Brevet FR2210396A1 — publié le 19740712

La présente invention concerne des composants de coagulation s a n K o i n 2 et, en général, une composition purifiée de composants de coagulation sangule utile en thérapeutique. ainsi qu'un procédé de préparation de ces composants à partir dt matieles qu'il est facile de se procurer. On tstime qu!il existe aux Etats-Unis d Amérique 100 000 cas d'hémophilie congénitale. Parmi ceux-ci, 20000 environ sont des ces d'hémophilie B, le sang de ces malades étant soit totalement dépourvu de PTC (plasma thromboplastin component) ou en manque de façon très importante. Cette maladie présente donc des degrés de gravité variables qui nécessitent un traitement allant de toutes les semaines à une à deux fois par an. Les cas de déficience complète nécessitent un traitement de remplacement chaque semaine; les cas de déficience partielle ne ttécessitent qu'un traitement lors des épisodes de saignement, ce qui peut ne se produire qu'une fois par an. Les épisodes de saignement dans les cas de déficience partielle congénitale sont généralement provoqués par une sensibilité aquise temporaire, plutt que par une lésion seule. L'injection intraveineuse d'une quantité suffisamment importante de plasma frais ou d'une quantité équivalente de sang frais corrige provisoirement la déficience du malade.L'effet bénéfique ne dure souvent que deux ou trois semaines, bien que l'anomalie de coagulation déterminée par les tests in vitro sur le sang du malade ne montre une amélioration que pendant deux à trois jours. Ce traitement avec du plasma frais ou du sang frais est efficace mais présente de nombreux inconvénients graves : (1) il nécessite de disposer facilement d'une quantité importante de plasma frais; (2) il nécessite l'hospitalisation pour l'administration du plasma; (3) ut grand nombre de malades se sensibilisent aux perfusions répétées de sang ou de plasma et finalement présentent des réactions fatales à la transfusion; (4) au mieux le plasma ne peut que pallier partiellement la déficience et (5) un traitement prolongé ou une intervention chirurgicale sont impossibles en raison des quantités importantes de sang ou de plasma nécessaires qui provoqueraient un oedème aigu fatal-. De nombreux chercheurs ont noté qu'en mélangeant le sang de certains hémophiles, on obtient une correction mutuelle du défaut de coagulation de chacun de ces sangs. Ces découvertes ont été interprétées par Aggeler et coli. /Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 79 : b92-696 (1952) 1 et S.C. White et coll. [Blood 8 101-124 (1953)]. Ces chercheurs étudiant un malade du sexe masculin présentant une diathèse hémorragique sévère associée à un temps de coagulation allongé qu'il était impossible en clinique de différencier de l'hémophilie classique, ont postulé l'existence d'un nouveau facteur de coagulation. Aggeler et coll. ont montré que ce nouveau facteur était un précurseur de la thromboplastine et l'ont nommé Plasma Thromboplastin Component (PTC).Ce travail a été confirmé par Biggs et coll. ~Brit. Med. J. 9: 1378-1382 (1952)~I en Angleterre, qui lui ont donné le nom de Christmas Factor et par Soulier et Larrieu /New Eng. J. Med. 249 : 547-553 (1953) 7 en France, qui l'ont appelé facteur antihémophiiique B. On appelle maintenant officiellement ce facteur facteur IX. Le rle joué par le facteur IX ainsi que par les facteurs II, VII et X est bien connu dans l'art antérieur. En collaboration avec Aggeler et coll., on a préparé la première préparation de PTC fractionnée ~ Revue d'Hématologie IX 444-453 (1954) 7. On a adsorbé le PTC sur du sulfate de baryum à partir d'une solution de fraction IV de Cohn et on a élué avec du citrate de sodium 0,34 M. Les rendements étaient très faibles et l'activité in vivo après perfusion n'était égale qu'au quart environ de celle prévue par les essais in vitro selon le test de consommation de la prothrombine. Plus tard, en collaboration avec Aggeler et coll., on a mis au point un procédé dans lequel on adsorbe le PTC sur du sulfate de baryum à partir de plasma rendu incoagulable par de l'EDTA, on élue avec du tampon chlorure de sodium-citrate de sodium, puis on purifie par fractionnement avec de l'éthenol froid. On a utilisé cette préparation en clinique avec d'excellents résultats: /Aggeler, P. M. et coll. Trans. 