas réagi par un processus de précipitations multiples : or précipite le substrat coloré, on le redissout et 1e reprécipite jusqu'à ce que le liquide surnageant de la dernière précipitation re présente pas de coloration due au colorant. Les produits obtenus par ce procédé conviennent pour lquti- lisation dans le procédé perfectionné d'essai de l'amylase décrit dans la demande de brevet des Etats--Unis d'Amérique NO 771 354, déposée le 28 octobre 1968. Les colorants réactif s utilisables dans l'invention sont bien connus dans la technique de la teinture des textiles cellulosiques et ils peuvent, selon cette technique, appartenir à diverses classes de colorants, T?ar exemple les colorants azol- ques, azoïques à complexe métallique, anthraquinoniques, de phtalocyanine, de dioxazine ou de formcyle, lesquels, en particulier, peuvent également contenir un groupe sulfonique. Ces colorants sont vendus par exemple par Ciba Co., Inc. sous la marque "cIBACRON", par Imperial Chemical Industries Ltd sous la marque "PROCION", par Farbwerke Hoechst AG sous la marque "REMAZOL", par Sandoz sous la marque "DRIMARENE", et par Geigy sous la marque "REACTONE". En général, ces colorants réactifs ont les formules structurales suivantes où R est un chromophore dérivant des diverses classes de colorants comme les structures azoïque , anthraquinonique, formazyle ou phtalocyanine citées et où X est un halogène ou peut être un radical inactif pouvant contenir un groupe solubilisant. Des exemples de ces colorants réactifs sont donnés par exemple dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique NO 2 820 785 ; 2 889 316 2 891 941 ; 2 892 828 ; 2 979 498 ; 3 054 795 ; 3 036 058 3 149 100 ; 3 127 232 etc. Les groupes réactifs de ces colorants contiennent au moins un substituant qui, dans des conditions déterminées, se sépare à l'état d'anion. Le groupe réactif peut se composer, par exemple, du radical d'un halogénure de carbimide cyclique contenant au moins un atome d'halogène mobile lié à un atome de carbone dans le cycle adjacent à un atome d'azote tertiaire du cycle. Le groupe réactif peut être constitué, en particulier, d'un cycle azine de caractère aromatique qui contient au moins deux atomes tertiaire dans le cycle et au moins un atome d'halogène mobile lié au carbone du cycle adjacent à ces atomes d'azote, tel que par exemple le chlore ou le brome; comme exemples de ces groupes réactifs, on peut citer les groupes mono-, di-, ou tri-halo diazinyle ou mono- ou di- halo triazinyle. L'amidon qui convient pour l'utilisation dans 1 'inven- tion peut être obtenu par exemple à partir de la pomme de terre, du tapioca, du mais, du blé, du riz, de la patate douce, du maïs cireux ou de toute autre source pouvant être colorée conformément au procédé de l'invention pour donner le substrat soluble coloré désiré. Les caractéristiques de solubilité de l'amidon de départ peuvent varier dans une large gamme, mais le produit final coloré doit être soluble dans l'eau pour être utilisé dans l'essai suivant l'invention. L'amylose et l'amylopectine sont disponibles dans le commerce sous forme de fractions soigneusement normal sées, obtenues à partir de l'amidon de la manière suivante : on traite à l'autoclave des pâtes d'amidon diluées contenant de 2 à 3% d'amidon.On sature la solution chaude d'amidon par un alcool comme le butanol ou le pentanol, pour précipiter essentiellement l'amylose, la fraction à chaîne droite de l'amidon, qui donne avec l'iode une intense couleur bleue. La masse principale de l'amidon présent, non séparée par ce traitement au butanol, est l'amylopectine ou fraction à chaîne ramifiée de l'amidon qui donne une couleur rouge avec l'iode. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la fraction utilisée est l'amylopectine. Bien qu'il ne soit pas nécessaire que l'amidon de depart présente un degré élevé de solubilité dans l'eau, on a trouvé qu'il est essentiel que le substrat coloré obtenu en vue de l'utilisation dans le mode opératoire d'essai amélioré soit soluble dans lleau. L'utilisation d'un substrat hydrosoluble.coloré donne un essai techniquement supérieur : il est simple et rapide, mais suffisamment sensible pour être precis et sûr. Pour cette raison, bien qu'on puisse faire réagir des amidons insolubles ou relativement insolubles avec un colorant réactif adéquat pour obtenir un produit soluble, le mode de réalisation prefére de l'invention utilise l'amylopectine, fraction soluble de l'amidon, comme produit de départ, l'amylopectine préférée est vendue dans le commerce par la National Starch and Chemical Corporation sous le nom d'Amioca 51-6002. On soulignera à nouveau que, comme ce produit est soluble, il est possible d'utiliser un large choix des colorants réactifs adéquats, en étant sûr d'obtenir un substrat hydrosoluble coloré Cependant, dans le mode de réalisation préféré de l'invention, on utilise le