Brevet FR2211469A1 — publié le 19740719

La présente invention concerne la préparation rapide d'enzymes purifiées par extraction par affinité. Les enzymes sont actuellement extraites et purifiées en deux étapes essentielles. La première étape consiste à effectuer une extraction le la matière de départ, telle broyat de tissu, lyssat microbien, millieu de fermentation, par précipitation ou extraction fractionnées au moyen de sels neutres ou de solvants organiques; on obtient un extrait brut, qui correspond à un mélange des enzymes avec des protéines de propruiétés physicochimiques @den tiques. La deuxième étape consiste à séparer les enzymes de leurs contaminants protéiques, par des opérations physicochimiques comme les cristallisations fractionnées, les ultrafiltrations sélectives sur memoranes ou La chromatogra- p@ie sur des supports appropriés tels que échangeurs d'ions, celluloses modifiées ou tamis moléculaires adaptés.Les différences de comportement de ces macromolécules permettent d'isoler les enzymes pures. On connaît de nombreux procédés couramment appliqués depuis plusieurs années. Généralement, ces procédés sont très longs et provoquent des pertes importantes de rendement, dues à de nombreuses difficultés techniques. Tout d'abord,les précipitations par les sels fourmissent des extraits bruts très chargés en sels minéraux, ce qui nécessite l'élimination de ces sels par des opérations longues, soit de dialyse au travers de membranes semi-perméa- bles soit de reprécipitations successives par ces alcools ou des solvants. D'autre part, l'absence de sélectivités étroite exige des précipitations en ge r.e n- des concentrations croissantes en sels, tone e nombreux transferts et reprIses augmentant la durée des opérations et provoquant ses pertes inévita- bles de produit. De plus, les opérations de précipitation doivent s'effectuer en solution aqueuse à des températures allant de ++ C à +10 C. Ce séjour prolongé des enzymes en solution dans ces conditions de température entraîne des risques certains d'autolyse et d'inactivation d'un fraction de cse molécules actives. En outre, la précipitation par les solvant-organiques n'est pas applicable à toutes les enzymes, certaines étant dénaturées en phase organique.La cristallisation des enzymes demande une durée prolongée, et plusieurs opérations successives sont toujours nécessaires pour parvenir à un produit purifié; et l'on sait les pertes de rendement importantes qui proviennent ce ces opérations. Par ailleurs, la chromatographie sur des supports ionisés permet que très exceptionnellement, de parvenir à @coler une fraction protéique pure à partir d'un mélange hétérogène de protéines sont les caractéristiques physicochimiques sont proches. ############ chromatographie de gel-filtration ne permet pas, en raison te la durée des opération et des pertes te char- ges importantes dans la mise en oeuvre de ces procédés te parvenir a une exploitation industrielle satisfaisante. Enfin, la filtration gélective sur membranes d'ultrafiltration est d'un emploi très limité, étant donné les colmatages qui apparaissent à partir de solutions colloidales. Dans I'ensemble, ces voies technologiques basées sur des différences de caractéristiques physicochimiques ne sont pas suffisamment sélectives pour obtenir une purification rapide et efficace avec des rendements- convenables. Ces difficultés sont en grande partie responsables du coût très élevé des enzymes pures. I1 a été trouvé suivant la présente invention un procédé mettant en oeuvre la sélectivité enzymes-substrats et conduisant à l'obtention d'enzymes purifiées d'une manière simplifiée, rapide et efficace, c'est-à-dire avec des rendements élevés, tout en évitant les autolyses et les dégradations enzymatiques au cours de la lyse cellulaire. le nouveau procédé perfectionné est basé sur l'extraction par affinité, suivie