Brevet FR2207761A1 — publié le 19740621

L'invention a pour objet un appareil d'électrophorèse préparative du genre de ceux dans lesquels le support est constitué par un gel, notamment un gel de polyacrylamide. L'électrophorèse sur gel d'acrylamide permet de séparer des dérivés biologiques trop semblables pour entre séparés par dtau tres moyens tels que les résines échangeuses d'ions ou les gels de filtration, et se révèle ainsi être une technique très appréciée des biologistes. Son application à ltéchelle préparative stest rapidement avérée d'un très grand intérêt, notamment dans la séparation des protéines insolubles et des protéines membranaires en présence de détergent ou, d'une manière générale, de deux protéines de poids moléculaires très proches. Elle permet de se procurer un matériel biologique pur en quantité suffisante pour des travaux de recherche ultérieurs. La mise en oeuvre des procédés d'électrophorèse amène des difficultés importantes, bien illustrées par le grand nombre d'appareils apparus jusqu'à ce jour. Les appareils d'électrophorèse du genre en question comprennent essentiellement, d'une part, un élément séparateur supérieur, généralement établi en gel d'acrylamide - refroidi ou non - imbibé de tampon et au sein duquel s'effectue une migration différentielle, d'autre part, faisant suite au gel séparateur, une chambre dite "d'élution" au niveau de laquelle les molécules déjà séparées sont entraînées en continu dès leur apparition X l'interface gel / chambre d'élution et, d'autre part, encore, des moyens propres à créer un champ électrique permettant la susdite migration. On sait que l'électrophorèse sur gel est un procédé de séparation qui met à profit simultanément les différences de dimension,de poids moleculaires et d'état ionique des dérivés biologiques mis en jeu ; on sait aussi que la nature et la texture du gel constitutif de l'élément séparateur supérieur peuvent être choisies dans des gammes de valeurs étendues qui accroissent les possibilités d'utilisation des susdits appareils. Toutefois, les performances finales de ceux-ci sont liées aux moyens de refroidissement éventuellement mis en oeuvre et, surtout, aux caractéristiques de la chambre d'élution.Il est essentiel de limiter le plus possible , au niveau de la chambre d'élution, des perturbations qui interviendraient sur la séparation électro phonétique initiale réalisée au niveau du gel séparateur ; en d'autres termes, il faut tendre à conserver le pouvoir de résolution obtenu dans le gel ; or, malgré la variété des systèmes proposés, aucune solution adoptée jusqu'à présent nwa été totalement satisfaisante. Ainsi, dans un premier type d'appareìls connus, la chambre d'élution est constituée par un logement en forme d'anneau cylindrique très plat, disposé à la sortie du gel de résolution, et limité inférieurement par exemple par un verre fritté. Le tampon d'élution pénètre latéralement dans cette cavité et le parcourt entièrement selon un flux radial en direction de moyens d'évacuation axiaux. Dans le cas d'un autre type d'appareils connus, la chambre d'elution est cloisonnée par un ensemble de chicanes propres à canaliser l'éluat qui pénètre et qui sort respectivement par une seule entrée et une seule sortie prévues sur-la chambre en balayant l'interface gel / chambre d'élution. Aucun de ces deux types d'appareils ne permet d'éviter de manière satisfaisante à la fois le placage des éléments séparés sur la face inférieure de la cellule et une dilution excessive. L'invention a pour but, surtout, de remédier à ces difficultés et de fournir un appareil d'électrophorèse du genre en question qui réponde mieux que ceux qui existent déjà aux divers desiderata de la pratique, notamment sur le plan des performances et du pouvoir de résolution. L'appareil d'électrophorèse préparative sur gel de polyacrylamide conforme à l'invention est caractérisé par le fait qu'il comprend une chambre d'élution qui se présente sous une forme générale de couronne conique, limitée supérieurement par la face inférieure plane du gel séparateur et inférieurement par une surface inclinée s'éloignant radialement de la face inférieure du gel séparateur en direction de moyens d'évacuation axiaux, ladite surfae étant formée par un élément en gel imbibé de tampon et coopérant à la formation du champ électrique, ladite chambre en forme de couronne conique qui est alimentée à sa périphérie en tampon d'élutlon est en outre limitée parallèlement à son axe par une paroi en matériau inerte. Mises à part les susdites dispositions, l'invention vise encore d'autres dispositions qui s'utilisent de préférence en meme temps et dont il sera plus explicitement question ci-après. Et elle pourra > de toute façon, être bien comprise à l'aide du complément de description qui suit et des dessins ci-annexés, lesquels complément et dessins sont donnés à propos d'un mode de réalisation avantageux. La figure 1 de ces dessins montre en coupe axiale un appareil du genre en question agence