Brevet FR2233334A1 — publié le 19750110

La présente invention concerne des résines échan-euses d'ions porteuses d'enzymes ; elle a également pour objet un procédé pour l'obtention de ces résines g elle concerne aussi l'ap- plication de ces résines, notamment à l'hydrolyse du saccharose. l'utilisation d'enzymes pour catalyser des réactions à grande échelle présente certains avantages par rapport aux procédés chimiques et biologiques. Parmi ces avantages on peut noter la simplicité de l'équipement et des opérations qui peuvent entre effectuées en milieu stérile, la spécificité de la catalyse et sa rapidité. Toutefois, åusqutà ces dernières années, l'utilisation des enzymes était limitée d'une part par leur prix élevé et d'autre part par leur instabilité. En raison des anéliorations récentes des techniques de production des enzymes, notamment par fermentation, de la mise au point de nouvelles méthodes de purifications par exemple par chromatographie d'affinité, de la possibilité de fixer les enzy-, mes, la mise en oeuvre des procédés de catalyse enzymatique a été largement facilitée. On connaît éjà différents procédés de fixation des enzymes sur des sports Insolubles. tes ensymes peuvent autre fixées par adsorption physique sur des supports insolubles [Goldman et Coll. (1971) Biochemical Aspects of Reactions on Solid Supports ; G.R. Stark ed. Academic Press -, 1971, p. 173 ]. La liaison formée entre le support et l'enzyme est'réversible. D'autre part, la fixation de protéines et particulièrement d'enzymes sur différents supports est souvent dénaturante. tes supports utilisés pour l'adsorption physique d'enzymes sont constitués notamment de billes de verre ou de quartz, de particules de charbon ou de membranes de collodion. Dans un autre procédé de fixation; les enzymes sont fixées sur un Support activé par l'intermédiaire d'un groupement chimique capable de réagir avec les fonctions aminées, hydroxyles ou carboxyliques libres des enzymes. te groupe actif du composé chimique fixé sur le support peut entre par exemple un groupe azide, diazo, isothiocyanate ou triazinyle. Selon un autre mode de réalisation connu, les enzymes sont réticulées entre elles par des liaisons covalentes transversales réalisées à l'aide de réactifs multifonctionnels. Les agents multifonctionnels utilisés sont par exemple le glutaraldehySe, l'a cide bis-diazobenzidine-2,2-disulfonique. Un aut-re procédé connu de fixation d'enzymes consiste à immobiliser de façon irréversible les molécules d'enzymes par inclusion dans un gel fortement réticulé ; le gel peut être notamment un gel de polyacrylamide, de dextranes, ou d'amidon, ou des membranes semi-perméables. D'autres procédés font simultanément appel à plusieurs des modes de fixation cités ci-dessus. Il est à noter que l'adsorption physique est le mode de fixation le plus simple, mais l'utilisation prolongée des enzymes fixées par adsorption physique sur un support est limitée du fait de la perte d'activité enzymatique qui résulte de la désorption facile des enzymes au cours des réactions enzymatiques. La présente invention a pour objet un procédé pour la fixation, de façon quasi irréversible, d'une enzyme : ltinvertase de levure, sur des résines échangeuses d'ions, qui permet l'utilisation prolongée de l'enzyme et sa mise en ceuvre dans des réac téurs continus. La présente invention a également pour objet un procédé pour la fixation de l'invertase sur des résines échangeuses d'ions au cours duquel l'enzyme n'est pas dénaturée. Le procédé de la présente invention consiste à sécher la résine échangeuse d'ions sous vide, à mettre une solution d'invertase dans un tampon en contact avec ladite- résine et à re eueillir la résine désirée -sur laquelle l'invertase est fixée. On opère par exemple sous un vide de 17,5 nn' r-- environ. Le tampon est en général un tampon acétate de sodium 0,01 H pH 4. Le pH de la solution enzymatique est choisi de façon à optimiser l'adsorption, c'est-à-dire de manière à ce que la résine et 1'invertase aient des charges électriques opposées, le