éventuellement d'une ultime purification par la chromatographie dlaffinité. Selon une variante de I'invention, les opérations initiales d'extraction, sont conduites en phase hydroorganique à basse température. Selon l'objet de l'invention, on isole sélectivementune enzyme à partir d'un mélange protéique hétérogène, en utilisant l'extraction par affinité. On sait que les enzymes forment de manière très spécifique des complexes avec leurs substrats ou des inhibiteurs compétitifs, analogues de leurs substrats. I1 a été trouvé selon l'invention des molécules constituées d'un support, soluble en milieu hydro organique, associé avec plusieurs restes d'inhibiteur sélectif d'une enzyme déterminée. Le polyinhibiteur obtenu, permet ainsi d'effectuer spécifiquement un complexe avec plusieurs molécules d'enzymes. Le complexe formé, désigné par Poly I - (E)n, peut être sélectivement isolé, soit par précipitations des autres protéines, le complexe restant en solution par suite des propriétés particulières de solubilité du support, soit par précipitation sélective du complexe, Poly I - (E)n, en raison de son poids moléculaire élevé par rapport aux autres protéines présentes. Le complexe isolé est ensuite dissocié par modification du pH ou -de la force ionique. L'enzyme est isolée par une dernière précipitation totale à l'aide d'un solvant pur et le polyinhibiteur est recyclé. On peut également appliquer un traitement "en cascade" à un mélange de plusieurs enzymes différentes, à l'aide de plusieurs polyinhibfteurs sélectifs différents afin d'isoler successivement les enzymes présentes dans le mélange initial. Les nolyinhibiteurs peuvent etre constitués de molécules supports à. chaîne aliphatique possédant au moins deux sites ou groupes fonction nels aux extrémités sur lesquels sont branchés des inhibiteurs à l'aide de'li- aisonstelles celles couramment utilisées pour la chromatographie d'affinité. On peut citer quelques supports et inhibiteurs appropriés. Les supports peuvent être avantageusement choisis parmi les poly oxy afkylène glycols, tels le poly oxyéthylene glycol, désigné sous la marque commerciale "Tergitols"; les poly alkylène glycols tels poly éthylène glycol ou poly propylène glycol, les chitosanes et produits d'hydrolyse partielle de la chitine, de poids moléculaire variable; les dextrans de poids moléculaire variable : les polymères maléiques; les poly amino acides de type poly lysine, poly glutamique, poly aspartique ou polymères mixtes tels lysine-glutamique par exemple. Ces supports sont activés à l'aide de réactions faisant intervenir un halogénure de cyanogène, tel le bromure de cyanogène, le phosgène, un halogénure de sulfuryle ou de thionyle tel le chlorure de sulfuryle ou le chlorure de thionyle. On peut aussi fixer une chaîne intermédiaire par substitution par l'acide. #-aminocaproïque, l'aminopropanol, la glutaraldéhyde ou tout autre dérivé poly fonctionnel. Le poids moléculaire du support et sa nature sont choisis en fonction' du solvant utilisé et du but recherché, soit la précipitation sélective du complexe Poly I (E)n ou l'extraction sélective en phase fluide du complexe Poly I (E)n par précipitation des contaminants ou par extraction liquide. Divers inhibiteurs sélectifs des enzymes recherchées peuvent être ensuite branchés sur les supports activés. Les iniilbiteurs sont choisis de telle sorte que leur affinité pour 1' enzyme permette la formation quantitative du complexe Poly I (E)n et rende possible la dissociation dans les conditions les plus douces. L'inhibiteur est, suffisamment stable pour que le nolyinhibi teur puisse être recyclé de nombreuses fois. Les polyinhibiteurs tels que décrits précédemment sont choisis à base de D-phénylalanine ou D-tryptophane pour la chymotrypsine, d'ovomucoude, d'inhibiteur de Künitz, de D ou L arginine, ou D ou L lysine, de para aminobenzamidine pour la