Brevet FR2215466A1 — publié le 19740823

La présente invention se rapporte a la détermination du taux de cholestérol et plus particulièrement du taux de cholestérol dans le sérum. L'invention est basée sur le fait que le micro-organisme "Nocardia erythropolis" (classé par la "National collection of industria bacteria", Torry Research Station, Aberdeen, Grande Bretagne sous le n" NCIB 9158) est capable de métaboliser le cholestérol. Lorsqu'il se développe dans un milieu renfermant le cholestérol comme unique source de carbone, ce micro-organisme secrète un enzyme intracellulaire susceptible de transformer le cholestérol en cholestènone (cholesterol) deshydrogénase. Une préparation dotée du pouvoir de cholestérol deshydrogenase peut être obtenue sous une forme exempte de cellules en brisant les cellules puis éliminant les débris de cellules de manière a obtenir un liquide surnageant ou liqueur) exempt de cellules. La préparation peut être employée pour transformer le choles stérol du sérum en cholesténone, le dosage de cette derniere permettant d'établir le taux de cholestérol dans le sérum. L'invention permet d'élaborer une préparation enzymatique quasiment exempte de cellules et de cholestérol et passédant une activité cholestérol deshydrogénase, a partir de cultures de microorganisme "Nocardia erythropolis" en présence de cholestérol. Bien que la préparation enzymatique soit obtenue et utilisée sous forme liquide, il est éventuellement possible de la mettre sous forme solide en vue du stockage et/ou du transport, par exemple par congélation ou mise en poudre par lyophylisation, auquel cas le solide doit être reconstitué en liquide avant emploi. Dans un autre mode de réalisation, la préparation peut être présentée sous la forme d'une suspension dans le sulfate d'ammonium. La méthode de préparation d'une solution enzymatique selon l'invention consiste a développer une culture de micro-organismes Nocardia erythropolis, dans un milieu dont la seule source de carbone est le cholestérol, puis a briser les cellules et éliminer ensemble les debris de cellule et le -cholestérol insoluble. De préférence, on ensemence en micro-organismes un milieu salin renfermant du cholestérol et dont le pH est compris entre 7 et 8 et on laisse se développer la culture pendant trois jours a trois jours et demi. Du fait de son insolubilité, le cholestérol doit être dispersé dans le milieu, par exemple au moyens d'ondes sonores, avant l'ensemencement. Les cellules ainsi obtenues sont alors recueillies -par centrifugation par exemple- a un moment déterminé par la teneur en cholesténone du milieu. Les cellules sont mêlées au reliquat de cholestérol du milieu. A ce stade, on peut, le cas échéant, conserver les cellules à -20 C. Les cellules, éventuellement décongelées, sont ensuite brisées. Cette opération peut être effectuée en mettant en suspension les cellules sous forme de pâte dans un tampon phosphate et en soumettant les cellules soit à des ondes sonores, soit a une surcongélation de la pâte puis a un passage a travers une filière. Les debris de cellule et la majeure partie du cholestérol insoluble sont alors éliminés, par exemple par centrifugation. On obtient alors un liquide surnageant -ou liqueur- possédant une activité de cholestérol deshydrogenase. La liqueur peut parfois renfermer également du cholestérol résiduel ou de la cholestenone qu'on peut éliminer par exemple au moyen de filtration en serie ou sur gel à travers une colonne de "Sephadex G100". La préparation enzymatique peut être purifiee afin d'eliminer d'autres enzymes actives contaminantes qui ont pour effet une oxydation ultérieure de la cholesténone produite, par exemple au moyen d'une colonne de Sep-hadex G100, d'un échangeur d'ion Sephadex ou par précipitation par le sulfate d'ammonium, auquel cas, 1 'en- zyme est précipttée et la preparation est ultérieurement reconstituée a partir du précipité. Il est également possible d'a.dditionner un inhibiteur agissant sur l'enzyme provoquant l'oxydation ultérieure de la cholesténone mais n'inhibant pas l'action de choles térol deshydrogénase. L'invention a en outre