Brevet FR2234313A1 — publié le 19750117

L'invention, réalisée dans les laboratoires de ltOrgano- technie de la Coopération Pharmaceutique Française, a pour objet un procédé d'extraction de la glutathion peroxydase, permettant de préparer celle-ci sur une échelle industrielle. On rappelle que la glutathion peroxydase (numéro de code attribué par l'organisme dit enzymes Commission de l'Union Internationale de Biochimie : : EC. 1.11.1.9) est une enzyme dont le poids moléculaire est de 84.000 et qui se rencontre dans l'organisme des mammifères, notamment dans les érythrocytes où elle assure la protection de l'hémoglobine. Elle peut être utilisée en analyse biochimique, bromatologique, dans le dosage des hydroperoxydes ainsi que comme substance active dans des médicaments destinés au traitement des affections ayant pour origine l'afflux pathologique des peroxydes lipidiques. Pour ses différentes applications, la glutathion peroxydase doit être débarrassée des protéInes contaminantes qui l'accompagnent dans la matière première, par exemple de celles qui sont susceptibles, dans les applications thérapeutiques, de provoquer des phénomènes d'origine toxique, éventuellement de nature immunologique. C'est ce but que l'invention se propose d'atteindre à l'é- chelle industrielle en utilisant, en tant que matière première, des hématies, et en particulier des hématies de boeuf. Pour ce faire, conformément à l'invention, du sang, notamment de boeuf, débarrassé du plasma sanguin, est hémolyse et mis en contact avec un support adsorbant, notamment une résine, après avoir été amené aux conditions correspondant au pH isoélectrique de la glutathion peroxydase qui se fixe sur ledit support et qui, après avoir été enlevée dudit support par élution, est soumise à une précipitation saline, de préférence au sulfate d'ammonium, en soi connue, le précipité obtenu étant dissous et sa solution soumise a' une dialyse suivie d'une chromatographie sur échangeur d'ions, une purification supplémentaire indispensable pour amener le produit à 1 t état de pureté requis pour ses applications, étant réalisée au moyen, soit d'un passage sur un gel propre à séparer les protéines selon leur poids moléculaire, soit d'une chromatographie d'adsorptionsur polymère protéique. D' autres caractéristiques de 1' invention apparaitront dans le développement de la description qui suit et qui est relative à des modes de réalisation avantageux. Du sang, notamment du sang de boeuf, est recueilli sur du citrate de sodium (de l'ordre de 13g par kg de sang), ou tout autre anticoagulant, puis centrifugé de façon à éliminer le-plasma, la température étant d'environ 40C, une température de O à 100C étant maintenue durant toutes les opérations qui suivent. La susdite centrifugation peut être opérée en continu sur séparateur à assiette, par exemple du type connu sous la marque Westfalia. Une fois la centrifugation terminée, on procède au lavage de la purée globulaire à l'aide d'une solution isotonique -- autre que du chlorure de sodium, dont les traces subsistantes perturberaient le dosage polarographique de l'activité enzymatique -autant de fois que nécessaire pour éliminer aussi complètement que possible les protéines plasmatiques. Dans la pratique, trois lavages successifs se sont révélés suffisants. On recueille ainsi une purée globulaire, débarrassée de la plus grande partie de ses protéines plasmatiques et qui est hémolysée par dilution avec de l'eau distillée, ou toute solution hypotonique, le mélange étant centrifugé, après une heure de contact, à au moins 15.000 G, pour parfaire l'hémolyse grâce i l'action d'une force centrifuge brutale et également pour éliminer lesstroma globulaires en suspension. Il convient de maintenir l'action du champ gravitationnel pendant au moins deux minutes. L'hémolysat ainsi obtenu est ensuite débarrassé des 4/5 de la catalase normalement présente,et de plus de 99 % de l'hémo- globine qutil contient, par mise en contact avec un support adsorbant, notamment une résine adsorbante, capable de fixer sélectivement la glutathion peroxydase au pH isoélectrique de cette dernière, l'hémolysat étant par conséquent amené, préalablement à cette mise en contact, à un état correspondant au pH isoélectrique de l'enzyme recherchée. Pour réaliser ces conditions, l'hémolysat