trypsine, de thymidine 5'-(ester para aminophénylique), d'adénosine 5'-(ester para aminophénylique) monophosphate, de cytidine 5'-(ester para aminophénylique) monophosphate, de 5'-(-4-amino phényl phosphoryl) uridine 2(3') phosphate ou d'uridine 5'-(ester p-aminophénylique) monophosphate pour la ribonucléase. On peut aussi choisir tout autre inhibiteur compétitif sélectif d'une enzyme déterminée. Selon une variante de 1' invention on conduit la phase initiale d'extraction en milieu hydro organique à basse température, dont la- constan- te diélectrique à basse température est voisine de celle de l'eau à 25-500C, c'est-à-dire voisine de 80, comprise entre .7 et Les tissus, animaux ou végétaux, congelés ou les microorganismes, congelés ou lyophilisés sont mis en suspension dans les dits mélanges hydroorganiques. L'emploi de ces mélanges permet de réaliser la lyse cellulaire à basse température, dans une phase fluide dont la constante diélectrique est voisine de celle du milieu physiologique à la température normale. En outre, à partir de certaines préparations brutes d'enzymes il est possible d'obtenir une précipitation sélective de l'enzyme ou des impuretés, par simple abaissement de température, la constante-didlectrique tent maintenue invariable par addition progressive de solvant Les mélanges hydroorganiques appropriés sont choisis parmi les alcools inférieurs, tels le méthanol et méthanol, les aikylènes inférieurs glycols, tels l'éthylène glycol, les esters d'alkyles inférieurs, tels les acétates,-en particulier l'acétate d'méthyles les dialkyles inférieurs formamides, tels le diméthylformamide ou tout autre solvant mise rible à liteau, additionnés d'eau dans des proportions telles que l'on obtienne une constante diélectrique voisine de 80, comprise entre 75 et 82. Les mélanges suivants répondent à cette exigence à -20oC : eau à 509 de méthanol, eau à 35% d'éthanol, eau à 50 d'éthylène glycol, eau à 40 de diméthylformamide. I1 a été constaté que, dans les conditions de l'invention, il est possible d'éviter toute dénaturation des enzymes quelle que soit la température. Le point de précipitation peut être atteint sans aucune dénaturation, tandis que les protéines contaminantes peuvent être sélectivement dénaturées. Selon une autre variante de l'invention, l'addition progressive de phase organique combinée avec un abaissement de température, à constante diélectrique invariante quelque soit a température, peut permettre de precipiter sélectivement une enzyme à partir d'un mélange de plusieurs enzymes. L'emploi d'un mélange hydroorganique à'constante dielectrique invariante est applicable, en évitant toute dénaturation des enzymes - pour le broyage, ou la lyse, à basse température des tissus ou des microorganismes; -pour dénaturer sélectivement des contaminants protéiques qui accompagnent les enzymes dans l'extrait brut - pour précipiter sélectivement une enzyme à partir d'un mélange enzymatique; - pour parfaire la purification finale d'une enzyme isolée. Dans une chaîne d'extraction, la mise en oeuvre de cette phase initiale apporte divers avantages, notamment, la possibilité de réaliser une extraction dans des conditions évitant toute dénaturation des enzymes et l'élimination directe, par dénaturation, d'une fraction des contaminants protéiques sans étape supplémentaire de fractionnement, donc obtention d'un broyat (ou lyast) ayant subi une opération de purification, dès la première phase. Selon urne autre variante de l' nvention, dans le cas où l'ex- traction par afinité ne conduIt pas directement à une enzyme totalement pures fiée, l'enrichissement très poussé ainsi obtenu permet d'envisager une ultime purification de la préparation concentrée à l'aide de la chromatographie d'af flnité. L'extraction par affinité peut être applIquée, selon les cas et le but recherché, soit par traitements successifs à