pour objet une méthode de dosage du cholestérol dans le sérum au moyen de la préparation décrite cidessus comportant l'addition de la préparation enzymatique à un échantillon du sérum, determinant par là l'oxydation du cholestérol du serum en cholesténone et le dosage de la cholesténone formee. L'absorption à 240 mV dans l'ultra-violet de la cholesténone elle-même peut servir à déterminer directement la quantite de cholesténone présente,car la préparation enzymatique purifiée selon la présente invention a une absorption suffisamment faible a 240 m. On peut également effectuer. le dosage de la cholestenone par colorimetrie, par exemple sous forme de sa 2,4-dinitrophenyl hydrazone ou en utilisant toute autre réaction colorée de la cholestenone. Du fait que le cholestérol est insoluble, il est avantageux d'utiliser un système de solvants permettant la. solubilisation du cholestérol mais n'inhibant pas l'activité de cholestérol deshydrogénase. On emploie de préférence le mélange éthanol/dioxanne comme système de solvant. Donc, la méthode de dosage comporte de préférence une étape d'incubation -du serum à doser avec un mélange éthanol-dioxanne et une étape de saponification du liquide surnageant ainsi forme. Cette méthode comporte en outre de préférence les étapes suivantes: a) réaction de dosage comportant l'incubation d'un échantillon du liquide surnageant saponifié et de la preparation enzymatique selon l'invention en milieu tamponné ayant une forte concentration en protéines b) essai à blanc comportant de même 1 'in- cubation de la préparation enzymatique dans un milieu tamponné riche en protéines suivie de l'addition d'un échantillon de liquide surnageant saponifié,au mélange incubé apres achèvement de la réaction et c) incubation des produits de la réaction de dosage et de l'essai a blanc, isolement du précipité et dosage de la cho lesténone contenue dans le liquide surnageant. La protéine utilisée de préférence est l'albumine du sérum de boeuf. L'invention a egalement pour objet un ensemble de réactifs destiné à la mise en oeuvre du test décrit ci-dessus et comportant une préparation enzymatique selon l'invention, du solvant éthanol- dioxanne, de l'hydroxyde de potassium pour la saponi-fication, de l'albumine de sérum de boeuf et un tampon, tous en quantités mesurees d'avance,suffisantes pour un seul test. Le tampon peut éventuellement contenir la protéine. Si on effectue le dosage de la cholesténone par colorimétrie, on prévoit en outre de la 2,4-dinitrophenyl hydrazine parmi ces reactifs. Les ensembles de reactifs peuvent renfermer les quantités juste nécessaires pour effectuer un test unique, ou des quantites plus importantes permettant l'analyse automatique. Dans un mode d-e realisation particulier donné a titre d'exemple non limitatif, on ensemence en micro-organismes "Nocardia erythropolis" un milieu. salin renfermant 5 g de cholestérol par litre de solution saline. Ce milieu renferme, par litre d'eau distillée, 13,6 g de K2PO4, 0,2 g de MgSOX, 2 g de (NH4)2SO4 et 1 ml d'une solution a 0,5 g/Q de FeSO4 et du KOH (ajouté sous forme solide) pour obtenir un pH de 7,2, le cholestérol etant disperse au moyen d'ondes sonores avant l'ensemencement. On partage le milieu renfermant les micro-organismes en fractions de 100 ml qu'on secoue séparément. On laisse la culture se développer à une température de 25"C pendant trois à trois jours et demi. Les cellules ainsi engendres sont collectées par centrifugation du milieu de culture à 12 000 g pendant 20 minutes à une température de 2"C. On détermine le moment de la centrifugation en prélevant des échantillons pour vérifier la teneur en cholesténone du milieu. En général, on obtient 4 à 5 ml de cellules agglomérées par litre de milieu de culture. Le cas échéant, on conserve les cellules collectées à -20 C. L'étape suivante consiste à additionner aux cellules collectees un tampon phosphate en une quantité suffisante pour former une pâte. Si les cellules proviennent drune fraction de 600 ml de milieu de culture, il faut environ 10 ml de tampon phosphate. On brise ensuite les cellules, soit au moyen d'ondes sonores, soit