Brevet FR2230351A1 — publié le 19741220

La présente invention concerne un nouvel agent immunosuppresseur. Cet agent immuno-suppresseur est l'hydroxyde d'anhydro4-carbamoyl-5-hydroxy-1-ribofuranosyl-imidazolium, ci-après appelé "Bredinine", qui présente la formule ainsi qu'un procédé pour sa production. La Demanderesse a découvert qu'un micro-organisme appartenant à l'Supenicillium produit un composé de formule I qui présente des activités d'immuno-suppresseur et antivirales dans un milieu de culture et qui est ci-après désigné comme "Bredinine". On connaissait jusqu'à présent le "Virazol" (l-P- ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-carboxamide), la "Pyrazomycine" L-5 t5)-ribofuranosyl-4-hydroxy-pyrazol-5(3)-carboxamide7, la Cytosine arabinoside (1-ss-D-arabinofuranosyl cytosine) et l"'Azathioprine" (Imurane), 6-[(1-méthyl-4-nitroimidazol-5-yl) thio7-purine, comme composés présentant une activité antivirale et/ou comme immuno-suppresseurs. Récemment le besoin d'un agent immuno-suppresseur efficace s'est fait sentir dans les opérations de transplanta tion d'organes, de tels agents, en particulier l'Imurane, sont fréquemment utilisés pour ces opérations, toutefois leur toxicité élevée rend impossible une administration continue. L'un des objets de la présente invention est de fournir un nouveau médicament agissant comme immuno-suppresseur de faible toxicité, la "Bredinine" présentant la formule I cidessus. D'autres objets de la présente invention sont de fournir un procédé de production de "Bredinine" par culture d'un micro-organisme producteur de "Bredinine" appartenant au genre Eupenicillium et l'isolement de la "Bredinine" présentant une activité d'immuno-suppresseur. Selon la présente invention, l'Eupenicillium brefeldianum (voir A.C. STOLK, Persoonia, 4, 391 (1967); E.B. RAYER, Â Manuel of the Penicilla, page 141 (1949) est utilisé comme micro-organisme producteur de Bredinine. Ce micro-organisme a été déposé à l'Institute for Microbial Industry and Dechnology, agence of Industrial Science & Technology, Japon, BERM-P No11O4. La même souche a également été déposée au Département de l'Â- griculture des Etats-Unis d'Amérique, Northern Marketing and Nutrition Research Division, et ajoutée à sa collection permanente sous la désignation NRRL 5754. Selon l'une des formes de mise en oeuvre de la présente invention, on cultive Eupenicillium brefeldianum NRRL 5734 (BERE-P No 1104) de la façon classique. On peut le cultiver comme culture solide ou comme culture liquide, cependant, pour la production industrielle, on préfère appliquer culture submergée aérée. On peut utiliser comme milieu, un milieu nutritif classique quelconque de culture de micro-organismes. On peut utiliser comme source de carbone des sources de carbone assimilables comme le glucose, le saccharose, le lactose, le maltose l'amidon, la dextrine, les mélasses, la glycérine, etc. Les sources d'azote assimilables sont l'extrait soluble de mais, la poudre de graines de soja, la poudre de graines de coton, le gluten de froment, la peptone, l'extrait de viande, l'extrait de levure, l'hydrolysat de caséine, des sels d'ammonium, un nitrate, etc. On peut aussi ajouter s'il est nécessaire des sels comme un phosphate, des sels de magnésium, de calcium, de potassium, de sodium, de zinc, des sels ferreux ou ferriques, un manganate. La température de la culture peut être modifiée pour la croissance du micro-organisme et la production de laBredinine, de préférence elle est de 26 à 300 C. La durée de la culture peut dépendre de la condition et elle este préférence de 40 à 70 heures, et lorsque la production de la Bredinine est à sa plus