colorant vendu dans le commerce par Geigy sous la marque Rouge REACTONE 2B. La littérature (Ackermann et Dussy, Melliand Textilber. Vol. 42, p. 1167, 1961) indique que ce colorant possède la structure suivante Le substrat hydrosoluble coloré est obtenu conformément à l'invention en couplant l'amidon de départ en solution alcaline avec un colorant réactif approprié, et en éliminant du produit obtenu tout le colorant n'ayant pas réagi.La température et la durée de la réaction, ainsi que le rapport de l'amidon au colorant et la concentration de l'alcali sont des variables reliées entre elles, que l'on peut modifier dans une large mesure en obtenant toujours le substrat soluble désiré de l'invention. Cependant, pour la facilité du travail, on a trouvé qu'il est commode, et par conséquent préférable, d'effectuer la réaction à la température ambiante (d'environ 20"C à environ 300C) pendant environ 18 heures en adoptant un rapport de l'amidon au colorant d'environ 2,5 : 1 à environ 100 : 1, de préférence environ 4 : 1, et des concentrations en alcali d'environ 0,1 à environ 1,5N. On neutralise ensuite l'alcali dans le mélange obtenu par une solution aqueuse d'un acide, par exemple l'acide chlorhydrique aqueux. La structure chimique exacte du substrat soluble coloré de l'invention n'est pas connue, maison pense que, de la même façon que les colorants réactifs se couplent avec la cellulose traitée par l'alcali, les colorants se combinent également aux groupes hydroxyle libres de l'amidon, de l'amylose ou de l'amylopectine utilisés. On consultera par exemple les brevets des Etats Unis d'Amérique NO 1 886 480 ; 3 044 843 ; et 3 029 123. On a attribué à ces nouveaux produits ou substrats la formule empirique (C6H1005)n-D, où n est un grand nombre entier, (C6Hî0O5)n re présente un polymère naturel comme l'amidon, l'amylose ou l'amylopectine, et D est le résidu d'un colorant réactif quelconque. I1 est essentiel que tout le colorant n'ayant pas réagi soit éliminé du mélange réactionnel ci-dessus pour que le substrat coloré obtenu convienne pour l'utilisation dans la détermination de l'activité de l'amylase : la présence de colorant libre dans le substrat interférerait sérieusement avec les résultats d'essai, car la mesure de l'activité de l'amylase dans cet essai se fait-au moyen de la densité optique. Les procédés classiques utilisés dans le domaine du textile pour l'élimination du colorant n'ayant pas réagi des produits colorés, tels que ceux décrits dans le brevet des Etats-Unis d'AmErique NO 3 304 297 mettent en jeu l'utilisation d'alcool absolu.Cependant, on a trouvé que ces procédé avaient un effet défavorable sur la solubilité dans l'eau du substrat coloré purifié obtenu, et ils ont donc été considérés comme inacceptables. On a trouvé à présent, de façon très surprenante, que l'on peut éliminer le colorant n'ayant pas réagi d'un substrat hydrosoluble coloré, par un procédé de précipitation multiple dans lequel la température et les concentrations de l'alcool et du sel sont soigneusement réglés, la solubilité dans l'eau du substrat color ultérieurement purifié reste inchangée. Le mode opératoire implique que l'on règle la température de toutes les réactions tout en ajoutant au mélange réactionnel de substrat coloré non purifié qui contient une certaine concentration de sel résultant de la neutralisation, une solution diluée d'alcool pour avoir une concentration déterminée d'alcool dans le mélange réactionnel total, ce qui provoque la précipitation du substrat coloré.On élimine le fluide surnageant contenant du sel et du colorant libre, et on redissout ensuite le précipité de substrat coloré partiellement purifié dans l'eau ou dans une solution aqueuse contenant du sel et/ou de l'alcool. Selon le solvant utilisé pour redissoudre le précipité, on ajoute des quantités supplémentaires de sel et d'alcool à la solution pour obtenir les concentrations auxquelles le substrat coloré reprécipite. On continue ces opérations de redissolution/reprécipitation à une température réglée jusqu'à ce que le fluide surnageant de la dernière précipitation soit pratiquement exémpt de couleur due au colorant. Comme alcools utilisables dans les opérations ci-dessus, on citera les alcools à 1 à 3 atomes de carbone ; on préfère le méthanol.Parmi les sels adéquats, on peut citer des sels minéraux comme le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le sulfate de sodium, le sulfate de potassium etc... Parmi ceux-ci, on préfère le chlorure de sodium. Pour être sûr que l'on a éliminé tout le colorant libre par ce procédé de précipitation multiple perfectionné, on a trouvé qu'il était particulièrement intéressant d'utiliser le mode opératoire de contrôle de la demande de brevet précédemment citée NO 100 373. On dissout dans l'eau un échantillon du substrat coloré supposé purifié, et on ajoute l'agent de Erécipitation à l'acide tannique