Brevet FR2210392A1 — publié le 19740712

L'invention concerne un procédé d'augmentation du rendement en vincristine lors de l'isolement de la vincristine de parties de la plante Vinca rosea L. La vincristine est un agent cytostatique très important, salvateur même dans le cas de la leucémie aigüe de l'enfant (Raggard, M.E. : Cancer Chemother, Reports, 52, 477/1968) ; on peut de plus obtenir, dans 60 à 65 % des cas de maladies à tumeurs dures de l'enfant, une régression considérable en utilisant cette substance (Sealavry, O., Holland, J.F., Wolmsn, I.J. : Cancer Chemother. Reports, 52, 497/1968). On sait que la vincristine est un des alcaloedes dimères mineurs de Vinca rosea L., et représente quelque dix pour cent de la teneur totale en alcaloides de la plante. En conséquence, la quantité de vincristine que l'on peut séparer de la plante est très insuffisante pour satisfaire à la demande. Jusqu'à présent, cependant, on ne savait pas que Vinca rosea L. contenait aussi la N-déméthyl-vinblastine à l'état d'al- caloie dimère. La préparation de la N-déméthyl-vinblastine est décrite dans l'exemple 1 du brevet US NO 3.354.163. Suivant ce procédé, on dissout le sulfate de vincristine pur dans de l'acide sulfurique aqueux à 0,1 %, et on fait bouillir pendant 18 heures la 50- lution obtenue qui a un pH de 2,03. La solution pure obtenue est alcalimisée par une solution d'hydroxyde d'ammonium concentrée, après quoi on extrait le mélange alcalin par du chlorure de méthylène. On évapore l'extrait à sec sous vide, on mouille le résidu avec du chlorure de méthylène et le dissout dans l'éther. On élimine les insolubles par centrifugation et on évapore à sec sous vide le liquide surnageant transparent. Le poids du résidu sec représente 75 % de la quantité de vincristine de départ.On dissout le résidu sec dans du benzène, et on fait passer la solution à travers une colonne remplie d'oxyde d'aluminium. On élue la substance adsorbée avec un mélange de benzène et de chloroforme. Par cette séparation chromatographique, on obtient deux constituants la majeure partie est constituée par la N-déméthyl-vinblastine, tandis que la déacétyl-N-déméthyl-vinblastine est obtenue comme sous produit en quantités mineures. Cet exemple ne mentionne pas le rapport des deux constituants, et il est seulement dit qu'à un pH inférieur à 0,2 la quantité du composé déacétylé augmente tandis qu'à un pH supérieur à 2,5, la transformation de la vincristine ntest pas complète.Le troisième exemple du brevet cité ci-dessus décrit la formylation de la N-déméthyl-vinblastine par l'aci- de formique en présence d'anhydride acétique ; dans ce procédé, la N-déméthyl-vinblastine obtenue par déméthylation de la vincristine peut être reconvertie en vincristine avec un rendement d'environ 50 %. il est mentionné dans ce brevet que l'on peut aussi préparer la N-déméthyl-vinblastine à partir de la vinblastine en utilisant comme agent de déméthylation un système oxydant faible, en utilisant par exemple une oxydation biologique par un système contenant du peroxyde d'hydrogène et une peroxydase. En dehors de cette affirmation générale, cependant, le brevet ne contient-pas d'autre information sur la préparation de la-N-déméthyl-vinblastine en partant de la vinblastine. Un inconvénient du procédé décrit dans le brevet US ci-dessus est que l'alcaloide dimère le plus précieux de Vinca roséa L., à savoir la vincristine, dont la préparation à l'état pur est une opération très compliquée, et par conséquent très couteuse, est décomposé en N-déméthyl-vinblastine et qu'ensuite la N-déméthyl-vinblastine est reconvertie en vincristine avec un taux de conversion d'environ 50 %. Suivant le procédé décrit dans le brevet US nO 3.20 > .22% on prépare la vincristine comme suit : on prétraite la plante Vinca rosea L. séchée par un acide, puis on l'extrait par un solvant organique, on soumet l'extrait à plusieurs opérations d'extraction en utilisant comme agent d'extraction de l'eau et des solvants organiques, et on,évapore à sec la solution purifiée obtenue. On soumet à une séparation chromatographique la fraction alcaloldique faiblement alcaline obtenue, de -composition complexe, contenant les alcaloïdes dimères dans une proportion de 1 à 2 % seulement, et contenant seulement quelques