Brevet FR2238974A1 — publié le 19750221

La présente invention concerne un procedé de comptage de microparticules dans un liquide par itétude microscopique diun échantillon préparé de ce liquide, et un appareil pour mettre en oeuvre ce procédé. Dans un tel échantillon, les microparticules å compter, par exemple des bactéries, des cellules de tissus, etc., sont teintes avec un colorant de manière à distinguer ces particules de leur environnement, grâce à leur couleur ou, quand on utilise un colorant fluorescent, grâce à leur fluorescence. Dans un procédé connu, on prélève une quantité appropriée du liquide préparé, par exemple 10 microlitres. Cette quantité de liquide est répartie en une couche uniforme entre un porte-objet et un couvre-objet de microscope. En général, cette couche de liquide a une épaisseur de l'ordre 2 de 10 à 20 microns et l'échantillon couvre ainsi une aire de 500 à 100 mm On fait passer, à l'aide de la platine du microscope, l'échantillon d'un mouvement discontinu au-dessous de l'objectif et on compte dans un certain nombre de champs visuels, par exemple 20 à 25, le nombre de microparticules. 2 Chaque champ visuel couvrant environ 0,5 mm , on procède ainsi au comptage pour au maximum 2 ou 3% de la totalité deslO microlitres de liquide prélevés. La répartition des particules est, dans la plupart des cas, très peu satisfaisante et ce procédé est par conséquent entaché d'une forte erreur relative qui est en fait estimée à 20 7.. I1 est par ailleurs évident que ce comptage manuel-nécessite beaucoup d'attention de la personne qui y procède. Une analyse de ce type connu prend environ 5 mn et on peut donc dire qu'elle est assez longue. Par conséquent, la présente invention a pour objet un procédé de comptage de microparticules dans un liquide par examen au microscope d'un échant.llon de ce liquide, qui est plus rapide et plus précis que le procédé connu. Cet objet a été atteint par un procédé dans lequel l'échantillon liquide est appliqué à l'aide d'une seringue graduée sur une bande mobile avançant à vitesse constante et, ensuite, on fait passer la pellicule liquide déposée sur la bande mobile à travers le champ utile d'un objectif de microscope raccordé à un appareil de comptage automatique des microparticules. Ce procédé donne,gr3ce au comptage automatique, la possibilité d'effectuer le comptage de la totalité de l'échantillon de 10 microlitres en 30 à 60 secondes Par conséquent, toutes les microparticules contenues dans l'échantillon prélevé, de 10 microlitres par exemple, ont été comptées en moins d'un cinquième du temps précédemment nécessaire pour cette analyse ; de plus, le comptage intéresse 50 fois la quantité précédente et le pourcentage d'erreur est de 3 à 5 7c, à comparer aux 20arc du procédé déjà connu. Avec ce procédé, on peut opérer avantageusement par fluorescence. Si l'on a recours au comptage automatique, on observe qu'il est particulièrement commode d'utiliser un colorant fluorescent et il est ainsi possible d'utiliser un appareil avec une source de lumière associée à des filtres tels que les particules seront exposées à une lumière de longueur d'onde inférieure à celle de la lumère rayonnée par le colorant fluorescent, appareil dans lequel la lumière rayonnée est envoyée à travers des filtres sur un compteur automatique. Un appareil convenant particulièrement bien pour la mise en oeuvre de ce procédé comprend un dispositif d'avance constitué par une bande sans fin, un dispositif pour déposer les échantillons de liquide sur cette bande, un objectif de microscope ou analogue et un dispositif de nettoyage, tous disposés successivement dans la direction de déplacement du dispositif d'avance, à proximité immédiate de son trajet. Dans cet appareil, la bande d'avance se déplace continûment à une vitesse constante alors que les nouveaux échantillons à analyser sont mis en place et que les échantillons déjà analysés sont éloignés efficacement de la bande avant qu'elle ne passe à nouveau. Dans une réalisation préférée de l'invention, l'organe d'avance est un disque dont la surface cylindrique définit le trajet de la bande. D'autres objets et avantages de la présente invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre d'un exemple de réalisation et en se référant au dessin annexé dans lequel la figure unique représente schématiquement un appareil utilisable pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. L'échantillon liquide contenant les microparticules est préparé à l'aide