Brevet FR2236938A1 — publié le 19750207

Le mode de préparation des enzymes dépend de la matière première mise en oeuvre. Si l'enzyme est localisée dans une sécre tion (salive, suc gastrique) on peut traiter le liquide fermen taire, mais il est en général plus commode de traiter les glandes excrétrices elles-mêmes par broyage par exemple et de traiter en suite le filtrat par une suite d'opérations bien connues. Lorsque l'enzyme est incluse dans une cellule, il faut rompre la barrière que forment les parois de celle-ci, on y arrive soit par des moyens chimiques, soit par des moyens physiques (bro yage, ultrasons, par exemple). Les methodes de purification et de mise sur support sont bien connues et il n'est pas nécessaire de les rappeler ici. Actuellement on cherche à obtenir des enzymes d'un type bien defini, mais même lorsque le produit final n'est pas pur, le nombre d'enzymes composant le complexe est très restreint. Pour obtenir des préparations comportant de nombreuses en zymes, on doit fabriquer chaque enzyme séparément, puis les mélan ger. Ce mélange, apparemment avantageux est néanmoins artificiel, onéreux (plusieurs souches), et ne donne pas entière satisfaction. Le mélange se trouve en équilibre, instable, et les constituants ont tendance à développer des réactions secondaires non prévisibles et inhibitrices. Pour remédier à ces inconvénients et d'autres, l'inventeur a mis au point des préparations enzymatiques d'extraits de végétaux, caractérisées en ce quelles se présentent sous forme d'un complexe polyenzymatique sans interaction inhibitrice entre les constituants, et que toutes les enzymes présentes dans tous les produits inter médiaires ou terminaux sont obtenues simultanément au cours ou à la fin d'une même fabrication.Le nombre d'enzymescomposant le complexe est supérieur à six, et peut comprendre w E - AMYLASE - iGLUCOSIDASE -4 GLUCOSIDASE -}FRUCTOSIDASE oC GALACTOSIDASE -ss GALACTOSIDASE -ssMANNOSIDASE - PECTINE ESTERASE - PECTINE POLYGaLaCTURONASE - HEMI-CELLULASE - ENZYME SCINDANT UNE GLUCORO-ARABoGALACrANE - LIPASES - PROTEINASES La matière végétale de base qui peut être du son de blé est micronisée et mise sous forme de pâte, en dessous de 600, avec un pH compris entre 3,5 et 5,5, d'où lton extrait le liquide enzymati que qui est ensuite combiné à un support et séché.Le premier cycle de fabrication peut être prolongé par un deuxième cycle, après mélange, avec les enzymes obtenues précédemment, d'une nouvelle quantité de matière végétale, identique ou différente de la matière d'origine. Pour mieux faire comprendre l'invention il est donné ci-après à titre non limitatif un exemple de réalisation On prend comme matière première nécessaire à la fabrication le son de blé, tel qu'il est possible de l'obtenir dans le commerce. On s'assure cependant I) par chromatographie de l'absence, ou de la présence en quantité maximale autorisée des substances suivantes HCB HCH isomère 4 I1 Heptachlore + époxyde Aldrine + dieldrine DDT et métabolites Mal athion 2) Par analyse bactériologique de l'absence ou de la présence de germes pathogènes, levures, .. par les méthodes couramment utilisées à cet effet. D'autre part, le matériel utilisé sera entièrement constitué par des aciers inoxydables (cuves, agitateurs...) on s'assure de la propreté de ce matériel en adoptant les tolérances autorisées dans les laiteries lorsqu'il y est fait le traitement du lait en vue d'en faire un lait en poudre par le procédé connu sous le nom de "spray". Le son -répondant a ces critères est constitué avantageusement par 12 % d'amidon et 12,5 % de cellulose. Ce son est au préalable micronisé à moins 350 centigrade. On obtient ainsi une poudre ayant 95 % de passants à 200 microns. On mélange une partie de son avec 3 parties d'eau déminéralisée et amenée à pH 2,5 à laide de préférehce d'acide lactique et à une température de 400 centigrade. Le pH de la pâte ainsi obtenue va dès lors se situer aux environs de pH 5,3 Il y a lieu d'ajuster ce pH à pH5 à l'aide d'acide lactique. Le mélange est effectué dans une cuve en inox, thermosta tisée et munie d'un agitateur pouvant etre réglé à 60 tours/minute. L'enceinte de cette cuve sera équipée d'un tube à rayonnement ultra-violet, comme utilisée en industrie lorsque l'on veut travailler en atmosphère stérile. Le mélange est effectue pendant 10 minutes afin d'obtenir une pâte homogène et lisse. Ensuite on provoque une réaction ayant pour but la cellu lolyse. Cette réaction sera effectuée par les méthodes connues dans l'industrie, ultra-sons, enzymes cellulolytiques, ou tout autre procédé. On peut travailler par ultra-sons dans la plupart des cas, ce qui évite de devoir constasment ajuster le pH0 Dans