Brevet FR2230346A1 — publié le 19741220

La présente invention on concerne l'application de l'éthylène-imine connue comme inactivateur dans la préparation de substances immunisantes (antigènes et immunogènes) pour preparations pharmaceutiques, par exemple pour vaccins viravx et bactériens. Il est connu que iton doit utiliser pour la préparation des compositions pharmaceutiques mentiornées ci-dessus, des procédés et des agents d'inactivation qui, une part, détruisent a coup sûr la pathogènicité des virus ou bactéries à utiliser, mais laissent dtautre part entièrement intactes leurs propriétés antigènes. Pcur obtenir des préparations à coup sûr inactivées, ce processus doit avoir lieu dans une réaction de premier ordre, de manîère que le moment de la perte totale de la pathogénicité puisse être déterminé avec sûreté.Il nten est pas ainsi dans le cas de nombreux procédés usuels d'inactivisation (chaleur, lu mière ultraviclette) et de nombreux inactivateurs classiques (formaldéhyde, peroxyde d'hydrogène, p-propioîactone). Dtautres substances connues, qui nront pas cet inconvénient, sont peu stables du point de vue chimique, par exemple les acyléthylène- imines(brevet de la République Fédérale d'Allemagne N 1 041 648), ou bien elles nécessitent une plus longue durée d'action etjou de plus grandes concentrations, par exemple l'éthyléthylène- imine (voir brevet français N0 70.17 450jX La Demanderesse vient de découvrir que l'éthylène-imine connue de formule peut être utilisée comme inactivateur dans la préparation de substances immunisantes (antigènes et immunogènes) pour compositions pharmaceutiques. r. est surprenant de constater que l'éthylène-imine ne pas les inconvéniants, mentionnés ci.dessus, des inactivateurs connus. L'éthylène-imine est très facile à obtenir du pcint de vue technique elle est très stable et elle se conserve bien, et elle permet drobtenir dans une réaction du premier ordre une inactivation rapide et strie de micro-organismes infectieux sans nuire à leur antigénicité ou à leurs propriétés immunogènes. DU fait de la courte période de réaction, pour une concentration relativement faible, l'lnactivation de la matière à inactiver est extrêmement douce. Btutilisation de l2éthylène-imine comme agent inactivateur dans la préparation de substances immunisantes pour préparations pharmaceutiques représente donc un enrichissement de la pharmacie. l'éthylène-imine est ajoutée aux suspensions virales ou bactériennes à inactiver jusqu'à des concentrations finales de 0,005 à 2 % (volume/volume), de préférence 0,01 à 0,5 % (volume/volume). Suivant les conditions de l'essai, la durée de réaction va de quelques heures à deux jours. On opère à des températures de O à 450CI de préférence de 20 à 370C. les souches de virus et bactéries inactivées à l'éthy lène-imine conformément à ltinvention peuvent être utilisées aussi bien pour la prophylaxie que pour le traitement dtinfec- tions à virus et bactéries tant en médecine humaine quten médecine vétérinaire. Des antigènes viraux ou bactériens obtenus par le procédé de l2invention peuvent être formulés par les procédés classiques et administrés sous-forme de solution, sirop, émulsion, suspension, composition pulvérisable, pommade, patte, crème, lotion, aérosol, comprimés, etc. les formulations sont préparées de façon connue, par exemple par dilution des préparations virales ou bactériennes inactivées conformément à ltinvention avec des solvants et/ou des supports inertes non toxiques,solides, semi-solides ou liquides convenables, le cas échéant en utilisant des émulsifiants et/ou des dispersifs, des agents de pulvérisation et des gaz propulseurs, ainsi que des agents stabilisants appropriés. A titre de solvants, supports, émulsifiants et disper sifs, on peut mentionner les composés suivants Eau, solvants et diluants organiques non toxiques tels que paraffines (par exemple fractions de pétrole), huiles végétales (par exemple huile d'arachide, huile de césame), alcools (par exemple éthanol, glycérine), glycols (par exemple