forte activité, on doit l'interrompre. La Bredinine est présente dans le filtrat liquide et n'est pas contenue dans le gateau mycélial. Comme la Bredinine est une substance hydrosoluble, difficilement soluble dans la plupart des solvants organiques et en particulier insoluble dans les solvants non miscibles à l'eau, il est impossible de l'extraire avec un solvant organique. On préfère par conséquent l'isoler en appliquant une nature faiblement soluble à la Bredinine ou l'insolubilité dans un solvant organique. Comme la Bredinine a une faible activité antimicrobienne, on peut la titrer par le procédé classique à la coupelle en utilisant Candida albicans comme organisme d'expérience. Une forme de mise en oeuvre d'isolement et de purification de la Bredinine est la suivante. On règle à pH 9,0 un filtrat cultivé d'Eupenicillium brefeldianum IZERL 5734 (FER;-P nO 1104) et on le fait passer sur une résine échangeuse d'anion, fortement basique du type hydroxy, par exemple Amberlite IRA-411 (marque de fabrique de Rohm & Hass CO, Etats-Unis d'AmE- rique), pour fixer la Bredinine.L'élution se fait avec de l'a- cide acétique aqueux à 2 % et facultativement, on traite encore l'éluant avec la résine échangeuse d'anion fortement basique, et on concentre l'éluat sous vide pour obtenir un résidu huileux qu'on précipite par addition de méthanol et d'acétone sous forme d'une poudre gris-blanc. On dissout la poudre dans une petite quantité d'eau pour le développement à travers une co lonne de gel de silice et on obtient des fractions actives violettes, qu'on sèche sous vide. On dissout la poudre dans liteau, après quoi on sature avec de l'hydrogène sulfuré gazeux pour libérer les agents métalliques chélatants.On peut conduire une purification ultérieure padissolution de la poudre brute de Bredinine dans une solution tampon de 0,1 mole de pyridineacide acétique et on fait passer cette solution à travers une colonne de DRAE-Sephadex A-25, marque de fabrique pour un gel de diéthyl-aminoéthyl-dextrane réticulé, produit de Pharmacia CO, Suède). On recristallise la Bredinine à partir de l'éluat actif par addition de méthanol, sous forme de cristaux blancs. Les propriétés physico-chimiques de la Bredinine sont les suivantes 1) Analyse élémentaire : Trouvé : C 41,70 %; H 5,06 %; N 16,21 %; O 37,03 k. 2) Poids moléculaire et formule moléculaire : Trouvé : 265 (par titrage théorique : 259,22 comme étant 09H13N306. 3) Point de fusion : > 20000 décomposé, coloration brune. 4) Rotation optique : [&alpha;]D27 = -35 (C = 0,8, H2O) 5) Absorption dans l'ultraviolet (spectre dans H20 1% 1% #max : 245 m E1cm = 250; # max : 279 m E1cm = 580 6) Spectre d'absorption en infra-rouge (pastille de KBr): Bandes d'absorption en 3420, 3130, 2925, 2770, 1625, 1540, 1445, 1300, 1260, 1195, 1030, 1100, 1080, 1055, 980, 873, 829, 770, 740, 725, 560 cm-1. 7) Réactions colorées : Positives, chlorure ferrique, Molîsh, permanganate de potassium, Pauli- & Ehlrich. Négative : solens, Fehling, Dragendorf, Leidon-Smith, Isatine, Sakagushi et Ninhydrine. 8) Solubilité : Facilement soluble dans l'eau; légèrement 80- luble dans le méthanol; difficilement soluble dans l'éthanol, insoluble dans les solvants organiques courants. 9) pKa : faiblement acide (pg 6,75) 10) Couleur ou aspect : cristaux blancs. 