l'aide de nolyinhibi- teurs specifiques des différentes enzymes à séparer, soit par isolement direct en mélange des différentes énzymes recherchées à l'aide d'une phase d'extrac- tion par affinité faisant Intervenir le mélange des polyinhibiteurs correspon avant aux enzymes du mélange. Dans le premier cas, la chromatographie d'affinité ou une répétition de la phase initiale d'extraction permet une purification ultime de l'enzyme isolée. Dans le deuxième cas, la chromatographie, d'affinité "en cascade" permet la séparatIon et l'isolement direct d'enzymes purifiées à partir du mélange concentré résultant de la phase d'extraction par affinité sélective. Le procédé de la présente invention a un très large domaine d'application. Sa Sa mise en oeuvre est particulièrement avantageuse pour la séparation de la ribonueléase, la chymotrypsine et la trypsine purifiées à partir iu pancréas. Dans le cas de isolement de ses enzymes à partir du pan- créas dans la dernière purification, on fixe la ribonucléase sur la colonne d'affinité, a partir d'un mélange constitué des deux zymogènes ae la chymotryp- sine et le la trypsine, en présence de la ribonucléase, la trypsine est saturée par la para aminobenzidine, après activatlon'des zymogènes et avant passage sur la colonne "trypsine" afin d' a'éviter les autolyses, le support commun des trois colonnes est l'#-aminocaproylsépharose et les inhibiteurs sont les inhibiteurs décrits précédemment spécifiques des différentes enzymes. L'Invention est aussi applicable de manière très satisfaisante c ia préparation de subtilisine et de suotllopeptidase A purifiées. Le schéma d'ensemble du procédé de l'invention avec les variantes est le suivant Tissu animal ou - -A ;é-étal eorl~elé Sttspension dans un mélange Broyage ou lyse à croor-anisnes dans un basse température congelés nydroorganique t 0pY 1 COPy Elimination de l'insoluble. 1 - - 7 Addition de ) Précipitation ou extraction polyinhibiteur sélective du complexe Poly I1. PolyI1- E1. Additions successives de Poly I2, Poly I etc. Séparation des complexes Poly I,- E2 > Poly 5- 13 -- 0 etc 5 t Recyclage Reeyelage de Poly I1 Dissociation du complexe Poly I1 E1. E1 > E2, E3 - extraits bruts 8 / ~ C Chromatographie d'affinité de E1,E2, 2 etc..... t Enzyme s pures. I1 est donné ci-après des exemples qui illustrent l'invention à titre non limitatif. Exemple 1 Précipitation sélective de la trypsine à partir d'un mélange de trypsine, chymotrypsine et ribonucléase, à l'aide de mélange hydroorganiques à base le méthanol. On place à + 4 OC un mélange à 5 g/1 de trypsine, chymotrypsine et ribonucléase du pancréas. On ajoute progressivement du méthanol sous agi station en abaissant la température de manière à obtenir un # #T de 1,2 C pour 50 ml de méthanol ajouté par litre de solution initiale. Dans ces conditions la trypsine précipite d'abord à -10 C, pour 33% en méthanol; le gain d'activité spécifique par rapport au produit initial est de 10%. La chymotrypsine et la ribonucléase précipitent ensemble à -190/-200C, dans un milieu hydroorganique contenant 49 à 50% de méthanol, de, constante diélectrique 75,5.Le gain en ac tivité spécifique de la ribonucléase est de + 32,5X- Le point de précipitation est atteint sans dénaturation et les précipités se redissolvent parfaitement sans perte d'activité enzymatique. On obtient, en outre, une purification simple par cette voie, puisque le gain d'activité spécifique est supérieur à 10ss. Exemple 2 Purification de la subtilopeptidase A commerciale par traitement à basse température dans un mélange eau-éthylène glycol. On place à +4 0C une solution à 50 g/l de subtilopeptidase A commerciale (de type Sigma), puis l'additionne d'éthylène glycol en abaissant la température jusqu'à obtention d'un mélange eau-éthylèneglycol à 50-50, de constante diélectrique de 80,7 à -20"G. A la température de -200C, la solution