Brevet FR2204409A1 — publié le 19740524

La présente invention concerne dans son ensemble une matière douée d 2 activité Physiologique, qui influence le métabolisme du glucose et de l'urée, airsi qu'un procédé de prépara- tion de cette matière. L'invention a plus particulièrement trait à une protéine que lton peut extraire du foie et qui est capable dtaccroitre l'assimilation du glucose et la synthèse du glycogène. La préparation d'extraits de foie a fait l'objet de nombreux travaux de recherche, ce qui est dû, en grande partie, à la présence, dans le foie, de très nombreuses substances douées activité biologique. L'extraction de l'enzyme appelé arginasse a été décrite dans un article de Mohamed et Greenberg (Archives of Biochemistry, 8:349, 1945). Le procédé d'extraction de la présente invention ressemble, dans ses étapes initiales au procédé décrit dans l'article de Mohamed et Greenberg, mais il exploite une liqueur surnageante gui est jetée dans le procédé de Mohamed et Greenberg. En outre, la protéine de la présente invention exerce une activité physiologique totalement différente de celle de l'arginase du foie. Il existe très peu dSagents capables de faciliter l'absorption de sources d'énergie, telles que le glucose, dans les cellules. La plupart des protéines inhibent l'absorp- tion du glucose. L'une des quelques protéines qui facilitent l'assimilation du glucose et la synthèse du glycogène est l'insuline. Il est nécessaire de trouver d'autres protéines qui manifestent simultanément ces deux propriétés. Le produit de la présente invention influence le métabolisme Primaire des glucides et le cycle de l'urée. Ce produit est un catalyser biologique, présent en grandes quantités dans le foie. I1 augmente l'assimilation du glucose et la synthèse du glycogène dans le muscle en cours de développement, il influence le métabolisme du glucose dans le foie isolé en perfusion, et il affecte l'emmagasinage du glycogène chez des animaux sur lesquels on a pratiqué ltabla- tion des glandes surrénales. Il favorise in vivo la synthèse du glycogène et facilite les fonctions rénales, ce qui prouve son transport humoral et son entrée dans leicellules périphériques, ou bien il influence leur métabolisme au niveau de la membrane. Le produit est une protéine simple de poids moléculaire à peu près égal à 25 000. La structure exacte de la protéine de la présente invention n'est pas connue avec précision. Elle a la structure polypeptidique caractéristique des protéines. Be poids molé- culaire, déterminé par ultracentrifugation et par dosage des amino-aeides, est à peu près égal à 25 000. Le dosage des amino-acides d'une forme du produit est indiqué sur le tableau suivant. TABLEAU Composition en amino-acides de trois préparations du facteur actif Amino-acide Nombre moyen Nombre moyen Ecart moyen de micromoles de moles d'a- (%) d'amino-acide mino-acide par milligram- par mole de me de protéine protéine* Lysine 0,598 15,0 3,0 Histidine 0,175 4,3 7,9 NH3 0,667 16,7 0,5 Arginine 0,275 6,9 1,3 Tryptophane** 0,042 t,0 acide aspartique 0,806 20,7 3,0 Thrécine 0,458 11,4 5,4 Sérine 0,524 13,1 3,8 Acide glutamique 1,208 31,0 4,5 Proline 0,616 15,4 3,2 Glycine 0,713 17,9 6,2 Alanine 0,726 18,2 3,1 Hémi-cystine 0,202 5,0 6,0 Valine 0,644 16,1 1,9 Méthinnine 0,121 3,0 4,1 Isoleucine 0,349 8,7 5,4 Leucine 0,552 13,8 5,8 Tyrosine 0,150 3,8 8,0 Phényl- 0,241 6,0 5,0 alanine Ecart moyen global 4,3 % * On suppose un poids moléculaire égal à 25 000 ** Le tryptophane est dosé séparément par chromatographie La plupart des amino-acides, dans l'analyse préédente, ont été dosés quantitativement par chromatographie par échange ionique dans un analyseur automatique dtamino acides, la chromatographie étant suivie d'une hydrolyse dans l'acide chlorhydrique 6M à 1100C, sous vide. L'hydrolyse a été effectuée à deux époques différentes pour chaque préparation, de manière à pouvoir effectuer des corrections d'ordre cinétique pour tenir compte de la destruction de la sérine et de la thréonine et de la lente libération de la valine, de ltisoleucine et de la leucine.La teneur en hémi-cystine (cystéine + cystine) a été déterminée par oxydation à ltaeide performique, conformément à la