Brevet FR2205571A1 — publié le 19740531

L'invention est relative à l'établissement d'un essai pour le diagnostic sérologique de maladies virales ; et elle concerne, plus particulièrement, un procédé pour la préparation de réactifs utilisables en vue de la mise en oeuvre du susdit essai, ainsi qu'un mode opératoire pour la mise en oeuvre de cet essai. L'est sai en question est utilisable pour diagnostiquer des infections virales, y compris oreillons, grippe, rubéole, celles des formes d'encéphalomyélite connues sous les dénominations WEE, EEE et VEE, encéphalite de St-Louis et J.B., polyomyélite, herpès et d'autres encore. Trois principaux essais sérologiques ont été utilisés jusqu'à présent pour le diagnostic de maladies virales. Ce sont les essais de fixation de complément, d'hémagglutination-inhibition (dénommé HI), et de neutralisation de virus. Mais ces essais présentent de nombreux inconvénients. Ils sont difficiles à mettre en oeuvre, et exigent un personnel hautement spécialisé. La plupart des réactifs sont coûteux, instables et difficiles à préparer. Les épreuves essais nécessitent l'utilisation d'un équipement coûteux et exigent beaucoup de temps (en fait, il doit s'écouler plusieurs heures avant que l'on connaisse les résultats de l'essai). Pour ces raisons, ils ne peuvent être effectués que par des laboratoires hautement spécialisés et très bien équipés pour la virologie. Un but essentiel de l'invention est de réaliser un essai pour le diagnostic de maladies virales grâce à l'utilisation de réactifs qui soient plus sensibles et plus spécifiques à l'égard de réactions virales que ceux utilisés jusqu'à présent, et qui, par conséquent, fonctionnent rapidement pour déceler la présence d'anticorps spécifiques dans le sang du patient. Un autre but de l'invention est de réaliser un tel essai qui puisse être mis en oeuvre si rapidement que l'on soit en possession des résultats après un laps de temps de seulement quelques minutes. Un autre but de l'invention est de réaliser un essai de diagnostic utilisable pour le dépistage systématique, par exemple dans des grands et petits hôpitaux, cliniques, laboratoires de santé publique, sans qu'il soit nécessaire de prévoir des installations de laboratoire complexes et coûteuses. Encore un autre but de l'invention est de réaliser un essai de diagnostic donnant des résultats précis et sûrs, et que l'on puisse utiliser pour déceler l'une quelconque d'un grand nombre de maladies virales différentes. Un autre but de l'invention est de réaliser un essai de diagnostic utilisant des réactifs ayant une longue durée de conservation, par exemple de l'ordre d'une année et plus. D'autres buts et avantages de l'invention apparaîtront au cours de la description détaillée suivante. Lors de la mise en oeuvre de l'invention, des cellules du sang brutes provenant de certains animaux, y compris des oiseaux, sont spécialement traitées pour produire une substance possédant des propriétés qui la rendent capable d'être facilement agglutinée par des virus tels que ceux énumérés ci-dessus (aussi bien que par certains anticorps). On utilise ensuite cette substance pour déceler la présence d'anticorps spécifiques dans le sérum d'un patient. Selon la coutume en immunologie, sérologie et autres sciences connexes, on a dénommé le nouvel antigène en question antigène de Zichis. Le mode opératoire consiste essentiellement à préparer et à titrer un antigène viral spécifique. Le sérum du patient, suspecté de contenir des anticorps, est mélangé avec l'antigène viral. Ensuite, la substance agglutinable spéciale sus-mentionnée, dénommée ci-dessus antigène de Zichis, est ajoutée au mélange. La présence ou l'absence d'une réaction d'agglutination visible intervenant dans le mélange après seulement quelques minutes constitue le résultat de l'essai. La présence d'agglutination indique un diagnostic négatif. L'absence d'agglutination indique un diagnostic positif. Dans un essai positif, le sérum du patient contient des anticorps spécifiques qui neutralisent le virus, de sorte qu'il n'intervient pas d'agglutination