6th Congress, Internat. Soc. Hematol. Grune & Stratton, N. Y. pages 490-497 (1958)/. Ce procédé a été ensuite décrit en détail et on a souligné qu'il n'avait jamais été commercialisé car les fractions d'albumine et de protéine plasmatiques obtenues comme sous-produits sont souillées par des concentrations potentielles dangereuses de baryum : /Hink, J. H. et Johnson, F. F., The Hemophilias, CH. 18, page 156 édité par Brinkhous, Univ. of North Carolina Press (1964) /. Biggs et coll., en Angleterre /Brit. J. Hematol. 7 : 349-364 (1961) T et Janiak et Soulier /Thromb. et Diath. Haemorr. 8 : 406-424 (1962) / en France, ont ensuite préparé le facteur IX selon un procédé semblable, en remplaçant le phosphate tricalcique par du sulfate de baryum.Cependant, il se produit toujours une formation spontanée de thrombine et il est toujours nécessaire d'ajouter de l'héparine pendant et après traitement pour neutraliser la thrombine qui présente un danger potentiel. Tullis et coll. /New Eng. J. Med. 273 : 667-674 (1965) 7 ont préparé et étudié une fraction de plasma quelque peu semblable qu'ils ont appelé "complexe prothrombique". Dans le procédé de Tullis, on adsorbe du plasma traité par une résine échangeuse d'ions sur de la DEAE-cellulose, on élue avec un mélange de phosphate et de chlorure de sodium ayant un gradient croissant en chlorure de sodium, on réadsorbe sur DEAE-cellulose et on élue à nouveau. On conduit-l'élution avec un tampon phosphate de sodium chlorure de sodium stabilisé par de 1'ENTA. On trouvera dans la référence ci-dessus, des études cliniques sur le complexe prothrombique et on dispose depuis de nouvelles données caractérisant ce complexe. Généralement, on empêche la coagulation du sang prélevé et destiné à la transfusion en le traitant par un anticoagulant au citrate. On ne peut utiliser un tel sang que pendant une durée limitée. Lorsque cette limite expire, on doit se débarrasser du sang ou l'utiliser pour le fractionner en composants utiles. En pratique, la source principale de sang total transformé en plasma destiné au fractionnement est constituée par le sang périmé qu'on a protégé par un anticoagulant au citrate. Il est dont important que les procédés de fractionnement du plasma tels que ceux destinés à obtenir un concentré contenant le facteur IX, s'appliquent à du sang conservé dont on a empoché la coagulation par du citrate. Le procédé de préparation du concentré de l'invention utilise du plasma provenant de sang qu'on a rendu anticoagulant par du citrate. Il est également important que ces concentrés ne contiennent pas de thrombine car l'injection de thrombine chez l'homme serait très dangereuse. Bien qu'on puisse neutraliser l'activité de la thrombine par de ltheparine, on préfère en premier lieu qu'il nty ait pas de thrombine. L'héparine est indésirable dans un concentré contenant du facteur IX, car elle constitue un risque potentiel pour le malade et rend difficile la détermination des-fateteurs de coagulation dans le concentré. Lors de l'administration d'un concentré contenant du facteur IX, il est nécessaire de suivre de façon constante la coagulation du malade et la présence d'héparine complique non seulement cette surveillence, mais rend douteux les résultats ainsi obtenus. L'invention vise donc un concentré ne contenant ni thrombine ni héparine. L'invention concerne également un concentré contenant les facteurs de coagulation II, VII, IX et X dans des proportions essentiellement égales à celles observées dans le plasma, mais ne contenant pas de facteur X sous forme activee, ce qui réduit le risque de formation d'une coagulation intravasculaire. L'invention concerne également un concentré ne présentant pas l'activité anticomplémentaire qui est souvent associée aux globulines plasmatiques et qui rendrait très dangereuse l'administration intraveineuse du produit. L'invention concerne également un produit très pur par suite de l'adsorption sélective des composants actifs et d'une sélection complémentaire par élution fractionnée. D'autres caractéristiques et avantages de lwinvention ressortiront de la description suivante des modes de réalisation préférés. Selon l'invention, on prépare un concentré lyophilisé stable pendant sa conservation dérivant du plasma humain pour lutter contre les saignements dans l'hémophilie et dans d'autres cas de déficience en un ou plusieurs des facteurs II, VII, IX et X, ne contenant pas d'héparine, de thrombine, de forme activée du facteur X, n'ayant pas d'activité hypotensive ni antlcomplementaire, et