est amené par dilution avec un tampon phosphate à 0,005 M pH 5,8 à un abaissement cryoscopique compris entre -0,080C et -0 > 14iC. Cet abaissement cryoscopique correspond à une force ionique de 0,022 à- pH 5,8 pour un- tampon 0,019 N (NaH2 P04/Na2H P04). Dans ces conditions, l'enzyme qui possède un point isoélectrique de 5,8 à une force ionique de 0,022, est placée dans des conditions minimales de solubilité et par conséquent dans des conditions maximales d'adsorption par l'agent adsorbant. La résine au contact de laquelle on met la solution tamponnée est une résine qui, dans des conditions de pH et. de force ionique ainsi réalisées, retient à son point isoélectrique l'en- zyme que l'on cherche. à extraire, alors qu'elle laisse passer la majorité des protéines contaminantes. De bons résultats sont obtenus avec les résines vendues sous les dénominations "XN 1009" et 'tXAD-8" par la société Rohm et Haas. Le contact entre la solution tamponnée et la résine est maintenu sous agitation pendant suffisamment longtemps pour obtenir un optimum de fixation d'enzyme. Dans la pratique, ce temps de contact est d'au moins quatre heures et peut atteindre une nuit. Ensuite, le liquide hémoglobinique surnageant est soutiré et la résine est abondamment rincée au tampon phosphate 0,019 M pH 5,8, de façon à éliminer au maximum l'hémoglobine pouvant rester sur la résine. Dans la pratique, on utilise généralement un volume de tampon phosphate équivalent à douze fois le volume de résine. Il peut être avantageux de faire passer le filtrat ainsi récupéré sur une autre colonne contenant également de la résine adsorbante. On peut ainsi récupérer jusqu'à 50 % de l'enzyme se trouvant encore dans le filtrat. Le traitement adsorbant à l'aide de la résine sus-indiquée permet d'utiliser au minimum 99,5 % de l'hémoglobine contenue dans l'hémolysat. Cette opération étant effectuée, on procède à l'élution de 1 t enzyme fixée par adsorption. Cette élution consiste, par changement du pH, à s'éloigner autant que possible du point isoélectrique de enzyme, de façon à modifier ses conditions de solubilité, ce qui entraine son élution de la résine sur laquelle elle a été retenue. Le pH d'élution doit être choisi en tenant compte du fait que des pH extrêmes amélioreraient le rendement de ltélution mais auraient également pour conséquence une dénaturation rapide de l'enzyme ; c'est pour cette raison qu'on choisit un pH acide entre 3,5 et 4,5. L'élution peut se pratiquer en continu ou en discontinu, et les activités enzymatiques,dans 'élut, de la catalase normalement présente et de la glutathion peroxydase sont suivies en parallèle par dosage, de façon à ne recueillir que les fractions à la fois les plus riches en gluta- thionperoxydase et les plus pauvres en catalase À la sortie de la colonne, le pH des éluats réunis est immédiatement ramené à au moins 5,5 La totalité de l'éluat est ensuite soumise à un traitement de précipitation saline, par exemple au moyen de sulfate d'ammonium cristallisé.On peut pratiquer au préalable une étape de concentration par ultrafiltration, La précipitation au sulfate d'ammonium est conduite de telle manière que le maximum d'enzyme soit insolubilisé avec le minimum de protéines étrangères -; pour ce faire on poursuit la précipitation pendant 24 à 48 heures, la concentration en sulfate d-'ammonium étant comprise entre 60 et 70 % de la saturation de ce sel (saturation du sulfate d'ammonium dans l'eau distillée à + 40C 520 à 550 g par litre). Le précipité est récupéré par centrifugation de la suspension. Pour augmenter le rendement de la précipitation, on ajoute une dose de 5 à 10 mM par litre de glutathion au mélange précipitant. Le précipité ainsi obtenu est redis souks dans le minimum de tampon phosphate 0,005M pH 7, puis soumis à une dialyse contre du tampon phosphate 0,005 M pH 7, de façon à éliminer toute trace de sulfate d'ammonium, le dialysat étant-ensuite soumis à une chromatographie sur résine échangeuse d'ions ; comme résines, on peut utiliser par exemple celles qui sont connues sous les dénominations de DEAE-50 Séphadext' et "DEAE-Cellulose't ; l'échan- geur d'ions utilisé est préalablement équilibré dans du tampon phosphate 0,005 M pH 7. Une fois l'enzyme fixée sur la résine, on procède au rin çage de celle-ci avec le même tampon, de