Brevet FR2231748A1 — publié le 19741227

La présente invention concerne un procédé de fermentation pour la production de polysaccharides, par culture de microorganismes et plus particulièrement de bactéries en présence de méthanol comme source de carbone. Plus particulièrement l'invention a pour objet ltobtention de polysaccharides extracellulaires par culture de bactéries. Après avoir séparé la biomasse, c'est-à- dire les cellules des microorganismes, par exemple par centrifugation, on extrait du milieu de culture les polysaccharides produits extracellulairement par les cellules. Un premier objet de la présente invention est un procédé pour la production de polysaccharides avec un rendement élevé, en utilisant comme source principale de carbone, le méthanol, commercialement disponible à un prix raisonnable. Jusqu'à présent on a généralement utilisé dans des opérations industrielles des hydrates de carbonate, en particulier le glucose, du dextrose, du sucrose, des mélasses et des produits résultant de l'hydrolyse des amidons. Cependant, ces produits agricoles sont extremement recherchés et leur coût est très variable en fonction de divers facteurs affectant l'agriculture. Le procédé faisant objet de l'invention consiste à cultiver des microorganismes et notamment des bactéries gram-négatives en présence de méthanol comme source de carbone, d'un milieu minéral et dans des conditions aérobies, et à produire des polysaccharides à partir du méthanol ainsi assimilé. I1 est déjà connu que certains microorganismes sont susceptibles de se développer sur des milieux de culture contenant du méthanol comme unique source de carbone, mais le demandeur a découvert que certains de ces microorganismes sont capables de produire des polysaccharides sur un tel milieu de culture. Les auteurs de la présente invention ont isolé des souches de bactéries capables d'assimiler le méthanol et de produire des polysaccharides à partir du méthanol ainsi assimilé. Ces souches appartiennent aux espèces Pseudomonas, Achromobacter et Protaminobacter. Certaines de ces souches, notamment Achromobacter M-7 et Protaminobacter M-22 sont définies ci-après. Les caractéristiques bactériologiques de ces souches sont les suivantes Achromobacter M-7 o Provenance : sols .Petits bâtonnets isolés - 0,3 à 0,5 x 1,0 à 1,5 microns Non mobiles - Gram-négatifs - Pas de formation de spores .Colonies sur gélose, sels, méthanol (0,5 7) et extrait de levure (2 à 4 jours). Petites - circulaires - lisses - blanchStres aspect butyreux à mucoide - habituellement difficiles à émulsifier. Relation avec l'oxygène libre : aérobie Température : croissance satisfaisante à 25-350C pH : pousse bien à un pu de 6,5 à 8,0, capable de se développer à un pH de 6 à 9. Gélose nutritive : pas de croissance Réduction des nitrates : négative Catalase : négative Milieu citraté de Simmons : pas de croissance Lait au tournesol : inchangé Production d'indole : néant Uréase : négative Production d'hydrogène sulfuré : négative Hydrolyse de l'amidon : négative Production de pyocyanine (milieu A de King) : négative Production de fluorescéine (milieu B de King) : négative Utilisation des sources de carbone Le méanol, la monométhylamine, ltéthylamine, le glucose, le fructose sont assimilés, mais le méthane, l'éthane, le propane, le butane, l'heptane, l'hexadécane, méthanol, le propanol, le butanol, le mannitol, le sorbitol, le glycérol, les acétates, les succinates, les adipates, les glutarates, les glutamates, le saccharose, le lactose ne sont pas assimilables quand ils forment 11 unique source de carbone. Protaminobacter M-22 Provenance : sols Petits bâtonnets isolés - 0,3 à 0,5 x 1,0 à 1,5 microns Non mobiles - Gram-négatifs - Pas de formationde spores Colonies sur gélose, sels, méthanol (0,5 /0) et extrait de levure (2 à 4 jours). Circulaires - lisses - brillantes - jaunes aspect butyreux à mucoSde - habituellement difficiles à émulsifier. Relation avec l'oxygène libre : aérobie Température : croissance satisfaisante de 25-359C pH : pousse bien à un pH de 6,5 à 7,5, capable de se développer à un pH de 6 à 9. Réduction des nitrates : négative Catalase : positive s Miiieu citraté de Simmons : pas de croissance Lait au tournesol : inchangé Production dtindole : néant Uréase : positive Production d'hydrogène sulfuré : négative Production de pyocyanine (milieu A de King) : négative Production de fluorescéine (milieu B de King) : négative Utilisation des sources de carbone Le méthanol, l'éthanol, le propanol, le butanol, le glucose, le fructose, le lactose, le saccharose, les glutamates, les succinates, la mono-. méthylamine, l'éthylamine sont assimilés, mais l'heptane, l'hexadécane, les glutarates, les acétates, le glycérol, le sorbitol, le mannitol ne sont pas assimilables. La composition du milieu utilisé pour l'assimilation des différentes sources de carbone est, par exemple, la suivante Substrat carboné ....... 