méthode de Schram et Collaborateurs ("Biochem. J." 57, 33 (1954)), suivie d'une analyse chromatographîque effectuée avec l'analyseur automatique. T,e dosage du tryptophane a été effectué de deux façons. La première méthode est la technique spectrophotométrique de Goodwin et Morton ("Biochem. J." 40, 628 (t946)) la seconde méthode utilisée implique lthydrolyse alcaline décrite par Dreze et Reith (Biochem. J." 62, 3 P. (1956)). suivie d'une analyse chromatographique sur des colonnes d'amidon (Moore et Stein, "Ann. N.Y. Acad. Sci.", volume XLIX, 265 (1948)). Le procédé utilisé pour obtenir la protéine de la présente invention, consiste à soumettre une matière première à une extraction, puis à effectuer une purification convenable, par exemple par électrochromatographie. La protéine obtenue au moyen du procédé de irin vention, qui sera décrite ci-après, ne contient ordinairement qu'environ 4 à 6 % de la protéine de l'invention. Bien que cet extrait soit beaucoup plus concentré que la matière pre mière, par exemple le foie, il ne llest pas suffisamment pour la plupart des applications pratiques. En conséquence, le produit du fractionnement au solvant sera appelé produit "brut". Le plus souvent, il contient moins de 6 % de la protéine de l'invention. L'expression "partiellement purifié" est utilisée pour indiquer la protéine qui a été soumlse à l'électro- 4 chromatographie et purifiée à un certain degré a' & delà de la pureté de la préparation initiale. Une purification d'au moins 20 % est avantageuse, et pour la plupart des applications, on préfère que la protéine t'partiellement purifiée" ait une concentration de 50 %. Le terme "pur" est utilisée dans le présent mémoire pour désigner la pureté maximale obtenue par 18 méthode électrochromatographique au rideau. Dans la plupart des cas, cette pureté est évalue ou supérieure à environ 97 %. La protéine de la présente invention est susceptible d'une inactivation par oxydation. Elle peut être stabilisée par des agents réducteurs tels quelle thioglycérol. Des ions métalliques polyvalents peuvent aussi Btre utilisés pour la stabiliser. En particulier, le manganèse et le magnésium permettent de stabiliser la protéine pendant des périodes prolongées de temps. La protéine de la présente invention est préparée par extractions multiples à partir de toutes sources convenables. l'es organes glandulaires et ceux du système nerveux central de mammifères, d20iseaux et de poissons constituent des sources de cette protéine. Le foie de mammifères est une source préférée de la protéine désirée et le rein, la rate et le placenta de mammifères sont satisfaisants.Lorsqu'on utilise le foie, on le découpe en cubes et on le fait macérer puis on le traite, d'abord avec un ion de métal divalent qui convient pour activer une protéine douée d'activité biologique dans l'étape 1. Les ions métalliques divalents préférés sont les ions Mn++ ou Mg++. Le pi de la solution d'ions métalliques doit Autre essentiellement neutre ou légèrement alcalin. On préfère une gamme de pH de 6,5 à 8. Ce pH peut être ajuste avec tout tampon convenable tel qu'un tampon dilué dXacétate de sodium ou un tampon de glycine. Le foie doit être laissé au contact de l'ion métallique divalent pendant une période suffisante de temps pour permettre l'interaction complète entre le métal et la protéine. La nature précise de l'interaction n'est pas entièrement élucidée, mais on sait que certaines protéines telles que les enzymes ont une affinité pour certains métaux divalents. l'ion manganeux est préféré, peut-8tre parce qu'il est la forme réduite de l'ion métallique. l'e métal divalent doit être introduit sous la forme soluble dans l'eau. On utilise avantageusement le sulfate ou le dichlorure de l'ion manganeux. On a constaté que la concentration de l2ion métallique divalent est avantageusement comprise dans la gamme de 0,08 à 0,15. De préférence, on introduit un sel manganeux à une concentration d'environ 0,09 M. il est aussi préférable de refroidir le mélange de métal divalent et de matière première au repos. On a constaté qu'une température de 50C est convenable. Après le repos, les matières solides sont centrifugées et jetées. Après que les matières