11) Stabilité : n'est pas inactivée à pH 2-9 à 60 C pendant 30 minutes. La structure chimique de la Bredinine est assez raisonnable pour la formule (I) précédente, conformément à la dé termination par analyse par rayons I, cependant on doit inclure dans la présente invention l'autre formule de structure raisonnable. Les propriétés biologiques de la bredinine sont les suivantes 1) Toxicité aiguë : > 1 g/kg (i.p. chez la Souris) On observe les survivantes après plus d'une semaine lors d'une administration intra-péritonéale (i.p.) pendant 4 jours, avec 500 mg/kg/jour. 2) Observation du sang lors de l'administration en continu Les observations sur le sang lorsqu'on administre la Bredinine et l'Imurane chez la Souris, pendant 8 jours, sont illustrées par le tableau I TABLEAU I Leucocytes Erythrocytes Hémoglobine par mm3 par mm3 g/dl 5200 924 x 104 8,7 Témoin 7400 917 x 104 9,2 4700 821 x 104 9,4 "Bredinine" 5900 981 x i04 11,0 100 mg/kg/jour 4900 877 x 104 10,1 6600 793 x 104 8,8 "Imurane" 1900 620 x 104 7O 100 mg/kg/jour 1800 758 x 104 6,8 2600 640 x 104 7,2 Au tableau I on voit que la Bredinine diminue moins la teneur en leucocytes que l'Imurane. 5) Activité antimicrobienne La Bredinine n' a aucune activité anti-microbienne, mais présente une faible activité inhibitrice vis à vis de Candida albicans. 4) Activité comme immuno-suppresseur a) Pendant 4 jours consécutifs on administre la Bredinine. On injecte par voie intra-veineuse 4.108 globules rouges sanguins de mouton (appelés ci-après SBC "Sheep red blood cell"), à trois groupes de 10 souris chacun, mules de souche ddY. Pour deux groupes on administre à chacun respectivement 50 mg/kg/jour et 100 mg/kg/jour, par voie intrapéritonéale pendant 4 jours suivants. On observe le titre de l'hémolysine et des cellules en plaques sur la rate pendant 4 jours après l'immunisation à SRBC. Les résultats sont présentés au tableau Il TABlR & II Hémolysine Cellules en plaques titrée dans la rate Témoin 40 31,4 x 104 Brédinine (50 mg/kg/jour) 10 6,7 z Brédinine (100 mg/kg/jour) #5 1,8 x 104 Comme l'indique le Tableau, l'activité comme immunosuppresseur observe lors de l'administration de 50 mg/kg/jour pendant 4 jours en continu et la formation des cellules en plaques dans la rate est supprimée de 1/20 pour 100 mg/kg/jour. b) Effet d'une seule dose de Brédinine On injecte SR3C par voie intraveineuse chez la Souris. À la même époque (jour O), le 1er, le 2ème et le 3ème jours après l'injection de SRBC, on administre par voie intra-péritonéale 200 mg/kg de Brédinine. Le 4ème jour on observe le titrage de l'hémolysine et des cellules en plaques, dans la rate. Les résultats sont présentés au Tableau III. TABLEAU III Administration de Brédinine (200 mg/kg) Témoin Jour O 1er jour 2ème jour 3ème jour Titrage d'Hé- 40 40 40 10 20 molysine Cellules en plaque dans 31,4 31,8 33,1 11,2 18,2 la rate Comme l'illustre le tableau III, on observe de petites actions comme immuno-suppresseur lorsqu'on administre la Brédinine le même jour (jour O) ou le 1er jour après l'injection de SRBC. Lorsqu'on administre la Bredinine le 2ème jour, on observe un maximum d'activité comme immuno-suppresseur et aussi une suppression légèrement plus faible le 3ème jour. c) Effet sur le processus immunitaire indépendant de l'antigène du thymus Il résulte des expériences utilisant E. coli endotoxine que la Bredinine n'inhibe pas le processus immunitaire du thymus indépendamment de l'antigène. d) Actions sur les réponses secondaires On injecte par voie intra-péritonéale à 4 groupes de 10 souris chacune 4 x 108 SRBC. Après 21 jours, on injecte 4 x 108 de SRBC à nouveau par voie intra-veineuse à 3 groupes et en même temps, 100 mg/kg/jour de Bredinine et d'Imurane par voie intra-péritonéale pendant 3 jours, une fois par jour. Après trois jours suivant la seconde injection de SRBC on titre l'hémolysine et les cellules formant plaques dans la rate, ce qu'illustre le tableau IV TABLEAU IV Titre de Cellules en plaques l'hémolysine dans la rate Immunisation 40 secondaire