conformément à l'invention. La figure 2 montre à plus grande échelle une partie de lgap- pareil représenté figure 1. La figure 3 montre en coupe une variante de la partie représentée figure 2. Les figures 4 et 5 enfin sont-des courbes montrant des résultats d'expériences réalisées à l'aide de l'appareil de la figu- re 1. Selon l'invention et > plus spécialement, selon ceux des modes d'application, ainsi que selon ceux des modes de réalisation de ses diverses parties auxquels il semble qu'il y ait lieu d'accorder la préférence, se proposant d'établir un appareil du genre en question. on s'y prend comme suit ou de façon. analogue. On fait tout d'abord comprendre audit appareil d'électrophorèse un élément supérieur A de séparation, en gel d'acrylamide polymérisé et en forme de couronne cylindrique d'axe XY, audessous duquel se trouve une chambre d'élution E. L'élément A est disposé à l'intérieur d'un logement 1 > en forme de couronne cylindrique également d'axe XY, délimité intérieurement et extérieurement par deux parois > respectivement 2 et 3, faisant partie respectivement sur une partie de leur longueur d'un élément de refroidissement intérieur 4 et d'un élément de refroidissement extérieur 5. L'élément de refroidissement intérieur 4 se présente sous la forme d'un tube cylindrique d'axe XY, fermé à son extrémité inférieure par un fond plat 4a et alimenté en liquide de refroi dissement par un ajutage 6 prolongé par une tubulure 7 qui s'ouvre à proximité du fond plat 4a. ledit liquide de refroidissement. après avoir parcouru cette tubulure, remontant le long de la paroi 2 puis sortant à l'extérieur par un ajutage 8, L'élément de refroidissement extérieur 5 se présente sous la forme d'un manchon cylindrique d'axe XY fermé par un fond plan 5a et alimenté en liquide de refroidissement par un ajutage 9, ledittliquide s'échappant par un ajutage 10 après avoir balayé la paroi 3 grâce à un système de chicanes constituées par une paroi cylindrique Il parallèle aux parois 2 et 3 et s'arrêtant comme montré figure 1 à une faible distance du fond 5a. Les parois 2 et 3 du logement 1, lequel au-dessus de l'élément A contient du tampon d'électrophorèse T, sont établies de façon telle qu'approximativement à partir du niveau de l'extré- mite supérieure de élément de refroidissement 5, le logement 1 prend une forme évasée résultant de la figure 1 et se traduisant par la formation d'un logement 12 compris entre le logement 1 et la partie supérieure de l'élément de refroidissement 4 ; les logements 12 et 1 comportent un ajutage d'évacuation 14 prévu sur la paroi 3. Le logement 12 qui communique à sa partie inférieure avec le logement 1,race à au moins un et de préférence quatre orifices 13 régulièrement répartis,est également rempli de tampon d 'électrophorèse. L'élément de refroidissement 4 est solidarisé de l'élément de refroidissement 5 gracie à un couvercle centreur 15 coopérant avec les parties supérieures rodées des parois 2 et 3 qui font respectivement partie desdits éléments 4 et 5. Les éléments 4 et 5 ainsi que le couvercle 15 sont de préférence établis en verre comportant des parties rodées aux endroits convenables pour assurer l'adaptation étanche du couvercle sur les parois 2 et 3. Comme montré s'jr la figure 1, la solidarisation du couvercle 15 avec les prolongements des parois 2 et 3 peut entre réalisée à l'aide de moyens de serrage agissant à la fois sur le prolongement en forme de bride de la paroi 3 et sur la partie correspondante du couvercle. Ces moyens peuvent être du type de ceux décrits plus loin. L'ensemble constitué par les éléments 4 et 5 et le couvercle 15 forme ce qu'on rappelle la "partie supérieure" de l'appareil. Afin d'éviter toute surpression dans le logement 1, on prévoit au moins un trou 16 dans le couvercle 15. Ceci étant, conformément à l'lnvention, la chambre d'élution E sé présente sous la forme générale d'une couronne conique limitée supérieurement par la face inférieure 17 de l'élément A et inférieurement par une surface inclinée 18, s'éloignant ra diaiement de la face 17, c'est-à-dire au fur et à mesure que l'on se rapproche de l'axe XY, en direction de moyens d'évacuation axiaux dont il va être question, la surface 18 étant formée par un élément 19 en gel imbibé de tampon ; ladite chambre E, qui est alimentée par sa périphérie supérieure en tampon d'élutiont est en outre limitée parallèlement à son axe par une paroi 26 en matériau inerte > située dans le prolongement de la paroi 2. L'élément 19 en gel imbibé -- ce gel peut être de même nature que celui constituant ltélément A -- est en forme de couronne cylindrique d'axe XY ; sa surface inférieure 21 est située dans une chambre 22 remplie de tampon d'électrophorèse T ; il est délimité latéralement par deux parois cylindriques d'axe XY, à savoir une paroi intérieure 23 et une paroi extérieure 24 qui sont refroidies respectivement par un élément de refroidissement 25 et un élément de refroidissement 26 dont elles sont des parties constitutives. La