à la suite de l'addition de la substance agglutinable. Dans un essai négatif, des anticorps spécifiques sont absents dans le sérum du patient, et l'antigène viral n'est pas neutralisé. Quand on ajoute l'antigène de Zichis, il se trouve agglutiné par l'antigène viral. Dans de nombreuses maladies virales, il est possible de faire croître le virus dans une culture de tissu (dans des oeufs embryonnés, dans le corps d'animaux) pendant un bref laps de temps. On a découvert que l'antigène de Zichis est agglutiné par des cultures de virus ainsi obtenues. Par mise en oeuvre de ce mode opératoire, il est ensuite possible, en utilisant des antisérums viraux spécifiques, d'identifier le virus.Par conséquent, il est possible d'établir le diagnostic en un laps de temps relativement bref. On peut recourir à un tel essai pour diagnostiquer, par exemple, la grippe ou les oreillons. La préparation et le titrage des divers réactifs utilisés au cours de l'essai en question sont réalisables en opérant de la manière décrite ci-dessous. L'antigène de Zichis.- On prépare les antigènes de Zichis à partir d'érythrocytes d'animaux (y compris des oiseaux). On peut utiliser des érythrocytes provenant d'animaux de diverses espèces (y compris des oiseaux). Ainsi, par exemple, on peut utiliser des érythrocytes de rat, de souris, de porc, de chien ou de cobaye ; on peut utiliser aussi des érythrocytes de poulet, de poussin d'un jour, d'oie (plus spécialement d'oie mâle), de pigeon, -de cygne ou de canard. Les antigènes de Zichis possèdent habituellement des propriétés d'agglutinabilité dans un large spectre de conditions, mais ils réagissent sélectivement avec des virus selon la source d'érythrocytes utilisée pour préparer l'antigène. Par exemple, un antigène de Zichis préparé à partir d'érythrocytes de cobaye sera agglutiné par les virus de la grippe, des oreillons et de la polyomyélite, mais non par le virus de la rubéole. D'autre part, si l'antigène de Zichis est préparé à partir d'érythrocytes de poussin d'un jour, il est agglutiné par le virus de la rubéole. Dans le cas d'un antigène de Zichis (c'est-à-dire provenant d'une source spécifique d'érythrocytes), on observera une agglutination par le virus en question ; on parviendra facilement à ce résultat en procédant par tâtonnements en utilisant la méthode sur lame décrite ci-après. Pour préparer \'antigène de Zichis, on traite des érythrocytes de l'animal choisi (qui peut être un oiseau) par une solution aqueuse contenant des ions borate de préférence accompagnés par un anti-contaminant adéquat capable d'empêcher la croissance de micro-organismes susceptibles d'affecter l'antigène et qui, dans ces conditions,. agit à la manière d'un antiseptique, tel que de l'aède de sodium, et par un agent approprié capable d'améliorer le caractère isotonique de la solution (par exemple, du chlorure de sodium). I1 convient que la solution soit isotonique et neutre, c'est-à-dire possède un pH voisin de 7. Après un tel traitement, on incube le mélange à une température appropriée, puis on en sépare le sédiment, contenant l'antigène de Zichis. On peut utiliser diverses combinaisons d'acides et de sels capables de produire des ions borate en solution. Ainsi, des combinaisons d'un sel du type borate d'un métal alcalin, par exemple borate de sodium, avec un acide tel que de l'acide ascorbique ou isoascorbique, acétique ou chlorhydrique, ont été utilisées avec succès. Une combinaison plus particulièrement intéressante comprend de l'acide borique et de l'hydroxyde de sodium. Bien que le mécanisme exact ne soit pas encore bien compris, on a constaté que la technique sus-spécifiée, impliquant un traitement par des ions borates dans une solution neutre et isotonique, aboutit à l'obtention d'antigène de Zichis. Un mode opératoire représentatif de ceux utilisables pour préparer l'antigène de Zichis est décrit ci-après, à titre bien entendu non limitatif. 