Brevet FR2244456A1 — publié le 19750418

L'invention concerne un procédé de préparation d'un vaccin antirabique è partir de virus cultiva sur cellules bovines diplotdes. Le procédé selon l'invention comporte la multiplication d'une souche de virus fixe dérivée de la souche Pasteur sur des cellules d'origine bovine, entretenues en lignée continue, tellesque la cellule isolée par MADIN & DERBY, et désignée sous le nom de cellule "PLD.B.K.". L'invention concerne également la préparation, à partir des virus ainsi cultivés, d'un vaccinantirabique destiné spécialement à l'espèce bovine. La demanderesse a utilisé en particulier des cellules MDBK obtenues à leur 88e sous-culture, auprèsde l'American type Culture Collection (référence : ATCC - CCL22) et a trouvé qu'elles constituent un excellent substrat pour la multiplication du virus rabique devant servir à la préparation d'un vaccin. Toute autre cellule de lignée bovine ayant un coefficient de multiplication suffisant peut entre utilisée. On peut caractériser l'appartenance d'une souche de cellules à l'espèce bovine, par l'établissement du caryotype dlune part (2 n = 60 chromosomes), et par des tests immunologiques, d'autre part. L'origine bovine de la cellule MDBK, ou de toute autre cellule bovine ayant les mimes caractères de sensibilité au virus rabique que la MDBK, fait qu'elle convient particulièrement bien à la préparation de vaccin antirabique destiné à cette espèce, car elle évite ainsi les dangers de sensibilisation et les dangers de paralysie consécutifs à l'utilisation de vaccins obtenus à partir de cellules hétérologues, tels que vaccins obtenus à partir de virus multiplié sur cellules de hamsters, ou de virus multiplié sur tissu nerveux. La cellule MDBK peut etre conservée dans un milieu de maintien à la température de l'azote liquide (-1950C) et au congélateur à la température de -80 C. Elle se multiplie en monocouche avec les milieux de culture cellulaire usuels . base saline de Hanks ou Earle, enrichie avec des extraits de levure; hydrolysat de caséine ou de lactalbumine ; milieu semi-synthétique de Stocker contenant 10 X de Tryptose. Ces milieux sont additionnés de 5 à I O 7. de sérum de veau. On ajuste la quantité de liquide de culture cellulaire à 0,4 ml 2 par cm de surface de monocouche. Le coefficient de multiplication cellulaire entre chaque subculture est de 4 à 8 suivant la nature du milieu de culture, la température et le temps d'incubation. I1 est impératif de limiter le nombre de subcultures afin de garantir la stabilité, c'est-à-dire le caractère diploïde de la lignée cellulaire. En production courante, onne dépasse pas 10 subcultures successives a partir du stock de cellules d'origine, conservé congelé à la température de l'azote liquide. On a découvert que le virus rabique se multiplie de façon satisfaisante sur les cellules MDBK et que les suspensions de virus ainsi obtenues peuvent servir à la préparation d'un vaccin dont le pouvoir immunogène pour le bovin est égal ou supérieur à celui des virus multipliés surdautres cellules hétérologues, les caractères de ces suspensions et, en particulier, le titre infectieux, étant par ailleurs identiques. Le procédé de préparation d'un vaccin antirabique, à partir de virus multiplié sur cellules de lignée bovine telles que la cellule MDBK, est le suivant On prélève des cellules MDBK du stock conservé par congélation à -180 C, et on les cultive en monocouches, en flacons stationnaires type Boite de Roux, ou en flacons roulants, en utilisant un milieu classique, par exemple le milieu de Stocker, additionné de Tryptose et de 10 % de sérum de veau. On inocule le substrat cellulaire, obtenu à l'aide d'une suspension d'une souche de virus rabique fixe dérivée de la souche Pasteur adaptée. par 55 passages successifs à la culture cellulaire, conservé congelé à 700 C. Les couches monocellulaires de cellules sont infectées avec une dilution appropriée (comprise entre le 1/2 et le 1/50ème) de virus décongelé au moment dein'%SpilOiise 10 ml d'inoculum par flacon