d'un appareil de dilution représenté sur la droite de la figure et comprenant deux seringues graduées 1 et 2. La seringue 1 mesure la quantité choisie d'échantillon à prélever pour éschantillonnage dans un récipient 3, le liquide étant aspiré de ce récipient 3 à l'aide d'une pipette 4 et introduit da-ns une chambre de mélange 5. Le diluant conservé dans le récipient 6 est mesuré par la seringue 2 et,après manoeuvre du robinet 7 qui relie les seringues 1 et 2, introduit dans la chambre de mélange 5 dans laquelle il est mélangé avec le liquide d'échantillonnage.Au cours d'une phase quelconque de l'opération de dilution ou éventuellement dans la chambre de mélange, on ajoute un colorant fluorescent à l'échantillon ainsi préparé et il se fixe sur is cellules des microparticules. Le liquide est aspiré de la chambre de mélange 5 à travers un robinet 8 dans une seringue graduée 9 dont le piston, après fermeture du robinet 8, fait sortir par pression l'échantillon liquide de manière à l'appliquer sur le bord d'un disque de verre tournant 10. Le débit de la seringue graduée 9 et la vitesse de rotation du disque de verre 10 sont ajustés de manière à développer une pellicule d'épaisseur convenable sur la surface latérale du disque. La pellicule de liquide doit avoir de préférence 10 à 20 microns d'épaisseur et 1,5 mm de largeur. Pendant la rotation continue du disque de verre, la pellicule liquide passe à travers le champ utile de l'objectif Il, à travers lequel la lumière émise par une source 12 atteint la pellicule liquide. La lumière provenant de la source 2 traverse, au cours de son trajet aboutissant à l'objectif 11, un filtre d'excitation 13 qui laisse passer seulement de la lumière de longueur d'onde comprise entre 4000 et 5000 , et un miroir dichrot- que 14 qui réfléchit la lumière dans cette bande de longueurs d'onde.La lumière traverse ensuite l'objectif 11 et rencontre la pellicule liquide sur le disque de verre 10 où elle excite le colorant fluorescent lié aux microparticules, qui émettent ainsi de la lumière d'énergie inférieure, par quantum, à celle dela lumière excitatrice et correspond à des longueurs d'ondes égales ou supérieures à 5300 A. La lumière émise par fluorescence traverse l'objectif 11 dans le sens opposé à celui due la lumière excitatrice etrencontre le miroir dichrotque 14. Du fait de sa longueur d'onde plus grande, la lumière émise traverse directement le miroir 14 sans être réfléchie et ensuite un ensemble de filtres d'arret 15 et un oculaire 16 et peut ensuite être soumise à une détection électro-optique. Après être passée dans le champ utile de l'objectif 11, la pellicule liquide sur le disque de verre est enlevée par un dispositif de nettoyage comprenant deux gicleurs 17 et 18 qui projettent un détersif liquide pulvérisé sur le bord inférieur de ce disque de verre puis étalée à l'aide d'une brosse tournante 19 en contact avec le bord du disque de verre entre les gicleurs 17 et 18. I1 y a après le gicleur 18, dans le sens de rotation du disque de verre indiqué par une flèche, un disque 20 qui, grâce à un organe 21 d'aspiration, enlève le détersif liquide du disque qui est ensuite séché et est ainsi pret à recevoir l'échantillon suivant. Bien entendu la description n'est pas limitative et l'homme de l'art pourra y apporter des modifications sans sortir pour cela du domaine de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé de comptage de microparticules dans un liquide par examen au microscope d'un échantillon préparé de ce liquide, caractérisé en ce que lléchantillon liquide est appliqué par une seringue graduée sur une bande mobile avançant è vitesse constante, après quoi la pellicule liquide déposée sur la bande mobile passe à travers le champ utile d'un objectif raccordé à un appareil de comptage automatique des microparticules. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une technique de fluorescence. 3. Appareil destiné à la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il comprend un dispositif d'avance formant une bande mobile sans fin et en ce qu'il comprend en outre, successivement dans le sens de déplacement dudit dispositif d'avance et àproximité immédiate de son trajet, un dispositif d'application de l'échantillon liquide, un objectif de microscope ou analogue, et un appareil de nettoyage. 4. Appareil selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'organe d'avance est constitué par la surface latérale d'un disque cylindrique qui constitue la bande mobile.