0,5 % (poids/volume) (NH4)2HP04 ............. 2g KH2P04 2 .. 2 g MgSO4, 7 H20 . ......... 0,5 g PeSO4, 7 H20 ........... 0,01 g Extrait de levure ...... 0,1 g Eau distillée .......... 1 litre pH : 6,9 (dans le cas d'un milieu gélosé, on doit ajouter la gélose en une quantité telle que sa concentration soit de 10 g/l). Dans le cas des alcanes gazeux, les cultures sont frites en milieu liquide dans des tubes à essai, ceux-ci étant placés à l'intérieur d'un dessicateur dans lequel l'atmosphère contient 20 % d'alcanes gazeux mélangés à l'air. CONDITIONS DE CULTURE POUR LA PRODUCTION EXTRACELLULAIRE DE POLYSACCHARIDES Les milieux utilisables sont des milieux aqueux renfermant des composants usuellement utilisés pour la culture des microorganismes, c'est-à-dire renfermant une source d'azote, des composés minéraux et de petites quantités de substances organiques favorisant le développement comme les vitamines et produits analogues. Le méthanol est employé comme source de carbone dans la présente invention. Il est préférable que la concentration initiale de méthanol soit faible et que des additions de oe produit soient effectuées de façon intermit tente ou de façon continue au cours de la fermentation en correspondance avec la consommation du méthanol.D'une manière générale on utilise une concentration en volume de méthanol de l'ordre de 0,1 % à 2 % et préférentiellement de 0,5 à 1 %. Les sources d'azote sont les sources classiques et comprennent les sels d'ammonium tels que le chlorure, le sulfate ou le phosphate dibasique, les nitrates solubles tels que le nitrate de potassium, de sodium ou d'ammonium, l'urée et l'ammoniaque soit en solution aqueuse-, soit à l'état gazeux. Le milieu minéral renferme du phosphore, par exemple sous forme de sels de l'acide phosphorique, des ions essentiels tels que les ions magnésium et potassium, et des oligo-éléments généralement à l'état de traces, tels que le fer. Ce milieu pourra renfermer certains facteurs de croissance, par exemple des vitamines et des produits naturels contenant ces mêmes substances telles que les extraits de levure ou les liqueurs de macération du mats. La culture est effectuée dans des conditions aérobies à une température de 20 à 400C et de préférence à 300C, le pH étant maintenu entre 4 et 9, par exemple à environ 7,0. On peut utiliser des produits tampons tels que des phosphates ou du carbonate de calcium en vue de maintenir le pH dans la zone optimale, mais on peut également utiliser la soude caustique, l'ammoniac sous forme gazeuse ou en solution pour le réglage du pH, lorsqu'on emploie comme source d'azote des sels d'ammonium, la consommation d'ammoniaque contribuant -à abaisser le pH. Dans le cas où le pH s'alcalinise, on utilisera par exemple l'acide chlorhydrique, l'acide nitrique ou l'acide sulfurique pour régler le pH. La récupération des polysaccharides accumulés au cours de la fermentation peut être mise en oeuvre de toute manière connue. Généralement, on sépare, par exemple, par décantation, filtration ou centrifugation le milieu minéral aqueux des cellules de microorganismes. On précipite les polysaccharides par addition d'un alcool ou d'acétone au milieu débarrassé des cellules, par exemple par addition de méthanol, d'éthanol ou d'acétone au milieu. Le précipité est ensuite récupéré par centrifugation ou filtration, puis lavé avec un solvant et enfin séché. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée à ce mode particulier de récupération des polysaccharides. Les exemples suivants illustrent l'invention EXEMPLE 1 : : on utilise la souche Achromobacter M-7. On prépare un milieu de culture ayant la composition suivante Méthanol ..... ....... 