par surcongélation de la pâte suivie d'une expression à travers un petit orifice à travers lequel on la force dans les deux sens. Les cellules rompues sont alors centrifugees à 80 000 g pendant 2 heures à 2"C de'manière à separer les débris de cellules et le résidu de cholestérol du milieu contenu dans la pâte. On obtient ainsi une liqueur surnageante exempte de cellules. La liqueur est susceptible de renfermer du cholestérol résiduel sous forme colloldale ou de la cholesténone, visibles dans la liqueur, et qu'il est possible d'eliminer au moyen d'une filtration en série, c'est-à-dire en faisant passer la liqueur à travers une serie de filtres de pores de plus en plus fins, jusqu'à 0,1 p par exemple. On peut aussi employer la technique de filtration sur gel en utilisant une colonne de Sephadex G100. On obtient alors une préparation brute,renfermant un enzyme, ayant l'activité de cholestérol deshydrogénase mais pouvant contenir en outre d'autres enzymes ayant une activité sur la cholesténone. La préparation brute est purifiée par précipitation au sulfate d'ammonium. On additionne lentement le sulfate d'ammonium à la préparation brute jusqu'à formation du précipite de l'enzyme. Ceci demande une saturation à environ 30,0 avec du sulfate d'ammonium solide broyé, un autre enzyme ayant une activité sur la cholesténone demeurant en solution,du fait qu'elle exige une saturation à 35 pour precipiter. On abandonne la liqueur saturée pendant 30 minutes à une température de 0-2 C, puis, la soumet à une centrifugation à 7 840 g pendant 10 minutes à 20C. On reconstitue le précipité dans le tampon phosphate, dont il faut 0,5 ml pour le pre- cipité dérivé des cellules provenant de 600 ml de milieu de culture. De cette manière, on obtient une préparation enzymatique aqueuse purifiée > exempte de cellules, pratiquement exempte de cho lesterol, possédant 'activité de cholestérol deshydrogénase et permettant le dosage du cholestérol dans le sérum. La méthode d'utilisation de la préparation est Ta suivante. D'abord, on mélange 0,2 ml du sérum dont on veut connaître le taux de cholesterol avec 1,2 ml d'un mélange éthanol-dioxanne (0,9/1,1 en volume respectivement) et on laisse incuber le mélange ainsi obtenu pendant 1 heure à la température ambiante. Le mélange est centrifugé à 1 100 g pendant 10 minutes à la température ambiante afin d'éliminer les protéines qui précipitent, le cholestérol du sérum demeurant en solution. Alors, à 0,5 ml de l'extrait de sérum ainsi obtenu, on additionne 0,02 mi de solution de KOH (56 g/100 ml), saponifiant ensuite le mélange à 37"C pendant 55 minutes. Puis, on prépare u-n mélange pour a réaction de dosage et un mélange pour la réaction à blanc de la façon suivante: Le melange de dosage est obtenu en mélangeant 0,05 ml de l'extrait de sérum saponifié ; 0,2 ml de ABS (albumine du sérum de boeuf) dans un tampon phosphate 0,1 M à pH 5,8 (7 g/100 ml), 0,1ml du tampon phosphate de pH 5,8 ; 0,05 ml de la préparation enzymatique. Du fait de la nature alcaline de l'extrait saponifié, le pH final, de l'ordre de 7-7,2, convient à l'incubation avec la préparation enzymatique. Le mélange pour la reaction blanc est obtenu en mélangeant 0,05 ml de la préparation enzymatique avec 0,2 mi d'ABS dans un tampon phosphate 0,1 M à pH 7,2 (7 g/100 ml) et 0,1 mi de ce tampon phosphate de pH 7,2. La quantité totale d'ABS suffit pour main tenir le cholestérol en solution sous une forme pouvant être attaquée par l'enzyme. Les deux mélanges sont incubés à 37"C pendant 2 heures 30, bien qu'en fait, l'enzyme puisse supporter des températures d'incubation plus elevees et qu'il soit possible de maintenir la température d'incubation à 50"C, ce qui permet de réduire la durée d'incubation lorsque ceci est nécessaire, par exemple lorsqu'on emploie un appareil d'analyse automatique. On achève les réactions par addition à chaque mélange de 3 ml d'isopropanol qui fait precipiter la protéine et effectue l'extraction de la cholesténone. 