chambre 22 est alimentée en tampon grace à un ajutage 27, ledit tampon étant évacué grâce à un ajutage 28. L'élément de refroidissement 25 se présente sous la forme d'un bouchon conique dont la configuration résulte de la figure 1 et qui comporte une canalisation axiale 29 d'axe XY qui communique avec la chambre n et par laquelle est évacué l'éluat. L'élément 25 est alimenté en liquide de refroidissement par un ajutage 30, ledit liquide étant évacué par un ajutage 31, une chicane 32 en forme de paroi cylindrique d'axe XY étant comportée par l'élément 25 de façon telle que le liquide de refroidissement agisse d'abord sur la paroi 23 puis sur la canalisation 29. L'élément de refroidissement 26 entoure 11 élément 19 et est situé au-dessus de la chambre 22. il est alimenté en liquide de refroidissement par un ajutage 338 ledit liquide étant évacué par un ajutage 34 ; une chicane 35 en forme de bride perpendiculaire à XY et portée par la paroi extérieure 26a de l'élément 2b assure une bonne circulation du liquide de refroidissement Commé visible figure 1, la paroi 26a se prolonge vers le bas pour former la paroi latérale 22a et la paroi inférieure horizontale 22b de la chambre 22. La partie 22b comporte une bride 22c formant un entonnoir conique dont le sommet serait dirigé vers le bas et dans lequel vient s'adapter l'élément 25 dont la conicité correspond à celle dudit entonnoir.Toujours comme visible figure 1 > la paroi 26a se prolonge horizontalement pour former la paroi supérieure 26b de l'élément 26 et elle est reliée à la paroi 24 par la paroi inférieure 26c de l'élément 26. Cette paroi 26c délimite supérieurement la chambre 22, là où celle-ci n'est pas délimitée par la surface 21. La délimitation latérale intérieure de la chambre 22 est assurée > comme visible figure 1 > par le prolongement de la paroi 23 qui fait partie de l'élément de refroidissement 25. Il résulte de ce qui précède que les parois 24, 26a > 26b, 26c, 22a, 22b et la bride 22c forment une seule et unique pièce qui est de préférence établie en verre. L'ensemble constitué par la réunion de cette piece et de l'élément 25 forme ce qu'on appelle la "partie inférieurewde l'appareil. La susdite paroi inerte 20 est avantageusement formée par une pièce 36. avantageusement creuse, en verre, dont la surface supérieure 36a, de préférence rodée > s'applique contre le fond 4a également rodé. Sur cette pièce 36 peut être prévu à la surface supérieure 3ta, un moyen de centrage 36d qui s'adapte dans un moyen de centrage 4a complémentaire prévu sur le fond 4a (voir figure 2). La canalisation 29 est reliée à la chambre E par une nappe conique C située entre la pièce 36 -- qui comporte alors une pointe 36b dirigée vers le bas -- et une partie 25a évasée en forme de cEne appartenant à l'élément 25. Il serait toutefois également possible de remplacer la nappe C par une chambre annulaire plate telle que représentée figure 3 (la partie 25a est alors horizontale et la pointe 36b remplacée par une face plané 36c). L'alimentation de la chambre É se fait périphériquement à partir d'un réservoir 37 de tampon d'élution en forme de manchon d'axe XY formé entre la paroi extérieure de l'élément 5 et une paroi cylindrique 38 portée par la "partie inférieure" de l'appareil et constituant le prolongement de la paroi extérieure 26a de lXélémenv 26. La "part le inférieure et la "partie supérieure" de l'appe.- reii conforme à i'invention sont maintenues en place l'une par raifort à l'autre grâce a' des premiers moyens et à des seconds moyens de support qui peuvent être constitués respectivement par deux plaques S1 et S2 elles-mOmes portées par des tiges S3, la position des plaques S1 et S2 sur les tiges S3 étant réglable en hauteur. C'est la plaque S2 qui peut comporter les moyens de serrage dont il a été question à propos du couvercle 15. Ces moyens de serrage peuvent être constitués par trois éléments ou crochets 52 fixés par vissage au support S2 et qui s'encastrent sur les extrémités rodées de la paroi 3 et du couvercle centreur 15, les trois crochets étant répartis régulièrement sur le diamètre extérieur du couvercle. La seule pièce de l'appareil qui n'appartient ni à la partie supérieure, ni à la partie inférieure de l'appareil est constituée par la pièce 36. En rapprochant plus ou moins la partie inférieure de la partie supérieure, on agit sur l'épaisseur de la nappe conique C. Pour créer le champ électrique nécessaire au fonctionnement de l'appareil, on dispose deux- électrodes 40 et 41 en forme d'anneau respectivement dans le logement 1 et dans la chambre 22. L'électrode 40 est disposée juste au-dessous de la surface du tampon contenu dans le logement 1 et dont le niveau est limité supérieurement par l'ajutage 14 ; ses dimensions sont telles que le diamètre de l'anneau formé par l'électrode elle-meme coricide approximativement avec le milieu du gel séparateur, permettant ainsi l'établissement d'un champ électrique uniforme à l'intérieur du gel. Des ajutages 42 et 43 