solides ont été séparées du milieu de traitement au métal divalent, la phase liquide est traitée dans l'étape 2 avec un agent métallique précipitant, dont le relue est de précipiter le complexe protéinique insoluble venant de l'étape 1. Les ions métalliques convenables pour le phénomène de précipitation comprennent le plomb le zinc, l'argent; le cuivre et le baryum, les deux premiers étant préférés. La concentration de l'agent précipitant dépend de l'ion métallique choisi, mais elle doit ordinairement être comprise dans la gamme de 0,05 à 0,20 M. Lorsqu'on utilise le plomb ou le zinc sous la forme acétate, on préfère une concentration de 0,12 M. l"anion n'est pas déterminant on choisit l'acétate pour ses propriétés de tampon.Le citrate et le phosphate constituent d'autres anions convenables Dour 1 ragent précipitant. La précipitation dans l'étape 2 doit être complète il est donc préférable de laisser reposer le mélange pendant au moins 12 heures. De même, on préfère effectuer la précipitation à une basse température, par exemple de 500. Après la précipitation, le mélange est centrifugé et le précipité est jeté. le pli de la liqucur surnageante est ajusté dans la gamme de 8,3 à 8,5 dans l'étape 3. On peut procéder à cet ajustement de toute manière classique, par exemple en ajoutant de l'hydroxyde de sodium. le pH préféré est égal à 8,4 mais on obtient le même résultat à un pH égal à 8,4 # 0,05. Le pli ayant été ajusté, on laisse de nouveau reposer la liqueur, de préférence à froid, pour permettre la formation d'un supplément de matière solide au pli élevé. Lorsque la précipitation est terminée, on centrifuge de nouveau l'extrait et on jette le précipité. Dans 1' étape 4, on traite la liqueur surnageante avec un autre agent précipitant pour effectuer le relargage d'autres composants indésirables. Cette étape est conduite selon le mode opératoire classique pour la précipitation des protéines. Le sulfate d'azmnonium est un sel d'emploi classique pour cette précipitation,- mais on peut utiliser d'autres agents précipitants équivalents tels que le sulfate de sodium à demi-saturé, pour autant que la concentration efficace est la même.On a constaté que l'agent de relargage doit Qtre ajouté à la liqueur surnageante de étape 3 en une quantité telle que l'équivalent de 20 à 90 % de la solution totale consiste en agent de relargage,sur la base du sulfate d'ammonium. Avec le sulfate de sodium saturé. par exemple, la concentration finale peut être comprise dans la gamme de 10 à 15 %, ce qui équivaut à 20-30 % de sulfate d'ammonium. La concentration préférée est de 25 % dans le cas du sulfate d'ammonium. Lorsque le relargage est terminé, on sépare de nouveau les matières solides par centrifugation, et on les jette. Ensuite, on traite la liqueur surnageante avec un solvant qui convient pour le fractionnement.Les alcanols inférieurs et les cétones inférieures donnent satisfaction, l'acétone constituant le solvant préféré. Il convient d'utiliser également pour le fractionnement dtautres solvants tels que l'éthanol, le méthanol, le propanol, l'isopropanol et/ou le butanol. 'extraction au solvant, dans étape 5, est avantageusement effectuée par addition préalable de solvant tel que l'acétone, à la liqueur surnageante de l'étape de traitement au sulfate d'ammonium, en quantité représentant une concentration de solvant de 20 à 26 5 du volume total. Il se forme au repos une quantité supplémentaire de précipités qu'on sépare de toute manière convenable, par exemple par centrifugation. On effectue ensuite une seconde extraction au solvant, le solvant représentant, cette fois, 35 à 40 5 du volume du liquide total. Le liquide se sépare en trois phases au repos, et on jette la phase intermédiaire et la phase inférieure.La phase supérieure, que lton garde, a une forte coneentration en solvant, à savoir environ 44 à 50 %. Le troisième fractionnement an solvant est effectué par élévation de la concentration du solvant dans une gamme d'environ 70 à 77 % en volume. Après repos, on sépare les précipités solides, par exemple par centrifugation, et on garde les matières solides qui contiennent la protéine de bas poids moléculaire de la présente invention. Tes