le cas de cellulolyse par l'emploi d'une enzyme dé gradant la cellulose, il est impératif de travailler à un PH situé entre 4,5 et 5 et a' une température de 400C. Lors de cette opéra t ion, nous constatons de progressifs changements de pH, par palier, (le phénomène est connu), il faudra réajuster le pH a' l'aide d'a cide lactique. Il y a lieu d'agiter cette pâte pendant 2 minutes toutes les 10 minutes pendant la durée de l'opérationO En fin de réaction, dont le temps dépend de la température de travail, du pH et de la concentration en diastases cellulolytiques. L(on procède à la séparation des constituants des tissus végétaux (les sons en ltoccurence) par filtration ou par décanta tison, à l'aide d'un appareillage approprié tel que filtre presse, séparatrice centrifuge, ou décanteuse centrifuge-par exemple. La séparation est conduite de telle manière que la teneur en enzymes, du liquide séparé soit de l'ordre de 70 % de l-a quan- tité théoriquement extractible de sorte qu'il reste sur la cellu lose qui constitue le résidu de filtration, décantation ou analogue, 30 % de produit actif. L'on parvient à régler les teneurs respectives-du liquide et du résidu en produits actifs, par ajustement des conditions de température, de pression, de durée du processus de séparation et par la mise au point des conditions de séparation à l'aide dtana- lyse, tels que dosages des amylases et des phosphatases acides par exemple0 Le liquide obtenu à la suite du processus de séparation qui vient d'être décrit est soumis à un nouveau processus de sé -paration par filtration, décantation ou analogue à la suite duquel on recueille un résidu et un liquide. Le liquide obtenu à la suite de ce second processus de séparation est combiné avec un support connu (Malto-dextrine, Sorbitol, etc..) et passé dans un concentrateur à triple effet en ne dépassant pas la température de 45 . Lorsque l'extrait sec atteint une valeur de 50 %, le mélange est passé en tour d'atomisation dont la température d'ehtrée est avantageusement de 1730 à l'entrée et 940 à la sortie. Le produit peut faire l'objet d'une utilisation immédiate, ou dgun traitement complémentaire, dont le schéma sera le suivant Le son conforme aux normes chimiques et physiques définies plus haut et mélangé à raison de une partie de son-et trois parties d'eau. Cette eau "potable" sera mise au pH 3,22 à 11 aide d'acide lactique, le pH du mélange passant alors aux environs de 5,40. La température est de 350C. Le mélange étant effectué pendant 10 minutes afin d'obtenir une patte lisse et homogène, dans une cuve en inox, thermostatisée et muni comme précédemment d'un système ultraviolet permettant de travailler en atmosphère stérile.La réaction ayant pour but la cellulolyse est obtenue a l'aide d'agent cellulolytique qui est celui obtenu lors de la première fabrication à raison de 1,5 gr de cette substance par kg de son mis en oeuvre. Cette réaction dure environ 2 heures à une température de 35 , et au cours de cette opération, il est nécessaire de contrôler le pH et de le réajuster entre 5,20 et 5,40 à l'aide d'acide lactique. Pendant le temps de réaction, il est effectué toutes les dix minutes un mélange complémentaire pendant 2 minutes à la vi tes- se de + ou - 60 tours/minute. En fin de période d'enzymatation le mélange est a) ou bien amené dans un concentrateur à triple effet afin que le pourcentage de matières sèches soit augmenté jusqu'-a' une valeur de 50 , et ensuite passé en tour d'atomisation dont la tempé- rature d'entrée sera avantageusement de 1730 et la température de sortie de 940C maximum, la poudre ainsi obtenue sera: portée assez rapidement aux environs de 10 C. A cet effet le conduit de sortie de la tour diatomisation sera muni d'un système de refroidissement à circulation d'eau par exemple. b) ou bien l'on procède a' la séparation des constituants des tissus végétaux (les sons en ltoccurence) par filtration ou par décantation, à l'aide d'un appareillage approprié tel que filtre presse, séparatrice centrifuge ou décanteuse centrifuge par exemple. La séparation est conduite de telle manière que la teneur en enzymes du liquide séparé soit de 1'ordre de 70 % de la quantité théoriquement extractible de sorte qutil reste sur la cellulose qui constitue le résidu de filtration, décantation ou analogue, 30 % de produit actif. L'on parvient à régler les teneurs respectives du liquide et du résidu en produits actifs, par ajustement des conditions de température, de pression, de durée de processus de séparation et par la mise au point des conditions de séparation à laide d'analyse telle que dosage des amylases et des phosphatases acides par exemple Le liquide obtenu à la suite du processus