alcoolique, comme il est décrit dans la demande NO 100 373. On utilise de préférence comme agent de précipitation une solution alcoolique d'acide tannique constituée de méthanol à 50% contenant 1% d'acide tannique, tamponnée à un pH de 5,35 avec un tampon acide benzoique/benzoate de sodium 0,1 N, et portée à une température de 250C.La présence de couleur due au colorant dans le fluide surnageant de cet échantillon indique qu'il reste du colorant libre, et qu'on doit effectuer encore une fois les opérations de redissolution/reprécipitation, après quoi on contrôle un échantillon d'essai. En pratique, il est habituellement possible, en observant soigneusement le liquide surnageant, de répéter les opérations de précipitation un nombre suffisant de fois de façon que le contrôle de l'échantillon d'essai s'effectue en tant qu'opération finale, assurant une élimination complete du colorant. Comme il a été indiqué précédemment, l'opération de purification par précipitation multiple de l'invention dépend de la température, et par suite, il est nécessaire d'avoir des concentrations déterminées de sel et d'alcool pour les procédures de précipitation et de redissolution à diverses températures. Les concentrations et les températures auxquelles on opère sont déterminantes et doivent être soigneusement réglées. Par exemple, on a trouvé qu'à la température ambiante (que l'on considère normalement comme étant de 230C à 260C), la précipitation du substrat coloré à partir d'un mélange réactionnel contenant de 0,14% à 1,7% de sel, de préférence 0,17% à 0,56%, mieux encore 0,21% de sel du fait de la neutralisation, s'effectuera en ajoutant une quantité suffisante d'alcool pour avoir 25% à 34% d'alcool, de préférence 27% à 32%, mieux encore 30% d'alcool, par rapport au volume total de la solution de substrat coloré.On élimine le fluide surnageant contenant du colorant libre, de l'alcool et du sel, mais le substrat coloré partiellement purifié obtenu peut avoir entrainé de faibles quantités d'alcool et de sel, ainsi que du colorant libre restant. On peut ensuite redissoudre le substrat coloré partiellement purifie dans une des solutions suivantes : l'eau, une solution aqueuse de sel ne donnant pas plus de-1,7% de sel dans le volume total de solution de substrat coloré, une solution aqueuse d'alcool ne donnant pas plus de 34% d'alcool dans la solution totale de substrat coloré, ou une. solution aqueuse contenant du sel et de l'alcool à des concentrations inférieures au minimum nécessaire pour la précipitation, c'est-à-dire moins de 0,14% de sel et moins de 25% d'alcool, dans la solution totale de substrat coloré.On peut alors reprécipiter le substrat a'amidon coloré en ajustant les concentrations du sel et de l'alcool dans la solution de substrat coloré aux pourcentages indiqués ci-dessus pour la réaction initiale de précipitation, c'est-à-dire de 0,14% à 1,7%, de préférence de 0,17% à 0,56%, et mieux encore 0,21% de sel, et de 25% à 34%, de préférence de 27% à 32%, et mieux encore 30% d'alcool par rapport au volume total de la solution.Ainsi, le processus de redissolution/reprécipitation peut être répété jusqu'à ce que le liquide surnageant soit exempt de coloration due au colorant. I1 est également- essentiel, dans le cas des processus de purification effectués à la température ambiante, que la solution d'alcool ajoutée soit à une concentration de 80% ou moins, et que cette solution soit ajoutée très lentement au mélange réactionnel d'amidon coloré. On a trouvé que l'addition rapide d'alcool absolu ou d'une solution de concentration élevée, tout en fournissant les concentrations finales nécessaires, donnait-un précipitéen boule que l'on ne peut plus redissoudre en vue de sa purification ultérieure. Bien que le procédé de précipitation multiple puisse s'effectuer à la température ambiante, il est très souhaitable d'opérer à une température inférieure, c'est-à-dire à 40C, car à cette température, on peut utiliser de plus faibles concentrations d'alcool. A 40C, pour précipiter le substrat coloré, les concentrations d'alcool nécessaires sur la base du volume total du mélange réactionnel de substrat coloré contenant de 0,14 à 4,5% de sel, de préférence de 0,34% à 1,04%, mieux encore 0,61% de sel, sont de 10,5% à 21%, de préférence de 11,5 à 18%, -et mieux encore de 14%. Ensuite, on peut redissoudre le substrat coloré précipité partiellement purifié dans une des solutions suivantes l'eau, une solution aqueuse de sel ne donnant pas plus de 4,58 de sel dans le volume total de solution de substrat coloré, une solution aqueuse d'alcool ne donnant pas plus de 21% d'alcool dans le volume total de solution de substrat coloré, ou une solution aqueuse contenant du sel et de l'alcool à des concentrations inférieures au minimum nécessaire pour la précipitation, c'est-a- dire moins de 0,14% de sel et moins de 10,5% d'alcool, dans la solution