roulant. Après 2 h d'incubation l'inoculum est éliminé et remplacé par du milieu frais. Les cellules peuvent également entre infectées en suspension Une dilution adéquate de virus inoculum est ajoutée à une suspens ion contenant 5x106 cellules/ml en milieu sans sérum, maintenue entre 33 et 360C, sous agitation magnétique douce, Après 2 h d'adsorption du virus sur les cellules, la suspension est diluée dans du milieu frais et distribuée dans des flacons de culture. Un troisième type d'infection des cellules MDBK consiste à mélanger des cellules infectées et des cellules saines en respectant le rapport de 1 cellule infectée pour 5 à 10 cellules saines. Les cellules infectées proviennent d'une culture n'ayant subi que 3 ou 4 jours d'incubation. Ces cellules infectées sont trypsinées, les cellules lavées, remises en suspension, et mélangées avec des cellules fraîches (200 à 300.000 cellules/ml). La suspension cellulaire ainsi obtenue est distribuée dans des flacons de culture et incubée entre 33 et 360 C. La multiplication du virus est contrlée au moyen de l'immunofluorescence. La récolte des surnageants s'effectue entre le 4è et le 7e jour d'incubation, lorsqu'un nombre suffisant de cellules sont infectées (environ 80 7. des cellules positives en immunofluorescence). On a constaté au cours des études cinétiques de la multiplication du virus rabique que le titre infectieux des surnageants était alors optimal. Les titrages du pouvoir infectieux sont effectués sur souris blanches de 10-12 g (0,03 ml/souris - voie cérébrale - 14 jours d'observation 5 souris par dilution). Les titres sont déterminés par le calcul des totaux cumulatifs selon Reed et Muench. Le titre infectieux optimal est compris entre 107 et 108 DL50 (scuris) par mi Les titrages peuvent également être effectués au moyen de la technique des plages sous agarose sur cellules BHR 21 sensibles (cellules RHK 21 Wistar - technique décrite par Vicktor ; J. Virol. 1967 - I - nO 6 page 1224). Les qualités sérologiquespeuvent être déterminées d'après les tests dits de fixation du complément (technique KOIMER) et leurs résultats exprimés par dilution d'antigène qui fixe 100 % de 2 unités de complément admises dans la réaction. La suspension virulente est ensuite inactivée en presence de -propiolactone (l/4oo. ta température est maintenue pendant 2 h à 370C, puis abaissée à 40C pendant 24 h. L'antigène est alors clarifié par centrifugation ou filtration, puis stocké à 4 C. La suspension d'antigène nlest transformée en vaccin que lorsque les contrôles d'innocuitéconformes aux normes définies par les experts de l'O.M.S. (monographie 1966 - révisée en 1973) et le titre de la suspension avant inactivation sont satisfaisants. On peut avantageusement ajouter au vaccin llun des adjuvants classiques utilisés pour potentialiser le pouvoir antigénique des vaccins. L'adjuvant utilisé peut hêtre un composé chimique de l'aluminium, par exemple l'hydroxyde d'aluminium on mélange sous agitation 3 volumes de la suspension d'antigène avec un volume d'une préparation de gel d'alumine (contenant 2 % d'A1203 exprimé en masse sèche). L'adsorption des antigènes sur le support se prolonge pendant 16 h à 40C. Un agent de conservation tel que l'éthylmercurithiosalicylate de sodium peut etre ajouté à la concentration finale maximale de 1/10.000. Administré aux animaux de laboratoire et aux animaux domestiques auxquels il est destiné, le vaccin antirabique produit selon le procédé ci-dessus décrit provoque la production d'anticorps spécifiques. Il protège la souris contre une infection létale. Les contres d'efficacité sont réalisés selon les tests de Habel ou le test du NIH, décrits dans "Laboratory Techniques in Rabies'tss World Health Organisation - Monograph series N"23, p.l37-151 - 1966. Les tests de Habel réalisés avec ce nouveau vaccin (dénommé ci-après "vaccin MDBK) révèlent un excellent pouvoir antigénique Ce vaccin est aussi efficace que les vaccins préparés à l'aide d'antigènes produits sur cellules BHK (vaccin BHK) ou à l'aide d'antigènes produits