contenant les facteurs de coagulation II, VII, IX et X sous forme non activée, dans des proportions pratiquement identiques å celles du plasma humain, et ayant une activité du facteur IX, après reconsti- tution, égale à au moins 2 00070 environ de celle du plasma normal, une activité spécifique du facteur IX d'au moins environ 0,5 unité clinique par mg de protéine et une demi-vie biologique du facteur IX après injection d'environ 20 å 50 heures, en appliquant du plasma humain citraté non modifié ou une fraction correspondante contenant tous les facteurs de coagulation II, VII, IX et X une résine échangeuse d'ions comportant des groupes faiblement basiques présentant une attraction pour les ions de polarité opposée, en y adsorbant ces composants de coagulation du plasma ; en éluant de façon sélective la résine avec une solution d'un tampon volatil ayant un pH d'environ 7,3 à environ 8,2 de molarité croissante; en séparant la fraction d'éluat contenant les composants de coagulation; en congelant la fraction d'éluat séparée et en éliminant par lyophilisation le tampon volatil de la fraction congelée. Bien qu'on puisse utiliser comme produit de départ dans le procédé de l'invention le plasma humain total citraté ou toute autre fraction contenant la totalité des facteurs de coagulation II, VII, IX et X, on préfère utiliser le surnageant I, méthode de Cohn 6, Voir Kirk & Othmer, "Encyclopedia of Chez. Tecs., Vol. 2, pages 10-13 (1948), Interscience Enc., Inc., N.Y., publishers; Cohn et coll., J. Am. Chem. Soc., 68, 459 (1946). Les résines échangeuses d'ions qu'on utilise dans l'invention sont les résines échangeuses d'ions bien connues, dispersibles dans l'eau ou les tampons et ayant des groupes faiblement basiques qui présentent une attraction pour les ions de polarité opposée. On peut citer comme exemple de résines échangeuses d'ions de type cellulose et polysaccharide, les alkylamino inférieur-alkyl inférieur celluloses, la diéthylaminoéthyl (DEAE) cellulose et la triéthylaminoéthyl (TEAE) cellulose et le diéthylaminoéthyl-Sephadex. Ces résines ont généralement une capacité d'adsorption relativement faible, par exemple d'environ 1,0 à 5 milliéquivalents par gramme. Par exemple, la DEAE-cellulose a une capacité de 1,0 milliéquivalent/g (poids sec); le DEAE-Sephadex de 3,5 - 0,5 milliéquivalents/g et le TEAE-Sephadex, de 0,55 à 0,75 milliéquivalent/g. On peut citer comme autre résine, la DEAE-cellulose-52 microgranulaire de Whatman (W & R Balston Ltd., Hardstone, Kent, Angleterre). La résine échangeuse d'ions préférée de départ est le DEAE-Sephadex, c'est-à- dire une résine échangeuse d'ions constituée essentiellement d'une chaine de dextrane réticulée ayant des radicaux diéthylamino fixés aux motifs glucoses des chatnes de polysaccharides. Cette résine du commerce est fournie, aux Etats-Unis d'Amérique, par Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, New Jersey. On applique une solution du plasma de départ à la résine échangeuse d'ions choisie, en adsorbant ainsi les facteurs de coagulation II, VII, IX et X avec une petite fraction des autres protéines plasmatiques. On peut recueillir les protéines non adsorbées et les renvoyer dans le traitement de fractionnement du plasma de façon à ne pas perdre de plasma de départ. On lave ensuite la résine avec une solution tampon volatile ayant une molarité relativement faible, atteignant un exemple 0,3 M, jusqu'à ce que la résine soit débarrassée des protéines non adsorbées. On soumet la résine à une élution fractionnée avec une solution d'un tampon volatil de molarité croissante ayant un pH qui est de préférence pratiquement constant de 7,3 à 8,2. Le complexe de coagulation de l'invention est élué pour une molarité comprise entre 0,3 M et 0,75 M. On élimine ensuite le tampon de l'éluat par lyophilisation. Le rapport de la résine échangeuse d'ions, telle que le DEAE Sephadex au volume de plasma de départ, c'est-à-dire de surnageant I, peut varier dans une gamme étendue. L'utilisation d'un rapport élevé de résine échangeuse d'ions augmente le rendement en complexe de coagulation de faible pureté avec une perte plus importante des autres protéines plasmatiques qu'on peut norma lement récupérer dans les stades ultérieurs. L'utilisation d'un faible rapport de résine échangeuse d'ions conduit à un rendement réduit en produit de pureté plus élevée. Bien que le DEAE-Sephadex constitue la résine échangeuse d'ions