centièmes pour cent du composé désiré (à savoir la vincristine), pour avoir la vincristine pure. L'inconvénient du procédé est que pour isoler à l'état pur la vincristine présente dans le mélange dans la proportion de quelques centièmes pour cent, on doit d'abord soumettre la fraction alcaloldique faiblement alcaline à.une séparation chromatographique, puis l t extraire en fonction du gradient de pH. L'invention se propose d'augmenter la quantité de vincristine séparable de Vinca rosea L. et de préparer des quantités supplémentaires de vincristine précieuse du point de vue pharma ceutique en formylant la N-déméthyl-vinblastine naturelle, compo sé détecté dans la plante et isolé pour la première fois de celle ci par les inventeurs. L'invention est baséesur la découverte que le mélange d'alcaloides dimères de Vinca rosea L., qui, selon le brevet hon grois nO 160.967, peut être séparé de l'extrait purifié par un acide, par exemple, par l'acide sulfurique éthanolique, sous la forme d'un mélange de sels d'addition aux acides contenant envi ron 70 % d'alcaloides dimères, ou peut être enrichi à cette va leur, contient aussi de la B-déméthyl-vinblastine parmi les sels d'addition de la vinblastine, de la vinleurosine, de la vincris tine et dtauitres alcaloïdes digères. La N-déméthyl-vinblastine est une substance détectée dans Vinca rosea L. et isolée de celle ci pour la première fois par les inventeurs.Si l'on formyle alors ce mélange de sels d'addition contenant environ 70 % d'alcaloTdes dimères, ou éventuellement le mélange de bases d'alcaloOdes di mères libérées de leurs sels d'addition aux acides, on peut aussi isoler sous la forme de vincristine la N-déméthyl-vinblastine qui se trouve dans Vinca rosea t. à l'état naturel. La formylation peut s'effectuer suivant des procédés connus, par exemple, en uti lisant de l'acide formique en milieu anhydride acétique. En conséquence, l'invention concerne un procédé pour augmenter le rendement en vincristine lorsqu'on sépare la vincris tine de l'extrait de Vinca rosea L., dans lequel on formyle le mélange dralcaloldes dimères enrichi obtenu à partir de la drogue Vinca rosea L. contenant aussi la N-déméthyl-vinblastine naturelle ou le sel d'addition aux acides de ce mélange d'alcaloides dimères, onisole la vincristine du mélange formylé par les procédés connus, et la transforme si on le désire en son sel d'addition aux acides. ConforsémEnt à 11 invention, on procède de préférence de la façon suivante . on dissout un mélange de sulfates d'alcaloidess brut obtenu comme il est décrit dans le brevet hongre HO 160 967 dans un mélange d'acide formique et d'anhydride acétique, et on laisse le mélange réactionnel reposer à la température ambiante pendant quelques minutes, de préférence 1 à 10 minutes, après quoi on formyle la N-déméthyl-vinblastine présente dans le mélange de sulfates d'alcaloides brut pour donner la vincristine.On verse ensuite le mélange réactionnel dans environ 5 fois son volume d'eau en refroidissant, en prenant soin que la température de la solution aqueuse ne dépasse pas 100C, et soit de préférence infé- rieure à 0 à 50C. Puis on ajuste le pH de la solution aqueuse acide à 8,5-9, avec une solution aqueuse d'hydroxyde a'ammonium en refroidissant , et on extrait le mélange alcalin en plusieurs portions par un solvant organique, dé préférence par le chlorure de méthylène, jusqu' a obtention d'une réaction de l'alcaloide négative.On sépare les phases, on combine les phases organiques, les sèche et les évapore à sec sous pression réduite..Le résidu sec coloré en beige renferme maintenant la N-déméthyl-vinblastine contenue dans le mélange de sulfates d'alcaloldes bruts de départ sous la forme de vincristine. On dissout le résidu coloré en bei ge.dans un solvant, de préférence dans l'éthanol, et on ajoute au mélange une solution d'acide sulfurique éthanolique à 1 %. On laisse reposer la solution, après quoi le mélange de sulfates d' aicaloides dimères formylé cristallise. La substance obtenue est filtrée, lavée et séchée. On peut effectuer la séparation des constituants du mélange de sulfates d'alcaloldes dimère formylé obtenu comme il a été décrit.ci-dessus de la façon suivante : on dissout la substance dans un mélange 2 : 1 de chlorure de méthylène et