Brevet FR2213979A1 — publié le 19740809

La présente invention concerne la préparation de L-proline, et plus particulièrement, un procédé de préparation de L-proline par fermentation. La L-proline, qu'on appelle ci-après proline, est utilisée comme additif alimentaire, médicament et en recherche médicale. On sait à ce jour que certains germes auxotrophes appartenant au genre Brevibacterium produisent de la proline dans un milieu (voir le brevet des Etats-Unis d'sérique n" 3 329 577). Cependant, la concentration de la proline accumulée par ce procédé.est d'au plus 1,5 g/dl dans des conditions favorables. La demanderesse a découvert qu'on peut accumuler des quantités considérablement améliorées de proline dans un milieu de culture aqueux avec des souches mutantes résistant aux médicaments de type sulfa de micro-organismes appartenant aux genres Brevibacterium ou Corynebacterium. Lorsque les souches mutantes dérivent de souches parentes de germes auxotrophes produisant de la proline, la productivité de la proline est extrêmement améliorée. De plus, les souches mutantes dérivant de souches parentes incapables de produire de la proline, peuvent produire des quantités importantes de proline. Les micro-organismes utilisés dans le proc8dd de l'invention sont des mutants qui résistent aux médicaments de type sulfa. Le procédé de mutation est classique et consiste, par exemple, en une exposition des cellules des souches parentes à la lumière ultraviolette, aux rayons X ou aux rayons 7, à des doses provoquant une mutation ou une solution de nitrite de sodium, de nitrosoguanidine ou de sulfate de diéthyle, de façon connue en soi. Par exemple, on expose les cellules de la souche parente sur un milieu nutritif gélosé a de la lumière ultraviolette (2 375 ) provenant d'une source distante de 30 cm, pendant 3 minutes. On choisit les mutants résistant aux médicaments de type sulfa des souches parentes exposées selon des procédés classiques. On laisse cultiver les souches parentes exposées sur un milieu gélosé ou dans un milieu nutritif aqueux contenant une quantité de médicaments de type sulfa inhibant la croissance de la souche parente. On sépare alors les mutants résistant aux médicaments de type sulfa. On détermine la résistance des souches mutantes aux médicaments de type sulfa, en comparant la croissance relative de la souche mutante sur un milieu contenant des médicaments de type sulfa a celle de la souche parente, c 'est--dire que la croissance relative de la souche mutante est plus importante que celle de la souche parente dans son ensemble.La croissance relative est le rapport de la croissance sur un milieu contenant des médicaments de type sulfa a la croissance sur un milieu ne contenant pas de médicaments de type suiffa. Les médicaments de type sulfa dans l'invention ont les caractéristiques générales suivantes et sont connus de façon générale comme antagonistes de l'acide p-aminobenzotque. 1. Ils ont pour formule générale et une action antimicrobienne. 2. L'action antimicrobienne est supprimée par l'acide p-aminobenzoïque. Les médicaments de type sulfa connus à ce jour,présentant les caractéristiques précitées, sont la sulfapyridine, le sulfathiazole, la sulfadiazine, la sulfaguanidine, la sulfaméthazine, la sulfamérazine, la sulfadiméthoxine, la sulfaméthomidine, la sulfaméthoxypyridazine, la sulfisomidine, le sulfisoxazole, l'acétosulfamine, le sulfanylamide, le sulfimezole, le sulfaphénazole, le sulfaméthizole, le sulfaethizole, la sulfapyrazine, l'irgafen et l'irgamide. Les mutants produisant de la proline de la façon la plus efficace découverts à ce jour (et les médicaments de type sulfa utilisés pour les séparer) sont Brevibacterium flavum FERM-P 1681 (sulfaguanidine), Brevibacterium flavum FERM-P 1682 (sulfaguanidine), Corynebacterium acetoacidophilum FERM-P 1683 (sulfameradine) et Corynebacterium glutamicum FERM-P 1781 (sulfaguanidine). Les échantillons de culture des micro-organismes possédant une référence FERM-P sont à la libre disposition de toute personne