totale de substrat coloré.La reprécipitation du substrat coloré s'effectue en ajustant les concentrations de sel et d'alcool aux pourcentages indiqués précédemment pour la précipitation initiale, c'est-à-dire 0,14% à 4,5%, de préférence 0,34% à 1,04%, mieux encore 0,61% de sel, et 10,5% à 21%, de préférence 11,5% à 18% et mieux encore 14% d'alcool par rapport au volume total de la solution. A 40C, il est essentiel que la solution d'alcool ajoutée soit relativement diluée, par exemple 40% ou mieux, et que cette solution soit ajoutée très lentement à l'amidon ou à la solution colorés pour conserver les caractéristiques de solubilité du substrat coloré. Pour des températures de travail différentes de celles indiquées ci-dessus, on peut évidemment déterminer à partir des paramètres donnés d'autres concentrations efficaces du sel et de 1 'alcool. Le substrat hydrosoluble coloré purifié préparé conformément au procédé de l'invention convient pour l'utilisation dans l'essai amélioré de l'amylase décrit dans la demande-de brevet de NO 771 354 précitée. Selon cette demande, on doit tamponner une solution aqueuse du substrat coloré purifié à un pH d'environ 6,5 à environ 7,8 avec un agent tampon approprié à l'utilisation dans l'essai de l'amylase. On préfère un système tampon au phosphate dipotassique anhydre 0,-1M et au phosphate monopotassique 0,1M, qui maintient un pH d'environ 7. I1 faut- aussi de petites quantités d'un agent fournissant des ions chlore pour activer l'amylase au cours de l'essai : une solution aqueuse diluée de chlorure de sodium donnant une concentration d'environ 0,005 molaire à environ 0,05 molaire dans le milieu d'essai final s'est révélée efficace. Les milieux d'essai tels qu'ils sont décrits ci-desus peuvent être stockés tels quels, de préférence aux températures des réfrigérateurs, ou lyophilisés pour leur conservation, et reconstitués avec de l'eau au moment où on doit effectuer l'essai. On peut aussi lyophiliser le substrat coloré tel qu'il est préparé, et ajouter l'agent tampon et le produit fournissant les ions chlore juste avant l'utilisation dans un essai. Lorsqu'on effectue l'essai d'activité de l'amylase, on fait incuber d'environ 0,5 à environ 2 ml d'uné solution aqueuse contenant environ 1% de substrat soluble coloré, tamponné à un pH d'environ 6,5 à environ 7,8 et contenant suffisamment d'ion chlore pour l'activation de l'amylase, avec une petite quantité (d'environ 0,1 à environ 0,2 ml) de l'échantillon de fluide dont on doit déterminer l'activité. L'incubation s'effectue pendant environ 10 minutes à une tempérarure d'environ 370C.A la fin de la période d'incubation, on élimine tout le substrat coloré non digéré et toute matière protéinique éventuellement présente dans l'échantillon fluide essayé en utilisant, comme agent de précipitation, une solution à 1% d'acide tannique dans du méthanol à environ 50%, tamponnée à un pH d'environ 5,35, et portée à une tem péràture d'environ 250C. On élimine le précipité formé par centrifugation. On jette le résidu séparé et on détermine la densité optique du fluide surnageant transparent qui reste, à l'absorption maximale pour le colorant particulier utilisé. La densité optique (pouvoir d'absorption) est une fonction linéaire de la concentration de l'amylase dans les échantillons de fluide examinés, et avec un étalonnage adéquat, on peut lire directement la concentration en amylase. On effectue un témoin dans lequel on ajoute l'agent de précipitation avant l'échantillon d'enzyme. On soustrait la densité optique du témoin de la densité optique de l'échantillon pour éliminer l'effet des réactifs d'essai sur les valeurs obtenues pour les produits de l'hydrolyse enzymatique. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention EXEMPLE 1 Préparation d'amylopectine colorée. Méthode de la précipitation multiple à 40C. Dissolution du précipité dans d méthanol. On dissout 40 grammes d'amylopectine (AMIOCA STARCH 51-6002) dans 1000 ml d'eau distillée et on agite. On ajoute 100 ml d'eau distillée et on agite. On aJoute 100 ml d'une solution aqueuse à 10% de rouge REACTON 2B de Geigy, puis 100 ml d'une solution de NaOH 2,5 N, et on agite le milieu réactionnel jusqu'à ce que sa viscosité devienne trop forte pour qu'on puisse agiter. On recouvre le milieu réactionnel et le laisse reposer à la température ambiante (23 à 260C) pendant 18 heures. On ajoute de l'acide chlorhydrique 1 N (environ 250 ml) en agitant pour neutraliser le mélange réactionnel (pH 7) puis on dilue par de l'eau distillée à un volume de 1500 ml et mélange soigneusement.On élimine tout le colorant n'ayant pas reagi de ce mélange réactionnel en abaissant la température de toutes les solutions à 4"C et en effectuant toutes les réactions à cette température : à 1000 ml d'amidon coloré on ajoute lentement, en agitant énergiquement, 1000 ml de méthanol à 28% ; on laisse reposer (5 minutes) et on décante le liquide surnageant ; on ajoute au précipité obtenu, en agitant, 1003 ml de méthanol à 14% ; après dissolution totale du précipité, on reprécipite le substrat par 35 ml de chlorure de sodium 3,0 M ; on répète les opérations de reprécipitation et de redissolution au moins deux fois.On contrôle la présence éventuelle de colorant libre restant en ajoutant un agent de précipitation à l'acide tannique alcoolique spécialement préparé à une solution aqueuse du substrat coloré purifié et en déterminant le pouvoir d'absorption du fluide surnageant après que le substrat coloré a été précipité. L'agent-de précipitation se prépare à partir d'une solution d'acide tannique à 1% dans du méthanol à 50%, tamponnée par un tampon à l'acide benzoique/benzoate de sodium 0,1 M à un pH de 5,35 et portée à une température de 250C. On dissout le substrat coloré purifié provenant de la dernière précipitation dans 1000 ml d'eau distillée. On calcule la concentration relative du substrat coloré dans un échantillon de 1 ml de cette solution pour déterminer la quantité de solution à faire réagir avec 5 ml de l'agent de précipitation préparé ci-dessus.Ceci s'effectue en diluant l'échantillon de 1 ml à 100 ml avec de l'eau distillée, en faisant une lecture de densité optique par rapport à l'eau à 540 nanomètres, en comparant avec une solution normalisée connue, et en calculant la quantité nécessaire pour la réaction avec l'agent de précipitation. La quantité calculée, qui tombe ordinairement entre 2 et 3 ml, est prélevée dans la-solution aqueuse de substrat colorée et diluée avec de l'eau distillée à un volume de 10 ml. On ajoute à 1 ml de cette dernière solution 5 ml de l'agent de précipitation -à l'acide tannique alcoolique, dans un tube à centrifuger, et on mélange ; on ajoute ensuite 0,2 ml d'une solution protéinique (à environ 7%) au tube à centrifuger pendant 10 minutes, et on lit le pouvoir d'absorption du fluide surnageant à 540 nanomètres.Si le pouvoir d'absorption est supérieur à 0,020, on doit poursuivre la purification du substrat coloré pour éliminer le colorant libre par les procédures de reprécipitation et de redissolution précédemment décrites jusqu'à obtention d'un pouvoir d'absorption de 0,020. Lorsque le substrat coloré a été completement purifié, on ajuste la concentration du substrat coloré de telle sorte que le pouvoir d'absorption de 1 ml de solution aqueuse dilué à 100 ml par de l'eau distillée donne une valeur de 0,140 à 540 nanomètres. On ajuste le pH du substrat coloré à 7,0 avec un tampon au phosphate 0,1 M. La concentration du chlorure de sodium dans la solution finale (au moins 0,005 M) est suffisante pour l'essai de l'amylase. On peut utiliser cette solution finale telle quelle dans l'essai décrit dans l'exemple 4 ci-dessous ou la lyophiliser et la reconstituer au moment de son utilisation. EXEMPLE II Méthode de la précipitation multiple à 40C. DIssolution du précipité dans l'eau. On prépare l'amylopectine colorée comme il est décrit dans l'exemple I. On élimine tout le colorant n'ayant pas réagi du mélange réactionnel en amenant toutes les solutions à 40C et en effectuant toutes les opérations à cette température ; à 1000 ml d'amidon coloré, on ajoute lentement, en agitant énergiquement 1000 ml de méthanol à 28% ; on laisse déposer (5 minutes) et on décante le liquide surnageant ; on ajoute au précipité obtenu, .en agitant, 1000 ml d'eau ; après dissolution du précipité, on repré cipite le substrat par 1000 mlde méthanol à 28% contenant 0,61% de NaCl ; on répète au moins deux fois les opérations de redissolut ion et de reprécipitation ; on contrôle la solution de substrat coloré purifié comme dans l'exemple I pour s'assurer que tout le colorant libre a été éliminé.On prépare la solution finale du substrat coloré comme dans l'exemple I. EXEMPLE III Méthode de la pre~ pitation multiple à température ambiante. Dis solution du précipité dans l'eau On prépare l'amylopectine colorée comme il est décrit dans l'exemple I. On élimine du mélange réactionnel tout le colorant n'ayant pas réagi en effectuant toutes les opérations à la température ambiante : à 1000 ml d'amidon colore on ajoute lentement, en agitant énergiquement, 1000 ml de méthanol à 60% ; on laisse reposer 5 minutes et on décante le liquide surnageant ; au précipité obtenu, on ajoute en agitant 1000 ml d'eau ; après dissolution du précipité, on reprécipite le substrat par 1000 ml de méthanol à 60% contenant 0,21% de chlorure de sodium ; on répète les opérations de redissolution et de reprêcipitation au moins deux fois ; on contrôle la solution de substrat coloré purifié comme dans l'exemple I pour s'assurer que tout le colorant libre a été éliminé. On prépare la solution finale du substrat coloré comme dans l'exemple I. EXEMPLE IV On fait incuber 0,2 ml d'un échantillon de sérum sanguin avec 1 ml du substrat coloré