façon à éliminer les protéines non fixées. Ce rinçage devra être poursuivi jusqu'à ce que la densité optique à 280 mu de l'élut soit nulle. On élue ensuite l'enzyme fixée en appliquant une force ionique plus élevée, et choisie de telle sorte que les traces subsistantes de catalase restent fixées sur la résine (par exemple le tampon phosphate 0,03 M pH t. L'élut contenant l'enzyme est concentré dix à vingt fois par mise en oeuvre d'une ultrafiltration dont les conditions sont choisies en fonction du poids moléculaire de l'enzyme (membrane de porosité 30.000 ou 50.000 , le poids moléculaire de la glutathion peroxydase étant de 84.000 comme indiqué plus haut). Le concentré ainsi obtenu, qui est en général soumis à une purification supplémentaire qui permet de l'amener à un état de pureté compatible avec les utilisations analytiques et thérapeutiques envisagées peut également être directement lyophylisé et stocké sous cette forme, par exemple en tant que matière première pour des purifications ultérieures. Dans le cas général toutefois, pour abaisser le taux en protéines contaminantes du susdit concentré à une valeur compatible avec les susdites utilisations analytiques ou thérapeutiques, on a recours à ladite opération supplémentaire de purification, soit par un passage de la solution sur un gel capable de séparer les protéines contaminantes résiduelles, par exemple un gel du type de ceux connus sous les dénominations "Séphadex G. i50"- ou tSépharose 2-B'1, ou par une chromatographie d'adsorption. En ce qui concerne plus particulièrement cette chromatographie d'adsorption, elle peut être réalisée en ayant recours à un polymère, obtenu notamment à partir de plasma de sang de boeuf et fixé sur un support permettant son utilisation en colonne ce support peut être constitué par de la laine de verre ou par du sable. Pour préparer un polymère propre à être utilisé conformément à l'invention, par exemple on dilue 4,500 litres de plasma de boeuf contenant 60,5 g de protéine au litre, jusqu'à un volume de 6,400 litres avec du tampon phosphate 0,02 M pH 6,8, et on homogénéise avec 120 g de laine de verre préalablement lavée au mélange sulfochromique et abondamment rincée à l'eau distillée On ajoutè ensuite 2 litres d'une solution de glutaraldéhyde à 2,5 %.On homogénéise-de nouveau le mélange, puis on met immédiatement au congélateur. Une fois que la congélation est totale, on décongèle l'ensemble et l'on obtient ainsi une substance protéique insoluble uniformément répartie sur la laine de verre utilisée. On rince abondamment à l'eau distillée ou au tampon 0,005 M pH 7 jusqu'à disparition totale des protérnesnon polymérisées, puis on équilibre dans un tampon phosphate 0,005 M pH 7. Le polymère fixé sur la laine de verre peut être mis sous la forme d'une colonne au sommet de laquelle on applique l'échantillon à purifier, le volume de tampon surmontant le polymère étant préalablement réduit au maximum. L'élution est réalisée, à l'aide du même tampon, après pé nétration de l'échantillon dans le polymère et les fractions actives sont recueillies en les repérant au spectrophotomètre à 280 nm. L'enzyme ainsi recueillie avec un rendement de 80 % par rapport à l'échantillon est obtenue avec un taux de purification au moins égal à 2 et pouvant atteindre 4 ; ce taux de purification est fonction de l'activité spécifique de départ. Pour illustrer le susdit procédé, on donne ci-après un exemple numérique de mise en oeuvre. EXEMPLE On soumet 12 litres de globules rouges de sang de boeuf, lavés trois fois avec un tampon isotonique pH 7, à l'hémolyse par 6 litres d'eau distillée. L'hémolysat, appelé "fraction F11, est alors dilué au -moyen du tampon phosphate 0,005 M pH 5,8, de façon à être amené à un abaissement cryoscopique compris entre -0,08 et -0,14 C. On obtient ainsi une fraction F2 titrant 100.000 unités polarographiques. On signale que l'activité enzymatique peut autre déterminée par la méthode polarographique de L. FLOHE, décrite dans Z. Klin. Chem. u. Klin. Biochem. 