matières solides de l'étape 5 sont ensuite remises en suspension dans étape 6, dansunliquide destiné à la dialyse subséquente. La remise en suspension est avants- geusement effectuée par dilution des matières solides avec un tampon légèrement alcalin. On préfère utiliser un tampon au phosphate, tel que le phosphate de potassium, à un pH égal à environ 8,O, mais une gamme de pH de 7,8 à 8,2 est acceptable. Les matières solides non -dissoutes, ne contenant pas la protéine désirée, sont ensuite séparées, par exemple par centrifugation, et la liqueur surnageante est gardée. Dans l'étape 7, la liqueur surnageante est dialysée vis-à-vis d'eau distillée. il convient dteffectuer la dialyse à 50C jusqutà une conductivité inférieure à O,5 ppm, exprimée en NaCl. Le liquide obtenu est séparé des matières solides, par exemple par centrifugation, et le précipité est jeté. Dans 1 étape 8, on chauffe la liqueur s-urnageante à une température comprise dans la gamme de 46 à 50 C. On peut utiliser un bain-marie, et le chauffage doit entre assez long pour précipiter les matières solides qui peuvent être séparées à cette température, de préférence pendant une heure. La température préférée est de 470C;, On sépare de nouveau les matières solides, par exemple par centrifugation. Après chauffage dans l'étape 8, on obtient le produit brut, ayant une concentration d'environ 15 % de la protéine de bas poids moléculaire, douée d'activité biologique, décrite ci-dessus. Se produit brut est de préférence séparé en ses composants actifs. On effectue cette séparation de façon pratique par électrophorèse dans l'étape 9. On peut utiliser l'électrophorèse de frontière, l'électrophorèse sur papier ou l'électrophorèse sur gel. Exemple 1 On choisit quatre kilogrammes de foie de boeuf frais et on enlève la capsule, le tissu conjonctif, la graisse et les gros vaisseaux sanguins. On découpe ensuite le foie en dés de 2,5 cm d'arête et on le fait macérer ensuite dans un mélangeur Waring, en présence de 8 litres de tampon d'acétate de sodium à 5 % (PH 7,35) contenant 1,54 % de sulfate manganeux monohydraté. On agite ce mélange à 50C pendant t0-12 jours puis on le centrifuge et on jette la matière non dissoute et le précipité. Ensuite, on ajoute 4 litres d'acétate plombeux contenant 45,75 g de Pb(C2HD0252.3H20 par litre d'eau et on laisse reposer l'extrait à 50C pendant 18-24 heures. On le centrifuge ensuite et on jette le précipité. On ajuste le pH de la liqueur surnageante à 8,4 + 0,05 la par addition d'hydroxyde de sodium 0,2N. On/laisse ensuite re- poser à 50C pendant 18-24 heures puis on la centrifuge. On jette le précipité. On ajoute ensuite un volume de solution saturée de sulfate d'ammonium (saturée à 20 C) à 3 volumes de la liqueur surnageante venant de étape précédente et on laisse reposer le mélange à 50C pendant 18-24 heures, puis on le centrifuge. On jette le précipité. On ajoute ensuite de l'acétone en proportions de 25,9 % par rapport au volume du liquide total (c'est-à-dire 25,9 % du volume de la liqueur surnageante plus l'acétone) et on laisse reposer le liquide à 50C pendant 18-24 heures. On le centrifuge ensuite et on jette le précipité. On ajoute un supplément dtacétone pour ajustcr la concentration de l'acétone à 37,5 % du volume total. On laisse ensuite reposer le liquide à 5 C pendant 18-24 heures et on le verse pardécantation. Be liquide se sépare en trois phases. La phase supérieure est gardée, tandis que la phase intermédiaire solide et la phase inférieure liquide sont jetées. On ajoute à la phase liquide supérieure venant de l'étape précédente, qui contient environ 44-50 % d'acétone, un volume égal dtacétone, pour ajuster la concentration totale de l'acétone à environ 72-75 % en volume. On laisse reposer ce liquide à 50C pendant 18-24 heures. On le centrifuge ensuite. On jette la liqueur surnageante et on garde le précipité de cette étape et on le traite ensuite par mise en suspension dans une partie aliquote de tampon au phosphate de potassium 0,1 N à un pH égal à 8,0 La solution résultante de matière protéinique solide a une concentration au moins égale à 0,1 %. Elle est ensuite centrifugée et le précipité est jeté. La liqueur surnageante venant de