anionique préférée, il est évident qu'on peut utiliser d'autres adsorbants anioniques ayant des caractéristiques d'adsorption similaires. Le stade d'élution avec le tampon volatil présentant un gradient de concentration en tampon est extremement important. On préfère le bicarbonate d'ammonium, mais on peut également utiliser d'autres tampons volatils tels que l'acétate d'ammonium, environ au même pH. La sélectivité remarquable obtenue en utilisant une élution avec un gradient salin croissant combinée à la volatilité du tampon constitue un aspect capital du procédé de l'invention pour les raisons suivantes: 1) Le tampon qui est un sel volatil est totalement éliminé du produit desséché, ce qui donne une préparatin protéique entièrement exempte de sels. Ceci présente l'avantage de permettre d'ajuster facilement à l'isotonicité la préparation clinique finale. Ceci est également important en ce qui concerne la stabilité du produit. 2) La récupération d'un produit protéique ne contenant pas de sels rend inutiles les procédé d'élimination des sels tels que la dialyse, la filtration sur gel, I'ultrafiltrdti 1 etc, c qui simplifie l'utilisation du procédé à l'échelle industrielle. 3) Le bicarbonate d'ammonium s'est révélé permettre une élution sélective des protéines liées, permettant la séparation facile des impuretés indésirables telles que la céruloplasmine. De ce fait, on élue les composés désirés avec une pureté plus elevée qu'on ne pourrait le faire avec les solutions d'élution classiques. On préfère dans les stades d'élution un pH compris dans la gamme d'environ 7,0 à 7,8. Bien qu'on puisse utiliser des pH plus élevés atteignant 8,2, ceux-ci tendent à rendre le produit instable. Les conditions ci-dessus permettent un fractionnement ultérieur. Les stades de dissolution du produit protéique séché à la concentration préférée, la nature du tampon électrolytique et la filtration constituent des stades classiques dont les variantes sont connues de l'homme de l'art. Le produit obtenu selon le procédé ci-dessus est un produit lyophilisé contenant les facteurs II, VII, IX et X humains dans un tampon électrolytique approprié tel qu'un tampon chlorure de sodium-citrate de sodium. Ce produit ne contient pas de thrombine, d'activité thromboplastique, d'activité anticomplémentaire, ni d'activité hypotensive. Il présente une activité spécifique d'au moins environ 0,5 unité de facteur IX par mg de protéine. On définit l'unité de facteur IX par l'activité en facteur IX d'un ml d'un pool plasmatique frais moyen. Les résultats des déterminations sont exprimés en fonction d'un standard lyophilisé qui contient 0,7 unité par ml après reconstitution. DOSAGES Dosage in vitro de l'activité du facteur IX Ce dosage repose sur le temps partiel de thromboplastine de Langdell, Wagner et Brinkhous / J. Lab. Clin. Med. 41 : 637-647 (1953)/ et du temps de coagulation au kaolin de Proctor et Rapaport [Am. J. Clin. Path. 36 : 212-219 (1961) /. Le facteur plaquettaire 3 est apporté par une solution de céphaline. On obtient l'activation par la surface maximale de contact en utilisant de la poudre de Celite. Tous les autres facteurs de coagulation (à l'exception du facteur IX) sont apportés par un substrat constitué par le plasma d'un malade présentant une déficience grave en facteur IX, mélangé avec du plasma de boeuf adsorbé sur sulfate de baryum. On dose l'échantillon inconnu en comparant la durée de coagulation de l'essai à celle obtenue avec des dilutions d'un standard normal. REACTIFS 1.Solution de chlorure de calcium 0,05 M en CaCl2 2. Tampon véronal Barbital sodique 2,94 g Chlorure de sodium 3,67 g Acide chlorhydrique O,lN 105 ml Eau distillée qsp 500 ml. 3. Celite Adjuvant de filtration pour analyse, Johns Manville. 4. Suspension de céphaline. Préparée à partir de thromboplastine de cervelle de lapin selon Bell et Alton Nature 174 : 880-881 (1954). 5. Réactif céphaline-Celite. On mélange des volumes égaux de suspension de Celite en suspension dans 5 ml de solution à 0,9 % de chlorure de sodium. 6. Liquide de dilution I.' Citrate de sodium 0,1 M 50 ml Chlorure de sodium 0,15 M 300 ml 7. Liquide de dilution II. Tampon véronal 20 ml Chlorure de sodium 0,15 M 60 ml 8. Plasma de boeuf traité au sulfate de baryum. On adsorbe du plasma de boeuf oxalaté avec 100 mg/ml de sulfate de baryum et on conserve par petites fractions à -200C. 9. Substrat plasmatique. On mélange 1 partie de plasma citraté d'un malade présentant une déficience grave en facteur IX (conservé en petites fractions à -2O0C) avec 3 parties de plasma de boeuf traité au sulfate de baryum. 