as Pas d'immunisation émoin secondaire (immu- 5 0,19 x 104 libation primaire seulement) Bredinine (100 mg/kg) 5 3,1 x 104 Imurane (100 mg/kg) 20 8,3 x 104 La Bredinine est efficace pour une réponse d'immunité secondaire cependant l'Imurane a une très faible activité. Comme il a été précédemment indiqué, la Bredinine a une plus forte activité comme immuno-suppresseur que l'Imurane, non seulement pour l'immunité primaire mais aussi comme réponse à l'immunité secondaire. Ce fait indique le gros avantage de la Bredinine selon la présente invention en considérant l'application clinique parce que la stimulation antigénétique est continue après la transplantation d'organe. 5) Effet sur la multiplication des virus a) Effet de la Bredinine sur la multiplication du virus Herpes simplex, Polio virus, du virus agglutinant d'hématies du Japon et du virus de la vaccine étudié, et on ne constate aucune action inhibitrice sauf sur le virus de la vaccine. On cultive des cellules primaires d'embryons de souris dans un milieu contenant la Bredinine et après 24 heures, on leur inocule 100 DIT50 (dose infectieuse de culture de tissu à 50 %). On effectue les observations après 72 heures et les résultats sont présentés au tableau V ci-dessous TABLEAU V Bredinine 100 20 4 0,8 0,16 Témoin (Y/ml) Effet Cytopathique - ~ ~ ~ +++ b) Effet sur l'infection due au virus de l'influenza: On utilise la souris sauvage, souche lady, pesant 14-16 g pour l'expérience et le virus agglutinant d'hématie du Japon HJV. On multiplie au préalable le virus infectieux Inlfuenza A2, souche Kumamoto (H2N2) dans une cavité allantoïde de l'oeuf embryonaire, et en inhalation avec 1/250 ml de solution de virus par souris en utilisant le type de nébuliser "vapophrine" comme inhalateur. On règle le compresseur de l'inhalateur pour une pulvérisation de 10 ml de la solution de virus en 70 minutes. On effectue les administrations de Bredinine et d'Imurane en deux fois, 3 et 1 heure avant l'infection par le virus et deux fois, 1 et 3 heures après l'infection, et ensuite on l'administre pendant 5 jours deux fois par jour, par voie intra-péritonéale. Les résultats sont présentés au tableau VI TABLEAU VI Bredinine Imurane Témoin Dose (mg/kg) 25 5 25 5 salin Nombre de souris 10 10 10 10 40 traitées Survivantes/ traitées 8/10 7/10 10/10 6/10 4/40 Comme il est illustré ci-dessus, la Bredinine est efficace pour l'infection expérimentale par le virus de l'Influenza chez la souris et présente presque le même degré curatif que l'Imurane. 90 > des souris témoins sont mortes le 15ème jour après l'infection, cependant 20 c,t et 30 % des taux de mortalité pour des doses administrées, respectivement de 25 et de 5 mg/kg. L'activité antivirale de la Bredinine dépend non de la multiplication du virus mais de la suppression de l'immu- nité cellulaire provoquée par le virus de l t Influenza. 6) Activité anti-tumeur La Bredinine présente une faible activité anti-tumeur vis à vis de la tumeur de l'ascite de Ehrlich et la leucémie L-1210 chez la souris. La présente invention est illustrée en outre par les exemples suivants Es LE 1 On porte 100 ml d'un milieu (pH 6,5) constitué par 2 , de glucose, 10 6 d'extrait de pommes de terre (préparé à partir de 300 g de rognures de pommes de terre et d'un litre d'eau bouillies pendant une heure), 0,5 2' de poudre de graines de coton, 0,5 Yo de KH2PO4 et 0,25 2 de MgS04.7H20 dans un ballon de 500 ml, stérilisé à 1200C pendant 15 minutes.On inocule le milieu avec des spores d'Eupenicillium brefeldianum NRRL 5734 (FERM-P n 1104), on effectue la culture en secouant par rotation à 300 tours/minute à 2600. après 48 heures, on porte le milieu