Brevet FR2226468A1 — publié le 19741115

La présente invention a trait à un procédé de fabrication de préparations de toxoplasmes, c'est-à-dire de préparation de sus -pensions de toxoplasmes destinée au diagnostic de la toxoplasmose par agglutination directe. L'agglutination directe des toxoplasmes en présence d'anticorps immuns constitue un test sérologique connu fidèle et précis, notamment pour le diagnostic des toxoplasmoses. L'utilisation de cette technique se heurte cependant à la difficulté d'obtenir des antigènes de toxoplasmes en quantité suffisante. On sait que les souches de toxoplasmes peuvent être cultivées et conservées par passage sur des souris ou sur cultures cellulaires. On a déjà préparé des préparations de toxoplasmes par inoculation intra-péritonéale de souris à l'aide d'un mélange de toxoplasmes et de cellules néoplasiques telles que le Sarcome TG. 180. En effet, le Sarcome détermine la production d'un abondant épanchement péritonéal favorisant le développement des parasites qui peuvent être ensuite récoltés. La récolte s'effectue environ entre la 72e et la 80e heure. L'exsudat péritonéal récolté, riche en toxoplasmes, est cependant contaminé par des quantités d'éléments cellulaires indésirables qui doivent être éliminés par différentes centrifugations successives puis filtrations sous vide. Ces opérations nécessaires de purification présentent l'inconvénient d'être longues et coûteuses et surtout de provoquer une perte importante en parasites, de sorte que ce procédé n'est pas totalement satisfaisant. La présente invention se propose de fournir un procédé de fabrication de préparations d'antigènes de toxoplasmes permettant d'obtenir des rendements importants en parasites de haute qualité antigénique, tout en évitant les différentes opérations de purification nécessaires dans les techniques actuellement connues. L'invention se propose également de fournir des préparations d'antigènes de toxoplasmes, de grande pureté en ce qui concerne les éléments cellulaires étrangers, lesdites préparations étant destinées à la réalisation de tests sérologiques pour le diagnostic des toxoplasmoses et présentant une grande activité antigénique et un degré très élevé de spécificité dans la réaction d'agglutination. L'invention a pour objet un procédé de fabrication de préparations d'antigènes de toxoplasmes dans lequel on inocule des souris, par voie intra-péritonéale, à l'aide de toxoplasmes et de cellules néoplasiques, caractérisé par le fait que l'on inocule à chaque souris une quantité de toxoplasmes comprise entre 2 Millions et 20 Millions et une quantité de cellules néoplasiques comprise entre 1 Million et 10 Millions, et qu'après une durée d'attente, on récolte le liquide d'ascite. Conformément à une caractéristique de l'invention, le rapport de cellules parasites et de cellules néoplasiques est égal à ou proche de 2/1. Le liquide recueilli est extrêmement riche en toxoplasmes et ne contient que de très rares éléments cellulaires provenant du péritoine de la souris. De plus, les cellules néoplasiques sont pratiquement absentes. I1 en résulte qu'aucune opération de purification n'est nécessaire, de sorte que la suspension ainsi obtenue peut être traitée directement pour constituer l'antigène final, sans autre traitement de purification. La récolte est de préférence effectuée après un temps de l'ordre de 96 heures après l'inoculation. Le liquide récolté peut, le cas échéant, subir un traitement ultérieur. I1 peut être par exemple formolé à environ 2 % dans du sérum physiologique pendant 24 heures à la suite de quoi on ajuste la concentration en parasites à la valeur désirée. L'antigène peut ensuite être conservé par exemple en suspension isotonique formolée à 0,2 % ou encore par lyophilisation. L'invention a également pour objet, à titre de réactif diagnostic nouveau, les préparations d'antigènes de la toxoplasmose obtenue par le procédé selon l'invention. Dans une première forme de réalisation, la préparation selon l'invention est constituée par le liquide d'ascite provenant de la récolte et présentant une teneur élevée en toxoplasmes, et une teneur sensiblement nulle en cellules de Sarcomes et éléments cellulaires. En variante, la préparation peut être constituée, à partir du liquide récolté, par adjonction de formol ou encore par lyophilisation. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaitront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif. Le matériau antigénique de départ est constitué par la souche de parasites Toxoplasma Gondii. Cette souche peut être cultivée par passages sur souris d'une façon déjà connue par récolte du liquide d'ascite des souris inoculées avec la souche. A partir de ce liquide d'ascite, contenant des toxoplasmes et de liquides d'ascites provenant d'un autre lot de souris ayant été inoculées avec la souche de Sarcome TG 180 on prépare un mélange contenant, par mm3, les quantités précitées de toxoplasmes et de cellules de Sarcome. Ce mélange est ensuite inoculé à raison de 1 ml à des souris par voie intra-peritonéale. 96 heures après l'inoculation, on effectue une ponction du liquide d'ascite des souris inoculées, qui contient entre 20 000 et 50 000 toxoplasmes par mm3, tandis que le nombre de cellules, négligeable, est inférieurtà 500 cellules par mm3. On effectue ensuite 1 ou 2 lavages de cette suspension par centrifugation, le culot étant remis en suspension dans de l'eau physiologique stérile entre les deux centrifugations. A la suite de la deuxième centrifugation, le culot est repris par un volume de tampon PBS formolé à 1 % de façon à amener la concentration finale en parasites à 1 million de toxoplasmes par mm3. Cette suspension concentrée est laissée pendant une journée à la température de + 40C. On effectue ensuite une centrifugation de cette suspension et on reprend le culot par du tampon PBS formolé à 0,2 %. Dans le cas où l'on désire lyophiliser les antigènes on centrifuge à nouveau la suspension concentrée pour effectuer un ou plusieurs lavages en eau physiologique. Après le dernier lavage on reprend le culot par une quantité convenable de solution de saccharose à 50 grammes par litre, puis on effectue la lyophilisation. Le test d'agglutination-des toxoplasmes en présence de serum immun s'effectue selon la méthode classique d'agglutination par exemple avec une suspension d'antigènes ramenés à 100 000 toxoplasmes par mm3. Les dilutions sériques vont de 1/8 à 1/1024. Ces dilutions sériques, à raison de 0,025 mm3, sont réparties dans des plateaux à cupules coniques pour micro-agglutination à usage unique puis chaque cupule reçoit le même volume de suspension antigénique à savoir 0,025 mm3. Après agitation, on incube en chambre humide à température normale. La lecture de la réaction est macroscopique. La réaction est positive lorsque les parasites s'agglutinent en formant un voile et elle est négative lorsque les parasites floculent pour former un bouton. L'invention a été décrite à propos d'un mode de mise en oeuvre particulier, mais il est bien entendu qu'on peut lui apporter diverses modifications sans pour cela s'éloigner ni de son cadre ni de son esprit. REVEND ICAT IONS 1. Procédé de-fabrication d'une préparation d'antigènes de toxoplasmes dans lequel on inocule à une souris des toxoplasmes et des cellules néoplasiques par voie intra-péritonéale, caractérisé par le fait que l'on inocule, par souris, une quantité comprise entre 2 Millions et 20 Millions de toxoplasmes et une quantité comprise entre 1 Million et 10 Millions de cellules néoplasiques, le rapport de cellules parasites et de cellules néoplasiques étant égal ou voisin de 2/1, et qu'après un certain temps on récolte le liquide d'ascite obtenu. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on inocule à chaque souris un mélange de toxoplasmes et de cellules néoplasiques. 3. Procédé selon l'une quelconque des reveudications 1 et 2, caractérisé par le fait que les cellules néoplasiques sont les cellules de Sarcome TG 180. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que la durée d'attente avant la récolte est de l'ordre de 96 heures. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 4, caractérisé par le fait que le mélange de cellules et de toxoplasmes est inoculé à la souris sous un volume de l'ordre de 1 millilitre. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que l'on effectue un ou plusieurs lavages par centrifugation de la suspension récoltée. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que l'on met le suspension en présence d'un tampon formolé. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que l'on effectue une lyophilisation de la suspension lavée. 9. Préparation d'antigènes de toxoplasmes obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.