reste limpide et l'enzyme n'est pas dénaturée. On ne constate aucune amélioration de l'activité spécifique. On maintient alors la température à -200C et on ajoute de l'éthylène glycol jusqu'à 60% On obtient alors l'apparition d'un précipité, séparé par centrifugation. L'enzyme demeure quantitativement en solution et le gain en activité spécifique est de 12%.L'analyse poussée de la fraction enzymatique par les tests d'homogénéité en gel de polyacrylamide, par électrofocalisation et en ultracentrifugation analytique permet de conclure à l'obtention d'une molécule totalement purifiée. Exemple 3 O yinhibiteur spécifique de la chymotrypsine, composé de polyoxyéthylène glycol substitué par du D-tryptophane ou de laT)ghénylalanine. On agite une partie de polyoxyéthylène glycol pendant 24 heures à la température ordinaire dans du toluène contenant 100 parties de phosgène. On isole le dichloroformiate formé par évaporation de la solution. On ajoute une quantité stoechiométrique de ce composé à une solution de D-tryptophane dans le bicarbonate de sodium 1M. Après 2 heures d'agitation à la température ordinaire, la réaction est quantitative ; on acidifie par l'acide chlorhydrique concentré jusqu'à pH 2,5. On évapore -sous vide la solution et reprend le résidu par du méthanol ou de 1' acétone. On élimine le chlorure de sodium en excès par filtration. Le filtrat évaporé fournit le polyoxyéthylène glycol-di tryptophane. Le procédé peut être mis en oeuvre avec tous les polYoxyéthy- lène glycols des poids moléculaire compris entre 200 et 10.000. Ces différents inhibiteurs ne diffèrent que par leur poids moléculaire. Ils sont solubles dans l'eau, le méthanol, méthanol, l'acétone, l'éthylène glycol et les mélan ges hydroorganiques correspondants, en toutes proportions. L'addition de polyoxyéthylène glycol-di tryptophane de poids moléculaire 10.000, à une solution de chymotrypsine à 5 g/litre ou à une solution de pancréatine commerciale ou à un extrait de pancréas broyé à -10 C dans un mélange eau-éthylène glycol à 30%, permet après activation des zymogènes de précipiter sélectivement un complexe poly I-chymotrypsine. Le précipité est repris par une solution d'acide chlorhydrique à pH = 3 et la chymotrypsine est isolée par précipitation acétonique. On isole la chymotrypsine, avec un rendement supérieur à 90 , et le poly I est récupéré par évaporation sous vide du surnageant, pour être recyclé. Exemple 4 -Isolement de trypsine, chymotrypsine et ribonucléase pures par chromatographie d'affinité "en cascade" d'un extrait pancréatique. On obtient un extrait pancréatique, soit par la précipitation classique, soit par précipitation avec un mélange de poly inhibiteurs sélectifs de la trypsine, de la chymotrypsine et de la ribonucléase. Les enzymes pures sont isolées à partir du mélange brut par une chromatographie d'affinité "en cascade" mettant en oeuvre les étapes suivantes les inhibiteurs spécifiques de la chymotrypsine, de la trypsine et de la ribonucléase sont fixés sur du Sepharose-4 B. substitué par l'acide 6-aminocaprolque, après activation par le bromure de cyanogène, selon leprotocole décrit par CUATHECASAS. P(J. Biol. Chem. 1970, 245, 3055). Pour la chymotrypsine. on fixe l'ester méthylique du D. Tryptophane, préparé selon la méthode décrite par BOISSONNAS (Hel. Chim. Acta., 1958, 200, 1967), sur 1'2-aminocaproylsépharose. La fixation s'effectue en dissolvant 255 mg de l'ester méthylique du D. tryptophane dans 40 ml d'eau distillée; on ajoute 50 ml dtg -aminoeaproylsépharose et on amène à pH = 4,7 par addition d'HCl. IN. Le couplage s'effectue sur 20 heures à- 200C, en présence 'de cyclohexyy1-1-(morpholino-2)-3 éthyl-4 carbodiimide méthyl paratoluène sulfonate Après lavage à l'eau, -le support est placé dans une colonne et équilibré en tam- pon tris 0,05 M-pH = 8. On peut fixer sur 1' -aminocaproyl sépharose, l'amide