respectivement sont prévus pour relier les deux électrodes aux pâlies d'une source de tension. Il est avantageux de relier entre eux les différents éléments de refroidissement de l'appareil par des canalisations schématiquement représentées en 45 de façon à les alimenter sui van t les flèches F à partir d'une source de liquide refroidi commune. Il est également avantageux de relier par une canalisation 47, l'ajutage 14 de sortie du logement 1 à l'ajutage 27 d'entrée de la chambre 22. La circulation ainsi obtenue du-tampon d'électrophorèse empoche le pH de varier, aussi bien à l'intérieur du gel de résolution, que dans les réservoirs de tampon 1 et 22. L'alimentation en tampon d'élution du réservoir 37 est assurée par une canalisation 48 à partir d'un réservoir non représenté. L'alimentation de l'appareil en tampon d'électrophorèse est assurée par une canalisation 49 débouchant dans le logement 12. Il est avantageux, comme montré figure 1, et pour empêcher toute descente éventuelle du gel constitutif de l'élément A, de pouvoir disposer d'une pièce 36 différente de la pièce 36 susindiquée. comportant en plus une bride périphérique 50 en verre fritté de porosité suffisante pour n'opposer aucun obstacle au passage des particules séparées et dont la largeur est au moins égale à l'épaisseur e de l'élément séparateur A. Cette bride 50 est spécialement utilisée dans le cas d'une opération électrophorétique effectuée en présence d'un détergent quand la consistance du gel de polyacrylamide est trop faible. Quand le gel se tient solidement dans le logement 1, on utilise la pièce 36, sans bride frittée. Il est également avantageux de prévoir sur les parois 23 et 24 des protubérances 51 qui servent de points d'ancrage au gel constitutif de l'élément 19; pour garder les lignes de champ électrique uniformes, lesdites protubérances 51 de la paroi 26b ne dépassent pas les prolongements des parois 2 et 3 parallèles à Xy. il a été dit plus haut que le rapprochement de la partie inférieure de l'appareil de la partie supérieure de ce dernier permettait d'agir sur l'épaisseur de la nappe conique C. Ce rapprochement agit en même temps sur la largeur a de la fente périphérique P d'alimentation de la chambre E en tampon d'élution comprise entre la bride 50 (ou la face inférieure de l'élément A) et la paroi supérieure horizontale 26b délimitant supérieurement l'élément de refroidissement 26 (voir figure 2). Cette largeur a présente dans la pratique, une valeur qui estelle-mdme fonction de la valeur des débits d'élution et des champs électriques et qui présente généralement un ordre de grandeur de 3 mm. L'inclinaison de la surface 18 sur l'horizontale est, conformément à l'inventionsdéterminée de telle manière que si l'on désigne par R1 la largeur, et par h1 la hauteur maximum de la chambre d'élution (voir figure 3), on a dans la cellule d'élution de préférence La surface 18 peut éventuellement être faiblement incurvée. Le choix de la pente ou inclinaison de la surface 18 se fait en fonction du type d'électrophorèse pratiqué; c(est-à-dire l'électrophorèse à basse ou à haute tension. En d'autres termes, pour les conditions expérimentales identiques notamment pour un même débit d'élution, on a tendance à choisir une cellule agencée de telle manière que la valeur du rapport R1 R1 est plus petite quand la valeur de la tension est plus élevée. h1 rn outre, on prévoit avantageusement plusieurs jeux d'éléments 25 et de pièces 36 présentant respectivement des surfaces 25a et 36c correspondantes propres à délimiter des nappes C de forme variable. On peut ainsi, pour chaque type d'électrophorèse, choisir une cellule d'élution spécialement adaptée, en conservant toutefois le parallélisme entre les surfaces 25a et 36c. La chambre d'élution est remplie d'un tamis moléculaire discontinu, avantageusement de la marque "Biogel" ou de la marque "Sephadex" (par exemple Biogel P2 ou Sephadex G 25 > . La présence du tamis moléculaire a pour effet d'éviter les volumes morts, la diffusion, le remélange des produits séparés au niveau du gel A, autant de facteurs qui diminuent la dilution de l'éluat, et même de favoriser un déplacement des molécules en contribuant à éviter le placage de ces dernières sur la surface inférieure de la cellule. Le fonctionnement de l'appareil ainsi constitué est le suivant, étant entendu que cet appareil doit être soumis au préalable à une préélectrophorèse dont il va être question plus loin. La tension étant établie grâce aux électrodes 40 et .41 et le mélange biologique à fractionner introduit dans le tampon d'électrophorèse à la surface supérieure de l'élément A, les constituants dudit mélange subissent une migration différentielle à l'intérieur du gel constitutif de l'élément séparateur A, ce qui fait que ces constituants arrivent au niveau de la surface 17 à des moments décalés dans le temps les uns par rapport aux autres. Grâce au tampon d'élution balayant en permanence l'espace E, les molécules constitutives d'un composant du