qualifiée sans qu'elle ait à demander l'autorisation de la demanderesse, et sont fournis par l'Institut de Recherche sur les Fermentations, Ministère des Sciences et Techniques Industrielles 1-8-5, Inage Higashi Chiba-shi, Chiba, Japon. Les milieux nutritifs qui sont fermentés par les micro-organismes de l'invention sont classiques et contiennent des sources assimilables de carbone et d'azote et des sels minéraux. On peut ajouter de petites quantités d'éléments nutritifs organiques tels que des vitamines et des -amino-acides. parmi les sources de carbone assimilables, figurent des hydrates de carbone tels que le glucose, les hydrolysats d'amidon ou les mélasses, des alcools tels que l'éthanol, des acides organiques tels que liacide acétique et d'autres sources de carbone classiques. Parmi les sources d'azote assimilables figurent des composés organiques et minéraux azotés tels que des nitrates, des sels d'ammonium, l'ammoniac gazeux, les solutions d'hydroxyde d'ammonium et l'urée. Pour obtenir un bon rendement en proline, on conduit la fermentation en aérobiose en aérant etjou en agitant. Pour obtenir les meilleurs rendements, il est nécessaire. de maintenir le pH dans la gamme de 5 à 9. On peut maintenir le pH désiré en ajoutant de temps en temps des composés tels que L'ammoniac gazeux ou en solution aqueuse, du carbonate de calcium, un hydroxyde de métal alcalin, de l'urée, des acides organiques ou minéraux, certains de ces composés apportant également de l'azote assimilable. Lorsqu'on conduit la fermentation entre 24 C et 370C, la concentration en proline du bouillon atteint son maximum en 2 à 7 jours. On peut récupérer la proline accumulee-dans le bouillon de fermentation selon des procédés classiques, par exemple en séparant les cellules par filtration ou-centrifugation, en faisant passer le bouillon sur une résine échangeuse d'ions et en précipitant au point isoélectrique de la proline. L'invention est illustrée par les exemples suivants. EXEMPLE 1 La croissance relative. dans un milieu contenant de la sulfaguanidine du mutant résistant au médicament de type sulfa Brevibacterium flavum FERM-P 1681 qu'on a séparé sur un milieu gélosé contenant 500 y/ml de sulfaguanidine, et celle de la souche parente Brevibacterium flavum ATCC 15940 (mutant nécessitant de l'isoleucine et produisant de la proline) figurent dans le tableau I. T A B L E A U I Croissance Croissance relative de Sulfaguanidine ajoutée (&gamma;/ml) Brev. flavum FERM-P 1681- Brev. flavum ATCC 15940 O 100 100 100 98 95 200 95 88 300 90 42 400 68 O 500 40 O 600 11 0 Composition du milieu : glucose : 2 g/dl; sulfate d'ammonium . 1 g/dl ; /dl,' urée 0,1 g/dl; biotine : 50 y/l;-ctllorhydrate de thiamine : 100 )/1; L-isoleucine : 20 mg/dl, phosphate monopotassique : 0,1 g/dl; phosphate dipotassique : 0,3 g/dl; sulfate de magnésium heptahydraté : 0,1 g/dl; Fe : 2 ppm; 10 : 2 ppm et sulfaguanidine s selon 1 tableau ci-dessus. Culture : On place 3 ml du milieu dans un tube à essai de 10 ml, on ensemence avec 2 x.107 cellules et on cultive à 11 ,5'C pendant 48 heures. On prépare un milieu aqueux contenant 10 g/dl de glucose, 4 g/dl de sulfate d'ammonium, 0,1 g/dl de phosphate nonopotassique, 0,04 g/dl de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,1 g/dl d'acide tartrique, 0,2 mg/dl d'ions ferriques, 0,2 mg/dl de manganèse, 450 7/1 de biotine, 1000 y/l de chlorhydrate de thiamine, 10 mg/dl de L-isoleucine, 0,1 ml/dl d'hydrolysat de protéines de soja et 5 g/dl de carbonate de calcium et n ajuste à pH 7,0. On introduit des portions de 300 ml du milieu dans des récipients de fermentation de 1000 ml, on stérilise à la vapeur et on ensemence avec Brevibacterium flavum FERM-P 1681. On conduit la fermentation à 31 C pendant 72 heures. On ajuste le pH du milieu pendant la fermentation en introduisant de l'ammoniac gazeux. Après culture, le bouillon de fermentation contient 2,89 g/dl de proline. On filtre 1 1 de bouillon combiné pour éliminer les cellules et on fait passer sur une résine échangeuse dotions. On élue