Brevet FR2223383A1 — publié le 19741025

L'invention a pour objet une thromboplastine partielle, son procédé de préparation et ses applications pour l'établissement de diagnostic. Pour le diagnostic des anomalies du saignement on a besoin d'une substance dite " thromboplastine " pour effectuer la transposition catalytique de la prothrombine en thrombine. On fait toutefois une distinction entre une thromboplastine complète et une thromboplastine partielle la première servant à mettre en évidence les déficiences en facteurs II,V,VII et X et la seconde étant utilisée pour le diagnostic de l'hémophilie A ( carence en facteur VIII), de l'hémophilie B ( carence en facteur X ) ainsi que de carences plus rares en facteurs XI et XII. Pour préparer la thromboplastine partielle on se sert d'extraits organiques de cervelles d'animaux et de thrombocytes desséchés d'origine humaine. La composition chimique des thromboplastines partielles obtenues à partir de ces deux sources est très différente. Des différences se manifestent également dans la sensibilité de ces substances dans la détermination des carences en facteurs VIII,IX,XI et XII. La thromboplastine partielle provenant de cervelles d'animaux est toujours moins sensible. On a donc tendance à utiliser, comme matière première les thrombocytes desséchés pour préparer une thromboplastine partielle plus sensible, mais on ne peut disposer de thrombocytes qu'en quantité bien plus limitée. Toutefois, le besoin en thromboplastine partielle est de plus en plus marqué. L'invention vise entre autres à fournir un procédé permettant d'obtenir une thromboplastine partielle caractérisé en ce qu'on extrait avec un solvant organique des placentas séchés débarrassés de sang, on sépare les produits insolubles de l'extrait, on évapore le solvant, on disperse le résidu dans l'eau et, si on le désire, on ajoute un agent stabilisant et/ou on lyophilise. L'invention vise également la thromboplastine partielle ainsi obtenue et son utilisation comme produit pour diagnostic. L'obtention,a partir de placentas, d'une thromboplastine partielle convenant à des fins de diagnostic n'était pas connue antérieurement. Les placentas servant de matière première doivent de préférence être d'origine humaine. En principe les placentas d'animaux sont également utilisables dans le procédé selon l'invention, mais le produit extrait des placentas humains est préféré en raison de ses propriétés plus avantageuses. Pour faciliter l'extraction il convient au préalable de réduire les placentas en parties fines. Les placentas doivent être débarassés de sang, de préférence par lavage, afin d'éliminer les phosphatides actifs sur la coagulation qui se trouvent dans le sang, ainsi que des constituants solubles dans les solvants organiques, susceptibles d'avoir une action gênante dans le produit final. Pour éviter le passage des constituants gênants dans l'extrait, il est de plus nécessaire de procéder à l'extraction de placentas à l'état sec. Comme solvant d'extraction, les hydrocarbures halogénés et les éthers cycliques sont recommandés en premier lieu. Le chloroforme et le tétrahydrofuranne conviennent particulièrement pour cette extraction. On utilise le solvant dans une proportion ( en volume / poids) correspondant à 20-100 fois la quantité de placenta desséché. I1 convient d'utiliser cette quantité de solvant par portions séparées employées successivement en plusieurs fractions d'extraction. Dans ce cas, il est préférable de réunir tous les extraits pour le traiter ensuite ensemble, mais on peut aussi traiter séparément l'extrait provenant de chaque opération d'extraction. On peut aussi employer différents solvants d'extraction dans la même opération. L'extraction des placentas est effectuée de façon convenable à une température modérée, comprise approximativement entre la température ambiante ét 800C, par exemple en opérant à la température d'ébullition dans le cas de solvants volatils comme le chloroforme ou le tétrahydrofuranne. Comme agents de stabilisation du