du D-tryptophane ou l'ester méthylique de la D phénylalanine, ou l'amide de la D phénylalanine. Ces derniers inhibiteurs évitent tous risques d'interaction avec la ribonucléase. Pour la trypsine, on fixe l'ovomucoïde, à raison de 280 mg pour 25 ml d'#-aminocaproyl sépharose, à pH = 4,7 en présence de 1,4g de carbodiimide soluble. La réaction dure 3 Jours à la-température- ordinaire sous agitation. La colonne est équilibrée en tampon tris 0,05 M à pH = 8,6. On peut fixer sur 1' -aminocaproyl sepharose, l'inhibiteur trypoïque de Kunitz, la D ou la L arginine, la D ou la L lysine, la para aminobenzamidine. Pour la ribonucléase, on fixe sur lt #-aminocaproyl sépharose, par des techniques identiques aux cas ci-dessus, la thymidine 5'(ester para aminophénylique), ou l'adénosine 5'(ester para aminophénylique) monophosphate, ou la cytidine 5' (ester para aminophénylique) monophosphate, ou la 5' (4-aminopnényl phosphoryl) urine 2(3') phosphate ou l'uridine S'(ester para aminophénylique) monophosphate. La colonne est équilibrée en tampon tris 0,05 M - pH L'extrait brut correspondant au mélange des trois enzymes est passé successivement sur les 3 cuves (ou colonnes) contenant les supports spé- cifiques respectivement de la chymotrypsine, de la trypsine et de la ribonucléase.Pour un rendement optimum, on passe le mélange initialement sur la colonne spécifique de la ribonucléase, les 2 autres enzymes étant sous forme de zymogènes. On active ensuite les 2 zymogènes à la sortie de la colonne "ribonucléase" et on sature la trypsine par la para aminobenzamidine, avant passa- ge sur la colonne "trypsine"; l'effluent est enfin passé sur la colonne "chy- motrypsine". La présence de la para-amino-benzamidine, inhibiteur de la trypsine, permet d'éviter les autolyses, causes de perte d'efficacité et de rendement. Les élutions sont faites par l'acide acétique 0,1 M. pH = 3. Pour des colonnes de 11 cm x 2,5 cm, l'élution est quantitative sur 5 ml d'éluant, à un débit de 25 ml/h. Les enzymes obtenus sont plus purts que les produits purs commerciaux de référence. La colonne de chymotrypsine fixe, dans ces conditions, 150 mg d'enzyme pure pour 50 ml de support. REVENDICATIONS 1- Procédé de préparation rapide d'enzymes purifiées par extraction sélective caractérisé en ce qu'on effectue une extraction sélective par affinité à laide de nol-inhibiteurs formant un complexe rolyinhibiteur- enzyme et provoquant ainsi la précipitation sélective des enzymes ou permettant leur extraction sélective, les dits polyinhibiteurs étant initialement solubles dans un milieu hydroorganique. 2- Procédé de préparation rapide d'enzymes purifiées par extraction sélective selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on extrait par isolement l'enzyme pure à partir du complexe formé entre le poly inhibiteur et l'enzyme, le dit complexe polyinhibiteur-enzyme étant dissocié à laide de variations du pH et de la force ionique, dans des conditions telles que le poly inhibiteur soit directement recyclable. 3- Procédé de préparation rapide d'enzymes purifiées par extraction sélective, selon la revendication 1 ou 2, d'un mélange d'enzymes; caractérisé en ce qu'on traite le dit mélange d'enzymes par plusieurs polyinhi- biteurs- spécifiques des composants du mélange, le dit traitement étant conduit en cascade de manière telle que les différentes enzymes du mélange initial soient successivement séparées. 4- Procédé de préparation rapide d'enzymes purifiées par extraction sélective caractérisé en ce que les nolrinhibiteurs sélectifs mis en oeuvre sont choisis parmi le groupe constitué par les polyinhibiteurs, sélectifs, activés par un halogénure de cyanogène, le phospène, un halogénure de sulfuryle et un halogénure de thionyle, constitués par des molécules à chat- nes aliphatiques polyfonctionnelles, ayant au moins un groupe fonctionnel à chaque extrémité. 