point isoélec- trique de 1'invertase étant égal à 4,5. Ce pH se situe de préférence entre 4 et 5 et est plus particulitrerent égal à 5 si la résine est anionique, et 4, si la résine est cationique. Le temps de contact est de 6 à 24 heures à une température comprise entre + 1 et 10 C et de préférence de 4 C.Il est convenable de laver avec soin la résine obtenue porteuse d'invertase, notamment avec la même solution tampon que celle utilisée pour l'adsorption. Les résines échangeuses d'ions utilisées dans le procédé de l'invention sont avantageusement des résines polymères de styrène réticulé à l'aide de divinyl-benzène, ce sont notamment les rési nes "Amberlite" de type macroréticulé, telles que l nique "Amberlite IRA 93". La concentration des solutions dtinvertase utilisées pour la fabrication des résines porteuses d'invertase selon l'invention peut varier dans de larges mesures. Elle est comprise en général entre Q > 1 et 30 mg d'invertase par 1 de tampon et est de préférence de 15 mg par ml de tampon. La quantité de résine échangeuse d'ions utilise est telle que la ruine porteuse d'in- vertase contienne jusqu'à 50 mg d'invertase par g de résine après adsorption. L'invention concerne donc, bien entendu, à titre de nouveaux produits, les résines porteuses d'invertase, telles que définies ci-dessus. Les résines chanses d'ions porteuses d'invertase selon la présente Invention conviennent particulièrement bien pour l'hydrolyse du saccharose. L'invertase de levure catalyse l'hydrolyse du saccharose, en inversant le pouvoir rotatoire de la solution, selon le schéma réactionnel saccharose + H2O # D glucose + D fructose. Ainsi, la présente invention a également pour objet l1appli- cation des résines échangeuses d'ions porteuses d'invertase obtenues selon le procédé de l'invention, à l'hydrolyse du saccharose. On connais déjà des procédés pour l'obtention de saccharose inverti ; les solutions de saccharose inverti sont obtenus par hydrolyse acide en présence soit d'acide sulfurique ou d'acide chlorhydrique, soit en présence de résines sulfoniques d'effica- cité équivalente à une solution d'acide fort deux ou trois fois normale (Schneider, E,G. Int. Sugar. J, 1917, 73, 9-73, 100104). Les solutions de saccharose inverti obtenus selon les pro clés ci-dessus sont ensuite neutralisées et purifiées. L'utilisation des résines échangeuses d'ions porteuses d'invertase permet une hydrolyse continue du saccharose et l'obtention de solutions concentrées de saccharose inverti. t'hydrolyse de solutions de saccharose selon l'invention consiste à mettre en contact, dans des réacteurs quelconques des solutions de saccharose avec la résine échangeuse d'ions porteuse d'invertase, à une température comprise entre 10 et 300C environ et de préférence à 30 C. Au delà de 300C, on observe en effet une désorption de l'invertase au cours du temps. On obtient des rendements maximaux, meme avec des solutions de concentration élevée (de l'ordre de 8;) si le temps de contact des solutions de saccharose avec la résine est suffisamment long.En énéral les concentrations des solutions de saccharose sont comprises entre 10 et 85%, exprimes en poids de saccharose pa volume de solution. Divers types de réacteurs biochimiques tels que des réacteurs tubulaires, réacteurs homogènes, etc ... permettant une opération continue conviennent aux fins de l'invention. L'invention sera illustrée sans eAtre limitée par les exemples suivants Exemple 1 : fixation ie l'invertase sur une résine échangeuse d'ions. La résine utilisée dans cet exemple est la résine "Amberlite IRA 93" fabriquée par la compagnie Rohm et Hass, Philadeiphie, SUA. La résine a été préalablement lavée avec de l'eau distillée puis équilibrée avec une solution de tampon acétate de sodium 0,01 M à pi 5. Après filtration, la résine a été séchée sous un vide de 17,5 mm de Hg. Elle a été ensuite imbibée avec une solution d'invertase dans le même tampon acétate de sodium, à raison de 2 ml de ladite solution d'invertase par gramme de résine, la solution d'invertase contenant 15 mg