8. Jg., S. 156-161, mars 1970 "Some Hints to Avoid Pitfalls in Quantitative Determination of Gluta- thion peroxidase" - L. FLOHE - Ingebord BRAND. On fait passer lthémolysat sur vingt-quatre litres de résine adsorbante du type XN-1009 (Rohm et Hass) préalablement équi librée avec un tampon phosphate 0,019 M pH 5,8 et, après un contact sous agitation d'une nuit, l'hémolysat est soutiré, et la résine lavé avec le même tampon La majeure partie de l'hémoglobine ayant été éliminée (99,5%), on procède à l'évolution de l'enzyme fixée sur la résine en utilisant une solution acide pouvant être de l'acide acétique 0,01 M. On obtient ainsi 45 litres d'un éluat dont l'activité totale est de 46.000 unités polarographiques, soit un rendement par rapport à F2 de 46 %. On soumet cet-éluat à un traitement de précipitation en ayant recours, soit à une solution de sulfate d'ammonium saturée, soit à du sulfate d'ammonium cristallisë-, de façon à amener- l'en- semble à un degré de saturation de 70 % (saturation du sulfate d'ammonium à 4"C : 520-550 g/l). Pour augmenter le rendement de précipitation, on ajoute une quantité de glutathion suffisante pour que la concentration en ce composé soit de 5 à 10 mM. La précipitation est poursuivie pendant 24 à 48 heures. On récupère ainsi une fraction F4 qui est redissoute dans une quantité minimum de tampon phosphate o,0os M pH 7. Cette fraction titre 26.700 unités polarographiques, ce qui correspond à un rendement par rapport à F2 de 26,7 % Le précipité F4 repris est dialysé contre du tampon 0,005 M pH 7, de façon à éliminer le sulfate d'ammonium. On obtient ainsi une fraction dialysée F5 titrant 20.000 unités polarogra phiquesj ce qui correspond à un rendement de 20 % par rapport à F2. Le dialysat est passé sur résineaDEAE-A-50 Séphadexlléquili- brée dans un tampon 0,005 M pH 7. Après lavage de la résine au moyen du même tampon, on procède à l'élution de l'enzyme à l'aide du tampon phosphate 0,028 pH 7, ce qui permet d'obtenir une fraction F6 titrant 16.000 unités, ce qui correspond à un rendement de 16 % par rapport à F2. L'éluat ainsi obtenu est concentré par ultrafiltration sur membrane de marque "Amicon PM-30" ou "UM-tO" sous- pression d'azote (ou passé sur un dispositif d'ultrafiltration à cartouche de même porosité) de façon à réduire le volume dans des proportions permettant d'obtenir, après lyophilisation, un produit d'activité spécifique élevée. On obtient donc un concentrat F7 titrant 12.800 unités polarographiques, soit un rendement de 12,8 % par rapport à F2. Si l'on désire stocker le produit ainsi obtenu, on ajuste à 1 % de lactose, ou tout-autre adjuvant de lyophilisation, puis on le lyophilise. On peut éventuellement ajouter avant la lyophilisation un conservateur antibactérien, par exemple du merthiolate de sodium à la dose de 0,01 %. On obtient ainsi une fraction F8 qui titre 11.500 unités polarographiques, ce qùi correspond à un rendement par rapport à lthémolysat F2 de 11,5 %. L'évolution des activités spécifiques apparait (nombre d'unités polarographiques au gramme de protéines, ces dernières étant dosées par la méthode de O.H. Lowry , N.J. Rosenberg, A.L. Farr et R.J. Randall (1951), J. Biol. chem. 193, 265), à la lecture des valeurs réunies dans le tableau It dans lequel, pour chacune des fractions F2 à F8 , on fait figurer le nombre dsuni- tés polarographiques au gramme de protéines, ainsi que le coefficient de purification. TABLEAU I Fractions Unités polarographiques Coefficient de au gramme de protéines purification F2 25 1 F3 1 710 6-8,5 F4 2 860 114 F5 2 860 114 F6 29 700 I 160 F7 29 700 1 160 F8 29 700 1 160 Si, au contraire, on désire utiliser immédiatement le produit correspondant à la susdite fraction F7 , on abaisse le taux en protéines contaminantes de cette fraction à une valeur compatible avec l'utilisation envisagée ; pour ce faireon la sou- met à une purification supplémentaire consistant en une chromatographie d'adsorption sur polymère protéique. Le polymère protéique mis en oeuvre peut être le polymère obtenu à partir du plasma de sang de boeuf dont le mode de préparation est indiqué dans la description. On récupèreS en tête de chromatographie effectuée sur ce polymère, les fractions actives, soit 12. & 0 unités polarographiques, dont l'ensemble constitue une fraction F'8 Cette fraction purifiée est concentrée par ultrafiltration sur une membrane du type de celles connues sous les dénominations "AMICON PM 300"ou"UM lO", de façon à réduire ie volume dans des proportions permettant d'obtenir, après lyophilisation, un produit d'activité spécifique élevée. On obtient