la résine avec une solution d'hydroxyde d'ammonium et on évapore partiellement l'éluat sous vide. Ensuite, on obtient 14,5 g de proline cristallisée en versant de l'alcool éthylique dans l'élut Lorsqu'on cultive Brevibacterium flavum ATCC 15940 selon le même procédé que ci-dessus, le bouillon de fermentation contient 1,50 g/dl de proline. EXEMPLE 2 Les croissances relatives dans un milieu contenant de la sulfaguanidine d'un mutant résistant aux médicaments de type sulfa, Brevibacterium flavum FERM-P 1682, qu'on a séparé sur un milieu gélosé contenant 500 y/ml de sulfaguanidine et celle de la souche parente Brevibacterium flavum ATCC 15942 (mutant nécessitant de l'histidine et produisant de la proline) figurent dans le tableau II. T A B L E A U II Sulfaguanidine Croissance relative de ajoute (&gamma;/ml) Brev. flavum FERM-P 1682 Brev. flavum ATCC 15942 0 100 100 100 100 100 200 100 100 300 97 75 400 78 13 500 47 O 600 30 O Les conditions de culture sont identiques à celles de l'exemple 1, si ce n'est qu'on utilise 20mg/dl de L-histidine au lieu de 20 mg/dl de L-isoleucine. On cultive Brevibacterium flavum FERM-P 1682 sur le mEme milieu que décrit dans l'exemple 1, si ce n'est qu'on utilise lOmg/dl de L-histidine au lieu de 10 mg/dl de L-isoleucine, dans les mimes conditions de culture que dans l'exemple 1, Après culture, le bouillon de fermentation contient 2,66 g/dl de proline. Lorsqu'on cultive Brevibacterium flavum ATCC 15942 selon le mEme procédé que ci-dessus, on obtient dans le bouillon de fermentation 0,76 g/dl de proline. EXEMPLE 3 La croissance relative dans un milieu contenant de la sulfameradine du mutant résistant aux médicaments de type sulfa Corynebacterium acetoacidophilum FERM-P 1683 qu'on a séparé sur un milieu gélosé contenant 500 y/ml de sulfameradine et celle de sa souche parente Corynebacterium acetoacidophilum FERM-P 1780 (mutant nécessitant de l'isoleucine et produisant de la praline) figurent dans le tableau III. T A B L E A U III Croissance relative de ajoutée (&gamma;/ml) Coryn. acetoa@dophilum Coryn. acetoacidophilum FERM-P 1683- FERM-P 1780 0 100 100 100 100 100 200 100 100 300 96 75 400 78 13 500 50 O 600 31 0 Les conditions de culture sont identiques à celles de l'exemple I. On cultive Corynebacterium acetoacidophilum FERM-P 1683 selon le même procédé que décrit dans exemple 1. Après culture, le bouillon de fermentation contient 2,10 g/dl de proline. EXEMPLE 4 On prépare un milieu de culture aqueux contenant 0,8 g/dl d'acétate d'ammonium, 0,41 g/dl d'acétate de sodium, 0,3 g/dl de sulfate d'ammonium, 0,2 gldl de phosphate monopotassique, 0,04 g/dl de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,2 mg/dl d'ion ferrique, 0,2 mg/dl d'ion manganèse, 1 ml/dl d'hy-drolysat de protéines de soja, 15 mg/dl de L-isoleucine, 450 y/l de biotine, 1000 y/l de chlorhydrate de thiamine et 0,2 g/dl d'urée. On place 300 ml de milieu dans des jarres de fermentation de 1000 ml et on stérilise à 110 C pendant 10 minutes. On cultive Brevibacterium flavum FERM-P 1681 dans un milieu aqueux contenant 1,5 g/dl d'hydrolysat acide d'amidon, 0,3 g/dl d'acétate d'ammonium, 0,3 g/dl de sulfate d'ammonium, 0,15 g/dl de phosphate monopomassique, 0,04 g/dl de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,2 g/dl d'ion errique, 0,2 g/dl d'ion manganèse, 1 ml/dl d'hydrolysat acide de protéines de soja, 15 mg/dl de L-isoleucine, 450 y/l de biotine, 1000 7/1 de chlorhydrate de thiamine et 0,2 g/l d'urée, à 31,50C pendant 12 heures. On introduit 15 ml du bouillon cultivé dans la jarre de fermentation de 1000 ml. On conduit la fermentation en aérobiose à 31,54C Pendant la fermentation, on maintient le pH du milieu entre 7,5 et 8,0 en introduisant dans le fermenteur de l'ammoniac gazeux et une solution aqueuse à 50 gidl d'acide acétique. Après 48 heures de culture, 20 g d'acide acétique pour 100 ml de milieu ont été consommés et 4,70 g/il de proline se sont accumulés dans le bouillon de fermentation. On recueille 9,1 g de cristaux bruts de proline selon le même procédé