sur cerveaux de souriceaux (vaccin sounceaux), comme le montre le tableau I ci-après. TABLEAU I Test de Habel = comparaison entre différents types de vaccins ID 50 (index de protection) VACCIN MDBK - (adjuvant alumine) 5,5 VACCIN BHK - (adjuvant alumine) 5,3 VACCIN souriceaux - (adjwant alumine) 4,4 De plus, on obtient régulièrement un index de protection de l'ordre de 5 et plus, sur souris, pour un vaccin dilué au 1/20é; A titre d'exemple, les résultats obtenus sur plusieurs lots sont rassemblés dans le tableau Il TABLEAU II N des lots de vaccins dilution du vaccin Index de protection ID 50 7. VACCIN n 2 1120e 5,5 VACCIN n 3 1/20e 6,1 VACCIN n 5 1/20e 5,8 VACCIN n0 6 1/20e 4,8 VACCIN n 7 1/20è 5,5 Dans le test du NIH, les rapports entre les dilutions efficaces du vaccin de référence officielle et des vaccins selon l'invention scntsuperieuresà la norme exigée de 0,3, comme le montre le tableau III suivant TABLEAU III N de lot des vaccins Rapport aes dilutions efficace8 50 X VACCIN n 3 1,3 VACCIN n 5 2,4 Les résultats sérologiques obtenus chez les bovins sont encore plus significatifs. Les bovins, vaccinés avec une dose unique de vaccin, produisent rapidement des anticorps antirabiques, dont les titres dépassent largement le taux minimal exigé (0,1 unité internationale). A titre d'exemple, on rapporte dans le tableau IV ci-après une étude cinétique de la production des anticorps chez les jeunes bovins (6 à 9 mois). Le titre, mesuré sur un pool homogène de 5 sérums de bovins vaccinés est, dès la 3e semaine, de 0,3 U.I. Il devient maximal entre 6 semaines et 12 semaines. I1 est à noter que tous les bovins répondent rapidement, puisque les titres individuels des sérums prélevés à 6 semaines étaient tous supérieurs à 1/125. TABLEAU IV Titre des sérums de bovins exprimés en unités inernationales Temps 00 - U.I. 3 semaines après vaccination 0,3 U.I. 6 semaines après vaccination # 7,5 U.I. 12 semaines apres vaccination 5 U I. Une étude comparative effectuée å l'aide d'un vaccin du commerce, produit sur cellule de hamster type -NIL ou type BHK montre que le vaccin, préparé selon le procédé ci-dessus décrit, induit un taux d'anticorps antirabiqus plus élevé chez des bovins adultes. Pool de sérums de 10 bovins ayant Titre des sérums de bovins exprimés reçu chacun une dose de : en unités internationales 4 semaines après vaccination 1. - VACCIN NDBK 0,5 U.I. 2. - VACCIN du commerce produit 0,2 U.I. sur cellule de hamster On a ainsi montré que la cellule MDBK est un excellent substrat pour la multiplication du virus rabique et l'obtention de vaccins antirabiques d'une qualité immunogène pour 11 espèce bovine égale ou supérieure à celle des vaccins obtenus avec d'autres substrats, tels que les tissus nerveux, ou les cellules de rein de hamster. R E V E N D I C A T I O N S 1. Procédé de préparation d'un vaccin antirabique du type vaccin inactivé, utilisant une suspension de virus rabique multiplié sur des cellules d'origine bovine entretenues en lignée continue et dénommes "cellules MDBKV, caractérisé par le fait qu'on utilise, comme virus inoculum, une souche fixe, virulente, de virus rabique, dérivée de la souche Pasteur et adaptez par passages successifs à la culture cellulaire et, qu'apres avoir cultivé cette souche en monocouches sur cellules MDBK, on inactive > de façon connue, la suspension virale obtenue et l'adsorbe sur de l'hydroxyde d'aluminium comme adjuvant d'immunité. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on ajoute le virus inoculum à une suspension de cellules en milieu sans sérum, et cultive les cellules en monocouches. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait qu'on mélange des cellules infectées provenant d'une culture n'ayant subi que 3 à 4 jours d'incubation et des cellules fraîches dans le rapport de 1 cellule infectée pour 5 à 10 cellules fratches et qu'on cultive le mélange de cellules en monocouehes. 4. Vaccin antirabique, destiné à l'espèce bovine, caractérisé par le fait qu'on l'obtint par le procédé selon l'une des revendications 1 à 3.