Brevet FR2244508A1 — publié le 19750418

La présente invention concerne un nouveau dérivé de pyrrolobenzoxazole, un procédé à plusieurs variantes permettant sa préparation, ainsi qu'un médicament qui le contient. Le nouveau composé de l'invention a un large spectre d'activité et peut être utilisé notamment pour combattre le diabète, l'adiposité, l'artériosclérose, les troubles du système nerveux central et végétatif, les troubles de la circulation et les troubles de la fonction rénale. Le brevet français N 71 47 019 ou brevet belge NO 777 587 a teja fait connaître que des micro-organismes de l'ordre des actinomycétales peuvent former des Inhibiteurs de glucosidases. Certains de ces inhibiteurs sont, du fait da leur nature chimique des mélanges complexes d'oligosacchgarides es/ou de polysaccharides dont le fractionnement et la purification sont coûteux. La Demanderesse vient de découvrir que le nouveau dérivé de pyrrolobenzoxazole de formule : exerce chez le rat une action anti-hyperglycémique prononcée, d'après les tests d'absorption de saccharose et d'amidon. La Demanderesse a en outre découvert que lron obtient le nouveau dérivé de pyrroloboenzoxazole en soumettant les inbibi- teurs de glucosidases extraits d'actinomycétales qui ont été mentionnés ci-dessus à une décomposition chimique, notamment par hydrolyse acide totale ou par hydrolyse acide partielle, suivie d:une hydrolyse alcaline. On constate le fait surprenant, en contraste avec les inhibiteurs mentionnés ci-dessus, que le dérivé conforme à l'invention est un composé bien défini du point de vue chimique, qui ne contient pas d'impuretés dues à un processus de fermentation. Pour cette raison, et du fait de ses propriétés pharmacologiques, le composé de l'invention représente un enrichissement du domaine pharmaceutique. Si on utilise pour l'hydrolyse acide totale une préparation d inhibiteur du type décrit dans ltexemple 38 du brevet français N0 71 47 019 ou brevet belge N 777 387 précité, on peut représenter l'hydrolyse chimique comme une élimination de motifs glucosiques suivie d'une réaction de condensation dtaprès le schéma suivant Si on ne conduit qu'une hyJ-rolyse acide partielle, on peut isoler le produit intermédiaire de formule : que Iton peut encore scinder en dérivé conforme à l'invention dans un milieu faiblement alcalin, dans des conditions très dou- ces. Pour conduire llhydrolyse totale de la préparation d'inhibiteur selon il exemple 38 du brevet français ou beige précitée on utilise des acides minéraux ou organiques, de préference des acides minéraux, notamment une solution aqueuse d'acide chlorhydrique ou acide sulfurique de 0,1 à 10 N. On opère à des températures de +50 à +1500C, notamment entre 90 et 1000C, à savoir rendant 15 minutes à 5 heures, notamment pendant 1 à 4 heures, sous pression de 1 à 10 bars, notamment à la pression atmosphérique. On peut aussi utiliser des mélanges d'acides aqueux et de solvants organiques miscibles à l'eau. Une hydrolyse partielle de la préparation d'inhibi- teur selon 11 exemple 38 du brevet français ou beige précité stob tient par abaissement de la concentration en acide et/ou de la température et/ou de la durée dthydrolyse mentionnées ci-dessus. Pour une hydrolyse alcaline, on utilise des hydroxydes alcalins de concentration millinormale à normale, notamment décinormale, pendant 5 minutes à 1 heure, notamment pendant 20 minutes, à 20-100 C, notamment à 50-65 C, en solution squeuse. Pour isoler la substance de l'invention d'hydrolysats neutralisés,on l'adsorbe sur du charbon actif. Dans le cas de solutions dont les sels ont été éliminés, on peut aussi effectuer 12adsorption du dérivé de l'invention sur un échangeur ionique fortement acide. la désorption