Brevet FR2209842A1 — publié le 19740705

La présente invention est relative à un nouveau procédé de préparation de la vitamine B 12, facteur antipernicieux puissant. L'isolement de la vitamine B 12 fut réalisé pour la première fois en 1948-par RICKES aux U.S.A. et également en 1948 par SMITH en Angleterre. Depuis, de très nombreux chercheurs démontrèrent que cette vitamine était produite par un très grand nombre de microorganismes tels que bactéries ou ascomycètes. En effet, de très nombreuses souches appartenant au genre Streptomyces, Nocardia, Aerobacter, Bacillus, Clostridium, Flavobacterium, Escherichia, Lactobacillus, Nycobacterium, Propionibacterium, Proteus, Pseudomcnas, Serratia,etc..., sont capables de synthétiser la vitamine B 12 et on a pu même avancer une théorie selon laquelle toute la vitamine B 12 trouvée chez les êtres vivants supérieurs provient exclusivement des microorganismes (bactéries intestinales ou bactéries du rumen). La découverte de l'importance de la vitamine B 12 et analogues en tant que facteur antipernicieux puissant est à l'origine du très grand essor de la production industrielle de la vitamine B 12 par voie microbiologique. Outre les usages pharmaceutiques, la vitamine B 12 est également largement utilisée pour supplémenter la nourriture animale parce qu'elle permet une meilleure assimilation des protéines végétales ainsi qu'une augmentation considérable de la ponte chez la poule. Vu l'intérêt économique considérable que joue la production de la vitamine B 12, de très nombreux chercheurs se sont penchés sur le problème de la fermentation et de l'extraction de la vitamine B 12. Ainsi, de 2 mg/litre obtenus dès 1951, la production a vite atteint 50, puis 100-120 mg par litre ces dernières années. La présente invention permet de doubler ce dernier chiffre en utilisant une souche microbienne originale et des procédés de fermentation et d'extraction originaux. La présente invention a pour but de pourvoir à un nouveau procédé de préparation de la vitamine B 12 aboutissant 1 - à des jus fermentés titrant 200 à 220 mg par litre (méthode de dosage sur Lactobacillus Leichmanii. pour lequel la B 12 est un-facteur de croissance spécifique), 20 à une poudre brute destinée à l'alimentation animale extraite à partir des jus fermentés avec un rendement avoisi nant 100 %, 30 à des cristaux purs de cyanocobalamine- pour usage phar maceutique- à partir des jus fermentés avec un rendement de l'ordre de 90 . La présente invention a pour objet un procédé de fabrication de la vitamine B 12 caractérisé en ce que la souche microbienne utilisée pour la fabrication est une mutante (obtenue par action de gaz moutarde + antibiotique + sels de manganèse) de la souche de Propionibacterium freudenreichii ATCC 6207, souche nouvellement créée, désignée actuellement par le Demandeur sous le nom "R.S.A. 248". La présente invention a également pour objet un procédé de fabrication de la vitamine B 12 caractérisé en ce que le milieu de fermentation (laquelle fermentation comporte 2 phases anaérobie et aérobie) contient des précurseurs de la vitamine B 12. La présente invention a également pour objet un procédé de fabrication de la vitamine B 12 caractérisé en ce que le procédé d'extraction comporte les étapes suivantes a) filtration descellules b) extraction aqueuse des cellules c) extraction par solvants d) deuxième passage en phase aqueuse e) cristallisation de la cyanocobalamine Suivant un mode de réalisation avantageux du procédé qui fait l'objet de la présente invention, la durée de la phase de fermentation anaérobie par rapport à la durée de la phase aérobie est de 1/1 à 1/1,5. Suivant un autre mode de réalisation avantageux du procédé qui fait l'objet de la présente invention, les précurseurs de fermentation B 12 ajoutés au milieu de fermentation sont constitués à parties égales par une association