5 ml KNO3 ................... 2g Na2HPO4 . ........... 2g KH 2P04 2g Na2C03 .............. 2 g MgSO4, 7 H20 . 0,5 g FeS04, 7 H20 ........... 0,01 g Extrait de levure ...... 0,1 g Eau distillée . 1 litre On amène le pli de cette solution à 7,5 par addition de 112804 2 N. Le méthanol est ajouté après stérilisation du milieu minéral. A partir d'un tube gélosé de la souche Achromobacter N-7, on ensemence une fiole de préculture (fiole d'erlenmeyer de 150 ml de capacité) conte nant 25 ml du même milieu. Cette culture d'ensemencement est mise à incuber sur un agitateur rotatif à une température de 30 C. Après un jour de croissånce, la totalité de la culture est transférée dans une fiole de Fernbach de 2 litres de capacité contenant 200 ml du même milieu qui est mise à incuber sur un agitateur rotatif à une température de 30"C. On utilise ensuite cette culture après un jour de croissance pour inoculer un réacteur de fermentation contenant 1,6 1 de milieu.Ce fermenteur d'une capacité de 3 litres est équipé d'un agitateur, d'un dispositif d'aération, et de dispositifs de régulation de la température et du pH. La température dans le réacteur est maintenue à 300C et le FK à 7,5, l'aération étant maintenue à 0,5 lit-re d'air/litre de milieu!minute. A partir de la 20e heure de culture, on introduit en continu 1 ml/heure de méthanol. La concentn'ticn de polysaccharides extracellu la ires ainsi que la viscosité du milieu augmanLent avec la croissance bactérienne. Les polysaccharides présents dans le m 1 eu de fermentation sont dosés par la méthode à l'anthrone Les standards étant des solutions de glucose à différentes concentrations, ce dosage donne la quantité de polysaccharides mesurée en concentration de glucose. tes résultats sont indiqués dans le tableau 1. TABLEAU 1 Temps (h) de la culture Polysaccharides exprimés en mg/ml de glucose traces 40 1,15 65 1,65 EXEMPLE 2 : On utilise la- souche Protaminobacter M-22. On prépare un milieu de culture identique à celui de l'exemple 1, sauf que le nitrate de potassium est remplacé par le phosphate d'ammonium diammonique (2 g/l) comme source d'azote, et que le phosphate de sodium disodique ainsi que le carbonate de sodium sont supprimés. On amène le pH de cette solution à 7 par addition de potasse 3 N. Toutes les autres conditions de préculture et de fermentation sont identiques à celles indiquées dans l'exemple 1, sauf que le pli dans le réacteur de fermentation est maintenu automatiquement à 7 et non à 7,5, par addition d'ammoniac en solution aqueuse. A partir de la 18e heure de culture, on introduit en continu 2,0 ml/heure de méthanol. Les résultats sont indiqués dans le tableau 2. TABLEAU 2 Polysaccharides exprimés Temps (h) de la culture en en mg/ml de glucose 0 0,014 18 0,22 22 0,51 25 0,91 42 1,61 La viscosité du milieu en fin de culture, après avoir séparé les cellules du milieu de culture par centrifugation, est de 20 centipoisesà 250C. Le poids de précipité obtenu après addition au milieu refroidi à 4 C de 1,5 volumes d'acétone à - 40 C, puis lavage à l'acétone puis à l'éther, est de 3,5 g/l. REVENDICATIONS 1 - La présente invention concerne un procédé d'obtention de polysaccharides extracellulaires consistant à cultiver des microorganismes en présence dloxygène, en présence de méthanol comme source unique de carbone et d'un milieu minéral aqueux, et à séparer les polysaccharides du milieu minéral aqueux. 2 - Procédé selon la revendication 1 dans lequel les microorganismes sont des bactéries gram-négatives. 3 - Procédé selon la revendication 2 dans lequel les microorganismes sont des bactéries appartenant aux espèces Pseudomonas, Protaminobacter et Achromo bacter. 4 - Procédé selon la revendication 3 dans lequel le microorganisme est Achromo bacter M-7 ou Protaminobacter M-22. 5 - Procédé selon la revendication 1 dans lequel la concentration en volume initiale de méthanol dans le milieu de culture est comprise entre 0,1 et 2 %. 6 - Procédé selon la revendication 1 dans lequel le méthanol est ajouté à la culture de façon intermittente ou de façon continue. 7 - Procédé selon la revendication 1 dans lequel les polysaccharldes sont excrétés dans le milieu minéral aqueux et séparés de ce milieu par préci pitation en ajoutant un alcool ou de l'acétone.