du charbon actif est effectuée avec des solvants organiques aqueux, et la désorption de l'échangeur cationique est conduite avec des bases diluées, notamment avec une solution aqueuse d'ammoniac. Pour parfaire la purification de la substance, on la chromatographie sur de la cellulose, du gel de silice ou dpautres matières sorbantes convenables ou sur des tamis moléculaires. Caractérisation des la nouvelle substance conforme à l'invention Le dérivé de pyrrolobenzoxazole est un produit résineux visqueux ou aussi un produit solide amorphe d'aspect mousseux, incolore, se dissolvant bien dans les solvants polaires tels que l'eau, le méthanol, le diméthylsulfoxyde, le diméthyl formamide, la pyridine et liéthanol. a) Chromatographie en couche mince Pour caractériser et contrôler là pureté du dérive de pyrrolobenzoxazole, on fait passer ce dérivé sur des plaques protes à l'emploi en chromatographie en couche mince, de gel de silice "F254" de la firme Merck, ou sur des feuilles,prêtes à 11 emploi en chromatographie en couche mince,de gel de silice "F1500" de la firme Schleicher et Schull, dans les éluants suivants: I. MeOH/CCl4 1:1 plus 1 % de solution à 25 % de NH3 Valeurs de Rf Merck : 0,28 Schleicher + Schüll : 0,35 II. MeOH/acétate d'éthyle/H2O 6:10:4 Valeurs de Rf Merck : 0,71 (glucose : 0,66) Schleicher + Schüll : 0,63 (glucose : 0,65) Pour la révélation du dérivé de pyrrolobenzoxazole, on pulvérise sur les plaques les réactifs suivants : 1. Mélange contenant : 1 g de p-diméthylsminobenzaldéhyde 20 g de chlorure d'antimoine-(III) 20ml diacide chlorhydrique concentré @ 100ml d'éthanol. On observe une teinte allant du rouge cerise au rouge violacé après chauffage des plaques 2. D'abord une solution à 5 % de nitrate d'argent, puis une lessive de soude à Coloration en noir tirant sur le brun après le chauffage. b) Chromatographie en phase gazeuse Le dérivé de pyrrolobenzoxazole est silylé en vue de l'analyse par chromatographie en phase gazeuse en présence d'&alpha;- et de ss-D-glucose ou aussi de saccharose comme étalon interne dans un mélange de pyridine (1), de triméthylchlorosilane (o,5) et de N-méthyl-triméthyl-silyl-trifluoracétamide (1). Colonne : en verre, de 1,8 m, garnie de "SE 30" à 3 X sur 'Chromo- sorb WAW1, Températures : bloc d'injection 300 C Détecteur 300 C Chauffage isotherme au four à 220 C jusqu'à l'élu tion du pic de l'&alpha;- et du ss-D-glucose . ensuite, élévation de la terrpérature e de 150C par minute jusqu'à 300 C. Détecteur : à ionisation de flamme. Gaz : gaz vecteur : N2 40 ml/mn gaz combustible : air 80 ml/mn H2 20 ml/mn Temps de rétention : &alpha;-D-glucose 3 minutes ss-D-glucose 4 minutes dérivé de pyrro lobenzoxazole 10 à 11 minutes saccharose 12 à 13 minutes c) Spectre infrarouge Spectre dans KBr peu significatif, mal défini du point de vue structural. les groupes de bandes les plus intenses se situent dans la région de vibration de la valence 0-H et entre 1150 et 1000 cm-1 (vibration de la valence C-O), Aucune absorption de carbonyle n'apparaît dans le spectre. d) Spectre ultraciolet Absorption terminale. e) Basicité du dérivé de pyrrolobenzoxazole Par titrage à l'acide chlorhydrique en solution aqueuse, on trouve pour le dérivé de pyrrolobenzoxazole une valeur pKa d'environ 3,8. f) Angle de rotation La]D dans lreau = -0,30 g) Analyse C13H21NO7 Poids moléculaire : 303,315 C % H % N % Calculé 51,47 6,98 4,62 Trouvé 50,85 7,15 4,4 h) Spectre de résonance des protons du dérivé de pyrrolobenzoxazole dans D2O à 220 MHz (voir graphique annexé) : Migration chimique Composition du spectre Intensité (valeurs # en ppm) relative 1,3 doublet ;J=6,5 Hz 3HH 2,9 "triplet" ; "J" = 6,5 Hz 1 H 3,8 large signal 1H 3,9 - 4,1 groupe de signaux 4 H 4,1 