ainsi un concentrat appelé "fraction F'g ", qui titre 10.200 unités polarographiques, ce qui correspond à un rendement total par rapport à F2 de 10,2 %. Ce concentrat est alors ajusté à 1 % de lactose avec un adjuvant de lyophilisation adequat (on peut utiliser par exemple du dextran, un protéolysat de caséine, de la polyvinylpyrrolidone) puis lyophilisé. On peut éventuellement, avant la lyophilisation, y ajouter un conservateur antibactérien, par exemple du merthiolate de sodium à la dose de 0,01 %. On obtient ainsi une fraction F'1O titrant 9.500 unités polarographiques, ce qui correspond à un rendement total par rapport à F2 de 9,5 %. L'évolution des activités spécifiques au cours de la préparation (en passant de la fraction F2 à la fraction F'1o ) est celle qui apparat à l'examen des valeurs réunies dans le tableau II dans lequel on a fait figurer, pour chacune desdites fractions, le nombre d'unités polarographiques par gramme de protéines et le coefficient de purification. TABLEAU II Fractions Unités polarographiques au Coefficient de gramme graine de protéines purification F2 25 1 F3 1 170 68,5 F4 2 860 114 F5 2 860 114 F6 29 700 1 160 F7 - 29 700 1 160 F'8 79 100 3 480 F'g 79 100 3 480 Fo1 79 100 3 480 L'évolution des activités spécifiques et du coefficient de purification apparaissant dans le susdit tableau montre 1' inté- rêt de la purification supplémentaire effectuée sur la fraction F7 et qui conduit à la fraction F'1Q Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède; l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. REVENDICATIONS Procédé d'extraction de la glutathion peroxydase, caractérisé par le fait que du sang, débarrassé du plasma sanguin, est hémolysé et mis en contact avec un support adsorbant après avoir été amené aux conditions correspondant au pH isoélectrique de la glutathion peroxydase qui se fixe sur ledit support et qui, après avoir été enlevée dudit support par élution, est soumise à une précipitation saline en soi connue, le précipité obtenu étant dissous et sa solution soumise à-une dialyse suivie d'une chromatographie sur échangeur d'ions, une purification supplémentaire étant réalise au moyen , soit d'un passage sur un gel propre à séparer les protéInes selon leur poids moléculaire,soit d'une chromatographie d'adsorption sur polymère protéique. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on utilise des hématies de boeuf, le support adsorbant étant constitué par une résine et la précipitation saline réalisée à l'aide de sulfate d'ammonium. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que la résine utilisée pour l'adsorption de la glutathion peroxydase est constituée par l'une de celles que la Société Rohm et Haas vend sous les dénominations "XN 1009" et "X AD-8 ". 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractErisé~par le fait que le contact de lthémolysat de sang de boeuf amené aux conditions correspondant au pH isoélectrique de la glutathion peroxydase avec la résine est maintenu pendant 4 heures a une nuit. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que ltélution de enzyme fixée sur la résine, se pratique en continu ou en discontinu à l'aide d'une solution tampon dont le pH est de 3,5 à 4;5 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que la solution d'élution est constituée par de l'acide acétique 0,01 M. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à6 caractérisé par le. fait que la chromatographie qui suit la dialyse est effectuée sur une résine du type de celles qui sont connues sous les dénominations DEAE-50 Séphadex" et "DEAE-Cellulose". 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé par le fait que l'opération de purification supplémentaire consiste en un passage sur un gel du type de ceux connus sous les dénominations "Séphadex G. 150" ou "Sépharose 2-B" . 9 Procédé selon ltune quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé par le fait que-la purification supplémentaire consiste en une chromatographie d'adsorption sur un polymère pro trique fixé sur un support propre à permettre sa mise en oeuvre sous forme de colonne. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait que le polymère protéique est obtenu à partir de plasma de sang de boeuf, le support étant constitué par de la laine de verre ou du sable