produit préparé on peut utiliser convenablement toutes les substances Connues employées dans ce but. On peut citer par exemple des charges comme des hydrates de carbone, ( du type lactose, saccharose, dextrane de poids moléculaire ne dépassant pas 5000 environ), le polyéthylène glycol ou l'albumine, des produits tampons, comme la glycine,ou des antioxydants comme des esters de l'acide gallique ( par exemple le gallate de butyle) ou l'acide ascorbique. Pour améliorer la conservation, il est recommandé de sécher le produit. I1 est apparu particulièrement avantageux de distribuer la solution obtenue conformément à l'invention en quantités mesurées dans des flacons, et de la dessécher, par exemple par lyophilisation, à l'intérieur de ces flacons. Dans la mise en oeuvre du procédé, on peut, par exemple, partir de placentas, préalablement broyés, débarrassées du sang par lavage au sérum physiologique puis lyophilisés, que l'on extrait plusieurs fois, de préférence trois fois, avec un solvant comme le chloroforme, utilisé en excès, par exemple à raison de 20 fois le poids de matière traitée, en opérant à la température ordinaire. Le procédé peut également s'appliquer sans diminution de l'activité du produit, en opérant à une température plus élevée pouvant atteindre le point d'ébullition du chloroforme, de préférence en utilisant un extracteur de soxhlet Le volume de solvant nécessaire à l'extraction peut être réduit proportionnellement à l'élévation de la température. L'extrait obtenu est séparé des parties insolubles puis concentré, par exemple dans un évaporateur rotatif. On obtient ainsi un résidu jaune cireux que l'on met en suspension dans l'eau distillée à une concentration (poids/volume) comprise entre 0,025 et 0,2%,égale de préférence à 0,1%, en opérant dans un homogénéisateur rotatif. On peut encore ajouter à cette dispersion lipidique des agents stabilisants.Outre les substances déjà cités, on peut employer à cet effet des polyols, tels que le mannitol, le sorbitol, l'inositol, ou le glutamate de sodium. On utilise par exemple 1 à 5% de polyol et 0,2-2,5% de glutamate de sodium. Pour ajuster le pH à 7,5-8,4, de préférence 8,0, on peut ajouter la quantité nécessaire de solution 1N d'hydroxyde de sodium. En vue de sa conservation le produit ainsi obtenu peut être mis dans des flacons cylindriques et séché par lyophilisation. Pour son utilisation à des fins de diagnostic, le produit obtenu par le procédé selon l'invention, mis dans une suspension à 0,2-2% de préférence 0,5% dans le kaolin est dissous à nouveau dans une solution diluée de chlorure de sodium, de préférence à 0,5%. On peut alors ;L'utiliser pour déterminer le temps de thromboplastine partielle ( par un test de recherche de troubles du système endogène de coagulation ) ainsi que pour mesurer quantitativement l'activité en facteurs VIII,IX,XI et XII. Le test utilisant le produit selon l'invention pour le diagnostic des troubles du système endogène de coagulation (temps de thromboplastine partielle ) est conduit de la manière suivante dans un tube à essai, on mélange une partie de suspension lipidekaolin avec une partie de plasma normal ou de plasma pathologique dans lequel on veut déterminer quantitativement les troubles de coagulation, et on laisse incuber 2 minutes à 37 t 0,5"C. On ajoute encore une partie d'une solution 0,025M de chlorure de calcium, préalablement tiédie à 370C, et on mesure le temps qui s'écoule entre l'addition du chlorure de calcium en solution et la formation d'un caillot solide de fibrine.Si le temps de coagulation du plasma pathologique est plus long que celui du plasma normal (35-50secondes) on diagnostique un trouble de l'activité du système endogène de coagulation ( carence en facteur VIII,IX,XI et XII ), cette conclusion supposant que les autres tests qualitatifs (valeur deQuick et le temps de thrombine plasmique) donnent des temps de coagulation normaux. Le test utilisant le produit selon l'invention pour la détermination quantitative de l'activité en facteur VIII,IX,XI