Brevet FR2228837A1 — publié le 19741206

La présente invention a pour objet; la synthèse d'aminoacides et notamment de la L-#-N-acétyllysine par fermentatior à partir de mutants de types divers décrits ci-après derivés de souches bactériennes gram-positives. De nombreux brevets ont été déposés concernant la production de L- lysine à partir de bactéries. La présente invention a pour but : # de fournir un procédé de production d'un composé, la L-#-N-acétyl- lysine dont la synthèse biochimique n'a pas été décrite et dont l'intérêt nutritionnel est analogue à celui de la L-lysine, # d'utiliser à cet effet des substrats peu coûteux et abondants, en particulier les hydrocarbu-ries paraffilliç1ues; de. 10 à 22 atonies Se carbone ou des coupes pétrolières contenant un mélange de ces hydrocarbures. D'autres substrats tels que l'acide acétique-ou les hydrates e carbone sont également utilisables, # d'effectuer cette synthèse avec différents typas de mutants, notam meng des mutants sans exigences nutritionnelles, sélectionnés surtout pour leur résistance à des analogues de structure de la lysine , comme il est décrit plus loin. Un deuxième but de cette invention esL de fournir un procédé de pro duction, (outre de La E-N-acétyllysine), de L-lysine ainsi que d'acide diaminopimélique par des mutants sans besoins autritionnels obtenus à partir de bactéries gram-positives. Des microorganismes ont été sélectionnés en tenant compte de leur bonne croissance sur differents substrats, notamment sur paraffines, et du fait de leur incapacité de- dégrader la lysine Des souches gram-positives et des actinomycètes (apparténant à des geares tels que Micrococcus, Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter, Nocardia, Mycobacterium) qui répondaient à ces critères ont été obtenues. Des souches du genre Corynebacterium en particulier ont été retenues. Certaines de ces bactéries, notamment la souche Corynebacterium C91 correspondant à la description faite par Iizuka et Komayata (J. gen. Appl. Microbiol. 10, (3) 207-221 (1964)) pour Corynebacterium hydrocarboclastus. Ces caractères taxonomiques sont résumés ci-dessus DESCRiPTION DE LA SOUCHE CORYNEBACTERIUM C91. Bactérie aérobie gram-positive non mobile ne formant pas de spores. Les cellules forment principalement des bâtonnets courts mais des formes branchées et des variations des formes au cours des cultures sont: observées. On observe des granules métachromatiques. Sur milieu solide (par exemple, milieu minimum avec hexadécane) les cellules acquièrent une teinte orangée avec l'âge. La souche utilise les hydrocarbures paraffiniques liquides à partir du décane et des coupes pétrolières contenant des paraffines ayant entre 10 et 22 atomes de carbone. Elle utilise aussi le glucose, le succinate, le glycérol, l'éthanol, l'acétate. La température optimum est environ 300C. La croissance à 370C est très faible. Une certaine croissance est observée à 40C. Source : Sol. OBTENTION DES MUTANTS PRODUCTEURS DE L- -N-ACETYLLYSINE Les mutants sans besoins nutritionnels ont été obtenus à partir de la souche Corynebacterium C91. La méthode consiste en l'utilisation d'un analogue de structure de la lysine, la la -aminoéthylcystéine, dont la présence inhibe la croissance de- la souche considérée. On sélectionne alors les mutants résistants qui se développent en présence de cet analogue.Dans le cas présent, la méthode déjà utilisée par le demandeur pour l'obtention de mutants de Pseudomonas (Brevet français numéro 2 041 658) était inapplicable parce qu'aucun des analogues de la lysine essayés (S-(P-aminoéthyl) cystéine, trans-4-déhydrolysine, & méthyllysine, 3-aminocyclohexylalanine) n'inhibait la croissance des souches utilisées. Cependant, on a découvert quten changeant la composition du milieu, notamment en remplaçant les sels d'ammonium utilisés comme source d'azote par un nitrate, la croissance des souches de Corynebacterium utilisées était alors inhibée par les analogues de la lysine cités plus haut.On a ainsi pu isoler les mutants recherchés en procédant de la manière suivante : on a préparé des boites de Pétri contenant un milieu solide (milieu minéral de l'exemple 1 dans lequel le nitrate d'ammonium était remplacé par du nitrate de potassium à 2 g/l contenant l'acétate de sodium 50 mM comme source de carbone dans 2 7. d'agar) additionné d'aminoéthylcystéine à une concentration pouvant varier entre 0,01 et 0,1 M et de thréonine 1 mM qui renforce l'inhibition par l'aminoéthylcystéine et de méthionine 1 mM. Sur ces boites on a étalé quelques gouttes