de chloroforme, puis on fait passer la solution à travers une colonne remplie d'oxyde d'aluminium,-partiellement désactivé. Au cours de la séparation chromatographique, le sulfate est adsorbé, de sorte que effluent contient les alcaloïdes dimères séparés sous la forme des bases libres. On effectue ltélution avec un mélange de solvants de la composition indiquée ci-dessus.Les premières fractions contiennent les alcaloïdes d'accompagnement, les suivantes la vinblastine et la vinleurosine éventuellement présente. Puis les fractions contenant la vincristine quittent la colonne. Les alcaloïdes dimères dissous dans les diverses fractions sont identifiés par chromatographie sur papier ou sur couche mince. On combine les-fractions contenant les memes alcaloïdes dimères et on les évapore à sec dans des conditions ménagées, de préférence sous pression réduite. On dissout les bases.d'alcaloldes dimères amorphes séparées dans un solvant, de préférence méthanol, et on les transforme en leurs sulfates en ajoutant à la solution de l'acide sulfurique éthanolique à 1 %.Le sulfate de vincristine obtenu renferme ainsi, en plus de la vincristine contenue dans la plante, la vincristine obtenue par formylation de la N-déméthylvinblastine naturelle de la plante. Suivant une autre variante du procédé de l'invention, on soumet à la séparation le mélange de bases d'alcaloides dimères directement, c'esSà-dire sans le transformer en sulfate. En pareil cas, on dissout le mélange des bases d'alcaloldes dimères dans du benzène, et on fait passer la solution à travers une colonne remplie d'oxyde d'aluminium imprégné de benzène.On commence l''élution avec du benzène, qui élimine la majeure partie des alcaloldes d'accompagnement, puis on élue la colonne avec un mé- lange 2 : 1 de benzène et de chloroforme, et on utilise finalement un mélange 1 : 1 de benzène et de chloroforme comme agent d'élution. On traite les fractions obtenues comme .il a été décrit ci-dessus On peut par exemple séparer la N-déméthyl-vinblastine naturelle se trouvant dans Vinca rosea L. de la façon suivante on dissout un mélange brut de sulfates d'alcaloldes obtenu comme il est décrit dans le brevet hongrois nO 160.967 dans environ 40 fois son volume d'eau, on ajuste le pH de la solution aqueuse à 8,5-9,0 par une solution aqueuse d'hydroxyde d'ammonium, puis on extrait la solution alcaline en plusieurs portions par un solvant organique, de préférence par le chlorure de méthylène jusqu'à obtention d'une réaction de l'alcaloide négative. On sépare les phases les unes des autres, puis on combine les phases organiques, les sèche et les évapore à sec sous pression réduite.On dissout le mélange de basesd'alcaloides dimères amorphes obtenus dans un solvant apolaire, de préférence dans le benzène, et on fait passer la solution à travers une colonne d'oxyde d'aluminium imprégné de benzène. On commence l'élution avec un mélange 3 : 1 de benzène et de chloroforme. On recueille des fractions de 100 ml chacune, et on identifie les alcaloïdes dimères dans les diverses fractions par chromatographie sur papier ou sur couche mince. Les premières fractions renferment une partie des alcaloïdes d'accompagnement et la vinblastine, les suivantes contiennent la N-déméthyl-vinblastine, tandis que les autres contiennent la vincristine. On combine les fractions contenant la N-déméthyl-vinblastine et les évapore à sec dans des conditions ménagées, de préférence sous pression réduite.On dissout la N-déméthyl-vinblastine brute obtenue dans un solvant polaire, de préférence dans l'éthanol, et on ajoute au mélange une solution éthanolique d'acide sulfurique à 1 %. On laisse reposer le mélange obtenu, ce qui entraîne la cristallisation du sulfate de N-déméthyl-vinblastine. Par rapport aux procédés connus, le procédé de l'inven tion présente cet avantage que la N-déméthyl-vinblastine naturelle se trouvant dans Vinca rosea L., détectée dans la plante et isolée de celle-ci pour la première fois par les inventeurs, peut être transformée directement en vincristine. -Le progrès représentpar le procédé de l'invention par rapport aux procédés décrits dans le brevet US n" 3.205.220 et dans le brevet hongrois nO 160.967 ressort clairement des données du tableau ci-après (les données'numériques du tableau