0,05 ml de 1 l'extrait de sérum saponifié sont ajoutés au mé- lange pour la réaction à blanc et les deux mélanges sont alors incubés à 37"C durant 1 heure. Les deux mélanges sont centrifugés à 1 100 g pendant 10 minutes et à température ambiante. Enfin, on détermine l'absorption ultra-violette des deux mélanges à 240 ml, afin de déterminer la quantité de cholesténone présente dans le mélange de dosage. Dans une variante du procédé de determination de la cholesténone, on peut former la 2,4-dinitrophényl hydrazone. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation représentés. Elle est susceptible de nombreuses variantes, accessibles à l'homme de l'art sans que l'on ne s'écarte de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1.- Préparation enzymatique exempte de cellules, quasiment exempte de cholestérol et présentant une activité de cholestérol deshydrogenase, caractérisée en ce qu'elle est obtenue à partir de micro-organismes Nocardia erythropolis cultivés en présence de cholestérol. 2.- Préparation enzymatique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est sous la forme d'une suspension dans le sulfate d'ammonium. 3.- Procédé de préparation d'une solution enzymatique selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'elle consiste a développer une culture.de micro-organismes Nocardia erythropolis dans un milieu renfermant du cholestérol comme unique source de carbone, a briser les cellules, a éliminer en même temps les débris de cellule et le cholestérol insoluble pour obtenir une solution enzymatique possedant une activité de cholestérol deshydrogénase, exempte de cellules et quasiment exempte de cholesterol. 4.- Procedé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les micro-organismes sont ensemencés dans un milieu salin renfermant du cholestérol ou ils se développent, le cholestérol etant dispersé dans le milieu avant l'ensemencement. 5.- Procédé selon les revendications 3 ou 4, caractérisé en ce que les cellules, apres isolement du milieu, sont brisées en les mettant en suspension sous forme de pâte dans un tampon phosphate, puis soumises à l'action d'ondes sonores ou à une surconge- lation suivie d'un pa-ssage a travers une filière. 6.- Procédé selon une quelconque des revendications 3 a 5, caractérise en ce qu'après élimination des débris de cellule et du cholestérol insoluble, tout le cholestérol colloldal ou la cholesténone sont éliminés et la préparation est purifiee. 7.- Méthode de détermination du taux de cholestérol dans le sérum dans laquelle on utilise une preparation enzymatique obtenue selon le procédé d'une quelconque des revendications 3 a 6, caractérisee en ce que l'on additionne la préparation enzymatique a un extrait du sérum, ce qui entrain l'oxydation du cholestérol en cholesténone, puis on détermine la teneur en cholesténone. 8.- Methode de détermination du taux de cho-lesterol selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'on incube les sérum à tester avec un mélange alcool-dioxanne, puis saponifie la liqueur surnageante résultante. 9.- Methode de détermination du taux de cholestérol, selon les revendications 7 ou 8, caractérisée en ce qu'elle comporte les étapes suivantes a) on effectue une réaction de dosage comportant l'incubation d'un échantillon de liqueur saponifiée et de la préparation enzymatique en milieu tamponné ayant une forte concentration en protéines ; b) on effectue une réaction à blanc comportant de même l'incuba tion de la préparation enzymatique en milieu tamponné riche en protéines, suivie de l'addition d'un echantillon de liqueur surnageante saponifiée au mélange incubé après l'achèvement de la réaction ; enfin, c) on effectue l'incubation de la réaction de dosage et de la réaction à blanc, sépare le precipite et determine la teneur en cholesténone de la liqueur surnageant-e, par exemple en mesu rant son absorption ultra-violette à 240 mu. 10.- Ensemble de réactifs destiné a la determination du taux de cholestérol, caractérisé en ce qu'il comporte une préparation enzymatique préparée selon le procédé d'une quelconque des revendications 3 à 6, un solvant mixte ethanol--dioxanne, de 1 'hy- droxyde de potassium, de l'albumine de sérum de boeuf, un tampon et éventuellement de la 2,4-dinitrophényl hydrazine.