1") On ajoute les érythrocytes de l'animal (qui peut être un oiseau) à une solution aqueuse contenant en poids 3% de citrate de sodium. On utilise, de préférence, un rapport en volume de 5 à 6 du sang à la solution de citrate de sodium, car on a constaté que ce rapport permet d'empêcher une coagulation. La suspension résultante est ensuite soigneusement lavée avec du soluté physiologique froid (environ 30C) pour éliminer le citrate de sodium, le plasma et les sels solubles du sang. Par exemple, on a trouvé qu'un lavage réalisé en utilisant un rapport en volume de 10 à 1 du soluté physiologique au sang est satisfaisant. On peut, si on le désire, utiliser d'autres anti-coagulants que du citrate de sodium. 20) On prépare une solution-aqueuse contenant 2000 ml d' eau distillée, 60 g d'acide borique (qualité Codex E.U.A.), 80 ml d'une solution 1,0 N d'hydroxyde de sodium (chimiquement pur), 4 g d'azide de sodium (qualité technique), et 18 g de chlorure de sodium (chimiquement pur). I1 convient d'ajuster le pH à environ 7,0 si cela apparait nécessaire, en utilisant soit de l'acide borique, soit de l'hydroxyde de sodium selon les besoins. 3 ) On refroidit jusqu'à environ 2 à 4"C la solution préparée sous (2) ci-dessus. Si la température est supérieure à environ 40C, on peut constater une perte indésirable de la sensibilité de l'antigène final. 40) Les érythrocytes provenant de 100 ml du sang de l'animal (qui peut être un oiseau)(opération 1) sont ensuite ajoutés à la solution refroidie provenant de l'opération (3). Si le pH du mélange résultant s'écarte d'environ 7, il convient de le réajuster à 7 par addition de plus d'acide borique ou d'hydroxyde de sodium, selon le cas. 5 ) On conserve le mélange résultant à une température comprise entre environ 2 et 4"C, en l'agitant soit continuellement, soit par intermittence (par exemple, trois fois par jour) pour empêcher une sédimentation des cellules. Si on a recours une agitation continue, la durée du temps d'incubation a tendance à se trouver abrégée. On effectue une incubation poursuivie jusqu'à ce que l'on observe la formation d'une couche d'un blanc grisâtre constituée par l'antigène. Cette formation intervient habituellement en un laps de temps d'une durée comprise entre huit et vingt jours. On laisse ensuite la formation d'antigène se poursuivre pendant encore trois jours supplémentaires. 6 ) Après l'incubation décrite sous (5), on agite le mélange et on le centrifuge pendant 30 minutes à 4500 tours/minute pour séparer l'antigène des autres matières telles qu'hémoglobine, plasma, protéines cellulaires et citrate de sodium. La centrifugation produit trois couches : une couche inférieure de matières cellulaires denses, une couche médiane de la susdite matière d'une couleur blanc grisâtre contenant l'antigène, et une couche supérieure de liquide surnageant. 70) On rejette aussi bien le liquide surnageant (couche su périeure) que la matière cellulaire dense (couche inférieure). On lave la couche médiane, contenant l'antigène, avec du soluté phy sérologique par centrifugation, on rejette une fois encore la couche supérieure et la couche inférieure et on conserve la couche médiane contenant l'antigène. On répète l'opération de lavage jusqu'à ce que le liquide surnageant soit limpide (ce qui indique que l'hémoglobine et d'autres matières séparées, comme on l'a indique en décrivant l'opération 6 ci-dessus, ont bien été éliminées). Habituellement, trois lavages suffisent. 8 ) Le sédiment blanc grisatre constitue l'antigène spécial de Zichis. On reprend cet antigène dans 20 ml de soluté physiologique, et pour en assurer la conservation, on y ajoute, à titre d'antiseptique, 0,2 % en poids d'azide de sodium. Antigène viral.- L'antigène viral spécifique peut être obtenu à partir de l'une quelconque de plusieurs sources, par exemple : culture sur tissu, tissu d'animal infecté ou tissu infecté d'oeufs de poule en voie de développement de l'embryon. On peut le préparer à partir de la forme.brute en ayant recours à des méthodes physiques ou chimiques bien connues. Il convient que le virus se trouvant dans l'antigène soit sous une forme relativement pure et concentrée (par exemple, dans le cas des oreillons, partir avec un titre d'agglutination d'environ 1-20 et concentrer jusqu'à environ 1-5000). Pour des raisons de sécurité, il convient d'inactiver le virus (pour détruire son pouvoir infectieux tout en préservant son antigénicité) en ayant recours à des techniques connues, par exemple irradiation par de la lumière ultraviolette ou en ayant recours à des méthodes chimiques (par exemple : traitement par de la formaline, du phénol, du crésol, de la bêta-propiolactone). Titrage de l'antigène viral par rapport à l'antigène de Zichis.