de séparation qui vient d'être décrit est soumis à un nouveau processus de séparation par filtration, décantation ou analogue à la suite duquel on recueille un résidu et un liquide. Le liquide obtenu à la suite de ce second processus de sé paration est combiné avec un support dans un concentrateur à tri- ple effet en ne dépassant pas la température de 450, Lorsque 11 extrait sec atteint une valeur de 50 %, le melange est passé en tour d'atomisation dont la température d'entrée sera avantageusement de 1730 à l'entrée et 940 à la sortie. Les analyses effectuées sur le produit arrêté à divers stades après la mise en oeuvre de la cellulolyse ont donné les résultats suivants Azote total : 2,40 à 3;50 % m s (matière sèche) Protéines totales r 16 à 22 % m s Lipides : 3 à 6 Si ms Phosphore : 0,48 à 0,50 % m s Calcium : 0,25 à 0,30 % m s Chlorure :O Rapport phospho-calcique : 056 Chromatographie des sucres : (Mitose++ Glucose++, Fructose +) Sucres réducteurs après hydrolyse Clerget, exprimés en glucose en , sur sec : 5,3 à 4,3 Sucres réducteurs après hydrolyse totale exprimés en glucose en % sur sec : 48,7 à 46,6 380 gammes (Y) d'acide pantothénique 13 mgr de 1. lysine 12 mgr de méthionine pour I gramme 17 mgr de tryptophane 9 à 17 &gamma; de B6 Enzymes présentes ss AMYLASE - &alpha;KAMYLASE - &alpha;GLUSOSIDASE -ssGLUCOSIDASE -/ ssFRUCTOSIDASE- &alpha; GALACTOSIDASE ss GALACTOSIDASE ss MANNOSIDASE PECTINE ESTE - PECTINE POLYGALACTURONASE - HEMI-CELLULSE - ENZYME SCINDANT UNE GLUCORO-ARABOGALACTANE - LIPASES - PROTEINASES Min de bien distinguer du point de vue physique le produit de départ (ici le son de blé) d'avec le-produit final (composé polyenzymatiques) on peut faire une détermination-colorimétrique précise. Les spectres sont pris par réflexion sur des surfaces lisses obtenues par compression. Les différentes- exprimées ci-dessus sont calculées en prenant comme point de comparaison le premier échantillon cité et sont exprimées dans le système Hunter. Les résultats moyens sur 10 échantillons ont donné Produit fini Son v I II III IV Alpha ...............0,0497 0,0429 0,0424 0,0317 Beta e * o e o e ...0,0442 0,0428 -0,0441 0,0348 Différence de chromaticité s 12,166 12,91 36,84 Différence de luminance ...: 18,82 -1,85 -92,26 Différence totale de colo ration 0 ............. 22,41 13,04 99,34 Différence de saturation ..: -10738 9,39 -35,26 Différence de teinte . ....... : 1,929 1,955 1,800 L'échantillon de son se distingue de tous les autres par sa forte différence de saturation et de luminance et des coordonnées alpha beta plus proche du zéro, toutes choses qui le rapproche d'un aspect plus blanc. Les préparations enzymatiques sont incorporables aux aliments, ou utilisables dans l'industrie textile. I1 est évidemment possible d'apporter de nombreuses modifications de détail sans pour cela sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Préparations enzymatiques extraites de végétaux et procédé de préparation, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous forme d'un complexe polyenzymatique sans interaction inhibitrice entre les constituants, et que toutes les enzymes présentes dans tous les produits intermédiaires ou terminaux sont obtenues simultanément au cours ou à la fin d'une même fabrication. 2. Préparations enzymatiques et procédé de préparation selon la revendication 1, caractérisées en ce que le nombre d'enzymes composant le complexe est supérieure à six. 3. Préparations enzymatiques et procédé de préparation selpn les revendications précédentes, caractérisées en ce qu'elles comportent, au moins six, des enzymes suivantes ssAMYLASE - &alpha; AMYLASE - &alpha;GLUCOSIDASE -/ GLUCOSIVASE -/ FRUCTOSIDASE RGALACTOSIDASE -ss GALACTOSIDASE -ssNSuMNOSIDASE - PECTINE ESTERASE PECTINE POLYGALACTURONASE - HEMI-CELLULASE - ENZYME SCINDANT UNE GLUCORO-ARABOGALACTANE - LIPASES - PROTEINASES 4.Préparations enzymatiques et procédé de préparation selon l'une quelconque des- revendications précédentes, caractérisées en ce que la matière végétale de base est micronisée et mise sous forme de pâte, en dessous de 600, avec un pH compris entre 3,5 et 5,5, d'où l'on extrait le liquide enzymatique qui est ensuite combiné à un support et séché. 5. Préparations enzymatiques et procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisées en ce que le premier cycle de fabrication peut être prolongé par un deuxième cycle, après mélange, avec les enzymes obtenues pré cédemment, d'une nouvelle quantité de matière végétale, identique ou différente de la matière d'origine. 6. Préparations enzymatiques et procédé de préparation, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisées en ce que la matière de base est le son du blé.