Brevet FR2236936A1 — publié le 19750207

ta présente invention a pour objet la synthèse d'aminoacides et notamment de la L- #-N-acétyllysine par fermentation à partir de mutants de types divers décrits ci-après dérivés de souches bactériennes gram-positives. De nombreux brevets ont été déposés concernant la production de L- lysine à partir de bactéries. La présente invention a pour but . de fournir un procédé de production d1un composé, la L-#-N-acétyl- lysine dont la synthèse biochimique n'a pas été décrite et dont l'intérêt nutri-. tionnel est analogue à celui ,de la L-lysine. d'utiliser cet effet des substrats peu couteuxet abondants, en particulier les hydrocarbures paraffiniques de 10 à 22 atomes de carbone ou des coupes pétrolières contenant un mélange de ces hydrocarbures. D'autres substrats tels que l'acide acétique ou les hydrates de carbone sont également utilisables. . d'effectuer cette synthèse avec différents types de mutants, notamment des mutants ayant besoin de thréonine ou de méthionine et de thréonine pour leur croissance. Des microorganismes ont été sélectionnés en tenant compte de leur bonne croissance sur différents substrats, notamment sur paraffines, et du fait derleur incapacité de dégrader la lysine. Des souches gram-positives et des actinogycè. tes (appartenant à des genres tels que Micrococcuss Brevibacterium, Corynebacte- rium, Arthrobacter, Nocardia, Mycobacterium) qui répondaient à ces critères ont -été obtenues. Des souches du genre Corynebacterium en particulier ont été retenues. Certaines de ces bactéries, notamment la souche Corynebacterium A20,corres- pondent à la description faite-par lizuka et Komagata (J. gen. Appui, icrobiol. 10, (3) 207-221 (1964)) pour Corynebacterium hydrocarboclastus. Ces caractères taxonomiques sont résumés ci-dessus DESCRIPTION DE LA SOUCHE CDRYNEBACTERIUM A20. Bactérie aérobie. gram-positive non mobile ne formant pas de spores. Les cellules forment prineipalement des bâtonnets courts mais des formes bran chées et des variations des formes au cours des cultures sont observées. On observe des granules nétachromatiques. Sur milieu solide (par exemple, milieu minimum avec hexadécane)- les -cellules acquièrent une teinte orangée avec l'age. La souche utilise les-,hydrocarbures paraf,finiques liquides à partir du décane et des coupes pétrolières contenant des paraffines ayant entre 10 et 22 atomes de carbone. Elle utilise aussi le glucose, le succinate, le glycérol, l'éthanol, 1'acétate. ta température optimums est environ 3O0C. ta croissance à 37 C est très faible, Une certaine croissance est observée à 46C. Source : Eau de rivière. OBTENTION DES MUTANTS PRODUCTEURS DE L-#-N-ACETYLLYSINE Les mutants exigeants en thréonine ou en thréonine et en méthionine ont été obtenus en faisant agir l'agent mutagène N-nitroso-N-méthyl uréthane sur une culture de la souche Corynebacterium A20 et en sélectionnant selon des techniques connues les mutants exigeants en thréonine ou en thréonine et en méthionine. C'est ainsi que loin a obtenu notamment le mutant A20Tll (exigeant en thréonine) et le mutant A20H5 (exigeant en thréonine et en méthionine ou en homosérine). PRODUCTION DE LYSINE PAR LES MUTANTS OBTENUS EXEMPLE-l : On a utilisé un milieu minéral dont la composition est la suivante par litre KH2P04 ............ 2g Na2HP04 > 12 H20 ,, 2 g MgSO4, 7 H20 ........ 1 g MnSO4, H2O .......... 50 mg FeS04, 7H2O ......... 10 mg ZnSO4, 7 1120 10 mg NH4N03 ................ 10 g A ce milieu ajusté à pH 7,0 on a ajouté 5 % d'hexadécane comme source de carbone, 480 mg/l de L-thréonine et 600 mg/l de méthionine, et 2 X de carbonate de calcium.Les fioles contenant ce milieu ont été ensemencées a:vec une culture du mutant A20H5 et agitées à 30 C pendant 6 jours, le pH étant journellement rajusté à 7,0 par NH4OH N. A la fin de 1a culture, les cellules ont été éliminées par filtration ou centrifugation et les aminoacides produits extraits selon des techniques connues par passage du milieu sur une résine échangeuse de cation du type acide sulfonique sous forme acide puis élués par l'ammoniaque 2 N qui est ensuite éliminée par evaporation sous pression réduite. Le dosage des aminoacides produits était effectué au moyen d'un analyseur d'aminoacides. Une quantité de L-#-N-acétyllysine de 1,3 g/l était obtenue dans ces conditions.. On recueillait en même temps 300 mg/l de L-lysine et350 mg/l d'acide diaminopimélique. EXEMPLE 2 '. -ta culture était effectuée dans des conditions identiques à celles de l'exemple 1 sauf en ce qui concerne la composition du milieu de culture dans lequel on omettait la méthionine. On ensemençait avec la souche A2QTll. On obtenait à la fin de la culture (7 jours à 30 C) 0,24 g de L- & N-acétyllysine. De plus une quantité importante d'homosérine ( 3 g/l) était en même temps obtenue avec ce mutant. R E V E N D I C A T I O N S 1 - Procédé de production de L- E-N-acétyllysine par culture d'un microorganisme caractérisé'en ce que lton cultive dans un; milieu nutritif un mutant d'une bactérie gram-positive. 2 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le mutant est un mutant exigeant en méthionine et en thréonine. 3 - Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le mutant est un mutant de Micrococcus, Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter ou Mycobacterium. 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le mutant est un mutant de Corynebacterium. 5 - Procédé selon l'une des revendications l à 4, caractérisé en ce que le mutant est le mutant A20H5. 6 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le mutant est un mutant exigeant en thréonine. 7 - Procédé selon l'une des revendications 1 ou 6, caractérisé en ce que le mutant est un mutant de Micrococcus, Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter, Nocardia ou Mycobacterium. 8 - Procédé selon l'une des revendications 1, 6 ou 7, caractérisé en ce que le mutant est un mutant de Corynebacterium. 9 - Procédé selon l'une des revendications 1, 6, 7 on 8, caractérisé en ce que le mutant est le mutant A20Tll. 10 - Procédé selon ltune des revendications l à 9, caractérisé en ce que le milieu nutritif contient des sels minéraux et au moins un hydrocarbure paraff inique. ll - Utilisation de la L- -N-acétyllysine obtenue selon l'une des revendications 1 à 10 à des fins nutritionnelles. 12 - Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le mu tant est un mutant de Nocardia.