- Il s'agit ici d'une épreuve quantitative, et, pour cette raison, on doit établir quelle est la plus petite quantité d'antigène viral nécessaire pour réaliser une agglutination. I1 est donc necessaire de trouver la plus haute dilution d'antigène viral qui produit encore une réaction d'agglutination facilement observable avec l'antigène de Zichis. Pour cela, on titre l'antigène viral par rapport à l'antigène de Zichis par dilution. Une telle opération de titrage est réalisable comme suit 1") Faire des dilutions en série de l'antigène viral dans du soluté physiologique à partir d'une partie d'antigène viral pour deux parties de soluté physiologique jusqu'à une partie d'antigène viral pour cinq cent douze (512) parties de soluté physiologique. Dans certains cas, il peut être nécessaire de préparer et utiliser des dilutions encore plus hautes de l'antigène viral. 2 ) Placer une goutte de chaque dilution sur un carré séparé marqué sur une plaque en verre. 30) A chaque goutte, ajouter une goutte de l'antigène de Zichis. 4 ) Mélanger les réactifs sur chaque carré avec des applicateurs en bois séparés (ou bien utiliser un seul et unique applicateur, en allant de la haute dilution à la basse dilution). 5 ) Manipuler avec rotation la plaque en verre sur une lumière indirecte et observer les réactions d'agglutination. 6g) La dernière dilution qui présente une agglutination distincte (c'est-à-dire, lorsque la dilution supérieure immédiatement suivante ne produit plus d'agglutination) représente par définition une unité agglutinante d'antigène viral. Pour l'essai d'établissement de diagnostic, on recommande l'utilisation de la plus petite quantité d'antigène viral (donnant la plus haute sensibilité de lissai) permettant encore une lecture facile de la réaction d'agglutination. On a découvert que la deuxième dernière dilution, c'est-à-dire la dilution représentant deux unités agglutinantes d'antigène viral, est habituellement satisfaisante. Dans certains cas, il est possible qu' il faille utiliser quatre unités agglutinantes d'antigène viral pour faciliter la lecture de la réaction. Pré-traitement du sérum du patient Habituellement, des sérums normaux contiennent des substances qui empêchent non-spécifiquement une agglutination, comme on peut l'observer dans l'essai d'inhibition d'hémagglutination avec des érythrocytes bruts. Le sérum du patient doit donc être traité, par mise en oeuvre de techniques connues, pour éliminer ces inhibiteurs d'agglutination non-spécifiques. Ceci est réalisable en ayant recours à l'une des techniques connues utilisant kaolin, Co2, héparine, enzyme détruisant les récepteurs, ou rivanol. Essai.- L'essai pour établissement d'un diagnostic par mise en oeuvre de l'invention s'effectue en ayant recours au mode opératoire décrit en détail ci-après. On place, sur une plaque en verre, une goutte de sérum (pré-traité) du patient. On ajoute, à la goutte précédemment placée sur la plaque en verre, une goutte de l'antigène viral séparément préparé et titré. On mélange, avec un applicateur en bois, les deux gouttes (les deux réactifs), puis on laisse reposer pendant environ deux minutes. Ensuite, on ajoute, au mélange, une goutte de l'antigène de Zichis et on mélange à nouveau en opérant de la manière décri te ci-dessus. Enfin, on manipule la plaque en verre en la faisant tourner doucement sur une lumière indirecte pendant au maximum environ deux minutes, et on observe visuellement la présence ou l'absence de réactions d'agglutination. Dans un essai positif, l'antigène viral aura été neutralisé par les anticorps spécifiques contenus dans le sérum