mélange ou "bande" sont immédiatement entrainées en direction de la nappe conique C et de la canalisation 29. Grâce à l'inclinaison de la surface 18, tout placage de particules sur le gel, constitutif de l'élément 19, est évité.C'est en raison de la présence de la pièce 36 et plus particulièrement grâce à la paroi 20 de cette dernière que l'on évite qu'une molécule donnée sorte du champ électrique créé par les électrodes 40, 41 tant qu'elle ne se trouve pas engagée dans la nappe conique C, les forces conjuguées du champ électrique et du flux de tampon d'élution assurant l'évacuation d'une telle molécule dans les meilleures conditions (qui sont conservées lorsque la nappe conique est remplacée par un anneau plat tel que montré figure 3). C'est en rapport avec la figure 2 qu'on a illustré avec plus de précision les forces agissant sur une molécule donnée apparaissant au niveau de la surface 17 (ou de la plaque 50). Une telle molécule ou particule sortant du gel est soumise à l'action des deux susdites forces, à savoir une force verticale t1 dirigée vers le bas, due au champ électrique uniforme et identique pour toutes les particules, et une force radiale f dirigée vers l'axe XY qui représente l'entraînement dû au flux d'élution. En raison de la géométrie de la chambre E, P varie et, pour deux particules extrêmes Pe et Pi situés respectivement au niveau de la périphérie de la chambre et, près de la paroi 20, on a - > - > - > - > fe > fi ; (fe étant la valeur maximum et fi la valeur minimum de cette force d'élution). Une particule sortant de l'élément A est donc soumise à la résultante des forces 21 et f. En sortant du gel au niveau de Pe la force f est prépondérante, alors qu'unie particule sortant en Pi est surtout soumise à 21 Les particules sortant du gel séparateur subissent un entraînement hydrodynamique sur le plan incliné 18 ce qui a pour but à la fois d'éviter le placage, et de favoriser le rapprochement des particules qui arrivent en fin de migration sur le même plan horizontal, En plus à la base de la paroi 20, P devient encore plus élevé ; du fait que l'ensemble de l'élut entrant par P doit être évacué suivant 29, entraînant ainsi efficacement toutes les particules P. Ceci étant, il convient de donner quelques précisions à propos de la préparation de l'appareil conforme à l'invention en vue de sa mise en oeuvre. Dans un premier temps. on prépare le gel constitutif de l'élément 19, ce gel étant polymérisé sur place entre les parois 23 et 24. Pour ce faire, on peut assembler l'élément 25 et la pièce constituée de l'élément'26 et de la chambre 22, l'ensemble étant posé renversé, par exemple sur un bouchon conique dont la conicité correspond à l'inclinaison de la surface 18, ce bouchon fermant ainsi l'espace réservé à l'élément 19 au niveau de ladite surface 18. Des moyens d'étanchéité ainsi que des moyens assurant l'horizontalité sont prévus. On introduit alors par l'ajutage 27, les solutions permettant d'obtenir le gel. A titre d'exemple, on signale que la composition de ces solutions peut être la suivante Solution 1 : Cyanogum 41 (mélange commercial d'acrylamide et de bis-acrylamide) 40 g Dodécylsulfate de sodium 200 mg Tampon tris-phosphorique M pH = 8,7 (avec EDTA 2,10'2 M) 20 mi Eau distillée q.s.p. 150 ml Solution 2 : Persulfate d'ammonium 250 mg 2-diméthylaminopropionitrile 0,1 ml Eau distillée q.s.p. 50 ml Les deux solutions sont mélangées juste avant l'emploi. On peut préparer dans un deuxième temps, ou simultanément, le gel constitutif de l'élément A en assemblant les éléments de refroidissement 4 et 5 à l'aide du couvercle 15 et la plaque S2 équipée des crochets et, après avoir fermé à sa base l'ensemble ainsi constitué qui forme la partie supérieure de l'appareils par exemple à l'aide d'une feuille de cellulose régénérée de la marque Cellophane et, après avoir placé l'ensemble sur un plan parfaitement horizontal, on introduit par le logement 12, à travers les trous 13,les solutions pour la préparation du gel. On obtient facilement un gel de surface parfaitement plane et de texture régulière si la réaction de polymérisation est lente. A titre d'exemples, on indique ci-après deux expériences de préparation du gel à l'aide de deux solutions désignées par "Solution 3" et "Solution 4tut. Solution 3 : Essai 1 Essai 2 Acrylamide à 60 % (dans l'eau) 26,6 ml 53,3 mi N,N'-méthylène-bis-acrylamide 0,6 g 1,2 g Tampon tris-phosphorique M pH = 8,7 (avec EDTA. L'.10 M) 10 ml 10 ml Dodécylsulfate de sodium 200 mg 400 mg Eau distillée q.s.p. 150 ml 300 ml Solution 4 : Essai 1 Essai 2 Persulfate d'ammonium 400 mg 800 mg 3-diméthylaminopropionitrile 0,08 ml 0,16 ml Eau distillée q.s.p. 50 ml 100 ml On mélange les deux solutions juste avant l'emploi. Les quantités de catalyseurs utilisées permettent une polymérisation lente, pour les concentrations d'acrylamide et de bisacrylamide données. Toutefois, si l'on veut encore ralentir la réaction, on peut faire circuler l'eau dans les éléments 4 et5. Pour obtenir une