d'acide pantothénique, d'acide p-aminobenzoïque,5-6- dimethylbenzimidazole, présente dans une proportion ne dépassant pas 50/oo (poids/volume)du jus de fermentation. Suivant un autre mode de réalisation avantageux du procédé qui fait l'objet de la présente invention, la température de fermentation p e ndat la phase anaérobie est inférieure de 20C environ à celle de la phase aérobie (27 à 290 contre 29 à 31"). Suivant un autre mode de réalisation avantageux du procédé qui fait L'objet de la présente invention, on ajoute stérilement en trois fois à la cuve de fermentation pendant la phase anaérobie la moitié de la teneur initiale en sucre du milieu de départ ainsi que le sulfate d'aluminium (0,7 % poids/volume). Suivant un autre mode de réalisation avantageux du procédé qui fait l'objet de la présente invention, les cellules sont filtrées à la fin de la fermentation après avoir eu recours à un "collage" par un liant qui peut être organique (gomme arabique, agar-agar, blanc d'oeuf) ou minéral (silicate de calcium, ferrocyanure de zinc ou hydroxyde de zinc ou d'aluminium formés in situ). Le gâteau ainsi obtenu peut servir à l'alimentation animale ou comme matière première de départ pour l'obtention de cristaux purs de la cyanocobaîamine. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortent de la description qui va suivre. La présente tnv'-ti-: > vise particulièrement le procédé de préparation de la vitamine 12 conforme aux dispositions qui précèdent, ainsi que les moyens propres à la mise en oeuvre de ce procédé et les procédés d'ensemble, de même que les chaînes de fabrication,dans lesquels est inclus le procédé conforme à la présente invention. L'invention pourra être mieux comprise à l'aide du compte; ment de description qui va suivre, qui se réfère à un exemple de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. I1 doit être bien entendu toutefois que l'-exemple de mise en oeuvre qui sera décrit ci-après, est donné uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, mais n'en constitue en aucune manière une limitation. Exemple de préparation decyanocobalamine a) Des allonges contenant la souche "R.S.A. 248" sont préparés au laboratoire. Ces allonges servent à préparer les milieux de préculture. b) Composition du milieu de fermentation pour un chargement de 100.000 litres - Cérélose : 6.000 Kg - "Corn steep" liquide : 5.520 Kg - Phosphate monopotassique : 120 Kg - Phosphate dipotassique : 168 Kg - Benzoate de sodium : 140 Kg Précurseurs (acide pantothénique, acide p-aminobenzoSque et 5-6 dimethylbenzimidazoleen parties égales) : 0,8^Kg. La stérilisation a lieu à 1210C pendant 5 minutes. L'inoculation s'opère par 5 % de préculture. c) La fermentation débute par la partie anaérobiose, la tempéra ture est de 290 et la contrepression est maintenue par 0,3 Kg d'azote. Elle dure 48 heures. A la 16ème, à la 32ème et à la 48ème heure, on effectue une addition stérile de milieu, cha cune de ces additions contenant 1.000 Kg de cérélose et 267 Kg de sulfate d'aluminium. Le pH est chaque fois rajusté entre 6,5 et 7,0. d) La partie aérobiose de la fermentation dure 52 heures et s'opère à 310C sous une aération égale à 300 M3 d'air (à 3 Kg de pression) à l'heure. L'on ajoute de l'antimousse (sili cones) si besoin est. e) A la fin de la fermentation (99.720 litres récoltés titrant 216 Y de vitamine B 12 par ml), l'on ajoute 7.500 litres d'une solution aqueuse à 20 % de SiO3Na2, puis, en 90'minu- tes environ 6.000 litres d'une solution aqueuse à 30 % de CaC12 (exprimé en CaC12, 2H20), enfin de l'acide sulfurique dilué jusqu'à pH 7 + 0,1. Après 1 heure d'agitation, on filtre et l'on recueille le gâteau insoluble contenant la vitamine B 12. f) Le gâteau est repris par 40.000 litres, d'eau et l'on ajoute sous agitation 2.000 kg de métabisulfite de sodium et l'acide sulfurique jusqu'à pH 4,5 + 0,1. L'on maintient sous agitation pendant 2 heures à une tempéra ture comprise entre 60 et 700C. L'on filtre à chaud ; l'on répète une deuxième fois cette opération sur le gâteau récu péré. Les 2 filtrats riches sont réunis. g) Extraction par solvants. La vitamine 12 est transférée à la phase solvant (phénol- benzène) de la manière suivante 1ère extraction : 1/5 en volume de ('phénol 30 % (benzène 70 % 2ème " : 1/10 " 'I I 3ème " . 