propylèneglycol, polyéthylène-glycol) et eau ; supports solides, tels que poudres minérales naturelles (par exemple silice et silicates fortement dispersés), sucres (par exemple sucre de canne, lactose et sucre de raisin) ; alumine, polysaccharides (par exemple de::trane, gélose) ; émulsifiants non ionogènes et anionogènes (par exemple esters polyoxyéthyléniques d'acides gras, éthers polyoxyéthyléniques d'alcools gras, alkylsulfonates et arylsulfonates) ; dispersifs (par exemple lignine, liqueurs résiduaires sulfitiques, méthylcellulose ,amidon et polyvinylpyrrolidone) et lubrifiants (par exemple stéarate de magnésium, talc, acide stéarique et laurylsulfate de sodium). A titre d'agents stabilisants, on indique des aminoacides, des sucres, des protéines, des polysaccharides et des polyalkylene-glycols. Ces agents stabilisants peuvent entre ajoutés tant en solution aqueuse qu'à l2état lyophilisé. les souches virales ou bactériennes inactivées conformément à ltinvention et les médicaments obtenues à partir de ces souches peuvent sistre administrés de façon usuelle, par exemple par voie orale, intramusculaire, intrapéritonéale, sous-cutanée, locale, notamment sur toutes les muqueuses de la peau humaine et de la peau des animaux. Exemple 1 On ajoute une solution neutralisée à 2 fo (volume/volume) d'éthylène-imine à une solution du virus de la fièvre aphteuse, type C (pH 8,0) sous la forme du liquide centrifugé d'une culture inoculée de cellules permanentes de testicules de veau jusqu'à une concentration finale de 0,03 % (en volume/volume). On maintient le mélange à 770G sous agitation. Au bout de périodes déterminées de temps, on prélève des échantillons. La réaction d'inactivation est arrêtée dans chaque cas.par l'addition de 10 % en volume d'une solution à 20 % de thiosulfate de sodium. les échantillons prélevés, à ltétat non dilué et dans la gamme de dilution de dixième en dixième, sont ensuite inoculés, dans 10 petits tubes de culture sur tissu dans chaque cas, avec des cellules primaires de reins de veau en quantité de O,t ml. les titres en virus qui sont ainsi déterminés font apparattre en fonction du temps une baisse qui correspond à une réaction du premier ordre.Après une durée réaction de 3 heures, on ne peut plus déterminer aucune pathogénicité même dans le cas de ltinocu- lation de 0,5 mi. La figure unique du dessin annexé montre par un graphique l'allure de l'inactivation du virus de a fièvre aphteuse du type C à 3700 et à un pH de 8,0. L'axe des ordonnées porte le logarithme des unités infectieuses et l'axe des abscisses indique la durée d'action, en heures. La courbe 1 montre l'allure de ltinactivation dans le cas d'une concentration finale de 0,03 % (volume/volume). Une solution virale ainsi traitée pendant 4 heures est administrée par voie intrapéritonéale en quantité de 0,1 ml à 20 jeunes sourisàgées de 3 à 4 jours et par voie sous-cutanée en quantité de 1,5 ml 5 cobayes. Aucun animal ne présente de signes pathologiques. Trois semaines après 11 inoculation, on peut mettre en évidence dans le sérum de tous les cobayes des anti corps à effet neutralisant vis-à-vis du virus infectieux initial non traité au préalable. La solution virale ainsi désactivée déploie une aussi grande aptitude à fixer le complément que la solution virale ini tiale active non traitée. Exemple 2 Parallèlement au procédé décrit dans ltesemple i et en comparaison directe, on a utilisé au lieu de 0,03 % en volume/ volume d'éthylène-imine les substances- suivantes, aux concentra tions indiquées a) 0,05 % (volume/volume) d'éthylène-imine (courbe 2 du dessin annexé) b) 0,05 % (volume/volume) dtéthyléthylène-imine (courbe 3) c) 0,05 fio (volume/volume) de N-acétyléthylène-imine (courbe 4) d) 0,05 % (volume/volume) de 2,2'-diméthyléthylène-imine (courbe 5) e) 0,05 ffi (volume/volume) d'isopropyléthylène-imine (courbe 6) le dessin annexé montre l'allure de l'inactivation. Dans le cas de ltéthylère-imine (courbe 2), on ne peut plus déceler de virus pathogènes au bout de 1,5 heure; dans le cas des autres substances, cet