l'étape précédente est ensuite soumise à une dialyse vis-à-vis d'eau distillée à 50C, jusqutà ce qu'elle ait une conductivité inférieure à 0,5 ppm, exprimée en NaCl. Elle est ensuite centrifugée et le précipité est jeté. Le produit contenu dans la liqueur surnageante est ensuite purifié par chauffage au bain-marie à 46-500C. On préfère effectuer un chauffage à 470C pendant environ une heure. A ce stade, le produit brut contient six composants protéiniques différents, comme déterminé par micro-électrophorèse. Parmi ces composants, celui qui est appelé composant II la dans ce qui-suit a/plus grande activité biologique. Ce composant représente, habituellement, environ 4 à 6 C/o de la protéine totale du produit du procédé de l'exemple 1, dans lequel le foie de boeuf constitue la matière première. En tout cas, des concentrations au plus égales à 15 % de la protéine de l'invention sont récupérables lorsqu'on utilise le procédé de l'exemple 1. Le produit brut de l'exemple 1 est ensuite soumis à une électrochromatographie qui permet de fractionner un mélange complexe de protéines de différents potentiels électriques et de différentes caractéristiques chromatographiques, fractionnement qui consiste à recueillir simplement le courant venant de chacun des points d'écoulement goutte à goutte à la base du rideau pendant. On utilise un appareil automatique à grand rideau, à refroidissement mécanique, du type décrit par Karler dans "Separation by Continuous Electrochromatography", Anal. Chem. 31:848-851 (1959). La matière constituant le rideau est un papier-filtre Schleicher et Schuell N0 470-A de 50 cm x 50 cm, avec 31 points d'écoulement goutte à goutte distants de 16 mm.L'électrolyte tampon ou électrolyte de base consiste en une solution d'acétate d'ammonium 0,065 N (pH 6,7) dans de l'eau purifiée. Le lot ou échantillon est appliqué à un débit de 5 ml par heure en un point se trouvant légèrement sur la gauche du centre du rideau. L'anode se trouve sur le c8té gauche de chaque rideau. La température et l'humidité de l'air froid circulant rapidement (passant sur le rideau à un débit de 22,6 m /mn) sont maintenues respectivement à 3 C et 96 %. Le courant électrique consiste en un courant continu du type dtun courant non filtré à redressement des deux phases (1800 volts, 65 milliampères). Dès qu'on constate que toute la matière résiduelle soumise au fractionnement- a disparu du rideau, on évalue la quantité totale de matières solides de chaque point d'écoulement goutte à goutte par séchage à 185 C jusqu'à poids constant. On mesure l'activité biologique d'un échantillon de chaque point d'écoulement goutte à goutte, par détermination de l'activité d'absorption au glucose (appelée parfois ci-après áctivité de glucose n) décrite ciaprès. Ensuite, on soumet à une électrophorèse chaque point d'écoulement goutte à goutte présentant une activité biologique, en utilisant une membrane de polyacétate de cellulose, comme milieu de support (M. Ed. Bier, "Electrophoresis: Theory, Methods, and Applications", Academic Press 1959). On a constaté que la protéine moins part o conformément à la pré présente invention tend à avoir une plus grande stabilité que la forme entièrement purifiée. la sence d'autres composants provenant du rideau électrophorétique est parfois désirable, du point de vue de la stabilité. En outre, pour certaines applications finales, les propriétés d'autres facteurs de la matière brute peuvent être intéressantes, sans altérer l'activité de la protéine de l'invention. Pour cette raison, on peut utiliser un ou plusieurs des autres composants de la composition. La concentration et la purification par électrochromatographie sur papier donnent une composition dans laquelle la protéine de la présente invention est présente à un degré de pureté atteignant environ 97 fo. La pureté est établie au moyen d'un appareil Beckman - Spinco Analytrol. On peut choisir à volonté dans le rideau électrochromatographique une pureté comprise dans la gamme allant de la teneur en protéine de l'extrait brut de l'exemple 1 à la protéine sensiblement pure. Pour la plupart des applications, une concentration de protéine égale ou supérieure à 20 % est désirable. De