10. Standard. Plasma standard lyophilisé n' 788-27 Activité = 0,7 unité/ml. On remet soigneusement en suspension le réactif céphaline-celite avant utilisation. On décongèle les substrats en les agitant de façon constante au bain-marie à 370C, puis on les mélange dans le rapport d'une partie de plasma du malade pour 3 parties de plasma de boeuf traité au sulfate de baryum. On maintient dans un bain de glace fondante avec tous les autres réactifs à l'exception de la solution de calcium, qu'on place dans un bain-marie à 370C. On dilue le plasma standard au 1/10, 1/50, 1/100, etc. avec les liquides de dilution I et II selon la méthode de Hjort et colt. I J, Lab. Clin. Med. 46 89-97 (1955)]. On dose les échantillons inconnus à des dilutions appropriées. On introduit dans un tube de verre 0,1 ml de réactif céphaline-celite remis en suspension, 0,1 ml de substrat plasmatique et 0,1 ml d'échantillon inconnu ou de plasma standard, on introduit le tube dans un bain-marie à 370C et on déclenche le chronomètre. On bascule doucement le mélange pendant la période d'incubation de 3 minutes pour maintenir la Celite en suspension. Au bout de 9 minutes, on ajoute O,l ml de la solution de chlorure de calcium et on déclenche un second chronomètre. On bascule le tube jusqu'à ce que la coagulation apparaisse. On réalise tous les essais en double et on utilise a moyenne des temps de coagulation. On utilise le plasma témoin pour chaque groupe d'échantillons inconnu. On construit un graphique sur un papier log-log en plaçant la durée de coagulation en ordonnées et les concentrations plasmatiques en abscisses. On dispose sur le papier les durées de coagulation des diverses dilutions du plasma standard et on réunit les points par la courbe optimale. On détermine les concentrations en facteur IX des échantillons inconnus en utilisant ce graphique de référence. On détermine la moyenne des valeurs obtenues pour les diverses concentrations des échantillons inconnus. Dosage in.vitro du facteur II (prothrombine). Le dosage du facteur II est le test d'Owren classique en un stade. Les résultats sont exprimés en unités/ml, une unité de prothrombine étant définie par l'activité prothrombique d'un ml d'un plasma standard congelé. Dosage in vitro de la thromboplastine et de la thrombine. On détermine simultanément la thromboplastine et la thrombine par mesure du temps dc coagulation après recalcification. On compare la durée de coagulation en secondes d'un échantillon et d'un témoin de la façon suivanLe: échantillon: échantillon (à diverses dilutions) 0,1 ml plasma citraté 0,1 ml chlorure de calcium 0,05 M 0,1 ml - témoin : chlorure de sodium 0,15 M 0,1 ml plasma citraté 0,1 ml chlorure de calcium 0,05M ii 0,1 ml. On étudie l'échantillon à diverses dilutions avec de l'eau distillée car une concentration élevée en électrolytes neutres inhibe la coagulation provoquée par la thromboplastine ou la thrombine. Détermination de l'activité anticomplémentaire. On détermine l'activité anticomplémentaire de la façon suivante REACTIFS 1. Solution saline pour fixation du complément (SS) Solution stock de calcium et de magnésium CaCl2 10 g MgC12 4 g Eau distillée qsp 100 ml Ajouter 1 ml de solution stork à I 1 de chlorure de sodium à 0,85 %. 2. Solution d'Alsever Dextrose 20,5 g Chlorure de sodium 4,2 g Citrate de sodium 8,0 g Acide et trique 0,55 g Eau distillée qsp 1 1 3. Globules rouges de mouton (GRM) On introduit environ 20 ml de cellules dans 40 ml de solution d'Alsever Pour la détermination, on lave une partie des cellules 3 fois avec de l'eau physiologique ordinaire, puis on prépare une suspension à 2 en utilisant comme diluant la solution saline pour fixation du complément (SS). 4. Hémolysine Solution stock au 1/100 ème préparée en utilisant du phénol comme conservateur. 5. Complément Reconstitué avec le diluant fourni selon les indications données. 