sont les quantités de sulfate de vincristine pouvant être obtenues à partir de la même quantité de plante,de la même qualité). TABLEAU Méthode sulfate de vincris tine mg/kg de matière ~ végétale brevet US nO 3.205.220 4 brevet hongrois nO 160.967 6,5 procédé de l'invention 10,8 Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention. Exemple 1 On dissout 3,85 g d'un mélange brut' de sulfates d'al caloies, obtenu comme il est décrit dans le brevet hongrois nO 160.967 dans un mélange de 35 ml d'acide formique à 98 % et 5,75 ml d'anhydride acétique, et on laisse le mélange reposer à la température ambiante pendant 5 minutes. Ensuite, on verse la solution dans 150 ml d'eau froide (O à 50C) et on ajuste la solution à 8,5-9,0 par une solution aqueuse concentrée froide d'hydroxyde d'ammonium. Au cours de cette opération, le mélange est refroidi. On extrait la solution alcaline aqueuse obtenue en plusieurs portions par 300 ml de chlorure de méthylène jusqu'à obten -tion d'une réaction de l'alcaloïde négative. On combine les solutions de chlorure de méthylène, les sèche et les évapore à sec sous pression réduite. On obtient 3,1 g d'un'mélange de bases d'al caloies dimères- amorphes, de couleur beige qui, du fait de la réaction de formylation, contient la N-déméthyl-vinblastine présente dans le mélange initial sous forme de vincristine. On dissout le mélange dans l'éthanol, et on lui ajoute une solution éthanolique d'acide sulfurique à 1 % pour séparer les alcaloïdes dimères sous la forme de leurs sulfates. On obtient 2,46 g de mé- lange de sulfate d'alcaloides dimères cristallins. On dissout ce mélange cristallin dans 20 ml d'un mélange 2.: 1 de chlorure de méthylène et de' chloroforme, et on fait passer la solution à travers une colonne de 250 g d'oxyde d'aluminium partiellement désactivé à l'eau. Au cours de cette opération, les groupes ,sulfate sont adsorbés, et les bases alcaloldes dimères libres se séparent les unes des autres. L'élution s'effectue avec le même mélange de solvants. Les alcaloïdes dimèresiquit- tent la colonne sous la forme des bases libres. On recueille des fractions de 50 ml chacune. Les fractions 1 à 3 contiennent les alcaloïdes d'accompagnement, tandis que les fractions~4 à 9 contiennent la vinblastine, et éventuellement la vinleurosineb La vincristine n'apparait que dans la 9é fraction, et son élution se termine avec la 18é fraction.Les fractions contenant la vinblastine, la vinleurosine, ou la vincristine, identifiées par chromatographie sur papier ou sur couche mince, sont évaporées & sec séparément. Les bases d'alcaloTdes dimères amorphes obtenues sont transformées en leurs sulfates comme il a été décrit ci-dessus. De cette façon, on obtient 2,0 g de sulfate de vinblastine à partir des fractions 4 à 9 tandis que les fractions 9 à 18 donnent 0,25 g de sulfate de vincristine brut. On recristallise cette dernière substance dans un mélange de méthanol et d'éthanol 1 : 4 ce qui fournit 0,23 g de sulfate de vincristine ()D20 n + Il à 120 (C - 1, dans l'eau), Rf = 0,30 (le composé apparait en bleu vif). Le composé est identifié sur la base de son spectre infrarouge lequel, par comparaison avec le spectre IR de la vinblastine, présente une très forte bande d'absorption à Les examens èn chromatographie sur couche mince sont effectués sur 1'adsorbant oxyde d'aluminium G. Merok". Comme agent d'élution, on utilise du chloroforme contenant 0,5 % de méthanol, le développement est- effectué avec de l'acide phosphorique concentré contenant 1 % de sulfate céri-ammonique. Exemple 2 On formule le mélange brut de sulfate d'alcaloïde comme il est' décrit dans l'exemple 1; et on soumet à la chromatographie les 3,1 g de mélange de bases d'alcaloïdes dimères amorphes de couleur beige obtenus pour séparer -la vinblastine et la vincristine. On dissout le mélange de bases d'alcaloïdes dans 15 ml de benzène, et on fait passer la solution à travers une colonne de 150 gd'oxyde d'aluminium (degré d'activité III) imprégné de benzène. On commence l'élution avec 400 ml de benzène, et on recueille l'effluent par fractions de 50 ml chaque. Be.benzène élue la majeure partie des alcaloïdes d'accompagnement.Puis on continue ltélution avec 450 ml d'un mélange 2 : 1 de benzène et' de' chloroforme. L'effluent