1/10 " " 4eme " : 1/10 " " h) Passage en phase aqueuse Après avoir réuni les extraits solvants, on les dilue de moitié avec du butanol pur et l'on extrait à 1 'eau déminéralisée de la façon suivante 1ère extraction : 1/5 en volume 2ème " : 1/10 3ème " : 1/10 i) Transformation en cyanocobalamine On réunit les extraits aqueux (20.000 litres environ) et l'on y ajoute 100 litres d'une solution aqueuse de cyanure de potas sium à 100 g/1.On laisse réagir 15 minutes à 600C, puis on refroidit à la température ambiante et l'on ajuste le pH à 4,5 avec de l'acide acétique pur. j) On répète une deuxième fois les opérations décrites sous les rubriques g) et h), puis l'on concentre la phase aqueuse finale de manière à ce qu'elle titre 15.000 mcg/ml environ. L'on obtient 1.300 litres contenant 19,3 Kg de cyanocobalamine, soit un rendement d'extraction de 90 %. k) La solution aqueuse concentrée est filtrée, puis l'on procède à la cristallisation de la vitamine B 12 par addition à la phase aqueuse de 9 fois son volume d'acétone. Le rendement de l'opération est de l'ordre de 98 %. 1) Les cristaux de cyanocobalamine essorés et séchés correspon dent aux normes fixées par la Pharmacopée Française et notam ment - Humidité : 3 à 5 % - Le rapport E 361 = 1,7 à 1,9 E 278 E E 361 = 3,15 à 3,4 E 510 - Cyanure libre :(10 ppm REVENDICATIONS 10/ Souche microbienne productrice de la vitamine B 12 mutante de la souche de Propionibacterium freudenreichii ATCC 6207, caractérisée en ce que les agents mutagenes sont constitués par l'association de gaz moutarde + antibiotique + sels de manganèse. 2"/Procédé de préparation de la vitamine B 12, caractérisé en ce que la souche microbienne obtenue selon la Revendication 1 est ensemencée dans un milieu de fermentation contenant des précurseurs, en ce que ladite fermentation est conduite en phase anaérobie puis en phase aérobie, à la fin de laquelle la vitamine B 12 est extraite. 30/ Procédé de fermentation de la vitamine B 12 selon la Revendication 2, caractérisé en ce que les précurseurs contenus dans le milieu de fermentation sont constitués en parties égales par le mélange : acide pantothénique, acide p-aminobenzoi- que et le 5-6 dimethylbenzimidazole. 40/Procédé de fermentation de la vitamine B 12 selon la Revendication 2, caractérisé en ce que la durée de la phase de fermentation anaérobie par rapport à la durée de la phase aérobie est 1/1 à 1/1,5. 50/ Procédé de fermentation de la vitamine B 12 selon les Revendications 2 à 4, caractérisé en ce que l'on ajoute au milieu de fermentation pendant la phase anaérobie la moitié de sa teneur initiale en sucre et du sulfate d'aluminium. 60/ Procédé d'extraction de la vitamine B 12 selon la Revendication 2, caractérisé en ce que l'on procède avant la filtration de cellules à un-"collage" par un liant. .70/ Procédé d'extraction de la vitamine B 12 selon la Revendication 6, caractérisé en ce que le liant servant au "collage" des cellules est un liant organique constitué par de la gomme arabique,et/ou agar-agar et/ou blanc d'oeuf. 80/ Procédé d'extraction de la vitamine B 12 selon la Revendication 6, caractérisé en ce que le liant servant au collage des cellules est un liant minéral constitué par du silicate de calcium, et/ou du ferrocyanure de zinc, et/ou de l'hydro- xyde de zinc et/ou de l'hydroxyde d'aluminium. 90/ Procédé d'extraction de la vitamine B 12,selon la Revendication 8, caractérisé en ce que le liant est formé in situ.