d'invertase par mi de tampon. L'adsorption a eu lieu pendant 12 heures à 40C, cette température étant la plus adéquate afin de provoquer le moins possible la dénaturation de l'invertase. Après adsorption de l'invertase, la résine est lavée de fa- çon répétée sous agitation pendant 70 minutes à 20 C avec la solution tampon utilisée pour l'adsorption. La quantité de solution tampon utilisée est de 20 ml par gramme de résine. le pli optimum apparent d'activité de l'invertase adsorbée sur résine "Amberlite IRA 93" est égal à 3,2. A ce pli l'activité enzymatique est de 50% par rapport à l'activité maximum de I 'in- vertase soluble utilisée lors de l'adsorption. tes mesures de activité sont exprimées en tant que vitesse initiale de l'hydrolyse du saccharose, c'est-à-dire en micromôles de saccharose hydrolysées par minute au pH optimum, à 300C, à une concentration en saccharose égale à 10%. Environ 60% de l'invertase utilisée lors- de l'adsorption, c'est-à-dire 18 mg d'invertase, ont été fixés par gramme de re- sine, de façon stable et très peu dénaturante. I1 est possible de fixer des quantités d'invertase supé- rieures, mais le rendement global d'activité enzymatique peut être plus faible. Les résines porteuses d'invertase selon l'invention ont été conservées dans une solution tampon à pli 4 à 300C pendant 8 jours sans dénaturation. Exemple 2 : hydrolyse dtune solution de saccharose par l'inver tase fixée sur la résine "Amberlite RA 93". Dans un réacteur tubulaire réalisé à l'aide d'une colonne de verre de 30 cm de hauteur et de ,9 cm de diamètre, on a introduit de la résine nAmberlite IRA 92n porteuse d'invertase obtenue par le procédé décrit à l'Exemple I. Le lit fixe à l'intérieur de la colonne est constitué par 5 grammes de ladite résine. te volume total Vo du réacteur enzymatiquement actif est égal à 16 ml, le volume mort V1 du réacteur est de 7,5 ml. Au cours de ces essais le débit de la solution de saccharose varie entre 3,76 et 50 ml/mn, ce qui correspond à un temps de contact variant entre 4 et 0,3 minutes. te taux d'hydrolyse est mesuré lorsque l'état stationnaire est obtenu; celui-ci est généralement atteint après le passage de 100 ml de solution ee qui représente environ 13 volumes de réacteur. Dans une première série d'essais la quantité d'invertase utilisée lors de l'adsorption est de 3 mg par gramme de résine et les concentrations des solutions de saccharose utilisées lors de l'hydrolyse continue sont de 10 et 20% en poids de saccharose par volume de résine, le pH de la solution est amené à 4 à l'aide de la solution tampon acétate de sodium 0,01 M. Dans une deuxième série d'essais, la quantité d'invertase utilisée par gramme de résine est de 40 mg et les concentrations des solutions de saccharose sont respectivement de 40 et 50 (poids par volume), le pli étant de 4 comme dans les essais précédents. tes résultats obtenus sont indiqués sur la figure 1, sur laquelle sont portés en ordonnées les taux d'hydrolyse et en abscisses le temps de contact en minutes de la solution de saccharose avec le lit fixe du réacteur. La courbe (1) représente le taux dthydrolyse d'une solution de saccharose à 10% (poids par volume) obtenu avec une résine "Am- berlite IRA 93N contenant 3 mg d'invertase par g de résine, en fonction du temps de contact. La courbe (2) représente le taux d'hydrolyse d'une solution de saccharose à 20% (poids par volume) obtenu en présence d'une résine "Amberlite IRA 93" contenant 3 mb d'invertase ocr g de résine en fonction du temps de contact. Les courbes (3) et (4) représentent respectivement les taux d'hydrolyse de solutions de saccharose à 40% (courbe (3)) et à 50% (courbe (4)) obtenus en présence d'une résine "Amberlite IRA 93" contenant 40 mg d'invertase par g de résine. Les résultats précédents montrent que l'on peut obtenir des taux d'hyrolyse relativement élevés pour des temps de' contact assez courts. Exemple 3 : Hydrolyse continue d'une solution de saccharose. Dans cet essai on a utilisé une solution de saccharose à 50% (calculé en poids ie saccharose par volume