soluble tamponné préparé suivant l'exemple I pendant 10 minutes à 370C. A la fin de cette période d'incubation, on porte à la température de 250C 5 ml d'une solution d'acide tannique à 1% dans le méthanol à 50%, tam ponnée avec un tampon acide benzolque/benzoate de sodium 0,1 M à un pH de 5,35, et l'ajoute au milieu d'essai. On élimine par centrifugation le précipité obtenu. On détermine ensuite la densité optique de la solution surnageante à une longueur d'onde de 540 nanomètres. On effectue un essai témoin en ajoutant l'agent de précipitation d'acide tannique alcoolique tamponné avant la source d'enzyme. On soustrait la densité optique de ce témoin de la densité optique de l'échantillon de composition inconnue. On soumet également à l'essai, à titre de standard de référence, du sérum contenant une concentration connue d'amylase. Comme la quantité de fractions hydrolytiques colorées, solubles dans l'alcool, formées par hydrolyse enzymatique du substrat par l'amylase présente est proportionnelle à la concentration de l'enzyme, on peut facilement calculer la quantité d'amylase présente dans l'echantil- lon inconnu. EXEMPLE V On prépare un substrat soluble à partir de l'amylose et d'un colorant réactif, d'une manière analogue au mode opé ratoire de l'exemple I. On utilise ce produit dans le mode opératoire d'essai de l'exemple IV, et les résultats obtenus sont également satisfaisants. EXEMPLE VI On prépare un substrat soluble d'amidon de maÏs coloré et d'un colorant réactif suivant le mode opératoire de l'exemple I, et l'utilise dans le mode opératoire d'essai de l'exemple IV. Les résultats obtenus sont également satisfaisants. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparatiOn d'un produit ou substrat. hydrosoluble coloré, en particulier pour l'essai de l'aonylase,de formule (C6H10O5) n - D Où n est un grand no;-lbre entier, (C0H10O5) il est un polysaccharide choisi parmi l'amidon, l'amylose et l'amylopectine, et D est le résidu d'un colorant réactif, suivant lequel on fait incuber une solution alcaline du polysaccharide avec le colorant réactif ; on neutralise le mélange réactionnel, et on élimine tout le colorant n'ayant pas réagi par un procédé de précipitation multiple, carac- térisé en ce que le procédé de précipitation multiple s'effectue à une température allant d'environ 4 C à environ 2(3CC et on précipite le substrat coloré, le redissout et le reprécipite Jlsoutà ce que le fluide surnageant de la dernière précipitation soit exempt de toute coloration due au colorant, grâce à quoi le substrat hydrosoluble coloré obtenu ne contient que du colorant réactif chimiquement lié. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que (1) on fait incuber une solution alcaline du polysaccharie avec un colorant réactif (2) on neutralise le mélange réactionnel de substrat coloré de (1) pour avoir une concentration en sel d'environ 0,14- à environ 4,5% sur la base du volune total du mélange réactionnel (3) on ajoute au mélange réactionnel de (2) une solution aqueuse d'alcool donnant d'environ 10,5 à environ 34% d'alcool, par rapport au volume total du mélange réactionnel, pour précipiter le substrat coloré (4) on sépare le précipité de substrat coloré partiellement purifié de (3) du liquide surnageant contenant du sel, de l'alcool et du colorant libre (5) on dissout le substrat coloré partiellement purifié de (4) dans une solution choisie parmi (a) l'eau, (b) une solution aqueuse de sel donnant jusqu'à environ 4,5% de sel dans le volume total de solution de substrat coloré, (c) une solution aqueuse d'alcool donnant jusqu'à environ 34% d'alcool dans le volume total de solution de- substrat coloré, et (d) une solution aqueuse contenant moins d'environ 0,148 de sel et-moins d'environ 10,5% d'alcool dans le volume total de solution de substrat colo ré (6) on ajuste la concentration du sel dans la- solution de substrat coloré de (5) à une valeur d'environ 0,146 à environ 4,5% et la concentration de l'alcool à une valeur d'environ 1ou58 à environ 34%, par rapport au volume total de la soluçion de substrat coloré, pour reprécipiter le substrat coloré ; et (7) on répète les opérations (5) et (6) si nécessaire jusqu'à ce que le fluide surnageant final de l'opéra ion de repré- cipitation soit exempt de toute coloration due au colorant. 