que dans l!exemple 1 à partir de 200 ml de bouillon. EXEMPLE 5 On cultive Corynebacterium acetoacidophilum FERM-P 1683 comme décrit dans l'exemple 4. Après 48 heures de culture, 16,9 g d'acide acétique ont été consommés pour 100 ml de milieu et 4,23 g/dl de proline se sont accumulés dans le bouillon de fermentation. EXEMPLE 6 On prépare un milieu aqueux de culture contenant 1,5 g/dl d'éthanol, 0,5 g/dl de sulfate d'ammonium, 0,1 g/dl de phosphate monopotassique, 0,04 g/dl de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,2 g/dl d'ion ferrique,.0,2 g/dl d'ion manganèse, 2 ml/dl d'hydrolysat acide de protéines de soja, 15 mg/dl de L-isoleucine, 450 y/1 de biotine, 1000 y/l de chlorhydrate de thiamine, 0,5 ml/dl d'infusion de mats et 0,1 g/dl d'urée et on ajuste le pH à 7,2. On introduit 300 ml du milieu dans une jarre de fermentation de 1000 ml et on stérilise à la vapeur. On ensemence le milieu avec Brevibacterium flavum-FERM-P 1681 qu on a précédemment cultivé sur une gélose nutritive inclinée et on cultive en aérobiose à 31,5"C. Pendant la fermentation, on maintient le pH du milieu entre 7,5 et 8,0 en introduisant de l'ammoniac gazeux et on maintient la concentration d'éthanol dans le milieu à 0,1 g/dl environ en introduisant une solution d'éthanol à 90%. Après 48 heures de culture, 10 g d'êthanol ont été consommés pour 100 ml de milieu et 1,00 g/dl de proline s'est accumulé dans le bouillon de fermentation. EXEMPLE 7 On cultive Corynebacterium acetoacidophilum FERM-P 1683 comme décrit dans l'exemple 6. Après 48 heures de culture, 11,2 g d'éthanol ont été consommés pour 100 ml de milieu et 0,8 g/dl de proline s'est accumulé dans le bouillon de fermentation. EXEMPLE 8 La croissance relative dans un milieu contenant de la sulfaguanidine du mutant résistant aux médicaments de type sulfa Corynebacterium glutamicum FERM-P 1781 qu'on a séparé sur un milieu gélosé contenant 500 y/ml de sulfaguanidine et celle de la souche parente Corynebacterium glutamicum (Micrococcus glutamicus) ATCC 13032 (souche sauvage incapable de former de la prolîne) figurent dans le tableau IV. T A B L E A U IV Sulfaguanidine Croissance relative de ajoutée (7/ml) Coryn. glutamicum Coryn. glutamicum FERM-P 1781 ATCC 13032 0 - 100 ' 100 100 100 100 200 100 95 300 100 - 84 - 400 81 50 500 32 O 600 O - . O On cultive Corynebacterium glutamicum FERM-P 1781 selon le même procédé que dans l'exemple 1. Après culture, le bouillon de fermentation renferme 1,50 g/dl de proline. Lorsqu'on cultive Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 comme ci-dessus, on ne peut pas mettre en évidence de proline dans le bouillon de fermentation. Bien entendu diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de L-proline, caractérisé en ce qutil consiste a) à cultiver un mutant producteur de proline appartenant à un des genres Brevibacterium-et Corynebacterium et qui résiste à au moins un médicament de type sulfa, dans des conditions aérobies dans un milieu de culture aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote et des sels minéraux jusqu'à ce que la L-proline s'accumule dans le milieu et b) a récupérer la L-proline accumulée dans le milieu. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mutant est Brevibacterium flavum FERM-P 1681. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mutant est Brevibacterium flavum FERM-P 1682. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mutant est Corynebacterium acetoacidophilum FERM-P 1683. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mutant est Corynebacterium glutamicum FERM-P 1781. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les médicaments de type sulfa sont la sulfapyridine, le sulfathiazole, la sulfadiazine, la sulfaguanidine, la sulfaméthazine, la sulfamérazine, la sulfadiméthoxine, la sulfaméthomidine, la sulfaméthoxypyridazine, la sulfaisomédine, le sulfisoxazole, l'acétosulfamine, le sulfanylamide, le sulfimezole, le sulfaphénazole, le sulfaméthizole, le sulfaéthizole, la sulfapyrazine, l'irgafen et l'irgamide.