surface de gel parfaitement plane, on dépose une couche d'eau ou de tampon d'électrophorèse (30 à 40 ml) sur la solution d'acrylamide introduite précédemment dans l'appareil ; cette eau est versée très lentement par les trous 16, par exemple à l'aide d'une pipette prolongée par un tube capillaire en téflon, qui évite que l'eau ne descende trop brutalement. La polymérisat.iondu gel se fait de bas en haut et s'arrete selon une surface nette séparant la partie polymérisée de la phase liquide supérieure. Ce liquide est ensuite aspiré par exemple à l'aide d'une pompe à eau et la surface de gel est recouverte par du tampon d'électrophorèse. La composition de ce tampon peut être la suivante Tampon tris-phosphorique M pH = 8,7 50 ml (avec EDTA : 2.10 M) Dodécylsulfate de sodium à 2 % 50 ml Eau distillée q.s.p. 1000 ml Les deux gels étant ainsi formés, on assemble la partie supérieure et la partie inférieure de l'appareil. Pour ce faire, on fixe la partie inférieure sur la plaque inférieure horizontale S1. A la sortie de la canalisation 29, on peut brancher un tuyau capillaire par lequel sortira le tampon d'élution (qui peut avoir la même composition que celui d'électrophorèse, ou un autre selon le type d'électrophorèse). Sur la plaque S2 du support de l'appareil, on fixe la partie supérieure de l'appareil, la feuille de "cellophane" étant enlevée ; on place en outre la pièce 36 sur un tampon de laine 46 de verre disposé sur la surface 25a et représenté schématiquement figure 2, ce tampon étant destiné à empêcher le passage du biogel dans la canalisation 29 ; lorsqu'on rapproche l'une de l'autre les plaques Sl et S2, la pièce 36 vient se placer contre le fond 4a, son centrage étant assuré par les moyens 36d et 4d. La position de la plaque S2 est ensuite réglée en hauteur sur les tiges S3 par rapport à la plaque S1 à un niveau correspondant à la valeur a choisie pour la fente P. Les plaques, supérieure S2 et inférieure St, du support de l'appareil comportent un système de fixation- assurant la coaxialité des pièces qu'elles portent. L'espace resté libre dans la chambre d'élution E est ensuite rempli par du biogel P2 équilibré dans le tampon d'élution. On branche ensuite le circuit de refroidissement décrit plus haut de l'ensemble de l'appareil. L'appareil ainsi constitué doit être soumis à une opération de préélectrophorèse avant d'être prêt à l'emploi. Cette opération est nécessaire pour éliminer les produits provenant de l'acrylamide et absorbant à une longueur d'onde de 280 nm. Pour ce faire, on dépose sur le gel constitutif de l'élément A le mélange suivant Bleu de bromophénol à 0,05 % (dans l'eau) 0,3 ml Tampon d'électrophorèse 4,5 ml Glycérol 0,2 ml Le dépôt peut être fait à l'aide d'une pipette de 10 ml prolongée par un capillaire en téflon qui, passant par un des trous 16 ou 13 descend juste à la surface du gel. On fait passer un courant de 100 mA et on fait circuler le tampon d'électrophorèse (débit environ 300 ml/h). Le niveau de migration du bleu permet de repérer la portion de gel débarrassée des produits qui absorbent à la longueur d'onde de 280 nm. quand le bleu a pénétré d'environ 1,5 à 2 cm, on arrête le courant ; on remplace le tampon de la chambre supérieure par du tampon neuf, puis le mélange de protéines à séparer est déposé de la même façon que le bleu. Le mélange de protéines utilisé pour mettre en évidence les qualités de l'appareil conforme à l'invention est constitué par un ensemble de protéines d'origine membrnaire représentant l'un des cas les plus difficiles d'électrophorèse préparative, à sa- voir l'apoprotéine du protéolipide de Folch-Pi, isolé à partir de la myéline. Ld première difficulté réside dans le nombre de fractions à séparer et la proximité des bandes protéiques. En effet, la sus dite apoprotéine comprend une fraction principale de poids moléculaire 25 000, suivie de très près d'une fraction moins im- portante de poids moléculaire 20 000 à 21 000. Il existe aussi dans le mélange une fraction de plus faible poids moléculaire (à savoir 10 000 à 14 000). Une seconde difficulté provient du fait qu'il faut séparer ces protéines en milieu contenant du dodécylsulfate de sodium dont la présence augmente la conductivité du gel, donc l'effet Joule ; or, un refroidissement trop grand du gel n'est pas possible car le dodécylsulfate cristallise au froid. La diffusion est donc plus importante que dans le cas d'électrophorèse sans ledit dodécylsulfate. On opère dans les deux exemples qui sont donnés plus loin avec 5 ml d'une solution de protéines, ce qui correspond à des quantités de protéines comprises entre 30 et 60 mg. Dans le cas de l'appareil utilisé au cours de ces essais, le gel séparateur est constitué par une couronne cylindrique de diamètre extérieure et intérieur respectivement de 80 et 40 mm, la hauteur étant de l'ordre de 50 à 80 mm. Le tableau ci-dessous donne les conditions d'électrophorèse de deux essais de séparation des trois fractions voisines mentionnées précédemment. Les gels