obtenu contient le este des alcaloïdes' d'accompagnement et la vinleurosine présente en faible quantité. Par élution avec 450 ml supplémentaires d'un mélange 2 : 1 de benzène et de chloroforme, on obtient un effluent contenant de la vinblastine. On termine l'éluvion avec 1500 ml d'un mélange 1 : 1 de benzène et de chloroforme, ce qui entraîne le départ de la vincristine de la colonne. On combine les fractions contenant des alcaloïdes identiques, identifiées par chromatographie sur papier ou chromatographie: sur couche mince, et on les évapore à sec. On obtient 2,6 g de vinblastine amorphe. On transforme cette substance en son sulfate comme il est décrit dans l'exemple 1, ce qui donne 2,2 g de sulfate de vinblastine cristallin.L'évaporation de effluent contenant de la vincristine donne 0,32 g de vincristine base amorphe, qfle l'on transforme en son sulfate comme il est décrit dans l'exemple 1. On obtient 0,27 g de sulfate de vincristine brut. On recristallise le produit dans un mélange 1 : 4 de méthanol et d'éthanol, ce qui donne 0,21 g de sulfate de vincristine. Les constantes physiques de la substance obtenue sont identiques à celles données dans l'exemple 1. Exemple 3 Séparation de la N-déméthyl-vinblastine On dissout 6 g de mélange brut de sulfates d'alcaloldes dimères, obtenu comme il est décrit dans l'exemple 1 du brevet hongrois nO 160.967, dans 100 mi d'eau, et on alcalinise la solution aqueuse avec un solution aqueuse diluée d'hydroxyde b'ammo- nium. On extrait la solution alcaline en plusieurs portions par 3 x 100 ml de chlorure de méthylène jusqu'à obtention d'une réaction de l'alcaloïde négative. On sépare les phases les unes des autres, on combine les phases organiques, et les évapore à sec sous pression réduite. On obtient 4,5 g d'alcalofde base dimère amorphe.On dissout le produit dans 15 ml de benzène, et on fait passer la solution à travers une colonne d'oxyde d'aluminium (degré d'activité III) imprégné de benzène. On élue les alcaloïdes dimères comme suit : la vinblastine est éluée par 3600 ml d'un mélange 3 : 1 de benzène et de chloroforme. On recueille des fractions de 100 mi, et on identifie les alcaloïdes diméres présents dans les diverses fractions par chromatographie sur papier ou chromatographie sur couche mince. Les fractions 1 à 9 contiennent une partie des alcaloïdes d'accompagnement ainsi que la vinblastine. Les.fractions 10 à 24 contiennent la N-déméthyl-vinblas- tine. On évapore à sec ces dernières fractions, ce qui donne 0,35 g de N-déméthyl-vinblastine brute. On dissout la N-déméthyl-vinblastine ainsi obtenue dans du méthanol sec, et on ajoute au mélange une solution éthanolique d'acide sulfurique à 1 %. La substance séparée est filtrée, lavée et séchée, ce qui donne 0,26 g de sulfate de N-déméthylvinblastine brut. On fait recristalliser le produit dans un me- lange 1 : 4 de méthanol et d'éthanol, ce qui donne 0,24 g de sulfate de N-déméthyl-vinblastine. On transforme le sel obtenu en la N-déméthyl-vinblastine base libre. La base est identifiée à partir des données suivantes Point de fusion : 210 à 2150C (boétius) ()2DO = + 15,80 (o=1, dans le chlorofrome) Spectre W 211 46,504 258 11,300 286 10,740 294 9,965 310 4,995 Spectre IR : bandes caractéristiques à 3560, 3440, 3000, 2956, 2940, 2930, 2870, 2830, 2785, 1740, 1620, 1597, 1495, 1487, 1455, 1430, 1416, 1390, 1368, 1328, 1294, 1252, 1195, 1164, 1140, 1126, 1112, 1075, 1060, 1035, 1006, 998, 975, 954 et 915 -1 cm Chromatographie sur couche mince sur oxyde d'aluminium (élution par un mélange 99,5 : 0,5 de chloroforme et de méthanol, et développement par pulvérisation d'acide phosphorique concentré contenant 1 % de sulfate céri-ammonique sur la surface) : Eb = 0,60 ; tache orange, qui vire ensuite au violet. REVENDICATION Procédé pour augmenter le rendement en vincristine lors de l'isolement de la vincristine de parties de la plante Vinca rosea L., caractérisé en ce qu'on formyle le mélange enrichi d' alcaloïdes dimères obtenu à partir de la plante Vinca rosea L., contenant également de la N-déméthyl-vinblastine naturelle, ou le sel d'addition aux acides de ce mélange d'alcaloldes dimères, en ce qu'on isole la vincristine du mélange formylé, et en ce qu'on transforme si on le désire la vincristine en son sel d'addition.