singulet 2 H 4,2 "triplet" ; "J" = 5-6 Hz 1 H 4,3 "triplet" ; "J" = 5-6 Hz 1 H 4,8 singulet 6 H protons échan- gés contre du deu térium 4,9 doublet ; J = 3,5 Hz 1 E 5,7 large signal 1 H 21 H Le spectre de résonance magnétique nucléaire du dérivé de pyrrolobenzoxazole fait apparaître au total 21 protons. i) Spectre de résonance magnétique nucléaire (signaux de 13C) du dérivé de pyrrolobenzoxazole dans D2O L'enregistrement du spectre est effectué avec découplage simultané du bruit des protons. On trouve 13 signaux 13o différents, tous dans la région située au-dessus de CS2. Signaux 13C (après découplage du bruit des protons) du dérivé de pyrrolobenzoxazole N du signal (ppm par rapport au champ au-dessus de CS2) 1 - 53,96 2 - 70,63 3 - 98.02 4 - 115,67 5 - 116,27 6 - 116,47 7 - 121,83 8 - 122,62 9 - 124,80 10 - 130,15 11 - 130,27 12 - 143,26 13 - 172,42 k) Spsctre de masse du dérivé de pyrrolobenzoxazole Le spectre de masse qui ne peut être que difficilement enregistré à cause de la faible volatilité du dérIvé de pyrrolobenzoxazole présente le pic moléculaire à 303 (intensité relative de 33 . les pics partiels les plus importants sont les suivants 286 (65 % d'intensité relative) 258 (41 % dtintensité relative) 186 (30 % d'intensité relative) 142 (40 % d'intensité relative) 124 pic de base. l) Acétylation du dérivé de pyrrolobenzoxazole L'acétylation du dérivé de pyrrolobeneoxazole dans un mélange à 1:1 de pyridine et d'acétanhydride donne un dérivé hexa-acéthylique non cristallin du dérivé de pyrroloberzoxa- zole, duquel on a mesuré un spectre demasse à grande résolution. m/e Intensité relative 555, 1916 1,5 % Pic moléculaire C25H33NO13 496, 1087 100,0 % Pic de base C23H30NO11 312, 1081 60.0 % Pic partiel C14H18NO7 185, 0810 93,0 % Pic partiel C9H13O@ Toutes ces données concordent avec la formule suivante attribués au dérivé de pyrrolobenzoxazole :: m) Autres dérivés du dérivé de Pyrrolobenzoxazole On a en outre préparé par les procédés chimiques classiques les dérivés suivants de la substance conforme à l'invention Données de spectrométrie de masse pour la caractérsation du dérivé hexaméthylique du dérivé de pyrrolotenzoxazole m/e Intensité relative 387 7,5 % Pic moléculaire 356 100,0 % Pic de base 328 32.0 % Pic partiel 228 6,2 % Pic partiel 184 32,0 % Pic partiel 129 95,0 % Pic partiel Données de spectrométrie de masse pour la caractérisation du dérivé hexabenzoylique du dérivé de pyrrolobenzoxazole : m/e intensité relative 927 0,2 % Pic moléculaire 806 6,0 - Pic partiel 683 100,0 % Pic de base Ces données concordent également avec la formule du dérivé de pyrrolobenzoxazole reproduite ci-dessus. Le produit de réaction du dérivé de pyrrolobenzoxaeole avec ltisocyarate de phényle a été caractérIsé par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire comme étaiit le produit dthexa- addition de l'isocyanate de phényle au dérivé de pyrrolobenzoxazole. La substance active mentionnée a un large spectre d'activité. Dans des essais généraux et des essais spéciaux, elle exerce une influence sur le système nerveux central et le système neurovégétatif, elle inhibe les glucosidases dans les voies digestives, la transformation des glucides en lipides du tissu adipeux l'incorporation de la graisse alimentaire dans les couches de tissu adipeux, et exerce un effet favorable sur la fonction cardiaque, la circulation et la fonction rénale. Indications : Etat général de faiblesse dû à une mobilisation excessive du système nerveux central et/ou neurovégétatif, adiposité, diabète, hyperlipémie (artérioscléroseY, insuffisance de la fonc- tion cardiaque, de la circulation etZou de la fonction rénale. Formulations Comprimés, capsules, dragées, pilules, granulés1 solutions, poudres