3. Procéde suivant la revendication 2 , caractérise en ce qu'on effectue les stades (3), (4), (5), (6) et (7) à environ 4oC. 4. Procédé suivant la revendication 3 , caractérisé en ce que (1) on fait incuber une solution alcaline de polysacchar ides avec un colorant réactif (2) on neutralise le mélange réactionnel de substrat coloré de (1) pour avoir une concentration en sel d'environ 0,14 à environ 4,5% par rapport au volume total dumélange réactionnel; (3) on ajoute au mélange réactionnel de (2) une solution aqueuse alcool donnant d'environ 10,5% à environ 21% d'alcool, par rapport au volume total du mélange réactionnel, pour précipiter le substrat coloré (4) on sépare le précipité de substrat coloré partiellement purifié de (3) du lio,uide surnageant contenant du sel, de l'alcool et du colorant libre ;; (5) on redissout le substrat coloré partiellement purifié de (4) dans une solution choisie parmi (a) l'eau, (b) une solution aqueuse de sel donnant jusqu'à environ 4,5% de sel dans le volume total de solution de substrat coloré, (c) une solution aqueuse d'alcool donnant jusqu'à-environ 21% d'alcool dans le volume total de la solution de substrat coloré, et (d) une solution aqueuse contenant moins d'environ 0,14% de sel et moins d'environ 10,5% d'alcool dans le volume total de la solution de substrat coloré ;; (6) on ajuste la concentration en sel dans la solution dc substrat coloré de (5) à une valeur d'environ 0,14% à environ 4,5% de sel, et la coneen- tration en alcool à une valeur d'environ 10,5E à environ 21t, par rapport au v lune total de la solution de substrat coloré, pour reprécipi'er le substrat oelo- ré, et (7) on répète les opérations (5) et (6) si nécessaire jusqu'à ce que le fluide surnageant final de l'opération de reprécipitation soit exempt de toute coloration due au colorant. 5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que (1) on fait incuber une solution alcaline du polysaccllaride avec un colorant réactif ; (2) on neutralise le mélange réactionnel de substrat coloré de (1) pour avoir une concentration en sel d'environ 0,34% à environ 1049o par rapport au volume total du mélange réactionnel ; (3) on ajoute au mélange réactionnel de (2) une solution aqueuse d'alcool donnant environ 11,5% à environ 18% d'alcool, par rapport au voliez total du mélange réactionnel, pour précipiter le substrat coloré (4) on sépare le substrat coloré partiellement purifié de (3) du fluide surnageant contenant du sel, de l'alcool et du colorant libre;; (5) on redissout le substrat oeloré partiellement purifié de (4) dans une solution choisie parmi (a) l'eau, (b) une solution aqueuse de sel donnant jusqu'à environ 1,04% de sel dans le volume total de solution de substrat coloré, (c)une solution aqueuse d'alcooldrnant jusqu'à environ 18t d'alcool dans le volume total de solution de substrat coloré, et (d) une solution aqueuse contenant moins d'environ 0,14% de sel et noins d'environ 10,5% d'alcool dans le volume total de solution de substrat coloré (6) on ajuste la concentration en sel dans la solution de substrat coloré de (5) à une valeur d'environ 0,34% à environ 1,04% de sel, et la concentration de l'alcool à une valeur d'environ 11,5% à environ 18%, par rapport au volume total de solution de substrat coloré, pour reprécipiter le substrat teint ; et (7) on répète les opérations (5) et (6) si nécessaire jusqu'à ce que le fluide surnageant de l'opération de reprécipitation soit exempt de toute coloration due au colorant. 6. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que (1) on fait incuber une solution alcaline du polysaccharide avec un colorant réactif ; (2) on neutralise le mélange réactionnel de substrat coloré de (1) pour avoir une concentration en sel de 0,61e par rapport au volume total du mélange réactionnel (3) on ajoute au mélange réactionnel de (2) une solution aqueuse d'alcool donnant environ 14% d'alcool (4) on sépare le précipité de substrat coloré partiellement purifié de (3) du fluide surnageant contenant du sel, de l'alcool et du colorant libre ;; (5) on redissout le substrat coloré partiellement purifié de (4) dans une solution choisie parmi (a) liteau, (b) une solution aqueuse de sel donnant jusqu a environ 0,61% de- sel dans le volume total de solution de substrat coloré, (c) une solution aqueuse d'alcool donnant jusqu'à 14% d'alcool dans le volume total de la solution de substrat coloré, et (d) une solution aqueuse contenant moins d'environ 0,14% de sel et moins d'environ 10,5% d'alcool dans le volume total de solution de substrat coloré (6) on ajuste la concentration en sel dans la solution de substrat coloré de (5) à environ 0,61% et la concentration de l'alcool à environ 14 par rapport au volume total de solution de substrat coloré, pour reprécipiter le substrat coloré ; et (7) on répète les opérations (5) et (6) si nécessaire, jusqu'à ce que le fluide surnageant final provenant de l'opera- tion de reprécipitation soit exempt de toute coloration due au colorant. 