de résolution utilisés sont respectivement ceux décrits plus haut. Le gel constitutif de l'élément 19 est le même pour les deux expériences. Essai 1 Essai 2 Tampon d'électrophorèse tris-phosphorique tris-phosphorique 0,05 M pH = 8,7 0,05 M pH = 8,7 EDTA. lo M EDTA. 10-3 M dodécylsulfate de dodécylsulfate de Na : 0,1 X Na : 0,1 % Gel de résolution 200 ml 400 ml Protéines déposées densité optique densité optique=10 280 nm = 4,4 quantité : 5 ml quantité : 5 ml rourant pendant l'électrophorèse 40 mA 100 mA Courant pendant 1 'élutlon 150 mA 100 mA Débit de l'élution 10 ml/6 min 10 ml/6 min Durée de l'expérience j 24 h 24 h Les courbes d'élution des deux essais obtenus à l'aide de procédés classiques sont représentées respectivement par les figures 4 et 5. Dans les deux cas, les protéines récupérées dans les trois pics élués A4, B4 et C4 de la figure 4 et A5, B5 et C5 de la figure 5 représentent 82 % du produit de départ. Ce rendement ne signifie pas qu'il y a une perte au cours de l'élution ; en effet, on observe que le bleu est complètement entraîné par le flux d'élution-et ne reste pas accroche au gel 19. Comme les protéines migrent plus lentement que le bleu, ce flux est certainement suffisant pour les éluer totalement. On sait d'ailleurs que dans les échantillons déposés, il existe un faible pourcentage de protéines agrégées qui ne sortent pas du gel. Pour montrer qu'on peut obtenir préparativement les trois fractions pures, on a rassemblé les fractions éluées comme l'indiquent les figures 4 et 5, et fait leur analyse électrophorétique. L'expérience a montré que les trois fractions obtenues sont pures comparativement au produit de départ. En suite de quoi et quel que soit le mnde de réalisation adopté, on dispose ainsi d'un appareil d'électrophorèse préparative dont les caractéristiques résultent suffisamment de ce qui précède pour qu'il soit inutile dPinsister à ce sujet et qui présente de nombreux avantages, dont notamment - celui de permettre une très bonne élution sans phénomène de placage et sans dilution gênante de l'éluat, - celui de permettre un fonctionnement excellent grâce au refroidissement efficace de l'appareil. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'+nvention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variante. REVENDICATIONS 1, Appareil d'électrophorèse préparative dans lequel le support est constitué par un gel, notamment de polyacrylamide, caractérisé par le fait qu'il comprend une chambre d'élution qui se présente sous une forme générale de couronne conique, limitée supérieurement par la face inférieure plane du gel séparateur et inférieurement par une surface inclinée s'éloignant radialement de la face inférieure du gel séparateur en direction de moyens d'évacuation axiaux, ladite surface étant formée par un élément en gel imbibé dze tampon et coopérant à la formation du champ électrique, ladite chambre en forme de couronne conique qui est alimentée à sa périphérie en tampon d'élution est en outre limitée parallèlement à son axe par une paroi en matériau inerte. 2. Appareil d'électrophorèse préparative selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'inclinaison sur l'hori- zontale de la surface du gel délimitant inférieurement la chambre d'élution, se détermine de telle manière que si l'on désigne par R1 la largeur de la chambre d'élution, et par h1 la hauteur maximum de ladite chambre, on ait de préférence 3. Appareil d'électrophorèse préparative caractérisé par le fait que la chambre d'élution est alimentée en tampon d'élu- tion par une fente périphérique dont ltépaisseur est réglable. 4. Appareil d'électrophorèse préparative selon l'une quelconque des revendications l à 3, caractérisé par le fait que la chambre d'élution contient un tamis moléculaire. 5. Appareil d'électrophorèse préparative selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que la chambre d'élution est reliée par une nappe conique à une canalisation d'évacuation de l'éluat, coaxiale à la chambre d'élution. 6. Appareil d'électrophorèse préparative selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que la chambre d'élution est reliée par un volume en forme d'anneau plat à une canalisation d'évacuation de l'éluat, coaxiale à la chambre d'élution. 7. Appareil d'électrophorèse préparative selon l'une quel conque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que élément séparateur en gel de polyacrylamide se présente sous la forme d'une couronne cylindrique coaxiale à la chambre d'élu tion et délimité intérieurement et extérieurement par deux pa rois faisant partie respectivement, sur une partie de leur lon gueur, d'un élément de refroidissement intérieur et d'un élément de refroidissement extérieur et que le gel de polyacrylamide constitutif de la surface inclinée délimitant inférieurement la chambre d'élution est également en forme de couronne cylindrique coaxiale à la chambre d'élution et::déllmité latéralement par deux parois cylindriques refroidies respectivement par un élé ment de refroidissement intérieur et un élément de refroidissement extérieur dont elles sont des parties constitutives. 