de culture dans 20 litres du même milieu dans un vase de fermentation de 30 litres et on cultive à 260C en agitant à 300 tours/minute, aération à 20 litres/minute pendant 49 heures. On porte le milieu ainsi cultivé dans 20G ml de milieu préalablement cultivé (pH 6,5) constitué de 2 % de glucose, 1 % de peptone, 1 % d'extrait soluble de maïs, G,2 % de EIfiP04, 0,1 ib de MgSO4.7 H20 et 0,1 % d'un agent anti-mousse dans une cuve de fermentation de 300 litres, en acier inoxydable et on cultive à 260C en agitant à 350 tours/minute, aération à 200 litres/minute pendant 55 heures, pour obtenir le bouillon cultivé (pH 5,9) contenant 50 mcg/ml de Brédinine. On règle le bouillon à pH 9,0 avec addition d'hydroxyde de sodium à 50 % aqueux et on filtre pour obtenir 170 litres d'un filtrat limpide.On fait passer le filtrat à travers une colonne (diamètre de 15 cm) de 20 litres d'Amberlite IRÂ-411 (Type OH) avec un débit de 300 ml/minute pour absorber la matière et on lave avec 50 litres d'eau. On effectue lélution avec de l'acide acétique aqueux à 2 % et on fractionne chaque 5 litres d'éluat. On trouve que les fractions actives sont dans les fractions N 7 à 9 titrées par Candida albicans comme organisme d'expérience. On recueille les fractions actives, on règle à pH 9,6 avec de l'hydroxyde de sodium aqueux à 50 %, puis on fait passer à travers 4 litres d'Amberlite IRAA11 (Type OH) en colonne de 7,5 cm de diamètre, on lave à l'eau, on élue ensuite avec de l'acide acétique aqueux à 2 % pour obtenir chaque fois des fractions de 500 ml. On trouve que les fractions actives sont les fractions IS 13 à 18 qu'on recueille et concentre sous vide pour obtenir 200 ml d'un résidu huileux.On mélange bien le résidu avec 400 ml de méthanol et 200 ml d'acétone et on précipite par centrifugation à 3000 tours/minute pendant 10-minutes. On lave le précipité avec de l'acétone, on sèche sous vide pour obtenir 50 g de Brédinine brute (pureté 10 %) sous forme d'une poudre blanc-grisâtre. EsSI13 2 On dissout la poudre de Brédinine brute obtenue à l'Exemple 1 dans une petite quantité d'eau et onvla met en sus- pension dans le mélange solvant ci-dessous et on charge sur 500 ml de gel de silice (0,250 à 0,177 mm) en colonne tassée de 4,0 cm de diamètre, avec un mélange solvant de n-butanol/ acide acétique/eau Cl 0/1/2) après quoi on développe avec le même mélange solvant. On fractionne l'éluant par portion de 100 ml et on trouve les fractions actives dans les fractions N 5 à 7 présentant une coloration violette.On recueille les fractions actives et on sèche sous vide pour obtenir 14,3 g d'une poudre bleu-violet (pureté 26 ys). On dissout la poudre dans 100 ml d'eau et avec de l'hydrogène sulfuré pour libérer les métaux chélatés comme sulfure. On dissout la matière sèche dans 10 ml d'un tampon à pH 6,0 de 0,1 mole de pyridinefacide acétique et on charge dans une colonne de 400 ml de DE Sephadex À-25 (diamètre de 2 cm) tassée avec le mgme tampon. On fractionne l'éluat en fractions de 10 ml et on trouve l'activité dans les fractions n 70-135, qu'on recueille et qu'on sèche sous vide pour obtenir 1,8 g d'une poudre blanche (pureté 90 %). La recristallisation dans le méthanol chaud donne 1,1 g de cristaux de Brédinine (pureté 100 26). REVENDICATIONS 1 - Brédinine (hydroxyde d'anhydro-4-carbamoyl-5 hydroxy-1 -ribofuranosyl-imidazolium) de formule 2 - Procédé de production de Brédinine selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on cultive l'Supenicillium brefeldianum NRRL 5734 dans un milieu et qu'on isole la Brédinine présentant une activité d'immuno-suppresseur. 3 - Médicament contenant de la Brédinine selon la revendication 1.