7. Procédé suivant la revendication 5 , caractérisé en ce que le polysaccharide est 1'amylopectine, et le colorant réactif 8. Procédé suivant la revendication 2 , caractérisé en ce que les opérations 3, 4, 5, 6 et 7 sont effectuées à une température d'environ 23"C à environ 260C. 9. Procédé suivant la revendication , caractérisé en ce que (1) on fait incuber une solution alcaline du polysaccharide avec un colorant réactif (2) on neutralise le mélange réactionnel de substrat coloré de (1) pour avoir une concentration en sel d'environ 0,14% à environ 1,7, par rapport au volume total du mélange réactionnel (3) on ajoute au mélange réactionnel de (2) une solution aqueuse d'alcool qui donne d'environ 25% à environ 348 d'alcool, par rapport au volume total du mélange réactionnel, pour précipiter le substrat coloré (4) on sépare le précipité de substrat coloré partiellement purifié de (3) du fluide surnageant contenant du sel, de l'alcool et du colorant libre (5) on redissout le substrat coloré partiellement pu rifié de (4) dans une solution choisie parmi (a) l'eau, (b) une solution aqueuse de sel donnant jusqu'à environ 1,7% de sel dans le volume total de solution de substrat coloré, (c) une solution aqueuse d'alcool donnant jusqu'à environ 34% d'alcool dans le volume total de la solution de substrat coloré, et (d) une solution aqueuse contenant moins d'environ 0,14% de sel et moins d'environ 25% d'alcool dans le volume total de solution de substrat coloré (6) on ajuste la concentration du sel dans la solution de substrat coloré de (5) à une valeur d'environ 0,14% à environ 1,7%, et la concentration de l'alcool à une valeur d'environ 25 à environ 34%, par rapport au volume total de solution de substrat coloré, pour reprécipiter le substrat coloré ; et (7) on répète les opérations (5) et (6) si nécessaire, jusqu'à ce que le fluide surnageant final de l'opération de reprécipitation soit exempt de toute coloration due au colorant. 10. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé en ce que (1) on fait incuber une solution alcaline du polysaccharide avec un colorant réactif ; (2) on neutralise le mélange réactionnel de substrat coloré de (1) pour avoir une concentration en sel d'environ 0,17% à environ 0,56%, par rapport au volume total du mélange réaction nel ; (3) on ajoute au mélange réactionnel de (2) une solution aqueuse d'alcool donnant d'environ 27% à environ 32 d'al- cool, par rapport au volume total du mélange réactionnel, pour précipiter le substrat coloré (4) on sépare le précipité de substrat coloré partiellement purifié de (3) du fluide surnageant contenant du sel, de l'alcool et du colorant libre ;; (5) on redissout le substrat coloré partiellement pu rifié de (4) dans une solution choisie parmi (a) l'eau, (b) une solution aqueuse de sel donnant jusqu'à environ 0,56% de sel dans le volume total de la solution de substrat coloré, (c) une solution aqueuse d'alcool donnant jusqu'à environ 32t d'alcooi dans le volume total de la solution de substrat coloré, et (d) une solution aqueuse contenant moins d'environ 0,14a de sel et moins d'environ 25% d'alcool dans le volume total de solution de substrat coloré;; (6) on ajuste la concentration en sel dans la solution de substrat coloré de (5) à une valeur d'environ 0,17% à environ 0,56% et la concentration de l'alcool à une valeur d'environ 27% à environ 32% par rapport au volume total de la solution de substrat coloré, pour reprécipiter le substrat coloré ; et (7) on répète si nécessaire les opérations (5) et (6), jusqu' à ce que le fluide final surnageant de l'opération de reprécipitation soit exempt de toute coloration due au colorant 11.Procédé suivant la revendication g , caractérisé en ce que :: (1) on fait incuber une solution alcaline du polysaccharide avec un colorant réactif (2) on neutralise le mélange réactionnel de substrat coloré de (1) pour avoir une concentration en sel d'environ 0,21%, par rapport au volume total du mélange réactionnel (3) on ajoute au mélange réactionnel de (2) une solution aqueuse d'alcool donnant environ 30% alcool par rapport au volume total du mélange réactionnel, pour précipiter le substrat coloré ; (4) on sépare le précipité de substrat coloré partiellement purifié de (3) du fluide surnageant contenant du sel, de l'alcool et du colorant libre ;; (5) on redissout le substrat coloré partiellement puri fie de (4) dans une solution choisie parmi (a) 11 eau, (b) une solution aqueuse de sel donnant jusqu'à environ 0,21w de sel dans le volume total de solution de substrat coloré, (c) une solution aqueuse d'alcool donnant jusqu'à 30% d'alcool dans le volume total de solution de substrat coloré ; et (d) une solution aqueuse contenant moins d'environ 0,14% de sel et moins d'environ 2590 d'alcool dans le volume total de solution de substrat coloré (6) on ajuste la concentration en sel dans la solution de substrat coloré de (5) à environ 0,21 et la concentration en alcool à environ 30% par rapport au volume total de solution de substrat coloré, pour reprécipiter le substrat coloré, et (7) on répète les opérations (5) et (6) si nécessaire, jusqu'à ce que le fluide surnageant final de l'opération de reprécipitation soit exempt de toute coloration due au colorant. 12. Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que le polysaccharide est l'amylopectine, et le colorant réactif a pour formule :