du patient, et il n(intervient pas d'agglutination avec l'antigène de Zichis. Dans un essai négatif, on observera une agglutination, étant donné que le sérum du patient ne contient pas les anticorps spécifiques et étant donné que l'antigène viral reste libre d'agglutiner l'antigène de Zichis. Dans le cas où il intervient une agglutination, elle peut être de forte à faible, et elle est facilement visible à l'oeil nu. Si l'essai est positif, il est bien entendu nécessaire d'établir le titre en anticorps du sérum afin de s'assurer que les résultats de l'essai sont significatifs. Ceci est réalisable en préparant des dilutions en série du sérum dans du soluté physiologique, puis en déterminant la plus basse dilution (le plus bas titre) à laquelle une réaction d'agglutination est observable (c'est-à-dire que, à ce point, il n(y a pas assez d'anticorps du sérum présents pour neutraliser le virus, de sorte qu'une agglutination intervient). Si les résultats de l'essai sont positifs, il convient de déterminer ultérieurement (par exemple, 6 à 10 jours plus tard), sur un nouvel échantillon de sérum, le titre pour établir un diagnostic définitif. On aboutit à un diagnostic de confirmation si le dernier échantillon possède un plus haut titre en anticorps que celui du premier échantillon, car cela prouve qu'il existe chez le patient une infection active qui produit des anticorps additionnels au fur et à mesure que le temps passe. Etant donné que le procédé d'essai décrit ci-dessus implique une agglutination spécifique aussi bien qu'une inhibition d'une telle agglutination à la suite d'une réaction avec un antisérum spécifique, et est mis en oeuvre en utilisant la technique sur lame, on propose de le dénommer Vessai viral d'agglutinationinhibition sur lame. Plus de sept cents sérums dans des cas portant sur des études d'oreillons ont été soumis à l'essai conformément à l'invention sur une base comparative avec des techniques classiques, à savoir les essais HI (hémagglutination-inhibition), CF (fixation de complément), et de neutralisation. Similairement, plusieurs centaines de tels essais comparatifs ont été conduites sur des sérums provenant de cas de grippe. On a constaté que des résultats d'essais aussi bien positifs que négatifs obtenus en utilisant les techniques classiques sont confirmés dans chaque cas lorsqu'on utilise le procédé d'essai selon l'invention. On constate de plus que, dans un certain nombre de cas, l'essai selon l'invention est de deux à quatre fois plus sensible que l'essai HI. De ce qui précède, il ressort que l'invention est basée sur l'observation du fait qu'une neutralisation de l'antigène viral par le sérum spécifique intervient sur une lame sans agglutination visible, ce qui rend donc significative l'agglutination résultant de l'addition de l'antigène de Zichis lors de la mise en oeuvre du mode opératoire d'essai, et permet d'utiliser la technique simple et rapide sur lame décrite ci-dessus. L'essai pour établissement de diagnostic décrit ci-dessus est largement applicable à la détection de nombreuses maladies virales différentes. Non seulement l'antigène de Zichis décrit ci-dessus est sensible et répond à la présence d'anticorps viraux ou de virus, mais encore il est agglutinable par certains autres anticorps. Par exemple, la substance en question est agglutinable par des anticorps associés à la syphilis et est utilisable pour le diagnostic de cette maladie. Tout à fait indépendamment de l'essai en question pour établissement d'un diagnostic, le mode opératoire décrit ci-dessus pour la préparation de l'antigène de Zichis est avantageusement utilisable lors de la mise en oeuvre de techniques de purification de virus selon lesquelles un virus est absorbé sur l'antigène de Zichis, puis est élué sous une forme propre et concentrée. Bien que l'invention ait été décrite en se référant à certains de ses modes de réalisation particuliers, il ne faut pas perdre de'vue que de nombreuses variantes et modifications apparaitront facilement à tout spécialiste à la lumière de la description précédente. La portée de l'invention ne saurait donc en aucune façon être limitée aux susdits modes de réalisation particuliers. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la préparation d'un antigène caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement : à préparer des erythrocytes à partir du sang d'un animal (y compris un oiseau) ; à traiter cet érythrocytes par une solution aqueuse isotonique contenant des ions borate et un anti-comtaminant et possédant un pH égal à environ sept; à incuber le mélange résultant à une température comprise entre environ 2"C et 4"C pendant de huit à vingttrois jours ; à séparer l'antigène sédimenté résultant à partir des matières résiduelles contenant l'hémoglobine, le plasma et des protéines cellulaires ; et à mettre l'antigène en suspension dans un liquide convenable. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on utilise du sang d'un animal choisi parmi le groupe constitué par des rats, des souris, des chiens, des porcs et des cobayes. 3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on utilise le sang d'un oiseau choisi parmi le groupe constitué par des poulets, des poussins d'un jour, des pigeons, des oies, des cygnes et des canards. 4. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on utilise des ions borate dérivant d'acide borique. 5. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on utilise des ions borate dérivant de borate de sodium. 6. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on utilise une solution aqueuse contenant du chlorure de sodium, de l'acide borique et de l'hydroxyde de sodium. 7. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on utilise une solution aqueuse contenant du chlorure de sodium, de l'acide chlorhydrique et du borate de sodium. 8. Procédé d'essai sérologique pour l'établissement du diagnostic de maladies virales caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement : à mélanger une partie aliquote d'un échantillon de sérum du sang d'un patient suspecté de contenir des anticorps viraux particuliers avec un antigène viral spécifique ; à ajouter audit mélange un antigène préparé par mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 1 et qui est capable de réagir avec agglutination avec l'antigène viral ; et à observer', dans le cas d'un essai positif, l'absence d'agglutination et, dans le cas d'un essai négatif, la présence d'agglutination. 9. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'on effectue l'essai par mise en oeuvre d'une technique sur lame. 10. Procédé d'essai sérologique pour l'établissement du diagnostic de maladies virales caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement : à mélanger une partie aliquote d'un échantillon de sérum du sang d'un patient suspecté de contenir des anticorps viraux particuliers avec un antigène viral spécifique, de façon qu'une neutralisation intervienne entre l'antigène viral et le sérum sans agglutination visible ; à ajouter audit mélange un antigène préparé par mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 1 et qui est capable de réagir avec agglutination avec l'antigène viral ; et à observer, dans le cas d'un essai positif, l'absence d'agglutination et, dans le cas d'un essai négatif, la présence d'agglutination. 11. Procédé d'essai sérologique pour l'établissement du diagnostic de maladies virales caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement : à isoler un virus à partir du patient ; à neutraliser le virus avec un antigène viral spécifique ; à ajouter, au virus neutralisé, un antigène préparé par mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 1 et qui est capable de réagir avec agglutination avec le virus ; et à observer, dans le cas d'un essai positif, l'absence d'agglutination et, dans le cas d'un essai négatif, la présence d'agglutination. 12. Procédé pour la purification d'un virus, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement : à absorber le virus sur un antigène préparé par mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 1 ; puis à éluer le virus pour l'obtenir sous une forme propre et concentrée.