d'une culture de la souche C91 et on les a incubées à 30"C pendant 3 jours. Les colonies isolées de mutants résistants au mélange de thréonine et d'aminoéthylcystéine qui étaient alors apparues à la surface des boites ont été reprises et purifiées. On a déterminé chez chaque mutant la production extracellulaire de lysine par croissance en fioles avec l'acétate ou l'hexadécane comme source de carbone.On a aussi préparé à partir de cultures de ces mutants des extraits enzymatiques et on a déterminé la sensibilité de l'aspartokinase, premier enzyme de la biosynthèse de la lysine à l'inhibition par la lysine. On a sélectionné ainsi les mutant C9LMAT52 dont les caractéristiques biochimiques qui le distinguent de la souche sauvage C91 sont données dans le tableau 1. On voit dans ce tableau, que chez la souche sauvage, l'aspartokinase est inhibée par le mélange des aminoacides lysine et thréonine mais pas chez le mutant C91MAT52. On peut tenter d'expliquer la capacité d'excrétion de lysine du mutant considéré par cette propriété particulière de son aspartokinase. TABLEAU 1 Caractéristiques biochimiques des mutants sans exigences nutritionnelles obtenus par action de l'aminoéthylcystéine Inhibition de l'asparto- Inhibition de la croissance kinase par le mélange par le mélange amino lysine + thréonine (Z) éthylcystéine + thréonine a b C91 (souche sauvage) 96 + C91MAT52 O 0 a - Concentrations utilisées : 1 mM lysine + 0,5 mM thréonine b - Le signe + indique l'absence de croissance-visible après 4 jours à 30 C sur milieu solide contenant le nitrate de potassium comme seule source d'azote en présence de 100 mM aminoéthylcystéine + 1 mM thréonine + 1 mM méthionine. PRODUCTION DE LYSINE PAR LES MUTANTS OBTENUS EXEMPLE 1 : On a utilisé un milieu minéral dont la composition est la suivante par litre KH2P04 .. 2 g Na2HP04, 12 H20 ..... 2 g MgSO4, 7 H2O ........ 1 g MnS04, H20 .......... 50 mg FeS04, 7 H20 ........ 10 mg ZnSO4, 7 H20 ........ 10 mg NH4N03 .............. 10 g A ce milieu ajusté à pH 7;0, on a ajouté 5 % d'hexadécane comme source de-carbone et 2 % de carbonate de calcium. Les fioles contenant ce milieu ont été ensemencées avec une culture du mutant C9lMAT52 et agitées à 30 C pendant 6 jours, le pH étant journellement rajusté à 7,0 par NH40H N. A la fin de la culture, les cellules ont été éliminées par filtration ou centrifugation et les aminoacides produits extraits selon des techniques connues par passage du milieu sur une résine échangeuse de cation du type acide sulfonique sous forme acide puis élués par l'ammoniaque 2 N qui est ensuite éli- mineepar évaporation sous pression réduite. Le dosage des aminoacides produits était effectué au moyen d'un analyseur d'aminoacides. Une quantité de L- -N- acétyllysine de 0,4 g/l était obtenue dans ces conditions. On recueillait en même temps 60 mg/l de L-lysmeet 360 mg/l d'acide diaminopimélique. EXEMPLE 2 : Le milieu de culture était identique à celui de l'exemple l sauf en ce que l'acétate de sodium 50 mM remplaçait l'hexadécane comme source de carbone. Te pH de la culture était journellement ramené à 7,0 par de l'acide acétique. On ensemençait avec le mutant C91bAT52, et après 6 jours de culture à 30"C, on obtenait 0,3 g/l de L- 8 -N-acétyllysine. De la L-lysine (60 mg/l) et de l'acide diaminopimélique (200 mg/l) étaient également obtenus. REVENDICATIONS 1.- Procédé de production de L- E-N-acétyllysine, de L-lysine et d'acide dia minopimélique par culture d'un microorganisme, caractérisé en ce que l'on cultive dans un milieu nutritif contenant des sels minéraux et au moins un hydrocarbure paraffinique ou au moins un sel de l'acide acétique, un mutant d'une bactérie appartenant à l'un des genres Micrococcus, Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter, Nocardia ou Mycobacterium, ce mutant n'ayant pas d'exigences nutritionnelles et étant obtenu par culture préalable d'une bactérie gram-positive en présence d'un analogue de la lysine et d'un mi lieu de culture dépourvu de sels d'ammonium et contenant au moins un ni trate comme source 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mutant est un mutant de Corynebacterium. 3.- Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'a nalogue de la lysine est la S-( ss-aminoéthyl) cystéine, la trans-4-déhydro lysine, la t-méthyllysine ou la 3-aminocyclohexylalanine. 4.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le mutant est le mutant C91MAT52. 5.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les produits obtenus sont utilisés à des fins nutritionnelles.