6. Globules rouges de mouton sensibilisés (chauffés à 37 C, 15-30 minutes avant l'emploi) Hémolysine : 2 unités/0,2 ml en volumes égaux GRM à 2% TITRAGE 1. Hémolysine On prépare des dilutions de raison 2, jusqu'à 1/32 ème de la solution stock au 1/100 ème en utilisant comme diluant la solution saline de fixation du complément. Dilution d'hémolysine 0,2 ml Complément (1/30 avec SS) 0,2 ml# incubé 30 minutes GRM à 2 % 0,2 ml @ à 37 C SS 0,5 ml La dilution la plus élevée d'hémolysine donnant une hémolyse complète correspond à 1 unité. On utilise dans l'essai, 2 unités/0,2 ml. Témoins (incubés 70 minutes à 370C) 1. Hémolysine (non diluée) 0,2 ml GRM à 2 % 0,2 ml SS 0,7 ml 2. Complément (1/30) 0,2 ml GRM à 2 % 0,2 ml SS 0,7 ml 3. GRM à 2 % 0,2 ml SS 0,9 ml Tous les témoins doivent être négatifs (pas de lyse). 2. Complément Tube n 1 2 3 4 5 6 7 8 Complément 1/30 (ml) 0,12 0,11 0,10 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 SS. (ml) 0,48 0,49 0,50 0,51 0,52 0,53 0,54 0,55 Incuber les dilutions 30 mn à 370C. Ajouter 0,4 ml de CRM sensibilisés dans chaque tube Incuber 30 mn à 370C. La plus faible quantité C' donnant une lyse complète constitue l'unité exacte. La quantité immédiatement supérieure constitue l'unité entière. Dans le dosage, on utilise 2 unités entières/0,2 ml. Témoin : (incubé 30 mn à 370C) GRM sensibilisés 0,4 mi SS 0,6 mi doit être négatif (pas de lyse) DETERMINATION Echantillon 0,2 ml (dilutions de raison 2 avec le SS corne diluant) SS 0,2 ml C' (2 unités) 0,2 ml. On incube les dilutions pendant 1 heure à 370C. On ajoute à chaque dilution, 0,4 ml de GRM sensibilisés. On incube 30 minutes à 37 C. Point final : dilution d'échantillon la plus élevée présentant une lyse d'au moins 50%. Témoins (incubés à 37 C, 30 minutes) 1. Echantillon \ 0,2 ml (dilution la plus faible utilisée) GRM sensibilisés 0,4 ml SS 0,4 ml doit être négatif (pas de lyse). 2. C' (2 unités) 0,2 ml GRM sensibilisés 0,4 ml SS 0,4 ml doit être négatif (pas de lyse). 3. GRM sensibilisés 0,4 ml SS 0,6 ml doit être négatif (pas de lyse). Activité hypotensive. On détermine l'activité hypotensive selon le Depressor Substances Test décrit dans la Pharmacopée des Etats-Unis d'Amérique XVII, page 843. Les propriétés de divers lots de concentré de facteurs de coagulation obtenus selon le procédé de l'invention figurent dans le tableau I ci-après On prépare un lot de complexe de coagulation de l'invention selon le procédé décrit. Les essais montrent que ce lot ne présente pas d'activité hypotensive, ni d'activités thrombique, thromboplastique ni anticomplémentaire. On conserve Le lot à l'état lyophilisé à la température ambiante et on le soumet à de nouveaux essais après 3 à 6 mois. On n'observe pas d'ictivités hypotensive, thrombique ni thromboplastique. Pour mettre en évidence la stabilité du complexe de l'invention, on place un grand nombre de flaoQe de 3 lots à des températures différentes et on les examine à des intervalles appropriés. La stabilité du lot PR 2240 (1,8 % d'humidité), après reconstitution de chaque bouteille avec 20 ml d'eau, figure dans le tableau I ci-apres. L'activité du complexe de l'invention est mise en évidence par la reconstitution d'un lot préparé selon le procédé précédemment décrit et la détermination des facteurs de coagulation. Les résultats, exprimés en pourcentages du plasma normal figurent dans le tableau III ci-après. On soumet le complexe de l'invention aux essais de détermination des substances hypotensives de la Pharmacopée des Etats-Unis d'Amériqué XVII et il satisfait à toutes les conditions. Les résultats figurent dans le tableau IV ci-après. La détermination de la thromboplastine-thrombine précédemment décrite donne les résultats suivants avec un échantillon du complexe de l'invention. L'impossibilité pour l'échantillon de l'invention d'améliorer le temps de coagulation du plasma humain normal est due à l'absence de thrombine, de thromboplastine et de la forme activée du facteur X. Résultats cliniques. On a conduit des essais chez l'homme avec le complexe de coagulation de l'invention sur des malades manquant de facteur IX et des malades manquant de facteur VII. Les valeurs de la coagulation d'un de ces essais d'un malade déficient en facteur IX figurent dans le tableau VI ci-après. Pendant les 48 heures suivant l'administration du produit de l'invention contenant 2030 unités de facteur IX, on n'observe pas d'anomalie de la pression sanguine, du pouls, de la température, ni de la respiration. De plus, deux administrations du complexe de coagulation de l'invention au meme malade à 13 jours d'intervalle ne montrent pas de sensibilisation ni de caractère antigénique. De façon typique, la courbe de disparition après injection du facteur IX comporte deux phases ; T 1/2 pour le premier composant correspond à 7,5 heures; T 