préférence, une concentration d'au moins 50 % de la protéine de l'invention doit entre présente pour neutraliser à coup sûr les propriétés des autres ingrédients de la composition brute. L'électrophorèes sur rideau de papier est effectuée de la meilleure façon avec un tampon d'ammonium. Toutefois, un tampon d'acide acétique est convenable, pour autant que les ions métalliques qui sont entraînés par le tampon d'acide acétique sont remplacés Ainsi, le produit est activé par la présence d'ions métalliques. Les ions métalliques convenables comprennent les ions manganèse, magnésium, zinc, nickel, cobalt et cuivre. De préférence, l'ion ammonium peut être utilisé pour-stabiliser le produit purifié, ce qui évite la nécessité d'ajouter un ion métallique stabilisant après que le produit a été séparé dans l'électrophorèse sur rideau de papier. l"analyse par- absorption inftareuge de la matière purifiée montre que la protéine de la présente invention est une protéine ou un polypeptide simple. Aucune concentration importante en lipide ou en glucide n'est indiquée. 'Des diagrammes infrarouges sont négatifs en ce qui concerne les acides nucléiques, les stéroSdes et le groupe des phosphates. Des méthodes classiques de recherche de la transaminase glutamique-oxalo-acétique, de la trans aminase glutamiquepyruvique, de l'arginase, de la phosphatase alcaline et de la phosphatase acide, ne révèlent la présence d'aucune de ces substances. Des essais spectrographiques d'émission révèlent seulement la présence de traces d'ions métalliques. l'analyse des groupes terminaux de la protéine de l'invention est effectuée par la méthode décrite par W.R. Gray et B. S. Hartley, dans tBiochem., J." 89:379 (1963). La résidu amino terminal de la protéine pure apparat comme bloqué par acylation, probablement par acétylation. On ne trouve aucun groupe alpha-amino, bien que la méthode permette de déceler un dix-millième de la quantité attendue sur la base de la quantité totale de protéine trouvée. l'es chromatogrammes en couche mince révèlent les produits secondaires dominants usuels et la présence de tyrosine et de lysine. Aucune autre tache n'est décelée. Ltabsence de contamination par des groupes terminaux d'autres aminoacides indique le très haut degré de pureté de l'échantillon obtenu. On a trouvé que le point isoélectrique de la protéine non traitée de la présente invention apparaît à un pH de 5,40. Dans le cas d'une protéine traitée avec des ions métalliques, le point isoélectrique se situe à 5,80. Pour tous lee échantillons, on a trouvé un point isoélectrique situé entre pH 5 et pH 6. Il y a lieu de remarquer que les préparations du commerce, obtenues en utilisant le principe actif de la présente invention, peuvent contenir d'autres matières, outre les protéines qui les accompagnent. Lorsqu'on utilise la matière par injection intraveineuse ou injection intramusculaire (ctest-à-dire les voies d'administration actuellement prrées), elle est dissoute dans de lteau qui peut Etre rendue isotonique avec du chlorure de sodium, d la glycine, du dextrose, du glucose, etc. On peut utiliser avantageusement avec la protéine d'autres excipients compatibles du point de vue pharmaceutique. On peut ltadministrer également par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intradermique, buccale et rectale.On peut ajouter d2autres protéines ; de même, on peut incorporer des antibiotiques tels que la pénicilline, des vitamines telles que l'acide ascorbique et la vitamine B12, etc. La matière peut être lyophilisée en vue de sa conservation et de sa reconstitution. Il est évident que la présente invention offre une protéine simple dtun type nouveau, de poids moléculaire égal à environ 25 000, qui déploie une activité biologique, notamment dans le traitement de lturdmie, pour lequel l'aptitude à faciliter l'absorption du glucose et la synthèse du glycogène offre un intérêt. L'invention concerne aussi le procédé de préparation de la protéine à partir d'une source convenable telle que le foie. Ba protéine de l'invention peut Etre administrée par injection pour le traitement de l'urémie et d'états inflammatoires et pour le traitement de choc chez des mammifères. La protéine exerce