de tampon acétate de sodium 0,01 Z pW 4). La quantité d'invertase mise en contact lors de l'adsorption était de 40 mg par ramme de résine. Le réacteur utilisé fut le même que dans l'Exemple 2 précédent et le lit fixe était constitué par -6 grammes de résine. Le débit de la solution de saccharose à 50% dans le tampon acétate de sodium 0,01 M pB 4 était de 1 ml/mn. Après la phase de démarrage, on a observé que le taux d'hydrolyse restait constant et égal à 76% pendant toute la durée de l'hydrolyse, c'est-à-dire pendant 190 heures. Exemple 4 : Hydrolyse continue d'une solution industrielle de saccharose. Dans cet exemple une solution de saccharose provenant de la Société "Générale Sucrière" connue sous la référence "Sirop Clairce" a été traitée comme dans l'Exemple 3. La quantité d'invertase utilisée pour la fixation sur la résine "Amberlite IRA 93" était de 40 mg par gramme de résine ; le lit fixe de la colonne était constitué par 6 grammes de résine. Les résultats obtenus sont rassamblés dans le tableau ci-dessous. Concentra - : pH (ajusté : taux d'hydrolyse : débit : durée tion (P/V) : a l'aide à n l'équilibre et (ml/mn) d'utili- ; d'acide sul- à 300C satiofl : furique : : : (jours) : 50% : 4 : 73 : 1 : 8 : 50% : 3 : 80 : 1 : 7 : 80% : 4 : 25 : 0,5 : 8 : 80% : 3 : 29 : 0,3 : 4 : 80% : 3 : 35 : 0,33 : 2 : REVENDICATIONS 1. Résine échangeuse d'ions porteuse d'enzyme caractérisée en ce que l'enzyme -2t l'invertase de leuvre et en ce celle est fixée de façon quasi-irréversible et non dénaturante sur la résine. 2. Résine selon 'a revendication 1, caractérisée ce ne la résine est un polymère de styrène réticulé avec ciu divinylbenzène de type macroréticule. 3. Résine selon la revendication 2, caractérisée en ce que la résine est une résine disponible sur le marché sous la dénomination "Amberlite", par exemple une résine "Amberlite IRA 93". 4. Résine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la résIne contient jusqu'à 60 mg d'invertase par gramme de résine. 5. Résine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée an ce que la résine est "l'Amberlite IRA 93, et en ce qu'elle contrent 3 mg d'invertase par gramme de résine. 6. Résine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la résine est l'"Amberlite IRA 3", et en ce qu'elle contient 40 mg d'invertase par gramme de résine. 7. Procédé pour l'obtention de la résine échangeuse d'ions porteuse d'invertase selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'il consiste à sécher la résine sous vide, à mettre en contact une solution d'invertase dans un tampon avec ladite résine pendant 6 à 24 heures à une température de 1 à 100 C et à recueillir la résine porteuse d'invertase. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la résine est séchée sous un vide de 17,5 mn Hg environ. 9. Procédé selon l'une des revendications 7 et 8, caractérisé en ce que la concentration de la solution d'invertase est de 0,1 a 3G mg par ml de tampon, par exemple de 15 mg par ml de tampon 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que le pH de la solution tampon d'adsorption est compris entre 4 et 5 environ. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que le tampon d'adsorption est une solution d'acétate de sodium 0,01 M,pH 4, si la résine est cationique et pH 5, si la résine est anionique. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, caractérisé en ce que la résine porteuse d'invertase est lavée, notamment avec la même solution tampon que celle utilisée pour l'adsorption. 13. Application des résines échangeuses d'ions porteuses d'enzyme, selon l'une quelconque des revendications I à 5, à l'hydrolyse de sofutions de saccharose, caractérisée en ce nu'on ret en contact, en particulier en continu, des solutions de sac- charose avec ladite résine porteuse d'invertase à une température de 10 à 30 C environ, en particulier de 30 C. 14. Application selon la revendication 13, caractérisée en ce que les concentrations de solutions-de saccharose sont compri- ses entre 10 et 85% exprimé en poids de saccharose par volume).