1/2 pour le second composant correspond à 47 heures. La demivie après injection du facteur IX chez divers malades varie entre environ 20 heures et environ 50 heures. On a recueilli les résultats des tests de coagulation valables pour les quatre composants de coagulation après administration de huit lots différents à deux malades ou plus. Chez ces malades, qu'on peut considérer comme assez normaux (y compris les malades saignants mais ne présentant pas de fibrinolyse ni de déséquilibre important des volumes plasmatiques), l'administration de 2,2 unités/kg de poids corporel provoque uneaugmentation d'environ 4 % des facteurs II, VII, IX et X. L'élévation après injection du facteur X est généralement un peu supérieure à celle des trois autres facteurs. Le produit de l'invention a été utilisé par 14 cliniciens dans le traitement de cas d'urgence chez 65 malades. Ces malades présentaient soit une déficience congénitale permanente des facteurs VII ou IX ou X ou présentaient une déficience temporaire acquise des quatre facteurs (II, VII, IX et X); ou présentaient une hypersensibilité au plasma ou ne pouvaient supporter le volume plasmatique nécessaire; ou présentaient un épisode sérieux de saignement ou nécessitaient d'être protégés pendant uoeintervention chirurgicale majeure d'urgence, Le mode d'administration du produit de l'invention est bien connu des médecins. De façon générale, on reconstitue le produit lyophilisé avec de l'eau injectable pour réaliser une solution isotonique qu'on injecte au malade par voie intraveineuse. EXEMPLE Adsorber le surnageant I (méthode de Cohn 6) de plasma citraté standard sur du DEAE-Sephadex fratchement équilibré à raison de 10 g (poids humide) par litre de surnageant I, entre O et -3"C. Renvoyer le surnageant I Épuise dans un traitement de fractionnement du plasma pour en précipiter les fractions II + III de Cohn. Laver la résine DEAE-Sephadex avec du bicarbonate d'ammonium 0,2 M à pH 7,0 - 7,8 jusqu'à ce qu'il n'y ait plus d'élution de protéines et rejeter les liquides de lavage. Laver ensuite la résine DEAE-Sephadex avec du bicarbonate d'ammonium 0,3 M à pH 7,0- - 7,8 jusqu'à ce qu'il n'y ait plus d'élution de protéines. La céruloplasmine bleue est éluée avec ce liquide de lavage qu'on rejette. Eluer ensuite la résine DEAE-Sephadex avec du bicarbonate d'ammonium 0,75 M à pH 7,6 - 7,8 jusqu'à ce que la fraction de facteur IX soit éluée avec les facteurs II, VII et X. Congeler et lyophiliser cet éluat. Le bicarbonate d'ammonium sublime en laissant une poudre de protéines ne contenant pas de sels équivalant à environ 350 mg/l de surnageant I. Doser le facteur IX et conserver le récipient à l'abri de l'humidité à 50C ou moins. On peut transformer ce produit en un mélange sec contenant un tampon électrolytique convenant à l'administration intraveineuse de la façon suivante Dissoudre lentement la poudre de protéineslyophilisée dans un diluant constitué de citrate de sodium 0,05 M et de chlorure de sodium 0,088 M à une concentration finale de 25 unités de facteur IX par ml. Pendant la dissolution de la poudre, maintenir le pH à 7,0 - 7,5 par addition d'hydroxyde de sodium 1N. Ajuster le pH final à 7,3 - 0,1. Stériliser la solution par filtration à travers une membrane filtrante stérile ayant une porosité de 0,2 micron et en introduire aseptiquement des quantités appropriées dans des récipients stériles, congeler et lyophiliser. Conserver à 50C. Pour l'administration à l'homme, redissoudre de façon aseptique le contenu d'un des récipients ci-dessus dans de l'eau injectable. Sinon, on peut conditionner stérilement le produit du stade de sublimation et le lyophiliser en un produit ne contenant pas de sel. Dans ce cas, on le reconstitue avec un diluant isotonique approprié avant injection à l'homme. Bien entendu, diverses modifications peuvent Btre apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'entre décrits uniquement à titre d'exemple non limitatif, sans sortir du cadre de l'invention. T A B L E A U I TEST *RESULTATS lot n A B C D Facteur IX 480 unités 540 unités 500 unités 550 unités Facteur II 700 unités 640 unités 510 unités 370 unités Facteur VII 380 unités 500 unités 480 unités 570 unités Facteur X 1100 unités 500 unités 470 unités 570 unités Protéines 962 mg 606 mg 484 mg 340 mg Activité spécifique 0,5 0,89 1,03 1,6 pH 6,9 6,8 6,8 7,2 Na+ 242 mEq./1 237 mEq./1 240 mEq./1 237 mEq./1 Cl- 90 mEq./1 94 mEq./1 88 