une influence sur le métabolisme des glucides et le cycle de l'urée. REVENDICATIONS 1. Procédé pour extraire du foie une protéine douée d'activité biologique; caractérisé par le fait qu'il consiste (a) à traiter du foie avec une solution aqueuse dSun cation métallique divalent activateur à un pH essentiellement neutre ou légèrement alcalin et à séparer de la phase liquide les matières solides résultantes (b) à traiter le liquide avec un agent précipitant renfermant un métal lourd et à séparer de la phase liquide le précipité résultant ;; (c) à ajuster le pH du liquide venant de l'étape (b) dans une gamme comprise entre 8,3 et 8,5 et à séparer de la phase liquide le précipité résultant (d) à traiter le liquide venant de l'étape (c) avec une solution concentrée d'un agent de relargage pour précipiter la protéine non désirée et à séparer de la phase liquide le précipité de protéine (e) à ajouter un solvant à la phase liquide venant de l'étape (d) en quantité suffisante pour que le mélange résultant ait une concentration en solvant de 20 à 26 % en volume et à séparer de la phase liquide le précipité résultant ; à ajouter du solvant à la phase liquide en quantité suffisante pour que le mélange résultant contienne le solvant à une concentration de 35 à 40 % en volume, de manière à former un mélange de trois phases , à séparer la phase sup6- rieure et à y ajouter du solvant en quantité suffisante pour que le mélange résultant ait une teneur en solvant de 70 à 77 % en volume, en sorte que la protéine est précipitée (f) à séparer le précipité protéinique et à le dispercer dans un solvant à un pH de 7,8 à 8,2; (g) à dialyser la dispersion venant de étape (f);; (h) à chauffer le dialysat de étape (g) à une température comprise entre 46 et 500C et à séparer de la phase liquide le précipité résultant et (i) à soumettre le liquide de l'étape (h) à une élec- trophorèse pour isoler une protéine dousé d'activité biologique. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que l'ion métallique divalent de l'étape (a) est l'ion Mn++ ou Mg++, à une concentration comprise entre 0,08 et 0,15. 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que l'agent précipitant de l'étape (b) est choisi entre le plomb, le zInc, l'argent, le cuivre et le baryum à une concentration comprise entre 0,05 et 0;20. 4. Prooédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que-le pH est ajusté dans l'étape (c) entre 8,35 et 8,45. 5. Procédé pour extraire du foie une protéine douée d'activité biologique, caractérisé par le fait qu'il consiste (a) à traiter du foie avec une solution 0,09 M d'ion Mn++, à refroidir le milieu traité et à éliminer les matières solides ; (b) à traiter les liqueurs surnageantes avec l'ion Pb pour précipiter les matières solides, à refroidir et à éliminer ces matières solides ; (c) à ajuster le pH dans la gamme de 8,35 à 8,45, à refroidir et à éliminer le précipité (d) à traiter les liqueurs surnageantes avec du sulfate d'ammonium à une concentration finale correspondant à une saturation d'environ 25 % ; à refroidir et à éliminer le précipité; (e) à ajouter de l'acétone en proportion comprise entre 20 et 26 % en volume, à refroidir et à éliminer le précipité ;; (f) à ajouter un supplément d'acétone en en proportions comprises entre 37 et 38 % en volume, à refroidir et à éliminer le précipité et la phase inférieure (g) à ajouter un supplément d'acétone jusqu'à une concentration comprise entre 72 et 75 % en volume pour précipiter la protéine désirée et à séparer le précipité de protéine; (h) à remettre en suspension la protéine désirée dans un tampon au phosphate à un pH d'environ 8,0 et à éliminer les matières solides (i) à dialyser la liqueur surnageante vis-à-vis dteau distilleé à 5 C; (j) à chauffer le dialysat à environ 470C (k) à soumettre le dialysat à une électrophorèse à rideau d'écoulement avec un tampon d'ammonium et à isoler le composant d'activité biologique maximale. 6. A titre de produit industriel nouveau, le composé obtenu notamment au moyen d'un procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes. 7. Médicament, caractérisé par le fait qutil eot constitué par ou qu'il contient un produit suivant la revendication 6.