8. Appareil d'électrophorèse préparative selon l'une quel conque des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que la paroi en matériau inerte délimitant la chambre d'élution parallèlement à son axe est constituée par une pièce, de préfé rence creuse et en verre, qui coopère avec l'élément de refroi dissement intérieur du gel constitutif de la paroi inclinée,dé limitant inférieurement la chambre d'élution pour former la nappe conique ou le volume en forme d'anneau plat reliant la chambre d'elution aux moyens d'évacuation axiaux de l'éluat, ladite pièce étant susceptible d'être associée à une bride péri phérique en verre fritté s'appliquant contre la surface inté rieure du gel séparateur en polyacrylamide. 9. Appareil d'électrophokèse préparative selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait que la paroi en matériau inerte délimitant la chambre d'élution est située dans le polongement de la paroi délimitant intérieurement le gel séparateur de polyacrylamide. 1 a Appareil d'électrophornse préparative selon l'une quel- conque des revendications 1 à 9 caractérisé par le fait que le gel constitutif de la surface inclinée délimitant inférieu rement la chambre d'élution est situé, par sa surface inférieu re, dans une chambre remplie de tampon d'électrophorèse et que le gel séparateur en polyacrylamide est surmonté d'une couche de tampon d'électrophorèse, le champ électrique d'électrophorèse étant créé à l'aide de deux électrodes reliées respectivement aux pâles + d'une source de tension et situées respectivement dans le tampon d'électrophorèse surmontant le gel de séparation supérieur et dans la chambre remplie de tampon d'électrophorèse dans lauelle est située la surface inférieure du gel constitutif de la paroi inclinée délimitant inférieurement la chambre d 'élution. 11. Appareil d'électrophorèse préparative selon l'une quelconque des revendications 1 à ICI caractérisé par le fait que la chambre d'élution est alimentée en tampon d'élution par une fente périphérique qui est en communication avec un réservoir7 qui forme un manchon entourant l'appareil et qui est délimitée inté rieurementJpar la paroi extérieure de l'élément de refroidissement entourant extérieurement le gel d'acrylamide supérieur et extérieurement par une paroi cylindrique coaxiale aux autres parties de l'appareil portée par l'élément de refroidissement entourant extérieurement le gel comportant la surface inclinée qui délimite inférieurement la chambre d'élution. 12, Appareil d'électrophorèse préparative selon l'une quelconque des revendications 1 à li caractérisé par le fait qu'il se compose, d'une part. d'une partie dite "partie inférieure" comprenant le gel formant la surface inclinée qui délimite inférieurement la chambre d'élution, les éléments de refroidissement extérieur et intérieur par rapport à ce gel, la chambre contenant le tampon d'électrophorèse dans lequel baigne la surface inférieure du susdit gel et la paroi délimitant extérieurement le réservoir de tampon d'élution et, d'autre part, une partie dite "partie supérieure" qui comprend le gel séparateur en polyacrylamide ainsi que les moyens de refroidissement intérieur et extérieur entourant ledit gel séparateur en polyacrylamide et réunis l'un à l'autre par un couvercle centreur, la "partie inférieure" et la "partie supérieure" étant fixées respectivement sur des moyens de support individuels dont la positon en hauteur est ré qlafle sur des moyens communs, ce qui permet de régler la posi tio de la partie inférieure" par rapport à la "partie supérieure" au moment du montage de l'appareil et de fixer ainsi la valeur de la largeur de la fente d'alimentation périphérique de la chambre d'élution,et par la même occasion 1'épaisseur de la nappe conique ou du volume en forme d'anneau cylindrique reliant la chambre d'élution à la canalisation d'évacuation de 1'élut. 13. Appareil d'électrophorèse préparative selon l'une quelconque des revendications 1 à 12. caractérisé par le fait que les prolongements vers le haut des parois délimitant intérieurement et extérieurement le gel séparateur en polyacrylamide sont conformés-de façon telle qu'ils forment un premier logement ren-fermant l'élément séparateur en gel de polyacrylamide et; audessus de cet élément, la couche de tampon d'électrophorèse ainsi qu'un deuxième logement situé entre le premier et la partie supérieure de l'élément de refroidissement intérieur par rapport au gel séparateur en polyacrylamide, le renouvellement en tampon d'électrophorèse frais du susdit premier logement étant assuré à partir du susdit second logement. 14. Appareil d'électrophorèse préparative selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé par le fait que, mis à part les éléments en gel de polyacrylamide; les éléments constitutifs de la partie supérieure et de la partie inférieure dudit appareil sont établis en verre.