état n'apparat qutaprès des périodes respectives de 7 - 8 heures et il heures. Exemple 3 le procédé décrit dans l'exemple 1 est répété à une température de 22 C au lieu de 37 C. A mesure que le temps passe, on assiste également à une décroissance linéaire de la pathogénicité. Au bout de 16 heures, on ne peut plus déceler de virus infectieux. Exemple 4 On répète le mode opératoire de exemple 1 en utilisant une solution de virus de la fièvre aphteuse du type 1. Après une période de réaction de 4 heures, on ne peut plus déceler de pathogénicité. Exemple 5 On inactive des solutions de virus de la fièvre aphteuse des types C et Oî, par le procédé décrit dans l'exemple 1, pendant des périodes respectives de 5 et 6 heures. En utilisant le procédé connu au polyéthylène-glycol, on prépare à partir de ces solutions des concentrés viraux dont on inocule 1 ml par voie intramusculaire à 5 porcelets réceptifs. Dès qutil n'y a plus de signes de maladie dans un intervalle de 10 jours, on mélange dans chaque cas es parties égales des concentrés viraux inactivés avec un adjuvant et on traite 20 porcs par injection intramusculaire. les animaux produisent tous des anticorps neutralisants vis-à-vis des deux types actifs de virus.Huit semaines après la vaccination, 10 animaux sur 10 sont immunisés contre l'infection à virus actif de la fièvre aphteuse du type C, 9 animaux sur 10 sont immunisés contre l'infection à virus actif de la fièvre aphteuse du type 01, un animal est malade, mais son état est beaucoup moins grave que celui des témoins qui n'ont pas été préalablement traités. Exemple 6 On répète le mode opératoire décrit dans l'exemple 1 pour inactiver le virus de la rhinotrachéite bovine infectieuse (il stagit drun représentant des virus contenant de l'acide désoxyribonucléique) au lieu du virus de a fièvre aphteuse qui contient de l'acide ribonucléique. là encore, on peut constater une décroissance linéaire de la pathogénicité, en sorte qutau bout de 6 heures de réaction, on ne peut déceler de pouvoir infectieux. On injecte par voie intramusculaire 2 mi d'une solution virale traitée pendant 6 heures à 10 cobayes. Trois semaines après la vaccination, on peut déce.ler dans le sérum de ces animaux des anticorps neutralisants vis-à-vis du virus de la rhinotrachéite bovine. Exemple 7 On ajoute à une suspension bactérienne de Pasteurella haemolytica contewsnt environ 1010 bactéries/ml, comme dans le procédé décrit dans l'exemple 1, de l'éthylène-imine jusqu'à une concentratio finale de 0,05 % (volume/volume). Au bout de 14 heures, à 37 C, on sépare la masse bactérienne par centrifugation et on la remet en suspension dans une solution stérile de chlorure de sodium tamponnée au phosphate. On inocule un échantillon de la préparation ainsi obtenue à trois solutions nutritives bactériologiques différentes et on fait incuber les solutions à 3700. Au bout de 6 jours, on ne peut plus déceler de croissance bactérienne. On injecte un autre échantillon par voie intrapéritonéale à des doses de 0,1 ml à 20 souris. Au bout de 24 et 48 heures, les animaux ne présentent aucun signe de maladie, tandis que sur 20 animaux auxquels on injecte la même suspension bactérienne non traitée, 15 meurent en 16 heures et 5 en 24 heures. On mélange un autre échantillon avec le même volume d'un adjuvant. On inocule par voie sous-cutanée 1,5 ml de ces vaccins à 5 lapins. On répète la vaccination au bout de 14 jours. Aucun de ces animaux ne présente de bactériémie. Dans le sérum de ces animaux, on peut déceler à l'aide du test d'agglutination un titre en anticorps contre la meme bactérie, qui s'élève ensuite nettement après l'inoculation de rappel. REVENDICATIONS 1.L'application de l'éthylène-imine comme inactivateur dans la préparation d'antigènes et d'immunogènes pour compositions pllarmaceutiques. 2. Procédé de préparation de compositions pharmaceutiques contenant des antigènes, caractérisé par le fait qutil consiste à soumettre des micro-organismes infectieux ou leurs antigènes ou les deux à l'action de ltéthylène-imine.