mEq./1 87 mEq./1 Citrate (C6H5O7)* 51 mEq./1 48 mEq./1 51 mEq./1 50,2 mEq./1 Thrombine-thormoboplastique néant néant néant néant Essai des hypotenseurs négatif négatif négatif négatif * Par flacon, ou par unité de volume après reconstitution à 20 ml. T A B L E A U II Date du Durée écoulée Unités de facteur IX par mi@ dosage 5 C Température 40 C ordinaire 9/2/68 départ 33,6 33,6 33,6 19/3/68 5 semaines ---- ---- 34,6 19/4/68 9 semaines ---- 35,4 29,0 9/5/68 3 mois 28,0 ---- ---20/5/68 3,5 mois ---- ---- 28,7 19/6/68 4 mois 34,2 32,6 32,6 22/7/68 5 mois ---- ---- 21,8 8/8/68 6 mois 35,0 ---- --- T A B L E A U III II 2550% VII 2400% IX 2500% X 2350% (Activité spécifique du facteur IX: 1,03 unité/mg de protéines). T A B L E A U IV Dose Changement de la pression artérielle moyenne Histamine (base libre) 0,05 g/kg i.v. -35 Histamine (base libre) 0,10 g/kg i.v. -50 Histamine (base libre) 0,15 g/kg i.v. -55 Histamine (base libre) 0,10 g/kg i.v. -50 Histamine (base libre) 0,10 g/kg i.v. -50 Echantillon de l'invention 0,2 ml/kg i.v. -5 Histamine (base libre) 0,05 g/kg i.v. -40 Echantillon de l'invention 0,2 ml/kg i.v. -5 Histamine (base libre) 0,05 g/kg i.v. -40 (L'échantillon de l'invention est dilué à 3,0 ml). T A B L E A U V Echantillon étudié Temps de coagulation Solution saline (témoin) 135 Echantillon de l'invention non dilué 180 Echantillon de l'invention dilué au 1/3 135 Echantillon de l'invention dilué au 1/10 135 T A B L E A U VI Dose: 290 ml (2030 unités) début 11h 10 mn fin 24h 25 mn Echantillon Date Heure Durée écoulée Facteurs de coagulation (%) n (h/mn) heures minutes II VII IX X 0 222/67 11:00 0 0 75 64 1,0 95 Valeur preuve 1 12:45 0 20 144 165 54,2 200 pour le facteur IX= 2 13:10 0 45 136 122 49,2 213 =56,4 % 3 14:20 1 55 123 83 46,2 193 4 15:30 3 5 105 87 44,5 170 5 16:25 4 00 105 103 48,5 176 6 17:30 5 5 110 75 39,2 185 7 20:05 7 40 107 75 43,5 183 8 22:30 10 5 106 62 29,0 183 9 23/2/67 2:00 13 35 94 48 24,3 125 10 8:35 20 10 100 40 13,4 148 11 11:20 22 55 100 33 13,1 151 12 14:30 26 5 79 34 10,4 147 13 16:35 28 10 101 35 10,8 132 14 24/2/67 10: :05 45 40 99 55 9,1 139 15 13:00 48 35 101 51 9,6 138 16 16:30 52 5 106 38 9,2 141 17 25/2/67 10:15 69 50 95 37 7,0 117 18 26/2/67 11:00 94 35 92 39 5,9 121 19 27/2/67 11:14 118 50 85 42 3,35 97 20 28/2/67 14:10 143 45 80 47 2,9 98 REVENDICATIONS 1. Procédé de production d'un concentré lyophilisé stable pendant sa conservation, dérivant du plasma humain, pour lutter contre les saignements dans l'hémophilie et d'autres cas de déficience en un ou plusieurs des facteurs II, VII, IX et X par absorption et élution d'une fraction desplasma contenant un facteur de coagulation avec une résine échangeuse d'ions, caractérisé en ce qu'on applique du plasma humain non modifié ou une fraction correspondante contenant la totalité des facteurs de coagulation II, VII, IX et X sur une résine échangeuse d'ions constituée essentiellement d'une résine échangeuse d'anions ayant des radicaux diéthylaminoéthyle ou des radicaux faiblement basiques semblables présentant une attraction pour les ions de polarité inverse et à y adsorber ces composants de coagulation du plasma, à éluer sélectivement la résine avec une solution d'un tampon volatil ayant un pH d'environ 7,3 à Environ 8,2 de molarité croissante ; à séparer la fraction d'éluat contenant les composants-de coagulation ; à congeler la fraction d'éluat séparée et à éliminer le tampon volatil par lyophilisation de la fraction congelée. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la résine échangeuse d'ions est constituée de chaîne de dextrane réticulée avec des radicaux diéthylaminoéthyle fixés aux motifs glucoses des chaînes de polysaccharide. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le tampon volatil est le bicarbonate d'ammonium, 4, Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le plasma de départ constitue le surnageant I obtenu selon la méthode 6 de Cohn. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on conduit l'élution de la fraction contenant les facteurs de coagulation à une molarité d'environ 0,75 M et à un pH d'environ 7,6 à 7,8. 6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la résine échangeuse d'ions contenant les composants de coagulation adsorbés est tout d'abord débarrassée par lavage de la céruloplasmine avec une solùtion tampon ayant une molarité pouvant atteindre 0,3 M avant l'élution des facteurs de coagulation.