solubles, suspensions, gomme à matcher, pâtes dentifrice et addition aux substances alimentaires et/ou aux al-- ment s stimulants contenant des glucides. Posologie et administration 1 à 1000 mg/kg par voie orale sous-cutanée ou intraveineuse une ou plusieurs fois par jour ou dans des substances alimentaires et aliments stimulants contenant des glucides et des graisses. Méthode de détermination de l'activité du dérivé de pyrrolo ben@oxazole chez le rat Pour produire une hyperglycémie et une hyperinsulinémie alimentaires après l'absorption de glucides, on administre à des rats (n = 6) 2,5 g d'amidon ou de naltose ou de saccharose en solution ou en suspension, par kg de poids corporel par voie orale (animaux témoins), On fait absorber en outre à des groupes de 6 autres rats, en plus de l'un des glucides mentionn6s cidessus, le dérivé de pyrrolobenzoxazole conforme à l'invention à la dose indiquée, par voie orale.On détermine le tala de glycémie à ae courts intervalles de temps après l'absorption de gluS cides, dans le sang prélevé dans le plexus veineux rétroorbital, la détermination étant effectuée avec un appareil d'analyse automatique ["Technicon" (marque déposée), d'après Hoffman : "J. Biol. Chem." 120 51 (1937)]. On dose l'insuline à de courts intervalles de temps après l'absorption de glucides dans le sérum de rats (groupes de 6) dont un groupe reçoit 2,5 g d'amidon par kg par voie orale (témoin) et les autres groupes reçoivent en outre le dérivé de pyrrolobenzoxazole. lie dosage de 11 insuline dans le sérum est effectué par une méthode radlo-immunoîogique, basée sur la méthode i impliquant deux antisorps décrite par Eales et Randle dans "Biochem. J." 88, 137 (1963)]. Tableau I relatif à la méthode d2essai Inhibition de la saccharase dans l'intestin grêle du ret (n = 6) mesurée d'après l'hyperglycémie réduite après absorption de saccharose par voie orale (2,5 g/kg par voie orale), sous l'effet de la substance active en Question. 15 15 30 45 mn après ltad- ministration Témoin sans saccharose 73 + 4,5 77 + 5,3 82 + 9,7 Témoin avec saccharose 126 + 8,5 125 + 12 128 + 14 50 mg de substance active + saccharose 90 + 8,6 98 # 3,9 101 1 5,6 - P saccharose Tableau II relatif à la méthode d'essai Inhibition de l'amylase dans les voies gastro-intestinales chez le rat (n = 6), mesurée d'après la réduction d'hyperglycèmie après absorption d'amidon par voie orale t1 g/kg par voie orale), sous l'effet de la substance active en question. 10 20 minutes après l'ad ministration Témoin sans amidon 74 # 4,3 88 + 5,1 Témoin avec amidon 130 + 11 163 + 18 20 mg de substance active 102 + 6,1 133 + 8,6 + amidon == - P amidon Exemple I Hydrolyse acide totale On dissout 200 g de la préparation d'inhibiteur décrite dans l'exemple 38 du brevet français N0 71 47 019 ou brevet belge N0 777 387 précité, dans 940 mi d'eau distillée et 60 ml d'acide sulfurique concentré et on chauffe an reflux pendant 4 heures (température interne : 98 à 1 000C ; température du bain d'huile : 1400a). la solution refroidie, de couleur brunnoir, est additionnée de 10 g de charbon actif et agitée pendant 1 heure. Ensuite, on sépare le charbon actif par filtration à la trompe, on le lave à l'eau et on ajuste le pH du filtrat à 7-8 avec environ 250 ml d'hydroxyde de potassium 10N. On agite la solution pendant 1 heure avec 50 g de charbon actif. On filtre le charbon à la trompe, on-le lave avec 2 1 d'eau et on jette le filtrat.Pour effectuer la désorption, on fait digérer le char- bon pendant environ 16 heures avec 2 1 d'alcool à 30 . Enfin, on filtre le charbon à la trompé et on concentre la solution alcoolique à l'évaporateur rotatif. Résidu : 6,2 g. On dissout ce produit brut (6,2 g) dans 500 mi d'eau et on