et XII , est conduit de la manière suivante : dans un tube a essai on mélange une partie de suspens ion lipide--kaolin avec une partie de plasma déficient en facteur VIII,IX,XI ou XII et une partie de plasma normal, ou de plasma pathologique, dilué. On fait incuber ce mélange six minutes à 370C. On ajoute une partie d'une solution 0,025M de chlorure de sodium tiède à 370C, et on mesure le temps qui s'écoule entre l'addition de la solution de chlorure de calcium et la formation d'un caillot solide. Pour les résultats quantitatifs, le temps de coagulation obtenu avec le plasma pathologique dilué est rapporté à une courbe d'étalonnage faite avec une série de dilutions d'un plasma normal. Normalement la teneur en divers facteurs par rapport à celle du plasma normal est la suivante Facteur VIII 80-200% Facteur IX 80-150% Facteur XI 80-150% Facteur XII 80-120% Les exemples suivants illustrent l'invention. EXEMPLE 1 A l'aide d'un hachoir à viande, on réduit en parties fines lOkg de placentas humains congelés. On lave la bouillie obtenue 16 à 18 fois avec des portions de 90 litres de solution de chlorure de sodium à 0,9% à + 100C en éliminant après chaque lavage le liquide par sédimentation et décantation. Le liquide surnageant après le dernier lavage est incolore. La bouillie placentaire ainsi lavée est ensuite débarrassée de l'eau de lavage restant par centrifugation à 3000g, pendant 30 minutes, puis le dépôt humide est séché pendant 30 heures dans un lyophilisateur fermé jusqu'à 5% d'humidité résiduelle. On recueille environ 900g de produit sec. On extrait le produit sec 3 fois, en utilisant pour chaque opération 18 litres de chloroforme froid, pendant deux jours sous agitation. Entre deux extractions on isole le résidu par filtration. On rassemble les extraits, on les concentre à 500C dans un évaporateur rotatif sous le vide de la trompe à eau et on obtient finalement un résidu jaune cireux. On obtient 80g de thromboplastine partielle. On met en suspension îg du produit précédent dans un litre d'eau distillée à 11 aide d'un agitateur rotatif en opérant à la température ordinaire. Dans cette dispersion lipidique on dissout 40g de mannitol et lOg de glutamate de sodium tout en agitant. On ajuste le pH à 8,0 avec une solution lN d'hydroxyde de sodium, en controlant l'opération avec une électrode de verre. On agite le produit pendant une heure à 370C, on le distribue en fractions de lml dans des flacons cylindriques et on le lyophilise pendant 24 heures EXEMPLE 2 On soumet 70g de produit intermédiaire sec obtenu a l'exemple 1 à une extraction dans un appareil de soxhletavec 1,4 litres de chloroforme pendant deux heures à la température d'ébullition du chloroforme (61,50C). Le traitement ultérieur de l'extrait obtenu est fait ensuite comme à l'exemple 1 et on obtient 6,4g de produit final. REVEND ICAT IONS 1 - Procédé de préparation d'une thromboplastine partielle caractérisé en ce qu'on soumet des placentas débarrassés de sang et séchés à une extraction avec un solvant organique, on sépare l'extrait des parties insolubles, on évapore le solvant de l'extrait, on met le résidu en suspension dans l'eau et, si on le désire, on ajoute un agent stabilisant et/ou on lyophilise. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme solvant un hydrocarbure halogéné et/ou un éther cyclique. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on utilise comme solvant le chloroforme et/ou le tétrahydrofuranne. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on ajoute comme agent stabilisant une charge, par exemple un hydrate de carbone tel que le lactose, le saccharose, le dextrane, un polyalcool, tel que le polyéthylène glycol, ou une albumine, un produit tampon, tel que la glycine, et/ ou un antioxydant tel qu'un ester de l'acide gallique ou l'acide ascorbique. 5 - Thromboplastine partielle préparée par le procédé selon la revendication 1. 6 - Procédé de diagnostic caractérisé en ce qu'on utilise comme substance sensible la thromboplastine partielle selon la revendication 5.