5- Procédé de préparation rapide d'enzymes purifiées par extraction sélective selon la revendication 4 caractérisé en ce que les polyinhi- biteurs sélectifs sont choisis parmi le groupe constitué par les polyoxyalkylène glycols, tel le polyoxyéthylène, les poly alkylène glycols tels le poly éthy lène glycol et le poly propylène glycol, les chitosanes et produits dthydroly- se partielle de la chitine, les dextrans, les polymaléiques, les poly amino acides de type poly glutamique, poly lysine, poly aspartique et les polymère-s mixtes tels les polymères lysineglutamique. 6 Procédé de préparation rapide d'enzymes purifiées par extraction sélective selon la revendication 4, quand l'enzyme est la chymotrypsine, caractérisé en ce que le polyinhibiteur est choisi parmi le groupe constitué par la D-phénylalanine et le D-tryptohane. 7- Procédé de préparatioll rapide d'enzymes purifiées par extraction sélective selon la revendication 4, quand l'enzyme est la trypsine, caractérisé en ce que le polyinhibiteur est choisi parmi le groupe constitué par l'ovomucoide, l'inhibiteur de Künitz, la D ou L arginine, la D ou L lysine, et la para aminobenzamidine. 8- Procédé de préparation rapide d'enzymes purifiées par extraction sélective selon la revendication 4, quand l'enzyme est la ribonucléase, caractérisé en ce que le polyinhibiteur est choisi parmi le groupe constitué par la thymidine '5'(ester para aminophénylique) ,l' adénosine 5' 5' -(ester para aminophenylique)monophosphate, le 5'- (4-am9nophénylphosphoryl ) uridine 2(3') phosphate et l'uridine 5'-(ester para aminophénylique) monophosphate. 9- Procédé de préparation rapide d'enzymes purifiées par extraction sélective caractérisé en ce que 11extraction sélective par affinité est précédée par une phase initiale de broyage tissus congelés ou de lyse des micro organismes congelés ### conduite en milieu hydroorganique à basse température, dont la constante diélectrique est invariante, et voisine de elle de l'eau à 25-30 C, c'est-à-dire voisine de 80 et en particulier comprise entre .Ti- et 42. 10- Procédé de préparation rapide d'enzymes purifiées selon la revendication 9, caractérisé en ce que les mélanges hydroorganiques appropriés sont choisis parmi le groupe constitué par les alcools inférieurs tels le méthanol et méthanol, les aIkylenes inférieurs glycols, tels l'éthylène glycol, les esters dtalkyles inférieurs, tels les acétates en particulier lta- cétate d' éthyle, les dialkyles inférieurs formamides tels le diméthylformamide et tout solvant miscible à l'eau, additionnés d'eau dans des proportions telles que la constante diélectrique soit invariante et voisine de 80. 11- Procédé de préparation rapide d'enzymes purifiées selon la revendication 9 ou 10, à partir d'un mélange de plusieurs enzymes, caractérisé en ce que par addition progressive de phase organique combinée avec un abaissement de température, à constante diélectrique invariante, on précipite sélectivement une enzyme. 12- Procédé de préparation rapide d'enzymes purifiées par extraction sélective suivant une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'on effectue une ultime purification par chromatographie par affinité par mise en oeuvre de passages en cascade. 15- Procédé de préparation rapide d'enzymes purifiées par extraction sélective selon la revendication 12, quand les enzymes à isoler sont la ribonucléase, la chymotrypsine et la trypsine purifiées à partir du pancréas, caractérisé en ce qu'on fixe d'abord la ribonucléase sur la colonne d' affinité à partir d' un mélange constitué par les deux zymogènes de la chymotrypsine et de la trypsine, la trypsine étant saturée par la para aminoben zidine, après activation des zymogènes et avant passage sur la colonne ttryp- sine, le support commun des trois colonnes étant 1'# I -aminocaproylsépharose, et les inhibiteurs selon la revendication 6.