agite la solution avec précaution pendant 1 heure en pré- sence de 30 g de "Amberlite IR 120"(marque déposée) (forme H#). On filtre l'échangeur à la trompe et on le lave à l'eau distillée jusqu'à ce que le filtrat soit neutre et exempt de glucose. On agite ensuite l'échangeur pendant environ 16 heures avec 15 mi de solution à 25 % d'ammoniac dans 1000 ml d'eau, on le separe et on le jette. On concentre le filtrat à l'évaporateur rotatif. Résidu : 3,7 g. Pour séparer la substance conforme à l'invention des autres produits de l'hydrolyse, on effectue une chromatographie sur cellulose On charge 4,5 g du mélange désorbé de l'échangeur sur une colonne garnie de cellulose, de 1 m de longueur et de 2,5 cm de largeur. On utilise comme éluant tout d'abord un mélan- ge d'éthanol et d'eau à 5:1 et finalement, un mélange d'éthanol et d'eau à 3:1. On règle la vitesse d'écoulement à 20 gouttes par minute et on recueille des fractions de 14 ml chacune.Les fractions individuelles sont soumises à une chromatographie en couche mince. lies fractions 28-33 donnent après concentration 2 g du dérivé de pyrrolobenzoxazole de teinte brunâtre tirant Légèrement sur le jaune ; les fractions 43-85 donnent 1,6 g du produit d'hydrolyse partielle, de teinte légèrement brunâtre. Exemple 2 Hydrolyse alcaline. On dissout 1 g du produit d'hydrolyse partielle de l'exemple 1 dans 50 ml de NaOH 0,1N et on fait incuber la solution à 65 C pendant 30 minutes. Après refroidissement, on ajoute, en agitant par secousses, 10 g de "Amberlite IR 50" (marque déposée) sous la forme H# @ X en vue de la neutralisation. Au bout d'environ 5 minutes, le mélange devient neutre ; on filtre à la trompe et on lave l'échangeur avec 2 petites-portions d'eau. On rassemble le filtrat et l'eau de lavage et on les concentre à un volume de 20 ml, à l'évaporateur rotatif. On fait passer ce concentré sur une colonne garnie de 6 g de "Amserlite IR 120" (marque déposée) (forme H#) de 1,0 cm de diamètre et 10 cm de hauteur et on règle un écoulement très lent (3 gouttes par minute). On recueillie l'éluat en fractions de 100 gouttes. Lorsque toute la substance a été chargée, on procède tout d'abord à un lavage à à l'eau (12 goutes/minute), puis on effectue la désorption avec une solution aqueuse à 0,25 % d'ammoniac. les fractions éludes sont- examinées par chromatographie en couche mince. Les fractions désorbées avec la solution ammoniacale diluée, qui contiennent le dérivé de pyrrolobenzoxazole conforme à l'invention, sont rassemblées, concentrées à l'évaporateur rotatif et traitées par Filtration sur gel sur une colonne de "Sephadex" ("Sephadex G 15", 1,6 x 185 cm, dans H2O, 25 ml/h) pour séparer la matière de poids moléculaire élevé qui n'a pas réagi. es fractions de la colonne de -"Sephadex" contenant le dérivé de pyrrolobenzoxazole sont rassemblées, concentrées par évaporation et lyophilisées. REVENDICATIONS 1. lie rouveau dérivé de pyrrolobenzoxazole de for mule 2. Procédé de préparation du dérivé de pyrrolo benzoxazole suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il consiste à soumettre des inhibiteurs de glucosidases deri- vés d'actinomycétales : a) à une hydrolyse acide totale ou b) à une hydrolyse acide partielle,suivle d'une hydrolyse alcaline. 3. Médicament destiné notamment au traitement du diabète, de l'adiposité, de l'artériosclérose et de troubles du système nerveux central et du système neurovégétatif, de la circulation et de la fonction rénale, caractérisé par le fait qu'il contient un dérivé de pyrrolobenzoxazole suivant la revendication 1. 4. Médicament suivant la revendication 3, caractérisé par le fait qu'il contient en outre des supports inertes non toxiques acceptables du point de vue pharmaceutique.